(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−２変異体を含むＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。【選択図】図１Ａ
2021506291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ヒトＩＬ−２タンパク質を含むポリペプチド組成物であって、前記変異型ＩＬ−２タンパク質は、配列番号２と比較してＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７ＲおよびＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋの群から選択されるアミノ酸置換を含む、ポリペプチド組成物。
【請求項２】
前記変異型ＩＬ−２タンパク質がＣ１２５Ｓ変異体をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３】
前記ＩＬ−２変異体がＣ１２５Ａ変異体をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチド組成物が、ホモ二量体タンパク質複合体であり、各タンパク質単量体が、Ｆｃドメインに共有結合した前記変異型ＩＬ−２タンパク質を含む、請求項１、２または３に記載のポリペプチド組成物。
【請求項５】
前記Ｆｃドメインのそれぞれが変異型Ｆｃドメインである、請求項４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチド組成物が、第１の変異型Ｆｃドメインに共有結合している前記変異型ＩＬ−２タンパク質を含む第１のタンパク質単量体と、第２の変異型Ｆｃドメインを含む第２のタンパク質単量体とを含むヘテロ二量体タンパク質複合体である、請求項１、２または３に記載のポリペプチド組成物。
【請求項７】
前記変異型Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項５または６に記載のポリペプチド組成物。
【請求項８】
前記変異型Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項５または６に記載のポリペプチド組成物。
【請求項９】
前記第１および第２の変異型Ｆｃドメインが、図２に示されるものからなる群から選択されるヘテロ二量化変異体のセットを含む、請求項６、７または８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１０】
前記ヘテロ二量化変異体のセットが、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗからなる群から選択される、請求項９に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１１】
前記変異型Ｆｃドメインの１つが、図３に示されるものからなる群から選択されるｐＩ変異体のセットを含む、請求項６、７、８、９または１０に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１２】
前記ｐＩ変異体セットが、Ａ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８／Ｎ４２１Ｄである、請求項１１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチド組成物が、ＸＥＮＰ２７５６４（配列番号２９７および２９８）、ＸＥＮＰ２７５６３（配列番号２９５および２９６）、ＸＥＮＰ２６１０５（配列番号２４５および２４６）、およびＸＥＮＰ２６１０９（配列番号２４９および２５０）からなる群から選択される、請求項６に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の変異型ヒトＩＬ−２タンパク質をコードする核酸を含む核酸組成物。
【請求項１５】
核酸組成物であって、
ａ）請求項６〜１３のいずれか１項に記載の第１のタンパク質単量体をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項６〜１３のいずれか１項に記載の第２のタンパク質単量体をコードする第２の核酸と、をそれぞれ含む、核酸組成物。
【請求項１６】
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項１５に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項１５に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
【請求項１８】
ポリペプチド組成物の製造方法であって、前記組成物を製造する条件下で請求項１に記載の宿主細胞を培養することと、前記組成物を回収することとを含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｉ．優先権主張
この出願は、参照によりその全体が図、凡例および特許請求の範囲に特に言及して本明細書に明示的に組み込まれる、２０１７年１２月１９日に提出された米国仮出願第６２／６０７，８５０号および２０１８年５月２２日に提出された米国仮出願第６２／６７５，０７０号の利益を主張する。
【０００２】
ＩＩ．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１１月３０日に作成され、０６７４６１−５２１７−ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称で６０５，０３８バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
免疫系のホメオスタシスは、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ２５−ＦＯＸＰ３−）と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）を含む、様々な免疫細胞集団間の微妙なバランスに依存する。このバランスが崩れると、自己免疫疾患などの疾患が発生する可能性があり、Ｔ細胞は調節されないままで、身体自身の組織を攻撃する。通常の状態では、ＴｒｅｇはＴ細胞の分化とエフェクターおよび細胞毒性機能を調節する。したがって、この点に関する主な前提は、Ｔｒｅｇの細胞数および／または機能の欠陥が病態の要因であるということである。このように、Ｔ細胞応答を微調整することにより細胞毒性と調節のバランスを変える能力は、自己免疫疾患や他の疾患の治療に大きな可能性を秘めている。
【０００４】
ＩＬ−２は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の増殖および分化を補助する機能を持つ。ＩＬ−２はまた、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能および生存に必須である。ＩＬ−２は、３つの異なるタンパク質、ＩＬ−１５と共有される共通のガンマ鎖（γｃ；ＣＤ１３２）およびＩＬ−２受容体Ｂ−鎖（ＩＬ−２Ｒβ；ＣＤ１２２）、ならびにユニークなアルファ鎖受容体（ＩＬ−２Ｒγ；ＣＤ２５）からなる高親和性三量体受容体複合体への結合を介してその細胞シグナル伝達機能を発揮。ＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒβとγｃ（ＩＬ−２Ｒβγ）のみからなる中親和性二量体受容体複合体への結合を介して、その細胞シグナル伝達機能を発揮することもできる。
【０００５】
ＩＬ−２は通常組織に存在する低濃度のＩＬ−２のため、高親和性受容体複合体（ＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２；ＩＬ−２Ｒγβγ）を発現する細胞を優先的に活性化し、ＣＤ２５を構成的に発現するＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇｓを優先する。しかしながら、ＩＬ−２は、中間親和性受容体複合体（ＣＤ１２２：ＣＤ１３２；ＩＬ−２Ｒβγ）を発現するＦＯＸＰ３−Ｔ細胞の活性化と増殖を誘導することもできる。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＦＯＸＰ３−Ｔ細胞は、炎症、自己免疫、臓器移植片拒絶、または移植片対宿主病の一因となる可能性がある。ＩＬ−２はＴ細胞とＴｒｅｇの両方を限られた選択性で促進または低減する可能性があるため、より選択的なＴｒｅｇモジュレーターを作成することが強く求められている。さらに、潜在的な薬剤として、ＩＬ−２はクリアランスが非常に速く、半減期が分単位で測定されるため、好ましい投薬が妨げられる。本発明は、新規のＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質を提供することにより、これらの両方の問題を解決する。
【０００６】
したがって、有用なＩＬ−２変異体およびＦｃ融合タンパク質を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、ある態様では、本開示は、（配列番号２と比較して）変異型ヒトＩＬ−２タンパク質を含む組成物であって、当該変異型ＩＬ−２タンパク質は、Ｔ３Ａ、Ｒ３８Ａ；Ｒ３８Ｄ；Ｒ３８Ｅ；Ｒ３８Ｆ；Ｒ３８Ｇ；Ｒ３８Ｈ；Ｒ３８Ｉ；Ｒ３８Ｋ；Ｒ３８Ｌ；Ｒ３８Ｍ；Ｒ３８Ｎ；Ｒ３８Ｐ；Ｒ３８Ｑ；Ｒ３８Ｓ；Ｒ３８Ｔ；Ｒ３８Ｖ；Ｒ３８Ｗ；Ｒ３８Ｙ；Ｔ４１Ａ；Ｔ４１Ｄ；Ｔ４１Ｅ；Ｔ４１Ｆ；Ｔ４１Ｇ；Ｔ４１Ｈ；Ｔ４１Ｉ；Ｔ４１Ｋ；Ｔ４１Ｌ；Ｔ４１Ｍ；Ｔ４１Ｎ；Ｔ４１Ｐ；Ｔ４１Ｑ；Ｔ４１Ｒ；Ｔ４１Ｓ；Ｔ４１Ｖ；Ｔ４１Ｗ；Ｔ４１Ｙ；Ｆ４２Ａ；Ｆ４２Ｄ；Ｆ４２Ｅ；Ｆ４２Ｇ；Ｆ４２Ｈ；Ｆ４２Ｉ；Ｆ４２Ｋ；Ｆ４２Ｌ；Ｆ４２Ｍ；Ｆ４２Ｎ；Ｆ４２Ｐ；Ｆ４２Ｑ；Ｆ４２Ｒ；Ｆ４２Ｓ；Ｆ４２Ｔ；Ｆ４２Ｖ；Ｆ４２Ｗ；Ｆ４２Ｙ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｑ；Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｋ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｑ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｖ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｍ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｌ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｍ；Ｔ４１Ｉ／Ｆ４２Ｙ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｙ’Ｔ４１Ｄ／Ｆ４２Ｙ；Ｔ４１Ｍ／Ｆ４２Ｙ；４１Ｑ／Ｆ４２Ｙ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｈ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｌ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｐ；Ｒ３８Ｑ／Ｆ４２Ｙ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｒ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｋ；Ｒ３８Ｖ／Ｔ４１Ｒ；Ｒ３８Ｐ／Ｔ４１Ｒ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｋ；Ｔ４１Ｄ／Ｆ４２Ｋ；Ｔ４１Ｍ／Ｆ４２Ｋ；Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｋ；Ｒ３８Ｑ／Ｆ４２Ｋ；Ｔ４１Ｉ／Ｆ４２Ｋ；Ｒ３８Ｎ／Ｆ４２Ｋ；Ｔ４１Ｈ／Ｆ４２Ｋ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｙ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｙ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｙ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ／Ｆ４２Ｙ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｋ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｈ／Ｆ４２Ｋ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｋ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｋ；３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ／Ｆ４２Ｋ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｋ；Ｑ１１Ｅ；Ｌ１２Ｄ；Ｑ１３Ｅ；Ｅ１５Ｑ；Ｈ１６Ｙ；Ｌ１９Ｄ；Ｄ２０Ｎ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｒ３８Ｌ／Ｋ４８Ｅ／Ｖ６９Ａ／Ｎ７１Ｒ／Ｑ７４Ｐ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｑ１２６Ｔ；Ｑ２２Ｅ；Ｋ３５Ｒ；Ｔ３７Ｓ；Ｋ４３Ｒ；Ｆ４４Ｙ；Ｙ４５Ｆ；Ｋ４８Ｒ；Ｋ４９Ｅ；Ｅ６１Ｑ；Ｅ６２Ｑ；Ｋ６４Ｒ；Ｅ６８Ｑ；Ｖ６９Ｌ；Ｌ７２Ｉ；Ｒ８１Ｄ；Ｄ８４Ｎ；Ｓ８７Ｔ；Ｎ８８Ｄ；Ｖ９１Ｌ；Ｉ９２Ｌ；Ｅ９５Ｑ；Ｙ１０７Ｆ；Ｅ１１６Ｒ；Ｎ１１９Ｄ；Ｒ１２０Ｄ；Ｔ１２３Ｓ；Ｃ１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｅ；Ｃ１２５Ｓ／Ｓ１２７Ｔ；Ｃ１２５Ｓ／Ｉ１２９Ｌ；Ｃ１２５Ｓ／Ｓ１３０Ｔ；Ｃ１２５Ｓ／Ｔ１３３Ｓ；Ｔ３Ａ；Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｖ６９Ａ／Ｎ７１Ｒ／Ｑ７４Ｐ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ；Ｖ６９Ａ／Ｑ７４Ｐ／Ｉ１２８Ｔ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｖ６９Ａ／Ｎ７１Ｒ／Ｑ７４Ｐ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｑ１２６Ｔ；Ｃ１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｔ；Ｎ８８Ｒ；Ｒ３８Ｉ；Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ９２Ｆ；Ｌ１８Ｒ／Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ９２Ｆ／Ｑ１２６Ｔ；Ｌ１８Ｒ／Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ９２Ｆ／Ｑ１２６Ｔ／Ｓ１３０Ｒ；Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ／Ｎ８８Ｒ；Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ／Ｑ１２６Ｔ；Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ／Ｎ８８Ｒ／Ｑ１２６Ｔ；Ｌ１９Ｄ；Ｄ２０Ｎ；Ｎ８８Ｄ；Ｎ８８Ｋ；Ｎ８８Ｒ；Ｎ８８Ｒ；Ｎ８８Ｒ；Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ；Ｌ１９Ｄ／Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ；Ｄ２０Ｎ／Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ；Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ；Ｌ１９Ｄ／Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ；Ｄ２０Ｎ／Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ；Ｋ４８Ｅ；Ｌ１９Ｄ  Ｋ３５Ｒ；Ｌ１９Ｄ／Ｔ３７Ｒ；Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ；Ｌ１９Ｄ／Ｎ７１Ｋ；Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ；Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ；Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ；３８Ｉ；Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ；Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ；Ｄ２０Ｎ；Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ；Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ；Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ  Ｒ３８Ｉ；Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ；Ｄ２０Ｎ；Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ；Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ；Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ；Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ  Ｒ３８Ｉ；Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ；Ｄ２０Ｎ；Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ；Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ；Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ；Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｒ３８Ｉ；Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｖ６９Ａ／Ｎ７１Ｒ／Ｑ７４Ｐ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｑ１２６Ｔ、Ｒ３８Ａ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｆ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｇ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｈ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｌ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｍ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｐ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｓ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｔ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｖ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｗ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ａ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｆ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｇ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｈ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｌ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｍ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｐ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｓ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｖ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｗ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ａ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｇ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｈ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｌ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｍ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｐ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｓ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｔ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｖ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｗ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｖ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｍ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｓ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｌ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｍ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｉ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ’  Ｔ４１Ｄ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｍ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；４１Ｑ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｈ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｌ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｐ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｖ／Ｔ４１Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｐ／Ｔ４１Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｄ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｍ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｉ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｎ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ４１Ｈ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ／Ｆ４２Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｈ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｒ３８Ｌ／Ｋ４８Ｅ／Ｖ６９Ａ／Ｎ７１Ｒ／Ｑ７４Ｐ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｃ１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｔ；Ｑ１１Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｌ１２Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｑ１３Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｅ１５Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｈ１６Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｌ１９Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｑ２２Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｋ３５Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３７Ｓ／Ｃ１２５Ｓ；Ｋ４３Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｆ４４Ｙ／Ｃ１２５Ｓ；Ｙ４５Ｆ／Ｃ１２５Ｓ；Ｋ４８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｋ４９Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｅ６１Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｅ６２Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｋ６４Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｅ６８Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｖ６９Ｌ／Ｃ１２５Ｓ；Ｌ７２Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ８１Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｄ８４Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｓ８７Ｔ／Ｃ１２５Ｓ；Ｎ８８Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｖ９１Ｌ／Ｃ１２５Ｓ；Ｉ９２Ｌ／Ｃ１２５Ｓ；Ｅ９５Ｑ／Ｃ１２５Ｓ；Ｙ１０７Ｆ／Ｃ１２５Ｓ；Ｅ１１６Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｎ１１９Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ１２０Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ１２３Ｓ／Ｃ１２５Ｓ；Ｃ１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｅ；Ｃ１２５Ｓ／Ｓ１２７Ｔ；Ｃ１２５Ｓ／Ｉ１２９Ｌ；Ｃ１２５Ｓ／Ｓ１３０Ｔ；Ｃ１２５Ｓ／Ｔ１３３Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ／Ｃ１２５Ａ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｖ６９Ａ／Ｎ７１Ｒ／Ｑ７４Ｐ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｃ１２５Ｓ；Ｖ６９Ａ／Ｑ７４Ｐ／Ｉ１２８Ｔ／Ｃ１２５Ｓ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｖ６９Ａ／Ｎ７１Ｒ／Ｑ７４Ｐ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｃ１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｔ；Ｃ１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｔ；Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ９２Ｆ／Ｃ１２５Ｓ；Ｌ１８Ｒ／Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ９２Ｆ／Ｃ１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｔ；Ｌ１８Ｒ／Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ９２Ｆ／Ｃ１２５Ｓ／Ｑ���２６Ｔ／Ｓ１３０Ｒ；Ｔ３Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ａ；Ｔ３Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ／Ｃ１２５Ａ／Ｑ１２６Ｔ；Ｔ３Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ａ／Ｑ１２６Ｔ；Ｔ３Ａ／Ｌ１９Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｎ８８Ｄ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｎ８８Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ／Ｃ１２５Ａ；Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｃ１２５Ｓ；Ｌ１９Ｄ／Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｄ２０Ｎ／Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ；Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｌ１９Ｄ／Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｄ２０Ｎ／Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ；Ｋ４８Ｅ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｌ１９Ｄ  Ｋ３５Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｌ１９Ｄ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｌ１９Ｄ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ；３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ  Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ  Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ；Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ、およびＮ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｖ６９Ａ／Ｎ７１Ｒ／Ｑ７４Ｐ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｃ
１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｔの群から選択されるアミノ酸置換（複数可）を含む、組成物を提供する。
【０００８】
さらなる態様では、本開示は、ａ）Ｎ末端からＣ末端まで、ｉ）請求項Ａ１〜Ａ４のいずれかの変異型ＩＬ−２タンパク質、ｉｉ）第１のドメインリンカー、およびｉｉｉ）第１の変異体Ｆｃドメインを含む第１の単量体、ならびにｂ）第２の変異型Ｆｃドメインを含む第２の単量体を含む、ＩＬ−２−Ｆｃ融合二量体タンパク質を提供する。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体二量体タンパク質を提供し、第２の単量体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ａ）Ａ１〜Ａ４のいずれかの変異型ＩＬ−２タンパク質、ｂ）第２のドメインリンカー、および）第２の変異型Ｆｃドメインを含む。
【００１０】
さらなる態様では、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体二量体タンパク質は、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；／Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗからなる群から選択されるヘテロ二量体化変異体を含む、第１および第２の変異型Ｆｃドメインを有する。ある場合において、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体タンパク質は、Ｐ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋを含む切除変異体をさらに含む。ある局面において、融合タンパク質はまた、アミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳまたはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａを有するＦｃドメインを含む。ある局面では、ドメインリンカーはＩＧＧ１ヒンジであり、他の局面では、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎから選択されるリンカーを含み得、ｎは少なくとも１つの整数である。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、変異型ヒトＩＬ−２タンパク質を含むポリペプチド組成物を含み、ここで、変異型ＩＬ−２タンパク質は、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７ＲおよびＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋの群から選択される配列番号２と比較してアミノ酸置換（複数可）を含む。場合によっては、変異型ＩＬ−２タンパク質は、Ｃ１２５Ｓ変異体またはＣ１２５Ａ変異体をさらに含む。
【００１２】
さらなる態様では、ポリペプチド組成物はホモ二量体タンパク質複合体であり、各タンパク質単量体は、Ｆｃドメインに共有結合された変異型ＩＬ−２タンパク質を含む。ある態様では、Ｆｃドメインのそれぞれは、変異型Ｆｃドメインである。
【００１３】
さらなる態様において、ポリペプチド組成物は、第１の変異型Ｆｃドメインに共有結合している変異型ＩＬ−２タンパク質を含む第１のタンパク質単量体と、第２の変異型Ｆｃドメインを含む第２のタンパク質単量体とを含むヘテロ二量体タンパク質複合体である。
【００１４】
さらなる態様では、ポリペプチド組成物は、アミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである変異型Ｆｃドメインを有する。
【００１５】
さらなる態様では、ポリペプチド組成物は、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである変異型Ｆｃドメインを有する。
【００１６】
追加の態様では、ポリペプチド組成物は、図２に示されるものからなる群から選択されるヘテロ二量体化変異体のセットを含む第１および第２の変異型Ｆｃドメインを有する。ある実施形態では、ヘテロ二量体化変異体のセットは、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗからなる群から選択される。
【００１７】
さらなる態様では、ポリペプチド組成物は、ＸＥＮＰ２７５６４（配列番号２９７および２９８）、ＸＥＮＰ２７５６３（配列番号２９５および２９６）、ＸＥＮＰ２６１０５（配列番号２４５および２４６）、およびＸＥＮＰ２６１０９（配列番号２４９および２５０）からなる群から選択される。
【００１８】
また、ａ）請求項６〜１３のいずれかに記載の第１のタンパク質単量体をコードする第１の核酸と、ｂ）請求項６〜１３のいずれかに記載の第２のタンパク質単量体をコードする第２の核酸とをそれぞれ含む核酸組成物も提供される。さらに、ａ）第１の核酸を含む第１の発現ベクター、およびｂ）第２の核酸を含む第２の発現ベクター、ならびに核酸組成物および／または発現ベクター組成物を含む宿主細胞を含む発現ベクター組成物が提供される。さらに、ポリペプチド組成物の製造方法であって、組成物が産生される条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、組成物を回収することとを含む、製造方法が提供される。
【００１９】
さらなる態様では、ＩＬ−２  Ｆｃ融合二量体タンパク質は、ＸＥＮＰ２４６３５；ＸＥＮＰ２４６３６；ＸＥＮＰ２４６３７；ＸＥＮＰ２４６３８；ＸＥＮＰ２４６３９；ＸＥＮＰ２４６４０；ＸＥＮＰ２４６４１；ＸＥＮＰ２４６４２；ＸＥＮＰ２４６４３；ＸＥＮＰ２４７２５；ＸＥＮＰ２４７２８；ＸＥＮＰ２４７２９；ＸＥＮＰ２４７３０；ＸＥＮＰ２４７３１；ＸＥＮＰ２４７３２；ＸＥＮＰ２５７１７；ＸＥＮＰ２５７２０；ＸＥＮＰ２５７２５；ＸＥＮＰ２５７２７；ＸＥＮＰ２５９１０；ＸＥＮＰ２５９１１；ＸＥＮＰ２５９１２；ＸＥＮＰ２６０８６；ＸＥＮＰ２６０８８；ＸＥＮＰ２６０８９；ＸＥＮＰ２６０９２；ＸＥＮＰ２６０９３；ＸＥＮＰ２６０９６；ＸＥＮＰ２６１０４；ＸＥＮＰ２６１０５；ＸＥＮＰ２６１０８；ＸＥＮＰ２６１０９；ＸＥＮＰ２６８３５；ＸＥＮＰ２６８３９；ＸＥＮＰ２６８４０；ＸＥＮＰ２６８４１；ＸＥＮＰ２６９８６；ＸＥＮＰ２６９８７；ＸＥＮＰ２６９８９；ＸＥＮＰ２６９９０，ＸＥＮＰ２６９９１，ＸＥＮＰ２５９０６，ＸＥＮＰ２５９０７；ＸＥＮＰ２５９０８；ＸＥＮＰ２５９０９；ＸＥＮＰ２６９９２；ＸＥＮＰ２６９９３；ＸＥＮＰ２６９９４；ＸＥＮＰ２６９９５；ＸＥＮＰ２６９９６；ＸＥＮＰ２７００１；ＸＥＮＰ２７００２；ＸＥＮＰ２７００３；ＸＥＮＰ２７００４；ＸＥＮＰ２７００５；ＸＥＮＰ２７００６、およびＸＥＮＰ２７００７から選択される。
【００２０】
さらなる態様は、ＣＤ２５＋細胞を本発明のＩＬ−２−Ｆｃ融合体二量体タンパク質と接触させることを含むＣＤ２５＋細胞を活性化する方法、および、本明細書のタンパク質組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ヒトＩＬ−２とその受容体：ＩＬ−２Ｒα（別名ＣＤ２５）、ＩＬ−２Ｒβ（別名ＣＤ１２２）、および一般的なガンマ鎖（またＩＬ−２ＲγまたはＣＤ１３２として知られている）のアミノ酸配列（およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）を示す。
【図２】（スキューおよびＰＩ変異体を含む）Ｆｃヘテロ二量体変異体セットの有用な対を示す。図２では、対応する「単量体２」変異体が存在しない変異体があり、これらはいずれの単量体でも単独で使用できるｐＩ変異体である。
【図３】等立体（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）変異型抗体の定常領域とそれらの各々の置換の一覧を示す。ｐＩ＿（−）は低ｐＩ変異体を示し、ｐＩ＿（＋）は高ｐＩ変異体を示す。これらは、任意選択的に独立して、本発明の他のヘテロ二量体化変異体（および本明細書に概説される他の変異体種）と組み合わせることができる。
【図４】ＦｃγＲ結合を除去した有用な切除変異体を示す（しばしば「ノックアウト」または「ＫＯ」変異体と呼ばれる）。一般に、切除変異体は両方の単量体に見られるが、場合によっては、それらは一方の単量体のみにあってもよい。
【図５】本発明の「非サイトカイン」構成要素の特に有用な実施形態を示す。
【図６】サイトカイン配列を含まない、ヒトＩｇＧに基づくいくつかの有用なＩＬ−２−Ｆｃ融合体フォーマットバックボーンの配列を示す。バックボーン１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除変異体を有する。バックボーン２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除変異体を有する。バックボーン３は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除変異体を有する。バックボーン４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＤ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキュー変異体、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＫ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキュー変異体およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除変異体を有する。バックボーン５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除変異体を有する。バックボーン６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除変異体を有し、さらに両方の鎖にＮ２９７Ａ変異体を有する。バックボーン７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。バックボーン６および７の代替フォーマットは、両方の鎖において切除変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外することができる。バックボーン８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、鎖にＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体およびＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番によるもので、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）変異体を有し、これは当技術分野で既知のとおり、Ｆａｂアーム交換を切除する。バックボーン９はヒトＩｇＧ２に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体を有する。バックボーン１０はヒトＩｇＧ２に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキュー変異体、およびＳ２６７Ｋ変異体を含む。バックボーン１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含むことを除いて、バックボーン１と同一である。バックボーン１２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、そして両方の同一の鎖にＣ２２０Ｓ、両方の同一の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除変異体を含む。バックボーン１３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異体、Ｐ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩ変異体を含み、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキュー変異体、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除変異体を有する。
【００２２】
当業者によって理解され、以下に概説されるように、任意のＩＬ−２変異体は、任意の組み合わせでこれらの図６のバックボーンに組み込むことができる。これらのバックボーンのそれぞれに含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（またはバックボーンに応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比べて）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙されたバックボーンは、この図のバックボーン内に含まれるスキュー変異体、ｐＩ変異体および切除変異体に加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。特に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳなどのＦｃＲｎ変異体も含めることができる。
【００２３】
【図７】いくつかの例示的な可変長リンカーを示す。ある実施形態では、これらのリンカーは、ＩＬ−２のＣ末端をＦｃ領域（場合によっては、ヒンジドメインを含む）のＮ末端に連結するのに使用される。
【図８Ａ−８Ｂ】Ａ）高親和性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）と複合体を形成したＩＬ−２の構造モデル、およびＢ）ＩＬ−２Ｒαと接触する３つのＩＬ−２残基の位置を示すどの置換がＩＬ−２のＩＬ−２ＲαへのｐＨ依存的結合を減弱すると予測されたこと、を示す。
【図９】ＩＬ−２ＲαへのｐＨ依存的結合を弱めるように設計された例示的なＩＬ−２変異体のアミノ酸配列を示す。これらの変異体は、ここに示した配列から削除されたポリヒスチジン（Ｈｉｓｘ８またはＨＨＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注意することが重要である。
【図１０】ｐＨ６．０におけるＩＬ−２変異体のＩＬ−２Ｒαへの会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、および解離定数（ＫＤ）を示し、ならびにＸＥＮＰ１４１３５（Ｃ１２５Ｓ変異を伴う野生型ＩＬ−２）を超えるｋｄおよびＫＤの倍改善を示す。ＮＢは測定可能な結合がないことを示す。
【図１１】ｐＨ７．４でのＩＬ−２変異体のＩＬ−２Ｒαへの会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、および解離定数（ＫＤ）、ならびにＸＥＮＰ１４１３５（Ｃ１２５Ｓ変異を伴う野生型ＩＬ−２）を超えるｋｄおよびＫＤの倍改善を示す。ＮＢは測定可能な結合がないことを示す。
【図１２】様々な点変異によってもたらされる、ｐＨ６．０でのＩＬ−２ＲαからのＩＬ−２オフレート（ｋｄ）の倍改善を示す。
【図１３】様々な点変異によってもたらされる、ｐＨ７．４でのＩＬ−２ＲαからのＩＬ−２オフレート（ｋｄ）の倍改善を示す。
【図１４】Ａ）ＸＥＮＰ１４１３５（Ｃ１２５Ｓ変異を伴う野生型ＩＬ−２）およびＢ）ＸＥＮＰ１４１４２（Ｒ３８ＩおよびＣ１２５Ｓを伴う変異ＩＬ−２）のＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。
【図１５】ＩＬ−２ＲαへのｐＨ依存性結合を弱めるために含まれている、Ｒ３８Ｌ（ＸＥＮＰ１４２７７）なしおよびＲ３８Ｌ（ＸＥＮＰ１４３８１）ありの追加の先行技術ＩＬ−２変異体（２００９年５月１４日に公開された国際公開第ＷＯ２００９／０６１８５３号に記載された、Ｑ１２６Ｔを伴う変異体２〜４）のアミノ酸配列を示す。これらの変異体は、ここに示した配列から削除されたポリヒスチジン（Ｈｉｓｘ８またはＨＨＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注意することが重要である。
【図１６】ｐＨ７．４およびｐＨ６．０でＲ３８Ｌ置換を行った場合と行わない場合のＩＬ−２Ｒαに結合するＩＬ−２変異体の会合率（ｋａ）、解離率（ｋｄ）、および解離定数（ＫＤ）を示す。
【図１７】ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、γｃ、またはＩＬ−２Ｒβγへの結合が変化するように設計された例示的なＩＬ−２変異体のアミノ酸配列を示す。これらの変異体は、ここに示した配列から削除されたポリヒスチジン（Ｈｉｓｘ８またはＨＨＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注意することが重要である。
【図１８】オクテットによって決定された様々なＩＬ−２受容体の例示的なＩＬ−２変異体の（ＸＥＮＰ１４１３５と比較した）正規化されたＢＬＩ応答を示す。目標は、ＩＬ−２Ｒαへの結合を増加させるか、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２ＲγまたはＩＬ−２Ｒβγの界面への結合、またはその両方を減少させることである。
【図１９】本発明のＩＬ−２−Ｆｃ融合体のいくつかのフォーマットを示す。一価のＩＬ−２−Ｆｃまたは「ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ」（図１９Ａ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に組換えにより融合されたＩＬ−２を含み、分子の反対側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。二価のＩＬ−２−Ｆｃまたは「ｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ」（図１９Ｂ）は、ホモ二量体Ｆｃ領域の両側のＮ末端に組換え融合されたＩＬ−２を含む。リンカー付きの一価ＩＬ−２−Ｆｃまたは「ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（リンカー付き）」（図１９Ｃ）は、ドメインリンカーを介してヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に組換えで融合されたＩＬ−２を含み、分子の他の側は「Ｆｃ−ｏｎｌｙ」または「ｅｍｐｔｙ−Ｆｃ」である。リンカー付き二価ＩＬ−２−Ｆｃまたは「ｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（リンカー付き）」（図１９Ｄ）は、ドメインリンカーを介してホモ二量体Ｆｃ領域の両側のＮ末端に組換え融合されたＩＬ−２を含む。ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（リンカー付き）およびｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（リンカー付き）フォーマットでの使用に適したドメインリンカーの非限定的な例を図７に示す。
【図２０】本発明の例示的なｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列を示す。スラッシュ（／）は、ＩＬ−２領域とＦｃ領域の間の境界を示す（この場合、Ｆｃ領域にはヒンジとＣ２２０Ｓ変異体が含まれる）。
【図２１】オクテットによって決定されたＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβγの例示的なＩＬ−２−Ｆｃ融合体の親和性（ＫＤ）、会合率（ｋａ）、および解離率（ｋｄ）を示す。
【図２２Ａ−２２Ｆ】Ａ）ＸＥＮＰ２４６３６、Ｂ）ＸＥＮＰ２４６３８、Ｃ）ＸＥＮＰ２４６４１、Ｄ）ＸＥＮＰ２４６４２、Ｅ）ＸＥＮＰ２４６４３、およびＦ）ＸＥＮＰ２４７３１によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、およびＴｒｅｇに対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図２３】本発明の例示的なｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列を示す。スラッシュ（／）は、ＩＬ−２とＦｃ領域の境界を示し、Ｆｃ領域にはＣ２２０Ｓ変異体を持つＩｇＧ１のヒンジドメインが含まれる。
【図２４Ａ−２４Ｂ】Ａ）ＸＥＮＰ２５９０６およびＢ）ＸＥＮＰ２５９０７によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、およびＴｒｅｇに対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図２５】ドメインリンカーとの例示的なＩＬ−２−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列を示す。スラッシュ（／）は、ＩＬ−２、リンカー、およびＦｃ領域間の境界を示し、Ｆｃ領域もＣ２２０Ｓ変異体を持つＩｇＧ１のヒンジドメインを含む。リンカーには二重下線が引かれる。
【図２６Ａ−２６Ｅ】Ａ）ＸＥＮＰ２５９０８、Ｂ）ＸＥＮＰ２５９０９、Ｃ）ＸＥＮＰ２５９１０、Ｄ）ＸＥＮＰ２５９１１、およびＥ）ＸＥＮＰ２５９１２によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、およびＴｒｅｇに対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図２７】ＣＤ２５への親和性を高め、ＣＤ１２２への親和性を下げるように設計されたＩＬ−２との追加のＩＬ−２−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列を示す。スラッシュ（／）は、ＩＬ−２とＦｃ領域の境界を示し、Ｆｃ領域にはＣ２２０Ｓ変異体を持つＩｇＧ１のヒンジドメインが含まれる。
【図２８Ａ−２８Ｔ】Ａ）ＸＥＮＰ２４６３５、Ｂ）ＸＥＮＰ２４６３６、Ｃ）ＸＥＮＰ２４６３７、Ｄ）ＸＥＮＰ２４６３８、Ｅ）ＸＥＮＰ２４６４２、Ｆ）ＸＥＮＰ２５７１７、Ｇ）ＸＥＮＰ２５７２０、Ｈ）ＸＥＮＰ２５７２５、Ｉ）ＸＥＮＰ２５７２７、Ｊ）ＸＥＮＰ２６０８６、Ｋ）ＸＥＮＰ２６０８８、Ｌ）ＸＥＮＰ２６０８９、Ｍ）ＸＥＮＰ２６０９２、Ｎ）ＸＥＮＰ２６０９３、Ｏ）ＸＥＮＰ２６０９６、Ｐ）ＸＥＮＰ２６１０４、Ｑ）ＸＥＮＰ２６１０５、Ｒ）ＸＥＮＰ２６１０８、Ｓ）ＸＥＮＰ２６１０９、およびＴ）組換えヒトＩＬ−２による活性化の指標として、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ上のＳＴＡＴ５のリン酸化を示す。
【図２９Ａ−２９Ｂ】例示的なＩＬ−２−Ｆｃ融合体による活性化の指標としての、Ａ）ＴｒｅｇおよびＢ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞に対するＳＴＡＴ５リン酸化を示す。
【図３０】は、追加のＩＬ−２−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列を示す。スラッシュ（／）は、ＩＬ−２、ドメインリンカー（二重下線が引かれている）、およびＦｃ領域の境界を示し、Ｆｃ領域は、ここでも、Ｃ２２０Ｓ変異体を持つＩｇＧ１のヒンジドメインを含むＦｃ領域を含む。
【図３１】ある好ましい実施態様を示す。
【図３２】Ａ）ｐＨスイッチ置換、Ｂ）Ｔｒｅｇ選択性置換、およびＣ）ｐＨスイッチとＴｒｅｇ選択性置換の組み合わせで作製された変異体のある好ましい実施形態を示す。
【図３３】オクテットによって決定されたＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβγの例示的なＩＬ−２−Ｆｃ融合体の親和性（ＫＤ）、会合率（ｋａ）、および解離率（ｋｄ）を示す。Ｎ．Ｂ．は測定可能な結合がないことを示す。
【図３４】国際公開第ＷＯ２０１４／１５３１１１号に記載されているように非調節性Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの比率を増加させるように設計されたＦｃ−ＩＬ−２（Ｖ９１Ｋ／Ｃ１２５Ａ）融合であるＸＥＮＰ２７１９３の配列を示す。スラッシュ（／）は、ＩＬ−２、ドメインリンカー、およびＦｃ領域の境界を示し（ここでも、Ｆｃ領域は、Ｃ２２０Ｓ変異体を持つＩｇＧ１のヒンジドメインを含む）、リンカーには二重下線が引かれている。
【図３５Ａ−３５Ｅ】変異体ｍｏｎｏｖＩＬ−２による−ＦｃフュージョンＸＥＮＰ２４６３８、ＸＥＮＰ２４６４２、ＸＥＮＰ２６１０５、ＸＥＮＰ２６１０９、ＸＥＮＰ２６８３５、ＸＥＮＰ２６８３９、ＸＥＮＰ２６９９１、およびＸＥＮＰ２５７０２による、Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、Ｃ）ＮＫ細胞、Ｄ）γδＴ細胞、およびＥ）ＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。データは、変異体ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体が、組換えＩＬ−２および一価ＷＴ  ＩＬ−２−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２４６３５）ならびにＷＯ２０１４／１５３１１１（ＸＥＮＰ２７１９３）に記載されている先行技術の二価ＩＬ−２−Ｆｃ融合体と比較して、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−）、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−）、ＮＫ細胞、およびγδＴ細胞を超えるＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化を優先的に誘導したことを示す。
【図３６】リンカーなしのｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２４６４２）およびリンカー付きのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２５９０８）としてフォーマットされたＮ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ置換によるＩＬ−２変異体による、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図３７】リンカーなしのｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２５７２０）、リンカーなしのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６９９２）およびリンカー付きのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２７００２）としてフォーマットしたＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓ置換を有するＩＬ−２変異体によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図３８】リンカーなしのｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６１０５）、リンカーなしのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６９９３）、およびリンカー付きのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２７００３としてフォーマットされたＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ置換を有するＩＬ−２変異体によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＴｒｅｇ上のＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図３９】リンカーなしのｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６１０９）、リンカーなしのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６９９４）およびリンカー付きのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２７００４）としてフォーマットされたＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ置換を有するＩＬ−２変異体によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＴｒｅｇに対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図４０】リンカーなしのｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６８３５）、リンカーなしのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６９９５）およびリンカー付きのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２７００５）としてフォーマットされたＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ置換を有するＩＬ−２変異体によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＴｒｅｇ上のＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図４１】リンカーなしのｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６８３９）、リンカーなしのｂｉｖＩＬ−２（ＸＥＮＰ２６９９６）、およびリンカー付きのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２７００６）としてフォーマットされたＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓ置換を有するＩＬ−２変異体によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＴｒｅｇに対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図４２】リンカー付きのｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６９９１）、リンカーなしのｂｉｖＩＬ−２（ＸＥＮＰ２７００１）、およびリンカー付きのｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２７００７）としてフォーマットされたＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ置換を有するＩＬ−２変異体によるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＴｒｅｇに対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図４３】本発明のＸｔｅｎｄ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）Ｆｃ（ここでもヒンジおよびＣ２２０Ｓ変異体を含む）を含む例示的な二価ＩＬ−２−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列を示す。スラッシュ（／）は、ＩＬ−２領域とＦｃ領域の境界を示す。
【図４４】本発明のＸｔｅｎｄ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）Ｆｃを含む例示的な一価のＩＬ−２−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列を示す。スラッシュ（／）は、ＩＬ−２領域とＦｃ領域の境界を示す。
【図４５Ａ−４５Ｅ】Ａ）ＸＥＮＰ２６１０５、Ｂ）ＸＥＮＰ２６１０９、Ｃ）ＸＥＮＰ２４６３５、Ｄ）ＸＥＮＰ２５９０８、およびＥ）ＸＥＮＰ２７１９３による、様々なリンパ球集団に対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図４６】ＸＥＮＰ２７５６４または組換えＩＬ−２で処理したラパマイシンＴｒｅｇ培養の免疫表現型検査を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６４による処理からのより大きなＣＤ２５発現を示す。
【図４７】ＸＥＮＰ２７５６４または組換えＩＬ−２で処理されたラパマイシンＴｒｅｇは、ＣＤ２５の相対的発現を評価するためにヒストグラムで表される。データは、ＸＥＮＰ２７５６４  ＩＬ−２−Ｆｃで処理されたラパマイシンＴｒｅｇ培養物がより大きなＣＤ２５発現を示すことを示している。
【図４８】ラパマイシンおよびＸＥＮＰ２７５６４または組換えＩＬ−２とのインキュベーション後のＴｒｅｇを含む様々なＣＤ４＋コンパートメントを示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６４で拡大した培養物が、組換えＩＬ−２で拡大した培養物と比較して、より高いエフェクターＴｒｅｇ集団（ＣＤ４５ＲＡ−ＦｏｘＰ３中高）を示すことを示している。
【図４９Ａ−４９Ｂ】ＸＥＮＰ２７５６４または組換えＩＬ−２のいずれかで拡大したラパマイシンＴｒｅｇ培養物によるＡ）ＣＤ８レスポンダーＴ細胞およびＢ）ＣＤ４レスポンダーＴ細胞増殖の抑制を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６４によって拡張されたＴｒｅｇが抑制機能を強化している可能性があることを示唆している。
【図５０】Ａ）Ｔｒｅｇ上のＣＤ２５  ＭＦＩおよびＢ）ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇのパーセンテージによって示される、図Ｘに示される抑制アッセイにおけるＴｒｅｇ上のＣＤ２５の発現を示す。
【図５１Ａ−５１Ｂ】Ａ）Ｔｒｅｇ上のＣＤ１２７  ＭＦＩおよびＢ）ＣＤ１２７＋Ｔｒｅｇのパーセンテージによって示される、図Ｘに示される抑制アッセイにおけるＴｒｅｇ上のＣＤ１２７の発現を示す。
【図５２Ａ−５２Ｅ】Ａ）ＸＥＮＰ２７５６３、Ｂ）ＸＥＮＰ２７５６４、Ｃ）ＸＥＮＰ２４６３５、Ｄ）組換えＩＬ−２、およびＥ）組換えＩＬ−１５と、ＰＢＭＣおよびＴｒｅｇとのインキュベーション後の様々なリンパ球集団の増殖（ＣＦＳＥまたはＴａｇ−ｉｔバイオレット希釈によって決定）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４がＴｒｅｇ選択性を示すことを示している。
【図５３Ａ−５３Ｂ】Ａ）増殖細胞（ＣＦＳＥまたはＴａｇ−ｉｔバイオレット希釈で測定）、およびＢ）ＰＢＭＣおよびＴｒｅｇと、ＸＥＮＰ２７５６３、ＸＥＮＰ２７５６４、ＸＥＮＰ２４６３５、組換えＩＬ−２、組換えＩＬ−１５、および陰性対照抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１５０７４とのインキュベーション後の総細胞数によって示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４が、組換えＩＬ−２およびＩＬ−１５並びにＷＴ  ＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ変異を含む）を含むＩＬ−２−Ｆｃ融合体と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の誘導においてはるかに弱いことを示す。
【図５４】Ａ）増殖細胞（ＣＦＳＥまたはＴａｇ−ｉｔバイオレット希釈で測定）で示されるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示し、Ｂ）ＰＢＭＣおよびＴｒｅｇと、ＸＥＮＰ２７５６３、ＸＥＮＰ２７５６４、ＸＥＮＰ２４６３５、組換えＩＬ−２、組換えＩＬ−１５、およびネガティブコントロールの抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１５０７４とのインキュベーション後の総細胞数、によって示されたＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４が、を含む組換えＩＬ−２およびＩＬ−１５ならびにＷＴ  ＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ変異を含む）を含むＩＬ−２−Ｆｃ融合体と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の誘導においてはるかに弱いことを示す。
【図５５】指示された濃度の指示された試験物質およびＡ）５ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、またはＣ）２０ｎｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でのＰＢＭＣのインキュベート後の増殖性ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｋｉ６７を発現する細胞のパーセンテージで示される）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）がＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の誘導における機能障害を起こしていることを示す。
【図５６】指示された濃度の指示された被験物質およびＡ）５ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、またはＣ）２０ｎｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でのＰＢＭＣのインキュベーション後の増殖性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｋｉ６７を発現する細胞のパーセンテージで示される）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）がＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の誘導における機能障害を起こしていることを示す。
【図５７】指示された濃度の指示された試験物質およびＡ）５ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、またはＣ）２０ｎｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でのＰＢＭＣのインキュベート後の増殖性ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞（Ｋｉ６７を発現する細胞の割合で示される）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）がＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞増殖の誘導における機能障害を起こしていることを示す。
【図５８】指示された濃度の指示された試験物質およびＡ）５ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、またはＣ）２０ｎｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でのＰＢＭＣのインキュベート後の増殖性ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞（Ｋｉ６７を発現する細胞の割合で示される）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）がＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞増殖の誘導における機能障害を起こしていることを示す。
【図５９】指示された濃度の指示された試験品およびＡ）５ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、またはＣ）２０ｎｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でのＰＢＭＣのインキュベーション後の増殖性ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞（Ｋｉ６７を発現する細胞の割合で表示）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）が、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞増殖の誘導における機能障害を起こしていることを示す。
【図６０】指示された濃度の指示された試験品およびＡ）５ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、またはＣ）２０ｎｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でのＰＢＭＣのインキュベーション後の増殖性ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞（Ｋｉ６７を発現する細胞の割合で示される）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）が、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞増殖の誘導における機能障害を起こしていることを示す。
【図６１】指示された濃度の指示された被験物質および）５ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、またはＣ）２０ｎｇ／ｍｌを示すプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でのＰＢＭＣのインキュベーション後の増殖性ＮＫ細胞（Ｋｉ６７を発現する細胞の割合で示される）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）がＮＫ細胞増殖の誘導における機能障害を起こしていることを示す。
【図６２】指示された濃度の指示された試験品およびＡ）５ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、またはＣ）２０ｎｇ／ｍｌを示すプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でのＰＢＭＣのインキュベーション後の増殖性Ｔｒｅｇ（Ｋｉ６７を発現する細胞の割合で示される）を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）がＴｒｅｇの増殖を誘導することを示す。
【図６３】指示された濃度のＡ）ＸＥＮＰ２７５６３、Ｂ）ＸＥＮＰ２７５６４、Ｃ）ＸＥＮＰ２４６３５、Ｄ）ＩＬ−２、およびＥ）ＩＬ−１５および５ｎｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）での処理後の、増殖性のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ（Ｋｉ６７を発現している細胞のパーセンテージで示されている）を示す。
【図６４】指示された濃度のＡ）ＸＥＮＰ２７５６３、Ｂ）ＸＥＮＰ２７５６４、Ｃ）ＸＥＮＰ２４６３５、Ｄ）ＩＬ−２、およびＥ）ＩＬ−１５および１０ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３による処理後（ＯＫＴ３）での処理後の、増殖性のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｄ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ（Ｋｉ６７を発現する細胞のパーセンテージで示される）を示す。
【図６５】指示された濃度のＡ）ＸＥＮＰ２７５６３、Ｂ）ＸＥＮＰ２７５６４、Ｃ）ＸＥＮＰ２４６３５、Ｄ）ＩＬ−２、およびＥ）ＩＬ−１５および２０ｎｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）での処理後の、増殖性のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇｓ（Ｋｉ６７を発現する細胞のパーセンテージで示される）を示す。
【図６６】Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、Ｃ）ＣＤ８α−ＣＤ１６＋ＮＫ細胞、およびＤ）３倍用量のＸＥＮＰ２７５６３および３倍用量のＸＥＮＰ２７５６４を投与したカニクイザルのＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの拡大を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３とＸＥＮＰ２７５６４の両方が選択的にＴｒｅｇｓを拡張し、２つのテスト記事が同様の薬理学を促進することを示す。
【図６７】Ａ）３倍用量のＸＥＮＰ２７５６３およびＢ）３倍用量のＸＥＮＰ２７５６４を投与したカニクイザルの血清濃度レベルの経時変化を示す。データは、２つのテスト記事が同様の薬物動態プロファイルを示していることを示す。
【図６８】３倍用量のＸＥＮＰ２７５６３と３倍用量のＸＥＮＰ２７５６４を投与したカニクイザルの血清アルブミン濃度の変化を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６３を投与された１匹の動物で、１回目と２回目の両方の投与後に長期アルブミンドロップが検出されたことを示し、ＸＥＮＰ２７５６４を投与した１匹の動物では、２回目の投与後に一時的なアルブミンの低下が検出され、ベースラインレベルに迅速に回復した。
【図６９】Ａ）０日目と１５日目にＸＥＮＰ２７５６３を投与した第１のカニクイザル、Ｂ）０日目と１５日目にＸＥＮＰ２７５６３を投与した第２のカニクイザル、およびＣ）０日目と１５日目にＸＥＮＰ２７５６４を投与した第３のカニクイザルの血圧テレメトリデータを示す。データは、第１のサルでは第２の投薬１日後に鋭い血圧低下を示し、第２のサルでは第１の投薬１日後に鋭い血圧低下を示したが、第３のサルでは研究期間にわたって血圧が安定のままであったことを示す。
【図７０】カニクイザルにおけるＸＥＮＰ２７５６４の１倍、３倍、および１０倍の用量による経時的な、Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、Ｃ）ＣＤ８α−ＣＤ１６＋ＮＫ細胞、およびＤ）Ｔｒｅｇの拡大を示す。
【図７１】ＸＥＮＰ２７５６４の１倍および３倍用量を投与した後の、カニクイザルにおける７日目および１４日目のＴｒｅｇの拡大を示す。データは、１倍用量と３倍用量がサルの同様の薬理学を促進することを示しており、より低い用量で最大の効果が得られることを示唆している。
【図７２】ＸＥＮＰ２７５６４の１倍、３倍、および１０倍用量を投与した後の、カニクイザルにおける（血管漏出の指標としての）血清アルブミン濃度の変化を示す。データは、ＸＥＮＰ２７５６４の高用量が毒性を増加させたことを示す。
【図７３】ＸＥＮＰ２７５６４の１倍、３倍、および１０倍用量を投与した後の、カニクイザルにおける（血管漏出の指標としての）血清Ｃ反応性タンパク質濃度の変化を示す。データは、高用量のＸＥＮＰ２７５６４が毒性を劇的に増加させたことを示す。
【図７４】Ａ）ナトリウム濃度、Ｂ）塩化物濃度、Ｃ）好酸球数、およびＤ）１倍、３倍、または１０倍用量のＸＥＮＰ２７５６４を投与したカニクイザルの好塩基球数の変化を示す。データは、高用量のＸＥＮＰ２７５６４が毒性を増加させ、低用量はカニクイザルでは忍容性が高いことを示す。
【図７５】１倍、３倍、または１０倍用量のＸＥＮＰ２７５６４を投与されたカニクイザルの血清濃度レベルの経時変化を示す。データは、カニクイザルにおける数日までの薬物動態の持続を示す。
【図７６】０日目と１５日目にＡ）好酸球数とＢ）３倍用量のＸＥＮＰ２７５６３または３倍用量のＸＥＮＰ２７５６３を投与したカニクイザルの好塩基球数の変化を示すデータは、ＸＥＮＰ２７５６４の反復投与がカニクイザルで十分に許容されることを示す。
【図７７】Ａ）ＸＥＮＰ２６１０５、Ｂ）ＸＥＮＰ２６１０９、およびＣ）組換えヒトＩＬ−２による、マウスＣＤ４＋ＣＤ４４ｈｉ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉ細胞、およびＴｒｅｇ（Ｂ６マウスの脾細胞）におけるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。データは、操作されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体がマウスのＴｒｅｇに対して等しく選択的かつ強力であることを示し、前臨床マウスモデルを使用して自己免疫疾患を調査するのに適している。
【図７８】Ａ）ＸＥＮＰ２７５６３およびＢ）ＸＥＮＰ２７５６４による、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、γδＴ細胞、およびＴｒｅｇに対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す、
【図７９】Ａ）ＸＥＮＰ２７５６３およびＢ）ＸＥＮＰ２７５６４による、カニクイザルＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、γδおよびＴｒｅｇに対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。データは、操作されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体がカニクイザルのＴｒｅｇに対しても等しく選択的かつ強力であることを示し、前臨床マウスモデルの使用に適している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ａ．序論
本発明は、自己免疫疾患の治療のための操作されたＩＬ−２  Ｆｃ融合体を対象とする組成物および方法を対象とする。自己免疫疾患は、一般に「Ｔｒｅｇ細胞」または「Ｔｒｅｇ」と呼ばれる制御性Ｔ細胞を優先的に活性化するメカニズムを使用して治療できる。Ｔｒｅｇは、免疫抑制性であり、自己抗原に対する耐性を維持して自己免疫疾患を予防することにより免疫系を調節する免疫Ｔ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは、一般的にエフェクターＴ細胞の増殖をダウンレギュレートする。Ｔｒｅｇｓは、ＣＤ４、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５（ＣＤ２５はＩＬ−２Ｒαタンパク質としても知られている）などのバイオマーカーを発現する。
【００２５】
Ｔｒｅｇは、Ｔｒｅｇの機能と生存に不可欠なＩＬ−２によって調節できる。ＩＬ−２はＴ細胞とＴｒｅｇの両方を限られた選択性で促進または低減する可能性があるため、より選択的なＴｒｅｇモジュレーターを作成することが強く求められている。さらに、潜在的な薬剤として、ＩＬ−２はクリアランスが非常に速く、半減期が分単位で測定されるため、好ましい投薬が妨げられる。本発明は、新規のＩＬ−２−Ｆｃ融合体タンパク質を提供することにより、これらの両方の問題を解決する。
【００２６】
したがって、本発明は、２つの異なる方法で操作されるＩＬ−２タンパク質を提供する。第１は、本発明のＩＬ−２変異体は、ＣＤ２５−である他のＴ細胞よりもＴｒｅｇなどのＣＤ２５＋細胞を優先的に活性化し、他のＴ細胞よりもＴｒｅｇ選択性を高め、したがって、免疫機能を抑制して、自己免疫疾患の治療を可能にする組成物をもたらす。これは一般に、ＩＬ−２Ｒαへの結合を増加させるか、あるいは、ＩＬ−２Ｒβ（および／もしくはＩＬ−２Ｒγ）またはＩＬ−２Ｒβγの界面への結合、またはその両方を減少させることによって行われる。
【００２７】
上記の選択性工学に加えて、本発明はまた、Ｆｃ融合体を使用して行われる、血清半減期が増加したＩＬ−２タンパク質を提供する。この場合、当技術分野で一般に知られているように、Ｆｃドメインを追加すると、ＩＬ−２分子の半減期が長くなる。しかしながら、本発明は、血清半減期を増加させるための２つの追加の方法を提供する。
【００２８】
第１はＦｃＲｎ受容体に関連する。ＩｇＧでは、Ｃγ２ドメインとＣγ３ドメイン間のＦｃ上の部位が新生児受容体ＦｃＲｎとの相互作用を仲介する。ＦｃＲｎへの結合はエンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流にリサイクルする（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９６、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ、２０００、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６、両方とも完全に参照により組み込まれる）。このプロセスは、全長分子のサイズが大きいために腎濾過が排除されることと相まって、１〜３週間の範囲の好ましい抗体血清半減期をもたらす。生体内でのＦｃタンパク質の保持を高めるためには、ｐＨ７．４で低い親和性を維持しながら、結合親和性をｐＨ６付近で高める必要がある。まだ検討中ではあるが、エンドソーム内のｐＨ６でＦｃＲｎに結合するとＦｃが隔離されるため、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ１８（１２）：５９２−５９８、全体が参照により組み込まれる）。次いでエンドソーム区画はＦｃを細胞表面にリサイクルする。区画が細胞外空間に開くと、約７．４のより高いｐＨが、血中へのＦｃの放出を誘導する。
【００２９】
したがって、血清半減期の増加は、ＦｃＲｎへの結合を増加させるＦｃ変異体を利用することができ、多くの場合、半減期の増加をもたらす。
【００３０】
ＩＬ−２  Ｆｃ融合分子の血清半減期を延長する追加の方法は、エンドソームの選別経路からリサイクルするためのｐＨ設計に基づく。当技術分野で知られているように、ＩＬ−２などのサイトカインのエンドソームへのエンドサイトーシスは、サイトカインが分解されるか血流にリサイクルされるエンドサイトーシスソーティングをもたらす（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＦａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ、ＪＢＣ  ２７５（１０）：６７９０、２０００を参照）。エンドソームへの内在化に続いて、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒβ、およびγｃは分解され、ＩＬ−２Ｒαは構成的に細胞表面にリサイクルされる。血液のｐＨは約７．２〜７．４であり、エンドソームのｐＨは約ｐＨ６であるため、ＩＬ−２を操作してｐＨ６でＩＬ−２Ｒαリガンドへの結合を増加させると、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαは分解されるのではなくリサイクルされ、血清半減期が長くなる。
【００３１】
さらに、本発明のＩＬ−２  Ｆｃ融合分子の効力は、他の因子にも依存し得る。例えば、本発明は、変異体ＩＬ−２−Ｆｃ融合体のホモ二量体が作製され、それにより受容体への二価結合を提供する、図１９Ｂに示されるような二価ＩＬ−２構築物を提供する。あるいは、本発明は、ヘテロ二量体が生成される、図１９Ａに示されるような一価ＩＬ−２構築物を提供し、その一方の単量体は、変異体ＩＬ−２−Ｆｃ融合体であり、他方は、「空のアーム」Ｆｃ単量体である。さらに、追加の柔軟なリンカーの存在は、一価の構築物については図１９Ｃに、二価の構築物については図１９Ｄに示すように、場合によっては効力を高めることができる。
【００３２】
したがって、本発明は、ＣＤ２５−Ｔ細胞よりもＴｒｅｇなどのＣＤ２５＋細胞の優先的活性化を示し、血清半減期の増加を示す、操作されたＩＬ−２変異体および操作されたＩＬ−２  Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【００３３】
Ｂ．定義
本出願をより完全に理解できるようにするために、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
【００３４】
本明細書において「除去」とは、活性の低下または排除を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を切除する」とは、Ｆｃ領域アミノ酸変異体が、その特定の変異体を含まないＦｃ領域と比較して５０％未満の開始結合を有することを意味し、７０−８０−９０−９５−９８％未満の活性喪失が好ましく、一般に、活性はＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて検出可能な活性のレベル未満である。ＦｃγＲ結合の除去において特に有用なものは、図４に示すものである。
【００３５】
本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。本明細書で論じるように、本発明の多くの実施形態はＡＤＣＣ活性を完全に除去する。
【００３６】
本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。
【００３７】
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、ある実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しないかのいずれか）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｓ３６４Ｋは、３６４位のセリンがリジンで置換されている変異体ポリペプチド（この場合はＦｃ変異体）を指す。番号付けは、親ポリペプチドの番号付けに基づく。たとえば、ＩＬ−２番号付けの文脈ではＲ３８Ｗ。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、開始アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを増加させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（アルギニンをなおコードする）に交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質は、それが開始される特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００３８】
本明細書で使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後、および２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、かつ２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。
【００３９】
本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。ペプチジル基は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、すなわち、ペプトイド（全体が参照により組み込まれるＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８９（２０）：９３６７（１９９２）を参照）等の「類似体」を含んでよい。アミノ酸は、当業者には理解されるであろうとおり、天然に存在するものでもまたは合成物（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではないもの）のいずれかでよい。一般に、本発明のタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を利用する。さらに、変異型ポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。
【００４１】
「残基」とは、本明細書で使用されるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸素性を意味する。例えば、アルギニン３８（Ａｒｇ３８またはＲ３８とも呼ばれる）は、ヒトＩＬ−２タンパク質の３８位（成熟配列から番号付け）の残基である。
【００４２】
本明細書で使用される「変異型タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１〜約７０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸修飾を有する。以下に記載するように、ある実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＦｃ領域等のヒト野生型配列である。ＩＬ−２変異体との関連で、親ポリペプチドはヒトＩＬ−２であり、その成熟配列は図１に示されている。本明細書のタンパク質変異体の配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５−９８−９９％の同一性を有する。変異型タンパク質は、変異型タンパク質それ自体、タンパク質変異体を含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指すことができる。
【００４３】
本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除くＩｇＧ抗体の定常領域、および場合によってはヒンジの全部または一部を含む、ポリペプチドを意味する。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（ＣＨ２およびＣＨ３）、およびＣγ１（ＣＨ１）とＣγ２（ＣＨ２）の間のヒンジ領域を含む。ＩｇＧ抗体の関連において、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの関連における「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う３４１〜４４７位を指す。他に記載しない限り、本発明のＦｃドメインは、２１６位（ＥＵ付番）に始まるヒンジ、および４４７位のＣＨ３ドメインのＣ末端に末端を含み、これはＩｇＧの「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」と称される。本明細書のＦｃ融合などのいくつかの場合では、ヒンジは、本明細書で論じられるようにドメインリンカーとして機能する。ある実施形態では、以下により完全に記載されるように、例えば１つ以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を変化させるためにまたはＦｃドメインのヘテロ二量化を促進するために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
【００４４】
したがって、本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、Ｆｃドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃ変異体は、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃ変異であり、ここで付番はＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを有するＦｃ変異体を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述の変異体は４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される順序は任意であり、すなわち、例えば４２８Ｌ／４３４ＳはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃ変異体などである。抗体に関連する本発明において論じられる全ての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置の付番はＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔもしくはＥＵ付番スキームと同様のＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。修飾は、付加、欠失、または置換でよい。置換には、天然に存在するアミノ酸および場合によっては合成アミノ酸が含まれ得る。例としては、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ９８／４８０３２、ＷＯ０３／０７３２３８、ＵＳ２００４／０２１４９８８Ａ１、ＷＯ０５／３５７２７Ａ２、ＷＯ０５／７４５２４Ａ２、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４、およびＬ．Ｗａｎｇ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が含まれ、参照により全体が組み込まれる。
【００４５】
本明細書における「インターロイキン−２」または「ＩＬ−２」とは、図１に示される配列を有するヒトＩＬ−２を意味する。
【００４６】
本明細書における「ＩＬ−２変異体」または「変異体ＩＬ−２」とは、図１に示される成熟ヒトＩＬ−２配列においてアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＩＬ−２変異体は、上記のように、成熟ヒト型の番号付けを使用してそれらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。
【００４７】
本明細書における「Ｆｃ融合タンパク質」または「イムノアドヘシン」とは、一般に（任意選択で、ＩｇＧ１のようなＩｇＧのヒンジ領域でもよい、本明細書に記載されるようなリンカー部分を介して）ＩＬ−２などの異なるタンパク質に連結しているＦｃ領域を含むタンパク質を意味する。したがって、ＩＬ−２  Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に概説されるＩＬ−２（この場合、変異体ＩＬ−２）およびＦｃドメイン（やはり、一般にＦｃ変異体）を含むタンパク質である。これらは一般的にＩＬ−２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の構造を持っている。当技術分野で理解されるように、２つのＦｃドメインが自己集合して、本明細書で概説される二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【００４８】
本明細書で使用される「位置」は、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順番に付番されるか、または確立されたフォーマット、例えば、抗体の付番のためのＥＵインデックスによって付番されてもよい。
【００４９】
本明細書で使用される「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプ性ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧのうちのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に生じない修飾であると見なされる。
【００５０】
本明細書で使用される「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。
【００５１】
本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８およびＦ１５８を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）、ならびに任意の発見されていないヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来でよい。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に連結し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。
【００５４】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、変異体を生成するようにその後修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは改変されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、本明細書で使用される「親ＩＬ−２」とは、変異体を生成するように改変された非改変ヒトＩＬ−２タンパク質を意味し、本明細書で使用される「親Ｆｃ」または「親Ｆｃドメイン」とは、変異体Ｆｃドメインを生成するように改変された非改変ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを意味する。
【００５５】
本明細書中の本発明のヘテロ二量体抗体の単量体に牽連して「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「マッチ」する２本鎖ＤＮＡと同様に、「マッチ」してヘテロ二量体を形成する能力を保持するようにヘテロ二量体化変異体を各単量体に組み込むことを意味する。例えば、いくつかのｐＩ変異体が単量体Ａへと改変される（例えば、ｐＩをより高くする）場合、同様に利用され得る「電荷対」である立体変異体はｐＩ変異体を妨害せず、例えば、ｐＩを高くした電荷変異体は同一の「鎖」または「単量体」に置かれ、両方の機能を保持する。同様に、以下により詳細に概説されるように、対のセットになる「スキュー」変異体について、当業者は、対の１つのセットを組み入れる鎖または単量体がどちらに入るかを決定する際にｐＩを考慮し、同様にスキューのｐＩを使用してｐＩ分離を最大化するようにする。
【００５６】
本明細書における「野生型またはＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００５７】
本発明のヘテロ二量体タンパク質は一般に、単離されているか、または組換え体である。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、「単離された」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。「組換え」とは、外来性宿主細胞において組換え核酸技術を用いて抗体が生成されることを意味する。
【００５８】
タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列を整合し、必要ならギャップを導入した後の、特定の（親）配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整合を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整合を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。１つの特定のプログラムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６０２４４５２５号の段落番号［０２７９］〜［０２８０］に概説されているＡＬＩＧＮ−２プログラムである。
【００５９】
本発明のアミノ酸配列（「本発明の配列」）と親アミノ酸配列との間の同一性の程度は、「本発明の配列」の長さまたは親配列の長さのうちの短い方で割った、２つの配列の整合における正確な一致の数として計算される。結果は同一性パーセントで表される。
【００６０】
ある実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である。ある実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％まで同一である。
【００６１】
本明細書における「リンカー」とは、２つの他のタンパク質ドメイン（例えば、変異体ＩＬ−２ドメインおよび変異体Ｆｃドメイン）を結合するために使用されるタンパク質性リンカーを意味する。ある実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（および一般に３〜４〜５）である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。ある場合において、以下に概説するように、「鎖性」（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）に注意を払って、荷電ドメインリンカーである。さらに、ヒトＩｇＧ１タンパク質のヒンジドメインもドメインリンカーにすることができる。
【００６２】
本明細書における「調節性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」とは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋であるＴ細胞を意味する。
【００６３】
ＶＩＩ．本発明のＩＬ−２  Ｆｃ融合タンパク質
本発明は、本明細書および一般的に図１９に示されるような（ＩＬ−２）−（Ｆｃドメイン）融合タンパク質を提供する。当業者に理解されるように、本発明の融合タンパク質は、実際には、Ｆｃドメインがホモ二量体タンパク質（図１９Ｂ）またはヘテロ二量体タンパク質（図１９Ａ）のいずれかに存在するために自己集合する２つの異なるポリペプチドである。本発明のタンパク質は、一般に、３つの異なるドメインであるＦｃドメイン、１つ以上のドメインリンカー、およびＩＬ−２ドメインを有する。
【００６４】
Ａ．本発明のＩＬ−２ドメイン
本発明のＩＬ−２  Ｆｃ融合タンパク質は、変異型ヒトＩＬ−２ドメインであるＩＬ−２ドメインを含む。本明細書で説明するように、これらのドメインは、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団と比較して、ＴｒｅｇなどのＣＤ２５＋であるＴ細胞の活性化を高める特異性変異体を含むように設計されており、また、必要に応じて、ＩＬ−２変異型Ｆｃ融合タンパク質が分解されるのではなく、エンドサイトーシス経路を通じてリサイクルされるように、ｐＨ６でＩＬ−２からＩＬ−２Ｒαへの結合を増加するよう設計されたアミノ酸置換を含む。
【００６５】
１．発現変異体
予備的事項として、本発明のＩＬ−２変異体は、ヒトＩｌ−２の発現を増加させることが以前に示されているＣ１２５Ｓ変異体も含む。したがって、特に明記しない限り、本明細書に記載されているすべての変異体にはＣ１２５Ｓ変異体が含まれる。場合によっては、Ｃ１２５Ａ変異体も使用できる。
【００６６】
さらに、場合によっては、本発明のＩＬ−２変異体は、複雑さを低減するために、Ｏ−グリコシル化部位を除去するＴ３Ａ変異体を含む。
【００６７】
さらに、本発明のＩＬ−２変異体は、追加の変異を含む。
【００６８】
２．特異性変異体
したがって、本発明は、Ｔｒｅｇを含むＣＤ２５＋Ｔ細胞に対する特異性が増加したＩＬ−２変異タンパク質を提供する。これは一般に、ＩＬ−２Ｒαへの結合を増加させるか、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２ＲγまたはＩＬ−２Ｒβγの界面への結合、またはその両方を減少させることによって行われる。
【００６９】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２は、Ｃ１２５Ｓ発現変異体に加えてＤ２０Ｎアミノ酸置換を含み、したがって、アミノ酸セットＤ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓを有する。Ｄ２０Ｎ変異体は、高親和性受容体（ＩＬ−２Ｒαβ）と中間親和性受容体（ＩＬ−２Ｒβ）の両方の結合が失われると以前に報告されていることに注意されたい。「ＩＬ−２ＲβγまたはＩＬ−２Ｒαβγ間の差動結合または活性化は、２０位のＡｓｐの置換によっては達成できない」と述べているＣｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：７７０９−７７１３（１９８８）を参照されたい。米国特許第６，９５５，８０７号の関連技術の説明を参照されたい。
【００７０】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２は、Ｄ２０Ｎアミノ酸置換およびＣ１２５Ｓ発現変異体に加えてＴ３Ａアミノ酸変異体を含み、したがって、アミノ酸セットＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓを有する。
【００７１】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２は、Ｔ３Ａアミノ酸変異体、Ｄ２０Ｎアミノ酸置換およびＣ１２５Ｓ発現変異体に加えてＴ３７Ｒアミノ酸変異体を含み、したがって、アミノ酸セットＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓを有する。
【００７２】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２は、Ｔ３Ａアミノ酸変異体、Ｄ２０Ｎアミノ酸置換およびＣ１２５Ｓ発現変異体に加えてＮ７１Ｋアミノ酸変異体を含み、したがって、アミノ酸セットＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓを有する。
【００７３】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２は、Ｃ１２５Ｓ発現変異体に加えてアミノ酸変異体Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖを含み、したがって、どうなったのかアミノ酸セットＮ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｃ１２５Ｓを有する。
【００７４】
ａ．Ｔｒｅｇ特異性のアッセイ
当技術分野で知られているように、リン酸化によるＳＴＡＴ５タンパク質（ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂ）の活性化は、ＩＬ−２によって介在される初期のシグナル伝達事象の１つである。したがって、本発明の構築物を使用して異なるＴ細胞集団のＳＴＡＴ５リン酸化を調べることにより、特異性を評価することができる。
【００７５】
一般に、実施例に記載されるように、ＳＴＡＴ５リン酸化のアッセイは、実施例に概説される方法を使用して行われる。実施例に記載されているように、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−、Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）など、一般的に５つの異なるセルタイプが試験されて、他のＴ細胞型（例えば、ＣＤ４５ＲＡはメモリーＴ細胞で発現し、ナイーブＴ細胞では発現しない）のサンプリングが提供される。
【００７６】
一般に、増加した活性は、ヒト野生型ＩＬ−２と比較したものである。
【００７７】
３．ｐＨ変異体
さらに、本発明は、ｐＨ６（エンドソームのｐＨ）での結合が増加する、増加したｐＨ特異性を有するＩＬ−２変異型タンパク質を提供する。
【００７８】
この実施形態では、ＩＬ−２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｈ、Ｒ３８Ｉ、Ｒ３８Ｋ，Ｒ３８Ｌ，Ｒ３８Ｍ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｐ、Ｒ３８Ｑ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｔ、Ｒ３８Ｖ、Ｒ３８Ｗ、Ｒ３８Ｙ、Ｔ４１Ａ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｍ、Ｔ４１Ｎ、Ｔ４１Ｐ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｓ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｙ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｈ、Ｆ４２Ｉ、Ｆ４２Ｋ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ｍ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｐ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｖ、Ｆ４２ＷおよびＦ４２Ｙから選択される１個以上のアミノ酸置換を有することができる。さらに、これらの変異はＣ１２５Ｓと組み合わせることができる。
【００７９】
この実施形態では、ＩＬ−２変異体は、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ、Ｒ３８Ｑ／４１Ｑ、Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｋ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ、Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｑ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ、Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｖ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｍ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｓ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｌ、Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｍ、Ｔ４１Ｉ／Ｆ４２Ｙ、Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｙ、Ｔ４１Ｄ／Ｆ４２Ｙ、Ｔ４１Ｍ／Ｆ４２Ｙ、Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｙ、Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｈ、Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｌ、Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｐ、Ｒ３８Ｑ／Ｆ４２Ｙ／Ｔ４１Ｒ、Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｋ、Ｒ３８Ｖ／Ｔ４１Ｒ、Ｒ３８Ｐ／Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｋ、Ｔ４１Ｄ／Ｆ４２Ｋ、Ｔ４１Ｍ／Ｆ４２Ｋ、Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｋ、Ｒ３８Ｑ／Ｆ４２Ｋ、Ｔ４１Ｉ／Ｆ４２Ｋ、Ｒ３８Ｎ／Ｆ４２Ｋ、Ｔ４１Ｈ／Ｆ４２Ｋ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｙ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｙ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｙ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ／Ｆ４２Ｙ、Ｒ３８Ｎ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｋ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｈ／Ｆ４２Ｋ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｋ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｋ、Ｒ３８Ｑ／Ｔ４１Ｖ／Ｆ４１ＫおよびＲ３８Ｑ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｋから選択されるアミノ酸置換（複数可）を有することができる。さらに、これらの変異はＣ１２５Ｓと組み合わせることができる。
【００８０】
４．有用なＩＬ−２変異体
本発明は、本明細書に概説される野生型Ｆｃドメインおよび変異型Ｆｃドメインの両方を含む、単独およびＦｃドメインに融合された場合の両方で所望の活性を有する多くの特に有用なＩＬ−２変異体を提供する。さらに、これらのＩＬ−２変異体は、一価の構築物（例えば図１９Ａ）または二価の構築物（例えば図１９Ｂ）で使用されてもよい。
【００８１】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。この実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４からの野生Ｆｃドメインに融合され得る。あるいは、変異体ＩＬ−２ドメインは、変異体Ｆｃドメイン、例えば、切除およびＦｃＲｎ変異体を含むものに融合されてもよい。
【００８２】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００８３】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｒ３８Ｌ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００８４】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｒ３８Ｌ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。
【００８５】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。
【００８６】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００８７】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。
【００８８】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００８９】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。
【００９０】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｎ２９Ｓ／Ｙ３１Ｈ／Ｋ３５Ｒ／Ｔ３７Ａ／Ｋ４８Ｅ／Ｎ７１Ｒ／Ｎ８８Ｄ／Ｉ８９Ｖ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００９１】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。
【００９２】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００９３】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。
【００９４】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００９５】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。
【００９６】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｒ３８Ｉ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００９７】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓを有し、二価構築物で使用される。
【００９８】
１つの実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｒ３８Ｉ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓを有し、一価構築物で使用される。
【００９９】
特に好ましいたんぱく質は、ＸＥＮＰ１４１４２、ＸＥＮＰ１４１４４、ＸＥＮＰ２３８３３、ＸＥＮＰ２５７２０、ＸＥＮＰ２６０８６、ＸＥＮＰ２６１０５、ＸＥＮＰ２６９８７、ＸＥＮＰ２７００３、ＸＥＮＰ２６１０９、ＸＥＮＰ２６９９４、ＸＥＮＰ２６８４１、ＸＥＮＰ２７００４、ＸＥＮＰ２６８３９、ＸＥＮＰ２６９９６、ＸＥＮＰ２６９９０、ＸＥＮＰ２７００６、ＸＥＮＰ２６８４０、ＸＥＮＰ２７００１、ＸＥＮＰ２６９９１、ＸＥＮＰ２７００７、ＸＥＮＰ２７５６３、ＸＥＮＰ２６１０５、ＸＥＮＰ２７５６４およびＸＥＮＰ２６１０９を含む。
【０１００】
Ｂ．本発明のＦｃドメイン
本明細書で論じられるように、本発明は、任意にドメインリンカーを含む、融合されたＩｌ−２変異体を含む少なくとも１つのＦｃドメインを有する２つのＦｃドメインを含むＦｃ融合タンパク質を提供する。図１９に示すように、本発明の二量体タンパク質は、図１９Ａに示すように本明細書で「一価ＩＬ−２」と呼ばれることもある１つのＩＬ−２変異体を有するように構成でき、Ｆｃドメインの１つはＩＬ−２変異型タンパク質およびその他は「空」または「Ｆｃのみ」である。この実施形態は、以下で論じられるように、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに依存する。あるいは、図１９Ｂに示されるような「二価」ＩＬ−２構築物が使用され、各ＦｃドメインはＩＬ−２変異体に融合される。これらの実施形態は、上述のように、ホモ二量体Ｆｃドメインを利用する。
【０１０１】
両方の実施形態において、ホモ二量体またはヘテロ二量体のＦｃ融合構築物が使用されるかどうかにかかわらず、Ｆｃドメインは一般に、いくつかの機能のためのいくつかの特定のアミノ酸変異体を含む。
【０１０２】
１．追加の機能性のためのＦｃ変異体
ｐＩアミノ酸変異に加えて、１つ以上のＦｃγＲ受容体への連結の改変、ＦｃＲｎ受容体への連結の改変等を含むがこれらに限定されない、様々な理由で実施することができるいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾が存在する。
【０１０３】
したがって、本発明のタンパク質は、ｐＩ変異体および立体変異体を含む、本明細書に概説したヘテロ二量体化変異体を含むアミノ酸修飾を含むことができる。変異体の各セットは独立して任意選択的に特定のヘテロ二量体タンパク質に含み得るかまたはそれから除外し得る。
【０１０４】
（ｉ）ＦｃγＲ変異体
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への連結を改変するために実施され得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害性、すなわち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在性反応）の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結合の減少も有益であり得る。本発明で使用されるアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６に列挙されるものが含まれ、それらのすべてはその全体が、具体的にはそこで開示される変異体が参照により、明示的に本明細書に組み込まれる。使用される特定の変異体には、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、および２９９Ｔが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０５】
さらに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示されているように、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、４２８Ｌ／４３４Ａ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、ＦｃＲｎ受容体への結合の増加および血清半減期の増加に使用される追加のＦｃ置換が存在する。
【０１０６】
（ｉｉ）切除変異体
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは「ＦｃγＲ切除変異体」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）」変異体である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、１つ以上またはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去して、追加の作用機序を回避することが望ましい。つまり、例えば、多くの実施形態において、特に二機能性免疫調節性タンパク質の使用において、Ｆｃドメインのうちの１つが、１つ以上のＦｃγ受容体切除変異体を含むように、ＦＣγＲＩＩＩａ結合を切除してＡＤＣＣ活性を除去または顕著に減少させることが望ましい。これらの切除変異体は、図４に示されており、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される切除変異体を用いる好ましい態様で、それぞれが独立して任意選択的に含まれるかまたは除外することができる。本明細書で言及される切除変異体は、ＦｃγＲ結合を切除するが、ＦｃＲｎ結合を切除しないことに留意されたい。
【０１０７】
２．ホモ二量体Ｆｃドメイン
ある実施形態では、本発明は、図１９Ｂに一般的に示されるように、ホモ二量体Ｆｃドメインを含む二価のホモ二量体タンパク質を提供する。この実施形態では、各単量体は同一であり、一般に、変異体−ＩＬ−２−リンカー−Ｆｃドメインを含み、リンカーは一般にＩｇＧ１からのヒンジである。
【０１０８】
この実施形態では、Ｆｃドメインは、図４に一般的に示されているように切除変異体を有することができる。一般にＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａへの結合を除去する適切な切除変異体が図４に示されている。このＩｇＧ１の実施形態で特に有用なのは、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋの切除アミノ酸セットである（「Ｇ２３６＿」は、本明細書に記載されるような欠失である）。
【０１０９】
さらに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示されているように、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、４２８Ｌ／４３４Ａ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、ＦｃＲｎ受容体への結合の増加および血清半減期の増加に使用される追加のＦｃ置換が存在する。
【０１１０】
３．ヘテロ二量体Ｆｃドメイン
図１９Ｂに示されるように、ホモ二量体の二価のＩＬ−２融合タンパク質に加えて、代替の実施形態は一価のＩＬ−２融合タンパク質を利用し、Ｆｃドメインの１つは「空」であり、本発明はヘテロ二量体化変異体に依存して、２つのＦｃドメインを一緒にする。これらの実施形態は、自己集合してヘテロ二量体Ｆｃドメインおよびヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を形成する２つの異なる変異型Ｆｃ配列の使用に依存する。
【０１１１】
二機能性ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、集合して「二量体」を構築する２つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、以下でさらに詳しく説明するとおり、各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は概して、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の生成に関し、ヘテロ二量体形成を促進するために、かつ／またはホモ二量体よりもヘテロ二量体の精製を容易にするために、各鎖で異なる定常領域中のアミノ酸変異体に応じて、抗原をいくつかの方法で共結合することができる。
【０１１２】
本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができるいくつかのメカニズムが存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらのメカニズムを組み合わせて高いヘテロ二量体化を確実にすることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生をもたらすアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。後述するように、ヘテロ二量体化変異体は、ヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする立体変異体（例えば、後述の「ノブアンドホール（ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ）」または「スキュー」変異体および「電荷対」変異体）ならびに「ｐＩ変異体」を含んでよい。その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には以下で「ヘテロ二量体化変異」の議論について本明細書に援用されるように、ヘテロ二量体化の有用な機構には「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、本明細書においてしばしば「スキュー」変異体として（国際公開第ＷＯ２０１４／１４５８０６号中の議論を参照）、「国際公開第ＷＯ２０１４／１４５８０６号に記載されているような「静電ステアリング」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されるようなｐＩ変異体、および国際公開第ＷＯ２０１４／１４５８０６号および以下に概説されているような一般的なさらなるＦｃ変異体が含まれる。
【０１１３】
本発明において、ヘテロ二量体タンパク質の精製を容易に引き起こすことができるいくつかの基本的メカニズムが存在し、その１つは、各単量体が異なるｐＩを有することによって、Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、およびＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電精製が可能になるように、ｐＩ変異体の使用に依存する。さらに、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概説するように、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を「スキューさせる」ことも可能である。したがって、立体的ヘテロ二量体化変異体およびｐＩ変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において特に使用される。
【０１１４】
一般に、本発明において特に使用される実施形態は、２つの単量体間のｐＩ差を増加させる、ｐＩ変異体と組み合わせた、ホモ二量体形成に対するヘテロ二量体形成を促進するスキュー変異体を含む変異のセットに依存する。
【０１１５】
さらに、以下により完全に概説されるように、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のフォーマットに応じて、ｐＩ変異体は単量体の定常ドメインおよび／またはＦｃドメイン内に含まれるか、またはドメインリンカーが使用されるかのいずれかでよい。
【０１１６】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてｐＩを利用する本発明においては、アミノ酸変異を一方または両方の単量体のポリペプチドに導入することができ、すなわち、単量体の一方（本明細書では簡単のために「単量体Ａ」と呼ぶ）のｐＩを単量体Ｂと異なるように操作でき、または、単量体ＡとＢの両方の変化を、単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させるように改変できる。論じられるように、いずれかまたは両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えばグリシンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷への荷電残基の変更によって（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、または荷電残基の中性残基への変更によって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。多数のこれらの変異体を図に示す。
【０１１７】
したがって、本発明のこの実施形態は、ヘテロ二量体をホモ二量体から分離することができるように、少なくとも１つの単量体に十分なｐＩの変化を生じさせることを提供する。当業者には理解されるように、そして以下にさらに論じるように、これは、「野生型」重鎖定常領域およびそのｐＩ（ｗｔ  Ａ−＋Ｂまたはｗｔ  Ａ−−Ｂ）を増加または減少させるように操作された変異領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋−Ｂ−またはＡ−Ｂ＋）、実施できる。
【０１１８】
したがって、一般に、本発明のある実施形態の構成要素は、二量体タンパク質の単量体の両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を単量体の一方または両方に組み込むことによって変化させることを目的とする定常領域におけるアミノ酸変異体である。本明細書中に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５またはそれ以上異なるものがすべて本発明において使用される。
【０１１９】
ａ．ヘテロ二量体化変異体
本発明は、ヘテロ二量体形成および／またはホモ二量体からの精製を可能にするためにヘテロ二量体化変異体を利用する、様々なフォーマットのヘテロ二量体抗体を含む、ヘテロ二量体タンパク質を提供する。多数のヘテロ二量体化のバリエーションを図２に示す。
【０１２０】
ヘテロ二量体化スキュー変異体のセットのいくつかの好適な対がある。これらの変異体は、「セット」の「対」になる。すなわち、一方のセットの対が第１の単量体に組み込まれ、他のセットの対が第２の単量体に組み込まれる。注目すべきは、これらのセットは、一方の単量体上の残基と他方の単量体上の残基との間で一対一の対応関係を有する「ノブインホール」変異体として必ずしも振舞わないことであり、すなわち、これらのセットの対は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げる２つの単量体間の境界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の割合を予想の５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％ホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく９０％以上にする。
【０１２１】
ｂ．立体変異体
ある実施形態において、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の付加によって促進され得る。すなわち、各重鎖中のアミノ酸を変えることによって、異なる重鎖が会合して同一のＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりもヘテロ二量体構造を形成する可能性が高い。図には、適切な立体変異体が含まれている。
【０１２２】
１つの機構は、当該技術分野において一般的に「ノブアンドホール」と呼ばれ、ヘテロ二量体形成を有利にし、ホモ二量体形成を不利にする立体効果をもたらすアミノ酸操作を指し、任意選択で使用することもでき、これはしばしば、「ノブアンドホール」と呼ばれ、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号に記載されるようなものであり、それらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」対を特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ヘテロ二量体化に対するスキュー形成へのジスルフィド結合と組み合わせることができる。
【０１２３】
ヘテロ二量体の生成に使用される追加のメカニズムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、しばしば「静電ステアリング」と呼ばれる。これは、本明細書において、しばしば「電荷対」と呼ばれる。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロ二量体化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらは、ｐＩ、すなわち精製にも影響を及ぼす可能性があり、したがって場合によってはｐＩ変異体と見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体変異体」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「単量体の対応セット」である）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２４】
さらなる単量体Ａおよび単量体Ｂの変異体は、本明細書に概説されるｐＩ変異体または参照によりそれらの全てが本明細書に明示的に組み込まれるＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７に示される他の立体変異体などの他の変異体と、任意の量で任意選択で独立して組み合わせることができる。
【０１２５】
ある実施形態では、本明細書に概説される立体変異体は、任意のｐＩ変異体（またはＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体等の他の変異体）を一方または両方の単量体に任意選択的に独立して組み込むことができ、本発明のタンパク質に独立して任意選択的に含むかまたは除外することができる。
【０１２６】
多くの実施形態における特定の有用性のいくつかのペアを示す、適切なスキュー変形のリストが図２に見られる。多くの実施形態において特に有用であるのは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択で架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）を含むが、これらに限定されないセットの対である。命名法に関して、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、一方の単量体が二重変異体セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重変異体セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味し、上述のように、これらの対の「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は出発ｐＩに依存する。
【０１２７】
ｃ．ヘテロ二量体のためのｐＩ（等電点）変異体
一般に、当業者には理解されるように、ｐＩ変異体には２つの一般的なカテゴリー：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）がある。本明細書中に記載されるように、これらの変異体の全ての組み合わせがなされ得る：一方の単量体は野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さない変異体であり得、他方がより塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。代替的に、各単量体は、１つがより塩基性に、１つがより酸性へと変化する。
【０１２８】
ｐＩ変異体の好ましい組み合わせを図５に示す。本明細書に概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、すべてのアイソタイプをこのように変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。
【０１２９】
１つの実施形態において、ｐＩ変異体の好ましい組み合わせは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対して、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体（負側）と、（ＧＫＰＧＳ）４を含む正に帯電したｓｃＦｖリンカーを含む第２単量体（正側）とを有する。
【０１３０】
ｄ．アイソタイプ変異体
さらに、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、変異体に望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減または排除する。これらのうちの多数は、本明細書に参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示される。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１バックボーンに導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（または上昇）し、さらにより長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。以下に記載されるように、変異型Ｆｃ融合タンパク質のｐＩに顕著な影響を与えるためには、一般にいくつかのアミノ酸置換が必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることが以下に論じられるように留意されたい。
【０１３１】
他の実施形態では、非アイソタイプのアミノ酸変化を行って、（例えば、高ｐＩのアミノ酸から低ｐＩのアミノ酸へと変化させることによって）得られるタンパク質の全体的な荷電状態を低下させるか、または以下でさらに詳細に説明する安定性等のための構造の調整を可能にする。
【０１３２】
さらに、重定常ドメインと軽定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロ二量体の各単量体における顕著な変化を見ることができる。本明細書で考察されるように、２つの単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることが、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に高感度な他の方法による分離を可能する。
【０１３３】
ｅ．ｐＩを計算する
本明細書に概説されるように、各単量体のｐＩは、変異体ＩＬ−２ドメインおよびＦｃドメインのｐＩに依存することがある。したがって、ある実施形態において、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを用いて、変異体重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どの単量体を操作するかは概して、各単量体の固有のｐＩによって決定される。あるいは、各単量体のｐＩを比較することができる。
【０１３４】
ｆ．ヘテロ二量体とＦｃ変異体との組み合わせ
当業者には理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化変異体（スキュー変異体および／またはｐＩ変異体を含む）はすべて、それらの「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」または「単量体分割」を保持する限り、任意の方法で任意選択的に独立して組み合わせることができる。さらに、これらの変異体はすべて、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。
【０１３５】
ｐＩ変異体の場合、特に使用される実施形態が図面に示されているが、精製を促進するために２つの単量体間のｐＩの差異を変えるという基本的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。
【０１３６】
さらに、ヘテロ二量体化変異体、スキュー、およびｐＩのいずれも、本明細書で一般的に概説されるように、Ｆｃ除去変異体、Ｆｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体と独立して任意選択で組み合わせることができる。
【０１３７】
切除変異体に加えて、Ｆｃドメインには、一般に、本明細書では軽鎖は存在しないので削除されている、Ｃ２２０Ｓ変異体も含まれ（たとえば、本発明のＦｃドメインにはＥＵ付番２１６位から始まるヒンジ領域が含まれる）、このシステインは軽鎖とのジスルフィド形成に使用される。
【０１３８】
さらに、本発明の融合タンパク質のＦｃドメインは、必要に応じて半減期延長アミノ酸置換を含んでよい。
【０１３９】
最近、等電点が低い可変領域を持つ抗体は、血清半減期も長くなる可能性があることが示唆されている（Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ、２０１０  ＰＥＤＳ、２３（５）：３８５−３９２、全体が参照により組み込まれる）。ただし、このメカニズムはまだよくわかっていない。さらに、可変領域は抗体ごとに異なる。本明細書に記載されるように、ｐＩが減少し半減期が延長された定常領域変異体は、抗体の薬物動態特性を改善するためのよりモジュール化されたアプローチを提供するであろう。
【０１４０】
ＶＩＩＩ．本発明の有用な構成
本明細書で概説するように、本発明は、いくつかの有用な一価および二価の構築物を提供する。
【０１４１】
Ａ．ヘテロ二量体一価構築物
ある実施形態では、本発明のＩＬ−２−Ｆｃ融合体タンパク質は、図１９Ａおよび１９Ｃに示されるものなどのヘテロ二量体一価構築物である。この実施形態では、変異型ＩＬ−２ドメインは一般に、ヒンジをドメインリンカー（一般にＣ２２０Ｓ変異体を含む）として使用するか、またはヒンジに接続された追加のリンカーを使用して、変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合され、他のＦｃドメイン（ヒンジを含む）は「空」のままである。
【０１４２】
ある実施形態では、変異型ＩＬ−２ドメインは、変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（Ｃ２２０Ｓ変異体とのヒンジを含む）、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ「スキュー変異体」および切除変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む「＋」単量体側（図５Ａを参照）に接続され、「空のＦｃ側」は、変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（Ｃ２２０Ｓ変異体のヒンジを含む）、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ「スキュー変異体」および切除変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋである。この実施形態では、好ましい構築物は、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ａ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５ＳおよびＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する変異ＩＬ−２ドメインを含む。
【０１４３】
ある実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは、変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（Ｃ２２０Ｓ変異体とのヒンジを含む）、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ「スキュー変異体」および切除変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む「＋」単量体側（図５Ａを参照）に接続され、「空のＦｃ側」は変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（Ｃ２２０Ｓ変異体のヒンジを含む）、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ「スキュー変異体」および切除変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓである。この実施形態では、好ましい構築物は、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ａ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５ＳおよびＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する変異ＩＬ−２ドメインを含む。
【０１４４】
１つの実施形態では、「単量体１」は、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ（野生型ＩＬ−２と比較して、配列番号２）を含む変異ＩＬ−２ドメイン、および配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３を含む、図６のものから選択された「単量体１Ｆｃバックボーン」を含む。この実施形態では、「単量体２」は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４の「単量体２  Ｆｃバックボーン」から選択される「空のＦｃ」を含む。
【０１４５】
１つの実施形態では、「単量体１」は、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ（野生型ＩＬ−２と比較して、配列番号２）を含む変異ＩＬ−２ドメイン、および配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３を含む図６のものから選択される「単量体１Ｆｃバックボーン」を含むが、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを伴う。この実施形態では、「単量体２」は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４の「単量体２  Ｆｃバックボーン」から選択される「空のＦｃ」を含むが、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを伴う。
【０１４６】
１つの実施形態では、「単量体１」は、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ（野生型ＩＬ−２と比較して、配列番号２）を含む変異ＩＬ−２ドメイン、および配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３を含む、図６のものから選択された「単量体１Ｆｃバックボーン」を含む。この実施形態では、「単量体２」は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４の「単量体２  Ｆｃバックボーン」から選択される「空のＦｃ」を含む。
【０１４７】
１つの実施形態では、「単量体１」は、アミノ酸置換Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ（野生型ＩＬ−２、配列番号２と比較して）、および配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３を含む図６のものから選択される「Ｆｃバックボーン」を含むが、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを伴う。この実施形態では、「単量体２」は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４の「単量体２  Ｆｃバックボーン」から選択される「空のＦｃ」を含むが、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを伴う。
【０１４８】
これらの実施形態では、好ましい構築物には、ＸＥＮＰ２６１０５、ＸＥＮＰ２７５６３、ＸＥＮＰ２６１０９およびＸＥＮＰ２７５６４が含まれる。
【０１４９】
Ｂ．ホモ二量体二価構築物
ある実施形態では、本発明のＩＬ−２−Ｆｃ融合体タンパク質は、図１９Ｂおよび１９Ｄに示されるものなどのホモ二量体二価構築物である。この実施形態では、変異体ＩＬ−２ドメインは一般に、ヒンジをドメインリンカー（一般にＣ２２０Ｓ変異体を含む）として、またはヒンジに取り付けられた追加のリンカーを使用して、変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインにそれぞれ融合される。
【０１５０】
ある実施形態では、変異型ＩＬ−２ドメインは、変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（Ｃ２２０Ｓ変異体とのヒンジを含む）および切除変異型Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋに取り付けられている。この実施形態では、好ましい構築物は、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ａ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５ＳおよびＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する変異型ＩＬ−２ドメインを含む。
【０１５１】
ある実施形態では、変異型ＩＬ−２ドメインは、変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（Ｃ２２０Ｓ変異体とのヒンジを含む）、切除変異型Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７ＫおよびＦｃＲｎ変異型Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓが取り付けられている。この実施形態では、好ましい構築物は、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｔ３７Ｒ／Ｃ１２５Ａ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ、Ｔ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５ＳおよびＴ３Ａ／Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する変異型ＩＬ−２ドメインを含む。
【０１５２】
ＩＸ．本発明の核酸
本発明はさらに、ホモ二量体二価ＩＬ−２−Ｆｃ融合体タンパク質およびヘテロ二量体一価ＩＬ−２融合タンパク質をコードする核酸組成物を提供する。
【０１５３】
当業者には理解されるように、核酸組成物はヘテロ二量体タンパク質のフォーマットに依存するであろう。したがって、例えば、フォーマットが例えば図１９Ａのヘテロ二量体一価フォーマットのために２つのアミノ酸配列を必要とするとき、発現のために１つ以上の発現ベクターに２つの核酸配列を組み込むことができる。
【０１５４】
あるいは、図１９Ｂに示されるようなホモ二量体二価フォーマットの場合、単一の核酸構築物および単一の発現ベクターが使用される。
【０１５５】
当該技術分野において既知であるように、本発明の構成要素をコードする核酸は、当該技術分野において既知であるように、そして本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞に応じた発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能マーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組み込みベクターであり得る。
【０１５６】
次いで、本発明の核酸および／または発現ベクターを、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および／または真菌細胞を含む当該技術分野で周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に形質転換するが、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）が、多くの実施形態において使用される。
【０１５７】
ある実施形態では、各単量体をコードする核酸は、フォーマットに応じて適用可能なように、それぞれ一般に異なるまたは同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内に含まれる。本発明において特に使用される実施形態では、これら２つまたは３つの核酸の各々は異なる発現ベクターに含まれる。
【０１５８】
本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、当該技術分野において周知のように、発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦製造されると、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む従来の融合タンパク質または抗体精製工程が実施される。本明細書で論じるように、２つの単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。すなわち、各単量体の等電点（ｐＩ）が異なるｐＩを有し、かつヘテロ二量体も異なるｐＩを有するようになるように各単量体の等電点（ｐＩ）を変化させるｐＩ置換を含むことによって、ヘテロ二量体の等電点精製（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）を促進する。これらの置換はまた、精製後の任意の混入したホモ二量体の特定およびモニタリングにも役立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析用ＩＥＸカラム）。
【０１５９】
Ｘ．製剤
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度の抗体を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に一般に概説されるような）と混合することによって、保存のために、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．￥［１９８０］に概説されるように）。
【０１６０】
ＸＩ．処置
本発明のＩＬ−２−Ｆｃ融合体タンパク質の組成物は、例えば本発明の二量体タンパク質を使用して患者のＣＤ２５＋細胞を活性化することにより、自己免疫疾患の治療に用途を見出す。
【実施例】
【０１６１】
Ａ．例１：半減期を延長するためのＩＬ−２の作製
上記のように、ＩＬ−２は非常に速いクリアランスに悩まされている。この急速なクリアランスは、一部にはＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒ複合体の内部移行によるものである。エンドソームへの内在化に続いて、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒβ、およびγｃは分解され、ＩＬ−２Ｒαは構成的に細胞表面にリサイクルされる。Ｌ１８Ｍ／Ｌ１９Ｓ変異を持つＩＬ−２変異体２Ｄ１は、野生型ＩＬ−２よりも長い半減期を示す。Ｆａｌｌｏｎらは、野生型ＩＬ−２はエンドソームｐＨでＩＬ−２Ｒαに対する親和性が低く、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒαの間のｐＨ依存性結合を示唆していると報告している。このグループはさらに、２Ｄ１がエンドソームｐＨでＷＴ  ＩＬ−２よりもＩＬ−２Ｒαに対して高い親和性を持つため、２Ｄ１の延長された半減期がＩＬ−２Ｒαによるリサイクルから生じることを発見した。特に、ＩＬ−２上の残基Ｌ１８およびＬ１９は、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃと接触すると記載されている。対照的に、我々は、ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒαインターフェースでの残基の変更は、ｐＨ依存性結合の減衰、ＩＬ−２ＲαによるＩＬ−２のリサイクルの増加、さらには半減期の増加に適していると仮定した。
【０１６２】
１．ｐＨ依存性結合を減衰するためのＩＬ−２／ＩＬ−２ＲαインターフェースでのＩＬ−２作製
ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒαインターフェース（ＰＤＢコード２ＥＲＪ）の結晶構造を調べることにより、我々は、Ａｒｇ３８、Ｔｈｒ４１、および／またはＩＬ−２のＰｈｅ４２およびＩＬ−２ＲαのＨｉｓ１２０間の相互作用からなるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαインターフェースでの可能な自然の「ｐＨスイッチ」を特定した（図８を参照）。我々は、ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒαβγ複合体の内在化後のエンドソームの低ｐＨでは、Ｈｉｓ２０がプロトン化され、ＩＬ−２ＲαからのＩＬ−２の放出、およびその後の残りのＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒβγ複合体のリソソーム分解が起こると仮定した。ＩＬ−２Ｒαは細胞表面にリサイクルされることが知られており、これらの相互作用する残基の１つ以上を置換することにより、ｐＨ６．０でＩＬ−２とＩＬ−２Ｒαとのの結合親和性を高めると、ＩＬ−２のリサイクルが改善され、半減期が延長される。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎテクノロジーによる計算予測（たとえば、１９９８年１０月２２日公開のＷＯ１９９８／０４７０８９を参照）を使用して、我々は、これら３つの接触残基を飽和させる変異体を作製した。
【０１６３】
ＩＬ−２をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。ＩＬ−２には、精製のためのＣ末端ポリヒスチジンタグ（８ｘＨｉｓ）と、発現を改善するためのＣ１２５Ｓ置換が含まれていた。上記で予測された置換は、標準的な突然変異誘発技術によって導入された。タンパク質をＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生し、そしてＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製した。ポリヒスチジンタグを取り除いた、例示的な変異体の配列を図９に示す。
【０１６４】
ｐＨ７．４およびｐＨ６．０でのＩＬ−２Ｒαに対するＩＬ−２の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのテクノロジーであるＢｉａｃｏｒｅを使用して決定された。Ｂｉａｃｏｒｅの実験手順には、一般的に次のものが含まれる。固定化（センサーチップへのリガンドの捕捉）。関連付け（センサーチップ上での様々な濃度の検体の流れ）、および試験物品の親和性を決定するための解離（センサーチップ上を流れる緩衝液）。緩衝液のみを含む参照ウェルもまた、データ処理中のバックグラウンド補正のための方法に含まれた。この特定の画面では、最初にヒトＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）がセンサーチップ上にキャプチャされ、次に様々な濃度のＩＬ−２変異体がセンサーチップ上に流された。細胞表面の条件をシミュレートするためにｐＨ７．４の緩衝液を使用し、エンドソーム条件をシミュレートするためにｐＨ６．０の緩衝液を使用して別の実験を行った。得られた解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を図１０および１１に示す。結合親和性と速度定数は、１：１結合モデルを使用して処理されたデータを分析することで得られた。図１２はｐＨ６．０での解離速度の倍改善を示し、図１３はｐＨ７．４での解離速度の倍改善を示す。
【０１６５】
Ｒ３８、Ｔ４１、およびＦ４２で様々な置換が行われた多数の変異体は、ＷＴ  ＩＬ−２と比較して、ｐＨ６．０での解離速度が劣るかまたは類似していたが、大幅に改善されたオフレートを持ついくつかの変異体（つまり、ＩＬ−２Ｒαでリサイクルされる可能性が高いＩＬ−２変異体）を特定した。好ましい変異体には、ＸＥＮＰ１４１４２（Ｒ３８Ｉ）とＸＥＮＰ１４１４４（Ｒ３８Ｌ）がある。図１４は、ＸＥＮＰ１４１３５（Ｃ１２５Ｓ変異を持つ野生型ＩＬ−２）およびＸＥＮＰ１４１４２（Ｒ３８ＩおよびＣ１２５Ｓを持つ変異体ＩＬ−２）のＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。ｐＨ７．４およびｐＨ６．０でのＸＥＮＰ１４１４２の同様の解離曲線は、ｐＨ依存性結合の減衰が成功したことを示す。
【０１６６】
２．他のＩＬ−２変異体との関連でのｐＨ依存性結合の減衰
次に、Ｒ３８Ｌを従来のＩＬ−２変異体と組み合わせて（２００９年５月１４日公開のＷＯ２００９／０６１８５３に記載されているＱ１２６Ｔの変異体２−４）他のＩＬ−２変異体との関連でオフレートが改善されたかどうかを調査した。
【０１６７】
上記のように、置換は標準的な突然変異誘発技術によって導入された。タンパク質をＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生し、そしてＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製した。Ｒ３８ＬありおよびＲ３８Ｌなしの上記の先行技術変異体の配列を、ポリヒスチジンタグを除いて図１５に示す。
【０１６８】
実施例１Ａに記載されるように、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、ｐＨ７．４およびｐＨ６．０でのＩＬ−２Ｒαに対するＩＬ−２の親和性を決定した。得られた解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）、およびｐＨ７．４での親和性とｐＨ６．０での親和性の比を図１６に示す。データは、Ｒ３８Ｌ置換を含めると親和性の比率が増加することを示しており、ｐＨ依存性結合の減衰が成功したことを示す。
【０１６９】
Ｂ．例２：Ｔｒｅｇ選択性のためのＩＬ−２の作製
ＩＬ−２による増殖性シグナル伝達は、ＩＬ−２中間親和性受容体複合体（ＩＬ−２Ｒβγ）の一部として、またはＩＬ−２高親和性受容体複合体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の一部として、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃによって介在される。ＣＤ２５は、ＩＬ−２Ｒαβγ複合体のＩＬ−２への高親和性結合を付与するが、それ以外ではそれ自体がシグナル伝達を欠いている。ＩＬ−２Ｒαβγ複合体への高親和性結合により、ＩＬ−２はＩＬ−２Ｒαを構成的に発現するＴｒｅｇを支持する。したがって、ＩＬ−２Ｒαに対するＩＬ−２の親和性を増加させると、Ｔｒｅｇ上のＩＬ−２Ｒαβγ複合体に有利に結合をさらに歪めることができると仮定された。あるいは、ＩＬ−２Ｒβ、γｃ、またはＩＬ−２Ｒβγに対するＩＬ−２の親和性を低下させると、ＣＤ２５陰性Ｔ細胞およびＮＫ細胞からの結合をゆがめる可能性がある。
【０１７０】
ＩＬ−２とその受容体の間の界面の結晶構造を調べ、ＭＯＥソフトウェアを使用してモデリングすることにより、ＩＬ−２Ｒαに対するＩＬ−２親和性を増加させるまたはＩＬ−２Ｒβ、γｃ、および／またはＩＬ−２Ｒβγに対するＩＬ−２親和性を減少させるために置換できる残基を予測した。
【０１７１】
ＩＬ−２をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。ＩＬ−２には、精製のためのＣ末端ポリヒスチジンタグ（８ｘＨｉｓ）と、発現を改善するためのＣ１２５Ｓ置換が含まれていた。上記で予測された置換は、標準的な突然変異誘発技術によって導入された。タンパク質をＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生し、そしてＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製した。ポリヒスチジンタグを除いた、例示的な変異体の配列を図１７に示す。
【０１７２】
ＩＬ−２とその受容体コンポーネントとの結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）ベースの方法であるオクテットを使用して決定された。オクテットの実験工程は、一般的に以下を含んでいた。試験物質の親和性を決定するための、固定化（バイオセンサー上へのリガンドの捕捉）、会合（分析物の連続希釈物を含むウェルにリガンドコーティングしたバイオセンサーの浸漬）、解離（緩衝液を含むウェルにバイオセンサーを戻すこと）。緩衝液のみを含む参照ウェルもまた、データ処理中のバックグラウンド補正のための方法に含まれた。特に、抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーは、二価ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）−Ｆｃ融合、二価ＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒβ）−Ｆｃ融合、またはヘテロ二量体ＣＤ１２２：ＣＤ１３２（ＩＬ−２Ｒβγ）−Ｆｃのいずれかをキャプチャするために使用された融合し、ＩＬ−２変異体の複数の濃度に浸した。ＩＬ−２変異体の結果として得られたＢＬＩ応答は、ＸＥＮＰ１４１３５（Ｃ１２５Ｓを含む野生型ＩＬ−２）のＢＬＩ応答に対して正規化され、図１８に示されている。特に、Ｄ２０ＮやＮ８８ＤなどのＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒβインターフェースでのいくつかの置換は、ＩＬ−２ＲβへのＩＬ−２の結合を大幅に減少または排除した。
【０１７３】
Ｃ．例３：ＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質
ＩＬ−２の短い半減期にさらに取り組むために、我々は、生産を促進し、ＦｃＲｎを介したリサイクルを促進しおよび半減期を長くすることを目的として、Ｆｃ融合体（以下、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体と呼ぶ）としてＩＬ−２を作製した。
【０１７４】
１．ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の製造
ＩＬ−２をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合体パートナー（例えば、図６に示す定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。ＩＬ−２には、発現を改善するためのＣ１２５Ｓ置換と、Ｏ−グリコシル化部位を除去するためのＴ３Ａ置換が含まれる場合がある。例示的なＩＬ−２−Ｆｃ融合体フォーマットの概略図を図１９に示す。選択された置換は、標準的な突然変異誘発技術によって導入された。
【０１７５】
一価のＩＬ−２−Ｆｃまたは「ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ」フォーマット（図１９Ａ）は、最初のヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＩＬ−２を含み（たとえば、ＩＬ−２−Ｆｃバックボーン１−単量体２、図６）、分子の反対側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」ヘテロ二量体Ｆｃ（たとえば、図６のＩＬ−２−Ｆｃバックボーン１−単量体１を参照）である。例示的なｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体の配列を図２０に示す。二価のＩＬ−２−Ｆｃまたは「ｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ」フォーマット（図１９Ｂ）は、ホモ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＩＬ−２を含む（たとえば、図６のＩＬ−２−Ｆｃバックボーン１２を参照）。例示的なｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体の配列を図２３に示す。ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体およびｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体には、ＩＬ−２のＣ末端とＦｃ領域のＮ末端の間に可変長リンカーが含まれる場合がある（ＩＬ−２−Ｆｃ融合体での使用が見出される可能性のあるドメインリンカーの非限定的な例については、図７を参照、およびフォーマット画像については図１９Ｃ−Ｄ参照）。可変長リンカーとの例示的なＩＬ−２−Ｆｃ融合体の配列を図２５に示す。
【０１７６】
タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞での一過性トランスフェクションによって生成され、プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くイオン交換クロマトグラフィーを含む２段階精製プロセスによって精製された。
【０１７７】
２．ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体として作製された先行技術のＩＬ−２変異体の調査
ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体フォーマットの堅牢性と有効性を調査するために、多くの先行技術のＩＬ−２変異体がこのフォーマットで生成された。これらのＩＬ−２−Ｆｃ融合体には、ＸＥＮＰ２４６３７（２０１２年８月１６日公開のＷＯ２０１２／１０７４１７に記載された変異体に基づく）、ＸＥＮＰ２４６３８（ＷＯ２００５／００７１２１、２００５年１月２７日公開に記載の変異体２−４に基づく）、ＸＥＮＰ２４６３９（２００５年１月２７日公開、ＷＯ２００５／００７１２１に記載の変異Ｍ１に基づく）、ＸＥＮＰ２４６４０（２００９年５月１４日公開、ＷＯ２００９／０６１８５３に記載のＱ１２６Ｔを伴う変異２−４に基づく）、ＸＥＮＰ２４６４２（基盤１９９９年１１月２５日に公開されたＷＯ１９９９／０６０１２８に記載された変種）、ＸＥＮＰ２４７２８（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５に記載されたＨ９−ＲＥＴに基づく）、およびＸＥＮＰ２４７２９（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５に記載されたＨ９−ＲＥＴＲに基づく）が含まれる。ＸＥＮＰ２４６４１、ＸＥＮＰ２４７３０、ＸＥＮＰ２４７３１、およびＸＥＮＰ２４７３２などの追加の変異体は、従来技術で説明されている個々の置換または置換の組み合わせに基づいていた。配列は、図２０に示される。
【０１７８】
ａ．ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体のアフィニティスクリーン
様々なＩＬ−２受容体に対する上記のｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体の親和性は、実施例２に一般的に記載されているようにオクテットを使用して決定された。特に、ＩＬ−２Ｒαの親和性を決定するために、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）−Ｆｃ融合体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）をＡＲ２Ｇバイオセンサーにロードし、複数の濃度のＩＬ−２−Ｆｃ融合体に浸した。ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒβγの親和性を決定するには、二価ＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒβ）−Ｆｃ−Ｈｉｓ融合体またはヘテロ二量体ＣＤ１２２：ＣＤ１３２（ＩＬ−２Ｒβγ）−Ｆｃ−Ｈｉｓ融合体をＨＩＳ１Ｋバイオセンサーにロードし、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の複数の濃度に浸した。得られた解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を図２１に示す。
【０１７９】
ｂ．ｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体によるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導
サイトカインがその受容体に結合した後、受容体に関連するヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）がＳＴＡＴタンパク質をリン酸化し、ＳＴＡＴタンパク質が核に移行してさらに下流のプロセスを調節する。したがって、ＳＴＡＴタンパク質（特に、ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂを含むＳＴＡＴ５）のリン酸化は、ＩＬ−２が高または中親和性ＩＬ−２受容体に結合することによって引き起こされる最も初期のシグナル伝達現象の１つである（（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ（２０００）；Ｗｕｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８））。したがって、上記のｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体が、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇなどの様々な細胞型においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力を調べた。
【０１８０】
別の実験では、新鮮なＰＢＭＣを、指定の試験物質とともに指定濃度で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で、室温で、３０〜４５分間染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ（ＨＩ１００）、抗ＦＯＸＰ３−Ａｌｅｘａ４８８（２５９Ｄ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６８７）で染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２５−）にＳＴＡＴ５リン酸化のデータを示す誘導は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５−）およびＴｒｅｇの（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）は、図２２に示す。特に、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体ＸＥＮＰ２４６３８およびＸＥＮＰ２４６４２は、Ｔｒｅｇの強力な活性化因子であり（ＳＴＡＴ５リン酸化により示される）、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の最小限の活性化を伴い、これは、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体を構成するＩＬ−２変異体について報告された活性と一致する。
【０１８１】
３．ｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体として作製された先行技術のＩＬ−２変異体の調査
ｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体フォーマットの堅牢性と有効性を調査するには、先行技術のＩＬ−２変異体（１９９９年１１月２５日公開のＷＯ１９９９／０６０１２８に記載）とコントロールＩＬ−２（Ｃ１２５ＳとＴ３Ａ置換を併用）はこのフォーマットで生成され、その配列は図２３に示されている。
【０１８２】
ａ．ｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体によるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導
別の実験では、新鮮なＰＢＭＣを、指定の試験物質とともに指定濃度で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で、室温で、３０〜４５分間染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ５１０（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ（ＨＩ１００）、抗ＦＯＸＰ３−Ａｌｅｘａ４８８（２５９Ｄ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６９４）で染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴｒｅｇでのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示すデータを図２４に示す。
【０１８３】
４．ドメインリンカーとのＩＬ−２−Ｆｃ融合体として設計された先行技術のＩＬ−２変異体の調査
ＩＬ−２とＦｃ領域の間にリンカーを含めることの影響を調査するために、先行技術のＩＬ−２変異体（１９９９年１１月２５日公開のＷＯ１９９９／０６０１２８および２０１２年８月１６日公開のＷＯ２０１２／１０７４１７に記載）は、Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーとのｍｏｎｏｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体またはｂｉｖＩＬ−２−Ｆｃ融合体として生成された。これらのＩＬ−２−Ｆｃ融合体の配列は図２５に示されている。
【０１８４】
ａ．ドメインリンカーとのＩＬ−２−Ｆｃ融合体によるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導
別の実験では、新鮮なＰＢＭＣを、指定の試験物質とともに指定濃度で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で、室温で、３０〜４５分間染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ５１０（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ（ＨＩ１００）、抗ＦＯＸＰ３−Ａｌｅｘａ４８８（２５９Ｄ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６９４）で染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴｒｅｇでのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示すデータを図２６に示す。
【０１８５】
Ｄ．例４：ＣＤ２５に対する親和性が増加し、ＣＤ１２２に対する親和性が減少した変異体ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の作製
実施例２で論じたように、ＩＬ−２ＲのＩＬ−２Ｒβに対する親和性を増加させると、Ｔｒｅｇ上のＩＬ−２Ｒαβγ複合体に有利に結合をさらにゆがめ、一方で、ＩＬ−２Ｒβ、γｃ、またはＩＬ−２Ｒβγに対するＩＬ−２の親和性を減少させると、ＣＤ２５陰性Ｔ細胞およびＮＫ細胞からの結合をゆがめる可能性がある。ここでは、ＩＬ−２Ｒα結合を増加させる置換を、Ｔｒｅｇ選択性を高める目的で、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体との関連でＩＬ−２Ｒβ結合を減少させる置換と組み合わせた。
【０１８６】
ＩＬ−２をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合体パートナー（例えば、図６に示す定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。ＩＬ−２には、改善された発現のためのＣ１２５Ｓ置換と、Ｏグリコシル化部位を除去するためのＴ３Ａ置換が含まれている。実施例２に記載される選択された置換は、標準的な突然変異誘発技術によって導入された。タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞での一過性トランスフェクションによって生成され、プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くイオン交換クロマトグラフィーを含む２段階精製プロセスによって精製された。ＣＤ２５親和性の増加および／またはＣＤ１２２親和性の減少のために設計された例示的なＩＬ−２−Ｆｃ融合体の配列を図２７に示す。
【０１８７】
１．ＣＤ２５親和性の増加とＣＤ１２２親和性の減少のために作製された変異体ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の親和性分別
様々なＩＬ−２受容体に対する上記の変異体ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の親和性は、実施例３Ｂ（ａ）に一般的に記載されているようにオクテットを使用して決定された。特に、ＩＬ−２Ｒαの親和性を決定するために、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）−Ｆｃ融合体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）をＡＲ２Ｇバイオセンサーにロードし、複数の濃度のＩＬ−２−Ｆｃ融合体に浸した。ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒβγの親和性を決定するには、二価ＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒβ）−Ｆｃ−Ｈｉｓ融合体またはヘテロ二量体ＣＤ１２２：ＣＤ１３２（ＩＬ−２Ｒβγ）−Ｆｃ−Ｈｉｓ融合体をＨＩＳ１Ｋバイオセンサーにロードし、ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の複数の濃度に浸した。得られた解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を図３３に示す。
【０１８８】
２．様々な細胞集団におけるＣＤ２５親和性の増加およびＣＤ１２２親和性の減少のために設計された変異体ＩＬ−２−Ｆｃ融合体によるＳＴＡＴ５リン酸化
別の実験では、新鮮なＰＢＭＣを、指定の試験物質とともに指定濃度で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＶ３９６（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で、室温で、３０〜４５分間染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ（ＨＩ１００）、抗ＦＯＸＰ３−Ａｌｅｘａ４８８（２５９Ｄ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６８７）で染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。様々な細胞集団におけるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示すデータは、図２８〜２９に示されている。
【０１８９】
データは、コントロールＸＥＮＰ２４６３５（Ｃ１２５ＳのみのＩＬ−２−Ｆｃ）および組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）と比較して、ＣＤ２５−陰性Ｔ細胞（ＣＤ８＋およびＣＤ４＋）のＳＴＡＴ５リン酸化の誘導が最小限の、Ｔｒｅｇの強力な活性化因子であったことを示す。
【０１９０】
Ｅ．例５：追加の変異体ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の作製
価数、ドメインリンカー、ｐＨスイッチ、Ｔｒｅｇ選択性など、前の例で説明した特性を組み合わせて、追加のＩＬ−２−Ｆｃ融合体を設計し、例２で一般的に説明したように作製した。例示的な配列が、図３０に示される。さらに、ＷＯ２０１４／１５３１１１に記載されているように非制御性Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの比率を高めるように設計されたＦｃ−ＩＬ−２（Ｖ９１Ｋ／Ｃ１２５Ａ）融合体は、コンパレータ（ここではＸＥＮＰ２７１９３と呼ばれる。配列は図３４に示される）として生成された。
【０１９１】
１．追加の一価ＩＬ−２−Ｆｃ融合体によるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導
別の実験では、新鮮なＰＢＭＣを、指定のＩＬ−２−Ｆｃ試験物質とともに指定濃度で３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣはまず抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＦ７００（ＳＫ１）、および抗ＣＤ５６−ＰＥ抗体で染色された。最初の染色後、ＰｅｒＦｉｘ  ＥＸＰＯＳＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して細胞を透過処理した。透過処理後、細胞は抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＦｏｘＰ３−ＡＦ４８８（２５９Ｄ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−ＡＦ６４７（４７／Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４））抗体で染色された。第２の染色後、細胞をフローサイトメトリーで分析して、様々なリンパ球集団のＳＴＡＴ５リン酸化を調べた。ＩＬ−２受容体を介したＩＬ−２−Ｆｃ融合体によるシグナル伝達を示す、様々なリンパ球集団のｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩを示すデータを図３５に示す。
【０１９２】
データは、変異体のそれぞれがＴｒｅｇ上でＳＴＡＴ５リン酸化を誘導したことを示す。特に、変異体ＩＬ−２−Ｆｃ融合体が、両方の組換えＩＬ−２およびＷＴ一価ＩＬ−２−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２４６３５）と比較して、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−）、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−）、ＮＫ細胞、及びγδＴ細胞よりも優先的にＴｒｅｇを誘導した。比較すると、先行技術の変異型Ｆｃ−ＩＬ−２融合ＸＥＮＰ２７１９３は、Ｔｒｅｇ選択性が比較的低かった。
【０１９３】
２．二価のＩＬ−２−Ｆｃ融合体は一価の対応物よりも強力である
様々なＩＬ−２−Ｆｃ試験物品によるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を、実施例５Ａに記載されているように調査した。ＴｒｅｇとＣＤ４＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−）でｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩを示すデータは、ＩＬ−２受容体を介してＩＬ−２−Ｆｃ融合体によるシグナル伝達を示し、図３６〜４２に示されている。
【０１９４】
データは、各ＩＬ−２変異体について、２価のＩＬ−２−Ｆｃ変異体が、対応する１価のＩＬ−２−Ｆｃバージョンよりも、ＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導においてより強力であることを示す。特に、ＩＬ−２コンポーネントとＦｃコンポーネント間のドメインリンカー（たとえば、ＸＥＮＰ２７００２、ＸＥＮＰ２７００３、ＸＥＮＰ２７００４、ＸＥＮＰ２７００５、ＸＥＮＰ２７００６、およびＸＥＮＰ２７００７）を作製することは、２価のＩＬ−２−Ｆｃ融合体の効力をさらに高める。特に、２価のＩＬ−２−Ｆｃ融合体構築物（リンカー付きとリンカーなし）のそれぞれは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞などの他のリンパ球集団よりもＴｒｅｇの選択性を保持していた。
【０１９５】
Ｆ．例６：ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の曝露を最大化する
１．Ｘｔｅｎｄ  Ｆｃの組み込み
上記のＩＬ−２−Ｆｃ融合体は、ＦｃＲｎへの結合が強化されたＸｔｅｎｄ  Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）で設計され、融合のＦｃＲｎを介したリサイクルを促進し、その後循環半減期を延長した。Ｘｔｅｎｄ  Ｆｃとの例示的な二価ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の配列を図４３に示し、Ｘｔｅｎｄ  Ｆｃとの例示的な一価ＩＬ−２−Ｆｃ融合体の配列を図４４に示す。
【０１９６】
２．Ｔｒｅｇ選択性と効力のバランスがとれたＩＬ−２−Ｆｃ融合体の選択
我々は、また、効力の低いＩＬ−２−Ｆｃ融合体は抗原シンクを減少させ、それにより循環中の半減期を増加させると推論した。実施例５Ｂのデータを考慮して、二価のＩＬ−２−Ｆｃ融合体およびドメインリンカーを有するＩＬ−２−Ｆｃ融合体が効力を増強したことを示して、我々はドメインリンカーを欠く一価のＩＬ−２−Ｆｃ融合体に特に興味があった。したがって、選択性と効力の最適なバランスでＩＬ−２−Ｆｃ融合体を特定するために、我々は、ＸＥＮＰ２４６３５（Ｃ１２５Ｓ変異を伴う一価のＩＬ−２−Ｆｃ融合体）を伴う、一価のＩＬ−２融合体（それぞれＤ２０Ｎ／Ｔ３７ＲおよびＤ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ変異体を含むＸＥＮＰ２６１０５およびＸＥＮＰ２６１０９）、ならびにＸＥＮＰ２５９０８およびＸＥＮＰ２７１９３（自己免疫疾患の治療に適応されるコンパレータＩＬ−２−Ｆｃ融合体）のインビトロ効力（様々なリンパ球集団に対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導によって示される）をＳＴＡＴ５リン酸化アッセイで比較した。データは図４５に示されている。
【０１９７】
特に、ＸＥＮＰ２６１０５とＸＥＮＰ２６１０９はどちらもＸＥＮＰ２４６３５とＸＥＮＰ２７１９３（それぞれ１ｎＭと５ｎＭのＥＣ５０対０．０２ｎＭと０．０１ｎＭ）より強力ではなかったが、Ｔｒｅｇの選択性を維持しながら、より高用量でＴｒｅｇに対して同様のレベルの活性を達成できた。ＸＥＮＰ２６１０５の効力はＸＥＮＰ２５９０８に匹敵するが（それぞれＥＣ５０が１ｎＭ対０．７ｎＭ）、ＸＥＮＰ２６１０５とＸＥＮＰ２６１０９は、ＸＥＮＰ２５９０８よりもはるかに高いレベルの活動を達成できた。ＸＥＮＰ２６１０５とＸＥＮＰ２６１０９で観察された効力と選択性の低下は、それらが臨床環境での選択的かつ持続的なＴｒｅｇ拡大に役立つことを示唆している。したがって、ＸＥＮＰ２６１０５およびＸＥＮＰ２６１０９のＸｔｅｎｄ  ＦｃアナログであるＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４の可能性をさらに調査した。
【０１９８】
Ｇ．例７：ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４のインビトロ特性付け
１．ＣＤ２５選択的ＩＬ−２−Ｆｃ融合体で処理されたＴｒｅｇ培養物は、より優れたＣＤ２５発現を示す
ラパマイシンは、インビトロでＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの増殖を促進し、その結果生じる拡大したＴｒｅｇはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制することが以前に報告されている（例えば、Ｂａｔｔａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７（１２）８３３８−８３４７、およびＳｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（１）３２０−３２９）。
【０１９９】
したがって、ＣＤ４＋細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用したネガティブ選択により、ヒトＰＢＭＣから濃縮した。Ｔｒｅｇを、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎仔血清＋０．１μｇ／ｍｌラパマイシン＋５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｅｇ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して１〜４日間拡大させた。Ｔｒｅｇを０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でコーティングしたＴ７５フラスコに移し、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清＋０．１μｇ／ｍｌラパマイシン＋１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２＋０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８  ｍＡｂで培養した。実験は、ＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の初回の濃縮から少なくとも８日後に行われた。このように濃縮および培養されたＴｒｅｇは、本明細書ではラパマイシンＴｒｅｇと呼ばれる。
【０２００】
ラパマイシンＴｒｅｇは、１０％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８  ｍＡｂ、１００ｎｇ／ｍｌラパマイシン、および１０ｎｇ／ｍｌ組換えＩＬ−２または１０μｇ／ｌのＸＥＮＰ２７５６４（ＩＬ−２（Ｄ２０Ｎ／Ｎ７１Ｋ／Ｃ１２５Ｓ）変異体を持つＩＬ−２−Ｆｃ融合体）のいずれかを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、０．５μｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でさらに培養した。培養の１４日後、Ｔｒｅｇを、抗ＣＤ２５−ＦＩＴＣ（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＦｏｘＰ３−ＰＥ（ＰＣＨ１０１）、抗ＣＴＬＡ−４−ＰＥ−Ｄａｚｚｌｅ５９４（Ｌ３Ｄ１０）、抗ＰＤ−１−ＢＢ７００（ＥＨ１２．１）、ａｎｔｉ−ＧＩＴＲ−ＰＥ−Ｃｙ７（１０８−１７）、ａｎｔｉ−Ｋｉ６７−Ａｌｅｘａ６４７、ａｎｔｉ−ＩＣＯＳ−Ａｌｅｘａ７００（Ｃ３９８．４ａ）、ａｎｔｉ−ＴＩＧＩＴ−ＢＶ４２１（Ａ１５１５３Ｇ）、ａｎｔｉ−ＬＡＧ−３（１１Ｃ３Ｃ６５）、抗ＣＣＲ４−ＢＶ６０５（Ｌ２９１Ｈ４）、抗ＣＤ８−ＢＶ６５０（ＳＫ１）、抗ＣＤ３９−ＢＶ７１１（Ａ１）、抗ＴＩＭ−３−ＢＶ７８５（Ｆ３８−２Ｅ２）、抗ＣＤ４０ＢＵＶ３９６（ＳＫ３）、抗ＣＤ３−ＢＵＶ４９６（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４５−ＢＵＶ８０５（ＨＩ３０）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＵＶ７３７（ＨＩ１００）、およびゾンビＮＩＲ（ＡＰＣ−Ｃｙ７）で染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。そのデータを図４６〜４７に示す。データは、ＣＤ２５選択的ＸＥＮＰ２７５６４で処理されたＴｒｅｇが、より大きなＣＤ２５発現を示すことを示す。さらに、図４８に示されているように、ＸＥＮＰ２７５６４はエフェクターＴｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ−ＦｏｘＰ３中高）集団のより大きな拡大を示した。
【０２０１】
２．７Ｂ：ＣＤ２５選択的ＩＬ−２−Ｆｃ融合体で処理されたＴｒｅｇ培養物は、より優れた抑制機能を示す
実施例７Ａに記載されるようにＩＬ−２またはＸＥＮＰ２７５６４のいずれかでさらに培養されたラパマイシンＴｒｅｇは、１５日目にそれらの抑制機能について評価された。１ｘ１０５のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、示された数のＴａｇ−ｉｔバイオレット標識Ｔｒｅｇと４日間インキュベートし、ＣＤ８＋レスポンダーとＣＤ４＋レスポンダーの拡大をＣＦＳＥ希釈で測定した。リンパ球集団は次のように染色された：抗ＣＤ８−ＰｅｒＣｐ−Ｂｙ５．５（ＳＫ１）、抗ＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣ（Ａ０１９Ｄ５）、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ−Ｆｉｒｅ７５０（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＯ−Ａｌｅｘａ７００（ＵＣＨＬ１）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ６）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ７８５（ＨＩ１００）、抗ＣＤ４−ＢＵＶ３９５（ＳＫ３）、およびゾンビアクア（ＢＶ５１０）。特に、図４９に示されているデータは、Ｔｒｅｇ選択的ＩＬ−２−Ｆｃ融合体によって拡張されたＴｒｅｇが抑制機能を強化している可能性があることを示す。
【０２０２】
さらに、抑制アッセイにおけるＴｒｅｇ上のＣＤ２５およびＣＤ１２７の発現を調査した。そのデータは図５０〜５１に示されている。上記のデータと一致して、ＸＥＮＰ２７５６４で拡張されたＴｒｅｇは、より高いレベルのＣＤ２５発現を示した。特に、ＸＥＮＰ２７５６４で拡張されたＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇの抑制機能と逆相関することが以前に判明しているマーカーであるＣＤ１２７の発現が低いことを示した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（２００６）、ＣＤ１２７の発現は、ＦｏｘＰ３およびヒトＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能と逆相関する。Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０３（７）：１７０１−１７１１）。これは、ＸＥＮＰ２７５６４で拡張されたＴｒｅｇで観察された抑制機能の強化を説明している可能性がある。
【０２０３】
３．ＣＤ２５選択的ＩＬ−２−Ｆｃ融合体は、抗ＣＤ３による活性化後にＴｒｅｇ選択性と他のリンパ球集団に対する抑制効果を示す
抑制アッセイでは、ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣおよびＴａｇ−ｉｔ  Ｖｉｏｌｅｔ標識ラパマイシンＴｒｅｇを、指示された濃度の指示された被験物質とともに、１００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）とともに４日間インキュベートした。リンパ球集団は次のように染色された：抗ＣＤ８−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（ＳＫ１）、抗ＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ−Ｃｙ７（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＯ−Ａｌｅｘａ７００（ＵＣＨＬ１）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ６）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ７８５（ＨＩ１００）、抗ＣＤ４−ＢＵＶ３９５（ＳＫ３）、およびゾンビアクア（ＢＶ５１０）。試験品での処理後の様々なリンパ球集団の増殖（ＣＦＳＥまたはＴａｇ−ｉｔバイオレット希釈で測定、ゾンビ色素は死細胞を除外するために使用）を図５２に示す。データは、ＣＤ２５選択的ＩＬ−２−Ｆｃ融合体ＸＥＮＰ２７５６３とＸＥＮＰ２７５６４が、ＸＥＮＰ２４６３５（Ｃ１２５ＳのみのＩＬ−２−Ｆｃ）、組換えＩＬ−２、および組換えＩＬ−１５と比較して、Ｔｒｅｇを選択的に拡大したことを示す。実際、図５３および５４に示されているデータは、ＣＤ２５選択的ＩＬ−２−Ｆｃ融合体が、ＸＥＮＰ２４６３５、組換えＩＬ−２、および組換えＩＬ−１５と比べて、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導する効果を実質的に減少させたことを示している。
【０２０４】
増殖アッセイでは、ＰＢＭＣを、示された濃度の示された濃度の示された試験品とともに、示された濃度のプレート結合抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＯＫＴ３）とともにインキュベートした。リンパ球集団は次のように染色された：抗ＦｏｘＰ３−ＰＥ（ＰＣＨ１０１）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＳＫ１）、抗ＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＯＫＴ３）、抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ、抗ＣＤ４５ＲＯ−  Ａｌｅｘａ７００（ＵＣＨＬ１）、抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ６）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ７８５（ＨＩ１００）、抗ＣＤ４−ＢＵＶ３９６（ＳＫ３）、およびゾンビＮＩＲ（ＡＰＣ−Ｃｙ７）。様々なリンパ球集団の増殖は、増殖マーカーであるＫｉ６７を発現するパーセンテージに基づいて決定され、そのデータは図５５〜６５に示される。上記の抑制アッセイのデータと一致して、図５５〜６１に示す増殖アッセイのデータは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４（ＣＤ２５選択性のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体）がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞の増殖誘導の機能を損傷したことを示し、図６３〜６５に示すデータは、ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４が他のリンパ球集団よりもＴｒｅｇを選択的に拡大することを示す。
【０２０５】
Ｈ．例８：ＩＬ−２−Ｆｃ融合体はカニクイザルの選択的かつ持続的なＴｒｅｇ増殖を促進する
ＸＥＮＰ２７５６３およびＸＥＮＰ２７５６４の臨床的可能性を調査するために、カニクイザルにおけるそれらの活動を調査した。動物に投薬する前に、カニクイザルのリンパ球に対するＩＬ−２−Ｆｃ融合体の活性を確認した。以下のように、２つのアッセイを実施した。
【０２０６】
第１のアッセイでは、ヒトＰＢＭＣを様々な濃度のＸＥＮＰ２７５６３またはＸＥＮＰ２７５６４で、３７℃で１５分間刺激した。次に、ＰＢＭＣをａｎｔｉ＿ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＢＶ７１１（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＰＥで染色した。次に、細胞をＰｅｒＦｉｘ  ＥＸＰＯＳＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して透過処理した。透過処理後、細胞を抗ＣＤ１６−ＡＦ７００（ＤＪ１３０Ｃ）、抗ＦｏｘＰ３−ＡＦ４８８（２５９Ｄ）、およびｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）で染色し、様々なリンパ球集団のＳＴＡＴ５リン酸化についてフローサイトメトリーで分析した（図７８にデータを示す）。
【０２０７】
２番目のアッセイでは、カニクイザルのＰＢＭＣを様々な濃度のＸＥＮＰ２７５６３またはＸＥＮＰ２７５６４で、３７℃で１５分間刺激した。次に、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＶ４２１（ＳＰ３４）、抗ＣＤ４−ＢＶ７８５（ＯＫＴ４）、抗ＣＤ８−ＢＵＶ３９５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ２５−ＢＶ５１０（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｈ７（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＰＥで染色した。次に、細胞をＰｅｒＦｉｘ  ＥＸＰＯＳＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して透過処理した。透過処理後、細胞を抗ＣＤ１６−ＡＦ７００（ＤＪ１３０Ｃ）、抗ＦｏｘＰ３−ＡＦ４８８（２５９Ｄ）、およびｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）で染色し、様々なリンパ球集団のＳＴＡＴ５リン酸化についてフローサイトメトリーで分析した（図７９にデータを示す）。
【０２０８】
データは、ＸＥＮＰ２７５６３とＸＥＮＰ２７５６４が人間とカニクイザルの両方に対して同等に選択的で強力であることを示す。
【０２０９】
１．８Ａ：ＸＥＮＰ２７５６３とＸＥＮＰ２７５６４のＰＤとＰＫの比較
カニクイザルの最初の研究では、動物（ｎ＝２）に３倍量のＸＥＮＰ２７５６３または３倍量のＸＥＮＰ２７５６４を０日目と１５日目に静脈内投与した。血液を経時的に収集して、様々なリンパ球集団の拡大を調査し、被験物質の血清濃度を調査した。動物の血清アルブミン濃度と血圧も、試験品の耐容性を調査するために採取された。
【０２１０】
図６６は、様々なリンパ球集団の経時的な拡大を示す。データは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、およびＣＤ１６＋ＮＫ細胞のベースラインレベルに近い状態を維持しながら、両方のテスト記事がＴｒｅｇを拡張できたことを示す。さらに、データは、２つのテスト記事がサルで同様の薬理学を促進することを示す。図６７は、被験物質の血清濃度を示す。データは、２つの試験論文が同様の薬物動態プロファイルを示し、ＸＥＮＰ２７５６４の半減期が１．５日であることを示す。まとめると、これは、ＣＤ２５の選択性と効力の低下のために設計されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体が、選択的で持続的なＴｒｅｇ拡張を提供することを支持する。
【０２１１】
血管漏出症候群は、ＩＬ−２などのサイトカインによる治療に関連する特徴的な毒性副作用である。血管漏出の１つの兆候は低アルブミン血症、血清アルブミン濃度の低下である。したがって、動物の血清アルブミン濃度の変化を調査した。そのデータを図６８に示す。特に、ＸＥＮＰ２７５６３を投与された１匹の動物では、１回目と２回目の両方の投与後に長期アルブミンドロップが検出された。ＸＥＮＰ２７５６４を投与した１匹の動物では、２回目の投与後にアルブミンの低下が検出されたが、濃度はすぐにベースラインレベルに回復した。このデータは、ＸＥＮＰ２７５６３よりも効力が低いＸＥＮＰ２７５６４が優れた忍容性と治療指数を促進する可能性があることを示唆している。
【０２１２】
血管漏出の別の指標は、血圧の急激な低下である。したがって、０、１、３、５、９、１６、１８、２０、および２４日目の動物の血圧を記録した。そのデータを図６９に示す。特に、ＸＥＮＰ２７５６３を投与した最初のサルは１日目（最初の投与の１日後）に血圧が低下し、ＸＥＮＰ２７５６３を投与した２番目のサルは１６日目（２回目の投与の１日後）に血圧が低下したが、安定した血圧はＸＥＮＰ２７５６４を投与したサルのすべての日で観察された（テレメトリデータは、ＸＥＮＰ２７５６４を投与した２番目のサルでは破損していた）。これは、効力の低いＩＬ−２−Ｆｃ融合体が優れた忍容性と治療指数を促進する可能性があるという考えをさらに裏付けている。
【０２１３】
最後に、耐容性の追加の指標として好酸球数と好塩基球数も調査した。そのデータを図７６に示す。集合的に、データはＸＥＮＰ２７５６４で繰り返し投与することを示す。
【０２１４】
２．８Ｂ：ＸＥＮＰ２７５６４用量漸増試験
カニクイザルの最初の研究では、動物（ｎ＝３）に１Ｘ、３Ｘ、または１０Ｘのいずれかの用量でＸＥＮＰ２７５６４を静脈内投与した。様々なリンパ球集団の拡大、ならびに血清アルブミンとＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の濃度を調査するために、時間の経過とともに血液が収集された。
【０２１５】
様々なリンパ球集団の拡大が図７０〜７１に示されている。最初のカニクイザル研究からのデータと一致して、ＸＥＮＰ２７５６４は選択的かつ持続的なＴｒｅｇ拡大を提供する。さらに、データは、１Ｘと３Ｘの用量がサルで同様の薬理学を促進することを示す（Ｔｒｅｇの拡大で示されている）。特に、ＸＥＮＰ２７５６４の高用量（１０倍用量）は薬力学を向上させなかった。上記のデータと一致して、図７５は、ＸＥＮＰ２７５６４のすべてのテストされた用量でのカニクイザルにおける数日までの持続的な薬物動態を示す。
【０２１６】
最初の研究と同様に、血管漏出と忍容性の指標としてアルブミンドロップを調査した。そのデータを図７２に示す。さらに、忍容性のもう１つの指標として、炎症に関連する急性期タンパク質であるＣＲＰの血清濃度を調査した。そのデータを図７３に示す。忍容性の追加の指標として、ナトリウム濃度、塩化物濃度、好酸球数、および好塩基球数も調査した（データは図７４に示されている）。特に、データは、高用量のＸＥＮＰ２７５６４がアルブミンの低下と血清ＣＲＰ濃度（およびナトリウム濃度、塩化物濃度、好酸球数、および好塩基球数）の増加の両方によって示されるように毒性を増加させたが、それでもなお低用量であったことを示すＴｒｅｇｓの大幅な増加はより許容された。
【０２１７】
Ｉ．例９：ＩＬ−２−Ｆｃ融合体はマウスのＴｒｅｇに対して同様に選択的である
Ｂ６マウスの脾細胞をＩＬ−２−Ｆｃ融合体および組換えヒトＩＬ−２と１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を抗ＣＤ４−ＰＥ（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ２５−ＢＶ６０５（ＰＣ６１）、および抗ＣＤ４４−ＢＶ５１０（ＩＭ７）で染色した。次に、細胞をＰｅｒＦｉｘ  ＥＸＰＯＳＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して透過処理した。透過処理後、細胞を抗ＣＤ３−ＡＦ７００（２Ｃ１１）、抗ＣＤ８−ＡＦ４８８（５３−６．７）、抗ＦｏｘＰ３−ｅＦ４５０（ＦＪＫ−１６Ｓ）、および抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）で染色し、ＳＴＡＴ５のフローサイトメトリーで分析した様々なリンパ球集団のリン酸化。データは図７７に示されている。データは、操作されたＩＬ−２−Ｆｃ融合体がマウスのＴｒｅｇに対して等しく選択的かつ強力であることを示し、前臨床マウスモデルを使用して自己免疫疾患を調査するのに適している。
【図１Ａ】
2021506291.tif 000003
【図１Ｂ】
2021506291.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2021506291.tif 000009
【図３】
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【図４】
2021506291.tif 000011
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2021506291.tif 000013
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２８Ｇ】
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【図２８Ｈ】
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【図２８Ｉ】
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【図２８Ｊ】
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【図２８Ｋ】
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【図２８Ｌ】
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【図２８Ｍ】
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【図２８Ｎ】
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【図２８Ｏ】
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【図２８Ｐ】
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【図２８Ｑ】
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【図２８Ｒ】
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【図２８Ｓ】
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【図２８Ｔ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４５Ｅ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５２Ｄ】
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【図５２Ｅ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６６Ｄ】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図６９Ｃ】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７０Ｃ】
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【図７０Ｄ】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７４Ｃ】
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【図７４Ｄ】
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【図７５】
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【図７６Ａ】
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【図７６Ｂ】
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【図７７Ａ】
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【図７７Ｂ】
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【図７７Ｃ】
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【図７８】
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【図７９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021506291.tif 000191
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