(57)【要約】腫瘍微小環境、腫瘍組織、または細胞またはその細胞の区画またはサイトゾル、またはそれらの任意の組み合わせにホーミング、ターゲティング、移動するか、これらに誘導されるか、これらに保持されるか、これらに蓄積、透過、または結合できるペプチド免疫抗がん剤複合体（「ペプチドＩ／Ｏ複合体」）を開示する。さらに、血液脳関門を通過できるペプチドＩ／Ｏ複合体も開示する。かかるペプチドを含むペプチドＩ／Ｏ複合体の医薬組成物及び使用も開示する。かかる組成物は、腫瘍微小環境への免疫抗がん剤（「Ｉ／Ｏ」）の標的化された送達のために配合され得る。本開示の標的化組成物は、ペプチドＩ／Ｏ複合体を、ペプチドにより標的化された標的領域、組織、構造または細胞に送達することができる。
2021506849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドが腫瘍ホーミング性を有し、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）が、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである、前記組成物。
【請求項２】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドが細胞透過性を有し、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）が、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである、前記組成物。
【請求項３】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドが血液脳関門（ＢＢＢ）透過性を有し、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）が、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである、前記組成物。
【請求項４】
前記Ｉ／Ｏが受容体のアゴニストを含み、前記受容体が、ＩＬ−１５Ｒ、ＲＩＧ−Ｉ、４−１ＢＢ、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＣＧＡＳ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、またはＴＬＲ９を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、
ａ）ペプチドであって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、配列番号１２６３〜配列番号１２８９のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む腫瘍ホーミングペプチドであり、前記ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象の腫瘍によって保持され、前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、または前記対象の腫瘍に誘導される、前記ペプチドと、
ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記Ｉ／Ｏは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記Ｉ／Ｏと、を含む、前記組成物。
【請求項６】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、
ａ）ペプチドであって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドが、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、配列番号１２９０〜配列番号１３１６のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む腫瘍ホーミングペプチドであり、前記ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象の腫瘍によって保持され、前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、または前記対象の腫瘍に誘導される、前記ペプチドと、
ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記Ｉ／Ｏは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記Ｉ／Ｏと、を含む、前記組成物。
【請求項７】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、
ａ）ペプチドであって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、または配列番号１２６３〜配列番号１２８９のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む細胞透過性ペプチドである、前記ペプチドと、
ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記Ｉ／Ｏは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記Ｉ／Ｏと、を含む、前記組成物。
【請求項８】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、
ａ）ペプチドであって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドは、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、または配列番号１２９０〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む細胞透過性ペプチドであり、対象に投与されると前記ペプチドは細胞透過性である、前記ペプチドと、
ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記Ｉ／Ｏは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記Ｉ／Ｏと、を含む、前記組成物。
【請求項９】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、
ａ）ペプチドであって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、配列番号１２６３〜配列番号１２８９のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む血液脳関門（ＢＢＢ）透過性ペプチドであり、対象に投与されると前記ペプチドは血液脳関門（ＢＢＢ）透過性である、前記ペプチドと、
ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記Ｉ／Ｏは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記Ｉ／Ｏと、を含む、前記組成物。
【請求項１０】
ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、
ａ）ペプチドであって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記ペプチドは、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、配列番号１２９０〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む血液脳関門（ＢＢＢ）透過性ペプチドであり、対象に投与されると前記ペプチドは血液脳関門（ＢＢＢ）透過性である、前記ペプチドと、
ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記Ｉ／Ｏは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記Ｉ／Ｏと、を含む、前記組成物。
【請求項１１】
前記Ｉ／Ｏが、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドを含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｉ／Ｏが、受容体または標的のアゴニストを含み、前記受容体または標的が、ＩＬ−１５Ｒ、ＲＩＧ−Ｉ、４−１ＢＢ、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＣＧＡＳ、ＴＬＲ、ＴＬＲ７／８、またはＴＬＲ９を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドが、腫瘍ホーミング特性を有する、請求項２〜３または請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、細胞透過特性を有する、請求項１、請求項３〜６、または請求項９〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞透過特性が、エンドソーム内への取り込み、細胞内区画内への取り込み、細胞内区画内の取り込み及びプロセシングならびに分泌、細胞質への取り込み及び送達、取り込み及びトランスサイトーシス、取り込み及び核局在化、取り込み及び細胞外提示、ピノサイトーシス、腫瘍微小環境への取り込み、切断、及び分泌、または細胞表面タンパク質への取り込み及び提示を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が前記サイトゾルをターゲティングする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、取り込まれ、プロセシングされ、細胞外に提示される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、細胞区画に進入、蓄積するか、または細胞区画内でプロセシングされ、前記細胞区画が、細胞内区画、細胞質、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、またはリソソームを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドが、前記対象の腫瘍にホーミングするか、ターゲティングするか、移動するか、蓄積するか、結合するか、前記対象の腫瘍によって保持され、前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、または前記対象の腫瘍に誘導される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドが、腫瘍細胞環境中、細胞内、エンドソーム内、リソソーム内、サイトゾル内、小胞体内、またはゴルジ装置内で前記ペプチドＩ／Ｏ複合体から切断される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドが、前記血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、請求項１〜２または請求項５〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体、前記ペプチド、前記Ｉ／Ｏ、またはそれらの任意の組み合わせが、前記細胞サイトゾル、細胞内区画、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソームに入る、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記Ｉ／Ｏが、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を刺激する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、細胞または腫瘍微小環境によってプロセシングされる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記細胞または腫瘍微小環境による前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の前記プロセシングが、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の活性、濃度、方法、または提示の場所を変化させる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＩＬ−１５剤が、ＩＬ−１５超アゴニストを含む、請求項１〜４または請求項１１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＩＬ−１５剤が、ＩＬ−１５ドメインとＩＬ−１５Ｒα  ｓｕｓｈｉ＋ドメインとの融合体を含む、請求項１〜４または請求項１１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＩＬ−１５剤が、下式：Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（式中、Ｘ、Ｙのいずれか１つは、配列番号１１７７または配列番号１１７８または配列番号１４９１を含み、Ｘ、Ｙのいずれか１つは、配列番号１１７６または配列番号１１７９を含み、Ｌ０、Ｌ１、Ｌ２は、配列番号１１６３〜配列番号１１７２または配列番号１３５９〜配列番号１３６６または配列番号１１３９〜配列番号１１６１のうちのいずれか１つを含み、またはＬ０、Ｌ１、Ｌ２は、Ｘｎを含み、ただし各Ｘは、個々に任意のアミノ酸を含み、ｎは１〜５０の任意の数であるかまたは存在しない）を有する、請求項１〜４または請求項１１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＩＬ−１５剤が、２個の配列番号１１７７の部分と、１個の配列番号１１７９の部分とを含む、請求項１〜４または請求項１１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＩＬ−１５剤が、２個の配列番号１１７８の部分と、１個の配列番号１１７９の部分とを含む、請求項１〜４または請求項１１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＩＬ−１５剤が表３から選択される、請求項１〜４または請求項１１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ペプチド−ＩＬ−１５剤が、配列番号１３１７〜配列番号１３４１、及び配列番号１３４３〜配列番号１３４８から選択される、請求項１〜４または請求項１１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ＩＬ−１５剤が、Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（式中、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）から選択される、請求項１〜４または請求項１１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、表４から選択される、請求項１〜４または請求項１１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む、請求項１〜４または請求項１１〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、ヘアピンＲＮＡを含む、請求項１〜４または請求項１１〜３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＭＤＡ５リガンドが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む、請求項１〜４または請求項１１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＭＤＡ５リガンドが、ヘアピンＲＮＡを含む、請求項１〜４または請求項１１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ｄｓＲＮＡが、１０〜６０塩基対を含む、請求項３５または３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ｄｓＲＮＡが、１１〜１８塩基対を含む、請求項３５または請求項３８〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ｄｓＲＮＡが、７〜１０塩基対を含む、請求項３５または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ｄｓＲＮＡが、ヘアピンＲＮＡを含む、請求項３５または請求項３８〜５１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ヘアピンＲＮＡが、１４〜１２０塩基対を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ヘアピンＲＮＡが、７〜６０塩基対を含む、請求項４２〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記単一のヘアピンＲＮＡの少なくとも１個の塩基対が、前記ヘアピンＲＮＡ内で第２の塩基と対合した第１の塩基を含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ヘアピンＲＮＡが、５’三リン酸を含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ヘアピンＲＮＡが、単一のヘアピンＲＮＡである、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、５’三リン酸を含む、請求項１〜４または請求項１１〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、５’二リン酸を含む、請求項１〜４または請求項１１〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、キャップされていない５’ＡまたはＧを含む、請求項１〜４または請求項１１〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、平滑末端に５’三リン酸を含む、請求項１〜４または請求項１１〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのパンハンドル領域を含む、請求項１〜４または請求項１１〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、ベンゾビスチアゾール化合物を含む、請求項１〜４または請求項１１〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ＲＩＧ−ＩリガンドのＲＮＡ骨格が、前記ＲＩＧ−Ｉリガンドの非修飾ＲＮＡ骨格と比較してインビボ安定性を高める修飾を含む、請求項１〜４または請求項１１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記修飾が、２’−フルオロ−修飾、ホスホロチオエート置換、メチルホスホネート修飾、２’−Ｏメチル修飾、２’−Ｆ  ＲＮＡ塩基、架橋核酸、モルホリノ核酸、ＰＮＡ、ＬＮＡ、エチルｃＥｔ核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、それ自身の二本鎖を形成する、請求項１〜４または請求項１１〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、表６から選択される、請求項１〜４または請求項１１〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、配列番号１１８０及び配列番号１１８１、配列番号１１８２及び配列番号１１８３、配列番号１１８４及び配列番号１１８５、配列番号１１８６及び配列番号１１８７、配列番号１１８９及び配列番号１１９０、配列番号１１９１及び配列番号１１９２、配列番号１２０３及び配列番号１２０４、配列番号１２０５及び配列番号１２０６、配列番号１２３５及び配列番号１２３６、配列番号１２３７及び配列番号１２３８、配列番号１２３９及び配列番号１２４０、ならびに配列番号１２４１及び配列番号１２４２である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
配列番号１１８９、配列番号１１９１、配列番号１１９６、または配列番号１１９８が、センス鎖の５’末端に三リン酸を含む、請求項５７〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６０】
配列番号１１９６が三リン酸を含まない、請求項５７〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６１】
配列番号１１８０〜配列番号１１８７が、５’三リン酸基を含む、請求項５７〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ＲＩＧ−Ｉリガンドが、配列番号１３７１である、請求項１〜４または請求項１１〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ＭＤＡ５リガンドが、キャップされていない５’ＡまたはＧを含む、請求項１〜４または請求項１１〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ＭＤＡ５リガンドが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのパンハンドル領域を含む、請求項１〜４または請求項１１〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記ＭＤＡ５リガンドが、べンゾビスチアゾール化合物を含む、請求項１〜４または請求項１１〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ＭＤＡ５リガンドのＲＮＡ骨格が、前記ＭＤＡ５リガンドの非修飾ＲＮＡ骨格と比較してインビトロまたはインビボ安定性を高める修飾を含む、請求項１〜４または請求項１１〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記修飾が、２’−フルオロ−修飾、ホスホロチオエート置換、メチルホスホネート修飾、２’−Ｏメチル修飾、２’−Ｆ  ＲＮＡ塩基、架橋核酸、モルホリノ核酸、ＰＮＡ、ＬＮＡ、エチルｃＥｔ核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＭＤＡ５リガンドが、それ自身の二本鎖を形成する、請求項１〜４または請求項１１〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ＭＤＡ５リガンドが表６から選択される、請求項１〜４または請求項１１〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ＭＤＡ５リガンドが、配列番号１１８０及び配列番号１１８１、配列番号１１８２及び配列番号１１８３、配列番号１１８４及び配列番号１１８５、配列番号１１８６及び配列番号１１８７、配列番号１１８９及び配列番号１１９０、配列番号１１９１及び配列番号１１９２、配列番号１２０３及び配列番号１２０４、配列番号１２０５及び配列番号１２０６、配列番号１２３５及び配列番号１２３６、配列番号１２３７及び配列番号１２３８、配列番号１２３９及び配列番号１２４０、ならびに配列番号１２４１及び配列番号１２４２、及び配列番号１１９３、及び配列番号１１９４、及び配列番号１１９５、及び配列番号１１９６、及び配列番号１１９７、及び配列番号１１９８、及び配列番号１２００である、請求項１〜４または請求項１１〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ＭＤＡ５リガンドが、５’三リン酸、５’二リン酸、５’一リン酸、及びリボースの２’−Ｏ−メチル化の５’キャップの１つ以上を含まない、請求項１〜４または請求項１１〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ＭＤＡ５リガンドが、５’三リン酸を欠いてもよく、リボース２’−Ｏ−メチル化の５’キャップを欠いてもよい、請求項１〜４または請求項１１〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記ＭＤＡ５リガンドまたはＴＬＲ３リガンドが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む、請求項１〜４または請求項１１〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ｄｓＲＮＡが、１２〜６０００塩基対を含む、請求項３５、３７、または請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記ｄｓＲＮＡが、１１個よりも多い塩基対を含む、請求項３５、３７、請求項３９〜４２、または請求項７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７６】
前記ヘアピンＲＮＡが、１２〜６０００塩基対を含む、請求項３６、３８、または請求項４２〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７７】
前記ヘアピンＲＮＡが、１２〜４０塩基対を含む、請求項３６，３８、請求項４２〜４７、または７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ＭＤＡ５リガンドが、１２〜４０ｂｐの任意のｄｓＲＮＡである、請求項１〜４または請求項１１〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記ｄｓＲＮＡが、三リン酸を含まない、請求項３５、３７、請求項３９〜４２、または請求項７４〜７５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記４−１ＢＢリガンドが、ヒト４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）ペプチドまたはそのフラグメントを含む、請求項１〜４または請求項１１〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記４−１ＢＢリガンドが、ヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体、モノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質を含むか、または前記抗体が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃ、重鎖、軽鎖、一本鎖、もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む抗体フラグメントである、請求項１〜４または請求項１１〜８０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８２】
前記４−１ＢＢリガンドが、抗４−１ＢＢ抗体を含む、請求項１〜４または請求項１１〜８１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記抗４−１ＢＢモノクローナル抗体が、ｓｃＦｖ部分と融合されて二重特異性分子を形成する、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
前記４−１ＢＢリガンドが、ヒトコラーゲンのコラーゲンＣ−プロペプチドなどの三量体化ドメインと融合される、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８５】
前記４−１ＢＢリガンドが、ヒト４−１ＢＢに結合してこれを活性化する抗イディオタイプ抗体、及びｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃ、重鎖、軽鎖、一本鎖、もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む抗体フラグメントを含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８６】
前記４−１ＢＢリガンドが、ウレルマブを含む、請求項１〜４または請求項１１〜８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８７】
前記ウレルマブが、２個の配列番号１２２５の部分と、２個の配列番号１２２６の部分との複合体を含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
前記４−１ＢＢリガンドが、ウトミルマブを含む、請求項１〜４または請求項１１〜８７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８９】
前記ウトミルマブが、２個の配列番号１２２８の部分と、２個の配列番号１２２９の部分との複合体を含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記４−１ＢＢリガンドが、表５から選択される、請求項１〜４または請求項１１〜８９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９１】
前記４−１ＢＢリガンドが、配列番号１２２５〜配列番号１２２９のうちのいずれか１つである、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記ＳＴＩＮＧリガンドが、環状ジヌクレオチドを含む、請求項１〜４または請求項１１〜９１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９３】
前記環状ジヌクレオチドが、２’，３’−ｃＧＡＭＰを含む、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記ＳＴＩＮＧリガンドが、ＤＭＸＡＡ類似体を含む、請求項１〜４または請求項１１〜９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９５】
前記ＳＴＩＮＧリガンドが、４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−Ｎ−（フラン−２−イルメチル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−カルボキサミドを含む、請求項１〜４または請求項１１〜９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９６】
前記ＳＴＩＮＧリガンドが、１個のアデノシンヌクレオシド及び１個のイノシンヌクレオシドを含む、請求項１〜４または請求項１１〜９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９７】
前記ＳＴＩＮＧリガンドが、ジスピロジケトピペリジン（ＤＳＤＰ）を含む、請求項１〜４または請求項１１〜９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９８】
前記ＳＴＩＮＧリガンドが、ｃＧＭＰの合成類似体を含む、請求項１〜４または請求項１１〜９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９９】
前記ＳＴＩＮＧリガンドが、ホスホチオエステルを含む、請求項１〜４または請求項１１〜９８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１００】
前記ＳＴＩＮＧリガンドが、表８から選択される、請求項１〜４または請求項１１〜９９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記ＳＴＩＮＧリガンドがその標的に対するアゴニストとして作用する、請求項１〜４または請求項１１〜１００の１項に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端において、内部リシン残基のεアミンにおいて、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸において、システイン残基において、またはＣ末端において前記Ｉ／Ｏに連結される、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記ペプチドが非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸が別のアミノ酸に対する挿入、付加、または置換である、請求項１〜１０２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記ペプチドと前記Ｉ／Ｏとが、融合体として組換えにより発現される、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記ペプチドが、リンカーによって前記非天然アミノ酸において前記Ｉ／Ｏに連結される、請求項１〜１０４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０６】
リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ボロン酸エステル複合体、トリアゾール、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、または天然アミノ酸を含む、請求項１０２〜１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記リンカーが、腫瘍内または細胞内で選択的に切断されるように調整可能な切断速度を有する、請求項１０５〜１０６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、スペーサーを含む、請求項１〜１０７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記ペプチドとＩ／Ｏとが結合されている、請求項１〜１０３または請求項１０５〜１０８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記ペプチドとＩ／Ｏとが化学的に結合されるか、または組換え融合により結合される、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記ペプチドと前記Ｉ／Ｏとが、切断可能なリンカーによって連結される、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記切断可能なリンカーが、低ｐＨ、還元剤、グルタチオン、プロテアーゼ、酵素によって切断されるか、または加水分解に不安定であることにより、切断されたＩ／Ｏを生成する、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記酵素が、マトリックスメタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、トロンビン、カテプシン、ペプシノーゲン、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、ヒアルロニダーゼ、またはグルクロニダーゼである、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記切断可能なリンカーが、腫瘍微小環境に送達されたとき、前記腫瘍微小環境内の細胞の表面で、腫瘍細胞の前記表面で、細胞の細胞質内で、または細胞内区画でのみ、またはそこで選択的に切断される、請求項１１１〜１１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記細胞内区画が、小胞体、エンドソーム、リソソーム、またはゴルジ装置を含む、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記切断可能なリンカーが、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、または配列番号１３６０〜配列番号１３６３、及び配列番号１３６５のうちのいずれか１つを含む、請求項１１１〜１１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記切断されたＩ／Ｏが、前記Ｉ／Ｏと比較して化学的に修飾されている、請求項１０４〜１１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記切断されたＩ／Ｏが、前記Ｉ／Ｏと比較して化学的に修飾されていない、請求項１０４〜１１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記切断されたＩ／Ｏが、前記Ｉ／Ｏと比較して異なる効力または活性を有する、請求項１０４〜１１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記切断されたＩ／Ｏが、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体と比較して異なる効力または活性を有する、請求項１０４〜１１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記ペプチドと前記Ｉ／Ｏとが、安定的なリンカーを介して化学的に結合されている、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記安定的なリンカーが、配列番号１１６３〜配列番号１１６８のうちのいずれか１つを含む、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記ペプチド及びＩ／Ｏとが共配合される、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記ペプチド及びＩ／Ｏとがナノ粒子に配合される、請求項１〜１０３及び請求項１２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記Ｉ／Ｏがナノ粒子内に配合され、前記ペプチドが前記ナノ粒子の外側に結合される、請求項１〜１０３及び請求項１２３〜１２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記Ｉ／Ｏがベクターにコードされてナノ粒子内に配合され、前記ペプチドが前記ナノ粒子の外側に結合される、請求項１〜１０３及び請求項１２３〜１２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記ナノ粒子が、リポソームである、請求項１２４〜１２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記ベクターが、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを送達する、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記ペプチドと前記Ｉ／Ｏとの比が、１：１、１：２、１：３、１：４，１：８、２：１、３：１、４：１、または８：１である、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記投与が、吸入、鼻腔内、経口、局所、非経口、静脈内、皮下、腫瘍内注射、筋肉内投与、腹腔内投与、皮膚投与、経皮投与、脳室内投与、または髄腔内投与、またはこれらの組み合わせによるものである、請求項１〜１２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、または配列番号１２６３〜配列番号１２８９のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有し、前記ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象の腫瘍によって保持され、または前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、前記対象の腫瘍に誘導される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記ペプチドが、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、または配列番号１２９０〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有し、前記ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象の腫瘍によって保持され、前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、または前記対象の腫瘍に誘導される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３３】
前記ペプチドが、前記Ｉ／Ｏを、細胞内の細胞質、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソーム、またはこれらの任意の組み合わせにターゲティングする、請求項１〜１３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３４】
前記ペプチドが、がんにホーミングする、請求項１〜１３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３５】
前記がんが、脳癌、脳腫瘍、乳癌、黒色腫、肉腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌及び膀胱癌、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１３４に記載の組成物。
【請求項１３６】
ＰＤ−１またはＰＤＬ１療法を投与することをさらに含む、請求項１〜１３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３７】
前記ＰＤ−１またはＰＤＬ１療法が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、チェックポイント阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３８】
前記ペプチドが、４個以上のシステイン残基を含む、請求項１〜１３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記ペプチドが、６個以上のシステイン残基を含む、請求項１〜１３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４０】
前記ペプチドが、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含む、請求項１〜１３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４１】
前記ペプチドが、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の１つが他の２個のジスルフィド架橋によって形成されるループを通っている、請求項１〜１４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記ペプチドが、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む、請求項１〜１４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記ペプチドが、ジスルフィドノットを通るジスルフィドを含む、請求項１〜１４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基がＬ配置であるか、または前記ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基がＤ配置である、請求項１〜１４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記配列が、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個、少なくとも５１個、少なくとも５２個、少なくとも５３個、少なくとも５４個、少なくとも５５個、少なくとも５６個、少なくとも５７個、少なくとも５８個の残基、少なくとも５９個、少なくとも６０個、少なくとも６１個、少なくとも６２個、少なくとも６３個、少なくとも６４個、少なくとも６５個、少なくとも６６個、少なくとも６７個、少なくとも６８個、少なくとも６９個、少なくとも７０個、少なくとも７１個、少なくとも７２個、少なくとも７３個、少なくとも７４個、少なくとも７５個、少なくとも７６個、少なくとも７７個、少なくとも７８個、少なくとも７９個、少なくとも８０個、または少なくとも８１個の残基を含む、請求項１〜１４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４６】
Ｋ残基のいずれか１つ以上がＲ残基により置換されるか、またはＲ残基のいずれか１つ以上がＫ残基により置換されている、請求項１〜１４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４７】
Ｍ残基のいずれか１つ以上が、Ｉ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置換されている、請求項１〜１４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４８】
Ｌ残基のいずれか１つ以上が、Ｖ、Ｉ、またはＭ残基のいずれか１つにより置換されている、請求項１〜１４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４９】
Ｉ残基のいずれか１つ以上が、Ｍ、Ｌ、またはＶ残基のいずれかによって置換されている、請求項１〜１４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５０】
Ｖ残基のいずれか１つ以上が、Ｍ、Ｉ、またはＬ残基のいずれかによって置換されている、請求項１〜１４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５１】
Ｇ残基のいずれか１つ以上がＡ残基により置換されるか、またはＡ残基のいずれか１つ以上がＧ残基により置換されている、請求項１〜１５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５２】
Ｓ残基のいずれか１つ以上がＴ残基により置換されるか、またはＴ残基のいずれか１つ以上がＳ残基により置換されている、請求項１〜１５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５３】
Ｑ残基のいずれか１つ以上がＮ残基により置換されるか、またはＮ残基のいずれか１つ以上がＱ残基により置換されている、請求項１〜１５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５４】
Ｄ残基のいずれか１つ以上がＥ残基により置換されるか、またはＥ残基のいずれか１つ以上がＤ残基により置換されている、請求項１〜１５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記ペプチドの少なくとも１つの残基が化学修飾を含む、請求項１〜１５４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５６】
前記化学修飾が前記ペプチドの前記Ｎ末端をブロックしている、請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記化学修飾が、メチル化、アセチル化、またはアシル化である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１５８】
前記化学修飾が、
１つ以上のリシン残基またはその類似体のメチル化；
Ｎ末端のメチル化；または
１つ以上のリシン残基またはその類似体のメチル化及び前記Ｎ末端のメチル化である、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記ペプチドが、アシル付加物である、請求項１〜１５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記ペプチドが、配列番号１である、請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記ペプチドが、配列番号２である、請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記ペプチドが、配列番号５６８である、請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記ペプチドが、配列番号５６９である、請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記ペプチドが、配列番号５７０である、請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、さらなる細胞透過性ペプチドをさらに含む、請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記細胞透過性ペプチドが、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞透過、細胞質送達、エンドソーム取り込み、エンドソーム脱出、またはそれらの組み合わせを高める、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記細胞透過性ペプチドが、配列番号１２０７〜配列番号１２２４、または配列番号１３８２〜配列番号１４００、または配列番号１４４２〜配列番号１４９０のうちのいずれか１つを含む、請求項１６５〜１６６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記細胞透過性ペプチドが、システイン高密度ペプチドである、請求項１６７に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記システイン高密度ペプチドが、インペラトキシンＡ、マウロカルシン、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ｋａｌａｔａ  Ｂ１、ＳＦＴＩ−１、ＣｙＬｏＰ−１、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６８に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記ペプチドに改変が行われる、請求項１〜１６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記改変が、前記ペプチドのループ領域のアミノ酸の付加、前記ペプチドのループ領域のアミノ酸の改変である、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７２】
前記改変が、非ペプチド分子、小分子、ポリペプチド、脂質、またはそれらの任意の組み合わせの組み込みである、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記改変が、配合、非共有結合による複合体化、グラフト化、融合、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９、または配列番号５７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する配列を含み、前記Ｉ／Ｏが、配列番号１１３５、配列番号１１６９、配列番号１１６３、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９の配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む、請求項１〜１７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、下式を含む、請求項１〜１７４のいずれか１項に記載の組成物。
【化７】
2021506849.tif 000111
【請求項１７６】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、１つ以上の修飾ヌクレオチド塩基を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む、請求項１〜１７５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、２’フルオロ基、ホスホロチオエート結合、ＬＮＡもしくはＢＮＡ核酸、または２’ＯＭｅ基で修飾された１つ以上のヌクレオチド塩基を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む、請求項１〜１７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、２’フルオロ修飾を有する１つ以上の塩基を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む、請求項１〜１７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、２’フルオロ修飾を有する２５％、５０％、７５％、または１００％の塩基を含む、請求項１〜１７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、ホスホロチオエート結合を有する１つ以上の塩基を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む、請求項１〜１７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、５’末端及び３’末端のそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも２個がホスホロチオエート結合を含むＲＩＧ−Ｉを含む、請求項１〜１７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、３’末端のそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも２個がホスホロチオエート結合を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む、請求項１〜１７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、
【化８】
2021506849.tif 000112
（式中、Ｘ及びＹは、それぞれ５〜２００塩基の長さであるＲＮＡの相補鎖であり、ペプチドは配列番号５６９または配列番号５７０を含む）を含む、請求項１〜１８２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８４】
前記ペプチドが配列番号５６９または配列番号５７０を含み、前記Ｉ／Ｏが５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡを含み、前記ｄｓＲＮＡは二本鎖ＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡであり、前記ｄｓＲＮＡは５〜１００塩基対または１０〜４０塩基対を含む、請求項１〜１８３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９、または配列番号５７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する配列を含み、前記Ｉ／Ｏが、配列番号１３７１、配列番号１４２４、及び配列番号１４２５、配列番号１３７５、配列番号１３７６の配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む、請求項１〜１８４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８６】
ＣＤ２８−ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ−３、またはＴＩＧＩＴ療法をさらに含む、請求項１〜１８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が、図３４〜図４４及び図５５〜図７９のいずれか１つに記載の構造を有する、請求項１〜１８６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記ペプチドが、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などの診断薬または造影剤をさらに含む、請求項１〜１８７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８９】
治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１〜１８８のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９０】
免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）を腫瘍に送達する方法であって、
ａ）請求項１〜１８８のいずれか１項に記載のペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を与えることと、
ｂ）前記ペプチドＩ／Ｏ複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、前記ペプチドＩ／Ｏ複合体が投与後に腫瘍にホーミングする、前記方法。
【請求項１９１】
免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）を細胞内に送達する方法であって、
ａ）請求項１〜１８８のいずれか１項に記載のペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を与えることと、
ｂ）前記ペプチドＩ／Ｏ複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、前記ペプチドＩ／Ｏが投与後に細胞を透過する、前記方法。
【請求項１９２】
血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）を送達する方法であって、
ａ）請求項１〜１８８のいずれか１項に記載のペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を与えることと、
ｂ）前記ペプチドＩ／Ｏ複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、前記ペプチドＩ／Ｏが投与後に前記ＢＢＢを透過する、前記方法。
【請求項１９３】
請求項１８９〜１９２のいずれか１項に記載のペプチドＩ／Ｏ複合体をそれを必要とする対象に送達するまたは治療する方法であって、コンパニオン診断薬または造影剤を投与することをさらに含み、前記コンパニオン診断薬または造影剤が、
ａ）請求項１〜１８８のいずれかに記載のペプチドＩ／Ｏ複合体、
ｂ）請求項１８８に記載のペプチドＩ／Ｏ複合体、または
ｃ）さらに診断薬または造影剤を含む配列番号１〜配列番号１３１６のペプチドを含み、前記診断薬または造影剤が、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子を含む、前記方法。
【請求項１９４】
前記コンパニオン診断薬または造影剤が、装置によって検出される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記装置が、Ｘ線ラジオグラフィー、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、超音波、内視鏡、弾性イメージング法、触覚イメージング、サーモグラフィー、フローサイトメトリー、医療用撮影術、核医療機能的イメージング法、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、外科用器具、手術用顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光スコープ、外視鏡、内視鏡、または外科用ロボットを含む放射線医学または蛍光を取り入れたものである、請求項１９４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、あらゆる目的で本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところの２０１７年１２月１９日出願の米国特許仮出願第６２／６０７，８９３号、及び２０１８年１月２６日出願の米国特許仮出願第６２／６２２，７１１号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年７月１３日に作成され、４５６３９−７１５＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔの名前が付けられており、そのサイズは１，０４２，４２５バイトである。
【背景技術】
【０００３】
がん治療は、腫瘍細胞を根絶するための特定の治療の特異性と選択性に関して、多くの課題に直面してきた。特に、がん細胞に対する宿主の免疫活性を刺激することが可能な薬剤は、全身的に投与される場合に特異性の欠如が問題となり、健康な細胞に対するオフターゲット作用を生じる場合がある。さらに、宿主の免疫活性を刺激することが可能な他の薬剤は、それらの作用部位（細胞質中へ、または血液脳関門を通過して、など）に効率的に到達しない場合がある。したがって、当該技術分野において依然として存在する重要な課題として、腫瘍微小環境への免疫抗がん剤の標的化送達、腫瘍細胞内の適当な細胞内区画内への免疫抗がん剤の取り込み、及び脳などのアクセス不能な腫瘍部位への免疫抗がん剤の送達がある。本明細書では、がん治療用の免疫抗がん剤と結合することが可能な、腫瘍ホーミング特性、細胞透過特性、及び／または血液脳関門通過特性を備えたペプチドを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドが腫瘍ホーミング性を有し、ペプチドＩ／Ｏ複合体の免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）が、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである、組成物を提供する。
【０００５】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドが細胞透過性を有し、ペプチドＩ／Ｏ複合体の免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）が、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである、組成物を提供する。
【０００６】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドが血液脳関門（ＢＢＢ）透過性を有し、ペプチドＩ／Ｏ複合体の免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）が、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドである、組成物を提供する。いくつかの態様では、Ｉ／Ｏは受容体のアゴニストを含み、受容体はＩＬ−１５Ｒ、ＲＩＧ−Ｉ、４−１ＢＢ、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＣＧＡＳ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、またはＴＬＲ９を含む。
【０００７】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体が、ａ）ペプチドであって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、配列番号１２６３〜配列番号１２８９のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む腫瘍ホーミングペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される、ペプチドと、ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、Ｉ／Ｏと、を含む、組成物を提供する。
【０００８】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体が、ａ）ペプチドであって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、配列番号１２９０〜配列番号１３１６のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む腫瘍ホーミングペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される、ペプチドと、ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、Ｉ／Ｏと、を含む、組成物を提供する。
【０００９】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体が、ａ）ペプチドであって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、または配列番号１２６３〜配列番号１２８９のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む細胞透過性ペプチドである、ペプチドと、ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、Ｉ／Ｏと、を含む、組成物を提供する。
【００１０】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体が、ａ）ペプチドであって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、または配列番号１２９０〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む細胞透過性ペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、細胞透過性である、ペプチドと、ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、Ｉ／Ｏと、を含む、組成物を提供する。
【００１１】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体が、ａ）ペプチドであって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、または配列番号１２６３〜配列番号１２８９のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む血液脳関門（ＢＢＢ）透過性ペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、血液脳関門（ＢＢＢ）透過性である、ペプチドと、ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、Ｉ／Ｏと、を含む、組成物を提供する。
【００１２】
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む組成物であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体が、ａ）ペプチドであって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、または配列番号１２９０〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む血液脳関門（ＢＢＢ）透過性ペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、血液脳関門（ＢＢＢ）透過性である、ペプチドと、ｂ）免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）であって、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、Ｉ／Ｏと、を含む、組成物を提供する。
【００１３】
いくつかの態様では、Ｉ／Ｏは、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドを含む。
【００１４】
いくつかの態様では、Ｉ／Ｏは受容体または標的のアゴニストを含み、受容体または標的はＩＬ−１５Ｒ、ＲＩＧ−Ｉ、４−１ＢＢ、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＣＧＡＳ、ＴＬＲ、ＴＬＲ７／８、またはＴＬＲ９を含む。
【００１５】
いくつかの態様では、ペプチドは腫瘍ホーミング特性を有する。いくつかの態様では、ペプチドは細胞透過特性を有する。いくつかの態様では、細胞透過特性は、エンドソーム内への取り込み、細胞内区画内への取り込み、細胞内区画内の取り込み及びプロセシングならびに分泌、細胞質への取り込み及び送達、取り込み及びトランスサイトーシス、取り込み及び核局在化、取り込み及び細胞外提示、ピノサイトーシス、腫瘍微小環境への取り込み、切断、及び分泌、または細胞表面タンパク質への取り込み及び提示を含む。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体はサイトゾルをターゲティングする。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、取り込まれ、プロセシングされ、細胞外に提示される。
【００１６】
いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、細胞区画に進入、蓄積するか、または細胞区画内でプロセシングされ、前記細胞区画が、細胞内区画、細胞質、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、またはリソソームを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、対象の腫瘍にホーミングするか、ターゲティングするか、移動するか、蓄積するか、結合するか、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される。いくつかの態様では、ペプチドは、腫瘍細胞環境中、細胞内、エンドソーム内、リソソーム内、サイトゾル内、小胞体内、またはゴルジ装置内でペプチドＩ／Ｏ複合体から切断される。
【００１７】
いくつかの態様では、ペプチドは血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体、ペプチド、Ｉ／Ｏ、またはそれらの任意の組み合わせが、細胞サイトゾル、細胞内区画、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソームに進入する。いくつかの態様では、Ｉ／Ｏは免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を刺激する。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、細胞または腫瘍微小環境によってプロセシングされる。いくつかの態様では、細胞または腫瘍微小環境によるペプチドＩ／Ｏ複合体のプロセシングは、ペプチドＩ／Ｏ複合体の活性、濃度、方法、または場所を変化させる。
【００１８】
いくつかの態様では、ＩＬ−１５剤はＩＬ−１５超アゴニストを含む。いくつかの態様では、ＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５ドメインとＩＬ−１５Ｒα  ｓｕｓｈｉ＋ドメインとの融合体を含む。
【００１９】
いくつかの態様では、ＩＬ−１５剤は、下式：Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（式中、Ｘ、Ｙのいずれか１つは、配列番号１１７７または配列番号１１７８または配列番号１４９１を含み、Ｘ、Ｙのいずれか１つは、配列番号１１７６または配列番号１１７９を含み、Ｌ０、Ｌ１、Ｌ２は、配列番号１１６３〜配列番号１１７２または配列番号１３５９〜配列番号１３６６または配列番号１１３９〜配列番号１１６１のうちのいずれか１つを含み、またはＬ０、Ｌ１、Ｌ２は、Ｘｎを含み、ただし各Ｘは、個々に任意のアミノ酸を含み、ｎは１〜５０の任意の数であるかまたは存在しない）を含む。
【００２０】
いくつかの態様では、ＩＬ−１５剤は、２個の配列番号１１７７の部分と、１個の配列番号１１７９の部分とを含む。いくつかの態様では、ＩＬ−１５剤は、２個の配列番号１１７８の部分と、１個の配列番号１１７９の部分とを含む。いくつかの態様では、ＩＬ−１５剤は、表３から選択される。いくつかの態様では、ペプチド−ＩＬ−１５剤は、配列番号１３１７〜配列番号１３４１、及び配列番号１３４３〜配列番号１３４８から選択される。いくつかの態様では、ＩＬ−１５剤は、Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２から選択される（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、表４から選択される。
【００２１】
いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、ヘアピンＲＮＡを含む。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、ヘアピンＲＮＡを含む。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、１０〜６０塩基対を含む。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、１１〜１８塩基対を含む。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、７〜１０塩基対を含む。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、ヘアピンＲＮＡを含む。いくつかの態様では、ヘアピンＲＮＡは、１４〜１２０塩基対を含む。いくつかの態様では、ヘアピンＲＮＡは、７〜６０塩基対を含む。いくつかの態様では、単一のヘアピンＲＮＡの少なくとも１個の塩基対は、前記ヘアピンＲＮＡ内で第２の塩基と対合した第１の塩基を含む。いくつかの態様では、ヘアピンＲＮＡは、５’三リン酸を含む。いくつかの態様では、ヘアピンＲＮＡは、単一のヘアピンＲＮＡである。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、５’三リン酸を含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、５’二リン酸を含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、キャップされていない５’ＡまたはＧを含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、平滑末端に５’三リン酸を含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのパンハンドル領域を含む。
【００２２】
いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、ベンゾビスチアゾール化合物を含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−ＩリガンドのＲＮＡ骨格は、ＲＩＧ−Ｉリガンドの非修飾ＲＮＡ骨格と比較してインビボ安定性を高める修飾を含む。いくつかの態様では、修飾は、２’−フルオロ−修飾、ホスホロチオエート置換、メチルホスホネート修飾、２’−Ｏメチル修飾、２’−Ｆ  ＲＮＡ塩基、架橋核酸、モルホリノ核酸、ＰＮＡ、ＬＮＡ、エチルｃＥｔ核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、それ自身の二本鎖を形成する。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは表６から選択される。
【００２３】
いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、配列番号１１８０及び配列番号１１８１、配列番号１１８２及び配列番号１１８３、配列番号１１８４及び配列番号１１８５、配列番号１１８６及び配列番号１１８７、配列番号１１８９及び配列番号１１９０、配列番号１１９１及び配列番号１１９２、配列番号１２０３及び配列番号１２０４、配列番号１２０５及び配列番号１２０６、配列番号１２３５及び配列番号１２３６、配列番号１２３７及び配列番号１２３８、配列番号１２３９及び配列番号１２４０、ならびに配列番号１２４１及び配列番号１２４２である。いくつかの態様では、配列番号１１８９、配列番号１１９１、配列番号１１９６、または配列番号１１９８が、センス鎖の５’末端に三リン酸を含む。いくつかの態様では、配列番号１１９６は、三リン酸を含まない。いくつかの態様では、配列番号１１８０〜配列番号１１８７は、５’三リン酸基を含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、配列番号１３７１である。
【００２４】
いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、キャップされていない５’ＡまたはＧを含む。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのパンハンドル領域を含む。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、ベンゾビスチアゾール化合物を含む。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドのＲＮＡ骨格は、ＭＤＡ５リガンドの非修飾ＲＮＡ骨格と比較してインビトロまたはインビボ安定性を高める修飾を含む。
【００２５】
いくつかの態様では、修飾は、２’−フルオロ−修飾、ホスホロチオエート置換、メチルホスホネート置換、２’−Ｏメチル修飾、２’−Ｆ  ＲＮＡ塩基、架橋核酸、モルホリノ核酸、ＰＮＡ、ＬＮＡ、エチルｃＥｔ核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、それ自身の二本鎖を形成する。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは表６から選択される。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、配列番号１１８０及び配列番号１１８１、配列番号１１８２及び配列番号１１８３、配列番号１１８４及び配列番号１１８５、配列番号１１８６及び配列番号１１８７、配列番号１１８９及び配列番号１１９０、配列番号１１９１及び配列番号１１９２、配列番号１２０３及び配列番号１２０４、配列番号１２０５及び配列番号１２０６、配列番号１２３５及び配列番号１２３６、配列番号１２３７及び配列番号１２３８、配列番号１２３９及び配列番号１２４０、ならびに配列番号１２４１及び配列番号１２４２、及び配列番号１１９３、及び配列番号１１９４、及び配列番号１１９５、及び配列番号１１９６、及び配列番号１１９７、及び配列番号１１９８、及び配列番号１２００である。
【００２６】
いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、５’三リン酸、５’二リン酸、５’一リン酸、及びリボースの２’−Ｏ−メチル化の５’キャップの１つ以上を含まない。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドが、５’三リン酸を欠いてもよく、リボース２’−Ｏ−メチル化の５’キャップを欠いてもよい。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドまたはＴＬＲ３リガンドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、１２〜６０００塩基対を含む。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、１１個よりも多い塩基対を含む。いくつかの態様では、ヘアピンＲＮＡは、１２〜６０００塩基対を含む。いくつかの態様では、ヘアピンＲＮＡは、１２〜４０塩基対を含む。いくつかの態様では、ＭＤＡ５リガンドは、１２〜４０ｂｐの任意のｄｓＲＮＡである。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、三リン酸を含まない。
【００２７】
いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは、ヒト４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）ペプチドの自然配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは、ヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体、モノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質を含むか、または前記抗体が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃ、重鎖、軽鎖、一本鎖、もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは、抗４−１ＢＢ抗体を含む。
【００２８】
いくつかの態様では、抗４−１ＢＢモノクローナル抗体は、ｓｃＦｖ部分と融合されて二重特異性分子を形成する。いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは、ヒトコラーゲンのコラーゲンＣ−プロペプチドなどの三量体化ドメインと融合される。いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは、ヒト４−１ＢＢに結合してこれを活性化する抗イディオタイプ抗体、及びｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃ、重鎖、軽鎖、一本鎖、もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む抗体フラグメントを含む。いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは、ウレルマブを含む。いくつかの態様では、ウレルマブは、２個の配列番号１２２５の部分と、２個の配列番号１２２６の部分との複合体を含む。いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは、ウトミルマブを含む。いくつかの態様では、ウトミルマブは、２個の配列番号１２２８の部分と、２個の配列番号１２２９の部分との複合体を含む。いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは表５から選択される。いくつかの態様では、４−１ＢＢリガンドは、配列番号１２２５〜配列番号１２２９のうちのいずれか１つである。
【００２９】
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドは、環状ジヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、環状ジヌクレオチドは、２’，３’−ｃＧＡＭＰを含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドは、ＤＭＸＡＡ類似体を含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドまたはアゴニストは、４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−Ｎ−（フラン−２−イルメチル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−カルボキサミドを含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドは、１個のアデノシンヌクレオシド及び１個のイノシンヌクレオシドを含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドが、ジスピロジケトピペリジン（ＤＳＤＰ）を含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドは、ｃＧＭＰの合成類似体を含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドは、ホスホチオエステルを含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドは、表８から選択される。
【００３０】
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧリガンドは、その標的に対するアゴニストとして作用する。いくつかの態様では、ペプチドは、前記ペプチドのＮ末端において、内部リシン残基のεアミンにおいて、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸において、システイン残基において、またはＣ末端において前記Ｉ／Ｏに連結される。いくつかの態様では、ペプチドは非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸が別のアミノ酸に対する挿入、付加、または置換である。いくつかの態様では、ペプチドとＩ／Ｏとは、融合体として組換えにより発現される。いくつかの態様では、ペプチドは、リンカーによって非天然アミノ酸においてＩ／Ｏに連結される。
【００３１】
いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ボロン酸エステル複合体、トリアゾール、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、または天然アミノ酸を含む。いくつかの態様では、リンカーは、腫瘍内または細胞内で選択的に切断されるように調整可能な切断速度を有する。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、スペーサーを含む。いくつかの態様では、ペプチドとＩ／Ｏとは結合されている。いくつかの態様では、ペプチドとＩ／Ｏとは化学的に結合されるか、または組換え融合体により結合される。いくつかの態様では、ペプチドとＩ／Ｏとは、切断可能なリンカーによって連結される。
【００３２】
いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、低ｐＨ、還元剤、グルタチオン、プロテアーゼ、酵素によって切断されるか、または加水分解に不安定であることにより、切断されたＩ／Ｏを生成する。いくつかの態様では、酵素は、マトリックスメタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、トロンビン、カテプシン、ペプシノーゲン、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、ヒアルロニダーゼ、またはグルクロニダーゼである。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境に送達されたとき、腫瘍微小環境内の細胞の表面で、腫瘍細胞の表面で、細胞の細胞質内で、または細胞内区画でのみ、またはそこで選択的に切断される。いくつかの態様では、細胞内区画は、小胞体、エンドソーム、リソソーム、またはゴルジ装置を含む。
【００３３】
いくつかの態様では、酵素切断可能なリンカーは、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３、及び配列番号１３６５のうちのいずれか１つを含む。いくつかの態様では、切断されたＩ／Ｏは、Ｉ／Ｏと比較して化学的に修飾されている。いくつかの態様では、切断されたＩ／Ｏは、Ｉ／Ｏと比較して化学的に修飾されていない。いくつかの態様では、切断されたＩ／Ｏは、Ｉ／Ｏと比較して異なる効力または活性を有する。いくつかの態様では、切断されたＩ／Ｏは、ペプチドＩ／Ｏ複合体と比較して異なる効力または活性を含む。いくつかの態様では、ペプチドとＩ／Ｏとは、安定的なリンカーを介して化学的に結合されている。いくつかの態様では、安定的なリンカーは、配列番号１１６３〜配列番号１１６８のうちのいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドとＩ／Ｏとは共配合される。
【００３４】
いくつかの態様では、ペプチドとＩ／Ｏとはナノ粒子に配合される。いくつかの態様では、Ｉ／Ｏはナノ粒子内に配合され、ペプチドはナノ粒子の外側に結合される。いくつかの態様では、Ｉ／Ｏがベクターにコードされてナノ粒子内に配合され、ペプチドがナノ粒子の外側に結合される。いくつかの態様では、ナノ粒子が、リポソームである。いくつかの態様では、ベクターが、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを送達する。いくつかの態様では、ペプチドとＩ／Ｏとの比が、１：１、１：２、１：３、１：４、１：８、２：１、３：１、４：１、または８：１である。
【００３５】
いくつかの態様では、投与は、吸入、鼻腔内、経口、局所、非経口、静脈内、皮下、腫瘍内注射、筋肉内投与、腹腔内投与、皮膚投与、経皮投与、脳室内投与、または髄腔内投与、またはこれらの組み合わせによるものである。
【００３６】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、または配列番号１２６３〜配列番号１２８９のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有し、ペプチドは、対象に投与されると、対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される。
【００３７】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、または配列番号１２９０〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有し、ペプチドは、対象に投与されると、対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｉ／Ｏを、細胞内の細胞質、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソーム、またはこれらの任意の組み合わせにターゲティングする。いくつかの態様では、ペプチドは、がんにホーミングする。いくつかの態様では、がんは、脳癌、脳腫瘍、乳癌、黒色腫、肉腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌及び膀胱癌、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００３８】
いくつかの態様では、組成物は、ＰＤ−１またはＰＤＬ１療法を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、ＰＤ−１またはＰＤＬ１療法は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、チェックポイント阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、４個以上のシステイン残基を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、６個以上のシステイン残基を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含む。
【００３９】
いくつかの態様では、ペプチドは、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の１つが他の２個のジスルフィド架橋によって形成されるループを通っている。いくつかの態様では、ペプチドは、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、ジスルフィドノットを通るジスルフィドを含む。いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基がＬ配置であるか、またはペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基がＤ配置である。
【００４０】
いくつかの態様では、配列は、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個、少なくとも５１個、少なくとも５２個、少なくとも５３個、少なくとも５４個、少なくとも５５個、少なくとも５６個、少なくとも５７個、少なくとも５８個の残基、少なくとも５９個、少なくとも６０個、少なくとも６１個、少なくとも６２個、少なくとも６３個、少なくとも６４個、少なくとも６５個、少なくとも６６個、少なくとも６７個、少なくとも６８個、少なくとも６９個、少なくとも７０個、少なくとも７１個、少なくとも７２個、少なくとも７３個、少なくとも７４個、少なくとも７５個、少なくとも７６個、少なくとも７７個、少なくとも７８個、少なくとも７９個、少なくとも８０個、または少なくとも８１個の残基を含む。
【００４１】
いくつかの態様では、Ｋ残基のいずれか１つ以上は、Ｒ残基により置換されるか、またはＲ残基のいずれか１つ以上は、Ｋ残基により置換されている。いくつかの態様では、Ｍ残基のいずれか１つ以上は、Ｉ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置換されている。いくつかの態様では、Ｌ残基のいずれか１つ以上は、Ｖ、Ｉ、またはＭ残基のいずれか１つにより置換されている。いくつかの態様では、Ｉ残基のいずれか１つ以上は、Ｍ、Ｌ、またはＶ残基のいずれかによって置換されている。いくつかの態様では、Ｖ残基のいずれか１つ以上は、Ｍ、Ｉ、またはＬ残基のいずれかによって置換されている。いくつかの態様では、Ｇ残基のいずれか１つ以上は、Ａ残基により置換されるか、またはＡ残基のいずれか１つ以上は、Ｇ残基により置換されている。いくつかの態様では、Ｓ残基のいずれか１つ以上は、Ｔ残基により置換されるか、またはＴ残基のいずれか１つ以上は、Ｓ残基により置換されている。いくつかの態様では、Ｑ残基のいずれか１つ以上は、Ｎ残基により置換されるか、またはＮ残基のいずれか１つ以上は、Ｑ残基により置換されている。いくつかの態様では、Ｄ残基のいずれか１つ以上は、Ｅ残基により置換されるか、またはＥ残基のいずれか１つ以上は、Ｄ残基により置換されている。
【００４２】
いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも１つの残基は化学修飾を含む。いくつかの態様では、化学修飾はペプチドのＮ末端をブロックしている。いくつかの態様では、化学修飾は、メチル化、アセチル化、またはアシル化である。いくつかの態様では、化学修飾は、１つ以上のリシン残基またはその類似体のメチル化；Ｎ末端のメチル化；または１つ以上のリシン残基またはその類似体のメチル化及びＮ末端のメチル化である。
【００４３】
いくつかの態様では、ペプチドは、アシル付加物である。一部の態様では、ペプチドは、配列番号１である。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２である。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号５６８である。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号５６９である。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号５７０である。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、さらなる細胞透過性ペプチドをさらに含む。いくつかの態様では、細胞透過性ペプチドは、ペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞透過、細胞質送達、エンドソーム取り込み、エンドソーム脱出、またはそれらの任意の組み合わせを高める。
【００４４】
いくつかの態様では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１２０７〜配列番号１２２４、または配列番号１３８２〜配列番号１４００、または配列番号１４４２〜配列番号１４９０のうちのいずれか１つを含む。いくつかの態様では、細胞透過性ペプチドは、システイン高密度ペプチドである。
【００４５】
いくつかの態様では、システイン高密度ペプチドは、インペラトキシンＡ、マウロカルシン、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ｋａｌａｔａ  Ｂ１、ＳＦＴＩ−１、ＣｙＬｏＰ−１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ペプチドに改変が行われる。いくつかの態様では、改変は、ペプチドのループ領域のアミノ酸の付加、ペプチドのループ領域のアミノ酸の改変である。いくつかの態様では、改変は、非ペプチド分子、小分子、ポリマー、脂質、またはそれらの任意の組み合わせの組み込みである。いくつかの態様では、改変は、配合、非共有結合による複合体化、グラフト化、融合、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４６】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９、または配列番号５７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する配列を含み、前記Ｉ／Ｏが、配列番号１１３５、配列番号１１６９、配列番号１１６３、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９の配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む。
【００４７】
いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、下式を含む。
【化１】
2021506849.tif 000003
【００４８】
いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、１つ以上の修飾ヌクレオチド塩基を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、２’フルオロ基、ホスホロチオエート結合、ＬＮＡもしくはＢＮＡ核酸、または２’ＯＭｅ基で修飾された１つ以上のヌクレオチド塩基を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、２’フルオロ修飾を有する１つ以上の塩基を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、２’フルオロ修飾を有する２５％、５０％、７５％、または１００％の塩基を含む。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、ホスホロチオエート結合を有する１つ以上の塩基を含むＲＩＧ−Ｉリガンドを含む。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、５’末端及び３’末端のそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも２個がホスホロチオエート結合を含むＲＩＧ−Ｉを含む。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、３’末端のそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも２個がホスホロチオエート結合を含むＲＩＧ−Ｉを含む。
【００４９】
いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、
【化２】
2021506849.tif 000004
（式中、Ｘ及びＹは、それぞれ５〜２００塩基の長さであるＲＮＡの相補鎖であり、ペプチドは配列番号５６９または配列番号５７０を含む）を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号５６９または配列番号５７０を含み、Ｉ／Ｏは、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡを含み、ｄｓＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡであり、ｄｓＲＮＡは、５〜１００塩基対または１０〜４０塩基対を含む。
【００５０】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９、または配列番号５７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する配列を含み、前記Ｉ／Ｏが、配列番号１３７１、配列番号１４２４、及び配列番号１４２５、配列番号１３７５、配列番号１３７６の配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む。いくつかの態様では、組成物は、ＣＤ２８−ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ−３、またはＴＩＧＩＴ療法をさらに含む。いくつかの態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、図３４〜図４４及び図５５〜図７９のいずれか１つに記載の構造を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などの診断薬または造影剤をさらに含む。
【００５１】
さまざまな態様において、本開示は、治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、対象に治療有効量の上記の組成物のいずれか１つを投与することを含む、方法を提供する。
【００５２】
さまざまな態様において、本開示は、免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）を腫瘍に送達する方法であって、ａ）上記の組成物のいずれか１つのペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を与えることと、ｂ）ペプチドＩ／Ｏ複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、ペプチドＩ／Ｏ複合体が投与後に腫瘍にホーミングする、方法を提供する。
【００５３】
さまざまな態様において、本開示は、免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）を細胞内に送達する方法であって、ａ）上記の組成物のいずれか１つのペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を与えることと、ｂ）ペプチドＩ／Ｏ複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、ペプチドＩ／Ｏ複合体が投与後に細胞を透過する、方法を提供する。
【００５４】
さまざまな態様において、本開示は、免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）を、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して送達する方法であって、ａ）上記の組成物のいずれか１つのペプチド免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を与えることと、ｂ）ペプチドＩ／Ｏ複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、ペプチドＩ／Ｏ複合体が投与後にＢＢＢを透過する、方法を提供する。
【００５５】
さまざまな態様では、請求項１８９〜１９２のいずれか１項に記載のペプチドＩ／Ｏ複合体をそれを必要とする対象に送達するまたは治療する方法であって、コンパニオン診断薬または造影剤を投与することをさらに含み、コンパニオン診断薬または造影剤が、ａ）上記の組成物のいずれかのペプチドＩ／Ｏ複合体、ｂ）上記の組成物のいずれかのペプチドＩ／Ｏ複合体であって、ペプチドがさらに、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などの診断薬または造影剤を含む、ペプチドＩ／Ｏ複合体、またはｃ）診断薬または造影剤をさらに含む配列番号１〜配列番号１３１６のペプチドであって、診断薬または造影剤が、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などの診断薬または造影剤を含む、ペプチドを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、コンパニオン診断薬または造影剤は、装置によって検出される。いくつかの態様では、装置は、Ｘ線ラジオグラフィー、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、超音波、内視鏡、弾性イメージング法、触覚イメージング、サーモグラフィー、フローサイトメトリー、医療用撮影術、核医療機能的イメージング法、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、外科用器具、手術用顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光スコープ、外視鏡、または外科用ロボットを含む放射線医学または蛍光を取り入れたものである。
【００５６】
参照による援用
本明細書で言及、開示、または参照するすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、及び特許出願が詳細かつ個別に参照により援用されていることが示されているものと同様にして、それらの全容を参照により本明細書に援用するものである。
【００５７】
本発明の新規な特徴は付属の特許請求の範囲において詳細に記載する。本開示の特徴及び利点のより深い理解が、本開示の原理を利用した例示的な実施形態を記載した以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することで得られよう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】示された基のＲＮＡまたはＤＮＡへの組み込みを示す。５’末端チオール（チオヘキシル、Ｃ６）修飾（左）、及び３’末端チオール（Ｃ３）修飾（右）を有するオリゴヌクレオチドの構造を示す。
【図１Ｂ】示された基のＲＮＡまたはＤＮＡへの組み込みを示す。ＭＭＴ−ヘキシルアミノリンカーホスホロアミダイトを示す。
【図１Ｃ】示された基のＲＮＡまたはＤＮＡへの組み込みを示す。ＴＦＡ−ペンチルアミノリンカーホスホロアミダイトを示す。
【図１Ｄ】示された基のＲＮＡまたはＤＮＡへの組み込みを示す。アミンまたはチオール残基を組み込んだＲＮＡ残基を示す。
【図１Ｅ】示された基のＲＮＡまたはＤＮＡへの組み込みを示す。５’末端（左）及び３’末端（右）にアミノヘキシル修飾を有するオリゴヌクレオチドを示す。
【図２】骨格の安定性を高めるために２’−フルオロピリミジンを使用して合成されたＲＩＧ−１リガンドの例を示す。配列番号１１９７を開示する。
【図３Ａ】例示的なクロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチドとの例示的なＩＬ−１５超アゴニスト融合体を含む例示的なＲＬＩＸペプチド−免疫抗がん剤複合体（ＲＬＩＸペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む特定のペプチド−免疫抗がん剤複合体（ペプチドＩ／Ｏ複合体）を示す。  例示的なＩＬ−１５Ｒａ、リンカー、ＩＬ−１５、及びクロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチドを有する、Ｎ末端からＣ末端方向への例示的なＲＬＩＸペプチドＩ／Ｏ複合体の描画を示す。
【図３Ｂ】図３Ａの例示的なＲＬＩＸペプチドＩ／Ｏ複合体の配列を示す。配列番号１１７３を開示する。
【図４Ａ】例示的なクロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチドとの例示的なＩＬ−１５超アゴニスト融合体を含む例示的なＩＬＲＸペプチド−免疫抗がん剤複合体（ＩＬＲＸペプチドＩ／Ｏ複合体）を含む特定のペプチド−Ｉ／Ｏ複合体を示す。  例示的なＩＬ−１５、リンカー、ＩＬ−１５Ｒａ、及びクロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチドを有する、Ｎ末端からＣ末端方向への例示的なＩＬＲＸペプチドＩ／Ｏ複合体の描画を示す。
【図４Ｂ】図４Ａの例示的なＩＬＲＸペプチドＩ／Ｏ複合体の配列を示す。配列番号１１７４を開示する。
【図５】Ｐｒｏｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１７  Ａｐｒ  ４；３５（１５）：１９６４−１９７１）により提供される、ＲＩＧ−Ｉリガンドとなり得る非核酸ベンゾビスチアゾール化合物を含むＩ／Ｏの２つの例を示す。
【図６−１】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１６  ２６（３）：１７３−１８２）により提供される、ＲＩＧ−Ｉリガンド、詳細には一本鎖ＲＮＡを含むＩ／Ｏの例を示す。記載順に、それぞれ、配列番号１１９９、１２０１、１２０２、１５１６及び１２００を開示する。
【図６−２】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１６  ２６（３）：１７３−１８２）により提供される、ＲＩＧ−Ｉリガンド、詳細には一本鎖ＲＮＡを含むＩ／Ｏの例を示す。記載順に、それぞれ、配列番号１１９９、１２０１、１２０２、１５１６及び１２００を開示する。
【図７】Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｍａｙ，３７（５）：２０７−２１３）に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるＳＴＩＮＧリガンドを示す。
【図８】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ，１１（９）：７４１）に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を示す。
【図９】Ｌｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３，５９（２２）：１０２５３−１０２６７）に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を示す。
【図１０】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｎｏｖ；１４７：３７−４６）に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるＤＳＤＰ  ＳＴＩＮＧリガンドを示す。
【図１１】米国特許第９，７２４，４０８号に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるｃＧＡＭＰの合成類似体を示す。
【図１２Ａ】Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるＳＴＩＮＧリガンドを示す。結合の際に反応性チオールとして機能し得る、環状ホスホジエステル内のビス−ホスホロチオエートを含むＳＴＩＮＧリガンドＩ／Ｏを示す。上記チオールを、マレイミド、ブロモアセチル、ヨードアセチル、またはピリジルジチオール基と反応させることができる。
【図１２Ｂ】Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるＳＴＩＮＧリガンドを示す。ＣＤＮ内のプリン塩基を含む５員環のＣ８位をＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）で臭素化して反応性臭素基を与えることができることを示す。この臭素基は、機能的ハンドル、例えばチオールまたは保護されたアミンを含むアミン含有基と結合させるための反応基として機能する。
【図１３】ペプチド（例えば、クロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチド）と環状ジヌクレオチドとの間の切断可能なジスルフィド結合の生成を示す。
【図１４】Ｓｃｈｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．により提供される、短いＦｌｕ  Ａゲノム（セグメント５；ＮＣ−００２０１９）を示す。配列番号１１９３などの、ヘアピン構造を与える５’−＞３’  ｓｓＲＮＡ  ｓｓＲＮＡを模倣した類似の構造を類似体として使用できる。配列番号１５１７を開示する。
【図１５】Ｓｃｈｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．により提供される、ゲノムＲＮＡ配列（ＮＣ−００２６１７）を示す。配列番号１１９４などの、ヘアピン構造を与える５’−＞３’  ｓｓＲＮＡ  ｓｓＲＮＡを模倣した類似の構造を類似体として使用できる。配列番号１５１８を開示する。
【図１６】図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキン、クロロキン（ＣＱ）、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩをマイクロインジェクションし、処理の４時間後に採取して染色したＣＴ２６腫瘍試料を示す。破線の矢印は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はＣＣ３染色を示す。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンを注射した部位では大きな領域がＣＣ３染色を示したのに対して、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、クロロキン、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩを注射した部位は、顕著なＣＣ３染色の領域を有さなかった。
【図１７】図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキン、クロロキン、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩをマイクロインジェクションし、処理の２４時間後に採取して染色した、異なる動物由来のＣＴ２６腫瘍試料を示す。破線の矢印は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はＣＣ３染色の一部を示す。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した部位、及び図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンを注射した部位では大きな領域がＣＣ３染色を示したのに対して、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩを注射した部位は、顕著なＣＣ３染色の領域を有さなかった。クロロキンを注射した部位はこの腫瘍試料では存在していない。
【図１８】図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキン、クロロキン、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩをマイクロインジェクションし、処理の２４時間後に採取して染色した、異なる動物由来のＣＴ２６腫瘍試料を示す。矢印または丸で囲った領域は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はＣＣ３染色の一部を示す。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した部位、及び５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩを注射した部位では大きな領域がＣＣ３染色を示した。ＣＱ及び図３７のペプチドＩＯ複合体＋クロロキンは、この試料における腫瘍壊死の大まかな領域との融合のために解釈不能である。
【図１９】細胞を、１２ｐｍｏｌまたは１２０ｐｍｏｌの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、配列番号１４２４（５’末端に三リン酸を有する）と配列番号１４２５（末端のリン酸なし）とが互いに複合体化されたものである５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ（図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体におけるのと同じ５’ｐｐｐ  ＲＮＡの配列。二本鎖だがペプチドリンカーのないもの）（図１９で「５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡポジティブコントロール」として示される）、または配列番号１４２４と配列番号１４２５（両方の鎖に末端リン酸なし）とが互いに複合体化されたものであるｄｓＲＮＡ（図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体におけるのと同じＲＮＡ二本鎖の配列だが、５’ｐｐｐがなく、かつペプチドリンカーのないもの）（図１９で「ｄｓＲＮＡネガティブコントロール」として示される）により、細胞を処理した、２４、４８、または７２時間後のＳＥＡＰレポーター細胞のＩＦＮ経路の活性化からの発光シグナルを相対発光量（ＲＬＵ）で示す。
【図２０】図１９に記載される５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡと比較して１２ｐｍｏｌまたは１２０ｐｍｏｌの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を投与することによる、処置後２４、４８、及び７２時間のシグナルの増加倍率を示す。
【図２１】１２ｐｍｏｌの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体、図１９で述べたポジティブコントロールの５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ（「５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ」として示す）、または図１９で述べたネガティブコントロールのｄｓＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐなし）」として示す）（二本鎖だが、５’ＰＰＰがなく、ペプチドリンカーもない同じＲＮＡの配列）で細胞を処理した２４時間後の相対発光量（ＲＬＵ）を示す。
【図２２】図１９に記載される５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡポジティブコントロール（「５’ＰＰＰ  ｄｓＲＮＡ」として示される）＋ｔｆｘｎ、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋ｔｆｘｎ、図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体＋ｔｆｘｎ、または図１９に記載されるｄｓＲＮＡネガティブコントロール（「ｄｓＲＮＡ（５’ＰＰＰなし）」として示される）＋ｔｆｘｎの投与によるＲＬＵシグナルを示す（リポフェクタミントランスフェクション試薬（「ｔｆｘｎ」）も各試験物の配合に添加）。
【図２３】注射されていないコントロールマウスのＣＴ２６腫瘍における白色光画像（上列）及び蛍光シグナル（下列）、及びＩＣＧ色素を結合した配列番号５６９のペプチドを注射した２匹のマウスから得た腫瘍におけるシグナルを示す（図２７に示される分子を参照）。
【図２４】注射されていないコントロールマウスのＢ１６Ｆ１０腫瘍における白色光画像（上列）及び蛍光シグナル（下列）、及びＩＣＧ色素を結合した配列番号５６９のペプチドを注射した２匹のマウスから得た腫瘍におけるシグナルを示す（図２７に示される分子を参照）。
【図２５】注射されていないコントロールマウスのＡ２０腫瘍及び筋肉における白色光画像（上列）及び蛍光シグナル、及びＩＣＧ色素を結合した配列番号５６９のペプチドを注射した２匹のマウスから得た腫瘍及び筋肉（対側の側腹部）におけるシグナルを示す（図２７に示される分子を参照）。
【図２６Ａ】本開示のさまざまな化学構造を示す。  ＫＩＮ１１４８の構造を示す。
【図２６Ｂ】本開示のさまざまな化学構造を示す。ＡＤＵ−Ｓ１００の構造を示す。
【図２６Ｃ】本開示のさまざまな化学構造を示す。ＤＭＸＡＡの構造を示す。
【図２７】ＩＣＧ色素に結合した配列番号５６９のペプチドの構造を示し、各線は、システイン残基間のジスルフィド結合を表す。
【図２８Ａ】ＣＴＬＬ２細胞の増殖曲線を示す。  増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）に曝露した後のＣＴＬＬ２細胞の増殖曲線を示す。
【図２８Ｂ】ＣＴＬＬ２細胞の増殖曲線を示す。配列番号１３２０、ＩＬ−１５（配列番号１１７７）、及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）についてのＣＴＬＬ２増殖曲線を示す。各データ点は、ｎ＝３の平均を表す。ＲＦＵ−相対蛍光単位。
【図２９−１】増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、配列番号１３２０、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）に曝露した後のＭｏ７ｅ細胞の増殖曲線を示す。各曲線は各群ｎ＝３を示し、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図２９−２】増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、配列番号１３２０、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）に曝露した後のＭｏ７ｅ細胞の増殖曲線を示す。各曲線は各群ｎ＝３を示し、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図３０Ａ】ＣＤ８＋初代ヒトＴ細胞及び同じＣＤ８Ｔ細胞ドナーからのＰＨＡ誘導Ｔ細胞芽球の増殖曲線を示す。増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、配列番号１３２０、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）に曝露した後のＣＤ８＋初代ヒトＴ細胞の増殖曲線を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。ＲＦＵ−相対蛍光単位。
【図３０Ｂ】ＣＤ８＋初代ヒトＴ細胞及び同じＣＤ８Ｔ細胞ドナーからのＰＨＡ誘導Ｔ細胞芽球の増殖曲線を示す。増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、配列番号１３２０、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）に曝露した後の図３０Ａと同じＣＤ８Ｔ細胞ドナーからのＰＨＡ誘導Ｔ細胞芽球の増殖曲線を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。ＲＦＵ−相対蛍光単位。
【図３１】Ｍｏ７ｅ細胞中のＨｉｓタグ付きＲＬＩ（配列番号１３４２）及び配列番号１３１８のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体について、示された異なる濃度（ｎＭ）のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体またはＲＬＩでｐＨ５におけるカテプシンＢ処理をした場合（＋）としない場合（−）のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。
【図３２Ａ】ＣＴＬＬ２増殖アッセイにおけるカテプシンＢ切断を示す。  ＣＴＬＬ２細胞中の配列番号１３１９の、ｐＨ７でのカテプシンＢ処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。
【図３２Ｂ】ＣＴＬＬ２増殖アッセイにおけるカテプシンＢ切断を示す。ＣＴＬＬ２細胞中の配列番号１３２１の、ｐＨ７でのカテプシンＢ処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。
【図３３】ＣＴＬＬ２細胞中の配列番号１３１７の、ｐＨ５でのカテプシンＢ処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。
【図３４】ジスルフィド切断可能リンカーによって互いに連結された、配列番号５６８のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長アミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。）このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている点に留意されたい。
【図３５】図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドのジスルフィド切断産物を示す。
【図３６】延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、配列番号５６８のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図３７】延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図３８】延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、ＩＣＧ色素に結合された配列番号５６９のペプチド（図２７のペプチド複合体を参照）とｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図３９】ヒドラゾン／ＰＥＧリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図４０】ジスルフィド／ＰＥＧリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図４１】ジスルフィド／ＰＥＧリンカーによって互いに連結された、ＩＣＧ色素に結合された配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図４２】ヒドラゾンリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図４３】長いジスルフィドリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図４４】短いジスルフィドリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図４５】Ｈｉｓタグ付けされたＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）としてのＲＬＩタンパク質（例えば、配列番号１１６９、配列番号１１７６、及び配列番号１１７７を含む）のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗Ｈｉｓウエスタン分析を示し、約２５〜２６ｋＤａ及び３０〜３４ｋＤａに２本のバンドの強いシグナルを示している。
【図４６】Ｈｉｓタグ付けされたＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）としてのＲＬＩタンパク質のＩＭＡＣ精製のクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４７】配列番号１３１７〜配列番号１３２１の発現からの馴化培地のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗Ｈｉｓウェスタン分析を示す。
【図４８】配列番号１３１７及び配列番号１３２１のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４９】プールし、ＰＢＳ中でバッファー交換した後の配列番号１３１７（＃３）及び配列番号１３２１（＃５）の各ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の精製画分Ｅ２〜Ｅ３のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５０】配列番号１３１８の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５１】プールし、ＰＢＳ中でバッファー交換した後の配列番号１３１８（＃４）のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の精製画分Ｅ２〜Ｅ３のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５２】配列番号１３１９及び配列番号１３２０の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５３】配列番号１３１７及び配列番号１３２１の大規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５４】プールし、ＰＢＳ中でバッファー交換し、還元及び非還元条件下で更に分析した、配列番号１３１７（＃３）及び配列番号１３２１（＃５）のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の画分Ｅ２〜Ｅ４のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５５】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６８のペプチドと配列番号１３７５のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７５中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７５のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図５６】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７５のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７５中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７５のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図５７】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５７０のペプチドと配列番号１３７５のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７５中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７５のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図５８】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６８のペプチドと配列番号１３７６のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７６中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７６のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図５９】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７６のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７６中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７６のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図６０】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５７０のペプチドと配列番号１３７６のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７６中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７６のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図６１】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６８のペプチドと配列番号１３７１のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図６２】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７１のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図６３】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５７０のペプチドと配列番号１３７１のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図６４】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６８のペプチドと配列番号１３７６のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７６中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７６のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐ（二リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図６５】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７６のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７６中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７６のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐ（二リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図６６】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５７０のペプチドと配列番号１３７６のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７６中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７６のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐ（二リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図６７】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６８のペプチドと、配列番号１４２６と配列番号１４２７とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐは配列番号１４２６上に位置している）を含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡに付加された改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１４２６に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。
【図６８】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと、配列番号１４２６と配列番号１４２７とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐは配列番号１４２６上に位置している）を含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡに付加された改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１４２６に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。
【図６９】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５７０のペプチドと、配列番号１４２６と配列番号１４２７とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐは配列番号１４２６上に位置している）を含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡに付加された改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１４２６に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。
【図７０】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６８のペプチドと、配列番号１４２４と配列番号１４２５とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐは配列番号１４２４上に位置している）を含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡに付加された改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１４２４に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。配列番号１４２４と配列番号１４２５とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐは配列番号１４２４上に位置している）を含むＩ／Ｏは、図８１では、「５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ」としても示されている。
【図７１】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと、配列番号１４２４と配列番号１４２５とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐは配列番号１４２４上に位置している）を含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡに付加された改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１４２４に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。
【図７２】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５７０のペプチドと、配列番号１４２４と配列番号１４２５とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐは配列番号１４２４上に位置している）を含むＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡに付加された改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１４２４に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。
【図７３】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６８のペプチドと配列番号１３７９のＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７９中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７９のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図７４】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７９のＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７９のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図７５】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５７０のペプチドと配列番号１３７９のＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７９のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図７６】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７１のＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し（ホスホロチオエート結合はアスタリスク（＊）で示されている）、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図７７】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７１のＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し（ホスホロチオエート結合及び２’フルオロＲＮＡはそれぞれアスタリスク（＊）及び文字「ｆ」で示されている）、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図７８】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７１のＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し（ホスホロチオエート結合及び２’フルオロＲＮＡはそれぞれアスタリスク（＊）及び文字「ｆ」で示されている）、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図７９】安定的なリンカーによって連結された、配列番号５６９のペプチドと配列番号１３７１のＩ／Ｏとから構成される本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を示し（ホスホロチオエート結合及びＢＮＡ／ＬＮＡはそれぞれアスタリスク（＊）及びプラス記号「＋」で示されている）、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【図８０】トランスフェクション試薬であるリポフェクタミンを、１６．２ｐｍｏｌの図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３６のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３５のＩ／Ｏ（図３４のペプチドＩ／Ｏの切断産物）、５’ｐｐｐを有する配列番号１３７１（図３４及び図３６のペプチドＩ／Ｏ複合体におけるのと同じ５’ｐｐｐヘアピンＲＮＡの配列だが改変及びペプチドへの結合のないもの）、または配列番号１４２４と配列番号１４２５とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏ（図３４及び図３６のペプチドＩ／Ｏ複合体におけるのと同じ二本鎖ＲＮＡの配列だが５’ｐｐｐがなく、改変及びペプチドへの結合のないもの）のそれぞれと共に用いて細胞を処理した２４時間後のＳＥＡＰレポーター細胞内のＩＦＮ経路の活性化による発光シグナルを相対発光量（ＲＬＵ）で示す。
【図８１】図８１は、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションしたＡ２０リンパ腫試料を示す。白い点状斑は、ＣＣ３染色を示す。投与２４時間後に画像を撮影した。「５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ」はまた、配列番号１４２４と配列番号１４２５とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏである（５’ｐｐｐは、配列番号１４２４上に位置している）。「５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡ」は、５’ｐｐｐを有する配列番号１３７１のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏである（配列番号１３７１はヘアピン構造を形成する）。図８１Ａは、１ｕｇ及び２ｕｇの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションしたＡ２０リンパ腫試料の縮小画像を示す。図８１は、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションしたＡ２０リンパ腫試料を示す。白い点状斑は、ＣＣ３染色を示す。投与２４時間後に画像を撮影した。「５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ」はまた、配列番号１４２４と配列番号１４２５とを含む２本の別々のＲＮＡ鎖が互いに複合体化されたｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏである（５’ｐｐｐは、配列番号１４２４上に位置している）。「５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡ」は、５’ｐｐｐを有する配列番号１３７１のｄｓＲＮＡを含むＩ／Ｏである（配列番号１３７１はヘアピン構造を形成する）。図８１Ｂは、ＰＢＳ領域、５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡ領域、２ｕｇ用量の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体が活性を示した領域、及び１ｕｇ用量の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体が活性を示した領域の拡大画像を示す。ＣＣ３染色は白い点状斑で示される。
【図８２】投与の４時間及び２４時間後でペプチドＩ／Ｏ複合体を遊離Ｉ／Ｏ及びネガティブコントロール（ＰＢＳ）と比較した放射状プロット分析を示す。
【図８３】Ｍｏ７ｅ細胞を、配列番号１３２８の発現ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で馴化した培地、またはトランスフェクトしていない細胞（モックネガティブコントロール）から得られたＨＥＫ２９３馴化培地で処理した３日後にＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ生細胞アッセイからの相対蛍光単位（ＲＬＵ）で表した蛍光シグナルを示す。非処理のＭｏ７ｅ細胞も追加のネガティブコントロールとして含めた。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図８４】雌Ｂａｌｂｃマウスで増殖させたＡ２０リンパ腫細胞を用いたインビボで腫瘍内のインターフェロンβ（Ｉｆｎβ）応答を誘導する図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体の活性を示す。Ａ２０リンパ腫試料に図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションした。  ラベルで示したように、４時間後のＡ２０リンパ腫腫瘍内の試験部位の低倍率画像を示す。
【図８５】雌Ｂａｌｂｃマウスで増殖させたＡ２０リンパ腫細胞を用いたインビボで腫瘍内のインターフェロンβ（Ｉｆｎβ）応答を誘導する図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体の活性を示す。Ａ２０リンパ腫試料に図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションした。ラベルで示したように、４時間後に異なる選択試験物をＡ２０リンパ腫腫瘍に注射した領域の高倍率画像を示す。
【図８６】雌Ｂａｌｂｃマウスで増殖させたＣＴ２６結腸癌細胞を用いたインビボで腫瘍内のインターフェロンβ（Ｉｆｎβ）応答を誘導する図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体の活性を示す。ＣＴ２６腫瘍試料に、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、クロロキン、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキン、または５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ（図８１に記載されるｄｓＲＮＡ）をマイクロインジェクションした。ラベルで示したように、図は、腫瘍試料の低倍率画像と、４時間後のＣＴ２６大腸癌細胞内の選択された試験部位の高倍率画像とを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本開示は、一般的には、本明細書において「Ｉ／Ｏ」または「Ｉ／Ｏ剤」と称する免疫抗がん剤の適用を用いたがん治療のための組成物及び方法に関する。本明細書で使用するところの「Ｉ／Ｏ」または「Ｉ／Ｏ剤」は非限定的であり、単一剤、複数剤、または複数剤の複合体を含むことができ、かかる剤は、単量体、二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）、または多量体（例えば、ホモ多量体またはヘテロ多量体）の構造を有し、また、かかる剤は、一重、二重、または多重に複合体化、凝集、修飾、融合、連結されるか、または上記の任意の組み合わせである。詳細には、本開示は、本明細書でがんの治療用の「ペプチドＩ／Ｏ複合体」と称するペプチド−免疫抗がん剤複合体に関する。いくつかの実施形態では、本明細書の組成物及び方法は、腫瘍細胞にホーミングし、腫瘍細胞を標的化し、腫瘍細胞に誘導され、腫瘍細胞に保持され、腫瘍細胞に蓄積し、腫瘍細胞へと移動し、腫瘍細胞によってプロセシングされ、腫瘍細胞に透過し、及び／または腫瘍細胞に結合するペプチドを、免疫抗がん剤と組み合わせて用いる。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体は、腫瘍ホーミング性であり得る。腫瘍ホーミング性とは、ペプチドが腫瘍の特定の領域、組織、構造、または細胞にホーミングし、これらを標的化し、これらに誘導され、これらへ移動し、これらに保持され、これらに蓄積し、またはこれらに結合することができることを含み得るものであり、また、腫瘍またはがん性組織もしくは細胞中の蓄積または保持、腫瘍組織または腫瘍細胞の選択的蓄積もしくは浸透を含み得るものであり、または周囲の組織または細胞と比較して腫瘍組織または細胞中のペプチド及び／または前記ペプチドと複合体を形成する任意の物質のレベルの増加、またはより高いレベルをもたらし得ることを含み得るものとして理解される。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体は、細胞透過性であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体は、細胞に取り込まれることによって細胞透過性を示して細胞内区画にアクセスでき、エンドサイトーシスされ、ピノサイトーシスされ、細胞膜を通過して移動でき、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過でき、または特定の細胞内位置に蓄積するかもしくはペプチドＩ／Ｏ複合体またはＩ／Ｏを送達することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体は腫瘍ホーミング性であってよく、特定の腫瘍組織、細胞、細胞区画、及び／またはサイトゾルに蓄積または送達され得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体は、ＢＢＢを通過することも可能であり、脳腫瘍、転移性がん病変（例えば、ＣＮＳ内の）ならびに他の脳障害及び疾患をはじめとする中枢神経系（ＣＮＳ）がんの治療に使用することができる。例えば、本明細書に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、ＢＢＢを通過して神経実質に入り、治療活性を有する分子をＣＮＳがんを含む神経疾患の標的に送達することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体は、上記の特性の任意の組み合わせで機能することができ、したがって、細胞透過性、腫瘍ホーミング性、血液脳関門通過性、またはそれらの任意の組み合わせを有することができる。かかる特性は、所望の治療または疾患に応じて、本明細書に記載されるように、改変、最適化、及びペプチド自体またはペプチドＩ／Ｏ複合体に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドＩ／Ｏ複合体及びＩ／Ｏは、本明細書に記載される治療効果のいずれかを刺激することを含む、宿主免疫応答を刺激することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍ホーミングペプチドＩ／Ｏ複合体、細胞透過性ペプチドＩ／Ｏ複合体、ＢＢＢ透過性ペプチドＩ／Ｏ複合体、腫瘍ホーミング及び細胞透過性及びＢＢＢ透過性ペプチドＩ／Ｏ複合体、腫瘍ホーミング及び細胞透過性ペプチドＩ／Ｏ複合体、細胞透過性及びＢＢＢ透過性ペプチドＩ／Ｏ複合体、または腫瘍ホーミング及びＢＢＢ透過性ペプチドＩ／Ｏ複合体を提供する。
【００６０】
特定の実施形態では、本開示のペプチドとＩ／Ｏの組み合わせは、腫瘍微小環境、腫瘍組織、細胞、細胞区画、及び／またはサイトゾルへのＩ／Ｏの局所送達を可能にする。かかる送達も、腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性を含み得る。本開示の腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性ペプチドを用いてＩ／Ｏを送達することによって、Ｉ／Ｏの濃度を標的となる腫瘍微小環境中で増加させ、そこでＩ／Ｏの治療活性を発揮することができる。Ｉ／Ｏは極めて強力で重篤な副作用を伴う場合があり、そのようなオフターゲット効果は腫瘍学におけるＩ／Ｏの使用を制限し得る。本開示のペプチドの使用は、Ｉ／Ｏの投与の治療ウィンドウを効果的に増大させ、ペプチドを伴わないＩ／Ｏの全身性の非特異的送達から生じ得る毒性を低下させ得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体は、エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスなどによって細胞に取り込まれることにより細胞透過性であり、切断されて、腫瘍微小環境中に分泌され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、細胞外で、または腫瘍微小環境中の細胞表面で切断され得る。いくつかの実施形態では、細胞透過性は、エンドソームによる取り込みのみ、エンドソームによる取り込み、プロセシング、及び分泌、または細胞質への取り込み及び送達を示す。いくつかの実施形態では、細胞透過性は、任意の細胞内区画への送達を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞透過性は、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ装置、小胞体、サイトゾル、または核などの特定の細胞内区画への送達を含み得る。Ｉ／Ｏ単独またはペプチドＩ／Ｏ複合体の効力または活性は、腫瘍微小環境または細胞内でのプロセシングまたは切断後に増大させることができ、これにより、ペプチドＩ／Ｏ複合体の効力は全身輸送中にはより低く、腫瘍または腫瘍微小環境中でのプロセシング後にはより高くなる。固形腫瘍は、抗体のような大きな分子などの治療薬では透過しにくい場合がある。抗体のような一部の大きな分子は、腫瘍の外側部分を覆うことはできるが、腫瘍の各部分の内部には治療濃度以下のより低い濃度でしか透過することができない。本開示のペプチドは、固形腫瘍に透過することができる。本開示のペプチドによる固形腫瘍へのこのような透過は、ペプチドのより小さなサイズ、より速い解離速度、特異的な結合相互作用、それらの組み合わせ、他の特性、またはそれらの組み合わせによるものであり、これにより、腫瘍内への、または腫瘍全体にわたった、または腫瘍の特定の領域へのＩ／Ｏの送達を増大させ得る。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチド、例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つは、例えば、腫瘍、組織、細胞、細胞区画、またはそれらの任意の組み合わせなどの特定の標的にホーミングする能力を高めるように改変（例えば変異）することができる。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチド、例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つは、任意のがんの治療において有効性を高めるように改変（例えば変異）することができる。特定の実施形態では、Ｉ／Ｏと組み合わせた本開示のペプチドは、ペプチドの細胞透過特性により、細胞質、またはエンドソーム、または腫瘍微小環境の細胞の他の細胞内区画へのＩ／Ｏの送達を可能とし得る。ペプチドは、Ｉ／Ｏを細胞膜を通過して細胞質に運ぶことができる。例えば、ペプチドは、小胞体またはゴルジ装置の近くなどの細胞質内の特定の場所に細胞膜を横切ってＩ／Ｏを運ぶことができる。これに対して、本開示のペプチドなしでは、Ｉ／Ｏは、細胞内に効率的に、またはまったく入ることができない可能性がある。したがって、本開示のペプチドは、Ｉ／Ｏがその細胞内標的にアクセスしてその治療効果を発揮することを可能とし得る。いくつかの実施形態では、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、細胞への進入、細胞内でのペプチドＩ／Ｏ複合体のプロセシング、またはそれらの組み合わせを可能にすることができ、Ｉ／Ｏはその後、細胞表面に提示されるか、または腫瘍微小環境内に分泌される。いくつかの実施形態では、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏは、ペプチドＩ／Ｏ複合体の形態にあるときは不活性であるか、または低い活性を有するが、その後、ペプチドＩ／Ｏが細胞外空間または細胞内でプロセシングされた後、Ｉ／Ｏは放出または活性化されてペプチドＩ／Ｏ複合体の形態にある場合よりも高い活性を示すことができる。これにより、Ｉ／Ｏ単独の投与と比較して、ペプチドＩ／Ｏ複合体の投与後には、腫瘍細胞、腫瘍微小環境、またはそれらの組み合わせにおける活性化Ｉ／Ｏの濃度の増加をもたらし得る。さらに、これにより、Ｉ／Ｏ単独の投与と比較して、ペプチドＩ／Ｏ複合体としてのＩ／Ｏの投与の結果として、Ｉ／Ｏの治療ウィンドウ及び有効性が向上し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、Ｉ／Ｏ剤を血液脳関門を通過してＣＮＳ内に運ぶことができ、Ｉ／Ｏ剤のＣＮＳへの送達を可能とする。本開示のペプチドの腫瘍ホーミング特性は、腫瘍微小環境中への蓄積、腫瘍微小環境内での保持、他の組織よりも高いレベルでの腫瘍内での存在、腫瘍の細胞内での保持を含み得る。本明細書で使用するところの「腫瘍」なる用語は、がん細胞、間質細胞、血管、及びさまざまな浸潤細胞からなる総質量を指すことができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド及びＩ／Ｏは、複合体として一緒に送達される。これを、本明細書では「ペプチドＩ／Ｏ複合体」と称する。このペプチドＩ／Ｏ複合体は、直接的結合、共配合、送達ビヒクル（例えば、リポソームまたはナノ粒子）中への配合、または融合体としてペプチドとＩ／Ｏを一緒に組換え発現することによって形成することが可能である。ペプチドＩ／Ｏ複合体は、高親和性受容体−リガンド型相互作用などの非共有結合相互作用によっても互いに保持され得る。ペプチドＩ／Ｏ複合体は、特定の臓器及び／または腫瘍に特異的な区画にホーミングすることができる。例えば、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏは、腫瘍微小環境中の標的、脳内の標的、及び／または細胞表面もしくは細胞質、小胞体内、もしくはゴルジ装置内の標的にアクセスすることができる。
【００６２】
本開示の例示的なＩ／Ｏとしては、ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドを含む免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）が挙げられる。ＩＬ−１５剤、ＲＩＧ−Ｉリガンド、４−１ＢＢリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＭＤＡ５リガンド、ＣＧＡＳリガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドには、それぞれの受容体または標的の機能または活性を活性化、刺激または増強するアゴニストとして作用するものなどのアゴニスト活性を有する薬剤またはリガンドが含まれる。例えば、本明細書で使用するところの「リガンド」または「薬剤」とは、標的（ＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）、ＲＩＧ−Ｉ、４−１ＢＢ、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＣＧＡＳ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、またはＴＬＲ９）と結合または相互作用することによって、例えば、腫瘍の微小環境、腫瘍組織、細胞、細胞内区画、及び／またはサイトゾル中での標的の活性または機能を調節することが可能な任意の部分を包含するものを意味する。「リガンド」または「薬剤」である本開示のＩ／Ｏは、ペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏの相互作用及び所望の効果に応じて、それらの標的に対するさまざまな活性を調節する。例えば、リガンドまたは薬剤は、その標的と結合または相互作用する際、標的の機能を活性化、刺激または増強するアゴニストとして作用することにより、または標的の機能を遮断、阻止または低減するアンタゴニストとして作用することにより、標的の活性を調節することができる。
【００６３】
「リガンド」なる用語は、本明細書では、結合活性を示す、例えば、ＩＬ−１５受容体、ＲＩＧ−Ｉ  Ｉ、４−１ＢＢ、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＣＧＡＳ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、またはＴＬＲ９などの受容体への結合を示す広範囲のＩ／Ｏを指して用いることができる。リガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。例えば、ＳＴＩＮＧに結合することができる「ＳＴＩＮＧリガンド」は、ＳＴＩＮＧアゴニストであり得る。アゴニストは、それが結合する受容体または標的を活性化する特定のＩ／Ｏを指すことができる。アンタゴニストは、受容体または標的の天然のアゴニストを遮断するか、または受容体または標的のシグナル伝達経路を遮断し、それにより活性を阻害する特定のＩ／Ｏを指すことができる。
【００６４】
本開示の例示的なＩ／Ｏとしては、これらに限定されるものではないが、Ｉ型インターフェロン；インターフェロンγ；インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３を含むサイトカイン；これらに限定されるものではないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７Ｓ１、ガレクチン９、ＣＤ２４４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＩＳ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴの阻害剤を含むチェックポイント阻害剤；これらに限定されるものではないが、ＴＬＲ、ＮＬＲ、ＡＬＲ、ＣＬＲ、ＲＬＲ、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、及びＳＴＩＮＧを含むパターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンド；これらに限定されるものではないが、がん細胞の細胞表面のＣＤ４７発現を下方制御させることができる、またはＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用を直接遮断することができるＳＩＲＰαを含むマクロファージチェックポイントＣＤ４７を阻害する分子；酵素インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の活性を阻害する分子；これらに限定されるものではないが、ＣＩＳ、ＫＩＲ２ＤＬ１−３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のチェックポイントを遮断する分子；ならびに、これらに限定されるものではないが、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＴＬ−１Ａ、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ、及びＧＩＴＲを含むＴＮＦファミリーメンバーのリガンドまたは他のアゴニストもしくはアンタゴニストをさらに挙げることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、トランス提示され得るＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαスシドメインと複合体化された本開示のペプチドである。この場合、ペプチドはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαスシドメインを腫瘍微小環境に送達することができ、そこでＩ／Ｏは細胞外または細胞表面で活性化することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、ＲＩＧ−Ｉリガンド（例えば、５’ｐｐｐ−ＲＮＡ、少なくとも２０塩基または２個のフルオロピラミジン）、ＳＴＩＮＧリガンド（２’−３’ｃＧＡＭＰまたは変異体）、またはＭＤＡ５リガンドと複合体化された、腫瘍ホーミング性でもあり得る細胞透過性ペプチドであり、これにより、これらのリガンドはいずれも、細胞質の標的にアクセスしてアゴニストとして作用することができる。
【００６５】
本開示のさらなる態様及び利点が、本開示の例示的実施形態を示し、記載した、以下の詳細な説明より当業者には明らかとなるであろう。認識されるように、本開示は、他の実施形態及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの細部は、いずれも本開示から逸脱することなくさまざまな点で改変が可能である。したがって、図面及び説明文は、本質的に例示的なものとしてみなされるべきであり、制限的なものとしてみなされるべきではない。
【００６６】
本明細書で使用する場合、天然のｌ−エナンチオマーアミノ酸の略語は従来のものであり、以下のとおりである。すなわち、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。通常、Ｘａａは任意のアミノ酸を示すことができる。いくつかの実施形態では、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）であり得る。一般的でないタンパク質構成α−アミノ酸または天然のＬ−エナンチオマーアミノ酸前駆体または中間体を含む他のＬ−エナンチオマーアミノ酸の略語は、従来のものである場合もあり、例えば以下のように１文字コードがある場合とない場合とがある。すなわち、シトルリン（Ｃｉｔ、しばしば、Ｘとして示される）、セレノシステイン（Ｕ、Ｓｅｃ）、及びピロリシン（Ｏ、Ｐｙｌ）。
【００６７】
本開示のいくつかの実施形態では、任意の標準的もしくは非標準的アミノ酸またはその類似体のＤ−アミノ酸残基を想到している。アミノ酸配列が一連の３文字または１文字のアミノ酸略語で表記されている場合、標準的な使用法及び慣習に従って、左方向がアミノ末端方向、右方向がカルボキシ末端方向である。
【００６８】
ペプチド
本開示では、システイン高密度ペプチドを含むか、またはそれから誘導することが可能なペプチドを提供する。本明細書で使用するところの「システイン高密度ペプチド」なる用語は、「結節ペプチド」、「ノッティン」、及び「オプチド」なる用語と互換可能であり、また、システイン高密度ペプチドは「ＣＤＰ」と略記することもできる。ヒチン類は、他のジスルフィド含有ペプチドの中でも、本開示の目的では「結節ペプチド」とみなすこともできる。例えば、ノッティン類は、しばしばコンパクトな構造にフォールディングされた、アミノ酸約１１個から約８０個の長さを有するシステイン高密度ペプチドのクラスである。ノッティン類と他のシステイン高密度ペプチドは通常、分子内ジスルフィド架橋の数によって特徴付けられる複雑な三次構造にアセンブルされ、β鎖、α螺旋、及び他の二次構造を含み得る。ジスルフィド結合の存在は、システイン高密度ペプチドに優れた環境安定性を与えることにより、システイン高密度ペプチドが極端な温度及びｐＨに耐え、血流中または消化管内のタンパク質分解酵素に耐性を示すことを可能とし、さらに、特定の生体内分布、薬物動態、結合相互作用、細胞プロセシング、または生理学的及び治療的価値を有する他の特性を与えることができる。本明細書に開示されるペプチドは、特定のシステイン高密度ペプチドから誘導することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、そのコンパクトなサイズのために組織に透過することができる。システイン高密度ペプチドはさらに固形腫瘍に透過し、抗体などの他の分子よりも高い濃度で、より深く、またはより完全にこうした固形腫瘍に透過することができる。システイン高密度ペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）、細胞膜、または特異的または非特異的な結合相互作用によって生じ得る他の生理学的バリアなどのバリアを通過することもできる。システイン高密度ペプチドは、例えば抗体よりも速やかに循環中から除去される一方で、腫瘍組織または細胞などの他の組織中に蓄積または保持され得る。システイン高密度ペプチドは、他のペプチド、タンパク質、または抗体よりも免疫原性が低くなり得るが、これは、免疫細胞によるプロセシング及び提示を低下させるシステイン高密度ペプチドのコンパクトな構造及び／またはプロテアーゼに対する耐性に起因するものである。システイン高密度ペプチドは、コンパクトな構造、プロテアーゼ耐性、腫瘍透過性、またはその他の特性を維持したままで、アミノ酸及びループ領域の変異を可能とする。
【００７０】
システイン高密度ペプチドの剛性は、軟らかいペプチドが標的に結合する際に発生する「エントロピーペナルティ」を支払うことなく、システイン高密度ペプチドが標的に結合することを可能とし得る。例えば、結合は、ペプチドが標的に結合して複合体を形成する際に生じるエントロピーの損失によって悪影響を受ける。したがって、「エントロピーペナルティ」は結合に対する悪影響であり、この結合に際して発生するエントロピー損失が大きいほど、「エントロピーペナルティ」も大きくなる。さらに、柔軟な未結合分子は、複合体として結合すると柔軟性が失われるため、強固に構造化された分子よりも複合体を形成する際により多くのエントロピーを失う。しかし、未結合分子の剛性は、分子が形成できる複合体の数を制限することにより特異性も一般的に高める。
【００７１】
本明細書のシステイン高密度ペプチドは、抗体と同様の親和性で標的に結合することができる。システイン高密度ペプチドは、アネキシンＡ２、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、ニューロピリン１、リン脂質、脂質ラフトの成分、またはその他の標的に結合することができる。さらに、いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは細胞内に透過することができる。他の実施形態では、システイン高密度ペプチドは、他のタイプの分子と比較して、より迅速なクリアランス及び細胞取り込みを示す。
【００７２】
システイン高密度ペプチドは、ジスルフィド架橋を含むことができる。システイン高密度ペプチドは、残基の５％以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるようなペプチドであり得る。システイン高密度ペプチドは、残基の１０％以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるようなペプチドであり得る。ジスルフィド結合ペプチドは薬物の足場となり得る。いくつかの実施形態では、ジスルフィド架橋はノットを形成する。ジスルフィド架橋は、システイン残基間、例えばシステイン１と４、２と５、または３と６の間で形成され得る。場合により、１個のジスルフィド架橋が、他の２個のジスルフィド架橋によって形成されるループを通過することによって阻害剤ノットを形成する。他の場合では、ジスルフィド架橋は、任意の２個のシステイン残基の間に形成され得る。
【００７３】
本開示は、例えば、腫瘍微小環境、腫瘍組織、細胞、細胞区画、及び／またはサイトゾルを標的として、それらにホーミングすることができるさらなるペプチドを生成するための開始点として使用できるペプチドの足場として使用することが可能な、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、これらの足場は、各種のシステイン高密度ペプチドから誘導することができる。特定の実施形態では、システイン高密度ペプチドは、分子内ジスルフィド架橋の数によって特徴付けられる複雑な三次構造にアセンブルされ、β鎖及びα螺旋などの他の二次構造を含むことができる。例えば、システイン高密度ペプチドは、ジスルフィドノットを通じたジスルフィドによって特徴付けられる、ジスルフィドに富む小さなタンパク質を含み得る。このノットは、例えば、１個のジスルフィド架橋が２個の他のジスルフィドとそれらを相互接続する主鎖とによって形成された大環状分子と交差する際に得られる。いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、成長因子のシステインノットまたは阻害剤のシステインノットを含むことができる。他の可能なペプチド構造は、βシートなしで２個のジスルフィド架橋によって連結された２個の平行な螺旋を有するペプチド（例えば、ヘフトキシン）を含み得る。
【００７４】
システイン高密度ペプチドは、Ｌ配置の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むことができる。システイン高密度ペプチドは、Ｄ配置の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも１１〜８１個のアミノ酸残基からなる長さである。いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも２２〜６３個のアミノ酸残基からなる長さである。いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも１５〜４０個のアミノ酸残基からなる長さである。他の実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも１１〜５７個のアミノ酸残基からなる長さである。さらなる実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも２０個のアミノ酸残基からなる長さである。さらに、上記の各実施形態、またはその活性フラグメントは、所望の特性（例えば、腫瘍ホーミング、結合、細胞透過性など）を与えるために他のペプチドに挿入または他のペプチドと融合することができる。
【００７５】
本開示のペプチドは、システインアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは少なくとも４個のシステインアミノ酸残基を有することができる。場合によっては、、ペプチドは少なくとも６個のシステインアミノ酸残基を有することができる。他の場合では、ペプチドは、少なくとも８個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１２個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１４個のシステインアミノ酸残基、または少なくとも１６個のシステインアミノ酸残基を有することができる。特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のシステイン残基を含むことができる。
【００７６】
システイン高密度ペプチドは、ジスルフィド架橋を含むことができる。システイン高密度ペプチドは、残基の５％以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるようなペプチドであり得る。ジスルフィド結合で連結されたペプチドは薬物の足場となり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、阻害剤ノットを形成する複数のジスルフィド架橋を含む。特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、ペプチドのシステイン残基間に形成され得る。例えば、配列中の１番目のシステイン残基は、配列中の４番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができ、配列中の２番目のシステイン残基は、配列中の５番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができ、及び／または配列中の３番目のシステイン残基は、配列中の６番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができる。代替的な実施形態では、ジスルフィド架橋は、任意の２個のシステイン残基間に形成され得る。場合によっては、１個のジスルフィド架橋が、他の２個のジスルフィド架橋によって形成されたループまたはリングを通過することで「ツーアンドスルー」系としても知られるジスルフィドノット（例えば、阻害剤ノット）を介してジスルフィドを形成することができる。
【００７７】
表１に、本開示によるいくつかの例示的なペプチドを示す。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【表１−４１】
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【表１−４２】
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【表１−４３】
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【表１−４４】
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【表１−４５】
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【表１−４６】
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【表１−４７】
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【表１−４８】
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【表１−４９】
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【表１−５０】
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【表１−５１】
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【表１−５２】
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【表１−５３】
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【表１−５４】
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【表１−５５】
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【表１−５６】
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【表１−５７】
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【表１−５８】
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【表１−５９】
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【表１−６０】
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【表１−６１】
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【表１−６２】
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【表１−６３】
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【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体における本開示のペプチドは、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体における本開示のペプチドは、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体における本開示のペプチドは、配列番号５６８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体における本開示のペプチドは、配列番号５６９と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体における本開示のペプチドは、配列番号５７０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。
【００７９】
いくつかの実施形態において、クロロトキシン（ＣＴＸ）ペプチド及びその変異体のいくつかは、多くの異なるタイプのヒト腫瘍に結合することができる（Ｄａｒｄｅｖｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ）７：１０７９−１１０１（２０１５）；Ｏｊｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １０６：２５−３６（２０１６）；Ｓｔｒｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  １７：４３６２−４３７１（２０１１））。必要に応じて蛍光標識または放射標識されたクロロトキシンは、脳腫瘍、前立腺癌、肉腫、及び結腸癌のマウスモデルで腫瘍選択的な取り込みを示すことができる（Ｖｅｉｓｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：６８８２−６８８８  （２００７）；Ｋｏｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４４０：２１２−２１９（２０１３））。ＣＴＸの蛍光標識変異体であるトズレリスチドは、げっ歯類モデルにおいて（Ｂｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｆｏｃｕｓ  ３６：Ｅ１（２０１４）；Ｂａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  １４２：３３０−３３８  （２０１６））、及び自然腫瘍を有するイヌにおいて（Ｆｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５：４２８３−４２９１（２０１５））、複数の腫瘍タイプで腫瘍選択的取り込みを示す。放射性標識クロロトキシンは、第１相及び第２相の臨床試験で試験されている。放射性標識クロロトキシンは、結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性黒色腫、膵臓癌、及び神経膠腫をはじめとする固形腫瘍に選択的に結合することができる（Ｈｏｃｋａｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４６：５８０−５８６（２００５）；Ｍａｍｅｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：３６４４−３６５０（２００６）；Ｇｒｉｂｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：ａｂｓｔｒ  ｅ１４５０７（２００９）；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ及びＪａｃｏｂｙ，米国特許出願第２０１００２１５５７５号（２０１０））。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、対象への投与後に高い腫瘍対バックグラウンドシグナルを示し、対象はヒトまたは非ヒト動物である。腫瘍組織と比較して正常組織への結合が最小限であることは、クロロトキシンペプチド及びその変異体のいくつかが腫瘍ホーミングできる能力を示している。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチドは、これらに限定されるものではないが、結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、乳癌、及び神経膠腫を含む固形腫瘍に結合でき、正常組織へのオフターゲット結合が最小である。
【００８０】
１５位及び２３位にアラニンまたはアルギニン置換（Ｋ１５Ａ  Ｋ２３Ａ、またはＫ１５Ｒ  Ｋ２３Ｒ）を有するクロロトキシン変異体は、腫瘍結合特性を保持し、環状化形態は腫瘍結合特性を保持し、また直鎖状ペプチドと比較してより長い血清中半減期を有する（Ａｋｃａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５４：７８２−７８７（２０１１））。Ａｌａスキャン（ペプチド配列全体を通じて１個以上の残基をＡｌａで置換する）によって、例えば、変異体ペプチドを作製し、腫瘍の蓄積、血液脳関門の透過、正しいフォールディング、及びＩ／Ｏ経路の関与などの機能について試験することなどにより、ペプチドが機能するうえで重要なペプチドの領域を特定することができる。例えば配列番号５６８などの本開示のペプチド内の１個以上のアミノ酸残基をＡｌａで置換することができる。放射性標識（Ｈｏｃｋａｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４６：５８０−５８６  （２００５））及び蛍光タグ付け（Ｖｅｉｓｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：６８８２−６８８８（２００７））されたクロロトキシンで観察される長い保持時間は、単純な細胞表面に対する結合速度論以外の機構を示唆するものである。クロロトキシンペプチド及びその変異体の一部は、１５位及び２３位のリシンからアルギニンへの置換によって促進される能動的プロセスによって、がん細胞に内在化されることが示されている（Ｏｊｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １０８（２０１７））（Ｏｊｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １０８（２０１７）；Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｌ  １１：１−１３（２０１１））。クロロトキシンは、細胞表面のアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）と会合することができ（Ｋｅｓａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５：４３６６−４３７４  （２０１０））、アネキシンＡ２は、Ｓ１００Ａ１０とともにカルパクチンＩまたはＡＩＩｔと呼ばれる９４ｋＤａのヘテロ四量体を形成する（ＭａｃＬｅｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：２５５７７−２５５８４（２００３））。アネキシンＡ２は脂質ラフトと会合する能力があることが知られており、内在化されて、分解ではなくリサイクルされるようにターゲティングされる（Ｖａｌａｐａｌａ  ａｎｄ  Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈａ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：３０９１１−３０９２５（２０１１））。クロロトキシンは、ＭＭＰ−２の細胞表面発現と相互作用して発現を低下させることもできる（Ｄｅｓｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：４１３５−４１４４（２００３））。標識されたクロロトキシンの内在化は、クロロトキシン：Ｃｙ５．５への曝露後の培養細胞内の点状シグナルによって確認することができる（Ｖｅｉｓｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：６８８２−６８８８（２００７））。さらなる研究により、クロロトキシンはクラスリン介在性エンドサイトーシスによりがん細胞に内在化され得ること、及び核周囲のゴルジ領域にさらに局在化できることが示されている（Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １１：２７（２０１１））。クロロトキシンは、オンコナーゼなどの細胞毒性薬に結合させることができ、細胞への取り込みを増加させることにより、細胞毒性薬の抗腫瘍作用を高めることができる（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｇｕｏ，Ｏｎｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  ９：１３３７−１３４２（２０１５））。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチドは、細胞表面の標的への結合により、またはペプチドの任意の残基におけるリシンからアルギニンへの変異によって促進される能動的プロセスにより、またはピノサイトーシスにより、アネキシンＡ２と会合することができ、またはカルパクチンと会合することができ、または脂質ラフトと会合することができ、またはカベオリン介在性内在化によってＭＭＰ−２と相互作用でき、またはクラスリン介在性エンドサイトーシスによって内在化され得る。
【００８１】
また、インビボ研究によって、例えば、配列番号１２４３〜配列番号１２６２のペプチドのような、ＬＣＭＩ−ＩＩペプチド、ＴＨＰ１ペプチド、及びキモトリプシン阻害剤としても知られるパシファスチンペプチドが腫瘍の細胞に蓄積し、細胞を透過する能力も示されている（Ｓｏｔｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：５１−６０（２０１８））。配列番号１２４３〜配列番号１２６２に記載されるものなどのこれらのペプチドは、セリンプロテアーゼであるキモトリプシン及びエラスターゼなどのプロテアーゼと相互作用することができる。腫瘍微小環境中で、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼであるマトリプターゼ、ヘプシン、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ４などのがん関連セリンプロテアーゼなどのプロテアーゼが上方制御してより高い濃度で存在し、これらとの結合または相互作用によって、腫瘍及び腫瘍細胞中のパシファスチンペプチドの選択的蓄積が引き起こされている可能性がある。これらのペプチド、例えば、配列番号１２４３〜配列番号１２６２に記載されるものは、変異に対して高い耐性を有し得る。Ｉ／Ｏ剤を配列番号１２４３〜配列番号１２６２に記載されるものなどのパシファスチンペプチドまたはそれらの変異体と複合体化することにより、Ｉ／Ｏ剤を腫瘍に選択的に送達し、腫瘍に蓄積させ、または、腫瘍細胞の細胞内区画もしくは細胞質または腫瘍微小環境に送達することができる。さらに、本発明のペプチドＩ／Ｏ複合体を使用して、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン及びエラスターゼセリンプロテアーゼ、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ、マトリプターゼ、ヘプシン、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ４などのがん関連プロテアーゼが上方制御または存在しているがん及び腫瘍へのＩ／Ｏの送達を行うことができる。
【００８２】
本明細書に開示されるペプチドのいずれのもの、例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれも、細胞透過特性、ＢＢＢ通過特性、腫瘍ホーミング特性、またはそれらの組み合わせを有することができる。配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６、またはそれらのフラグメントのいずれにおいても、任意の１個以上のＫ残基をＲ残基で置き換えることができ、または任意の１個以上のＲ残基をＫ残基で置き換えることができる。配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６、またはそれらの任意のフラグメントのいずれにおいても、任意の１個以上のＭ残基を、Ｉ、Ｌ、またはＶ残基のうちのいずれか１つで置き換えることができ、１個以上のＬ残基を、Ｖ、Ｉ、またはＭ残基のうちのいずれか１つで置き換えることができ、任意の１個以上のＩ残基を、Ｍ、Ｌ、またはＶ残基のうちのいずれか１つで置き換えることができ、または、任意の１個以上のＶ残基を、Ｉ、Ｌ、またはＭ残基のうちのいずれか１つで置き換えることができる。いずれの実施形態においても、ペプチドまたはペプチドフラグメント中の少なくとも１つのアミノ酸を単独でまたは組み合わせて以下、すなわち、Ｋ／Ｒ、Ｍ／Ｉ、Ｌ／Ｖ、Ｇ／Ａ、Ｓ／Ｔ、Ｑ／Ｎ、及びＤ／Ｅのように交換することができる（ただし、各文字はそれぞれ個々に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体である）。いくつかの例では、ペプチドはリシン残基を１個だけ含む場合も、リシン残基を含まない場合もある。配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６、またはそれらのフラグメントのいずれにおいても、任意のアミノ酸をシトルリン（Ｃｉｔ）で置き換えることができる。いくつかの場合では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、または配列番号１２６３〜配列番号１２８９のペプチドと同様に、最初の２個のＮ末端アミノ酸としてＧＳを含むことができるか、またはそのようなＮ末端アミノ酸（ＧＳ）を他の任意の１個または２個のアミノ酸で置換することができる。他の場合では、ペプチドは、配列番号５６８〜配列番号１１３４、配列番号１２５３〜配列番号１２６２、または配列番号１２９０〜配列番号１３１６のペプチドと同様に、最初の２個のＮ末端アミノ酸としてＧＳを含まない。いくつかの場合では、ペプチドのＮ末端がアセチル基などによってブロックされてもよく、他の例では、ペプチドのＣ末端がアミド基などによってブロックされてもよい。
【００８３】
いくつかの例では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つまたはそれらの機能性フラグメントであり、それらの機能性フラグメントは、それが機能性フラグメントであるペプチドと同様に、腫瘍の特定の領域、組織、構造、または細胞にホーミング、標的化、誘導、移動、保持、蓄積、または結合することができる。他の実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つに対して９９％、９８％、９７％、９６、％、９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するペプチドをさらに含む。さらなる実施形態では、それらの機能性フラグメントは、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個の残基長である配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つの連続したフラグメントを含んでよく、それらの機能性フラグメントはペプチドの任意の部分から選択することができる。いくつかの実施形態では、それらの機能性フラグメントは、フラグメントがホーミングする細胞と接触することができ、ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体について本明細書に記載されているものの特性を示すことができる。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチドを、表２の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、本明細書に開示される任意のＣＰＰ、またはＣＰＰ特性を有する任意の他の部分にさらに結合または融合させることができる。
【００８４】
場合によって、ペプチド内に１つ以上の変異を操作することにより、生理学的ｐＨで等電点、電荷、表面電荷、またはレオロジーが変化したペプチドを得ることができる。サソリまたはクモ由来のペプチドへのそのような変異の操作は、例えば、正味電荷を１、２、３、４、または５だけ減少させることにより、または正味電荷を１、２、３、４、または５だけ増加させることにより、複合体の正味電荷を変化させることができる。そのような場合、操作された変異は、ペプチドが腫瘍に接触する能力を促進することができる。ペプチドのレオロジー及び効力を向上させるのに適したアミノ酸の改変は、保存的または非保存的変異を含むことができる。ペプチドは、最大１個のアミノ酸変異、最大２個のアミノ酸変異、最大３個のアミノ酸変異、最大４個のアミノ酸変異、最大５個のアミノ酸変異、最大６個のアミノ酸変異、最大７個のアミノ酸変異、最大８個のアミノ酸変異、最大９個のアミノ酸変異、最大１０個のアミノ酸変異、またはペプチドが由来する毒成分ペプチドまたは毒素の配列と比較して別の適当な数の変異を有することができる。他の場合では、ペプチド、またはその機能性フラグメントは、少なくとも１個のアミノ酸変異、少なくとも２個のアミノ酸変異、少なくとも３個のアミノ酸変異、少なくとも４個のアミノ酸変異、少なくとも５個のアミノ酸変異、少なくとも６個のアミノ酸変異、少なくとも７個のアミノ酸変異、少なくとも８個のアミノ酸変異、少なくとも９個のアミノ酸変異、少なくとも１０個のアミノ酸変異、またはペプチドが由来する毒成分ペプチドまたは毒素の配列と比較して別の適当な数の変異を有することができる。いくつかの実施形態では、変異をペプチド内で操作して、生理学的ｐＨで所望の電荷または安定性を有するペプチドを提供することができる。
【００８５】
ＮＭＲソリューション構造、Ｘ線結晶分析、または関連する構造ホモログの結晶構造を用いて、ペプチドが腫瘍にホーミングする能力を維持ながら、ペプチドのフォールディング、安定性、及び製造性を改善することができる変異手法を提供することができる。これらを用いて、構造的に相同な一群の足場の３Ｄファーマコフォアを予測し、関連するタンパク質の可能なグラフト領域を予測することで特性が改善された特性を有するキメラを作製することができる。例えば、この手法を用いることで、改善された特性を有する薬剤を設計するために、また、ペプチドのフォールディング及び製造性を困難とする有害な変異を修正するために使用することができる重要なアミノ酸位置及びループを特定することができる。これらの重要なアミノ酸の位置及びループを維持しつつ、ペプチド配列中の他の残基を変異させて、ペプチドの機能、ホーミング、及び活性を改善、変更、除去、または他の形で改変することができる。
【００８６】
さらに、２個以上のペプチドの一次配列及び三次配列の比較を用いて、ペプチドを改善し、またこれらのペプチドの生物活性を解析するために活用できる配列及び３Ｄフォールディングパターンを明らかにすることができる。例えば、腫瘍にホーミングする２個の異なるペプチド足場（例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれか１つのペプチド）同士の比較によって、フォールディング特性が改善された変異体を設計するといった、操作手法を導くことができる保存されたファーマコフォアを同定することができる。例えば、重要なファーマコフォアは、結合において重要となり得る芳香族残基または塩基性残基を含み得る。本発明のペプチドのいずれ（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチド）も、ペプチド足場として用いることができる。
【００８７】
改善されたペプチドは、ＴＥＰＩＴＯＰＥ及びＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎまたは他のインシリコの免疫原性予測方法によって予測される免疫原性情報などの免疫原性情報に基づいて操作することもできる。ＴＥＰＩＴＯＰＥは、位置固有のスコアリング行列を用いて、あるペプチドが５１種類の異なるＨＬＡ−ＤＲアレルに結合するかどうかについての予測ルールを提供する計算手法であり、ＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎは、ＴＥＰＩＴＯＰＥを使用して、ポケットの類似性に基づいて既知の結合特異性を有するＨＬＡ−ＤＲ分子から未知の結合特異性を有するＨＬＡ−ＤＲ分子を外挿する方法である。例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥ及びＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎを使用して、細胞透過特性、ＢＢＢ通過特性、腫瘍へのホーミング特性、またはそれらの組み合わせを有するペプチドの免疫原性を決定することが可能である。免疫原性の高いペプチドと免疫原性の低いペプチドの比較は、免疫原性が低下した変異体を設計するための、または類似の細胞透過性、腫瘍ホーミング活性、ＢＢＢ通過活性、またはそれらの組み合わせを有する一群のペプチドの中で、どのペプチドが最も低い免疫原性を誘発するかを特定するための操作手法を導くことができる。
【００８８】
本開示はまた、本明細書に記載されるさまざまなペプチドの多量体も包含することができる。多量体の例としては、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体などが挙げられる。多量体は、複数の同じサブユニットで形成されるホモマー、または複数の異なるサブユニットで形成されるヘテロマーであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも１個の他のペプチド、または２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の他のペプチドとの多量体構造として構成される。特定の実施形態では、多量体構造の各ペプチドはそれぞれ同じ配列を有することができる。別の実施形態では、多量体構造の各ペプチドのうちの一部のものまたはすべてが異なる配列を有することができる。さらなる実施形態では、多量体構造は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または七量体を含むことができる。多量体は必要に応じて、多量体内の各ペプチド間にリンカー、例えば配列番号１１６３〜配列番号１１７２を含むリンカーを有するペプチド配列の融合体を形成することにより、または多量体内の各ペプチドをポリマーまたはデンドリマーなどの基質と結合することにより、またはそれらの任意の組み合わせによって形成することができる。
【００８９】
本開示は、例えば、さらなるペプチドを生成するための開始点として使用できるペプチド足場として使用することが可能な、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、足場は、ノッティンまたはヒッチンなどの各種のシステイン高密度ペプチドから誘導することができる。足場として適当ないくつかのペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、起泡性タンパク質、アトラクチン、α−ＧＩ、α−ＧＩＤ、μ−ＰＩＩＩＡ、ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＣＶＩＤ、χ−ＭｒＩＡ、ρ−ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マーガトキシン、ｓｈＫ、毒素Ｋ、キモトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、及びＥＧＦエピレグリンコアが挙げられる。
【００９０】
さらに、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つを同様にさらなるペプチドを生成するための開始点または足場として使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド配列には、さらなるアミノ酸が隣接する。１つ以上のさらなるアミノ酸は、例えば、所望のインビボ電荷、等電点、化学結合部位、安定性、標識、または生理学的特性をペプチドに付与することができる。
【００９１】
配列相同性の特定は、腫瘍のホーミング機能を維持する重要な残基を決定するうえで重要となる場合がある。
【００９２】
２個以上のペプチドは、一定の相同性を共有し、インビボで似た特性を共有することができる。例えば、あるペプチドは、本開示のペプチドと一定の相同性を共有することができる。場合によっては、本開示のペプチドは、第２のペプチドと最大約２０％のペアワイズ相同性、最大約２５％のペアワイズ相同性、最大約３０％のペアワイズ相同性、最大約３５％のペアワイズ相同性、最大約４０％のペアワイズ相同性、最大約４５％のペアワイズ相同性、最大約５０％のペアワイズ相同性、最大約５５％のペアワイズ相同性、最大約６０％のペアワイズ相同性、最大約６５％のペアワイズ相同性、最大約７０％のペアワイズ相同性、最大約７５％のペアワイズ相同性、最大約８０％のペアワイズ相同性、最大約８５％のペアワイズ相同性、最大約９０％のペアワイズ相同性、最大約９５％のペアワイズ相同性、最大約９６％のペアワイズ相同性、最大約９７％のペアワイズ相同性、最大約９８％のペアワイズ相同性、最大約９９％のペアワイズ相同性、最大約９９．５％のペアワイズ相同性、または最大約９９．９％のペアワイズ相同性を有することができる。場合によっては、本開示のペプチドは、第２のペプチドと少なくとも約２０％のペアワイズ相同性、少なくとも約２５％のペアワイズ相同性、少なくとも約３０％のペアワイズ相同性、少なくとも約３５％のペアワイズ相同性、少なくとも約４０％のペアワイズ相同性、少なくとも約４５％のペアワイズ相同性、少なくとも約５０％のペアワイズ相同性、少なくとも約５５％のペアワイズ相同性、少なくとも約６０％のペアワイズ相同性、少なくとも約６５％のペアワイズ相同性、少なくとも約７０％のペアワイズ相同性、少なくとも約７５％のペアワイズ相同性、少なくとも約８０％のペアワイズ相同性、少なくとも約８５％のペアワイズ相同性、少なくとも約９０％のペアワイズ相同性、少なくとも約９５％のペアワイズ相同性、少なくとも約９６％のペアワイズ相同性、少なくとも約９７％のペアワイズ相同性、少なくとも約９８％のペアワイズ相同性、少なくとも約９９％のペアワイズ相同性、少なくとも約９９．５％のペアワイズ相同性、少なくとも約９９．９％のペアワイズ相同性を有することができる。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、または別の適当な方法またはアルゴリズムなどのさまざまな方法及びソフトウェアプログラムを使用して２個以上のペプチド間の相同性を決定することができる。
【００９３】
さらに他の例では、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドをコードし得る変異体核酸分子は、コードされたペプチドのアミノ酸配列と、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドのアミノ酸配列との配列同一性または相同性を決定することによって、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって同定することができる。かかるペプチド変異体としては、（１）洗浄のストリンジェンシーが、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．５×−２×ＳＳＣと同等であるストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子（または上記の配列の任意の相補体）とハイブリダイズした状態に維持され、かつ、（２）配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはそれ以上の配列同一性または相同性、または９５％よりも高い配列同一性もしくは相同性を有するペプチドをコードする核酸分子によってコードされるものが挙げられる。あるいは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチド変異体は、（１）洗浄ストリンジェンシーが５０〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×−０．２×ＳＳＣと同等である高度にストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のヌクレオチド配列を有する核酸分子（または上記の配列の任意の相補体）とハイブリダイズした状態に維持され、かつ、（２）配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはそれ以上の配列同一性もしくは相同性、または９５％よりも高い配列同一性もしくは相同性を有するペプチドをコードする核酸分子によってコードされるものとして特徴付けることができる。
【００９４】
配列同一率（％）または配列相同率（％）は、従来の方法によって決定することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６），及びＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９９２）を参照。簡単に述べると、２個のアミノ酸配列同士をアラインし、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ延長ペナルティ＝１、及びＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリング行列を使用して、アラインメントスコアが最適化される。次に、配列同一性または配列相同性を（［同一の一致の総数］／［長い方の配列の長さ＋２個の配列をアラインするために長い方の配列に導入されたギャップの数］）（１００）として計算する。
【００９５】
さらに、２個のアミノ酸配列同士をアラインするために利用できる確立された多くのアルゴリズムが存在する。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されるペプチドのアミノ酸配列とペプチド変異体のアミノ酸配列とによって共有される配列同一性または相同性のレベルを調べるうえで適当なタンパク質アラインメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８），及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）に記載されている。簡単に述べると、ＦＡＳＴＡは最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失は考慮せずに、クエリ配列（例えば、配列番号１）と、最も高い密度の一致（ｋｔｕｐ変数が１の場合）、または一致のペア（ｋｔｕｐ＝２の場合）を有する試験配列とによって共有される領域を同定することにより配列類似性を特徴付ける。次いで、一致の密度が最も高い１０個の領域を、ペアリングされたすべてのアミノ酸の類似性をアミノ酸置換行列を用いて比較することによって再スコアリングし、最も高いスコアに寄与する残基のみが含まれるように各領域の端部を「トリミング」する。スコアが「カットオフ」値（配列の長さとｋｔｕｐ値に基づいて所定の式によって計算される）よりも大きい複数の領域がある場合、トリミングされた最初の領域を調べて、各領域同士を連結してギャップを含むおおよそのアラインメントを形成することができるかどうかを判断する。最後に、アミノ酸を挿入及び欠失させることができるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの改変を用いて２個のアミノ酸配列の最も高いスコアの領域同士をアラインする（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｓｉａｍ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））。ＦＡＳＴＡ分析の例示的なパラメータは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ延長ペナルティ＝１、及び置換行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の補遺２に説明されるようにして、スコアリング行列ファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することによりＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
【００９６】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示した比を用いて核酸分子同士の配列同一性または相同性を決定するためにも使用することができる。ヌクレオチド配列を比較する場合、ｋｔｕｐ値は１〜６の範囲、好ましくは３〜６の範囲であってよく、最も好ましくは３であり、他のパラメータは上記のように設定する。
【００９７】
「保存的アミノ酸置換」である一般的なアミノ酸のいくつかの例は、以下の各群、すなわち、（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びスレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、ならびに（６）リシン、アルギニン、及びヒスチジンのアミノ酸間の置換によって例示される。ＢＬＯＳＵＭ６２テーブルは、タンパク質配列セグメントのおよそ２，０００の局所的な多数のアラインメントから導出された、５００以上の関連タンパク質群の高度に保存された領域を表すアミノ酸置換行列である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２））。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２の置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入することが可能な保存的アミノ酸置換を定義することができる。（上述のように）化学的性質のみに基づいてアミノ酸置換を設計することは可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という用語は、好ましくは、−１よりも大きいＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を指す。例えば、アミノ酸置換は、置換が０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる場合に保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられ、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。
【００９８】
構造的完全性を維持するうえで重要な領域またはドメイン内にあるアミノ酸残基を決定することができる。これらの領域内で、変化に対するある程度の耐性があり、分子の全体的な三次構造を維持することができる特定の残基を決定することができる。配列構造を分析する方法としては、これらに限定されるものではないが、アミノ酸またはヌクレオチドの同一性または相同性が高い複数の配列のアラインメント、及び利用可能なソフトウェア（Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ．ＲＴＭビューア及び相同性モデリングツール、ＭＳＩ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いたコンピュータ分析、二次構造の傾向、バイナリパターン、相補的充填及び埋没極性相互作用が挙げられる（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ５：３７２−６  （１９９５）及びＣｏｒｄｅｓ，  Ｍ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ６：３−１０  （１９９６））。一般に、分子に対する改変を設計する場合、または特定のフラグメントを識別する場合には、構造の決定は、通常、改変された分子の活性を評価することにより行うことができる。
【００９９】
ペアワイズ配列アラインメントを用いることで、２個の生物学的配列（タンパク質または核酸）間の機能的、構造的及び／または進化的関係を示すことができる類似領域を特定することができる。対照的に、複数配列アライメント（ＭＳＡ）は、３つ以上の生物学的配列のアライメントである。ＭＳＡアプリケーションの出力から相同性を推定し、配列間の進化的関係を評価することができる。当業者は、本明細書中で使用される場合、「配列相同性」及び「配列同一性」ならびに「配列同一率（％）」及び「配列相同率（％）」は、必要に応じて参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する配列の関連性または変動を意味するために互換的に使用されている点は認識されるであろう。
【０１００】
同様に、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、任意のポリヌクレオチド長、化学的性質、または構造のポリヌクレオチド（例えば、天然または非天然のＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、三本鎖以上、一次、二次、または三次ポリヌクレオチド構造、またはそれらの任意の組み合わせ）に適用される、本開示のペプチドについて上記に記載したものと同じ方法によって改変することができる。
【０１０１】
配列番号１、または配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、もしくは配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つなどの本開示のいずれのペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体も、腫瘍細胞によって内在化され得るものであり、したがって、細胞透過性である。配列番号１、または配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、もしくは配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つなどの本開示のいずれのペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体も、クラスリン依存的に、または別の機構によってエンドソーム区画内に内在化され得る。エンドソーム輸送経路及び本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体によってアクセスされ得るエンドソーム輸送経路については、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒａｎｓｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．２０１５  Ｓｅｐ  ３０；４：１８）及びＪｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６  Ａｕｇ  １９；４４（１４）：６５１８−４８）で考察されている。内在化に続き、初期エンドソーム内へと、異なる積荷は異なる運命を辿る。すなわち、積荷は、リソソームにエスコートされて分解されるか、例えばＦｃＲｎの場合のように細胞膜または外部にリサイクルされるか、または選択されたタンパク質がレトロマー複合体によって選別されてトランスゴルジネットワークに運ばれて回収され得る。多小胞体及び後期エンドソームを含むリソソームへとつながる小胞は徐々に酸性になり、小胞がリソソームに移動すると受容体−リガンド複合体の解離が生じる。小胞がエンドソームからリソソームに移動するにしたがって、酵素の含有量も変化する。解離した受容体は、レトロマー複合体及びＲａｂ７を介して再びゴルジ体にリサイクルされ得る（Ｐｕｒｕｓｈｏｔｈａｍａｎ  ２０１８）。初期エンドソームは、タンパク質を細胞表面に直接リサイクルすることができる。ペプチドはまた、「逆行性輸送」として知られる経路を辿って核周囲ゴルジまたはトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）に輸送され得る。エンドソーム輸送経路は、細胞表面または細胞外空間へのタンパク質のリサイクル、またはサイトゾルへのペプチドまたは解離したリガンドの進入を生じることができる。エンドソームはまた、リソソーム内へと酸性化することができ、それにより、ペプチドは細胞によって分解され得る。エンドソームの酸性化は、ペプチドと免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）とを接続する酸不安定リンカーなどの酸不安定リンカーが切断され得る環境を形成することができる。エンドソーム−リソソーム経路は、ｐＨの段階的な低下とさまざまなプロテアーゼのレベルの増加を伴い、ｐＨ感受性の切断、プロテアーゼによる切断、または他の機構による不安定な結合の切断を可能にする。本開示のペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体はまた、カベオラ、ピノサイトーシス、直接透過、エネルギー依存性または非依存性の機構などの他の機構、他の移行機構、またはそれらの任意の組み合わせによって細胞質に入ることもできる。さらに、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、必要に応じて、細胞表面に提示される（エンドソーム、ＴＧＮ、またはリソソーム経路を介して）ことによって細胞表面における生理学的Ｉ／Ｏ応答を活性化するか、または腫瘍微小環境中に再び分泌されるか（例えば、本開示のＩＬ−１５剤または本開示の４−１ＢＢリガンドをＩ／Ｏとして含むペプチドＩ／Ｏ複合体によって）、または細胞質内などの内部に分泌される（例えば、本開示のＲＩＧ−ＩリガンドＩ／Ｏまたは本開示のＳＴＩＮＧリガンドＩ／Ｏを含むペプチドＩ／Ｏ複合体により）ように設計することができる。さらに、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、細胞内で活性化及び分解されることで例えばがん治療における細胞内の作用部位にＩ／Ｏをターゲティングするように設計することができる。このように、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、Ｉ／Ｏを、固体または液体腫瘍に、腫瘍微小環境に、腫瘍組織、細胞、細胞区画、サイトゾルに、腫瘍細胞内部に、腫瘍細胞内の特定の区画もしくは場所に、またはそれらの任意の組み合わせに送達するように効果的にターゲティングされることで、Ｉ／Ｏを場合によりエンドソーム、ＴＧＮ、及び／またはリソソーム経路を介して作用部位に送達することができる。
【０１０２】
異なるＩ／Ｏ剤を異なる細胞内区画に送達することができるが、これは異なる細胞透過特性によるものと考えられる。望ましいターゲティングは、ＲＩＧ−ＩもしくはＳＴＩＮＧリガンドの細胞質への送達、ＩＬ−１５剤の細胞表面への提示もしくは細胞外腫瘍微小環境への分泌、または４−１ＢＢリガンドの細胞表面への提示もしくは分泌を含むＩ／Ｏの細胞内送達を含み得る。これら及び他のＩ／Ｏ剤は、本明細書に記載されるペプチドを介して、腫瘍細胞のエンドソームネットワークに送達され得る。ペプチドＩ／Ｏ複合体は、エンドソームネットワーク内部に入ると、分子設計に基づいてその最終目的地に誘導され得る。いくつかの例では、Ｉ／ＯがＲＩＧ−１リガンドを含むペプチドＩ／Ｏ複合体は、ペプチドが依然ＲＩＧ−１リガンドと複合体を形成していて、プロセシングを受けていない状態で完全に活性であり得る。これらのコンストラクトはエンドソームから細胞質へと脱出することができ、これには、本明細書に記載されるペプチドの存在が助けとなり得る。必要に応じて、本明細書に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、酵素によって、またはエンドソーム、リソソーム内で、もしくは細胞質への送達後に化学的に、除去、分解、または解離するようにプロセシングされ得る。細胞質への送達の効率を高めるため、細胞透過性ペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列の改変、疎水性リンカーの使用、またはペプチドＩ／Ｏ複合体の配合などの改変を必要に応じてペプチドＩ／Ｏ複合体に加えることができる。ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体が免疫系に対してシグナル伝達を行うためには、ＩＬ−１５剤は、場合により細胞表面に分泌または提示されることにより、細胞外の腫瘍微小環境に提示され得る。さらに、ＩＬ−１５剤は体循環中で毒性を示す場合がある。Ｉ／ＯがＩＬ−１５剤を含むペプチドＩ／Ｏ複合体（ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体）の設計は、プロセシングが（腫瘍細胞内または腫瘍微小環境内などで）行われてＩＬ−１５剤活性の活性化が生じるまでの間、ＩＬ−１５剤の活性を阻害するペプチドＩ／Ｏ複合体内の位置にペプチドを配置することを含み得る。このように、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、ＩＬ−１５剤プロドラッグとして機能することができる。エンドソームにおけるプロセシングの間のカテプシンＢなどの酵素によるプロセシング、または細胞外カテプシンまたは細胞表面もしくは腫瘍微小環境に存在する他の酵素によるプロセシングによって、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体のペプチド部分が放出され、残りのＩＬ−１５剤コンストラクトの効力を高めることができる。そのため、全身または他の臓器でＩＬ−１５剤の作用への曝露を減少させる一方で、腫瘍微小環境でのＩＬ−１５剤の作用への曝露をより高くすることができ、これにより、ＩＬ−１５剤の効果を腫瘍にターゲティングして、他の部位では毒性を低減することができる。カテプシンＢによるプロセシングは、カテプシンＢが初期エンドソームを含むエンドソームシステム全体に存在し、タンパク質がリソソームなどの酸性区画内に移動する必要なくプロセシングが可能であることから選択することができる。（Ｂｌｕｍ  １９９１，Ｌａｕｔｗｅｉｎ  ２００４，Ｇｕｈａ  ２００８，Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈ  ２０１２）。本明細書に記載されるペプチドの特性は、必要に応じてペプチドを解離させるプロテアーゼ切断部位または他の切断部位と組み合わされて、細胞内選別経路を決定することができる。カテプシンＢは、多くのがんの細胞表面または細胞周囲空間にもみられる（Ｆｏｎｏｖｉｃ  ａｎｄ  Ｔｕｒｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８４０：２５６０−２５７０（２０１４））。したがって、ペプチドＩ／Ｏ複合体プロドラッグの切断を、内在化の前、または内在化及び分泌の後で行うことができる。これらの場合、ペプチドＩ／Ｏ複合体はプロドラッグを腫瘍にターゲティングし、そこで細胞周囲空間内のプロセシングを受け、腫瘍微小環境中で治療レベルのＩ／Ｏ（例えば、ＩＬ−１５剤）を生じる。エンドソーム／リソソーム経路に存在する、または腫瘍の微小環境もしくは細胞周囲空間に存在する他の酵素も、プロドラッグのプロセシング機構に対してターゲティングされ得る。これらの酵素としては、これらに限定されるものではないが、β−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、及びＭＭＰ−１、２、７、９、１３、または１４のようなマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などのグルクロニダーゼが挙げられる。
【０１０３】
本開示のペプチドはまた、２０種の標準アミノ酸の一部ではない任意のアミノ酸などの非天然、非共通、または修飾アミノ酸も含むことができる。非天然アミノ酸は、化学的結合のための、または結合相互作用、安定性、もしくはコンフォメーションといったタンパク質の生物物理学的または生化学的特性を改変するための固有の官能基を有することができる。非天然アミノ酸は、組み換えにより、または合成により組み込むことができ、または酵素的に導入することもできる。非天然アミノ酸は、これらに限定されるものではないが、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ｐ−アセチル−フェニルアラニン、またはフルオロアラニンを含むことができ、これらに限定されるものではないが、アジド、アルキン、ケトン、もしくはアルデヒド官能基、またはそれらの任意の組み合わせを有することができる。非共通アミノ酸は、これらに限定されるものではないが、アミノ酸前駆体もしくは中間体、シトルリン（Ｃｉｔ；しばしばＸで示される）、セレノシステイン（Ｕ；Ｓｅｃ）及びピロリシン（Ｏ；Ｐｙｌ）、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１０４】
本開示のペプチドは、ペプチドのないＩ／Ｏと比較してより効果的に免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）を、腫瘍微小環境に、腫瘍組織、細胞、細胞区画、サイトゾルに、腫瘍細胞内部または腫瘍細胞内の特定の区画もしくは場所に、及び／または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過してターゲティングすることができる。本開示のペプチドはまた、腫瘍細胞によるより高量の、より一貫した取り込みも示し、それにより、複合体化Ｉ／Ｏのより高い細胞内送達をもたらすことができる。さらに、本開示のペプチドは、オフターゲットの蓄積を減少させることができる。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、腫瘍細胞または腫瘍微小環境中でプロセシングまたは修飾されるまで、より低い効力を有することもできる。これらの効果のいずれかの結果として、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体の投与は、遊離Ｉ／Ｏと比較してオフターゲットの正常組織における毒性を低減することができる。
【０１０５】
本開示のペプチドは、Ｉ／Ｏを含み得る脂質ナノ粒子の表面に結合させることができる。その後、脂質ナノ粒子を腫瘍細胞に誘導することができ、そこでナノ粒子は内在化されてＩ／Ｏを直接細胞質に送達することができる。さらに、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、ペプチドのないＩ／Ｏよりもより効率的に細胞質または細胞内区画内にＩ／Ｏを送達することができ、治療効果を有するのに充分なレベルのＩ／Ｏを腫瘍に送達することができる。
【０１０６】
さらに、本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体は、細胞透過、サイトゾル送達、エンドソーム取り込み、またはエンドソーム脱出、及び細胞質または他の細胞内区画へのＩ／Ｏの送達をさらに向上させるように改変することができる。Ｉ／Ｏの細胞質への送達は、ＲＩＧ−Ｉ経路の活性化など、所望の経路を活性化するうえで必要とされる場合がある。例えば、細胞透過性を高めることができるペプチドを、ペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体に融合または結合することで細胞透過性を高めることができる。そのような細胞透過性ペプチドは、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドとＩ／Ｏ剤との間のリンカー内に配置するか、またはペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏ剤またはペプチドのいずれかまたは両方に配置することができ、必要に応じてそれらの間にリンカーが配置される。１個、または複数個、または場合により１〜１０個のそのような細胞透過性ペプチドをペプチドＩ／Ｏ複合体に付加することができる。細胞透過性を向上させる例示的なペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔａｔ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、配列番号１２０７）、Ｒｘで示されるオリゴ−Ａｒｇ（Ｒｘ、ただしｘ＝６〜１２（配列番号１３８２）、またはｘ＝３〜２０（配列番号１４９５）、またはそれよりも多いＲ（Ａｒｇ）残基）、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号１２０８）、ｐＶＥＣ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、配列番号１２０９）、トランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号１２１０）、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２１１）、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２１２）、ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ、配列番号１２１３）、及びＲ６Ｗ３（ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ、配列番号１２１４）、Ｏｃｔ４（ＤＶＶＲＶＷＦＣＮＲＲＱＫＧＫＲ、配列番号１２１５）、ＷＴ１−ｐＴｊ（ＫＤＣＥＲＲＦＳＲＳＤＱＬＫＲＨＱＲＲＨＴＧＶＫＰＦＱ、配列番号１２１６）、ＤＰＶ３（ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳ、配列番号１２１７）、ＶＰ２２（ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ：配列番号１２１８）、ＫＷ（ＫＲＫＲＷＨＷ、配列番号１２１９）、ＫＦＧＦ（ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ、配列番号１２２０）、ＦＧＦ１２（ＰＩＥＶＣＭＹＲＥＰ、配列番号１２２１）、インテグリンβ３ペプチド（ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ、配列番号１２２２）、Ｃ１０５Ｙ（ＰＦＶＹＬＩ、配列番号１２２３）、及びＴＰ２（ＰＬＩＹＬＲＬＬＲＧＱＦ、配列番号１２２４）、ならびにＲａｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｓｅｐ；２１（９）：５６０−７０）、Ｒａｍｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１５  Ｏｃｔ；１５４：７８−８６）、Ｂｅｃｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０１３  Ｊｕｎ  １９；５８７（１２）：１６９３−７０２）に記載されるその他のペプチドが挙げられる。他の例示的な細胞透過性ペプチドとしては、インペラトキシンＡ、マウロカルシン、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ｋａｌａｔａＢ１、ＳＦＴＩ−１、及びＣｙＬｏＰ−１などのシステイン高密度ペプチドも挙げられる。
【０１０７】
多くの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が、本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞取り入れ／取り込み、または細胞膜を通過したペプチドＩ／Ｏ複合体の移動、またはサイトゾルもしくは細胞内区画へのペプチドＩ／Ｏ複合体の送達を促進する送達ビヒクルとして機能することができる。膜を通過して積荷を送達することができるカチオン性または両親媒性配列を有するアミノ酸８〜３０個の長さの特定のＣＰＰが記載されている。かかる積荷としては、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及びさまざまな小分子が挙げられる。通常、これらのＣＰＰは、ＣＰＰ−積荷のエンドソーム区画への進入を促進し、積荷はエンドソーム区画に蓄積するかそこでプロセシングされる。エンドソーム膜を通過して細胞質または核に積荷を効率的に送達するには、場合によってはさらなる改変が必要とされる。１つの例は、ＨＩＶ  ＴＡＴに由来するものである（Ｓａｗａｎｔ  ２０１０，Ｒｉｚｚｕｔｉ  ２０１５）。ＴＡＴペプチドは、エンドソームへの局在化は効率的に行えるが、細胞質送達にはそれほど効率的ではない。このＴＡＴペプチドの二量体化は、細胞質への透過を促進する（Ｍｏｎｒｅａｌ  ２０１５，Ｋｉｍ  ２０１８，Ｅｒａｚｏ−Ｏｌｉｖｅｒａｓ  ２０１４）。
【０１０８】
本明細書に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体の送達に使用することができるＣＰＰとしては、アルギニンリッチ配列ＴＡＴｐ  ４８−６０：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１２０７）及び最もよく知られているＴＡＴペプチドであるＣＰＰ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３９５）、及びＣＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＣ（配列番号１４９２）（ＴＡＴ）、ＧＶＦＶＬＧＦＬＧＦＬＡ（ＨＩＶ  ｂｐ１６０エンベロープタンパク質の膜融合ペプチド；配列番号１３８４）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ８；配列番号１３８５）などのエンドサイトーシス及びエンドソーム放出を高めるカチオン性Ａｒｇリッチ及び疎水性ペプチド、ＤＳＨＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ（ヒスタチン５及び誘導体ペプチド；ｄｅｎ  Ｈｅｒｔｏｇ  ２００４；配列番号１３８６）、ＫＲＬＦＫＫＬＬＦＳＬＲＫＹ（ｄｈｖａｒ４；配列番号１３８７）、ＣＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（メリチン；配列番号１３８８）、ＣＬＩＫＫＡＬＡＡＬＡＫＬＮＩＫＬＬＹＧＡＳＮＬＴＷＧ（トランスポータン；配列番号１３８９）、ＹＫＱＳＨＫＫＧＧＫＫＧＳＧ（ＮｒＴＰ６−Ｃ核小体ターゲティングペプチド；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ２０１１；配列番号１３９０）、（ＶＲＬＰＰＰ）３（トウモロコシγ−ゼイン由来のプロリンリッチペプチド；Ｆｅｒｎｕｎｄｅｚ−Ｃａｒｎｅａｄｏ  ２００４；配列番号１３９１）、ＶＳＲＲＲＲＲＲＧＧＲＲＲＲ（低分子量プロタミン；配列番号１３９２）、ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ（ＧＶ１００１は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）タンパク質の残基６１１〜６２６に相当するペプチドである。配列番号１３９３）、ＫＡＬＬＡＬ（Ｇｒｉｊａｌｖｏ  ２０１８；配列番号１３９４）、以下の表２に記載されるＣＰＰ（Ｐｅｒａｒｏ  ２０１８より）ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ；配列番号１３９５）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ９；配列番号１３９６）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＴＰ１０；配列番号１３９７）、ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（Ｐ２８；配列番号：１３９８）、ＣＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＹＬＩ（Ｃ１０５Ｙ；配列番号１３９９）、及びＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ（Ｐｅｐ−７；配列番号１４００）が挙げられる。
【０１０９】
本開示と適合する他のＴＡＴペプチドとしては、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号１４８７）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰ（配列番号１４８８）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号１４８９）、ＣＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＣ（配列番号１４９２）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４９０）、及び他の配列が挙げられる。多くの細胞透過性ペプチド配列がＣＰＰｓｉｔｅ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｐｐｓｉｔｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に記載されているが、主な配列を以下に記載する。
【０１１０】
本開示のＣＰＰはまた、本明細書にその全容を援用するところのＶａｒｋｏｕｈｉ（２０１１）に概説されるような他の細胞透過性化合物も含み得る。本開示のＣＰＰは、Ａｇｒａｗａｌ（２０１６）により記載されたＣＰＰｓｉｔｅ２．０データベース（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｐｐｓｉｔｅ／）において言及されるものも含むことができ、これらをいずれも本明細書にその全容にわたって援用するものである。
【０１１１】
本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体と組み合わされた上記のペプチドのいずれも、膜を通過した細胞質への積荷の送達を高めることができる。ペプチドＩ／Ｏ複合体の送達におけるＣＰＰの使用は、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、及びＳＴＩＮＧなどの細胞内標的を有するＩ／Ｏ剤において望ましいと考えられる。
【０１１２】
本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体と組み合わせて使用することができる細胞透過性ペプチドの概要を下記表２に示す。
【表２−１】
2021506849.tif 000068
【表２−２】
2021506849.tif 000069
【表２−３】
2021506849.tif 000070
【表２−４】
2021506849.tif 000071
【表２−５】
2021506849.tif 000072
【表２−６】
2021506849.tif 000073
【表２−７】
2021506849.tif 000074
【０１１３】
ウイルスベクターは、核酸分子を標的細胞の細胞質及び核に送達するための効率的な方法である。ウイルスベクターの使用とは対照的な遺伝子送達を促進するための新しい戦略の開発では、配合及び共有結合に基づくアプローチの両方を採用することができる。ウイルスのエンベロープタンパク質は、エンドソーム膜との融合を誘導することが可能であり、ウイルス核酸を挿入するための孔形成を可能にすることができる。これらのタンパク質は、膜融合を担う重要なペプチド配列を有している。１つは、ＨＩＶ及びＳＩＶ  ｇｐ１６０膜貫通エンベロープタンパク質のＮ末端にある疎水性の膜融合ヘリックスペプチドであるｐＨ依存性融合ペプチド（ＧＶＦＶＬＧＦＬＧＦＬＡ；配列番号１３８４）であり、脂質層を局所的に破壊することが見出されており、これは融合プロセスにおいて必要なステップである（Ｈｏｒｔｈ  １９９１）。他のエンベロープウイルスも、酸性化されたエンドソームから細胞質に侵入するためにｐＨ依存性融合ペプチドを利用している。これらのペプチドには、インフルエンザウイルス及びその融合ペプチドであるヘマグルチニンＡ、パラミクソウイルスＦのＦペプチド、ＳＡＲＳスパイク糖タンパク質Ｓ、パピローマウイルスのマイナーカプシドタンパク質Ｌ２（Ｋａｍｐｅｒ  ２００６）、及びエボラＧＰ２（Ｌａｍｂ  ２００７）が含まれる。これらのウイルスは、ウイルスの遺伝物質を細胞内に輸送するためにさまざまな戦略を用いているが、これらはいずれもエンドソーム膜の挿入と破壊を必要とする。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体と組み合わされたこのような膜破壊ウイルスペプチドは、膜を通過した細胞質への積荷の送達を高めることができる。
【０１１４】
ペプチドＩ／Ｏ複合体の送達におけるウイルスタンパク質の使用は、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＳＴＩＮＧなどの細胞内標的を有するＩ／Ｏ剤を送達するうえで望ましいと考えられる。ペプチドＩ／Ｏ複合体を送達するためのウイルスタンパク質には、ヒト唾液抗菌ペプチドであるヒスタチン５ペプチド及びその誘導体ペプチドｄｈｖａｒ５、ＬＬＬＦＬＬＫＫＲＫＫＲＫＹ（ｄｈｖａｒ５；配列番号１４０１）であるヒスタチン５ペプチドに類似性を示すＨＰＶのＬ２カプシドペプチドが含まれ得る。ＨＰＶ  Ｌ２カプシドペプチドとしては（Ｋａｍｐｅｒ  ２００６）、ＳＹＦＩＬＲＲＲＲＫＲＦＰＹ（ＨＰＶ３  ３Ｌ２；配列番号１４０２）、ＳＹＹＭＬＲＫＲＲＫＲＬＰＹ（ＨＰＶ１  ６Ｌ２；配列番号１４０３）、ＬＹＹＦＩＲＫＫＲＫＲＶＰＹ（ｈｐｖ１  ８Ｌ２；配列番号１４０４）が挙げられる。
【０１１５】
パラミクソウイルス科の代表的なメンバーのＦタンパク質から得られる融合ペプチドのアミノ酸配列の比較（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ２００４）により、以下の配列を有するペプチドＩ／Ｏ複合体を送達するためのウイルスタンパク質が明らかとなっている。すなわち、
ＦＡＧＶＶＩＧＬＡＡＬＧＶＡＴＡＡＱＶＴＡＡＶＡＬＶ（ＳＶ５；配列番号１４０５）、
ＦＩＧＡＩＩＧＳＶＡＬＧＶＡＴＡＡＱＩＴＡＡＳＡＬＩ（ＮＤＶ；配列番号１４０６）、
ＦＦＧＧＶＩＧＴＩＡＬＧＶＡＴＳＡＱＩＹＡＡＶＡＬＶ（ＨＰＩＶ３；配列番号１４０７）、
ＦＡＧＶＶＬＡＧＡＡＬＧＶＡＴＡＡＱＩＴＡＧＩＡＬＨ（麻疹；配列番号１４０８）、及び
ＬＡＧＶＩＭＡＧＶＡＩＧＩＡＴＡＡＱＩＴＡＧＶＡＬＹ（ニパ；配列番号１４０９）。
【０１１６】
ペプチドＩ／Ｏ複合体を送達するためのウイルスタンパク質として、ＳＡＲＳ  Ｓタンパク質を含めることができるが、これは、ＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＭＫＱＹ（ＦＰ１；配列番号１４１０）及びＫＱＹＧＥＣＬＧＤＩＮＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦ（ＦＰ２；配列番号１４１１）を含む、協調して作用する２つの融合ペプチドＦ１とＦ２を有するものである（Ｌａｉ  ２０１７）。
【０１１７】
ペプチドＩ／Ｏ複合体を送達するためのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルスＸ−３１（Ｈ３Ｎ２）のヘマグルチニンサブユニットＨＡ−２のアミノ末端配列であるＩｎｆ  ＨＡ−２を含めることができる。ＣＯＯＨ末端のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成によりＣＯＯＨ末端において二量体化されたＩｎｆ  ＨＡ−２の対応する二量体類似体ペプチドｄｉＩＮＦ−７も、Ｉ／Ｏ剤の細胞質への送達に使用される。これらのペプチドは、（Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ  ２００２）に記載されるような以下の配列を有する。すなわち、
ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ（Ｉｎｆ  ＨＡ２；配列番号１４１２）、
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ（ｄｉＩＮＦ−７；配列番号１４１３）。
【０１１８】
上記のペプチドのいずれも（例えば、配列番号１４０１〜配列番号１４１４のうちのいずれか１つ）、標的への細胞質送達を助けるために、ペプチドＩ／Ｏ複合体に必要に応じて付加することができる。
【０１１９】
本開示のペプチド、例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれか１つもまた、エンドソームの膜融合及び透過性をさらに高めるために改変することができる。１つの関連する例として、細胞質への透過のためのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の改変があり、ｍＡｂによる低効率レベルの透過の観察が、ｍＡｂのトリプトファン、リシン、及びヒスチジンによる部位特異的改変によって増加し、ｍＡｂの細胞質への透過が改善された（Ｋｉｍ  ２０１６）。本開示のペプチドも、初期エンドソームにおけるその放出性を高めるため、または膜孔形成性を高めるため、または細胞質透過性を高めるために、主要な位置でＴｒｐ、Ｌｙｓ、及びＨｉｓ残基により同様に改変することができる。
【０１２０】
エンドソームエスケープドメイン（ＥＥＤ）を使用して、本開示のＩ／Ｏ剤またはペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞質への送達性を高めることもできる。エンドソームエスケープドメイン（ＥＥＤ）は、エンドソームからのウイルスの脱出に必要とされる短い疎水性アミノ酸配列で構成され得る。エンドソーム脱出を最適化するためにさまざまなＥＥＤが設計されており、ＣＰＰ（例えば、ＴＡＴ）にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位を少なくとも６個、１２個、及び１８個の固定距離で結合されている。疎水性ＥＥＤを含む試験されたペプチドには、−ＧＦＦＧ（配列番号１４１５）、−ＧＷＧ（配列番号１４１６）、−ＧＦＷＧ（配列番号１４１７）、−ＧＦＷＦＧ（配列番号１４１８）、−ＧＷＷＧ（配列番号１４１９）、−ＧＷＧＧＷＧ（配列番号１４２０）、及び−ＧＷＷＷＧ（配列番号１４２１）が含まれる。最適なエンドソーム脱出のためには、ペプチドは、少なくとも１個の芳香族インドール環及び場合により２個（例：ＧＷＷＧ；配列番号１４１９）または少なくとも１個のインドール環と少なくとも１個及び場合により２個の芳香族フェニル基（例：ＧＦＷＦＧ；配列番号１４１８）を少なくともＰＥＧ単位６個の距離で有するアミノ酸を含むことができる。例えば、１つのグループは、２個の芳香族インドール環（ＧＷＷＧ；配列番号１４１９）または１個のインドール環と少なくとも２個の芳香族フェニル基（ＧＦＷＦＧ；配列番号１４１８）をＰＥＧ単位６個の固定距離で有するアミノ酸を含むペプチドのエンドソーム脱出を示した（Ｌｏｎｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．２０１６  Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３２３０１）。
【０１２１】
カテプシンＤの切断可能なＧＫＰＩＬＦＦ（配列番号１４２３）配列に由来する合成ペプチドＦＦＬＩＰＫＧ（配列番号１４２２）などの透過促進配列（ＰＡＳ）も、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体と組み合わせてカチオン性ＣＰＰの細胞質進入を高めるために使用することができる（Ｔａｋａｙａｍａ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．９，１２２２−１２３０）。
【０１２２】
さらに、細胞透過性に関連する要素を、例えば、本開示のペプチドのループ領域内でアミノ酸を付加または改変することなどにより本開示のペプチドにグラフトすることで、細胞透過性を高めることができる。細胞透過に関連するこれらの要素には、上記の細胞透過性ペプチドの細胞透過に関連する任意の要素を含むことができる。さらに、細胞透過性を高める小分子、ポリマー、脂質などを含む非ペプチド分子を、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体と組み合わせることができる。また、グラフト化及び融合アプローチに加えて、上記または他のものなどの細胞透過性に関連する要素を、配合物中で、及び／または非共有結合による組み合わせによって組み合わせることができる。
【０１２３】
細胞質に積荷を送達させるウイルス融合ペプチドを模倣した合成ポリマーなどのペプチド以外のポリマーも開発されている。（Ｂｕｌｍｕｓ  ２００６，Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ  ２００９）。そのようなポリマーは、エンドソーム膜を破壊し、細胞質及び核へのオリゴヌクレオチド（ＲＩＧ−Ｉリガンドなど）の送達を促進するように設計されている。そのようなポリマーの最も標準的な例としては、ポリエチレンイミンがある。このカチオン性ポリマー及び他のカチオン性ポリマーは、積荷核酸と複合体を形成してナノ粒子を形成する。しかしながら、これはエンドソーム放出を可能にする遊離ポリマーであってもよい（Ｃｈｅｎ  ２０１８）。多くのポリマーは、エンドソーム放出を促進するためのｐＨ応答性基としてアミド基を使用している。酸性で赤血球を溶解するが中性ｐＨでは溶解しないウイルス融合ペプチドを模倣した合成ポリマーが開発されている（Ｂｕｌｍｕｓ  ２００６、Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ  ２００９）。上記のポリマーのいずれかを、細胞質送達性を高めるために本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体との複合体、結合体、または配合物として使用することができる。
【０１２４】
さらに、疎水性ドメインを本開示のペプチドＩ／Ｏに付加することによりエンドソーム脱出、エンドソーム取り込み、及び／または細胞質送達性を高めることができる。高分子複合体の細胞質への取り込みと送達を改善するため、疎水性ドメインを含めてＣＰＰに付加することでエンドソーム放出を高めることが行われている。例えば、ＣＰＰ  ＴＰ−１０のＮ末端のステアリル化は、エンドソーム脱出と負に帯電したオリゴヌクレオチドの細胞質への送達を促進する（Ｍａｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００９    Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３，２２１−２２７．）。疎水性ドメインの付加は、細胞取り込み、膜透過化、エンドソーム放出、及び細胞質への送達を促進することもできる（ｄｅ  Ｐａｕｌａ，Ｂｅｎｔｌｅｙ，  ａｎｄ  Ｍａｈａｔａ．ＲＮＡ，１３：４３１−４５６（２００７））。有用な疎水性ドメインとしては、脂質、脂肪酸、コレステロール、リトコール酸、ラウリン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサン酸、（ＣＨ２）ｘ（ｘ＝１〜４０）が挙げられる。疎水性ドメインはリンカー内にあってもよく、リンカーもしくはペプチドもしくはＩ／Ｏ剤の側部に付加してもよく、または分子のいずれかの端部に付加してもよい。細胞透過、エンドソーム脱出、エンドソーム取り込み、または細胞質送達を支援するために、さまざまな長さの複数の疎水性ドメインを付加することができる。疎水性ドメインは、直鎖、環状ドメイン（芳香族または非芳香族）、及び場合により１個または複数の二重結合または三重結合を含むことができる。同様に、そのような疎水性ドメインを使用して、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞取り込み、膜透過化、エンドソーム放出、及び細胞質への送達を促進することができる。
【０１２５】
化学修飾
本開示のペプチドを化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態では、機能を付加する、機能を欠失させる、またはペプチドのインビボ挙動を改変するようにペプチドを変異させることができる。ジスルフィド結合間の１個以上のループを他のペプチドからの活性要素を含むように修飾または置換することができる（Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，ｐ．２２３−２５１，２０１２に記載されるものなど）。アミノ酸は、半減期またはバイオアベイラビリティーを増大させ、インビボでの結合挙動を改変、付加または欠失させ、新たなターゲティング機能を付加し、表面電荷及び疎水性を改変し、及び／または結合部位を与えるといった目的で変異させることもできる。Ｎ−メチル化は、本開示のペプチドで生じ得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミンのメチル化によって修飾することができる。例えば、完全メチル化は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的メチル化を使用することによって行うことができる。本開示のペプチドのＮ末端は、結合時のＮ末端のアミンとの反応をブロックするために、アセチル化またはメチル化などによってブロックすることができる。
【０１２６】
化学修飾は、例えば、ペプチドの終末相半減期、吸収相半減期、分布相半減期を延長するか、またはペプチドの生体内分布または薬物動態プロファイルを変化させることができる。化学修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、生体高分子、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Ｆｃ領域、パルミチン酸やミリストレイン酸などの単純な飽和炭素鎖、糖、ヒアルロン酸、またはアルブミンを含むことができる。Ｆｃ領域によるペプチドの化学修飾は、Ｆｃ−ペプチド融合体であり得る。ポリアミノ酸は、例えば、単一のアミノ酸が繰り返されるポリアミノ酸配列（例えば、ポリグリシン）、一定のパターンに従うかまたは従わない場合がある、混在するポリアミノ酸配列を有するポリアミノ酸配列（例えば、ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｙ−ａｌａ（配列番号１４９６））、または上記の任意の組み合わせを含むことができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、ペプチドの特性を改変または変化させることができる別の部分に結合（例えば、コンジュゲート）することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、がんに対する治療効果を与えるＩ／Ｏなどの別の分子に結合することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、これらに限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、一本鎖Ｆｖ、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学薬品、フルオロフォア、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫調節剤、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法剤、細胞毒性化学物質、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、アミノグリコシド、ケトロラックまたはイブプロフェンなどの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、デンドリマー、脂肪酸、またはＦｃ領域、またはそれらの活性フラグメントもしくは修飾体を含み得る活性剤と結合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、直接またはリンカーを介して、またはリポソーム内などの製剤によって、Ｉ／Ｏまたは活性剤に共有結合または非共有結合によって結合される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｉ／Ｏ、例えば、サイトカインとの融合タンパク質として発現させることができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、修飾がペプチドの安定性及び／または半減期を増加させるように修飾することができる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部アミノ酸などへの疎水性部分の結合を利用して、本開示のペプチドの半減期を延ばすことができる。他の実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、血清中半減期に影響を及ぼし得る翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／またはアミド化）を含むことができる。いくつかの実施形態では、（例えばミリストイル化及び／またはパルミチル化により）単純な炭素鎖をペプチドに結合させることができる。いくつかの実施形態では、例えば、単純な炭素鎖は、結合したペプチドを非結合物質から容易に分離可能とすることができる。例えば、本発明の所望のペプチドを非結合物質から分離するために使用できる方法としては、これらに限定されるものではないが、溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィーが挙げられる。いくつかの実施形態では、親油性部分をペプチドに結合させることができ、血清アルブミンへの可逆的結合を介して半減期を延ばすことができる。さらに、結合される部分は、血清アルブミンへの可逆的結合を介してペプチドの半減期を延ばす親油性部分とすることができる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、コレステロール、またはコレステン、コレスタン、コレスタジエン、及びオキシステロールを含むコレステロール誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドをミリスチン酸（テトラデカン酸）またはその誘導体に結合することができる。他の実施形態では、本開示のペプチドを半減期改変剤に結合（例えば、コンジュゲート）することができる。半減期改変剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、両性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含む水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、抗体、またはアルブミンに結合する分子が挙げられる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜配列番号５６７、配列番号１２４３〜配列番号１２５２、または配列番号１２６３〜配列番号１２８９の最初の２個のＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は、別の分子との結合または融合を促進するための、また、かかる結合分子または融合分子からのペプチドの切断を促進するためのスペーサーまたはリンカーとして機能することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、ペプチドの特性を改変または変化させることができる他の部分に結合することができる。
【０１３０】
免疫抗がん剤（「Ｉ／Ｏ」）
本開示は、本明細書で「Ｉ／Ｏ」（複数可）と称する、がん治療で使用するためにやはり本明細書に開示されるペプチドと複合体化される免疫抗がん剤を提供する。本明細書で使用するところの「Ｉ／Ｏ」（複数可）は非限定的であり、単一剤、複数剤、または複数剤の複合体を含むことができ、かかる剤は、単量体、二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）、または多量体（例えば、ホモ多量体またはヘテロ多量体）の構造を有し、また、かかる剤は、一重、二重、または多重に複合体化、凝集、修飾、融合、連結されるか、または上記の任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示のＩ／Ｏは、抗腫瘍宿主免疫応答を促進することができる。例えば、Ｉ／Ｏは、腫瘍微小環境内の抗腫瘍宿主免疫応答を促進することができる。腫瘍に対する強力な免疫応答を得るために使用できる手法としては、これらに限定されるものではないが、サイトカインまたはケモカイン分泌の誘導、共刺激分子の上方制御、Ｔ細胞（例えば、エフェクターメモリーＴ細胞）の活性化及び増殖、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化及び増殖、適当な共刺激シグナル、ケモカイン、及び／または成長因子による抗原のプロセシング及び提示のための樹状細胞（ＤＣ）の活性化及び増殖、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び骨髄由来抑制細胞の阻害、腫瘍細胞における免疫原性細胞死（ＩＣＤ）の誘導、インフラマソームの活性化、アポトーシスの誘導、またはこれらの組み合わせが挙げられる。上記に述べた手法によって抗腫瘍免疫を促進することができるＩ／Ｏとしては、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１ファミリー（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３）からのサイトカイン、これらに限定されるものではないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７Ｓ１、ガレクチン９、ＣＤ２４４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＩＳ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴの阻害剤を含むチェックポイント阻害剤；これらに限定されるものではないが、ＴＬＲ、ＮＬＲ、ＡＬＲ、ＣＬＲ、ＲＬＲ、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、及びＳＴＩＮＧを含むパターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンド；これらに限定されるものではないが、がん細胞の細胞表面のＣＤ４７発現を下方制御させる剤、高親和性の競合阻害剤となるように操作された可溶性ＳＩＲＰα、またはＳＩＲＰαもしくはＣＤ４７のいずれかに直接結合してそれらの相互作用及びＳＩＲＰαシグナルを遮断する他のアンタゴニストなどの、ＳＩＲＰαを阻害する剤を含む、マクロファージＳＩＲＰα−ＣＤ４７のチェックポイントを阻害する分子；酵素インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の活性を阻害する分子；これらに限定されるものではないが、ＫＩＲ２ＤＬ１−３、ＫＩＲ３ＤＬ１、及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のチェックポイントを遮断する分子；ならびに、これらに限定されるものではないが、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＴＬ−１Ａ、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ、及びＧＩＴ��を含むＴＮＦファミリーメンバーのリガンドまたは他のアゴニストもしくはアンタゴニストが挙げられる。これらに限定されるものではないが、ＢＣＬ２、Ｍｃｌ−１、ＢＣＬＸＬ、ＢＦＬａ／Ａ１、ＢＣＬＷ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＭＦ及びＨＲＫを含むＢＣＬ２ファミリーのアゴニストまたはアンタゴニストをターゲティングすることができる。Ｂｃｌ−２調節因子であるＦＬＩＰは可能な標的である。特定の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体との併用治療、及びがんの治療のためのＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤またはチェックポイント阻害剤の任意の組み合わせを提供する。これらに限定されるものではないが、カスパーゼ、カテプシン、カルパインを含む細胞内プロテアーゼを標的とすることができる。いくつかの実施形態では、Ｂｕｒｕｇｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｏｃｔ  ５．ｐｉｉ：Ｓ１０４４−５７９Ｘ（１７）３０１８２−７０）に記載されるＩ／Ｏを、参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、Ｉ／Ｏは、ＩＬ−１５及びＩＬ−１２のような強力かつ効果的な抗腫瘍免疫応答を促進することができるサイトカインであってよい。いくつかの実施形態では、Ｉ／Ｏは、ＲＩＧ−Ｉリガンド、ＭＤＡ５リガンド、またはＳＴＩＮＧリガンドなどのＰＲＲリガンドであってよい。いくつかの実施形態では、Ｉ／Ｏは、天然ヒト４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ４０ＬなどのＴＮＦファミリーのリガンドであってよい。ペプチドＩ／Ｏ複合体によるこれらのＩ／Ｏの送達は、抗腫瘍免疫を促進することができる一方で、全身投与された遊離Ｉ／Ｏと比較して毒性が低減されるため、さまざまながんの効果的な治療を促進するものである。
【０１３１】
Ａ．  ＩＬ−１５剤を含むＩ／Ｏ
本開示の免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）は、ＩＬ−１５剤を含むことができる。本明細書に記載されるＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５受容体に結合する任意の剤を含み得る。例えば、本明細書に開示されるＩＬ−１５剤は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）自体、ＩＬ−１５のフラグメント、ＩＬ−１５の変異体、ＩＬ−１５Ｎ７２ＤなどのＩＬ−１５の突然変異体、任意のＩＬ−１５受容体リガンド、ならびにかかるＩＬ−１５分子とＩＬ−１５受容体α鎖の全体または一部との融合体もしくは複合体、例えば、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合体もしくは複合体またはＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ＋ドメイン融合体もしくは複合体（例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαまたはＩＬ−１５ＲαＳｕとの融合体）を含むことができる。ＩＬ−１５剤の成分同士は、組換え融合体または化学的結合体などによって共有結合で、またはＩＬ−１５とα受容体鎖の全体または一部との間の非共有結合性の高親和性の会合などによって非共有結合で連結することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５は、ヒトに、ＮＫ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、及びγ／δＴ細胞を強力に誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５は、ＩＦＮ−γ及びグランザイムを誘導することができ、それによって細胞毒性活性を増大させることができる。ＩＬ−１５は、さらにＲＯＲγｔＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ１７）を阻害することができ、活性化誘発細胞死（ＡＩＣＤ）を刺激せず、Ｔｒｅｇにほとんどまたはまったく影響を及ぼさない場合がある（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３：２１９−２２７（２０１５））。Ｄｅｌｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６  Ｊｕｌ；１７（７）：８１６−２４）に記載されるように、ＩＬ−１５産生は、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有（ＣＩＳ）タンパク質、サイトカインシグナル伝達（ＳＯＣＳ）タンパク質の抑制因子、及びＮＫチェックポイントによって調節され得る（Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６  Ｊｕｌ；１７（７）：８１６−２４）。ＩＬ−１５は、ヒト、非ヒト霊長類、または他の任意の動物などの対象において腫瘍退縮を誘発し、及び／または転移を阻害または低減し、及び／または腫瘍進行を防止または低減し、及び／または生存率を増大させることができる。ＩＬ−１５剤としては、Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより販売されるＡｌｔ−８０３（ＩＬ−１５受容体α／ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質に結合されたＩＬ−１５突然変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）からなる新規なＩＬ−１５スーパーアゴニスト複合体）（Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ２０１８、Ｗｒａｎｇｌｅ  ２０１８、Ｒｏｍｅｅ  ２０１８）、ＩＬ−１５及びＩＬ−２のＰＥＧ化形態（Ｎｅｋｔａｒ／ＢＭＳにより開発されたように、ＩＬ−２に対する高い親和性を与えるＩＬ−２Ｒα鎖を利用しないように設計されたもの（ＮＫＴＲ−２１４、ＮＣＴ０３１３８８８９９、ＮＣＴ０２９８３０４５）及びＡｒｍｏ）、ＡＬＫＳ４２３０（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、ＮＣＴ０２７９９０９５）、及びヘテロ二量体ＩＬ−１５（Ａｄｍｕｎｅ／ＮｏｖａｒｔｉｓによるｈｅｔＩＬ１５、ＮＣＴ０２４５２２６８）が挙げられる。これらの初���の研究は、安全な用量及びＩＬ−１５アゴニスト治療に対する重要な薬力学的反応を確立している。がん治療における可能性、及び毒性及び短い半減期といったかかる治療としてのＩＬ−１５に関する問題は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｕｎｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９０：１５９−１６８（２０１７）に概説されている。ＩＬ−１５剤によるがん治療の有効性及び安全性は、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体などにより、ＩＬ−１５剤を腫瘍にターゲティングすることにより、または腫瘍細胞でプロセシングされる前にＩＬ−１５剤の活性を低下させることにより、または腫瘍細胞によるＩＬ−１５剤のトラフィッキング及び提示により高めることができる。
【０１３２】
ＩＬ−１５剤の影響を受ける免疫細胞サブセットは、腫瘍を根絶する能力を有する可能性がある。ＩＬ−１５剤は、ＩＬ−２との重要な違いを含み、複数の細胞タイプに影響を与える可能性がある。ＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５Ｒαとの融合体を含み得るが、この融合体は裸のＩＬ−１５剤と比較して顕著に高い効力及びインビボの循環時間を有し得る。
【０１３３】
ペプチドＩ／Ｏ複合体のいくつかの実施形態では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体（本明細書では、かかる複合体をＩＬ−１５  Ｉ／Ｏとも称する）である。かかるペプチド−ＩＬ−１５剤複合体のＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５フラグメントを含み得る。さらに、かかるペプチド−ＩＬ−１５剤複合体のＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα（ＩＬ−１５ＲαはＩＬ−１５受容体のα受容体鎖である）との融合体であり得る。したがって、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、少なくともＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαのヘテロ二量体融合体を含むことができ、このヘテロ二量体融合体は、ＩＬ−１５Ｒβ／γ受容体と結合または相互作用して、ＩＬ−１５Ｒβ／γに対する生物学的活性を誘導、活性化、または増強する、またはＩＬ−１５Ｒβ／γに対する活性を低減、遮断または阻害するといった所望の生物学的活性を得ることができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体のＩＬ−１５剤部分は、少なくとも１つのＩＬ−１５剤とその受容体の少なくとも１つのサブユニット（例えばＩＬ−１５Ｒα）とを含む融合体である。他の態様では、ＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５の少なくとも１つのフラグメントとその受容体サブユニットの少なくとも１つのフラグメント（例えばＩＬ−１５Ｒαのフラグメント）とを含む融合体であると理解される。ＩＬ−１５剤のＩＬ−１５Ｒα部分のそのようなフラグメントとして、本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、例えば、スシドメインとも呼ばれるＩＬ−１５Ｒαのエクソン２ドメイン、またはそのＮ末端にアミノ酸１３個のペプチドを含むエクソン３ドメイン、またはスシドメイン＋エクソン３由来のアミノ酸１３個のペプチドが挙げられる。かかる複合体及びフラグメントは、ＩＬ−１５Ｒβ／γに対する生物学的活性を誘導、活性化、または増強するか、またはＩＬ−１５Ｒβ／γに対する活性を低減、遮断、または阻害するようなかたちでＩＬ−１５Ｒβ／γと結合または相互作用する。さらに、ＩＬ−１５剤中のＩＬ−１５自体またはＩＬ−１５Ｒαとの組み合わせは、本明細書中に記載されるような変異を有することができる。ＩＬ−１５Ｒβ／γ受容体は、ヒトまたは非ヒト霊長類などのＴ細胞やＮＫ細胞の表面に発現され得る。
【０１３４】
このＩＬ−１５Ｒβ／γ受容体は、ＩＬ−２及びＩＬ−１５受容体の共通のサブユニットを含むことができ、ＩＬ−１５剤に対して低〜中程度の親和性を有し得る。ＩＬ−２及びＩＬ−１５剤に対する高親和性受容体はそれぞれが、サイトカイン特異的であり、サイトカイン結合の親和性を高める第３のα鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、完全長ＩＬ−１５Ｒαと細胞表面で非共有結合的に融合または複合体化されてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、投与に先立ってＩＬ−１５Ｒαと非共有結合的に融合または複合体化される。ＩＬ−１５剤とＩＬ−１５Ｒαまたはその一部との組み合わせはスーパーアゴニストとして作用することができ、ＩＬ−１５単独よりも高い効力を示すことができる。他の実施形態では、ＩＬ−１５剤は、投与後にＩＬ−１５Ｒαの可溶形態と複合体化されて循環することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒβγは、Ｍｏｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｊａｎ  ２０；２８１（３）：１６１２−９）に記載されるように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合体によって活性化され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαのエクソン２ドメインはスシドメインとも呼ばれ、ＩＬ−１５自体に融合させるうえで重要である可能性があり、そのＮ末端にアミノ酸１３個のペプチドを含むエクソン３ドメインは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合体を安定化させるうえで重要である可能性がある。スシドメインとエクソン３のアミノ酸１３個のペプチドは、ＩＬ−１５Ｒα「ｓｕｓｈｉ＋」または「ｓｕｓｈｉプラス」とも呼ばれる場合もあり、これについてはＢｏｕｃｈａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ｓｅｐ  ２６；３８２（１）：１−１２）に記載されている。ＩＬ−１５Ｒαの「ＩＬ−１５Ｒａ  ｓｕｓｈｉ＋」の配列は
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号１１７６）である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５Ｒａ  ｓｕｓｈｉ＋との融合体であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａ  ｓｕｓｈｉ＋とのＩＬ−１５融合体は、配列番号１１３５〜配列番号１１３８、配列番号１１７６〜配列番号１１７９、または配列番号１３４２に記載される配列のいずれか１つを含むことができ、配列はすべて表３に記載されている。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５  Ｎ７２Ｄと二量体ＩＬ−１５Ｒα  ｓｕｓｈｉドメイン−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質とを含む可溶性複合体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）とすることができるが、これは、Ｆｃドメインに融合されたＩＬ−１５ＲαＳｕとの非共有結合性の高親和性相互作用によって複合体化されたＩＬ−１５  Ｎ７２Ｄ突然変異体である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、配列番号１１７９
【化３】
2021506849.tif 000075
【化４】
2021506849.tif 000076
、Ｆｃドメインに融合されたＩＬ−１５ＲαＳｕ、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合体、太字部分はＩＬ−１５ＲαＳｕを示し、太字でない部分はＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃドメイン）を示す）、配列番号１１７９（Ｆｃドメインに融合されたＩＬ−１５ＲαＳｕ）、配列番号１１７８
（ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＤＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ，ＩＬ−１５  Ｎ７２Ｄ突然変異体）、及び配列番号１１７８（ＩＬ−１５  Ｎ７２Ｄ突然変異体）を含む複合体を含み得る。言い換えると、２個の配列番号１１７９の部分が２個の配列番号１１７８の部分と複合体化されてＩＬ−１５  Ｉ／Ｏを形成する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、配列番号１１７９（Ｆｃドメインに融合されたＩＬ−１５ＲαＳｕ）、配列番号１１７９（Ｆｃドメインに融合されたＩＬ−１５ＲαＳｕ）、配列番号１１７７（ＩＬ−１５）、及び配列番号１１７７
（ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、ＩＬ−１５）を含むことができる。言い換えると、２個の配列番号１１７９の部分が２個の配列番号１１７７の部分と複合体化されてＩＬ−１５剤を形成する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、ＸまたはＹの一方は配列番号１１７７または配列番号１１７８のいずれか一方であってよく、ＸまたはＹの一方は配列番号１１７９または配列番号１１７６であってよい）とすることができる。また、Ｌ０、Ｌ１、及びＬ２は、配列番号１１６３〜配列番号１１７２、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、または配列番号１３５９〜配列番号１３６６のいずれかを含んでよく、またはＸｎ（ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎ＝１〜５０であるか、または存在しなくともよい）であってよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、２個の配列番号１１７７の部分と配列番号１１７９の部分との複合体であってよい。他の実施形態では、ＩＬ−１５剤は、２個の配列番号１１７８の部分と配列番号１１７９の部分との複合体であってよい。例えば、ＩＬ−１５剤は、Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２であってよい（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤のＩＬ−１５
（ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ；配列番号１１７７）部分は、以下の変異、すなわち、Ｌ４５Ｄ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｌ４５Ｅ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｑ４８Ｋ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｖ４９Ｄ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｓ５１Ｄ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｌ５２Ｄ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｎ７２Ｄ（Ｚｈｕ  ２００９及びＵＳ００８１６３８７９）、Ｎ７２Ｅ（Ｚｈｕ  ２００９）、Ｎ７２Ａ（Ｚｈｕ  ２００９）、Ｎ７２Ｓ（Ｚｈｕ  ２００９）、Ｎ７２Ｙ（Ｚｈｕ  ２００９）、Ｎ７２Ｒ（ＵＳ００８１６３８７９）、Ｄ６１Ａ（ＵＳ００８１６３８７９）、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を有することができる。いくつかの実施形態では、上記に述べた変異のうちのいずれか１つまたは複数のものは、ＩＬ−１５の変異形態中に存在するか、または配列番号１１３５〜配列番号１１３８に組み込むことができ、ＩＬ−１５部分に充てた番号付けは以下、すなわち、Ｎ７２Ｄ、Ｌ４５Ｄ、Ｌ４５Ｅ、Ｑ４８Ｋ、Ｖ４９Ｄ、Ｓ５１Ｄ、Ｌ５２Ｄ、Ｎ７２Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｓ、Ｎ７２Ｙ、Ｎ７２Ｒ、またはＤ６１Ａである。かかる変異の任意の組み合わせまたは多くのものが、ＩＬ−１５突然変異体中に存在するか、または配列番号１１３５〜配列番号１１３８に組み込むことができる点は理解されよう。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドとＩ／Ｏとの複合体（ただし、Ｉ／ＯはＡＬＴ−８０３である）は、細胞内取り込みまたは腫瘍内濃度の増大、ならびに長期生存及び腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫応答を含む治療効果をもたらすことができる。ＡＬＴ−８０３及びＩＬ−１５剤は、本明細書に参照により援用するところのＵＳ２０１４０１３４１２８及びＨａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．２０１１  Ｄｅｃ；５６（３）：８０４−１０）に記載されている。ペプチドは必要に応じて、分子のＩＬ−１５  Ｎ７２Ｄ部分、分子のＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｆｃ部分、またはそれらの任意の組み合わせと、切断可能なリンカーまたは安定的なリンカーによって融合することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドとＩ／Ｏとの複合体（ただし、Ｉ／ＯはＩＬ−１５Ｒα／ＩＬ−１５Ｆｃである）は、細胞内取り込みまたは腫瘍内濃度の増大、ならびに腫瘍に対する抗腫瘍活性を含む治療効果をもたらすことができる。腫瘍は、膠芽腫及び黒色腫などの、本明細書に記載されるような任意の種類の腫瘍であってよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、機能及び活性を保持した任意のＩＬ−１５剤配列またはその任意のフラグメントもしくは変異体を含むことができる。すなわち、本開示のＩＬ−１５剤は、ＩＬ−１５受容体に結合して下流の細胞応答を刺激することが依然可能である、短縮及び／または変異されたＩＬ−１５剤であってよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮ（配列番号１４９１）
の配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号１２３３
（ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧＤＹＫＤＤＤＤＫＩＥＧＲＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ）または配列番号１２３４
（ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧＤＹＫＤＤＤＤＫＩＥＧＲＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ）、
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（配列番号１３４９）、または
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（配列番号１３５０）に示されるＩＬ−１５超アゴニストに融合することができ、細胞内取り込みまたは腫瘍内濃度の増大、ならびに長期生存及び腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫応答を含む治療効果をもたらすことができる。配列番号１２３３、配列番号１２３４、または配列番号１３４９、または配列番号１３５０中のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｘ３２、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、及びＸ５０のうちのいずれのものも、それぞれ個々に任意のアミノ酸残基であってよく、または存在しなくてもよい。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｘ３２、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、及びＸ５０のうちのいずれのものも、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３、または配列番号１３６５のうちのいずれか１つなどの本開示の任意の切断可能なリンカーを含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｘ３２、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、及びＸ５０のうちのいずれのものも、配列番号１１６３〜配列番号１１７２のうちのいずれか１つ、または配列番号１３５９、配列番号１３６４、配列番号１３６６のうちのいずれか１つなどの安定的なリンカーを含むことができ、さらに、場合により、切断可能なリンカーを含むことができる。前記融合体の前にはシグナルペプチドが配置されてもよく、その例示的な配列は、配列番号１２３２
（ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＰＰＡＴＲＧ）またはＩｇＧκリーダー配列（ＭＥＴＤＬＬＬＬＷＶＬＬＬＶＶＰＧＳＴＧ；配列番号１３６７）に示され、さらに、配列番号１１６２に示されるＦＬＡＧ−Ｘａ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＩＥＧＲ）などの精製タグ、またはＨｉｓｘ（ｘ＝１〜２０（配列番号１３６８）などのＨｉｓタグがその前またはその後に配置されてもよい。配列番号１２３３及び配列番号１２３４をそれぞれ図３及び図４に示す。図３及び図４におけるＸは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０を表す。
【０１４０】
ＩＬ−１５は腫瘍では細胞外で活性であるため、本開示は、ペプチドが腫瘍微小環境にホーミングし、分布し、ターゲティングし、移動し、プロセシングされ、または蓄積することができるペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を含むペプチドＩ／Ｏ複合体を提供することができる。その後、ペプチドは細胞透過に介在し、細胞内プロセシングにより、必要に応じて、高い局所濃度で、またはより高い生物活性で、または細胞表面においてペプチドＩ／Ｏ複合体からＩＬ−１５を放出することができ、または、ペプチドは腫瘍透過、及び／または腫瘍微小環境中のＩＬ−１５の細胞外送達に介在することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、本開示のペプチドとの融合体として化学的に結合されるかまたは組換えにより発現されたＩＬ−１５剤を含むことができる。これらの場合では、ペプチドとＩＬ−１５剤とは、必要に応じて切断可能なリンカーによって連結され、リンカーが腫瘍微小環境または腫瘍細胞内で選択的に切断され、それによりＩＬ−１５を切断後のより高い濃度及び／またはより高い効力で放出することができる。あるいは、ペプチドとＩＬ−１５剤とは、安定的なリンカーによって連結されてもよく、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体として活性であり得るか、またはリンカーが異化作用によって切断されるようにしてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドとＩ／Ｏとは、本明細書にさらに記載されるように、切断、解離、分解、プロセシングされ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、ペプチドの細胞透過特性により、エンドソーム、リソソーム、小胞体、またはゴルジ装置などの細胞内区画に到達することができる。そのような場合、リンカーは酸に対して不安定であってよく、エンドソームの酸性環境中で切断され得るか、または酵素的に切断可能であり得るか、または還元により切断され得る。この後、細胞表面へのサイトカインリサイクルが生じてもよく、その位置で必要に応じて切断が生じてもよい。他の実施形態では、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は共配合される。いくつかの実施形態では、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、リポソームなどの送達ビヒクル中に配合される。例えば、リポソーム粒子を本開示のペプチドでコーティングすることができ、さらにＩＬ−１５を配合することができる。粒子状ビヒクルは、細胞内区画への細胞取り込みを高めることができ、それにより、より高い濃度のＩＬ−１５がサイトカインリサイクル経路にアクセスできるようになる。他の実施形態では、ＩＬ−１５  ｍＲＮＡ剤をリポソームに封入することができ、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。他の実施形態では、ＩＬ−１５剤を発現ベクターによってコードすることもできる。ＤＮＡをリポソームに封入してもよく、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。このために、プロモーターを発現ベクター中に用いて、ＩＬ−１５剤ががん細胞内で一度だけ活発に発現されるようにすることができる。いくつかの実施形態では、以下の表３に示されるＩＬ−１５剤のいずれのものも、本開示の任意のペプチドと複合体化されたＩ／Ｏであってよい。本出願においてＩ／Ｏとして使用することができる他���ＩＬ−１５剤としては、いずれも本明細書に参照によりその全容を援用するところのＣｈｅｒｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１３  Ｊｕｎ；２８８（２５）：１８０９３−１０３），Ｏｃｈｏａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２；７３（１）：１３９−１４９），Ｂｏｕｃｈａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００８；２８３：１−１２），Ｋｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｊｕｎｅ；１１（６）：１２７９−１２８８），Ｋｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｊａｎ；１３（１）：１１２−１２１），Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：２０９９−２１０６），Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４  Ｎｏｖ；３（１１）：ｅ９６３４０９），Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０１２  Ｎｏｖ；２８（６）：１５８８−１５９７），Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．２０１１；２４（４）：３７３−３８３），Ｗｕ  ａｎｄ  Ｘｕ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０；２：２１７−２２２）に記載されるものが挙げられる。
【０１４１】
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、毒性を最小限にするために、ＩＬ−１５剤単独と比較して効力が大幅に低くなるようにプロドラッグとして設計されたペプチド融合体とすることもできる。腫瘍標的細胞によるこのペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の取り込み及びプロセシングによって、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体からペプチドが除去され、ＩＬ−１５剤のより高いまたは完全な効力の回復がもたらされる。このプロドラッグ形態は、プロドラッグでない場合に可能であるよりも高い用量のＩＬ−１５剤の投与を可能とする。腫瘍ターゲティングとペプチド−ＩＬ−１５剤複合体のプロドラッグ形態との組み合わせは、ＩＬ−１５療法の治療効果を改善することができる。
【０１４２】
プロドラッグ切断及びペプチド−ＩＬ−１５剤複合体からの完全な効力を有するＩＬ−１５剤の放出は、表面に発現されるか分泌される酵素のため、細胞表面及び／または腫瘍微小環境中でも生じ得る。このプロセスは、循環による場合と比較して腫瘍内により高い濃度の薬物を放出することができ、全身毒性を低く抑えた有効量の投与を可能とする。
【０１４３】
特定の場合では、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、潜在的なリガンド／受容体相互作用の検討後にのみ改変すればよい。例えば、ＩＬ−１５剤のＤ８を含む領域は、ＩＬ−２／１５受容体β鎖と相互作用し、この相互作用は、完全に機能するリガンド／受容体複合体に対して維持され得る。同様に、２個の自由にアクセスできるリシンＫ１０及びＫ１１のＰＥＧ化は、ＩＬ−２／１５受容体β鎖との相互作用が妨げられることからシグナル伝達ができないＩＬ−１５剤を生じる。Ｑ１０８を含むＩＬ−１５剤の領域は、共通のγ受容体鎖と相互作用することができ、完全に機能するリガンド／受容体複合体で保存されている可能性がある（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ．ａｌ  １９９７）。ＩＬ−１５剤は、Ｏ−またはＮ−結合グリコシル化タンパク質を生成することができず、生物学的アッセイで活性を有しうるＥ．ｃｏｌｉを用いた生産系で生産することが可能であることから、ＩＬ−１５剤のＯ−及び／またはＮ−結合グリコシル化は、活発なシグナル伝達またはリガンド／受容体相互作用にとって必要ではない可能性がある。したがって、ＩＬ−１５自体はグリコシル化されてもされなくてもよく、Ｅ．ｃｏｌｉなどのグリコシル化を行わない細胞、またはＣＨＯ、ピキア、もしくはＨＥＫ細胞などのグリコシル化を行う細胞で産生することができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、配列番号１１７７の配列を有するポリペプチドと会合した配列番号１１７９の配列を有する２個のポリペプチドから構成さる複合体である（天然のＩＬ−１５）。特定の実施形態では、このＩＬ−１５剤は、配列番号１１７９の２個のポリペプチド同士がジスルフィド結合によって共有結合され、さらに配列番号１１７９のそれぞれと配列番号１１７７との間の高親和性結合を介して非共有結合的に会合した複合体から構成される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５剤は、配列番号１１７８の配列を有する２個のポリペプチドと会合した配列番号１１７９の配列を有する２個のポリペプチドの複合体を含む（ＩＬ−１５のＮ７２Ｄ突然変異体）。特定の実施形態では、このＩＬ−１５剤は、配列番号１１７９の２個のポリペプチド同士がジスルフィド結合によって共有結合され、さらに配列番号１１７９のそれぞれと配列番号１１７８との間の高親和性結合を介して非共有結合的に会合した複合体から構成される。
【０１４６】
本明細書で使用するところの「ＲＬＩ」または「ＩＬＲ」は、ＩＬ−１５「受容体」（本明細書に記載されるＩＬ−１５受容体の変異体またはフラグメントのいずれかを意味する）とＩＬ−１５Ｒ「リガンド」（本明細書に記載されるＩＬ−１５の変異体またはフラグメントのいずれかを意味する）とを、これらの任意の組み合わせで連結したポリヌクレオチドまたはペプチドの複合体、及びこれらの任意のフラグメントを含むＩＬ−１５剤であるＩ／Ｏを記述して用いられる略語として用いられる。
【表３−１】
2021506849.tif 000077
【表３−２】
2021506849.tif 000078
【表３−３】
2021506849.tif 000079
【表３−４】
2021506849.tif 000080
【０１４７】
下記表４に、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の配列を示す。表４の配列番号１３１７〜配列番号１３５８及び配列番号１４２８〜配列番号１４３１では、タグは太字で示し、Ｓｕｓｈｉドメインは下線で示し、ＩＬ−１５剤のリンカーはイタリック体で示し、ＩＬ−１５剤は太字及び下線で示し、ペプチドとのリンカーは太字及びイタリック体で示し、切断可能な部位はイタリック体及び下線で示し、ペプチドは書式なしで示す。表４の配列番号１４３４〜配列番号１４４１では、ＩＬ−１５Ｒａ  Ｓｕｓｈｉ、それに続くＩｇＧ１ヒンジ（太字）、ＣＨ２＋ＣＨ３領域（Ｆｃ）（書式なし）、柔軟なリンカー（配列番号１３５９または配列番号１３６２）（下線）、及び配列番号５６９のペプチド（イタリック体で示す）を示す。
【表４−１】
2021506849.tif 000081
【表４−２】
2021506849.tif 000082
【表４−３】
2021506849.tif 000083
【表４−４】
2021506849.tif 000084
【表４−５】
2021506849.tif 000085
【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
2021506849.tif 000089
【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
2021506849.tif 000092
【０１４８】
Ｂ．  ４−１ＢＢリガンドを含むＩ／Ｏ
いくつかの実施形態では、本開示は、４−１ＢＢリガンドを含むＩ／Ｏを提供し、ここで本開示の４−１ＢＢリガンドは、場合により本開示のペプチドと複合体化されたアゴニストとすることができる。本開示の４−１ＢＢリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＴＮＦＳＦ９、またはＴＮＦＬ９とも呼ばれる腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー９とすることができる。ペプチドと４−１ＢＢリガンドとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書では「ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体」と称する場合がある。本開示の４−１ＢＢリガンドは、天然のヒト４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）タンパク質の活性な受容体結合形態である三量体として分泌され得る。いくつかの実施形態では、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体中の本開示の４−１ＢＢリガンドは、これらに限定されるものではないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び骨髄細胞（ＤＣ及び破骨細胞を含む）を含むさまざまな免疫細胞で発現される４−１ＢＢと相互作用することができる。さらなる態様では、４−１ＢＢリガンドは、ヒトコラーゲンのコラーゲンＣ−プロペプチドまたは他の三量体化ドメインなどの三量体化ドメインに融合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体中の本開示の４−１ＢＢリガンドは、ＣＮＳで発現される４−１ＢＢと相互作用することができる。４−１ＢＢリガンドは、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＤＣを含むＴｈ１応答を刺激し、メモリー機能、増殖機能、及び高いエフェクター機能（例えば、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞溶解）を促進する。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、サイトカイン、白血球増殖、腫瘍阻害、またはそれらの任意の組み合わせを誘導することができる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、Ｔｈ２及びＴｈ１７応答ならびにＡＩＣＤを阻害することができる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、ヒト、非ヒト霊長類、または任意の他の動物において腫瘍退縮を誘発することができる（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒａｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ５：１１７  （２０１５））。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、４−１ＢＢに対するモノクローナル抗体、ＣＤＲ、または抗体フラグメントとすることができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体、ＣＤＲ、または抗体フラグメントである４−１ＢＢリガンドは、強力な抗腫瘍応答を誘発することができる。抗４−１ＢＢモノクローナル抗体のｓｃＦｖは、本開示のペプチドに融合することが可能なＩ／Ｏであってよい。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、ウレルマブもしくはウレルマブのｓｃＦｖ、ウレルマブＣＤＲ、またはウレルマブ抗体フラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、ウトミルマブまたはウトミルマブのｓｃＦｖである。ウレルマブ及びウトミルマブの初期の臨床経験において、腫瘍応答のエビデンスを含む有望な結果が得られている（Ｃｈｅｓｔｅｒ  ２０１８，Ｔｏｌｃｈｅｒ  ２０１７，Ｓｅｇａｌ  ２０１８）。しかしながら、これらの治療に関連した顕著な毒性もあり（Ａｔｋｉｎｓ  ２０１８，Ｃｈｅｓｔｅｒ  ２０１８）、これは、奏功する４−１ＢＢリガンド療法は、本明細書に記載のペプチドＩ／Ｏ複合体を使用した腫瘍ターゲティングから利することを示唆するものである。
【０１５０】
４−１ＢＢリガンドは細胞外で活性であるため、本開示は、ペプチドが腫瘍微小環境にホーミングし、分布し、ターゲティングし、移動し、プロセシングされ、または蓄積することができるペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体を含むペプチドＩ／Ｏ複合体を提供することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は、本開示のペプチドとの融合体として化学的に結合するかまたは組換えにより発現させることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドと４−１ＢＢリガンドＩ／Ｏとは、切断可能なリンカーによって連結されることで、腫瘍微小環境中でリンカーが選択的に切断されることにより４−１ＢＢリガンドを高い濃度で放出することができる。場合により、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は、切断前により低い効力を有し、切断後はより高い効力を有し得るプロドラッグである。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドＩ／Ｏは、ペプチドの細胞透過特性により、エンドソームもしくはリソソーム、小胞体、またはゴルジ装置などの細胞内区画にアクセスすることができる。そのような場合、リンカーは酸に対して不安定でエンドソームの酸性環境中で切断され得るか、またはリンカーは酵素的に不安定でエンドソーム内で酵素によって切断され得る。この後、細胞表面または細胞外空間へのサイトカインリサイクルが生じてもよい。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、安定的なリンカーによってペプチドに連結することができ、活性であるが、ペプチドのホーミング、細胞透過特性、またはその両方のために、腫瘍微小環境中により高い濃度で蓄積する。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、小胞体及び／またはゴルジ装置の区画に集合し、その後、表面上で発現され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、ヒトコラーゲンのＣ−プロペプチド（テナシン−Ｃ三量体化ドメイン；配列番号１３７０）（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１８  Ｍａｙ  ９；８（１）：７３２７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８−０１８−２５６５２−ｗ．；Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００７  Ｄｅｃ；１４（１２）：２０２１−３４．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｕｇ  １７）またはコラーゲンα１（ＸＶＩＩＩ）ＮＣ１ドメイン（配列番号１３６９）（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ａｕｇ；９７（１６）：７２５３−６４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５３−０１２−４６０４−０．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｄｅｃ  ４．）などの三量体化ドメインとの融合タンパク質として発現させることができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、使用される４−１ＢＢリガンドがモノクローナル抗体である場合、４−１ＢＢリガンドを本開示の複数のペプチドに化学的に連結することができる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、細胞外でまたは内在化後に腫瘍細胞プロセシングの間に酵素的に切断され得る切断可能なリンカーを介してｓｃＦｖと組換えによって融合することができる。他の実施形態では、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は共配合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は、リポソームなどの送達ビヒクル中に配合することができる。例えば、４−１ＢＢリガンドをリポソームナノ粒子中に配合することができ、これを本開示のペプチドでコーティングすることができる。他の実施形態では、４−１ＢＢリガンドｍＲＮＡをリポソームに封入することができ、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。他の実施形態では、４−１ＢＢリガンドを発現ベクターによってコードすることもできる。ＤＮＡをリポソームに封入してもよく、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。これらの場合では、プロモーターを発現ベクター中に用いて、４−１ＢＢリガンドががん細胞内で一度だけ活発に発現されるようにすることができる。他の実施形態では、４−１ＢＢリガンドはアゴニストアプタマーであってもよい（Ｓｃｈｒａｎｄ  ２０１４）。
【表５−１】
2021506849.tif 000093
【表５−２】
2021506849.tif 000094
【表５−３】
2021506849.tif 000095
【０１５３】
Ｃ．  ＲＩＧ−Ｉリガンドを含むＩ／Ｏ
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のペプチドと複合体化されたＭＤＡ５リガンドまたはＴＬＲ３リガンドなどのＲＩＧ−Ｉリガンドまたは関連するリガンドを含むＩ／Ｏを提供する。ペプチドとＲＩＧ−Ｉリガンドとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書では「ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体」と称する場合がある。ペプチドとＭＤＡ５リガンドとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書では「ペプチド−ＭＤＡ５リガンド複合体」と称する場合がある。ペプチドとＴＬＲ３リガンドとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書では「ペプチド−ＴＬＲ３リガンド複合体」と称する場合がある。
【０１５４】
ＴＬＲ３はエンドソーム受容体であり、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５は、ウイルス感染に関連するものなど、５’末端の二リン酸または三リン酸（ＲＩＧ−Ｉの場合）を有する異常な二本鎖ＲＮＡの細胞質受容体である。ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５リガンドは、マウスにおける抗腫瘍免疫及びアポトーシスの促進に有効であり得る（Ｗｕ  ２０１７，Ｙｕ  ２０１６）。ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５はいずれもＲＮＡヘリカーゼであり、いずれもリガンド特異性に関与するＣ末端ドメインと、ＭＡＶＳを介したシグナル伝達を可能にする２個のＮ末端ＣＡＲＤドメインを有し、いずれも細胞質に存在する。どちらも内部ＲＮＡ二本鎖構造を認識するが、ＲＩＧ−ＩはｄｓＲＮＡの５’末端も認識することができる（Ｗｕ  ２０１３）。
【０１５５】
ＲＩＧ−ＩまたはＭＤＡ５のリガンド結合はＭＡＶＳ依存性シグナル伝達経路の活性化をもたらし、抗ウイルス免疫及び抗腫瘍免疫につながり（Ｅｌｉｏｎ  ２０１８）、ＴＬＲ３の活性化によって誘導される遺伝子発現とは異なるＩ型ＩＦＮを含む炎症性物質の産生を引き起こす。ＲＩＧ−ＩまたはＭＤＡ５の活性化はさらにインフラマソームの活性化をもたらし、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、及びＤＡＭＰＳの分泌など、抗腫瘍免疫を促進する腫瘍微小環境の変化をもたらす。ポリＩ：ＣがＴＬＲ３ではなくＭＤＡ５をターゲティングするようにトランスフェクトされると、マウスの抗腫瘍免疫が効果的に増強される（Ｂｈｏｏｐａｔｈｉ  ２０１４）。ＭＤＡ５とＴＬＲ３は同様の二本鎖ＲＮＡリガンドを認識し、５’末端の三リン酸を必要としない（Ｌｉｎｅｈａｎ  ２０１８）。詳細には、ＭＤＡ５及びＴＬＲ３はいずれもポリＩ：Ｃを認識するが、異なる細胞区画においてもポリＩ：Ｃ認識する。ＴＬＲ３以外に、ＴＬＲ７、８、及び１０を含む、ｄｓＲＮＡを検知する他のＴＬＲがエンドソームに存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガンドを本開示のペプチドに結合することでその複合体はＲＩＧ−１またはＭＤＡ５を活性化し、場合によってはさらに、エンドソームのＲＮＡ検知ＴＬＲの１つを活性化することができる。場合によっては、エンドソームＴＬＲのみがトリガーされるか、複合体が１つまたは他の受容体に対して特異的である場合もある。
【０１５６】
ヒトの疾患を引き起こす多くの生物は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）に結合することなどによって宿主によって検出され得ることで、感染から宿主を保護する自然免疫応答を活性化する、核酸、糖、またはリポタンパク質などのいわゆる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）を有している。異常ＲＮＡは、抗ウイルス免疫応答の開始につながるウイルス感染からの主要な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）である。これらのＲＮＡは、ウイルスの感染時に、主として分節マイナス鎖ウイルスによって生じ得る。これらのウイルスとしては、限定されるものではないが、高病原性ウイルス、インフルエンザ、麻疹、おたふく風邪、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、及びパラインフルエンザ、ならびにニューカッスル病ウイルス、ハンタウイルス、マールブルクウイルス、エボラウイルス、及び狂犬病ウイルスが含まれる。これらのＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ワクシニア、及び単純ヘルペスウイルスなどの一部のＤＮＡウイルスに感染する際にも生じ得る。ＴＬＲ３は、レオウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、フラビウイルス、及び西ナイルウイルス由来のＲＮＡを認識する。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、エンドソームにおいても、センダイウイルス（ＳｅＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、及びレトロウイルスの感染によって生じるＲＮＡを認識する。ＴＬＲ１０は、ＲＮＡを認識する別のエンドソームＴＬＲであるが、そのリガンドについてはあまり知られていない。ＭＤＡ５は、ＥＭＣＶ、ポリオ、及びコクサッキーウイルス、ならびにレオウイルスからのｄｓＲＮＡを認識する（Ｃｈｅｎ  ２０１７）。
【０１５７】
ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５はいずれも、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達（ＭＡＶＳ）タンパク質を介してシグナル伝達し、これにより、ＩＲＦ３／７及びＮＦκＢ因子を介したシグナル伝達が開始される（Ｗｕ  ２０１７）。ＭＡＶＳはまた、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）につながる腫瘍細胞アポトーシスのＲＬＲ活性化による開始にとっても重要である。さらに、ＲＩＧ−Ｉは複数のインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）を利用することができる。したがって、ＲＩＧ−ＩまたはＭＤＡ５とＲＩＧ−Ｉ特異的リガンドとの結合は抗ウイルス免疫機構を活性化することができ、それにより腫瘍に対する治療効果をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ−１またはＭＤＡ５とＲＩＧ−１リガンドとの結合は、腫瘍細胞の直接的な免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導することができるが、正常細胞の細胞死は誘導しない。これにより、免疫系に対する腫瘍抗原のＤＣによる提示が生じ得る。５’末端の三リン酸ｄｓＲＮＡによるＲＩＧ−ＩまたはＭＤＡ５の結合により、炎症性サイトカインＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮβ、及びその他の分泌が生じ得る。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ−１またはＭＤＡ５リガンドは、インフラマソーム活性を含むＤＣ活性化を刺激することができる。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、腫瘍細胞がＩＲＦ３経路を介してＩＦＮ及びＣＸＣＬ１０を産生するように誘導することができる。ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５リガンドの多様な免疫原性活性の結果として、抗腫瘍Ｔ細胞が誘導され得る。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ−１またはｍＤＡ５リガンドは、ヒト、非ヒト霊長類、または他の任意の動物などの対象において腫瘍退縮を誘導することができる（Ｂｈｏｏｐａｔｈｉ  ２０１４，Ｅｌｉｏｎ  ２０１８）。ＲＩＧ−ＩリガンドはさらにＴｈ１７及びＴｒｅｇ応答を阻害することができる（Ｙａｎｇ  ２０１７）。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本開示のＩ／Ｏは、ＲＩＧ−１と同じ機能の多くを共有する、ｄｓＲＮＡに対する関連する細胞質センサーであるＭＤＡ５をターゲティングとすることができる。ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５はいずれもＲＮＡヘリカーゼファミリーに属し、いずれもウイルスのｄｓＲＮＡに結合し、ＭＡＶＳを介してシグナル伝達する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＲＩＧ−Ｉまたは他のＲＮＡセンサーに対するオリゴヌクレオチドリガンドは、特定の遺伝子の発現を調節するように機能する配列も含む。このような配列としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Ｌａｉｎａ  ２０１８）、及び非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ならびにスプライス修正オリゴヌクレオチド（ＳＣＯ）（Ｔｈｉｅｒｒｙ  ２００６）、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム（Ｍａｊｏ  ２０１８）が挙げられる。かかる薬剤は、特定のタンパク質の翻訳を調節するか、または特定のタンパク質標的を直接阻害または活性化するように作用し得る。
【０１６０】
ＲＩＧ−Ｉリガンドは、短いｄｓＲＮＡを含み得る（少なくとも５〜６０塩基対、少なくとも５〜１０塩基対、少なくとも７〜１０塩基対、少なくとも１１〜１８塩基対、少なくとも１４〜１２０塩基対、少なくとも５〜１５塩基対、少なくとも１５〜２５塩基対、少なくとも２５〜４０塩基対、少なくとも４０〜６０塩基対、少なくとも６０〜８０塩基対、少なくとも８０〜１００塩基対、少なくとも１００〜１２０塩基対、少なくとも１２０〜１４０塩基対、少なくとも１４０〜１６０塩基対、及び、最適には少なくとも１９〜６０塩基対であり、少なくとも１つの５’末端の三リン酸（二リン酸も許容できる）、及びキャップされていない５’末端のＡまたはＧ、平滑末端の５’末端三リン酸（３リン酸を有する５’末端における１ヌクレオチドの重複である１ｎｔ  ５’重複も許容される）を有する）。（Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６  Ｎｏｖ  １０；３１４（５８０１）：９９４−７；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００９  Ｊｕｌ  ２１；１０６（２９）：１２０６７−７２を参照）。少なくとも１つの５’三リン酸または５’二リン酸は、好ましくは得られるｄｓＲＮＡのセンス鎖の５’末端に位置し得る。５’三リン酸から遠位に位置する場合、例えば、５’末端から８塩基対以上離れている場合、ｄｓＲＮＡ内のミスマッチが許容できる。このことは、本開示のリンカー及び／またはペプチドとの結合などの他のＲＮＡ修飾も、５’三リン酸部位から遠位に位置する、例えば５’末端から８塩基対以上離れている場合には許容され得ることも示す。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、そのリボシドの一部が同じヘアピン内のパートナーと対をなしたヘアピンＲＮＡであり、５’三リン酸をさらに有する。ＲＩＧ−Ｉリガンドとなり得る短い５’三リン酸ｄｓＲＮＡとしては、配列番号１１８０〜配列番号１１８７、配列番号１２０３、配列番号１２０５、及び配列番号１１９３〜配列番号１２０２に記載されるようなポリリボヌクレオチドから構成されるもの（それ自身の上に折り返され得ることでｄｓＲＮＡを形成するヘアピン構造を示す）、ならびに本明細書に記載される５’三リン酸を有し、二本鎖（センス／アンチセンスとして、またはヘアピンとして）ＲＮＡである他の多くの配列が挙げられる。本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの塩基対合領域は、ＲＮＡ配列のより長い及び／または一本鎖との関連において、または別々のポリリボヌクレオチドとの関連において、対合する際に本明細書に記載されるような二本鎖部分を有するようになる対合したポリリボヌクレオチドであり得る点は理解されよう。
【０１６１】
さらなる配列は、Ｓｃｈｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００９  Ｊｕｌ  １７；３１（１）：２５−３４）にも記載されている。ＲＩＧ−Ｉリガンドを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖とを二本鎖の形態に組み合わせるために用いられるさまざまな方法によって作製することができる。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、各種の組換え技術または合成技術を用いて別々に転写または合成してから、ｄｓＲＮＡ構造に組み合わせることができる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をループ構造（ヘアピン）を含む一本鎖ＲＮＡとして転写または合成し、このループ構造を必要に応じて後でＲＮＡｓｅで切断することによりｄｓＲＮＡを得ることもできる。ループ構造（ヘアピンなど）は、ポリリボヌクレオチドの長さ及び組成において異なり得る。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造はループ構造を有することができる。他の実施形態では、ヘアピン構造はループ構造を有さない。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造は、対合したｄｓＲＮＡ構造内にミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ  ＬによるＵリッチなサイトゾルＲＮＡの切断により生成される短いｄｓＲＮＡがＲＩＧ−１リガンドとなり得る。分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスの場合、そのようなＲＩＧ−Ｉリガンドは、保存された相補的な５’及び３’ゲノム末端の塩基対合によって形成された「パンハンドル」に見出され、これがＲＩＧ−Ｉを活性化することができる。狂犬病ウイルスのパンハンドルに相当するＲＩＧ−Ｉリガンドを一例として配列番号１１８８に示す。一部のウイルスでは、ＲＩＧ−Ｉを回避するために、ＲＮＡの５’末端にミスマッチを進化させている。インフルエンザウイルスゲノムプロモーターは、そのほぼ相補的なゲノム末端に含まれ、配列番号１１８９〜配列番号１１９２のうちのいずれか１つに記載されるものなどの、ＲＩＧ−Ｉを活性化することができる５’ｐｐｐ平滑末端ｄｓＲＮＡを形成することができる（Ａｎｃｈｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ７；９０（１）：５８６−９０）。ＲＩＧ−Ｉリガンドとして機能し得るさらなるウイルスパンハンドル配列としては、配列番号１１９３〜配列番号１１９８が挙げられる。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｓｅｐ  ３０；４４（１７）：８４０７−１６），Ｇｏｌｄｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４；１１６９：１５−２５），及びＳｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００９  Ｊｕｌ  ２１；１０６（２９）：１２０６７−７２）に記載されるＲＩＧ−Ｉリガンドを、本明細書においてＩ／Ｏとしてさらに使用することができる。そのような場合、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、一方または両方の鎖に５’二リン酸または三リン酸基を有する、２本鎖として互いに複合体化された２本のＲＮＡ鎖から構成されるものとするか、または分子の１つ以上の位置で二本鎖となるヘアピンとして互いに複合体化された１本鎖ＲＮＡから構成されるものとすることができる。二本鎖は配列全体にわたって延在してもよく、またはミスマッチの領域があってもよく、一方または両方の鎖内にヘアピンで自己会合する１つ以上の位置があってもよい。さらに、二本鎖の末端は同じ平滑位置にあってもよく、または一方または他方の末端が突出してもよい。ＲＮＡ複合体内のヘアピンやその他の構造は、より免疫原性が高い場合があり、ＲＩＧ−Ｉ経路をより高いレベルで活性化することができる。ＭＤＡ５リガンドもまた、上記の構造的バリエーションのすべてを呈してもよいが、５’リン酸を有さずともまたは１個の５’リン酸を有してもよい。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、図５に示され、また、Ｐｒｏｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１７  Ａｐｒ  ４；３５（１５）：１９６４−１９７１）に記載されるように、非核酸ベンゾビスチアゾール化合物としてもよい。
【０１６２】
ＲＩＧ−ＩリガンドのＲＮＡ骨格または塩基を修飾することにより、血清中安定性を含むインビトロ及びインビボの安定性、製造性、保存安定性、または塩基対合親和性及び免疫系の活性化を含む分子の他の特性を向上させることができる。ピリミジンは２’−フルオロ修飾することができ（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１７  Ｊｕｎ  ７；２５（６）：１２９５−１３０５）、これによりヌクレアーゼに対する安定性を高めるだけでなく、免疫系の活性化を高めることができる。ＲＮＡ骨格は、ホスホロチオエート置換（非架橋酸素が硫黄で置換される）することができ、これにより、ヌクレアーゼ消化に対する耐性を高めることができるばかりでなく、生体内分布及び組織保持率を改変し、タンパク質結合を増大させることなどによって薬物動態を高め、また、より多くの免疫刺激を誘導することができる。ＲＮＡのホスホン酸メチル修飾を用いることもできる。２’−Ｏメチル及び２’−Ｆ  ＲＮＡ塩基を使用することができ、これにより、塩基の加水分解及びヌクレアーゼから保護し、二本鎖の融解温度を上げることができる。修飾はまた、架橋された核酸、モルホリノ核酸、ＰＮＡ、ＬＮＡ、エチルｃＥｔ核酸も含み得る。リボースの２’位の酸素と４’位の炭素間のＮ−Ｏ結合などの任意の化学架橋を含む架橋形態、ロック形態、及び他の同様の形態のＢｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＢＮＡ、ＬＮＡ、ｃＥｔ）を組み込むことでエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対する耐性を高め、生物学的安定性を高めることができる。このようなものとしてはＢｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＢＮＡ）が挙げられ、その場合、２’位と４’位の炭素間にＮ−Ｏ結合が存在し、架橋内の窒素（ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３、Ｎ−ベンゼンを含むがこれに限定されない）の任意の化学修飾を加えることで安定性を高めることができる。ＲＮＡの骨格または塩基の修飾は、１個、複数個、またはすべての塩基の位置など、ＲＮＡ配列内の任意の場所に行うことができる。必要に応じて、修飾は、５’三リン酸を有し、ヘリカーゼと相互作用するｄｓＲＮＡ複合体の末端から遠位に行うことができる。このようなＲＮＡの骨格または塩基の修飾は、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体によるＲＩＧ−Ｉ活性化のレベルを高めるか、低めるか、または影響を及ぼさない場合がある。必要に応じて、ホスホロチオエート核酸を、一方または両方の配列の２〜３個の末端核酸に使用することができる。必要に応じて、２’Ｆ修飾核酸を、内部位置の少なくとも２〜４個の位置、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、内部位置の少なくとも５０％、少なくとも７５％、または最大１００％に用いるか、すべての内部位置またはすべての位置に用いることができる。
【０１６３】
ＲＩＧ−Ｉリガンドは、例えば、リンカー及びペプチドへの結合、または脂質、コレステロール、もしくは炭化水素鎖などのさらなる送達剤への結合などの化学修飾を可能にするために、配列内に存在するさらなる修飾ヌクレオチドまたは塩基を有してもよい。
【０１６４】
ＲＩＧ−Ｉは細胞内で活性であることから、本開示は、ペプチドが腫瘍微小環境にホーミング、分布、ターゲティング、移動、プロセシング、または蓄積することができるか、またはペプチドが、ＲＩＧ−Ｉリガンドが標的細胞の細胞質にアクセスできるように細胞に透過することが可能であるようなペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体を提供する。ＲＩＧ−ＩリガンドはＲＩＧ−Ｉヘリカーゼと接触する場合にはそれ自体でＲＩＧ−Ｉヘリカーゼを活性化できると考えられるが、インビボまたはインビトロで細胞に適用する場合には低濃度でしか細胞質にアクセスできず、そのため、ＲＩＧにアクセスして活性化することができないと考えられる。本開示のペプチドを用いない場合、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、トランスフェクション試薬または細胞質にアクセスするための他の成分を含む製剤を必要とすると考えられるが、これは、毒性、安定性、安全性の問題、または製剤を全身に適用できない（静脈内または皮下投与などにより）ことにより、ヒトのがん治療には実用的でなく、充分な量の活性剤を腫瘍に送達することができないものと考えられる。本開示のペプチドをＩ／Ｏと組み合わせて、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体を含むペプチドＩ／Ｏ複合体を作製することにより、ＲＩＧ−Ｉをインビボで活性化させて抗がん治療を行うことができる。例えば、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉ  Ｉ／Ｏ複合体中のＲＩＧ−Ｉリガンドは、エンドソーム内でのペプチドＩ／Ｏの切断によって標的細胞の細胞質にアクセスできるか、またはエンドソームからサイトゾル中に出た後、複合体から解離したＲＩＧ−Ｉリガンドが細胞質にアクセスすることができるか、または本明細書に記載される他の任意の機構を介して細胞質にアクセスすることができる。ＲＩＧ−Ｉリガンドは、場合により、切断されることなく細胞質及びＲＩＧ−Ｉにアクセスすることもできる。ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は、ペプチドが、ヘリカーゼを活性化するＲＩＧ−Ｉリガンドの末端から遠位に位置するように設計することができ、こうすることで、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は切断されずに活性を示すことができる。Ｄｅｖａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１１３（３）：５９６−６０１，２０１６の結晶構造に示されるような、ＲＩＧ−ＩリガンドとＲＩＧ−Ｉヘリカーゼとの間の相互作用を分析してペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体を設計することができる。ペプチドＩ／Ｏ複合体において、本開示のペプチドは、ＲＩＧ−Ｉ  Ｉ／Ｏの５’ｐｐｐ末端から３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上の塩基対のように５’ｐｐｐ末端から所定数の塩基対だけ離れた位置に配置することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５’ｐｐｐ末端から７〜２０個の塩基対だけ離れて結合される。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５’ｐｐｐ末端から２０個よりも多くの塩基対だけ離れて結合される。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ−１リガンドＩ／Ｏは、ペプチドに化学的に結合させることができる。例えば、ペプチドとＲＩＧ−Ｉリガンド��／Ｏとは切断可能なリンカーによって連結することができるため、リンカーは、エンドソームまたはサイトゾル中といった細胞内に入ると選択的に切断され、それにより、ＲＩＧ−Ｉリガンドが高い濃度で細胞内に適宜放出されることで細胞内ＲＩＧ−Ｉにターゲティングすることができる。ペプチドとＲＩＧ−Ｉリガンドとは、ペプチドが除去されるまでＲＩＧ−Ｉが不活性であるかまたはペプチドによってその受容体への結合が阻害されるように連結することができ、それにより非がん性組織のＩ／Ｏへの曝露を低減することができる。例えば、リンカーは、細胞質、エンドソーム−リソソーム経路、細胞の表面上、または腫瘍微小環境中の還元的環境で切断されるジスルフィド結合とすることができる。他の実施形態では、リンカーは、酸に不安定であってもよく、それによりリンカーはエンドソーム−リソソーム経路の酸性環境中で切断される。他の実施形態では、リンカーは、酵素的に切断可能であってもよく、それによりリンカーはエンドソーム−リソソーム経路、サイトゾル内、または腫瘍微小環境中の酵素によって切断される。他の実施形態において、ペプチド−ＲＩＧ−１リガンド複合体は、異化経路の一部として切断されてもよい。他の実施形態では、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は共配合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は、リポソームなどの送達ビヒクル中に配合することができる。他の実施形態では、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は、リポソームに封入することができるＲＩＧ−Ｉリガンドを含み、リポソームを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。他の実施形態では、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は、安定的なリンカーによって連結することができ、複合体として活性である。リンカーは、エンドソームからの脱出、エンドソームへの取り込み、腫瘍への組織生体内分布、または細胞透過性を高めるペプチドまたは化学構造としてのさらなる機能を有することができる。細胞透過性またはエンドソーム脱出性のペプチド配列を、リンカーに、またはペプチドの他方の端部に付加することができる。リンカーは、疎水性ドメイン（（ＣＨ２）ｘ（ただしｘ＝１−３０）など）、コレステロール、ＬＣＡ、ＤＨＡ、またはＤＬＡ、親水性ドメイン（ヒドロキシル基またはオリゴエチレングリコールなど）、または細胞成分と相互作用を行うためのペプチドとＲＩＧ−Ｉリガンドとの運動自由度を与える柔軟なドメイン（（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｘ（ただしｘ＝１〜１０、１〜３０、２０〜１００、１００〜１０００）など）から構成されるものとすることができる。
【０１６５】
本開示のペプチドは細胞透過性であってよく、エンドサイトーシスされ、ピノサイトーシスされ、細胞によって取り込まれ、及び／またはがん細胞などの細胞の細胞質にアクセスすることができる。本開示のペプチド及びその変異体の一部のものは、エンドサイトーシスによる膜輸送に関与するカルシウム調節リン脂質結合タンパク質（Ｌｉｚａｒｂｅ  ２０１３）であるアネキシンＡ２の特異性により、腫瘍細胞に選択的に結合することができる（Ｍｏｒｅｌ  ２００９）。アネキシンＡ２はがん細胞の表面で過剰発現し、これは予後不良と関連している（Ｓｈａｒｍａ  ２０１８）。アネキシンＡ２は、微小小胞体形成、小胞凝集、食作用、ヌクレオチド及びタンパク質のトラフィッキングなどの膜トラフィッキング事象に関与し、さらに、パピローマウイルスのエンドソームへの送達、及びウイルスＤＮＡのＭＶＥ及びＴＧＮを介した核への輸送において役割を担っている（Ｔａｙｌｏｒ    ２０１８）。アネキシンＡ２は、治療用オリゴヌクレオチドの輸送にも関与しており、エンドソーム放出を促進すると考えられる（Ｗａｎｇ  ２０１６）。ＤＮＡ送達におけるアネキシンＡ２の役割、及びＴＧＮを含むさまざまなエンドソーム区画へのクロロトキシンペプチドの既知の輸送（Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｌ  １１：１−１３  （２０１１））を考慮すると、本開示のペプチド−ＲＩＧ−Ｉ複合体は、細胞質へのＲＩＧ−Ｉリガンドの送達を促進することができる。同様に、インビボ研究によって、例えば、配列番号１２４３〜配列番号１２６２のペプチドのような、ＬＣＭＩ−ＩＩペプチド、ＴＨＰ１ペプチド、及びキモトリプシン阻害剤としても知られるパシファスチンペプチドが腫瘍の細胞に蓄積し、細胞を透過する能力も示されている（Ｓｏｔｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：５１−６０（２０１８））。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、Ｉ／ＯとしてＲＩＧ−Ｉリガンドを含む本開示の例示的なペプチドＩ／Ｏ複合体は、図３４〜図４４及び図５５〜図７９に記載される構造で示される。特定の実施形態では、Ｉ／ＯとしてＲＩＧ−Ｉリガンドを含む本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体の１つが図３７に示される。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ−Ｉリガンドを含む本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、配列番号５６９のペプチドと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するペプチドを含み、安定的なリンカーを含み、配列番号１３７１のＲＩＧリガンドを含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、配列番号１１８０〜配列番号１２０６のいずれのものも、センス鎖の５’末端に少なくとも三リン酸または二リン酸を有することができる。いくつかの実施形態では、配列番号１１８０〜配列番号１２０６は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５’末端に１つ以上の５’三リン酸または１つ以上の５’二リン酸を有することができる。いくつかの実施形態では、配列番号１１８０〜配列番号１２０６のいずれのＲＩＧ−１刺激活性も、センス鎖上の５’ｐｐｐの存在を必要とし得る。他の実施形態では、配列番号１１８０〜配列番号１２０６のいずれのものも、５’三リン酸を含まない。いくつかの実施形態では、Ｌｅｅ  ２０１６で考察されているように、ｄｓＲＮＡ配列のいずれかへの２’フルオロピラミジンの組み込みによって、ＲＩＧ−Ｉの活性化を高めることができる。下記表６に、本開示の例示的なＲＩＧ−１リガンドを含む例示的なＩ／Ｏを列挙する。表６に記載されるすべての配列において、５’末端は、５’三リン酸（５’ｐｐｐ）、５’二リン酸（５’ｐｐ）、５’一リン酸（５’ｐ）を有するか、またはリン酸を有さなくともよい。
【表６−１】
2021506849.tif 000096
【表６−２】
2021506849.tif 000097
【表６−３】
2021506849.tif 000098
【表６−４】
2021506849.tif 000099
【表６−５】
2021506849.tif 000100
【０１６８】
Ｄ．インターフェロン遺伝子タンパク質（ＳＴＩＮＧ）リガンドの刺激物質を含むＩ／Ｏ
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のペプチドと複合体化されたＳＴＩＮＧリガンド、例えばアゴニストを含むＩ／Ｏを提供する。ペプチドと、標的に対してアゴニストとして作用するＳＴＩＮＧリガンドなどのＳＴＩＮＧリガンドとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書では「ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体」と称する場合がある。ＳＴＩＮＧは、ウイルス感染に対する自然免疫の重要な要素であり、サイトゾルのｄｓＤＮＡ（ウイルスシグナル）に応じてＩ型ＩＦＮの産生を調節することができる。ＳＴＩＮＧは、細胞質酵素ｃＧＡＳ（パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって生成され得る環状ジヌクレオチド（例えば、Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｍａｙ；３７（５）：２０７−２１３））に開示される２’，３’−ｃＧＡＭＰ）と反応することができる。ＳＴＩＮＧは、ＥＲに付随して細胞質中に存在し得るタンパク質であり、ｄｓＤＮＡを放出するウイルスによる細胞の感染に応じたＩ型ＩＦＮなどの炎症性サイトカインの産生の主要な調節因子と考えられている。細胞質内のｄｓＤＮＡの存在は、ｃＧＡＳを刺激して環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の合成を触媒することができる。この分子は、２’３’−ｃＧＡＭＰと呼ばれ、Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｍａｙ；３７（５）：２０７−２１３）に記載されるように他のホスホジエステル結合の組み合わせを含むｃＧＡＭＰ分子よりも大幅に高い親和性でＳＴＩＮＧと結合することができる。２’，３’−ｃＧＡＭＰは、ＳＴＩＮＧをトリガーしてＩＲＦ３及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達を活性化することができる。２’，３’−ｃＧＡＭＰはＳＴＩＮＧの生理学的リガンドになり得るが、他の環状ジヌクレオチドも活性を示す。図７は、Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｍａｙ；３７（５）：２０７−２１３）に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる上記のＳＴＩＮＧリガンドを示す。ＳＴＩＮＧは核周囲小胞体（ＥＲ）に付随して位置し、活性化されるとゴルジ体に移行することができる。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧリガンドは、抗ＰＤＬ１チェックポイント阻害剤との相乗作用を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧリガンドは、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性抗腫瘍活性を促進する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍活性の相乗作用及び促進は、インターフェロン分泌を介するなど、ＳＴＩＮＧリガンドの間接的活性によるものであり得る。２’３’−ｃＧＡＭＰが非常に強力なそのＳＴＩＮＧリガンドである腫瘍内環状ジヌクレオチドは、腫瘍退縮の誘導に効果的であると考えられる。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧリガンドは、ＩＲＦ３及びＮＦＫＢをトリガーすることができ、腫瘍細胞及びインフラマソームアセンブリによるＩ型ＩＦＮ及び他の炎症性サイトカインの産生をもたらす（ＩＬ−１／ＩＬ−１８分泌を含む）。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧリガンドは、腫瘍細胞由来のＤＮＡのＤＣによる取り込み後の骨髄細胞によるインターフェロン分泌及び共刺激性リガンド発現を活性化することにより、腫瘍特異的エフェクターＴ細胞応答を促進することができる。ＳＴＩＮＧリガンドはがんのマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有し、いくつかの強力なヒトＳＴＩＮＧリガンドが臨床試験にまで進んでいる（Ｖａｒｇａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７５：８６−９７（２０１７））。ＳＴＩＮＧはまた、ｃＧＡＳを刺激してｃＧＡＭＰを生成することによって間接的にも刺激され得る。ｃＧＡＭＰは、細胞質中のｄｓＤＮＡを長さに依存して検出する。ｃＧＡＳは、細胞質内のｍｔＤＮＡだけでなく、細菌またはウイルス病原体に由来する短い（２０ｂｐ）または５０ｂｐ以上のｄｓＤＮＡに最もよく反応する。ｃＧＡＳリガンドはｓｓｔＤＮＡを含み、これは、
ＣＡＧＡＣＧＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＧＴＴＣＣＣＴＡＧＴ（配列番号１５１３）または
ＣＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＣＴＴＡＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＧＧＴ（配列番号１５１４）または
ＣＡＧＧＧＧＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧＧＴ（配列番号１５１５）
などのＨＩＶ感染の際に生じるもののような一本鎖のステムループ構造である（Ｈｅｒｚｎｅｒ  ２０１５）。
【０１６９】
環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）は、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５リガンドと同様、細胞内区画にアクセスできないために治療効果が低くなり得るＳＴＩＮＧリガンドである。ＣＤＮの配合物は、マウスモデルにおいて抗腫瘍免疫応答の活性化を促進し（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ａｐｒ  １５；７（２８３）：２８３ｒａ５２）、低い細胞膜透過性及び代謝不安定性を有し、そのため、医療へのその応用は限定され得る。したがって、細胞のエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ１）の分解に耐性を有する新規ＣＤＮを生成するために、薬化学的な取り組みが行われている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ；１１（９）：７４１）及びＬｉｏｕｘら（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３；５９（２２）：１０２５３−１０２６７））。いくつかの実施形態では、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ；１１（９）：７４１）及びＬｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３；５９（２２）：１０２５３−１０２６７）に開示されるＣＤＮを、本開示の任意のペプチドとのＩ／Ｏとして使用することができる。ナノ粒子またはリポソームによるＣＤＮの送達はインビボでの抗腫瘍活性を向上させることができる（Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５  Ｊｕｎ；１２５（６）：２５３２−４６）。さらに、ヒトＳＴＩＮＧの単一のＳ１６２Ａ置換はＤＭＸＡＡ感度を付与することができる（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１３  Ａｕｇ  １５；１５４（４）：７４８−６２）。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＩＮＧリガンドは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ．２０１３  Ａｕｇ  １５；１５４（４）：７４８−６２）に開示されるようなＤＭＸＡＡ類似体とすることができる。Ｇ１０、または４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−Ｎ−（フラン−２−イルメチル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−カルボキサミドは、ＳＴＩＮＧ特異的アゴニストである可能性がある。本開示のＩ／Ｏは、ヒト線維芽細胞においてアルファウイルスに対する抗ウイルス応答を誘導することができる（Ｓａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１５  Ｄｅｃ  ８；１１（１２）：ｅ１００５３２４））。いくつかの実施形態では、Ｇ１０、または４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−Ｎ−（フラン−２−イルメチル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−カルボキサミドは、Ｓａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１５  Ｄｅｃ  ８；１１（１２）：ｅ１００５３２４）に開示されるように、ＳＴＩＮＧリガンドである可能性がある。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＩＮＧリガンドは、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ；１１（９）：７４１）に開示されるように、ホスホロチオエート結合を有するものとして開発された加水分解耐性を有する類似体とすることができる。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ；１１（��）：７４１）に報告されているように、酵素エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ１）は、細胞、組織抽出物、及び血液中の主要な２’３’−ｃＧＡＭＰヒドロラーゼである可能性がある。これらの結合を２’−５’及び３’−５’ホスホジエステル結合のいずれかまたは両方の代わりに用いることができる（２’３’−ｃＧｓＡｓＭＰ）。二重置換類似体は、活性であると同時に加水分解に耐性を有し得る。図８は、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ；１１（９）：７４１）に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる例示的なＣＤＮを示す。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＩＮＧリガンドは、Ｌｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３；５９（２２）：１０２５３−１０２６７）に記載されるように、１個のアデノシンヌクレオシドと１個のイノシンヌクレオシド（ｃＡＩＭＰ）を含み得る。類似体は、糖（リボース、２’−デオキシリボース、または２’−フルオロ−２’−デオキシリボース）、ヌクレオチド間の結合位置（２’，２’；２’，３’；３’，３’；または３’，２’）、リン酸修飾（ビスホスホジエステルまたはビスホスホロチオエート）、またはそれらの組み合わせにおいて異なり得る。図９は、Ｌｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３；５９（２２）：１０２５３−１０２６７）に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる例示的なＣＤＮを示す。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＩＮＧリガンドは、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｎｏｖ；１４７：３７−４６）に記載されるような、ジスピロジケトピペルジン（ＤＳＤＰ）とすることができる。図１０は、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｎｏｖ；１４７：３７−４６）に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる例示的なＤＳＤＰ  ＳＴＩＮＧリガンドを示す。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＩＮＧリガンドは、本明細書に参照によりその全容を援用するところの米国特許第９，７２４，４０８号に記載されるようなｃＧＡＭＰの合成類似体とすることができる。図１１は、米国特許第９，７２４，４０８号に提供される、Ｉ／Ｏとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる例示的なｃＧＡＭＰの合成類似体を示す。
【０１７０】
糖（リボース、２’−デオキシリボース、または２’−フルオロ−２’−デオキシリボース）、及びヌクレオチド間の結合位置（２’，２’；２’，３’；３’，３’；または３’，２’）、及びリン酸修飾（ビスホスホジエステルまたはビスホスホロチオエート）において異なるｃＡＩＭＰの類似体が上記の論文及び特許において試験されている。表７は、Ｌｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３；５９（２２）：１０２５３−１０２６７）からの引用であり、図９にも示される試験化合物において糖の変化が生じる位置を示す。
【表７】
2021506849.tif 000101
【０１７１】
上記の類似体はいずれも、ＳＴＩＮＧをアゴナイズするＩ／Ｏである。類似体９、１０、２３、５１、５４、及び５５は、２’，３’−ｃＧＡＭＰと同等の活性を示し、類似体１３、５２、５３、５６は、２’，３’−ｃＧＡＭＰよりも強力であり得る。
【０１７２】
ＳＴＩＮＧは細胞内で活性であることから、本開示は、ペプチドが腫瘍微小環境にホーミング、分布、ターゲティング、移動、プロセシング、または蓄積することができるか、またはペプチドが、細胞に透過することが可能であるようなペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、エンドソームまたはリソソームを含む細胞内区画を継続して通過することができ、ＳＴＩＮＧが存在することができるトランスゴルジ領域に達することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は、本開示のペプチドに化学的に結合することができる。例えば、ペプチドとＳＴＩＮＧリガンドＩ／Ｏとは切断可能なリンカーによって連結することができるため、リンカーは、細胞内に入ると選択的に切断され、それにより、ＳＴＩＮＧリガンドが高い濃度で放出されて細胞内ＳＴＩＮＧにターゲティングされる。リンカーは、サイトゾルの還元的環境またはエンドソーム／リソソーム経路の還元的環境によって切断され得るジスルフィド結合であってもよく、酵素的に切断可能なものとして、サイトゾルまたはエンドソーム／リソソーム経路の酵素によって切断されてもよく、または酸に不安定であってもよく、それにより、リンカーはエンドソーム−リソソーム経路の酸性環境中で切断され得る。いくつかの実施形態では、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は、安定的なリンカーによって連結することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は、複合体として活性であってもよく、または活性な代謝産物に異化されてもよい。他の実施形態では、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は共配合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は、リポソームなどの送達ビヒクル中に配合することができる。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧリガンドをリポソームに封入することができ、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。
【表８−１】
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【表８−２】
2021506849.tif 000103
【０１７３】
Ｅ．  ＭＤＡ５、ＴＬＲ、またはＲＬＲリガンドを含むＩ／Ｏ
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のペプチドと複合体化されたＭＤＡ５リガンド、ＴＬＲリガンド、またはＲＬＲリガンドを含むＩ／Ｏを提供する。いくつかの実施形態では、上記のリガンドのいずれもアゴニストとして作用する。ペプチドとＭＤＡ５リガンドとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書では「ペプチド−ＭＤＡ５リガンド複合体」と称する場合がある。ペプチドとＴＬＲリガンドとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書では「ペプチド−ＴＬＲリガンド複合体」と称する場合がある。ペプチドとＲＬＲリガンドとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書では「ペプチド−ＲＬＲリガンド複合体」と称する場合がある。
【０１７４】
ＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５とは関連する細胞質センサータンパク質である。これらはいずれもＲＮＡヘリカーゼであり、リガンドの特異性に関与するＣ末端領域と、ＭＡＶＳ介在型シグナル伝達を可能とする２個のＮ末端のＣＡＲＤドメインを有している。どちらもｄｓＲＮＡ二本鎖構造を認識できるが、ＲＩＧ−Ｉは一部のｄｓＲＮＡの５’末端のリン酸基も認識することができる（Ｗｕ  ２０１３）。ＭＤＡ５はポリＩ：Ｃのような二本鎖ＲＮＡを認識できるが、ＲＩＧ−Ｉとは異なり、ＭＤＡ５は、５’三リン酸、リボースの５’キャップの２’−Ｏ−メチル化、またはどちらも必要としない。上記の表６は、本開示の例示的なＭＤＡ５リガンドを含む例示的なＩ／Ｏも列挙してるが、これらの配列は、５’三リン酸（５’ｐｐｐ）、５’二リン酸（５’ｐｐ）、５’一リン酸（５’ｐ）、またはリボースの５’キャップの２’−Ｏ−メチル化、または上記のいずれか１つ以上を含まない。いくつかの実施形態では、ＭＤＡ５リガンドは、５’三リン酸を欠くか、リボースの５’キャップの２’−Ｏ−メチル化を欠くか、またはその両方を欠く。ポリＩ：ＣもＴＬＲ３のリガンドであり、したがってＴＬＲ３  Ｉ／Ｏである。ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡに対するエンドソームセンサーとして機能することができる。ＲＩＧ−ＩまたはＭＤＡ５のリガンド結合はＭＡＶＳ依存性シグナル伝達経路の活性化をもたらし、抗ウイルス免疫及び抗腫瘍免疫につながり（Ｅｌｉｏｎ  ２０１８）、Ｉ型ＩＦＮを含む炎症性物質の産生を引き起こすが、これはＴＬＲ３の活性化によって誘導される遺伝子発現とは異なり得る。ＲＩＧ−ＩまたはＭＤＡ５の活性化はさらにインフラマソームの活性化をもたら、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、及びＤＡＭＰＳの分泌など、抗腫瘍免疫を促進する腫瘍微小環境の変化をもたらす。ポリＩ：ＣがＴＬＲ３ではなくＭＤＡ５をターゲティングするようにトランスフェクトされると、マウスの抗腫瘍免疫が効果的に増強され得る（Ｂｈｏｏｐａｔｈｉ  ２０１４）。ＴＬＲ３以外に、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ１０を含む他のＴＬＲが、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及びＲＮＡ分解産物を検知するエンドソーム及びリソソームに存在する（Ｍｉｙａｋｅ  ２０１８）。ＴＬＲ９はエンドソームにも存在し、非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを認識できる。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、パピローマウイルスいぼの局所治療に用いられるレシキモド（Ｒ−８４８）及びイミキモド合成イミダゾキノリン化合物などのアゴニストとして機能する小分子リガンドに結合する。小分子ＴＬＲ８アゴニストであるモトリモドは、がん治療にも使用できる（Ｆｅｒｒｉｓ  ２０１８，Ｄａｎｇ  ２０１８）。いくつかの実施形態では、本開示は、エンドリソソームＴＬＲファミリーのリガンドを含むＩ／Ｏを提供し、このＴＬＲリガンドを本開示のペプチドと複合体化してペプチド−ＴＬＲリガンド複合体を形成することができる。かかるペプチド−ＴＬＲリガンド複合体は、ＴＬＲのアゴニストとして作用し得る。
【０１７５】
おそらくはウイルス感染経路においてエンドサイトーシスが共通して用いられているために、他のＲＮＡ及びＤＮＡ検知ＴＬＲもエンドソームに存在する可能性がある。ＭＤＡ５リガンドＩ／Ｏ（ペプチド−ＭＤＡ５リガンド複合体）またはＴＬＲ  Ｉ／Ｏ（ペプチド−ＴＬＲリガンドＩ／Ｏ））を含むＩ／Ｏを有するものなどの本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体によるエンドサイトーシス経路のターゲティングを用いてこれらのＴＬＲ経路を活性化することができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のペプチドと複合体化されるＩ／Ｏとして、ＲＬＲ及びＴＬＲの両方を活性化するＲＬＲリガンドを提供する。本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体のエンドソームへの進入は、エンドソームに存在するＴＬＲのターゲティングを可能にする。さらに、ペプチド−核酸結合体のエンドソームからの放出を促進する能力により、細胞質のＲＬＲのターゲティングが可能となり得る。本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体中のＩ／ＯとしてのＲＬＲリガンドは、単一の薬剤によってＲＬＲだけでなく、１つ以上のＴＬＲをターゲティングすることができることから、ペプチドＩ／Ｏ複合体のシグナル伝達及び応答を大幅に増強することができる。免疫応答の増強は、細胞質ＲＬＲによって媒介されるＭＡＶＳ依存性シグナル伝達経路、ならびにエンドソームＴＬＲによって媒介されるＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ及びＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路を含む、ＴＬＲ及びＲＬＲによって利用される個別のシグナル伝達経路の調節または活性化の組み合わせによって引き起こされると考えられる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ２０１７）。複数のシグナル伝達経路の調節または活性化の組み合わせは、さらなる免疫エフェクター細胞を動員し、抗腫瘍免疫応答を増幅することができる。ＴＬＲリガンド及びＲＬＲリガンドなどのこれらの核酸リガンドは、アポトーシス及び免疫の誘導などの抗ウイルス応答も促進する。活性化または刺激された場合の同じ抗ウイルス免疫系機構は、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏとして作用することにより、腫瘍細胞を殺滅するのにも有効である。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体のＩ／Ｏとして作用するＲＮＡリガンドは、ＲＩＧ−１またはＭＤＡ５、またはエンドソームのＲＮＡ検知ＴＬＲまたはＲＬＲを活性化する。場合によっては、エンドソームＴＬＲのみがトリガーされる。本開示のペプチド−ＭＤＡ５  Ｉ／Ｏリガンドの分子設計は、本明細書に記載される（例えば、ＲＩＧ−Ｉについて）任意の設計要素、例えば、安定的で、切断可能な、疎水性または親水性の、ＲＮＡ長及び改変、及び細胞質への送達のための細胞透過性を与える改変、ならびにエンドソーム取り込みまたはエンドソーム脱出ペプチドなどを含むことができる。
【０１７７】
ＲＩＧ−Ｉは、ＲＮＡ配列とは無関係に、１０塩基対以上（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ２００９）の短い、平滑な５’末端及び非修飾ヌクレオチドを有する５’二リン酸または三リン酸ｄｓＲＮＡを最も効率的に認識することができる（Ｕｃｈｉｋａｗａ  ２０１６）。ＭＤＡ５はｄｓＲＮＡを認識し、末端ではなくステムに結合すると考えられており、特定のＲＮＡ末端構造を必要とない（Ｗｕ  ２０１２）。ＭＤＡ５は１２量体のｄｓＲＮＡに結合し、１５量体はＡＴＰ加水分解を刺激することが示されている。ＲＮＡの長さが長くなるにしたがって、高い活性を有するＭＤＡ５の繊維状オリゴマーが形成される。５’三リン酸のないポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＭＤＡ５を活性化することができ、１５〜３９塩基対の長さである場合にはＭＤＡ５は活性化するがＴＬＲ３は活性化しない場合がある。ＴＬＲ３も、好ましくは少なくとも４０塩基対の長さのポリ（Ｉ：Ｃ）に反応する。
【０１７８】
結合、融合、及びプロセシング
本開示によるペプチドは、腫瘍の治療に使用するために、ペプチド生物薬剤またはアミノ酸を含む他の剤（例えば、抗体または抗体フラグメント、受容体または受容体フラグメント、リガンドまたはリガンドフラグメント、ホルモンまたはホルモンフラグメント、成長因子及び成長因子フラグメント、生物毒素及びそのフラグメント、またはペプチドの他の活性部分）と結合または融合させることができる。ペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書に記載される任意の機構によってＩ／Ｏに結合されたペプチドであり得る。例えば、ペプチドをＩ／Ｏに共有結合によって結合させてペプチドＩ／Ｏ複合体を形成することができる。ペプチドをＩ／Ｏに化学的に結合させてペプチドＩ／Ｏ複合体を形成することができる。ペプチドはまた、分子のＩ／Ｏまたは他の部分と会合させることにより非共有結合的に複合体化することで２つの剤を一体とすることができる。ペプチドとＩ／Ｏとは、融合タンパク質として発現させることでペプチドＩ／Ｏ融合タンパク質を形成することができる。例えば、抗体またそのフラグメントまたはサイトカインとペプチドとを融合タンパク質として発現させることでペプチドＩ／Ｏ融合タンパク質を形成することができる。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、抗がん活性を与えるＩ／Ｏなどの別の分子と融合することができる。ペプチドは、ペプチドの配列をＩ／Ｏの配列と共に含むベクターの発現によってＩ／Ｏと融合することができる。異なる実施形態において、ペプチドの配列とＩ／Ｏの配列とは、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現される。異なる実施形態において、ペプチドの配列とＩ／Ｏの配列とは、連続した配列を構成することができる。当該技術分野では周知のさまざまなベクター及び組換え系を用いてそのような融合ペプチドを作製することができる。ペプチドとＩ／Ｏとは、別々に発現される場合のそれらの機能的能力と比較して、融合ペプチド中でそれぞれ同様の機能的能力を保持することができる。いくつかの実施形態では、Ｉ／Ｏは、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドから切断、プロセシング、または解離されるまでの間、不活性または低活性であってよい。ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドから切断、プロセシング、及び／または解離された活性またはより高活性の薬物は、本明細書では「切断されたＩ／Ｏ」と称する場合がある。ペプチドＩ／Ｏ複合体からのＩ／Ｏの切断、プロセシング、及び／または解離は、腫瘍微小環境中または細胞内で生じ得る。さらなる態様では、ペプチドＩ／Ｏ複合体は、低ｐＨ、還元剤、グルタチオン、プロテアーゼ、酵素によって切断されるか、または加水分解に不安定である切断可能なリンカーによって接続されることにより、切断されたＩ／Ｏを生成する。いくつかの態様では、切断されたＩ／ＯのＩ／Ｏ部分は、ペプチドに結合されたＩ／Ｏと比較して化学的に修飾されている。他の態様において、切断されたＩ／ＯのＩ／Ｏ部分は、ペプチドに結合されたＩ／Ｏと比較して化学的に修飾されていない。いくつかの態様において、切断されたＩ／Ｏは、切断前のペプチドＩ／Ｏ複合体中のＩ／Ｏとは、切断後の効力または活性が異なる。同様に、ペプチドの活性は、腫瘍微小環境中または細胞内におけるＩ／Ｏとの切断、プロセシング、または解離の際に変化または低下し得る。例えば、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドは、エンドソーム、リソソーム内で、または、細胞質への送達後に、酵素によって、または化学的に、切断、除去、分解、プロセシング、または解離され得る。切断は、本開示のリンカー内またはペプチド内で、またはＩ／Ｏ剤内で、またはペプチドＩ／Ｏ複合体の任意の位置で生じ得る。ペプチドとＩ／Ｏとは、リポソームまたはナノ粒子の内部及び／またはその表面上などで配合により複合体化することもできる。
【０１７９】
リンカー
腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動し、腫瘍によって保持され、腫瘍に蓄積、透過、及び／または結合し、腫瘍によってプロセシングされ、または腫瘍に誘導されるか、または腫瘍細胞に透過もしくは進入する本開示によるペプチドは、小分子、第２のペプチド、タンパク質、サイトカイン、サイトカイン−受容体鎖複合体、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、パンハンドルＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ、環状ジヌクレオチド、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、ポリマー、バイオポリマー、脂肪酸、アシル付加物、化学リンカー、または糖、または本明細書に記載の他のＩ／Ｏまたは他の活性剤などの別の部分（例えば、本開示の任意のＩ／Ｏまたは任意の他の活性剤）と、とリンカーを介して、またはリンカーなしで直接、結合させることができる。
【０１８０】
ペプチドは、共有結合によって別の分子と直接結合することができる。例えば、ペプチドは、より大きなポリペプチドまたはペプチド分子のアミノ酸配列の末端に結合するか、またはリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基の側鎖などの側鎖に結合することができる。ペプチドはまた、例えば、３’末端、５’末端において、またはアミンやスルフヒドリル基などの化学ハンドルを有する修飾ヌクレオチド塩基を含む、配列内の残基の１つにおいて、ポリヌクレオチドに結合させることもできる。ペプチドは、環状ジヌクレオチドの窒素、酸素、炭素、または硫黄原子などで環状ジヌクレオチドに結合することもできる。結合は、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、ホスホエステル結合、ホスホジエステル結合、ホスホジエステル結合のジチオ類似体、エーテル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素の一重、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、またはチオエーテル結合を介したものとすることができる。結合はまた、非共有結合複合体または可逆的共有結合、例えば、シス−ジオールとのフェニルボロン酸複合体を介して、またはイオン性もしくは疎水性相互作用を介したものでもよい。いくつかの実施形態では、開示されたペプチド（複数可）自体の類似の領域（例えば、アミノ酸配列の末端、リシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸の側鎖などのアミノ酸側鎖）、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、ホスホエステル結合、ホスホジエステル結合、ホスホジエステル結合のジチオ類似体、エーテル結合、カルバメート結合、炭酸結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素の一重、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、非共有結合もしくは可逆共有結合リンカー、または任意の本明細書に記載される他のリンカー）を使用して、他の分子を連結するか、または本明細書に記載される任意のＩ／Ｏに連結することができる。
【０１８１】
リンカーを介した結合には、他の分子とペプチドとの間へのリンカー部分の組み込みが含まれ得る。ペプチドと他の分子とは両方ともリンカーに共有結合によって結合することができる。リンカーは、切断可能、安定的、自己犠牲、親水性、または疎水性のものであり得る。切断可能なリンカーは、秒単位、分単位、時間単位、日単位、または週単位にわたって切断され得る。安定的なリンカーは切断されないか、極めてゆっくりと切断されるか、または異化作用によって分解され得る。リンカーは、一方がペプチドに結合し、他方が他の分子に結合した少なくとも２個の官能基と、２個の官能基間の連結部分とを有することができる。
【０１８２】
結合のための官能基の非限定的な例としては、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、ホスホエステル結合、ホスホジエステル結合、ホスホジエステル結合のジチオ類似体、エーテル結合、カーボネート結合、カルバメート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素の一重、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、またはチオエーテル結合を形成することが可能な官能基が挙げられる。そのような結合を形成することができる官能基の非限定的な例としては、アミノ基；カルボキシル基；ヒドロキシル基；アルデヒド基；アジド基；アルキン及びアルケン基；ケトン；ヒドラジド；酸フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物などの酸ハロゲン化物；対称、混合、及び環状無水物を含む酸無水物；炭酸塩；シアノ、スクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルなどの脱離基に結合されたカルボニル官能基；マレイミド；加水分解するように設計されたマレイミド基を含むリンカー；マレイミドカプロイル；ＭＣＣ（［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）；Ｎ−エチルマレイミド；マレイミドアルカン；ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ；ＤＵＢＡ（デュオカルマイシンヒドロキシベンズアミド−アザインドールリンカー）；ＳＭＣＣスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート；ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）；ＳＰＤＢ  Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート；スルホ−ＳＰＤＢ  Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート；ＳＰＰ  Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート；ジチオピリジルマレイミド（ＤＴＭ）；ヒドロキシルアミン、ビニルハロ基；ハロアセトアミド基；ブロモアセトアミド；ヒドロキシル基；スルフヒドリル基；及び、例えば、ハライド、メシレート、トシレート、トリフレート、エポキシド、リン酸エステル、硫酸エステル、及びベシレートなどの、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、またはベンジル脱離基を有する分子が挙げられる。
【０１８３】
連結部分の非限定的な例としては、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリエーテル、ヒドロキシカルボン酸、オリゴエチレングリコール、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、両性イオン性ポリペプチド、ポリペプチド、ＧＧＧＳ（配列番号１１７０）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１７１）、（ＧＧＧＳ）ｘ（配列番号１１７２）（ただしｘ＝１〜１０）などのＧ及びＳから構成されるポリペプチド、Ｐｒｏ、Ａｌａ、及びＳｅｒ、切断可能なペプチド、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）（配列番号１１４２）、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号１１４３）、Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号１１４０）、Ｖａｌ−Ａｌａ（配列番号１１３９）、Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号１１４０）、Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１１４１）、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（配列番号１１４４）、Ａｓｎ−Ｌｙｓ（配列番号１１４５）、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（配列番号１１４６）、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号１１４７）、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１１４８）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（配列番号１１４９）、Ｍｅｔ−Ｉｌｅ（配列番号１１５１）、Ａｌａ−Ｉｌｅ（配列番号１１５２）、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（配列番号１１５３）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４９７）、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３及び配列番号１３６５のうちの任意のペプチドを含むポリペプチド、Ｄｏｒｏｎｉｎａｅｔａｌ．，２００８に示されるような他のペプチドリンカー、β−グルクロニダーゼなどのグルクロニダーゼにより切断可能なリンカー、カテプシンにより、またはカテプシンＢ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、Ｏ、Ｆ、Ｖ、Ｘ、もしくはＷにより切断可能なリンカー、ＭＭＰ−１、２、７、９、もしくは１３などのマトリックスメタロプロテアーゼにより切断可能なリンカー、ヒアルロニダーゼにより切断可能なリンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル、グルクロニド−ＭＡＢＣ、アミノベンジルカルバメート、Ｄ−アミノ酸、及びポリアミンが挙げられ、これらのいずれも、非置換であるか、または、ハロゲン、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキシアルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、ハロアルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレタン基、エポキシド、荷電基、両性イオン性基、及びエステル基などの任意の数の置換基により置換される。分子同士を連結する反応の他の非限定的な例としては、クリックケミストリー、銅フリーのクリックケミストリー、ＨＩＰＳライゲーション、シュタウディンガーライゲーション、及びヒドラジン−イソ−ピクテ−スペングラーが含まれる。
【０１８４】
ペプチドとＩ／Ｏとは、式：Ａ−Ｂ−Ｃで記述されるリンカーを介して結合することができる。Ａは、ペプチド及びリンカー上のアミンまたはカルボン酸への安定的なアミド結合であり、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、ＮＨＳエステル、またはＡＴＴ基（チアゾリジン−チオン）を介して得ることができる。Ａは、ペプチド上のアミンを、ＣＤＩとリンカー上のヒドロキシルとの反応によって形成されたイミダゾールカルバメート活性中間体と反応させることによって形成されるものなどの安定的なカルバメートリンカーであってよい。Ａは、リンカー上のアルデヒドまたはケトン基によるペプチド上のアミンの還元的アルキル化によって形成されるものなどの安定的な第２級アミン結合であってよい。Ａは、リンカー中のマレイミドまたはブロモアセトアミドをペプチド中のチオールとともに用いて形成される安定的なチオエーテルリンカー、トリアゾールリンカー、安定的なオキシムリンカー、またはオキサカルボリンリンカーであってよい。Ｂは、（−ＣＨ２−）ｘ−、分岐の有無にかかわらず、短いＰＥＧ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｘ（ｘは１〜２０）、またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１７１）のような短いポリペプチド  、Ｖａｌ−Ａｌａ（配列番号１１３９）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（配列番号１１４２）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号１１４７）、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１１４８）、他のスペーサーを含むことができるか、またはスペーサーを含まなくともよい。Ｃは、Ｉ／Ｏ上のチオール、アミン、ヒドロキシル、またはカルボン酸に対するジスルフィド結合、アミド結合、カルバメート、炭素−炭素一重、二重もしくは三重結合、またはエステル結合であってよい。Ｃは、リンカー上のマレイミドとＩ／Ｏ上のスルフヒドロイルとの間に形成されるチオエーテル、第２級または第３級アミン、カルバメート、または他の安定的な結合であってよい。いくつかの実施形態では、Ｃは、リンカーの「切断可能な」または「安定」な部分を指すことができる。他の実施形態では、Ａ及び／またはＢも、「切断可能な」または安定な部分であり得る。いくつかの実施形態において、Ａは、アミド、カルバメート、マレイミドまたはブロモアセトアミドを介したチオエーテル、トリアゾール、オキシム、またはオキサカルボリンであり得る。“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ＡＤＣ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２０１５  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１１０９５−０１５−１６５７−７またはＧｒｅｇ  ＨｅｒｍａｎｓｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎに記載されるいずれのリンカー化学も用いることができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ペプチド結合体は、安定的なリンカーを有することができる。本開示のペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成することができる。ペプチドは、アミド結合またはカルバメート結合などの安定的なリンカーを介して、検出可能な薬剤、活性薬剤、またはＩ／Ｏに結合させることができる。ペプチドは、標準的な１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）に基づく化学、または塩化チオニルもしくは塩化リンに基づくバイオコンジュゲーション化学を用いて、アミド結合などの安定的なリンカーを介して、検出可能な薬剤、活性薬剤、またはＩ／Ｏと結合することができる。
【０１８６】
得られたペプチド結合体は、ヒトまたは動物に、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、経口投与するか、または腫瘍もしくは腫瘍微小環境（腫瘍内）もしくは臓器内に直接注入もしくは適用することにより疾患を治療することができる。ペプチドは、標的とされる機構を介して、検出可能な薬剤、活性薬剤、またはＩ／Ｏから特異的に切断されてもよいし、されなくてもよい。ペプチドは、異化などの機構によって分解され、その「天然」または最初の形態から改変されるかまたは改変されていない薬物を放出することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｓｉｎｇｈ，  Ｌｕｉｓｉ，ａｎｄ  Ｐａｋ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ（２０１５）３２：３５４１−３５７１）。ペプチド薬物結合体は、インタクトな状態で、または部分的もしくは完全に分解、代謝、もしくは異化された状態でその薬理活性を示す。ペプチド結合体は、Ｉ／Ｏが切断後にのみ活性となるかまたは切断後にさらに活性となるように設計することができるか、または、ペプチド結合体は、Ｉ／Ｏがペプチドに結合している間、Ｉ／Ｏが活性であるように設計することもできる。
【０１８７】
切断可能な結合の周囲の切断速度は、炭素長（−ＣＨ２−）ｘ、立体障害またはその欠如（メチル、エチル、環状基などの隣接する側基、ならびにＧ、Ａ、またはＳなどのアミノ酸を含むことができるペプチド性スペーサーなどの隣接するスペーサーを含む）、親水性（ヒドロキシル、カルボン酸、またはオリゴエチレングリコール基の付加など）、または疎水性（フッ素、炭化水素基、または脂肪尾部の付加など）、電子吸引基または電子供与基の付加を含む、結合の周囲の局所環境を変化させることによって変化させることができる。いくつかの実施形態では、切断速度は、局所的なｐＨによって影響され得る。
【０１８８】
切断は、異なる機構によって、体内または細胞内の異なる場所で生じ得る。切断は、エンドソーム、リソソーム、または腫瘍などの病変組織中の低ｐＨのような低ｐＨ環境ではより高い速度で生じ得る。より低いｐＨで切断可能な特定の結合としては、エステル、カルバメート、カーボネート、ヒドラゾン、オキシム、及びフェニルボロン酸とｃｉｓ−ジオールの間の可逆的な共有結合複合体が挙げられる。切断は、還元的環境またはジスルフィド交換によって生じる場合もある。サイトゾル、エンドソーム、リソソーム、腫瘍微小環境、及び細胞表面はいずれも還元的であり得るか、またはジスルフィド交換のための物質（グルタチオン、アルブミン、またはシステイン残基など）を与えることができる。切断は、エステラーゼ、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ペプシノーゲン、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、グルクロニダーゼ、またはヒアルロニダーゼなどによって酵素的に生じ得る。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境、腫瘍細胞表面、細胞の細胞質、またはエンドソームもしくはリソソームなどの細胞内区画に送達されたときにのみ、または選択的に切断され得る。これらの酵素は、腫瘍微小環境、細胞表面、エンドソーム−リソソーム経路、またはサイトゾルに、より高い濃度で存在し得る。ｐＡＢＣなどの自己犠牲基を含めることにより、切断時に遊離の非修飾薬物を放出させることができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｓｉｎｇｈ，Ｌｕｉｓｉ，ａｎｄ  Ｐａｋ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  （２０１５）  ３２：３５４１−３５７１）。リンカーの切断速度は、腫瘍内の結合体またはペプチドＩ／Ｏ複合体の滞留時間に応じて調整することができる。例えば、ペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体が比較的速やかに腫瘍から除去される場合、リンカーが速やかに切断されるように調整することができる。対照的に、例えば、ペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体が腫瘍内でより長い滞留時間を有する場合、切断速度をより遅くすることで、Ｉ／Ｏの送達を延ばすことができる。これは、ペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体が薬剤またはＩ／Ｏを腫瘍に送達する目的で使用される場合に重要となり得る。
【０１８９】
リンカーの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。すなわち、
【化５】
2021506849.tif 000104
【化６】
2021506849.tif 000105
（ただし、各ｎは独立して、０〜約１，０００、１〜約１，０００、０〜約５００、１〜約５００、０〜約２５０、１〜約２５０、０〜約２００、１〜約２００、０〜約１５０、１〜約１５０、０〜約１００、１〜約１００、０〜約５０、１〜約５０、０〜約４０、１〜約４０、０〜約３０、１〜約３０、０〜約２５、１〜約２５、０〜約２０、１〜約２０、０〜約１５、１〜約１５、０〜約１０、１〜約１０、０〜約５、または１〜約５である）。いくつかの実施形態では、各ｎは、独立して０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０である）、またはＪａｉｎ，  Ｎ．，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ３２（１１）：  ３５２６−４０  （２０１５）  もしくはＤｕｃｒｙ，  Ｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  （２０１３）に開示されるような任意のリンカー。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜約１，０００、１〜約５００、１〜約２５０、１〜約２００、１〜約１５０、１〜約１００、１〜約５０、１〜約４０、１〜約３０、１〜約２５、１〜約２０、１〜約１５、１〜約１０、または１〜約５である。いくつかの実施形態では、ｍは、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｉ／Ｏを非修飾の形で放出することができる。他の実施形態では、Ｉ／Ｏは、化学修飾により放出され得る。さらに他の実施形態では、リンカー及び／またはペプチドの一部に依然として連結されているＩ／Ｏを異化によって放出させることができる。
【０１９１】
切断可能なリンカーは、ペプチドからＩ／Ｏを放出することができる。例えば、ペプチドとの結合体の形のＩ／Ｏ（すなわちペプチドＩ／Ｏ複合体）は最初は活性ではない場合があるが、腫瘍にターゲティングされた後に結合体から放出されると、例えば、ペプチドをＲＮＡの５’三リン酸領域または機能に不可欠なＩ／Ｏの他の部分に結合させることなどにより、Ｉ／Ｏは活性となることができる。これにより、体内の腫瘍以外の部位におけるＩ／Ｏによる副作用を減らすことができる。あるいは、安定的なリンカーは、細胞内での異化後の活性な切断産物の放出を依然可能とし得る。あるいは、Ｉ／Ｏは、ペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドにまだ結合している場合に活性であってもよく、またはペプチドは、腫瘍微小環境中、細胞表面上、またはサイトゾル中のＩ／Ｏの局所濃度を増加させるように機能することもできる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（２０１３）によるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載されているものなどの当該技術分野では周知の一般的な方法によって、Ｉ／Ｏに結合することができる。
【０１９３】
リンカーの選択は、本開示のＩ／Ｏの標的に基づいて行うことができる。例えば、Ｉ／Ｏが、リンカーが還元され得るエンドソーム／リソソーム経路または細胞質にターゲティングされる場合、切断可能なジスルフィド結合を用いることができる。リンカーが低ｐＨのために切断され得るエンドソーム／リソソーム経路または腫瘍微小環境一般にＩ／Ｏがターゲティングされている場合には、切断可能なヒドラゾンまたはエステル結合またはボロン酸ジオール複合体を用いることができる。Ｉ／Ｏが、エンドソーム／リソソーム経路、細胞外細胞表面、腫瘍微小環境一般、または細胞質にターゲティングされている場合には、リンカーは酵素切断可能（例えば、カテプシンまたはＭＭＰにより）としてもよい。
【０１９４】
さらに、ペプチドＩ／Ｏ複合体は異なる比で設計することができる。例えば、Ｉ／Ｏは複数のペプチドと複合体化される場合がある。例えば、複数のペプチドを、それらの間にスペーサー（複数可）を配置した鎖としてＮまたはＣ末端でＩＬ−１５超アゴニストと融合するか、またはアゴニストの複数の位置に融合することができる。別の例では、複数のＩ／Ｏを、ペプチドのＮ末端及びＬｙｓ残基などで１つのペプチドと複合体化することができる。Ｉ／Ｏとペプチドとのさまざまな比は、配合によっても得られる。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドＩ／Ｏ複合体中のＩ／Ｏとペプチドとの比は、０．０５：１〜２０：１であり得る。
【０１９５】
ペプチドの安定性
本開示のペプチドは、さまざまな生物学的条件において安定であり得る。例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれのペプチドも、還元剤、プロテアーゼ、酸化条件、または酸性条件に対する耐性を示すことができる。
【０１９６】
特定の場合では、生物学的分子（ペプチドやタンパク質など）が治療機能を与えることができるが、そのような治療機能は、インビボ環境によって引き起こされる不安定性によって低下または妨害される。（Ｍｏｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １０１：１０８−２１  （２０１６），Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １３（９）：６５５−７２  （２０１４），Ｂｒｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ  （１１）：１４４３−６７  （２０１３），Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２４（１）：６３−９２  （２００７），Ｈａｍｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １９（３）：１６５−７７  （２００５））。例えば、消化管は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ約１）の領域、還元的環境、またはペプチド及びタンパク質を分解し得るプロテアーゼが豊富な環境を含み得る。口、目、肺、鼻腔内、関節、皮膚、膣道、粘膜、腫瘍組織、及び血清など、身体の他の領域のタンパク質分解活性も、機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達を妨げ得る。さらに、血清中のペプチドの半減期は、プロテアーゼに一部起因して極めて短くなる場合があり、その結果、ペプチドは急速に分解されて、妥当な投与計画を投与した場合に持続的な治療効果を得ることができない。同様に、リソソーム、エンドソーム、またはゴルジ装置などの細胞区画におけるタンパク質分解活性、ならびにリソソーム、エンドソーム、またはゴルジ装置及びサイトゾルにおける還元活性は、ペプチド及びタンパク質を分解し、これらが細胞内の標的に治療機能を与えられなくなる可能性がある。したがって、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨに耐性のあるペプチドは、向上した治療効果を与えるか、またはインビボで共配合または結合されたＩ／Ｏの治療効果を高める可能性がある。
【０１９７】
さらに、薬物の経口送達は、この投与方法によって提示される機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達に対する障害にもかかわらず、身体の特定の領域（例えば、結腸癌などの消化管の疾患）をターゲティングするうえで望ましい場合がある。薬物の経口送達は、非経口送達と比較して患者が服用するのにより便利な剤形を提供することにより、コンプライアンスを高めることができる。経口送達は、治療ウィンドウが大きい治療計画で有用であり得る。したがって、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨに耐性のあるペプチドは、治療機能を無効にすることなくペプチドの経口送達を可能とする。例えば、特定の小分子Ｉ／Ｏ（例えば、ＳＴＩＮＧまたはＲＩＧ−Ｉアゴニストとして作用するＳＴＩＮＧリガンドまたはＲＩＧ−ＩリガンドＩ／Ｏ）は、本開示のいずれかのペプチドと（ペプチドＩ／Ｏ複合体を作製するために）結合させることによって改善することができ、これにより、経口送達用に最適化される。
【０１９８】
還元剤に対するペプチドの耐性。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、還元に対する耐性を有することができる。本開示のペプチドは、ペプチドがフォールディングした状態を維持するうえで欠かせないジスルフィド架橋に関与し得る１個以上のシステインを含むことができる。ペプチドを還元物質を含む生物学的環境に曝すとペプチドがアンフォールドし、機能と生物活性が失われ得る。例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）は、身体の多くの領域及び細胞に存在し得る、かつジスルフィド結合を還元することができる還元物質である。別の例として、ペプチドは、経口投与後にペプチドが消化管上皮を通過して輸送される際に細胞に内在化されると還元され得る。ペプチドは、消化管のさまざまな部分への曝露時に還元され得る。消化管は還元的環境であり得るため、ジスルフィド結合の還元により、ジスルフィド結合を有する治療用分子が最適な治療効果を発揮する能力を阻害し得る。ペプチドはまた、エンドソームまたはリソソームによる内在化後などの細胞への進入時、またはサイトゾルまたは他の細胞区画への進入時にも還元され得る。ジスルフィド結合の還元及びペプチドのアンフォールディングは、機能の喪失につながるか、またはバイオアベイラビリティー、ピーク血漿濃度、生物活性、及び半減期などの重要な薬物動態パラメータに影響を及ぼし得る。ジスルフィド結合の還元によって、ペプチドはプロテアーゼによるその後の分解も受けやすくなり、投与後のインタクトなペプチドの急速な消失につながり得る。いくつかの実施形態では、還元に対する耐性を有するペプチドはインタクトな状態に維持され、より容易に還元されるペプチドと比較して、身体のさまざまな区画及び細胞内でより長期間にわたって機能的活性を与えることができる。。
【０１９９】
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、還元剤に対する耐性の特性について分析することで安定なペプチドを同定することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、０．００００１Ｍ〜０．０００１Ｍ、０．０００１Ｍ〜０．００１Ｍ、０．００１Ｍ〜０．０１Ｍ、０．０１Ｍ〜０．０５Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１Ｍ、といった異なるモル濃度の還元剤に１５分以上曝された後もインタクトな状態に維持され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの安定性を決定するために使用される還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、（還元型）グルタチオン（ＧＳＨ）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％は、還元剤への曝露後にインタクトな状態に維持される。
【０２００】
プロテアーゼに対するペプチド耐性。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、プロテアーゼ分解に対する耐性を有することができる。本開示のペプチドの安定性は、プロテアーゼによる分解に対する耐性によって測定することができる。プロテアーゼは、ペプチダーゼまたはプロテイナーゼとも呼ばれ、隣接するアミノ酸間の結合を切断することによってペプチド及びタンパク質を分解することができる酵素であり得る。特定のアミノ酸をターゲティングとする特異性を有するプロテアーゼのファミリーには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、エステラーゼ、血清プロテアーゼ、及びアスパラギンプロテアーゼが含まれ得る。さらに、メタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、チトクロームＰ４５０酵素、及びカテプシンもペプチド及びタンパク質を消化することができる。プロテアーゼは、血液、粘膜、肺、皮膚、消化管、口、鼻、目、及び細胞の区画内に高濃度で存在し得る。プロテアーゼの誤調節もまた、関節リウマチ及び他の免疫障害ならびにがんなどのさまざまな疾患に存在し得る。プロテアーゼによる分解は、治療用分子のバイオアベイラビリティー、生体内分布、半減期、及び生物活性を低下させ、治療用分子の治療機能を発揮できなくし得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼに対する耐性を有するペプチドは、インビボで合理的に許容される濃度で治療活性をより良好に与えることができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、いずれのクラスのプロテアーゼによる分解にも抵抗することができる。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、ペプシン（胃に見出される）、トリプシン（十二指腸に見出される）、血清プロテアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗する。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、肺プロテアーゼ（例えば、セリン、システイニル、及びアスパルチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、好中球エラスターゼ、α１アンチトリプシン、分泌性ロイコプロテアーゼ阻害剤、エラフィン）、またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド安定性を測定するために使用されるプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％は、プロテアーゼへの曝露後にインタクトな状態に維持される。
【０２０２】
酸性条件におけるペプチドの安定性。本開示のペプチドは、酸性の生物学的環境で投与することができる。例えば、経口投与後、ペプチドは胃及び消化（ＧＩ）管の胃液中の酸性の環境条件に曝され得る。胃のｐＨは約１〜４の範囲であり得るが、消化管のｐＨは酸性〜通常の生理的ｐＨの範囲であり、消化管上部から結腸に向かって低下している。さらに、膣、後期エンドソーム、リソソーム、及び腫瘍の微小環境も、ｐＨ７．４未満のように酸性ｐＨ値を有し得る。これらの酸性条件は、ペプチド及びタンパク質をアンフォールドした状態に変性させ得る。ペプチド及びタンパク質のアンフォールディングは、他の酵素によるその後の消化を受けやすくするばかりでなく、ペプチドの生物活性の喪失につながり得る。
【０２０３】
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、酸性条件、及び酸性条件を再現する緩衝液中での変性及び分解に抵抗することができる。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、１未満のｐＨ、２未満のｐＨ、３未満のｐＨ、４未満のｐＨ、５未満のｐＨ、６未満のｐＨ、７未満のｐＨ、または８未満のｐＨを有する緩衝液中での変性または分解に抵抗することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１〜３のｐＨでインタクトな状態に維持される。特定の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％は、１未満のｐＨ、２未満のｐＨ、３未満のｐＨ、４未満のｐＨ、５未満のｐＨ、６未満のｐＨ、７未満のｐＨ、または８未満のｐＨの緩衝液への曝露後にインタクトな状態に維持される。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％は、１〜３のｐＨの緩衝液への曝露後にインタクトな状態に維持される。他の実施形態では、本開示のペプチドは、模擬胃液（ｐＨ１〜２）中での変性または分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％は、模擬胃液への曝露後にインタクトな状態に維持される。いくつかの実施形態では、模擬胃液またはクエン酸緩衝液などの低ｐＨ溶液を使用してペプチドの安定性を測定することができる。
【０２０４】
高温でのペプチドの安定性。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、高温に対する耐性を有する。本開示のペプチドは、高温の生物学的環境で投与することができる。例えば、経口投与後、ペプチドは体内で高温に曝され得る。体温は３６℃〜４０℃の範囲であり得る。高温は、ペプチド及びタンパク質をアンフォールドした状態に変性させ得る。ペプチド及びタンパク質のアンフォールディングは、他の酵素によるその後の消化を受けやすくするばかりでなく、ペプチドの生物活性の喪失につながり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、２５℃から１００℃の温度でインタクトな状態に維持され得る。高温はペプチドの分解を早める可能性がある。高温での安定性は、熱帯環境または冷蔵へのアクセスが制限されている地域でのペプチドの保管を可能とする。特定の実施形態では、ペプチドの５％〜１００％は、２５℃への６ヶ月〜５年間の曝露後にインタクトな状態に維持され得る。ペプチドの５％〜１００％は、７０℃への１５分〜１時間の曝露後にインタクトな状態に維持され得る。ペプチドの５％〜１００％は、１００℃への１５分〜１時間の曝露後にインタクトな状態に維持され得る。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％は、２５℃への６ヶ月〜５年間の曝露後にインタクトな状態に維持される。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％は、７０℃への１５分〜１時間の曝露後にインタクトな状態に維持される。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％は、１００℃への１５分〜１時間の曝露後にインタクトな状態に維持される。
【０２０５】
ペプチドの薬物動態
本開示の任意のペプチドの薬物動態を、異なる投与経路を介したペプチドの投与後に決定することができる。例えば、本開示のペプチドの薬物動態パラメータは、静脈内、皮下、筋肉内、直腸内、エアロゾル、非経口、眼内、肺内、経皮、膣内、視神経、鼻腔、経口、舌下、吸入、皮膚、くも膜下腔内、鼻腔内、腫瘍内、関節内、腹腔内、頬側、滑膜、臓器内、または局所投与後に定量することができる。本開示のペプチドは、放射性標識またはフルオロフォアなどの追跡剤を使用することによって分析することができる。例えば、本開示の放射性標識ペプチドは、さまざまな投与経路を介して投与することができる。血漿、尿、糞便、任意の臓器、皮膚、筋肉、及び他の他の組織などのさまざまな生体試料中のペプチド濃度または用量回復は、ＨＰＬＣ、蛍光検出技術（ＴＥＣＡＮ定量、フローサイトメトリー、ｉＶＩＳ）または液体シンチレーションカウンティングなどの広範な方法を使用して測定することができる。
【０２０６】
本明細書に記載される方法及び組成物は、対象への任意の経路を介したペプチド投与の薬物動態学に関連し得る。薬物動態は、方法及びモデル、例えば、コンパートメントモデルまたは非コンパートメント法を使用して記述することができる。コンパートメントモデルとしては、これらに限定されるものではないが、１コンパートメントモデル、２コンパートメントモデル、マルチコンパートメントモデルなどが含まれる。モデルは異なるコンパートメントに分割でき、対応するスキームにより記述することができる。例えば、１つのスキームは吸収、分布、代謝及び排泄（ＡＤＭＥ）スキームである。別の例として、別のスキームは、遊離、吸収、分布、代謝及び排泄（ＬＡＤＭＥ）スキームである。いくつかの態様において、代謝及び排泄は、排泄コンパートメントと呼ばれる１つのコンパートメントに分類することができる。例えば、遊離は、組成物の活性部分の送達システムからの遊離を含むことができ、吸収は、対象による組成物の活性部分の吸収を含み、分布は、血漿を介した異なる組織への組成物の分布を含む。代謝は、組成物の代謝または不活化を含み、最後に、排泄は、組成物または組成物の代謝産物の排泄または排出を含む。対象に静脈内投与される組成物には、多相性薬物動態プロファイルが適用され、これには、組織分布及び代謝／排泄の側面が含まれるが、それらに限定されない。このように、組成物の血漿または血清濃度の低下は、しばしば例えばα相及びβ相を含む二相性であり、時折γ、δまたは他の相が観察される。
【０２０７】
薬物動態学は、対象へのペプチドの投与に関連する少なくとも１つのパラメータを決定することを含む。いくつかの態様では、パラメータには、少なくとも用量（Ｄ）、投与間隔（τ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、次の用量が投与される前に到達した最小濃度（Ｃｍｉｎ）、最小時間（Ｔｍｉｎ）、Ｃｍａｘに到達するまでの最大時間（Ｔｍａｘ）、分布体積（Ｖｄ）、定常状態の分布体積（Ｖｓｓ）、時間０における逆外挿濃度（Ｃ０）、定常状態濃度（Ｃｓｓ）、排出速度定数（ｋｅ）、注入速度（ｋｉｎ）、クリアランス（ＣＬ）、バイオアベイラビリティー（ｆ）、変動（％ＰＴＦ）、及び排出半減期（ｔ１／２）が含まれる。
【０２０８】
特定の実施形態では、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれのペプチドも、経口投与後に最適な薬物動態パラメータを示す。他の実施形態では、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれのペプチドも、経口投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、腫瘍内、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、皮膚投与、またはそれらの任意の組み合わせなどの任意の投与経路後に最適な薬物動態パラメータを示す。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれのペプチドにおいても、平均Ｔｍａｘは、０．５〜１２時間、または１〜４８時間であり（そこでＣｍａｘに到達する）、経口経路で対象にペプチドを投与した後の対象の血清中平均バイオアベイラビリティーは、０．１％〜１０％であり、消化管への送達のための対象への経口投与後の血清中平均バイオアベイラビリティーは、０．１％未満であり、非経口投与後の血清中の平均バイオアベイラビリティーは、１０〜１００％であり、対象へのペプチドの投与後の対象における平均ｔ１／２は、０．１時間〜１６８時間、または０．２５時間〜４８時間であり、対象へのペプチドの投与後の平均クリアランス（ＣＬ）は、ペプチド０．５〜１００Ｌ／時、または０．５〜５０Ｌ／時であり、対象にペプチドを全身投与した後の、または場合により全身の取り込みがない場合の対象における平均分布体積（Ｖｄ）は、２００〜２０，０００ｍＬであり、またはこれらの任意の組み合わせであった。
【０２１０】
製造方法
さまざまな発現ベクター／宿主系を、本明細書に記載されるペプチド、ペプチドＩ／Ｏ複合体、またはＩ／Ｏの組換え発現の製造に利用することができる。そのような系の非限定的な例としては、本明細書に記載されるペプチドまたはペプチド融合タンパク質／キメラタンパク質またはタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、上記の核酸配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、上記の核酸配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、上記の核酸配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させるかもしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、または、安定的に増幅された（例えば、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミンシンセターゼ）もしくは二重微小染色体で不安定に増幅された（例えば、マウス細胞株）上記の核酸配列の複数のコピーを含むように操作された細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染させた動物細胞系が挙げられる。ペプチドのジスルフィド結合の形成及びフォールディングは、発現中または発現後、あるいはその両方で生じ得る。
【０２１１】
宿主細胞は、本明細書に記載される１つ以上のペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドＩ／Ｏ複合体を発現するように適合することができる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞であってよく、昆虫細胞を含む。場合により、宿主細胞は、所望の特定の様式で挿入された配列の発現を調節することができ、または遺伝子またはタンパク質産物を修飾及びプロセシングすることができる。例えば、特定のプロモーターからの発現を、特定のインデューサー（例えば、メタロチオニンプロモーターにおける亜鉛及びカドミウムイオン）の存在下で上昇させることができる。場合により、ペプチド産物の修飾（例えば、リン酸化及びグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）がペプチドの機能にとって重要な場合がある。宿主細胞は、ペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾のための特性及び特定の機構を有することができる。場合により、ペプチドを発現させるために使用される宿主細胞は、分泌するタンパク質分解酵素の量が最小限である。
【０２１２】
細胞に基づくまたはウイルスに基づく試料の場合、生物を精製前に処理して、標的ポリペプチドを保存及び／または放出することができる。いくつかの実施形態では、細胞は固定剤を用いて固定される。いくつかの実施形態では、細胞は溶解される。細胞材料は、大部分の細胞を破壊しないが、細胞材料の表面から、及び／または細胞間の隙間からタンパク質を除去するような形で処理することができる。例えば、細胞材料を液体バッファーに浸漬するか、または植物材料の場合では、真空にかけることで細胞間空間及び／または植物細胞壁中に存在するタンパク質を除去することができる。細胞材料が微生物である場合、タンパク質を微生物培養培地から抽出することができる。あるいは、ペプチドを封入体に充填することもできる。封入体は、培地中の細胞成分からさらに分離することができる。いくつかの実施形態では、細胞は破壊されない。細胞またはウイルスによって提示される細胞性またはウイルス性ペプチドを、インタクトの細胞またはウイルス粒子の付着及び／または精製に使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質を細胞から培地中に分泌させてもよい。組換え系以外に、ペプチド及びポリペプチドは、タンパク質及びペプチド合成に使用されるさまざまな既知の技術を使用して無細胞系で合成することもできる。
【０２１３】
場合により、宿主細胞は、薬物の結合点を有するペプチドを産生する。結合点は、リシン残基、Ｎ末端、システイン残基、システインジスルフィド結合、または非天然アミノ酸を含み得る。非天然アミノ酸を合成により、または組換え法により組み込むことができる。
【０２１４】
ペプチドは、例えば固相ペプチド合成法または液相ペプチド合成法などによる合成によって生成することもできる。ペプチド合成は、例えばＦｍｏｃ固相ペプチド合成法（“Ｆｍｏｃ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，”  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に従って、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学によって、またはブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）化学によって行うことができる。ペプチドは、合成中もしくは合成後またはその両方でフォールディング（ジスルフィド結合の形成など）することができ、例えば、切断及び保護基の除去及び精製の後、または樹脂上にある間に、還元型及び酸化型のシステインまたはグルタチオンなどの酸化還元対の存在下、弱塩基性ｐＨでペプチドをインキュベートすることによって行うなど、当該技術分野では周知の方法で行うことができる。ペプチドフラグメントを、酵素的にまたは合成または組換えにより生成し、その後、合成により、組換えにより、または酵素によって互いに連結することができる。
【０２１５】
他の態様では、本開示のペプチドは、従来の液相ペプチド合成によって調製することができる。
【０２１６】
米国特許第９，２７９，１４９号に記載される方法を用いてＲＮＡポリヌクレオチドを作製することもでき、参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、酵素／ＰＣＲ法によって合成される。例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドを３’末端に付加することができるヌクレオチジルトランスフェラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼまたはＥ．ｃｏｌｉポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）などの酵素を使用して合成することができる。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用することもできる。３’末端がブロックされていない可逆的ターミネーターリボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）を、ポリヌクレオチド合成時に使用することができる。あるいは、３’ブロック、２’ブロック、または２’−３’ブロックされたｒＮＴＰを、上記のいずれかの酵素と共に使用することもできる。ＲＮＡポリヌクレオチドは、標準的な固相合成法及びホスホロアミダイトを用いた方法を使用して合成することもできる。本開示のＲＮＡポリヌクレオチドは、従来の固相オリゴヌクレオチド合成によって調製することができる。例えば、これらに限定されるものではないが、いずれも本明細書に参照により援用するところの、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｄｂｉｏ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１７／Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、及びＡｌｂｅｒｉｃｉｏ（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＤＮＡ，ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＲＮＡ，Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ，Ｓｅｎｓｅ，Ｂｅｔａｓｃｒｉｐｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１０）、及びＧｕｚａｅｖ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１３；５３：３．１：３．１．１−３．１．６０．）に示されるような記載された方法を含む任意の固相合成法を用いることができる。ＣＰＧまたはポリスチレンなどの固体支持体を使用することができる。ホスホロアミダイト化学反応は、以下のステップ、すなわち、支持体に結合させた３’ヌクレオシドの脱トリチル化、活性化及びカップリング、キャッピング、及び酸化のサイクルを繰り返して用いることができる。合成の最後に、保護されたヌクレオチドを支持体から切断し、その後脱保護することができる。ＲＮＡポリヌクレオチドの固相合成に用いられる保護基には、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）またはトリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）が含まれ得る。ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定性を高めるために修飾された骨格を有してもよい。さらに、非天然塩基または修飾塩基を使用して、その後の化学的結合のための固有の機能的ハンドルとして機能させることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの５’��び／または３’末端の修飾を行って、所望の官能基、安定性、または活性を与えることができる。いくつかの実施形態では、機能的ハンドルは、ＲＮＡの１つ以上の修飾ウリジン、修飾グアニシン、修飾シチジン、または修飾アデノシン塩基を含む修飾塩基を含む。そのような修飾塩基の例として、延長アミンを有するウリジンがある。
【０２１７】
本開示のＩ／Ｏは、合成により、組換えにより、または小分子合成技術により作製することができる。本開示のペプチドは、合成により、または組換えにより作製することができる。ペプチドとＩ／Ｏとは、有機合成法により、組換え発現時のポリペプチド融合により、酵素によるライゲーションにより、配合により、または他の手段によって組み合わせることができる。
【０２１８】
ペプチド及びペプチドＩ／Ｏ複合体の医薬組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載される任意のペプチドもしくはペプチドＩ／Ｏ複合体、またはその塩と、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、酸化防止剤、可溶化剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、塩、界面活性剤、アミノ酸、カプセル化剤、増量剤、凍結保護剤、及び／または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせとすることができる。医薬組成物は、本明細書に記載されるペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体の生物への投与を容易とする。医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、眼内、肺内、経皮、膣内、点眼、経鼻、経口、舌下、吸入、皮膚、くも膜下腔内、鼻腔内、腫瘍内、関節内、局所投与、臓器内、またはそれらの組み合わせを含むさまざまな形態及び経路により、医薬組成物としての治療有効量で投与することができる。医薬組成物は、局所的または全身的に、例えば、本明細書に記載されるペプチドを臓器に直接、場合によりデポ剤として注射することにより投与することができる。
【０２１９】
ボーラス注射または点滴用の非経口注射剤を配合することができる。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の滅菌懸濁液、溶液またはエマルションとして非経口注射に適した形態とすることができ、懸濁化剤、安定化剤、及び／または分散剤などの配合剤を含むことができる。非経口投与用の医薬製剤には、水溶性形態の本明細書に記載のペプチドの水溶液が含まれる。本明細書に記載されるペプチドの懸濁液は、油性注射懸濁液として調製することができる。適当な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カロボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含むことができる。懸濁液は、適当な安定化剤、または本明細書に記載のかかるペプチドの可溶性を高め、及び／またはかかるペプチドの凝集を低減することで高度に濃縮された溶液の調製を可能とする剤を含んでもよい。あるいは、本明細書に記載されるペプチドは、凍結乾燥するか、または適当なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水で使用前に戻すための粉末形態とすることもできる。いくつかの実施形態では、精製されたペプチドが静脈内投与される。
【０２２０】
本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体は、外科的処置中に、脳もしくは脳組織またはがん細胞などの臓器、または臓器組織もしくは細胞に直接適用することができる。本明細書に記載の組換えペプチドは局所投与することができ、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリーム、及び軟膏などのさまざまな局所投与可能な組成物中に配合することができる。かかる医薬組成物は、可溶化剤、安定化剤、張度増強剤、緩衝剤及び防腐剤を含むことができる。
【０２２１】
本明細書で提供される治療または使用の方法を実施する際に、本明細書に記載される治療有効量のペプチドを、免疫系に影響する状態を有する対象に医薬組成物中で投与することができる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物、例えばヒトである。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的健康状態、使用される化合物の効力、及び他の因子に応じて幅広く異なり得る。
【０２２２】
医薬組成物は、賦形剤及び助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して配合することができ、これにより、活性化合物を薬学的に使用可能な製剤に加工することが容易となる。配合は、選択される投与経路に応じて変更することができる。本明細書に記載のペプチドを含む医薬組成物は、例えば、組換え系でペプチドを発現させ、ペプチドを精製し、ペプチドを凍結乾燥し、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、封入、または圧縮プロセスによって製造することができる。医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、遊離塩基または医薬的に許容される塩の形態としての本明細書に記載される化合物とを含むことができる。
【０２２３】
本明細書に記載の化合物を含む、本明細書に記載のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体、またはその塩の調製方法は、本明細書に記載のペプチドを、１つ以上の不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体と配合して固体、半固体、または液体組成物を形成することを含む。固体組成物としては、例えば、散剤、錠剤、分散性粒剤、カプセル剤、カシェ剤、及び坐剤が挙げられる。これらの組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び他の薬学的に許容される添加剤などの少量の非毒性の補助物質も含むことができる。
【０２２４】
薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、いずれも参照によりその全容を援用するところの、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）に見ることができる。
【０２２５】
リポソームは、Ｓｔｅａｌｔｈ及び他のリポソームを含む、当該技術分野では周知の任意の方法によって調製することができる。リポソームの調製は、有機溶媒からの脂質の乾燥、水性媒体への液体の分散、及び必要に応じて超音波処理または押し出しを含む精製またはサイジングを含むことができる。リポソームは、機械的分散、固体分散、洗剤除去、（Ａｋｂａｒｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１３，８：１０２）に開示されるいずれかの方法、または当該技術分野では周知の他の任意の方法を含む、受動的または能動的封入技術によって封入することができる。
【０２２６】
がんの治療
本明細書で使用するところの「有効量」なる用語は、腫瘍に対する免疫応答及びがん細胞の減少または殺滅をもたらす、投与される薬剤または化合物の充分な量を指すことができる。その結果は、他のより毒性の高い治療法の必要性の減少、無増悪生存期間の改善、長期全生存期間の改善、進行速度の低下、転移の予防、生活の質の改善、寛解、完全寛解、部分寛解、症状の軽減、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。かかる薬剤または化合物を含む組成物は、予防的、増強的、及び／または治療的治療を行うために投与することができる。任意の個々の症例における適当な「有効」量は、用量漸増試験などの手法を用いて決定することができる。
【０２２７】
本開示の方法、組成物、及びキットは、単独で、または他の治療と併用される場合に、状態の症状を予防、治療、抑止、逆転、または改善する方法を含むことができる。現在のがん治療は、手術及び放射線に加えて複数の薬剤の使用を伴う場合がある。さまざまな治療法の併用は、個々の薬剤よりも効果的で、完全な治癒につながり得る。併用は、免疫腫瘍学の分野において特に重要であり、補完的及び／または相乗的な組み合わせが知られている。併用は、個々の薬剤が明らかな効果を示さない場合に有効であり得る。例えば、ヒトのがんの治療では放射線を化学療法と併用することができる。マウスでも同様の効果がみられる（Ｄｅｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｄｅｃ  １５；１８（２４）：６６６８−７８）。放射線は、本開示のいずれのペプチドＩ／Ｏ複合体とも併用することができる。チェックポイント阻害剤であるＰＤ１及びＣＴＬＡ４に対する抗体は、最近承認された薬剤であり、互いに併用されて、また、他の薬剤と併用されて向上した治療効果を得ることができる。これは、マウス腫瘍モデルでみられる（Ｆａｌｌｏｎ  ２０１７，Ｆｕ  ２０１５）。上記のチェックポイント阻害剤に対する抗体は、本開示のいずれのペプチドＩ／Ｏ複合体とも併用することができる。ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＫＩＲなどの研究されている他のチェックポイント阻害剤も、本開示の任意のペプチドＩ／Ｏ複合体と併用することができる。
【０２２８】
本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、Ｉ／Ｏの効力を高めるか、または治療ウィンドウを広げるように設計されている。Ｉ／Ｏ単独の併用で有効な治療は、ペプチドＩ／Ｏ複合体の併用でも有効となり得る。かかる治療の例としては、前臨床または臨床活性を示した併用療法が含まれ、ＩＬ−１５スーパーアゴニストなどのＩＬ−１５剤と、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４０、またはシクロホスファミドとの併用（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｕｎｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９０：１５９−１６８（２０１７））；４−１ＢＢリガンドと、ＩＬ−１２、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、放射線、シスプラチン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミド、セツキシマブ、リツキシマブ、またはトラスツズマブとの併用（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒａｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ５：１１７（２０１５））、ＳＴＩＮＧリガンドと、ワクチン、放射線、５−フルオロウラシル、ＧＭ−ＣＳＦ、または抗ＰＤ−１との併用（Ｖａｒｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７５：８６−９７（２０１７））が挙げられる。他の新たな免疫療法の標的は、有効性を高め、及び／または毒性を低減するために本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体と併用することができる臨床治療薬を創成することができる。これらには、Ｂ７ｘ、ＨＨＬＡ２、及びＢ７−Ｈ３を含むＢ７ファミリーのメンバー；ＶＩＳＴＡ；ＣＤ２７；ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ；ＧＩＴＲ；Ｔｉｍ−３；ＬＡＧ−３；ＢＴＬＡ；及びＩＤＯシンターゼが含まれる（Ａｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ７：１１６９−１１８６（２０１５））。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、単独で投与されるか、または、例えば、Ｉ／Ｏ、化学物質、生物学的薬剤、抗体、放射線治療薬、造影剤、診断薬、光増感剤、放射線増感剤、栄養素、化学療法、毒素、タンパク質、ペプチド、または、化学療法として一般的に認識されている以下のクラスの小分子化学療法薬、すなわち、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、マイクロチューブリン阻害剤、細胞毒性抗生物質、及び代謝拮抗剤などの他の治療薬、診断薬または造影剤と組み合わせて投与することができ（ペプチドＩ／Ｏ複合体に連結されるか、またはペプチドＩ／Ｏ複合体と共にペプチドに連結される診断薬または造影剤として使用されるかによらず）、かかる薬剤は、（治癒、改善、または予防につながる）治療効果等を目的とするかまたは治療効果を有するものである。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、単独で、または例えば、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などのコンパニオン診断薬または造影剤と組み合わせて投与することができ（かかる診断薬または造影剤がペプチドＩ／Ｏ複合体に連結されるか、またはペプチドＩ／Ｏ複合体と併用するためのペプチドに連結された別個のコンパニオン診断薬または造影剤として使用されるかどうかによらず）、かかる薬剤は診断または造影効果を目的とするかまたは有するものである。コンパニオン診断薬及びコンパニオン造影剤に使用される薬剤は、本明細書に記載される診断及び造影剤を含むことができる。診断テストを使用して���本明細書に開示されるような治療用製品の使用を強化することができる。画像診断（インビボまたはインビトロの）を用いるテストなど、対応する診断テストを有する治療用製品の開発は、診断、治療に役立ち、治療する患者集団を特定し、対応する治療の治療効果を高めることができる。テストはまた、ＦＤＡが規制の決定を行うために使用するデータを取得するための治療製品開発も支援する。例えば、このようなテストは、治療を行うための適切な部分母集団を特定したり、深刻な副作用のリスクが高いために特定の治療を受けるべきではない集団を特定することができ、これにより、応答する可能性が最も高い患者、または特定の副作用のリスクの程度が異なる患者を特定することにより、医療を個別化またはパーソナライズすることを可能とする。したがって、本開示は、いくつかの実施形態では、治療製品としてのペプチドＩ／Ｏ複合体の安全で効果的な使用と併せて使用される治療製品及び診断装置の共同開発を含む（ペプチドＩ／Ｏ複合体自体を検出するために使用されるか、またはコンパニオン診断薬または造影剤を検出するために使用され、かかる診断薬または造影剤がペプチドＩ／Ｏ複合体に連結されているか、ペプチドＩ／Ｏ複合体と併用するためにペプチドに連結された別のコンパニオン診断薬または造影剤として使用されているかによらない）。コンパニオン装置の非限定的な例としては、生物学的診断またはイメージングに使用されるか、またはＸ線ラジオグラフィー、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、医療用超音波検査または超音波、内視鏡、弾性イメージング法、触覚イメージング、サーモグラフィー、医療用撮影術及び陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及び単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）としての核医療機能的イメージング法のイメージング技術を含む放射線医学を採り入れた、手術用顕微鏡、共焦点顕微鏡、Ｘ線透視スコープ、外視鏡、内視鏡、または外科用ロボット及び装置などの外科用器具が挙げられる。コンパニオン診断及び装置は、対象へのコンパニオン診断薬の投与後に切除された組織または細胞からのシグナルの検出、または対象からの切除後の組織または細胞にコンパニオン診断薬またはコンパニオン造影剤を直接適用した後、シグナルを検出することを含む、エクスビボで行われる試験を含み得る。エクスビボ検出に使用される装置の例としては、蛍光顕微鏡、フローサイトメーターなどが挙げられる。
【０２２９】
本開示の方法、組成物、及びキットは、状態の症状を予防、治療、抑止、逆転、または改善する方法を含むことができる。治療は、対象（例えば、疾患または状態に罹患した個人または馴化動物、野生動物または実験動物）を本開示のペプチドで治療することを含み得る。疾患の治療において、ペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体は、対象の腫瘍に接触することができる。対象はヒトであってよい。対象は、ヒト；チンパンジーなどの非ヒト霊長類、または他の類人猿もしくはサルの種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ、ネコなどの馴化動物；ラット、マウス、モルモットなどのげっ歯類を含む実験動物であってよい。対象は任意の年齢であってよい。対象は、例えば、高齢者、成人、青年期、青年期前、小児、幼児、乳児、または子宮内の胎児であってよい。
【０２３０】
治療は、疾患の臨床的発症前に対象に与えることができる。治療は、疾患の臨床的発症後に対象に与えることもできる。治療は、疾患の臨床的発症の１日、１週間、６ヶ月、１２ヶ月、または２年後、またはそれよりも後で対象に与えることができる。治療は、疾患の臨床的発症後、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２年以上、またはそれよりも長い期間にわたって対象に与えることができる。治療は、疾患の臨床的発症後、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、または２年もしくは５年未満の期間で対象に与えることができる。治療には、臨床試験でのヒトの治療も含まれ得る。治療は、本開示の全体を通じて記載される医薬組成物の１つ以上のものなどの医薬組成物を対象に投与することを含み得る。治療は、１日１回の投与を含み得る。治療は、単回投与または２回投与を含み得る。治療は、週１回、隔週、または月１回の投与、または年に１〜５回の投与を含み得る。治療は、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、皮内、関節内注射、経口、くも膜下腔内、経皮、鼻腔内、腹腔経路のいずれかを介して、または例えば直接注入経路を介して腫瘍または腫瘍の微小環境に直接、ペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体を対象に投与することを含み得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を治療するための方法であって、治療を必要とする対象に有効量の本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体を投与することを含む方法を提供する。本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体で治療することができるがんまたは状態の一例として、固形腫瘍がある。本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体で治療することができるがんの別の例として、リンパ腫、白血病、及び血液悪性腫瘍などの液性腫瘍がある。本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体によって治療することが可能ながんまたは状態のさらなる例としては、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、乳癌の転移、本明細書に記載される任意のがんの転移、結腸癌、結腸癌の転移、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、カポジ肉腫などのＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経原発性リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児型星状細胞腫、星状細胞腫、小児型非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、皮膚癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、腫瘍のユーイング肉腫ファミリー、骨肉腫、軟骨腫、骨軟骨腫、原発性及び転移性骨癌、悪性線維性組織球腫、小児型脳幹神経膠腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳及び脊髄腫瘍、中枢神経系胚芽腫、小児型中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞腫瘍、小児型中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、小児型頭蓋咽頭腫、上衣腫、小児型上衣腫、乳癌、気管支腫瘍、小児型気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、消化器癌、原発不明癌腫、心臓腫瘍、小児型心臓腫瘍、原発性リンパ腫、子宮頸癌、胆管癌、脊索腫、小児型脊索腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、びまん性正中グリオーマ、非浸潤性乳管癌、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、嗅神経芽細胞腫、小児型嗅神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、小児型頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼の癌、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫、卵管癌、骨の線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質細胞腫瘍、卵巣癌、睾丸癌、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、低悪性度グリオーマ、大脳神経膠腫症、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、組織球症、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、黒色腫、黒色腫の転移、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、腎癌、腎細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、小児型腎腫瘍、口唇癌、肝臓癌、肺癌、髄芽腫、非ホジキンリンパ腫、マクログロブリン血症、原発性マクログロブリン血症、男性乳癌、メルケル細胞癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線癌、口腔癌、多発性内分泌腺腫症、小児型多発性内分泌腺腫症、、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄増殖性腫瘍、粘液乳頭状上衣腫、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、乏突起膠細胞腫瘍、混合星状細胞腫、中咽頭癌、卵巣癌、低悪性度腫瘍、膵癌、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫、小児型乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、咽頭癌、毛様細胞性星細胞腫、下垂体腫瘍、多形黄色星細胞腫（ＰＸＡ）、胸膜肺芽腫、小児型胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、妊娠関連癌、横紋筋肉腫、小児型横紋筋肉腫、唾液腺癌、セザリー症候群、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、睾丸癌、咽頭癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、子宮癌、尿道癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、血管腫瘍、及び外陰癌が挙げられる。
【０２３２】
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、その機能の強さもしくは特異性を変化させるため、または機能を獲得もしくは欠失させるために、特定の組織（他の組織ではなく）にホーミング、分布、ターゲティング、移動、蓄積、または誘導されるように変異される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本開示は、がんを治療するための方法であって、治療を必要とする対象に有効量の本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体を投与することを含む方法を提供する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本開示は、がんを治療するための方法であって、治療を必要とする患者に本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体と、薬学的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞の侵襲活性を阻害するための方法であって、有効量の本開示のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２３６】
本明細書に記載される配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれかの配列を含むペプチド、及び任意のペプチド誘導体またはペプチドＩ／Ｏ複合体を用いて、がん（例えば、脳腫瘍、乳癌、軟部組織肉腫、腎細胞癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、上部消化管癌、膵癌、前立腺癌、頭頸部扁平上皮癌、尿路上皮癌、卵巣癌、滑膜癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮癌、食道癌、胃癌、子宮頸癌、皮膚癌、骨肉腫、または他の任意の固形腫瘍）にターゲティングすることができる。本明細書に記載される配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれかの配列を含むペプチド、及び任意のペプチド誘導体またはペプチドＩ／Ｏ複合体を用いて任意のがんにさらにターゲティングするか、または細胞内、必要に応じて細胞質、エンドソーム、または細胞内区画にＩ／Ｏの送達をターゲティングすることができる。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、対象のがん状態を治療する方法であって、配列番号１の配列を含む治療有効量のペプチドＩ／Ｏ複合体またはそのフラグメントを対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、対象のがん状態を治療する方法であって、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドＩ／Ｏ複合体またはそのフラグメントを対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２３８】
本明細書に記載される毒または毒素由来のペプチド（複数可）、ペプチド、修飾ペプチド、標識ペプチド、ペプチドＩ／Ｏ複合体、及び医薬組成物は、治療的処置のために投与することができる。治療用途では、組成物は、既に疾患または状態を罹患している対象に、疾患または状態の症状を治療するかもしくは少なくとも部分的に抑止するうえで、または状態を治療、治癒、改善、もしくは緩和するうえで充分な量で投与することができる。本明細書に記載されるそのようなペプチドは、状態を、予防、すなわち発症、罹患、または増悪させる確率を（全体的または部分的に）低減するために投与することもできる。この使用に有効な量は、疾患または状態の重症度及び経過、以前の治療、対象の健康状態、体重、薬剤に対する反応、及び治療に当たる医師の判断に基づいて異なり得る。本明細書に記載される毒または毒素由来のペプチド（複数可）、ペプチド、修飾ペプチド、標識ペプチド、ペプチドＩ／Ｏ複合体、及び医薬組成物は、ペプチド、ペプチドＩ／Ｏ複合体、及び任意の結合体の局所送達のターゲティングされたホーミングを可能とする。例えば、ＩＬ−１５剤、４−１ＢＢリガンド、ＲＩＧ−Ｉリガンド、及び／またはＳＴＩＮＧリガンドなどのＩ／Ｏと結合されるか、またはＩ／Ｏとの複合体（例えば、リポソーム製剤）として共配合されたペプチドは、Ｉ／Ｏの局所送達を可能とし、これは、従来のＩ／Ｏの全身的送達よりもはるかに効果的で毒性が低い。
【０２３９】
一部のがんは、脳または中枢神経系（ＣＮＳ）に発生し得る。Ｉ／Ｏなどのさまざまな治療薬は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができず、または治療に適切な濃度でＣＮＳに入ることができない。本開示のペプチドまたはその変異体はＢＢＢ透過性を有し得るものであり、ＣＮＳ及び脳のがんにＩ／Ｏを送達することができる。あるいは、本開示のペプチドまたはその変異体は、Ｉ／Ｏへの曝露から脳を保護しつつ末梢腫瘍を治療するために非ＢＢＢ透過性であってもよい。
【０２４０】
キット
ペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体は、キットとしてパッケージングすることができる。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチド、Ｉ／Ｏ、ペプチドＩ／Ｏ複合体、またはそれらの任意の組み合わせの使用または投与についての使用説明書を含む。
【実施例】
【０２４１】
以下の実施例は、本開示のいくつかの実施形態をさらに説明するために含まれるものであり、本開示の範囲を限定するために使用されるべきではない。
【０２４２】
実施例１
組換え発現によるペプチドの製造
本実施例では、組換え発現によるペプチドの製造について記載する。ペプチド配列を、標準的な分子生物学技術を使用してＤＮＡに逆翻訳し、合成し、シデロカリンとインフレームでクローニングする。（Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．２０１２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．）。得られたコンストラクトをレンチウイルスにパッケージングし、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で単離し、タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断し、逆相クロマトグラフィーで均一になるまで精製する。精製後、各ペプチドを凍結乾燥し、冷凍保存する。
【０２４３】
実施例２
ペプチドの合成による製造
本実施例では、ペプチドの合成による製造について記載する。ペプチド配列を、標準的なＦｍｏｃ化学及び保護手法を用いた固相ペプチド合成法により合成した。合成後、ペプチドを樹脂から切断し、逆相クロマトグラフィーで精製する。酸化用の酸化還元対を使用して弱塩基性ｐＨでインキュベーションすることによってペプチドをフォールディングさせ、ジスルフィド結合を形成した。次に、フォールディングしたペプチドを逆相クロマトグラフィーで精製し、バッファー交換し、凍結乾燥した。ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣ、質量分析、及び必要に応じて２Ｄ−ＮＭＲやＬＣ−ＭＳペプチドマッピングなどの他の方法によって特性評価した。
【０２４４】
配列番号５６８、配列番号６８３、及び配列番号５６９のペプチドは、Ｆｍｏｃ化学により合成し、樹脂から切断し、フォールディングさせ、精製した。各ペプチドの質量をＬＣ−ＭＳで検証し、その純度をＲＰ−ＨＰＬＣで特性評価した。
【０２４５】
本開示のペプチドのいずれも、同様の方法で製造することができる。
【０２４６】
実施例３
ペプチドの放射性標識
本実施例では、還元的アルキル化などの標準的な方法によるペプチドの放射性標識について記載する。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５４（１１）：４３５９−６５  （１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖ９１：１９８３  ｐ．５７０、及びＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５４（１１）：１９７９  ｐ．４３５９を参照されたい。１４Ｃホルムアルデヒドを過剰量で使用して、完全なメチル化（すべての遊離アミンのジメチル化）を確実に行う。標識されたペプチドは、Ｓｔｒａｔａ−Ｘカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ８Ｂ−Ｓ１００−ＡＡＫ）による固相抽出によって単離し、５％メタノールを含む水で洗浄し、２％ギ酸を含むメタノール中に回収する。その後、穏やかな加熱と窒素ガス流を用いてブローダウンエバポレータで溶媒を除去する。
【０２４７】
実施例４
ペプチドの同位体標識
本実施例では、ペプチドの同位体標識について記載する。固相ペプチド合成において、同位体標識したアミノ酸、１５Ｎ１３Ｃアルギニンをペプチドに組み込んだ。同位体標識されたペプチドが生成された。このペプチドを用いて、生物学的試料中のペプチドまたはペプチドＩ／Ｏ複合体の濃度を測定した。
【０２４８】
固相ペプチド合成を行って、同位体標識されたアルギニンが組み込まれた配列番号５６９のペプチドを生成した。Ａｒｇ１４、Ａｒｇ１５及びＡｒｇ２３に、均一に標識した１３Ｃ６（９８％）及び１５Ｎ４（９８％）を組み込み、適切にフォールディングされた配列番号５６９のペプチドを得た。同位体標識したペプチドを近赤外色素ＩＣＧ−スルホをリシン２７に結合させることによりさらに改変し、質量４７９５．５ダルトン、純度９６％の同位体標識された結合体を得た。この結合体は、動物実験で血中のペプチド濃度を測定するために効果的に使用された。
【０２４９】
本開示のペプチドのいずれも同様の方法で標識することができる。
【０２５０】
実施例５
ペプチドと検出可能な薬剤との結合体
本実施例では、ペプチドの色素標識について記載する。配列番号２または配列番号５６９のペプチド（配列番号２の非ＧＳバージョン）を組換えにより発現させ、または化学的に合成した後、このペプチドのＮ末端及び／または１つ以上のリシン残基の側鎖のアミンを、アミド結合を介して検出可能な薬剤に結合して、ペプチドと検出可能な薬剤との結合体を作製した。検出可能な薬剤はインドシアニングリーン色素（ＩＣＧ）とした。
【０２５１】
このペプチドと検出可能な薬剤との結合体を対象に投与した。対象は、がん細胞を移植し、腫瘍にまで増殖させた非ヒト動物とした。投与後、ペプチドと検出可能な薬剤との結合体は腫瘍にホーミングした。対象または対象から得た組織をイメージングして、ペプチドと検出可能薬剤との結合体の腫瘍への局在化を可視化した。投与後の腫瘍におけるペプチドと検出可能な薬剤との結合体の可視化は、がんの診断における造影剤または診断薬として用いることができる。対象の生検におけるがんの確認は、標準的な組織病理学によって確認した。配列番号５６８のペプチドを、ヒト神経膠腫Ｕ３７３またはＵ８７細胞またはヒト肺癌Ａ５４９細胞などの細胞に適用し、２４時間インキュベートした。ペプチドは単独で適用し、免疫細胞化学によって検出するか、または適用に先立ってＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素で標識した後、共焦点顕微鏡によりイメージングした。ペプチドは細胞に透過し、トランスゴルジ近傍及び核周囲領域などの細胞内の場所で検出された。Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｌ  １１：１−１３（２０１１）。本明細書に開示されるペプチドの腫瘍蓄積を実証するための実験を行った。配列番号５６９のペプチドをＩＣＧ色素に結合して、図２７に示す分子を合成した。同種移植片を作製するため、マウス（雌性Ｂａｌｂｃ及びＣ５７ＢＬ６／Ｊ系統、Ｅｎｖｉｇｏ）にＣＴ２６、Ｂ１６Ｆ１０、またはＡ２０細胞を容量１００μｌで接種した。腫瘍を移植後１２〜１５日間増殖させた後、腫瘍を有するマウスにＩＣＧ色素に結合した配列番号５６９のペプチドを１０ナノモル（容量１００μＬ）で静脈内注射した。腫瘍を投与２４時間後に切除し、近赤外蛍光スキャナーを使用してイメージングした。図２３は、ＩＣＧ色素に結合した配列番号５６９のペプチドを注射しなかったマウスのＣＴ２６腫瘍における白色光イメージ及び蛍光シグナル、及びＩＣＧ色素に結合させた配列番号５６９のペプチドを注射した２匹のマウスから得た腫瘍におけるシグナルを示す。図２４は、ＩＣＧ色素に結合した配列番号５６９のペプチドを注射しなかったマウスのＢ１６Ｆ１０腫瘍における白色光イメージ及び蛍光シグナル、及びＩＣＧ色素に結合させた配列番号５６９のペプチドを注射した２匹のマウスから得た腫瘍におけるシグナルを示す。図２５は、ＩＣＧ色素に結合した配列番号５６９のペプチドを注射しなかったマウスのＡ２０腫瘍及び筋肉（対側脇腹）における白色光イメージ及び蛍光シグナル、及びＩＣＧ色素に結合させた配列番号５６９のペプチドを注射した２匹のマウスから得た腫瘍及び筋肉（対側脇腹）におけるシグナルを示す。ＩＣＧ色素に結合させた配列番号５６９のペプチドで処理したＡ２０マウスにおける腫瘍のシグナルは、これらの処理マウスの筋肉のシグナルよりも５〜１１倍高かった。腫瘍のシグナルは、各群の非処理マウスの腫瘍のシグナルよりもＣＴ２６腫瘍で２０００〜４０００倍、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍で１０００〜１５００倍高かった。これらのデータは、ＩＣＧ色素に結合した配列番号５６９のペプチドが、ＣＴ２６結腸癌腫瘍、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍、及びＡ２０リンパ腫腫瘍にインビボで蓄積することを示している。
【０２５２】
本開示のペプチドのいずれも、ＩＣＧ色素を用いた同様の方法で標識することができる。他の検出可能な色素を使用して、本明細書に記載される本開示のペプチドを標識することもできる。
【０２５３】
実施例６
ペプチドの投与
本実施例では、ペプチドをマウスに投与するための投薬計画について記載する。異なる用量のペプチドを、体重２０ｇ〜２５ｇの雌性Ｈａｒｌａｎ胸腺欠損ヌードマウスに尾静脈注射により投与する（ペプチド当たりｎ＝２匹のマウス）。必要に応じて、腎臓を結紮してペプチドの腎濾過を防止する。必要に応じて、実際の結合剤がメチルまたはジメチルリシン（複数可）及びメチル化またはジメチル化されたアミノ末端を含むことができるように、リシン及びＮ末端をメチル化することによって各ペプチドを放射性標識するか、および／または各ペプチドをＣｙ５．５−ＮＨＳエステルのような検出可能な薬剤で標識する。
【０２５４】
必要に応じてペプチドとのモル比が１：１のフルオロフォアを含む、１０〜２５ｕＣｉの１４Ｃを保持する標的用量５０〜１００ｎｍｏｌの各ペプチドを、雌性Ｈａｒｌａｎ胸腺欠損ヌードマウスに投与する。各ペプチドを動物体内で自由に循環させた後、動物を安楽死させ、切片化する。
【０２５５】
実施例７
ペプチドホーミング
本実施例では、マウスの腫瘍へのペプチドのホーミングについて説明する。実施例６の投与期間の終了時に、マウスをヘキサン／ドライアイス浴で凍結し、次いでカルボキシメチルセルロースのブロック中で凍結する。動物全体の矢状切片を調製し、イメージングに用いる薄い凍結切片を得る。脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部消化管、下部消化管、骨、骨髄、生殖器系、目、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、及びその他の種類の組織などの組織のイメージングを含む動物の薄い凍結切片をミクロトームを用いて得て、冷凍庫内で乾燥させ、ホスホイメージャープレートに約１０日間曝露する。
【０２５６】
放射性標識ペプチドの場合では、これらのプレートを現像し、各臓器からのシグナル（デンシトメトリー）を各動物の心臓の血液に見られるシグナルに対して正規化する。検出可能な薬剤とペプチドとの結合体については、組織を蛍光イメージャーまたは蛍光顕微鏡法でイメージングする。その組織に存在する血液から予想されるシグナルよりも強い組織中のシグナルは、領域、組織、構造、または細胞中のペプチドの蓄積を示す。あるいは、組織を採取して、ホモジナイズし、液体シンチレーションカウンティング（放射性標識）または吸光度測定（検出可能な薬剤の結合体）などにより、異なる組織中のペプチド含有量を分析する。
【０２５７】
実施例８
安定的なリンカーを有するペプチド結合体
本実施例では、安定的なリンカーを有するペプチド結合体の調製について記載する。本開示のペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成する。ペプチドを、検出可能な薬剤またはＩ／Ｏまたは他の任意の活性剤と、アミド結合またはカルバメート結合などの安定的なリンカーを介して結合する。ペプチドは、標準的な１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）に基づいた化学、または塩化チオニルもしくは塩化リンに基づいたバイオコンジュゲーション化学、または本開示に記載されるような他の化学を用いて結合される。
【０２５８】
リンカーを介して結合されたペプチドとＩ／Ｏとは、リンカーをＡ−Ｂ−Ｃとして式：ペプチド−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｉ／Ｏで記述される。Ａは、ペプチド上のアミンを、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルまたはＮＨＳエステルまたはＡＴＴ（アシル−１，３−チアゾリジン−２−チオン）基を含むリンカーと反応させることにより形成されるものなどの安定的なアミド結合とすることができる。Ａは、ペプチド上のアミンを、ＣＤＩとリンカー上のヒドロキシルとの反応によって形成されたイミダゾールカルバメート活性中間体と反応させることによって形成されるものなどの安定的なカルバメートリンカーであってもよい。Ａは、リンカー上のアルデヒドまたはケトン基によるペプチド上のアミンの還元的アルキル化によって形成されるものなどの安定的な第２級アミン結合であってもよい。Ａは、リンカー中のマレイミドまたはブロモアセトアミドをペプチド中のチオールとともに用いて形成される安定的なチオエーテルリンカー、トリアゾールリンカー、安定的なオキシムリンカー、またはオキサカルボリンリンカーであってもよい。Ｂは、（−ＣＨ２−）ｘ−、または短鎖ＰＥＧ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｘ（ｘは０〜２０）、または他のスペーサー、またはスペーサーなしである。Ｃは、Ｉ／Ｏ上のアミンまたはカルボン酸と形成されるアミド結合、リンカー上のマレイミドとＩ／Ｏ上のスルフヒドロイル間で形成されるチオエーテル、第２級もしくは第３級アミン、カルバメート、またはその他の安定的な結合であるか、またはＡとして形成された結合を超えて存在しない。“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ＡＤＣ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２０１５  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１１０９５−０１５−１６５７−７、または‘Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”  Ｇｒｅｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎに記載される任意のリンカー化学を用いることができる。
【０２５９】
得られたペプチド結合体を、ヒトまたは動物に、皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍内に直接注入することにより疾患を治療する。ペプチドは、標的とする機構によって検出可能な薬剤、Ｉ／Ｏ、または活性剤から特異的に切断されない。ペプチドは、異化などの機構によって分解され、その「天然」または最初の形態から改変されるかまたは改変されていない薬物を放出することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｓｉｎｇｈ，  Ｌｕｉｓｉ，ａｎｄ  Ｐａｋ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ（２０１５）３２：３５４１−３５７１）。ペプチド薬物結合体は、インタクトな状態で、または部分的もしくは完全に分解、代謝、もしくは異化された状態でその薬理活性を示す。
【０２６０】
実施例９
切断可能なリンカーを有するペプチド結合体
本実施例では、切断可能なリンカーを有するペプチド結合体の調製について記載する。本開示のペプチドを、組換えによって発現させるかまたは化学合成する。ペプチドとＩ／Ｏとはリンカーを介して結合され、リンカーをＡ−Ｂ−Ｃとして式：ペプチド−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｉ／Ｏで記述される。Ａは、ペプチド上のアミンを、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルまたはＮＨＳエステルまたはＡＴＴ基を含むリンカーと反応させることにより形成されるものなどの安定的なアミド結合である。Ａは、ペプチド上のアミンを、ＣＤＩとリンカー上のヒドロキシルとの反応によって形成されたイミダゾールカルバメート活性中間体と反応させることによって形成されるものなどの安定的なカルバメートリンカーであってもよい。Ａは、リンカー上のアルデヒドまたはケトン基によるペプチド上のアミンの還元的アルキル化によって形成されるものなどの安定的な第２級アミン結合であってもよい。Ａは、リンカー中のマレイミドまたはブロモアセトアミドをペプチド中のチオールとともに用いて形成される安定的なチオエーテルリンカー、トリアゾールリンカー、安定的なオキシムリンカー、またはオキサカルボリンリンカーであってもよい。場合により、Ａは、ペプチドがＣに切断可能な結合を介して直接結合されるために存在しない。Ｂは、（−ＣＨ２−）ｘ−、または短鎖ＰＥＧ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｘ（ｘは０〜２０）、または他のスペーサー、またはスペーサーなしである。Ｃは、Ｉ／Ｏ上のヒドロキシルまたはカルボン酸とのエステル結合、または加水分解によって、及び／または酵素的に切断されるように設計されたカーボネート、ヒドラゾン、またはアシルヒドラゾンである。開裂速度は、炭素長（−ＣＨ２−）ｘ、立体障害（メチル、エチル、環状基などの隣接する側基を含む）、親水性または疎水性など、エステル周囲の局所環境を変化させることによって変化する。加水分解速度は、エンドソーム及びリソソームまたは病変組織などの身体または細胞の特定の区画における低いｐＨなど、局所的なｐＨによって影響される。あるいは、Ｃは、ヒドラゾンまたはオキシム結合などのｐＨ感受性基である。あるいは、Ｃは、グルタチオンによるものなど、還元によって放出されるように設計されたジスルフィド結合である。あるいは、Ｃ（またはＡ−Ｂ−Ｃ）は、酵素によって切断可能なペプチド結合の設計である。場合により、ｐＡＢＣなどの自己犠牲基を含めることにより、切断に際して遊離非修飾薬物を放出させる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｓｉｎｇｈ，Ｌｕｉｓｉ，ａｎｄ  Ｐａｋ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ（２０１５）３２：３５４１−３５７１）。リンカーは、エステラーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、カテプシンＢなどのカテプシン、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、またはトロンビンなどの酵素によって切断される。あるいは、切断されるように設計された結合は、ＣではなくＡとし、Ｃは安定的な結合または切断可能な結合とすることができる。別の設計は、ＡとＣに安定的なリンカー（アミドまたはカルバメートなど）を有し、Ｂにジスルフィ��結合などの切断可能なリンカーを有することである。還元速度は、メチル基またはエチル基による立体障害などの局所効果または、疎水性／親水性を調整することによって調節される。
【０２６１】
得られたペプチド結合体を、ヒトまたは動物に、皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍内に直接注入することにより疾患を治療する。
【０２６２】
実施例１０
ＲＮＡまたはＤＮＡへのチオール基、アミン基、またはアルデヒド基の導入
本実施例では、ＲＮＡまたはＤＮＡへのチオール基、アミン基、またはアルデヒド基の組み込みについて記載する。図１は、ＲＮＡまたはＤＮＡへのこれらの基の組み込みまたは付加を示している。チオール基は、例えば、ＲＩＧ−ＩリガンドまたはＭＤＡ５リガンド上で、ＥＤＣ及びイミダゾールを使用して５’リン酸基をホスホリルイミダゾリドに活性化し、次いで、得られた生成物をシスタミンと反応させることにより、ＲＮＡまたはＤＮＡに付加される。次いで、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元して、遊離チオール基へのホスホロアミダイト結合を形成する。あるいは、チオール基は、図１に示されるように、固相ホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成中にチオールを有するホスホロアミダイトを組み込むことによって、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかにおいてＲＮＡまたはＤＮＡに付加される。合成中に使用されるホスホロアミダイトは、切断、精製、及びワークアップ時に除去される保護基を、合成中にチオールに有してもよい。図１Ａは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｄｂｉｏ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／５０／Ｔｈｉｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに示される、５’末端チオール（チオヘキシル、Ｃ６）修飾（左）、及び３’末端チオール（Ｃ３）修飾（右）を有するオリゴヌクレオチドの構造を示す。
【０２６３】
アミン基は、後で脱保護される保護されたアミノ基を有するホスホロアミダイトを合成中に組み込むことにより、ＲＮＡまたはＤＮＡに付加される。図１Ｂは、ＭＭＴ−ヘキシルアミノリンカーホスホロアミダイトを示す。図１Ｃは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｍ０１０２３ｈｈ？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳに示されるＴＦＡ−ペンチルアミノリンカーホスホロアミダイトを示す。
【０２６４】
あるいは、チオールまたはアミン含有オリゴヌクレオチド残基は、Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｍａｙ  ２７；７０（１１）：４２８４−９９）に記載されるような、ＲＮＡまたはＤＮＡ中の任意の選択された位置において配列内に導入される。図１Ｄは、Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｍａｙ  ２７；７０（１１）：４２８４−９９）に示されるようなアミンまたはチオール残基を含むＲＮＡ残基を示す。また、ホスホジエステル骨格内にホスホロチオエート基（硫黄原子がオリゴヌクレオチドのリン酸骨格の非架橋酸素を置き換えている）を含むオリゴヌクレオチド残基は、チオール基への結合に同様に使用される反応基を与える。ホスホロチオエート含有残基の使用により、ＲＮＡのヌクレアーゼ分解に対する耐性を高めることもできる。
【０２６５】
図１Ｅは、５’末端（左）及び３’末端（右）にアミノヘキシル修飾を有するオリゴヌクレオチドを示す。
【０２６６】
過ヨウ素酸酸化を使用してジオールを２個のアルデヒド基に変換することにより、ＲＮＡの３’末端にアルデヒド官能基を組み込むことができる。
【０２６７】
官能基を組み込むかまたは修飾する他の方法は、Ｇｒｅｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載される方法を用いて行われる。
【０２６８】
実施例１１
環状ジヌクレオチドへのカルボキシレート基、チオール基、またはアミン基の組み込み
本実施例では、環状ジヌクレオチドへのカルボキシレート基、チオール基、またはアミン基の組み込みについて記載する。環状ジヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのいずれか１つに結合される本開示のＩ／ＯであるＳＴＩＮＧリガンドとして機能する。
【０２６９】
環状ジヌクレオチドのヒドロキシル基をクロロ酢酸と反応させてカルボン酸塩を形成させる。このカルボン酸塩を、ＥＤＣを用い、エチレンジアミンなどのジアミンとのその後の反応によってアミン基に変換する。あるいは、カルボン酸塩を、ＥＤＣを用い、シスタミンとのその後の反応によってチオール基に変換する。これに続いて、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）による還元を行う。得られた環状ジヌクレオチドは、本開示の任意のペプチドと結合することができる状態であり、ＳＴＩＮＧをアゴナイズするために投与される。
【０２７０】
あるいは、環状ホスホジエステルにビスホスホロチオエート結合を含むＳＴＩＮＧリガンドは、ペプチド−Ｉ／Ｏ複合体のＩ／Ｏとして使用することができる反応性チオールを与える。これらのチオールを、マレイミド、ブロモアセチル、ヨードアセチル、またはピリジルジチオール基と反応させる（図１２Ａ）。
【０２７１】
あるいは、ＣＤＮ内のプリン塩基の５員環のＣ８位をＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）で臭素化して反応性臭素基を与えることもできる。次に、反応性臭素基を、チオールなどの官能基を有するアミン含有基、またはさらなる結合に利用することができる保護されたアミンと結合する（図１２Ｂ）。
【０２７２】
例えば、構造中に１個もしくは２個のホスホロチオレート結合を有するか、または１個もしくは２個のグアノシンを有することにより（アデノシンはＮＢＳとの反応性がより低いため）、１個または２個の官能基が環状ジヌクレオチドに組み込まれる。
【０２７３】
実施例１２
ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドとペプチドとの間の切断可能なリンカーの生成
本実施例では、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのいずれか１つとの間の切断可能なリンカーの生成について記載する。チオールを有するＲＮＡ／ＤＮＡ／環状ジヌクレオチドと遊離チオール基を含むペプチドとを組み合わせることによりジスルフィドリンカーが生成される。チオールは、反応性アミンにＴｒａｕｔ試薬、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、またはその他の適切な試薬（Ｎ末端またはリシン残基を有するヘテロ二官能性ＳＰＤＰ及びＮＨＳエステルリンカーなど）を用いるか、またはペプチドに遊離システイン残基を組み込むことによってペプチドに組み込まれる（図１３）。ジスルフィドリンカーは、細胞質の還元的環境中、またはエンドソーム／リソソーム経路で切断される。
【０２７４】
エステル結合は、遊離ヒドロキシル基（ＲＮＡもしくはＤＮＡの３’末端、または環状ジヌクレオチド内のリボース単位上のものなど）と、ペプチドのカルボン酸基（Ｃ末端、アスパラギン酸、グルタミン酸残基からのもの、またはリンカーを介してリシン残基またはＮ末端に導入されたものなど）とを、例えばフィッシャーエステル化反応により、または塩化アシルの使用によって組み合わせることによって生成される。エステルリンカーは、エンドソーム及びリソソームのより低いｐＨによって加速される加水分解によって、または酵素的エステラーゼ切断によって切断される。
【０２７５】
オキシムまたはヒドラゾン結合は、ＲＮＡ／ＤＮＡ／環状ジヌクレオチドのアルデヒド基と、アミノオキシ基（オキシム結合を形成する）またはヒドラジド基（ヒドラゾン結合を形成する）で官能化されたペプチドとを組み合わせることによって生成される。オキシムまたはヒドラゾン結合の安定性または不安定性は、隣接する基によって調整され（Ｋａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２００８；４７（３９）：７５２３−６．）、エンドソーム／リソソームなどの酸性区画内で加水分解による切断が加速される。
【０２７６】
ヒドラジド基は、アジピン酸ジヒドラジドまたはカルボヒドラジドをＣ末端またはアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸基と反応させることによってペプチドに組み込まれる。アミノオキシ基は、Ｎ末端またはリシン残基を、一端にＮＨＳエステルを、他端にフタルイミドキシ基を含むヘテロ二官能性分子と反応させた後、ヒドラジンで切断することによってペプチド上に組み込まれる。反応は、場合により、アニリンの添加によって触媒される。
【０２７７】
いずれのリンカーの切断速度も、例えば、切断可能な結合の近くの電子密度を改変することによって、または切断部位へのアクセスに立体的に影響を及ぼすことによって（例えば、メチル基、エチル基、または環状基などのかさ高い基を付加することによって）調節される。
【０２７８】
あるいは、切断可能なリンカーは、Ｇｒｅｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに示されている方法を使用して生成される。
【０２７９】
ＲＮＡまたはＤＮＡへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例１０で上記に述べたようにして行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミン基の導入は、実施例１１で上記に述べたようにして行われる。
【０２８０】
例示的なペプチド−ＲＮＡ結合体を、図３４〜図３５、及び図３９〜図４４に示す。図３４は、ジスルフィド切断可能リンカーによって互いに連結された、配列番号５６８のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長アミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている点に留意されたい。図３５は、図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体のペプチドの切断産物を示す。
【０２８１】
図３９は、ヒドラゾン／ＰＥＧリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。図４０は、ジスルフィド／ＰＥＧリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。図４１は、ジスルフィド／ＰＥＧリンカーによって互いに連結された、ＩＣＧ色素に結合された配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。図４２は、ヒドラゾンリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。図４３は、長いジスルフィドリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。図４４は、短いジスルフィドリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【０２８２】
図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体は、合成によって生成し、精製し、質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで検証し、純度をＲＰ−ＨＰＬＣで測定した。
【０２８３】
実施例１３
ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドとペプチドとの間の安定的なリンカーの生成
本実施例では、ＲＩＧ−ＩリガンドまたはＳＴＩＮＧリガンドなどの、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのいずれか１つとの間の安定的なリンカーの生成について記載する。第２級アミンを介した安定的なリンカーは、アルデヒドを有するＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドを、ペプチドのＮ末端またはリシン残基のアミンに結合させた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することで行われる、還元的アミノ化によって生成される。
【０２８４】
安定的なアミド結合は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドのアミン基を、ペプチドのＣ末端またはアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボキシレートと組み合わせることによって生成される。
【０２８５】
安定的なカルバメート結合は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドのヒドロキシル基を、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）で活性化し、続いてペプチドのＮ末端またはリシン残基と反応させることによって生成される。
【０２８６】
マレイミドリンカーは、チオールを有するＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドをマレイミドで官能化されたペプチドと組み合わせることによって生成される。ペプチドは、ペプチド中の反応性アミンに対してＮＨＳ−Ｘ−マレイミドヘテロ二官能性剤を使用して官能化される（Ｘは任意のリンカーである）。マレイミドリンカーは、安定的なリンカーとして、または緩慢に切断可能なリンカーとして使用され、後者は生物学的液体中の他のチオール含有分子との交換によって切断される。マレイミドリンカーは、Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０１５，２６（１），ｐｐ  １４５−１５２に記載されるものを含むさまざまな置換基を用いてリンカーのスクシンイミド部分を加水分解することによっても安定化される。
【０２８７】
例えば、ポリヌクレオチドに官能基を組み込む、付加する、または修飾する他の方法は、Ｇｒｅｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載される方法を用いて行われる。
【０２８８】
ＲＮＡまたはＤＮＡへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例１０で上記に述べたように行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミン基の導入は、実施例１１で上記に述べたように行われる。
【０２８９】
ＲＮＡ  Ｉ／Ｏを含む例示的な安定的なペプチドＩ／Ｏ複合体を図３６〜図３８に示す。図３６〜図３８に示されるペプチドＩ／Ｏ複合体は合成により生成し、精製した。それらの質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって検証され、純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって測定した。
図３６は、延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、配列番号５６８のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。図３７は、延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、配列番号５６９のペプチドとｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。図３８は、延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、ＩＣＧ色素に結合された配列番号５６９のペプチド（図２７のペプチド複合体を参照）とｄｓＲＮＡ（配列番号１３７１）を含むＩ／Ｏとから構成されるペプチドＩ／Ｏ複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるｄｓＲＮＡ中の改変塩基に結合されている（例えば、図に示されるように、配列番号１３７１中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている［図示のように］）。このペプチドＩ／Ｏ複合体中の配列番号１３７１のｄｓＲＮＡは、５’ｐｐｐ（三リン酸）を有し、ヘアピン構造として形成されている。
【０２９０】
実施例１４
ＲＮＡとペプチドとの間のボロン酸エステル結合の生成
本実施例では、ＲＩＧ−ＩリガンドまたはＭＤＡ５リガンドなどのＲＮＡと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのいずれか１つとの間のボロン酸エステル結合の生成について記載する。フェニルボロン酸（ＰＢＡ）は、ｃｉｓジオールと可逆的な共有結合による複合体を形成する。切断可能なリンカーは、ＲＮＡの３’末端のジオールとＰＢＡ含有ペプチドの間で共有結合による複合体を形成することによって形成される。ＰＢＡグループは、還元的アミノ化を介して４−ホルミル−ＰＢＡをペプチドのＮ末端またはペプチド中のリシンと反応させることによりペプチドに組み込まれる。ＰＢＡのｐＫａは、隣接基（例えば、アミン）によってｐＫａを約６にまで低下させるように調節され、中性ｐＨで複合体化を、より低いｐＨで放出を可能とする（Ａｇｕｉｒｒｅ−Ｃｈａｇａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｍａｃｒｏ  Ｌｅｔｔ．，２０１４，３  （１２），ｐｐ  １２４９−１２５３；Ｗｉｎｂｌａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０００  Ｗｉｎｔｅｒ；１（４）：５２３−３３；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｍａｃｒｏ  Ｌｅｔｔ．，２０１２，１（５），ｐｐ  ５２９−５３２，Ｇｅｎｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０１７，２８（５），ｐｐ  １３９１−１４０２）。ボロン酸エステル結合は、エンドソーム／リソソームの低ｐＨ環境によって切断される。切断後、ＲＮＡは未修飾の形態で放出されるため、ＲＮＡの送達はトレースできない。
【０２９１】
実施例１５
ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドとペプチドとの間の酵素切断可能な結合の生成
本実施例では、ＲＩＧ−ＩリガンドまたはＳＴＩＮＧリガンドなどの、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのいずれか１つとの間の酵素切断可能な結合の生成について記載する。酵素的に切断可能な結合が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドとペプチドとの間に生成される。切断可能な結合を有する結合体はインビトロまたはインビボで投与され、細胞内または体内の酵素によって切断されて、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドを放出する。酵素は、エンドソーム／リソソーム、サイトゾル、細胞表面に存在するか、腫瘍の微小環境中で上方制御する。これらの酵素としては、これらに限定されるものではないが、カテプシンＢなどのカテプシン（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２０１７  Ｏｃｔ；３８（１０）：８７３−８９８に記載されるすべてのものなど）、β−グルクロニダーゼを含むグルコロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、及びＭＭＰ−１、２、７、９、１３、または１４などのマトリックスメタロプロテアーゼ（Ｋｅｓｓｅｎｂｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１０  Ａｐｒ  ２；１４１（１）：５２−６７）が挙げられる。カテプシンまたはＭＭＰは、以下の表９に示される配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３、及び配列番号１３６５のいずれかのアミノ酸配列を切断する（Ｎａｇａｓｅ，Ｈｉｄｅａｋｉ．  “Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＭＭＰｓ．”Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１．３９−６６；Ｄａｌ  Ｃｏｒｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０１７，２８  （７），ｐｐ  １８２６−１８３３；Ｄａｌ  Ｃｏｒｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１．１８（２０１５）：６９２１−６９２９；Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００８  Ｏｃｔ；１９（１０）：１９６０−３．も参照）。グルクロニダーゼリンカーには、Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００６，１７（３），ｐｐ８３１−８４０に記載されるリンカーのいずれか１つを含まれる。
【表９−１】
2021506849.tif 000106
【表９−２】
2021506849.tif 000107
【０２９２】
Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｎｏｖ；３２（１１）：３５２６−４０に記載されるような酵素的に切断可能なリンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドのアミン基にＰＡＢＣ末端を結合させることにより作製される。バリン末端は、例えば、ペプチドのＣ末端とのアミド結合を生成することにより、ペプチドにさらに結合される。Ｖａｌ−Ｃｉｔ結合（配列番号１１４２）への酵素の立体的アクセスを促進するため、必要に応じて分子のいずれかの側にスペーサーを組み込む。あるいは、ペプチドへの結合は、ペプチドのＮ末端をＳＡＴＡにより活性化し、チオール基を形成し、次いでこのチオール基をＶａｌ−Ｃｉｔのペア（配列番号１１４２）のＮ末端に結合されたマレイミドカプロイル基と反応させることによって生成される。カテプシンＢによる切断時に自己犠牲ＰＡＢＣ基は自然に脱離し、アミンを含むＲＮＡ、ＤＮＡ、または環状ジヌクレオチドをさらなる化学修飾なしで放出する。他のアミノ酸ペアとしては、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４９７）が挙げられる。
【０２９３】
ＲＮＡまたはＤＮＡへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例１０で上記に述べたようにして行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミノ基の導入は、実施例１１で上記に述べたようにして行われる。
【０２９４】
実施例１６
ＲＩＧ−Ｉリガンドとペプチドの結合
本実施例では、本開示のペプチドへのＲＩＧ−１リガンドの結合について記載する。ペプチドは、配列番号２または配列番号５６９（Ｎ末端のＧＳのない配列番号２）である。図２に示されるＲＩＧ−Ｉリガンドを、骨格の安定性を高めるために２’−フルオロピリミジンを使用して合成する。配列番号５６９のＬｙｓ２７残基（配列番号２の２９位）を、還元的アミノ化によって４−ホルミル−ＰＢＡに結合する。このＰＢＡ含有ペプチドは、ＲＩＧ−１リガンドの３’ジオール基と複合体を形成して、ボロン酸エステルを形成する。
【０２９５】
あるいは、２’−フルオロピリミジンを用いて調製したＲＩＧ−Ｉリガンドは、合成時に、５’ｐｐｐの遠位に、例えば少なくとも１０塩基対離れて位置するチオール含有またはホスホロチオレート含有ヌクレオチド残基を配列中に含む。配列番号５６９のＬｙｓ２７（または配列番号２のＬｙｓ残基２９）を、ＳＡＴＡで修飾し（その後、ヒドロキシルアミンを使用して脱保護し）、チオール基を形成する。
【０２９６】
あるいは、配列番号５６９のＬｙｓ２７（または配列番号２のＬｙｓ残基２９）をＳＰＤＰ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルで修飾して、柔軟な親水性ＰＥＧスペーサーを有する保護チオール基を形成する。修飾されたＲＩＧ−Ｉリガンドと配列番号５６９の２個のチオール基が結合して、切断可能なジスルフィド結合を形成する。あるいは、配列番号５６９のＬｙｓ２７（または配列番号２のＬｙｓ残基２９）をブロモアセトアミド−ＰＥＧ４−ＴＦＰエステルで修飾してアミド結合を形成した後、２’−フルオロピリミジンを用いて調製したＲＩＧ−Ｉリガンド内のチオール基と反応させて安定的なチオエーテル結合を形成する。
【０２９７】
あるいは、２’−フルオロピリミジンを用いて調製したＲＩＧ−Ｉリガンドは、合成時に、５’ｐｐｐより遠位に位置するアミン含有ヌクレオチドを配列中に含む。配列番号５６９のＬｙｓ２７（配列番号２の２９位）をＳＡＴＡで修飾してチオール基を形成する。マレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣリンカーを、ＲＩＧ−Ｉリガンドのアミン、及び配列番号２または配列番号５６９のチオールと結合する。
【０２９８】
あるいは、２’−フルオロピリミジンを用いて調製したＲＩＧ−Ｉリガンドを、３’ジオールを酸化した後に還元的アミノ化を行って配列番号５６９のＬｙｓ２７（配列番号２の２９位）に結合させて第２級アミン結合体を形成する。
【０２９９】
あるいは、２’−フルオロピリミジンを用いて調製したＲＩＧ−Ｉリガンドを、過ヨウ素酸酸化によって３’末端をアルデヒドに酸化する。次いで、このアルデヒドを配列番号２のペプチドと反応させ、Ｎ末端をアミノオキシ基で官能化して、切断可能なオキシム結合を形成する。
【０３００】
あるいは、配列番号１１８０（センス）及び配列番号１１８１（アンチセンス）のＲＩＧ−１リガンドを、骨格の安定性を高めるために２’−フルオロピリミジンを用いて使用する。センス鎖の３’末端を、図１に示されるようなチオール修飾を用いて合成する。配列番号５６９のＬｙｓ２７（または配列番号２のＬｙｓ残基２９）をブロモアセトアミド−ＰＥＧ４−ＴＦＰエステルで修飾してアミド結合を形成した後、ＲＩＧ−Ｉリガンド内のチオール基と反応させて安定的なチオエーテル結合を形成する。あるいは、センス鎖またはアミノ末端ヌクレオチドの５’末端が修飾部位として機能する。
【０３０１】
あるいは、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つである。
【０３０２】
ＲＮＡまたはＤＮＡへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例１０で上記に述べたようにして行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミノ基の導入は、実施例１１で上記に述べたようにして行われる。
【０３０３】
実施例１７
環状ジヌクレオチドとペプチドの結合
本実施例では、本開示のペプチドへの環状ジヌクレオチドの結合について記載する。ペプチドは、配列番号２または配列番号５６９（Ｎ末端のＧＳのない配列番号２）である。２’３’ｃＧＡＭＰのヒドロキシル基を利用し、このヒドロキシル基をグルタル酸無水物と反応させ、次いで、修飾された２’３’ｃＧＡＭＰのＮＨＳグルタル酸エステルを形成した後、配列番号５６９のＬｙｓ２７（配列番号２の２９位）のアミンと反応させることにより、配列番号２または配列番号５６９とのエステル結合を形成する。
【０３０４】
あるいは、マレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣリンカーを、２’３’ｃＧＡＭＰのアミン及び配列番号２または配列番号５６９のチオール基（Ｌｙｓ２７（配列番号５６９）またはＬｙｓ２９（配列番号２）をＳＡＴＡと反応させてチオール基を形成する）と結合させる。
【０３０５】
あるいは２’３’ｃＧＡＭＰのヒドロキシル基を利用し、このヒドロキシル基をＤＳＣにより活性化した後、得られた化合物を配列番号５６９のＬｙｓ２７（配列番号２の２９位）と反応させることにより、配列番号２または配列番号５６９とのカルバメート結合を形成する。
【０３０６】
あるいは、ＭＬ−ＲＲ−Ｓ２−ＣＤＡなどのホスホロチオエートを含む表８の環状ジヌクレオチドも用いられる。配列番号５６９のＬｙｓ２７（または配列番号２のＬｙｓ残基２９）をＳＰＤＰ−ＰＥＧ８−ＮＨＳエステルで修飾してアミド結合を形成した後、環状ジヌクレオチドのホスホロチオレート基と反応させて切断可能なジスルフィド結合を形成する。
【０３０７】
あるいは、１個以上の安定的なスペーサーペプチド（配列番号１１６４〜配列番号１１７２のうちのいずれか１つなど）、及び／または酵素的に切断可能なペプチド（配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３及び配列番号１３６５のうちのいずれか１つなど）、ならびに配列番号１１７０、配列番号１１３９、または配列番号２などの本開示のペプチドを含む融合産物を得る。この融合産物のＮ末端をブロモアセチル基で官能化し、このブロモ基を環状ジヌクレオチドのホスホロチオレート基と反応させて、酵素的に切断可能な結合を形成する。
【０３０８】
あるいは、２’３’ｃＧＡＭＰのグアノシンのＣ８をＮＢＳで臭素化し、シスタミンと反応させ、還元してチオールを生成する。配列番号５６９のＬｙｓ２７（または配列番号２のＬｙｓ残基２９）をＳＰＤＰ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルで修飾してアミド結合を形成し、チオール基と反応させて切断可能なジスルフィド結合を形成する。
【０３０９】
あるいは、２’３’ｃＧＡＭＰのグアノシンのＣ８をＮＢＳで臭素化する。これを、１個以上の安定的なスペーサーペプチド（配列番号１１６３〜配列番号１１７２のうちのいずれか１つ、または配列番号１３５９、配列番号１３６４、配列番号１３６６のうちのいずれか１つなど）、及び／または酵素的に切断可能なペプチド（配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３及び配列番号１３６５のうちのいずれか１つなど）、ならびに配列番号１１３９、配列番号１１７０、及び配列番号２などの本開示のペプチドを含む融合産物のＮ末端と反応させる。
【０３１０】
あるいは、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つである。
【０３１１】
ＲＮＡまたはＤＮＡへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例１０で上記に述べたようにして行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミン基の導入は、実施例１１で上記に述べたようにして行われる。
【０３１２】
実施例１８
腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性ペプチドに融合されたＩＬ−１５超アゴニストの発現
本実施例では、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれか１つなどの本開示のいずれかの腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性ペプチドに融合されたＩＬ−１５超アゴニストを含むＩＬ−１５剤の発現及び精製について記載する。ペプチドは、ＩＬ−１５超アゴニストのＮ末端またはＣ末端に融合される。ＩＬ−１５超アゴニストは、ＩＬ−１５Ｒａ、リンカー、及びＩＬ−１５（Ｎ末端からＣ末端方向に例示的に「ＲＬＩ」と呼ばれる；配列番号１１３５）で構成されるか、またはＩＬ−１５、リンカー、及びＩＬ−１５Ｒａで構成される（例示的に「ＩＬＲ」と呼ばれる）。ＩＬ−１５超アゴニストの例を表３に示す。ＩＬ−１５超アゴニストとペプチドとは、カテプシンまたはＭＭＰによって切断されるリンカーなどの酵素的に切断可能なリンカーを介して連結される。酵素切断可能なリンカーは、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３、及び配列番号１３６５のうちのいずれか１つである。あるいはまたはこれに加えて、ＩＬ−１５超アゴニスト及びペプチドとは、下記表１０に示されるような配列番号１１６３〜配列番号１１６８のうちのいずれか１つのリンカーなどの安定的なリンカーまたは他の安定的なリンカーを介して連結される。ＦＬＡＧなどの標識または精製に有用なタグを、必要に応じて融合体に付加する。前記タグは、「Ｘａ」などの精製後に酵素的に切断されるリンカーと連結することができる。ＦＬＡＧ−Ｘａ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＩＥＧＲ）タグは、配列番号１１６２に示される。
【０３１３】
ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、または配列番号５６９のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドであってよい。Ｎ末端からＣ末端にかけて、酵素的に切断可能なリンカーを有する融合ペプチドの例は、（１）配列番号１１３５または配列番号１１３６、（２）配列番号１１７０、（３）配列番号１１３９または配列番号１１４７、及び（４）配列番号１である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、安定的なリンカーを有する融合ペプチドの例は、（１）配列番号１１３５または配列番号１１３６、（２）配列番号１１７０、及び（３）配列番号１である。
【表１０−１】
2021506849.tif 000108
【表１０−２】
2021506849.tif 000109
【０３１４】
ペプチド−タンパク質融合は、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．２０１２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．に記載されるような標準的な分子生物学の手法を使用して、細胞内または無細胞系で組換えによって発現される。例えば、設計されたポリペプチド、ならびにリーダーペプチド及び発現に必要な他の要素をコードするＤＮＡを合成する。コンストラクトを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを組み込んだウイルスを使用してＣＨＯ哺乳動物細胞またはＳＦ９昆虫細胞などの細胞にトランスフェクトする。タンパク質を発現させ、精製する。あるいは、ＨｅｒｍａｎｓｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載されるバイオコンジュゲート化学を用い、ＩＬ１５超アゴニストを腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性ペプチドに化学的に結合する。
【０３１５】
Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体などの他のペプチドＩ／Ｏ複合体も同様に腫瘍ホーミング性を示し得る。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０３１６】
実施例１９
腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性ペプチドに融合された４−１ＢＢリガンドの発現
本実施例では、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれか１つなどの本開示のいずれかの腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性ペプチドに融合された４−１ＢＢリガンドの発現について記載する。ペプチドは、４−１ＢＢリガンドのＮ末端またはＣ末端に融合される。４−１ＢＢリガンドの例を表５に示す。４−１ＢＢリガンド及びペプチドとは、カテプシンまたはＭＭＰによって切断されるリンカーなどの酵素的に切断可能なリンカーを介して連結される。酵素切断可能なリンカーは、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３、及び配列番号１３６５のうちのいずれか１つである。あるいは、４−１ＢＢリガンド及びペプチドとは、上記表１０に示されるような配列番号１１６３〜配列番号１１６８のうちのいずれか１つのリンカーなどの安定的なリンカーまたは他の安定的なリンカーを介して連結される。ＦＬＡＧなどの標識または精製に有用なタグを、必要に応じて融合体に付加する。前記タグは、「Ｘａ」などの精製後に酵素的に切断されるリンカーと連結することができる。ＦＬＡＧ−Ｘａリンカー（ＤＹＫＤＤＤＤＫＩＥＧＲ）は、配列番号１１６２に示される。
【０３１７】
ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、または配列番号５６９のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドであってよい。
【０３１８】
ペプチド−タンパク質融合は、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．２０１２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．に記載されるような標準的な分子生物学の手法を使用して、細胞内または無細胞系で組換えによって発現される。例えば、設計されたポリペプチド、ならびにリーダーペプチド及び発現に必要な他の要素をコードするＤＮＡを合成する。コンストラクトを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを組み込んだウイルスを使用してＣＨＯ哺乳動物細胞またはＳＦ９昆虫細胞などの細胞にトランスフェクトする。タンパク質を発現させ、精製する。あるいは、ＨｅｒｍａｎｓｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載されるバイオコンジュゲート化学を用い、４−１ＢＢリガンドを腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性ペプチドに化学的に結合する。
【０３１９】
実施例２０
中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍のペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体による治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による、脳腫瘍を含むＣＮＳ腫瘍の治療について記載する。Ｉ／ＯはＲＩＧ−Ｉリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＲＩＧ−Ｉリガンドに結合される。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、ＣＮＳ腫瘍を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０３２０】
実施例２１
中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍のペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体による治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による、脳腫瘍を含むＣＮＳ腫瘍の治療について記載する。Ｉ／ＯはＳＴＩＮＧリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＳＴＩＮＧリガンドに結合される。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、ＣＮＳ腫瘍を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０３２１】
実施例２２
ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体による乳癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による乳癌の治療について記載する。Ｉ／ＯはＲＩＧ−Ｉリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＲＩＧ−Ｉリガンドに結合される。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、乳癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０３２２】
実施例２３
ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体による乳癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による乳癌の治療について記載する。Ｉ／ＯはＳＴＩＮＧリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＳＴＩＮＧリガンドに結合される。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、乳癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０３２３】
実施例２４
ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体による肉腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による肉腫の治療について記載する。Ｉ／ＯはＲＩＧ−Ｉリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＲＩＧ−Ｉリガンドに結合される。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肉腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０３２４】
実施例２５
ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体による肉腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による肉腫の治療について記載する。Ｉ／ＯはＳＴＩＮＧリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＳＴＩＮＧリガンドに結合される。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肉腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０３２５】
実施例２６
ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体による黒色腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による黒色腫の治療について記載する。Ｉ／ＯはＲＩＧ−Ｉリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＲＩＧ−Ｉリガンドに結合される。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、黒色腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０３２６】
実施例２７
ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体による黒色腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による黒色腫の治療について記載する。Ｉ／ＯはＳＴＩＮＧリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＳＴＩＮＧリガンドに結合される。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、黒色腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０３２７】
実施例２８
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体によるＣＮＳ腫瘍の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現される本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による、ＣＮＳ及び／または脳のあらゆるがんを含むＣＮＳ腫瘍の治療について記載する。Ｉ／Ｏは、本明細書に開示される任意のＩＬ−１５剤である。ペプチドを、実施例１８に記載されるように、ＩＬ−１５との複合体として組換えによって発現させる。このペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、ＣＮＳ及び／または脳のあらゆるがんを含む脳腫瘍を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、ＩＬ−１５剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、ＩＬ−１５剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。ＩＬ−１５剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０３２８】
Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体などの他のペプチドＩ／Ｏ複合体も同様にＣＮＳ腫瘍の治療に使用することができる。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０３２９】
実施例２９
ペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体によるＣＮＳ腫瘍の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの複合体として発現される本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による、ＣＮＳ及び／または脳のあらゆるがんを含む脳腫瘍の治療について記載する。Ｉ／Ｏは４−１ＢＢリガンドである。ペプチドを、実施例１９に記載されるように、４−１ＢＢリガンドとの複合体として組換えによって発現させる。このペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、ＣＮＳ及び／または脳のあらゆるがんを含む脳腫瘍を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。４−１ＢＢリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０３３０】
実施例３０
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体による乳癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による乳癌の治療について記載する。Ｉ／Ｏは、本明細書に開示される任意のＩＬ−１５剤である。ペプチドを、実施例１８に記載されるように、ＩＬ−１５剤との融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、乳癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、ＩＬ−１５剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、ＩＬ−１５剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。ＩＬ−１５剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０３３１】
Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体などの他のペプチドＩ／Ｏ複合体も同様に乳癌の治療に使用することができる。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０３３２】
実施例３１
ペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体による乳癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による乳癌の治療について記載する。Ｉ／Ｏは４−１ＢＢリガンドである。ペプチドを、実施例１９に記載されるように、４−１ＢＢリガンドとの融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、乳癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。４−１ＢＢリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０３３３】
実施例３２
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体による肉腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による肉腫の治療について記載する。Ｉ／Ｏは、本明細書に開示される任意のＩＬ−１５剤である。ペプチドを、実施例１８に記載されるように、ＩＬ−１５剤との複合体として組換えによって発現させる。このペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肉腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、ＩＬ−１５剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、ＩＬ−１５剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。ＩＬ−１５剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０３３４】
Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体などの他のペプチドＩ／Ｏ複合体も同様に肉腫の治療に使用することができる。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０３３５】
実施例３３
ペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体による肉腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による肉腫の治療について記載する。Ｉ／Ｏは４−１ＢＢリガンドである。ペプチドを、実施例１９に記載されるように、４−１ＢＢリガンドとの融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肉腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。４−１ＢＢリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０３３６】
実施例３４
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体による黒色腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による黒色腫の治療について記載する。Ｉ／Ｏは、本明細書に開示される任意のＩＬ−１５剤である。ペプチドを、実施例１８に記載されるように、ＩＬ−１５との複合体として組換えによって発現させる。このペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、黒色腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、ＩＬ−１５剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、ＩＬ−１５剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。ＩＬ−１５剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０３３７】
Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体などの他のペプチドＩ／Ｏ複合体も同様に黒色腫の治療に使用することができる。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０３３８】
実施例３５
ペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体による黒色腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による黒色腫の治療について記載する。Ｉ／Ｏは４−１ＢＢリガンドである。ペプチドを、実施例１９に記載されるように、４−１ＢＢリガンドとの融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、黒色腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−４−１ＢＢリガンド融合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。４−１ＢＢリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０３３９】
実施例３６
ペプチド結合によるがん細胞の細胞質へのＲＩＧ−Ｉリガンドの送達
本実施例では、ＲＩＧ−Ｉリガンドとのペプチド結合体のがん細胞の細胞質への送達について記載する。ＲＩＧ−Ｉリガンドは、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載される本開示の任意のペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６）に結合される。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド結合体を、ヒトまたは非ヒト動物などの対象に投与する。ペプチドの腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性により、結合体はがん細胞の細胞質にアクセスする。
【０３４０】
あるいは、任意のヒト腫瘍細胞株（例えば、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、Ｈｕｈ７（．５）細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＨＣＴ−１５細胞、ＣａＣＯ−２細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株、ＢＴ−５４９細胞株、ＨＣＣ３８細胞株、４Ｔ１細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞株、ＨＬ−６０細胞株、Ｃａｐａｎ−１細胞株、ＣＦＰＡＣ−１細胞株、ＳＫ−ＯＶ３細胞株、ＰＣ３細胞株、Ｄｕ１４５細胞株、ＬｎＣａｐ細胞株、Ｈ１２９９細胞株、Ａ５４９細胞株、Ｈ３５８細胞株、Ｈ４６０細胞株、ＬＫ２細胞株、ＤＯ４ｍｅｌ細胞株、またはＭａ−Ｍｅｌ−８６ｃ細胞株）、または任意のマウス腫瘍細胞株（例えば、Ｐａｎｃ０２細胞株、ＰＡＮＣ−１細胞株、Ｍｉａ  ＰａＣａ−２細胞株、４Ｔ１細胞株、ＣＴ２６細胞株、Ａ２０細胞株、ＨｃＭｅｌ１２細胞株、Ｂ１６Ｆ１０細胞株、ＥＧ７（Ｏｖａ）細胞株、Ｃ１４９８細胞株、ＬＬＣ細胞株、ＧＬ２６１−ｌｕｃ細胞株、またはＭＣ３８細胞株）などのがん細胞株を培養中で増殖させる。細胞をペプチドＩ／Ｏ複合体に曝露する。曝露されると、結合体は細胞に内在化され、Ｉ／Ｏが放出される。標的（ＲＩＧ−Ｉ）は細胞質中に存在し、Ｉ／Ｏによって刺激され、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮβ）が細胞培地中に放出される。細胞培地を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＩ型インターフェロンの量を測定する。放出された量を、刺激されていない細胞及び遊離Ｉ／Ｏで処理した細胞を含むコントロールから放出されたＩ型インターフェロンの量と比較する。ペプチド結合がない場合、Ｉ／Ｏは細胞膜を透過せず、細胞質中の標的（ＲＩＧ−Ｉ）をペプチドＩ／Ｏ複合体と同じレベルで刺激することはできない。コントロールと比較して、結合体で刺激した培養物からのＩ型インターフェロンの放出量の増加は、ペプチドによる細胞質へのＩ／Ｏの送達、及びＩ／ＯであるＲＩＧ−ＩリガンドによるＲＩＧ−Ｉの刺激を示す。
【０３４１】
実施例３７
ペプチド結合によるがん細胞の細胞質へのＳＴＩＮＧリガンドの送達
本実施例では、ＳＴＩＮＧリガンドとのペプチド結合体のがん細胞の細胞質への送達について記載する。ＳＴＩＮＧリガンドは、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載される本開示の任意のペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６）に結合される。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド結合体を、ヒトまたは非ヒト動物などの対象に投与する。ペプチドの腫瘍ホーミング及び／または細胞透過性により、結合体はがん細胞の細胞質にアクセスする。
【０３４２】
あるいは、任意のヒト腫瘍細胞株（例えば、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、Ｈｕｈ７（．５）細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＨＣＴ−１５細胞、ＣａＣＯ−２細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株、ＢＴ−５４９細胞株、ＨＣＣ３８細胞株、４Ｔ１細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞株、ＨＬ−６０細胞株、Ｃａｐａｎ−１細胞株、ＣＦＰＡＣ−１細胞株、ＳＫ−ＯＶ３細胞株、ＰＣ３細胞株、Ｄｕ１４５細胞株、ＬｎＣａｐ細胞株、Ｈ１２９９細胞株、Ａ５４９細胞株、Ｈ３５８細胞株、Ｈ４６０細胞株、ＬＫ２細胞株、ＤＯ４ｍｅｌ細胞株、またはＭａ−Ｍｅｌ−８６ｃ細胞株）、または任意のマウス腫瘍細胞株（例えば、Ｐａｎｃ０２細胞株、ＰＡＮＣ−１細胞株、Ｍｉａ  ＰａＣａ−２細胞株、４Ｔ１細胞株、ＣＴ２６細胞株、Ａ２０細胞株、ＨｃＭｅｌ１２細胞株、Ｂ１６Ｆ１０細胞株、ＥＧ７（Ｏｖａ）細胞株、Ｃ１４９８細胞株、ＬＬＣ細胞株、ＧＬ２６１−ｌｕｃ細胞株、またはＭＣ３８細胞株）などのがん細胞株を培養中で増殖させる。細胞をペプチドＩ／Ｏ複合体に曝露する。曝露されると、結合体は細胞に内在化され、Ｉ／Ｏが放出されるかまたは細胞質中に存在する。標的（ＳＴＩＮＧ）は細胞質中に存在し、Ｉ／Ｏによって刺激され、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮβ）が細胞培地中に放出される。細胞培地を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＩ型インターフェロンの量を測定する。放出された量を、刺激されていない細胞及び遊離Ｉ／Ｏで処理した細胞を含むコントロールから放出されたＩ型インターフェロンの量と比較する。ペプチド結合がない場合、Ｉ／Ｏは細胞膜を透過せず、また、充分な量でエンドソームから放出もされず、細胞質中の標的（ＳＴＩＮＧ）をペプチドＩ／Ｏ複合体と同じレベルで刺激することはできない。コントロールと比較して、結合体で刺激した培養物からのＩ型インターフェロンの放出量の増加は、ペプチドによる細胞質へのＩ／Ｏの送達、及びＩ／ＯであるＳＴＩＮＧリガンドによるＳＴＩＮＧの刺激を示す。
【０３４３】
実施例３８
免疫原性細胞死（ＩＣＤ）のインビトロでの実証
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体の曝露後の、がん細胞における免疫原性細胞死（ＩＣＤ）のインビトロでの誘導について記載する。ペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）を組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようにしてＲＩＧ−ＩリガンドまたはＳＴＩＮＧリガンドに結合した。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株などのがん細胞株を培養中で増殖させる。細胞をペプチドＩ／Ｏ複合体に曝露する。曝露されると、ペプチドＩ／Ｏ複合体は細胞に内在化され、Ｉ／Ｏが放出されるかまたは細胞質中に存在する。Ｉ／Ｏは、その標的（ＲＩＧ−１、ＭＤＡ５、またはＳＴＩＮＧ）を刺激し、実施例３６に記載されるようなＩ型インターフェロンの放出、及びＩＣＤに起因する他の細胞事象をもたらす。これらには、ケモカインＣＸＣＬ１０とサイトカインＩＬ−６の分泌、ＨＭＧＢ１及びＨｓｐ７０の放出、細胞表面ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ  Ｉ）及びＦａｓ発現の上方制御、及び細胞表面のカルレティキュリンの露出が挙げられる。培養中の細胞を、ペプチドＩ／Ｏ複合体に一晩、２４時間、４８時間、またはそれよりも長い時間にわたって曝露する。細胞培養培地を採取し、分泌されたＣＸＣＬ１０、ＩＬ−６、ＨＭＧＢ１、またはＨｓｐ７０の量をＥＬＩＳＡで測定する。ＭＨＣ  Ｉ及びＦａｓの発現、ならびにカルレティキュリンの細胞表面露出は、フローサイトメトリーによって測定される。細胞死の誘導は、アネキシンＶに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に加えてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）などの別の蛍光ＤＮＡ染色で細胞を染色することによって示される。細胞でアポトーシスが進行するのにつれ、細胞は最初にアネキシンＶを発現し、次いでＰＩに対する透過性を示すようになる。コントロール細胞培養と比較して、これらのパラメータの１つ以上の増加は、ＩＣＤ経路がペプチドＩ／Ｏ複合体によって刺激されたことを示す。
【０３４４】
実施例３９
免疫原性細胞死を起こしたがん細胞による樹状細胞活性化のインビトロでの実証
本実施例では、実施例３８に記載されるような本開示のいずれかのペプチドＩ／Ｏ複合体への曝露後に免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を起こしたがん細胞との共培養後の樹状細胞（ＤＣ）の活性化について記載する。ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞をマウス脾臓から単離し、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体で処理した、例えば、任意のヒト腫瘍細胞株（例えば、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、Ｈｕｈ７（．５）細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＨＣＴ−１５細胞株、ＣａＣＯ−２細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株、ＢＴ−５４９細胞株、ＨＣＣ３８細胞株、４Ｔ１細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞株、ＨＬ−６０細胞株、Ｃａｐａｎ−１細胞株、ＣＦＰＡＣ−１細胞株、ＳＫ−ＯＶ３細胞株、ＰＣ３細胞株、Ｄｕ１４５細胞株、ＬｎＣａｐ細胞株、Ｈ１２９９細胞株、Ａ５４９細胞株、Ｈ３５８細胞株、Ｈ４６０細胞株、ＬＫ２細胞株、ＤＯ４ｍｅｌ細胞株、またはＭａ−Ｍｅｌ−８６ｃ細胞株）、または任意のマウス腫瘍細胞株（例えば、Ｐａｎｃ０２細胞株、ＰＡＮＣ−１細胞株、Ｍｉａ  ＰａＣａ−２細胞株、４Ｔ１細胞株、ＣＴ２６細胞株、Ａ２０細胞株、ＨｃＭｅｌ１２細胞株、Ｂ１６Ｆ１０細胞株、ＥＧ７（Ｏｖａ）細胞株、Ｃ１４９８細胞株、ＬＬＣ細胞株、ＧＬ２６１−ｌｕｃ細胞株、またはＭＣ３８細胞株）と共に培養中で増殖させる。非処理のＭＣＦ−７細胞をネガティブコントロールとして用いる。細胞は、１２時間、一晩、２４時間、４８時間、またはそれよりも長い時間にわたって共培養する。共培養後、ＤＣ上の細胞表面マーカーの発現及び共培養の培地中へのサイトカイン産生を測定する。ＤＣ上で発現が上方制御する細胞表面マーカーとしては、共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６ならびに初期活性化マーカーＣＤ６９が挙げられる。サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、及び／またはＣＸＣＬ１０のレベルは、刺激された腫瘍細胞単独の培養よりも共培養からの培地で顕著に高く、これは主としてＤＣからの産生を示す。
【０３４５】
実施例４０
リポソーム送達
本実施例では、本開示の薬物またはペプチド薬物結合体をインビボでがん細胞に送達するためのリポソームの使用について記載する。本開示のペプチドを、実施例４１に記載されるようにリポソーム粒子または他のナノ粒子の表面に付着させる。本開示のＲＩＧ−１またはＳＴＩＮＧリガンドをリポソームに封入する。リポソームを、静脈内または腫瘍内注射によって患者に送達する。ペプチドは、リポソームをターゲティングして腫瘍細胞により内在化させる。内在化後、リガンドは腫瘍細胞の細胞質に送達され、そこで標的を刺激して免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導することができる。
【０３４６】
実施例４１
リポソームの製造
本実施例では、リポソームの製造について記載する。大豆ホスファチジルコリン、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、及びマレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥをクロロホルムに溶解する。ロータリーエバポレーションまたはガス吹き付けにより溶媒を蒸発させる。脂質膜をクロロホルムに再溶解し、送達するＩ／Ｏ（例えば、ＲＩＧ−Ｉリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、ＩＬ−１５剤、４−１ＢＢリガンド、またはＭＤＡ５リガンド）をバッファーに加える。混合物をボルテックスし、超音波処理する。溶液を３７℃で蒸発させてクロロホルムを除去し、リポソームを水相溶液中に残す。ポリカーボネートフィルターを代えて（例えば、４００ｎｍ、２００ｎｍ、次いで１００ｎｍ）溶液を押し出す。本開示のペプチドはチオール基を有するが、これを、アミン基をトラウト試薬と反応させることによってペプチドに導入する。チオール化されたペプチドを押し出されたリポソームとインキュベートすると、ペプチドのチオール基が脂質のマレイミド基と反応し、それにより、表面に本開示のペプチドを提示したリポソームが得られる。場合により、上記の代わりにまたは上記に加えて、送達する薬剤をチオール基で官能化してリポソームとインキュベートすることにより、表面に薬剤が結合したリポソームが得られる。室温で一晩インキュベートした後、リポソームをクロマトグラフィーにより精製する。
【０３４７】
実施例４２
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体またはペプチド−ＩＬ−１５超アゴニスト複合体のインビトロ生物活性
本実施例では、本開示のいずれかのペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つなど）との複合体として発現された任意のＩＬ−１５剤または具体的にはＩＬ−１５超アゴニスト（Ｉ／Ｏ）のインビトロ生物活性について記載する。本開示のペプチドを、実施例１８に記載されるようにしてＩＬ−１５剤またはＩＬ−１５超アゴニスト（例えば、配列番号１１３５〜配列番号１１３８のうちのいずれか１つ）との複合体として組換えにより発現させる。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康な成人ドナーから分離され、密度勾配遠心分離により調製する。細胞を、サイトカインが添加されていない培地（ネガティブコントロール）、組換えヒトＩＬ−１５を含む培地（ポジティブコントロール）、または等モル量の本明細書に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体を含む培地中で培養する。最大７日間の培養後、細胞をさまざまな細胞系統に特異的な細胞表面タンパク質に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーを使用して定量する。ネガティブコントロール培養物に対するＣＤ５６＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞集団の増殖は、ＩＬ−１５活性が存在することを示す。
【０３４８】
Ｔ細胞の細胞毒性も、ＩＬ−１５剤またはＩＬ−１５超アゴニストによって増加する。この活性を測定するため、ＣＤ３＋Ｔ細胞を抗体でコーティングした磁気ビーズを使用してＰＢＭＣから単離し、単離した細胞を、サイトカインが添加されていない培地（ネガティブコントロール）、組換えヒトＩＬ−１５を含む培地（ポジティブコントロール）、または等モル量の本明細書に記載されるペプチドＩ／Ｏ融合体を含む培地中で培養する。最大７日間の培養後、細胞を、Ｋ５６２（ヒト白血病細胞株）などの標的細胞株に対する細胞毒性アッセイにおいてエフェクターとして使用する。標的細胞の殺傷を例えば、５１Ｃｒ放出アッセイによって測定する。細胞毒性エフェクター機能の増加は、ＩＬ−１５活性が存在することを示す。
【０３４９】
ＩＬ−１５活性は、ＣＴＬＬ、３２Ｄ、及びＴＦ１を含む因子依存性細胞株の増殖を刺激する能力によってインビトロで定量化される。活性化されたヒト末梢血Ｔ細胞の増殖も、ＩＬ−１５活性の測定に用いることができる。例えば、因子依存性細胞株またはＴ細胞の培養物に、異なるＩＬ−１５融合体を異なる濃度で加える。培養の数日（１〜４日）後、各培養中の細胞数を、生細胞を検出するための多くの定量的方法のいずれか１つによって測定することができる。最大増殖率の５０％を与えるサイトカイン融合体の濃度を効力の尺度として用いる。
【０３５０】
ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａ  ｓｕｓｈｉ＋及び本開示の任意のペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つなど）との融合体、ならびに、Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体であるペプチドＩ／Ｏ複合体などの他のペプチドＩ／Ｏ複合体も同様にそのようなＩＬ−１５活性を示し得る。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０３５１】
実施例４３
ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａ  ｓｕｓｈｉ＋及びペプチドの融合
本実施例は、腫瘍に非常に強力なＩＬ−１５剤を送達するためのＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａ  ｓｕｓｈｉ＋及び本開示の任意のペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つなど）との融合体であるペプチドＩ／Ｏ複合体について記載する。融合体は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａの部分とから構成され、これらは、ＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒａ超アゴニスト融合体と本開示のペプチドとの間で場合により切断可能であることにより、ＩＬ−１５超アゴニスト融合体を細胞内に放出させ、細胞表面に再びリサイクルかまたは分泌することを可能とするリンカーを含むリンカーを介して本開示のペプチドにさらに連結される。図３Ａは、本開示の配列番号５６８のペプチドとのＩＬ−１５超アゴニスト融合体の図を示す（（Ｍｏｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｊａｎ  ２０；２８１（３）：１６１２−９）より改変））。ペプチドは一例であり、本開示の任意のペプチドで置換することができる。
【０３５２】
図３Ａは、ｓｕｓｈｉ＋部分、リンカー、ＩＬ−１５、及び配列番号５６８を使用したＩＬ−１５Ｒａの配列を示す（Ｎ末端からＣ末端方向に「ＲＬＩＸ」と呼ばれる）。前記融合体の配列は配列番号１１７３に記載される
（図３Ｂにも示される、ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧＤＹＫＤＤＤＤＫＩＥＧＲＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ）。配列番号１１７３の一連のＸはリンカーで置き換えられる。リンカーは、切断可能であり得るか（例えば、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３及び配列番号１３６５のうちのいずれか１つ）、または安定的であり得る（例えば、配列番号１１６３〜配列番号１１７２のうちのいずれか１つ）。Ｓｐリーダー（ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲ  ＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬ  ＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧ）（配列番号１２３２）及びＦＬＡＧ−Ｘａタグは、分泌の案内及び標識用のタグとしてどちらも任意選択的であり、これらは、他のリーダーまたはタグに置き換えるかあるいは省略することができる。図４Ａは、ＩＬ−１５、リンカー、ＩＬ−１５Ｒａ  ｓｕｓｈｉ＋、及び配列番号５６８のペプチド（「ＩＬＲＸ」と呼ばれる）の説明図を示し、その配列は、配列番号１１７４
（図４Ｂにも示される、ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧＤＹＫＤＤＤＤＫＩＥＧＲＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ）に記載されている。Ｓｐリーダー（配列番号１２３２）及びＦｌａｇ−Ｘａタグは、分泌の案内及び標識用のタグとしてどちらも任意選択的であり、これらは、他のリーダーまたはタグに置き換えるかあるいは省略することができる。完全な配列には、成熟した分泌タンパク質及びＩＬ−１５Ｒα  ｓｕｓｈｉ＋配列（エクソン２によってコードされるｓｕｓｈｉドメインとエクソン３によってコードされるＮ末端の１３個のアミノ酸とから構成さる）が含まれる。例えば、ＩＬ−１５剤は、Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、ＸまたはＹの一方は配列番号１１７７または配列番号１１７８のいずれか一方であってよく、ＸまたはＹの一方は配列番号１１７６であってよい。さらに、Ｌ０、Ｌ１及びＬ２は、配列番号１１６３〜配列番号１１７２のうちのいずれか１つであるか、またはＸｎであってよい（ただし、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｎ＝１〜５０であるか、または存在しなくてよい）。別の例として、ＩＬ−１５剤は、Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２であってよい（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０３５３】
ＦＬＡＧエピトープ及び第Ｘａ因子結合部位（ＦＬＡＧ−Ｘａ）をコードする配列番号１１６２を、シグナルペプチド（その翻訳後分泌を案内する）とコード配列との間に場合により付加する。シグナルペプチドは、サブユニットに関連付けられた天然の配列、または人工配列である。１９ａａのペプチドＮＨ２−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ−ＣＯＯＨ（配列番号１１６３）（Ｂｏｕｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ｓｅｐ  ２６，３８２（１）：１−１２）または２０ａａのペプチドＮＨ２−ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ−ＮＨ２（配列番号１１６９）（Ｍｏｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｊａｎ  ２０；２８１（３）：１６１２−９）などのリンカーペプチドが、ＲＬＩＸのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ＋のＣ末端とＩＬ−１５のＮ末端との間に挿入される。２６ａａリンカーペプチド：ＮＨ２−ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ−ＣＯＯＨ（配列番号１１６５）（Ｍｏｒｔｉｅｒ  ２００６）が、ＩＬＲＸのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ＋のＮ末端とＩＬ−１５のＣ末端の間に挿入される。この切断可能なリンカー（ＮＨ２切断可能リンカー）は、ＩＬ−１５（ＲＬＩＸ）または１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ＋（ＩＬＲＸ）のＣ末端とクロロトキシンのＮ末端の間に挿入される。ＮＨ２切断可能リンカーは、配列番号１１３９〜配列番号１１６１、配列番号１３６０〜配列番号１３６３、及び配列番号１３６５のうちのいずれか１つのような任意の切断可能なリンカーである。
【０３５４】
上記のＩＬ−１５配列以外に、以下のＩＬ−１５突然変異体のうちの１つ以上を置換することができる。すなわち、Ｌ４５Ｄ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｌ４５Ｅ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４，２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｑ４８Ｋ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｖ４９Ｄ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｓ５１Ｄ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｌ５２Ｄ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｊｕｎ  ４；，２７９（２３）：２４３１３−２２）、Ｎ７２Ｄ（Ｚｈｕ  ２００９及びＵＳ００８１６３８７９）、Ｎ７２Ｅ（Ｚｈｕ  ２００９）、Ｎ７２Ａ（Ｚｈｕ  ２００９）、Ｎ７２Ｓ（Ｚｈｕ  ２００９）、Ｎ７２Ｙ（Ｚｈｕ  ２００９）、Ｎ７２Ｒ（ＵＳ００８１６３８７９）、またはＤ６１Ａ（ＵＳ００８１６３８７９）（ただし、最初の文字は、ＩＬ１５配列中の数字で示される位置で変異されるアミノ酸を示し、２番目の文字はそれに置き換えられる新たなアミノ酸を示す）。例えば、Ｌ４５Ｄは、ＩＬ１５の４５位のＬがＤに変異していることを意味する。内因性の３０ａａのＩＬ−１５Ｒαシグナルペプチドは、効率的なＣＨＯ分泌のために当該分野で使用されるシグナルペプチドのいずれかで置換することができる。
【０３５５】
本明細書に開示されるペプチドをさまざまなＩＬ−１５剤に結合（例えば、組換えにより融合）することによってペプチド−ＩＬ−１５剤複合体が得られた。本開示のペプチドを、リンカーを介して完全長の成熟ヒトＩＬ−１５（配列番号１１７７）及びヒトＩＬ−１５受容体のＩＬ−１５Ｒα  ｓｕｓｈｉドメインの残基残基１〜７７（配列番号１１７６）と融合した。ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体には、剛直なリンカー及び柔軟なリンカーが含まれ（Ｃｈｅｎ  ２０１３）、配列番号５６８及び配列番号５６９のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、同一である任意のペプチドで構成されていた。一部のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、カテプシン切断可能なＶａｌ−Ａｌａ部位（配列番号１１３９）（Ｋｒａｍｅｒ  ２０１７，Ｊａｉｎ  ２０１５）またはＭＭＰ切断可能なＰＬＧＬＡＧ配列（配列番号１４９９）（Ａｇｕｉｌｅｒａ  ２００９）などの設計された酵素による切断可能部位も含んでいる。１０ｘＨｉｓタグ（配列番号１４９８）またはＦＬＡＧタグを、通常はペプチドを有していないペプチドＩ／Ｏ複合体の末端に付加することで精製及び標識を容易にすることが行われていた。ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の配列を表４に示す。配列番号１３１７〜配列番号１３２９の配列を有するペプチドＩ／Ｏ複合体の遺伝子を合成した。
【０３５６】
分子生物学的手法を行った。各遺伝子配列は以下の設計：ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ｉｇｋａｐｐａ−１０ｘＨｉｓ（配列番号１４９８）−ＧＯＩ−＊＊−ＥｃｏＲＩを用いて生成した（ただし、ＩｇＫリーダーは、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴ（配列番号１５００）であり、ＧＯＩは目的の遺伝子を意味する）。遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４に直接サブクローニングし、コーディング領域の配列を確認した。目的の合成遺伝子を含む５μｇの精製プラスミドＤＮＡを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、供給した。遺伝子は支障なく合成され、プラスミドが作製された。
【０３５７】
発現及びＲＬＩの精製。配列番号１３１７〜配列番号１３２１のペプチドＩ／Ｏ複合体を、Ｅｘｐｉ２９３（ＨＥＫ２９３）細胞培養中、３７℃、８％ＣＯ２、回転速度１２５ＲＰＭで１００ｍＬスケールで発現させた。生存率が８０％以下に低下し次第（トランスフェクションの６日後）、馴化上清を回収し、遠心分離により単離した。得られた馴化培地をドライアイスで凍結した。
【０３５８】
Ｈｉｓタグ付けされたＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）としてのＲＬＩ（Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、Ｌ１は、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）などのＩＬ−１５剤を含む）を、回転速度８５ＲＰＭで３００ｍＬのスケールで同様に発現させ、ＨｉｓＴｒａｐ  ＩＭＡＣカラムを使用して精製した。溶出は、ＰＢＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ中、２０〜５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配を用いて行った。Ｄ１３〜Ｈ１３の画分をプールし、次いでＰＢＳに対して１６時間透析した。６３ｍｇの０．６７ｍｇ／ｍＬの生成物（Ａ２８０及びＥ１％＝９．３に基づく）を、４７×２．０ｍＬアリコートとして凍結し、発送した。分析では、クーマシー染色による還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び、抗Ｈｉｓ抗体を使用した還元的ウエスタンブロットをレーンごとに１２μＬをロードして行った。
【０３５９】
配列番号１３１７〜配列番号１３２１の精製。ＨｉｓＰｕｒ  ＮＩ−ＮＴＡニッケルカラムを使用して配列番号１３１７〜配列番号１３２１の小規模精製を行った。各ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体について、２ｍＬの馴化上清を２ｍＬの平衡化バッファー（１０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）と混合した。各カラムを最初のローディングの前に２ｍＬの平衡化バッファーで平衡化し、４ｍＬの１：１希釈試料をカラムにロードしてフロースルーした。フロースルー（ＦＴ）画分を収集し、４℃で保存した。ロード後、カラムを２ｍＬずつの洗浄バッファー（２５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、各画分（Ｗ１〜３）を別々に回収（３×２ｍＬ）して４℃で保存した。ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を、１ｍＬの溶出バッファー（２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ）を加えてさらに２回繰り返すことによって溶出し、合計で３ｍＬ（３×１ｍＬ）を回収した。溶出画分（Ｅ１〜３）を４℃で保存した。すべての画分（上清、ＦＴ、Ｗ１〜３、及びＥ１〜３）を、還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーンあたり２０μＬのロード）で分析し、クーマシーブルー（Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｓｔａｉｎ）で染色した。
【０３６０】
融合タンパク質を含む溶出画分をプールし（合計２ｍＬ）、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（床容量５ｍＬ）を使用してバッファーをＰＢＳと交換した。１５ｍＬのコニカルコレクションチューブにカラムを入れ、１０００×ｇで２分間遠心して保存バッファーを除去することによってカラムの準備処理を行った。ＰＢＳ（２．５ｍＬ）をカラムに加え、１０００×ｇで２分間遠心し、毎回コレクションチューブからバッファーを捨ててさらに３回繰り返した。カラムを新しいコレクションチューブに入れ、２ｍＬの試料をレジン床の中央に加えた。カラムを１０００×ｇで２分間遠心して試料を回収した。すべての試料を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブルーで染色し、Ａ２８０及びＥ１％（８．２〜８．６の範囲）に基づいて定量した。試料をエッペンドルフチューブに分注し（各５００μＬ）、−２０℃で保存した。
【０３６１】
２０ｍＬの各上清を２０ｍＬの平衡化バッファーと混合することにより、配列番号１３１７及び配列番号１３２１の各ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体に対して大規模な精製（１０×）を行った。１：１希釈試料（４０ｍＬ）をニッケルカラムにロードし、さらなる洗浄（５×２ｍＬ）工程及び溶出（５×１ｍＬ）工程を追加した以外は小規模精製について上記に述べたのと同じ条件を用いて洗浄及び溶出した。すべての画分を、還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブルーで染色した。プールされた溶出画分のＰＢＳでのバッファー交換に続いて、最終試料を還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥと非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方で比較した。
【０３６２】
Ｈｉｓタグ付けされたＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）精製としてのＲＬＩタンパク質（例えば、Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、Ｌ１は、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）などのＩＬ−１５剤を含む）の発現。精製３００ｍＬの配列番号１３４２の発現及び精製により、０．６７ｍｇ／ｍＬ（２８μＭ）の６３ｍｇの生成物、または細胞培養液１ｍＬ当たり０．２ｍｇの生成物が得られた。図４５は、Ｈｉｓタグ付けされたＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）としてのＲＬＩタンパク質（例えば、配列番号１１６９、配列番号１１７６、及び配列番号１１７７を含む）のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗Ｈｉｓウエスタン分析を示し、約２５〜２６ｋＤａ及び３０〜３４ｋＤａに２本のバンドの強いシグナルを示している。２本のバンドは、Ｋｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｊｕｎｅ；１１（６）：１２７９−１２８８）にみられるような異なるグリコシル化パターンを表し得る。
【０３６３】
図４６は、Ｈｉｓタグ付けされたＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）としてのＲＬＩタンパク質（例えば、配列番号１１６９、配列番号１１７６、及び配列番号１１７７を含む）のＩＭＡＣ精製のクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画分Ｄ１３〜Ｈ１３をプールし、透析して最終物質を得た。図４７は、配列番号１３１７〜配列番号１３２１の発現からの馴化培地のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗Ｈｉｓウェスタン分析を示す。配列番号１３１７、配列番号１３１９、及び配列番号１３２１は、両方の分析で約３８〜４２ｋＤａに強いバンドを示した。バンドの幅及び不明瞭さは、複数の重複するグリコシル化パターンを示し得る。Ｎ末端において、配列番号１３１７、配列番号１３１９、及び配列番号１３２１はいずれもＨｉｓタグを有し、その後にＩＬ−１５Ｒαタンパク質が続く。配列番号１３１８では、クーマシー染色による標的サイズの近くに大幅に薄いバンドがみられたが、このウエスタン分析では明らかなシグナルはみられなかった。配列番号１３１８もＮ末端のＨｉｓタグを有していたが、ＨｉｓタグはＩＬ−１５に隣接している。このような構成のため、Ｈｉｓタグがウェスタンブロットで可視化するための抗Ｈｉｓ抗体によって利用しにくくなる可能性がある。配列番号１３２０は、クーマシーにより標的サイズに視認される染色を（あったにしても）ほとんど示さなかったが、ウエスタン分析ではシグナル（約３４ｋＤａ及び３９ｋＤａの２本のバンド、異なるグリコシル化パターンも表し得る）を示した。配列番号１３２０はＮ末端に配列番号５６８のペプチドを含み、Ｃ末端にＨｉｓタグを有する。より高い発現収量が、Ｎ末端にＩＬ−１５または配列番号５６８を有する場合よりも、Ｎ末端に１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ＋を有する場合に得られるようである。
【０３６４】
配列番号１３１７及び配列番号１３２１の精製。図４８は、配列番号１３１７及び配列番号１３２１のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図４９は、プールし、ＰＢＳ中でバッファー交換した後の各ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の精製画分Ｅ２〜Ｅ３のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。予想されたとおり、配列番号１３１７及び配列番号１３２１の両方がニッケルカラムに結合してカラムから溶出し、各融合体の精製された形態はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約３８ｋＤのバンドを示し、上記に述べたウエスタンブロットのデータと一致することが分かった。
【０３６５】
配列番号１３１８の精製。図５０は、配列番号１３１８の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図５１は、プールし、ＰＢＳ中でバッファー交換した後の精製画分Ｅ２〜Ｅ３のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。配列番号１３１７及び配列番号１３２１と同様、配列番号１３１８はニッケルカラムに結合してカラムから溶出し、精製された形態はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約３８ｋＤのバンドを示した。上記に述べたように抗Ｈｉｓ抗体を使用してウェスタンブロットで分析した場合に顕著なバンドは存在しなかったため、この結果は予想外のものであったが、Ｈｉｓタグ配列は、ニッケルカラムに固定化されたニッケル荷電キレートにアクセスすることができた。
【０３６６】
配列番号１３１９及び配列番号１３２０の精製。図５２は、配列番号１３１９及び配列番号１３２０の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。配列番号１３１７、配列番号１３１８、及び配列番号１３２１と同様、配列番号１３１９はニッケルカラムに結合して、カラムから溶出し、精製された形態はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約３８ｋＤのバンドを示した。しかしながら、配列番号１３２０のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる染色はほとんど認められなかった。これは、出発物質の同じ領域の極めて薄いバンド及びウェスタンブロット分析でみられた薄い染色の両方と一致している。
【０３６７】
配列番号１３１７〜配列番号１３２１の精製の概要を表１１に示す。全体として、それぞれのＨｉｓタグ付けされたペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の精製は成功し、高発現の複合体ではクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥで顕著なバンドが認められ、１ｍＬの出発物質からの最終収量は、８０〜１３０μｇの範囲内であった。
【表１１】
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【０３６８】
小規模精製に使用したものと同じサイズのカラム（１ｍＬ）で、２０ｍＬの出発物質（１０×）を使用して配列番号１３１７及び配列番号１３２１の大規模精製を行った。図５３は、配列番号１３１７及び配列番号１３２１の大規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。両方のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体で、高濃度の精製タンパク質が画分Ｅ２〜Ｅ４に溶出した。各精製ランのフロースルー（ＦＴ）画分に３８ｋＤにみられる顕著なバンドがないことは、カラムのロード量が過剰でなく、これらのタンパク質に対して高い結合能力を有することを示した。図５４は、プールし、ＰＢＳでバッファー交換し、還元及び非還元条件下でさらに分析した、画分Ｅ２〜Ｅ４のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。非還元条件下で見られる約３８ｋＤの単一の顕著なバンドは、タンパク質が均質であり、分子間ジスルフィドを形成してジスルフィド結合された凝集体を生じ得るジスルフィド結合のスクランブルがないことを示唆している。
【０３６９】
Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体などの他のペプチドＲＬＩも同様に精製することができる。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０３７０】
実施例４４
ペプチド免疫抗がん剤（Ｉ／Ｏ）複合体のスクリーニング
本実施例では、がん治療のために本開示のペプチドとの複合体として投与されるＩ／Ｏのスクリーニングについて記載する。配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のいずれかのペプチドなどの本開示のペプチドは、組換えによって発現されるかまたは化学合成されて、Ｉ／Ｏと複合体化される。Ｉ／Ｏは、ＩＬ−１５剤、４−１ＢＢリガンド、ＲＩＧ−Ｉリガンド、ＭＤＡ５リガンド、もしくはＳＴＩＮＧリガンド、または、本出願の例示的なＩ／Ｏ、例えば、これらに限定されるものではないが、インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３を含むサイトカイン；これらに限定されるものではないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７Ｓ１、ガレクチン９、ＣＤ２４４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＩＳ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴの阻害剤を含むチェックポイント阻害剤；これらに限定されるものではないが、ＴＬＲ、ＮＬＲ、ＡＬＲ、ＣＬＲ、ＲＬＲ、ＲＩＧ−Ｉ、及びＳＴＩＮＧを含むパターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンド；これらに限定されるものではないが、がん細胞の細胞表面のＣＤ４７発現を下方制御させることができる、またはＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用を直接遮断することができるＳＩＲＰαを含むマクロファージチェックポイントＣＤ４７を阻害する分子；酵素インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の活性を阻害する分子；これらに限定されるものではないが、ＫＩＲ２ＤＬ１−３、ＫＩＲ３ＤＬ１、及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のチェックポイントを遮断する分子；ならびに、これらに限定されるものではないが、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＴＬ−１Ａ、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ、及びＧＩＴＲを含むＴＮＦファミリーメンバーのリガンドまたは他のアゴニストのうちのいずれか１つである。複合体は、切断可能なまたは安定的なリンカーとの化学的結合、切断可能なまたは安定的なリンカーとの融合体としての組換え発現、リポソーム中の共配合、またはリポソーム中に配合された、Ｉ／Ｏをコードする発現ベクターとペプチドとの複合体によって形成される。
【０３７１】
最初のインビトロスクリーニングは、遊離Ｉ／Ｏと比較して、ペプチドがＩ／Ｏを適切な区画（すなわち、ＩＬ−１５剤及び４−１ＢＢリガンドでは細胞外、ＲＩＧ−Ｉリガンド及びＳＴＩＮＧリガンドでは細胞内）にどれだけ効率的に送達できるかを評価するために行われる。それに続くインビボスクリーニングは、リードＩ／Ｏを特定するために行われる。ペプチドＩ／Ｏ複合体をインビボでペプチド単独、空のリポソーム、及び遊離Ｉ／Ｏと比較する。インビトロ及びインビボの結果を分析して、遊離Ｉ／Ｏとは対照的に最大の腫瘍退縮を誘発するペプチドＩ／Ｏ複合体を特定する。
【０３７２】
実施例４５
インビボの腫瘍活性
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体がマウスにおいて確立された腫瘍を効果的に治療することを示すための実験計画について記載する。腫瘍細胞株を、皮下、静脈内（転移）、または同所性を含むさまざまな組織の１つに移植する。例えば数日間または数週間、腫瘍が確立するための時間を与える。マウスを、例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、または腹腔内などのさまざまな投与経路の１つによって薬物で処理する。薬物は実験期間中、１回または数回投与する。未処理のマウスが腫瘍増殖したことで屠殺されるまで腫瘍のサイズを監視する。利用可能な場合、標的化遺伝子を欠失またはノックアウトしたマウスを用いて作用機序を検証する。あるいは、遺伝子ノックアウトした腫瘍も用いられる。薬力学的バイオマーカーを用いて、Ｉ／Ｏに関連した生物学的影響を測定し、さらにＩ／Ｏの作用機序を示す。ペプチドＩ／Ｏ複合体を投与したマウスを遊離Ｉ／Ｏと比較して、Ｉ／Ｏを本開示のペプチドと複合体化することによって得られる効力の増強を評価する。
【０３７３】
例えば、治療モデル４Ｔ１は、マウスの侵襲性乳腺腫瘍である（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｊａｎ  １７；８（３）：４７３０−４７４６，Ｃｈａｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｓｅｐ；２（９）：９０１−１０，Ｃａｌｄｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１７  Ｆｅｂ  １５；２８（２）：４６１−４７０，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｍａｒ  ２９；７（１３）：１６１３０−４５）。腫瘍を乳腺脂肪体に同所的に移植すると、そこで腫瘍は増殖して転移する。腫瘍が触知可能なサイズ（５０〜１００ｍｍ３）に達するまで、通常は移植後約７日間、マウスを休ませる。マウスを処置群または非処置群に無作為に割り当てる。処置群には、３日、例えば、０、７、及び１４日目のそれぞれにＩ／ＯまたはペプチドＩ／Ｏ複合体を投与する。特定の実験日まで、またはマウスが安楽死されるまで、治療をより頻繁に、例えば、２日ごと、週３回、週４回、または毎日投与することもできる。腫瘍の成長は、例えば毎日監視し、腫瘍が１０００ｍｍ３に達した時点でマウスを安楽死させる。実験終了前に、リンパ組織（脾臓及びリンパ節）を各群のマウスから採取し、放射線照射またはマイトマイシンＣで処理した４Ｔ１細胞でこれらの細胞をインビトロで刺激することにより、腫瘍に対する免疫応答を分析する。培養細胞は、マルチプレックスアッセイを用いてケモカイン及びサイトカインなどの主要な調節因子の産生について１８〜２４時間後にアッセイする。腫瘍及び流入領域リンパ節を、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞、ＤＣ、ＮＫ、Ｂ細胞、Ｔｒｅｇ、メモリーＴ細胞、骨髄抑制細胞などの免疫細胞の存在についてさらに評価する。ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６などの活性化マーカーの発現を、免疫細胞で測定する。これらの細胞における分泌されたサイトカインの発現を、サイトカインに対する抗体を用いた細胞内染色によって測定する。抗腫瘍免疫応答は、腫瘍細胞または既知の抗原ペプチドに対するリンパ球の応答によるサイトカインの分泌によってインビトロで測定する。血清サイトカインの濃度を測定して全身の免疫活性化を評価する。循環している抗腫瘍抗体を測定する。腫瘍の免疫組織化学を用いて、浸潤性免疫細胞及び腫瘍内の関連タンパク質の発現を評価する。腫瘍組織を、Ｉ／ＯまたはペプチドＩ／Ｏ複合体の存在についても評価する。原発腫瘍の増殖に加えて、４Ｔ１は転移性腫瘍である。転移は、流入領域の肺、リンパ節、肝臓、及び脾臓においてカウントする。転移の数及び／またはサイズの減少は、ペプチドＩ／Ｏ複合体が腫瘍に対する全身性免疫を誘導したことを示す。特定のペプチドＩ／Ｏ複合体による処理は、腫瘍細胞に直接作用してアポトーシスを誘導する。アポトーシスの誘導は、Ｔｕｎｅｌアッセイなどの主要なアポトーシス調節因子の発現、またはカスパーゼ３、８、及び９の検出を評価することにより、免疫細胞化学によってインビトロで測定することができる。４Ｔ１モデルの１つの形態（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒ  Ｓｏｃ  Ｏｐｅｎ  Ｓｃｉ．２０１７  Ｏｃｔ  ２５；４（１０）：１７０８２２）では、腫瘍細胞を、ＧＦＰ及びルシフェラーゼ���発現するように操作する。これにより、血液中を循環する腫瘍細胞の検出、及び全身のイメージングによる腫瘍の測定が可能となる。
【０３７４】
上記の４Ｔ１乳腺腫瘍モデルについて記載したのと同じ方法が、他の腫瘍モデル、例えば、結腸腫瘍モデルＣＴ２６（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｍａｒ  ２９；７（１３）：１６１３０−４５）及びＭＣ３８（Ｆａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｍａｒ  ２８；８（１３）：２０５５８−２０５７１）、膵臓腫瘍モデルＭＩＡＰａＣａ−２、及びＰＡＮＣ−１（Ｄｕｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１５  Ａｐｒ  １４；４（１０）：ｅ１０２９６９８）及びＰＡＮＣ−０２（Ｄｕｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０１４  Ｄｅｃ；２１（１２）：１８２５−３７）、黒色腫モデルＢ１６Ｆ１０（Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｓｅｐ；５（９）：８１２−８２０，Ｄｅｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１５  Ｄｅｃ  １５；１１２（５０）：１５４０８−１３）、前立腺腫瘍モデルＴＲＡＭＰ−Ｃ２（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ａｐｒ  １５；７（２８３）：２８３ｒａ５２）、膀胱腫瘍モデルＭＢ４９（Ｆａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｍａｒ  ２８；８（１３）：２０５５８−２０５７１）、骨髄腫モデルＭＯＰＣ−３１５及び５Ｔ３３Ｐ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ  １５；７３（１０）：３０７５−８６）、ＡＭＬモデルＣ１４９８（Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１６  Ｊｕｎ  １４；１５（１１）：２３５７−６６）、乳腺腫瘍モデルＴＳＡ、ならびにマウス肺癌モデルＬＬＣ及びＴＣ−１（Ｙａｎｇ  ２０１６）についても用いられる。これらの皮下腫瘍モデルは、そのうちの１つだけに腫瘍内治療を投与する両側性腫瘍を使用してアブスコパル効果を研究するうえで有用である。対側性腫瘍に対する治療効果は、抗腫瘍免疫の誘導を反映する。抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍移植を生存したマウスにおいて、生存マウスに腫瘍で再チャレンジし、治療を行わない場合の生存率を示すことによって確認することもできる（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ  １５；７３（１０）：３０７５−８６，Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１６  Ｊｕｎ  １４；１５（１１）：２３５７−６６）。Ｂ１６Ｆ１０も転移モデルを提供し、その場合、腫瘍細胞を静脈内注射し、転移性病変を肺でカウントする（Ｄｅｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１５  Ｄｅｃ  １５；１１２（５０）：１５４０８−１３）。転移の数及び／またはサイズの減少は、ペプチドＩ／Ｏ複合体が腫瘍に対する全身性免疫を誘導したことを示す。ヒトＢ細胞リンパ腫Ｄａｕｄｉ（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  １１；２９１（４６）：２３８６９−２３８８１）及びヒト前立腺腫瘍ＰＣ３（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１６  Ｏｃｔ  １０；２３９：２２３−３０）などのヒト腫瘍の異種移植片をｓｃｉｄマウスで増殖させることができる。このモデルでは、ＮＫ��胞または他の自然免疫機構を刺激するＩ／Ｏも試験される。
【０３７５】
場合によっては、ペプチドＩ／Ｏ複合体を、外科的切除が予定されている原発腫瘍を有する対象に投与することができる。対象は、ヒトまたは非ヒト動物とすることができる。免疫反応が生じるのに充分な期間を置いた後、原発腫瘍を切除する。対象を局所または遠隔再発について監視する。
【０３７６】
実施例４６
ペプチドＩ／Ｏ複合体による併用治療
本実施例では、ペプチドＩ／Ｏ複合体による併用治療について記載する。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、ペプチドＩ／Ｏ複合体または他の治療薬単独の投与と比較して向上した効力を得るために別の治療薬と組み合わせて対象に投与される。他の治療薬は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１または抗ＣＴＬＡ４、抗ＣＤ４０、ＩＬ−１２などのチェックポイント阻害剤、セツキシマブ、リツキシマブ、またはトラスツズマブなどの治療用抗体、がんワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、５−フルオロウラシルまたはシクロホスファミドなどの化学治療薬、放射線治療、または他のがん治療薬である。併用療法の向上した有効性は、実施例３８及び実施例４５に記載されるように、個々の治療をインビトロ及びインビボで併用治療と比較することによって示される。
【０３７７】
実施例４７
予防的腫瘍モデル
本実施例では、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導するＩ／Ｏを評価するための予防的腫瘍モデルについて記載する。このモデルは、必要に応じて、黒色腫モデルとしてＢ１６Ｆ１０細胞を使用して試験することができる。抗腫瘍免疫応答は、ＩＣＤを誘導するＩ／Ｏで処理した腫瘍細胞によるマウスの予防的治療によって調べる。腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するＩ／Ｏは、ＩＣＤを起こすことが可能である。ＩＣＤでは、腫瘍細胞が活性酸素種（ＲＯＳ）、カルレティキュリン、及びＨＭＧＢ１などのシグナルを放出することができ、カスパーゼ活性、及び樹状突起を動員及び活性化する腫瘍抗原に依存する。成熟した樹状細胞はＴ細胞を刺激するようになり、それにより抗腫瘍免疫応答を促進する。
【０３７８】
腫瘍細胞を本開示の任意のＩ／Ｏ（例えば、実施例３８及び実施例３９に記載されるように、それぞれアゴニストとして作用するＲＩＧ−ＩリガンドまたはＳＴＩＮＧリガンド）でインビトロで処理し、処理細胞を対象に投与する。対象はマウスである。投与数日または数週間後に生きた腫瘍細胞をマウスに投与する。あるいは、生きた腫瘍細胞を、処理細胞の投与と同時に投与する。処理した腫瘍細胞は、Ｉ／Ｏによって誘導されるＩＣＤを起こし始める。誘導されたＩＣＤは、マウスにおける強力な抗腫瘍免疫応答の増加を促進する。抗腫瘍免疫の存在及び特異性を、生存マウスを同じ腫瘍細胞または異なる腫瘍細胞でチャレンジすることによって評価する。ＣＴ２６、Ｐａｎｃ−０２、及びＴＣ−１及びＥＬ４を含むいくつかの腫瘍を用いてＩＣＤが効果的に調べられた。
【０３７９】
実施例４８
ペプチドＩ／Ｏ複合体の腫瘍へのホーミング
本実施例では、がんを有するヒトまたは動物の腫瘍へのペプチドＩ／Ｏ複合体のホーミングについて説明する。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、組換えにより発現されるか化学的に合成され、直接、放射標識後、またはフルオロフォアへの結合後に使用される。ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのいずれか１つから選択される。ペプチドＩ／Ｏ複合体は、ヒトまたは動物に皮下、静脈内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮内、または経口投与される。ペプチドＩ／Ｏ複合体は腫瘍にホーミングし、腫瘍に蓄積し、腫瘍に保持され、腫瘍もしくはその微小環境によってプロセシングされ、Ｉ／Ｏ単独の場合よりも高い濃度もしくは長い期間で腫瘍中に存在し、または他の形で腫瘍中に選択的に存在する。
【０３８０】
実施例４９
ペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞内透過
本実施例では、がんを有するヒトまたは動物におけるペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞内透過について説明する。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、組換えにより発現されるか化学的に合成され、直接、放射標識後、またはフルオロフォアへの結合後に使用される。ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのいずれか１つから選択される。ペプチドＩ／Ｏ複合体は、ヒトまたは動物に皮下、静脈内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮内、または経口投与される。ペプチドＩ／Ｏ複合体は細胞膜を透過して、Ｉ／Ｏ単独の場合よりも高い濃度もしくは長い期間で細胞内区画にアクセスする。
【０３８１】
実施例５０
非ヒト動物の腫瘍へのペプチドＩ／Ｏ複合体のホーミング
本実施例では、非ヒト動物の腫瘍への本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体のホーミングについて説明する。非ヒト動物としては、これらに限定されるものではないが、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、及び他の非ヒト動物が挙げられる。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、組換えにより発現されるか化学的に合成され、直接、放射標識後、またはフルオロフォアへの結合後に使用される。ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのいずれか１つから選択される。得られたペプチド結合ペプチドＩ／Ｏ複合体を、非ヒト動物に、皮下、静脈内、もしくは経口投与するか、または腫瘍内に直接注入する。生体内分布を、ＬＣ／ＭＳ、オートラジオグラフィー、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、シンチレーションカウンティング、免疫組織化学、または蛍光イメージングによって評価する。ペプチドＩ／Ｏ複合体は腫瘍にホーミングされ、腫瘍に蓄積し、腫瘍に保持され、腫瘍もしくはその微小環境によってプロセシングされ、Ｉ／Ｏ単独の場合よりも高い濃度もしくは長い期間で腫瘍中に存在し、または他の形で非ヒト動物の腫瘍中に選択的に存在する。
【０３８２】
実施例５１
ペプチドＩ／Ｏ複合体の血液脳関門の通過及び脳へのホーミング
本実施例では、ペプチドＩ／Ｏ複合体の脳血液関門（ＢＢＢ）及び／または血液脳脊髄液（ＣＳＦ）関門の通過、及び一部の場合では、中枢神経系（ＣＮＳ）内の腫瘍へのホーミングについて示す。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、組換えによって発現されるか化学合成され、直接、放射性標識後、またはフルオロフォアとの結合後に使用され、動物に投与される。投与期間の終了時に、マウスをヘキサン／ドライアイス浴で凍結し、次いでカルボキシメチルセルロースのブロック中で凍結する。脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部消化管、下部消化管、骨、骨髄、生殖器系、目、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、及びその他の種類の組織を含む動物全体の矢状切片の薄い凍結切片をミクロトームを用いて得て、冷凍庫内で乾燥させ、ホスホイメージャープレートに約１０日間曝露する。
【０３８３】
これらのプレートを現像し、各臓器からのシグナル（放射能または蛍光など）を各動物の心臓血または他の組織にみられるシグナルに対して正規化する。その組織の血液から予想されるシグナルよりも暗い組織のシグナルは、領域、組織、構造、または細胞中の蓄積を示す。
【０３８４】
実施例５２
ホーミングペプチドの全身オートラジオグラフィー
本実施例では、本開示のホーミングペプチドの全身オートラジオグラフィーについて説明する。実施例３に記載されるようにペプチドをＮ末端のリシンをメチル化することにより放射性標識する。このように、ペプチドはメチルまたはジメチルリシン及びメチル化またはジメチル化アミノ末端を含むことができる。１００ｎｍｏｌの放射性標識ペプチドを、体重２０〜２５ｇの雌Ｈａｒｌａｎ胸腺欠損ヌードマウスに尾静脈注射で投与する。実験は少なくとも２連で行う（各群ｎ＝２匹の動物）。一部の動物で、腎臓を結紮して放射性標識ペプチドの腎濾過を防ぎ、血漿中半減期を延ばす。各放射性標識ペプチドを記載される時間にわたって動物体内で自由に循環させた後、動物を安楽死させ、切片化する。
【０３８５】
全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）の矢状切片化は以下のようにして行う。投与期間の終了時に、マウスをヘキサン／ドライアイス浴で凍結し、次いでカルボキシメチルセルロースの凍結ブロック中に埋め込む。動物全体の矢状切片を調製し、イメージング用の薄い凍結切片を得る。薄い凍結切片はミクロトームを用いて得て、脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部消化管、下部消化管、骨、骨髄、生殖器系、目、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、及びその他の組織などの組織を可視化する。切片は、イメージングに先立って冷凍庫で乾燥させる。
【０３８６】
オートラジオグラフィーイメージングでは、テープでマウントした薄い切片を凍結乾燥し、放射性試料をホスホイメージャープレートに７日間曝露した。これらのプレートを現像し、各臓器からのシグナル（デンシトメトリー）を各動物の心臓血にみられるシグナルに対して正規化した。その組織中の血液から予想されるシグナルよりも暗い組織中のシグナルは、領域、組織、構造、または細胞中の蓄積を示す。
【０３８７】
実施例５３
腫瘍中のペプチドＩ／Ｏ複合体の局在化
本実施例では、インタクトな腎臓を有する動物の腫瘍内の細胞への本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体の結合について説明する。一実施形態では、実施例６及び実施例７に記載されるようにして動物に投与及び処理を行う。投与期間の終わりに、動物を安楽死させ、染色及びイメージング法で使用するために腫瘍を必要に応じて取り出す。動物全体の矢状切片を調製し、染色及びイメージングに用いる薄い凍結切片を得る。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、腫瘍微小環境に局在化し、腫瘍細胞によって細胞内に局在化されるかもしくは細胞外に結合するかまたはその両方であることが分かっている。局在化は顕微鏡で可視化して確認する。場合により、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、腫瘍に透過することが分かっている。
【０３８８】
別の実施形態では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体は、ヒトに投与され、腫瘍細胞の表面または腫瘍細胞内に局在化される。
【０３８９】
実施例５４
ペプチド−Ｆｃタンパク質融合体
本実施例では、Ｆｃタンパク質との融合体としてのペプチドＩ／Ｏ複合体の作製及び使用について説明する。配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドを、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞中でヒトＩｇＧ１  Ｆｃタンパク質の配列のＮ末端またはＣ末端に融合することによって組換え発現させることで配列番号１２３０
（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＧＳＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ、ただし、Ｘは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つを含む本開示の任意のペプチドである）が得られる。
【０３９０】
配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドを、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞中でヒトＩｇＧ１  Ｆｃタンパク質の配列のＮ末端またはＣ末端に融合することによって組換え発現させることで
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１４９３）、ただし、Ｘは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つを含む本開示の任意のペプチドである）が得られる。
【０３９１】
ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞中でヒトＩｇＧ１  Ｆｃタンパク質の配列のＮ末端またはＣ末端に融合して組換え発現されるペプチドは、
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＧＳＧＶＰＩＮＶＲＣＲＧＳＲＤＣＬＤＰＣＲＲＡＧＭＲＦＧＲＣＩＮＳＲＣＨＣＴＰＧＧＳＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１４９４）の配列を生じることができる。
【０３９２】
本開示の任意のペプチドの配列は、分泌シグナル配列をＮ末端に、Ｆｃ配列をＣ末端に付加することにより、マウスまたはヒトＦｃのいずれかとの融合タンパク質として発現される。これにより、分泌及び／または薬物動態特性が改善された二価の分子が作製される。このより大きなペプチド−Ｆｃ融合体は、異なる哺乳動物または昆虫の細胞株で発現させられ、研究用の試薬及び治療薬として有用である。
【０３９３】
本開示のいずれのペプチドも、Ｆｃタンパク質と共発現させることでより長い半減期及び改善された腫瘍へのホーミング性を有するＦｃ融合ペプチドを生じる。配列番号１２３０では、分泌シグナル配列ＭＥＴＴＤＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１２３１）に続いて、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドが配置され、これに続いてＦｃタンパク質の配列が配置される。切断は不正確であり得、配列番号１２３０の２０位または２１位で切断を生じる。次いで、ペプチド−Ｆｃ融合体は、本開示のＩ／Ｏに化学的に結合されるかもしくは配合されるか、またはペプチド−Ｆｃ融合体は本開示のＩ／Ｏと組換えによって発現される。
【０３９４】
実施例５５
ペプチド結合体の切断
本実施例では、調整可能な切断速度を有するペプチドＩ／Ｏ複合体の調製について記載する。化学構造を用いて切断に対する立体障害を与えるか、または切断点における変化した局所環境を与えるような改変（加水分解などの化学的切断及び酵素的切断の両方に対して）を行ってペプチドＩ／Ｏ複合体を合成または発現させる。１つの例示的な結合体では、ペプチドＩ／Ｏ複合体を、切断可能な結合に近接した１個以上のメチル基を有するように合成することで立体障害を生じさせ、これにより切断速度を低下させる。別の例示的な結合体では、隣接する炭素に１個のメチル基が存在する。別の例示的な結合体では、隣接する炭素に２個のメチル基が存在する。別の例示的な結合体では、隣接する炭素に１個のエチル基が存在する。別の例示的な結合体では、隣接する炭素に２個のエチル基が存在する。別の例示的な結合体では、切断部位の近くに環状基が存在する。別の例示的な結合体では、炭素リンカーの長さを大きくし、局所的な疎水性を増大させ、加水分解速度を低下させる。別の例示的な結合体では、隣接する炭素にヒドロキシル基を配置し、局所的な親水性を増大させ、切断速度を増大させる。このように、これらの例示的な結合体の切断速度を調整して、早すぎる切断を防止し、活性Ｉ／Ｏが放出される前に体内または細胞内の所望の部位により多くのペプチドＩ／Ｏ複合体を確実に蓄積させる一方でＩ／Ｏを腫瘍微小環境中でも適時放出させる。
【０３９５】
得られたペプチドＩ／Ｏ複合体は、ヒトまたは動物に静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注入によって投与され、疾患を治療する。
【０３９６】
実施例５６
ペプチド及びペプチド結合体の腫瘍内投与
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体の腫瘍内投与について説明する。本開示のペプチドを、組換えによって発現させるかまたは化学合成する。場合により、この後、ペプチドをＩ／Ｏに結合するか、Ｉ／Ｏ剤と組換えにより発現させるか、またはＩ／Ｏと配合する。ペプチドまたはペプチド結合体を腫瘍内投与によって投与を必要とする対象に投与する。ペプチドＩ／Ｏ複合体のサイズが小さいことにより、また、ペプチドＩ／Ｏ複合体による腫瘍成分の結合により、ペプチドＩ／Ｏ複合体は腫瘍に透過する。ペプチドＩ／Ｏ複合体は腫瘍に結合し、この結合により腫瘍内の滞留時間が長くなる。必要に応じて、注入された物質は凝集するか、結晶化するか、または複合体を形成し、それによりデポ効果をさらに延長し、より長い滞留時間に寄与する。
【０３９７】
ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６から選択される配列を有する任意のペプチドであってよい。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる（例えば、実施例８及び９）。
【０３９８】
実施例５７
ペプチドＩ／Ｏ複合体による脳腫瘍の治療
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を用いた脳腫瘍の治療について説明する。本開示のペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、Ｉ／Ｏに結合した後、直接使用する。ペプチドＩ／Ｏ複合体を脳腫瘍の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドＩ／Ｏ複合体は、脳腫瘍に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
【０３９９】
さらに、多くの化学療法剤は血液脳関門を通過しない。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してＩ／Ｏに結合する。Ｉ／Ｏと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのうちのいずれか１つとの結合は、Ｉ／Ｏを脳内、さらに腫瘍にターゲティングする。１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体がヒトまたは動物に投与される。
【０４００】
ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６から選択される配列を有する任意のペプチドである。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる（例えば、実施例８及び９）。
【０４０１】
実施例５８
ペプチドＩ／Ｏ複合体による乳癌の治療
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を用いた乳癌の治療について説明する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成し、Ｉ／Ｏに結合した後、直接使用する。ペプチドＩ／Ｏ複合体を乳癌の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドＩ／Ｏ複合体は、乳癌に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
【０４０２】
ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６から選択される配列を有する任意のペプチドである。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる（例えば、実施例８及び９）。
【０４０３】
実施例５９
ペプチドＩ／Ｏ複合体による黒色腫の治療
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を用いた黒色腫の治療について説明する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成し、Ｉ／Ｏとの複合体として使用する。ペプチドＩ／Ｏ複合体を黒色腫の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドＩ／Ｏ複合体は、黒色腫に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
【０４０４】
ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号番号１３１６のうちのいずれか１つである。かかるペプチドＩ／Ｏ複合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる（例えば、実施例８及び９）。
【０４０５】
実施例６０
ペプチドＩ／Ｏ複合体による肉腫の治療
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を用いた肉腫の治療について説明する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成し、Ｉ／Ｏに結合した後、直接使用する。ペプチドＩ／Ｏ複合体を肉腫の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドＩ／Ｏ複合体は、肉腫に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
【０４０６】
ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６から選択される配列を有する任意のペプチドである。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる（例えば、実施例８及び９）。
【０４０７】
実施例６１
ペプチドＩ／Ｏ複合体による脳腫瘍の治療
本実施例では、ペプチドＩ／Ｏ複合体による脳腫瘍の治療について記載する。多くの化学療法剤は血液脳関門を通過しない。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してＩ／Ｏに結合する。Ｉ／Ｏと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のペプチドのうちのいずれか１つとの結合は、Ｉ／Ｏを脳内、さらに腫瘍にターゲティングする。１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体がヒトまたは動物に投与される。
【０４０８】
実施例６２
ペプチドＩ／Ｏ複合体によるユーイング肉腫の治療
本実施例では、ユーイング肉腫を治療するための本明細書に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体の使用について記載する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してＩ／Ｏに結合する。Ｉ／Ｏと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドとの結合は、薬物をユーイング肉腫にターゲティングする。１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体がヒトまたは動物に投与される。
【０４０９】
実施例６３
ペプチドＩ／Ｏ複合体による膠芽腫の治療
本実施例では、膠芽腫を治療するための本明細書に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体の使用について記載する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してＩ／Ｏに結合する。Ｉ／Ｏと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドとの結合は、薬物を膠芽腫にターゲティングする。１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体がヒトまたは動物に投与される。
【０４１０】
実施例６４
ペプチドＩ／Ｏ複合体によるトリプルネガティブ乳癌の治療
本実施例では、トリプルネガティブ乳癌を治療するための本明細書に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体の使用について記載する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してＩ／Ｏ複合体に結合する。Ｉ／Ｏと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つのペプチドとの結合は、薬物をトリプルネガティブ乳癌にターゲティングする。１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体がヒトまたは動物に投与される。
【０４１１】
実施例６５
変異ペプチドによる非脳腫瘍の治療
本実施例では、非脳腫瘍の治療に用いられるペプチドＩ／Ｏ複合体について記載する。本開示のペプチドに変異を導入する。この変異は、変異ペプチドが血液脳関門を通過することを防ぐものである。変異ペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してＩ／Ｏ剤に結合する。Ｉ／Ｏと、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つの変異ペプチドとの結合は、薬物を非脳腫瘍にターゲティングする。例えば、変異ペプチドＩ／Ｏ複合体は、がんである非脳腫瘍にターゲティングする。１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体がヒトまたは動物に投与される。
【０４１２】
実施例６６
ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による頭頸部癌の治療について記載する。Ｉ／ＯはＲＩＧ−Ｉリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＲＩＧ−Ｉリガンドに結合させる。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、頭頸部癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、癌細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０４１３】
実施例６７
ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による頭頸部癌の治療について記載する。Ｉ／ＯはＳＴＩＮＧリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＳＴＩＮＧリガンドに結合させる。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、頭頸部癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０４１４】
実施例６８
ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体による肺癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による肺癌の治療について記載する。Ｉ／ＯはＲＩＧ−Ｉリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＲＩＧ−Ｉリガンドに結合させる。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肺癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０４１５】
実施例６９
ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体による肺癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による肺癌の治療について記載する。Ｉ／ＯはＳＴＩＮＧリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＳＴＩＮＧリガンドに結合させる。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肺癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０４１６】
実施例７０
ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体による腎細胞癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による腎細胞癌の治療について記載する。Ｉ／ＯはＲＩＧ−Ｉリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＲＩＧ−Ｉリガンドに結合させる。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり腎細胞癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０４１７】
実施例７１
ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体による腎細胞癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による腎細胞癌の治療について記載する。Ｉ／ＯはＳＴＩＮＧリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＳＴＩＮＧリガンドに結合させる。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、腎細胞癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０４１８】
実施例７２
ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体によるリンパ腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）によるリンパ腫の治療について記載する。Ｉ／ＯはＲＩＧ−Ｉリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＲＩＧ−Ｉリガンドに結合させる。このペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、リンパ腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０４１９】
実施例７３
ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体によるリンパ腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏに結合された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）によるリンパ腫の治療について記載する。Ｉ／ＯはＳＴＩＮＧリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようなＳＴＩＮＧリガンドに結合させる。このペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、リンパ腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＳＴＩＮＧリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
【０４２０】
実施例７４
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの複合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による頭頸部癌の治療について記載する。Ｉ／Ｏは、本明細書に開示される任意のＩＬ−１５剤である。ペプチドを、実施例１８に記載されるように、ＩＬ−１５剤との複合体として組換えによって発現させる。このペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、頭頸部癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、ＩＬ−１５剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、ＩＬ−１５剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。ＩＬ−１５剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０４２１】
実施例７５
ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの複合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による頭頸部癌の治療について記載する。Ｉ／Ｏは４−１ＢＢリガンドである。ペプチドを、実施例１９に記載されるように、４−１ＢＢリガンドとの複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、頭頸部癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。４−１ＢＢリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０４２２】
実施例７６
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体による肺癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの複合体または融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による肺癌の治療について記載する。Ｉ／Ｏは、本明細書に開示される任意のＩＬ−１５剤である。ペプチドを、実施例１８に記載されるように、ＩＬ−１５剤との複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肺癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、ＩＬ−１５剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、ＩＬ−１５剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。ＩＬ−１５剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０４２３】
実施例７７
ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体による肺癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による肺癌の治療について記載する。Ｉ／Ｏは４−１ＢＢリガンドである。ペプチドを、実施例１９に記載されるように、４−１ＢＢリガンドとの複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肺癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。４−１ＢＢリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０４２４】
実施例７８
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体による腎細胞癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による腎細胞癌の治療について記載する。Ｉ／Ｏは、本明細書に開示される任意のＩＬ−１５剤である。ペプチドを、実施例１８に記載されるように、ＩＬ−１５剤との複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、腎細胞癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、ＩＬ−１５剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、ＩＬ−１５剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。ＩＬ−１５剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０４２５】
実施例７９
ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体による腎細胞癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）による腎細胞癌の治療について記載する。Ｉ／Ｏは４−１ＢＢリガンドである。ペプチドを、実施例１９に記載されるように、４−１ＢＢリガンドとの融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、腎細胞癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。４−１ＢＢリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０４２６】
実施例８０
ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体によるリンパ腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの複合体または融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）によるリンパ腫の治療について記載する。Ｉ／Ｏは、本明細書に開示される任意のＩＬ−１５剤である。ペプチドを、実施例１８に記載されるように、ＩＬ−１５剤との複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、リンパ腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、ＩＬ−１５剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、ＩＬ−１５剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。ＩＬ−１５剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０４２７】
実施例８１
ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体によるリンパ腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるＩ／Ｏとの複合体または融合体として発現された本開示の任意のペプチド（配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）によるリンパ腫の治療について記載する。Ｉ／Ｏは４−１ＢＢリガンドである。ペプチドを、実施例１９に記載されるように、４−１ＢＢリガンドとの複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、リンパ腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド−４−１ＢＢリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、４−１ＢＢリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。４−１ＢＢリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例３８に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例４５に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び／または増強する。
【０４２８】
実施例８２
ペプチド結合によるＳＥＡＰレポーター細胞株の細胞質へのＲＩＧ−Ｉリガンドの送達
本実施例では、ペプチド結合によるＳＥＡＰレポーター細胞株の細胞質へのＲＩＧ−Ｉリガンドの送達について記載する。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路及び／またはＩＲＦ３経路の活性化を監視することにより、生物活性マウスＩ型ＩＦＮの検出を可能にするマウスＢ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＦＮ−α／β  ＳＥＡＰレポーター細胞株を使用した。これらの細胞をＩ型ＩＦＮインデューサー（ＲＩＧ−Ｉリガンドなど）で刺激すると、ＩＲＦ誘導性プロモーターの活性化による分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生が細胞内でトリガーされる。これらの細胞は、多量体ＩＳＲＥによって増強されたＩＦＮ−α／β誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下で、ＳＥＡＰレポーター遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＣ５７ＢＬ／６由来のマウスＢ１６黒色腫細胞株から誘導される。細胞を解凍し、熱不活性化１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ  Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎを含むＲＰＭＩ中で維持した。すべてのアッセイ読み取りにおいて、選択用抗生物質を完全な増殖培地から除外した。アッセイは以下のように行った。Ｂ１６−Ｂｌｕｅレポーター細胞を、１００μＬ容量の透明な９６ウェル組織培養プレートにウェル当たり２０，０００個または６０，０００個の細胞となるように播種し、一晩付着させた。翌日、適当な実験用処理培地を調製した。二本鎖ＲＮＡ及びペプチドＩ／Ｏ複合体などのＲＮＡ含有試験物を水に溶解して、ストック溶液を調製した。トランスフェクションを用いるウェルについては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３００処理液を製造者のプロトコールに従って調製した。処理に際して適当なウェルを吸引した。次に、処理培地を、７５または２００μＬの最終容量となるように適当な対応するウェルに再び加えた。各プレートを適当な時間（２４時間、４８時間、または７２時間）インキュベートした。２４時間、４８時間、７２時間の時点で、細胞プレート（複数可）をインキュベーターから取り出し、１０μＬを実験ウェル及びコントロールウェルからピペットで取り、５０μＬのＳＥＡＰアッセイ試薬が入った新しい白色壁９６ウェルプレートに移した。このプレートを軽く振って混合し、プレートリーダーで読み取る前に１５〜２０分間インキュベートした。
【０４２９】
図１９は、ＳＥＡＰレポーター細胞内のＩＦＮ経路が活性化されることによる発光シグナルを示す。図１９は、細胞を、１２ｐｍｏｌまたは１２０ｐｍｏｌの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、配列番号１４２４（５’末端に三リン酸を有する）と配列番号１４２５（末端のリン酸なし）とが互いに複合体化されたものである５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ（図３７と同じ５’ｐｐｐ  ＲＮＡの配列。二本鎖だがペプチドリンカーのないもの）、または配列番号１４２４と配列番号１４２５（両方の鎖に末端リン酸なし）とが互いに複合体化されたものであるｄｓＲＮＡ（図３７と同じＲＮＡの配列。二本鎖だが、５’ｐｐｐがなく、かつペプチドリンカーのないもの）により、細胞を処理した、２４、４８、または７２時間後の相対発光量（ＲＬＵ）を示す。この実験ではトランスフェクション試薬を使用しなかった。この経路を活性化するためには、５’ｐｐｐの存在及び細胞質への薬剤の送達の両方が必要であると予想された。これは、５’ｐｐｐがＲｉｇ−Ｉの活性化に不可欠であり、Ｒｉｇ−Ｉが細胞質中に存在しているためである。また、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ単独では、トランスフェクション試薬を添加しなければ、細胞質に顕著なレベルで到達しないことも予想された。５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡでは極めてわずかなシグナルしか観察されなかったが、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体では１２ｐｍｏｌ及び１２０ｐｍｏｌの両方の用量で顕著かつ増加するシグナルが見られた。これは、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体は、トランスフェクション試薬を添加することなく、細胞の細胞質にアクセスしてＲＩＧ−Ｉヘリカーゼを活性化することができたことを示した。図２０は、１２ｐｍｏｌまたは１２０ｐｍｏｌの一致させたモル用量で、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡではなく、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を投与したことによるシグナルの増加倍率を示す。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を添加したことによる増加倍率は、ペプチドのない５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡのみの投与により得られたシグナルの約３〜３０倍の範囲であった。図２１は、１２ｐｍｏｌの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体、図１９で述べたポジティブコントロールの５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ（「５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ」として示す）、または図１９で述べたネガティブコントロールのｄｓＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐなし）」として示す）（二本鎖だが、５’ＰＰＰがなく、ペプチドリンカーもない同じＲＮＡの配列）で細胞を処理した２４時間後の相対発光量（ＲＬＵ）を示す。この実験ではトランスフェクション試薬を使用しなかった。これらの結果は、図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体及び図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体がトランスフェクション試薬の非存在下で、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡと比較してより高いレベルで細胞内のＩＦＮ経路を活性化したことを示した。図２２は、トランスフェクション試薬の存在下で異なる薬剤を投与することによって得られたＲＬＵシグナルを示す。５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡをリポフェクタミントランスフェクション試薬とともに、またはｄｓＲＮＡをリポフェクタミントランスフェクション試薬とともに投与した。リポフェクタミンなどのトラン���フェクション試薬は、トランスフェクション試薬がなければ入らないものを含む分子をインビトロで細胞質に送達する方法を提供し、これにより、細胞質に送達された場合にそれが細胞質の標的を活性化するかどうかを示すものである。ただし、トランスフェクション試薬は毒性が高く、インビトロでの使用には制限がある。図２２では、トランスフェクション試薬を、５’ｐｐｐを有するＲＮＡと共に使用した場合（例えばトランスフェクション試薬とともに細胞質に送達された場合の５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡの活性を示す）、及び、トランスフェクション試薬を図３４の、及び図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体と共に使用した場合（細胞質中でのこれらの複合体の活性を示す）に高いシグナルが生じたが、ｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐなし）では、ＲＩＧ−Ｉ経路の活性化に５’ｐｐｐが重要な役割を果たしていることから、生じたシグナルは大幅に低かった。さらに、図８０は、トランスフェクション試薬であるリポフェクタミンを、１６．２ｐｍｏｌの図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３６のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３５のＩ／Ｏ、５’ｐｐｐを有する配列番号１３７１（５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡと同じ配列だがペプチドリンカーのないもの）、または配列番号１４２４及び配列番号１４２５のｄｓＲＮＡ（二本鎖だが５’ｐｐｐがなく、ペプチドリンカーもない同じ配列のＲＮＡ）のいずれかと共に用いて細胞を処理した２４時間後のＳＥＡＰレポーター細胞内のＩＦＮ経路の活性化による相対発光量（ＲＬＵ）を示す。
【０４３０】
トランスフェクション試薬を、５’ｐｐｐを有するＲＮＡ、図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体の切断産物（図３５の構造）、または図３６のペプチドＩ／Ｏ複合体のいずれかと共に用いた場合に高いシグナルがみられた。図２２及び図８０のデータは、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ、図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３６のペプチドＩ／Ｏ複合体、または図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体の切断産物（図３５に示される構造である）が細胞質に送達される場合、これらはＲＩＧ−Ｉ経路を活性化できることを示している。
【０４３１】
合わせたデータもまた、細胞質に入ってＲＩＧ−Ｉ経路及びＩ型インターフェロンの応答を活性化する、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体及び図３４のペプチドＩ／Ｏ複合体のようなペプチドＩ／Ｏ複合体の能力を示している。
【０４３２】
実施例８３
細胞死のインビトロでの実証
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体への曝露後の、インビトロのがん細胞におけるアポトーシスを含む細胞死のインビトロでの実証について記載する。ペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６のうちのいずれか１つ）を組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、実施例１２、実施例１３、実施例１５、実施例１６、または実施例１７に記載されるようにして、または図３４〜４４に示されるようにしてＲＩＧ−ＩリガンドまたはＳＴＩＮＧリガンドに結合した。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株などのがん細胞株を培養中で増殖させる。細胞をペプチドＩ／Ｏ複合体に曝露する。曝露されると、ペプチドＩ／Ｏ複合体は細胞に内在化され、一部が細胞質に入る。Ｉ／Ｏがそのターゲット（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、またはＳＴＩＮＧ）を刺激すると、アポトーシスを含む細胞死をもたらす細胞内シグナル伝達経路が刺激される。細胞死の誘導は、アネキシンＶに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に加えてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）などの別の蛍光ＤＮＡ染色で細胞を染色することによって示される。
【０４３３】
実施例８４
がん細胞に対する免疫応答のインビトロでの実証
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体で処理されたがん細胞と単離された免疫細胞とを共培養することによる、がん細胞に対する免疫応答のインビトロでの実証について記載する。免疫細胞を、免疫エフェクター細胞及び／またはメモリー細胞のサブセットの増殖及び活性化について特性評価を行う。ヒトがん細胞株または実施例３６、３７、３９、４５、４７に記載されるような同系腫瘍モデルで使用されるマウスがん細胞株のいずれかなどのがん細胞を、実施例１６〜１９、４３、５４、３６、３７、３８に記載されるようにしてペプチドＩ／Ｏに曝露する。細胞は、ペプチドＩ／Ｏ複合体に対する応答を生じるのに充分な時間、例えば３０分、１時間、４時間、一晩、２４時間、または４８時間にわたってインキュベートする。培地を除去し、細胞を洗浄して残存するペプチドＩ／Ｏ複合体をすべて除去する。コントロールの細胞培養はペプチドＩ／Ｏ複合体を含まない培地中に維持し、それ以外は同様に処理する。一方で、免疫細胞を単離する。がん細胞がヒト細胞株である場合には、ヒトＰＢＭＣを免疫細胞源として用いる。がん細胞がマウス細胞株である場合には、免疫細胞を同系マウス系統の脾臓から単離する。単離した免疫細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなＣＦＳＥ色素で染色した後、がん細胞と共培養中で増殖させる。例えば、３０分、１時間、４時間、一晩、２４時間、４８時間、または最大１週間など、応答を生じるのに充分な時間にわたるインキュベーションの後、免疫細胞を共培養から取り出す。細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、及びＢ２２０などの系統マーカーに対する抗体で染色し、マークされたサブセットの増殖をフローサイトメトリーによって分析する。免疫サブセットでのＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６などの活性化マーカーの発現を、評価する系統マーカー（複数可）及び活性化マーカー（複数可）に対して特異的な抗体で染色し、その後、フローサイトメトリー分析を行うことにより測定する。これらの共培養中に分泌されるサイトカインの発現を、サイトカインに対する抗体を用いた細胞内染色、及び／またはＥＬＩＳＡなどのアッセイによって測定して培地中に分泌された各タンパク質の量を測定する。
【０４３４】
コントロール細胞培養に対する応答とは異なる、ペプチドＩ／Ｏ複合体で処理されたがん細胞に対する免疫細胞応答は、がん細胞がペプチドＩ／Ｏ複合体への曝露により免疫原性を獲得または高めたことを示す。免疫細胞応答には、増殖、活性化マーカーの増加、及びサイトカインの発現が含まれる。
【０４３５】
あるいは、ＣＦＳＥ標識した免疫細胞を、がん細胞培養から回収した馴化培地で培養する。系統特異的な増殖と活性化についてのアッセイを上記と同様に行う。応答は、ペプチドＩ／Ｏ複合体で処理されたがん細胞が、免疫応答を刺激する可溶性因子（複数可）を分泌することを示す。
【０４３６】
実施例８５
免疫細胞の走化性及び遊走のインビトロでの実証
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体で処理したがん細胞と単離した免疫細胞との共培養について記載し、免疫細胞を多孔性膜またはマトリックスによってがん細胞から分離し、がん細胞に応答してバリアに向かって、またはバリアを通過して遊走する能力について特性評価する。例えば、ヒトがん細胞株、または実施例３６、３７、及び４５に記載される同系腫瘍モデルにおいて使用したマウスがん細胞株のいずれかのようながん細胞を、実施例３６、３７、及び３８に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体に曝露する。細胞をペプチドＩ／Ｏ複合体に対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、３０分、１時間、４時間、一晩、２４時間、または４８時間にわたってインキュベートする。培地を除去し、細胞を洗浄して残存するペプチドＩ／Ｏ複合体をすべて除去する。コントロールの細胞培養はペプチドＩ／Ｏ複合体を含まない培地中に維持し、それ以外は同様に処理する。一方で、免疫細胞を単離する。がん細胞がヒト細胞株である場合には、ヒトＰＢＭＣを免疫細胞源として用いる。がん細胞がマウス細胞株である場合には、免疫細胞を同系マウス系統の脾臓から単離する。単離した免疫細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなＣＦＳＥ色素で染色した後、がん細胞に隣接した培養チャンバに加える。応答を生じるのに充分な時間、例えば３０分、１時間、４時間、一晩、２４時間、４８時間、または最大１週間のインキュベーション後、チャンバを分離し、免疫細胞を元の区画内、バリア材料内、及びチャンバのがん細胞部分内で可視化する。コントロールの細胞培養との培養物におけるよりも多い、ペプチドＩ／Ｏ複合体で処理したがん細胞との培養におけるバリアまたはがん細胞チャンバ内の免疫細胞の存在は、ペプチドＩ／Ｏ複合体への暴露によって、がん細胞が免疫走化性を獲得または増大させたことを示す。
【０４３７】
実施例８６
ペプチドＩＬ−１５剤複合体で処理した細胞のインビトロ増殖
本実施例では、サイトカイン依存性ＣＴＬＬ２（マウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株）、Ｍｏ７ｅ（ヒト急性巨核芽球性白血病細胞株）、及びヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用し、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体で処理した細胞のインビトロ増殖について記載する。すべてのアッセイは、透明底の黒色壁組織培養プレートの９６ウェルプレートフォーマットで行った。配列番号５６８を含むペプチドＩ／Ｏ複合体、ＩＬ−１５剤を含むペプチドＩ／Ｏ複合体、及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩコントロールタンパク質を含むペプチドＩ／Ｏ複合体（配列番号１３４２）を、補充サイトカインを含まない培地中に希釈した。２、５、及び１０倍の段階希釈（濃度は実験及び細胞型によって変えた）を行い、各分子の分析を３連で行った。
【０４３８】
ＣＴＬＬ２及びＭｏ７ｅ細胞は、ＩＬ−２（ＣＴＬＬ２）またはＩＬ−３（Ｍｏ７ｅ）のいずれかを含む培地中で細胞培養として維持した。生存率及び細胞濃度は、Ｖｉａｃｅｌｌセルカウンターを使用して分析した。カウント後、必要な数の細胞を浮遊培養から取り出し、２〜３回洗浄し、補充サイトカインを含まない培地に再懸濁し、培養フラスコに入れて３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートすることによりサイトカイン飢餓状態とした。次いで、細胞を、１０μＬの各試験タンパク質が入ったウェルに加え（９０μｌ中、２０，０００個のＭｏ７ｅ細胞または５，０００個のＣＴＬＬ２細胞）、２日間（ＣＴＬＬ２）または３日間（Ｍｏ７ｅ）インキュベートした（最終容量を１ウェル当たり１００μＬとした）。細胞を含まない増殖培地を含むさらなるウェルを、アッセイのブランクとして含めた。
【０４３９】
ＣＤ８＋で選択した初代ヒトＴ細胞を凍結細胞として受け取り、使用するまでＬＮ２気相中で保存した。細胞を３７℃の水浴中で解凍した後、５ｍＬの室温の５０％ＦＢＳ／５０％ＲＰＭＩ培地にゆっくりと加えた。１５ｍＬの室温の１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ培地を細胞懸濁液に加えた後、細胞をペレット化し、１０％ＦＢＳ培地に再懸濁し、Ｖｉａｃｅｌｌを使用してカウントした。次いで、細胞の半分を１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ培地を使用して適宜希釈し、４０，０００細胞／ウェル（９０μＬ中）を、各試験タンパク質が入った９６ウェルプレートに加えた。最終容量を１００μＬとした。細胞の残りの半分を５μｇ／ｍＬのＰＨＡを含む培地に再懸濁し、３７℃で３日間インキュベートして芽球を形成させた。次いで、細胞を洗浄し、１０単位／ｍＬのＩＬ−２を含む培地に再懸濁し、３７℃で１日間インキュベートした後、上記で述べたようにしてプレーティングした。
【０４４０】
インキュベーション期間の終了後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ生細胞アッセイ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに加えた（１００μＬウェル当たり１０μＬ）。次いで、プレートをインキュベーターに４〜６時間（ＣＴＬＬ２及びＭｏ７ｅ）または２４時間（ＣＤ８＋細胞）戻した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ２１０４）プレートリーダーを使用して蛍光を定量した。データをグラフ化し、Ｅｘｃｅｌ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７、またはＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ  ｇｒａｐｈｉｎｇ  ａｎｄ  ＥＣ５０  ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｔｂｉｏ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ｅｃ５０−ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）で分析した。
【０４４１】
配列番号５６８を含むペプチドＩ／Ｏ複合体は、サイトカイン活性を保持し、ＣＴＬＬ２、Ｍｏ７ｅ、及びＣＤ８＋初代ヒトＴ細胞の増殖を刺激した。図２８は、ＣＴＬＬ２細胞の増殖曲線を示す。図２８Ａは、増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）に曝露した後のＣＴＬＬ２細胞の増殖曲線を示す。図２８Ｂは、配列番号１３２０、ＩＬ−１５（配列番号１１７７）、及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）についてのＣＴＬＬ２増殖を示す。各データ点は、ｎ＝３の平均を表す。ＲＦＵ−相対蛍光単位。
【０４４２】
図２９は、増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、配列番号１３２０、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）に曝露した後のＭｏ７ｅ細胞の増殖曲線を示す。各曲線は各群ｎ＝３を示し、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表す。結果は、これらのＩＬ−１５剤がＭｏ７ｅ細胞を刺激することを示している。図３０は、ＣＤ８＋初代ヒトＴ細胞及び同じＣＤ８＋Ｔ細胞ドナーからのＰＨＡ誘導Ｔ細胞芽球の増殖曲線を示す。図３０Ａは、増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、配列番号１３２０、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）に曝露した後のＣＤ８＋初代ヒトＴ細胞の増殖曲線を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。ＲＦＵ−相対蛍光単位。図３０Ｂは、増加する濃度の配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、配列番号１３２０、及び配列番号１３２１及びＨｉｓタグ付けしたＲＬＩ（配列番号１３４２）に曝露した後の図３０Ａと同じＣＤ８＋Ｔ細胞ドナーからのＰＨＡ誘導Ｔ細胞芽球の増殖曲線を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。ＲＦＵ−相対蛍光単位。これらのデータは、これらのＩＬ−１５剤がヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することを示している。
【０４４３】
配列番号５６９−ＩＬ−１５剤複合体で処理した細胞のインビトロ増殖。配列番号１３２８を含む発現プラスミドをトランスフェクトした（したがって、配列番号１３２８のタンパク質を上清に分泌すると予想される）ＨＥＫ２９３細胞からの未精製の上清を、Ｍｏ７ｅ増殖アッセイを使用してサイトカイン活性について試験した。Ｍｏ７ｅ細胞は、サイトカイン依存性ヒト巨核芽球性白血病細胞株であり、ＩＬ−３を含む培地中で維持されるが、ＩＬ−１５刺激にも応答して増殖する。生存率及び細胞濃度は、Ｖｉａｃｅｌｌセルカウンターを使用して分析した。カウント後、必要な数の細胞を浮遊培養から取り出し、培地で３回洗浄して残留ＩＬ−３を除去し、補充サイトカインを含まない培地に再懸濁した。Ｍｏ７ｅ細胞を、培養フラスコに入れて３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートすることによりサイトカイン飢餓状態とした。次に、細胞を、未精製の配列番号１３２８を含む上清、発現ベクターをトランスフェクトしていないＨＥＫ２９３馴化培地（「モック」、配列番号１３２８の発現）、または培地のみ（「非処理」）が１１０倍の最終希釈倍率で含むウェルに加え、３日間インキュベートした。細胞を含まない培地を含むさらなるウェルを、アッセイのブランクとして含めた。
【０４４４】
インキュベーション期間の終了後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ生細胞アッセイ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに製造者の指示に従って加えた。次いで各プレートをインキュベーターに４時間戻した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ２１０４）プレートリーダーを使用してＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅの蛍光を定量した。
【０４４５】
配列番号１３２８を含むペプチドＩ／Ｏ複合体は、サイトカイン活性を示し、Ｍｏ７ｅ細胞の増殖を刺激した。図８３は、Ｍｏ７ｅ細胞を、配列番号１３２８の発現ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得られた馴化培地（上清）、またはトランスフェクトしていない細胞（モックネガティブコントロール）から得られたＨＥＫ２９３馴化培地で処理した３日後にＰｒｅｓｔＢｌｕｅ生細胞アッセイからの相対蛍光単位（ＲＬＵ）で表した蛍光シグナルを示す。非処理のＭｏ７ｅ細胞もさらなるネガティブコントロールとして含めた。エラーバーは標準偏差を示す（各群ｎ＝３）。これは、配列番号１３２８を含むペプチドＩ／Ｏ複合体がＭｏ７ｅ細胞を刺激することを示している。
【０４４６】
配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の結果を有するペプチド−ＩＬ−１５複合体を構成することができる。
【０４４７】
実施例８７
ペプチドＩ／Ｏ複合体に対する腫瘍細胞の応答
本実施例では、ペプチドＩ／Ｏ複合体によるインターフェロン産生、インターフェロンで刺激した遺伝子を含む抗腫瘍遺伝子発現プロファイルの誘導、及びアポトーシスを含む腫瘍細胞応答について記載する。本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を、ＣＴ２６結腸癌細胞及びＡ２０リンパ腫細胞を使用して、アポトーシスを引き起こし、インビボで腫瘍にインターフェロン応答を誘導する能力について試験した。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を、雌性Ｂａｌｂｃマウスで評価した。
【０４４８】
側腹部腫瘍を形成するため、マウスに１００μＬの容量で２０万個のＣＴ２６細胞を接種した。Ｋｌｉｎｇｈｏｆｆｅｒ，Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ  ｔｕｍｏｒ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ  ７，２８４ｒａ２５８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａａ７４８９（２０１５）、及びＭｏｒｅｎｏ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ａ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．  ＆  Ｋｌｉｎｇｈｏｆｆｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｔｈａｔ  ｍａｔｔｅｒｓ−ｔｈｅ  ｐａｔｉｅｎｔ．ＭｏｌＣｅｌｌ  Ｏｎｃｏｌ  ３，ｅ１０５７３１５，ｄｏｉ：１０．１０８０／２３７２３５５６．２０１５．１０５７３１５（２０１６）に記載されるようにして、独自のマイクロインジェクターデバイスを使用して腫瘍に直接試験物を注射することで、同じ腫瘍の異なる位置に４つの別々の試験群を局所的に別々に注射した。注射に先立って各試験物を蛍光追跡マーカー（ＦＴＭ）と混合することで、腫瘍内の各注射の位置を特定できるようにした。移植した腫瘍が９ｍｍ（長さ）、８ｍｍ（幅）及び３ｍｍ（深さ）のおよその寸法に達した時点で、マウスをマイクロインジェクション実験に用いた。マイクロインジェクションデバイスは、４本の注射針を備え、各腫瘍注射ごとに針１本当たり１．２μＬの総容量を送達する構成のものとした。空間的な位置確認のため、蛍光追跡マーカー（ＦＴＭ）を注射内容に加えた。部位ごとに注射した薬剤の総量は以下のとおりであった。すなわち、ａ：１μｇ（６０ｐｍｏｌ）の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ｂ：５０μＭのクロロキン二リン酸塩、ｃ：１ｕｇの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋５０μＭのクロロキン、またはｄ：製造者の指示に従ってｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ／ＶＷＲ）に配合した０．６μｇ（４８ｐｍｏｌ）の５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（１２．５μＬの５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡストック、４μＬのｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ試薬、２５μＬの１０％グルコース、２．５μＬのＦＴＭ、及び６μＬの水を含み、最終グルコース濃度５％、Ｎ／Ｐ比＝８とした）（ただし、５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡは、センス鎖に５’ｐｐｐを有する、配列番号１４２４と配列番号１４２５との二本鎖ＲＮＡである）。マイクロインジェクションの４時間後及び２４時間後に腫瘍を切除して分析を行った。切除した腫瘍を、Ｋｌｉｎｇｈｏｆｆｅｒ  ｒｅｆに記載されているように固定、処理、染色、及びスキャンした。ウサギ抗ＣＣ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃９６６１、希釈倍率１：１５０）を免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに使用した。免疫蛍光検出を行うため、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（＃１１１−６０５−１４４  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、希釈倍率１：６００）に結合した二次抗体を製造元の指示に従って適用し、組織をＤＡＰＩで対比染色した。Ｈ＆Ｅ染色を一般的な組織学的評価のために行った。
【０４４９】
実験の結果を図１６〜図１８及び図８６に示す。Ｐａｎｏｒａｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒを使用して画像を撮影し、輝度及びコントラストをＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用して調整した。画像パネル（高倍率の図で必要とされる）をＡｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒを使用して作成し、必要に応じて上記のように調整した。試験物治療群からのＦＴＭと局在化した切断カスパーゼ３（ＣＣ３）染色の共局在は、試験物の注射によって引き起こされたアポトーシスを示し、これは、ＣＴ２６がん細胞の細胞質中に存在するＲＩＧ−Ｉヘリカーゼにオリゴヌクレオチドが送達されることによるＲＩＧ−Ｉ経路の活性化を示し得る。図１６は、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキン、クロロキン（ＣＱ）、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩをマイクロインジェクションし、処理の４時間後に採取して染色したＣＴ２６腫瘍試料を示す。上の画像は腫瘍試料全体を示し、下の各画像は標識された特定の治療領域を拡大したものである。破線の矢印は、注射の位置のいくつか（ＦＴＭでトレースしたもの）を示し、白い点状斑はＣＣ３染色を示す。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンを注射した部位では大きな領域がＣＣ３染色を示したのに対して、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体単独、クロロキン単独、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩを注射した部位は、顕著なＣＣ３染色の領域を有さなかった。下の各画像は、染色画面をさらに拡大して示している。図１６では、ＣＣ３アポトーシスマーカーは、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンの試験物と共局在化しており、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンによって４時間でアポトーシスが誘導されたことを示している。ＣＣ３とこの試料中の他の試験物との顕著な共染色の明確な証拠は認められない。図１７は、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキン、クロロキン、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩをマイクロインジェクションし、処理の２４時間後に採取して染色した、異なる動物由来のＣＴ２６腫瘍試料を示す。上の画像は腫瘍試料全体を示し、下の各画像は標識された特定の治療領域を拡大したものである。破線の矢印は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はＣＣ３染色の一部を示す。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した部位、及び図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンを注射した部位では大きな領域がＣＣ３染色を示し、これらを下の画像に拡大して示した。一方、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩを注射した部位は、顕著なＣＣ３染色の領域を有さなかった。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体及び図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンは、いずれも強いＣＣ３との共局在化染色を示し、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体及び図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンの両方による２４時間でのアポトーシスの誘導を示している。５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩの注射では明らかなＣＣ３との共染色は認められない（この腫瘍試料にはクロロキン部位は存在していない）。図１８は、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキン、クロロキン、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩをマイクロインジェクションし、処理の２４時間後に採取して染色した、異なる動物由来のＣＴ２６腫瘍試料を示す。矢印または丸で囲った領域は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はＣＣ３染色の一部を示す。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した部位、及び５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩを注射した部位では大きな領域がＣＣ３染色を示した。ＣＱ及び図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキンの注射部位は、この試料における腫瘍壊死の大まかな領域との融合のために解釈不能である。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体及び５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩは、いずれも強いＣＣ３との共局在化染色を示し、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体及び５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩの両方による２４時間でのアポトーシスの誘導を示している。Ｔシグナルは、試験した動物によって異なった。１匹の動物が、クロロキン単独を注射した部位で２４時間でＣＣ３染色を示した。このデータは、腫瘍への注入時に（ＰＥＩまたはトランスフェクション試薬なしで）局所的なアポトーシスを誘発する図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体の能力を示している。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体と同時注入されるクロロキンを加えることで、アポトーシス応答を加速すると考えられる。Ｒｉｇ−Ｉ経路を介してアポトーシス応答を誘導するには、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体は、腫瘍の細胞のサイトゾル中に存在するＲｉｇ−Ｉヘリカーゼに送達される必要がある。これは、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体が、５’ｐｐｐヘアピンＲＮＡをサイトゾルに送達できる可能性を示している。５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩもまた、図１８に示されるように腫瘍にアポトーシス応答を示し、その場合、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡの細胞質送達が行われることでトランスフェクション試薬ＰＥＩにｄｓＲＮＡの細胞質送達を引き起こさせると考えられる。
【０４５０】
別の実験において、ＢａｌｂＣマウスに同様にＡ２０リンパ腫細胞を接種して腫瘍を形成し、移植された腫瘍が１４ｍｍ（長さ）、１０ｍｍ（幅）、及び７ｍｍ（深さ）のおよその寸法に達した時点で用いた。マウスに、６箇所（ここでは、注射部位当たり１．２μＬ）に同時に注射できるデバイスを用いたマイクロインジェクションによって複数の試験物を投与し、４及び２４時間で安楽死させ、腫瘍を同様にさまざまなマーカーで染色した。部位ごとに注射する薬剤の総量は、１または２μｇ（６０または１２０ｐｍｏｌ）の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、０．７４μｇ（６０ｐｍｏｌ）の５’ｐｐｐ−ｈｐＲＮＡ（配列番号１３７１）、製造業者の説明書に従ってｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ中に配合した０．６μｇ（４８ｐｍｏｌ）の５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ、１ｕｇ（３５４２ｐｍｏｌ）のＤＭＸＡＡ（図２６Ｄ）、またはＰＢＳとした。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ配合物中の５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡは、５μＬの５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡストック、４μＬのｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ試薬、２５μＬの１０％グルコース、２．５μＬのＦＴＭ、及び１３．５μＬの水を含み、最終グルコース濃度５％、Ｎ／Ｐ比＝８）とした。５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡは、配列番号１４２５と複合体化された配列番号１４２４のセンス鎖に５’ｐｐｐを有する二本鎖ＲＮＡである。
【０４５１】
図８１は、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションしたＡ２０リンパ腫試料を示す。白い点状斑は、ＣＣ３染色を示す。画像を投与２４時間後に撮影した。図８１Ａは、１μｇ及び２μｇの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションしたＡ２０リンパ腫試料の縮小画像を示し、各注射領域をテキストで示している。図８１Ｂは、ＰＢＳ領域、５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡ領域、２μｇ用量の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した領域、及び１μｇ用量の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した領域の拡大画像を示す。ＣＣ３染色は白い点状斑で示される。１μｇ及び２μｇ用量の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体は、強いＣＣ３との共局在化染色を示し、この試験物の注射によるアポトーシスの誘導を示した。この試料の他の注射部位は、同様に強いアポトーシスの誘導は示していない。
【０４５２】
薬物反応の定量分析は、これまでに記載されているようにして行った（Ｋｌｉｎｇｈｏｆｆｅｒ，Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１５）；Ｄｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１６））。注射部位はＦＴＭの補助により自動的に特定され、次に注射部位を中心とする円形の対象領域内で細胞が自動的に特定され、それらの染色パターンに基づいて異なるクラスに割り当てられる。各クラスに属する細胞（例えば、ＣＣ３陽性）の割合は、径方向距離の関数としてマッピングされる。２つの薬剤によって誘導される応答を比較するため、各剤単独及びビヒクルコントロールの径方向の効果曲線を線形の混合効果モデルと組み合わせて使用して、一方の薬剤からの応答が他方の薬剤よりも顕著に大きいかどうかを推定する。
【０４５３】
図８２は、４時間及び２４時間の時点で、各試験物について合計７〜８個の腫瘍で、注射部位からの距離が増加するにつれて細胞のどれだけの割合がＣＣ３染色について陽性であるかを示す放射状プロット分析である（０．３の割合は、細胞の３０％が陽性であることを示す）。２４時間の時点では、１μｇ及び２μｇの両方の用量の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体で、試験物の注入部位に近いほどＣＣ３陽性細胞の割合が増加しているのに対し、ＰＢＳまたは５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡでは注射部位の近くでＣＣ３陽性細胞の増加がほとんどみられないことを示している。トランスフェクション試薬ＰＥＩを５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡと組み合わせて加えた場合にも、ＣＣ３陽性細胞にある程度の増加がみられる。試験物の注射部位の近くにおけるＣＣ３陽性細胞の割合の増加は、６０ｐｍｏｌ（１μｇ）の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した場合に、等モル量の５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮを注射した部位の近くよりも有意に高くなっている（グラフの＊で示されるＰ＜０．０５）。図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体は同じ５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡ配列を含むが、本開示のペプチドも付加されているため、これは、本開示のペプチドとＲｉｇ−Ｉ  Ｉ／Ｏ剤である５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡとの組み合わせが、細胞にアポトーシスを引き起こす複合体の能力を高めることを示しており、これは、Ｒｉｇ−Ｉヘリカーゼへの５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡのサイトゾル送達によるものと考えられる。
【０４５４】
さらに、両方の実験からの腫瘍試料をＩＦＮｂ応答の誘導についても染色した。インターフェロンβ（ＩＦＮｂ）応答は、ＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光試薬キットｖ２（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を製造元の指示に従って使用したインサイチューハイブリダイゼーションを用いて検出した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ  ＩＳＨアッセイは、マウスＩＦＮｂ１プローブを用い、ＴＳＡ  Ｐｌｕｓ  Ｃｙａｎｉｎｅ  ５検出により完了する。スライドをＤＡＰＩで対比染色し、画像化した。
【０４５５】
図８６は、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体＋クロロキン、クロロキン（ＣＱ）、または５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩをマイクロインジェクションし、処理の４時間後に採取して染色したＣＴ２６腫瘍試料を示す。上の画像は腫瘍試料全体を示し、下の各画像は標識された特定の治療領域を拡大したものである。破線の矢印は、注射の位置のいくつか（ＦＴＭでトレースしたもの）を示し、白い点状斑はＩＦＮｂ  ｍＲＮＡ染色を示す。クロロキン注射部位はこの試料では存在していない。上の画像及び下の画像に拡大して示されるように、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した領域及び５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ＰＥＩを注射した領域では、ＩＦＮｂ  ｍＲＮＡの顕著な染色が認められる。これは、トランスフェクション試薬を使用することなくＩＦＮｂ応答を生成することができる図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体の能力を示しており、これは、サイトゾルへのＩ／Ｏ  ＲＮＡの送達とＲｉｇ−Ｉ経路の関与を示すと考えられる。
【０４５６】
図８４及び図８５は、図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションした上記の実験からのＡ２０リンパ腫試料を示す。白い点状斑は、ＩＦＮｂ  ｍＲＮＡの染色を示す。画像を投与４時間後に撮影した。図８４は、１μｇ及び２μｇの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体、ＰＢＳ、ＤＭＸＡＡ、５’ｐｐｐ  ｄｓＲＮＡ＋ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ  ＰＥＩ、及び５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡをマイクロインジェクションしたＡ２０リンパ腫試料の縮小画像を示し、各注射領域をテキストで示している。図８５は、ＰＢＳ領域、５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡ領域、２μｇ用量の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した領域、及び１μｇ用量の図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した領域の拡大画像を示す。ＩＦＮｂ  ｍＲＮＡの染色は白い点状斑で示される。１ｕｇまたは２ｕｇの図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体を注射した領域は、顕著なＩＦＮｂ  ｍＲＮＡ染色を示している。５’ｐｐｐ  ｈｐＲＮＡを注射した領域もＩＦＮｂ  ｍＲＮＡ染色も示しているが、ＰＢＳを注射した領域では染色はみられない。これは、トランスフェクション試薬を使用することなくＩＦＮｂ応答を生成する図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体の能力を示しており、これは、サイトゾルへのＩ／Ｏ  ＲＮＡの送達とＲｉｇ−Ｉ経路の関与を示すと考えられる。
【０４５７】
以上をまとめると、これらの実験の結果は、トランスフェクション試薬を使用せずにＡ２０及びＣＴ２６腫瘍にインビボで送達される場合にＩＦＮｂ  ｍＲＮＡを誘導し、アポトーシスを誘導する図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体の能力を示すものである。これは、ＲＮＡ  Ｉ／Ｏを細胞のサイトゾルに送達し、Ｒｉｇ−Ｉ経路を誘導する図３７のペプチドＩ／Ｏ複合体の能力を示していると考えられる。
【０４５８】
実施例８８
ペプチドＩ／Ｏ複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体を用いた頭頸部癌の治療について説明する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成し、Ｉ／Ｏに結合した後、直接使用する。ペプチドＩ／Ｏ複合体を頭頸部癌の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の１つ以上のペプチドＩ／Ｏ複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドＩ／Ｏ複合体は、頭頸部癌に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
【０４５９】
ペプチドは、配列番号１〜配列番号１１３４、配列番号１２４３〜配列番号１２６２、または配列番号１２６３〜配列番号１３１６から選択される配列を有する任意のペプチドである。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる（例えば、実施例８及び９）。
【０４６０】
実施例８９
ペプチドＩＬ−１５剤複合体の酵素によるプロセシング
本実施例では、本開示のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の酵素によるプロセシングについて記載する。腫瘍細胞または腫瘍微小環境に曝されたペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、腫瘍環境中、またはエンドソームへのエンドサイトーシスなどによって複合体が送達される細胞内区画内に高濃度で存在する酵素によってプロセシングされる。本実施例では、酵素カテプシンＢに曝露された後のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体中のＩＬ−１５剤の効力の変化について記載する。カテプシンＢは、ｐＨ５でエキソペプチダーゼ活性を、ｐＨ７でエンドペプチダーゼ活性を示す。配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３１９、配列番号１３２０及び配列番号１３２１、ならびにＨｉｓタグ付きＲＬＩ（配列番号１３４２）を、それらのＩＬ−１５サイトカイン活性について、ｐＨ７及びｐＨ５でカテプシンＢへの曝露を行うかまたは行わずに試験した。ｐＨ条件は、エンドペプチダーゼ活性を決定する初期エンドソームの中性ｐＨ、及び後期エンドソーム及びリソソームのより酸性のｐＨ５依存性エキソペプチダーゼ活性を再現するように選択した。
【０４６１】
カテプシンＢ切断をｐＨ７及びｐＨ５で行った。ｐＨ７の条件の反応バッファーはＰＢＳ＋８ｍＭシステインとし、ｐＨ５の条件の反応バッファーは５０ｍＭ酢酸ナトリウム＋８ｍＭシステインとした。融合タンパク質を微量遠心管中、反応バッファーで２μＭに希釈した。カテプシンＢ（０．４４μｇ）を各反応液に加え、３７℃、５％ＣＯ２に設定した組織培養インキュベーターに２時間入れた。コントロール条件は、カテプシンＢ酵素を含まない点以外は同じとした。反応時間の後、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（反応容量の１％）をｐＨ５条件に加えて酸性バッファーを中和した。反応バッファーを使用して各反応の段階希釈を行い（ｐＨ５条件の希釈液に１％ＨＥＰＥＳを添加）、９６ウェルプレートの各ウェルに３連で添加した（ウェル当たり１０μＬ）。
【０４６２】
すべてのアッセイは、透明底の黒色壁組織培養プレートで９６ウェルプレートフォーマットで行った。ＣＴＬＬ２細胞（マウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株）を、ＩＬ−２を添加した培地中で細胞培養として維持した。Ｍｏ７ｅ（ヒト急性巨核芽球性白血病細胞株）を、ＩＬ−３を添加した培地中で維持した。生存率及び細胞濃度は、Ｖｉａｃｅｌｌセルカウンターを使用して分析した。カウント後、必要な数の細胞を浮遊培養から取り出し、補充サイトカインを含まない培地に再懸濁した。ｐＨ５条件の培地はＨＥＰＥＳを含むものとした。ＣＴＬＬ２細胞とＭｏ７ｅ細胞を３７℃の組織培養インキュベーター中で４時間、サイトカイン飢餓状態にした後、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を含むウェルに最終容量１００μＬとなるように加えた（９０μＬ中、５，０００個のＣＴＬＬ２または２０，０００個のＭｏ７ｅ細胞）。各プレートをインキュベーターに２日間（ＣＴＬＬ２）または３日間（Ｍｏ７ｅ）戻した。細胞を含まない増殖培地を含むさらなるウェルを、アッセイのブランクとして含めた。インキュベーション期間の終了後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ生細胞アッセイ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに加えた（１００μＬウェル当たり１０μＬ）。次いで各プレートをインキュベーターに４〜２４時間戻した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ２１０４）プレートリーダーを使用して蛍光を定量した。
【０４６３】
サイトカイン活性は、ｐＨ７またはｐＨ５でのカテプシンＢへの曝露後に、試験した融合タンパク質の一部で増加した。図３１は、Ｍｏ７ｅ細胞中のＨｉｓタグ付きＲＬＩ（配列番号１３４２）及び配列番号１３１８のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体について、示された異なる濃度（ｎＭ）のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体またはＲＬＩでｐＨ５におけるカテプシンＢ処理をした場合（＋）としない場合（−）のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。図３１は、Ｍｏ７ｅ細胞でｐＨ５でのカテプシンＢによる切断を行った場合と行わなかった場合の配列番号１３１８の増殖曲線を示す。カテプシンＢによる切断を行わない場合、配列番号１３１８の効力はＨｉｓタグ付きＲＬＩ（配列番号１３４２）よりも顕著に低くなっている。カテプシンＢによる切断後、効力はＲＬＩと同様のレベルに増加し、このペプチド−ＩＬ−１５複合体でＲＬＩ様活性が回復している。図３２は、ＣＴＬＬ２増殖アッセイにおけるカテプシンＢ切断を示す。
【０４６４】
図３２Ａは、ＣＴＬＬ２細胞中の配列番号１３１９の、ｐＨ７でのカテプシンＢ処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。図３２Ｂは、ＣＴＬＬ２細胞中の配列番号１３２１の、ｐＨ７でのカテプシンＢ処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。図３２は、配列番号１３１９では、ＣＴＬＬ２細胞中、ｐＨ７でのカテプシンＢ切断後にサイトカイン活性が増大することを示している。図３２は、ＣＴＬＬ２細胞中の配列番号１３１７の、ｐＨ５でのカテプシンＢ処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群ｎ＝３の平均を示す。図３３は、配列番号１３１７では、ＣＴＬＬ２細胞中、ｐＨ５でのカテプシンＢ切断（エキソペプチダーゼ条件）後にサイトカン活性が増大することを示している。配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の結果を有するペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を構成することができる。
【０４６５】
実施例９０
ペプチドＩ／Ｏ複合体に対する腫瘍細胞応答のインビトロ特性評価
本実施例では、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体に対する腫瘍細胞応答のインビトロ特性評価について記載する。例えば、ヒトがん細胞株、または実施例３６、３７、４５に記載される同系腫瘍モデルにおいて使用したマウスがん細胞株のいずれかのようながん細胞を、実施例３６、３７、３８に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体に曝露する。細胞はペプチドＩ／Ｏ複合体に対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、３０分、１時間、４時間、一晩、２４時間、または４８時間にわたってインキュベートする。各種の応答を測定する。培養皿の所定の領域から細胞をこすり取り、除去された領域の幅の経時的な変化を測定することによって細胞が遊走する能力を測定する。サイトカインや成長因子などの分泌タンパク質は、ＥＬＩＳＡなどの標準的な方法で測定される。発現パターンの変化は、タンパク質レベル（プロテオミクス分析）またはマイクロアレイまたはＲＮＡシーケンシングによりＲＮＡレベルで測定される。
【０４６６】
実施例９１
間質及び内皮との腫瘍細胞の相互作用のインビトロ特性評価
本実施例では、間質及び内皮との腫瘍細胞の相互作用のインビトロ特性評価について記載する。詳細には、本実施例は、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体で処理されたがん細胞と間質細胞及び／または血管内皮細胞とを共培養し、腫瘍細胞は炎症を誘発するかもしくは他の形で腫瘍促進環境を増強する、間質に侵入する、及び／または血管内皮を通じて血管外に遊出する細胞の能力について特性評価を行うことについて記載する。例えば、ヒトがん細胞株、または実施例３６、３７、４５に記載される同系腫瘍モデルにおいて使用したマウスがん細胞株のいずれかのようながん細胞を、実施例３６、３７、３８に記載されるペプチドＩ／Ｏ複合体に曝露する。細胞をペプチドＩ／Ｏ複合体に対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、３０分、１時間、４時間、一晩、２４時間、または４８時間にわたってインキュベートする。培地を除去し、細胞を洗浄して残存するペプチドＩ／Ｏ複合体をすべて除去する。コントロールの細胞培養はペプチドＩ／Ｏ複合体を含まない培地中に維持し、それ以外は同様に処理する。一部の実験では、ペプチドＩ／Ｏ複合体を共培養物に直接添加する。一部の実験では、がん細胞をＣＦＳＥまたは他の蛍光マーカーで標識することができる。線維芽細胞などの間質細胞は、直接播種するか、マトリゲルなどのゲルに懸濁する。血管内皮細胞は、直接播種するか、２つの培養物が多孔質膜で分離されているトランスウェルプレートなどのプレートで増殖する。がん細胞は、間質細胞または血管内皮細胞と共に直接培養するか、トランスウェル型プレートで同じチャンバ内または間質細胞または血管内皮細胞の反対側のチャンバ内で培養する。例えば、３０分、１時間、４時間、一晩、２４時間、４８時間、または最大１週間など、応答を生じるのに充分な時間にわたるインキュベーションの後、培養物を分析する。分泌された成長因子及びサイトカインをＥＬＩＳＡなどの標準的な方法で測定する。がん細胞の数及び位置を、マトリゲルに浸潤した、または血管内皮細胞層に、または細胞層を通過して遊走した蛍光標識細胞をカウントすることによって決定する。コントロール細胞培養と比較して、ペプチドＩ／Ｏ複合体で処理されたがん細胞との培養における、間質またはマトリックスへの浸潤の減少、血管内皮へのもしくは血管内皮を通過する遊走の減少、及び／または腫瘍細胞の増殖を促進し、及び／またはアポトーシスを阻害する成長因子及びサイトカインの減少は、ペプチドＩ／Ｏ複合体に曝露されることでがん細胞の浸潤または転移特性が低下したことを示す。
【０４６７】
実施例９２
インビトロでのＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＴＬＲ３、またはＳＴＩＮＧ経路の活性化
本実施例では、インビトロでのＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＴＬＲ３、またはＳＴＩＮＧ経路の活性化について記載する。本開示のペプチドを、ＲＩＧ−１、ＭＤＡ５、ＴＬＲ３、またはＳＴＩＮＧ経路を活性化することができる薬剤と複合体を形成させる。複合体化は、実施例１６または１７の方法を使用するなどして、ペプチドを薬剤に結合させることによって行うことができる。図１３、３４、３７の薬剤などのペプチドＩ／Ｏ複合体も必要に応じて用いる。本開示のペプチドを、実施例８２に記載されるように、ＩＲＦ３シグナル伝達を介してＳＥＡＰレポーターもトリガーする細胞内の関連する複数の標的を刺激するリガンドに結合する。詳細には、本開示のペプチドを、５’二リン酸を有し、少なくとも１０塩基対で平滑な５’末端を有するＲＩＧ−Ｉリガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）または５０ｂｐよりも長いポリ（Ｉ：Ｃ）などの、ＭＤＡ５をトリガーする１２塩基対より長いｄｓＲＮＡ（５’リン酸なし）、ＴＬＲ３をトリガーするｄｓＲＮＡ、ＳＴＩＮＧの環状ジヌクレオチドリガンド、またはＴＬＲ９のＣＰＧと結合する。
ペプチドＩ／Ｏ複合体を、実施例８２に記載されるようなＩＲＦ３を介してＳＥＡＰレポートをトリガーすることが示されている細胞に適用する。
【０４６８】
実施例９３
免疫細胞集団に対するペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の作用
本実施例では、免疫細胞集団に対するペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の作用について記載する。Ｉ／ＯとしてＩＬ−１５剤を含むペプチドＩ／Ｏ剤複合体は、ペプチドＩ／Ｏ剤複合体にＩＬ−１５Ｒα鎖の一部を含むなどの因子に応じてさまざまな形で免疫細胞を活性化することができる。ＩＬ−１５Ｒ、特にＩＬ−１５Ｒα鎖の発現及び組成の差異が、免疫細胞間で生じる。ナイーブＴ細胞がほとんどまたはまったくＩＬ−１５Ｒαを発現しないのに対してメモリー及びエフェクターＴ細胞は高レベルで発現する。ＩＬ−１５はＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を促進するが、ＮＫ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞、特にＣＤ８エフェクターメモリー細胞の増殖よりは大幅に低くなる（Ｃｏｎｌｏｎ  ２０１５，Ｒｏｍｅｅ  ２０１８）。ＩＬ−２Ｒβγ  鎖とＩＬ−１５Ｒαとの発現は、ＩＬ−１５に対する極めて高い感受性を細胞に与える（Ｄｕｂｏｉｓ  ２００２）。ＩＬ−１５Ｒａの差次的発現のため、裸のＩＬ−１５は、ナイーブ細胞（ＩＬ−１５Ｒα−）よりも成熟Ｔ細胞（ＩＬ−１５Ｒα＋）をより効果的に刺激するが、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ＋など）を含む融合ＩＬ−１５剤は、両方を等しく刺激すると予想される。これは、抗腫瘍免疫を増強できる超アゴニストの有用な特性である。Ｔｒｅｇの増殖がないことも、有用な基準である。
【０４６９】
実施例１８に記載されるようなＩＬ−１５及びペプチド−ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒａ（ＩＬ−１５融合体）複合体のヒト白血球サブセットに対する効力を、正常なヒトＰＢＭＣでインビトロで試験する。細胞を、Ｋｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２０１２  Ｊｕｎｅ；１１（６）：１２７９−１２８８）に記載されるようなＣＦＳＥを用い、異なる濃度のＩＬ−１５またはペプチド−ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒａ複合体と培養する。５日後、細胞を採取し、ＣＦＳＥ含有量とＴ細胞及びＮＫ細胞表面マーカーの発現についてフローサイトメトリーで分析する。マーカーとしては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１６、Ｋｉ６７、ＣＤ４５（ＲＡ及びＲＯ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１２７、ＣＣＲ７、ＣＣ２７、ＣＤ９５、ＮＫｐ３０、ＴＩＭ−３、及びＣＤ１０７ａが含まれ得る。ペプチド−ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒａ（ＩＬ−１５融合）複合体は、これらの細胞の特定のサブセット、特にＣＤ４、ＣＤ８、γδＴ、Ｔｒｅｇ、及びＮＫ細胞を、裸のＩＬ−１５よりも低い濃度で刺激する。ＣＤ４  Ｔ細胞は、公開されている臨床試験結果（Ｃｏｎｌｏｎ  ２０１５，Ｒｏｍｅｅ  ２０１８）に基づけば、ＣＤ８またはＮＫ細胞よりも増殖が少ないと予想される。
【０４７０】
実施例９４
ペプチドＩ／Ｏ複合体が細胞に入る輸送及び区画の決定
本実施例では、本明細書に開示されるペプチドＩ／Ｏ複合体が細胞に入る輸送及び区画の決定について記載する。ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体であるペプチドＩ／Ｏ複合体が細胞質に入る区画を、エンドソームの成熟及び酸性化の薬理学的阻害剤を用いて調べる。エンドソームの成熟と酸性化の薬理学的阻害剤には、エンドソームの酸性化の阻害剤であるバフィロマイシン（この薬剤によるＳＥＡＰレポーターの遮断は、エンドソームの酸性化が重要であることを示す）、ＥＥの後期エンドソームへの成熟を妨げるワートマンニン、ＥＥのゴルジ体及び小胞体への輸送の阻害剤であるブレフェルディンＡ、または、初期エンドソームから後期エンドソームへの輸送を阻害するが、細胞膜から初期エンドソームへの輸送は阻害しない微小管重合の阻害剤であるノコダゾールが挙げられる（Ｇａｏ  ２０１６）。
【０４７１】
上記の薬剤の存在下でＩＲＦ３を活性化するペプチド−ＲＩＧ−ＩリガンドＩ／Ｏ複合体の能力を、実施例３６の方法により試験する。これらの阻害剤の存在下でのＳＥＡＰレポーター活性化のパターンによって、細胞質への透過が生じる正確な区画の知見が得られる。
【０４７２】
実施例９５
細胞透過性を高めるためのペプチド変異体
本実施例では、細胞透過性を高めるためのペプチド変異体について記載する。より高いレベルの細胞透過性、エンドソーム放出、または細胞質送達を示す本開示のペプチドの変異体を作製する。Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）は、サイトゾル透過活性を有するｍＡｂ（ＴＭａｂ４）を同定している。ＴＭａｂ４にみられるｐＨ依存性の移動が生じるには、エンドソーム膜との疎水性相互作用が可能となるような酸性のＧｌｕ（Ｅ）またはＡｓｐ（Ｄ）残基のプロトン化が必要である。配列番号５６９などのペプチドは、αヘリックス中に存在すると考えられる３つの酸性Ｄ残基を有し、細胞質透過のｐＨ依存性にはこれらの残基が関与していると考えられる。これらのＤ残基のＥ残基への置換、またはさらなるＥ残基の付加が細胞質送達に与える影響について試験する。試験は、そのようなペプチドをＲＩＧ−Ｉリガンドと複合体化し、実施例３６に記載されるＳＥＡＰアッセイを行うことによって行う。配列番号５６８は、３個のＡｒｇ（Ｒ）及び３個のＬｙｓ（Ｋ）残基を有している。このような塩基性残基は、細胞透過特性を有するカチオン性両親媒性のαヘリックス（ＴＡＴ、Ｒ８（配列番号１３８５）、メリチン）に共通してみられる。これらの残基はｐＨに反応し、酸性のエンドソーム区画内で正電荷を失う。配列番号５６８の細胞質送達におけるこれらの残基の役割は、Ｋ及びＲ残基を置換、除去するかまたはさらなるＲまたはＫ残基を付加し、ＲＩＧ−Ｉと複合体化し、さらに実施例３６の方法によりＩＲＦ３活性化について試験することによって評価される。配列番号５６９の二次構造を調べることでβシート及びαヘリックス要素が明らかとなる。これらの構造は、細胞透過またはリガンド結合などの機能ドメインを決定する。上記に述べたものなどのこれらのドメインの主要な残基の変更が、エンドソーム内のアネキシンＡ２からのペプチドの解離（輸送）に対して、また、細胞質透過（ＳＥＡＰレポーターの活性化）に対して及ぼす影響を試験することができる。これらの方法により、ペプチドＩ／Ｏ複合体で使用するためのさらに高いレベルの送達性を有するペプチドが同定される。
【０４７３】
配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の細胞透過性の結果を有するペプチドＩ／Ｏ複合体を構成することができる。
【０４７４】
実施例９６
ペプチド−ＩＬ−１５複合体の輸送
本開示のペプチドをＩＬ−１５  Ｉ／Ｏに結合することにより、ＩＬ−１５  Ｉ／Ｏの細胞内の輸送が変化する。ペプチドはＩＬ−１５  Ｉ／Ｏのエンドソームへの取り込みを増加させ、またそれを細胞表面にリサイクルして分泌させることができるのに対して、ペプチドのないＩＬ−１５  Ｉ／Ｏは、低レベルで細胞に取り込まれ、リソソームで分解されるために輸送されると考えられる。
【０４７５】
ＣＴ２６またはＵ８７細胞を、実施例１８のものなどのペプチド−ＩＬ−１５剤複合体に曝露した後、免疫細胞化学によって画像化する。ポリリシンでコーティングされた顕微鏡スライドを使用してチャンバを構築する。１ウェル当たり２０，０００個のＣＴ２６細胞を播種し、一晩付着させる。培地を吸引し、細胞を１０ｕＭの配列番号１３１７〜配列番号１３２１、ＲＬＩ、または薬剤なしで１、２、３、４、８、または２４時間インキュベートする。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンで１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄する。次いで、ウェルを０．１％ＴＢＳＴで洗浄し、０．１％ＴＢＳＴ＋１０％ヤギ血清で４５分間インキュベートした後、溶液を除去する。一次抗体ミックスを室温で６０分間ウェルに加え、その後除去し、ウェルを０．１％ＴＢＳＴで洗浄する。次いで、溶液を除去し、０．０１％ＴＢＳＴ、１％ヤギ血清、ＤＡＰＩ染色、及びファロイジン染色を含む蛍光二次抗体溶液と、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ二次抗体の適当な希釈液を室温で４５分間加える。ウェルを０．０１％ＴＢＳＴで洗浄し、自然乾燥させてから、カバーグラスをかけ、暗所で乾燥させる。その後、ウェルを、例えば２０×の全スライドスキャナー、６０×の油浸顕微鏡、共焦点顕微鏡（ｚスタックの設定をスライス間で０．４５ミクロンとする）、またはｚスタックの設定を０．２ミクロンとしたＤｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ顕微鏡により画像化し、適宜アルゴリズムを用いてデコンボリューションする。
【０４７６】
染色は、Ｒａｂ５（初期エンドソーム）、Ｒａｂ７（後期エンドソーム）、Ｒａｂ１１（リサイクルエンドソーム）、及びｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ５５５（リソソーム）、ならびにＨｉｓタグを含むペプチド−ＩＬ−１５−Ｉ／Ｏ複合体を同定するための抗Ｈｉｓについて行う。ペプチド−ＩＬ−１５複合体は、取り込みのレベルが低く、またリソソームへ輸送される可能性のある、Ｈｉｓタグ付きＲＬＩタンパク質（配列番号１３４２）としてのＲＬＩタンパク質（配列番号１１６９、配列番号１１７６、及び配列番号１１７７を含む）と比較してより高い細胞取り込み、Ｒａｂ５及び／またはＲａｂ１１エンドソームでより高いレベルの取り込みを示すことが示された。Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体などの他のペプチドＩ／Ｏ複合体も同様の取り込みを示し得る。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０４７７】
同じ実験をＵ８７神経膠腫細胞で行ったところ、ＩＬ−１５剤類似体と比較してより高い細胞取り込み、Ｒａｂ５またはＲａｂ１１エンドソームでより高いレベルの取り込みを伴うペプチド−ＩＬ−１５複合体の同様の輸送が観察された。
【０４７８】
フローサイトメトリーを用いて、ペプチド−ＩＬ−１５Ｉ／Ｏ複合体としての送達による、細胞表面でのＩＬ−１５Ｉ／Ｏの提示も実証する。Ｕ８７、ＣＴ２６、またはＢ１６Ｆ１０などのがん細胞を、０．０５、０．５、１、２、４、または２４時間にわたってペプチド−ＩＬ−１５Ｉ／Ｏ複合体に曝露する。この後、細胞をＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαに対する抗体で標識し、フローサイトメトリーで分析する。分析は、ＩＬ−１５ががん細胞の表面に提示されることを示している。
【０４７９】
配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の輸送の結果を有するペプチド−ＩＬ−１５複合体を構成することができる。
【０４８０】
実施例９７
腫瘍内のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の蓄積
本実施例では、腫瘍内のペプチド−ＩＬ−１５剤複合体の蓄積について記載する。実施例１８におけるこのようなペプチドＩＬ−１５剤複合体を発現させ、精製した。マウスに２０万個のＣＴ２６細胞を投与し、５日間増殖させ、その時点で腫瘍は触知可能であった。マウスに、１００μｌ中、１〜１２ｕｇの配列番号１３１７、配列番号１３２１、ＲＬＩ、または薬剤を含まないものを週４日、腹腔内投与した。各処置はよく忍容された。７回の投与後、動物を屠殺し、腫瘍組織を採取して固定した。
【０４８１】
切片を、Ｈｉｓタグ、ＩＬ−１５、またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ＋に対する抗体を用いた免疫組織化学によって染色する。ＲＬＩで処理されたマウスに対して、配列番号１３１７、配列番号１３２１で処理したマウスの腫瘍でより高いシグナルがみられ、本開示のペプチドの結合が腫瘍内のＩ／Ｏ複合体の蓄積を増加させたことを裏付ける。
【０４８２】
配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の腫瘍蓄積を有するペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を構成することができる。
【０４８３】
Ｌ０−Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２（ただし、任意の組み合わせで、Ｌ１は、配列番号１１６９または配列番号１１６３であってよく、Ｘは、配列番号１１７６または配列番号１１７９であってよく、Ｙは、配列番号１１７７、配列番号１１７８であってよい）のようなＩＬ−１５剤を含むペプチド−ＩＬ−１５剤複合体などの他のペプチドＩ／Ｏ複合体も同様に取り込みを示し得る。さらに、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体は、表４の複合体のいずれを含んでもよい。
【０４８４】
実施例９８
特にＲｉｇ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＳＴＩＮＧの場合でのペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞透過性の増大
本実施例では、特にＲｉｇ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＳＴＩＮＧの場合でのペプチドＩ／Ｏ複合体の細胞透過性の増大について記載する。本開示のＩ／Ｏの細胞透過性のレベルを、本開示のペプチドＩ／Ｏ複合体にさらなる細胞透過性部分を付加することによって増加させる。必要に応じて、表２のペプチドのような１つ以上のペプチドを、ペプチドＩ／Ｏ複合体と複合体化する。必要に応じて、表２のペプチドを表１のペプチドと融合または結合する。必要に応じて、表２のペプチドは、表１のペプチドとＩ／Ｏとの間のリンカー内に配置する。必要に応じて、脂質、脂肪酸、コレステロール、リトコール酸、ラウリン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサン酸、（ＣＨ２）ｘ（ｘ＝１〜４０）などの１つ以上の疎水性ドメインをペプチドＩ／Ｏと複合体化する。必要に応じて、疎水性ドメインは、表１のペプチドまたはＩ／Ｏと複合体化させて配置する。必要に応じて、疎水性ドメインは表１のペプチドとＩ／Ｏとの間のリンカー内に配置される。必要に応じて、表１のペプチドとＩ／Ｏの間のリンカーは三官能性であり、１つの端部は表１のペプチドに連結され、１つの端部はＩ／Ｏにリンクされ、１つの端部は表２のペプチドまたは疎水性ドメインのような、複合体の細胞透過を増加させる部分に連結される。
【０４８５】
プロセシングもしくは切断されたＩ／Ｏ複合体としての、またはペプチドＩ／Ｏ複合体自体としてのＩ／Ｏにより、細胞質、エンドソーム、または他の細胞内区画を含む細胞の任意の部分への送達が増加し、及び／または場合により、細胞取り込みまたはエンドソーム脱出が増加した。
【０４８６】
配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の細胞透過性の結果を有するペプチドＩ／Ｏ複合体を構成することができる。
【０４８７】
実施例９９
Ｒｉｇ−Ｉ経路の活性化の確認
特定のペプチドＩ／Ｏ複合体によるＲｉｇ−ＩまたはＭＤＡ５経路のターゲティングは、所望により一方または他方の経路のターゲティングを試験することできるようにＲｉｇ−ＩまたはＭＤＡ５をコードする遺伝子を欠失またはノックアウトした１つ以上のレポーター細胞株の使用により確認することができる。Ｒｉｇ−ＩまたはＭＤＡ５の必要性を直接確認するために使用することができる細胞株としては、Ａ５４９−Ｄｕａｌ細胞、ならびにＲｉｇ−ＩまたはＭＤＡ５をノックアウトした対応する細胞であるＡ５４９−Ｄｕａｌ  ＫＯ−Ｒｉｇ−Ｉ及びＡ５４９−Ｄｕａｌ  ＫＯ−ＭＤＡ５が挙げられる。ペプチドＩ／Ｏ複合体に対する応答における関連ＲＬＲへの依存は、Ａ５４９−Ｄｕａｌ  ＫＯ−ＭＡＶＳ細胞株を使用してさらに確立することができる。例えば、両方の受容体が関与する場合など、予期しない形でＲｉｇ−ＩまたはＭＤＡ５と関与するペプチドＩ／Ｏ複合体が存在し得る。あるいは、特定の下流のシグナル伝達経路に関与するが、別の経路には関与しない偏ったリガンドが存在し得る。Ｒｉｇ−Ｉは、ＩＳＲＥを用いるＩ型ＩＦＮ経路を介して、また異なる重複遺伝子群の発現を調節するＮＦκＢプロモーターを介して転写を刺激する。ＭＡＶＳもこれらの遺伝子の転写に寄与し、さらに、カスパーゼ１を活性化するインフラマソームに作用し、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８などのさらなる炎症性分子の活性化と分泌を引き起こすことができる。これらの細胞株を用いて、特定のペプチドＩ／Ｏ複合体が標的とする経路を評価することができる。
本開示のＲｉｇ−ＩリガンドがＲｉｇ−Ｉを介した応答を誘導できることを確認するため、ペプチド−Ｒｉｇ−Ｉリガンド複合体を初代ヒト細胞で試験することもできる。末梢血単球及び樹状細胞は、インフラマソーム活性化に依存するＩＬ−１ｂを産生するため、特に興味深いものである。このＲｉｇ−Ｉ経路は、Ａ５４９−Ｄｕａｌ細胞株で分析されるＩＲＦ３及びＮＦｋＢ経路とは独立しており、Ａ５４９−Ｄｕａｌ細胞株の結果をさらに裏付けるために用いることができる。異なる由来の腫瘍細胞も試験し、それらのＲｉｇ−Ｉ及びＭＤＡ５の発現をＲｉｇ−ＩペプチドＩ／Ｏ複合体に対するそれらの応答とともに試験する。
【０４８８】
本実施例ではさらに、ＲＩＧ−Ｉ経路の活性化の確認について記載する。ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体が、ＭＤＡ５などの関連する受容体ではなく、ＲＩＧ−Ｉを特異的に活性化することを確認するため、ＲＩＧ−Ｉを発現しない細胞を複合体で処理し、その応答を、ＲＩＧ−Ｉを発現する同様の細胞と比較することができる。ヒト肺癌細胞株Ａ５４９の変異体をこの実験に使用する。Ａ５４９−Ｄｕａｌ（商標）ＫＯ−ＲＩＧ−Ｉ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）が、ＲＩＧ−Ｉ遺伝子の安定したノックアウトにより親細胞株（Ａ５４９−Ｄｕａｌ（商標））から作製されていた。この細胞は、ＲＩＧ−Ｉタンパク質を発現しないが、他の経路成分はインタクトである。この細胞株は、ＲＩＧ−Ｉ経路及び関連するＮＦ−ｋＢ経路を介した刺激の直接的な測定を可能にするレポーターコンストラクトを有している。
【０４８９】
Ａ５４９−Ｄｕａｌ  ＫＯ−ＲＩＧ−Ｉ及びＡ５４９−Ｄｕａｌ細胞を、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体で処理する。培地を異なる時点で回収し、レポーターコンストラクトによって誘導される分泌ルシフェラーゼのレベルを、ＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）などの試薬を使用して測定し、ルミノメーターで読み取る。相対発光量（ＲＬＵ）は、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉ複合体に応答して分泌されるルシフェラーゼの量に比例する。Ａ５４９−Ｄｕａｌ細胞と比較して、Ａ５４９−Ｄｕａｌ  ＫＯ−ＲＩＧ−Ｉにおけるルシフェラーゼ分泌の減少または欠如は、ＲＩＧ−Ｉが活性に必要であることを示す。これは、ペプチド−ＲＩＧ−Ｉ複合体が直接ＲＩＧ−Ｉを活性化することを示すものである。
【０４９０】
配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様のＲｉｇＩ経路の活性化を示すペプチド−ＲｉｇＩリンカー複合体を構成することができる。
【０４９１】
実施例１００
腫瘍細胞によるペプチド−ＩＬ−１５剤複合体のインビトロ活性化
本実施例では、腫瘍細胞によるペプチド−ＩＬ−１５剤複合体のインビトロ活性化について記載する。
【０４９２】
馴化培地。ヒトまたはマウスのがん細胞株などのがん細胞を、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体に曝露する。がん細胞をペプチド−ＩＬ−１５剤複合体に結合し、これを内在化させ、それに対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、一晩、２４時間、または４８時間にわたってインキュベートする。指定の時間後、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を含む培地を除去し、細胞を洗浄して残存する試験物質を除去する。細胞に増殖培地を加え、細胞がプロセシングされたペプチド−ＩＬ−１５剤分子を培地中に分泌するなどの応答を生じるのに充分な時間、例えば１時間、２時間、４時間、８時間、一晩、２４時間にわたって組織培養インキュベーター中に置く。この後、馴化培地を除去し、例えば、Ｍｏ７ｅ（ヒト巨核芽球性白血病細胞株）、ＣＴＬＬ２（マウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株）、初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ８＋Ｔ細胞ＰＨＡ誘導芽球などのサイトカイン依存性細胞株を使用した増殖アッセイでサイトカイン活性について試験する。馴化培地は、サイトカイン依存性細胞株において増殖応答を誘導する。
【０４９３】
共培養。ヒトまたはマウスのがん細胞株などのがん細胞を、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体に曝露する。がん細胞をペプチド−ＩＬ−１５剤複合体に結合し、これを内在化させ、それに対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、一晩、２４時間、または４８時間にわたってインキュベートする。指定の時間後、ペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を含む培地を除去し、細胞を洗浄して残存する試験物質を除去する。半透膜を含む組織培養インサートを、付着したがん細胞が入ったウェルに加える。サイトカイン依存性細胞株、例えばＭｏ７ｅ（ヒト巨核芽球性白血病細胞株）またはＣＴＬＬ２（マウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株）を、膜の反対側に配置する。半透膜は、細胞同士を直接接触させることなく、培地及び細胞が分泌した産物の受動拡散を可能にする。サイトカインの唯一の供給源はがん細胞からの分泌であり、例えば、プロセシング及び／または分泌されたペプチドＩ／Ｏ複合体である。共培養を、サイトカイン依存性細胞が応答を生じるに充分な時間、例えば、２時間、４時間、８時間、一晩、２４時間、４８時間、または７２時間にわたって組織培養インキュベーターに戻す。この後、サイトカイン依存性細胞をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅなどの生細胞アッセイを用いて増殖についてアッセイする。サイトカイン依存性細胞は増殖を示す。
【０４９４】
配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の腫瘍細胞の活性化を示すペプチド−ＩＬ−１５剤複合体を構成することができる。
【０４９５】
実施例１０１
Ｒｉｇ−Ｉ−またはＭＤＡ５−リガンドペプチドＩ／Ｏ複合体によるアブスコパル抗腫瘍免疫の誘導
Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫の誘導は、全身作用が可能なＴ細胞の出現を生じる。かかるＴ細胞は、原発腫瘍の殺滅、さらにそれに加えて、遠隔部位における原発腫瘍のその後の転移の根絶において機能することが予想される。かかるＴ細胞は、原発腫瘍の消失後に再発腫瘍を根絶する機能を有するメモリーＴ細胞を生じさせることも予想される。
【０４９６】
アブスコパル効果を示した最初のモデルは腫瘍ワクチン接種の使用であり、腫瘍細胞をインビトロで薬物で処理した後、マウスに接種するというものである（Ｆｅｎｄ  ２０１７）。その後、マウスを生きた腫瘍でチャレンジする。マウスが抗腫瘍Ｔ細胞の誘導物質で前処理されていた場合、これらのマウスは腫瘍の進行に抵抗性を示す。このモデルでは、ＭＣＡ２０５、ＣＴ２６、４Ｔ１または他の腫瘍細胞などの腫瘍細胞をＲｉｇ−ＩリガンドペプチドＩ／Ｏ複合体でインビトロ処理して、これらの細胞をできる限りアポトーシスに誘導する。次に、処理細胞を、マウスの側腹部の皮下に接種する。次いで、マウスを未処理の同じ腫瘍で最初の接種後の任意の時間、例えば４日後に、対側の側腹部にチャレンジする。その後、腫瘍の進行を同側と対側の両方の部位で監視する。腫瘍は同側の部位では成長せず、対側の部位では腫瘍の進行が顕著に遅れる。
抗腫瘍Ｔ細胞の役割を実証する別のモデルは、抗腫瘍治療を生き延びたマウスに腫瘍再チャレンジを用いることである（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ２０１８）。腫瘍に対するメモリーＴ細胞応答を有する生存マウスは、腫瘍による２回目のチャレンジで生き残る。このようなＴ細胞の記憶は、特定の化学療法による腫瘍治療、放射線療法、またはＲｉｇ−Ｉのリガンドなどの特定の生物学的製剤による治療の後に生じ得る。腫瘍を有するマウスを、Ｒｉｇ−ＩリガンドペプチドＩ／Ｏ複合体で処置する。腫瘍は退行し、マウスは生存する。次に、マウスを同じ腫瘍タイプからの細胞で再度チャレンジする。マウスは２番目のチャレンジを生き残る。
【０４９７】
別のモデルは、薬物の腫瘍内投与によるマウスの腫瘍の処置後、同じ動物の対側の非処置の腫瘍の退行の評価を行うものである（Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉ  ２０１５）。同じ種類の２つの腫瘍をマウスの右側腹部と左側腹部に１つずつのようにしてマウスに誘導する。右側腹部の腫瘍などの一方の腫瘍に、Ｒｉｇ−ＩリガンドペプチドＩ／Ｏ複合体を腫瘍内注射する。左側腹部の腫瘍などの他の腫瘍は退行する。
【０４９８】
配列番号１、配列番号２、配列番号５６８、配列番号５６９または配列番号５７０の任意のペプチド、または上記のいずれかと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の腫瘍細胞の活性化を有するペプチド−ＲＩＧ−Ｉリガンド複合体を構成することができる。
【０４９９】
本開示の特定の実施形態を本明細書に例示または図示または記載したが、かかる実施形態はあくまで実例として与えられるものであることは当業者には明白であろう。本開示は、明細書内で提供される特定の例によって限定されることを意図しない。本開示を上記の明細書を参照して説明したが、本明細書の実施形態の説明及び図解は、限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。この時点で、当業者には、本開示から逸脱することなく数多くの変形、変更及び置換が想到されるであろう。さらに、本開示のすべての実施形態は、さまざまな条件及び変数に依存する、本明細書に記載された特定の描写、構成または相対的比率に限定されない点を理解されたい。本明細書に記載される開示の実施形態のさまざまな代替物を本開示の実施において採用することが可能である点を理解されたい。したがって、本開示は、かかる代替物、改変物、変形物または均等物も包含することが企図されている。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物が本開示によって包含されることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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