(57)【要約】本開示は、γサルコグリカン（ＳＧＣＧ）をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクター、例えば、ＡＡＶベクター、および筋ジストロフィー、例えば、肢帯型ジストロフィー２Ｃ型（ＬＧＭＤ２Ｃ）に罹患している被験体を処置するために、このような遺伝子治療ベクターを使用する方法に関する。一局面において、被験体においてγサルコグリカン異常症を処置する方法が提供され、上記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを上記被験体に投与するステップを含み、上記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、上記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する。
2021512072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてγサルコグリカン異常症を処置する方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項２】
被験体において筋力、筋持久力、および／または筋量を増加させる方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項３】
被験体において線維症を低減する方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項４】
被験体において収縮誘発性損傷を低減する方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項５】
筋ジストロフィーに罹患している被験体において筋ジストロフィーを処置する方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項６】
筋ジストロフィーに罹患している被験体において変性線維または壊死線維を低減する方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項７】
筋ジストロフィーに罹患している被験体において炎症を低減する方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項８】
筋ジストロフィーに罹患している被験体においてクレアチンキナーゼレベルを上昇させる方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項９】
筋ジストロフィーに罹患している被験体において筋線維の萎縮および肥大を処置する方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項１０】
筋ジストロフィーに罹患している被験体においてジストロフィー性石灰化を減少させる方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項１１】
被験体において脂肪浸潤を減少させる方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項１２】
被験体において中心核形成を減少させる方法であって、前記方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記被験体に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含み、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法。
【請求項１３】
γサルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
γサルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１に記載するヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｒＡＡＶベクターが、自己相補性ＡＡＶベクターゲノムを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ  ＤＮＡを欠くゲノムを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｒＡＡＶベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３またはＡＡＶ  ｒｈ７４のベクターである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｒＡＡＶベクターが、血清型ＡＡＶ  ｒｈ７４のベクターであり、前記ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシドが、配列番号１０に記載するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｒＡＡＶベクターの前記ゲノムが、筋特異的制御エレメントを含み、γサルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記筋特異的制御エレメントに動作可能に結合している、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記筋特異的制御エレメントが、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７、Ｃ５−１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導核因子、ステロイド誘導エレメント、およびグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記筋特異的制御エレメントが、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロモーターが、ＭＨＣＫ７プロモーターである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＨＣＫプロモーターが、配列番号３に記載するヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｒＡＡＶベクターの前記ゲノムが、配列番号５に記載するヌクレオチド配列を含むイントロンを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
γサルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２のアミノ酸配列をコードする、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｒＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を投与するステップを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記肢帯型筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｒＡＡＶベクター、または前記ｒＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む前記組成物を、筋肉内注射または静脈内注射により投与するステップを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｒＡＡＶベクター、または前記ｒＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む前記組成物を、全身投与するステップを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｒＡＡＶベクター、または前記ｒＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む前記組成物を、注射、輸注、または移植により非経口投与するステップを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体の１つまたは複数の筋肉の筋力、筋持久力、および／または筋量を増加させる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
１つまたは複数の前記筋肉が、心臓、横隔膜、大腿、下腿、骨盤帯、肩、および腕からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
筋力、筋持久力、および／または筋量が、未処置対照被験体と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約８０％増加する、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＡＡＶカプシド、およびプロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター。
【請求項３７】
前記遺伝子発現カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、請求項３６のｒＡＡＶベクター。
【請求項３８】
γサルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３６または請求項３７に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項３９】
γサルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１に記載するヌクレオチド配列を含む、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４０】
血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３またはＡＡＶ  ｒｈ７４のベクターである、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４１】
前記ｒＡＡＶベクターのゲノムが、筋特異的制御エレメントを含み、前記ポリヌクレオチド配列が、前記筋特異的制御エレメントに動作可能に結合している、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４２】
前記筋特異的制御エレメントが、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７、Ｃ５−１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導核因子、ステロイド誘導エレメント、およびグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）からなる群より選択される、請求項４１に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４３】
前記筋特異的制御エレメントが、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）である、請求項４２に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４４】
前記プロモーターが、ＭＨＣＫ７である、請求項３６〜４３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４５】
前記ＭＨＣＫプロモーターが、配列番号３に記載するヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４６】
前記ｒＡＡＶベクターの前記ゲノムが、配列番号５に記載するヌクレオチド配列を含む、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４７】
γサルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列をコードする、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４８】
請求項３６〜４７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む組成物。
【請求項４９】
薬学的に許容される担体を含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
被験体においてγサルコグリカン異常症を処置するための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
被験体において筋力、筋持久力、および／または筋量を増加させるための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
被験体において線維症を低減するための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
被験体において収縮誘発性損傷を低減するための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５４】
筋ジストロフィーに罹患している被験体における筋ジストロフィーのための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５５】
筋ジストロフィーに罹患している被験体において変性線維または壊死線維を低減するための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５６】
筋ジストロフィーに罹患している被験体において炎症を低減するための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５７】
筋ジストロフィーに罹患している被験体においてクレアチンキナーゼレベルを上昇させるための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５８】
筋ジストロフィーに罹患している被験体における筋線維の萎縮および肥大のための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５９】
筋ジストロフィーに罹患している被験体においてジストロフィー性石灰化を減少させるための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項６０】
被験体において脂肪浸潤を減少させるための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項６１】
被験体において中心核形成を減少させるための、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項６２】
乳酸リンゲル液（ＬＲＳ）を含む、請求項４８〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６３】
請求項３６〜４７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６４】
請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組成物およびコルチコステロイドを含む、併用療法。
【請求項６５】
請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組成物およびコルチコステロイドまたは請求項６４に記載の併用療法を含む、キット。
【請求項６６】
コルチコステロイドを含む、請求項６５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１８年１月３１日出願の米国特許仮出願第６２／６２４，６１６号への優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されている配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年１月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、１０６８８７−７１４１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１８，７６０バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、遺伝子治療に関する。より詳細には、本開示では、筋ジストロフィー、例えば、肢帯型ジストロフィー２Ｃ型（ＬＧＭＤ２Ｃ）を処置するための、遺伝子治療ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。
【背景技術】
【０００４】
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、遺伝性疾患の１つの群である。この群は、運動を制御する骨格筋の進行性衰弱および変性により特徴づけられる。乳児期または小児期に発生する型のＭＤも存在すれば、中年以降まで現れない可能性のある型のＭＤも存在する。この障害は、筋衰弱の分布および程度の点で異なり、一部のＭＤ型はまた、心筋、発症年齢、進行速度、および遺伝のパターンに影響する。
【０００５】
ＭＤの１つの群は、ＭＤの肢帯型の群（ＬＧＭＤ）である。ＬＧＭＤは、まれな状態であり、発症年齢、筋衰弱の部位、心臓および呼吸器への影響、進行速度ならびに重症度に関して、異なる人々において異なって現れる。ＬＧＭＤは、小児期、思春期、青年期またはさらにそれ以降に始まり得る。男女ともに平等に発症する。ＬＧＭＤは、肩および骨盤帯の衰弱を引き起こし、大腿および腕の付近の筋肉も経時的に衰弱していくことがある。脚の衰弱は、腕が衰弱する前に現れることが多い。顔面筋では、通常、発症しない。状態が進行するにつれて、発症した個体は、歩行に問題を生じる可能性があり、徐々に車椅子を使用する必要が出る可能性がある。肩および腕の筋肉への影響は、頭上に腕を上げること、および物を持ち上げることに困難を生じ得る。一部の型のＬＧＭＤでは、心筋および呼吸筋に影響し得る。
【０００６】
ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型ジストロフィー２Ｃ型）は、ガンマ（γ）サルコグリカン（ＳＧＣＧ）の欠損により引き起こされる。他のサルコグリカン異常症と同様に、これは、進行性筋ジストロフィーとして現れ、肢帯筋から開始した後、下肢および最終的には上肢の筋肉に広がる。症状は、１０代半ばから後半に典型的に発生する。ＬＧＭＤ２Ｃを処置しようとする試みにおいて、コルチコステロイドをも含む、いかなる形態の薬物治療によっても、疾患の経過を変えることはできていない。
【０００７】
ＬＧＭＤ２Ｃおよび他の筋ジストロフィーに罹患している患者における機能的向上は、遺伝子修復と線維症の低減の両方を必要とする。当技術分野において、ＬＧＭＤ２Ｃおよび他の筋ジストロフィーを処置するための、組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
γサルコグリカンをコードする、遺伝子治療ベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびγサルコグリカンをコードするこのようなベクターを筋肉に送達して、筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物被験体において、線維症を低減もしくは予防し、筋機能を維持もしくは向上させ、筋力（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｆｏｒｃｅ）を増加させ、筋持久力（ｍｕｓｃｌｅ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ）を増加させ、またはγサルコグリカン異常症を処置する方法を本明細書において記載する。
【０００９】
加えて、本開示では、遺伝子治療ベクターを使用して、γサルコグリカンを送達して、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型ジストロフィー２Ｃ型）に認められる遺伝子欠陥に対処する、治療およびアプローチを提供する。一態様では、それを必要とする被験体における、γサルコグリカン異常症の処置、筋力、筋持久力、および／もしくは筋量の増加、線維症の低減、収縮誘発性損傷の低減、脂肪浸潤の減少、ならびに／または中心核形成（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）の減少、ならびに／あるいは筋ジストロフィーに罹患している被験体における、筋ジストロフィーの処置、変性線維もしくは壊死線維の低減、炎症の低減、クレアチンキナーゼレベルの上昇、筋線維の萎縮および肥大の処置、ならびに／またはジストロフィー性石灰化の減少のうちの１つまたは複数のための方法であって、方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり、ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる遺伝子発現カセットを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり、前記カセットが、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、方法を本明細書において提供する。
【００１０】
一態様では、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを本明細書において記載する。一部の実施形態では、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載するヌクレオチド配列と例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超えて同一の配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり、γサルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載するヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。一部の実施形態では、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載するヌクレオチド配列、または配列番号１に記載するヌクレオチド配列と例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはこれを超えて同一の配列からなり、γサルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードし、これは一態様では、γサルコグリカンをコードする野生型ヒトポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドと比較して、配列番号１のヌクレオチドの変化を保持する。
【００１１】
別の態様では、本明細書に記載するｒＡＡＶベクターは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、およびさらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり、このタンパク質は、γサルコグリカン活性を保持する。
【００１２】
γサルコグリカン活性は、筋機能に重要である。γサルコグリカンは、ジストロフィンと相互作用し、ジストロフィン−糖タンパク質複合体を形成する、いくつかの筋細胞膜貫通糖タンパク質のうちの１つであり、これは、筋細胞膜にわたり、ジストロフィン、シントロフィン、αジストログリカンおよびβジストログリカン、ならびにγサルコグリカンを含むサルコグリカンで構成される。ジストロフィン−糖タンパク質複合体は、筋細胞膜下細胞骨格と筋細胞の細胞外基質との間に構造的結合をもたらす。筋細胞の非限定的な例としては、心臓、横隔膜、脚、骨盤帯、肩および腕の筋細胞が挙げられる。γサルコグリカン活性のさらなる非限定的な例およびγサルコグリカン異常症の結果は、Ｂｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．；８２（２）：２９１−３２９およびＴａｒａｋｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  （Ｌａｎｄｍａｒｋ  Ｅｄ）；２１：７４４−５６に記載されている。
【００１３】
別の態様では、本明細書に記載するｒＡＡＶベクターは、発現が筋肉に制限されるように、プロモーターおよび／または筋特異的制御エレメントに動作可能に結合していてもよい。例えば、筋特異的制御エレメントは、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００６６７２．１）、心筋アクチン遺伝子エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７５５３．１）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿０１６４４３．２）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１８８００２．１）、ｔＭＣＫ（切断型ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７（ＭＨＣおよびＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５−１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導核因子、ステロイド誘導エレメントまたはグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である。
【００１４】
一部の実施形態では、筋特異的プロモーターは、ＭＨＣＫ７（配列番号４）またはその等価物である。本明細書に記載する、例となるｒＡＡＶベクターは、配列番号３のヌクレオチド配列もしくはその等価物を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになるｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＣであり、この場合、このＭＨＣＫ７プロモーターがヌクレオチド１３６〜９２７にわたり、ＣＭＶイントロンがヌクレオチド９３７〜１０８４にわたり、γサルコグリカン配列がヌクレオチド１０９４〜１９６８にわたり、ポリＡがヌクレオチド１９７６〜２０２８にわたる。ある特定の場合では、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＣは、ＡＡＶ  ｒｈ７４カプシドにパッケージングされる。
【００１５】
ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３またはＡＡＶ  ｒｈ７４であり得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。
【００１６】
偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に記載されている。また、他の型のｒＡＡＶ改変体、例えば、カプシドの変異を有するｒＡＡＶが、検討されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ２２（１１）：  １９００−１９０９  （２０１４）を参照されたい。
【００１７】
また、本明細書に記載するｒＡＡＶベクターのいずれかを含むか、またはこれから本質的になる組成物を検討する。
【００１８】
また、組換えＡＡＶベクター粒子を生成する方法であって、本明細書に記載する任意の組換えＡＡＶベクターをトランスフェクトした細胞を培養するステップ、およびトランスフェクトした細胞の上清から組換えＡＡＶ粒子を回収するステップを含む方法を提供する。また、本明細書に記載する組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むか、またはこれから本質的になるウイルス粒子を検討する。
【００１９】
また、それを必要とする哺乳動物被験体において線維症を低減する方法を提供する。この点に関しては、方法は、治療有効量の本明細書に記載するＡＡＶベクター（または本明細書に記載するＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物）を哺乳動物被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。一部の実施形態では、哺乳動物被験体は、筋ジストロフィーに罹患している。一部の実施形態では、本明細書に記載するＡＡＶベクター（または本明細書に記載するＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物）を投与すると、被験体の骨格筋または心筋において線維症が低減される。
【００２０】
別の態様では、哺乳動物被験体において筋力または筋量または筋持久力を増加させる方法であって、治療有効量の本明細書に記載するＡＡＶベクター（または本明細書に記載するＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物）を哺乳動物被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる方法を本明細書において記載する。
【００２１】
本開示の方法のいずれかでは、被験体は、筋ジストロフィー、例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患している可能性がある。
【００２２】
また、哺乳動物被験体において筋ジストロフィーを処置する方法であって、治療有効量の本明細書に記載するＡＡＶベクター（または本明細書に記載するＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物）を哺乳動物被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる方法を提供する。一部の実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型ジストロフィーである。
【００２３】
本開示の方法のいずれかでは、ｒＡＡＶは、適切な任意の投与様式、例えば、筋肉内注射または静脈内注射により投与する。加えて、本開示の方法のいずれかでは、ｒＡＡＶは、全身投与し、例えば、注射、輸注または移植により非経口投与する。
【００２４】
本開示の組成物は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化する。加えて、本開示の組成物は、全身投与、例えば、注射、輸注または移植による非経口投与用に製剤化する。
【００２５】
加えて、組成物のいずれかは、筋ジストロフィー（例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィー）に罹患している被験体への投与用に製剤化する。また、本明細書に記載する組成物の１つまたは複数およびコルチコステロイドを含むか、またはこれから本質的になる併用療法を本明細書において記載する。本開示のｒＡＡＶベクターを含む宿主細胞を本明細書において提供する。本明細書に開示する１つまたは複数の実施形態のいずれか、および使用のための指示を含むキットを本明細書において、さらに提供する。キットは、本明細書に開示する組成物の１つもしくは複数およびコルチコステロイド、または本明細書において提供する併用療法の１つもしくは複数を含み得るか、またはこれから本質的になり得る。本開示の使用のいずれかでは、医薬は、投与用、例えば、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化する。加えて、本開示の使用のいずれかでは、医薬は、全身投与、例えば、注射、輸注または移植による非経口投与用に製剤化する。加えて、医薬のいずれかは、筋ジストロフィー（例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィー）に罹患している被験体への投与用に調製し得る。
【００２６】
前述の段落では、本発明のあらゆる態様を定義することを意図しておらず、さらなる態様は、他の節、例えば、発明を実施するための形態において記載する。文書全体は、統合された開示として言及することを意図しており、特徴の組合せが、この文書の同一の文、または段落、または節中にともに見出されなくても、本明細書に記載する特徴のすべての組合せを検討していることが理解されるべきである。本発明は、さらなる態様として、上記の特定の段落により定義された変形形態よりも範囲が多少制限された、本発明のすべての実施形態を含む。例えば、１つの属として記載される本発明のある特定の態様の場合では、１つの属のあらゆるメンバーが、それぞれに、本発明の態様であることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、コドン最適化完全長ヒトγサルコグリカン（ｈＳＣＧＢ）ｃＤＮＡ（配列番号１）を含むＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ）を示す。構築物は、２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）約１００ｂｐと隣接し、コドン最適化ヒトγサルコグリカンｃＤＮＡ（ｈＳＧＣＧ）、キメライントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）、合成ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を含み、骨格筋および心筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーターにより駆動される。
【００２８】
【図２】図２は、８週齢のＢＬ６  ＷＴマウスおよびγサルコグリカンノックアウト（γ−ＳＧ  ＫＯ）マウス由来の前脛骨（ＴＡ）筋のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示し、罹患マウスにおいてジストロフィー表現型を示す。
【００２９】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのベクター効力を示す。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを総用量３ｅ１０ｖｇでγ−ＳＧ  ＫＯマウスの前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。図３Ａは、γ−ＳＧ  ＫＯマウスにおけるＴＡ筋の免疫蛍光染色を示す。ほぼ１００％のγサルコグリカンタンパク質発現が、筋細胞膜において、ベクター送達により生じた。図３Ｂは、処置したマウス＃７９４、７９５由来の注射したＴＡ筋におけるγサルコグリカン発現についてのウエスタンブロットを示す。図３Ｃは、対照野生型マウス（「ＢＬ６  ＷＴ  ＴＡ」）または未注射対照γ−ＳＧ  ＫＯマウス（「ＧＳＧ  ＫＯ  ＴＡ」）におけるＴＡ筋の免疫蛍光染色、ならびに未染色サンプル（「ＧＳＧ  ＫＯ、一次抗体なし」）を示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのベクター効力を示す。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを総用量３ｅ１０ｖｇでγ−ＳＧ  ＫＯマウスの前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。図３Ａは、γ−ＳＧ  ＫＯマウスにおけるＴＡ筋の免疫蛍光染色を示す。ほぼ１００％のγサルコグリカンタンパク質発現が、筋細胞膜において、ベクター送達により生じた。図３Ｂは、処置したマウス＃７９４、７９５由来の注射したＴＡ筋におけるγサルコグリカン発現についてのウエスタンブロットを示す。図３Ｃは、対照野生型マウス（「ＢＬ６  ＷＴ  ＴＡ」）または未注射対照γ−ＳＧ  ＫＯマウス（「ＧＳＧ  ＫＯ  ＴＡ」）におけるＴＡ筋の免疫蛍光染色、ならびに未染色サンプル（「ＧＳＧ  ＫＯ、一次抗体なし」）を示す。
【００３０】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ＢＬ６野生型（ＷＴ）マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのベクター効力および毒性を示す。図４Ａは、膜および細胞内染色によりγサルコグリカンの過剰発現を示す免疫蛍光染色を示す。図４Ｂは、注射したＬＴＡ筋においてγサルコグリカンの過剰発現を示すウエスタンブロットを示す。
【００３１】
【図５】図５は、ＢＬ６野生型（ＷＴ）マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのベクター効力および毒性を示す。未注射および注射したＢＬ６  ＷＴ  ＴＡ筋のＨ＆Ｅ染色により毒性は示されず、中心核、壊死線維、炎症性浸潤、または線維性組織のいずれも完全に存在しない。
【００３２】
【図６】図６は、ＴＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）、四頭筋（ＱＵＡＤ）、殿筋（ＧＬＵＴ）、ＰＳＯＡＳ、三頭筋、横隔膜、および心筋についてのγサルコグリカンの免疫蛍光染色を示し、γサルコグリカンの広範な発現を実証する。
【００３３】
【図７】図７は、ＩＶ効力組織の免疫蛍光染色を示す。種々の骨格筋、横隔膜、および心臓におけるγサルコグリカンについてのＩＦ染色により、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧの全身送達後６週に、陰性線維がほとんどない、ロバストな発現が実証される。
【００３４】
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、ＩＶ処置動物におけるＳＧＣＧの発現を示す。総用量１ｅ１３ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを静脈内注射したＳＧＣＧ−／−マウス由来の骨格筋、横隔膜、および心臓の免疫蛍光イメージングを、代表的２０×画像により示す（図８Ａ）。ウエスタンブロットにより、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを静脈内送達したマウス由来のすべての骨格筋および心臓におけるｈＳＧＣＧ発現を示す（図８Ｂ）。
【００３５】
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、全身処置後の組織の組織学的評価を示す。ＢＬ６  ＷＴ、未処置ＳＧＣＧ−／−、およびＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置ＳＧＣＧ−／−マウスにおけるＴＲＩおよびＤＩＡ骨格筋のヘマトキシリン＆エオシン染色により、処置後のジストロフィー病理の逆転が示される（図９Ａ）。中心核形成を有する線維のパーセンテージの定量により、処置した筋肉の減少が示される。ＢＬ６  ＷＴ（ｎ＝５）、未処置ＳＧＣＧ−／−（ｎ＝６）、ＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置（ｎ＝５）（図９Ｂ）。＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【００３６】
【図１０−１】１０Ａ〜１０Ｆは、線維径の定量を示す。ＢＬ６  ＷＴ（ｎ＝５）、未処置ＳＧＣＧ−／−（ｎ＝６）、およびＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置ＳＧＣＧ−／−（ｎ＝５）マウスのＧＡＳ（図１０Ａ）、ＰＳＯＡＳ（図１０Ｂ）、およびＴＲＩ（図１０Ｃ）における線維径の定量、および処置後の線維径分布の正規化を実施した。平均線維径は、未処置ＳＧＣＧ−／−マウスのＧＡＳ（図１０Ｄ）、ＰＳＯＡＳ（図１０Ｅ）、およびＴＲＩ（図１０Ｆ）筋において減少し、ＳＧＣＧ−／−マウスのＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置後の各筋肉においてＷＴのレベルまで増加する。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図１０−２】１０Ａ〜１０Ｆは、線維径の定量を示す。ＢＬ６  ＷＴ（ｎ＝５）、未処置ＳＧＣＧ−／−（ｎ＝６）、およびＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置ＳＧＣＧ−／−（ｎ＝５）マウスのＧＡＳ（図１０Ａ）、ＰＳＯＡＳ（図１０Ｂ）、およびＴＲＩ（図１０Ｃ）における線維径の定量、および処置後の線維径分布の正規化を実施した。平均線維径は、未処置ＳＧＣＧ−／−マウスのＧＡＳ（図１０Ｄ）、ＰＳＯＡＳ（図１０Ｅ）、およびＴＲＩ（図１０Ｆ）筋において減少し、ＳＧＣＧ−／−マウスのＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置後の各筋肉においてＷＴのレベルまで増加する。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【００３７】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＴＡおよび横隔膜の生理学を示す。ＢＬ６  ＷＴ（ｎ＝５）、未処置ＳＧＣＧ−／−（ｎ＝６）、およびＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置（ｎ＝５）マウスのＴＡおよびＤＩＡ筋を正規化した比筋力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ）発生の測定に供した。ＴＡ筋を伸張性収縮損傷プロトコール（ｅｃｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に供した（図１１Ａ）。処置したＳＧＣＧ−／−マウスにおけるＴＡ比筋力出力および収縮誘発性損傷に対する耐性の向上を観察した（図１１Ｂ）。ＤＩＡ比筋力出力は、処置したＳＧＣＧ−／−マウスにおいてＷＴのレベルまで回復した（図１１Ｃ）。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【００３８】
【図１２】図１２は、オープンフィールドのケージ活動のレーザーモニタリングを示す。ｘおよびｙ面における全歩行運動は、ＳＧＣＧ−／−マウスにおいて減少し、ＡＡＶ．ＭＣＨＫ７．ｈＳＧＣＧ処置マウスにおいて向上する。ＢＬ６  ＷＴ（ｎ＝６）、未処置ＳＧＣＧ−／−（ｎ＝６）、およびＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置（ｎ＝５）。
【００３９】
【図１３】図１３は、ベクターゲノムの体内分布を示す。１マイクログラムゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）あたりの平均ｖｇコピーのベクターゲノム分布を、総用量１ｅ１３ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧのＩＶ送達３カ月後に、ＳＧＣＧ−／−マウス２匹由来の種々の組織において測定した。
【００４０】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、血清ＡＬＴおよびＡＳＴの比較を示す。ＢＬ６  ＷＴマウス（ｎ＝６）、未処置ＳＧＣＧ−／−マウス（ｎ＝６）、およびＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ  ＩＶ処置ＳＧＣＧ−／−マウス（ｎ＝５）（総用量１ｅ１３ｖｇ）由来の血清を、生化学成分レベルについて解析した。肝臓酵素アルカリアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ、図１４Ａ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ、図１４Ｂ）は、罹患ＳＧＣＧ−／−マウスにおいて上昇し、処置後にＷＴレベル付近まで戻った。＊＝ｐ＜０．０５。破線は、正常範囲の下限および上限を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本開示は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している個体における筋線維症の低減または完全な逆転のための、γサルコグリカンを発現するポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの投与に関する。実施例において実証するように、本明細書に記載するｒＡＡＶベクターを投与すると、ノックアウトマウスにおいてγサルコグリカン発現が回復した。本明細書に記載するｒＡＡＶベクターを投与すると、伸張性収縮から防御され、力の発生が増加することにより、より少ない変性線維、炎症の低減、および機能回復の向上を含むジストロフィーの特徴が逆転する。本開示は、本明細書に記載するｒＡＡＶベクターを投与することによる、被験体（例えば、ヒト被験体）における肢帯型筋ジストロフィーの処置を包含する。
【００４２】
本明細書では、任意の濃度の範囲、パーセンテージの範囲、比の範囲、または整数の範囲は、他に指示しない限り、列挙する範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、この分率（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書において使用する場合、他に指示しない限り、列挙する成分の「１つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方、またはこれらの任意の組合せを意味すると理解されるべきである。本明細書において使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義的に使用する。本明細書において使用する場合、「複数」は、１つまたは複数の成分（例えば、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ標的配列）を指し得る。本出願では、「または」の使用は、他の提示がない限り、「および／または」を意味する。
【００４３】
本出願において使用する場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、等価物として使用する。約（ａｂｏｕｔ／ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）を使用して、または使用せずに、本出願において使用する任意の数字は、関連する技術分野の当業者により理解される、任意の正常変動を包含することを意味する。ある特定の実施形態では、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、そうでないと提示しない限り、または文脈から、そうでないことが明白でない限り（このような数が可能値の１００％を超える場合を除いて）、提示する基準値の両方向性で（それを超えて、またはそれ未満の）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはこれ未満に入る値の範囲を指す。
【００４４】
「減少」または「低減」は、基準値と比較して少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％の特定の値の減少または低減を指す。また、特定の値の減少または低減は、基準値と比較した値の変化倍率、例えば、基準値と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００分の１またはこれを超える減少として表し得る。
【００４５】
「増加」は、基準値と比較して少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００、２００、３００、４００、５００％またはこれを超える特定の値の増加を指す。また、特定の値の増加は、基準値と比較した値の変化倍率、例えば、基準値のレベルと比較して少なくとも１倍、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍またはこれを超える増加として表し得る。
【００４６】
「相補性」は、天然に存在するまたは天然に存在しない（例えば、上記のように修飾した）塩基（ヌクレオチド）またはその類似体を含む２つの配列間の、塩基スタッキングおよび特異的水素結合により対形成するための能力を指す。例えば、核酸のある位置の塩基が、標的の対応する位置の塩基と水素結合可能である場合、塩基は、この位置で相互に相補性であると考えられる。核酸は、ユニバーサル塩基、または水素結合に正にも負にも寄与しない不活性脱塩基スペーサーを含み得る。塩基対形成は、正準のワトソン−クリック塩基対形成と非ワトソン−クリック塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成）の両方を含み得る。相補性塩基対形成では、アデノシン型塩基（Ａ）が、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に相補性であり、シトシン型塩基（Ｃ）が、グアノシン型塩基（Ｇ）に相補性であり、ユニバーサル塩基、例えば、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールが、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれかとハイブリダイズし、これに相補性であると考えられ得ることが理解される。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９９４；３６９：４９２−４９３およびＬｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９４；２２：４０３９−４０４３。また、イノシン（Ｉ）は、ユニバーサル塩基であると当技術分野において考えられており、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれかに相補性であると考えられる。Ｗａｔｋｉｎｓ  ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００５；  ３３  （１９）：  ６２５８−６２６７を参照されたい。
【００４７】
用語「被験体」は、動物、例えば、哺乳動物等を含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、霊長類である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態では、被験体は、家畜、例えば、ウシ類（ｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ｃｏｗ）、ブタ等、または飼育動物、例えば、イヌおよびネコである。一部の実施形態（例えば、特には、研究的文脈）では、被験体は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、またはブタ、例えば、近交系ブタ等である。用語「被験体」および「患者」は、本明細書において互換的に使用する。
【００４８】
「投与」は、本明細書において、薬剤または組成物を被験体に導入することを指す。
【００４９】
「処置」は、本明細書において使用する場合、薬剤または組成物を被験体に送達して、生理学的転帰に影響することを指す。一部の実施形態では、処置は、（ａ）疾患の阻害、例えば、疾患発生の停止または疾患進行の予防、（ｂ）疾患の軽減、例えば、疾患状態の退行を引き起こすこと、（ｃ）疾患の治癒、および（ｄ）疾患発症の予防、例えば、遺伝的欠陥のキャリアであると同定された無症状の被験体における疾患発生の停止を含む、被験体、例えば、ヒトにおける疾患の処置を指す。一態様では、処置は、予防または防止を除外する。
【００５０】
疾患が筋ジストロフィーである場合、次の臨床エンドポイント：比筋力の減少、損傷に対する耐性の増加、筋力の増加、筋持久力の増加、筋量の増加、収縮誘発性損傷の低減、脂肪浸潤の減少、中心核形成の減少、変性線維もしくは壊死線維の低減、炎症の低減、クレアチンキナーゼレベルの上昇、筋線維の萎縮および肥大の減少ならびに／またはジストロフィー性石灰化の減少は、処置の非限定的な例である。
【００５１】
疾患が線維症である場合、次の臨床エンドポイント：線維性組織の低減、炎症の低減、線維芽細胞病変の低減、活性化線維芽細胞増殖の低減、筋線維芽細胞発生の低減、努力肺活量（ＦＶＣ）の低下率の低減（ここで、ＦＶＣは肺機能検査中の呼気の総量である）、ＦＶＣのベースラインからの絶対的および相対的増加、ＦＶＣのベースラインからの絶対的増加（％予測）、無増悪生存期間の増加、セントジョージ呼吸器アンケート（ＳＧＲＱ）総スコアのベースラインからの減少（ここで、ＳＧＲＱは、３つの成分：症状、活性および影響に分類される健康に関連した生活の質アンケートであり、総スコア（重みの合計）は、０〜１００の範囲に及び、スコアが低いほど健康状態が良好となることを表し得る）、ならびに高分解能コンピュータ断層撮影（ＨＲＣＴ）による定量的肺線維症（ＱＬＦ）スコアのベースラインからの相対的減少（ここで、ＱＬＦスコアは、０〜１００％の範囲に及び、値が高いほど肺線維症の量が多くなることを表し、健康状態が悪化すると考えられる）は、処置の非限定的な例である。前記臨床エンドポイントを測定するために実施され得る、線維症の処置および試験の臨床エンドポイントの非限定的な例は、次の臨床試験：ＮＣＴ０３７３３４４４（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０３７３３４４４）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ００２８７７２９（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００２８７７２９）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ００２８７７１６（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００２８７７１６）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ０２５０３６５７（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２５０３６５７）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ０００４７６４５（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０００４７６４５）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ０２８０２３４５（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２８０２３４５）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ０１９７９９５２（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１９７９９５２）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ００６５００９１（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００６５００９１）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ０１３３５４６４（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１３３５４６４）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ０１３３５４７７（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１３３５４７７）（最終アクセス２０１９年１月９日）、ＮＣＴ０１３６６２０９（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１３６６２０９）（最終アクセス２０１９年１月９日）に記載されている。前記臨床エンドポイントを測定するために実施され得る、線維症の処置および試験の臨床エンドポイントのさらなる非限定的な例は、Ｋｉｎｇ  ｅ���  ａｌ，  （２０１４）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  Ｍａｙ  ２９；３７０（２２）：２０８３−９２およびＲｉｃｈｅｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  Ｍａｙ  ２９；３７０（２２）：２０７１−８２に記載されている。
【００５２】
用語「有効量」または「治療有効量」は、特定の生理学的作用を生じるのに必要とされる薬剤または組成物の最小量（例えば、特定の生理学的作用の増加、活性化、または増強に必要とされる量）を指す。特定の薬剤の有効量または治療有効量は、薬剤の性質、例えば、質量／容量、細胞の数／容量、粒子数／容量、（薬剤の質量）／（被験体の質量）、細胞の数／（被験体の質量）、または粒子数／（被験体の質量）に基づく多様な方法により表し得る。また、特定の薬剤の有効量または治療有効量は、最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）として表すことがあり、これは、基準レベルと最大応答レベルの間にある、特定の生理学的応答の大きさを生じる薬剤の濃度を指す。
【００５３】
細胞の「集団」は、１を超える任意の数の細胞を指すが、好ましくは、少なくとも１×１０３細胞、少なくとも１×１０４細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも１×１０１０細胞、またはこれより多い細胞である。細胞の集団は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの集団（例えば、培養下の細胞集団）またはｉｎ  ｖｉｖｏでの集団（例えば、特定の組織に存在する細胞集団）を指す。
【００５４】
句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内にあり、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症もなく、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に適し、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書において用いる。
【００５５】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」は、ヒトおよび／または飼育動物における使用に許容されるものとして米国食品医薬品局により認可されている、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤（ｆｌａｖｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書において使用する場合、「ベクター」は、１つまたは複数のウイルスタンパク質、例えば、ウイルスを被包するためのウイルスカプシドとともに、ウイルスベクターにより核酸分子を細胞に導入または輸送することが可能な核酸分子を指す。導入された核酸は一般に、ベクター核酸分子に結合しており、例えば、挿入されている。ベクターは、細胞内で自律複製もしくは逆転写を方向づける配列を含むことがあり、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能とするのに十分な配列を含むことがある。「ベクター」は、遺伝子治療ベクターを含む。本明細書において使用する場合、用語「遺伝子治療ベクター」は、遺伝子治療の実施、例えば、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の被験体への送達における使用が可能なベクターを指す。遺伝子治療ベクターは、タンパク質、例えば、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド（「導入遺伝子」）を含み得る。
【００５７】
本明細書において使用する場合、用語「発現カセット」は、前記発現カセットに組み込むタンパク質（例えば、γサルコグリカン）をコードするポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の発現を駆動する適切な設定において有能なＤＮＡ断片を指す。宿主細胞に導入する場合、とりわけ発現カセットは、導入遺伝子をＲＮＡに転写し、次いで、これが通常さらにプロセシングされ、最終的に、治療的に活性なポリペプチドに翻訳されるように細胞機構を方向づけることが可能である。遺伝子治療ベクターは、発現カセットを含むか、またはこれから本質的になり得る。用語、発現カセットは、５’ＩＴＲに対して５’にあるポリヌクレオチド配列および３’ＩＴＲに対して３’にあるポリヌクレオチド配列を除外する。本開示のｒＡＡＶベクターを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる宿主細胞を本明細書において提供する。細胞は、任意の適切な種、例えば、哺乳動物の細胞であり得る。
【００５８】
本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドに関する句「動作可能に結合」または「転写制御下」は、プロモーター、または筋特異的制御エレメント、およびポリヌクレオチドがプロモーターに結合可能なポリメラーゼにより転写されることを可能とするポリヌクレオチドの構成を互換的に指す。一態様では、筋特異的制御エレメントは、発現を筋肉に制限するためのものである。筋特異的制御エレメントの非限定的な例は、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００６６７２．１）、心筋アクチン遺伝子エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７５５３．１）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿０１６４４３．２）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１８８００２．１）、ｔＭＣＫ（切断型ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７（ＭＨＣおよびＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５−１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導核因子、ステロイド誘導エレメントまたはグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である。
【００５９】
分子細胞生物化学における一般的方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１  ）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  （Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｉ．  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）のような標準的教科書に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本明細書において使用する場合、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの標準的略称である。アデノ随伴ウイルスは、同時感染するヘルパーウイルスにより、ある特定の機能がもたらされる細胞のみにおいて増殖する、１本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶの一般的情報および総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，  １９８９，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｖｏｌ．  １，  ｐｐ．  １６９−  ２２８、およびＢｅｒｎｓ，  １９９０，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ｐｐ．  １７４３−１７６４，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において見出すことができる。種々の血清型が、構造と機能の両方において、さらに遺伝子レベルにおいても、非常に密接に関連していることが周知であるため、このような総説に記載されている同一の原理が、総説の公開日後に特徴づけられた、さらなるＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に期待されている（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，  １９８８，  ｐｐ．  １６５−１７４  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｐａｔｔｉｓｏｎ，  ｅｄ．；およびＲｏｓｅ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：  １−６１  （１９７４）を参照）。例えば、すべてのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子により媒介される、非常に類似した複製特性を示すとみられ、すべては、３つの関連するカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２において発現するカプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ヘテロ２本鎖解析によりさらに示唆され、これにより、ゲノム長による血清型間の大規模なクロスハイブリダイゼーション、および「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する、類似性の自己アニーリングセグメントの末端における存在が明らかとなる。また、類似の感染パターンは、各血清型における複製機能が、類似の制御管理下にあることを示唆する。
【００６１】
「ＡＡＶベクター」は、本明細書において使用する場合、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接する１つまたは複数の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードし発現するベクターをトランスフェクトされている宿主細胞に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。
【００６２】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子）を含む場合、これは典型的に「ＡＡＶベクター粒子」または単純に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶベクター粒子の生成は、ＡＡＶベクターの生成を必然的に含み、したがって、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子に含まれる。
【００６３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、この１本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）１４５ヌクレオチドを含む、約４．７ｋｂの長さである。複数のＡＡＶ血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、公知である。例えば、ＡＡＶ−１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７により提供され、ＡＡＶ−２の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ４５：  ５５５−５６４  ｛  １９８３）により提供され、ＡＡＶ−３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９により提供され、ＡＡＶ−４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９により提供され、ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６により提供され、ＡＡＶ−６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２により提供され、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部分は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９によりそれぞれ提供され、ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７８：  ６３８１−６３８８  （２００４）により提供され、ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １３（１）：  ６７−７６  （２００６）により提供され、ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３３０（２）：  ３７５−３８３  （２００４）により提供されている。ＡＡＶ  ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号において提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージングおよび宿主細胞染色体の組込みを方向づけるｃｉｓ作用配列は、ＡＡＶ  ＩＴＲに含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的マップ位置からｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）により、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現が駆動される。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐｉ９）は、（ヌクレオチド２１０７および２２２７で）単一ＡＡＶイントロンの差次的スプライシングと組み合わせて、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０）の産生を生じる。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノム複製の原因となる、複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現し、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生の原因となる。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １５８：  ９７−１２９  （１９９２）に総説が記載されている。
【００６４】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞へ送達するためのベクターとして、これを魅力的とするユニークな特徴を有する。培養下の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞傷害性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントであり無症候性である。その上、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、多種多様な組織をｉｎ  ｖｉｖｏで標的とする可能性を与える。その上、ＡＡＶは、分裂および非分裂細胞に緩徐に形質導入し、このような細胞の生存期間中、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として本質的に持続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、クローン化ＤＮＡとしてプラスミドに挿入し、これにより組換えゲノムの構成が実現可能となる。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムのカプシド形成を方向づけるシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲに含まれるため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）の一部またはすべては、外来ＤＮＡで置換し得る。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をトランスに提供し得る。ＡＡＶの別の顕著な特徴は、これが非常に安定かつ強力なウイルスであることである。これは、アデノウイルスの不活化に使用される条件（５６°〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存がそれほど必要不可欠でなくなる。ＡＡＶは、さらに凍結乾燥し得る。最終的には、ＡＡＶ感染細胞は、重感染に耐性ではない。
【００６５】
複数の研究では、筋肉における長期（＞１．５年）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  ８：  ６５９−６６９  （１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ  Ｓｃ．  ＵＳＡ，  ９３：  １４０８２−１４０８７  （１９９６）；およびＸｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ７０：  ８０９８−８１０８  （１９９６）を参照されたい。また、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，  ２：６１９−６２３  （２０００）およびＣｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，  ４：２１７−２２２  （２００１）を参照されたい。その上、筋肉が高度に血管新生されるため、Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９４：  ５８０４−５８０９  （１９９７）およびＭｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９４：  １３９２１−  １３９２６  （１９９７）に記載するように、組換えＡＡＶ形質導入により、筋肉内注射後に体循環において導入遺伝子産物の出現が生じた。その上、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ７６：  ８７６９−８７７５  （２００２）は、骨格筋筋線維が、正しい抗体グリコシル化、フォールディング、および分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が、分泌タンパク質治療薬を安定に発現させることが可能であることを示した。本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、γサルコグリカンをコードする核酸分子（例えば、配列番号１）およびこの核酸分子と隣接する１つまたは複数のＡＡＶ  ＩＴＲを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ  ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来することがあり、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３およびＡＡＶ  ｒｈ７４を含むが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されている。また、他の型のｒＡＡＶ改変体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶが、検討されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ２２（１１）：  １９００−１９０９  （２０１４）を参照されたい。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。骨格筋特異的発現を促進させるために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９を使用し得る。したがって、一態様では、プロモーターおよび／または筋特異的制御エレメントの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になる組換えＡＡＶベクターを本明細書において記載する。一部の実施形態では、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載する（表１を参照）コドン最適化ヒトγサルコグリカンのヌクレオチド配列と例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２���、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超えて同一の配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり、γサルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載するヌクレオチド配列、またはγサルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする配列番号１と例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の配列を含む。
【００６６】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の塩基またはアミノ酸の、同一であり、同一の相対位置に存在するパーセンテージを指す。したがって、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して、ある特定のパーセンテージの配列同一性を有する。配列比較では、典型的に、１つの配列は、試験配列を比較する基準配列として作用する。用語「基準配列」は、試験配列を比較する分子を指す。ある特定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の基準配列との「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、アラインメントする場合、試験配列における各位置の塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが、基準配列における同一の位置の塩基（またはアミノ酸）と同一であることを意味する。このアラインメントおよび相同性のパーセントまたは配列同一性は、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを使用して決定することができる。好ましくは、アラインメントのためにデフォルトのパラメータを使用する。１つのアラインメントプログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフォルトのパラメータを使用する。特に、プログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、次のデフォルトパラメータ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；  Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する。このようなプログラムの詳細は、次のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉに見出すことができる。ポリペプチドまたはタンパク質の「等価物」は、その基準ポリペプチドまたはタンパク質との、ある特定の配列同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の基準との同一性）を有し、基準ポリペプチドまたはタンパク質と比較して類似の活性または機能を保持するものである。
【００６７】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物、例えば、培地、および方法が、列挙した要素を含むが、他を除外しないことを意味することを意図する。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用する場合、提示された目的のために、組合せに対して任意の本質的意義を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義する要素から本質的になる組成物は、特許請求する発明の基本的かつ新規の特性（複数可）に実質的に影響しない、他の物質またはステップを除外しない。「からなる」は、他の成分の、わずかではない要素、および実質的方法ステップを除外することを意味するものとする。このような移行用語のそれぞれにより定義する実施形態は、本開示の範囲内である。
【００６８】
一態様では、本開示のｒＡＡＶベクターの遺伝子発現カセットは、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する。別の態様では、ｒＡＡＶベクターのγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列、および／または配列番号１に記載するヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり、γサルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。さらなる態様では、ｒＡＡＶベクターのγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２と少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列をコードし、γサルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。
【００６９】
一部の実施形態では、本明細書に開示するｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３またはＡＡＶ  ｒｈ７４のベクターである。他の実施形態では、ｒＡＡＶベクターのゲノムは、筋特異的制御エレメントを含むか、またはこれから本質的になり、この場合、筋特異的制御エレメントは、ポリヌクレオチド配列に動作可能に結合している。筋特異的制御エレメントの非限定的な例は、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７、Ｃ５−１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導核因子、ステロイド誘導エレメント、およびグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である。一態様では、ｒＡＡＶベクターの筋特異的制御エレメントは、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）である。別の態様では、ｒＡＡＶベクターのプロモーターおよび／または筋特異的制御エレメントは、ＭＨＣＫ７プロモーターである。さらなる態様では、ＭＨＣＫプロモーターは、配列番号３に記載するヌクレオチド配列またはその等価物を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり、プロモーター機能を提供する。一実施形態では、本明細書に開示するｒＡＡＶベクターのゲノムは、配列番号５に記載するヌクレオチド配列を含むイントロンを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。
【００７０】
一部の実施形態では、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載するヌクレオチド配列、または配列番号１と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％もしくは９４％およびより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列からなり、γサルコグリカン活性を保持する。
【００７１】
別の態様では、本明細書に記載する組換えＡＡＶベクターは、配列番号２に記載する（表１を参照）ヒトγサルコグリカンのアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、およびさらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になり、このタンパク質は、γサルコグリカン活性を保持する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【００７２】
別の態様では、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、またはその相補体を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、機能性γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターを本明細書において記載する。機能性γサルコグリカンは、γサルコグリカン活性を保持するγサルコグリカンポリペプチドを意味する。γサルコグリカン活性は、筋機能に重要である。γサルコグリカンは、ジストロフィンと相互作用し、ジストロフィン−糖タンパク質複合体を形成する、いくつかの筋細胞膜貫通糖タンパク質のうちの１つであり、これは、筋細胞膜にわたり、ジストロフィン、シントロフィン、αジストログリカンおよびβジストログリカン、ならびにγサルコグリカンを含むサルコグリカンで構成される。ジストロフィン−糖タンパク質複合体は、筋細胞膜下細胞骨格と筋細胞の細胞外基質との間に構造的結合をもたらす。筋細胞の非限定的な例としては、心臓、横隔膜、脚、骨盤帯、肩および腕の筋細胞が挙げられる。γサルコグリカン活性のさらなる非限定的な例およびγサルコグリカン異常症の結果は、Ｂｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．；８２（２）：２９１−３２９およびＴａｒａｋｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  （Ｌａｎｄｍａｒｋ  Ｅｄ）；２１：７４４−５６に記載されている。
【００７３】
用語「ストリンジェント」は、ストリンジェントであるとして当技術分野において一般に理解される条件を指すために使用する。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは主に、温度、イオン強度、および変性剤、例えば、ホルムアミドの濃度により決定する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェントな条件の例は、６５〜６８℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、または４２℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％のホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  １９８９）を参照されたい。また、さらにストリンジェントな条件（例えば、さらに高い温度、さらに低いイオン強度、さらに高濃度のホルムアミドまたは他の変性剤）を使用し得るが、ハイブリダイゼーション率に影響する。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合では、さらに例となるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、３７℃（１４塩基オリゴ用）、４８℃（１７塩基オリゴ用）、５５℃（２０塩基オリゴ用）、および６０℃（２３塩基オリゴ用）の６×ＳＳＣ、０．０５％のピロリン酸ナトリウムによる洗浄が挙げられる。
【００７４】
非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的のために、他の薬剤をハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液に含み得る。例としては、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のポリビニル−ピロリドン、０．１％のピロリン酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳ０４（ＳＤＳ）、フィコール、デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補性ＤＮＡ）、およびデキストラン硫酸であるが、他の適する薬剤も使用し得る。このような添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響することなく、変更することができる。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実行するが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーション率は、ｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｃｈ．  ４，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、当業者により調整して、このような変数を適応させ、種々の配列関連性を有するＤＮＡのハイブリッド形成を可能とすることができる。
【００７５】
別の態様では、本明細書に記載する組換えＡＡＶベクターは、プロモーターおよび／または筋特異的制御エレメントに動作可能に結合している、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。例えば、筋特異的制御エレメントは、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（切断型ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７（ＭＨＣおよびＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５−１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導核因子、ステロイド誘導エレメントまたはグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＭＨＣＫ７プロモーター（配列番号４）を含む。
【００７６】
本明細書に記載する例となるｒＡＡＶベクターは、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＣであり、これは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、この場合、ＭＣＨＫ７プロモーターは、ヌクレオチド１３６〜９２７（配列番号４）にわたり、イントロンは、ヌクレオチド９３７〜１０８４（配列番号５）にわたり、γサルコグリカン配列は、ヌクレオチド１０９４〜１９６９（配列番号１）にわたり、ポリＡは、ヌクレオチド１９７６〜２０２８（配列番号６）にわたる。図１を参照されたい。一部の場合では、ｒＡＡＶベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、逆位末端反復であり、これは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要とされる。一部の場合では、７〜１１６ヌクレオチドにわたるイントロン（配列番号５）、および２１２８〜２２３１ヌクレオチドにわたる５’ＵＴＲ（配列番号７）は、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。ある特定の場合では、３’ＵＴＲは、配列番号８に記載する配列を含む。ある特定の場合では、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＣは、ＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシドにパッケージングする。
【００７７】
本開示のＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）による感染に耐えられる細胞に導入して、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子内に集合させる。パッケージングしようとしているＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞にもたらされる、ｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの生成では、次の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわちゲノム内に存在しない）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書においてパッケージング細胞として表す）内に存在することが必要とされる。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲと異なるＡＡＶ血清型由来であってもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３およびＡＡＶ  ｒｈ．７４を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の態様では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２の逆位ＩＴＲ配列を含み、ＡＡＶ  ｒｈ．７４のカプシドによりカプシド形成される。ある特定の場合では、ｒＡＡＶベクターのゲノムは、配列番号１１に記載するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の場合では、ＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシドは、配列番号１０に記載するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１１に記載するヌクレオチド配列と例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超えて同一の配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになるポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１０に記載するＡＡＶ  ｒｈ．７４ＶＰ３のアミノ酸配列と例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超えて同一の配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになるポリペプチドを含む。
【００７８】
パッケージング細胞系を生成する方法は、ＡＡＶ粒子生成に必要なすべての成分を安定に発現する細胞系を作製することである。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド（または複数のプラスミド）を細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓ６．  ＵＳＡ，  ７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの追加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｇｅｎｅ，  ２３：６５−７３）などの手順により、または直接的平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ  ＆  Ｃａｒｔｅｒ，  １９８４，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５９：４６６１−４６６６）により、細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞系を、ヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルスにより感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模な生成に適することである。適する方法の他の例では、プラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。ある特定の場合では、ｒＡＡＶベクターのゲノムは、配列番号１１に記載するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の場合では、ＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシドは、配列番号１０に記載するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１１に記載するヌクレオチド配列と例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超えて同一の配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになるポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１０に記載するＡＡＶ  ｒｈ．７４ＶＰ３のアミノ酸配列と例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超えて同一の配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになるポリペプチドを含む。
【００７９】
ｒＡＡＶ生成の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，  １９９２，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １５３３−５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ，  １９９２，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５８：９７−１２９に総説が記載されている。種々のアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４：２０７２  （１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６４６６  （１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３２５１  （１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６２：  １９６３  （１９８８）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：３４９  （１９８８）に記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６３：３８２２−３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；国際公開第９５／１３３６５号および対応する米国特許第５，６５８，７７６号；国際公開第９５／１３３９２号；国際公開第９６／１７９４７号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第９８／１８６００号；国際公開第９７／０９４４１号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第９６／１４４２３号）；国際公開第９７／０８２９８号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第９６／１３８７２号）；国際公開第９７／２１８２５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第９６／２０７７７号）；国際公開第９７／０６２４３号（国際出願ＰＣＴ／ＦＲ第９６／０１０６４号）；国際公開第９９／１１７６４号；Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：  １２４４−  １２５０；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９−６１５；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：  １１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；ならびに米国特許第６，２５８，５９５号。前述の文書は、本出願により、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ生成に関する文書の節に特に重点を置く。
【００８０】
したがって、本開示では、感染性ｒＡＡＶを生成するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、安定に形質転換するがん細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＰｅｒＣ．６細胞（同族の２９３株）であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換しないがん細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１により形質転換したヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）およびＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）の細胞である。
【００８１】
本開示の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド形成ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。実施形態は、配列番号３に記載するポリヌクレオチド配列を含む、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＣと名付けられたｒＡＡＶを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
ｒＡＡＶは、当技術分野において標準的な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配により精製し得る。ｒＡＡＶベクターをヘルパーウイルスから精製するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １０（６）：  １０３１−１０３９  （１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ６９  ４２７−  ４４３  （２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号および国際公開第９８／０９６５７号に記載されている方法を含む。
【００８３】
別の実施形態では、本開示では、本開示のｒＡＡＶを含むか、またはこれから本質的になる組成物を検討する。本明細書に記載する組成物は、薬学的に許容される担体中にｒＡＡＶを含むか、またはこれから本質的になる。特定の一実施形態では、本開示の組成物は、乳酸リンゲル液（ＬＲＳ）を含むか、またはこれから本質的になる。また、組成物は、他の成分、例えば、希釈剤およびアジュバントを含み得る。許容される担体、希釈剤およびアジュバントは、レシピエントに対して無毒であり、好ましくは、用いる用量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸の緩衝液；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。開示する組成物は、それを必要とする被験体におけるγサルコグリカン異常症の処置；筋力、筋持久力、および／もしくは筋量の増加、線維症の低減、収縮誘発性損傷の低減、脂肪浸潤の減少、ならびに／または中心核形成の減少、ならびに／または筋ジストロフィーに罹患している被験体における筋ジストロフィーの処置、変性線維もしくは壊死線維の低減、炎症の低減、クレアチンキナーゼレベルの上昇、筋線維の萎縮および肥大の処置、ならびに／またはジストロフィー性石灰化の減少のうちの１つまたは複数に使用することができる。
【００８４】
本開示の方法において投与するｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、処置目標、個体、および標的とする細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野において標準的な方法により決定し得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌあたり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３〜約１×１０１４またはこれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲に及び得る。また、用量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）単位で表し得る。
【００８５】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的細胞をｒＡＡＶにより形質導入する方法を本開示により検討する。用語「形質導入」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで、目的のポリヌクレオチド（例えば、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列）を、記載する複製欠損ｒＡＡＶによりレシピエント細胞へ投与／送達して、レシピエント細胞によるγサルコグリカンの発現を生じさせることを指すために使用する。
【００８６】
一態様では、それを必要とする被験体における、γサルコグリカン異常症の処置、筋力、筋持久力、および／もしくは筋量の増加、線維症の低減、収縮誘発性損傷の低減、脂肪浸潤の減少、ならびに／または中心核形成の減少、ならびに／あるいは筋ジストロフィーに罹患している被験体における、筋ジストロフィーの処置、変性線維もしくは壊死線維の低減、炎症の低減、クレアチンキナーゼレベルの上昇、筋線維の萎縮および肥大の処置、ならびに／またはジストロフィー性石灰化の減少のうちの１つまたは複数のための方法であって、方法が、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり、ｒＡＡＶベクターが、プロモーターの転写制御下でγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる遺伝子発現カセットであって、１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復と隣接する、遺伝子発現カセットを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、方法を本明細書において提供する。一部の実施形態では、前記プロモーターは、筋特異的制御エレメントである。一実施形態では、本明細書において開示する方法では、被験体の１つまたは複数の筋肉の筋力、筋持久力、および／または筋量が増加する。筋肉の非限定的な例としては、心臓、横隔膜、大腿、下腿、骨盤帯、肩、および腕の筋肉が挙げられる。特定の一実施形態では、筋力、筋持久力、および／または筋量は、未処置対照被験体と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約８０％増加する。
【００８７】
特定の一態様では、被験体は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。さらなる態様では、被験体は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型である肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。
【００８８】
ポリヌクレオチドの被験体への送達に関する用語「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、意図する機能を果たすようにポリヌクレオチドを被験体に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、任意の適する経路により行うことができ、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、頭蓋内、または局所を含む。さらなる投与経路は眼窩内、輸注、動脈内、関節内、心臓内、皮内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管を含む。投与は、自己投与および他己投与を含む。
【００８９】
一態様では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる組成物を投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。さらなる態様では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含むか、もしくはこれから本質的になるか、もしくはこれからまたさらになる組成物を、筋肉内注射または静脈内注射により投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。またさらなる態様では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含むか、もしくはこれから本質的になるか、もしくはこれからまたさらになる組成物を全身投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。特定の一態様では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含むか、もしくはこれから本質的になるか、もしくはこれからまたさらになる組成物を、注射、輸注、または移植により非経口投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。
【００９０】
一態様では、本明細書に記載する方法における使用のためのｒＡＡＶベクターのγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載するヌクレオチド配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。別の態様では、ｒＡＡＶベクターのγサルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。また別の態様では、本明細書に開示する方法において使用するｒＡＡＶベクターは、自己相補性ＡＡＶベクターゲノムを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。特定の一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ  ＤＮＡを欠くゲノムを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３またはＡＡＶ  ｒｈ７４のベクターである。さらなる態様では、ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ  ｒｈ７４であり、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシドを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。またさらなる態様では、ｒＡＡＶベクターのＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシドは、配列番号１０に記載するアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。
【００９１】
本明細書に開示する方法において使用するｒＡＡＶベクターは、プロモーターおよび／または筋特異的制御エレメントをさらに含むか、またはこれから本質的になることがあり、この場合、筋特異的制御エレメントは、γサルコグリカンをコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合している。一部の筋特異的制御エレメントの非限定的な例は、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７、Ｃ５−１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導核因子、ステロイド誘導エレメント、およびグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である。一態様では、ｒＡＡＶベクターの筋特異的制御エレメントは、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）である。別の態様では、ｒＡＡＶベクターのプロモーターおよび／または筋特異的制御エレメントは、ＭＨＣＫ７プロモーターである。さらなる態様では、ＭＨＣＫプロモーターは、配列番号３に記載するヌクレオチド配列またはその等価物を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。
【００９２】
一実施形態では、本明細書に開示するｒＡＡＶベクターのゲノムは、配列番号５に記載するヌクレオチド配列を含むイントロンを含む。
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの方法は、本開示のｒＡＡＶを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、有効な単回用量の、または有効な複数回用量の組成物を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。障害／疾患の発生前に用量を投与する場合、投与は、予防的である。障害／疾患の発生後に用量を投与する場合、投与は、治療的である。本開示の実施形態では、有効な単回用量は、処置する障害／疾患の状態と関連する少なくとも１つの症状を軽減（除去もしくは低減）し、障害／疾患の状態への進行を遅延もしくは予防し、障害／疾患の状態の進行を遅延もしくは予防し、疾患の程度を弱め、疾患の寛解（部分的もしくは完全に）を生じ、および／または生存を延ばす用量である。本開示の方法による予防または処置について検討する疾患の例は、筋ジストロフィー、例えば、肢帯型筋ジストロフィーである。一部の実施形態では、本開示の方法による予防または処置について検討する疾患は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型（ＬＧＭＤ２Ｃ）である。
【００９４】
用語「筋ジストロフィー」は、本明細書において使用する場合、強度および筋量（ｍｕｓｃｌｅ  ｂｕｌｋ）が徐々に低下する障害を指す。筋ジストロフィー疾患の非限定的な例としては、ベッカー型筋ジストロフィー、脛骨筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス方筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、サルコグリカン異常症、先天性筋ジストロフィー、例えば、ＬＡＭＡ２の部分的欠損による先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、ＩＤ型先天性筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、肢帯１Ａ型筋ジストロフィー、肢帯２Ａ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｂ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｃ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｄ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｅ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｆ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｇ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｈ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｊ型筋ジストロフィー、肢帯２Ｋ型筋ジストロフィー、肢帯ＩＣ型筋ジストロフィー、単純型先天性表皮水疱症を伴う強直性脊椎筋ジストロフィー（ｒｉｇｉｄ  ｓｐｉｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、およびウルリッヒ型硬化性筋ジストロフィー（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｓｃｌｅｒｏａｔｏｎｉｃ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）が挙げられ得る。一部の実施形態では、被験体は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。一部の実施形態では、被験体は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型（ＬＧＭＤ２Ｃ）に罹患している。
【００９５】
少なくとも１９種のＬＧＭＤ型が存在し、型は、それらの関連する遺伝的欠陥により分類される。
【表１−７】
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【００９６】
一部の態様では、本開示は、被験体において筋ジストロフィー（例えば、ＬＧＭＤ２Ｃ）を処置する方法であって、本明細書に記載するγサルコグリカンをコードする治療有効量のｒＡＡＶベクター、またはこのようなｒＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物を被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、方法に関する。
【００９７】
一部の実施形態では、本開示では、筋ジストロフィー（例えば、ＬＧＭＤ２Ｃ）に罹患している被験体において筋力、筋持久力および／または筋量を増加させる方法であって、本明細書に記載するγサルコグリカンをコードする治療有効量のｒＡＡＶベクター、またはこのようなｒＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物を被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、方法を提供する。
【００９８】
ある特定の態様では、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＬＧＭＤ２Ｃ）に罹患している被験体において収縮誘発性損傷を低減する方法であって、本明細書に記載するγサルコグリカンをコードする治療有効量のｒＡＡＶベクター、またはこのようなｒＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物を被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、方法を包含する。
【００９９】
ある特定の態様では、本開示は、被験体においてγサルコグリカン異常症を処置する方法であって、本明細書に記載するγサルコグリカンをコードする治療有効量のｒＡＡＶベクター、またはこのようなｒＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物を被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、方法を包含する。
【０１００】
また、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＬＧＭＤ２Ｃ）に罹患している被験体において線維症を低減する方法であって、本明細書に記載するγサルコグリカンをコードする治療有効量のｒＡＡＶベクター、またはこのようなｒＡＡＶベクターを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物を被験体に投与するステップを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、方法を包含する。用語「線維症」は、本明細書において使用する場合、骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、および膵臓を含む損傷時の組織における、細胞外基質（ＥＣＭ）成分の過剰または無制御な堆積、および修復過程の異常を指す。堆積するＥＣＭ成分は、コラーゲン、例えば、コラーゲン１、コラーゲン２またはコラーゲン３、およびフィブロネクチンを含む。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する方法により処置する被験体は、哺乳動物であり得る。一部の場合では、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウスまたはラットである。被験体は、ヒト女性またはヒト男性であり得る。一部の場合では、被験体は、１〜７、７〜１５、１６〜２５、２６〜５０、５０〜７０歳の間または７０歳を超える年齢のヒト被験体である。他の年齢範囲を検討し、これは、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、６０〜７０または７０歳を超える年齢、ならびに前述に含まれる任意の範囲を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
本明細書において使用する場合、用語「必要とする患者」または「必要とする被験体」は、本明細書において提供する、γサルコグリカンをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ、またはこのようなｒＡＡＶを含むか、もしくはこれから本質的になる組成物による処置または好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）に適する疾患、障害または状態のリスクを有するか、またはこれに罹患している患者または被験体を指す。必要とする患者または被験体は、例えば、γサルコグリカンの機能不全と関連する疾患、例えば、ＬＧＭＤ２Ｃと診断された患者または被験体であり得る。被験体は、γサルコグリカン遺伝子またはタンパク質の変異または機能不全を有し得る。「被験体」および「患者」は、本明細書において互換的に使用する。
【０１０３】
また、本明細書に開示する組成物の１つまたは複数およびコルチコステロイドを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる、併用療法を本開示により検討する。本明細書において使用する組合せは、同時処置または逐次処置を含む。本開示の方法の標準的薬物処置（例えば、コルチコステロイド）との組合せは、新規治療との組合せと同様に、詳細に検討する。一部の実施形態では、被験体は、ステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、デフラザコート）により処置して、本明細書に記載するｒＡＡＶの投与に対する免疫応答を予防または低減し得る。ある特定の場合では、被験体が、本明細書に記載するｒＡＡＶに対する抗体を発現する場合、被験体に、アファレーシスまたは別の免疫調節因子を施し得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、１回または複数回の範囲に及ぶ投与において、約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅｉ３ｖｇ／ｋｇ〜約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１３〜約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３〜約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３〜約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ〜約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ〜約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４〜約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲の用量のｒＡＡＶである。また、本開示は、このような範囲のｒＡＡＶベクターを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる組成物を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。
【０１０５】
例えば、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量である。また、本開示は、このような用量のｒＡＡＶベクターを含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる組成物を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになる。
【０１０６】
一部の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶは、約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１５ｖｇ／ｋｇまたは約１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１６ｖｇ／ｋｇの範囲に及ぶ用量のｒＡＡＶである。本開示では、一部の実施形態において、約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約１．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約２．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約３．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約６．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約７．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約８．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約９．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約１．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約２．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約３．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約４．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１５ｖｇ／ｋｇの用量で本開示のｒＡＡＶベクターを被験体に投与する方法を提供する。本開示では、一部の実施形態において、約４．０ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４．９ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．０ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５．９ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約６ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総用量で本開示のｒＡＡＶベクターを被験体に投与する方法を提供する。
【０１０７】
種々の実施形態では、投与するステップは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはこれを超える分割用量で総用量を投与することを含み得る。例えば、総用量は、被験体の複数の部位へ、または数分、数時間、もしくは数日にわたる間隔をあけた被験体への注射により送達し得る。
【０１０８】
有効量の組成物の投与は、それらに限定されないが、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または腟を含む、当技術分野において標準的な経路によってであり得る。投与経路（複数可）、および本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ  ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の血清型（複数可）は、処置する感染症および／または疾患の状態、ならびにγサルコグリカンを発現させる標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者により選択および／または適合され得る。
【０１０９】
本開示では、有効用量の本開示のｒＡＡＶおよび組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与は、循環系へ投与して全身に影響させることである。全身投与は、腸内投与、例えば、胃腸管による吸収、および注射、輸注または移植による非経口投与を含む。
【０１１０】
特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織内に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成し得る。本開示による投与は、筋肉、血流および／または直接肝臓への注射を含むが、これらに限定されない。リン酸緩衝食塩水中へのｒＡＡＶの単純な再懸濁は、筋組織発現に有用なビヒクルの提供に十分であることが実証されており、担体またはｒＡＡＶと同時投与され得る他の成分に対する公知の制限は存在しない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の方法において回避すべきである）。
【０１１１】
ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、修飾して、ｒＡＡＶを目的の特定の標的組織、例えば、筋肉に対して標的化し得る。例えば、国際公開第０２／０５３７０３号を参照されたく、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。医薬組成物は、注射製剤または局所製剤として調製して、経皮輸送により筋肉に送達することができる。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤が、これまでに開発されており、本開示の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、任意の薬学的に許容される担体とともに使用して、投与および取扱いを容易とすることができる。
【０１１２】
筋肉内注射の目的のために、アジュバント、例えば、ゴマもしくはピーナツ油中、または水性プロピレングリコール中の溶液を、無菌水溶液とともに用いることができる。このような水溶液は、必要に応じて緩衝することができ、はじめに液体希釈剤を食塩水またはグルコースにより等張化する。遊離酸（ＤＮＡが酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｐｒｏｐｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）と適切に混合した水中に調製することができる。また、ｒＡＡＶの分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中、ならびに油中に調製することができる。保管および使用の通常の条件下では、このような調製物は、保存剤を含み、微生物の増殖を防ぐ。これに関して、用いる無菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準的技術により容易に入手可能である。
【０１１３】
注射による使用に適する薬学的形態は、無菌注射用溶液または分散物の即時調製のための、無菌水溶液または分散物および無菌粉末を含む。あらゆる場合において、形態は、注射針を容易に通過可能である範囲において、無菌でなければならず、流動性でなければならない。これは、製造および保存条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、適するこれらの混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用により、分散物の場合、必要とする粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により、もたらすことができる。多くの場合、これは、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用により、もたらすことができる。
【０１１４】
無菌注射用溶液は、必要量のｒＡＡＶを、適切な溶媒に、上に列挙する種々の他の成分とともに組み入れ、必要に応じて、その後、ろ過滅菌することにより調製する。一般に、分散物は、塩基性分散媒および上に列挙するものの中から必要とする他の成分を含む無菌ビヒクルに、滅菌した活性成分を組み入れることにより調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分と任意のさらなる所望の成分の粉末が、これまでに無菌ろ過したその溶液から得られる。
【０１１５】
また、ｒＡＡＶによる形質導入は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行し得る。一実施形態では、所望の標的筋細胞は、被験体から取り出し、ｒＡＡＶにより形質導入し、被験体に再導入する。あるいは、同系または異種の筋細胞を使用することができ、この場合、このような細胞は、被験体において不適切な免疫応答を生じない。
【０１１６】
被験体への形質導入および形質導入細胞の再導入に適する方法は、当技術分野において公知である。一実施形態では、細胞は、ｒＡＡＶを筋細胞と、例えば、適切な培地中で混合し、従来の技術、例えば、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲを使用して、または選択マーカーを使用して、目的のＤＮＡを含む細胞についてスクリーニングすることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入することができる。次いで、形質導入細胞は、医薬組成物に製剤化することができ、組成物は、種々の技術により、例えば、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射により、または例えば、カテーテルを使用した平滑筋および心筋への注射により、被験体に導入することができる。
【０１１７】
本開示のｒＡＡＶにより細胞に形質導入すると、γサルコグリカンの発現が持続する。したがって、本開示では、γサルコグリカンを発現するｒＡＡＶを、哺乳動物被験体、好ましくは、ヒトに投与／送達する方法を提供する。このような方法は、本開示の１つまたは複数のｒＡＡＶにより、組織（組織、例えば、筋肉、臓器、例えば、肝臓および脳、ならびに腺、例えば、唾液腺を含むが、これらに限定されない）に形質導入するステップを含む。形質導入は、組織特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットにより行い得る。例えば、本開示の一実施形態では、それらに限定されないが、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリー［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１  ：  ７６１−７６６  （１９９１）を参照］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：  ４８５４−４８６２  （１９９１）］、ヒト骨格筋アクチン遺伝子に由来する制御エレメント［Ｍｕｓｃａｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ７：  ４０８９−４０９９  （１９８７）］、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列エレメント［Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｈ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ９：３３９３−３３９９  （１９８９）を参照］およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント、骨格筋速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子および遅筋トロポニンＩ遺伝子：低酸素誘導核因子（Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｈ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８８：  ５６８０−５６８４  （１９９１））に由来する制御エレメント、ステロイド誘導エレメント、およびグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５６０３−５６０７  （１９９３）を参照）、ならびに他の制御エレメントを含む筋特異的制御エレメントにより方向づけられた形で、筋細胞および筋組織に形質導入する方法を提供する。
【０１１８】
筋組織は、必須な臓器ではなく接触が容易であるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡ送達において魅力的な標的である。本開示では、形質導入された筋線維からの導入遺伝子（例えば、γサルコグリカン）の持続発現を検討する。
【０１１９】
「筋細胞」または「筋組織」により、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管または心臓組織に由来する、例えば、骨格筋および平滑筋）に由来する細胞または細胞の群を意味する。このような筋細胞は、分化または未分化であり、例えば、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞および心筋芽細胞であり得る。
【０１２０】
したがって、γサルコグリカンをコードする有効用量（または本質的に同時に投与する用量もしくは間隔を置いて与えられる用量）のｒＡＡＶを、それを必要とする哺乳動物被験体に投与する方法をまた本明細書において記載する。
【０１２１】
本明細書に開示する実施形態の１つまたは複数のいずれか、および必要に応じて使用のための指示を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになるキットを本明細書において、さらに提供する。キットは、本明細書に開示する組成物の１つまたは複数およびコルチコステロイドまたは本明細書において提供する併用療法の１つもしくは複数および必要に応じて使用のための指示を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからまたさらになり得る。
【０１２２】
本開示が、記載する特定の態様に制限されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることが理解される。また、本開示の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、限定することを意図しないことが理解される。
【０１２３】
本開示の多数の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、種々の修飾形態が、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、行われ得ることが理解される。したがって、以下の例では、特許請求の範囲に記載する開示の範囲を、例示することを意図するが、限定することは意図しない。
【０１２４】
明示的に記載せず、他に意図しない限り、本技術が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、このようなものの等価物または生物学的等価物が、本技術の範囲内であることを意図することが推測されるべきである。
【０１２５】
任意の特許、特許出願、刊行物または他の任意の文書の引用は、前述のいずれかが、関連先行技術であることを承認するものでもなく、このような刊行物または文書の内容または日付に関して任意の承認を成すものでもない。
【０１２６】
本明細書において開示する特徴のすべては、任意の組合せで併用し得る。本明細書において開示する各特徴は、同一に作用する代替の特徴、等価物、または類似の目的により置換し得る。したがって、他に明示的に指示しない限り、開示する特徴（例えば、抗体）は、等価物または類似の特徴の一属の例である。
【０１２７】
本明細書において使用する場合、すべての数値または数値範囲は、文脈上他に明らかに指示しない限り、このような範囲内の整数および範囲内の値または整数の分率を含む。さらに、値のリストを本明細書において記載する場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、リストは、すべてのその中間値および小数値を含む（例えば、５４％、８５．４％）。したがって、例えば、８０％またはこれを超える同一性への参照は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、ならびに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等、およびその他を含む。
【０１２８】
それを超える（それよりも大きい）、またはそれ未満の整数の参照は、それぞれ基準数よりも大きいまたは小さい任意の数字を含む。したがって、例えば、１００未満への参照は、９９、９８、９７等から減少して１の数に至るまでを含み、１０未満は、９、８、７等から減少して１の数に至るまでを含む。
【０１２９】
本明細書において使用する場合、すべての数値または範囲は、文脈上他に明らかに指示しない限り、このような範囲内の値および整数の分率、ならびにこのような範囲内の整数の分率を含む。したがって、例えば、数値範囲、例えば、１〜１０への参照は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ならびに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、およびその他を含む。したがって、１〜５０の範囲への参照は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、５０を含むそれ以下、ならびに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等、およびその他を含む。
【０１３０】
一連の範囲への参照は、その連続内の種々の範囲の境界値を組み合わせた範囲を含む。したがって、例えば、一連の範囲、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００または８，０００〜９，０００の範囲への参照は、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００等の範囲を含む。
【０１３１】
前述への修飾は、本技術の基本的態様から逸脱することなく、加えることができる。本技術は、１つまたは複数の特定の実施形態を参照して、実質的に詳細に記載されているが、当業者は、本出願において詳細に開示する実施形態に変更を加えることができ、なお、このような修飾および改良は、本技術の範囲および趣旨の内であることを認識する。
【０１３２】
本明細書において例示的に記載する技術は、本明細書において詳細には開示しない任意のエレメント（複数可）の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置換することができる。用いられている用語および表現は、説明するための用語であり非限定的な用語として使用し、このような用語および表現の使用は、示し記載する特徴の任意の等価物またはその断片を除外せず、種々の修飾修態が、特許請求する本技術の範囲内で可能である。
【０１３３】
本明細書において言及する、すべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許のそれぞれが参照により組み込まれると詳細かつ個別に示すのと同様に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先される。しかし、本明細書において引用する任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願への言及は、それらが、有効な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における共通の一般知識の一部を形成するという、承認または任意の形態の示唆として解釈せず、解釈するべきではない。
【０１３４】
本明細書では、任意の濃度の範囲、パーセンテージの範囲、比の範囲、または整数の範囲は、他に指示しない限り、列挙する範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分率（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。用語「約」は、数または数値の前に直接付く場合、数または数値が、プラスマイナス１０％の範囲に及ぶことを意味する。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書において使用する場合、他に指示しない限り、列挙する成分の「１つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方、またはこれらの任意の組合せを意味すると理解されるべきである。用語「および／または」は、選択肢のいずれか１つ、または両方を意味することが理解されるべきである。本明細書において使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義的に使用する。
【０１３５】
本明細書において使用する節の見出しは、単なる構成目的のためのものであり、記載する主題を限定するものとして解釈されない。
【０１３６】
本開示は、以下の実施例において、さらに記載し、これは、特許請求の範囲に記載する本開示の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１：ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢの構築およびベクター効力）
コドン最適化完全長ヒトγサルコグリカン（ＳＣＧＢ）ｃＤＮＡ（配列番号１）を含むＳＧＣＧ  ＡＡＶ構築物を、図１に示すように構築した。形質導入効率をより効率的にするために、自己相補性ＡＡＶ骨格を使用してパッケージングされるようにＳＧＣＧ  ＡＡＶ構築物を構成した。ＳＧＣＧ  ｃＤＮＡ（９６９）を、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９２ｂｐ）により駆動させるように構成した。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来した。ＳＧＣＧ  ＡＡＶ構築物は、ＡＴＧ開始コドンの直前にコンセンサスコザックを有し、またｍＲＮＡ終結のための小型の５３ｂｐ合成ポリＡシグナルを有した。ｃＤＮＡは、ヒトへの使用のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により合成された。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ＡＡＶ２の逆位末端反復であり、これは、ウイルスＤＮＡ複製とパッケージングの両方に必要であった。
【０１３８】
この試験のためのベクターは、研究グレード条件下で、ＨＥＫ２９３細胞の３重トランスフェクション方法を利用して生成した。生成後のベクターの特徴付けは、スーパーコイルの標準物質を用いたｑＰＣＲによる力価の決定、エンドドキシンレベル（ＥＵ／ｍＬ）の決定および無菌性の評価を含んだ。生成したベクターは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析して、予想されるｒＡＡＶとのバンド形成パターンの一貫性を検証した。ベクター調製物は、線状プラスミド標準物質を用いて力価を測定し、スーパーコイルのプラスミド標準物質により力価を再測定した。ベクターは、完全長ヒトγサルコグリカンｃＤＮＡ（ＮＣ＿００００１３．１１）、発現を駆動する筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーター、コンセンサスコザック配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、合成ポリアデニル化部位（５３ｂｐ）を含むプラスミドを使用して生成した（図１）。ＳＧＣＧ発現カセットは、自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶｒｈ．７４ベクターにパッケージングしたＡＡＶ２  ＩＴＲ間にクローン化して、心臓組織への形質導入を増強する。
【０１３９】
この試験デザインの概要を表２に提供する。用量値は、ベクターゲノム（ｖｇ）の総数のｑＰＣＲ評価により決定する。ベクター調製物に、部分的な完全ＡＡＶカプシドが少なくともいくらか含まれると、ｑＰＣＲ方法により、用量の過剰評価が生じ得る。したがって、所与の用量（例えば、５Ｅ＋１３）における有効性の決定では、ベクターを精製して部分的な完全ＡＡＶカプシドを除去すると、ｑＰＣＲにより測定した低いベクター用量において、有効性が認められ得ることを示唆する。表２におよび実施例を通して列挙した総用量（ｖｇ）および被験体１キログラムあたりのベクターゲノムに関する用量（ｖｇ／ｋｇ）は、部分的な完全ＡＡＶカプシドを考慮に入れていない。
【表２−１】
2021512072.tif 000010
【表２−２】
2021512072.tif 000011
【０１４０】
すべての有効動物は、４〜８週齢で処置し、注射後３カ月に剖検した。ＳＧＣＧ−／−陰性対照マウスは、４カ月齢で剖検した。
【０１４１】
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ試験物質の効力決定は、ＳＧＣＧ−／−マウスへのベクターの筋肉内および全身注射を実施することにより達成した。乳酸リンゲル液（ＬＲＳ）を注射した野生型マウスは、陽性対照として作用し、未注射のＳＧＣＧ−／−マウスは、陰性対照として作用する。
【０１４２】
８週齢のＢＬ６野生型（ＷＴ）マウスおよびγサルコグリカンノックアウト（γ−ＳＧ  ＫＯ）マウス由来の前脛骨（ＴＡ）筋を抽出し、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、各筋肉の組織学を検査した。このような非常に若年齢であっても、γ−ＳＧ  ＫＯマウスは、筋肉において、筋線維の壊死、炎症性浸潤物、および線維性組織の存在により疾患表現型を実証した（図２）。
【０１４３】
ＳＧＣＧ  ＡＡＶ構築物をｒｈ．７４血清型のＡＡＶにパッケージングして、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を生成し、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧと名付けた。合計３匹のマウスに注射して、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧの効力を決定した。ＬＲＳを注射したＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウス１匹、および未注射のＳＧＣＧ−／−マウス１匹は、それぞれ陽性および陰性対照として作用した。残りのマウス３匹は、ＳＧＣＧ−／−であり、ＬＴＡへのＩＭ（ｎ＝２）または尾静脈へのＩＶ（ｎ＝１）のいずれかによりｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを注射して、ベクターのロットが効力を有するかどうかを決定した。試験デザインを表３に要約する。
【表３】
2021512072.tif 000012
【０１４４】
４週齢のγ−ＳＧ  ＫＯマウスに筋肉内（ＩＭ）注射によりＴＡ筋へｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを総用量３ｅ１０ｖｇの用量で注射した。注射後４週（８週齢）にマウスを安楽死させ、ＴＡ筋を抽出し、液体窒素で冷却したメチルブタン中に新鮮凍結させた。γサルコグリカンについての免疫蛍光（ＩＦ）染色により、未注射の右ＴＡ（ＲＴＡ）筋においてγサルコグリカンの非存在が示され、注射した左ＴＡ（ＬＴＡ）筋において膜γサルコグリカンタンパク質発現のほぼ完全な回復が示された（図３Ａ）。γサルコグリカンについてのウエスタンブロット（図３Ｂ）により、２匹のＢＬ６  ＷＴ  ＴＡ筋におけるγサルコグリカン発現、γ−ＳＧ  ＫＯ  ＴＡ筋におけるタンパク質の非存在、および注射したマウス＃７９４および＃７９５由来のＴＡ筋におけるγサルコグリカンタンパク質発現の回復が示された。
【０１４５】
総用量３×１０１１ｖｇの特定用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧをＩＭによりＳＧＣＧ−／−マウスへ送達すると、注射したＬＴＡ筋において９３．０３％のｈＳＧＣＧ発現が生じた。これは、本発明者らのこれまで試験したβサルコグリカン（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ）ベクターのレベルに類似している。ベクターを投与したマウス（動物ＩＤ：７９４、７９５）の免疫蛍光イメージングにより、ｈＳＧＣＧ導入遺伝子の発現が確認される（図３Ａ）。２０×画像を含めて、注射した筋肉における発現量を可視化する。予想されたように、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウスは、１００％のγサルコグリカンタンパク質発現を示し、ＳＧＣＧ−／−マウスでは、γサルコグリカン発現が完全に存在しなかった（図３Ｃ）。
【０１４６】
尾静脈を介してＳＧＣＧ−／−マウス１匹（＃７９７）へ全身注射すると、高レベルのｈＳＧＣＧ導入遺伝子発現が生じた。出願人は、総用量１×１０１３ｖｇ（５×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧで処置した、このような有効マウスのすべての骨格筋において≧９４．００％の形質導入を達成することが可能であった。ＡＡＶにより送達されたｈＳＧＣＧ導入遺伝子発現の、解析した骨格筋のすべてを平均化したパーセントは、９５．９８％であった。また、出願人は、非常に高レベルの、全身送達時の心臓への形質導入を達成することができた。ｈＳＧＣＧの広範な発現を示す、すべての骨格筋ならびに横隔膜および心臓の代表的２０×免疫蛍光画像を図７に示す。
【０１４７】
（実施例２：ＢＬ６  ＷＴマウスにおけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢベクターの効力および毒性）
４週齢のＢＬ６ＷＴマウスのＴＡ筋に、筋肉内（ＩＭ）注射により総用量３ｅ１０ｖｇの用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを注射した。注射後４週（８週齢）にマウスを安楽死させ、ＴＡ筋を抽出し、液体窒素で冷却したメチルブタン中に新鮮凍結させた。γサルコグリカンについての免疫蛍光（ＩＦ）染色により、未注射の右ＴＡ（ＲＴＡ）筋においてγサルコグリカンについての膜染色が示され、注射した左ＴＡ（ＬＴＡ）筋においてγサルコグリカンタンパク質の過剰発現を意味する細胞内染色が示された（図４Ａ）。γサルコグリカンについてのウエスタンブロット（図４Ｂ）により、注射したＬＴＡ筋におけるγサルコグリカンタンパク質の過剰発現が示された。ＴＡ筋のＨ＆Ｅ染色により、毒性は示されず、未注射のＲＴＡまたは注射したＬＴＡのいずれにおいても、中心核、壊死線維、炎症性浸潤、または線維性組織のいずれも完全に存在しなかった（図５）。
【０１４８】
（実施例３：ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢの全身送達後の遺伝子発現）
４〜５週齢のγ−ＳＧ  ＫＯマウスの尾静脈に総用量１ｅ１２ｖｇ（５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。処置の６週後にマウスを安楽死させた。ＴＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）、四頭筋（ＱＵＡＤ）、殿筋（ＧＬＵＴ）、ＰＳＯＡＳ、三頭筋、横隔膜、および心筋に対する免疫蛍光染色により、γサルコグリカンの広範な発現が実証された（図６）。
【０１４９】
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ試験物質の有効性の決定は、単回用量（総用量１×１０１３ｖｇ、５×１０１４ｖｇ／ｋｇ）を使用した、ＳＧＣＧ−／−マウス（遺伝子型：ｓｇｃｇＣ５７）への全身注射を実施することにより達成した。臨床用量（総用量１×１０１２ｖｇ（５×１０１３ｖｇ／ｋｇ））、中間用量（総用量４×１０１２ｖｇ（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ））、および高用量（総用量１×１０１３ｖｇ（５×１０１４ｖｇ／ｋｇ））のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧをＳＧＣＧ−／−マウスの尾静脈へ全身注射し、注射後３カ月に安楽死させた。
【０１５０】
本発明者らのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ効力アッセイの結果に従って、出願人は、ＳＧＣＧ−／−マウス５匹への尾静脈注射によりベクターを総用量１×１０１３ｖｇ（５×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の発明者らによる有効用量で送達して、３カ月の延長時点で全身送達された場合の、本発明者らのベクターの導入遺伝子発現および有効性を評価した。４週齢のマウスに注射し、注射後３カ月に完全な剖検を実施した。効力アッセイにおいて上に考察したすべての骨格筋ならびに横隔膜および心臓を抽出して解析した。また、肺、腎臓、肝臓、脾臓、および生殖腺を含む臓器を採取して、毒性学および体内分布試験を行った。要するに、ｈＳＧＣＧ導入遺伝子発現は、３カ月の処置後も高いままであり、処置したマウス由来のすべての筋肉は、再び高度に形質導入された。これは、筋肉の組織病理の改善ならびにＴＡおよび横隔膜筋の機能の改善により達成された。ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターの全身送達により、筋肉または臓器において、いかなる毒性も誘導されなかった。
【０１５１】
γサルコグリカン発現
ヒトγサルコグリカンについての免疫蛍光染色を使用して、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターを全身注射した、すべてのＳＧＣＧ−／−マウスの左右両方の骨格筋６種に加えて横隔膜および心臓においてｈＳＧＣＧ導入遺伝子発現を決定した。このような筋肉は、ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＵＡＤ、ＧＬＵＴ、ＰＳＯＡＳ、ＴＲＩを含んだ。発現解析および形質導入効率の目的のために、処置したマウス５匹由来の左右の筋肉の画像を利用して定量した。各筋肉の２０×画像を４つ取得し、ｈＳＧＣＧ陽性線維のパーセント（陽性発現線維の数／線維の総数）を各画像について決定して、各マウス由来の各筋肉についての形質導入パーセントの平均を結果として生じさせた。図８Ａは、処置したマウスから取得した代表的画像を示し、横隔膜を含む定量したすべての筋肉を平均化した９２．２６％の高レベルの発現を実証する。また、出願人は再び、ベクターで処置したすべてのマウスの心筋において高レベルの形質導入を確認した。図８Ｂは、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターを静脈送達したマウス由来の、すべての骨格筋および心臓におけるｈＳＧＣＧ導入遺伝子の発現を確認するウエスタンブロットを示す。表４では、各マウスの各筋肉についての４つの２０×画像間の発現パーセントの平均、ならびにすべてのマウス５匹にわたる各筋肉の平均を列挙する。
【表４】
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【０１５２】
処置した筋肉の組織病理
骨格と心臓の両方のＳＧＣＧ−／−マウス由来の筋肉は、複数の限局性壊死部を有する明白な筋線維の萎縮および肥大を含む広範なミオパシーを示す。また、増え続ける単核細胞炎症数（リンパ球およびマクロファージと、点在する好中球）、ならびにジストロフィー性石灰化、脂肪浸潤、中心核形成、および線維症の増加が存在する。図９Ａのヘマトキシリン＆エオシン染色では、正常ＷＴマウスと比較した場合のＳＧＣＧ−／−マウスにおけるこのジストロフィー表現型、および処置後の筋病理の改善を示す。組織学的パラメータの定量により、ＳＧＣＧ−／−マウスの骨格筋における中心的に核形成した線維の数の有意な増加の後、γサルコグリカン遺伝子導入の結果として、多種多様な骨格筋における中心核形成の低減が示される（図９Ｂ）。さらに徹底的な筋組織病理解析により、ベクターで処置した罹患ＳＧＣＧ−／−マウスの調べた筋肉３つすべて（ＧＡＳ、ＰＳＯＡＳおよびＴＲＩ）において、平均線維径の増加を伴う線維サイズ分布の正常化が明らかとなる（図１０Ａ〜１０Ｆ）。種々の筋肉についての個々の中心核数および平均線維径を各マウスから解析した。
【０１５３】
（実施例４：γ−ＳＧ  ＫＯマウスの生理学的欠乏）
シリウスレッド染色を実施して、線維性組織の量を定量する。４カ月齢のγ−ＳＧ  ＫＯマウスおよびＢＬ６  ＷＴマウスを試験して、骨格筋における力の欠乏が存在するかどうかを評価する。前脛骨（ＴＡ）筋は、比筋力および損傷に対する耐性の顕著な減少について、対照と比較して試験する。また、横隔膜筋は、類似の方法で試験して、任意の顕著な減少を検出する。この測定可能な減少により、ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ療法の有効性を確立する機能的転帰尺度がもたらされる。
【０１５４】
（実施例５：ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢ処置後の機能的転帰）
定期的な３カ月の試験に基づいてγ−ＳＧ  ＫＯマウスのコホートに注射して、有効性および毒性を定量する（表５）。マウスを活動ケージ解析に供した後、安楽死させて、処置したマウスの全体的活動をγ−ＳＧ  ＫＯ対照と比較して決定する。ＴＡおよび横隔膜筋を生理学的解析に供して、比筋力出力および損傷／疲労に対する耐性を決定する。γ−ＳＧ  ＫＯ筋をＢＬ６  ＷＴ対照と比較して、処置したマウスにおける処置有効性の決定に使用する機能的転帰尺度を確立する。すべての骨格筋は、γサルコグリカンの発現についてＩＦ（免疫蛍光）染色し、組織病理についてＨ＆Ｅ染色する。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を、注射したマウス由来の筋肉および臓器について実施して、ベクターゲノムの体内分布を決定する。
【表５】
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【０１５５】
（実施例６：全身送達の機能的評価）
ｈＳＧＣＧ遺伝子導入により罹患筋肉に機能的利点がもたらされるかどうかを決定するために、出願人は、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＧで処置したＳＧＣＧ−／−マウス由来のＴＡおよび横隔膜筋の機能特性を評価した。実施例１〜５に概要を述べるように、はじめに、出願人は、マウスの四肢骨格筋および横隔膜の組織病理を、γサルコグリカンの非存在下で実証した。未処置ＳＧＣＧ−／−マウスのＴＡ筋のｉｎ  ｓｉｔｕでの解析により、正規化した比筋力の発生において、ＢＬ６  ＷＴ  ＴＡ筋と比較して、３７．６８％の統計学的に有意な減少が明らかとなった（ＢＬ６  ＷＴ：２９１．６５ｍＮ／ｍｍ２対ＳＧＣＧ−／−：１８１．７７ｍＮ／ｍｍ２）。比筋力出力は、処置後、ＳＧＣＧ−／−筋と比較して、正常ＷＴレベルまで有意に増加した（ＳＧＣＧ−／−：１８１．７７ｍＮ／ｍｍ２対処置：２６６．０２ｍＮ／ｍｍ２）（図１１Ａおよび図１１Ｃ）。ｈＳＧＣＧ遺伝子導入の機能的利点を決定する、さらなる一機能的転帰尺度は、伸張性収縮の反復後のＴＡ筋における収縮誘発性損傷に対する耐性を評価することである。正常ＢＬ６  ＷＴマウスのＴＡ筋は、１０回の伸張性収縮ラウンドの後に、未処置ＳＧＣＧ−／−ＴＡ筋における３７％の力の喪失と比較して、１８％の力の発生を失ったのみであった。ベクター処置ＳＧＣＧ−／−筋は、ＷＴを超えるレベルまで向上し、この場合、伸張性収縮（ＥＣＣ）プロトコールの後にほんの１０％の力の喪失を確認した（図１１Ｂ）。
【０１５６】
治療的ｈＳＧＣＧ導入遺伝子の全身送達から生じ、最終的に、ＳＧＣＧ−／−マウスの疾患表現型を改善させる機能的利点の可能性をさらに試験するために、オープンフィールドケージ活動のレーザーモニタリングをマウスのすべての群に実施した。図１２のグラフは、正常ＢＬ６ＷＴと比較して、ＳＧＣＧ−／−マウスのｘおよびｙ面における全歩行運動の２３．６４％の減少を示す（ＢＬ６  ＷＴ：７６５５．４２ビームブレーク／時対ＳＧＣＧ−／−：５８４６．００ビームブレーク／時）。ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置マウスは、定性的観察により、ＳＧＣＧ−／−マウスと比較して、全体的にさらに活動性であり、オープンフィールドのケージ活動の定量的測定では、２４．９０％の歩行運動の増加を示した（ＳＧＣＧ−／−：５８４６．００ビームブレーク／時対処置：７３０１．８０ビームブレーク／時）。また、個々のマウスにおける各パラメータの詳細値を測定した。
【０１５７】
（実施例７：毒性学およびベクター体内分布）
この試験の目的は、試験物質ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧの送達後３カ月のＳＧＣＧ−／−マウスにおけるｈＳＧＣＧ遺伝子治療の潜在的毒性または安全性への懸念を、上記と同一の動物を利用して評価することであった。総用量１．０×１０１３ｖｇ（５×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の試験物質を、午前と午後の２回の別々の注射２３０μＬに分割した４６０μＬの容量で、静脈内（ＩＶ）経路により、４週齢のＳＧＣＧ−／−５匹に与えた。未注射のＳＧＣＧ−／−マウス６匹は、未処置罹患対照として作用し、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウス５匹は、正常健常対照として作用した（表６）。完全な剖検をすべてのマウスについて実施して、６種の骨格筋（ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＵＡＤ、ＧＬＵＴ、ＰＳＯＡＳおよびＴＲＩ）を左右両側、横隔膜および心臓、ならびに肺、腎臓、肝臓、脾臓、および生殖腺を含む内臓とともに抽出した。本発明者らのベクターの安全性を評価するために、筋組織の凍結切片についてヘマトキシリン＆エオシン染色を実施し、回収したすべての臓器をホルマリンで固定し、また、ヘマトキシリン＆エオシンで染色した。次いで、このような切片は、独立した獣医病理学者により、毒性について公式に検査したところ、有害作用は検出されなかった。結果を以下の表７に要約する。組織病理報告の詳細も作成した。定量的ＰＣＲを実施して、ベクターの体内分布を評価した。このような結果を以下の表７および図１３に示す。
【０１５８】
ベクター形質導入組織の組織病理検査
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧの安全性および毒性学プロファイルを、全身送達を使用して決定するために、この前臨床試験由来のベクター投与ＳＧＣＧ−／−マウスおよび対照の群から回収した、横隔膜、ならびに心臓および他の５種の臓器を含む、すべての骨格筋をＨ＆Ｅで染色し、各組織の切片を、独立した獣医病理学者により公式に検査した。群の詳細および試験デザインを表６に示す。
【表６】
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【０１５９】
要約すれば、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧのＩＶ注射により、調べた任意の骨格筋の筋線維において、いかなる顕微鏡的変化も誘発されなかった（表７）。加えて、処置に関連する病変は、組織学的に評価した組織のいずれにおいても確認されず、試験物質の耐容性が良いことを示した。補遺Ｊの詳報を参照されたい（レポート番号ＡＡＶｒｈ７４−ＳＧＣＧ−ＭＯＵＳＥ−００１．１）。顕著な任意の変化は、処置マウスと対照マウスの両方において確認され、偶発的所見であると考えられた。その上、独立した検査により、対照マウス由来の基準検体と比較して、試験物質ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを投与すると、筋線維の萎縮、変性、および破壊が実質的に低減することが示され、ベクターにより、罹患マウスにおけるＳＧＣＧの非存在と関連するミオパシーの程度が好転可能であることを示唆した。
【表７】
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【０１６０】
ベクターゲノム体内分布
試験物質特異的ＤＮＡ配列の存在を、リアルタイム定量的ＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）を使用して調べた。ベクターを投与したＳＧＣＧ−／−動物２匹から採取した組織サンプルについて、体内分布解析を実施した。陽性シグナルは、検出されたゲノムＤＮＡ１μｇ当たりの１本鎖ＤＮＡ１００コピーと同等か、またはこれを超えるあらゆるものである。組織を剖検において回収し、ＭＨＣＫ７プロモーターの配列に対して特異的なベクター特異的プライマープローブセットを利用した。表８および図１３では、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ注射マウス由来の各組織サンプルにおいて検出されたベクターゲノムコピーを示す。
【０１６１】
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ転写物を、採取したすべての組織において、様々なレベルで検出した。予想されたように、静脈内送達経路の性質のため、ベクターは、肝臓において高レベルで検出されたが、骨格筋および心臓において最も高いレベルで確認された。最も低いレベルは、肺、腎臓、および脾臓において検出された。このようなデータは、試験物質が、ベクター投与マウスの調査したすべての組織に効率的に送達されたことを示す。
【表８】
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【０１６２】
血清化学の解析
肝機能をさらに評価するために、出願人は、通常の血清化学パラメータである２つの肝臓酵素、アルカリアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルを評価した。このような酵素のいずれかの上昇は、肝細胞の損傷および肝機能障害を意味し得る。出願人は、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウス全６匹、未処置ＳＧＣＧ−／−マウス全６匹、およびｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ投与マウス全５匹の由来の血清を解析した。図１４Ａは、未処置ＳＧＣＧ−／−マウスにおけるＡＬＴが上昇して、健常ＢＬ６  ＷＴマウスにおいて確認されるレベルの２倍となることを示す（ＢＬ６  ＷＴ：４４．２０Ｕ／Ｌ対ＳＧＣＧ−／−：８９．００Ｕ／Ｌ）。ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧをＳＧＣＧ−／−マウスへＩＶ送達すると、ＡＬＴレベルの３２．０２％の減少が生じた（ＳＧＣＧ−／−：８９．００Ｕ／Ｌ対処置：６０．５０Ｕ／Ｌ）。図１４Ｂは、マウスの３群すべてにおけるＡＳＴレベルが、未処置ＳＧＣＧ−／−マウスにおいて１１３．２７％の有意な上昇を示したことを示す（ＢＬ６  ＷＴ：３２６．００Ｕ／Ｌ対ＳＧＣＧ−／−：６９５．２５Ｕ／Ｌ）。このようなＡＳＴレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧの全身送達後に４１．１０％低減した（図１４Ｂ）。まとめると、肝臓損傷のバイオマーカーであると考えられる肝臓酵素が、罹患ＳＧＣＧ−／−マウスにおいて上昇するが、ＳＧＣＧ−／−罹患マウスにおいて全身ｈＳＧＣＧ遺伝子導入を行うと、ＡＬＴとＡＳＴの両方のレベルが正常化される。すべてのマウスにおいて、各酵素についての個々の値を決定した。
【０１６３】
結論として、ｈＳＧＣＢ導入遺伝子を保有する２つの異なる用量のＡＡＶウイルスの全身送達は、安全かつ無毒であると示された。試験した用量は、総用量１．２×１０１３ｖｇ（６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）および総用量１．０×１０１３ｖｇ（５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）を含む。特に、高用量（総用量１．０×１０１３ｖｇ−５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧの、ＳＧＣＧ−／−の尾静脈を介する全身送達は、罹患筋肉における、γサルコグリカン発現の回復およびジストロフィー組織病理の逆転において安全かつ有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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