(57)【要約】  本発明は、ＣＤ４−結合性ポリペプチドおよび抗ＨＩＶ広域中和抗体（抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）ポリペプチド、ならびにそれらの組合せを含む抗原結合性ポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインタンパク質および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドまたはそれらの組合せを含む抗原結合性ポリペプチドに関する。任意選択で、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド（Ｎ１７Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））および／またはｇｐ４１と結合するＨＩＶ融合ペプチド阻害剤部分も、抗原結合性ポリペプチド中に存在し得る。本発明はまた、ＨＩＶを治療するための治療的適用における本発明の革新的抗原結合性ポリペプチドの使用に関する。
2021507717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、
第１のポリペプチドドメインが、（ｉ）ＣＤ４結合性ポリペプチド、または（ｉｉ）ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、
第２のポリペプチドドメインが、抗ＨＩＶ広域中和抗体（ｂｎＡｂ）ポリペプチドまたはその断片である、抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２】
第１、第２および第３のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、
第１のポリペプチドドメインは、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、
第２のポリペプチドドメインは、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、
第３のポリペプチドドメインは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片である、抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドがそれぞれ、リンカーによって抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片に接続されている、請求項２に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項４】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドがそれぞれ、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域またはＬＣ領域に接続されている、請求項３に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項５】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域が、配列番号７、配列番号８、配列番号７７７、配列番号７７８または配列番号７７９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項３に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項６】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドがそれぞれ、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域に接続されている、請求項４に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項７】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域に接続されている、請求項４に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項８】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣに接続されており、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣに接続されている、請求項３に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項９】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣに接続されており、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣに接続されている、請求項３に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１０】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域が、配列番号６、配列番号７８０または配列番号７８１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含み、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域が、配列番号７、配列番号８、配列番号７７７、配列番号７７８または配列番号７７９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項８または９に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１１】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域が、配列番号６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項３に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１２】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域が、配列番号７９０のＬＣ領域の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１３】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域が、配列番号７８１のＬＣ領域の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１４】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域が、配列番号７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１５】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域が、配列番号８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１６】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域が、配列番号７７７のＨＣ領域の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１７】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域が、配列番号７７８のＨＣ領域の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１８】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域が、配列番号７７９のＨＣ領域の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１９】
ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２０】
ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤が、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドに接続されている、請求項１９に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２１】
第１のポリペプチドドメインが、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、第２のポリペプチドドメインが、抗ＨＩＶ広域中和抗体（ｂｎＡｂ）ポリペプチドまたはその断片である、請求項１に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２２】
第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、
第１のポリペプチドドメインが、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、
第２のポリペプチドドメインが、（ｉ）抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂもしくはその断片、（ｉｉ）１、２もしくは３つのアミノ酸改変を有する（ｉ）のＣＤＲバリアント、（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７８０もしくは配列番号７８１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含むＬＣ領域、および／または（ｉｖ）配列番号７、配列番号８、配列番号７７７、配列番号７７８もしくは配列番号７７９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含むＨＣ領域である、抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２３】
第１のポリペプチドドメインが、配列番号１３〜７１のうちいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるＦＧループ配列またはＣＤループ配列を含み、第２のポリペプチドドメインが、表８に記載される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２４】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、配列番号７２〜９１のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２５】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドが、Ａｐｅｘ（Ｖ１／Ｖ２）ｂｎＡｂ、Ｎ３３２グリカンｂｎＡｂ、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）ｂｎＡｂ、ｇｐ１２０−ｇｐ４１インターフェイスｂｎＡｂおよびＭＰＥＲ  ｂｎＡｂまたはそれらの断片から選択される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのクラスから選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２６】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７８に対して１００％同一である配列を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２７】
ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび請求項２１に記載の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含む抗原結合性ポリペプチドであって、ｇｐ４１のＮ１７  ｄドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドをさらに含む、抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２８】
ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、配列番号９２〜３４８のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、請求項２７に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２９】
第１および第２および／または第３のポリペプチドドメインが、リンカーによって、任意の順序で互いに接続されている、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３０】
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片が、Ｎ６  ｂｎＡｂ、ＶＲＣ０１抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂおよび１０Ｅ８ｖ４抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂから選択される、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３１】
ポリペプチド配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番号７６６、または配列番号７６７のうちいずれか１つを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、または配列番号７７２に対して１００％同一である抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ配列を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３３】
ＣＤ４結合性ポリペプチドが、カニクイザルＣＤ４と交差反応しない、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３４】
ＨＩＶ  ＣＤ４の二次または三次構造内のコンホメーションエピトープと結合する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３５】
療法において使用するための、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３６】
療法がＨＩＶ感染のためである、請求項３５に記載の療法において使用するための抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドおよび担体を含む医薬組成物。
【請求項３８】
ＨＩＶ感染の治療において使用するための、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドまたは請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ＨＩＶ感染のための医薬の調製のための、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質の使用。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドまたはその医薬組成物の有効量を投与することを含む、対象においてＨＩＶを治療する方法。
【請求項４１】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項４２】
ｂｎＡｂポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のｂｎＡｂポリペプチド領域をコードする核酸配列を含む、請求項４１に記載の核酸配列。
【請求項４３】
ＣＤ４結合性ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番号７６６、または配列番号７６７のＣＤ４結合性ポリペプチド領域をコードする核酸配列を含む、請求項４１に記載の核酸配列。
【請求項４４】
請求項４１、４２または請求項４３に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項４５】
請求項４１、４２または４３に記載の核酸配列または請求項４４に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドの産生のための方法であって、請求項４５に記載の宿主細胞を、核酸配列またはベクターの発現に適した条件下で培養することを含み、それによって、ＣＤ４結合性ポリペプチドおよび抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドが産生される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１８日に出願された米国特許仮出願第６２／５９９，９０２号の優先権を主張する。この出願の内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＣＤ４結合性ポリペプチドおよび抗ＨＩＶ広域中和抗体（抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）を含む抗原結合性ポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド（ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチド部分またはその組合せを含むポリペプチドに関する。ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド（Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））および／またはｇｐ４１と結合するＨＩＶ融合ペプチド阻害剤部分などのさらなるポリペプチド部分も存在し得る。本発明はまた、ＨＩＶを治療および／または予防するための治療的および予防的適用における、広域中和抗体を有する革新的ポリペプチドの使用に関する。
【０００３】
配列表
本出願は、２０１８年１２月１８日にＰａｔｅｎｔ−Ｉｎ  ３．５を使用して作成された５７４ｋＢの大きさのＰＲ６６４７５＿ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿Ｔｘｔと題された電子配列表において列挙された配列を含有し、その内容および配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）として知られるレトロウイルスによる感染の結果である。依然として大きな医学的問題であり、２０１５年末には世界中で推定３６７０万人が感染し、そのうち１８０万人が１５歳未満の小児である。さらに、２０１５年には２１０万の新規感染があり、流行の開始以来、ＡＩＤＳ関連状態のために３５００万人を超える人が死亡し、それには、２０１５年単年で１１０万人が含まれる（ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｇｏｖ）。
【０００５】
ＨＩＶ感染個体の現在の療法は、承認された抗レトロウイルス剤の組合せからなる。ＨＩＶ感染を治療するために２４種を超える薬物が、単剤、固定用量の組合せまたは単一錠剤レジメンのいずれかとして現在承認されており（ｈｔｔｐｓ：／／ａｉｄｓｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ−ｈｉｖ−ａｉｄｓ／ｆａｃｔ−ｓｈｅｅｔｓ／２１／５８／ｆｄａ−ａｐｐｒｏｖｅｄ−ｈｉｖ−ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ）、後者の２種は２〜４種の承認された薬剤を含有する。これらの薬剤は、ウイルス酵素またはウイルス生活環の間のウイルスタンパク質の機能のいずれかを標的とするいくつかの異なるクラスに属する。したがって、薬剤は、ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、インテグラーゼ阻害剤（ＩＮＩ）または侵入阻害剤（マラビロク、宿主ＣＣＲ５タンパク質を標的とする；エンフビルチドは、ウイルスｇｐ１６０タンパク質のｇｐ４１領域を標的とするペプチドである；イバリズマブは、宿主ＣＤ４タンパク質を標的とするモノクローナル抗体である）のいずれかとして分類される。さらに、抗ウイルス活性を有さない薬物動態エンハンサー（コビシスタット）は、追加免疫を必要とする抗レトロウイルス剤（ＡＲＶ）との併用のために承認されている。
【０００６】
薬剤および合剤の医療装備にもかかわらず、幾分かは、感染と闘うための慢性投薬のために必要なために新規抗レトロウイルス剤が依然として医学的に必要である。長期毒性と関連する重大な問題が実証されており、併存症（例えば、ＣＮＳ、ＣＶ／代謝、腎疾患）に対処し、予防する必要が生じている。また、現在の療法での失敗率が増大することは、耐性株の存在もしくは発生または休薬期間もしくは有害な副作用による非コンプライアンスのいずれかのために問題であり続ける。例えば、療法にもかかわらず、併用療法を受けている対象のうち６３％が、＞５００コピー／ｍｌのウイルス量を有していたのでウイルス血症のままであると推定されている（Ｏｅｔｔｅ，Ｍら、「Ｐｒｉｍａｒｙ  ＨＩＶ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｆｉｒｓｔ−Ｌｉｎｅ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｇｕｉｄｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ」、Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄ．、４１巻（５号）：５７３〜５８１頁（２００６年））。これらの患者の中で、７６％が、１つまたは複数のクラスの抗レトロウイルス剤に対して耐性であるウイルスを有していた。結果として、より便宜であり、耐性の発生に対して高い遺伝子障壁を有し、現在の薬剤を上回って安全性が改善されている新規薬物が必要とされる。
【０００７】
現在、細胞は、細胞膜とウイルス膜との間で融合が生じるプロセスによってＨＩＶに感染し得るということは周知である。このプロセスの一般的に認容されたモデルは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質複合体（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）が、標的細胞の膜上の細胞表面受容体と相互作用することである。ｇｐ１２０の細胞受容体（例えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４などのケモカイン共受容体と組み合わせたＣＤ４）との結合後、ｇｐ４１が標的細胞の膜に挿入され、膜融合を媒介することを可能にするコンホメーション変化が、ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体において誘導される。これらの侵入プロセスは細胞膜上で生じるので、それらは、生物学的ペプチドを含む高分子による阻害に適している（Ｈａｑｑａｎｉら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．、９８巻：１５８頁（２０１３年））。例えば、承認された抗ウイルスペプチドエンフビルチド（ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））は、膜融合に関与するｇｐ４１の領域を標的とする。モノクローナル抗体などの大きなポリペプチドもまた、ウイルス侵入の種々の態様を阻害し得る。ウイルス侵入の初期ステップ、細胞受容体ＣＤ４との結合後に生じるｇｐ１６０コンホメーション変化の阻害を標的とするモノクローナル抗体（イバリズマブ；Ｂｒｕｎｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、６５巻：１８３９頁（２０１０年））が、高度治療を経験した（ＨＴＥ）患者における使用のために最近承認され、共受容体ＣＣＲ５（ＰＲＯ−１４０；Ｔｅｎｏｒｉｏ、Ｃｕｒｒ．ＨＩＶ／ＡＩＤＳ  Ｒｅｐ．、８巻：１頁（２０１１年））を標的とする別のモノクローナル抗体は、現在第３相試験にある。これらの抗体はまた、長時間作用性抗レトロウイルス剤であるという特性を有し、イバリズマブは、静脈内注入によって送達される隔週投薬として既に承認されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１８／７６１０６５ｌｂｌ．ｐｄｆ、Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０１巻：１４８１頁（２０１０年）；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５３巻：４５０頁（２００９年））。
【０００８】
ペプチド侵入阻害剤（peptide entry inhibitor）の別の特性は、２種のペプチド阻害剤が互いに結合している場合には、または単一阻害剤が膜生体分子との結合による作用部位付近に局在する場合には、増強されたまたは相乗的な特性を得ることができるということである。したがって、それを標的細胞膜の表面に位置付けるための、融合ペプチド阻害剤の、ＣＣＲ５を標的とするモノクローナル抗体（Ｋｏｐｅｔｚｋｉら、Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．、５巻：５６頁（２００８年））との結合またはコレステロール部分の、ペプチド融合阻害剤のＣ末端との結合（Ｉｎｇａｌｌｉｎｅｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０６巻：５８０１頁（２００９年）；Ａｕｇｕｓｔｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、６９巻：１２８６頁（２０１４年））は、組み合わされた分子の効力を、別個の分子と比較して著しく増大する。同様に、イバリズマブに融合されたｇｐ１２０を標的とする抗ＨＩＶ−１中和抗体断片からなる二重特異性抗体は、個々の阻害剤と比較して効力の相乗的増大を示した（Ｓｕｎら、Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．、６６巻：４７３頁（２０１４年））。
【０００９】
ＨＩＶに対する免疫応答は、複雑であり、完全には理解されていない。ｇｐ１２０タンパク質およびｇｐ４１サブユニットを含むＨＩＶエンベロープ表面スパイクは、ＣＤ４およびＣＣＲ５細胞表面受容体と相互作用して、細胞へのウイルス侵入を促進する。ＨＩＶに対する免疫応答では、エンベロープ表面スパイクと結合する抗体のみが、ＨＩＶビリオンを直接中和できる。ＨＩＶは、特に、ＨＩＶエンベロープ表面スパイクの中和抗体による誘発および認識を逃れることによって、体液性免疫応答を逃れる手段を発達させた。広域中和抗体（ｂｎＡｂ）は、広範囲のウイルスに対して免疫学的に作用し得る抗体であるが、ＨＩＶの場合には、スパイク上のｂｎＡｂエピトープへの接近が困難であることによって、ＨＩＶエンベロープ表面スパイクの誘発および認識が妨げられる。最近、ＨＩＶ−１に対して活性な強力なｂｎＡｂの単離が報告された。１０Ｅ８などのある特定の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂは、ＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）を認識することによって、ＨＩＶ株の＞９７％を中和し、０．４０μｇ／ｍＬの中央値ＩＣ５０効力を有するとわかった（Ｈｕａｎｇら、「Ｂｒｏａｄ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｂｙ  ａ  ｇｐ４１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」Ｎａｔｕｒｅ、４９１巻、４００６〜４１２頁（２０１２年）を参照のこと）。関連１０Ｅ８  ｂｎＡｂバリアントとして、１０Ｅ８ｖ４、溶解度が改善されたバリアント（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｗｏｎら、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＨＩＶ−１−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  １０Ｅ８  ｔｈｏｕｇｈ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９０巻、５８９９〜５９１２頁（２０１６年））、Ｈｕａｎｇら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｑｕｉｓｉｔｅ  ＨＩＶ−１−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｃｅｌｌ１６５、１６２１〜１６３１頁（２０１６年）に記載されるものならびに参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｗｏｎら  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２２巻１７９８〜１８０９頁（２０１８年）に記載される１０Ｅ８バリアント１０Ｅ８ｖ４−１００ｃＷ、１０Ｅ８ｖ４−１００ｃＦおよび１０Ｅ８ｖ４−５Ｒ＋１００ｃＦが挙げられる。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書において記載される融合タンパク質／ポリペプチドと組み合わせた強力な抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂは、ＨＩＶ生活環のその他の成分も標的としながら、ＨＩＶエンベロープ表面スパイクを直接標的とすることによってＨＩＶ療法を増強する新規の、刺激的な方法に相当する。本明細書において記載されるように、融合ポリペプチドにおいて使用され得る抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂとして、４Ｅ１０（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｄｏｓｏら「Ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ４Ｅ１０  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ａ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｇｐ４１」Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２２巻、１６３〜１７３頁（２００５年）；Ｎ６、ＣＤ４結合部位を標的とする広域中和抗体（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｎｇら「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣＤ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＨＩＶ  ｔｈａｔ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｎｅａｒ−ｐａｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｄｔｈ」Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４５巻、１１０９〜１１２１頁（２０１６年）ならびに１０Ｅ８、４Ｅ１０およびＮ６またはそれらの断片の組合せが挙げられる。
【００１１】
ｂｎＡｂと組み合わされた、本明細書に記載の抗原結合融合ポリペプチド分子は、この治療戦略を利用する。
【００１２】
本発明は、（ｉ）ＣＤ４結合性ポリペプチドおよび抗ＨＩＶ広域中和抗体（抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）ポリペプチドを含み、任意選択で、さらなるｇｐ４１結合性ポリペプチドを含み、（ｉｉ）ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含み、任意選択で、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を含み、（ｉｉｉ）ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）であり得るＣＤ４結合性ポリペプチド、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドおよび任意選択で、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）であり得るｇｐ４１結合性ポリペプチドを含み、任意選択で、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤をさらに含み、または（ｉｖ）ＣＤ４結合性ポリペプチドおよび／またはｇｐ４１結合性ポリペプチドおよび／または抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチド（例えば、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたは抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片）を有するＨＩＶ融合ペプチド阻害剤の組合せを含む、（ａ）標的細胞のＣＤ４受容体および（ｂ）ＨＩＶエンベロープと結合する抗原結合性ポリペプチドに関する。
【００１３】
本発明の一実施形態は、（ｉ）抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ（例えば、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチド）に連結されたＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド、および／または（ｉｉ）ＣＤ４フィブロネクチンベースのポリペプチドに連結された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結されたｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド、および／または（ｉｉｉ）抗ＣＤ４フィブロネクチンベースのポリペプチドに連結された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに結合されたＨＩＶ融合ペプチド阻害剤を含む抗原結合性ポリペプチドに関する。
【００１４】
本発明の一実施形態では、（ｉ）ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド、（ｉｉ）ｇｐ４１のＮ１７ドメインおよび／またはＨＩＶ融合ペプチド阻害剤と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチドは、リンカー、例えば、本明細書において記載されるリンカーによって抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分または抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片に接続される。本発明の別の実施形態では、ＣＤ４結合性ポリペプチドおよび／またはＮ１７結合性ポリペプチドおよび／またはＨＩＶ融合ペプチド阻害剤は、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ  部分または抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片に任意の順序で接続され得る。
【００１５】
本発明はまた、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド（抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドまたは抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片、任意選択で、ｇｐ４１と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド（抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））および／または任意選択で、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤の組合せに関する。本発明の一実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および任意選択で、抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および／またはＨＩＶ融合ペプチド阻害剤は、リンカーによって、互いに、または抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分もしくは抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片に接続される。本発明の別の実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および任意選択で、抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ならびに／または任意選択で、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分もしくは抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片は、互いに任意の順序で接続され得る。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチド部分またはその断片を含むポリペプチドを提供し、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、表３に示されるＣＤおよび／またはＦＧループ領域を含む。本発明の別の実施形態は、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分またはその断片を含むポリペプチドを提供し、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、表３に示されるＣＤ／ＦＧループ組合せを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明は、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分またはその断片を含むポリペプチドであって、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）が、配列番号１３〜１６のＣＤまたはＦＧループ領域のうちいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分またはその断片を含むポリペプチドであって、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）が、配列番号１３または１５のＣＤループ領域のいずれか一方に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明は、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドであって、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）が、配列番号１４または１６のＦＧループ領域のいずれか一方に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号７２〜９１の非リンカー領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
別の実施形態は、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドを提供し、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分またはその抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片は、表８に記載される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分またはその抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片である。
【００２２】
特定の実施形態は、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ−１  ｂｎＡｂポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドを提供し、ＨＩＶ−１  ｂｎＡｂ部分またはその断片は、ＰＧ９、ＰＧＴ１２５−１３１、ＶＲＣ０１、３ＢＮＣ１１７、ＮＩＨ４５−４６、３ＢＣ１７６、Ｎ６、４Ｅ１０または１０Ｅ８／１０Ｅ８ｖ４  ＨＩＶ−１  ｂｎＡｂまたはそれらの断片である。
【００２３】
特定の実施形態は、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）およびＨＩＶ−１  ｂｎＡｂポリペプチド部分またはその断片を含むポリペプチドを提供し、抗ＨＩＶ−１  ｂｎＡｂ部分またはその断片は、ＶＲＣ０１、Ｎ６または１０Ｅ８／１０Ｅ８ｖ４  抗ＨＩＶ−１  ｂｎＡｂまたはそれらの断片である。
【００２４】
特定の実施形態は、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分またはその断片を含むポリペプチドを提供し、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片は、Ａｐｅｘ（Ｖ１／Ｖ２）ｂｎＡｂ、Ｎ３３２グリカンｂｎＡｂ、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）ｂｎＡｂ、ｇｐ１２０−ｇｐ４１インターフェイスｂｎＡｂおよびＭＰＥＲ  ｂｎＡｂから選択されるＨＩＶ−１  ｂｎＡｂのクラスに由来する。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、薬物動態（ＰＫ）部分が、本発明のポリペプチドに結合される。ＰＫ部分の例として、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃ断片、トランスフェリン、血清アルブミン（ＨＳＡ）、血清アルブミン結合性タンパク質および血清免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。本発明の一実施形態では、ＰＫ部分は、リンカーまたは本発明のポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に結合され得る。
【００２６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのうち１種または複数および担体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、対象においてＨＩＶを治療する方法であって、本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、ＨＩＶの治療において使用するための本発明のポリペプチドを提供する。本発明はまた、ＨＩＶを治療するための医薬の調製のための、本発明のポリペプチドの使用を提供する。
【００２７】
一実施形態は、第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドを提供し、第１のポリペプチドドメインは、（ｉ）ＣＤ４結合性ポリペプチドまたは（ｉｉ）Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）であり、第２のポリペプチドドメインは、抗ＨＩＶ広域中和抗体（抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）ポリペプチド（例えば、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）またはその断片である。
【００２８】
一実施形態は、第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドを提供し、第１のポリペプチドドメインは、（ｉ）ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドまたは（ｉｉ）Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドであり、第２のポリペプチドドメインは、抗ＨＩＶ広域中和抗体（抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）ポリペプチド部分またはその断片である。
【００２９】
一実施形態は、第１および第２のポリペプチドドメインを含む二重特異性抗原結合性ポリペプチドを提供し、第１のポリペプチドドメインは、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドであり、第２のポリペプチドドメインは、（ｉ）抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分またはその断片、（ｉｉ）１、２もしくは３つのアミノ酸改変を有する（ｉ）のＣＤＲバリアント、（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７８０もしくは配列番号７８１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含む（ｉ）のＬＣ領域および／または（ｉｖ）配列番号７、配列番号８、配列番号７７７、配列番号７７８もしくは配列番号７７９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含む（ｉ）領域のＨＣである。
【００３０】
一実施形態は、対象においてＨＩＶを治療する方法であって、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドまたはその医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態は、ＨＩＶの治療において使用するための、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドまたはその医薬組成物の有効量を提供する。一実施形態は、ＨＩＶを治療するための医薬の調製における、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドまたはその医薬組成物の有効量の使用を提供する。
【００３１】
一実施形態は、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００３２】
一実施形態は、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【００３３】
一実施形態は、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え宿主細胞を提供する。
【００３４】
一実施形態は、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドの産生のための方法であって、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、または本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、核酸配列またはベクターの発現に適した条件下で培養することを含み、それによって、本開示のポリペプチドが産生される、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ポリペプチドを宿主細胞が増殖された細胞培養培地から、または細胞抽出物から単離することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分を含む代替のポリペプチドの図を示す。ポリペプチドの異なる成分は、リンカーによって、任意の順序で互いに接続され、ｂｎＡｂの軽鎖または重鎖のいずれかに接続され得る。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分を含む代替のポリペプチドの図を示す。ポリペプチドの異なる成分は、リンカーによって、任意の順序で互いに接続され、ｂｎＡｂの軽鎖または重鎖のいずれかに接続され得る。
【図２】図２は、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独、１０８Ｅｖ４  ｂｎＡｂ単独、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および１０８Ｅｖ４  ｂｎＡｂの混合物、または１０８Ｅｖ４  ｂｎＡｂに連結されたＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を含む２つの融合ポリペプチド１および２の抗ＨＩＶ効力（ＩＣ５０）を示す。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドに融合された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの重鎖および軽鎖ポリペプチドの概略図である。図３Ａは、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）に融合された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ重鎖を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドに融合された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの重鎖および軽鎖ポリペプチドの概略図である。図３Ｂは、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）およびＨＩＶ融合ペプチド阻害剤に融合された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ軽鎖を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドに融合された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの重鎖および軽鎖ポリペプチドの概略図である。図３Ｃは、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）に融合された重鎖、ならびにＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）およびＨＩＶ抗ｇｐ４１融合ペプチド阻害剤に融合された軽鎖を有する抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを示す。
【図３Ｄ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドに融合された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの重鎖および軽鎖ポリペプチドの概略図である。図３Ｄは、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）に融合された軽鎖、ならびにＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）およびＨＩＶ抗ｇｐ４１融合ペプチド阻害剤に融合された重鎖を有する抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを示す。
【図４】図４は、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを有するモジュール性のＡｄｎｅｃｔｉｎが使用されて、ＨＩＶに対する二重特異性および三重特異性の活性を有する融合ペプチドを産生させ得る方法を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のＨＩＶエンベロープタンパク質への結合の概略図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、それぞれ、ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）またはＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のＣＤ４のドメイン２またはＣＤ４のドメイン４への結合の概略図を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）／ｂｎＡｂ融合ポリペプチドの抗ウイルス（ＨＩＶ）活性を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）／ｂｎＡｂ融合ポリペプチドまたはＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）／ｂｎＡｂ融合ポリペプチドの抗ウイルス（ＨＩＶ）活性を示す。
【図７】図７は、１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ融合ポリペプチド中のＢ  ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）対Ａ  ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の細胞結合の増強が、そのような融合ポリペプチドで観察された効力の改善に寄与することを示す。
【図８】図８は、ＤＨ５１１．１２Ｐ融合ポリペプチドおよび１０Ｅ８ｖ４融合ポリペプチド中のＢ  ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）対Ａ  ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の細胞結合の増強を示す。
【図９】図９は、複製ＮＬ４−３主鎖上で操作された１０Ｅ８耐性突然変異（Ｗ６８０Ｅ／Ｋ６８３Ｑ）を使用する、１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂに耐性であると報告されているＨＩＶ株に感染した細胞に対するＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドの活性を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、１２３個の異なる臨床エンベロープタンパク質について、１０Ｅ８ｖ４、ＣＤ４  ＡまたはＣＤ４  Ｂ単独と比較して、ＣＤ４  Ａ／１０Ｅ８ｖ４融合体またはＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４融合体の結合ＥＣ５０を示す。本明細書で使用される場合、Ａは、抗ＣＤ４ドメイン２  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を指し、Ｂは、抗ＣＤ４ドメイン４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を指すが、ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）およびＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、ＣＤ４内の２つ以上のドメイン（例えば、ドメイン３）と結合することが可能である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１２３個の異なる臨床エンベロープタンパク質に対するＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４融合ポリペプチドによる最大阻害パーセント（ＭＰＩ）を示す。Ｂは、抗ＣＤ４ドメイン４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリタンパク質を指す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および組成物が、本発明の実施または試験において使用されてもよいが、好ましい方法および組成物は、本明細書に記載される。
【００３７】
用語「抗原結合性タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、ＣＤ４ならびに／またはＨＩＶエンベロープのｇｐ１２０および／もしくはｇｐ４１と結合可能である、抗体およびその他のタンパク質構築物、例えば、ドメインを指す。
【００３８】
用語「Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）」とは、治療上関連する標的と高い親和性および選択性で結合するように設計および選択された、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）をベースとする治療用ポリペプチドのファミリーを意味する。Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、ｍＲＮＡディスプレイ、ファージディスプレイおよび酵母ディスプレイを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化法を使用して選択され得る。
【００３９】
「抗体」は、抗原のエピトープを特異的に認識および結合する、少なくとも軽鎖または重鎖の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドまたはその断片、例えば、抗原のエピトープを特異的に認識および結合する断片として定義される。抗体は、重鎖および軽鎖から構成され、それらは、それぞれ、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する。ＶＨ領域およびＶＬ領域は一緒に、抗体によって認識される抗原との結合に関与する。用語抗体は、無傷の免疫グロブリンならびにそのバリアントおよび部分、例えば、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、ドメイン抗体（ＤＡＢ））、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、ＴＡＮＤＡＢＳなどおよび上記のもののうちいずれかの改変版を含む。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合される融合タンパク質であり、一方で、ｄｓＦｖでは、鎖は、ジスルフィド結合を導入して鎖の会合を安定化するように突然変異されている。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態を含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州、ロックフォード）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年も参照のこと。
【００４０】
用語「広域中和抗体」または「抗ＨＩＶ広域中和抗体」（ｂＮＡｂまたは抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）とは、限定されない例として、ＨＩＶ−１エンベロープ偽型ウイルスおよびウイルス分離株の大きなパネル（１００を超える）の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上より多くにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染の５０％阻害まで、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）（例えば、ｇｐ１６０）との結合によってウイルス付着または細胞内移行を阻害する抗体として定義される。例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２１５９７号を参照のこと。用語「ドメイン」とは、タンパク質の残りとは独立して、その三次構造を保持するフォールディングされたタンパク質構造を指す。全般的に、ドメインは、タンパク質の別個の機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質のおよび／またはドメインの残部の機能を喪失することなく、付加、除去またはその他のタンパク質に移行され得る。用語「単一可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインに特有の配列を含むフォールディングされたポリペプチドドメインを指す。したがって、完全抗体可変ドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＨＨおよびＶＬならびに改変抗体可変ドメインを含む。改変抗体可変ドメインとは、例えば、１つまたは複数のループが、抗体可変ドメインに特有ではない配列あるいは末端切断型となった、またはＮもしくはＣ末端延長を含む抗体可変ドメインならびに少なくとも全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインのフォールディングされた断片によって置き換えられている可変ドメインを意味する。単一可変ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープと結合可能である。単一可変ドメインは、ヒト単一可変ドメインであり得るが、げっ歯類、コモリザメ、カニクイザルおよびラクダ科ＶＨＨなどのその他の種に由来する単一可変ドメインも含む。ラクダ科ＶＨＨは、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準技術に従ってヒト化されることができ、このようなドメインは、「単一可変ドメイン」であると考えられる。本明細書で使用される場合、ＶＨは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【００４１】
通常、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。２種類の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。
【００４２】
各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域はまた「ドメイン」としても知られる）。重鎖および軽鎖可変領域は、組み合わせて、抗原と特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する。
【００４３】
「ＣＤＲ」は、抗原結合性タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。したがって、「ＣＤＲ」とは、本明細書で使用される場合、３つの重鎖ＣＤＲすべて、３つの軽鎖ＣＤＲすべて、重鎖および軽鎖ＣＤＲのすべてまたは少なくとも２つのＣＤＲを指す。
【００４４】
本明細書を通して、可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付け慣例に従って番号付けされている。同様に、実施例において使用される用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」は、Ｋａｂａｔ番号付け慣例に従う。さらなる情報については、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省、国立衛生研究所（１９９１年）を参照のこと。
【００４５】
可変ドメイン配列および全長抗体配列においてアミノ酸残基の代替番号付け慣例があるということは、当業者には理解されよう。ＣＤＲ配列の代替番号付け慣例、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２巻：８７７〜８８３頁に示されるものもある。抗体の構造およびタンパク質フォールディングは、その他の残基がＣＤＲ配列の一部と考えられ、当業者にはそうであると理解されることを意味する可能性がある。
【００４６】
当業者に利用可能なＣＤＲ配列のその他の番号付け慣例として、「ＡｂＭ」（バース大学）および「接触」（ユニバーシティカレッジロンドン）法が挙げられる。「最小結合ユニット」を提供するために、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよび接触法のうち少なくとも２つを使用して最小重複領域が決定され得る。最小結合ユニットは、ＣＤＲの小部分であり得る。
【００４７】
以下の表１は、各ＣＤＲまたは結合ユニットの各番号付け慣例を使用した１つの定義を表す。可変ドメインアミノ酸配列を番号付けするためにＫａｂａｔ番号付けスキームが、表１において使用されている。いくつかのＣＤＲ定義は、使用される個々の刊行物に応じて変わり得ることは注目すべきである。
【００４８】
【表１】
2021507717.tif 000003
【００４９】
したがって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ由来の改変されたＣＤＲのうちいずれか１つまたは組合せを含む二重特異性抗原結合性タンパク質が提供される。
【００５０】
ＣＤＲバリアント
ＣＤＲまたは最小結合ユニットは、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または付加によって改変されてもよく、バリアント抗原結合性タンパク質は、未改変タンパク質、例えば、１０ｅ８／１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂまたは表８に列挙された任意の未改変ｂｎＡｂの生物学的特徴を実質的に保持する。
【００５１】
ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３の各々は、単独で、または任意の順列もしくは組合せで任意のその他のＣＤＲと組み合わせて改変されてもよいということは認められよう。一実施形態では、ＣＤＲは、最大３個のアミノ酸、例えば、１個または２個のアミノ酸、例えば、１個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって改変される。通常、改変は、置換、特に、例えば、以下の表２に示されるような保存的置換である。
【００５２】
【表２】
2021507717.tif 000004
【００５３】
例えば、バリアントＣＤＲでは、最小結合ユニットのアミノ酸残基は、同一のままであってもよいが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ定義の一部としてＣＤＲを含む両端に位置する残基は、保存的アミノ酸残基で置換されてもよい。
【００５４】
上記のような改変ＣＤＲまたは最小結合ユニットを含むこのような抗原結合性タンパク質は、本明細書において、「機能的ＣＤＲバリアント」または「機能的結合ユニットバリアント」と呼ばれることもある。
【００５５】
エピトープ
用語「エピトープ」とは、本明細書で使用される場合、抗原結合性タンパク質の特定の結合ドメインと接触させる抗原のその部分を指す。エピトープは、直鎖であっても、コンホメーション／不連続であってもよい。コンホメーションまたは不連続エピトープは、その他の配列、すなわち、抗原の一次配列では連続配列中にないものによって分けられているアミノ酸残基を含む。残基は、ペプチド鎖の異なる領域に由来する場合もあるが、それらは、抗原の三次元構造では極接近している。多量体抗原の場合には、コンホメーションまたは不連続エピトープは、異なるペプチド鎖に由来する残基を含み得る。エピトープ内に含まれる特定の残基は、コンピュータモデリングプログラムによって、またはＸ線結晶学などの当技術分野で公知の方法によって得られた三次元構造によって、決定され得る。
【００５６】
競合
抗原結合性タンパク質（例えば、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂである、またはそれを含有する）と参照抗体との間の競合は、競合ＥＬＩＳＡ、ＦＭＡＴまたはＢＩＡｃｏｒｅによって決定され得る。この競合について、いくつかの可能性ある理由がある：２種のタンパク質は、同一または重複するエピトープと結合する場合がある、結合の立体阻害がある場合がある、または第１のタンパク質の結合が、抗原のコンホメーション変化を誘導し、それが、第２のタンパク質の結合を妨げるまたは低減する場合がある。
【００５７】
生物活性の低減または阻害は、部分である場合も完全である場合もある。中和抗原結合性タンパク質（例えば、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂである、またはそれを含有する）は、ＨＩＶの活性を、抗原結合性タンパク質の不在下でのＨＩＶ活性に対して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％まで中和し得る。
【００５８】
中和は、当業者に公知の、または本明細書に記載の１つまたは複数のアッセイを使用して決定または測定され得る。
【００５９】
基準
ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２は、有限数の主鎖コンホメーションのうち１つを構造的に示す傾向がある。ＣＤＲの特定の基準構造クラスは、ＣＤＲおよびフレームワーク領域両方中の重要な位置に局在する残基（構造的に決定する残基またはＳＤＲ）によって決定される、ＣＤＲの長さおよびループパッキングの両方によって定義される。ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６年；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６３巻：８００〜８１５頁）は、「重要残基」基準鋳型を規定するための自動法を作出した。クラスター解析は、ＣＤＲのセットの基準クラスを定義するために使用され、次いで、埋め込まれた疎水性物質、水素結合残基ならびに保存されたグリシンおよびプロリンを解析することによって基準鋳型が同定される。抗体配列のＣＤＲは、配列を重要な残基鋳型に対して比較することおよび同一性または類似性マトリックスを使用して各鋳型をスコア付けすることによって基準クラスに割り当てられ得る。
【００６０】
ＣＤＲあたりの、対応するＣＤＲあたりの、結合ユニットあたりの、重鎖または軽鎖可変領域あたりの、重鎖または軽鎖あたりの、および抗原結合性タンパク質あたりの複数のバリアントＣＤＲ基準位置があり、したがって、抗原結合性タンパク質がその受容体と特異的に結合可能となるようにＣＤＲの基準構造が維持されるという条件で、本発明の抗原結合性タンパク質中に置換の任意の組合せが存在し得る。例えば、本発明の抗原結合性ポリペプチドについて、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂがその標的、すなわち、ＨＩＶエンベロープスパイクと結合可能であり、中和抗体として作用するその能力を維持するように、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ  ＣＤＲの基準構造が維持されるという条件で、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのバリアントＣＤＲ配列は、記載されるように複数の方法で置換され得る。
【００６１】
上記で論じたように、ＣＤＲの特定の基準構造クラスは、ＣＤＲおよびフレームワーク領域両方中の重要な位置に局在する残基によって決定されるＣＤＲの長さおよびループパッキングの両方によって定義される。
【００６２】
タンパク質スキャフォールド
抗原結合断片は、抗体または非抗体タンパク質スキャフォールド上での１つまたは複数のＣＤＲの配置によって提供され得る。「タンパク質スキャフォールド」は、本明細書で使用される場合、それだけには限らないが、免疫グロブリン（Ｉｇ）スキャフォールド、例えば、４鎖もしくは２鎖の抗体であり得る、または抗体のＦｃ領域のみを含み得る、または定常領域がヒトもしくは霊長類起源のものであり得る、またはヒトおよび霊長類定常領域の人工キメラであり得る、抗体由来の１つもしくは複数の定常領域を含み得るＩｇＧスキャフォールドを含む。タンパク質スキャフォールドは、Ｉｇスキャフォールド、例えば、ＩｇＧまたはＩｇＡスキャフォールドであり得る。ＩｇＧスキャフォールドは、抗体のいくつかまたはすべてのドメイン（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、ＶＬ）を含み得る。抗原結合性タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４ＰＥから選択されるＩｇＧスキャフォールドを含み得る。例えば、スキャフォールドは、ＩｇＧ１であり得る。スキャフォールドは、抗体のＦｃ領域からなり得る、または含み得る、またはその一部である。
【００６３】
タンパク質スキャフォールドは、天然リガンド以外のＣＤ４またはｇｐ４１などの抗原との結合を得るために、タンパク質工学に付された、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ−ドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ−ドメイン（アビマー／マキシボディ）、熱ショックタンパク質、例えば、ＧｒｏＥｌおよびＧｒｏＥＳ、トランスフェリン（トランスボディ）、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ペプチドアプタマー、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）、ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）、ＰＤＺドメイン、ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒クニッツ型ドメインおよびフィブロネクチン／Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）からなる群から選択されるスキャフォールドの誘導体であり得る。
【００６４】
用語「ｇｐ１２０」は、ＨＩＶ由来のエンベロープタンパク質として定義される。このエンベロープタンパク質は、ｇｐ１６０と名付けられた、大きさが８４５〜８７０個のアミノ酸の長い前駆体タンパク質として最初に合成される。ｇｐ１６０は、細胞性プロテアーゼによって、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に切断される。ｇｐ１２０は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質複合体の、表面に露出した外部ドメインのほとんどを含有し、細胞性ＣＤ４受容体と、および細胞性ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ５）と結合するのはｇｐ１２０である。例えば、米国特許出願公開第２０１６０００９７８９号を参照のこと。
【００６５】
用語「ｇｐ４１」は、膜貫通ドメインを含有し、三量体立体配置のままであるＨＩＶタンパク質として定義され、ｇｐ１２０と非共有結合によって相互作用する。ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質は、ｇｐ１６０と名付けられた、大きさが８４５〜８７０個のアミノ酸の長い前駆体タンパク質として最初に合成される。ｇｐ１６０は、ホモトリマーを形成し、ゴルジ体内でグリコシル化を起こす。ｉｎ  ｖｉｖｏで、次いで、細胞性プロテアーゼによってｇｐ１２０およびｇｐ４１に切断される。ｇｐ４１の一例のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ．ＲＴＭ．受託番号ＣＡＤ２０９７５（２００９年１０月１６日に入手可能として）に示される。ｇｐ４１の配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ．ＲＴＭ．受託番号ＣＡＤ２０９７５で与えられたものから変わり得るということは理解される。ｇｐ４１は、膜貫通ドメインを含有し、通常、三量体立体配置のままであり、非共有結合によってｇｐ１２０と相互作用する。例えば、２０１７年８月２２日に米国特許第９，７８３，７０３号として発行された米国特許出願公開第２０１６０００９７８９号を参照のこと）。
【００６６】
用語「ｇｐ１６０」とは、１６０ｋＤａの分子量を有するエンベロープタンパク質を指し、種々のグリコシル化部位を含有する。ｇｐ１６０は、ｇｐ４１およびｇｐ１２０両方の前駆体として作用する。本発明の目的上、ｇｐ１６０は、代表的なエンベロープ糖タンパク質であり、ＨＸＢ２Ｄは、エンベロープ配列の限定されない例である。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＨＸＢ２Ｄに関するｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＨＩＶ／ＲＥＶＩＥＷＳ／ＨＸＢ２．ｈｔｍｌを参照のこと。
【００６７】
用語「エンベロープ糖タンパク質」または「糖タンパク質」または「ＥｎＶ」とは、ポリペプチド側鎖に共有結合によって結合されたオリゴ糖鎖（グリカン）を含有し、ＨＩＶエンベロープの表面に曝露されるタンパク質を指す。本発明の目的上、対象への融合ポリペプチドの投与後、ＨＩＶ  ｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質は、融合ポリペプチドによって結合される。一部の実施形態では、ＨＩＶ  ｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質は、融合ポリペプチドの抗体部分に結合される。
【００６８】
「ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、長さ、翻訳後改変または融合にかかわらず、２個以上のアミノ酸の任意の配列を指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用される。ポリペプチドは、さまざまな標準的な化学法のいずれかで改変され得る（例えば、アミノ酸は、保護基を用いて改変され得る、カルボキシ末端アミノ酸は、末端アミド基に作製され得る、アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基を用いて改変され得る、またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化され得る、そうでなければ、安定性もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大するように改変され得る）。ポリペプチド改変は、ポリペプチドへの環状化合物またはその他の分子などの別の構造の結合を含み得、かつ変更された立体配置に（すなわち、ＲもしくはＳまたはＬもしくはＤ）１個または複数のアミノ酸を含有するポリペプチドも含み得る。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、例えば、ＣＤ４ドメインと結合するように改変されており、「抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）」、「ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）」と本明細書において呼ばれる、フィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメインに由来するポリペプチドを含み得る。本発明のポリペプチドはまた、例えば、ｇｐ−４１のＮ１７ドメインと結合するように改変されており、本明細書において、「抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）」、「Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）」または抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）と呼ばれる、フィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメインに由来するタンパク質を含み得る。本発明のポリペプチドはまた、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結されたＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を含むポリペプチドを含む（図１）。本発明のポリペプチドはまた、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結されたＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を含むポリペプチドを含む（図３）。あるいは、ポリペプチドは、表８に記載された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ断片に連結されたＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および／またはＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を含む。本発明のポリペプチドはまた、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）に連結されていてもよいＨＩＶ融合ペプチド阻害剤を含み得る。
【００７０】
「単離された」ポリペプチドは、その天然環境の成分から同定および分離され、および／または回収されたものである。その天然環境の混入成分は、ポリペプチドの診断的または治療的使用を干渉する材料であり、組換え宿主細胞タンパク質およびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。一実施形態では、ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定されるようにポリペプチドの９５重量％を超えて、最も好ましくは、９９重量％を超えて、または（２）クーマシーブルーもしくは銀染色を使用して還元もしくは非還元状態下でＳＤＳＰＡＧＥによって均一に精製される。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００７１】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、本明細書において、最大配列同一性パーセントを達成するために、必要に応じて、配列をアラインし、ギャップを導入した後に、配列同一性の一部として保存的置換を全く考慮せずに、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的としたアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標））ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内である種々の方法で達成され得る。当業者ならば、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを容易に決定できる。例えば、所与のアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ）、それとの、またはそれに対する（ａｇａｉｎｓｔ）所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替として、所与のアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ）、それとの、またはそれに対する（ａｇａｉｎｓｔ）ある特定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現され得る）は、以下の通りに算出される：割合Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、ＡおよびＢの配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のアラインメントにおけるそのプログラムによる同一マッチとしてスコア付けされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくならないということは認められよう。本明細書で使用する場合、「保存的置換」は、それだけには限らないが、アミノ酸の、同様の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族などといった）を有するものとの置き換えを含む、ペプチドの全体的なコンホメーションおよび機能を変更することのない、アミノ酸残基の別のものによる置き換えを表す。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野で周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンは、親水性塩基性アミノ酸であり、交換可能であり得る。同様に、イソロイシン、疎水性アミノ酸は、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置き換えられ得る。互いに置換され得る中性親水性アミノ酸として、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニンが挙げられる。「置換された」または「改変された」については、本発明は、天然に存在するアミノ酸から変更または改変されているアミノ酸を含む。同一性％は、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のＣＤＲ（複数可）またはＣＤもしくはＦＧループを含む、クエリー配列の全長にわたって決定され得る。あるいは、同一性％は、ＣＤＲ（複数可）またはＣＤもしくはＦＧループ（複数可）を排除し得る、例えば、ＣＤＲ（複数可）またはＣＤ／ＦＧループ（複数可）は、対象配列に対して１００％同一であり、同一性％変動は、クエリー配列の残存部分においてであり、その結果、ＣＤＲまたはＣＤ／ＦＧループ配列（複数可）が固定される／無傷である。
【００７２】
バリアント配列は、抗ＨＩＶ  ｂｎＡＢまたは未改変ＣＤ４もしくはＮ１７Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列などの未改変タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持する。
【００７３】
配列変動
ＶＨもしくはＶＬ（またはＨＣもしくはＬＣ）配列は、最大１０のアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するバリアント配列であり得る、またはＣＤもしくはＦＧループ配列は、最大５のアミノ酸置換を有するバリアント配列であり得る。例えば、ＶＨもしくはＶＬバリアント配列は、最大９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１つのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有し得る、またはＣＤもしくはＦＧループバリアント配列は、最大５、４、３、２もしくは１つのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有し得る。
【００７４】
配列変動は、ＣＤＲ（複数可）またはＣＤ／ＦＧループ（複数可）を排除し得る、例えば、ＣＤＲ（複数可）は、ＶＨもしくはＶＬ（またはＨＣもしくはＬＣ）配列と同一であり、変動は、ＶＨもしくはＶＬ（またはＨＣもしくはＬＣ）配列の残存する部分においてであり、その結果、ＣＤＲ配列は固定される／無傷である。またはバリアントＣＤ４もしくはＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）中のＣＤ／ＦＧループは、ＣＤもしくはＦＧ（またはＡＢもしくはＥＦ）配列と同一であり、変動は、バリアントＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列の残存する部分においてであり、その結果、ＣＤ／ＦＧループ（複数可）配列は、固定される／無傷である。
【００７５】
バリアント配列は、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはＣＤ４もしくはＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）などの未改変タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持する。改変されたＣＤ／ＦＧループ配列を有するＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の例は、それぞれ表３に示されている。
【００７６】
そのようなものとして、本発明の内容において、保存的置換は、１個のアミノ酸の、同様の特性を有する別のアミノ酸との置換として当技術分野で認識されるということは理解されなければならない。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「結合部位」または「抗原結合部位」とは、本発明の特定のタンパク質と相互作用または結合する（例えば、エピトープが抗体によって認識されるように）タンパク質（例えば、ＣＤ４またはｇｐ４１）の部位または部分を指す。結合部位は、連続アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並べられる不連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸によって形成される結合部位は、通常、変性溶媒に対する曝露の際に保持されるが、三次フォールディングによって形成される結合部位は、通常、変性溶媒の処置で失われる。
【００７８】
本発明の抗ＣＤ４またはＣＤ４結合部分の結合部位は、それだけには限らないが、プロテアーゼマッピングおよび突然変異解析を含む、抗体のエピトープマッピングのために通常使用される標準技術の適用によって決定され得る。あるいは、結合部位は、同一ポリペプチド、例えば、ＣＤ４と結合する参照タンパク質（例えば、別のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）または抗体）を使用する競合アッセイによって決定され得る。試験タンパク質および参照分子（例えば、別のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）または抗体）が競合する場合には、それらは同一の結合部位と、または一方の分子の結合が他方を干渉するように十分に近位な結合部位と結合する。
【００７９】
用語「特異的に結合する」、「特異的結合」、「選択的結合」および「選択的に結合する」は、本明細書において同義的に使用される場合、それだけには限らないが、スキャッチャード解析法および／または競合結合アッセイ（例えば、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲアッセイ）などの当技術分野で利用可能な技術によって測定されるように、ＣＤ４またはｇｐ４１またはｇｐ１２０（評価される特定のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）または融合ポリペプチドに対して関連するものとして）に対して親和性を示すが、異なるポリペプチドと顕著に結合しない（例えば、約１０％未満の結合）タンパク質を指す。この用語はまた、例えば、本発明のタンパク質の結合ドメインが、ＣＤ４、ｇｐ４１またはｇｐ１２０（関連するものとして）に対して特異的である場合に適用可能である。
【００８０】
用語「優先的に結合する」とは、本明細書で使用される場合、それだけには限らないが、スキャッチャード解析法および／または競合結合アッセイ（例えば、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲアッセイ）などの当技術分野で利用可能な技術によって測定されるように、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）または本発明のポリペプチドが、ＣＤ４、ｇｐ１２０またはｇｐ４１と、異なるポリペプチドと結合するよりも少なくとも約２０％多く結合する状況を指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「交差反応性」とは、同一または極めて類似した結合部位を有する２種以上の別個のタンパク質と結合するタンパク質を指す。
【００８２】
用語「Ｋｄ」とは、本明細書で使用される場合、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを使用して測定されるような、特定の単離されたＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、抗体、抗体断片または１種もしくは複数のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、抗体もしくは抗体断片を含む融合ポリペプチド阻害剤の、標的タンパク質（例えば、ＣＤ４）に対する結合の解離平衡定数を指すものとする。
【００８３】
用語「ＩＣ５０」とは、本明細書で使用される場合、最大阻害反応の５０％、すなわち、最大阻害反応と未処置反応との間の中間であるレベルに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのいずれかで反応を阻害する、例えば、本発明のポリペプチドの濃度を指す。
【００８４】
用語「阻害する」または「中和する」とは、本明細書で使用される場合、本発明のポリペプチドの活性に関して、例えば、それだけには限らないが、生物活性もしくは特性、疾患または状態を含む阻害されているものの進行または重症度を実質的に弱める、禁止する、防ぐ、制限する、減速する、破壊する、排除する、停止する、低減するまたは逆転させる能力を意味する。阻害または中和は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高くである。用語「中和する」は、本明細書を通して使用される場合、ＨＩＶエンベロープタンパク質の生物活性が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの不在下でのＨＩＶエンベロープタンパク質の活性との比較において、本明細書に記載の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの存在下で低減されることを意味する。中和は、その受容体とのＨＩＶエンベロープタンパク質結合を遮断すること、ＨＩＶエンベロープタンパク質がその受容体を活性化するのを防ぐこと、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはその受容体を下方制御することまたはエフェクター機能性に影響を及ぼすことのうち１つまたは複数によるものであり得る。例えば、実施例２に記載される効力方法は、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの中和能を評価するために使用され得る。
【００８５】
用語「ＰＫ」は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝および排出を含む化合物の特性を包含する。「ＰＫ調節タンパク質」または「ＰＫ部分」とは、本明細書で使用される場合、生物学的に活性な分子と融合されると、または一緒に投与されると、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響を及ぼす任意のタンパク質、ペプチドまたは部分を指す。ＰＫ調節タンパク質またはＰＫ部分の例として、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合剤（米国特許出願公開第２００５／０２８７１５３号、米国特許第７，６９６，３２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０８３８０４号およびＷＯ２００９／１３３２０８号に開示されるような）、ヒト血清アルブミン、ＦｃまたはＦｃ断片およびそのバリアントならびに糖（例えば、シアル酸）が挙げられる。
【００８６】
用語「ＣＤ４結合部分」または「ＣＤ４結合性ポリペプチド」とは、ＣＤ４と結合し、ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４受容体とのＨＩＶ表面タンパク質ｇｐ１２０結合を遮断する、またはｉｉ）ｇｐ１２０がＣＤ４と結合するのを可能にするが、ｇｐ１２０の、共受容体（ＣＣＲ５またはＣＣＲ４）とのその後の相互作用もしくは細胞内移行に必要なその他の事象を遮断する任意の部分またはポリペプチドを指す。ＣＤ４結合部分は、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）とも呼ばれるＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、抗体（例えば、イバリズマブ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、抗体断片（例えば、Ｆａｂ）、二重特異性抗体またはその融合タンパク質であり得る。
【００８７】
「ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤部分」または「ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤」とは、ｇｐ４１のヘプタッドリピート１（ＨＲ１）領域との結合による融合を阻害する任意の部分を指す。融合ペプチド阻害剤部分の例として、それぞれＮＨＲおよびＣＨＲペプチドと名付けられた、ｇｐ４１のＮＨＲおよびＣＨＲ領域に由来するペプチドが挙げられる。エンフビルチドは、ＣＨＲペプチドの一例である。
【００８８】
用語「ｇｐ４１結合部分」または「ｇｐ４１結合性ポリペプチド」とは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質複合体（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）のＴ細胞との相互作用を干渉する任意の部分またはポリペプチドを指す。ｇｐ４１結合部分は、抗ｇｐ４１−Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−抗体（Ａｂ）、−ドメイン抗体（ｄＡｂ）、−抗体断片（例えば、Ｆａｂ）、−二重特異性抗体およびその融合タンパク質であり得る。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、例えば、表４に列挙されるような配列を含むＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および表８に記載される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片を含み得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号７８から選択される配列を含むＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および表８に記載される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片を含み得る。本発明の別の実施形態は、表４に列挙されるような配列を含むＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および表５に列挙されるような配列を含むＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および表８に記載される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片を提供する。本発明のポリペプチドはまた、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤も含み得る。
【００９０】
ポリペプチドの「半減期」は、一般に、例えば、天然機序によるポリペプチドの分解および／またはポリペプチドのクリアランスもしくは隔離によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドの血清濃度が、５０％低減されるのにかかる時間として定義され得る。半減期は、それ自体公知の任意の方法で、例えば、薬物動態解析によって決定され得る。適した技術は、当業者には明らかとなろうが、例えば、一般的に、対象に、本発明のポリペプチドの適した用量を適宜投与するステップ、一定間隔で対象から血液試料またはその他の試料を採取するステップ、血液試料における本発明のポリペプチドのレベルまたは濃度を決定するステップおよびこのように得られたデータ（のプロット）から、本発明のポリペプチドのレベルまたは濃度が、投薬の際の最初のレベルと比較して５０％低減されるまでの時間を算出するステップを含み得る。例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ａ．ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓおよびＰｅｔｅｒｓら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ中：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６年）などの標準的なハンドブックが参照される。Ｇｉｂａｌｄｉ，Ｍ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、第２改訂版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（１９８２年）も参照される。
【００９１】
半減期は、ｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータ、ＨＬ＿ラムダ＿ｚおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表されてもよい。本明細書において、「半減期の増大」とは、これらのパラメータのうち任意の１つ、これらのパラメータのうち任意の２つ、これらのパラメータのうち任意の３つまたはこれらのパラメータのうち４つすべての増大を指す。
【００９２】
抗原結合性タンパク質の半減期に影響を及ぼす改変
ＩｇＧ抗体の長い半減期は、ＦｃＲｎとのその結合に左右されると報告されている。したがって、定常領域を操作することによる、標的との相互作用のｐＨ依存を維持しながら、ｐＨ６．０（エンドソームにおけるｐＨ）でのＩｇＧのＦｃＲｎとの結合親和性を増大する置換は、大規模に研究されてきた（Ｇｈｅｔｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５巻：６３７〜６４０頁、１９９７年；Ｈｉｎｔｏｎら、ＪＢＣ  ２７９巻：６２１３〜６２１６頁、２００４年；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、１０  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７巻：１１２９〜１１３８頁、２００６年）。本発明の抗原結合性タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、中の重鎖定常ドメインまたはＦｃＲｎ（Ｆｃ受容体新生児）結合ドメインの改変によって変更され得る。
【００９３】
成体哺乳動物では、新生児Ｆｃ受容体としても知られるＦｃＲｎは、ＩｇＧアイソタイプの抗体と結合し、分解から救う保護的受容体として作用することによって、血清抗体レベルの維持において重要な役割を果たす。ＩｇＧ分子は、内皮細胞によってエンドサイトーシスを受け、それらがＦｃＲｎと結合する場合には、細胞の再循環から出され、循環に戻される。対照的に、細胞内に移行するが、ＦｃＲｎ結合しないＩｇＧ分子は、リソソーム経路を標的とし、ここでそれらは分解される。
【００９４】
ＦｃＲｎは、抗体クリアランスおよび組織中にわたる経細胞輸送の両方に関与していると考えられている（Ｊｕｎｇｈａｎｓ  Ｒ．Ｐ（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ  １６巻．２９〜５７頁およびＧｈｅｔｉｅら（２０００年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８巻、７３９〜７６６頁）。ヒトＦｃＲｎと直接的に相互作用すると決定されたヒトＩｇＧ１残基は、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５を含む。これらの位置のいずれかでのスイッチが、本発明の抗原結合性タンパク質の血清半減期の増大および／またはエフェクター特性の変更を可能にし得る。
【００９５】
ＦｃＲｎ結合に付加することまたは増大させることにより半減期を増大するための突然変異
本発明の抗原結合性タンパク質は、ＦｃＲｎの定常ドメインまたはその断片の親和性を増大するアミノ酸改変を有し得る。治療用および診断用ＩｇＧ抗体ならびにその他の生物活性分子の半減期（すなわち、血清半減期）を増大することは、これらの分子の投薬の量および／または頻度を低減することを含む多数の利益を有する。一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、以下のアミノ酸改変のうち１つまたは複数を有するＩｇＧ定常ドメインのすべてまたは一部（ＦｃＲｎ結合部分）を含む。
【００９６】
例えば、ＩｇＧ１に関して、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（一般的に「ＹＴＥ」突然変異と呼ばれる）およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（一般的に「ＬＳ」突然変異と呼ばれる）は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎ結合を増大する（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ．２０１８年１月；９巻（１号）：６３〜７３頁）。
【００９７】
半減期も、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４ＡおよびＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ突然変異によって増強され得る（ＩｇＧ１およびＫａｂａｔ番号付けに関して）（Ｍｏｎｎｅｔら、２０１４年  ｍＡｂｓ、６巻：２号、４２２〜４３６頁）。
【００９８】
半減期およびＦｃＲｎ結合はまた、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ突然変異（一般的に「ＨＮ」または「ＮＨａｎｃｅ」突然変異と呼ばれる）を導入することによって延長され得る（ＩｇＧ１に関して）（ＷＯ２００６／１３０８３４）。
【００９９】
表記「ｍｐｋ」、「ｍｇ／ｋｇ」または「ｋｇあたりのｍｇ」とは、キログラムあたりのミリグラムを指す。すべての表記は、本開示を通して同義的に使用される。
【０１００】
用語「個体」、「対象」および「患者」とは、本明細書において同義的に使用され、動物、好ましくは、それだけには限らないが、マウス、サル、ヒト、哺乳動物家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ）、哺乳動物スポーツ動物（例えば、ウマ）および哺乳動物ペット（例えば、イヌおよびネコ）を含む哺乳動物（非霊長類および霊長類を含む）を指し、好ましくは、この用語は、ヒトを指す。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物であり、好ましくは、ヒトであり、ＨＩＶに感染している。
【０１０１】
用語「治療有効量」とは、対象に治療的利益を与えるために必要である、薬剤の少なくとも最小用量であるが、毒性用量未満を指す。例えば、本発明のポリペプチド（例えば、抗原結合性ポリペプチドまたは融合ポリペプチド）の治療有効量は、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおいて、感染個体内で循環ＨＩＶの著しい低下をもたらす量である。
【０１０２】
概要
本出願人らは、ＣＤ４結合性ポリペプチド（ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）などの抗ＣＤ４ポリペプチド）を、抗ＨＩＶ広域中和抗体（抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）に連結することによって、ＨＩＶエンベロープ融合の破壊における得られた抗ＣＤ４−抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドの効果が、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ単独、ＣＤ４結合性ポリペプチドの効果と、またはＣＤ４結合性ポリペプチドおよび抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの混合物と比較して著しく増強されることを見い出した。本出願人らは、驚くべきことに、ＨＩＶ融合に対して抗ＣＤ４−抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドが有する効果が、相乗的であると思われるということを見い出した。図２は、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独を用いる、または抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ単独（１０Ｅ８ｖ４抗体）を用いる、または抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの混合物もしくは抗ＣＤ４−抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含む２つの融合ポリペプチド１および２を用いる、それらのＨＩＶ−１感染細胞の処置後の、宿主細胞の、ＨＩＶ−１複製のＩＣ５０（ＨＩＶ複製が５０％阻害される濃度）に基づく種々の成分の抗ウイルス効力を示す。図２においてわかるように、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドについて得られたＩＣ５０値は、単一成分または混合物（ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの混合物）について得られたＩＣ５０値よりもかなり低い。見てわかるように、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドのウイルス複製に対する効果（したがって、その抗ウイルス効力）は、ＨＩＶ複製に対する個々の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ成分の効果の単なる付加よりも大きく、ＨＩＶ  複製に対する抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの混合物の効果よりも大きい。
【０１０３】
理論に捉われようとは思わないが、本出願人らは、ＣＤ４結合性ポリペプチドは、その固有の抗ウイルス活性を発揮することに加えて、標的細胞を標的とする部分として働き、その結果、標的細胞をＣＤ４結合性ポリペプチドでコーティングし、ｂｎＡｂ成分を、ＨＩＶ  ｇｐ１６０エンベロープタンパク質上のその標的との相互作用にとってより最適に配置すると考える。本出願人らは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂをＣＤ４結合性ポリペプチドに連結することによって、作用部位で抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを濃縮し、したがって、ＨＩＶ融合破壊に対する抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの効果を相乗的な方法で増大する方法を見い出した。
【０１０４】
本発明の実施形態は、ＣＤ４と結合する新規ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド、例えば、抗原結合性ポリペプチド）を提供する。ポリペプチドは、共有結合によって連結された、またはその組み合わせとしてのＣＤ４結合部分および抗ＨＩＶ広域中和抗体部分を含む。より詳しくは、本発明の実施形態は、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインタンパク質および抗ＨＩＶ広域中和抗体（ｂｎＡｂ）またはその組合せを含むポリペプチドに関する。
【０１０５】
ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を同定するために、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の大きな合成ライブラリーに対して可溶性ＣＤ４（細胞外ドメイン）が提示された。数ラウンドの選択を生き残ったＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）が、ＣＤ４結合について、生物物理学的特性について、およびＨＩＶ−１阻害活性についてスクリーニングされた。スクリーニングから現れた最良の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列が突然変異され、標的濃度を低下させることおよび／または速い結合速度および／または遅い解離速度で抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を選択することによって達成される、増大された選択圧を用いるさらなるラウンドの選択に付した。この最適化プロセスから、複数のファミリーのＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）が、好都合な生化学的および生物物理的活性を有するＨＩＶ−１特異的阻害剤として同定された。その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ＣＤ４−Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＡｄｎｅｃｔｉｎＴＭ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１７年７月２５日；６１巻（８号）を参照のこと。
【０１０６】
Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を同定するために、同様のプロセスが利用された。その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａ  Ｎｏｖｅｌ  ｇｐ４１−Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＡｄｎｅｃｔｉｎＴＭ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｓ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｗｈｅｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ａ  ＣＤ４−Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＡｄｎｅｃｔｉｎＴＭ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１８年５月９日を参照のこと。
【０１０７】
特定の実施形態は、第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、第１のポリペプチドドメインは、（ｉ）ＣＤ４結合性ポリペプチド、または（ｉｉ）ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、第２のポリペプチドドメインは、抗ＨＩＶ広域中和抗体（ｂｎＡｂ）ポリペプチドまたはその断片である、抗原結合性ポリペプチドを提供する。
【０１０８】
別の特定の実施形態は、第１、第２および第３のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、第１のポリペプチドドメインは、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、第２のポリペプチドドメインは、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、第３のポリペプチドドメインは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片である、抗原結合性ポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドはそれぞれ、リンカーによって抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片に接続されている、本明細書に記載の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含む抗原結合性ポリペプチドを提供する。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドはそれぞれ、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域またはＬＣ領域に接続されている。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含む抗原結合性ポリペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号７７７、配列番号７７８または配列番号７７９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域を有する。
【０１１０】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチド、請求項４に記載の抗原結合性ポリペプチドを提供し、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドはそれぞれ、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域に接続されている。本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドはそれぞれ、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域に接続されている。
【０１１１】
本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣに接続されており、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣに接続されている。
【０１１２】
本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣに接続されており、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣに接続されている。
【０１１３】
本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域は、配列番号６、配列番号７８０または配列番号７８１から選択される配列を含み、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域は、配列番号７、配列番号８、配列番号７７７、配列番号７７８または配列番号７７９から選択される配列を含む。
【０１１４】
本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域は、配列番号６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域は、配列番号７８０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＬＣ領域は、配列番号７８１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
【０１１５】
本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域は、配列番号７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域は、配列番号８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域は、配列番号７７７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域は、配列番号７７８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのＨＣ領域は、配列番号７７９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
【０１１６】
本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤をさらに含む。本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤をさらに含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤は、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドに接続されている。
【０１１７】
ある特定の実施形態は、第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、第１のポリペプチドドメインは、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、第２のポリペプチドドメインは、抗ＨＩＶ広域中和抗体（ｂｎＡｂ）ポリペプチドまたはその断片である、抗原結合性ポリペプチドを提供する。
【０１１８】
ある特定の実施形態は、第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、第１のポリペプチドドメインは、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、第２のポリペプチドドメインは、（ｉ）抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂもしくはその断片、（ｉｉ）１、２もしくは３つのアミノ酸改変を有する（ｉ）のＣＤＲバリアント、（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７８０もしくは配列番号７８１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含むＬＣ領域および／または（ｉｖ）配列番号７、配列番号８、配列番号７７７、配列番号７７８もしくは配列番号７７０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含むＨＣ領域または（ｖ）その断片である、抗原結合性ポリペプチドを提供する。
【０１１９】
第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、第１のポリペプチドドメインは、配列番号１３〜７１のうちいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるＦＧループ配列またはＣＤループ配列を含み、第２のポリペプチドドメインは、表８に記載される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドは、配列番号７２〜９１のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドは、Ａｐｅｘ（Ｖ１／Ｖ２）ｂｎＡｂ、Ｎ３３２グリカンｂｎＡｂ、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）ｂｎＡｂ、ｇｐ１２０−ｇｐ４１インターフェイスｂｎＡｂおよびＭＰＥＲ  ｂｎＡｂまたはそれらの断片から選択される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのクラスから選択される。
【０１２０】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドを提供し、ＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂおよびＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドは、ｇｐ４１のＮ１７  ｄドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドをさらに含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ、本明細書に記載のＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび本明細書に記載の、ｇｐ４１のＮ１７  ｄドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、ｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドは、配列番号９２〜３４８のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、第１および第２のおよび／または第３のポリペプチドドメインは、リンカーによって、任意の順序で互いに接続されている。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂまたはその断片は、Ｎ６  ｂｎＡｂ、ＶＲＣ０１抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂおよび１０Ｅ８ｖ４抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂから選択される。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番号７６６または配列番号７６７のうちいずれか１つを含む。
【０１２５】
第１および第２のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドのある特定の実施形態では、第２のポリペプチドドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、または配列番号７７２に対して１００％同一である抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、ＣＤ４結合性ポリペプチドは、カニクイザルＣＤ４と交差反応しない。ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含み、抗原結合性ポリペプチドは、ＨＩＶ  ＣＤ４の二次または三次構造内のコンホメーションエピトープと結合する。
【０１２７】
ある特定の実施形態は、療法において使用するための、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態は、療法がＨＩＶ感染のためである、療法において使用するための、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドを提供する。
【０１２８】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドおよび担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１２９】
ある特定の実施形態は、ＨＩＶ感染の治療において使用するための、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／もしくはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドまたは本明細書に記載のその医薬組成物を提供する。
【０１３０】
ある特定の実施形態は、ＨＩＶ感染のための医薬の調製のための、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドの使用を提供する。
【０１３１】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドまたはその医薬組成物の有効量を投与することを含む、対象においてＨＩＶを治療する方法を提供する。
【０１３２】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【０１３３】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を提供し、ｂｎＡｂポリペプチドをコードする核酸列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番号７６６または配列番号７６７のｂｎＡｂポリペプチド領域をコードする核酸配列を含む。
【０１３４】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を提供し、ＣＤ４結合性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番号７６６または配列番号７６７のＣＤ４結合性ポリペプチド領域をコードする核酸配列を含む。
【０１３５】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【０１３６】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、またはその発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【０１３７】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドの産生のための方法であって、このような抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主細胞を培養することまたはこのような本明細書に記載の、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび／またはｇｐ４１のＮ１７ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドの発現ベクターを含む宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞が、核酸配列またはベクターの発現に適した条件下で培養され、それによって、ＣＤ４結合性ポリペプチドおよび抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドが産生される、方法を提供する。
【０１３８】
Ｉ．フィブロネクチンベースのスキャフォールド−Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）
本出願の一態様は、溶媒接近可能ループのうち１つまたは複数の一部またはすべてが、ランダム化または突然変異されている、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインを含む抗ＣＤ４および抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を提供する。一部の実施形態では、非ループベータ鎖のうち１つまたは複数中の１個または複数の残基もランダム化または突然変異されている。一部の実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンの１０番目の３型モジュール（１０Ｆｎ３）に由来するＦｎ３ドメインである：
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）（ＢＣ、ＣＤ、ＤＥおよびＦＧループには下線が引かれている）
【０１３９】
その他の実施形態では、１０Ｆｎ３の非リガンド結合配列、すなわち、「１０Ｆｎ３スキャフォールド」は、１０Ｆｎ３がリガンド結合機能および／または構造的安定性保持するという条件下で、変更され得る。さまざまな変異体１０Ｆｎ３スキャフォールドが報告されている。一態様では、配列番号１のＡｓｐ７、Ｇｌｕ９およびＡｓｐ２３のうち１つまたは複数が、例えば、負電荷を有さないアミノ酸残基（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど）などの別のアミノ酸によって置き換えられている。これらの突然変異は、野生型形態と比較して、中性ｐＨで突然変異体１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有すると報告されている（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０４５２３号を参照のこと）。有益または中立のいずれかである１０Ｆｎ３スキャフォールドにおけるさまざまなさらなる変更が開示されている。例えば、Ｂａｔｏｒｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１５巻（１２号）：１０１５〜１０２０頁（２００２年１２月）；Ｋｏｉｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０巻（３４号）：１０３２６〜１０３３３頁（２００１年８月２８日）を参照のこと。
【０１４０】
バリアントおよび野生型１０Ｆｎ３タンパク質の両方とも、同一構造、すなわち、ＡからＧと名付けられた７つのベータ鎖ドメイン配列および７つのベータ鎖ドメイン配列を接続する６つのループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧループ）によって特徴付けられる。ＮおよびＣ末端に最も近接して位置するベータ鎖は、溶液中でベータ様コンホメーションをとり得る。配列番号１では、ＡＢループは、残基１４〜１７に対応し、ＢＣループは、残基２３〜３１に対応し、ＣＤループは、残基３７〜４７に対応し、ＤＥループは、残基５１〜５６に対応し、ＥＦループは、残基６３〜６７に対応し、ＦＧループは、残基７５〜８７に対応する。
【０１４１】
したがって、一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４または抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１に示されるヒト１０Ｆｎ３ドメインに対して少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である１０Ｆｎ３ポリペプチドである。可変性の多くは、全般的にループのうち１つまたは複数で生じる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのベータまたはベータ様鎖の各々は、このような変動が、生理学的条件においてポリペプチドの安定性を破壊しないという条件で、配列番号１の対応するベータまたはベータ様鎖の配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列から本質的になり得る。
【０１４２】
一部の実施形態では、本発明は、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含む１種または複数のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を提供し、１０Ｆｎ３ドメインは、ループＡＢ、ループＢＣ、ループＣＤ、ループＤＥ、ループＥＦおよびループＦＧを含み、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列に対して、アミノ酸配列が変更された、ループＢＣ、ＣＤ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する。一部の実施形態では、本発明のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１の非ループ領域に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが変更される。一部の実施形態では、ＢＣおよびＦＧループが変更され、一部の実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが変更され、すなわち、１０Ｆｎ３ドメインは、天然に存在しないループを含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、ＡＢ、ＣＤおよび／またはＥＦループが変更される。一部の実施形態では、ＣＤおよびＦＧループが変更される。一部の実施形態では、隣接するループの変更を伴って、または伴わずに、ループ間の鎖中の溶媒接近可能アミノ酸が変更される。「変更される」とは、鋳型配列（対応するヒトフィブロネクチンドメイン）に対する１つまたは複数のアミノ酸配列変更を意味し、アミノ酸付加、欠失、置換またはそれらの組合せを含む。アミノ酸配列の変更は、全般的に、核酸コード配列の意図的な、ブラインドのまたは自発的な配列変動によって達成されてもよく、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲまたは化学的ＤＮＡ合成によって生じ得る。
【０１４４】
一部の実施形態では、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥおよびＦＧから選択される１つまたは複数のループは、対応するヒトフィブロネクチンループに対して、長さが延長または短縮され得る。一部の実施形態では、ループの長さは、１〜２５個のアミノ酸だけ延長され得る。一部の実施形態では、ループの長さは、１〜１１個のアミノ酸だけ減少され得る。したがって、抗原結合を最適化するために、１０Ｆｎ３のループは、抗原結合において最大のあり得る可動性および親和性を得るために、長さが、ならびに配列が変更され得る。
【０１４５】
一部の実施形態では、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１の非ループ領域に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインを含み、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが変更される。一部の実施形態では、変更されたＢＣループは、最大１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９つのアミノ酸置換、最大１、２、３もしくは４つのアミノ酸欠失、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態では、変更されたＣＤループは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１のアミノ酸置換、最大１、２、３、４、５もしくは６つのアミノ酸欠失、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態では、変更されたＤＥループは、最大１、２、３、４、５もしくは６つのアミノ酸置換、最大１、２、３もしくは４つのアミノ酸欠失、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくは１３のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態では、ＦＧループは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくは１３のアミノ酸置換、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１のアミノ酸欠失、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。
【０１４６】
延長配列
ある特定の実施形態では、本発明のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）分子は、Ｎ末端延長配列および／またはＣ末端延長を含むように改変され得る。例えば、ＭＧ配列は、配列番号１によって定義される１０Ｆｎ３のＮ末端に配置され得る。Ｍは、普通、切断除去され、Ｎ末端にＧが残る。本明細書に記載されるＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）はまた、本明細書において末端切断型Ｃ末端またはＣ末端延長配列と呼ばれる代替Ｃ末端テール配列を含み得る。さらに、末端切断型版は、末端切断型形態で治療用分子として使用されてもよく、またはＨｉｓ６タグなどの代替Ｃ末端延長が末端切断型版に付加されてもよい。ある特定の実施形態では、Ｃ末端延長配列（「テール」とも呼ばれる）は、ＥおよびＤ残基を含み、８〜５０、１０〜３０、１０〜２０、５〜１０および２〜４アミノ酸長であり得る。ある特定の実施形態では、Ｃ末端延長の第１の残基は、プロリンである。ある特定の他の実施形態では、Ｃ末端延長の第１の残基は、グルタミン酸である。
【０１４７】
一部の実施形態では、Ｎ末端は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれより多くのアミノ酸だけ延長されてもよく、これは、標的結合、安定性または両方を改善するために、選択のラウンドの前または後に任意の方法で変更されてもよい。他の実施形態では、Ｃ末端は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれより多いアミノ酸だけ延長されてもよく、これは、標的結合、安定性または両方を改善するために、選択のラウンドの前または後に任意の方法で変更されてもよい。さらに他の実施形態では、ＮおよびＣ末端の両方が、この方法で延長され得る。
【０１４８】
抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）
本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ドメインは、以下の配列を含む：
抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号３）
ＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＨＳＹＨＩＱＹＷＰＬＧＳＹＱＲＹＱＶＦＳＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＥＹＱＩＲＶＹＡＥＴＧＲＧＥＳＤＱＳＬＧＷＩＱＩＧＹＲＴＥ
抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号４）
ＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＨＳＹＨＩＱＹＷＰＬＧＳＹＱＲＹＱＶＦＳＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＥＹＱＩＲＶＹＡＥＴＧＲＧＥＳＤＱＳＬＧＷＩＱＩＧＹＲＴＰ
抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号５）
ＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＨＳＹＨＩＱＹＷＰＬＧＳＹＱＲＹＱＶＦＳＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＥＹＱＩＲＶＹＡＥＴＧＧＡＤＳＤＱＳＦＧＷＩＱＩＧＹＲＴＰ
【０１４９】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの軽鎖（ＬＣ）または重鎖（ＨＣ）、特に、表８に記載された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのいずれかのＬＣまたはＨＣ、より詳しくは、１０Ｅ８  ｂｎＡｂ、ＶＲＣ０１  ｂｎＡｂまたはＮ６のＬＣまたはＨＣに連結された、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７８のいずれかに記載されるような抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を提供する。
【０１５０】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの軽鎖（ＬＣ）または重鎖（ＨＣ）、特に、表８に記載された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのいずれかのＬＣまたはＨＣ、より詳しくは、１０Ｅ８  ｂｎＡｂまたはＶＲＣ０１  ｂｎＡｂまたはＮ６のＬＣまたはＨＣに連結された、配列番号３、４、５または７８のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を提供する。
【０１５１】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含み、任意選択で、抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）をさらに含む。一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）／抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチド（および任意選択の抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番号７６６または配列番号７６７に示される配列のうちいずれか１つを有する。
【０１５２】
抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ループ領域ＣＤおよびＦＧ
本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ループ領域ＣＤおよびＦＧのアミノ酸配列は、それだけには限らないが、以下の表３に列挙される配列組合せを含む。表３に記載されるＣＤループは、配列番号１によって定義される１０Ｆｎ３のＲ３０からＴ４９を置き換える。表３に記載されるＦＧループは、配列番号１によって定義される１０Ｆｎ３のＤ６７からＮ９１を置き換える。
【０１５３】
表３はまた、列挙されたＣＤ／ＦＧループ配列組合せを含む各抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のＩＣ５０値を列挙する。
【０１５４】
【表３】
2021507717.tif 000005
2021507717.tif 000006
2021507717.tif 000007
【０１５５】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１３〜７１のＣＤ／ＦＧループ領域配列組合せに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、３９、４１、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６４、６５、６７、６９および７１のＣＤループ領域のうちいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１４、１６、１８、２３、２５、２７、３５、３８、４０、４２、４５、４９、５４、６３、６６、６８および７０のＦＧループ領域のうちいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
ＷｅｂＬｏｇｏ（ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ）が使用されて、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のコンセンサス配列を同定した。配列番号１の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＣＤループのＹ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｑ４６およびＦ４８は、保存されたアミノ酸である（ＷＯ２０１６／１７１９８０の図６を参照のこと）。一部の実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、保存されたアミノ酸Ｙ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｑ４６およびＦ４８のうち１つまたは複数を含む。
【０１５９】
ＷｅｂＬｏｇｏは、保存されたアミノ酸として抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＦＧループの配列番号１のＹ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｔ７６、Ｉ８８およびＩ９０を同定した（ＷＯ２０１６／１７１９８０の図７を参照のこと）。一部の実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１の保存されたアミノ酸Ｙ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｔ７６、Ｉ８８およびＩ９０のうち１つまたは複数を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１の保存されたアミノ酸Ｙ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｑ４６、Ｆ４８、Ｙ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｔ７６、Ｉ８８およびＩ９０のうち１つまたは複数を含む。
【０１６１】
本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の全長アミノ酸配列として、それだけには限らないが、以下の表４に列挙されるものが挙げられる。表４はまた、各抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の抗ウイルスＥＣ５０値を列挙する。
【０１６２】
【表４】
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2021507717.tif 000010
【０１６３】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号７２〜９１のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、任意のＮ末端延長領域を含まない、配列番号７２〜９１のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、任意のＣ末端延長領域を含まない、配列番号７２〜９１のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、Ｎ末端およびＣ末端延長領域の両方を含まない、配列番号７２〜９１のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６７】
他の実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号７２〜９１のＮ末端領域（配列番号７８において強調された）、ＢＣループ、ＣＤループおよびＦＧループ領域に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
特定の実施形態では、抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のＤＥループは、配列番号１の保存されたＤＥループアミノ酸Ｓ５２、Ｖ５３、Ｌ５４およびＳ５５のうち１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＢＣループの２６位は、バリンまたはロイシンである。
【０１６９】
特定の実施形態では、抗ｇｐ４１（Ｎ１７）Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号９２〜３４８のＢＣループ、ＤＥループおよび／またはＦＧループ領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１の保存されたアミノ酸Ｇ７８およびＳ８５のうち１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、配列番号１の抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＦＧループの７９位は、バリンまたはイソロイシンである。
【０１７０】
特定の実施形態では、抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１のＹ２４、Ｖ２６、Ｌ２６、Ｓ５２、Ｖ５３、Ｌ５４、Ｓ５５、Ｇ７８、Ｖ７９、Ｉ７９およびＳ８５に対応する保存されたアミノ酸のうち１つまたは複数を含む。
【０１７１】
抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の点突然変異解析は、いくつかの１０Ｆｎ３非ループスキャフォールド位置を突然変異させることの利点を示した。具体的には、配列番号１の突然変異位置Ｔ５６およびＴ５８は、効力を後押しした。一部の実施形態では、抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎは、配列番号１のＴ５８Ｎ、Ｔ５８ＥまたはＴ５８Ｑの１０Ｆｎ３非ループ突然変異を含む。
【０１７２】
抗ｇｐ４１（Ｎ１７）Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−ｂｎＡｂ融合ポリペプチド
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結された表５に記載されるような抗ｇｐ４１  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））配列またはその断片を含む。
【０１７３】
本発明の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチドとともに使用するための、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドの全長アミノ酸配列として、それだけには限らないが、以下の表５に列挙されるものが挙げられる。表５はまた、各Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の抗ウイルスＥＣ５０値を列挙する。抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ−Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ペプチド融合は、表３または４から得たＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）に連結された表８に記載される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの対応する重鎖または軽鎖と対形成されて、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含むｂｎＡｂ融合物を作製し得る。図３Ａ〜３Ｄは、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含む本発明のいくつかの例示的ポリペプチドを示す。
【０１７４】
【表５】
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【０１７５】
一部の実施形態では、本発明のＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号９２〜３４８のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、本発明の抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、任意のＮ末端延長領域を含まない、配列番号９２〜３４８のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、本発明のＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、任意のＣ末端延長領域を含まない、配列番号９２〜３４８のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、本発明のＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、Ｎ末端およびＣ末端延長領域の両方を含まない、配列番号９２〜３４８のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７９】
他の実施形態では、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号９２〜３４８のＢＣループ、ＤＥループおよびＦＧループ領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１８０】
上記の配列の解析は、配列番号１のＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＤＥループのＳ５２、Ｖ５３、Ｌ５４およびＳ５５が、保存されたアミノ酸であることを示す。一部の実施形態では、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１の保存されたアミノ酸Ｓ５２、Ｖ５３、Ｌ５４およびＳ５５のうち１つまたは複数を含む。さらに、上記の配列の解析は、配列番号１の抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＢＣループのＹ２４が、保存されたアミノ酸であることを示す。一部の実施形態では、配列番号１のＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＢＣループの２６位は、バリンまたはロイシンである。
【０１８１】
上記の配列の解析は、配列番号１の抗Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＦＧループのＧ７８およびＳ８５が、保存されたアミノ酸であることを示す。一部の実施形態では、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、保存されたアミノ酸Ｇ７８およびＳ８５のうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、配列番号１のＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＦＧループの７９位は、バリンまたはイソロイシンである。一部の実施形態では、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１の保存されたアミノ酸Ｙ２４、Ｖ２６、Ｌ２６、Ｓ５２、Ｖ５３、Ｌ５４、Ｓ５５、Ｇ７８、Ｖ７９、Ｉ７９およびＳ８５のうち１つまたは複数を含む。
【０１８２】
Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の点突然変異解析は、いくつかの１０Ｆｎ３非ループスキャフォールド位置を突然変異させることの利点を示した。具体的には、配列番号１の突然変異位置Ｔ５６およびＴ５８は、効力を後押しした。一部の実施形態では、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、配列番号１のＴ５８のＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの突然変異を含む。
【０１８３】
ＩＩ．ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤
ｇｐ４１のアミノ酸配列、およびＨＩＶ−１の異なる株間のその変動は周知である。膜融合ドメイン（しばしば、融合ペプチドまたはＦＰと呼ばれる）は、標的細胞膜への挿入および破壊に関与すると考えられる。膜貫通アンカー配列を含有する膜貫通ドメインは、タンパク質のＣ末端に向かって配置される。膜融合ドメインと膜貫通アンカーとの間は、ヘプタッドリピート（ＨＲ）領域として知られる２つの別個の領域であり、各領域は複数のヘプタッドを有する。ＨＲ１領域を含むアミノ酸配列およびＨＲ２領域を含むアミノ酸配列は、それぞれ、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質中の比較的保存された領域である。ｇｐ４１（クレードＢコンセンサス）の外部ドメインの代表的な配列は以下の通りである：
５１２  ＡＶＧＩＧＡＭＦＬ  ＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭ  ＧＡＡＳＶＴＬＴＶＱ  ＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱ  ＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥ
５６１  ＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶ  ＷＧＩＫＱＬＱＡＲＶ  ＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ  ＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧ  ＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷ
６１１  ＮＡＳＷＳＮＫＳＬＤ  ＥＩＷＮＮＭＴＷＭＥ  ＷＥＲＥＩＤＮＹＴＧ  ＬＩＹＴＬＩＥＥＳＱ  ＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬ
６６１  ＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷ  ＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷ  ＹＩＫ（配列番号２）
【０１８４】
融合ペプチドは、最初のおよそ２３個のアミノ酸Ａｌａ５１２〜Ｓｅｒ５３４を含む。ＨＲ１領域は、同型で相互作用して３−ヘリックスバンドル構造のコアを形成する、第１（「ａ」）の位置および第４（「ｄ」）の位置で、疎水性残基の優位性を有する、複数の連続した７アミノ酸残基のストレッチまたは「ヘプタッド」（各ヘプタッド中の７つのアミノ酸は「ａ」から「ｇ」で示される）を有する。グルタミンなどの中性極性アミノ酸はまた、これらの位置を占めることがある。１つの代表的なヘプタッドは、Ｌｅｕ５４５で開始する。ＨＲ１の高度に保存された部分は、Ｌｅｕ５６５からＬｅｕ５８１までの１７残基からなり、「Ｎ１７」と呼ばれる。
【０１８５】
ｇｐ４１のＣ末端部分は、融合プロセス中にアルファヘリックス構造を形成し、ＨＲ１三重ヘリックス構造の溝に結合すると考えられるＨＲ２領域を含む。ＨＲ２もまた、ヘプタッドを含むが、これらは、同型的に相互作用せず、むしろＨＲ１からのアミノ酸と相互作用する。１つの代表的なヘプタッドはＴｒｐ６２８で開始する。
【０１８６】
ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤
本発明のＨＩＶ融合ペプチド阻害剤は、それだけには限らないが、以下の表６中の配列を含む。
【０１８７】
【表６】
2021507717.tif 000035
【０１８８】
一部の実施形態では、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤は、配列番号３４９〜３６９のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤のＣ末端領域における点突然変異は、効力を後押しすることがわかった。一部の実施形態では、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤のＣ末端付近のアスパラギン酸（Ｄ）の疎水性の置き換えは、少なくとも１０倍の効力の増大をもたらす。一部の実施形態では、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤は、「ＤＫ」を「ＹＫ」、「ＬＫ」、「ＦＫ」または「ＷＫ」で置き換えることを含む。
【０１９０】
Ｃ末端領域における他の点突然変異の研究は、Ｃ末端アミノ酸「ＷＡＳ」がどのようにして効力に対して良好な効果を伴って突然変異され得るかを示した。一部の実施形態では、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤は、Ｃ末端アミノ酸「ＷＡＳ」を「ＷＦＳ」または「ＷＡＬ」に置き換えることを含む。
【０１９１】
ＩＩＩ．リンカー
本発明のポリペプチドの種々の成分は、共有結合または非共有結合によって連結されてもよい。一部の実施形態では、ＰＫ部分は、直接的に、またはポリペプチドリンカーを介して間接的に、本発明のポリペプチドに連結されてもよい。適切なリンカーは、別々のドメインが互いに独立して折り畳まれ、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成することを可能にするものである。
【０１９２】
一部の実施形態では、成分（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）は、直接的に、またはポリペプチドリンカーを介して間接的に連結されてもよい。適切なリンカーは、（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および／または抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの）別々のドメインが互いに独立して折り畳まれ、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成することを可能にするものである。
【０１９３】
本開示は、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカーを含む、これらの要件を満たすいくつかの適切なリンカーを提供する。本明細書に記載される実施例は、ポリペプチドリンカーを介して接合された本発明のドメインのポリペプチドが、それらの標的結合機能を保持するように設計される。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびセリン残基を含み、８〜５０、１０〜３０および１０〜２０アミノ酸長であってもよい。例として、アミノ酸配列（ＧＳ）７（配列番号３７０）、Ｇ（ＧＳ）６（配列番号３７１）およびＧ（ＧＳ）７Ｇ（配列番号３７２）を有するリンカーが挙げられる。他のリンカーは、グルタミン酸を含有し、例えば、（ＧＳＥ）５（配列番号３７３）およびＧＧＳＥＧＧＳＥ（配列番号３７４）が挙げられる。他の例示的なグリシン−セリンリンカーとしては、（ＧＳ）４（配列番号３７５）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号３７６）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号３７７）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号３７８  （ＧＧＧＧＳ）３Ｇ（配列番号３７９）が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−プロリンベースのリンカーである。
【０１９４】
これらのリンカーは、グリシンおよびプロリン残基を含み、３〜３０、１０〜３０および３〜２０アミノ酸長であってもよい。例として、アミノ酸配列（ＧＰ）３Ｇ（配列番号３８０）および（ＧＰ）５Ｇ（配列番号３８１）を有するリンカーが挙げられる。他の実施形態では、リンカーは、３〜３０、１０〜３０および３〜２０アミノ酸長を有するプロリン−アラニンベースのリンカーであってもよい。プロリンアラニンベースのリンカーの例として、例えば、（ＰＡ）３（配列番号３８２）、（ＰＡ）６（配列番号３８３）および（ＰＡ）９（配列番号３８４）が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、グルタミン酸−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グルタミン酸およびプロリン残基を含み、３〜３０、１０〜３０および３〜２０アミノ酸長であってもよい。例として、アミノ酸配列ＥＳＰＥＰＥＴＰＥＤＥ（配列番号３８５）および（ＥＳＰＥＰＥＴＰＥＤ）２Ｅ（配列番号３８６）を有するリンカーが挙げられる。
【０１９５】
本発明の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂは、１アミノ酸長〜１５０アミノ酸長、または１アミノ酸長〜１４０アミノ酸長、例えば、１アミノ酸長〜１３０アミノ酸長、または１〜１２０アミノ酸長、または１〜８０アミノ酸長、または１〜５０アミノ酸長、または１〜２０アミノ酸長、または１〜１０アミノ酸長、または５〜１８アミノ酸長であってもよいアミノ酸配列で構成されるリンカーによって、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および／またはＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、すなわちエピトープ結合ドメインに連結されていてもよい。このような配列は、それら自体の三次構造を有していてもよく、例えば、本発明のリンカーは、単一の可変ドメインを含んでいてもよい。一実施形態では、リンカーのサイズは、単一の可変ドメインに等しい。適切なリンカーは、１〜２０オングストローム、例えば、１５オングストローム未満、または１０オングストローム未満、または５オングストローム未満のサイズであり得る。
【０１９６】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインは、１〜１５０個のアミノ酸、例えば、１〜２０個のアミノ酸、例えば、１〜１０個のアミノ酸を含むリンカーを有する抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに直接結合される。このようなリンカーは、表７に示される配列番号３７０〜４１５に示されるもののうちいずれか１つ、または複数のこのようなリンカーから選択され得る。
【０１９７】
【表７】
2021507717.tif 000036
2021507717.tif 000037
【０１９８】
本発明の抗原結合性タンパク質中において使用されるリンカーは、単独で、または他のリンカーに加えて、Ｇ３残基の１つもしくは複数のセット、例えば、「ＧＳＴＶＡＡＰＳ」（配列番号３９３）、または「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号３９２）または「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号３９４）を含んでいてもよい。一実施形態では、リンカーは配列番号３８８を含む。
【０１９９】
一実施形態では、エピトープ結合ドメインの抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、リンカー「（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（配列番号４０８〜４５７）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、リンカー「（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（配列番号４５８〜５０７）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、リンカー「（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（配列番号５０８〜５５４）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ」（配列番号５５５〜５９８）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（配列番号５９９〜６４８）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（配列番号６４９〜６９８）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（配列番号６９９〜７４８）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。すべてにおいて、このような実施形態は、配列番号４０８〜７５７、ｎ＝１〜１０およびｍ＝０〜４によって記載した。
【０２００】
このようなリンカーの例として、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１（配列番号４１８））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１（配列番号４１９））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１（配列番号４２０））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１（配列番号４２１）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０（配列番号４０９））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０（配列番号４１０））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０（配列番号４１１））が挙げられる。
【０２０１】
このようなリンカーの例として、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１（配列番号４６８））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１（配列番号４６９））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１（配列番号４７０））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１（配列番号４７１））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０（配列番号４５９））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０（配列番号４６０））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０（配列番号４６１））が挙げられる。
【０２０２】
このようなリンカーの例として、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１（配列番号３９２））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１（配列番号４００））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１（配列番号４０１））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１（配列番号５１８））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０（配列番号５０９））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０（配列番号５１０））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０（配列番号５１１））が挙げられる。
【０２０３】
このようなリンカーの例として、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１（配列番号３９４））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１（配列番号３９５））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１（配列番号３９６））、または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１（配列番号３９７））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝５およびｍ＝１（配列番号３９８））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝６およびｍ＝１（配列番号３９９））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１およびｍ＝０（配列番号５５５））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝２およびｍ＝４（配列番号５９２））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０（配列番号５５７））、または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝２およびｍ＝５（配列番号５９３）が挙げられる。
【０２０４】
このようなリンカーの例として、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１（配列番号７０９））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１（配列番号７１０））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１（配列番号７１１））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１（配列番号７１２））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０（配列番号７００））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０（配列番号７０１）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０（配列番号７０２））が挙げられる。
【０２０５】
別の実施形態では、エピトープ結合ドメインと抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂとの間にリンカーは存在しない。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「ＴＶＡＡＰＳ」（配列番号３８８）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号３９２）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「ＧＳ」によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「ＡＳＴＫＧＰＴ」（配列番号３８９）によって、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂに連結される。最適なリンカーの長さおよびそのアミノ酸組成は、当技術分野において周知の方法による日常的な実験によって決定され得ることが企図される。
【０２０６】
リンカーまたはスペーサーは、抗ＣＤ４部分のＮ末端、または抗ＣＤ４部分のＣ末端で導入されてもよい。抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂは、抗ＣＤ４部分のＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結されてもよい。一部の実施形態では、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）とＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）との間の好ましいリンカーは、短いグルタミン−プロリンリッチのリンカーである。一部の実施形態では、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）とＨＩＶ融合ペプチド阻害剤との間の好ましいリンカーは、可動性のグリシン−セリンリッチのリンカーである。
【０２０７】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４−Ａ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結された抗ＣＤ４  Ａ）−配列番号９
【化１】
2021507717.tif 000038
【０２０８】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ａ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結された抗ＣＤ４  Ａ）−配列番号１０
【化２】
2021507717.tif 000039
【０２０９】
１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４  Ａ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの軽鎖に連結された抗ＣＤ４  Ａ）−配列番号１１
【化３】
2021507717.tif 000040
【０２１０】
１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ａ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの軽鎖に連結された抗ＣＤ４  Ａ）−配列番号１２
【化４】
2021507717.tif 000041
【０２１１】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４  Ｂ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結された抗ＣＤ４  Ｂ）−配列番号７６４
【化５】
2021507717.tif 000042
【０２１２】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ｂ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結された抗ＣＤ４  Ｂ）−配列番号７６５
【化６】
2021507717.tif 000043
【０２１３】
１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４  Ｂ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの軽鎖に連結された抗ＣＤ４  Ｂ）−配列番号７６６
【化７】
2021507717.tif 000044
【０２１４】
１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ｂ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの軽鎖に連結された抗ＣＤ４  Ｂ）−配列番号７６７
【化８】
2021507717.tif 000045
【０２１５】
上記の配列番号９〜１２および配列番号７６４〜７６７において、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列は下線付きである。抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分は太字で示す。リンカー配列はイタリック体で示す。
【０２１６】
ＩＶ．薬物動態部分
一態様では、本出願は、抗ＣＤ４部分および抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含むポリペプチド、ならびにその組合せを提供し、ポリペプチドは、未改変ポリペプチドと比べて、改善された薬物動態を提供するために改変される。改善された薬物動態は、認知される治療的必要性に従って、評価されてもよい。多くの場合、場合によりタンパク質が投与後の血清中で利用可能なままである時間を増加させることによって、生物学的利用率を増加させること、および／または投与間の時間を増加させることが望ましい。一部の例では、経時的にタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること（例えば、投与直後および次の投与直前のタンパク質の血清濃度の差を減少させること）が望ましい。
【０２１７】
免疫グロブリンＦｃドメイン（および断片）
一部の実施形態では、本発明の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂポリペプチド部は、改変された機能的Ｆｃドメイン、またはその断片もしくはバリアントを有する。本明細書で使用される場合、「機能的Ｆｃ領域」は、ＦｃＲｎに結合する能力を保持するＦｃドメインまたはその断片である。一部の実施形態では、機能的Ｆｃ領域はＦｃＲｎに結合するが、エフェクター機能は持たない。ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域またはその断片の能力は、当技術分野で公知の標準的な結合アッセイによって決定され得る。他の実施形態では、改変Ｆｃ領域またはその断片はＦｃＲｎに結合し、天然Ｆｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を改善する。例示的な「エフェクター機能」として、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。
【０２１８】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変により、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書において、バリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは、これらと少なくとも約９５％、９６％または９７％の配列同一性、さらにより好ましくは、これらにと少なくとも約９８％の配列同一性を有する。
【０２１９】
Ｖ．核酸−タンパク質融合技術
一態様では、本発明は、ＣＤ４、またはｇｐ４１のｎ１７ドメインに結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を提供する。特異的結合特性を有するＦｎ３ドメインを迅速に作製および試験する１つの方法は、核酸−タンパク質融合技術である。本開示は、核酸−タンパク質融合物（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合物）を利用して、タンパク質への結合のために重要である新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを特定する、「ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ」と称されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現およびタグ化技術を用いる。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコード遺伝情報に共有結合によってカップリングする技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な説明については、これらのすべてが、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｏｓｔａｋら、米国特許第６，２５８，５５８号、米国特許第６，２６１，８０４号、米国特許第６，２１４，５５３号、米国特許第６，２８１，３４４号、米国特許第６，２０７，４４６号、米国特許第６，５１８，０１８号および米国特許第６，８１８，４１８号；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９４号：１２２９７〜１２３０２頁（１９９７年）；ならびにＫｕｒｚら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、５巻：１２５９〜１２６４頁（２０００年）を参照のこと。
【０２２０】
ＶＩ．抗ＨＩＶ広域中和抗体（ｂｎＡｂ）と連結された抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）
表４に記載される抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列は、抗ＨＩＶ広域中和抗体（抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ）またはその断片に連結されていてもよい。このような抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂとして、それだけには限らないが、表８に記載される抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂが挙げられる。
【０２２１】
【表８】
2021507717.tif 000046
2021507717.tif 000047
【０２２２】
表４から得た抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列と組み合わされる表８から得た特定の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂとして、ＰＧ９、ＰＧＴ１２５−１３１、ＶＲＣ０１、３ＢＮＣ１１７、ＮＩＨ４５−４６、３ＢＣ１７６、４Ｅ１０、Ｎ６、１０Ｅ８、１０Ｅ８ｖ４および他の１０Ｅ８バリアントが挙げられる。本発明の一実施形態では、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂは、１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ、ＰＧＴ−１２８  ｂｎＡｂ、ＤＨ５１１．２もしくはＤＨ５１１．１２Ｐ  ｂｎＡｂ、ＰＧ９  ｂｎＡｂ、Ｎ６  ｂｎＡｂまたはＶＲＣ０１  ｂｎＡｂである。
【０２２３】
他の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂは、４Ｅ１０およびＮ６を含む本明細書に記載されるポリペプチドまたはその断片、ならびに１０Ｅ８のバリアントと組み合わされてもよい。１０Ｅ８のバリアントの例として、１０Ｅ８ｖ４として公知の溶解度が改善された１０Ｅ８  ｂｎＡｂが挙げられ、１０Ｅ８のアミノ酸配列は、その汎反応性ＨＩＶ中和活性を改善するために改変されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｗｏｎら、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＨＩＶ−１−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  １０Ｅ８  ｔｈｏｕｇｈ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、９０巻、５８９９〜５９１２頁（２０１６年））。参照によって本明細書に組み込まれる、Ｙ．Ｄ．Ｋｗｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓにおける「Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｓｅｍｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａ  Ｎｅａｒ  Ｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＨＩＶ−１−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２２巻、１７９８〜１８０９頁（２０１８年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１８．０１．０２３）によって記載されている１０Ｅ８ｖ４−１００ｃＷ、１０Ｅ８ｖ４−１００ｃＦおよび１０Ｅ８ｖ４−５Ｒ＋１００ｃＦを含む他の１０Ｅ８ｖ４バリアント、およびＨｕａｎｇら「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｑｕｉｓｉｔｅ  ＨＩＶ−１−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｃｅｌｌ  １６５巻、１６２１〜１６３１頁（２０１６年）によって記載されたものは、このようなバリアントの他のものである。
【０２２４】
本明細書に記載されるような融合ポリペプチドにおいて使用され得る他の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂとして、４Ｅ１０（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｄｏｓｏら「Ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ４Ｅ１０  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ａ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｇｐ４１」Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２２巻、１６３〜１７３頁（２００５年））；ＣＤ４結合部位を標的とする広域中和抗体であるＮ６（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｎｇら「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣＤ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＨＩＶ  ｔｈａｔ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｎｅａｒ−ｐａｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｄｔｈ」Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４５巻、１１０９〜１１２１頁（２０１６年））、ならびに１０Ｅ８、４Ｅ１０およびＮ６またはこれらの断片の組合せが挙げられる。
【０２２５】
本発明の一実施形態では、抗ｂｎＡｂ融合ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番号７６６または配列番号７６７のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を含む。
【０２２６】
本発明の一実施形態では、１０Ｅ８  ｂｎＡｂは、表８に示される１０Ｅ８バリアントのうちいずれかのアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を含む。
【０２２７】
一実施形態では、１０Ｅ８  ｂｎＡｂは、以下の配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１および配列番号７７２に示されるＨＣまたはＬＣ配列のうちいずれかに対して９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を含む。
【０２２８】
１０Ｅ８ｖ４  ＬＣ（配列番号６）
ＡＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＫＱＴＶＴＩＴＣＲＧＤＳＬＲＳＨＹＡＳＷＹＱＫＫＰＧＱＡＰＶＬＬＦＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＡＳＧＮＲＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＲＤＫＳＧＳＲＬＳＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０２２９】
１０Ｅ８ｖ４  ＨＣ−ＳＬＳＬＳＰバリアント（配列番号７）
ＥＶＲＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＤＦＤＮＡＷＭＴＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＴＧＰＧＥＧＷＳＶＤＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＴＬＹＬＥＭＮＮＶＲＴＥＤＴＧＹＹＦＣＡＲＴＧＫＹＹＤＦＷＳＧＹＰＰＧＥＥＹＦＱＤＷＧＱＧＴＬＶＩＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
【０２３０】
１０Ｅ８ｖ４  ＨＣ−ＳＬＳＬＳＰＧＫバリアント（配列番号８）
ＥＶＲＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＤＦＤＮＡＷＭＴＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＴＧＰＧＥＧＷＳＶＤＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＴＬＹＬＥＭＮＮＶＲＴＥＤＴＧＹＹＦＣＡＲＴＧＫＹＹＤＦＷＳＧＹＰＰＧＥＥＹＦＱＤＷＧＱＧＴＬＶＩＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２３１】
１０Ｅ８ｖ２−ＨＣ（重鎖）配列番号７６８
ＥＶＲＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＮＦＤＤＡＷＭＴＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＳＧＰＧＥＧＷＳＶＤＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＬＮＳＩＮＦＬＹＬＥＭＮＮＶＲＴＥＤＴＧＹＹＦＣＡＲＴＧＫＨＹＤＦＷＳＧＹＰＰＧＥＥＹＦＱＤＷＧＱＧＴＬＶＩＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２３２】
１０Ｅ８ｖ３−ＨＣ（重鎖）配列番号７６９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＳＦＫＮＴＷＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＴＧＰＧＥＧＷＴＳＤＹＡＡＴＶＱＧＲＦＴＩＳＲＮＮＭＩＤＭＬＹＬＥＭＮＲＬＲＴＤＤＴＧＬＹＹＣＶＨＴＥＫＹＹＮＦＷＧＧＹＰＰＧＥＥＹＦＱＨＷＧＲＧＴＬＶＩＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２３３】
１０Ｅ８ｖ４−Ｖ５Ｒ−１００ｃＦ−ＨＣ（重鎖）配列番号７７０
ＥＶＲＬＲＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＤＦＤＮＡＷＭＴＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＴＧＰＧＥＧＷＳＶＤＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＴＬＹＬＥＭＮＮＶＲＴＥＤＴＧＹＹＦＣＡＲＴＧＫＹＹＤＦＷＦＧＹＰＰＧＥＥＹＦＱＤＷＧＱＧＴＬＶＩＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２３４】
１０Ｅ８ｖ２−ＬＣ（軽鎖）配列番号７７１
ＡＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＫＱＴＶＴＩＴＣＲＧＤＳＬＲＳＨＹＡＳＷＹＱＫＫＰＧＱＡＰＩＬＬＦＹＧＫＮＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＡＳＧＮＲＡＳＬＴＩＳＧＡＱＡＥＤＤＡＥＹＹＣＳＳＲＤＫＳＧＳＲＬＳＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０２３５】
１０Ｅ８ｖ３−ＬＣ（軽鎖）配列番号７７２
ＡＳＥＬＴＱＥＴＧＶＳＶＡＬＧＲＴＶＴＩＴＣＲＧＤＳＬＲＳＨＹＡＳＷＹＱＫＫＰＧＱＡＰＩＬＬＦＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＨＤＲＦＳＧＳＡＳＧＮＲＡＳＬＴＩＳＧＡＱＡＥＤＤＡＥＹＹＣＳＳＲＤＫＳＧＳＲＬＳＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０２３６】
ＶＩＩ．ベクターおよびポリヌクレオチド
本明細書に開示される種々のタンパク質またはポリペプチド（例えば、抗原結合性ポリペプチドまたは融合ポリペプチド）のいずれかをコードする核酸は、化学的に合成されてもよい。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するように選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特定化されたコドン使用頻度パターンは、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のために開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００巻（２号）：４３８〜４４２頁（２００３年１月２１日）；Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、２６巻（Ｉ）：９６〜１０５頁（２００２年１０月）；Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｎ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻（５号）：４４６〜４４９頁（２００１年１０月）；Ｍａｋｒｉｄｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６０巻（３号）：５１２〜５３８頁（１９９６年９月）；およびＳｈａｒｐら、Ｙｅａｓｔ、７巻（７号）：６５７〜６７８（１９９１年１０月）を参照のこと。
【０２３７】
核酸操作のための一般的な技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８７年）、および定期的なアップデートに記載されている。一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。このような調節エレメントとして、転写プロモーター、転写をコントロールするための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結をコントロールする配列が挙げられる。宿主において複製する能力は、通常、複製開始点により付与され、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が追加で組み込まれる。
【０２３８】
本明細書に記載されるタンパク質は、直接的だけではなく、好ましくはシグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、組換え的に産生されてもよい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。
【０２３９】
天然シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。
【０２４０】
酵母分泌については、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス属およびクリベロミセス属のアルファ因子リーダーを含む）、もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー、または米国特許第５，６３１，１４４号に記載されているシグナル配列によって置換されてもよい。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のためのＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、タンパク質をコードするＤＮＡにライゲートされてもよい。
【０２４１】
発現およびクローニングベクターは両方とも、ベクターが１つまたは複数の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡと独立して複製することを可能にするものであり、複製開始点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性菌に対して適しており、２ミクロンプラスミド開始点は酵母に対して適しており、種々のウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０開始点は、典型的には、早期プロモーターを含有するという理由のみで、使用され得る）。
【０２４２】
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有していてもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠失を補充する、あるいは（ｃ）複合培地から利用可能ではない重要な意味を持つ栄養素を供給する、タンパク質をコードする、例えば、バチルス属のためにはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０２４３】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、本発明のタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含有する。原核生物宿主とともに使用するのに適切なプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｎプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが適切である。
【０２４４】
細菌系における使用のためのプロモーターは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有する。真核生物のためのプロモーター配列は公知である。実質的には、すべての真核遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべては、真核発現ベクターに適切に挿入される。
【０２４５】
酵母宿主とともに使用するための適切な促進配列の例として、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
【０２４６】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であるという条件で、コントロールされ得る。
【０２４７】
高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が、現在公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例として、複製開始点の後ろ側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターのエンハンサー、複製開始の後ろ側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のための増強エレメントについて、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照のこと。エンハンサーは、ペプチドコード配列に対して５’または３’の位置でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’部位に位置する。
【０２４８】
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結のため、およびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含有する。このような配列は、真核またはウイルスＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５’および、時々３’の非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６、およびそこに開示されている発現ベクターを参照のこと。
【０２４９】
組換えＤＮＡは、タンパク質を精製するために有用であり得る任意のタイプのタンパク質タグ配列を含むこともできる。タンパク質タグの例として、それだけには限らないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞の宿主で使用するために適したクローニングおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク（１９８５年）に見出され得、この関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５０】
発現構築物は、当業者に明らかであるように、宿主細胞に適した方法を使用して、宿主細胞に導入される。核酸を宿主細胞に導入するためのさまざまな方法は、当技術分野において公知であり、それだけには限らないが、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性因子である）が挙げられる。
【０２５１】
適切な宿主細胞として、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞が挙げられる。適切な細菌として、グラム陰性またはグラム陽性の生物体、例えば、大腸菌またはバチルス種が挙げられる。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために用いられ得る。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：４７頁（１９８８年））により概説されている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例として、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。精製ポリペプチドは、適切な宿主／ベクター系を培養して、組換えタンパク質を発現させることによって調製される。多くの用途のために、本明細書に開示される小さいサイズの多くのポリペプチドが、発現のための好ましい方法として、大腸菌において発現される。次いで、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。
【０２５２】
ＶＩＩＩ．タンパク質産生
Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）などの融合タンパク質（例えば、抗原結合性ポリペプチド）の成分を産生する細胞株の作出および単離は、本明細書において記載されるもの、およびその全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６０４１４のような、当技術分野で公知の標準技術を使用して、達成され得る。
【０２５３】
宿主細胞は、タンパク質産生のための本明細書に記載される発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適した、改変された慣用の栄養培地中で培養される。本明細書に示される例において、ハイスループットタンパク質産生（ＨＴＰＰ）および中規模の産生のために使用される宿主細胞は、ＨＭＳ１７４細菌株由来のものであった。
【０２５４】
本明細書に記載されるようなタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、さまざまな培地中で培養され得る。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ））は、宿主細胞を培養するのに適切である。加えて、Ｈａｍら  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、５８巻：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｉｔｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、米国特許第５，１２２，４６９号、米国特許第６，０４８，７２８号、米国特許第５，６７２，５０２号、または米国特許第ＲＥ３０，９８５号に記載されている多くの培地が、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。任意のこれらの培地は、必要により、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェートなど）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（マイクロモル濃度の範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー供給源で補充されていてもよい。任意の他の必要な栄養補充はまた、当業者に公知である適した濃度で含まれていてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかである。
【０２５５】
本明細書に開示されるタンパク質はまた、無細胞翻訳系を使用して産生されてもよい。このような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写がｍＲＮＡを産生することを可能にし、利用される特定の無細胞系（真核生物、例えば、哺乳動物もしくは酵母無細胞翻訳系、または原核生物、例えば、細菌無細胞翻訳系）におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように改変されなければならない。
【０２５６】
本明細書に記載されるタンパク質はまた、化学合成によって（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．（１９８４年）に記載される方法によって）産生され得る。タンパク質への改変も化学合成によって産生され得る。
【０２５７】
本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野において一般に公知のタンパク質に対する単離／精製方法によって精製され得る。非限定的な例として、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、異なる緩衝液に交換されてもよく、ならびに／または、それだけには限らないが、濾過および透析を含む、当技術分野で公知のさまざまな方法のいずれかによって濃縮されてもよい。
【０２５８】
精製ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも８５％純粋、または好ましくは、少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは、医薬品としての使用のために十分に純粋である。
【０２５９】
ＩＸ．生物物理学的および生化学的特性評価
本発明のタンパク質の標的分子（例えば、ＣＤ４またはｇｐ４１）への結合は、平衡定数（例えば、解離、Ｋｄ）に関して、および速度定数（例えば、結合速度定数、ｋｏｎ、および解離速度定数、ｋｏｆｆ）に関して、評価されてもよい。本発明のタンパク質は、一般に、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫｄで標的分子に結合するが、より高いＫｄ値が許容され得、その場合、ｋｏｆｆが十分に低いか、またはｋｏｎが十分に高い。
【０２６０】
結合親和性のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ＣＤ４またはｇｐ４１に結合するポリペプチド（Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）など）は、各種のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して特定され得る。好ましくは、アッセイは、複数の候補を同時にスクリーニングすることを可能にするハイスループットアッセイである。
【０２６１】
一部の実施形態では、生体分子相互作用は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムを用いてリアルタイムで監視され得、これは、ＳＰＲを使用して、最大で３００ｎｍ離れた表面の屈折率の変化に起因する、ガラス支持体上の金薄膜の表面での光の共鳴角の変化を検出する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）解析は、結合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数および親和性定数を生じる。結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、結合速度定数および解離速度定数を評価することによって得られる。バイオセンサーチップは、標的の共有結合によるカップリングのために活性化される。次いで、標的は希釈され、チップ上に注入されて、固定化された物質の応答単位でシグナルを得る。共鳴単位（ＲＵ）のシグナルは固定化された物質の質量に比例するので、これは、マトリックス上の固定化された標的密度の範囲を表す。結合および解離のデータは、１：１の二分子相互作用についての正味の速度表現を解釈するためのグローバル解析に同時にフィットされ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＲｍａｘ（飽和時の最大応答）に対する最適なフィット値を得る。結合についての平衡解離定数であるＫｄは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてＳＰＲ測定から算出される。
【０２６２】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、１００ｎＭ以下のＫｄを示す。好ましくは、Ｋｄは１０ｎＭ以下である。より好ましくは、Ｋｄは１ｎＭ以下である。
【０２６３】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下のＩＣ５０を示す。好ましくは、ＩＣ５０は１．５ｎＭ以下である。より好ましくは、ＩＣ５０は０．５ｎＭ以下である。
【０２６４】
本明細書において上記に記載されるアッセイは例示的であり、タンパク質間の結合親和性を決定するための当技術分野において公知の任意の方法（例えば、蛍光に基づく移動（ＦＲＥＴ）、酵素結合免疫吸着アッセイ、および競合結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ））が使用されて、本発明のポリペプチドの結合親和性を評価し得ることが理解されるべきである。
【０２６５】
本発明では、ＥＬＩＳＡアッセイは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲによって決定される親和性で、ＣＤ４に結合するＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を特定するために利用された。ＦＡＣＳアッセイも使用されて、Ｔ細胞表面上に天然に存在するＣＤ４へのＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（単独、およびＣＤ結合部分−ｂｎＡｂポリペプチドの一部として）の結合のＥＣ５０を決定する。ペプチド親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲによって測定される。
【０２６６】
阻害活性のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ＨＩＶ感染、特に、ＨＩＶ−１感染に対する本発明のｂｎＡｂ融合ポリペプチド（または個々の阻害剤もしくはそれらの組合せ）の効力の調査を可能にする当技術分野において認識されている種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が存在する。これらは、培養細胞または末梢血単球培養物中の実験室由来ウイルスまたは臨床分離株の各種の株の完全な複製を可能にする系を含む。加えて、感染の初期の細胞内移行段階を再現する系は、生存可能なウイルスを使用することなく、本発明のポリペプチド、個々の阻害剤またはそれらの組合せの有効性を解析するために使用され得る。これらとして、それだけには限らないが、感染性ビリオンの産生を不可能にさせる欠失を含有する「シュードタイプ」ウイルス、または標的細胞に対するＨＩＶ特異的融合反応を監視するために使用され得るＨＩＶ  ｇｐ１６０遺伝子のみを発現する細胞が挙げられる。
【０２６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ法
当業者は、複製を可能にし、一部の場合では、ＨＩＶ感染の症状を再現することを可能にする、当該技術分野において認識されている各種の動物モデルを知っている。これらのモデルは、本発明のポリペプチド、個々の阻害剤または本発明のそれらの組合せの有効性を試験するために使用され得る。
【０２６８】
Ｘ．治療的用途
一態様では、本発明は、ＨＩＶ感染の治療または予防のために有用な本発明の融合ポリペプチド（例えば、抗原結合性ポリペプチド）を提供する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、有効量の本発明のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象におけるＨＩＶ融合を減弱または阻害するための方法を提供する。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、哺乳動物、特にヒトに対して、薬学的に許容される。「薬学的に許容される」ポリペプチドとは、重大な有害な医学的結果なしで、動物に投与されるポリペプチドを指す。
【０２６９】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、治療される特定の障害または疾患に有用であることが当技術分野において公知である薬剤と組み合わせて（同時にまたは別々に）、対象に投与される。
【０２７０】
一部の実施形態では、本発明の療法のポリペプチドのための標的患者集団は、例えば、年齢、既往症、遺伝子構造および／または併存疾患に起因して、治療される疾患のための標準療法が受け入れられない患者集団である。本発明のポリペプチドは、実質的な副作用または安全性の懸念に関連する既存の療法の代替としての役割を果たすことができる。
【０２７１】
一部の実施形態では、本発明の療法のポリペプチドのための標的患者集団は、生活習慣または他の悪化要因に起因して、感染の危険性が高い非感染個体で構成される。本発明のポリペプチドは、これらの個体がＨＩＶに感染することから保護するために使用される（曝露前の予防）。
【０２７２】
ＸＩ．医薬組成物
本発明は、本明細書に記載される本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む医薬組成物をさらに提供し、組成物は、エンドトキシンを本質的に含まないか、または少なくとも、適切な規制当局（例えば、ＦＤＡ）によって決定される許容レベル以下のエンドトキシンを含有する。
【０２７３】
本発明の組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、または非経口投与のための液体；あるいは、局所投与のためのゲル、ローション、軟膏、クリーム、もしくはポリマー、または他の持続放出ビヒクル、あるいは吸入または経鼻投与のために適切な噴霧可能な懸濁液の形態であり得る。
【０２７４】
組成物を作製するための当技術分野において周知の方法は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ＰＡ（２０００年）に見出される。非経口投与のための組成物は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含有していてもよい。生体適合性で生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、化合物の放出をコントロールするために使用され得る。ナノ粒子組成物（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）は、化合物の生体内分布をコントロールするために使用され得る。他の潜在的に有用な非経口送達系として、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、インプラント可能な注入系、およびリポソームが挙げられる。組成物中の化合物の濃度は、投与される薬物の投薬量および投与の経路を含む、いくつかの要因に応じて変化する。
【０２７５】
許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２７６】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に封入されていてもよい。このような技術は、Ｏｓｏｌ，Ａ．編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（１９８０年）に開示されている。
【０２７７】
持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の適切な例として、本発明のタンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なマイクロスフィア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日を超えて分子の放出を可能にするが、ある特定のハイドロゲルは、より短期間、タンパク質を放出する。本発明のカプセル化されたタンパク質が、長時間、身体内に残り得る場合、それらは３７℃で水分に曝露された結果として変性または凝集することがあり、生物活性の喪失および免疫原性の可能性のある変化をもたらす。関係する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されると、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量をコントロールすること、適した添加剤を使用すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって、達成され得る。
【０２７８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される医薬組成物は、典型的には、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態、または溶液中で保管され得る。加えて、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈用溶液バッグまたは皮下注射針で穿孔可能な栓を有するバイアルに入れられる。
【０２７９】
医薬組成物が製剤化されたら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として、滅菌バイアル中で保管され得る。このような製剤は、直ぐに使える形態、または投与の前に再構成が必要な形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれかで保管され得る。
【０２８０】
本明細書における組成物はまた、治療される特定の兆候について必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物を含有していてもよい。このような分子は、適切には、意図される目的のために有効な量で、組み合わされて存在する。
【０２８１】
ＸＩＩ．投与
本発明のポリペプチドまたは本発明のその融合タンパク質を含む医薬組成物は、非経口、肺、経皮、筋肉内、経鼻、頬側、舌下、または坐剤投与を含む標準的な投与技術を使用して、ＨＩＶを有する対象に投与され得る。好ましくは、本発明のポリペプチドの投与は、非経口である。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、経膣または腹腔内投与を含む。静脈内、または腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達が好ましい。
【０２８２】
治療有効用量は、それが投与されて、治療的効果が生じる用量を指す。治療的に用いられる医薬組成物の有効量は、例えば、治療の背景および目的に依存する。当業者は、したがって、治療のための適した投薬量レベルが、送達される分子、結合剤分子が使用される兆候、投与の経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面または器官のサイズ）および状態（年齢および全体的な健康状態）に、部分的に依存して変化することを理解するだろう。
【０２８３】
例えば、治療有効用量は、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタもしくはサルなどの動物モデルのいずれかにおいて、最初に推定され得る。動物モデルはまた、適した濃度範囲および投与の経路を決定するために使用され得る。次いで、このような情報は、ヒトにおける投与のための有用な用量および経路を決定するために使用され得る。
【０２８４】
正確な投薬量は、治療を必要とする対象に関連する要因を考慮して決定され、標準技術を使用して確定され得る。投薬量および投与は、十分なレベルの活性化合物を提供するため、または所望の効果を維持するために調整される。考慮され得る要因として、疾患状態の重症度、対象の全体的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、投与の時間および頻度、合剤（複数可）、反応感受性、ならびに療法への応答性が挙げられる。一般に、本発明のポリペプチドは、１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２８５】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは，約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは，約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇの週投薬量で投与される。あるいは、本発明のポリペプチドは、約１５〜約１００ｍｇ／週、約２０〜約８０ｍｇ／週、約２０〜約６０ｍｇ／週、または約２０〜約２５ｍｇ／週で投与される。
【０２８６】
投薬の頻度は、使用される製剤中の結合剤分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、組成物は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで投与される。したがって、組成物は、経時的に単一用量もしくは複数用量として（同一または異なる濃度／投薬量で）、または持続注入として、投与されてもよい。適した投薬量のさらなる改良は、日常的に行われる。適した投薬量は、適した用量反応データの使用によって確認され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、毎日（例えば、１日１回、２回、３回または４回）、またはより少ない頻度で（例えば、１日おきに１回、週に１回もしくは２回、または毎月）投与されてもよい。加えて、当技術分野において公知であるように、年齢、ならびに体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与の時間、薬物相互作用、および疾患の重症度についての調整が必要である場合があり、当業者によって日常的な実験により確認され得る。本発明のポリペプチドは、１回で、または一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。
【０２８７】
本発明のポリペプチドまたはその融合体、および１つまたは複数の追加の治療剤の投与は、同時投与または連続投与にかかわらず、治療的用途のために上に記載されるようにして起こり得る。同時投与のための適切な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、投与される特定の治療剤の固有性に依存することが、当業者によって理解されるだろう。
【０２８８】
ＸＩＩＩ．キットおよび製造品
本発明のポリペプチドは、所定量の試薬と本発明の治療方法または診断方法における使用説明書との包装された組合せのキットで提供され得る。
【０２８９】
例えば、本発明の一実施形態では、上に記載される障害または状態の治療または予防のために有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルを含む。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成され得る。容器は、ＨＩＶを治療するために有効な本発明の組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈用溶液バッグまたは皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、本発明のポリペプチドである。容器上、またはそれに関連するラベルは、組成物がＨＩＶを治療するために使用されることを示す。製造品は、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでいてもよい。製造品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジおよび使用説明書を伴う添付文書を含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【実施例】
【０２９０】
ここで、本発明は以下の実施例を参照して説明されるが、これらは例示のみであって、本発明を限定することを意図するものではない。本発明は、その特定の実施形態を参照して詳細に説明されてきたが、その精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更および改変が行われ得ることは当業者には明らかであろう。
【０２９１】
〔実施例１〕
ＨＩＶポリペプチドＦｃ構築物；哺乳動物細胞培養
ＤＮＡは、適した哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。
細胞は、細胞培養において増殖される。
遠心分離および／または濾過によって回収される。
アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製する。
タンジェント流濾過を使用して、製剤化および濃縮する。
【０２９２】
〔実施例２〕
ポリペプチドの効力アッセイ
ＭＴ−２細胞、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞およびＮＬ４−３のプロウイルスＤＮＡクローンは、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから入手された。ＭＴ−２細胞は、１０％の熱不活性化されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５５、および２ｍＭのＬ−グルタミンで補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖された。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞は、１０％の熱不活性化されたＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５５、および２ｍＭのＬ−グルタミンで補充されたＤＭＥＭ培地中で増殖された。ＮＬ４−３のプロウイルスクローン由来のｎｅｆ遺伝子の一部分がＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子で置き換えられた組換えＮＬ−Ｒｌｕｃウイルスは、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂで構築された。複製可能なウイルスは、改変されたｐＮＬＲｌｕｃプロウイルスクローンによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションから３日後に回収された。トランスフェクションは、製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、行われた。ウイルスは、バイオマーカーとしてルシフェラーゼ酵素活性を使用して、ＭＴ−２細胞において力価測定された。ＮＬ−Ｒｌｕｃウイルスは、ＭＴ−２細胞を１時間、０．０１の多重度で感染させるために使用された後、９６ウェルプレート中のペプチドに添加された。ペプチドは、４倍に連続希釈され、１１個の濃度が、三連で播種された。インキュベーションから４〜５日後、細胞は、処理され、発現したルシフェラーゼの量によってウイルス増殖について定量化された。ルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅキットを使用して、製造業者のプロトコールに修正を加えて、定量化された。希釈されたＰａｓｓｉｖｅ溶解溶液は、再懸濁されたルシフェラーゼアッセイ試薬と予め混合され、次いで、ＳＴＯＰ  ＆  ＧＬＯ（登録商標）基質に再懸濁された（２：１：１の比）。合計５０μＬの混合物は、アッセイプレート上のそれぞれの吸引されたウェルに添加され、ルシフェラーゼ活性は、Ｗａｌｌａｃ  ＴｒｉＬｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で直ちに測定された。５０％有効濃度（ＥＣ５０）は、ペプチドが添加されていないウェルと比較して、阻害ペプチドの存在中で産生されたルシフェラーゼの量を比較することによって、産出された。５個のパラメータのシグモイド方程式が、得られたシグナル対濃度曲線をフィットさせるために使用され、５０％の最大阻害を生じるそれぞれの阻害剤の濃度（ＥＣ５０）が決定された。３つの独立した実験の結果は、平均化およびプロットされ、エラーバーは１標準偏差に相当する。
【０２９３】
〔実施例３〕
１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂおよび１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ−ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合体を産生させるための方法（図２）：
１０Ｅ８ｖ４抗体をコードする重鎖および軽鎖遺伝子、ならびに重鎖−ＣＤ４  ＡまたはＢ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合体は、ｐＴＴ５発現ベクターにクローニングされた。得られたプラスミドは、２９３ＨＥＫ細胞に共トランスフェクトされた。条件付けされた細胞培地は、回収され、抗体のために一般に使用される標準的な手順によって、プロテインＡがコンジュゲートされた樹脂による精製に付された。
【０２９４】
成熟アミノ酸配列（分泌シグナルペプチドの除去後の最終配列）は、配列番号６（１０Ｅ８ｖ４軽鎖）および配列番号７または配列番号８（それぞれ、ＳＬＳＬＳＰ中の１０Ｅ８ｖ４重鎖末端、またはＳＬＳＬＳＰＧＫ中の１０Ｅ８ｖ４重鎖末端）に相当する。追加のアミノ酸配列（分泌シグナルペプチドの除去後）は、配列番号７７７（１０Ｅ８ｖ２  ＨＣ）、配列番号７７８（１０Ｅ８ｖ３  ＨＣ）、配列番号７７９（１０Ｅ８ｖ４−Ｖ５Ｒ−１００ｃＦ  ＨＣ）、配列番号７８０（１０Ｅ８ｖ２  ＬＣ）および配列番号７８１（２０Ｅ８ｖ３  ＬＣ）を含む。
【０２９５】
１０Ｅ８ｖ４（ＬＣおよびＨＣ）、またはＶＲ０Ｃ１  ｂｎＡｂ、および／もしくはＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および／もしくは種々のリンカーとのＨＩＶ融合ペプチド阻害剤
本発明の特定の実施形態は、ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を有し、任意選択でＨＩＶ融合ペプチド阻害剤を有する、１０Ｅ８ｖ４抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの重鎖または軽鎖のいずれかを含む融合ポリペプチドを提供する。本発明の特定の実施形態は、ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を有し、任意選択でＨＩＶ融合ペプチド阻害剤を有する、ＶＲＣ０１抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含む融合ポリペプチドを提供する。本発明の他の特定の実施形態は、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を有し、任意選択でＨＩＶ融合ペプチド阻害剤を有する、１０Ｅ８ｖ４抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの重鎖または軽鎖のいずれかを含む融合ポリペプチドを提供する。ｂｎＡｂ部分とＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）部分および任意選択のＨＩＶ融合ペプチド阻害剤との間のリンカーは、必要に応じて変わってもよい。このようなＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドの特定の例は、配列番号７４９から配列番号７６７に示される。
【０２９６】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ａ（ｂｎＡｂ  １０Ｅ８ｖ４の重鎖に連結されたＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７４９）
【化９】
2021507717.tif 000048
【０２９７】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４−Ａ（ｂｎＡｂ  １０Ｅ８ｖ４の重鎖に連結されたＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５０）
【化１０】
2021507717.tif 000049
【０２９８】
ＶＲＣ０１−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４  Ａ（ＶＲＣ０１  ｂｎＡｂの軽鎖に連結されたＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５１）
【化１１】
2021507717.tif 000050
【０２９９】
ＶＲＣ０１−ＬＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４  Ａ（ＶＲＣ０１  ｂｎＡｂの軽鎖に連結されたＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５２）
【化１２】
2021507717.tif 000051
【０３００】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＰＥＤＥ−Ｎ１７−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＩＶ融合阻害剤（ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤に連結された１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結されたＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５３）
【化１３】
2021507717.tif 000052
【０３０１】
１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＰＥＤＥ−Ｎ１７−ＧＧＧＧＳ４−ＨＩＶ融合ペプチド（ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤に連結された１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの軽鎖に連結されたＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５４）
【化１４】
2021507717.tif 000053
【０３０２】
上記の配列番号７４９〜７５４について、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分は太字であり、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）部分は二重下線付きであり、ＨＩＶ融合体部分は点線下線付きであり、リンカー部分はイタリック体である。
【０３０３】
ＣＤ４  ＡまたはＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を有する１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ  １０Ｅ８ｖ４由来のＨＣ配列、およびＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）と、ドメイン２結合（Ａ）またはドメイン４結合（Ｂ）ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のいずれかと、異なるリンカーを含む特定の抗原結合性ポリペプチドは、配列番号７５５および配列番号７５６（ＣＤ４  Ａ）、または配列番号７５７および配列番号７５８（ＣＤ４  Ｂ）；ならびに配列番号７５９および配列番号７６０（ＣＤ４  Ａ）、または配列番号７６１および配列番号７６２（ＣＤ４  Ｂ）として、以下に示される。以下の種々の融合ポリペプチドについて、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列は下線で示され、リンカーはイタリックであり、ｂｎＡｂ  １０Ｅ８ｖ４またはＶＲＣ０１重鎖／軽鎖配列は太字であり、存在する場合、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、二重下線付きであり、存在する場合、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤は点線下線の太字で示す。
【０３０４】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ａ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結されたＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５５）：
【化１５】
2021507717.tif 000054
【０３０５】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４−Ａ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結されたＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５６）：
【化１６】
2021507717.tif 000055
【０３０６】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ｂ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結されたＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５７）：
【化１７】
2021507717.tif 000056
【０３０７】
１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４  Ｂ（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂの重鎖に連結されたＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））（配列番号７５８）：
【化１８】
2021507717.tif 000057
【０３０８】
本発明の他の実施形態は、以下に配列番号７６８および配列番号７６９（ＶＲＣ０１  ｂｎＡｂとＣＤ４  Ａ）として、ならびに配列番号７７０および配列番号７７１（ＶＲＣ０１  ｂｎＡｂとＣＤ４  Ｂ）として示される、１０Ｅ８以外の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂを含むｂｎＡｂ−ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合体を提供する。
【０３０９】
ＶＲＣ０１−ＨＣ−ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号７５９）：
【化１９】
2021507717.tif 000058
【０３１０】
ＶＲＣ０１−ＬＣ−ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号７６０）：
【化２０】
2021507717.tif 000059
【０３１１】
ＶＲＣ０１−ＨＣ−ＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号７６１）：
【化２１】
2021507717.tif 000060
【０３１２】
ＶＲＣ０１−ＬＣ−ＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号７６２）：
【化２２】
2021507717.tif 000061
【０３１３】
ｂｎＡｂ−Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−ペプチド融合体
本発明の他の実施形態は、以下に配列番号７６３および配列番号７６４（１０Ｅ８  ｂｎＡｂとＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））として示される、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂと、ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の代わりにＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）とを含むｂｎＡｂ−Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合体を提供する。抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ  １０Ｅ８ｖ４からのＨＣ配列、ｇｐ４１のＮ１７ドメイン（Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチド、およびＨＩＶ融合ペプチド阻害剤を含む、１つの特定の抗原結合性ポリペプチドは、以下に配列番号７６３として示され、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ  １０Ｅ８ｖ４からのＬＣ配列、ｇｐ４１のＮ１７ドメイン（Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチド、およびＨＩＶ融合ペプチド阻害剤を含む、別の特定の抗原結合性ポリペプチドは、以下に配列番号７６４として示される。配列番号７６３および７６４について、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分は太字であり、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）部分は二重下線付きであり、ＨＩＶ融合体部分は点線下線付きであり、リンカー部分はイタリック体である。
【０３１４】
配列番号７６３（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−Ｎ１７−Ａｄｎ）
【化２３】
2021507717.tif 000062
【０３１５】
配列番号７６４（１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−Ｎ１７  Ａｄｎ）
【化２４】
2021507717.tif 000063
【０３１６】
配列番号７６３および７６４について、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分は太字であり、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）部分は二重下線付きであり、ＨＩＶ融合体部分は点線下線付きであり、リンカー部分はイタリック体である。
【０３１７】
ある特定の実施形態では、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチド融合体は、他の成分との抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合体（例えば、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂおよび／またはＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および／またはＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）および／またはＨＩＶ融合ペプチド阻害剤）を作製するために、１つまたは複数のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）に連結され、ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤とさらに連結されたｂｎＡｂ重鎖または軽鎖を含んでいてもよい。
【０３１８】
〔実施例４〕
抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂおよび抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ−ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合体を産生させるための一般的方法（図４Ａ〜Ｄ）：
異なるエピトープまたは作用機構を有することが公知の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂのパネルが選択された。次いで、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドおよび／またはＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドとの融合は、実施例３に記載されているようにして行われた。それぞれのｂｎＡｂ−Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドの効力は、親のｂｎＡｂ単独、またはｂｎＡｂのＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドとの非融合組合せと比較されて、どの抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂエピトープ（複数可）および／または作用機構（複数可）が、相乗効果を示すのか、および最良の効力を有するのかを特定し、スクリーニングされたｂｎＡｂのすべてのパネルから、ｂｎＡｂのクラスの最良の代表的なｂｎＡｂが特定された。
【０３１９】
以下の表９は、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−ｂｎＡｂ融合ポリペプチドにおいて使用するための抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂについてスクリーニングするために使用されたｂｎＡＢパネルを示す。スクリーニングされたｂｎＡｂは、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂの、ＣＤ４ｂ（ＶＲＣ０１およびＣＨ２３５．１２）、Ｖ３ループ（ＰＧＴ−１２８）、ＭＰＥＲ（１０Ｅ８ｖ４、ＤＨ５１１．２およびＤＨ５１１．１２Ｐ）およびＶ１／Ｖ２（ＰＧ９）のクラスからの代表を含む。ｂｎＡｂペプチド融合ポリペプチドの調製のために選択されたＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、ｇｐ４１内の保存部位と結合し、６−ヘリックス束の形成、およびその後ＨＩＶエンベロープタンパク質によって膜融合をブロックするＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、ならびにＣＤ４のドメイン２またはドメイン４のいずれかと結合し、エンベロープタンパク質によるＣＤ４結合の後、エンベロープタンパク質のｇｐ１２０におけるコンホメーション変化をブロックするＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を含む。
【０３２０】
【表９】
2021507717.tif 000064
【０３２１】
他の抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂは、類似のプロトコール、および予想されるｂｎＡｂの異なるパネルを使用して、見出され得る。次いで、特定された得られた抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂは、新たに特定された抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂならびにＣＤ４結合性ポリペプチド（例えば、ＣＤ４  ＡまたはＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））および／またはｇｐ４１結合性ポリペプチド（例えば、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））を含む融合ポリペプチドである抗原結合性ポリペプチドを作出するために、本明細書に記載されるアミノ酸リンカーのいずれかを使用して、本明細書に記載されるようなＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドまたはＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ポリペプチドと組み合わされ得る。得られた抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドはまた、本明細書に記載されるアミノ酸リンカー配列を使用して、本明細書に記載されるように、ＨＩＶ融合ポリペプチド阻害剤と任意選択で組み合わされてもよい。
【０３２２】
〔実施例５〕
ＨＩＶに対する抗ウイルス活性におけるＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）／抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドの活性
阻害活性および結合親和性は、上記のＩＸ項において、および本明細書に記載されるようなＣＤ４／Ｎ１７／抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ融合ポリペプチドを使用する実施例において記載されるようにして測定された。
【０３２３】
図６Ａおよび図６Ｂにおいて、１０８ｖ４（ＭＰＥＲ）ｂｎＡｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合体が、驚くべきことに効力の増強を示したことが分かり得る。１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ−Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合体は、図６Ａにおいて示されるように、リンカーに応じて、最大で５倍までの効力の増加を示した。Ａ  ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）またはＢ  ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のいずれかとの１０Ｅ８ｖ４−ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合体は、１０Ｅ８  ｂｎＡｂ単独またはＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独と比較して、ピコモル濃度以下の活性（０．４ｐＭ）で、最大で＞２０００倍の増強という顕著な効力の増強を示した（図６Ｂを参照のこと）。やはり、リンカーは、見てわかる結果に影響を与えた。
【０３２４】
理論によって拘束されないが、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）およびＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）がＣＤ４の結合後に作動するので、両方のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、１０Ｅ８．ｖ４  ｂｎＡｂとよく相乗作用することが可能である。ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）について、ＨＩＶウイルスは、効果がある表面結合阻害剤のために標的細胞に近接近しなければならないことが公知であるので、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のアンカリング効果によって提供される相乗効果は、ウイルスのＣＤ４結合を必要とし得る。Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）について、ＣＤ４相互作用はｇｐ４１におけるＮ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）結合部位に曝されることが必要であるので、これらのＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、ＣＤ４結合後に機能する。
【０３２５】
対照的に、ＣＤ４  ｂｎＡｂは、ウイルスが細胞表面に接触しないように、ＣＤ４との相互作用をブロックする。そして、同様に、ＰＧＴ−１２８は、ｇｐ１２０三量体を架橋することによって作用し得、それらを不安定化し得、その効果はＣＤ４との接触後に無関係になり得、このようにして、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−ｂｎＡｂ融合ポリペプチドなどによる活性の増強は提供しない。１０Ｅ８  ｂｎＡｂはＣＤ４結合後に作動して膜融合をブロックするので、これは、活性の増強、および１０Ｅ８  ｂｎＡｂ／Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）融合ポリペプチドによって見られる明らかな相乗効果を説明することができる。
【０３２６】
図７は、１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ融合ポリペプチド中のＢ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）対Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の細胞結合の増強が、そのような融合ポリペプチドで観察された効力の改善に寄与することを示す。Ａ融合体は、リンカー（ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ）２Ｅおよび１０Ｅ８ｖ４の重鎖（配列番号７）を使用する、ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号５）とであり、Ｂ融合体は、リンカー（ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ）２Ｅおよび１０Ｅ８ｖ４の重鎖（配列番号７）とのＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（配列番号７８）とであった。それぞれの融合体は、結合ＥＣ５０対抗ウイルスＥＣ５０においておよそ２０００倍の差を示す（図７を参照のこと、ここで、Ｂ融合体は、０．９ｎＭの結合ＥＣ５０、および０．４ｐＭの抗ウイルスＥＣ５０を示し、Ａ融合体は、３３ｎＭの結合ＥＣ５０、および１７ｐＭの抗ウイルスＥＣ５０を示す）。２つの用量反応曲線は、ＭＴ−２細胞上に存在するＣＤ４タンパク質における、１０Ｅ８ｖ４−抗ＣＤ４ドメイン２  Ａｄｎｅｃｔｉｎ融合タンパク質（太線）および１０Ｅ８ｖ４−抗ＣＤ４ドメイン４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ融合タンパク質（破線）の受容体占有を測定する。矢印は、それぞれのタンパク質の抗ウイルスＥＣ５０を図示し、これは、受容体結合ＥＣ５０よりもはるかに強力である。Ａ融合タンパク質と比較してＢ融合タンパク質の改善された抗ウイルスＥＣ５０は、より強力な受容体結合ＥＣ５０によって証拠付けられるように、改善されたＣＤ４への結合に関連し得る。
【０３２７】
図８は、ＤＨ５１１．１２Ｐを含む別のＭＰＥＲ  ｂｎＡｂ融合体（ＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、および図７について上で記載されるものと同じリンカー配列）による結果を示すが、ＤＨ５１１．１２Ｐ  ｂｎＡｂ融合体による活性の増強は、１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂを含む融合体で見られたものと同じ程度の大きさではない。
【０３２８】
図９は、１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂに耐性であると報告されているＨＩＶ株に感染した細胞に対するＣＤ４  Ａ／１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ融合ペプチドおよびＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ融合ペプチドの活性を示す。活性は、複製ＮＬ４−３主鎖上で操作された１０Ｅ８耐性突然変異（Ｗ６８０Ｅ／Ｋ６８３Ｑ）を使用して、実施例２に記載されるようにして、決定された（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２年）、４９１巻、４０６〜４１２頁を参照のこと）。見てわかるように、ＣＤ４  Ａ／１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ融合体およびＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ融合体の両方とも、１０Ｅ８ｖ４、ＣＤ４  Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）またはＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独と比較して増強された活性のあるレベルを示すが、驚くべきことに、ＣＤ４  Ｂ／ｂｎＡｂ融合ポリペプチドは、１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂに対する耐性を有することが示されたＨＩＶに感染した細胞に対して、４ｐＭの活性を保持する。
【０３２９】
〔実施例６〕
１２３個のＨＩＶ臨床エンベロープを用いる細胞−細胞融合アッセイ
１２３個の臨床エンベロープに対するＣＤ４  Ａ／１０Ｅ８ｖ４融合ポリペプチドまたはＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４融合ポリペプチドの活性の幅が行われた。
【０３３０】
図１０Ａは、１２３個の異なる臨床エンベロープについて、１０Ｅ８ｖ４、ＣＤ４  ＡまたはＣＤ４  Ｂ単独と比較して、ＣＤ４  Ａ／１０Ｅ８ｖ４融合体またはＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４融合体の結合ＥＣ５０を示す。試験されたエンベロープのサブグループの内訳は以下の通りであった：合計で１２３個の臨床エンベロープについて、サブグループＡ：１０；サブグループＢ：６４；サブグループＣ：２５；サブグループＤ：４；サブグループＦ：８；他のサブグループ：１２。
【０３３１】
６８（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂと一緒に）、５．３（Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独）および１３００（Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独）と比較して、Ａ融合体についての中央ＥＣ５０（ｎＭ）値は０．５９であり、Ｂ融合体についての中央ＥＣ５０（ｎＭ）値は、０．００２８であった。同様の値は、Ａ融合ポリペプチドおよびＢ融合ポリペプチドに対する幾何平均ＥＣ５０（ｎＭ）について決定されたが、対照値は、特にＢ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独に対して、若干異なっていた。μｇ／ｍＬとして表される場合、Ａ融合ポリペプチドおよびＢ融合ポリペプチドについての幾何平均ＥＣ５０値は、８．７（１０Ｅ８ｖ４  ｂｎＡｂ単独）、０．０６（Ａ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）と一緒に）および１．８（Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独）と比較して、それぞれ、０．０９３および０．００４８であった。試験されたすべてのエンベロープは、０．３ｎＭをすべて下回るＥＣ５０で、ＣＤ４／１０Ｅ８ｖ４融合ポリペプチドに対する感受性を示した。Ｄ＄融合体について、中央ＥＣ５０値は、対照と比較して、＞２４００改善した。以下の表１０は、図１０Ａについて決定された平均値を示す。
【０３３２】
【表１０】
2021507717.tif 000065
【０３３３】
図１０Ｂは、臨床エンベロープに対するＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４融合ポリペプチドによる最大阻害パーセントを示す。見てわかるように、Ｂ融合ポリペプチドは、ＣＤ４  Ｂ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）単独と比較して、１００％の最大阻害を示した。ほとんどのウイルスも１０Ｅ８ｖ４単独に対して１００％の最大阻害を示したが、より低かったいくつかは、処理されたＣＤ４  Ｂ／１０Ｅ８ｖ４融合ポリペプチドにおいてＭＰＩの改善も示した。
【０３３４】
〔実施例７〕
ポリペプチド薬物動態の評価
ヒトＣＤ４トランスジェニックマウスモデル
雄および雌のホモ接合性ヒトＣＤ４マウスは、ＧｅｎＯｗａｙ、リヨン、フランスから入手される。
【０３３５】
ＷＴマウスのＰＫ研究
８〜２１日の単回ＩＶボーラス用量研究は、種々の本発明のポリペプチドのＰＫ特性を評価するために雌Ｃ５７Ｂｌ／６  ＷＴマウスにおいて行われる。本発明のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）−ｂｎＡｂ融合ポリペプチドは、５ｍｇ／ｋｇから最大で１０ｍｇ／ｋｇで投薬され得る。血漿試料は、リン酸クエン酸塩デキストロースチューブ（ＣＰＤ）中に回収され、解析するまで−８０℃で保存され得る。
【０３３６】
ｈＣＤ４マウスのＰＫ研究
７〜１０日の単回ＩＶボーラス用量研究は、標的の存在下で種々の本発明のポリペプチドのＰＫ特性を評価するために、ヘテロ接合性ｈＣＤ４マウスにおいて行われ得る。本発明のポリペプチドの用量および試料の回収方法は、ＷＴマウスについて上に記載されたものと同じである。
【０３３７】
カニクイザルの研究
１週間の単回用量研究は、本発明のポリペプチドのＰＫを決定するために雌カニクイザル（ｃｙｎｏ）において実施される。１ｍｇ／ｋｇの投薬後、血清試料は、指示された時間で回収され、等分され、ＭＳＤまたはＬＣ／ＭＳ解析のために急速凍結される。
【０３３８】
薬物動態測定
薬物レベルは、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ技術プラットフォームまたは比色分析ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して、マウスまたはカニクイザルの血漿中で測定され得る。Ｆｃ−ポリペプチド融合体は、本発明のポリペプチドのペプチド成分に特異的に結合するタンパク質ＰＲＤ８２８（ＢＭＳ）を介して捕捉され得、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰコンジュゲート化ｐＡｂ（Ｐｉｅｒｃｅ＃３１４１３）を使用して、検出される。ＨＳＡ−ポリペプチド融合体は、ＰＲＤ８２８を介して捕捉され得、ルテニウム標識されたＨＳＡに対するヤギｐＡｂ（Ｂｅｔｈｙｌ、ＴＸ＃Ａ８０−２２９Ａ）を使用して検出され得る。試料濃度は、５パラメータの対数フィットを使用して、標準曲線から算出され得る。非コンパートメント解析は、血漿モデルおよびリニアアップ／ログダウン算出法を使用するＰｈｏｅｎｉｘ  ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して行われ得る。
【０３３９】
配列
【０３４０】
配列番号１
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT
【０３４１】
配列番号２
AVGIGAMFLGFLGAAGSTMGAASVTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLDEIWNNMTWMEWEREIDNYTGLIYTLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIK
【０３４２】
配列番号３
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETGRGESDQSLGWIQIGYRTE
【０３４３】
配列番号４
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETGRGESDQSLGWIQIGYRTP
【０３４４】
配列番号５
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETGGADSDQSFGWIQIGYRTP
【０３４５】
配列番号６（１０Ｅ８ｖ４軽鎖）
ASELTQDPAVSVALKQTVTITCRGDSLRSHYASWYQKKPGQAPVLLFYGKNNRPSGIPDRFSGSASGNRASLTITGAQAEDEADYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
【０３４６】
配列番号７（１０Ｅ８ｖ４重鎖−ＳＬＳＬＳＰバリアント）
EVRLVESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEGWSVDYAESVKGRFTISRDNTKNTLYLEMNNVRTEDTGYYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
【０３４７】
配列番号８（１０Ｅ８ｖ４重鎖−ＳＬＳＬＳＰＧＫバリアント）
EVRLVESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEGWSVDYAESVKGRFTISRDNTKNTLYLEMNNVRTEDTGYYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０３４８】
配列番号９（ｂｎＡｂ−Ａｄｎｅｃｔｉｎ融合ポリペプチド（商標））
【化２５】
2021507717.tif 000066
【０３４９】
配列番号１０（ｂｎＡｂ−Ａｄｎｅｃｔｉｎ融合ポリペプチド（商標））
【化２６】
2021507717.tif 000067
【０３５０】
配列番号１１（ｂｎＡｂ−Ａｄｎｅｃｔｉｎ融合ポリペプチド（商標））
【化２７】
2021507717.tif 000068
【０３５１】
配列番号１２（ｂｎＡｂ−Ａｄｎｅｃｔｉｎ融合ポリペプチド（商標））
【化２８】
2021507717.tif 000069
【０３５２】
配列番号１３
HSYHIQYWPLGSYQRYQVFS
【０３５３】
配列番号１４
EYQIRVYAETGGADSDQSMGWIQIG
【０３５４】
配列番号１５
LSYHIQYWPLGLYQAYQVFS
【０３５５】
配列番号１６
EYQIRVYAETGRGESPASFGWIQIG
【０３５６】
配列番号１７
HAYHIQYWPLGFYQGYQVFS
【０３５７】
配列番号１８
EYQIRVYAETGLGDAHQSLGWIQIG
【０３５８】
配列番号１９
LAYHIQYWPLGWYQRYQIFS
【０３５９】
配列番号２０
LAYHIQYWPLGWYQRYQVFS
【０３６０】
配列番号２１
HFYHIQYWPLGLYHLYQVFS
【０３６１】
配列番号２２
YSYHIQYWPLGWYHRYQVFS
【０３６２】
配列番号２３
EYQIRVYAETGADDPVQALGWIQIG
【０３６３】
配列番号２４
RCYHIQYWPLGLYPLYQVFS
【０３６４】
配列番号２５
EYQIRVYAETGDESSVQPFGWIQIG
【０３６５】
配列番号２６
YSYHIQYWPLGWYQRYQVFS
【０３６６】
配列番号２７
EYQIRVYAETDGGRSQQSFGWIQIG
【０３６７】
配列番号２８
SSYHIQYWPLGAYQRYQVFS
【０３６８】
配列番号２９
HAYHIQYWPLGLYQRYQVFS
【０３６９】
配列番号３０
HAYYIQYWPLGSYQFYQVFA
【０３７０】
配列番号３１
HSYHIQYWPLGSYLRYQVFS
【０３７１】
配列番号３２
LSYHIQYWPLGFYQRYQVFS
【０３７２】
配列番号３３
SAYHIQYWPLGWYHRYQIFS
【０３７３】
配列番号３４
YSYHIQYWPLGAYSRHQLFS
【０３７４】
配列番号３５
EYQIRVYAETGGDGSEMYFGWIQIG
【０３７５】
配列番号３６
LAYHIQYWPLGWYHLYQVFS
【０３７６】
配列番号３７
LAYHIQYWPLGWYQLYKVFS
【０３７７】
配列番号３８
DYQIRVYAETSGESSEQYLGWIQIG
【０３７８】
配列番号３９
HSYHIQYWPLGWYQLYQVFS
【０３７９】
配列番号４０
EYQIRVYAETEVDSGQHSFGWIQIG
【０３８０】
配列番号４１
LAYHIQYWPLGWYQRYQIFS
【０３８１】
配列番号４２
EYQIRVYAETGESGAQQSFGWIQIG
【０３８２】
配列番号４３
QSYHIQYWPLGAYQLYQLFS
【０３８３】
配列番号４４
HAYHIQYWPLGFYQGYQVFS
【０３８４】
配列番号４５
EYQIRVYADTGRGYQLSYSWIQIGY
【０３８５】
配列番号４６
FRYHIQYWPLGGYERYQVFT
【０３８６】
配列番号４７
HSYHIQYWPLGSYHLYQLFS
【０３８７】
配列番号４８
HSYHIQYWPLGWYQLYQVFT
【０３８８】
配列番号４９
EYQIRVYAETGGFGSPPNFGWIQIG
【０３８９】
配列番号５０
QFYHIQYWPLGSYQRYQVFS
【０３９０】
配列番号５１
NSYHIQYWPLGWYHRYQVFS
【０３９１】
配列番号５２
HSYHIQYWPLGRYQLYQVFS
【０３９２】
配列番号５３
LAYHIQYWPLGWYHLYQIFS
【０３９３】
配列番号５４
EYQIRVYAETGGVGWHHSFGWIQIG
【０３９４】
配列番号５５
HVYHIQYWPLGWYPRYQVFS
【０３９５】
配列番号５６
HSYHIPYWELAWYQRYQVFS
【０３９６】
配列番号５７
ESYHIQYWPLGLYHRYQVFS
【０３９７】
配列番号５８
LAYHIQYWPLGWYQAYQVFS
【０３９８】
配列番号５９
YLYHIQYWPLGWYHRYQVFT
【０３９９】
配列番号６０
RFYHIQYWPLGWYHCYQVFV
【０４００】
配列番号６１
EYQIRVYAQTGDGSSQEYFGWIQIG
【０４０１】
配列番号６２
HSYHIQYWPLGWYYRYQVFS
【０４０２】
配列番号６３
EYQIRVYAETGGSGSQQYWGWIQIG
【０４０３】
配列番号６４
HAYHIQYWPLGFYQGYQVFS
【０４０４】
配列番号６５
HSYHIQYWPLGLYVLYQVFS
【０４０５】
配列番号６６
EYQIRVYAETGAGGSEHSFGWIQIG
【０４０６】
配列番号６７
LSYHIQYWPLGRYERYQVFS
【０４０７】
配列番号６８
EYQIRVYAETVGGESLDSFSWIQIG
【０４０８】
配列番号６９
LSYHIQYWPLGWYQLYQVFY
【０４０９】
配列番号７０
EYQIRVYAETRVGGSVASFGWIQIG
【０４１０】
配列番号７１
LAYHIQYWPLGRYQLYQVFS
【０４１１】
配列番号７２〜９１（ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））は表４に列挙した。
【０４１２】
配列番号９２〜３４８（Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））は表５に列挙した。
【０４１３】
配列番号３４９〜３６９（ＨＩＶ融合ペプチド阻害剤）は表６に列挙した。
【０４１４】
配列番号３７０〜７４８（リンカー）は表７に列挙した。
【０４１５】
配列番号７４９（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４−Ａ）
【化２９】
2021507717.tif 000070
【０４１６】
配列番号７５０（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４−Ａ）
【化３０】
2021507717.tif 000071
【０４１７】
配列番号７５１（ＶＲＣ０１−ＨＣ−ＣＤ４−Ａ）：
【化３１】
2021507717.tif 000072
【０４１８】
配列番号７５２（ＶＲＣ０１−ＬＣ−ＣＤ４−Ａ）：
【化３２】
2021507717.tif 000073
【０４１９】
配列番号７５３（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−Ｎ１７）
【化３３】
2021507717.tif 000074
【０４２０】
配列番号７５４（１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−Ｎ１７）
【化３４】
2021507717.tif 000075
【０４２１】
上記の配列番号７４９〜７５４について、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分は太字であり、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）部分は二重下線付きであり、ＨＩＶ融合体部分は点線下線付きであり、リンカー部分はイタリック体である。
【０４２２】
配列番号７５５（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ａ）
【化３５】
2021507717.tif 000076
【０４２３】
配列番号７５６（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４  Ａ）
【化３６】
2021507717.tif 000077
【０４２４】
配列番号７５７（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＥＳＰＥＰＥＴＥＤ２−ＣＤ４  Ｂ）
【化３７】
2021507717.tif 000078
【０４２５】
配列番号７５８（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−（Ｇ４Ｓ）５−ＣＤ４  Ｂ）
【化３８】
2021507717.tif 000079
【０４２６】
配列番号７５９（ＶＲＣ０１−ＨＣ−ＣＤ４  Ａ）
【化３９】
2021507717.tif 000080
【０４２７】
配列番号７６０（ＶＲＣ０１−ＬＣ−ＣＤ４  Ａ）
【化４０】
2021507717.tif 000081
【０４２８】
配列番号７６１（ＶＲＣ０１−ＨＣ−ＣＤ４  Ｂ）
【化４１】
2021507717.tif 000082
【０４２９】
配列番号７６２（ＶＲＣ０１−ＬＣ−ＣＤ４  Ｂ）
【化４２】
2021507717.tif 000083
【０４３０】
上記の配列番号７５５〜７６２において、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列は下線付きである。抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分は太字で示す。リンカー配列はイタリック体で示す。
【０４３１】
配列番号７６３（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−Ｎ１７４３０）
【化４３】
2021507717.tif 000084
【０４３２】
配列番号７６４（１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−Ｎ１７）
【化４４】
2021507717.tif 000085
【０４３３】
配列番号７６３および７６４について、抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分は太字であり、Ｎ１７  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）部分は二重下線付きであり、ＨＩＶ融合体部分は点線下線付きであり、リンカー部分はイタリック体である。
【０４３４】
配列番号７６５（１０Ｅ８ｖ４−ＨＣ−ＣＤ４  Ｂ）
【化４５】
2021507717.tif 000086
【０４３５】
配列番号７６６（１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−ＣＤ４  Ｂ）
【化４６】
2021507717.tif 000087
【０４３６】
配列番号７６７（１０Ｅ８ｖ４−ＬＣ−ＣＤ４  Ｂ）
【化４７】
2021507717.tif 000088
【０４３７】
上記の配列番号７６５〜７６７において、抗ＣＤ４  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）配列は下線付きである。抗ＨＩＶ  ｂｎＡｂ部分は太字で示す。リンカー配列はイタリック体で示す。
【０４３８】
１０Ｅ８ｖ２−ＨＣ（重鎖）配列番号７６８
EVRLVESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFNFDDAWMTWVRQPPGKGLEWVGRISGPGEGWSVDYAESVKGRFTISRLNSINFLYLEMNNVRTEDTGYYFCARTGKHYDFWSGYPPGEEYFQDWGQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０４３９】
１０Ｅ８ｖ３−ＨＣ（重鎖）配列番号７６９
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCSASGFSFKNTWMTWVRQAPGKGLEWVGRITGPGEGWTSDYAATVQGRFTISRNNMIDMLYLEMNRLRTDDTGLYYCVHTEKYYNFWGGYPPGEEYFQHWGRGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０４４０】
１０Ｅ８ｖ４−Ｖ５Ｒ−１００ｃＦ−ＨＣ（重鎖）配列番号７７０
EVRLRESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEGWSVDYAESVKGRFTISRDNTKNTLYLEMNNVRTEDTGYYFCARTGKYYDFWFGYPPGEEYFQDWGQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０４４１】
１０Ｅ８ｖ２−ＬＣ（軽鎖）配列番号７７１
ASELTQDPAVSVALKQTVTITCRGDSLRSHYASWYQKKPGQAPILLFYGKNNRPSGVPDRFSGSASGNRASLTISGAQAEDDAEYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
【０４４２】
１０Ｅ８ｖ３−ＬＣ（軽鎖）配列番号７７２
ASELTQETGVSVALGRTVTITCRGDSLRSHYASWYQKKPGQAPILLFYGKNNRPSGIHDRFSGSASGNRASLTISGAQAEDDAEYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
【図１Ａ】
2021507717.tif 000089
【図１Ｂ】
2021507717.tif 000090
【図２】
2021507717.tif 000091
【図３Ａ】
2021507717.tif 000092
【図３Ｂ】
2021507717.tif 000093
【図３Ｃ】
2021507717.tif 000094
【図３Ｄ】
2021507717.tif 000095
【図４】
2021507717.tif 000096
【図５Ａ】
2021507717.tif 000097
【図５Ｂ】
2021507717.tif 000098
【図６Ａ】
2021507717.tif 000099
【図６Ｂ】
2021507717.tif 000100
【図７】
2021507717.tif 000101
【図８】
2021507717.tif 000102
【図９】
2021507717.tif 000103
【図１０Ａ】
2021507717.tif 000104
【図１０Ｂ】
2021507717.tif 000105
【配列表】
2021507717000001.xml
【国際調査報告】
2021507717.tif 000136
2021507717.tif 000137
2021507717.tif 000138