(57)【要約】  本開示は、養子免疫療法のためのＴ細胞を製造する方法に関する。本開示はさらに、Ｔ細胞を遺伝的に形質導入する方法、Ｔ細胞を使用する方法、およびそのＴ細胞集団を提供する。一態様では、本開示は、冷凍末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍し、解凍ＰＢＭＣを休止させ、培養ＰＢＭＣ中のＴ細胞を固相上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化し、活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入し、形質導入Ｔ細胞を増殖させ、増殖Ｔ細胞を取得する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
冷凍末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍するステップと、
前記解凍ＰＢＭＣを休止させるステップと、
前記休止ＰＢＭＣ中の前記Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、
前記活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップと、
前記形質導入Ｔ細胞を増殖させるステップと、
前記増殖Ｔ細胞を取得するステップと
を含んでなる、Ｔ細胞を形質導する方法。
【請求項２】
前記活性化するステップが、固相支持体上の前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体を用いて、前記休止ＰＢＭＣ中の前記Ｔ細胞を固定化するステップを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記休止させるステップが、約０．５時間〜約４８時間、約０．５時間〜約３６時間、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１８時間、約０．５時間〜約１２時間、約０．５時間〜約６時間、約１時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、または約１時間〜約２４時間、約２〜約２４時間、約１２〜約４８時間、約０．５時間〜約１２０時間、約０．５時間〜約１０８時間、約０．５時間〜約９６時間、約０．５時間〜約８４時間、約０．５時間〜約７２時間、または約０．５時間〜約６０時間の期間内に実行される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体がそれぞれ、約０．１μｇ／ｍｌ以下、約０．２μｇ／ｍｌ以下、約０．３μｇ／ｍｌ以下、約０．４μｇ／ｍｌ以下、約０．５μｇ／ｍｌ以下、約０．６μｇ／ｍｌ以下、約０．７μｇ／ｍｌ以下、約０．８μｇ／ｍｌ以下、約０．９μｇ／ｍｌ以下、約１．０μｇ／ｍｌ以下、約２．０μｇ／ｍｌ以下、約４．０μｇ／ｍｌ以下、約６．０μｇ／ｍｌ以下、約８．０μｇ／ｍｌ以下、または約１０．０μｇ／ｍｌ以下の濃度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体がそれぞれ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約８．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約６．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約４．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．８μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．６μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．２５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ〜約０．４μｇ／ｍｌ、または約０．４μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記活性化するステップが、約１時間以下、約２時間、３約時間、４約時間、５約時間、６約時間、７約時間、８約時間、９約時間、１０約時間、１１約時間、１２約時間、１４約時間、１６約時間、１８約時間、２０約時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１０８時間、または約１２０時間の期間内に実行される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化するステップが、約１時間〜約１２０時間、約１時間〜約１０８時間、約１時間〜約９６時間、約１時間〜約８４時間、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約２４時間、約４時間〜約２４時間、約６時間〜約２４時間、約８時間〜約２４時間、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約７２時間、約２４時間〜約７２時間、約６時間〜約４８時間、約２４時間〜約４８時間、約６時間〜約７２時間、または約１時間〜約１２時間の期間内に実行される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記固相が、ビーズ、プレート、フラスコ、またはバッグの表面である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プレートが、６ウェル、１２ウェル、または２４ウェルプレートである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フラスコが、約２５ｃｍ２〜約７５ｃｍ２、約２５ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、約２５ｃｍ２〜約１５０ｃｍ２、または約５０ｃｍ２〜約１７２０ｃｍ２の播種表面積を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記バッグが、約５ｍｌ〜約１００リットル、約１００ｍｌ〜約１００リットル、約１５０ｍｌ〜約１００リットル、約２００ｍｌ〜約１００リットル、約２５０ｍｌ〜約１００リットル、約５００ｍｌ〜約１００リットル、約１リットル〜約１００リットル、約１リットル〜約７５リットル、約１リットル〜約５０リットル、約１リットル〜約２５リットル、約１リットル〜約２０リットル、約１リットル〜約１５リットル、約１リットル〜約１０リットル、約１リットル〜約５リットル、約１リットル〜約２．５リットル、または約１リットル〜約２リットルの容積を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記休止させるステップが、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン７（ＩＬ−７）および／またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約２ｎｇ／ｍｌ以下、約３ｎｇ／ｍｌ以下、約４ｎｇ／ｍｌ以下、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約６ｎｇ／ｍｌ以下、約７ｎｇ／ｍｌ以下、約８ｎｇ／ｍｌ以下、約９ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１１ｎｇ／ｍｌ以下、約１２ｎｇ／ｍｌ以下、約１３ｎｇ／ｍｌ以下、約１４ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約１６ｎｇ／ｍｌ以下、約１７ｎｇ／ｍｌ以下、約１８ｎｇ／ｍｌ以下、約１９ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、または約１００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、約１１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１２０ｎｇ／ｍｌ以下、約１３０ｎｇ／ｍｌ以下、約１４０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５０ｎｇ／ｍｌ以下、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、または５００ｎｇ／ｍｌである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または約４０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記形質導入するステップが、約１時間以下、約２時間以下、約３時間以下、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下、約７時間以下、約８時間以下、約９時間以下、約１０時間以下、約１１時間以下、約１２時間以下、約１４時間以下、約１６時間以下、約１８時間以下、約２０時間以下、約２２時間以下、約２４時間以下、約２６時間以下、約２８時間以下、約３０時間以下、約３６時間以下、約４２時間以下、約４８時間以下、約５４時間以下、約６０時間以下、約６６時間以下、約７２時間以下、約８４時間以下、約９６時間以下、約１０８時間以下、または約１２０時間以下の期間内に実行される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記形質導入するステップが、約１時間〜１２０時間、約１時間〜１０８時間、約１時間〜９６時間、約１時間〜７２時間、約１時間〜４８時間、約１時間〜３６時間、約１時間〜２４時間、約２時間〜２４時間、約４時間〜２４時間、約６時間〜２４時間、約８時間〜２４時間、約１０時間〜２４時間、約１２時間〜２４時間、約１４時間〜２４時間、約１６時間〜２４時間、約１８時間〜２４時間、約２０時間〜２４時間、または約２２時間〜２４時間の期間内に実行される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスベクターが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレトロウイルスベクターである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターが、ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記形質導入するステップが、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン７（ＩＬ−７）および／またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約２ｎｇ／ｍｌ以下、約３ｎｇ／ｍｌ以下、約４ｎｇ／ｍｌ以下、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約６ｎｇ／ｍｌ以下、約７ｎｇ／ｍｌ以下、約８ｎｇ／ｍｌ以下、約９ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１１ｎｇ／ｍｌ以下、約１２ｎｇ／ｍｌ以下、約１３ｎｇ／ｍｌ以下、約１４ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約１６ｎｇ／ｍｌ以下、約１７ｎｇ／ｍｌ以下、約１８ｎｇ／ｍｌ以下、約１９ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、または約１００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、または約９ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、約１１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１２０ｎｇ／ｍｌ以下、約１３０ｎｇ／ｍｌ以下、約１４０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５０ｎｇ／ｍｌ以下、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、または５００ｎｇ／ｍｌである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または約４０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法
【請求項２８】
前記増殖させるステップが、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン７（ＩＬ−７）および／またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約２ｎｇ／ｍｌ以下、約３ｎｇ／ｍｌ以下、約４ｎｇ／ｍｌ以下、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約６ｎｇ／ｍｌ以下、約７ｎｇ／ｍｌ以下、約８ｎｇ／ｍｌ以下、約９ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１１ｎｇ／ｍｌ以下、約１２ｎｇ／ｍｌ以下、約１３ｎｇ／ｍｌ以下、約１４ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約１６ｎｇ／ｍｌ以下、約１７ｎｇ／ｍｌ以下、約１８ｎｇ／ｍｌ以下、約１９ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、または約１００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍ以下ｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１１０ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１３０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、または５００ｎｇ／ｍｌである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または約４０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法
【請求項３４】
前記増殖させるステップが、約１日以下、約２日以下、約３日以下、約４日以下、約５日以下、約６日以下、約７日以下、約８日以下、約９日以下、約１０日以下、約１５日以下、約２０日以下、約２５日以下、または約３０日以下の期間内に実行される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記増殖させるステップが、約１日〜約３０日間、約１日〜約２５日間、約１日〜約２０日間、約１日〜約１５日間、約１日〜約１０日間、約２日〜約１０日間、約３日〜約１０日間、約４日〜約１０日間、約５日〜約１０日間、約６日〜約１０日間、約７日〜約１０日間、約８日〜約１０日間、または約９日〜約１０日間の期間内に実行される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記得られたＴ細胞の数が、少なくとも約１×１０９個であり、少なくとも約２×１０９個であってもよく、少なくとも約３×１０９個であってもよく、少なくとも約４×１０９個であってもよく、少なくとも約５×１０９個であってもよく、少なくとも約６×１０９個であってもよく、少なくとも約７×１０９個であってもよく、少なくとも約８×１０９個であってもよく、少なくとも約９×１０９個であってもよく、少なくとも約１×１０１０個であってもよく、少なくとも約５×１０１０個であってもよく、少なくとも約１×１０１１個であってもよく、少なくとも約５×１０１１個であってもよく、少なくとも約１×１０１２個であってもよく、少なくとも約５×１０１２であってもよくまたは少なくとも約１×１０１３個であってもよい、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記得られたＴ細胞の数が、約１×１０９〜約１×１０１３個、約１×１０９〜約５×１０１２個、約１×１０９〜約１×１０１２個、約１×１０９〜約５×１０１１個、約１×１０９〜約１×１０１１個、約１×１０９〜約５×１０１０個、約１×１０９〜約１×１０１０個、約２×１０９〜約１×１０１０個、約３×１０９〜約１×１０１０個、約４×１０９〜約１×１０１０個、約５×１０９〜約１×１０１０個、約６×１０９〜約１×１０１０個、約７×１０９〜約１×１０１０個、約８×１０９〜約１×１０１０個、または約９×１０９〜約１×１０１０個である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記得られたＴ細胞が、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法によって製造された得られたＴ細胞の有効量を患者に投与するステップを含んでなる、がんを有する患者を治療する方法。
【請求項４０】
前記ＰＢＭＣが前記患者から得られる、請求項３９に記載の方法
【請求項４１】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝的形質導入Ｔ細胞。
【請求項４２】
請求項４１に記載の遺伝的形質導入Ｔ細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項４３】
冷凍末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍するステップと、
前記解凍ＰＢＭＣを休止させるステップと、
前記休止ＰＢＭＣ中の前記Ｔ細胞を固相上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、
前記活性化Ｔ細胞を増殖させるステップと、
前記増殖Ｔ細胞を含んでなる前記Ｔ細胞集団を取得するステップと
を含んでなる、Ｔ細胞集団を調製する方法。
【請求項４４】
前記休止させるステップが、約１時間以下、約２時間、３約時間、４約時間、５約時間、６約時間、７約時間、８約時間、９約時間、１０約時間、１１約時間、１２約時間、１４約時間、１６約時間、１８約時間、２０約時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１０８時間、または約１２０時間の期間内に実行される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記休止させるステップが、約１時間〜約１２０時間、約１時間〜約１０８時間、約１時間〜約９６時間、約１時間〜約８４時間、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約２４時間、約４時間〜約２４時間、約６時間〜約２４時間、約８時間〜約２４時間、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約７２時間、約２４時間〜約７２時間、約６時間〜約４８時間、約２４時間〜約４８時間、約６時間〜約７２時間、または約１時間〜約１２時間の期間内に実行される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体がそれぞれ、約０．１μｇ／ｍｌ以下、約０．２μｇ／ｍｌ以下、約０．３μｇ／ｍｌ以下、約０．４μｇ／ｍｌ以下、約０．５μｇ／ｍｌ以下、約０．６μｇ／ｍｌ以下、約０．７μｇ／ｍｌ以下、約０．８μｇ／ｍｌ以下、約０．９μｇ／ｍｌ以下、約１．０μｇ／ｍｌ以下、約２．０μｇ／ｍｌ以下、約４．０μｇ／ｍｌ以下、約６．０μｇ／ｍｌ以下、約８．０μｇ／ｍｌ以下、または約１０．０μｇ／ｍｌ以下の濃度を有する、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体がそれぞれ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約８．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約６．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約４．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．８μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．６μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．２５μｇ／ｍｌ、または約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記活性化するステップが、約１時間以下、約２時間以下、約３時間以下、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下、約７時間以下、約８時間以下、約９時間以下、約１０時間以下、約１１時間以下、約１２時間以下、約１４時間以下、約１６時間以下、約１８時間以下、約２０時間以下、約２２時間以下、約２４時間以下、約２６時間以下、約２８時間以下、約３０時間以下、約３６時間以下、約４２時間以下、約４８時間以下、約５４時間以下、約６０時間以下、約６６時間以下、約７２時間以下、約８４時間以下、約９６時間以下、約１０８時間以下、または約１２０時間以下の期間内に実行される、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記活性化するステップが、約１時間〜約１２０時間、約１時間〜約１０８時間、約１時間〜約９６時間、約１時間〜約８４時間、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約２４時間、約４時間〜約２４時間、約６時間〜約２４時間、約８時間〜約２４時間、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１４時間〜約２４時間、約１６時間〜約２４時間、約１８時間〜約２４時間、約２０時間〜約２４時間、約２２時間〜約２４時間、または約２３時間〜約２４時間の期間内に実行される、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記固相が、ビーズ、プレート、フラスコ、またはバッグの表面である、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記プレートが、６ウェル、１２ウェル、または２４ウェルプレートである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記フラスコが、約２５ｃｍ２〜約７５ｃｍ２、約２５ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、約２５ｃｍ２〜約１５０ｃｍ２、または約５０ｃｍ２〜約１７２０ｃｍ２の播種表面積を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記バッグが、約５０ｍｌ〜約１００リットル、約１００ｍｌ〜約１００リットル、約１５０ｍｌ〜約１００リットル、約２００ｍｌ〜約１００リットル、約２５０ｍｌ〜約１００リットル、約５００ｍｌ〜約１００リットル、約１リットル〜約１００リットル、約１リットル〜約７５リットル、約１リットル〜約５０リットル、約１リットル〜約２５リットル、約１リットル〜約２０リットル、約１リットル〜約１５リットル、約１リットル〜約１０リットル、約１リットル〜約５リットル、約１リットル〜約２．５リットル、または約１リットル〜約２リットルの容積を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記活性化するステップが、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行される、請求項４３〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン７（ＩＬ−７）および／またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含んでなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約２ｎｇ／ｍｌ以下、約３ｎｇ／ｍｌ以下、約４ｎｇ／ｍｌ以下、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約６ｎｇ／ｍｌ以下、約７ｎｇ／ｍｌ以下、約８ｎｇ／ｍｌ以下、約９ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１１ｎｇ／ｍｌ以下、約１２ｎｇ／ｍｌ以下、約１３ｎｇ／ｍｌ以下、約１４ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約１６ｎｇ／ｍｌ以下、約１７ｎｇ／ｍｌ以下、約１８ｎｇ／ｍｌ以下、約１９ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、または約１００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、約１１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１２０ｎｇ／ｍｌ以下、約１３０ｎｇ／ｍｌ以下、約１４０ｎｇ／ｍｌ以下、または約５００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップをさらに含んでなる、請求項４３〜５９のいずれか一項に記載の方法
【請求項６１】
前記ウイルスベクターが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレトロウイルスベクターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６２】
前記ウイルスベクターが、ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターである、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記形質導入するステップが、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行される、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン７（ＩＬ−７）および／またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含んでなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約２ｎｇ／ｍｌ以下、約３ｎｇ／ｍｌ以下、約４ｎｇ／ｍｌ以下、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約６ｎｇ／ｍｌ以下、約７ｎｇ／ｍｌ以下、約８ｎｇ／ｍｌ以下、約９ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１１ｎｇ／ｍｌ以下、約１２ｎｇ／ｍｌ以下、約１３ｎｇ／ｍｌ以下、約１４ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約１６ｎｇ／ｍｌ以下、約１７ｎｇ／ｍｌ以下、約１８ｎｇ／ｍｌ以下、約１９ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、または約１００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＩＬ−７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、約１１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１２０ｎｇ／ｍｌ以下、約１３０ｎｇ／ｍｌ以下、約１４０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５０ｎｇ／ｍｌ以下、約２００ｎｇ／ｍｌ以下、約２５０ｎｇ／ｍｌ以下、約３００ｎｇ／ｍｌ以下、約３５０ｎｇ／ｍｌ以下、約４００ｎｇ／ｍｌ以下、約４５０ｎｇ／ｍｌ以下、または約５００ｎｇ／ｍ以下である、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＩＬ−１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
請求項４３〜６８のいずれか一項に記載の方法によって調製される、Ｔ細胞集団。
【請求項７０】
前記増殖させるステップが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行される、請求項１〜３８および４３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ−２を含んでなる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を含んでなる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍するステップと、
前記解凍ＰＢＭＣを約４〜約６時間休止させるステップと、
前記休止ＰＢＭＣ中の前記Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、
前記活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップと、
前記形質導入Ｔ細胞を増殖させるステップと、
前記増殖Ｔ細胞を取得するステップと
を含んでなる、Ｔ細胞集団を調製する方法。
【請求項７４】
前記得られたＴ細胞が、約２倍〜５倍、約５倍〜約１０倍、約５倍〜約１５倍、約５倍〜約２０倍、約５倍〜約２５倍、約２５倍〜約５０倍、約５０倍〜約６０倍、約６０倍〜約１００倍、約６５倍〜約９０倍、約７０倍〜約８５倍、および約６７倍〜約８８倍からなる群から増殖される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
約４時間〜約６時間の休止時間で得られたＴ細胞の倍数増殖が、約１６〜約２０時間の休止時間で同じ条件下で調製された得られたＴ細胞の倍数増殖よりも少なくとも約１．５倍大きい、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記得られたＴ細胞の数が、約２×１０９〜約５×１０９、約５×１０９〜約１０×１０９、約１０×１０９〜約１５×１０９、約５×１０９〜約３５×１０９、約５×１０９〜約３０×１０９、約１０×１０９〜約３０×１０９、約１５×１０９〜約２０×１０９、約２０×１０９〜約３５×１０９、約２４×１０９〜約３３×１０９、および約２４．８×１０９〜約３２．２×１０９からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
約４時間〜約６時間の休止時間で得られたＴ細胞の数が、約１６時間〜約２０時間の休止時間で同じ条件下で調製された得られたＴ細胞の数よりも約１．５〜約２．０大きい、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記解凍するステップ、前記休止させるステップ、前記活性化するステップ、前記形質導入するステップ、前記増殖させるステップ、および前記取得するステップが、閉鎖系で実施される、請求項１&#12316;３８、４３&#12316;６８、および７０&#12316;７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記閉鎖系が、ＣｌｉｎｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）、ＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター、ＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター、Ｇ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系、またはＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＧ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系である、請求項７８の方法。
【請求項８０】
新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取得するステップと、
前記新鮮ＰＢＭＣ中の前記Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、
前記活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップと、
前記形質導入Ｔ細胞を増殖させるステップと、
前記増殖Ｔ細胞を収穫するステップと
を含んでなる、Ｔ細胞集団を調製する方法。
【請求項８１】
前記増殖させるステップが、約１日〜２日間、約１日〜３日間、約１日〜約４日間、約１日〜約５日間、約１日〜６日間、約１日〜７日間、約１日〜８日間、約１日〜９日間、約１日〜１０日間、約２日〜３日間、約２日〜４日間、約２日〜５日間、約２日〜６日間、約２日〜７日間、約２日〜８日間、約２日〜９日間、約２日〜１０日間、約３日〜４日間、約３日〜５日間、約３日〜６日間、約３日〜７日間、約３日〜８日間、約３日〜９日間、約３日〜１０日間、約４日〜５日間、約４日〜６日間、約４日〜７日間、約４日〜８日間、約４日〜９日間、約４日〜１０日間、約５日〜６日間、約５日〜７日間、約５日〜８日間、約５日〜９日間、または約５日〜１０日間にわたり実施される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記収穫するステップが、前記活性化するステップ後、約４日〜約１２日間、約４日〜約１１日間、約４日〜約１０日間、約４日〜約９日間、約４日〜約８日間、約４日〜約７日間、約４日〜約６日間、約４日〜約５日間、約５日〜約１２日間、約５日〜約１１日間、約５日〜約１０日間、約５日〜約９日間、約５日〜約８日間、約５日〜約７日間、または約５日〜約６日間以内に実施される、請求項８０に記載の方法
【請求項８３】
前記収穫されたＴ細胞の数が、約２×１０９〜約５×１０９、約５×１０９〜約１０×１０９、約１０×１０９〜約１５×１０９、約５×１０９〜約３５×１０９、約５×１０９〜約３０×１０９、約１０×１０９〜約３０×１０９、約１５×１０９〜約２０×１０９、約２０×１０９〜約３５×１０９、約２４×１０９〜約３３×１０９、および約２４．８×１０９〜約３２．２×１０９からなる群から選択される、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記活性化するステップ、前記形質導入するステップ、前記増殖させるステップ、前記収穫するステップが、閉鎖系で実施される、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記閉鎖系が、ＣｌｉｎｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）、ＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター、ＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター、Ｇ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系、またはＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＧ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系である、請求項８４の方法。
【請求項８６】
前記新鮮なＰＢＭＣが、凍結保存されたＰＢＭＣを解凍して取得されていない、請求項８０&#12316;８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記取得するステップおよび前記活性化するステップが１日以下にわたり実施される、請求項８０&#12316;８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記増殖させるステップが、１日を超えて実施される、請求項８０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国仮特許出願であり、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１８年９月３日に出願された米国仮特許出願第６２／７２６，３５０号明細書、２０１８年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／６４７，５７１号明細書、２０１８年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／６３３，１１３号明細書、２０１８年２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６２８，５２１号明細書、２０１８年４月１６日に出願された独国特許出願第１０２０１８１０８９９６．１号明細書；２０１８年２月２８日に出願された独国特許出願第１０２０１８１０４６２８．６号明細書；および２０１８年２月９日に出願された独国特許出願第１０２０１８１０２９７１．３号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、一般に、養子免疫療法のためのＴ細胞を製造する方法に関する。本開示はさらに、Ｔ細胞を遺伝的に形質導入する方法、Ｔ細胞を使用する方法、およびそのＴ細胞集団を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝的強制発現によって、腫瘍関連抗原に対するＴ細胞の特異性をリダイレクトすることは、養子Ｔ細胞移植の分野を最近後押ししている。第二世代および第三世代のＣＡＲの使用は、その有効性を大きく妨げていた、移植後における生体内のＴ細胞の持続性が不十分であるという長年の問題を解決するのに役立っている。それにもかかわらず、Ｔ細胞製品を個別に製造する必要があるなど、より広範な応用のための重大な障害が残っており、この有望な治療法は経済的に実行可能とは言い難い。例えば、自己由来Ｔ細胞などのＴ細胞の使用は有望であることが示されているが、重度の前処置を受けた患者では、適切な数の自己由来細胞を得ることは困難であり得る。
【０００４】
米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１７５２７２号明細書には、養子免疫療法のための方法が記載されており、その中では、Ｔ細胞を少なくとも４８&#12316;７２時間、典型的には少なくとも約７２&#12316;１２０時間にわたり、活性化刺激から取り出すことによってそれらを休止させ、次に、例えば可溶性抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂなどの分裂促進性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で細胞を標識することによって、輸液前にそれらを再活性化し、次に、標識された細胞を任意に単球および顆粒球で増強された自己由来単核細胞と混合する。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１７／００５１２５２号明細書は、Ｔ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する細胞集団を取得するステップと；（ｉ）１つまたは複数のサイトカイン、（ｉｉ）抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合断片、および（ｉｉｉ）抗ＣＤ２８抗体またはそのＣＤ２８結合断片、Ｂ７−１またはそのＣＤ２８結合断片、またはＢ７−２またはそのＣＤ２８結合断片を含んでなり、その中で培養がＴ細胞を活性化および刺激する、細胞培養培地中で細胞集団を培養するステップと；活性化細胞集団をウイルスベクターで形質導入するステップと；細胞増殖培地中で細胞集団を培養して、形質導入Ｔ細胞を増殖させるステップと；それによって、Ｔ細胞治療薬を製造するステップとを含むＴ細胞治療薬を製造する方法を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
研究、診断、および治療目的に十分なＴ細胞を産生し得る細胞集団を生体外で形質導入するための改善されたストラテジーが、必要とされている。この技術的問題の解決策が、本明細書で提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本開示は、冷凍末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍するステップと、解凍ＰＢＭＣを休止させるステップと、培養ＰＢＭＣ中のＴ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップと、形質導入Ｔ細胞を増殖させるステップと、増殖Ｔ細胞を取得するステップとを含む、Ｔ細胞を形質導入する方法に関する。
【０００８】
一態様では、Ｔ細胞は、固相支持体上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて、培養ＰＢＭＣ中で活性化される。
【０００９】
別の態様では、休止させるステップは、約１時間以下、約２時間以下、約３時間以下、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下、約７時間以下、約８時間以下、約９時間以下、約１０時間以下、約１１時間以下、約１２時間以下、約１８時間以下、約２４時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下、約４８時間以下、約６０時間以下、約７２時間以下、約８４時間以下、約９６時間以下、約１０８時間以下、または約１２０時間の期間内に実行されてもよい。
【００１０】
別の態様では、休止は、約０．５時間〜約４８時間、約０．５時間〜約３６時間、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１８時間、約０．５時間〜約１２時間、約０．５時間〜約６時間、約１時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、約３時間〜約４時間、約４〜約５時間、または約１時間〜約２４時間、約２〜約２４時間、約１２〜約４８時間、約０．５時間〜約１２０時間、約０．５時間〜約１０８時間、約０．５時間〜約９６時間、約０．５時間〜約８４時間、約０．５時間〜約７２時間、または約０．５時間〜約６０時間の期間内に実行されてもよい。
【００１１】
別の態様では、休止させるステップは、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、または約１０時間の期間内に実行されてもよい。
【００１２】
一態様では、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、約３時間〜約４時間、または約４〜約５時間の休止させるステップで生成されたＴ細胞の倍数増殖は、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２４時間、または約１６〜約２０時間の休止させるステップによって生成されたＴ細胞の倍数増殖とほぼ等しく（約１：１）；それよりも少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．７倍、または少なくとも約２．０倍大きい。好ましい一態様では、約４時間の休止させるステップによって生成されたＴ細胞の倍数増殖は、約１６時間（例えば、一晩）の休止させるステップによって生成されたＴ細胞の倍数増殖よりも少なくとも約１．５倍大きい。一態様では、Ｔ細胞の生成の違いは、休止時間の短縮だけである。
【００１３】
一態様では、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、約３時間〜約４時間、または約４〜約５時間の休止させるステップで生成されたＴ細胞の数は、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２４時間、または約１６〜約２０時間の休止させるステップによって生成されたＴ細胞の数とほぼ等しく（約１：１）；それよりも少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．７倍、または少なくとも約２．０倍大きい。好ましい態様では、約４時間の休止させるステップによって生成されたＴ細胞の数は、約１６時間（例えば、一晩）の休止させるステップによって生成されたＴ細胞の倍数増殖よりも少なくとも約１．５倍または約１．３倍〜約２．０倍大きい。一態様では、Ｔ細胞の生成の違いは、休止時間の短縮だけである。
【００１４】
なおも別の態様では、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、それぞれ、約０．１μｇ／ｍｌ以下、約０．２μｇ／ｍｌ以下、約０．３μｇ／ｍｌ以下、約０．４μｇ／ｍｌ以下、約０．５μｇ／ｍｌ以下、約０．６μｇ／ｍｌ以下、約０．７μｇ／ｍｌ以下、約０．８μｇ／ｍｌ以下であり、約０．９μｇ／ｍｌ以下、約１．０μｇ／ｍｌ以下、約２．０μｇ／ｍｌ以下、約４．０μｇ／ｍｌ以下、約６．０μｇ／ｍｌ以下、約８．０μｇ／ｍｌ以下、または約１０．０μｇ／ｍｌ以下の濃度を有してもよい。
【００１５】
なおも別の態様では、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、それぞれ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．８μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．６μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．２５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ〜約０．４μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約８．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約６．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約４．０μｇ／ｍｌ、または約０．１μｇ／ｍｌ〜約２．０μｇ／ｍｌの濃度を有してもよい。
【００１６】
一態様では、本明細書に記載の活性化は、約１時間以下、約２時間以下、約３時間以下、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下、約７時間以下、約８時間以下、約９時間以下、約１０時間以下、約１１時間以下、約１２時間以下、約１４時間以下、約１６時間以下、約１８時間以下、約２０時間以下、約２２時間以下、約２４時間以下、約２６時間以下、約２８時間以下、約３０時間以下、約３６時間以下、約４８時間以下、約６０時間以下、約７２時間以下、約８４時間以下、約９６時間以下、約１０８時間、または約１２０時間以下の期間内に実行されてもよい。
【００１７】
別の態様では、本明細書に記載の活性化は、約１時間〜約１２０時間、約１時間〜約１０８時間、約１時間〜約９６時間、約１時間〜約８４時間、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約２４時間、約４時間〜約２４時間、約６時間〜約２４時間、約８時間〜約２４時間、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約７２時間、約２４時間〜約７２時間、約６時間〜約４８時間、約２４時間〜約４８時間、約６時間〜約７２時間、または約１時間〜約１２時間の期間内に実行されてもよい。
【００１８】
一態様では、本明細書に記載のＴ細胞は、患者または個人に対して自己由来である。別の態様では、本明細書に記載のＴ細胞は、患者または個人に対して同種異系である。
【００１９】
別の態様では、本明細書に記載の固相は、ビーズ、プレート、フラスコ、またはバッグの表面であってもよい。
【００２０】
なおも別の態様では、本明細書に記載のプレートは、６ウェル、１２ウェル、または２４ウェルプレートであってもよい。
【００２１】
一態様では、本明細書に記載のフラスコは、少なくとも約２５ｃｍ２、約７５ｃｍ２、約９２．６ｃｍ２、約１００ｃｍ２、約１５０ｃｍ２、約１６２ｃｍ２、約１７５ｃｍ２、約２２５ｃｍ２、約２３５ｃｍ２、約３００ｃｍ２、約１７２０ｃｍ２、約２５ｃｍ２〜約７５ｃｍ２、約２５ｃｍ２〜約２２５ｃｍ２、または約２５ｃｍ２〜約１７２０ｃｍ２の播種表面積を有してもよい。
【００２２】
別の態様では、本明細書に記載のバッグは、約５０ｍｌ〜約１００リットル、約１００ｍｌ〜約１００リットル、約１５０ｍｌ〜約１００リットル、約２００ｍｌ〜約１００リットル、約２５０ｍｌ〜約１００リットル、約５００ｍｌ〜約１００リットル、約１リットル〜約１００リットル、約１リットル〜約７５リットル、約１リットル〜約５０リットル、約１リットル〜約２５リットル、約１リットル〜約２０リットル、約１リットル〜約１５リットル、約１リットル〜約１０リットル、約１リットル〜約５リットル、約１リットル〜約２．５リットル、または約１リットル〜約２リットルの容積を有してもよい。
【００２３】
なおも別の態様では、本明細書に記載の活性化は、Ｔ細胞活性化刺激の存在下で実行されてもよい。
【００２４】
一態様では、本明細書に記載のサイトカインとしては、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、および／またはインターロイキン２１（ＩＬ−２１）が挙げられてもよい。
【００２５】
別の態様では、ＩＬ−７の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約２ｎｇ／ｍｌ以下、約３ｎｇ／ｍｌ以下、約４ｎｇ／ｍｌ以下、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約６ｎｇ／ｍｌ以下、約７ｎｇ／ｍｌ以下、約８ｎｇ／ｍｌ以下、約９ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１１ｎｇ／ｍｌ以下、約１２ｎｇ／ｍｌ以下、約１３ｎｇ／ｍｌ以下、約１４ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約１６ｎｇ／ｍｌ以下、約１７ｎｇ／ｍｌ以下、約１８ｎｇ／ｍｌ以下、約１９ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、または約１００ｎｇ／ｍｌ以下であってもよい。
【００２６】
別の態様では、ＩＬ−７の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００２７】
なおも別の態様では、ＩＬ−１５の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、約１１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１２０ｎｇ／ｍｌ以下、約１３０ｎｇ／ｍｌ以下、約１４０ｎｇ／ｍｌ以下、約１５０ｎｇ／ｍｌ以下、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、または５００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００２８】
別の態様では、ＩＬ−１５の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００２９】
別の態様では、ＩＬ−２の濃度は、約１０００ＩＵ／ｍｌ以下、約９５０ＩＵ／ｍｌ以下、約９００ＩＵ／ｍｌ以下、約８５０ＩＵ／ｍｌ以下、約８００ＩＵ／ｍｌ以下、約７５０ＩＵ／ｍｌ以下、約７００ＩＵ／ｍｌ以下、約６５０ＩＵ／ｍｌ以下、約６００ＩＵ／ｍｌ以下、約５５０ＩＵ／ｍｌ以下、約５００ＩＵ／ｍｌ以下、約４５０ＩＵ／ｍｌ以下、約４００ＩＵ／ｍｌ以下、約３５０ＩＵ／ｍｌ以下、約３００ＩＵ／ｍｌ以下、約２５０ＩＵ／ｍｌ以下、約２００ＩＵ／ｍｌ以下、約１５０ＩＵ／ｍｌ以下、約１００ＩＵ／ｍｌ以下、約９０ＩＵ／ｍｌ以下、約８０ＩＵ／ｍｌ以下、約７０ＩＵ／ｍｌ以下、約６５ＩＵ／ｍｌ以下、約６０ＩＵ／ｍｌ以下、約５５ＩＵ／ｍｌ以下、約５０ＩＵ／ｍｌ以下、約４０ＩＵ／ｍｌ以下、約３０ＩＵ／ｍｌ以下、約２０ＩＵ／ｍｌ以下、約１０ＩＵ／ｍｌ以下、または約５ＩＵ／ｍｌ以下であってもよい。
【００３０】
別の態様では、ＩＬ−２の濃度は、約１０ＩＵ／ｍｌ〜１０００ＩＵ／ｍｌ、約２０ＩＵ／ｍｌ〜９００ＩＵ／ｍｌ、約３０ＩＵ／ｍｌ〜８００ＩＵ／ｍｌ、約４０ＩＵ／ｍｌ〜７００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜６００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜５５０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜５００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜４５０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜４００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜３５０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜３００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜２５０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜２００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜１５０ＩＵ／ｍｌ、または約５０ＩＵ／ｍｌ〜１００ＩＵ／ｍｌであってもよい。
【００３１】
別の態様では、ＩＬ−２１の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約２ｎｇ／ｍｌ以下、約３ｎｇ／ｍｌ以下、約４ｎｇ／ｍｌ以下、約５ｎｇ／ｍｌ以下、約６ｎｇ／ｍｌ以下、約７ｎｇ／ｍｌ以下、約８ｎｇ／ｍｌ以下、約９ｎｇ／ｍｌ以下、約１０ｎｇ／ｍｌ以下、約１１ｎｇ／ｍｌ以下、約１２ｎｇ／ｍｌ以下、約１３ｎｇ／ｍｌ以下、約１４ｎｇ／ｍｌ以下、約１５ｎｇ／ｍｌ以下、約１６ｎｇ／ｍｌ以下、約１７ｎｇ／ｍｌ以下、約１８ｎｇ／ｍｌ以下、約１９ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、約２５ｎｇ／ｍｌ以下、約３０ｎｇ／ｍｌ以下、約３５ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約４５ｎｇ／ｍｌ以下、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約７０ｎｇ／ｍｌ以下、約８０ｎｇ／ｍｌ以下、約９０ｎｇ／ｍｌ以下、または約１００ｎｇ／ｍｌ以下であってもよい。
【００３２】
別の態様では、ＩＬ−２１の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００３３】
一態様では、本明細書に記載の形質導入は、約１時間以下、約２時間以下、約３時間以下、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下、約７時間以下、約８時間以下、約９時間以下、約１０時間以下、約１１時間以下、約１２時間以下、約１４時間以下、約１６時間以下、約１８時間以下、約２０時間以下、約２２時間以下、約２４時間以下、約２６時間以下、約２８時間以下、約３０時間以下、約３６時間以下、約４２時間以下、約４８時間以下、約５４時間以下、約６０時間以下、約６６時間以下、約７２時間以下、約８４時間以下、約９６時間以下、約１０８時間以下、または約１２０時間以下の期間内に実行されてもよい。
【００３４】
なおも別の態様では、本明細書に記載の形質導入は、約１時間〜約１２０時間、約１時間〜約１０８時間、約１時間〜約９６時間、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約１２時間、約２時間〜約２４時間、約４時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約４８時間、約１２時間〜約７２時間、約２４時間〜約７２時間、または約３６時間〜約７２時間の期間内に実行されてもよい。
【００３５】
別の態様では、本明細書に記載のウイルスベクターは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するγ−レトロウイルスベクターであってもよい。
【００３６】
なおも別の態様では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターであってもよい。
【００３７】
一態様では、本明細書に記載の形質導入は、Ｔ細胞活性化刺激の存在下で実行されてもよい。
【００３８】
一態様では、本明細書に記載の増殖は、Ｔ細胞活性化刺激の存在下で実行されてもよい。
【００３９】
一態様では、本明細書に記載の増殖は、約１日以下、約２日以下、約３日以下、約４日以下、約５日以下、約６日以下、約７日以下、約８日以下、約９日以下、約１０日以下、約１５日以下、約２０日以下、約２５日以下、または約３０日以下の期間内に実行されてもよい。
【００４０】
別の態様では、本明細書に記載の増殖は、約１日〜約３０日間、約１日〜約２５日間、約１日〜約２０日間、約１日〜約１５日間、約１日〜約１０日間、約２日〜約１０日間、約３日〜約１０日間、約４日〜約１０日間、約４日〜約３０日間、約６日〜約２５日間、約１０日〜約３０日間、または約１２日〜約３０日間の期間内に実行されてもよい。
【００４１】
一態様では、得られたＴ細胞の数は、少なくとも約１×１０９個であってもよく、少なくとも約２×１０９個であってもよく、少なくとも約３×１０９個であってもよく、少なくとも約４×１０９個であってもよく、少なくとも約５×１０９個であってもよく、少なくとも約６×１０９個であってもよく、少なくとも約７×１０９個であってもよく、少なくとも約８×１０９個であってもよく、少なくとも約９×１０９個であってもよく、少なくとも約１×１０１０個であってもよく、少なくとも約５×１０１０個であってもよく、少なくとも約１×１０１１個であってもよく、少なくとも約５×１０１１個であってもよく、少なくとも約１×１０１２個であってもよく、少なくとも約５×１０１２であってもよくまたは少なくとも約１×１０１３個であってもよい。
【００４２】
別の態様では、得られたＴ細胞の数は、約１×１０９〜約１×１０１３個、約１×１０９〜約５×１０１２個、約１×１０９〜約１×１０１２個、約１×１０９〜約５×１０１１個、約１×１０９〜約１×１０１１個、約１×１０９〜約５×１０１０個、約１×１０９〜約１×１０１０個、約２×１０９〜約１×１０１０個、約３×１０９〜約１×１０１０個、約４×１０９〜約１×１０１０個、約５×１０９〜約１×１０１０個、約６×１０９〜約１×１０１０個、約７×１０９〜約１×１０１０個、約８×１０９〜約１×１０１０個、または約９×１０９〜約１×１０１０個であってもよい。
【００４３】
一態様では、得られたＴ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよい。
【００４４】
別の態様では、ＰＢＭＣは患者から得られてもよい。
【００４５】
なおも別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法によって製造された、遺伝的形質導入Ｔ細胞に関する。
【００４６】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法によって製造された、遺伝的形質導入Ｔ細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含有する、医薬組成物に関する。
【００４７】
別の態様では、本開示は、冷凍末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍するステップと、解凍ＰＢＭＣを休止させるステップと、休止ＰＢＭＣ中のＴ細胞を固相上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、活性化Ｔ細胞を増殖させるステップと、増殖Ｔ細胞を含んでなるＴ細胞集団を取得するステップとを含む、Ｔ細胞集団を調製する方法に関する。
【００４８】
なおも別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法によって調製されたＴ細胞集団に関する。
【００４９】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の増殖Ｔ細胞の有効量を患者に投与するステップを含んでなる、がんを有するかまたはその治療を必要とする患者または個人を治療する方法に関する。一態様では、患者またはそれを必要とする個人は、がん患者である。一態様では、治療されるがんは、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、および子宮がん（ＵＥＣ）の１つまたは複数から選択される。
【００５０】
別の態様では、増殖させるステップは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１からなる群から選択される、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行されてもよい。一態様では、増殖は、ＩＬ−７とＩＬ−１５の組み合わせの存在下で行われる。
【００５１】
別の態様では、解凍するステップ、休止させるステップ、活性化するステップ、形質導入するステップ、増殖させるステップ、および／または取得するステップは、閉鎖系で実施されてもよい。
【００５２】
別の態様では、本開示は、新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取得する（すなわち、ＢＭＣは凍結保存ＰＢＭＣを解凍して取得されていない）ステップと、新鮮ＰＢＭＣ中のＴ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップと、形質導入Ｔ細胞を増殖させるステップと、増殖Ｔ細胞を収穫するステップとを含む、Ｔ細胞集団を調製する方法に関する。
【００５３】
一態様では、取得するステップおよび活性化するステップは、１日以下にわたり実施されてもよい。
【００５４】
一態様では、増殖させるステップは、１日を超えて実施されてもよい。
【００５５】
別の態様では、増殖させるステップは、約１日〜２日間、約１日〜３日間、約１日〜約４日間、約１日〜約５日間、約１日〜６日間、約１日〜７日間、約１日〜８日間、約１日〜９日間、約１日〜１０日間、約２日〜３日間、約２日〜４日間、約２日〜５日間、約２日〜６日間、約２日〜７日間、約２日〜８日間、約２日〜９日間、約２日〜１０日間、約３日〜４日間、約３日〜５日間、約３日〜６日間、約３日〜７日間、約３日〜８日間、約３日〜９日間、約３日〜１０日間、約４日〜５日間、約４日〜６日間、約４日〜７日間、約４日〜８日間、約４日〜９日間、約４日〜１０日間、約５日〜６日間、約５日〜７日間、約５日〜８日間、約５日〜９日間、または約５日〜１０日間にわたり実施されてもよい。
【００５６】
別の態様では、収穫するステップは、活性化するステップ後、約４日〜約１２日間、約４日〜約１１日間、約４日〜約１０日間、約４日〜約９日間、約４日〜約８日間、約４日〜約７日間、約４日〜約６日間、約４日〜約５日間、約５日〜約１２日間、約５日〜約１１日間、約５日〜約１０日間、約５日〜約９日間、約５日〜約８日間、約５日〜約７日間、または約５日〜約６日間以内に実施されてもよい。
【００５７】
別の態様では、収穫されたＴ細胞の数は、約２×１０９〜約５×１０９、約５×１０９〜約１０×１０９、約１０×１０９〜約１５×１０９、約５×１０９〜約３５×１０９、約５×１０９〜約３０×１０９、約１０×１０９〜約３０×１０９、約１５×１０９〜約２０×１０９、約２０×１０９〜約３５×１０９、約２４×１０９〜約３３×１０９、および約２４．８×１０９〜約３２．２×１０９からなる群から選択されてもよい。
【００５８】
別の態様では、活性化するステップ、形質導入するステップ、増殖させるステップ、および収穫するステップは、閉鎖系または半閉鎖系で実施されてもよい。
【００５９】
別の態様では、閉鎖系は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）、ＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター、ＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター、Ｇ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系、またはＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＧ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
本開示の性質、目的、および利点のさらなる理解のために、同様の参照番号が同様の要素を示す以下の図面と併せて読まれる、以下の詳細な説明を参照すべきである。
【図１Ａ】異なるドナーから得られたＴ細胞の長期化生体外培養による、Ｔｎａｉｖｅ／ｓｃｍおよびＴｃｍ表現型の損失を示す。
【図１Ｂ】同上
【図２】異なるドナーからの１０日目の培養細胞と比較した、１５日目の培養細胞におけるＩＦＮ−γの分泌量の減少を示す。
【図３】Ｔ細胞の活性化と増殖に対する、休止条件の影響を試験するための実験デザインを示す。
【図４】異なる実験群における、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびｈＬＤＬ−Ｒの発現レベルを示す。
【図５Ａ】それぞれ、増殖７日目および増殖１０日目の異なる実験群における、倍数増殖および細胞生存率を示す。
【図５Ｂ】同上
【図６】９日目の異なる実験群における、ウイルスベクターで形質導入された活性化Ｔ細胞の倍数増殖および生存率を示す。
【図７】９日目の異なる実験群における、ウイルスベクターで形質導入された活性化Ｔ細胞の倍数増殖および生存率を示す。
【図８】異なる休止時間および異なる規模の製造から得られたＴ細胞における、導入遺伝子発現を示す。
【図９】異なる休止時間および異なる規模の製造から得られた、１０日目の倍数増殖を示す。
【図１０】Ｔ細胞活性化に対する、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の濃度の影響を試験するための実験デザインを示す。
【図１１】異なる濃度の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化されたＴ細胞における、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびｈＬＤＬ−Ｒの発現を示す。
【図１２】異なる濃度のＩＬ−１５の存在下で異なる濃度の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化された、増殖１０日目のＴ細胞の細胞数を示す。
【図１３】異なる濃度のＩＬ−１５の存在下で異なる濃度の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化された、組換えＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の四量体染色を示す。
【図１４】図１４Ａ：異なる活性化持続時間から得られた、ＣＤ３＋ＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞の百分率を示す。図１４Ｂ：異なる活性化持続時間から得られた、導入遺伝子発現を示す。
【図１５】プレート結合またはフラスコ結合抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化されたＴ細胞における、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＬＤＬ−Ｒの発現を示す。
【図１６】図１６Ａ：フラスコ結合（ＦＢ）およびプレート結合（ＰＢ）活性化Ｔ細胞における、形質導入のレベルを示す。図１６Ｂ：フラスコ結合（ＦＢ）およびプレート結合（ＰＢ）活性化Ｔ細胞における、倍数増殖を示す。
【図１７】異なるドナーにおける腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する腫瘍細胞に応答して、フラスコ結合（ＦＢ）活性化ＬＶ−Ｒ７３（Ｔ細胞受容体を発現するレンチウイルスベクター）形質導入Ｔ細胞およびプレート結合（ＰＢ）活性化形質導入Ｔ細胞によって惹起された、抗原特異的ＩＦＮ−γレベルを示す。
【図１８】Ｔ細胞活性化に対する、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆されたバッグおよびプレートを使用することの効果を試験するための実験デザインを示す。
【図１９】バッグ結合またはフラスコ結合抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体中で活性化されたＴ細胞における、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＬＤＬ−Ｒの発現を示す。
【図２０】増殖６日目における、異なる濃度のバッグ結合抗体によって活性化されたＴ細胞から得られた細胞増殖、およびＦＢ条件下で活性化されたＴ細胞から得られた細胞増殖を示す。
【図２１】増殖１０日目における、異なる濃度のバッグ結合抗体によって活性化されたＴ細胞から得られた細胞増殖、およびＦＢ条件下で活性化されたＴ細胞から得られた細胞増殖を示す。
【図２２】本開示の一実施形態に従ったＴ細胞の製造工程を示す。
【図２３Ａ】本開示の一実施形態に従って製造されたＴ細胞の倍数増殖を示す。
【図２３Ｂ】本開示の一実施形態に従って製造されたＴ細胞の形質導入ＴＣＲ発現を示す。
【図２３Ｃ】本開示の一実施形態に従って製造されたＴ細胞の表現型を示す。
【図２３Ｄ】本開示の一実施形態に従って製造されたＴ細胞の腫瘍細胞増殖阻害活性を示す。
【図２３Ｅ】本開示の別の実施形態に従って製造されたＴ細胞の腫瘍細胞増殖阻害活性を示す。
【図２３Ｆ】本開示の別の実施形態に従って製造されたＴ細胞の腫瘍細胞増殖阻害活性を示す。
【図２３Ｇ】本開示の別の実施形態に従って製造されたＴ細胞の腫瘍細胞殺滅活性を示す。
【図２３Ｈ】本開示の別の実施形態に従って製造されたＴ細胞の腫瘍細胞殺滅活性を示す。
【図２４】一晩の休止（約１６時間）を用いた、Ｔ細胞製造工程を示す。
【図２５Ａ】一晩の休止（約１６時間）を用いて製造されたＴ細胞の倍数増殖を示す。
【図２５Ｂ】一晩の休止（約１６時間）を用いて製造されたＴ細胞の形質導入ＴＣＲ発現を示す。
【図２５Ｃ】一晩の休止（約１６時間）を用いて製造されたＴ細胞の表現型を示す。
【図２５Ｄ】一晩の休止（約１６時間）を用いて製造されたＴ細胞の腫瘍細胞増殖阻害活性を示す。
【図２５Ｅ】一晩の休止（約１６時間）を用いて製造されたＴ細胞の細胞傷害活性を示す。
【図２５Ｆ】同上
【図２６】開放系および閉鎖系における生体外操作プロトコルを示す。
【図２７】本開示の一実施形態に従った閉鎖系における生体外操作プロトコルを示す。
【図２８】本開示の別の実施形態に従った閉鎖系における生体外操作プロトコルを示す。
【図２９】開放系および閉鎖系で製造されたＴ細胞からのＩＦＮ−γ放出を示す。
【図３０】本開示のいくつかの実施形態に従ったＴ細胞製造の概略図を示す。
【図３１】本開示の一実施形態に従った、白血球アフェレーシス採取から輸液可能になるまでの代表的なターンアラウンド時間を示す。ＬＰ＃：白血球アフェレーシス採取、処理および凍結（任意選択的）。ＣｏＡ：分析証明書の発行に必要な追加的な時間。
【図３２】本開示の一実施形態に従ったＴ細胞製造工程を示す。
【図３３】本開示の一実施形態に従った製造工程によって製造されたＴ細胞のＴ細胞記憶表現型決定を示す。
【図３４】本開示の一実施形態に従った製造工程によって製造されたＴ細胞のＣＤ２７およびＣＤ２８共刺激表現型決定を示す。
【図３５】本開示の一実施形態に従った、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２によって誘導されるＴ細胞増殖が、増殖時間依存様式で減少することを示す。
【図３６】図３６は、本開示の一実施形態に従ったＩＦＮ−γの分泌が、増殖時間依存様式で減少することを示す。
【図３７】本開示の一実施形態に従った、増殖時間依存様式でのＥＣ５０増加を示す。
【図３８】本開示の一実施形態に従った増殖測定基準を示す。
【図３９】本開示の一実施形態に従ったＴＣＲの表面発現を示す。
【図４０】本開示の一実施形態に従った最終製品のＴ細胞記憶表現型を示す。
【図４１】本開示の一実施形態に従った標的細胞への曝露に応答したＩＦＮ−γ放出を示す。
【図４２】本開示の一実施形態に従ったＥＣ５０判定を示す。
【図４３】本開示の一実施形態に従ったＴ細胞の細胞傷害可能性を示す。
【図４４】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の細胞回復における比較を示す。
【図４５】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の細胞生存率における比較を示す。
【図４６】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の倍数増殖における比較を示す。
【図４７】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の細胞表現型における比較を示す。
【図４８】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の細胞表現型における比較を示す。
【図４９】本開示の実施形態に従ったＴ細胞製品のＴＣＲ発現を示す。
【図５０】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間のＴＣＲ発現における比較を示す。
【図５１】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間のＴＣＲ発現における比較を示す。
【図５２】本開示の実施形態に従った、ゲーティングスキームおよびＴｍｅｍｏｒｙサブセットを示す。
【図５３】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の細胞表現型における比較を示す。
【図５４】本開示の実施形態に従ったＴ細胞製品のサイトカイン発現を示す。
【図５５】本開示の実施形態に従った、健常ドナーから得られたＴ細胞製品のサイトカイン発現を示す。
【図５６】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間のサイトカイン発現における比較を示す。
【図５７】本開示の実施形態に従った、がん患者から得られたＴ細胞製品からのＩＦＮ−γ放出を示す。
【図５８】本開示の実施形態に従った、健常ドナーから得られたＴ細胞製品からのＩＦＮ−γ放出を示す。
【図５９】本開示の実施形態に従った、健常ドナーから得られたＴ細胞製品からのＩＦＮ−γ放出を示す。
【図６０】本開示の実施形態に従った、がん患者から得られたＴ細胞製品からのＩＦＮ−γ放出を示す。
【図６１−１】本開示の実施形態に従った、健常ドナーから得られたＴ細胞製品の細胞殺滅活性を示す。
【図６１−２】同上
【図６２−１】本開示の実施形態に従った、健常ドナーから得られたＴ細胞製品の細胞殺滅活性を示す。
【図６２−２】同上
【図６３Ａ】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の細胞殺滅における比較を示す。
【図６３Ｂ】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の細胞殺滅における比較を示す。
【図６３Ｃ】本開示の実施形態に従った、健常ドナーおよびがん患者から得られたＴ細胞製品間の細胞殺滅における比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
一態様では、本開示は、冷凍末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍するステップと、解凍ＰＢＭＣを休止させるステップと、休止ＰＢＭＣ中のＴ細胞を固相上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、活性化Ｔ細胞を増殖させるステップと、増殖Ｔ細胞を含んでなるＴ細胞集団を取得するステップとを含む方法によって製造された、Ｔ細胞集団を提供する。
【００６２】
一態様では、本開示は、冷凍末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍するステップと、解凍ＰＢＭＣを休止させるステップと、培養ＰＢＭＣ中のＴ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップと、形質導入Ｔ細胞を増殖させるステップと、増殖Ｔ細胞を取得するステップとを含む、Ｔ細胞を形質導入する方法；冷凍末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍するステップと、解凍ＰＢＭＣを休止させるステップと、休止ＰＢＭＣ中のＴ細胞を固相上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化するステップと、活性化Ｔ細胞を増殖させるステップと、増殖Ｔ細胞を含んでなるＴ細胞集団を取得するステップとを含む、Ｔ細胞集団を調製する方法；および本明細書に記載の増殖Ｔ細胞の有効量を患者に投与するステップを含んでなる、がんを有するかまたはその治療を必要とする患者または個人を治療する方法を提供する。一態様では、患者またはそれを必要とする個人は、がん患者である。一態様では、治療されるがんは、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、および子宮がん（ＵＥＣ）の１つまたは複数から選択される。
【００６３】
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連タンパク質または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的化する。腫瘍特異的Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわち、それらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それぞれの腫瘍細胞において発現され、同一起源の非改変細胞と比較して、通常、上方制御される。
【００６４】
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ＭＨＣクラスＩ分子はα重鎖およびβ２ミクログロブリンから構成され、ＭＨＣクラスＩＩ分子はαおよびβ鎖から構成される。それらの三次元立体構造は、ペプチドとの非共有結合相互作用のために用いられる結合溝をもたらす。ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞上に見られる。それらは、主に、内因性タンパク質、欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰ）、およびより大型のペプチドのタンパク質切断から得られる、ペプチドを提示する。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外因性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見られる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、交差提示と称される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に主に見いだされ、例えば、エンドサイトーシス中にＡＰＣによって取り込まれ引き続いてプロセシングされる、外因性タンパク質または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。
【００６５】
ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。
【００６６】
ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による効果的な応答を誘導し維持する上で、重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発のために非常に重要である腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）親和的サイトカイン環境をサポートし、例えば、ＣＴＬ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける。
【００６７】
炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などの、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者においては、腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが判明している。本明細書の伸長された（より長い）ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ活性エピトープとして作用し得る。
【００６８】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープによって活性化されたＴヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるＣＴＬのエフェクター機能を取りまとめるのに重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた細胞傷害機能をはじめとする、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。
【００６９】
例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の不在下であってさえも、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された。ＣＤ４陽性Ｔ細胞が、直接抗腫瘍エフェクターであるという証拠がある。
【００７０】
ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性があり得るとは、これまで考えられなかった。しかしＤｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．は、腫瘍からいくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを直接同定することに成功した（その内容全体が参照により援用される、国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書）。
【００７１】
ＣＤ８依存性およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、共同して相乗的に抗腫瘍効果に寄与するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発にとって重要である。
【００７２】
ＭＨＣクラスＩペプチドが、細胞性免疫応答を始動（惹起）するためには、それはまた、ＭＨＣ分子に結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多型性とに依存する。ＭＨＣクラス１結合ペプチドは、通常は長さが８〜１２アミノ酸残基であり、通常はそれらの配列中に、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用する２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する「結合モチーフ」を有する。
【００７３】
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応において、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
【００７４】
タンパク質が、Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現され、健常組織によって発現されず、または比較的少量発現されるべきである。好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い濃度（すなわち、それぞれのペプチド細胞当たりのコピー数）で存在することもさらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期調節またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が上方制御されてもよく、したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよいこのようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）が腫瘍関連抗原に由来して、生体外または生体内Ｔ細胞応答をもたらすことを確実にするために、抗原のアミノ酸配列内にエピトープが存在する。
【００７５】
したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。ＴＡＡを同定し特性決定する方法は、通常は、患者または健常人から単離され得るＴ細胞の使用に基づき、またはそれらは、腫瘍と正常組織との間の示差的転写プロファイルまたは示差的ペプチド発現パターンの生成に基づく。しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株において過剰発現され、またはこのような組織または細胞株において選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。それは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本明細書の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能的および／または増殖性Ｔ細胞が見いだされる、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能的Ｔ細胞は、特異的抗原での刺激時にクローン増殖され得て、エフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」）と定義される。
【００７６】
「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」という用語は、本明細書の用法では、アルファ（α）およびベータ（β）鎖のヘテロ二量体から構成されるＴ細胞上のタンパク質受容体を指すが、ただしいくつかの細胞では、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。いくつかの実施形態では本開示のＴＣＲは、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、およびγδＴ細胞をはじめとする、ＴＣＲを含んでなる任意の細胞上で修飾されてもよい。
【００７７】
ＴＣＲはＴリンパ球（またはＴ細胞）の表面に見られる分子であり、それは一般に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識する役割を担っている。それは、Ｔ細胞の９５％ではαおよびβ鎖からなるヘテロ二量体であるが、Ｔ細胞の５％はγおよびδ鎖からなるＴＣＲを有する。ＴＣＲと抗原およびＭＨＣとの係合は、関連する酵素、共受容体、および特殊なアクセサリー分子によって媒介される一連の生化学的事象を介して、そのＴリンパ球の活性化をもたらす。免疫学では、ＣＤ３抗原（ＣＤは分化抗原群の略である）は、哺乳類では４本の異なる鎖（ＣＤ３−γ、ＣＤ３δ、２本のＣＤ３ε）から構成されるタンパク質複合体であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子およびζ鎖と結びついて、Ｔリンパ球で活性化シグナルを発生させる。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は、一緒にＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３−γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖は、単一細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、これは、これらの鎖が正に帯電したＴＣＲ鎖（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）と結合できるようにする特性である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたは短縮してＩＴＡＭとして知られる単一の保存モチーフを含有し、これはＴＣＲのシグナル伝達能力に不可欠である。
【００７８】
ＣＤ２８はＴ細胞上で発現される分子の１つであり、それはＴ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを提供する。ＣＤ２８は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）の受容体である。Ｔｏｌｌ様受容体リガンドによって活性化されると、Ｂ７．１発現が抗原提示細胞（ＡＰＣ）において上方制御される。抗原提示細胞上のＢ７．２発現は、構成的である。ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞上で構成的に発現される唯一のＢ７受容体である。ＴＣＲに加えてＣＤ２８を介した刺激は、様々なインターロイキン（特にＩＬ−２およびＩＬ−６）の産生のために、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを提供し得る。
【００７９】
一態様では、Ｔ細胞の増殖および／または活性化は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１の１つまたは複数の存在下で行われる。別の態様では、Ｔ細胞の増殖および／または活性化は、ＩＬ−２単独、ＩＬ−７単独、ＩＬ−１５単独、ＩＬ−２とＩＬ−１５の組み合わせ、またはＩＬ−７とＩＬ−１５の組み合わせで行われる。
【００８０】
本開示のＴＣＲコンストラクトは、がんを有するかまたはがんが疑われる対象において、腫瘍の大きさを減少させまたは腫瘍の増殖または再増殖を防止することにより、これらの対象に適用可能であってもよい。したがって、本開示は、本開示のＴＣＲコンストラクトを対象の単離されたＴ細胞に導入し、形質転換Ｔ細胞を対象に再導入し、その結果、対象における腫瘍を縮小させまたは除去するための抗腫瘍反応をもたらすことによって、対象において腫瘍の増殖を減少させまたは形成を予防する方法にさらに関する。使用され得る適切なＴ細胞としては、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）、または破壊を必要とするＴ細胞受容体を有する任意の細胞が挙げられる。当業者には周知であるように、対象からこれらの細胞を単離するために、様々な方法が容易に利用できる。例えば、細胞表面マーカー発現の使用、または市販されるキット（例えば、イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅからのＩＳＯＣＥＬＬ（商標））の使用。
【００８１】
ＴＣＲコンストラクトは、裸のＤＮＡとして、または適切なベクター内で、対象自身のＴ細胞に導入され得ることが考察される。当該技術分野の裸のＤＮＡを使用した電気穿孔によるＴ細胞の安定的な形質移入の方法。例えば、その内容全体が参照により援用される、米国特許第６，４１０，３１９号明細書を参照されたい。裸のＤＮＡは、一般に、発現のために適切な方向でプラスミド発現ベクターに含有される、本開示のＴＣＲをコード化するＤＮＡを指す。有利なことに、裸のＤＮＡの使用は、本開示のＴＣＲを発現するＴ細胞を製造するための所用時間を短縮する。
【００８２】
代案としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を使用して、ＴＣＲコンストラクトをＴ細胞に導入し得る。本開示の方法に従って使用するのに適したベクターは、対象のＴ細胞において自己複製しない。ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、その中では、細胞内に維持されるウイルスのコピー数は、細胞の生存能力を維持するのに十分に低い。例示的なベクターとしては、ｐＦＢ−ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））、ならびにＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、またはＢＰＶに基づくベクターが挙げられる。
【００８３】
形質移入または形質導入されたＴ細胞が、所望の調節を有する表面膜タンパク質として、ＴＣＲコンストラクトを所望レベルで発現できることがひとたび確立されたら、ＴＣＲが宿主細胞において所望のシグナル誘導を提供するために機能的であるかどうかが、判定され得る。引き続いて、形質導入Ｔ細胞は対象に再導入または投与されて、対象における抗腫瘍応答が活性化される。
【００８４】
投与を容易にするために、本開示に従った形質導入Ｔ細胞は、さらに薬学的に許容可能であり得る適切な担体または希釈剤を用いて、医薬組成物にするかまたは生体内投与に適したインプラントにし得る。このような組成物またはインプラントを製造するための手段は、当該技術分野で記載されている（例えば、参照によりその内容全体が本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  Ｅｄ．、Ｍａｃｋ、ｅｄ．（１９８０｛閉じ括弧不足、そのまま｝を参照されたい）。適切な場合には、形質導入Ｔ細胞は、それぞれの投与経路のための通常の方法で、カプセル、溶液、注射、吸入剤、または煙霧剤のなどの半固体または液体の形態の調製物に製剤化され得る。当該技術分野で公知の手段を利用して、組成物が標的組織または器官に到達するまで、組成物の放出および吸収が防止または最小化され、または組成物の時限放出が確実にされ得る。しかし、望ましくは、細胞がＴＣＲを発現することを妨げない、薬学的に許容可能な形態が用いられる。したがって、望ましくは、形質導入Ｔ細胞は、平衡塩類溶液、好ましくはハンク平衡塩類溶液、または生理食塩水を含有する、医薬組成物にされ得る。
【００８５】
特定の態様では、本発明は、ＴＣＲをコード化するＤＮＡコンストラクトを含有する発現ベクターを用いてＴ細胞を形質移入するステップと、次に、任意選択的に、細胞を抗原陽性細胞で、組換え抗原で、または受容体に対する抗体で刺激して、細胞を増殖させるステップとを含んでなる、抗原特異的再誘導Ｔ細胞を生成しおよび／または増殖させる方法を含む。
【００８６】
別の態様では、裸のＤＮＡを使用して、電気穿孔、またはその他の非ウイルス性遺伝子移入（ソノポレーションなどであるが、これに限定されるものではない）によって、Ｔ細胞を安定に形質移入し、再誘導する方法が提供される。ほとんどの研究者らは、異種遺伝子をＴ細胞に輸送するために、ウイルスベクターを使用している。裸のＤＮＡを使用することで、再誘導Ｔ細胞の製造に必要な時間が短縮され得る。「裸のＤＮＡ」は、表現のための適切な方向で発現カセットまたはベクターに含有される、ＴＣＲをコード化するＤＮＡを意味する。本開示の電気穿孔法は、ＴＣＲを発現してその表面に保有する、安定な形質移入体を生成する。
【００８７】
特定の態様では、Ｔ細胞は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＣＧ−ＣＳＦでの刺激後に採取されたＰＢＭ、骨髄、または臍帯血由来のＴ細胞などの初代ヒトＴ細胞である。条件としては、ｍＲＮＡおよびＤＮＡおよび電気穿孔の使用が挙げられる。形質移入に続いて、細胞は、即座に輸液されてもよく、または保存されてもよい。特定の態様では、形質移入に続いて、細胞は、細胞への遺伝子移入後、約１、２、３、４、５日またはそれ以上の期間内に、バルク集団として、数日間、数週間または数ヶ月間にわたり生体外で増殖されてもよい。さらなる態様では、形質移入に続いて  形質移入体がクローン化され、  単一の  組み込まれた  または  エピソーム的  に維持された  発現カセット  または  プラスミドの存在、および    ＴＣＲ  の発現を実証するクローンが、生体外で増殖された。増殖のために選択されたクローンは、ペプチド発現標的細胞を特異的に認識して溶解する能力を実証する。組換えＴ細胞は、ＩＬ−２での刺激、または共通γ鎖に結合するその他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１など）での刺激によって増殖させてもよい。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞での刺激によって増殖させてもよい。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞上で増殖させてもよく、またはＴ細胞表面上のＣＤ３を架橋するＯＫＴ３などの抗体を用いて増殖させてもよい。組換えＴ細胞のサブセットは、人工抗原提示細胞上で欠失させてもよく、またはＴ細胞表面上でＣＤ５２に結合するＣａｍｐａｔｈなどの抗体を用いて欠失させてもよい。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は凍結保存されてもよい。
【００８８】
本発明の組成物は単位用量剤形で提供され得て、その中では、例えば、注射などの各投与単位が、所定量の組成物を単独で、またはその他の活性剤との適切な組み合わせで含有する。本明細書の用法では、単位用量剤形という用語は、ヒトおよび動物対象のための単位投薬量として適切な物理的離散単位を指し、各単位は、適切な場合には薬学的に許容可能な希釈剤、担体、またはビヒクルと関連して、単独で、またはその他の活性剤との組み合わせで、所望の効果を生じるのに十分な量で計算された本発明の組成物の所定量を含む。本発明の新規の単位用量剤形の仕様は、特定の対象における医薬組成物に関連する特定の薬力学に依存する。
【００８９】
長期的な特異的抗腫瘍応答が確立されて、このような治療の非存在下で帰結するよりも、腫瘍のサイズを縮小させまたは腫瘍の増殖または再増殖を排除するように、望ましくは単離された形質導入Ｔ細胞の有効量または十分な数が組成物中に存在して、対象に導入される。望ましくは、対象に再導入された形質導入Ｔ細胞の量は、形質導入Ｔ細胞が存在しないこと以外は同じ条件と比較して、腫瘍サイズの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の減少を引き起こす。
【００９０】
したがって、投与される形質導入Ｔ細胞の量は、投与経路を考慮すべきであり、所望の治療応答を達成するのに十分な数の形質導入Ｔ細胞が導入されるような量であるべきである。さらに、本明細書に記載の組成物に含まれる各活性剤の量（例えば、接触させる各細胞あたりの量、または特定の体重あたりの量）は、異なる用途において変動し得る。一般に、形質導入Ｔ細胞の濃度は、好ましくは、治療される対象に少なくとも約１×１０６〜約１×１０９個の形質導入Ｔ細胞／ｍ２（またはｋｇ）患者、なおもより望ましくは、約１×１０７〜約５×１０８個の形質導入Ｔ細胞／ｍ２（またはｋｇ）患者を提供するのに十分であるべきであるが、それを上回る例えば、５×１０８細胞／ｍ２（またはｋｇ）患者を超える、またはそれを下回る例えば、１×１０７細胞／ｍ２（またはｋｇ）患者未満などの任意の適切量が利用され得る。投与スケジュールは、十分確立された細胞ベースの治療法に基づき得て（例えば、参照によりその内容全体が本明細書に援用される、米国特許第４，６９０，９１５号明細書を参照されたい）、または交互の持続輸液ストラテジーが用いられ得る。
【００９１】
これらの値は、本発明の方法を本発明の実施のために最適化する際に、実務家によって利用される、一連の形質導入Ｔ細胞の一般的ガイダンスを提供する。本明細書におけるこのような範囲の列挙は、特定の用途で正当化されるかもしれないように、より多いまたはより少ない量の成分の使用を決して排除するものではない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、組成物がその他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかによって、または薬物動態、薬物消長、および代謝における個人間の差異によって変動し得る。当業者は、特定の状況の要件に従って、容易に任意の必要な調節をし得る。
【００９２】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は技術分野で認識されており、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。特定の実施形態で使用するのに適した例示的なＴ細胞集団としては、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、または任意のその他のＴ細胞のサブセットが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で使用するのに適したその他の例示的なＴ細胞集団としては、マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＨＬＡ−ＤＲの１つまたは複数を発現するＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されず、所望ならば、正または負の選択技術によってさらに単離され得る。
【００９３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、丸い核を有する任意の血液細胞（すなわち、リンパ球、単球、またはマクロファージ）として定義される。これらの血球は、感染症と戦い、侵入者に適応するための免疫系の重要な構成要素である。リンパ球集団は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞、ＣＤ１４＋単球、および好塩基球／好中球／好酸球／樹状細胞からなる。これらの細胞は、血液の層を分離する親水性多糖類であるＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を使用して、全血から、または白血球アフェレーシス産物から分離されることが多く、血漿の層の下に単球およびリンパ球がバフィーコーを形成する。一実施形態では、「ＰＢＭＣ」は、少なくともＴ細胞、および任意選択的にＮＫ細胞、および抗原提示細胞を含んでなる、細胞集団を指す。
【００９４】
「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されている、Ｔ細胞の状態を指す。特定の実施形態では、活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能に付随し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、増殖中のＴ細胞を指す。Ｔ細胞の完全な活性化には、ＴＣＲを介して生成されたシグナルだけでは不十分であり、１つまたは複数の二次的シグナルまたは共刺激シグナルもまた必要である。したがって、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した一次刺激シグナルと、１つまたは複数の二次的共刺激シグナルとを含んでなる。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を介したまたはＣＤ２を介した刺激などの一次活性化シグナルを受信したＴ細胞による、増殖および／またはサイトカイン産生によって証明され得る。
【００９５】
本明細書の用法では、休止Ｔ細胞は、分裂していないまたはサイトカインを産生していないＴ細胞を意味する。休止Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞（およそ１２〜１５ミクロン）と比較して、サイズが小さい（およそ６〜８ミクロン）。
【００９６】
本明細書の用法では、プライミングされたＴ細胞は、少なくとも一度は以前に活性化されており、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１０８時間、または少なくとも約１２０時間にわたり活性化刺激から除去されている、休止Ｔ細胞である。代案としては、休止は、約０．５時間〜約１２０時間、約０．５時間〜約１０８時間、約０．５時間〜約９６時間、約０．５時間〜約８４時間、約０．５時間〜約７２時間、約０．５時間〜約６０時間、約０．５時間〜約４８時間、約０．５時間〜約３６時間、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１８時間、約０．５時間〜約１２時間、約０．５時間〜約６時間、約１時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、または約４時間〜約５時間の期間内に実行されてもよい。プライミングされたＴ細胞は、通常は記憶表現型を有する。
【００９７】
Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞を活性化し、アクセサリー分子に結合するリガンドを用いて、Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子を刺激することによって、増殖するように誘導されてもよい。Ｔ細胞集団の活性化は、Ｔ細胞内のＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを刺激する第１の薬剤をＴ細胞に接触させることによって、達成されてもよい。Ｔ細胞内のＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルの刺激は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体またはＣＤ２表面タンパク質のライゲーションによって、または受容体共役シグナル伝達経路を直接刺激することによって、達成されてもよい。したがって、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、またはタンパク質キナーゼＣ活性化剤をカルシウムイオノフォアと併用して、Ｔ細胞集団が活性化されてもよい。
【００９８】
増殖を誘導するために、活性化Ｔ細胞集団と、Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子を刺激する第２の薬剤とを接触させてもよい。例えば、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８分子を対象とする抗ＣＤ２８抗体を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団が刺激され増殖され得る。代案としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ７−１およびＢ７−２などのＣＤ２８に対する天然リガンドで刺激され得る。天然リガンドは、細胞膜上で可溶性であるか、または固相表面に共役され得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増殖は、活性化Ｔ細胞上に存在する約２７ｋＤの分子量を有するアクセサリー分子ＣＤ９に結合する、モノクローナル抗体ＥＳ５．２Ｄ８の使用によって達成されてもよい。代案としては、活性化Ｔ細胞集団の増殖は、ＣＤ２８などのアクセサリー分子のライゲーションに起因する、１つまたは複数の細胞内シグナルの刺激によって誘導され得る。
【００９９】
一次活性化シグナルを提供する薬剤および共刺激剤を提供する薬剤は、可溶性形態で添加されるか、または固相表面に共役させ得る。好ましい実施形態では、２つの薬剤が同じ固相表面に共役されてもよい。
【０１００】
Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の活性化と刺激に続いて、細胞内で作用してアクセサリー分子によって媒介される経路をシミュレートする、リガンドまたはその他の薬剤への継続的な曝露に応答したＴ細胞の増殖の進行が、モニターされてもよい。Ｔ細胞の増殖速度が低下した場合、追加的な抗ＣＤ３抗体および共刺激性リガンドなどを用いて、Ｔ細胞を再活性化して再刺激し、さらなる増殖が誘導されてもよい。一実施形態では、Ｔ細胞の増殖速度は、細胞サイズを調べることによってモニターされてもよい。代案としては、Ｔ細胞増殖は、Ｂ７−１またはＢ７−２などのリガンドまたはその他の薬剤への曝露に応答した細胞表面分子の発現をアッセイすることによって、モニターされてもよい。持続的な増殖についてＴ細胞のモニタリングと再刺激を繰り返し、元のＴ細胞集団よりも約１００倍〜約１００，０００倍に増加したＴ細胞集団が生成されてもよい。
【０１０１】
本開示の方法を使用して、感染性疾患またはがんの治療で使用するための選択されたＴ細胞集団が増殖され得る。得られたＴ細胞集団は遺伝的に形質導入されて、免疫療法に使用され得るか、または感染性因子の生体外分析のために使用され得る。Ｔ細胞集団の十分な数への増殖に続いて、増殖Ｔ細胞は個人に回復されてもよい。本開示の方法はまた、Ｔ細胞の再生可能な供給源を提供してもよい。したがって、個人からのＴ細胞を生体外で増殖させ得て、増殖した集団の一部が個人に再投与され得て、別の部分は長期保存および引き続く増殖と個人への投与のためにアリコートで冷凍され得る。同様に、がんに罹患した個人から腫瘍浸潤性リンパ球の集団を得て、Ｔ細胞を刺激して十分な数に増殖させ、個人に回復させ得る。
【０１０２】
本開示はまた、固相表面に共役された、Ｔ細胞増殖のためにＴ細胞に共刺激シグナルを提供する薬剤（例えば、抗ＣＤ２８抗体、Ｂ７−１またはＢ７−２リガンド）を含有する組成物に関係してもよく、それは、同じ固相表面に共役された、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する薬剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）をさらに含んでもよい。これらの薬剤は、好ましくは、ビーズまたはフラスコまたはバッグに付着されてもよい。異なる固相表面に共役された各薬剤（すなわち、第１の固相表面に共役された、一次Ｔ細胞活性化シグナルを提供する薬剤、および第２の固相表面に共役された、共刺激シグナルを提供する薬剤）を含んでなる組成物もまた、本開示の範囲内であってもよい。
【０１０３】
一態様では、本明細書に記載の方法および実施形態で使用できる、ＴＡＡペプチドとしては、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３７０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許出願公開第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２５３６３３号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２６０２４９号明細書、米国特許出願公開第２０１８００５１０８０号明細書、および米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書に記載されるＴＡＡペプチドが挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１０４】
一態様では、本明細書に記載のＴ細胞は、上記の特許および刊行物の１つまたは複数に記載されるＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。
【０１０５】
別の態様では、本明細書に記載の方法および実施形態で使用できるＴＡＡは、配列番号１〜配列番号１５７から選択される少なくとも１つを含む。
【０１０６】
【表Ａ−１】
2021512621.tif 000002
【表Ａ−２】
2021512621.tif 000003
【表Ａ−３】
2021512621.tif 000004
【０１０７】
【実施例】
【０１０８】
実施例１
自己由来Ｔ細胞製造工程
純化ナイーブ（Ｔｎ）、幹細胞記憶（Ｔｓｃｍ）、および中央記憶（Ｔｃｍ）Ｔ細胞サブセットの養子細胞移入は、より分化したエフェクター記憶（Ｔｅｍ）およびエフェクター（Ｔｅｆｆ）Ｔ細胞の移入と比較して、より優れた腫瘍退縮を引き起こす。操作Ｔ細胞製品の伝統的な製造工程は、１０〜１５日間かかることがある。しかし、例えば、１４日間などの約１２日間よりも長い工程は、より効果的なＴｎ、Ｔｓｃｍ、およびＴｃｍＴ細胞サブセットの減少、および効果に劣るＴｅｍおよびＴｅｆｆＴ細胞サブセットの増加など、細胞の力価の低下をもたらすことがある。例えば、図１Ａは、例えば、ドナー６およびドナー８の２人の健常ドナーからのＴ細胞の、例えば、１４日間の長期化生体外培養を示し、その中では、望ましいＴｃｍＴ細胞サブセットが、０、６、または１０日間培養したものから減少した。他方、０日、６日、１０日間培養したものよりも、さらに分化してより持続性に劣るＴｅｍＴ細胞サブセットが増加した。図１Ｂは、例えば、患者８６４、患者４５３、および患者２６５などの３人の患者からのＴ細胞の、例えば、１４日間の長期化生体外培養を示し、その中では、望ましいＴｃｍＴ細胞サブセットは、０、６、または１０日間培養したものから減少した。他方、０日、６日、１０日間培養したものよりも、さらに分化してより持続性に劣るＴｅｍＴ細胞サブセットが増加した。
【０１０９】
より効果的なＴｎ、Ｔｓｃｍ、およびＴｃｍＴ細胞サブセットの減少は、例えば、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）などのサイトカインを分泌する｛ｓｅｃｒｅｔ／ｓｅｃｒｅｔの誤記｝、効果的に活性化されたＴ細胞の減少をもたらすことがある。図２は、例えば、ドナー６（Ｄ６）、ドナー７（Ｄ７）、ドナー８（Ｄ８）などの３人の健常ドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を活性化して１０日間培養した場合と比較した、活性化して１０日間培養した場合のＩＮＦ−γ分泌量の減少を示す。
【０１１０】
製造工程を短縮するために、本開示の実施形態は、力価の損失なしに、約７日〜約１０日間で１００億（１０×１０９）個を超える細胞の製造をもたらす工程を含む。さらに、いくつかの原料の濃度を最適化し、製品のコストを３０％削減してもよい。
【０１１１】
Ｔ細胞活性化に対する自己由来Ｔ細胞製造工程の休止条件の排除または変更の影響
図３は、Ｔ細胞の活性化と増殖に対する休止条件の影響を試験するために使用した実験デザインを示す。簡潔に述べると、グループＡは、０日目に解凍し、一晩（Ｏ／Ｎ）、すなわち、サイトカインなしの２４時間の休止がそれに続き、非組織培養処理プレート上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体での休止ＰＢＭＣの活性化がそれに続く、ＰＢＭＣの第１のバッチに相当する。ＩＬ−７は、アポトーシスを防ぐことによってＴ細胞の生存を促進する、恒常性サイトカインである。ＩＬ−７は、休止中にＰＢＭＣに添加してもよい。グループＢ１〜Ｂ３は、１日目に解凍し、ＩＬ−７の存在下での（グループＢ１）またはＩＬ−７＋ＩＬ−１５の存在下での（グループＢ２）またはサイトカインなしでの（グループＢ３）４〜６時間の休止がそれに続き、非組織培養処理プレート上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体での休止ＰＢＭＣの活性化がそれに続く、ＰＢＭＣの第２のバッチに相当する。グループＣは、１日目に解凍し（休止なしおよびサイトカインなし）、組織培養プレート上に固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体での解凍ＰＢＭＣ活性化がそれに続く、ＰＢＭＣの第３のバッチに相当する。８〜１０日目に細胞を収穫し計数してもよく、活性化パネル分析がそれに続く。
【０１１２】
ＣＤ２５およびＣＤ６９は、サイトカインまたはマイトジェンで活性化されたリンパ球の表面上の活性化マーカーである。ＬＶ−Ｒ７３などのＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターの結合および侵入は、宿主細胞上におけるＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質と低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）との相互作用によって媒介されることが示されている。休止Ｔ細胞はＬＤＬ−Ｒを発現しないが、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体での活性化によってＴ細胞上でＬＤＬ−Ｒ発現が誘導され、効率的なレンチウイルス導入ができるようになる。これは、活性化のレベルによって調節されるＬＤＬ−Ｒ発現の動態が、ＶＳＶ−Ｇレンチウイルスベクターによる形質導入効率に影響を与え得ることを示唆する。
【０１１３】
図４は、グループＡ、Ｂ１〜Ｂ３、およびＣ間で、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびｈＬＤＬ−Ｒ発現レベルが同等であることを示し、Ｔ細胞活性化を有意に低下させることなく、休止時間を例えば、２４時間から４〜６時間まで短縮してもよいことが示唆される。
【０１１４】
Ｔ細胞増殖に対する自己由来Ｔ細胞製造工程の休止条件の排除または変更の影響
図５Ａおよび５Ｂは、グループＡおよびＢ１〜Ｂ３における倍数増殖および細胞生存率が、それぞれ、増殖７日目および増殖１０日目において同等であることを示す。しかし、休止なしのグループＣは、増殖７日目（５倍）（図５Ａ）および増殖１０日目（１６倍）（図５Ｂ）では、最小の倍数増殖を有する。これらの結果は、Ｔ細胞の増殖を有意に低下させることなく、休止時間を例えば、２４時間から４〜６時間まで短縮してもよいことを示唆する。
【０１１５】
図６および図７は、２人のドナー、すなわち、ドナー１（図６）またはドナー２（図７）のグループＡ、Ｂ１〜Ｂ３、およびＣにおける、例えば、ＬＶ−Ｒ７３などのＴＣＲを発現するウイルスベクターで形質導入された活性化Ｔ細胞の増殖９日目の倍数増殖および生存率を示す。グループＢ１およびＢ２は、グループＡ、Ｂ３、およびＣよりも良好な細胞増殖を示し、例えば、ＩＬ−７またはＩＬ−７＋ＩＬ−１５などのサイトカインの存在下での、例えば、５時間などの短い休止時間が、形質導入Ｔ細胞の増殖を増加させてもよいことが示唆される。Ｒｅｐ１およびＲｅｐ２は、２つの複製物に相当する。これらの結果は、Ｔ細胞の増殖を有意に低下させることなく、例えば、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５などのサイトカインの存在下での自己由来Ｔ細胞の製造工程における、例えば、２４時間から４〜６時間まで短縮された休止時間の使用を支持する。
【０１１６】
Ｔ細胞における導入遺伝子発現に対する自己由来Ｔ細胞製造工程における休止条件の排除または変更の影響
ペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的に結合する形質導入ＴＣＲを発現するＴ細胞を検出するためのペプチド／ＭＨＣ複合体負荷四量体を使用して、図８は、ドナー１３、ドナー１４、およびドナー１６について、Ｔ７５組織培養フラスコ内で４時間（ＩＬ−７あり）および２４時間（サイトカインなし）休止させたＴ細胞、または大規模製造実行でのＧ−Ｒｅｘ  １００フラスコ内で４時間（ＩＬ−７あり）休止させたＴ細胞における、例えば、組換えＴＣＲなどの導入遺伝子の同等の発現を示す。これらの結果は、形質導入Ｔ細胞における導入遺伝子発現を有意に低下させることなく、スケールアップ製造工程で、休止時間を例えば、２４時間から４〜６時間まで短縮してもよいことを示唆する。さらに、１本のＧ−Ｒｅｘ  １００フラスコの使用は、複数のＴ７５フラスコを置き換えることによって、休止工程をさらに簡略化し得る。
【０１１７】
図９は、ドナー１３、ドナー１４、およびドナー１６についての小規模または大規模製造において、４〜６時間、６時間、または２４時間休止させたＴ細胞の増殖１０日目における同等の倍数増殖を示す。これらの結果は、形質導入Ｔ細胞の増殖に大きな影響を与えることなく、スケールアップ製造工程で、休止時間を例えば、２４時間から４〜６時間まで短縮してもよいことを示唆する。
【０１１８】
Ｔ細胞活性化に対する自己由来Ｔ細胞製造工程中の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の濃度の影響
形質導入効率および増殖率はどちらもＴ細胞の活性化に依存することから、活性化は自己由来Ｔ細胞の製造工程における重要なステップである。抗体を使用した、ＣＤ３受容体とＣＤ２８などの共受容体との係合を介したＴ細胞の刺激は、Ｔ細胞を活性化するための一般的な方法である。Ｔ細胞活性化は、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターによる形質導入の準備段階として機能する。
【０１１９】
図１０は、Ｔ細胞活性化に対する抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の濃度の影響を試験するために使用した実験デザインを示す。簡潔に述べると、０日目に、ＰＢＭＣを解凍し、一晩または２４時間、活性化サイトカインを使用せずに培養しまたは休止させた。１日目に、ＩＬ−７＋ＩＬ−１５の存在下で、例えば、０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌの異なる濃度の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆された２つの２４ウェルプレート内でインキュベートすることによって、休止ＰＢＭＣを活性化した。２日目に、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびｈＬＤＬ−Ｒ発現について、活性化Ｔ細胞を分析し、例えば、１ｘＥｎｇ  ＬＶ−Ｒ７３などのＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターで形質導入した。６／７日目および９日目に、組換えＴＣＲを発現するＴ細胞を検出するための複数のフルオレセインおよびペプチド／ＭＨＣ複合体を保有するデキストラン主鎖ベースの多量体であるデキストラマー（Ｄｅｘ）を用いて、細胞数、生存率、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの分析を実施した。
【０１２０】
図１１は、ウイルス形質導入に先立って、０．５μｇ／ｍｌおよび１．０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化されたＴ細胞が、各ドナー１６およびドナー１４内でＣＤ２５、ＣＤ６９、およびｈＬＤＬ−Ｒ発現の同等のレベルを有することを示す。しかし、これらの発現レベルは、例えば、０．１μｇ／ｍｌおよび０．２５μｇ／ｍｌなどのより低濃度の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化されたＴ細胞からの発現レベルよりも有意に高い。これらの結果は、Ｔ細胞活性化を有意に低下させることなく、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の濃度を例えば、１．０μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌまで減少させてもよいことを示唆する。
【０１２１】
Ｔ細胞増殖に対する自己由来Ｔ細胞製造工程中の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体およびサイトカインの濃度の影響
図１２は、増殖１０日目に、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化されたＴ細胞の細胞数が、例えば、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌなどの異なる濃度のＩＬ−１５の存在で、各ドナー１６、ドナー１３、およびドナー１４において同等であることを示す。これらの結果は、Ｔ細胞の増殖を有意に減少させることなく、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の濃度を例えば、１．０μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌに減少させてもよく、ＩＬ−１５の濃度を例えば、１００ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌに減少させてもよいことを示唆する。
【０１２２】
図１３は、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化された組換えＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の四量体染色が、例えば、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌなどの異なる濃度のＩＬ−１５の存在下で、各ドナー１６、ドナー１３、およびドナー１４において同等であることを示す。これらの結果は、Ｔ細胞のウイルス形質導入を有意に減少させることなく、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の濃度を例えば、１．０μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌに減少させてもよく、ＩＬ−１５の濃度を例えば、１００ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌに減少させてもよいことを示唆する。
【０１２３】
総合して、これらの結果は、（１）Ｔ細胞活性化、導入遺伝子発現、およびＴ細胞増殖を有意に低下させることなく、ＰＢＭＣ解凍後の休止時間を例えば、２４時間から４〜６時間まで短縮し得ること；および（２）Ｔ細胞活性化、導入遺伝子発現、およびＴ細胞増殖を有意に減少させることなく、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の濃度を例えば、１．０μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌに減少させ得て、ＩＬ−１５などのサイトカインの濃度を例えば、１００ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌに減少させ得ることを示唆する。
【０１２４】
レンチウイルスベクターによる導入効率に対する自己由来Ｔ細胞製造工程における活性化持続時間の影響
自己由来Ｔ細胞製造工程を開発する主要な目標の１つは、ＴＣＲをコード化するレンチウイルスコンストラクトを用いて、初代ヒトＴ細胞において達成される形質導入率を改善することである。分裂している細胞のみを形質導入し得るγレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、理論上は、分裂している細胞および分裂していない細胞の双方を形質導入し得る。しかし、休止Ｔ細胞をレンチウイルスで形質導入すると、形質導入効率が低下する。Ｔ細胞の活性化は、それらのレンチウイルスによる形質導入を促進することが示されている。したがって、固定化されたビーズまたは可溶性の形態の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でのＴ細胞の刺激は、レンチウイルス形質導入を実施するための前提条件となっており、養子細胞療法のための遺伝子改変Ｔ細胞を製造するための標準的な部分である。
【０１２５】
Ｔ細胞活性化ステップは、形質導入のためにＴ細胞を準備する上で重要な役割を果たしていることから、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体での活性化の有効持続期間を最適化する必要があってもよい。
【０１２６】
最適な活性化持続時間を判定するために、形質導入効率に対する異なる活性化持続期間の影響を評価する、時間経過研究を実施した。結果は、Ｔ細胞を形質導入するための最適ウィンドウが、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体での活性化の１６〜２４時間後であってもよいことを示す。したがって、形質導入に先だつＴ細胞活性化のための時間は、全てのさらなる工程開発および臨床製造について、４８時間から１６〜２４時間まで短縮されてもよい。
【０１２７】
本開示の別の実施形態では、新鮮なＰＢＭＣ、すなわち、凍結されていないＰＢＭＣでは、休止は不要であってもよい。したがって、休止なしの新鮮なＰＢＭＣは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化されてもよく、形質導入Ｔ細胞を取得するためのウイルスベクター形質導入がそれに続く。
【０１２８】
Ｔ細胞を導入する方法は、組織培養中のＴ細胞を活性化するステップと、それに続く、その中で活性化Ｔ細胞がウイルスベクターで形質導入される、活性化Ｔ細胞を異なる組織培養に移すステップとを順次伴ってもよいが、活性化および導入するステップは併行して実行してもよい。例えば、Ｔ細胞が抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化される間に、活性化Ｔ細胞の形質導入を同一培養内で同時に実行してもよい。そうすることによって、Ｔ細胞形質導入工程全体、すなわち、ＰＢＭＣの提供から形質導入Ｔ細胞の取得までを例えば、３〜４日間まで短縮してもよい。
【０１２９】
実施例２
レンチウイルスコンストラクトによる形質導入効率向上のための最適なＴ細胞活性化持続時間の判定
形質導入に備えて、健常ドナーからのＰＢＭＣを異なる時間間隔で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲを標的化するＴＡＡを発現する異なるレンチウイルスコンストラクトを用いて生成された濃縮上清を使用して、ＰＢＭＣからの活性化Ｔ細胞を処理した。形質導入細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で増殖させた。生成物は、特定のデキストラマー／四量体を使用したフローサイトメトリーによって判定されたＲ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲ導入遺伝子発現に基づいて比較した。
【０１３０】
【表Ｂ】
2021512621.tif 000005
【０１３１】
代表的な方法
Ｔ細胞活性化の異なる持続時間を比較するために、例えば、解凍／休止、活性化、導入、および増殖の４つのステップを伴う、標準的な小規模Ｔ細胞製造工程に従って、本明細書に記載された代表的な実験を実行した。
【０１３２】
解凍および休止
健常ドナー（ｎ＝３、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ９）からの冷凍ＰＢＭＣは、５％ヒトＡＢ血清を補充した暖かいＴｅｘＭＡＣＳ培地中で解凍した。細胞をベンゾナーゼヌクレアーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）を用いて３７℃で１５分間処理し、洗浄し、計数し、完全ＴｅｘＭＡＣＳ培地中で一晩休止させた。
【０１３３】
活性化
細胞を解凍した日に、ＰＢＳ（１μｇ／ｍＬ）で希釈された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて２４ウェル非組織培養プレートを被覆し、密封して４℃で一晩インキュベートした。翌日、休止ＰＢＭＣを収穫し、計数し、洗浄して、１×１０６／ｍｌの濃度に再懸濁した。抗体溶液を吸引してウェルを完全培地で洗浄し、各ウエルへの２×１０６個の細胞の添加がそれに続いた。活性化は、３７℃で所定の時間間隔で実行した。
【０１３４】
形質導入
活性化Ｔ細胞を収穫し、洗浄し、計数した。濃縮ウイルス上清、硫酸プロタミン（１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する形質導入混合物を準備した。各形質導入のために、１．０×１０６個の細胞を滅菌微量遠心管内で分離し、４００×ｇで５分間遠心分離した。各細胞ペレットを特定のＭＯＩに対応する０．５ｍｌの形質導入混合物に再懸濁した。細胞懸濁液を２４ウェルＧ−Ｒｅｘプレートの適切に標識したウェルに入れた。３７℃、５％ＣＯ２での２４時間の培養後、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充した１．５ｍｌの培地を各ウェルに添加した。形質導入の９６時間後に、導入遺伝子の発現をフローサイトメトリーで判定した。多量体ＭＨＣ−ペプチド複合体（デキストラマーまたは四量体）を使用して、ＦＡＣＳによる遺伝子組換えＴＣＲの表面発現をモニターした。
【０１３５】
フローサイトメトリー
簡潔に述べると、所与のレンティウイルス多重感染（ＭＯＩ）で形質導入された１．０×１０６個の細胞を作業指示書に従って染色した。四量体染色のために、細胞を５０μｌの流動緩衝液中の１μｌのＴＡＡ四量体と共に、暗所で１５分間ＲＴでインキュベートした。四量体染色に、Ｔ細胞表面マーカーに対する抗体での染色が続いた（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８など）。サンプルは、補償ビーズ由来の自動補償マトリックスを用いて取得した。
【０１３６】
結果
プレート結合抗ＣＤ３およびＣＤ２８抗体を使用して、２人のドナー（Ｄ３およびＤ４）から得られたＰＢＭＣを１６、２４および４８時間にわたり活性化した。細胞を３つの異なるレンチウイルスコンストラクト（Ｒ７２、Ｒ２１、およびＲ２２）で形質導入した。
【０１３７】
図１４Ａは、％ＣＤ３＋ＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞が、１６ｈ＞２４ｈ＞４８ｈの順で活性化持続時間の増加と共に徐々に減少していることを示す。この順序は、試験されたコンストラクトおよびドナーの双方で一貫して観察された。
【０１３８】
時間経過研究を実施して、高い導入遺伝子発現をもたらしてもよい、ウイルス形質導入のための最適活性化持続時間を判定した。例えば、０〜４８時間の所定の活性化の持続時間にわたり、１人のドナー（Ｄ９）からのＰＢＭＣをプレート結合抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化し、Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲをコード化する２つの異なるレンチウイルスコンストラクト、すなわち、ＬＶ−Ｒ７３およびＬＶ−Ｒ７８のそれぞれで形質導入した。
【０１３９】
図１４Ｂは、１６〜２０時間にわたり活性化された細胞において、導入遺伝子発現が最も高いことを示す。結果は、形質導入後９６時間のフローサイトメトリーによる％ＣＤ３＋ＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞として測定された、導入遺伝子発現レベルを示す。最適な活性化のためのウィンドウは、約１６時間〜約２０時間と判定され、最大で２４時間まで延長してＧＭＰ製造に融通性を加えてもよい。
【０１４０】
全体的に、これらの結果は、４８時間にわたり活性化されたＴ細胞で観察された低い形質導入率の原因の１つを説明してもよく、１６〜２４時間にわたるより短い活性化がレンチウイルス形質導入を実施するのに最適であってもよいことを示す。活性化時間を１６時間〜２４時間に制限することによって、４８時間の活性化で達成された堅牢な増殖が影響を受けてもよいが、この変更は、製品にとって非常に有益であると見なされ、全てのさらなる工程開発および臨床製造に実装され得る。
【０１４１】
実施例３
全てのバイオプロセスと同様に、Ｔ細胞製造のスケールアップは、工程開発の難易度の高い部分である。製品の有効性を保つためにＴ細胞の機能および品質を維持することは、スケールアップの全ての段階を通じて最も重要である。自己由来Ｔ細胞製造工程のために、本発明者らは重要な段階を特定し、スケールアップを２つの部分に分割した：活性化のスケールアップは、非組織培養表面で実行してもよく、形質導入および増殖のスケールアップは、Ｇ−Ｒｅｘ装置内で実行してもよい。
【０１４２】
ビーズまたは可溶性抗体は、規模が容易に拡大縮小できる細胞を活性化するためのより単純な方法を提示するが、活性化のための非組織培養表面（２４ウェルプレート）上の固定化抗体を使用した自己由来Ｔ細胞製造工程が、レンチウイルスによる最良の形質導入および増殖率をもたらした。しかし、複数の２４ウェル非組織培養抗体被覆プレートから活性化細胞を収穫することは、手間がかかり、時間のかかるステップであり、さもなければ単純な工程に複雑度が加わる。１×１０９ＰＢＭＣまでの活性化を考慮すると、例えば、各製造実行でおよそ２０枚のプレートと４８０回の操作が、活性化された細胞を収穫するために必要であってもよい。
【０１４３】
Ｔ細胞を活性化する従来法は、市販のビーズ、またはそれぞれ、１ｕｇ／ｍＬ濃度の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆された（「プレート結合」）非組織培養処理２４ウェルまたは６ウェルプレートのどちらかを使用する、開放系および労働集約的工程を含んでもよい。しかし、開放系の方法は、完了するまでに、例えば、約８時間などの比較的長時間を要してもよい。開放系および労力集約的工程を簡略化するために、本開示の実施形態は、例えば、Ｇ−Ｒｅｘ（商標）システムおよびＸｕｒｉ（商標）細胞増殖システムなどの市販の閉鎖系のバッグなどの容器と併用され得る、閉鎖系に適応可能な単純明快な工程を含んでもよく、従来法を使用して活性化されたＴ細胞と同等のＴ細胞活性化プロファイル、Ｔ細胞の形質導入可能性、および最終製品の機能性をもたらす。さらに、例えば、フラスコ結合法などの本開示の方法は、完了するまでに例えば、約１時間などの比較的短時間を要してもよく、これは、従来法よりも約８倍迅速である。
【０１４４】
活性化では２４ウェル非組織培養プレートを使用し、形質導入および増殖では２４ウェルＧ−Ｒｅｘプレートを使用して、自己由来Ｔ細胞製造工程を開発するための最適化を小規模で実施した。この規模では、２日目に形質導入された百万〜２百万個のＴ細胞は、１０日目まで３０倍〜４０倍に増殖し、収穫時には３千万個〜８千万個の細胞をもたらした。しかし、最終的工程の目標は、２億５千万〜４億個の活性化細胞を形質導入し、１０日間の製造タイムラインを維持したまま、１００億個以上の生存可能なＣＤ３＋Ｔ細胞に増殖させることであってもよい。したがって、一態様では、工程全体のスケールアップが本明細書で提供される。
【０１４５】
より多くの細胞を活性化する方法を含む本開示の実施形態では、非組織培養処理Ｔ１７５ｃｍ２フラスコが、より大きな表面積を提供し、非常にわずかな操作を必要とするより単純なプラットフォームを提供する。最適化後に、Ｔ細胞を活性化するためのフラスコ結合抗体の使用は、プレート結合抗体と同等の増殖および形質導入をもたらした。したがって、活性化ステップのスケールアップは、臨床製造のための自己由来Ｔ細胞製造工程を簡略化する上で大きな進展となった。より多くの細胞数に基づいて、Ｇ−Ｒｅｘ−２４ウェルプレートからＧ−Ｒｅｘ１００に、形質導入および増殖をスケールアップした。Ｇ−Ｒｅｘ装置の使用は、特に播種密度の観点から、活性化後のステップのほぼ直線的なスケールアップを促進してもよい。栄養供給回数や分割回数などのその他のパラメータを標準化し、最大の増殖率および生存率を達成してもよい。フルスケールＰＤ実行においてスケールアップ工程全体を検証することは、ＧＭＰにおけるＴ細胞製品＃１工程の成功裏の技術移転を確実にする。
【０１４６】
プレート結合対フラスコ結合
Ｔ細胞活性化と、それに続く形質導入および増殖は、Ｔ細胞製造の重要なステップである。これらのステップをスケールアップするための条件を最適化するために、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコの使用は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆された２４ウェルプレートを置き換える、より大きな表面積とより少ない操作での活性化に適したプラットフォームを提示した。Ｔ１７５ｃｍ２フラスコ内の重要なパラメータの最適化に続いて、フラスコ上に被覆された（フラスコ結合）抗体を使用して活性化された細胞は、複数のドナーにおいて、２４ウェルプレート上に被覆された（プレート結合）抗体を使用して活性化された細胞と、同等の活性化、形質導入、および増殖レベルを示した。
【０１４７】
さらに、小規模（Ｇ−Ｒｅｘ−２４ウェルプレート）から中規模（２〜６つのＧ−Ｒｅｘ１０または１つのＧ−Ｒｅｘ１００）からフルスケール（５〜８つのＧ−Ｒｅｘ１００）へと、形質導入および増殖ステップをスケールアップした。スケールアップされた工程全体は、２回のフルスケール工程開発（ＰＤ）実行において検証してもよい。最終工程を使用して製造された全ての製品は、％Ｄｅｘ＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の観点から臨床リリース基準に合格し、臨床用量を満たすのに十分な細胞数を生成した。
【０１４８】
プレート結合法によって活性化されたＴ細胞と、フラスコ結合法（非組織培養フラスコは抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆される）で活性化Ｔ細胞との活性化レベル（フローサイトメトリー）、形質導入可能性（デキストラマー染色、ＦＡＣＳ）、増殖（細胞数）、および機能性（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ）についての比較
【０１４９】
形質導入に備えて、非組織培養処理Ｔ１７５ｃｍ２フラスコまたは２４ウェルプレートを使用し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用して、健常ドナーからのＰＢＭＣを活性化した。活性化Ｔ細胞をＲ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲをコード化するレンチウイルスコンストラクトで形質導入し、Ｇ−Ｒｅｘ２４ウェルプレートまたはＧ−Ｒｅｘ１０／Ｇ−Ｒｅｘ１００フラスコに播種した。形質導入Ｔ細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で増殖させ、工程１０日目に収穫した。製品に製造過程試験および最終試験を実施して、形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞数、生存率、および百分率を判定した。
【０１５０】
【表Ｃ】
2021512621.tif 000006
【０１５１】
方法
実験は、解凍／休止、活性化、形質導入、増殖という４段階を伴う標準的な自己由来Ｔ細胞製造工程に従うが、異なる規模で実行した。
【０１５２】
解凍および休止
健常ドナーからの冷凍ＰＢＭＣは、５％ヒトＡＢ血清を補充した暖かいＴｅｘＭＡＣＳ培地（完全培地）中で解凍した。細胞をベンゾナーゼヌクレアーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）を用いて３７℃で１５分間処理し、洗浄し、計数し、完全ＴｅｘＭＡＣＳ培地中で一晩休止させた。
【０１５３】
活性化
細胞を解凍する当日、ＰＢＳ（１μｇ／ｍＬ）中で希釈した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて２４ウェル非組織培養プレートまたはＴ１７５ｃｍ２フラスコを被覆し、密封して４℃で一晩インキュベートした。翌日、休止ＰＢＭＣを収穫し、計数し、洗浄して、１×１０６／ｍｌの濃度に再懸濁した。抗体溶液を吸引してウェルを完全培地で洗浄し、各ウエルへの２×１０６個の細胞の添加がそれに続いた。活性化は、３７℃で所定の時間間隔で実行した。
【０１５４】
形質導入
活性化Ｔ細胞を収穫し、洗浄し、計数した。前臨床レンティウイルス上清（所定のＭＯＩに基づいて計算された）、硫酸プロタミン（１０μｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍＬ）を含有する形質導入混合物。各形質導入のために、活性化された細胞を分離し、４００×ｇで５分間遠心分離した。各細胞ペレットを形質導入混合物（２×１０６個の細胞あたり１ｍｌ）に再懸濁し、適切な大きさのＧ−Ｒｅｘフラスコ内に播種した。３７℃および５％ＣＯ２で２４時間培養した後、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充した培地を用いて、各Ｇ−Ｒｅｘフラスコ内の培養容積を所定の通りに半量または全容量にした。細胞数および生存率を工程の１０日目まで定期的にモニターした。多量体ＭＨＣ−ペプチド複合体（デキストラマーまたは四量体）を使用して、ＦＡＣＳによる遺伝子組換えＴＣＲの表面発現をモニターした。
【０１５５】
フローサイトメトリー
簡潔に述べると、１．０×１０６個の形質導入細胞を作業指示書に従って染色した。四量体染色に、Ｔ細胞表面マーカーに対する抗体での染色が続いた。サンプルは、補償ビーズ由来の自動補償マトリックスを用いて取得した。
【０１５６】
結果
Ｔ細胞を活性化するために抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を被覆するための２４ウェルプレートの代案として、非組織培養処理Ｔ１７５ｃｍ２フラスコを評価するために、抗体濃度を小規模と同一に維持して、被覆容積、細胞密度、および播種容積などのその他のパラメータをフラスコ内のより大きな面積のために最適化した。
【０１５７】
プレート結合（ＰＢ）およびフラスコ結合（ＦＢ）活性化ＰＢＭＣにおける活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９およびＬＤＬ−Ｒの生存率および発現を比較するために、ＦＢまたはＰＢ抗ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体を使用して、ＦＡＣＳ染色および取得を活性化１６〜２４時間後に実施した。非刺激ＰＢＭＣを陰性対照として使用した。
【０１５８】
図１５は、最適化された条件下で、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコ内で活性化されたＴ細胞（フラスコ結合、ＦＢ）が、プレート結合（ＰＢ）条件下で活性化されたＴ細胞と同等の活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９およびＬＤＬ−Ｒの発現レベルを示すことを示す。これらの結果は、ＦＢ抗体を使用したスケールアップ活性化が、ＦＢおよびＰＢ活性化Ｔ細胞から得られた同等の活性化レベルの観点から、実行可能であってもよいことを示唆する。
【０１５９】
活性化のためのＰＢ抗体またはＦＢ抗体を使用して、１０日目に収穫されたＴ細胞製品（ドナー６、ドナー７、およびドナー８から）における導入遺伝子発現および増殖を比較するために、ＴＡＡ特異的デキストレーマーまたは遺伝子組換えＴＣＲβ鎖特異的抗体を使用して、フローサイトメトリーによってＲ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲの表面発現を判定した。倍数増殖は、形質導入時（２日目）および収穫時（１０日目）に、Ｇ−Ｒｅｘプレートまたはフラスコに播種された生存可能細胞数に基づいて計算した。図１６Ａおよび１６Ｂは、それぞれ、ＦＢおよびＰＢ活性化Ｔ細胞における、同等のレベルの形質導入および倍数増殖を示す。これらの結果は、ＦＢおよびＰＢ活性化Ｔ細胞から得られた形質導入および増殖のレベルが同等であるという観点から、ＦＢ抗体を使用したスケールアップ形質導入および増殖が実行可能であってもよいことを示唆する。
【０１６０】
成功裏の活性化のスケールアップのさらなる妥当性検証のために、ＦＢおよびＰＢ活性化法によって製造されたＴ細胞製品の機能性を比較した。活性化のためのＰＢ抗体またはＦＢ抗体を使用して製造されたＬＶ−Ｒ７３形質導入Ｔ細胞製品による抗原特異的ＩＦＮ−γの誘導を評価するために、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、腫瘍細胞株（Ｔａｒｇｅｔ＋ｖｅ、Ｔａｒｇｅｔ−ｖｅ）と共培養したＴ細胞の上清中に放出されたＩＦＮ−γを定量した。
【０１６１】
図１７は、各ドナー６、ドナー７、およびドナー８において、ＴＡＡを発現する腫瘍細胞に応答して、ＦＢ活性化ＬＶ−Ｒ７３形質導入Ｔ細胞が、ＰＢ活性化形質導入Ｔ細胞と同等のレベルの抗原特異的ＩＦＮ−γを分泌したことを示す。これらの結果は、ＦＢ抗体を使用したＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞のスケールアップが、ＦＢおよびＰＢ活性化Ｔ細胞から得られたＩＦＮ−γ分泌のレベルが同等であるという観点から実行可能であってもよいことを示唆する。
【０１６２】
残りの工程のスケールアップのために、２．５×１０８〜４．０×１０８個の活性化Ｔ細胞を形質導入して、Ｇ−Ｒｅｘ１００フラスコの表面積１ｃｍ２当たり０．５×１０６の最適播種密度で播種した。複数のＧ−Ｒｅｘ１００フラスコを使用して、最適密度で形質導入細胞を播種した。細胞に栄養供給する条件および細胞を分割する条件などの追加的なパラメータもまた最適化し、最大増殖を達成した。最終製造工程は、２回のフルスケール工程開発（ＰＤ）実行において試験した。最終工程を使用して製造された全ての製品は、％デキストラマーおよび組み込みコピー数のリリース基準に合格した。これらの製造実行で製造された細胞数は、全てのコホートレベルで臨床用量を満たした。ＰＤスケールアップ実行の結果は、以下の表１に要約される。
【０１６３】
【表１】
2021512621.tif 000007
【０１６４】
上記の工程を用いたＧＭＰ製造は、少数のドナーについて２００億個を超える細胞をもたらした。
【０１６５】
フラスコ結合対バッグ結合
フラスコ結合法によって活性化されたＴ細胞と、バッグ結合法（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆されたＳａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ  ＶｕｅＬｉｆｅ  ＡＣＡＣバッグ）によって活性化Ｔされた細胞との活性化レベル（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、形質導入可能性（デキストラマー染色、ＦＡＣＳ）、および増殖（細胞数）についての比較
【０１６６】
抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆されたバッグを使用したＴ細胞と、プレートを使用したＴ細胞との活性化を比較するために、図１８は、Ｔ細胞の活性化に対する抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆されたバッグおよびプレートの影響を試験するために使用した実験デザインを示す。簡潔に述べると、０日目に、ＰＢＭＣを解凍し一晩（２４時間）休止させた。１日目に、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆された、例えばＴ１７５ｃｍ２フラスコなどのフラスコ上、または例えば、Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ  ＶｕｅＬｉｆｅ  ＡＣバッグなどのバッグ上に、休止ＰＢＭＣを播種することによって１６〜２０時間にわたり活性化した。２日目に、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびｈＬＤＬ−Ｒ発現について、活性化Ｔ細胞を分析し、例えば、１ｘＥｎｇ  ＬＶ−Ｒ７３などのＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターで形質導入した。６／７日目および１０日目に、細胞数、生存率、デキストラーマー（Ｄｅｘ）を用いた蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの分析を実施した。
【０１６７】
図１９は、最適化された条件下で、１μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌの濃度で抗体と結合したバッグ内で活性化Ｔ細胞（ドナー１６およびドナー１４から）が、フラスコ結合（Ｔ１７５ｃｍ２フラスコ、「標準」と標識される）条件下で活性化されたものと同等の活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９およびｈＬＤＬ−Ｒ発現を提示することを示す。これらの結果は、バッグ結合（Ｂａｇ）抗体を使用したスケールアップ活性化が、バッグ結合（Ｂａｇ）およびフラスコ結合（ＦＢ）活性化Ｔ細胞から得られた同等の活性化レベルの観点から、実行可能であってもよいことを示唆する。
【０１６８】
図２０および２１は、増殖の６日目および１０日目に、それぞれ、１μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌの濃度で抗体と結合したバッグ中で活性化Ｔ細胞（ドナー１６およびドナー１４から）が、ＦＢ条件下で活性化Ｔされた細胞と同等のＴ細胞数、すなわち、細胞増殖を提示することを示す。これらの結果は、バッグ結合抗体を使用したスケールアップ増殖が、バッグ結合およびフラスコ結合活性化Ｔ細胞から得られた同等の増殖レベルの観点から、実行可能であってもよいことを示唆する。
【０１６９】
実施例４
Ｔ細胞製造工程における短い休止と一晩休止の比較
図２２は、本開示の一実施様態に従った、約４時間の一定期間のＰＢＭＣの休止によるＴ細胞製造工程２２０を示す。例えば、Ｔ細胞製造工程２２０は、その中で無菌性が試験されてもよい、白血球アフェレーシス（２２１）からのＰＢＭＣの単離および凍結保存；解凍、休止（例えば、約４時間）、およびＴ細胞活性化（２２２）；ウイルスベクターによる形質導入（２２３）；サイトカインによる増殖（２２４）；その中で細胞数および免疫表現型決定フェノタイピンが試験されてもよい、細胞の分割／栄養供給（２２５）；その中で細胞数およびマイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）が試験されてもよい、製剤細胞の収穫および凍結保存（２２６）、およびその中で生存率、無菌性、内毒素、免疫表現型決定、組み込まれたベクターのコピー数、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−ｇ）が試験されてもよい、凍結保存後のリリース（２２７）を含んでもよい
【０１７０】
表２は、本開示の一実施形態に従ったＩＬ−７の存在下で、例えば、約４〜約６時間の短時間にわたり、ＰＢＭＣを休止させることにより、Ｔ細胞製造工程２２０の３つの異なる定性実行によって製造されたＴ細胞の特性を示す。
【０１７１】
【表２】
2021512621.tif 000008
【０１７２】
図２３Ａおよび表２は、ＰＢＭＣを一晩休止させることによって製造されたＴ細胞（ｎ＝７）の平均倍数増が、約７８．７倍であることを示す。
【０１７３】
形質導入ＴＣＲが増殖Ｔ細胞の細胞表面上で発現しているかどうかを判定するために、形質導入ＴＣＲに特異的に結合するペプチド／ＭＨＣ複合体負荷デキストラーマーを用いて増殖Ｔ細胞を染色し、形質導入されたＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を識別する、フローサイトメトリーがそれに続いた。図２３Ｂおよび表２は、短い休止によって製造された平均％Ｄｅｘ＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｎ＝７）が約５３．４％であることを示し、形質導入ＴＣＲが増殖Ｔ細胞の細胞表面上で発現されたことが示唆される。
【０１７４】
形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞にどのようなＴ細胞表現型が存在するかを判定するために、細胞を様々な免疫細胞表面マーカーで染色し、例えば、Ｔｎ／ｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｆｆなどのＴ細胞表現型を同定するフローサイトメトリーがそれに続いた。中でも、Ｔｎ／ｓｃｍは、リンパ系ホーミング特性、増殖可能性、自己再生、および多能性を有してもよいことから、Ｔｎ／ｓｃｍは、その他のものよりも免疫療法のためにより望ましくあってもよい。図２３Ｃは、増殖Ｔ細胞の平均約５０％が、Ｔｎ／ｓｃｍ表現型を示す形質導入ＴＣＲ（ｎ＝４）を発現することを示す。
【０１７５】
形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞の細胞傷害活性を判定するために、標的ペプチド／ＭＨＣ複合体を特異的に認識する形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞と共に、異なる濃度の標的ペプチドを用いてパルス処理した腫瘍細胞をインキュベートし、腫瘍細胞増殖の測定がそれに続いた。図２３Ｄは、形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞が、ペプチド濃度依存様式で腫瘍細胞増殖を阻害することを示す。
【０１７６】
形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞の細胞傷害活性は、例えば、ドナー７、１３、１７、１８、および２１などの異なる健常ドナーから得られたＢＭＣ（図２３Ｅ）と、例えば、患者３１２、３１９、３５１、４７２、および９５６などの異なる患者から得られたＢＭＣ（図２３Ｆ）との間で同等に現れた。
【０１７７】
形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞の細胞傷害可能性を判定するために、標的ペプチド／ＭＨＣ複合体を特異的に認識する形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞（２２０−Ｔ）と共に、標的ペプチドを発現する腫瘍細胞をインキュベートし、腫瘍細胞の増殖倍数の測定がそれに続いた。図２３Ｇおよび図２３Ｈは、標的特異的ＴＣＲを欠く非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）と比較した、１０：１および３：１のエフェクター対腫瘍細胞比での、形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞（エフェクター）（２２０−Ｔ）とのインキュベーションによる、腫瘍増殖の退縮または抑制の増加を示す。
【０１７８】
図２４は、ＰＢＭＣを一晩（約１６時間）休止させることよる、Ｔ細胞製造工程２４０を示す。例えば、Ｔ細胞製造工程２４０は、ＰＢＭＣを新鮮なまま使用するか、または使用可能になるまで冷凍保存してもよく、またはＴ細胞製造のための出発原料として使用してもよく、リンパ球集団（例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、またはその双方）の選択もまた可能であってもよい、ＰＢＭＣの単離（２４１）；アポトーシス細胞を死滅させＴ細胞機能性を復元してもよい（新鮮な材料を使用する場合、このステップは必要でないこともある）、リンパ球の解凍および例えば、約１６時間などの一晩の休止（２４２）；抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（可溶性のまたは例えば、磁性または生分解性ビーズ表面に結合した）を使用してもよい、リンパ球（２４３）の活性化；ＣＡＲまたはＴＣＲをコード化するレンチウイルスまたはレトロウイルスコンストラクトを使用してもよく、または非ウイルス法を使用してもよい、ＣＡＲまたはＴＣＲによる形質導入（２４４）；サイトカイン、血清（ＡＢＳまたはＦＢＳ）、および／または凍結保存培地の存在下で実行してもよい、リンパ球の増殖、収穫、および凍結保存（２４５）を含んでもよい。
【０１７９】
表３は、ＰＢＭＣを例えば、約１６時間など一晩休止させることによって、Ｔ細胞製造工程（２４０）の３つの異なる定性実行によって製造されたＴ細胞の特性を示す。
【０１８０】
【表３】
2021512621.tif 000009
【０１８１】
例えば約４時間などの短い休止を用いたＴ細胞の製造工程とは対照的に、約１６時間の休止を用いて製造されたＴ細胞は、Ｔ細胞のより少ない倍数増殖をもたらした。図２５Ａおよび表３は、約４時間の短い休止を用いた約７８．７倍（表２）と比較して、約１６時間のＰＢＭＣの休止を用いて製造されたＴ細胞（ｎ＝７）の平均倍数増殖が約４５倍であることを示す。ＴＴおよびＰＱは、それぞれ、技術移転および工程検証実行を意味する。
【０１８２】
一晩の休止（約１６時間）は、約４時間の休止よりも、形質導入ＴＣＲを発現するより少ない増殖Ｔ細胞をもたらした。図２５Ｂおよび表３は、約４時間の休止を用いた約５３．４％（表２）と比較して、ＰＢＭＣを約１６時間にわたり一晩休止させることによって製造された平均％Ｄｅｘ＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｎ＝７）が約５１．９％であることを示す。
【０１８３】
約１６時間にわたる一晩の休止は、約４時間の休止よりも、Ｔｎ／ｓｃｍ表現型を有する形質導入ＴＣＲを発現するより少ない増殖Ｔ細胞をもたらした。図２５Ｃは、平均約４０％の増殖Ｔ細胞（ｎ＝５）が、約４時間の休止を用いた約５０％（図２３Ｃ）と比較して、Ｔｎ／ｓｃｍ表現型を有することを示す。
【０１８４】
図２５Ｄは、１０：１、３：１、および１：１のエフェクター対腫瘍細胞比での、形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞（エフェクター）と腫瘍細胞とのインキュベーションが、例えば、形質導入ＴＣＲを発現しない（標的−ｖｅ）、またはエフェクターを発現しない、増殖Ｔ細胞と共にインキュベートされた腫瘍細胞などの陰性対照よりも、腫瘍細胞の増殖を有意により多く阻害することを示す。さらに、形質導入ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞の細胞傷害活性は、健常ドナー（ｎ＝５）から得られたＰＢＭＣ（図２５Ｅ）と、がん患者（ｎ＝７）から得られたＰＢＭＣ（図２５Ｆ）との間で同等に現れる。
【０１８５】
表４は、本開示の一実施形態に従って約４時間の短い休止（工程２２０）で製造されたＴ細胞、および約１６時間の一晩の休止（工程２４０）を用いて製造されたＴ細胞の特性を要約する。
【０１８６】
【表４】
2021512621.tif 000010
【０１８７】
表４は、短い休止２２０（約４〜６時間）を用いた工程が、もう１日を増殖に追加してもよいことを示し、例えば、工程２４０の８日目は工程２２０の９日目であり、したがってより多くの細胞がもたらされる。
【０１８８】
実施例５
閉鎖系におけるＴ細胞製造
上述したように、工程２２０および２４０は、Ｇ−Ｒｅｘ（商標）などの開放系で実行してもよい。しかし、例えば、Ｔ細胞などの造血性細胞の開放系における生体外操作は、感染性因子による汚染の危険を導入することもあり、生着の可能性および造血適性を低下させることもある。臨床細胞製品の製造では、培養工程全体を通じた無菌性の保証のために、閉鎖細胞培養システムが好ましくあってもよい。
【０１８９】
図２６は、開放系および閉鎖系における生体外操作プロトコルを示す。閉鎖系は、外部処理リスクおよび汚染を軽減し得るだけでなく、製品の堅牢性および品質を促進して製品の安全性を高め得て、ひいては下流処理、最終製品の分析および試験などの課題を低減させ得る。開放系では、例えば、１リットルなどの比較的小容積中で、例えば、≦１×１０９個などの比較的少数の細胞を培養してもよい一方で、閉鎖系では、例えば、５リットル（例えば、ＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクターバッグおよびＧ−Ｒｅｘ（商標）フラスコ）〜５０リットル（例えば、静的バッグ）などの比較的大容積中で、例えば、約１×１０９〜約２×１０１１個などの比較的多数の細胞を培養してもよい。これらの閉鎖系細胞培養技術は、細胞製造の調節された、より迅速な、費用効果の高い経路として、高品質の個別化された細胞療法を提供してもよい。
【０１９０】
本開示のＴ細胞製造工程は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、単独またはＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および単独またはＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＧ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）などの市販のシステムをはじめとする任意の細胞培養閉鎖系で実行してもよい。Ｇ−Ｒｅｘ（商標）閉鎖系は増殖容器であり、ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）は濃縮および収穫用ポンプである。
【０１９１】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳＰｒｏｄｉｇｙ（商標）とＴＣＴ工程ソフトウエアおよびＴＳ５２０管材料セットは、細胞の濃縮、形質導入、洗浄、および増殖のための閉鎖系処理を可能にしてもよい。例えば、ＭＡＣＳ−ＣＤ４およびＣＤ８−マイクロビーズを濃縮のために使用してもよく、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８試薬などのＴｒａｎｓＡＣＴビーズを活性化のために使用してもよく、組換えＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターを形質導入のために使用してもよく、ＴｅｘＭＡＣＳ培地−３％−ＨＳ−ＩＬ２を培養のために使用してもよく、リン酸緩衝生理食塩水／エチレンジアミン四酢酸緩衝液を洗浄のために使用してもよい。このシステムは、約４〜５×１０９個の細胞をもたらしてもよく、チャンバーの最大充填量約３００ｍＬでの製造のための自動化されたプロトコルを含み、１０日〜１４日間かけて選択と活性化（ＴｒａｎｓＡＣＴビーズ）、導入、増殖を実施する。
【０１９２】
ＷＡＶＥ（Ｘｕｒｉ（商標））バイオリアクター（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
ＷＡＶＥ（Ｘｕｒｉ（商標））バイオリアクターは、灌流ありおよび／またはなしで、例えば、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇｓなどの培養バッグ内でＴ細胞を培養できるようにする。栄養供給のための中型バッグは、５リットルのＨｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｔａｉｎｅｒであってもよい。老廃物バッグは、Ｍｂａｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入された）であってもよい。このシステムは、約１５〜３０×１０９個の細胞をもたらし、培養制御とモニタリングを可能にするｕｎｉｃｏｒｎソフトウエアを使用して、約０．３リットル〜約２５リットルを保持するロッキングトレーを含み、ガス交換を媒介して新鮮な培地およびサイトカインを細胞培養に導入しながら、灌流機能を果たして培養容積を維持してもよい。
【０１９３】
ＷＡＶＥ（Ｘｕｒｉ（商標））バイオリアクターは、増殖のためのＸｕｒｉバッグ、解凍および休止のためのＳａｉｎｔ  Ｇｏｂａｉｎ‘ｓ  ＶｕｅＬｉｆｅバッグ、および活性化のためのＶｕｅＬｉｆｅを含んでもよい。ＷＡＶＥ（Ｘｕｒｉ（商標））バイオリアクターは、培養洗浄および減容化ステップのために、例えば、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システム（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのその他の技術と組み合わせて使用してもよい。滅菌ウェルダー（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ（商標））は、溶液移送用の滅菌バッグの接続、および管材料を封着するためのヒートシーラーに使用してもよい。
【０１９４】
Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムは、シリンジチャンバーの回転による分離（遠心分離）と、シリンジピストンの転置による成分移送との双方を提供する、分離チャンバーに依存する。光学的センサーは、分離された成分の吸光度を測定し、正しい排出容器内への各成分の流れ方向を管理し、例えば、血漿、バフィーコート、および赤血球が、このようにして血液サンプルから分離され採取されてもよい。
【０１９５】
図２７は、０日目に、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムによって単離された冷凍ＰＢＭＣを解凍、洗浄し、例えば、一晩（Ｏ／Ｎ）休止させてもよく、例えば、ＶｕｅＬｉｆｅ  ＡＣ細胞バッグなどの培養バッグを抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆してもよく；１日目に、休止ＰＢＭＣを活性化のために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆された培養バッグに移してもよく；２日目に、細胞を洗浄してもよく、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムによって、例えば、ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターによる形質導入などのウイルス形質導入に適した適切な容積まで、培地を減少させてもよいことを示す。細胞増殖は、ガス交換を媒介して新鮮な培地およびサイトカインを細胞培養に導入しながら、培養容積を維持する灌流機能を備えたロッキングトレイ上のＸｕｒｉ（商標）培養バッグ内で実施し得る。増殖した形質導入Ｔ細胞は、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムを使用して収穫し洗浄してもよい。
【０１９６】
Ｇ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）
Ｇ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系は、細胞増殖のためのガス交換容器（Ｇ−Ｒｅｘ−ＣＳ）および自動ポンプ（ＧａｔｈｅＲｅｘ）を含んでなり、操作者が、汚染の危険なしに培養物中の過剰な培地を排出し、細胞を採取できるようにしてもよい。収穫は、細胞の濃縮および細胞の収穫の２段階に分割されてもよい。細胞濃縮工程では、ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系は、例えば、フラスコなどのＧ−Ｒｅｘ（商標）装置を滅菌空気で加圧する空気ポンプを介して動作してもよく、細胞の上にある培地の９０％を培地採取バッグに移せるようにする。この工程がひとたび完了すると、第１の光学的検出器が培地採取ライン内の空気の存在を感知し、ポンプを自動的に停止させる。収穫工程を開始する前に、操作者は、Ｇ−Ｒｅｘ（商標）装置を手動で旋回させて、細胞をガス透過性膜から剥がすことによって、培地の残差の１０％を使用して細胞を再懸濁してもよい。次に、空気ポンプを再起動し、再懸濁した細胞を細胞回収バッグに引き込む。この段階は、第２の光学的検出器が細胞採取ライン内の空気をひとたび検出すると、自動的に終了してもよい。このシステムは、約１５〜２０×１０９個の細胞をもたらし、容器当たり５リットルが保持されてもよい。
【０１９７】
Ｇ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系は、容器内での伝形質導入および増殖と、ポンプによる収穫とをサポートしてもよい。解凍、休止、および活性化ステップは、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグ内で実行してもよい。ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系は、培養洗浄および減容化ステップのための例えば、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムなどのその他の技術と組み合わせて使用してもよい｛。｝滅菌ウェルダー（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ（商標））は、溶液移送用の滅菌バッグの接続、および管材料を封着するためのヒートシーラーに使用してもよい。
【０１９８】
図２８は、０日目に、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムによって単離された冷凍ＰＢＭＣを解凍、洗浄し、例えば、一晩（Ｏ／Ｎ）休止させてもよく；１日目に、培養バッグを抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆してもよく、休止ＰＢＭＣを活性化のために、被覆された培養バッグに移してもよく；２日目に、細胞を洗浄してもよく、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムによって、例えば、ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターによる形質導入などのウイルス形質導入に適した適切な容積まで、培地を減少させてもよいことを示す。細胞増殖および栄養供給は、Ｇ−Ｒｅｘ（商標）閉鎖系装置内で実施してもよい。増殖した形質導入Ｔ細胞は、次に、ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）ポンプを使用して収穫し、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムを使用して洗浄してもよい。
【０１９９】
表５は、例えば、表４、すなわち、工程２２０および２４０に示されるようなＧ−Ｒｅｘ（商標）などの開放系によって得られたＴ細胞と、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）；ＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター；およびＢｉｏＳａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＧ−Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系などの閉鎖系によって得られたＴ細胞との比較を示す。
【０２００】
【表５】
2021512621.tif 000011
【０２０１】
これらの結果は、本開示のＴ細胞製造工程が閉鎖系で容易に実施され得て、外的処理リスクおよび汚染を軽減し、製品の堅牢性および品質を促進して製品の安全性を高め、ひいては、下流処理、最終製品の分析および試験などの課題を低減させながら、開放系で製造されたものと同等の特性を備えたＴ細胞を製造することを示す。
【０２０２】
閉鎖系で製造された操作Ｔ細胞の機能特性と、開放系で製造されたものとをさらに比較するために、本開示の工程に従って、ドナー１７から得られたＰＢＭＣを処理し、増殖した形質導入Ｔ細胞を製造した。次に、ＴＣＲ特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体（標的）の存在下または非存在下でのＩＦＮ−γ放出について、ＴＣＲを発現する増殖した形質導入Ｔ細胞を測定した。
【０２０３】
図２９は、実行＃１および実行＃２の２回の実行によって測定された閉鎖系で製造された操作Ｔ細胞が、例えば、工程２２０などの開放系で製造されたものよりも、有意により多くのＩＦＮ−γを標的の存在下で放出したことを示す。これらの結果は、閉鎖系で製造された操作Ｔ細胞が、開放系で製造されたものよりも、より高い細胞傷害活性を提示してもよいことを示唆する。
【０２０４】
実施例６
約５〜６日間でのＴＣＲ操作Ｔ細胞のＧＭＰ製造
自己操作Ｔ細胞アプローチを用いた養子細胞療法は、安全で効果的な標的およびそれらの同族ＴＣＲのトランスレーショナル開発を利用する。これらのＴＣＲは、固形腫瘍の免疫療法のために、患者自身の（自己由来）Ｔ細胞に遺伝子操作で組み込まれる。
【０２０５】
図３０は、それぞれそれ自身のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性腫瘍標的化抗原に対する遺伝子組換えＴＣＲを発現する、３つのＴ細胞製品（Ｔ細胞製品＃１、Ｔ細胞製品＃２、およびＴ細胞製品＃３）の製造概要を示す。Ｔ細胞製品＃１およびＴ細胞製品＃２は、治験薬主導の第１相臨床試験のために、開放系を使用して、凍結ＰＢＭＣを解凍し、解凍ＰＢＭＣを休止させ、休止ＰＢＭＣを活性化し（ステップ２）、活性化Ｔ細胞を形質導入し（ステップ３）、「製剤細胞を収穫および凍結保存する」（ステップ６）まで、それぞれ、約８〜１１日間、および約７〜１０日間で製造した。
【０２０６】
Ｔ細胞製品＃３は、増殖期を約５〜８日（Ｔ細胞製品＃１および＃２）から約３〜４日まで短縮することによって製造してもよい。さらに、Ｔ細胞製品＃３は、０日目に、新鮮なＰＢＭＣを活性化することによって製造してもよく、すなわち、ＰＢＭＣは凍結保存されておらず解凍されてもいない。これは、凍結保存ＰＢＭＣを０日目に解凍し、次に解凍ＰＢＭＣを１日目に活性化することによってＴ細胞製品＃１を製造する場合、および凍結保存ＰＢＭＣを解凍し、解凍ＰＢＭＣを０日目に活性化することによってＴ細胞製品＃２を製造する場合とは、対照的である。
【０２０７】
開放系の使用によって製造されたＴ細胞製品＃１および＃２とは対照的に、Ｔ細胞製品＃３は、完全閉鎖系の使用によって製造されてもよく、または例えば、Ｔ細胞活性化から形質導入のための減容化に至るおよび／または収穫から洗浄、濃度、および凍結保存に至るいくつかのステップが開放系の使用によって実施されてもよい、半閉鎖系の使用によって製造されてもよい。
【０２０８】
図３１は、白血球アフェレーシス採取から輸液可能なＴＣＲ  Ｔ細胞製品＃１までのターンアラウンド時間が、例えば、サンプル採取から収穫まで約１４日間、および品質管理（ＱＣ）から製品リリースまで約１６日など、約３０日間であってもよく、ＴＣＲ  Ｔ細胞製品＃２の製造のターンアラウンド時間が、例えば、サンプル採取から収穫まで約１０日間、およびＱＣから製品リリースまで約１６日間など、約２６日間であってもよいことを示す。
【０２０９】
しかし、迅速なターンアラウンドに対する必要性がある。図３０に示すように、Ｔ細胞製品＃３は、半閉鎖系を使用して、「任意の解凍、休止、および活性化」（ステップ２）から「製剤細胞の収穫および凍結保存」（ステップ６）に至る、例えば、５〜６日間のより短い製造工程を使用して製造した。図３１は、ＴＣＲ  Ｔ細胞製品＃３が、例えば、サンプル採取から収穫まで約７日間、およびＱＣから製品リリースまで約１６日間など、製造に約２３日間を要してもよいことを示す。商業的な製造では、例えば、Ｔ細胞製品＃１、Ｔ細胞製品＃２、およびＴ細胞製品＃３などのＴＣＲ  Ｔ細胞製品は、例えば、サンプル採取から収穫まで約６日間、およびＱＣから製品リリースまで約７日間など、製造に約１３日間を要してもよい。
【０２１０】
図３２は、凍結保存ＰＢＭＣを解凍して取得されておらず、したがってＰＢＭＣの凍結、解凍、および／または休止に起因する細胞損失が最小化されており、製造工程開始時における細胞数が最大化されている、新鮮なＰＢＭＣを使用したＴ細胞製造工程３２０を示す。例えば、Ｔ細胞製造工程３２０は、０日目における、新鮮なＰＢＭＣ（３２１）の単離、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で被覆されたＳａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ  ＶｕｅＬｉｆｅＡＣバッグなどのバッグ内における、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（可溶性のまたは例えば、磁性または生分解性ビーズ表面に結合する）を使用した新鮮なリンパ球（３２２）の活性化；１日目における、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲをコード化するレンチウイルスまたはレトロウイルスコンストラクト、または例えば、リポソームなどの非ウイルス法を使用した、ＣＡＲまたはＴＣＲ（３２３）による形質導入；および２日目におけるリンパ球の増殖、５／６日目における収穫、およびサイトカイン、血清（ＡＢＳまたはＦＢＳ）、および／または凍結保存培地の存在下での凍結保存（３２４）を含んでもよい。
【０２１１】
より短い増殖時間による製品プロファイルの改善
Ｔ細胞免疫の品質、有効性、寿命、および位置は、ナイーブＴ細胞（Ｔｎ）が、防御免疫において特定の役割を有する表現型的に異なるサブセットに多様化することに起因してもよい。これらとしては、記憶幹（Ｔｓｃｍ）、中央記憶（Ｔｃｍ）、エフェクター記憶（Ｔｅｍ）、および高度分化型エフェクター（Ｔｅｆｆ）Ｔ細胞が挙げられる。抗原特異的Ｔｎは、自己再生する長寿命ＴｓｃｍおよびＴｃｍを生じ、より短命のＴｅｍおよびＴｅｆｆ細胞の増殖する集団を提供する。したがって、遺伝子修飾のために低分化型Ｔｎ、ＴｓｃｍまたはＴｃｍサブセットを選択することで、より高い治療有効性を有する細胞を提供してもよい。
【０２１２】
製造の異なる時点で収穫したＴ細胞製品の分化状態を評価するために、製造４日目（３日間の増殖）、７日目（６日間の増殖）および１０日目（９日間の増殖）に、３人のドナー（ドナー１、ドナー２、およびドナー３）から得られたＣＤ８＋Ｔ細胞を収穫し、Ｔ細胞記憶表現型決定分析がそれに続いた。
【０２１３】
図３３は、例えば、Ｔｎ／ｓｃｍ−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋およびＴｃｍ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋などの低分化型表現型を示すＣＤ８＋Ｔ細胞の量が、増殖時間依存様式で、すなわち、４日間＞７日間＞１０日間で減少することを示す。逆に、例えば、Ｔｅｍ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−およびＴｅｆｆ−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−などの高分化型表現型を示すＣＤ８＋Ｔ細胞の量は、増殖時間依存様式で、すなわち、４日＜７日＜１０日で増加し、４日目の増殖細胞の低分化型表現型が、７日目および１０日目の増殖細胞のそれよりも多いことが示唆される。これらの結果は、Ｔ細胞の増殖が短いほど、Ｔ細胞が低分化型記憶表現型をより多く提示し、したがってより高い治療有効性を有することを示唆する。
【０２１４】
ＣＤ２７およびＣＤ２８の共刺激は、一次ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の間に必要であってもよい。この共刺激は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に、増殖および生存のシグナルを提供してもよい。製造の異なる時点で収穫したＴ細胞製品のＣＤ２７およびＣＤ２８共刺激可能性を評価するために、製造の４日目、７日目、および１０日目に、３人のドナー（ドナー１、ドナー２、およびドナー３）から得られたＣＤ８＋Ｔ細胞を収穫し、ＣＤ２７およびＣＤ２８発現分析がそれに続いた。
【０２１５】
図３４は、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋共刺激表現型を示すＣＤ８＋Ｔ細胞の量が、時間依存様式で、すなわち、４日＞７日＞１０日で減少することを示し、４日目の増殖細胞のＣＤ２７およびＣＤ２８共刺激が、７日目および１０日目の増殖細胞のそれよりも優れていることが示唆される。これらの結果は、一般に、Ｔ細胞の増殖が短いほど、Ｔ細胞がＣＤ２７およびＣＤ２８の双方をより多く発現することを示唆する。
【０２１６】
製造の異なる時点で収穫したＴ細胞製品の複製可能性を評価するために、製造の４日目、７日目、および１０日目にＴ細胞を収穫し、サイトカイン感受性アッセイにおいて、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２などの関連するサイトカインに応答した増殖をモニターした。
【０２１７】
図３５は、約２１日間にわたり、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２によって誘導されたＴ細胞の増殖が、増殖時間依存様式で、すなわち、４日＞７日＞１０日で減少することを示し、４日目の増殖細胞の複製可能性が、７日目および１０日目の増殖細胞のそれよりも優れていることが示唆される。これらの結果は、Ｔ細胞の増殖が短いほど、Ｔ細胞が増殖のためのサイトカインにより強く応答することを示唆する。
【０２１８】
製造の異なる時点で収穫したＴ細胞製品の抗腫瘍活性を評価するために、製造の５日目、７日目、および９日目に、４人のドナー（ドナー１、ドナー２、ドナー３、およびドナー４）から得られたＴ細胞製品を収穫し、標的陽性細胞株への曝露に応答したインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）放出アッセイがそれに続いた。
【０２１９】
図３６は、ＩＦＮ−γ分泌が、増殖時間依存様式で、すなわち、５日＞７日＞９日で減少することを示し、一般に、５日目の増殖細胞の抗腫瘍活性が、７日目および９日目の増殖細胞のそれよりも優れていることが示唆される。これらの結果は、一般に、Ｔ細胞の増殖が短いほど、Ｔ細胞がＩＦＮ−γをより多く分泌する｛ｓｅｃｒｅｔ／ｓｅｃｒｅｔの誤記｝ことを示唆する。
【０２２０】
製造の異なる時点で収穫したＴ細胞製品細胞傷害活性をさらに評価するために、同族ペプチドの濃度を減少させてパルス処理したＴ２細胞に対するＩＦＮ−γ応答に基づく、ＥＣ５０を判定した。
【０２２１】
図３７は、ＥＣ５０が増殖時間依存様式で、すなわち、５日＞７日＞９日で増加することを示し、５日目の増殖細胞のペプチド特異的な細胞傷害活性が、７日目および９日目の増殖細胞のそれよりも優れていることが示唆される。
【０２２２】
Ｔ細胞製品＃３ＧＭＰ製造
最終Ｔ細胞製品＃３工程を用いて製造された製品の特性決定
図３８は、増殖測定基準を示す。２回の技術移転（ＴＴ）製造実行および２回の工程検証（ＰＱ）製造実行（ｎ＝４）において、例えば、約６日間の短い増殖後に、平均で１．３×１０１０個の細胞を＞９０％の生存率で収穫した。
【０２２３】
図３９は、ＴＣＲ特異的ＨＬＡ−デキストラマーを使用したフローサイトメトリーによって検出された、Ｔ細胞製品＃３  ＴＣＲの表面発現を示す。代表的なＦＡＣＳプロットおよび統合データ（平均±ＳＤ）が、健常ドナーからの白血球アフェレーシス産物を使用して実施された技術移転（ＴＴ）および工程検証（ＰＱ）製造実行（ｎ＝４）から示される。
【０２２４】
図４０は、最終Ｔ細胞製品＃３のＴ細胞記憶表現型を示し、技術移転（ＴＴ１、ＴＴ２）および工程検証（ＰＱ１、ＰＱ２）の製造実行によって製造されたＴ細胞は、製造に使用されたＰＢＭＣ中のＴ細胞集団の高度に可変性の記憶表現型を表すドナー（ｎ＝４）において、低分化型表現型を保持している（それぞれ、Ｔｎ／ｓｃｍ−１７．９％、１９．２％、１１．２％、３５．０％Ｔｃｍ−２３．４％、１５．７％、０．９％、２．４％Ｔｅｍ−３４．８％、２７．０％、２５．９％、４３％Ｔｅｆｆ−２３．８％、３８．２％、６２．０％、１６．１％）。
【０２２５】
図４１は、標的陽性（ＬＶＲ１１ＫＥＡ）および陰性（ＮＴ）細胞株への曝露に応答したＩＦＮ−γ放出を示す。技術移転（ＴＴ）および工程検証（ＰＱ）製造実行によって製造されたＴ細胞は、標的陽性細胞に対して、例えば、ＩＦＮ−γ放出などの特異的細胞傷害活性を示す。陰性対照細胞に対しては、ＩＦＮ−γ放出は検出されなかった。
【０２２６】
図４２は、同族ペプチドの濃度を減少させてパルス処理した標的細胞に対するＩＦＮ−γ応答に基づく、ＥＣ５０判定決定を示す。結果は、工程検証（ＰＱ１）製造実行によって製造されたＴ細胞が、アッセイ中の陽性対照によって生じた抗腫瘍活性（ＥＣ５０＝０．７０３７）と同等の抗腫瘍活性（ＥＣ５０＝０．３１４９）を提示することを示す。
【０２２７】
図４３は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）殺滅アッセイにおける、Ｔ細胞製品＃３の細胞傷害可能性を示す代表的な図である。データは、関連するペプチドの濃度を減少させてパルス処理した標的陰性細胞株との７２時間の共培養期間にわたる、Ｔ細胞製品＃３の存在下での倍の腫瘍増殖として提示される。結果は、工程検証（ＰＱ１）製造実行によって製造されたＴ細胞による、標的細胞のペプチド用量依存性殺滅を示す。
【０２２８】
まとめると、生体外での増殖および全体的な「ターンアラウンド時間」の短縮は、細胞製品の品質だけでなく、細胞性免疫療法の臨床適用性にも実質的な影響を有し得る。ＴＣＲ操作Ｔ細胞のＧＭＰ製造中の増殖期を短縮するための工程開発努力は、Ｔ細胞製品＃３のための５〜６日間の堅牢な半閉鎖Ｔ細胞製造工程の開発によって完了した。ＧＭＰ環境無菌室におけるＴ細胞製品＃３製造のための技術移転（ＴＴ）および工程検証（ＰＱ）実行は、短縮された増殖期を用いた製造工程の再現性および実現可能性を確認した。ＧＭＰ製造Ｔ細胞製品について、ＴＣＲ操作Ｔ細胞の放出試験、表現型試験、および機能性試験を全て確認した。
【０２２９】
実施例７
がん患者から生成されたＴ細胞製品の製造および機能性
上述したように、健常ドナーから生成されたＴ細胞製品＃３は、Ｔ細胞記憶表現型および細胞傷害可能性を示す。以下に示すように、がん患者から生成されたＴ細胞製品＃３は、健常ドナーから生成されたＴ細胞製品＃３と比較して、類似特性が観察された。
【０２３０】
【表６】
2021512621.tif 000012
【０２３１】
がん患者および健常ドナーから得られたＰＢＭＣを使用して、Ｔ細胞製品＃３を小規模で製造した。簡潔に述べると、０日目に、４人のがん患者および４人の健常ドナーの白血球アフェレーシス産物から単離された凍結保存ＰＢＭＣを解凍し、ＩＬ−７の存在下で約４〜６時間休止させ、ＮＴＣ２４ウェル内での活性化と、約１６〜２４時間のインキュベーションがそれに続いた。１日目に、５μｌ／１０６個の細胞で、例えば、Ｒ１１ＫＥＡ  ＴＣＲなどの組換えＴＣＲを発現するウイルスベクターで細胞を形質導入した。非形質導入（ＮＴ））細胞を対照として含めた。例えば、２．０×１０６個の細胞／ｍｌなど、少なくとも１．０×１０６個の細胞／ｍｌで、形質導入および非形質導入細胞を播種した。２日目に、形質転換細胞および非形質転換細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５を用いて、ＴｅｘＭＡＣＳ完全培地中で増殖させた。６日目、すなわち４日間の増殖後に、増殖細胞を収穫し、フローサイトメトリー分析および機能性アッセイがそれに続き、例えば、回収率、生存率、表現型、組み込まれたＤＮＡコピー数、および機能性を判定した。
【０２３２】
図４４は、解凍後、休止、および活性化後における、がん患者（Ｐｔ）および健常ドナー（ＨＤ）から得られたＴ細胞の同等の回収率を示す。
【０２３３】
図４５は、全ての細胞が形質導入されたＰＴ１およびＰＴ４を除く、各個人内の形質導入および非形質導入細胞における、６日目、すなわち４日間の増殖における、Ｔ細胞製品＃３の同等の総生存細胞および％生存率を示す。
【０２３４】
図４６は、全ての細胞が形質導入されたＰＴ１およびＰＴ４を除く、各個人内の形質導入および非形質導入細胞における、６日目、すなわち４日間の増殖における、Ｔ細胞製品＃３の同等の増殖倍数を示す。
【０２３５】
表現型分析
図４７は、がん患者（ＰＴ１〜ＰＴ４）および健常ドナー（Ｄ１〜Ｄ４）から得られたＰＢＭＣにおける、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞と比較した、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（矢印で示される）の優先的な増殖を示す。
【０２３６】
図４８は、患者（ＰＴ１〜ＰＴ４）および健常ドナー（Ｄ１〜Ｄ４）から得られたＴ細胞製品＃３および非導入細胞（ＮＴ）における、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の同等の全体平均を示す。
【０２３７】
図４９は、Ｔ細胞製品＃３のフローサイトメトリー分析の一例を示す。結果は、Ｔ細胞製品＃３の４３．８％がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を含有し、その中では、ペプチド／ＭＨＣデキストラマー（Ｄｅｘ）染色によって示されるように、細胞の６４．７％がＲ１１ＫＥＡ  ＴＣＲを発現し、細胞の３５．３％がＲ１１ＫＥＡ  ＴＣＲを発現しないことを示す。
【０２３８】
図５０は、がん患者（ＰＴ１〜ＰＴ４）および健常ドナー（Ｄ１〜Ｄ４）から生成されたＣＤ８＋Ｔ細胞製品＃３における、同等のＲ１１ＫＥＡ  ＴＣＲ発現を示す。
【０２３９】
図５１はまた、がん患者（ＰＴ１〜ＰＴ４）（例えば、６４．３％）および健常ドナー（Ｄ１〜Ｄ４）（例えば、６８．２％）から生成されたＣＤ８＋Ｔ細胞製品＃３における、同等の平均Ｒ１１ＫＥＡ  ＴＣＲ発現も示す。
【０２４０】
図５２は、Ｔ細胞製品＃３のＴ細胞記憶（Ｔｍｅｍｏｒｙ）表現型を判定するためのゲーティングスキームを示す。例えば、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７に対するゲーティングによって、ナイーブな「若い」Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、最終分化した「古い」Ｔ細胞（ＴｅｍＲＡ）（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）、エフェクター記憶Ｔ細胞（Ｔｅｍ）（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）、および中央記憶Ｔ細胞（Ｔｃｍ）（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）を同定し得る。
【０２４１】
図５３は、患者（ＰＴ１〜ＰＴ４）および健常ドナー（Ｄ１〜Ｄ４）の双方から生成されたＴ細胞製品＃３の望ましいナイーブコンパートメントおよびＴｃｍコンパートメントの双方における、顕著な平均増加を示す。これらの結果は、形質導入細胞が輸液後も持続するより高い能力を保有し、生体内でより長い持続性の応答を生じてもよいことを示唆する。
【０２４２】
機能性アッセイ
Ｔ細胞製品＃３の機能性を判定するために、Ｒ１１ＫＥＡ  ＴＣＲと特異的に結合する関連ペプチド（例えば、１μｇ／ｍｌ）を用いて、または対照としてＲ１１ＫＥＡ  ＴＣＲと結合しない無関係のペプチド（例えば、１μｇ／ｍｌ）を用いて、細胞を刺激してもよい。全てのリンパ球を活性化するＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激が陽性対照として機能し；非刺激は陰性対照として機能する。２時間の刺激後、タンパク質輸送阻害剤を添加した。刺激の６時間後に、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞における、サイトカインおよび、例えば、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびマクロファージ炎症性タンパク質−１−β（ＭＩＰ−１β）などのシグナル分子の発現を細胞内染色（ＩＣＳ）によって評価した。
【０２４３】
図５４は、Ｔ細胞製品＃３の一例を示し、関連ペプチド（ｄ）で刺激した後、Ｔ細胞製品＃３におけるＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＭＩＰ−１βの発現レベルは、無関係なペプチド（ｃ）で刺激した場合と比較して増加する。全てのリンパ球を活性化するＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激が陽性対照（ｂ）として機能し；非刺激は陰性対照（ａ）として機能する。
【０２４４】
図５５は、Ｔ細胞製品＃３の多機能性を示す。数字０、１、２、３、４、および５は、それぞれ、皆無、任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、および５つ全てのＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＭＩＰ−１βを発現するＴ細胞製品＃３の部分を示す。例えば、関連ペプチドでの刺激後に、Ｒ１１ＫＥＡ  ＴＣＲ（Ｒ１１）で形質導入された健常ドナー（Ｄ３）から得られたＴ細胞製品＃３の５０％以上は、無関係のペプチドでの刺激（すなわち、０％の細胞が少なくとも２つのサイトカインを発現する）と比較して、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＭＩＰ−１βからの少なくとも２つのサイトカインを発現する。対照的に、非形質導入（ＮＴ）細胞では、関連ペプチドでの刺激と、無関係なペプチドでの刺激との間で、サイトカイン発現に有意差はない。これらの結果は、健常ドナーから生成されたＲ１１ＫＥＡ  ＴＣＲで形質転換されたＴ細胞製品＃３が、多機能性であることを示す。陽性対照、すなわち、ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激されたＴ細胞は、ＴＣＲ形質導入の有無にかかわらず多機能性を示す。陰性対照、すなわち、刺激のないＴ細胞は、ＴＣＲ形質導入の有無にかかわらず不良な機能性を示す。
【０２４５】
図５６は、関連ペプチドで刺激した後に、例えば、Ｄ３およびＤ２などの健常ドナーから、および例えば、ＰＴ１、ＰＴ２、およびＰＴ３などのがん患者から生成されたＲ１１ＫＥＡ  ＴＣＲ＋（ＣＤ８＋Ｖｂ８＋）Ｔ細胞製品＃３の多機能性を示す。Ｄ１、Ｄ４、およびＰＴ４から生成されたＴ細胞は、これらの機能性アッセイによる判定で多機能であるようには見えないこともある。しかし、以下に示すように、Ｄ１、Ｄ４、およびＰＴ４から生成されたＴ細胞は、依然として標的細胞に対する細胞傷害活性を有する。
【０２４６】
図５７は、例えば、ＰＴ１〜ＰＴ４などのがん患者から生成されたＴ細胞製品＃３が、細胞当たり約１，０００コピーで細胞表面上に提示される関連ペプチドを有する高標的細胞株と接触した際における、例えば、１０：１＞３．３：１＞１：１などのＥ：Ｔ比依存様式でのＩＦＮ−γ放出を示す。図５６では多機能性でないように見えるＰＴ４から生成されたＴ細胞もまた、Ｅ：Ｔ比依存様式でＩＦＮ−γの放出を示すことに留意されたい。
【０２４７】
図５８は、例えば、Ｄ１〜Ｄ４などの健常患者から生成されたＴ細胞製品＃３が、細胞当たり約１，０００コピーで細胞表面上に提示される関連ペプチドを有する高標的細胞株と接触した際における、例えば、１０：１＞３．３：１＞１：１などのＥ：Ｔ比依存様式でのＩＦＮ−γ放出を示す。図５６では多機能性でないように見えるＤ１およびＤ４から生成されたＴ細胞もまた、Ｅ：Ｔ比依存様式でＩＦＮ−γの放出を示すことに留意されたい。
【０２４８】
図５９は、健常ドナー（Ｄ１〜Ｄ４）から生成されたＴ細胞製品＃３が、例えば、細胞当たり約１，０００コピーで細胞表面上に提示される関連ペプチドを有する高標的細胞株、細胞当たり約５０コピーで細胞表面上に提示される関連ペプチドを有する低標的細胞株、および細胞表面上に提示される関連ペプチドがない非標的細胞株などの、細胞表面上に提示される関連ペプチドの異なるレベルを有する細胞と接触した際における、ペプチド提示レベル依存様式、すなわち高標的＞低標的＞非標的での平均ＩＦＮ−γ放出を示す。
【０２４９】
図６０は、同様に、がん患者（ＰＴ１〜ＰＴ４）から生成されたＴ細胞製品＃３が、高標的細胞株、低標的細胞株、および非標的細胞株と接触した際における、ペプチド提示レベル依存様式、すなわち高標的＞低標的＞非標的での平均ＩＦＮ−γ放出を示す。
【０２５０】
図６１は、関連ペプチドが細胞表面に提示されていない標的陰性細胞株と接触した、例えば、Ｄ３などの健常ドナーから生成されたＴ細胞製品＃３の殺滅活性の欠如を示す。簡潔に述べると、Ｒ１１ＫＥＡ  ＴＣＲ（Ｒ１１）で形質導入されたＤ３または非形質導入（ＮＴ）Ｄ３から生成されたＴ細胞を１０：１、３．３：１、および１：１のＥ：Ｔ比で、標的陰性細胞株と共培養した。細胞殺滅活性は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ殺滅アッセイを使用して測定した。これらの結果は、ＴＣＲ形質導入あり（Ｒ１１）またはなし（ＮＴ）のＴ細胞の間で、標的陰性細胞株に対する細胞殺滅に有意差がないことを示す。
【０２５１】
対照的に、図６２は、関連ペプチドが細胞表面に提示されている標的陽性細胞株と接触させた、例えば、Ｄ３などの健常ドナーから生成されたＴ細胞製品＃３のＴＣＲ特異的殺傷活性を示す。すなわち、Ｒ１１ＫＥＡ  ＴＣＲを発現するＴ細胞は、例えば、１０：１＞３．３：１＞１：１などのＥ：Ｔ比依存様式で、標的陽性細胞を殺滅する。対照的に、異なるＥ：Ｔ比で、形質導入なしのＴ細胞（ＮＴ）の間には、細胞殺滅に有意差はなかった。
【０２５２】
図６３Ａ〜６３Ｃは、関連ペプチドが細胞表面上に提示されている標的陽性細胞株と接触させた、Ｒ１１ＫＥＡ  ＴＣＲ（Ｒ１１）で形質導入された、例えば、Ｄ３およびＤ４などの健常ドナー、および例えば、ＰＴ１およびＰＴ２などのがん患者から生成されたＴ細胞製品＃３のＴＣＲ特異的殺滅活性を示す。Ｄ３、Ｄ４、ＰＴ１、およびＰＴ２から生成されたＲ１１ＫＥＡ  ＴＣＲ（Ｒ１１）発現Ｔ細胞は、例えば、１０：１（図６３Ａ）＞３．３：１（図６３Ｂ）＞１：１（図６３Ｃ）などのＥ：Ｔ比依存様式で、標的陽性細胞を殺滅する。対照的に、異なるＥ：Ｔ比で、Ｒ１１ＫＥＡ  ＴＣＲ形質導入なしのＴ細胞（ＮＴ）の間には、細胞殺滅に有意差はなかった。
【０２５３】
まとめると、これらの結果は、Ｔ細胞製品＃３工程が、標的特異性を有するＴＣＲ導入遺伝子を発現するＴ細胞製品を生成してもよいことを示す。この工程は、健常康ドナーから得られた出発材料と同様に、がん患者から得られた出発材料でも機能する。Ｔ細胞製品＃３工程は、Ｔ細胞製品＃１および＃２を調製する工程よりも短時間で、しかもナイーブおよびＴｃｍ細胞を大量に含む製品を製造する。Ｔ細胞製品＃３は、多機能性であってもよく、標的陽性腫瘍細胞株に応答してＩＦＮ−γを分泌してもよい。Ｔ細胞製品＃３はまた、細胞株殺滅アッセイにおいて良好なエフェクター機能を提示してもよい。
【０２５４】
本開示の利点としては、休止時間を例えば、４〜６時間まで短縮し、活性化時間を例えば、１６〜２０時間まで短縮し、形質導入時間を例えば、２４時間まで短縮し、増殖期を例えば、５〜７日まで短縮してもよい、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞製品の臨床製造のための自己由来Ｔ細胞製造工程が挙げられてもよい。各ステップに影響を与える重要なパラメータを体系的に評価してもよく、最適化して、標的を発現する腫瘍細胞を認識して効率的に殺滅する強力な能力を備えた、１００億個を超える若い腫瘍反応性のＴ細胞をもたらしてもよい。これらの最適化は、Ｔ細胞製品の品質を改善するだけでなく、製造コストの３０％削減をもたらしてもよい。さらに、本開示の自己由来Ｔ細胞製造工程は、Ｔ細胞を活性化するためのフラスコ結合および／またはバック結合抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用してスケールアップし、同等レベルの活性化、形質導入可能性、および増殖をもたらしてもよく、これらのスケールアップ工程は、プレート結合抗体を使用する工程よりも迅速であってもよい。
【０２５５】
本明細書で言及される全ての参考文献は、各参考文献が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。あらゆる参考文献の引用は、出願日より前のその開示に対するものであり、本開示が、先行発明の性質上、そのような参照を先取りする権利を有していないことを認めるものとして、解釈されるべきではない。
【０２５６】
上述の要素のそれぞれ、または２つ以上を合わせて、上述の種類とは異なるその他の各種方法においても、有用な用途が見いだされてもよいことが理解されるであろう。さらなる分析なしに、前述のものは、本開示の要旨を完全に明らかにするので、その他の人々は、先行技術の観点から、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の一般的なまたは特定の態様の本質的な特徴を公正に構成する特徴を省略することなく、現在の知識を適用することによって、様々な用途に容易に適応させ得るであろう。前述の実施形態は、例示のためだけに示され；本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2021512621.tif 000013
【図１Ｂ】
2021512621.tif 000014
【図２】
2021512621.tif 000015
【図３】
2021512621.tif 000016
【図４】
2021512621.tif 000017
【図５Ａ】
2021512621.tif 000018
【図５Ｂ】
2021512621.tif 000019
【図６】
2021512621.tif 000020
【図７】
2021512621.tif 000021
【図８】
2021512621.tif 000022
【図９】
2021512621.tif 000023
【図１０】
2021512621.tif 000024
【図１１】
2021512621.tif 000025
【図１２】
2021512621.tif 000026
【図１３】
2021512621.tif 000027
【図１４】
2021512621.tif 000028
【図１５】
2021512621.tif 000029
【図１６】
2021512621.tif 000030
【図１７】
2021512621.tif 000031
【図１８】
2021512621.tif 000032
【図１９】
2021512621.tif 000033
【図２０】
2021512621.tif 000034
【図２１】
2021512621.tif 000035
【図２２】
2021512621.tif 000036
【図２３Ａ】
2021512621.tif 000037
【図２３Ｂ】
2021512621.tif 000038
【図２３Ｃ】
2021512621.tif 000039
2021512621.tif 000040
【図２３Ｄ】
2021512621.tif 000041
【図２３Ｅ】
2021512621.tif 000042
2021512621.tif 000043
【図２３Ｆ】
2021512621.tif 000044
【図２３Ｇ】
2021512621.tif 000045
【図２３Ｈ】
2021512621.tif 000046
【図２４】
2021512621.tif 000047
【図２５Ａ】
2021512621.tif 000048
【図２５Ｂ】
2021512621.tif 000049
【図２５Ｃ】
2021512621.tif 000050
【図２５Ｄ】
2021512621.tif 000051
【図２５Ｅ】
2021512621.tif 000052
【図２５Ｆ】
2021512621.tif 000053
【図２６】
2021512621.tif 000054
【図２７】
2021512621.tif 000055
【図２８】
2021512621.tif 000056
【図２９】
2021512621.tif 000057
【図３０】
2021512621.tif 000058
【図３１】
2021512621.tif 000059
【図３２】
2021512621.tif 000060
【図３３】
2021512621.tif 000061
【図３４】
2021512621.tif 000062
【図３５】
2021512621.tif 000063
【図３６】
2021512621.tif 000064
【図３７】
2021512621.tif 000065
【図３８】
2021512621.tif 000066
【図３９】
2021512621.tif 000067
【図４０】
2021512621.tif 000068
【図４１】
2021512621.tif 000069
【図４２】
2021512621.tif 000070
【図４３】
2021512621.tif 000071
【図４４】
2021512621.tif 000072
【図４５】
2021512621.tif 000073
【図４６】
2021512621.tif 000074
【図４７】
2021512621.tif 000075
【図４８】
2021512621.tif 000076
【図４９】
2021512621.tif 000077
【図５０】
2021512621.tif 000078
【図５１】
2021512621.tif 000079
【図５２】
2021512621.tif 000080
【図５３】
2021512621.tif 000081
【図５４】
2021512621.tif 000082
【図５５】
2021512621.tif 000083
【図５６】
2021512621.tif 000084
【図５７】
2021512621.tif 000085
【図５８】
2021512621.tif 000086
【図５９】
2021512621.tif 000087
【図６０】
2021512621.tif 000088
【図６１−１】
2021512621.tif 000089
【図６１−２】
2021512621.tif 000090
【図６２−１】
2021512621.tif 000091
【図６２−２】
2021512621.tif 000092
【図６３Ａ】
2021512621.tif 000093
【図６３Ｂ】
2021512621.tif 000094
【図６３Ｃ】
2021512621.tif 000095
【配列表】
2021512621000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月6日(2021.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021512621000001.app
【国際調査報告】
2021512621.tif 000096
2021512621.tif 000097
2021512621.tif 000098
2021512621.tif 000099