(57)【要約】  本発明は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、および血液脳関門（ＢＢＢ）内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含む構築物に関する。本発明はまた、例えば、過体重および肥満の予防または治療における、かかる構築物の組成物および使用に関する。体重の調節に好ましい化合物には、ＧＬＰ−１受容体作動薬（ＧＬＰ−１ＲＡ）が含まれ、ＢＢＢ内に位置する好ましい受容体には、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）が含まれる。ＧＬＰ−１  ＲＡおよび抗ＴｆＲ−Ｆａｂの例示的な融合体および複合体は、特にＢＢＢによって保護される脳領域内で、不活性対照Ｆａｂとの融合体または複合体と比較して、ＧＬＰ−１受容体を発現する脳領域との増加した結合を示す。インビボマウスの研究では、活性構築物について、不活性構築物と比較して、食物摂取量の減少および体重低下の増加が確認される。
2021528437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、および血液脳関門（ＢＢＢ）内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含む構築物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミドもしくはエステルであって、
前記化合物が、ＧＬＰ−１受容体作動薬（ＧＬＰ−１ＲＡ）であり、前記血液脳関門内に位置する受容体が、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である、構築物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミドもしくはエステル。
【請求項２】
前記化合物が、体重の調節に関与する脳内の経路を標的とする、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記化合物が、体重の調節に関与する脳内の受容体を標的とする、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
前記化合物が、腸由来ホルモンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５】
ＴｆＲと結合する前記アロステリックリガンドが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項６】
融合タンパク質または複合体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項７】
リンカーをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項８】
前記リンカーが、ペプチド性または非ペプチド性である、請求項７に記載の構築物。
【請求項９】
食物摂取量を低下させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１０】
体重低下を引き起こす、請求項１〜９のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１１】
ＴｆＲと結合しないリガンドを組み込むことだけが前記構築物と異なる対照構築物と比較して、ＢＢＢによって保護されるＧＬＰ−１Ｒ発現脳領域への増加した結合を示し、ＧＬＰ−１Ｒを発現するＢＢＢ保護脳領域が、（ｉ）外側中隔核（ＬＳ）、歯状回（ＤＧ）、内側手綱（ＭＨ）、および傍小脳脚核（ＰＢ）から、ならびに／または（ｉｉ）側坐核（ＡＣＢ）、視床下部の背内側核（ＤＭＨ）、外側視床下部野（ＬＨＡ）、および外側手綱（ＬＨ）から選択される１つ以上の領域である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の構築物および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む、組成物。
【請求項１３】
医薬として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の構築物、または請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
肥満の予防または治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の構築物、または請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満症および関連する状態を治療するための新規化合物に関する。
【０００２】
参照による配列表の組み込み
「配列表」と題される配列表は、９６７６バイトであり、２０１８年５月２３日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
肥満は、エネルギー摂取量が消費を上回る長期的な正のエネルギーバランスの結果である。中枢神経系（ＣＮＳ）は、エネルギー摂取量を調節することで、狭い範囲内の体重を維持するのに重要な役割を果たす。エネルギー摂取量を調節するために、食物摂取量に関与する末梢器官から生じる神経および液性の両方のシグナルが、空腹および／または満腹に関する情報を脳に伝える。栄養状態に関する食事関連情報を脳に伝達することによる摂食調節の担い手として、食事により分泌されるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）などの腸由来ホルモンが特定されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０１４），ｖｏｌ．２２１（１），ｐ．Ｔ１−Ｔ１６）。
【０００４】
ＣＮＳにおけるＧＬＰ−１受容体の存在、ならびに動物およびヒト研究からの発見は、ＧＬＰ−１受容体作動薬（ＧＬＰ−１ＲＡ）が誘発する満腹感および体重の影響が、少なくとも部分的に、脳に対するそれらの作用によって媒介されることを示すが、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１ＲＡの脳への浸透は、大部分が不浸透性血液脳関門（ＢＢＢ）によって厳しく制限される（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１４），ｖｏｌ．１２４（１０），ｐ．４４７３−４４８８）。
【０００５】
ＢＢＢを介したタンパク質治療剤の送達を促進するための１つのアプローチは、受容体を介したトランスサイトーシス、すなわちリガンドが内皮細胞バリアを越えて輸送される内因性エンドサイトーシスプロセスを利用することである。この障害を克服するための多くの戦略の中には、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）などの脳毛細血管内皮で発現する内因性受容体のトランスサイトーシス輸送経路を利用することが挙げられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１１），ｖｏｌ．３（８４），ｐ．１−８）。
【０００６】
ＷＯ２００４／０１９８７２  Ａ２は、少なくとも１つの治療用タンパク質またはペプチドと融合されたグリコシル化の低下を示すトランスフェリン（Ｔｆ）タンパク質を含む薬学的組成物、およびそれらを使用する方法に関する。予知的な実施例１は、「ＧＬＰ−１−トランスフェリン融合タンパク質」と題される。
【０００７】
ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４の類似体を用いたトランスフェリン融合タンパク質の調製は、論文「Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｂｙｕｎｇ−Ｊｏｏｎ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３３４  Ｎｏ．３（２０１０），ｐ．６８２−６９１に開示される。これらの融合体は、それぞれＧＬＰ−１−ＴｆおよびＥｘ−４−Ｔｆと示され、非グリコシル化型のヒトトランスフェリンで作製される。要約によると、ＧＬＰ−１−Ｔｆは、ＧＬＰ−１受容体を活性化し、ペプチダーゼによる不活性化に抵抗性を示し、半減期は約２日間であった。また、この要約では、融合タンパク質が血液脳関門を通過しなかったことを明確にしているが、例えば、ＧＬＰ−１−Ｔｆは、糖尿病動物において天然ＧＬＰ−１の急性グルコース依存性インスリン分泌特性を保持し、膵臓ベータ細胞の増殖に大きな影響を与えた。
【０００８】
ＵＳ２０１０／００７７４９８  Ａ１は、マウスにおける血液脳関門送達のための組成物および方法に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、肥満および関連する状態を治療するための新規化合物ならびにその使用に関する。
【００１０】
一態様では、本発明は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、および血液脳関門（ＢＢＢ）内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含む構築物、ならびにその薬学的に許容可能な塩、アミドまたはエステルに関する。
【００１１】
他の態様では、本発明は、かかる構築物および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤、一般に、特に肥満および関連する状態の予防または治療において医薬として使用するための構築物を含む組成物に関する。
【００１２】
一態様では、本発明の構築物は、体重の調節に関与する脳の領域への改善した結合を示す。結合は、ＢＢＢによって保護される領域内で特に改善される。
【００１３】
一態様では、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物は、ＧＬＰ−１受容体作動薬（ＧＬＰ−１ＲＡ）である。
【００１４】
したがって、一態様では、本発明は、脳内の食欲調節領域へ、全身投与されるＧＬＰ−１ＲＡのアクセシビリティを増加させる役割を果たす。
【００１５】
さらに、または代替的に、本発明は、脳内の追加のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）集団、例えば、ＢＢＢによって保護される集団を標的とする役割を果たす。
【００１６】
一態様では、食欲および体重に対するこれらの効果は、グルコース恒常性を従来のＧＬＰ−１療法（例えば、リラグルチドおよびセマグルチドのようなＧＬＰ−１誘導体を用いた）による全身治療と同じレベルに維持しながら得られる。
【００１７】
さらに、または代替的に、本発明の構築物は、全身投与されたＧＬＰ−１ＲＡの、ＧＬＰ−１Ｒを発現する脳領域への結合を増加させる。これは、例えば、実施例１６に記載される研究によって実証され得る（図１６Ａを参照されたい）。
【００１８】
さらに、または代替的に、本発明の構築物は、全身投与されたＧＬＰ−１ＲＡの、ＢＢＢによって保護されるＧＬＰ−１Ｒを発現する脳領域への結合を増加させる。これは、例えば、実施例１６に記載される研究によって実証され得る（図１６Ｃを参照されたい）。
【００１９】
さらに、または代替的に、一態様では、構築物は、食物摂取量を低下する効果を有する。これは、例えば、実施例２０、パートＩに記載される研究によって実証され得る。
【００２０】
さらに、または代替的に、一態様では、構築物は、体重低下を引き起こす効果を有する。これは、例えば、実施例２０、パートＩＩＩに記載される研究によって実証され得る。
【００２１】
一態様では、ＢＢＢ内に位置する受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。
【００２２】
ＴｆＲはＢＢＢ内皮中で高発現し、トランスフェリンの担体タンパク質である。トランスフェリンは、生体液中の遊離鉄（Ｆｅ）レベルを制御する鉄結合性血漿糖タンパク質である。トランスフェリンは鉄の細胞内への取り込みに必要であり，細胞内の鉄濃度により調節される。それは、受容体媒介性エンドサイトーシスを介してトランスフェリン−鉄複合体を内在化することによって鉄を移入する。したがって、この受容体経路を介した完全なトランスサイトーシスは起こりにくいと考えられ、これはＴｆＲを送達系として用いるために克服すべき課題の１つである。
【００２３】
本発明の特徴についてのより深い理解は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１に記載するように調製した抗ＴｆＲ−Ｆａｂの構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１９で使用される、図１ＡのＦａｂの蛍光標識されたバージョンの構造を示す。
【図２】図２は、実施例２に記載するように調製したＴｆＲと結合しない対照Ｆａｂの構造を示す。
【図３】図３は、実施例３に記載するように調製した抗ＴｆＲ−Ｆａｂの構造を示す。
【図４】図４は、実施例４に記載するように調製したＴｆＲと結合しない対照Ｆａｂの構造を示す。
【図５】図５は、実施例５に記載するように調製した対照ＦａｂおよびＧＬＰ−１類似体の融合タンパク質の構造を示す。
【図６】図６は、実施例６に記載するように調製したＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合タンパク質の構造を示す。
【図７】図７は、実施例７に記載するように調製したＧＬＰ−１対照Ｆａｂ融合タンパク質の構造を示す。
【図８】図８は、実施例８に記載するように調製した蛍光標識したＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合タンパク質の構造を示す。
【図９】図９は、実施例９に記載するように調製した蛍光標識したＧＬＰ−１対照Ｆａｂ融合タンパク質の構造を示す。
【図１０】図１０は、実施例１０に記載するように調製したＧＬＰ−１類似体の構造を示す。
【図１１】図１１は、実施例１１に記載するように調製したＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体の構造を示す。
【図１２】図１２は、実施例１２に記載するように調製したＧＬＰ−１対照Ｆａｂ複合体の構造を示す。
【図１３】図１３は、実施例１３に記載するように調製したＧＬＰ−１類似体の誘導体の構造を示す。
【図１４】図１４は、実施例１４に記載するように調製したＧＬＰ−１対照Ｆａｂ複合体の構造を示す。
【図１５】図１５は、実施例１５に記載するように調製したＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体の構造を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、マウスへの急性投与後の蛍光標識したＧＬＰ−１  Ｆａｂ融合タンパク質のインビボイメージング、より詳細には、ＧＬＰ−１Ｒを発現するすべての脳領域内における定量化後の、ＴｆＲと結合する「活性」構築物、およびＴｆＲと結合しない「非活性」対照構築物の蛍光シグナルの総強度の結果を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、マウスへの急性投与後の蛍光標識したＧＬＰ−１  Ｆａｂ融合タンパク質のインビボイメージング、より詳細には、ＧＬＰ−１Ｒを発現するがＢＢＢを欠く脳室周囲器官内における定量化後の、ＴｆＲと結合する「活性」構築物、およびＴｆＲと結合しない「非活性」対照構築物の蛍光シグナルの総強度の結果を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、マウスへの急性投与後の蛍光標識したＧＬＰ−１  Ｆａｂ融合タンパク質のインビボイメージング、より詳細には、ＢＢＢによって保護される例示的な脳構造内における定量化後の、ＴｆＲと結合する「活性」構築物、およびＴｆＲと結合しない「非活性」対照構築物の蛍光シグナルの総強度の結果を示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、マウスへの急性投与後の蛍光標識したＧＬＰ−１  Ｆａｂ融合タンパク質のインビボイメージング、より詳細には、ＧＬＰ−１Ｒを発現しない脳領域内における定量化後の、ＴｆＲと結合する「活性」構築物、およびＴｆＲと結合しない「非活性」対照構築物の蛍光シグナルの総強度の結果を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、除脂肪マウスにおける急性インビボ研究、より詳細には、「活性」ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体の投与後最大２４時間の期間にわたるｇでの累積食物摂取量（ＦＩ）の結果を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、除脂肪マウスにおける急性インビボ研究、より詳細には、「活性」ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体の投与後最大２４時間の期間にわたって測定したｐＭでの血漿曝露レベルを示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、除脂肪マウスにおける急性インビボ研究、より詳細には、「活性」ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体または「非活性」ＧＬＰ−１対照−Ｆａｂ複合体のいずれかの投与後最大２４時間の期間にわたるｇでの累積食物摂取量（ＦＩ）の結果を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、除脂肪マウスにおける急性インビボ研究、より詳細には、「活性」ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体または「非活性」ＧＬＰ−１対照−Ｆａｂ複合体のいずれかの投与後最大２４時間の期間にわたって測定したｐＭでの血漿曝露レベルを示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける亜慢性インビボ研究、より詳細には、「活性」ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体または「非活性」対照Ｆａｂ複合体のいずれかを１日１回投与した、１９日間の治療期間にわたって測定した％での体重低下の結果を示す（さらなる詳細については、実施例２０、パートＩＩＩを参照されたい）。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける亜慢性インビボ研究、より詳細には、「活性」ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体または「非活性」対照Ｆａｂ複合体のいずれかを１日１回投与した、１９日間の治療期間にわたって測定した％での体重低下の結果を示す（さらなる詳細については、実施例２０、パートＩＩＩを参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下では、ギリシャ文字は、その記号または対応する名称、例えば：α＝アルファ、β＝ベータ、ε＝イプシロン、γ＝ガンマ、δ＝デルタ、ω＝オメガなどによって表され得る。また、μのギリシャ文字は、「ｕ」によって、例えばμｌ＝ｕｌまたはμＭ＝ｕＭによって表され得る。
【００２６】
以下では、化学用語は当技術分野における慣例どおりに使用され、例えば、−Ｃ（Ｏ）−という名称は、以下のカルボニル基のジラジカルを指し、
化学物質７
【化１】
2021528437.tif 000003
（ＣＯＯＨ）は、例えば、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−という名称で使用されると、以下の化学物質８のカルボン酸基のモノラジカルを指し、
【化２】
2021528437.tif 000004
左に示す炭素原子（ＣＨ）に付着する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ａ」という語は、概して「１つ以上」を意味する。例えば、本発明の構築物（体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする「１つの」化合物、および血液脳関門（ＢＢＢ）内に位置する受容体に対する「１つの」アロステリックリガンドを含むように定義される）は、かかる化合物およびリガンドのうちの１つ以上が組み込まれ得る。
【００２８】
本明細書に別途示されていない限り、単数形で示した用語は、概して複数の状態も含む。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に開示されるような構築物、化合物、リガンド、ＧＬＰ−１  ＲＡ、ＧＬＰ−１類似体、調製方法、組成物、および使用に関し、ここで、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの制限のない用語は、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などの閉鎖的な用語に置き換えられる。
【００３０】
本発明は、肥満および関連する状態を治療するための新規化合物ならびにその使用に関する。本発明の化合物は、体重の調節に関与する脳の領域への改善された結合を示す。結合は、特に血液脳関門（ＢＢＢ）によって保護される領域で改善される。
【００３１】
一態様では、本発明は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、およびＢＢＢ内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含む構築物、ならびにその薬学的に許容可能な塩、アミドまたはエステルに関する。
【００３２】
構築物
「構築物」という用語は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、およびＢＢＢに位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含み、化合物およびリガンドが、任意でリンカーを介して共有結合する化学物質（分子）を指す。
【００３３】
一実施形態では、構築物は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、ＢＢＢに位置する受容体に対するアロステリックリガンド、および任意のリンカーからなる。
【００３４】
一実施形態では、化合物およびリガンドは、互いに直接結合される（リンカーが存在しない）。
【００３５】
別の実施形態では、化合物およびリガンドは、リンカーを介して互いに結合される。
【００３６】
融合タンパク質
一実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。
【００３７】
融合タンパク質は、宿主細胞中の融合タンパク質全体の組換え発現のステップを含むプロセスによって生成され得る化合物である。
【００３８】
一実施形態では、融合タンパク質のアミノ酸配列は、コードされたアミノ酸のみからなる。
【００３９】
一実施形態では、組み換え発現ステップから生じるタンパク質は、所望の融合タンパク質と同一であり、その場合、融合タンパク質は、「完全組み換え」プロセスによって生成されるか、または生成され得る。この場合、融合タンパク質のさらなる化学修飾は必要とされず、発現した融合タンパク質を単離および精製することができ、最終的な所望の生成物を構成する。
【００４０】
融合タンパク質の非限定的な一例は、実施例６の融合タンパク質（図６）であり、ＧＬＰ−１類似体は、ペプチドリンカー（４ｘ（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ））を介して、抗ＴｆＲ−ＦａｂのＶＬドメインのＮ末端と融合する。これら３つの部分のそれぞれのアミノ酸配列は、全てコードされたアミノ酸からなる。
【００４１】
複合体
一実施形態では、構築物は、複合体である。
【００４２】
一実施形態では、「複合体」は、融合タンパク質ではない。
【００４３】
一実施形態では、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、アロステリックリガンド、および任意のリンカーの間の共有結合は、完全組換えプロセスを除く、任意の化学的プロセスによって形成され得る。
【００４４】
一実施形態では、複合体の構造式は、少なくとも１つの非コードアミノ酸を含む。非コードアミノ酸の非限定的な一例は、アミノ酸Ａｉｂである（例えば、実施例１１の複合体を参照されたい（図１１）。
【００４５】
さらに、または代替的に、複合体の構造式は、アミノ酸ではない少なくとも１つの要素を含む。かかる要素の非限定的な一例は、化学物質１：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−（例えば、実施例１１の複合体を参照されたい（図１１）などの化学的リンカーであり、化学物質１のリンカーは、Ｌｙｓ４８５のイプシロンアミノ基およびＣｙｓ３７７のチオール基を接続する。かかる要素の別の非限定的な例は、化学物質２：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ａｄｏ−ｇＧｌｕ−Ａｄｏ（例えば、実施例１５の複合体を参照されたい）の化学的リンカーであり、化学物質２のリンカーは、Ｌｙｓ４３８のイプシロンアミノ基およびＣｙｓ３７７のチオール基を接続する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、複合体は、部分的組換えプロセスによって生成され得るか、または生成され、（例えば所望の複合体のタンパク質部分は、組換え発現ステップで生成され得るか、または生成され、所望の複合体の残りの部分（複数可）は、組換え発現ステップの後、宿主細胞の外側の１つ以上の化学反応ステップにおいて、１つ以上の別個のプロセスステップで追加され得るか、または追加される。こうした生成プロセスは、「半組換え」プロセスと称され得る。
【００４７】
体重の調節に関与する脳内の領域
体重の調節に関与する脳内の領域の非限定的な例は、Ｂｌｏｅｍｅｎｄａａｌ  ｅｔ  ａｌ、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｏｎ  ａｐｐｅｔｉｔｅ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ：ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ」、Ｔｈｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０１４）、２２１、Ｔ１−Ｔ１６で言及され、例えばｐ．Ｔ８の図１を参照されたい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、体重の調節に関与する脳内の領域には、限定されないが、側方中隔核（ＬＳ）、歯状回（ＤＧ）、内側手綱（ＭＨ）、および／または傍小脳脚核（ＰＢ）が含まれる（図１６Ｃおよび実施例１６を参照されたい）。
【００４９】
いくつかの実施形態では、体重の調節に関与する脳内の領域には、限定されないが、側坐核（ＡＣＢ）、視床下部の背内側核（ＤＭＨ）、外側視床下部野（ＬＨＡ）、および／または外側手綱（ＬＨ）が含まれる。
【００５０】
体重の調節
一実施形態では、体重の調節は、体重の減少を指す。
【００５１】
一実施形態では、体重の減少は、食物摂取量の減少、カロリー摂取量の減少、食欲の減少、エネルギー消費量の増加、および／または食物嗜好の変化のうちの１つ以上に起因し得る。
【００５２】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の構築物の化合物部分は、ａ）食物摂取量の減少、ｂ）カロリー摂取量の減少、ｃ）食欲の減少、ｄ）エネルギー消費量の増加、および／またはｅ）食物嗜好の変化に関与する脳内の領域を標的とする。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明は、体重管理のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、食欲の減少のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、食物摂取量の減少のための方法に関する。
【００５４】
一般に、肥満を患っているすべての対象は、過体重も患っていると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明は、肥満を治療または予防するための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、肥満を治療または予防するための本発明の構築物の使用に関する。いくつかの実施形態では、肥満を患っている対象は、成人のヒトまたは小児のヒト（幼児、児童、および青年を含む）などのヒトである。ボディマス指数（ＢＭＩ）は、身長および体重に基づく体脂肪の指標である。計算式は、ＢＭＩ＝体重（キログラム）／身長（メートル）２である。肥満を患っているヒト対象は３０以上のＢＭＩを有することがあり、この対象は肥満とも呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、肥満を患っているヒト対象は、３５以上のＢＭＩを有するか、または３０以上４０未満の範囲のＢＭＩを有する。いくつかの実施形態では、肥満は、ヒト対象が４０以上のＢＭＩを有する重度の肥満または病的肥満である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、任意で少なくとも１つの体重に関連する併存疾患の存在下での過体重の治療または予防のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、任意で少なくとも１つの体重に関連する併存疾患の存在下での過体重の治療または予防のための本発明の構築物の使用に関する。いくつかの実施形態では、過体重を患っている対象は、成人のヒトまたは小児のヒト（幼児、児童、および青年を含む）などのヒトである。いくつかの実施形態では、過体重を患っているヒト対象は、２５以上のＢＭＩ、例えば２７以上のＢＭＩなどを有する。いくつかの実施形態では、過体重を患っているヒト対象は、２５〜３０未満の範囲または２７〜３０未満の範囲のＢＭＩを有する。いくつかの実施形態では、体重に関連する併存疾患は、高血圧、糖尿病（２型糖尿病など）、脂質異常症、高コレステロール、および閉塞性睡眠時無呼吸からなる群から選択される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、体重の減少のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、体重の減少のための本発明の構築物の使用に関する。本発明による体重の減少を享受するヒトは、２５以上のＢＭＩ、例えば２７以上のＢＭＩまたは３０以上のＢＭＩなどを有し得る。いくつかの実施形態では、本発明による体重の減少を享受するヒトは、３５以上のＢＭＩまたは４０以上のＢＭＩを有し得る。「体重の減少」という用語は、肥満および／もしくは過体重の治療または予防を含み得る。
【００５７】
化合物
体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物には、これらに限定されないが、栄養状態に関する食事関連情報を脳に伝達することによって、栄養調節の担い手として特定されている腸由来ホルモンが含まれる。
【００５８】
一実施形態では、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物は、タンパク質である。一実施形態では、化合物は、ポリペプチドである。一実施形態では、化合物は、ペプチドである。
【００５９】
一実施形態では、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物は、ホルモンである。一実施態様では、化合物は、腸由来ホルモンである。一実施形態では、ホルモンは、エイコサノイド、ステロイド、およびアミノ酸／タンパク質誘導体からなる群から選択される。一実施形態では、ホルモンは、アミノ酸／タンパク質誘導体である。
【００６０】
一実施形態では、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物は、ＧＬＰ−１受容体作動薬（ＧＬＰ−１ＲＡ）である。
【００６１】
一実施形態では、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物は、インスリン分泌剤である。この用語は、当技術分野で即知であるように、インスリン分泌促作用または生理学的効果をもたらすシグナル伝達経路を開始する能力を指す。
【００６２】
一実施形態では、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物は、体重の調節に関与する脳内の経路を標的とする。一実施形態では、化合物は、体重の調節に関与する脳内の受容体を標的とする。
【００６３】
ＢＢＢ内に位置する受容体
血液脳関門（ＢＢＢ）内に位置する受容体は、脳毛細血管内皮で発現する内因性受容体である。
【００６４】
一実施形態では、ＢＢＢ内に位置する受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。
【００６５】
アロステリック／オルソステリック
受容体の「オルソステリックリガンド」は、受容体の活性化を調節する内因性または一次的なリガンドである。オルソステリックリガンドが受容体と結合する部位は、受容体の「オルソステリック部位」と称される。
【００６６】
受容体の「アロステリックリガンド」とは、内在性（オルソステリック）リガンドとは異なる部位で、すなわち受容体の「アロステリック部位」と結合するリガンドを指す。
【００６７】
例として、トランスフェリン（Ｔｆ）は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の活性化を調節するオルソステリックリガンドであり、ＴｆはＴｆＲのオルソステリック部位と結合する。ＴｆＲのアロステリックリガンドは、オルソステリックリガンド（Ｔｆ）とは異なる部位で、すなわちＴｆＲのアロステリック部位と結合する。
【００６８】
ＧＬＰ−１受容体作動薬
受容体作動薬は、受容体と結合し、天然リガンドに典型的な応答を誘発する化合物として定義され得る。完全作動薬は、天然リガンドと同じ度合いの応答を誘発する作動薬として定義され得る（例えば、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、ＡＬ  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、ＤＬ  Ｎｅｌｓｏｎ、ＭＭ  Ｃｏｘ、第２版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９３年、７６３ページを参照されたい）。
【００６９】
したがって、例えば、「ＧＬＰ−１受容体作動薬」（ＧＬＰ−１ＲＡ）は、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）と結合することができ、それを活性化することができる化合物として定義され得る。また、「完全」ＧＬＰ−１ＲＡは、天然ＧＬＰ−１と同等の程度のＧＬＰ−１受容体応答を誘発することができるＧＬＰ−１受容体作動薬として定義され得る。一実施形態では、ＧＬＰ−１受容体は、ヒトＧＬＰ−１受容体である。
【００７０】
ヒトＧＬＰ−１受容体を活性化する能力は、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する膜を含む培地において、および／またはヒトＧＬＰ−１受容体を発現する全細胞を用いたアッセイにおいて適切に決定され得る。
【００７１】
例えば、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する安定なトランスフェクト細胞株から精製された原形質膜は、論点の化合物で刺激され得、ｃＡＭＰ生成の効力は、例えば、特定の抗体を使用して捕捉され得る、内因的に形成されたｃＡＭＰと外因的に添加されたビオチン標識ｃＡＭＰとの間の競合に基づいて、測定され得る。
【００７２】
さらに、または代替的に、ヒトＧＬＰ−１受容体の応答は、レポーター遺伝子アッセイ、例えばヒトＧＬＰ−１受容体を発現し、プロモーターと結合したｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）のＤＮＡおよびホタルルシフェラーゼ（ＣＲＥルシフェラーゼ）の遺伝子を含む、安定的にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞株で測定され得る。ＧＬＰ−１受容体の活性化の結果としてｃＡＭＰが生成されると、これは次にルシフェラーゼの発現をもたらす。ルシフェラーゼは、ルシフェリンを追加することによって決定することができ、これは酵素によってオキシルシフェリンに変換されて生物発光を生じ、これが測定されて、インビトロ効力の尺度となる。かかるアッセイの非限定的な一例は、実施例１７に記載される。
【００７３】
５０％効果濃度（ＥＣ５０）という用語は一般的に、用量反応曲線を参照することにより、ベースラインと最大との中間の反応を誘発する濃度を指す。ＥＣ５０は、化合物の効力の尺度として使用され、その最大効果の５０％が観察される濃度を表す。
【００７４】
本発明の構築物およびＧＬＰ−１ＲＡ化合物のインビトロ効力は、上記のように決定され得、論点の化合物または構築物のＥＣ５０が決定され得る。ＥＣ５０値がより低いほど、効力がより良好である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明の構築物のＧＬＰ−１ＲＡは、ＧＬＰ−１類似体である。いくつかの実施形態では、本発明の構築物のＧＬＰ−１ＲＡは、ＧＬＰ−１誘導体である。
【００７６】
ＧＬＰ−１類似体の非限定的な例は、実施例６、１０、および１３（図６、図１０、図１３）、すなわち配列番号１１のアミノ酸１〜３１、配列番号１３のアミノ酸１〜２８、および配列番号１５のアミノ酸１〜３１のそれぞれのものである。
【００７７】
ＧＬＰ−１誘導体の非限定的な例は、実施例１０および１３（配列番号１３、配列番号１５）に開示される。これらは、共有結合リンカーを有するＧＬＰ−１類似体である。
【００７８】
リンカー
本発明の構築物は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物を、ＢＢＢ内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドと接続するリンカーを含み得る。言い換えれば、リンカーは、任意である。
【００７９】
一実施形態では、リンカーは、ペプチド性である。ペプチドリンカーは、アミノ酸からなる。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸からなる。一実施形態では、リンカーは、コードされたアミノ酸からなる。
【００８０】
ペプチドリンカーの非限定的な例は、ＧＱＡＰＧＱＡＰＧＱＡＰＧＱＡＰＧＱＡＰＫ（配列番号１３）およびＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１の残基３２〜４７）であり、実施例１１および６（図１１および図６のそれぞれ）を参照されたい。
【００８１】
別の実施形態では、リンカーは、非ペプチド性、または化学的である。非ペプチド性リンカーは、アミノ酸残基を含み得るが、それは完全にアミノ酸からなるものではない。
【００８２】
非ペプチドリンカーの非限定的な例は、化学物質１：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−であり、実施例１１（図１１）を参照されたく、化学物質２：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ａｄｏ−ｇＧｌｕ−Ａｄｏ−であり、式中、Ａｄｏは、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸のジラジカルであり、化学物質３：−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−であり、ｇＧｌｕは、Ｌ−ガンマ−グルタミン酸のジラジカルであり、化学物質４：−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−であり、実施例１５（図１５）を参照されたい。
【００８３】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質
アミノ酸は、アミン基およびカルボン酸基、ならびに任意で側鎖と称されることが多い１つ以上の追加の基を含む化合物として定義され得る。アミン基は、例えば、一級または二級アミノ基であり得る。プロリンは、二級アミノ基を含むアミノ酸の非限定的な一例である。
【００８４】
アミノ酸のサブグループは、一級または二級アミノ基の窒素原子がα−炭素原子と結合されたα−アミノ酸である。
【００８５】
アミノ酸残基は、ペプチドまたはタンパク質に組み込まれたアミノ酸のラジカルである。
【００８６】
ペプチドは、サイズに基づいてポリペプチドおよびタンパク質と区別される。本文脈では、特に指定されない限り、ペプチドは、最大５０個のアミノ酸残基からなるが、ポリペプチドおよびタンパク質は、５０個を超えるアミノ酸残基からなる。タンパク質は、生物学的に機能的な方法で配置され得る１つ以上のポリペプチド鎖からなり得る。特定の実施形態では、ペプチドは、（ｉ）少なくとも２個のアミノ酸残基、（ｉｉ）少なくとも５個のアミノ酸残基、（ｉｉｉ）少なくとも１０個のアミノ酸残基、（ｉｖ）少なくとも２０個のアミノ酸残基、（ｖ）少なくとも３０個のアミノ酸残基、または（ｖｉ）少なくとも４０個のアミノ酸残基からなる。さらに特定の実施形態では、ポリペプチドは、（ｉ）２０００個以下のアミノ酸残基、（ｉｉ）１５００個以下のアミノ酸残基、（ｉｉｉ）１０００個以下のアミノ酸残基、または（ｉｖ）６００個以下のアミノ酸残基からなる。さらに特定の実施形態では、タンパク質は、（ｉ）２０００個以下のアミノ酸残基、（ｉｉ）１５００個以下のアミノ酸残基、（ｉｉｉ）１０００個以下のアミノ酸残基、（ｉｖ）６００個以下のアミノ酸残基、または（ｖ）５００個以下のアミノ酸残基からなる。
【００８７】
アミノ酸は、コードされたアミノ酸または非コードアミノ酸として、起源に基づいて分類され得る。「コードされた」アミノ酸（「天然」アミノ酸とも称される）という用語は、ＩＵＰＡＣ（セクション３ＡＡ−１内の表１）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ＡｍｉｎｏＡｃｉｄ／ＡＡ１ｎ２．ｈｔｍｌ＃ＡＡ１）を参照することによって定義され得、これらの２０アミノ酸についての構造、慣用名、系統名、１および３文字の記号を記載する。これらはすべてα−アミノ酸である。
【００８８】
非コードアミノ酸の非限定的な一例は、Ａｉｂであり、α−アミノイソ酪酸としても知られ、以下の構造を有する：
化学物質６：
【化３】
2021528437.tif 000005
【００８９】
ＧＬＰ−１ペプチドおよび類似体
本明細書で使用される「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１（７〜３７））を指し、その配列は配列番号１６として列挙される配列、またはその類似体に含まれる。配列番号１６の配列を有するペプチドはまた、「天然」ＧＬＰ−１と称され得る。
【００９０】
本明細書で使用される「ＧＬＰ−１類似体」または「ＧＬＰ−１の類似体」という用語は、ＧＬＰ−１（７〜３７）（配列番号１６）のバリアントであるペプチドまたは化合物を指す。
【００９１】
配列表では、配列番号１６（ヒスチジン）の第１のアミノ酸残基には番号１が割り当てられている。しかしながら、当該技術分野において確立された慣行に従って、以下では、このヒスチジン残基は番号７と称され、それ以降のアミノ酸残基はそれに応じて番号付けされ、グリシン番号３７で終わる。したがって、概して、本明細書におけるＧＬＰ−１（７−３７）配列のアミノ酸残基番号または位置番号への言及は、７位のＨｉｓで始まり３７位のＧｌｙで終わる配列への言及である。
【００９２】
本発明の構築物および誘導体のＧＬＰ−１類似体は、ｉ）変化したアミノ酸残基（すなわち、天然ＧＬＰ−１内の対応する位置）に対応する天然ＧＬＰ−１（７−３７）内のアミノ酸残基の番号、およびｉｉ）実際の変化を参照することにより説明され得る。
【００９３】
ＧＬＰ−１類似体は、天然ＧＬＰ−１（７〜３７）（配列番号１６）と比較した場合に、アミノ酸残基の番号が変化しているＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチドである。これらの変化は、独立して、１つ以上のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を表し得る。
【００９４】
上記の例から明らかなように、アミノ酸残基は、その完全な名称、１文字コードおよび／または３文字コードによって特定され得る。これら３つの方法は、完全に同等である。
【００９５】
「〜に同等の位置」または「対応する位置」という表現は、天然ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１６）を参照してバリアントＧＬＰ−１（７−３７）配列の変化部位を特徴付けるために使用され得る。同等の、または対応する位置、ならびに変化の数は、例えば単純な手書きおよび目測によって簡単に推定され、および／またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づく「整列」などの標準タンパク質またはペプチド整列プログラムを使用してもよい。このアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３−４５３、およびＭｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ、「Ｏｐｔｉｍａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｐａｃｅ」  ＣＡＢＩＯＳ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８８）４：１１−１７による整列プログラムに説明されている。整列のために、デフォルトのスコアマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２およびデフォルトの同一性マトリックスを使用してもよく、またギャップの第１の残基に対するペナルティは−１２、好ましくは−１０に設定されてもよく、そしてギャップにおける追加的な残基に対するペナルティは−２、好ましくは−０．５に設定されてもよい。
【００９６】
「ペプチド」という用語は、例えば本発明の誘導体のＧＬＰ−１類似体の文脈で使用される場合、アミド（またはペプチド）結合によって相互接続された一連のアミノ酸を含む化合物を指す。
【００９７】
本発明のＧＬＰ−１ペプチドは、ペプチド結合によって結合された少なくとも５個の構成アミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個、なおより好ましくは少なくとも２５個、または最も好ましくは少なくとも２８個のアミノ酸を含む。
【００９８】
追加的な特定の実施形態では、ペプチドは、ｉ）２９、ｉｉ）３０、ｉｉｉ）３１、もしくはｉｖ）３２個のアミノ酸ａ）から構成されるか、またはｂ）それらからなる。
【００９９】
なおさらなる特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチド結合によって相互接続されたアミノ酸からなる。
【０１００】
以下では、光学異性体が記載されていないＧＬＰ−１ペプチドのすべてのアミノ酸は、（別段の指定がない限り）Ｌ−異性体を意味すると理解されるべきである。
【０１０１】
薬学的に許容可能な塩、アミド、エステル
本発明の構築物は、薬学的に許容可能な塩、アミド、またはエステルの形態であり得る。これはまた、その構築化合物およびリガンド部分も同様である。
【０１０２】
塩は、例えば、塩基と酸との間の化学反応、例えば：２ＮＨ３＋Ｈ２ＳＯ４→（ＮＨ４）２ＳＯ４によって形成される。
【０１０３】
塩は塩基性塩、酸性塩である場合があり、またはどちらでもない場合もある（すなわち、中性塩）。塩基性塩は、水中で水酸化イオンを、酸性塩はヒドロニウムイオンを生成する。
【０１０４】
塩は、それぞれ、アニオン基またはカチオン基の間に、付加されたカチオンまたはアニオンで形成され得る。これらの基は、本発明の構築物の化合物部分、リガンド部分、および／または任意のリンカー部分に位置し得る。
【０１０５】
本発明の構築物のアニオン性基の非限定的な例には、遊離カルボン酸基、例えば、構築物のＣ末端アミノ酸における遊離カルボン酸基、およびＡｓｐおよびＧｌｕなどの内部酸アミノ酸残基における遊離カルボン酸基が含まれる。
【０１０６】
カチオン性基の非限定的な例には、存在する場合、Ｎ末端の遊離アミノ基、ならびにＨｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓなどの内部塩基アミノ酸残基の任意の遊離アミノ基が含まれる。
【０１０７】
本発明の構築物のエステルは、例えば、遊離カルボン酸基とアルコールまたはフェノールとの反応によって形成されてもよく、これは、アルコキシまたはアリールオキシ基による少なくとも１つのヒドロキシル基の置換をもたらす。
【０１０８】
エステル形成は、Ｃ末端の遊離カルボン酸基、および／または構築物の内部の任意の遊離カルボン酸基を含み得る。
【０１０９】
本発明の構築物のアミドは、例えば、遊離カルボン酸基とアミンもしくは置換アミンの反応によって、または遊離もしくは置換アミノ基とカルボン酸の反応によって形成され得る。
【０１１０】
アミド形成には、Ｃ末端における遊離カルボン酸基、構築物の内部の任意の遊離カルボン酸基、構築物のＮ末端の遊離アミノ基、および／または構築物の内部の任意の遊離もしくは置換アミノ基が含まれ得る。
【０１１１】
特定の実施形態では、構築物は、薬学的に許容可能な塩の形態である。別の特定の実施形態では、構築物は、薬学的に許与可能なアミドの形態であり、好ましくは、Ｃ末端にアミド基を有する。なおさらなる特定の実施形態では、構築物は、薬学的に許容可能なエステルの形態である。
【０１１２】
生成プロセス
本明細書に開示される対照Ｆａｂ、抗ＴｆＲ−Ｆａｂ、およびＧＬＰ−１類似体のようなタンパク質およびペプチドの生成は、当技術分野で周知である。
【０１１３】
ＧＬＰ−１類似体は、例えば、ｔ−ＢｏｃもしくはＦｍｏｃ化学または他の定評のある技術を用いた従来のペプチド合成、例えば、固相ペプチド合成により生成されてもよく、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９，Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ  Ｚａｒａｇｏｚａ  Ｄｏｒｗａｌｄ，「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ」、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，２０００，ａｎｄ  「Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照されたい。
【０１１４】
さらに、または代替的に、それらは、遺伝子組換え方法により、すなわち、類似体をコードしているＤＮＡ配列を含み、かつペプチドの発現を許す条件下で、適切な栄養培地でペプチドを発現することができる宿主細胞を培養することによって、生成され得る。これらのペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例は、大腸菌、出芽酵母、ならびに哺乳類ＢＨＫまたはＣＨＯ細胞株である。
【０１１５】
非コードアミノ酸を含む本発明の構築物は、例えば、実験部分で記載されるように生成され得る。または、例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ：「Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ．３３，ｎｏ．７（２００４），ｐ．４２２−４３０、および「Ｓｅｍｉ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＬＰ−１  ａｎａｌｏｇｕｅｓ」と題されたＷＯ２００９／０８３５４９  Ａ１を参照されたい。
【０１１６】
いくつかの構築物を調製する方法の特定の例は、実験部分に含まれる。
【０１１７】
医薬組成物
一実施形態では、本発明の組成物は、医薬組成物である。
【０１１８】
本発明の構築物またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステルおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で公知のように調製され得る。
【０１１９】
「賦形剤」という語は、活性治療成分（複数可）以外の任意の成分を広く指す。賦形剤は、不活性物質、非活性物質、および／または医薬的に活性でない物質であり得る。
【０１２０】
賦形剤は、例えば、担体、ビヒクル、希釈剤、錠剤補助剤などの様々な目的を果たし、ならびに／あるいは活性物質の投与および／または吸収を改善するように機能し得る。
【０１２１】
様々な賦形剤を伴った薬学的に活性な成分の製剤は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、第１９版（１９９５年）、および任意のそれ以降の版）を参照されたい。
【０１２２】
賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、張性調節剤、キレート剤、および安定剤である。
【０１２３】
製剤の例としては、液体製剤、すなわち水を含む水性製剤が含まれる。液体製剤は、溶液または懸濁液であり得る。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、または少なくとも６０％、７０％、８０％、もしくは少なくとも９０％ｗ／ｗの水を含む。
【０１２４】
代替的に、医薬組成物は、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥などの固体製剤であり得、そのまま使用してもよく、医師または患者が使用前に溶媒および／または希釈剤を追加して使用することもできる。
【０１２５】
医薬組成物は、緩衝液を含み得る。
【０１２６】
医薬組成物は、防腐剤を含み得る。
【０１２７】
医薬組成物は、キレート剤を含み得る。
【０１２８】
医薬組成物は、安定化剤を含み得る。
【０１２９】
医薬組成物は、１つ以上の界面活性剤を含み得る。
【０１３０】
医薬組成物は、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤を含み得る。
【０１３１】
本発明の構築物は、医薬組成物の形態で投与され得る。医薬組成物は、それを必要とする患者に、いくつかの部位で投与され得る。
【０１３２】
投与経路は、例えば、非経口であり得る。
【０１３３】
組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、微乳濁液、複数の乳濁液、注射液、注入液として、いくつかの剤形で投与され得る。
【０１３４】
全身または非経口投与は、シリンジによって、任意にペン様シリンジまたは注入ポンプによって皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射により実施され得る。
【０１３５】
本発明による構築物を用いた治療はまた、１つ以上の追加の薬理学的に活性な物質と組み合わせることもできる。
【０１３６】
本発明による構築物を用いた治療はまた、ブドウ糖レベル、および／または胃バンディングまたは胃バイパスなどの脂質恒常性に影響を与える手術と組み合わせることもできる。
【０１３７】
特定の実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態によってさらに記載される。
１．構築物は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、および血液脳関門（ＢＢＢ）内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含み、またはその薬学的に許容可能な塩、アミドもしくはエステルである。
２．実施形態１に記載の構築物は、化合物が、体重の調節に関与する脳内の経路を標的とする。
３．実施形態１または２に記載の構築物は、化合物が、体重の調節に関与する脳内の受容体を標的とする。0
４．実施形態１〜３のいずれか１つに記載の構築物は、化合物が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。0
５．実施形態１〜４のいずれか１つに記載の構築物は、化合物が、ホルモンである。0
６．実施形態５に記載の構築物は、ホルモンが、エイコサノイド、ステロイド、およびアミノ酸／タンパク質誘導体からなる群から選択される。 
７．実施形態５に記載の構築物は、ホルモンが、アミノ酸／タンパク質誘導体である。0
８．実施形態１〜７のいずれか１つに記載の構築物は、化合物が、腸由来ホルモンである。 
９．実施形態１〜８のいずれか１つに記載の構築物は、化合物が、インスリン分泌剤である。 
１０．実施形態１〜９のいずれか１つに記載の構築物は、化合物が、ＧＬＰ−１受容体作動薬（ＧＬＰ−１ＲＡ）である。 
１１．実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の構築物は、ＢＢＢ内に位置する受容体が、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。 
１２．実施形態１１に記載の構築物は、ＴｆＲと結合するアロステリックリガンドが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。 
１３．実施形態１１または１２に記載の構築物は、ＴｆＲと結合するアロステリックリガンドが、抗トランスフェリン受容体Ｆａｂ（抗ＴｆＲ−Ｆａｂ）である。 
１４．実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の構築物は、融合タンパク質または複合体である。 
１５．実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の構築物は、リンカーをさらに含む。0
１６．実施形態１５に記載の構築物は、リンカーが、ペプチド性または非ペプチド性である。 
１７．実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の構築物は、ＧＬＰ−１ＲＡである。0
１８．実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の構築物は、完全ＧＬＰ−１ＲＡである。0
１９．実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の構築物は、実施例１７のアッセイを使用して決定された、１０００ｐＭ以下のＥＣ５０に対応するインビトロ効力を有する。0
２０．実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の構築物は、ＧＬＰ−１Ｒと結合することができる。 
２１．実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の構築物は、実施例１８のアッセイを使用して決定された、１００ｎＭ以下のＩＣ５０に対応するＧＬＰ−１Ｒ結合親和性を有する。 
２２．実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の構築物は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）と結合することができる。0
２３．実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の構築物は、ＴｆＲ標的抗体の取り込みを阻害することができる。0
２４．実施形態２３に記載の構築物は、実施例１９のアッセイを使用して決定された、１００ｎＭ以下のＩＣ５０に対応するＴｆＲ標的抗体の取り込みを阻害する。 
２５．実施形態２４に記載の構築物は、ＩＣ５０値が、同じＧＬＰ−１ＲＡを組み込んでいるが、ＴｆＲと結合しないリガンドを組み込んだ対照構築物のＩＣ５０値よりも低くなり、ここで、両方のＩＣ５０値は、実施例１９のアッセイを使用して決定される。 
２６．実施形態１１〜２５のいずれか１つに記載の構築物は、ＴｆＲと結合しないリガンドを組み込むことだけが構築物と異なる対照構築物と比較して、ＧＬＰ−１Ｒを発現する脳領域への増加した結合を示す。 
２７．実施形態２６に記載の構築物は、ＧＬＰ−１Ｒを発現する脳領域への結合が、蛍光標識した構築物のインビボイメージングを使用して決定される。0
２８．実施形態２７に記載の構築物は、ＧＬＰ−１Ｒを発現する脳領域の少なくとも大部分において、対照構築物と比較してより高い蛍光シグナルをもたらし、ＧＬＰ−１Ｒを発現する脳領域は、図１６Ａに示される通りである。0
２９．実施形態２８に記載の構築物は、蛍光シグナルが、ＧＬＰ−１Ｒ発現脳領域において少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または好ましくは少なくとも９０％高い。0
３０．実施形態２６〜２９のいずれか１つに記載の構築物は、ＧＬＰ−１Ｒを発現する脳領域への結合が、本質的に実施例１６に記載されるように決定される。 
３１．実施形態１１〜３０のいずれか１つに記載の構築物は、ＴｆＲと結合しないリガンドを組み込むことだけが構築物と異なる対照構築物と比較して、ＢＢＢによって保護されるＧＬＰ−１Ｒ発現脳領域への増加した結合を示す。 
３２．実施形態３１に記載の構築物は、ＧＬＰ−１Ｒを発現するＢＢＢで保護される脳領域の少なくとも大部分において、対照構築物と比較してより高い蛍光シグナルをもたらす。0
３３．実施形態３２に記載の構築物は、ＧＬＰ−１Ｒを発現するＢＢＢで保護される脳領域が、図１６Ｃに示されるようにＬＳ、ＤＧ、ＭＨ、およびＰＢである。0
３４．実施形態３２に記載の構築物は、ＧＬＰ−１Ｒを発現するＢＢＢで保護される脳領域が、ＡＣＢ、ＤＭＨ、ＬＨＡ、およびＬＨである。0
３５．実施形態３２〜３４のいずれか１つに記載の構築物は、蛍光シグナルが、ＧＬＰ−１Ｒ発現脳領域において少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％高い。 
３６．実施形態３２〜３５のいずれか１つに記載の構築物は、蛍光シグナルが、対照構築物の蛍光シグナルよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または少なくとも１０倍高い。 
３７．実施形態３２〜３６のいずれか１つに記載の構築物は、ＢＢＢによって保護されるＧＬＰ−１Ｒ発現脳領域への結合が、本質的に実施例１６に記載されるように決定される。 
３８．実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の構築物は、食物摂取量を低下させる。0
３９．実施形態３８に記載の構築物は、食物摂取量を従属的に低下させる。0
４０．実施形態３８または３９に記載の構築物は、ＴｆＲと結合しないリガンドを組み込むことだけが構築物と異なる対照構と比較して、より低い食物摂取量をもたらす。 
４１．実施形態３８〜４０のいずれか１つに記載の構築物は、食物摂取量が、２４時間の期間にわたるｇでの累積食物摂取量である。 
４２．実施形態３８〜４１のいずれか１つに記載の構築物は、食物摂取量が、本質的に実施例２０、パートＩまたはパートＩＩに記載されるように、除脂肪マウスにおける急性研究で決定される。 
４３．実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の構築物は、体重低下を引き起こす。0
４４．実施形態４３に記載の構築物は、ＴｆＲと結合しないリガンドを組み込むことだけが構築物と異なる対照構と比較して、より高い体重低下を引き起こす。 
４５．実施形態４３または４４に記載の構築物は、体重低下が、本質的に実施例２０、パートＩＩＩに記載されるように、ＤＩＯマウスにおける亜慢性研究で決定される。 
４６．組成物は、実施形態１〜４５のいずれか１つに記載の構築物および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。0
４７．実施形態１〜４５のいずれか１つに記載の構築物、または実施形態４６の組成物は、医薬として使用するためのものである。
４８．実施形態１〜４５のいずれか１つに記載の構築物、または実施形態４６に記載の組成物は、肥満の予防または治療に使用するためのものである。00
４９．肥満の予防または治療のための方法は、実施形態１〜４５のいずれか１つに記載の構築物または実施形態４６の組成物を投与することを含む。00
【実施例】
【０１３８】
この実験部分は、略語のリストで始まり、本発明の構築物を検出および特徴付けるための一般的な方法を含むセクションが続く。次に、特定の構築物部分および構築物の調製に関連するいくつかの実施例が続き、最後にこれらの類似体および誘導体の活性ならびに特性に関連するいくつかの実施例が含まれる（薬理学的方法という見出しのセクション）。
【０１３９】
実施例は、本発明を例証する役割を果たす。
【０１４０】
【表Ａ−１】
2021528437.tif 000006
【表Ａ−２】
2021528437.tif 000007
【表Ａ−３】
2021528437.tif 000008
【０１４１】
全般的な検出および特徴付けの方法
１．ＬＣ−ＭＳ法
【０１４２】
【表Ｂ】
2021528437.tif 000009
【０１４３】
方法：ＬＣＭＳ＿３６
このプロトコルは、プロトコルタイトルで表されるＭＳ法を概説し、方法の説明を分析結果にリンクするために使用される。この方法は、試料のクロマトグラフィー分離によって分析対象物の純度を測定し、質量スペクトルおよび総イオン数（ＴＩＣ）によって成分を同定および定量するために使用される。
【０１４４】
【表Ｃ】
2021528437.tif 000010
【０１４５】
実施例１：
抗ＴｆＲ−Ｆａｂの一過性発現
本実施例は、図１Ａ（配列番号３）に示される抗Ｔｆｒ−Ｆａｂの一過性発現を説明する。
軽鎖（配列番号１）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＬＥＥＩＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＧＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＧＡＴＳＬＡＤＧＶＰＳ
ＲＦＳＧＳＲＳＧＴＱＦＳＬＫＩＳＲＶＱＶＥＤＩＧＩＹＹＣＬＱＡＹＮＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ
ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ
ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
重鎖（配列番号２）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＴＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＫＫＧＬＥＷＩＡＭＩＹＹＤＳＳＫＭＮＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＶＰＴＳＨＹＶＶＤＶＷＧＱＧＶＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＣＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫ
【０１４６】
抗ＴｆＲ−Ｆａｂは、ＵＳ２０１０／００７７４９８  Ａ１で公開されている可変ドメイン、ならびにヒトＣＬおよびＩｇＧ４ＣＨ１ドメインを有するキメラＦａｂとして設計した。ＣＨ１ドメインは、Ａ１５８Ｃ変異を担持し、化学的複合体化のためのシステインハンドルを生成する。
【０１４７】
抗ＴｆＲ−Ｆａｂをコードする核酸配列をｐＴＴ５由来の発現ベクターにクローン化した。Ｆａｂを発現するために、ＨＥＫ２９３  ６Ｅ細胞を１ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの細胞密度まで培養し、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３４７−５００）を使用して発現ベクタープラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。発現上清を、トランスフェクションの５日後に遠心分離および濾過することにより、発現上清を回収した。
【０１４８】
分泌された抗ＴｆＲ−Ｆａｂを含有する細胞培養上清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したプロテインＧセファロース４ＦＦアフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。結合したＦａｂを、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８で溶出した。画分を収集し、１／２０体積２  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で直ちに中和した。次いでプールした画分を２５ｍＭ  ＮａＯＡｃｐＨ５．０に希釈し、ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。結合したＦａｂは、２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．０中の１００〜４００ｍＭのＮａＣｌ線形勾配で溶出し、Ｇ２５脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＰＢＳに緩衝液交換した。精製したタンパク質を、０．２ｍｍフィルター単位（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過により滅菌した。抗ＴｆＲ−Ｆａｂの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。Ｆａｂの同一性を質量分析により確認した。
【０１４９】
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは９５％、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ａ２８０ｎｍ）では９９．１％を上回った。観察した質量は４７１９８．３Ｄａであり、理論質量（４７１９８．５Ｄａ）と一致した。
【０１５０】
実施例２
対照Ｆａｂの一過性発現
この実施例は、ＴｆＲと結合しない図２に示す対照Ｆａｂの一過性発現を説明する。図２の対照Ｆａｂは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。
軽鎖（配列番号４）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶ
ＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬ
ＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０１５１】
対照Ｆａｂは、抗ＴＮＰ抗体の軽鎖（配列番号４）の可変ドメイン、および実施例１の抗ＴｆＲ抗体（配列番号２）と同じ重鎖を有するように設計した。
【０１５２】
実施例１に記載される同様の手順を使用して、対照Ｆａｂをクローン化し、発現させた。
【０１５３】
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは９５％、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ａ２８０ｎｍ）では９９．２％を上回った。観察した質量は４７７８７．４Ｄａであり、理論質量（４７７８７．０Ｄａ）と一致した。
【０１５４】
実施例３：
抗ＴｆＲ−Ｆａｂを発現する安定した細胞株の生成
本実施例は、図３に示される抗ＴｆＲ−Ｆａｂを発現する安定細胞株の生成を説明する（図１Ａ、配列番号３に示されるのと同じ）。
【０１５５】
実施例１の抗ＴｆＲ−Ｆａｂを発現する安定細胞株は、ＧＳ選択を伴うＣＨＯ  Ｋ１ＳＶ  ＧＳ  ＫＯ細胞株（Ｌｏｎｚａ）を使用して生成した。Ｎ末端ＣＤ３３シグナルペプチド（配列番号１７）を有するＦａｂ軽鎖（配列番号１）および重鎖（配列番号２）を、ｐＥＥ１７．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）にサブクローン化した。ＤＮＡを線形化し、エレクトロポレーションによりＣＨＯ  Ｋ１ＳＶ  ＧＳ  ＫＯ細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞マイクロプールを、ＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、２５ＭのＭＳＸ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）濃度で２週間増殖させた。次に、細胞をＭＳＸを含まない９６ディープウェルプレートに移し、プロテインＧセンサ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用したＦｏｒｔｅｂｉｏ分析により、より高い発現量の２４個のマイクロプールを選択した。
【０１５６】
より高い発現安定性を達成するために、単一細胞クローンを、限られた希釈により選択した高発現マイクロプールで単離した。細胞を２〜３週間増殖させ、９６個の単一クローンをピッキングし、Ｆｏｒｔｅｂｉｏによりスクリーニングした。上位２４個のクローンを２４ウェルプレートでさらに増殖させ、プロテインＧセンサおよびＳＤＳＰＡＧＥ分析を使用してＦｏｒｔｅｂｉｏによってランク付けした。６個のそれぞれの最も発現の高い細胞クローンを、さらなる安定性試験に使用した。ＨＰＬＣによる発現レベル評価のため、フェッドバッチ培養で３０日間の増殖前後の細胞を培養した（フェッドバッチ培養は、３日目および７日目に２つの栄養素を与えることを伴う１２日間の培養である）。２つの単一クローンは、３０日の継代後の発現レベルが７０％を上回り、安定していた。
【０１５７】
Ｆａｂを発現する安定した細胞株が復活し、増殖した。次いで、細胞培養物を、１３ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓバイオリアクタに、ＣＤ−ＣＨＯ培地中の１０．５Ｌの初期体積で播種し、細胞密度を０．３×１０Ｅ６細胞／ｍｌとした。フェッドバッチ細胞培養は、３６．５℃、溶存酸素レベル４０％、ｐＨ７（±０．３）に維持した。栄養素の供給は、細胞密度およびグルコースレベルに基づいて行った。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅデプスフィルタＭＤ０ＨＣ０５４Ｈ１を使用して、１３日後に細胞培養液を回収した。
【０１５８】
抗ＴｆＲ  Ｆａｂを、実施例１に記載されるように、精製、滅菌、および分析した。
【０１５９】
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは９５％、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ａ２８０ｎｍ）では９６．７％を上回った。観察した質量は４７１９９．３Ｄａであり、理論質量（４７１９８．５Ｄａ）と一致した。
【０１６０】
実施例４：
対照Ｆａｂを発現する安定した細胞株の生成
本実施例は、図４に示される対照Ｆａｂを発現する安定細胞株の生成を説明する（図２、配列番号５に示されるのと同じ）。
【０１６１】
実施例２の対照Ｆａｂを発現する安定細胞株は、配列番号１の代わりに配列番号４のＦａｂ軽鎖を使用したことを除いて、実施例３に記載されるように生成した。また、実施例３に記載されるより高い発現安定性を達成するための手段に従った。３つの単一クローンは、３０日の継代後、７０％を上回る発現レベルで安定していた。
【０１６２】
対照Ｆａｂを発現する安定細胞株を、実施例３に記載されるように、１３ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓバイオリアクタでさらに培養した。
【０１６３】
分泌された対照Ｆａｂを含む細胞培養上清を濃縮し、接線流濾過（ＴＦＦ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中の限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を使用して２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．０に緩衝液交換し、次いでＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。結合したＦａｂを、２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．０中の０〜３５０ｍＭのＮａＣｌ線形勾配で溶出し、ＴＦＦシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中のＵＦ／ＤＦを使用してＰＢＳに緩衝液交換した。
【０１６４】
精製対照Ｆａｂを、０．２ｍｍフィルター単位（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過により滅菌した。純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。Ｆａｂの同一性を質量分析により確認した。
【０１６５】
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは９５％、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ａ２８０ｎｍ）では９８．７％を上回った。観察した質量は４７７８７．５Ｄａであり、理論質量（４７７８７．０Ｄａ）と一致した。
【０１６６】
実施例５：
ＧＬＰ−１抗ＴＮＰ−Ｆａｂ融合タンパク質の一過性発現
本実施例は、対照ＦａｂおよびＧＬＰ−１類似体の図５（配列番号８）に示す融合タンパク質の発現を説明する。対照Ｆａｂは抗ＴＮＰＦａｂであり、ＴＮＰは２，４，６−トリニトロフェノールを指す。
軽鎖（配列番号６）：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＰＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
重鎖（配列番号７）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＧＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＴＩＳＹＳＧＤＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＧＳＹＶＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ
【０１６７】
二本鎖Ｆａｂ融合タンパク質は、軽鎖（配列番号６）および重鎖（配列番号７）からなる。軽鎖では、活性ＧＬＰ−１類似体は、柔軟な４ｘ（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）リンカーを介して、実施例２（配列番号４）の抗ＴＮＰ−ＦａｂのＶＬドメインのＮ末端に融合される。重鎖では、ＣＨ１ドメインのＣ末端が伸長され、１０ｘヒスチジン精製タグが含まれる。したがって、軽鎖は「ＧＬＰ−１−（ＧＧＧＳ）４−ａＴＮＰ軽鎖」と称され得、重鎖は「ａＴＮＰ−（Ｈｉｓ）１０重鎖」と称され得る。
【０１６８】
抗ＴＮＰ−Ｆａｂ融合をコードする核酸配列を、実施例１に記載されているようにｐＴＴ由来発現ベクターにクローン化した。
【０１６９】
融合タンパク質を発現するために、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４５２７）を、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４３５１０１）中で浮遊培養し、細胞密度を３ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌとした。一過性トランスフェクションを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４５２５）、および２つのタンパク質鎖をコードするプラスミドＤＮＡの混合物を使用して実施した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットのトランスフェクションエンハンサー１および２を、トランスフェクションの翌日に添加した。発現上清を、トランスフェクションの４日後に遠心分離および濾過することにより、発現上清を回収した。
【０１７０】
分泌されたＧＬＰ−１抗ＴＮＰ−Ｆａｂ融合タンパク質を含む細胞培養上清を、５０ｍＭ  ＮａＰ（リン酸ナトリウム）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールｐＨ７．５で平衡化した２ｘ５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。結合した融合タンパク質を、５０ｍＭ  ＮａＰ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．５で溶出した。画分をプールし、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６＿６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。精製したタンパク質を、０．２ｍｍフィルター単位を通して濾過により滅菌した。融合タンパク質の純度を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、９０％を超える純度を示す単一のバンドを生成し、サイズ排除ＨＰＬＣは１２％の高分子量種を示した。融合タンパク質の同一性を質量分析により確認した。トリプシンペプチドの測定した無傷の平均質量５２９７７Ｄａおよびペプチド質量マッピング（データは示さず）は、ＶＨ１ドメイン（配列番号７）のＮ末端グルタミン酸が実際に精製タンパク質中のピログルタミン酸であることを示した。
【０１７１】
実施例６：
ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合タンパク質の一過性発現
本実施例は、抗ＴｆＲ−ＦａｂおよびＧＬＰ−１類似体の図６（配列番号１１）に示す融合タンパク質の発現を説明する。
軽鎖（配列番号９）：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＰＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＬＥＥＩＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＧＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＧＡＴＳＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＱＦＳＬＫＩＳＲＶＱＶＥＤＩＧＩＹＹＣＬＱＡＹＮＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
重鎖（配列番号１０）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＴＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＫＫＧＬＥＷＩＡＭＩＹＹＤＳＳＫＭＮＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＶＰＴＳＨＹＶＶＤＶＷＧＱＧＶＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ
【０１７２】
二本鎖Ｆａｂ融合タンパク質は、軽鎖（配列番号９）および重鎖（配列番号１０）からなる。軽鎖では、活性ＧＬＰ−１類似体は、柔軟な４ｘ（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）リンカーを介して抗ＴｆＲ−ＦａｂのＶＬドメインのＮ末端に融合される。重鎖では、ＣＨ１ＦａｂドメインのＣ末端が伸長され、１０ｘヒスチジン精製タグが含まれる。したがって、軽鎖は、「ＧＬＰ−１−（ＧＧＧＳ）４−ａＴｆＲ軽鎖」と称され得、重鎖は「ａＴｆＲ−（Ｈｉｓ）１０重鎖」と称され得る。
【０１７３】
抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合をコードする核酸配列を、実施例１に記載されているようにｐＴＴ由来発現ベクターにクローン化した。
【０１７４】
融合タンパク質をｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させ、上清を実施例５に記載されるように回収した。
【０１７５】
分泌されたＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合タンパク質を含む細胞培養上清を２ｘ５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌカラムから溶出する前に、５０ｍＭ  ＮａＰ（リン酸ナトリウム）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾールｐＨ７．５で厳密に洗浄して、実施例５に記載されるようにさらに精製および滅菌した。
【０１７６】
融合タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣで分析し、９５％を超える純度を示した。融合タンパク質の同一性を質量分析により確認した。質量分析により無傷の平均質量は５３２４３．７Ｄａと測定され、それにより精製タンパク質の同一性を確認した。
【０１７７】
実施例７：
ＧＬＰ−１対照Ｆａｂ融合タンパク質の一過性発現
本実施例は、別の対照ＦａｂおよびＧＬＰ−１類似体の図７（配列番号１２）に示す融合タンパク質の発現を説明する。
【０１７８】
このタンパク質の軽鎖（配列番号６）をコードするプラスミドＤＮＡは、実施例５で使用したものと同じであり、このタンパク質の重鎖（配列番号１０）をコードするプラスミドＤＮＡは、実施例６で使用したものと同じである。これは、実施例６（配列番号１１）のＧＬＰ−１抗ＴｆＲ  Ｆａｂと同様の活性ＧＬＰ−１要素を依然として有するが、ＴｆＲ結合を有しないハイブリッド構築物をもたらす。
【０１７９】
対照Ｆａｂ融合をコードする核酸配列を、実施例１に記載されているようにｐＴＴ由来発現ベクターにクローン化した。
【０１８０】
融合タンパク質をｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させ、上清を実施例５に記載されるように回収した。
【０１８１】
分泌された融合タンパク質を含む細胞培養上清を、２ｘ５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、実施例５に記載されるようにさらに精製および滅菌した。
【０１８２】
Ｆａｂ融合タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣで分析し、９５％を超える純度を示した。融合タンパク質の同一性を質量分析により確認した。質量分析により無傷の平均質量は５３６６２．９Ｄａと測定され、それにより精製タンパク質の同一性を確認した。
【０１８３】
実施例８：
蛍光標識ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合タンパク質の調製
本実施例は、実施例６（配列番号１１）のＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合タンパク質の蛍光標識を説明する。蛍光標識化化合物を図８に示す（示すように、標識化はＮ末端上だけではなく、ランダムに付着することに留意されたい）。
【０１８４】
実施例６の２ｍｌのＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合タンパク質（約９２ｎｍｏｌを含む）に、１２０ｎｍｏｌのＶｉｖｏＴａｇ７５０−ＮＨＳを追加し、これは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから市販されているインビボイメージングアプリケーション用の生体分子を標識するためのアミン反応性（ＮＨＳエステル）近赤外蛍光色素である。
【０１８５】
通常、この蛍光標識は、Ｆａｂにかなり定量的に付着するが、この場合、非常に限られた標識しか得られなかった。６００ｎｍｏｌのＶｉｖｏＴａｇ７５０−ＮＨＳを追加し、カップリングを一晩進行させた。翌日、溶液をＰＢＳで実行されているＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、標識された材料を１．６ｍｌＰＢＳ中に収集した。青色の大部分は、後で加水分解されたタグとして溶出した。ＣＬＮＤ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）により濃度を３２ｎｍｏｌ／ｍｌに決定し、溶液を５本のエッペンドルフチューブにそれぞれ３２０μＬずつ分注して凍結した。
【０１８６】
ＬＣＭＳは、分子あたり混合物０、１、２、３標識を示した（平均約１）。
【０１８７】
実施例９：
蛍光標識ＧＬＰ−１対照Ｆａｂ融合タンパク質の調製
本実施例は、実施例７（配列番号１２）のＧＬＰ−１対照Ｆａｂ融合タンパク質の蛍光標識を説明する。蛍光標識化化合物を図９に示す（示すように、標識化はＮ末端上だけではなく、ランダムに付着することに留意されたい）。
【０１８８】
実施例７の２ｍｌのＧＬＰ−１対照Ｆａｂ融合タンパク質（配列番号１２）（約１３８ｎｍｏｌを含む）に、１６０ｎｍｏｌのＶｉｖｏＴａｇ７５０−ＮＨＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を追加した。
【０１８９】
実施例８に記載されているように、追加量の蛍光色素、この場合は９００ｎｍｏｌを追加する必要があった。標識された材料のカップリングおよび収集は、実施例８に記載された通りである（この場合、標識された材料は、２ｍｌのＰＢＳ中に収集した）。青色の大部分は、後で加水分解されたタグとして溶出した。実施例８に記載のようにＣＬＮＤにより４９ｎｍｏｌ／ｍｌに決定し、溶液を５本のエッペンドルフチューブにそれぞれ４００μＬずつ分注して凍結した。
【０１９０】
ＬＣＭＳは、分子あたり０、１、２、３標識の混合物を示した（平均約１）。
【０１９１】
実施例１０：
複合に使用したＧＬＰ−１ペプチドの合成
本実施例は、図１０に示すＧＬＰ−１ペプチドの合成を説明する。
【０１９２】
５８位のＣ末端Ｌｙｓ残基のイプシロンアミノ基におけるブロモアセトアミド（ＢｒＡｃ）誘導体化を伴わない図１０のペプチドは、配列番号１３を有する（５８位は、配列番号１３の５２位に対応する）。
【０１９３】
配列番号１３のペプチドは、Ｃ末端ペプチドリンカーを有するＧＬＰ−１（７〜３７）の類似体（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ）として定義され得る（すなわち、残基番号３８〜５８がＧＬＰ−１（７〜３７）に付加され、残基３８〜５８は、配列番号１３の残基３２〜５２に対応する）。ペプチドリンカーは、Ｇ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｋであり、配列番号１４を有する。
【０１９４】
使用したＦｍｏｃ保護アミノ酸誘導体は、以下の標準的に推奨されるものである：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｌｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨなどで、例えば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏＣｈｅｍから供給される。他に何も指定されていない場合、アミノ酸の天然Ｌ型が使用される。Ｎ末端アミノ酸を、アルファアミノ基（例えば、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）におけるＮ末端Ｂｏｃ保護とともに用いた。ＳＰＰＳは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国アリゾナ州ツーソン８５７１４）製のＳｙｍｐｈｏｎｙＸ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＳｙｍｐｈｏｎｙＸ固相ペプチド合成装置）上でのＦｍｏｃベースの化学を使用して実施した。ペプチド合成には、予め装填されたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ｗａｎｇ  ＬＬ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、装填０．３３ｍｍｏｌ／ｇ）を使用した。Ｆｍｏｃ−脱保護は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで達成した。ペプチド二重カップリングを最初の２０サイクルで１時間行い、残りをキャッピング（無水酢酸を使用）した２時間単一カップリングを行った。アミノ酸／オキシマピュア／ＤＩＣ溶液の混合物（４倍のモル過剰でＤＭＦ中０．３Ｍ／０．３Ｍ／０．３Ｍ）をすべてのカップリングに使用した。
【０１９５】
樹脂をフィルターを備えたガラス反応器に移した。ＨＦＩＰ／ＤＣＭ／ＴＩＰＳ  ７５：２２：３溶液（７０ｍｌ）を加え、２０分間撹拌し、ろ過し、さらに６０ｍｌで１回繰り返し、ＤＣＭ（３ｘ６５ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ６５ｍｌ）で洗浄した。
【０１９６】
ＤＭＦ／ＤＣＭ  １：１（５０ｍｌ）中のブロモ酢酸（３．０ｇ、１２当量、２２ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（１．３９ｇ、６当量、１１ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間静置し、樹脂上に注いだ。
一晩静置し、撹拌した。濾過し、ＤＭＦ（４ｘ６０ｍｌ）およびＤＣＭ（４ｘ６０ｍｌ）で洗浄した。
【０１９７】
ペプチドを、混合物（９５ＴＦＡ：２．５ＴＩＰＳ：２．５水、８０ｍｌ）中で３時間、室温で攪拌することにより、樹脂から切断した。濾過し、樹脂を少量のＴＦＡで洗浄した。
【０１９８】
溶液を１２個のプラスチックバイアルに分割し、ドライアイス冷却ジエチルエーテル（２５ｍｌ）を各バイアルに加え、さらに約２０ｍｌのエーテルを充填した。沈殿物をスピンダウンした。
【０１９９】
上清を除去し、生成物を分取ＨＰＬＣで精製した。
ＬＣＭＳ＿３４：Ｒｔ＝２．３７分、Ｍ／４＝１３７８．３
【０２００】
実施例１１：
ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体の合成
本実施例は、ＧＬＰ−１ペプチドおよび抗ＴｆＲ−Ｆａｂの複合体の合成を説明する。複合体の構造を図１１に示す。
【０２０１】
要素
【化４】
2021528437.tif 000011
は、Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕのトリペプチド（図１１の残基４３４〜４３６）を指す。
【０２０２】
図１１のＮ末端部分（残基１〜４３３）は、配列番号３の抗ＴｆＲ−Ｆａｂと同一である（実施例１および３を参照されたい）。
【０２０３】
図１１のＣ末端部分（残基４３４〜４８５）は、配列番号１３と同一である（実施例１０を参照されたい）。
【０２０４】
図１１に示されるように、Ｌｙｓ４８５のイプシロンアミノ基およびＣｙｓ３７７のチオール基は、化学物質１：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−を介して相互接続される。
【０２０５】
ＰＢＳ緩衝液に溶解した実施例３の抗ＴｆＲ−Ｆａｂ（２５２．４ｍｇ、５３４８ｎｍｏｌの抗ＴｆＲ−Ｆａｂを含む４１ｍｌ）の溶液に、ｐＨ７．４、５２２ｕｌの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を加えた。
【０２０６】
ＴＣＥＰ（５．０５ｍｏｌ／ｍｌ、１．０５当量、１１１２Ｌ、５６１５ｎｍｏｌ）をタンパク質溶液に加えた。
ＴＣＥＰ溶液の調製：ＴＣＥＰ、０．５Ｍ、ｐＨ７、ＭＷ：２８６ｇ／ｍｏｌ、
２５ｕＬの０．５Ｍ  ＴＣＥＰ溶液を、２４７５ｕＬ緩衝液（２０ｍＭ  ＴＥＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５緩衝液）で希釈した。約２〜３時間、または完全に減少するまで放置する。
【０２０７】
実施例１０の３．６当量のペプチドをＤＭＳＯ（１．５ｍｌ）に溶解し、Ｆａｂ溶液に加え、フラスコを少量のｐＨ９のトリス緩衝液で濯いだ。ｐＨをｐＨ９〜ｐＨ８．３（ｐＨ＝６．５で開始）のトリス緩衝液で調整し、一晩静置した。
【０２０８】
反応混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０、１０Ｋフィルターで回転させることにより濃縮して１３ｍｌを得、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡｋｔａ精製器で精製した。
カラム：Ｈｉｌｏａｄ  ２６／６００、ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ＳＥＣ
緩衝液：ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４
【０２０９】
得られた生成物の以下の特性を決定した：
ＬＣＭＳ＿３６：Ｒｔ＝３．５２分、ｍ／３０＝１７５１．４、ｍ／３２＝１６４２．０
【０２１０】
実施例１２：
ＧＬＰ−１対照−Ｆａｂ複合体の合成
本実施例は、ＧＬＰ−１ペプチドおよび対照Ｆａｂの複合体の合成を説明する。複合体の構造を図１２に示す。
【０２１１】
要素
【化５】
2021528437.tif 000012
は、Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕのトリペプチド（図１２の残基４３９〜４４１）を指す。
【０２１２】
この複合体は、実施例１１に記載されるのと同じプロトコルを使用して、実施例１０のブロモアセチルペプチド（図１０）を用いた実施例４の対照ＦａｂのＣｙｓアルキル化によって調製した。
【０２１３】
図１２のＮ末端部分（残基１〜４３８）は、配列番号５の対照Ｆａｂと同一である（実施例２および４を参照されたい）。
【０２１４】
図１２のＣ末端部分（残基４３９〜４９０）は、配列番号１３と同一である（実施例１０を参照されたい）。
【０２１５】
図１２に示されるように、Ｌｙｓ４９０のイプシロンアミノ基およびＣｙｓ３８２のチオール基は、化学物質１：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−を介して相互接続される。
【０２１６】
得られた生成物の以下の特性を決定した：
ＬＣＭＳ＿３６：Ｒｔ＝３．０１分、ｍ／２９＝１８３２．１、ｍ／３１＝１７１３．９
【０２１７】
実施例１３：
複合に使用したＧＬＰ−１ペプチドの合成
本実施例は、図１３のＧＬＰ−１ペプチド誘導体の合成を説明する。
【０２１８】
図１３は、ＧＬＰ−１（７〜３７）（配列番号１５）のＧＬＰ−１類似体（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ、３６Ｋ）を組み込んでいる。
【０２１９】
図１３はまた、化学物質５：−Ａｄｏ−ｇＧｌｕ−Ａｄｏ−として定義することができる非ペプチドリンカーを組み込んでおり、式中、Ａｄｏは、Ｇｌｕの側鎖のガンマ位置でカルボン酸基が関与するアミド結合を介して別の分子に結合した場合に、アミノ酸Ｇｌｕに対して８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸およびｇＧｌｕを指す。Ａｄｏのジラジカルは、化学物質３：−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−の式を有する。ｇＧｌｕのジラジカルは、化学物質４：−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−）の式を有する。リンカーの１つのＡｄｏは、ＧＬＰ−１類似体の３６位のＬｙｓ残基のイプシロンアミノ基と結合される。リンカーの他のＡｄｏは、それぞれ実施例１５および１４に記載されるように、抗ＴｆＲ  Ｆａｂまたは対照Ｆａｂに後で結合するために、ブロモアセトアミドで誘導体化される。
【０２２０】
使用したＦｍｏｃ保護アミノ酸誘導体は、以下の標準的に推奨されるものである：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｌｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨなどで、例えば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏＣｈｅｍから供給される。他に何も指定されていない場合、アミノ酸の天然Ｌ型が使用される。Ｎ末端アミノ酸を、アルファアミノ基（例えば、Ｎ末端にＴｙｒを有するペプチド用のＢｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ）でＮ末端Ｂｏｃ保護とともに用いた。ＳＰＰＳは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国アリゾナ州ツーソン８５７１４）製のＳｙｍｐｈｏｎｙＸ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＳｙｍｐｈｏｎｙＸ固相ペプチド合成装置）上でのＦｍｏｃベースの化学を使用して実施した。Ｃ末端ペプチドの調製に使用した樹脂は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ｗａｎｇ  ＬＬ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、負荷、例えば０．２９ｍｍｏｌ／ｇ）であった。Ｆｍｏｃ−脱保護は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで達成した。１時間のペプチドカップリングを、アミノ酸／オキシマピュア／ＤＩＣ溶液（４倍のモル過剰でＤＭＦ中０．３Ｍ／０．３Ｍ／０．３Ｍ）を使用して実行した。Ｍｔｔ基は、樹脂をＤＣＭ（５ｘ１０ｍＬ）で洗浄する前に、ＨＦＩＰ／ＴＩＳ／ＤＣＭ（７５：２．５：２２．５、ｖ／ｖ／ｖ）（３ｘ１０ｍＬｘ３０分）で洗浄することにより除去した。合成を、上述のようにＦｍｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−ｇＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨで継続した。樹脂をフィルターを備えたガラス反応器に移した。
【０２２１】
ＤＭＦ（１６ｍｌ）中のブロモ酢酸（０．８４０ｇ、１２当量、６ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（０．４００ｍｌ、５．２当量、２．６ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間静置し、樹脂上に注いだ。一晩静置した。濾過し、ＤＭＦ（４ｘ６ｍｌ）およびＤＣＭ（４ｘ６ｍｌ）で洗浄した。
【０２２２】
ペプチドを、混合物（９５ＴＦＡ：２．５ＴＩＰＳ：２．５水、８０ｍｌ）中で３時間、室温で攪拌することにより、樹脂から切断した。濾過し、樹脂を少量のＴＦＡで洗浄した。溶液を１２個のプラスチックバイアルに分割し、ドライアイスで冷却したジエチルエーテル（２５ｍｌ）を各バイアルに加え、さらに約２０ｍｌのエーテルを充填した。沈殿物をスピンダウンした。上清を除去し、生成物を分取ＨＰＬＣで精製した。
ＬＣＭＳ＿３４：Ｒｔ＝２．４５分、Ｍ／３＝１３２８．２
【０２２３】
実施例１４：
ＧＬＰ−１対照Ｆａｂ複合体の合成
本実施例は、ＧＬＰ−１ペプチドおよび対照Ｆａｂの複合体の合成を説明する。複合体の構造を図１４に示す。
【０２２４】
この複合体は、実施例１３のペプチド誘導体を代わりに３．６当量で使用したことを除いて、実施例１１に記載したのと同じプロトコルを使用して、実施例１３のブロモアセチルペプチド誘導体（図１３）を用いた実施例４の対照ＦａｂのＣｙｓアルキル化によって調製した。
【０２２５】
図１４のＮ末端部分（残基１〜４３８）は、配列番号５の対照Ｆａｂと同一である（実施例２および４を参照されたい）。
【０２２６】
図１４のＣ末端部分（残基４３９〜４６９）は、化学物質５：−Ａｄｏ−ｇＧｌｕ−Ａｄｏ−のリンカーの遠位Ａｄｏの実態を除いて、図１３と同一であり、図１３で誘導体化したブロモアセトアミドが、化学物質１化学リンカー（化学物質１：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−）を介してＣｙｓ３８２のチオール基と接続される。したがって、リンカー全体が、化学物質２：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ａｄｏ−ｇＧｌｕ−Ａｄｏ−である。
【０２２７】
得られた生成物の以下の特性を決定した：
ＬＣＭＳ＿３６：Ｒｔ＝３．１４分、ｍ／３０＝１７２０．０、ｍ／３２＝１６１２．６
【０２２８】
実施例１５：ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体の合成
本実施例は、ＧＬＰ−１ペプチドおよび抗ＴｆＲ−Ｆａｂの複合体の合成を説明する。複合体の構造を図１５に示す。
【０２２９】
この複合体は、実施例１４について上述したのと同じプロトコルを使用して、実施例１３のブロモアセチルペプチド誘導体（図１３）を用いた実施例３の抗ＴｆＲ−ＦａｂのＣｙｓアルキル化によって調製した。
【０２３０】
図１５のＮ末端部分（残基１〜４３３）は、配列番号３の抗ＴｆＲ−Ｆａｂと同一である（実施例１および３を参照されたい）。
【０２３１】
図１５のＣ末端部分（残基４３４〜４６４）は、化学物質５：−Ａｄｏ−ｇＧｌｕ−Ａｄｏ−のリンカーの遠位Ａｄｏの実態を除いて、図１３と同一であり、図１３で誘導体化したブロモアセトアミドが、化学リンカー（化学物質１：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−）を介してＣｙｓ３７７のチオール基と接続される。したがって、リンカー全体が、化学物質２：−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ａｄｏ−ｇＧｌｕ−Ａｄｏ−である。
【０２３２】
得られた生成物の以下の特性を決定した：
ＬＣＭＳ＿３６：Ｒｔ＝３．５５分、ｍ／３０＝１７００．４、ｍ／３２＝１５９４．２
【０２３３】
薬理学的方法
実施例１６：
蛍光標識したＧＬＰ−１  ＴｆＲ融合タンパク質のインビボイメージング
本実施例は、「活性」および「不活性」ＧＬＰ−１−Ｆａｂ融合タンパク質（ＴｆＲと結合するという意味では「活性」、ＴｆＲと結合しないという意味では「不活性」）の脳の様々なＧＬＰ−１受容体発現領域へのアクセスを検討する。２つの融合タンパク質は、１つの同じＧＬＰ−１受容体作動薬化合物を含むが、Ｆａｂ部分が異なる。これは、血液脳関門（ＢＢＢ）によって保護される脳領域へのアクセスにおいて、活性融合タンパク質と不活性融合タンパク質との間に実質的な差があるかどうかを判断するためのものである。本研究は、マウスを用いた急性研究である。
【０２３４】
化合物投与：
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄、Ｔａｃｏｎｉｃ、ｎ＝４／群）は、実施例８、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの蛍光標識ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ融合タンパク質（「ＧＬＰ−１−活性ＴｆＲ」）、または実施例９、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの蛍光標識ＧＬＰ−１対照Ｆａｂ融合タンパク質（「ＧＬＰ−１不活性ＴｆＲ」）の静脈内単回用量を受けた。化合物の投与後６時間（「６Ｈ」）イソフルランでマウスを麻酔し、１０ｍｌのヘパリン化（１０Ｕ／ｍｌ）生理食塩水、続いて１０ｍｌの１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で経心臓灌流により安楽死させた。脳を摘出し、１０％ＮＢＦに浸し、さらに処理するまで４℃で一晩保存した。
【０２３５】
組織の浄化：
脳を脱水し、ジベンジルエーテル（ＤＢＥ）で飽和させて、水の除去および屈折率の一致によるスキャン中の光の散乱を最小化した。脳組織を、脱塩Ｈ２Ｏ（ｗ／ｖ）５０／８０／９６／９９％／２ｘ１００％で希釈した段階的テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で、各ステップについて６〜１２時間室温で脱水した。次に、各ステップで６〜１２時間、３ｘＤＢＥで室温で脳を浄化した。
【０２３６】
ライトシート蛍光顕微鏡法（ＬＳＦＭ）によるスキャン：
ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ＩＩ  ＬＳＦＭシステム（Ｌａｖｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１０．３２μｍの等方性解像度で脳試料をスキャンした。データ収集を、自家蛍光をイメージングするための６２０／６０ｎｍ励起フィルターおよび６８０／３０ｎｍ発光フィルター、ならびに特定のシグナルをイメージングするための７１０／７５ｎｍ励起フィルターおよび７８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して実行した。
【０２３７】
画像解析：
画像は、ｚ平面（２Ｄ）の単一平面画像である。提示された特定のシグナルの画像における組織の自家蛍光の寄与を最小化するために、スペクトルのアンミキシングを実施した。アンミキシングは、インポートしたｔｉｆｆファイル上のＩｍａｒｉｓ（Ｒｅｌｅａｓｅ７．６．５、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施した。特定チャネル内の推定自家蛍光の寄与は、非特定記録内の選択されたボクセルと特定チャネル内の対応するボクセルとの間のボクセル強度の比率に基づいて計算され、除去した。比率は、非特定記録のヒストグラムに基づいて選択された４０セットのボクセルについて計算した。アンミキシングアルゴリズムはＭａｔｌａｂ（Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２ｂ、ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）で記述され、ＩｍａｒｉｓのＸＴプラグインとして適用した。
【０２３８】
画像は、Ｅｌａｓｔｉｘソフトウェアライブラリバージョン４を使用して、視覚化および定量化のために共通の参照アトラススペースに登録した（Ｋｌｅｉｎ，Ｓｔｅｆａｎ，ｅｔ  ａｌ．「Ｅｌａｓｔｉｘ：ａ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｅ  ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ．」ＩＥＥＥ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ２９．１（２０１０）：１９６−２０５）。源画像ＩＳ（ｘ）は、ＩＳ（Ｔ（ｘ））をＩＴ（ｘ）と空間的に位置合わせする座標変換Ｔ（ｘ）を見つけることにより、標的アトラス画像ＩＴ（ｘ）に登録した。初期化のためにアフィン座標変換を使用し、その後、源と標的との間の相互情報に関して反復的に最適化された非剛性のｂ−スプライン座標変換を行った。ＬＳＦＭデータのマッピングのための登録パラメータは、Ｒｅｎｉｅｒらで使用したものと同様であった。画像登録後、正しい登録のために手動品質チェックを行った。登録された脳の一部がずれていた場合、これらの個々の領域に接続された測定値を除去した。したがって、一部の脳領域については、各群内の試料の数が３〜４の間で変化した。定量化は、個々の脳領域内のすべてのボクセルの非混合強度値を合計することによって行われ、これらの領域の化合物からの蛍光シグナルの合計を示す。合計シグナルは任意の単位（「ＡＵ」）で報告される。合計シグナルは、個々の脳領域の比混合ボクセル強度値の合計である。したがって、合計シグナルは、これらの領域の化合物からの合計蛍光シグナルを示す。（Ｒｅｎｉｅｒ，Ｎｉｃｏｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．「Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｇｅｎｅｓ．」Ｃｅｌｌ（２０１６））。
【０２３９】
結果：
画像分析の結果を図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、および１６Ｄに示す。
【０２４０】
図１６Ａでは、蛍光標識した化合物（「ＧＬＰ−１−活性ＴｆＲ」および「ＧＬＰ−１−非活性ＴｆＲ」）の合計強度は、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）を発現する脳領域内で定量化した。合計シグナルは任意の単位（ＡＵ）で報告され、平均を表す。図１６Ｂは、ＧＬＰ−１Ｒを発現するがＢＢＢを欠く脳室周囲器官の例における蛍光標識した化合物の強度を示す。図１６Ｃは、ＢＢＢによって保護されるＧＬＰ−１Ｒを発現する脳構造の例における蛍光標識した化合物の強度を示す。図１６Ｄは、ＧＬＰ−１Ｒを発現しない脳領域の例における蛍光標識した化合物の強度を示す。様々な脳領域に使用される略語は、略語のリストで定義される。
【０２４１】
図１６Ａは、ＧＬＰ−１Ｒ発現領域において、ＧＬＰ−１非活性ＴｆＲと比較して、ＧＬＰ−１活性ＴｆＲから蛍光シグナルがより高かったことを示す。
【０２４２】
活性ＴｆＲ化合物と不活性ＴｆＲ化合物との間の差は、ＧＬＰ−１Ｒを発現しているが、ＢＢＢを欠いている脳室周囲器官では小さかった（図１６Ｂ）。ＴｆＲは毛細血管および脳実質の両方で発現する。したがって、これらの領域における活性ＴｆＲ化合物からの寄与がわずかに高いことは、ＧＬＰ−１Ｒによる結合に加えて、化合物のＴｆＲ結合からの寄与を示す。
【０２４３】
また、このシグナルは、ＧＬＰ−１Ｒを発現しない脳領域でも定量化した（図１６Ｄ）。ここで、シグナルは両方の化合物でほぼ同じであり、活性ＴｆＲ化合物からのわずかに高い寄与は、化合物のＴｆＲ結合からの寄与を示す。
【０２４４】
ＢＢＢによって保護される脳構造の例を図１６Ｃに示す。ここで、ＧＬＰ−１不活性ＴｆＲと比較して、ＧＬＰ−１活性ＴｆＲからのシグナルが著しく増加したことは、ＧＬＰ−１成分がＧＬＰ−１自体が容易にアクセスできない領域に運ばれたことを示している。ＴｆＲとの結合は、このシグナルにも寄与し得るが、ＧＬＰ−１Ｒを発現する領域における２つの化合物間の差は、ＧＬＰ−１Ｒのない領域よりもはるかに大きい（図１６Ｄ）。これは、シグナルの大部分がＧＬＰ−１Ｒとの結合に由来することを示唆している。
【０２４５】
結論：
ＢＢＢによって保護される脳構造に見られる活性ＴｆＲ化合物と不活性ＴｆＲ化合物との間のシグナル強度の明瞭かつ顕著な差（図１６Ｃ）は、ＧＬＰ−１Ｒ作動薬の抗ＴｆＲ  Ｆａｂへのカップリングが、ＧＬＰ−１Ｒ作動薬がＧＬＰ−１Ｒ作動薬によって容易にアクセスできない脳の領域にＧＬＰ−１Ｒ作動薬を標的化する手段として使用できることを示す。ＡＣＢ、ＤＭＨ、ＬＨＡ、およびＬＨなどのこれらの領域の一部は、体重の調節および食物摂取量に関連する行動において重要であることが示されている。
【０２４６】
実施例１７：ＧＬＰ−１インビトロ効力
本実施例の目的は、本明細書で開示される活性および不活性ＧＬＰ−１融合体ならびに複合体のＧＬＰ−１活性を試験することである（活性／不活性という用語は、それぞれトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）と結合する／結合しない能力を指す）。ＧＬＰ−１活性は、ＧＬＰ−１インビトロ効力として決定され、全細胞アッセイにおけるヒトＧＬＰ−１受容体活性化の尺度である。
【０２４７】
原理：
インビトロ効力は、レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトＧＬＰ−１受容体の応答を測定することによって決定した。アッセイは、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現し、プロモーターと結合したｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）のＤＮＡおよびホタルルシフェラーゼ（ＣＲＥルシフェラーゼ）の遺伝子を含む安定にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞株において行った。ヒトＧＬＰ−１受容体が活性化される場合、ｃＡＭＰの生成をもたらし、これは順に、ルシフェラーゼタンパク質の発現をもたらす。アッセイインキュベーションが完了した時に、ルシフェラーゼ基質（ルシフェリン）を追加し、酵素がルシフェリンをオキシルシフェリンに変換して、生物発光を生じる。発光はアッセイの読み取り値として測定される。
【０２４８】
化合物のアルブミンとの結合を試験するために、血清アルブミンの非存在下、および血清アルブミンのかなり高い濃度（１．０％の最終アッセイ濃度）の存在下で、アッセイを実施することができる。血清アルブミンの存在下でのインビトロ効力、ＥＣ５０値の増加は、血清アルブミンとの親和性を示し、動物モデルにおける試験物質の長期の薬物動態プロファイルを予測する方法を表す。
【０２４９】
細胞培養および調製：
このアッセイで使用した細胞（クローンＦＣＷ４６７−１２Ａ／ＫＺ１０−１）は、親細胞株としてＢＨＫＴＳ１３を有するＢＨＫ細胞であった。細胞を、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現するクローン（ＦＣＷ４６７−１２Ａ）に由来し、ＣＲＥルシフェラーゼでのさらなるトランスフェクションによって確立し、現在のクローンを得た。細胞は、細胞培養培地中、５％ＣＯ２で培養した。それらをアリコートし、液体窒素中に保存した。各アッセイ前に、アリコートを、ＰＢＳ中で吸収し、２回洗浄した後、アッセイ特異的緩衝液中の所望濃度で懸濁した。９６ウェルプレートの場合、５ｘ１０３細胞／ウェルの最終濃度になるように懸濁液を作製した。
【０２５０】
材料：
以下の化学物質をアッセイで使用した：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（１０％ｖ／ｖ）（Ｇｉｂｃｏ  ２４０４）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ９５１１）、オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ５５０３）、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  １１８８０−０２８）、１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ  １５６３０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ  １００ｘ（Ｇｉｂｃｏ  ３５０５０）、およびｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ６０１６７５７）。
【０２５１】
緩衝液：
細胞培養培地は、１０％ｗ／ｖ  ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １６１４０−０７１）、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５１４０−１２２）、２４０ｎＭ  ＭＴＸ（メトトレキサート、Ｓｉｇｍａ  Ｍ９９２９）、および１％ｗ／ｖ  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５１４０−１２２）を有するＤＭＥＭ培地からなる。
【０２５２】
アッセイ培地は、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、および１ｘＧｌｕｔａｍａｘからなる。１％アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の２％オボアルブミン、０．２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、および２％ＨＳＡからなる  ０％アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の２％ｗ／ｖオボアルブミンおよび０．２％ｖ／ｖ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８からなる。
【０２５３】
手順：
１．細胞ストックを３７℃水浴で解凍した。
２．細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
３．細胞をカウントし、アッセイ培地中に５ｘ１０３細胞／５０μｌ（１ｘ１０５細胞／ｍｌ）に調整した。細胞の５０μｌアリコートをアッセイプレートの各ウェルに移した。
４．試験化合物のストックを、０％ＨＳＡ  ＣＲＥルシフェラーゼアッセイについては０％アッセイ緩衝液中に、および１％ＨＳＡ  ＣＲＥルシフェラーゼアッセイについては１％アッセイ緩衝液中に０．２μＭの濃度に希釈した。化合物を１０倍希釈して、２ｘ１０−７Ｍ、２ｘ１０−８Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１１Ｍ、２ｘ１０−１２Ｍ、２ｘ１０−１３Ｍ、および２ｘ１０−１４Ｍの濃度を得た。
５．化合物またはブランクの５０μｌアリコートを希釈プレートからアッセイプレートに移した。化合物は、１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、１ｘ１０−１１Ｍ、１ｘ１０−１２Ｍ、１ｘ１０−１３Ｍ、および１ｘ１０−１４Ｍの最終濃度で試験した。
６．アッセイプレートを５％  ＣＯ２のインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。
７．アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で１５分間放置した。
８．ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅの１００μｌアリコート＋試薬をアッセイプレートの各ウェルに加えた（試薬は感光性であった）。
９．各アッセイプレートをアルミホイルで覆って遮光し、室温で３０分間振盪した。
１０．各アッセイプレートをマイクロタイタープレートリーダーで読み取った。
【０２５４】
計算および結果：
プレートリーダーからのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアに転送した。ソフトウェアは、非線形回帰を実行した（ｌｏｇ（作動薬）対  応答）。ソフトウェアによって計算し、ｐＭで報告されたＥＣ５０を以下の表１に示す。別々のアッセイプレートで各試料について最低２つの複製を測定した。報告された値は複製の平均である。いくつかの例では、複数のアッセイが実行され、この場合、報告されたデータは平均化された複製の平均である。
【０２５５】
【表Ｄ】
2021528437.tif 000013
【０２５６】
すべての化合物には、それらがＧＬＰ−１受容体作動薬であることを確認する効力データがある。すべての化合物は、１０００ｐＭを下回る０％ＨＳＡでのＥＣ５０に対応する良好なＧＬＰ−１インビトロ効力を有していた。
【０２５７】
実施例１８：ＧＬＰ−１受容体結合
本実施例の目的は、本明細書で開示される活性および不活性ＧＬＰ−１融合体ならびに複合体のインビトロでのＧＬＰ−１受容体結合活性を試験することである（活性／不活性という用語は、それぞれトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）と結合する／結合しない能力を指す）。受容体結合は、ヒトＧＬＰ−１受容体への化合物の親和性の尺度である。
【０２５８】
原理：
ヒトＧＬＰ−１受容体との結合は、競合結合アッセイで測定した。このタイプのアッセイでは、標識リガンド（この場合は１２５Ｉ−ＧＬＰ−１）が受容体と結合される。各試験化合物を一連の濃度でヒトＧＬＰ−１受容体を含む単離した膜に添加し、標識したリガンドの置換をモニタリングした。受容体結合は、標識したリガンドの半分が受容体から置換された濃度として報告され、ＩＣ５０値であった。誘導体のアルブミンとの結合を試験するために、アッセイは、血清アルブミンのかなり低い濃度（最大０．００１％（ｗ／ｖ）最終アッセイ濃度）、および血清アルブミンのかなり高い濃度（２．０％（ｗ／ｖ）の最終アッセイ濃度）の存在下で実行され得る。血清アルブミンの存在下でのＩＣ５０値の増加は、血清アルブミンとの親和性を示す。
【０２５９】
材料：
以下の化学物質をアッセイで使用した：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ１６５３）、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  １１８８０−０２８）、Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５１４０−１２２）、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０１３１−０２７）、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  １５６３０）、ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５５７５−０３８）、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １４１９０−０９４）、ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １６１４０−０７１）、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ  １．０５８３２．１０００）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ  ０８５０Ｃ３３５）、ＳＰＡ粒子（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）  ＳＰＡビーズ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＲＰＮＱ０００１）、［１２５Ｉ］−ＧＬＰ−１］−（７−３６）ＮＨ２（自社生成）、ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（商標）−９６（Ｐａｃｋａｒｄ  ６００５２９０）。
【０２６０】
緩衝液１は２０ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳと１０ｍＭ  ＥＤＴＡからなり、ｐＨを７．４に調整した。緩衝液２は２０ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳと０．１ｍＭ  ＥＤＴＡからなり、ｐＨを７．４に調整した。アッセイ緩衝液は、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳからなり、ｐＨを７．４に調整した。８％アルブミンストックは、８％（ｗ／ｖ）のアッセイ緩衝液で溶解したＨＳＡからなる。０．０２％アルブミンストックは、アッセイ緩衝液中に０．０２％（ｗ／ｖ）で溶解したＨＳＡからなる。
【０２６１】
細胞培養および膜調整：
このアッセイで使用した細胞（クローンＦＣＷ４６７−１２Ａ）は、親細胞株としてＢＨＫＴＳ１３を有するＢＨＫ細胞であった。細胞はヒトＧＬＰ−１受容体を発現する。細胞を、５％  ＣＯ２、ＤＭＥＭ中１０％ｗ／ｖ胎児仔ウシ血清、および１％ｗ／ｖＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）で増殖させた。膜調製物を作るために、細胞を約８０％のコンフルエンスまで増殖させた。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、回収した。細胞を短時間の遠心分離を用いてペレット化し、細胞ペレットを氷上に保持した。細胞ペレットを、適切な量の緩衝液１（例えば、１０ｍｌ）中で２０〜３０秒間、ＵＬＴＲＡ−ＴＨＵＲＲＡＸ（商標）分散装置でホモジネートした。ホモジネートを１５分間遠心分離した。ペレットを１０ｍｌの緩衝液２に再懸濁（ホモジネートした）し、遠心分離した。このステップをもう一度繰り返した。得られたペレットを緩衝液２に再懸濁し、タンパク質濃度を測定した。膜をアリコートし、マイナス８０℃で保存した。
【０２６２】
手順：
１．低ＨＳＡ（０．００１％）の存在下での受容体結合アッセイでは、５０μｌのアッセイ緩衝液をアッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイはステップ３で継続した。
２．高ＨＳＡ（２．０％）の存在下での受容体結合アッセイでは、５０μｌの８％アルブミンストックをアッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイはステップ３で継続した。
３．試験化合物を連続希釈して、８ｘ１０−７Ｍ、８ｘ１０−８Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１１Ｍ、８ｘ１０−１２Ｍ、および８ｘ１０−１３Ｍの濃度を得た。２５μｌをアッセイプレート中の適切なウェルに添加した。
４．細胞膜のアリコートを解凍し、作業濃度に希釈した。５０ｕｌをアッセイプレート中の各ウェルに添加した。
５．ＷＧＡ  ＳＰＡビーズを、２０ｍｇ／ｍｌのアッセイ緩衝液中に懸濁した。懸濁液を、アッセイプレートに添加する直前に、アッセイ緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌに希釈した。５０ｕｌをアッセイプレート中の各ウェルに添加した。
６．アッセイプレートの各ウェルに２５ｕｌの４８０ｐＭの［１２５Ｉ］−ＧＬＰ−１］−（７−３６）ＮＨ２の溶液を添加してインキュベートを開始した。合計数／ウェルを測定するために、２５μｌのアリコートを保留した。
７．アッセイプレートを３０℃で２時間インキュベーした。
８．アッセイプレートを１０分間遠心分離した。
９．アッセイプレートをＰａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ装置で読み取った。
【０２６３】
計算：
ＴｏｐＣｏｕｎｔ装置からのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアに転送した。ソフトウェアは複製の値を平均化し、非線形回帰を実行した。ＩＣ５０値をソフトウェアによって計算し、ｎＭで報告した。
【０２６４】
結果：
以下の結果が得られた。
【０２６５】
【表Ｅ】
2021528437.tif 000014
【０２６６】
すべての誘導体は、６０ｎＭを下回るＩＣ５０（低アルブミン）を有した。
【０２６７】
実施例１９：トランスフェリン受容体取り込み阻害
本実施例の目的は、本明細書で開示される例示的な活性および不活性ＧＬＰ−１融合体ならびに複合体のインビトロでのトランスフェリン受容体結合活性を試験することである（活性／不活性という用語は、それぞれトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）と結合する／結合しない能力を指す）。トランスフェリン受容体結合は、マウストランスフェリン受容体への化合物の親和性の尺度である。
【０２６８】
原理：
トランスフェリン受容体標的抗体の取り込みを阻害する実施例１１〜１２および１４〜１５の複合体の能力を、競合取り込みアッセイで測定した。Ｆａｂ複合体の各セット（実施例１１および１２、ならびに実施例１５および１４）中の２つの化合物は、同じＧＬＰ−１Ｒ作動薬部分を含むが、ＴｆＲへの結合に関して、それぞれ「活性」および「不活性」であるＦａｂ部分に関しては異なる。
【０２６９】
各化合物を、一連の濃度で、市販のマウス線維芽細胞株（ＭＥＦ−１）に、設定濃度の蛍光標識したＦａｂ断片（以下に説明）とともに添加した。各化合物による標識したＦａｂ断片の細胞取り込みの阻害は、最大シグナルの半分が得られた濃度として報告した（ＩＣ５０値）。
【０２７０】
材料：
蛍光標識したＦａｂ断片の調製：
蛍光標識したＦａｂ断片を、実施例１の抗ＴｆＲ−ＦａｂのＣｙ５標識によって作製した。Ｃｙ５標識抗したＴｆＲ−Ｆａｂを図１Ｂに示し、Ｃｙ５色素がＣｙｓの３７７位に付着していることが示されている。
【０２７１】
２２６μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を、実施例１の抗ＴｆＲ−Ｆａｂの溶液（６．１５ｍｇ／ｍｌ、１７．５ｍｌ）に添加した。２５ｕＬのＴＣＥＰ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ７．０）を、２４７５ｕｌの緩衝液（２０ｍＭ  ＴＥＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）で希釈した。５１７ｕＬ（１．２５当量、２．９ｕｍｏｌ）の希釈したＴＣＥＰ溶液を、抗ＴｆＲ−Ｆａｂ溶液に添加した。溶液を−８０℃で保存した。
【０２７２】
１ｍＬの上記で生成した溶液（６．１５ｍｇ、１３１ｎｍｏｌ）のアリコートをアルゴンでバブル化し、１００ｕＬの乾燥ＤＭＦに溶解した１ｍｇのＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｙ５マレイミド単反応性色素）を添加した。混合物をアルゴン下で一晩、５℃で保持した。
【０２７３】
生成物を、以下のプロトコルを使用して、Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎｎ脱塩カラム、７Ｋ  ＭＷＣＯ、５ｍｌで精製した：カラムを１０００Ｇで２分間回転させた。２．４ｍｌを洗い流した。２．４ｍｌのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、毎回１０００Ｇで２分間回転させた。３回実施した後、生成物（１ｍｌ＋０．７ｍｌ洗浄）をカラムの上に配置し、１０００Ｇで２分間回転させた。生成物（１．７ｍｌ）を回収した。正確な質量の計算値（ｍ＋ｚ）／ｚ（無次元）：４７８５９．８８。検出される正確な質量（ｍ＋ｚ）／ｚ（無次元）：４７８５９．８３。
【０２７４】
以下の追加の化学物質をアッセイで使用した：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ３１９６６−０２６）、Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５１４０−１２２）、Ｇ４１８  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０１３１−０２７）、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  １５６３０）、ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５５７５−０３８）、ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １６１４０−０７１）、ＰＦＡ  ４％（Ｃｈｅｍ  Ｃｒｕｚ  Ｓｃ−２８１６９２）、ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ９５１１）、コラーゲンコーティングされたイメージングプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ７３４−０３１９）、ＤＡＰＩ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ  Ｂ２２６１）、小麦胚芽凝集素−Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｗ３２４６４）、ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ  １４０２５）。
【０２７５】
手順：
１．細胞プレートに播種する前に、ＭＥＦ−１細胞を、ＤＭＥＭ中の５％ＣＯ２、１０％ｗ／ｖ胎児仔ウシ血清、および１％ｗ／ｖペニシリン／ストレプトマイシンで増殖させた。各アッセイの前日に、細胞を５０００細胞／ウェルに播種した。
２．アッセイ日に、細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含有するＨＢＳＳで洗浄した。
３．試験化合物を連続希釈して、２ｘ１０−６Ｍ、２ｘ１０−７Ｍ、２ｘ１０−８Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１１Ｍ、２ｘ１０−１２Ｍ、および２ｘ１０−１３Ｍの濃度を得た。１００μｌの各々をアッセイプレート中の適切なウェルに添加した。
４．各ウェルに蛍光標識したＦａｂ断片を５ｎＭの最終濃度で添加した。
５．プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、緩衝液を除去し、細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含有するＨＢＳＳで洗浄した。
６．５０μｌの冷４％ＰＦＡをヒュームフード内で添加した。プレートを室温で１０分間インキュベートした後、ＰＦＡを除去した。
７．５０μｌの標識溶液をプレートに添加し、１０分間インキュベートした。標識溶液には、１：２００（ｖ／ｖ；１０ｍｇ／ｍｌストックから）のＤＡＰＩおよび１：２００（ｖ／ｖ；５ｍｇ／ｍｌストックから）のＷＧＡ−Ａｌｅｘａ４８８が含まれた。アッセイプレートを室温で１０分間インキュベートした。
８．アッセイプレートを１００μｌのＨＢＳＳで３回洗浄し、洗浄ステップ後に１００μｌのＨＢＳＳを各ウェルに添加した。
９．アッセイプレートを、ハイコンテンツメージング装置（ＩＮ  Ｃｅｌｌ  ２２００装置、ＧＥ）で読み取った。
【０２７６】
計算：
ＩＮ  Ｃｅｌｌ装置からのデータを、装置に付属のソフトウェアを使用して解析した。核をＤＡＰＩ染色した核を使用して定義し、細胞境界をＷＧＡ−Ａｌｅｘａ４８８染色に基づいて構築した。内在化される蛍光の量は、装置のＣｙ５チャネルで視認可能な顆粒を定義し、内在化Ｃｙ５標識Ｆａｂ断片に対応することによって計算した。各細胞における顆粒の数および強度を計算した。さらなる計算に使用した装置からの読み取り値は、顆粒の総面積を各取得フィールドの細胞数で割ったものであった。典型的な実験には、ウェルあたり２０倍の顕微鏡対物レンズを使用した３２個のフィールドが含まれた。データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアに転送し、Ｘ軸にｌｏｇ  Ｍ（Ｍは試験化合物のモル濃度）、ｙ軸に細胞あたりの総顆粒面積を含む濃度応答曲線としてプロットした。ソフトウェアは、非線形回帰を実行した。ＩＣ５０値をソフトウェアによって計算し、ｎＭで報告した。
【０２７７】
結果：
以下の結果が得られた：
【０２７８】
【表Ｆ】
2021528437.tif 000015
【０２７９】
活性Ｆａｂ（ＴｆＲ−Ｆａｂ）を有するすべての誘導体は、２０ｎＭを下回るＩＣ５０値を有し、一方で不活性Ｆａｂ（対照Ｆａｂ）を有するすべての誘導体は、＞１０００ｎＭのＩＣ５０を有した。
【０２８０】
実施例２０：マウスでのインビボ研究
本実施例の目的は、肥満関連の特徴に焦点を当てて、ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体がインビボで生物学的に活性であるかを評価することである。
【０２８１】
本実施例のパートＩは、急性静脈内投与した除脂肪マウスにおける本発明の「活性」ＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体の食物摂取量の低下能力の研究を報告する。
【０２８２】
パートＩＩでは、この「活性」複合体と「非活性」ＧＬＰ−１対照−Ｆａｂ複合体の比較を報告し、ＴｆＲアームがパートＩで得られた結果に寄与するかを判断する。
【０２８３】
パートＩＩＩは、パートＩおよびＩＩで観察した食物摂取量の減少が体重低下につながるかを調査する目的で、亜慢性的に治療した食餌誘発性肥満マウスでの研究を報告する。
【０２８４】
Ｉ．実施例１１のＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体のインビボ研究
研究デザイン：
雄のＣ５７Ｂｌ６Ｊマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に、実施例１１のＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体を２４時間にわたって静脈内に急性投与し（０〜１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ｂｉｏｄａｑ自動モニタリングシステム（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて、食物摂取量を研究した。簡潔に述べると、マウスを食物（Ａｌｔｒｏｍｉｎ、カタログ番号１３１４、Ｌｉｐｐｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および水道水を適宜利用できる状態で、１２時間の明暗サイクル下で維持した。投与前に、マウス（群当たりｎ＝４〜６）を体重が均等に一致する５つの治療群のうちの１つに割り当て、試験および取扱い手順に適応させるために、投与の８日前にｂｉｏｄａｑシステムに配置した。実験の日に、マウスに、以下の表に従って、時間０で、ビヒクルまたは実施例１１の化合物のいずれかを静脈内に投与した：
【０２８５】
【表Ｇ】
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【０２８６】
血漿曝露：
２４時間後、血液試料を、血漿分析中にペプチドを安定化することを目的とした５０ｍｌ  Ｔｒａｓｙｌｏｌ、１０．０００ＫＩＵ（カリクレイン不活化剤単位）、０．５ｍｌ  ２０ｍＭＶａｌ−Ｐｙｒ（１６．４８ｍｇ  Ｖａｌ−ｐｙｒ／４ｍｌ  Ｈ２ＯのｐＨは１Ｍ  ＨＣｌによって７．４に調整される）に溶解したプロテアーゼ阻害剤カクテルＦｌｕｋａ０３６６５（３．０９７ｇ  Ｋ３ＥＤＴＡ（ＭＷ  ４０６．５３）を含むＥＤＴＡチューブに、舌下神経叢を介して採取した。その後、麻酔下で放血とそれに続く頸椎脱臼により動物を安楽死させた。血液試料を氷上に保持し、４℃で３０分以内に遠心分離（４分ｘ４０００ｇ）した。次に、５０μｌの血漿を適切にラベル化したチューブに分注し、ドライアイス上に置き、分析までマイナス８０℃で保存した。
【０２８７】
実施例１１の化合物（およびパートＩＩおよびＩＩＩについては実施例１２の化合物も）の血漿濃度を、ＬＯＣＩ（発光酸素チャネリング免疫測定法）によって測定した。簡潔に述べると、ＬＯＣＩ試薬には、２つのラテックスビーズ試薬（ドナーおよびアクセプタビーズ）と、ＧＬＰ−１のＮ末端エピトープを認識するビオチン化モノクローナル抗体が含まれていた。光感受性色素を含有するドナービーズ試薬をストレプトアビジンでコーティングした。第２のビーズ試薬であるアクセプタビーズは、サンドイッチを構成するＧＬＰ−１のＣ末端に特異的な別のモノクローナル抗体と複合体化された。アッセイ中、三つの反応物質を、血漿中の実施例１１の化合物（または、パートＩＩおよびＩＩＩでは、実施例１１の化合物または実施例１２の化合物のいずれか）と混合して、ビーズ凝集免疫複合体を形成した。複合体の励起により、ドナービーズから一重項酸素分子が放出され、アクセプタビーズに誘導され、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで測定された化学発光応答を誘発した。生成された光の量は、１秒あたりのカウント（ｃｐｓ）として報告され、分析対象物の濃度に比例した。
【０２８８】
すべての標準物質、ＱＣ−試料およびＥＤＴＡ血漿中の未知試料を、４回測定で分析した。
【０２８９】
分析手順は以下のとおりであった：
アクセプタビーズ／ビオチン化抗体およびドナービーズの両方の作業溶液をＬＯＣＩ緩衝液で調製した。
【０２９０】
１μＬの血漿試料／標準物質／ＱＣをウェルごとに適用した。
【０２９１】
ＧＬＰ−１のＮ末端エピトープを認識するビオチン化モノクローナル抗体およびＧＬＰ−１のＣ末端に特異的なモノクローナル抗体でコーティングされたアクセプタビーズを含む１５μＬの作業溶液を各ウェルに添加した。
【０２９２】
プレートを密封し、黒色の蓋で覆った。
【０２９３】
アッセイは、１８〜２２℃で１時間インキュベートした。
【０２９４】
ＬＯＣＩ緩衝液で希釈した３０μＬのストレプトアビジンコーティングドナービーズを、緑色光下で添加した。
【０２９５】
プレートを黒色の蓋で覆い、１８〜２２℃で３０分間インキュベートした。
最後に、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎで読み取った。
【０２９６】
解析は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎソフトウェアによって制御されるＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーを使用して実行した。装置応答（１秒あたりのカウント数）をＬＯＣＩ計算機にエクスポートし、そこで血漿中濃度を計算した。
【０２９７】
標準物質：実施例１１の標準物質の化合物（およびパートＩＩおよびＩＩＩについては、実施例１２の標準物質の化合物も）の希釈ラインを、４００．０００〜４２ｐｍｏｌ／Ｌの範囲をカバーするマウス血漿プールで調製した。マウス血漿プールを０  ｐＭ標準物質（ブランク）として含めた。標準物質はＭｉｃｒｏｎｉｃチューブにマイナス１８℃で保存した。
【０２９８】
性能：
定量下限（ＬｏＱ）を４０ｐｍｏｌ／Ｌと決定した。定量上限（ＵＬｏＱ）を２５．０００ｐＭと決定した。不精密性（ＣＶ）は、１２回の連続分析で３つの試料を測定し、同じ分析で３つの試料のそれぞれを２１回測定することにより評価した。全体のＣＶは＜１０％であった。
【０２９９】
材料：
試薬：
ＬＯＣＩ緩衝液：２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｈ−３３７５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ  ８．２２１８４）、１０ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ（Ｆｌｕｋａ  ０３６６４）、２ｍｇ／ｍｌ  Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ  ５５１００５００９００７）、０．５％  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ＯＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａ  ５５７３）、０．０５％  ＢＧＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−７５１６）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｍｅｒｃｋ  ８．２２１８４）、０．０１％  Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ４８９１２−Ｕ）、０．０１％  Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（Ｂｉｏｌ．Ｉｎｄｕｓｔ．０３−０３５−１）、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＨＢＲ１（Ｓｃａｎ．Ｌａｂ．３ＫＣ５３３）、ｐＨ７．４
【０３００】
希釈および標準物質用のマウス血漿：
雌のマウス血漿（Ｃ５７ＢＬ／６）をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｋ２  ＥＤＴＡ、カタログ番号ＭＳＥＰＬＥＤＴＡ２−Ｃ５７−Ｆから入手した。
【０３０１】
アッセイプレート：
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＰＰＮ  ６００５３５９。
【０３０２】
データ分析：
Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ（登録商標）ソフトウェアをすべての分析に使用した。データを平均値として示した。統計分析を、２元配置分散分析とそれに続くすべての群を比較するボンフェローニの多重比較検定を使用して実行した。
【０３０３】
結果：
結果を図１７に示し、図１７Ａは、ｇでの累積食物摂取量（ＦＩ）を示し、図１７Ｂは、投与の２４時間後に測定したｐＭでの血漿曝露レベルを示す。データを平均値として示す。
【０３０４】
図１７Ａからは、実施例１１の化合物が用量依存的な様式で食物摂取量を減少させたことが明白である。また図１７Ｂは、用量が高いほど、血漿曝露が高くなることを示す。これは、化合物がインビボで生物学的に活性であることを確認する。
【０３０５】
ＩＩ．実施例１１および１２の「活性」および「不活性」化合物のヘッドトゥーヘッドのインビボ研究
実施例１１のＧＬＰ−１抗ＴｆＲ−Ｆａｂ複合体のＴｆＲアームが、上記で決定されたように食物摂取量の低下能力に寄与したかを決定するために、実施例１２のＧＬＰ−１対照−Ｆａｂ複合体を用いてヘッドトゥーヘッドの比較を行い、ここでは同じＧＬＰ−１Ｒ作動薬が不活性なＦａｂと結合し、対照化合物として機能する。
【０３０６】
簡潔に述べると、除脂肪Ｃ５７Ｂｌ６Ｊマウスを、上記のパートＩのように、食物および水を適宜利用できる状態で、１２時間の明暗サイクル（午前１１時に消灯）で維持した。また、上記のパートＩと同様に、マウスを、体重が均等に一致する３つの治療群のうちの１つに割り当てられる前に、７日間、ｂｉｏｄａｑ食物摂取量モニタリングシステムに馴化させた。実験の日に、マウスに、以下の表に従って、ビヒクルまたは１００ｎｍｏｌ／ｋｇの実施例１１の化合物または実施例１２の化合物のいずれかを投与した：
【０３０７】
【表Ｈ】
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【０３０８】
次の２４時間にわたって１時間ごとに食物摂取量をモニタリングし、その後、麻酔下で放血とそれに続く頸椎脱臼によりマウスを安楽死させた。
【０３０９】
マウスのサテライト群を使用して、各化合物の曝露プロファイルを生成した。上記のパートＩで説明したように、血液試料を舌下神経叢を介してプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＥＤＴＡチューブに採取し、血漿を収集して曝露について分析した。各化合物について、静脈内投与１時間後、４時間後、８時間後、１０時間後、１６時間後、１８時間後、および２４時間後の時点あたりｎ＝３マウスの低密度なサンプリングを介して採血した。血漿試料は、上記のパートＩで述べたように、曝露について分析した。
【０３１０】
データ分析：
Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ（登録商標）ソフトウェアをすべての分析に使用した。データを平均値として示した。統計分析を、２元配置分散分析とそれに続くすべての群を比較するボンフェローニの多重比較検定を使用して実行した。
【０３１１】
結果：
結果を図１８に示し、図１８Ａは、ｇでの累積食物摂取量（ＦＩ）を示し、図１８Ｂは、２４時間にわたって測定した血漿曝露レベル（ｐＭでの血漿濃度）を示す。
【０３１２】
図１８Ａから、両方のＧＬＰ−１化合物が、２４時間の観察にわたって、ビヒクル処置マウスと比較して食物摂取量を減少させたことは明らかである。しかしながら、食物摂取量の低下は、実施例１２の化合物で処置したマウスと比較して、実施例１１の化合物で処置したマウスにおいて有意に大きかった。図１８Ｂは、実施例１２の対照化合物で処置したマウスにおいて血漿曝露レベルが類似またはそれ以上であることを示し、類似体間の食物摂取量の低下の差がＰＫにおける差とは無関係であることを示す。むしろ、これらのデータは、実施例１１の化合物中の活性ＴｆＲ  Ｆａｂが、より大きな食物摂取量の低下に寄与したことを示す。
【０３１３】
ＩＩＩ．実施例１１および１２の「活性」および「不活性」化合物を用いた食餌誘発性肥満マウスにおける亜慢性インビボ研究、体重低下の決定
急性食物摂取量の低下の減少が肥満の前臨床モデルにおける体重低減につながるかを決定するために、次に、１９日間亜慢性的に治療したＤＩＯマウスで上記のパートＩおよびＩＩで使用した化合物を比較した。簡潔に述べると、雄のＣ５７Ｂｌ６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）（ｎ＝７９）は、約４週齢で開始した６０％高脂肪食（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）で維持された。約２０週齢で肥満マウスを試験施設に輸送し、温度および湿度が制御された環境、ケージあたりｎ＝１０、１２〜１２時間の明暗サイクル（午後１１：００に消灯）で飼育した。４日後、高脂肪食給餌群のマウスを６０％〜４５％の高脂肪食（ＨＦＤ  Ｄ１２４５１、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）に切り替えて、粉々になるのを防ぎ、より正確に食物摂取量を測定した。すべてのマウスをこの時点で単独で飼育し、さらに２週間、それらの新しい環境に順応させた。食物および水はいつでも適宜利用できた。
【０３１４】
体組成（Ｅｃｈｏ  ＭＲＩ  ７００、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を投与前の５日目に測定し、投与前の３日目にマウスを脂肪および除脂肪組織量を均等に一致させた３つの治療群のうちの１つに割り当てた。
【０３１５】
投与の前日から始めて、食物摂取量および体重を毎日モニタリングした。化合物は、以下の表６に従って、１日目から始め、午後１２時３０分から開始して毎日投与した。マウスに、最初の１〜４日目に静脈内に投与し、その後、５〜１９日目に皮下投与した。血漿曝露用の血液試料は、１９日目の投与の２時間後に収集し、上記のパートＩで説明したように分析した。
【０３１６】
【表Ｉ】
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【０３１７】
結果：
結果を図１９に示し、図１９Ａは、平均体重低下（％）を示し、図１９Ｂは、１９日目の投与の２時間後に測定した平均血漿濃度（ｐＭ）を示す。
【０３１８】
図１９Ａから、両方の化合物がビヒクル処置マウスと比較して体重を低下させたことは明らかである。図１９Ｂは、血漿中曝露レベルの差が群間で類似していたことを示すが、実施例１１の「活性」化合物で治療したＤＩＯマウスは、実施例１２の「不活性」化合物で治療したＤＩＯマウスよりも多く体重を減少させ、ＴｆＲ  Ｆａｂを含む「活性」化合物が、対照化合物と比較して体重低減に追加の利点を与えることを示す。
【０３１９】
本発明のある特定の特徴を本明細書において例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更、および均等物がここで当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのような全ての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021528437.tif 000032
【図１４】
2021528437.tif 000033
【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2021528437.tif 000036
【図１６Ｃ】
2021528437.tif 000037
【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
2021528437.tif 000039
【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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