(57)【要約】  本発明は、生物学的サンプル、例えば、未加工または加工済み植物材料由来のサンプル、好ましくはキャノーラミールなどの脱脂植物種子ミールからの、膜結合型タンパク質の効率的な単離のための方法および手段を提供する。生物学的サンプルは、例えば、高温、圧力、または化学的処理を施すことにより高度に加工されてもよく、種子マトリックス（seed matrices）ならびに他の典型的植物組織、例えば、種子、穀粒（grain）、葉、根、または花粉に由来してもよい。本発明は、新規抽出バッファー（MEB）および本発明の方法でのその利用の提供を含み、このとき、該バッファーは、10〜12.5の強アルカリ性pHを有し、かつ0.5％〜5％のレベルの可溶性濃度の界面活性剤を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.5％〜5％のレベルの可溶性濃度の界面活性剤を含有するpH10〜12.5の緩衝試薬（膜抽出バッファー（MEB））中でサンプルをインキュベートするステップを含む、生物学的材料からの膜結合型タンパク質の抽出のための方法。
【請求項２】
pH11.5〜12.5の溶解バッファーMEBを添加する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
35℃〜55℃のインキュベーション温度でサンプルをインキュベートする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
1.5〜5％の可溶性濃度のイオン性界面活性剤を有する溶解バッファーMEBを添加するステップを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
1.5〜3％LDSを含有する溶解バッファーMEBを添加するステップを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
溶解バッファーMEBが還元剤を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
溶解バッファーMEBが、DTT、BMEまたはTCEP-HCLを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
溶解バッファーMEBが、20mM〜70mM TCEPと同等な1種以上の還元剤を含む、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
MEBバッファーが、20mM〜70mM TCEP、または30〜120nM DTTまたは1〜5％BMEを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
pH依存性緩衝剤、または塩溶液を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
緩衝剤が、Tris-CL、HEPES、CAPS、および/またはリン酸ナトリウムバッファーNaH2PO4/Na2HPO4である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
緩衝剤が、
i. 5〜300mM Tris-CL、
ii. 20〜40mM HEPES、
iii. 10〜40mMリン酸ナトリウム（NaH2PO4/Na2HPO4）、および/または
iv. 50mM〜500mM CAPS
である、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
粘性剤を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
粘性剤を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法であって、該粘性剤が10％〜25％グリセロールである、方法。
【請求項１５】
pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、および還元試薬20〜70mM TCEP、好ましくは50mMを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法であって、緩衝試薬が、100mM〜150mM Tris-Cl、好ましくは120mM、および10％〜20％グリセロールである、方法。
【請求項１６】
前記インキュベーション温度でのインキュベーション時間が10分間〜180分間である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
抽出が複数回の連続的抽出として行なわれ、好ましくは抽出が3回以下、繰り返され、さらにより好ましくは抽出が2回以下、最も好ましくは1回のみ行なわれる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
組織が、植物サンプルに由来する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
組織が、葉（leave）、種子、穀粒、葉、根、または花粉に由来する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
材料が、脱脂植物種子ミールである、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
以下のステップ：
a. 界面活性剤および、任意により、還元剤を含有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の溶解バッファーMEB中、35℃〜55℃の温度でサンプルをインキュベートするステップ、
b. 膜結合型タンパク質を抽出するステップ、
c. タンパク質の分析のために、抽出物を希釈してpHを調整するステップ、
d. 事前に沈殿、再懸濁または可溶化を行なわずに、タンパク質を分析するステップ
を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
抽出されたタンパク質が、ウエスタンブロッティング、質量分析、等電点電気泳動、または二次元タンパク質分離において分析される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
pH10〜12.5の緩衝試薬、および0.5％〜2.5％の界面活性剤含有量および還元剤を含む組成物。
【請求項２４】
pH10.0〜pH12.5において、以下を含む、請求項23に記載の組成物：
i. 1.5％〜2.5％LDS、および
ii. 30mM〜70mM TCEP。
【請求項２５】
生物由来の組織および/または膜をさらに含む、請求項23または24に記載の組成物。
【請求項２６】
35℃〜55℃の温度を有する、請求項23または25に記載の組成物。
【請求項２７】
以下のステップのうちの1以上を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法：
a. サンブルを粉砕するステップ、
b. サンプルを、ドライアイス上で冷却するステップ、
c. サンプルの重量を量るステップ、
d. 請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法で用いられる抽出バッファーMEBまたは請求項23〜26に記載の組成物を添加することにより、粉砕および冷却されたサンプルからポリペプチドを抽出するステップ、および
e. サンプルを遠心分離し、新規試験管に上清を移すステップであって、それにより試験管が冷却される、ステップ。
【請求項２８】
以下のステップを含む、請求項1〜22または27のいずれか1項に記載の方法：
a. 植物ミールを準備するステップ、
b. 予熱した請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法で用いられる抽出バッファーMEBまたは請求項23〜26に記載の組成物を添加するステップ、
c. サンプルを粉砕するステップ、
d. 30℃〜45℃で、5〜15分間、サンプルをインキュベートするステップ、
e. サンプルを遠心分離し、上清を新規な容器に移すステップ、および
f. 上清を分析するステップ。
【請求項２９】
膜結合型である可能性のあるポリペプチドに特異的に結合する1種以上の抗体を用いることにより、1種以上のポリペプチドの定量分析を行うステップを含む、請求項1〜2および27または28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ、好ましくはトランスジェニックデサチュラーゼまたはエロンガーゼである、請求項1〜9および16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプル、例えば、未加工または加工済み植物材料由来のサンプル、好ましくはキャノーラミールなどの脱脂植物種子ミールからの、膜結合型タンパク質の効率的な単離のための方法および手段を提供する。生物学的サンプルは、例えば、高温、圧力、または化学的処理を施すことにより高度に加工されてもよく、種子マトリックス（seed matrices）ならびに他の典型的植物組織、例えば、種子、穀粒（grain）、葉、根、または花粉に由来してもよい。本発明は、新規抽出バッファー（MEB）および本発明の方法でのその利用の提供を含み、このとき、該バッファーは、10〜12.5の強アルカリ性pHを有し、かつ0.5％〜5％のレベルの可溶性濃度の界面活性剤を含む。
【背景技術】
【０００２】
生物学的組織およびサンプルからの扱いにくいタンパク質の上首尾かつ効率的な抽出のためには、最適な溶解バッファー成分および溶解条件を特定することが必要である。
【０００３】
タンパク質の抽出に関して直面する最も困難な組織タイプは、穀粒ミール、例えば、キャノーラなどのアブラナ属の種に由来する、例えば、油糧種子植物の高度加工済み種子マトリックスに由来するミールである。ミールは、油抽出の副生成物であり、多量のタンパク質を含有し得る。ミールは、高温（80〜120℃での加熱およびトースト）、圧力（圧縮）、および過酷な化学的（ヘキサン溶媒抽出）条件を加えることにより、高度に加工される。ミール中に含有される膜結合型タンパク質は変性され、典型的な抽出バッファーを用いて抽出することは極めて困難である。
【０００４】
農業バイオテクノロジー産物の規制解除に重要なデータを作成するために、定量的免疫アッセイが用いられる。有効な免疫アッセイ法の最も重要な側面の1つは、所与のマトリックスからのアナライトの抽出可能性である。キャノーラミールからのタンパク質の高い抽出可能性を実現することは、その高度に加工された特性に起因して、非常に困難である。加えて、膜結合型タンパク質の扱いにくい性質は、キャノーラミールからの抽出可能性の困難性に対して、複合的影響を有する。
【０００５】
したがって、生物学的サンプルから、例えば、植物ミールから膜タンパク質を効率的に抽出できる方法を開発することが、非常に重要である。
【０００６】
標準的な抽出バッファーは、特に高度加工（高温および高pH）植物ミールから、例えばキャノーラミールのような油糧種子植物ミールから、膜タンパク質を抽出するためには不十分であることが見出された。標準的抽出バッファーは、例えば、http://www.vbcf.ac.at/fileadmin/user_upload/ProTech/SW_Buffer_compatibility.pdfおよび実施例5に記載されている。
【０００７】
Klockmanらは、タンパク質の品質に負の影響を与えることなく、タンパク質回収を最大化する抽出法を開発した（J. Agric. Food Chem., 1997, 45, 3867-3870）。室温での0.4％NaOHを含有するアルカリ性分散溶液を用いたタンパク質の単離が記載された。Klockemanらは、キャノーラミールからのタンパク質の抽出が、室温での高pH NaOH溶液中でのサンプルの攪拌、およびそれに続く、酢酸を用いた沈殿によって可能であることを示した。この方法は、可溶性キャノーラタンパク質の下流分析には有用である一方で、タンパク質、具体的には膜結合型であるタンパク質の迅速かつ効率的な免疫アッセイ分析には役立たなかった。
【０００８】
Gerzhivaらは、キャノーラミールからのタンパク質の抽出効率を改善するための過去のいくつかの試みにもかかわらず、アルカリ抽出が未だに最も効果的であると結論付けた。そして、著者らは、キャノーラミールからのタンパク質抽出に対する、pH、塩添加およびゼータ電位/比濁分析の影響を調べている（Food Chemistry, 2016, 243-252）。著者らは、pHが、タンパク質抽出可能性に対して最も強力な作用を有し、最大の抽出可能性は、室温でのpH12で得られたことを結論付けている。この高pHでは、抽出は、バッファーの塩条件およびイオン強度の影響を受けない。
【０００９】
しかしながら、Gerzhivaらは、Klockmanらと同様に、生物学的サンプルからの、例えば、植物ミールからの、膜タンパク質の効果的抽出に関するいかなる方法も提供しなかった。
【００１０】
先行技術に記載された方法は沈殿法であり、これは、免疫アッセイ分析に先立って、再懸濁および/または可溶化を必要とするであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Klockman et al., J. Agric. Food Chem., 1997, 45, 3867-3870
【非特許文献２】Gerzhiva et al., Food Chemistry, 2016, 243-252
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、タンパク質の迅速分析（immediate analysis）を可能にするが、効率的に、例えば、高度に加工されたミールから膜タンパク質を抽出する、新規抽出方法が必要とされていた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明は、以下のステップを含む、生物学的材料からの膜結合型タンパク質の抽出のための方法を提供する：
0.5％〜3％の界面活性剤を含有するpH10〜12.5の緩衝試薬中、35℃〜55℃のインキュベーション温度でサンプルをインキュベートするステップ。
【００１４】
高温、強力な変性剤および/または界面活性剤が、膜結合型タンパク質の効率的抽出をもたらすことが見出された。その結果、迅速分析に適用可能な抽出方法を求める中で、新規抽出バッファー処方および最適化された抽出条件が開発され、それにより、油糧種子ミール、例えば、キャノーラミールから、膜結合型タンパク質を効率的に抽出することが可能となった。
【００１５】
界面活性剤および高pHの組み合わせは、高度に加工された植物種子マトリックスからの膜結合型タンパク質の高い抽出率を確実にするために必要であった。加えて、抽出は、バッファー成分の溶解性を与え、かつ抽出された膜タンパク質の凝集を防止するために、30℃超の温かい温度で行なうことができる。
【００１６】
還元剤と組み合わせてこの手順を用いることによって、例えば、最大100％の、非常に高いタンパク質抽出可能率（％）を達成することができ、このことは、高油糧種子ミールからの、例えば、キャノーラ、または他の高度加工植物種子マトリックス、ならびに他の典型的な植物組織（例えば、種子、穀粒、葉、根、または花粉）から抽出されたタンパク質のレベルを首尾よく定量することを可能にする。
【００１７】
加えて、本発明の方法は、好ましくはサンプルを予め再懸濁および/または可溶化することなく、分析ステップのためにpHを調整または中性化するための希釈後の迅速分析に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】抽出可能性に対するpHの影響を示す図である。レーンC1:1−分子量ラダー；レーンC1:2〜C1:7−参照タンパク質を用いて作成された標準曲線；レーンC1:9−pH8で抽出されたタンパク質1発現トランスジェニック組織；レーンC1:15−pH10で抽出されたタンパク質1発現トランスジェニック組織；レーンC1:21−pH12で抽出されたタンパク質1発現トランスジェニック組織。pH8バッファーを用いたミール抽出は71.3ng/mLのタンパク質1を抽出し、pH10バッファーを用いた抽出は102.14ng/mLのタンパク質1を抽出し（pH8から43％の増加）、かつpH12バッファーを用いた抽出は174.54ng/mLのタンパク質1を抽出した（pH10から71％の増加）。pH8抽出と比較して、pH12での抽出は、2.45倍多くの抽出タンパク質を生じた。
【図２】抽出可能性に対する界面活性剤および還元剤の影響を示す図である。レーンC1:1−分子量ラダー；レーンC1:2〜C1:7−完全MEBバッファー中の参照タンパク質を用いて作成された標準曲線；レーンC1:8−完全MEBバッファー中で抽出された野生型キャノーラミールサンプル；レーンC1:9−完全MEBバッファー中で抽出されたトランスジェニックキャノーラミールサンプル；レーンC1:10〜C1:15−TCEP（還元剤）を含まないMEBバッファー中の参照タンパク質を用いて作成された標準曲線；レーンC1:16−TCEP（還元剤）を含まないMEBバッファー中で抽出された野生型キャノーラミールサンプル；レーンC1:17−TCEP（還元剤）を含まないMEBバッファー中で抽出されたトランスジェニックキャノーラミールサンプル；レーンC1:18〜C1:23−LDS（界面活性剤）を含まないMEBバッファー中の参照タンパク質を用いて作成された標準曲線；レーンC1:24−LDS（界面活性剤）を含まないMEBバッファー中で抽出された野生型キャノーラミールサンプル；レーンC1:25−LDS（界面活性剤）を含まないMEBバッファー中で抽出されたトランスジェニックキャノーラミールサンプル。抽出されたタンパク質を、対応する標準曲線に対して定量化した。完全MEBは146.72ng/mLのタンパク質1を抽出し、還元剤（TCEP）を含まないMEBは70.40ng/mLのタンパク質1を抽出し、かつ界面活性剤（LDS）を含まないMEBはトランスジェニックミールサンプルからタンパク質1を抽出できなかった。この結果は、界面活性剤（例えば、LDS）が、ミールマトリックスから膜タンパク質を抽出するために必要であることを実証する。界面活性剤と組み合わせた還元剤およびpH12での抽出は、ミールからの膜タンパク質の抽出を改善する。例えば、TCEPを含まない場合と比較してTCEPが抽出バッファー中に含められた場合に、2.1倍多くのタンパク質1が抽出された。
【図３】タンパク質抽出可能性に対するMEBの影響（膜タンパク質1）を示す図である。膜タンパク質の抽出可能性に対するMEBの影響を評価するために、完全MEBバッファー中で、トランスジェニックおよび野生型対照キャノーラサンプルを抽出した。トランスジェニックサンプルは3回抽出され、1回目の抽出で抽出されたタンパク質の割合(%)として、抽出可能性を評価した。タンパク質抽出物は、すべてのサンプルを分析する準備が整うまで、40℃で維持した。レーンC1:1−分子量ラダー；レーンC1:2〜C1:7−MEBバッファー中の参照タンパク質を用いて作成された標準曲線；レーンC1:8−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の1回目の抽出；レーンC1:9−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の2回目の抽出；レーンC1:10−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の3回目の抽出；レーンC1:11−S1サンプルの3回目の抽出と同時に行なわれたMEBバッファー中での新規トランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の1回目の抽出；レーンC1:12−S1サンプルの3回目の抽出と同時に行なわれたMEBバッファー中での野生型キャノーラミールサンプルの1回目の抽出。本実験は、MEBが、1回目の抽出でタンパク質1のうちの大部分を抽出すること（レーンC1:8）を実証する（100%抽出可能性）。野生型キャノーラミールサンプルでは、目的のタンパク質は全く抽出されなかった（レーンC1:12）。加えて、本発明者らは、トランスジェニックタンパク質1が、実験の間40℃で安定であることを確認した（レーンC1:8とC1:11を比較されたい）。
【図４】タンパク質抽出可能性に対するMEBの影響（膜タンパク質2）を示す図である。レーンC1:1−分子量ラダー；レーンC1:2〜C1:7−MEBバッファー中の参照タンパク質を用いて作成された標準曲線；レーンC1:8−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の1回目の抽出；レーンC1:9−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の1回目の抽出；レーンC1:10−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の1回目の抽出；レーンC1:11−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の2回目の抽出；レーンC1:12−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の2回目の抽出；レーンC1:13−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の2回目の抽出；レーンC1:14−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の3回目の抽出；レーンC1:15−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の3回目の抽出；レーンC1:16−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の3回目の抽出。3種類のトランスジェニックキャノーラミールサンプルを、MEB中でそれぞれ3回抽出した。すべてのサンプルにおいて、トランスジェニックタンパク質2の大部分が1回目の抽出で抽出された（100%抽出可能性）。
【図５】タンパク質抽出可能性に対するMEBの影響（膜タンパク質3）を示す図である。レーンC1:1−分子量ラダー；レーンC1:2〜C1:7−MEBバッファー中の参照タンパク質を用いて作成された標準曲線；レーンC1:8−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の1回目の抽出；レーンC1:9−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の2回目の抽出；レーンC1:10−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の3回目の抽出；レーンC1:11−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の1回目の抽出；レーンC1:12−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の2回目の抽出；レーンC1:13−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の3回目の抽出；レーンC1:14−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の1回目の抽出；レーンC1:15−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の2回目の抽出；レーンC1:16−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の3回目の抽出。3種類のトランスジェニックキャノーラミールサンプルを、MEB中でそれぞれ3回抽出した。すべてのサンプルにおいて、トランスジェニックタンパク質2の大部分が1回目の抽出で抽出された（100%抽出可能性）。
【図６】タンパク質抽出可能性に対するMEBの影響（可溶性タンパク質4）を示す図である。レーンC1:1−分子量ラダー；レーンC1:2〜C1:7−MEBバッファー中の参照タンパク質を用いて作成された標準曲線；レーンC1:8−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の1回目の抽出；レーンC1:9−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の2回目の抽出；レーンC1:10−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS1の3回目の抽出；レーンC1:11−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の1回目の抽出；レーンC1:12−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の2回目の抽出；レーンC1:13−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS2の3回目の抽出；レーンC1:14−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の1回目の抽出；レーンC1:15−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の2回目の抽出；レーンC1:16−MEBバッファー中でのトランスジェニックキャノーラミールサンプルS3の3回目の抽出。3種類のトランスジェニックキャノーラミールサンプルを、MEB中でそれぞれ3回抽出した。すべてのサンプルにおいて、トランスジェニックタンパク質2の大部分が1回目の抽出で抽出された（100%抽出可能性）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
用語「膜タンパク質」または「膜結合型タンパク質」は、生物学的膜またはマトリックスに連結したすべてのタンパク質を包含し、限定するものではないが、例えば、細胞壁または細胞小器官の膜内のポリペプチドのような、細胞の膜内のタンパク質が挙げられ、限定するものではないが、膜貫通型タンパク質および表在性膜タンパク質などのタンパク質が挙げられ；タンパク質は、限定するものではないが、種子マトリックスならびに他の典型的植物組織（例えば、穀粒、葉、根、または花粉）に結合したタンパク質のように、様々な手段により付着していてもよい。
【００２０】
温かい温度で抽出を行なうことは、抽出された膜タンパク質の凝集を防止しながら、バッファー成分の溶解性を改善することが見出された。高pHでの界面活性剤（例えば、LDS）と高温との組み合わせは、効率的抽出を可能にした。還元剤（例えば、TCEP）との組み合わせでは、キャノーラミールからの膜結合型タンパク質の非常に高度な、多くの場合には完全な抽出を達成できた。
【００２１】
この手順を用い、非常に高いタンパク質抽出可能率（％）を達成することによって、植物ミールから抽出されたタンパク質レベルを首尾よく定量することが可能になった。したがって、本発明の方法および本発明のバッファーは、他の高度加工植物種子マトリックスならびに他の典型的植物組織（例えば、種子、穀粒、葉、根、または花粉）から、不溶性タンパク質および可溶性タンパク質を首尾よく抽出することを可能にする。
【００２２】
したがって、本発明の方法では、膜結合型タンパク質を効率的に抽出することが特定された溶解バッファー成分および抽出条件の新規組み合わせは、高pH（例えば、pH10〜pH12.0）の、高濃度の界面活性剤（例えば、0.5％〜5％）を含有する、最適化された膜結合型タンパク質溶解バッファー（本明細書中では、「膜抽出バッファー」または「MEB」）を用いる。
【００２３】
この処方を用いた抽出を高いインキュベーション温度（例えば、35℃〜55℃）で行なう場合、膜結合型タンパク質が効率的に抽出され、得られた清澄化抽出物は、例えば、免疫ブロッティング前に中性pHへと抽出物を希釈した後での、迅速分析に好適である。抽出されたタンパク質は、例えば、質量分析、等電点電気泳動、タンパク質の二次元ゲル分離、プロテオーム分析またはウエスタンブロッティングにより、分析することができる。
【００２４】
したがって、本発明の方法は、0.5または1.5％〜5％、より好ましくは1.5％〜3％、最も好ましくは約2％の界面活性剤含有量を含むMEBバッファー中でサンプルをインキュベートするステップを含む。界面活性剤の濃度は、温度および界面活性剤の溶解度に依存する。したがって、界面活性剤およびその含有量は、本発明の方法で用いられる正確な温度およびpHに応じて選択される。可溶性濃度の界面活性剤が、本発明の方法で用いられる。
【００２５】
したがって、生物学的材料からの膜結合型タンパク質の抽出のための方法は、1.5％〜5％のレベルの可溶性濃度の界面活性剤を含有する、pH10〜12.5の溶解バッファー中でサンプルをインキュベートするステップを含む。
【００２６】
さらに、本発明は、0.5％〜5％の可溶性濃度の界面活性剤を含有する、pH10〜12.5の溶解バッファーMEB中、35℃〜55℃のインキュベーション温度でサンプルをインキュベートするステップを含む、生物学的材料からの膜結合型タンパク質の抽出のための方法に関する。
【００２７】
界面活性剤は、タンパク質およびサンプル中で用いられる組織タイプに応じて、イオン性または非イオン性界面活性剤であり得る。さらなる界面活性剤に関する例は、例えばhttp://www.vbcf.ac.at/fileadmin/user_upload/ProTech/SW_Buffer_compatibility.pdfの下に記載される通りの、TrintonX-100、NP40、C7bzO、CHAPS、デオキシコール酸ナトリウム、LDSまたはSDSである。
【００２８】
TritonX-100は、例えば、0.5％〜3％で溶解バッファー中に用いられる。LysoFos Choline 12は、例えば、0.5％〜10％で溶解バッファー中に用いられる。NP40は、例えば、0.5％〜1％で溶解バッファー中に用いられる。C7Bzoは、例えば、0.5％〜2％で溶解バッファー中に用いられる。CHAPSは、例えば、0.5％〜2％で溶解バッファー中に用いられる。デオキシコール酸ナトリウムは、例えば、0.5％〜2％で溶解バッファー中に用いられる。SDSは、例えば、0.5％〜2％で溶解バッファー中に用いられる。
【００２９】
界面活性剤は、SDSまたはLDSなどのイオン性界面活性剤であり得る。例えば、SDSは、高pHおよび低温ではLDSよりも溶解性が低いことが、当技術分野で公知である。本発明の方法の温度に関して、LDSは十分に可溶性であることが見出された。したがって、本発明の方法は、1〜3％LDS、例えば、1,5％〜2.5％LDS、例えば、約2％LDSの界面活性剤含有量を含むMEBバッファー中でサンプルをインキュベートするステップを含む。
【００３０】
本発明の方法でのインキュベーションのために選択されるインキュベーション温度は過酷な抽出条件を与えるが、しかしながら、タンパク質が凝集しないことが必要とされる。したがって、インキュベーションは、30℃超のインキュベーション温度で行なわれ、例えば、インキュベーション温度は、35℃超、例えば、37℃以上、40℃以上、42℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上であるが、しかしながら、75℃未満、さらにより好ましくは70℃未満、例えば、65℃以下、60℃以下、55℃以下、50℃以下、47℃以下、45℃以下、42℃以下、例えば、約35℃、約37℃、約40℃または約42℃または約45℃、または約47℃または約50℃または約60℃である。したがって、本発明の方法のインキュベーションは、35℃〜55℃、または37℃〜50℃または40℃〜47℃で行なうことができる。
【００３１】
迅速分析、例えば、ウエスタンブロット分析に適用可能な抽出方法を求める中で、最適化された抽出条件と組み合わせ、キャノーラミールから膜結合型タンパク質を効率的に抽出する、新規抽出バッファー処方が開発された。本手順は、例えば、サンプルの希釈による、例えば、バッファーpHの中和のみの後での、ウエスタンブロット法を用いたタンパク質の迅速分析を可能にする。
【００３２】
さらに、本発明の方法のインキュベーションステップ中に用いられる溶解バッファーは、還元剤を含む。還元剤は当技術分野で周知であり、例えば、DTT（DL-ジチオトレイトール；Clelands Reagenz）、BME（β-メルカプトエタノール）またはTCEP-HCL（Tris(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩）がある。標準的な溶解バッファー中では、DTTの濃度は、5〜50mMの範囲内であり、BMEは200mM〜1Mの範囲内であり、かつTCEPは0.5〜10mMの範囲内である。
【００３３】
1種の還元剤または還元剤の混合物を、5mM〜100mM TCEP-HCLと同様の還元能力を生じる場合に、用いることができる。好ましくは、還元能力は、例えば、20mM〜70mM TCEP-HCL、40mM〜60mM TCEP-HCL、例えば、約50mM TCEP-HCLの還元能力と同等である。
【００３４】
本発明の方法のインキュベーションで用いられるMEB溶解バッファーは、例えば、5mM〜100mM TCEP、例えば、20mM〜70mM TCEP-HCL、40mM〜60mM TCEP、例えば、約50mM TCEPを含有する。したがって、MEB溶解バッファーは、例えば、20mM TCEP以上、30mM TCEP以上、40mM TCEP以上、および100mM TCEP以下、80mM TCEP以下、70mM TCEP以下、または60mM TCEP以下を含有する。一実施形態では、TCEPの含有量は、約50mMである。
【００３５】
本発明の方法で用いられるMEB溶解バッファーはまた、例えば、30〜120nM DTT、例えば、50nM〜100nM DTTを含有することもできる。
【００３６】
本発明の方法で用いられるMEB溶解バッファーはまた、例えば、1〜5％BME、例えば、2％〜4％BMEを含有することもできる。
【００３７】
イオン性界面活性剤としてのLDSおよび還元剤としてのTCEPの高pH（例えば、約pH12.0）での組み合わせは、キャノーラミールからの膜結合型タンパク質のほとんど完全な抽出を可能にした。温かい温度で抽出を行うことは、抽出された膜タンパク質の凝集を防止しながら、バッファー成分の溶解性を維持することを助ける。
【００３８】
本手順を用いると、例えば、最大100％の、非常に高いタンパク質抽出可能率（％）を達成することができ、それにより、例えば、キャノーラ由来の高油糧種子ミール、または他の高度加工植物種子マトリックスならびに他の典型的な植物組織（例えば、種子、穀粒、葉、根、または花粉）から抽出されたタンパク質のレベルを首尾よく定量化することが可能になる。
【００３９】
膜抽出バッファーMEBは、適切なpH依存性緩衝剤、または塩溶液、または水溶液（例えば、水）を含有することができる。また、緩衝成分を省くこともできる。溶解バッファーのための標準的な緩衝試薬は、例えば、Tris-CL、HEPES、CAPS、またはリン酸ナトリウムバッファーNaH2PO4/Na2HPO4である。通常は、緩衝剤の濃度は以下の通りである：5〜300mM Tris-CL、20〜40mM HEPES、10〜40mMリン酸ナトリウム（NaH2PO4/Na2HPO4）、または50mM〜500mM CAPS。
【００４０】
したがって、本発明の方法は、緩衝剤を含むかまたは含まない、溶解バッファーMEB中でのインキュベーションを含むことができる。
【００４１】
インキュベーションで用いられるバッファーは、10〜12.5のpH、例えば、pH11〜pH12.5、例えば、約pH12を有する。
【００４２】
好ましくは、溶解バッファーMEBは、5〜300mM Tris-CL、例えば、約110mM、約150mM、約200mM、または約250mM、例えば、150mM未満、例えば、140mM以下、例えば、50〜250mM、70〜200mM、100〜150mMを含有する。
【００４３】
本発明の方法で用いられる溶解バッファーMEBはまた、一実施形態では、粘性剤（例えば、グリセロールまたはスクロース）を含有する。例えば、本発明の方法で用いられる溶解バッファーMEBは、5％〜30％グリセロール、好ましくは10〜25％グリセロール、例えば約20％グリセロールを含有する。
【００４４】
したがって、本発明の方法は、溶解バッファーMEB中でのサンプルを含む膜タンパク質のインキュベーションを含み、溶解バッファーMEBは、以下を含む：
i. pH10〜12.5の緩衝試薬、および0.5％〜2.5％の界面活性剤含有量、または
ii. pH10〜12.5の緩衝試薬、および0.5％〜3％の界面活性剤含有量（好ましくは、LDSまたはSDS）、および粘性剤、または
iii. pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、好ましくは、約2％LDS、および粘性剤、または
iv. pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、好ましくは、約2％LDS、および還元試薬、または
v. pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、好ましくは、約2％LDS、および還元試薬、および粘性剤、または
vi. pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、好ましくは、約2％、還元試薬20〜70mM TCEP、好ましくは50mM、および粘性剤グリセロール（好ましくは15〜25％で）、または
vii. 緩衝試薬であって、pH10〜12.5の100mM〜150mM Tris-Cl（好ましくは120mM）である、緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、還元試薬20〜70mM TCEP（好ましくは50mM）、および10％〜20％グリセロール、または
viii. 緩衝試薬であって、約pH12の約120mM Tris-Clである、緩衝試薬、約2％のLDS含有量、および還元試薬約50mM TCEP、および約20％グリセロール。
【００４５】
本発明の方法内でのインキュベーションは、適切な時間にわたって行なわれ：短すぎる場合、抽出効率が損なわれ、長すぎる場合、タンパク質が凝集に見舞われる。インキュベーション温度でのインキュベーション時間は、例えば、2分間〜180分間、例えば、5分間〜60分間、例えば、約5、10または15分間である。
【００４６】
抽出は、単回抽出または複数回の連続的抽出として行なわれ、好ましくは、抽出は3回以下、繰り返され、さらにより好ましくは、抽出は2回以下、最も好ましくは1回のみ、行なわれる。
【００４７】
本発明の方法は、生物学的サンプル、例えば、植物体または植物体由来の部分もしくは断片（種子、穀粒、葉、根、もしくは花粉または細胞サンプルなど）からの膜結合型タンパク質の効率的な抽出を可能にする。本発明の方法は、特に、植物由来ミールからの、例えば、油糧種子植物ミール（アブラナ属の種由来のミールなど、セイヨウアブラナミールまたはキャノーラミールなど）からの、またはダイズミールからの、効率的な抽出を可能にする。キャノーラ脱脂ミールの生成方法は、Donna M. Klockeman, Romeo Toledo, and Kevin A. Sims. Isolation and Characterization of Defatted Canola Meal Protein. (1997). J. Agric. Food Chem. 45:3867-3870に記載されている。
【００４８】
バッファー中の種子ミールの含有量は、1％以上、例えば、5％以上、10％以上、15％以上、17％以上、20％以上、25％以上、しかし60％未満、例えば、50％、30％、25％以下であり得る。したがって、本発明の方法におけるミールの含有量は、例えば2％〜50％、例えば、5％〜40％、例えば、10％〜20％、または5％〜15％であり得る。
【００４９】
ミールは、例えば、植物ミール、例えば、アブラナ属の種のような油糧種子植物、特にキャノーラからのミールなどに由来する。キャノーラミールのようなミールは、キャノーラ種子油生成の副生成物である。
【００５０】
したがって、一実施形態では、サンプル中に含まれるタンパク質は、変性している。種子ミール、例えば、高油糧植物種子油（例えば、キャノーラ種子に由来する）の生成は、多くの場合、過酷な加工条件の使用を必要とする。得られるミールは、変性タンパク質を含有する。本発明の方法はまた、変性タンパク質サンプル、例えば、大部分〜すべてのタンパク質が変性されているサンプルの使用も含む。例えば、タンパク質のうちの少なくとも30％または50％、または少なくとも60％、70％または90％または約100％が変性している。
【００５１】
溶解バッファーはまた、粘性剤もまた含有することができる。標準的な粘性試薬は、グリセロールおよびスクロースである。したがって、本発明の方法のインキュベーションステップで用いられるバッファーは、5％〜25％、例えば、10％〜20％、好ましくは約20％グリセロールを含有することができる。
【００５２】
したがって、一実施形態では、ミール抽出バッファー（MEB）は、pH12.0、約40℃で、120mM Tris、20％グリセロール、2％LDS、および50mM TCEPからなる。タンパク質抽出のために、これがキャノーラミールに添加され、混合しながら5〜15分間、40℃でインキュベートされる。次いで、粗抽出物は、例えば、遠心分離により、清澄化されてもよく、上清がさらに分析される。
【００５３】
得られる本発明の方法の清澄化抽出物は、例えば、質量分析、等電点電気泳動、または二次元タンパク質分離、ウエスタンブロットによる、迅速分析に適している。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、例えば、遠心分離機中で、サンプルを遠心分離し、新規試験管に上清を移すステップであって、好ましくはそれにより試験管が冷却される、ステップをさらに含む。
【００５４】
したがって、本発明の方法はまた、上記の通りのサンプルのインキュベーション、インキュベーションからの抽出物を清澄化するステップ、および続いて、ELISA、ウエスタンブロッティング、質量分析、等電点電気泳動、または二次元タンパク質分離、タンパク質配列決定により、抽出されたタンパク質を分析するステップを含む方法にも関する。
【００５５】
したがって、本発明の方法は、一実施形態では、以下のステップを含む：
a. サンブルを粉砕するステップ、
b. サンプルを、例えば、ドライアイス上で、冷却するステップ、
c. サンプルの重量を量るステップ、
d. 本発明の抽出バッファーMEBまたは本発明の方法での使用に関して記載されたバッファーMEBを添加すること、および本発明のインキュベーション温度でサンプルをインキュベートすることにより、粉砕および冷却されたサンプルからポリペプチドを抽出するステップ、および
e. サンプルを遠心分離し、新規試験管に上清を移すステップであって、それにより試験管が冷却される、ステップ。
【００５６】
したがって、本発明の方法は、一実施形態では、以下のステップを含む：
a. 植物ミールを準備するステップ、
b. 予熱した本発明の抽出バッファーMEBまたは本発明の方法での使用に関して記載された通りのバッファーMEBを、植物材料に添加するステップ、
c. サンプルを粉砕するステップ、
d. 30℃〜45℃、好ましくは約40℃で、1〜15分間、好ましくは2〜5分間、より好ましくは約3分間、サンプルをインキュベートするステップ、
e. サンプルを遠心分離し、上清を新規な容器に移すステップ、
f. 例えば、ウエスタンブロッティング、質量分析、等電点電気泳動、または二次元タンパク質分離により、上清中のタンパク質を分析するステップ。
【００５７】
本発明の方法は、続いて、以下のさらなるステップを含むことができる：膜結合型である可能性があるポリペプチドに特異的に結合する1種以上の抗体を用いることにより、1種以上のポリペプチドの定量分析を行なうステップであって、このとき、例えば、ポリペプチドは、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ、好ましくはトランスジェニックデサチュラーゼまたはエロンガーゼである。
【００５８】
さらに、本発明は、タンパク質を抽出するための組成物に関する。したがって、新規ミール抽出バッファー（MEB）が、例えば、植物由来ミールから、膜結合型タンパク質を効率的に抽出することが本明細書中で特定される。したがって、本発明はまた、本発明の方法に関して上記の通りの、膜結合型タンパク質の効率的抽出のための新規溶解バッファーMEBにも関する。
【００５９】
新規ミール抽出バッファー（MEB）は、10〜12.5のpH、例えば、pH11〜pH12.5、例えば、約pH12を有する。
【００６０】
MEB溶解バッファーは、0.5または1.5％〜5％、より好ましくは、1.5％〜3％、最も好ましくは約2％の界面活性剤含有量を含む。界面活性剤の濃度は、温度および界面活性剤の溶解度に依存する。したがって、界面活性剤およびその含有量は、本発明の方法で用いられる正確な温度およびpHに応じて選択される。可溶性濃度の界面活性剤が、本発明の方法で用いられる。
【００６１】
界面活性剤は、タンパク質およびサンプル中で用いられる組織タイプに応じて、イオン性または非イオン性界面活性剤であり得る。さらなる界面活性剤に関する例は、例えばhttp://www.vbcf.ac.at/fileadmin/user_upload/ProTech/SW_Buffer_compatibility.pdfの下に記載される通りの、TrintonX-100、NP40、C7bzO、CHAPS、デオキシコール酸ナトリウム、LDSまたはSDSである。
【００６２】
TritonX-100は、例えば、0.5％〜3％で溶解バッファー中に用いられる。LysoFos Choline 12は、例えば、0.5％〜10％で溶解バッファーMEB中に用いられる。NP40は、例えば、0.5％〜1％で溶解バッファー中に用いられる。C7Bzoは、例えば、0.5％〜2％で溶解バッファー中に用いられる。CHAPSは、例えば、0.5％〜2％で溶解バッファー中に用いられる。デオキシコール酸ナトリウムは、例えば、0.5％〜2％で溶解バッファー中に用いられる。SDSは、例えば、0.5％〜2％で溶解バッファー中に用いられる。
【００６３】
界面活性剤は、SDSまたはLDSなどのイオン性界面活性剤であり得る。例えば、SDSは、高pHおよび低温ではLDSよりも溶解性が低いことが、当技術分野で公知である。本発明の方法の温度に関して、LDSは十分に可溶性であることが見出された。したがって、MEBバッファーは、1〜3％LDS、例えば、1.5％〜2.5％LDS、例えば、約2％LDSの界面活性剤含有量を含む。
【００６４】
MEB溶解バッファーは、例えば、5mM〜100mM TCEP-HCLと同様の還元能力を生じる場合に用いられ得る、1種の還元剤または還元剤の混合物を含む。好ましくは、還元能力は、例えば、20mM〜70mM TCEP-HCL、40mM〜60mM TCEP-HCL、例えば、約50mM TCEP-HCLの還元能力と同等である。
【００６５】
MEB溶解バッファーは、一実施形態では、5mM〜100mM TCEP、例えば、20mM〜70mM TCEP-HCL、40mM〜60mM TCEP、例えば、約50mM TCEPを含有する。したがって、MEB溶解バッファーは、例えば、20mM TCEP以上、30mM TCEP以上、40mM TCEP以上、および100mM TCEP以下、80mM TCEP以下、70mM TCEP以下、または60mM TCEP以下を含有する。一実施形態では、TCEPの含有量は、約50mMである。
【００６６】
MEB溶解バッファーは、例えば、30〜120nM DTT、例えば、50nM〜100nM DTTを含有する。
【００６７】
MEB溶解バッファーはまた、例えば、1〜5％BME、例えば、2％〜4％BMEも含有することができる。
【００６８】
膜抽出バッファーMEBは、一実施形態では、適切なpH依存性緩衝剤、または塩溶液、または水溶液（例えば、水）を含有する。また、緩衝成分を省くこともできる。溶解バッファーのための標準的な緩衝試薬は、例えば、Tris-CL、HEPES、CAPS、またはリン酸ナトリウムバッファーNaH2PO4/Na2HPO4である。通常は、緩衝剤の濃度は以下の通りである：5〜300mM Tris-CL、20〜40mM HEPES、10〜40mMリン酸ナトリウム（NaH2PO4/Na2HPO4）、または50mM〜500mM CAPS。
【００６９】
溶解バッファーMEBはまた、一実施形態では、粘性剤（例えば、グリセロールまたはスクロース）を含有する。例えば、溶解バッファーMEBは、5％〜30％グリセロール、好ましくは10〜25％グリセロール、例えば約20％グリセロールを含有する。
【００７０】
したがって、新規溶解バッファーMEBは、例えば、以下を含む：
i. pH10〜12.5の緩衝試薬、および0.5％〜2.5％の界面活性剤含有量、または
ii. pH10〜12.5の緩衝試薬、および0.5％〜3％の界面活性剤含有量（好ましくは、LDSまたはSDS）、および粘性剤、または
iii. pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、好ましくは、約2％LDS、および粘性剤、または
iv. pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、好ましくは、約2％LDS、および還元試薬、または
v. pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、好ましくは、約2％LDS、および還元試薬、および粘性剤、または
vi. pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、好ましくは、約2％、還元試薬20〜70mM TCEP、好ましくは50mM、および粘性剤グリセロール（好ましくは15〜25％で）、または
vii. 緩衝試薬であって、pH10〜12.5の100mM〜150mM Tris-Cl（好ましくは120mM）である、緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS含有量、還元試薬20〜70mM TCEP（好ましくは50mM）、および10％〜20％グリセロール、または
viii. 緩衝試薬であって、約pH12の約120mM Tris-Clである、緩衝試薬、約2％のLDS含有量、および還元試薬約50mM TCEP、および約20％グリセロール。
【００７１】
一実施形態では、バッファーMEBは、35℃超の温度、例えば、37℃以上、40℃以上、42℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上であるが、しかしながら、75℃未満、さらにより好ましくは70℃未満、例えば、65℃以下、60℃以下、55℃以下、50℃以下、47℃以下、45℃以下、42℃以下、例えば、約35℃、約37℃、約40℃、または約42℃または約45℃、または約47℃または約50℃または約60℃の温度を有する。したがって、バッファーの温度は、例えば、35℃〜55℃、または37℃〜50℃または40℃〜47℃である。
【００７２】
1つのさらなる実施形態では、溶解バッファーMEBはまた、例えば、1％以上、例えば、5％以上、10％以上、15％以上、17％以上、20％以上、25％以上、しかし60％未満、例えば、50％、30％、25％以下の種子ミールを含む。したがって、本発明の方法におけるミールの含有量は、例えば、2％〜50％、例えば、5％〜40％、例えば、10％〜20％、または5％〜15％であり得る。
【００７３】
さらに、溶解バッファーMEBは、生物学的材料、例えば、植物体または植物体由来の部分もしくは断片（種子、穀粒、葉、根、もしくは花粉または細胞サンプルなど）に由来する生物学的材料、例えば、油糧種子植物ミール（アブラナ属の種由来のミールなど、セイヨウアブラナミールまたはキャノーラミールなど）、またはダイズミールを含む。
【００７４】
参考文献
[1] Canola Council of Canada. Steps in Oil and Meal Processing. https://www.canolacouncil.org/oil-and-meal/what-is-canola/how-canola-is-processed/steps-in-oil-and-meal-processing/#Pressing. (2017年11月8日にアクセス).  
[2] Donna M. Klockeman, Romeo Toledo, and Kevin A. Sims. Isolation and Characterization of Defatted Canola Meal Protein. (1997). J. Agric. Food Chem. 45:3867-3870.
【実施例】
【００７５】
実施例1：
全般的な抽出およびサンプル調製手順
抽出バッファー成分（120mM Tris、20％グリセロール、2％LDS、および50mM TCEP、pH12.0）を混合し、最終pHを約12.0に調整した。溶液を、LDSの溶解度を高めるために40℃まで加温した。ホモジナイズされたキャノーラミールサンプル（10〜50mg）を、加温抽出バッファーに対して適切な割合のキャノーラミール組織（例えば、含められる実験に関して、1：40〜50）、およびステンレス鋼ビーズを2mLスクリューキャップチューブに併せ入れることにより、抽出した。サンプル、抽出バッファー、およびビーズが入ったチューブを、Geno/Grinder（SPEX Sample Prep, Metuchen, NJ）を用いて1200rpmで2分間、強く振盪した。得られたサンプル溶解液を、30分間、Eppendorf Thermomixerを用いて振盪しながら、40℃でインキュベートした。インキュベーション後、溶解液を、12000〜16000rcfで5〜15分間で遠心分離した。上清を吸引し、新しいポリプロピレンチューブへと移した。必要な場合、上清を、抽出バッファーを用いて希釈し（例えば、含められる実験に関して、24倍〜60倍）、続いて、ProteinSimpleキャピラリーウエスタンブロットプラットホームを用いる分析のために調製した。サンプル調製は、キット試薬と共に提供される製造業者の説明書に従って行なった。膜結合型タンパク質1、2および3に特異的な一次抗体を用いて、それらのそれぞれのタンパク質標的を検出した。
【００７６】
また、相同的に（homologously）発現される参照標準タンパク質を抽出バッファーに補充することにより作成された標準曲線を用いて、抽出されたタンパク質の定量化も行った。参照標準は、組織サンプルと同じ手順に従って、分析用に希釈および調製した。
【００７７】
実施例2：
抽出可能性に対するpHの影響
キャノーラミールからのタンパク質抽出可能性に対する抽出バッファーpHの影響を、pH8.0、10.0、および12.0で調製したバッファーを用いて3個の別個の（unique）ミールサンプルを抽出することにより決定した。それ以外は、全般的な抽出およびサンプル調製手順に従った。サンプルの抽出可能性は、pH12およびpH10を用いて抽出したタンパク質1のシグナル応答を、pH8バッファーを用いて抽出したタンパク質のシグナル応答と比較することにより決定した。
【００７８】
実施例3：
抽出可能性に対する界面活性剤および還元剤の影響
還元剤（TCEP）および界面活性剤（LDS）成分の影響を、これらの成分のうちの一方を用いずにタンパク質1の抽出を行ない、これらの結果を、全般的な抽出およびサンプル調製手順に記載されたすべての成分を含む最適化された抽出バッファーを用いて達成された抽出可能性と比較することにより評価した。
【００７９】
実施例4：
キャノーラミールからの膜結合型タンパク質1、2、および3ならびに可溶性タンパク質4の抽出可能性
キャノーラミールからの膜結合型タンパク質および可溶性タンパク質の抽出可能性を、全般的な抽出およびサンプル調製手順を用いて3種類の別個の（unique）タンパク質1、2、および3を抽出することにより実証した。各タンパク質のレベルは、トランスジェニック（タンパク質1、2、および3を含有する）キャノーラミールサンプルの3回の連続的抽出から測定した。各タンパク質の抽出可能性は、3回全部の抽出から測定された濃度の合計に対する、1回目の抽出から測定されたタンパク質の濃度として表した。
【００８０】
実施例5：
標準的抽出バッファー：
RIPA：20mM TrisCl pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％NP40、1％デオキシコール酸ナトリウム、プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル
細胞溶解バッファー：20mM TrisCl pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％Triton、プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル
SDS溶解バッファー：50mM TrisCl pH8.1、10mM EDTA、1％SDS
IP溶解バッファー：25mM TrisCl pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1％NP40、5％グリセロール
T-Per：25mMビシンpH7.6、150mM NaCl、独自の(proprietary)界面活性剤
Cellytic MT：ビシン、濃度不明、150mM NaCl、独自の透析可能な弱い界面活性剤
種々の溶解バッファー中に調製された市販の溶解物：62.5mM TrisCl、pH6.8、2％SDS、10％グリセロール
【図１】
2021506896.tif 000002
【図２】
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【図３】
2021506896.tif 000004
【図４】
2021506896.tif 000005
【図５】
2021506896.tif 000006
【図６】
2021506896.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月31日(2020.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.5％〜5％のレベルの可溶性濃度の界面活性剤を含有するpH10〜12.5の緩衝試薬（膜抽出バッファー（MEB））中でサンプルをインキュベートするステップを含む、植物サンプルからの膜結合型タンパク質の抽出のための方法であって、溶解バッファーMEBが還元剤を含む、方法。
【請求項２】
pH11.5〜12.5の溶解バッファーMEBを添加する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
35℃〜55℃のインキュベーション温度でサンプルをインキュベートする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
1.5〜5％の可溶性濃度のイオン性界面活性剤を有する溶解バッファーMEBを添加するステップを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
1.5〜3％LDSを含有する溶解バッファーMEBを添加するステップを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
溶解バッファーMEBが、DTT、BMEまたはTCEP-HCLを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
溶解バッファーMEBが、20mM〜70mM TCEPと同等な1種以上の還元剤を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
溶解バッファーMEBが、20mM〜70mM TCEP、または30〜120nM DTTまたは1〜5％BMEを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
溶解バッファーMEBが、pH依存性緩衝剤、または塩溶液を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
緩衝剤が、Tris-CL、HEPES、CAPS、および/またはリン酸ナトリウムバッファーNaH2PO4/Na2HPO4である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
緩衝剤が、
i. 5〜300mM Tris-CL、
ii. 20〜40mM HEPES、
iii. 10〜40mMリン酸ナトリウム（NaH2PO4/Na2HPO4）、および/または
iv. 50mM〜500mM CAPS
である、請求項9または10に記載の方法。
【請求項１２】
溶解バッファーMEBが、粘性剤を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
溶解バッファーMEBが、粘性剤を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法であって、該粘性剤が10％〜25％グリセロールである、方法。
【請求項１４】
溶解バッファーMEBが、pH10〜12.5の緩衝試薬、1.5％〜2.5％のLDS、還元試薬20〜70mM TCEP、好ましくは50mM TCEP、および10％〜20％グリセロールを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法であって、緩衝試薬が、100mM〜150mM Tris-Cl、好ましくは120mM Tris-Clである、方法。
【請求項１５】
前記インキュベーション温度でのインキュベーション時間が10分間〜180分間である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
抽出が複数回の連続的抽出として行なわれ、好ましくは抽出が3回以下、繰り返され、さらにより好ましくは抽出が2回以下、最も好ましくは1回のみ行なわれる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
植物サンプルが、葉（leave）、種子、穀粒、葉、根、または花粉に由来する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
植物サンプルが、脱脂植物種子ミールである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
以下のステップ：
a. 界面活性剤および、任意により、還元剤を含有する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法で用いられる溶解バッファーMEB中、35℃〜55℃の温度でサンプルをインキュベートするステップ、
b. 膜結合型タンパク質を抽出するステップ、
c. タンパク質の分析のために、抽出物を希釈してpHを調整するステップ、
d. 事前に沈殿、再懸濁または可溶化を行なわずに、タンパク質を分析するステップ
を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
抽出されたタンパク質が、ウエスタンブロッティング、質量分析、等電点電気泳動、または二次元タンパク質分離において分析される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
pH10〜12.5の緩衝試薬、および0.5％〜2.5％の界面活性剤および還元剤を含む組成物。
【請求項２２】
pH10.0〜pH12.5において、以下を含む、請求項21に記載の組成物：
i. 1.5％〜2.5％LDS、および
ii. 30mM〜70mM TCEP。
【請求項２３】
生物由来の組織および/または膜をさらに含む、請求項21または22に記載の組成物。
【請求項２４】
35℃〜55℃の温度を有する、請求項21または22に記載の組成物。
【請求項２５】
以下のステップのうちの1以上を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法：
a. サンブルを粉砕するステップ、
b. サンプルを、ドライアイス上で冷却するステップ、
c. サンプルの重量を量るステップ、
d. 請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法で用いられる溶解バッファーMEBまたは請求項21〜24のいずれか1項に記載の組成物を添加することにより、粉砕および冷却されたサンプルからポリペプチドを抽出するステップ、および
e. サンプルを遠心分離し、新規試験管に上清を移すステップであって、それにより試験管が冷却される、ステップ。
【請求項２６】
以下のステップを含む、請求項1〜20および25のいずれか1項に記載の方法：
a. 植物ミールを準備するステップ、
b. 予熱した請求項1〜20および25のいずれか1項に記載の方法で用いられる溶解バッファーMEBまたは請求項21〜24のいずれか1項に記載の組成物を添加するステップ、
c. サンプルを粉砕するステップ、
d. 30℃〜45℃で、5〜15分間、サンプルをインキュベートするステップ、
e. サンプルを遠心分離し、上清を新規な容器に移すステップ、および
f. 上清を分析するステップ。
【請求項２７】
膜結合型である可能性のあるポリペプチドに特異的に結合する1種以上の抗体を用いることにより、1種以上のポリペプチドの定量分析を行うステップを含む、請求項1〜20、25および26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ、好ましくはトランスジェニックデサチュラーゼまたはエロンガーゼである、請求項1〜20および25〜27のいずれか1項に記載の方法。
【国際調査報告】
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