(57)【要約】  抗Ｂ７−Ｈ４抗体、その抗原結合断片、及びその医薬的用途。前記抗Ｂ７−Ｈ４抗体ＣＤＲ領域を含むキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗Ｂ７−Ｈ４抗体及びその抗原結合断片を含む医薬組成物、及びその抗癌薬物としての用途。ヒト化抗Ｂ７−Ｈ４抗体、及びそのＢ７−Ｈ４媒介性疾患又は症状を治療する薬物の製造における用途。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２の配列から選択される少なくとも１つに示したＬＣＤＲを含む抗体軽鎖可変領域と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の配列から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲを含む抗体重鎖可変領域と、を含む、
抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体重鎖可変領域は、それぞれ、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；又は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；又は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体又はその断片、キメラ抗体又はその断片、ヒト抗体又はその断片及びヒト化抗体又はその断片から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記ヒト化抗体の重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその変異体の重鎖ＦＲ領域をさらに含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖ＦＲ領域を含み、より好ましくはアミノ酸変異によりＡＤＣＣ毒性を増強させたＩｇＧ１重鎖ＦＲ領域を含む、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記ヒト化抗体軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０の配列を含む軽鎖可変領域から選択される、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記ヒト化抗体重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９の配列を含む重鎖可変領域から選択される、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
前記ヒト化抗体の軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８の配列を含む軽鎖から選択される、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記ヒト化抗体の重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７の配列を含む重鎖から選択される、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２０】
前記ヒト化抗体は、（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５の重鎖可変領域、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の重鎖可変領域、（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９の重鎖可変領域、又は（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１の重鎖可変領域を含む、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記ヒト化抗体は、（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３の重鎖、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５の重鎖、（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７の重鎖、又は（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９の重鎖を含む、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２２】
（１）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸４１〜６０を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５３〜５９を含むエピトープと結合すること、の少なくとも１つを特徴とする抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２３】
（１）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５３を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５４を含むエピトープと結合すること、（３）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５６を含むエピトープと結合すること、（４）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５７を含むエピトープと結合すること、（５）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５８を含むエピトープと結合すること、（６）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５９を含むエピトープと結合すること、の少なくとも１つを特徴とする抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２５】
請求項２４に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現ベクターを導入又は含有する宿主細胞。
【請求項２７】
細菌であり、好ましくは大腸菌であることを特徴とする、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
酵母菌であり、好ましくはピキア酵母であることを特徴とする、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
哺乳動物細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞であることを特徴とする、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２６〜２９に記載の宿主細胞を培養し、培養物から抗体を分離し、抗体を精製することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項３１】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含有する、医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む、検出試薬。
【請求項３３】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む、診断剤。
【請求項３４】
Ｂ７−Ｈ４媒介性疾患又は症状を治療又は予防するための薬物の製造における請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片又は請求項３１に記載の医薬組成物の用途であって、前記疾患は、好ましくは癌であり、より好ましくはＢ７−Ｈ４を発現する癌であり、前記癌は最も好ましくは乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、胆嚢癌、膠芽腫及び黒色腫である、用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＢ７−Ｈ４受容体に対して免疫反応性を有する抗Ｂ７−Ｈ４抗体、その抗原結合断片、前記抗Ｂ７−Ｈ４抗体ＣＤＲ領域を含むキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗Ｂ７−Ｈ４抗体及びその抗原結合断片を含む医薬組成物、及びその抗癌薬物としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍免疫治療は、腫瘍治療の分野で長期的に持続している研究及び開発のホットスポットであり、そのうち、Ｔ細胞腫瘍免疫治療は、中核的な位置にある。腫瘍回避は、腫瘍免疫治療が直面する大きな障害であり、大部分の腫瘍発現を、宿主の免疫系は異なる程度に認識することができるが、多くの場合で、エフェクターＴ細胞の低効率の活性化により、不十分な免疫反応が誘発されるため、腫瘍細胞は、自己の免疫系に対する抑制作用により腫瘍の成長を促進する。腫瘍免疫治療は、腫瘍患者の体内のキラーＴ細胞及び／又は他の免疫細胞を十分に利用して、腫瘍を殺傷する作用発揮させる。
【０００３】
ＣＤ２８受容体及びそのリガンドに対する研究は、Ｂ７スーパーファミリーと呼ばれる関連分子の特徴づけを促進している。Ｂ７ファミリーメンバーは、免疫グロブリンＶ様ドメイン（ＩｇＶ）及び免疫グロブリンＣ様ドメイン（ＩｇＣ）を有する免疫グロブリンであり、そのメンバーは、共刺激分子Ｂ７．１（ＣＤ８０）とＢ７．２（ＣＤ８６）、誘導可能な共刺激因子のリガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ／Ｂ７−Ｈ２）、プログラム細胞死−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１）、プログラム細胞死−２リガンド（ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ）、Ｂ７−Ｈ４及びＢ７−Ｈ４などを含む。
【０００４】
ヒトＢ７−Ｈ４は、２８２個のアミノ酸からなるＩ型膜貫通型タンパク質であり、そのコード遺伝子が１番染色体のｐ１１．１領域（ＣｈｏｉＩＨら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ  １、１７１（９）：４６５０−４）にある。Ｂ７−Ｈ４は、Ｔ細胞免疫応答に対して負の調節の作用を果たし、Ｂ７−Ｈ４は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化発育、細胞周期の進行、及びサイトカインの産生において広い抑制作用を発揮する（Ｓｉｃａ  ＧＬら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００３  Ｊｕｎ、１８（６）：８４９−６１）。Ｂ７−Ｈ４遺伝子ノックアウトマウスにおいて免疫細胞障害及び自己免疫現象が発見されなかった（Ｚｈｕ  Ｇら、Ｂｌｏｏｄ．２００９  Ｆｅｂ  １９、１１３（８）：１７５９−６７、Ｓｕｈ  ＷＫらなど、Ｂｌｏｏｄ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００６  Ｓｅｐ、２６（１７）：６４０３−１１）。現在Ｂ７−Ｈ４の受容体及びそのシグナル伝達経路については明らかではない。
【０００５】
最近の研究により、Ｂ７−Ｈ４タンパク質は様々な腫瘍組織において大量に発現して、腫瘍細胞を体の免疫系の攻撃から逃れさせていることが発見されている。Ｂ７−Ｈ４分子を腫瘍治療標的とすることは、腫瘍免疫治療に新しい方法を提供する。
【０００６】
現在、ヒトＢ７−Ｈ４は、乳癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌及び肝臓癌等の様々な癌細胞に発現することが知られている。脾臓、肺、胸腺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、精巣及び卵巣中にＢ７−Ｈ４ｍＲＮＡの発現が発見され、タンパク質レベルについては乳房（乳管及び小葉）、輸卵管上皮、子宮内膜腺等の組織に低レベルのＢ７−Ｈ４発現がある。相関研究も、Ｂ７−Ｈ４が腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に過剰発現していること（Ｋｒｙｃｚｅｋ、Ｉ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００６、２０３（４）：８７１−８８１）を示しており、マクロファージは、腫瘍微小環境の１つの重要な成分を構成しており、５０％の腫瘍質量を表すことができる。
【０００７】
現在、多くの多国籍製薬会社は、患者自身の腫瘍に対する免疫系反応を向上させて、腫瘍細胞を直接殺傷するという目的を達成する、Ｂ７−Ｈ４を対象とするモノクローナル抗体及び／又はその薬物コンジュゲートを開発している。関連特許は、例えば、ＷＯ２０１３０２５７７９、ＵＳ２０１４０３２２１２９などがある。Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、ＦｉｖｅＰｒｉｍｅなどの会社の抗Ｂ７−Ｈ４モノクローナル抗体は、現在臨床前に開発しており、ジェネンテック社の抗Ｂ７−Ｈ４抗体−薬物コンジュゲートも既に臨床前の開発段階にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許出願第２０１３０２５７７９号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４０３２２１２９号
【０００９】
本発明は、高い親和性、高い選択性、高い生物活性を有する抗Ｂ７−Ｈ４抗体、腫瘍に用いられるモノクローナル抗体免疫療法及びその関連応用を提供する。Ｂ７−Ｈ４陽性腫瘍の治療に用いられる薬物、組成物及び方法である。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２の配列から選択される少なくとも１つに示したＬＣＤＲを含む抗体軽鎖可変領域と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の配列から選択される少なくとも１つに示したＨＣＤＲを含む抗体重鎖可変領域と、を含む、抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記抗体重鎖可変領域は、それぞれ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び  ＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；又は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、又は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【００１３】
特に好ましい抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ領域配列又はそれらと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変領域の組み合わせから選択されるいずれか一種である。
【００１４】
（１）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００１５】
（２）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。
【００１６】
（３）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００１７】
（４）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００１８】
（５）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００１９】
（６）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００２０】
（７）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００２１】
（８）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００２２】
（９）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００２３】
（１０）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示すようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示すようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体又はその断片である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記抗体又はその抗原結合断片は、キメラ抗体又はその断片である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体又はその断片である。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗体又はその断片である。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２の配列を含む軽鎖可変領域から選択される。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１の配列を含む重鎖可変領域から選択される。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその変異体の重鎖ＦＲ領域をさらに含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖ＦＲ領域を含み、より好ましくはアミノ酸変異によりＡＤＣＣ毒性を増強させたＩｇＧ１を含む。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体の軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０の配列を含む軽鎖から選択される。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体の重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９の配列を含む重鎖から選択される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０の配列を含む軽鎖可変領域から選択される。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９の配列を含む重鎖可変領域から選択される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体の軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８の配列を含む軽鎖から選択される。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記ヒト化抗体の重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７の配列を含む重鎖から選択される。
【００３７】
本発明のより好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５の重鎖可変領域、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の重鎖可変領域、（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９の重鎖可変領域、又は（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１の重鎖可変領域から選択されるいずれの一種である。
【００３８】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３の重鎖、
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５の重鎖、
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７の重鎖、又は
（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９の重鎖から選択されるいずれの一種である。
【００３９】
抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片は、（１）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸４１〜６０を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５３〜５９を含むエピトープと結合すること、の少なくとも１つを特徴とする。
【００４０】
抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片は、（１）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５３を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５４を含むエピトープと結合すること、（３）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５６を含むエピトープと結合すること、（４）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５７を含むエピトープと結合すること、（５）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５８を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸５９を含むエピトープと結合すること、の少なくとも１つを特徴とする。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片において、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、線形抗体、一本鎖抗体、ナノ抗体、ドメイン抗体及び多特異的抗体である。
【００４２】
本発明は、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列をさらに提供する。
【００４３】
本発明は、上記のようなＤＮＡ配列を含む発現ベクターをさらに提供する。
【００４４】
本発明は、上記のような発現ベクターを導入又は含有する宿主細胞をさらに提供する。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような宿主細胞において、前記宿主細胞は、細菌であり、好ましくは大腸菌であることを特徴とする。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような宿主細胞は、酵母菌であり、好ましくはピキア酵母である。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、上記のような宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。
【００４８】
本発明は、上記宿主細胞を培養し、培養物から抗体を分離し、抗体を精製することを含む、抗Ｂ７−Ｈ４抗体を産生する方法をさらに提供する。
【００４９】
本発明は、前記のような軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む多特異的抗体をさらに提供する。
【００５０】
本発明は、前記のような軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をさらに提供する。
【００５１】
本発明は、前記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片を含有する検出試薬又は診断剤をさらに提供する。
【００５２】
本発明は、本発明に係る抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片を用いることを含む、Ｂ７−Ｈ４の免疫検出又は測定方法をさらに提供する。
【００５３】
本発明は、本発明に係る抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片を用いてＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４陽性細胞を検出するか又は測定することを含む、Ｂ７−Ｈ４陽性細胞に関連する疾患を診断するための方法をさらに提供する。
【００５４】
本発明は、上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含有する、医薬組成物をさらに提供する。
【００５５】
本発明は、Ｂ７−Ｈ４媒介性疾患又は症状を治療するための薬物の製造における上記のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片の用途をさらに提供し、前記疾患は、好ましくは癌であり、より好ましくはＢ７−Ｈ４を発現する癌であり、前記癌は最も好ましくは乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、胆嚢癌、膠芽腫及び黒色腫である。
【００５６】
本発明は、必要な患者に治療的有効量の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片、又はその前記医薬組成物を投与することを含む、Ｂ７−Ｈ４媒介性疾患又は症状を治療し予防する方法をさらに提供し、前記疾患は、好ましくは癌であり、より好ましくはＢ７−Ｈ４を発現する癌であり、前記癌は最も好ましくは乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌、胆嚢癌、子宮頸癌、膠芽腫及び黒色腫である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】７種類のキメラ抗体の精製ヒトＢ７−Ｈ４抗原に対する結合活性を示し、そのうち、キメラ抗体２Ｆ７と２Ｆ８のＥＣ５０が約０．１ｎＭである抗体のＥＬＩＳＡ体外結合実験。
【図２】抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈｕ２Ｆ７が結合する抗原エピトープを示す間接ＥＬＩＳＡ結合実験。
【図３】抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈｕ１Ｃ９の抗腫瘍効果を示すマウス体内薬効実験。
【図４】抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈｕ１Ｃ９及びｈｕ２Ｇ６の免疫強化（Ｔ細胞増殖）の効果を示す免疫機能実験。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
一、用語
【００５９】
本発明をより理解しやすくするため、専門技術及び科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の場所で具体的に定義していない限り、本明細書で使用される他のすべての専門用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。
【００６０】
本発明で用いられるアミノ酸の３文字記号及び１文字記号は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）において記述している通りである。
【００６１】
本発明に記載の「抗体」という用語は、免疫グロブリン、すなわち、鎖間ジスルフィド結合により結合された２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖により形成された４本のペプチド鎖構造を指す。免疫グロブリンの重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順が異なるため、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンは、５種類、又は免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに分けることができ、これらの対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同じ種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖のジスルフィド結合の数と位置により、さらに異なるサブカテゴリーに分類し、例えば、ＩｇＧをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域により、κ鎖又はλ鎖に分類される。これら５種類のＩｇは、いずれもκ又はλ鎖を有することができる。
【００６２】
本発明において、本発明に係る抗体軽鎖可変領域は、ヒト又はマウスのκ、λ鎖又はその変異体を含む軽鎖定常領域をさらに含んでもよい。
【００６３】
本発明において、本発明に係る抗体重鎖可変領域は、ヒト又はマウスのＩｇＧ１、２、３、４又はその変異体を含む重鎖定常領域をさらに含んでもよい。
【００６４】
抗体重鎖と軽鎖のＮ端に近い約１１０個のアミノ酸の配列は、大きく変化し、可変領域（Ｖ領域）であり、Ｃ端に近い残りのアミノ酸配列は、相対的に安定し、定常領域（Ｃ領域）である。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と配列が相対的に安定した４つの骨格領域（ＦＲ）を含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。各軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域で構成され、アミノ末端からカルボキシル末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順に配列する。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を指す。発明に係る抗体又は抗原結合断片のＶＬ領域及びＶＨ領域のＣＤＲアミノ酸残基の数及び位置は、既知のＫａｂａｔ番号規則及びＫａｂａｔ又はＡｂＭ定義規則と一致する（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）。
【００６５】
「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」という用語は、その表面にＭＨＣと複合した外来抗原を示す細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこのような複合体を認識する。ＡＰＣの実例は、樹状細胞（ＤＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単核細胞、Ｂリンパ芽球細胞及び単核細胞から誘導された樹状細胞（ＤＣ）を含むが、それらに限定されない。「抗原提示」という用語は、ＡＰＣが抗原を捕捉し、例えばＭＨＣ−Ｉ／ＭＨＣ−ＩＩコンジュゲートの成分として、それらをＴ細胞に認識可能にする過程を指す。
【００６６】
「Ｂ７−Ｈ４」という用語は、ヒトＢ７タンパク質ファミリーのメンバーを指し、ＣＤ２７６とも呼ばれ、４つのＩｇ様細胞外ドメインを有するＩ型の膜貫通型タンパク質である。Ｂ７−Ｈ４は、抗原提示細胞又は癌細胞の表面に発現する免疫チェックポイントタンパク質の１つであり、Ｔ細胞の機能賦活に抑制作用がある。「Ｂ７−Ｈ４」という用語は、細胞により天然に発現された「Ｂ７−Ｈ４」の任意の変異体又はアイソタイプを含む。本発明の抗体は、非ヒト種からのＢ７−Ｈ４と交差反応することができる。別の選択肢として、該抗体も、ヒトＢ７−Ｈ４に特異的であってもよく、他の種との交差反応性を示しなくてもよい。Ｂ７−Ｈ４又はその任意の変異体又はアイソタイプは、それらを天然に発現した細胞又は組織から分離して取得するか、又は本分野の汎用の及び本明細書に記載の技術を用いて組換え技術により生成することができる。好ましくは、抗Ｂ７−Ｈ４抗体は、正常なグリコシル化パターンを有するヒトＢ７−Ｈ４を標的とする。
【００６７】
「組換えヒト抗体」という用語は、組換え方法により製造され、発現され、作成され、又は分離されたヒト抗体を含み、かかる技術及び方法は本分野においてよく知られているものであり、例えば、（１）ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子組換え、染色体導入動物（例えば、マウス）又はそれから製造されたハイブリドーマから分離された抗体、（２）形質転換により抗体を発現する、トランスフェクトーマのような宿主細胞から分離された抗体、（３）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから分離された抗体、及び（４）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングする等の方法で製造され、発現され、作成され、又は分離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、可変領域と定常領域とを含み、これらの領域は、生殖細胞系列遺伝子でコードされた特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を利用するが、例えば抗体の成熟過程で生じる以降の再配列と変異も含む。
【００６８】
本発明における「マウス抗体」という用語は、本分野の知識及び技術に基づいて調製されたヒトＢ７−Ｈ４に対するモノクローナル抗体を指す。調製において、Ｂ７−Ｈ４抗原を試験対象に注射した後、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。本発明の好ましい実施形態では、前記マウスＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片は、さらに、マウスκ、λ鎖若しくはその変異体の軽鎖定常領域を含むか、又はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４若しくはその変異体の重鎖定常領域を含んでもよい。
【００６９】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列の可変及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異による誘発又はインビボ細胞突然変異により導入された変異）を含んでもよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、他の哺乳動物（例えば、マウス）種族から誘導されたＣＤＲ配列をヒト骨格配列上に移植した抗体（すなわち「ヒト化抗体」）を含まない。
【００７０】
「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域のフレームワーク上に移植することにより産生された抗体を指す。キメラ抗体がマウスのタンパク質成分を多く持つことにより誘導される強い免疫応答反応を克服することができる。免疫原性が低下するとともに、活性の低下を引き起こすことを回避するために、前記ヒト抗体可変領域に対して最小限の逆突然変異を行って活性を維持することができる。
【００７１】
「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とを融合した抗体であり、マウス抗体から誘発された免疫応答反応を軽減することができる。キメラ抗体を確立するには、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立し、次にマウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、さらに必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とを接続してキメラ遺伝子にした後にヒトベクターに挿入し、最後に真核細胞産業系又は原核細胞産業系においてキメラ抗体分子を発現する。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域、好ましくはヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４を含む重鎖定常領域、又はアミノ酸変異によりＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）の毒性を増強させたＩｇＧ１から選択することができる。
【００７２】
「抗原結合断片」という用語は、抗体の抗原結合断片及び抗体類似体を指し、一般に、少なくとも一部の母体抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の抗原結合領域又は可変領域（例えば１つ以上のＣＤＲ）を含む。抗体断片は、母体抗体の少なくともいくつかの結合特異性を保持する。一般に、モルに基づいて活性を表すと、抗体断片は、少なくとも１０％の母体結合活性を保持する。好ましくは、抗体断片は、少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以上の母体抗体の標的に対する結合親和性を保持する。抗原結合断片の実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、線形抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体、ナノ抗体、ドメイン抗体及び多特異的抗体を含むが、これらに限定されない。工学的に操作された抗体変異体は、ＨｏｌｌｉｇｅｒとＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６において概説されている。
【００７３】
「Ｆａｂ断片」は、一本の軽鎖及び一本の重鎖のＣＨ１及び可変領域で構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００７４】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１及びＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合で、ＣＨ３ドメインの疎水性作用により一体に保持される。
【００７５】
「Ｆａｂ’断片」は、１本の軽鎖と、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の領域を含む１つの重鎖の部分を含有することにより、２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
【００７６】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本の軽鎖、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖を含有し、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖間のジスルフィド結合により保持された２つのＦａｂ’断片で構成される。
【００７７】
「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが，定常領域を欠く。
【００７８】
「多特異的抗体」という用語は、その最も広義の意味で使用され、マルチエピトープ特異性を有する抗体を包含する。これらの多特異的抗体は、ＶＨ−ＶＬユニットがマルチエピトープ特異性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体、各ＶＨ−ＶＬユニットが異なるターゲット又は同じターゲットの異なるエピトープに結合される、２つ以上のＶＬとＶＨ領域とを有する抗体、各単一の可変領域が異なるターゲット又は同じターゲットの異なるエピトープに結合される、２つ以上の単一の可変領域を有する抗体、全長抗体、抗体断片、二重抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、二重特異的二重抗体及び三重抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、共有結合又は非共有結合の抗体断片などを含むが、それらに限定されない。
【００７９】
「一本鎖抗体」という用語は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）で一段の連結ペプチドを介して接続された一本鎖組換えタンパク質であり、完全抗原結合部位を有する最小抗体断片である。
【００８０】
「ドメイン抗体断片」という用語は、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域鎖のみを含有する、免疫学的機能を有する免疫グロブリン断片である。いくつかの場合において、２つ以上のＶＨ領域は、ペプチドリンカーと共有結合されて二価ドメイン抗体断片を形成する。二価ドメイン抗体断片の２つのＶＨ領域は、同じ又は異なる抗原を標的化することができる。
【００８１】
本発明における「Ｂ７−Ｈ４に結合」という用語は、ヒトＢ７−Ｈ４と相互作用することができることを指す。本発明における「抗原結合部位」とは、抗原上に不連続であり、本発明の抗体又は抗原結合断片によって認識される三次元空間部位を指す。
【００８２】
「エピトープ」という用語は、抗原上に免疫グロブリン又は抗体と特異的に結合する部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸、又はタンパク質の三次折り畳みにより並列するが隣接しないアミノ酸で形成し得る。隣接するアミノ酸で形成されるエピトープは、一般に、変性溶媒に露出された後に保持されるが、三次折り畳みにより形成されるエピトープは、一般に、変性溶媒で処理された後に失われる。エピトープは、一般に、独特な空間的コンフォメーションで少なくとも３〜１５個のアミノ酸を含む。どのようなエピトープが所定の抗体で結合されるかを決定する方法は本分野においてよく知られており、免疫ブロット法及び免疫沈降検出分析等を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、例えば、Ｘ線結晶分析法、二次元核磁気共鳴等の本分野における技術、本明細書に記載の技術を含む。
【００８３】
本発明で使用される「特異的結合」、「選択的結合」という用語は、抗体が所定の抗原におけるエピトープと結合することを指す。一般に、分析物として組換えヒトＢ７−Ｈ４を用い、リガンドとして抗体を用いた場合、機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により測定した時に、抗体は、約１０−７Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で所定の抗原に結合し、所定の抗原に結合する親和性は、所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（ＢＳＡ等）に結合する親和性の少なくとも二倍である。「抗原を認識する抗体」という用語は、本明細書において「特異的に結合する抗体」という用語と交換して使用しもよい。
【００８４】
「交差反応」という用語は、本発明の抗体が異なる種からのＢ７−Ｈ４と結合する能力を指す。例えば、ヒトＢ７−Ｈ４を結合する本発明の抗体も他の種のＢ７−Ｈ４と結合してもよい。交差反応性は、結合測定（例えば、ＳＰＲ及びＥＬＩＳＡ）において、精製抗原との特異的反応性を検出したり、生理発現Ｂ７−Ｈ４の細胞との結合又は機能的な相互作用により測定したりする。交差反応性を決定する方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、又はフローサイトメトリーのような標準結合測定を含む。
【００８５】
「抑制」又は「遮断」という用語は、交換して使用しもよく、部分的及び完全に抑制／遮断することを意味する。リガンドの抑制／遮断は、好ましくは、抑制しないか又は遮断しない場合にリガンド結合が発生したときに活性が現れる正常なレベル又はタイプを低減するか又は変更する。抑制と遮断も、抗Ｂ７−Ｈ４抗体に接触した場合に、抗Ｂ７−Ｈ４抗体に接触していないリガンドと比較して、任意の測定可能なリガンドの結合親和性を低下させることを意図している。
【００８６】
「増殖抑制」（例えば細胞に関する）という用語は、任意の測定可能な細胞増殖の低下を含むことを意図している。
【００８７】
「免疫応答誘導」と「免疫応答強化」という用語は、交換して使用してもよく、特定の抗原に対する免疫応答の刺激（すなわち、受動的又は適応的）を指す。ＣＤＣ又はＡＤＣＣを誘発することに関して使用される「誘発する」という用語は、特定の直接細胞殺傷機構の刺激を指す。
【００８８】
本発明に記載の「ＡＤＣＣ」、すなわちａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用は、Ｆｃ受容体を発現している細胞が、抗体のＦｃ断片を認識することにより、抗体で覆われた標的細胞を死滅させることを指す。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃ断片を修飾することにより強化又は低減又は除去することができる。前記修飾とは、抗体の重鎖定常領域での変異を指す。
【００８９】
抗体及び抗原結合断片を製造及び精製する方法は、コールド・スプリング・ハーバー研究所の抗体実験技術ガイドにおける第５〜８章及び第１５章のような従来技術でよく知られている。例えば、マウスは、ヒトＢ７−Ｈ４又はその断片で免疫することができ、得られた抗体は、復元され、精製されてもよく、かつ従来の方法でアミノ酸配列決定を行うことができる。抗原結合断片は、同様に従来の方法で製造することができる。発明に係る抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学方法で非ヒトＣＤＲ領域に１つ以上のヒトＦＲ領域を加える。ヒトＦＲ生殖細胞系列は、Ｉｍ  Ｍｕｎｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから取得されるか、又は免疫グロブリン雑誌、２００１  ＩＳＢＮ  ０１２４４１３５１から取得されてもよい。
【００９０】
本発明の改変抗体又は抗原結合断片は、従来の方法を用いて調製及び精製することができる。対応する抗体のｃＤＮＡ配列は、ＧＳ発現ベクターにクローニングして再構築することができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定的に遺伝子導入することができる。より推奨される従来技術としては、哺乳類発現系は、特にＦＣ領域中の高度に保存されたＮ末端でグリコシル化された抗体を作ることができる。安定クローンは、ヒト抗原に特異的に結合する抗体の発現を介して得ることができる。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体産生に用いる血清不含培養液で増やされる。抗体が分泌される培養液は、従来技術により精製され、採取される。抗体は濾過し、従来の方法により濾過され、濃縮される。可溶性混合物と多量体も、分子篩、イオン交換を含む従来の方法により除去されてもよい。得られた産物は直ちに凍結し（例えば−７０℃）、又は凍結乾燥される。
【００９１】
本発明における抗体とは、モノクローナル抗体を指す。本発明に係るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、単一のクローン細胞株から得られた抗体を指す。前記細胞株は、真核生物、原核生物又はファージクローン細胞株に限定されない。モノクローナル抗体又は抗原結合断片は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ等）又は他の従来技術による組み換えにより得ることができる。
【００９２】
動物、ヒト、実験被験者、細胞、組織、臓器又は体液に適用される「投与」及び「処理」は、外因的な薬物、治療薬、診断剤又は組成物を、動物、ヒト、被験者、細胞、組織、臓器又は体液と接触させることを指す。「投与」と「処理」は、例えば、治療学的、薬物動態学的、診断学的研究又は実験方法を指す。細胞の処理は、薬物を細胞と接触させる、及び薬物を液体と接触させる（ここでは前記液体は細胞と接触している）ということを含む。「投与」と「処理」は、さらに、試薬、診断、結合組成物、又は、他の細胞のインビトロ及びインビトロ処理により、例えば、細胞を処理することを意味する。ヒト、獣医学又は研究被験者に適用される「処理」は、治療処理、予防又は予防措置、研究及び診断適用を指す。
「治療」は、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、内用又は外用で、薬物が治療効果を有することが知られた１つ以上の疾患症状を有する患者に投与することを意味する。一般に、治療薬は、治療を受ける患者又は集団において、１つ以上の疾患症状を緩和するのに有効な量が投与され、かかる症状の進展を、臨床的に測定可能な程度に軽減するか又は抑制する。特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療的有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢及び体重などの要因、及び患者において所望の反応を導き出す薬物の能力により変動する。疾患症状が軽減されたかどうかは、医師又は他の熟練したヘルスケア提供者により、その症状の重症度又は進行状態を評価するために一般的に用いられる臨床的測定により評価することができる。本発明の実施態様（例えば治療方法又は製品）では、対象の疾患症状を緩和することについて、すべての患者で効果があるわけではないが、統計学的に相当数の患者については、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定、カイ二乗検定、ＭａｎｎとＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ−検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定及びＷｉｌｃｏｘｏｎ検定などのこの技術分野で周知の統計的検定により判定すれば、対象の疾患症状を緩和するはずである。
【００９３】
明細書及び特許請求の範囲で用いられる、「基本的に〇〇〇からなる」という用語又はその変形表示は、列挙された要素又は要素群、及び、任意に、列挙された要素と類似する又は相違する性質の他の要素であって、特定された投薬計画、方法又は組成物の基本的又は新規な特性を実質的に変化させない要素を包含することを示す。なんら制限することのない実施例として、基本的に、列挙されたアミノ酸配列からなる結合化合物は、結合化合物の特性に実質的に影響しない１つ以上のアミノ酸をさらに包含してもよい。
【００９４】
本発明のある対象に適用される「天然に存在する」という用語は、該対象が自然界に発見できるという事実を指す。例えば、自然界から分離して得られた生体（ウイルスを含む）、かつ人工的に実験室で意図的に修飾されていないポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００９５】
「有効量」は、疾患の症状又は兆候を、改善するか又は抑制するのに十分な量を包含する。また有効量は、診断を可能にする、又は容易にするのに十分な量を意味する。特定の患者又は獣医学被験者に対する有効量は、治療される疾患、患者の一般的健康状態、投与経路と用量及び副作用の重大性などの要因によって変動する。有効量は、顕著な副作用又は毒性効果を回避できる最大用量又は投薬計画でもあり得る。
【００９６】
「外因性」は、状況に応じて、生物、細胞又は人体の外側で産生される物質を指す。「内因性」は、状況に応じて、生物、細胞又は人体の内側で産生される物質を指す。
【００９７】
「相同性」は、２本のポリヌクレオチド配列間又は２本のポリペプチド間の配列類似性を指す。２本の比較される配列の両方とも、ある位置が同一の塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれのある位置がアデニンで占められている場合、前記分子は、その位置で相同性がある。２つの配列間の相同性の百分率は、一致又は２つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の数により割った後で、１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列を最適に整列させた場合に、１０個の位置のうち６個が一致又は相同している場合、２つの配列は６０％の相同性がある。一般に２つの配列が整列された場合、比較が行われ、最大百分率相同性が与えられる。
【００９８】
本明細書に使用されるように、「細胞」、「細胞系列」、及び「細胞培養物」という表現は、交換して使用しもよく、そのような名称はすべて後代を含む。したがって、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、初代の受験細胞及び移入の数に関係なくそれらから誘導される培養物を含む。計画的な又は偶発性の変異のために、すべての子孫はＤＮＡ含有量が正確に同一であるとは限らないこともまた理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が包含される。異なる名称が表わされる場合、それは文脈から明らかとなる。
【００９９】
「任意の」又は「任意に」は、後に続く事象又は状態が必ずしも起こらないことを意味し、この記述は、事象又は状態が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意に１〜３個の抗体重鎖可変領域」は、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしも必要ではないことを意味する。
【０１００】
「医薬組成物」は、１種以上の本発明による化合物又はそれらの生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ及びその他の化学的成分、ならびに生理学的／薬学的に許容されるベクター及び賦形剤などの付加的な成分を含む混合物を指す。医薬組成物は、生物体への薬物投与を促進し、活性成分の吸収を容易にし、それにより生物活性を発揮させることを目的としている。
【０１０１】
以下、本発明を、実施例を参照してさらに記述するが、そこへ本発明の範囲が制限されるわけではない。本発明の実施例において、具体的な条件が記載されていない場合、実験は、通常、従来の条件下で、例えば、コールド・スプリング・ハーバーの抗体技術実験マニュアル、分子クローニングマニュアルを参照して実施するか、又は、材料もしくは製品の製造者により提示される条件下で実施した。試薬の出所が具体的に与えられていない場合、その試薬は市販の慣用的な試薬である。
【０１０２】
実施例１：抗原準備及び安定細胞株の構築
ＨｉｓＦｌａｇタグ付きのヒトＢ７−Ｈ４（ｈｕＢ７−Ｈ４−ＨＦ）をコードする配列と、ｈｕＦｃタグ付きのヒトＢ７−Ｈ４（ｈ−Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃ）をコードする配列は、ＣＲＯ社のＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＤＴ）により合成され（以上のＢ７−Ｈ４組換えタンパク質の鋳型配列はいずれも本発明により設計される）、それぞれｐＴＴ５ベクター（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）にクローニングされた。組換えたＢ７−Ｈ４タンパク質は、２９３Ｔ細胞で発現した後、実施例２により精製された。
【０１０３】
精製されたタンパク質は、下記各実施例の実験に用いることができる。
【０１０４】
ｈｕＢ７−Ｈ４−Ｆｃ配列：
【化１】
2021513331.tif 000002
ｈｕＢ７−Ｈ４−ｈｉｓ配列：
【化２】
2021513331.tif 000003
【０１０５】
ｈｕＢ７−Ｈ４−ｈｉｓの精製ステップ：
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、緩衝液をＰＢＳに置換し、イミダゾールを添加することにより終濃度５ｍＭに達した。ニッケルカラムを５ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ溶液で平衡化し、２〜５倍のカラム体積で洗浄した。置換した上清サンプルをコラムにかけた。Ａ２８０読み値がベースラインまで減少するまで、カラムを５ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。その後、ＰＢＳ＋１０ｍＭのイミダゾールでクロマトグラフィーカラムを洗浄し、非特異結合の不純タンパク質を除去し、流出液を採取した。さらに３００ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ溶液で標的タンパク質を溶出し、溶出ピークを採取した。採取した溶出液は、イオン交換（ＳＰカラム）によりさらに精製した。Ａ液の製造：０．０１ＭのＰＢ、ｐＨ８．０。Ｂ液の製造：Ａ液＋１ＭのＮａＣｌ。まず、イミダゾールを含有するＰＢＳ溶液で溶出された標的タンパク質をＡ液に置換し、Ａ液でＳＰカラムを平衡化し、サンプリングして、Ｂ液の濃度段階が０〜１００％であり、１０倍のカラム体積で溶出し、各溶出ピークを採取した。得られたタンパク質は、電気泳動により、正確なものに検定した後に分注して使用に備える。ＨｉｓＦｌａｇタグ付きのヒトＢ７−Ｈ４（ｈｕ−Ｂ７−Ｈ４−ｈｉｓ）を得る。
【０１０６】
ｈｕＢ７−Ｈ４−Ｆｃの精製ステップ：
ＨＥＫ２９３細胞で発現した上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、緩衝液をＰＢＳに置換した。１０ｍＭのリン酸緩衝液でＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性カラムを平衡化し、２〜５倍のカラム体積で洗浄する。置換した上清サンプルをコラムにかけた。Ａ２８０読み値がベースラインまで減少するまで、カラムを２５倍のカラム体積の緩衝液で洗浄した。標的タンパク質をｐＨ３．５の０．８％酢酸緩衝液で溶出し、溶出ピークを採取し、分取後に直ちに１ＭのｐＨ８．０のＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液を添加して中和し、さらにＭｉｌｌｉｐｏｒｅ’ｓ  Ａｍｉｃｏ−１５濾過カラムを用いて溶液をＰＢＳに置換した。得られたタンパク質は、電気泳動により、ペプチドマッピング、ＬＣ−ＭＳで検定した後に分取して使用に備える。
【０１０７】
安定したＣＨＯ−Ｓ細胞プールの構築：
ヒト又はカニクイザルＢ７−Ｈ４タンパク質（ｈｕＢ７−Ｈ４又はｃｙＢ７−Ｈ４）をコードする全長配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＤＴ）社により合成され（以上のＢ７−Ｈ３組換えタンパク質の鋳型配列はいずれも本発明により設計される）、それぞれ改造されたｐｃＤＮＡ３．１ベクター、すなわち、ｐｃＤＮＡ３．１／ｐｕｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｖ７９０２０）にクローニングされた。ＣＨＯ−Ｓ（ＡＴＣＣ）細胞は、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１０７４３０２９）内で０．５ｘ１０６／ｍｌまで培養した。ｈｕＢ７Ｈ３又はｃｙＢＨ７Ｈ３遺伝子をコードする１０ｕｇのベクターと５０ｕｌのＬＦ−ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ａ１２６２１）を１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃３１９８５０８８）で混合し、室温で２０分間インキュベートした後、ＣＨＯ細胞培養液を添加して二酸化炭素インキュベーターに入れて培養した。２４時間後に新たな培地を取り替えて１０ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した。その後に２〜３日ごとに新たな培養液を１回取り替え、１０〜１２日後にスクリーニングした後に安定したＣＨＯ−Ｓ細胞プールを得る。
【０１０８】
実施例２：マウスハイブリドーマ及び抗体配列の取得
ヒト抗原ｈｕＢ７−Ｈ４−Ｆｃを用いて動物免疫を行い、雌性、１０週齢の合計５匹のＢａｌｂ／ｃマウスと５匹のＡ／Ｊマウスに対して、Ｓｉｇｍａ完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とＳｉｇｍａ不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて、免疫原と免疫アジュバントとを１：１の割合で十分に混合乳化し、安定した「油中水」液体を製造し、２５μｇ／２００μＬの注射量で注射する。
【０１０９】
【表１】
2021513331.tif 000004
【０１１０】
免疫マウス血清に対して、実施例３に記載の間接ＥＬＩＳＡ、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いて血清力価及び細胞表面抗原結合能力を評価し、力価検出状況（１０万倍希釈度より大きい）を対照して細胞融合を開始することを決定した。血清力価、親和性及びＦＡＣＳ結合が強い免疫マウスを選択して１回の最終免疫を行った後にマウスを屠殺し、脾臓細胞とＳＰ２／０骨髄腫細胞を融合してプレートに細胞を播種してハイブリドーマを得て、間接ＥＬＩＳＡ及び捕捉ＥＬＩＳＡ法により標的ハイブリドーマをスクリーニングし、限界希釈法によりモノクローナル細胞株を構築する。得られた陽性抗体株は、さらにＢ７−Ｈ４を安定して発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞を用いて、ブランクＣＨＯ−Ｓ細胞を比較して非特異的結合抗体ハイブリドーマ株を排除し、フロー式選別方法でスクリーニングすることにより、組換えタンパク質と結合し、かつ細胞発現抗原とも結合した８株のハイブリドーマを選定した。対数増殖期ハイブリドーマ細胞を採取し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６−０１８）でＲＮＡを抽出し逆転写する（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｔａｋａｒａ＃２６８０Ａ）。逆転写して得られたｃＤＮＡをｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６  Ｒｅｖ．Ｂ  ０５０３）でＰＣＲ増幅した後、配列決定し、最終的に８株のマウス抗体の配列を得た。
【０１１１】
マウスモノクローナル抗体２Ｆ７の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化３】
2021513331.tif 000005
【０１１２】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表２】
2021513331.tif 000006
【０１１３】
Ｍ１の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化４】
2021513331.tif 000007
【０１１４】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表３】
2021513331.tif 000008
【０１１５】
マウスモノクローナル抗体２Ｆ８の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化５】
2021513331.tif 000009
【０１１６】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表４】
2021513331.tif 000010
【０１１７】
マウスモノクローナル抗体２Ｆ４の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化６】
2021513331.tif 000011
【０１１８】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表５】
2021513331.tif 000012
【０１１９】
マウスモノクローナル抗体２Ａ１０の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化７】
2021513331.tif 000013
【０１２０】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表６】
2021513331.tif 000014
【０１２１】
マウスモノクローナル抗体２Ｅ４の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化８】
2021513331.tif 000015
【０１２２】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表７】
2021513331.tif 000016
【０１２３】
マウスモノクローナル抗体１Ｅ４の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化９】
2021513331.tif 000017
【０１２４】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表８】
2021513331.tif 000018
【０１２５】
マウスモノクローナル抗体２Ｇ６の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化１０】
2021513331.tif 000019
【０１２６】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表９】
2021513331.tif 000020
【０１２７】
マウスモノクローナル抗体１Ｃ９の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
【化１１】
2021513331.tif 000021
【０１２８】
以下のＣＤＲ配列を含む：
【表１０】
2021513331.tif 000022
【０１２９】
マウス抗体の各株重鎖と軽鎖可変領域をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とκ軽鎖定常領域にそれぞれクローニングし、実施例４で説明した方法で精製し、同定し、関連する活性検出を行った。
【０１３０】
実施例３：抗体のインビトロ結合活性検出方法
【０１３１】
（１）インビトロ間接ＥＬＩＳＡ結合実験：
ｐＨ７．４のＰＢＳでｈｕＢ７−Ｈ４  Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃１０７３８−Ｈ０８Ｈ）を１μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、９６ウェルの高親和性酵素標識プレートに１００μｌ／ウェルの体積で添加し、４℃の冷蔵庫で一晩（１６〜２０時間）インキュベートした。ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４のＰＢＳが０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する）で４回洗浄した後、ＰＢＳＴで希釈した１５０μｌ／ウェルの３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ブロッキング液を添加し、室温で１時間インキュベートして封止した。封止終了後、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液で４回洗浄した。
【０１３２】
測定対象抗体を３％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで希釈し、１μＭから、１０倍の段階で１０個の投与量に希釈し、１００μｌ／ウェルで酵素標識プレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。インキュベート終了後にＰＢＳＴで４回洗浄し、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで希釈した１００μｌ／ウェルのＨＲＰ標識のヤギ抗ヒト二次抗体（Ａｂｃａｍ、ｃａｔ＃ａｂ９７２２５）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃７００４Ｓ）を添加し、室温で１分間遮光してインキュベートし、１００μｌ／ウェルのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃７００２Ｓ）を添加して反応を終了し、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、型番Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１）を用いて４５０ｎｍで吸収値を読み取り、データを分析した。濃度信号値曲線解析結果を以下の表に示す：
【表１１】
2021513331.tif 000023
【０１３３】
（２）競合性ＥＬＩＳＡ実験：
ｐＨ７．４のＰＢＳでｈｕＢ７−Ｈ４  Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃１０７３８−Ｈ０８Ｈ）を１μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、９６ウェルの高親和性酵素標識プレートに１００μｌ／ウェルの体積で添加し、４℃の冷蔵庫で一晩（１６〜２０時間）インキュベートし、ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４のＰＢＳが０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する）で４回洗浄した後、ＰＢＳＴで希釈した１５０μｌ／ウェルの３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ブロッキング液を添加し、室温で１時間インキュベートして封止した。封止終了後、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液で４回洗浄した。
【０１３４】
３％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで０．１ｎＭの参照キメラ抗体を調製し、該抗体を希釈液として測定対象マウス抗体を１００ｎＭから、１０倍の段階で、１０個の投与量に希釈し、希釈した抗体を１００μｌ／ウェルで酵素標識プレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。インキュベート終了後にＰＢＳＴで４回洗浄し、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで希釈した１００μｌ／ウェルのＨＲＰ標識のヤギ抗ヒト二次抗体（Ａｂｃａｍ、ｃａｔ＃ａｂ９７２２５）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃７００４Ｓ）を添加し、室温で１分間遮光してインキュベートし、１００μｌ／ウェルのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃７００２Ｓ）を添加して反応を終了し、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、型番Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１）を用いて４５０ｎｍ箇所で吸収値を読み取り、データを分析した。競合性抑制率＝（（参照抗体吸光値−競合抗体吸光値）／Ａｂｖ抗体吸光値）＊１００。
【０１３５】
（３）インビトロ捕捉ＥＬＩＳＡ結合実験：
ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ＃１１５−００６−０７１）をｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で２ｕｇ／ｍｌ濃度に希釈し、１００ｕｌ／ウェルの体積で９６ウェルの酵素標識プレートに添加し、３７℃のインキュベーター中で２時間放置した。ＰＢＳＴで一回洗浄した後、ＰＢＳＴで希釈した２００ｕｌ／ウェルの５％脱脂乳（光明脱脂粉乳）ブロッキング液を添加し、３７℃のインキュベーター中で２時間インキュベートしたり、４℃で一晩（１６〜１８時間）放置して封止した。封止終了後、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【０１３６】
５％ＮＨＳを含有するサンプル希釈液（２．５％脱脂乳のＰＢＳＴ）で測定対象マウス血清を希釈するか、又は組換え抗体を異なる濃度に精製し、室温で４０分間インキュベートした後、１００ｕｌ／ウェルで酵素標識プレートに添加し、３７℃のインキュベーターに置いて４０分間インキュベートした。インキュベート終了後にＰＢＳＴで４回洗浄し、サンプル希釈液で希釈した１００ｕｌ／ウェルのビオチン化ｈｕＢ７−Ｈ４−ｈｉｓ（義翹神州＃１０７３８−Ｈ０８Ｈ）タンパク質溶液を添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベート終了後にＰＢＳＴで４回洗浄し、ＰＢＳＴで希釈した１００μｌ／ウェルのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ＃０１６−０３０−０８４）を添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（湖州英創生物科技有限公司）を添加し、室温で１０〜１５ｍｉｎ遮光してインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４を添加して反応を終了し、マイクロプレートリーダー（北京普朗新技術有限公司、型番ＤＮＭ−９６０２）を用いて４５０ｎｍ箇所で吸収値を読み取り、データを分析した。
【０１３７】
（４）インビトロ細胞結合実験：
培養したＣＨＯ−ｈｕＢ７−Ｈ４で安定的に遺伝子導入された細胞又はＳＫ−ＢＲ３細胞を採取し、細胞密度を調節した後に９６ウェルのＵ形ベースプレートに分注して、ウェルあたり１〜２ｘ１０５個の細胞を準備した。１２００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、１００ｕｌの段階希釈した抗体溶液又はマウス免疫血清を添加し、４℃で６０ｍｉｎインキュベートし、１２００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、１００ｕｌ／ウェルで蛍光標識二次抗体（ＰＥ−ＧＡＭ又はＰＥ−ＧＡＨ）を添加し、４℃で６０ｍｉｎインキュベートした。１２００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターを用いて信号を検出し、濃度曲線解析結果とした。
【０１３８】
実施例４：抗Ｂ７−Ｈ４組換えキメラ抗体の構築発現
【０１３９】
本発明における各マウス抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）に対してそれぞれＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）領域の部位特異的アミノ酸変異を行い、異なるアミノ酸変異組み合わせに応じて、異なるヒト化抗体重鎖と軽鎖を設計し、異なる軽重鎖組み合わせプラスミドを細胞に遺伝子導入してヒト化抗体を産生することができる。
【０１４０】
重鎖ベクターの設計は、シグナルペプチド＋変異の重鎖可変領域配列＋ヒトのＩｇＧ１定常領域配列である。
【０１４１】
軽鎖ベクターの設計は、シグナルペプチド＋変異の軽鎖可変領域配列＋ヒトのＫａｐｐａ定常領域配列である。
【０１４２】
上記配列をそれぞれｐＣＥＰ４ベクターに挿入する。上記設計に応じて発現ベクターを合成し、ベクタープラスミドを得た後、大量のプラスミドを抽出し、プラスミドに対して配列決定検証を行った。検証に合格したプラスミドをＰＥＩでヒト２９３Ｆ細胞に遺伝子導入し、連続培養し、２９３Ｆ細胞を無血清培養液（上海奥浦邁生物、ＯＰＭ−２９３ＣＤ０３）で対数増殖期に培養して細胞の遺伝子導入に使用した。２１．４μｇのヒト化抗体軽鎖プラスミドと２３．６μｇのヒト化抗体重鎖プラスミドを１０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ、３１９８５−０７０）に溶解して均一に混合した後、２００μｇのＰＥＩを添加して均一に混合し、ＲＴで１５ｍｉｎインキュベートし、５０ｍＬの細胞に添加した。細胞培養条件は、５％ＣＯ２、３７℃、１２５ｒｐｍ／ｍｉｎである。培養期間で、１日目と３日目に、細胞生存率が７０％未満になるまで栄養を追加し、細胞上清を受け取り、遠心濾過した。遠心濾過後の細胞培養液を抗体精製アフィニティーカラムにサンプリングし、リン酸緩衝液でカラムを洗浄し、グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７、０．１ＭのＧｌｙ−ＨＣｌ）で溶出し、ｐＨ９．０、１ＭのＴｒｉｓ塩酸で中和し、かつリン酸緩衝液で透析し、最終的に精製された各キメラ抗体を得た。
【０１４３】
実施例５：インビトロ結合親和性と動力学的実験：
【０１４４】
Ｂｉａｃｏｒｅ方法は、一般に認められたタンパク質相互間の親和性及び動力学を客観的に検出する検出方法である。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ）により本発明の測定対象Ｂ７−Ｈ４抗体の特徴的親和性及び結合動力学を分析する。
【０１４５】
Ｂｉａｃｏｒｅで提供されるキットを利用し、ＮＨＳ標準アミノカップリング法で本発明の測定対象の抗Ｂ７−Ｈ４抗体をＣＭ５（ＧＥ）チップに共有結合する。次に、
ａ）、同様の緩衝液に希釈した５０ｎＭのヒトｈｕＢ７−Ｈ４−ｈｉｓタンパク質（義翹神州＃１０７３８−Ｈ０８Ｈ）をサンプル注入し、１０ｕＬ／ｍｉｎの流速で、サンプル注入後にキット内に再生試薬を添加して再生する。抗原−抗体結合動力学を３分間追跡し、かつ解離動力学を１０分間追跡する。得られたデータを、ＧＥのＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルで解析し、この方法で推定した各マウス抗体の単一点ｋｄ（ｋｏｆｆ）データを以下の表に示す。
【０１４６】
【表１２】
2021513331.tif 000024
【０１４７】
ｂ）、同様の緩衝液に希釈した一連の濃度段階のヒトｈｕＢ７−Ｈ４−ｈｉｓタンパク質を、前後にそれぞれサイクルしてサンプル注入し、１０ｕＬ／ｍｉｎの流速で、サンプル注入後にキット内に再生試薬を添加して再生する。抗原−抗体結合動力学を３分間追跡し、かつ解離動力学を１０分間追跡する。得られたデータを、ＧＥのＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルで解析し、この方法で測定したキメラ抗体ｋａ（ｋｏｎ）、ｋｄ（ｋｏｆｆ）及びＫＤ値を以下の表に示す。
【０１４８】
【表１３】
2021513331.tif 000025
【０１４９】
実施例６：マウス抗体ヒト化実験
【０１５０】
マウス抗ヒトＢ７−Ｈ４モノクローナル抗体のヒト化は、本分野の多くの文献に開示された方法で行われる。要するに、親族（マウス抗体）定常ドメインに代えてヒト定常ドメインを用い、マウス抗体とヒト抗体との相同性に応じてヒト抗体配列を選択し、本発明は、マウス候補分子２Ｆ７、２Ｆ８、２Ｇ６及び１Ｃ９をヒト化する。
【０１５１】
得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬ  ＣＤＲの典型的な構成を基に、重、軽鎖可変領域配列をヒト抗体生殖細胞系列データベースと比較して、相同性の高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得る。
【０１５２】
マウス抗体２Ｆ７、２Ｆ８、２Ｇ６及び１Ｃ９のＣＤＲ領域を選択された対応するヒト化テンプレートに移植した。２Ｆ８のＨＣＤＲ１領域（ＧＹＴＦＴＮＳＷＭＮ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）とＨＣＤＲ２領域（ＧＩＹＰＮＳＧＮＩＥＹＮＥＫＦＫＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）は、それぞれＧＹＴＦＴＳＳＷＭＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）とＧＩＹＰＮＲＧＮＩＥＹＮＥＫＦＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）に変異して潜在的な脱アミド不安定部位を除去する。ヒト化可変領域を置換し、さらにＩｇＧ定常領域（好ましくは重鎖がＩｇＧ１で、軽鎖がκである）と組み換えた。次に、マウス抗体の三次元構造を基礎として、埋め込み残基と、ＣＤＲ領域と直接的に相互作用する残基と、ＶＬ及びＶＨのコンフォメーションに重要な影響を与える残基とを復帰変異し、ＣＤＲ領域の化学不安定アミノ酸残基を最適化し、ヒト化軽重鎖可変領域配列を組み合わせて形成した抗体を設計し、検出する。
【０１５３】
発現試験と復帰変異の数の対比により、最終的なヒト化ｈｕ２Ｆ７、ｈｕ２Ｆ８、ｈｕｂ２Ｇ６及びｈｕ１Ｃ９抗体分子を選択し、それぞれの重鎖及び軽鎖の可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５〜８２に示すように、それぞれの重鎖及び軽鎖配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３〜９０に示すとおりである。
【化１２−１】
2021513331.tif 000026
【化１２−２】
2021513331.tif 000027
【化１２−３】
2021513331.tif 000028
【化１２−４】
2021513331.tif 000029
【０１５４】
以上の各ヒト化抗体の軽鎖と重鎖のアミノ酸配列に基づいてｃＤＮＡ断片を合成し、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９０−２０）に挿入した。発現ベクターとトランスフェクション試薬ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）をＨＥＫ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１１６２５０１９）に１：２の割合で遺伝子導入し、ＣＯ２含有のインキュベーター中で４〜５日間インキュベートした。発現した抗体を遠心分離して回収した後、実施例４の方法で抗体精製を行い、本発明のヒト化抗体タンパク質ｈｕ２Ｆ７及びｈｕｂ２Ｆ８を得た。
【０１５５】
実施例７：ヒト化抗体活性測定
【０１５６】
ｈｕｂＦ７とｈｕｂＦ８ヒト化抗体に対してインビトロで以下の実験測定を行った。
【０１５７】
１．インビトロ細胞結合実験：
培養したＭＸ−１細胞を採取し、ｐＨ７．４のＰＢＳで細胞密度を調節して９６ウェルのＶ字形ベースプレートに分注し、ウェルあたり１ｘ１０５個の細胞を準備した。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、各ウェルに、段階希釈した１００μｌのキメラ抗体溶液（０．５％ＢＳＡ含有のＰＢＳで１μＭから、３倍の段階で、１０個の使用量に希釈）を添加し、均一に混合し、４℃で振盪で１時間インキュベートし、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、各ウェルに、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈した１００μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト二次抗体（Ａｂｃａｍ、ｃａｔ＃ａｂ９７２２４）を添加し、均一に混合し、４℃で振盪で３０分間インキュベートした。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ、型番ＤｘＦＬＥＸ）を用いて信号を検出し、濃度曲線解析結果とした。結果はグラフに示すとおりであり、ヒト化抗体２Ｆ７、２Ｆ８、２Ｇ６及び１Ｃ９は、いずれもＢ７−Ｈ４を高発現したＭＸ−１細胞と陽性結合した。
【表１４】
2021513331.tif 000030
【０１５８】
２．親和性動力学実験（方法ステップが実施例５と同じ）については、結果は次の表に示すとおりであり、ヒト化抗体ｈｕ２Ｆ７、ｈｕ２Ｆ８、ｈｕ２Ｇ６及びｈｕ１Ｃ９は、いずれもヒトＢ７−Ｈ４抗原タンパク質に対して強い親和力を示している。
【０１５９】
【表１５】
2021513331.tif 000031
【０１６０】
実施例８：ヒト化抗体結合エピトープ測定
【０１６１】
方法ステップは、実施例３の（１）インビトロ間接ＥＬＩＳＡ結合実験と同じである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のＢ７−Ｈ４を、長さが２０個のアミノ酸である抗原性断片に分解し、インビトロ間接ＥＬＩＳＡ結合実験により、抗原性断片Ｐ１２（アミノ酸配列：ＴＶＡＳＡＧＮＩＧＥＤＧＩＬＳＣＴＦＥＰ）とヒト化抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈｕ２Ｆ７とが特異的に結合したことを発見し、結果を図２に示す。抗体結合エピトープをさらに確認するために、抗原性断片Ｐ１２にアラニンスキャンを行い、Ｐ１２における単一のアミノ酸をそれぞれアラニンに変異させた。インビトロ間接ＥＬＩＳＡ接合実験により、アミノ酸配列：ＩＬＳＣＴＦＥ部分の変異は抗体と抗原性断片の結合を著しく弱め、抗体結合エピトープはアミノ酸配列：ＴＶＡＳＡＧＮＩＧＥＤＧＩＬＳＣＴＦＥＰ中のアミノ酸配列：ＩＬＳＣＴＦＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）部分に位置していることを発見した。結果を以下の表に示す。
【０１６２】
【表１６】
2021513331.tif 000032
インビトロ間接ＥＬＩＳＡ結合実験により、抗原性断片Ｐ１２（アミノ酸配列：ＴＶＡＳＡＧＮＩＧＥＤＧＩＬＳＣＴＦＥＰ）とヒト化抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈｕ１Ｃ９とが特異的に結合したことを発見し、結果を以下の表に示す。抗体結合エピトープをさらに確認するために、抗原性断片Ｐ１２にアラニンスキャンを行い、Ｐ１２における単一のアミノ酸をそれぞれアラニンに変異させた。インビトロ間接ＥＬＩＳＡ接合実験により、アミノ酸配列：ＬＳＣＴＦ部分の変異は抗体と抗原性断片の結合を著しく弱め、抗体結合エピトープはアミノ酸配列：ＴＶＡＳＡＧＮＩＧＥＤＧＩＬＳＣＴＦＥＰ中のアミノ酸配列：ＬＳＣＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）部分に位置していることを発見した。結果を以下の表に示す。
【０１６３】
【表１７】
2021513331.tif 000033
【０１６４】
インビトロ間接ＥＬＩＳＡ結合実験により、抗原性断片Ｐ１２（アミノ酸配列：ＴＶＡＳＡＧＮＩＧＥＤＧＩＬＳＣＴＦＥＰ）とヒト化抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈｕ２Ｇ６とが特異的に結合したことを発見し、結果を以下の表に示す。抗体結合エピトープをさらに確認するために、抗原性断片Ｐ１２にアラニンスキャンを行い、Ｐ１２における単一のアミノ酸をそれぞれアラニンに変異させた。インビトロ間接ＥＬＩＳＡ接合実験により、アミノ酸配列：ＩＬＳＣＴＦＥＰ部分の変異は抗体と抗原性断片の結合を著しく弱め、抗体結合エピトープはアミノ酸配列：ＴＶＡＳＡＧＮＩＧＥＤＧＩＬＳＣＴＦＥＰ中のアミノ酸配列：ＩＬＳＣＴＦＥＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）部分に位置していることを発見した。結果を以下の表に示す。
【０１６５】
【表１８】
2021513331.tif 000034
【０１６６】
実施例９：ヒト化抗体の抗腫瘍効果
【０１６７】
遺伝子編集技術によりヒトＢ７Ｈ４遺伝子を導入したマウスにＭＣ３８腫瘍細胞を移植し、腫瘍が平均１００ｍｍ３に成長した後、３日おきにマウスに対照又はヒト化Ｂ７−Ｈ４抗体ｈｕ１Ｃ９（１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ）を１回注射し開始した。腫瘍の大きさの観察により、ｈｕ１Ｃ９が腫瘍成長を顕著に抑制する機能を有し、抗腫瘍効果を有することを発見した。具体的な結果を図３及び以下の表に示す。
【０１６８】
【表１９】
2021513331.tif 000035
【０１６９】
実施例１０：ヒト化抗体の免疫強化の効果
【０１７０】
抗Ｂ７−Ｈ４の抗腫瘍効果は腫瘍免疫効果を強化することにより媒介される可能性がある。このメカニズムを検証するために、ヒト末梢血からＣＤ４陽性のＴ細胞を抽出した後、培養したＴ細胞に異なる濃度のヒト化抗体ｈｕ２Ｇ６とヒト化抗体ｈｕ１Ｃ９のような抗Ｂ７−Ｈ４抗体を添加した。具体的な結果は、図４及び以下の表に示すように、ヒト化抗体ｈｕ２Ｇ６及びヒト化抗体ｈｕ１Ｃ９は、Ｔ細胞増殖を向上させる作用を有し、腫瘍免疫を強化することにより抗腫瘍の効果を達成することができる。
【０１７１】
【表２０】
2021513331.tif 000036
【図１】
2021513331.tif 000037
【図２】
2021513331.tif 000038
【図３】
2021513331.tif 000039
【図４】
2021513331.tif 000040
【配列表】
2021513331000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月6日(2020.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２の配列から選択される少なくとも１つに示したＬＣＤＲを含む抗体軽鎖可変領域と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の配列から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲを含む抗体重鎖可変領域と、を含む、
抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体重鎖可変領域は、それぞれ、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；又は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；又は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体又はその断片、キメラ抗体又はその断片、ヒト抗体又はその断片及びヒト化抗体又はその断片から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記ヒト化抗体の重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域をさらに含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、より好ましくはアミノ酸変異によりＡＤＣＣ毒性を増強させたＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記ヒト化抗体軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０の配列を含む軽鎖可変領域から選択される、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記ヒト化抗体重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９の配列を含む重鎖可変領域から選択される、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
前記ヒト化抗体の軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８の配列を含む軽鎖から選択される、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記ヒト化抗体の重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７の配列を含む重鎖から選択される、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２０】
前記ヒト化抗体は、（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５の重鎖可変領域、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の重鎖可変領域、（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９の重鎖可変領域、又は（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２の軽鎖可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１の重鎖可変領域を含む、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記ヒト化抗体は、（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３の重鎖、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５の重鎖、（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７の重鎖、又は（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０の軽鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９の重鎖を含む、請求項１４に記載のＢ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２２】
（１）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸４１〜６０を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５３〜５９を含むエピトープと結合すること、の少なくとも１つを特徴とする抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２３】
（１）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５３を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５４を含むエピトープと結合すること、（３）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５６を含むエピトープと結合すること、（４）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５７を含むエピトープと結合すること、（５）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５８を含むエピトープと結合すること、（６）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５９を含むエピトープと結合すること、の少なくとも１つを特徴とする抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２５】
請求項２４に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現ベクターを導入又は含有する宿主細胞。
【請求項２７】
細菌であり、好ましくは大腸菌であることを特徴とする、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
酵母菌であり、好ましくはピキア酵母であることを特徴とする、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
哺乳動物細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞であることを特徴とする、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２６〜２９に記載の宿主細胞を培養し、培養物から抗体を分離し、抗体を精製することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項３１】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含有する、医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む、検出試薬。
【請求項３３】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む、診断剤。
【請求項３４】
Ｂ７−Ｈ４媒介性疾患又は症状を治療又は予防するための薬物の製造における請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片又は請求項３１に記載の医薬組成物の用途であって、前記疾患は、好ましくは癌であり、より好ましくはＢ７−Ｈ４を発現する癌であり、前記癌は最も好ましくは乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、胆嚢癌、膠芽腫及び黒色腫である、用途。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片は、（１）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸４１〜６０を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５３〜５９を含むエピトープと結合すること、の少なくとも１つを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原結合断片は、（１）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５３を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５４を含むエピトープと結合すること、（３）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５６を含むエピトープと結合すること、（４）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５７を含むエピトープと結合すること、（５）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５８を含むエピトープと結合すること、（２）Ｂ７−Ｈ４におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のアミノ酸５９を含むエピトープと結合すること、の少なくとも１つを特徴とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
方法ステップは、実施例３の（１）インビトロ間接ＥＬＩＳＡ結合実験と同じである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００のＢ７−Ｈ４を、長さが２０個のアミノ酸である抗原性断片に分解し、インビトロ間接ＥＬＩＳＡ結合実験により、抗原性断片Ｐ１２（アミノ酸配列：ＴＶＡＳＡＧＮＩＧＥＤＧＩＬＳＣＴＦＥＰ）とヒト化抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈｕ２Ｆ７とが特異的に結合したことを発見し、結果を図２に示す。抗体結合エピトープをさらに確認するために、抗原性断片Ｐ１２にアラニンスキャンを行い、Ｐ１２における単一のアミノ酸をそれぞれアラニンに変異させた。インビトロ間接ＥＬＩＳＡ接合実験により、アミノ酸配列：ＩＬＳＣＴＦＥ部分の変異は抗体と抗原性断片の結合を著しく弱め、抗体結合エピトープはアミノ酸配列：ＴＶＡＳＡＧＮＩＧＥＤＧＩＬＳＣＴＦＥＰ中のアミノ酸配列：ＩＬＳＣＴＦＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）部分に位置していることを発見した。結果を以下の表に示す。
【国際調査報告】
2021513331.tif 000041
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