(57)【要約】本発明の第１の態様は、腫瘍細胞を、ＭＡＧＥ由来ペプチドを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に対する特異的結合分子の特異的相互作用によって少なくとも１つの免疫エフェクター細胞と接触させるステップを含む、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体を表面に発現している腫瘍細胞を根絶する方法に関する。一方のアームが、異常細胞に付随しているＭＨＣ−ＭＡＧＥ由来ペプチド複合体に特異的に結合し、他方のアームが、免疫エフェクター細胞に付随している標的を特異的に認識する二重特異性免疫グロブリンについて記載される。本発明は、そのような二重特異性抗体並びに適切な希釈剤及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。また、ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチドを含むＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を含むＴ細胞、並びにα鎖及びβ鎖又はキメラ抗原受容体をコードしている核酸を前記Ｔ細胞に導入するステップを含む、Ｔ細胞を作製する方法について記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＧＥに由来するペプチドを含むＭＨＣ−ペプチド複合体をその表面に発現している腫瘍細胞を根絶する方法であって、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体に対する特異的結合分子の特異的相互作用によって、前記細胞を少なくとも１つの免疫エフェクター細胞と接触させるステップを含む、方法
【請求項２】
前記特異的結合分子が、二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特異的結合分子が、Ｔ細胞受容体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記特異的結合分子が、キメラ抗原受容体である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記特異的結合分子が、Ｔ細胞に付随している、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
一方のアームが、異常細胞に付随しているＭＡＧＥに由来するペプチドを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合し、他方のアームが、免疫エフェクター細胞に付随している標的を特異的に認識する、二重特異性抗体。
【請求項７】
前記分子が、免疫グロブリン可変領域を含む、請求項６に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
前記免疫グロブリン可変領域が、Ｖｈを、好ましくはＢｉＴＥ形式で含む、請求項７に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
前記免疫グロブリン可変領域が、Ｖｈｈを、好ましくはＢｉＴＥ形式で含む、請求項６又は７に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン可変領域が、Ｖｌをさらに含む、請求項６、７、８又は９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
前記二重特異性抗体が、ヒトＩｇＧ、優先的にはヒトＩｇＧ１、最も好ましくは、Ｆｃ部分がＦｃ受容体を活性化しないヒトＩｇＧである、請求項６、７又は８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
前記ＭＨＣ−ペプチド複合体が、ＭＡＧＥ−Ａに由来するペプチドを含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
免疫エフェクター細胞に付随している前記標的が、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｄ及びＮＫｐ４６、好ましくはＣＤ３である、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
がんの治療に使用するための請求項６〜１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
ＭＡＧＥ−Ａに由来するペプチドを含むＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を含むＴ細胞。
【請求項１７】
α鎖及びβ鎖又はキメラ抗原受容体をコードする核酸を前記Ｔ細胞に導入するステップを含む、請求項１６に記載のＴ細胞を作製する方法。
【請求項１８】
請求項６〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体並びに適切な希釈剤及び／又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記Ｖｈドメインが、配列番号１を含む、請求項６に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
前記Ｖｈドメインが、配列番号２を含む、請求項６に記載の二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物療法の分野に関する。本発明は、腫瘍生物学の分野にも関する。より特には、本発明は、がんの異常細胞へ免疫エフェクター細胞を誘引する能力のある分子の分野に関する。本発明は、異常細胞を標的化し、免疫エフェクター細胞を誘引する一方で、正常細胞は本質的に影響を受けないままにするような分子にも関する。より特には、本発明は、一方は異常細胞の表面にあり、他方は免疫エフェクター細胞の表面にある少なくとも２つの異なる結合部位に対して特異的な結合ドメインを含む特異的結合分子に関する。本発明は、がん細胞を選択的に死滅させるためのこれら特異的結合分子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、制御の効かない細胞増殖を駆動する異常細胞の発癌性形質転換に起因し、細胞周期チェックポイントの不整合、ＤＮＡ損傷及び代謝的ストレスを招く。これら異常は、生物に脅威をもたらす異常細胞を排除する手段として多細胞動物において進化してきたアポトーシスの経路へと腫瘍細胞を仕向けるべきである。実際、大部分の形質転換細胞又は腫瘍形成性細胞は、アポトーシスによって死滅される。しかしながら、ときとして、アポトーシス死の回避を可能にする追加的な突然変異を持つ細胞が生存し、したがって悪性の進行が可能になる。したがって、がん細胞は、増殖及び／又は細胞周期調節の不均衡によるだけでなく、アポトーシス機構の不均衡によっても増殖し得る。例えば、非機能的なアポトーシス誘導タンパク質又はアポトーシス阻害タンパク質の過剰発現をもたらす遺伝子突然変異のような不均衡は、腫瘍形成の基礎となる。幸いにも、細胞の異常な表現型によって活性化される場合にこの方法でアポトーシスシグナルをどうにかして回避する細胞でさえ、なおも生物から根絶する準備をしている。これら異常細胞におけるアポトーシスでは、突然変異によって誘導されるアポトーシス阻害シグナルをサイレンシングし又は封じることが、なお引き金となり得る。伝統的ながん療法は、アポトーシスを活性化できるが、その療法は間接的であり、腫瘍抵抗性をしばしば発生する。これら異常細胞においてアポトーシス機構の鍵となる成分を直接及び選択的に標的化することは、新規の抗腫瘍治療薬の開発にとって有望な戦略である。アポトーシス経路の選択的な活性化は、腫瘍成長の停止を可能にすることになり、腫瘍退縮の誘導を可能にすることになる。
【０００３】
現在市販されている又は開発中の抗腫瘍薬の全てではないにせよ、不都合な点の多くは、これらの薬物が異常細胞と健康細胞とを識別しないことである。この非特異性は、薬物に誘発される有害事象の困難な危険性を負っている。そのような厄介な副作用の例は、本分野において周知である：放射線療法及び化学療法剤は、極めて重要な細胞成分に引き起こす損傷の二次効果としてのみ細胞死を誘導する。異常細胞が標的化されるだけでなく、実際には、健康細胞を含めた大部分の増殖細胞が、アポトーシス刺激療法に応答する。したがって、現在のアポトーシス誘導化合物の不都合な点は、非選択的な性質であり、その潜在性を低下させている。
【０００４】
前世紀の６０年代以降、免疫系（Ｔ細胞及び抗体）の特異的結合力を使用して、患者の体内の腫瘍細胞を選択的に死滅させるが、正常細胞を残すことが提案されてきた。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の導入は、個人用の、より腫瘍特異的な医薬へとより近づける大きなステップであった。しかしながら、有効であると同時に真にがんに特異的な療法を設計するという主要な難題のうちの１つは、未解決なままである。現在米国食品医薬品局によって承認されており、臨床試験において評価を受けているｍＡｂの大多数は、細胞表面抗原、まれに可溶性タンパク質、を標的化している［Ｈｏｎｇ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｃａｎｓｅｒ  Ｒｅｓ、２０１２年、７２（１５）：３７１５〜９頁；Ｆｅｒｒｏｎｅ，Ｓ．、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１１年、３（９９）：９９頁］。これらの抗原は、造血分化抗原（例えばＣＤ２０）、固形腫瘍によって発現される糖タンパク質（例えばＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ又はＣＡＩＸ）、糖脂質（すなわちガングリオシド）、炭水化物（すなわちＬｅｗｉｓ  Ｙ抗原）、間質及び細胞外基質抗原（例えばＦＡＰ）、血管形成に関係するタンパク質（例えばＶＥＧＦＲ又はインテグリン）、成長及び分化シグナル伝達に関係する受容体（例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＩＧＦ１Ｒ）を表す。これら抗原の本質的に全てについて、発現は、正常組織と同様に関連する。したがって、これまでのところ、異常細胞の選択的致死は捉えどころのない目的である。
【０００５】
黒色腫抗原遺伝子ファミリー（ＭＡＧＥ）のタンパク質は、がん精巣抗原（ＣＴ）の同定された最初のメンバーであった。その発現パターンは、免疫特権的精巣の生殖細胞及び胎盤、並びに広範囲にわたる悪性細胞に制限される。がん細胞におけるＣＴ抗原の発現は、制御の効かない増殖、細胞死に対する抵抗性、遊走の潜在性、離れた部位での増殖、及び新生血管の成長を誘導する能力をもたらすことが示された［Ｍｏｒｔｅｎ  Ｆ．Ｇｊｅｒｓｔｏｒｆｆら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１５年、６（１８）：１５７７２〜１５７８７頁；Ｓｃａｎｌａｎ  ＭＪ，Ｇ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００２年、１８８：２２〜３２頁］。ＭＡＧＥタンパク質は細胞内で発現するため、細胞質内で短いペプチドへとプロテアソーム分解を受けるまで接近できない標的のままである。プロテアソームによって生成されたこれらペプチドは、小胞体内へ次いで輸送され、ＭＨＣクラスＩ分子に搭載される。細胞内でプロセッシングされたＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合して細胞膜上に一旦提示されると、免疫療法標的として使用され得る。ＭＨＣ分子は、免疫系の特殊化した細胞にＭＡＧＥ由来ペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩ分子を発現しないごく少数の細胞は、精巣及び胎盤由来の細胞である。したがって、ＭＡＧＥタンパク質を発現する正常細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を有さず、ＭＨＣクラスＩ分子を有する正常細胞は、ＭＡＧＥタンパク質を有しない。ＭＨＣクラスＩの文脈においてＭＡＧＥ由来ペプチドは、したがって真に腫瘍特異的な標的である。
【０００６】
免疫エフェクター細胞のサブセットのうちの１つは、ＮＫ細胞である。ＮＫ細胞表面におけるＣＤ１６の発現により、ＮＫ細胞は、免疫グロブリンのＦｃ部分を認識及び結合できる。Ｆｃ受容体へＩｇＧのＦｃ領域が結合すると、ＮＫ細胞は、ＩｇＧに結合された細胞の死を引き起こす細胞障害性因子を放出する。これら細胞障害性因子には、異常細胞の溶解を引き起こすプロテアーゼのクラスであるパーフォリン及びグランザイムがある。免疫エフェクター細胞を誘引するそのような様式は、「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」と呼ばれる。二重特異性抗体の第２のアームがＣＤ１６を認識し、二重特異性抗体のＦｃ部分を無効化することも当然ながら可能であり、実際には好ましい。
【０００７】
異常細胞へのＴ細胞など免疫エフェクター細胞の誘引は、異常細胞の細胞表面で発現されるマーカーに特異性を与えるキメラＴ細胞受容体（ｃＴＣＲ）又はキメラ抗体受容体（ＣＡＲ）の（レトロウイルス）導入によって行い得る。キメラＴＣＲは、抗体由来ＶＨ及びＶＬ鎖をＴＣＲ  Ｃβ及びＣα鎖にそれぞれ融合させることによってこれまで生成されてきた。これらｃＴＣＲを発現しているＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的機能性を示すことが記載されている［Ｇｒｏｓｓ，Ｇら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９８９年、８６（２４）：１００２４〜１００２８頁］。ＣＡＲ形式に勝るｃＴＣＲ形式の優位性のうちの１つは、ｃＴＣＲを発現するＴ細胞における細胞内シグナル伝達が、ＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるシグナル伝達とは対照的に、天然のＣＤ３複合体を介して起こることであろう。ＴＣＲ及びＣＡＲを操作したＴ細胞を使用する複数の臨床研究が、有望な結果を示してきた［Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１３年、５（１７７）；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年、２１（５）：１０１９〜１０２７頁；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１５年、７（３０３）］。
【０００８】
ＣＡＲは、キメラＴＣＲと同じ原理で異常細胞へ免疫エフェクター細胞を誘引するが、分子形式は異なることを表す。３世代のＣＡＲが、これまでに開発されてきた。第一世代のＣＡＲは、抗体由来ＶＨ及びＶＬ鎖が、ＣＤ４膜貫通ドメイン及びＣＤ３複合体内のタンパク質のうちの１つから得られるシグナル伝達ドメイン（例えば：ζ、γ）に融合されたいわゆる一本鎖（ｓｃＦｖ）又はＦａｂ形式からなる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能及び持続性を改善するために、例えばＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）又は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）から得られる共刺激エンドドメインを１つ含有する第２世代ＣＡＲが開発された。第３世代のＣＡＲは、共刺激ドメインを２つ保有する［Ｓａｄｅｌａｉｎ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２０１３年、３（４）：３８８〜３９８頁］。長い間、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の使用は、小規模な臨床試験に制限されてきており、進行血液がんの患者を主に登録してきた。ＦＤＡによって最近承認された２つの療法には、急性リンパ芽球性白血病の子供の処置用の療法（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のキムリア）及び進行性リンパ腫の成人用の他の療法（Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製のイエスカルタ）がある。これらの両方とも、腫瘍マーカーとして健康なＢ細胞にも存在するＣＤ１９分子を利用する。しかしながら、固形腫瘍を標的化することは、免疫腫瘍学分野において大きい難題のままである。根底にある主要な理由は、Ｔ細胞の浸潤性の低さ及び腫瘍細胞が免疫細胞を免れるために創出する免疫抑制性環境である。
【０００９】
腫瘍部位に免疫エフェクター細胞を誘引する別の可能性は、二重特異性抗体の使用である。（ｉ）２つの細胞表面受容体を阻害する、（ｉｉ）２つのリガンドを遮断する、（ｉｉｉ）２つの受容体を架橋する又は（ｉｖ）Ｆｃ受容体を保有しない免疫細胞を動員する（そのような細胞は、抗体によって活性化されない）ために二重特異性抗体が、がん治療薬として開発されている。やがて、二重特異性抗体を作製するいくつかの方法が、開発されてきた。最初の二重特異性抗体は、モノクローナル抗体のヒンジ領域にあるシステインの還元及び再酸化によって作製された。別の選択肢は、２つのハイブリドーマの融合によって二重特異性抗体を作製することであった。そのような融合は、クアドローマの形成をもたらし、そのクアドローマから、ＩｇＧ分子の混合物が作製される。しかしながら、そのような作製系は、限られた量の実際の二重特異性分子を生じる。二重特異性分子を生成するために、キメラハイブリドーマ、共通の軽鎖及び組換えタンパク質が、適当な抗体軽鎖及び重鎖会合の限定に取り組んだ。キメラクアドローマにおける重軽鎖対合は、種制限的である。組換えＤＮＡ技術分野の進歩は、二重特異性抗体の組成物及び作製系の点で新たな機会を開いた。組換えタンパク質における正しい二重特異性抗体構造は、例えばノブインホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎ−ｈｏｌｅｓ）手法（一方の重鎖が、比較的大きなアミノ酸からなるノブで操作され、他方が、比較的小さいアミノ酸からなるホールで操作される）又はペプチド鎖として抗体断片を接続して鎖のランダムな会合を回避する（例えば、ＢｉＴＥ手法において利用される）など、様々な戦略を利用することによって確保され得る。二重特異性抗体は、その構造に基づいて、Ｆｃ領域を含有するＩｇＧ様分子、又はＦｃ領域を欠く非ＩｇＧ様分子に分類され得る。ＩｇＧ様二重特異性分子は、サイズがより大きく、血清中でより長い半減期を有し、一方で非ＩｇＧ様抗体は、より良好な腫瘍浸透が可能になるより小さいサイズを有するが、非常に短い血中半減期を呈する。数多くの形式の二重特異性抗体が利用可能であることにより、それら抗体の免疫原性、エフェクター機能及び半減期の調整が可能である。
【００１０】
免疫腫瘍学への関心の高まりは、免疫細胞結合抗体の開発をもたらした。一方の結合アームが、腫瘍細胞の表面上に発現される標的を認識し、第２のアームが、例えばＴ細胞上のＣＤ３などエフェクター免疫細胞上に存在する抗原を認識する二重特異性抗体の例が、記載されている［Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ＭＡｂｓ  ２０１２年、４（２）：１８２〜９７頁；Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ．ら、ＭＡｂｓ  ２００９年、１（６）：５３９〜４７頁；Ｍｏｏｒｅ  Ｐ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２０１１年、１１７（１７）：４５４２〜５１頁］。いわゆるトリオｍＡｂ  ＣＤ３ｘＥｐｃａｍ二重特異性抗体、別名カツマキソマブが、臨床的に開発され、上皮起源の腹部腫瘍の対症療法用としてヨーロッパにおいて登録された。カツマキソマブは、一方の抗原結合アームでＥｐＣＡＭ陽性がん細胞及び他方でＴ細胞抗原ＣＤ３を結合する［Ｃｈｅｌｉｕｓ  Ｄ．ら、ＭＡｂｓ  ２０１０年、２（３）：３０９〜１９頁］。ＣＤ３結合を介するＥｐＣＡＭ陽性がん細胞へのＴ細胞の指向に加えて、この手法は、この抗体のＦｃドメインによって他の免疫細胞、例えばナチュラルキラー細胞及びマクロファージの結合も促進し、この戦略を二重特異性でありながら、３機能的にしている。しかしながら、この形式の幅広い適用は、反復投薬により抗産物免疫応答を誘導する齧歯目の性質によって妨げられる。
【００１１】
Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓによって開発されているデュアルアフィニティリターゲティング（Ｄｕａｌ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）［ＤＡＲＴ（商標）］分子、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、現Ａｍｇｅｎによって開発されたバイスペシフィックＴセルエンゲージャー（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ）［ＢｉＴＥ（登録商標）］分子［Ｓｈｅｒｉｄａｎ  Ｃ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２年（３０）：３００〜１頁］、Ａｂｂｏｔｔによって開発されているデュアルバリアブルドメインイムノグロブリン（Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）［ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）］分子、及びＡｆｆｉｍｅｄによって開発されているＴａｎｄＡｂ（登録商標）リクルート（ＴａｎｄＡｂ  ＲＥＣＲＵＩＴ）分子など、免疫エフェクター細胞をがん部位へ再方向付けする分子の代わりの形式が、評価されてきた。今日まで、これらの形式によって標的化されるがん関連抗原は、ＭＡＧＥ抗原の場合のように真に腫瘍特異的ではない。ＣＤ３ｘＣＤ１９  ＢｉＴＥ（登録商標）、ブリナツモマブは、難治性非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ球性白血病患者において著しい臨床的有効性を実証した［Ｂａｒｇｏｕ  Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８年、３２１（５８９１）：９７４〜７頁］。ブリナツモマブによって認識される標的のうちの１つは、新生物と健康なＢ細胞の両方で発現される細胞表面抗原、ＣＤ１９である。ブリナツモマブの結果は、Ｔ細胞活性を腫瘍部位に仕向ける様々な分子の開発に拍車をかけた。ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３３、ＥｒｂＢファミリーメンバー（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ）、細胞死受容体（ＣＤ９５又はＣＤ６３など）、血管形成に関係するタンパク質（Ａｎｇ−２又はＶＥＧＦ−Ａなど）又はＰＳＭＡなど、腫瘍に関連するが腫瘍特異的ではない標的を認識するこれらの分子のいくつかは、現在臨床的評価を受けている（Ｋｒｉｓｈａｎｕｍｕｒｔｈｙ  Ａ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１８年５月；１８５：１２２〜１３４頁）。
【００１２】
したがって、異常細胞の表面に排他的に接近可能な標的を認識し、免疫原性なしにそのような細胞に免疫エフェクター細胞を動員することができる、効果的な特異的結合分子に対する必要性が残されている。
【発明の概要】
【００１３】
腫瘍細胞に免疫エフェクター細胞を特異的に誘引することが、本発明の目的である。第２の目的は、異常細胞の死の特異的且つ効果的な誘導を促進する薬学的に活性がある分子を提供することである。特に、異常細胞を特異的且つ選択的に標的化し、これら異常細胞のアポトーシスを誘導し、健康細胞は本質的に影響を受けないままにすることが本発明の目的である。ほとんどあらゆる起源の腫瘍に対してＭＨＣ−１ペプチド複合体は有益な標的であるが、ＭＨＣ−２ペプチド複合体は、造血起源の腫瘍に対して有益な標的である。この出願において、本発明者らは、ＭＨＣ−Ｉについて一般に言及することになる。当然ながらほとんどの実施形態において、ＭＨＣ−ＩＩが、同様に使用されてもよく、そのためＭＡＧＥ／ＭＨＣ−ＩＩペプチド複合体も、本発明の部分である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】Ａ０９免疫グロブリンの特異性を、異なる起源の細胞のパネルを利用するフローサイトメトリーアッセイにおいて評価した図である。Ｈ１２９９細胞は、ＨＬＡ−Ａ２陰性、ＭＡＧＥ−Ａ陽性であり、陰性対照としての機能を果たし、Ｈ１２９９＿Ａ２／ｍＭＡは、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ複合体を安定して発現し、陽性対照としての機能を果たす。Ｕ８７細胞（ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＡＧＥ陽性）は、神経膠芽腫起源のものであり、９１１細胞（ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＡＧＥ陰性）は、胚網膜芽細胞から得られる。（Ａ）Ａ０９の結合を、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出した。Ａ０９  ＩｇＧは、ＨＬＡ−Ａ２＋、ＭＡＧＥ＋細胞（Ｕ８７、Ｈ１２９９＿Ａ２／ｍＭＡ）に特異的に結合したが、ＨＬＡ−Ａ２＋、ＭＡＧＥ−細胞（９１１）又はＨＬＡ−Ａ２−、ＭＡＧＥ＋細胞（Ｈ１２９９）に結合しなかった。（Ｂ）使用した細胞株のＨＬＡ−Ａ２発現状態を、抗ＨＬＡ−Ａ２−ＢＢ５１５抗体を使用するフローサイトメトリー染色によって評価した。
【図１Ｂ】Ａ０９免疫グロブリンの特異性を、異なる起源の細胞のパネルを利用するフローサイトメトリーアッセイにおいて評価した図である。Ｈ１２９９細胞は、ＨＬＡ−Ａ２陰性、ＭＡＧＥ−Ａ陽性であり、陰性対照としての機能を果たし、Ｈ１２９９＿Ａ２／ｍＭＡは、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ複合体を安定して発現し、陽性対照としての機能を果たす。Ｕ８７細胞（ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＡＧＥ陽性）は、神経膠芽腫起源のものであり、９１１細胞（ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＡＧＥ陰性）は、胚網膜芽細胞から得られる。（Ａ）Ａ０９の結合を、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出した。Ａ０９  ＩｇＧは、ＨＬＡ−Ａ２＋、ＭＡＧＥ＋細胞（Ｕ８７、Ｈ１２９９＿Ａ２／ｍＭＡ）に特異的に結合したが、ＨＬＡ−Ａ２＋、ＭＡＧＥ−細胞（９１１）又はＨＬＡ−Ａ２−、ＭＡＧＥ＋細胞（Ｈ１２９９）に結合しなかった。（Ｂ）使用した細胞株のＨＬＡ−Ａ２発現状態を、抗ＨＬＡ−Ａ２−ＢＢ５１５抗体を使用するフローサイトメトリー染色によって評価した。
【図２Ａ】形質導入されたＴ細胞が、その表面上にＭＡＧＥ／ＨＬＡ−Ａ２特異的ＣＡＲを発現することを示す図である。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  ｐＭｘ−ｐｕｒｏベクターで形質導入されたＴ細胞及びｐＭｘ−ｐｕｒｏベクターでトランスフェクトされた対照Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２−ＭＡ３（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）−ＰＥの四量体を使用するフローサイトメトリー染色に供した。四量体は、モル比５：１でビオチン化ＨＬＡ−Ａ２−ＭＡ３複合体をＰＥストレプトアビジンと混合することによって作製された。試料を４℃暗所で３０分間インキュベートした。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出を、ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ８（図２Ａ及び図２Ｂ）を使用して実行し、ＣＤ４  Ｔ細胞を検出するためにＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４抗体を使用した（図２Ａ、下段パネル）。
【図２Ｂ】形質導入されたＴ細胞が、その表面上にＭＡＧＥ／ＨＬＡ−Ａ２特異的ＣＡＲを発現することを示す図である。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  ｐＭｘ−ｐｕｒｏベクターで形質導入されたＴ細胞及びｐＭｘ−ｐｕｒｏベクターでトランスフェクトされた対照Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２−ＭＡ３（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）−ＰＥの四量体を使用するフローサイトメトリー染色に供した。四量体は、モル比５：１でビオチン化ＨＬＡ−Ａ２−ＭＡ３複合体をＰＥストレプトアビジンと混合することによって作製された。試料を４℃暗所で３０分間インキュベートした。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出を、ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ８（図２Ａ及び図２Ｂ）を使用して実行し、ＣＤ４  Ｔ細胞を検出するためにＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４抗体を使用した（図２Ａ、下段パネル）。
【図３Ａ】Ｔ細胞活性化による効果としてのグランザイムＢ放出を示す図である。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｄ−Ｆ）又はｐＭｘ−ｐｕｒｏ−ＲＴＶ  ０１４  Ｔ細胞（Ａ−Ｃ）を、ＭＡ３（関連する、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）又はＭＡ１（関連しない）ペプチドでパルスしたＴ２細胞と同時インキュベートした。イオノマイシンを、Ｔ細胞活性化に対する陽性対照として使用した。細胞を、抗ヒトＣＤ８（Ａ−Ｆ左列）及びＣＤ４（Ａ−Ｆ右列）で細胞外染色し、続いて抗ヒトグランザイムＢ（ｙ軸：グランザイム：ＰＥ、ｘ軸：ＣＤ８／ＣＤ４）で細胞内染色した。
【図３Ｂ】Ｔ細胞活性化による効果としてのグランザイムＢ放出を示す図である。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｄ−Ｆ）又はｐＭｘ−ｐｕｒｏ−ＲＴＶ  ０１４  Ｔ細胞（Ａ−Ｃ）を、ＭＡ３（関連する、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）又はＭＡ１（関連しない）ペプチドでパルスしたＴ２細胞と同時インキュベートした。イオノマイシンを、Ｔ細胞活性化に対する陽性対照として使用した。細胞を、抗ヒトＣＤ８（Ａ−Ｆ左列）及びＣＤ４（Ａ−Ｆ右列）で細胞外染色し、続いて抗ヒトグランザイムＢ（ｙ軸：グランザイム：ＰＥ、ｘ軸：ＣＤ８／ＣＤ４）で細胞内染色した。
【図３Ｃ】Ｔ細胞活性化による効果としてのグランザイムＢ放出を示す図である。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｄ−Ｆ）又はｐＭｘ−ｐｕｒｏ−ＲＴＶ  ０１４  Ｔ細胞（Ａ−Ｃ）を、ＭＡ３（関連する、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）又はＭＡ１（関連しない）ペプチドでパルスしたＴ２細胞と同時インキュベートした。イオノマイシンを、Ｔ細胞活性化に対する陽性対照として使用した。細胞を、抗ヒトＣＤ８（Ａ−Ｆ左列）及びＣＤ４（Ａ−Ｆ右列）で細胞外染色し、続いて抗ヒトグランザイムＢ（ｙ軸：グランザイム：ＰＥ、ｘ軸：ＣＤ８／ＣＤ４）で細胞内染色した。
【図３Ｄ】Ｔ細胞活性化による効果としてのグランザイムＢ放出を示す図である。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｄ−Ｆ）又はｐＭｘ−ｐｕｒｏ−ＲＴＶ  ０１４  Ｔ細胞（Ａ−Ｃ）を、ＭＡ３（関連する、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）又はＭＡ１（関連しない）ペプチドでパルスしたＴ２細胞と同時インキュベートした。イオノマイシンを、Ｔ細胞活性化に対する陽性対照として使用した。細胞を、抗ヒトＣＤ８（Ａ−Ｆ左列）及びＣＤ４（Ａ−Ｆ右列）で細胞外染色し、続いて抗ヒトグランザイムＢ（ｙ軸：グランザイム：ＰＥ、ｘ軸：ＣＤ８／ＣＤ４）で細胞内染色した。
【図３Ｅ】Ｔ細胞活性化による効果としてのグランザイムＢ放出を示す図である。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｄ−Ｆ）又はｐＭｘ−ｐｕｒｏ−ＲＴＶ  ０１４  Ｔ細胞（Ａ−Ｃ）を、ＭＡ３（関連する、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）又はＭＡ１（関連しない）ペプチドでパルスしたＴ２細胞と同時インキュベートした。イオノマイシンを、Ｔ細胞活性化に対する陽性対照として使用した。細胞を、抗ヒトＣＤ８（Ａ−Ｆ左列）及びＣＤ４（Ａ−Ｆ右列）で細胞外染色し、続いて抗ヒトグランザイムＢ（ｙ軸：グランザイム：ＰＥ、ｘ軸：ＣＤ８／ＣＤ４）で細胞内染色した。
【図３Ｆ】Ｔ細胞活性化による効果としてのグランザイムＢ放出を示す図である。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｄ−Ｆ）又はｐＭｘ−ｐｕｒｏ−ＲＴＶ  ０１４  Ｔ細胞（Ａ−Ｃ）を、ＭＡ３（関連する、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）又はＭＡ１（関連しない）ペプチドでパルスしたＴ２細胞と同時インキュベートした。イオノマイシンを、Ｔ細胞活性化に対する陽性対照として使用した。細胞を、抗ヒトＣＤ８（Ａ−Ｆ左列）及びＣＤ４（Ａ−Ｆ右列）で細胞外染色し、続いて抗ヒトグランザイムＢ（ｙ軸：グランザイム：ＰＥ、ｘ軸：ＣＤ８／ＣＤ４）で細胞内染色した。
【図４Ａ】二重特異性分子の精製及び特異性を示す図である。（Ａ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３、Ａ０９ｘＣＤ３及びＣＤ１９ｘＣＤ３を哺乳動物細胞で発現させ、Ｔａｌｏｎビーズを使用して細胞培養培地から精製した。溶出画分の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して評価した。（Ｂ）二重特異性分子の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して脱塩ステップ後に評価した。（Ｃ）４Ａ６ｘＣＤ３は、ビオチン化ペプチド／ＨＬＡ複合体に対するＥＬＩＳＡにおいてＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３、１２（黒四角）を特異的に結合するが、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ（黒丸）を結合しない。（Ｄ）４Ａ６ｘＣＤ３は、健康なドナー由来のＰＢＭＣを結合する（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、下のヒストグラムにおけるＭＦＩシグナルの移動によって示される）。陰性対照分子４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶは、ＰＢＭＣを結合しなかった（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、中段のヒストグラムにおいて移動がないことによって示される）。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３の精細な特異性のアラニンスキャニング分析を示す図である。（Ｆ）アラニンスキャニング実験において使用したペプチドのアミノ酸配列、及びＨＬＡ−Ａ２分子に対する予測される親和性を示す表である。ランダムなペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性がある対照ペプチドとして使用する。４Ａ６ｘＣＤ３は、このペプチド／ＨＬＡ複合体に対する精細な特異性を保有しないので、陰性対照である。
【図４Ｂ】二重特異性分子の精製及び特異性を示す図である。（Ａ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３、Ａ０９ｘＣＤ３及びＣＤ１９ｘＣＤ３を哺乳動物細胞で発現させ、Ｔａｌｏｎビーズを使用して細胞培養培地から精製した。溶出画分の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して評価した。（Ｂ）二重特異性分子の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して脱塩ステップ後に評価した。（Ｃ）４Ａ６ｘＣＤ３は、ビオチン化ペプチド／ＨＬＡ複合体に対するＥＬＩＳＡにおいてＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３、１２（黒四角）を特異的に結合するが、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ（黒丸）を結合しない。（Ｄ）４Ａ６ｘＣＤ３は、健康なドナー由来のＰＢＭＣを結合する（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、下のヒストグラムにおけるＭＦＩシグナルの移動によって示される）。陰性対照分子４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶは、ＰＢＭＣを結合しなかった（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、中段のヒストグラムにおいて移動がないことによって示される）。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３の精細な特異性のアラニンスキャニング分析を示す図である。（Ｆ）アラニンスキャニング実験において使用したペプチドのアミノ酸配列、及びＨＬＡ−Ａ２分子に対する予測される親和性を示す表である。ランダムなペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性がある対照ペプチドとして使用する。４Ａ６ｘＣＤ３は、このペプチド／ＨＬＡ複合体に対する精細な特異性を保有しないので、陰性対照である。
【図４Ｃ】二重特異性分子の精製及び特異性を示す図である。（Ａ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３、Ａ０９ｘＣＤ３及びＣＤ１９ｘＣＤ３を哺乳動物細胞で発現させ、Ｔａｌｏｎビーズを使用して細胞培養培地から精製した。溶出画分の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して評価した。（Ｂ）二重特異性分子の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して脱塩ステップ後に評価した。（Ｃ）４Ａ６ｘＣＤ３は、ビオチン化ペプチド／ＨＬＡ複合体に対するＥＬＩＳＡにおいてＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３、１２（黒四角）を特異的に結合するが、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ（黒丸）を結合しない。（Ｄ）４Ａ６ｘＣＤ３は、健康なドナー由来のＰＢＭＣを結合する（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、下のヒストグラムにおけるＭＦＩシグナルの移動によって示される）。陰性対照分子４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶは、ＰＢＭＣを結合しなかった（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、中段のヒストグラムにおいて移動がないことによって示される）。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３の精細な特異性のアラニンスキャニング分析を示す図である。（Ｆ）アラニンスキャニング実験において使用したペプチドのアミノ酸配列、及びＨＬＡ−Ａ２分子に対する予測される親和性を示す表である。ランダムなペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性がある対照ペプチドとして使用する。４Ａ６ｘＣＤ３は、このペプチド／ＨＬＡ複合体に対する精細な特異性を保有しないので、陰性対照である。
【図４Ｄ】二重特異性分子の精製及び特異性を示す図である。（Ａ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３、Ａ０９ｘＣＤ３及びＣＤ１９ｘＣＤ３を哺乳動物細胞で発現させ、Ｔａｌｏｎビーズを使用して細胞培養培地から精製した。溶出画分の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して評価した。（Ｂ）二重特異性分子の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して脱塩ステップ後に評価した。（Ｃ）４Ａ６ｘＣＤ３は、ビオチン化ペプチド／ＨＬＡ複合体に対するＥＬＩＳＡにおいてＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３、１２（黒四角）を特異的に結合するが、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ（黒丸）を結合しない。（Ｄ）４Ａ６ｘＣＤ３は、健康なドナー由来のＰＢＭＣを結合する（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、下のヒストグラムにおけるＭＦＩシグナルの移動によって示される）。陰性対照分子４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶは、ＰＢＭＣを結合しなかった（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、中段のヒストグラムにおいて移動がないことによって示される）。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３の精細な特異性のアラニンスキャニング分析を示す図である。（Ｆ）アラニンスキャニング実験において使用したペプチドのアミノ酸配列、及びＨＬＡ−Ａ２分子に対する予測される親和性を示す表である。ランダムなペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性がある対照ペプチドとして使用する。４Ａ６ｘＣＤ３は、このペプチド／ＨＬＡ複合体に対する精細な特異性を保有しないので、陰性対照である。
【図４Ｅ】二重特異性分子の精製及び特異性を示す図である。（Ａ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３、Ａ０９ｘＣＤ３及びＣＤ１９ｘＣＤ３を哺乳動物細胞で発現させ、Ｔａｌｏｎビーズを使用して細胞培養培地から精製した。溶出画分の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して評価した。（Ｂ）二重特異性分子の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して脱塩ステップ後に評価した。（Ｃ）４Ａ６ｘＣＤ３は、ビオチン化ペプチド／ＨＬＡ複合体に対するＥＬＩＳＡにおいてＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３、１２（黒四角）を特異的に結合するが、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ（黒丸）を結合しない。（Ｄ）４Ａ６ｘＣＤ３は、健康なドナー由来のＰＢＭＣを結合する（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、下のヒストグラムにおけるＭＦＩシグナルの移動によって示される）。陰性対照分子４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶは、ＰＢＭＣを結合しなかった（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、中段のヒストグラムにおいて移動がないことによって示される）。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３の精細な特異性のアラニンスキャニング分析を示す図である。（Ｆ）アラニンスキャニング実験において使用したペプチドのアミノ酸配列、及びＨＬＡ−Ａ２分子に対する予測される親和性を示す表である。ランダムなペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性がある対照ペプチドとして使用する。４Ａ６ｘＣＤ３は、このペプチド／ＨＬＡ複合体に対する精細な特異性を保有しないので、陰性対照である。
【図４Ｆ】二重特異性分子の精製及び特異性を示す図である。（Ａ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３、Ａ０９ｘＣＤ３及びＣＤ１９ｘＣＤ３を哺乳動物細胞で発現させ、Ｔａｌｏｎビーズを使用して細胞培養培地から精製した。溶出画分の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して評価した。（Ｂ）二重特異性分子の純度を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して脱塩ステップ後に評価した。（Ｃ）４Ａ６ｘＣＤ３は、ビオチン化ペプチド／ＨＬＡ複合体に対するＥＬＩＳＡにおいてＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３、１２（黒四角）を特異的に結合するが、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ（黒丸）を結合しない。（Ｄ）４Ａ６ｘＣＤ３は、健康なドナー由来のＰＢＭＣを結合する（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、下のヒストグラムにおけるＭＦＩシグナルの移動によって示される）。陰性対照分子４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶは、ＰＢＭＣを結合しなかった（バックグラウンド参照としての機能を果たす上のヒストグラムと比較して、中段のヒストグラムにおいて移動がないことによって示される）。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３の精細な特異性のアラニンスキャニング分析を示す図である。（Ｆ）アラニンスキャニング実験において使用したペプチドのアミノ酸配列、及びＨＬＡ−Ａ２分子に対する予測される親和性を示す表である。ランダムなペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性がある対照ペプチドとして使用する。４Ａ６ｘＣＤ３は、このペプチド／ＨＬＡ複合体に対する精細な特異性を保有しないので、陰性対照である。
【図５Ａ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現するＨ１２９９細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３を含まない（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３（中段のヒストグラム）若しくはＡ０９ｘＣＤ３（下のヒストグラム）を含むかいずれかで図５Ａ及び図５Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）漸増量の二重特異性分子に伴うＴ細胞のＣＤ６９発現の用量依存的増大を示す図である。（Ｅ）Ｈ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２細胞に対して４Ａ６ｘＣＤ３又はＨ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ細胞に対してＡ０９ｘＣＤ３のいずれかとインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｆ）インキュベーション２４時間後の４Ａ６ｘＣＤ３存在下におけるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２発現Ｈ１２９９細胞に対するＰＢＭＣの物理的誘引力を示す図である。
【図５Ｂ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現するＨ１２９９細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３を含まない（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３（中段のヒストグラム）若しくはＡ０９ｘＣＤ３（下のヒストグラム）を含むかいずれかで図５Ａ及び図５Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）漸増量の二重特異性分子に伴うＴ細胞のＣＤ６９発現の用量依存的増大を示す図である。（Ｅ）Ｈ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２細胞に対して４Ａ６ｘＣＤ３又はＨ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ細胞に対してＡ０９ｘＣＤ３のいずれかとインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｆ）インキュベーション２４時間後の４Ａ６ｘＣＤ３存在下におけるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２発現Ｈ１２９９細胞に対するＰＢＭＣの物理的誘引力を示す図である。
【図５Ｃ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現するＨ１２９９細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３を含まない（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３（中段のヒストグラム）若しくはＡ０９ｘＣＤ３（下のヒストグラム）を含むかいずれかで図５Ａ及び図５Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）漸増量の二重特異性分子に伴うＴ細胞のＣＤ６９発現の用量依存的増大を示す図である。（Ｅ）Ｈ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２細胞に対して４Ａ６ｘＣＤ３又はＨ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ細胞に対してＡ０９ｘＣＤ３のいずれかとインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｆ）インキュベーション２４時間後の４Ａ６ｘＣＤ３存在下におけるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２発現Ｈ１２９９細胞に対するＰＢＭＣの物理的誘引力を示す図である。
【図５Ｄ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現するＨ１２９９細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３を含まない（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３（中段のヒストグラム）若しくはＡ０９ｘＣＤ３（下のヒストグラム）を含むかいずれかで図５Ａ及び図５Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）漸増量の二重特異性分子に伴うＴ細胞のＣＤ６９発現の用量依存的増大を示す図である。（Ｅ）Ｈ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２細胞に対して４Ａ６ｘＣＤ３又はＨ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ細胞に対してＡ０９ｘＣＤ３のいずれかとインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｆ）インキュベーション２４時間後の４Ａ６ｘＣＤ３存在下におけるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２発現Ｈ１２９９細胞に対するＰＢＭＣの物理的誘引力を示す図である。
【図５Ｅ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現するＨ１２９９細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３を含まない（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３（中段のヒストグラム）若しくはＡ０９ｘＣＤ３（下のヒストグラム）を含むかいずれかで図５Ａ及び図５Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）漸増量の二重特異性分子に伴うＴ細胞のＣＤ６９発現の用量依存的増大を示す図である。（Ｅ）Ｈ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２細胞に対して４Ａ６ｘＣＤ３又はＨ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ細胞に対してＡ０９ｘＣＤ３のいずれかとインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｆ）インキュベーション２４時間後の４Ａ６ｘＣＤ３存在下におけるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２発現Ｈ１２９９細胞に対するＰＢＭＣの物理的誘引力を示す図である。
【図５Ｆ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現するＨ１２９９細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＰＢＭＣ存在下で、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２を発現するＨ１２９９細胞（標的Ａ）と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ａ）との７２時間のインキュベーション及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡを発現するＨ１２９９細胞（標的Ｂ）と５００ｎｇ／ｍＬ  Ａ０９ｘＣＤ３（ＢｉＴＥ  Ｂ）との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３を含まない（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３（中段のヒストグラム）若しくはＡ０９ｘＣＤ３（下のヒストグラム）を含むかいずれかで図５Ａ及び図５Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）漸増量の二重特異性分子に伴うＴ細胞のＣＤ６９発現の用量依存的増大を示す図である。（Ｅ）Ｈ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２細胞に対して４Ａ６ｘＣＤ３又はＨ１２９９  ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ細胞に対してＡ０９ｘＣＤ３のいずれかとインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｆ）インキュベーション２４時間後の４Ａ６ｘＣＤ３存在下におけるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２発現Ｈ１２９９細胞に対するＰＢＭＣの物理的誘引力を示す図である。
【図６Ａ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現する９１１細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３非存在下（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３存在下（下のヒストグラム）のいずれかで図６Ａ及び図６Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の存在下で４Ａ６ｘＣＤ３とインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３及びＰＢＭＣの７２時間インキュベーションによるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の数の減少を示す代表的な画像である。
【図６Ｂ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現する９１１細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３非存在下（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３存在下（下のヒストグラム）のいずれかで図６Ａ及び図６Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の存在下で４Ａ６ｘＣＤ３とインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３及びＰＢＭＣの７２時間インキュベーションによるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の数の減少を示す代表的な画像である。
【図６Ｃ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現する９１１細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３非存在下（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３存在下（下のヒストグラム）のいずれかで図６Ａ及び図６Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の存在下で４Ａ６ｘＣＤ３とインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３及びＰＢＭＣの７２時間インキュベーションによるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の数の減少を示す代表的な画像である。
【図６Ｄ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現する９１１細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３非存在下（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３存在下（下のヒストグラム）のいずれかで図６Ａ及び図６Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の存在下で４Ａ６ｘＣＤ３とインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３及びＰＢＭＣの７２時間インキュベーションによるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の数の減少を示す代表的な画像である。
【図６Ｅ】標的ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド／ＨＬＡ複合体を発現する９１１細胞の文脈における本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞と５００ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３との７２時間のインキュベーションは、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大をもたらす。（Ｃ）二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３非存在下（上のヒストグラム）又は二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３存在下（下のヒストグラム）のいずれかで図６Ａ及び図６Ｂに示すように標的細胞とインキュベートしたＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。（Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の存在下で４Ａ６ｘＣＤ３とインキュベートした場合、標的細胞対エフェクター細胞の異なる比は、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージに影響を及ぼさなかった。（Ｅ）４Ａ６ｘＣＤ３及びＰＢＭＣの７２時間インキュベーションによるＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体を発現する９１１細胞の数の減少を示す代表的な画像である。
【図７Ａ】Ａ０９ｘＣＤ３及び神経膠芽腫細胞とのインキュベーションによるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣを、Ｕ８７細胞の存在下で４Ａ６ｘＣＤ３又はＡ０９ｘＣＤ３分子と７２時間インキュベートした場合、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの特異的増大が観察された。（Ｂ）二重特異性分子非存在下（上のヒストグラム）又は二重特異性分子存在下（下のヒストグラム）のいずれかでＵ８７細胞とインキュベーションしたＣＤ６９陽性Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。
【図７Ｂ】Ａ０９ｘＣＤ３及び神経膠芽腫細胞とのインキュベーションによるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣを、Ｕ８７細胞の存在下で４Ａ６ｘＣＤ３又はＡ０９ｘＣＤ３分子と７２時間インキュベートした場合、ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージの特異的増大が観察された。（Ｂ）二重特異性分子非存在下（上のヒストグラム）又は二重特異性分子存在下（下のヒストグラム）のいずれかでＵ８７細胞とインキュベーションしたＣＤ６９陽性Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムである。
【図８】二重特異性ナノボディの精製を示す図である。精製後にペリプラスム画分（Ｐ）に存在する発現されたナノボディは、通過画分（Ｆ）においてもはや検出不能であり、精製ビーズ（Ｅ）から効率的に溶出された可能性がある。溶出画分をプールし、脱塩した（ＤＥ）。
【図９】ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ複合体に対するファージディスプレイ選択したＦａｂ断片の特異的結合を示す図である（上の表に示すデータ）。陽性対照としてＡＨ５  Ｆａｂ（ｐＣＥＳベクターから産生した）及びＡＨ５モノクローナルＩｇＧを使用した。ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３複合体に対する結合を示すクローン（下の表に示すデータ）は、所望の精細な特異性を保有しないと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
異常細胞は、健康で正常な相対物から逸脱している細胞と定義される。異常細胞は、例えば、腫瘍細胞、ウイルスなどの病原体によって侵された細胞、及び自己免疫細胞である。したがって、一実施形態において、上述した実施形態のいずれかに記載の免疫グロブリンが提供され、ＭＨＣ−ペプチド複合体は、異常細胞に特異的である。
【００１６】
したがって、本発明は、ＭＡＧＥ由来ペプチドを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に対する特異的結合分子の特異的相互作用によって異常細胞、特に前記ＭＨＣ−ペプチド複合体を表面に発現している腫瘍細胞を少なくとも１つの免疫エフェクター細胞と接触させるステップを含む、前記細胞を根絶する方法を提供する。本発明によると、免疫エフェクター細胞は、異常細胞の非常に近くに呼び込まれる。腫瘍細胞上の標的であるＭＡＧＥ／ＭＨＣ−Ｉペプチド複合体が腫瘍特異的であることは、本発明の重要な態様である。したがって、標的に誘引されるエフェクター細胞は、一般に、異常細胞において細胞死を誘導するだけになる。免疫エフェクター細胞、特にＮＫ細胞及びＴ細胞を異常細胞の非常に近くに呼び込む方法がいくつか存在する。ＭＡＧＥ／ＭＨＣ−Ｉペプチド複合体を使用するそのような方法の全てが、この発明に原理的に適している。好ましい方法は、二重特異性抗体を含む。
【００１７】
別の好ましい方法は、ＭＡＧＥ／ＭＨＣ−Ｉペプチド複合体を認識する特異的結合分子と共にエフェクター細胞、特にＴ細胞を提供することである。したがって、本発明は、異常細胞の表面上に露出される特定のＭＨＣ−ペプチド複合体を特異的に認識する結合ドメイン及びこの異常細胞へエフェクター免疫細胞を誘引できる結合ドメインを含む結合分子を提供する。本明細書では、用語「ＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する」とは、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体が前記結合分子付近に存在する状況において前記分子が、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体を特異的に認識し、結合する能力を有することを意味する。同様に、用語「免疫エフェクター細胞を動員できる」とは、免疫エフェクター細胞が前記特異的結合分子付近に存在する場合に、前記分子が、前記免疫エフェクター細胞に特異的な抗原を特異的に認識し、結合する能力を有することを意味する。
【００１８】
用語「特異的に結合する」とは、この発明によると、分子が、本明細書に定義される標的分子のそれぞれの少なくとも２つのアミノ酸と特異的に相互作用する及び／又はそれに結合できることを意味する。前記用語は、分子の特異性、すなわち標的分子の特定の領域同士を識別する能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば抗原配座の変化、抗原のオリゴマー形成、等を誘導することにより、シグナルの開始をもたらし得る。さらに、前記結合は、「鍵と鍵穴の原理」の特異性によって例示してもよい。したがって、抗原相互作用部位のアミノ酸配列中の特異的モチーフと抗原は、その一次、二次又は三次構造の結果として及び前記構造の二次修飾の結果として互いに結合する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、抗原に対する前記部位の単純な結合を同様にもたらし得る。
【００１９】
本発明により使用される用語「結合分子」とは、二重特異性構築物が、類似の構造の（ポリ）ペプチドと交差反応しない又は本質的に交差反応しないことを意味する。調査下での構築物の交差反応性は、例えば、従来通りの条件下で前記構築物の、対象とする抗原及び多数の多かれ少なかれ（構造的及び／又は機能的に）密接に関連した抗原への結合を評価することによって試験されてもよい（例えばＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年及びＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年を参照のこと）。対象とする抗原には結合するが、他の抗原のいずれにも結合しない又は本質的に結合しない構築物だけが、対象とする抗原に対して特異的であると考えられる。
【００２０】
本発明に記載の二重特異性抗体が使用される場合、本明細書において前に開示された二重特異性抗体（ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴ、等など）のどんな形式も適していることは、当業者に明らかである。一般にこれらの形式は、単一ポリペプチド形式又は異なるポリペプチド鎖の複合体を含むことになる。これらの鎖／ポリペプチドは、Ｖｈ、Ｖｈｈ及び／又はＶｌを一般に含むことになる。
【００２１】
ＩｇＧなど二重特異性抗体の一部の形式は、Ｆｃ領域を含む。Ｆｃ領域は、免疫エフェクター細胞に対する別の結合部分である。免疫エフェクター細胞上に標的を認識するアームがすでに存在する形式において、この部分は、公知の手段によって無効にされてもよい。
【００２２】
好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、異常細胞に付随しているＭＡＧＥ由来ペプチドを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する一方のアーム、及び免疫エフェクター細胞に付随している標的を特異的に認識する他方のアームを含む。したがって、本発明は、本発明による二重特異性抗体を提供し、前記二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧであり、優先的にはヒトＩｇＧ１であり、Ｆｃ部分は、Ｆｃ受容体を活性化しない。
【００２３】
ＭＡＧＥ−Ａを標的化する優位性については、参照により本明細書に組み込まれる先の出願、米国特許出願公開第２０１５／００５６１９８号に記載されている。簡潔には、ＭＡＧＥ−Ａ発現は、精巣及び胎盤は別として、異常細胞に限定される。胎盤及び精巣は、古典的なＭＨＣを発現せず、事実上ＭＡＧＥ−Ａ／ＭＨＣ−Ｉペプチド複合体は、腫瘍特異的標的である。ＭＨＣ分子及びＭＡＧＥ−Ａペプチドの考え得る組合せは多くあるので、療法からの腫瘍逃避の問題に取り組む代替及び／又は併用療法を考案することが可能である。
【００２４】
本明細書では用語「免疫エフェクター細胞」又は「エフェクター細胞」とは、活性化されて標的細胞の生存率に影響を及ぼし得る哺乳動物の免疫系における天然の細胞レパートリー内の細胞のことを指す。免疫エフェクター細胞には、次の細胞型：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞（細胞障害性Ｔ細胞を含む）、Ｂ細胞、単球又はマクロファージ、樹状細胞及び好中球がある。それゆえ、前記エフェクター細胞は、好ましくはＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞又は好中球である。本発明によると、異常細胞へのエフェクター細胞の動員とは、免疫エフェクター細胞が動員先の異常細胞を（死滅過程の開始によって直接的又は間接的に）死滅させ得るように、エフェクター細胞を異常標的細胞に近接させることを意味する。
【００２５】
免疫エフェクター細胞に存在する標的抗原には、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｄ及びＮＫｐ４６があり得る。免疫エフェクター細胞の最も好ましい抗原は、ＣＤ３ε鎖である。
【００２６】
Ｔ細胞は、免疫エフェクター細胞の例であり、前記特異的結合分子によって異常細胞へと誘引され得る。ＣＤ３は、先行技術に記載されている抗体によって特異的に認識されるＴ細胞のよく記載されているマーカーである。さらに、ヒトＣＤ３に対して作られる抗体は、従来通りの当業者に公知の方法によって生成される。前記ＣＤ３特異的ドメインのＶＨ及びＶＬ領域は、例えばそれだけには限らないが、ＯＫＴ−３又はＴＲ−６６などのＣＤ３特異的抗体から得られる。この発明によると、前記ＶＨ及びＶＬ領域は、他のＴＣＲサブユニットの文脈においてヒトＣＤ３イプシロンを特異的に認識できる抗体（複数）／抗体（単数）誘導体などから得られる。
【００２７】
抗体でがんを治療する方法は当業者に周知であり、用量増加研究によって一般に決定される有効な量の抗体の非経口注射を一般に含む。
【００２８】
本発明の態様は、がんの治療に使用するための本発明による二重特異性抗体に関する。
【００２９】
免疫エフェクター細胞と異常細胞を結びつける別の方法は、免疫エフェクター細胞を細胞表面結合分子、一般に受容体と共に提供することである。この場合、本発明によると、Ｔ細胞は、ＭＡＧＥ−Ａ／ＭＨＣ−Ｉペプチド複合体を特異的に認識するＴ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体と共に一般に提供される。したがって、本発明は、前記発明による方法を提供し、前記特異的結合分子は、Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体である。これらのＴ細胞は、α鎖及びβ鎖又はキメラ抗原受容体をコードしている核酸を前記Ｔ細胞に導入することによって作製される。
【００３０】
特異的結合分子の投薬量は、動物研究、（細胞に基づく）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究、及びいわゆる用量増加実験における臨床研究によって確立される。一般に、現在の抗体の用量は、３〜１５ｍｇ／ｋｇ体重、又は用量当たり２５〜１０００ｍｇであり、現在のＢｉＴｅは、４８時間にわたり注入される２８μｇ／日用量、及び現在のＣＡＲ−Ｔ細胞の１ｋｇ体重当たり２×１０６〜２×１０８個ＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞である。
【００３１】
対象へ投与する場合、本発明の特異的結合分子は製剤化されなければならない。一般に、特異的結合分子は、静脈内に与えられることになる。製剤の場合、注射用の水（生理食塩水）が、単に十分であり得る。安定性の理由により、より複雑な製剤が必要な場合もある。本発明は、通常の添加物と共に提供される凍結乾燥組成物及び液体組成物を予期する。
【００３２】
配列番号１及び配列番号２に与えられるＶｈドメインを有する抗体は、本発明により使用するのに充分な親和性及び特異性を有することが示されている。
【００３３】
ＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合できる多くの結合ドメインは、当業者に明らかである。直ちに明らかなドメインは、ＴＣＲドメイン及び免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインなど、免疫系から得られる結合ドメインである。好ましくは、ドメインは１００〜１５０アミノ酸残基を包含する。好ましくは、本発明に使用される結合ドメインは、抗体の可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）である、又はそれに類似している。そのような結合ドメインの優れた供給源は、ファージディスプレイライブラリである。選択すべき結合ドメインがライブラリから実際に物理的に選択されるかどうか、又は情報（配列）だけが使用されるかどうかは、ほとんど関連性がない。本発明による結合分子が、適切なリンカー配列でペプチド結合を介して連結された抗体の２つ以上の可変ドメインを好ましくは包含する（複数特異性）ことが、本発明の部分である。ＭＨＣ−ペプチド複合体に対するＦａｂ、全ＩｇＧ及び一本鎖Ｆｖなど古典的形式の抗体も、本発明の範囲内である。
【００３４】
前に記載されている通り、本発明により選択される結合ドメインは、免疫グロブリンドメインに好ましくは基づく又はそれから得られる。免疫グロブリン（Ｉｇ）は、標的化した異常細胞へ免疫エフェクター細胞を特異的且つ選択的に局在的に誘引し、健康細胞は本質的に影響を受けないままにするのに適している。免疫グロブリンは、免疫グロブリン可変領域を含む免疫グロブリン可変ドメインと呼ばれる免疫グロブリン結合ドメインを含む。免疫グロブリン可変領域の成熟は、標的結合部位に対する特異的結合に適合された可変ドメインを生じる。
【００３５】
本発明によると、Ｉｇ由来抗原相互作用の文脈において使用される用語「可変領域」は、抗体、抗体断片又はその誘導体から得られるＣＤＲを少なくとも１つ含む（ポリ）ペプチドの断片及び誘導体を含む。前記少なくとも１つのＣＤＲは、好ましくはＣＤＲ３、より好ましくは抗体の重鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｈ３）であることが本発明によって想定される。
【００３６】
治療的処置レジメにおいて、本発明の結合分子の予想される主たる使用は、人体用であるので、免疫グロブリン可変領域は、ヒト起源のアミノ酸配列を好ましくは有する。ヒト以外の種を起源とするアミノ酸配列を包含する前駆体抗体を含むヒト化免疫グロブリン可変領域も、本発明の部分である。また、本発明の部分は、ヒト以外の種が起源の免疫グロブリン可変領域（の部分）を含むキメラ分子である。
【００３７】
別々に異なる２つの標的結合部位に対する本発明の特異的結合分子の親和性は、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆが、異なる結合部位両方に同時に結合する方へ大きく偏るように、好ましくは設計される。したがって、本発明の一実施形態において、これまでの実施形態のいずれかに記載の抗体は、ヘテロ二量体二重特異性免疫グロブリンＧ又は異なるが相補的な２つの重鎖を含む重鎖のみの抗体である。異なるが相補的な２つの重鎖は、それぞれのＦｃ領域を介して次いで二量体化されてもよい。好ましい対合生化学を適用すると、ヘテロ二量体は、ホモ二量体よりも優先的に形成される。例えば、異なるが相補的な２つの重鎖は、記載されているように「ノブインホール」ＣＨ３ドメイン操作技術を適用すると強制的な対合を起こしやすい［Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９９６年（参照１４）］。この好ましい実施形態において、この二重特異性免疫グロブリン中の異なる２つの免疫グロブリン可変領域は、１つのアームで、異常細胞に優先的に付随しているＭＨＣ−ペプチド複合体、及び免疫エフェクター細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。
【００３８】
本発明は、ＭＨＣと抗原性ペプチドとの多くの異なる組合せを予期しているが、最も好ましものは、ＭＨＣ−１とＭＨＣ−１によって提示される腫瘍関連抗原由来抗原性ペプチドとの組合せである。ＨＬＡの制限のため、ＭＨＣ−１−ペプチド複合体及びＭＨＣ−２−ペプチド規則には、ＭＨＣの文脈において提示され得るペプチドのサイズの限度、細胞内で抗原をプロセッシングするために存在する必要がある制限部位、提示されるペプチド上に存在する必要があるアンカー部位、などを含め、多くの組合せがある。厳密な規則は、異なるＨＬＡクラス及び異なるＭＨＣクラスで異なる。ＭＡＧＥ由来ペプチドが、ＭＨＣの文脈において提示に非常に適していることを発見した。ほぼ全てのＭＡＧＥ−Ａバリアント中に存在し（ｍｕｌｔｉＭＡＧＥペプチドと称される）、コーカサス集団において最も多くみられるＭＨＣ−１対立遺伝子のうちの１つによって提示されることになるＭＡＧＥ−Ａ中の配列Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇを含むＭＨＣ−１提示可能な抗原性ペプチド（すなわち、ＨＬＡ−Ａ０２０１）が同定された。別のＭＨＣ−１対立遺伝子（すなわち、ＨＬＡ−ＣＷ７）によって提示され、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ６、及び−Ａ１２のような多くのＭＡＧＥバリアントに存在する第２のＭＡＧＥペプチドは、Ｅ−Ｇ−Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｅ−Ｋである。ＭＨＣ−１及びＭＡＧＥペプチドのこれら２つの組合せは、一緒に、コーカサス集団の８０％を網羅する可能性がある。ｍｕｌｔｉＭＡＧＥペプチドと同じＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子によって提示される別のＭＡＧＥペプチドは、配列Ｆ−Ｌ−Ｗ−Ｇ−Ｐ−Ｒ−Ａ−Ｌ−Ｖを有し、ＭＡＧＥ−Ａ３及びＭＡＧＥ−Ａ１２タンパク質中に存在する。
【００３９】
したがって、一実施形態において、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２及びＨＬＡ−Ｃ０７０１の文脈において示されるＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチドのリストが、提供される。
【００４０】
本発明は、下記の実施例によって例示される。
【００４１】
実施例１
本発明の特異的結合分子による異常細胞の特異的且つ選択的標的化に適した標的結合部位は、ＭＨＣ分子と複合体形成したＭＡＧＥ由来抗原ペプチドである。示したＨＬＡ分子と複合体形成されるＭＡＧＥ−Ａタンパク質のＴ細胞エピトープの例が、以下に提供される。ＭＡＧＥ由来Ｔ細胞エピトープと複合体形成したＨＬＡ分子の任意の組合せは、この特異的結合分子に対する異常細胞上の特異的標的を提供する。適切な標的ＭＡＧＥ由来エピトープの例は、ペプチド：
Ｃ０７０１によって示されるFRAVITKKV、KVSARVRFF、FAHPRKLLM、SVFAHPRKL、LRKYRAKEL、FREALSNKV、VYGEPRKLL、SVYWKLRKL、VRFLLRKYQ、FYGEPRKLL、RAPKRQRCM、LRKYRVKGL、SVFAHPRKL、VRIGHLYIL、FAHPRKLLT
Ａ２４０２によって示されるIMPKTGFLI、VSARVRFFF、NYKHCFPEI、EYLQLVFGI、VMPKTGLLI、IMPKAGLLI、NWQYFFPVI、VVGNWQYFF、SYPPLHEWV、SYVKVLHHM、IFPKTGLLI、NYKRCFPVI、IMPKTGFLI、NWQYFFPVI、VVGNWQYFF、SYVKVLHHM、RFLLRKYQI、VYYTLWSQF、NYKRYFPVI、VYVGKEHMF、CYPSLYEEV、SMPKAALLI、SSISVYYTL、SYEKVINYL、CYPLIPSTP、LYDGMEHLI、LWGPITQIF、VYAGREHFL、YAGREHFLF、EYLQLVFGI、SYVKVLHHL
Ａ０２０１によって示されるKVLEYVIKV、FLIIVLVMI、FLWGPRALA、YVIKVSARV、LVLGTLEEV、CILESLFRA、IMPKTGFLI、KVADLVGFL、YVLVTCLGL、KASESLQLV、KMVELVHFL、KIWEELSML、FLWGPRALI、KASEYLQLV、YILVTCLGL、GLLIIVLAI、LQLVFGIEV、HLYILVTCL、QLVFGIEVV、LLIIVLAII、GLVGAQAPA、FLWGPRALV、KVAELVHFL、YIFATCLGL、KIWEELSVL、ALSRKVAEL、GLLIIVLAI、FQAALSRKV、HLYIFATCL、LLIIVLAII、GLVGAQAPA、KVLHHMVKI、GNWQYFFPV、KVLEHVVRV、ALLEEEEGV、FLWGPRALA、KVDELAHFL、ALSNKVDEL、AVSSSSPLV、YTLVTCLGL、LLIIVLGTI、LVPGTLEEV、YIFATCLGL、FLWGPRALI、KIWEELSVL、FLIIILAII、KVAKLVHFL、IMPKTGFLI、FQAALSRKV、KASDSLQLV、GLVGAQAPA、KVLHHMVKI、GNWQYFFPV、GLMDVQIPT、LIMGTLEEV、ALDEKVAEL、KVLEHVVRV、FLWGPRALA、LMDVQIPTA、YILVTCLGL、KVAELVRFL、AIWEALSVM、RQAPGSDPV、GLLIIVLGM、FMFQEALKL、KVAELVHFL、FLWGSKAHA、ALLIIVLGV、KVINYLVML、ALSVMGVYV、YILVTALGL、VLGEEQEGV、VMLNAREPI、VIWEALSVM、GLMGAQEPT、SMLGDGHSM、SMPKAALLI、SLLKFLAKV、GLYDGMEHL、ILILSIIFI、MLLVFGIDV、FLWGPRAHA、GMLSDVQSM、KMSLLKFLA、FVLVTSLGL、KVTDLVQFL、VIWEALNMM、NMMGLYDGM、QIACSSPSV、ILILILSII、GILILILSI、GLEGAQAPL、AMASASSSA、KIIDLVHLL、KVLEYIANA、VLWGPITQI、GLLIIVLGV、VMWEVLSIM、FLFGEPKRL、ILHDKIIDL、FLWGPRAHA、AMDAIFGSL、YVLVTSLNL、HLLLRKYRV、GTLEELPAA、GLGCSPASI、GLITKAEML、MQLLFGIDV、KMAELVHFL、FLWGPRALV、KIWEELSVL、KASEYLQLV、ALSRKMAEL、YILVTCLGL、GLLGDNQIV、GLLIIVLAI、LQLVFGIEV、KVLHHLLKI、HLYILVTCL、QLVFGIEVV、LLIIVLAII、RIGHLYILV、GLVGAQAPA
である。
【００４２】
この異常細胞の特異的且つ選択的標的化に適した結合部位を選択するのに優れた供給源は、ＮｅｔＭＨＣである（ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣでＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ上にある）。ポータルは、示したクラスのＨＬＡを含むＭＨＣ分子の文脈において対象となる抗原のアミノ酸配列をアップロードすることで、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ結合を予測するツールを構成する。
【００４３】
実施例２
Ａ０９  ＩｇＧは、ＨＬＡ−Ａ２を介してｍＭＡペプチドを提示しているヒトの異常細胞を特異的に結合する
Ａ０９  ＩｇＧの特異性を確認するために、分子を、ＨＬＡ−Ａ２及びＭＡＧＥ発現において異なる細胞株のパネルとインキュベートした。利用した細胞株は、非小細胞肺癌Ｈ１２９９（ＨＬＡ−Ａ２−ＭＡＧＥ＋）、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡの発現構築物で安定にトランスフェクトした非小細胞肺癌Ｈ１２９９＿Ａ２／ｍＭＡ細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＭＡＧＥ＋）、神経膠芽腫細胞Ｕ８７（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＭＡＧＥ＋）及び胚網膜芽細胞９１１（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＭＡＧＥ−）を含む。簡潔には、細胞を４℃で、４５０×ｇで４分間遠沈した。上清を穏やかに取り出し、細胞ペレットを、試料当たりＰＢＳ＋０．１％  ＢＳＡ  １００μＬに再懸濁した。細胞を、９６ウェルプレートの指定されたウェルに移し（１００μＬ／ウェル）、４℃で、４５０×ｇで４分間遠沈した。上清を、穏やかに取り出した。ＰＢＳ＋０．１％  ＢＳＡ中の試験される抗体を、細胞ペレットに添加した（２０μＬ／試料）。プレートを、穏やかな様式で短くボルテックスして細胞ペレットを再懸濁した。氷冷ＰＢＳ＋０．１％  ＢＳＡをウェル当たり２００μＬ添加してすぐに、細胞を２〜８℃で３０分間インキュベートした。細胞を、４℃で、４５０×ｇで４分間遠沈することによって洗浄した。上清を穏やかに取り出した。洗浄ステップを繰り返した。一次検出抗体を、ＰＢＳ＋０．１％  ＢＳＡに希釈し、細胞ペレットに添加した（２０μＬ／試料）。試料を、ヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ６４７又はマウス抗ヒトＨＬＡ  Ａ２  ＢＢ５１５と２〜８℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を前述のように２回洗浄した。ＲＴで試料当たり２００μＬの１％  ＰＦＡに細胞ペレットを再懸濁することによって細胞を固定した。蛍光シグナルを、フローサイトメーターを使用して測定した。図１Ａのフローサイトメトリーによるドットプロットに示すように、Ａ０９抗体は、ＨＬＡ−Ａ０２０１と複合したｍｕｌｔｉＭＡＧＥペプチドを特異的に認識した。Ｈ１２９９＿Ａ２／ｍＭＡ細胞、Ｕ８７細胞及び９１１細胞によるＨＬＡ−Ａ０２０１の発現を、図１Ｂに示すように確認した。
【００４４】
実施例３
ＨＬＡ−Ａ０２０１の文脈において示されるＭＡＧＥ−Ａペプチドを特異的に認識するＴ細胞の生成
ｐＭｘ−ｐｕｒｏ  ＲＴＶ０１４ベクター及びｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ配列をコードするベクターを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化した。消化産物を、１％アガロースゲルから抽出し、ＤＮＡ精製キットを使用して精製した。Ｔ４リガーゼを使用して、ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ精製断片を、精製したｐＭｘ−ｐｕｒｏ  ＲＴＶ０１４と４℃で、Ｏ／Ｎでライゲートした。次にコンピテントＸＬ−Ｉ  ｂｌｕｅ細菌を熱ショック形質転換した。形質転換されたクローンの選択は、アンピシリン抵抗性（１００μｇ／ｍＬ）に基づいた。細菌の培養をＬＢ寒天プレート上で実行した。コロニーを、制限分析を使用してスクリーニングした。ＤＮＡを、Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用して単離した。陽性クローンを、ＬＢ＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン培養液１００ｍＬ中で増殖させた。トランスフェクションの１日前に、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞を、ＤＭＥＭ［１０％（容積／容積）ウシ胎仔血清、２００ｍＭグルタミン、１００Ｕペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充した］中に１０ｃｍディッシュ当たり１．２×１０６個細胞で播種した。培地を、トランスフェクション４時間前に新しくした。無血清ＤＭＥＭ  ８００μＬをＦｕｇｅｎｅ６試薬３５μＬと混合し、ＲＴで５分間インキュベートした。ＤＮＡ（ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  ｐＭｘ−ｐｕｒｏ  ＲＴＶ０１４）１０μｇ並びにヘルパープラスミドｐＨｉｔ６０及びｐＣｏｌｔＧａｌｖのそれぞれ５μｇを混合物に添加した。ＲＴで１５分間インキュベートした後、混合物をＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞に添加した。同日に、ＰＢＭＣを解凍し、２４ウェルプレート中で３０ｎｇ／ｍＬ  ＯＫＴ−３抗体及び６００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２を含有するｈｕＲＰＭＩ  ２ｍＬ中に２×１０６個細胞／ウェルの密度で播種した。ＯＫＴ−３抗体を、ＰＢＭＣ混合物におけるＴ細胞の増殖に有利に働くように添加した。２４時間後に、トランスフェクトしたＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞の培地を、ｈｕＲＰＭＩと置き換えた。１日後に、形質導入を開始した。ウイルス上清を、３２℃で、２０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により採集した。Ｔ細胞も、ＲＴで１５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により採集した。２×１０６個のＴ細胞を、２４ウェルプレート中で５μｇ／ｍＬポリブレンを含むウイルス上清０．５ｍＬに再懸濁した。プレートを、２０００ｒｐｍで９０分間回転させた。Ｔ細胞を３７℃でＯ／Ｎ培養した。翌日、Ｔ細胞を、ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで非特異的に刺激した。Ｔ細胞を特異的に刺激する場合、ペプチドをパルスしたＫ５６２−ＨＬＡ−Ａ２−ＣＤ８０及び６００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２を使用した。Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ａ２−ＣＤ８０を、ペプチド１０μｇにより３７℃で２時間パルスした。細胞を、１０，０００ｒａｄで次いで放射線照射した。パルス及び放射線照射したＫ５６２−ＨＬＡ−Ａ２−ＣＤ８０細胞０．３×１０６個を、２４ウェルプレート中に２ｍＬ  ｈｕＲＰＭＩ／ウェルの最終容量でＴ細胞０．５×１０６個に添加した。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲの検出を、ＨＬＡ−Ａ２−ＭＡ３（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）−ＰＥの四量体（０．５μＬ／試料）を使用してフローサイトメトリーによる染色によって実行した。四量体を、モル比５：１でビオチン化ＨＬＡ−Ａ２−ＭＡ３（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）複合体をＰＥストレプトアビジンと混合することによって作製した。試料を、４℃暗所で３０分間インキュベートした。図２Ａ及び図２Ｂに示したフローサイトメトリーによる染色は、４Ａ６  ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在を確認した。
【００４５】
実施例４
本開示の特異的結合分子でＴ細胞を促進することによる標的発現細胞のアポトーシス誘導
ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞は、パーフォリングランザイム経路によって標的細胞のアポトーシスを引き起こすことができる。これらの成分は、エフェクター細胞の細胞質顆粒に含まれる。Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲ活性化により顆粒が分泌され、グランザイム及びパーフォリンが相乗的に作用してアポトーシスを誘導する。本開示のＭＡＧＥ−Ａ特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞が、Ｔ細胞活性化及びアポトーシスをもたらすか否か決定するためにフローサイトメトリーによるアッセイを実行した。ｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、関連するＭＡ３ペプチド又は関連しないＭＡ１ペプチドのいずれかでパルスしたＴ２細胞と５時間同時インキュベートした。両方のペプチドが、Ｎｅｔ−ＭＨＣ予測に基づいてＨＬＡ−Ａ２に高い親和性を示した。カルシウムイオノホアであるイオノマイシン、一般的なＴ細胞活性化因子を、陽性対照として使用した。ｐＭｘ−ｐｕｒｏ  ＲＴＶ０１４（ｓｃＦｖ  ＣＡＲを発現しない）で形質導入したＴ細胞を、陰性対照として使用した。予想された通り、形質導入されたＴ細胞の型とは無関係に、陽性対照であるイオノマイシンは、高いグランザイムＢ産生をもたらした（図３Ａ−Ｃ及び図３Ｄ−Ｆの下のパネル）。Ｔ２−ＭＡ３パルスした細胞によるｓｃＦｖ  ４Ａ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異的活性化を記録した（図３Ｄ−Ｆ、中段のパネル、左のドットプロット）。活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４サブタイプによる若干の小さい反応性があるものの、ＣＤ８陽性画分に主に属する。
【００４６】
実施例５
ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド複合体及びＣＤ３を標的化する本開示の二重特異性分子の精製及び特異性
５．１．ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド複合体に対する本開示の二重特異性分子の結合
二重特異性分子を、適当なｐＦｕｓｅ発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｆ細胞において、１ｍＬ当たり１，０００，０００〜２，０００，０００個細胞の細胞密度で産生させた。トランスフェクトした細胞を、３７℃で２日間回復させ、続いて３０℃で４日間インキュベーションし、その間に二重特異性分子を培地中に分泌させた。二重特異性分子を、製造業者の説明書にしたがってＮｉ−ＮＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＴａｌｏｎビーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のいずれかを使用して培地から精製した。分子を精製したら、二重特異性分子に対応する透明なバンドを図４Ａ及び図４Ｂに示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で可視化した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチド複合体に対する発現させた分子の特異性を確認した。ビオチン化ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）及びＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ（ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ）複合体を、９６ウェルプレートに被覆した。漸減濃度の４Ａ６ｘＣＤ３をインキュベートし、複合体を結合させておき、続いて抗ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体とインキュベーションした。二重特異性分子の結合を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベーションし、続くＯＤ４５０における吸光度測定によって可視化した。図４Ｃに示した結果により、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２に対する４Ａ６ｘＣＤ３の特異性を確認する。
【００４７】
５．２．免疫細胞に対する本開示の二重特異性分子の結合
Ｔ細胞によって発現されたＣＤ３分子に対する４Ａ６ｘＣＤ３の結合を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）２００，０００個を５０ｎｇ／ｍＬ  ４Ａ６ｘＣＤ３又は４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶ（陰性対照としてここで使用した単一特異的抗体断片）とインキュベートすることによりフローサイトメトリーアッセイにおいて確立した。フローサイトメトリー分析は、ＰＢＭＣに対する４Ａ６ｘＣＤ３の結合だけを示し、対照分子４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶの結合を示さなかった（図４Ｄ）。４Ａ６＿ＳＣ＿ＦＶ分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２に特異的に結合し、免疫細胞に存在するＣＤ３分子を結合しない（図４Ｄの中段のヒストグラムにおいてシグナルの移動がないことにより示される）。この結果により、４Ａ６ｘＣＤ３が、Ｔ細胞の表面において発現されるＣＤ３分子を特異的に認識することを確認した。
【００４８】
５．３．４Ａ６ｘＣＤ３の精細な特異性の決定
二重特異性分子の精細な特異性を、ＪＹ細胞２００，０００個を無血清条件下で１００μｇ／ｍＬペプチドバリアントで終夜パルスすることにより評価した。使用したペプチドのアミノ酸を、アラニンに順次置換した。パルスしたＪＹ細胞を、一定濃度の４Ａ６ｘＣＤ３とインキュベートした。４Ａ６ｘＣＤ３の結合を、抗ｈｉｓ抗体とインキュベーションすることにより検出した。図４Ｅに示す得られた結合パターンは、全てのペプチドアミノ酸が、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体への４Ａ６ｘＣＤ３の結合に寄与しており、２〜６位までのアミノ酸が、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３，１２複合体に対する４Ａ６ｘＣＤ３の結合に特に重要であることを示した。図４Ｆに示した表は、アラニンスキャン実験に使用した全ペプチドのアミノ酸配列及びＨＬＡ−Ａ２に対する予測された親和性を列挙している。
【００４９】
実施例６
本開示の二重特異性分子によるＴ細胞活性化
６．１．開示の二重特異性分子は、ＨＬＡと複合してＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチドを安定して発現するＨ１２９９細胞の存在下でＴ細胞活性化をもたらす
ＨＬＡと複合してそれぞれのＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチドを安定して発現するようにトランスフェクトした非小細胞肺癌Ｈ１２９９細胞、さらに標的細胞と称される、を播種し、培養プレートに終夜付着させた。翌日、細胞培養培地を新しくし、ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）及び濃度５００ｎｇ／ｍＬの開示の二重特異性分子を添加した。アッセイを、標的対エフェクター細胞比１：１６で、７２時間のインキュベーションで実行した。標的及びエフェクター細胞の両方を採取した。フローサイトメトリー分析を実行してＴ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９及びＣＤ２５）の発現を検出した。ＣＤ６９又はＣＤ２５を発現するＣＤ３陽性細胞の％としてプロットした結果を、図５Ａ及び図５Ｂにそれぞれ示す。ＰＢＭＣを二重特異性分子及びそれぞれの標的細胞とインキュベートした場合にだけ、両方のＴ細胞活性化マーカーの特異的な増大が観察された。二重特異性分子非存在下でのＰＢＭＣ及び標的細胞のインキュベーションは、ＣＤ６９又はＣＤ２５発現の増大をもたらさなかった。図５Ｃに示したヒストグラムは、特異的Ｔ細胞活性化が、二重特異性分子、標的細胞及びＰＢＭＣの存在下においてのみ起こることを確認する。
【００５０】
６．２．Ｔ細胞活性化は、二重特異性分子濃度に依存的である
それぞれの標的細胞を播種し、培養プレートに終夜付着させた。翌日、細胞培養培地を新しくし、ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）及び漸増濃度で開示の二重特異性分子を添加した。アッセイを、標的対エフェクター細胞比１：１６で、７２時間のインキュベーションで実行した。標的及びエフェクター細胞の両方を採取した。フローサイトメトリー分析を実行してＴ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９及びＣＤ２５）の発現を検出した。ＰＢＭＣを、４Ａ６ｘＣＤ３又はＡ０９ｘＣＤ３のいずれかをそれぞれの標的発現細胞株と共にインキュベートした場合に、両方のＴ細胞活性化マーカーの特異的増大が観察された（図５Ｄ）。二重特異性分子の濃度の増大と同時にＴ細胞活性化の増大が観察された。
【００５１】
６．３．Ｔ細胞活性化に対する標的対エフェクター細胞比の効果
標的細胞を、一定濃度の二重特異性分子（５００ｎｇ／ｍＬ）及び様々な標的対エフェクター比で７２時間インキュベートした場合、ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルとして決定したＴ細胞活性化のレベルに差異は観察されなかった（図５Ｅ）。
【００５２】
６．４．免疫シナプスの形成
免疫シナプスの形成を、６．１〜６．４に記載されるアッセイに使用した細胞の顕微鏡検査により観察した。図５Ｆに示した標的細胞への免疫細胞の物理的誘引は、フローサイトメトリーによる測定でＴ細胞活性化マーカーの増大を示した試料においてのみ２４時間後に観察された。
【００５３】
実施例７  開示の二重特異性分子は、Ｔ細胞活性化をもたらす
７．１開示の二重特異性分子は、ＨＬＡと複合してＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチドを安定して発現する９１１細胞の存在下でＴ細胞活性化をもたらす
ＨＬＡと複合してそれぞれのＭＡＧＥ−Ａ由来ペプチドを安定して発現するようにトランスフェクトした形質転換ヒト胚網膜細胞、さらに標的細胞と称される、を播種し、培養プレートに終夜付着させた。翌日、細胞培養培地を新しくした。ＰＢＭＣ（標的対エフェクター比１：８）及び４Ａ６ｘＣＤ３（５００ｎｇ／ｍＬ）を添加し、７２時間インキュベートした。標的及びエフェクター細胞の両方を採取した。エフェクター細胞のフローサイトメトリー分析は、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現の増大を示した。ＣＤ６９又はＣＤ２５を発現するＣＤ３陽性細胞の％としてプロットした結果を、図６Ａ及び図６Ｂにそれぞれ示す。これらの条件で記録されたＭＦＩシグナルの明白な移動に示されるように、図６Ｃに示したヒストグラムは、特異的Ｔ細胞活性化が、二重特異性分子、標的細胞及びＰＢＭＣの存在下においてのみ起こることを確認する。
【００５４】
７．２．Ｔ細胞活性化に対する標的対エフェクター細胞比の効果
標的細胞を、一定濃度の二重特異性分子（５００ｎｇ／ｍＬ）及び様々な標的対エフェクター比で７２時間インキュベートした場合、ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルとして決定したＴ細胞活性化のレベルに差異は観察されなかった（図６Ｄ）。
【００５５】
上述したアッセイの間、標的細胞は、Ｔ細胞活性化を示す条件において７２時間後にほとんど観察され得なかった。
【００５６】
７．３．免疫シナプスの形成
免疫シナプスの形成を、７．１及び７．２に記載されるアッセイにおいて観察した。図６Ｅに示した標的細胞への免疫細胞の物理的誘引は、フローサイトメトリーによる測定でＴ細胞活性化マーカーの増大を示した試料においてのみ２４時間後に観察された。二重特異性分子の存在下で標的細胞をエフェクター細胞と７２時間インキュベーションすると、標的細胞はほとんど残らなかった。
【００５７】
実施例８
Ａ０９ｘＣＤ３及び神経膠芽腫細胞とのインキュベーションによるＴ細胞活性化
ＭＡＧＥ−ＡとＨＬＡ−Ａ２タンパク質の両方を発現するＵ８７細胞を播種し、培養プレートに終夜付着させた。翌日、培養培地を新しくした。ＰＢＭＣを、標的対エフェクター比１：８で添加し、二重特異性分子４Ａ６ｘＣＤ３を終濃度５０ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬのいずれかで、Ａ０９ｘＣＤ３を３１ｎｇ／ｍＬで添加した。インキュベーションを、７２時間続けた。標的及びエフェクター細胞の両方を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現を評価した。ＰＢＭＣを、Ｕ８７細胞の存在下でＡ０９ｘＣＤ３とインキュベートした場合、図７ＡにプロットしたＴ細胞活性化マーカーの発現の特異的増大が観察された。これらの条件で記録されたＭＦＩシグナルの明白な移動を、図７Ｂのヒストグラムに示す。
【００５８】
実施例９
二重特異性ナノボディの作製
ＢＬ２１細胞を、対数増殖期に達するまで３７℃で、２ＹＴ培地中で増殖させた。イソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、終濃度１ｍＭになるように培地に添加し、二重特異性ナノボディ分子の産生を誘導した。ＩＰＴＧを添加したら、温度を２５℃に低下させ、インキュベーションを１６時間続けた。インキュベーション終了時に、細胞を遠心分離（４００ｇで１５分間）によってペレット化し、ＰＢＳに再懸濁した。産生されたナノボディを単離するために、細菌細胞ペレットを、凍結融解周期に３回供した。細胞残屑を、遠心分離（４０００ｇで１５分間）によって除去した。産生されたナノボディを含有する上清を、製造業者のプロトコールにしたがってＮｉＮＴＡビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベーションに供した。産生されたナノボディの効率及び純度を、図８に示すように無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ）によって評価した。
【００５９】
実施例１０
ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ複合体に対するファージディスプレイ選択したＦａｂ断片の特異的結合
親和性によるファージディスプレイ選択によって特異的結合体が溶出され、得られたクローンを細菌中で発現させた。ペリプラスム画分を単離し、１：５に希釈した。ニュートラアビジン（２μｇ／ｍＬ）プレートを、１０ｎＭ  ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡペプチドで被覆した。発現されたＦａｂの結合を、検出抗体：マウス抗ｃ−ｍｙｃ（１：１０００）及び抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（１：５０００）とインキュベーションして検出した。陽性対照として、ＡＨ５  Ｆａｂ（ｐＣＥＳベクターから産生される）及びＡＨ５モノクローナルＩｇＧを使用した。産生されたＦａｂクローンの結合を、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡペプチド複合体で被覆したプレート及び対照ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３ペプチド複合体で被覆したプレート上で並行して評価した。ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡペプチド複合体（図９の上の表）への結合を示すが、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡ３ペプチド複合体（図９の下の表）への結合を示さないＦａｂクローンだけを、ｍｕｌｔｉＭＡＧＥペプチド（ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ）を示すＨＬＡ−Ａ２に対する所望の特異性を有すると考えた。両方の型の複合体に結合を示したクローンを、複合体のＨＬＡ−Ａ２部分を認識し、所望の精細な特異性を欠くと考えた。表１は、ＨＬＡ−Ａ０２０１と複合したＭＡＧＥ由来ペプチドを特異的に結合するＶＨ配列の概要を提供する。配列番号３〜配列番号４６は、ＨＬＡ−Ａ２／ｍＭＡ複合体を特異的に結合するＦａｂのＶＨ配列を表す。
【００６０】
【表１】
2021528382.tif 000002
【００６１】
配列識別番号（配列番号）：
配列番号１．４Ａ６  ＩｇＧのアミノ酸配列Ｖｈ
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTADYAQKFQGRATITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDYDFWSGYYAGDVWGQGTTVTVSS
配列番号２．Ａ０９  ＩｇＧのアミノ酸配列Ｖｈ
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTFPMHWVRQAPGKGLEWVAVIDYEGINKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFPMMWIRQAPGKGLEWVASISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号４
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRNqMWWVRQAPGKGLEWVAVISIDQSVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号５
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTFPMHWVRQAPGKGLEWVAVIDYEGINKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号６
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSESAMHWVRQAPGKGLEWVAAISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号７
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVFAMQWVRQAPGKGLEWVAAISYDGDNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号８
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSERQMWWVRQAPGKGLEWVAVISNDTSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号９
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSERqMWWVRQAPGKGLEWVAVISHDGSTKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１０
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSRQMWWVRPAPGKGLEWVAVISHDASAKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１１
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVISMQWVRQAPGKGLEWVASISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１２
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTFPMHWVRQAPGKGLEWVAAISYAGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１３
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTLPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYNGENKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１４
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTLPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１５
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSERQMWWVRQAPGKGLEWVAVISNDSSQKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１６
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTMSMQWVRQAPGKGLEWVASISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１７
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTLSMGWVRQAPGKGLEWVAWISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１８
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTSAMQWVRQAPGKGLEWVAVIGYDGANKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号１９
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTLPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２０
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAAISYDGRNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２１
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSAGqMWWVRQAPGKGLEWVAVISHDESNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２２
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYTGINKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２３
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSRQMWWVRQAPGKGLEWVAVISHDASAKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２４
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSESAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYSGMNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２５
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSAGqMWWVRQAPGKGLEWVAVISHDESNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２６
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSESAMGWVRQAPGKGLEWVAWIGYDGQNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２７
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSqTMQWVRQAPGKGLEWVASISYDGENKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２８
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTLPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYNGENKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号２９
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVQSMLWVRQAPGKGLEWVASIGYDGVNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３０
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRNqMWWVRQAPGKGLEWVAVISIDQSVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３１
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFPMQWVRQAPGKGLEWVASIAYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３２
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMFAMHWVRQAPGKGLEWVAAISIDGSGKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３３
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSESPMFWVRQAPGKGLEWVAVISYTGYNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３４
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHRMFWVRQAPGKGLEWVAGIGYWGWNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３５
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSWRQMWWVRQAPGKGLEWVAVISHDGSGKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３６
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSSqMWWVRQAPGKGLEWVAVISHDTSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３７
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRQQMWWVRQAPGKGLEWVAVISLDPSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３８
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMFAMHWVRQAPGKGLEWVAAISIDGSGKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号３９
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSIPMFWVRQAPGKGLEWVASISYNGENKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号４０
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSESSMQWVRQAPGKGLEWVASIGYDGqNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号４１
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVQSMQWVRQAPGKGLEWVAAIGYDGENKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号４２
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSESAMHWVRQAPGKGLEWVAAISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号４３
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSERqMWWVRQAPGKGLEWVAVISHDGSTKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号４４
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号４５
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSERqMWWVRQAPGKGLEWVAVISHDGSTKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
配列番号４６
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSLPMHWVRQAPGKGLEWVAAISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
【図１Ａ】
2021528382.tif 000003
【図１Ｂ】
2021528382.tif 000004
【図２Ａ】
2021528382.tif 000005
【図２Ｂ】
2021528382.tif 000006
【図３Ａ】
2021528382.tif 000007
【図３Ｂ】
2021528382.tif 000008
【図３Ｃ】
2021528382.tif 000009
【図３Ｄ】
2021528382.tif 000010
【図３Ｅ】
2021528382.tif 000011
【図３Ｆ】
2021528382.tif 000012
【図４Ａ】
2021528382.tif 000013
【図４Ｂ】
2021528382.tif 000014
【図４Ｃ】
2021528382.tif 000015
【図４Ｄ】
2021528382.tif 000016
【図４Ｅ】
2021528382.tif 000017
【図４Ｆ】
2021528382.tif 000018
【図５Ａ】
2021528382.tif 000019
【図５Ｂ】
2021528382.tif 000020
【図５Ｃ】
2021528382.tif 000021
【図５Ｄ】
2021528382.tif 000022
【図５Ｅ】
2021528382.tif 000023
【図５Ｆ】
2021528382.tif 000024
【図６Ａ】
2021528382.tif 000025
【図６Ｂ】
2021528382.tif 000026
【図６Ｃ】
2021528382.tif 000027
【図６Ｄ】
2021528382.tif 000028
【図６Ｅ】
2021528382.tif 000029
【図７Ａ】
2021528382.tif 000030
【図７Ｂ】
2021528382.tif 000031
【図８】
2021528382.tif 000032
【図９】
2021528382.tif 000033
【配列表】
2021528382000001.app
【国際調査報告】
2021528382.tif 000034
2021528382.tif 000035
2021528382.tif 000036
2021528382.tif 000037
2021528382.tif 000038
2021528382.tif 000039