(57)【要約】本発明は、免疫系を刺激し、疾患を処置及び予防するための細菌株を含む組成物を提供する。【選択図】図２３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の免疫系を刺激するのに使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物。
【請求項２】
免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するための、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
ワクチンアジュバントとして使用するための、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
ＣＡＲ−Ｔなどの細胞療法を増強するのに使用するための、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２３並びに／またはＴＮＦ−αの発現レベル及び／もしくは活性を上昇させるのに使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項６】
ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させるのに使用するための、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
細菌株が、
配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有するか、または
配列番号２によって表される１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する、
請求項１〜６のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項８】
細菌株が、
配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有するか、または
配列番号３によって表される１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する、
請求項１〜７のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項９】
細菌株が、受入番号４２４８８でＮＣＩＭＢに寄託された菌株である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
細菌株が、受入番号４２７６１でＮＣＩＭＢに寄託された菌株である、請求項１〜９のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
組成物が、経口投与用である、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
組成物が、１もしくは２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
細菌株が、凍結乾燥されている、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物を含む食品。
【請求項１５】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、免疫刺激の低減に関連する疾患もしくは状態を処置または予防する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかで定義された細菌株の細胞を含む組成物であって、前記細胞が１または２以上の異種抗原を発現する、前記組成物。
【請求項１７】
細胞が、１または２以上の異種抗原を提示する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ワクチンとして使用するための、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれかで定義された細菌株の細胞であって、前記細胞が１または２以上の異種抗原を発現する、前記細胞。
【請求項２０】
細胞が、１または２以上の異種抗原を提示する、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
ワクチンとして使用するための、請求項１９または請求項２０に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の消化管から単離された細菌株を含む組成物及び疾患の処置において、特に、疾患の処置において免疫系を刺激することにおけるそのような組成物の使用の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸は、子宮内では無菌であると考えられているが、出生直後に母体及び環境の様々な微生物に曝露される。その後、微生物のコロニー形成及び継承の動的な期間が生じる。これは、送達形態、環境、食事、及び宿主の遺伝子型などの要素に影響され、これらの要素のすべてが、特に幼年期に腸内細菌叢の組成に影響を与える。その後、細菌叢は安定化し、成人のようになる［１］。ヒトの腸内細菌叢は、細菌の２つの主要な門であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓに本質的に属する５００〜１０００種を超える様々な系統型を含む［２］。ヒトの腸における細菌のコロニー形成から生じる相利共生関係の成功は、多種多様な代謝機能、構造的機能、保護機能、及び他の有益な機能をもたらしている。コロニー形成された腸の代謝活性の増強により、さもなければ難消化性の食物成分が、宿主に重要な栄養源を提供する副産物の放出によって確実に分解されるようになる。同様に、腸内細菌叢の免疫学的重要性は十分に認識されており、共生細菌の導入後に機能的に再構成される障害のある免疫系を有する無菌動物で例示されている［３〜５］。
【０００３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸障害では、細菌叢組成の劇的な変化が記録されている。例えば、ＩＢＤ患者では、Ｅ．ｃｏｌｉの数が増大する一方でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａ細菌のレベルが低下し、腸内の共生生物と病原性共生生物とのバランスの変化を示唆している［６〜９］。興味深いことに、この微生物のディスバイオシスは、Ｔエフェクター細胞集団の不均衡とも関連している。
【０００４】
ある特定の細菌株が動物の腸に及ぼし得る好影響の可能性が認識され、様々な疾患の処置に使用するための様々な菌株が提案されている（例えば、［１０〜１３］を参照されたい）。また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を主に含むある特定の菌株を、腸に直接関係しない様々な炎症性疾患及び自己免疫疾患の処置に使用することが提案されている（総説については［１４］及び［１５］を参照されたい）。ある特定のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ菌株、そして比較的程度は低いがＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ菌株は、インビトロで様々なサイトカインに対して効果の異なる免疫調節効果を有することが示唆されており、インビトロで個体の菌株で得られたデータは、インビボでの腸内細菌叢群集の混合物に対する免疫応答を適切に表している可能性が低いことが示唆される［８８］。しかしながら、様々な疾患と様々な細菌株との間の関係、そして特定の細菌株が腸及び全身レベルにおいて、また任意の特定のタイプの疾患に及ぼす正確な影響は、十分に特性評価されていない。
【０００５】
当技術分野では、疾患を処置する新しい方法が必要である。また、腸内細菌を使用した新しい療法を開発できるように腸内細菌の潜在的な影響の特性評価を行う必要もある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、免疫系の刺激ならびに疾患の処置及び予防に使用することのできる、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来の細菌株を含む新しい組成物を開発した。本発明者らは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の菌株が免疫系を強力に活性化することができ、がんを処置することができることを特定した。これは、これらの菌株が、免疫系の活性化が有用であり得る他の疾患を処置することもできる可能性があることを示している。
【０００７】
したがって、本発明は、対象の免疫系を刺激するのに使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物を提供する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、ＣＡＲ−Ｔなどの細胞療法を増強するのに使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物を提供する。
【００１１】
好ましくは、本発明において使用される細菌は、受入番号４２４８８でＮＣＩＭＢに寄託された菌株である。
【００１２】
さらに好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、受入番号４２７６１でＮＣＩＭＢに寄託された菌株である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】乳癌のマウスモデル−腫瘍誘導後の腫瘍体積の変化及び各時点での各２つの処理間における統計学的有意性を示す表。
【図１Ｂ】上部パネル：ＥＭＴ６腫瘍における壊死面積（未処理  ｎ＝６、ビヒクル  ｎ＝６、ＭＲｘ０５１８  ｎ＝８）。下部パネル：ＥＭＴ６腫瘍における分裂細胞のパーセンテージ。Ｐ＝０．０１９（未処理  ｎ＝４、総細胞計数＝３７２０１、ビヒクル  ｎ＝６、総細胞計数＝６４２９７、ＭＲｘ０５１８  ｎ＝６、総細胞計数＝３３５３９）。
【図１Ｃ】乳癌のマウスモデル−免疫細胞の浸潤。散布図は、各処理群の個別の動物からの様々な免疫マーカーの細胞計数を表す。
【図１Ｄ】乳癌のマウスモデル−腫瘍溶解物におけるサイトカイン生成。カラムは、各処理群からの総タンパク質の平均ｐｇ／ｍＬを表す。一元配置分散分析、次にダネットの多重比較検定を使用した群間＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｅ】乳癌のマウスモデル−血漿中のサイトカイン生成。カラムは、各処理群からの平均ｐｇ／ｍＬ（＋／−ＳＥＭ）を表す。
【図１Ｆ】ＣＤ８αに対する抗体で免疫標識した、ビヒクル処理、ＭＲｘ０５１８処理及び抗ＣＴＬＡ−４処理マウスの回腸凍結切片の代表的な画像（下部パネル）、ならびにＤＡＰＩでカウンター染色した代表的な画像（上部パネル）。
【図１Ｇ】ビヒクル、ＭＲｘ０５１８、または抗ＣＴＬＡ−４で処理したマウスの回腸陰窩領域より採取した、１領域当たりのＣＤ８α＋細胞が３個超である動物試験のサブセットの定量化したプロット。
【図２】肺癌のマウスモデル−腫瘍誘導後の腫瘍体積の変化及び各時点での各２つの処理間における統計学的有意性を示す表。
【図３Ａ】肝癌のマウスモデル−肝臓重量。
【図３Ｂ】腎臓癌のマウスモデル−腫瘍誘導後の腫瘍体積の変化及び各時点での各２つの処理間における統計学的有意性を示す表。
【図４Ａ】未成熟樹状細胞（細菌なし）中のサイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬｍＬ）。
【図４Ｂ】ＬＰＳ添加後の、未成熟樹状細胞中のサイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬｍＬ）。
【図４Ｃ】ＭＲｘ０５１８ＭＲｘ０５１８添加後の、未成熟樹状細胞中のサイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬｍＬ）。
【図４Ｄ】ＭＲｘ０５１８ＭＲｘ０５１８及びＬＰＳ添加後の、未成熟樹状細胞中のサイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬｍＬ）。
【図５Ａ】ＴＨＰ−１細胞（細菌なし）中のサイトカインレベル。
【図５Ｂ】細菌沈降物添加後の、ＴＨＰ−１細胞中のサイトカインレベル。
【図５Ｃ】ＭＲｘ０５１８ＭＲｘ０５１８を単独で、またはＬＰＳと組み合わせて添加後の、ＴＨＰ−１細胞中のサイトカインレベル。
【図６】免疫刺激応答−ＴＮＦα
【図７】免疫刺激応答−ＴＮＦα
【図８】免疫刺激応答−ＩＬ−１２ｐ７０
【図９】免疫刺激応答−ＩＬ−１０
【図１０】免疫刺激応答−ＩＬ−８
【図１１】免疫刺激応答−ＩＬ−２３
【図１２】免疫刺激応答−ＩＬ−１β
【図１３】免疫刺激応答−ＩＬ−６
【図１４】作用メカニズム−ＮＦκＢの活性化
【図１５】作用メカニズム−ＴＬＲ５の活性化
【図１６Ａ】本明細書にて以下に記載する実施例８で使用される、様々な群の処理スケジュールの概略図。
【図１６Ｂ】ＥＭＴ−６細胞によって形成された腫瘍を担持するマウスの平均腫瘍体積。マウスは、未処理であるか、またはＹＣＦＡビヒクル（ビヒクル）、ＹＣＦＡ培地中のＭＲｘ０５１８細菌（ＭＲｘ０５１８）、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びＹＣＦＡ培地（抗ＣＴＬＡ−４）もしくはＭＲｘ０５１８と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせによる処理のいずれかであった。提示されている表は、各時点での各２つの処理間における統計学的有意性を示す。
【図１７】乳癌のマウスモデル−腫瘍体積。
【図１８】ＭＲｘ０５５４のＡＰＩ  ５０  ＣＨＬのプロファイル。
【図１９】作用メカニズム−ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ９レポーター細胞株におけるＭＲｘ０５１８（ＭＲｘ０５１８ＬＶ）、加熱死ＭＲｘ０５１８（ＭＲｘ０５１８ＨＫ）及びＭＲｘ０５１８培養上清（ＭＲｘ０５１８ＳＮ）によるＴＬＲ９活性化。ＯＤＮ２００６を陽性対照として使用し、ＹＣＦＡ培地をＭＲｘ０５１８ＳＮに対する陰性対照として含めた。棒グラフは、少なくとも３つの生物学的反復試験の平均を表す。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（通常の一元配置分散分析、次いでテューキーの多重比較検定）を使用して実施した。関連する対照との統計学的有意性を、グラフ上で＊＊＊＊として示す（ｐ＜０．０００１）。
【図２０Ａ】サイトカインを添加せずに（サイトカインなし）、加熱死ＭＲｘ０５１８（ＨＫ  ５１８）、ＭＲｘ０５１８培養物からの上清またはＲＰＭＩ培地を使用した、Ｔヘルパー細胞集団のＴ細胞分化誘導を示す。＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．０１、＊＊＊＝ｐ≦０．００１、＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１。
【図２０Ｂ】サイトカインを添加せずに（サイトカインなし）、加熱死ＭＲｘ０５１８（ＨＫ  ５１８）、ＭＲｘ０５１８培養物からの上清またはＲＰＭＩ培地を使用した、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）集団のＴ細胞分化誘導を示す。＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．０１、＊＊＊＝ｐ≦０．００１、＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１。
【図２１Ａ】ＹＣＦＡ＋培地（「ビヒクル」）またはＭＲｘ０５１８の無細胞細菌上清（「ＭＲｘ０５１８」）で処理したＰＢＭＣ細胞によるインビトロにおけるサイトカイン生成。
【図２１Ｂ】ＹＣＦＡ＋培地（「ビヒクル」）またはＭＲｘ０５１８の無細胞細菌上清（「ＭＲｘ０５１８」）で処理した脾細胞によるインビトロにおけるサイトカイン生成。
【図２１Ｃ】ＹＣＦＡ＋培地（「ビヒクル」）またはＭＲｘ０５１８の無細胞細菌上清（「ＭＲｘ０５１８」）で処理したＴＨＰ−１細胞によるインビトロにおけるサイトカイン生成。
【図２１Ｄ】ＣａＣｏ−２細胞を生菌（「ＭＲｘ０５１８」）で処理後のサイトカイン発現における、未処理細胞と比較した倍率変化を示す。
【図２１Ｅ】未処理細胞（「未処理」）、ＹＣＦＡブランク培地で処理した細胞（「１０％ＹＣＦＡ」）またはＭＲｘ０５１８無細胞細菌上清で処理した細胞（「１０％ＭＲｘ０５１８」）のいずれかからの脾細胞（Ｎ＝３）によるインビトロにおけるサイトカイン生成。
【図２１Ｆ】ＭＴＴアッセイにより測定した、マウス（Ｎ＝４）から摘出した脾細胞の生存率。細胞は、未処理（「未処理」）、ＹＣＦＡブランク培地で処理（「１０％ＹＣＦＡ」）またはＭＲｘ０５１８無細胞上清で処理（「１０％ＭＲｘ０５１８」）のいずれかであった。
【図２２Ａ】ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＮＯＤ２細胞におけるＮＦ−κＢプロモーターの活性化。細胞は、未処理、ＹＣＦＡ培地で処理（「ＹＣＦＡ」）、ＭＲｘ０５１８で処理（「ＭＲｘ０５１８」）または陽性対照で処理のいずれかであった。
【図２２Ｂ】ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞におけるＮＦ−κＢプロモーターの活性化。細胞は、未処理、ＹＣＦＡ培地で処理（「ＹＣＦＡ」）、ＭＲｘ０５１８で処理（「ＭＲｘ０５１８」）または陽性対照で処理のいずれかであった。
【図２２Ｃ】ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ９細胞におけるＮＦ−κＢプロモーターの活性化。細胞は、未処理、ＹＣＦＡ培地で処理（「ＹＣＦＡ」）、ＭＲｘ０５１８で処理（「ＭＲｘ０５１８」）または陽性対照で処理のいずれかであった。
【図２２Ｄ】ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ５細胞におけるＮＦ−κＢプロモーターの活性化。細胞は、未処理、ＹＣＦＡ培地で処理（「ＹＣＦＡ」）、ＭＲｘ０５１８で処理（「ＭＲｘ０５１８」）または陽性対照で処理のいずれかであった。
【図２３】ＹＣＦＡビヒクル（「ビヒクル」）またはＭＲｘ０５１８（「ＭＲｘ０５１８」）で処理後のＥＭＴ６腫瘍微小環境のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析を表すヒートマップ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
細菌株
本発明の組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む。実施例は、この属の細菌は、免疫系の刺激及び疾患の処置に有用であることを示している。
【００１５】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは、主に対であるかまたは短い連鎖状である球状細胞を形成する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは運動性であり、血液寒天または栄養寒天上のコロニーは、円形で平滑である。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは、ランスフィールドＤ群の抗血清と反応する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの基準株は、Ｆ８７／２７６＝ＰＢ２１＝ＡＴＣＣ４９５７３＝ＣＣＵＧ１８６５８＝ＣＩＰ１０３０１３＝ＪＣＭ８７２８＝ＬＭＧ１３１２９＝ＮＢＲＣ１００６７５＝ＮＣＩＭＢ７０２３１３（以前のＮＣＤＯ２３１３）＝ＮＣＴＣ１２３５９である［１６］。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＡＦ０３９９００である（本明細書では配列番号１として開示される）。例示的なＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株は、［１６］に記載されている。
【００１６】
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌を実施例において試験した。この細菌は、本明細書において菌株ＭＲｘ０５１８とも称される。ＭＲｘ０５１８への言及及びＭＲｘ０５１８は、互換的に使用される。試験したＭＲｘ０５１８菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を配列番号２に示す。菌株ＭＲｘ０５１８は、国際寄託機関ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ  （Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２５  ２ＺＳ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）により、２０１５年１１月１６日に「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ」として寄託され、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８を割り当てられた。
【００１７】
菌株ＭＲｘ０５１８のゲノムには、染色体及びプラスミドが含まれる。菌株ＭＲｘ０５１８の染色体配列は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に示されている。菌株ＭＲｘ０５１８のプラスミド配列は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に示されている。これらの配列は、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩプラットフォームを使用して生成された。
【００１８】
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌も実施例において試験した。この細菌は、本明細書において菌株ＭＲｘ０５５４とも称される。ＭＲｘ０５５４への言及及びＭＲｘ０５５４は、互換的に使用される。菌株ＭＲｘ０５５４は、国際寄託機関ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２５  ２ＺＳ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）により、２０１７年５月２２日に「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５５４」として寄託され、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１を割り当てられた。この細菌のゲノム配列は、本明細書では、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２として開示される。ゲノム配列は、多数のコンティグからアセンブルされる。配列中のＮは、コンティグ間のギャップを表す。「Ｎ」はヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣまたはＴを表し得る。ＭＲｘ０５５４菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、配列番号３に示されている。配列番号３は、ＭＲｘ０５５４に存在する５つの１６Ｓ遺伝子のコンセンサスではなく、アセンブリに存在する完全長配列を表す。
【００１９】
実施例で試験した菌株と近縁の細菌株も、免疫系を刺激するのに有効であると予想される。ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、配列番号１または２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する。好ましくは、配列同一性は、配列番号２に対するものである。好ましくは、本発明に使用するための細菌株は、配列番号２によって表される１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する。ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する。
【００２０】
受入番号４２４８８で寄託された細菌の生物型である細菌株も、免疫系を刺激するのに有効であると予想される。生物型は、同一または極めて類似の生理学的及び生化学的特性を有する近縁の菌株である。
【００２１】
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌の生物型であり、かつ本発明における使用に好適な菌株は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌の他のヌクレオチド配列を配列決定することによって同定してもよい。例えば、実質的に全ゲノムを配列決定することができ、本発明に使用するための生物型菌株は、その全ゲノムの少なくとも８０％にわたって（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％またはその全ゲノムにわたって）少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、生物型菌株は、そのゲノムの少なくとも９８％にわたる９８％の配列同一性、またはそのゲノムの９９％にわたる少なくとも９９％の配列同一性を有する。生物型菌株の同定に使用するための他の好適な配列には、ｈｓｐ６０、または反復配列、例えばＢＯＸ、ＥＲＩＣ、（ＧＴＧ）５もしくはＲＥＰ、もしくは［１７］が含まれ得る。生物型菌株は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌の対応する配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し得る。いくつかの実施形態では、生物型菌株は、ＮＣＩＭＢ  ４２４８８として寄託された菌株ＭＲｘ０５１８の対応する配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し、配列番号２と少なくとも９９％同一である（例えば、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％同一である）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、生物型菌株は、ＮＣＩＭＢ  ４２４８８として寄託された菌株ＭＲｘ０５１８の対応する配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。
【００２２】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して配列同一性を有する染色体を有する。好ましい実施形態では、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性）を有する染色体を有する。例えば、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の７０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の８０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の１００％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の７０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の８０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の１００％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の７０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の８０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９５％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の１００％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９９．５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９５％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９９．５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９８％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９９．５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の１００％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９９．５％の配列同一性を有する染色体を有し得る。
【００２３】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して配列同一性を有するプラスミドを有する。好ましい実施形態では、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性）を有するプラスミドを有する。例えば、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の７０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の８０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の９０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の１００％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の７０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の８０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の９０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の１００％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の７０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の８０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の９０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の１００％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して少なくとも９８％の配列同一性の配列同一性を有するプラスミドを有し得る。
【００２４】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して配列同一性を有する染色体及びＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して配列同一性を有するプラスミドを有する。
【００２５】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、例えば上記のような、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して配列同一性を有する染色体、及び例えば上記のような、配列番号１または２のいずれかと配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含み、好ましくは配列番号２と少なくとも９９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有し、より好ましくは配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含み、任意で、上記のようなＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して配列同一性を有するプラスミドを含む。
【００２６】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、例えば上記のような、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して配列同一性を有する染色体を有し、任意で、上記のようなＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して配列同一性を有するプラスミドを含み、免疫系を刺激するのに有効である。
【００２７】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、例えば上記のような、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して配列同一性を有する染色体、及び例えば上記のような、配列番号１または２のいずれかと配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有し、任意で、上記のようなＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して配列同一性を有するプラスミドを含み、免疫系を刺激するのに有効である。
【００２８】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、配列番号２によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に対して少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列（例えば、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む１６ｓ  ｒＲＮＡ配列）及びＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の少なくとも９０％にわたってＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する染色体を有し、任意で、上記のようなＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して配列同一性を有するプラスミドを含み、免疫系を刺激するのに有効である。
【００２９】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、配列番号２によって表される１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（例えば、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む１６ｓ  ｒＲＮＡ配列）及びＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の少なくとも９８％にわたって（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％にわたって）ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性）を有する染色体を有し、任意で、上記のようなＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して配列同一性を有するプラスミドを含み、免疫系を刺激するのに有効である。
【００３０】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであり、配列番号２によって表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列に対して少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列（例えば、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む１６ｓ  ｒＲＮＡ配列）及びＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の少なくとも９８％にわたって（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％にわたって）ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性）を有する染色体を有し、任意で、上記のようなＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４に対して配列同一性を有するプラスミドを含み、免疫系を刺激するのに有効である。
【００３１】
あるいは、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌の生物型であり、本発明における使用に好適な菌株を、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８の寄託物、ならびに制限酵素断片分析及び／またはＰＣＲ分析を使用することによって、例えば、蛍光増幅断片長多型（ＦＡＦＬＰ）及び反復ＤＮＡエレメント（ｒｅｐ）−ＰＣＲフィンガープリンティングまたはタンパク質プロファイリング、または部分的な１６Ｓ  ｒＤＮＡもしくは２３ｓ  ｒＤＮＡの配列決定を使用することによって同定してもよい。好ましい実施形態では、そのような技術は、他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株を同定するために使用され得る。
【００３２】
ある特定の実施形態において、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌の生物型であり、本発明における使用に好適な菌株は、増幅リボソームＤＮＡ制限分析（ＡＲＤＲＡ）によって分析した場合に、例えばＳａｕ３ＡＩ制限酵素を使用した場合に、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌と同じパターンを示す菌株である（例示的な方法及び指針に関しては、例えば［１８］を参照されたい）。あるいは、生物型菌株は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌と同じ炭水化物発酵パターンを有する菌株として同定される。いくつかの実施形態では、炭水化物発酵パターンは、ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬパネル（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して決定される。いくつかの実施形態では、本発明で使用される細菌株は、好ましくは、（好ましくはｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ  ５０  ＣＨＬパネルを使用して）ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ分析によって測定した場合に、
（ｉ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、スクロース、Ｄ−トレハロース、ゲンチオビオース、Ｄ−タガトース及びグルコン酸カリウムのうちの少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個もしくはすべての）発酵に対して陽性、及び／または
（ｉｉ）Ｄ−マンニトール、メチル−αＤ−グリコピラノシド、Ｄ−ラクトース、デンプン、及びＬーフコースのうちの少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つもしくはすべての）発酵に対して中間である。
【００３３】
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌の生物型などの、本発明の組成物及び方法において有用である他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株は、実施例に記載のアッセイを含む任意の適切な方法または方策を使用して同定してもよい。例えば、本発明に使用するための菌株は、実施例で実施されるように、サイトカインレベルに対する効果を評価することによって同定してもよい。特に、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌と類似の増殖パターン、代謝タイプ、及び／または表面抗原を有する細菌株は、本発明において有用であり得る。有用な株は、ＮＣＩＭＢ  ４２４８８菌株と同等の免疫調節活性を有するであろう。特に、生物型菌株は、がんの疾患モデルに対して実施例に示される効果と同等の効果を誘発し、このことは、実施例に記載される培養及び投与プロトコールを使用することによって明らかにすることができる。いくつかの実施形態によると、本発明に使用され得る生物型菌株は、本発明の方法で投与された場合、実施例に示されるがんの疾患モデルに対して同等の効果を誘発することが可能な菌株である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明で使用される細菌株は、好ましくは、炭水化物、アミノ酸及び硝酸塩代謝物のアッセイによって、ならびに任意でアルカリホスファターゼ活性のアッセイによって測定した場合に、より好ましくは、（好ましくはｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＲａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａ系を使用して）Ｒａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａ分析によって測定した場合に、
（ｉ）マンノース発酵、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、アルギニンアリルアミダーゼ、フェニルアラニンアリルアミダーゼ、ピログルタミン酸アリルアミダーゼ、チロシンアリルアミダーゼ、ヒスチジンアリルアミダーゼ及びセリンアリルアミダーゼのうちの少なくとも１つに（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つもしくはすべてに）対して陽性、及び／または
（ｉｉ）βガラクトシダーゼ−６−ホスフェート、β−グルコシダーゼ及びＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼのうちの少なくとも１つに（例えば、少なくとも２つもしくはすべてに）対して中間、及び／または
（ｉｉｉ）ラフィノース発酵、プロリンアリルアミダーゼ、ロイシルグリシンアリルアミダーゼ、ロイシンアリルアミダーゼ、アラニンアリルアミダーゼ、グリシンアリルアミダーゼ及びグルタミルグルタミン酸アリルアミダーゼのうちの少なくとも１つに（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくはすべてに）対して陰性である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明で使用される細菌株は、
（ｉ）例えば、炭水化物、アミノ酸及び硝酸塩代謝物のアッセイによって測定した場合に、好ましくは（好ましくはｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＲａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａ系を使用して）、Ｒａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａ分析によって測定した場合に、グリシンアリルアミダーゼ、ラフィノース発酵、プロリンアリルアミダーゼ及びロイシンアリルアミダーゼのうちの少なくとも１つに（例えば、少なくとも２つ、３つもしくは４つすべてに）対して陰性、及び／または
（ｉｉ）好ましくは（好ましくはｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ  ５０  ＣＨＬパネルを使用して）、ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ分析によって測定した場合に、Ｌーフコースの発酵に対して中間陽性である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明で使用される細菌株は細胞外ＡＴＰ産生株であり、例えば、ＡＴＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＡＫ１９０）を使用して測定した場合に、６〜６．７ｎｇ／μｌ（例えば、６．１〜６．６ｎｇ／μｌまたは６．２〜６．５ｎｇ／μｌまたは６．３３±０．１０ｎｇ／μｌ）のＡＴＰを産生するものである。細菌細胞外ＡＴＰは、Ｔ細胞受容体媒介性のシグナル伝達の活性化（Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、腸内のＴｈ１７細胞分化の促進（Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）及びＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化させることによる炎症性メディエーターＩＬ−１βの分泌の誘導（Ｋａｒｍａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）を含む多面的効果を有し得る。したがって、細胞外ＡＴＰ産生株である細菌株は、本発明の方法との関係において、免疫系を刺激するのに有用である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明に使用するための細菌株は、次の３つの遺伝子、すなわち、可動因子タンパク質；キシロースＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼ構成成分のうちの１または２以上；及び仮想タンパク質のＦＩＧ００６３２３３３を含む。例えば、ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、可動因子タンパク質及びキシロースＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼ構成成分；可動因子タンパク質及び仮想タンパク質ＦＩＧ００６３２３３３；キシロースＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼ構成成分及び仮想タンパク質ＦＩＧ００６３２３３３；または可動因子タンパク質、キシロースＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼ構成成分、及び仮想タンパク質ＦＩＧ００６３２３３３をコードする遺伝子を含む。
【００３８】
本発明の特に好ましい株は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株である。これは、実施例で試験した例示的なＭＲｘ０５１８菌株であり、疾患の処置に有効であることが示されている。本発明は、いくつかの実施形態によって、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の細胞またはその派生体を含む細菌組成物を、本発明の一部として提供する。受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された細菌の派生体は、原菌株の娘株（後代）、または原菌株から培養された（サブクローニングされた）菌株であってもよい。
【００３９】
本発明に含まれる組成物の派生菌株は、例えば生物活性を損ねることなく、遺伝子レベルで改変されていてもよい。特に、本発明の派生菌株は、治療的に活性である。派生菌株は、ＮＣＩＭＢ  ４２４８８の原菌株と同等の免疫調節活性を有するであろう。特に、派生菌株は、実施例に記載される培養及び投与プロトコールを使用することによって明らかにすることができる場合に、がんの疾患モデルに対して同等の効果を誘発するであろう。ＮＣＩＭＢ  ４２４８８菌株の派生体は、概してＮＣＩＭＢ  ４２４８８菌株の生物型であろう。
【００４０】
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の細胞への言及は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された菌株と同じ安全性及び治療効力特性を有するいかなる細胞も包含し、そのような細胞は、本発明に包含される。したがって、いくつかの実施形態では、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の細胞に対する言及は、ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されたＭＲｘ０５１８菌株のみを指し、ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されていない細菌株を指すものではない。いくつかの実施形態では、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の細胞への言及は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された菌株と同じ安全性及び治療効力特性を有する細胞を指すが、それらは、ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されていない菌株ではない。
【００４１】
受入番号４２７６１で寄託された細菌の生物型である細菌株も、免疫系を刺激するのに有効であると予想される。生物型は、同一または極めて類似の生理学的及び生化学的特性を有する近縁の菌株である。
【００４２】
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌の生物型であり、かつ本発明における使用に好適な菌株は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌の他のヌクレオチド配列を配列決定することによって同定してもよい。例えば、実質的に全ゲノムを配列決定することができ、本発明に使用するための生物型菌株は、その全ゲノムの少なくとも８０％にわたって（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％またはその全ゲノムにわたって）少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、生物型菌株は、そのゲノムの少なくとも９８％にわたる９８％の配列同一性、またはそのゲノムの少なくとも９９％にわたる９９％の配列同一性を有する。生物型菌株の同定に使用するための他の好適な配列には、ｈｓｐ６０、または反復配列、例えばＢＯＸ、ＥＲＩＣ、（ＧＴＧ）５もしくはＲＥＰ、もしくは［１９］が含まれ得る。生物型菌株は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌の対応する配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し得る。いくつかの実施形態では、生物型菌株は、ＮＣＩＭＢ  ４２７６１として寄託された菌株ＭＲｘ０５５４の対応する配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、生物型菌株は、ＮＣＩＭＢ  ４２７６１として寄託された菌株ＭＲｘ０５５４の対応する配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し、配列番号３と少なくとも９９％同一である（例えば、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％同一である）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、生物型菌株は、ＮＣＩＭＢ  ４２７６１として寄託された菌株ＭＲｘ０５５４の対応する配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し、配列番号３の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する。
【００４３】
あるいは、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌の生物型であり、本発明における使用に好適な菌株を、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１の寄託物、ならびに制限酵素断片分析及び／またはＰＣＲ分析を使用することによって、例えば、蛍光増幅断片長多型（ＦＡＦＬＰ）及び反復ＤＮＡエレメント（ｒｅｐ）−ＰＣＲフィンガープリンティングまたはタンパク質プロファイリング、または部分的な１６Ｓ  ｒＤＮＡもしくは２３ｓ  ｒＤＮＡの配列決定を使用することによって同定してもよい。
【００４４】
ある特定の実施形態において、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌の生物型であり、本発明における使用に好適な菌株は、増幅リボソームＤＮＡ制限分析（ＡＲＤＲＡ）によって分析した場合に、例えばＳａｕ３ＡＩ制限酵素を使用した場合に、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌と同じパターンを示す菌株である（例示的な方法及び指針に関しては、例えば［２０］を参照されたい）。あるいは、生物型菌株は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌と同じ炭水化物発酵パターンを有する菌株として同定される。いくつかの実施形態では、炭水化物発酵パターンは、ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬパネル（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して決定される。いくつかの実施形態では、本発明で使用される細菌株は、好ましくは、（好ましくはｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ  ５０  ＣＨＬパネルを使用して）ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ分析によって測定した場合に、
（ｉｉｉ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、スクロース、Ｄ−トレハロース、ゲンチオビオース、Ｄ−タガトース及びグルコン酸カリウムのうちの少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個もしくはすべての）発酵に対して陽性、及び／または
（ｉｖ）Ｄ−マンニトール、メチル−αＤ−グリコピラノシド、Ｄ−ラクトース、デンプン、及びＬーフコースのうちの少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つもしくはすべての）発酵に対して中間である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明で使用される細菌株は、好ましくは、（好ましくはｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ  ５０  ＣＨＬパネルを使用して、かつ好ましくは実施例１０に記載の条件を使用して）ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ分析によって測定した場合に、
（ｉ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、Ｄ−サッカロース（スクロース）、Ｄ−トレハロース、ゲンチオビオース、Ｄ−タガトース及びグルコン酸カリウムのうちの少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個もしくはすべての）発酵に対して陽性、
（ｉｉ）Ｄ−マンニトール、メチル−αＤ−グリコピラノシド、Ｄ−ラクトース、Ｄ−ラフィノース、アミドン（デンプン）及びＤ−ツラノースのうちの１つの（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つもしくはすべての）発酵に対して中間、及び／または
（ｉｉｉ）グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌキシロース、Ｄ−アドニトール、メチル−βＤ−キシロピラノシド、Ｌーソルボース、Ｌーラムノース、ズルシトール、イノシトール、Ｄ−ソルビトール、メチル−αＤ−マンノピラノシド、Ｄ−メリビオース、イヌリン、Ｄ−メレジトース、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−フコース、Ｌーフコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、２−ケトグルコン酸カリウム及び５−ケトグルコン酸カリウムのうちの少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個もしくはすべての）発酵に対して陰性である。
【００４６】
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌の生物型などの、本発明の組成物及び方法において有用である他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株は、実施例に記載のアッセイを含む任意の適切な方法または方策を使用して同定してもよい。例えば、本発明に使用するための菌株は、嫌気性のＹＣＦＡ中で培養すること、及び／または細菌をＩＩ型コラーゲン誘導関節炎マウスモデルに投与すること、次いでサイトカインレベルを評価することによって同定してもよい。特に、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された細菌と類似の増殖パターン、代謝タイプ、及び／または表面抗原を有する細菌株は、本発明において有用であり得る。有用な菌株は、ＮＣＩＭＢ  ４２７６１菌株と同等の免疫調節活性を有するであろう。特に、生物型菌株は、がんの疾患モデルに対して実施例に示される効果と同等の効果を誘発し、このことは、実施例に記載される培養及び投与プロトコールを使用することによって明らかにすることができる。
【００４７】
本発明の派生菌株は、例えば生物活性を損ねることなく、遺伝子レベルで改変されていてもよい。特に、本発明の派生菌株は、治療的に活性である。派生菌株は、ＮＣＩＭＢ  ４２７６１の原菌株と同等の免疫調節活性を有するであろう。特に、派生菌株は、がんの疾患モデルに対して実施例に示される効果と同等の効果を誘発し、このことは、実施例に記載される培養及び投与プロトコールを使用することによって明らかにすることができる。ＮＣＩＭＢ  ４２７６１菌株の派生体は、概してＮＣＩＭＢ  ４２７６１菌株の生物型であろう。
【００４８】
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の細胞への言及は、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託された菌株と同じ安全性及び治療効力特性を有するいかなる細胞も包含し、そのような細胞は、本発明に包含される。したがって、いくつかの実施形態では、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の細胞に対する言及は、ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託されたＭＲｘ０５５４菌株のみを指し、ＮＣＩＭＢ  ４２７６１で寄託されていない細菌株を指すものではない。
【００４９】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して配列同一性を有するゲノムを有する。いくつかの実施形態では、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の少なくとも６０％にわたって（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％にわたって）、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性）を有するゲノムを有する。例えば、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の７０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の８０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の９０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の１００％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の７０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の８０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の９０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の１００％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の７０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の８０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の９０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の９５％にわたって少なくとも９８％の同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の１００％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の９０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９９．５％の配列同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の９５％にわたって少なくとも９９．５％の同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の９８％にわたって少なくとも９９．５％の同一性、またはＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の１００％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９９．５％の配列同一性を有するゲノムを有し得る。
【００５０】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、例えば上記のような、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して配列同一性を有するゲノム、及び例えば上記のような、配列番号１または３のいずれかと配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有し、好ましくは配列番号３と少なくとも９９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有し、より好ましくは配列番号３の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。
【００５１】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、例えば上記のような、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して配列同一性を有するゲノムを有し、免疫系を刺激するのに有効である。
【００５２】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、例えば上記のような、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して配列同一性を有するゲノム、及び例えば上記のような、配列番号１または３に対して配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有し、免疫系を刺激するのに有効である。
【００５３】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、配列番号３によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（例えば、配列番号３の１６Ｓ遺伝子ｒＲＮＡ配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列）及びＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の少なくとも９０％にわたってＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するゲノムを有し、免疫系を刺激するのに有効である。
【００５４】
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであり、配列番号３によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（例えば、配列番号３の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列）及びＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２の少なくとも９８％にわたって（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％にわたって）、ＷＯ２０１８／２１５７８２の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性）を有するゲノムを有し、免疫系を刺激するのに有効である。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物中の細菌株は、生存しており、腸に部分的または完全にコロニー形成することができる。
【００５６】
本発明のすべての実施形態の代替的な態様では、本発明の組成物中の細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ種のものである。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍと非常によく似ており、有鞭毛性でもある。
【００５７】
治療的使用
免疫系の刺激
実施例は、本発明の組成物の投与が、免疫刺激をもたらし得ることを示す。本発明の組成物の投与が免疫刺激効果を有することが示されたため、本発明の組成物は、疾患、特に免疫活性化の低減を特徴とする疾患、及び免疫応答の増大によって処置可能な疾患の処置に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激することにより、疾患を処置するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【００５８】
本発明の組成物は、細胞集団におけるＴｒｅｇのパーセンテージの増大を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＴｒｅｇのパーセンテージの増大を特徴とする疾患を処置または予防するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−細胞のパーセンテージの増大を特徴とする疾患を処置または予防するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＴｒｅｇのパーセンテージを減少させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇによる免疫応答の抑制を低減させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇの選択的低減によって免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫刺激に使用するためのものであり、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇの数またはパーセンテージを低減させる。
【００５９】
本発明の組成物は、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ及び／または活性化ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、活性化ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比を増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、活性化ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比を増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
【００６０】
本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ１９＋ＣＤ３−細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＢ細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものであり、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
【００６１】
本発明の組成物は、ＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものであり、ＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
【００６２】
本発明の組成物は、ＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものであり、ＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
【００６３】
実施例は、本発明の組成物の投与は、炎症性サイトカインなどの炎症誘発性分子の発現の増大をもたらし得ることを示す。本発明の組成物を投与すると発現レベルの上昇を示した炎症誘発性分子の例としては、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６が挙げられる。本発明の組成物の投与が炎症誘発性分子の発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、炎症性サイトカインなどの炎症誘発性分子の発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、炎症誘発性分子の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患、特に炎症性サイトカインの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及び／またはＩＬ−６の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及び／またはＩＬ−６の発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及び／またはＩＬ−６の発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【００６４】
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−１βの発現の増大をもたらし得ることも示す。ＩＬ−１βは炎症性サイトカインである［２１］。ＩＬ−１βの生成及び分泌は、炎症応答の活性化に関連するタンパク質複合体であるインフラマソームによって調節される［２２］。本発明の組成物の投与がＩＬ−１βの発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものである。
【００６５】
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−２３の発現の増大をもたらし得ることも示す。ＩＬ−２３は、炎症に関係付けられている［２３、２４］。免疫応答において提唱されているＩＬ−２３の機能には、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の増殖の促進、及び樹状細胞（ＤＣ）によるＩＦＮ−γの分泌の促進が含まれる［２５］。本発明の組成物の投与がＩＬ−２３の発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ＩＬ−２３の発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−２３の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−２３の発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−２３の発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【００６６】
実施例は、本発明の組成物の投与が、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現の増大をもたらし得ることを示す。ＴＮＦ−αは、細胞死を促進する様々なシグナル伝達経路に関与することが知られている炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αは、その同族受容体であるＴＮＦＲ−１に結合することによりアポトーシスを開始し、アポトーシス経路における一連の切断事象を引き起こす［２６］。ＴＮＦ−αは、ＲＩＰキナーゼ依存性メカニズムを介して壊死を誘発することもできる［２７］。本発明の組成物の投与によりＴＮＦ−α発現の増大が示されるため、本発明の組成物は、疾患の処置、特にＴＮＦ−αの発現の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−α発現の減少を特徴とする疾患の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【００６７】
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−６の発現の増大をもたらし得ることも示す。ＩＬ−６は、炎症時に生成され、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の分化、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性Ｔ細胞への分化を促進する炎症性サイトカインである［２８］。本発明の組成物の投与がＩＬ−６の発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【００６８】
Ｂｅｔｔｅｌｌｉら［２９］は、ＩＬ−６がＴｒｅｇの増殖を阻害すると報告した。実施例により、本発明の組成物がＩＬ−６の発現を増大させることが示されているため、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現を増大させることにより、Ｔｒｅｇの数またはパーセンテージを選択的に減少させ得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現を増大させることにより、免疫刺激に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇの数またはパーセンテージを減少させることにより、免疫刺激に使用するためのものである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明による免疫系の刺激は、ＴＬＲ５の活性化またはＴＬＲ５の活性化の上方制御を含む。いくつかの実施形態では、本発明による免疫系の刺激は、ＴＬＲ９の活性化またはＴＬＲ９の活性化の上方制御を含む。いくつかの実施形態では、本発明による免疫系の刺激は、ＴＬＲ５及びＴＬＲ９の活性化またはＴＬＲ５及びＴＬＲ９の活性化の上方制御を含む。いくつかの実施形態では、本発明による免疫系の刺激は、限定されないが、Ｔヘルパー細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞などのＴ細胞の分化の誘導及び／または上方制御を含む。
【００７０】
ＴＬＲシグナル伝達経路は、最終的に、転写因子の核内因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化をもたらす。ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ−αを含む数々の炎症性サイトカイン遺伝子の発現を制御する。免疫刺激は、例えば、ＴＬＲ５の二量体化を引き起こし、これがその後、ＭｙＤ８８を動員し、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、及びＩＲＡＫ−Ｍを含むプロテインキナーゼを活性化する。これらのキナーゼの活性化は、炎症性サイトカインであるＮＦ−κＢの核局在化をもたらす［３０］。
【００７１】
実施例において示されるように、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢの発現の増大をもたらす。本発明の組成物の投与は、炎症性サイトカインであるＮＦ−κＢの発現を増大させるため、本発明の組成物は、免疫応答を刺激するのに有用であり得る。さらに、本発明の組成物は、疾患、特に免疫活性化の低減を特徴とする疾患、及び／または免疫応答の増大によって処置可能な疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させることにより、免疫刺激剤として使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させることにより、免疫活性化の低減を特徴とする疾患を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答の増大によって処置可能な疾患を処置するのに使用するためのものである。
【００７２】
特に、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢの発現及び／または活性化の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢの発現及び／または活性化の減少を特徴とする疾患を処置するのに使用するためのものである。
【００７３】
ＮＦ−κＢの活性化は、自然免疫応答を誘発し、その後、適応免疫応答を発生させるために重要である。したがって、本発明の組成物などのＴＬＲのアゴニストは、自然免疫応答と適応免疫応答との両方を促進することにより、感染性疾患、アレルギー、及び腫瘍を処置するためのアジュバントとして有用である可能性が高い［３０］。一実施形態において、本発明の組成物は、感染性疾患、アレルギー、及び／または腫瘍を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させることにより、感染性疾患、アレルギー、及び／または腫瘍を処置するのに使用するためのものである。
【００７４】
実施例はまた、本発明の組成物がＴヘルパー細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球の分化を促進することも示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｔヘルパー細胞及び／または細胞傷害性Ｔリンパ球の分化を刺激するのに使用するためのものである。
【００７５】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物によって処置される疾患は、がんではない。
【００７６】
ワクチンアジュバントとしての使用
実施例は、本発明の組成物の投与が、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現の増大をもたらし得ることを示す。ＴＮＦ−αは、ワクチン応答に重要であることが知られている。例えば、ＴＮＦ−αは、高齢者集団のインフルエンザワクチン接種における効率的なワクチン応答に必要であることが示されている［３１］。本発明の組成物の投与がＴＮＦ−α発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αのレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、インフルエンザ治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答を増強するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明は、抗原と組み合わせて投与される組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワクチン接種の直前または直後に患者に投与するためのものである。
【００７７】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、特に菌株ＭＲｘ０５１８は有鞭毛性であり、フラジェリンはＴＬＲ５アゴニストであり得る。ＴＬＲアゴニストは、特に高齢者集団において、様々な抗原タイプに対するワクチンアジュバントとして開発中である［３２］。実施例におけるデータによっても、ＭＲｘ０５１８のフラジェリンがＴＬＲ５アゴニストであることが確認されている。したがって、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして、特に免疫系の活性が低減している場合がある高齢患者（例えば、４０、５０、６０、７０または８０歳超）に投与されるワクチンのために有用であり得る。ＴＬＲ５シグナル伝達は、年齢に関連した自然免疫応答においても重要な役割を果たす［３３］。ある特定の実施形態において、本組成物は、自然免疫応答を増強するのに使用するためのものである。ＴＬＲ５アゴニストはワクチンアジュバントとして開発中であるが、これらはすべて既知の病原体に由来し、及び／または合成である。対照的に、本発明の組成物は、共生細菌を含む。
【００７８】
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−６の発現の増大をもたらし得ることも示す。ＩＬ−６の発現の増大は、多くの疾患でワクチン応答に関連付けられてきた。例えば、成人にインフルエンザワクチンを投与した後、ＩＬ−６がＣＤ１４＋ＣＤ１６−炎症性単球によって生成され［３４］、より高いレベルのＩＬ−６は、インフルエンザワクチンに対するワクチン応答の達成に関連付けられた［３５］。さらに、ＡＳ０３アジュバント系の注射後にＩＬ−６が生成され［３６］、結核ワクチンの投与後には、マウスにおけるＩＬ−６の下方制御がＴヘルパー細胞応答を低減させることが示された［３７］。本発明の組成物の投与がＩＬ−６発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、結核治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
【００７９】
さらに、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの発現は、治療用ＨＩＶワクチン［Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ］、結核ワクチン及びクラミジアワクチンの効力と相関することが示されている［３８］。Ｓｕら［３９］は、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αをＦＭＤＶ  ＤＮＡワクチンと同時接種すると、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ発現が増大し、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−４の発現が高まり、抗原特異的細胞傷害性応答が高まったことを示した。本発明の組成物の投与がＩＬ−６及びＴＮＦ−αの発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αのレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＨＩＶ治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、クラミジア治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
【００８０】
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−１βの発現の増大をもたらし得ることも示す。Ｌｉら［４０］は、アジュバントの水酸化アルミニウムがＩＬ−１βの分泌を活性化したことを示し、ＩＬ−１β自体がアジュバントとして作用し得ることを示唆した。本発明の組成物の投与がＩＬ−１βの発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。実施例は、本発明の組成物の投与が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対する比を増大させ得ることを示す。アジュバントはＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することが示されており［４１］、本発明の組成物の投与がＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対する比を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対する比を増大させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
【００８１】
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＣＸＣＲ３リガンドのＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の発現またはレベルの上昇をもたらし得ることも示す。ＡＳＯ３、ＣｐＧ、ＧＬＡ−ＳＥ、αＧａｌＣｅｒなどの既知のアジュバントはすべて、ＣＸＣＬ９及び１０を増大させ［４２、４３］、これは、本発明の組成物がアジュバントとして有効であることを示唆している。同様に、ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０は、ＩＦＮγ／Ｔｈ１応答と関連しており、抗体応答を促進する［４４］。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原、特に病原性抗原またはがん抗原に対する抗体応答を促進するのに使用するためのものである。同様に、ＣＸＣＬ９は検討されたマラリアワクチンを投与された志願者におけるワクチン誘導性Ｔ細胞応答の、ＩＦＮ−γよりも感受性の高い指標である［４５］。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原、特に病原性抗原またはがん抗原に対するＴ細胞応答を促進するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本組成物は、マラリアからの保護に使用するためのものである。
【００８２】
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−１２ｐ７０の発現またはレベルの上昇をもたらし得ることも示す。この効果はワクチンアジュバントの効率に関連付けられており、ＩＬ−１２自体がアジュバントとして提案されている［４６］。これは、本発明の組成物がアジュバントとして有効であることを示唆している。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ワクチンアジュバントとして使用する場合、本発明の組成物は、患者に別々に投与された抗原に対するアジュバント効果をもたらすために単独で投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は経口投与され、抗原は非経口的に注射される。
【００８４】
本発明の組成物は、任意の有用な抗原に対する免疫応答を増強するために使用され得る。本発明で使用される例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原、タンパク質及び／または糖類抗原などの細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ならびに腫瘍抗原が含まれる。本発明は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、クラミジア、ＳＡＲＳコロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルスなどに対するワクチンにとって特に有用である。本発明で使用されるさらなる抗原には、糖タンパク質抗原及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Ｔａｕ、ＰＣＳＫ９ならびに習慣性物質、例えば、ニコチン、アルコール、アヘン剤が含まれる。
【００８５】
本発明で使用される好ましい抗原には、病原体抗原及び腫瘍抗原が含まれる。抗原は、病原体による感染から保護したり、腫瘍を攻撃したりするのに有効な、抗原に特異的な免疫応答を誘発する。抗原は、例えば、ペプチドまたは多糖であり得る。
【００８６】
本発明はまた、患者の免疫応答を高めるための薬物の製造における、（ｉ）抗原の水性調製物、及び（ｉｉ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物の使用を提供する。
【００８７】
これらの方法及び使用によって高められる免疫応答には、概して、抗体応答、好ましくは防御抗体応答が含まれる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株は、抗原を提示するように操作されている。本発明の細菌株上に抗原を提示することにより、その免疫刺激活性が最大化し、抗原に対して発生する防御免疫応答がさらに増強し得る。さらに、抗原と本発明の細菌とを含む治療薬を製造及び投与することは、抗原及び細菌株を含む組成物の各々を別々に製造及び投与する場合よりも、この方法でより効率的かつ有効となり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物であって、この細菌が、例えばその細胞表面に抗原を提示する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、抗原を提示する細菌株を含む組成物は、ワクチン抗原として使用するためのものである。いくつかの実施形態では、抗原は、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、クラミジア、ＳＡＲＳコロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、エプスタインバーウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、抗原は、糖タンパク質及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Ｔａｕ、ＰＣＳＫ９または例えばニコチン、アヘン剤などの習慣性物質である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌は、１または２以上の抗原を発現する。概して、この抗原は、組換えにより発現され、本発明の細菌に対して異種である。したがって、本発明は、異種抗原を発現するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を提供する。抗原は、細菌に対して同種の１または２以上のポリペプチドとともに発現される融合ポリペプチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、細菌は、非融合ポリペプチドとして抗原を発現する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株の細胞を含む組成物を提供し、この細胞は異種抗原を発現する。いくつかの実施形態では、組成物は、ワクチンとして使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株の細胞を提供し、この細胞は異種抗原を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ワクチンとして使用するためのものである。
【００９０】
本発明で使用される例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原、タンパク質及び／または糖類抗原などの細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ならびに腫瘍抗原が含まれる。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株において発現させるためのさらなる抗原には、糖タンパク質及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Ｔａｕ、ＰＣＳＫ９、ならびに習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、アヘン剤などが含まれる。
【００９１】
本発明はまた、（例えば、ＰＣＳＫ９抗原を介して）コレステロール高値などの非感染性疾患に対するワクチンへの応答を増強するために有用であり得る。
【００９２】
本発明はまた、習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、またはアヘン剤に対するワクチンへの応答を増強するために有用であり得る。
【００９３】
細胞療法
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−６の発現の増大をもたらし得ることも示す。ＩＬ−６発現の増大は、慢性リンパ球性白血病のＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ療法に対する応答と相関付けられている。血清ＩＬ−６の増大はＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖と関連付けられ、一方、ＩＬ−６の阻害はＣＡＲ−Ｔ細胞増殖の阻害と関連付けられた［４７］。本発明の組成物の投与がＩＬ−６発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、細胞療法、特にＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、慢性リンパ球性白血病の処置に使用するためのものである。
【００９４】
Ｔｒｅｇの選択的枯渇は、細胞傷害性リンパ球の効力を増強することが示されている［４８］。ＣＡＲ−Ｔ細胞は細胞傷害性リンパ球のサブセットであり、したがって、Ｔｒｅｇの選択的枯渇はＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有効であると考えられている。本発明の組成物の投与がＴｒｅｇを枯渇させることが示されたため、本発明の組成物は、細胞療法、特にＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有用であり得る。
【００９５】
したがって、本発明の組成物は、細胞療法において、特に細胞療法に対する応答を増強するのに有用であり得る。
【００９６】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法には免疫刺激特性があることが報告されている。ＭＳＣをＬＰＳで処理すると、炎症性サイトカインのＩＬ−６及びＩＬ−８が上方制御され、Ｂ細胞増殖の増大がもたらされる［４９］。したがって、本発明の組成物はＩＬ−６の発現を増大させることが示されたため、本組成物はＭＳＣ細胞療法との組み合わせにおいて有用であり得る。
【００９７】
幹細胞移植療法
幹細胞移植療法において未分化幹細胞を使用する代わりに、移植前に幹細胞をある程度まで分化させることが有益であり得ることが報告されている。例えば、Ｈｅｎｇら［５０］は、幹細胞の心筋形成分化が、比較的高い生着効率、筋細胞の再生の増強、及び心臓機能の回復の増大をもたらすことにより有益であり得ることを報告した。本発明の組成物の投与により、未分化神経芽腫細胞のニューロン分化が開始したため、本発明の組成物は、幹細胞移植療法における幹細胞分化に有用であり得る。
【００９８】
造血幹細胞移植
造血幹細胞移植は、通常は骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する多能性造血幹細胞の移植である。同種造血幹細胞移植前にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）が腸にコロニー形成すると、無再発死亡率が減少するため、患者の２年生存率が著しく向上することが示されている［５１］。したがって、実施例において示される免疫調節効果は、造血幹細胞移植療法において有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植後、特に同種造血幹細胞移植後の生存率を向上させるのに有用であり得る。
【００９９】
本発明の組成物は、同種造血幹細胞移植との組み合わせにおいて有用であり得る。本発明の組成物は、同種造血幹細胞移植に対する患者の応答成功を後押しするのに効果的であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植の前に投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植を受ける予定である患者に投与するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植の後に投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植を受けた患者に投与するためのものである。
【０１００】
免疫老化
Ｆｕｌｏｐら［５２］は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大及びＢ細胞数の減少が適応免疫系の老化に関連していることを特定した。したがって、本発明の組成物は、免疫老化を予防または遅延させるために使用され得る。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化の予防に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｂ細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大及びＢ細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数を減少させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞数を増大させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数を増大させ、Ｂ細胞数を減少させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化に起因する疾患の処置に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化を遅延させること及び／または予防することにより、老化関連疾患の処置に使用するためのものである。
【０１０１】
さらに、ワクチンアジュバントが免疫老化を克服し得ることが提唱されている［５３］。本発明の組成物はワクチンアジュバントとして使用するのに好適であるため、本発明の組成物は、免疫老化を予防または遅延させるのに有用であり得る。別の実施形態では、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして免疫老化を遅延させること及び／または予防することに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものであり、本組成物は、免疫老化を遅延させ、及び／または予防する。
【０１０２】
免疫老化に関連する疾患としては、循環器疾患、がん、真性糖尿病２型［５４］、及び自己免疫障害［５５］が挙げられる。
【０１０３】
投与形態
好ましくは、本発明の組成物は、本発明の細菌株の腸への送達及び／または腸における部分的もしくは全体的なコロニー形成を可能にするために、消化管に投与される。概して、本発明の組成物は経口投与（舌下投与を含む）されるが、直腸内投与または鼻腔内投与してもよい。
【０１０４】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、泡状物、スプレーまたはゲルとして投与してもよい。
【０１０５】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えばカカオ油（カカオバター）、合成硬質脂肪（例えばｓｕｐｐｏｃｉｒｅ、ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、グリセロゼラチン、ポリエチレングリコール、またはセッケングリセリン組成物の形態における肛門坐剤などの坐剤として投与してもよい。
【０１０６】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、経鼻胃管、経口胃管、胃管、空腸瘻管（Ｊチューブ）、経皮内視鏡的胃瘻造設術（ＰＥＧ）などの管、または胃、空腸、及び他の好適なアクセスポートへのアクセスを提供する胸壁ポートなどのポートを介して、消化管に投与される。
【０１０７】
本発明の組成物は、１回投与されてもよいし、または処置レジメンの一部として連続的に投与されてもよい。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は連日投与される。
【０１０８】
本発明のある特定の実施形態では、本発明に係る処置は、患者の腸内細菌叢の評価を伴う。本発明の菌株の送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成が達成されず、効力が観察されなければ処置を繰り返してもよく、または送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成が成功して効力が観察されれば処置を中止してもよい。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、子宮内の子供及び／または出産後の子供に疾患が発生する可能性を減少させるために妊娠中の動物、例えばヒトなどの哺乳動物に投与されてもよい。
【０１１０】
本発明の組成物は、免疫活性の低減によって媒介される疾患もしくは状態を有すると診断されている患者、または免疫活性の低減によって媒介される疾患もしくは状態のリスクがあると特定された患者に投与されてもよい。本組成物はまた、健康な患者における免疫活性の低減によって媒介される疾患または状態の発生を予防するための予防手段として投与されてもよい。
【０１１１】
本発明の組成物は、免疫活性欠乏と診断された患者、または免疫活性欠乏のリスクがあると特定された患者に投与され得る。例えば、患者において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのコロニー形成が低減しているか、または存在しない場合がある。
【０１１２】
本発明の組成物は、食品、例えば栄養補助剤として投与されてもよい。
【０１１３】
概して、本発明の組成物はヒトの処置のためのものであるが、家禽、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、またはウサギなどの単胃哺乳動物を含む動物を処置するのに使用してもよい。本発明の組成物は、動物の成長及び能力を増強するために有用であり得る。動物に投与する場合は、強制経口投与を使用してもよい。
【０１１４】
組成物
本発明の組成物は、概して、細菌を含む。本発明の好ましい実施形態では、組成物は凍結乾燥形態で製剤化される。例えば、本発明の組成物は、本発明の細菌株を含む顆粒剤またはゼラチンカプセル、例えば硬ゼラチンカプセルを含み得る。
【０１１５】
好ましくは、本発明の組成物は、凍結乾燥細菌を含む。細菌の凍結乾燥は十分に確立された手順であり、関連する指針を、例えば参考文献［５６、５８］で入手することができる。
【０１１６】
あるいは、本発明の組成物は、生きた活性な細菌培養物を含み得る。
【０１１７】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、腸への細菌株の送達を可能にするようにカプセル封入されている。カプセル封入は、例えば、ｐＨの変化によって誘発され得る圧力、酵素活性、または物理的崩壊などの化学的または物理的な刺激による破裂によって標的位置で送達されるまで、組成物を分解から保護する。任意の適切なカプセル封入方法を使用してよい。例示的なカプセル封入技術には、多孔性マトリックスへの封入、固体担体表面への結合または吸着、凝結または架橋剤による自己凝集、及び微孔性膜またはマイクロカプセルへの機械的封じ込めが含まれる。本発明の組成物を調製するために有用であり得るカプセル化の指針は、例えば参考文献［５９］及び［６０］で入手することができる。
【０１１８】
この組成物は経口投与されてもよく、錠剤、カプセル、または粉末の形態であってもよい。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓは嫌気性菌であるため、カプセル封入製品が好ましい。インビボの送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成及び生存率を向上させるための脱酸素剤及びプレバイオティクス基質として、他の成分（例えばビタミンＣなど）を含めてもよい。あるいは、本発明のプロバイオティクス組成物は、食品もしくは栄養製品、例えば乳ベースもしくは乳清ベースの発酵乳製品、または医薬品として経口投与されてもよい。
【０１１９】
組成物はプロバイオティクスとして製剤化されてもよい。
【０１２０】
本発明の組成物は、治療有効量の本発明の細菌株を含む。細菌株の治療有効量は、患者に有益な効果を及ぼすのに十分である。細菌株の治療有効量は、患者の腸への送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成をもたらすのに十分であり得る。
【０１２１】
例えば成人に対する細菌の好適な１日用量は、約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）、例えば約１×１０７〜約１×１０１０ＣＦＵであってもよく、別の例では約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵであってもよく、別の例では約１×１０７〜約１×１０１１ＣＦＵであってもよく、別の例では約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵであってもよく、別の例では約１×１０８〜約１×１０１１ＣＦＵであってもよい。
【０１２２】
ある特定の実施形態において、細菌の用量は、少なくとも１日当たり１０９細胞、例えば、少なくとも１日当たり１０１０細胞、少なくとも１日当たり１０１１細胞、または少なくとも１日当たり１０１２細胞である。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、組成物は、組成物の重量に対して約１×１０６〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、例えば約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの量の細菌株を含有する。用量は、例えば、１ｇ、３ｇ、５ｇ、及び１０ｇであり得る。
【０１２４】
ある特定の実施形態において、本発明は、細菌株の量が、組成物の重量１グラム当たり約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位である、上記の医薬組成物を提供する。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、本発明は、上記の医薬組成物を提供し、この組成物は、５００ｍｇ〜１０００ｍｇ、６００ｍｇ〜９００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ、５００ｍｇ〜７５０ｍｇまたは７５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量で投与される。ある特定の実施形態において、本発明は、上記の医薬組成物を提供し、この医薬組成物中の凍結乾燥細菌は、５００ｍｇ〜１０００ｍｇ、６００ｍｇ〜９００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ、５００ｍｇ〜７５０ｍｇまたは７５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量で投与される。
【０１２６】
典型的には、本発明の組成物などのプロバイオティクスを、少なくとも１つの好適なプレバイオティクス化合物と任意で組み合わせてもよい。プレバイオティクス化合物は通常、オリゴ糖もしくは多糖などの消化できない炭水化物、または上部消化管で分解もしくは吸収されない糖アルコールである。既知のプレバイオティクスには、市販の製品、例えばイヌリン及びトランスガラクトオリゴ糖が含まれる。
【０１２７】
ある特定の実施形態において、本発明のプロバイオティクス組成物は、プレバイオティクス化合物を、組成物の全重量に対して約１〜約３０重量％（例えば、５〜２０重量％）の量で含む。炭水化物は、フラクトオリゴ糖（またはＦＯＳ）、短鎖フラクトオリゴ糖、イヌリン、イソマルトオリゴ糖、ペクチン、キシロオリゴ糖（またはＸＯＳ）、キトサンオリゴ糖（またはＣＯＳ）、ベータグルカン、アレイブル（ａｒａｂｌｅ）ゴム修飾耐性デンプン、ポリデキストロース、Ｄ−タガトース、アカシアファイバー、イナゴマメ、オート麦、及びシトラスファイバーからなる群から選択され得る。一態様では、プレバイオティクスは、短鎖フラクトオリゴ糖（簡単にするために、本明細書において以降ＦＯＳｓ−ｃ．ｃと示す）であり、前記ＦＯＳｓ−ｃ．ｃは、消化されない炭水化物であり、概してビートシュガーの転換によって得られ、３つのグルコース分子が結合しているスクロース分子を含む。
【０１２８】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。そのような好適な賦形剤の例は、参考文献［６１］に見出すことができる。治療用途に許容される担体または希釈剤は製薬分野において周知であり、例えば参考文献［６２］に記載されている。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬務との関連で選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、もしくは希釈剤として、またはそれに加えて、任意の好適な結合剤（複数可）、滑沢剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含み得る。好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、天然及び合成のガム、例えばアカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。好適な滑沢剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。保存剤、安定剤、色素、及びさらには香味料を医薬組成物中に供給してもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁化剤を使用してもよい。
【０１２９】
本発明の組成物は、食品として製剤化されてもよい。例えば、食品は、例えば栄養補助剤のように、本発明の治療効果に加えて、栄養上の利益をもたらし得る。同様に、本発明の組成物の味を向上させるために、または医薬組成物ではなく一般的な食品により類似させることによって組成物の消費をより誘引するために、食品を製剤化してもよい。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は乳ベースの製品として製剤化される。「乳ベースの製品」という用語は、多様な脂肪含有量を有する任意の液体または半固体の乳ベースまたは乳清ベースの製品を意味する。乳ベースの製品は、例えば牛乳、ヤギ乳、ヒツジ乳、スキムミルク、全乳、粉乳から還元した乳、及び加工していない乳清、または加工製品、例えばヨーグルト、凝固乳、カード、サワーミルク、サワー全乳、バターミルク、及び他のサワーミルク製品であり得る。別の重要な群としては、乳飲料、例えば乳清飲料、発酵乳、コンデンスミルク、幼児用または乳児用ミルク；フレーバーミルク、アイスクリーム；ミルク含有食品、例えばスイーツが挙げられる。
【０１３０】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、１つの細菌株または種を含有し、他のいかなる細菌株または種も含有しない。そのような組成物は、ごく微量のまたは生物学的に無関係な量の他の細菌株または種を含んでもよい。そのような組成物は、他の生物の種を実質的に含まない培養物であってもよい。
【０１３１】
本発明に従って使用するための組成物は、販売承認を必要とする場合と必要としない場合がある。
【０１３２】
場合によっては、凍結乾燥細菌株は、投与前に再調製される。場合によっては、再調製は、本明細書に記載の希釈剤の使用による。
【０１３３】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在する。
【０１３５】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する。
【０１３６】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する。
【０１３７】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する。
【０１３８】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−３α、ＩＬ−２３またはＩＬ−６炎症性サイトカインによって媒介される疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する、医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用される細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、ＴＮＦ−αによって媒介される疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、本発明は、細菌株の量が、組成物の重量１グラム当たり約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位である、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、本発明は、１ｇ、３ｇ、５ｇ、または１０ｇの用量で投与される、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４１】
ある特定の実施形態において、本発明は、経口、直腸内、皮下、経鼻、頬側、及び舌下からなる群から選択される方法で投与される、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４２】
ある特定の実施形態において、本発明は、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、及びソルビトールからなる群から選択される担体を含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４３】
ある特定の実施形態において、本発明は、エタノール、グリセロール、及び水からなる群から選択される希釈剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、本発明は、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムからなる群から選択される賦形剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、本発明は、保存剤、抗酸化剤、及び安定剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、本発明は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルからなる群から選択される保存剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４７】
ある特定の実施形態において、本発明は、前記細菌株が凍結乾燥されている、上記の医薬組成物を提供する。
【０１４８】
ある特定の実施形態において、本発明は、上記の医薬組成物であって、約４℃または約２５℃の密封容器に組成物を保管し、容器を相対湿度５０％の雰囲気に置いた場合、少なくとも約１か月、３か月、６か月、１年、１．５年、２年、２．５年、または３年の期間が経過した後に、コロニー形成単位で測定した細菌株の少なくとも８０％が残る、医薬組成物を提供する。
【０１４９】
培養方法
本発明に使用するための細菌株は、例えば参考文献［６３、６５］に詳述されている標準的な微生物学的技術を使用して培養することができる。
【０１５０】
培養に使用する固体または液体培地は、ＹＣＦＡ寒天またはＹＣＦＡ培地であってもよい。ＹＣＦＡ培地は、（１００ｍＬ当たり、概算値）カシトン（１．０ｇ）、酵母抽出物（０．２５ｇ）、ＮａＨＣＯ３（０．４ｇ）、システイン（０．１ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＮａＣｌ（０．０９ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．０９ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００９ｇ）、ＣａＣｌ２（０．００９ｇ）、レサズリン（０．１ｍｇ）、ヘミン（１ｍｇ）、ビオチン（１μｇ）、コバラミン（１μｇ）、ｐ−アミノ安息香酸（３μｇ）、葉酸（５μｇ）、及びピリドキサミン（１５μｇ）を含み得る。
【０１５１】
ワクチン組成物に使用するための細菌株
本発明者らは、本発明の細菌株が免疫活性の低減に関連する疾患または状態の処置または予防に有用であることを明らかにした。これは、本発明の細菌株が宿主免疫系に対して有する効果の結果である可能性が高い。したがって、本発明の組成物は、ワクチン組成物として投与された場合に、疾患または状態を予防するのに有用であり得る。そのようなある特定の実施形態において、本発明の細菌株は、死滅、不活化または弱毒化され得る。そのようなある特定の実施形態において、組成物は、ワクチンアジュバントを含み得る。ある特定の実施形態において、組成物は、注射によって、例えば皮下注射によって投与されるためのものである。
【０１５２】
概説
本発明の実践には、特記なき限り、当業者が備えている技能の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学、及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、参考文献［６６］及び［６７，７３］などを参照されたい。
【０１５３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘだけからなる場合もあれば、何らかの追加要素を含む、例えばＸ＋Ｙである場合もある。
【０１５４】
数値ｘに関する「約」という用語は任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５５】
「実質的に」という用語は「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という用語は本発明の定義から省略されてもよい。
【０１５６】
２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アライメントしたとき、そのパーセンテージのヌクレオチドが２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアライメント及び相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献［７４］のセクション７．７．１８に記載されているものを使用して決定することができる。好ましいアライメントは、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭ行列が６２のアフィンギャップ検索を使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献［７５］に開示されている。
【０１５７】
特に明記しない限り、多数のステップを含むプロセスまたは方法は、方法の最初もしくは最後に追加のステップを含んでもよいし、または途中に追加のステップを含んでもよい。また、必要に応じて、ステップを組み合わせたり、省略したり、または代替的な順序で行ったりしてもよい。
【０１５８】
本明細書では、本発明の様々な実施形態を記載している。各実施形態で規定した特徴を他の規定の特徴と組み合わせて、さらなる実施形態をもたらすことができることは理解されよう。特に、本明細書で好適、典型的、または好ましいと強調された実施形態は、互いに組み合わせることができる（それらが相互排他的である場合を除く）。
【実施例】
【０１５９】
実施例１−がんのマウスモデルにおける細菌接種物の効力
要旨
この試験では、４つの腫瘍モデルにおいて本発明に係る細菌株を含む組成物の効力を試験した。
【０１６０】
材料
試験物質−細菌株＃ＭＲｘ０５１８。
【０１６１】
参照物質−抗ＣＴＬＡ−４抗体（クローン：９Ｈ１０、カタログ：ＢＥ０１３１、アイソタイプ：シリアンハムスターＩｇＧ１、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）。
【０１６２】
試験物質及び参照物質のビヒクル−細菌培地（酵母抽出物、カシトン、脂肪酸培地（ＹＣＦＡ））。マウスへ注射する各日に、抗体をＰＢＳで希釈した（参照：ＢＥ１４−５１６Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【０１６３】
処理用量−細菌：２００μＬ中に２×１０８個。抗ＣＴＬＡ−４を１０ｍｇ／ｋｇ／注射で注射した。マウスの直近の体重に従って、抗ＣＴＬＡ−４を１０ｍＬ／ｋｇ／投与の投与量で投与した（すなわち、体重２０ｇのマウス１匹に対して２００μＬの試験物質が投与される）。
【０１６４】
投与経路−細菌接種物を、カニューレによる強制経口投与（経口、ＰＯ）によって投与した。カニューレは毎日汚染除去した。抗ＣＴＬＡ−４をマウスの腹腔内に注射した（腹腔内、ＩＰ）。
【０１６５】
細菌株の培養条件−細菌株の培養条件は以下の通りであった。
・（調製済の１０ｍＬ  Ｅ＆Ｏ  ｌａｂラボボトルより）１０ｍＬのＹＣＦＡをピペットで取り、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに入れる
・チューブを密封し、シリンジによる投入でＣＯ２を流して、系を排気する
・Ｈｕｎｇａｔｅチューブをオートクレーブする
・冷却後、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに１ｍＬのグリセロールストックを接種する
・３７℃のインキュベータ内でチューブを約１６時間静置する。
・翌日、この継代培養物１ｍＬを取り、１０ｍＬのＹＣＦＡに接種する（再度予熱してフラッシュしたＨｕｎｇａｔｅチューブ、すべて二連）
・３７℃のインキュベータ内でチューブを５〜６時間静置する
【０１６６】
がん細胞株及び培養条件
使用した細胞株を以下の表に詳述する。
【０１６７】
【表１】
2021518414.tif 000003
【０１６８】
ＥＭＴ−６細胞株は、乳腺過形成胞状結節の移植後、ＢＡＬＢ／ｃＣＲＧＬマウスに生じた可移植性マウス乳癌から確立された［７６］。
【０１６９】
ＬＬ／２（ＬＬＣ１）細胞株は、原発性Ｌｅｗｉｓ肺癌の移植により生じた腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの肺から確立された［７７］。
【０１７０】
Ｈｅｐａ  １−６細胞株は、Ｃ５７／Ｌマウスに生じたＢＷ７７５６マウス肝癌の派生株である［７８］。
【０１７１】
細胞培養条件−細胞株はすべて湿潤雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）中、３７℃で単層として増殖させた。培地及び添加物を以下の表に示す。
【０１７２】
【表２】
2021518414.tif 000004
【０１７３】
実験で使用するために、接着した腫瘍細胞を、カルシウムまたはマグネシウム非含有Ｈａｎｋｓ培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中でトリプシン−バーゼン（参照：ＢＥ１７−１６１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）で５分間処理することにより培養フラスコから剥離させ、完全培地を添加することにより中和させた。細胞をヘモサイトメーターで計数し、その生存率は０．２５％トリパンブルー排除アッセイによって評価することになる。
【０１７４】
動物の使用
体重及び週齢を一致させた健康な雌ＢＡＬＢ／Ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスを、ＥＭＴ６モデル及びＲＥＮＣＡモデルの実験のために、ＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲから入手した。
【０１７５】
体重及び週齢を一致させた健康な雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬｌ６Ｊ）マウスを、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）モデル及びＨｅｐａ１−６モデルの実験のために、ＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手した。
【０１７６】
動物を、ＦＥＬＡＳＡのガイドラインに従ってＳＰＦ健康状態で維持し、フランス及び欧州の規則ならびにＮＲＣ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従う動物の収容及び実験手順を遵守した［７９、８０］。動物を、管理された環境条件下の飼育室（温度２２±２℃、湿度５５±１０％、照明時間（１２時間照明／１２時間消灯）、ＨＥＰＡフィルター濾過空気、再循環せずに１時間に１５回換気）で維持した。動物飼育室には、床敷材料、飼料及び水を備えた無菌で適切な空間、環境及び社会的エンリッチメント（群飼育）を備え、その詳細は、換気ラック中の９００ｃｍ２ケージ（参照：緑色、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）、Ｅｐｉｃｅａ床敷（ＳＡＦＥ）、１０ｋＧｙ照射飼料（Ａ０４−１０、ＳＡＦＥ）、免疫コンピテントげっ歯類用完全飼料（Ｒ／Ｍ−Ｈ  Ｅｘｔｒｕｄａｔｅ）、水ボトルからの水であった。
【０１７７】
実験計画及び処理
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスをマウスの個々の体重に従って９／８匹の群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与した。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＥＭＴ−６腫瘍細胞を移植した。２４日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
【０１７８】
処理スケジュールを以下の表に要約する。
【０１７９】
【表３】
2021518414.tif 000005
【０１８０】
動物のモニタリングを以下に記載の通りに実施した。
【０１８１】
動物におけるＥＭＴ６腫瘍の誘導−１４日目に、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中のＥＭＴ−６細胞１×１０６個をマウスの右側腹部に皮下注射することによって腫瘍を誘導した。
【０１８２】
安楽死−マウスが以下に記載される人道的エンドポイントに達した場合、または投与開始後最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０１８３】
抗腫瘍活性、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）モデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスを個々の体重に従って９／８匹の７つの群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与した。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＬＬ／２腫瘍細胞を移植した。２７日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
【０１８４】
処理スケジュールを以下の表に要約する。
【０１８５】
【表４】
2021518414.tif 000006
【０１８６】
動物のモニタリングを以下に記載の通りに実施した。
【０１８７】
動物におけるＬＬ／２（ＬＬＣ１）腫瘍の誘導−１４日目に、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中のＬＬ／２（ＬＬＣ１）細胞１×１０６個をマウスの右側腹部に皮下注射することによって腫瘍を誘導した。
【０１８８】
安楽死−マウスが以下に記載される人道的エンドポイントに達した場合、または投与開始後最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０１８９】
抗腫瘍活性、Ｈｅｐａ１−６モデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスをマウスの個々の体重に従って９匹の７つの群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与した。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＨｅｐａ１−６腫瘍細胞を移植した。１６日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
【０１９０】
処理スケジュールを以下の表に要約する。
【０１９１】
【表５】
2021518414.tif 000007
【０１９２】
動物のモニタリングを以下に記載の通りに実施した。
【０１９３】
動物における脾臓内注射によるＨｅｐａ１−６腫瘍細胞の同所性の誘導−０日目に、５０μＬのＲＰＭＩ  １６４０培地中のＨｅｐａ１−６腫瘍細胞１００万個（１×１０６個）を、脾臓内注射によってマウスに移植した。簡潔に述べると、左肋骨下側腹部に小さな切開を置き、脾臓を体外に露出させた。脾臓を滅菌ガーゼパッド上に露出させ、細胞懸濁液を２７ゲージ針により目視下で注射した。細胞の接種後、脾臓を切除した。
【０１９４】
安楽死−マウスが以下のセクションに記載される人道的エンドポイントに達した場合、または投与開始後最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０１９５】
安楽死時の腫瘍量の評価−終了時、肝臓を回収して重量を測定した。
【０１９６】
抗腫瘍活性、ＲＥＮＣＡモデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、非移植マウスを、マウスの個々の体重に従って１２匹の群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株（１００μＬ中に２×１０８個、経口）を投与した。１４日目に、すべてのマウスに、以下に記載の通りに左後方側腹部への皮下投与でＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を移植した。抗ＣＴＬＡ−４（クローン９Ｄ９、１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）及び抗ＰＤＬ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）による処理を、１７日目から開始した。
【０１９７】
処理スケジュールを以下の表に要約する。
【０１９８】
【表６】
2021518414.tif 000008
【０１９９】
動物のモニタリングを以下に記載の通りに実施した。
【０２００】
１４日目（細菌投与／前処理の２週間後）に、１００μＬのＰＢＳ中の５×１０５個の生細胞を各マウスの左後方側腹部（消毒用アルコールで滅菌済）へと、各マウスにつき１つのシリンジと針で皮下注射した。細胞移植前日に、移植部位を剃毛した。
【０２０１】
安楽死−マウスが以下のセクションに記載される人道的エンドポイントに達した場合、または投与開始後最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０２０２】
安楽死時の腫瘍量の評価−終了時、腫瘍を回収してそれらの体積を評価した。
【０２０３】
動物のモニタリング
臨床モニタリング−腫瘍の長さ及び幅をノギスで週に２〜３回測定して、腫瘍の体積をこの式によって推定した［８１］。
【０２０４】
【数１】
2021518414.tif 000009
【０２０５】
人道的エンドポイント［８２］：疼痛、苦しみまたは苦痛の徴候：疼痛の姿勢、疼痛の表情（ｐａｉｎ  ｆａｃｅ  ｍａｓｋ）、行動；通常の体重の１０％を超えるが２０００ｍｍ３を超えない腫瘍；移動または栄養摂取に干渉する腫瘍；潰瘍化した腫瘍または組織のびらん；３日連続して持続する２０％の体重減少；不良な身体状態、羸痩、悪液質、脱水症状；外部刺激に対する随意反応の持続的な欠如；速い努力呼吸、貧血、著しい出血；神経学的徴候：旋回、痙攣、麻痺；体温の持続的な低下；腹部膨満。
【０２０６】
麻酔−イソフルランガス麻酔をすべての処置、すなわち外科手術または腫瘍の接種、静脈内注射、採血に使用した。ケタミン麻酔及びキシラジン麻酔を定位外科的処置に使用した。
【０２０７】
鎮痛−カルプロフェンまたはカルプロフェン／ブプレノルフィンのマルチモーダルな鎮痛プロトコールを、外科的処置の重症度に合わせた。痛みを伴うすべての処置に非薬理学的ケアを提供した。さらに、試験に干渉しない薬理学的ケア（局所処置）を、担当獣医師の推奨により提供した。
【０２０８】
安楽死−動物の安楽死を、ガス麻酔（イソフルラン）の過量投与後、頸椎脱臼または瀉血によって実施した。
【０２０９】
結果
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
結果を図１Ａに示す。本発明の細菌株による処理によって、両方の陰性対照と比較して腫瘍体積の明らかな減少が生じた。予想されていたように、陽性対照によっても腫瘍体積の減少が生じた。
【０２１０】
ＭＲｘ０５１８が同系腫瘍モデルにおいてその治療効果をもたらすメカニズムをさらに明らかにするために、ＥＭＴ６同系腫瘍モデル試験においてエクスビボ分析を実施した。腫瘍体積は、がんの前臨床試験における主要な測定値であるが、腫瘍は多くの場合、壊死性コアとともに、活発に分裂している腫瘍細胞から構成される。ＭＲｘ０５１８による処理が、ＥＭＴ６腫瘍内に見られる壊死の程度に影響を及ぼしたかどうかを調査するために、腫瘍の腹部中央領域からのパラフィン切片をヘマトキシリン及びエオジンで染色した。マウスＥＭＴ６乳癌モデルのＭＲｘ０５１８による処理は、腫瘍内の壊死の断面積を増加させる傾向を示した（図１Ｂ、上部パネル）。ＭＲｘ０５１８による処理が腫瘍内の分裂細胞に影響を及ぼしたかどうかを調査するために、腫瘍の腹部中央領域からのパラフィン切片を、ＤＡＰＩカウンター染色に加えて、増殖タンパク質であるＫｉ６７で染色して、ＥＭＴ６腫瘍内で分裂している細胞のパーセンテージを推定した。マウスＥＭＴ６乳癌モデルのＭＲｘ０５１８による処理は、腫瘍内に見られる分裂細胞のパーセンテージを著しく減少させた（図１Ｂ、下部パネル、Ｐ＝０．０１９）。
【０２１１】
免疫細胞集団
ＭＲｘ０５１８細菌株が、免疫系を調節して抗腫瘍効果を誘導する能力を有するという仮説を検討するために、腫瘍のフローサイトメトリーによる腫瘍微小環境のさらなる調査を実施した。異なる処理群から切除した腫瘍を、小片に切断した。１小片をフローサイトメトリー分析に供した。腫瘍内に存在するＴリンパ球の相対パーセンテージを評価するために、次のマーカー：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３を使用した。
【０２１２】
表１Ｃに示す（及び図２３に示す、以下に記載するデータによってさらに裏付けられる）予備的フローサイトメトリーのデータは、腫瘍内のリンパ球の相対パーセンテージが、ＭＲｘ０５１８処理群及び抗ＣＴＬＡ−４処理群の両方で、それぞれビヒクル動物または対照動物と比較してわずかに減少したことを示す。同様に、ＣＤ４＋細胞の相対パーセンテージは、ＭＲｘ０５１８処理動物及び抗ＣＴＬＡ−４処理動物において減少したように思われるが、一方、ＣＤ８＋細胞の相対パーセンテージは、程度は異なるもの両方の群において反対の傾向となった。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の相対パーセンテージは、ＭＲｘ０５１８処理動物におけるわずかな減少と比較して、抗ＣＴＬＡ−４処理群でより低下したが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の相対パーセンテージの減少は、抗ＣＴＬＡ−４処理群のみで顕著であった。ＣＤ８＋／ＦｏｘＰ３＋比は、抗ＣＴＬＡ−４処理群において、ＭＲｘ０５１８動物よりも大幅な増大を示した。ここに示すこれらのデータは、抗ＣＴＬＡ−４抗体が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の細胞数を減少させることによって、または腫瘍組織におけるＴｒｅｇの抑制活性を減弱させることによってＴｒｅｇを標的にしているという仮説を裏付けており、一方で、ＭＲｘ０５１８に関する異なる作用メカニズムを示唆している。
【０２１３】
ＭＲｘ０５１８細菌株が、ＥＭＴ６モデルにおいて免疫系を調節して抗腫瘍効果を誘導する能力を有するかどうかを調査するために、腫瘍組織のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析を使用して、腫瘍微小環境の追加の調査を実施した。ビヒクル処理群及びＭＲｘ０５１８処理群から切除した腫瘍を回収した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＲＮＡを腫瘍組織から抽出し、続いてＤＮａｓｅ  Ｉ処理（Ｑｉａｇｅｎ）を含むＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してクリーンアップした。次いで、ＲＮＡをＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＯ  ３６０パネルを使用したＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析に用いた。既に様々な細胞集団に特有であることが示されている遺伝子を使用して、これらの集団の存在量を測定した。
【０２１４】
【表７】
2021518414.tif 000010
【０２１５】
各細胞集団のＺスコアを、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって提供される直線状細胞型スコア（ｌｉｎｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  ｓｃｏｒｅ）を使用して算出した（図２３、ヒートマップ）。
【０２１６】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータは、Ｂ細胞、ＣＤ４５、Ｔ細胞、細胞傷害性細胞及びＮＫ細胞の存在量が、ＭＲｘ０５１８処理群の腫瘍組織において、ビヒクル処理動物と比較して増加したことを示す（図２３）。ここに示すデータは、腫瘍微小環境における白血球、特にＮＫ細胞、Ｔ細胞及び細胞傷害性細胞の増加によって、ＭＲｘ０５１８が免疫刺激効果を有するという仮説を裏付ける。
【０２１７】
サイトカイン生成
別の腫瘍片を、血漿試料とともに、総タンパク質の抽出及び後続のサイトカイン分析に使用した。腫瘍微小環境におけるＩＬ−１０、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＦＮ−γのタンパク質レベルを、ＭａｇＰｉｘ技術で分析した。ＩＬ−１７Ａ及びＧＭ−ＣＳＦは検出レベルを下回ったが、他のすべてのマーカーは、適度なレベルで発現した（図１Ｄ）。ＩＦＮ−γに関して、ビヒクル群と抗ＣＴＬＡ−４群間で有意差が観察された。免疫マーカーであるＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の生成は、対照処理と比較して、ＭＲｘ０５１８処理後に減少したようであった。
【０２１８】
同じ動物の血漿中のサイトカインレベルも評価した。ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＦＮ−γのタンパク質レベルを、ＭａｇＰｉｘ技術で分析した。全体として、腫瘍誘導前または試験終了時のいずれにおいても、動物の血漿中にサイトカイン生成はほとんど検出されなかった（図１Ｅ）。ＶＥＧＦ及びＣＸＣＬ１０は相当なレベルで検出されたが、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ２は低レベルで検出された。ＩＬ−２、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１７Ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＦＮ−γは、試料中に検出されなかった。ＭＲｘ０５１８は、０日目のＩＬ−６の生成を著しく増加させた。ＭＲｘ０５１８は、ＩＬ−２３の生成も増加させたようであった。ＶＥＧＦ及びＣＸＣＬ１０は、２２日目に抗ＣＬＴＡ−４群において著しく下方制御された。免疫細胞集団について示される結果と同様に、腫瘍及び血漿におけるＭＲｘ０５１８と抗ＣＴＬＡ−４間のサイトカイン生成の相違は、ＭＲｘ０５１８及び抗ＣＴＬＡ−４のそれぞれが別個のメカニズムで機能しており、かつ相補的なメカニズムで作用する可能性があることを示唆している。
【０２１９】
回腸におけるＣＤ８α陽性細胞の局在化
１０μｍの回腸の凍結切片をクリオスタット（ＣＭ１９５０、Ｌｅｉｃａ）で切断し、ポリ−Ｌリジンスライド上に載せた。次に、この薄片を１時間空気乾燥させ、氷冷メタノールで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ｐＨ７．２のＰＢＳ中の１０％ＢＳＡでブロッキングして、その後、一次抗体（ラット抗マウスＣＤ８α抗体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに一晩インキュベートした。
【０２２０】
翌朝、スライドをＰＢＳで洗浄し、二次抗体であるヤギ抗ラット抗体−Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で室温で１時間染色した。第２の洗浄ステップの後で、スライドを４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で対比染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした。スライドを、水銀灯、適切なフィルター及び２０倍アポクロマート対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ顕微鏡を使用して観察し画像化した。ビヒクル、ＭＲｘ０５１８、及び抗ＣＴＬＡ４動物からのスライドより得られた画像の例を示す（図１Ｆ−上部パネル：ＤＡＰＩ染色、下部パネル：ＣＤ８α染色）。
【０２２１】
２０匹の動物からの観察領域を検査して、手動露出時間を使用して画像化した。動物の数及び分析した領域の数を次の表に示す。
【０２２２】
【表８】
2021518414.tif 000011
【０２２３】
画像を次のようにスコア化した。陽性細胞が３個以下の領域を０とスコア化し、細胞が３個超の領域を１とスコア化した。この分析の結果を示す（図１Ｇ）。
【０２２４】
抗ＣＤ８αで染色した回腸の凍結切片は、ＭＲｘ０５１８で処理した動物及び抗ＣＴＬＡ−４で処理した動物の陰窩領域組織に局在するＣＤ８α陽性細胞の数が、ビヒクル群と比較して多いことを示した。
【０２２５】
この観察結果は、感染性または炎症性の微小環境の場合において、免疫応答の一環として腸に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞と一致する。
【０２２６】
抗腫瘍活性、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）モデル
結果を図２に示す。本発明の細菌株による処理によって、両方の陰性対照と比較して腫瘍体積の明らかな減少が生じた。
【０２２７】
抗腫瘍活性、Ｈｅｐａ１−６モデル
結果を図３Ａに示す。未処理陰性対照群における肝臓重量が他の群より低かったことから、未処理陰性対照は予想通りではないと思われる。しかし、ビヒクルのみで処理したマウスは、抗ＣＴＬＡ４抗体によって処理したマウスより肝臓が大きく、ビヒクル陰性対照群において腫瘍量がより大きいことを反映していることから、ビヒクル陰性対照群及び陽性対照群はいずれも予想通りであるように思われる。本発明の細菌株による処理によって、ビヒクル陰性対照群におけるマウスと比較して肝臓重量（したがって、腫瘍量）の明らかな減少が生じた。
【０２２８】
抗腫瘍活性、ＲＥＮＣＡモデル
結果を図３Ｂに示す。ＭＲｘ０５１８単独投与による処理は、ビヒクル処理群と比較して、５１％の試験／対照で腫瘍体積を減少させた（１８日目）。パクリタキセル及び抗ＣＴＬＡ−４＋抗ＰＤＬ−１は、１８日目及び２２日目に、未処理群及びビヒクル群の両方と比較して腫瘍サイズを（ほぼ）完全に減少させたことを示した。
【０２２９】
これらのデータは、菌株ＭＲｘ０５１８が、免疫系の活性の低減に関連する他の疾患の処置または予防に有用であり得ることを示す。
【０２３０】
実施例２−ＰＣＲ遺伝子分析
細菌ＭＲｘ０５１８の純粋培養物を、ＰＣＲ遺伝子分析で試験した。実験には、２つのアーム、すなわち、１）ＭＲｘ０５１８をヒト結腸細胞（ＣａＣｏ２）と共培養して宿主に対する細菌の効果を調査する、及び２）ＭＲｘ０５１８をＩＬ１で刺激したＣａＣｏ２細胞上で共培養して炎症性環境における細菌の効果を模倣する、が存在した。両方のシナリオにおける効果を、遺伝子発現分析を通じて評価した。結果を以下に示す。
【０２３１】
【表９】
2021518414.tif 000012
2021518414.tif 000013
【０２３２】
これらのデータは、２つの遺伝子発現特性、すなわち、炎症誘発性の細胞遊走と関連するＣＸＣＲ１／２リガンド（ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−８）、及びＩＦＮ−γ型応答をより特異的に示し、ＩＦＮ−γ誘導性であるＩＬ−３２によっても補助されるＣＸＣＲ３リガンド（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０）を示しているように思われる。これらのデータにより、本発明の組成物は、免疫系を刺激するのに有用であることが示唆される。
【０２３３】
実施例３−安定性試験
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株を含有する本明細書に記載の組成物を、２５℃または４℃で密封容器の中で保管して、容器を相対湿度が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％である雰囲気中に置く。１か月、２か月、３か月、６か月、１年、１．５年、２年、２．５年、または３年後に、細菌株の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が、標準的なプロトコールによって決定したコロニー形成単位で測定した場合に残るものとする。
【０２３４】
実施例４−ＭＲｘ０５１８＋ＬＰＳと比較した、ＭＲｘ０５１８によって誘導される未成熟樹状細胞におけるサイトカイン生成
要旨
この試験では、細菌株ＭＲｘ０５１８単独及びリポ多糖（ＬＰＳ）との組み合わせの、未成熟樹状細胞におけるサイトカイン生成に対する効果を試験した。
【０２３５】
単球集団を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。続いて、単球細胞を未成熟樹状細胞へと分化させた。未成熟樹状細胞を２００，０００細胞／ウェルで沈着させ、ＬＰＳを最終濃度１００ｎｇ／ｍＬで任意に添加して、最終濃度１０７／ｍＬのＭＲｘ０５１８とインキュベートした。陰性対照は、細胞をＲＰＭＩ培地と単独でインキュベートすることを含み、陽性対照は、細胞を最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳとインキュベートした。次いで、細胞のサイトカイン含有量を分析した。
【０２３６】
結果
これらの実験の結果は、図４Ａ〜図４Ｄに見ることができる。ＭＲｘ０５１８単独の添加により、陰性対照と比較してサイトカインＩＬ−６及びＴＮＦ−αのレベルの相当な上昇が生じる（図４Ａ及び図４Ｃ）。ＬＰＳの添加（陽性対照）により、陰性対照と比較してＩＬ−６及びＴＮＦ−αのレベルの上昇が生じるが、ＩＬ−１βの上昇は生じない（図４Ｂ）。ＭＲｘ０５１８とＬＰＳの組み合わせにより、生成されたＩＬ−１βのレベルの相乗的上昇が生じた（図４Ｄ）。
【０２３７】
結論
ＭＲｘ０５１８は、未成熟樹状細胞におけるＩＬ−６及びＴＮＦ−αサイトカインのより高い生成を誘導する能力を有する。ＬＰＳとＭＲｘ０５１８の組み合わせは、未成熟樹状細胞においてサイトカインＩＬ−１βのレベルを上昇させることができる。これらのデータは、ＭＲｘ０５１８単独またはＬＰＳとの組み合わせは、炎症を促進させる炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αを増加させることができることを示す。
【０２３８】
実施例５−ＭＲｘ０５１８＋ＬＰＳと比較した、ＭＲｘ０５１８によって誘導されるＴＨＰ−１細胞におけるサイトカイン生成
要旨
この試験では、細菌株ＭＲｘ０５１８単独及びＬＰＳとの組み合わせの、単球及びマクロファージのモデル細胞株であるＴＨＰ−１細胞におけるサイトカイン生成に対する効果を試験した。
【０２３９】
ＴＨＦ−１細胞を、５ｎｇ／ｍＬのホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート（ＰＭＡ）で４８時間、Ｍ０培地中へと分化させた。続いて、これらの細胞を、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬでＬＰＳを添加して、または添加せずに、最終濃度１０８／ｍＬのＭＲｘ０５１８とインキュベートした。次いで、細菌を洗い流して、細胞を通常の生育条件下で２４時間インキュベートした。次に、細胞をスピンダウンし、得られた上清をサイトカイン含有量について分析した。
【０２４０】
結果
これらの実験の結果は、図５Ａ〜図５Ｃに見ることができる。ＬＰＳなしのＭＲｘ０５１８の添加により、細菌なしの対照及び細菌沈降物の対照と比較して、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αのサイトカインレベルの上昇が生じた。ＬＰＳ及びＭＲｘ０５１８の添加により、サイトカイン生成の相乗的増加が生じる。
【０２４１】
結論
ＭＲｘ０５１８は、ＴＨＰ−１細胞におけるサイトカイン生成を誘導する能力を有し、この能力は、ＬＰＳの添加とともに相乗的に上昇し得る。これらのデータは、ＭＲｘ０５１８単独またはＬＰＳとの組み合わせは、炎症を促進させる炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αを増加させることができることを示す。
【０２４２】
実施例６−サイトカイン分析
概要
本発明者らは、本発明の組成物の免疫刺激効果のさらなる分析を試みた。本発明者らは、ＭＲｘ０５１８による処理直後の単球に由来する、ＴＨＰ−１マクロファージ及び樹状細胞からの特定のサイトカインの発現を分析した。マクロファージ及び樹状細胞は、自然免疫系の重要な構成成分であり、自然免疫系と適応免疫系との間のメッセンジャーとして作用しており、腸に存在しそこで様々なサイトカインを放出して免疫応答を調節する。
【０２４３】
自然免疫応答に関与するサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０）を分析し、また、適応免疫細胞の動員及び活性化に関与するサイトカイン（ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β及びＩＬ−６）も分析した。
【０２４４】
方法
細菌株
ＭＲｘ０５１８
ＬＰＳを陽性対照として使用した
【０２４５】
結果
結果を図６〜図１３に示す。ＭＲｘ０５１８は、ＴＨＰ−１由来マクロファージ及び単球に由来する樹状細胞において、強力で特徴的な免疫刺激プロファイルを誘導する。自然免疫応答に関与するサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０）は、樹状細胞及びマクロファージの両方で、ＭＲｘ０５１８によって著しく誘導される。ＭＲｘ０５１８は、マクロファージ及び樹状細胞の両方で、極めて強力かつ有意なＩＬ−８誘導を誘導する。ＭＲＸ０５８１は、強力かつ有意なＩＬ−２３誘導及びＩＬ−６誘導を誘導する。ＭＲｘ０５１８は、ＩＬ−１βも誘導した。
【０２４６】
考察
これらのデータは、ＭＲｘ０５１８が免疫刺激特性を有し、免疫刺激のための有効な組成物であり得ることを示す。
【０２４７】
実施例７−作用メカニズム
ＭＲｘ０５１８が免疫系を刺激する作用メカニズムの特性を明らかにするために、さらなる実験を実施した。ＴＬＲ５シグナル伝達レポーターアッセイを選択し、データを図１４及び図１５に示す。ＭＲｘ０５１８上清は、ＴＬＲ５及びＮＦ−κＢの最も強力な活性化因子であった。また、上清を各種溶解酵素で処理し、トリプシンが活性の大半を抑制することが判明した。
【０２４８】
実施例８−ＣＴＬＡ−４阻害剤との治療的併用におけるＭＲｘ０５１８の補助的免疫刺激活性
要旨
この試験では、ＥＭＴ−６腫瘍細胞担持マウスにおいて、ＭＲｘ０５１８、ＣＴＬＡ−４阻害剤、及びＭＲｘ０５１８とＣＴＬＡ−４阻害剤との治療的併用の抗腫瘍活性を比較した。
【０２４９】
材料
試験物質及び参照物質−細菌株＃ＭＲｘ０５１８、抗ＣＴＬＡ４抗体（参照：ＢＥ０１３１、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ、クローン：９Ｈ１０、反応性：マウス、アイソタイプ：ハムスターＩｇＧ１、保管条件：＋４℃）。
【０２５０】
試験物質及び参照物質のビヒクル−ＭＲｘ０５１８細菌を細菌培地（酵母抽出物、カシトン、脂肪酸培地（ＹＣＦＡ））で増殖させ、−８０℃でグリセロールストックとして保管した。試験プロトコールに従って、動物に細菌を投与した。マウスへ注射する各日に、抗ＣＴＬＡ−４抗体をＰＢＳで希釈した（参照：ＢＥ１４−５１６Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【０２５１】
処理用量−細菌：２００μＬ中に２×１０８個。抗ＣＴＬＡ４抗体をマウスの直近の体重に従って、１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。
【０２５２】
投与経路−細菌組成物を、強制飼養チューブを介した２００μＬ／注射の量の強制経口投与（経口、ＰＯ）によって投与した。抗ＣＴＬＡ−４抗体を、直近の個々のマウスの体重に適合させた１０ｍＬ／ｋｇの量でマウスの腹腔内に注射（腹腔内、ＩＰ）した。
【０２５３】
がん細胞株及び培養条件−この試験で使用した細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）から得たＥＭＴ−６細胞株である。ＥＭＴ−６細胞株は、乳腺過形成胞状結節の移植後、ＢＡＬＢ／ｃＣＲＧＬマウスに生じた可移植性マウス乳癌から確立された。
【０２５４】
腫瘍細胞は、湿潤雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）中、３７℃で単層として増殖させた。培地は、１０％ウシ胎児血清（参照：３３０２、Ｌｏｎｚａ）を補充した２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ  １６４０（参照：ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）であった。ＥＭＴ−６腫瘍細胞は、プラスチックフラスコに接着する。実験で使用するために、腫瘍細胞を、カルシウムまたはマグネシウム非含有Ｈａｎｋｓ培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中でトリプシン−バーゼン（参照：ＢＥ０２−００７Ｅ、Ｌｏｎｚａ）で５分間処理することにより培養フラスコから剥離させ、完全培地を添加することにより中和させた。細胞を計数して、その生存率を０．２５％トリパンブルー排除アッセイによって評価した。
【０２５５】
動物の使用−５〜７週齢の健康な雌ＢＡＬＢ／Ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスをＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手し、ＦＥＬＡＳＡのガイドラインに従って、ＳＰＦ健康状態で維持した。フランス及び欧州の規則ならびにＮＲＣ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って、動物の収容及び実験手順を実現した。動物を、管理された環境条件下の飼育室（温度２２±２℃、湿度５５±１０％、照明時間（１２時間照明／１２時間消灯）、ＨＥＰＡフィルター濾過空気、再循環せずに１時間に１５回換気）で、ケージ当たり３〜４匹で維持した。動物飼育室には、床敷材料、飼料及び水を備えた無菌で適切な空間、環境及び社会的エンリッチメント（群飼育）を備え、その詳細は、ポリカーボネートのフィルタートップの欧州標準（Ｅｕｒｏｓｔａｎｄａｒｄ）ＩＩＩ型またはＩＶ型ケージ、コーンコブ床敷（参照：ＬＡＢ  ＣＯＢ  １２、ＳＥＲＬＡＢ，Ｆｒａｎｃｅ）、２５ｋＧｙ照射飼料（Ｓｓｎｉｆｆ（登録商標）Ｓｏｅｓｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、免疫コンピテントげっ歯類用完全飼料（Ｒ／Ｍ−Ｈ  Ｅｘｔｒｕｄａｔｅ）、０．２μｍで濾過した無菌水及び環境エンリッチメント（ＳＩＺＺＬＥ−ｄｒｉ  ｋｒａｆｔ−Ｄ２０００４  ＳＥＲＬＡＢ，Ｆｒａｎｃｅ）であった。動物をＲＦＩＤトランスポンダーによって個別に識別し、各ケージに特定の符号を表示した。動物の処理を、バッチ２及びバッチ３に対しては順化１週間後に開始し、またはバッチ１に対しては順化３週間後に開始した。
【０２５６】
実験計画及び処理
−１４日目（Ｄ−１４）に、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスをマウスの個々の体重に従って３０匹の３つの群及び１０匹の２つの群に無作為化した。マウスを処理群ごとに、−１４日目または０日目の試験開始から異なる終了時点を有する１０匹の動物の３つのバッチ（バッチ１：第１群、第２群及び第３群の１０匹の動物、バッチ２：第１群、第２群及び第３群の１０匹の動物及びバッチ３：第１群〜第５群の１０匹の動物）に分けた。
【０２５７】
終了及びＦＡＣＳ分析スケジュールのために、終了時にバッチ３を２つのコホートに分け、これらコホートを１日ずらした（２４日目／２５日目）。したがって、動物の各コホートは、処理群ごとに５匹の動物（ケージ１から４匹、ケージ２から１匹）を有した。倫理的基準に基づいて、腫瘍体積が１５００ｍｍ３より大きい場合、２４日目及び２５日目に安楽死させるべき動物の選択は、ケージではなく腫瘍体積に基づく。実験計画を図１６Ａに示し、以下に要約する。
１）バッチ１（第１群、第２群及び第３群）は、０日目に処理を開始し、１４日目に間引きした（１０匹の動物が第１〜３群を形成する）。これらは腫瘍細胞を投与されておらず、ベースライン群を構成した。
２）バッチ２（第１群、第２群及び第３群）は、−１４日目に処理を開始し、７日目に間引きした（１０匹の動物が第１〜３群を形成する）。
３）バッチ３（第１群〜第５群）は、−１４日目に処理を開始し、２４日目／２５日目に間引きした（１０匹の動物が第１〜５群を形成する）。抗ＣＴＬＡ−４の処理は、１０日目に開始した。
【０２５８】
０日目（Ｄ０）、バッチ２及びバッチ３のマウスすべて（それぞれ７日目及び２４／２５日目に終了）に、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中のＥＭＴ−６細胞１×１０６個の右側腹部への皮下注射により、ＥＭＴ−６腫瘍細胞を移植した（１４日目に屠殺するバッチ１からのマウス３０匹には、腫瘍注射を施さなかった）。マウスを次の処理スケジュール群に従って処理した（ＴＷ×２＝週２回）。
【０２５９】
【表１０】
2021518414.tif 000014
【０２６０】
動物のモニタリング
動物の生存率及び行動を毎日記録した。体重を週２回測定した。腫瘍の長さ及び幅をノギスで週２回測定して、腫瘍の体積を次の式によって推定した。
【０２６１】
【数２】
2021518414.tif 000015
【０２６２】
対照動物と比較した処理動物の腫瘍体積に対する試験物質の効果に関して、処理効力を評価した。次の抗腫瘍効力の評価基準を、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して決定した。第１群〜第５群の平均腫瘍体積を図１６Ｂに示す。試験期間を通じて、腫瘍誘導の１４日後から腫瘍増殖の退縮が生じたＭＲｘ０５１８＋抗ＣＴＬＡ−４処理群を例外として、すべての群で腫瘍増殖の進行が観察された。ＭＲｘ０５１８＋抗ＣＴＬＡ−４処理は、腫瘍誘導後２１日及び２４日目に、ビヒクル処理群と比較して有意に腫瘍増殖を減少させた。ＭＲｘ０５１８の抗ＣＴＬＡ−４との併用処理は、皮下移植されたＥＭＴ６腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、腫瘍増殖を減少させるのに最も効果的であった。これらのデータは、ＭＲｘ０５１８が免疫刺激効果を有することを示している。
【０２６３】
実施例９−がんのマウスモデルにおける細菌接種物の効力
要旨
この試験では、腫瘍モデルにおいて本発明に係る細菌株を含む組成物の効力を試験した。
【０２６４】
材料
試験物質−細菌株＃ＭＲｘ０５５４。
【０２６５】
参照物質−抗ＣＴＬＡ−４抗体（クローン：９Ｈ１０、カタログ：ＢＥ０１３１、アイソタイプ：シリアンハムスターＩｇＧ１、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）。
【０２６６】
試験物質及び参照物質のビヒクル−細菌培地（酵母抽出物、カシトン、脂肪酸培地（ＹＣＦＡ））。マウスへ注射する各日に、抗体をＰＢＳで希釈した（参照：ＢＥ１４−５１６Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【０２６７】
処理用量−細菌：２００μＬのＹＣＦＡ中に２×１０８個。抗ＣＴＬＡ−４を１０ｍｇ／ｋｇ／注射で注射した。マウスの直近の体重に従って、抗ＣＴＬＡ−４を１０ｍＬ／ｋｇ／投与の投与量で投与した（すなわち、体重２０ｇのマウス１匹に対して２００μＬの試験物質が投与される）。
【０２６８】
投与経路−細菌接種物を、カニューレによる強制経口投与（経口、ＰＯ）によって投与した。カニューレは毎日汚染除去した。抗ＣＴＬＡ−４をマウスの腹腔内に注射した（腹腔内、ＩＰ）。
【０２６９】
細菌株の培養条件−細菌株の培養条件は以下の通りであった。
・（調製済の１０ｍＬ  Ｅ＆Ｏ  ｌａｂラボボトルより）１０ｍＬのＹＣＦＡをピペットで取り、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに入れる
・チューブを密封し、シリンジによる投入でＣＯ２を流して、系を排気する
・Ｈｕｎｇａｔｅチューブをオートクレーブする
・冷却後、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに１ｍＬのグリセロールストックを接種する
・３７℃のインキュベータ内でチューブを約１６時間静置する。
・翌日、この継代培養物１ｍＬを取り、１０ｍＬのＹＣＦＡに接種する（再度予熱してフラッシュしたＨｕｎｇａｔｅチューブ、すべて二連）
・３７℃のインキュベータ内でチューブを５〜６時間静置する
【０２７０】
がん細胞株及び培養条件
使用した細胞株を以下の表に詳述する。
【０２７１】
【表１１】
2021518414.tif 000016
【０２７２】
ＥＭＴ−６細胞株は、乳腺過形成胞状結節の移植後、ＢＡＬＢ／ｃＣＲＧＬマウスに生じた可移植性マウス乳癌から確立された［８３］。
【０２７３】
細胞培養条件−細胞株はすべて湿潤雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）中、３７℃で単層として増殖させた。培地及び添加物を以下の表に示す。
【０２７４】
【表１２】
2021518414.tif 000017
【０２７５】
実験で使用するために、カルシウムまたはマグネシウムを含まないＨａｎｋｓ培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中でトリプシン−バーゼン（参照：ＢＥ１７−１６１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）による５分間の処理によって、接着した腫瘍細胞を培養フラスコから剥離させ、完全培地を添加することにより中和した。細胞をヘモサイトメーターで計数し、その生存率は０．２５％トリパンブルー排除アッセイによって評価することになる。
【０２７６】
動物の使用
体重及び週齢を一致させた健康な雌ＢＡＬＢ／Ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスを、ＥＭＴ６モデルの実験のために、ＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手した。
【０２７７】
動物を、ＦＥＬＡＳＡのガイドラインに従ってＳＰＦ健康状態で維持し、フランス及び欧州の規則ならびにＮＲＣ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従う動物の収容及び実験手順を遵守した［８４、８５］。動物を、管理された環境条件下の飼育室（温度２２±２℃、湿度５５±１０％、照明時間（１２時間照明／１２時間消灯）、ＨＥＰＡフィルター濾過空気、再循環せずに１時間に１５回換気）で維持した。動物飼育室には、床敷材料、飼料及び水を備えた無菌で適切な空間、環境及び社会的エンリッチメント（群飼育）を備え、その詳細は、換気ラック中の９００ｃｍ２ケージ（参照：緑色、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）、Ｅｐｉｃｅａ床敷（ＳＡＦＥ）、１０ｋＧｙ照射飼料（Ａ０４−１０、ＳＡＦＥ）、免疫コンピテントげっ歯類用完全飼料（Ｒ／Ｍ−Ｈ  Ｅｘｔｒｕｄａｔｅ）、水ボトルからの水であった。
【０２７８】
実験計画及び処理
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスをマウスの個々の体重に従って８〜９匹の群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与した。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＥＭＴ−６腫瘍細胞を移植した。２４日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
【０２７９】
処理スケジュールを以下の表に要約する。
【０２８０】
【表１３】
2021518414.tif 000018
【０２８１】
動物のモニタリングを以下に記載の通りに実施した。
【０２８２】
動物におけるＥＭＴ６腫瘍の誘導−１４日目に、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中のＥＭＴ−６細胞１×１０６個をマウスの右側腹部に皮下注射することによって腫瘍を誘導した。
【０２８３】
安楽死−マウスが以下に記載される人道的エンドポイントに達した場合、または投与開始後最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０２８４】
動物のモニタリング
臨床モニタリング−腫瘍の長さ及び幅をノギスで週に２回測定して、腫瘍の体積をこの式によって推定した［８６］。
【０２８５】
【数３】
2021518414.tif 000019
【０２８６】
人道的エンドポイント［８７］：疼痛、苦しみまたは苦痛の徴候：疼痛の姿勢、疼痛の表情（ｐａｉｎ  ｆａｃｅ  ｍａｓｋ）、行動；通常の体重の１０％を超えるが２０００ｍｍ３を超えない腫瘍；移動または栄養摂取に干渉する腫瘍；潰瘍化した腫瘍または組織のびらん；３日連続して持続する２０％の体重減少；不良な身体状態、羸痩、悪液質、脱水症状；外部刺激に対する随意反応の持続的な欠如；速い努力呼吸、貧血、著しい出血；神経学的徴候：旋回、痙攣、麻痺；体温の持続的な低下；腹部膨満。
【０２８７】
麻酔−イソフルランガス麻酔をすべての処置、すなわち外科手術または腫瘍の接種、静脈内注射、採血に使用した。ケタミン麻酔及びキシラジン麻酔を定位外科的処置に使用した。
【０２８８】
鎮痛−カルプロフェンまたはカルプロフェン／ブプレノルフィンのマルチモーダルな鎮痛プロトコールを、外科的処置の重症度に合わせた。痛みを伴うすべての処置に非薬理学的ケアを提供した。さらに、試験に干渉しない薬理学的ケア（局所処置）を、担当獣医師の推奨により提供した。
【０２８９】
安楽死−動物の安楽死を、ガス麻酔（イソフルラン）の過量投与後、頸椎脱臼または瀉血によって実施した。
【０２９０】
結果
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
結果を図１７に示す。本発明の細菌株による処理によって、両方の陰性対照と比較して腫瘍体積の明らかな減少が生じた。予想されていたように、陽性対照によっても腫瘍体積の減少が生じた。
【０２９１】
これらのデータは、菌株ＭＲｘ０５５４が、免疫系の活性の低減に関連する他の疾患の処置または予防に有用であり得ることを示す。
【０２９２】
実施例１０−炭水化物代謝の分析−ＭＲｘ０５５４のＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ分析
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｉｎｄｅｘ（ＡＰＩ）試験系は、細菌種における酵素活性に関してアッセイする小型化した生化学的試験を含有するストリップからなる。これらの試験は、新規菌株の特性決定に日常的に使用されている。ＭＲｘ０５５４における炭水化物代謝を調査するために、ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ試験を実施した。製造業者の説明書に従って、嫌気性ワークステーション内で、細菌を１０ｍＬのＹＣＦＡブロス中で３７℃で１６〜１８時間培養した。この培養物を、ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液番号２にほぼ等しい濃度が得られるように１０ｍＬのＡＰＩ  ＣＨＬ培地中で希釈し、１１０μｌのこの混合物を使用してＡＰＩ  ５０  ＣＨ試験ストリップのセットの各小チューブ（ｃｕｐｕｌｅ）に接種した。試験ストリップを、嫌気性ワークステーション内の加湿インキュベーションボックス中で３７℃で４８時間インキュベートした後、それぞれの小チューブの色を記録して、陰性、中間陽性、陽性、または疑わしいという値に割付けた。
【０２９３】
ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ分析を使用したところ、ＭＲｘ０５５４は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、Ｄ−サッカロース（スクロース）、Ｄ−トレハロース、ゲンチオビオース、Ｄ−タガトース、及びグルコン酸カリウムの発酵について陽性であった（図１８）。中間反応は、Ｄ−マンニトール、メチルα−Ｄ−グルコピラノシド、Ｄ−ラクトース、Ｄ−ラフィノース、アミドン（デンプン）、及びＤ−ツラノースにおいて観察された。
【０２９４】
実施例１１−ＴＬＲ９活性化
ＭＲｘ０５１８が免疫系を刺激するメカニズムをさらに明らかにするために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ヒトＴＬＲ９レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＴＬＲ９活性化に対するＭＲｘ０５１８の効果を試験した。
【０２９５】
細胞株及び細菌株の維持
１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｍｇ／ｍＬのグルコース、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬのＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）及び１００μｇ／ｍＬのゼオシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を補充したＤＭＥＭ中で、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ヒトＴＬＲ９レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、密度９０％まで増殖させた。細胞株は３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。アッセイのために、細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）で１回洗浄し、抗生物質を含まない増殖培地中に４５０，０００細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。特に明記されていない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから供給された。Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５１８を、通常通り、嫌気性キャビネット（Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｌｅｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）中、３７℃で、酵母抽出物、カシトン、脂肪酸培地（ＹＣＦＡ、Ｅ＆Ｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｏｎｎｙｂｒｉｄｇｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）中で培養した。
【０２９６】
ＴＬＲ９レポーターアッセイ
次の組成物を、ＴＬＲ９活性化を誘導する能力について試験した。
１．      ＭＲｘ０５１８の生菌画分（ＭＲｘ０５１８ＬＶ）−後期対数期の細菌培養物を５，０００×ｇで５分間室温で遠心分離して、細菌画分を作製した。ペレット化した細菌をＰＢＳで１回洗浄し、抗生物質を含まない細胞培地に適切な希釈度まで再懸濁した。
２．      ＭＲｘ０５１８上清画分（ＭＲｘ０５１８ＳＮ）−培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのフィルターを通して濾過して、水で希釈した。
３．      ＭＲｘ０５１８の加熱死画分（ＭＲｘ０５１８ＨＫ）−細菌培養物を８０℃で４０分、熱不活化させ、生菌画分について上記したように調製した。
【０２９７】
ＭＲｘ０５１８ＬＶ及びＭＲｘ０５１８ＨＫは、１００：１の感染多重度（ＭＯＩ）で使用した。ＭＲｘ０５１８ＳＮについては、１００：１のＭＯＩに相当する量を使用した。合成ＣｐＧオリゴヌクレオチドであるＯＤＮ２００６（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、５μＭの濃度でアッセイの陽性対照として使用した。ＹＣＦＡを陰性対照として使用した。生細胞数をプレーティングにより測定した。
【０２９８】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ヒトＴＬＲ９レポーター細胞を、上記の処理とともに、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で２２時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を製造業者の推奨に従って使用して、アッセイを２時間展開した。図１９に示した結果は、少なくとも３つの独立した実験の平均値である。統計学的有意性を、通常の一元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定を使用して決定した。
【０２９９】
結果は、生菌画分及び上清画分がＴＬＲ９を活性化させることができたことを示す。
【０３００】
実施例１２−Ｔ細胞分化
Ｔ細胞分化を誘導するＭＲｘ０５１８の能力について、インビトロで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号７００２５）を用いて調査した。簡潔に述べると、ウェル当たり５０μｌのｃＲＰＭＩ培地中、４００，０００／ウェルで、抗ＣＤ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３クローン）、機能的グレード、カタログ番号１６−００３７−８１）を播種した９６ウェルプレートに、ＰＢＭＣを播種した（ｃＲＰＭＩは、ＲＰＭＩ  １６４０（＋Ｌ−Ｇｌｕｔ、２１８７５−０３４）２ｍＭ最終濃度ストック２００ｍＭ、１０％のＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１００８２−１４７）、５０μｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１９８５−０２３）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ４３３３、１０ｍｇ／ｍＬ）を含む）。次いで、加熱死ＭＲｘ０５１８（８０℃で３０分間インキュベーションし、その後培養物をＰＢＳで洗浄して、適切な細胞培地に再懸濁することにより調製し、生存数をプレーティングによって確認した）を、１００μｌ／ウェル中に４，０００，０００個で各ウェルに添加した。
【０３０１】
３７℃のインキュベータに３日間入れた後、細胞を取り出し、ＰＭＡ−（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８１３９）、イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３９０９）、及びＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（ＢＤ、カタログ番号５５４７２４）を含む培地に５時間再懸濁した。ＰＭＡストックはＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬであり、これを１００ｕｇ／ｍＬにさらに希釈し（各試料でｃＲＰＭＩ中５０ｎｇ／ｍＬが必要であった）、イオノマイシンストックはＤＭＳＯ中１ｍＭであり（ｃＲＰＭＩ中１μＭを使用した）、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ濃度は４μｌ／６ｍＬで使用した。上清を０．２２μｍフィルターに通し、共培養培地で適切に希釈した。
【０３０２】
次に細胞をフローサイトメトリー染色に供した。
【０３０３】
洗浄後、これらの細胞を、ＰＢＳ中で、生死判定用色素（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃのＶｉｏｂｉｌｉｔｙ  ４０５／５２０  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｙｅ）（１μｌ／試料）とヒトＦｃブロック（カタログ番号５６４２１９）（１μｌ／試料）とともに、暗所で室温において１０分間インキュベートした。次に、ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｖｉｏ  ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１３−１３６）、ＣＤ４−ＶｉｏＢｌｕｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１４−５３４）、及びＣＤ２５−ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１３−２８３）の表面抗体（各２μｌ）を、暗所で室温において、１０分間にわたってウェルに直接加えた。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３００ｇ／５分／室温でスピンダウンした。
【０３０４】
次に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦｏｘＰ３転写因子染色緩衝液（カタログ番号００−５５２３）を使用して、細胞の固定及び透過処理を行った。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのプロトコールに従い、濃縮液１部及び希釈剤３部を使用して、透過処理／固定緩衝液を調製した。細胞を室温で１時間固定し、次に１倍の透過洗浄液で２回洗浄し、３００ｇ／５分／室温でスピンダウンした。以下の細胞内染色抗体または転写因子抗体を、透過洗浄液（１倍）中の試料に加え、４５分／暗所／室温で、または冷蔵庫で一晩（最長１８時間）おいた後、透過洗浄液（３００μｌ）を使用して抗体を２回洗浄し、ＰＢＳ（２５０μｌ）に再懸濁して、サイトメーターで取得した。
【０３０５】
【表１４】
2021518414.tif 000020
・抗ＩＦＮγ−ＰＥ  Ｖｉｏ７７０ヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１４−０２５）
・抗ＩＬ１０−ＰＥヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１２−７２８）
・抗ＩＬ１７ａ−ＡＰＣヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９９−２０２）
・抗ＲＯＲｙｔ−ＰＥヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１０３−８３７）
・抗Ｔｂｅｔ−ＡＰＣヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９８−６５５
・抗Ｆｏｘｐ３モノクローナル抗体（２３６Ａ／Ｅ７）、ＰＥ−Ｃｙ７（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カタログ番号２５−４７７７−４１
【０３０６】
図２０Ａ〜図２０Ｂに見られるように、ＭＲｘ０５１８の上清（ＳＰ  ５１８）及び加熱死ＭＲｘ０５１８（ＨＫ  ５１８）のいずれも、分化を誘導するサイトカインの不存在下（サイトカインなし）であっても、それぞれＴヘルパー細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の分化を誘導することが可能であった。
【０３０７】
実施例１３−ＭＲｘ０５１８によって誘導されたサイトカインの特性
脾細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスから単離して、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５５μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０中に、９６ウェルプレートに９００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。異なる濃度のブランク培地（ＹＣＦＡ＋）または定常期からの細菌上清で、細胞を７２時間処理した。各時点後に、無細胞上清を回収し、サイトカイン分析のために−８０℃で保管した。サイトカインを、マルチプレックスｐｒｏｃａｒｔａｐｌｅｘ  ＭＯ  Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ９／Ｔｈ１７／Ｔｈ２２／Ｔｒｅｇ  １７ｐｌｅｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。図２１Ｆに示すように、未処理脾細胞または１０％ＹＣＦＡ培地もしくは１０％ＭＲｘ０５１８細菌上清で処理した脾細胞の細胞増殖を、ＭＴＴアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して測定した。
【０３０８】
生存し増殖しているＭＲｘ０５１８細菌を、ヒト腸上皮細胞株ＣａＣｏ−２及びヒト単球／マクロファージ細胞株ＴＨＰ−１とともに、最大２時間インキュベートした。宿主反応を、直ちに（ＣａＣｏ−２）またはさらに２４時間インキュベートした後に（ＴＨＰ−１）分析した。
【０３０９】
健康なヒトの凍結ＰＢＭＣをＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫ）から購入した。細胞を解凍して、３７℃のＣＯ２インキュベータ内の完全増殖培地（１０％ＦＢＳ、５５μＭのβ−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ．グルタミン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０）中に一晩静置した。実験のために、細胞を４８ウェルプレート中に７５０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、完全増殖培地中で、１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳの存在下、または非存在下で細胞を１０％細菌上清で処理した。細胞培地を未処理ウェルに添加した。細胞を７２時間静置し、その後、無細胞上清を回収して４℃、１０，０００ｇで３分間スピンダウンした。サイトカイン分析のために、試料を−８０℃で保管した。製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の推奨に従ってＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘマルチプレックスイムノアッセイを使用して、サイトカインの定量化を実施した。簡潔に述べると、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）システム（Ｍｅｒｃｋ）をｘＰＯＮＥＮＴソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）とともに用いて、５０μｌの無細胞の共培養上清をサイトカインの定量化に使用した。５パラメータロジスティック曲線及びバックグラウンド除去を用いた、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ）を使用してデータを分析し、平均蛍光強度をｐｇ／ｍＬ値に変換した。
【０３１０】
データを、１０回の生物学的反復試験（ＰＢＭＣ）または３回の生物学的反復試験（脾細胞）の２回の技術的反復試験の平均として図２１Ａ〜図２１Ｄに示し、データはＹＣＦＡブランク培地（「ビヒクル」）またはＭＲｘ０５１８細菌／ＭＲｘ０５１８無細胞細菌上清（「ＭＲｘ０５１８」）による処理後の、（Ａ）ＰＢＭＣ、（Ｂ）脾細胞、（Ｃ）ＴＨＰ−１細胞、及び（Ｄ）Ｃａｃｏ−２細胞中のサイトカイン生成を示している。図２１Ｅは、未処理（「未処理」）、ＹＣＦＡブランク培地で処理（「１０％ＹＣＦＡ」）またはＭＲｘ０５１８無細胞細菌上清で処理（「１０％ＭＲｘ０５１８」）のいずれかの細胞からの脾細胞（Ｎ＝３）からのサイトカイン分泌に関する追加のデータを示す。
【０３１１】
図２１Ａ〜図２１Ｄに見られるように、サイトカイン生成の増加から明らかなように、ＭＲｘ０５１８細菌の上清による様々な細胞の処理により免疫刺激が生じた。
【０３１２】
実施例１４−ＮＦ−κＢ活性化
ＮＦ−κＢ誘導性分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を、ヒトＮＯＤ２遺伝子、ＴＬＲ４遺伝子、ＴＬＲ９遺伝子またはＴＬＲ５遺伝子（それぞれＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＮＯＤ２細胞、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ５細胞、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ９細胞及びＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡより）のいずれかと共発現させたＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢプロモーターの活性化を試験した。
【０３１３】
簡潔に述べると、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞は、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのｎｏｒｍｏｃｉｎ、１倍のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ選択培地を補充したＤ−グルコース４．５ｇ／ＬのＤＭＥＭ中に維持し、ＨＥＫ−ＴＬＲ５及びＨＥＫ−ＴＬＲ９については、２ｍＭのＬ−グルタミンの使用以外は同じである培地を使用した。ＨＥＫ−ＴＬＲ５及びＨＥＫ−ＴＬＲ９を、培養物中にそれぞれ３０μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンならびに両方の細胞株に対して１００μｇ／ｍｌのゼオシン培地を使用して選択した。
【０３１４】
実験のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中で解離させて増殖培地中に回収した。細胞を、ＨＥＫ−ＴＬＲ４及びＨＥＫ−ＴＬＲ５については２５，０００細胞／ウェル、ＨＥＫ−ＴＬＲ９については８０，０００細胞／ウェル、ならびにＨＥＫ−ＮＯＤ２については５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。
【０３１５】
細胞のそれらのリガンドに対する応答性を評価するために、細胞を、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＨＥＫ−ＴＬＲ４）、１ｎｇ／μｌのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来の超純粋なフラジェリン（ＨＥＫ−ＴＬＲ５）、１μＭのＯＤＮ２００６  ＣＰＧ（ＨＥＫ−ＴＬＲ９の陽性対照）または１μＭのＯＤＮ２００６  ＧＰＣ  （ＨＥＫ−ＴＬＲ９の陰性対照）、１ｎｇ／ｍｌのＬ１８−ＭＤＰで処理して、ＣＯ２インキュベータで３７℃でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で２２時間処理を進行させ、その後、ＱＵＡＮＴＩ−ｂｌｕｅ溶液を製造業者の説明書に従って使用して、細胞培養上清からの分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の検出を実施した。簡潔に述べると、２０μＬの細胞培地を回収し、２００μｌのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ検出培地と混合することによって、ＳＥＡＰの存在を分析した。３７℃で２時間（ＨＥＫ−ＴＬＲ４及びＨＥＫ−ＴＬＲ５）または４時間（ＨＥＫ−ＴＬＲ９及びＨＥＫ−ＮＯＤ２）インキュベーション後、６５５ｎｍにおける光学濃度を、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋマイクロプレート、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
【０３１６】
図２２Ａ〜図２２Ｄに見られるように（３つの独立した試験に対して平均化した技術的反復試験の結果を示している）、未処理（「未処理」）、ＹＣＦＡ＋培地で処理（「ＹＣＦＡ」）またはＭＲｘ０５１８で処理（「ＭＲｘ０５１８」）のいずれかの細胞において、ＮＦ−κＢプロモーターの活性化を測定した。次の陽性対照（１ｎｇ）を使用した。Ｌ１８−ＭＤＰ（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＮＯＤ２細胞用、図２２Ａ）、リポ多糖（ＬＰＳ）（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４用、図２２Ｂ）、ＣＰＧまたはｎｅｇＣ（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ９用、図２２Ｃ）、またはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来の組換えフラジェリン（ＦＬＡ）（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ５用、図２２Ｄ）。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で２２時間、様々な処理とともにインキュベートした。ＮＦ−κＢプロモーターの活性化を測定するため、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を細胞上清と混合し、プレートを２時間インキュベートして６５５ｎｍにおける光学濃度を測定した（Ｎ＝３）。
【０３１７】
配列
配列番号１（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子−ＡＦ０３９９００）
2021518414.tif 000021
配列番号２（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株ＭＲｘ０５１８のコンセンサス１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列）
2021518414.tif 000022
配列番号３（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株ＭＲｘ０５５４の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）
2021518414.tif 000023
【０３１８】
参考文献
［１］Ｓｐｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９（４）：２７９−９０。
［２］Ｅｃｋｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ．１０；３０８（５７２８）：１６３５−８。
［３］Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．３（１２）：１０２１−３５
［４］Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５９（１２）：２０８８−９６。
［５］Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ  １５；１２２（１）：１０７−１８。
［６］Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ  １０４（３４）：１３７８０−５。
［７］Ｓｃａｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４（１１）：３９８０−８。
［８］Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．１６（１２）：２０３４−４２。
［９］Ｍａｃｈｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｇｕｔ．６３（８）：１２７５−８３。
［１０］ＷＯ２０１３／０５０７９２
［１１］ＷＯ０３／０４６５８０
［１２］ＷＯ２０１３／００８０３９
［１３］ＷＯ２０１４／１６７３３８
［１４］Ｇｏｌｄｉｎ  ａｎｄ  Ｇｏｒｂａｃｈ（２００８）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．４６  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ９６−１００。
［１５］Ａｚａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＢＭＪ．３４７：ｆ６４７１。
［１６］Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：２２０−２２３。
［１７］Ｍａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２６：５５７−５６３。
［１８］Ｓｒｕｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８７（１）：１０−６。
［１９］Ｍａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２６：５５７−５６３。
［２０］Ｓｒｕｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８７（１）：１０−６。
［２１］Ｒｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ（２００９）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．；６０（１）：５７−６４
［２２］Ｍａｒｔｉｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．；１０（２）：４１７−２６。
［２３］Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００３；１９８（１２）：１９５１−１９５７。
［２４］Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．；２０３（１２）：２５７７−２５８７。
［２５］Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００６）
［２６］Ｇａｕｒ  ａｎｄ  Ａｇｇａｒｗａｌ（２００３）．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．；６６（８）：１４０３−８。
［２７］Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｎ（２００８）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ．；２９（１１）：１２７５−１２８８。
［２８］Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ．；６（１０）：ａ０１６２９５。
［２９］Ｂｅｔｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３５−２３８
［３０］Ｋａｗａｉ  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，１１，４６０−４６９
［３１］Ｂｌｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．；２７（３）：６３−６７
［３２］Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ（２０１８）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４１，３４−４１。
［３３］Ｌｉｍ（２０１５）Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  １４，９０７−９１５
［３４］Ｍｏｈａｎｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２１１（７）１１７４−１１８４。
［３５］Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１５  ３３（５１）
［３６］Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ，２９（１３）２４６１−２４７３。
［３７］Ｌｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０３（３）３７５−３８１
［３８］Ｋｎｕｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６），Ｓｃｉ  Ｒｅｐｓ，６（１９５７０）。
［３９］Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６（４０），５１１１−２２
［４０］Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７８（８），５２７１−５２７６
［４１］Ｃｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３３（４）４９２−５０３
［４２］Ｏｌａｆｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３３（４０）５３０２−５３０７
［４３］Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４，１９３（４）１９２０−１９３０
［４４］Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９（３），１４３３−１４４３
［４５］Ｂｅｒｔｈｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４０（１）３３−４１
［４６］Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４２，２７０９−２７１９
［４７］Ｆｒａｉｅｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２４（５）：５６３−５７１
［４８］Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１６（１４）：２４８４−９３。
［４９］Ｇｌｅｎｎ  ａｎｄ  Ｗｈａｒｔｅｎｂｙ（２０１４）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．；６（５）：５２６−５３９。
［５０］Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００４  Ａｐｒ  １；６２（１）：３４−４２。
［５１］Ｒａｓｈｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２４，１２６０−１２６３
［５２］Ｆｕｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｇ．２０１３；１８（６）：４８９−５１３。
［５３］Ｂｅｋｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．；１０２（４）：９７７−９８８。
［５４］Ｆｕｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｒｅｖ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｃｌｉｎ．；６８（２）：８４−９１。
［５５］Ｆｕｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．；８：１９６０。
［５６］Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，９−２４。
［５７］Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｄａｙ  ａｎｄ  ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ。
［５８］Ｌｅｓｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，３５９２−３５９７。
［５９］Ｍｉｔｒｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ．（２０１３）７１６８６１。
［６０］Ｋａｉｌａｓａｐａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（２）：３９−４８。
［６１］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４），Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ  Ｗａｄｅ  ａｎｄ  ＰＪ  Ｗｅｌｌｅｒ
［６２］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）
［６３］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１０）Ｒｏｎａｌｄ  Ａｔｌａｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ。
［６４］Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（１９９６）Ｊｅｎｎｉｅ  Ｃ．Ｈｕｎｔｅｒ−Ｃｅｖｅｒａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
［６５］Ｓｔｒｏｂｅｌ（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５８１：２４７−６１。
［６６］Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２。
［６７］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。
［６８］Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
［６９］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
［７０］Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
［７１］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）
［７２］Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）（２００２）Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）。
［７３］ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ  ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）
［７４］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０
［７５］Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９
［７６］Ｒｏｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７２）Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４９：７３５−４９。
［７７］Ｂｅｒｔｒａｍ  ａｎｄ  Ｊａｎｉｋ（１９８０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１１：６３−７３。
［７８］Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５１：１９−３８。
［７９］Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ  ｄｅ  ｌ’ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｅ，Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｎ°２０１０／６３  ＣＥＥ  ２２ｎｄ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１０，Ｄｅｃｒｅｔ  ｎ°２０１３−１１８  １ｓｔ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３。
［８０］Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ：Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ；２０１１
［８１］Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｈｅｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ（１９７０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ．５４：１４３−７４。
［８２］Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０２：１５５５−７７。
［５４］ＷＯ２０１７／０８５５２０
［８３］Ｒｏｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７２）Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４９：７３５−４９。
［８４］Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ  ｄｅ  ｌ’ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｅ，Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｎ°２０１０／６３  ＣＥＥ  ２２ｎｄ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１０，Ｄｅｃｒｅｔ  ｎ°２０１３−１１８  １ｓｔ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３。
［８５］Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ：Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ；２０１１
［８６］Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｈｅｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ（１９７０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ．５４：１４３−７４。
［８７］Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０２：１５５５−７７。
［８８］Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ；９（１２）：１−２０。
【図１Ａ】
2021518414.tif 000024
【図１Ｂ】
2021518414.tif 000025
【図１Ｃ−１】
2021518414.tif 000026
【図１Ｃ−２】
2021518414.tif 000027
【図１Ｄ−１】
2021518414.tif 000028
【図１Ｄ−２】
2021518414.tif 000029
【図１Ｄ−３】
2021518414.tif 000030
【図１Ｅ−１】
2021518414.tif 000031
【図１Ｅ−２】
2021518414.tif 000032
【図１Ｅ−３】
2021518414.tif 000033
【図１Ｅ−４】
2021518414.tif 000034
【図１Ｆ】
2021518414.tif 000035
【図１Ｇ】
2021518414.tif 000036
【図２】
2021518414.tif 000037
【図３Ａ】
2021518414.tif 000038
【図３Ｂ】
2021518414.tif 000039
【図４Ａ】
2021518414.tif 000040
【図４Ｂ】
2021518414.tif 000041
【図４Ｃ】
2021518414.tif 000042
【図４Ｄ】
2021518414.tif 000043
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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