(57)【要約】本明細書において、ＥＶ、例えばエキソソームに封入されたＳＴＩＮＧアゴニストを含む組成物、及び記載の組成物の生産方法が提供される。また、本明細書において、治療量のＳＴＩＮＧアゴニストを封入するＥＶ、例えばエキソソームの投与を介した免疫応答の調節方法も提供される。免疫応答は、ＩＦＮβ応答または骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化であってもよい。また、本明細書において、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入するエキソソームの投与を介した、全身性炎症を誘導しない免疫応答の調節方法も提供される。【選択図】図１
2021518386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外小胞と、インターフェロン遺伝子刺激因子タンパク質（ＳＴＩＮＧ）アゴニストとを含む、組成物。
【請求項２】
前記細胞外小胞が、エキソソーム、ナノ小胞、アポトーシス小体、微小胞、リソソーム、エンドソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、多層膜構造体、再小胞化された小胞、または押し出された細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞外小胞が、エキソソームである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、前記細胞外小胞に会合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、前記細胞外小胞内に封入される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、任意選択でリンカーによって、前記細胞外小胞の脂質二重層に連結されている、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞外小胞が、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を過剰発現する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、任意選択でリンカーによって、前記ＰＴＧＦＲＮタンパク質に連結されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞外小胞が、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を過剰発現する細胞によって産生される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞外小胞が、グリカン修飾されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞外小胞が、脱シアリル化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞外小胞が、脱グリコシル化されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞外小胞が、前記ＳＴＩＮＧアゴニストに結合するか、またはそれと酵素的に反応するタンパク質を更に含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞外小胞が、リガンド、サイトカイン、または抗体を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記リガンドが、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、及び／またはＣＤ２７Ｌを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記サイトカインが、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、及び／またはＩＬ−１５を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体が、アンタゴニスト抗体及び／またはアゴニスト抗体を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、環状ジヌクレオチドである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、非環状ジヌクレオチドである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、脂質結合タグを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、物理的及び／または化学的に修飾されている、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記修飾型ＳＴＩＮＧアゴニストが、対応する未修飾型ＳＴＩＮＧアゴニストとは異なる極性及び／または電荷を有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞外小胞に会合した前記ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約０．０１μＭ〜１００μＭである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記細胞外小胞に会合した前記ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約０．０１μＭ〜０．１μＭ、０．１μＭ〜１μＭ、１μＭ〜１０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、または５０μＭ〜１００μＭである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記細胞外小胞に会合した前記ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約１μＭ〜１０μＭである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、
【化２５】
2021518386.tif 000039
［式中、
Ｘ１は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｚは、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨ、またはＳＲ１であり、ここで、
ｉ）Ｒ１は、ＮａもしくはＮＨ４であるか、または
ｉｉ）Ｒ１は、ピバロイルオキシメチル等の、インビボでＯＨまたはＳＨをもたらす酵素不安定基であり、
Ｂｉ及びＢ２は、下記から選定される塩基であるが、
【化２６】
2021518386.tif 000040
但し、
−式（Ｉ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨではなく、
−式（ＩＩ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨであるとき、Ｂ１がアデニンではなく、かつＢ２がグアニンではなく、かつ
−式（ＩＩＩ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨであるとき、Ｂ１がアデニンではなく、Ｂ２がグアニンではなく、かつＺがＯＨではないことを条件とする］、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、
【化２７−１】
2021518386.tif 000041
【化２７−２】
2021518386.tif 000042
及びその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、前記細胞外小胞の内腔中にあり、足場部分に連結されていない、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストに会合した前記細胞外小胞が、以下の特性、すなわち、
（ｉ）樹状細胞、例えば骨髄樹状細胞を活性化する、
（ｉｉ）前記ＳＴＩＮＧアゴニスト単独（「遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト」）よりも低い程度に単球細胞を活性化する、
（ｉｉｉ）単球細胞を活性化しない、
（ｉｖ）前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較してより広い治療指数を有する、
（ｖ）前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低い全身毒性を有する、
（ｖｉ）前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低い免疫細胞殺傷性を有する、
（ｖｉｉ）前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも高い細胞選択性を有する、
（ｖｉｉｉ）前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低い用量で腫瘍防御免疫を提供する、
（ｉｘ）抗原提示細胞、例えば樹状細胞において、インビボで特異的細胞応答を誘導する、
（ｘ）局所投与後に遠位領域で免疫応答を誘導することができる、及び
（ｘｉ）前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低いレベルで投薬することができる、
のうちの１つまたは複数を示す、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストに会合した前記細胞外小胞が、哺乳動物に投与されたとき、前記哺乳動物においてＴ細胞及び／またはマクロファージを枯渇させない、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストに会合した前記細胞外小胞が、哺乳動物に投与されたとき、前記哺乳動物において、前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低い程度にＴ細胞及び／またはマクロファージを枯渇させる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
【請求項３４】
ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの生産方法であって、
ａ．ＥＶ、例えばエキソソームを得ることと、
ｂ．前記ＥＶ、例えばエキソソームを溶液中でＳＴＩＮＧアゴニストと混合することと、
ｃ．前記ＥＶ、例えばエキソソームと、前記ＳＴＩＮＧアゴニストとの前記混合物を、緩衝液を含む溶液中、好適な条件下でインキュベートすることと、
ｄ．前記ＳＴＩＮＧアゴニストを含む前記ＥＶ、例えばエキソソームを精製することと、
を含む、前記方法。
【請求項３５】
前記好適な条件が、前記ＥＶ、例えばエキソソームと、前記ＳＴＩＮＧアゴニストとを約２〜２４時間インキュベートすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記好適な条件が、前記ＥＶ、例えばエキソソームと、前記ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１５〜９０℃でインキュベートすることを含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記好適な条件が、前記ＥＶ、例えばエキソソームと、前記ＳＴＩＮＧアゴニストとを約３７℃でインキュベートすることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記混合ステップにおける前記ＳＴＩＮＧアゴニストの量が、少なくとも０．０１ｍＭ〜１００ｍＭを含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記混合ステップにおける前記ＳＴＩＮＧアゴニストの量が、少なくとも１ｍＭ〜１０ｍＭを含む、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記混合ステップにおける前記エキソソームの量が、少なくとも約１０８個〜少なくとも約１０１６個の総粒子を含む、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記混合ステップにおける前記ＥＶ、例えばエキソソームの量が、少なくとも約１０１２個の総粒子を含む、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記緩衝液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記精製ステップが、１つまたは複数の遠心分離ステップを含む、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つまたは複数の遠心分離ステップが、約１００，０００×ｇでのものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
免疫応答及び／または炎症性応答の誘導または調節を必要とする対象における前記免疫応答及び／または炎症性応答の誘導方法または調節方法であって、前記対象に薬学的有効量の請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物または請求項３２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４６】
腫瘍の処置を必要とする対象における前記腫瘍の処置方法であって、前記対象に請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物または請求項３２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
前記投与が、前記対象において前記免疫応答及び／または前記炎症性応答を誘導するか、または調節する、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与が樹状細胞を活性化する、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与が骨髄樹状細胞を活性化する、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記投与が、前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して低減された単球細胞活性化をもたらす、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与が単球細胞活性化を誘導しない、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記投与がインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生を誘導する、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記投与が、前記遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して低減された全身性炎症をもたらす、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記投与が、非実質的な量の全身性炎症をもたらす、請求項４５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記投与が、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである、請求項４５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記投与が静脈内である、請求項４５〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫応答が抗腫瘍応答である、請求項４５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、ＩＦＮ−βを誘導する及び／または樹状細胞を活性化するのに十分な量である、請求項４５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が、１つの場所の第１の腫瘍において腫瘍内投与され、前記第１の腫瘍において投与された前記組成物が、第２の場所での１つまたは複数の腫瘍の転移を予防する、請求項４５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
追加の治療剤を投与することを更に含む、請求項４５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記追加の治療剤が免疫調節剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記追加の治療剤が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ３の阻害剤である、請求項６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記投与が、前記対象において前記腫瘍の転移を予防する、請求項４５〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／６４７，４９１号、２０１８年６月４日に出願された同第６２／６８０，５０１号、２０１８年６月２２日に出願された同第６２／６８８，６００号、２０１８年１１月６日に出願された同第６２／７５６，２４７号、及び２０１９年３月２１日に出願された同第６２／８２２，０１９号の利益、及びそれらに対する優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は本明細書での参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への参照
本願とともに提出された、ＡＳＣＩＩテキストファイルとして電子的に提出された配列表（名称：４０００＿０２１００００＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：２３８，０６１バイト、及び作成日：２０１９年３月２０日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、典型的には細菌によって産生される環状ジヌクレオチドの細胞質センサーである。活性化された際に、それはＩ型インターフェロンの産生をもたらし、免疫応答を発動する。ＳＴＩＮＧのアゴニズムは、前臨床において腫瘍に対する免疫応答を生成するための有望な方策であることが示されてきた。残念ながら、ＳＴＩＮＧの広範な発現プロファイルを考慮すると、ＳＴＩＮＧアゴニストの全身送達は、全身性炎症につながる。これは与えることのできる用量を制限し、これが転じて治療有効性を制限する。全身送達の代替となる方策は、ＳＴＩＮＧアゴニストを腫瘍内に直接注射することである。腫瘍内注射はかなり有効であるが、それらは針で到達できる固形腫瘍に限定され、また組織損傷につながる。したがって、ＳＴＩＮＧアゴニストの改善された送達方法が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書において、必要のある対象に投与された際にヒト免疫系を調節することができる、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入するか、またはそれに会合したエキソソームを含む組成物が提供される。かかる組成物を用いて、ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の調節が有益な効果をもつ複数の疾患または病態を処置することができる。例えば、ヒト対象における腫瘍またはがん病変の処置。ＳＴＩＮＧアゴニストのエキソソームの内部への封入は、免疫細胞の選択的活性化を可能にするとともに、より狭い体内分布プロファイルを提供し、それによって、アゴニストを単独で投与することに関連する毒性を伴わずに全身送達を可能にする。
【０００５】
いくつかの実施形態では、該組成物は、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。
【０００６】
一実施形態では、該組成物は、細胞外小胞及びＳＴＩＮＧアゴニストを含み、細胞外小胞は、エキソソーム、ナノ小胞、アポトーシス小体、微小胞、リソソーム、エンドソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、多層膜構造体、再小胞化された小胞、または押し出された細胞である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、タンパク質ＰＴＧＦＲＮを過剰発現する。一実施形態では、エキソソームは、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現する細胞によって産生される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、ＩｇＶドメイン含有タンパク質を過剰発現する。一実施形態では、エキソソームは、ＩｇＶドメイン含有タンパク質を過剰発現する細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、ＩｇＶ含有タンパク質は、ベイシジン、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、またはＩＧＳＦ８である。別の実施形態では、エキソソームまたはエキソソーム産生細胞は、米国特許出願６２／６５６，９５６号に詳述されるエキソソーム表面タンパク質を過剰発現するものであり、同特許は参照によりその全体が本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、グリカン修飾されている。一実施形態では、グリカン修飾は、酵素修飾または化学修飾を含む。別の実施形態では、エキソソームは、グリカン修飾型プロデューサー細胞に由来する。一実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、酵素修飾または化学修飾を含む。一実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、キフネンシンでの処理を含む。別の実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子またはシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトを含む。一実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子またはシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを含む。一実施形態では、該遺伝子は、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＡＳ）である。他の実施形態では、エキソソームは、脱シアリル化されているか、または脱グリコシル化されている。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮまたはＩｇＶドメイン含有タンパク質を過剰発現するエキソソームは、グリカン修飾型エキソソームである。一実施形態では、ＰＴＧＦＲＮまたはＩｇＶドメイン含有タンパク質を過剰発現するエキソソームは、脱シアリル化されている。一実施形態では、ＰＴＧＦＲＮまたはＩｇＶドメイン含有タンパク質を過剰発現するエキソソームは、脱グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、エキソソームまたはプロデューサー細胞は、約９５％以上、９０〜９５％、８５〜９０％、８０〜８５％、７５〜８０％、７０〜７５％、６５〜７０％、６０〜６５％、５０〜６０％、４０〜５０％、３０〜４０％、２０〜３０％、１０〜２０％、または０〜１０％脱グリコシル化されているか、または脱シアリル化されている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、リガンド、サイトカイン、または抗体を発現するエキソソームを更に含む。一実施形態では、リガンドは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ２７Ｌを含む。別の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１５を含む。一実施形態では、抗体は、アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体を含む。
【００１１】
一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、脂質結合タグを含む環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。別の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、物理的または化学的に修飾された環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含み、該修飾は、該アゴニストの極性または電荷を改変することを含む。別の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、物理的及び／または化学的に修飾された環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、修飾前のＳＴＩＮＧアゴニスト（すなわち、対応する未修飾型ＳＴＩＮＧアゴニスト）とは異なる極性及び／または電荷を有する。
【００１２】
エキソソームに会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ〜１００μＭであり得る。一実施形態では、エキソソームに会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ〜０．１μＭ、０．１μＭ〜１μＭ、１μＭ〜１０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、または５０μＭ〜１００μＭである。別の実施形態では、エキソソームに会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約１μＭ〜１０μＭである。
【００１３】
本明細書において、先行請求項のいずれかに記載の組成物と、使用説明書とを含むキットもまた提供される。
【００１４】
また、本明細書において、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームの生産方法も提供され、そのステップは、エキソソームを得ることと、エキソソームを溶液中でＳＴＩＮＧアゴニストと混合することと、エキソソームとＳＴＩＮＧアゴニストとの混合物を、緩衝液を含む溶液中でインキュベートすることと、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを精製することと、を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約２〜２４時間インキュベートすることを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約６〜１２時間インキュベートすることを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１２〜２０時間インキュベートすることを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１４〜１８時間インキュベートすることを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１６時間インキュベートすることを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１５〜９０℃でインキュベートすることを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約３７℃でインキュベートすることを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１５〜３０℃でインキュベートすることを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約３０〜５０℃でインキュベートすることを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、エキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約５０〜９０℃でインキュベートすることを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、少なくとも０．０１ｍＭ〜１００ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストを含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、少なくとも１ｍＭ〜１０ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、少なくとも約１０８個〜少なくとも約１０１６個の精製エキソソームの総粒子を含む。一実施形態では、インキュベーションステップは、少なくとも約１０１２個の精製エキソソームの総粒子を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、精製ステップは、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオンクロマトグラフィーを含む。一実施形態では、精製ステップは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、精製ステップは、脱塩、透析、接線流濾過、限外濾過、または透析濾過を含む。一実施形態では、精製ステップは、１つまたは複数の遠心分離ステップを含む。一実施形態では、精製ステップは、約１００，０００×ｇでの１つまたは複数の遠心分離ステップを含む。
【００２１】
また、本明細書において、対象における免疫応答または炎症性応答の誘導方法または調節方法も提供され、該方法は、それを必要とする対象に、薬学的有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含む組成物を投与し、それによって、該対象において免疫応答または炎症性応答を誘導するか、または調節することを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、該方法は、樹状細胞を活性化する。一実施形態では、該方法は、骨髄樹状細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、該方法は、類似したまたは同一レベルの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与と比較して低減された単球細胞活性化をもたらす。一実施形態では、該方法は、単球細胞活性化を誘導しない。
【００２３】
いくつかの実施形態では、該方法は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生を誘導する。
【００２４】
一実施形態では、該方法は、類似したまたは同一レベルの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与と比較して低減された全身性炎症をもたらす。いくつかの実施形態では、該方法は、非実質的な量の全身性炎症をもたらす。
【００２５】
いくつかの実施形態では、投与は、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである。一実施形態では、投与は、静脈内である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗腫瘍応答である。
【００２６】
また、本明細書において、対象における免疫応答または炎症性応答の誘導方法または調節方法も提供され、該方法は、それを必要とする対象に、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含む組成物を、ＩＦＮ−βを誘導するか、または樹状細胞を活性化するのに十分な量で投与し、それによって、該対象において免疫応答または炎症性応答を誘導するか、または調節することを含む。一実施形態では、該方法は、骨髄樹状細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、該方法は、類似したまたは同一レベルの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与と比較して低減された単球細胞活性化をもたらす。一実施形態では、該方法は、単球細胞活性化を誘導しない。一実施形態では、該方法は、類似したまたは同一レベルの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与と比較して低減された全身性炎症をもたらす。いくつかの実施形態では、該方法は、非実質的な量の全身性炎症をもたらす。
【００２７】
別の態様では、本明細書において、対象におけるがんの処置方法もまた提供され、該方法は、それを必要とする対象に、治療上有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含む組成物を投与し、それによって、該対象において抗腫瘍免疫応答を誘導するか、または調節することを含む。
【００２８】
一実施形態では、該方法は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生を誘導する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、投与は、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである。
【００３０】
種々の実施形態では、該方法は、追加の治療剤を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、免疫調節剤である。一実施形態では、追加の治療剤は、抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態では、治療用抗体またはその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ３の阻害剤である。
【００３１】
別の態様では、本明細書において、対象におけるがんの転移の予防方法もまた提供され、該方法は、それを必要とする対象に、治療上有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含む組成物を投与することを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、治療上有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームは、対象における１つの場所での１つまたは複数の腫瘍が対象における別の場所での１つまたは複数の腫瘍の増殖を促進することを予防することができる。
【００３３】
一実施形態では、該方法は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生を誘導する。
【００３４】
種々の実施形態では、投与は、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、該組成物は、１つの場所の第１の腫瘍において腫瘍内投与され、第１の腫瘍において投与された該組成物が、第２の場所での１つまたは複数の腫瘍の転移を予防する。
【００３６】
種々の実施形態では、該方法は、追加の治療剤を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、免疫調節剤である。一実施形態では、追加の治療剤は、抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態では、治療用抗体またはその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ３の阻害剤である。
【００３７】
本明細書において、細胞外小胞と、インターフェロン遺伝子刺激因子タンパク質（ＳＴＩＮＧ）アゴニストとを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、エキソソーム、ナノ小胞、アポトーシス小体、微小胞、リソソーム、エンドソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、多層膜構造体、再小胞化された小胞、または押し出された細胞である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、エキソソームである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、細胞外小胞に会合している。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、細胞外小胞内に封入される。ある特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択でリンカーによって、細胞外小胞の脂質二重層に連結されている。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示の細胞外小胞は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を過剰発現する。ある特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択でリンカーによって、ＰＴＧＦＲＮタンパク質に連結されている。
【００４０】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を過剰発現する細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、グリカン修飾されている。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、脱シアリル化されている。更なる実施形態では、細胞外小胞は、脱グリコシル化されている。
【００４１】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、ＳＴＩＮＧアゴニストに結合するか、またはそれと酵素的に反応するタンパク質を更に含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、リガンド、サイトカイン、または抗体を更に含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、及び／またはＣＤ２７Ｌを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、及び／またはＩＬ−１５を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、アンタゴニスト抗体及び／またはアゴニスト抗体を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチドである。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、非環状ジヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、脂質結合タグを含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、物理的及び／または化学的に修飾されている。ある特定の実施形態では、修飾型ＳＴＩＮＧアゴニストは、対応する未修飾型ＳＴＩＮＧアゴニストとは異なる極性及び／または電荷を有する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞に会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ〜１００μＭである。ある特定の実施形態では、細胞外小胞に会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ〜０．１μＭ、０．１μＭ〜１μＭ、１μＭ〜１０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、または５０μＭ〜１００μＭである。更なる実施形態では、細胞外小胞に会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約１μＭ〜１０μＭである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、
【化１】
2021518386.tif 000003
［式中、
Ｘ１は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｚは、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨ、またはＳＲ１であり、ここで、
ｉ）Ｒ１は、ＮａもしくはＮＨ４であるか、または
ｉｉ）Ｒ１は、ピバロイルオキシメチル等の、インビボでＯＨまたはＳＨをもたらす酵素不安定基であり、
Ｂｉ及びＢ２は、下記から選定される塩基であるが、
【化２】
2021518386.tif 000004
但し、
−式（Ｉ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨではなく、
−式（ＩＩ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨであるとき、Ｂ１がアデニンではなく、かつＢ２がグアニンではなく、かつ
−式（ＩＩＩ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨであるとき、Ｂ１がアデニンではなく、Ｂ２がグアニンではなく、かつＺがＯＨではないことを条件とする］、またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、
【化３−１】
2021518386.tif 000005
【化３−２】
2021518386.tif 000006
及びその薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストに会合した細胞外小胞は、以下の特性、すなわち、（ｉ）樹状細胞、例えば骨髄樹状細胞を活性化する、（ｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト単独（「遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト」）よりも低い程度に単球細胞を活性化する、（ｉｉｉ）単球細胞を活性化しない、（ｉｖ）遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較してより広い治療指数を有する、（ｖ）遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低い全身毒性を有する、（ｖｉ）遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低い免疫細胞殺傷性を有する、（ｖｉｉ）遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも高い細胞選択性を有する、（ｖｉｉｉ）遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低い用量で腫瘍防御免疫を提供する、（ｉｘ）抗原提示細胞、例えば樹状細胞において、インビボで特異的細胞応答を誘導する（ｘ）局所投与後に遠位領域で免疫応答を誘導することができる、及び（ｘｉ）遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低いレベルで投薬することができる、のうちの１つまたは複数を示す。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストに会合した細胞外小胞は、哺乳動物に投与されたとき、哺乳動物においてＴ細胞及び／またはマクロファージを枯渇させない。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストに会合した細胞外小胞は、哺乳動物に投与されたとき、哺乳動物において、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも低い程度にＴ細胞及び／またはマクロファージを枯渇させる。
【００４８】
本明細書において、（例えば、本明細書に記載される細胞外小胞を含む）組成物と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が開示される。
【００４９】
本明細書において、（例えば、本明細書に記載される細胞外小胞を含む）組成物と、使用説明書とを含むキットが開示される。
【００５０】
また、本明細書において、ＳＴＩＮＧアゴニストを含む細胞外小胞（ＥＶ）（例えばエキソソーム）の生産方法も提供され、該方法は、（ａ）ＥＶ、例えばエキソソームを得ることと、（ｂ）ＥＶ、例えばエキソソームを溶液中でＳＴＩＮＧアゴニストと混合することと、（ｃ）ＥＶ、例えばエキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとの混合物を、緩衝液を含む溶液中、好適な条件下でインキュベートすることと、（ｄ）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームを精製することと、を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、好適な条件は、ＥＶ、例えばエキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約２〜２４時間インキュベートすることを含む。ある特定の実施形態では、好適な条件は、ＥＶ、例えばエキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１５〜９０℃でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、好適な条件は、ＥＶ、例えばエキソソームと、ＳＴＩＮＧアゴニストとを約３７℃でインキュベートすることを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、混合ステップにおけるＳＴＩＮＧアゴニストの量は、少なくとも０．０１ｍＭ〜１００ｍＭを含む。ある特定の実施形態では、混合ステップにおけるＳＴＩＮＧアゴニストの量は、少なくとも１ｍＭ〜１０ｍＭを含む。更なる実施形態では、混合ステップにおけるエキソソームの量は、少なくとも約１０８個〜少なくとも約１０１６個の総粒子を含む。いくつかの実施形態では、混合ステップにおけるＥＶ、例えばエキソソームの量は、少なくとも約１０１２個の総粒子を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソームを生産するための緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームの精製は、１つまたは複数の遠心分離ステップを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遠心分離ステップは、約１００，０００×ｇでのものである。
【００５５】
本開示はまた、免疫応答及び／または炎症性応答の誘導または調節を必要とする対象における免疫応答及び／または炎症性応答の誘導方法または調節方法も提供し、該方法は、該対象に薬学的有効量の本明細書に開示される組成物または薬学的組成物を投与することを含む。
【００５６】
また、腫瘍の処置を必要とする対象における腫瘍の処置方法も提供され、該方法は、該対象に本明細書に開示される組成物または薬学的組成物を投与することを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、投与は、対象において免疫応答及び／または炎症性応答を誘導するか、または調節する。ある特定の実施形態では、投与は、樹状細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して低減された単球細胞活性化をもたらす。更なる実施形態では、投与は、単球細胞活性化を誘導しない。いくつかの実施形態では、投与は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生を誘導する。いくつかの実施形態では、投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して低減された全身性炎症をもたらす。いくつかの実施形態では、投与は、非実質的な量の全身性炎症をもたらす。
【００５８】
いくつかの実施形態では、投与は、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである。ある特定の実施形態では、投与は、静脈内である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に開示される組成物または薬学的組成物の投与によって誘導または調節され得る）免疫応答は、抗腫瘍免疫応答である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に開示される）組成物は、ＩＦＮ−βを誘導する及び／または樹状細胞を活性化するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、該組成物は、１つの場所の第１の腫瘍において腫瘍内投与され、第１の腫瘍において投与された該組成物が、第２の場所での１つまたは複数の腫瘍の転移を予防する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答及び／または炎症性応答の誘導方法もしくは調節方法、または対象における腫瘍の処置方法は、追加の治療剤を投与することを更に含む。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、免疫調節剤である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ３の阻害剤である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物または薬学的組成物の投与は、対象において腫瘍の転移を予防する。
【００６３】
実施形態
実施形態１．細胞外小胞と、インターフェロン遺伝子刺激因子タンパク質（ＳＴＩＮＧ）アゴニストとを含む、組成物。
【００６４】
実施形態２．該細胞外小胞が、エキソソーム、ナノ小胞、アポトーシス小体、微小胞、リソソーム、エンドソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、多層膜構造体、再小胞化された小胞、または押し出された細胞である、実施形態１に記載の組成物。
【００６５】
実施形態３．該細胞外小胞が、エキソソームである、実施形態２に記載の組成物。
【００６６】
実施形態４．該ＳＴＩＮＧアゴニストが、該エキソソームに会合している、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００６７】
実施形態５．該ＳＴＩＮＧアゴニストが、該エキソソームの脂質二重層に会合しているか、または該エキソソーム内に封入される、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００６８】
実施形態６．該エキソソームが、タンパク質ＰＴＧＦＲＮを過剰発現する、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００６９】
実施形態７．該エキソソームが、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現する細胞によって産生される、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００７０】
実施形態８．該エキソソームが、グリカン修飾されている、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００７１】
実施形態９．該グリカン修飾が、酵素修飾または化学修飾を含む、実施形態８に記載の組成物。
【００７２】
実施形態１０．該エキソソームが、グリカン修飾型プロデューサー細胞に由来する、実施形態１〜８のいずれかに記載の組成物。
【００７３】
該プロデューサー細胞の該グリカン修飾が、酵素修飾または化学修飾を含む、実施形態１０に記載の組成物。
【００７４】
実施形態１２．該プロデューサー細胞の該グリカン修飾が、キフネンシンでの処理を含む、実施形態１０に記載の組成物。
【００７５】
実施形態１３．該プロデューサー細胞の該グリカン修飾が、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子またはシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトを含む、実施形態１０に記載の組成物。
【００７６】
実施形態１４．該プロデューサー細胞の該グリカン修飾が、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子またはシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを含む、実施形態１３に記載の組成物。
【００７７】
実施形態１５．該遺伝子が、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＡＳ）である、実施形態１３または１４に記載の組成物。
【００７８】
実施形態１６．該エキソソームが、脱シアリル化されている、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００７９】
実施形態１７．該エキソソームが、脱グリコシル化されている、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００８０】
実施形態１８．ＰＴＧＦＲＮを過剰発現する該エキソソームが、グリカン修飾型エキソソームである、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００８１】
実施形態１９．ＰＴＧＦＲＮを過剰発現する該エキソソームが、脱シアリル化されている、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００８２】
実施形態２０．ＰＴＧＦＲＮを過剰発現する該エキソソームが、脱グリコシル化されている、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００８３】
実施形態２１．該エキソソームまたはプロデューサー細胞が、約９５％以上、９０〜９５％、８５〜９０％、８０〜８５％、７５〜８０％、７０〜７５％、６５〜７０％、６０〜６５％、５０〜６０％、４０〜５０％、３０〜４０％、２０〜３０％、１０〜２０％、または０〜１０％脱グリコシル化されているか、または脱シアリル化されている、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００８４】
実施形態２２．該エキソソームが、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストに結合するか、またはそれと酵素的に反応するタンパク質を更に含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００８５】
実施形態２３．該エキソソームが、リガンド、サイトカイン、または抗体を発現するエキソソームを更に含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００８６】
実施形態２４．該リガンドが、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ２７Ｌを含む、実施形態２３に記載の組成物。
【００８７】
実施形態２５．該サイトカインが、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１５を含む、実施形態２３に記載の組成物。
【００８８】
実施形態２６．該抗体が、アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体を含む、実施形態２３に記載の組成物。
【００８９】
実施形態２７．該ＳＴＩＮＧアゴニストが、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００９０】
実施形態２８．該ＳＴＩＮＧアゴニストが、脂質結合タグを含む環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００９１】
実施形態２９．該ＳＴＩＮＧアゴニストが、物理的または化学的に修飾された環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含み、該修飾が、該アゴニストの極性または電荷を改変することを含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００９２】
実施形態３０．該エキソソームに会合した該ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約０．０１μＭ〜１００μＭである、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００９３】
実施形態３１．該エキソソームに会合した該ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約０．０１μＭ〜０．１μＭ、０．１μＭ〜１μＭ、１μＭ〜１０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、または５０μＭ〜１００μＭである、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００９４】
実施形態３２．該エキソソームに会合した該ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約１μＭ〜１０μＭである、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００９５】
実施形態３３．先行実施形態のいずれかに記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
【００９６】
実施形態３４．ＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームの生産方法であって、
ａ．エキソソームを得ることと、
ｂ．該エキソソームを溶液中でＳＴＩＮＧアゴニストと混合することと、
ｃ．該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとの該混合物を、緩衝液を含む溶液中でインキュベートすることと、
ｄ．該ＳＴＩＮＧアゴニストを含む該エキソソームを精製することと、
を含む、該方法。
【００９７】
実施形態３５．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約２〜２４時間インキュベートすることを含む、実施形態３４に記載の方法。
【００９８】
実施形態３６．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約６〜１２時間インキュベートすることを含む、実施形態３４に記載の方法。
【００９９】
実施形態３７．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１２〜２０時間インキュベートすることを含む、実施形態３４に記載の方法。
【０１００】
実施形態３８．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１４〜１８時間インキュベートすることを含む、実施形態３４に記載の方法。
【０１０１】
実施形態３９．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１６時間インキュベートすることを含む、実施形態３４に記載の方法。
【０１０２】
実施形態４０．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１５〜９０℃でインキュベートすることを含む、実施形態３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１０３】
実施形態４１．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約３７℃でインキュベートすることを含む、実施形態３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１０４】
実施形態４２．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約１５〜３０℃でインキュベートすることを含む、実施形態３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１０５】
実施形態４３．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約３０〜５０℃でインキュベートすることを含む、実施形態３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１０６】
実施形態４４．該インキュベーションステップが、該エキソソームと、該ＳＴＩＮＧアゴニストとを約５０〜９０℃でインキュベートすることを含む、実施形態３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１０７】
実施形態４５．該インキュベーションステップが、少なくとも０．０１ｍＭ〜１００ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストを含む、実施形態３４〜４４のいずれかに記載の方法。
【０１０８】
実施形態４６．該インキュベーションステップが、少なくとも１ｍＭ〜１０ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストを含む、実施形態３４〜４４のいずれかに記載の方法。
【０１０９】
実施形態４７．該インキュベーションステップが、少なくとも約１０８個〜少なくとも約１０１６個の精製エキソソームの総粒子を含む、実施形態３４〜４６のいずれかに記載の方法。
【０１１０】
実施形態４８．該インキュベーションステップが、少なくとも約１０１２個の精製エキソソームの総粒子を含む、実施形態３４〜４６のいずれかに記載の方法。
【０１１１】
実施形態４９．該緩衝液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む、実施形態３４〜４７のいずれかに記載の方法。
【０１１２】
実施形態５０．該精製ステップが、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオンクロマトグラフィーを含む、実施形態３４〜４９のいずれかに記載の方法。
【０１１３】
実施形態５１．該精製ステップが、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、実施形態３４〜５０のいずれかに記載の方法。
【０１１４】
実施形態５２．該精製ステップが、脱塩、透析、接線流濾過、限外濾過、または透析濾過を含む、実施形態３４〜５１のいずれかに記載の方法。
【０１１５】
実施形態５３．該精製ステップが、１つまたは複数の遠心分離ステップを含む、実施形態３４〜４９のいずれかに記載の方法。
【０１１６】
実施形態５４．該精製ステップが、約１００，０００×ｇでの１つまたは複数の遠心分離ステップを含む、実施形態５３に記載の方法。
【０１１７】
実施形態５５．対象における免疫応答または炎症性応答の誘導方法または調節方法であって、それを必要とする該対象に、薬学的有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含む組成物を投与し、それによって、該対象において該免疫応答または炎症性応答を誘導するか、または調節することを含む、該方法。
【０１１８】
実施形態５６．該方法が、樹状細胞を活性化する、実施形態５５に記載の方法。
【０１１９】
実施形態５７．該方法が、骨髄樹状細胞を活性化する、実施形態５５〜５６のいずれかに記載の方法。
【０１２０】
実施形態５８．該方法が、類似したまたは同一レベルの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与と比較して低減された単球細胞活性化をもたらす、実施形態５５〜５７のいずれかに記載の方法。
【０１２１】
実施形態５９．該方法が、単球細胞活性化を誘導しない、実施形態５５〜５８のいずれかに記載の方法。
【０１２２】
実施形態６０．該方法が、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生を誘導する、実施形態５５〜５９のいずれかに記載の方法。
【０１２３】
実施形態６１．該方法が、類似したまたは同一レベルの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与と比較して低減された全身性炎症をもたらす、実施形態５５〜６０のいずれかに記載の方法。
【０１２４】
実施形態６２．該方法が、非実質的な量の全身性炎症をもたらす、実施形態５５〜６０のいずれかに記載の方法。
【０１２５】
実施形態６３．該投与が、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである、実施形態５５〜６２のいずれかに記載の方法。
【０１２６】
実施形態６４．該投与が静脈内である、実施形態５５〜６３のいずれかに記載の方法。
【０１２７】
実施形態６５．該免疫応答が抗腫瘍応答である、実施形態５５〜６４のいずれかに記載の方法。
【０１２８】
実施形態６６．対象における免疫応答または炎症性応答の誘導方法または調節方法であって、それを必要とする該対象に、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含む組成物を、ＩＦＮ−βを誘導するか、または樹状細胞を活性化するのに十分な量で投与し、それによって、該対象において該免疫応答または炎症性応答を誘導するか、または調節することを含む、該方法。
【０１２９】
実施形態６７．該方法が、骨髄樹状細胞を活性化する、実施形態６６に記載の方法。
【０１３０】
実施形態６８．該方法が、類似したまたは同一レベルの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与と比較して低減された単球細胞活性化をもたらす、実施形態６６〜６７のいずれかに記載の方法。
【０１３１】
実施形態６９．該方法が、単球細胞活性化を誘導しない、実施形態６６〜６７のいずれかに記載の方法。
【０１３２】
実施形態７０．該方法が、類似したまたは同一レベルの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与と比較して低減された全身性炎症をもたらす、実施形態６６〜６９のいずれかに記載の方法。
【０１３３】
実施形態７１．該方法が、顕著な全身性炎症を誘導しない、実施形態６６〜６９のいずれかに記載の方法。
【０１３４】
実施形態７２．該投与が、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである、実施形態６６〜７１のいずれかに記載の方法。
【０１３５】
実施形態７３．該投与が静脈内である、実施形態６６〜７１のいずれかに記載の方法。
【０１３６】
実施形態７４．該免疫応答が抗腫瘍応答である、実施形態６６〜７３のいずれかに記載の方法。
【０１３７】
実施形態７５．対象におけるがんの処置方法であって、それを必要とする該対象に、治療上有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含む組成物を投与し、それによって、該対象において抗腫瘍免疫応答を誘導するか、または調節することを含む、該方法。
【０１３８】
実施形態７６．該方法が、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生を誘導する、実施形態７５に記載の方法。
【０１３９】
実施形態７７．該投与が、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである、実施形態７５または７６に記載の方法。
【０１４０】
実施形態７８．追加の治療剤を投与することを更に含む、実施形態７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【０１４１】
実施形態７９．該追加の治療剤が免疫調節剤である、実施形態７５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【０１４２】
実施形態８０．該追加の治療剤が、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態７９に記載の方法。
【０１４３】
実施形態８１．該治療用抗体またはその抗原結合断片が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ３の阻害剤である、実施形態８０のいずれか１項に記載の方法。
【０１４４】
実施形態８２．対象におけるがんの転移の予防方法であって、それを必要とする該対象に、治療上有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含む組成物を投与することを含む、該方法。
【０１４５】
実施形態８３．該治療上有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含む該エキソソームが、該対象における１つの場所での１つまたは複数の腫瘍が該対象における別の場所での１つまたは複数の腫瘍の増殖を促進することを予防することができる、実施形態８１に記載の方法。
【０１４６】
実施形態８４．該方法が、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生を誘導する、実施形態８２または８３に記載の方法。
【０１４７】
実施形態８５．該投与が、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介するものである、実施形態８１〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【０１４８】
実施形態８６．該組成物が、１つの場所の第１の腫瘍において腫瘍内投与され、該第１の腫瘍において投与された該組成物が、第２の場所での１つまたは複数の腫瘍の転移を予防する、実施形態８１〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【０１４９】
実施形態８７．追加の治療剤を投与することを更に含む、実施形態８１〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【０１５０】
実施形態８８．該追加の治療剤が免疫調節剤である、実施形態８７に記載の方法。
【０１５１】
実施形態８９．該追加の治療剤が、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態８８に記載の方法。
【０１５２】
実施形態９０．該追加の治療剤が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ３の阻害剤である治療用抗体またはその抗原結合断片である、実施形態８９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】エキソソームにＳＴＩＮＧアゴニストを負荷する方法の図表を示す。
【図２】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮβ応答の比較を示す。
【図３】ＣＤ８６の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された細胞における単球活性化の比較を示す。
【図４】ＣＤ８６の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された細胞におけるｍＤＣ活性化の比較を示す。
【図５】Ａは、ＣＤ８６染色によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト（エキソ−ＳＴＩＮＧ）または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された試料におけるｍＤＣ活性化を示す。Ｂは、ＣＤ８６染色によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト（エキソ−ＳＴＩＮＧ）または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された試料における単球活性化を示す。
【図６】Ａ及びＢは、遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＳＴＩＮＧアゴニスト）での処置後の、異なる細胞型の集団（ｍＤＣ、ｐＤＣ、単球、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、及びＢ細胞）の活性化マーカー陽性細胞のパーセンテージを示す。
【図７】Ａは、遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＳＴＩＮＧアゴニスト）での処置後の、異なる細胞型の集団（ｍＤＣ、ｐＤＣ、単球、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、及びＢ細胞）の活性化マーカー陽性細胞のパーセンテージを示す。Ｂは、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＳＴＩＮＧエキソソーム）での処置後の、異なる細胞型の集団（ｍＤＣ、ｐＤＣ、単球、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、及びＢ細胞）の活性化マーカー陽性細胞のパーセンテージを示す。
【図８】Ａ及びＢは、遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＳＴＩＮＧエキソ）、またはＳＴＩＮＧアゴニストを封入したグリカン修飾型もしくはタンパク質過剰発現エキソソーム（脱グリコシル化［脱グリコシル］、脱シアリル化［脱シアリル］、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現［ＰＴＧＦＲＮ］、脱グリコシル化かつＰＴＧＦＲＮ過剰発現［ＰＴＧＦＲＮ脱グリコシル］、または脱シアリル化かつＰＴＧＦＲＮ過剰発現［ＰＴＧＦＲＮ脱シアリル］）での処置後の、２つのドナー由来のＰＢＭＣにおける用量依存的ＩＦＮ−β応答を示す。
【図９】図８において試験された遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストについてのＩＦＮ−β産生のＥＣ５０の比較を示す。
【図１０】Ａ及びＢは、図８Ａ及びＢにあるような遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＳＴＩＮＧエキソ）、またはＳＴＩＮＧアゴニストを封入したグリカン修飾型もしくはタンパク質過剰発現エキソソームでの処置後の、２つのドナー由来の単球における用量依存的ＣＤ８６発現応答を示す。
【図１１】図１０において試験された遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストについての単球活性化のＥＣ５０の比較を示す。
【図１２】Ａ及びＢは、図８Ａ及びＢにあるような遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＳＴＩＮＧエキソ）、またはＳＴＩＮＧアゴニストを封入したグリカン修飾型もしくはタンパク質過剰発現エキソソームでの処置後の、ｍＤＣにおける用量依存的ＣＤ８６発現応答を示す。
【図１３】図１２において試験された遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストについてのｍＤＣ活性化のＥＣ５０の比較を示す。
【図１４】エキソソーム中のＳＴＩＮＧアゴニストの濃度の定量を示す。
【図１５】Ａ及びＢは、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を有するか、または有しないキフネンシン処理（エキソ＋Ｋｉｆ）または未処理（エキソ）エキソソームでの処置後の、２つの異なるドナー試料における用量依存的ＩＦＮβ応答を示す。
【図１６】Ａ及びＢは、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を有するか、または有しないキフネンシン処理（エキソ＋Ｋｉｆ）または未処理（エキソ）エキソソームでの処置後の、２つの異なるドナー試料における、ＣＤ８６シグナルによって測定されるような単球の用量依存的活性化を示す。
【図１７】Ａ及びＢは、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を有するか、または有しないキフネンシン処理（エキソ＋Ｋｉｆ）または未処理（エキソ）エキソソームでの処置後の、２つの異なるドナー試料における、ＣＤ８６シグナルによって測定されるようなｍＤＣの用量依存的活性化を示す。
【図１８】Ａ及びＢは、異なる時間の長さ（２時間、６時間、一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）（一晩（Ｏ／Ｎ）））にわたってＳＴＩＮＧアゴニストとともにインキュベートされたエキソソーム、またはＳＴＩＮＧアゴニストなし（エキソ）のエキソソームでの処置後の、２つの異なるドナー試料における用量依存的ＩＦＮβ応答を示す。
【図１９】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、２つの異なるエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ及び３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ）で処置されたヒトＰＢＭＣにおける用量依存的ＩＦＮβ応答を示す。
【図２０Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮβ）を示す。
【図２０Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ９）を示す。
【図２０Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ１０）を示す。
【図２０Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図２１】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの流入領域リンパ節におけるサイトカイン発現プロファイル（それぞれＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）を示す。
【図２２】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの脾臓におけるサイトカイン発現プロファイル（それぞれＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）を示す。
【図２３Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮβ）を示す。
【図２３Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＴＮＦ−α）を示す。
【図２３Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＬ−６）を示す。
【図２３Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＭＣＰ−１）を示す。
【図２３Ｅ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図２４Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮβ）を示す。
【図２４Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ９）を示す。
【図２４Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ１０）を示す。
【図２４Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図２５Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの流入領域リンパ節におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮβ）を示す。
【図２５Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの流入領域リンパ節におけるサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ９）を示す。
【図２５Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの流入領域リンパ節におけるサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ１０）を示す。
【図２５Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの流入領域リンパ節におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図２６Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの脾臓におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮβ）を示す。
【図２６Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの脾臓におけるサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ９）を示す。
【図２６Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの脾臓におけるサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ１０）を示す。
【図２６Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの脾臓におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図２７Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮβ）を示す。
【図２７Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＴＮＦ−α）を示す。
【図２７Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＬ−６）を示す。
【図２７Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＭＣＰ−１）を示す。
【図２８】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、もしくは０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腹腔内注射、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイル（それぞれＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）を示す。
【図２９】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、もしくは０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腹腔内注射、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの膵臓におけるサイトカイン発現プロファイル（それぞれＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）を示す。
【図３０】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、もしくは０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腹腔内注射、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの脾臓におけるサイトカイン発現プロファイル（それぞれＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）を示す。
【図３１】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの肺におけるサイトカイン発現プロファイル（それぞれＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）を示す。
【図３２】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの脾臓におけるサイトカイン発現プロファイル（それぞれＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）を示す。
【図３３】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの膵臓におけるサイトカイン発現プロファイル（それぞれＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）を示す。
【図３４Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−β）を示す。
【図３４Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図３４Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＴＮＦ−α）を示す。
【図３４Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＬ−６）を示す。
【図３４Ｅ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＭＣＰ−１）を示す。
【図３４Ｆ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＬ−１ａ）を示す。
【図３４Ｇ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または等しい数のエキソソームの単回腹腔内注射後の、ナイーブマウスの血清におけるサイトカイン発現プロファイル（ＩＬ−２７）を示す。
【図３５】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腹腔内注射から２４時間後の、腹膜における免疫細胞活性化プロファイルを示す。
【図３６】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの単回腹腔内注射から２４時間後の、脾臓における免疫細胞活性化プロファイルを示す。
【図３７Ａ】実施例９に記載される研究（すなわち、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの有効性を比較する腫瘍内注射研究）の経過にわたる、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける腫瘍増殖曲線を示す。
【図３７Ｂ】異なる群（すなわち、ＰＢＳ）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図３７Ｃ】異なる群（すなわち、ＳＴＩＮＧアゴニスト（２０μｇ））における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図３７Ｄ】異なる群（すなわち、ＳＴＩＮＧアゴニスト（０．２μｇ））における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図３７Ｅ】異なる群（すなわち、エキソＳＴＩＮＧアゴニスト（０．２μｇ））における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図３８Ａ】図３７Ａに記載されるようにＳＴＩＮＧアゴニストで事前に処置されたＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける、２回目の腫瘍細胞接種による再攻撃後の腫瘍増殖曲線を示す。
【図３８Ｂ】異なる群における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図３８Ｃ】図３７Ａに記載される研究における動物の生存率を示す。
【図３９】実施例１０に記載される研究（Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおいて８ｎｇ、４０ｎｇ、及び２００ｎｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの有効性を比較する腫瘍内注射用量漸増研究）の経過中の腫瘍増殖曲線を示す。
【図４０】Ａ〜Ｄは、図３９に記載される異なる群（すなわち、それぞれＰＢＳ、エキソＳＴＩＮＧアゴニスト（８ｎｇ）、エキソＳＴＩＮＧアゴニスト（４０ｎｇ）、及びエキソＳＴＩＮＧアゴニスト（２００ｎｇ））における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図４１Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡのいずれかと混合された２００μｇの卵白アルブミンを注射したナイーブマウスにおける、抗原として卵白アルブミンを用いた抗原特異的Ｔ細胞誘導実験の実験計画を示す。
【図４１Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡのいずれかと混合された２００μｇの卵白アルブミンを注射したナイーブマウスにおける、抗原として卵白アルブミンを用いた抗原特異的Ｔ細胞誘導実験からの結果を示す。卵白アルブミン反応性Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。
【図４１Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡのいずれかと混合された２００μｇの卵白アルブミンを注射したナイーブマウスにおける、抗原として卵白アルブミンを用いた抗原特異的Ｔ細胞誘導実験からの結果を示す。卵白アルブミン反応性Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。
【図４１Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡのいずれかと混合された２００μｇの卵白アルブミンを注射したナイーブマウスにおける、抗原として卵白アルブミンを用いた抗原特異的Ｔ細胞誘導実験からの結果を示す。ＩＦＮ−γ産生脾細胞の数を測定した。
【図４１Ｅ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡのいずれかと混合された２００μｇの卵白アルブミンを注射したナイーブマウスにおける、抗原として卵白アルブミンを用いた抗原特異的Ｔ細胞誘導実験からの結果を示す。ＩＦＮ−γ産生脾細胞の数を測定した。
【図４２】実施例１２に記載される研究（すなわち、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのエキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡで処置されたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍担持マウスにおいて抗腫瘍効果及び免疫記憶応答誘導を比較する腫瘍内注射研究）の経過中の腫瘍増殖曲線を示す。
【図４３Ａ】異なる群（すなわち、ＰＢＳ）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図４３Ｂ】異なる群（すなわち、ＳＴＩＮＧアゴニスト（２０μｇ））における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図４３Ｃ】異なる群（すなわち、ＳＴＩＮＧアゴニスト（０．２μｇ））における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図４３Ｄ】異なる群（すなわち、エキソＳＴＩＮＧアゴニスト（０．２μｇ））における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図４３Ｅ】各群における動物の脾臓から単離された卵白アルブミン反応性記憶Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図４４Ａ】新たに調製されたＰＢＭＣにおける、天然エキソソームまたはＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームの中に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストの効力を示す。効力は、ＩＦＮβ産生によって測定される。
【図４４Ｂ】−８０℃で７日間凍結させたＰＢＭＣにおける、天然エキソソームまたはＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームの中に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストの効力を示す。効力は、ＩＦＮβ産生によって測定される。
【図４４Ｃ】新たに調製されたエキソソームと比較した、−８０℃で７日間の貯蔵後の天然エキソソームまたはＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームの中に負荷されたＳＴＩＮＧの効力の低減を示す。
【図４５】Ａ〜Ｄは、新たに調製されたエキソソームと比較した、−８０℃で７日間の貯蔵後のＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームにおける取り込み動態の保持を示す。Ａ及びＢは、２つの別々のドナー（それぞれドナー１及び２）からの新たに調製されたエキソソームについての結果を示す。Ｃ及びＤは、２つの別々のドナー（それぞれドナー５及び６）からの貯蔵後のエキソソームについての結果を示す。
【図４６Ａ】実施例１４に記載される研究（すなわち、ＰＢＳ、高用量もしくは低用量の遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、またはＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームの中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの３つの用量のうちの１つで処置されたＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける抗腫瘍効果を比較する、腫瘍内注射研究とそれに続く肺転移攻撃）の経過中の腫瘍増殖曲線を示す。
【図４６Ｂ】研究の完了後の各群における動物からの代表的な肺の画像を示す。
【図４７】図４６Ａ及び４６Ｂに示される研究における動物の肺転移の顕微鏡定量である。
【図４８】図４６Ａ及び４６Ｂに示される研究における動物の肺転移の組織学的定量である。
【図４９Ａ】実施例１５に記載されるチェックポイント遮断研究（すなわち、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームの中に負荷された３０ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの３回の投薬により処置されたＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける、全身免疫チェックポイント阻害（抗ＰＤ−１抗体での処置）と組み合わせた腫瘍内注射研究）の経過中の腫瘍増殖曲線を示す。
【図４９Ｂ】実施例１５に記載されるＴ細胞枯渇研究（すなわち、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームの中に負荷された１００ｎｇの３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの３回の投薬により処置されたＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける、Ｔ細胞枯渇（抗ＣＤ−８抗体での処置）と組み合わせた腫瘍内注射研究）の経過中の腫瘍増殖曲線を示す。
【図４９Ｃ】実施例１５に記載される研究（すなわち、高用量もしくは低用量遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、またはＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームの中に負荷された低用量ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの３回の注射により処置され、続いて腫瘍細胞特異的ＥＬＩＳＰＯＴにより腫瘍抗原に対するＴ細胞反応性を測定した、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける組み合わせた腫瘍内注射研究）からのＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図５０Ａ】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、野生型エキソソームからのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム、またはＰＴＧＦＲＮノックアウトエキソソームで処置されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮβ応答の比較を示す。
【図５０Ｂ】図５０Ａにあるエキソソームで処置されたＰＢＭＣからの最大ＩＦＮβシグナルの比較を示す。
【図５０Ｃ】ＰＢＳ、または野生型エキソソーム、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム、もしくはＰＴＧＦＲＮノックアウトエキソソームの中に負荷された２０ｎｇの３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの３回の腫瘍内注射（埋め込み後６日目、９日目、及び１２日目）後の、マウスの皮下に埋め込まれたＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍の増殖曲線を示す。
【図５１Ａ】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８標識エキソソームを注射した皮下腫瘍から単離された、異なるクラスの腫瘍浸潤リンパ球のうちの陽性集団パーセントを示す。
【図５１Ｂ】ＰＢＳ、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された２００ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（ＥｘｏＳＴＩＮＧ（商標））、２００ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを注射した皮下腫瘍から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の相対的集団を示す。
【図５１Ｃ】ＰＢＳ、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された２００ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（ＥｘｏＳＴＩＮＧ（商標））、２００ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを注射した皮下腫瘍から単離されたマクロファージの相対的集団を示す。
【図５１Ｄ】ＰＢＳ、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された２００ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（ＥｘｏＳＴＩＮＧ（商標））、２００ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを注射した皮下腫瘍から単離された樹状細胞の相対的集団を示す。
【図５２Ａ】極低用量の遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、またはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを有するか、もしくは有しない表示されるエキソソームを直接注射したマウス肉腫細胞における、ＩＦＮβ転写物の定量的画像解析結果を示す。
【図５２Ｂ】極低用量の遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、またはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを有するか、もしくは有しない表示されるエキソソームを直接注射したマウス肉腫細胞における、切断型カスパーゼ３タンパク質の定量的画像解析結果を示す。
【図５２Ｃ】極低用量の遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ負荷エキソソームを注射した後の、ＩＦＮβ転写物の径方向応答解析を示す。
【図５２Ｄ】極低用量の遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ負荷エキソソームを注射した後の、ＣＸＣＬ１０転写物の径方向応答解析を示す。
【図５３Ａ】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮβ応答の比較を示す。ＳＴＩＮＧアゴニストＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを負荷されたエキソソーム（「エキソＭＬ  ＲＲ−Ｓ２」）または２−３  ｃＧＡＭＰを負荷されたエキソソーム（「エキソ２−３  ｃＧＡＭＰ」）についての結果を示す。対応する遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、それぞれ「遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２」及び「遊離２−３  ｃＧＡＭＰ」と記述される。
【図５３Ｂ】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮβ応答の比較を示す。ＳＴＩＮＧアゴニスト３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを負荷されたエキソソーム（「エキソ３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ」）または３−３  ｃＡＩＭ（ＰＳ）２を負荷されたエキソソーム（「エキソ３−３  ｃＡＩＭ（ＰＳ）２」）についての結果を示す。「遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ」及び「遊離３−３  ｃＡＩＭ（ＰＳ）２」は、それぞれ、遊離型の対応するアゴニストを表す。３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、３−３  ｃＡＩＭ（ＰＳ）２は、それぞれ、文献（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３；５９（２２）：１０２５３−１０２６７）からの化合物５３及び１３に対応付けられる。
【図５３Ｃ】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮβ応答の比較を示す。３−３  ｃＡＩＭＰを負荷されたエキソソーム（「エキソ３−３  ｃＡＩＭＰ」）及び３−３  ｃＡＩＭＰｄＦを負荷されたエキソソーム（「エキソ３−３  ｃＡＩＭＰｄＦ」）についての結果を示す。対応する遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、それぞれ「遊離３−３  ｃＡＩＭＰ」及び「遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦ」として示される。３−３  ｃＡＩＭＰｄＦ、ｃＡＩＭＰは、それぞれ、文献（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３；５９（２２）：１０２５３−１０２６７）からの化合物５２及び５１に対応付けられる。
【図５３Ｄ】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮβ応答の比較を示す。ＳＴＩＮＧアゴニスト３−３  ｃＡＩＭＰｍＦＳＨを負荷されたエキソソーム（「エキソ３−３  ｃＡＩＭＰｍＦＳＨ」）、及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト３−３  ｃＡＩＭＰｍＦＳＨ（「遊離３−３  ｃＡＩＭＰｍＦＳＨ」）についての結果を示す。
【図５３Ｅ】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮβ応答の比較を示す。ＳＴＩＮＧアゴニストＣＰ２１４を負荷されたエキソソーム（「エキソ−ＣＰ２１４」、白いひし形）、及び遊離ＣＰ２１４  ＳＴＩＮＧアゴニスト（「ＣＰ２１４」、黒いひし形）についての結果を示す。ＣＰ２１４は、２−３  ｃＡＭＰｍＦＳＨである。
【図５３Ｆ】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮβ応答の比較を示す。ＳＴＩＮＧアゴニストＣＰ２０１を負荷されたエキソソーム（「エキソ−ＣＰ２０１」、白い正方形）、及び遊離型のＣＰ２０１  ＳＴＩＮＧアゴニスト（「ＣＰ２０１」、黒い正方形）についての結果を示す。ＣＰ２０１は、特許ＷＯ２０１７／１７５１５６からの化合物の類似体である。
【図５３Ｇ】相対発光量（ＲＬＵ）によって決定したときの、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮβ応答の比較を示す。ＳＴＩＮＧアゴニストＣＰ２０４を負荷されたエキソソーム（「エキソ−ＣＰ２０４」、白い三角形）及び遊離ＣＰ２０４  ＳＴＩＮＧアゴニスト（「ＣＰ２０４」、黒い三角形）についての結果を示す。ＣＰ２０４は、ＷＯ２０１７／１７５１４７からの化合物の類似体である。
【図５４Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（腫瘍）におけるＩＦＮβ発現プロファイルを示す。
【図５４Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（流入領域リンパ節）におけるＩＦＮβ発現プロファイルを示す。
【図５４Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（脾臓）におけるＩＦＮβ発現プロファイルを示す。
【図５５Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（腫瘍）におけるＣＸＣＬ９発現プロファイルを示す。
【図５５Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（流入領域リンパ節）におけるＣＸＣＬ９発現プロファイルを示す。
【図５５Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（脾臓）におけるＣＸＣＬ９発現プロファイルを示す。
【図５６Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（腫瘍）におけるＣＸＣＬ１０発現プロファイルを示す。
【図５６Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（流入領域リンパ節）におけるＣＸＣＬ１０発現プロファイルを示す。
【図５６Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（脾臓）におけるＣＸＣＬ１０発現プロファイルを示す。
【図５７Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（腫瘍）におけるＩＦＮ−γ発現プロファイルを示す。
【図５７Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（流入領域リンパ節）におけるＩＦＮ−γ発現プロファイルを示す。
【図５７Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの組織（脾臓）におけるＩＦＮ−γ発現プロファイルを示す。
【図５８Ａ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）における血清中サイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−β）を示す。
【図５８Ｂ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）における血清中サイトカイン発現プロファイル（ＴＮＦ−α）を示す。
【図５８Ｃ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）における血清中サイトカイン発現プロファイル（ＩＬ−６）を示す。
【図５８Ｄ】ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）またはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）における血清中サイトカイン発現プロファイル（ＭＣＰ−１）を示す。
【図５９】実施例２０に記載される研究（すなわち、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウスにおいてＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの有効性を比較する腫瘍内注射研究）の経過にわたる、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウスにおける腫瘍増殖曲線を示す。
【図６０】実施例２１に記載される研究の経過にわたる、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける腫瘍増殖曲線を示す。
【図６１Ａ】図６０及び実施例２１に示される異なる群における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。異なる群は、エキソソームを含む。
【図６１Ｂ】図６０及び実施例２１に示される異なる群における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。異なる群は、エキソＳＴＩＮＧ（０．１μｇ）を含む。
【図６１Ｃ】図６０及び実施例２１に示される異なる群における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。異なる群は、エキソＳＴＩＮＧ（０．３μｇ）を含む。
【図６１Ｄ】図６０及び実施例２１に示される異なる群における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。異なる群は、ＳＴＩＮＧアゴニスト（３０μｇ）を含む。
【図６１Ｅ】図６０及び実施例２１に示される異なる群における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。異なる群は、ＳＴＩＮＧアゴニスト（０．３μｇ）を含む。
【図６２】実施例２２に記載される研究の経過にわたる、ＣＴ２６．ＣＴ２５腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍増殖曲線を示す。
【図６３】実施例２２に記載される研究の経過にわたる、ＣＴ２６．野生型腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍増殖曲線を示す。
【図６４】実施例２３に記載される研究の経過にわたる、注射したＢ１６Ｆ１０腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。
【図６５】実施例２３に記載される研究の経過にわたる、注射しなかった対側Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。
【図６６】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における３０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、及び０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの腫瘍内注射後の、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの腫瘍における薬物動態を示す。表は、各試料の半減期を示す。
【図６７】ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの静脈内注射後の、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの血漿中薬物動態を示す。
【図６８】ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける０．１μｇ、０．３μｇ、及び０．６μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの静脈内注射後の、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの血漿中薬物動態を示す。表は、各試料の半減期を示す。
【図６９Ａ】２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における経時的なサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−β）を示す。
【図６９Ｂ】２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における経時的なサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ９）を示す。
【図６９Ｃ】２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における経時的なサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ１０）を示す。
【図６９Ｄ】２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における経時的なサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図７０Ａ】２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓における経時的なサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−β）を示す。
【図７０Ｂ】２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓における経時的なサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ９）を示す。
【図７０Ｃ】２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓における経時的なサイトカイン発現プロファイル（ＣＸＣＬ１０）を示す。
【図７０Ｄ】２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓における経時的なサイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図７１Ａ】ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、経時的な血清中サイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−β）を示す。
【図７１Ｂ】ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、経時的な血清中サイトカイン発現プロファイル（ＴＮＦ−α）を示す。
【図７１Ｃ】ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、経時的な血清中サイトカイン発現プロファイル（ＩＬ−６）を示す。
【図７１Ｄ】ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、経時的な血清中サイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図７１Ｅ】ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回静脈内注射後の、経時的な血清中サイトカイン発現プロファイル（ＭＣＰ−１）を示す。
【図７２】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからの組織（それぞれリンパ節、脾臓、及び肝臓）におけるＩＦＮβ発現プロファイルを示す。
【図７３】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからの組織（それぞれリンパ節、脾臓、及び肝臓）におけるＣＸＣＬ９発現プロファイルを示す。
【図７４】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからの組織（それぞれリンパ節、脾臓、及び肝臓）におけるＣＸＣＬ１０発現プロファイルを示す。
【図７５】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからの組織（それぞれリンパ節、脾臓、及び肝臓）におけるＩＦＮ−γ発現プロファイルを示す。
【図７６Ａ】ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清中サイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮβ）を示す。
【図７６Ｂ】ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清中サイトカイン発現プロファイル（ＴＮＦα）を示す。
【図７６Ｃ】ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清中サイトカイン発現プロファイル（ＩＬ−６）を示す。
【図７６Ｄ】ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清中サイトカイン発現プロファイル（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図７６Ｅ】ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの単回皮下注射後の、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清中サイトカイン発現プロファイル（ＭＣＰ−１）を示す。
【図７７Ａ】実施例２８に記載されるようなエキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．１μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍切片からの腫瘍における定量的ＩＦＮβ発現プロファイルを示す。
【図７７Ｂ】実施例２８に記載されるようなエキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．１μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの腫瘍内注射後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍切片からの間質領域における定量的ＩＦＮβ発現プロファイルを示す。
【図７８Ａ】実施例２８に記載されるようなエキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの腫瘍内注射後の、腫瘍切片におけるＣＤ８陽性細胞の数を示す。
【図７８Ｂ】実施例２８に記載されるようなエキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのエキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの腫瘍内注射後の、腫瘍切片におけるＦ４／８０陽性細胞の数を示す。
【図７９Ａ】実施例２９に記載される研究の経過にわたる、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける原発腫瘍増殖曲線を示す。
【図７９Ｂ】異なる群（すなわち、ＰＢＳ）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図７９Ｃ】異なる群（すなわち、エキソソーム）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図７９Ｄ】異なる群（すなわち、ＡＤＵＳ１００）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図７９Ｅ】異なる群（すなわち、エキソＣＬ６５６）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図８０Ａ】実施例２９に記載される研究の経過にわたる、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける再攻撃した腫瘍の増殖曲線を示す。
【図８０Ｂ】異なる群（すなわち、ＰＢＳ）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図８０Ｃ】異なる群（すなわち、ＡＤＵＳ１００）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【図８０Ｄ】異なる群（すなわち、エキソＣＬ６５６）における各動物についての腫瘍増殖曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５４】
本発明をより詳細に記載する前に、本発明が記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら、様々であり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
【０１５５】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意の方法及び材料が、本発明の実施または試験においても使用され得るが、代表的な例示的方法及び材料が次に記載される。
【０１５６】
本明細書に引用された全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物または特許が参照によって援用されることが具体的かつ個々に示されているかのように、参照により本明細書に援用され、刊行物が引用されるのと関連した方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用される。
【０１５７】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に切り離され得るか、またはそれと組み合わされ得る別々の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で行われ得る。
【０１５８】
Ｉ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。特許請求の範囲がいずれの任意選択的な要素をも除外するように起草され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等のような排他的な専門用語の使用のため、または否定的な制限の使用のための先行詞として役立つよう意図される。
【０１５９】
更に、本明細書で使用される場合、「及び／または」は、２つの明記される特徴または構成要素の各々が、他方の有無にかかわらず具体的に開示されていると解釈されるべきである。故に、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」等の語句において使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」等の語句において使用される「及び／または」という用語は、以下の態様の各々、すなわち、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を包含することを意図する。
【０１６０】
態様が「〜を含むこと」という言い回しとともに本明細書に記載される場合はいずれも、「〜からなること」及び／または「〜から本質的になること」という用語で記載される、その他の点では類似した態様もまた提供されることが理解される。
【０１６１】
別途定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くについての一般辞書を当業者に提供する。
【０１６２】
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）により承認される形態で表される。数値範囲は、その範囲を画定する数を含む。ある範囲の値が列挙される場合、その範囲の列挙される上限と下限との間に介在する各整数値、及びそれらの各分数もまた、かかる値の間の各部分範囲とともに具体的に開示されることを理解されたい。任意の範囲の上限及び下限は、独立して、その範囲に含まれることも、その範囲から排除されることも可能であり、いずれかの限界値を含む、いずれの限界値も含まない、または両方の限界値を含む各範囲もまた本開示内に包含される。故に、本明細書に列挙される範囲は、列挙される端点値を含めて、その範囲内の値の全てについての簡略表記であることが理解される。例えば、１〜１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解される。
【０１６３】
ある値が明示的に列挙される場合、列挙される値とおよそ同じ数量または量である値もまた本開示の範囲内にあることを理解されたい。ある組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各部分的組み合わせもまた具体的に開示され、本開示の範囲内にある。逆に、異なる要素または要素の群が個々に開示される場合、それらの組み合わせもまた開示される。本開示の任意の要素が複数の選択肢を有するものとして開示される場合、その開示において各選択肢が単独でまたは他の選択肢との任意の組み合わせで除外される例もまた、これによって開示される。本開示の１つよりも多くの要素がかかる除外を有することができ、かかる除外を有する要素の全ての組み合わせが、これによって開示される。
【０１６４】
ヌクレオチドは、広く認められている１文字の略号で言及される。別途指示されない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’の向きで左から右に記載される。ヌクレオチドは、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されているそれらの公知の１文字の記号によって言及される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
【０１６５】
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで左から右に記載される。アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されているそれらの公知の３文字の記号、または１文字の記号のいずれかによって言及される。
【０１６６】
「約」または「およそ」という用語は、本明細書で、およそ大まかに、前後、またはその領域を意味するように使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用されるとき、それは、記載の数値を上回る境界、及び下回る境界を延長させることによってその範囲を修飾する。本明細書で使用されるこの用語は、参照される量の５％以内を意味し、例えば、約５０％は、４７．５％〜５２．５％の範囲の値を包含することが理解される。
【０１６７】
本明細書で使用されるとき、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は、内部空間を取り囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）を含む。一般に、細胞外小胞は直径が２０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内で、細胞外小胞の外部表面上に発現されて、及び／または膜をまたいでのいずれかで、種々の高分子ペイロードを含むことができる。当該ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、足場部分を含む。例として、かつ限定することなく、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的操作または間接的操作による細胞由来の小胞（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理による）、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合による）を含む。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植された組織もしくは器官、原核もしくは真核細胞、及び／または培養された細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、１つまたは複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。
【０１６８】
本明細書で使用されるとき、「エキソソーム」という用語は、内部空間（すなわち、内腔）を取り囲む膜を含み、直接原形質膜出芽によるか、または後期エンドソームの原形質膜との融合により当該細胞から生成される、細胞由来の小さい（直径２０〜３００ｎｍ、より好ましくは直径４０〜２００ｎｍ）小胞を指す。エキソソームは、細胞外小胞の一種である。エキソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）または他の分子を含む。いくつかの実施形態では、エキソソームは、足場部分を含む。エキソソームは、プロデューサー細胞に由来することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。いくつかの実施形態では、本開示のエキソソームは、１つまたは複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。
【０１６９】
本明細書で使用されるとき、「ナノ小胞」という用語は、内部空間を取り囲む膜を含み、直接的操作または間接的操作により、当該ナノ小胞が当該操作なしでは当該プロデューサー細胞によって産生されないように当該細胞から生成される、細胞由来の小さい（直径２０〜２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０〜１５０ｎｍ）小胞を指す。当該プロデューサー細胞の適切な操作は、連続押出し、アルカリ溶液での処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、当該プロデューサー細胞の破壊をもたらし得る。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合によりプロデューサー細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）または他の分子を含む。いくつかの実施形態では、ナノ小胞は、足場部分を含む。ナノ小胞は、ナノ小胞が当該操作に従ってプロデューサー細胞に由来すると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。
【０１７０】
「修飾された」という用語は、本明細書に記載されるエキソソームの関連で使用されるとき、ＥＶの改変または操作により、修飾型ＥＶが天然型ＥＶとは異なるようになることを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾型ＥＶは、天然型ＥＶの膜と比較してタンパク質、脂質、小分子、炭水化物等の組成が異なる膜を含む（例えば、膜は、より高い密度もしくは数の天然ＥＶタンパク質を含む、及び／または膜は、ＥＶに天然に見出されないタンパク質を含む）。ある特定の実施形態では、膜に対するかかる修飾は、ＥＶの外表面を変化させる。ある特定の実施形態では、膜に対するかかる修飾は、ＥＶの内腔を変化させる。
【０１７１】
本明細書で使用されるとき、「足場部分」という用語は、本明細書に開示されるＳＴＩＮＧアゴニストまたは目的とする任意の他の化合物（例えば、ペイロード）を、ＥＶの内腔表面上または外表面上のいずれかでＥＶに係留するために使用することができる分子を指す。ある特定の実施形態では、足場部分は、合成分子を含む。いくつかの実施形態では、足場部分は、非ポリペプチド部分を含む。他の実施形態では、足場部分は、ＥＶに天然に存在する脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、足場部分は、エキソソームに天然に存在しない脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、足場部分は、足場Ｘである。いくつかの実施形態では、足場部分は、足場Ｙである。更なる実施形態では、足場部分は、足場Ｘ及び足場Ｙの両方を含む。
【０１７２】
本明細書で使用されるとき、「足場Ｘ」という用語は、エキソソームの表面上で最近同定されたエキソソームタンパク質を指す。例えば、米国特許第１０，１９５，２９０号を参照されたく、同特許は参照によりその全体が本明細書に援用される。足場Ｘタンパク質の非限定的な例としては、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（「ＰＴＧＦＲＮタンパク質」）、ベイシジン（「ＢＳＧタンパク質」）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２タンパク質」）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３タンパク質」）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８タンパク質」）、インテグリンベータ１（「ＩＴＧＢ１タンパク質）、インテグリンアルファ４（「ＩＴＧＡ４タンパク質」）、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２タンパク質」）、及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ２タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ３タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ４タンパク質」、「ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂタンパク質」）が挙げられる。いくつかの実施形態では、足場Ｘタンパク質は、全タンパク質またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、別の部分を、ＥＶ、例えばエキソソームの外表面上または内腔表面上で係留することが可能な最小断片）であり得る。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、ある部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト）を、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面または内腔表面に係留することができる。
【０１７３】
本明細書で使用されるとき、「足場Ｙ」という用語は、エキソソームの内腔表面内で新たに同定されたエキソソームタンパク質を指す。例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９号を参照されたく、同出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。足場Ｙタンパク質の非限定的な例としては、ミリストイル化アラニンリッチタンパク質キナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）、ミリストイル化アラニンリッチタンパク質キナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）、及び脳酸可溶性タンパク質（ｂｒａｉｎ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１（「ＢＡＳＰ１タンパク質」）が挙げられる。いくつかの実施形態では、足場Ｙタンパク質は、全タンパク質またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、ある部分を、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面上で係留することが可能な最小断片）であり得る。いくつかの実施形態では、足場Ｙは、ある部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト）を、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔に係留することができる。
【０１７４】
本明細書で使用されるとき、タンパク質（例えば、治療用タンパク質、足場Ｘ、または足場Ｙ）の「断片」という用語は、天然型配列よりも短いタンパク質、天然型タンパク質と比較して当該タンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端で欠失のある、または当該タンパク質の任意の部分に欠失のあるタンパク質の、アミノ酸配列を指す。本明細書で使用されるとき、「機能的断片」という用語は、タンパク質機能を保持するタンパク質断片を指す。したがって、いくつかの実施形態では、足場Ｘタンパク質の機能的断片は、ある部分を、ＥＶの内腔表面上及び／または外表面上で係留する能力を保持する。同様に、ある特定の実施形態では、足場Ｙタンパク質の機能的断片は、ある部分を、ＥＶの内腔表面で係留する能力を保持する。断片が機能的断片であるかどうかは、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ解析、及び、例えばＧＦＰのような自家蛍光タンパク質との断片の融合を含めた、ＥＶのタンパク質含量を決定するための当該技術分野で既知の任意の方法によって評価することができる。ある特定の実施形態では、足場Ｘタンパク質の機能的断片は、天然型足場Ｘタンパク質の能力、例えば、ある部分を係留する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保持する。いくつかの実施形態では、足場Ｙタンパク質の機能的断片は、天然型足場Ｙタンパク質の能力、例えば、別の分子を係留する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保持する。
【０１７５】
本明細書で使用されるとき、分子（例えば、機能的分子、抗原、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）の「バリアント」という用語は、当該技術分野で既知の方法によって比較した際に、別の分子とある特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、あるタンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフト、または再構成を含むことができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、足場Ｘのバリアントは、完全長の成熟ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰトランスポータータンパク質またはＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰトランスポータータンパク質の断片（例えば、機能的断片）に対して少なくとも約７０％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮのバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号１によるＰＴＧＦＲＮまたはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＢＳＧのバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号９によるＢＳＧまたはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ２のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号３４によるＩＧＳＦ２またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ３のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２０によるＩＧＳＦ３またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ８のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号１４によるＩＧＳＦ８またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＢ１のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２１によるＩＴＧＢ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＡ４のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２２によるＩＴＧＡ４またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ３Ａ２のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２３によるＳＬＣ３Ａ２またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ１のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２４によるＡＴＰ１Ａ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ２のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２５によるＡＴＰ１Ａ２またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ３のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２６によるＡＴＰ１Ａ３またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ４のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２７によるＡＴＰ１Ａ４またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ｂ３のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２８によるＡＴＰ１Ｂ３またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ１のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号２９によるＡＴＰ２Ｂ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ２のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号３０によるＡＴＰ２Ｂ２またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ３のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号３１によるＡＴＰ２Ｂ３またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ４のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号３２によるＡＴＰ２Ｂ４またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される足場Ｘタンパク質のバリアントまたはその断片のバリアントは、ＥＶに特異的に標的化される能力を保持する。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、１つまたは複数の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、足場Ｙのバリアントは、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片に対して少なくとも７０％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣＫＳのバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号４７によるＭＡＲＣＫＳまたはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号４８によるＭＡＲＣＫＳＬ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＢＡＳＰ１のバリアントまたはその断片のバリアントは、配列番号４９によるＢＡＳＰ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、足場Ｙタンパク質のバリアントまたはその断片のバリアントは、ＥＶの内腔に特異的に標的化される能力を保持する。いくつかの実施形態では、足場Ｙは、１つまたは複数の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。
【０１７８】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられている置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、これらには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。故に、ポリペプチドにおけるアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸と置き換えられる場合、その置換は保存的と見なされる。別の実施形態では、あるアミノ酸の連なりは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似した連なりと保存的に置き換えられ得る。
【０１７９】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、２つの配列の最適なアライメントを得るために導入する必要のある付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮した上で、比較ウィンドウにわたってそれらの配列によって共有される、同一のマッチした位置の数を指す。マッチした位置は、標的配列及び参照配列の両方において同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が提示される、任意の位置である。ギャップはヌクレオチドでもアミノ酸でもないため、標的配列において提示されるギャップは計数されない。同様に、参照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸が計数されるため、参照配列において提示されるギャップは計数されない。
【０１８０】
配列同一性のパーセンテージは、両方の配列において同一のアミノ酸残基または核酸塩基が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内にある位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。２つの配列間の配列の比較及び配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用及びダウンロードの両方で容易に利用可能なソフトウェアを用いて遂行されてもよい。好適なソフトウェアプログラムが、種々のソースから、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアライメントのために利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能なＢＬＡＳＴプログラム集の一部である、ｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方で、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラム集の一部であり、またｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにてＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも利用可能な、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。
【０１８１】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する、単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域が各々、それらの独自の配列同一性パーセントを有することができる。配列同一性パーセント値は、小数第１位に丸められることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り下げられる一方で、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることにも留意されたい。
【０１８２】
当業者であれば、配列同一性パーセントの算出のための配列アライメントの生成が、もっぱら一次配列データによって駆動される配列対配列のバイナリ比較に限定されないことを理解しよう。配列アライメントは、多重配列アライメントに由来することができる。多重配列アライメントを生成するための１つの好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から利用可能なＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、代替として、例えばＥＢＩから利用可能である。
【０１８３】
また、配列アライメントは、配列データを、構造的データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、変異の箇所）、または系統発生学的データ等の異種の供給源からのデータと統合することによって生成され得ることも理解されよう。多重配列アライメントを生成するために異種データを統合する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇにて利用可能、また代替として、例えばＥＢＩから利用可能な、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅである。また、配列同一性パーセントを算出するために使用される最終的アライメントは、自動的にまたは手動でのいずれかで精選され得ることも理解されよう。
【０１８４】
ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、または両方における改変を含有することができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失を生み出すが、コードされたポリペプチドの性質または活性を改変しない改変を含有する。別の実施形態では、ヌクレオチドバリアントは、遺伝コードの縮重に起因するサイレント置換によって生み出される。他の実施形態では、５〜１０個、１〜５個、または１〜２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換されるか、欠失されるか、または付加されるバリアントである。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由で、例えば、特定の宿主用にコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを他のもの、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌宿主に変化させる）ために、生み出され得る。
【０１８５】
天然型バリアントは、「アレルバリアント」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらのアレルバリアントは、ポリヌクレオチドレベル及び／またはポリペプチドレベルのいずれかで様々であり得、本開示に含まれる。代替として、非天然型バリアントは、変異誘発技法によって、または直接合成によって生み出され得る。
【０１８６】
タンパク質操作及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を用いて、バリアントを生成して、ポリペプチドの特性を改善または改変することができる。例えば、生物学的機能の実質的な喪失を伴わずに、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸を欠失させることができる。Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）（参照によりその全体が本明細書に援用される）は、アミノ末端の３個、８個、または２７個のアミノ酸残基を欠失させた後であってもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質について報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後に、最大で１０倍高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８）（参照によりその全体が本明細書に援用される））。
【０１８７】
その上、バリアントは、天然型タンパク質の生物学的活性と類似した生物学的活性を保持する場合が多いことを十分な証拠が実証している。例えば、Ｇａｙｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３）（参照によりその全体が本明細書に援用される））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの大規模な変異解析を実施した。研究者らは、ランダム変異誘発を用いて、分子の全長にわたって１つのバリアント当たり平均２．５個のアミノ酸変化をもつ３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異体を生成した。可能なアミノ酸位置の各々で複数の変異を検査した。研究者らは、「分子の［大半］が、［結合活性または生物学的活性］のいずれかに対する影響をほとんど伴わずに改変可能であった」ことを見出した（要約を参照されたい）。実際、検査した３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、２３個の固有のアミノ酸配列のみが、野生型とは活性が顕著に異なるタンパク質をもたらした。
【０１８８】
上述したように、ポリペプチドバリアントは、例えば、修飾ポリペプチドを含む。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスフォチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６：２７０−７９（２０１０）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される））、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）等のタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が含まれる。いくつかの実施形態では、足場Ｘ及び／または足場Ｙは、任意の好都合な箇所で修飾される。
【０１８９】
本明細書で使用されるとき、「プロデューサー細胞」という用語は、ＥＶの生成に使用される細胞を指す。プロデューサー細胞は、インビトロで培養された細胞、またはインビボの細胞であり得る。プロデューサー細胞には、ＥＶ、例えばエキソソームの生成に有効であることが知られる細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｓ９ｆ細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆体細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、及びＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、細菌細胞である。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ−Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、またはこれらの細胞のうちのいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、細菌細胞ではない。他の実施形態では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞ではない。
【０１９０】
本明細書で使用されるとき、「〜に会合した」という用語は、第１の部分、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストの、第２の部分、例えば、細胞外小胞への封入、または、第１の部分と第２の部分、例えば、それぞれ、ＳＴＩＮＧアゴニストと細胞外小胞、例えば、細胞外小胞の内腔表面上もしくは細胞外小胞の外部表面上の、それぞれ、細胞外小胞中もしくは細胞外小胞上で発現された足場部分とＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）との間で形成される、共有結合もしくは非共有結合を指す。一実施形態では、「〜に会合した」という用語は、共有結合性、非ペプチド結合、または非共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基上のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。共有結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、アゴスチック（ａｇｎｏｓｔｉｃ）結合、曲がった結合、双極子結合、パイ背面結合（ｂａｃｋｂｏｎｄ）、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、コンジュゲーション、ハイパーコンジュゲーション、芳香族性、ハプト数（ｈａｐｔｉｃｉｔｙ）、または反結合が挙げられるが、これらに限定されない。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオン−パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、低障壁水素結合、または対称的水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー的な力、または化学的極性が挙げられる。他の実施形態では、「〜に会合した」という用語は、第１の部分、例えば、細胞外小胞による、第２の部分、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入の状態を意味する。封入状態において、第１の部分及び第２の部分は、互いに連結され得る。他の実施形態では、封入は、第１の部分及び第２の部分が互いに物理的及び／または化学的に連結されていないことを意味する。
【０１９１】
本明細書で使用されるとき、「〜に連結される」または「〜にコンジュゲートされる」という用語は、互換的に使用され、第１の部分と第２の部分、例えば、それぞれ、ＳＴＩＮＧアゴニストと細胞外小胞、例えば、細胞外小胞の内腔表面上または細胞外小胞の外部表面上の、それぞれ、細胞外小胞中または細胞外小胞上で発現された足場部分と、ＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）との間で形成される、共有結合または非共有結合を指す。
【０１９２】
「封入される」という用語、またはこの用語の文法的に異なる形態（例えば、封入、または封入すること）は、当該２つの部分の化学的または物理的連結を伴わずに、第１の部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト）を第２の部分（例えば、ＥＶ、例えばエキソソーム）の内部に有する状態またはそのプロセスを指す。いくつかの実施形態では、「封入される」という用語は、「〜の内腔中にある」と互換的に使用され得る。第１の部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト）の、第２の部分（例えば、ＥＶ、例えばエキソソーム）への封入の非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示される。
【０１９３】
本明細書で使用されるとき、「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、ならびに「抽出された」及び「抽出すること」という用語は、互換的に使用され、精製、例えば、所望のＥＶ調製物の選択または濃縮の１つまたは複数のプロセスを経た所望のＥＶの調製物の状態（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される、単離することまたは精製することとは、プロデューサー細胞を含有する試料からＥＶ（例えば、画分）を取り出す、部分的に取り出すプロセスである。いくつかの実施形態では、単離されたＥＶ組成物は、検出可能な望まれない活性を有しないか、または、代替的には、望まれない活性のレベルもしくは量は、許容されるレベルもしくは量以下である。他の実施形態では、単離されたＥＶ組成物は、許容される量及び／または濃度以上の所望のＥＶの量及び／または濃度を有する。他の実施形態では、単離されたＥＶ組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、プロデューサー細胞調製物）と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発材料と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。いくつかの実施形態では、単離されたＥＶ調製物は、残留生物由来産物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、単離されたＥＶ調製物は、いかなる混入生物物質も１００％含まないか、９９％含まないか、９８％含まないか、９７％含まないか、９６％含まないか、９５％含まないか、９４％含まないか、９３％含まないか、９２％含まないか、９１％含まないか、または９０％含まない。残留生物由来産物には、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物が含まれ得る。残留生物由来産物を実質的に含まないことはまた、ＥＶ組成物が検出可能なプロデューサー細胞を含有しないこと、及びＥＶのみが検出可能であることを意味し得る。
【０１９４】
本明細書で使用されるとき、「アゴニスト」という用語は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を生み出す分子を指す。受容体は、内因性アゴニストまたは外因性アゴニストのいずれかによって活性化され得る。内因性アゴニストの非限定的な例としては、ホルモン、神経伝達物質、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。外因性アゴニストの非限定的な例としては、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。アゴニストは、完全、部分的、または逆アゴニストであり得る。
【０１９５】
本明細書で使用されるとき、「アンタゴニスト」という用語は、受容体に結合すると、生物学的応答自体を誘発するよりも、むしろアゴニスト媒介性応答を遮断または抑制する分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に定義された結合部位で内因性リガンドまたは基質と競合することにより、それらの効力を達成する。アンタゴニストの非限定的な例としては、アルファ遮断薬、ベータ遮断薬、及びカルシウムチャネル遮断薬が挙げられる。アンタゴニストは、競合的、非競合的、または不競合的アンタゴニストであり得る。
【０１９６】
本明細書で使用される「遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト」という用語は、細胞外小胞に会合していないが、その他の点では細胞外小胞に会合したＳＴＩＮＧアゴニストと同一のＳＴＩＮＧアゴニストを意味する。とりわけＳＴＩＮＧアゴニストに会合した細胞外小胞と比較したとき、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、細胞外小胞に会合した同じＳＴＩＮＧアゴニストである。いくつかの実施形態では、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストが、その有効性、毒性、及び／または任意の他の特性においてＳＴＩＮＧアゴニストを含む細胞外小胞と比較されるとき、細胞外小胞に会合したＳＴＩＮＧアゴニストと比較した遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの量は、ＥＶに会合したＳＴＩＮＧアゴニストの量と同じである。
【０１９７】
本明細書で使用されるとき、「リガンド」という用語は、受容体に結合し、受容体を調節して生物学的応答を生み出す分子を指す。調節は、受容体によって媒介される生物学的応答の活性化、不活性化、遮断、または抑制であり得る。受容体は、内因性リガンドまたは外因性リガンドのいずれかによって調節され得る。内因性リガンドの非限定的な例としては、抗体及びペプチドが挙げられる。外因性アゴニストの非限定的な例としては、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。リガンドは、完全、部分的、または逆リガンドであり得る。
【０１９８】
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、天然であるか、または部分的もしくは全体的に合成的に生産されたかにかかわらず、免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を網羅する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを更に含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル、及び組換え抗体、それらの断片を含むことを意図し、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチド等の、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片を更に含む。抗体は、それらが所望の生物学的活性または機能を示す限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。
【０１９９】
本明細書で使用されるとき、「治療上有効量」という用語は、それを必要とする対象に対して所望の治療効果、薬理及び／または生理効果を生み出すのに十分である試薬または薬学的化合物の量である。予防は療法と見なされ得るため、治療上有効量は、「予防上有効量」であり得る。
【０２００】
本明細書で使用されるとき、「薬学的組成物」という用語は、例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤等の１つまたは複数の他の化学成分と混合もしくは混ぜ合わされた、またはその中に懸濁されたＥＶ等の、本明細書に記載される化合物のうちの１つまたは複数を指す。薬学的組成物の１つの目的は、ＥＶの調製物の対象への投与を容易にすることである。「賦形剤」または「担体」という用語は、化合物の投与を更に容易にするために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語及びそれらの文法的変形は、ヒトを含む動物での使用について米国連邦政府の規制機関によって承認されたか、または米国薬局方に列挙されている薬剤のうちのいずれか、ならびに、対象への組成物の投与が禁じられる程度までの望ましくない生理効果の生成を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物学的活性及び性質を抑止しない任意の担体または希釈剤を包含する。薬学的組成物を調製するのに有用であり、一般に安全で、無毒、かつ望ましい賦形剤及び担体が含まれる。
【０２０１】
本明細書で使用されるとき、「ペイロード」という用語は、ＥＶと接触させられた標的（例えば、標的細胞）に作用する治療剤を指す。ＥＶ及び／またはプロデューサー細胞中に導入され得るペイロードには、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素等のポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ等の制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または翻訳を妨害するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬物及び毒素）等の治療剤が含まれる。
【０２０２】
「投与」、「投与すること」という用語及びそれらの変形は、ＥＶ等の組成物、または薬剤を対象中に導入することを指し、組成物または薬剤の同時及び順次導入を含む。対象中への組成物または薬剤の導入は、腫瘍内、経口的、肺内、鼻腔内、非経口的（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸内、リンパ管内、くも膜下腔内、眼周囲、または局所的を含む、任意の好適な経路による。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を果たすことを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈中に導入することによって投与される。
【０２０３】
本明細書で使用される「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、例えば、疾患または病態の重症度の低減；疾患過程の継続期間の低減；疾患または病態に関連する１つまたは複数の症状の改善または排除；疾患または病態の治癒を必ずしも伴わない、疾患または病態を有する対象への有益な効果の提供を指す。この用語はまた、疾患もしくは病態またはその症状の予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）も含む。一実施形態では、「処置すること」または「処置」という用語は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導することを意味する。
【０２０４】
本明細書で使用される「予防する」または「予防すること」という用語は、特定の転帰の発生または重症度を減少または低減することを指す。いくつかの実施形態では、転帰の予防は、予防的処置により達成される。
【０２０５】
本明細書で使用されるとき、「調節する」、「調節すること」、「修飾する」、及び／または「調節因子」という用語は、一般に、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用するため等で、特定の濃度、レベル、発現、機能、または挙動を増加または減少により変化させる、例えば、直接的または間接的に促進／刺激／上方制御または干渉／阻害／下方制御する能力を指す。いくつかの例では、調節因子は、対照と比べて、または一般に予想されるであろう活性の平均的レベルと比べて、または活性の対照レベルと比べて、ある特定の濃度、レベル、活性、または機能を増加及び／または減少させることができる。
【０２０６】
本明細書で使用されるとき、「哺乳類対象」は、限定されないが、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）を含む、全ての哺乳動物を含む。
【０２０７】
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置、または療法が所望される任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。本明細書に記載される方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物であり、他の実施形態では、対象はヒトである。
【０２０８】
本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」という用語は、ＥＶを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）パーセンテージ濃度に基づいて１０％未満の高分子を含むことを意味する。一部の画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％（ｍ／ｖ）未満の高分子を含有し得る。
【０２０９】
本明細書で使用されるとき、「高分子」という用語は、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを意味する。
【０２１０】
本明細書で使用されるとき、「非実質的な」、「低減された」、または「ごくわずかな」という用語は、対象におけるベースライン炎症応答と比べた、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与に対する対象の炎症応答と比較した、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入するＥＶを含む試料の投与後の対象における炎症応答の存在、レベル、または量を指す。例えば、ごくわずかなまたは非実質的な全身性炎症の存在、レベル、または量は、対象におけるベースライン炎症と比べて、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与に対する対象の免疫応答と比較して０．００１％未満、０．０１％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、１７％未満、２０％未満、または２５％未満の全身性炎症であり得る。全身性炎症のレベルまたは量は、ベースラインと比べて、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与に対する炎症応答と比較して０．１倍未満、０．５倍未満、０．５倍未満、１倍未満、１．５倍未満、２倍未満であり得る。
【０２１１】
本明細書に列挙される範囲は、列挙される端点値を含めて、その範囲内の値の全てについての簡略表記であることが理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲を含むことが理解される。
【０２１２】
別途指示されない限り、１つまたは複数の立体中心を有する化合物への言及は、各立体中心、及びそれらの立体中心の全ての組み合わせを意図する。
【０２１３】
ＩＩ．ＳＴＩＮＧアゴニストを有する組成物（小胞）
自然免疫系は、免疫応答を誘導するパターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する。ＰＲＲは、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡを含む様々な病原体分子を認識する。レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）及び一部のトル様受容体（ＴＬＲ）等のＰＲＲは、ＲＮＡリガンドを認識する。ＤＮＡリガンドは、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、ＡＩＭ２、及び他のＴＬＲによって認識される。ＴＬＲ、ＲＬＲ、及びＡＩＭ２は、他のシグナルカスケードアダプタータンパク質と直接相互作用して、転写因子を活性化する一方で、ｃＧＡＳは、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体を活性化する環状ジヌクレオチド分子であるｃＧＡＭＰを産生する。ＳＴＩＮＧ及びＲＬＲの両方が、転写因子ＩＲＦ３及びＮＦ−κＢの活性化を誘導するアダプターキナーゼＴＢＫ１を活性化し、Ｉ型ＩＦＮ及び炎症促進性サイトカインの産生をもたらす。
【０２１４】
環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）は、分子ｃ−ジ−ＧＭＰにあるような、２つの３’、５’ホスホジエステル結合を特徴とする細菌シグナル伝達分子として最初に同定された。ＳＴＩＮＧは、細菌ＣＤＮによって活性化され得るが、哺乳類細胞における自然免疫応答はまた、ｃＧＡＳによって産生されるＣＤＮシグナル伝達分子ｃＧＡＭＰによっても媒介される。ｃＧＡＭＰは、混合の２’、５’及び３’、５’ホスホジエステル結合を特徴とする。細菌ＣＤＮ及び哺乳類ＣＤＮの両方がＳＴＩＮＧと直接相互作用して、炎症促進性シグナル伝達カスケードを誘導し、これがＩＦＮα及びＩＦＮ−β等のＩ型ＩＦＮの産生をもたらす。
【０２１５】
ＩＩ．Ａ．ＳＴＩＮＧアゴニスト
本開示で使用されるＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）または非環状ジヌクレオチドアゴニストであり得る。限定されないが、ｃＧＭＰ、環状ジ−ＧＭＰ（ｃ−ジ−ＧＭＰ）、ｃＡＭＰ、環状ジ−ＡＭＰ（ｃ−ジ−ＡＭＰ）、環状−ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、環状ジ−ＩＭＰ（ｃ−ジ−ＩＭＰ）、環状ＡＭＰ−ＩＭＰ（ｃＡＩＭＰ）、及びその任意の類似体等の環状プリンジヌクレオチドが、患者における免疫応答または炎症応答を刺激するか、または強化することが知られている。ＣＤＮは、環状ジヌクレオチドを連結する２’２’、２’３’、２’５’、３’３’、もしくは３’５’結合、またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。
【０２１６】
環状プリンジヌクレオチドは、標準的な有機化学技法を介して修飾されて、プリンジヌクレオチドの類似体を生み出し得る。好適なプリンジヌクレオチドには、アデニン、グアニン、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、イソグアニン、または当該技術分野で既知の任意の他の適切なプリンジヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。環状ジヌクレオチドは、修飾された類似体であってもよい。ホスホロチオエート、ビホスホロチオエート（ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、フッ素化、及び二フッ素化修飾を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の好適な修飾が使用されてもよい。
【０２１７】
５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、または当該技術分野で既知の任意の他の非環状ジヌクレオチドアゴニスト等の、非環状ジヌクレオチドアゴニストもまた使用されてもよい。
【０２１８】
任意のＳＴＩＮＧアゴニストが使用され得ることが企図される。ＳＴＩＮＧアゴニストの中でも、ＤＭＸＡＡ、ＳＴＩＮＧアゴニスト−１、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２ｃ−ジ−ＧＭＰ、ＭＬ−ＲＲ−Ｓ２  ｃＧＡＭＰ、２’３’−ｃ−ジ−ＡＭ（ＰＳ）２、２’３’−ｃＧＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰｄＦＨＳ、３’３’−ｃＧＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰｄＦＳＨ、ｃＡＩＭＰ、ｃＡＩＭ（ＰＳ）２、３’３’−ｃＡＩＭＰ、３’３’−ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、２’２’−ｃＧＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭ（ＰＳ）２、３’３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ジ−ＡＭＰ、２’３’−ｃ−ジ−ＡＭＰ、２’３’−ｃ−ジ−ＡＭ（ＰＳ）２、ｃ−ジ−ＧＭＰ、２’３’−ｃ−ジ−ＧＭＰ、ｃ−ジ−ＩＭＰ、ｃ−ジ−ＵＭＰ、またはそれらの任意の組み合わせがある。好ましい実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、３’３’−ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、別名３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨである。当該技術分野で既知の追加のＳＴＩＮＧアゴニストもまた使用されてもよい。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化４】
2021518386.tif 000007
［式中、
Ｘ１は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｚは、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨ、またはＳＲ１であり、ここで、
ｉ）Ｒ１は、ＮａもしくはＮＨ４であるか、または
ｉｉ）Ｒ１は、ピバロイルオキシメチル等の、インビボでＯＨまたはＳＨをもたらす酵素不安定基であり、
Ｂｉ及びＢ２は、下記から選定される塩基であるが、
【化５】
2021518386.tif 000008
但し、
−式（Ｉ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨではなく、
−式（ＩＩ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨであるとき、Ｂ１がアデニンではなく、かつＢ２がグアニンではなく、かつ
−式（ＩＩＩ）において、Ｘ１及びＸ２がＯＨであるとき、Ｂ１がアデニンではなく、Ｂ２がグアニンではなく、かつＺがＯＨではないことを条件とする］を含む。ＷＯ２０１６／０９６１７４を参照されたく、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、
【化６−１】
2021518386.tif 000009
【化６−２】
2021518386.tif 000010
その薬学的に許容される塩を含む。ＷＯ２０１６／０９６１７４Ａ１を参照されたい。
【０２２１】
他の実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化７−１】
2021518386.tif 000011
【化７−２】
2021518386.tif 000012
またはその任意の薬学的に許容される塩を含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化８】
2021518386.tif 000013
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１４／０９３９３６に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化９】
2021518386.tif 000014
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１４／１８９８０５に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化１０】
2021518386.tif 000015
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１５／０７７３５４に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  １１，１０１８−１０３０（２０１５）もまた参照されたい。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＷＯ２０１３／１８５０５２及びＳｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２８３，２８３ｒａ５２（２０１５）に記載される、ｃ−ジ−ＡＭＰ、ｃ−ジ−ＧＭＰ、ｃ−ジ−ＩＭＰ、ｃ−ＡＭＰ−ＧＭＰ、ｃ−ＡＭＰ−ＩＭＰ、及びｃ−ＧＭＰ−ＩＭＰを含み、同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化１１】
2021518386.tif 000016
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１４／１８９８０６に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化１２】
2021518386.tif 000017
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１５／１８５５６５に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化１３】
2021518386.tif 000018
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１４／１７９７６０に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化１４−１】
2021518386.tif 000019
【化１４−２】
2021518386.tif 000020
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１４／１７９３３５に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＷＯ２０１５／０１７６５２に記載される、以下の式を有する化合物、
【化１５】
2021518386.tif 000021
を含み、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＷＯ２０１６／０９６５７７に記載される、以下の式を有する化合物、
【化１６】
2021518386.tif 000022
を含み、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化１７】
2021518386.tif 000023
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１６／１２０３０５に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化１８】
2021518386.tif 000024
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１６／１４５１０２に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化１９】
2021518386.tif 000025
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１７／０２７６４６に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化２０】
2021518386.tif 000026
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１７／０７５４７７に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化２１】
2021518386.tif 000027
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１７／０２７６４５に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化２２】
2021518386.tif 000028
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１８／１００５５８に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化２３】
2021518386.tif 000029
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１７／１７５１４７に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
【化２４】
2021518386.tif 000030
を含み、式中、各記号はＷＯ２０１７／１７５１５６に定義され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２４０】
いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０６、ＣＬ６１１、ＣＬ６０２、ＣＬ６５５、ＣＬ６０４、ＣＬ６０９、ＣＬ６１４、ＣＬ６５６、ＣＬ６４７、ＣＬ６２６、ＣＬ６２９、ＣＬ６０３、ＣＬ６３２、ＣＬ６３３、ＣＬ６５９、またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０６またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６１１またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０２またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５５またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０４またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０９またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６１４またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５６またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６４７またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６２６またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６２９またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０３またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６３２またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６３３またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５９またはその薬学的に許容される塩である。
【０２４１】
いくつかの態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニスト及び／または非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。いくつかの態様では、いくつかの環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストが、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソーム上に存在するとき、かかるＳＴＩＮＧアゴニストは同じであり得るか、またはそれらは異なり得る。いくつかの態様では、いくつかの非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストが存在するとき、かかるＳＴＩＮＧアゴニストは同じであり得るか、またはそれらは異なり得る。いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えばエキソソーム組成物は、ＥＶ、例えばエキソソームの２つ以上の集団を含むことができ、ここで、ＥＶ、例えばエキソソームの各集団は、異なるＳＴＩＮＧアゴニストまたはそれらの組み合わせを含む。
【０２４２】
ＳＴＩＮＧアゴニストはまた、細胞外小胞またはＥＶ中（例えば、いずれも内腔中で未結合で）のアゴニストの封入を増加させるように修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、足場部分、例えば、足場Ｙに連結されている。ある特定の実施形態では、修飾は、ＥＶ、例えばエキソソームの外表面上でのＳＴＩＮＧアゴニストのよりよい発現を可能にする（例えば、本明細書に開示される足場部分、例えば、足場Ｘに連結されて）。この修飾は、アゴニストを化学物質もしくは酵素で処理することによる、またはＳＴＩＮＧアゴニストの極性もしくは電荷を物理的もしくは化学的に改変することによる、脂質結合タグの付加を含むことができる。ＳＴＩＮＧアゴニストは、単一の処理によって、または処理の組み合わせによって、例えば、脂質結合タグを付加することのみ、または脂質結合タグを付加するとともに、極性を改変することによって、修飾され得る。先の例は、非限定的な例示的事例であることを意図する。修飾の任意の組み合わせが実施され得ることが企図される。修飾は、ＥＶ中のアゴニストの封入を、未修飾アゴニストの封入と比較して２倍〜１０，０００倍、１０倍〜１，０００倍、または１００倍〜５００倍増加させ得る。修飾は、ＥＶ中のアゴニストの封入を、未修飾アゴニストの封入と比較して少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、または１０，０００倍増加させ得る。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶ、例えばエキソソームの外表面でのアゴニストのよりよい発現を可能にするように修飾することができる（例えば、本明細書に開示される足場部分、例えば、足場Ｘに連結されて）。上述の修飾のうちのいずれかを使用することができる。修飾は、ＥＶ、例えばエキソソーム中のアゴニストの封入を、未修飾アゴニストの封入と比較して約２倍〜１０，０００倍、約１０倍〜１，０００倍、または約１００倍〜５００倍増加させ得る。修飾は、ＥＶ、例えばエキソソームの外表面上でのアゴニストの発現を、未修飾アゴニストの発現と比較して少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、または１０，０００倍増加させることができる。
【０２４４】
ＥＶに会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ〜１０００μＭであり得る。会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１〜０．０５μＭ、０．０５〜０．１μＭ、０．１〜０．５μＭ、０．５〜１μＭ、１〜５μＭ、５〜１０μＭ、１０〜１５μＭ、１５〜２０μＭ、２０〜２５μＭ、２５〜３０μＭ、３０〜３５μＭ、３５〜４０μＭ、４５〜５０μＭ、５５〜６０μＭ、６５〜７０μＭ、７０〜７５μＭ、７５〜８０μＭ、８０〜８５μＭ、８５〜９０μＭ、９０〜９５μＭ、９５〜１００μＭ、１００〜１５０μＭ、１５０〜２００μＭ、２００〜２５０μＭ、２５０〜３００μＭ、３００〜３５０μＭ、２５０〜４００μＭ、４００〜４５０μＭ、４５０〜５００μＭ、５００〜５５０μＭ、５５０〜６００μＭ、６００〜６５０μＭ、６５０〜７００μＭ、７００〜７５０μＭ、７５０〜８００μＭ、８００〜８５０μＭ、８０５〜９００μＭ、９００〜９５０μＭ、または９５０〜１０００μＭであり得る。会合したＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭ、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、６５０μＭ、７００μＭ、７５０μＭ、８００μＭ、８５０μＭ、９００μＭ、９５０μＭ、または１０００μＭ以上であり得る。
【０２４５】
ＩＩ．Ｂ．足場Ｘ操作型ＥＶ、例えばエキソソーム
いくつかの実施形態では、本開示のＥＶは、その組成が修飾された膜を含む。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質、またはグリカン含量を変化させることによって修飾することができる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、表面操作型ＥＶは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合等の化学的方法及び／または物理的方法によって生成される。他の実施形態では、表面操作型ＥＶ、例えばエキソソームは、遺伝子操作によって生成される。遺伝子修飾されたプロデューサー細胞または遺伝子修飾された細胞の子孫から産生されたＥＶは、修飾された膜組成を含有することができる。いくつかの実施形態では、表面操作型ＥＶ、例えばエキソソームは、足場部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、足場Ｘ）をより高いもしくはより低い密度（例えば、より多い数）で有するか、または足場部分のバリアントもしくは断片を含む。
【０２４７】
例えば、表面操作型ＥＶ（例えば、足場Ｘ操作型ＥＶ）は、足場部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、足場Ｘ）またはそのバリアントもしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）によって産生され得る。外因性配列から発現された足場部分を含むＥＶは、修飾された膜組成を含むことができる。
【０２４８】
足場部分の種々の修飾体または断片を本開示の実施形態に使用することができる。例えば、結合剤に対して強化された親和性を有するように修飾された足場部分は、結合剤を用いて精製され得る表面操作型ＥＶを生成するために使用することができる。ＥＶ、例えばエキソソーム、及び／または膜により有効に標的化されるように修飾された足場部分を使用することができる。ＥＶ、例えばエキソソーム、膜への特異的かつ有効な標的化に必要とされる最小限の断片を含むように修飾された足場部分もまた使用することができる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＳＴＩＮＧアゴニストは、融合タンパク質、例えば、足場ＸへのＳＴＩＮＧアゴニストの融合タンパク質として、ＥＶ、例えばエキソソームの表面上に発現される。例えば、融合タンパク質は、足場部分（例えば、足場Ｘ）に連結された、本明細書に開示されるＳＴＩＮＧアゴニストを含むことができる。ある特定の実施形態では、足場Ｘは、ＰＴＧＦＲＮタンパク質、ＢＳＧタンパク質、ＩＧＳＦ２タンパク質、ＩＧＳＦ３タンパク質、ＩＧＳＦ８タンパク質、ＩＴＧＢ１タンパク質、ＩＴＧＡ４タンパク質、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質、ＡＴＰトランスポータータンパク質、またはその断片もしくはバリアントを含む。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される表面操作型ＥＶ、例えばエキソソーム（例えば、足場Ｘ操作型ＥＶ、例えばエキソソーム）は、当該技術分野で既知のＥＶ、例えばエキソソームと比較してより優れた特性を示す。例えば、表面（例えば、足場Ｘ）操作型は、それらの表面上に、天然型ＥＶ、例えばエキソソーム、または、従来のエキソソームタンパク質を用いて生産されたＥＶ、例えばエキソソームよりも高度に濃縮された修飾タンパク質を含有する。その上、本発明の表面操作型ＥＶ、例えばエキソソーム（例えば、足場Ｘ操作型ＥＶ、例えばエキソソーム）は、天然型ＥＶ、例えばエキソソーム、または、従来のエキソソームタンパク質を用いて生産されたＥＶ、例えばエキソソームと比較して、より高い、より特異的な、またはより制御された生物学的活性を有することができる。
【０２５１】
他の実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び足場Ｘを含有し、該ＳＴＩＮＧアゴニストは、足場Ｘに連結されている。いくつかの実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び足場Ｘを含み、該ＳＴＩＮＧアゴニストは、足場Ｘに連結されていない。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、本開示に有用な足場Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮタンパク質はまた、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ−１）、Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ  ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ−Ｆ）、プロスタグランジンＦ２−アルファ受容体制御タンパク質、プロスタグランジンＦ２−アルファ受容体関連タンパク質、またはＣＤ３１５とも称され得る。ヒトＰＴＧＦＲＮタンパク質の完全長アミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）は、表１で配列番号１として示される。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸１〜２５）、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２６〜８３２）、膜貫通ドメイン（配列番号１のアミノ酸８３３〜８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸８５４〜８７９）を含有する。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチドを含めない配列番号１、すなわち、配列番号１のアミノ酸２６〜８７９からなる。いくつかの実施形態では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびに（ｉ）膜貫通ドメインのＮ末端に少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１１０個、少なくとも１２０個、少なくとも１３０個、少なくとも１４０個、少なくとも１５０個のアミノ酸、（ｉｉ）膜貫通ドメインのＣ末端に少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、もしくは少なくとも２５個のアミノ酸、または（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの断片は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２５４】
他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号１のアミノ酸２６〜８７９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号３３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、配列番号３３のアミノ酸配列、ならびに配列番号３３のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
【０２５５】
他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号２、３、４、５、６、または７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号２、３、４、５、６、または７のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、配列番号２、３、４、５、６、または７のアミノ酸配列、ならびに配列番号２、３、４、５、６、または７のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
【表１−１】
2021518386.tif 000031
【表１−２】
2021518386.tif 000032
【表１−３】
2021518386.tif 000033
【表１−４】
2021518386.tif 000034
【表１−５】
2021518386.tif 000035
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本開示に有用な足場Ｘは、配列番号９によって表される、ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）を含む。ＢＳＧタンパク質は、５Ｆ７、コラゲナーゼ刺激因子、細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）、白血球活性化抗原Ｍ６、ＯＫ血液型抗原、腫瘍細胞由来コラゲナーゼ刺激因子（ＴＣＳＦ）、またはＣＤ１４７としても知られる。ヒトＢＳＧタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、Ｐ３５６１３である。ＢＳＧタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号９のアミノ酸１〜２１である。配列番号９のアミノ酸１３８〜３２３は、細胞外ドメインであり、アミノ酸３２４〜３４４は、膜貫通ドメインであり、配列番号９のアミノ酸３４５〜３８５は、細胞質ドメインである。
【０２５７】
他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号９のアミノ酸２２〜３８５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベイシジンポリペプチドの断片は、ＩｇＶ、例えば、配列番号９のアミノ酸２２１〜３１５等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号１０、１１、または１２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１０、１１、または１２のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、配列番号１０、１１、または１２のアミノ酸配列、ならびに配列番号１０、１１、または１２のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本開示に有用な足場Ｘは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩｇＳＦ８またはＩＧＳＦ８タンパク質）を含み、これは、ＣＤ８１パートナー３、Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ  ＥＷＩモチーフ含有タンパク質２（ＥＷＩ−２）、ケラチノサイト関連膜貫通タンパク質４（ＫＣＴ−４）、ＬＩＲ−Ｄ１、プロスタグランジン制御様タンパク質（ＰＧＲＬ）、またはＣＤ３１６としても知られる。完全長ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて受託番号Ｑ９６９Ｐ０であり、本明細書で配列番号１４として示される。ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号１４のアミノ酸１〜２７）、細胞外ドメイン（配列番号１４のアミノ酸２８〜５７９）、膜貫通ドメイン（配列番号１４のアミノ酸５８０〜６００）、及び細胞質ドメイン（配列番号１４のアミノ酸６０１〜６１３）を有する。
【０２５９】
他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号１４のアミノ酸２８〜６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ８タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号１５、１６、１７、または１８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、配列番号１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列、ならびに配列番号１５、１６、１７、または１８のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＳＴＩＮＧアゴニストとともに使用することができる足場Ｘは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩｇＳＦ３またはＩＧＳＦ３タンパク質）を含み、これはＧｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ  ＥＷＩモチーフ含有タンパク質３（ＥＷＩ−３）としても知られ、配列番号２０のアミノ酸配列として示される。ヒトＩＧＳＦ３タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号２０のアミノ酸１〜１９）、細胞外ドメイン（配列番号２０のアミノ酸２０〜１１２４）、膜貫通ドメイン（配列番号２０のアミノ酸１１２５〜１１４５）、及び細胞質ドメイン（配列番号２０のアミノ酸１１４６〜１１９４）を有する。
【０２６１】
他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号２０のアミノ酸２８〜６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ３タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、本開示に有用な足場Ｘは、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１タンパク質）を含み、これは、フィブロネクチン受容体サブユニットベータ、糖タンパク質ＩＩａ（ＧＰＩＩＡ）、ＶＬＡ−４サブユニットベータ、またはＣＤ２９としても知られ、配列番号２１のアミノ酸配列として示される。ヒトＩＴＧＢ１タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号２１のアミノ酸１〜２０）、細胞外ドメイン（配列番号２１のアミノ酸２１〜７２８）、膜貫通ドメイン（配列番号２１のアミノ酸７２９〜７５１）、及び細胞質ドメイン（配列番号２１のアミノ酸７５２〜７９８）を有する。
【０２６３】
他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号２１のアミノ酸２１〜７９８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＢ１タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２６４】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＩＴＧＡ４タンパク質を含み、これは、シグナルペプチド（配列番号２２のアミノ酸１〜３３）を含めない配列番号２２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＡ４タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２６５】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号２３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２６６】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号２４と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２６７】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号２５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２６８】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号２６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２６９】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号２７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２７０】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ１Ａ５タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号２８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ５タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２７１】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号２９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２７２】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号３０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２７３】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号３１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２７４】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号３２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２７５】
他の実施形態では、足場Ｘは、ＩＧＳＦ２タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号３４と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ２タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２７６】
ＳＴＩＮＧアゴニストをＥＶ、例えばエキソソームの表面に連結するために使用することができる、他の足場Ｘタンパク質の非限定的な例は、２０１９年２月５日に発行された米国特許第１０，１９５，２９０  Ｂ１号にて見出すことができ、同特許は参照によりその全体が援用される。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、本開示に有用な足場Ｘタンパク質は、天然タンパク質のＮ末端から少なくとも５個、１０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、または８００個のアミノ酸を欠いている。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、天然タンパク質のＣ末端から少なくとも５個、１０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、または８００個のアミノ酸を欠いている。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から少なくとも５個、１０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、または８００個のアミノ酸を欠いている。いくつかの実施形態では、足場Ｘは、天然タンパク質の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される足場Ｘを用いて、ＳＴＩＮＧアゴニストを、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面上及び／または外表面上に同時に連結することもできる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドを用いて、ＳＴＩＮＧアゴニストを、ＥＶ、例えばエキソソームの表面に加えて、内腔の内部に連結することができる。いくつかの実施形態では、足場Ｘを用いて、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び追加の治療剤を、ＥＶ、例えばエキソソームに連結することができる（例えば、ペイロード）。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される足場Ｘは、二重目的で使用することができる。
【０２７９】
足場Ｙ操作型ＥＶ、例えばエキソソーム
いくつかの実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、天然型ＥＶ、例えばエキソソームの内部空間とは異なる内部空間（すなわち、内腔）を含む。例えば、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔側の組成が、天然型ＥＶ、例えばエキソソームのタンパク質、脂質、またはグリカン含量とは異なるタンパク質、脂質、またはグリカン含量を有するように、変化させられ得る。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、操作型ＥＶ、例えばエキソソームは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔側の組成または含量を変化させる、足場部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、足場Ｙ）または足場部分の修飾体もしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生され得る。ＥＶ、例えばエキソソームの内腔側で発現され得る、エキソソームタンパク質の種々の修飾体または断片を本開示の実施形態に使用することができる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔中にある（すなわち、封入される）。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面に連結されている。本明細書で使用されるとき、分子（例えば、抗原またはアジュバント）が、ＥＶ、例えばエキソソームの「内腔中にある」として記載される場合、それは、当該分子がＥＶ、例えばエキソソーム内に位置する（例えば、会合している）が、ＥＶの内腔表面上のいかなる分子にも連結されていないことを意味する。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、融合分子、例えば、足場部分（例えば、足場Ｙ）へのＳＴＩＮＧアゴニストの融合分子として、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面上で発現される。ある特定の実施形態では、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質、ＢＡＳＰ１タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０２８２】
他の実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び足場Ｙを含有し、該ＳＴＩＮＧアゴニストは、足場Ｙに連結されている。いくつかの実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び足場Ｙを含み、該ＳＴＩＮＧアゴニストは、足場Ｙに連結されていない。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔側を変化させることができる足場部分（例えば、足場Ｙ）には、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質、ＢＡＳＰ１タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、足場Ｙは、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）を含む。ＢＡＳＰ１タンパク質は、２２ｋＤａの神経組織濃縮酸性タンパク質（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）または神経軸索膜タンパク質（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｘｏｎａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＮＡＰ−２２としても知られる。完全長ヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）は、表２に示される。選択的スプライシングによって生み出される異性体は、配列番号ＸＸ（異性体１）からアミノ酸８８〜１４１が欠損している。
【表２−１】
2021518386.tif 000036
【表２−２】
2021518386.tif 000037
【０２８４】
成熟ＢＡＳＰ１タンパク質配列は、配列番号４９から最初のＭｅｔが欠損しており、故に、配列番号４９のアミノ酸２〜２２７を含有する。
【０２８５】
他の実施形態では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４９のアミノ酸２〜２２７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場Ｘは、配列番号５０〜１５５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本開示に有用な足場Ｙは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号５０〜１５５のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号５０〜１５５のアミノ酸配列、ならびに配列番号５０〜１５５のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本開示に有用な足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号４７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質を含み、これは、シグナルペプチドを含めない配列番号４８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、本開示に有用な足場Ｙは、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫを有するペプチドを含み、ここで、Ｘは、アラニンまたは任意の他のアミノ酸（配列番号１６３）である。いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含み、ここで、各括弧付きの位置はアミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、位置５は（＋）ではなく、位置６は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。更なる実施形態では、本明細書に記載されるＥＶ、例えばエキソソーム（例えば、操作型ＥＶ、例えばエキソソーム）は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含み、ここで、各括弧付きの位置はアミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、位置５は（＋）ではなく、位置６は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面上にＳＴＩＮＧアゴニストを発現させるために使用することができる足場Ｙは、配列番号７〜１５５のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０２９０】
本明細書に記載される足場Ｙ操作型ＥＶ、例えばエキソソームは、配列番号４７〜１５５に記載の配列で形質転換された細胞から産生され得る。
【０２９１】
ＩＩ．Ｃ．リンカー
本開示のＥＶは、ＳＴＩＮＧアゴニストをＥＶまたは足場部分、例えば、ＥＶの外表面上の足場Ｘに連結する、１つまたは複数のリンカーを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、リンカーによってＥＶに直接、またはＥＶ上の足場部分において連結されている。リンカーは、当該技術分野で既知の任意の化学部分であり得る。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、「リンカー」という用語は、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）または非ポリペプチドを指す。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーがタンデムで連結され得る。一般に、リンカーは、柔軟性を提供するか、または立体障害を阻止／改善する。リンカーは典型的には切断されないが、ある特定の態様では、かかる切断が望ましい場合がある。したがって、いくつかの態様では、リンカーは、プロテアーゼにより切断可能な１つまたは複数の部位を含むことができ、これらの部位は、リンカーの配列内に位置し得るか、またはリンカー配列のそれぞれの末端でリンカーに隣接し得る。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含むことができる。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち非天然型である。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直線状配列を、それが自然界で天然には連結されないか、または遺伝子的に融合されないアミノ酸の第２の直線状配列に連結するか、または遺伝子的に融合するアミノ酸配列を含む、ペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然または非天然型ペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然型ポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換、または欠失等の変異を含む）非天然型ポリペプチドを含むことができる。
【０２９５】
リンカーは、切断を受けやすい（「切断可能なリンカー」）場合があり、それによって、ＳＴＩＮＧアゴニストまたは他のペイロードの放出を容易にする。いくつかの態様では、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。いくつかの態様では、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含有する。いくつかの態様では、リンカーは、「酸不安定リンカー」である。いくつかの態様では、酸不安定リンカーは、ヒドラゾンを含有する。好適な酸不安定リンカーにはまた、例えば、シス−アコニット酸リンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせも含まれる。いくつかの態様では、リンカーは、切断不可能なリンカー（ｌｉｋｅｒ）を含む。
【０２９６】
ＩＩ．Ｄ．プロデューサー細胞及び修飾
ＥＶ、例えばエキソソームは、インビトロで増殖させた細胞、または対象の体液から産生され得る。ＥＶ、例えばエキソソームをインビトロ細胞培養物から産生させる場合、種々のプロデューサー細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞を使用することができる。本明細書に記載される内腔操作型ＥＶ、例えばエキソソームの産生に使用され得る追加の細胞型には、限定されないが、間葉系幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、及びがん細胞株が含まれる。更なる例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆体細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、及びＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ−Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のうちのいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。
【０２９７】
いくつかの実施形態はまた、小胞表面上に外因性タンパク質を発現する修飾型ＥＶを生産するための１つまたは複数の外因性配列を含むように、ＥＶ、例えばエキソソームを遺伝子修飾することを含み得る。外因性配列は、ＥＶ、例えばエキソソームタンパク質、またはＥＶタンパク質の修飾体もしくは断片をコードする配列を含むことができる。ＥＶ、例えばエキソソームタンパク質をコードする配列の余分のコピーを導入して、より高い密度のＥＶタンパク質を有する表面操作型ＥＶを生産することができる。ＥＶ、例えばエキソソームタンパク質の修飾体もしくは断片をコードする外因性配列を導入して、ＥＶタンパク質の修飾体または断片を含有する修飾型ＥＶを生産することができる。親和性タグをコードする外因性配列を導入して、ＥＶタンパク質に結合した親和性タグを含む融合タンパク質を含有する、修飾型ＥＶ、例えばエキソソームを生産することができる。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、外因性配列は、足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質、ＢＳＧタンパク質、ＩＧＳＦ２タンパク質、ＩＧＳＦ３タンパク質、ＩＧＳＦ８タンパク質、ＩＴＧＢ１タンパク質、ＩＴＧＡ４タンパク質、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質、ＡＴＰトランスポータータンパク質、またはその断片もしくはバリアント）をコードする。いくつかの実施形態では、修飾型ＥＶ、例えばエキソソームは、足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質、ＢＳＧタンパク質、ＩＧＳＦ２タンパク質、ＩＧＳＦ３タンパク質、ＩＧＳＦ８タンパク質、ＩＴＧＢ１タンパク質、ＩＴＧＡ４タンパク質、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質、ＡＴＰトランスポータータンパク質、またはその断片もしくはバリアント）を過剰発現する。他の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質、ＢＳＧタンパク質、ＩＧＳＦ２タンパク質、ＩＧＳＦ３タンパク質、ＩＧＳＦ８タンパク質、ＩＴＧＢ１タンパク質、ＩＴＧＡ４タンパク質、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質、ＡＴＰトランスポータータンパク質、またはその断片もしくはバリアント）を過剰発現する細胞によって産生される。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、外因性配列は、足場Ｙ（例えば、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質、ＢＡＳＰ１タンパク質、またはその断片もしくはバリアント）をコードする。いくつかの実施形態では、修飾型ＥＶ、例えばエキソソームは、足場Ｙ（例えば、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質、ＢＡＳＰ１タンパク質、またはその断片もしくはバリアント）を過剰発現する。他の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、足場Ｙ（例えば、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質、ＢＡＳＰ１タンパク質、またはその断片もしくはバリアント）を過剰発現する細胞によって産生される。
【０３００】
外因性配列は、トランスフェクション、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、または当該技術分野で既知の任意の他の適切な遺伝子送達方法もしくはそれらの組み合わせを介して、プロデューサー細胞または細胞株において一過性で、または安定に発現され得る。外因性配列は、プロデューサー細胞のゲノム中に組み込まれても、または染色体外に留まってもよい。外因性配列は、プラスミドとして形質転換が行われ得る。外因性配列は、標的とする部位で、またはランダムな部位においてプロデューサー細胞のゲノム配列中に安定に組み込まれ得る、外因性配列は、ＥＶ、例えばエキソソームタンパク質をコードする内因性配列内、その上流（５’末端）または下流（３’末端）に位置する、プロデューサー細胞のゲノム配列中に挿入され得る。当該技術分野で既知の種々の方法を、外因性配列のプロデューサー細胞への導入に使用することができる。例えば、種々の遺伝子編集法（例えば、相同組換え、トランスポゾン媒介系、ｌｏｘＰ−Ｃｒｅ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹもしくはＣａｓＸ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼもしくはＴＡＬＥＮ、または亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系を用いた方法）を用いて修飾された細胞が、種々の実施形態の範囲内にある。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、追加の外因性配列を含むように更に修飾される。例えば、内因性遺伝子発現を調節する、免疫応答もしくは免疫シグナル伝達を調節する、または、ペイロードもしくは追加の表面発現リガンドとしてある特定のポリペプチドを含むＥＶ、例えばエキソソームを生産するために、追加の外因性配列を含めることができる。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、追加の機能性、例えば、特異的標的化性能、送達機能、酵素機能、インビボでの増加したまたは減少した半減期等をＥＶ、例えばエキソソームに付与する、追加の外因性配列を含むように更に修飾され得る。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、一方が、エキソソームタンパク質またはエキソソームタンパク質の修飾体もしくは断片をコードし、他方が、エキソソームに追加の機能性を付与するタンパク質をコードする、２つの外因性配列を含むように修飾される。
【０３０２】
より具体的には、本ＥＶ、例えばエキソソームは、リガンド、サイトカイン、もしくは抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない１つまたは複数の追加の外因性タンパク質をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。これらの追加の外因性タンパク質は、ＳＴＩＮＧアゴニストと組み合わせて追加の免疫刺激シグナルの活性化または調節を可能にし得る。使用が企図される例となる追加の外因性タンパク質には、米国特許出願６２／６１１，１４０号に詳述されるタンパク質、リガンド、及び他の分子が含まれ、同特許は参照によりその全体が本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ２７Ｌを含むリガンドで更に修飾される。いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１５を含むサイトカインで更に修飾される。本明細書に記載される１つまたは複数のエキソソームタンパク質のうちのいずれも、プラスミド、ゲノム中に挿入された外因性配列、または合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等の他の外因性核酸から発現され得る。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニストの組み合わせ効果を強化するために、ＥＶの取り込みを導き、細胞経路を活性化するか、または遮断する、アンタゴニスト抗体もしくはアゴニスト抗体またはそれらの断片をＥＶ、例えばエキソソーム表面上に発現するように更に修飾される。いくつかの具体的な実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＬＯＸ−１、またはランゲリンに対する抗体である。プロデューサー細胞は、アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体をコードする追加の外因性配列を含むように修飾され得る。代替として、アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体は、当該技術分野で既知の任意の適切な連結化学作用を介して、ＥＶ、例えばエキソソームに共有結合性で連結されるか、またはコンジュゲートされ得る。適切な連結化学作用の非限定的な例としては、アミン反応性基、カルボキシル反応性基、スルフヒドリル反応性基、アルデヒド反応性基、光反応性基、クリックＩＴケミストリー（ＣｌｉｃｋＩＴ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ビオチン−ストレプトアビジンもしくは他のアビジンコンジュゲーション、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３０４】
ＩＩ．Ｄ．１．プロデューサー細胞またはＥＶ、例えばエキソソームのグリカン修飾
いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、酵素処理または化学処理を介してグリカン修飾される。一実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、グリカン修飾型プロデューサー細胞に由来する。別の実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、酵素修飾または化学修飾を含む。種々の実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、キフネンシンでの処理、またはシアリルトランスフェラーゼ遺伝子もしくはシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトである。一実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子であるシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＡＳ）のノックアウトを含む。一実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、マンノース生合成遺伝子であるマンノシダーゼアルファクラス１Ａメンバー１（ＭＡＮ１Ａ１）のノックアウトを含む。一実施形態では、プロデューサー細胞のグリカン修飾は、マンノース生合成遺伝子であるマンノシダーゼアルファクラス２Ａメンバー１（ＭＡＮ２Ａ１）のノックアウトを含む。
【０３０５】
グリカン修飾は、プロデューサー細胞または単離もしくは精製されたＥＶ、例えばエキソソームの脱グリコシル化または脱シアリル化であってもよい。ＥＶ、例えばエキソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入前またはＳＴＩＮＧアゴニストの封入後にグリカン修飾され得る。プロデューサー細胞またはＥＶ、例えばエキソソームは、未修飾プロデューサー細胞またはＥＶ、例えばエキソソームと比べて約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以上グリカン修飾（例えば、脱グリコシル化、または脱シアリル化）され得る。プロデューサー細胞またはＥＶ、例えばエキソソームは、未修飾プロデューサー細胞またはＥＶ、例えばエキソソームと比べて９５〜１００％、９０〜９５％、８５〜９５％、８０〜８５％、７５〜８０％、７０〜７５％、６５〜７０％、６０〜６５％、５５〜６０％、５０〜５５％、４５〜５０％、４０〜４５％、３５〜４０％、３０〜３５％、２５〜３０％、２０〜２５％、１５〜２０％、１０〜１５％、または５〜１０％グリカン修飾され得る。
【０３０６】
プロデューサー細胞またはＥＶ、例えばエキソソームは、化学的、酵素的、または遺伝子編集技法を介してグリカン修飾され得る。グリカン修飾は、プロデューサー細胞を、プロデューサー細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、またはシチジリルトランスフェラーゼ酵素を改変するか、または阻害する化学物質、小分子、または酵素で処理して、グリカン修飾されたプロデューサー細胞に由来するＥＶ、例えばエキソソームをもたらすことを含んでもよい。グリカン修飾はまた、ＥＶ、例えばエキソソームを、小分子阻害剤、またはシアリダーゼもしくはノイラミニダーゼ酵素等のグリコシドヒドロラーゼ等の、ＥＶ表面上のグリカンを改変する化学物質または酵素で処理すること、ならびに任意の他の適切な化学的または酵素的グリカン修飾処理を含んでもよい。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞またはＥＶ、例えばエキソソームは、キフネンシンでの処理を介してグリカン修飾される。キフネンシンは、マンノシダーゼＩが前駆体糖タンパク質からマンノース残基を除去することを阻害するマンノシダーゼＩ阻害剤である。細胞のキフネンシンでの処理は、末端マンノース残基を有する糖タンパク質をもたらす。使用され得る別のマンノシダーゼＩ阻害剤は、１−デオキシマンノジリマイシンである。スワインソニン等の、アルファ−マンノシダーゼＩもしくはＩＩまたはベータ−マンノシダーゼ酵素を阻害する他の小分子もまた使用されてもよい。
【０３０８】
いくつかの実施形態は、プロデューサー細胞またはＥＶ、例えばエキソソームの、シアリダーゼ、ノイラミニダーゼ、またはマンノシダーゼ等のグリコシドヒドロラーゼでの処理を含んでもよい。エキソ−α−シアリダーゼ、エンド−α−シアリダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミニダーゼ、シアリダーゼ１、シアリダーゼ２、シアリダーゼ３、もしくはシアリダーゼ４、任意の他の適切なシアリダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意のグリコシドヒドロラーゼが使用されてもよい。
【０３０９】
加えて、グリカン修飾は、プロデューサー細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、またはシチジリルトランスフェラーゼ酵素のノックアウトまたはノックダウン等の改変されたグリカン酵素発現を有するように、適切なゲノム編集技法を介してプロデューサー細胞を遺伝子改変することを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、もしくはＣ２ｃ３、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹもしくはＣａｓＸ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼもしくはＴＡＬＥＮ、または亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意のゲノム編集技法が使用されてもよい。
【０３１０】
改変され得る例となる遺伝子には、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＡＳ）、ならびにマンノース生合成遺伝子マンノシダーゼアルファクラス１Ａメンバー１（ＭＡＮ１Ａ１）及びマンノシダーゼアルファクラス２Ａメンバー１（ＭＡＮ２Ａ１）が含まれる。
【０３１１】
グリカン修飾型ＥＶ、例えばエキソソームはまた、同じくグリカン修飾されたＰＴＧＦＲＮ過剰発現プロデューサー細胞株に由来してもよい。かかる例では、プロデューサー細胞株は、ＰＴＧＦＲＮ遺伝子及び遺伝子産物を発現するように、ならびに改変されたグリカントランスフェラーゼ酵素発現を有するように、形質転換されるか、トランスフェクトされるか、形質導入されるか、またはその他の方法で遺伝子修飾されてもよい。一実施形態では、プロデューサー細胞は、ＰＴＧＦＲＮ遺伝子及び遺伝子産物を過剰発現するように、ならびにシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子ＣＭＡＳがノックダウンまたはノックアウトされるように改変される。代替として、プロデューサー細胞株は、ＰＴＧＦＲＮ遺伝子及び遺伝子産物を発現するように遺伝子修飾されるとともに、キフネンシン、または当該技術分野で既知の他のマンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、もしくはシチジリルトランスフェラーゼ阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせで処理されて、それによって、ＰＴＧＦＲＮ遺伝子及び遺伝子産物を過剰発現すると同時に、改変されたグリカン発現を有する、プロデューサー細胞をもたらしてもよい。
【０３１２】
ＩＩＩ．ＳＴＩＮＧアゴニストを有するＥＶの生産方法
ＩＩＩ．Ａ．ＳＴＩＮＧアゴニストをＥＶ中に封入するための方法
ＳＴＩＮＧアゴニストは、当該技術分野で既知の任意の適切な技法を介して、ＥＶ、例えばエキソソーム中に封入することができる。生体分子をＥＶ、例えばエキソソームの中に負荷する全ての既知の様態が、本明細書における使用に好適であると考えられることが企図される。かかる技法には、受動的拡散、エレクトロポレーション、化学的もしくはポリマートランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊もしくは機械的せん断、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＥＶ、例えばエキソソームは、封入の間に適切な緩衝液中でインキュベートされてもよい。
【０３１３】
一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、受動的拡散によってＥＶ、例えばエキソソームにより封入される。ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＥＶ、例えばエキソソームは、一緒に混合されて、ＳＴＩＮＧアゴニストが小胞の脂質二重層を通って拡散し、それによって、ＥＶ、例えばエキソソーム中に封入されるようになるのに十分な時間枠にわたってインキュベートされてもよい。ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＥＶ、例えばエキソソームは、約１〜３０時間、２〜２４時間、４〜１８時間、６〜１６時間、８〜１４時間、１０〜１２時間、６〜１２時間、１２〜２０時間、１４〜１８時間、または２０〜３０時間、一緒にインキュベートされてもよい。ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＥＶ、例えばエキソソームは、約２時間、４時間、６，時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、または３０時間、一緒にインキュベートされてもよい。
【０３１４】
ＥＶ、例えばエキソソームの溶液の緩衝液の条件もまた、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を最適化するように変更されてもよい。一実施形態では、緩衝液は、ショ糖を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。ＰＢＳは、当業者に周知の緩衝液である。小胞の構造的性質に影響を及ぼすせん断保護剤、粘度調整剤、及び／または溶質等の追加の緩衝液調整もまた使用されてもよい。ＳＴＩＮＧアゴニスト封入の効率を改善するために、膜軟化材料及び分子密集剤等の賦形剤もまた添加されてもよい。緩衝液に対する他の調整には、塩、有機溶媒、小分子、洗剤、双性イオン、アミノ酸、ポリマーの特定のｐＨ範囲及び／または濃度、及び／または複数の濃度を含めた上記の任意の組み合わせが含まれ得る。
【０３１５】
インキュベーション中のＥＶ、例えばエキソソーム及びＳＴＩＮＧアゴニストの溶液の温度が、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を最適化するように変えられてもよい。温度は室温であってもよい。温度は、約１５℃〜９０℃、１５〜３０℃、３０〜５０℃、５０〜９０℃であってもよい。温度は、約１５℃、２０℃、３５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃であってもよい。
【０３１６】
アゴニストとＥＶ、例えばエキソソームとのインキュベーション中のＳＴＩＮＧアゴニストの濃度もまた、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を最適化するように変更されてもよい。アゴニストの濃度は、少なくとも０．０１ｍＭ〜１００ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストであってもよい。アゴニストの濃度は、少なくとも０．０１〜１ｍＭ、１〜１０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、または５０〜１００ｍＭであってもよい。アゴニストの濃度は、少なくとも０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、または１００ｍＭであってもよい。
【０３１７】
ＳＴＩＮＧアゴニストとともにインキュベートされる細胞外粒子の数もまた、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を最適化するように変更されてもよい。精製ＥＶ、例えばエキソソーム粒子の数は、少なくとも約１０６個〜少なくとも約１０２０個の精製小胞の総粒子であってもよい。精製粒子の数は、約１０８〜１０１８個、１０１０〜１０１６個、１０８〜１０１４個、または１０１０〜１０１２個の精製小胞の総粒子であってもよい。精製粒子の数は、少なくとも約１０６個、１０８個、１０１０個、１０１２個、１０１４個、１０１６個、１０１８個、または１０２０個の精製小胞の総粒子であってもよい。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、カチオン性脂質及びポリマー等の合成高分子を用いて好適なプロデューサー細胞中に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１１８−Ｓ１３０（２００５））。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、電荷相互作用を通して１つまたは複数の部分と複合体を形成する。これらの実施形態のいくつかでは、正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞により取り込まれる。いくつかの他の実施形態では、カチオン性ポリマーを用いて、プロデューサー細胞をトランスフェクトすることができる。これらの実施形態のいくつかでは、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレン等の化学物質を用いて、１つまたは複数の部分をプロデューサー細胞に導入することができる。１つまたは複数の部分はまた、粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃、または粒子衝撃技術等の物理的方法を用いてプロデューサー細胞中に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１１８−Ｓ１３０（２００５））。例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子を用いて、プロデューサー細胞のトランスフェクション効率を評価することができる。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、ウイルス形質導入によってプロデューサー細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプマウイルスを含むいくつかのウイルスが、遺伝子導入ビヒクルとして使用され得る。ウイルス媒介性遺伝子導入ビヒクルは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びヘルペスウイルス等のＤＮＡウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターを含む。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、エレクトロポレーションによってプロデューサー細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞膜に一時的な孔を作成して、細胞中への種々の分子の導入を可能にする。いくつかの実施形態では、ポリペプチド及び非ポリペプチド治療剤と同様に、ＤＮＡ及びＲＮＡが、エレクトロポレーションによってプロデューサー細胞中に導入され得る。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、微量注射によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ガラス製マイクロピペットを用いて、１つまたは複数の部分を顕微鏡レベルでプロデューサー細胞中に注射することができる。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、押出しによってプロデューサー細胞に導入される。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、超音波処理によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、高強度音波に曝露され、細胞膜の一時的な破壊を引き起こして、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、細胞融合によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、電気的細胞融合によって導入される。他の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、プロデューサー細胞を融合するために使用される。更なる実施形態では、センダイウイルスが、プロデューサー細胞を融合するために使用される。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、低張溶解によってプロデューサー細胞に導入される。かかる実施形態では、プロデューサー細胞は、低イオン強度緩衝液に曝露され、それらを破裂させて１つまたは複数の部分の負荷を可能にし得る。他の実施形態では、低張溶液に対する制御された透析を用いて、プロデューサー細胞を膨潤させ、プロデューサー細胞膜に孔を作成することができる。プロデューサー細胞は、その後、膜の再封止を可能にする条件に曝露される。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、洗剤処理によってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする孔を作成することによってプロデューサー細胞膜を一時的に損なう穏やかな洗剤で処理される。プロデューサー細胞が負荷された後、洗剤は洗い流され、それによって膜を再封止する。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、１つまたは複数の部分が結合すると受容体及び関連する部分の内部移行を誘導する、表面受容体を有する。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の部分は、濾過によってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞及び１つまたは複数の部分は、プロデューサー細胞より小さい孔径のフィルターに強制的に通されて、プロデューサー細胞膜の一時的な破壊を引き起こし、１つまたは複数の部分がプロデューサー細胞に入ることを可能にする。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、いくつかの凍結融解サイクルに供され、細胞膜破壊をもたらして、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする。
【０３３０】
ＩＶ．ＥＶ精製
本開示のために調製されるＥＶ、例えばエキソソームは、プロデューサー細胞から単離することができる。ＥＶ、例えばエキソソームの単離の全ての既知の様態が、本明細書における使用に好適であると考えられることが企図される。例えば、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるい等）、密度（例えば、通常遠心分離または勾配遠心分離）、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ定数（例えば、外力を伴うまたは伴わない沈降等）に基づく分離を含めて、ＥＶ、例えばエキソソームの物理的性質が、培地または他の供給源材料からそれらを分離するために採用されてもよい。代替として、または追加として、単離は、１つまたは複数の生物学的性質に基づいてもよく、表面マーカーを採用し得る方法を含んでもよい（例えば、沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合等）。なおも更なる企図される方法では、ＥＶ、例えばエキソソームはまた、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合を含めた化学的及び／または物理的方法を用いて融合されてもよい。
【０３３１】
ＥＶ、例えばエキソソームはまた、ＳＴＩＮＧアゴニストとのインキュベーション後に精製して、封入されていない遊離ＳＴＩＮＧアゴニストを組成物から除去してもよい。ＥＶ、例えばエキソソームの物理的または生物学的性質に基づく分離を含む、以前に開示された方法の全ての様態もまた、本明細書における使用に好適であると考えられる。
【０３３２】
単離、精製、及び濃縮は、一般的かつ非選択的様態（典型的には連続遠心分離を含む）で行われ得る。代替として、単離、精製、及び濃縮は、より特異的かつ選択的様態（例えば、プロデューサー細胞特異的表面マーカーを用いて）で行われ得る。例えば、特異的表面マーカーが、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、親和性精製、磁気分離のためのビーズ結合リガンド等において使用されてもよい。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、ＥＶ、例えばエキソソームを単離または精製することができる。サイズ排除クロマトグラフィー技法は、当該技術分野で既知である。例となる非限定的な技法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ボイド容積画分が単離され、これは目的とするＥＶ、例えばエキソソームを含む。いくつかの実施形態では、例えば、密度勾配遠心分離を利用して、ＥＶ、例えばエキソソームを更に単離することができる。依然として更に、いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞由来のＥＶ、例えばエキソソームを、他の起源のＥＶから更に分離することが望ましい場合がある。例えば、プロデューサー細胞由来のＥＶ、例えばエキソソームは、プロデューサー細胞に特異的な抗原抗体を用いた免疫吸着剤捕捉により、非プロデューサー細胞由来のＥＶ、例えばエキソソームから分離され得る。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームの単離は、サイズ排除クロマトグラフィー、または陰イオン交換、陽イオン交換等のイオンクロマトグラフィー、またはミックスモードクロマトグラフィーを伴い得る。いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームの単離は、脱塩、透析、接線流濾過、限外濾過、もしくは透析濾過、またはそれらの任意の組み合わせを伴い得る。いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームの単離は、示差遠心分離、サイズに基づく膜濾過、濃度及び／または速度ゾーン遠心分離を含むが、これらに限定されない方法の組み合わせを伴い得る。いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームの単離は、１つまたは複数の遠心分離ステップを伴い得る。遠心分離は、約５０，０００〜１５０，０００×ｇで行われてもよい。遠心分離は、約５０，０００×ｇ、７５，０００×ｇ、１００，０００×ｇ、１２５，０００×ｇ、または１５０，０００×ｇで行われてもよい。
【０３３５】
Ｖ．治療的投与
Ｖ．Ａ．免疫調節及び投薬量
本明細書において、薬学的有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームを投与することによる、対象における免疫応答または炎症性応答の誘導方法及び／または調節方法が提供される。
【０３３６】
樹状細胞（ＤＣ）は、自然免疫系及び適応免疫系を連結させる造血細胞系列に由来する抗原提示細胞の集団である。ＤＣは、単球及びマクロファージと共通の骨髄前駆体を共有し、一般に、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）、及び古典的ＤＣ（ｃＤＣ）としても知られる骨髄ＤＣ（ｍＤＣ）の２つの主要な群に分けられる。ｍＤＣは、骨髄前駆体またはリンパ球前駆体からのそれらの発生、ならびにＣＤ８α、ＣＤ４、及びＣ１１ｂの発現レベルに基づいて更に分類される。ＤＣの第３の集団は、ｐＤＣ及びｃＤＣのようなＤＣ始原細胞ではなく、単球前駆体から生じる単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）である。ｍｏＤＣは、炎症性の合図を受け取った後に発生する。未熟ＤＣは、成熟前には末梢組織に常在する。パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって誘導されるシグナル伝達カスケードを含めた、いくつかのシグナル伝達経路がＤＣの成熟につながる。未熟ＤＣの各サブセットは、ＰＲＲのタンパク質発現パターンが様々であり、このことが、同じＰＲＲの活性化に際して未熟ＤＣ集団が異なって応答することを可能にする。これは、ＤＣによって媒介される免疫応答の調節をもたらす。ＤＣにおいて提示されるＰＲＲには、トル様受容体（ＴＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体、レチノイン酸誘導性遺伝子（ＲＩＧ）−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、及びＳＴＩＮＧが含まれる。
【０３３７】
ＳＴＩＮＧ経路は、ｍＤＣ及びｐＤＣの両方において優勢なＤＮＡ感知経路である。ＤＣにおけるＳＴＩＮＧ経路の活性化は、ＴＢＫ１、ＩＲＦ３、及びＮＦ−κＢシグナル伝達を介したＩ型ＩＦＮ及び炎症促進性サイトカインの産生をもたらす。ＩＦＮの細胞上のそれらの受容体への結合は、ＩＦＮ刺激応答要素の活性化及びＩＦＮ感受性遺伝子の転写をもたらし、これが免疫応答及び炎症性応答をもたらす。ＩＦＮシグナル伝達はまた、ＤＣをクロスプライムして、抗原の存続（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）を促進し、ＭＨＣＩ提示に利用可能な抗原レパートリーを変化させ、ＭＨＣＩによる抗原提示を強化し、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ならびに共刺激分子であるＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の全体的な表面発現を増加させる。これらの作用は、腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のプライミングの増加及び適応免疫応答の発動をもたらす。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入している及び／またはＳＴＩＮＧアゴニストを表面上に発現しているＥＶ、例えばエキソソームの、それを必要とする対象への投与方法は、樹状細胞を活性化するか、または誘導し、それによって、対象において免疫応答または炎症性応答を誘導するか、または調節する。いくつかの実施形態では、活性化される樹状細胞は、骨髄樹状細胞である。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、形質細胞様樹状細胞である。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、該方法は、インターフェロン（ＩＦＮ）−β産生を誘導する。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して２倍〜１０，０００倍高いＩＦＮ−βの誘導をもたらし得る。（例えば、封入されるか、または表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して約２〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、または９０００〜１０，０００倍高いＩＦＮ−βの誘導をもたらし得る。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して約２倍超、＞５倍、＞１０倍、＞２０倍、＞３０倍、＞４０倍、＞５０倍、＞６０倍、＞７０倍、＞８０倍、＞９０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞３００倍、＞４００倍、＞５００倍、＞６００倍、＞７００倍、＞８００倍、＞９００倍、＞１０００倍、＞２０００倍、＞３０００倍、＞４０００倍、＞５０００倍、＞６０００倍、＞７０００倍、＞８０００倍、＞９０００倍、または＞１０，０００倍のＩＦＮ−βの誘導をもたらし得る。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象のベースラインＩＦＮ−β産生と比較して２倍〜１０，０００倍高いＩＦＮ−βの誘導をもたらし得る。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象のベースラインＩＦＮ−β産生と比較して約２〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、または９０００〜１０，０００倍高いＩＦＮ−βの誘導をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象のベースラインＩＦＮ−β産生と比較して約２倍超、＞５倍、＞１０倍、＞２０倍、＞３０倍、＞４０倍、＞５０倍、＞６０倍、＞７０倍、＞８０倍、＞９０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞３００倍、＞４００倍、＞５００倍、＞６００倍、＞７００倍、＞８００倍、＞９００倍、＞１０００倍、＞２０００倍、＞３０００倍、＞４０００倍、＞５０００倍、＞６０００倍、＞７０００倍、＞８０００倍、＞９０００倍、または＞１０，０００倍のＩＦＮ−βの誘導をもたらし得る。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソームの、対象への投与はまた、他の免疫調節因子（例えば、サイトカインまたはケモカイン）のレベルも制御し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ９、及び／またはＣＸＣＬ１０のレベルを増加させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＥＶ、例えばエキソソームの投与（は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して約２〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、または９０００〜１０，０００倍高い量のＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ９、及び／またはＣＸＣＬ１０をもたらすことができる。
【０３４１】
いくつかの実施形態では、該方法は、骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）活性化を誘導する。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して２倍〜５０，０００倍高いｍＤＣ活性化をもたらし得る。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して約２〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、９０００〜１０，０００倍、１０，０００〜１５，０００倍、１５，０００〜２０，０００倍、２０，０００〜２５，０００倍、２５，０００〜３０，０００倍、３０，０００〜３５，０００倍、３５，０００〜４０，０００倍、４０，０００〜４５，０００倍、または４５，０００〜５０，０００倍高いｍＤＣ活性化をもたらし得る。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して約２倍超、＞５倍、＞１０倍、＞２０倍、＞３０倍、＞４０倍、＞５０倍、＞６０倍、＞７０倍、＞８０倍、＞９０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞３００倍、＞４００倍、＞５００倍、＞６００倍、＞７００倍、＞８００倍、＞９００倍、＞１０００倍、＞２０００倍、＞３０００倍、＞４０００倍、＞５０００倍、＞６０００倍、＞７０００倍、＞８０００倍、＞９０００倍、＞１０，０００倍、＞１５，０００倍、＞２０，０００倍、＞２５，０００倍、＞３０，０００倍、＞３５，０００倍、＞４０，０００倍、＞４５，０００倍、または＞５０，０００倍のｍＤＣ活性化をもたらし得る。
【０３４２】
（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象のベースラインｍＤＣ活性化と比較して２倍〜１０，０００倍高いｍＤＣ活性化をもたらし得る。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象のベースラインｍＤＣ活性化と比較して約２〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、９０００〜１０，０００倍、１０，０００〜１５，０００倍、１５，０００〜２０，０００倍、２０，０００〜２５，０００倍、２５，０００〜３０，０００倍、３０，０００〜３５，０００倍、３５，０００〜４０，０００倍、４０，０００〜４５，０００倍、または４５，０００〜５０，０００倍高いｍＤＣ活性化をもたらし得る。（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象のベースラインｍＤＣ活性化と比較して約２倍超、＞５倍、＞１０倍、＞２０倍、＞３０倍、＞４０倍、＞５０倍、＞６０倍、＞７０倍、＞８０倍、＞９０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞３００倍、＞４００倍、＞５００倍、＞６００倍、＞７００倍、＞８００倍、＞９００倍、＞１０００倍、＞２０００倍、＞３０００倍、＞４０００倍、＞５０００倍、＞６０００倍、＞７０００倍、＞８０００倍、＞９０００倍、＞１０，０００倍、＞１５，０００倍、＞２０，０００倍、＞２５，０００倍、＞３０，０００倍、＞３５，０００倍、＞４０，０００倍、＞４５，０００倍、または＞５０，０００倍のｍＤＣ活性化をもたらし得る。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与方法は、対象のベースライン単球活性化と比較したときに単球活性化を誘導しない。いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象のベースライン単球活性化と比べて約２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、＜５０，０００倍、＜５５，０００倍、＜６０，０００倍、＜６５，０００倍、＜７０，０００倍、＜７５，０００倍、＜８０，０００倍、＜８５，０００倍、＜９０，０００倍、＜９５，０００倍、＜１００，０００倍、＜２００，０００倍、＜３００，０００倍、＜４００，０００倍、＜５００，０００倍、＜６００，０００倍、＜７００，０００倍、＜８００，０００倍、＜９００，０００倍、または＜１，０００，０００倍の単球活性化の誘導をもたらす。いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの、対象への投与は、対象のベースライン単球活性化と比べて約２倍未満〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、９０００〜１０，０００倍、１０，０００〜１５，０００倍、１５，０００〜２０，０００倍、２０，０００〜２５，０００倍、２５，０００〜３０，０００倍、３０，０００〜３５，０００倍、３５，０００〜４０，０００倍、４０，０００〜４５，０００倍、４５，０００〜５０，０００倍、５５，０００〜６０，０００倍、６０，０００〜６５，０００倍、６５，０００〜７０，０００倍、７０，０００〜７５，０００倍、７５，０００〜８０，０００倍、８０，０００〜８５，０００倍、８５，０００〜９０，０００倍、９０，０００〜９５，０００倍、９５，０００〜１００，０００倍、１００，０００〜２００，０００倍、２００，０００〜３００，０００倍、３００，０００〜４００，０００倍、４００，０００〜５００，０００倍、５００，０００〜６００，０００倍、６００，０００〜７００，０００倍、７００，０００〜８００，０００倍、８００，０００〜９００，０００倍、または９００，０００〜１，０００，０００倍の単球活性化の誘導をもたらす。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの、対象への投与方法は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較したときに単球活性化を誘導しない。いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与後の単球活性化の量と比べて約２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、または＜５０，０００倍の単球活性化の誘導をもたらす。いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの、対象への投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与後の単球活性化の量と比べて約２倍未満〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、９０００〜１０，０００倍、１０，０００〜１５，０００倍、１５，０００〜２０，０００倍、２０，０００〜２５，０００倍、２５，０００〜３０，０００倍、３０，０００〜３５，０００倍、３５，０００〜４０，０００倍、４０，０００〜４５，０００倍、または４５，０００〜５０，０００倍の単球活性化の誘導をもたらす。単球活性化は、単球上でのＣＤ８６の表面発現によって、または当該技術分野で既知の任意の他の適切な単球活性化マーカーによって測定されてもよい。
【０３４５】
本明細書に記載されるＥＶ、例えばエキソソームに関連する改善された治療効果の故に、いくつかの実施形態では、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較してより低い投薬量の、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームが送達され得る。その上、高用量のＳＴＩＮＧアゴニストの非選択的送達は、望ましい免疫刺激応答を減弱させる場合がある。したがって、本明細書に記載されるＥＶ、例えばエキソソームはより低い用量で投与され得るため、いくつかの実施形態では、それらはより広い治療域で働き、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで観察される不利点（例えば、全身毒性、免疫細胞殺傷性、細胞選択性の欠如）を低減することができる。
【０３４６】
本明細書に記載される組成物は、それを必要とする対象の疾患、障害、病態、または症状を改善するのに十分な投薬量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、必要とする対象に投与されるＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投薬量は、約０．０１〜０．１μＭ、０．１〜１μＭ、１〜１０μＭ、１０〜１００μＭ、または１００〜１０００μＭである。ある特定の実施形態では、必要とする対象に投与されるＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投薬量は、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、４０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭ、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、６５０μＭ、７００μＭ、７５０μＭ、８００μＭ、８５０μＭ、９００μＭ、９５０μＭ、または１０００μＭである。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、必要とする対象に投与される（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの量は、必要とする対象において同じ改善結果をもたらすのに必要とされる遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの量と比べて２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、または＜５０，０００倍である。いくつかの実施形態では、必要とする対象に投与される（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの量は、必要とする対象において同じ改善結果をもたらすのに必要とされる遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの量と比べて約２倍未満〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、９０００〜１０，０００倍、１０，０００〜１５，０００倍、１５，０００〜２０，０００倍、２０，０００〜２５，０００倍、２５，０００〜３０，０００倍、３０，０００〜３５，０００倍、３５，０００〜４０，０００倍、４０，０００〜４５，０００倍、または４５，０００〜５０，０００倍低い。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与方法は、対象のベースライン全身性炎症と比較したときに全身性炎症を誘導しない。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象のベースライン全身性炎症と比べて約２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、または＜５０，０００倍の全身性炎症の誘導をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの、対象への投与は、対象のベースライン全身性炎症と比べて約２倍未満〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、９０００〜１０，０００倍、１０，０００〜１５，０００倍、１５，０００〜２０，０００倍、２０，０００〜２５，０００倍、２５，０００〜３０，０００倍、３０，０００〜３５，０００倍、３５，０００〜４０，０００倍、４０，０００〜４５，０００倍、または４５，０００〜５０，０００倍の全身性炎症の誘導をもたらす。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの、対象への投与方法は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較したときに全身性炎症を誘導しない。いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与後の全身性炎症の量と比べて約２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、または＜５０，０００倍の全身性炎症の誘導をもたらす。いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの、対象への投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与後の全身性炎症の量と比べて約２倍未満〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜６０倍、６０〜７０倍、７０〜８０倍、８０〜９０倍、９０〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜３００倍、３００〜４００倍、４００〜５００倍、５００〜６００倍、６００〜７００倍、７００〜８００倍、８００〜９００倍、９００〜１０００倍、１０００〜２０００倍、２０００〜３０００倍、３０００〜４０００倍、４０００〜５０００倍、５０００〜６０００倍、６０００〜７０００倍、７０００〜８０００倍、８０００〜９０００倍、９０００〜１０，０００倍、１０，０００〜１５，０００倍、１５，０００〜２０，０００倍、２０，０００〜２５，０００倍、２５，０００〜３０，０００倍、３０，０００〜３５，０００倍、３５，０００〜４０，０００倍、４０，０００〜４５，０００倍、または４５，０００〜５０，０００倍の全身性炎症の誘導をもたらす。全身性炎症は、当該技術分野で既知の任意の適切な方法によって定量または測定されてもよい。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームの、対象への投与方法は追加として、追加の治療剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、免疫調節剤である。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、負のチェックポイント制御因子に対する阻害剤、または負のチェックポイント制御因子の結合パートナーに対する阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、負のチェックポイント制御因子は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３）、Ｂリンパ球及びＴリンパ球減弱因子（Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される。種々の実施形態では、追加の治療剤は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の全抗体、ポリクローナル、モノクローナル、及び組換え抗体、それらの断片であり、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチド等の、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片を更に含む。抗体という用語は、それらが所望の生物学的活性または機能を示す限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ３の阻害剤である治療用抗体またはその抗原結合断片である。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、Ｔ細胞疲弊を予防するか、または処置する薬剤である。かかる薬剤は、Ｐｒｄｍ１、Ｂｈｌｈｅ４０、Ｉｒｆ４、Ｉｋｚｆ２、Ｚｅｂ２、Ｌａｓｓ６、Ｅｇｒ２、Ｔｏｘ、Ｅｏｍｅｓ、Ｎｆａｔｃ１、Ｎｆａｔｃ２、Ｚｂｔｂ３２、Ｒｂｐｊ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌａｇ３、Ｔｎｆｒｓｆ９、Ｐｔｇｅｒ２、Ｈａｖｃｒ２、Ａｌｃａｍ、Ｔｉｇｉｔ、Ｃｔｌａ４、Ｐｔｇｅｒ４、Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ、Ｃｃｌ４、ＣＤ１０９、ＣＤ２００、Ｔｎｆｓｆ９、Ｎｒｐ１、Ｓｅｍａ４ｃ、Ｐｔｐｒｊ、Ｉｌ２１、Ｔｓｐａｎ２、Ｒｇｓ１６、Ｓｈ２ｄ２ａ、Ｎｕｃｂ１、Ｐｌｓｃｒ１、Ｐｔｐｎ１１、Ｐｒｋｃａ、Ｐｌｓｃｒ４、Ｃａｓｐ３、Ｇｐｄ２、Ｇａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ１、Ｎｈｅｄｃ２、Ｐｌｅｋ、Ｔｎｆａｉｐ２、及びＣｔｓｂ、またはそれらの任意の組み合わせを含めた、Ｔ細胞疲弊に関連する遺伝子の発現を増加させ得るか、減少させ得るか、または調節し得る。治療剤はまた、ＮＦＡＴ−１またはＮＦＡＴ−２を含めた、Ｔ細胞疲弊に関連するタンパク質を増加させ得るか、減少させ得るか、または調節し得る。
【０３５２】
Ｖ．Ｂ．がんの処置方法
本明細書において、対象におけるがんの処置方法が提供される。該方法は、対象に治療上有効量の本明細書に開示される組成物を投与することを含み、該組成物は、対象においてＳＴＩＮＧ媒介性免疫応答を上方制御し、それによって、対象の免疫系の腫瘍標的化を強化することができる。いくつかの実施形態では、該組成物は、対象に腫瘍内投与される。いくつかの実施形態では、該組成物は、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、または任意の他の適切な投与経路を介して投与される。
【０３５３】
また、本明細書において、対象におけるがんの転移の予防方法も提供される。該方法は、対象に治療上有効量の本明細書に開示される組成物を投与することを含み、該組成物は、対象における１つの場所での１つまたは複数の腫瘍が対象における別の場所での１つまたは複数の腫瘍の増殖を促進することを予防することができる。いくつかの実施形態では、該組成物は、１つの場所の第１の腫瘍において腫瘍内投与され、第１の腫瘍において投与された該組成物が、第２の場所での１つまたは複数の腫瘍の転移を予防する。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソームの投与は、対象において腫瘍増殖を阻害及び／または低減する。いくつかの実施形態では、腫瘍増殖（例えば、腫瘍体積または重量）は、参照（例えば、遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニストを有しないＥＶ、例えばエキソソームの投与後の対応する対象における腫瘍体積）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、処置されているがんは、白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）の腫瘍微小環境への浸潤、またはいわゆる「熱い腫瘍（ｈｏｔ  ｔｕｍｏｒ）」もしくは「炎症性腫瘍」を特徴とする。いくつかの実施形態では、処置されているがんは、腫瘍微小環境への低レベルもしくは検出不能なレベルの白血球浸潤、またはいわゆる「冷たい腫瘍（ｃｏｌｄ  ｔｕｍｏｒ）」もしくは「非炎症性腫瘍」を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、「冷たい腫瘍」を「熱い腫瘍」に変換するのに十分な量及び時間投与され、すなわち、該投与は、白血球（Ｔ細胞等）の腫瘍微小環境への浸潤をもたらす。ある特定の実施形態では、がんは、膀胱癌、子宮頸癌、腎細胞癌、精巣癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、及び卵巣、リンパ腫、肝臓癌、膠芽腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、膵臓癌、またはそれらの組み合わせを含む。本明細書で使用される「遠位腫瘍」または「遠隔腫瘍」という用語は、元の（または原発）腫瘍から遠隔臓器または遠隔組織、例えば、リンパ節に広がった腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、転移性で広がった後の腫瘍を処置する。
【０３５６】
本明細書に開示される方法で処置され得るがん（または腫瘍）の非限定的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、消化管癌、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、卵巣癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、大腸癌、及び頭頸部癌（または癌腫）、胃癌、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫等の転移性悪性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門部の癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、食道の癌（例えば、食道胃接合部癌）、小腸の癌、内分泌系の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児期の固形腫瘍、尿管の癌、腎盂の癌腫、腫瘍血管新生、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、石綿によって誘導されるがん、ウイルス関連がん、またはウイルス起源のがん（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ関連またはＨＰＶ起源の腫瘍））を含めた環境に誘導されるがん、ならびに２つの主要な血液細胞系列、すなわち、骨髄細胞株（これは顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、及び肥満細胞を産生する）またはリンパ球系細胞株（これはＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び形質細胞を産生する）のいずれかに由来する血液悪性腫瘍、例えば、全ての種類の白血病、リンパ腫、及び骨髄腫、例えば、急性、慢性リンパ球性及び／または骨髄性白血病、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化型ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽球性白血病（Ｍｌ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２、細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３バリアント［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増多を伴うＭ４バリアント［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、孤立性顆粒球性肉腫、及び緑色腫；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞血液悪性腫瘍、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞様リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ１＋）大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；ならびにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真の組織球性リンパ腫（ｔｒｕｅ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ球系列の造血器腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、��まん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉腫またはセザリー症候群とも呼ばれる）、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞様リンパ腫（ＬＰＬ）；骨髄腫、例えば、ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（低悪性度骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫（ｐｌａｓｍｏｃｙｔｏｍａ）、及び多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞リンパ腫；骨髄系列の造血器腫瘍、線維肉腫及び横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｃｏｍａ）を含めた間葉起源の腫瘍；精上皮腫、奇形癌、線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｏｍａ）、及び骨肉腫を含めた間葉起源の腫瘍；ならびに、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌及び奇形癌、リンパ球系列の造血器腫瘍、例えば、Ｔ細胞障害、例えば、小細胞及び大脳様細胞型（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ）のものを含むＴ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むが、これらに限定されないＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；及びＴ−ＮＨＬ肝脾型リンパ腫；末梢性／成熟（ｐｏｓｔ−ｔｈｙｍｉｃ）Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管中心性（鼻型）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄性リンパ腫を含めた、他の腫瘍、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、処置され得るがん（または腫瘍）は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎臓癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、腹膜癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、消化管癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、本開示で処置され得るがんは、膵臓癌及び／または腹膜癌である。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法はまた、転移性がん、切除不能、不応性がん（例えば、以前のがん療法に不応性のがん）、及び／または再発がんの処置にも使用することができる。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソームは、１つまたは複数の追加の抗がん剤及び／または免疫調節剤と併用することができる。かかる薬剤には、例えば、所与のがんに対する免疫応答を刺激する化学療法薬、小分子薬、または抗体が含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、標準治療による処置（例えば、外科手術、放射線、及び化学療法）と併用される。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるがんの処置方法は、免疫経路の複数の要素が標的とされ得るように、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えばエキソソームを、１つまたは複数のがん免疫療法薬とともに投与することを含むことができる。非限定的なかかる組み合わせには、腫瘍抗原提示を強化する療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド）；例えば、ＣＴＬＡ−４及び／またはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路を阻害すること、及び／またはＴレグもしくは他の免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来の抑制細胞）を枯渇させるかもしくは遮断することによって、負の免疫制御を阻害する療法；例えば、ＣＤ−１３７、ＯＸ−４０、及び／またはＣＤ４０またはＧＩＴＲ経路を刺激する、及び／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストにより、正の免疫制御を刺激する療法；抗腫瘍Ｔ細胞の存在比率（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を全身的に増加させる療法；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト（例えば、ダクリズマブ）を用いて、またはエクスビボでの抗ＣＤ２５ビーズによる枯渇によって、腫瘍におけるＴレグ等のＴレグを枯渇させるかまたは阻害する療法；腫瘍における抑制骨髄細胞の機能に影響を及ぼす療法；腫瘍細胞の免疫原性を強化する療法（例えば、アントラサイクリン）；遺伝子修飾細胞、例えば、キメラ抗原受容体によって修飾された細胞（ＣＡＲ−Ｔ療法）を含む養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入；インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼ、または一酸化窒素シンテターゼ等の代謝酵素を阻害する療法；Ｔ細胞アネルギーまたは疲弊を回復させる／予防する療法；腫瘍部位での自然免疫活性化及び／または炎症を誘発する療法；免疫刺激サイトカインの投与；または免疫抑制サイトカインの遮断が含まれる。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソームと併用することができるがん免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害剤（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介したシグナル伝達を遮断する）を含む。本方法で使用することができる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体）、ＰＤ−１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、ＴＩＭ−３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ−３抗体）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、がん免疫療法剤は、免疫チェックポイント活性化剤（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介したシグナル伝達を促進する）を含む。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント活性化剤は、ＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）、ＬＡＧ−３アゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ−３抗体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト（例えば、抗ＣＤ１３７抗体）、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソームと、本明細書で考察される第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物として同時に投与することができる。他の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームと、本明細書で考察される第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせは、別々の組成物として同時に投与することができる。更なる実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームと、本明細書で考察される第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせは、順次に投与することができる。いくつかの実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）の投与前に投与される。
【０３６４】
Ｖ．Ｃ．薬学的組成物
本明細書において、対象への投与に好適である、ＥＶ、例えばエキソソームを含む薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、一般に、（例えば、封入されるか、または内腔表面もしくは外表面上に発現された）ＳＴＩＮＧアゴニストを含む複数のＥＶ、例えばエキソソームと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを、対象への投与に好適な形態で含む。薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的には、投与されようとしている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、複数のＥＶ、例えばエキソソームを含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８ｔｈ  ｅｄ．（１９９０）を参照されたい）。薬学的組成物は、一般に、滅菌して、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して製剤化される。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストと、本明細書に記載されるＥＶ、例えばエキソソームとを含む。
【０３６６】
薬学的に許容される賦形剤には、獣医学的使用ならびにヒトの薬学的使用に対して許容される賦形剤を含めた、一般に安全で（ＧＲＡＳ）、無毒、かつ望ましい賦形剤が含まれる。
【０３６７】
担体または希釈剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び化合物の使用は、当該技術分野で周知である。いずれかの従来の媒体または化合物が、本明細書に記載されるＥＶ、例えばエキソソームと不適合性でない限り、組成物中でのそれらの使用が企図される。補助的な治療剤もまた、組成物に組み込まれてもよい。典型的には、薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化される。ＥＶ、例えばエキソソームは、腫瘍内、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内経路によって、または吸入剤として投与することができる。一実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームを含む薬学的組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。ＥＶ、例えばエキソソームは、任意選択で、ＥＶ、例えばエキソソームが意図される疾患、障害、または病態を処置する上で少なくとも部分的に有効である他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
【０３６８】
溶液または懸濁液は、以下の成分、すなわち、水、食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌化合物、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化合物、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧の調整のための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整され得る。調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックから作製された複数回用量バイアルに封入され得る。
【０３６９】
注射用の使用に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は、一般に、滅菌されており、容易なシリンジ注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。所望される場合、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、塩化ナトリウムが、組成物に添加され得る。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０３７０】
滅菌注射液は、ＥＶ、例えばエキソソームを、所望されるように、有効量で、かつ本明細書に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に組み込むことによって調製され得る。一般に、分散液は、ＥＶ、例えばエキソソームを、基本的な分散媒及び任意の所望の他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分と、事前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥である。ＥＶ、例えばエキソソームは、ＥＶ、例えばエキソソームの持続放出またはパルス放出を可能にするような様態で製剤化され得る、デポー注射または埋込調製物の形態で投与することができる。
【０３７１】
ＥＶ、例えばエキソソームを含む組成物の全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与の場合、透過すべき障壁に適切な浸透剤が製剤において使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般に既知であり、例えば、経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与の場合、修飾型ＥＶ、例えばエキソソームは、当該技術分野で一般に既知のように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームへと製剤化される。
【０３７２】
このＰＣＴ出願は、２０１８年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／６４７，４９１号、２０１８年６月４日に出願された同第６２／６８０，５０１号、２０１８年６月２２日に出願された同第６２／６８８，６００号、及び２０１８年１１月６日に出願された同第６２／７５６，２４７号の優先権の利益を主張するものであり、これらの各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３７３】
以下の実施例は、例証目的で提供されるにすぎず、決して本発明の範囲または内容を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の実施は、別途指示されない限り、当業者の技能の範囲内の、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、及び薬理学の従来の方法を採用する。かかる技法は、文献において完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２）；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ＆  Ｋａｐｌａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２）；Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  ＆  Ｃａｒｅｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００７）を参照されたい。
【０３７４】
方法
エキソソーム精製
ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を既知組成培地中で７日間、高密度になるまで増殖させた。馴化細胞培養培地を回収し、室温で５分間、３００〜８００×ｇで遠心分離して、細胞及び大きな破片を除去した。次いで、培地上清に１０００Ｕ／ＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を補充し、水浴中、３７℃で１時間インキュベートした。上清を回収し、４℃で３０分間、１６，０００×ｇで遠心分離して、残留細胞破片及び他の大きな夾雑物を除去した。次いで、上清を４℃で３時間、１３３，９００×ｇで超遠心分離して、エキソソームをペレット状にした。上清を破棄し、いずれの残留培地も管の底から吸引した。ペレットを２００〜１０００μＬのＰＢＳ（−Ｃａ  −Ｍｇ）中に再懸濁した。
【０３７５】
エキソソーム集団を更に濃縮するために、ペレットを、密度勾配精製（ショ糖またはＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標））を介して処理した。ショ糖勾配精製のために、エキソソームペレットを、下記の表３に規定されるようにショ糖勾配液の上層に重層した。
【表３】
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【０３７６】
勾配液を、ＳＷ  ４１  Ｔｉローターに配置した１２ｍＬ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）管中、４℃で１６時間、２００，０００×ｇでスピンして、エキソソーム画分を分離させた。
【０３７７】
エキソソーム層を上層から穏やかに取り出し、３８．５ｍＬ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）管中、約３２．５ｍＬのＰＢＳ中に希釈し、４℃で３時間、１３３，９００×ｇで再び超遠心分離して、精製エキソソームをペレット状にした。結果として得られたペレットを最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁し、４℃で貯蔵した。
【０３７８】
ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配の場合、ＳＷ  ４１  Ｔｉローター用の１２ｍＬ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）管中、等体積の１０％、３０％、及び４５％ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）により３段の滅菌勾配液を調製する。ペレットをＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配液に添加し、４℃で１６時間、２００，０００×ｇで超遠心分離して、エキソソーム画分を分離させた。次いで、エキソソーム層を管の上層約３ｍＬから穏やかに回収した。
【０３７９】
エキソソーム画分を３８．５ｍＬ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）管中、約３２ｍＬのＰＢＳ中に希釈し、４℃で３時間、１３３，９００×ｇで超遠心分離して、精製エキソソームをペレット状にした。次いで、ペレット状にしたエキソソームを最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁し、４℃で貯蔵した。
【０３８０】
ＣＩＶＯ（登録商標）によるインビボ腫瘍内微量注射研究
腫瘍細胞培養物
Ａ２０細胞（ＡＴＣＣロット番号７０００６０８２）を、Ｌ−グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、及び５０ナノモル濃度のＢＭＥを含むＲＰＭＩ  １６４０中、摂氏３７度、５％ＣＯ２で培養した。マイコプラズマ不含及び病原体不含状態を確認するために、ＩＭＰＡＣＴ  ＩＩＩ試験（ＩＤＥＸＸ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を実施した。供給元からの入手後に細胞を増殖させ、２〜３回継代した後、凍結保存した。融解後、細胞を、１週間に３回継代培養することによって最大８週間維持し、それ以降は新鮮な凍結原液から継ぎ足した。
【０３８１】
インビボ研究
マウスにおける全ての実験は、ＩＡＣＵＣ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｓａｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ＰＲ−００１））によって承認され、関連するガイドライン及び規制に準拠してＰｒｅｓａｇｅにて行われた。全ての関連する手順は、麻酔下で行われ、疼痛及び苦痛を最小化するよう全ての努力が払われた。平均体重１８グラムの雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）を５〜７週齢で実験に使用した。Ａ２０同種移植片を作出するために、マウスに１００μｌの接種体積で１００万個のＡ２０細胞を接種した。
【０３８２】
ＣＩＶＯ（登録商標）による腫瘍内微量注射
ＣＩＶＯによる腫瘍内微量注射を、Ｋｌｉｎｇｈｏｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅに記載されるように行った。簡潔に述べると、マウス（ｎ＝４時間及び２４時間の時点につき６匹）を、埋め込まれた腫瘍がおよそ以下の直径、すなわち１４ｍｍ（長さ）、１０ｍｍ（幅）、及び７ｍｍ（奥行）に達したときに、微量注射研究に組み入れた。ＣＩＶＯデバイスは、６本の３０ゲージ注射針、送達総体積２．０μｌで設定した。空間的配向を得るためにＰｒｅｓａｇｅの蛍光トラッキングマーカー（ＦＴＭ、５体積％）を注射内容物に添加した。微量注射した薬剤は以下の通りであった：対照ＰＴＧＦＲＮ＋＋  ＧＦＰエキソソーム、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ負荷ＰＴＧＦＲＮ＋＋  ＧＦＰエキソソーム、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ負荷ＰＴＧＦＲＮ＋＋  ＧＦＰ脱シアリル化エキソソーム、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ負荷天然エキソソーム（全て１０ｎｇ／μｌのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡであり、結果的に送達された総量は２０ｎｇであった）。遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡは、２０ｎｇ及び２μｇの両方で微量注射した。バイオマーカー分析のため、ＣＩＶＯ微量注射から４時間及び２４時間で、ＣＯ２吸入を用いてマウスを安楽死させた。
組織学的検査、免疫組織化学的検査、及びインサイツハイブリダイゼーション
【０３８３】
切除した腫瘍を注射カラムに対して直角に、２ｍｍ厚の切片に切り分け、１０％緩衝ホルマリン中に４８時間固定した。ＵＶ画像解析を用いて、各ＣＩＶＯ部位における注射されたＦＴＭからのシグナルに基づいてＣＩＶＯ微量注射を確認した。次いで、２ｍｍ厚の組織切片を標準的なパラフィン包埋用に処理した。４μｍ厚の切片を、下記に記載されるように全ての組織学的アッセイに使用した。標準的方法を用いてヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。
【０３８４】
免疫組織化学的検査
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した腫瘍を厚さ４μｍでスライド上に切り出した。スライドを６０℃で１時間ベーキングし、キシレン中で脱パラフィンし、段階的アルコールを介して再水和した。
【０３８５】
スライドを１００℃で２０分間の標的賦活液でのインキュベーションに供し、続いて２０分間、室温まで冷却させた。血清ブロック（ＴＢＳＴ中５％正常ヤギ血清）を室温で１時間行った。５％のＮＧＳ  ＴＢＳ希釈液中、適切な一次抗体により一次抗体染色を室温で一晩実施した。各バッチにおいて対応するアイソタイプ対照を含めた。５％のＮＧＳ  ＴＢＳ希釈液中、適切な二次抗体により二次抗体染色を室温で一晩実施した。スライドをＤＡＰＩで１０分間対比染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにカバーガラスをかけた。デジタル自動化高解像度スキャナを用いて、染色されたスライドを画像解析した。
【０３８６】
ＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光試薬キットバージョン２（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、インサイツハイブリダイゼーションを完了した。ホルマリン固定し、パラフィン包埋した腫瘍を厚さ４μｍでスライド上に切り出した。スライドを６０℃で１時間ベーキングし、キシレン中で脱パラフィンし、段階的アルコールを介して再水和した。過酸化水素を１０分間添加して、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。スライドを１００℃で１５分間の標的賦活液でのインキュベーションに供し、続いて４０℃で１５分間のプロテアーゼ消化を行った。マウスＩｆｎｂ１プローブ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及びＴＳＡ  Ｐｌｕｓ  Ｃｙａｎｉｎｅ  ５検出（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により、ＲＮＡｓｃｏｐｅ  ＩＳＨアッセイを完了した。スライドをＤＡＰＩで１０分間対比染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにカバーガラスをかけた。デジタル自動化高解像度スキャナを用いて、染色されたスライドを画像解析した。
【０３８７】
全スライドスキャニング及び画像解析
染色された各組織切片からの各々全ての細胞の画像を、デジタル自動化高解像度全組織スキャニング（３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃｈ  Ｐａｎｏｒａｍｉｃ  ２５０  Ｆｌａｓｈ）によって取得した。ＰｒｅｓａｇｅのカスタムＣＩＶＯアナライザ画像解析プラットフォームを用いて、各組織切片からの画像ファイルから腫瘍応答を定量した。スライドスキャナによって取得した全組織切片画像は、ＣＩＶＯアナライザによって自動的に処理された。各組織切片からの各細胞を、核（ＤＡＰＩ）シグナルに基づいて分割し、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いてバイオマーカー陰性または陽性として分類した。細胞の分割及び分類後、各画像において円形の関心領域（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＲＯＩ）を各位置のＦＴＭ周辺の各微量注射部位周辺に局在させ、このうち最大のＲＯＩは半径２０００μｍ以下であった。既存の壊死がバイオマーカー測定値に及ぼす影響を軽減するために、主として無細胞の腫瘍領域内に該当する注射部位を定量分析前に除外する。
【０３８８】
実施例１：エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト
ＳＴＩＮＧアゴニストの封入
ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡアンモニウム塩（ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、カタログ番号ＨＹ−１２８８５Ｂ）及び（３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ−ｎａｃａｉｒｓ）を含む１ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストを、３００ｕｌのＰＢＳ中、精製エキソソーム（１Ｅ１２個の総粒子）とともに３７℃で一晩インキュベートした。次いで、混合物をＰＢＳ中で２回洗浄し、１００，０００×ｇでの超遠心分離によって精製した（図１）。
【０３８９】
環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストの定量
ＬＣ−ＭＳ分析のための試料調製
全ての試料は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中またはＰＢＳ及び５％ショ糖中のいずれかで受け取った。分析前に、粒子濃度（Ｐ／ｍＬ）をＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００におけるナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）によって測定した。各注射が実質的に同一の数の粒子を含有するように全ての標準物質及び試料を調製した。これは、試料の最初の粒子濃度に応じて１．０〜４．０Ｅ＋１１Ｐ／ｍＬの最終濃度に達するように、試料を希釈することと、エキソソームを標準物質中にスパイクすることとを組み合わせることにより達成された。
【０３９０】
既知の濃度のＳＴＩＮＧアゴニストをＰＢＳ緩衝液中にスパイクし、次いで段階希釈により追加の標準物質を調製することによって標準曲線を作成した。別々の標準物質は、典型的に、最終濃度（全ての試料調製ステップ後）が２５、５０、２５０、５００、１２５０、２５００、及び５０００ｎＭのＳＴＩＮＧアゴニストとなるように調製した。まず、７５．０μＬの適切に希釈した各試料及びマトリックスマッチした各標準物質を、別々の１．５ｍＬ微量遠心管中で調製した。次に、２５．０μＬのエキソソーム溶解緩衝液（６０ｍＭのトリス、４００ｍＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＴＣＥＰ、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を各管に添加し、次いで全ての管をボルテックスして混合し、短時間遠心分離して沈降させた。最後に、１．０μＬの濃縮プロテイナーゼＫ酵素溶液（Ｄａｋｏ、照会番号Ｓ３００４）を各管に添加し、再び全ての管をボルテックスし、次いで短時間遠心分離し、続いて５５℃で６０分間インキュベートした。ＬＣ−ＭＳにおける注射前に、試料を室温に冷却させ、ＨＰＬＣバイアルに移した。
【０３９１】
ＬＣ−ＭＳ分析
２０．０μＬの標準物質及び試料を、クリーンアップなしにＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＲＳＣＬｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）低流速クロマトグラフィーシステム中に無希釈で注射した。分析物の分離を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  ＥＶＯ  Ｃ１８コアシェル分析カラム（５０×２．１ｍｍ、粒径２．６μｍ、孔径１００Å）、ならびに５００μＬ／分の流量で移動相Ａ（ＭＰＡ：水、０．１％ギ酸）及び移動相Ｂ（ＭＰＢ：アセトニトリル、０．１％ギ酸）の勾配を送達する負荷用ポンプ（ｌｏａｄｉｎｇ  ｐｕｍｐ）を用いて行った。勾配は２％ＭＰＢで開始し、これを２分間保って、ＳＴＩＮＧアゴニスト分析物を負荷し、脱塩した。次いで、ＭＰＢパーセンテージを３分間かけて２％から３０％に増加させて、ＳＴＩＮＧアゴニスト分析物を溶出させた。次いで、ＭＰＢパーセンテージを１分間かけて３０％から９５％に増加させ、９５％で３分間保ち、１分間かけて９５％から２％に減少させ、次いで２％で更に３分間保って、カラムを再平衡化させた。この方法の合計実行時間は１３分間であり、ＬＣ流動は２．５〜４．５分間のみＭＳへと導かれた。典型的なキャリーオーバーは、先の注射のピーク面積の０．０５％未満であったため、分析注射間でブランク注射は行わなかった。
【０３９２】
Ｉｏｎ  Ｍａｘ源及び負イオンモードで作動するＨＥＳＩ−ＩＩプローブを備えたＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｂａｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計により質量分析を行い、５００〜８００Ｄａの全ＭＳ−ＳＩＭモードスキャニングを用いて質量スペクトルを収集し、このうちＡＧＣ標的は１Ｅ＋６イオン、最大注射時間は２００ｍｓ、分解能は３５，０００であった。ＳＴＩＮＧアゴニストの定量は、６８８．９７〜６８９．１３Ｄａのｍ／ｚ範囲内の全てのイオンを選択的に抽出し、次いで保持時間３．８０〜３．９０分間での結果として得られたピークを積分することによって、モノアイソトピック−１のＳＴＩＮＧアゴニストピークを用いて行った。所与の試料中のＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、相対定量に典型的であるが、その試料中のＳＴＩＮＧアゴニストピーク面積を、標準物質によって生成されたＳＴＩＮＧアゴニストピーク面積と比較することによって決定した。
【０３９３】
実施例２：エキソソーム中に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストの増加した効力
エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストをヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における活性に関して試験した。ＰＢＭＣを新鮮なヒト血液から、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐの層上での遠心分離によって１０００×ｇで１５分間単離した。結果として得られたバフィーコートをＰＢＳ中で洗浄し、計数した。ＰＢＭＣを９６ウェルのＵ底プレートにプレートした。用量応答研究を行うために、エキソソーム封入型（エキソ−ＳＴＩＮＧアゴニスト）または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの漸増用量（Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を別個のＵ底プレート中で調製した。エキソソーム封入型または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストをＰＢＭＣに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。上清中のＩＦＮβの量を測定することによって、ＳＴＩＮＧアゴニストによるＰＢＭＣの全般的な活性化を検出した。図２に示されるように、遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストの両方が、類似した程度に最大ＩＦＮβを誘導した。興味深いことに、エキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストのＥＣ５０は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストに関してよりも約６５倍低く、このことは、エキソソームがＳＴＩＮＧアゴニスト活性の効力を増加させ得ることを示唆する。ＰＢＭＣ中のどの細胞型がエキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストによって差次的に影響を受けるかについて理解するために、単球及び樹状細胞活性化を測定した。図３に示されるように、エキソ−ＳＴＩＮＧアゴニスト処置細胞において最大単球活性化が減弱した一方で、ＥＣ５０が遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して改善された。対照的に、同じくＥＣ５０の改善された効力を達成しながらも、骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）の最大活性化はより高かった（図４）。ｍＤＣ及び単球活性化を、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストまたはエキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストでの処置後の１３のドナー由来のＰＢＭＣ中で測定した。最大ｍＤＣ活性化は、エキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストで、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して有意により高かった一方で、最大単球活性化は有意に減弱した（図５）。これらの結果は、ＰＢＭＣの関連において、ごく一部の骨髄樹状細胞のみが活性化されたことを実証する。追加の化合物を追加しても活性化の量は増加しないため、この結果は飽和可能であり（ｓａｔｕｒａｂｌｅ）、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の限界を例証するものである。対照的に、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストは、有意により高い割合の骨髄樹状細胞を活性化させた。単球は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独によって頑健に活性化され、マイクロモル濃度のアゴニストで９０％超が活性化されるようになった。しかしながら、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストでは、有意により低い割合の単球が活性化される結果となった。単球は、循環中で骨髄樹状細胞よりもはるかに豊富に存在することを考慮すると、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストによる単球のより低い活性化プロファイルは、等量の遊離化合物と比較したときに低減された全身性炎症をもたらし得る。更に、腫瘍に対する適応免疫応答の発動は、主として樹状細胞活性化に依存し、したがって、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストは、化合物単独と比較したときに低減された毒性を伴って、増加した抗腫瘍免疫応答をもたらす可能性が高い。
【０３９４】
異なる免疫細胞型がＳＴＩＮＧアゴニストによって活性化される程度について理解するために  細胞表面上のＣＤ６９の量をフローサイトメトリーにより測定することによって、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞の特異的活性化を評価した。細胞表面上のＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、またはＣＤ８３の量をフローサイトメトリーにより測定することによって、単球、骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、及びＢ細胞を含めた抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を評価した。図６に示されるように、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、２つの異なるドナー由来の単球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及びＣＤ８  Ｔ細胞を容易に活性化した。対照的に、エキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストは、抗原提示細胞の活性化を保持しながらも、Ｂ細胞及びＴ細胞の活性化を低減した（図７Ａ及びＢ）。これらの結果は、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化を低減しながらも、抗原提示細胞がＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームによって特異的に活性化され得ることを示唆し、これは全身毒性を制限し得る。
【０３９５】
実施例３：ＰＴＧＦＲＮ過剰発現及びエキソソームグリカン修飾によるＳＴＩＮＧエキソソーム活性の強化
実施例１及び２における結果は、エキソソーム表面分子が、エキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストの、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して増加した効力を媒介し得ることを示唆する。以前の結果により、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮ）が、エキソソームの内腔表面または外表面上に豊富に存在する糖タンパク質であることが実証されている。ＰＴＧＦＲＮがプロデューサー細胞において過剰発現されるとき、ＰＴＧＦＲＮは、エキソソームの内腔表面または外表面上で優勢的な糖タンパク質である。ＰＴＧＦＲＮがエキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストによる免疫細胞の活性化を媒介する上で役割を果たすのかどうかを決定するために、修飾グリカンプロファイルを有するか、またはより高いレベルのＰＴＧＦＲＮを発現するように操作されたエキソソームを、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較した。図２における結果に類似して、エキソ−ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＰＢＭＣ中でＩＦＮβ産生の最大レベルを変化させることなく、ＩＦＮβ産生を誘導する上で遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも強力であった。ＰＮＧａｓｅ  Ｆによって最初に脱グリコシル化されたエキソソームの中に負荷されたＳＴＩＮＧは、この効力のシフトを更に強化した一方で、シアリダーゼにより最初に脱シアリル化されたエキソソーム中のＳＴＩＮＧアゴニストの送達は、効力の更なる強化及びＩＦＮβ産生のより高い最大レベルをもたらし、このことは、エキソソームのグリカン修飾がＳＴＩＮＧアゴニスト分子の免疫細胞への送達を変化させ得ることを示す。驚くべきことに、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現するとともに、ＳＴＩＮＧアゴニストを負荷されたエキソソームは、内因性レベルのＰＴＧＦＲＮを含有する未修飾またはグリカン操作型エキソソームと比較して、効力及びＩＦＮβの最大産生を更に強化した。ＰＴＧＦＲＮエキソ−ＳＴＩＮＧ試料の脱グリコシル化または脱シアリル化は、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現するエキソソーム単独の効果を上回って効力を更に強化した（２つのドナーにおける図８Ａ及びＢ）。ＳＴＩＮＧアゴニスト送達の結果としてのＩＦＮβのレベルの定量は、グリカン修飾型ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームが、ＳＴＩＮＧアゴニストの効力を、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストを１０００倍超上回って、及び未修飾エキソソーム中に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストを約５０倍上回って強化し得ることを実証する（図９）。
【０３９６】
図９における結果は、エキソソーム上のグリカン操作及びＰＴＧＦＲＮ過剰発現の組み合わせがＳＴＩＮＧアゴニスト分子の免疫細胞への送達を強化可能であることを実証する。これらの修飾がＰＢＭＣ中の具体的な細胞型の活性化に対して有する影響について理解するために、図９に示されるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム調製物を、それらによる単球及び樹状細胞の活性化において試験した。図１０は、ＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームのグリカン修飾及び／またはＰＴＧＦＲＮ過剰発現が、２つのドナーにおいてＥＣ５０によって測定されるような単球活性化の増加した効力をもたらすが、最大活性化レベルは低減されるかまたは無変化であることを実証した（図１０）。単球活性化のＥＣ５０の変化は、脱シアリル化ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームについて、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して最大５４，０００倍であった（図１１）。対照的に、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、２つのドナーにおいてｍＤＣを不十分に活性化した一方で、グリカン操作型及び／またはＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームは、ｍＤＣのＥＣ５０及び最大活性化を劇的に強化した（図１２）。脱シアリル化ＰＴＧＦＲＮ過剰発現ＳＴＩＮＧアゴニストエキソソームについて、ｍＤＣに対するＥＣ５０のシフトは＞１６，０００倍であった一方で（図１３）、最大活性化は約４〜１０倍高かった。重要な点として、上述のＬＣ−ＭＳによって決定したときのＳＴＩＮＧアゴニストの定量では、エキソソーム調製物にわたるＳＴＩＮＧアゴニストの正規化を考慮に入れたため、これらの実験において観察された効果は、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現またはグリカン操作型エキソソームの強化された負荷効率に起因するものではなかった。実際、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現及び／またはグリカン操作型エキソソームの負荷効率は、粒子当たりで未修飾エキソソームよりも低かった（図１４）。まとめると、これらの結果は、単一のエキソソーム表面タンパク質の特定のグリカン修飾及び／または過剰発現が、ＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームの効力を劇的に強化し得、かつ樹状細胞へのカーゴ送達の選択性を強化し得ることを実証する。
【０３９７】
ＳＴＩＮＧ活性化を調節するためのキフネンシン前処理
エキソソーム表面グリカンの何らかの撹乱が免疫細胞の取り込みを変化させ得るかどうかを決定するために、プロデューサー細胞株を、タンパク質のグリコシル化中に高マンノース糖残基のトリミングを阻止し、完全なグリコシル化を阻止する、アルカロイド薬剤キフネンシンで処理した。結果として得られたキフネンシン処理細胞からのエキソソームは、変化したグリコシル化状態を有し、高マンノースが濃縮されている。キフネンシン処理エキソソームにＳＴＩＮＧアゴニストを負荷し、２つのドナー由来のＰＢＭＣに投与した。これは、野生型エキソソームと比較してＳＴＩＮＧアゴニスト活性の部分的減弱をもたらした。具体的には、単球及びｍＤＣ活性化は主として無変化であった一方で（それぞれ図１６及び１７）、ＩＦＮβ産生は劇的に低減された（図１５）。これらの結果は、特定のグリコシル化パターンがエキソソームの免疫細胞中の取り込みを少なくとも部分的に媒介すること、及び表面糖タンパク質の全ての修飾がＳＴＩＮＧアゴニスト分子のエキソソーム媒介性送達中に免疫細胞の活性化を強化できるわけではないことを示唆する。
【０３９８】
実施例４：エキソソームへのＳＴＩＮＧアゴニストの負荷の最適化
先の実施例において、３７℃で一晩インキュベートすることによってエキソソームにＳＴＩＮＧアゴニストを負荷した。ＳＴＩＮＧアゴニスト負荷の動態を決定するために、エキソソームを１ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストとともに２時間、６時間、または一晩インキュベートし、ＰＢＭＣに添加して、ＩＦＮβ産生を測定した。図１８Ａ及びＢに示されるように、未負荷のエキソソームはＩＦＮβ産生を誘導しなかった一方で、ＳＴＩＮＧアゴニスト中で２時間インキュベートしたエキソソームは、ＩＦＮβ産生を誘導しなかったか、または比較的低いレベルをもたらしたかのいずれかであった。６時間負荷処理された試料は中程度のＩＦＮβ産生をもたらした一方で、一晩の負荷処理は、２つのドナーにおいて最も高いレベルのＩＦＮβ産生をもたらした。これらの結果は、エキソソームの中へのＳＴＩＮＧアゴニストの負荷が、インキュベーション時間を増加させることによって強化され得ることを示す。
【０３９９】
実施例５：異なるエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト環状ジヌクレオチドの効力比較
ＰＴＧＦＲＮを過剰発現するＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を、振とうフラスコ中で増殖させ、結果として得られたエキソソームを、方法に記載されるようにＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配超遠心分離によって精製した。実施例１の方法に従って、精製エキソソームに、ＳＴＩＮＧアゴニストＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、カタログ番号ＨＹ−１２８８５Ｂ）または３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ−ｎａｃａｉｒｓ）のいずれかを負荷した。実施例１に記載されるように負荷量を定量した。エキソソーム封入型または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストをヒトＰＢＭＣに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。上清中のＩＦＮβの量を測定することによって、ＳＴＩＮＧアゴニストによるＰＢＭＣの活性化を検出した。図１９に示されるように、両方の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストがＩＦＮβを類似した程度に誘導した一方で、両方のエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストは、実施例２に示されるように、効力のシフトをもたらした。しかしながら、エキソソーム封入型３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨは、エキソソーム封入型ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡよりも強力であり、このことは、フッ素化ＳＴＩＮＧアゴニストがエキソソーム製剤中で送達されるときに効力上の利点を提供し得ることを示唆する。
【０４００】
実施例６：腫瘍担持マウスにおけるエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストと比較した遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボでの効力及び全身効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの４つの群（１群当たり３〜４匹のマウス）に、５×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下接種した。接種から８日後、マウスに、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのＰＴＧＦＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（エキソＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ）の単回腫瘍内用量を注射した。腫瘍注射から４時間後、流入領域リンパ節、脾臓、及び血清を採取し、サイトカインレベルを測定した。腫瘍におけるＩＦＮβ遺伝子発現レベルは、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及び０．２μｇのエキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニスト群において同等であり、これらは両方とも、０．２μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＰＢＳ群よりも高かった（図２０Ａ）。追加として、ＩＦＮγならびにＴ細胞化学誘引物質であるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のレベルは全て、エキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニスト群においてより高かった（図２０Ｂ、２０Ｃ、及び２０Ｄ）。これらのデータは、ＳＴＩＮＧアゴニストがエキソソーム中に封入されるとき、１００倍低いＳＴＩＮＧアゴニストが腫瘍においてＩＦＮ遺伝子発現シグネチャの同等の誘導を誘導し得ることを実証する。
【０４０１】
ＳＴＩＮＧアゴニストは非常に強力な炎症促進性分子であり、これらの化合物の１つの臨床上の潜在的不利点は、遊離化合物が腫瘍注射部位から抜け出し、循環中に拡散することに起因した、それらによる全身毒性の誘導である。エキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニストで処置された腫瘍担持マウスの流入領域リンパ節は、濃度マッチした遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群と比較して、同等のまたはわずかに上昇したＩＦＮβ（図２１Ａ）、ＣＸＣＬ９（図２１Ｂ）、及びＣＸＣＬ１０（図２１Ｃ）の遺伝子発現を示したが、１００倍高い遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト処置群と比較すると劇的に低減された発現レベルを示した。これらの結果は、脾臓（図２２Ａ、Ｂ、及びＣ）及び血清（図２３Ａ〜２３Ｅ）においてより劇的であり、このうち血清においては、エキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニスト群において、遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群のうちのいずれかと比較して、炎症促進性サイトカインＩＦＮβ（図２３Ａ）、ＴＮＦ−α（図２３Ｂ）、及びＩＬ−６（図２３Ｃ）の著しい減少が示された。
【０４０２】
図２０〜２３で観察された効果が、他のＳＴＩＮＧアゴニストにも適用可能であることを確認するために、Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍担持マウスに、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ（エキソ３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ）を注射した。腫瘍（図２４Ａ〜２４Ｄ）、流入領域リンパ節（図２５Ａ〜２５Ｄ）、脾臓（図２６Ａ〜２６Ｄ）、及び血清（図２７Ａ〜２７Ｄ）におけるサイトカインレベルを測定し、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡについて図２０〜２３に示される結果に類似した発現パターンが示された。まとめると、これらの結果は、インビボでの腫瘍内注射後に、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストが、１００倍高い遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと同等の強力なＩＦＮ遺伝子発現シグネチャを誘導し得ること、及びこの同等の遺伝子発現パターンが、主として腫瘍微小環境に限定され、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで観察されるような全身性炎症性シグナルをもたらさないことを実証する。追加として、これらの効果は２つの異なるＳＴＩＮＧアゴニストで観察され、このことは、エキソソームを用いてＳＴＩＮＧアゴニストを腫瘍に送達することの広範な適用性を実証する。
【０４０３】
実施例７：腫瘍担持マウスにおける遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストの腫瘍内及び腹腔内投与後のＳＴＩＮＧ経路の局所的及び全身的活性化比較
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの５つの群（ｎ＝１群当たり４匹のマウス）に、５×１０５個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下接種した。接種から８日後、マウスに、ＰＢＳ、２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、０．２μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２（エキソＳＴＩＮＧ  ＩＰ）のいずれかの単回用量を腹腔内（ＩＰ）注射、または０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２（エキソＳＴＩＮＧ  ＩＴ）の単回用量を腫瘍内（ＩＴ）注射した。エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト製剤は、実施例１に記載されるように負荷し、定量した。ＩＰ注射された高用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、腫瘍、膵臓、及び脾臓においてＰＢＳ処置群を上回るＩＦＮβ発現を誘導した。エキソＳＴＩＮＧ  ＩＰは、１００倍低い用量で、高用量遊離ＳＴＩＮＧと比較して、膵臓（図２９Ａ）及び脾臓（図３０Ａ）においてより優れたＩＦＮβ発現、ならびに腫瘍（図２８Ａ）において低減されたＩＦＮβ発現をもたらした。ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０発現は、腫瘍（図２８Ｂ〜Ｃ）及び脾臓（図３０Ｂ〜Ｃ）においてこれらの２つの群間で同様であったが、膵臓（図２９Ｂ〜Ｃ）においてはエキソＳＴＩＮＧ  ＩＰ群で強化された。エキソＳＴＩＮＧ  ＩＴは、腫瘍において、他の群と比較してはるかにより大きいＳＴＩＮＧ経路の活性化を示したが、脾臓においては、エキソＳＴＩＮＧ  ＩＰまたは高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群と比較して頑健な発現変化をもたらさず、膵臓においては、高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して類似した発現を示した。膵臓及び脾臓において、ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、エキソＳＴＩＮＧ  ＩＰによって、濃度マッチした低用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して一貫して強化され、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストについての効力の増加が確認された。重要な点として、エキソＳＴＩＮＧ  ＩＰは、膵臓及び脾臓において、１００倍高い用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して同等の、または場合によっては強化された効力をもたらした。これらの結果は、ＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームの低用量での局部的ＩＰ投与が、膵臓を含めた組織において強力な免疫応答を誘導し得、膵臓癌及び他の腹膜癌を処置するための局部投与の機会を提示することを示唆する。
【０４０４】
実施例８：エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニスト及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストによるナイーブマウスにおけるインビボでの差次的ＳＴＩＮＧ経路シグナル伝達
ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ、２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、０．２μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、または実施例１に記載されるように製剤化し、定量した、０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２（エキソＳＴＩＮＧ）のいずれかの単回用量を腹腔内注射（ＩＰ）した（ｎ＝１群当たり５匹のマウス）。肺、脾臓、膵臓、及び血清を注射から４時間後に単離し、遺伝子発現及びサイトカイン産生に関して分析した。ＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０発現は、エキソＳＴＩＮＧ処置マウスの肺（図３１Ａ〜Ｃ）及び脾臓（図３２Ａ〜Ｃ）において、１００倍高い用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストを受けたマウスと比較して劇的により高かった一方で、膵臓における遺伝子発現プロファイルは、これらの２つの群間で類似していた（図３３Ａ〜Ｃ）。同様に、エキソＳＴＩＮＧ処置マウスにおける血清中サイトカインレベルは、１００倍高い用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで処置されたマウスよりも高いか、またはそれと同等であった（図３４Ａ〜３４Ｇ）。まとめると、これらの結果は、ＳＴＩＮＧアゴニストを負荷されたエキソソームが、インビボで等量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較してＳＴＩＮＧ経路の有意により強力な活性化剤であること、したがって、エキソソーム負荷ＳＴＩＮＧアゴニストが、とりわけ高用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの全身毒性の低減及びＴ細胞化学誘引物質（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃａｎｔｓ）の発現の強化の関連において、差別化された治療用途を提供し得ることを実証する。
【０４０５】
先の研究に類似した第２の実験を単回用量ＩＰ投与により、かつ２４時間に延長して実施した。腹膜細胞及び脾細胞を処置マウスから単離し、細胞活性化をＣＤ８６の検出によって測定した。高用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、腹膜におけるＢ細胞、マクロファージ、単球、及び古典的樹状細胞（ｃＤＣ）の活性化をもたらした一方で、１００倍低い用量でのエキソＳＴＩＮＧは、マクロファージのより高い活性化、ｃＤＣの類似した活性化、ならびにＢ細胞及び単球の減弱した活性化を誘導した（図３５）。脾臓においては、高用量ＳＴＩＮＧアゴニストは、中程度のレベルの免疫細胞活性化を誘導した一方で、１００倍低い用量でのエキソＳＴＩＮＧは、より高いマクロファージ及びＴ細胞活性化、ならびに劇的により高いｃＤＣ活性化を誘導し、このことは、インビボでのｃＤＣ及びマクロファージにおける細胞型によるエキソソームに対する取り込み／送達選好を示唆する（図３６）。これらの結果は、ＳＴＩＮＧアゴニストを負荷されたエキソソームが、ＳＴＩＮＧ経路誘導性抗腫瘍及び抗病原体応答の主要な媒介因子である、抗原提示細胞において、インビボで特異的細胞応答を誘導し得ることを実証する。
【０４０６】
実施例９：黒色腫のマウスモデルにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボでの有効性比較
先の実施例の結果は、エキソＳＴＩＮＧが、同等またはより高い量の可溶性ＳＴＩＮＧアゴニストよりも強力な抗腫瘍製剤であり得ることを示唆する。この仮説について試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下接種した（ｎ＝１群当たり５匹のマウス）。接種から５日、８日、及び１１日後、マウスに、ＰＢＳ、２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、０．２μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、または０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２を腫瘍内注射した。腫瘍体積を３９日目まで毎日測定し、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときに動物を屠殺した。ＰＢＳ対照群と比較して、腫瘍増殖は、０．２μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストでの処置後に中程度に増強され、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストでの処置時には２５日目にほぼ完全に排除された。驚くべきことに、０．２μｇのエキソＳＴＩＮＧでの処置は、２５日目に、濃度マッチした遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群と比較して劇的に改善された腫瘍退縮、及び高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群と類似した程度の腫瘍退縮をもたらした。注目すべきことに、エキソＳＴＩＮＧ及び高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストでの処置は、各群の５匹の動物中３匹において完全応答（接種部位で検出不能な腫瘍として定義される；ＣＲ）をもたらした（図３７Ａ〜３７Ｅ）。図３７Ａは、動物群における平均腫瘍増殖を示し、図３７Ｂ〜３７Ｄは、各処置群の個々のマウスにおける腫瘍増殖を示す。
【０４０７】
ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、記憶Ｔ細胞の動員、及び最終的には持続性の適応免疫応答をもたらす。この研究における抗腫瘍効果が免疫応答をもたらしたのかどうかを決定するために、高用量ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソＳＴＩＮＧ群における５匹の動物を２１日目に、反対側の脇腹への５×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞の移植によって再攻撃した。細胞生存及び増殖動態を確かにするために、５匹の追加のナイーブマウスに同じ腫瘍細胞調製物を接種し、ＰＢＳで毎日処置した。３９日目（攻撃から１８日後）までに、ＰＢＳ群における全てのマウスは屠殺された。高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群からの動物における腫瘍は、５匹の動物中４匹で増殖しなかった一方で、際だったことに、腫瘍増殖はエキソＳＴＩＮＧ群の５匹全てのマウスにおいて検出不能であった（図３８Ａ〜３８Ｄ）。図３８Ａは、動物群における平均腫瘍増殖を示し、図３８Ｂは、個々のマウスにおける腫瘍増殖を示す。図３８Ｃは、各処置群の生存率を示す。注目すべきことに、エキソＳＴＩＮＧ群における２匹の動物は、原発腫瘍において処置に不応性であったものの、これらの動物は、再攻撃部位では腫瘍増殖を示さず、このことは、エキソソーム中に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストによって媒介される免疫応答の頑健性を実証する（図３７Ａ〜３７Ｅ及び３８Ａ〜３８Ｃ）。
【０４０８】
実施例１０：黒色腫のマウスモデルにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームの用量依存的抗腫瘍応答
実施例９における結果は、エキソＳＴＩＮＧがインビボで、１００倍高い用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと類似した程度に抗腫瘍効果を誘導し得ることを実証する。エキソＳＴＩＮＧの注射用量と腫瘍増殖との間の関係を決定するために、インビボ用量漸増実験を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下接種した（ｎ＝１群当たり５匹のマウス）。接種から６日、９日、及び１２日後、マウスに、ＰＢＳ、及び２００ｎｇ、４０ｎｇ、または８ｎｇのいずれかのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２）を腫瘍内注射した。腫瘍体積を１８日目まで毎日測定し、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときに動物を屠殺した。ＰＢＳ対照群における５匹のマウス中４匹は、１８日目に屠殺された一方で、いずれの群のエキソＳＴＩＮＧ処置マウスでも研究の経過中に屠殺されたマウスはいなかった。２００ｎｇのエキソＳＴＩＮＧ群において２例の完全応答及び４０ｎｇのエキソＳＴＩＮＧ群において１例の完全応答が存在した。驚くべきことに、８ｎｇのエキソＳＴＩＮＧ群において、ＰＢＳ群と比較して腫瘍増殖の実質的な低減が存在し、このことは、極低用量のエキソＳＴＩＮＧが侵攻性腫瘍モデルにおいて測定可能な薬理学的影響を有し得ることを実証する（図３９及び４０Ａ〜４０Ｄ）。図３９は、動物群における平均腫瘍増殖を示し、図４０Ａ〜４０Ｄは、各処置群の個々のマウスにおける腫瘍増殖を示す。低ナノグラム用量のＳＴＩＮＧアゴニストは、より高い用量（１０〜１００マイクログラム）で観察される有害な全身毒性を誘導する可能性が低く、故に、他の抗がん剤またはがん免疫療法剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ−４に対する治療用抗体）との併用療法の魅力的な機会であり得る。注目すべきことに、２００ｎｇ及び４０ｎｇのエキソＳＴＩＮＧ群についての腫瘍増殖曲線は同等であり、このことは、持続性の免疫応答を誘導するには中間用量で十分であり得ること、及びエキソＳＴＩＮＧが腫瘍内注射においてＳＴＩＮＧアゴニストの用量を１００〜１，０００倍低減する治療機会を提示し得ることを示唆する。
【０４０９】
実施例１１：遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームによる抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導
樹状細胞におけるＳＴＩＮＧ経路アゴニズムは、抗原提示、ＩＦＮβ産生を強化し、ＣＤ８＋  記憶Ｔ細胞を動員して、持続性の適応免疫応答を誘発する。エキソＳＴＩＮＧが既定の抗原に対する記憶Ｔ細胞応答を誘導可能であるかどうかを決定するために、精製卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いて抗原特異的Ｔ細胞応答研究を実施した。実験概要の図表が図４１Ａに示される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ、２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、０．２μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、または０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２のいずれかと混合した２００μｇのＯＶＡを腹腔内注射した（ｎ＝１群当たり４〜１０匹のマウス）。注射から６日後、脾臓及び腸間膜リンパ節を採取し、単細胞懸濁液に均質化し、生存リンパ球を密度遠心分離によって濃縮した。単離したリンパ球をフローサイトメトリーにより、ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ及びフィコエリトリン（ＰＥ）に結合した固定化ＭＨＣクラスＩ四量体（ｉＴＡｇ四量体／ＰＥ−Ｈ−２  ＯＶＡ；ＭＢＬ（登録商標）、コード番号Ｔ０３０００）への結合を測定することによって分析した。ＯＶＡ反応性記憶Ｔ細胞を、ＰＥ、ＣＤ４４、及びＣＤ８陽性にゲートをかけることによって定量した。高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソＳＴＩＮＧ群において、ＰＢＳ、低用量遊離ＳＴＩＮＧ、及び天然エキソソームと比較して脾臓（図４１Ｂ）及び腸間膜リンパ節（図４１Ｃ）でより高い割合のＯＶＡ反応性Ｔ細胞が検出された。エキソＳＴＩＮＧと濃度マッチした、低用量ＳＴＩＮＧアゴニストは、脾臓において活性を何ら示さず、腸間膜リンパ節においてはほんの中程度の応答を示し、このことは、エキソソーム中に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストについての効力の明確な増加を実証する。未修飾エキソソームで処置されたマウスは、免疫応答を示さず、このことは、エキソソーム単独が、実験の時間経過にわたって非免疫原性であることを実証する。
【０４１０】
抗原特異的免疫を測定するための直交型の方法として、ＩＦＮγ発現をＥＬＩＳｐｏｔによって、標準プロトコルに従って測定した（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）。脾細胞を単細胞懸濁液に均質化し、抗ＩＦＮγ抗体でコーティングしたプレート中にプレートした（２００，０００細胞／ウェル）。ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを細胞に添加して１８時間置いて、ＩＦＮγ産生を誘導し、細胞をプレートから洗浄し、プレートに結合したＩＦＮγを、直交型の抗体を用いて検出した（図４１Ｄ）。プレート当たりの反応性スポットの総数を計数し、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて群にわたって比較した。ＰＢＳ、エキソソーム単独（ＥＶ）、及び低用量ＳＴＩＮＧアゴニスト群は、極低レベルのＯＶＡ反応性を示した。高用量ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソＳＴＩＮＧ群の両方は高度に反応性であり、このうちエキソＳＴＩＮＧ群における反応性が、この群における１００倍低いＳＴＩＮＧアゴニストの用量にもかかわらずより高かった（図４１Ｅ）。これらの結果は、エキソＳＴＩＮＧが、がん及び感染疾患における用途で、免疫応答の誘発において差別化された治療機会であり得ることを実証する。
【０４１１】
実施例１２：マウスＴ細胞リンパ腫のモデルにおける抗腫瘍有効性及び抗原特異的免疫応答
実施例９及び１０に示されるインビボ有効性の結果ならびに実施例１１に示される免疫応答誘導は、エキソＳＴＩＮＧが、インビボで抗原特異的腫瘍殺傷応答及びその後の免疫応答を誘導するのに十分であり得ることを示唆する。この仮説について試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＯＶＡを安定に発現するように操作された、マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞応答のモデル化を可能にするマウスＴ細胞リンパ腫細胞株である、１×１０６個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２１１３（商標））を皮下接種した（ｎ＝１群当たり５匹のマウス）。接種から１０日、１３日、及び１６日後、マウスに、ＰＢＳ、２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、０．２μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２、または０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２）を腫瘍内注射した。Ｂ１６Ｆ１０モデル（図３７〜３８、実施例９）において観察された効果に類似して、ＰＢＳ群と比較して、低用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、腫瘍増殖を中程度に減弱した一方で、高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソＳＴＩＮＧは、腫瘍増殖を劇的に阻止した（図４２及び４３Ａ〜４３Ｄ）。図４２は、動物群における平均腫瘍増殖を示し、図４３Ａ〜４３Ｄは、各処置群の個々のマウスにおける腫瘍増殖を示す。全ての群からの脾臓におけるＴ細胞を単離し、実施例１１に記載されるようにＯＶＡ特異的反応性に関して測定した。低用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、中程度の記憶Ｔ細胞応答を誘導した一方で、高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソＳＴＩＮＧの両方は、強力な記憶Ｔ細胞応答を誘導した（図４３Ｅ）。これらのデータは、エキソソーム中に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストが、１００倍高い遊離化合物と比較してインビボで同等の抗腫瘍性及び記憶Ｔ細胞応答を同時に誘導し得ることを実証する。
【０４１２】
実施例１３：ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームは、天然エキソソームと比較してＳＴＩＮＧアゴニストの安定性を強化する
ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞からのエキソソーム（天然エキソＳＴＩＮＧ）及びＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰを過剰発現するＨＥＫ２９３ＳＦ細胞からのエキソソーム（ＰＴＧＦＲＮエキソＳＴＩＮＧ）にＭＬ  ＲＲ−Ｓ２を、実施例１に記載されるように負荷し、精製し、定量した。天然エキソＳＴＩＮＧ及びＰＴＧＦＲＮエキソＳＴＩＮＧの新鮮な試料は、単一のドナーからのＰＢＭＣ中で類似したＩＦＮβレベルを誘導し、両方が、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストを上回る効力の強化を提供した（図４４Ａ）。エキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニスト製剤のアリコートを−８０Ｃで７日間凍結させ、融解させ、ＰＢＭＣに添加した。ＰＴＧＦＲＮエキソＳＴＩＮＧは、新鮮な調製物に類似したＩＦＮβ産生プロファイルを誘導した一方で、天然エキソＳＴＩＮＧは、鈍化したＩＦＮβ発現プロファイルを誘導し、このうちＣｍａｘは遊離ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＰＴＧＦＲＮエキソＳＴＩＮＧと比較して劇的に低減された（図４４Ｂ）。ＰＴＧＦＲＮエキソＳＴＩＮＧの効力の喪失は、天然エキソＳＴＩＮＧ効力の喪失と比較して中程度であった（図４４Ｃ）。
【０４１３】
ＰＴＧＦＲＮエキソＳＴＩＮＧの新鮮な調製物及び凍結調製物をＰＢＭＣとともにインキュベートし、ＤＣ、ＮＫ細胞、及び単球についての細胞取り込みプロファイルを細胞特異的表面マーカー及びＧＦＰ陽性度によって測定した。新鮮なＰＴＧＦＲＮエキソＳＴＩＮＧ（図４５Ａ〜Ｂ）と、凍結ＰＴＧＦＲＮエキソＳＴＩＮＧ（図４５Ｃ〜Ｄ）との間で取り込みプロファイルの差異はなく、このことは、１サイクルの凍結融解がエキソソーム取り込みを妨害しないことを示す。これらの結果は、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現が、ＳＴＩＮＧアゴニストを負荷された治療用エキソソームの長期貯蔵及び製剤化により好適であり得ることを実証する。
【０４１４】
実施例１４：ＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームの腫瘍内投与による防御免疫の誘導及び転移の低減
実施例１１及び１２に示されるように、ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、抗原提示を促進し、持続性のＴ細胞応答を誘導する。故に、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）によって誘導される免疫記憶応答は、原発腫瘍内の局所投与後に腫瘍転移を予防するのに十分であり得る。この仮説について試験するために、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現するＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から精製したエキソソームに、環状ジヌクレオチド３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを、実施例１に記載されるように負荷した。０日目、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下接種し、肺転移を播種するために１×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の追加の尾静脈注射により攻撃した（ｎ＝１群当たり８匹のマウス）。接種から５日、８日、及び１１日後、マウスに、皮下腫瘍においてＰＢＳ、２０μｇの３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、１２０ｎｇの３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または１２０ｎｇ、１２ｎｇ、もしくは１．２ｎｇのいずれかのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ（エキソＳＴＩＮＧアゴニスト）を腫瘍内注射した。１７日目までに、２０μｇのＳＴＩＮＧアゴニスト及び１２０ｎｇのエキソＳＴＩＮＧアゴニスト群における原発腫瘍は増殖しなかった。１２ｎｇ及び１．２ｎｇのエキソＳＴＩＮＧアゴニスト群において用量応答関係が存在したが、ＰＢＳまたは１２０ｎｇのＳＴＩＮＧアゴニスト群においては、腫瘍退縮は何ら観察されなかった（図４６Ａ）。全てのマウスからの肺を採取し、撮像し、転移に関して計数した。ＰＢＳ注射群と比較して、肺転移は、１２０ｎｇ及び１２ｎｇのエキソＳＴＩＮＧアゴニスト群ならびに２０μｇのＳＴＩＮＧアゴニスト群において劇的に低減された。わずか１２ｎｇのエキソＳＴＩＮＧアゴニストが、２０μｇのＳＴＩＮＧアゴニストと同程度に肺転移を予防した（図４６Ｂ及び４７）。興味深いことに、２０μｇのＳＴＩＮＧアゴニスト処置群は、組織学的検査によって評価したとき、肺の内部に有意な量の肺病変を有したが、一方で、１２０ｎｇ及び１２ｎｇのエキソＳＴＩＮＧアゴニスト群は、各々４例の完全応答を有した（図４８）。これらのデータは、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストが、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較してはるかにより低い用量（約１，０００倍）で腫瘍防御免疫を誘導し得ることを実証する。
【０４１５】
実施例１５：ＳＴＩＮＧアゴニストのエキソソーム媒介性送達は、免疫チェックポイント遮断免疫療法との相乗作用を有し、Ｔ細胞媒介性腫瘍殺傷に依存する
ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、免疫経路チェックポイントの上方制御を誘導し、これがその後、Ｔ細胞媒介性細胞殺傷性を低減し、ひいては治療根拠としてのＳＴＩＮＧ経路アゴニズムの効果を抑える（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｍａｙ  １９；１１（７）：１０１８−３０）。したがって、免疫媒介性の腫瘍細胞排除を更に改善するために免疫チェックポイント制御の阻害剤を組み合わせることは有益であり得る。この仮説について試験するために、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現するＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から精製したエキソソームに、環状ジヌクレオチドＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを、実施例１に記載されるように負荷した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下接種した（ｎ＝１群当たり６匹のマウス）。接種から５日、８日、及び１１日後、マウスに、３０ｎｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標））の腫瘍内注射とともに、またはなしで、対照抗体（α−ＩｇＧ；１０ｍｇ／ｋｇ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００５５９、クローンＲＴＫ３７５８）またはＰＤ−１に対するアンタゴニスト抗体（α  ＰＤ−１；１０ｍｇ／ｋｇ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１１４１１１、クローンＲＭＰＩ−１４）を腹腔内注射した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍は、免疫細胞浸潤が不十分で、チェックポイント遮断薬に不応性である。準最適用量の３０ｎｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）は部分的腫瘍縮小をもたらし、これはα  ＰＤ−１での処置によって増幅されたが、α  ＩｇＧによっては増幅されなかった（図４９Ａ）。
【０４１６】
別個の研究において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下接種した（ｎ＝１群当たり６匹のマウス）。接種から５日、８日、１１日、及び１４日後、マウスに、ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＤ８抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。抗体のＩＰ投与から６日、９日、及び１２日後、マウスをエキソソームまたはエキソＳＴＩＮＧ（３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、１００ｎｇ）で腫瘍内処置した。
【０４１７】
図４９Ｂに示される略図に従って、マウスをＴ細胞枯渇α  ＣＤ８抗体（１０ｍｇ／ｋｇ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７６９、クローン５３−６．７）で処置してから、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）（３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ）を腫瘍内投与した。Ｔ細胞の全身枯渇は、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）の効果を完全に抑止し、このことは、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）のＳＴＩＮＧアゴニスト誘導性抗腫瘍効果を媒介する上でのＣＤ８＋  Ｔ細胞の必要不可欠な役割を実証する（図４９Ｂ）。
【０４１８】
別個の研究において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝各時点につき５匹）を、ＰＢＳ（８日目のみ）、０．２μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５日目及び８日目）、２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５日目及び８日目）、及び０．２μｇのエキソＳＴＩＮＧ（５日目及び８日目）で腫瘍内処置した。８日目の注射から４８時間後、腫瘍及び脾臓を単離し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ機器において、製造業者の推奨プロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉマウス消化キット（それぞれ、カタログ番号１３０−０９６−７３０及び１３０−０９５−９２６）を利用して、単細胞懸濁液中に解離させた。細胞を濾過し、２回洗浄し、次いでＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞からの抗原に対する特異的反応性を検出するために、フローサイトメトリー分析、またはＥＬＩＳＰＯＴに向けた培養に供した。製造業者のプロトコルに従ってＭａｂｔｅｃｈマウスＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ  ＰＬＵＳ（ＨＲＰ）を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴを実施した。簡潔に述べると、５×１０５個の脾細胞を１０μｇ／ｍｌの３種のＢ１６Ｆ１０ペプチド、すなわち、ＧＰ１００アミノ酸２５〜３３（ＡｎａＳｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ−６２５８９）、チロシナーゼアミノ酸３６８〜３７６（ＡｎａＳｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ−６１４５６）、及びＴＲＰ２アミノ酸１８０〜１８８（ＡｎａＳｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ−６１０５８）とともにインキュベートした。図４９Ｃに示されるように、２００ｎｇでのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）は、高用量または低用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して、Ｂ１６Ｆ１０ペプチドに対して有意により多くのＩＦＮγ陽性スポットを誘導した。まとめると、これらのデータは、Ｔ細胞が、ＳＴＩＮＧアゴニストによって誘導される抗腫瘍免疫の必要不可欠な媒介因子であること、及びＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）が、単剤としてまたはチェックポイント遮断薬と組み合わせて、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストよりも優れた活性を提供することを実証する。
【０４１９】
実施例１６：エキソソーム中ＰＴＧＦＲＮレベルは、ＳＴＩＮＧアゴニストを負荷されたエキソソームの効力と相関がある
実施例３及び１３における結果は、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現がＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームの活性を強化することを示唆する。ＰＴＧＦＲＮレベルがＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）活性と相関があるかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって遺伝子操作して、内因性ＰＴＧＦＲＮ遺伝子座を欠失させた（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４８０２６号に記載される通り）。エキソソームを野生型ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞（野生型エキソ）、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞（ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソ）、及びＰＴＧＦＲＮノックアウト細胞（ＰＴＧＦＲＮノックアウトエキソ）から精製し、上述のように３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを負荷した。可溶性３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨと比較して、全てのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）製剤は、ＰＢＭＣ培養物中でＩＦＮβ産生のより強力な活性化剤であった（ｎ＝２回の反復実験）。興味深いことに、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）は、ＩＦＮβの最も強力な活性化剤であり、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）製剤の最も高いＣｍａｘをもたらした。野生型ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）は、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）と比較して減弱し、ＰＴＧＦＲＮノックアウトＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）は、最も軽度のＩＦＮβ応答をもたらした（図５０Ａ）。最大ＩＦＮβシグナルもまたＰＴＧＦＲＮレベルと相関があった（図５０Ｂ）。この効力の差異がインビボ腫瘍設定で一貫しているかどうかを決定するために、Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍に、ＰＢＳ、または２０ｎｇの野生型ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）、もしくはＰＴＧＦＲＮノックアウトＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）を注射した（６日目、９日目、及び１２日目に注射）。ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）処置が腫瘍増殖を減弱した程度もまたＰＴＧＦＲＮ発現レベルと相関があり、このことは、増加したレベルのＰＴＧＦＲＮがより有利な抗腫瘍免疫応答を誘導し得、故に、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）治療製剤が、エキソソーム表面上でのＰＴＧＦＲＮの発現を増加させることによって最適化され得ることを示す（図５０Ｃ）。
【０４２０】
実施例１７：ＳＴＩＮＧアゴニストを負荷されたエキソソームは、抗原提示細胞によって貪食され、腫瘍常在免疫エフェクター細胞に有毒でない
ＳＴＩＮＧ経路の構成的活性化は、頑健な炎症促進性シグナル伝達をもたらし、細胞及び組織に有毒であり得る（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１４  Ａｕｇ  ７；３７１（６）：５０７−５１８）。腫瘍微小環境におけるＳＴＩＮＧアゴニストの非選択的送達は頑健なＩＦＮβ応答をもたらし得るが、応答が過度に強力であるか、または望まれない細胞集団に源を発する場合、ＣＤ８＋  Ｔ細胞等のエフェクター細胞は、殺傷されるか、またはさもなければ減弱する場合がある。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８で標識したＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームを注射し、注射から１時間後に取り出した。腫瘍浸潤リンパ球を精製し、４８８ｎｍでの蛍光に関して測定して、エキソソーム取り込みを追跡した。ほんの約２０％のＴ細胞がエキソソームを貪食した一方で、それぞれ約９０％及び約７０％のマクロファージ及び樹状細胞がエキソソームを貪食した（図５１Ａ）。これらのデータは、腫瘍微小環境において抗原提示細胞が、ヒトエキソソームの天然の標的細胞であることを示唆する。エキソソームの細胞特異的取り込みが、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）対遊離ＳＴＩＮＧアゴニストについて差次的なＳＴＩＮＧ経路活性化をもたらすのかどうかを決定するために、上記からのＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍に、ＰＢＳ、２０μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、０．２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または２００ｎｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷されたＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの２回目の注射を行った。注射から２４時間後、腫瘍を単離し、均質化し、生存ＣＤ４５＋細胞集団を計数した。２０μｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ群において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞は、他の群と比較して劇的に低減された（図５１Ｂ〜５１Ｄ）。これらのデータは、高用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストが、腫瘍微小環境において、抗原提示及び腫瘍細胞殺傷に必要とされる細胞そのものである、抗原提示細胞及びＴ細胞に有毒であり得ることを示す。したがって、高用量のＳＴＩＮＧアゴニストの非選択的送達は、望ましい免疫刺激応答を減弱させ得る。したがって、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）は、同等の治療応答を得るために必要とされる用量がより低いことに起因して、より広い治療域で働き、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで観察される不利点（例えば、全身毒性、免疫細胞殺傷性、細胞選択性の欠如）を低減する。
【０４２１】
実施例１８：腫瘍内投与されたＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームの高分解能画像解析は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して増加した効力及び低減された毒性を実証する
先の実施例に示されるＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）活性の測定は、エキソソーム、特にＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームが、ＳＴＩＮＧアゴニスト分子の活性を強化し得ることを実証する。均質化した組織または単離した血清からのバルク測定は、種々の用途におけるＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）の効力及び選択性に関する意義のあるデータを提供するが、同じ腫瘍における試料間のまたは注射部位での局所的効果との直接比較を可能にするものではない。この疑問に応えるために、マルチインジェクター装置（ＣＩＶＯ（登録商標）；Ｐｒｅｓａｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて極低用量腫瘍内注射研究を完了した。上記の方法に記載されるように、Ａ２０リンパ腫細胞をマウスの皮下に埋め込み、最大６つの異なる薬剤を同時に注射した。２μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、２００ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム、２０ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを含有する野生型エキソソーム、または２０ｎｇのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを含有するＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームにより単回用量注射を行った。注射後４時間及び２４時間で腫瘍を採取し、処理し、ＩＦＮβ  ｍＲＮＡ（インサイツハイブリダイゼーションによって）及び切断型カスパーゼ３タンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、抗体番号１１１−６０５−１４４）の存在に関して染色した。注射後４時間時点で、ＩＦＮβレベルは、高用量ＳＴＩＮＧアゴニスト群とＰＴＧＦＲＮ過剰発現ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）群との間で同等であり、低用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストまたは空のエキソソーム群よりもはるかに高かった（図５２Ａ）。ＩＦＮβシグナルは、処置後２４時間までにベースラインに戻った。アポトーシスのマーカーである切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）は、４時間及び２４時間時点で、高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストについて、他の全ての群と比較して劇的に増加し、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）及び低用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群については中程度であり、このことは、高用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストが、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）と比較して、ＩＦＮβ産生に対する有益性の強化なしにより高いアポトーシスをもたらしたことを示す（図５２Ｂ）。これらのデータは、実施例１７に記載される選択的細胞型取り込みと併せて、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）が、免疫細胞を選択的に標的としており、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストで観察される非選択的細胞殺傷を伴わずに、強化されたＩＦＮβ分泌をもたらすことを示唆する。
【０４２２】
別の研究において、２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、２０ｎｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．４ｎｇ、２．２ｎｇ、６．６ｎｇ、または２０ｎｇのＰＴＧＦＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨにより、Ａ２０腫瘍内への単回用量注射を行った。注射後４時間時点で腫瘍を採取し、処理し、ＩＦＮβまたはＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡ（インサイツハイブリダイゼーションによって）の存在に関して染色し、径方向応答解析を実施した。ＩＦＮβ（図５２Ｃ）またはＣＸＣＬ１０（図５２Ｄ）ｍＲＮＡ発現は、試料に注射した箇所で最も高く、径方向距離が増加するにつれて徐々に減少した。
【０４２３】
実施例１９：異なるエキソソーム封入型環状ジヌクレオチドまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストの効力比較
ＰＴＧＦＲＮを過剰発現するＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を、振とうフラスコ中で増殖させ、結果として得られたエキソソームを、方法に記載されるようにＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配超遠心分離によって精製した。実施例１にある方法に従って、精製エキソソームに、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、２−３  ｃＧＡＭＰ、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、３−３  ｃＡＩＭ（ＰＳ）２、ｃＡＩＭＰｍＦＳＨ、ｃＡＩＭＰｄＦ、ｃＡＩＭＰ、ＣＰ２１４、ＣＰ２０１、及びＣＰ２０４を含めたＳＴＩＮＧアゴニストを負荷した。３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、３−３  ｃＡＩＭ（ＰＳ）２、ｃＡＩＭＰｄＦ、ｃＡＩＭＰは、それぞれ、文献（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｎｏｖ  ２３；５９（２２）：１０２５３−１０２６７）からの化合物５３、１３、５２、及び５１に対応する。ＣＰ２１４は、２−３  ｃＡＭＰｍＦＳＨである。ＣＰ２０１及びＣＰ２０４は、それぞれ特許ＷＯ２０１７／１７５１５６及びＷＯ２０１７／１７５１４７からの化合物の類似体である。実施例１に記載されるように負荷量を定量した。エキソソーム封入型または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストをヒトＰＢＭＣに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。上清中のＩＦＮβの量を測定することによって、ＳＴＩＮＧアゴニストによるＰＢＭＣの活性化を検出した。図５３Ａ〜５３Ｇに示されるように、全てのエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストが、実施例２に示されるように、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して効力のシフトをもたらした。
【０４２４】
実施例２０：腫瘍担持マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）及びＳＴＩＮＧノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔ）における、エキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストと比較した遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボでの効力
Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウスの３つの群（１群当たり４〜５匹のマウス）に、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下接種した。接種から８日後、マウスに、ＰＢＳ、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのＰＴＧＦＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ（エキセ（ｅｘｅ）ＳＴＩＮＧ）の単回腫瘍内用量を注射した。腫瘍注射から４時間後、流入領域リンパ節、脾臓、及び血清を採取し、サイトカインレベルを測定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）からの腫瘍（図５４Ａ）、流入領域リンパ節（図５４Ｂ）、及び脾臓（図５４Ｃ）におけるＩＦＮβ遺伝子発現レベルは、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及び０．１μｇのエキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニスト群において同等であったが、一方で、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からの腫瘍（図５４Ａ）、流入領域リンパ節（図５４Ｂ）、及び脾臓（図５４Ｃ）におけるＩＦＮβ遺伝子発現レベルは、対照群と類似していた。追加として、ＩＦＮγならびにＴ細胞化学誘引物質であるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のレベルは全て、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（中実のバー）からのエキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニスト群においてより高かったが、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウス（中空のバー）からのエキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニスト群においては誘導されなかった（図５５、５６、及び５７）。遺伝子発現に加えて、血清中サイトカインプロファイルが同じ傾向を示している（図５８）。
【０４２５】
図５４〜５８で観察された効果が、抗腫瘍活性に変換されることを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＣ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウスに、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下接種した（ｎ＝１群当たり５匹のマウス）。接種から７日、１０日、及び１３日後、マウスに、ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを腫瘍内注射した。腫瘍体積を１９日目まで毎日測定し、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときに動物を屠殺した。予想通り、０．１μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）及び２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨでの処置は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて劇的に改善された腫瘍退縮をもたらした（図５９）。しかしながら、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｍｅｍ１７３ｇｔマウスにおいては、いずれの処置からも腫瘍退縮は何ら観察されなかった（図５９）。合わせて、これらのデータは、エキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニストの活性がＳＴＩＮＧ経路によって媒介されることを実証する。
【０４２６】
実施例２１：進行した黒色腫のマウスモデルにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボでの有効性比較
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍による先のデータ（図３７、４０、４７、４９、５０、及び６０）は、ＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームの強化された抗腫瘍活性を示した。腫瘍体積が約５０ｍｍ３に達したときに処置を開始した。進行した腫瘍における活性を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下接種し（ｎ＝１群当たり５匹のマウス）、腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達するまで時間を置いた。接種から１０日、１３日、及び１６日後、マウスに、エキソソーム、３０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．３μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．１μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．３μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを腫瘍内注射した。腫瘍体積を２８日目まで毎日測定し、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときに動物を屠殺した。エキソソーム対照群と比較して、腫瘍増殖は、０．３μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストでの処置後に影響を受けなかったが、３０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストでの処置時には腫瘍負荷が大きく低減された。驚くべきことに、０．１μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）での処置は、中程度に増強された腫瘍増殖をもたらし、０．３μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）での処置は、濃度マッチした遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群と比較して劇的に改善された腫瘍退縮、及び高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群と類似した程度の腫瘍退縮をもたらした。図６０は、動物群における平均腫瘍増殖を示し、図６１Ａ〜６１Ｅは、各処置群の個々のマウスにおける腫瘍増殖を示す。
【０４２７】
実施例２２：マウス結腸直腸癌モデルのモデルにおける抗腫瘍有効性
インビボでの有効性を試験し、他の種類の腫瘍に拡張するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ベータ−ガラクトシダーゼを安定に発現するように操作されたマウス結腸直腸癌細胞株である、５×１０５個のＣＴ２６．ＣＬ２５細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２６３９（商標））、または５×１０５個のＣＴ２６．野生型細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２６３８（商標））を皮下接種した（ｎ＝１群当たり約５〜７匹のマウス）。接種から１３日、１６日、及び１９日後、マウスのＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍に、エキソソーム、０．０１２μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．０１２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを、及びＣＴ２６．野生型腫瘍に、ＰＢＳ、エキソソーム、１００μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを腫瘍内注射した。Ｂ１６Ｆ１０モデル（図３７、３９、４０、４６、４７、４８、４９、５０、及び５９）において観察された効果に類似して、対照群と比較して、低用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストは、腫瘍増殖を中程度に減弱し、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）は、ＣＴ２６．ＣＬ２５（図６２）及びＣＴ２６．野生型腫瘍（図６３）の両方の腫瘍増殖を劇的に阻止した。
【０４２８】
実施例２３：黒色腫モデルの両脇腹マウスモデルにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボでのアブスコパル有効性比較
ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、全身性の腫瘍特異的Ｔ細胞応答の誘導につながり、これがアブスコパル抗腫瘍活性をもたらした（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１８  Ｄｅｃ  １１；２５（１１）：３０７４−３０８５）。加えて、ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、免疫経路チェックポイントの上方制御を誘導し、これがその後、Ｔ細胞媒介性細胞殺傷性を低減し、ひいては治療根拠としてのＳＴＩＮＧ経路アゴニズムの効果を抑える（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｍａｙ  １９；１１（７）：１０１８−３０）。両方の仮説について試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６個及び５×１０５個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を、それぞれ、マウスの右脇腹及び左脇腹から皮下接種した（ｎ＝１群当たり５匹のマウス）。接種から７日、１０日、及び１３日後、右脇腹の腫瘍に、対照抗体（α−ＩｇＧ；１０ｍｇ／ｋｇ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００５５９、クローンＲＴＫ３７５８）またはＰＤ−１に対するアンタゴニスト抗体（α  ＰＤ−１；１０ｍｇ／ｋｇ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１１４１１１、クローンＲＭＰＩ−１４）とともに、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．１μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを腫瘍内注射した。抗体は腹腔内注射した。腫瘍体積を２１日目まで毎日測定し、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときに動物を屠殺した。注射した腫瘍において、エキソソーム対照群と比較して（両方ともＩｇＧまたは抗ＰＤ１とともに）、０．１μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト＋ＩｇＧ及び０．１μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト＋抗ＰＤ１のいずれでの処置後にも、腫瘍増殖が中程度に増強された。２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及び０．１μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）での処置時には、抗ＰＤ１とは無関係にほぼ完全な排除が観察された（図６４）。驚くべきことに、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及び０．１μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）での処置時に、注射した腫瘍ではなかった対側腫瘍において有意な腫瘍縮小が観察された。加えて、この腫瘍縮小は、抗ＰＤ１との組み合わせでより強化された（図６５）。これらのデータは、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）による全身性の腫瘍特異的Ｔ細胞応答の誘導を実証した。
【０４２９】
実施例２４：黒色腫のマウスモデルにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの腫瘍薬物動態分析
ＳＴＩＮＧアゴニストの腫瘍薬物動態について検査するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下接種した（ｎ＝１群及び１時点当たり３匹のマウス）。接種から８日後、腫瘍に、３０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．３μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．３μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを腫瘍内注射した。注射から５分、３０分、２時間、６時間、２４時間、及び４８時間後、腫瘍を切除し、６体積の血漿で溶解させた。実施例１に記載されるように、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。３０μｇ及び０．３μｇの両方での遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨは、腫瘍から迅速に消失し、１０分前後の半減期を有した。驚くべきことに、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの半減期は、エキソソームによって送達されたときに大幅に強化された（約１２０分）（図６６）。このデータは、実施例６に記載されるように、高用量の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの腫瘍内注射後に、ＳＴＩＮＧアゴニストが、全身循環中に迅速に漏れ出し、最終的に血清中サイトカインの増加を含めた全身性応答を導くことを示唆する。しかしながら、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）は、腫瘍に保持される薬理学を有し、全身ではなく局所で応答を活性化し、これが最終的にＳＴＩＮＧアゴニストの毒性を低減した。
【０４３０】
実施例２５：マウス血漿中でのＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの薬物動態分析
マウス血漿中でのＳＴＩＮＧアゴニストの薬物動態について検査するために、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇ、０．３μｇ、０．６μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを静脈内注射した。注射から１分、５分、１０分、及び３０分で、血液を採取し、血漿を調製した。実施例１に記載されるように、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨは、循環から迅速に消失し、１．２分の半減期を有した（図６７）。０．１μｇ及び０．３μｇの３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ負荷エキソソームは、遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨと類似した半減期（それぞれ１．２分及び１．８分）を示したが、０．６μｇの３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ負荷エキソソームは、強化された半減期（８．５分）を示した（図６８）。
【０４３１】
実施例２６：静脈内注射後のマウスにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボ活性比較
腫瘍内投薬以外の遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームのインビボ活性を比較するために、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨまたは０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを静脈内注射した。注射から３０分、２時間、６時間、及び２４時間後、肝臓、脾臓、及び血清を採取し、サイトカインレベルを測定した。驚くべきことに、ＩＦＮβ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮγを含めた本実施例で試験した全てのサイトカイン遺伝子発現レベルは、全ての時点にわたって、肝臓（図６９Ａ〜６９Ｄ）、脾臓（図７０Ａ〜７０Ｄ）、及び血清（図７１Ａ〜７１Ｅ）において、−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨの注射量がＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）群では１００倍低かったものの、０．２μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）で、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して有意により高かった。これは、エキソソームの肝臓及び脾臓への選択的取り込み機構に起因し得（Ｊ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．２０１５  Ａｐｒ  ２０；４：２６３１６）、これはＳＴＩＮＧアゴニストのこれらの臓器への送達を可能にする。これらのデータは、１００倍低いＳＴＩＮＧアゴニストが、ＳＴＩＮＧアゴニストの変化する薬物動態及び薬力学に起因して、エキソソームによる静脈内注射後に、ＩＦＮ遺伝子発現の有意により高い誘導を誘導し得ることを実証する。
【０４３２】
実施例２７：皮下注射後のマウスにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボ活性比較
腫瘍内投薬以外の遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソームのインビボ活性を比較するために、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを皮下注射した。注射から４時間後、リンパ節、脾臓、肝臓、及び血清を採取し、サイトカインレベルを測定した。リンパ節（図７２Ａ）、脾臓（図７２Ｂ）、及び肝臓（図７２Ｃ）におけるＩＦＮβ遺伝子発現レベルは、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト処置後に有意に上昇したが、ＩＦＮβ遺伝子発現レベルは、ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）後に、より高い遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト処置群と比較して劇的に低減された。追加として、ＩＦＮγ及びＴ細胞化学誘引物質であるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のレベルは、ＩＦＮβと類似した傾向を示した（図７３、７４、及び７５）。これらの結果は、血清中サイトカインにおいてより劇的であり、エキソソーム−ＳＴＩＮＧアゴニスト群において、遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群と比較して、炎症促進性サイトカインＩＦＮβ（図７６Ａ）、ＴＮＦ−α（図７６Ｂ）、ＩＬ−６（図７６Ｃ）、ＩＦＮγ（図７６Ｄ）、及びＭＣＰ−１（図７６Ｅ）の著しい減少が示された。
【０４３３】
実施例２８：腫瘍担持マウスにおけるエキソソーム封入型ＳＴＩＮＧアゴニストと比較した遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボでの効力及び全身効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの４つの群（１群当たり５匹のマウス）に、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下接種した。接種から８日後、マウスに、エキソソーム、２０μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、０．１μｇの遊離３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、または０．１μｇのＰＴＧＦＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ（ＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標））の用量を腫瘍内注射した。マウスのうちの半分に、接種後１１日目に再び腫瘍内注射した。各注射の注射から４時間または２４時間後、腫瘍を採取し、サイトカインレベルをインサイツハイブリダイゼーションによって測定し、ＣＤ８またはＦ４／８０陽性細胞を免疫組織化学的検査によって計数した。腫瘍領域及び間質領域を組織学的に特定した。腫瘍（図７７Ａ）及び間質（図７７Ｂ）領域におけるＩＦＮβ遺伝子発現レベルは、単回投薬後４時間で、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及び０．１μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）群において増加した。驚くべきことに、腫瘍領域及び間質領域の両方におけるＩＦＮβのレベルは、第２の投薬後４時間で、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群において有意に減少したが、一方で、腫瘍領域及び間質領域の両方におけるＩＦＮβのレベルは、０．１μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）群においては維持された。加えて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、第２の投薬後４時間及び２４時間で、０．１μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）群において有意に増加したが、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群においては増加しなかった（図７８Ａ）。Ｆ４／８０陽性細胞は、２０μｇの遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト群において減少したが、細胞は、０．１μｇのＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）群においては回復した（図７８Ｂ）。これらのデータは、高用量遊離ＳＴＩＮＧアゴニストが、単回投薬後に、ＩＦＮ応答を誘導する能力を有する免疫細胞を破壊する可能性があり、これにより、それらが第２の投薬後に類似したレベルのＩＦＮ応答を誘導することができず、Ｔ細胞を腫瘍の中に動員することができなくなることを実証する。しかしながら、エキソＳＴＩＮＧは、免疫細胞を破壊せず、複数回の処置後であってもＩＦＮ応答を誘導し、これがＴ細胞の浸潤の増加を導いた。
【０４３４】
実施例２９：持続性のＴ細胞応答を示す、黒色腫のマウスモデルにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト負荷エキソソーム及び遊離ＳＴＩＮＧアゴニストのインビボでの有効性比較
先の実施例９の結果は、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを負荷されたＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）が、再攻撃した腫瘍の増殖を遮断する持続性のＴ細胞応答を示したことを示唆する。本実施例において、３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを負荷されたＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）が同じ応答を示すかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下接種した（ｎ＝１群当たり５〜１０匹のマウス）。接種から６日、９日、及び１２日後、腫瘍に、ＰＢＳ、エキソソーム、１００μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または０．２μｇのＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソーム中に負荷された３−３  ｃＡＩＭＰｄＦＳＨを腫瘍内注射した。図７９Ａは、動物群における平均腫瘍増殖を示し、図７９Ｂ〜７９Ｅは、個々のマウスにおける腫瘍増殖を示す。完全応答を示した１００μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ群における１０匹の動物及びＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）群における４匹の動物を２０日目に、反対側の脇腹への１×１０６個のＢ１６Ｆ１０細胞の移植によって再攻撃した。細胞生存及び増殖動態を確かにするために、５匹の追加のナイーブマウスに同じ腫瘍細胞調製物を接種し、ＰＢＳで毎日処置した。３７日目（攻撃から１７日後）までに、ＰＢＳ群における全てのマウスは屠殺された。１００μｇの遊離ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡからの動物における腫瘍は、１０匹の動物中１０匹で腫瘍増殖を阻害しなかった一方で、際だったことに、腫瘍増殖はＥＸＯＳＴＩＮＧ（商標）群の４匹全てのマウスにおいて検出不能であった（図８０Ａ〜８０Ｄ）。図８０Ａは、動物群における平均腫瘍増殖を示し、図８０Ｂ〜８０Ｄは、個々のマウスにおける腫瘍増殖を示す。
【０４３５】
参照による援用
本出願に引用された刊行物、特許、特許出願、及び他の文献は全て、あたかも各個別の刊行物、特許、特許出願、または他の文献があらゆる目的のために参照により援用されるように個別に示されるのと同じ範囲まで、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０４３６】
均等物
本開示は、とりわけ、治療薬として使用するための、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入するエキソソームの組成物を提供する。本開示はまた、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入するエキソソームの生産方法及びかかるエキソソームの治療薬としての投与方法も提供する。種々の具体的な実施形態が例示され、説明されたが、上記の明細書は制限的ではない。本発明（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることが理解されよう。本明細書を査読すれば、当業者には多くの変形形態が明らかとなろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３７Ｅ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４１Ｅ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５１Ｄ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５２Ｄ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５３Ｄ】
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【図５３Ｅ】
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【図５３Ｆ】
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【図５３Ｇ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５５Ａ】
2021518386.tif 000157
【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５６Ｃ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５８Ｄ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６１Ｃ】
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【図６１Ｄ】
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【図６１Ｅ】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図６９Ｃ】
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【図６９Ｄ】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７０Ｃ】
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【図７０Ｄ】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７１Ｃ】
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【図７１Ｄ】
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【図７１Ｅ】
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【図７２】
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【図７３】
2021518386.tif 000198
【図７４】
2021518386.tif 000199
【図７５】
2021518386.tif 000200
【図７６Ａ】
2021518386.tif 000201
【図７６Ｂ】
2021518386.tif 000202
【図７６Ｃ】
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【図７６Ｄ】
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【図７６Ｅ】
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【図７７Ａ】
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【図７７Ｂ】
2021518386.tif 000207
【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
2021518386.tif 000209
【図７９Ａ】
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【図７９Ｂ】
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【図７９Ｃ】
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【図７９Ｄ】
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【図７９Ｅ】
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【図８０Ａ】
2021518386.tif 000215
【図８０Ｂ】
2021518386.tif 000216
【図８０Ｃ】
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【図８０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021518386.tif 000219
2021518386.tif 000220
2021518386.tif 000221
2021518386.tif 000222
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