(57)【要約】  本発明は、統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有し、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン並びに／又は抗菌剤で機能化された、コポリマーの球状ポリマー粒子を得るための沈殿重合の方法に関する。本発明はまた、前記ポリマー粒子にも関する。本発明はさらに、ポリマー粒子を含む組成物、及び薬物を製造するための粒子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能化ポリマー粒子を得る方法であって、
前記機能化ポリマー粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・１０００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されており、
前記方法は、以下の工程：
ａ）以下を含む溶液を調製する工程：
・前記溶液の総重量に対して０．０５重量％〜１０重量％の割合で、アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー、
・前記溶液の総重量に対して０．０５重量％〜１０重量％の割合で、アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤、
・前記溶液の総重量に対して０．０５重量％〜１０重量％の割合で、アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー、
・前記溶液の総重量に対して８０重量％〜９９．８重量％の割合で、少なくともアセトニトリル、アクリロニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、ブチロニトリル、メチルエチルケトン（ブタノン）、エチルアセテート、１，２−ジメトキシエタン又はそれらの組合せを含む溶媒、
・前記溶液の総重量に対して０．０１重量％〜２重量％の割合で、開始剤、
・前記溶液の総重量に対して０．００９重量％〜２重量％の割合で、フラクタル表面を有する粒子；
ｂ）工程（ａ）で得られた前記溶液中に存在する酸素を除去する工程；
ｃ）３０℃と工程（ａ）で使用した前記溶媒の沸点との間の温度に、（ｂ）で得られた前記溶液を加熱する工程；
ｄ）工程（ｃ）で得られたポリマー粒子を単離し、リンス及び乾燥する工程；
ｅ）懸濁液を得るために、工程（ｄ）で得られた前記ポリマー粒子を、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｓｒ＋２及び／又は抗菌剤を含む水溶液中でインキュベートすることにより機能化する工程であって、ここで前記懸濁液中の前記ポリマー粒子の重量％は０．０１％〜３０％である、工程；及び、
ｆ）工程（ｅ）で機能化された前記ポリマー粒子を単離し、乾燥する工程；
を含む沈殿重合であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ポリマー粒子は３００ｎｍ未満の粒子寸法を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマー粒子は球状である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の前記酸モノマーは、メタクリル酸（ＭＡ）、アクリル酸（ＡＡ）、２−カルボキシエチルアクリレート、モノ−２−（メタクリロイルオキシ）エチルマレエート、２−カルボキシエチルアクリレートオリゴマー、２−ブロモアクリル酸、２−ブロモメタクリル酸、２−エチルアクリル酸、２−プロピルアクリル酸及び２−トリフルオロメチルアクリル酸から選択される、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）の前記架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、３−（アクリロイルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスフェート、ビスフェノールＡプロポキシレートジアクリレート、１，３−ブタンジオールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，３−ブタンジオールジメタクリレート、ジ（トリメチルプロパン）テトラクリレート、ジウレタンジメタクリレート、グリセロール１，３−ジグリセロレートジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、グリセロールプロポキシレート（１ＰＯ／ＯＨ）トリアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ペンタエリスリトールジアクリレートモノステアレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート及びトリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレートから選択される、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）の前記ヒドロキシル化モノマーは、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、ヒドロキシブチルメタクリレート及び２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルアクリレートから選択される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）の前記溶媒は、純粋であり、アセトニトリル、アクリロニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、ブチロニトリル、メチルエチルケトン（ブタノン）、エチルアセテート、１，２−ジメトキシエタン及びそれらの組合せから選択される、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）の前記開始剤は、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンニトリル）（ＡＩＢＮ）、１，１’アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＡＣＨＮ）、２，２’−アゾビス（２’−メチルプロピオンアミジン）２，２’−ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド、２，５−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド）−２，５−ジメチル−３−ヘキシン、ジクミルペルオキシド及び２，５−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド）−２，５−ジメチルヘキサンから選択される、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）のフラクタル表面を有する前記粒子は、１ｎｍ〜４００ｎｍの粒径を有するＳｉＯ２又はＡｌ２Ｏ３核である、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳｉＯ２又はＡｌ２Ｏ３核の粒径は１ｎｍ〜５０ｎｍである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｅ）の前記抗菌剤は、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリンハイクレート、ドキシサイクリンヒドロクロリド、４−エピ−クロルテトラサイクリンヒドロクロリド、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、マクロリド、ペニシリン、バンコマイシン、セファロスポリン及び経口用の無毒性消毒剤であるクロルヘキシジンジグルコネート又はクロルヘキシジンアセテートを含むリストから選択される、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法によって得られるポリマー粒子であって、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・１０００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されている、
粒子。
【請求項１３】
前記粒子寸法は３００ｎｍ未満である、請求項１２に記載の粒子。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の粒子を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１２又は１３に記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項１６】
医薬品の製造用の、請求項１２に記載の粒子の使用。
【請求項１７】
前記粒子はＺｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される少なくとも１つの二価カチオンで機能化されている、象牙質の再石灰化用の医薬品を製造するための、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記粒子は少なくとも１つの抗菌剤で機能化されている、歯根象牙質の細菌感染症の治療及び／又は予防用の医薬品を製造するための、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記粒子はＺｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される少なくとも１つの二価カチオン及び少なくとも１つの抗菌剤で機能化されている、象牙質の再石灰化用の、並びに歯根象牙質の細菌感染症の治療及び／又は予防用の医薬品を製造するための、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
象牙質の過敏症の治療及び／又は予防用の医薬品を製造するための、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
歯内治療侵襲後の感染性再発の治療及び／又は予防用の医薬品を製造するための、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有し、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン並びに／又は抗菌剤で機能化された、コポリマーのポリマー球状粒子を得るための沈殿重合の方法に関し、前記ポリマー粒子にも関する。さらに、本発明は、前記ポリマー粒子を含む組成物、及び医薬品を製造するための前記粒子の使用に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
歯内治療侵襲後に起こりうる最も重大な問題の１つは、その後に別の侵襲を必要とする、又は歯片の損失をもたらす可能性のある長期感染症の出現である。この問題の主な原因は歯内治療手術中の歯根象牙質の消毒が不完全であり、その結果、存在する細菌が完全に除去されないことである。
【０００３】
現在、歯内治療処置における最大の課題の１つは、根管系の細菌を完全に除去することである。処置を生き延びることができる微生物は、歯根尖端周囲の治癒に影響を及ぼし、先端病変の進行を促進する。これらの細菌の再活性化は、メタロプロテアーゼの活性化を介した直接的及び間接的に有害な作用を有する。したがって、象牙質の壁、根管に適用することができ、長期間の殺菌効果及びメタロプロテアーゼの阻害活性を有する薬剤が必要とされる。
【０００４】
根管内で有意な抗菌効果を有する生体材料の探索は、新たな課題ではなく、様々な材料が以前から提案されている：
最近、三種の抗生物質の混合物（triple antibiotic mixture、ＴＡＭ）が、根管系に一般的に見られる病原体に対する管内医薬品として使用されている。この混合物はシプロフロキサシン、メトロニダゾール及びミノサイクリンを含み、細菌を効果的に排除できるが、２つの重大な欠点がある：
混合物は、歯の構造の暗色化を引き起こす［Shakouie S, Shahi S, Samiei M, Milani AS, Reyhani MF, Paksefat, Eskandarinekhad M, Ghasemi N. Effects of different intra canal medicaments on the push out bond strength of endodontic sealers.（歯内治療シーラーの押し出し結合強度に対する異なる管内医薬品の効果）  J Clin Exp Dent. 2017;9（3）:e443−e447］。
【０００５】
混合物は、管シーラーの接着力を変化させる［Shokraneh A, Farhad AR, Farhadi N, Saatchi M, Hasheminia SM. Antibacterial effect of triantibiotic mixture versus calcium hydroxide in combination with active agents against Enterococcus faecalis biofilm.（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓのバイオフィルムに対する活性剤と結合させた三重抗菌混合物対水酸化カルシウムの抗菌効果）  Dent Mater J 2014;33（6）:733−738］。
【０００６】
水酸化カルシウムＣａ（ＯＨ）２は、歯内治療後の処置に広く使用されている。根管におけるＣａ（ＯＨ）２の短期及び長期の使用は、歯根の象牙質の化学的及び機械的性質に悪影響を及ぼす可能性があり、これはおそらく、象牙質の表面のコラーゲンに有害な影響を及ぼす可能性がある歯根の象牙質ｐＨ増加によるものであることが示されている。また、Ｃａ（ＯＨ）２は、長期的には根管内の耐性微生物に有意な影響を及ぼさないことが示されている。
【０００７】
さらに、歯は、象牙質の内層及びエナメル質の硬い外層を有する。ヒトにおいて、エナメル質は歯の表面上で厚さが変化し、時には、上部領域でより厚く、最大２．５ｍｍまであり、セメント質−エナメル質結合の端部でより薄い。しかしながら、脱塩プロセスはエナメル質中で頻繁に起こり、エナメル質を分解する。このエナメル質の破壊は象牙質の口腔環境への露出をもたらし、時には、象牙質細管内への流体の移動中に象牙質過敏症をもたらすことに関係する。一般的に使用される脱感作剤は例えば、シュウ酸塩結晶による細管の一時的な閉塞をもたらすシュウ酸カリウムを含有する。しかし、損傷した象牙質の再石灰化と、失われたものと同様の無機化合物を沈着させることによる細管閉塞とを達成する必要がある。
【０００８】
〔発明の説明〕
本発明は、統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有し、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン並びに／又は抗菌剤で機能化されたコポリマーのポリマー球状粒子を得るための沈殿重合の方法である。当該方法は、コポリマーのモノマー、架橋剤、溶媒、開始剤及びフラクタル表面を有する粒子を有するモノマー溶液を調製する第１の工程と、ポリマー粒子を機能化することを目的としてＺｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｓｒ＋２及び／又は抗菌剤を含む水溶液中でポリマー粒子をインキュベートする次の工程とを含む、方法に関する。
【０００９】
コポリマーは、化学結合によって種々の様式で結合され得る、２つ以上のモノマー又は種々の反復単位から構成される高分子である。本発明において、用語「統計的トポロジーを有するコポリマー」とは統計的コポリマー、すなわち、溶液中に存在する全てのモノマーが、同じ化学的性質のモノマーと（それ自体と）、及び異なる化学的性質のモノマーと、の両方と反応するための同じ親和性／確率を有するため、鎖中のモノマーの分布がランダムであるコポリマーを指す。
【００１０】
機能化ポリマー粒子が３００ｎｍ未満の寸法を有する場合、それらは象牙質細管を塞ぐことができ、その結果、前記粒子は、象牙質を再石灰化する能力を有する医薬品を製造するために、並びに／又は根管の象牙質の細菌感染症の治療及び／若しくは予防用に、使用することができる。したがって、前記粒子は、象牙質の過敏症の治療及び／又は予防用の医薬品を製造するために、並びに歯内治療侵襲後の感染性再発の治療及び／又は予防用の医薬品を製造するために、使用することができる。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、沈殿重合によってポリマー粒子を得る方法（以下、「本発明の方法」と称する）であって、
ポリマー粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・１０００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されており、
前記方法は、以下の工程：
ａ）以下を含む溶液を調製する工程：
・前記溶液の総重量に対して０．０５重量％〜１０重量％の割合で、アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー、
・前記溶液の総重量に対して０．０５重量％〜１０重量％の割合で、アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤、
・前記溶液の総重量に対して０．０５重量％〜１０重量％の割合で、アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー、
・前記溶液の総重量に対して８０重量％〜９９．８重量％の割合で、少なくともアセトニトリル、アクリロニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、ブチロニトリル、メチルエチルケトン（ブタノン）、エチルアセテート、１，２−ジメトキシエタン又はそれらの組合せを含む溶媒、
・前記溶液の総重量に対して０．０１重量％〜２重量％の割合で、開始剤、
・前記溶液の総重量に対して０．００９重量％〜２重量％の割合で、フラクタル表面を有する粒子；
ｂ）工程（ａ）で得られた前記溶液中に存在する酸素を除去する工程；
ｃ）３０℃と工程（ａ）で使用した溶媒の沸点との間の温度に、（ｂ）で得られた前記溶液を加熱する工程；
ｄ）工程（ｃ）で得られたポリマー粒子を単離し、リンス及び乾燥する工程；
ｅ）懸濁液を得るために、工程（ｄ）で得られた前記ポリマー粒子を、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｓｒ＋２及び／又は抗菌剤をそれぞれ含む水溶液中でインキュベートすることにより機能化する工程であって、ここで懸濁液中のポリマー粒子の重量％は０．０１％〜３０％である、工程；及び、
ｆ）工程（ｅ）で機能化された前記ポリマー粒子を単離し、乾燥する工程；
を含む沈殿重合であることを特徴とする、方法に関する。
【００１２】
本発明の方法の好ましい実施形態において、得られるポリマー粒子は、３００ｎｍ未満の粒子寸法を有する。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態では、得られるポリマー粒子は球状である。
【００１４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、工程（ａ）の酸モノマーは、メタクリル酸（ＭＡ）、アクリル酸（ＡＡ）、２−カルボキシエチルアクリレート、モノ−２−（メタクリロイルオキシ）エチルマレエート、２−カルボキシエチルアクリレートオリゴマー、２−ブロモアクリル酸、２−ブロモメタクリル酸、２−エチルアクリル酸、２−プロピルアクリル酸及び２−トリフルオロメチルアクリル酸から選択される。
【００１５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、工程（ａ）の架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、３−（アクリロイルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスフェート、ビスフェノールＡプロポキシレートジアクリレート、１，３−ブタンジオールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，３−ブタンジオールジメタクリレート、ジ（トリメチルプロパン）テトラクリレート、ジウレタンジメタクリレート、グリセロール１，３−ジグリセロレートジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、グリセロールプロポキシレート（１ＰＯ／ＯＨ）トリアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ペンタエリスリトールジアクリレートモノステアレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート及びトリメチロールプロパンプロポキシレートトリアクリレートから選択される。
【００１６】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、工程（ａ）のヒドロキシル化モノマーは、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、ヒドロキシブチルメタクリレート及び２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルアクリレートから選択される。
【００１７】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、工程（ａ）の開始剤は、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンニトリル）（ＡＩＢＮ）、１，１’アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＡＣＨＮ）、２，２’−アゾビス（２’−メチルプロピオンアミジン）２，２’−ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド、２，５−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド）−２，５−ジメチル−３−ヘキシン、ジクミルペルオキシド及び２，５−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド）−２，５−ジメチルヘキサンから選択される。
【００１８】
本発明の方法の工程（ａ）は、少なくともアセトニトリル、アクリロニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、ブチロニトリル、メチルエチルケトン（ブタノン）、エチルアセテート、１，２−ジメトキシエタン又はそれらの組合せを含む溶媒の存在下で行われる。
【００１９】
本方法の工程（ａ）を水の存在下で行う場合、ポリマー粒子は凝集し、これは望ましくなく、避けるべきである。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態では、工程ａ）の溶液を得るために使用される溶媒は水ではない。
【００２０】
本方法の工程（ａ）が、アルコール（１−プロパノール、２−プロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール）のような、ハンセン溶解度パラメータが高い値であり、水素結合（δｈ）を形成する純粋な溶媒中で行われる場合、コポリマーのポリマー鎖は、高い転化率値まで溶媒和されたまま維持され、望ましくない非晶質マクロゲルが得られる。
【００２１】
本方法の工程（ａ）が、キシレン、トルエン、エチルベンゼン、オクタン、ヘプタン、ヘキサンのような、ハンセン溶解度パラメータが高い値であり、分散強度（δｄ）を与える純粋な溶媒中で行われる場合、より小さい粒子の凝集／凝固によって形成される１５００ｎｍ径の望ましくない非球状粒子が得られる。
【００２２】
本方法の工程（ａ）が、
・少なくともアセトニトリル、アクリロニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、ブチロニトリル、メチルエチルケトン（ブタノン）、エチルアセテート、１，２−ジメトキシエタン又はそれらの組合せ、
・及び前述の溶媒のいくつか、
を用いて行われる場合、１０００ｎｍ未満の粒子寸法が得られる。
【００２３】
本発明の方法の好ましい実施形態において、溶媒は純粋であり、アセトニトリル、アクリロニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、ブチロニトリル、メチルエチルケトン（ブタノン）、エチルアセテート、１，２−ジメトキシエタン及びそれらの組合せから選択される。
【００２４】
本発明において、「フラクタル表面を有する粒子」とは、フラクタル表面、すなわち、その幾何学がフラクタル次元を含む表面を含む粒子として理解される。フラクタル次元とは、接空間を許容しない幾何学的物体に対する通常の次元概念を一般化する実数である。微分幾何学においては、接空間とは、各点に向くすべての接線ベクトルによって形成される識別可能な様々な各点に関連付けられた組合せである。
【００２５】
親水性のフラクタル面を有する粒子の例は、多孔質シリカＳｉＯ２又はアルミナＡｌ２Ｏ３ナノ粒子である。
【００２６】
シリカＳｉＯ２は、水素結合、静電相互作用等による、コポリマーを構成するモノマーの極性基（ＣＯＯＨ及びＯＨ）とシリカ中に存在する一価及び二価カチオンとの間の錯化によって、極性ポリマー及びコポリマーの高い吸着能を有する多孔質で親水性の物質である。ＳｉＯ２核は核形成障壁を実質的にゼロに下げることができるフラクタル親水性表面のように振る舞い、そこで核形成現象（金属凝固、液状濃縮、鉱物凝固等）が起こり、不均一核形成を介して前記核の表面上で核形成現象を好適に起こさせる。沈殿重合プロセスでは核形成現象も行われる。したがって、ＳｉＯ２核は同じように挙動する：ＳｉＯ２核の存在は、沈殿重合における核形成メカニズムが専ら不均一核形成を介することを意味する。
【００２７】
本方法の工程（ａ）はフラクタル表面を有する粒子の存在を必要とし、沈殿重合反応は、以下に示すようにフラクタル表面を有する前記粒子の存在下で不均一核形成メカニズムによって行われる。沈殿重合における不均一核形成は、固体表面が既に存在する面積、すなわち粒子のフラクタル表面上で成長するポリマー鎖の沈殿からなる。以下の図表では、フラクタル表面粒子としてＳｉＯ２核を用いている。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
提示したメカニズムの工程１は、ＳｉＯ２核の存在下での、酸性モノマー、ヒドロキシル化モノマー、架橋剤、溶媒及び開始剤を基にした開始及び形成からなる。
【００３０】
工程２は、溶液中でのポリマー鎖の増殖及び伸長の工程である。
【００３１】
工程３は２段階からなる：
ａ）沈殿；ポリマー鎖は溶液中で可能な最大の大きさに達するまで溶媒和されて伸長し、続いてＳｉＯ２核上に沈殿し、第１のＳｉＯ２コポリマー粒子を形成する。
ｂ）成長；全てのＳｉＯ２核がＳｉＯ２コポリマー形態になると、続く沈殿は最初のＳｉＯ２コポリマー粒子の成長を引き起こす。
【００３２】
工程４は、界面重合現象に相当する。界面重合現象は、粒子の表面上へモノマーが吸着し得ること、及び、それに続いて、粒子の表面上に留まることができる残留伸長鎖上へモノマーが増殖することによる。
【００３３】
例えばＳｉＯ２核のようなフラクタル表面を有する粒子の存在下で沈殿重合の反応を行った結果、フラクタル表面を有する前記粒子の非存在下で同じ実験条件下で得られた径の１／４以下までポリマー粒径が減少する。
【００３４】
さらに、ポリマー粒子の多分散指数は、フラクタル表面を有する粒子の存在下で沈殿重合を行う場合にも減少する。
【００３５】
本発明の方法の工程（ａ）の好ましい実施形態では、工程（ａ）のフラクタル表面を有する粒子は１ｎｍ〜４００ｎｍの粒径を有するＳｉＯ２又はＡｌ２Ｏ３核である。より好ましくは、ＳｉＯ２又はＡｌ２Ｏ３核の粒径は１ｎｍ〜５０ｎｍである。
【００３６】
本発明の方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた溶液中に存在する酸素を除去することに関する。前記工程（ｂ）は、好ましくは窒素パージによって行われる。
【００３７】
本発明の方法の工程（ｃ）は、３０℃と工程（ａ）で使用した溶媒の沸点との間の温度に、（ｂ）で得られた溶液を加熱することに関する。
【００３８】
本発明の方法の工程（ｄ）は、工程（ｃ）で得られたポリマー粒子を単離することに関し、好ましくは遠心分離及び上清の除去による。
【００３９】
リンス及び乾燥した後、工程（ｄ）で得られたポリマー粒子を、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｓｒ＋２及び／又は抗菌剤をそれぞれ含む水溶液中でインキュベートすることによって工程（ｅ）で機能化し、懸濁液を得る。ここで懸濁液中のポリマー粒子の重量％は０．０１％〜３０％である。ＺｎＣｌ２、ＣａＣｌ２の水溶液は、それぞれカチオンＺｎ＋２及びＣａ＋２による機能化のために好ましい。
【００４０】
Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２又はＳｒ＋２等の二価カチオンでポリマー粒子が機能化されるメカニズムは、前記二価カチオンとの錯体形成のためにポリマー粒子の表面上に存在するカルボキシ（ＣＯＯＨ）基及びヒドロキシル（ＯＨ）基によって示される高い親和性定数に起因し、一方で、抗菌剤による機能化は、使用される抗菌剤の化学構造に応じて、共有結合によって、又は疎水性、水素結合、分散性、イオン性等の非共有相互作用によって、行われ得る。
【００４１】
本発明の方法の好ましい実施形態において、工程（ｅ）の抗菌剤は、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリンハイクレート、ドキシサイクリンヒドロクロリド、４−エピ−クロルテトラサイクリンヒドロクロリド、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、サルフェート及びその誘導体、エリスロマイシン等のマクロライド、アンピシリン及びアモキシシリン等のペニシリン、バンコマイシン、セファロスポリン、及びその形態のいずれかにおけるクロルヘキシジン等の経口用の無毒性消毒剤であるクロルヘキシジンジグルコネート及びクロルヘキシジンアセテートを含むリストから選択される。
【００４２】
本発明の別の態様は、前述の方法によって得られるポリマー粒子（以下、「本発明の粒子」と称する）に関し、ここで、前記粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・１０００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・及び、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されている。
【００４３】
本発明の粒子の好ましい実施形態では、粒子寸法は３００ｎｍ未満である。
【００４４】
本発明の別の態様は、その技術的特徴が前述されている本発明の粒子を含む組成物に関する。
【００４５】
本発明の別の態様は、本発明の粒子を含む薬学的に許容される組成物に関する。
【００４６】
本発明の組成物は、クリーム、エマルジョン、無水組成物、水性分散液、油、乳、バルム、泡、ローション、ゲル、水性アルコール溶液、水性グリコールゲル、ヒドロゲル、リニメント、血清、軟膏（ointment）、ムース、軟膏（salve）、粉末、気化剤、エアロゾル、カプセル、丸剤、錠剤、顆粒剤、溶液、懸濁液、シロップ、フィルム等からなるリストから選択される製剤で提供され得る。
【００４７】
本発明の特定の実施形態では、３００ｎｍ未満の寸法を有する本発明の粒子は、
・機能化ポリマー粒子から、長期間にわたって根管内に活性成分をゆっくりと放出することができる抗菌剤、又はそれ自体が作用することができる抗菌剤として使用することができ、
・象牙質過敏症の治療等の歯科学的用途において使用することができ、（Ｚｎ＋２又はＣａ＋２によって機能化された）前記粒子が象牙質の細管を塞ぐことができるので、象牙質の再石灰化を促進する。
【００４８】
次に、本文書の文脈における「治療」又は「治療する」という用語は、患者における疾患、病的状態、又は当該疾患、若しくは状態に関連する１つ以上の症状を改善、又は除去するための、本発明による化合物又は組成物の投与に関連するものである。「治療」は、病気の生理学的影響の改善、又は除去も含む。
【００４９】
具体的には、「治療する」という概念は以下のように解釈することができる：
ｉ．疾患又は病的状態を予防すること、すなわち、その出現を妨害又は遅延させること；
ｉｉ．疾患又は病的状態を阻害すること、すなわち、その進行を停止すること；
ｉｉｉ．疾患又は病的状態を軽減すること、すなわち、疾患又は病的状態の後退を引き起こすこと；
ｉｖ．疾患又は病的状態を安定させること。
【００５０】
本明細書で使用される「医薬品」という用語は、ヒト又は動物における疾患又は病的状態の治療に使用される任意の物質を指す。
【００５１】
本発明の粒子の１つの利点は、その長期持続効果、及び細菌阻害とメタロプロテアーゼの活性阻害との間の相乗作用における、抗菌剤としてのその使用である。メタロプロテアーゼはドキシサイクリンによって強力に阻害され、二価カチオンに対してキレート効果を有する。本発明の粒子はメタロプロテアーゼのコラーゲン分解作用（歯及び骨の破壊）を競合的に阻害すること、すなわち、本発明の粒子は象牙質メタロプロテアーゼを阻害し、コラーゲンの破壊を停止することに留意すべきである。
【００５２】
本発明の粒子の生体適合性は、それらをヒト線維芽細胞に対して分析した場合には９０％を超えることが確認されている。したがって、本発明の粒子は歯内治療の血管再生技術において有用なツールであり得る。
【００５３】
さらに、本発明の粒子は、根管を密封するために使用される全ての公知の材料と適合性がある。したがって、本発明の粒子は根管において使用でき、歯内治療侵襲後の再発及び二次的な外科的侵襲の必要性を大幅に低減することができる。
【００５４】
本発明の粒子のさらなる適用は、歯根表面又は頸部歯の象牙質への局所投与であり、象牙質細管を塞ぎ、象牙質のメタロプロテアーゼを阻害し、その再石灰化特性のために象牙質表面の機械的特性を回復させることができる。したがって、過敏症は細管の閉塞によって低減され、損傷の進行は象牙質の機械的特性の向上及びメタロプロテアーゼ（この象牙質浸食過程の進行に関与する）の阻害によって回避される。
【００５５】
したがって、本発明の別の態様は、医薬品の製造用の、本発明の粒子の使用（以下、「本発明の使用」と称する）に関し、粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・１０００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されている。
【００５６】
加えて、本発明は、医薬品として使用するための本発明の粒子に関し、粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・１０００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されている。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の粒子の使用は、癌又は炎症プロセス等のメタロプロテアーゼの活性に由来する疾患の治療及び／又は予防用の医薬品の製造に関する。
【００５８】
次に、本発明は、癌又は炎症プロセス等のメタロプロテアーゼの活性に由来する疾患の治療及び／又は予防用の医薬品として使用するための本発明のポリマー粒子に関し、前記粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・１０００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される少なくとも１つの二価カチオンによって機能化されている。
【００５９】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明のポリマー粒子の使用は、象牙質の再石灰化用の医薬品の製造に関し、ここで、粒子は、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される少なくとも１つの二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されている。
【００６０】
次に、本発明は、象牙質の再石灰化用の医薬品として使用するための本発明のポリマー粒子に関し、粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・３００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される少なくとも１つの二価カチオンによって機能化されている。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の粒子の使用は、歯根象牙質の細菌感染症の治療及び／又は予防用の医薬品の製造に関し、ここで、粒子は、少なくとも１つの抗菌剤によって機能化されている。
【００６２】
さらに、本発明は、歯根象牙質の細菌感染の治療及び／又は予防用の医薬品として使用するためのポリマー粒子に関し、粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・３００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・少なくとも１つの抗菌剤によって機能化されている。
【００６３】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の粒子の使用は、象牙質の再石灰化用の、並びに象牙質の細菌感染症の治療及び／又は予防用の医薬品の製造に関し、ここで、粒子は、Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される少なくとも１つの二価カチオンによって、並びに少なくとも１つの抗菌剤によって、機能化されている。
【００６４】
本発明はまた、象牙質の再石灰化用、及び歯根象牙質の細菌感染症の治療及び／又は予防用の本発明の粒子にも関し、粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・３００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される少なくとも１つの二価カチオンによって、並びに少なくとも１つの抗菌剤によって、機能化されている。
【００６５】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の使用は、象牙質の過敏症の治療及び／又は予防用の医薬品の製造に関する。
【００６６】
本発明はまた、象牙質の過敏症の治療及び／又は予防用の、本発明のポリマー粒子に関し、粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・３００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されている。
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の粒子の使用は、歯内治療侵襲後の感染性再発の治療及び／又は予防用の医薬品の製造に関する。
【００６８】
次に、本発明は、歯内治療後の感染性再発の治療及び／又は予防用の、本発明のポリマー粒子に関し、粒子は、
・統計的トポロジー及び化学構造（アクリル又はメタクリルから選択される酸モノマー）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択される架橋剤）−ｃｏ−（アクリル又はメタクリルから選択されるヒドロキシル化モノマー）を有するコポリマーを含み、
・３００ｎｍ未満の粒子寸法を有し、および、
・Ｚｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２及びＳｒ＋２から選択される二価カチオン、抗菌剤、並びに／又はそれらの任意の組合せによって機能化されている。
【００６９】
明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって、「含む」という語及びその変形は、他の技術的特徴、追加部分、構成要素又は工程を排除することを意図するものではない。当業者にとって、本発明の他の対象、利点及び特徴は、一部は明細書から、一部は本発明の実施から、明らかになるであろう。以下の実施例及び図面は、例示のために提供され、本発明を限定することを意図しない。
【００７０】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ガラスバイアル（Ａ）及びＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）（プラスチック）ボトル（Ｂ）中での沈殿重合によって得られた粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。
〔図２〕ガラスバイアル中で得られた粒子の光学顕微鏡画像。
〔図３〕Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で、及びガラスバイアル中で行われた沈殿重合によって得られたポリマー粒子についての粒径及び多分散指数ＰＤＩの比較。
〔図４〕Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で、量が増加していくガラスの存在下で行われた沈殿重合によって得られた粒子についての粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）の比較。
〔図５〕無機ナノ粒子ＮＴＩ４（Ａ）及びＮＴＩ５（Ｂ）の存在下で得られた粒子の光学顕微鏡画像。
〔図６〕重合溶媒中に存在する無機ナノ粒子ＮＴＩ４の濃度に対するポリマー粒子の径及び多分散指数（ＰＤＩ）値。
〔図７〕無機ナノ粒子ＮＴＩ４−Ｆ（Ａ）、ＮＴＩ４−Ｇ（Ｂ）及びＮＴＩ４−Ｈ（Ｃ）の存在下での沈殿重合によって得られたポリマー粒子の光学顕微鏡画像。
〔図８〕トルエン中で得られた１５００ｎｍのポリマー粒子（Ａ）、アセトニトリル中で得られた２５０ｎｍのポリマー粒子（Ｂ）、各溶媒が以下の体積比Φトルエン＝０．７３  Φアセトニトリル＝０．２５  Φ２−プロパノール＝０．０２であるアセトニトリル／２−プロパノール／トルエンの混合物中で得られた６００ｎｍのポリマー粒子（Ｃ）、以下の体積比Φトルエン＝０．０３５  Φアセトニトリル＝０．９０  Φ２−プロパノール＝０．０１５であるアセトニトリル／２−プロパノール／トルエンの混合物中で得られた１２００ｎｍのポリマー粒子（Ｄ）、及び２−プロパノール中で得られたマクロゲル（Ｅ）の走査型電子顕微鏡画像。
〔図９〕（Ａ）各時間間隔でのドキシサイクリン放出量（Ｄｏｘ粒子１ｍｇ当たり、μｇ／ｍｌ）の平均値と標準偏差（ＳＤ）。（Ｂ）各時間間隔でのＤｏｘ粒子１ｍｇ当たりのドキシサイクリン放出（％）。
〔図１０〕異なる時間間隔で異なる粒子とインキュベーションした後のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの生存（生存細胞数）。全ての場合において、リン酸緩衝液中でインキュベーションした後の生存数を参照対照として使用する。
〔図１１〕Ａ）７日間の保管後の、未治療の歯頸部の走査型電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）画像。この期間の後、いくつかの小さな結晶又は無機堆積物（矢印で示される）が、管間象牙質及び管周囲象牙質（それぞれ、ＩＤ及びＰＤ）において見られた。表面の残りの部分はすべて、無機堆積物が無いように見える。Ｂ）７日間の保管後の、Ｚｎ粒子で治療した歯頸部の走査型電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）画像。象牙質の表面は、丸みのある形状（星印）、又は無定形の形状（矢印）を有するリン酸カルシウムの密なネットワークとして、集合した非結晶性無機堆積物を示し、細管は観察されなかった。分散エネルギー分析により得られるこれらの堆積物のスペクトルは、リン（Ｐ）及びカルシウム（Ｃａ）の元素組成を示す。
〔図１２〕２４時間目及び７日目に分析した試料の関数としての象牙質流体流（ＤＦＦ）に対する減少割合。
〔図１３〕Ａ）２４時間目及び７日目に異なる機能化ポリマー粒子を実験群に適用した後の、管周囲領域及び管間領域の両方における歯頚部表面上のナノ硬度（Ｈｉ）（ＧＰａ）の平均値及び標準偏差。Ｂ）２４時間目及び７日目に異なる機能化ポリマー粒子を実験群に適用した後の、管周囲領域及び管間領域の両方における歯頸部表面上のヤング弾性率（Ｅｉ）（ＧＰａ）。
【００７１】
〔実施例〕
本発明は、本発明の生成物の有効性を明らかにする、本発明者らによって行われた試験によって、以下に説明されるであろう。
【００７２】
実施例１：機能化ＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡのポリマー粒子の合成
以下のモノマー系を用いて、熱開始による沈殿重合によって、ＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡの球状ポリマー粒子を調製した：２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡ）及び架橋剤エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）；アセトニトリル（ＡＮＣ）中で、熱開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を用いた。
【００７３】
沈殿重合反応のための供給物の組成、及び反応に使用した実験条件を以下の表１に示す。
【００７４】
【表２】
2021512994.tif 000003
【００７５】
重合を行う前に、モノマーを精製し、モノマー及び開始剤を含む溶液を調製した後、溶媒中に存在するＯ２を除去する目的で、系を冷却し、Ｎ２で５分間パージした。反応は、８２℃の油浴中で温度を制御しながら行った。重合が完了した後、粒子を遠心分離し、上清をデカンテーションにより除去し、粒子を３０ｍＬのメタノールで３回リンスし、粒子を７０℃の減圧炉中で恒量まで乾燥し、乾燥後、粒子の懸濁液をＭｅＯＨ中で調製し、Ｍａｌｖｅｒｎ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０装置を用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ）により粒径を測定した。
【００７６】
沈殿重合が異なる組成のバイアル中で行われる場合、驚くべきことに、ＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡの球状粒子について異なる直径が得られる。
【００７７】
最初の実験は、２０ｍｌのガラスバイアル中及び１００ｍｌのＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で本発明を行うことからなる。
【００７８】
Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックブランドは、高圧及び高温で化学反応を行うために設計され、化学的及び物理的な要因耐性を有する、高度に不活性なプラスチックである。
【００７９】
使用した受容器（ガラスバイアル又はＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル）の関数として得られた粒径の差を確認するために、合成を各受容器において５回繰り返し、以下の結果を得た。
【００８０】
・多分散指数（ＰＤＩ）値０．００４±０．００１及び収率（Ｒ）６５±９％を有するガラス中で行った反応について、２１０±２５ｎｍの平均粒径。なお、収率は、供給に用いたモノマーの重量に対する、得られた粒子の重量による割合として算出した。
【００８１】
・Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で行った合成について、８８０±５０の粒径が、ＰＤＩ０．１±０．０３５、及び収率６７±８％で、得られた。
【００８２】
図１は、ガラスバイアル（Ａ）及びＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）（プラスチック）ボトル（Ｂ）中での沈殿重合によって得られた球状ポリマー粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
【００８３】
図２は、ガラスバイアル中で得られ、図１に示される高度に単分散した球状ポリマー粒子の光学顕微鏡画像を示す。光学顕微鏡の図２において、ポリマー粒子が、乾燥されると、どのようにしてコンパクトな束の形態で約１０×３０μｍのマクロ構造によって形成された亀裂が入った表面を生成し、単分散性を増加させるかが観察され得る。
【００８４】
以下の実験は、両方の受容器（２０ｍｌのガラスバイアル及び１００ｍｌのＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル）における反応時間の関数としての粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）の調査からなる。選択した反応時間は、５、１０、２０、３０、６０、１２０、２１０及び３６０分であった。曇り時間、すなわち、懸濁液中の第１の核の形成による系の濁りを視覚的に観察するために必要な時間は、両方の場合において、約１０分間の反応で生じる。急速冷却及び酸素への暴露によって反応を停止させ、続いて粒径及び多分散指数値をＤＬＳによって測定した。
【００８５】
図３に、この実験で得られた結果を示す。
【００８６】
図３では、重合を行って得られた粒径間の比較：１００ｍｌのＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中：黒色線：径（−黒四角−）及び収率（・・・黒四角・・・）、及び２０ｍｌのガラスバイアル中：灰色線：径（−黒丸−）及び収率（・・黒丸・・）（Ａ）、多分散指数ＰＤＩの値の間の比較：Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ボトル中で行った重合：黒線（−黒四角−）及びガラス中で行った重合；灰色線（−黒丸−）（Ｂ）、を示す。
【００８７】
図３Ａにおいて、収率が両方の系（ガラス及びプラスチック）においてどの程度同じであるか、及びガラス中で合成されたポリマー粒子がどの程度より小さく、極めて単分散であるか、が観察され得る。粒径の減少は、使用される系に起因する初期段階での重合の阻害によっては生じないと結論付けることができる。
【００８８】
ガラスの何らかの成分の浸出が粒径の減少をもたらすことを確認するために、ガラスバイアルから得られる３〜５ｍｍ径の破砕及び粉砕されたガラスが添加されたＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で、重合を３回反復した。重合が終了した後、ガラスを除去し、粒子をＭｅＯＨで３回リンスし、その径をＤＬＳによって測定したところ、１９０±１５ｎｍの平均値が得られ、多分散指数０．００２６±０．０００８、及び収率６５±６％が得られた。これらの結果を考慮して、我々は、沈殿重合反応において粒径及び多分散指数の減少を生じるのはガラスの何らかの成分の浸出であることを確認することができる。
【００８９】
ガラスの主な成分は、７０％〜９５％の比率のシリカＳｉＯ２である。純粋なシリカは非常に高い温度で溶融する。したがって、高含有量のＳｉＯ２を有するガラスは加工することが困難であり、高価である；この理由のため、様々な添加剤が溶融温度を下げ、製造プロセスのコストを削減するために使用されており、これは、ガラスの機械的特性を改質し、ガラスをより流動的に、より割れやすく、脆く、多孔質等にする。以下の添加剤が顕著である：ＣａＯ、Ｎａ２Ｏ、Ｋ２Ｏ、Ａｌ２Ｏ３、ＭｇＯ等。ガラスの冷却プロセスにおいて、ナノメートルのＳｉＯ２核を生成することができる核形成現象が発生し、この核はガラスの組織に捕捉され。したがって、この核は、ガラスが種々の液状溶媒に曝されたときに浸出することができる。
【００９０】
以下の実験は、３００ｎｍ未満の直径を有する粒子を得るために必要とされるガラスの最少量を測定することを意図した。この目的のために、沈殿反応による重合を、反応溶媒中に２０ｍｌのガラスバイアル由来の異なる量のガラスを含むＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で、前述したものと同様に行った。表２は、この実験の結果を示す。
【００９１】
【表３】
2021512994.tif 000004
【００９２】
図４は、量を増加させたガラスの存在下でＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で行った沈殿重合によって得られた、ポリマー粒子の粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を示す。
【００９３】
図４では、粒径を３００ｎｍ未満にするには１５ｇのガラスで十分であることを観察することができる。さらに、前記図４では、すべての場合について、多分散指数の値がどの程度に極めて低いかを観察することができ、これは、得られる粒子の非常に高い単分散性を示す。この実験で得られた３００ｎｍ以下の径を有する粒子は、光学顕微鏡下で図２のものと同様の構造を示した。
【００９４】
沈殿重合において粒径及び多分散指数ＰＤＩの減少を生じさせるガラス成分がナノメートルのＳｉＯ２核であるかどうかを同定するために、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックバイアル中で、前の場合と同じ実験条件下で、かつ、ＴｉＯ２をベースとする様々な種類の固定量の無機ナノ粒子（それらのうちの１つのみがＳｉＯ２で覆われている）の存在下で、沈殿重合を行った。
【００９５】
この実験で使用した無機ナノ粒子を以下に詳述する：
ＮＴＩ−１：アナターゼ二酸化チタン（ＴｉＯ２）、純度：９９．５％、粒径：２０ｎｍ、ｉｏ−ｌｉ−ｔｅｃ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓにより提供。
ＮＴＩ−２：ルチル二酸化チタン（ＴｉＯ２）、粒径：１０ｎｍ、Ｄｕｐｏｎｔにより流通。
ＮＴＩ−３：ルチル二酸化チタン（ＴｉＯ２）、純度９９．５％、粒径１０〜３０ｎｍ、ｉｏ−ｌｉ−ｔｅｃ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓにより提供。
ＮＴＩ−４：二酸化ケイ素樹脂（silicone dioxide）（ＳｉＯ２）で被覆された二酸化チタン（ＴｉＯ２）９９％、粒径：２０〜４０ｎｍ、ｉｏ−ｌｉ−ｔｅｃ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓにより提供。
ＮＴＩ−５：ルチル二酸化チタン（ＴｉＯ２）、微量の塩基性金属を含む純度９９．５％、粒径＜１００ｎｍ、ｉｏ−ｌｉ−ｔｅｃ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓにより提供。
【００９６】
この実験の結果を表３に示す。
【００９７】
【表４】
2021512994.tif 000005
【００９８】
表３に示すように、使用した無機ナノ粒子の濃度では、得られたポリマー粒子の径は３００ｎｍより大きい。
【００９９】
図５は無機ナノ粒子ＮＴＩ４（Ａ）及びＮＴＩ５（Ｂ）の存在下で合成されたポリマー粒子の光学顕微鏡画像を示し、ここで、前記ポリマー粒子がどの程度に高い単分散性及びコンパクトな束を有するかが分かる。無機ナノ粒子ＮＴＩ４を含む試料は、ＳｉＯ２で被覆されたＴｉＯ２ナノ粒子に相当する。
【０１００】
以下の実験は、粒径に対する無機ナノ粒子の濃度の影響を試験することからなる。結果を表４に示す。
【０１０１】
【表５−１】
2021512994.tif 000006
【表５−２】
2021512994.tif 000007
【０１０２】
得られた結果を考慮すると、無機ナノ粒子ＮＴＩ４を０．４３０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度（溶液の全重量に対して０．０５３重量％）で使用した場合にのみ、３００ｎｍ未満の径を有するポリマー粒子が得られたことが分かる。無機ナノ粒子ＮＴＩ４は正確にはＳｉＯ２で覆われたＴｉＯ２ナノ粒子であり、したがって、ＳｉＯ２ナノメートル核が、ポリマー粒径の減少、ひいては多分散指数値の低下の原因であることを確認することができることに留意されたい。浸出した核は主にＳｉＯ２ナノメートル核であると結論づけることができた。
【０１０３】
図６において、重合溶媒中に存在する無機ナノ粒子ＮＴＩ４の濃度に対してポリマー粒子の径及び多分散指数（ＰＤＩ）値がどの程度減少するかが分かる。
【０１０４】
図７は、無機ナノ粒子ＮＴＩ４−Ｆ（Ａ）、ＮＴＩ４−Ｇ（Ｂ）及びＮＴＩ４−Ｈ（Ｃ）を用いて得られたポリマー粒子の光学顕微鏡画像を示す。コンパクトな束の形態の高度に単分散のポリマー粒子が観察される。
【０１０５】
さらに、図７において、無機ナノ粒子ＮＴＩ４の最適濃度は、２８０±３１ｎｍのポリマー粒径をもたらす０．５３８ｍｇ／ｍｌ（ＮＴＩ４−Ｇ）からであり、前記濃度に基づいて、ＳｉＯ２で被覆された過度のＴｉＯ２無機ナノ粒子が、それらが形成するポリマー粒子の表面上に堆積されることが観察され得ることが分かる。
【０１０６】
ガラスからのＳｉＯ２核は、増大した比表面積を有する高度に多孔質の親水性無機物であり、フラクタル表面と考えられる。前記ＳｉＯ２核はこの合成に使用されるポリマーに対して高い親和性を有し、ＳｉＯ２ポリマー相互作用の強度はポリマー−ポリマー、ポリマー−溶媒及び溶媒−ＳｉＯ２相互作用よりもはるかに大きく、表面エネルギーによる核形成のエネルギー障壁をほぼ０まで減少させる。このことは、相分離がガラスに由来するこれらのＳｉＯ２一次核の表面上でのみ引き起こされることを意味する。したがって、前記ＳｉＯ２核が反応溶媒中で適当な濃度に維持されるならば、ポリマー鎖が溶解状態で生成され得る最大分子量に達すると、相分離は主にＳｉＯ２核上で起こる。したがって粒径は劇的に低下し、それによって得られるポリマー粒径ははるかに小さくなり、得られるポリマー粒子は高度に単分散である（図１参照）。粒径は、ＳｉＯ２核の非存在下での沈殿重合で得られる粒径に対して１／４まで減少する（図３、４及び６参照）。懸濁液中のＳｉＯ２核の濃度を制御することにより、ポリマー粒径を調節し、単分散粒子群を得ることができると結論づけることができる。
【０１０７】
さらに、ＳｉＯ２核の存在下及び非存在下での沈殿重合で得られた多分散指数の値を比較すると、ＳｉＯ２核の存在下での多分散指数の値は非常に低いと結論づけることができる。
【０１０８】
さらに、図８は、沈殿重合が種々の溶媒又はそれらの混合物中で行われる場合に、使用される溶媒／混合物の種類に応じて粒径がどのように変化するかを示す。重合反応がアルコール等のハンセン溶解度パラメータが高い値であり、水素結合（δｈ）を形成する純粋な溶媒中で行わる場合、コポリマーのポリマー鎖は、高い転化率値まで溶媒和されたまま維持され、非晶質マクロゲルが得られる；重合反応が無極性溶媒（トルエン、キシレン、エチルベンゼン、オクタン、ヘキサン等）等のハンセン溶解度パラメータが高い値であり、分散強度（δｄ）を与える純粋な溶媒中で行われる場合、より小さい粒子の凝集／凝固によって形成される１５００ｎｍ径の非球形粒子が得られる（図８を参照のこと）；ハンセン溶解度パラメータが高い値であり、極性相互作用（δｐ）を提供する純粋な溶媒（アセトニトリル、アクリロニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、ブチロニトリル等）中で重合反応が行われる場合、２５０ｎｍ〜５００ｎｍの粒子が得られる；重合反応が３種類の溶媒（例えば、アセトニトリル／２−プロパノール／トルエン）の混合物中で行われ、ハンセン溶解度パラメータの各１つの値が好ましくはアセトニトリル／２−プロパノール／トルエンの混合物中で調節され得る場合、６００ｎｍ〜２５００ｎｍの粒径が得られ得る。
【０１０９】
Ｚｎ＋２，Ｃａ＋２又はドキシサイクリンによって機能化するために、ＳｉＯ２核の存在下で得たポリマー粒子を、ＺｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、及び／又はドキシサイクリンの水溶液中に懸濁し、その機能化が起きるまでに必要な時間、すなわち吸着平衡に到達するまでの時間、これは数時間から数日になり得るが、かき混ぜながら維持する。次に、粒子を遠心分離し、恒量になるまで真空オーブン中で乾燥させる。Ｚｎ＋２，Ｃａ＋２又はドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子の具体例を以下に示す。
【０１１０】
実施例２：歯内療法侵襲後の感染性再発を予防又は治療するための、ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子
ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子は、根管に一般的に見られる細菌に対して有効な、広いスペクトルの抗生物質（ドキシサイクリン）によって前もって得られたポリマー粒子を機能化することによって得ることができる。ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子は、以下に示すように、２８日を超えて有効用量で抗生物質をゆっくりと放出することができる：
ＳｉＯ２核の存在下で前もって得られた３００ｎｍ未満の径を有する球形粒子を、ドキシサイクリンによって機能化するために、以下のプロトコルに従う：
３００ｎｍ未満の径を有するポリマー粒子３０ｍｇを、連続撹拌下で、濃度４０ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンハイクレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）水溶液１８ｍＬに４時間以上浸漬した。次いで、懸濁液を遠心分離し、粒子を上清から分離し、恒量になるまで真空オーブン中で乾燥させた。
【０１１１】
３００ｎｍ未満の径を有するポリマー粒子を浸漬する前の水溶液、及びドキシサイクリン溶液中でポリマー粒子をインキュベーションした後の上清におけるドキシシクリンの量を、紫外線検出器を備えた技術である高分解能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって分析した。８０：２０（Ａ：Ｂ）の割合での定組成溶離の方式で、２つの溶媒Ａ及びＢによって形成された２成分移動相を使用した。移動相Ａは５０ｍＭのＫＨＰＯ４水溶液であり、移動相Ｂは１００％アセトニトリルであった。使用した流量は１．０ｍｌ／分であり、全分析時間は１０分であった。保持時間は４．８５分であった。ドキシサイクリン濃度は、２７３ｎｍでの吸光度を測定し、既知レベルのドキシサイクリンを用いた標準曲線に基づいて計算した。
【０１１２】
リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）で緩衝された１ｍＬの生理食塩水中でドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子を３７℃でインキュベートした後、ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子から生じるドキシサイクリンの放出プロファイルを評価した。インキュベーションプロセスの後、１２時間、２４時間、４８時間、７日、１４日、２１日及び２８日の時間間隔で、１００μＬのアリコートを収集した。各上清収集プロセスの後、新しい緩衝液を、３００ｎｍ未満の径を有するポリマー粒子懸濁液に添加した。アリコートは分析するまで−２０℃で保存した。全ての実験は３回行った。
【０１１３】
ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子を浸漬及びインキュベーションした後に溶液中にあるドキシサイクリンの量は、３９９．５μｇ／ｍｌ（ＮＰ１ｍｇ当たり）であり、これは、約７０％の負荷効力を示す。
【０１１４】
図９Ａにおいて、ドキシサイクリンの放出値（μｇ／ｍｌ）は、調査した各時間間隔についての、ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子の各ｍｇについて示す（平均値及び標準偏差）。
【０１１５】
１２時間で、ドキシサイクリン放出は１２１μｇ／ｍｌ（ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子１ｍｇ当たり）であった。ドキシサイクリンの速やかな放出効果が、より大きな量で、１２時間から保存の最初の週まで観察された。
【０１１６】
７時間後、抗生物質放出はより遅く、２０μｇ／ｍｌ（ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子１ｍｇ当たり）より大きかった。
【０１１７】
１４日後、ドキシサイクリン放出は、ほとんど安定に維持され、１４、２１及び２８日目それぞれにおいては、９、８及び６μｇ／ｍｌ（ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子１ｍｇ当たり）であった。
【０１１８】
図９Ｂは、２８日間にわたるドキシサイクリンの累積放出を示す。
【０１１９】
データによれば、ドキシサイクリンは、少なくとも２８日間にわたって持続的に放出され、２４時間では速やかな放出効果を有する。いずれの調査期間においても、放出される量はPorphyromonas gingivalis（Ｐｇ）に対して有効と考えられる量よりはるかに大きい。
【０１２０】
表６は、ドキシサイクリン放出のすべてのデータ、すなわち各時間におけるドキシサイクリンの放出（ドキシサイクリンによって機能化したポリマー粒子１ｍｇ当たり、μｇ／ｍＬ）、各時間におけるドキシサイクリンの累積放出（ドキシサイクリンによって機能化したポリマー粒子１ｍｇ当たり、μｇ／ｍＬ）、及び％単位の累積放出を示す。
【０１２１】
【表６】
2021512994.tif 000008
【０１２２】
ドキシサイクリンに対する平均細菌感受性は０．１〜０．２μｇ／ｍＬ前後であり、ＰＧが感受性を示す最小阻害濃度（ＭＩＣ）は６μｇ／ｍＬである。ドキシサイクリンはＰＧに対して作用し、種々の微生物タンパク質の合成を阻害する。ドキシサイクリンは、リボソームに結合して、ポリペプチドへのより多くのアミノ酸の付加を妨げるので、ＲＮＡの合成を回避する。ドキシサイクリンはまた、慢性炎症プロセス及び歯根尖レベルでの異常に関連している象牙質組織のメタロプロテアーゼの強力且つ持続的な抑制を引き起こす。したがって、抗菌薬としての効果を示さない用量（subantimicrobial dose）のドキシサイクリンの長期投与は、歯肉縁下微生物に対して抗菌作用を引き起こさない場合でも、歯周及び根尖周囲の炎症に対する有効な治療法と考えることができる。
【０１２３】
検出されたドキシサイクリン放出のレベルは、Ｐｇに対してだけでなくヒト歯肉縁下プラークに存在する他の細菌に対しても抗菌作用を及ぼすことができる。濃度０．５〜１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンは種々のＰｇ種に対して殺菌性があり、濃度０．１〜６．０μｇ／ｍＬでは想定される歯周病原体に対して効果的である。評価されたドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子は、２８日後であっても６．２μｇ／ｍｌを超えて放出することができることを示していることが重要である。
【０１２４】
ドキシサイクリン放出に関して本明細書で概説されるデータは、例えば、Tonetti［Tonetti MS, Lang NP, Cortellini P, Suvan JE, Eickholz P, Fourmousis I, Topoll H, Vangsted T, Wallkamm B. Effects of a single topical doxycycline administration adjunctive to mechanical debridement in patients with persistent/recurrent periodontitis but acceptable oral hygiene during supportive periodontal therapy.（持続性／再発性歯周炎を有するが対症的歯周治療中に許容可能な口腔衛生を有する患者における、機械的創傷切除に付属する単一局所的なドキシサイクリン投与の効果）  J Clin Periodontol 2012;39（5）：475-482］によって研究されたセルロースアセテートマトリクスに組み込まれたドキシサイクリン製剤等の、現在までに試験された他の放出系よりも徐放性であり、はるかに有効であることを示す。
【０１２５】
Kimら［Kim TS, Burklin T, Schacher B, Ratka-Kruger P, Schaecken MT, Renggli HH, Fiehn W, Eickholz P. Pharmacokinetic profile of a locally administered doxycycline gel in crevicular fluid, blood, and saliva．（歯肉溝流体、血液、唾液における局所投与されたドキシサイクリンゲルの薬動力学的プロファイル）  J Periodontol 2002；73（11）：1285-1291］による研究には、生分解性ドキシサイクリンゲルの製剤、及び、３日後に５７７μｇ／ｍＬに、１２日後に１６μｇ／ｍＬにまで低下する２０ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンの１５分間での放出能が記載されている。
【０１２６】
［Deasy PB, Collins AE, MacCarthy DJ, Russell RJ. Use of strips containing tetracycline hydrochloride or metronidazole for the treatment of advanced periodontal disease.（進行した歯周病の治療に対するテトラサイクリンヒドロクロリド又はメトロニダゾールを含むストリップの使用）  J Pharm Pharmacol 1989；41（10）：694-699］には、生分解性ポリマーマトリクスを生成するための、ポリ（ヒドロキシ酪酸）と共にテトラサイクリンヒドロクロリドの使用が記載されており、これは５日間よりわずかに長い間徐放性を示し、最初の２４時間の間に非常に有意な高用量で速やかな放出効果を示した。
【０１２７】
一般に、既に公開された全ての材料は、より高い濃度であるが非常に短い時間でドキシサイクリンを放出することができ、これは非常に短い時間での制御されていない速やかな放出効果を示す。ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子（ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子）は、２８日を超えて有効用量で抗生物質を緩やかに放出することができる。
【０１２８】
プランクトン培養におけるＰｇに対するドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子（ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子）の抗菌効率を示すために行われた実験を以下に記載する。
【０１２９】
細菌Ｐｇ  ３３２７７は、ＡＴＣＣ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から入手した。嫌気性微生物Ｐｇを、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、ヘミン（５ｍｇ／Ｌ）、メナジオン（１ｍｇ／Ｌ）を補充したトリプシン大豆培地中で、嫌気性受容器（８０％  Ｎ２、１０％  ＣＯ２、１０％  Ｈ２）中で７２時間にわたって培養した。細菌を遠心分離によって回収し、同じ培地に再懸濁した。６００ｎｍにおける光学濃度を測定することにより１ｍｌ当たりの細菌数を決定し、それを１×１０７ＣＦＵ／ｍｌの標準細菌懸濁液に調整した。
【０１３０】
ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子及び機能化されていないポリマー粒子によって形成された対照を、３つの異なる濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌ）のリン酸食塩水緩衝液に懸濁した。懸濁液を、細菌培養液（１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、懸濁液０．４５ｍｌ毎に）を含むエッペンドルフチューブに入れ、３７℃で３、１２、２４及び４８時間インキュベートした。各インキュベーション期間の終了時に、細菌に対する効果を評価し、以下に記載する。全ての実験を嫌気性条件下で行い、細菌細胞の生存率を評価して、着色剤ホルマザン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）中のテトラゾリウム塩（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（ＭＴＴ）を形質転換する能力を決定した。種々の細菌懸濁液を９６ウェルマイクロプレートに入れた。ＭＴＴマーキング反応剤を各培養ウェルに添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、製造者によって提供された可溶化反応剤を添加し、次いで、室温で一晩再びインキュベートした。
【０１３１】
生存細菌細胞の数を評価するために、生存細菌細胞によってＭＴＴから産生された着色剤ホルマザンに由来する紫色の分光測定を行った。この目的のために、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｔａｒ  Ｎａｎｏ、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）［Banziら、２０１４］を使用して、５６０ｎｍで読み取りを行った。対照パラメータとして、インキュベートした細菌培養液を、粒子の非存在下、リン酸緩衝液中でのみ使用した。
【０１３２】
全ての試験を３回行った。データは平均±標準偏差として表し、ＡＮＯＶＡ解析によって、及び事後比較のためのシェッフェＦ法によって、解析した。
【０１３３】
図１０において、生存値は、ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子、機能化されていないポリマー粒子、及び対照としてリン酸緩衝液への暴露の３、１２、２４及び４８時間後のインキュベーション後の生存Ｐｇ細胞の数として表される。
【０１３４】
ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子は、試験した種々の濃度及びインキュベーション時間において、７７．５〜９８．８％の細菌減少を示した。２４時間で、ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子の試験された全ての濃度は、９８％を超える細菌死に達した。４８時間のインキュベーション後、これらの値は８０．３％、９４．８％及び９６．４％（それぞれ０．１、１及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度）に減少した。
【０１３５】
本明細書に記載されるドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子の利点は、抗菌剤の持続性放出効果、及び２つの有益な効果の連携：１）抗菌効果、２）メタロプロテアーゼの阻害、である。それは、適用するのが簡単な製剤であり、根管を充填するために使用される全ての材料に対して適合性がある。根管におけるこの製剤の適用は、歯内療法侵襲後の二次的外科的侵襲の必要性及び感染性再発を大幅に減少／予防／解決することが期待される。ドキシサイクリンによって機能化されたポリマー粒子の生体適合性は、ヒト線維芽細胞に対しては９０％を超えるので、ドキシサイクリンによって機能化されたこれらのポリマー粒子は、歯内治療の血管再生技術が使用される場合、非常に有用なツールであり得る。これらの粒子のさらなる適用は、象牙質における局所的投与である。それらは象牙質細管を閉鎖し、象牙質のメタロプロテアーゼを阻害し、象牙質界面の機械的特性を回復することができる。
【０１３６】
実施例３：象牙質過敏症の治療用である、亜鉛及びカルシウムによって機能化されたポリマー粒子
Ｃａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子は、象牙質表面に局所的に投与することができ、それらは象牙質マトリクス（コラーゲン）のタンパク質に結合し、前記イオンのゆっくりとした放出、並びに生物学的流体を含有するカルシウム及びリン酸の誘引によって、それらの再石灰化を促進する。
【０１３７】
Ｃａ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子およびＺｎ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子を以下の方法で得た：金属イオンの吸着平衡を達成するために、亜鉛又はカルシウム濃度４０ｍｇ／ＬのＺｎＣｌ２又はＣａＣｌ２の水溶液中に、ｐＨ６．５で、ポリマー粒子３０ｍｇを室温で３日間、絶えず撹拌しながら浸漬した。次いで、懸濁液を遠心分離し、粒子を上清から分離し、恒量になるまで真空オーブン中で乾燥させた。イオン結合において達成された値は、０．９６±０．０４μｇのＣａ／１ｍｇの粒子であり、２．１５±０．０５μｇのＺｎ／１ｍｇの粒子であった。カルシウム及び亜鉛イオンの放出能は、Ｃａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子を５ｍＬの二重蒸留水中で３７℃においてインキュベートした後に測定した。このインキュベーション工程の後、５ｍＬのアリコートを以下の時間間隔で収集した：２４時間、４８時間、７日、２１日、２８日。各上清の収集後、５ｍｌの新鮮な二重蒸留水を加えた。アリコートは、その分析まで−２０℃で保存した。カルシウム及び亜鉛の濃度を、分光計（ＩＣＰ−ＯＥＳ）（ＩＣＰ−ＯＥＳ  Ｏｐｔｉｍａ  ８３００、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって分析した。全ての試験を３回行った。
【０１３８】
Ｃａ２＋及びＺｎ２＋イオンの放出結果（平均及び標準偏差）を表７に示す。値は、各時点でのＣａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子１０ｍｇ当たりの放出イオンμｇとして表した。
【０１３９】
カルシウム放出は、最初の１週間にわたって０．８５６から１．００７μｇまで変化した。このカルシウム放出は２１日後に倍増し、約２μｇになった。Ｚｎ２＋によって機能化されたポリマー球状粒子は、１２時間から２１日目まで、０．０２１〜０．０２５μｇの持続性亜鉛放出を維持した。２８日目には二倍の増加が観察され、０．０４４μｇが放出された。
【０１４０】
Ｃａ＋２：９．６±０．４μｇのＣａ２＋によって機能化されたポリマー粒子、及びＺｎ＋２：２１．５±０．５μｇのＺｎ２＋によって機能化されたポリマー粒子１０ｍｇごとの最初のカチオン負荷を考慮に入れて、各時間における粒子１０ｍｇごとのＣａ２＋及びＺｎ２＋の放出割合の合計も表７に示す。
【０１４１】
【表７】
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【０１４２】
Ｃａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子は、象牙質細管を塞ぐことができる。この閉塞により、象牙質過敏症がある場合の痛みを軽減することができる。細管の閉塞能は、走査型電子顕微鏡による直接観察及び象牙質を通した透過性試験により実証されている。
【０１４３】
象牙質細管の閉塞を確認するために、以下の治療プロトコルを行った：ドナー（１８〜２５歳）のインフォームドコンセントの下で、研究倫理委員会の制度（４０５／ＣＥＩＨ／２０１７）によって承認されたプロトコルに従って、健康な臼歯を得、象牙質細管の最初の開口を保証し且つスメア層を除去するために、象牙質試料をクエン酸溶液（ｐＨ３．８）に１分間曝した。機能化した及び機能化されていないポリマー粒子を適用する前に、象牙質表面をリンスした。機能化されていないポリマー粒子のリン酸緩衝液である懸濁液、濃度１０ｍｇ／ｍＬのＣａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子のリン酸緩衝液である懸濁液、並びにいかなる種類の粒子も含まないリン酸緩衝液（これは、未処理象牙質と呼ばれる）を、３０秒間適用した。前記試料は、リン酸緩衝液中で２４時間及び７日間保存する。
【０１４４】
次いで、試料を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液である２．５％グルタルアルデヒド溶液に２４時間組み込んだ。試料を超臨界乾燥（Ｌｅｉｃａ  ＥＭ  ＣＰＤ  ３００、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）に供し、それらを、Ｎａｎｏｔｅｃｈ  Ｐｏｌａｒｏｎ−ＳＥＭＰＲＥＰ２  スパッタコーティング（Ｐｏｌａｒｏｎ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｌｔｄ．、Ｗａｔｆｏｒｄ、ＵＫ）によって炭素で被覆し、走査型電子顕微鏡ＦＥＳＥＭ（ＦＥＳＥＭ  Ｇｅｍｉｎｉ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって評価した。
【０１４５】
細管閉塞割合をＦＥＳＥＭトポグラフィー画像から決定し、細管の以下の状態を考えられる段階として定義した：「開いた」細管（Ａ）、「部分的に充填された」細管（Ｐ）、閉塞した細管（Ｏ）及び「被覆された」細管（Ｃ）。
【０１４６】
この目的のために、分散エネルギーの分析を、ＦＥＳＥＭと一体化したＲ−Ｘ検出器システム（ＥＤＸ  Ｉｎｃａ  ３００、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて選択した地点で行った。
【０１４７】
図１１Ａにおいて観察され得るように、７日間の保管後、未処理象牙質において、象牙質細管の１００％は開いていた。２４時間で、機能化されていないポリマー粒子を用いて処理された歯頸部において、細管の１００％が閉塞されたことが示された。これらの細管の半分は、７日間の保管後、充填されたままであった。
【０１４８】
図１１Ｂでは、Ｚｎ＋２によって機能化された球形ポリマー粒子で処理された象牙質試料（適用の７日後）において、閉じた細管の１００％がどのように存在するかが観察され得る。Ｃａ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子の場合には、７日後に、いくつかの細管が見え始め、それらの大量（９５％）が占有されたままであった。象牙質細管の閉塞は、カルシウム及びリン酸塩からなる無機構造の堆積及び成長によるものであり、これは定性分析におけるＣａ及びＰの検出により明らかになった。
【０１４９】
表８は、使用した異なる製剤による象牙質表面の処理の２４時間後の、及び適用した処理の７日後の、細管の状態のすべてのデータを示す。粒子の適用後に生成した無機堆積物は時間と共には消失しないように思われるが、象牙質の過敏症の他の治療に使用される炭酸アパタイトを形成するリンケイ酸ナトリウム及びリンケイ酸カルシウムは高い溶解速度を示す。同様に、象牙質の過敏症の治療に使用されるカルシウム、カリウム又はフェライトの種々のシュウ酸塩も、唾液の作用によって、高い除去速度、又は溶解速度を示す。
【０１５０】
象牙質過敏症のために最近提案された別の治療は、ナノヒドロキシアパタイト粒子が細管の閉鎖を引き起こすことに起因する、ナノヒドロキシアパタイト粒子の適用であるが、これらの緩衝液が溶解され、長期間の治療の有効性を損なうことが実証されている。
【０１５１】
【表８】
2021512994.tif 000010
【０１５２】
象牙質の透過性を評価するために、ドナー（１８〜２５歳）のインフォームドコンセントの下で、研究倫理委員会の制度（４０５／ＣＥＩＨ／２０１７）によって承認されたプロトコルに従って、異なる健康な単根歯を得た。低速のミクロトーム（Ａｃｃｕｔｏｍ−５０  Ｓｔｒｕｅｒｓ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に取り付けたダイヤモンドブレードを用いて、セメント質−エナメル質結合の下の、各根の５ｍｍを除去した。歯髄腔に流体濾過システムを挿入し、象牙質を通過できる流体の体積を測定した。８０１−０１４カーバイドバーを用いて、近心−遠心幅５ｍｍ、咬合頸部高さ３ｍｍ、深さ２ｍｍのＶ字形の頸腔を準備した。酸エッチング（３２％リン酸）を行って、スミア層を除去し、象牙質透過性を確保した。機能化されていないポリマー粒子、Ｃａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー粒子のリン酸緩衝液中の懸濁液を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、又は緩衝液単独（未処理象牙質の試験のため）で、適用した。処理後、試料を２４時間及び７日間保存した。２つの保管期間の後、歯頸部を通る象牙質流体流（ＤＦＦ）を測定した。３分毎に１５分間、５つの流体体積のリーディングを記録し、平均を計算した。種々の処理の適用後に、最初の流量に対する象牙質流体流ＤＦＦの比率は、［流量の減少％＝１００×（ＤＦＦ最初−ＤＦＦ処理後）／ＤＦＦ最初］で評価した。統計解析は、多重比較ＡＮＯＶＡ及びＳｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  ｓａｍｐｌｅｓで行った。有意性を得るためにＰ＜０．０５の値を確保した。
【０１５３】
図１２では、各試料における象牙質流体流ＤＦＦの低下の％を観察することができる。
【０１５４】
２４時間で、機能化されていないポリマー粒子及びＣａ＋２によって機能化されたポリマー粒子の両方で処理された歯頸部は、象牙質流体流ＤＦＦの最大の減少を達成した。
【０１５５】
処理の７日目に、Ｃａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子の両方で処理された象牙質は、象牙質流体流ＤＦＦの最大の減少を達成した。
【０１５６】
Ｚｎ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子で処理された試料は、７日間の保管後に９０％を超える象牙質流体流ＤＦＦの減少を示し、Ｃａ＋２によって機能化されたポリマー球状粒子で処理された象牙質は、調査した期間中に、象牙質流体流ＤＦＦの値を変化させなかった。
【０１５７】
流量指数の減少は、象牙質細管の閉塞の効果及び患者の痛みの消失を明白に反映している。
【０１５８】
３０％の象牙質細管が開いているか、又は部分的に満たされていること（表２）は、機能化されていないポリマー粒子の閉塞能が減少し、再石灰化効果が一時的であることを示す。さらに、７日目の流体流の小さい減少（図１２）は、象牙質の過敏症のための機能化されていないポリマー粒子の使用を無視した。
【０１５９】
反対に、Ｃａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー粒子で象牙質を処理した場合、７日間の保存での象牙質流体流の減少は、９０％に近い似た値を達成した（図２）。象牙質流体流指数の減少に対するこの十分な効果は、象牙質細管の閉塞に関連し、ＦＥＳＥＭ及びＥＤＸによる分析後に確認されたように、リン酸カルシウム塩堆積物の生成によるものである。したがって、Ｃａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー粒子は、象牙質細管の閉塞のための高い能力を実証し、そしてリン酸カルシウム沈殿が引き起こされる場合に象牙質細管を閉塞し得るので、象牙質の過敏症のための実行可能な治療と考えられるべきである。
【０１６０】
ナノ硬度（Ｈｉ）及びヤング弾性率を評価するために、ドナー（１８〜２５歳）のインフォームドコンセントの下で、研究倫理委員会の制度（４０５／ＣＥＩＨ／２０１７）によって承認されたプロトコルに従って、健康な歯を得た。ミクロトーム（Ａｃｃｕｔｏｍ−５０  Ｓｔｒｕｅｒｓ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に取り付けたダイヤモンドブレードを用いて、多量の水で潅漑しながら切断することによって、セメント質−象牙質結合のすぐ下の、各歯根の頬側表面から象牙質の２つのブロックを得た。表面は、８００〜４０００グリット（粒度）の研磨剤ＳｉＣディスクを使用することによって研磨され、続いて、１μｍ〜０．２５μｍのダイヤモンドペースト（Ｓｔｒｕｅｒｓ  ＬａｂｏＰｏｌ−４；Ｓｔｒｕｅｒｓ  ＧｍｂＨ、Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて最終研磨工程が行われた。
【０１６１】
細管閉塞の有無を評価するために、全ての試料をＡＦＭにより観察し、閉塞した細管を有するものは試験から除外した。
【０１６２】
象牙質試料をクエン酸溶液（ｐＨ３．８）で１分間処理して、象牙質細管の開口を確保し、象牙質スメア層を除去した。試料／懸濁液を適用する前に象牙質表面をリンスした。機能化されていないポリマー粒子のＰＢＳ緩衝液、濃度１０ｍｇ／ｍＬのＣａ＋２及びＺｎ＋２によって機能化されたポリマー粒子のＰＢＳ緩衝液、又は未処理象牙質の試験のために緩衝液単独の溶液を３０秒間適用した。
【０１６３】
処理した歯を、リン酸緩衝液中、３７℃で２４時間及び７日間保存した。
【０１６４】
Ｂｅｒｋｏｖｉｃｈダイヤモンド圧子を用いた実質的に静的なナノ押込みのために、２４時間及び７日間の保存時点で、ＰＤ及びＩＤ領域中の各象牙質試料において、４０００μＮのピーク荷重及び１０秒の操作時間で、１０回の押込みを行った。この試験に基づいて、試料のナノ硬度（Ｈｉ）及びヤング弾性率（Ｅｉ）の値を得た。圧子は、４０００μＮの最大荷重（実験の荷重値）まで試料を漸進的に（一定速度で）押し、次いで、荷重を漸進的に値ゼロ（実験の除荷値）まで解放した。荷重対深さのこれらの曲線の傾きに基づいて、Ｏｌｉｖｅｒ−Ｐｈａｒｒ法を適用することによって、ナノ押込み値が得られた。Ｏｌｉｖｅｒ−Ｐｈａｒｒ法は、連続的、等方的、均一的な弾性接触モデルに基づいている。データは、ＡＮＯＶＡ及びＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓにより評価し、統計的有意性を得るためにｐ＜０．０５に設定した。
【０１６５】
本調査の結果は、Ｚｎ＋２によって機能化したポリマー球状粒子を適用した後に得られた歯頚部表面のナノ硬度（Ｈｉ）及びヤング弾性率（Ｅｉ）は、２４時間処理した試料と比較して、７日間の保存後に有意に増加したことを示した。さらに、Ｚｎ＋２によって機能化されたポリマー粒子で処理された象牙質は、７日間の保管後に、調査された全ての試料の中で最高のＨｉ及びＥｉ値を示した（図１３）。
【０１６６】
象牙質の表面上のナノ硬度（Ｈｉ）及びヤング弾性率（Ｅｉ）の増加は、原線維内区画における、脱塩された有機マトリクス内部での、基本的にはＣａ、Ｐ及びＺｎの無機沈殿物の発生に関連する再石灰化効果に起因する。実際、原線維外無機物は負荷を支持することができる顆粒状材料のように作用するが、内原線維内石灰化は、コラーゲン原線維が生石灰化天然象牙質と同じ高い弾性率及び硬度を有することを確実にするための重要な因子である。機能的再石灰化は、食品及び咀嚼によって生じる摩耗及び浸食による象牙質中の物理的特性及び化学的特性の損失の回復を引き起こすプロセスの結果である。最も重要な点は、Ｚｎ＋２によって機能化されたポリマー粒子を用いると、象牙質細管が閉塞され痛みが除去されるだけでなく、亜鉛を生成する象牙質の機械的特性の増強が象牙質摩耗の停止又は少なくとも遅延を引き起こし、この疾患の進行を停止させる可能性が非常に高いことである。Ｚｎ＋２によって機能化されたポリマー粒子はまた、侵食された象牙質の化学的分解及び加水分解を引き起こすことによりこの病的状態の急速な進行に明らかに関与するメタロプロテアーゼを阻害する。したがって、三つの有益な効果がある。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】ガラスバイアル（Ａ）及びＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）（プラスチック）ボトル（Ｂ）中での沈殿重合によって得られた粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。
【図２】ガラスバイアル中で得られた粒子の光学顕微鏡画像。
【図３】Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で、及びガラスバイアル中で行われた沈殿重合によって得られたポリマー粒子についての粒径及び多分散指数ＰＤＩの比較。
【図４】Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックボトル中で、量が増加していくガラスの存在下で行われた沈殿重合によって得られた粒子についての粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）の比較。
【図５】無機ナノ粒子ＮＴＩ４（Ａ）及びＮＴＩ５（Ｂ）の存在下で得られた粒子の光学顕微鏡画像。
【図６】重合溶媒中に存在する無機ナノ粒子ＮＴＩ４の濃度に対するポリマー粒子の径及び多分散指数（ＰＤＩ）値。
【図７】無機ナノ粒子ＮＴＩ４−Ｆ（Ａ）、ＮＴＩ４−Ｇ（Ｂ）及びＮＴＩ４−Ｈ（Ｃ）の存在下での沈殿重合によって得られたポリマー粒子の光学顕微鏡画像。
【図８】トルエン中で得られた１５００ｎｍのポリマー粒子（Ａ）、アセトニトリル中で得られた２５０ｎｍのポリマー粒子（Ｂ）、各溶媒が以下の体積比Φトルエン＝０．７３  Φアセトニトリル＝０．２５  Φ２−プロパノール＝０．０２であるアセトニトリル／２−プロパノール／トルエンの混合物中で得られた６００ｎｍのポリマー粒子（Ｃ）、以下の体積比Φトルエン＝０．０３５  Φアセトニトリル＝０．９０  Φ２−プロパノール＝０．０１５であるアセトニトリル／２−プロパノール／トルエンの混合物中で得られた１２００ｎｍのポリマー粒子（Ｄ）、及び２−プロパノール中で得られたマクロゲル（Ｅ）の走査型電子顕微鏡画像。
【図９】（Ａ）各時間間隔でのドキシサイクリン放出量（Ｄｏｘ粒子１ｍｇ当たり、μｇ／ｍｌ）の平均値と標準偏差（ＳＤ）。（Ｂ）各時間間隔でのＤｏｘ粒子１ｍｇ当たりのドキシサイクリン放出（％）。
【図１０−１】異なる時間間隔で異なる粒子とインキュベーションした後のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの生存（生存細胞数）。全ての場合において、リン酸緩衝液中でインキュベーションした後の生存数を参照対照として使用する。
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１１】Ａ）７日間の保管後の、未治療の歯頸部の走査型電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）画像。この期間の後、いくつかの小さな結晶又は無機堆積物（矢印で示される）が、管間象牙質及び管周囲象牙質（それぞれ、ＩＤ及びＰＤ）において見られた。表面の残りの部分はすべて、無機堆積物が無いように見える。Ｂ）７日間の保管後の、Ｚｎ粒子で治療した歯頸部の走査型電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）画像。象牙質の表面は、丸みのある形状（星印）、又は無定形の形状（矢印）を有するリン酸カルシウムの密なネットワークとして、集合した非結晶性無機堆積物を示し、細管は観察されなかった。分散エネルギー分析により得られるこれらの堆積物のスペクトルは、リン（Ｐ）及びカルシウム（Ｃａ）の元素組成を示す。
【図１２】２４時間目及び７日目に分析した試料の関数としての象牙質流体流（ＤＦＦ）に対する減少割合。
【図１３】Ａ）２４時間目及び７日目に異なる機能化ポリマー粒子を実験群に適用した後の、管周囲領域及び管間領域の両方における歯頚部表面上のナノ硬度（Ｈｉ）（ＧＰａ）の平均値及び標準偏差。Ｂ）２４時間目及び７日目に異なる機能化ポリマー粒子を実験群に適用した後の、管周囲領域及び管間領域の両方における歯頸部表面上のヤング弾性率（Ｅｉ）（ＧＰａ）。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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