(57)【要約】  本発明は癌を治療または予防する方法における二機能性の組成物の使用に関する。当該組成物は、癌を治療または予防するためにDNAリガンドとタンパ質クリガンドとを含み、当該DNAリガンドはDNA代謝を妨害し、タンパク質リガンドはシグナル伝達経路を妨害する。特に、本発明は癌の治療または予防のためにピロナリジンの使用に関する。また本発明は、DNAリガンドとタンパクリガンドを含む組成物、化合物及び薬剤、例えばピロナリジンを含む組成物、化合物、および薬剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の癌の治療または予防のために増殖癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）、あるいはその誘導体または医薬として許容される塩を含む組成物を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
哺乳類の腫瘍の増殖癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）、あるいはその誘導体または医薬として許容される塩を含む組成物を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法。
【請求項３】
哺乳類の腫瘍の癌細胞に対する細胞死を誘導する方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）、あるいはその誘導体または医薬として許容される塩を含む組成物を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法。
【請求項４】
哺乳類の癌の治療または予防のために癌細胞に対する細胞死を誘導する方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）、あるいはその誘導体または医薬として許容される塩を含む組成物を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法。
【請求項５】
哺乳類の腫瘍のサイズを減少させる方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）、あるいはその誘導体または医薬として許容される塩を含む組成物を前記哺乳類に投与する工程を含み、前記投与が、腫瘍の中の増殖癌細胞におけるアポトーシスを誘導することで腫瘍のサイズを減少させる、方法。
【請求項６】
癌または腫瘍が：膵臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、中皮腫癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、頭頸部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌から成る群から選択される癌（carcinoma)であるか、線維肉腫、横紋筋肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、中皮肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫から成る群から選択される肉腫であるか、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫から成る群から選択される中枢神経系又は末梢神経系の腫瘍であるか、あるいは黒色腫、精上皮腫、奇形腫瘍、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞腫、カポジ肉腫のその他腫瘍、またはB細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、外套細胞リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫、胃腸または乳頭または脳のリンパ節外腫、形質細胞性骨髄腫、カーレル病、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、顆粒球性白血病、リンパ性白血病、リンパ球性白血病、及びリンパ芽球性白血病から成る群から選択される他の腫瘍である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
癌が乳癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
癌がリンパ腫である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、治療上有効量の：酢酸アビラテロン、乳癌アルブミン結合（nab）パクリタキセル、アレムツズマブ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン（Ara-C）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、DaunoXome（脂肪性ダウノルビシン）、デポサイト（脂肪性シタラビン）、ドセタキセル、ドキシル（脂肪性ドキソルビシン）、ドキソルビシン、エリブリンメシル酸塩、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、フロクスリジン、フルダラビン、フルロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ギリアデル・ウェファー、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、レナリドミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトマイシン、ミオキサントロン、MG132、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、ペグインターフェロンアルファ２ｂ、ペメトレキセド、ペントスタチン、プラトレキサート、プロカルバジン、リツキシマブ、ロミデプシン、ルキソリチニブ、シプルセル-Ｔ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トシツモマブ、トラスツズマブ、バルルビシン、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン、またはそれらの組み合わせ、から成る群から選択される化学療法剤をさらに含むか、あるいは前記化学療法剤と同時投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学療法薬剤がボルテゾミブ、シスプラチン、ゲムシタビン、及びMG132から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学療法薬剤がシスプラチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学療法薬剤がゲムシタビンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
癌の治療または予防のための方法であって、必要としている被験者に治療上有効量のDNAリガンドとタンパク質リガンドとを含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１４】
前記DNAリガンドがトポイソメラーゼIおよび／またはトポイソメラーゼIIの阻害剤または毒である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質リガンドが：MEK、 Raf、 ERK、 PI3K、 Akt、 PDK1 、 GSK-3、 Wee1 、 Myt1 、 CHK1 、 CHK2、 ATR、 ATM、 mTOR、 CDK2、 PIP5K、 RIPK3、 RIPK1、 TAK1、 FADDおよびPCK、および／またはそのアイソフォームから成る群から選択されるプロテインキナーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記DNAリガンドが1,5‐ジアザ‐アントラセンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質リガンドが一つ以上のピロリジン分子を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質リガンドとDNAリガンドが一つの化合物の成分である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物がピロナリジンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
癌または腫瘍が膵臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、中皮腫癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、頭頸部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌から成る群から選択される癌（carcinoma)であるか、線維肉腫、横紋筋肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、中皮肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫から成る群から選択される肉腫であるか、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫から成る群から選択される中枢神経系又は末梢神経系の腫瘍であるか、あるいは黒色腫、精上皮腫、奇形腫瘍、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞腫、カポジ肉腫のその他腫瘍、またはB細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、外套細胞リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫、胃腸または乳頭または脳のリンパ節外腫、形質細胞性骨髄腫、カーレル病、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、顆粒球性白血病、リンパ性白血病、リンパ球性白血病、及びリンパ芽球性白血病から成る群から選択される他の腫瘍である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が乳癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌がリンパ腫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、治療上有効量の：酢酸アビラテロン、乳癌アルブミン結合（nab）パクリタキセル、アレムツズマブ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン（Ara-C）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、DaunoXome（脂肪性ダウノルビシン）、デポサイト（脂肪性シタラビン）、ドセタキセル、ドキシル（脂肪性ドキソルビシン）、ドキソルビシン、エリブリンメシル酸塩、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、フロクスリジン、フルダラビン、フルロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ギリアデル・ウェファー、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、レナリドミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトマイシン、ミオキサントロン、MG132、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、ペグインターフェロンアルファ２ｂ、ペメトレキセド、ペントスタチン、プラトレキサート、プロカルバジン、リツキシマブ、ロミデプシン、ルキソリチニブ、シプルセル-Ｔ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トシツモマブ、トラスツズマブ、バルルビシン、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン、またはそれらの組み合わせ、から成る群から選択される化学療法剤をさらに含むか、あるいは前記化学療法剤と同時投与される、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学療法薬剤がボルテゾミブ、シスプラチン、ゲムシタビン、及びMG132から成る群から選択される、請求２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学療法薬剤がシスプラチンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学療法薬剤がゲムシタビンである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
[0001] 本発明は癌の療法または予防の方法に関する。特に、本発明は癌の療法または予防に二機能性組成物および成分の使用を考慮する。もっと具体的に本発明はDNAリガンドとタンパク質リガンドとを含む組成物の使用による癌の療法または予防に関する。また本発明はDNAインターカレーターとタンパク質リガンドが含まれる成分、組成物、および薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
[0002]  この説明の中で以前の技術に関する議論は決してその以前の技術が広く知られている、またはこの分野の常識であると認めているわけではない。
【０００３】
[0003] 癌の生存率はたいてい以下の因子と強く関わっている：初期診断の頻度、癌の悪性の強さ、その癌を対象とした効果的な抗癌療法の有無、療法を受けている患者の総合的な健康、また腫瘍や癌細胞を手術でまたはその他切断する方法の有無である。
【０００４】
[0004]  すべての癌はおおむね細胞の分子シグナル伝達経路が暴走して無制御の細胞分裂による細胞周期の休止やアポトーシスを回避する特徴を持つ。この持続的な細胞分裂の少なくとも一部は予定されたアポトーシスの過程が無効化されていることが原因だとよく思われている。
【０００５】
[0005]  しかし多くの癌について言えるのは、無差別に因子を対象とした治療法や薬剤の毒性は抗癌療法の効果をかなり制限するということである。
【０００６】
[0006]  対象を絞る問題を避け、また、幅広い適応性を持つ療法を作るには癌に関わる細胞分裂がかなり増加されている過程に対象を絞ることが有効である。このような療法の作用法は一般的にアポトーシスの過程を誘導するDNA損害に関わって、これによって細胞死を促す。増殖中の癌細胞の選択的なアポトーシスは癌の効果的な療法には不可欠である。
【０００７】
[0007]  ＤＮＡと結合する分子はＤＮＡ複写を妨害でき、ＤＮＡと転写因子、ポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼなどの結合も妨害できる。特に、ＤＮＡ両鎖の塩基の介入の役割があるＤＮＡリガンドはＤＮＡ転写と複写の時にＤＮＡと結合してともに動く細胞機構や成分を妨害するのが特に効果的である。しかし、このようなＤＮＡリガンドは癌細胞を対象とする可能性があるが、通常の細胞分裂に対して影響を及ぼすこともあり、分裂しない細胞にも影響を与え、幅広い副作用の可能性につながる。
【０００８】
[0008] そのうえ、ＤＮＡリガンドの作用は十分でない可能性もあり、アポトーシスを促すＤＮＡ複写の妨害は療法効果の可能性があるにもかかわらず、癌細胞の細胞死を避ける性能は癌細胞に対するＤＮＡ損害の療法利得を無効化にする可能性もある。
【０００９】
[0009] これにあたって、細胞死を避ける因子と腫瘍を促進するシグナル縦続とたとえＤＮＡ損害応答のような免疫応答を妨害することとＤＮＡリガンドの作用を併合するのが利得だと考えられる。
【００１０】
[0010]  細胞死と腫瘍の誘導に関わる分子の一種はタンパクキナーゼ、この多くは気質が何度も接合でき、生産性も上がっている。残念ながら、複数の経路に関するタンパクキナーゼの妨害はしばしば重篤な副作用をもたらし、薬剤の開発と商品化に対して大きな妨げとなる。
【００１１】
[0011] 新しい両方の薬剤開発の経路を促す一つの戦略はすでに承認されている薬剤を新たな医学的対応に再利用（またはリポジショニング）することである。この再利用はつまり、薬剤を新しい適用の特定の症状に基づいてもう一度使用、既存の知識や安全データを活用することである。最近の癌の療法または予防に対する効果的そうな再利用した薬剤は抗寄生虫薬や抗精神病薬である。また、ある耐薬マラリアの一種が目的の抗マラリア薬のインビトロ試験で化学療法薬剤と併用して再利用され化学療法薬剤の耐性に抵抗する、または逆効果にすることで療法をより効果的にした。もちろん、再利用は薬剤開発の一面の迅速化に必要の安全データがあっても再利用した薬剤は新たな使用において人間体験とインビボ試験で効果があると示す必要をなくすわけではなくて、特にこのインビボのデータはインビトロのデータより明確になっているからである。新しい両方の薬剤開発の経路を促す一つの戦略はすでに承認されている薬剤を新たな医学的対応に再利用（または再配置）することである。この再利用はつまり、薬剤を新しい適用の特定の症状に基づいてもう一度使用、既存の知識や安全データを活用することである。最近の癌の療法または予防に対して効果が期待されそうな再利用した薬剤の例は抗寄生虫薬や抗精神病薬である。また抗マラリアの薬剤が抗マラリア薬のインビトロ試験で化学療法薬剤と併用して再利用され化学療法薬剤の耐性の抵抗、または逆効果にすることで療法をより効果的にした。もちろん、再利用は安全データに関して薬剤開発迅速化に役立つ面があるが、再利用した薬剤が新たな適用において臨床試験とインビボ試験で効果があると示す必要をなくすわけではない。何故なら、インビトロのデータはインビボ結果を代替できる物でないことがあるからである。
【００１２】
[0012] 一つの例として、US20110300137 で化学療法薬剤と併用する抗マラリア薬ルメハントリンの使用が説明されて、このルメハントリンは自己貪食を妨害することによって癌の治療効果を高める。自己貪食とはよく知られている癌の幹細胞が化学療法薬剤に対して行う過程で、これによって細胞は静止状態のままに温存され、化学療法薬剤がなくなってから再増殖し始める働きである。この静止状態で癌細胞は主に増殖癌細胞を狙う化学療法の薬剤からの防御をし、癌の化学療法薬剤に対する耐性がさらに強まる。自己貪食の妨害によって癌細胞が化学療法薬剤を避けることができなくなって耐性が弱まるが、癌の治療を行っているのは化学療法薬剤の活性化である。 US201 103001 37のインビトロ試験でルメハントリンは抗自己貪食の活性を示したにもかかわらず、単独で癌の細胞分裂を効果的に療法するにあたってルメハントリン、また他に挙げられた多くの抗マラリア薬（この区別の中の数々の薬剤は、ピロナリジンも含むが、同じ効果があると示唆した薬剤類とあまりにも構造式が違う）は対増殖またはアポトーシスの活性を何も示さず、またこの効果を示したインビボ試験は一つもなかったのである。
【００１３】
[0013] もう一つの例として、 CN1 135977Cで多耐性的な腫瘍の治療において併用抗悪性腫瘍薬の準備の中でピロナリジンというもう一つ抗マラリア薬を使った場合もある。同じように、この場合でピロナリジンはアドリアミシン（ADR:ドキソルビシン）と前提的または併用的に使って、ADRの細胞毒性を強めるために多様な薬剤もADRに耐性を持つ細胞の一種の治療に使ったのである。インビトロ試験でMDR細胞のADRによるアポトーシス誘導はピロナリジンの追加において強まる効果は確認できたが、単独的にPNDは増殖癌細胞におけるアポトーシスを促す効果は示さず、見られたピロナリジンの効果は実際の腫瘍に転移して再発するはずもなかった。したがって、 CN1 135977C で主張されている発明はインビトロの耐性を持つ腫瘍のMDR反転として抗癌剤と併用に使うピロナリジンの使用のみである。
【００１４】
[0014] 癌の療法のための製薬開発を促進するには安全服用の長い歴史を持つ抗マラリア薬のようにＤＮＡとタンパクの結合活性をもつ既存の薬剤を新たな療法に使用するのは得策であろう。
【００１５】
[0015] 本発明の目的は以前の技術の少なくとも一つの不都合を乗り越える、または改善する、または利得な代替を提供することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
発明の概要
[0016] 驚くべきことに、癌の治療と予防においてDNAリガンドとタンパク質リガンドの結合とを含む分子は利得であることが発見された。特に、本発明者はピロナリジンというDNAリガンドとタンパク質リガンドの結合とを含む抗マラリア薬が以前に知られていなかった増殖中の癌細胞に対する対増殖効果を持ち、またこの効果は選択的であり副作用は少ないと発見した。本発明者はピロナリジンがMDRによる不滅となった癌細胞に対する化学療法の効果を高めただけではなくて、選択的な細胞毒性を持っており癌の治療または予防においての使用が可能だとインビボ試験ではじめて確認したのである。
【００１７】
[0017] したがって、本発明の第１の実施形態では、哺乳類の癌の治療または予防のために増殖癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）または医薬として許容される塩を含む組成物を哺乳類へ投与する工程を含む方法が提供される
【００１８】
[0018] 本発明の第２の実施形態では、哺乳類の腫瘍の増殖癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）または医薬として許容される塩を含む組成物を哺乳類へ投与する工程を含む方法が提供される。
【００１９】
[0019] 本発明の第３の実施形態では、哺乳類の腫瘍の癌細胞に対する細胞死を誘導する方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）または医薬として許容される塩を含む組成物を前哺乳類へ投与する工程を含む方法が提供される。
【００２０】
[0020] 本発明の第４の実施形態では、哺乳類の癌の治療または予防のために癌細胞に対する細胞死を誘導する方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）または医薬として許容される塩を含む組成物を哺乳類へ投与する工程を含む方法が提供される。
【００２１】
[0021] 本発明の第５の実施形態では、哺乳類の腫瘍のサイズを減少させる方法であって、治療上有効量のピロナリジン（ＰＮＤ）または医薬として許容される塩を含む組成物を哺乳類へ投与する工程を含み、前記投与が腫瘍の中の増殖中の癌細胞のアポトーシスを誘導することで腫瘍のサイズを減少させる、方法が提供される。
【００２２】
[0022] 本発明の第６の実施形態では、癌の治療または予防のための方法であって、DNAリガンドとタンパク質リガンドとを含む組成物を必要としている対象へ投与する工程を含む方法が提供される。
【００２３】
[0023] DNAリガンドは、ＤＮＡと結合してDNA代謝を妨害する全ての分子であってもよい。DNA代謝とはDNAが使用または保持する細胞の過程、例えば、DNA複写や修復に必要なDNA合成と崩壊の反応のこともDNA転写のことである。複写とはDNA配列がコピーされる過程のことである。リガンドはDNAと非特異的な静電相互作用によって、または特異的なDNA溝の結合相互作用によって、または塩基の介入相互作用によってＤＮＡと結合することがある。好ましい実施形態は、ＤＮＡリガンドがインターカレーターとなることである。DNAインターカレーターはDNAの主溝またはDNAの福溝で塩基の介入またはスレッディングによる介入を行う。
【００２４】
[0024] DNAリガンドは平面的な環構造もあり、これによってDNA二重螺旋の中の二つの隣り合わせている塩基に挟むことでDNA介入を促進して、したがってDNA二重螺旋を歪める、またはDNA解除や延長や連結を阻むことで複写または転写を妨害することもある。癌細胞のように増殖癌細胞の中でDNA合成の妨害によってDNA複写と細胞増殖を制御または阻止することも、細胞周期を妨げることも、細胞生命力を弱めることも、細胞死を促すこともある。
【００２５】
[0025] 特定の場合、トポイソメラーゼの活性を妨害することでDNAインターカレーターはアポトーシスの経路を促すこともある。DNAインターカレーターはトポイソメラーゼ阻害剤またはトポイソメラーゼ毒に区別する可能性があり、トポイソメラーゼIまたトポイソメラーゼIIを狙うこともある。DNAインターカレーターはトポイソメラーゼのタンパク質に結合することもある。望ましくは、DNA合成を受けている増殖細胞においてDNAおよびトポイソメラーゼIIと複合体を形成することにより、DNAおよびトポイソメラーゼIIは「切断可能な複合体」に閉じ込められるようになることが提案されている。これによってそもそも解除を促すために活性したトポイソメラーゼによって分離したDNAの再連結が不可能になる。 その後の内因的なDNA鎖の損害は損害したDNA反応を促進し、アポトーシスに至ることになる。この作用法の原因または補足にはそのDNAインターカレーターが二重螺旋の分離を安定するまたはDNAの二つの鎖の再連結を阻止することが考えられる。
【００２６】
[0026] DNAリガンドがDNAインターカレーターの場合、本発明の組成物によるタンパク質リガンドもDNAまたはトポイソメラーゼとの相互作用によってアポトーシスの経路の開始を誘導する可能性がある。
【００２７】
[0027] DNAインターカレーターの平面的な環構造は二つ以上の融合した環を含んでもよい。この環は芳香族が理想である。この環は5つまたは6つの芳香族化合物で置換式または複素環式である。置換芳香族性の環とは環に属している水素が別の分子か成分に置換されることである。複素環式の芳香族化合物はその環構造が炭素と少なくとももう一つの窒素、酸素、または硫黄といった分子から構成されている。例えばこのDNAインターカレーターはベンゼン環またはピリジン、ピリミジン、ピラジン、ホスファニン、ジアジン、またはチアジンのような6員の複素環化合物となる事がある。ほかの例で、DNAインターカレーターはピロル、イマダゾレ、フラン、チアゾーレ、またはチオフェネのような5員の複素環化合物となることがある。
【００２８】
[0028] 好ましい実施形態では、この平面的な環構造は最低一つのピリジン環が含まれており、2つ以上のピリジン環を含む環構造も考えられる。平面的な環構造は三つの融合した芳香族化合環を含む可能性もある。この三つの融合した環は5員または6員の環となることもある。一つの形態で、この平面的な環構造は三つの融合した6員の芳香族化合環、またこの中で最低一つ、理想的には二つの芳香族化合環は複素環となる。それぞれの環はベンゼンである可能性があり、その場合の環構造はアントラセンと呼ばれることがある。このベンゼン環の一つ以上はハロゲン化、窒化、硫黄化、アルキル化、アシル化、または立体的に可能となる合成に置換できる。このDNAインターカレーターはアントラセンの複素化合環となり、この場合で最低一つの環は炭素と少なくとも窒素をもつ環構造となる。アントラセンの炭素と一つ、二つ、また三つの窒素を持つ複素化合環はモノアザアントラセン、ジアザントラセン、またトライアザアントラセンとそれぞれ呼ばれる。
【００２９】
[0029] DNAインターカレーターに含むアントラセンまたはアントラセン成分の非限定の例は以下の通り： 1,-モノアザアントラセン, 2,-モノアザアントラセン, 5,-モノアザアントラセン, 1,2-ジアザントラセン, 1,3-ジアザントラセン, 1,4-ジアザントラセン, 1,5-ジアザントラセン, 1,6-ジアザントラセン, 1,7-ジアザントラセン, 1,8-ジアザントラセン, 1,9-ジアザントラセン, 1,10-ジアザントラセン, 2,3-ジアザントラセン, 2,5-ジアザントラセン, 2,7-ジアザントラセン, 2,8-ジアザントラセン and 5,10-ジアザントラセン. 本発明の好ましい実施形態は、DNAインターカレーターの平面的な環構造は1,5-ジアザントラシーン(別名：ベンゾ(b)-1,5-ナシリジン)、またはその誘導体。
【００３０】
[0030] 本発明の好ましい実施形態では、DNAインターカレーターの平面的な環構造はアントラセン、またはジアザントラシーン、またより理想的なのは以下の成分の置換基を持っている1,5‐ジアザ‐アントラセン：-0(-),-OH, -OR, - OOpH5 ,- OCOCH3, -NH 2, -NR2, -NHCOCH3, -R, -C6H5,-N0 2,-NR <+,-PR <<,-SR <+,-SO3H, -S0 2R,-C0 2H,-C0 2R,- CONH2,-CHO, -COR, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -CH 2CI, -CH=CHN0 2, （Rは任意のアルキル族である）。
【００３１】
[0031] タンパク質リガンドは、タンパクに結合してその活性を妨害する任意の分子である可能性があり、そのタンパクが関与する任意のシグナル伝達経路を妨げる可能性がある。細胞内また細胞の間にシグナル伝達経路（別名はシグナル伝達）を通してシグナルの伝達によってコミュニケーションを行うのが思われている。発明の好ましい実施形態では、タンパク質リガンドと結合するタンパクは癌の進歩を誘導、強化、または可能にするシグナル伝達経路に属している。このシグナル伝達経路は癌に属しているすべての表現型に到着する経路で、以下が非限定のリストである：細胞増殖、細胞のアポトーシスまたは壊死を避ける性能、細胞の免疫応答を避ける性能、損害したＤＮＡの取り組みと増殖、細胞運動性が上昇、また細胞の物質代謝が上昇のことである。癌に属している表現型に到着する経路の妨害によって、このタンパク質リガンドは癌に属している表現型または表現型の影響を低減、最小化、逆転、予防、遅延、または除去することにより、癌の治療または予防を支援する可能性がある。
【００３２】
[0032] タンパク質リガンドはタンパクと結合してシグナル伝達経路を阻む方法として特定的な解裂反応、ジスルフィド結合、低分子量の族の例えアセチル化、アミド化、ビオチン化、システイン化、脱アミド、ホルミル化、グルタチオン付加、糖化、糖鎖付加、水酸化、メチル化、酸化、パルミトイル化、リン酸化の結合、または他の成分との結合のようなタンパク翻訳後の改造を妨害することもある。他の例でシグナル伝達経路の妨害方法としてタンパク質リガンドはタンパクと結合して前述のタンパク翻訳後の過程で起こる低分子量族の脱離反応を阻むこともある。
【００３３】
[0033] 当業者は細胞のもっとも一般的なシグナル伝達の過程はキナーゼによるタンパクのリン酸化またホスファターゼによる脱リン酸の事だと考えるであろう。したがって発明の好ましい実施形態では、タンパク質リガンドはシグナル伝達経路の一つのタンパクのリン酸化状態を変えることで癌の進歩を誘導、強化、または可能にすることに属しているシグナル伝達経路を妨害する。リン酸化状態を変えることとは二つの方法でシグナル伝達経路を阻むこと：まず、タンパク質リガンドはそのシグナル伝達経路におけるタンパクと結合してリン酸化または脱リン酸を妨害または促進する、それとも、タンパク質リガンドはそのシグナル伝達経路におけるタンパクと結合してそのタンパクが他の経路基質をリン酸化または脱リン酸することを妨害または促進することである。
【００３４】
[0034] 癌でよく見られる特徴はタンパクキナーゼの活性上昇、過剰発現、または負調節の脱落、これらは全てタンパクキナーゼの増加調節と総合的に呼ばれる事がある。発明の好ましい実施形態では、タンパク質リガンドはタンパクキナーゼと結合して、また、より理想的には、タンパク質リガンドが癌の進歩を誘導、強化、または可能にするシグナル伝達経路に属しているタンパクキナーゼと結合する。タンパク質リガンドはタンパクキナーゼと結合してタンパクキナーゼのシグナル伝達経路に属している基質をリン酸化する性能を阻止、弱化、または変動することもある。タンパクキナーゼの活性はタンパク質リガンドとの結合によって阻止、弱化、または変動となり、この効果は一時的、可逆的に、永久的に、または特定的な刺激の下で起こり得る。タンパクキナーゼの活性はタンパク質リガンドとの結合によって阻止、弱化、または変動となる方法は、例えば、タンパク質リガンドはタンパクキナーゼの立体構造の変更の促進、タンパク質リガンドはタンパクキナーゼの結合サイトの占領、タンパク質リガンドは他の普通にリン酸化を促進する受容体サイトの閉塞、またはタンパク質リガンドはタンパクキナーゼに対する立体的な活性の妨害をすることである。したがって、タンパク質リガンドはタンパクキナーゼ阻害剤としても呼ばれるであろう。
【００３５】
[0035] タンパク質リガンドはすべての癌の進歩を誘導、強化、または可能にするシグナル伝達経路に属している増加調節中のタンパクキナーゼと結合して阻止することが可能である。この発明の実施形態で、そのタンパクキナーゼはMAP（マイトジェン活性化タンパク）のキナーゼ経路（別名はRas/MAPK経路, またはRas/Raf/MAPK 経路またはMAP/Erk 経路またはRas/Raf/Mek/Erk 経路）に属しており、この経路は細胞増殖、細胞残存、また癌転移にも関わっている。特に、このタンパク質リガンドはMEK (MAPK/Erkキナーゼ)と結合して阻止し、Rafキナーゼと結合して阻止し、またはERK（細胞外受容体キナーゼ）と結合して阻止し、またはそのアイソフォームにも結合することもある。
【００３６】
[0036] 他の形態でタンパク質リガンドはPI3K/Akt (ホスホイノシチド3-キナーゼ/タンパクキナーゼB)経路に属しているタンパクキナーゼと結合して、この経路は細胞増殖、物質代謝、細胞残存、またDNA損害の修復に関わる多様の単独経路の組み合わせである。特に、タンパク質リガンドはPI3K, Akt, PDK1 , GSK-3, Wee1 , Myt1 , CHK1 , CHK2, ATR, ATM, mTOR, CDK2 またはPIP5K, またはそのアイソフォームと結合して阻止することができる。
【００３７】
[0037] もう一つの例で、タンパク質リガンドはRIPK3/RIPK1 (受容体相互作用セリン/スレオニンキナーゼ3/1 ; 別名はRIP1 またはRIP3 キナーゼ経路)経路に属しているキナーゼと結合して、この経路はアポトーシスとネクロプトーシスに関する。特に、タンパク質リガンドはRIPK3, RIPK1, TAK1、またはFADD、またはそのアイソフォームと結合して阻止することもある。他の例でタンパク質リガンドはPKC (タンパクキナーゼC)またはそのアイソフォームと結合して阻止して、このキナーゼは細胞増殖、運動性、また残存に関する。
【００３８】
[0038] 本発明の形態で、タンパク質リガンドはタンパクキナーゼ阻害剤となり、そのタンパクキナーゼはMEK, Raf, ERK, PI3K, Akt, PDK1, GSK-3, Wee1 , Myt1 , CHK1, CHK2, ATR, ATM, mTOR, CDK2, PIP5K, RIPK3, RIPK1 , TAK1 , FADD またPCK, 、またはそのアイソフォームの族である。
【００３９】
[0039] タンパク質リガンドは一つ以上のタンパクキナーゼと結合することもある。したがって、本発明の形態では、タンパク質リガンドは次のキナーゼ族の一つ以上と結合して阻止する： MEK, Raf, ERK, PI3K, Akt, PDK1 , GSK-3, Wee1, Myt1, CHK1 ,CHK2, ATR, ATM, mTOR, CDK2, PIP5K, RIPK3, RIPK1 ,TAK1 , FADD またPCK, またはそのアイソフォーム
【００４０】
[0040] 本発明の態様では、タンパク質リガンドはグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3 (GSK-3)と結合するので、GSK-3のリガンドとも呼ばれる。この場合、タンパク質リガンドはGSK3a及び／又はGSK3βと結合する任意の分子であり、ただしGSK3αとGSK3βは異なる重複のリン酸化基質を持つパラログで、異なる重複の分子シグナルと反応もすると理解されている。参照しやすいように、両方の分子はGSK-3として総合的に呼ばれるが、GSK-3リガンドは一つのパラログと優先的に結合、各パラログと異なる優先と親和力で結合、または一つのパラログと優先的に結合することが考えられる、例えば特定的な細胞配置、違う刺激を受けるときに、または違う癌の治療または予防に使っているときに異なるのであろう。その一方、GSK-3リガンドは双方のパラログと同じ配置で等しい優先と親和力をもって結合する可能性もある。
【００４１】
[0041] GSK-3は多産的で相互作用の多いキナーゼで、細胞代謝の上昇と対アポトーシスタンパク合成との活性による腫瘍の促進に関すると考えられているGSK- 3は細胞中で偏在して、細胞核にでも存在する。したがって、理論に縛られることを望まずに、癌細胞のような増殖癌細胞のGSK-3のシグナル伝達の妨害は多くの必要な細胞経路を阻んで、細胞増殖を遅延または阻止するまたはアポトーシスを誘導する効果があると提案する。
【００４２】
[0042] 一つ以上の態様で、タンパク質リガンドは一つ以上の5員または6員の芳香族環からなり、この環は置換式または複素環式である。他の態様で、タンパク質リガンドは5員または6員の芳香族ではない環は環のどこの分子でも置換する可能性があるであろう。発明の態様では、タンパク質リガンドは一つ以上のベンゼン環またはフェニル環からなり、この環はロゲン化、窒化、硫黄化、アルキル化、アシル化、または立体的に可能となる合成に置換できる。また他の態様では、タンパク質リガンドは一つ以上のピロリジン環からなっている。タンパク質リガンドは一つ以上の6員の芳香族環または一つ以上の5員の芳香族環からなり、この環は-0-, -OH, -OR, -OC6H5 ,-OCOCH3,-NH2,-NR2,-NHCOCH3, -R, -C6H5,-NO2, -NR3+, -PR 3+),-SR2(+), -SO3H, -S0 2R,-C0 2H,-C0 2R, -CONH 2,-CHO, -COR, -CN, -F, -Cl, -Br, -I,-CH 2CI, -CH=CHN0 2, - C2H5, -CR 2H, -CR3（Rは任意のアルキル族である）の合成から一つ以上の置換基を持っている事がある。好ましい実施形態では、タンパク質リガンドはフェニル環と一つ以上のピロルジン環からなり、このフェニル環またはピロリジン環は-0-, -OH, -OR, -OC6H5 ,-OCOCH3, -NH 2,-NR 2, - NHCOCH3,-R, -C6H5,-N02,-NR(+),-PR3(+),-SR2(+), -SO3H , -S02R,-C02H,-CO2R, -CONH2, -CHO, -COR, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -CH2CI, -CH=CHN0 2, -C2H5,-CR2H, -CR3（Rは任意のアルキル族である）の合成から一つ以上の置換基を持っていることがある。
【００４３】
[0043] タンパク質リガンドはタンパクの特定の残基で結合または相互作用をする可能性がある。例えば、これらの残基はタンパクにおける一つ以上のリン酸化または結合の残基であってもよい。その一方で、この残基はタンパク基質の結合またはリン酸化に不可欠の残基となることもある。
【００４４】
[0044] 本発明の態様ではタンパク質リガンドはGSK-3の特定残基と結合または相互作用をすることもある。例えば、GSK-3リガンドはGSK-3の活性サイトのバリン135またはグルタミン185との水素結合またはンデルワールス相互作用によってその他の数々のアミノ酸と結合することもある。
【００４５】
[0045] 本発明の方法には、癌の治療または予防のためにDNAリガンドとタンパク質リガンドが別々の成分として投与をすることも提案する。これによって成分の中で二つのリガンドのモル比は異なることができ、またリガンドは細胞の別々のところに局在または互いに局在していてもよい。例えば、成分はDNAリガンドの過剰を持つ（例：DNAリガンド：タンパク質リガンドのモル比を1000：1または1.1：1にする）またはタンパク質リガンドの過剰を持つ（例：DNAリガンド：タンパク質リガンドのモル比を1：1000または1：1.1にする）またはDNAリガンドとタンパク質リガンドと同量にすることもあるであろう。次の因子によってDNAリガンドとタンパク質リガンドの比例が変更する可能性がある：癌の種類、癌の進歩、患者の年齢やタンパク質リガンドまたはDNAリガンドの耐性によって変更する可能性もある。
【００４６】
[0046] 他の態様では、DNAリガンドとタンパク質リガンドは配合されている別々の分子、普通に1：1の比例だが、リガンドはDNAリガンドまたはタンパク質リガンドの過剰を可能にする配合となることもある。例えば、DNAリガンドの1から10の分子は一つのタンパク質リガンドと配合したり、またタンパク質リガンドの1から10の分子は一つのDNAリガンドと配合したりする。配合とは、DNAリガンドとタンパク質リガンドは別々に製造して設定した比例の投与のために正当で医薬として許容されるスペーサー、クロスリンカー、または静電、または共有結合によって連結されることである。このスペーサーまたはクロスリンカーは特定の刺激において分裂できる可能性もあり、配合は不可逆となることもある。
【００４７】
[0047] 本発明の好ましい実施形態では, DNAリガンドとタンパク質リガンドは一つの化合物の成分である。DNAリガンドとタンパク質リガンドは一つの成分の中で正当なリンカーによって結合する可能性もある。このリンカーは剛体または柔軟にでき、またDNAリガンドがDNAとの結合を可能にしながらタンパク質リガンドもタンパクと結合を可能にすることがある場合、任意の長さでしてもできるものである。リンカーはDNAとタンパクの同時結合を可能にする必要はないが、いくつかの態様によっては、これは理想的である。リンカーはアミン族を含むこともできる。成分は他のリガンドまたは活性サイトを含む可能性もある。
【００４８】
[0048]  DNAリガンドとタンパク質リガンドは一つの成分に配合されるの場合で、その結果がDNAリガンドとタンパク質リガンドは共局在となるのが考えられる。時点のなんでもに、この成分または配合したリガンドはDNAリガンドまたはタンパク質リガンドがDNAまたはタンパクと結合できるように局在化となる可能性もある。その一方、成分または配合したリガンドはDNAリガンドとタンパク質リガンドが標的の分子と同時に結合できるように局在化となる可能性もある。成分または配合したリガンドの中のDNAリガンドとタンパク質リガンドのDNAとタンパクに結合する性能は同時であれ順次であれ時間の経過または細胞の活動によって変動するであろう。
【００４９】
[0049] 好ましい実施形態では、DNAリガンドとタンパク質リガンドはピロナリジン（PND）、あるいはその誘導体または医薬として許容される塩の形となる。ピロナリジンの化学式はC29h32CIN5O2、化学名は 4-[(7-クロロ-2-メトキシ-1 ,5- ジヒドロベンゾ[b][1,5]ナフチリジン10-アル)アミノ]-2,6-ビス(ピロリジン-1-イルメチル)シクロヘキサ2,5-ジエン-1-ワン(以前： 2-メトキシ-7-クロロ-10-(3',5'-ビス(ピロリジン-1-イルメチル)-4'-ヒドロキシフェニルアミノ)ベンゾ(b)-1 ,5-ナフチリジン)。現在、ピロナリジンはマラリジンまたベンゾナフチリジン7351としても呼ばれている。
【００５０】
[0050] 治療用途で、ピロナリジンは理想的にリン塩またはピロナリジン四リン酸として使われ、この化学式はC29H44CIN5O18P4、また化学名は4-[(7-クロロ-2-メトキシ-1 ,5- ジヒドロベンゾ[b][1,5]ナフチリジン10-アル)アミノ]-2,6-ビス(ピロリジン-1-イルメチル)シクロヘキサ2,5-ジエン-1-ワン；リン酸である。
【００５１】
[0051] ピロナリジン四リン酸は尋常の抗マラリア薬であり、マラリアの治療において30年以上承認され効果的に使われてきている。最近、多耐性的な癌を標的にしている尋常の化学療法薬剤の抗腫瘍活性を高まる効果が確認できたが、インビボ試験で癌の治療または予防のために単独的な使用したことがなく、増殖癌細胞を標的にできる単独抗癌療法として提案したことがないのである。驚くことに、本発明の方法によってピロナリジンはDNAリガンドとタンパク質リガンドを持つ効果的な抗癌剤であることが判明した。療法標的は二つにしても、耐性と安全性はたいてい高いのである。理論に縛られることを望まずに、ピロナリジンはアポトーシスを誘導するように増殖中の癌細胞を選択的に標的にして、癌細胞が細胞死を一般的に避ける分子過程を妨害する効果があると推測する。選択性の低い癌療法によく見られる副作用を減少するので、ピロナリジンは増殖癌細胞に対して選択的な特徴を持つのが重要である。
【００５２】
[0052] ピロナリジンはアントラセンの誘導体の3環の結合したベンゼン環のDNAと結合するリガンドと6員の芳香族環と二つの5員の環が結合するタンパク質リガンドからなっている。ピロナリジンでは、DNAと結合するリガンドは置換された1,5‐ジアザ‐アントラセンだが、発明の態様ではその方法はピロナリジンの誘導体が必要で、この誘導体は環の構造において代替の置換基があるであろう。ピロナリジンの他の誘導体には、DNAリガンドが複素環のアントラセンの誘導体で、融合した芳香族環の構造には数々の配置に窒素が存在する。このピロナリジンの構造の特徴（三つの融合したベンゼン環の平面的な構造の特徴）のおかげでパイナリディンのDNAリガンドはアポトーシスを誘導するDNAインターカレーターであってもよいと提案する。
【００５３】
[0053] この特徴はアモジアキン、メフロキン、ナフソキン、パマキン、プリマキン、ピペラキン、タフェノキン、メパクリン、ハロファントリン、ピロナリジン、ニタゾキサナイド、またアトバコンのような他の化学療法薬剤の効果を高めると提案した抗マラリア薬と異なっているのである。ピロナリジンとこの他の抗マラリア薬の構造上の類似性はピロナリジン（単独で癌の治療の活性）とこの他の抗マラリア薬（自己貪食を妨害することによる癌の治療の効果を高める活性）の活性違いの対比を説明している可能性がある。
【００５４】
[0054] ピロナリジンでは、タンパクと結合するリガンドはフェニル族からなっているが、発明の態様では、その方法はベンゼン環の代替配置での代替置換基を持つピロナリジンの誘導体を必要としていることもある。ピロナリジンの他の誘導体では、タンパク質リガンドは6員の複素環からなっている。ピロナリジンではタンパクと結合するリガンドは二つのピロリジン環からもなっているが、発明の態様では、その方法は5員の芳香族環または5員の炭素と窒素以外の分子が入る環の構造または一つ以上の置換されたピロリジン環を持つピロナリジンの誘導体を必要としていることもある。
【００５５】
[0055] 他の発明の好ましい実施形態では、その方法には必要としている被験者にピロナリジン四リン酸とを含む組成物の投与も含まれている。
【００５６】
[0056] 発明の方法では、その癌は限りなく次の腫瘍または血液癌のような形で発現できる、肉腫、腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、または末梢循環腫瘍細胞（CTC）。例えば癌は膵臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、中皮腫癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、頭頸部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌のような形となる。一般的に、その癌は制御のない細胞増殖の特徴を持つ。
【００５７】
[0057] 他の例で、そのリンパ腫はB細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、外套細胞リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫、胃腸または乳頭または脳のリンパ節外腫となることもある。
【００５８】
[0058] その肉腫は、例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、中皮肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、骨腫、また星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、シュワン細胞腫が含む末梢神経系または中枢神経系の腫瘍、また黒色腫、精上皮腫、奇形腫瘍、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞腫、カポジ肉腫が含むその他腫瘍となることもある。
【００５９】
[0059] 骨髄腫は例えば形質細胞性骨髄腫、カーレル病、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、顆粒球性白血病、リンパ性白血病、リンパ球性白血病、及びリンパ芽球性白血病、赤血球増加症、赤血病であってもよい。
【００６０】
[0060] 他の限られていない例で、その癌はたとえ急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、HIVとAIDSに属する癌、原発性CNSリンパ腫、肛門癌、結腸腫瘍、脳星状細胞腫、非定型奇形腫様/横紋筋肉腫様腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳膠腫、気管支腫、心臓腫、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、胆管細胞癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、非浸潤性乳管癌（DCIS）、子宮癌、上衣細胞腫、鼻腔神経芽細胞腫、性腺外性生殖細胞腫瘍、眼球腫瘍、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、胃癌、消化管間葉性腫瘍、精巣癌、下咽頭癌、唇、口、または口腔癌、男性乳癌、メルケル細胞癌、NUT遺伝変更性正中管癌、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、鼻腔または副鼻腔腫瘍、 鼻咽腔癌、中咽頭癌、 膵内分泌腫瘍、 乳頭腫, 傍神経節腫, 副甲状腺癌, 陰茎癌, 甲状腺癌, 褐色細胞腫, 下垂体腫瘍, 胸膜肺芽腫, 原発腹膜腫瘍, 唾液腺癌, 動脈癌, 尿道癌, 子宮肉腫, 腟癌, 外陰癌, またウィルムス腫瘍であってもよい。
【００６１】
[0061] 本発明の方法は以上の癌の転移によって普通に発現する癌の進歩を妨害、遅延、または阻止する可能性がある。この方法は以上の癌の治療後の再発現を妨害、遅延、または阻止する可能性がある。
【００６２】
[0062] その癌は癌細胞の増殖性はタンパクによって調整する任意の癌も含む。ある態様では、その癌は癌細胞がタンパクを過剰に生産するすべての癌も含む。この「過剰に生産する」とは、その癌細胞は同類または同組織の健康的な細胞よりタンパクを多く生産することである。例えば、乳頭腫瘍の癌細胞と乳頭腫瘍の無癌細胞を比べて、乳頭腫瘍の癌細胞のタンパク生産量が多いのなら、その細胞は過剰に生産しているとなる。当業者の常識の通り、細胞のタンパク生産量は周知のｍRNA定量法、免疫蛍光法、ウエスタンブロット法のような方法で測ることができる。
【００６３】
[0063] 本発明の組成物は単独で効果的に癌の治療または予防に使う場合もあるが、本発明のある態様では、その方法は、必要としている被験者にDNAリガンドとタンパク質リガンドを含む組成物と、追加生理活性剤とを投与することを含む。生理活性剤はDNAリガンドとタンパク質リガンドを含む組成物に福豆られてもよく、あるいは、生理活性剤はDNAリガンドとタンパク質リガンドとを含む組成物と併用して投与されてもよい。併用して投与するとは、その活性剤と組成物の投与を同時にする、または活性剤と組成物の投与を交互に、または互いの前や、互いの後、またはその組み合わせ（したがって併用しての投与の定義には前投与も後投与も含まれる）ということである。例えば、生理活性剤は組成物の前に投与する、または組成物と同時にまたは同じ存続期間で投与する。「同時に」とは実在する時間の意味ではなくて、それより時間枠または存続期間の意味である。例えば、生理活性剤は被験者に本発明の組成物と同時に投与することもできる、これは生理活性剤が、特定の期間（日、週、月または年）の任意の適切なスケジュールに従って投与されることを意味し 、または被験者が同じ特定の期間に同じ、または異なるスケジュールで本発明の組成物の投与を受けるというわけである（例えば、被験者は3か月の間に本発明の組成物を毎日服用しながら、その同じ3か月の間に被験者は生理活性剤を毎週服用していることとなる）。
【００６４】
[0064] 生理活性剤は癌に対して療法の活性も含む任意の生理活性を持つ成分である。生理活性剤は癌の細胞と結合したり相互作用したりする可能性もある。生理活性剤は癌の療法、予防、または観察のために使う任意の活性剤、薬物、成分、または組成物とできる。本発明の態様では、生理活性剤は療法剤であり、より理想的に化学療法剤となるのである。本発明の態様では、DNAリガンドとタンパク質リガンドはピロナリジン、あるいはその誘導体または医薬として許容される塩となり、また生理活性剤はピロナリジンを含む組成物に含まれている、または生理活性剤はピロナリジンを含む組成物と併用して投与される。
【００６５】
[0065] 本発明の特に好ましい実施形態では、生理活性剤は次のグループから選ばれた化学療法薬剤とする：酢酸アビラテロン、乳癌アルブミン結合（nab）パクリタキセル、アレムツズマブ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン（Ara-C）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、DaunoXome（脂肪性ダウノルビシン）、デポサイト（脂肪性シタラビン）、ドセタキセル、ドキシル（脂肪性ドキソルビシン）、ドキソルビシン、エリブリンメシル酸塩、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、フロクスリジン、フルダラビン、フルロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ギリアデル・ウェファー、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、レナリドミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトマイシン、ミオキサントロン、MG132、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、ペグインターフェロンアルファ２ｂ、ペメトレキセド、ペントスタチン、プラトレキサート、プロカルバジン、リツキシマブ、ロミデプシン、ルキソリチニブ、シプルセル-Ｔ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トシツモマブ、トラスツズマブ、バルルビシン、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンである。当業者は、これが決して網羅的なリストではなく、将来開発される他の化学療法剤が本発明の方法での使用に適している可能性があることを理解するであろう。
【００６６】
[0066] 発明のより好ましい実施形態では、DNAリガンドとタンパク質リガンドはピロナリジン、あるいはその誘導体または医薬として許容される塩となり、また生理活性剤はピロナリジンを含む組成物に含まれている、または生理活性剤はピロナリジンを含む組成物と併用して投与され、この場合で生理活性剤はシスプラチン、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、またはMG132のグループから選ばれている。
【００６７】
[0067] 本発明の態様では、その方法は二つ以上の生理活性剤を含む組成物の投与を含む。
【００６８】
[0068] 本発明の他の好ましい実施形態では、DNAリガンド、タンパク質リガンド、または生理活性剤はプロドラッグとなるのである。プロドラッグとは活性ドラッグのドラッグ誘導体で活性ドラッグより毒性が弱まっているまたは不活性化していることで、インビボで活性化する同化作用できることもある。この同化作用は酵素的または科学的な方法またはPHの変動または細胞分子との結合とかの生理シグナルによって起こることもある。
【００６９】
[0069] 発明のもう一つでは、癌の治療または予防のために薬剤の製薬におけるDNAリガンドとタンパク質リガンドの使用の方法も含まれている。
【００７０】
組成物と薬剤、投与量と投与
[0070] 本発明の組成物、化合物、また薬剤の投与は静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下のような経口、局所、非経口の方法で投与できる。腫瘍に直接注入で投与できる。生体外で器官、組織、または細胞に投与できる。
【００７１】
[0071] 静脈内、筋肉内、腹腔内、また皮下の投与には、本発明の組成物と薬剤はおそらく正しいＰＨと等張力を持つ無菌液体の溶液または懸濁液で提供するであろう。ふさわしい液体の媒介物はリンゲル液、等張食塩水などである。発明に従う液体の懸濁液は繊維素の誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムのような懸濁剤、またレシチンのような液体剤も含む可能性がある。液体の懸濁液のふさわしい防腐剤はエチル、N-プロピルP-ヒドロキシ安息香酸も含む。
【００７２】
[0072] 経口投与には、本発明の組成物はおそらく錠剤またはカプセル、または液体の溶液または懸濁液で提供するであろう。経口用の錠剤は活性成分と希釈剤、崩壊剤、結着剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、また防腐剤のような医薬として許容される賦形剤の合成を含む可能性がある。ふさわしい不活性希釈液は炭酸、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、また乳糖も含む。コーンスターチとアルギン酸はふさわしい崩壊剤の一例である。結着剤はでんぷん、またゼラチンも含む。潤滑剤は合成するとなると、一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石となる。希望であれば、錠剤は胃腸管の吸収作用を延ばすのためにモノステアリン酸グリセリンやジステアリン酸グリセリンで上塗りはできる。
【００７３】
[0073] 経口用のカプセルは活性成分と固体希釈液が合成した固いゼラチンカプセルまた活性成分と水または落花生油、オリーブ油、または流動パラフィンと合成した柔らかいゼラチンカプセルも含む。
【００７４】
[0074] 局所的な投与には、本発明の組成物はおそらく液体、外用水薬、乳剤、ムース、ペースト、クリーム状の薬、軟膏、または膠化体の状態で提供され、DNAリガンドとタンパク質リガンドが異常の細胞に普及できることによって皮膚面と近い癌または皮膚癌の治療または予防に利得となる可能性がある。発明の組成物の局所投与に医薬として許容される湿潤剤、エモリアント、保湿剤、密度調整剤、キレート剤、賦形剤、希釈液、また着色剤も含む。
【００７５】
[0075] 本発明の成分、組成物、または薬剤の効果的な投与量は因習的な方法によって把握でき、一般的に使用する療法剤により異なるであろう。各々の被験者の具体的な投与量は治療中の症状の重度、投与方法、また被験者の体重も含む数々の因子により異なるのである。
【００７６】
[0076] 例えば、1単位の投与量はDNAリガンドとタンパク質リガンドの一つの化合物、またはその他の形態、誘導体、塩など、またはその合成、または発明の例や態様で説明した任意の一部の約 0.1 mg から 約 10000 mgも含む。他の例では、単位の投与量はDNAリガンドとタンパク質リガンドの一つ成分、またはその他の形態、誘導体、塩など、またはその合成、または発明の例や態様で説明した任意の一部の約 50 mg から 約 10000 mg, 約 100 mg から 約 10000 mg, 約 200 mg から 約 10000 mg, 約 500 mg から 約 10000 mg, 約 1000 から 約 10000 mg, 約 2000 mg から 約 10000 mg, 約 4000 mg から 約 10000 mg, 約 8000 mg から 約 10000 mg, 約 5 mg から 約 1000 mg, 約 10 mg から 約 1000 mg, 約 20 mg から 約 1000 mg, 約 50 mg から 約 1000 mg, 約 100 から 約 1000 mg, 約 200 mg から 約 1000 mg, 約 400 mg から 約 1000 mg, 約 800 mg から 約 1000 mg, 約 0.5 mg から 約 100 mg, 約 1 mg から 約 100 mg, 約 2 mg から 約 100 mg, 約 5 mg から 約 100 mg, 約 10 から 約 100 mg, 約 20 mg から 約 100 mg, 約 40 mg から 約 100 mg, or 約 80 mg から 約 100 mg. Preferably, the unit dose includes 約25 mg, 約100 mg, 約200 mg, 約300 mg, 約400 mg, 約500 mg, 約600 mg, 約700 mg, 約800 mg, 約900 mg, or 約1000 mg も含む。
【００７７】
[0077] 他の例では、単位の投与量はDNAリガンドとタンパク質リガンドの一つ成分、またはその他の形態、誘導体、塩など、またはその合成、または発明の例や態様で説明した任意の一部の約 0.1 mg から 約 10000 mgも含む他の例では、単位の投与量はDNAリガンドとタンパク質リガンドの一つ成分、またはその他の形態、誘導体、塩など、またはその合成、または発明の例や態様で説明した任意の一部の約 50 mg から 約 10000 mg, 約 100 mg から 約 10000 mg, 約 200 mg から 約 10000 mg, 約 500 mg から 約 10000 mg, 約 1000 から 約 10000 mg, 約 2000 mg から 約 10000 mg, 約 4000 mg から 約 10000 mg, 約 8000 mg から 約 10000 mg, 約 5 mg から 約 1000 mg, 約 10 mg から 約 1000 mg, 約 20 mg から 約 1000 mg, 約 50 mg から 約 1000 mg, 約 100 から 約 1000 mg, 約 200 mg から 約 1000 mg, 約 400 mg から 約 1000 mg, 約 800 mg から 約 1000 mg, 約 0.5 mg から 約 100 mg, 約 1 mg から 約 100 mg, 約 2 mg から 約 100 mg, 約 5 mg から 約 100 mg, 約 10 から 約 100 mg, 約 20 mg から 約 100 mg, 約 40 mg から 約 100 mg, or 約 80 mg から 約 100 mg of a DNA ligand, and 約 50 mg から 約 10000 mg, 約 100 mg から 約 10000 mg, 約 200 mg から 約 10000 mg, 約 500 mg から 約 10000 mg, 約 1000 から 約 10000 mg, 約 2000 mg から 約 10000 mg, 約 4000 mg から 約 10000 mg, 約 8000 mg から 約 10000 mg, 約 5 mg から 約 1000 mg, 約 10 mg から 約 1000 mg, 約 20 mg から 約 1000 mg, 約 50 mg から 約 1000 mg, 約 100 から 約 1000 mg, 約 200 mg から 約 1000 mg, 約 400 mg から 約 1000 mg, 約 800 mg から 約 1000 mg, 約 0.5 mg から 約 100 mg, 約 1 mg から 約 100 mg, 約 2 mg から 約 100 mg, 約 5 mg から 約 100 mg, 約 10 から 約 100 mg, 約 20 mg から 約 100 mg, 約 40 mg から 約 100 mg, 又は約 80 mg から 約 100 mg of a protein ligand. Preferably, the unit dose includes 約25 mg, 約100 mg, 約200 mg, 約300 mg, 約400 mg, 約500 mg, 約600 mg, 約700 mg, 約800 mg, 約900 mg, 又は約1000 mgのDNAリガンドと、約 25 mg, 約 100 mg, 約 200 mg, 約 300 mg, 約 400 mg, 約 500 mg, 約 600 mg, 約 700 mg, 約 800 mg, 約 900 mg, 又は約 1000 mgのタンパク質リガンドを含む。
【００７８】
[0078] 単位投与の時間枠として、投与は毎日1回、2回、3回、4回、5回、または2日おき、3日おき、または毎週1回、2週おき1回、3週おき1回にすることもある。
【００７９】
[0079] ある態様では、組成物、化合物、または薬剤は単独でまたは追加生理活性剤と併用で投与する可能性もある。その態様では、この投与は同時にまたは順次にすることもある。
【００８０】
[0080] 普通の治療の適用には、その組成物、化合物、また薬剤は癌が存在する限りの期間で投与する。そのうえ、専門家でない者でも単位投与の最適な投与量と時間枠が症状の特性と進歩度または治療されている症状、または投与の形、経路、局所、またその被験者の特性から認識できるとわかるであろう。
【００８１】
[0081] 本発明のある態様では、組成物または薬剤の投与は数回で別々にする可能性もある。したがって、以下で説明している治療と予防の方法は被験者に数回の別々に投与し、決めた期間中で投与する。
【００８２】
[0082] 本発明の組成物と薬剤は放射線治療のような追加療法的な治療の一つ以上または抗生抗腫瘍薬、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞分裂阻害剤、副腎皮質ステロイド薬、標的療法、分化剤、ホルモン療法、免疫療法が含む様々な化学療法の薬剤と一つ以上と併用すること（同時にまたは持続的に投与）に利得があるであろう。
【００８３】
定義
[0083] 文脈は明確に違う以外は、説明と主張で使われている「含む」「含まれている」などの言葉は排他性ではなくて包括性を持つとし、言い換えれば、「限りなく含む」という意味を持つ。
【００８４】
[0084] 「治療」などのような単語はこの具体的な文脈では、癌に属している症状の緩和、癌の退化、または免除の意味が含まれている。ある態様では、その治療は癌細胞の増殖または転移を遅延、遅滞、または阻止、腫瘍における細胞増殖による腫瘍のサイズの増加を遅延、遅滞、または阻止、細胞集団の分化を阻止、腫瘍のサイズを減少、または一つ以上の腫瘍の進歩を一時的でも退化する。治療は癌の完治または病死の遅延をする可能性がある。したがって、本発明の文脈では、「治療」とその派生語は療法の適用に関しては療法の全面の治療されている癌に属する苦痛の緩和、治療されている癌の重度の緩和、治療されている癌の一つ以上の症状の向上、治療されている被験者の健康の全体的な向上も含む。「治療」とその派生語にあたって、これは「治療されている」被験者は一つ以上の以上の利益を得られるという意味にする。要するに、治療は癌に属している増殖癌細胞の細胞死に関するといえるであろう。
【００８５】
[0085] 本発明の文脈において、「予防」などの単語は癌の免除後の癌に属している症状の全般的または一部的の再発の予防、また一つ以上のたとえ転移による癌の発現の予防という意味を指す。この予防は一つ以上の癌の病死を予防、または一つ以上の癌の病死を遅延することもある。要するに、予防は癌の転移、再発現、発現するの原因の増殖癌細胞の細胞死に関するのである。
【００８６】
[0086] 本発明の文脈では、「おおよそ」という単語は当業者がその値に関連する尋常の耐性とする。
【００８７】
[0087] 本発明の文脈では、パラメーターの範囲が表すと、このパラメーターは範囲内の全数値、範囲の限界値も包括とする。
【００８８】
[0088] 本発明の文脈では、「被験者」は癌に属している症状を経験または発現した動物、より理想的に哺乳動物、もっとも理想的に人間である。一般的に、被験者は癌を抱えている個人であり、医療者の臨床ケアを受けているのである。被験者は人間であれ、人間ではないであれ、また人間または個体の指定は人間も人間ではない動物も指し、この個体は限りなく以下の通りの社会的、経済的、または研究的に大事な全動物分類上の固体：ヒツジ類、ウシ類、ウマ類、ブタ類、ネコ類、サル類、ネズミ類、特にその類のヒツジ、ウシ、ウマ、イヌのような栽培種の族類も含む。そのうえ、これから指定する「必要としている被験者」は癌の症状を発現した被験者だけではなくて、臨床心理士、医者、またはその他の医療専門家によって癌の発現のリスクを持っている被験者も含む。例えば、被験者は被験者の医療歴史、家族歴史、体質、起因または共存する癌の影響のために癌が発現のリスクがある（それゆえ、予防または予防療法を必要としている）と指摘される可能性がある。
【００８９】
[0089] 本発明の文脈では、「医薬として許容される賦形剤または希釈剤」は生理的にふさわしくない賦形剤または希釈剤、たとえばその成分は本発明の医薬組成物に合成して不適当または不快な毒性、拒絶反応、不安定性、炎症、アレルギー応答などのような不適当または不快な生理的な影響を与えず被験者に投与できるという意味をする。好ましい実施形態では、賦形剤または希釈剤は薬剤を規定する組織や機関（その規定する機関とは、例えば、地方または連邦政治）によって承認可能または承認され、またはアメリカの薬局方または他の一般的に承認された薬局方によって被験者用に承認された。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
[0090] 図面の簡単な説明  発明の形態はこれから例えのみとして説明し、その図表も参照され、以下で凡例もついている。
【図１】ピロナリジン（PND）四リン酸の化学構造
【図２】ピロナリジン（PND）がおそらく活性する経路のトランスクリプトーム解析HL-60 細胞におけるPNDの治療に応じてもっとも活性増加（記している四角）遺伝子の従経路である。PNDの転写痕跡のピアソン相関係解析とLINCSプロジェクトに登録した痕跡との比較である。記した成分はPNDの効果と関連しており、記が濃くなるほど関連がより強いというわけである。
【図３】ピロナリジン（PND）が可能性的に活性する経路のトランスクリプトーム解析と目標の確認（A）MDA-MB-231細胞におけるPNDの治療に応じてもっとも活性増加（記している四角）遺伝子の従経路である。PNDの転写痕跡のピアソン相関係解析とLINCSプロジェクトに登録した痕跡との比較である。記した成分はPNDの効果と関連しており、色が濃くなるほど関連がより強いというわけである。(B) SDS-PAGE解析はPNDが投与量に応じるトポイソメラーゼIIの活性の阻止を促進したと示した。第1欄は 鎖状動原核ＤＮＡ（kDNA）、第2欄は無鎖状、第3欄は線状kDNA、第4欄トポイソメラーゼIIとkDNA、第5欄はkDNAとトポイソメラーゼとPNDの5μM、第6欄はkDNAとトポイソメラーゼとPNDの50μM、第7欄はkDNAとトポイソメラーゼとPNDの500μM、 第8欄はkDNAとトポイソメラーゼIIとエトポソイテ（トポII阻害剤）、第9欄はkDNAとトポイソメラーゼIIとPBS、第10欄はkDNAとトポイソメラーゼIIとDMSO。
【図４】PNDの分子結合の研究 PNDとキナクリンの予測するグリコーゲン合成酵素キナーゼ3βとの相互作用アミノ酸の痕跡（A）、またPNDとGSK3βの予測した結合残基との具体的な相互作用（B）である。
【図５】人間細胞種のパネルにおけるPNDの細胞毒性濃度50% (CC50) と選択的な細胞毒性指標（SCI）SCIは次の割合で計算した：SCI = 無癌細胞のCC50 / 癌細胞のCC50
【図６】CC50値を把握するための代表的なPND投与量に応じた曲線この解析には、細胞は72時間においてPNDと培養してその生存能力はDNSパネルによって検討した。例として、 MDA-MB-231 (A) と HL-60 (B) は X軸で表示されているようにPNDの段階的な投与を受けて、Y軸で細胞毒性（死亡した細胞）の割合が表示されている。この試験の中で、数々の規定も入れた；試見本体に投入したPNDの希釈液のPBS(0.5% v/v)、陰性規定として未処理細胞、細胞毒性の陽性規定として1 mM H2O2。各データ点は四つの複製体の平均値で、誤差は対応する標準偏差を無意味とする。細胞毒性濃度50% はミクロモル(μM)で表して、72時間において50％の細胞群衆の細胞膜を損害するに必要のPNDの投与量として定義される。
【図７】PNDはMDA-MB-231とHL-60 細胞において24時間の培養の上、ホスファチジルセリン外在化を起こした。細胞死の過程は細胞をアネキシンV-FITCとPIで2回染色した後でサイトフローメトリーによって観察した。 (A-B) 総合のアポトーシスを受けた細胞の割合（Y軸）は初期と終期のアポトーシスの合計（緑の線）で表示されているが、PIのみで染色した、言い換えればV-FITC陰性の、細胞は壊死細胞群衆（黒い線）として数えられた。PND投与の細胞、PBS投与の細胞 (*) 、また未処理の細胞 (‡) を比較して、両側の対応スチューデントt‐試験によって計測した結果で両方の状況で一貫したP<0.001の数値が出た。各線は三つの複製体の平均値で、誤差は対応する標準偏差を無意味とする。MDA-MB-231（C）とHL-60 （Ｄ）細胞でＰＮＤはミトコンドリア脱分極によってその細胞毒性を活性した。細胞はＰＮＤの投与を受けて6時間培養してから集合活性を持つ親油性蛍光色素試剤のJC-1で染色してサイトフローメトリーによってミトコンドリア膜の位置エネルギー（Δψｍ）を検討した。JC-1試剤はミトコンドリア脱分極の場合で緑蛍光シグナルを発信する。 (C-D) 緑蛍光シグナルを発信している細胞の割合をＹ軸にして、Ｘ軸で異なる投与が表示されている。ミトコンドリア膜位置エネルギー(Δψｍ)を損害する陽性規定としてH2O2の1 mM を使用した。各線は三つの複製体の平均値で、誤差は対応する標準偏差を無意味とする。PND投与の細胞、PBS投与の細胞 (*) 、また未処理の細胞 (＋) を比較して、両側の対応スチューデントt‐試験によって計測した結果でP<0.001とP<0.01の数値が出た。
【図８】ＰＮＤは投与量に応じてMDA-MB-231(A-D)とHL-60(E-H)の癌細胞の細胞周期を妨害して、またアポトーシスによるDNA破砕の活性を示した。PNDを73時間の培養してから24凹状のプレートの細胞を採取して、固定して、透過処理して、DAPIで染色して、サイトフローメトリーによって検討した。各細胞周期の割合はY軸で表され、異なる投与はX軸で表示されている。この数々の試験には、次の規定も入れた：細胞周期の損害剤としてのHCLの１ｍM、溶解液の規定としての0.1%PBS、また未処理の細胞である。各線は三つの複製体の平均値で、誤差は対応する標準偏差を無意味とする。パネルのデータの収集と解析には、FL9検知器、シングルセルゲート、またカルザサイトフローメトリーソフト（ベックマン・コールター）を使用した。
【図９】PNDは投与量に応じてDNA移動の遅延を促進した。三つの異なる濃度のPNDとキナクリンは100ngのプラスミドDNAと単独的に培養して、複合体形成の可能性をアガロースゲルの電気泳動法によって解析した。反応産物はTris/アセテート/EDTA緩衝液での1 % (w/v) 電気泳動で分けて、臭化エチジウムで染色した。PIが陽性規定としてまた自由プラスミドDNAが陰性規定として使用した。投入凹状はこの画像の上に二つの矢印で記している（上右と上左の隅）黄色の鎖線は参照として自由スーパーコイルDNA の最大運動性を表示している。三つのDNA移動変遷は青い線と矢印で表示されている（図の左側）。また、DNAの移動方向は矢印で記して、起点は陰極とし、終点は陽極とした。DNA複合体の形成の可能性を検討するために使用した代表的な画像が表示されている。
【図１０】子牛胸腺DNAはPNDの最大光線吸収度に対して低色性と深色性の効果があった。-Tris/HCI 緩衝液で段階的に子牛胸腺（CT）DNA（10.1 mM) をPND (22.8μM) に追加して紫外可視分光光度滴定 (300-650 nm) を行った。矢印はDNA投入によるスペクトラ変遷を記す。 (B) PNDとCTDNAの相互作用における紫外可視分光光度滴定の要約である。
【図１１】PNDは子牛胸腺DNAの円偏光二色性の陰線と陽線の光度を強化する効果を促進した。子牛胸腺（CT）DNAの円偏光二色性（CD）における変遷である。Tris/HCl緩衝液の中でCTDNA (150μM) はモル比0.03, 0.06, 0.2 と0.3を持つPNDと30分（A）または20時間（B）で培養した後でCD解析を行った。矢印は段階的に増加するPNDの投与量に対するCTDNAのCDスペクトラ変遷を記す。ブランクは同じPNDの段階的な濃度を持つCTDNAなしの20時間培養したCDスペクトラである（C）。ミリ度 = mdegs。
【図１２】ネズミのPND投与は腫瘍のサイズの減少を生じた。乳頭腫瘍のサイズはPND投与のネズミ(430mm3)より規定ネズミ(750mm3)のほうは大きくて、その差は第1日から第15日まで著しかった、f−テストのP値は0.001。（A）では、第1日から第9日（左から右）は各ネズミの単独的な線である。
【図１３】MDA-MB-231乳癌細胞種でPNDは低濃度で化学療法薬剤の活性を強化する。
【実施例】
【００９１】
実施例１  トランスクリプトーム解析
[0091] PNDと周知の薬物記号を比較するために幅広い細胞種の範囲を使ってトランスクリプトーム解析を行った。
【００９２】
[0092] HL-60細胞 (400,000 細胞/ 2 ml/凹状 の 6凹状プレート) は5.6μMで投与、または規定のPBS溶解液投与 を6時間において培養した。次日、RNAは抜粋してエルパソのテキサス州立大学のゲノム解析中心機関で全体トランスクリプトーム解析を行った。各投与において、三つの生理模写が試験された。
【００９３】
[0093] MDA-MB-231細胞はCC50の二倍のPND投与量または規定のPBS溶解液と6時間において培養した。次日、RNAは抜粋して全体トランスクリプトーム解析を行った。
【００９４】
[0094] PNDの可能性的な作用法を検査するために、各細胞種のトランスクリプトームの結果はLINCSプロジェクト(http://www.lincsproject.org) の遺伝子発現データと比較して、このプロジェクトには多様な人間細胞に投与したFDAの承認また不適格の化合物と特徴がよく検討された化学成分との遺伝子発現プロフィールが含まれている。その理屈は主の化合物の遺伝子発現プロフィールが既存のLINCSで登録した薬物と相当になるべきのことであった。この方法を使って、PND投与を受けた細胞の記号はLINCSの476,251のゲノムプロフィールの記号と比較できた。その結果は図2と図3Aに示しており、PNDはGSK阻害剤またはトポイソメラーゼ阻害剤となっている可能性がある。PNDのトポイソメラーゼ阻止の活性はトポゲンのトポイソメラーゼIIパネルキットを使って確認できた、この結果は図3Ｂで見られる。
【００９５】
実施例２   GSK-3との結合
【００９６】
[0095] GSKの結晶構造はタンパクデータバンクから借りてもらい、PNDとキナクリンとの結合をモデリングすることに利用した（図4Aを参照）。ＰＮＤはGＳＫ3ｐの予測した結合凹みと特定的に結合することができると示している（図4Ｂを参照）。結合試験はシュレーディンガーソフトのGLIDE 5.0 を利用して行った。分子結合試験はＰＮＤが高い結合数値(-9.4 Kcal/mol)を持ってGSK3pと結合し、SB 216763 も等しい数値(-9.2 Kcal/mol)で結合することがあると確認した。キナクリンは-7.6 Kcal/molの低い結合数値を示したので、ＰＮＤの横側にある成分はおそらく結合凹みにより多い結合部位（図4Aを参照）を持っているおかげでGSK３ともっと強く結合できるようになっていることが示されている。
【００９７】
実施例３  人間の乳頭と血液癌細胞におけるＰＮＤの細胞毒性の解析
【００９８】
[0096] ベンゾナフチリジンピロナリジンという薬物はベンゾナフチリジンの誘導体で、1970年に中国寄生虫病センターで初めて製薬してから抗マラリア薬として中国で30年以上に使用されている。 以前の報告ではPNDが熱帯熱マラリア原虫のインビトロ研究によりb‐ヘマチンの合成を阻止することでb‐ヘマチン促進赤血球渙散を促す効果があると示唆した。それに、以前にＰＮＤは多剤耐性（ＭＤＲ）K562/A02とMCF-7/ADR癌細胞に対するドクソルビシン(DOX)との併用が試されて、細胞のドキソルビシンに対する敏感性を強めたと発見した。ただし、ＰＮＤは単独的に癌の治療としての効果があると確認または示唆したことがない。
【００９９】
材料と方法
ピロナリジン四リン酸‐PNDの準備
【０１００】
[0097] ピロナリジン四リン酸 (PND; 2-メトキシ-7-クロロ-10[3,5-ビス(ピロリジニル-1- メチル )4ヒドロキシフェニル]アミノベンジル-(b)-1,5-ナフチリジン; APExBIO, ヒューストン市, TX, USA) の標準溶剤とPND希釈液をズルベッコのリン酸緩衝食塩水（PBS；シグマ‐アルドリッチ、セイントルイス市、MO、USA）の溶液を使用して新しく準備した。その標準溶剤とその希釈液は細胞が入っていた培養基質の凹状に直接に投入した。ピロナリジン四リン酸の化学構造は図1に表示されている。
【０１０１】
細胞種と培養条件
【０１０２】
[0098] この試験では、以下の19の人間細胞種を使用した：7種の人間乳癌、MDA-MB- 468, MCF-7, T47D, HCC1419, HCC70, MDA-MB-231 (トリプル陰性)とその転移性の肺誘導体MDA-MB-231 LM2; 4種の人間白血病/リンパ腫細胞 HL-60, ラモス, ジャーカット、またCEM、 3種の人間卵巣癌、 Ovcar 8、 Ovcar 5、Ovcar 3、1種の肺癌、 A549、 1種の黒色腫、A375、 また１種の膵臓細胞種、Panc-1。それに、選択と比較のため、無癌細胞種のMCF-10A、 HS-27 も試験に入れた。MDA-MB-231、 MDA-MB-231 LM2、 MDA-MB- 468、 MCF-7、 A549、 A375、 Panc-1、 とHS-27で使用した培養基質はDMEM (ハイクロン、 ローガン、 UT) 。しかし、T47D、 HCC-1419、 HCC-70、 HL-60、 Ramos、 Jurkat、 CEM、 Ovcar 8 とOvcar 5はRPMI-1640 (ハイクロン、 ローガン、 UT)を使用した。一定として、DMEMとRPMIの培養基質の両方は 10％熱失活したウシ胎仔血清(FBS: ハイクロン)、100 U/ml ペニシリン、また100 pg/ml ストレプトマイシン（サーモフィッシャー化学株式会社、ロックフォード、IL）が追加した。MCF-10A細胞はDMEM/F12に培養して、この基質に10％FBS、10 pg/mlヒューマリン（シグマ）、0.5 pg/ml ヒドロコルチゾン（シグマ）、20 ng/ml 上皮増殖因子、2.5 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、 100 pg/ml ストレプトマイシンが追加である。それに、HL-60とOvcar 3細胞種の微妙な変更として基質に20％FBSは追加した（ATCC、 マナッサス、 VA、 USA）。それに、Ovcar 3細胞は10 pg/mlヒューマリン（シグマ）を必要としていた。60-75%群衆の対数成長周期中の付着した細胞はHyQtase酵素（サーモフィッシャー化学株式会社）によって取り外して、数えられて、96凹状を持つプレートに各凹状に10, 000 細胞濃度の100 pLの培養成分を培養した。懸濁液で培養した細胞はHyQtase酵素の追加以外に類似した方法で処理した。一般的に、全細胞の培養状況は37度と５％CO2湿度の環境である。
【０１０３】
細胞死を定量するための差異的な核染色パネル
[0099] PNDの可能性的な細胞毒性を検討するため、生細胞生理撮影を使用する高処理スクリーニング（HTS）の承認を受けた差異的な核染色（DNS）パネルを利用した。このパネルには細胞は96凹状の100piの培養基質で１凹状において10,000細胞の濃度率で培養し始めて夜通し培養して72時間においてPNDを段階的に投入した。撮影する二時間前に、二つの蛍光性核酸インターカレーターのヘキスト333442とヨウ化プロピジウム（PI、インビトロゲン）は1 pg/ml の濃度で各凹状に投入した。高浸透性があるので、ヘキストはすべての細胞を染色する（生きている細胞も死んでいる細胞も全部）に比べてPIは死亡した、または死亡中の細胞を染色する。HTSと高情報量分析（HCA）システムを持つ多凹状を解読するIN細胞分析器（GEヘルスケア生理学、ピッツバーグ、PA）の利用を通して、各凹状から直接に2ｘ２のモンタージュ画像が撮影できた。各プレートには次の規定も含んでいた：溶解液の規定としてのPBS、細胞毒性の陽性規定の過酸化水素、また培養順序に属する潜在的の細胞操作による毒性の背景を理解するための投与しなかった細胞。各試験データ点と規定は3 通検討した。細胞毒性濃度50% (CC50)値は直線補間公式によって計算した。CC50の定義は溶解液投与の細胞と比較して全細胞の細胞膜を妨害するにあたって必要のPND濃度である。
【０１０４】
選択的な細胞毒性指標の計算
[0100] 選択的な細胞毒性指標（SCI）とは指定した試成分の無癌細胞に対して低毒性を起こしながら癌細胞をより効果的に殺す活性のことである。したがって、PNDのSCIは次の割合で計算した：SCI＝無癌細胞のCC50/癌細胞のCC50。
【０１０５】
アネキシンV/PIパネルによるホスファチジルセリン外在化の解析
[0101] PNDが促進する細胞死はアポトーシスまたは壊死によって起こったかを検討するために、MDA-MB-231とHL-60 はアネキシンV-FITCとPIに染色してサイトフローメトリーで観察した。細胞は24凹状のプレートの1ml培養基質に付着したMDA-MB-231とHL-60 細胞が100,000濃度で培養した。夜通しの培養後、細胞はPNDの投与を受けて、さらに24時間培養した。MDA-MB-231細胞には、不付着した細胞は冷たい試験管に採取して、付着した細胞はHyQtase（サーモフィッシャー）で取り外して、両方は37度で5分培養した。付着と不付着した細胞は各凹状から取り出して冷たいPBSで洗って260 xg で遠心分離機に５分入れた。HL-60 は懸濁液の培養期間直後に遠心分離機に入れた。その後製薬会社（ベックマン・コールター）の説明に従って、細胞は100piの結合緩衝液の中にV-FITCとPIの合成で染色して氷の上に15分培養した。最後に、細胞は400μlの冷淡な結合緩衝液で再懸濁してサイトフローメトリーによって解析した（サイトミックFC500；ベックマン・コールター）。この試験の過程において、溶液規定のPBS投与の細胞、細胞毒性の陽性規定のH202投与の細胞、また未処理の細胞は平行で処理した。各見本体には、10,000細胞は採取してCXPソフトによって解析した（ベックマン・コールター）。試験見本体と規定体は類似で処理して三通検討した。初期と終期アポトーシス両方を計算してアポトーシスした細胞の総合数を検討した。
【０１０６】
ミトコンドリア膜位置エネルギーの多色性解析
[0102] MDA-MB-231とHL-60 細胞は以上に説明しているように培養してPNDを投与して7時間で培養した。投与後、細胞は採取して製薬会社の説明に従って2μM の5,5',6,6'-テトラクロロ-1,T,3,3'- テトラエシルベンジミダゾリカルボサイアナインヨウ化(JC-1)のフルオロフォアで染色した(ミトプロブ; 生理テック、 グランドアイランド、 NY、 USA)。通常の分極性のミトコンドリアを持つ細胞は群衆となるようにJC-1を良好にして、赤いシグナルを発信する。脱分極性のミトコンドリアにはJC-1の単量体が分散しているので緑のシグナルを発信している。以上に説明しているような規定も平行で解析した。データの収集と分析はCXPソフトによって行った（ベックマン・コールター）。各データ点は三通解析した。
【０１０７】
細胞周期の進歩の解析
[0103] 指数増殖期の非同時性MDA-MB-231とHL-60 細胞は24凹状のプレートで多少のPND投与を受けた。72時間の培養してから細胞は遠心分離機に入れて以上のように処理して固定して透過処理してDNAインターカレーターの4', 6-ジアミジノ-2-フェニリノドル（DAPI）のフルオロフォアで染色した。この三つの過程は細胞を単核分離培地（NIM）‐DAPI溶液（ベックマン・コールター）に投入することで達成できた。それから細胞懸濁液はさらに3分室温で暗闇の中で培養した。この試験で使用した規定は以上の試験のような規定を使った。おおよそ、各見本体は405nm固体レーザーを持つサイトフローメトリー（ガリオス、ベックマン・コールター）によって20,000細胞を採取した。全細胞周期の実施形態における細胞従種の採取と配分はカルザサイトフローメトリーソフト（ベックマン・コールター）によって行った。それに、二重体は細胞周期の手順において単体細胞門の加入によって排除できた。
【０１０８】
DNA移動の変動パネル
[0104] 一般的に、二重螺旋(ds)DNAに結合または介入する実験化合物は、複合体を形成することにより分子量を増大させ、未処理のdsDNAと比べてアガロースゲルでの電気泳動移動度を減少させる。PNDとdsDNAとの可能性的な相互作用を検討するため、DNA移動の変動パネルを行った。各反応混合物はPBSで総量が10μlでｐHが７．４だった。PND（シグマアルドリッチ）もキナクリン（シグマアルドリッチ）も両方は1μM、 0.5μM、または0.25μMの三つの濃度で検討した。各反応混合物に100ngのプラスミトDNA(pCMV-dR8.91 ; アッドゲノム、 ケームブリッジ、 MA)が投入して37℃で30分培養してから2μlの 6Xゲル添加液の投入後に冷凍したことで培養を停止した。PNDとキナクリンのdsDNAとの可能性的な結合相互作用はpH8.0のTAE buffer (0.04 MTris 基質、 0.04 M アセテートと 0.001 M EDTA) に溶解した1％（w/v）アガロースゲル電気泳動法で解析した。dsDNA複合体を染色するため、0.5 pg/mlの濃度で臭化エチジウムは電気泳動法においてアガロースゲルに追加した。DNA移動はゲル撮影システムによって可視となり、紫外光トランスイルミネーター（アルファイノテック、サンリオナード、CA）によって画像が撮影できた。周知のDNAインターカレーターのヨウ化プロピジウム（PI）は各反応混合物に陽性の規定として追加した。規定として通常のゲルにおける電気泳動を把握するため投与しなかったプラスミドDNAも投入した。
【０１０９】
紫外光可視分光法でPNDと子牛胸腺DNAの相互作用の解析
[0105] バリアンカリー100分光光度計によって紫外光可計測をとった。子牛胸腺（CT）DNA と緩衝液はシグマアルドリッチから購入した。PNDとCTDNAの結合定数を計算するために緩衝液 (5 mM Tris/HCI、 50 mM NaCI、 pH=7.39) の中のPND (22.8μM) の2ml活性溶液に同じ緩衝液の中のCTDNA (10.1 mM; 5 L 追加) の溶液を追加するの段階的な室温で吸収滴定法を使用した。吸収スペクトラは424 nm で計算して飽和状態が達したときに吸収滴定法は終了とした。結合親和性を計算するため、データはスカチャード公式r/Cf=K(n-r)（ミックギーとボンヒッペル見取り図）に入れて、この公式では、ｒはCTDNAの1molと結合するPNDのモルの数値、nは同類結合部位の数値、Kはその結合部位の複合体との親和性である。自由（Cf）と結合した（Cb）複合体の濃度はCf=C(1-a) と Cb=C-Cf の公式から計算して、ここでCはPNDの総合濃度である。結合した複合体(a)の割合はa=(Af-A)/(Af-Ab)の公式で計算して、ここでAfとAbは指定した波長の自由と完全結合した薬物の吸収度、またAは滴定のどの時点でもの吸収度である。r/Cf 対 r の見取り図は結合定数のkbを傾向値に設定する [16] 。すべての試験は三通行い、kbの数値を平均した。
【０１１０】
PNDと子牛胸腺（CT）DNAの相互作用の円二色性分光法による解析
[0106] キセノンランプを持つ100分光旋光計のJASCO-1（JASCO、イーストン、MD）によって円二色性（CD）スペクトラが計測した。CT DNAと緩衝液はシグマアルドリッチから購入した。CT DNAの標準溶液はTris/HCI緩衝液（5 mM Tris/HCI、 50 mM NaCI、 pH=7.39）で準備してその濃度（4.325 mM）は モル吸光係数を260 nm で6600 M-1cm-1 にして分光測定で計測した。150μMのTris/HCl緩衝液の希釈液を準備して試験に使用した。使用する前にPNDの2.0 mM標準溶液はMQ水で新しく準備した。150μM CT DNA の3mlの活性溶液に適当な以上の溶液を追加して、モル比0.03、 0.06、 0.2と0.3 PND/DNAがあるようにした。見本は三つ準備して30分と20時間において培養した。すべてのDNAとDNA/PNDのCDスペクトラが25度で205- 380 nm の範囲内に登録して、最終的にブランクと雑音減少で修正した。最終データはこの三つの試験の平均値で、ミリ度（mdeg）で表示している。
【０１１１】
統計学上の解析
[0107] 各データ点には、三試験の平均値とその標準偏差が報告している。統計著しさは両側の対応スチューデントt‐試験によって計測して、<0.05 のＰ値は著しいと判断した。
【０１１２】
結果
PNDは癌種類細胞に対して強い選択的な細胞毒性を示す。
[0108] 11種の人間癌細胞種と一つの無癌コントロール細胞種において可能性的なPNDの細胞毒性を核分染法（DNS）パネルによって解析した（MCF-10A; 図5) 。各細胞種には、PNDのCCSを把握するために投与反応曲線もDNSパネルによって作られた。おおよそ、PNDはすべての試験細胞に対して強い細胞毒性を示して、この細胞は1.6μMから9.4 pMの低マイクロモル濃度一定CC50値も示した（図5）。6A-B図に表示している通り、MDA-MB-231トリプル陰性乳癌細胞種と急性前骨髄球性白血病細胞種との多少の濃度のPNDの効果としてはPNDのCC50値は1.6 pMと1.9 pMとなった。このパネルにも他のパネルにも、投与されなかった細胞は細胞操作また細胞培養による細胞死の基盤的なレベルを定義するために使われた。特定なし細胞死と標準化の規定には溶解液を受けた細胞も使われ、また細胞毒性の陽性規定にはH2C>2を受けた細胞も使われた（図6）。PNDは乳頭無癌MCF-10A 細胞と比較してパネルの乳癌細胞種の6の4のMDA-MB-231、MDA-MB-231 LM2、 MDA-MB- 468 とMCF-7PNDの種に対して強い選択的な細胞毒性を示した（図5）。興味深いのは、T47D とHCC-70の1以下のSCI値は適当ではなかったことである（図5）。それに、白血病/リンパ腫の最高SCI値はHL-60 細胞種と等しい3.5のSCI値であった（図5）。そのうえ、ラモスとジャーカット細胞に対してPNDは３と3.3のSCI値を示したが、CEM細胞種に対して弱い選択も確認した（図5）。黒色腫細胞種（3.2のSCI値）と3の2の卵巣癌細胞種（3.1のSCI値）に対して強い選択性が示された。しかし膵臓と肺癌細胞種に対して弱い選択性（＜2.0）が確認された。MDA-MB-231とHL-60の細胞種に対してPNDは低いCC50値と強い選択性 (SCI >3) を示したので、解析進行の候補者となった。
【０１１３】
PNDはMDA-MB-231とHL-60細胞に対してホスファチジルセリン外在化を示す
[0109] PNDの細胞毒性はアポトーシスか壊死かによるもののを把握するために、細胞は二つの異なるPND濃度に24時間の投与を受けて、流動細胞計測法によって解析を行った。陽性と陰性規定と比較してPNDは両方細胞種に強いホスファチジルセリン（PS）外在化を示した(P<0.001 ; (図7A-B)。PNDはHL-60 細胞に投与量に応じて強いPS外在化を促進して、34 pMと68 pMの時に14.8％と30.2％のアポトーシスした細胞が見せられた (P=0.0033, 図7A) 。そのうえ、PNDはHL-60 細胞よりMDA-MB-231細胞のほうに両方の投与量で高いPS外在化を示し、11 pMと22 pMは67.2％と71.1％アネキシン陽性細胞の結果が出した（図7B）。予測通り、溶解液を受けたり受けなかったりする細胞は重度なアポトーシスまたは壊死を示した傾向がなかった。（図7A-B）。それに、H202は細胞毒性の効果をMDA-MB-231細胞でアポトーシスによって促進し、HL-60 細胞で壊死によって促進した（図7A-B）。それゆえ、PNDはMDA-MB-231にもHL-60 細胞にも周知のアポトーシス活性の事象のPS外在化を促進したのである。
【０１１４】
PNDは癌細胞のミトコンドリアに脱分極を促進する
[0110] アポトーシス経路の初期的な潜在する生化学的の事象はミトコンドリア脱分極で、これは多染性JC-1試剤と流動細胞計測法によって定量ができる。JC-1はミトコンドリアが分極しているときに赤い蛍光を発光し、脱分極しているときに緑蛍光を発光する。それゆえ、MDA-MB-231とHL-60 細胞はPNDと6時間で培養してミトコンドリア膜電位（Δψｍ）の状態が記入した。PS外在化の情報に基づいた予測通り、両方のPND投与された癌細胞は、特に投与なしまたは溶解液投与の細胞に比較したときにかなり脱分極性を示した（図7C-D）。この結果は両方の癌細胞種にPNDがミトコンドリア脱分極を促進することができ、一方PNDは潜在的なアポトーシス経路によって細胞死を誘導できることを示しているというわけである。
【０１１５】
PNDは細胞周期のプロフィールを妨害してMDA-MB-231とHL-60 細胞でDNA破砕を示している。
[0111] PNDの影響のもとでどのようにMDA-MB-231とHL-60 細胞が増殖したかを検討するため、細胞周期プロフィールはサイトフローメトリーによって検討した（図8）。PNDの細胞周期進行に対する影響を検討するためにDAPI（4', 6-ジアミジノ-2-フェニリノドル）というスミレ刺激のDNAインターカレーターのフルオロフォアを中心にした細胞内DNAを定量する策略を実施した。MDA-MB-231細胞にPNDを投与した後、G0/G1の細胞従種の大減少が見られたが、HL-60 細胞にこの効果は見られなかった（図8BとF）。PBSと投与しなかった規定と比較するとPNDはMDA-MB-231とHL-60 細胞のSとG2/Mの従種の減少効果があった（図8B-DとF-H）。そのうえ、従G0/G1の従種の大増加で分かるようにPNDは両方の癌細胞種において濃度に応じて大DNA破砕が見られた (P<0.0005; 図8AとE)。PBSと投与しなかった細胞の両方の全細胞周期の違いはたいていなかった。この試験はＰＮＤが両方の癌細胞種に細胞周期プロフィールを妨害してＤＮＡ破砕（従G0/G1種）も促進したのことを明確にした。
【０１１６】
PND はdsDNAと直接に相互作用する
[0112] PNDとdsDNAの可能性的な相互作用はプラスミドDNAの結合基質によるDNA移動変動パネルを使用して、相当の構造を持ち、周知のDNAインターカレーターであるキナクリンと比較した。PNDの1ｍMとDNAと培養すると、PND投与のDNAは自由プラスミトDNAと比較して著しい移動の遅延が観察した（変動は図9の左側にある）。 総合の投入したDNAの約半分は最低運動性を示すアガロースゲルの最初投入所にあった。それに、PNDの0.5と0.25mMがDNAと培養すると、著しい運動性の減少が見られた（図9の左側を参照）。そのうえ、自由スーパーコイルDNA より小さいDNA破片の不在によるとPND投与はDNA破砕を促進しなかった（図9）。以前の研究では、PNDと相当の構造を持つキナクリンは介入によってDNAと相互作用をすることが確認できた。第9図に表示されている通り、染みとして示しているようにキナクリンは最高の試した濃度（１ｍM）でDNA運動性の最大遅延を起こして、これはスーパーコイルDNAとの合成を指すのである。また、キナクリンは0.5 と0.25 mM で試したときにPNDのようにDNAの運動性の明確な遅延を促進した（図9）。PND投与のDNAの場合と同様で、キナクリンはDNA破砕活性もしめさなかった（図9）。PIもDNA結合の陽性規定として使われ、これもDNA運動性の遅延を促進した。我々の結果はＰＮＤがＤＮＡと直接に結合することによってアガロースゲルでの移動変動を促進でき、またキナクリンとの相当の活性はＰＮＤがdsDNAの塩基の間に介入する活性もある可能性があると明確に示している。
【０１１７】
紫外可視分光光度滴定法によりPNDはDNAと介入する
[0113] PNDとCTDNAの介入相互作用をさらに証するのため、Tris/HCI 緩衝物を使って分光光度滴定を行った。PNDは300-500 nm において強い吸収線を示し、これは複合芳香族環の一般的な電子エネルギー準位の変遷を示した。通常では、紫外可視の最大吸収レベルで観察する低色性と深色性の現象はDNAの核酸塩基と介入する複合芳香族環構成の重なり相互作用の証拠として考えられるのである。図10Aは連続的なCTDNAの投入したPNDの注目局所の吸収スペクトラを示している。DNAと化合物の相互作用を検証するために424 nmの最大吸収度を検問した。我々の結果は著しい低色性（39％）と8 nmの赤色移動を示している。そのうえ、PNDとCTDNAの結合親和性[8.5 ± 0.7 x 105 M-1]を把握するためにスカチャード公式も使った。すべてのPNDとCTDNAの結合データは、図10Bに示している通り、類似の構造を有する周知のインターカレーターと類似であり、移動変更パネルで示しているようにPNDもDNAの塩基の間に介入できると示しているのである。
【０１１８】
PNDは、円二色性分光法で観察されるように、CTDNAのBコンフォメーションを安定化させる。
[0114] それに、Tris/HCI 緩衝物の円二色性分光法によって微妙的なDNA立体的な変遷が検討できた。B型のCTDNAの異常CDスペクトラムによると、塩基重なりのためポジティブ線の最高は275 nm となり、右巻き螺旋のためネガティブ線の最低は248 nm となったのである。したがって、ＣＤシグナルの変遷はＤＮＡの二次構造の相当的な変遷に比べることができる。図11のＡとＢはCTDNAのCDスペクトラムを示し、PNDの30分と20時間の追加的な投与の影響も示されている。我々の結果はPNDが投与量に応じてネガティブとポジティブの線の光度を著しい赤色移動なしで増加できると示している。この結果は以前報告された類似の化合物に匹敵しており、PNDはB型のDNAの右巻き螺旋を著しい立体変更なしで安定できると示している。同様スペクトラム変遷は30分にも20時間にも見られた証拠に基づいて、そこで起こっている相互作用は数分間で起こるもので、介入結合の方法を再び確認するのである。それに、DNAが光を吸収しない局所の300-340 nm の範囲でポジティブのシグナルが発現し、核酸の不在においてPNDのシグナルは観察されなかったので、PNDはCTDNAと結合することによって左右非対象の変更がPNDに促進されている可能性もあるとの証拠がある（図10C参照）。
【０１１９】
考察
[0115] すべての解析した癌細胞種には、PNDは低ミクロモル濃度（1.6μMから9.4 μM）で細胞死を誘導すると発見した。無癌細胞に対して毒性が劣っている(MCF-10A; 6.6 pM のCC50)の上に、PNDは無癌細胞に比べて数々の乳癌細胞に対してSCI値> 2.5の良好な選択性を示した。ＰＮＤは白血病/リンパ腫に対しても良好的なSCI値（1.43から3.47）を示し、HL-60 細胞に対して最高の選択性を示した。
【０１２０】
[0116] PNDの作用はMDA-MB-231とHL-60 細胞種に解析した。細胞は毒物の影響のもとでたいてい二つの経路に従い、アポトーシスまたは壊死のどちらかがある。ホスファチジルセリン（PS）は理想的に内細胞膜の内側にあり、細胞基質に向いている方向で、また細胞はアポトーシス経路を促進する次第、外細胞膜に移転されて、これはアポトーシスの生化学的な痕跡である。サイトフローメトリーはヨウ化プロピジウムとPSとの高い和解力を持つFITC複合アネキシンVを通してこのアポトーシスの跡を認識できた。PNDを受けたMDA-MB-231とHL-60 細胞は通常的にPS外在化を示し、これはPNDが投与量にお応じてアポトーシスの経路を通して毒性を活性することを指してる。
【０１２１】
[0117] したがって、アポトーシスは潜在的または外在的な生化学経路によって誘導されることがある。この潜在的な経路を誘導する大事な生化学事象はミトコンドリア脱分極である。したがって、細胞死を誘導する経路にはミトコンドリア脱分極が参加したかどうかを検討するためにMDA-MB-231とHL-60 細胞はPNDの影響のもと、多染性JC-1試剤で染色した。我々のデータで明確に示しているように、PNDの影響のもとで両方の癌細胞種はかなりのミトコンドリア脱分極を示し、これはPNDの細胞毒性の活性が潜在的なアポトーシス経路が絡んでいることを指しているのである。
【０１２２】
[0118] 周知的な細胞周期プロフィールを検討する方法にはサイトフローメトリーによって細胞内のDNA量を計測することが中心である。この方法を利用しているとき、細胞周期のG0/G1、 S、 とG2/Mの三つの段階を識別することができる。それに、アポトーシスのカスケードを誘導した開始シグナルによらず細胞死のシグナルは最終的にDNA破砕となり、これはアポトーシスの痕跡となるのである。サイトフローメトリーで細胞周期を検討するときに、DNA破砕の事象が起こっている細胞は従G0/G1の従種の存在によって安易に見極めることができ、これは細胞周期のヒストグラムの左側の局所的な高点の形となるのである。したがって、細胞とPNDを72時間で培養したうえ、アポトーシスが原因のDNA破砕の事象と細胞周期は付随的に解析した。このパネルはPNDがMDA-MB-231とHL-60 細胞の細胞周期プロフィールを妨害することができると示して、各細胞種は違うパターンを持っていた。それに、PNDはMDA-MB-231とHL-60 細胞に一貫したDNA破砕を投与量に応じて促進して、以前のPNDがアポトーシスを誘導する結果と再確認したのである。
【０１２３】
[0119] DNAと薬物やタンパクの相互作用はゲル電気泳動法による移動変更パネルのDNA移動の遅延を通して明確となれる。このDNAを結合するパネルには、試験薬とDNA合成は自由DNA（合成していない規定のDNA）より遅く泳動して、その結果はDNAがより重い分子量があるのことである。それに、化合物とプラスミドDNAと一緒に培養する時、退廃的な効果によるDNA破砕や退廃を観察することができる。試験結果はPNDがDNAと直接に相互作用をすると示している、なぜならアガロースゲルで投与量に応じる著しいDNA遅延が起こったがDNA破砕が起こらなかったからである。DNAとPNDの介入的な結合は紫外可視分光光度滴定法とCTDNAの円偏光二色性によって確認できた。そのうえ、CDスペクトラからB型のCTDNAが安定して、PNDとの相互作用による立体構造変更は観察できなかったの証拠もあった。結局、移動変更パネル、紫外可視、またCDの試験の結果はPNDとDNAの結合は核酸塩基の介入法であると強い根拠をあげている。
【０１２４】
[0120] この前臨床試験では、結果としてPNDは人間癌細胞のパネルに対して低ミクロモルCC50値と良好的な細胞毒性準の強い細胞毒性を持ち、トリプル陰性乳癌MDA-MB-231細胞（強悪性腫瘍のの一種）と白血病HL-60 細胞に対して著しい選択性を示す。PS外在化、ミトコンドリア脱分極、DNA破砕、また細胞周期の妨害の証拠の上、PNDは著しくて一貫する細胞毒性のアポトーシスを誘導する活性を示すので、PNDと関連の化合物と誘導体は抗癌薬として活性がある。それに、ＰＮＤとＤＮＡの直接相互作用はアガロースゲル電気泳動法のＤＮＡ遅延、ＰＮＤの紫外可視プロフィールの変動、またＤＮＡのＣＤスペクトラに基づいて、介入結合があると示している。
【０１２５】
実施例４ - ネズミの転移性乳癌に対するＰＮＤの活性
材料と方法
[0121] MDA-MB-231  LM2-LUC4細胞種の転移性乳癌を持つ12匹の比較できるネズミはピロナリジン（PND）の液体合成またはプラセボ（水）を胃管栄養法で投与した。投与開始時は腫瘍が150 - 300 mm3となった時点 (第1日から)。
【０１２６】
[0122] PND投与群（ｎ=6）には、ネズミ全員の6匹に第1日から第9日まで160 mg/kg を投与した。PND投与したネズミ2、4、5は試験中ずっと160 mg/kg を投与したが、PND投与したネズミ1、3、6は第9日で最大の腫瘍があったので、第10日に240 mg/kg 投与追加があって、また第13日も320 mg/kg 投与追加があった。規定のネズミ(n=6) には試験中ずっとプラセボを投与した。腫瘍のサイズは毎日計測した。試験の終了時点は腫瘍が1500 mm3となってこの時点でネズミの安楽死をさせた。解析には、重度性はP<0.05で設定した。
【０１２７】
結果
[0123] 第1日から第9日の腫瘍のサイズを比較して、一般的に腫瘍はPND投与のネズミ(430 mm3)より規定ネズミ(750 mm3)のほうが大きくなったのである。この差は著しく、ｆ-試験のＰ値は0.01であった（図12Ａ参照）。第1日から第15日（ネズミ12匹の全員はまだ生きている時点）の腫瘍のサイズを比較して、平均に腫瘍はPND投与のネズミより規定ネズミのほうが大きくなって、またこの差は著しかった、ｆ-試験のＰ値は0.0001であった（図12B参照）。
【０１２８】
[0124] 生存期間にはかなりのPND投与を受けたグループが利得した違いがあったが、第15日後の比較は3匹のPND投与ネズミの投与量追加とプラセボネズミの安楽死により困難に遭った。
【０１２９】
[0125] 試験中、第15日後で歩行に苦痛を経験した以外に悪い影響が出した報告はない。第20日ごろで6匹全員のネズミは目、肌、耳、また足の黄色化が発現、これはおそらくPNDは強い黄色素のためだと考えられる。体重減少、摂食障害、または毛づくろいの問題は視察しなかった。PND投与の6匹のネズミは解体して、PND蓄積は胃腸、結腸、または肝臓も含むどこにも発見ができなかった。
【０１３０】
[0126] この結果は明確にPND投与を受けたネズミはプラセボを受けるネズミより転移性乳頭腫瘍は小さくなりまた生存期間は永くなる。
【０１３１】
実施例５‐化学療法とPNDの併用の効果の解析
材料と方法
[0127] MDA-MB-231の乳癌細胞種の培養に周知の数々の化学療法薬剤を投与してから24時間後PNDも投与して細胞の細胞死率を解析した。各薬剤は一般的な癌の治療における投与量には重度な副作用があるのは常識であった。化学療法薬剤の投与量は初投与量2分の1、4分の1、8分の1、16分の1にして、PNDの投与量は一定のままであった。この併用療法の効果は癌細胞に対して50％以上の細胞毒性を持つ（CC50）濃度で計測された。シスプラチン、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、またMG132の初投与量（CC50）は順位で95.42μM、 0.44μM、 0.01μM、 また 0.5μMで、PNDの投与量は一定した5.5ｍｍであった。
【０１３２】
結果
[0128] 図12で表示されている結果通り、PＮＤの併用（ＰＮＤは化学療法薬剤の後で投与する場合）は癌細胞を効果的に滅亡するための薬剤量をかなり減少できる。
【０１３３】
実施例６  PNDによる犬類の進行期癌の治療
材料と方法
[0129] 5人の病状末期の癌を持つ犬類被験者に経口用ピロナリジン四リン酸（PND）の寿命延長の効果と安全性を検討するために非盲検を行った。
【０１３４】
[0130] 適格した被験者の悪性癌は転移性または非切除性で、尋常の治療または緩和が無効化となりまたは存在しない。病状末期の犬の治療に関する道徳上の懸念のため、プラセボ体はなかった。
【０１３５】
[0131] このPNDはマンガラム薬物と有機物株式会社に製薬してもらい、ゼラチンカプセルに包まれて毎日2回の経口用に作られた。
【０１３６】
[0132] 主に検討した結果は被験者の試験時の期待した生存期間（各被験者は約2週間から4週間）と実際生存した期間の違いである。副次的な結果は悪性にかかわる症状の緩和、対腫瘍活性、またPNDの安全性と耐性である。
【０１３７】
[0133] 5匹の犬で行った試験は以下の通り：
【０１３８】
[0134] ケース１：肥満細胞腫瘍：犬(ゴールデンレトリーバー)、 メス、 6歳、 28.7kg。病理組織診断により癌は確認した。2019年5月中期ごろ、犬に経口PNDの投与が開始し、この後患者は他の抗癌薬を受けることがない。試験開始時、獣医者は生存期間を4か月から6か月に予測した。患者には毎日23mg/kg PND (朝325mg 夜325mg )を投与した。
【０１３９】
[0135] ケース２：骨肉腫：犬（セントバーナード）オス、5歳、49.7kg。2019年5月17日、犬に経口PNDの投与が開始し、この後患者は他の抗癌薬を受けることがない。試験開始時、獣医者は生存期間を4か月から6か月に予測した。患者には毎日20mg/kg PND (朝325mg 夜650mg )で投与した。
【０１４０】
[0136] ケース３：紡錘細胞肉腫：犬（ボーダーコリー）、オス、9歳、28.5kg。2014年、犬は低重紡錘細胞肉腫の診断を受け、2019年2月11日に安楽死が予定されて、生存期間は1週間から2週間で予測した。その代わり、獣医者は2019年2月11日から経口PNDの投与が開始し、この後患者は他の抗癌薬を受けることがない。患者には毎日15mg/kg PND (朝215mg 夜215mg )で投与した。
【０１４１】
[0137] ケース４： 非ホジキンリンパ腫：犬（ボクサー）メス、27kg、 11歳。生体組織検査により癌は確認した。2018年12月、犬に経口PNDの投与が開始し、この後患者は他の抗癌薬を受けることがない。患者には毎日15mg/kg PND (朝210mg 夜210mg )を投与した。しかし、2019年2月からPND投与は中止となり（アメリカからカナダへの郵送の問題により）継続することはなかった。
【０１４２】
[0138] ケース５：肥満細胞腫瘍：犬、オス、27.9kg。病理組織診断により癌は確認した。舌から腫瘍は手術によって切除して、精密な境界線はなかった。2018年12月、犬に経口PNDの投与が開始し、この後患者は他の抗癌薬を受けることがない。患者には毎日15mg/kg PND (朝210mg 夜210mg )を投与した。
【０１４３】
結果
[0139] ケース１：試験薬から悪い影響が出た報告はない。四つの腫瘍のサイズは試験入力開始時で計測して試験後の大きさと比べた。右下顎骨腫瘍は 2.5cm X 2cm 対2cm X 1cm; 左下顎骨腫瘍は 3cm X 2cm 対2.2cm X 1cm; 右膝窩（膝の後ろ）腫瘍は 0.5cm X 0.5cm 対 0.2cm X 0.2cm; ; 左膝窩腫瘍は 0.5cm X 0.5cm 対 0.2cm X 0.2cm. 2019年5月に犬はまだ生きて、悪性に属する症状の緩和により日常活動ができるようになった。すべての次回計測では腫瘍のサイズは臨床的に著しかった減少である。
【０１４４】
[0140] ケース２：試験薬から悪い影響が出た報告としてはよだれ、顔の膨張、また嘔吐、この症状はジフェンヒドラミンで治療した。試験入力開始時に腫瘍は3.7cm X 2.6cm。2019年5月に、犬はまだ生きて悪性による症状の緩和により日常生活ができるようになったほど体調が向上であった。
【０１４５】
[0141] ケース３：試験薬から悪い影響が出た報告はない。 これは初回の嘔吐以外、この嘔吐も制御できた。試験入力開始時に三つの腫瘍は計測した：2cm X 2.5cm; 3cm X 3.8cm; and 3cm X 4cm。次回で各腫瘍のサイズは約20％で減少と報告は出した。2019年5月犬は安楽死にさせたが、犬の生存期間は3か月延長となった。
【０１４６】
[0142] ケース４：試験薬から悪い影響が出た報告はない。患者の一つの頸部腫瘍は試験入力開始時に計測して次回の計測と比べた。2019年3月に腫瘍は70％減少となった。2019年5月20日犬は安楽死にさせて、犬の生存期間は2.5か月で延長となった。
【０１４７】
[0143] ケース５： 患者は膨張した左顎骨があった。一つの腫瘍は試験入力開始時に計測して次回の計測と比べた。腫瘍は同じ大きさのまま 2cm X 1cm 対 2cm X 1cmであった。2019年5月に犬はまだ生きて、悪性に属する症状の緩和により日常活動ができるようになった。
【０１４８】
実施例６- PNDによる人間の進行期癌の治療
材料と方法
[0144] 5人の病状末期の特定した癌を持つ人間被験者にピロナリジン四リン酸（PND）の効果長さと安全性を検討するために非盲検、追加投与量を行った。適格した被験者の悪性癌は転移性または非切除性で、尋常の治療または緩和が無効化となりまたは存在しない。非適格の条件は臨床的に重度の感染、制御されていない介入性の感染、好中球減少症、また妊娠が含まれている。
【０１４９】
[0145] このPNDはマンガラム薬物と有機物株式会社に製薬してもらい、活性PNDは経口用サイズ00ゼラチンカプセルに包まれている。各カプセルは125mgPNDと不活性な充填材の微結晶性繊維素（MCC）または200mgPNDが入った。
【０１５０】
[0146] 試験のデータ入力また投与追加する前に、その被験者の全血球計算値（CBC）包括的な代謝パネル（CMP）との通常範囲内の試験結果は確認された。
【０１５１】
[0147] 適性のない毒性がなかったのなら被験者たちはその投与量を追加すると説明した。試験群1は初回2週間毎日1回250mg投与、次2週間375mg、次500mg、このままで続く。試験群1は初回2週間毎日1回200mg投与、次2週間400mg、次6030mg、このままで続く。病状末期の患者の治療に関する道徳上の懸念のため、プラセボ体はなかった。
【０１５２】
[0148] 主に検討した結果は被験者の試験時の期待した生存期間（各被験者は約2週間から4週間）と実際生存した期間の違いである。副次的な結果は悪性にかかわる症状の緩和、対腫瘍活性、またPNDの安全性と耐性である。
【０１５３】
[0149] 5人の人間で行った試験は以下の通り：
【０１５４】
[0150] ケース１：男、65歳、2018年3月肝内胆汁管クラシキン（Hepatic bile duct Klatskin (別名：肝門部胆管癌) の診断。2018年12月20日から患者は手順に従って毎日２回ＰＮＤの服用が開始した。
【０１５５】
[0151] ケース２：男、43歳、肺癌、ステージIV、2017年5月で診断。患者は化学療法を受けて、最終の周期は2018年12月、2019年1月22日から毎日２回ＰＮＤの服用が開始した。
【０１５６】
[0152] ケース３：女、55歳、卵巣癌、ステージIV、2017年6月で診断。患者は化学療法を受けて、最終の周期は2018年11月、2019年1月15日から毎日２回ＰＮＤの服用が開始した。
【０１５７】
[0153] ケース４：女、54歳、乳癌、ステージIV、2017年11月で診断。患者は2019年1月20日から毎日２回ＰＮＤの服用が開始した。
【０１５８】
[0154] ケース５：女、40歳、小細胞肺癌、ステージIV、2017年4月で診断。患者は化学療法を受けて、最終の周期は2018年12月、2019年1月29日から毎日２回ＰＮＤの服用が開始した。
【０１５９】
結果
[0155] ケース１：試験薬から悪い影響が出た報告はない。2019年6月で患者はまだ生きて、最新のCBCとCMPの結果は普通範囲内、また悪性に属している症状の減少があったので日常生活ができた。
【０１６０】
[0156] ケース２：試験薬から悪い影響が出た報告はない。2019年2月22日で肺癌の影響で患者は亡くなった。
【０１６１】
[0157] ケース３：試験薬から悪い影響が出た報告はない。2019年1月29日で卵巣癌の影響で患者は亡くなった。
【０１６２】
[0158] ケース４：患者は2019年2月15日で乳癌の影響で亡くなった。
【０１６３】
[0159] ケース５：治療の最初の一週間で皮膚の炎症が出現、一週間で消えて試験薬の影響が可能性、ただ一つの試験薬の悪い影響の報告である。2019年6月で患者はまだ生きて、最新のCBCとCMPの結果は普通範囲内、また悪性に属している症状の減少があったので日常生活ができた。
【０１６４】
[0160] PNDの毒性は少ないよう（患者の一人でもは最高投与量にならなかった）、また癌を抱えている5人の2人の患者の寿命を延びたので寿命を延びながら厳重な副作用を持たないPNDに基づいている薬剤が公式となれる臨床的な試験をする十分の理由がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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