(57)【要約】  本発明は、ＬＡＧ−３結合剤、特にＬＡＧ−３およびＰＤ−１の両方を標的とする可変重鎖（ＶＨ）ｓｄＡｂおよび二重特異性剤、ならびに疾患の治療、予防および検出におけるそのような結合剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３または７から選択されるＣＤＲ３配列、またはそれらと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列を含む、ヒトＬＡＧ−３に結合する単離されたヒト重鎖可変ドメイン（ＶＨ）単一ドメイン抗体。
【請求項２】
配列番号１に示されるＣＤＲ１またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列、配列番号２に示されるＣＤＲ２またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列、および配列番号３に示されるＣＤＲ３またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列を含む、請求項１に記載の単離されたＶＨ単一ドメイン抗体。
【請求項３】
配列番号５に示されるＣＤＲ１またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列、配列番号６に示されるＣＤＲ２またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列、および配列番号７に示されるＣＤＲ３またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列を含む、請求項２に記載の単離されたＶＨ単一ドメイン抗体。
【請求項４】
配列番号４または８から選択される配列、またはそれらと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列を含む、請求項１に記載の単一ドメイン抗体。
【請求項５】
前記単一ドメイン抗体が、毒素、酵素、放射性同位元素、半減期延長部分、標識、治療用分子または他の化学的部分にコンジュゲートされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項６】
前記半減期延長部分が、アルブミン結合部分、トランスフェリン結合部分、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片、およびヒト血清アルブミンに結合するアルブミン結合ペプチドまたは単一ドメイン抗体からなる群から選択される、請求項６に記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項７】
ヒトＶ、ＤおよびＪ領域を含む導入遺伝子を発現するトランスジェニックげっ歯類から得られる、または得ることができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項８】
前記げっ歯類が機能的な内因性軽鎖および重鎖を産生しない、請求項７に記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項９】
ヒトＬＡＧ−３に結合する第１（ＶＨ）単一ドメイン抗体、およびヒトＬＡＧ−３に結合する第２（ＶＨ）単一ドメイン抗体を含む、単離された結合剤。
【請求項１０】
前記ヒトＬＡＧ−３に結合する第１および／または第２（ＶＨ）単一ドメイン抗体が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された単一ドメイン抗体から選択される、請求項９に記載の単離された結合剤。
【請求項１１】
前記単一ドメイン抗体とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に連結された、請求項９に記載の単離された結合剤または請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体を含む、結合剤。
【請求項１２】
前記第２の機能的部分がＬＡＧ−３に結合しない、請求項１１に記載の単離された結合剤。
【請求項１３】
前記第２の結合分子が抗体またはその断片である、請求項１１または１２に記載の単離された結合剤。
【請求項１４】
前記断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄＡｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ断片、ヒト重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、または単離されたＣＤＲである、請求項１３に記載の単離された結合剤。
【請求項１５】
前記第２の機能的部分が、配列番号４または配列番号８を有するＶＨ単一ドメイン抗体である、請求項１４に記載の単離された結合剤。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＶＨ単一ドメイン抗体または請求項９〜１５のいずれか一項に記載の結合剤と、ＰＤ−１に結合する第２の機能的部分とを含む、多重特異性結合剤。
【請求項１７】
前記ＰＤ−１に結合する第２の機能的部分が抗体またはその断片である、請求項１６に記載の多重特異性結合剤。
【請求項１８】
前記断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄＡｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ断片、ＶＨヒト重鎖可変ドメイン、または単離されたＣＤＲである、請求項１７に記載の多重特異性結合剤。
【請求項１９】
前記ＰＤ−１に結合する第２の機能的部分がＶＨ単一ドメイン抗体である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の多重特異性結合剤。
【請求項２０】
前記ＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体が、表５に列挙されたＶＨ単一ドメイン抗体から選択される、請求項１９に記載の多重特異性結合剤。
【請求項２１】
前記ＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体が、ＶＨ２．６３、２．７７または２．９２から選択される、請求項２０に記載の多重特異性結合剤。
【請求項２２】
ＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体を含む、請求項２１に記載の多重特異性結合剤。
【請求項２３】
前記ＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体が配列番号８またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列を有する、請求項２２に記載の多重特異性結合剤。
【請求項２４】
毒素、酵素、放射性同位元素、半減期延長部分、治療用分子または他の化学的部分にコンジュゲートされている、請求項９〜２３のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項２５】
前記半減期延長部分が、アルブミン結合部分、トランスフェリン結合部分、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片、およびヒト血清アルブミンに結合するアルブミン結合ペプチドまたは単一ドメイン抗体からなる群から選択される、請求項２４に記載の結合剤。
【請求項２６】
前記部分が（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーと連結され、ｎ＝１〜２０である、請求項９〜２５のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項２７】
多価結合剤における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体の使用。
【請求項２８】
前記多価結合剤が多重特異性である、請求項２７に記載の単一ドメイン抗体の使用。
【請求項２９】
前記多重特異性結合剤がＬＡＧ−３およびＰＤ−１に結合する、請求項２８に記載の単一ドメイン抗体の使用。
【請求項３０】
治療剤に連結された、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体または請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤を含む、免疫複合体。
【請求項３１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤、または請求項３０に記載の免疫複合体と、医薬担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤、または請求項３０に記載の免疫複合体、または請求項３１に記載の医薬組成物の治療上有効量を投与することを含む、癌、免疫疾患、神経疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植拒絶、ウイルス感染症、免疫不全または他の免疫系関連疾患を治療する方法。
【請求項３３】
癌、免疫疾患、神経疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植拒絶、感染症、免疫不全症または他の免疫系関連疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤、または請求項３０に記載の免疫複合体、または請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３４】
医薬として使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤、または請求項３０に記載の免疫複合体、または請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
癌、免疫疾患、神経疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植拒絶、ウイルス感染症、免疫不全症、およびその他の免疫系関連疾患の治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤、または請求項３０に記載の免疫複合体、または請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記癌が、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、乳癌、脳腫瘍、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、非小細胞肺癌、胸腺腫、尿路上皮癌、白血病、前立腺癌、中皮腫、副腎皮質癌、ホジキン病、非ホジキン病等のリンパ腫、胃癌、および多発性骨髄腫および他の白血病から選択される、請求項３２に記載の方法、請求項３３に記載の使用、または請求項３１に記載の単一ドメイン抗体、結合剤もしくは医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項９〜２３のいずれか一項に記載の結合剤、または請求項３０に記載の免疫複合体、または請求項３１に記載の医薬組成物を投与することを含む、免疫応答を調節する方法。
【請求項３８】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体または請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３９】
配列番号１０または１１から選択される、請求項３８に記載の単離された核酸分子。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４１】
請求項３５または３６に記載の核酸または請求項４０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、細菌、酵母、ウイルス、植物または哺乳動物細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
宿主細胞において結合分子をコードする核酸を発現させること、および前記宿主細胞から前記結合分子を単離することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体を製造する方法。
【請求項４４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤、または請求項３０に記載の免疫複合体、または請求項３１に記載の医薬組成物を含む、キット。
【請求項４５】
試験サンプル中のヒトＬＡＧ−３の存在を検出するための方法であって、前記サンプルと、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体および少なくとも１つの検出可能な標識とを接触させること、および前記単一ドメイン抗体のヒトＬＡＧ−３への結合を検出することを含む、方法。
【請求項４６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体を第２の治療剤と共に投与することを含む、併用療法。
【請求項４７】
請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の結合剤を投与することを含む、免疫チェックポイントＰＤ−１およびＬＡＧ−３を同時に阻害する方法。
【請求項４８】
請求項１〜８のいずれかの単一ドメイン抗体または請求項９〜２６のいずれかの結合剤を投与することを含む、ＬＡＧ−３とガレクチン−３、レセクチンまたはα−シヌクレインとの相互作用を改変または遮断する方法。
【請求項４９】
ＬＡＧ−３と請求項１〜８のいずれかの単一ドメイン抗体または請求項９〜２６のいずれかの結合剤とを接触させることを含む、ＬＡＧ−３とガレクチン−３、レセクチンまたはα−シヌクレインとの相互作用を改変または遮断する方法。
【請求項５０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体または請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤を含む、ＣＡＲ。
【請求項５１】
請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤を提供することを含む、表面にＰＤ−１およびＬＡＧ−３を提示する細胞を選択的に標的化するか、または表面にＰＤ−１を提示する細胞と比較してそのような細胞の標的化を増大させる方法。
【請求項５２】
前記方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
二重特異性療法を受けた対象または該対象からのサンプルにおけるＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌのタンパク質またはＲＮＡ発現を測定することにより、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１に結合する二重特異性薬剤による療法に反応する対象を識別する方法。
【請求項５４】
前記療法が請求項９〜２６のいずれか一項に記載の結合剤によるものである、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗体ベースの治療法は、腫瘍学、炎症性疾患、感染症等の分野におけるヒトの悪性腫瘍の増加に対する治療の重要な要素として浮上している。実際に、抗体は現在最も売れている薬の１つであり、最も売れている薬の上位１０のうち５つは抗体である。
【０００２】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３、ＬＡＧ３、ＣＤ２２３）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの膜貫通タンパク質である。これは４つの細胞外ドメインを有し、ＣＤ４と相同性を有する（Triebel 1990 J. Exp.Med. 171:1393-1405）。
【０００３】
ＬＡＧ−３は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔ調節細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および形質細胞様樹状細胞において発現する（Huard 1994 Eur. J. Immunol. 24:3216-21; Grosso 2007 J. Clin. Invest. 117:3383-92; Huang 2004 Immunity. 21:503-13; Kieslow 2005 Eur. J. Immunol. 35:2081-88; Triebel 1990 J. Exp.Med. 171:1393-140; Castelli 2014 Oncoimmunology. 3:11）。
【０００４】
Ｔ細胞に対するＬＡＧ−３の役割は、Ｔ細胞の活性化を調節することである（Huard 1994 Eur. J. Immunol. 24:3216-21）。ＬＡＧ−３はＭＨＣクラスＩＩと結合し、ＣＤ４＋Ｔ細胞のダウンレギュレーションを引き起こす（Huard 1996 Eur. J. Immunol. 26:1180-6）。Ｔ細胞が活性化すると、ＬＡＧ−３の表面発現が増大する。ＬＡＧ−３ダイマーとリガンドとの結合により、細胞内ＫＩＥＥＬＥドメイン（Workman 2002 J.Immunol 169:5392-5）を介したシグナル伝達が誘導され、Ｔ細胞活性のダウンレギュレーションが引き起こされる。したがって、ＬＡＧ−３は抗原に対する応答を調節し、過剰刺激を防ぎ、免疫恒常性を維持する働きをする。
【０００５】
ＬＡＧ−３は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１〜４の番号が付けられた４つの細胞外ドメインで構成されている（Huard 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. 94:5744-9）。ドメイン１−２はＭＨＣクラスＩＩリガンドと会合し、ドメイン１の先端（エクストラループ（extra loop））が結合部位を形成することが示されている（Huard 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. 94:5744-9）。ＬＡＧ−３は、その抑制性シグナル伝達を誘導する代替的なリガンドであるガレクチン−３およびレセクチン（LSECtin）とも会合し得る（Kouo 2015 Cancer Immunol Res. 3(4):412-23; Xu 2014 Cancer Res 74(13):3418-28）。細胞上または細胞外マトリックス内のガレクチン−３との会合は、通常はＣＤ８＋Ｔ細胞等のＭＨＣクラスＩＩと結合しないＴ細胞をダウンレギュレートし得る。したがって、このリガンドの遮断は、幅広いＴ細胞機能を増強するためのメカニズムとして役立つ可能性がある。
【０００６】
ＬＡＧ−３に結合する抗体には治療の可能性がある。マウスでは、抗ＬＡＧ−３抗体は機能的に無反応なＴ細胞を逆転させ、腫瘍の進行を遅らせる（Grosso 2007 J. Clin. Invest. 117: 3383-92）。ＬＡＧ−３は、ヒト腫瘍浸潤リンパ球において発現し、この局在化により、これらの細胞を刺激するための好ましい経路が遮断される（Matsuzaki 2010 PNAS 107(17):7875-80）。
【０００７】
Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １（ＰＤ−１）タンパク質はＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされ、５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質として発現する（Agata 1996 Int Immunol 8(5):765-72）。ＰＤ−１は免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーであり（Ishida 1992 EMBO 11(11):3887-95）、Ｔ細胞レギュレーターの拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーの阻害性メンバーである。このファミリーの他のメンバーとしては、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡが挙げられる。ＰＤ−１は単量体として存在し、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに特徴的な不対システイン残基を欠いている（Zhang 2004 Immunity 20:337-47）。その細胞質ドメインには、シグナル伝達中にリン酸化される免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）と免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）が含まれる（Riley 2009 Immunol Rev 229(1):114-25）。
【０００８】
ＰＤ−１はＢ細胞、Ｔ細胞および単球において発現する（Agata 1996）。免疫学的自己寛容の維持におけるＰＤ−１の役割は、自己免疫疾患を発症するＰＤＣＤ１−／−マウスにおいて実証された（Nishimura 1999 Immunity 11:141-51, Nishimura 2001 Science 291(5502):319-22）。したがって、ＰＤ−１経路は抗原応答を調節し、自己免疫と寛容とのバランスをとる。
【０００９】
ＬＡＧ−３およびＰＤ−１はどちらもＴ細胞の活性化を調節する。それらとリガンドとの結合により、Ｔ細胞活性化の阻害が引き起こされ、抗原特異的応答の調節がもたらされる。ＰＤ−１には、その調節機能を媒介する２つのリガンドが存在する。ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）は、樹状細胞、マクロファージ、休止Ｂ細胞（resting B cell）、骨髄由来のマスト細胞およびＴ細胞、ならびに非造血細胞系統において発現する（Francisco 2010 Immunol Rev 236:219-42において概説されている）。ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）は、主に樹状細胞およびマクロファージにおいて発現する（Tseng 2001 J Exp Med 193(7):839-45）。リガンドとＰＤ−１との結合はＰＤ−１を架橋し、免疫シナプス内のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体にクラスター化する（Yokosuka 2012 J Exp Med 209(9):1201-17）。Ｔ細胞の細胞質内では、ＰＤ−１シグナル伝達ドメインであるＩＴＩＭおよびＩＴＳＭがリン酸化される。これにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達のさまざまなコンポーネントを減衰させるＳｒｃホモロジー２ドメインを含むチロシンホスファターゼ（ＳＨＰ１／２）が誘導される。ＬＡＧ−３ダイマーとリガンドとの結合により、細胞内ＫＩＥＥＬＥドメインを介したシグナル伝達が誘導される（Workman 2002 J.Immunol 169:5392-5）。シグナル伝達により、Ｔ細胞の活性化が抑制され、それによりサイトカイン応答、増殖および細胞溶解活性の低下が引き起こされる。これらの経路の遮断は、Ｔ細胞機能を回復できることを意味し、抗原または腫瘍特異的細胞応答の回復を可能にする。
【００１０】
ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する抗体は、腫瘍学および癌以外の疾患の治療のために医療機関において使用されるが、応答率が低いため限定的である。このような遮断治療の恩恵を受ける患者の割合を増大させ、治療への抵抗に取り組み、安全性プロファイルを改善し、重複経路を克服する必要性がある。併用療法は、ＰＤ−１遮断に対する応答を改善するために使用される。抗ＬＡＧ−３抗体は、現在、単剤として、およびＰＤ−１経路遮断抗体と組み合わせて、臨床試験で評価されている。併用療法が有益である可能性がある１つの理由は、単剤チェックポイント遮断が他のチェックポイントの代償性アップレギュレーションにつながることにある（Huang 2017, Oncoimmunol 6(1) e1249561）。
【００１１】
ＬＡＧ−３特異的抗体は当技術分野で知られており、癌治療のための臨床試験中である（例えば、ＮＣＴ０２０６１７６１、ＮＣＴ０２４６０２２４）。しかしながら、強力な遮断と改善された応答率が必要とされる。ＬＡＧ−３に結合してＬＡＧ−３シグナル伝達を遮断し、免疫療法剤等の他の薬剤と組み合わせて有益な治療効果を達成できる薬剤を提供する必要性もある。特に、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３の両方に結合し、使い果たされた腫瘍特異的細胞のこれらの受容体と結合する二重特異性抗体は、そのような細胞の機能を増強し、腫瘍の退行を引き起こす可能性がある。ＰＤ−１およびＬＡＧ−３の両方に結合する二重特異性抗体は、後者を使用することによりいずれかの標的を発現する細胞上の各標的が普遍的に遮断されるため、併用療法よりも利点がある。一方、二重特異性抗体は両方の標的を発現する細胞を標的とし、最も使い果たされた表現型（ＰＤ−１とＬＡＧ−３の両方を発現）を有するＴ細胞をより的確に標的化できる。
【００１２】
本発明は、代替的かつ改善された治療法の必要性を解決することを目的とし、免疫チェックポイント阻害剤として作用することができ、癌等の疾患を治療するための免疫療法において、例えばＰＤ−１およびＬＡＧ−３の二重遮断のための二重特異性形態で使用することができるＬＡＧ−３結合剤を提供する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ＬＡＧ−３に結合するタンパク質、特に可変重鎖（ＶＨ）ｓｄＡｂ等の抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むかまたはそれらからなるタンパク質、ならびに疾患の治療、予防および検出におけるそれらの使用に関する。
【００１４】
一つの態様では、本発明は、少なくとも１つのＶＨ単一ドメイン抗体等の、ヒトＬＡＧ−３に結合する少なくとも１つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む単離された結合分子に関する。一つの態様では、本発明は、ＬＡＧ−３結合について二価であり、ヒトＬＡＧ−３に結合する２つのｓｄＡｂ、特に２つのＶＨ単一ドメイン抗体を含むかまたはそれからなる単離された結合分子に関する。
【００１５】
上記の結合分子は、本明細書で説明されるように、いくつかの望ましい特性を有する。
【００１６】
本発明の結合分子は、ヒトＬＡＧ−３に結合し、ＬＡＧ−３とそのリガンドとの相互作用を調節する。結合分子は、好ましくは高い親和性でＬＡＧ−３に結合し、下記のようにＬＡＧ−３とそのリガンドとの機能的相互作用を遮断する。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、Ｔ細胞活性化を刺激または増強し得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、免疫応答を刺激または増強するため、および／または癌または他の疾患に罹患している対象を治療するために有用であり得る。
【００１７】
本発明の抗ＬＡＧ−３  ＶＨ  ｓｄＡｂは、多くの有益な特性を示す。特に、本発明のｓｄＡｂは、多価結合分子、例えば、多重特異的分子、すなわちＬＡＧ−３に結合し、１つ以上の他の抗原結合部位を有する分子における機能的構成要素（functional building block）として使用することができる。また、２つの抗ＬＡＧ−３  ＶＨ  ｓｄＡｂを融合タンパク質中で組み合わせて、本明細書に記載されるような増強された効果を得ることができる。
【００１８】
したがって、本発明はまた、少なくとも１つの抗ＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体、好ましくは２つの抗ＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体を含む多価および／または多重特異性結合剤に関する。
【００１９】
一つの態様では、本発明は、同じ細胞に存在するＬＡＧ−３およびＰＤ−１に結合する、例えば、同時に結合し、少なくとも１つの抗ＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体、好ましくは２つの抗ＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体を含む多重特異性結合分子に関する。別の態様において、本発明は、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１に同時に結合し、２つの抗ＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体を含む多重特異性結合分子に関する。一つの実施形態では、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１に同時に結合する多重特異性結合分子は、２つの抗ＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体、およびＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン、ならびに任意で半減期延長部分を含むかまたはそれからなる。
【００２０】
本明細書に示されるように、本発明の二重特異的性薬剤を使用することにより、腫瘍特異的細胞に対する分子が選択的に標的化され、したがってシグナル伝達および増殖に対して選択的に効果が発揮されるため、特定の利益がもたらされる。例えば、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３の両方に結合する二重特異性薬剤は、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３のモノクローナル抗体が別々に投与される併用療法と比較して有益な特性を有する。これは、二重特異性抗体が、両方の標的、すなわちＰＤ−１およびＬＡＧ−３をその表面に発現する細胞を標的とするためである。したがって、二重特異性分子を使用することにより、最も枯渇した表現型（ＰＤ−１およびＬＡＧ−３の両方を発現）のＴ細胞をより的確に標的化することができる。一方、併用療法によれば、いずれかの標的を発現する細胞上の各標的の普遍的な遮断がもたらされる。ＰＤ−１の遮断によりＬＡＧ−３の発現が増大することも知られている。したがって、二重特異性薬剤による治療は、ＰＤ−１遮断に応答しない、またはＰＤ−１遮断に応答しなくなった患者の治療に特に有用である可能性がある。本明細書に記載される二重特異性薬剤は、最も機能不全の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）に対して選択的である。それらによれば、内因性または後天性のＰＤ−１耐性を逆転させる用途を見出すことができる。ＰＤ−１遮断の減少により、末梢Ｔ細胞が節約され、免疫学的に機能するＰＤ−１陽性細胞の過剰活性化が回避され、その結果、安全性プロファイルが改善される。したがって、二重特異性薬剤によれば、特異的に二重陽性の細胞、すなわち、それらの表面にＬＡＧ−３およびＰＤ−１の両方を提示する細胞に対する改善された標的化および活性が提供もたらされる。さらに、本明細書に示されるように、分子はまた、より大きな二重特異性抗体形態よりも改善された特性を有する。理論に拘束されることを望むものではなく、この効果は、より小さなサイズ、より優れた柔軟性をもたらし、かつ、より完全で強力なクラスタリング（細胞表面でのＬＡＧ−３およびＰＤ−１のリクルート）を提供する、本明細書に記載される分子の特定の構成に起因する可能性がある。したがって、最も小さい抗原結合実体であるＶＨに基づく分子の形態は、さらなる利点をもたらす。
【００２１】
本発明の好ましい結合剤は、ＬＡＧ−３を標的とする少なくとも１つのＶＨ単一ドメイン抗体およびＰＤ−１を標的とする少なくとも１つのＶＨ単一ドメイン抗体を含む。大きな二重特異性モノクローナル抗体と比較して、Ｆｃを介したクリアランスが治療効果を制限する可能性があるため、Ｆｃドメインを欠くことにより、この形態には利点がある。
【００２２】
したがって、本発明は、配列番号３または７から選択されるＣＤＲ３配列、またはそれらと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性／同一性を有する配列を含む、ヒトＬＡＧ−３に結合する単離されたヒト重鎖可変ドメイン（ＶＨ）単一ドメイン抗体に関する。
【００２３】
一つの実施形態では、配列番号１に示されるＣＤＲ１またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性／同一性を有する配列、配列番号２に示されるＣＤＲ２またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性／同一性を有する配列、および配列番号３に示されるＣＤＲ３またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性／同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＶＨ単一ドメイン抗体。
【００２４】
一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号５に示されるＣＤＲ１またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性／同一性を有する配列、配列番号６に示されるＣＤＲ２またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列、および配列番号７に示されるＣＤＲ３またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性／同一性を有する配列を含む。
【００２５】
一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号４または８から選択される配列、またはそれらと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性／同一性を有する配列を含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、例えば本明細書に記載されるように、ＬＡＧ−３とガレクチン３、レセクチンおよび／またはα−シヌクレインとの相互作用を改変または遮断するための、抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体または抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体を含む結合剤の使用に関する。本発明のｓｄＡｂまたは結合剤を投与することにより、ＬＡＧ−３とガレクチン３、レセクチンおよび／またはシヌクレインとの相互作用を改変または遮断する方法もまた本発明の範囲内である。
【００２７】
別の態様では、本発明は、例えば本明細書に記載されるように、抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体または抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体を含む結合剤の投与を含む神経学的状態の治療に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本開示は、以下の非限定的な図によりさらに説明される。
【図１】ＶＨ  ｓｄＡｂを含む二重特異性結合剤は、同時に標的に結合できる。ＬＡＧ３−ＦｃはＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーへのアミンカップリングを介して固定化された。二重特異性結合剤（すなわち、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１への結合）１．１−６ＧＳ−１．１−６ＧＳ−２．６３を１００ｎＭで添加し、次いでＰＤ−１−Ｆｃを添加した。プロファイルは、ＬＡＧ−３への二重特異性（濃い灰色）の結合と、それに続くＰＤ−１の付加的結合を示す。ＬＡＧ−３特異的（二価１．１−６ＧＳ−１．１）はＬＡＧ−３への結合を示すが、予想された通り、ＰＤ−１の添加はそれ以上の結合を示さない（中間灰色の曲線）。
【図２】ＣＤ４＋Ｔ細胞は抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激された。細胞は、ビオチンおよびストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識されたＨＩＳタグ付きＶＨ＋抗ＨＩＳタグで染色された。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ（登録商標）サイトメーターを使用して細胞を分析した。二重特異性（すなわち、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１への結合）結合剤１．１−６ＧＳ−１．１−９ＧＳ−２．６３は、個々の構成要素よりも高いメジアンの蛍光で結合する。ネガティブ対照は、標的に結合しないＶＨである。
【図３】３ａ）組み合わせによるＩＬ−２の増強。ヒトＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で２日間刺激した。細胞を１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢおよび２５ｎＭのＶＨまたは完全モノクローナル抗体（ペムブロリズマブおよびレラトリマブ類似体）で再刺激した。抗体の組み合わせが使用された場合、等濃度、例えば２５ｎＭのＬＡＧ−３  ＶＨ／抗体と共に２５ｎＭ  ＰＤ−１抗体（ｍＡｂ）が使用された。３日後、ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用してＩＬ−２測定のために培養上清を採取した。３ｂ）二重特異性分子によるＩＬ−２の増強。ヒトＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で２日間刺激した。細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ、およびＶＨまたは完全モノクローナル抗体（ニボルマブおよびレラトリマブ類似体）の滴定で再刺激した。抗体の組み合わせが使用された場合、等濃度、例えば５０ｎＭのＰＤ−１抗体（ｍＡｂ）と共に５０ｎＭのＬＡＧ３抗体（ｍＡｂ）が使用された。２日後、ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用してＩＬ−２測定のために培養上清を採取した。ネガティブ対照は、標的に結合しないＶＨである。３ｃ）二重特異性分子は、その構成成分ＶＨよりも多くのＩＬ−２を誘導する。ＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌのＳＥＢで刺激し、５０ｎＭまたは５０＋５０ｎＭのＶＨの存在下で３日間０．１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢで再刺激した。３ｄ）二重特異性分子との関連で、一価ＬＡＧ−３よりも二価ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体コンストラクトの方がより強力にＩＬ−２を増強する。ヒトＰＢＭＣを５０ｎｇ／ｍｌブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で一晩刺激した。細胞を４０ｎｇ／ｍｌのＳＥＢおよびＶＨ二重特異性（すなわち、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１への結合）の滴定で２日間再刺激した。３ｅ）いくつかの１：１の形態よりも非対称形態において、より強力にＩＬ−２が増強される。ヒトＰＢＭＣを２０ｎｇ／ｍｌのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で一晩刺激した。細胞を５ｎｇ／ｍｌのＳＥＢおよび１０ｎＭのＶＨで３日間再刺激した。３ｆ）二重特異性分子により炎症性サイトカインが誘導される。ヒトＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌのＳＥＢで一晩刺激した。細胞を１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢおよび５０ｎＭのＶＨで３〜６日間再刺激した。上清はＨＴＲＦキットを使用して試験された。
【図４】ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、二重特異性１．１−６ＧＳ−１．１−９ＧＳ−２．６３によって増強される。８名のドナーからのＰＢＭＣに１００μＭＣＭＶペプチドで１時間パルスした（pulsed）。ＶＨを１００ｎＭで細胞に添加し、５日間培養した。７つの異なるＨＬＡ四量体に関し陽性であったＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、ＨＬＡ分類に応じて分析した。無関係なＶＨを超える倍数増加を計算した。各点を、１つのドナーと１つの四量体として表す。一元配置分散分析（one way ANOVA）およびＤｕｎｎｓ多重比較検定を使用して統計的有意性が計算された。ｐ＝０．０００２。
【図５】対照ＶＨと比較した場合、１０ｍｇ／ｋｇの抗マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）ＶＨと共に二重特異性（すなわち、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１への結合）結合剤１．１−６ＧＳ−１．１−６ＧＳ−２．７７が、ＲＫＯ結腸癌細胞の腫瘍増殖率を低下させる。この時点での平均腫瘍体積（ｎ＝６動物／群）。Ｔｕｋｅｙの事後検定を伴う二元配置分散分析（two-way ANOVA）を使用して統計的有意性が決定された（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ネガティブ対照は、標的に結合しないＶＨである。
【図６】患者のＴ細胞の増殖は二重特異性によって増強され、ＰＤ−１抗体はほとんど増加しない。患者のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍細胞株と共にインキュベートし、Ｋｉ６７陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。
【発明の詳細な説明】
【００２９】
ここで、本開示をさらに説明する。以下の節では、本開示の異なる態様がより詳細に定義されている。そのように定義された各態様は、それとは反対のことが明確に示されない限り、他の任意の一つの態様または複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された他の任意の一つの特徴または複数の特徴と組み合わせることができる。
【００３０】
一般に、本明細書に記載される細胞および組織の培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される学術用語および技術は、当技術分野において周知であり、また一般的に知られている。本開示の方法および技術は、一般的に、当技術分野において周知の従来の方法に従って、特に指示がない限り、本明細書全体で引用および議論される様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Green and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Zhiqiang An (Editor), Wiley, (2009);およびAntibody Engineering, 2nd Ed., Vols. 1 and 2, Ontermann and Duebel, eds., Springer-Verlag, Heidelberg (2010)を参照されたい。
【００３１】
酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品および製薬化学に関して使用される学術用語、およびそれらの実験手順および技術は、当技術分野において周知であり、また一般的に使用されている。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤および送達、ならびに患者の治療に使用される。
【００３２】
本発明者らは、ヒトＬＡＧ−３抗原に特異的に結合することができ、いくつかの有益な特性を有する結合剤を作製した。これらの結合剤は、ヒトＬＡＧ−３に結合する少なくとも１つのＶＨ単一ドメイン抗体を含むかまたはそれからなる。本発明者らは、ヒトＶ、ＤおよびＪ領域を有する導入遺伝子を発現し、機能的な内因性重鎖およびκ軽鎖およびλ軽鎖を産生することができないトランスジェニックマウスにおいて、ヒト重鎖のみの抗体を生成した。軽鎖がない状況下、重鎖のみの抗体がマウスで生成され、体細胞超変異および親和性成熟の通常のプロセスを経る。
【００３３】
したがって、本発明によれば、ヒトＬＡＧ−３に結合し、ＬＡＧ−３とそのリガンドとの相互作用を遮断する、ＶＨ単一ドメイン抗体等の少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含む単離された結合分子、そのような結合分子を含む医薬組成物、ならびに単離された核酸、単離された組換え発現ベクター、ならびにそのような結合タンパク質を作製するための単離された宿主細胞が提供される。例えば、単一ドメイン抗体は、ドメインがヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメインである単一ドメイン抗体である。
【００３４】
一つの実施形態では、結合分子は、２つ以上のＶＨ単一ドメイン抗体を含み、少なくとも１つのＶＨ単一ドメイン抗体は、ヒトＬＡＧ−３に結合する。一つの実施形態では、結合分子は、それぞれがヒトＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体を含み、ＬＡＧ−３に結合するさらなる実体を含まない。一つの実施形態では、結合分子は、それぞれがヒトＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体を含み、半減期延長部分をさらに含む。一つの実施形態では、結合分子は、それぞれがヒトＬＡＧ−３に結合する１つまたは２つ以上のＶＨ単一ドメイン抗体、および別の標的、例えばＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体を含む。
【００３５】
本発明の結合分子および単一ドメイン抗体を使用してヒトＬＡＧ−３を検出する方法、疾患を治療する方法、および結合分子を産生する方法も提供される。
【００３６】
一つの態様では、本発明は、１つ以上のＶＨ単一ドメイン抗体を含む、例えば２つのＶＨ単一ドメイン抗体を含むＶＨ単一ドメイン抗体または結合分子に関し、１つおよび／またはそれ以上のＶＨ単一ドメイン抗体は、以下の特性の１つ以上またはすべてを示し、その組み合わせを含む：
ａ）ヒトＬＡＧ−３に結合する；
ｂ）サルＬＡＧ−３に結合する；
ｃ）マウスＬＡＧ−３に結合しない；
ｄ）ＬＡＧ−３のＮ末端ドメイン内に結合する；
ｅ）ＬＡＧ−３の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩへの結合を遮断し、レポーター細胞株においてＴ細胞シグナル伝達を回復する；
ｆ）ＬＡＧ−３のヒトガレクチン−３（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＢＡＡ２２１６４）への結合を遮断する；
ｇ）ＬＡＧ−３のヒトレセクチン（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＰ＿９４０８９４）への結合を遮断する；
ｈ）ＬＡＧ−３のヒトα−シヌクレイン（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＰ３７８４０）への結合を遮断する；および／または
ｊ）スーパー抗原およびＰＤ−１遮断で刺激されたＴ細胞におけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生を刺激する、実施例１０を参照されたい。
【００３７】
上記の特性を測定するための適切なアッセイは実施例に記載されており、代替法は当業者に知られているであろう。
【００３８】
例えば、本発明によれば、ＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞は、ＬＡＧ−３を発現するレポーターＴ細胞との相互作用が阻害され、ＮＦＡＴ駆動型ルシフェラーゼ活性の増大をもたらす。本発明者らは、一価のＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体が高濃度（例えば、＞約３３３ｎＭ）でのみ相互作用を阻害することを示した。二価のＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体および二重特異性ＶＨ単一ドメイン抗体（ＬＡＧ−３とＰＤ−１の両方を標的化する）は、ナノモル範囲、例えば約１．２〜約８．３ｎＭのＥＣ５０値でルシフェラーゼ活性の用量依存的な増加を阻害することを示した。
【００３９】
例えば、ヒトガレクチン−３への結合はＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定することができ、本発明のｓｄＡｂはナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。
【００４０】
例えば、レセクチンへの結合はＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定することができ、本発明のｓｄＡｂはナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。
【００４１】
例えば、α−シヌクレインへの結合はＥＬＩＳＡを使用して測定することができ、本発明のｓｄＡｂはナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。例えば、ＶＨ  １．１は、約４４．９ｎＭのＩＣ５０でＬＡＧ−３とα−シヌクレインとの間の相互作用を阻害する。
【００４２】
スーパー抗原刺激されたＰＢＭＣにおけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生の刺激は、実施例に示されるようにＨＴＲＦにおいて分泌されたＩＬ−２を測定することにより評価できる。二重特異性ＶＨ単一ドメイン抗体は、ＰＤ−１の遮断単独よりもＩＬ−２が２〜３倍増加することを示す。
【００４３】
一つの態様では、本発明は、ヒトＬＡＧ−３に結合し、ＬＡＧ−３とヒトガレクチン−３、レセクチンおよび／またはα−シヌクレインとの結合を遮断する単一ドメイン抗体、例えばＶＨ単一ドメイン抗体に関する。いくつかの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、本明細書に記載される配列を有する。
【００４４】
上記の結合分子および単一ドメイン抗体の特性は、本明細書に記載される治療および診断方法、ならびに使用において利用され得る。そのような方法および使用は、本発明の範囲内である。大きなモノクローナル抗体と比較して、Ｆｃを介したクリアランスが治療効果を制限する可能性があるため、Ｆｃドメインを欠くことにより、単一ドメイン形態には利点がある。同様に、サイズが小さいため、標的、すなわちＬＡＧ−３に簡単にアクセスできる。これは、免疫シナプスでの発現のため、この標的にとって特に有益である。
【００４５】
特に、以下に説明するように、本明細書に記載のヒトＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体は、多価および／または多重特異的形態で使用することができる。したがって、本発明者らは、多機能分子を構築するための構成要素を提供する。
【００４６】
本明細書に記載される分子は、野生型ヒトＬＡＧ−３（アクセッション番号ＮＭ＿００２２８６）に特異的に結合する。野生型ヒトＬＡＧ−３のアミノ酸配列を以下に示す（配列番号９）。
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL
【００４７】
「ＬＡＧ−３、ＬＡＧ３、リンパ球活性化遺伝子３」および「ＣＤ２２３」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒトＬＡＧ−３の変異体、アイソフォーム、種ホモログを含む。
【００４８】
特に明記しない限り、本明細書で使用されるＬＡＧ−３という用語は、ヒトＬＡＧ−３を指す。したがって、ＬＡＧ−３に結合すると記載されている単一ドメイン抗体は、ヒトＬＡＧ−３に結合する。
【００４９】
「ＬＡＧ−３結合分子／タンパク質／ポリペプチド／剤」、「ＬＡＧ−３抗原結合分子タンパク質／ポリペプチド／剤」、「抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体」、「抗ＬＡＧ−３単一免疫グロブリン可変ドメイン」、「抗ＬＡＧ−３重鎖のみ抗体」、「抗ＬＡＧ−３  ＶＨ単一ドメイン抗体」、「抗ＬＡＧ−３  ＶＨ」または「抗ＬＡＧ−３抗体」という用語はすべて、上記のようにヒトＬＡＧ−３抗原に特異的に結合することができる分子を指す。結合反応は、例えば、無関係な特異性の抗体を使用するネガティブ対照試験を参照して、標準的な方法によって示され得る。「結合剤」および「結合分子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。結合分子および結合剤という用語はすべて、上記のようにヒトＬＡＧ−３抗原に特異的に結合することができる生物学的実体、例えば融合タンパク質等のタンパク質を指す。
【００５０】
目的の抗原、例えばヒトＬＡＧ−３に「結合する」または「結合することができる」、本明細書に記載される単一ドメイン抗体または単一ドメイン抗体を含む結合分子は、抗原を発現する細胞または組織において抗体が治療剤として有用であるように十分な親和性で抗原に結合するものである。
【００５１】
本明細書に記載される単一ドメイン抗体または単一ドメイン抗体を含む結合分子は、マウスＬＡＧ−３と交差反応しない。
【００５２】
一つの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、ヒトＬＡＧ−３と結合し、またカニクイザルＬＡＧ−３とも結合する。
【００５３】
ＬＡＧ−３に結合する、本明細書に記載される単一ドメイン抗体および結合剤は、本明細書において「遮断単一ドメイン抗体または抗体」または「中和単一ドメイン抗体または抗体」とも記載され、ＬＡＧ−３に結合することによりＬＡＧ−３の少なくとも一つの生物活性が阻害される単一ドメイン抗体または結合剤を指す。例えば、ＬＡＧ−３の前記生物活性は、以下の１つ以上から選択される：
ａ）ＭＨＣクラスＩＩとの相互作用；
ｂ）ガレクチン−３との相互作用；
ｃ）レセクチンとの相互作用；
ｄ）ＬＡＧ−３を発現する細胞内でのリガンド媒介シグナル伝達；
ｅ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路への影響；
ｆ）ＬＡＧ−３のオリゴマー化、または免疫シナプスにおける他の細胞表面受容体との相互作用；
ｇ）細胞表面から切断された可溶性ＬＡＧ−３の結合；および／または
ｈ）Ｔ調節細胞の調節。
【００５４】
本明細書で使用される特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープとの「特異的結合」または「特異的に結合する」または「に対して特異的」という用語は、例えば、標的に関して少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤを有する分子によって示され得る。一つの実施形態では、「特異的結合」という用語は、分子が他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
【００５５】
一つの実施形態では、本明細書に記載される一価単一ドメイン抗体は、１０−９から少なくとも１０−５までのＫＤを有する。別の実施形態では、本明細書に記載される二価単一ドメイン抗体は、１０−９〜１０−１２Ｍ以上のＫＤを有する。
【００５６】
「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子またはその抗原結合部分、またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持したそれらの任意の機能的断片、突然変異体、変異体、誘導体を広く指す。このような突然変異体、変異体または誘導体の抗体形態は、当技術分野で知られている。
【００５７】
完全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域またはドメイン（本明細書ではＨＣＶＲと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域またはドメイン（本明細書ではＬＣＶＲと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。
【００５８】
重鎖および軽鎖の可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化できる。各重鎖および軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００５９】
免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００６０】
「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに３つのＣＤＲがあり、これらは各可変領域についてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれている。「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域で生じる３つのＣＤＲのグループを指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、当技術分野で知られているさまざまなシステムに従ってさまざまに定義することができる。
【００６１】
Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の変動性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391およびKabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに構造ループの場所に言及する（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987)）。可変ドメインの残基（軽鎖の約１〜１０７残基および重鎖の１〜１１３残基）に言及する場合、Ｋａｂａｔナンバリングシステムが一般的に使用される。
【００６２】
本明細書では、特に断りのない限り、Ｋａｂａｔのシステムを使用する。「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔの定義」および「Ｋａｂａｔラベリング」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当技術分野で認識されているこれらの用語は、抗体または抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基よりも可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基に番号を付けるシステムを指す。
【００６３】
キメラ抗体は、ある種に由来する抗体、好ましくはげっ歯類抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含み、抗体分子の定常ドメインがヒト抗体の定常ドメインに由来する組換えタンパク質である。獣医学的適用のために、キメラ抗体の定常ドメインは、猫または犬等の他の種の定常ドメインに由来し得る。
【００６４】
ヒト化抗体は、ある種の抗体；例えば、げっ歯類抗体のＣＤＲが該げっ歯類抗体の重鎖および軽鎖可変鎖からヒト重鎖および軽鎖可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）に移された組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。特定の実施形態では、親（げっ歯類）抗体からの限られた数のフレームワーク領域アミノ酸残基を、ヒト抗体フレームワーク領域配列に置換することができる。
【００６５】
「抗原結合部位」という用語は、抗原に特異的に結合する領域を含む抗体または抗体断片の部分を指す。抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインによって提供され得る。好ましくは、抗原結合部位は、抗体または抗体断片の会合したＶＨおよびＶＬ内に含まれる。
【００６６】
抗体断片は、抗体、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等の一部である。完全長抗体の機能的断片は、完全長抗体の標的特異性を保持する。したがって、Ｆａｂ（断片抗体）、ｓｃＦｖ（一本鎖可変鎖断片）および単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）等の組換え機能性抗体断片は、ｍＡｂに基づく治療法の代替としての治療法を開発するために使用されてきた。
【００６７】
ｓｃＦｖ断片（〜２５ｋＤａ）は、２つの可変ドメイン、ＶＨとＶＬで構成される。当然、ＶＨおよびＶＬドメインは、疎水性相互作用を介して非共有結合的に会合し、解離する傾向がある。しかしながら、ドメインと親水性の柔軟なリンカーとを架橋して一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を作製することによって、安定した断片を設計できる。
【００６８】
最小の抗原結合断片は単一の可変断片、すなわちＶＨまたはＶＬドメインである。軽鎖／重鎖パートナーそれぞれとの結合は、標的の結合には必要ない。そのような断片は単一ドメイン抗体と呼ばれる。したがって、単一ドメイン抗体（〜１２〜１５ｋＤａ）はＶＨまたはＶＬドメインのいずれかを有し、抗体の他の部分を含まない。ＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ抗原に結合することができる。サイズが１つの単一ドメイン（ＶＨまたはＶＬドメインに対応）に縮小された抗体の抗原結合実体は、一般的に「単一ドメイン抗体」または「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と呼ばれる。天然に軽鎖を欠いているラクダ科の重鎖のみの抗体に由来する単一ドメイン抗体、ならびにヒト重鎖ドメインを有する単一ドメイン抗体が記載されている（Muyldermans J Biotechnol. 2001 Jun;74(4):277-302, Holliger Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36）。
【００６９】
抗原結合単一ＶＨドメインは、例えば、免疫されたマウスの脾臓からのゲノムＤＮＡから増幅されたマウスＶＨ遺伝子のライブラリーからも同定され、大腸菌で発現された（Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546）。Ward et al.では、分離された単一のＶＨドメインは「ｄＡｂｓ」、「ドメイン抗体」と命名された。「ｄＡｂ」という用語は一般的に、抗原に特異的に結合する単一の免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬ）ポリペプチドを指す。治療に使用するには、患者に投与したときに免疫応答を誘発する可能性が低いというのが主な理由で、ラクダ科動物由来のＶＨＨよりもヒト単一ドメイン抗体が好ましい。
【００７０】
「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、可変単一ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）」という用語はすべて当技術分野で周知であり、標的抗原と結合する抗体の単一可変断片を表す。これらの用語は、本明細書では互換的に使用される。「単一重鎖ドメイン抗体、単一可変重鎖ドメイン、免疫グロブリン単一重鎖可変ドメイン（ＩＳＶ）、ヒトＶＨ単一ドメイン、ＶＨ単一ドメイン抗体」は、軽鎖または他の抗体断片がない場合の抗原との結合特異性を保持する抗体の単離された単一重鎖可変断片を表す。したがって、単一ドメイン抗体は、完全な抗体分子の他の部分を含まない。単一の可変重鎖ドメイン抗体は、軽鎖がなくても抗原に結合することができる。ヒト重鎖単一可変ドメイン抗体（ＶＨドメイン抗体）が好ましい。
【００７１】
一つの態様では、本発明者らは、ヒトＬＡＧ−３に結合する単離された単一可変重鎖ドメイン抗体を提供する。
【００７２】
以下に説明するように、特定の実施形態は、ＬＡＧ−３抗原に結合する単離された単一可変重鎖ドメイン抗体／免疫グロブリン単一可変重鎖ドメインに関する。したがって、単一可変重鎖ドメイン抗体は、軽鎖の非存在下でＬＡＧ−３に結合することができる。ヒト単一可変重鎖ドメイン抗体（「ＶＨ単一ドメイン抗体」）が特に好ましい。このような結合分子は、本明細書ではＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）とも呼ばれる。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）はＣｒｅｓｃｅｎｄｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌｔｄ．の登録商標である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含むかまたはそれからなる単離された結合剤／分子を提供し、前記ドメインはヒト可変重鎖ドメインであり；それらはＶＬドメインまたは他の抗体断片を欠いており、標的抗原に結合する。
【００７４】
「単離された」単一ドメイン抗体という用語は、異なる抗原特異性を有する他の単一ドメイン抗体、抗体または抗体断片を実質的に含まない単一ドメイン抗体を指す。さらに、単離された単一ドメイン抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。本発明のｓｄＡｂおよびそのようなｓｄＡｂを含む結合分子は、好ましくは、ヒトＶ、ＤおよびＪ領域を有する導入遺伝子を発現し、重鎖のみ抗体を産生する重鎖のみ抗体単離トランスジェニックマウスに由来する／それから単離される。これについては、実施例において詳しく説明する。
【００７５】
各単一ＶＨドメイン抗体は、３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置されている：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。したがって、一つの実施形態では、ドメインは、以下の式ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有するヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメインである。
【００７６】
Ｃ末端またはＮ末端のＶＨフレームワーク配列への改変は、それらの特性を改善するために、本発明の単一ドメイン抗体に行われてもよい。例えば、ＶＨドメインは、Ｃ末端またはＮ末端の伸長または欠失を含み得る。Ｃ末端伸長は、残基ＶＴＶＳＳで終結するＶＨドメインのＣ末端に付加され得る。
【００７７】
一つの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、１〜５０残基、例えば１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の追加のアミノ酸のＣ末端伸長を含む。一つの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、ヒトＣＨ１ドメインの追加のアミノ酸を含み、したがって、Ｃ末端がＣＨ１ドメインに伸長する。一つの実施形態では、前記伸長は、少なくとも１つのアラニン残基、例えば、単一のアラニン残基、二つのアラニン残基または三つのアラニン残基を含む。
【００７８】
別の実施形態では、Ｃ末端またはＮ末端の追加の残基は、本明細書に記載の単一ドメイン抗体と、ペプチドリンカー、または分子の検出を助けるタグ等の別の部分とをコンジュゲートさせるために使用されるリンカーから選択される。そのようなタグは、当技術分野で周知であり、例えば、リンカーＨｉｓタグ、例えば、ヘキサＨｉｓまたはｍｙｃタグが挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「相同性」または「同一性」という用語は、一般的に、配列を整列させた後、いくつかの実施形態では、必要に応じて、相同性の割合を最大にするためにギャップを導入し、配列同一性の一部として保存的置換を考慮することなく、比較した参照ポリペプチドの残基と同一である配列中のアミノ酸残基の割合を指す。したがって、２つのアミノ酸配列間の相同性の割合は、２つの配列間の同一性の割合に等しい。Ｎ末端またはＣ末端の拡張、タグ、または挿入は、同一性または相同性を低下させるものと解釈してはならない。Ｂｌａｓｔ等のアラインメントの方法およびコンピュータープログラムはよく知られている。２つのアミノ酸配列間の相同性または同一性の割合は、よく知られた数学的アルゴリズムを使用して決定できる。本明細書で相同性が使用される場合、それは同一性と置き換えることができる。
【００８０】
本明細書に記載される様々な態様のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される単一ドメイン抗体の可変ドメインは、ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ヒト化ＶＨＨドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、配列改変ＶＨまたはＶＨＨドメインである。好ましい実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体の可変ドメインは、ヒト可変ドメイン（ＶＨ）である。用語「ＶＨ」、例えば、本明細書で使用されるＶＨドメイン抗体は、単一ヒト可変重鎖ドメイン抗体を表す。
【００８１】
本明細書で使用する場合、ヒトＶＨドメインには、完全ヒトＶＨドメインまたは実質的に完全ヒトＶＨドメインが含まれる。本明細書で使用する場合、ヒトＶＨドメインという用語は、特に、例えばＷＯ２０１６／０６２９９０および実施例に記載されているように、所望の抗原による免疫に応答して、完全ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスによって作製された重鎖のみ抗体から単離されたＶＨドメインも含む。一つの実施形態では、ヒトＶＨドメインは、ヒトＶＨドメインのアミノ酸またはそのようなＶＨドメインをコードする核酸配列に由来するかまたはそれに基づくＶＨドメインも含み得る。したがって、この用語には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するかまたはそれによってコードされる可変重鎖領域が含まれる。実質的ヒトＶＨドメイン、またはヒトＶＨドメインに由来するかまたはそれに基づくＶＨドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入された、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。したがって、「ヒトＶＨドメイン」という用語は、例えば、配列障害を修正するために１つ以上のアミノ酸残基が改変されている実質的ヒトＶＨドメインも含む。例えば、実質的ヒトＶＨドメインは、完全なヒト配列と比較して、最大２０個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸改変を含み得る。
【００８２】
しかしながら、本明細書で使用される「ヒトＶＨドメイン」または「実質的ヒトＶＨドメイン」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。好ましくは、本明細書で使用される「ヒトＶＨドメイン」という用語は、ラクダ化ＶＨドメイン、すなわち、例えば、ＶＨドメインの所定の位置を選択して、該所定の位置に１つ以上の点突然変異を導入する従来の突然変異誘発法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで１つ以上の所定の残基をラクダ科のＶＨＨドメインに見られる特定の残基に改変されたヒトＶＨドメインを含むことを意図しない。
【００８３】
例示的な配列特性
一つの実施形態では、ヒトＬＡＧ−３に結合する単一ＶＨドメイン抗体は、以下の表１に示すＣＤＲ３配列、またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性または同一性を有する配列を含む。したがって、一つの態様では、本発明者らは、配列番号３または７から選択されるＣＤＲ３配列またはそれらの配列の一つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の配列相同性または同一性を有する配列を含み、ヒトＬＡＧ−３に結合することができる単離された単一ＶＨドメイン抗体を説明する。一つの実施形態では、前記配列相同性は、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。一つの実施形態では、前記配列相同性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【００８４】
一つの実施形態では、ヒトＬＡＧ−３に結合する単一のＶＨドメイン抗体は、配列番号１または５のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有する配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ１を含む。一つの実施形態では、ヒトＬＡＧ−３に結合する単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号２または６のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有する配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ２をさらに含む。
【００８５】
一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性を有する配列を含むＣＤＲ１、配列番号２またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性または同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、および配列番号３またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性を有する配列を含むＣＤＲ３を含む。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号５またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性を有する配列を含むＣＤＲ１、配列番号６またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性または同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性を有する配列を含むＣＤＲ３を含む。
【００８６】
一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号４または配列番号８、またはそれらと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性、例えば、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。
【００８７】
【表１】
2021513848.tif 000002
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、ヒトＬＡＧ−３に結合する上記の単一ＶＨドメイン抗体のいずれかの変異体であるＶＨ単一ドメイン抗体を提供する。
【００８９】
本発明において使用される変異体ＶＨ単一ドメイン抗体は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または他の改変を有し、本明細書に記載される機能的特性を保持する。例えば、ＬＡＧ−３に結合する変異ＶＨ単一ドメイン抗体に関して、機能的特性は、ＬＡＧ−３への結合または上記に列挙された他の特性の１つであり得る。
【００９０】
変異ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列を改変することができる。改変としては、天然配列ＶＨ単一ドメイン抗体またはポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化をもたらす単一ドメイン抗体またはポリペプチドをコードする１つ以上のコドンの１つ以上の置換、欠失または挿入が挙げられる。アミノ酸置換は、ロイシンのセリンへの置換、すなわち保存的アミノ酸置換等の、１つのアミノ酸を類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸に置換した結果であり得る。挿入、置換または欠失は、任意に１〜２０個、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または１〜１０個の範囲のアミノ酸であり得る。一つの実施形態において、変異体は、１、２、３、４または５個の置換を有する。許容される変異は、配列内のアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に行い、得られた変異体を、完全長または成熟した天然配列によって示される活性について試験することによって決定できる。
【００９１】
一つの実施形態では、改変は保存的配列改変である。本明細書で使用する場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響を与えたり変更したりしないアミノ酸の改変を指すものとする。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発等の当技術分野で公知の標準的な技術によって単一ドメインに導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）を有するアミノ酸、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、本明細書に記載される単一ドメイン抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、改変された抗体を、本明細書に記載される機能アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上記（ｃ）〜（ｌ）に記載された機能）について試験することができる。
【００９２】
したがって、これらのアミノ酸変化は、典型的には、生物活性、機能、または抗原に対する親和性または特異性等のポリペプチドの他の所望の特性を変化させることなく行うことができる。一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変化させない。さらに、構造または機能が類似しているアミノ酸の置換は、ポリペプチドの生物学的活性を阻害する可能性が低い。本明細書に記載されるポリペプチドおよびペプチドを含むアミノ酸残基の略語、およびこれらのアミノ酸残基の保存的置換を以下の表２に示す。
【００９３】
【表２】
2021513848.tif 000003
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、表１に示されるものから選択されたＬＡＧ−３に結合し、かつ１つ以上の配列改変を含み、かつ改変されていない単一ドメイン抗体と比較して、結合親和性、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低下、または溶解性等の特性の１つ以上が改善された単一ドメイン抗体の変異体であるＶＨ単一ドメイン抗体を提供する。
【００９５】
当業者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの発現ライブラリーを含む、本明細書に記載される抗原結合分子を同定、取得および最適化するための異なる方法があることを知っているであろう。これについては、実施例においてさらに説明する。ディスプレイ（例えば、リボソームおよび／またはファージディスプレイ）および／または突然変異誘発（例えば、エラーを起こしやすい（error-prone）突然変異誘発）等の当技術分野で既知の最適化技術を使用することができる。したがって、本発明者は、本明細書に記載される単一ドメイン抗体の配列最適化バリアントも提供する。
【００９６】
一つの実施形態では、単一ドメイン抗体の免疫原性を低下させるように改変を行うことができる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応するヒト生殖系列配列に戻すことである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。そのような残基は、単一ドメイン抗体のフレームワーク配列と、単一ドメイン抗体が由来する生殖系列配列とを比較することによって特定することができる。フレームワーク領域の配列の１つ以上のアミノ酸残基をそれらの生殖系列配置に戻すために、体細胞突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって生殖系列配列に「復帰突然変異」させることができる。
【００９７】
別のタイプのフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、または１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。
【００９８】
さらに別の実施形態では、分子のグリコシル化が改変される。グリコシル化を変更して、例えば、抗原に対する分子の親和性を高めることができる。そのような炭水化物改変は、例えば、分子配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換を行って、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去し、それによりその部位でのグリコシル化を除去することができる。このような非グリコシル化は、抗原に対する分子の親和性を高める可能性がある。
【００９９】
一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号１または１〜５個のアミノ酸置換を有する配列番号１に示されるＣＤＲ１、配列番号２または１〜５個のアミノ酸置換を有する配列番号２に示されるＣＤＲ２、および配列番号３または１〜５個のアミノ酸置換を有する配列番号３に示されるＣＤＲ３を有する。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号５または１〜５個のアミノ酸置換を有する配列番号１に示されるＣＤＲ１、配列番号５または１〜５個のアミノ酸置換を有する配列番号２に示されるＣＤＲ２、および配列番号７または１〜５個のアミノ酸置換を有する配列番号３に示されるＣＤＲ３を有する。
【０１００】
一つの実施形態では、バリアントＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号４または８のいずれか１つから選択されるが、１つ以上のアミノ酸置換、例えば１〜２０個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含む。一つの実施形態では、変異体は、１、２、３、４または５個の置換を有する。
【０１０１】
一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号４（ＶＨ１．１）を含むが、以下の位置の１つ以上においてアミノ酸置換を伴う：
Ｓ２３、Ｐ１１９、Ｎ５７、Ｓ５８、Ｎ５４、Ｄ３０、Ｙ３２、Ｓ５８、Ｇ５５、Ｇ５６、Ｎ５７、Ｇ５９、Ｙ９５、Ｓ１０６、Ｓ１０８および／またはＡ１０７。一つの実施形態では、これらの１６個の位置における２つ以上の置換が組み合わされ、例えば、変異体は、位置が上記で列挙されたものから選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の置換を含み得る。一つの実施形態では、変異体は、Ｓ２３における置換および上記のものからの１つ以上の置換を含む。
【０１０２】
一つの実施形態では、以下のアミノ酸置換の１つ以上は、Ｓ２３Ａ、Ｐ１１９Ｑ、Ｎ５７Ｓ、Ｓ５８Ｔ、Ｎ５４Ｉ、Ｄ３０Ｎ、Ｙ３２Ｆ、Ｓ５８Ｔ、Ｇ５５Ｓ、Ｇ５６Ｄ、Ｎ５７Ｉ、Ｎ５７Ｓ、Ｓ５８Ｔ、Ｇ５９Ａ、Ｙ９５Ｈ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０８Ａおよび／またはＡ１０７Ｔから選択される。一つの実施形態では、変異体は、Ｓ２３Ａにおける置換および上記のものからの１つ以上の置換を含む。
【０１０３】
一つの実施形態では、置換はＳ２３Ａ（変異体１）である。一つの実施形態では、置換は、Ｓ２３Ａ、Ｐ１１９Ｑ、Ｎ５７ＳおよびＳ５８Ｔ（変異体２、ＶＨ１．２）である。一つの実施形態では、置換は、Ｓ２３Ａ、Ｎ５７ＳおよびＳ５８Ｔ（変異体３）である。一つの実施形態では、置換は、Ｓ２３ＡおよびＮ５４Ｉ（変異体４）である。一つの実施形態では、置換は、Ｓ２３Ａ、Ｄ３０Ｎ、Ｙ３２ＦおよびＳ５８Ｔ（変異体５）である。一つの実施形態では、置換は、Ｓ２３Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｇ５５Ｓ、Ｇ５６Ｄ、Ｎ５７Ｉ、Ｓ５８ＴおよびＧ５９Ａである（変異体６）。一つの実施形態では、置換は、Ｓ２３Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｓ５８Ｔ、Ｓ１０６ＶおよびＳ１０８Ａである（変異体７）。一つの実施形態では、置換は、Ｓ２３Ａ、Ｄ３０ＮおよびＡ１０７Ｔである（変異体８）。一つの実施形態では、置換は、Ｓ２３Ａ、Ｙ９５Ｈ、Ｇ５６Ｄ、Ｎ５７ＳおよびＳ５８Ｔである（変異体９）。
【０１０４】
上記の変異体はすべて、ＬＡＧ−３への結合について試験され、ナノモル範囲のＫＤを示した。
【０１０５】
【表３】
2021513848.tif 000004
【０１０６】
上記のナンバリングは、本明細書に示されるタンパク質内の残基の位置に基づいている。
【０１０７】
本明細書に記載されるＶＨ単一ドメイン抗体は、優れた安定性を示す。それらは高濃度で熱ストレスに耐性があることが示されている。さらに、本明細書に記載されるＶＨ単一ドメイン抗体はまた、ヒトＬＡＧ−３に対する特異性、ヒトＴ細胞への結合、ＬＡＧ−３リガンド結合の遮断およびＴ細胞活性の刺激を示す（実施例を参照されたい）。
【０１０８】
本明細書に記載されるＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体は、好ましくは、本明細書にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ値を有する。例えば、生物層干渉法（生体分子相互作用分析、Ｏｃｔｅｔ（登録商標））により測定すると、ＫＤは少なくとも約１０−８Ｍであり得る。
【０１０９】
「ＫＤ」という用語は、「平衡解離定数」を指し、平衡での滴定測定で得られる値、または解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を会合速度定数（Ｋｏｎ）で割ることによって得られる値を指す。「ＫＡ」は親和定数を指す。会合速度定数、解離速度定数、および平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。会合および解離速度定数を決定する方法は、当技術分野でよく知られている。蛍光ベースの技術を使用することにより、高感度で、平衡状態にある生理的緩衝液中のサンプルを試験することができる。ＨＴＲＦ、フローサイトメトリー、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術等の他の実験的アプローチおよび機器を使用することができる。いくつかの実施形態では、結合分子は、例えば、本質的に実施例８に記載されるように、融合ポリペプチドが生物層干渉法（Ｏｃｔｅｔ（登録商標））を使用して測定される場合、最大で約６．１５μＭまたはそれ未満、例えば、約５０ｎＭ、約１０ｎＭまたは約５ｎＭまたはそれ未満のＫＤ値でＬＡＧ−３に結合し得る。
【０１１０】
結合分子は、例えば、実施例８に記載されるように、融合ポリペプチドがＨＴＲＦ結合アッセイで測定される場合、最大で１００ｎＭまたはそれ未満、例えば、約１０ｎＭ、約５ｎＭまたは約２ｎＭまたはそれ未満のＥＣ５０値でＬＡＧ−３に結合し得る。
【０１１１】
一つの実施形態では、ＬＡＧ−３に結合する上記のＶＨ単一ドメイン抗体は、本明細書にさらに記載されるようにヒトＶＨ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスから得られるか、またはトランスジェニックマウスから得られるＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体の配列最適化変異体である。
【０１１２】
本開示はさらに、本明細書に記載されるＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。一つの態様では、本発明者らは、表１に示され、上記でさらに定義されるＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、２つまたは３つのＣＤＲのセット、またはＶＨ単一ドメイン抗体をコードする核酸を提供する。
【０１１３】
核酸配列
一つの態様では、本発明者らは、表４に示される配列番号１０または１１から選択される配列を含むかまたはそれからなる単離された核酸配列を提供する。表４の核酸配列は、表１に示されるＶＨ単一ドメイン抗体をコードする。
【０１１４】
一つの実施形態では、核酸配列は、表２から選択される配列の１つに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列相同性または同一性を有する。一つの実施形態では、前記配列相同性は、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。一つの実施形態では、核酸配列、核酸配列は、配列番号１０または１１と比較して１〜２０個の置換を有する。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、全体的または部分的に合成または組換えによって生成されてもよい。本明細書に記載されるヌクレオチド配列への言及は、文脈が他に必要としない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＵがＴに置換された特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。上記に示される核酸の変異体、例えば、最大２０個のコドン変化を有する変異体、特に本明細書において提供されるＶＨ変異体をコードするもの（表３を参照されたい）も本発明の範囲内である。
【０１１７】
さらに、本発明者らは、上記で定義された少なくとも１つの核酸を含む単離された核酸コンストラクトを提供する。コンストラクトは、プラスミド、ベクター、転写物または発現カセットの形態であり得る。
【０１１８】
本発明はまた、上記の核酸コンストラクトの１つ以上を含む単離された組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌、ウイルス、植物、真菌、哺乳動物または他の適切な宿主細胞であり得る。一つの実施形態では、細胞は大腸菌細胞である。別の実施形態では、細胞は酵母細胞である。別の実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、または当業者に明らかであろう他の細胞である。一つの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であるが、ヒト宿主細胞ではない。
【０１１９】
一つの実施形態では、本明細書に記載される抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体を作製する方法が提供され、この方法は、単一ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養すること、および単一ドメイン抗体を単離することを含む。
【０１２０】
ヒトＬＡＧ−３への結合について分子と競合する薬剤
別の態様では、本発明者らは、結合分子、例えば、本発明のＬＡＧ−３単一ドメイン抗体のいずれかと同様にヒトＬＡＧ−３上のエピトープに結合する抗体、抗体断片または抗体模倣物（antibody mimetic）を提供する（すなわち、ヒトＬＡＧ−３への結合について単一ドメイン抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体。したがって、単一ドメイン抗体は参照抗体として使用できる）。いくつかの実施形態では、交差競合研究のための参照抗体は、本明細書に示される単一ドメイン抗体ＶＨ１．１である（表１を参照されたい）。
【０１２１】
そのような交差競合抗体は、標準的な結合アッセイにおけるヒトＬＡＧ−３への結合について、単一ドメイン抗体１．１または１．２と交差競合するそれらの能力に基づいて同定することができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーを使用して、本発明の単一ドメイン抗体との交差競合を実証することができる。
【０１２２】
一つの実施形態では、本発明者らは、ヒトＬＡＧ−３を結合することができる結合剤を提供し、ここで、上記の単一ドメイン抗体は、競合アッセイにおいて結合剤を置換する。いくつかの実施形態では、結合剤は、抗体、その機能的断片、例えば、単一ドメイン抗体、または抗体模倣タンパク質である。別の態様では、本発明者らは、ヒトＬＡＧ−３に結合することができる結合剤を提供し、結合剤は、競合アッセイにおいて上記の単一ドメイン抗体を置換する。別の態様では、本発明者らは、ヒトＬＡＧ−３に結合することができる結合剤を提供し、結合剤は、本明細書に記載される単一ドメイン抗体のように、重複エピトープを含む、本質的に同じエピトープに結合する。
【０１２３】
別の態様では、本発明者らは、多価分子、例えば二価分子、または上記の１つまたは２つのＶＨ単一ドメイン抗体を含む多重特異的分子において使用するための上記ＶＨ単一ドメイン抗体を提供する。
【０１２４】
重鎖のみ抗体
別の態様では、本発明者らは、本明細書に記載され、表１に列挙されているＶＨドメインを含む単離された重鎖のみ抗体、またはそれらと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の相同性または同一性を有する単離された重鎖のみ抗体を提供する。
【０１２５】
多価結合剤
本明細書に記載されるＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体は、以下でさらに説明するように、別の治療薬と組み合わせて投与することができる。
【０１２６】
さらに、本明細書に記載されるＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体は、多価結合剤／分子の一部を形成することができる。そのような薬剤は、ＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体および１つ以上の標的抗原に結合する１つ以上のサブユニット／部分を含む。本明細書に記載される多価結合剤において、少なくとも２つの結合実体が共有結合または非共有結合で連結されている。例えば、以下に記載の実施形態では、多重特異性結合剤は好ましくは融合タンパク質であり、したがって、本開示は、本明細書に記載されるＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体を含む融合タンパク質を提供する。好ましくは、融合ポリペプチドは、２つ以上のサブユニット間の翻訳融合である。翻訳融合を生成する技術はよく知られており、リーディングフレーム内の１つのサブユニットのコード配列を、さらなるサブユニットのコード配列で遺伝子操作することを含む。２つのサブユニットは、例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって連結される。例示的なペプチドリンカーは、以下により詳細に記載されている。好ましい実施形態では、結合剤は、２つまたは３つまたはそれ以上の単一ドメイン抗体、例えば、単一ドメイン抗体が別の単一ドメイン抗体と連結されている融合タンパク質を含むかまたはそれらからなる。当業者にとって明らかであるように、そのようなタンパク質は完全な抗体分子の他の部分を含まず、標的への結合は単一ドメイン抗体によって媒介される。
【０１２７】
したがって、別の態様では、本発明は、多価および／または多機能融合タンパク質の構築における使用のためのＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体（例えば、表１に示される単一ドメイン抗体またはその変異体を参照されたい）を提供する。したがって、別の態様は、多機能融合タンパク質における、本明細書に記載されるＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体（例えば、表１に示される配列またはその変異体を有する）の使用に関する。別の態様は、宿主細胞において第２の治療標的に結合するタンパク質をコードする第２の核酸に連結された、ＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体をコードする核酸（例えば、表４に示されるような）を含む核酸コンストラクトを発現すること、および、前記宿主細胞から前記多機能タンパク質を単離することを含む、多価結合剤を作製する方法にも関する。したがって、さらなる態様は、本明細書に記載される、例えば表１に示される、ＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体を含む多価結合剤にも関する。
【０１２８】
本明細書に記載されるＬＡＧ−３結合構成要素により構成される分子は、例えばリンカー設計を通じて、最適な標的結合のために設計することができる。これにより、機能が向上したり、投薬量が低下したりする可能性がある。本明細書に記載される機能的利点に加えて、分子の組み合わせに対する上記の多機能性分子の利点としては、限定されないが、製造、前臨床試験および臨床投与を介したより単純な経路が挙げられる。
【０１２９】
多価結合剤は、同じまたは異なる標的上の同じまたは異なるエピトープに対する結合特異性を有する少なくとも２つの部分を含む結合剤である。「多重特異性」結合剤は、１つ以上の抗原上の複数のエピトープを認識する結合剤である、二重特異性結合剤は、同じまたは異なる抗原上の２つの異なるエピトープを認識する結合剤である。
【０１３０】
したがって、一つの態様は、ＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体、例えば本明細書に記載されるアミノ酸を有するもの、および１つ以上のさらなる部分、例えば第２のｓｄＡｂを含む多価結合剤に関する。例えば、結合剤は、以下にさらに記載されるように、二重特異性結合剤であり得る。一つの実施形態では、第２の部分は、治療的に関心のある抗原に結合する。一つの実施形態では、第２の部分は、抗原に結合する結合分子、例えば、抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体、例えばＶＨドメイン）または抗体模倣タンパク質から選択される結合分子である。別の実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または両方、および任意にヒンジ領域を含む、抗体Ｆｃ領域またはその断片に連結することができる。一つの好ましい実施形態では、第２の部分は単一のＶＨドメイン抗体である。
【０１３１】
結合剤は、多価、例えば二価、または多重パラトピック（multiparatopic）、例えば二重パラトピックであってよい。したがって、一つの実施形態では、結合分子は、ＬＡＧ−３に結合する第１のＶＨ単一ドメイン抗体ＶＨ（Ａ）およびＬＡＧ−３または別の標的抗原に結合する第２のＶＨ単一ドメイン抗体ＶＨ（Ｂ）を含むかまたはそれらからなり、したがって、下記の式を有する：ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）、ここでＬはリンカー、例えばペプチドリンカーである。
【０１３２】
各ＶＨはＣＤＲおよびＦＲ領域を有する。したがって、一つの実施形態では、第１のＶＨ単一ドメイン抗体ＶＨ（Ａ）および第２のＶＨ単一ドメイン抗体ＶＨ（Ｂ）を有する結合分子は、下記の式を有する：ＦＲ１（Ａ）−ＣＤＲ１（Ａ）−ＦＲ２（Ａ）−ＣＤＲ２（Ａ）−ＦＲ３（Ａ）−ＣＤＲ３（Ａ）−ＦＲ４（Ａ）−Ｌ−ＦＲ１（Ｂ）−ＣＤＲ１（Ｂ）−ＦＲ２（Ｂ）−ＣＤＲ２（Ｂ）−ＦＲ３（Ｂ）−ＣＤＲ３（Ｂ）−ＦＲ４（Ｂ）。免疫グロブリン単一可変ドメインＡおよびＢの順序は特に限定されないため、本明細書に記載されるポリペプチド内で、免疫グロブリン単一可変ドメインＡはＮ末端に配置され、免疫グロブリン単一可変ドメインＢはＣ末端に配置され得、またはその逆であってもよい。ＶＨドメイン抗体は、通常、第１のＶＨのＣ末端と第２のＶＨのＮ末端とを接続するリンカーを介して接続される。
【０１３３】
一つの実施形態では、結合分子は二重パラトピックである。一つの実施形態では、結合分子は二価である。一つの実施形態では、結合分子は多重特異性、例えば二重特異性、三重特異性または四重特異性である。
【０１３４】
二価結合分子
本発明者らは、驚くべきことに、両方が単一分子でＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体を組み合わせることが有益であり、ＬＡＧ−３に結合する一価のＶＨ単一ドメイン抗体と比較して効果が増大することを見出した。実施例に示されるように、２つのＶＨ単一ドメイン抗体を組み合わせる２価分子は、増大したＫＤでＬＡＧ−３と結合し、一価のＬＡＧ−３結合ＶＨ単一ドメイン抗体と比較してＥＣ５０およびＩＣ５０値が増大している。例えば、一価のＬＡＧ−３ＶＨは細胞に弱く結合するのに対し、二価の分子の形態とするとこれが増強される（図２、実施例８を参照されたい）。
【０１３５】
したがって、一つの態様では、本発明は、ヒトＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体、例えば同じ配列または異なる配列の２つの分子を含むかまたはそれらからなる分子、融合タンパク質、コンストラクトまたは結合分子を提供する。各ＶＨ単一ドメイン抗体は、ＬＡＧ−３上の同じエピトープまたはＬＡＧ−３上の異なるエピトープ（二重パラトピック）に結合し得る。ＬＡＧ−３結合について二価であるそのような分子は、ＶＨ−Ｌ−ＶＨの形態を有し、Ｌはペプチドリンカーであり、任意にＶＨ−Ｌ−ＶＨ−Ｌ−Ｘであり、Ｘは別の結合部分、例えば別のＶＨ単一ドメイン抗体である。したがって、そのような分子は単一ドメイン抗体のみを含み、抗体の他の部分は存在しない。必要に応じて、上記分子は、半減期延長部分等のさらなるＣ末端部分、および／または最大２５アミノ酸のタグまたはアミノ酸配列等の追加のアミノ酸配列を含み得る。本明細書でさらに説明されるように、Ｌはタンパク質リンカーである。別の態様において、表１に示されるものから選択されるヒトＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体またはそれらの変異体を含むかまたはそれらからなる二価コンストラクト、タンパク質または結合分子が提供される。一つの実施形態では、ヒトＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体は、同じ配列を有する。別の実施形態では、上記結合分子は、ヒトＬＡＧ−３に結合し、異なる配列を有する２つのＶＨ単一ドメイン抗体を含んでもよく、それぞれは、表１に示されるかまたは本明細書に記載される配列またはそれらの変異体から選択される。上記分子またはコンストラクトは融合タンパク質である。
【０１３６】
したがって、様々な実施形態では、結合分子は、第１のＶＨ単一ドメイン抗体ＶＨ（Ａ）および第２のＶＨ単一ドメイン抗体ＶＨ（Ａ）またはＶＨ（Ａ’）を有し、したがって、下記の式を有する：ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ａ）またはＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ａ’）、ここで、Ｌはリンカー、例えばペプチドリンカーである。ＶＨ（Ａ）およびＶＨ（Ａ’）は、いずれもヒトＬＡＧ−３に結合する。
【０１３７】
一つの実施形態では、結合分子は、ＶＨ１．１と連結したＶＨ１．１を含む。一つの実施形態では、結合分子は、ＶＨ１．２と連結したＶＨ１．２を含み、すなわち、上記分子は、ＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ１．２と記載することができる。一つの実施形態では、結合分子は、ＶＨ１．２と連結したＶＨ１．１を含む。
【０１３８】
本明細書に記載される二価結合分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、および実施例に記載されるように構築することができる。
【０１３９】
一つの実施形態では、そのような二価融合タンパク質は、以下の１つを含む：配列番号４−（Ｇ４Ｓ）ｎ−配列番号４、配列番号８−（Ｇ４Ｓ）ｎ−配列番号８、配列番号４−（Ｇ４Ｓ）ｎ−配列番号８、配列番号８−（Ｇ４Ｓ）ｎ−配列番号４。
【０１４０】
別の態様は、そのような融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【０１４１】
一つの実施形態では、上記のＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体を含む二価結合剤は、以下の特性の１つ以上またはすべてを有する：高い純度および安定性、ヒトＬＡＧ−３との結合、Ｔ細胞との結合、およびＴ細胞の刺激。
【０１４２】
二価結合剤は、実施例８に示すように、ＬＡＧ−３−Ｆｃタンパク質に強力に結合することができる。
【０１４３】
二価結合剤は、例えば、実施例８に記載されるように、ＬＡＧ−３結合がアッセイで測定される場合、ＬＡＧ−３タンパク質またはＴ細胞に、最大５０ｎＭまたはそれ以下、例えば、約１０ｎＭ、約１ｎＭまたは約０．１ｎＭまたはそれ以下のＥＣ５０値で結合し得る。
【０１４４】
二価結合剤は、Ｔ細胞機能を増強することができる。ヒト細胞がスーパー抗原（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）および抗ＰＤ−１抗体で刺激されると、二価結合剤はＩＬ−２等の炎症性サイトカインの分泌を増加させ、活性化を示す（実施例１０ａ）。ＮＦＡＴシグナル伝達経路を介してＴ細胞シグナル伝達を測定するレポーター細胞は、ＬＡＧ−３が２価分子で遮断されると刺激され、少なくとも３ｎＭのＩＣ５０値を生成する（実施例９ｂ）。
【０１４５】
例えば、二価結合剤は、サイズ排除クロマトグラフィーで測定すると、４０℃で加熱した後でも９５％以上の純度を保持する。
【０１４６】
多重特異性結合剤
特定の態様では、ＬＡＧ−３に結合し、ＬＡＧ−３とそのリガンドの１つ以上との機能的相互作用を遮断し、本明細書に記載される１つ以上のＶＨ  ｓｄＡｂを含み、別の標的にも結合する多重特異性結合剤が提供される。多重特異性結合剤は、少なくとも２つの異なる標的に結合する、すなわち、少なくとも二重特異性である。
【０１４７】
二重特異性抗体形態は、当技術分野で一般に知られている。通常、Fan et al. (Journal of Hematology & Oncology (2015) 8:130)において説明されているように、二重特異性抗体は２つのカテゴリーに分けられる：免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）様分子および非ＩｇＧ様分子。ＩｇＧ様ｂｓＡｂｓは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）等のＦｃ介在エフェクター機能を保持している。以下に説明するように、好ましい実施形態では、本発明の二重特異性分子はＦｃドメインを有さない。
【０１４８】
本明細書において提供される多重特異性結合剤は、本明細書に記載されるＬＡＧ−３に対する結合特異性を有し、かつ、例えば表１から選択される少なくとも１つのＶＨ単一ドメイン抗体、およびＬＡＧ−３ではない第２の抗原との第２の結合特異性を有する少なくとも１つの第２の結合分子を含む。結合実体は、ペプチドリンカー等のリンカーによって結合される。前記第２の結合分子は、抗体、抗体断片または抗体模倣物から選択され得る。一つの実施形態では、前記抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖまたはドメイン抗体から選択される。一つの好ましい実施形態では、抗体断片は、ＶＨ単一ドメイン抗体である。したがって、好ましい実施形態は、ＬＡＧ−３に対する結合特異性を有する１つのＶＨ単一ドメイン抗体が第２のＶＨ単一ドメイン抗体に連結されている結合分子に関する。
【０１４９】
したがって、一つの態様では、本発明者らは、下記の式を有する結合分子を提供する：ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）、ここで、ＶＨ（Ａ）は、ＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体であり、ＶＨ（Ｂ）は、第２の標的に結合するＶＨ単一ドメイン抗体であり、Ｌはリンカー、例えばペプチドリンカーである。
【０１５０】
一つの実施形態では、結合剤は二重特異性であり、本明細書に記載されるＬＡＧ−３に対する結合特異性を有し、かつ、例えば表１に示されるＶＨ単一ドメイン抗体から選択される単一ドメイン抗体、および第２の結合特異性を有する第２の結合分子を含む。
【０１５１】
別の態様では、本発明者らは、特に上記の二価分子の項に記載されているように、第２の標的に結合するさらなる部分と結合した、本明細書に記載されるＬＡＧ−３に結合する２つ以上のＶＨ単一ドメイン抗体を含む上記の二重特異性結合剤を提供する。第３の部分は、ＶＨ単一ドメイン抗体から選択することができる。これは下記の式を有する：ＶＨ（Ａ’）−Ｌ１−ＶＨ（Ａ’）−Ｌ２−ＶＨ（Ｂ）、ここで、Ｌ１およびＬ２はリンカー、例えばペプチドリンカーである。Ｌ１およびＬ２は同じリンカーであっても異なるリンカーであってもよい。
【０１５２】
一つの実施形態では、第２の結合分子は、免疫調節剤、チェックポイントモジュレーター、Ｔ細胞活性化に関与する薬剤、腫瘍微小環境修飾因子（ＴＭＥ）または腫瘍特異的標的に結合する。
【０１５３】
例えば、免疫調節剤は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＣＥＡＣＡＭ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲβの１つ以上の阻害剤から選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤であり得る。別の実施形態では、免疫調節剤は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４またはＣＤ８３リガンド、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＩＣＡＭ−１の１つ以上のアゴニストから選択される共刺激分子の活性化因子であり得る。
【０１５４】
例えば、本発明者らは、ＰＤ−１シグナル伝達を遮断するＶＨ単一ドメイン抗体に連結されたＬＡＧ−３に結合する２つのＶＨ単一ドメイン抗体を含む多重特異性結合剤を提供する。そのような形態は、一価の実体と比較して効力が増強される。
【０１５５】
ＰＤ−１およびＬＡＧ−３の両方の遮断は、特にＰＤ−１およびＬＡＧ−３の両方がＴ細胞の活性化を調節することを考えると、癌治療のための有望な組み合わせ戦略である。したがって、一つの態様では、本発明者らは、下記の式を有する結合分子を提供する：ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）または好ましくはＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）、ここで、ＶＨ（Ａ）はＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体であり、ＶＨ（Ｂ）はＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体であり、Ｌはリンカー、例えばペプチドリンカーである。
【０１５６】
免疫チェックポイントＰＤ−１およびＬＡＧ−３を同時に標的とすることにより、本開示の結合剤は、強力な抗腫瘍および／または抗感染応答を生じ、抗腫瘍リンパ球細胞活性を増大させ、抗腫瘍免疫を増強し、それにより少なくとも相加的または相乗的な抗腫瘍結果をもたらす。
【０１５７】
実際、本発明者らは、ＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体と、ＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体とを二重または多重特異性融合タンパク質において組み合わせることによって、一価の実体と比較して機能が増強されることを示している。さらに、他で説明されているように、併用療法から生じる普遍的な遮断とは対照的に、本発明の二重特異性分子は、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１の両方を発現する細胞に結合する。本発明の二重特異性分子は、そのような二重陽性細胞に選択的に結合および活性化し、かつ、ＰＤ−１陽性細胞、すなわち、それらの表面上にＰＤ−１のみを提示する細胞の遮断を減少させる。したがって、本発明者らは、ＬＡＧ−３と結合するＶＨ単一ドメイン抗体、およびＰＤ−１と結合するＶＨ単一ドメイン抗体を含む二重または多重特異性分子を提供する。したがって、好ましい態様では、本発明は、ＬＡＧ−３に結合する少なくとも１つのＶＨ単一ドメイン抗体、およびＰＤ−１に結合する少なくとも１つのＶＨ単一ドメイン抗体を含み、同じ細胞上のＬＡＧ−３およびＰＤ−１と結合し、Ｆｃ領域等の他の抗体断片を含まない結合剤を提供する。
【０１５８】
これらの分子は、野生型ヒトＰＤ−１（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ１５１１６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６４８６３）に特異的に結合する。野生型ヒトＰＤ−１のアミノ酸配列を以下に示す（配列番号１２）。
【０１５９】
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
【０１６０】
特に明記しない限り、本明細書で使用されるＰＤ−１という用語は、ヒトＰＤ−１を指す。「Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １」、「Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  １」、「タンパク質ＰＤ−１」、「ＰＤ−１」、「ＰＤ−１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ−１」および「ｈＰＤ−１」という用語が互換的に使用され、ヒトＰＤ−１の変異体、アイソフォーム、種ホモログが含まれる。
【０１６１】
「ＰＤ−１結合分子／タンパク質／ポリペプチド／薬剤」、「ＰＤ−１抗原結合分子タンパク質／ポリペプチド／薬剤」、「抗ＰＤ−１単一ドメイン抗体」、「抗ＰＤ−１単一免疫グロブリン可変ドメイン」、「抗ＰＤ−１重鎖のみ抗体」または「抗ＰＤ−１抗体」という用語はすべて、ヒトＰＤ−１抗原に特異的に結合することができる分子を指す。結合反応は、例えば、無関係な特異性の抗体を使用するネガティブ対照試験を参照して、標準的な方法によって示され得る。「ＰＤ−１結合分子／薬剤」という用語は、ＰＤ−１結合タンパク質を含む。
【０１６２】
二重または多重特異性融合タンパク質において使用されるＰＤ−１結合ＶＨ単一ドメイン抗体は、下記の特性の１つ以上を有する：：高い親和性でのヒトＰＤ−１との結合、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２との相互作用の調節、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２との機能的相互作用の遮断、および／またはＴ細胞活性化の刺激または増強。
【０１６３】
したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるヒトＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単一ドメイン抗体を含み、本明細書に記載されるようにＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用および／またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用を遮断し、かつ／またはＴ細胞活性化を刺激または増強する結合分子を提供する。
【０１６４】
二重または多重特異性融合タンパク質において使用されるＰＤ−１結合ＶＨ単一ドメイン抗体は、以下の特性の１つ以上またはすべてを有する：
（ａ）ヒトＰＤ−１に結合する；
（ｂ）ＭＬＲアッセイでＩＬ−２分泌を増大させる；
（ｃ）ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する；
（ｄ）マウスＰＤ−１に結合しない；
（ｅ）ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１との結合を阻害；および／または
（ｆ）ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【０１６５】
ＰＤ−１結合ＶＨ単一ドメイン抗体は、高い親和性でヒトＰＤ−１と特異的に結合し得、ＫＤは、表面プラズモン共鳴（生体分子相互作用分析、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析によって測定される１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ等の少なくとも約１０−８Ｍ〜１０−１２Ｍである。ＰＤ−１結合ＶＨ単一ドメイン抗体は、機能アッセイで決定される１０−８Ｍ〜１０−９Ｍの範囲のＰＤ−１阻害のＩＣ５０値を有し得る。実施例に示されるように、ＰＤ−１陽性細胞に対する二重特異性コンストラクトの効力は、モノクローナル抗体よりも３０倍以上低い。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２との結合を遮断し、かつ／またはＴ細胞活性化を刺激または増強し、表５から選択される。これらのＶＨは、上記の特性ａ）〜ｆ）の１つ以上またはすべてを有することが示されている。
【０１６７】
ＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体は、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１８１２７７１０に開示されているものから選択することができる。
【０１６８】
【表５】
2021513848.tif 000006
2021513848.tif 000007
2021513848.tif 000008
2021513848.tif 000009
2021513848.tif 000010
2021513848.tif 000011
2021513848.tif 000012
【０１６９】
これらは、配列番号１２８〜２４２を有する核酸によってコードされる。
【０１７０】
一つの実施形態では、ＰＤ−１に結合するＶＨは、上記に示されるＶＨ２．６３、２．７７または２．９２（配列番号１０４）、またはそれらと少なくとも７５％、例えば８０％、８５％、９０％または９５％の相同性または同一性を有する配列から選択される。一つの実施形態では、ＶＨはＶＨ２．６３である。一つの実施形態では、ＶＨはＶＨ２．７７である。一つの実施形態では、ＶＨはＶＨ２．９２である。
【０１７１】
一つの態様では、本発明者らは、ＬＡＧ−３に結合する第１のＶＨ単一ドメイン抗体およびＰＤ−１に結合する第２のＶＨ単一ドメイン抗体を有する二重または多重特異的分子、すなわち第１の単一ドメイン抗体が下記の特性の１つ以上を有する式ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）の第２の単一ドメイン抗体と連結されている分子を提供する：
ａ）同じ細胞のＬＡＧ−３およびＰＤ−１に結合する；
ｂ）同じ細胞で発現したＰＤ−１およびＬＡＧ−３を、表１０に示すように、より大きな二重特異性抗体よりも大きな効力で物理的近接状態にする；
ｃ）ＬＡＧ−３またはＰＤ−１ＶＨ単独よりも大きな蛍光強度のメジアンで、刺激されたＴ細胞に結合する；
ｄ）個々のユニットの組み合わせよりも高く、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体の組み合わせよりも高いレベルで、スーパー抗原で刺激されたヒトＰＢＭＣのＩＬ−２を刺激する；
ｅ）臨床ＰＤ−１モノクローナル抗体よりも大きくマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害する；
ｆ）ＰＤ−１ＶＨ単独およびＬＡＧ−３遮断単独よりも大きく抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する；
ｇ）ＰＤ−１モノクローナル抗体よりも大きく患者のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を誘導する；
ｈ）組み合わせに応答しない細胞における抑制性シグナル伝達を著しく減少させる；
ｉ）ＰＤ−１が存在する場合に実質的により高い親和性でＬＡＧ−３に結合する；
ｊ）ＬＡＧ−３が存在する場合に実質的により高い親和性でＰＤ−１に結合する：
ｋ）ＰＤ−１抗体よりもＰＤ１＋単一陽性細胞におけるＰＤ−１遮断能は低いが、ＬＡＧ−３＋ＰＤ−１＋細胞のターゲティングが強化される；および／または
ｌ）ｅｘ  ｖｉｖｏ系でＴ細胞を回復することができる（例８を参照されたい）。
【０１７２】
別の態様では、本発明者らは、ＬＡＧ−３に結合する１つ以上のＶＨ単一ドメイン抗体を含み、前記ＶＨ単一ドメイン抗体が本明細書に記載されているようにＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体に連結されている二重または多重特異性結合剤を提供する。一つの実施形態では、ＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体は、表５に列挙されるＶＨ単一ドメイン抗体の１つから選択される。一つの実施形態では、二重または多重特異性結合剤は、上記で列挙されたａ）〜ｆ）の特性の１つ以上を有する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合ＶＨ単一ドメイン抗体は、ヒトＰＤ−１に結合する上記の単一ＶＨドメイン抗体のいずれかの変異体である。変異体という用語は、本明細書の他の場所で定義されている。例えば、変異体はＶＨ２．１の変異体であり、１〜２０個、例えば１〜１０個または１〜５個のアミノ酸置換を有する。別の実施形態では、変異体は、ＶＨの変異体であり、それと少なくとも７５％、例えば、８０％、８５％、９０％または９５％の配列相同性または同一性を有する。
【０１７４】
一つの実施形態では、二重特異性分子は、本明細書に記載されるようにＬＡＧ−３に結合する１つの単一ドメイン抗体を含む。別の実施形態では、二重特異性分子は、本明細書に記載されるように、ＬＡＧ−３に結合する２つの単一ドメイン抗体を含む。
【０１７５】
別の態様では、本発明者らは、ＬＡＧ−３に結合する２つの単一ドメイン抗体およびＰＤ−１に結合する１つの単一ドメイン抗体を含む、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３に結合する二重特異性結合剤も提供する。一つの実施形態では、ＬＡＧ−３に結合する２つの単一ドメイン抗体は、上記の通りである。一つの実施形態では、ＰＤ−１に結合する単一ドメイン抗体は、上記の通りである。本発明者らは、驚くべきことに、ＬＡＧ−３に結合する２つの単一ドメイン抗体を含むそのような結合剤において、ＬＡＧ−３に結合する１つの単一ドメイン抗体を含む結合剤と比較して効力が増強されていることを実証した。これは、ＩＬ−２放出の刺激の増強を示す図３ｃにおいて見出すことができる。二重または多重特異性分子においてＰＤ−１に結合する単一ドメイン抗体に連結されている、ＬＡＧ−３に結合する２つの単一ドメイン抗体を有することにより、ＬＡＧ−３に結合する１つの単一ドメイン抗体を有する結合剤と比較して、少なくとも相加効果が得られる。したがって、一つの実施形態では、分子は下記の式を有し：ＶＨ（Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（Ａ）−Ｌ２−ＶＨ（Ｂ）、必要に応じてさらなるＣ末端部分および／または配列を含む。したがって、ＬＡＧ−３に結合する同じ配列の２つの単一ドメイン抗体およびＰＤ−１に結合する１つの単一ドメイン抗体がある。例示的な分子は以下の通りである：ＶＨ１．１−Ｌ−ＶＨ１．１−Ｌ−ＶＨ２．６３；ＶＨ１．１−Ｌ−ＶＨ１．１−Ｌ−ＶＨ２．６３；ＶＨ２．７７−Ｌ−ＶＨ１．１−Ｌ−ＶＨ１．１；およびＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ２．９２。一つの実施形態では、分子はＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ２．９２である。Ｌは、本明細書でさらに定義されるリンカーである。
【０１７６】
一つの実施形態では、分子は、ＶＨ１．１−６ＧＳ−ＶＨ１．１−６ＧＳ−ＶＨ２．６３；ＶＨ１．１−６ＧＳ−ＶＨ１．１−９ＧＳ−ＶＨ２．６３；ＶＨ２．７７−９ＧＳ−ＶＨ１．１−６ＧＳ−ＶＨ１．１；およびＶＨ１．２−６ＧＳ−ＶＨ１．２−６ＧＳ−ＶＨ２．９２から選択される。一つの実施形態では、分子は、ＶＨ１．２−６ＧＳ−ＶＨ１．２−６ＧＳ−ＶＨ２．９２（配列番号２５９）である。
【０１７７】
別の実施形態では、上記のようにＬＡＧ−３およびＰＤ−１に同時に結合する二重特異性結合剤、すなわち融合タンパク質は、さらなる結合分子を含む。したがって、結合剤は、三重特異性または四重特異性であり得る。追加の特異性も想定される。上記の分子の任意の組み合わせは、多重特異性結合剤、例えば、ＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体ならびに第２および第３の結合特異性を含む三重特異性結合剤で作製することができる。例えば、以下に詳細に説明するように、第３の結合特異性は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するものであり得る。したがって、結合剤は、下記の構成用よそを含み得る：本明細書に記載され、例えば、表１から選択される、ＬＡＧ−３に結合する１つまたは２つのＶＨ単一ドメイン抗体、ＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体、およびＨＳＡに結合するＶＨ単一ドメイン抗体。実体（entity）は、本明細書において説明されるように、リンカーを介して連結される。実体の順序は自由であってよく、例えば、ＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体は、Ｃ末端またはＮ末端に配置することができる。
【０１７８】
したがって、別の態様では、本発明者らは、第３の標的に結合するさらなる部分を含む、上記のような多重特異性結合剤を提供する。前記さらなる部分は、ＶＨ単一ドメイン抗体であり得る。これは、例えば、下記の式の１つを有する：ＶＨ（Ｃ）−Ｌ１−ＶＨ（Ａ）−Ｌ２−ＶＨ（Ｂ）、ＶＨ（Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（Ｂ）−Ｌ２−ＶＨ（Ｃ）、ＶＨ（Ａ’）−Ｌ１−ＶＨ（Ａ’）−Ｌ２−ＶＨ（Ｂ）−Ｌ３−ＶＨ（Ｃ）またはＶＨ（Ｃ）−Ｌ１−ＶＨ（Ａ’）−Ｌ２−ＶＨ（Ａ’）−Ｌ３−ＶＨ（Ｂ）。例えば、ＶＨ（Ａ）およびＶＨ（Ａ’）はどちらもＬＡＧ−３に結合するＶＨ単一ドメイン抗体であり、ＶＨ（Ｂ）はＰＤ−１に結合するＶＨ単一ドメイン抗体であり、ＶＨ（Ｃ）はＨＳＡに結合するＶＨ単一ドメイン抗体である。
【０１７９】
好ましい態様は、単一ドメイン抗体を含むかまたはそれからなる分子、すなわち他の抗体部分を有さない分子に関するが、本発明は、ＬＡＧ−３に結合する２つの結合部分および別の標的、例えばＰＤ−１に結合する１つの結合部分を有する分子にも及ぶ。重要なことに、本発明者らは、ＬＡＧ−３に高い親和性で結合する二重特異性分子がＬＡＧ−３およびＰＤ−１の両方を発現する細胞に結合し（favour）、ＰＤ−１単一陽性細胞への結合を減少させることを示した。
【０１８０】
さらに別の態様では、本発明者らは、本明細書に記載される結合剤を投与することにより、免疫ＰＤ−１およびＬＡＧ−３を同時に阻害する方法を提供する。
【０１８１】
半減期を延長する分子または他の部分とのコンジュゲート
一つの実施形態では、さらなる部分（例えば、第２または第３、第４等の部分）は、結合分子の半減期を延ばすのに役立ち得る。さらなる部分は、タンパク質、例えば、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合する抗体またはその一部を含み得る。さらなる部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合するＶＨドメインを含み得る。
【０１８２】
さらなる部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＨＳＡ  Ｃ３４Ｓ等のその変異体を含み得る。半減期延長部分は、Ｃ末端、Ｎ末端、または結合分子内の他の場所、例えば連結されたＶＨ単一ドメイン抗体の「鎖」に位置し得る。
【０１８３】
一つの実施形態では、本明細書に記載される抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体または多価結合剤は、検出可能なまたは機能的な標識で標識される。標識は、限定されないが、蛍光色素分子、蛍光物質、放射性標識、酵素、化学発光物質、核磁気共鳴活性標識または光増感剤を含む、シグナルを生成するかまたは生成を誘導し得る任意の分子であり得る。したがって、結合は、蛍光または発光、放射能、酵素活性または吸光度を検出することによって検出および／または測定することができる。
【０１８４】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載される抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体または多価結合剤は、薬物、酵素または毒素等の少なくとも１つの治療部分に結合される。一つの実施形態では、治療部分は毒素、例えば細胞毒性放射性核種、化学毒素またはタンパク質毒素である。
【０１８５】
別の態様では、本明細書に記載される抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体または多価結合剤は、例えば化学修飾、特にＰＥＧ化、またはリポソームへの組み込み、または血清アルブミンタンパク質の使用により、半減期を増加させるように修飾される。
【０１８６】
半減期は、本明細書に記載される対応するＶＨ単一ドメイン抗体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍超長くなり得る。例えば、半減期の増加は、本明細書に記載される対応するＶＨ単一ドメイン抗体と比較して、１時間超長く、好ましくは２時間超長く、より好ましくは６時間超長く、例えば１２時間より長く、さらには２４、４８または７２時間超長くあり得る。
【０１８７】
リンカー
多価結合剤では、サブユニットは化学リンカーまたはペプチドリンカーを介して連結することができる。結合は、共有的または非共有的であり得る。好ましい共有結合は、ペプチド結合を介したものである。他に記載されているように、多価結合剤は、好ましくはタンパク質融合物の形態である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多価結合剤、２つ以上の結合分子は、例えば、ポリペプチドリンカー（Ｌ）等のリンカーによって接続される。適切なリンカーとしては、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ等のＧＳ残基を有するリンカーを含み、ここで、ｎ＝１〜２０、例えば１〜１２、例えば１〜１２、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。一つの実施形態では、ｎ＝５、６、８または１２である。
【０１８８】
例示的なリンカーは、２ＧＳ、４ＧＳ、６ＧＳ、９ＧＳ、すなわち、それぞれ配列番号２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９または２５０である。
【０１８９】
他のリンカーは当業者に知られているであろう。
【０１９０】
単一ドメイン抗体を作製するための例示的な方法
本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、実施例に記載されるように組換えＬＡＧ−３抗原で刺激されると重鎖のみの抗体を発現するトランスジェニックげっ歯類から得られるまたは得ることができる。トランスジェニックげっ歯類、例えばマウスは、好ましくは内因性抗体遺伝子を発現する能力が低下している。したがって、一つの実施形態では、げっ歯類は、内因性軽鎖および／または重鎖抗体遺伝子を発現する能力が低下している。したがって、げっ歯類は、内因性κおよびλ軽鎖、および／または重鎖抗体遺伝子の発現を遮断するための改変を含み得、その結果、例えば、以下でさらに説明されるように、機能的軽鎖および／または重鎖が生成されない。本発明のｓｄＡｂを生成するための例示的な方法を以下に記載する。
【０１９１】
ヒトＬＡＧ−３に結合することができるヒト重鎖のみ抗体を産生するための方法は、
ａ）再配列されていないヒト重鎖Ｖ遺伝子を含む核酸コンストラクトを発現し、機能的な内因性軽鎖または重鎖を産生することができないトランスジェニックげっ歯類をＬＡＧ−３抗原で免疫すること、
ｂ）ヒト重鎖のみ抗体を単離すること
を含む。
【０１９２】
さらなる工程は、例えば、前記マウスからのＶＨドメイン配列を含む配列のライブラリーを生成し、前記ライブラリーからＶＨドメイン配列を含む配列を単離することにより、前記重鎖のみ抗体からＶＨドメインを単離することを含み得る。
【０１９３】
ヒトＬＡＧ−３に結合することができる単一ＶＨドメイン抗体を産生するための方法は、
ａ）再配列されていないヒト重鎖Ｖ遺伝子を含む核酸コンストラクトを発現し、機能的な内因性軽鎖または重鎖を産生することができないトランスジェニックげっ歯類をＬＡＧ−３抗原で免疫すること、
ｂ）前記マウスからのＶＨドメイン配列を含む配列のライブラリーを生成すること、
ｃ）前記ライブラリーからＶＨドメイン配列を含む配列を単離すること
を含む。
【０１９４】
さらなる工程は、例えば、実施例に示されるような機能アッセイを使用することによって、ヒトＬＡＧ−３に結合する単一のＶＨドメイン抗体または重鎖のみ抗体を同定することを含み得る。
【０１９５】
本明細書に記載されるポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物（product）および組成物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現ライブラリーを用いて調製または生成する方法は、以下の工程を含み得る：
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供する工程；および
ｂ）ＬＡＧ−３に結合することができる／ＬＡＧ−３に親和性を有するアミノ酸配列について、前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｃ）ＬＡＧ−３に結合することができる／ＬＡＧ−３に親和性を有するアミノ酸配列を単離する工程。
【０１９６】
上記の方法において、スクリーニングを容易にする等のために、アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを、ファージ、ファージミド（phagemid）、リボソームまたは適切な微生物（酵母等）にディスプレイしてもよい。アミノ酸配列（のセット、コレクションまたはライブラリー）をディスプレイおよびスクリーニングするための適切な方法、技術および宿主生物は、当業者には明らかであろう（例えば、Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press; 1st edition (October 28, 1996) Brian K. Kay, Jill Winter, John McCaffertyを参照されたい）。
【０１９７】
ライブラリー、例えばファージライブラリーは、抗原特異的な重鎖のみ抗体を発現する細胞または組織を単離し、単離された細胞または組織に由来するｍＲＮＡからＶＨドメインをコードする配列をクローニングし、ライブラリーを使用してコードされたタンパク質をディスプレイすることによって生成される。ＶＨドメインは、細菌、酵母または他の発現系で発現させることができる。
【０１９８】
別の態様はまた、ヒトＶＨ生殖系列配列のアミノ酸生成物またはそれに由来するアミノ酸生成物を含むＬＡＧ−３に結合するＶＨドメインを含む、単離されたＶＨ単一ドメイン抗体または単離された重鎖のみ抗体に関する。重鎖のみ抗体は完全にヒトの物であってもよく、マウス配列を含んでいてもよい。
【０１９９】
げっ歯類という用語は、マウスまたはラットに関する。
【０２００】
一つの実施形態では、げっ歯類はマウスである。マウスは、非機能的内因性λ軽鎖遺伝子座を含み得る。したがって、マウスは機能的内因性λ軽鎖を産生しない。一つの実施形態では、λ軽鎖遺伝子座は、部分的または完全に欠失しているか、または挿入、逆位、組換えイベント、遺伝子編集または遺伝子サイレンシングによって機能しなくなっている。例えば、少なくとも定常領域遺伝子Ｃ１、Ｃ２およびＣ３は、上記のように挿入または他の改変により削除されるかまたは機能しないようにすることができる。一つの実施形態では、遺伝子座は、マウスが機能的なλ軽鎖を産生しないように機能的にサイレンシングされる。
【０２０１】
さらに、マウスは、非機能的内因性κ軽鎖遺伝子座を含み得る。したがって、マウスは機能的内因性κ軽鎖を産生しない。一つの実施形態では、κ軽鎖遺伝子座は、部分的または完全に欠失しているか、または挿入、逆位、組換えイベント、遺伝子編集または遺伝子サイレンシングによって機能しなくなっている。一つの実施形態では、遺伝子座は、マウスが機能的なκ軽鎖を産生しないように機能的にサイレンシングされる。
【０２０２】
機能的にサイレンシングされた内因性λおよびκＬ鎖遺伝子座を有するマウスは、例えば、ＷＯ２００３／０００７３７に開示されているように作製することができ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０３】
さらに、マウスは非機能的内因性重鎖遺伝子座を含み得る。したがって、マウスは機能的内因性重鎖を産生しない。一つの実施形態では、重鎖遺伝子座は、部分的または完全に欠失しているか、または挿入、逆位、組換えイベント、遺伝子編集または遺伝子サイレンシングによって機能しなくなっている。一つの実施形態では、遺伝子座は、マウスが機能的な重鎖を産生しないように機能的にサイレンシングされる。
【０２０４】
例えば、ＷＯ２００４／０７６６１８（参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているように、８つのすべての内因性重鎖定常領域免疫グロブリン遺伝子（μ、δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、εおよびα）はマウスに存在しないか、またはそれらが機能しない程度に部分的に存在せず、または遺伝子δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂおよびεは存在せず、かつ隣接遺伝子μおよびαが、それらが機能しない程度に部分的に存在せず、または遺伝子μ、δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、εおよびαが存在せず、かつαが、それが機能しない程度に部分的に存在せず、またはδ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、εおよびαが存在せず、かつμが、それが機能しない程度に部分的に存在しない。部分的に欠失しているとは、機能的な内因性遺伝子産物が遺伝子座によってコードされない、すなわち、機能的な生成物が遺伝子座から発現しない程度まで、内因性遺伝子座遺伝子配列が、例えば挿入によって削除または破壊されていることを意味する。別の実施形態では、遺伝子座は機能的にサイレンシングされる。
【０２０５】
一つの実施形態では、マウスは、非機能的内因性重鎖遺伝子座、非機能的内因性λ軽鎖遺伝子座、および非機能的内因性κ軽鎖遺伝子座を含む。したがって、マウスは機能的内因性軽鎖または重鎖を産生しない。したがって、マウスはトリプルノックアウト（ＴＫＯ）マウスである。
【０２０６】
トランスジェニックマウスは、異種、好ましくはヒトの重鎖遺伝子座を発現するためのベクター、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含み得る。ＹＡＣは、酵母の非常に大きなＤＮＡ挿入物のクローニングに使用することができるベクターである。天然酵母染色体（自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア（ＣＥＮ）および２つのテロメア（ＴＥＬ））のように動作するために不可欠な３つのシス作用構造要素のすべてを含むだけでなく、大きなＤＮＡ挿入物を受容する能力により、染色体のような安定性および酵母細胞における伝達の忠実性に必要な最小サイズ（１５０ｋｂ）が達成され得る。ＹＡＣの構築および使用は、当技術分野でよく知られている（例えば、Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences, 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group）。
【０２０７】
例えば、ＹＡＣは、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサーおよび調節領域を欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて、再配列されていないヒトＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子を多数含み得る。ヒトのＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子はヒトのＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子座であり、それらは完全にヒトのものである再配列されていない遺伝子である。
【０２０８】
当技術分野で知られている別の方法を、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサーおよび調節領域を欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて、内因性マウスまたはラット免疫グロブリン遺伝子の欠失または不活化、ならびにヒトＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子の導入に使用することができる。
【０２０９】
トランスジェニックマウスは、実施例に示されている標準的な技術に従って作製することができる。トランスジェニックマウスを作製するための２つの最も特徴的な経路は、受精直後の卵母細胞への遺伝物質の前核マイクロインジェクション、または桑実胚または胚盤胞期胚への安定的にトランスフェクトされた胚性幹細胞の導入である。遺伝物質がどのように導入されるかに関係なく、処理された胚は偽妊娠した雌のレシピエントに移され、妊娠が継続し、トランスジェニックの候補子が生まれる。
【０２１０】
これらの広範な方法の主な違いは、ＥＳクローンをトランスジェニック動物の作製に使用する前に、広範囲にわたってスクリーニングできることである。対照的に、前核マイクロインジェクションは、導入後に宿主ゲノムに組み込まれる遺伝物質に依存しており、一般的に言えば、導入遺伝子の正常な取り込みは、子が生まれるまで確認することができない。
【０２１１】
導入遺伝子の組み込みが成功するかどうかを補助および決定するための、当技術分野で知られている多くの方法がある。トランスジェニック動物は、コンストラクトのゲノムへのランダムな組み込み、部位特異的組み込み、または相同組換えを含む複数の手段によって生成することができる。薬剤耐性マーカー（ポジティブ選択）、リコンビナーゼ、組換え媒介カセット交換、ネガティブ選択技術、および組換えの効率を向上させるヌクレアーゼの使用を含む、導入遺伝子の組み込みとそれに続く改変の促進と選択の両方に使用できるさまざまなツールと技術がある。これらの方法のほとんどは、ＥＳ細胞の改変において一般的に使用される。しかしながら、これらの技術のいくつかは、前核インジェクションを介して媒介される遺伝子組換えを増強するため有用である場合がある。
【０２１２】
さらなる改良により、所望のバックグラウンド内でトランスジェニック系統をより効率的に生成することができる。上記のように、好ましい実施形態では、内因性マウス免疫グロブリン発現をサイレンシングして、導入された導入遺伝子を、創薬に利用できる重鎖のみのレパートリーの発現に単独で使用できるようにする。遺伝子操作されたマウス、例えば、すべての内因性免疫グロブリン遺伝子座（マウス重鎖、マウスκ鎖およびマウスλ鎖）がサイレンシングされたＴＫＯマウスを、上記のように使用することができる。導入された導入遺伝子のこのＴＫＯバックグラウンドへの導入は、従来の育種法またはＩＶＦ工程を組み込んでプロセスを効率的にスケーリングすることで実現できる。しかしながら、遺伝子組み換え手順の間にＴＫＯバックグラウンドを含めることも可能である。例えば、マイクロインジェクションの場合、卵母細胞はＴＫＯドナーに由来する。同様に、ＴＫＯ胚からのＥＳ細胞は、遺伝子導入で使用するために派生させることができる。
【０２１３】
免疫グロブリン遺伝子座を発現するために導入遺伝子が導入されたトリプルノックアウトマウスは、本明細書においてＴＫＯ／Ｔｇと呼ばれる。一つの実施形態では、マウスは、その全体が本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／０６２９９０に記載されている通りである。
【０２１４】
例示的な医薬組成物
別の態様では、本発明の結合分子、例えば、本明細書に開示されるＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体、またはＬＡＧ−３およびＰＤ−１の両方に結合する本明細書に記載される二重特異性分子を含む、ＬＡＧ−３に結合する単一ドメイン抗体を含む本明細書に記載される結合分子、および任意に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が手供される。本明細書に記載される単一ドメイン抗体、結合分子または医薬組成物は、限定されないが、経口、局所、非経口、舌下、直腸、膣内、眼内、鼻腔内、肺内、皮内、硝子体内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、脳内、経皮、経粘膜を含む任意の簡便な経路、吸入、または特に耳、鼻、目または皮膚への局所的、または吸入により投与され得る。別の実施形態では、送達は、薬物をコードする核酸、例えば本発明の分子をコードする核酸の送達である。
【０２１５】
非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、直腸、膀胱内、皮内、局所または皮下投与が挙げられる。好ましくは、組成物は非経口的に投与される。
【０２１６】
薬学的に許容可能な担体またはビヒクルは粒子状であり得、その結果、組成物は、例えば、錠剤または粉末形態である。「担体」という用語は、本発明の薬物抗体コンジュゲートと共に投与される希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を指す。そのような医薬担体は、水および油等の液体であり得、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物または合成起源のものが挙げられる。担体は、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素等であり得る。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することができる。一つの実施形態では、動物に投与される場合、本発明の単一ドメイン抗体または組成物および薬学的に許容可能な担体は無菌である。本発明の薬物抗体コンジュゲートが静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液も、特に注射可能な溶液のための液体担体として使用することができる。適切な医薬担体には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等の賦形剤も含まれる。本発明の組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。
【０２１７】
医薬組成物は、液体の形態、例えば、溶液、シロップ、溶液、乳濁液または懸濁液の形態であり得る。液体は、経口投与、または注射、注入（例えば、静脈内注入）または皮下による送達に有用であり得る。
【０２１８】
経口投与が意図される場合、組成物は固体または液体の形態であり得、半固体、半液体、懸濁液およびゲルの形態は、本明細書において固体または液体のいずれかと見なされる形態に含まれる。
【０２１９】
経口投与用の固体組成物として、組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、丸薬、カプセル、チューインガム、ウエハース等に製剤化することができる。そのような固体組成物は、典型的には１つ以上の不活性希釈剤を含む。さらに、下記の１つ以上が存在していてもよい：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースまたはゼラチン等のバインダー；デンプン、ラクトースまたはデキストリン等の賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；ショ糖またはサッカリン等の甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料等の香料；および着色剤。組成物がカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態である場合、上記のタイプの材料に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリンまたは脂肪油等の液体担体を含むことができる。
【０２２０】
経口投与が意図される場合、組成物は、１つ以上の甘味料、保存料、染料／着色剤および風味増強剤を含むことができる。注射による投与のための組成物には、１つ以上の界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤および等張剤も含むことができる。
【０２２１】
組成物は、１つ以上の投薬単位の形をとることができる。
【０２２２】
特定の実施形態では、治療を必要とする領域に局所的に、または静脈内注射もしくは注入によって組成物を投与することが望ましい場合がある。
【０２２３】
特定の疾患または症状の治療において有効／活性である、本明細書に記載される単一ドメイン抗体または結合分子の量は、疾患または症状の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを任意で使用して、最適な投与量範囲の特定に役立てることができる。組成物に使用される正確な用量は、投与経路および疾患の重症度にも依存し、開業医の判断によって各患者の状況に従って決定されるべきである。年齢、体重、性別、食事、投与時間、排泄率、宿主の状態、薬物の組み合わせ、反応感受性および疾患の重症度等の要因が考慮される。
【０２２４】
典型的には、量は、組成物の重量に対して本発明の単一ドメイン抗体が少なくとも約０．０１％である。経口投与が意図される場合、この量は、組成物の約０．１重量％〜約８０重量％の範囲で変動し得る。好ましい経口組成物は、組成物の重量に対して本発明のｓｄＡｂを約４％〜約５０％を含み得る。
【０２２５】
組成物は、非経口投与単位が本発明の単一ドメイン抗体を約０．０１重量％〜約２重量％含むように調製することができる。
【０２２６】
注射による投与の場合、組成物は、典型的には動物の体重に対して約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは動物の体重に対して約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは動物の体重に対して約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ含み得る。一つの実施形態では、組成物は、約１〜３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約５〜２５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投薬スケジュールは、例えば、週に１回から２、３または４週間ごとに１回まで変動し得る。
【０２２７】
別の態様では、本発明者らは、本明細書に記載の単離される抗ＬＡＧ−３ＶＨ単一ドメイン抗体または本明細書に記載される多重特異性結合剤、特にＰＤ−１およびＬＡＧ−３の両方に対する単一ドメイン抗体を有する本明細書に記載される結合剤を含むＣＡＲコンストラクトを提供する。
【０２２８】
ＣＡＲは、典型的には、単一の融合分子中の１つ以上のシグナル伝達ドメインに会合する標的化／結合部分からなる合成受容体である。ＣＡＲの結合部分は、典型的には、柔軟なリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変断片を含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。ｓｃＦｖは、それが由来する完全な抗体と同じ特異性と類似の親和性を保持し、目的の特定の標的に結合することができる。ＣＡＲコンストラクトがＴ細胞の表面に発現し、その標的タンパク質に結合すると、Ｔ細胞の活性化が引き起こされる。Ｔ細胞の活性化は強力な攻撃手段（weapon）であり、したがってＴ細胞の非特異的な活性化は安全上の大きな懸念事項である。ｓｃＦｖは、典型的には標的化剤（targeting agent）として使用されるが、ＣＡＲ−Ｔの治療効果に悪影響を及ぼす可能性のあるいくつかの特性を有する。ｓｃＦｖは、発現と安定性が低く、脱フォールディング（unfolding）および凝集が起こりやすいという特徴がある。結果として、しばしばＣＡＲの発現の達成を困難にするか、Ｔ細胞の標的化に非特異的であり、シグナル伝達の開始に非特異的である。ｓｃＦｖを有するＣＡＲ−Ｔは、異なるＣＡＲ−Ｔの重鎖と軽鎖との架橋により、膜上にクラスターを形成することもできる。これにより、不要な構成的シグナル伝達が発生する。
【０２２９】
さらに、ＣＡＲ−Ｔにおいて使用されるｓｃＦｖも、通常マウスｍＡｂに由来するため、抗ｓｃＦｖ応答が潜在的に架橋によってＴ細胞応答を開始するだけでなく、ＣＡＲ−Ｔを循環から除去するため、潜在的な免疫原性の問題を有する。
【０２３０】
理論に拘束されることを意図するものではなく、ｓｃＦｖを使用して二重特異性、二価または二重パラトピックの抗原結合部分を有するＣＡＲ−Ｔを設計する場合、これらの問題が悪化する傾向がある。したがって、一つの態様では、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを有する単離されたＣＡＲに関し、前記抗原結合ドメインは、本明細書に記載される単離された抗ＬＡＧ−３ＶＨ単一ドメイン抗体、または本明細書に記載される多重特異性結合剤、特に本明細書に記載されるＰＤ−１およびＬＡＧ３の両方に対する単一ドメイン抗体を有する結合剤である。本発明はまた、本発明によるＣＡＲをコードする単離された核酸に関する。本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターに関する。別の態様では、本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、１つ以上の本発明のＣＡＲを含む単離された細胞または細胞集団に関する。そのような細胞は、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている。一つの実施形態では、上記細胞はＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）である。本発明はさらに、本発明のＴ細胞または医薬組成物を投与することを含む、癌を治療する方法に関する。
【０２３１】
例示的な治療用途
本発明はまた、本発明のＬＡＧ−３結合分子の治療用途に関する。一つの態様では、本発明者らは、本発明の結合分子、例えば、本明細書に記載のＬＡＧ−３に結合する少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含む結合分子の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物、例えばヒト患者におけるＬＡＧ−３媒介疾患を治療する方法を提供する。
【０２３２】
本明細書で使用される「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」または「治療（treatment）」は、疾患を阻害または軽減することを意味する。例えば、治療は、疾患に関連する症状の発症の先送り、および／または上記疾患と共に発症する、または発症すると予想されるそのような症状の重症度の軽減を含み得る。この用語には、既存の症状の改善、追加の症状の予防、およびそのような症状の根本的な原因の改善または予防が含まれる。したがって、これらの用語は、治療対象の哺乳動物、例えばヒト患者の少なくとも一部に有益な結果がもたらされていることを示す。多くの医療は、すべてではないが、治療を受けている患者の一部に有効である。
【０２３３】
「対象」または「患者」という用語は、治療、観察または実験の対象である動物を指す。ほんの一例として、対象としては、限定されないが、ヒト、または非ヒト霊長類、限定されないが、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコ等の非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられる。
【０２３４】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、単独でまたは追加の治療薬と組み合わせて細胞、組織または対象に投与した場合に、投与状況下で所望の治療または予防効果を達成するのに有効な抗ＬＡＧ−３抗体の量を意味する。
【０２３５】
本発明はまた、疾患の治療または予防における使用のための、本明細書に記載される単一ドメイン抗体、結合分子または医薬組成物に関する。
【０２３６】
別の態様では、本発明は、疾患の治療または予防における、本明細書に記載される単一ドメイン抗体、結合分子または医薬組成物の使用に関する。
【０２３７】
別の態様では、本開示は、本明細書に列挙される疾患の治療または予防のための医薬品の製造における、本明細書に記載される単一ドメイン抗体または結合分子の使用に関する。
【０２３８】
上記疾患は、癌、免疫疾患、神経疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植拒絶、ウイルス感染症、免疫不全および他の免疫系関連疾患から選択され得る。
【０２３９】
一つの実施形態では、疾患は癌である。癌は、固形腫瘍または非固形腫瘍から選択され得る。例えば、癌は、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、乳癌、脳腫瘍、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、非小細胞肺癌、胸腺腫、前立腺癌、中皮腫、副腎皮質癌、ホジキン病、非ホジキン病等のリンパ腫、胃癌、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＡＭＬ、尿路上皮癌白血病および多発性骨髄腫等の白血病から選択され得る。
【０２４０】
一つの実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。それに応じて治療され得る固形腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、神経膠腫およびリンパ腫が挙げられる。そのような腫瘍のいくつかの例には、類表皮腫瘍、頭部および頸部の腫瘍等の扁平上皮腫瘍、大腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、小細胞および非小細胞肺腫瘍を含む肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍および肝臓腫瘍が挙げられる。他の例としては、カポジ肉腫、ＣＮＳ、新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、胃腸および腎臓の癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、好ましくは多形性膠芽腫、および平滑筋肉腫が挙げられる。本発明のアンタゴニストが有効である血管新生皮膚癌の例としては、扁平上皮癌、基底細胞癌、およびヒト悪性ケラチノサイト等の悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することによって治療することができる皮膚癌が挙げられる。
【０２４１】
一つの実施形態では、腫瘍は非固形腫瘍である。非固形腫瘍の例としては、白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫が挙げられる。
【０２４２】
一つの実施形態では、癌は、局所進行性の切除不能、転移性または再発性の癌である。
【０２４３】
癌には、本発明の抗体を使用してその増殖が阻害され得るものが含まれ、免疫療法に典型的に応答する癌が含まれる。治療に好ましい癌の非限定的な例としては、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、乳癌、結腸癌および肺癌（例えば、非小細胞肺癌）が挙げられる。
【０２４４】
一つの実施形態では、癌は、別の治療、例えば化学療法の後に進行するものである。一つの実施形態では、患者は、抗ＰＤ−１療法または抗ＰＤ−Ｌ１療法で治療された癌患者である。一つの実施形態では、患者は、ＰＤ１不応性患者から選択される。
【０２４５】
二重陽性細胞への標的化の改善が期待されることは、安全性の改善を意味し得る。
【０２４６】
免疫疾患は、移植片対宿主病、関節炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アディソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性尿道炎および睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック性スプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、性ルピナス症候群、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、ループス多発性硬化症、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋炎、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフパーソン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、横断性脊髄炎、潰瘍性結腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎等の血管炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症から選択され得る。
【０２４７】
本発明者らは、ＬＡＧ−３に結合するｓｄＡｂが、ＬＡＧ−３とα−シヌクレインとの相互作用を遮断できることを実証した。アルファ−シヌクレイン（またα−シヌクレイン）は、遺伝的および神経病理学的にパーキンソン病に関連するシナプス前ニューロンタンパク質である。α−シヌクレインはいくつかの方法でＰＤの病因に寄与する可能性があるが、一般的には、前原線維と呼ばれるその異常な可溶性オリゴマー構造は、シナプス機能を含むさまざまな細胞内標的への影響を通じて、細胞の恒常性の破壊と神経細胞死を媒介する毒性種であると考えられている。調節不全のときにこのタンパク質によって付与される毒性機能を標的とすることで、ＰＤだけでなく、シヌクレイン病と呼ばれる他の神経変性状態でも新しい治療戦略がもたらされ得る（Stefanis, Cold Spring Harb Perspect Med. 2012 Feb; 2(2)）。
【０２４８】
したがって、上記の態様の一つの実施形態では、疾患は神経疾患、例えばシヌクレイン病である。神経疾患は、アルツハイマー病、てんかん、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、末梢神経障害または帯状疱疹後神経痛から選択され得る。
【０２４９】
一つの実施形態では、疾患は、ＨＩＶ、ＨＣＶまたは寄生虫感染症等の感染症から選択される。
【０２５０】
本明細書に記載される単一ドメイン抗体、結合分子または医薬組成物は、単一の活性成分として、または１つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与することができる。治療薬は、疾患の治療に有用な化合物または分子である。治療剤の例としては、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤または光活性色素、および放射性同位元素が挙げられる。
【０２５１】
一つの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体、結合分子または医薬組成物は、既存の治療または治療薬、例えば抗癌治療と組み合わせて使用される。したがって、別の態様では、本発明はまた、本発明の単一ドメイン抗体または医薬組成物の投与と抗癌療法とを含む併用療法に関する。抗癌療法としては、治療剤または放射線による療法が挙げられ、遺伝子療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、骨髄移植、ナノ療法、標的化抗癌療法または腫瘍溶解薬が挙げられる。他の治療薬の例としては、他のチェックポイント阻害剤、抗腫瘍薬、免疫原薬、弱毒化癌細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸で刺激された樹状細胞等の抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ）、標的化された小分子および生体分子（シグナル伝達経路の構成要素、例えば、チロシンキナーゼのモジュレーターおよび受容体チロシンキナーゼの阻害剤、ならびにＥＧＦＲアンタゴニストを含む腫瘍特異的抗原に結合する薬剤等）、抗炎症剤、細胞毒性剤、放射線毒性剤、または免疫抑制剤、および免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞、化学療法が挙げられる。一つの実施形態では、単一ドメイン抗体は、手術と組み合わせて使用される。
【０２５２】
一つの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体、結合剤または医薬組成物は、免疫調節剤、チェックポイント調節剤、Ｔ細胞活性化に関与する薬剤、腫瘍微小環境修飾剤（ＴＭＥ）または腫瘍特異的標的とともに投与される。例えば、免疫調節剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲβの１つ以上の阻害剤から選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤であり得る。別の実施形態では、免疫調節剤は、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３またはＣＤ８３リガンド、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＩＣＡＭ−１の１つ以上のアゴニストから選択される共刺激分子の活性化因子であり得る。
【０２５３】
本発明の特定の実施形態では、組成物は、化学療法剤または放射線療法と同時に投与される。別の特定の実施形態では、化学療法剤または放射線療法は、本発明の組成物の投与の前または後に、好ましくは少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月、より好ましくは本発明の組成物の投与の前または後に数ヶ月（例えば、最大３ヶ月）投与される。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体または結合剤は、２つ以上の治療剤と共に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、２つ以上の治療剤と共に投与され得る。
【０２５５】
本明細書に記載される単一ドメイン抗体、医薬組成物または結合分子は、他の治療または治療化合物または治療と同時または異なる時に、例えば、同時に、別々にまたは連続して投与することができる。
【０２５６】
さらに別の態様では、本発明者らは、本明細書に記載される単一ドメイン抗体、医薬組成物または結合分子を対象に投与して、該対象の免疫応答を調節することを含む、対象の免疫応答を調節する方法を提供する。一つの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体、医薬組成物または結合分子は、対象における免疫応答を増強、刺激または増大させる。
【０２５７】
さらなる態様では、本発明者らは、本明細書に記載される単一ドメイン抗体、医薬組成物または結合分子の治療有効量を対象に投与することを含む、該対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【０２５８】
さらなる態様では、本発明者らは、本発明の結合剤を提供する、例えばそのような結合剤を患者に投与することにより、表面上にＰＤ−１およびＬＡＧ−３を提示する細胞を選択的に標的化する方法を提供する。さらなる態様において、本発明者らは、例えばそのような結合剤を患者に投与することによって、本発明の結合剤を提供する、例えばそのような結合剤を患者に投与することにより、それらの表面上のＰＤ−１およびＬＡＧ−３の二重遮断する方法を提供する。一つの実施形態では、上記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法である。
【０２５９】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの治療薬および／または診断薬にコンジュゲートした、本明細書に記載される単一ドメイン抗体、医薬組成物または結合分子を含む免疫複合体に関する。
【０２６０】
また、本発明者らは、Ｅ３ユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌが、二重特異性抗ＬＡＧ＋抗ＰＤ１結合分子による治療の予測バイオマーカーとして使用できることも確認した。予後バイオマーカーは、治療法に関係なく、患者の全体的な癌の転帰に関する情報を提供するが、予測バイオマーカーは、治療的介入の効果に関する情報を提供する。したがって、本発明はまた、二重特異性抗ＬＡＧ＋抗ＰＤ１結合分子を用いた癌治療における予測バイオマーカーとしてのＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌの使用に関する。本発明はまた、例えば本明細書に記載されるようなＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ２．９２等の二重特異性抗ＬＡＧ＋抗ＰＤ１結合分子を用いて、上記二重特異性治療がおこなわれる対象またはそのサンプルにおけるＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−ＣＢｌのタンパク質またはＲＮＡの発現を測定することにより、治療に応答する対象を同定する方法に関する。Ｃｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌの発現の抑制または減少は、対象が治療に反応することを示す。これは、これらのマーカーと細胞の増殖との関連を示す実施例９のデータによってサポートされている。
【０２６１】
本発明者らはまた、癌を有する対象に対する治療の結果の予測を提供するための方法、または癌に罹患している対象に対する治療を選択するための方法を提供し、該方法は、
ａ）対象由来の生体サンプルと、例えば、本明細書に記載されているようなＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ２．９２等の二重特異性抗ＬＡＧ＋抗ＰＤ１結合分子とを接触させること；
ｂ）サンプル中のＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌのタンパク質またはＲＮＡの発現を測定すること；
ｃ）サンプル中のＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌのタンパク質またはＲＮＡの発現レベルに基づいて、対象のリスクスコアを決定すること；および
ｄ）対象のリスクスコアに基づいて、二重特異性結合分子による治療に対する反応の予後を提供すること
を含む。
【０２６２】
一つの態様では、本発明者らは、癌を有する対象の治療に対する応答のレベルを予測する工程を含む、癌を有する対象の治療方法を提供し、該方法は、
ａ）対象由来の生体サンプルと、例えば、本明細書に記載されているようなＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ１．２−Ｌ−ＶＨ２．９２等の二重特異性抗ＬＡＧ＋抗ＰＤ１結合分子とを接触させること；
ｂ）サンプル中のＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌのタンパク質またはＲＮＡの発現を測定すること；
ｃ）サンプル中のＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌのタンパク質またはＲＮＡの発現レベルに基づいて、対象のリスクスコアを決定すること；
ｄ）リスクスコアと閾値とを比較して、対象が二重特異性結合分子による治療に応答する可能性があるかどうかを予測すること；
ｅ）治療を選択すること；および
ｆ）治療を施すこと
を含む。
【０２６３】
一つの実施形態では、治療は、本明細書に記載される二重特異性分子によるものである。
【０２６４】
一つの実施形態では、サンプルは二重特異性結合剤とインキュベートされる。一つの実施形態では、サンプルは血液サンプルである。一つの実施形態では、Ｔ細胞は血液サンプルから単離され、薬剤と共にインキュベートされる。Ｃｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌの発現は、標準的な方法を使用して、例えばプライマーを含むタンパク質またはＲＮＡに結合する薬剤を使用して測定することができる。Ｃｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌに結合する試薬を含み、タンパク質または核酸の発現を測定するために使用できる上記の方法で使用するためのキットも提供される。
【０２６５】
キットおよび診断検査
別の態様では、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体を含む、疾患または免疫応答の治療または予防のため、および／または疾患の診断、予後またはモニタリングのためにＬＡＧ−３を検出するためのキットを提供する。このようなキットには、ＬＡＧ−３タンパク質の検出に役立つ他の構成要素、パッケージ、説明書または材料が含まれていてもよい。キットは、本明細書に記載される標識された単一ドメイン抗体または結合剤、および該標識を検出するための１つ以上の化合物を含んでいてもよい。
【０２６６】
別の態様では、本発明は、凍結乾燥形態で包装された、または水性媒体に包装された、本発明の本明細書に記載される単一ドメイン抗体または結合剤を提供する。
【０２６７】
本発明はまた、図および実施例を参照して本明細書に記載される単一ドメイン抗体または結合分子に関する。
【０２６８】
別の態様では、本明細書に記載される単一ドメイン抗体または結合分子は、診断検査およびアッセイ等の非治療目的で使用される。試験サンプル、例えば血清または血漿におけるヒトＬＡＧ−３の存在を検出するための方法は、上記サンプルと本明細書に記載される単一ドメイン抗体および少なくとも１つの検出可能な標識とを接触させること、および上記単一ドメイン抗体とヒトＬＡＧ−３との結合を検出することを含む。
【０２６９】
一つの実施形態では、本発明は、癌を有する患者におけるＬＡＧ−３媒介適応免疫抵抗性を診断する方法に関する。この方法は、サンプルと、検出可能な部分で標識されてた、本明細書に開示される単一ドメイン抗体とを接触させること；および免疫細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔ調節細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および形質細胞様樹状細胞上のＬＡＧ−３の発現を検出する。サンプルは腫瘍組織であってもよい。
【０２７０】
診断目的の抗体の修飾は、当技術分野でよく知られている。例えば、抗体は、ビオチン等のリガンド基、または蛍光基、放射性同位元素もしくは酵素等の検出可能なマーカー基で修飾することができる。本発明の化合物は、従来の技術を使用して標識することができる。適切な検出可能な標識としては、限定されないが、発蛍光団（fluorophore）、発色団（chromophore）、放射性原子、電子密度の高い試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。
【０２７１】
本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。前述の開示は、本発明を作製および使用する方法ならびにその最良の形態を含む、本発明の範囲内に包含される主題の一般的な説明を提供するが、以下の実施例は、当業者が本発明をさらに実施できるように、かつその完全な説明を提供するために提供される。しかしながら、当業者は、これらの実施例の詳細が本発明を限定するものとして読まれるべきではなく、その範囲は、本開示に添付される請求項およびその均等物から理解されるべきであることを理解する。本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【０２７２】
本明細書で言及されたすべての文書は、遺伝子アクセッション番号への言及および特許公開への言及を含めて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７３】
「および／または」は、本明細書で使用される場合、他方を伴うまたは伴わない、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれについての特定の開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、あたかもそれぞれが本明細書で個別に述べられているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの特定の開示とみなされる。文脈で他に指示がない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されず、記載されるすべての態様および実施形態に同様に適用される。
【０２７４】
本発明を、非限定的な実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【０２７５】
実施例１．Ｔｇ／ＴＫＯマウスの構築
内因性の重鎖および軽鎖抗体発現が抑制されたバックグラウンド内（トリプルノックアウト、またはＴＫＯ）で生殖系列構成でヒト重鎖抗体トランスジェニック遺伝子座を有するマウスを、従来記載されたようにした（ＷＯ２００４／０７６６１８、ＷＯ２００３／０００７３７、Ren et  al., Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003およびＷＯ２０１６／０６２９９０）。簡潔に言うと、トランスジェニックマウスを、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサーおよび調節領域を欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせた大量のヒトＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いて、受精直後の卵母細胞の前核マイクロインジェクションに続いて作出した。酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、酵母の非常に大きなＤＮＡ挿入物のクローニングに使用することができるベクターである。天然酵母染色体（自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア（ＣＥＮ）および２つのテロメア（ＴＥＬ））のように動作するために不可欠な３つのシス作用構造要素すべてを含むだけでなく、大きなＤＮＡ挿入物を受け入れる能力により、染色体のような安定性と酵母細胞における伝達の忠実度に必要な最小サイズ（１５０ｋｂ）に達することができた。ＹＡＣの構築と使用は、当技術分野でよく知られている（例えば、Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences, 2002, Macmillan Publishers Ltd., Nature Publishing Group / www.els.net）。
【０２７６】
使用したＹＡＣには、複数のヒト重鎖Ｖ遺伝子、複数のヒト重鎖ＤおよびＪ遺伝子、マウスＣＨ１遺伝子およびマウス３’エンハンサー遺伝子を含んでいた。それはＣＨ１エクソンを欠いている。
【０２７７】
トランスジェニックファウンダーマウス（transgenic founder mouse）を、内因性免疫グロブリン発現を欠く動物と戻し交配して、下記の免疫化研究で使用されるＴｇ／ＴＫＯ系統を作製した。
【０２７８】
実施例２．免疫および特徴付けのための抗原
ＬＡＧ−３
ヒトおよびサルのＬＡＧ−３細胞外ドメインを、トランスジェニックマウスの免疫化または結合研究のためのＩｇＧ融合タンパク質として作製した。ヒトＬＡＧ−３配列アクセッションＮＭ＿００２２８６。アカゲザルＬＡＧ−３アクセッションＸＭ＿００１１０８９２３。アカゲザルのアミノ酸配列は、ＬＡＧ−３ドメイン１〜３（ＮＣ＿０２２２８２）のカニクイザルのアミノ酸配列と一致する。マウスＬＡＧ−３はＲ＆Ｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ（カタログ３３２８−Ｌ３）からのものであった。ヒトＬＡＧ−３ドメイン１〜４および１〜２は、標準的な分子生物学技術を使用してクローニングされた。Huard et al 1997 PNAS 94:5744-9に従ってドメインを識別した。ＨＥＫ２９３細胞で発現を行い、ＬＡＧ−３タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。ヒトＬＡＧ−３を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、誘導性発現ベクター内のヒトＬＡＧ−３配列を使用して生成した。プラスミドを、リポフェクションおよび抗生物質で選択された安定した細胞プールを使用してトランスフェクトした。ＬＡＧ−３を発現する細胞を、マウス抗ＬＡＧ−３抗体（クローン１７Ｂ４、Ａｂｃａｍ）の積極的な結合に基づいて分類した。
【０２７９】
ＰＤ−１
Ｒ＆Ｄから購入した組換えヒトＰＤ−１  Ｆｃキメラ、カタログ番号１０８６−ＰＤを使用して免疫付与した。表面上にヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞株を特徴付けに使用した。
【０２８０】
実施例３．免疫付与プロトコル
生後８〜１２週齢のＴｇ／ＴＫＯマウスのそれぞれに、完全フロイントアジュバントに乳化された４０μｇの組換え精製ヒトＬＡＧ−３−Ｆｃタンパク質を初回投与し、皮下に送達し、その後、この最初のプライミング後にさまざまな間隔で、フロイント不完全アジュバントに乳化された１０μｇの組換えタンパク質を３回追加免疫し、同様に皮下に送達した。２０μｇの最終用量の組換え精製ヒトＬＡＧ−３−Ｆｃタンパク質抗原を、アジュバントの非存在下、リン酸緩衝生理食塩水中で腹腔内投与した。
【０２８１】
ＰＤ−１遮断物質を生成するための免疫付与では、生後８〜１２週のＴｇ／ＴＫＯマウスのそれぞれに、５０μｇまたは１０μｇの組換え精製ヒトＰＤ−１−Ｆｃタンパク質の初回投与量を投与した。
【０２８２】
実施例４．免疫マウスからの抗ＬＡＧ３ライブラリーの作製
上記の免疫化されたマウスからのライブラリーの作製は、以下に要約されるようなライブラリー作製の標準的なプロトコルに従った：
ａ）組織の採取および均質化、ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ
免疫したマウス数匹から、脾臓、鼠径部および上腕のリンパ節をＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）に収集した。ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（カタログ７４１０４）を使用して、またはＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｔｉｓｓｕｅキット（カタログ９８０４０４９６）を使用してＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ自動システム（Ｔｈｅｒｍｏ）を介して、脾臓全体から抽出した。製造元のプロトコルに従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ−ＰＣＲハイファイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ１２５７４−０３５）を使用して、ＲＮＡサンプルからＶＨシーケンスを引き出した。
【０２８３】
ｂ）ファージミドベクターへのクローニング
これらの研究では、ファージミドベクターであるｐＵＣＧ３を使用した。従来のＰＣＲベースの方法を、増幅されたＶＨシーケンスからＶＨファージミドライブラリーを構築するために使用した。精製されたＶＨ  ＲＴ−ＰＣＲ産物を使用して、線形化されたｐＵＣＧ３からＰＣＲ反応を準備し、ｐＵＣＧ３にクローン化されたＶＨの不均一な集団を得た。
【０２８４】
ＰＣＲ産物を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分析した。
【０２８５】
ｃ）ファージミドライブラリーの作製
ＶＨ／ファージミドＰＣＲ産物を、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号Ｋ０７０２）を使用して、製造元の指示に従って精製した。溶出したＤＮＡを使用して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌを使用したエレクトロポレーションにより、ＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２−２）を形質転換した。エレクトロポレーションした細胞をプールし、２％（ｗ／ｖ）グルコースと１００μｇ／ｍｌアンピシリンとを補充した大判２×ＴＹ寒天バイオアッセイディッシュにプレーティングした。すべての寒天プレートを３０℃で一晩インキュベートした。
【０２８６】
大判バイオアッセイディッシュにブロスを添加してコロニーを再懸濁することにより、ライブラリーを収集した。細菌コロニーをプールし、ファージ選択プロセスで使用した。
【０２８７】
実施例５．ＶＨの単離のための選択戦略
ライブラリーファージストックの調製およびファージディスプレイ選択を、公開された方法（Antibody Engineering, edited by Benny Lo, chapter 8, p161-176, 2004）に従って行った。ほとんどの場合、パンニングアプローチ（panning approach）と組み合わせたファージディスプレイを使用して、結合ＶＨドメインを単離した。しかしながら、可溶性選択およびストレス（例えば、熱）下で行われる選択を含む、様々な異なる選択方法が当技術分野において十分に説明されている。
【０２８８】
実施例６．形態
ＬＡＧ−３組換えタンパク質またはＬＡＧ−３発現ＣＨＯ細胞に結合すると確認された各ＶＨクローンについて、ファージミドから配列決定し、ＶＨ生殖系列およびＣＤＲ３アミノ酸類似性に基づいてグループ化した。
【０２８９】
ＣＨＯヒトＰＤ−１細胞への結合およびＰＤ−Ｌ１結合ＰＤ−１の阻害についてのペリプラズム抽出物のスクリーニングを行った。ライブラリーの選択に続いて、ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞に結合し、組換えヒトＰＤ−１タンパク質と組換えヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質との間の相互作用を阻害した特定のＶＨが、細菌のペリプラズム抽出物のシングルポイントスクリーニングによって同定された。ＦＬ２蛍光＞１０００でＣＨＯヒトＰＤ−１細胞に結合し、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を阻害するＶＨのファミリーが同定された。
【０２９０】
ＬＡＧ−３結合の二価のコンストラクトは、ＶＨ間のグリシン−セリンリンカーを使用して、ＰＣＲアセンブリによって生成された。組み立てられたコンストラクトを、微生物細胞での発現のためにＤＮＡベクターにクローニングした。異なるリンカーを有するそのような配列の例を以下に示す。実験で使用されたコンストラクトはそれぞれ、３つのアラニン、および６つのヒスチジンのＨｉｓタグを有するＣ末端配列をさらに含んでいた。
【０２９１】
配列番号251
VH1.1-6GS-VH1.1-6GS-VH2.63-His6
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDSSMTWMRQAPGKGLEWVSYISSGGGVKFYTDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCAREAPLRLGESPHDAFDISGQGTMVTVSSAAAHHHHHH
【０２９２】
配列番号252
VH1.1-6GS-VH1.1-9GS-VH2.63-His6
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDSSMTWMRQAPGKGLEWVSYISSGGGVKFYTDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCAREAPLRLGESPHDAFDISGQGTMVTVSSAAAHHHHHH
【０２９３】
配列番号253
VH1.1-6GS-VH1.1-His6
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSAAAHHHHHH
【０２９４】
配列番号254
VH1.1-4GS-VH1.1-His6
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSAAAHHHHHH
【０２９５】
配列番号255
VH1.1-8GS-VH1.1-His6
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSAAAHHHHHH
【０２９６】
配列番号256
VH1.1-12GS-VH1.1-His6
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSAAAHHHHHH
【０２９７】
配列番号257
VH2.77-9GS- VH 1.1-6GS- VH 1.1-His6
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDSSMTWMRQAPGKGLEWVSYISSGGGVKFYTDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAPLRLGESPHDAFDISGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCSASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGNSGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGPGTMVTVSSAAAHHHHHH
【０２９８】
配列番号258
VH 1.2-6GS- VH 1.2-6GS- VH 2.92-His6
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDESMTWMRQAPGKGLEWVSYISSGGGVKFYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAPLRLGESPHDAFDISGQGTMVTVSSAAAHHHHHH
【０２９９】
配列番号259
VH 1.2-6GS- VH 1.2-6GS- VH 2.92
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIHWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARIPREDCSSASCYTDAIDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDESMTWMRQAPGKGLEWVSYISSGGGVKFYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAPLRLGESPHDAFDISGQGTMVTVSS
【０３００】
配列の一部を生殖細胞系に戻したり、結合反応速度を改善したり、異性化や脱アミド化等の生物物理学的な障害を除去したりするために、ＶＨ１．１に変異を加えた。個々の変異またはランダム化は、標準的なオーバーラップエクステンションＰＣＲ手法を使用して達成された。ＶＨ１．２（配列番号８）は、このような配列の例である。
【０３０１】
二重特異性コンストラクトを、ＰＣＲアセンブリにより作製した。表５は、リンカーを使用して、任意の向きで表１の配列と組み合わせることができるＰＤ−１クローンのアミノ配列を示す。対応する核酸配列もまた本明細書で提供される。組み立てられたコンストラクトを、微生物細胞における発現のためにＤＮＡベクターにクローニングした。
【０３０２】
実施例７．精製ＶＨの調製
Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨを微生物細胞システムによって発現させた。タンパク質を、アフィニティー精製を使用して細胞上清から分離した。精製されたタンパク質の収量を分光光度計で推定し、純度をＵＰＬＣ−ＳＥＣを使用して評価した。安定性を、４０℃で一晩インキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィーで分析することにより評価した。簡潔に言うと、精製されたＶＨを４〜４０℃のＰＢＳバッファーに３〜１０ｍｇ／ｍｌで保存し、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ１２５Å  ＳＥＣカラムにより分離して、ＰＤＡ検出器（２８０ｎｍで検出）を含むＷａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  ＵＰＬＣを使用して分析した。サンプルを１０μｌの容量で注入し、２００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋５％プロパン−１−オールを含む移動相で０．４ｍｌ／分の流速で行った。データを６分間収集し、開始時（Ｔ＝０）に存在するモノマーと比較して、保存後に残っているモノマーのパーセンテージを計算した。
【０３０３】
１０ｍｇ／ｍｌのＶＨ１．１を４０℃で１４日間インキュベートしたところ、サイズ排除クロマトグラフィーは、非加熱ピーク面積と比較して、ＶＨピークの純度が９７．６７％であることを示した。
【０３０４】
３ｍｇ／ｍｌのＶＨ１．１−６ＧＳ−ＶＨ１．１を４０℃で一晩インキュベートしたところ、ピーク面積はＴ＝０の１００．１％であった。１．５ｍｇ／ｍｌの１．１−６ＧＳ−１．１−９ＧＳ−２．６３を４０℃で一晩インキュベートしたところ、ピーク面積はＴ＝０の１００．３４％であった。したがって、これらの形態は優れた安定性を示す。
【０３０５】
実施例８．コンストラクトの結合特性
精製されたＶＨを、以下に対する結合能力について試験した：ヒトＬＡＧ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号２３１９−Ｌ３）、アカゲザルＬＡＧ−３（実施例２を参照されたい）、マウスＬＡＧ−３（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号５３０６９−Ｍ０２Ｈ）、ヒトＬＡＧ−３ドメイン１−２（実施例２を参照されたい）、ヒトＬＡＧ−３を発現するＣＨＯ細胞、ヒトＰＤ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  カタログ番号１０８６−ＰＤ）および活性化Ｔ細胞。
【０３０６】
ヒトＬＡＧ−３を発現するＣＨＯ細胞への結合をスクリーニングするために、ＰＢＳ、０．１％のウシ血清アルブミン、０．０１％のアジ化ナトリウムを含むＦＭＡＴアッセイバッファー（ｐＨ７．４）で試薬を調製した。ＶＨを３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  カタログ番号３６５５）に移し、１．５ｎＭの抗Ｈｉｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号０５−９４９）／３ｎＭのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ  カタログ番号１１５−５４５−０７１）およびＤＲＡＱ５で前染色した２０００  ＣＨＯヒトＬＡＧ−３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号６２２５１）と共に２時間インキュベートした。４８８ｎｍおよび６４０ｎｍで励起した後、ＴＴＰ  ＭｉｒｒｏｒｂａｌｌプレートリーダーのＦＬ２（５０２ｎｍ〜５３７ｎｍ）およびＦＬ５（６７７〜８００ｎｍ）チャネルでプレートを読み取った。データは、ＦＬ５の境界とピーク強度でゲートされ、ゲートされたデータのＦＬ２メジアンの平均蛍光強度をＶＨ結合の決定に使用した。ＶＨ１．１は、ＣＨＯ細胞で発現したＬＡＧ−３への結合を示し、平均ＥＣ５０は１．８Ｅ−０９Ｍ、ｎ＝２であった。
【０３０７】
ＥＬＩＳＡにより特異性をスクリーニングするために、抗原を１〜５ｕｇ／ｍｌでコーティングし、マーベル粉乳でブロッキングした。ＶＨを１０μｇ／ｍｌで添加し、１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識抗ＨＩＳ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  カタログ番号１３０−０９２−７８５）を添加した。ＴＭＢ基質および酸性溶液を使用して、比色シグナルを生成した。ＶＨ１．１およびＶＨ１．１−６ＧＳ−ＶＨ１．１は、バックグラウンドの１０倍を超えるシグナルで、ヒトＬＡＧ−３、カニクイザルＬＡＧ−３およびヒトＬＡＧ３ドメイン１−２に結合した。それらは、マウスＬＡＧ−３、ヒトＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａまたは密接に関連した抗原、ＣＤ４（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ  ５１４−ＣＤ）への結合を示さなかった。１．２−６ＧＳ−１．２−６ＧＳ−２．９２は、リアルタイムバイオレイヤー干渉計ベースのバイオセンサーＯｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で試験した場合、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４タンパク質への結合を示さなかった。
【０３０８】
結合速度を、リアルタイムのバイオレイヤー干渉計ベースのバイオセンサーＯｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で測定した。組換えヒトＬＡＧ−３−Ｆｃは、ｐＨ５．０で１０ｍＭの酢酸ナトリウム中のアミン反応性バイオセンサーへの標準的なアミンカップリングによって固定化された。すべての結合研究は、ＨＢＳ−ＥＴ  Ｏｃｔｅｔ動態バッファー中で行われた。バイオセンサーは、異なる工程の間にＯｃｔｅｔ動態バッファーで洗浄された。各Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨの７ポイントの２倍希釈シリーズを、１．６μＭの最高濃度で作製した。各会合工程の接触時間は１５０秒で、解離工程は３００〜４００秒であった。速度論的な会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）の速度定数は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用してデータを処理し、１：１結合モデルにフィッティングすることによって決定された。選択した配列について計算された親和定数を以下の表６に示す。
【０３０９】
【表６】
2021513848.tif 000013
【０３１０】
多価および二重特異性ＶＨの結合速度も、リアルタイムのバイオレイヤー干渉計ベースのバイオセンサーＯｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で測定された。組換えヒトＬＡＧ−３−Ｆｃまたはドメイン１−２−Ｆｃは、プロテインＧバイオセンサーによって固定化した。すべての結合研究は、ＨＢＳ−ＥＴ  Ｏｃｔｅｔ動態バッファー中で行われた。バイオセンサーは、異なる工程の間にＯｃｔｅｔ動態バッファーで洗浄された。各Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨの７ポイントの２倍希釈シリーズを、２５ｎＭ（完全長ＬＡＧ−３、または４００ｎＭを切り捨て）の最高濃度で作製した。各会合工程の接触時間は１５０秒で、解離工程は４００秒であった。カニクイザルのＬＡＧ−３の反応速度を測定するために、ｐＨ５の１０ｍＭの酢酸ナトリウムでＡＲＧ２センサーを使用してタンパク質を固定化し、ＶＨ濃度は１．６μＭで始まり、会合時間は１８０秒であった。コンストラクトを比較するために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用してデータを１：１結合モデルに処理およびフィッティングすることにより、速度論的な会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。値を表７に示す。
【０３１１】
【表７】
2021513848.tif 000014
【０３１２】
ＰＤ−１への結合を、ＨＴＲＦ（均一な時間分解蛍光）によって測定した。ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡおよび０．４Ｍのフッ化カリウムを含むアッセイバッファー中で、段階的に希釈したＨＩＳタグ付きコンストラクトを調製した。サンプルまたはアッセイバッファー（非特異的結合）を、プレートで１〜２ｎＭのヒトＬＡＧ−３−Ｆｃ／ＰＤ−１−Ｆｃ、１ｎＭの抗ヒト−Ｆｃクリプテート  ＰＡｂ（Ｃｉｓｂｉｏ  カタログ番号６１ＨＦＣＫＬＢ）および１５ｎＭの抗Ｈｉｓ−Ｄ２（ＣｉｓＢｉｏ  カタログ番号６１ＨＩＳＤＬＡ）と共に室温で最低３時間インキュベートした。６２０ｎｍおよび６６５ｎｍでの時間分解蛍光発光を、ＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーにより３３７ｎｍで励起した後に測定した。ＨＴＲＦ比を計算し（（６６５ｎｍ発光／６２０ｎｍ発光）＊１００００）、データを（非特異的結合）について修正し、特異的結合シグナルを得た。ＥＣ５０を滴定曲線から計算した（下の表８）。
【０３１３】
【表８】
2021513848.tif 000015
【０３１４】
１．２−６ＧＳ−１．２−６ＧＳ−２．９２のタンパク質への結合を、バイオレイヤー干渉計ベースのバイオセンサーＯｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定した。ＬＡＧ−３抗原を、アミンカップリングを介してＡＲＧ２センサーに結合させ、希釈系列でサンプルを試験した。ＰＤ−１抗原を、プロテインＧセンサーを使用して補足した。親和性測定値を表９に示す。
【０３１５】
【表９】
2021513848.tif 000016
【０３１６】
両方の標的を同時に結合するコンストラクトの能力は、バイオレイヤー干渉計ベースのバイオセンサーＯｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して実証された。組換えＬＡＧ３−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）を、ｐＨ６の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中で、アミン反応性バイオセンサーへの標準的なアミンカップリングによって固定化した。結合工程は、ＰＢＳ中の０．１％のＢＳＡおよび０．０２％のＴｗｅｅｎ２０中で行った。最初の結合工程では１００ｎＭのＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）を使用し、その後５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ１−Ｆｃを結合した。会合と解離の接触時間は２００秒であった。図１は、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１への１．１−６ＧＳ−１．１−６ＧＳ−２．６３の結合を示す。
【０３１７】
細胞表面の標的への結合は、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社が開発した細胞株を使用して実証された。ヒトＬＡＧ−３およびヒトＰＤ−１を細胞の表面で発現させ、それらの細胞内ドメインと酵素断片とを融合させた。受容体の二量体化により酵素断片の補完が強制され、基質の添加により化学発光シグナルを生成した。ＥＣ５０を、バックグラウンドを超える相対光単位の倍数増加から計算し、表１０に示す。二重特異性分子は、より大きな差異座右の二重特異性抗体よりも高いシグナルおよび改善されたＥＣを示し、これは二重結合（dual-angagement）の潜在能力を示すものである。
【０３１８】
【表１０】
2021513848.tif 000017
【０３１９】
Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）コンストラクトのＬＡＧ−３およびＰＤ−１抗原への結合を、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ技術とデュアルカラー検出を使用して決定した。抗原を、アミンカップリング法を使用してバイオセンサー表面に共有結合させ、各抗原を、赤色または緑色の蛍光タグが付いた異なるナノレバーに連結させた。二重特異性コンストラクトの結合を、個々の抗原のみ、または両方の抗原が同時に表面に存在する場合について測定した。各抗原との相互作用の動態を表１１に示す。
【０３２０】
ＰＤ−１が存在する場合、１．２−６ＧＳ−１．２−６ＧＳ−２．９２とＬＡＧ−３とを結合させることにより、親和性ＫＤが６８倍向上した。ＬＡＧ−３が存在する場合、ＰＤ−１への結合はＫＤで１０７倍の改善があった。これらは、両方が存在する場合、二重特異性が標的への親和性を強化したことを示すものである。
【０３２１】
【表１１】
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【０３２２】
ヒト活性化Ｔ細胞への結合を、サイトメトリーで測定した。ＰＢＭＣまたは磁気的に分離されたＴ細胞を白血球の錐体から分離し、細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）でコーティングされた９６ウェルプレートで培養した。抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）をＲＰＭＩ培地およびウシ胎児血清に１μｇ／ｍｌで添加した。７２〜９６時間後、細胞を回収し、標準的なフローサイトメトリー法を使用して染色した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）コンストラクトを３倍シリーズで滴定し、抗ＨＩＳビオチン（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ  ＢＡＭ０５０）とストレプトアビジンＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して検出した。蛍光標識された抗ＣＤ４および抗ＣＤ８が、ＰＢＭＣ培養物およびライブ／デッドダイに含まれていた。染色された細胞を、ＩＱｕｅサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ）を使用して分析した。ＥＣ５０はＨｕｍａｂｏｄｙのメジアン蛍光の滴定曲線から算出し、混合細胞を使用する場合にはＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞でゲーティングした。カニクイザル細胞の場合、磁気分離を使用してパンＴ細胞（pan T cell）を分離し、製造元の指示に従ってＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で刺激した。培養７２時間後、細胞をフローサイトメトリーのためにヒト細胞と同様に染色した。ＥＣ５０を、陽性であったＣＤ４またはＣＤ８の割合の滴定曲線から算出した。表１２は、Ｔ細胞結合のＥＣ５０を示す。二重特異性は、ヒトＴ細胞への強力な結合とサルとの交差反応性を示す。一価のＬＡＧ−３  ＶＨ１．１は細胞に弱く結合するのに対し、二価の形態はこれを強化する、図２を参照されたい。
【０３２３】
二重特異性結合剤は、ＰＤ−１またはＬＡＧ−３の構成要素のみの場合よりも高いメジアン蛍光を示します（図２）。これは、ＬＡＧ３＋、ＰＤ１＋およびＬＡＧ３＋ＰＤ１＋細胞への結合を示唆するものであり得る。二重特異性結合剤は、単一陽性細胞よりも高い結合力で二重陽性細胞を標的とする。
【０３２４】
【表１２】
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【０３２５】
実施例９．リガンドの阻害
ａ）ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１阻害
ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１遮断の結果として、トランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞おいてＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）が機能的応答を阻害する能力を、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポータージーンアッセイを使用して評価した。ＮＦＡＴ応答要素を有するプロモーターの制御下でヒトＰＤ−１およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＴ細胞受容体活性化因子およびヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞株を、標準的な方法で作製した。
【０３２６】
ＣＨＯヒトＰＤ−Ｌ１／ＴＣＲアクチベーター細胞を、９６ウェルの白いプレートに１００００細胞／ウェルで播種した。プレートを５％のＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で一晩インキュベートした。サンプルをアッセイ培地（ＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ）で段階希釈した。Ｊｕｒｋａｔ  ＰＤ−１レポーター細胞を、５ｅ５細胞／ｍｌでアッセイ培地に希釈した。培地をＣＨＯ細胞から除去し、５０μｌの希釈サンプルまたはアッセイ培地（バックグラウンド対照）をプレートに添加し、その後５０μｌの希釈したＪｕｒｋａｔレポーター細胞を添加した。プレートをＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で６時間インキュベートし、インキュベーターから取り出し、室温で２０分間平衡化した。ＮａｎｏＧｌｏ基質（ＮａｎＧｌｏバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｎ１１２０）で１：５０に希釈した基質１００μｌ）を添加し、プレートを室温で２０分間インキュベートした後、発光シグナル（ＲＬＵ）を測定した。データは倍数／バックグラウンドシグナルとして表される。
【０３２７】
Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨは、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示すアッセイにおいて、ルシフェラーゼシグナルの用量依存的な増強を示した。ＥＣ５０を、倍数／バックグラウンドの非線形回帰曲線の当てはめから算出し、選択されたクローンとコンストラクトとのデータを表１３に示す。
【０３２８】
ＰＤ−１陽性細胞に対する二重特異性コンストラクトの効力は、モノクローナル抗体よりも３０倍以上低い。これは、非特異的Ｔ細胞が抗ＰＤ−１によって活性化され得るｉｎ  ｖｉｖｏにおける利点となる。単一ＰＤ１＋細胞では効力が低く、ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋細胞では効力が高いため、特定の「消耗した」Ｔ細胞を標的とする機能が可能になる。
【０３２９】
【表１３】
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【０３３０】
精製された一価ＶＨが、ＣＨＯヒトＰＤ−１細胞へのＰＤ−Ｌ１結合を阻害する能力を、ＦＭＡＴ阻害アッセイを使用して試験した。
【０３３１】
すべての試薬および段階希釈されたＶＨは、ＦＭＡＴアッセイバッファーで調製した。ＶＨ、バッファー（合計結合対照）または過剰な競合相手（非特異的結合対照）を、１００ｐＭのヒトＦｃタグ付きヒトＰＤＬ−１、３ｎＭの抗ヒトＦｃ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８および１ウェル当たり２０００のＣＨＯヒトＰＤ−１  ＤＲＡＱ５染色細胞を、３８４ウェルの黒色透明の底のアッセイプレートにおいてインキュベートした。プレートを室温で２時間インキュベートした後、４８８ｎｍおよび６４０ｎｍで励起した後、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌプレートリーダー（ＴＴＰ）のＦＬ２（５０２ｎｍ〜５３７ｎｍ）およびＦＬ５（６７７〜８００ｎｍ）チャネルで蛍光を測定した。非特異的結合対照ウェルから決定されたバックグラウンドシグナルを差し引いた後、データを合計結合対照の％（すなわち、％対照）として表した。ＩＣ５０を表１４に示すが、一価の抗ＰＤ−１  ＶＨは極めて類似した配列および活性を有する。
【０３３２】
【表１４】
2021513848.tif 000021
【０３３３】
ｂ）ＬＡＧ−３：ＭＨＣＩＩ阻害
ＬＡＧ−３：ＭＨＣＩＩ阻害の結果としてＴ細胞の機能的応答を阻害するＶＨの能力を、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＬＡＧ−３アッセイ）を使用して評価した。ＮＦＡＴ応答要素を有するプロモーターの制御下でヒトＬＡＧ−３およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株を、ＭＨＣクラスＩＩを発現するＲａｊｉ  Ｂ細胞株と共にインキュベートした。Ｔ細胞活性化因子であるブドウ球菌エンテロトキシンＤを添加してＴ細胞を刺激し、ＬＡＧ−３：ＭＨＣＩＩが１７Ｂ４等の抗体によって遮断されると、ルシフェラーゼシグナルが増加する。
【０３３４】
製造元の指示に従って、サンプルを段階希釈し、試薬を添加した。発光信号（ＲＬＵ）を６時間後に読み取った。データは倍数／バックグラウンドシグナルとして表現した。
【０３３５】
Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）は、ＬＡＧ−３：ＭＨＣＩＩ相互作用の遮断を示すアッセイにおいてＮＦＡＴシグナリングを強化する。ＥＣ５０は倍数／バックグラウンド非線形回帰曲線の当てはめから算出し、選択されたクローンとコンストラクトとのデータを表１５に示す。
【０３３６】
【表１５】
2021513848.tif 000022
【０３３７】
ｃ）代替リガンド阻害
ガレクチン−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  カタログ番号４５０−３８−１００）、レセクチン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号２９４７−ＣＬ）またはα−シヌクレイン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＳＰ４８０−５００）を１〜２μｇ／ｍｌでｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。プレートを、ＰＢＳ中の３％マーベルスキムミルクパウダーでブロッキングした。ＬＡＧ−３−Ｆｃを、コーティングされたプレートに加える前に、ＶＨと共に１時間プレインキュベートした。ＬＡＧ−３結合を、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧを使用して検出した。洗浄工程を、ＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回行った。ＴＭＢと０．５Ｍ硫酸溶液を使用して発色させた。ＬＡＧ−３固有のＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨにより、ＬＡＧ−３：ガレクチン、ＬＡＧ−３：レセクチンおよびＬＡＧ３：α−シヌクレインの相互作用が遮断された。ＥＣ５０を、非線形回帰曲線に当てはめられた吸光度から算出し、データの例を表１６に示す。ＰＤ−１に結合する無関係のＶＨは、これらの相互作用を阻害しなかった。
【０３３８】
【表１６】
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【０３３９】
実施例１０．免疫細胞機能の増強
ａ）スーパー抗原アッセイ
健康な人間のドナーからのＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離を使用して白血球の錐体から分離した。ＰＢＭＣを、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を使用して２〜３日間刺激した。抗体またはＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）の存在下で、細胞をさまざまな濃度のＳＥＢで再刺激した。上清に分泌されたＩＬ−２を、ＨＴＲＦ（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２キット  カタログ番号６４ＩＬ１ＰＥＢ）を使用して測定した。二価のＶＨ１．１−６ＧＳ−１．１は、ＰＤ−１遮断と組み合わせることによりＴ細胞刺激を増強した（図３ａ）。二価のＨｕｍａｂｏｄｙのみでは、Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ネガティブ対照またはＩｇＧネガティブ対照よりも最小限しか増強されなかった。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）１．１−６ＧＳ−１．１−９ＧＳ−２．６３により、ベンチマークのＰＤ−１およびＬＡＧ−３抗体を上回ってＴ細胞刺激が増強された（図３ｂ）。１．２−６ＧＳ−１．２−６ＧＳ−２．９２は、ベンチマーク（レラトリマブアナログおよびニボルマブアナログ）を超える同様の強化を示した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）１．１−６ＧＳ−１．１−９ＧＳ−２．６３は、その構成要素の組み合わせよりもＴ細胞刺激を増強した（図３ｃ）。２つのＬＡＧ−３  ＶＨを含む二重特異性形態は、１つのＬＡＧ−３  ＶＨを含む形態よりもＩＬ−２産生する刺激が高かった（図３ｄおよび３ｅ）。このデータは、非対称形態が他のＬＡＧ−３：ＰＤ１結合形態よりも機能上の利点があることを示すものである。図３ｆは、培養６日後の炎症誘発性サイトカイン、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびインターフェロン−γの誘導を示す。
【０３４０】
ｂ）抗原特異的アッセイ
８名のヒトドナーからのＰＢＭＣを、ＣＭＶペプチド刺激システムで使用した。ＰＢＭＣをＣＭＶペプチドのプールで１時間パルスし、Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）をインキュベーション前に添加した。細胞を、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養した。５日目に細胞を洗浄し、フローサイトメトリーのために染色した。さまざまなＨＬＡタイプのＣＭＶテトラマーを使用して細胞を染色し、ＣＤ８＋テトラマー＋細胞のパーセンテージを計算した。パーセンテージの増加倍率を、無関係なＶＨと比較して算出した。図４は、二重特異性１．１−６ＧＳ−１．１−９ＧＳ−２．６３の処理により増殖が増加することを示している。一部の応答では、二重特異性は、二重パラトピックＰＤ−１結合剤（ＰＤ−１に２つのＶＨが結合している）および二価のＬＡＧ−３にはない効果を有している。
【０３４１】
実施例７．ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性
２４匹のｈｕ−ＰＢＭＣ  ＮＣＧマウスに、５０％のマトリゲル中の５×１０６個のＲＫＯ結腸癌細胞の皮下移植の７日前に、尾静脈注射により３×１０７個のｈＰＢＭＣを移植した。腫瘍が触知可能になった時点でデジタルキャリパーによる測定を開始し、週に２回腫瘍体積を測定した。腫瘍体積が約３０〜６０ｍｍ３に達した時点で、マウスを腫瘍体積に基づいて無作為化した。表１７に従って、研究１日目からマウスに投薬した。表１７に示すように、多くの薬剤を試験した。
【０３４２】
体重、臨床観察およびデジタルキャリパー測定値を、投与開始後、毎週２回記録した。二重特異性は腫瘍増殖の阻害を媒介し得る（図５）。ＭＳＡは、マウスの血清アルブミンに結合するＶＨを示す。ＨＥＬ４は、標的に結合しないネガティブ対照ＶＨである。
【０３４３】
【表１７】
2021513848.tif 000024
【０３４４】
実施例８．患者のＴ細胞の増殖
１．２−６ＧＳ−１．２−６ＧＳ−２．９２を、癌細胞およびＴ細胞の相互作用をモデル化した患者のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞システムにおいてＴ細胞を回復する（rescue）ことができる。ＮＳＣＬＣ患者からのＰＢＭＣを、抗ＣＤ３による弱いＴＣＲ刺激を提供する肺腺癌細胞株と共にインキュベートした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞では、Ｋｉ６７＋増殖細胞の割合が１．２−６ＧＳ−１．２−６ＧＳ−２．９２の存在下で増加した。これは、増殖をわずかに増加させたＰＤ−１抗体による治療よりも有意に高かった（図６）。これらの患者はＰＤ−１抗体治療に応答しない可能性があるため、二重特異性によって提供されるＴ細胞増殖の刺激は有益である。二重特異性は、さらに４人の患者の細胞において併用治療よりも増殖を促進した（表１８）。
【０３４５】
【表１８】
2021513848.tif 000025
【０３４６】
実施例９．抑制性シグナル伝達の抑制
ＮＳＣＬＣ患者のＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞を、弱いＴＣＲ刺激を提供するヒト肺癌腺癌細胞株（Ａ５４９）と共にインキュベートした。培養物をＬＡＧ−３二価、ＰＤ−１一価または抗体または等しい濃度のＬＡＧ−３二価およびＰＤ−１一価ＶＨの組み合わせで処理し、これらを二重特異性１．２−６ＧＳ−１．２−６ＧＳ−２．９２と比較した。細胞を、フローサイトメトリーによって、ネガティブＴ細胞レギュレーターＣＢＬ−ｂおよびｃ−ＣＢＬの発現について分析した。Ｅ３ユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ１３１９１またはＮＣＢＩリファレンスＮＰ＿００１３０８７１７．１）およびｃ−Ｃｂｌ（Ｃ−ＣＢＬ、ＣＢＬ、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２２６８１としても知られている）を発現する細胞の割合または細胞の平均蛍光強度を計算した、表１９。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路に関与していた（Karwacz et al, EMBO MOl Med 3, 581-592, 2011）。
【０３４７】
【表１９】
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【０３４８】
ＰＤ−１の遮断によりＣＤ４＋Ｔ細胞のＣｂｌ−ｂは減少するが、ＬＡＧ−３二価は効果を示さなかった。ＰＤ−１およびＬＡＧ−３の遮断の組み合わせは、ＰＤ−１の遮断のみの場合と比較して追加的な効果を示さなかった。二重特異性は、ＮＳＣＬＣ患者からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方においてＣｂｌ−ｂおよびｃ−ｃｂｌの発現を有意に阻害した。したがって、増殖に関する図６に示すデータと一致して、二重特異性による標的の結合は併用治療とは異なり、Ｔ細胞阻害シグナル伝達のバイオマーカーの抑制を可能にする。ｃ−ＣｂｌおよびＣｂｌ−ｂタンパク質発現を減少させる唯一の治療法は二重特異性であり、二重特異性による二重標的への結合により、治療法の組み合わせと比較して代替的なシグナル伝達経路を可能にすることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
2021513848.tif 000031
【図３ｄ】
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【図３ｅ】
2021513848.tif 000033
【図３ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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