(57)【要約】生物学的産物及びウイルス汚染物質の粗製溶液を分離するための修正フィルタ膜であって、以下を含む：（ａ）セルロース系多孔質表面を有するフィルタ膜、（ｂ）前記フィルタ膜の前記セルロース系多孔質表面に結合し、修正フィルタ膜セルロース系多孔質表面を形成する少なくとも１つの二価金属イオン、ここで、前記修正セルロース系多孔質表面は、直径１５ｎｍよりも小さい生物学的産物を通過させながら、直径１５ｎｍよりも大きいウイルス汚染物質を保持することによって、前記粗製溶液を分離する。【選択図】図１
2021513913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的産物及びウイルス汚染物質の粗製溶液を分離するための修正フィルタ膜であって、以下を含む：
(a)   セルロース系多孔質表面を有するフィルタ膜、
(b)   前記フィルタ膜の前記セルロース系多孔質表面に結合し、修正フィルタ膜セルロース系多孔質表面を形成する少なくとも１つの二価金属イオン、
前記修正セルロース系多孔質表面は、直径１５ｎｍよりも小さい生物学的産物を通過させながら、直径１５ｎｍよりも大きいウイルス汚染物質を保持することによって、前記粗製溶液を分離する、
修正フィルタ膜。
【請求項２】
前記二価金属イオンが、Ｃｕ２＋、Ｃａ２＋、及びＺｎ２＋からなる群から選択される、
請求項１に記載の修正フィルタ膜。
【請求項３】
前記ウイルス汚染物質が、非エンベロープウイルス粒子またはウイルスを含む、
請求項２に記載の修正フィルタ膜。
【請求項４】
前記ウイルス汚染物質が、１５〜２５ｎｍの範囲のパルボウイルスまたはサーコウイルスを含む、
請求項３に記載の修正フィルタ膜。
【請求項５】
前記ウイルス汚染物質が、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｉｖｉｒｉｄａｅ、及びＡｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルスをさらに含む、
請求項３に記載の修正フィルタ膜。
【請求項６】
前記ウイルス汚染物質が、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、ｆｌｖｉｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｒｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｓｅ、及びＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＲＮＡウイルスをさらに含む、
請求項３に記載の修正フィルタ膜。
【請求項７】
前記粗製溶液がタンパク質溶液を含む、
請求項１に記載の修正フィルタ膜。
【請求項８】
前記二価金属イオンが塩化カルシウム化合物に由来する、
請求項１に記載の修正フィルタ膜。
【請求項９】
前記フィルタ膜がＡｓａｈｉ  Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎウイルスフィルタを含む、
請求項１に記載の修正フィルタ膜。
【請求項１０】
前記修正セルロース系多孔質表面が、１〜３０ｎｍの範囲の孔径を含む、
請求項１に記載の修正フィルタ膜。
【請求項１１】
前記セルロース系多孔質表面が、１〜５００ｎｍの範囲の孔径を含む、
請求項１に記載の修正フィルタ膜。
【請求項１２】
修正フィルタ膜を用いて生物学的産物及びウイルス汚染物質の粗製溶液を濾過する方法であって、以下を含む：
(a)   フィルタ膜の多孔質表面に２価の金属イオンを加えて孔径１〜１５ｎｍの範囲の孔径を有する修正フィルタ膜の多孔質表面を形成し、
(b)   前記修正フィルタ膜の前記多孔質表面を通して前記生物学的産物及び前記ウイルス汚染物質の前記粗製溶液を濾過し、前記修正フィルタ膜は、前記生物学的産物を通過させながら前記ウイルス汚染物質を前記多孔質表面に保持する、
方法。
【請求項１３】
前記フィルタ膜がセルロースまたは再生セルロース材料を含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フィルタ膜がＡｓａｈｉ  Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎウイルスフィルタを含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記粗製溶液が、ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｎ−ミチルグルカミド（ＭＥＧＡ）誘導体、トリトンＸ及び誘導体からなる群から選択される非イオン性界面活性剤をさらに含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
多孔質表面が１〜５００ｎｍの孔径を含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
修正多孔質表面が、１〜１５ｎｍの孔径を含む、
請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、修正フィルタ膜及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々のフィルタ及び方法が、不純物または汚染物質から生物学的分子を分離するために設計されている。サイズ排除ベースの濾過は、生物学的製造プロセスのバイオリアクターから哺乳動物細胞、血漿、動物／ヒト組織液または細胞培養液に由来する小粒子及びウイルスを除去するための望ましい有効な技術である。現在の濾過技術は、様々な汚染物質、及び直径１５ｎｍを超えるウイルス粒子を除去することができる。しかしながら、今日まで、このサイズ未満の粒子及び組織液の効果的かつ強固な除去のための技術またはフィルタは存在しない。例えば、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）及びサーコウイルス（ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）のような小型及び非エンベロープウイルスは、生物学的溶液から除去するのが非常に困難である。これらの小さい粒子、ウイルス、及び微量汚染物質は細胞培養及び／または生産製造サイクルを通して増幅され得るという事実のために、生物製剤製造において問題を提示する。さらに、粗製溶液または条件が変化し、タンパク質分子サイズが大きく、タンパク質濃度が非常に低い場合、ウイルス濾過フィルタ及び方法によって生物学的産物の高度かつ一貫した修復を得ることは非常に困難である。これら及び他の問題は、本実施形態によって対処されてきた。
【発明の概要】
【０００３】
本実施形態は、対象となる生物学的産物から分離する必要がある粗製溶液中に存在するウイルスなどの、小粒子及び他の未知のまたは同定されていない汚染物質を除去するための修正フィルタ膜を提供する。
【０００４】
本実施形態はさらに、セルロース系多孔質表面を有するフィルタ膜と、フィルタ膜のセルロース系多孔質表面に結合して修正フィルタ膜セルロース系多孔質表面を形成する少なくとも１つの二価金属イオンとを含み、生物学的産物の粗製溶液及びウイルス汚染物質を分離するための修正フィルタ膜をさらに提供し、ここで、修正セルロース系多孔質表面が直径１５ｎｍより大きいウイルス汚染物質を保持しながら、直径１５ｎｍより小さい生物学的産物を通過させることによって粗製溶液を分離する、
【０００５】
実施形態はまた、生物学的産物の粗製溶液及びウイルス汚染物質を、修正フィルタ膜を使用して濾過する方法であって、二価金属イオンをフィルタ膜多孔質表面に添加して、サイズが１〜１５ｎｍの範囲の孔径を有する修正フィルタ膜多孔質表面を形成することと、修正フィルタ膜の多孔質表面を通して生物学的産物及びウイルス汚染物質の粗製溶液を濾過することとを含み、修正フィルタ膜は生物学的産物が通過することを可能にしながら、多孔質表面上にウイルス汚染物質を保持する方法を提供する。
【０００６】
さらなる実施形態は、濾過膜分離組成物及び方法をさらに増強し、粗製溶液から分離された生物学的産物の収率を増加させるために、Ｔｗｅｅｎ８０の添加を任意に含むことができる。
【０００７】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、本教示または特許請求の範囲をいかなる形でも限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はウイルスフィルタ膜（例えば、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ）を使用する濾過システムを示す。フィルタ負荷材料は圧力源（例えば、圧縮空気または蠕動ポンプ）を介して再生ニトロセルロース中空繊維膜に適用される。濾液を収集容器に収集される。
【図２】図２は、未修飾ウイルスフィルタ膜の多孔質表面の強化部分を示す。
【図３】図３は、二価金属イオン増強ウイルス濾過において使用される方法を示す。
【図４】図４は、二価金属イオンセルロースベースのフィルタの種々の提案されたメカニズムを示す。
【図５】図５は、ロード（ｌｏａｄ）中のＣａＣｌ２の存在による、ウイルスフィルタ膜を有するスパイクされたＰＰＶの増強された取り出しを示す。（Ａ）濾過緩衝液は、２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１である。（Ｂ）濾過緩衝液は、２０ｍＭイミダゾール、３７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１である。Ａ及びＢの両方を、周囲温度で一定圧力（１２〜１４ＰＳＩ）下で行う。
【図６】図６は、ウイルスフィルタ膜によるスパイクＰＰＶの除去がＴｗｅｅｎ８０の存在及び濾過温度によって有意に影響されないことを示す。（Ｃ）２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｐｐｍ  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１で周囲（１５〜２６℃）での濾過。（Ｄ）２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｐｐｍ  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１で２〜８℃での濾過。（Ｅ）２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１において周囲で濾過する。（Ｆ）２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１で２〜８℃での濾過。
【図７】図７は、ウイルスフィルタ膜によりスパイクされたＰＰＶの除去が異なる緩衝系の選択によって有意に影響されないことを示す。（Ｇ）２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１において周囲で濾過する。（Ｈ）２０ｍＭトリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１において周囲で濾過する。（Ｉ）５０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１において周囲で濾過する。（Ｊ）５０ｍＭクエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ＝  ６．６〜６．８において周囲温度で濾過する。
【図８】図８は、種々のＣａＣｌ２濃度でのウイルスフィルタ膜によるＰＰＶスパイクＩｇＧ２抗体負荷（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．９〜７．１中５．７〜８．１ｍｇ／ｍＬ）からのウイルス除去の増強、及び、ＥＤＴＡキレート剤による増強の逆転を示す。
【図９】図９は、種々のＣａＣｌ２濃度でのウイルスフィルタ膜によるＰＰＶ添加ＩｇＧ１抗体負荷（５０ｍＭクエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．６〜６．８中４．９〜１３．１ｍｇ／ｍＬ）からのウイルス除去の増強、及び、ＥＧＴＡキレート剤による増強の逆転はないことを示す。
【図１０】図１０は、ウイルスフィルタ膜による、スパイクされたｒＦＶＩＩＩ処理中間体（２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｐｐｍ  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１中の約０．１ｍｇ／ｍＬ）からのＰＰＶの完全な除去（検出限界未満まで）を示す。
【図１１】図１１は、ウイルスフィルタ膜を使用した場合の、Ｔｗｅｅｎ８０による組換えヒト第ＶＩＩＩ因子の収率一貫性の改善を示す。
【図１２】図１２は、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子負荷を適用したＴｗｅｅｎ８０による増強ウイルスフィルタ膜容量（ＶＭａｘ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、溶液から小粒子及びウイルス汚染物質を除去するための修正フィルタ膜を含む組成物を提供する。
【００１０】
定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用される。
【００１１】
以下に記載される定義が参照により本明細書に組み込まれる文書を含む他の文書における当該用語の使用と矛盾する場合、逆の意味が明確に意図されていない限り（例えば、用語が最初に使用された文書において）、以下に記載される定義は常に、本明細書及びその関連クレームを解釈する目的のためにコントロールするものとする。
【００１２】
適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。本明細書中の「ａ」の使用は別段の記載がない限り、または「１つ以上」の使用が明らかに不適切でない場合に、「１つ以上」を意味する。「または」の使用は別段の記載がない限り、「及び／または」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は交換可能であり、限定的ではない。「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」及び「例えば（ｅ．ｇ．）」という用語もまた、限定的であることを意図していない。例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「を含むがこれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ．）」を意味する。
【００１３】
本明細書で使用する「粗製溶液」または「粗製負荷」という用語は一般に、１つまたは複数の生物学的物質または分子を含む未処理または未精製の溶液または物質を指す。また、この溶液または物質中に存在するのは以前に同定されていてもいなくてもよい１つまたは複数の汚染物質であってもよい。例えば、ウイルスは「粗製溶液」中に存在する１つのタイプの汚染物質であってもよい。「粗製溶液」が目的の生物学的産物から分離するために存在するかまたは望ましい他の病原体及び汚染物質も含むことが予想される。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、提供される単位値の＋／１０％をいう。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に」は、関心のある特徴または特性の全体的または近似的な程度を示す定性的条件をいう。生物学的及び化学的現象が生物学的及び化学的組成物及び材料の試験、生産、及び貯蔵に影響を及ぼす多くの変数のため、及び生物学的及び化学的組成物及び材料の試験、生産、及び貯蔵に使用される器具及び装置の固有の誤差のため、絶対的な結果を、生物学的及び化学的現象がたとえあったとしても、まれに達成または回避することを、生物学的及び化学的現象が理解する。したがって、用語「実質的に」は本明細書中では多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために使用される。
【００１６】
フィルタシステム：
【００１７】
記載された実施形態は、任意の数の方法で修正及び変更することができる。記載されたシステムは、可能な用途及び実施形態の範囲を決して限定すべきではない。ここで図１を参照すると、本実施形態の濾過システム１０は、入口２０または２０’、閉鎖出口３０、開放出口４０、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０  Ｎウイルスフィルタ５０などのフィルタ膜、及び少なくとも１つの収集容器６０を提供する。濾過システム１０はまた、加圧負荷入口７０を有し、ここで、粗製負荷をシステムに搭載し、加圧下に置いて、生物学的産物２２を汚染物質から分離することができる（生物学的産物２２は、図１には示されていない）。
【００１８】
フィルタ膜：
【００１９】
実施形態は、構築または購入することができる１つまたは複数のフィルタ膜５０の使用を提供する。例えば、フィルタ膜５０は、セルロース、再生セルロース、及び／またはニトロセルロースベースの材料または組成物を含む多孔質表面を有することができる。さらに、本実施形態のフィルタ膜は、Ａｓａｈｉ  Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎウイルスフィルタを含むことができる。当技術分野で知られている他のタイプのフィルタも、本実施形態で使用することができる。フィルタ膜５０は、単離、収集、及び／または精製される必要がある、所定のサイズ及び形状の汚染物質を、目的の生物学的産物２２から機能的に除去するために有効であるように改変され得ることが重要である。さらに、フィルタ膜５０は以下にさらに記載されるように、改変されたフィルタ膜５０’になるために、１つ以上の二価金属イオンを結合し得なければならない。
【００２０】
未修正ナノメートル孔径を有する多孔質表面を有する再生セルロースベースのフィルタ膜は、比較的高い容量及び低コストである。再生セルロース膜の多孔質表面の強化図を図２に示す。典型的な多孔質表面は、形状及びサイズが変化する細孔サイズを含むことができる。例えば、修正されていない多孔質表面細孔サイズは、１〜５００ｎｍの直径の範囲であり得る。他の可能な孔径も可能である。多孔質表面及び細孔サイズは様々であってよく、一般に、生物学的産物を他のタンパク質または汚染物質から分離するのに有効ではない。多くの状況において、フィルタ孔サイズが大きすぎるか、またはウイルス直径が小さすぎるかのいずれかである。いずれの場合も、ウイルスまたは他の汚染物質から生物学的生成物２２を分離することは特に困難である。
【００２１】
本実施形態は、様々なタイプのセルロースベースのフィルタを含むことができることが予想される。セルロースは、定義されていない数のグルコース部分の直鎖状多糖である。セルロースは、古典的なビスコース技術または銅アンモニウム法またはＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（ＮＭＭＯ）法によって、セルロース誘導体（エーテル及びエステル）及び再生材料（繊維、フィルムなど）に変換される。ｃｕｐｒａｍｍｏｎｉｕｍプロセスによるセルロース再生材料の製造は、Ｃｕ２＋ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）を介してセルロースのヒドロキシル基と錯化したｃｕｐｒａｍｍｏｎｉｕｍ（Ｈ２Ｎ−Ｃｕ２＋−ＮＨ２）を導入する。この構造は、理論的にはカルシウムイオンに対する潜在的な結合部位を提供し得る（図４を参照）。
【００２２】
修正フィルタ膜：
【００２３】
フィルタ膜は、生物学的産物を汚染物質から分離するのに有効にするために改変される必要がある。本実施形態は、本実施形態の修正フィルタ膜５０’を作製するために、１つ以上の二価イオンをフィルタ膜５０に結合または付着させることを必要とする。二価イオンはアッセイ溶液に追加でき、Ｃｕ２＋、Ｃａ２＋、及びＺｎ２＋を含むことができる。本実施形態では、当技術分野で公知の他の同様の二価イオンを使用することができる。
【００２４】
提案メカニズム：
【００２５】
修正フィルタ膜５０’が粗製負荷溶液から目的の生物学的産物２２から汚染物質を分離することができる機能的能力を提供することは、本実施形態にとって重要である。
【００２６】
Ｃａ２＋イオンのような二価金属イオンによるウイルス保持増強のメカニズムは十分に理解されていない。１つの理論は、セルロース鎖の還元末端にカルボン酸基を形成させるセルロース再生プロセス中に酸化が起こることを示唆している。カルボキシル基の解離を通して、再生セルロース繊維は弱いアニオン交換体として作用することができ、したがって、すべてのタイプの再生セルロース繊維（リオセル（ｌｙｏｃｅｌｌ）、ビスコース（ｖｉｓｃｏｓｅ）及びモード繊維（ｍｏｄａｌ  ｆｉｂｅｒｓ）など）は、Ｃａ２＋イオンに結合する明確な能力を示す。１つの可能性は、Ｃａ２＋イオンとカルボキシル基との結合がセルロース膜上の細孔を明らかに「狭く」し、ウイルスが通過することをより困難にし得ることである。本発明者らはさらに、他の二価イオン（例えば、Ｃｕ２＋）が再生セルロース膜について、とりわけ、ｃｕｐｒａｍｍｏｎｉｕｍが再生に使用された場合に、低レベルでセルロース中に依然として存在するいくつかの残留Ｃｕ２＋について、同様のウイルスクリアランス増強作用を有し得ることを提案する。いくつかの提案されたメカニズムは、ウイルス汚染物質中のＡｓｐまたはＧｌｕ残基が図４に示されるように、修正されたフィルタ膜と結合することを示唆する。ウイルス汚染物質中の再生多孔質セルロース膜のヒドロキシル基及びＡｓｐまたはＧｌｕのカルボキシル基と相互作用し、フィルタ膜へのウイルス結合をもたらすのは、二価金属イオン、すなわちＣｕ２＋ｏｒ  Ｃａ２＋である。生物学的溶液の濾過試験において、再生セルロースフィルタが使用される場合、サイズ排除単独では、通常、約３〜５ＬＲＦのパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）を与える。一旦、あるレベルの二価金属イオンが使用されると、さらなる２〜４ＬＲＦ及び／またはＰＰＶの完全な除去が達成され得る。
【００２７】
言及されるような修正フィルタ膜５０’は、セルロースまたは再生セルロースベースの多孔質表面を含むことができる。未修正形態では、フィルタ膜の細孔が典型的には１〜５００ｎｍの範囲の細孔直径を含むことができる。フィルタ膜が修正されると、フィルタ膜はその孔径を変化させることができる。修正後の細孔径は、おそらく１〜１５ｎｍの範囲である。これらはいくつかの一般的な推定値にすぎず、他の可能性及びサイズも本実施形態の範囲内であることを理解されたい。
【００２８】
ウイルス汚染物質と小粒子：
【００２９】
さらに、本実施形態の修正フィルタ膜５０’は、多数の異なるタイプの生物学的産物を汚染物質から分離するために使用することができることも予想され得る。汚染物質は、任意の数の既知または未知の生物学的物質、小粒子及び／または病原体を含み得る。例えば、ウイルスは、生物学的産物から注意深く分離する必要がある１つの特に困難なタイプの汚染物質を提示する。本実施形態に関連する様々なタイプのウイルスは、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡウイルスであってもよい。例えば、ウイルス汚染物質は、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｉｖｉｒｉｄａｅ、及びＡｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅからなる群から選択されるＤＮＡウイルスを含むことができる。
【００３０】
さらに、ウイルス汚染物は、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｒｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｓｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅからなる群から選択されるＲＮＡウイルスを含むこともできる。
【００３１】
他の可能なウイルス汚染物質もまた予想され、当技術分野で知られている。本リストは、本実施形態の範囲を限定するものではない。
【００３２】
生物学的産物：
【００３３】
本実施形態及び修正フィルタ膜５０’は、生物学的産物２２から種々の汚染物質を分離するために使用され得る。分離され得る生物学的産物２２は、抗体、タンパク質、ペプチド、リガンド、及びレセプターを含み得る。様々なタイプの抗体クラスをウイルス汚染物質から分離することができる。例えば、本実施形態は、ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２抗体負荷で効果的である。さらに、特定のタンパク質及びタンパク質フラグメントは、第ＶＩＩＩ因子ならびに関連するフラグメント及び／または切断されたもしくは欠失したタンパク質及び部分を含み得る。
【００３４】
濾過方法：
【００３５】
濾過システム１０及びフィルタ膜５０及び修正フィルタ膜５０’組成物を説明したが、ここでは本実施形態が目的の生物学的産物２２から汚染物質を分離するためにどのように使用され得るかを記載する。次に、図３を参照して、本実施形態の方法をさらに説明する。本実施形態の方法は、濾過システム１０に装填される粗製負荷溶液１２（図示せず）の調製から始まる。粗製負荷溶液１２は、１つ以上の汚染物質を含む目的の生物学的産物２２を含む。汚染物質は、他のタンパク質または生物学的物質及び／またはウイルスであり得る。また、粗製負荷溶液１２中には、Ｔｗｅｅｎ８０、または１つ以上の追加の賦形剤、及びＣａ２＋などの少なくとも１つの二価金属イオンを含むことができる分析緩衝液が存在する。
【００３６】
粗製負荷溶液１２は、入口または入口ポート７０に装填され、そこで、それは圧力下にあり、収集チャンバ１４に一時的に貯蔵され得る。次に、粗製負荷溶液１２を高圧下に置き、濾過膜５０に接触するまで第１の接続管１６に通す。粗製負荷溶液及びアッセイ緩衝液中に存在する任意の二価金属イオンはフィルタ膜５０の多孔質表面に結合し、それを修正フィルタ膜５０’に変える。次いで、ウイルスまたは汚染物質は修正されたフィルタ膜５０’に結合され、一方、目的の生物学的産物２２は収集容器６０に供給する第２の接続チューブ１８に通過し得る。次いで、目的の最終生物学的生成物２２を収集容器６０から収集することができる。
【００３７】
例
【００３８】
実施例１−濾過緩衝液
【００３９】
完全なウイルス保持を達成するために、生物学的溶液は、中性ｐＨ緩衝液、塩化ナトリウム、少なくとも１つの二価金属イオン、すなわち、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋を含む。非イオン性界面活性剤のような他の成分は、濾過プロセス及びウイルス汚染物質の除去を補助し得る。以下の緩衝液を、一般に、濾過緩衝液マトリックス評価のために使用した。当技術分野で知られている他の緩衝液も使用することができる。
【００４０】
２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１；
２０ｍＭイミダゾール、３７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１；
２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｐｐｍ  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１；
２０ｍＭトリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１；
５０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１；
５０ｍＭクエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ＝  ６．６〜６．８。
【００４１】
濾過緩衝液を調製するか、または購入した。全ての化学物質（例えば、イミダゾール、トリス、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、Ｔｗｅｅｎ８０、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。各緩衝液調製はバランスまたはシリンダーを用いて各成分の適切な量を測定し、調製目標に近い溶液体積を有する５００ｍＬまたは１０００ｍＬ容器中の精製水に全ての成分を溶解及び混合することによって、周囲温度で実施した。緩衝液のｐＨをｐＨメーターで測定し、ＨＣｌまたはＮａＯＨ溶液のいずれかを用いて目標ｐＨ範囲に調整した。精製水を添加することにより、最終緩衝溶液を目標体積にした。調製した各緩衝液の導電率も導電率計で測定した。調製した各緩衝液を、使用前に０．２２μｍフィルタを通して濾過した。
【００４２】
実施例２−ＩｇＧ１濾過負荷物質
【００４３】
５０ｍＭクエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．６〜６．８中の組換えヒトＩｇＧ１の４．９〜１３．１ｍｇ／ｍＬ。この材料は、Ｂａｙｅｒ製造施設から入手した。それは、プロセス中間試料、すなわち精製プロセスにおけるカチオン交換コラム工程からの溶出液であった。
【００４４】
実施例３−ＩｇＧ２濾過負荷物質
【００４５】
５０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．９〜７．１中の組換えＩｇＧ２の５．７〜８．１ｍｇ  ／  ｍＬを他の場所で得た。これは、プロセス中間試料、すなわち精製プロセスにおけるアニオン交換膜吸着器ステップからのフロースルーであった。
【００４６】
実施例４−組換えＦＶＩＩＩ負荷材料
【００４７】
２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０〜１００ｐｐｍ  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１中の組換えヒトＦＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を０．１ｍｇ／ｍＬ。この物質は他の場所で得られた。これは、プロセス中間試料、すなわち精製プロセスにおけるカチオン交換コラム工程からの溶出液であった。
【００４８】
実施例５−ウイルスストック
【００４９】
ＰＰＶ  （ＮＡＤＬ−２株、ＡＴＣＣ  ＃  ＶＲ−７４２）ストックは、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。ベンダ認証ウイルス力価は、使用前に５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）検定を用いて確認した。ウイルスフィルタの負荷材料の急増に使用されたストックウイルスは、約１０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００５０】
実施例６−細胞株及び培地
【００５１】
ＰＫ１３（ＡＴＣＣ  ＃  ＣＲＬ−６４８９）細胞株をＡＴＣＣから購入した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、及び、ペニシリン／ストレプトマイシン（例えば、１００ｘ）を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＰＫ１３細胞培養及びＰＰＶ  ＴＣＩＤ５０アッセイに使用した培養増殖培地及び２Ｘアッセイ培地を、滅菌容器中で適切な容量の成分を混合し、続いて０．２２μｍフィルタを通して濾過することによって調製した。最終的に調製した増殖培地は、ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンであった。最終調製した２Ｘアッセイ培地は、ＤＭＥＭ、４％  ＦＢＳ、２００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンであった。
【００５２】
分析例
【００５３】
実施例１−濾過プロセス
【００５４】
ウイルスフィルタ膜を通る濾過プロセスは一定圧力に設定された加圧空気または蠕動ポンプ（例えば、Ｓｃｉｌｏｇ  ＦｉｌｔｅｒＴｅｃポンプ）によって駆動された（図１参照）。使用前に、フィルタを、当技術分野で公知の気泡点法を用いて膜の完全性について試験した。ウイルスフィルタを水ですすぎ、適切なウイルス濾過緩衝液で平衡化した。
【００５５】
次いで、生物学的負荷物質を、１２〜１４ＰＳＩの一定圧力で、未改変ウイルスフィルタに適用した。ロード（ｌｏａｄ）完了後、フィルタをウイルス濾過緩衝液でさらに追跡した。チェイス（ｃｈａｓｅ）からの流出液を収集し、ロード（ｌｏａｄ）工程からの濾液と合わせた。
【００５６】
各濾過操作において、負荷及び濾液の量を、分析天秤によって測定した。各工程（負荷及び追跡）の持続時間もまた、平均流速の評価のために記録した。
【００５７】
実施例２−ウイルス滴定
【００５８】
ＰＰＶ滴定は、エンドポイント（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）希釈アッセイ、すなわちＴＣＩＤ５０アッセイを用いて行った。ＰＫ１３細胞を、９６ウェルプレート中のウェル（ｗｅｌｌ）あたり２０００〜４０００細胞で播種し、そして安全実験室基準操作手順に従って、加湿インキュベーターにおいて４〜６％ＣＯ２共に３７℃で一晩インキュベートした。試験サンプル及び陽性コントロールサンプルを、ＤＭＥＭ培地中で連続希釈した（例えば、１：３．２連続希釈）。各希釈レベルを、播種したＰＫ１３細胞（と使用済み培地を除去し、ウェル（ｗｅｌｌ）あたり１００μＬ接種）の８ウェル（ｗｅｌｌ）の対応するコラムに接種し、上記インキュベーター中の細胞に１．５〜２．５時間感染させた。最後に、１００μＬの２Ｘアッセイ培地を各ウェル（ｗｅｌｌ）に添加し、アッセイプレートをインキュベーターに戻して、感染及び細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生を６〜７日間継続させた。ＣＰＥを、各サンプル希釈レベルに対応する各ウェルについてスコア付けし、ウイルス力価を、制御されたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌシート中で実行されるＳｐｅａｒｍａｎ  Ｋａｅｒｂｅｒ方程式を使用して計算した。
【００５９】
実施例３−ｒＦＶＩＩＩ活性についての発色アッセイ
【００６０】
ｒＦＶＩＩＩ活性は、ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＦＶＩＩＩキット（ＤｉａＰｈａｒｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．８２４０９４）を使用する発色アッセイ法によって決定した。ＦＶＩＩＩ標準曲線希釈レベルは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ６．０  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．７．４（Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ）に従って１〜１０ｍＩＵ／ｍＬであった。使用したＦＶＩＩＩ標準及びコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌｓ）は、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｉｔｏｎ（ＷＨＯ）ＦＶＩＩＩ標準に対して適格なＢａｙｅｒ内部製品であった。試験サンプルは、初期推定に基づいて、最終ＦＶＩＩＩ濃度が１〜１０ｍＩＵ／ｍＬ範囲と重なるように適切に希釈した。発色反応及び吸光度読み出しは、アッセイキット指示及び標準的な実験室手順に記載された手順に従って行った。試験サンプルのｒＦＶＩＩＩ活性を、上記の線形回帰適合標準曲線から計算した。試験試料中のＦＶＩＩＩ活性の初期推定が、検量線の１〜１０ｍＩＵ／ｍＬ範囲と重複する試料希釈レベルを生成しなかった場合、アッセイを繰り返した。
【００６１】
実施例４−ウイルススパイク緩衝液の濾過
【００６２】
濾過負荷はＰＰＶ試験ウイルス（例えば、１：１００スパイク比）を上記のような目的の緩衝液にスパイクすることによって調製した。標的量の負荷を、１２〜１４ｐｓｉの一定圧力でウイルスフィルタ膜に適用し、濾液を収集した（図１）。スパイクした負荷及び濾液サンプル中のウイルス力価を、ＰＰＶ  ＴＣＩＤ５０アッセイによって決定した。ウイルスクリアランス能の指標であるｌｏｇ１０減少係数（ＬＲＦ）を、フィルタに負荷した総ウイルス感染能と濾液中の総ウイルス感染能とのｌｏｇ１０差として算出した。
【００６３】
図５は、ロード（ｌｏａｄ）中の二価Ｃａ２＋イオン（４３ｍＭ  ＣａＣｌ２）が再生セルロースウイルスフィルタ膜によるＰＰＶ排除を有意に増強したことを示す。濾過液中のウイルス力価はＣａ２＋（パネルＡ）による検知のアッセイ限界を下回り、ロード（パネルＢ）のＣａ２＋の無しと比較して、ＰＰＶクリアランスの少なくとも２ｌｏｇ１０向上（ｔｗｏ  ｌｏｇ１０  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）を示した。
【００６４】
図６は、Ｃａ２＋イオンによる増強されたウイルスクリアランス結果は、Ｔｗｅｅｎ８０（０対５０ｐｐｍ）の存在及び濾過温（周囲対２〜８℃）によって影響されなかったことを示す。４回全ての濾過操作からの濾液中のウイルス力価は、検出のアッセイ限界未満であった。パネルＥに示されるより高い範囲は、大きなサンプル容量のＴＣＩＤ５０アッセイを使用した検出限界の改善によるものであった。
【００６５】
図７は、Ｃａ２＋イオンによる増強されたウイルスクリアランス結果は、異なる緩衝系（２０ｍＭイミダゾール対２０ｍＭトリス、または５０ｍＭトリス対５０ｍＭクエン酸）によって影響されなかったことを示す。Ｃａ２＋では、濾液中のウイルス力価がイミダゾール（パネルＧ）またはトリス（パネルＨ）緩衝液中の検出のアッセイ限界未満であった。Ｃａ２＋なしで、濾液中のウイルス力価が両方の緩衝液中で検出され（パネルＩ及びＪ）、Ｃａ２＋イオンによる少なくとも≧１０００〜１００００倍または３〜４ｌｏｇ１０減少因子（ＬＲＦ）ウイルスクリアランス増強を示した。
【００６６】
例５−  ウイルススパイクＩｇＧ２ロード（ｌｏａｄ）のフィルタリング
【００６７】
精製工程中間体試料の５．７〜８．１ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧ２モノクローナル抗体溶液中にＰＰＶ試験ウイルス（例えば、１：１００スパイク比）をスパイクすることによって、負荷を調製した。負荷を１２〜１４ｐｓｉの一定圧力でウイルスフィルタ膜にかけ、濾液を回収した（図１）。スパイクした負荷及び濾液試料中のウイルス力価を、ＰＰＶ  ＴＣＩＤ５０Ａアッセイによって決定した。ＬＲＦを、フィルタ上にロード（ｌｏａｄ）した全ウイルス感染性と濾液中の全ウイルス感染性との間のｌｏｇ１０差として計算した。
【００６８】
図８は、５．０、１９．７及び３８．８ｍＭ濃度レベルでのＣａ２＋イオンによるＰＰＶクリアランス増強を示し、この増強は、負荷中の４５．４ｍＭ  ＥＤＴＡキレート剤の添加によって効果的に逆転した。Ｃａ２＋イオンは５ｍＭで既に最大効果に達し、試験したＣａ２＋濃度範囲全体でウイルスクリアランス増強について水平状態に達した（ｐｌａｔｅａｕｅｄ）。Ｃａ２＋のためのキレート剤であるＥＤＴＡの添加により、ウイルスクリアランスエンハンスメント影響もはや観察されず、観察されたエンハンスメント影響は、特にＣａ２＋の存在によるものであることを示す。
【００６９】
例６  −  ウイルススパイクされたＩｇＧ１負荷のフィルタリング
【００７０】
精製工程中間体試料の４．９〜１３．１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ１モノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体溶液中にＰＰＶ（例えば、１：１００スパイク比）をスパイクすることによって、負荷を調製した。負荷を１２〜１４ｐｓｉの一定圧力でウイルスフィルタ膜にかけ、濾液を回収した（図１）。スパイクした負荷及び濾液サンプルの両方を、ＰＰＶ  ＴＣＩＤ５０アッセイに供して、ウイルス力価を決定した。ＬＲＦを、フィルタ上に負荷した全ウイルス感染性と濾液中の全ウイルス感染性との間のｌｏｇ１０差として計算した。
【００７１】
図９は１．０、４．８及び１０．０ｍＭ濃度レベルでのＣａ２＋イオンによるＰＰＶクリアランス増強を示し、この増強は、負荷中の１２．０ｍＭ  ＥＧＴＡキレート剤の添加によって有意には逆転しなかったことを示す（おそらく、カルシウムイオンへのＥＧＴＡの弱い結合による）。Ｃａ２＋は１ｍＭで最高作用に近づき、試験したＣａ２＋濃度域ではウイルスクリアランス増強のために水平状態に達し（ｐｌａｔｅａｕｅｄ）、Ｃａ２＋による２〜３ｌｏｇ１０のウイルスクリアランス増強を示した。Ｃａ２＋の代わりにＭｇ２＋に特化したキレーター（ｃｈｅｌａｔｏｒ）であるＥＧＴＡ（ＥＤＴＡではない）の追加は、ウイルスクリアランス強化を完全に逆転させず、強化効果が特にＣａ２＋イオンによってもたらされたことを再確認した。
【００７２】
実施例７−ｒＦＶＩＩＩ負荷の濾過
【００７３】
Ｂａｙｅｒ  ｒＦＶＩＩＩプロセス中間体の非スパイクウイルス濾過負荷サンプルを、種々の濃度のＴｗｅｅｎ８０（０〜１００ｐｐｍ）を含むように調整し、１２〜１４ｐｓｉの一定圧力でウイルスフィルタ膜に適用し、濾液を収集した（図１）。負荷試料及び濾液試料の両方を発色アッセイに供して、ＦＶＩＩＩ活性を決定した。ｒＦＶＩＩＩ収率は、ロード（ｌｏａｄ）中の全ＦＶＩＩＩ活性に対する濾液中の全ＦＶＩＩＩ活性のパーセンテージとして計算した（表１参照）。
【００７４】
表１：。ＣａＣｌ２存在下での再生セルロースフィルタによる組換えヒト第ＶＩＩＩ因子処理中間体からのウイルス除去
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【００７５】
表中のＬＲＦ値は、各プロセス条件についての３回の反復（Ｎ＝３）の平均である。ｒＦＶＩＩＩ−ＷＴ  ：組換えヒト第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）野生型及びｒＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ：ｒＦＶＩＩＩ結合ドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩサブ分子。ＮＴ：ｆＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの直径は測定されなかったが、その大きさはｒＦＶＩＩＩ−ＷＴとほぼ同じである。
【００７６】
組換え野生型（ｗｔ）ヒト第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ−ＷＴ）または組換えヒト第ＶＩＩＩ因子結合ドメイン欠失（ＢＤＤ）（ｒＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ）分子を含む製造工程中間体を、２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｐｐｍ  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１中で調製したウイルス濾過負荷溶液。負荷サンプルは最初に、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＰＰＶ）、Ｒｅｏ  ３  ウイルス（Ｒｅｏ  ３）、ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ（Ｘ−ＭｕＬＶ）、または、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）を個別にスパイクし、次いで、別々に０．４５μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃａｔ．４３０３２０または同等品）のプレフィルタを通して濾過した。使用したｃｕｐｅｒａｍｍｏｎｉａ再生ウイルスフィルタは、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０  Ｎ  （０．００１  ｍ２），  Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２０ＮＺ−００１  （９−１，  Ｋａｎｄａ  Ｍｉｔｏｓｈｉｒｏ−ｃｈｏ，  Ｃｈｉｙｏｄａ−ｋｕ，  Ｔｏｋｙｏ，  １０１−８４８２  Ｊａｐａｎ）であった。ウイルスフィルタを、最初にサンプル緩衝液でフラッシュし、そして個々に試験して、各々が一体であることを確実にした。それぞれのウイルススパイク試料ロード（ｌｏａｄ）を、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０  Ｎ（０．００１ｍ２）ウイルスフィルタを通して濾過した。各ウイルススパイク負荷及び濾液中のウイルス力価を、各ウイルスについて特異的に設計されたＴＣＩＤ５０アッセイによって決定した。ウイルス除去結果は、対数減少因子（ＬＲＦ）を、各濾過実験についての負荷の力価から濾液中のウイルス力価を差し引くことによって計算した。スパイクした各ウイルスについて、３つの別々の実験を行った。各モデルウイルスの３つの実験結果を用いて、９５％信頼区間の平均値を算出した。その結果、再生セルロースウイルスフィルタ（〜２０ｎｍ孔径）は、負荷液（ｌｏａｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）がＣａＣｌ２を含有する場合、感染性アッセイを用いて、４つの様式ウイルスを全て検出限界まで除去した（完全除去）ことが実証された。完全な除去は、ウイルスの形態、サイズ、または全長（ｒＦＶＩＩＩ−ｗｔ）またはＢＤＤ組換えｒＦＶＩＩＩ（表１を参照）に依存しなかった。
【００７７】
図１０は、ウイルスフィルタ膜による、スパイクされたｒＦＶＩＩＩ処理中間体（２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｐｐｍ  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ  ＝  ６．９〜７．１中の約０．１ｍｇ／ｍＬ）からのＰＰＶの完全な除去（検出限界未満まで）を示す。
【００７８】
ＰＰＶ  （例えば、１：５０スパイク比）を、Ｂａｙｅｒ  ｒＦＶＩＩＩ製造キャンペーンプロセスから得られたｒＦＶＩＩＩウイルス濾過負荷サンプルの溶液にスパイクすることによって、ウイルススパイク負荷を調製した。負荷を１２〜１６ｐｓｉの一定圧力でウイルスフィルタ膜にかけ、濾液を回収した（図１）。スパイクした負荷及び濾液サンプルの両方を、ＰＰＶ  ＴＣＩＤ５０アッセイに供して、ウイルス力価を決定した。ＬＲＦを、フィルタ上に負荷した全ウイルス感染性と濾液中の全ウイルス感染性との間のｌｏｇ１０差として計算した。
【００７９】
図１０は、２つのＢａｙｅｒ  ｒＦＶＩＩＩ産物についての完全なＰＰＶクリアランス結果（検出のＴＣＩＤ５０アッセイ限界未満まで）を示す。パネルＸは、全長ｒＦＶＩＩＩタンパク質を含有する負荷材料を用いた３回の複製濾過ランからの平均クリアランス結果である。パネルＹは、Ｂドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩタンパク質を含有する負荷物質を用いた６回の反復濾過ラン（ｒｕｎｓ）からの平均結果である。両方の負荷材料（ｌｏａｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ）は、４３ｍＭのＣａＣｌ２を含む緩衝液中に約０．１ｍｇ／ｍＬのｒＦＶＩＩＩを含有する（図３、パネルＡに示されるのと同じ緩衝系）。パネルＸにおいて観察された比較的低いＬＲＦ範囲は、比較的低い力価のＰＰＶストックウイルス（ｓｔｏｃｋ  ｖｉｒｕｓ）が対応する濾過研究において使用された因子によるものであった。これらの結果は、負荷中のＣａ２＋イオンの存在がフィルタ膜によるウイルスクリアランスを有意に増強するという観察と一致する。
【００８０】
再生セルロース中空糸膜フィルタを、優れたウイルス除去結果及び他の生物学的産生を有する組換えＦＶＩＩＩ産物を分離するために使用した。開発及び最適化プロセスの間に、改変されたウイルス濾過膜及びフィルタが予想外に発見された。さらに、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）のような二価の金属イオンは、再生セルロースベースのウイルスフィルタ（旭化成バイオプロセス社によって製造されたＰｌａｎｏｖａ（商標）２０Ｎ）のパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）除去能力を大幅に高めることができることが発見された。修正フィルタ膜及び多孔質表面は、タンパク質及び抗体の両方の粗製負荷で有効であった。ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓは小型の非エンベロープウイルスであり、除去が困難なウイルスであることから、我々の研究では、Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＰＰＶ）を用いて、修正ウイルスフィルタ膜によるウイルス汚染除去を評価した。
【００８１】
Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓは、ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科の非エンベロープの一本鎖ＤＮＡウイルスである。このウイルスは、極端な化学的及び物理的環境に対して高い耐性を有するので、通常、生物学的製造プロセス工程によるウイルスクリアランスの評価のための非特異的モデルウイルスとして選択される。ＰＰＶウイルス粒子は非常に小さく（１５〜２４ｎｍ）、これはウイルス濾過に基づくサイズ排除による除去を困難にする。
【００８２】
図１１は、２５〜１００ｐｐｍでのＴｗｅｅｎ８０の存在が一貫して高い収率（９４〜１０４％）に対応し、一方、収率はＴｗｅｅｎ８０なしではあまり一貫していなかった（６３〜１０２％）ことを示す。
【００８３】
図１２は、ウイルスフィルタ膜の能力（ＶＭａｘ）が、２５〜１００ｐｐｍのＴｗｅｅｎ８０（２５６〜１２５０Ｍ／Ｌ２）の存在下で、Ｔｗｅｅｎ８０（１４７〜２７０Ｌ／Ｍ２）の非存在下よりも高かったことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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