(57)【要約】本発明は、キナーゼ（例えば、タンパク質およびペプチドのリン酸化を媒介するプロテインキナーゼ）およびホスファターゼ（例えば、タンパク質およびペプチドの脱リン酸化を媒介するプロテインホスファターゼ）を含むリン酸化調節機構を担う酵素のアッセイに関する。本発明はランタニドイオン（例えば、キレート化増強発光を示すユーロピウムイオン）を使用し、キナーゼによるペプチドのリン酸化は、ランタニドイオンとホスフェート基とレポーター基（例えば、錯体状態にある場合に、発光を生じるヒドロキシキノリン）との間で錯体を形成させ得る。従って、発光の決定はキナーゼ活性を示し得る。特定の実施形態では、ホスファターゼ活性の検出のための基質の使用を含み得、脱リン酸化はシグナルアッセイの喪失を生じる。本発明はまた、このようなペプチドまたは錯体を作製および使用するための技術、このようなペプチドまたは錯体が関わるキットなどに関する。
2021517911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１９】
2021517911.tif 000022
を含む第１の部分であって、
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、ｎは、０または正の整数である、
第１の部分を有するペプチド、ならびに
ホスフェート基を含む第２の部分、
を含む組成物であって、
ここで前記第１の部分のＮおよび／またはＯ、ならびに前記第２の部分のホスフェート基は、ランタニドイオンを介して配位される、組成物。
【請求項２】
前記ペプチドは、以下の構造：
【化２０】
2021517911.tif 000023
を含み、ここで：
Ｌｎは、前記ランタニドイオンであり；そして
波線は、前記ペプチドへの前記構造の共有結合を示す、
請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌｎは、複数のＨ２Ｏ分子にさらに配位される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｌｎは、４個または５個のＨ２Ｏ分子にさらに配位される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ランタニドイオンはユーロピウムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ユーロピウムイオンは、３＋状態にある、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ１は、−Ｈである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ２は、−Ｈである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ４は、−Ｈである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ５は、−Ｈである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記構造は、１個のみの−ＳＯ２Ｘを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒ３は、−ＳＯ２Ｘである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｘは、−ＮＲ’Ｒ”である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ’およびＲ”は同一である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｒ’およびＲ”は、各々−ＣＨ３である、請求項１３または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ホスフェート基は、前記ペプチド内のリン酸化したアミノ酸残基の一部である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記リン酸化したアミノ酸はセリンである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リン酸化したアミノ酸はスレオニンである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記リン酸化したアミノ酸はチロシンである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
ｎは０である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
ｎは１である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記構造の中の−（ＣＨ２）ｎ−は、前記ペプチド内の第２のアミノ酸残基に共有結合される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第２のアミノ酸残基はシステインである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記構造の中の−（ＣＨ２）ｎ−は、前記システイン残基の硫黄原子に共有結合される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第２のアミノ酸残基はグリシンである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記構造の中の−（ＣＨ２）ｎ−は、前記ペプチドのアミノ酸骨格に共有結合される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
前記リン酸化したアミノ酸および前記第２のアミノ酸残基は、少なくとも１個のアミノ酸残基によって分離される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記リン酸化したアミノ酸および前記第２のアミノ酸残基は、１〜５個のアミノ酸残基によって分離される、請求項２６または２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドは、１５アミノ酸残基またはこれ未満の長さを有する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基またはこれより大きい長さを有する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ペプチドは、天然のアミノ酸のみを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ペプチドは、少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ペプチドは、配列ＬＶＥＰＬＴＰＣＧＥＡ（配列番号１）を有し、ここで前記ホスフェート基は、前記ペプチド中のスレオニン残基に共有結合され、前記構造の中の−（ＣＨ２）ｎ−は、共通のペプチド中のシステイン残基に共有結合される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
方法であって、前記方法は、
ランタニドイオンを、第１の部分を含むペプチド、およびホスフェート基を含む第２の部分に非共有結合的に結合する工程であって、
前記第１の部分は、以下の構造：
【化２１】
2021517911.tif 000024
を有し、ここで：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、
ｎは、０または正の整数であり、
波線は、前記ペプチドへの前記構造の共有結合を示す、工程；ならびに
前記構造の発光を決定して、前記ペプチドの第１の部分および第２の部分への前記ランタニドイオンの結合を決定する工程、
を包含する方法。
【請求項３５】
前記ペプチドは、リン酸化可能なアミノ酸残基を有する前駆体ペプチドを、前記リン酸化可能なアミノ酸残基をリン酸化し得るキナーゼに曝露して、ホスホペプチドを生成することによって調製される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドは、リン酸化したアミノ酸残基を有する前駆体ペプチドを、ホスファターゼを実質的に含まない溶液に曝露することによって調製される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ランタニドイオンは、前記第２の部分のホスフェート基ならびに前記第１の部分の酸素原子および窒素原子に非共有結合的に結合する、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ランタニドイオンは、前記第２の部分のホスフェート基ならびに前記第１の部分の酸素原子および窒素原子に対してキレート化される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
方法であって、前記方法は、
キナーゼを、ペプチドおよびマグネシウムイオンに曝露する工程であって、ここで前記キナーゼによる前記ペプチドのリン酸化後に、前記マグネシウムイオンは、前記ペプチドに非共有結合的に結合して、錯体を形成する工程；
前記錯体をユーロピウムイオンに曝露する工程；ならびに
前記錯体の発光を決定して、前記キナーゼによる前記ペプチドのリン酸化を決定する工程、
を包含する方法。
【請求項４０】
前記キナーゼは、ＡＧＣキナーゼ、ＣａＭキナーゼ、ＣＫ１キナーゼ、ＣＭＧＣキナーゼ、ＳＴＥキナーゼ、ＴＫキナーゼ、またはＴＫＬキナーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
組成物であって、前記組成物は、
溶解したランタニドイオンおよび以下の構造を有する部分を含むペプチドを含む溶液であって、前記構造は、
【化２２】
2021517911.tif 000025
であって、ここで：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は各々独立して、水素またはアルキルであり、
ｎは、０または正の整数であり、
波線は、前記ペプチドへの共有結合を示す、
溶液を含む、組成物。
【請求項４２】
前記溶液は、キナーゼをさらに含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記溶液は、ホスファターゼをさらに含む、請求項４１または４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
方法であって、前記方法は、
キナーゼを、第１の部分を含むペプチド、およびホスフェート基を含む第２の部分に曝露する工程であって、前記第１の部分は、以下の構造：
【化２３】
2021517911.tif 000026
を有し、ここで：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、
ｎは、０または正の整数であり、
波線は、前記ペプチドへの共有結合を示す、工程；ならびに
６１６±５ｎｍにおいて前記構造の発光を決定することによって、前記ペプチドのリン酸化を決定する工程、
を包含する方法。
【請求項４５】
方法であって、前記方法は、
ホスファターゼを含むと疑われる溶液を、リン酸化したペプチドおよびマグネシウムイオンに曝露する工程；
前記錯体をユーロピウムイオンに曝露する工程；ならびに
前記錯体の発光を決定して、前記ホスファターゼによる前記ペプチドの脱リン酸化を決定する工程、
を包含する方法。
【請求項４６】
方法であって、前記方法は、
ホスファターゼを、第１の部分を含むペプチド、およびホスフェート基を含む第２の部分に曝露する工程であって、前記第１の部分は、以下の構造：
【化２４】
2021517911.tif 000027
を有し、ここで：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、
ｎは、０または正の整数であり、
波線は、前記ペプチドへの共有結合を示す、工程；ならびに
６１６±５ｎｍにおいて前記構造の発光を決定することによって、前記ペプチドの脱リン酸化を決定する工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年３月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６４１，５８７号、Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．による発明の名称「Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｖｉａ  Ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  Ｃｈｅｌａｔｅｓ」（その全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
分野
本発明は一般に、キナーゼ（例えば、タンパク質およびペプチドのリン酸化を媒介するプロテインキナーゼ）およびホスファターゼ（例えば、タンパク質およびペプチドの脱リン酸化を媒介するプロテインホスファターゼ）を含む、リン酸化調節機構を担う酵素のアッセイに関する。明瞭性のために、その提供される記載は、本発明のある種の実施形態を例証するために、プロテインキナーゼに概して焦点を当てるが、他の実施形態において、ホスファターゼが使用され得ることは理解されるべきである。
【背景技術】
【０００３】
背景
プロテインキナーゼは、細胞内での調節の局面に関与する。プロテインキナーゼは一般に、ある種のアミノ酸残基（例えば、セリン、スレオニン、またはチロシン）にホスホリル基を付加する（リン酸化）ことによって作用する。リン酸化はしばしば、酵素活性、細胞位置、または他のタンパク質との会合を変化させることによって、標的タンパク質（基質）の機能変化を生じる。プロテインキナーゼは、広く種々の生物（動物、植物、および細菌が挙げられる）において見出される。タンパク質内のリン酸化事象の検出はしばしば、蛍光を伴って行われるが、バックグラウンド蛍光に起因して、例えば、低分子有機化合物の大きなライブラリーの存在下では困難であり得る。よって、改善が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
本発明は一般に、キナーゼ（例えば、タンパク質およびペプチドのリン酸化を媒介するプロテインキナーゼ）のアッセイに関する。本発明の主題は、いくつかの場合には、相互に関係する生成物、特定の問題に対する代替の解決策、ならびに／または１またはこれより多くのシステムおよび／もしくは物品の複数の異なる用途を含む。
【０００５】
一局面において、本発明は一般に、組成物に関する。１セットの実施形態において、上記組成物は、以下の構造：
【化１】
2021517911.tif 000003
を含む第１の部分であって、
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、ｎは、０または正の整数である、第１の部分を有するペプチド、ならびにホスフェート基を含む第２の部分を含み、ここで上記第１の部分のＮおよび／またはＯ、ならびに上記第２の部分のホスフェート基は、ランタニドイオンを介して配位される。
【０００６】
上記組成物は、別のセットの実施形態において、溶解したランタニドイオンおよび以下の構造：
【化２】
2021517911.tif 000004
を有する部分を含むペプチドであって、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、ｎは、０または正の整数であり、波線は、上記ペプチドの共有結合を示すペプチドを含む溶液を含む。
【０００７】
別の局面において、本発明は一般に、方法に関する。１セットの実施形態において、上記方法は、ランタニドイオンを、第１の部分を含むペプチド、およびホスフェート基を含む第２の部分に非共有結合的に結合する工程であって、ここで上記第１の部分は、以下の構造：
【化３】
2021517911.tif 000005
を有し、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、ｎは、０または正の整数であり、波線は、上記ペプチドへの共有結合を示す、工程；ならびに上記構造の発光を決定して、上記ペプチドの第１の部分および第２の部分への上記ランタニドイオンの結合を決定する工程、を包含する。
【０００８】
上記方法は、別のセットの実施形態によれば、キナーゼを、ペプチドおよびマグネシウムイオンに曝露する工程であって、ここで上記キナーゼによる上記ペプチドのリン酸化後に、上記マグネシウムイオンは、上記ペプチドに非共有結合的に結合して、錯体を形成する工程；上記錯体をユーロピウムイオンに曝露する工程；ならびに上記錯体の発光を決定して、上記キナーゼによる上記ペプチドのリン酸化を決定する工程、を包含する。
【０００９】
さらに別のセットの実施形態において、上記方法は、キナーゼを、第１の部分を含むペプチド、およびホスフェート基を含む第２の部分に曝露する工程であって、上記第１の部分は、以下の構造：
【化４】
2021517911.tif 000006
を有し、ここで：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、ｎは、０または正の整数であり、波線は、上記ペプチドへの共有結合を示す、工程；ならびに６１６±５ｎｍにおいて上記構造の発光を決定することによって、上記ペプチドのリン酸化を決定する工程、を包含する。
【００１０】
なお別のセットの実施形態において、上記方法は、ホスファターゼを含むと疑われる溶液を、リン酸化したペプチドおよびマグネシウムイオンに曝露する工程；上記錯体を、ユーロピウムイオンに曝露する工程；ならびに上記錯体の発光を決定して、上記ホスファターゼによる上記ペプチドの脱リン酸化を決定する工程、を包含する。
【００１１】
上記方法は、さらに別のセットの実施形態において、ホスファターゼを、第１の部分を含むペプチド、およびホスフェート基を含む第２の部分に曝露する工程であって、ここで上記第１の部分は、以下の構造：
【化５】
2021517911.tif 000007
を有し、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１個は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルであり、ｎは、０または正の整数であり、波線は、上記ペプチドへの共有結合を示す、工程；ならびに６１６±５ｎｍにおいて上記構造の発光を決定することによって、上記ペプチドの脱リン酸化を決定する工程、を包含する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、本明細書で記載される実施形態の１またはこれより多くを作製する方法を包含する。さらに別の局面において、本発明は、本明細書で記載される実施形態の１またはこれより多くを使用する方法を包含する。
【００１３】
本発明の他の利点および新規な特徴は、添付の図面とともに考慮される場合、本発明の種々の非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の非限定的な実施形態は、添付の図面を参照しながら、例示によって記載される。その添付の図面は模式図であり、スケールどおりに描かれていることは意図されない。図面において、図示される各同一のまたはほぼ同一の構成要素は、代表的には、１つの数字によって表される。明瞭にする目的で、全ての構成要素が、全ての図面に表示されているわけではなく、当業者が本発明を理解することを可能にするために例示が必要ではない場合、本発明の各実施形態の全ての構成要素が示されているわけではない。図面において：
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、本発明のいくつかの実施形態によるある種の構造を図示する模式図である。
【図２】図２は、本発明の別の実施形態における、Ｅｕ（ＩＩＩ）の付与を図示する。
【図３】図３は、本発明の別の実施形態において、漸増するＥｕ（ＩＩＩ）濃度の存在下で、ペプチドとホスホペプチドとの間の発光変化を図示する。
【図４】図４は、本発明のさらに別の実施形態において、単一濃度のＥｕ（ＩＩＩ）の存在下で、リン酸化したペプチドとリン酸化されていないペプチドとのスペクトル比較を示す。
【図５】図５は、本発明の別の実施形態において、別のペプチドおよびホスホペプチドのＥｕ（ＩＩＩ）滴定曲線を図示する。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｃは、本発明のなお別の実施形態に従って、ＣＳｏｘ基質を使用するＥｕ結合を図示する。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｃは、本発明のなお別の実施形態に従って、ＣＳｏｘ基質を使用するＥｕ結合を図示する。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、本発明の一実施形態において、ＹＥＳキナーゼを使用してスタウロスポリンのＩＣ５０を決定するためのヒドロキシキノリン増感Ｅｕキレートの適用を図示する。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、本発明の別の実施形態において、ＣａＭＫ２δキナーゼを使用して、スタウロスポリンのＩＣ５０を決定するためのヒドロキシキノリン増感Ｅｕキレートの適用を図示する。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、低ＡＴＰ濃度および高ＡＴＰ濃度でのＡＳＫ１キナーゼの活性を評価するためのヒドロキシキノリン増感Ｅｕキレートの適用を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
配列改変体の簡単な説明
配列番号１は、ＬＶＥＰＬＴＰＣＧＥＡであり、ある種のプロリン指向性セリン／スレオニンキナーゼの基質の非限定的な例である；
【００１６】
配列番号２は、配列ＬＶＥＰＬＴＰＣ（Ｓｏｘ）ＧＥＡを有するＳｏｘ−ＯＨであり、ここでＴは、リン酸化されておらず、「Ｓｏｘ」は、以下の構造を有し、この場合、波線は、システインのＳへの結合を示す：
【化６】
2021517911.tif 000008
および
配列番号３は、配列ＬＶＥＰＬＴ＊ＰＣ（Ｓｏｘ）ＧＥＡを有するＳｏｘ−Ｐであり、ここでＴはリン酸化されており（Ｔ＊として示される）、「Ｓｏｘ」は、以下の構造を有し、この場合、波線は、システインのＳへの結合を示す：
【化７】
2021517911.tif 000009
および
配列番号４は、Ａｃ−ＥＥＰＩＹＶＣ（Ｓｏｘ）ＦＧであり、ここで「Ｓｏｘ」は、以下の構造を有し、この場合、波線は、システインのＳへの結合を示す：
【化８】
2021517911.tif 000010
。
【００１７】
配列番号５は、Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｃ（Ｓｏｘ）−Ａｌａ−Ｌｅｕであり、ここで「Ｓｏｘ」は、以下の構造を有し、この場合、波線は、システインのＳへの結合を示す：
【化９】
2021517911.tif 000011
配列番号６は、Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｃ（Ｓｏｘ）−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであり、ここで「Ｓｏｘ」は、以下の構造を有し、この場合、波線は、システインのＳへの結合を示す：
【化１０】
2021517911.tif 000012
および
配列番号７は、Ａｃ−Ｃ（Ｓｏｘ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅであり、ここで「Ｓｏｘ」は、以下の構造を有し、この場合、波線は、システインのＳへの結合を示す：
【化１１】
2021517911.tif 000013
。
【００１８】
詳細な説明
本発明は一般に、キナーゼ（例えば、タンパク質およびペプチドのリン酸化を媒介するプロテインキナーゼ）およびホスファターゼ（例えば、タンパク質およびペプチドの脱リン酸化を媒介するプロテインホスファターゼ）を含む、リン酸化調節機構を担う酵素のアッセイに関する。本発明のある種の局面は、ランタニドイオン（例えば、キレート化増強発光を示すユーロピウムイオン）を使用する。キナーゼによるペプチドのリン酸化は、錯体がランタニドイオンと、ホスフェート基、レポーター基（例えば、錯体化状態にある場合に、発光を生じるヒドロキシキノリン）との間で形成することを引き起こし得る。従って、ある種の実施形態において、発光の決定は、キナーゼ活性を示し得る。ある種の実施形態はまた、ホスファターゼ活性の検出のための基質の使用を含み、ここで脱リン酸化は、シグナルアッセイの喪失を生じる。他の局面は一般に、このようなペプチドまたは錯体を作製および使用するための技術、このようなペプチドまたは錯体が関わるキットなどに関する。
【００１９】
本発明の一局面は、ここで図１Ａに関して示される。この図において、ペプチド１０は、上記ペプチドへと、例えば、ある種のアミノ酸残基（例えば、セリン、スレオニン、またはチロシン）上にホスホリル基２０を転移させるキナーゼ（例えば、プロテインキナーゼ１５）に曝露される。しかし、ある種の実施形態において、リン酸化事象を定性的におよび／または定量的に決定することは、望ましいことであり得る。さらに、他の実施形態において、ホスファターゼが使用され得ることは、理解されるべきである。
【００２０】
図１Ｂに示されるような、いくつかの場合には、これは、ヒドロキシキノリンのような基、およびレポーター基およびホスフェートと非共有結合的に配位し得るイオンを使用することによって達成され得る。従って、この図において、ランタニド（ＩＩＩ）［Ｌｎ（ＩＩＩ）］イオンは、ペプチド１０上のホスフェート２０およびレポーター基２５の両方に錯体化される。
【００２１】
このような化合物の１つの非限定的な例は、ランタニドイオンとしてのユーロピウム（ＩＩＩ）［Ｅｕ（ＩＩＩ）］とともに、図１Ｃにおいて図示される。この図において、ペプチド１０は、ホスフェート基２０およびヒドロキシキノリン基２５の両方を含む。Ｅｕ（ＩＩＩ）は、これらの基の両方に非共有結合的に配位される。適切な波長の入射光３０を印加すると、その錯体は発光し得、いくつかの様式で決定され得る放射光３５を生成し得る。例えば、この放射光は、上記ペプチドがリン酸化されているかまたはそうでないかを（例えば、キナーゼまたはホスファターゼによる）決定するために使用され得る。しかし、ホスフェート基２０が存在しない場合、上記錯体は形成できず（または不十分にしか形成できず）、放射光３５は生成されない（または生成されるが、遙かに弱いシグナルでしか生成されない）。よって、例えば、上記ペプチドをリン酸化し得るキナーゼまたはホスファターゼの存在は、例えば、定性的におよび／または定量的に決定され得る。
【００２２】
しかし、図１Ｃに示されるものの他の放射性の基が、本発明の他の実施形態においても可能であることは、理解されるべきである；同様に、ユーロピウム以外のランタニドがいくつかの場合には使用され得る。また、このようなシステムは、プロテインキナーゼのようなキナーゼの検出のみに限定されない。例えば、一実施形態において、このようなシステムは、ホスフェートが基質上に存在するか否かを決定するために使用され得る。別の実施形態において、ホスホペプチドは、プロテインホスファターゼの活性を測定するために使用され得る。さらに別の実施形態において、上記システムは、ホスファターゼを決定するために使用され得る。
【００２３】
本発明のいくつかの局面において、共通する構造（例えば、ペプチドまたはタンパク質）は、レポーター基を有する第１の部分、およびリン酸化され得る第２の部分を有し得、上記第２の部分がリン酸化される（すなわち、ホスフェート基の共有結合的付加によって改変される）場合、適切なイオン（例えば、ランタニドイオン）へと非共有結合的結合またはキレート化すると、錯体は、上記イオンと、ホスフェート、レポーター基との間に形成する。対照的に、上記第２の部分がリン酸化されない場合、上記錯体は形成できないか、または適切に形成できない。非限定的な例として、上記第２の部分は、リン酸化されなくてもよい。なぜならキナーゼは存在しないか、もしくは上記ホスフェート基がその後除去されるか、または上記第２の部分がある理由で、例えば、変異、干渉する化学反応、立体障害などに起因してリン酸化され得ないからである。
【００２４】
いくつかの場合には、上記錯体は、形成した場合、発光シグナルによって決定され得る。例えば、上記錯体が存在する場合、適切な波長の入射光は、上記錯体に発光させて、例えば、定性的にまたは定量的に決定され得る放射光を生じ得る。いくつかの実施形態において、上記錯体は、ヒドロキシキノリン基を含み得る。例えば、上記錯体は、以下の構造：
【化１２】
2021517911.tif 000014
を有し得る。この構造において、ホスフェートは下にあり、レポーター基（この例では、ヒドロキシキノリン基）は、上にあり、両方がランタニドイオン（Ｌｎ）に対してキレート化される。波線は、例えば、ペプチドまたはタンパク質のような共通の構造への結合を示す。いくつかの実施形態において、他の共通の構造が存在し得る。例えば、上記共通の構造は、核酸、グリカン、リン脂質、または合成ポリマーであり得る。
【００２５】
さらに、Ｌｎがまた、Ｈ２Ｏのような他の配位子（ここでは明瞭性のために例証されない）に錯体化することは、理解されるべきである，例えば、上記Ｌｎは、全てにおいて６個、７個、８個、９個、またはこれより多くの配位子に対して配位する錯体を形成し得る。従って、例えば、上記のＬｎはまた、例えば、示される結合に加えて、２個、３個、４個、５個、またはこれより多くのＨ２Ｏ分子に対して配位され得る。
【００２６】
上記共通の構造がペプチドまたはタンパク質である場合、２つの結合点の間に任意の適切な数のアミノ酸残基が存在し得る。例えば、２つの結合点の間に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはこれより多くのアミノ酸残基が存在し得、いずれか１個が、Ｎ末端またはＣ末端に近くてもよい。上記ペプチドまたはタンパク質自体は、任意の適切な数のアミノ酸残基を有し得る。例えば、上記ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、または少なくとも１００個のアミノ酸残基を有し得る。いくつかの場合には、上記ペプチドまたはタンパク質は、７５個未満、５０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、または１０個未満のアミノ酸残基を有し得る。上記アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸および／または合成アミノ酸を含んでいてもよい。
【００２７】
言及されるように、上記共通の構造の第２の部分は、リン酸化され得る、例えば、上記で示されるホスフェート基を導入し得る部分を含み得る。例えば、上記第２の部分は、セリン、スレオニン、またはチロシンを含み得、ここでホスホリル基は、アミノ酸側鎖中の酸素に転移される。いくつかの場合には、上記第２の部分は、側鎖中にヒドロキシル基を含む、天然に存在するアミノ酸残基または合成アミノ酸残基を含み得る。さらに、ある種の実施形態において、上記第２の部分は、ヒスチジン、リジン、もしくはアルギニンを（これらは、ホスホルアミデート結合を通じてリン酸化され得る）、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸を（これらは、混合した無水物連結を通じてリン酸化され得る）を含み得る。従って、非限定的な例としては、リン酸化可能なアミノ酸（例えば、セリン、スレオニン、またはチロシン）は、図２に示され、配列番号２においてＳｏｘ−ＯＨとして定義されるもののような遊離−ＯＨ基を有し得る；リン酸化（例えば、キナーゼによる）すると、上記ＯＨ基は、−ＯＰＯ３＝ホスフェート基（すなわち、この図において示されるとおりのかつ配列番号３においてＳｏｘ−Ｐとして定義されるとおりの−ＯＰＯ３＝）に変換され得る。
【００２８】
上記ランタニドイオンは、任意の適切なランタニドイオンであり得る。一実施形態において、上記ランタニドは、ユーロピウムである。他の実施形態において、上記ランタニドは、サマリウム、テルビウム、またはジスプロシウムであり得る。大部分の場合には、上記錯体内のランタニドは、＋３状態にあるが、＋２状態にあってもよい。
【００２９】
上記錯体の第１の部分は、ある種の実施形態において、ヒドロキシキノリンのようなレポーター基であり得る。いくつかの場合には、上記キノリンは、以下の構造：
【化１３】
2021517911.tif 000015
，
を有し得、ここで波線は、ペプチドまたは他の共通の構造への共有結合（例えば、以下で考察されるとおり）を示す。いくつかの場合には、ランタニドイオンのキレート化、配位または非共有結合的結合は、酸素原子および窒素原子で起こり得る。さらに、いくつかの場合には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素または−ＳＯ２Ｘ部分であり得、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの１個、２個、またはこれより多くは、−ＳＯ２Ｘ部分である。このような構造中のＸは、ある種の場合には、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ”であり得、ここでＲ’およびＲ”は、各々独立して、水素またはアルキルである。Ｒ’およびＲ”は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。上記アルキル基は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、またはこれより多くの炭素原子を有していてもよく、置換されていなくてもよいし、置換されていてもよく、環状であってもまたは直線状であってもよく、飽和されていても不飽和であってもよい。アルキル基の非限定的な例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、シクロペンチル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどが挙げられる。置換されたアルキルの非限定的な例としては、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、１−クロロエチル、２−クロロエチルなどが挙げられる。
【００３０】
非限定的な例としては、１セットの実施形態において、上記ヒドロキシキノリンは、以下の構造：
【化１４】
2021517911.tif 000016
を有し、すなわち、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、各々水素であり、Ｒ３は、−ＳＯ２Ｘであり、ここでＸは、ＮＲ’Ｒ”であり、Ｒ’およびＲ”の各々は、独立してメチルである。他の実施形態において、上記ヒドロキシキノリンは、以下のような構造：
【化１５】
2021517911.tif 000017
を有し得る。さらに、先に言及されるように、２個またはこれより多くの−ＳＯ２Ｘ基は、例えば、キノリンまたはいくつかの場合には他のレポーター基に置換基として存在し得る。
【００３１】
言及されるように、上記レポーター基は、波線によって示される位置において、共通の構造（例えば、ペプチドまたはタンパク質）に共有結合され得る。いくつかの実施形態において、結合を促進するために、上記レポーター基内に１個またはこれより多くのリンカー（例えば、１個またはこれより多くの−ＣＨ２−基）が存在し得る（すなわち、以下の構造：
【化１６】
2021517911.tif 000018
ここでｎは、０または正の整数である（例えば、１、２、３、４、５など）
にあるとおり）。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記レポーター基は、上記ペプチドまたはタンパク質内にアミノ酸残基の側鎖（すなわち、骨格構造…−ＮＨ−ＣＨＲ−Ｃ（＝Ｏ）−…におけるＲ）であり得る（従って、これは、α−ＣＨが、上記レポーター基によって置き換えられる、グリシンに類似の構造を有し得る）。別のセットの実施形態において、上記レポーター基は、アミノ酸残基の側鎖に結合され得る。例えば、上記レポーター基は、上記ペプチドまたはタンパク質内のシステイン残基の硫黄に共有結合され得、例えば、図２の例に示されるように、ジスルフィド結合（例えば、上記システイン内のチオール基に対する上記レポーター基内のチオール基の反応の際に）またはチオエーテル結合（例えば、上記システイン内のチオール基に対する上記レポーター基内のハロアルキル基の反応の際に）を形成し得る。別の非限定的な例としては、カルボン酸への上記レポーター基内のアミンの反応は、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸のようなアミノ酸残基に対してアミド結合を形成するために使用され得る。
【００３３】
よって、非限定的な例としては、上記レポーター基は、以下の構造：
【化１７】
2021517911.tif 000019
を有し得、例えば、ここで上記−（ＣＨ２）ｎ−基は、システイン残基の硫黄に、ジスルフィド基（例えば、システイン残基の）に、アミド結合に、骨格構造に（例えば、骨格構造…−ＮＨ−ＣＨＲ−Ｃ（＝Ｏ）−…におけるＲとして）などに結合される。他の実施形態において使用指され得る他のレポーター基としては、本明細書で記載されるもののうちのいずれかを含む。上記レポーター基は、共通のペプチドまたは他の共通の構造の一部であり得る。このようなペプチドの非限定的な例は、実施例２により詳細に考察される、ＬＶＥＰＬＴＰＣＧＥＡ（配列番号１）である。
【００３４】
よって、言及されるように、錯体は、レポーター基、ホスフェート誘導体、およびランタニドイオンが存在する場合に形成され得る。非限定的な例としては、Ｅｕ（ＩＩＩ）が存在する場合、以下のような錯体が形成され得る（繰り返すが、他の配位子（例えば、Ｈ２Ｏ）への配位は、明瞭性の目的のためにここでは図示されない）：
【化１８】
2021517911.tif 000020
。Ｅｕ（ＩＩＩ）は、例えば、８座または９座であり得る。このような錯体は、よって、例えば、ランタニドイオン（例えば、Ｅｕ（ＩＩＩ））が存在するか否かを決定するために、および／またはリン酸化が起こったか否かを決定するために使用され得る。非限定的な例としては、ある種のアミノ酸は、キナーゼ（例えば、プロテインキナーゼ）との反応の際にリン酸化され得るので、この錯体の存在は、キナーゼの存在および／または活性を決定するために使用され得る。
【００３５】
上記ペプチド（または他の構造）の濃度は、例えば、０．１μＭ〜１０ｍＭの間であり得る。例えば、上記濃度は、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも３００μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、および／または１０ｍＭ、以下、３ｍＭ以下、１ｍＭ以下、３００μＭ以下、１００μＭ以下、３０μＭ以下、１０μＭ以下、３μＭ以下、１μＭ以下、または０．３μＭ以下（これらの範囲の内のいずれかの組み合わせを含む）であり得る。任意の適切なホスホリルドナー供給源が使用され得、例えば、１μＭ〜１０μＭの間の濃度での、例えば、アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）が使用され得る。しかし、他の濃度が、他の実施形態において使用され得る。当業者は、このようなペプチドを、例えば、標準的な固相ペプチド合成と一緒に、標準的な（Ｎ−α）−Ｆｍｏｃ−アミノ酸保護化学のような技術を使用して調製し得る。
【００３６】
いくつかの場合には、アミノ酸の保護および選択的脱保護は、例えば、側鎖または残基を改変するために使用され得る。例えば、Ｏ−アリルエステル（ＯＡｌｌ）（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖における例えば、カルボキシル基に関して）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）（例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖における例えば、アミノ窒素に関して）、ｐ−メトキシトリチル（ＭＭＴ）またはアセトアミドメチル（Ａｃｍ）（例えば、システインのスルフヒドリルに関して）のような直交側鎖保護技術（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が、使用され得る。非限定的な例としては、ＯＡｌｌおよびＡｌｌｏｃは、Ｐｄによって除去され得、Ａｃｍは、ヨウ素処理によって除去され得、ＭＭＴは、温和な酸処理によって除去され得る。
【００３７】
キナーゼの例としては、セリン／スレオニンおよびチロシンキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。上記キナーゼの濃度は、非限定的な例として、約１ｐＭ〜約１μＭの範囲に及び得る。例示的なキナーゼとしては、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｃａ／カルモジュリン依存性キナーゼ、ＡＭＰ活性化キナーゼ、ｓ６キナーゼ、ｅＩＦ−２キナーゼ、ｐ３４ｃｄｃ２プロテインキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、カゼインキナーゼ−２、カゼインキナーゼ−１、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３、Ｔｙｒ特異的プロテインキナーゼが挙げられる。プロテインキナーゼの他の非限定的な例としては、ＡＧＣキナーゼ（例えば、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＧなど）、ＣａＭキナーゼ（カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ）、ＣＫ１キナーゼ（カゼインキナーゼ１）、ＣＭＧＣキナーゼ（例えば、ＣＤＫ、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３、ＣＬＫキナーゼ）、ＳＴＥキナーゼ（酵母Ｓｔｅｒｉｌｅキナーゼ）、ＴＫキナーゼ（チロシンキナーゼ）、ＴＫＬキナーゼ（チロシン−キナーゼ様キナーゼ）が挙げられる。プロテインキナーゼとしてはまた、セリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼ（例えば、ＣＫ２、ＰＫＡ、ＰＫＣ、Ｍｏｓ／Ｒａｆキナーゼ、ＭＡＰＫ、ＣａＭキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＫＢ、ＩＲＡＫ−１など）、チロシン特異的プロテインキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＳＣＦなど）が挙げられる。キナーゼのなお他の例としては、脂質キナーゼ、炭水化物キナーゼ、ヌクレオシド−ホスフェートキナーゼ、およびヌクレオシド−ジホスフェートキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明が、キナーゼ検出のみに限定されないことは、理解されるべきである。例えば、ある種の実施形態において、ペプチドまたは他の構造のリン酸化の状態が所望され得る、すなわち、必ずしもキナーゼに曝露されているものではない。
【００３８】
さらに、先に考察されるように、本発明のある種の実施形態は、一般に、ホスファターゼ（チロシンホスファターゼ、セリンホスファターゼなどを含む）に関する。いくつかの場合には、上記ホスファターゼは、比較的決まりがなく（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）、１種より多くの基質を認識してもよい。
【００３９】
言及されるように、上記錯体は、存在する場合、ある種の局面に従って発光放射によって決定され得る。いくつかの場合には、上記錯体は、適切な波長の入射光に曝露される場合に上記錯体によって放射される光を決定することによって、定性的にまたは定量的に、決定され得る。当業者に公知の任意の方法は、例えば、蛍光光度計、蛍光分光光度計、蛍光プレートリーダー、光電子倍増管、アバランシェフォトダイオードなどを含め、発光を決定するために使用され得る。
【００４０】
いくつかの場合には、およそ３６０ｎｍの入射光が、上記錯体を刺激するために使用され得る。上記入射光は、例えば、３６０±２０ｎｍ、３６０±１０ｎｍ、または３６０±５ｎｍの波長を有し得る。くつかの場合には、他の周波数の光（または周波数分布）が使用され得る。
【００４１】
ある種の実施形態において、ユーロピウムイオンまたは他のランタニドイオンは、それらの放射周波数、および／またはそれらの寿命（すなわち、励起後）に起因して使用され得る。例えば、ある種の場合には、ユーロピウムイオンは、およそ６１５ｎｍ〜６２０ｎｍおよびおよそ５８０ｎｍ〜６００ｎｍの放射波長を示し得る。例えば、上記放射は、およそ６１６ｎｍ、例えば、６１６±２０ｎｍ、６１６±１０ｎｍ、もしくは６１６±５ｎｍを、または他の関連Ｅｕ（ＩＩＩ）発光放射バンドにおいて、モニターされ得る。このような波長は、例えば、他の有機種または生物学的種から、驚くほどわずかなバックグラウンド干渉を与え得る。
【００４２】
さらに、キレート化したユーロピウムイオン錯体は、ナノ秒の規模で寿命を示し得る非ランタニドイオンおよび有機性発蛍光団とは対照的に、マイクロ秒〜ミリ秒の規模の寿命を示し得る。寿命が長いほど、それによってより容易な検出を可能にし得る。例えば、場合によっては、寿命が長いほど、干渉するバックグラウンドの有機種または生物学的種からの放射が、例えば、ランタニドイオン発光を決定する前に、短時間の遅延を使用することによって「ゲート」アウト（ｇａｔｅｄ  ｏｕｔ）されることを可能にし得る。よって、ユーロピウムイオン（または他のランタニドイオン）を含む錯体は、ある種の実施形態において、他の非ランタニドイオンキレートより検出しやすいこともある。
【００４３】
いくつかの局面において、上記ユーロピウムイオン（または他のランタニドイオン）は、例えば、本明細書で示されるもののような構造を形成するために、レポーター基およびホスフェート基と直接的に、非共有結合的に結合し得るか、またはキレート化し得る。例えば、溶液は、リン酸化されている（例えば、キナーゼへの曝露の際に）と疑われるペプチド（または本明細書で考察されるとおりの他の構造）を含み得る。上記ペプチドはまた、レポーター基を含み得る。上記溶液はまた、ユーロピウムイオンおよび／または他のランタニドイオンを含み得、これらのイオンは、例えば、上記溶液が形成される場合に、またはその後に、添加され得る。例えば、このようなイオンは、キナーゼまたはホスファターゼへのペプチドまたは他の構造の曝露の前または後に添加され得る。いくつかの場合には、錯体を形成するためのユーロピウムイオンの結合は、例えば、周囲の温度および／または圧力下で自発的に起こり得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、錯体は、最初に、他のイオンを使用して形成され得、そのイオンは、次いで、ユーロピウムイオンまたは他のランタニドイオンと交換または置き換えられ得る。例えば、いくつかの場合には、マグネシウムのようなイオンが、最初に、レポーター基およびホスフェート基へと錯体化し、次いで、上記イオンは、ユーロピウムイオンまたは他のランタニドイオンと交換または置き換えられ得る。このような反応の非限定的な例は、図２に示される。他のイオンおよびランタニドイオンはともに、最初に存在してもよいし、いくつかの場合には、上記ランタニドイオンは、上記錯体の形成後に添加されてもよい。上記錯体内でのイオン交換は、部分的であっても完全であってもよく、すなわち、上記錯体内のイオンの１００％またはより小さなパーセンテージが、イオン濃度、温度、持続時間などのような要因に依存して、ユーロピウムまたは他のランタニドイオンによって置き換えられてもよい。
【００４５】
本明細書で考察されるとおりの方法は、インビトロまたはインビボで使用され得る。いくつかの適用において、反応は、その適用に依存して、適切なイオン、ホスフェート、および／またはキナーゼ、ホスファターゼなどを含む緩衝液中で行われ得る。適切な緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＲＩＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
いくつかの場合には、上記反応は、細胞の中で起こり得る。上記細胞は、十分なキナーゼ、ホスファターゼ、Ｍｇ２＋、ＡＴＰ供給源などを、例えば、サイトゾルの中に含み得る。いくつかの場合には、さらなるイオン（例えば、ユーロピウムまたは他のランタニド）はまた、添加され得る。ある種の実施形態において、細胞インターナリゼーション配列が、使用され得る。細胞インターナリゼーション配列の非限定的な例としては、透過因子（ｐｅｎｅｔｒａｉｎｔ）、ＨＩＶ−ＴＡＴドメインおよびポリアルギニン配列が挙げられる。しかし、細胞は必要とされず、いくつかの実施形態において、本明細書で考察されるもののような反応は、インビトロで起こり得ることは、理解されるべきである。
【００４７】
さらに、いくつかの実施形態において、それらのユーロピウムイオンキレートまたは他のホスホペプチド−ランタニドイオン錯体としての上記ヒドロキシキノリン改変ホスホペプチドは、ホスファターゼ基質として使用され得る。いくつかの場合には、ホスファターゼ活性は、ホスフェートを除去し、結果として発光は、上記ランタニドに対する親和性の低減に起因して減少する；従って、キナーゼ基質として働くヒドロキシキノリン改変ペプチドのうちのいくつかまたは全ては、ある種の実施形態において、一旦リン酸化された後、ホスファターゼ基質として同様に働き得る。
【００４８】
本明細書で記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおいて、上記配列が、任意の適切なＣ末端、例えば、アミド（例えば、一級アミド）でキャップされるか、またはキャップされないものを有し得る；独立して、上記配列が、任意の適切なＮ末端、例えば、遊離であるか、またはＮ−アセチル化されるものを有し得ることは理解されるべきである。
【００４９】
米国特許第７，２６２，２８２号および同第７，９６４，７２９号は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【００５０】
さらに、Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．による２０１８年３月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６４１，５８７号、発明の名称「Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｖｉａ  Ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  Ｃｈｅｌａｔｅｓ」は、その全体において本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本発明のある種の実施形態を例証することが意図されるが、本発明の全範囲を例示するわけではない。
【００５２】
実施例１
この実施例は、Ｍｇ（ＩＩ）結合ＣＳｏｘ−ホスホ−ペプチドキレートの形成に起因する４８５ｎｍでの蛍光リードアウトを使用する選択的プロテインキナーゼ活性アッセイを例証する。図２もまた参照のこと。
【００５３】
同じペプチドをまた、クエンチ点リードアウトにおいて、例えば、酵素反応が停止されているか否かに関わらず、アッセイ混合物をＥｕ（ＩＩＩ）イオンを含む緩衝液に添加する速度論分析の最後に付与し得る。Ｅｕ（ＩＩＩ）は、Ｍｇ（ＩＩ）に置き換わり、およそ６１６ｎｍの最大発光での増感放射を示す新たなキレートを形成する。これは、バックグラウンド干渉がほとんどないかまたは全くない可能性がある波長において存在する。上記Ｅｕ（ＩＩＩ）キレートの比較的長い寿命に起因して、任意の干渉するバックグラウンド蛍光有機種からの任意の放射形態は、ある種の実施形態において、Ｅｕ（ＩＩＩ）発光データを集める前に、短時間の遅延（例えば、１０〜５００マイクロ秒またはこれより長い）を適用することによって、「ゲート」アウトされ得る。
【００５４】
実施例２
この実施例は、本発明のある種の実施形態に従って、キナーゼ活性をプローブするＳｏｘ−Ｅｕペプチドセンサーを例証する。
【００５５】
図２は、この実施例においてプロテインキナーゼ活性をプローブするＥｕ（ＩＩＩ）ベースのＳｏｘセンサーの模式的代表図を示す。このＳｏｘ含有基質はサイレントであるが、リン酸化すると、その発色団は、Ｅｕ（ＩＩＩ）に結合し得、キレート化増強発光を受け得る。
【００５６】
この実施例において使用される機器類は、以下のとおりである。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｌａｂｔｅｃｈ）であった。蛍光光度計は、時間分解蛍光測定のために装備されたＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）蛍光分光光度計（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ）であった。プレートは、Ｇｒｅｉｎｅｒアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）、９６ウェル蓋なし平底、中程度結合表面、無滅菌、黒色ポリスチレンであった。
【００５７】
ストック溶液に関しては、最高純度および最低金属イオン含有量の試薬のみを使用した。上記ペプチドのストック溶液を、再蒸留水中で調製し、濃度をＵＶ−Ｖｉｓによって決定した（１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡを有する０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で、３５５ｎｍにおいて発蛍光団単位、５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホンアミド）−８−ヒドロキシ−２−メチルキノリンの決定された吸光係数ε３５５（エプシロン）＝８２４７Ｍ−１ｃｍ−１に基づく）。３つの別個の溶液からの値の平均（各々、ストック溶液の異なる容積を使用して調製）を、上記ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で読み取った。精製したペプチドストック溶液は、４℃において少なくとも６ヶ月間、または−２０℃においてより長期間にわたって貯蔵できた。
【００５８】
５０ｍＭの塩化ユーロピウム（ＥｕＣｌ３）ストック溶液（９９．９９％  微量金属基準，  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、超純水中で調製した。５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ）を調製し、ＮａＯＨ（９９．９９８＋％，  Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液でｐＨ７．５に調節した。５Ｍ  ＮａＣｌを、塩化ナトリウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ）を超純水中に溶解させることによって調製した。
【００５９】
発光実験を、以下のとおりに行った。時間分解放射測定を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）蛍光分光光度計で行った。スペクトルを、４１０〜７００ｎｍの間で記録し、全ての測定を以下の設定を使用して行った：励起波長３６０ｎｍ；遅延時間０．４ｍｓ；ステップ幅１．０ｎｍ；放射バンド幅８ｎｍ；ゲイン：３０００；  焦点高８ｎｍ；  ２０フラッシュ／ウェル。上記スペクトル全てを、上記溶媒溶液のブランクスキャンを差し引くことによって、バックグラウンド発光に対して補正した。
【００６０】
ホスホペプチド（Ｓｏｘ−Ｐ）とリン酸化していないバイオセンサ（Ｓｏｘ−ＯＨ）との比較。    ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中３０℃でのホスホペプチドＳｏｘ−Ｐ（５μＭ）およびその相当するリン酸化していないバイオセンサＳｏｘ−ＯＨ（５μＭ）の時間分解発光スペクトルを、蛍光光度計において記録した。発光の差異を、合成ホスホペプチドとリン酸化されていないペプチドとの最大放射波長（６２０ｎｍ）における発光強度を比較することによって決定した。報告した値は、３回の別個の実験の平均である。
【００６１】
図３は、異なる濃度のＥｕＣｌ３を使用して、リン酸化したペプチド（Ｓｏｘ−Ｐ）とその相当する基質（Ｓｏｘ−ＯＨ）との間の発光差異を示す。図４は、２０μＭのＥｕＣｌ３の存在下で、リン酸化したペプチド（Ｓｏｘ−Ｐ，  ５μＭ）およびリン酸化されていないペプチド（Ｓｏｘ−ＯＨ，  ５μＭ）のスペクトルの比較を示す。
【００６２】
Ｅｕ（ＩＩＩ）解離定数（ＫＤ）の決定。    Ｅｕ（ＩＩＩ）滴定を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５μＭのホスホペプチドＳｏｘ−Ｐ（５μＭ）またはその相当するリン酸化されていないバイオセンサＳｏｘ−ＯＨ（５μＭ）を含む緩衝液中で、合計容積２００マイクロリットルにおいて３０℃において行った。ＥｕＣｌ３ストック溶液のアリコートを添加し（ウェル中の最終ＥｕＣｌ３濃度については、およそ２．５〜６０００μＭの範囲にある）、データを蛍光光度計において記録した。データを、プログラムＧｒａＦｉｔ  ７でフィットさせた。報告した値は、３回の別個の実験の平均である。
【００６３】
図５は、Ｓｏｘ−ＯＨおよびＳｏｘ−ＰのＥｕ（ＩＩＩ）滴定曲線を示す。表１は、ペプチド配列およびＥｕ（ＩＩＩ）の解離定数を示す。
【表１】
2021517911.tif 000021
【００６４】
実施例３
この実施例は、ある種のチロシンキナーゼの活性を決定するためにＣＳｏｘ基質を使用する結合の例示を示す。この実施例において使用される機器類は、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２マイクロプレートリーダーであった。この反応において、図２に示されるように、１００マイクロ秒遅延は、Ｅｕ（ＩＩＩ）の結合が示されるとおりの錯体内で決定されることを可能にする。＞６００ｎｍ放射での時間分解蛍光は、化合物干渉の排除を可能にする。特に、この実施例において、キナーゼ活性を、ユーロピウムイオンとの組み合わせにおいて、ＣＳｏｘペプチドＡｃ−ＥＥＰＩＹＶＣ（Ｓｏｘ）ＦＧ（配列番号４）を使用する蛍光によって決定した。
【００６５】
使用される反応条件は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５〜１０００μＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  Ｂｒｉｊ−３５、１％  グリセロール、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＣＳｏｘペプチド、１〜５ｎＭ  ＹＥＳ（キナーゼ）、アミノ酸１−５４３（Ｃａｒｎａ  Ｂｉｏ）を含んだ。
【００６６】
上記反応を、５０マイクロリットル  最終反応容積において、１％  グリセロール最終に対して、１０マイクロリットル  ＣＳｏｘ−ペプチド（５×）、ＡＴＰおよびＤＴＴ（１．６７×）を有する反応混合物  ３０マイクロリットル、３０℃において５分間の予備インキュベーション（ＥＤＢ／ＹＥＳを除く全ての構成要素）、１０マイクロリットル  酵素希釈緩衝液（１×）またはＹＥＳ（ＥＤＢ中５×）を使用して設定した。
【００６７】
読み取りを、励起波長３６０ｎｍおよび放射波長４８５ｎｍ（フィルター，  ２０ｎｍまたは４０ｎｍ  バンド幅）で速度論的に、プレートの頂部から蛍光強度を測定して行った。エンドポイントアッセイに関して、ユーロピウムイオン（５０〜１，０００μＭ）の添加後に、蛍光シグナルを、励起波長３６０ｎｍおよび放射波長６２０ｎｍ（フィルター，  ゲイン＝１００）を使用して、または５００〜６８０ｎｍの波長スキャンとして時間分解蛍光（０．１  ｍｓｅｃ遅延）およびゲイン２００を使用して、決定した。
【００６８】
上記酵素希釈緩衝液（ＥＤＢ）は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％  Ｂｒｉｊ−３５、５％  グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。従って、実際の最終反応濃度は、５４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１２％  Ｂｒｉｊ−３５、１％  グリセロール、１．２ｍＭ  ＤＴＴ、および０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡであった。酵素を除く全ての構成要素を、３０℃に平衡化した。反応を、Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ハーフエリア９６ウェル、白色平丸底（ｆｌａｔ  ｒｏｕｎｄ  ｂｏｔｔｏｍ）ポリスチレンＮＢＳマイクロプレートにおいて、蒸発および生じるドリフトを排除するために、光学的に透明な接着フィルム（ＴｏｐＳｅａｌＡ−Ｐｌｕｓプレートシール，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ローラーで提供））を使用してシールした後に実行した。
【００６９】
図６Ａ〜６Ｃは、１ｎＭ  ＹＥＳおよびＣＳｏｘ基質Ａｃ−ＥＥＰＩＹＶＣ（Ｓｏｘ）ＦＧ（配列番号４）を使用して、５０〜３００μＭを使用するＥｕ（ＩＩＩ）滴定の結果を示す。反応を、１ｎＭ  ＹＥＳ、１０μＭ  ＣＳｏｘ基質、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＡＴＰ、および１０〜３００μＭ  ユーロピウムで３０分間実行した。Ｅｕ（ＩＩＩ）の存在下でのシグナルは、ブランクまたはコントロールより遙かに大きく、高濃度であるほど概してシグナルは大きかった。Ｚ’値は、０．５より大きく、試験した範囲全体で優れたアッセイであると考えられた。
【００７０】
実施例４
この実施例はＹＥＳキナーゼを使用してスタウロスポリンのＩＣ５０を決定するための、Ｔｈｒ−Ｖａｌ−ＣＳｏｘ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号５）コアを有するアセチルおよび一級アミドキャップしたトリデカペプチドとのヒドロキシキノリン増感Ｅｕキレートの適用を示す。速度論  対  エンドポイント（Ｅｕ）の比較アッセイを、図７Ａ〜７Ｃに示す。反応を、１ｎＭ  ＹＥＳ、１０μＭ  ＡＱＴ０１０４、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ＡＴＰとともに３０分間行い、次いで、２００μＭのＥｕを添加した。これらの結果は、ＰＥ／ｃａｌｉｐｅｒ  ＭＢＳアッセイを使用して、ＹＥＳに関して報告した値と一致した。
【００７１】
実施例５
この実施例は、ＣａＭＫ２δキナーゼを使用してスタウロスポリンのＩＣ５０を決定するための、Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＣＳｏｘ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号６）コアを有するアセチルおよび一級アミドキャップしたトリデカペプチドとのヒドロキシキノリン増感Ｅｕキレートの適用を例証する。速度論  対  エンドポイント（Ｅｕ）の比較アッセイを、図８Ａ〜８Ｃに示す。両方の図において、濃度は、以下のとおりであった：  ＣａＭＫ２δキナーゼ、１ｎＭ；  ＡＴＰ、５μＭ；およびペプチド、１０μＭ。
【００７２】
実施例６
この実施例は、低ＡＴＰ濃度および高ＡＴＰ濃度でのＡＳＫ１キナーゼの活性を評価するための、Ａｃ−ＣＳｏｘ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ（配列番号７）コアを有するアセチルおよび一級アミドキャップしたヘキサデカペプチドとのヒドロキシキノリン増感Ｅｕキレートの適用を例証する。結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。高Ｓ／Ｂ（シグナル対バックグラウンド）（４．５またはこれより高い）およびＺ’（低ＡＴＰ条件に関しては０．６および高ＡＴＰ条件に関しては０．８６）が観察された。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態が、本明細書で記載されかつ例証されてきたが、当業者は、機能を実施するならびに／または結果および／または本明細書で記載される利点のうちの１またはこれより多くを得るために、種々の他の手段および／または構造に容易に想到し、このようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本発明の範囲内であるとみなされる。より一般には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、物質、および構成が、例示であることが意味され、実際のパラメーター、寸法、物質、および／または構成が、本発明の教示が使用される具体的適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。従って、前述の実施形態が、例示によって示されるに過ぎず、添付の請求項およびこれに対する均等物の範囲内で、本発明が、具体的に記載されかつ特許請求されるとおりのもの以外の他のもので実施され得ることは、理解されるべきである。本発明は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法に関する。  さらに、２またはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法が、相互に矛盾していなければ、本発明の範囲内に包含される。
【００７４】
本明細書および援用される文書が、矛盾するおよび／または不一致の開示を含む場合、本明細書が優先する。援用される２またはこれより多くの文書が、互いに関して矛盾するおよび／または不一致の開示を含む場合、新しい方の有効日を有する文書が優先するものとする。
【００７５】
全ての定義は、本明細書で定義されかつ使用される場合、辞書の定義、援用される文書中の定義、および／または定義される用語の通常の意味に優先すると理解されるべきである。
不定冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」とは、本明細書および請求項において使用される場合、明らかにそうでないことが示されなければ、「少なくとも１（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」を意味することが理解されるべきである。
【００７６】
語句「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、ここで本明細書および請求項において使用される場合、そのように結合した要素のうちの「いずれかまたは両方（ｅｉｔｈｅｒ  ｏｒ  ｂｏｔｈ）、すなわち、いくつかの場合には、共同して存在し、他の場合には、分離して存在する要素を意味することが理解されるべきである。および／またはとともに列挙される多数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように結合した要素のうちの「１またはこれより多く」と解釈されるべきである。他の要素は、必要に応じて、「および／または」の節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定されたそれら要素に関連しようが関連しまいが存在し得る。従って、非限定的な例としては、「Ａおよび／またはＢ（Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ）」への言及は、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような開放系の文言とともに使用される場合に、一実施形態において、Ａのみ（必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態において、Ｂのみ（必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態において、ＡおよびＢの両方（必要に応じて、他の要素を含む）；などに言及し得る。
【００７７】
ここで本明細書および請求項において使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義されるように、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」と同じ意味を有することが理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または（ｏｒ）」または「および／または」は、包括的である、すなわち、多くの要素または要素のリストのうちの少なくとも１つ、しかし同様に１より多く、および必要に応じて、さらなる列挙されていない項目の包含として解釈されるべきである。「のうちのただ１つ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」または「のうちの正確に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」のような、または請求項において使用される場合には、「からなる(ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ)」のような、そうでないと明確に示される用語のみが、多くの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含に言及する。一般に、用語「または」は、本明細書で使用される場合、「いずれかの」、「のうちの１つ（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「のうちのただ１つ」または「のうちの正確に１つ」のような排除の用語が先立つ場合には、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない（ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」）を示すと解釈されるべきであるに過ぎない。
【００７８】
ここで本明細書および請求項において使用される場合、１またはこれより多くの要素のリストへの言及における語句「少なくとも１つ」は、要素のリスト中の要素のうちのいずれか１つまたはこれより多くから選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙される各々のおよびあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ず含むわけではなく、要素のリストの中の要素の任意の組み合わせを排除しないことが理解されるべきである。この定義はまた、要素が、必要に応じて、語句「少なくとも１つ」が言及する要素のリスト内で具体的に特定された要素以外に、それらの具体的に特定された要素に関連しようが関連しまいが存在し得ることを可能にする。従って、非限定的な例としては、「ＡおよびＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」（または等しいことには、「ＡまたはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」、または等しいことには、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ）」）は、一実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ａと、Ｂは存在しない（および必要に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ｂと、Ａは存在しない（および必要に応じてＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ａ、および少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ｂ（および必要に応じて他の要素を含む）；などに言及し得る。
【００７９】
「約（ａｂｏｕｔ）」という文言は、数字に言及して本明細書で使用される場合、本発明のさらに別の実施形態が、「約」という文言の存在によって修飾されていないその数字を含むことは、理解されるべきである。
【００８０】
明らかにそうでないことが示されなければ、１より多くの工程または行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、その方法の工程または行為の順序が、その方法の工程または行為が記載される順序に必ずしも限定されないことはまた、理解されるべきである。
【００８１】
請求項、および上記の明細書において、全ての移行句（例えば、「包含する、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「包含する、関わる（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」など）は、開放系である、すなわち、が挙げられるがこれらに限定されない、を意味すると理解されるべきである。移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」のみが、それぞれ、米国特許商標庁の特許審査基準、セクション２１１１．０３に示されるとおり、閉鎖系または半閉鎖系の移行句であるものとする。
【図１】
2021517911.tif 000028
【図２】
2021517911.tif 000029
【図３】
2021517911.tif 000030
【図４】
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【図５】
2021517911.tif 000032
【図６−１】
2021517911.tif 000033
【図６−２】
2021517911.tif 000034
【図７】
2021517911.tif 000035
【図８】
2021517911.tif 000036
【図９】
2021517911.tif 000037
【配列表】
2021517911000001.app
【国際調査報告】
2021517911.tif 000038
2021517911.tif 000039
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