(57)【要約】本発明は、光反応性官能基を有するアミノ酸に置換された抗体接合ペプチド、前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質、及び前記生理活性物質に抗体が結合されている抗体−生理活性物質接合体に関し、本発明に係る接合ペプチドで修飾された生理活性物質を抗体に結合させる場合、従来に比べて抗体と生理活性物質との間の結合効率が画期的に向上するので、抗体の特異性を害しない状態で薬物を堅固に結合させることができ、抗体−生理活性物質接合体の商業化を加速化させることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で表されるＦｃ位置選択的結合ペプチドにおいて５番目、１０番目又は１１番目の位置が光反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチド。
【請求項２】
前記光反応性官能基を有するアミノ酸に置換された位置が１０番目であることを特徴とする、請求項１に記載の接合ペプチド。
【請求項３】
前記光反応性官能基を有するアミノ酸は、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐ−ｂｅｎｚｏｙｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）であることを特徴とする、請求項１に記載の接合ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに生理活性物質が直接又はリンカーを介して連結されている接合ペプチドで修飾された生理活性物質。
【請求項５】
前記生理活性物質は治療剤又は診断製剤であることを特徴とする、請求項４に記載の接合ペプチドで修飾された生理活性物質。
【請求項６】
前記治療剤又は診断製剤は、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、抗体断片、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、心臓血管薬、中枢神経作用薬、腎臓機能及び電解質代謝作用薬、及び化学療法剤で構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の接合ペプチドで修飾された生理活性物質。
【請求項７】
前記リンカーは、反応性官能基、アミノ酸、及び自己切断スペーサーを含むことを特徴とする、請求項４に記載の接合ペプチドで修飾された生理活性物質。
【請求項８】
次の段階を含む抗体−生理活性物質接合体の製造方法：
（ａ）請求項４に記載の接合ペプチドで修飾された生理活性物質をＦｃドメイン含有分子と混合する段階；
（ｂ）前記混合物に光を照射し、前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質の光反応性官能基とＦｃドメイン含有分子とが結合された抗体−生理活性物質接合体を生成させる段階；及び
（ｃ）前記生成された抗体−生理活性物質接合体を収得する段階。
【請求項９】
前記光は３２０ｎｍ〜３８０ｎｍであることを特徴とする、請求項８に記載の抗体−生理活性物質接合体の製造方法。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメイン含有分子は、標的分子に特異的に結合可能な標的指向型天然又は非天然抗体であることを特徴とする、請求項８に記載の抗体−生理活性物質接合体の製造方法。
【請求項１１】
前記Ｆｃドメイン含有分子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、これらの組み合わせ及びこれらのＦｃ領域からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の抗体−生理活性物質接合体の製造方法。
【請求項１２】
前記Ｆｃドメイン含有分子は、ＩｇＧ１由来のドメインの組み合わせ及びこれらのＦｃ領域からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体−生理活性物質接合体の製造方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の接合ペプチドで修飾された生理活性物質に抗体が結合されている抗体−生理活性物質接合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＦｃ位置選択的結合ペプチドにおいて５番目、１０番目又は１１番目の位置が光反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチド、前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質、前記生理活性物質に抗体が結合されている抗体−生理活性物質接合体、及び前記抗体−生理活性物質接合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去２０年間、抗体工学は、マウスでモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）を開発するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）技術に基づいてキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍＡｂ）、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍＡｂ）及びヒト抗体（ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ）の製造技術開発で進化しており、近年は、抗体が一つの治療用薬物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍＡｂ）として認められている。現在までＦＤＡの承認を受けた治療用抗体は２８種であり、移植拒否反応、癌、自己免疫疾患、炎症、心臓疾患、伝染性感染などの広範囲な疾病治療剤として使用されており、約３００余種の治療用抗体が現在臨床開発段階にあり、今後、さらに多くの治療用抗体が開発されると同時に商業化されると見込まれる。さらに、既存の抗体（ｎａｋｅｄ  ｍＡｂ）より効能を向上させた次世代治療用抗体を開発するための多くの研究が進行中である。このうち、特定抗原に対する特異性を有するモノクローナル抗体と、生物学的活性を有している生理活性物質とを連結した接合体に対する研究が活発に進められている。これらの抗体−生理活性物質接合剤が治療用薬物として開発されたとき、抗体の標的特異性を通じた生理活性物質の高い効能及び低い副作用を期待できるだけでなく、抗体の体内非毒性、低い免疫原性、長い体内半減期などの特性は、開発された抗体−生理活性物質接合体薬物の商業化を加速化できる要素である。抗体と細胞毒性を有する小分子薬物とを連結した接合体（ＡＤＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、各製薬社によって既に開発されており、腫瘍標的治療剤として使用されている。
【０００３】
治療用薬物として開発するにおいて、抗体−生理活性物質接合体は、接合されていない抗体と生理活性物質の特性を保有しなければならない。抗体−生理活性物質接合体は、生理活性物質と結合される前の抗体と同じ親和力を維持しなければならない。すなわち、抗体と生理活性物質との結合によって本然の抗原−抗体結合が阻害されてはならない。また、抗体−生理活性物質接合体の生理活性物質も、標的に到逹した後で活性を示さなければならない。すなわち、抗体−生理活性物質接合体において、モノクローナル抗体と生理活性物質のそれぞれの内在的特性が維持されなければならなく、これは、二つの物質を接合する方法によって決定される。また、接合に使用されるリンカーは、血液でも安定しており、生理活性物質が抗体から分離されることを防止し、標的組織／細胞に到逹できるようにしなければならない。一般に、抗体−生理活性物質接合体に使用されるリンカーとしては、酸性に不安定なヒドラゾン（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ  ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、タンパク質分解酵素に不安定なペプチド（ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｌａｂｉｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）及び還元剤（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）に敏感な二硫化物（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）がある。また、切断されていない（ｎｏｎ−ｃｌｅａｖａｂｌｅ）チオエーテル（ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）リンカーも使用される。抗体と生理活性物質との接合のために、抗体が有している官能基（リシンのε−アミノ基又はシステインのチオール基）や突然変異によって抗体にシステイン残基を導入し、このチオール基の反応性を用いる方法が一般的に使用される。抗体自体の官能基を用いる方法は、生理活性物質が連結される位置を調整することができなく、抗体に対する生理活性物質のモル比も一定でないので、不均一な抗体−生理活性物質接合体を製造するようになる。抗体に人為的に導入されたシステインのチオール基を用いる場合は、抗体に突然変異を起こさなければならなく、これによる抗体自体の構造及び活性への影響を予測しにくい。
【０００４】
近年、抗体のＦｃドメインに特異的に結合するＦｃドメイン結合ペプチド（米国公開特許第２００４０２５３２４７号（２００４．１２．１６．））に、光照射によって共有結合する光反応性人工アミノ酸を置換させることによって低分子ペプチド変異体を製造し、前記製造された低分子ペプチド変異体に薬物を結合した抗体−薬物接合体を製造する方法が報告された（大韓民国公開特許第１０−２０１４−０００４５３０号（２０１４．０１．１３．））。しかし、前記発明で使用されたペプチド物質は、化学合成を通じて製造しなければならなく、このために、接合方法は、薬物を抗体に接合する場合に限定され、タンパク質などの生理活性物質と抗体との接合には使用しにくい。また、発明で使用した光反応性アミノ酸（実験例：フォトロイシン、フォトメチオニン利用）の非特異的な反応性により、抗体−生理活性物質接合体を医薬品に開発するのに問題がある（Ｙｏｓｈｉｈｉｔｏ  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，４（６）：４７３−４８０，２００８）。
【０００５】
そこで、本発明者等は、抗体Ｆｃドメインに特異的に結合可能なＦｃ位置選択的結合ペプチドの特定位置を、光反応性官能基を有しているアミノ酸（ｐａｒａ−ｂｅｎｚｏｙｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（ｐＢｐａ））に置換したＦｃ位置選択的接合ペプチドを開発し、前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質を製造した後、光反応を通じて抗体と前記生理活性物質とを結合させた結果、簡単な光反応を通じて生理活性物質が抗体に位置選択的に且つ高効率で結合することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本背景技術部分に記載した前記情報は、本発明の背景に対する理解を向上させるためのものに過ぎないので、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者に既に知られている先行技術を形成する情報を含まない場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、光反応を通じて抗体と生理活性物質とを位置特異的に接合できるペプチドを提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記ペプチドで修飾された生理活性物質を提供することにある。
【０００９】
本発明の更に他の目的は、前記生理活性物質と抗体とが連結された抗体−生理活性物質接合体の製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の更に他の目的は、前記製造方法で製造された抗体−生理活性物質接合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＦｃ位置選択的結合ペプチドにおいて５番目、１０番目又は１１番目の位置が光反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチドを提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記ペプチドに生理活性物質が直接又はリンカーを介して連結されている接合ペプチドで修飾された生理活性物質を提供する。
【００１３】
また、本発明は、（ａ）前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質をＦｃドメイン含有分子と混合する段階；（ｂ）前記混合物に光を照射し、前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質の光反応性官能基とＦｃドメイン含有分子とが結合された抗体−生理活性物質接合体を生成させる段階；及び（ｃ）前記生成された抗体−生理活性物質接合体を収得する段階；を含む抗体−生理活性物質接合体の製造方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質に抗体が結合されている抗体−生理活性物質接合体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の抗体と生理活性物質との接合技術を示した模式図である。
【図２】本発明のＦｃＩＩＩペプチドのｐ−ベンゾイルフェニルアラニンの置換位置を決定するために、抗体と前記ペプチドで修飾された生理活性物質とを光反応させた後、電気泳動した結果を示した図である。
【図３】本発明のＦｃＩＩＩペプチドで修飾されたβ−ラクタマーゼ（ＦｃＩＩＩ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ）発現プラスミド及び前記プラスミドで発現されたＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼを概略的に示した図である。
【図４】本発明のＦｃＩＩＩペプチドで修飾されたβ−ラクタマーゼ酵素前駆体（ＦｃＩＩＩ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｚｙｍｏｇｅｎ）発現プラスミド及び前記プラスミドで発現されたＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体を概略的に示した図である。
【図５】本発明のＦｃＩＩＩペプチドで修飾されたＰＥ２４（ＦｃＩＩＩ−β−ＰＥ２４）発現プラスミド及び前記プラスミドで発現されたＦｃＩＩＩ−β−ＰＥ２４を概略的に示した図である。
【図６Ａ】本発明で組み換えられたｔＲＮＡ合成酵素発現プラスミドを示した図である。
【図６Ｂ】プロリンｔＲＮＡ合成酵素発現プラスミドを示した図である。
【図７】本発明の融合タンパク質と抗体（セツキシマブ）との結合を電気泳動で観察した図である。
【図８】Ｚ−ドメインを用いて本発明の融合タンパク質と抗体（セツキシマブ）との位置特異的結合を電気泳動で観察した図である。
【図９】本発明のＦｃＩＩＩと抗体（セツキシマブ）との接合位置をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで確認した図である。
【図１０】本発明の融合タンパク質と抗体（セツキシマブ）とが１：１で結合したセツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体を分離した結果を電気泳動で観察した図である。
【図１１】本発明のセツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体のＥＦ２リボース化活性を確認した結果を示した図である。
【図１２】本発明のセツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体の細胞成長阻害活性を確認した結果を示した図である。
【図１３】本発明の融合タンパク質と抗体（トラスツズマブ）とが位置特異的に結合した結果と、融合タンパク質と抗体とが１：１で結合したトラスツズマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体を分離した結果を電気泳動で観察した図である。
【図１４】本発明のトラスツズマブ−ＦｃＩＩ−ＰＥ２４接合体の細胞成長阻害活性を確認した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
【００１７】
本発明では、抗体Ｆｃドメインに特異的に結合可能であり、Ｆｃ位置選択的結合ペプチドにおいて５番目、１０番目又は１１番目の位置が光反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチドで修飾された生理活性物質を抗体と結合させた結果、従来と異なり、非可逆的な共有結合が形成され、光反応性官能基の導入位置によって抗体と接合ペプチドで修飾された生理活性物質との結合効率が向上することを確認した（図２）。
【００１８】
したがって、本発明は、一観点において、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＦｃ位置選択的結合ペプチドにおいて５番目、１０番目又は１１番目の位置が光反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチドに関する。
【００１９】
本発明において、前記Ｆｃ位置選択的結合ペプチド（ＦｃＩＩＩ）（アミノ酸配列番号１、遺伝子配列番号２）は、ヒト由来抗体（ＩｇＧ１）のＦｃドメインのＣＨ３−ＣＨ２インターフェース領域（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｒｅｇｉｏｎ）に位置特異的に結合する１３個のアミノ酸からなる短いペプチドである（Ｗ．Ｌ．ＤｅＬａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００）。前記ペプチドは、二つのシステインが互いに二硫化結合を形成しており、Ｕ字構造を示す。
【００２０】
本発明において、前記光反応性官能基を有するアミノ酸に置換された位置が１０番目であることを特徴とすることができる。
【００２１】
本発明において、光反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチドを製造する方法は、Ｆｃ位置選択的結合ペプチドのアミノ酸配列を同定し、公知の方法で、例えば、前記ペプチドを発現できる発現ベクターを製造し、宿主細胞に形質転換させることによって組換え技法で発現させたり、人工的に合成して製造した後、公知の方法でこのうち一つ以上のアミノ酸残基を光反応性官能基を有するアミノ酸に置換又は導入して製造したり、又は、人工合成時、一つ以上の光反応性官能基を有するアミノ酸を含ませて合成することができる。
【００２２】
前記遺伝子の導入は、通常的に知られている遺伝子操作方法を用いて行うことができる。例えば、ウイルスなどのベクターを用いる方法、合成リン脂質や合成陽イオン性高分子などを使用する非ウイルス性方法、及び細胞膜に一時的な電気刺激を加えることによって遺伝子を導入する電気透過法などの物理的な方法を使用することができ、これに限定されない。
【００２３】
本発明において、「増幅」とは、該当遺伝子の一部の塩基を変異、置換、又は削除させたり、一部の塩基を導入させたり、又は、同一の酵素をコーディングする他の微生物由来の遺伝子を導入させることによって対応する酵素の活性を増加させることを包括する概念である。
【００２４】
本発明において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、適切な宿主内でＤＮＡを発現できる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は、簡単な潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製して機能したり、又は、一部の場合は、ゲノム自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書における「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、時々相互交換的に使用される。しかし、本発明は、当業界に知られている機能又は当業界に知られるようになる機能と同等な機能を有するベクターの他の形態を含む。
【００２５】
本発明において、「発現ベクター」とは、通常、異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）であって、一般に、２本鎖ＤＮＡ断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦宿主細胞内にあると、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。当業界で周知のように、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当の遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解毒発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び該当の遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞である場合、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００２６】
本発明において、「統合ベクター」とは、核酸への統合又は挿入がインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）を通じて行われるベクターを意味するものであって、統合ベクターの例としては、レトロウイルスベクター、トランスポゾン及びアデノ随伴ウイルスベクターなどがあるが、これに制限されない。
【００２７】
前記ベクターによって形質転換又は形質感染された宿主細胞は、本発明の更に他の側面を構成する。本発明で使用された用語である「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体外因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。これは、核酸を有機体、細胞、組織又は機関に導入する如何なる方法も含み、当分野で公知のように、宿主細胞に応じて適切な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などが含まれるが、これに制限されない。発明の宿主細胞は、原核又は真核生物細胞であり得る。また、通常、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が使用される。大腸菌、シュードモナス、バシラス、ストレプトマイセス、真菌、酵母などの周知の真核及び原核宿主、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などの昆虫細胞、ＣＨＯ及びマウス細胞などの動物細胞、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０及びＢＭＴ  １０などのアフリカグリーンモンキー細胞、及び組織培養されたヒト細胞は、使用可能な宿主細胞の例である。
【００２８】
もちろん、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現するのに全て同等な機能を発揮することはないことを理解しなければならない。同様に、全ての宿主が同一の発現システムに対して同一に機能を発揮することはない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担なく、本発明の範囲を逸脱しない状態で多くのベクター、発現調節配列及び宿主から適宜選択することができる。例えば、ベクターを選択するにおいては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその内部で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力及び当該ベクターによってコーディングされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮しなければならない。発現調節配列を選定するにおいても、様々な因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性及び本発明のＤＮＡ配列との相溶性などのように、特に可能性のある二次構造と関連して考慮しなければならない。単細胞宿主は、選定されたベクター、本発明のＤＮＡ配列によってコーディングされる産物の毒性、分泌特性、タンパク質を正確にフォールディングできる能力、培養及び発酵要件、本発明のＤＮＡ配列によってコーディングされる産物を宿主から精製することの容易性などの因子を考慮して選定しなければならない。これらの変数の範囲内で、当業者は、本発明のＤＮＡ配列を発酵又は大規模動物培養で発現できる各種ベクター／発現調節配列／宿主の組み合わせを選定することができる。発現クローニングによってＮＳＰタンパク質のｃＤＮＡをクローニングしようとするときのスクリーニング法として、バインディング（ｂｉｎｄｉｎｇ）法、パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）法、フィルムエマルジョン（ｆｉｌｍ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）法などが適用され得る。
【００２９】
本発明において、「原形質体融合」とは、植物細胞又は菌類などの細胞壁を除去した原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）を用いて互いに異なる形質を有する二つの細胞を融合する技術を意味する。原形質体の融合には、高濃度の浸透圧溶液にカルシウム、マグネシウムなどの金属イオンを添加する化学的方法、又は、電気衝撃を与えることによって細胞膜に一時的に小さい穴が生じるように原形質体を露出させ、原形質体のＤＮＡ吸収を増加させる物理的方法がある。
【００３０】
本発明において、「光反応性官能基」とは、光照射時に特定波長の光を吸収し、隣接した反応性官能基と共有結合を形成できる官能基であり得る。
【００３１】
本発明の光反応性官能基を備えたＦｃ位置選択的接合ペプチドは、抗体と混合したとき、内在的特性である特異性によって抗体のＦｃドメインに隣接又は結合する。その後、前記混合物に光を照射すると、特定波長の光を吸収し、光反応性官能基を通じてこれと隣接した抗体Ｆｃドメイン上の反応性官能基と共有結合を形成することができる。すなわち、本発明のＦｃ位置選択的接合ペプチドは、光照射時、前記光反応性官能基を通じてＦｃドメインの特定官能基に共有結合することができる。
【００３２】
本発明において、前記光反応性官能基を有するアミノ酸は、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐ−ｂｅｎｚｏｙｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）であることを特徴とすることができる。光反応性官能基を有する人工アミノ酸は、フォトロイシン、フォトメチオニン或いはアジドフェニルアラニンなどで構成できるが、本発明で使用された光反応性官能基は、特定官能基に選好度を有して作用し、高い波長帯を有する、すなわち、低いエネルギーを有する光エネルギーを通じて共有結合が活性化される点を特異性として有する。
【００３３】
本発明のｐ−ベンゾイルフェニルアラニンは、下記の化学式１で表される。
【化１】
2021504493.tif 000003
【００３４】
本発明は、他の観点において、前記ペプチドに生理活性物質が直接又はリンカーを介して連結されている接合ペプチドで修飾された生理活性物質に関する。
【００３５】
本発明において、前記生理活性物質は、治療剤又は診断製剤であることを特徴とすることができ、前記治療剤又は診断製剤は、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、抗体断片、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、心臓血管薬、中枢神経作用薬、腎臓機能及び電解質代謝作用薬、及び化学療法剤で構成された群から選ばれることを特徴とすることができる。
【００３６】
本発明の生理活性物質は治療剤又は診断／検出製剤であり得る。具体的に、前記生理活性物質として使用される抗体は治療用抗体であり得る。治療用抗体は、現在約３０種がＦＤＡの承認を受けており、生体内に存在するＩｇＧと性質がほぼ類似するので、その安全性が非常に高い。治療用抗体は、広範囲な疾病治療剤（例えば、移植拒否反応、癌、自己免疫疾患、炎症、心臓疾患及び伝染性感染など）に使用されている。特に、Ｆｃドメイン含有分子が治療用抗体である場合、前記治療用抗体は、疾病が生じた組織に特異的に存在する受容体タンパク質或いは抗原タンパク質を認識して結合するので、その特異性が非常に高い。よって、治療用抗体に生理活性物質として分子画像プローブや薬物伝達体を結合させると、薬物併用効果があると共に、治療過程をモニタリングできるセラグノーシス（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ）製剤に転換することができる。また、単純な標的化抗体にも分子画像プローブや薬物伝達体を結合させることによって、診断、治療、或いは診断と治療を同時に進行するセラグノーシス製剤を開発することができる。
【００３７】
治療剤の非制限的な例としては、抗体、抗体断片、薬物、毒素、核酸加水分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ホルモン、免疫調節剤、キレート、ホウ素化合物、光活性（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ）製剤、染料、及び放射性同位元素を含む。
【００３８】
診断製剤／検出製剤の非制限的な例としては、放射性同位元素、染料（例えば、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）−ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）複合体）、造影剤、蛍光化合物、分子、及び磁気共鳴映像化（ＭＲＩ）への増加剤（常磁性イオン）を含む。好ましくは、診断製剤は、放射性同位元素、磁気共鳴映像で使用される増加剤、及び蛍光化合物を含む。抗体成分を放射性金属又は常磁性イオンと共に負荷するために、イオンを結合するのにキレート基の多数と付着した長いテールを有する反応物と反応することが必要な場合もある。前記テールは、ポリリジン、多糖などの高分子、又は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ；ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン（ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ）、ポリオキシム（ｐｏｌｙｏｘｉｍｅｓ）などのキレート基と結合できるペンダント基を有し、前記目的に有用であると知られている基を有する、誘導されたり又は誘導可能な鎖であり得る。キレートは、正常に免疫反応性の最小損失と最小集合体及び／又は内部交差連結で分子に結合を形成できる官能基によってＦｃ位置選択的接合ペプチドに連結され得る。
【００３９】
特に、有用な金属−キレートの組み合わせは、診断性同位元素、６０ｋｅＶ〜４，０００ｋｅＶの一般的なエネルギー範囲で使用される２−ベンジル−ＤＴＰＡ及びそのモノメチル、及びシクロヘキシル類似体を含み、例えば、放射性映像化剤には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒがある。マンガン、鉄及びガドリニウムなどの非−放射性金属と複合化される場合、同じキレートは、本発明のナノ粒子又は抗体と共に使用されるときにＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡなどの大環状（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ）キレートは、金属及び放射性金属の種類と共に使用され、好ましくは、ガリウム、イットリウム（ｙｔｔｒｉｕｍ）及び銅の放射性核種と共にそれぞれ使用される。前記金属−キレート複合体は、対象の金属に環の大きさを合わせることによって非常に安定的に製造され得る。本発明により、ＲＡＩＴに２２３Ｒａなどの核種と共に安定的に結合するのに有用な大環状ポリエーテル類などの環状キレートを製造することができる。
【００４０】
免疫接合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、治療剤又は診断製剤と抗体成分との接合体である。前記診断製剤は、放射性又は非放射性標識、造影剤（磁気共鳴映像化、コンピューター断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、又は超音波に適切な造影剤）を含み、放射性ラベルは、λ−、β−、α−、オージェ電子−又は陽電子放出同位元素であり得る。
【００４１】
本発明において、「免疫調節剤」は、典型的に大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、Ｂ−細胞、及び／又はＴ−細胞などの免疫反応カスケード（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ）で増殖又は活性化される兔疫細胞を刺激する。前記免疫調節剤の例としてはサイトカインがある。当業者等によると、インターロイキン及びインターフェロンがＴ−細胞又はその他の免疫細胞活性を刺激するサイトカインの一種である。
【００４２】
本発明のＦｃ位置選択的接合ペプチドにＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）又はＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が直接又はリンカーを介して連結され得る。前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡは、相補的配列を有する物質と特異的に結合する性質を有する重合体であるので、前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＬＮＡを連結させたＦｃ位置選択的接合ペプチドは、遺伝子スクリーニング、バイオセンサーなどに使用され得る。
【００４３】
前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＬＮＡを連結させたＦｃ位置選択的接合ペプチドは、バイオチップ、バイオセンサー、免疫検出キット又は相補的に自己アドレス指定可能なチップ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｌｆ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｃｈｉｐ）に活用するために固体支持体に固定させて使用することができる。
【００４４】
本発明において、前記リンカーは、反応性官能基、アミノ酸及び自己切断スペーサーを含むことを特徴とすることができる。
【００４５】
本発明のリンカーは、光反応性官能基に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチド内の特定残基と生理活性物質とを連結する形態であって、光反応性官能基に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチド上に存在する求核性残基（例えば、システイン）に反応する求電子性基を有する反応性部位を有することができる。前記リンカーは、例えば、光反応性官能基に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチドに結合する反応性官能基、アミノ酸及び自己切断スペーサーを含むことができる。
【００４６】
前記官能基は、ｉ）マレイミド基、アセトアミド基、又はその誘導体、ｉｉ）アジリジン基、アリルハライド、アクリロイル基、又はその誘導体、ｉｉｉ）アルキル化反応基、アリール化反応基、ピリジルジスルフィド 、チオニトロ安息香酸、又はその誘導体であり得る。具体的に、前記リンカーは、具体的な例として、ｉ）マレイミド基又はその誘導体−バリン−シトルリン（ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）−パラアニリン安息香酸（ｐａｒａ−ａｎｉｌｉｎｅ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ：ＰＡＢＡ）；又はｉｉ）アセトアミド基又はその誘導体−バリン−シトルリン（ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）−パラアニリン安息香酸（ｐａｒａ−ａｎｉｌｉｎｅ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ：ＰＡＢＡ）の形態であり得るが、これに制限されることはない。
【００４７】
前記リンカーを介した光反応性官能基に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチドと生理活性物質との結合は、公知の方法、例えば、アルキル化、二硫化（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）相互交換方法及びトランスチオエステル化反応法を用いて行うことができる。これを通じて、光反応性官能基に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチド内のシステイン残基のチオール基を介して前記接合ペプチドと生理活性物質とが接合され得る。
【００４８】
一つの具体例において、チオール−リンカー結合のために使用されるマレイミド基の場合、システイン残基のチオールがマレイミド基に対して有する求核反応性がタンパク質中に存在する他のアミノ酸官能基、例えば、リシン残基のアミノ基又はＮ−末端アミノ基に比べて約１，０００倍ほど高いので、システインに特異的に結合させるのに活用され得る。よって、マレイミド基又はその誘導体、アセトアミド基又はその誘導体、例えば、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド基を通じた接合ペプチドで修飾された生理活性物質は、システインがチオエーテル結合で光反応性官能基に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチドと結合されることが分かる。
【００４９】
また、本発明は、他の観点において、（ａ）前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質をＦｃドメイン含有分子と混合する段階；（ｂ）前記混合物に光を照射し、前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質の光反応性官能基とＦｃドメイン含有分子とが結合された抗体−生理活性物質接合体を生成させる段階；及び（ｃ）前記生成された抗体−生理活性物質接合体を収得する段階；を含む抗体−生理活性物質接合体の製造方法に関する。
【００５０】
本発明において、前記光は、３２０ｎｍ〜３８０ｎｍであることを特徴とすることができ、好ましくは、３５０ｎｍ〜３６５ｎｍであることを特徴とすることができるが、これに制限されることはない。
【００５１】
本発明において、「Ｆｃドメイン含有分子」は、Ｆｃドメインを含み、Ｆｃ位置選択的接合ペプチドによって特異的に認識され、隣接又は結合できる分子を制限なく含む。前記Ｆｃドメイン含有分子は、Ｆｃドメインを含むタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、抗体、抗体の断片、兔疫グロブリン又は兔疫グロブリンの断片などを含む。前記抗体及び兔疫グロブリンは、約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であって、同一の二つの軽鎖及び同一の二つの重鎖を含む。Ｆｃドメインを含むその断片は、抗体又は兔疫グロブリンにパパイン処理をして得た軽鎖及び重鎖が除去された断片であり得る。
【００５２】
本発明において、前記Ｆｃドメイン含有分子は、標的分子に特異的に結合可能な標的指向型天然又は非天然抗体であることを特徴とすることができる。
【００５３】
本発明において、抗体は、キメラ、ヒト化抗体又はヒト抗体などの特定の組換え抗体だけでなく、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を全て含む。前記抗体は、受容体−特異的抗体又はリガンド−特異的抗体であり得る。また、本発明において、抗体は、リガンド結合を防止しないが、受容体活性化を防止する受容体−特異的抗体であり得る。また、前記抗体は、治療用抗体であってもよく、別途の治療剤又は診断製剤と結合できる抗体であってもよく、治療効果がない標的化のための抗体であってもよく、単純に抗原−抗体反応を行える抗体であってもよい。
【００５４】
本発明において、抗体−生理活性物質接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、体内血液循環時の非毒性（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）及び薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）などの抗体の長所を最大限活用し、薬物が具体的に特定組織（例えば、癌細胞）のみをターゲッティングするのに焦点を合わせた技術である。よって、免疫接合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｔ）とも呼ばれ、「標的化学療法（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」のための坑癌薬物もこれに属する。免疫接合体は、薬物、モノクローナル抗体、及び前記抗体と薬物とを連結するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む３つの要素で構成され、具体的には、抗癌目的において、免疫接合体技術は、癌細胞の表面に発現される特定抗原に特異的に結合する抗体を用いて生理的活性を有する物質を腫瘍細胞に伝達する方法である。
【００５５】
本発明の一実施例において、生理活性化合物としては、β−ラクタマーゼ（β−ｌａｃｔａｍａｓｅ（ＴＥＭ−１））、β−ラクタマーゼ酵素前駆体（β−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｚｙｍｏｇｅｎ）（大韓民国登録特許第１０１６９５６８４００００号（２０１７．０１．０６．））及びシュードモナス外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ（ＰＥ２４））を使用した。
【００５６】
本発明において、「β−ラクタマーゼ」（アミノ酸配列番号３）は、それ自体では細胞毒性を有さないが、β−ラクタム環（β−ｌａｃｔａｍ  ｒｉｎｇ）を有するプロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）を切断し、薬物として活性化させる機作であって、適切なプロドラッグと共に処理したときに効果的な腫瘍治療薬物として利用可能である。本発明では、ＧＣ−ｍｅｌという不活性状態のプロドラッグを用いることができ、β−ラクタマーゼによってＧＣ−Ｍｅｌのβ−ラクタム環が切断されると、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）の形態に転換され、細胞内ＤＮＡにアルキル化（ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）される。そして、これによって、細胞増殖が阻害され、細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発する。
【００５７】
本発明において、「β−ラクタマーゼ酵素前駆体」（アミノ酸配列番号５）は、β−ラクタマーゼ阻害タンパク質（β−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＬＩＰ））がβ−ラクタマーゼと融合され、これらが共に非活性状態で発現される。しかし、二つのタンパク質の間をつなぐリンカーに、癌細胞で過剰発現されるマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２（ＭＭＰ−２））切断部位を導入しており、癌細胞の周辺でＢＬＩＰが切断されて除去されるので、β−ラクタマーゼが活性を示す。
【００５８】
本発明において、「ＰＥ２４」（アミノ酸配列番号７）は、細胞内タンパク質の合成に関与する伸長因子−２（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−２（ＥＦ−２））をＡＤＰ−リボース化（ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）させることによってＥＦ−２を不活性化させ、細胞のアポトーシスを誘発する（米国特許登録第０９３８８２２２号（２０１６．０７．１２．））。
【００５９】
本発明において、前記Ｆｃドメイン含有分子は、兔疫グロブリン由来のドメイン、これらの組み合わせ及びこれらのＦｃ領域からなる群から選ばれることを特徴とすることができ、好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、これらの組み合わせ及びこれらのＦｃ領域からなる群から選ばれることを特徴とすることができ、さらに好ましくは、ＩｇＧ１又はそのＦｃ領域であることを特徴とすることができるが、これに制限されることはない。
【００６０】
本発明において、（ｃ）段階で生成された抗体−生理活性物質接合体を収得する段階は、ＦｃＩＩＩが抗体の重鎖のＦｃドメインに結合するので、融合タンパク質と抗体との光反応により、合計３つの形態（結合していない抗体、１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が抗体に結合した形態、及び２個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が抗体に結合した形態）の産物が生成され得る。治療的薬物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇ）として用いるためには正確な薬物動態学を有する産物を収得しなければならないので、生産された３つの形態の産物を分離し、１つの形態の産物を収得しなければならない。１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が結合された形態の抗体−生理活性物質接合体は、一側の胎児性Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ））が自由な状態であり、２個の融合タンパク質が結合された形態に比べて、体内での血液循環時に分解されないので、高い薬物の半減期を期待することができる。
【００６１】
接合ペプチドで修飾された生理活性物質が結合していない抗体は、抗体と融合タンパク質との反応比率及び紫外線照射時間を調節し、反応条件を最適化して除去することができる。
【００６２】
１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が抗体と結合した抗体−生理活性物質接合体と、２個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が抗体と結合した抗体−生理活性物質接合体は、プロテインＡと抗体のＦｃドメインとの間の結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を用いて分離することができる。プロテインＡは、抗体のＦｃドメインのＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェースに特異的な結合親和性を有するので、抗体を発現した後で精製するときに使用する親和クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）のレジン（ｒｅｓｉｎ）として使用される。よって、２個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が抗体に結合された抗体−生理活性物質接合体は、プロテインＡレジンと結合しない（Ｗ．Ｌ．ＤｅＬａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７（５４５６）：１２７９−８３，２０００）。２個の生理活性物質が抗体と結合した形態は、プロテインＡ親和クロマトグラフィーを通じて除去され得る。その後、収得物に連続的に陰イオンクロマトグラフィー（ａｎｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を実施することによって、等電点 （ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ）の差によって結合していない抗体と、１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が抗体に結合した形態とを分離することができる。
【００６３】
また、本発明は、更に他の観点において、前記接合ペプチドで修飾された生理活性物質に抗体が結合されている抗体−生理活性物質接合体に関する。
【００６４】
本発明の他の実施例において、ＩｇＧ１−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体の活性を確認するために、ＷＳＴ−８アッセイ及びＭＴＳアッセイを行った。前記ＷＳＴ−８アッセイ及びＭＴＳアッセイは、培地内の菌が生産するミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によって溶液中のテトラゾリウム塩（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ）が、特定の吸光度で測定可能なポルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）に変化するので、吸光度の測定を通じて細胞の生存を確認することができる。前記３つの抗体−生理活性物質接合体の濃度を特定の範囲内で増加させながら吸光度の変化を測定した。その結果、抗体と接合ペプチドで修飾された生理活性物質とが結合された抗体−生理活性物質接合体を高い濃度で処理するほど、細胞増殖及び生存能が減少することを観察した。よって、本発明の抗体−生理活性物質接合体は、治療的薬物として使用可能であることを確認した。
【００６５】
本発明において、商業的ヒトＩｇＧの一実施例として、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）及びトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を用いて生理活性物質接合体を形成し、精製及び分離することによって活性を確認した。トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、ＥＧＦＲやＨＥＲ４とヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するＨＥＲ２に特異的に作用し、各リガンドに依存的なＥＧＦＲ（ＥＧＦ、ＴＧＦα）やＨＥＲ４（ＮＲＧ１）の活性化を抑制し、下位信号の伝逹を防止する。また、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は、各リガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦα）に依存的なＥＧＦＲの活性化を抑制し、その下位信号の伝逹を防止する。
【００６６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００６７】
実施例１：Ｆｃ位置選択的接合ペプチドの製造
効率的な光反応結合が可能なｐ−ベンゾイルフェニルアラニンの置換位置を選定するために、配列番号１のアミノ酸配列のうち５番目、１０番目、又は１１番目の位置のＤＮＡ塩基配列がそれぞれアンバーコドン（ａｍｂｅｒ  ｃｏｄｏｎ）に置換されたＦｃＩＩＩペプチドを遺伝子合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ）した後、融合タンパク質の形態で発現できるように遺伝子操作を行った。次に、ＦｃＩＩＩペプチドのアンバーコドンの位置にｐ−ベンゾイルフェニルアラニンが挿入されるように発現した後で精製した。置換位置による光反応効率の変化を観察するために、ヒトＩｇＧ１と、前記アミノ酸配列のうち５番目の位置のＤＮＡ塩基配列がそれぞれアンバーコドンに置換されたＦｃＩＩＩペプチド（アミノ酸配列番号１１、遺伝子配列番号１２）、１０番目の位置のＤＮＡ塩基配列がそれぞれアンバーコドンに置換されたＦｃＩＩＩペプチド（アミノ酸配列番号１３、遺伝子配列番号１４）、及び１１番目の位置のＤＮＡ塩基配列がそれぞれアンバーコドンに置換されたＦｃＩＩＩペプチド（アミノ酸配列番号１５、遺伝子配列番号１６）で修飾された生理活性物質とをそれぞれ１：３の比率で混合することによってサンプルを製造した後、前記サンプルには、１ｘＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）上でＵＶハンドランプ（ｈａｎｄ  ｌａｍｐ）（Ｌｋｌａｂ、Ｕ０１−１３３−１９４）を用いて３６５ｎｍの紫外線を２時間にわたって照射した。
【００６８】
その結果、１０番目のアミノ酸であるバリンが、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニンに置換されたＦｃＩＩＩで修飾された生理活性物質と抗体との結合効率に最も優れることを確認した（図２）。よって、ＦｃＩＩＩペプチドの１０番目のアミノ酸であるバリンの位置にｐ−ベンゾイルフェニルアラニンを置換したサンプルが最も高い光反応効率を示す。
【００６９】
ＦｃＩＩＩペプチド発現プラスミドを製造するために、１０番目のアミノ酸をコーディングする遺伝子がアンバーコドンに置換されたＦｃＩＩＩペプチド遺伝子は、２．１  ＮＥＢバッファーでＮｈｅＩを処理して切断し、スピンカラム（ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ）を用いて切断された遺伝子をフィルタリングした後、３．１  ＮＥＢバッファーでＢａｍＨＩを処理して切断した。前記バッファーの組成は、ＤＤＷ、１０ｘ  ＮＥＢバッファー３．１、ＤＮＡ、制限酵素であって、全体の体積は５０μｌで、処理条件はそれぞれ３７℃にして４時間にわたって処理した。前記と同じ制限酵素を処理し、両端が接着性末端（ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ）として切断されたｐＥＴ２１−ａベクターと前記切断されたＦｃＩＩＩ遺伝子とを１：３のモル比で混ぜることによって全体の体積を１０μｌにした後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて常温で２時間反応させてライゲーションした。
【００７０】
前記ライゲーションされたＤＮＡ混合溶液を受容性細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）であるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ６４０００３）５０μｌと混合し、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を行った。その後、アンピシリンが含まれたＬＢアガー培地に塗抹し、３７℃で１２時間〜１４時間培養することによって形質転換された菌株を獲得し、ＤＮＡをプレップ（ｐｒｅｐ）（ＧｅｎｅＡｌｌ、ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）することによってＦｃＩＩＩ発現プラスミド−１を収得した。
【００７１】
また、ベクターとしてｐＥＴ２２−ｂを使用し、挿入ＤＮＡとして１０番目のアミノ酸をコーディングする遺伝子がアンバーコドンに置換されたＦｃＩＩＩペプチドシーケンスを使用し、制限酵素としてＮｄｅＩ及びＮｃｏＩを用いて、前記と同じ方法でＦｃＩＩＩ発現プラスミド−２を収得した。
【００７２】
実施例２：接合ペプチドで修飾された生理活性物質の製造
実施例２−１：ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼのクローニング
配列番号４で表されるβ−ラクタマーゼの全体のシーケンスを含むプラスミド（ｐＳＰＥＬ１０４）を鋳型として、表１のプライマーを用いて重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ））を通じて増幅させた後、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを処理することによって制限酵素で切断した後、実施例１のＦｃＩＩＩ発現プラスミド−１にライゲーションした。
【００７３】
ＰＣＲは、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の３段階を経ており、その方法は次の通りである。ＰＣＲの反応組成は、ＤＤＷ、１０ｘ  ｐｆｕバッファー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌのプライマーＦ／Ｒ、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）、５ユニット（ｕｎｉｔｓ）Ｐｆｕ重合酵素であり、最終反応体積は５０μｌである。表１のＢａｍｈＩ−−ｆ及びＴＥＭ１−ＮｏｔＩ−ｒを用いて９５℃の条件で２分間反応した後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を一つのサイクルとして２５サイクルを反応させ、反応の終了後、７２℃の条件で１０分間処理した。
【００７４】
表１は、本発明に使用されたＰＣＲプライマーを示したものである。
【表１】
2021504493.tif 000004
【００７５】
前記二つの制限酵素は、３．１  ＮＥＢバッファーに共に処理して切断した。バッファーの組成は、ＤＤＷ、１０ｘ  ＮＥＢバッファー３．１、ＤＮＡ、制限酵素であって、全体の体積は５０μｌで、３７℃の条件で４時間にわたって処理した。前記制限酵素を処理し、両端が付着末端（ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ）として切断されたＦｃＩＩＩ発現プラスミド−１とβ−ラクタマーゼとを１：３のモル比で混合し、全体の体積が１０μｌになるようにした後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて２５℃の条件で２時間にわたってライゲーションした。
【００７６】
ライゲーションされたＤＮＡ混合溶液を受容性細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）であるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ６４０００３）５０μｌに入れた後、混ぜることによってエレクトロポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵSＡ）を行った。その後、アンピシリンが含まれたＬＢアガー培地に塗抹し、３７℃で１２時間〜１４時間培養することによって形質転換された菌株を獲得し、ＤＮＡをプレップ（ｐｒｅｐ）（ＧｅｎｅＡｌｌ、ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）することによってＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ（アミノ酸配列番号１７、遺伝子配列番号１８）発現プラスミドを収得した（図３）。
【００７７】
実施例２−２：ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体のクローニング
配列番号６で表されるβ−ラクタマーゼ酵素前駆体シーケンス（１３５３ｂｐ）を含むプラスミド（ｐＳＰＥＬ１６６）を鋳型として、前記条件と同一の条件で表１のプライマーを用いてＰＣＲを通じて増幅させた後、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ及び制限酵素で切断した後、実施例１のＦｃＩＩＩ発現プラスミド−２に前記と同じ方法でライゲーションした。
【００７８】
ライゲーションされたＤＮＡ混合溶液をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ６４０００３）５０μｌに入れた後、混ぜることによってエレクトロポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を行った。その後、アンピシリンが含まれたＬＢアガー培地に塗抹し、３７℃で１２時間〜１４時間培養した後で形質転換された菌株を獲得し、ＤＮＡをプレップ（ｐｒｅｐ）（ＧｅｎｅＡｌｌ、ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）することによってＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体（アミノ酸配列番号１９、遺伝子配列番号２０）発現プラスミドを収得した（図４）。
【００７９】
実施例２−３：ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４のクローニング
脱免疫化された配列番号８で表されるＰＥ２４を遺伝子合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ）で収得し、前記と同じ方法でＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの制限酵素で切断した後、ＦｃＩＩＩ発現プラスミド−１にライゲーションした。
【００８０】
ライゲーションされたＤＮＡ混合溶液をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ６４０００３）５０μｌに入れた後、混ぜることによってエレクトロポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を行った。その後、アンピシリンが含まれたＬＢアガー培地に塗抹し、３７℃で１２時間〜１４時間培養することによって形質転換された菌株を獲得し、ＤＮＡをプレップ（ｐｒｅｐ）（ＧｅｎｅＡｌｌ、ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）することによってＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４融合タンパク質（アミノ酸配列番号２１、遺伝子配列番号２２）発現プラスミドを収得した（図５）。
【００８１】
実施例２−４：オーソゴナル（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ＴＡＧコドン認知ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡ合成酵素のクローニング
配列番号１０で表されるｐ−ベンゾイルフェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素（アミノ酸配列番号９）シーケンスにＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩを処理して切断した後、ＴＡＧコドンを認知するｔＲＮＡシーケンス（Ｊａｓｏｎ  Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ｖｏｌ．９９，１１０２０−１１０２４，２００２）を含むｐＥＶＯＬプラスミドをベクターとして用いてライゲーションした（図６Ａ）。
【００８２】
ライゲーションされたＤＮＡ混合溶液をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ６４０００３）５０μｌに入れた後、混ぜることによってエレクトロポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を行った。その後、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）が含まれたＬＢアガー培地に塗抹し、３７℃で１２時間〜１４時間培養することによって形質転換された菌株を獲得し、ＤＮＡをプレップ（ｐｒｅｐ）（ＧｅｎｅＡｌｌ、ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）することによってＴＡＧコドンを認知し、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニンを挿入するｔＲＮＡ合成酵素（遺伝子配列番号２３）発現プラスミドを収得した。
【００８３】
本発明では、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）ｔＲＮＡ合成酵素シーケンスを含むｐＢｂＳ２Ｋプラスミドを用いた（Ｂｙｅｏｎｇ  Ｓｕｎｇ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｓ０３０４−４１６５，２０１７）（図６Ｂ）。
【００８４】
実施例３：接合ペプチドで修飾された生理活性物質の発現及び精製
実施例３−１：ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼの発現及び精製
ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼの発現のために、ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ発現プラスミド、ＴＡＧコドン認知ｔＲＮＡとｐ−ベンゾイルフェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素のペアを含むプラスミド及びプロリンｔＲＮＡ合成酵素を含むプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＩＧＭＡ  ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＭＣ００１６）にエレクトロポレーションした後、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンが含まれたＬＢプレートに塗抹することによって形質転換された菌株を収得した。
【００８５】
前記収得した単一コロニーをシード（ｓｅｅｄ）として、３７℃、１８０ｒｐｍの条件で１２時間にわたって種菌培養し、１０：１の比率で培地に再び接種し、３７℃、１８０ｒｐｍの条件で６時間にわたって培養した。前記培養液を２００ｍｌ  ２ｘＹＴ（アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンを含む）培地に１００：１の比率で接種した後、３７℃、１８０ｒｐｍの条件で培養し、６００ｎｍでの吸光度が０．５になったとき、最終濃度が０．２％になるようにアラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）を入れ、２０ｎＭになるように無水テトラサイクリン（ａｎｈｙｄｒｏｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（ａＴｃ））を添加した。吸光度が１．０になると、最終濃度が１ｍＭになるようにｐ−ベンゾイルフェニルアラニン及びＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加した後、３７℃、１８０ｒｐｍの条件で１２時間にわたって培養した。
【００８６】
前記発現されたＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼを精製するために、４℃、９３００ｇの条件で１５分間遠心分離した。その後、上澄み液を除去し、５ｍｌの溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（０．７５Ｍのスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、０．１のトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ８．０）に再び懸濁させ、０．０５ｇ／ｍｌのリソザイム及び１ｍＭのＥＤＴＡ  １０ｍｌを添加した後、４℃で２０分間回転させた。その後、０．５ＭのＭｇＣｌ２  １ｍｌを入れ、４℃で１０分間回転させた後、４℃、９３００ｇの条件で１５分間遠心分離し、上澄み液を分離した。
【００８７】
その後、ヒスチジンタグタンパク質（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を精製するために、前記上澄み液２０ｍｌに５０％のＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）レジン（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＵＳＡ）スラリー１ｍｌを添加し、４℃の条件で１時間にわたって回転させながらＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼをレジンと結合させた。前記反応液を空カラムにローディングした後、３０ｍｌの洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＰＯ３、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール）をローディングして洗浄し、５ｍｌの溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＰＯ３、３００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール）をローディングすることによって６ｘ  Ｈｉｓ−タグ（ｔａｇ）ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼを溶出した。
【００８８】
実施例３−２：ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体の発現及び精製
ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体の発現のために、ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体発現プラスミド、ＴＡＧコドン認知ｔＲＮＡとｐ−ベンゾイルフェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素のペアを含むプラスミド、及びプロリンｔＲＮＡ合成酵素を含むプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＩＧＭＡ  ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＭＣ００１６）にエレクトロポレーションした後、前記ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼの発現と同一に培養することによってＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体を発現させた。
【００８９】
その後、前記ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼの精製反応と同一の条件で精製反応を行い、６ｘ  Ｈｉｓ−タグＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体を溶出した。
【００９０】
実施例３−３：ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４の発現及び精製
ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４の発現のために、ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４発現プラスミド、ＴＡＧコドン認知ｔＲＮＡとｐ−ベンゾイルフェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素のペアを含むプラスミド、及びプロリンｔＲＮＡ合成酵素を含むプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＩＧＭＡ  ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＭＣ００１６）にエレクトロポレーションした後、前記ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼの発現と同一に培養することによってＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４を発現させた。
【００９１】
その後、前記ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼの精製反応と同一の条件で精製反応を行い、６ｘ  Ｈｉｓ−タグＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４を溶出した。
【００９２】
実施例４：セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）と接合ペプチドで修飾された生理活性物質との結合及び接合体の分離と活性
実施例４−１：セツキシマブと接合ペプチドで修飾された生理活性物質との結合確認
抗体と実施例３で収得した接合ペプチドで修飾された生理活性物質（ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ、ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体及びＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４）との結合を確認するために、１：５の比率でセツキシマブと接合ペプチドで修飾された生理活性物質とを混合し、ｐＨ７．４の１ｘＰＢＳバッファー上でＵＶハンドランプ（ｈａｎｄ  ｌａｍｐ）（Ｌｋｌａｂ、Ｕ０１−１３３−１９４）を用いて３６５ｎｍの紫外線を２時間にわたって照射した。その結果、セツキシマブと接合ペプチドで修飾された生理活性物質（ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ、ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ酵素前駆体及びＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４）とが結合したことを確認した（図７）。
【００９３】
接合ペプチドで修飾された生理活性物質が正確に抗体のＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェースに位置特異的に結合するかどうかを確認するために、１０μＭのヒトＩｇＧ１と３０μＭのＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼとを固定された濃度比率で混合し、Ｚ−ドメインの濃度を１０μＭから３５μＭまで５μＭの間隔で増加させながら処理した後、ＵＶハンドランプ（ｈａｎｄ  ｌａｍｐ）を用いて３６５ｎｍの紫外線を照射しながら２時間にわたって光反応を行った。前記Ｚ−ドメインは、ＦｃＩＩＩペプチドと同一のＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェースに結合する。
【００９４】
その結果、ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼの濃度より高い濃度である３５μＭのＺ−ドメインを処理した後で光反応を行ったとき、形成されるヒトＩｇＧ１−ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼが著しく減少することを確認した。これは、間接的にＦｃＩＩＩ融合タンパク質が位置特異的に抗体のＦｃドメインに結合することを意味する（図８）。
【００９５】
また、接合ペプチドで修飾された生理活性物質と抗体との接合位置を確認するために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析を行った。セツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−β−ラクタマーゼ接合体をトリプシン／グルタミルエンドペプチダーゼ混合物消化（Ｔｒｙｐｓｉｎ／Ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）処理して分析した。その結果、ＦｃＩＩＩのＶａｌ１０の位置に挿入されたｐＢｐａの官能基が抗体のＭｅｔ２５２の官能基に形成する共有結合によって位置特異的に生成された接合体フラグメントのピークを確認した（図９）。
【００９６】
実施例４−２：セツキシマブと接合ペプチドで修飾された生理活性物質とが結合された抗体−生理活性物質接合体の分離
１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が抗体と結合された抗体−生理活性物質接合体を分離するために、実施例４の接合ペプチドで修飾された生理活性物質に抗体が結合された抗体−生理活性物質接合体を５ｍｌの１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）に混合した後、１ｍｌのプロテインＡ５０％のレジンスラリー（ＣａｐｔｉｖＡ  プロテインＡレジン、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を添加し、４℃の条件で１時間３０分間回転させた。前記反応液を空カラムにローディングした後、レジンが完全に沈むようにし、３０ｍｌの１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）をローディングして洗浄した。その後、５ｍｌの溶出バッファー（ｐＨ３．０  ０．１Ｍのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ））をローディングすることによって産物を収得し、１２５μｌの中和バッファー（ｐＨ９．０のトリス（Ｔｒｉｓ））を入れることによってｐＨを滴定した。
【００９７】
その結果、前記収得した産物は、１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が結合した抗体−生理活性物質接合体と、接合されていない抗体との混合物であることを確認した（図１０）。
【００９８】
実施例４−３：セツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体のＥＦ２リボース化（ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）活性の確認
セツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体のＡＤＰ−リボース化活性を測定するために、ＺｈａｎｇとＳｎｙｄｅｒの方法でビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ＮＡＤ＋からＥＦ−２へのＡＤＰ−リボース転移を測定した。
【００９９】
ＰＥ２４とセツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体をそれぞれ２０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴで１ｎＭに希釈させ、３７℃の条件で１時間にわたって、５０ｎＭのビオチン化ＮＡＤ＋の存在下で小麦胚芽抽出物と共に培養した。その後、５ｘのドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ））ゲルローディング緩衝液で反応を終決させた。タンパク質は、ＳＤＳ−１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルで分離した。ビオチン化ＥＦ−２は、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ））接合体を用いてウェスタンブロットで検出した。ウェスタンブロットイメージは、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳシステムを使用して分析した。
【０１００】
その結果、ＰＥ２４と同様に、セツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体も、ＥＦ−２をＡＤＰ−リボース化させて不活性化させることを確認した（図１１）。
【０１０１】
実施例４−４：セツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体の細胞成長阻害活性の確認
光反応を通じて生成されたセツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体の活性を確認するために、セツキシマブが結合する特定抗原であるＥＧＦＲを細胞の表面に過剰発現する細胞株を用いて細胞生存力の測定（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を行った。
【０１０２】
ＥＧＦＲ細胞株であるＡ４３１（ＳＩＧＭＡ  ａｌｄｒｉｃｈ、８５０９０４０２）をＤＭＥＭ培地（１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン）に培養した後、９６−ウェルプレートに２Ｘ１０３ｃeｌｌ／ｗｅｌｌで種菌培養した。２４時間後、セツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４を０ｎＭ、０．０１６ｎＭ、０．１６ｎＭ、１．６ｎＭ及び１６ｎＭの濃度で処理し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で７２時間にわたって培養した。その後、ＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３５８０）を２０μｌ／ｗｅｌｌで処理し、２時間後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０３】
その結果、セツキシマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体を高い濃度で処理するほど吸光度が低く示され、陰性対照群として野生型セツキシマブ及びＰＥ２４を処理したウェルに比べて細胞生存能が著しく減少することを確認した（図１２）。
【０１０４】
実施例５：トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）と接合ペプチドで修飾された生理活性物質との結合及び接合体の分離と活性
実施例５−１：トラスツズマブとＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４との結合確認
抗体と実施例３で収得した接合ペプチドで修飾された生理活性物質（ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４）との結合を確認するために、１：５の比率でトラスツズマブと接合ペプチドで修飾されたＰＥ２４とを混合し、ｐＨ７．４の１ｘＰＢＳバッファー上でＵＶバンドランプ（ｈａｎｄ  ｌａｍｐ）（Ｌｋｌａｂ、Ｕ０１−１３３−１９４）を用いて３６５ｎｍの紫外線を２時間にわたって照射した。その結果、セツキシマブと接合ペプチドで修飾された生理活性物質（ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４）とが結合したことを確認した（図１３）。
【０１０５】
実施例５−２：トラスツズマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体の分離
１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質（この抗体と結合された抗体−生理活性物質接合体を分離するために、実施例４の接合ペプチドで修飾された生理活性物質に抗体が結合された抗体−生理活性物質接合体を５ｍｌの１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）に混合した後、１ｍｌのプロテインＡ  ５０％のレジンスラリー（ＣａｐｔｉｖＡ  プロテインＡレジン（ｒｅｓｉｎ）、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を添加し、４℃の条件で１時間３０分間回転させた。前記反応液を空カラムにローディングした後、レジンが完全に沈むようにし、３０ｍｌの１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）をローディングして洗浄した。その後、５ｍｌの溶出バッファー（ｐＨ３．０  ０．１Ｍのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ））をローディングすることによって産物を収得し、１２５μｌの中和バッファー（ｐＨ９．０のトリス（Ｔｒｉｓ））を入れることによってｐＨを滴定した。
【０１０６】
その結果、前記収得した産物は、１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が結合した抗体−生理活性物質接合体と、接合されていない抗体との混合物であることを確認した（図１３）。連続的に前記収得した産物に２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．９）を混合し、陰イオンクロマトグラフィー（ｍｏｎｏ−Ｑ  ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を実施し、結合していない抗体と、１個の接合ペプチドで修飾された生理活性物質が抗体に結合した形態とを分離して確認した（図１３）。
【０１０７】
実施例５−３：トラスツズマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体の細胞成長阻害活性の確認
光反応を通じて生成されたトラスツズマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体の活性を確認するために、トラスツズマブが結合する特定抗原であるＨＥＲ２を細胞の表面に過剰発現する各細胞株と未発現する細胞株を用いて細胞生存力の分析（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を行った。
【０１０８】
ＨＥＲ２過剰発現細胞株であるＢＴ−４７４（韓国細胞株銀行、６００６２）、ＨＣＣ−１９５４（韓国細胞株銀行、９Ｓ１９５４）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（韓国細胞株銀行、３０１３１）及びＨＥＲ２未発現細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１（韓国細胞株銀行、３００２６）をＲＰＭＩ培地（１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン）に培養した後、９６−ウェルプレートに３−５Ｘ１０３ｃeｌｌ／ｗｅｌｌで種菌培養した。２４時間後、トラスツズマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４を０ｎＭ、０．００６４ｎＭ、０．０３２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭの濃度で処理し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で７２時間にわたって培養した。その後、ＷＳＴ−８溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ、ＣＫ０４−１１）を１０μｌ／ｗｅｌｌで処理し、２時間後に４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０９】
その結果、ＨＥＲ２過剰発現細胞にトラスツズマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体を高い濃度で処理するほど吸光度が低く示され、陰性対照群として野生型トラスツズマブ及びＰＥ２４を処理したウェルに比べて細胞生存能が著しく減少することを確認した。対照的に、ＨＥＲ２未発現細胞に対しては、トラスツズマブ−ＦｃＩＩＩ−ＰＥ２４接合体の細胞毒性が該当の濃度範囲で作用しないという結果を確認した（図１４）。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明に係る特定位置が光反応性官能基に置換されたＦｃ位置選択的接合ペプチドを用いて接合ペプチドで修飾された生理活性物質を製造した後、光反応を通じて抗体と前記生理活性物質とを結合させると、生理活性物質を簡単な光反応を通じて抗体に位置選択的に且つ高効率で連結することができる。よって、多様な種類の生理活性物質と抗体とを連結した抗体−生理活性物質接合体の製造に用いることができ、その商業化を加速化させることができる。
【０１１１】
以上では、本発明の内容の特定部分を詳細に説明したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されることはない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021504493.tif 000021
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