(57)【要約】  本発明は、骨格筋由来細胞（ＳＭＤＣ）を得るための方法、並びに、神経筋障害及び／又は筋障害が失禁、特に尿の及び／又は肛門の若しくは糞便の失禁、である、神経筋障害及び／又は筋障害を予防及び／又は治療する方法におけるＳＭＤＣの使用、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格筋細（ＳＭＤＣ）を取得する方法であって、
（ａ）骨格筋組織から得られた試料を緩衝液中で冷却するステップ；
（ｂ）前記試料を処理及び冷却するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）の試料を少なくとも１つの酵素を含む血清を伴う媒体中で再懸濁し、３８℃に至るまで１〜２０時間加熱するステップ；試料をペレット形成し、及び、
（ｄ）ステップ（ｃ）の試料から単一細胞懸濁液を提供するためにステップ（ｃ）の試料のペレットを再懸濁し、それによってＳＭＤＣを取得するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が、１６℃より低い温度、好ましくは１〜１６℃、好ましくは４〜１０℃、特に好ましくは７℃の温度で；最大９６時間の範囲の時間で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）が、はさみ、メス、ピンセット、フィルター又はボールミルの使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）における冷却が、１〜１６℃の範囲、好ましくは４〜８℃の範囲、特に好ましくは４℃の温度で、かつ、２時間から４８時間の範囲の時間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）が、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ及びＤＮＡｓｅからなる群から選択される１つ又は２つ以上を含む溶液で酵素処理を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）が２５〜３８℃の範囲、好ましくは３６〜３８℃の範囲、特に好ましくは３７℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｄ）が、好ましくは、ＦＡＣＳソーティング、遠心分離、動電学的ソーティング、音響フォレーシスソーティング、ビーズベースの細胞ソーティング及び光学的ソーティングの少なくとも１つから選択される方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
さらなる任意のステップ（ｅ）が、ステップ（ｄ）の後に実施され、ステップ（ｄ）で得られた単一細胞懸濁液のインキュベーションを含み、ステップ（ｅ）でのインキュベーションが、好ましくは２５〜３８℃の範囲、好ましくは３６〜３８℃の範囲、特に好ましくは３７℃の温度により、付着性ＳＭＤＣが得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｅ）の後に、任意に、ステップ（ｅ）の非付着性細胞の廃棄を含むさらなるステップ（ｆ）が実施され、ステップ（ｆ）が好ましくは少なくとも６時間〜４日後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｆ）の後に、任意に、ステップ（ｅ）の付着細胞を増殖させるさらなるステップ（ｇ）が実施され、ステップ（ｈ）における増殖が、１〜５継代に対して７０〜８０％の集密度の付着細胞の培養を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＭＤＣが、少なくとも６０％のＣＤ５６陽性及び６０％のＡ２Ｂ５陽性細胞を含むＳＭＤＣ。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従って得られたＳＭＤＣ。
【請求項１３】
ＳＭＤＣが、ＣＤ５６、Ａ２Ｂ５、ＣＤ１０５、Ｍｙｆ５及びＰａｘ７から選択される少なくとも１つ以上のマーカーの陽性発現、並びに、ＣＤ３４及びＭｙｏＤから選択される少なくとも１つ以上のマーカーの陰性発現から選択される異なるマーカーの組み合わせの発現によって特徴付けられる、請求項１１又は１２に記載のＳＭＤＣ。
【請求項１４】
医薬組成物として使用するための、請求項１１〜１３に記載のＳＭＤＣ。
【請求項１５】
神経筋障害及び／又は筋障害を予防及び／又は治療する方法で使用するための、請求項１１から１３に記載のＳＭＤＣ。好ましくは、便失禁及び／又は尿失禁などの神経筋障害及び／又は筋障害を予防及び／又は治療する方法で使用ためのＳＭＤＣ。
【請求項１６】
筋機能障害を治療する方法において使用するための請求項１１〜１３に記載のＳＭＤＣであって、筋機能障害が失禁、特に尿失禁及び／又は肛門若しくは便失禁である、ＳＭＤＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格筋由来細胞（ＳＭＤＣ）を得るための方法、並びに、神経筋結合を改善する方法における、及び筋機能障害が失禁、特に尿失禁及び／又は肛門失禁である筋機能障害の治療における使用のためのＳＭＤＣの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
排泄抑制能力を維持する能力は、社会的存在としての我々の満足できる生活状態のための基本である。肛門の排泄抑制能力の喪失は、身体的、生理学的、社会的な障害をもたらす。一般に、主に高齢者や障害者が肛門失禁に罹患していると考えられているが、これらの症状はすべての年齢の人々に発生し得る。肛門失禁のスペクトル、すなわち腸の内容物の制御の喪失は、下着の小さな糞便の跡から、腸内ガスの喪失まで、最大、軟便又は固形便の制御されない排便の大量のエピソードまでの範囲に及ぶ。この理由は、多層的で複雑な場合があり得る。影響を受ける個人の生活の質が極端に損なわれていることとは関係なく、肛門の排泄抑制能力の障害は、公衆衛生システムのコスト要因を過小評価してはならないという結果をもたらす。さらに、肛門失禁は老人ホームでの２番目に頻度の高い（認知症よりも頻繁な）入院の理由である。老人ホームや病院の高齢者の３分の１は、糞便に対して自制できない。
【０００３】
排泄抑制能力器官の随意制御には２つの骨格筋が重要である：それは、外肛門括約筋と、肛門挙筋の一部としての恥骨直腸筋である。残りの骨盤隔膜（恥骨尾骨筋、尾骨筋、腸骨尾骨筋）が多かれ少なかれサポート的な役割を果たす可能性がある。外肛門括約筋は陰部神経によってサポートされている。外肛門括約筋と恥骨直腸筋の両方の筋肉は、直腸の中身の体積／量に正比例する一定の筋組織の緊張（トーヌス）を維持できる。このトーヌスは、排便プロセスの開始とともに減少する。恥骨直腸筋の一定の基線トーヌスは、肛門管と直腸の間に９０°の角度を形成する結合に対する肛門直腸移行部の「ねじれ」をもたらす。この肛門直腸の角度はまた、肛門の排泄抑制能力の維持にも寄与する。恥骨直腸筋のさらなる機能は、外肛門括約筋が損傷している場合に、少なくとも部分的に形成された糞便を保持することである。
【０００４】
恥骨直腸筋では、腸内ガス又は液体の糞便を制御することはできない。これらの便の種類の肛門の排泄抑制能力は、内部と外部の肛門括約筋の相互作用によって提供される。痔疾部クッションは気密閉塞を提供する。安静状態では、肛門管は外肛門括約筋の一定の緊張性活動と内肛門括約筋の基線安静圧によって閉塞される。結腸の円形平滑筋層の継続及び拡張である内肛門括約筋は、閉鎖された肛門管の基準値圧力の約７５〜８５％を提供する。この平滑筋成分の活動は、直腸の膨張、いわゆる直腸肛門抑制反射によって完全に抑制される。この弛緩は、排便を防ぐための外肛門括約筋及び恥骨直腸筋の反射収縮を伴う。
【０００５】
上記のように、現在の治療方法は、主に括約筋の断裂の外科的矯正を目的としている。これは、上記の症状の短期的な改善につながる。
【０００６】
軽度の形態の肛門失禁は、保守的な治療方法で治療でき、症状の改善をもたらす。しかしながら、より深刻なケースでは、それぞれの外科的介入の結果、成功する可能性が小さい短期的な改善をしばしばもたらす。
【０００７】
保守的な治療方法は、繊維の摂取量の増加に加えて食物摂取の変化や、肛門の感度が低下している場合に肛門タンポンや直腸浣腸の使用などを含む。ロペラミドの摂取は、必要に応じて、胆汁酸結合物質と組み合わせて、腸の運動性を低下させ、肛門括約筋の圧力を増加させる。新しい形態の治療では、閉経後の女性に対して局所的に適用される局所エストロゲンが利用されるが、ランダム化された研究が欠けている。
【０００８】
しかしながら、外科的介入が必要な患者の数が異なる：ほとんどの場合、出産後の外傷性損傷の急性治療に対して、（隣接した又は重複した）括約筋の修復が適用される。短期的な見込みは良好であり、長期的な結果は不十分である。
【０００９】
緊張性尿失禁については、筋肉由来細胞を損傷部位に注入して、緊張性尿失禁を改善することが提案されている。しかしながら、２つの異なる疾患の原因は完全に異なるため、緊張性尿失禁は肛門失禁と比較できない。さらに、２つのシステム（尿道 vs 肛門）はまた類似の機能を有さない。尿道は、液体のみを十分に制御する必要がある。直腸は、固体、液体及び気体の内容物を制御することができる。これは完全に異なる感覚的要件を必要とする。したがって、尿生殖路と直腸では解剖学が大きく異なる。例えば、直腸を取り囲む外肛門括約筋があるが、尿道を完全に取り囲む同等のものはない。さらに、尿道の背側は、成人男性ではほとんど横紋筋を見つけることができないが、一方、直腸の外肛門括約筋は完全に円形の横紋筋である。
【００１０】
筋線維の前駆体である筋芽細胞は、他の種類の細胞とは多くの点で異なる単核筋細胞である。筋芽細胞は自然に融合して、生理活性タンパク質の長期的な発現と送達をもたらす有糸分裂後の多核筋管を形成する。筋芽細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋肉関連疾患の筋肉への遺伝子送達のほか、例えば、アデノシンデアミナーゼ欠乏症候群に対するヒトアデノシンデアミナーゼの遺伝子送達；糖尿病に対するヒトプロインスリンの遺伝子導入；パーキンソン病のチロシンヒドロキシラーゼの発現のための遺伝子導入；血友病Ｂに対する第ＩＸ因子の移行と発現；成長遅滞のためのヒト成長ホルモンの送達；などの非筋肉関連疾患の遺伝子送達に使用されている。
【００１１】
筋肉変性を治療するため、組織の損傷を修復するため、又は疾患を治療するための筋芽細胞の使用が、米国特許第５，１３０，１４１号及び第５，５３８，７２２号に開示されている。また、筋芽細胞移植は、心筋機能障害の修復に採用されてきた（Robinsonet al., 1995; Murry et al., 1996; Gojo et al., 1996; Zibaitis et al., 1994）。
【００１２】
筋芽細胞はまた、特に尿失禁及び／又は肛門失禁の排泄抑制能力の維持に関与する筋肉損傷を修復するために使用することができる。筋芽細胞を含む骨格筋由来細胞は、成体の筋肉損傷を修復するために分化することができる骨格筋の前駆細胞として知られている。
【００１３】
骨格筋由来細胞を単離するためのいくつかの方法が先行技術に記載されている。骨格筋由来細胞の分離のための明確な方法は、プレプレーティング技術を適用する。それにより、細胞が筋組織から得られ、その単一細胞懸濁液が、プレプレートとしても知られる異なる細胞培養容器に連続的に移され、線維芽細胞などの非筋原性細胞を排除し、筋芽細胞などの筋原性細胞を濃縮する。例えば、Rando and Blau, 1994は、細胞培養における筋芽細胞のそのような精製について記載する（T. A. Rando and H. M. Blau, “Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.,” J. Cell Biol., vol. 125, no. 6, pp. 1275-1287, Jun. 1994)）。単一のプレプレーティングと比較して複数のプレプレーティングステップを使用すると、筋芽細胞の純度と生存率が向上するが、これは、筋芽細胞移植療法の治療効果に必要である（Z. Qu, L. Balkir, J. C. T. van Deutekom, P. D. Robbins, R. Pruchnic, and J. Huard, “Development of Approaches to Improve Cell Survival in Myoblast Transfer Therapy,” J. Cell Biol., vol. 142, no. 5, pp. 1257-1267, Sep. 1998）。
【００１４】
プレプレーティング技術に基づく方法の欠点は、いくつかのプレプレーティングステップの実施に時間がかかることである。細胞はプレプレーティングによって複数回継代されるが、有効な純度で目的の量の細胞に到達するには、さらに再プレーティングする必要がある(B. Gharaibeh et al., “Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique,” Nat. Protoc., vol. 3, no. 9, p. 1501, Aug. 2008; A. Lu et al., “Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics,” Gene Ther., vol. 15, no. 15, pp. 1116-1125, May 2008)。したがって、培養期間の延長と、プレ及び再プレーティング中の筋芽細胞の倍増細胞数の増加は、成長停止を伴う老化をもたらす可能性があり、筋芽細胞移植に必要な量の細胞に到達できないことさえある(W. E. Wright and J. W. Shay, “Historical claims and current interpretations of replicative aging,” Nat. Biotechnol., vol. 20, no. 7, pp. 682-688, Jul. 2002)。さらに、プレプレーティングの感度の欠如が、純度の向上が達成されたとしても、筋芽細胞の数の全体的な減少をもたらす可能性がある(B. C. Syverud, J. D. Lee, K. W. VanDusen, and L. M. Larkin, “Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering,” J. Regen. Med., vol. 3, no. 2, 2014)。
【００１５】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）や磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）などの筋芽細胞を分離する他の方法は有望に思われたが、ＦＡＣＳに高電圧レーザー強度を適用することによる細胞の損傷の可能性と、ＭＡＣＳが使用する磁気抗体の保持についての懸念により、これらの方法は、筋芽細胞の単離には優れた選択ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
先行技術の方法のこれらの欠点を考慮して、骨格筋由来細胞（ＳＭＤＣ）を提供するための新しい方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この目的は、特許請求の範囲で規定された主題によって解決される。
【００１８】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに表すために含まれている。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ又は複数を参照することにより、よりよく理解される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、標準的な細胞培養フラスコに付着したＳＭＤＣの位相差顕微鏡写真（倍率１００倍）を示す。
【図２】図２は、ＳＭＤＣの純度と生存率を示すＦＡＣＳ分析である。ヒストグラムＡはＣＤ５６分析であり、９９．３％の細胞がＣＤ５６陽性であることを示している。ヒストグラムＢは７ＡＡＤ生存率分析を示し、９８．７７％の細胞が生存可能であることを示している。
【図３】図３は、筋原性マーカーであるデスミンの免疫染色によって示された、ＳＭＤＣの純度を１００倍に拡大した顕微鏡写真を示している。陽性細胞はより暗い染色で表示されるが、陰性細胞は染色されない。
【図４】図４は、多核筋管に分化するように誘導されたＳＭＤＣの顕微鏡写真を示す。筋管は、暗い染色で示されるように、筋原性デスミンタンパク質を発現する。
【図５】図５は、ＳＭＤＣのＡ２Ｂ５染色のＦＡＣＳ分析を示している。ヒストグラムＢに示されているＡ２Ｂ５抗体染色と比較して、アイソタイプ対照染色がヒストグラムＡに示されている。ヒストグラムＢは、細胞の９６％がＡ２Ｂ５に陽性であることを示している。
【図６】図６は、Ａ２Ｂ５反応性抗原合成酵素の遺伝子発現を示している。ＳＴ３ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ２及びＳＴ３ＧＡＬ３の遺伝子アノテーション当たりの平均リード数は、商業的に利用可能なＳＭＤＣ（ＳＴ３ＧＡＬ１：５．９７；ＳＴ３ＧＡＬ２：９．５９；ＳＴ３ＧＡＬ３：９７．８１）と比較して、本発明によって得られたＳＭＤＣのこれらのｍＲＮＡのより高い発現を示唆している。
【図７】図７は、冷却ステップありを意味する実施例１、又は冷却ステップなしを意味する実施例９のいずれかによって得られた細胞における％ＣＤ５６陽性細胞の比較を示す。実施例１で得られた細胞は、実施例９で得られた細胞（平均±ＳＤ：７７．１１±８．３７）と比較して有意に高い（スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５；＊）ＣＤ５６陽性細胞（平均±ＳＤ：９３．２８±８．３７）を含むことが示されている。データは、同じドナーからの細胞に対して実施例１及び９による手順を実施するために半分に分割された３人の個々のヒトドナーの筋バイオプシーに由来する細胞の平均±ＳＤとして提示された。
【図８】図８は、ＳＭＤＣ上の間葉マーカーＣＤ１０５の発現を示すＦＡＣＳ分析を示している。ヒストグラムＢはＣＤ１０５分析であり、ＳＭＤＣの９８．６９％がＣＤ１０５に陽性であることを示している。ヒストグラムＡは、ＳＭＤＣのわずか０．３１％でアイソタイプ対照陽性を示すことにより、陽性閾値の正確な設定を示す。
【図９】図９は、ＣＤ５６＋のＳＭＤＣ（約１００％のＣＤ５６発現細胞を含む）とＣＤ５６−のＳＭＤＣ（約３０％のＣＤ５６陽性細胞を含む）の間のＡＣｈＥ活性（タンパク質１ｇ当たりのｍＵｒｅｌ）を比較することによる、本発明によるＳＭＤＣの神経筋再生能力を示す。ＡＣｈＥ活性測定は、実施例１１に記載されているように実施された。ＣＤ５６＋のＳＭＤＣは、ＣＤ５６−のＳＭＤＣと比較して有意に高い（スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５；＊）ＡＣｈＥ活性を示す。データは、３人の個人ドナーの筋バイオプシーに由来する細胞の平均±ＳＥＭとして表示した。
【図１０】図１０は、ＣＤ５６＋のＳＭＤＣ（約１００％のＣＤ５６発現細胞を含む）とＣＤ５６−のＳＭＤＣ（約３０％のＣＤ５６陽性細胞を含む）の融合能力（％融合指数）を比較することによる、本発明によるＳＭＤＣの神経筋再生能力を示す。融合能力の定量化は、実施例１２に記載されたように実施された。ＣＤ５６＋のＳＭＤＣは、ＣＤ５６−のＳＭＤＣと比較して有意に高い（スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５；＊）融合率を示している。データは、３人の個人ドナーの筋バイオプシーに由来する細胞の平均±ＳＥＭとして提示した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
「a」又は「an」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において、「含む」という用語と共に使用される場合、「１」を意味し得るが、「１又はそれ以上」、「少なくとも１」及び「１又は１を上回る」の意味とも一致する。
【００２１】
「約」という用語は、記述された値、記述された値の５％のプラス若しくはマイナス又は所与の値の測定に対する標準誤差が企図されることを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される「肛門失禁」という用語は、腸内ガス、液体又は固形便などの、肛門を介した腸内容物の望ましくない喪失を指す。この用語には、３つの重症度グレード；グレード１＝気体のみ、グレード２＝液体及び軟便、グレード３＝固形の形成された糞便がすべて含まれる。
【００２３】
本明細書において使用される「肛門括約筋」又は「肛門括約筋組織」という用語は、具体的には、肛門挙筋の一部としての外肛門括約筋及び恥骨直腸筋を指す。しかしながら、それは、恥骨尾骨筋、尾骨筋、腸骨尾骨筋、及び陰部神経も含む。
【００２４】
「骨格筋由来細胞」又は「ＳＭＤＣ」という用語は、初代細胞及び／又はインビトロ培養細胞であってもよい、多核融合形質転換受容性細胞、例えば筋芽細胞、あるいは、筋原性能力を有するその他の細胞（例えば、脂肪吸引組織、又は骨髄などの組織を保持しているその他の幹細胞に由来）を指す。その用語は、骨格筋細胞の培養のために単離され使用され得る脂肪に由来する細胞も含む。「骨格筋由来細胞」又は「ＳＭＤＣ」という用語は、筋組織から単離された細胞集団も指す。一般に、そのような細胞集団は、筋組織を形成する能力を有しないさらなる細胞を含む。そのような細胞は、本明細書において「非筋原細胞」又は「骨格筋由来非筋原細胞」と呼ばれ、好ましくは、ＣＤ５６陰性及び／又はデスミン陰性である。従って、本明細書において使用される「骨格筋由来細胞」又は「ＳＭＤＣ」という用語は、好ましくは、多核融合形質転換受容性細胞を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％含む細胞集団を指す。
【００２５】
本明細書において使用される「穿通」という用語は、注射過程に影響を与えることなく、注射デバイス、例えば、針を身体組織へ導入する過程を指す。
【００２６】
本明細書において使用される「注射」という用語は、注射デバイスからの、上記細胞を含む注射液の、ヒト体内の特定の部位、具体的には、肛門排泄抑制能力を提供する筋組織中への又はその近傍への排出を指す。注射過程は、静的、即ち、注射デバイスが到達した位置に留まるものであり得るが、これに限定されない。代替的に、注射過程は動的である。例えば、本発明のいくつかの態様において、注射は、注射の部位からの注射デバイスの引き戻しと同時に行われる。
【００２７】
本明細書において使用される「注射部位」という用語は、注射過程が開始される、肛門の排泄抑制能力を提供する筋組織又はその近隣のような、ヒト体内の部位を指す。注射部位は、注射過程が終了する部位と同一である必要はない。
【００２８】
本明細書において使用される「注射デバイス」という用語は、関心対象の注射部位に到達するためにヒト組織を穿通するために適当であって、溶液、具体的には、筋由来細胞を含む溶液を、関心対象の注射部位へ送達することができるデバイスを指す。
【００２９】
本明細書において使用される「便失禁」という用語は、肛門を介した液体又は形成された便の望ましくない喪失のみを指す。
【００３０】
本明細書において使用される「受動的失禁」という用語は、糞便の喪失の感覚的認識の欠如を指す。これは、肛門の基線の圧力値が低く、肛門及び直腸粘膜の感覚能力が不足していることを含む。
【００３１】
本明細書において使用される「強制的排便」又は「強制的切迫」とは、ヒトが５分間より長く排便を遅らせる能力が欠如していることを指す。そのような患者は、直ちにトイレに行かなければならない。
【００３２】
本明細書において使用される「ＣＤ５６＋」又は「ＣＤ５６陽性」という用語は、細胞マーカーＣＤ５６を発現する細胞を指す。「ＣＤ５６＋」又は「ＣＤ５６陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が細胞マーカーＣＤ５６を発現する場合は、異なる細胞タイプを含む細胞集団についても使用できる。
【００３３】
本明細書において使用される「ＣＤ５６−」又は「ＣＤ５６陰性」という用語は、細胞マーカーＣＤ５６を発現していない細胞を指す。「ＣＤ５６−」又は「ＣＤ５６陰性」という用語は、好ましくは細胞集団に対して多くとも４９％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％が細胞マーカーＣＤ５６を発現する場合に、異なる細胞タイプを含む細胞集団についても使用できる。
【００３４】
本明細書において使用される「Ａ２Ｂ５＋」又は「Ａ２Ｂ５陽性」という用語は、細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現している細胞を指す。「Ａ２Ｂ５＋」又は「Ａ２Ｂ５陽性」という用語は、好ましくは、細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現する場合に、異なる細胞タイプを含む細胞集団にも使用できる。
【００３５】
本明細書において使用される「Ａ２Ｂ５−」又は「Ａ２Ｂ５陰性」という用語は、細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現していない細胞を指す。「Ａ２Ｂ５−」又は「Ａ２Ｂ５陰性」という用語は、最大で４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１又は０パーセントが細胞集団の細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現する場合、異なる細胞タイプを含む細胞集団にも使用できる。
【００３６】
本明細書において使用される「デスミン陽性」という用語は、細胞マーカーデスミンを発現している細胞を指す。「デスミン陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が細胞マーカーデスミンを発現する場合に、異なる細胞タイプを含む細胞集団についても使用できる。
【００３７】
本明細書において使用される「デスミン陰性」という用語は、細胞マーカーデスミンを発現していない細胞を指す。「デスミン陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の多くとも４９％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％が細胞マーカーデスミンを発現する場合に、異なる細胞タイプを含む細胞集団についても使用できる。
【００３８】
本明細書で使用される「ＣＤ１０５＋」又は「ＣＤ１０５陽性」という用語は、細胞マーカーＣＤ１０５を発現している細胞を指す。「ＣＤ１０５＋」又は「ＣＤ１０５陽性」という用語は、好ましくは、細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーＣＤ１０５を発現する場合に、異なる細胞タイプを含む細胞集団にも使用できる。
【００３９】
本明細書で使用される「ＣＤ１０５−」又は「ＣＤ１０５陰性」という用語は、細胞マーカーＣＤ１０５を発現していない細胞を指す。「ＣＤ１０５−」又は「ＣＤ１０５陰性」という用語は、細胞集団の最大で４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１又は０パーセントが、細胞マーカーＣＤ１０５を発現する場合、異なる細胞タイプを含む細胞集団にも使用できる。
【００４０】
本明細書において使用される「分化培地」という用語は、例えば筋芽細胞として、多核融合形質転換受容性細胞又は筋原細胞において融合を誘導する細胞培養培地を指す。しかしながら、前記用語は、多核融合形質転換受容性細胞又は筋原細胞がそれぞれの誘導なしに融合することができる場合、融合の誘導のために必要な、いかなる物質を含まない細胞培養培地も指す。
【００４１】
本明細書で使用する「細胞増殖培地」という用語は、ＳＭＤＣなどの哺乳動物細胞の培養に適したいかなる培地を指し、これにより、培養容器の表面上に前記哺乳動物細胞が付着することを可能にする。
【００４２】
本発明によれば、骨格筋由来細胞（ＳＭＤＣ）を取得するための方法が提供される。
【００４３】
本発明の第１の主題は、骨格筋由来細胞（ＳＭＤＣ）を得るための方法に関し、この方法は、以下のステップを含む：（ａ）緩衝液中で骨格筋組織から得られた試料を冷却するステップ；（ｂ）試料を処理し冷却するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）の試料を、少なくとも１つの酵素を含む血清を含む培地中で再懸濁し、３８℃まで１〜２０時間加熱するステップ；試料をペレット化し、及び、（ｄ）ステップ（ｃ）の試料のペレットを再懸濁して、ステップ（ｃ）の試料から単一の細胞懸濁を提供し、それによりＳＭＤＣを得るステップ。
【００４４】
本発明者らは、本発明の方法を実施することにより、プレプレーティングステップを実施する必要なしに、高い筋形成能力を示すＳＭＤＣの獲得及び濃縮が有利に可能になることを見出した。これらの濃縮されたＳＭＤＣは、ＣＤ５６やデスミンなどの筋原性マーカーに対して非常に純粋であり、例えば適切な力価アッセイによってアッセイされたときに、増加した筋原性能力を示す。さらに、最初のプレーティングの前にＳＭＤＣを濃縮することは、細胞が継代培養を受ける必要がより少ないため有利であり、したがって、本発明により、老化細胞の量が少なくなり、生存率が高くなる。さらに、本発明は、ＣＤ５６及びデスミンなどの筋原性マーカーだけでなく、Ａ２Ｂ５などの神経前駆細胞のマーカーも発現する細胞を生成し、神経筋サポートの可能性も示唆する。実際に、本発明によって得られるＳＭＤＣは、Ａ２Ｂ５反応性抗原の神経筋サポートに必要なＡ２Ｂ５反応性抗原合成酵素ＳＴ３ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ２及びＳＴ３ＧＡＬ３の遺伝子発現において、最新の細胞とは異なる。要約すると、本発明によって得られる濃縮されたＳＭＤＣは、高純度及び生存能力を示し、したがって、特に尿失禁及び／又は便失禁の状態における神経筋結合のサポート並びに筋力低下の再生において高い臨床効果を有することが示唆される。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ（ａ）は、筋バイオプシーを実施することを含む。
【００４６】
筋肉由来細胞の供給源として機能するそのような筋肉バイオプシーは、損傷部位の筋肉から、又は臨床外科医がより容易にアクセスできる別の領域から得ることができる。バイオプシーの部位は、明確な骨格筋に限定されず、上腕などからであってもよい。バイオプシーのサイズは、約１ｃｍｘ１ｃｍｘ１ｃｍ以上を含む場合がある。
【００４７】
例えば失禁の治療のための筋傷害の治療において筋芽細胞を使用するために、前記筋芽細胞は、好ましくは、治療される対象の骨格筋バイオプシーから単離される。
【００４８】
さらに好ましい実施形態において、ステップ（ａ）は、１６℃より低い温度、好ましくは１〜１６℃の範囲、好ましくは４〜１０℃の範囲、特に好ましくは７℃の温度で、最大９６時間の範囲の時間行われる。
【００４９】
したがって、本発明の方法は、ステップ（ａ）において、１〜１６℃の温度範囲又はこの範囲の間のいかなる温度、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５℃、又はこの範囲内のいかなる中間温度などで行われることが好ましい。本発明のさらに好ましい実施形態では、温度範囲は６〜８℃である。さらに好ましい実施形態では、温度範囲は４℃未満、好ましくは１〜３℃の範囲である。
【００５０】
さらに、ステップ（ａ）における本発明の方法は、最大９６時間までの範囲の時間、又はこの範囲内のいかなる時間、例えば１２〜９６時間、１２〜７２時間、１２〜４８時間、２４〜９６時間、２４〜７２時間、２４〜４８時間、又はいかなるその他の中間範囲で実施されることが好ましい。
【００５１】
好ましくは、ステップ（ｂ）は、はさみ、メス、ピンセット、フィルター又はボールミル及び遠心分離機の使用を含む。しかしながら、骨格筋組織の細切り又は細断を可能にするいかなる他の手段が本発明に包含され一致していることは、当業者に明らかである。
【００５２】
さらに好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）は、１〜１６℃の範囲の温度、又はこの範囲の間の任意の温度、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５℃、又はこの範囲内の任意の中間温度で行われる。本発明のさらに好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）は、４〜８℃の範囲、特に好ましくは４℃の温度で行われる。さらに好ましい実施形態では、温度範囲は４℃未満、好ましくは１〜３℃の範囲である。
【００５３】
さらに好ましくは、本発明のステップ（ｂ）は、２〜４８時間又はこの範囲内のいかなる時間などの明確な時間範囲、例えば、２〜３６時間、２〜２４時間又は任意の他の中間範囲で行われる。
【００５４】
したがって、本発明の方法のステップ（ｂ）は、骨格筋組織を処理し、及び処理された骨格筋組織の明確な時間の冷却により行われることが予見される。本発明の好ましい実施形態において、試料の冷却は、処理ステップの後に行われることが予見される。本発明者らは、処理された試料の冷却は、線維芽細胞などの非筋原細胞が休止状態の筋原細胞よりも高い代謝活性に起因して温度感受性であるために達成される線維芽細胞などの非筋原細胞の決定的な減少につながるため、有益であることを見出した。この特性により、線維芽細胞などの非筋原性細胞は低温状態で死ぬ。この結果として、本発明の方法のステップ（ｂ）における冷却は、筋原細胞の濃縮を提供する。この濃縮は、プレプレーティングのステップを実行する必要なしに達成される。したがって、本発明の方法は、時間及び費用がかかるステップを実施する必要なしに、筋原細胞の良好な濃縮及び精製を提供する。
【００５５】
冷却ステップの重要性は、特に、以下の実施例に示す比較データの形で示されている。そこでは、ＣＤ５６陽性細胞の量が著しく上昇していることが示されている。ＣＤ５６陽性細胞は、得られたＳＭＤＣの純度を示すマーカーを意味する。したがって、本発明の方法は、本発明の方法で予見されるような冷却ステップを行わない従来技術の方法と比較して、より多くの量及びより高い品質でＳＭＤＣを得ることができる方法を意味する。
【００５６】
神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）としても知られるＣＤ５６は、インビトロでの骨格筋筋芽細胞（Belles-Isles et al., 1993）及びインビボでの平滑筋組織（Romanska et al., 1996）に発現する筋原性コミットメントマーカーである。ＣＤ５６は、融合能力のあるデスミン＋ＳＭＤＣに存在する。特にＣＤ５６は、多核筋管を形成し、ＣＤ５６陰性ＳＭＤＣよりも高い酵素的アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性を発現できるＳＭＤＣ集団を示すことが示されている（Thurner et al., 2018）。便失禁患者の治療に使用されるＳＭＤＣの高いＡＣｈＥ活性は、実際、便失禁の症状の軽減という点で治療の成功に結びついている（Thurner et al., 2018）。したがって、ＣＤ５６に対して高純度であり、したがって、ＡＣｈＥ活性が高いＳＭＤＣが、便失禁などの神経筋障害及び／又は筋障害を有する患者の治療を成功させるために望まれる。本発明は、ＣＤ５６に対して高純度であり、かつ高いＡＣｈＥ活性を有するＳＭＤＣを単離する方法を提供する。
【００５７】
好ましくは、ステップ（ｃ）は、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、及びＤＮＡｓｅからなる群から選択される１つ又は２つ以上を含む溶液で酵素的処理を行うことを含むことが予見される。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）はコラゲナーゼの使用を予見する。
【００５８】
本発明によれば、ステップ（ｃ）での再懸濁は、ステップ（ｂ）の試料の遠心分離、上清の廃棄、及び少なくとも１つの酵素を含む血清を含む培地での細胞ペレットの再懸濁を含むことが好ましくは予見される。さらに、本発明の好ましい実施形態では、緩衝液などの適切な溶液中での細胞のボルテックスを含む、ステップ（ｃ）の細胞で１つ又は複数の洗浄ステップを行うことも好ましい。本発明によれば、少なくとも１つの酵素を含む血清を含む培地中でステップ（ｂ）の再懸濁された試料は、インキュベーション時間後に遠心分離され、試料の細胞をペレット化し、酵素含有上清を廃棄する。
【００５９】
本発明の特に好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の酵素はトリプシンである。
【００６０】
本発明のさらに好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）は、２５〜３８℃、好ましくは３６〜３８℃の範囲、特に好ましくは３７℃の温度で行われる。
【００６１】
好ましくは、ステップ（ｄ）は、ＦＡＣＳソーティング、遠心分離、動電学的ソーティング、音響フォレーシスソーティング、ビーズベースの細胞ソーティング、及び光学的ソーティングのうちの少なくとも１つから選択される方法を好ましくは含む。
【００６２】
単一細胞懸濁液を得る方法は、当技術分野でよく知られている。適切な濃縮方法の一例は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ（登録商標））である。ＭＡＣＳ法では、特定の表面抗原に対する抗体でコーティングされた粒子と細胞をインキュベートすることにより、細胞を分離できる（http://en.wikipedia.org/wiki/Magnetic_nanoparticles）。続いて、培養した細胞を磁場中に置いたカラムに移す。このステップでは、抗原を発現し、したがってナノ粒子に付着している細胞がカラムに留まり、抗原を発現していない他の細胞がカラムを流れる。この方法により、細胞は特定の抗原に関して陽性及び／又は陰性に分離することができる。適切な濃縮方法の別の例は、例えば、Webster et al. （Exp Cell Res. 1988 Jan; 174（1）：252-65）に記載のとおり、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ（登録商標））である。
【００６３】
本発明のさらに好ましい実施形態において、ステップ（ｄ）の後に、さらに、ステップ（ｄ）で得られた単一細胞懸濁液のインキュベーションを含む、任意のステップ（ｅ）が実施され、ステップ（ｅ）でのインキュベーションは、２５〜３８℃、好ましくは３６〜３８℃の範囲、特に好ましくは３７℃の温度により、付着性ＳＭＤＣが得られる。
【００６４】
この追加の任意のインキュベーションステップにより、細胞を培養してより大量のＳＭＤＣを達成できる。当業者は、培地及び温度などの培養条件を調整して、したがってＳＭＤＣの最大量を得る。
【００６５】
さらに好ましくは、ステップ（ｅ）の後、任意に、ステップ（ｅ）の非付着細胞の廃棄を含むさらなるステップ（ｆ）が行われ、ステップ（ｆ）は好ましくは少なくとも６時間〜４日後に行われることが予見される。
【００６６】
本発明によれば、この任意のステップにより、好ましくは、非筋形成細胞又は死細胞などの培養容器中に浮遊している細胞を廃棄することができる。それにより、所望の付着細胞がさらに濃縮される。当業者は、任意のステップ（ｆ）を、そのようなステップを実施する実際の必要性に応じて、６時間〜３日の好ましい範囲内の適切な時間で実施する。そのような任意のステップ（ｆ）が本当に必要かどうかは、例えば、顕微鏡下での細胞の観察によって規定され、細胞培養中の非付着細胞の量を決定することができる。
【００６７】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ステップ（ｆ）の後、任意に、ステップ（ｅ）の付着細胞を増殖させるさらなるステップ（ｇ）が実施され、ステップ（ｈ）での増殖は、１〜５継代で７０〜８０％の集密度へ付着細胞を培養することを含む。
【００６８】
本発明によれば、当業者は、７０〜８０％の所望の集密度を達成するために必要な持続時間及び継代の量を決定することができる。
【００６９】
本発明の第２の主題はＳＭＤＣに関し、ＳＭＤＣは、少なくとも６０％のＣＤ５６陽性及び６０％のＡ２Ｂ５陽性細胞を含む。
【００７０】
本発明のさらに好ましい態様において、ＳＭＤＣはＣＤ１０５陽性であり、これは、ＳＭＤＣがそれらの細胞表面にＣＤ１０５を発現することを意味する。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％又はＳＭＤＣの上記の値の間の任意の中間範囲がＣＤ１０５陽性であり、これは、ＳＭＤＣが細胞表面にＣＤ１０５を発現することを意味する。
【００７２】
ＣＤ１０５は、エンドグリンとしても知られている。それは、血管内皮細胞と胎盤の合胞体栄養芽細胞で見られる９０ｋＤのサブユニットを持つタイプＩ内在性膜ホモ二量体タンパク質である。ＣＤ１０５は間質性線維芽細胞に弱く発現している。また、活性化された単球や組織マクロファージにも発現している。ＣＤ１０５の発現は、腫瘍などの血管新生を受けている組織や、創傷治癒や皮膚炎症の場合に、活性化内皮細胞で増加する。ＣＤ１０５は、ヒト臍帯静脈内皮細胞のＴＧＦ−β受容体システムのコンポーネントであり、ＴＧＦ−β１及びβ３に高い親和性で結合するが、ＴＧＦ−β２には結合しない。ＴＧＦ−β受容体が骨格筋の分化に必要であることが示されている。実際に、ＴＧＦ−β受容体は、ミオゲニンの増加、骨格筋分化因子、及び筋芽細胞の融合能力に必要であることが示された。したがって、ＣＤ１０５陽性細胞は、ＳＭＤＣ、及び本発明に開示される方法により得られるＳＭＤＣに好ましい場合がある。
【００７３】
本発明のさらに好ましい態様において、ＳＭＤＣはデスミン陽性であり、これはＳＭＤＣが細胞表面にデスミンを発現することを意味する。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％又はＳＭＤＣの上記の値の間の任意の中間範囲がデスミン陽性であり、これは、ＳＭＤＣがデスミンを細胞表面に発現することを意味する。
【００７５】
本発明のさらに好ましい態様において、ＳＭＤＣはＰａｘ７陽性であり、これは、ＳＭＤＣが細胞表面にＰａｘ７を発現することを意味する。
【００７６】
本発明のさらに好ましい実施形態において、ＳＭＤＣはＭｙｆ５陽性であり、これは、ＳＭＤＣが細胞表面でＭｙｆ５を発現することを意味する。
【００７７】
Ａ２Ｂ５反応性抗原は、細胞系の接着や認識、シグナル伝達などの機能を発揮する神経系で最も豊富な糖脂質のファミリーであるｃシリーズガングリオシドのファミリーに属する。ガングリオシドの喪失は、ｃシリーズガングリオシド欠損マウスにおいて、運動神経の再生欠損などの神経学的欠陥をもたらす(R. K. Yu, Y.-T. Tsai, T. Ariga, and M. Yanagisawa, “Structures, biosynthesis, and functions of gangliosides - An overview,” J. Oleo Sci., vol. 60, no. 10, pp. 537-544, 2011)。また、神経筋接合部（ＮＭＪ）では、大量のガングリオシドが検出された。抗ガングリオシド抗体でＮＭＪを処置するとＮＭＪに重篤な欠陥が生じ、したがって、ＮＭＪでガングリオシドが必要であるという考えを支持している(J. J. Plomp and H. J. Willison, “Pathophysiological actions of neuropathy-related anti-ganglioside antibodies at the neuromuscular junction,” J. Physiol., vol. 587, no. Pt 16, pp. 3979-3999, Aug. 2009)。さらに、ガングリオシドは特に再生能を有すると考えられる幹細胞を特徴付ける(R. K. Yu, Y.-T. Tsai, T. Ariga, and M. Yanagisawa, “Structures, biosynthesis, and functions of gangliosides-An overview,” J. Oleo Sci., vol. 60, no. 10, pp. 537-544, 2011)。Ａ２Ｂ５反応性ガングリオシドはシアリルトランスフェラーゼによって合成される。それらの中で、脳で高度に発現されるインビトロでのスフィンゴ糖脂質受容体活性が最も高いのは、ＳＴ３ＧＡＬ１及びＳＴ３ＧＡＬ２である(E. R. Sturgill et al., “Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b,” Glycobiology, vol. 22, no. 10, pp. 1289-1301, Oct. 2012)。ＳＴ３ＧＡＬ１及びＳＴ３ＧＡＬ２の両方のｍＲＮＡは、本発明により得られるＳＭＤＣで発現され、商業的に利用可能なＳＭＤＣと比較して大量に発現される。ＳＭＤＣと筋原性再生能力を組み合わせて、Ａ２Ｂ５反応性抗原も発現すると、骨格筋のみが再生されるだけでなく、特に、筋肉再生中に新たに形成される神経筋接合部で、神経筋サポートが提供される可能性がある。
【００７８】
筋機能障害の治療、特に尿失禁及び／又は肛門失禁などの失禁の治療に使用できるＳＭＤＣは、好ましくは特徴的な発現パターンを示す。好ましくは、前記ＳＭＤＣの約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％以上がＣＤ５６及びＡ２Ｂ５を発現する。好ましくは、該ＳＭＤＣはＣＤ３４、Ｓｃａ−１及びＭｙｏＤを発現しない。したがって、「発現しない」という用語は、好ましくはＳＭＤＣの４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は２％未満が前記マーカーを発現することを意味する。上記のＳＭＤＣの発現パターンは、分化を必要とせずに細胞培養の筋原性指数を決定するために使用することができる。したがって、ＳＭＤＣの前記発現パターンは、骨格筋由来細胞が筋機能障害の治療、特に尿失禁及び／又は肛門失禁などの失禁の治療に使用できるかどうかを検証することができる。
【００７９】
本発明のさらなる主題は、本発明の方法に従って得られるＳＭＤＣに関する。
【００８０】
本発明によれば、本発明の方法で得られるＳＭＤＣは、Ａ２Ｂ５マーカー及び／又はＡ２Ｂ５マーカー反応性抗原合成酵素の明確な発現の観点から、先行技術の細胞と明確に区別することができる。Ａ２Ｂ５反応性ガングリオシドはシアリルトランスフェラーゼによって合成されるので、これらのシアリルトランスフェラーゼはＡ２Ｂ５の発現のための間接的なマーカーとして役立つ可能性がある。３つの重要なシアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ２及びＳＴ３ＧＡＬ３のうち、脳で高発現しているインビトロのスフィンゴ糖脂質受容体活性が最も高いのは、ＳＴ３ＧＡＬ１とＳＴ３ＧＡＬ２である(E. R. Sturgill et al., “Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b,” Glycobiology, vol. 22, no. 10, pp. 1289-1301, Oct. 2012)。ＳＴ３ＧＡＬ１及びＳＴ３ＧＡＬ２の発現の検出により、Ａ２Ｂ５の発現の間接的な証明が可能になる。したがって、本発明の新しい方法は、当技術分野で知られている方法で得られるＳＭＤＣと比較して異なるＳＭＤＣを得ることを可能にする。
【００８１】
本発明のさらに好ましい態様において、ＳＭＤＣ及び本発明の方法により得られるＳＭＤＣは、明確なマーカーの発現により特徴付けられる。本発明によれば、ＳＭＤＣは、マーカーＣＤ５６、Ａ２Ｂ５、ＣＤ１０５、デスミン、Ｍｙｆ５及びＰａｘ７の１、２、３、４又は５つの陽性発現によって特徴付けられることが予見される。さらに好ましくは、本発明の方法によって得られるＳＭＤＣ及びＳＭＤＣは、ＣＤ５６、Ａ２Ｂ５、ＣＤ１０５、Ｍｙｆ５及びＰａｘ７から選択される少なくとも１つ以上のマーカーの陽性発現、並びに、ＣＤ３４とＭｙｏＤから選択される少なくとも１つ以上のマーカーの陰性発現から選択される異なるマーカーの明確な組み合わせの発現によって特徴付けられることが予測される。好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は前述のＳＭＤＣの値の間の任意の中間の範囲が、ＣＤ５６、Ａ２Ｂ５、ＣＤ１０５、Ｍｙｆ５及びＰａｘ７のいずれか１つ以上で陽性であり、これは、ＳＭＤＣが細胞表面でＣＤ５６、Ａ２Ｂ５、ＣＤ１０５、Ｍｙｆ５及び／又はＰａｘ７を発現することを意味する。さらに好ましくは、細胞集団の最大５９％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％が、ＣＤ３４及び／又はＭｙｏＤのいずれかを発現する。
【００８２】
本発明の特に好ましい実施形態では、ＳＭＤＣ及び本発明による方法によって得られるＳＭＤＣは、ＣＤ５６、Ａ２Ｂ５、ＣＤ１０５、Ｍｙｆ５、Ｐａｘ７の陽性発現、及びＣＤ３４及びＭｙｏＤの陰性発現によって特徴付けられる。
【００８３】
本発明のさらなる主題は、医薬組成物として使用するための、本発明の方法によって得られるＳＭＤＣに関する。
【００８４】
本発明によれば、本発明の方法によって得られるＳＭＤＣは、医薬組成物内の活性成分として使用することができる。
【００８５】
本発明のさらなる主題は、神経筋結合を改善する方法において使用するための、本発明の方法に従って得られるＳＭＤＣに関する。
【００８６】
好ましくは、本発明によるＳＭＤＣは、神経筋障害及び／又は筋障害の予防及び／又は治療を改善する方法で使用するためである。好ましくは、ＳＭＤＣは、便失禁及び／又は尿失禁などの神経筋障害及び／又は筋障害を予防及び／又は治療する方法で使用するためである。
【００８７】
本発明によれば、ＳＭＤＣは、好ましくは、ＳＭＤＣが失禁に罹患している対象に注射されることを予見する方法で使用される場合がある。一般に、所与の組織又は損傷部位にＳＭＤＣを注入することは、溶液又は懸濁液中の治療的に有効な量の細胞、好ましくは１００μｌの注入溶液当たり約１ｘ１０５〜約６ｘ１０６個の細胞を含む。注射液は、自家血清の有る又は無い、生理学的に許容される媒体である。生理学的に許容される媒体は、非限定的な例として、生理食塩水又はリン酸緩衝溶液であることができる。
【００８８】
最後に、本発明のさらなる主題は、筋機能障害を治療する方法において使用するための、本発明の方法によって得られるＳＭＤＣに関し、該筋機能障害は失禁、特に尿及び／又は肛門失禁である。
【００８９】
原則として、肛門の筋肉システムを強化は直腸充填物をよりよい制御を提供するため、いかなるタイプの肛門失禁が治療できる。しかし、特に肛門括約筋系及び／又は恥骨直腸筋が損傷及び傷害している場合に、会陰破裂に起因する肛門失禁が治療される。このような会陰破裂は、上記で概説したように、さまざまな原因から生じ得る。しかしながら、そのような会陰破裂の原因は、本発明の方法及びＳＭＤＣの適用を制限するものではない。患者は、第３又は第４グレードの会陰破裂を罹患している場合、本発明の方法及びＳＭＤＣで治療することができる。これは特に、鉗子分娩後にそのような会陰破裂に罹患する、初めて出産する、４ｋｇを超える体重の子供を出産する、又は、出産前の子供の体位異常による結果を患う女性に適用される。本発明の方法及びＳＭＤＣはまた、外科的手術による肛門括約筋系及び／又は恥骨直腸筋の損傷後に適用できる。さらに、本発明の方法及びＳＭＤＣは、一時的な失禁のみがある場合にも適用することができる。このような治療は、完全な肛門失禁の発症を防止する。本発明の方法及びＳＭＤＣで治療されるさらなる肛門失禁疾患状態は、受動性失禁、便失禁及び避けられない排便である。
【００９０】
本発明による方法及びＳＭＤＣは、すでに肛門失禁に罹患している、すなわち肛門失禁の症状を示している患者を治療するために使用できるだけでなく、肛門失禁にまだ罹患していないが、例えば、直腸の筋肉組織が手術、出産、事故などにより損傷を受けた場合において、罹患するリスクが増加した場合に使用できると理解すべきである。別の事例としては、直腸の筋肉組織が健康人よりも薄くなった場合や、他の理由で変性した場合がある。本発明の方法は、肛門失禁の発症を抑制するための適切な予防を提供できる。
【００９１】
失禁の治療又は予防に使用するＳＭＤＣは、好ましくは移植者と相同（homologous）である。
【００９２】
より好ましい実施形態において、前記ＳＭＤＣは、移植者に対して自家又は異種性である。前記ＳＭＤＣは、例えば、移植者の上腕二頭筋のバイオプシーによって得られる。自家ＳＭＤＣは、ＳＭＤＣが移植者に注入された後、アレルギー反応のリスクを軽減又は最小限に抑える。好ましくは、ＳＭＤＣは、多核融合形質転換受容性細胞又は筋芽細胞などの筋原細胞である。より好ましくは、前記ＳＭＤＣはヒト細胞である。
【００９３】
したがって、本発明はまた、尿道括約筋及び／又は肛門括約筋を強化するために自家骨格筋由来細胞を使用することによって、尿失禁及び／又は肛門失禁を有するか、尿失禁及び／又は肛門失禁を発症するリスクがある女性及び男性のためのシンプルな予防アプローチまたは治療方法を提供する。そのような筋肉由来細胞療法は、損傷した尿道及び肛門括約筋の修復及び改善を可能にする。本発明によれば、治療は、例えば、筋肉由来細胞を得るための針吸引、並びに、培養及び調製された細胞を患者に注入するための簡単なフォローアップ処置を含む。また、本発明によれば、特定の尿失禁及び／又は肛門失禁患者から採取され、培養された自家骨格筋由来細胞（ＳＭＤＣ）を非アレルギー性薬剤として使用して、尿道及び／又は直腸壁を増大することができ、それにより、接合を強化し、尿道及び／又は肛門括約筋を改善する。本発明のこの態様において、上述のように、シンプルな自家筋細胞移植が実施される。
【００９４】
本発明によれば、尿道括約筋及び／又は肛門括約筋に直接投与された自家骨格筋由来細胞は、長期生存を示す。したがって、自家筋芽細胞注射は、尿道及び／又は肛門括約筋における筋線維の安全かつ非免疫原性の長期生存をもたらす。
【００９５】
本発明による特定の実施形態では、（１００μｌの注射液当たり約１×１０５〜約６×１０６個の細胞の濃度で）約５０〜約２００μｌの骨格筋由来細胞懸濁液が尿道括約筋中に注射される。注射デバイスは、注射される細胞懸濁液を含む容器に接続することができる。肛門失禁の治療のために、（１００μｌ当たり約１ｘ１０５〜約６ｘ１０６個の細胞の濃度で）好ましくは約５０μｌ〜約１ｍｌ、より好ましくは約０．５ｍｌの骨格筋由来細胞懸濁液を外肛門括約筋中に注射する。注射デバイスは、注射される細胞懸濁液を含む容器に接続することができる。
【００９６】
別の実施形態では、注射ステップは、骨格筋由来細胞懸濁液の約２０〜約４０回の注射などのいくつかの個別の注射を含む場合があり、各注射では、約５０〜約５００μｌの骨格筋由来細胞懸濁液が注射され、ここで、各注射は、肛門括約筋の別の領域に適用される。しかしながら、これらのパラメータは単に例示的なものであると考えるべきであり、当業者はこれらの手順を各個々の患者の治療要件に容易に適合させることができる。
【００９７】
本発明の別の実施形態では、尿道及び／又は肛門括約筋に対する注射デバイスの動作は、超音波検査及び／又はＥＭＧ（筋電図）手段によってモニターされる。特定の実施形態では、経直腸プローブが導入され、経直腸プローブの位置は、本発明による方法を用いる尿道及び／又は肛門括約筋の治療のために最適に調整される。別の特定の実施形態では、骨格筋由来細胞は、尿道及び／又は肛門括約筋欠損の周囲の領域、及び／又は特に尿道及び／又は肛門括約筋欠損の領域に移植される。患者は、本発明による尿失禁及び／又は肛門失禁のさらなる治療のために、細胞の注入の翌日に身体運動から開始することができる。
【００９８】
別の実施形態では、治療が繰り返される。処置は、例えば、最後の治療後１年以内、最後の治療後１０、９、８、７、６、５、４、３、２若しくは１ヶ月後、又は１〜８週間、好ましくは２〜３週間、又は、最後の治療から１０〜２０日に繰り返すことができる。特に、前の治療に使用したのと全く同じ細胞培養からの細胞で、最後の治療後２〜３週間以内に、治療を繰り返すことができる。このアプローチにより、１回の注入当たりの注入量を減らすことができ、細胞が適応して統合し筋肉を構築するための時間が長くなる。さらにより具体的な実施形態において、注入は、尿道及び／又は肛門の排泄抑制能力の改善が達成されるまで、２〜３週間の時間間隔で繰り返される。
【００９９】
上述のように、特定の穿通経路は、直腸の方向と並行して患者の皮膚を通る。しかしながら、穿通は、損傷した筋肉の近くの直腸から直接起こり得ることも考えられる。特に、穿通及び注入プロセスは、超音波画像化手段を介してモニターされる。さらに、女性に対して代替的な穿通経路、すなわち経膣注射が考えられる。このシナリオでは、注射デバイスは膣の壁を穿通し、目的の注入部位に到達するまで前方に移動される。特に、穿通及び注入プロセスは、このシナリオでも、超音波検査及び／又はＥＭＧ（筋電図）イメージング手段によってモニターされる。
【０１００】
別の実施形態では、注射は、「注入帯」の形態で骨格筋由来細胞を注入することを含む。本明細書で使用される「注入帯」は、注入トラックの長さに沿った、又は長さの一部に沿った、すなわち、筋肉組織への針の挿入によって作られた管に沿った細胞の配置を指す。換言すれば、注入に続いて、針が引き抜かれると同時に、細胞は、注射針が動かされ、特に注射トラックに沿って引っ込められると、連続的又は断続的な仕方でシリンジから排出される。細胞のそのような安定した分配は、注射デバイス／針が標的筋組織に入るときに形成される注入管（injection canal）に沿って、細胞を含む注射溶液の連続的な送達を提供する。特定の実施形態において、注入帯又は管は、約０．８ｍｍ以下の直径を有するべきである。そうでなければ、これは、注入管の中心にある骨格筋由来細胞の壊死につながり、その結果、有害な炎症及びその他の作用をもたらすからである。
【０１０１】
本発明の方法で使用するための注射デバイスは、対象の組織、特にヒト組織を穿通することができ、溶液、特に骨格筋由来細胞を含む溶液を、特に患者の組織内の所望の位置に送達することができるいかなるデバイスであってもよい。注射デバイスは、例えば、中空針を含むことができる。注射デバイスはまた、骨格筋由来細胞を注入するのに適したいかなるタイプのシリンジであってもよい。より洗練された実施形態では、注射デバイスは、例えば、空気圧を加えることにより細胞懸濁液を注入する注入ガンであることができる。特に、注射デバイスは、それぞれキーホールアプリケーションとキーホール手術に適している。
【０１０２】
特定の直径の注射針を選択することにより、１ｍｍ３あたりの注射量を正確に事前に決定できる。注射針の直径は筋肉構造の損傷につながる可能性があるため、通常５ｍｍを超えない。
【０１０３】
注射デバイスの位置及び動作をモニターするための超音波画像化手段は、当技術分野で知られるいかなる標準的な超音波画像化装置によって達成することができる。モノプラナー又はバイプラナーの標準的な超音波プローブに加えて、例えば、３Ｄソノグラフィーやカラードップラーソノグラフィーなどの新しい超音波技術を使用することもできる。特定の実施形態では、上記のように、注射デバイスはソノグラフィーイメージング手段を含む。
【０１０４】
本明細書に記載されるいかなる方法又は組成物は、本明細書に記載されるいかなる他の方法又は組成物に関して実施され得ることが企図される。
【０１０５】
以下の実施例は本発明を説明するが、限定するものと見なされない。
【実施例】
【０１０６】
実施例１−ＳＭＤＣの取得
ＳＭＤＣを取得するため、失禁患者の大胸筋または上腕二頭筋から、骨格筋バイオプシー検体を採取した。バイオプシーを行うため、まず大胸筋筋膜に達するまで、筋肉の上から約１ｃｍ長の切開により皮膚を開いた。筋膜を切開し、１ｃｍ３の筋肉組織（バイオプシー検体）を採集した。約４°Ｃまで予冷され、ゲンタマイシン（１〜５μｇ／ｍｌの最終濃度）を含有するハムＦ−１０基礎培地からなるバイオプシー検体輸送培地の中に、バイオプシー検体を直接移した。バイオプシー検体を、バイオプシー検体輸送培地内に約２６時間、１〜１１℃で保存した。次に、バイオプシー検体を１×ＰＢＳで満たされたペトリ皿に移した。無菌の鉗子とメスを使って筋肉組織を結合組織から分離した。その後、筋肉組織を１×ＰＢＳで満たされた別のペトリ皿に移し、メスを使って２〜３ｍｍ２のサイズの小片に切り分けた。上記のような追加の移動ステップを経たのち、組織小片をさらに１ｍｍの小片に切り分けた。組織片を最終的に１×ＰＢＳで満たされた遠心分離管の中に移し、１３００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。遠心分離後、上清を取り除き、８μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する１×ＰＢＳ中に筋肉組織を再懸濁した筋肉組織懸濁液を、その後２〜８℃まで４８時間、冷却した。冷却後、筋肉組織懸濁液を１０分間１３００ｒｐｍで遠心分離し、上清を取り除き、２．５ｍｌの消化液は、ハムＦ−１０中に、１〜５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼと、２〜４％ｖ／ｖのＨＥＰＥＳ緩衝液と、０．１〜１０％ｖ／ｖのウシ胎児血清と、５〜１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンとを含有した。その後、筋肉組織懸濁液に、５％のＣＯ２、３７℃で６〜２０時間インキュベーションを行った。次に、懸濁液を１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取り除き、ハムＦ−１０中に、１０〜２０％ｖ／ｖのＦＣＳと、１〜３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、３〜１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンと、を含有する培地中に、ペレットを再懸濁し、細胞培養フラスコに播種した。培養フラスコの底に付着したＳＭＤＣは、培地を３〜４日毎に交換し、コンフルエントに達した後での剥離後の継代培養により、さらに維持された。１×１０７〜５×１０７のＳＭＤＣに到達するまで継代培養を行った。
【０１０７】
細胞の計測はケモメテック（商標）の細胞計数装置のマニュアルに沿って行った。この方法は、細胞核のヨウ化プロピジウム染色を利用して、０．２ｍｌ中の細胞数を算出するものである。自動計測の前に、（細胞膜を透過処理するために）１００μｌの細胞懸濁液を２００μｌの試薬Ａ（溶解バッファー）と混合し、常温で５分間インキュベーションを行った。２００μｌの試薬Ｂ（安定化バッファー）を添加した。懸濁液を混合し、ヌクレオカセット（商標）を用いて採集し、最後に測定した。
【０１０８】
図１は、本発明により得られ位相差顕微法により可視化された、標準的な細胞培養フラスコ上のＳＭＤＣの形態を示している。
【０１０９】
実施例２−フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析を、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ６ＨＴ−２Ｌフローサイトメーター（メルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツ）で行った。簡潔に言えば、３７℃、５分間でトリプシンを用いて細胞を採取し、４００ｒｃｆで遠心分離し、１％のＦＣＳを含有する１×ＰＢＳ中に再懸濁した。４００００／反応物の濃度の細胞を、５μｌの抗ＣＤ５６−ＰＥ（ベックマン・コールター社、フランス）、イソ型ＩｇＧ１−ＰＥ（ベックマン・コールター社）、イソ型Ａｌｅｘａ４８８（シグマ）、抗ＣＤ１０５−ＰＥ（ベックマン・コールター社、フランス）またはＡ２Ｂ５−Ａｌｅｘａ４８８抗体（ミリポア）と共に、１５分間、１．５ｍｌのエッペンドルフ（登録商標）チューブ中で、４℃の暗所でインキュベーションを行った。９６ウェル丸底型プレート中でＦＡＣＳ測定を行うために、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４００ｒｃｆで遠心分離し、２００μｌの１×ＰＢＳの中に再懸濁した。洗浄と懸濁の後、各反応物に、５μｌの生存判別色素である７−アミノアクチノマイシンＤ（ベックマン・コールター社、フランス）を加え、プレートを４℃で１０分間インキュベーションした。Ｇｕａｖａ  ＩｎＣｙｔｅ（商標）ｖ．２．３ソフトウェアを用いて細胞イベントを取得した。１．８μｌ／ｍｌのサンプル供給量、最小の３０００イベントで、ヒストグラムとドットプロットが生成された。陽性染色は、少なくとも９９％陰性として設定されたアイソタイプ対照との比較により得られた。
【０１１０】
実施例３−免疫細胞染色
まず、細胞培養皿の上清を廃棄し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。常温で２０分間、４％のホルムアルデヒド溶液で細胞を覆うことにより、透過化と固定化を行った。次いで、各々にインキュベーションステップを行った後に、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。その後、細胞を５００μｌのハイドロゲンパーオキサイド−ブロック（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で覆い、常温で５分間インキュベーションを行った。終濃度が４０μｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）の一次抗体（デスミン）をピペットで細胞に加え、少なくとも９０分間インキュベーションを行った（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞をその後、５００μｌのビオチンコンジュゲート二次抗体（ヤギ抗ウサギ、ポリクローナル、サーモフィッシャーサイエンティフィック）で覆い、一次抗体と同じ条件下であるが少なくとも６０分間インキュベーションを行った。抗体結合の可視化のため、５００μｌの西洋ワサビストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ベクターラブズ社）を、（ＰＢＳで希釈された）２〜５μｇ／ｍｌの終濃度で添加し、３７℃、５％のＣＯ２で２０分間インキュベーションを行った後、５００μｌのクロモゲン単一溶液によって細胞を覆い、５〜１５分後にそれを除去した。ＰＢＳによる最終洗浄ステップを実施した後、結果を観察した。免疫細胞染色によってデスミン陽性に染色された細胞は、暗赤色に視覚化される。
【０１１１】
実施例４−ＳＭＤＣの純度
実施例１に記載の手順で取得したＳＭＤＣを、筋原性マーカーであるＣＤ５６（ＮＣＡＭ）とデスミンの純度に対して試験した。ＣＤ５６で陽性である細胞の百分率を実施例２に記載のフローサイトメトリーを用いて測定した。本発明により得られた実施例１に記載のＳＭＤＣは、９９．３％のＣＤ５６陽性細胞（図２Ａ）と、９８．７７％の生存細胞（図２Ｂ）を含んでいた。さらに、実施例１に記載の方法を用いて得られた１つの代表的なＳＭＤＣバッチのデスミン発現について、実施例３に記載されている免疫細胞染色により分析した。図４は実施例１により得られた高純度のＳＭＤＣを示しており、細胞のほとんどがデスミン染色に対して陽性であった（図３）。
【０１１２】
実施例５−細胞分化
ヒト筋芽細胞の合胞体筋管への分化は、増殖培地を無血清分化培地に交換した場合に起こる。骨格筋細胞分化培地（プロモセル社）に、骨格筋細胞分化培地補充パックおよび２５０μｌのゲンタマイシンを（培地を入手した会社のプロトコルに記載されているように）補足した。分化の開始のため、実施例１で説明したようにして事前計測された（６００００〜４８００００細胞の）４ウェルまたは２４ウェルのディッシュの中に、（増殖培地中の）細胞を播種した。細胞をディッシュに付着させた後（一晩）、増殖培地を廃棄し、細胞を分化培地で１回洗浄し、５００μｌの分化培地で覆った。
【０１１３】
実施例６−ＳＭＤＣの筋原性能力
筋原性系譜からなるＳＭＤＣは、インビボで骨格筋繊維を表している合胞体筋管を、インビトロで融合して形成することができる。したがってＳＭＤＣの筋原性能力がインビトロの分化により試験された。実施例１に記載され取得された細胞を、実施例５に記載されている通りに分化誘導することにより筋原性能力を試験した。ＳＭＤＣは、図４でのＳＭＤＣの代表的なバッチに図示されている通り、デスミン陽性（実施例３に記載の染色）の巨大な筋管を形成した。これらの結果から、骨格筋組織を機能的に再生するために必要なＳＭＤＣの筋原性能力が確認された。
【０１１４】
実施例７−遺伝子発現解析
実施例１により得られたＳＭＤＣを、実施例１にも記載されている細胞計測に従って、７０パーセントの密集度まで６ウェルのプレートで１ウェル当たり５０００００細胞の密度で播種し、次いで全ＲＮＡをＮｅａｓｙ  ＲＮＡ  単離キット（キアゲン社）を用いてメーカの使用説明書に従って分離した。ＲＮＡ濃度と精製度を、変性剤ゲル電気泳動法およびアジレント社の２１００バイオアナライザを用いたマイクロ流体分析によって評価した。マイクロアレイハイブリダイゼーションのサンプル調整を、ニュージェン社のＯｖａｔｉｏｎ  Ｐｉｃｏ  ＳＬＷＴＡシステムＶ２およびニュージェン社のＥｎｃｏｒｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅマニュアル（ニュージェンテクノロジー社、サンカルロス市、米国）に記載の通りに行った。簡潔には、７．５ｎｇの全ＲＮＡを２ステッププロセスで二本鎖ｃＤＮＡに逆転写し、ＳＰＩＡタグ配列を導入した。ビーズ精製したｃＤＮＡを、ＳＰＩＡ増幅反応を用いて増幅した後、追加でビーズ精製を行った。４．５μｇのＳＰＩＡ  ｃＤＮＡを細分化し、末端ビオチン標識し、アフィメトリクスのＰｒｉｍｅＶｉｅｗヒト遺伝子発現アレイに対し、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ  ６４０の中で４５℃で１６時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション済みのアレイを洗浄し、アフィメトリクスのＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ＦＳ４５０の中で染色し、アフィメトリクスのＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ３０００  ７Ｇを用いて蛍光シグナルを計測した。アフィメトリクスのＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ｖ４．１．３ソフトウェアにより流体性とスキャン機能を制御した。データ処理はアフィメトリクスのサービスプロバイダーおよびコア施設である「ＫＦＢ−Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ」（レーゲンスブルク、ドイツ；www.kfb-regensburg.de）で行った。ｌｏｇ２スケールの合計プローブセットシグナルを、アフィメトリクス社のＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ｖ１．４ソフトウェアのＲＭＡ（１）アルゴリズムを用いて計算した。実施例１で得られたＳＭＤＣの遺伝子発現の結果を既存の方法で得られたＳＭＤＣと比較するため、２０１４年のＡｂｕｊａｒｏｕｒら（R. Abujarour et al., “Myogenic differentiation of muscular dystrophy-specific induced pluripotent stem cells for use in drug discovery,” Stem Cells Transl. Med., vol. 3, no. 2, pp. 149-160, Feb. 2014）により発行された、商業的に入手可能なＳＭＤＣ（Ｌｏｎｚａ）の遺伝子発現データを、出版物に付属のデータベース「ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/geo/DATA/supplementary/series/GSE46633/GSE46633_RAW.tar；最終追加；２０１７年７月２１日）」からダウンロードした。実施例１で得られたＳＭＤＣの遺伝子発現と、Ａｂｕｊａｒｏｕｒら（２０１４年）により分析されたＳＭＤＣの比較は、Ｐａｒｔｅｋ−Ｆｌｏｗ−ソフトウェアを提供会社（Ｐａｒｔｅｋ社）に従って適用し、異なる遺伝子のアノテーション当たりの平均リード数を比較することにより行った。したがって、アノテーション当たりの平均リード数が多いほど、より高い遺伝子発現を表すアノテーション付きｍＲＮＡの存在量が��くなる。
【０１１５】
実施例８−ＳＭＤＣの神経筋サポート機能
実施例１を実施して得られたＳＭＤＣの神経筋サポート機能を、フローサイトメトリー（実施例２に記載）により行われたＳＭＤＣの細胞表面へのＡ２Ｂ５抗体の陽結合により判断した。図５に図示の通り、実施例１で得られた９６．１６％のＳＭＤＣは、Ａ２Ｂ５反応性抗体に対して陽性であり、筋原性決定の他に、ＳＭＤＣは神経細胞的な特性を呈していることが示された。本発明により得られたＳＭＤＣの神経筋サポート機能を、先行技術により単離された筋芽細胞と比較するために、ＳＭＤＣのインビトロＳＴ３ＧＡＬ１およびＳＴ３ＧＡＬ２で最も高いスフィンゴ糖脂質受容体活性を呈するＡ２Ｂ５反応性ガングリオシドの形成に不可欠な酵素の遺伝子発現を、実施例７に記載した通りに解析した。図５に図示の通り、ＳＴ３ＧＡＬ１とＳＴ３ＧＡＬ２の何れのｍＲＮＡ発現も、本発明により得られたＳＭＤＣの方が、市販のＳＭＤＣと比較して高かった。さらに、ＳＴ３ＧＡＬ３発現は、実施例１で得られたＳＭＤＣの方が高かった。
【０１１６】
実施例９−組織切り分け後に冷却しない細胞の取得
比較例として、冷却ステップを省略して本発明による方法を実施した。ＳＭＤＣを取得するため、失禁患者の大胸筋または上腕二頭筋から、骨格筋バイオプシー検体を採取した。バイオプシーを行うため、まず大胸筋の筋膜に達するまで、筋肉の上から約１ｃｍ長の切開により皮膚を開いた。筋膜を切開して、１ｃｍ３の筋肉組織（バイオプシー検体）を採取した。約４℃まで事前に冷却され、ゲンタマイシン（１〜５μｇ／ｍｌの最終濃度）を含有するハムＦ−１０基礎培地からなる、バイオプシー検体輸送培地の中に、バイオプシー検体を直接移した。バイオプシー検体を、バイオプシー検体輸送培地内に約２６時間、１〜１１℃で保存した。次に、バイオプシー検体を１×ＰＢＳで満たされているペトリ皿に移した。無菌の鉗子とメスを使って筋肉組織を結合組織から分離した。その後、筋肉組織を１×ＰＢＳで満たされた別のペトリ皿に移し、メスを使って２〜３ｍｍ２サイズの小片に切り分けた。上記のような追加の移動ステップを経たのち、組織小片をさらに１ｍｍの小片に切り分けた。組織片を最終的に１×ＰＢＳで満たされた遠心分離管の中に移し、１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を取り除いて、８μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する１×ＰＢＳの中に筋肉組織を再懸濁させた。筋肉組織懸濁液を１０分間１３００ｒｐｍで遠心分離してから、上清を取り除き、２．５ｍｌの消化液は、ハムＦ−１０中に、１〜５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼと、２〜４％ｖ／ｖのＨＥＰＥＳ緩衝液と、０．１〜１０％ｖ／ｖのウシ胎児血清と、５〜１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンとを含有した。その後、筋肉組織懸濁液に、５％のＣＯ２、３７℃で６〜２０時間、インキュベーションを行った。次に、懸濁液を１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取り除き、ハムＦ−１０中の３〜１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンと、１０〜２０％ｖ／ｖのＦＣＳと、１〜３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、を含有する培地中に、ペレットを再懸濁し、細胞培養フラスコに播種した。培養フラスコの底に付着したＳＭＤＣは、培地を３〜４日おきに交換し、コンフルエントに達した後での剥離後の継代培養により、さらに維持された。１×１０７〜５×１０７のＳＭＤＣに到達するまで継代培養を行った。
【０１１７】
実施例１０−ＳＭＤＣの間葉細胞マーカー発現
実施例１を実施して得られたＳＭＤＣの間葉系マーカー発現を、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０５−ＰＥ（ベックマン・コールター社）の、フローサイトメトリー（図２に記載）により測定されたＳＭＤＣの細胞表面への結合により、決定した。図８に図示されている通り、陽性の閾値をアイソタイプ対照（０．３１％陽性）に従って設定したとき、実施例１で得られた９８．６９％のＳＭＤＣが、ＣＤ１０５反応性抗体に対して陽性と判定され、ＳＭＤＣが間葉系細胞および／または間葉に由来するものであることが示唆された。
【０１１８】
実施例１１−ＳＭＤＣのアセチルコリンエステラーゼ活性測定
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性を測定するため、２０００００のＳＭＤＣを２４ウェルプレートのゼラチンコートウェル中に播種し、実施例５に説明されるように分化誘導した。分化の開始から６日で、３００μｌの０．５ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）溶液（ｐＨ７．２、０．１％トリトンＸ−１００を含むリン酸緩衝液で調整）を直ちに添加して、分化培地を２４ウェルプレートから丁寧に取り除いた。常温で暗所にて２分間のインキュベーションを行った後、（蒸留水で調製された）５０μｌの５．７６ｍＭのヨウ化アセチルチオコリン（ＡＴＩ）を添加した。反応内容物は、３０℃で６０分間のインキュベーションが行われ、Ａｎｔｈｏｓ  Ｚｅｎｙｔｈ  ３４０ｒｔのマイクロプレートリーダー（バイオクロム社、ケンブリッジ、英国）で、４１２ｎｍ（ＯＤ４１２ｎｍ）で光学密度（ＯＤ）測定を行った。細胞以外の全ての試薬から構成されたブランク反応もまた含まれた。較正ＯＤ４１２ｎｍ値は、平均ＯＤ４１２ｎｍからブランクの平均測定値を差し引くことにより取得された。標準曲線の直線方程式を参照して、相対ｍＵ（ＡＣｈＥｍＵｒｅｌ）のＡＣｈＥ活性を計算した。すぐに使用できる５０Ｕ／ｍｌのＡＣｈＥ原液（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｅｌｅｃｔｒｉｃｕｓ由来、ＡＡＴバイオクエスト（登録商標）社、サニーベール、カリフォルニア州、米国）の４〜５００ｍＵ／ｍｌ希釈液を測定することにより、標準曲線を取得した。標準希釈液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１％のトリトンＸ−１００を含む）で調整して、直ちに使用した。ＡＣｈＥ標準酵素分析については、２００μｌの各希釈液を、それぞれ３００μｌの０．５ｍＭのＤＴＮＢおよび５０μｌの５．７６ｍＭのＡＴＩと混合し、６０分後に２４ウェルプレートの中でＯＤ４１２ｎｍを測定した。細胞タイプ特定のタンパク質の濃度に対して正規化するため、測定量の細胞のＡＣｈＥ活性を、これら細胞の総タンパク質含有量で割ることにより、単位ｇタンパク質あたりのｍＵｒｅｌＡＣｈＥ活性が得られた（ＡＣｈＥｍＵｒｅｌ／ｇタンパク質）。細胞集団内の総タンパク質量を分析するため、実施例５に従って分化した付着細胞の分取分をまずＰＢＳで２回洗浄し、次いでＰＢＳＴ（０．１％のトリトンＸ−１００）で覆ってから、常温で１０分間のインキュベーションを行った。次に、溶解物（lysate）を再懸濁し、エッペンドルフ（登録商標）チューブに移し、すぐにボルテックスにかけた後に、１２００×ｇで４分間、遠心分離した。最後に、上澄み液を新たなエッペンドルフチューブに移し、Ａｎｔｈｏｓ  Ｚｅｎｙｔｈ  ３４０ｒｔのマイクロプレートリーダー（バイオクロム社、ケンブリッジ、英国）を用いて５４０ｎｍでＯＤを測定して、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  タンパク質定量キット（サーモサイエンティフィック、マサチューセッツ州、米国）を、メーカの説明書に従って使用することにより、タンパク質濃度を測定した。
【０１１９】
実施例１２−ＳＭＤＣ融合能力の定量化
ＳＭＤＣの融合能力は、多核筋管を形成する能力に基づいており、筋原潜在力を表すものである。融合能力は融合率として定量化されるが、これは多核筋管内に存在する核数を表しており、少なくとも３つの核を含む細胞を、観察された顕微鏡視野内の総核数で割ったものとして定められる。ＳＭＤＣの融合率を測定するために、２×１０５個の細胞を、ゼラチンでコーティングした２４ウェルプレート上に播種し、播種から２４時間後に、増殖培地から骨格筋分化培地に切り替えることで、分化誘導を行った。分化から６日後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、４％のＰＦＡで１０分間、固定化を行った。次に、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、２μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２溶液により２０分間、染色を行った。各サンプルについて、免疫蛍光イメージングの際に少なくとも３つの視野が捉えられ、核と細胞境界を簡単に検出できるように位相差画像を重ね合わせた。融合率は、分析した全ての視野に対する平均値を算出した後に、捉えた各視野に対して、管内の核数を視野あたりの総核数で割ることにより算出した。少なくとも３つの核を有する細胞のみを筋管とみなした。統計分析のため、異なる患者に由来する少なくとも３つの集団を、各集団細胞に対して分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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