(57)【要約】  Ｒａｓタンパク質レベルを阻害する医薬品の製造におけるＥ３ユビキチンリガーゼＮｅｄｄ４−１の使用を提供する。また、腫瘍を予防及び／又は治療する医薬品、又は生物の寿命を延長する医薬品の製造における使用を提供する。【選択図】図１ａ
2021518751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｓレベルを調整する化合物の同定方法であって、
Ｒａｓを発現させる細胞又はインビトロユビキチン化系を試験化合物と接触させるステップａと、
ステップａにおける細胞又は系のＲａｓレベルを増加又は減少させることができる化合物、好ましくはステップａにおける細胞又は系のＲａｓレベルを減少させることができる化合物を選択するステップｂと、を含み、
任意選択で、前記方法は、さらに
ステップｂで得られた化合物によるＲａｓレベルの調整がＮｅｄｄ４−１タンパク質の存在に依存するか否かを検出するステップｃと、
Ｎｅｄｄ４−１タンパク質の存在に依存してＲａｓレベルを調整する化合物を選択するステップｄと、を含む方法。
【請求項２】
前記Ｒａｓを発現させる細胞又は系は、外因性Ｒａｓ又は内因性Ｒａｓ、又はその両方を発現させる細胞又は系である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞内Ｒａｓレベルの調整方法であって、
Ｒａｓユビキチン化分解を調整する化合物を、Ｒａｓを発現させる細胞又はインビトロユビキチン化系と接触させ、任意選択で、Ｒａｓユビキチン化分解を調整する化合物の活性が、Ｎｅｄｄ４−１依存性又は非依存性であるステップａと、
任意選択で、細胞内のＮｅｄｄ４−１のレベルを調整し、任意選択で、Ｎｅｄｄ４−１のレベルを調整することは、ａ、遺伝子編集、ｂ、過剰発現、ｃ、ＲＮＡ干渉、ｄ、小分子化合物、ｅ、抗体を含むステップｂと、を含む方法。
【請求項４】
Ｒａｓレベルの調整方法であって、
Ｒａｓタンパク質の状態を判断するステップａと、
Ｒａｓタンパク質が野生型タンパク質又は不活性状態である場合、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整することによってＲａｓのレベルを調整するステップｂと、
Ｒａｓタンパク質が突然変異体タンパク質又は活性状態である場合、化合物を添加することによってＲａｓのレベルを調整するステップｃと、を含み、
任意選択で、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルの調整と化合物の添加は同時に行うことができ、
任意選択で、Ｎｅｄｄ４−１のレベルを向上させることによってＲａｓのレベルを低下させるか、又は、Ｎｅｄｄ４−１のレベルを低下させることによってＲａｓレベルを増加させ、
任意選択で、化合物の添加はＲａｓタンパク質のレベルを低下させるが、ＲａｓのｍＲＮＡレベルには影響しない方法。
【請求項５】
前記Ｒａｓは、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ又はＮ−Ｒａｓ又はそれらの突然変異体から選択され、好ましくは前記突然変異体は、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒから選択され、より好ましくはＧ１２Ｖである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
好ましくは、前記化合物は、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質依存的にＲａｓユビキチン化分解を促進することができ、任意選択で、前記化合物は、
2021518751.tif 000008
から選択され、
好ましくは、前記化合物は、
2021518751.tif 000009
から選択される、請求項１又は２の方法を用いてスクリーニングされた化合物又はその異性体、プロドラッグ、薬学的に許容される塩又は溶媒和物。
【請求項７】
腫瘍を予防又は治療する化合物の同定方法であって、
インビトロで腫瘍細胞株を請求項６の化合物と接触させるステップａと、
前記細胞コロニー形成能を抑制又は低下させ得る化合物を候補医薬品として選択するステップｂと、を含み、
任意選択で、前記腫瘍細胞株はＲａｓ陽性遺伝的背景である同定方法。
【請求項８】
Ｒａｓ又はＮｅｄｄ４−１レベルを検出する１つ以上の試薬を含み、任意選択で、Ｒａｓ又はＮｅｄｄ４−１を発現させる発現プラスミドをさらに含み、任意選択で、Ｒａｓを発現させる宿主細胞をさらに含み、任意選択で、Ｒａｓユビキチン化分解を促進する化合物をさらに含み、任意選択で、前記化合物は、本発明の前記いずれかの方法を用いて得られた化合物である、キット。
【請求項９】
任意選択で、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整する前記化合物は、核酸構築体、小分子化合物、抗体などを含むが、これらに限定されず、好ましくは、前記化合物は、請求項６に記載の化合物である、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整する化合物の腫瘍を予防又は治療するための医薬品の製造における使用。
【請求項１０】
好ましくは、Ｒａｓタンパク質のユビキチン化分解を促進する前記化合物は、Ｎｅｄｄ４−１依存性であるか、又はＮｅｄｄ４−１に結合され、任意選択で、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整する前記化合物は、核酸構築体、小分子化合物、抗体などを含むが、これらに限定されず、好ましくは、前記化合物は、請求項６に記載の化合物である、Ｒａｓタンパク質のユビキチン化分解を促進する化合物の腫瘍を予防又は治療するための医薬品の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、Ｅ３ユビキチンリガーゼＮｅｄｄ４−１によるＲａｓのユビキチン化の調整方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒａｓタンパク質は細胞内の分子スイッチとして機能し、ＧＤＰ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に結合する不活性状態とＧＴＰ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に結合する活性状態との間で変換され、遺伝子発現、細胞の成長と分化、細胞周期、細胞骨格と細胞遊走、小胞輸送、細胞核と細胞質間の輸送など、細胞内の多くの生理・生化学的な調整プロセスにおいて重要な役割を果たす。ＧＴＰの結合によって、Ｒａｓタンパク質の複数の残基（主にｓｗｉｔｃｈ  １領域に位置する残基３０−４０とｓｗｉｔｃｈ  １１領域に位置する残基６０−７０）がＲａｓのエフェクタータンパク質を結合させ得るコンフォメーションを形成し、Ｒａｓタンパク質の活性状態と不活性状態の間の変換は、ＧＡＰｓ（ＧＴＰａｓｅ  活性化タンパク質）とＧＥＦｓ（グアノシン一リン酸交換因子）によって調整される。Ｒａｓ遺伝子の突然変異はＲａｓタンパク固有のＧＡＰａｓｅ活性を損なう又はＧＡＰとの結合を阻止し、それによって下流シグナル経路の持続的な活性化を招き、腫瘍の発生や進行を促進する。また、Ｒａｓタンパク質（Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、及びＮ−Ｒａｓを含む）は、ヒトで最も一般的な癌原タンパク質であり、腫瘍の成長及び形質転換活性と密接に関連している。ヒトのすべての腫瘍の２０〜３０％にＲａｓ遺伝子の突然変異が認められ、そのうち、９０％の膵臓癌、５０％の結腸癌、３０％の肺癌、５０％の甲状腺癌、及び３０％の骨髄性白血病などにはＲａｓ遺伝子の点突然変異が認められており、研究から明らかなように、多くの腫瘍が細胞レベル及び動物モデルでのＲａｓタンパク質の持続的な発現に依存している。そのため、Ｒａｓファミリータンパク質に関する研究は、研究者により注目されてきた。Ｎｅｄｄ４−１は、ＨＥＣＴファミリーに属するＥ３ユビキチンリガーゼであり、構造的には、Ｎ末端のＣ２ドメイン、中間のＷＷドメイン、及びＣ末端のＨＥＣＴドメインを含み、ＮＣＢＩタンパク質データベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００６１４５に示されるアミノ酸配列を有する。この因子はＲａｓタンパク質をユビキチン化により分解することができる。
【０００３】
タンパク質分子のユビキチン化は細胞内タンパク質の翻訳後の重要な共有結合修飾であり、タンパク質分子の分解、ＤＮＡ修復、遺伝子転写、細胞周期、細胞エンドサイトーシスなど、多くの重要な生物学的機能を制御する。ユビキチン化修飾を介したタンパク質分解は、細胞の正常な生物学的機能を維持する上で極めて重要な役割を果たしており、異常なタンパク質分解は、癌を含む多くの疾患を引き起こす恐れがある。近年の研究の結果から明らかなように、プロテアーゼ複合体の活性を阻害することによって、癌、自己免疫疾患、炎症や心血管疾患などの疾患に対して一定の治療効果がある。現在、Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂなどのプロテアソーム阻害剤は米国ＦＤＡによって腫瘍の臨床治療、多発性骨髄腫などの悪性腫瘍の治療への応用を承認されている。しかしながら、プロテアーゼ複合体阻害剤はほとんどすべてのタンパク質の分解に非特異的に影響を与えるため、強い毒性や副作用を引き起こし、それにより、その応用が大幅に制限されている。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、本発明は、
Ｒａｓレベルを調整する化合物の同定方法であって、
Ｒａｓを発現させる細胞又はインビトロユビキチン化系を試験化合物と接触させるステップａと、
ステップａにおける細胞又は系のＲａｓレベルを増加又は減少させることができる化合物を選択するステップｂと、を含み、
任意選択で、前記方法は、
ステップｂで得られた化合物によるＲａｓレベルの調整がＮｅｄｄ４−１タンパク質の存在に依存するか否かを検出するステップｃと、
Ｎｅｄｄ４−１タンパク質の存在に依存してＲａｓレベルを調整する化合物を選択するステップｄと、を含む方法に関する。
【０００５】
上記方法によれば、前記Ｒａｓを発現させる細胞は、外因性Ｒａｓ又は内因性Ｒａｓ、又はその両方を発現させる細胞である。
【０００６】
上記のいずれか１項に記載の方法によれば、前記ステップｂにおいて、ステップａにおける細胞又は系のＲａｓレベルを低下させる化合物を選択してもよい。
【０００７】
別の態様では、本発明は、上記のいずれかの方法を用いてスクリーニングされた化合物に関する。
【０００８】
前記化合物によれば、前記化合物は、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質依存的（すなわち、前記化合物は、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質が存在する場合、Ｒａｓタンパク質の分解を促進し、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質が存在しない場合、Ｒａｓタンパク質の分解を促進する能力が著しく低下する）にＲａｓユビキチン化分解を促進することができる。
【０００９】
前記化合物によれば、前記化合物は、
2021518751.tif 000003
から選択され、
好ましくは、
2021518751.tif 000004
から選択される。
【００１０】
一態様では、本発明は、
Ｒａｓユビキチン化分解を調整する化合物を、Ｒａｓを発現させる細胞又はインビトロユビキチン化系と接触させるステップａと、
任意選択で、細胞又は系におけるＮｅｄｄ４−１のレベルも調整するステップｂと、を含む細胞内Ｒａｓレベルの調整方法に関する。
【００１１】
前記方法によれば、前記Ｎｅｄｄ４−１レベルの調整は、ａ、遺伝子編集、ｂ、過剰発現、ｃ、ＲＮＡ干渉を含む。
【００１２】
上記のいずれかに記載の方法によれば、前記Ｒａｓは、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ又はＮ−Ｒａｓ及びそれらの様々な突然変異体である。
【００１３】
上記のいずれかに記載の方法によれば、Ｒａｓユビキチン化分解を調整する前記化合物は、上記のいずれかに記載の化合物である。
【００１４】
上記のいずれかに記載の方法によれば、Ｒａｓユビキチン化分解を調整する前記化合物の活性は、Ｎｅｄｄ４−１依存性又は非依存性である。
【００１５】
一態様では、本発明は、
Ｒａｓタンパク質の状態を判断するステップａと、
Ｒａｓタンパク質が野生型タンパク質又は不活性状態である場合、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整することによってＲａｓのレベルを調整するステップｂと、
Ｒａｓタンパク質が突然変異体タンパク質又は活性状態である場合、化合物を添加することによってＲａｓのレベルを調整するステップｃと、
任意選択で、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルの調整と化合物の添加は同時に行うことができるステップｄと、を含むＲａｓレベルの調整方法に関する。
【００１６】
一態様では、本発明は、
ＲａｓレベルがＮｅｄｄ４−１によって調整可能であるか否かを判断するステップａと、
ＲａｓレベルがＮｅｄｄ４−１によって調整可能である場合、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整することによってＲａｓのレベルを調整するステップｂと、
ＲａｓレベルがＮｅｄｄ４−１によって調整できない場合、化合物を添加することによってＲａｓレベルを調整するステップｃと、
任意選択で、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルの調整と化合物の添加は同時に行うことができるステップｄと、を含むＲａｓレベルの調整方法に関する。
【００１７】
上記のいずれかの方法によれば、Ｎｅｄｄ４−１のレベルを向上させることによってＲａｓレベルを低下させるか、又はＮｅｄｄ４−１のレベルを低下させることによってＲａｓレベルを増加する。
【００１８】
上記のいずれかの方法によれば、化合物の添加はＲａｓタンパク質のレベルを低下させ、好ましくは、Ｒａｓタンパク質のレベルを低下させるが、ＲａｓのｍＲＮＡレベルには影響しない。
【００１９】
一態様では、本発明は、
インビトロで腫瘍細胞株を本発明の化合物と接触させ、任意選択で、前記癌又は腫瘍がＲａｓ陽性遺伝的背景であるステップａと、
前記細胞コロニー形成能を抑制又は低下させ得る化合物を候補医薬品として選択するステップｂと、を含む癌又は腫瘍を予防又は治療する化合物の同定方法に関する。
【００２０】
本発明の一実施形態において、該試験医薬品は、癌細胞コロニー形成能を抑制又は低下させることができるものであれば、候補医薬品とすることができる。
【００２１】
上記のいずれかの方法によれば、前記方法はインビトロで行われる。
【００２２】
上記のいずれかの方法によれば、上記方法はインビボで行われる。
【００２３】
一態様では、本発明は、Ｒａｓユビキチン化分解を促進する化合物を、癌又は腫瘍に罹患しているか、又は癌又は腫瘍のリスクが高い対象に投与すること、任意選択で、本発明の上記のいずれかの方法を用いてＲａｓユビキチン化分解を促進する化合物をスクリーニングして同定することを含む、癌又は腫瘍を予防又は治療する方法に関する。任意選択で、前記癌又は腫瘍はＲａｓ陽性遺伝的背景である。
【００２４】
上記のいずれかの方法によれば、前記Ｒａｓは、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、又はＮ−Ｒａｓ、及びＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒを含むがこれらに限定されない様々な活性突然変異体である。好ましくは、前記突然変異体は、Ｈ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒ；Ｋ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒ；Ｎ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒである。最も好ましくは、前記突然変異体はＫ−ＲａｓのＧ１２Ｖである。
【００２５】
一態様では、本発明は、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整する化合物の、癌又は腫瘍を予防又は治療する薬品の製造における使用に関する。Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整する前記化合物は、核酸構築体、小分子化合物、抗体などを含むが、これらに限定されない。
【００２６】
一態様では、本発明は、Ｒａｓタンパク質のユビキチン化分解を促進する化合物の、癌又は腫瘍を予防又は治療する薬品の製造における使用に関し、好ましくは、Ｒａｓタンパク質のユビキチン化分解を促進する前記化合物は、Ｎｅｄｄ４−１依存性であり、任意選択で、前記化合物は、上記のいずれかに記載の化合物である。
【００２７】
一態様では、本発明は、Ｒａｓタンパク質のユビキチン化分解を促進する化合物の、Ｒａｓ関連の自己免疫疾患、炎症及び心血管疾患を予防又は治療する薬品の製造における使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｎｅｄｄ４−１がＲａｓタンパク質レベルを調整することを示す。（ａ）はＨｅＬａ細胞における内因性Ｎｅｄｄ４−１とＲａｓタンパク質の相互作用を示す。（ｂ）はＮｅｄｄ４−１タンパク質とＲａｓタンパク質のインビトロでの直接相互作用を示す。（ｃ）はＮｅｄｄ４−１タンパク質の過剰発現がＨｅＬａ中の内因性Ｒａｓタンパク質レベルを低下させ得ることを示し、統計の結果は、互いに独立した３回の実験のＭｅａｎ±ＳＤを取ったものである。（ｄ）はＮｅｄｄ４−１タンパク質の過剰発現が、外因性Ｒａｓタンパク質のレベルを低下させ得ることを示す。（ｅ）は、Ｎｅｄｄ４−１を介したＲａｓタンパク質の分解がリソソーム経路を介して行われることを示す。（ｆ）は、Ｎｅｄｄ４−１がＨ−ＲａｓとＮ−Ｒａｓのインビボユビキチン化を媒介することを示す。（ｇ）はインビトロ条件下でＮｅｄｄ４−１がＨ−ＲａｓとＮ−Ｒａｓを直接にユビキチン化修飾することを示す。（ｈ）は、Ｎｅｄｄ４−１がＨ−Ｒａｓタンパク質の半減期を調整することを示す。（ｉ）は、Ｎｅｄｄ４−１がＮ−Ｒａｓタンパク質の半減期を調整することを示す。（ｊ）は、ＨＴ−２９細胞におけるＮｅｄｄ４−１の過剰発現が内因性ＷＴ  Ｋ−Ｒａｓのタンパク質レベルを低下させ、Ｎｅｄｄ４−１をノックダウンすると内因性ＷＴ  Ｋ−Ｒａｓのタンパク質レベルを向上させることを示す。（ｋ）は、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異体がＦ／Ｎｅｄｄ４−１を過剰発現したときには明らかに分解しないことを示す。（ｌ）は、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異が、Ｎｅｄｄ４−１を介したＫ−Ｒａｓのインビボユビキチン化を弱めることを示す。（ｍ）は、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異が、Ｎｅｄｄ４−１を介したＫ−Ｒａｓのインビトロユビキチン化を弱めることを示す。
【図２】外因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質のレベルを低下させることができる化合物をスクリーニングすることを示す。（ａ）は、ドットブロットによるハイスループットスクリーニングで２８種類の化合物をスクリーニングし、２９３Ｔ細胞でＦｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２ＶとＦｌａｇ−Ｎｅｄｄ４−１−ＷＴを過剰発現させ、薬物添加処理により外因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質レベルを低下させ得る７種類の化合物をスクリーニングしたことを示す。（ｂ）は、外因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖを低下させ得る７種類の化合物をＳＷ６２０細胞でさらにスクリーニングし、内因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質レベルを低下させ得る３種類の化合物を選択したことを示す。図２（は、内外因性スクリーニングによる３種類の化合物について、Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質レベルを低下させるのがＮｅｄｄ４−１タンパク質の存在に依存しているか否かを検出したことを示す。
【図３】スクリーニングされた化合物が、細胞内の内因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖのタンパク質レベルの低下とは用量反応関係を有することを示す。（ａ）は、化合物ＺＴ−１０−１５８−０１がＳＷ６２０細胞中の内因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖのタンパク質レベルを効果的に低下でき、抑制効果が濃度と正の相関性を持つことを示す。（ｂ）は、化合物ＺＴ−１０−１５８−０１がＨＥＫ２９３Ｔ細胞中の外因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖのタンパク質レベルを効果的に低下させ、抑制効果が濃度とは正の相関性を示すことを示す。
【図４】スクリーニングされた化合物がＲａｓシグナル障害のある腫瘍細胞のコロニー形成を選択的に抑制できることを示す。（ａ）は、化合物ＺＴ−１０−１５８−０１が寒天上でのＭＣＦ−７細胞のコロニー形成能を効果的に抑制できることを示す。（ｂ）は、化合物ＺＴ−１０−１５８−０１が、寒天上でのＳＷ６２０細胞のコロニー形成能を効果的に抑制できることを示す。（ｃ）は、化合物ＺＴ−１０−１５８−０１が、寒天上でＨＴ−２９細胞のコロニー形成能を抑制できないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下は、当業者が本発明を実施するために提供される実施形態である。当業者は、本開示の精神又は範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態を修正したり変更したりすることができる。本明細書で記載のすべての開示、特許出願、特許、図面、及び他の参照文献は、明示的に全文として引用により組み込まれている。
【００３０】
特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本発明に使用される用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ使用され、本発明を限定することを意図していない。
【００３１】
なお、本明細書に記載された複数のステップ又は動作を含むいくつかの方法では、文脈からさらに示されない限り、前記方法のステップ又は動作の順序は、前記方法のステップ又は動作について挙げられた順序に必ずしも限定するとは限らない。
【００３２】
本明細書で使用されるように、Ｒａｓという用語は、Ｈ−Ｒａｓ（たとえば、ＮＣＢＩタンパク質データベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１１２３９１４に示されるアミノ酸配列を有する）、Ｋ−Ｒａｓ（たとえば、ＮＣＢＩタンパク質データベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿２０３５２４に示されるアミノ酸配列を有する）、又はＮ−Ｒａｓ（たとえば、ＮＣＢＩタンパク質データベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＥＡＷ５６６１１に示されるアミノ酸配列を有する）、ならびにそれらの様々な異なるサブタイプタンパク質（ｉｓｏｆｏｒｍ）及び様々な活性突然変異体である。前記突然変異体は、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒを含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記突然変異体は、Ｈ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒ；Ｋ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒ；Ｎ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒである。最も好ましくは、前記突然変異体は、Ｋ−ＲａｓのＧ１２Ｖである。たとえば、例示的なＫ−Ｒａｓタンパク質配列は、以下のとおりであってもよい。
1 mteyklvvvg aggvgksalt iqliqnhfvd eydptiedsy rkqvvidget clldildtag
61 qeeysamrdq ymrtgegflc vfainntksf edihhyreqi krvkdsedvp mvlvgnkcdl
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181 vkikkciem
例示的なＨ−Ｒａｓタンパク質配列は、以下のとおりであってもよい。
1 mteyklvvvg aggvgksalt iqliqnhfvd eydptiedsy rkqvvidget clldildtag
61 qeeysamrdq ymrtgegflc vfainntksf edihqyreqi krvkdsddvp mvlvgnkcdl
121 aartvesrqaqdlarsygip yietsaktrq gvedafytlv reirqhklrk lnppdesgpg
181 cmsckcvls
例示的なＮ−Ｒａｓタンパク質配列は、以下のとおりであってもよい。
1 mteyklvvvg aggvgksalt iqliqnhfvd eydptiedsy rkqvvidget clldildtag
61 qeeysamrdq ymrtgegflc vfainnsksf adinlyreqi krvkdsddvp mvlvgnkcdl
121 ptrtvdtkqa helaksygip fietsaktrq gvedafytlv reirqyrmkk lnssddgtqg
181 cmglpcvvm
【００３３】
本明細書で使用されるように、「Ｎｅｄｄ４−１」という用語は、ＨＥＣＴファミリーに属するＥ３ユビキチンリガーゼであり、構造的には、Ｎ末端のＣ２ドメイン、中間のＷＷドメイン、及びＣ末端のＨＥＣＴドメインを含み、たとえば、ＮＣＢＩタンパク質データベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００６１４５に示されるアミノ酸配列を有する。
1 maqslrlhfa arrsntypls etsgddldsh vhmcfkrptr istsnvvqmk ltprqtalap
61 likenvqsqe rssvpssenv nkkssclqis lqptrysgyl qssnvladsd dasftcilkd
121 giyssavvdn elnavndghl vsspaicsgs lsnfstsdng syssngsdfg scasitsggs
181 ytnsvisdss sytfppsddt flggnlpsds tsnrsvpnrn ttpceifsrs tstdpfvqdd
241 lehgleimkl pvsrntkipl krysslvifp rspsttrpts ptslctllsk gsyqtshqfi
301 ispseiahne dgtsakgfls tavnglrlsk tictpgevrd irplhrkgsl qkkivlsnnt
361 prqtvcekss egyscvsvhf tqrkaatldc ettngdckpe mseiklnsds eyiklmhrts
421 aclpssqnvd cqiningele rphsqmnknh gilrrsislg gaypniscls slkhncskgg
481 psqllikfas gnegkvdnls rdsnrdctne lsnscktrdd flgqvdvply plptenprle
541 rpytfkdfvl hprshksrvk gylrlkmtyl pktsgseddn aeqaeelepg wvvldqpdaa
601 chlqqqqeps plppgweerq dilgrtyyvn hesrrtqwkr ptpqdnltda engniqlqaq
661 rafttrrqis eetesvdnre ssenweiire deatmysnqa fpspppssnl dvpthlaeel
721 narltifgns avsqpasssn hssrrgslqa ytfeeqptlp vllptssglp pgweekqder
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841 flpkgwevrh apngrpffid hntktttwed prlkipahlr gktsldtsnd lgplppgwee
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1261 ygsngpqsft veqwgtpekl prahtcfnrl dlppyesfee lwdklqmaie ntqgfdgvd
【００３４】
本明細書で使用されるように、Ｒａｓ陽性遺伝的背景の癌又は腫瘍とは、このような腫瘍においてＲａｓタンパク質が突然変異又は上流シグナルの影響を受けて持続的に活性化された状態にあることを指す。
【００３５】
一態様では、本発明は、
インビトロでＲａｓを発現させる細胞又はユビキチン化系を試験化合物と接触させるステップａと、
ステップａにおける細胞又は系のＲａｓレベルを増加又は減少させることができる化合物を選択するステップｂと、を含み、
任意選択で、前記方法は、
ステップｂで得られた化合物によるＲａｓレベルの調整がＮｅｄｄ４−１タンパク質の存在に依存しているか否かを検出するステップｃと、
Ｎｅｄｄ４−１タンパク質の存在に依存してＲａｓレベルを調整する化合物を選択するステップｄと、を含むＲａｓレベルを調整する化合物の同定方法に関する。
【００３６】
前記検出方法は、当技術分野における従来の分子レベルの検出方法であり得、マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ技術、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）、ｌｕｍｉｎｅｘ技術、質量分析、フローサイトメトリー、ＲＮＡブロット、ＤＮＡブロット、ウエスタンブロット、ＰＣＲ、及びＲＩＡを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
一態様では、本発明は、
Ｒａｓタンパク質の状態を判断するステップａと、
Ｒａｓタンパク質が野生型タンパク質又は不活性状態である場合、Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整することによってＲａｓのレベルを調整するステップｂと、
Ｒａｓタンパク質が突然変異体タンパク質又は活性状態である場合、化合物を添加することによってＲａｓのレベルを調整するステップｃと、
任意選択で、さらにＮｅｄｄ４−１の発現レベルの調整と化合物の添加は同時に行うことができるステップｄと、を含むＲａｓレベルの調整方法に関する。
【００３８】
上記方法によれば、Ｎｅｄｄ４−１のレベルを向上させることによってＲａｓレベルを低下させるか、又は、Ｎｅｄｄ４−１のレベルを低下させることによってＲａｓレベルを増加する。
【００３９】
上記方法によれば、化合物の添加はＲａｓタンパク質のレベルを低下させるが、ＲａｓのｍＲＮＡレベルには影響しない。
【００４０】
本発明の方法によれば、Ｒａｓを発現させる前記細胞は、外因性Ｒａｓ又は内因性Ｒａｓ、又はその両方を発現させる細胞である。前記外因性Ｒａｓとは、本来細胞には存在せず、分子生物学的手段を通じて外部から細胞に導入されて発現させるＲａｓであり、前記内因性Ｒａｓとは、本来細胞には存在し、安定的に遺伝するＲａｓである。インビトロユビキチン化系は、当分野で一般的に使用されているインビトロユビキチン化の実験方法に従うものである、この系は、完全な細胞を必要とせずに、５０ｍＭTris-塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で２、５０μＭ  ＤＴＴの反応系に、精製したユビキチンタンパク質Ｅ１ユビキチン活性化酵素、Ｅ２ユビキチン結合酵素、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、及び対応する基質タンパク質を加えてユビキチン化反応を行うことができる。当業者は、これに基づいて、必要に応じて特定の成分を添加又は減少させることもできる。
【００４１】
本発明の方法によれば、ステップｂにおいて、ステップａにおける細胞のＲａｓレベルを低下させ得る化合物を選択する。
【００４２】
本発明の方法によれば、前記Ｒａｓは、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、又はＮ−Ｒａｓ、及びこれらの様々な突然変異体であり、前記突然変異体は、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒを含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記突然変異体は、Ｈ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒ；Ｋ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒ；Ｎ−ＲａｓのＧ１２Ｖ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｒである。最も好ましkは、前記突然変異体はＫ−ＲａｓのＧ１２Ｖである。
【００４３】
本発明の方法によれば、Ｒａｓレベルは、サンプル中の分子の基礎レベル又は状態であってもよく、サンプルの一部が調整剤と接触した後の分子のレベル又は状態であってもよい。一実施形態において、分子はタンパク質又は核酸分子である。別の実施形態において、分子は、タンパク質、核酸、脂質、糖、炭水化物、又は代謝物分子を含む。さらに別の実施形態において、分子は、マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ技術、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）、ｌｕｍｉｎｅｘ技術、質量分析、フローサイトメトリー、ＲＮＡブロット、ＤＮＡブロット、ウエスタンブロット、ＰＣＲ及びＲＩＡから選択される方法を用いて分析される。
【００４４】
本発明の方法によれば、相互作用は、イムノアッセイ、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）（Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11:54；Englebienne(1998)Analyst.123:1599、等温滴定熱測定（ＩＴＣ）、又は当技術分野で知られている他の動力学的相互作用測定方法により検出され得る（たとえば、Paul,ed.,Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages 332-336(1989)；抗体の結合親和性を計算するための例示的なＳＰＲ及びＩＴＣ方法を記載した米国特許第７,２２９,６１９号も参照される。）。結合速度をリアルタイムで検出・監視するための装置及び方法は公知のものであり、市販品として入手できる（BiaCore 2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare Life Sciences；Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335参照）。当業者が理解できるように、上記の分子レベルを検出する方法及び分子相互作用を検出する方法は交換可能に用いることができ、たとえば、分子レベルを検出するウェスタンブロット方法は、タンパク質間の相互作用を検出することも、タンパク質とＲＮＡ、ＤＮＡ分子との相互作用、又は抗原、抗体の相互作用などを検出することもできる。
【００４５】
別の態様において、本発明は、上記のいずれかの方法を用いてスクリーニングされた化合物に関する。
【００４６】
上記化合物によれば、前記化合物は、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質依存的（すなわち、前記化合物は、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質が存在する場合、Ｒａｓタンパク質の分解を促進し、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質が存在しない場合、Ｒａｓタンパク質の分解を促進する能力が著しく低下する）に、Ｒａｓユビキチン化分解を促進することができる。
【００４７】
前記化合物によれば、前記化合物は、
2021518751.tif 000005
から選択され、
好ましくは、
2021518751.tif 000006
である。
【００４８】
本発明はまた、本発明の方法を適用するためのキットを含む。前記キットは、Ｒａｓ又はＮｅｄｄ４−１レベルを検出する１つ以上の試薬を含み、任意選択で、Ｒａｓ又はＮｅｄｄ４−１を発現させる発現プラスミドをさらに含み、任意選択で、Ｒａｓを発現させる宿主細胞をさらに含み、任意選択で、Ｒａｓユビキチン化分解を促進する化合物をさらに含み、任意選択で、本発明の上記のいずれかの方法を用いて得られる化合物を含む。キットはまた、適切な容器、及び取扱書等を含むことができる。Ｒａｓ又はＮｅｄｄ４−１レベルの検出は、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルで行うことができ、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルの検出は、本分野で実施されている他の技術及びシステム、たとえば、１つ又は複数の設計されたプライマーで使用されるＲＴ−ＰＣＲ試験；免疫試験、たとえば酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）；ウェスタンブロット、たとえばウエスタンブロット又はインサイチュハイブリダイゼーションや類似技術を使用することができる。
【００４９】
本明細書で使用されるように、別の指示がない限り、「化合物」という用語は、文脈において、本明細書に開示された任意の特定の化学化合物を意味し、且つその互変異性体、位置異性体、幾何異性体、及び該当する場合の立体異性体（光学異性体（エナンチオマー）及び他の立体異性体（ジアステレオマー）を含む）、ならびにその薬学的に許容される塩及び誘導体（プロドラッグ形態を含む）を含む。文脈で使用される場合、化合物という用語とは一般に単一化合物を指し、且つ、開示された化合物の立体異性体、位置異性体及び／又は光学異性体（ラセミ混合物を含む）、ならびに特定のエナンチオマー又はエナンチオマーに富んだ混合物などの他の化合物を含むことができる。文脈において、前記用語はまた、活性部位への化合物の投与及び送達を容易にするように修飾された化合物のプロドラッグの形態を指す。
【００５０】
一方、本発明は、上記のいずれかの技術案に記載の化合物、その立体異性体、そのプロドラッグ、又はその薬学的に許容される塩又は薬学的に許容される溶媒和物、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬品組成物を提供する。たとえば、本発明の医薬品組成物の活性成分は、本発明の方法によって得られる化合物、及びＮｅｄｄ４−１の発現レベルを調整する分子をさらに含むことができ、前記Ｎｅｄｄ４−１の発現レベルを調整する分子は、小分子化合物、Ｎｅｄｄ４−１核酸構築体、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質などを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
一定量の活性成分を含有する種々の医薬品組成物を製造する方法は、公知なものであるか、又は本発明の開示から当業者にとって自明である。REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Martin, E.W., ed., Mack Publishing Company, 19th ed.(1995)に記載されているように、本発明の医薬品組成物の製造方法は、適切な薬学賦形剤、担体、希釈剤等を配合することを含む。
【００５２】
本発明の医薬品製剤は、従来の混合、溶解又は凍結乾燥方法を含む公知の方法で製造される。本発明の化合物は、医薬品組成物とすることができ、選択された特定の投与方式に適した様々な経路、たとえば経口又は非経口（静脈内、筋内、局所又は皮下経路を介して）で患者に投与することができる。
【００５３】
本明細書で使用されるように、特に断らない限り、「プロドラッグ」という用語は、生物学的条件（インビトロ又はインビボ）において、加水分解、酸化、又は他の反応を行うことで、本発明の化合物の誘導体を提供することを意味する。プロドラッグは、生物学的条件下でのみこの反応を経て活性化合物となるか、又は反応しない形態で活性を有する。通常、プロドラッグは、公知の方法、たとえば1 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff編, 第5版)に記載されている方法を用いて調製することができる。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される塩」の例としては、薬学的に許容されるアニオンを形成する有機酸から形成される有機酸付加塩であり、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、α−グリセロリン酸塩、アルキルスルホン酸塩又はアリールスルホン酸塩を含むが、これらに限定されず、好ましくは、前記アルキルスルホン酸塩は、メチルスルホン酸塩又はエチルスルホン酸塩であり、前記アリールスルホン酸塩は、ベンゼンスルホン酸塩又はパラトルエンスルホン酸塩である。適当な無機塩も形成され得、前記無機塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、硫酸塩又はリン酸塩などを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
薬学的に許容される塩は、たとえば、十分な量の塩基性化合物と、薬学的に許容されるアニオンを提供する適切な酸とを反応させるなど、当業者に周知の標準的な手順を用いて得ることができる。
【００５６】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品投与に適合する任意及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤や吸収遅延剤などを含むことを意図している。適切な担体は、当技術分野における標準的な参照書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されており、引用によって本明細書に組み込まれている。このような担体又は希釈剤の好ましい例には、水、食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソームや固定化油などの非水系担体を用いることもできる。このような媒体及び試薬を医薬品活性物質に使用することは当分野で公知するものである。抗体と非相溶性である従来の媒体又は試薬のいずれかを除いて、組成物におけるその使用が想定される。
【００５７】
本明細書で使用されるように、「治療」という用語は、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。該効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防することによって、予防的であってもよく、及び／又は、疾患及び／又は疾患に起因する副作用を部分的又は完全に安定化又は治癒することによって、治療的であってもよい。本明細書で使用される「治療」は、患者の疾患に対するいかなる治療も含まれ、（ａ）疾患又は症状に感染しやすいが、疾患と診断されていない患者に生じる疾患又は症状を予防すること、（ｂ）疾患の症状を抑制する、即ち、その進行を阻止すること、又は（ｃ）疾患の症状を緩和する、すなわち、疾患又は症状の退化を引き起こすことを含む。
【００５８】
別の態様では、本発明は、被験者又は患者（たとえば、ヒトなどの動物）の疾患、病気、又はその症状を治療又は改善する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の化合物又はその塩の形態の有効量（たとえば、治療有効量）と、薬学的に許容されるキャリア剤と、を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記組成物は、被験者の疾患又は病気又はその症状を効果的に治療又は改善することができる。
【００５９】
本明細書で使用されるように、「核酸構築体」という用語は、本明細書では、一本鎖又は二本鎖核酸分子として定義され、好ましくは人工的に構築された核酸分子を意味する。任意選択で、前記核酸構築体は、作動可能に連結された１つ又は複数の調整配列をさらに含んでもよい。
【００６０】
本明細書で使用されるように、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のヌクレオチド領域又は核酸配列の機能的な空間的配置を意味する。前記「作動可能に連結された」は、遺伝子組換えの手段によって達成することができる。
【００６１】
本明細書で使用されるように、「ベクター」という用語は、あるタンパク質を阻害するポリヌクレオチドをその中に挿入することができる核酸輸送手段を意味する。たとえば、ベクターは、プラスミド；ファージ粒子；コスミド；人工染色体、たとえば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、たとえばλファージ又はＭ１３ファージ及び動物ウイルスなどが含まれる。ベクターとして用いる動物ウイルスの種類はレトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（たとえば単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（たとえばＳＶ４０）がある。ベクターは、発現を制御する複数の要素を含んでいてもよい。
【００６２】
ここで使用されるように、「宿主細胞」という用語は、ベクターに導入される細胞を指し、大腸菌や枯草菌などの原核細胞、酵母菌やコウジカビなどの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞やＳｆ９などの昆虫細胞、又はＨｅＬａ細胞、ＳＷ６２０細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＴ−２９細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの動物細胞など多くの種類の細胞を含む。
【００６３】
本明細書で使用されるように、「有効量」という用語は、被験者において、本発明に記載される疾患又は病気を治療、予防、軽減、及び／又は緩和することが可能な用量を意味する。
【００６４】
本明細書で使用されるように、用語「疾患及び／又は病気」とは、本発明の疾患及び／又は病気に関連する被験者の身体状態を意味する。
【００６５】
本明細書で使用されるように、「被験者」という用語は、本発明に記載の疾患又は病気を治療、予防、軽減、及び／又は緩和するために本発明の医薬品組成物を受ける患者又は他の動物、特に哺乳動物、たとえばヒト、イヌ、サル、牛、馬などを意味する。
【００６６】
実施例
以下、実施例を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。当業者であれば、以下の実施例は本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではない。実施例では、具体的な技術又は条件が明記されていない場合、該分野の文献に記載されている技術又は条件（たとえば、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、黄培堂ら訳出の「分子クローン実験ガイドライン」、第３版、科学出版社参照）又は製品の取扱書に従って実施する。使用する試薬又は機器にメーカーが明記されていない場合は、いずれも市販品として入手できる通常の製品である。
【００６７】
実施例１：Ｎｅｄｄ４−１によるＲａｓタンパク質のユビキチン化修飾及びその分解
１．実験材料及び主要試薬
細胞株：
ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ（ｃａｔ．ＣＣＬ−２）、ＡＴＣＣより購入。ヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ｃａｔ．ＣＲＬ−３２１６）、ＡＴＣＣより購入。ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９（ｃａｔ．ＨＴＢ−３８）、ＡＴＣＣより購入。
ベクターｐ  ＣＭＶ６（ｃａｔ．ＰＳ１００００１）、ｏｒｉｇｅｎｅより購入。
トランスフェクション試薬：ＰＥＩ（ｃａｔ．１１６６８−０２７）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入。
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．１１９６５）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。
ウエスタンブロットに使用されている一次抗体：
抗−ｃ−Ｍｙｃ抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社より購入；抗−ｒａｔ−ＨＡ抗体、Ｒｏｃｈｅ社より購入；抗−Ｕｂ抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社より購入；抗−Ｆｌａｇ抗体、Ｓｉｇｍａ社より購入；抗−Ｋ−Ｒａｓ抗体、Ａｂｃａｍ社より購入；抗−Ｈ−Ｒａｓ抗体、Ａｂｃａｍ社より購入；抗−Ｎ−Ｒａｓ抗体、Ａｂｃａｍ社より購入；抗−Ｒａｓ抗体、Ａｂｃａｍ社より購入；抗−Ｎｅｄｄ４−１抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より購入；抗−β−ａｃｔｉｎ抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社より購入。
ウエスタンブロットに使用される二次抗体：
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、共にＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。
【００６８】
２．実験方法
２．１  タンパク質のインビトロ  ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ実験
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合ベクターを用いて、インビトロでＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｎｅｄｄ４−１  ＷＴ、ＧＳＴ−Ｎｅｄｄ４−１  ＣＡの融合タンパク質を発現させて精製し、また、ＧＳＴ−Ｆｌａｇ−Ｒａｓタンパク質をインビトロで精製し、タンパク質インビトロＧＳＴ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ反応系に従って、ＴＮＴＥ  ０．５％反応緩衝液に相当量の精製タンパク質を加えた。ロータリーシェーカーを用いて４℃で１〜２時間インキュベートし、４℃、２４００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨てた。ＴＮＴＥ  ０．５％反応緩衝液を加えて均一に混合し、４℃、２４００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨て、以上のステップを４〜６回繰り返した。２０μＬ  ４×ローディング緩衝液を加えて反応を停止し、沸騰水で５分間煮た。サンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析を行った。
２．２  インビトロユビキチン化実験
インビトロユビキチン化実験は、当該分野の従来の実験方法に従って行われ、具体的には、インビトロでＧＳＴ−ＵＢＥ１、Ｈｉｓ−ＵｂｃＨ７、Ｈｉｓ−Ｕｂ、ＧＳＴ−Ｎｅｄｄ４−１  ＷＴ、ＧＳＴ−Ｎｅｄｄ４−１  ＣＡ及びＧＳＴ−Ｆｌａｇ−Ｒａｓの融合タンパク質を発現させて精製し、タンパク質のインビトロユビキチン化反応系に従って、相当量の精製タンパク質を加えた。反応過程において、まず、Ｅ３を基質と混合し、氷上で３０〜４５分間インキュベートした後、水、Ｅ２、Ｕｂ、ＡＴＰ、及び５ｘ緩衝液を加え、最後に、Ｅ１を加えてユビキチン化反応を開始させ、２５℃で５０〜６０分間インキュベートした。反応終了後、最終濃度１％ＳＤＳ沸騰水を加えて５分間煮た。反応群ごとにＴＮＴＥ  ０．５％を加えて体積を拡大し、Ｆｌａｇ抗体、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇを加えて４℃のロータリーシェーカーで一晩インキュベートした。４℃、２４００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨てた。ＴＮＴＥ  ０．５％反応緩衝液を加えて均一に混合し、４℃、２４００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨て、以上のステップを３〜４回繰り返した。２０μＬ  ４×ローディング緩衝液を加え、沸騰水で５分間煮た。サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析を行った。
２．３  細胞が発現したタンパク質サンプルの調製
１．細胞培養プレートを３７℃の二酸化炭素インキュベータから取り出した後、上清を吸い捨て、温かいＰＢＳで１回洗浄した。
２．氷で予冷された溶解液（１：１００でＰＭＳＦを加える）を適量加え、脱色シェーカーに入れて振とうして、細胞を２０分間溶解した。
３．溶解液をすべて遠心管に収集し、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
４．上清を新しい管に移し、４×ローディング緩衝液を加えて均一に混合した。
５．１００℃の水浴で５分間加熱し、−２０℃の冷蔵庫に入れてウエスタンブロット分析に供した。
２．４  免疫共沈殿実験
１．ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇアガロースビーズ（１：１混合）２００μＬを、ＴＮＴＥ  ０．５％溶液で３回洗浄し、毎回３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、１％ＢＳＡを加えてビーズを２時間ブロックし、さらにＴＮＴＥ  ０．５％溶液で３回洗浄し、使用時まで４℃で保管した。
２．細胞溶解液５００μＬと抗体又はＩｇＧ０．５μＬを混合し、４℃で２時間回転してインキュベートした。
３．ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇアガロースビーズ２０μＬを加え、４℃で１２時間インキュベートし、標識したタンパク質を溶解液から免疫沈降させた。
４．４℃、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、アガロースビーズ／抗体／抗原複合体をチューブの底部まで遠心分離した。
５．上清を捨て、アガロースビーズをＴＮＴＥ  ０．５％溶液１ｍＬで洗浄し、次に、４℃、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、上清を捨て、このように３回繰り返した。
６．ＳＤＳローディング緩衝液２０μＬでアガロースビーズ／抗体／抗原複合体を再懸濁させ、１００℃水浴で５分間加熱し、得られたサンプルを、ウエスタンブロット分析に用いた。
【００６９】
３．実験結果
実験結果を図１に示す。図１（ａ）は、ＨｅＬａ細胞における内因性Ｎｅｄｄ４−１とＲａｓタンパク質との相互作用をＨｅＬａ細胞において検出することを示す。図１（ｂ）は、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質とＲａｓタンパク質とのインビトロでの直接相互作用を示す。図１（ｃ）は、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質の過剰発現がＨｅＬａ中の内因性Ｒａｓタンパク質レベルを低下させ得ることを示し、統計の結果は、互いに独立した３回の実験のＭｅａｎ±ＳＤを取ったものである。図１（ｄ）は、Ｎｅｄｄ４−１タンパク質の過剰発現が外因性Ｒａｓタンパク質レベルを低下させ得ることを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、それぞれ対応するプラスミドの組み合わせとして、Ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ  Ｋ−Ｒａｓ（Ｆ／Ｋ−Ｒａｓ）、Ｈ−Ｒａｓ（Ｆ／Ｈ−Ｒａｓ）又はＮ−Ｒａｓ（Ｆ／Ｎ−Ｒａｓ）及びＦｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ  Ｎｅｄｄ４−１（Ｆ／Ｎｅｄｄ４−１）又はＮｅｄｄ４−２（Ｆ／Ｎｅｄｄ４−２）、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ（ＷＴ）又は触媒活性を有さない突然変異体Ｃ８６７Ａ又はＣ９４２Ａが一過的にトランスフェクションされている。全細胞溶解液についてウエスタンブロットを行ってタンパク質レベルを検出し、ＧＡＰＤＨタンパク質レベルをサンプル対照とし、統計の結果は、互いに独立した５回の実験のＭｅａｎ±ＳＤを取ったものである。図１（ｅ）は、Ｎｅｄｄ４−１を介したＲａｓタンパク質の分解がリソソーム経路を介して行われることを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、プラスミドＦ／Ｎｅｄｄ４−１（ＷＴ又はＣ８６７Ａ）及び異なるＲａｓを一過的にトランスフェクションし、２０μＭプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２又は１２０μＭリソソーム阻害剤ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅで１２時間処理し又は処理しない場合に、それぞれＲａｓタンパク質レベルを検出しし、統計の結果は、互いに独立した３回の実験のＭｅａｎ±ＳＤを取ったものである。図１（ｆ）は、Ｎｅｄｄ４−１がＨ−ＲａｓとＮ−Ｒａｓのインビボユビキチン化を媒介することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｆ／Ｈ−Ｒａｓ又はＦ／Ｎ−Ｒａｓ、Ｍｙｃ／Ｎｅｄｄ４−１（ＷＴ又はＣ８６７Ａ）及びＨＡ／Ｕｂを一過的にトランスフェクションして、インビボユビキチン化実験を行った。図１（ｇ）は、インビトロ条件下でＮｅｄｄ４−１がＨ−ＲａｓとＮ−Ｒａｓを直接ユビキチン化修飾することを示す。ＧＳＴ／Ｎｅｄｄ４−１（ＷＴ又はＣ８６７Ａ）とＦ／Ｈ−Ｒａｓ又はＦ／Ｎ−Ｒａｓタンパク質をインビトロで精製し、インビトロユビキチン化実験を行い、ユビキチンに結合したＨ−Ｒａｓ又はＮ−ＲａｓをＵｂ抗体で検出した。図１（ｈ）は、Ｎｅｄｄ４−１がＨ−Ｒａｓタンパク質の半減期を調整することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、同図に示すようにＦ／Ｈ−Ｒａｓ、Ｆ／Ｎｅｄｄ４−１、対照ｓｈＲＮＡ、及びＮｅｄｄ４−１  ｓｈＲＮＡプラスミドを一過的にトランスフェクションし、ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＣＨＸ）で異なる時間処理した後、細胞を回収して、全細胞溶解液中のＦ／Ｈ−Ｒａｓタンパク質レベルを検出し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＧＡＰＤＨを内部参照としてタンパク質定量を行い、各時点でのＦ／Ｈ−Ｒａｓの零点に対���るタンパク質量を折れ線グラフにプロットして示した。図１（ｉ）は、Ｎｅｄｄ４−１がＮ−Ｒタンパク質の半減期を調整することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、同図に示すように、Ｆ／Ｎ−Ｒａｓ、Ｆ／Ｎｅｄｄ４−１、対照ｓｈＲＮＡ、及びＮｅｄｄ４−１  ｓｈＲＮＡプラスミドを一過的にトランスフェクションし、ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＣＨＸ）で異なる時間処理した後、細胞を回収して、全細胞溶解液中のＦ／Ｎ−Ｒａｓタンパク質レベルを検出し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＧＡＰＤＨを内部参照としてタンパク質定量を行い、各時点でのＦ／Ｎ−Ｒａｓの零点に対するタンパク質量を折れ線グラフにプロットして示した。図１（ｊ）は、ＨＴ−２９細胞におけるＮｅｄｄ４−１の過剰発現が内因性ＷＴ  Ｋ−Ｒａｓのタンパク質レベルを低下させ、Ｎｅｄｄ４−１をノックダウンすると内因性ＷＴ  Ｋ−Ｒａｓのタンパク質レベルを向上させることを示す。図１（ｋ）は、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異体がＦ／Ｎｅｄｄ４−１を過剰発現したときには明らかに分解しないことを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、同図に示すように、Ｆ／Ｋ−Ｒａｓ（ＷＴ又はＧ１２Ｖ）及びＦ／Ｎｅｄｄ４−１（ＷＴ又はＣ８６７Ａ）を一過的にトランスフェクションし、Ｆ／Ｋ−Ｒａｓタンパク質レベルを検出した。図１（ｌ）は、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異がＮｅｄｄ４−１を介したＫ−Ｒａｓのインビボユビキチン化を弱めることを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｆ／Ｋ−Ｒａｓ（ＷＴ又はＶ１２）、Ｍｙｃ／Ｎｅｄｄ４−１（ＷＴ又はＣ８６７Ａ）及びＨＡ／Ｕｂを一過的にトランスフェクションし、インビボユビキチン化実験を行った。図１（ｍ）は、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異がＮｅｄｄ４−１を介したＫ−Ｒａｓのインビトロユビキチン化を弱めることを示す。ＧＳＴ／Ｎｅｄｄ４−１（ＷＴ又はＣ８６７Ａ）及びＦ／Ｋ−Ｒａｓ（ＷＴ又はＶ１２）タンパク質をインビトロで精製し、インビトロユビキチン化実験を行い、ユビキチンタンパク質に結合したＫ−ＲａｓをＵｂ抗体で検出した。
【００７０】
実施例２：Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質の分解を促進する化合物を、ドットブロット（Ｄｏｔ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によりハイスループットでスクリーニングし、さらにウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により検出し、最終的に、Ｎ−ｅｄｄ４−１に依存してＫ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖを分解する標的化合物を得る。
１．実験材料及び主要試薬
細胞株：
ヒト結腸癌細胞ＳＷ６２０（ｃａｔ．ＣＣＬ−２２７）、ＡＴＣＣより購入。ヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ｃａｔ．ＣＲＬ−３２１６）、ＡＴＣＣより購入。ベクターｐＣＭＶ６（ｃａｔ．ＰＳ１００００１）、ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入。
トランスフェクション試薬：ＰＥＩ（ｃａｔ．１１６６８−０２７）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入。
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．１１９６５）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．３１８０００２２）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。
Ｗｅｓｔｅｒｎに使用されている一次抗体：
抗−Ｆｌａｇ抗体、Ｓｉｇｍａ社より購入；抗−Ｋ−Ｒａｓ抗体、Ａｂｃａｍ社より購入；抗−Ｎｅｄｄ４−１抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より購入；抗−β−ａｃｔｉｎ抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社より購入。
ウエスタンブロットに使用されている二次抗体：
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、すべてＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。
【００７１】
２．実験方法
ドットブロットによる、Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質の分解を促進する化合物のハイスループットスクリーニング
１）細胞トランスフェクション：密度７０〜９０％のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を準備し、トランスフェクションするプラスミド（Ｎ末端にＦｌａｇ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ）タグを有するＫ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖを発現させるプラスミドは、市販品として入手したｐＣＭＶ６発現ベクター（たとえば、ｏｒｉｇｅｎｅ社から購入できるｐＣＭＶ６汎用ベクター）と一般的なＰＣＲ技術によりＫ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖ遺伝子をクローンして挿入することによって構築された。Ｎ末端にＦｌａｇタグを有するＮｅｄｄ４−１を発現させるプラスミドは、市販品として入手したｐＣＭＶ６発現ベクターと一般的なＰＣＲ技術によりＮｅｄｄ４−１遺伝子をクローンして挿入することによって構築された）を０．１μｇ／μＬに希釈し、トランスフェクション系に従ってトランスフェクション緩衝液を調製し、ボルテックス振とう器で１０ｓ振とうさせた後、室温で３０分間静置し、その間にトランスフェクション対象の細胞をＦＢＳ不含ＤＭＥＭ培地に交換し、３０分後、細胞に１滴ずつ添加し、６〜１０時間後、液を交換した。
２）細胞プレーティング：トランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を消化して懸濁させ後、９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、播種量については、翌日に薬物を投与するときの細胞密度が７０％程度であった。
３）細胞への薬物投与：２４時間培養後、各種の薬物ストック液を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で希釈し、最終濃度２０μＭの薬液を得て、９６ウェルプレートから原液を捨て、調製した薬液を加え、ＤＭＳＯ群を空白対照とし、投与終了後、３７℃、ＣＯ２インキュベータに移して、培養を続けた。
４）Ｋ−Ｒａｓタンパク質レベルの検出：投与して２４時間培養後、ウェル内の液体を捨てて、通常のように細胞を収集し、細胞溶解液を加えて細胞総タンパク質を抽出し、ＢＣＡ法でタンパク質濃度を測定し、タンパク質サンプル３０μｇをニトロセルロースメンブレンに滴下し、サンプルが完全にメンブレンに吸着した後、メンブレンを順次ブロックし、それぞれＦｌａｇ抗体（１：２０００）及び内部参照抗体β−ａｃｔｉｎ（１：２０００）を用いて４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで５ｍｉｎ×３回リンスした後、対応するワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（１：５０００）を加えて１〜２時間インキュベートし、ＴＢＳＴでメンブレンを５ｍｉｎ×３回洗浄し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを用いて、化学発光画像を収集した。
５）単点Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率の算出：Ｉｍａｇｅ−Ｌａｂソフトウェアを用いてＦｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓとβ−ａｃｔｉｎを定量して校正分析し、単点Ｆｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率（％）＝（対照群−投薬群）／対照群×１００％の式により細胞内のＦｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓ分解率を算出した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における外因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖレベルを低下させ得る化合物のスクリーニング
１）細胞プレーティング：対数成長期のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、播種量については、翌日トランスフェクション時の細胞密度が７０〜９０％であることが好ましい。
２）細胞トランスフェクション及び投与：２４時間培養後、トランスフェクションするプラスミド（Ｎ−末端にＦｌａｇ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ）タグを有するＫ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖを発現させるプラスミドは、市販品として入手したｐＣＭＶ６発現ベクターと一般的なＰＣＲ技術によりＫ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖ遺伝子をクローンして挿入することによって構築された。Ｎ末端にＦｌａｇタグを有するＮｅｄｄ４−１を発現させるプラスミドは、市販品として入手したｐＣＭＶ６発現ベクターと一般的なＰＣＲ技術によりＮｅｄｄ４−１遺伝子をクローンして挿入することによって構築された）を０．１μｇ／μＬに希釈し、トランスフェクション系に従ってトランスフェクション緩衝液を調製し、ボルテックス振とう器で１０秒振とうさせた後、室温で３０分静置し、その間にトランスフェクション対象の細胞をＦＢＳ不含ＤＭＥＭ培地に交換し、３０分後、細胞に１滴ずつ添加し、６〜１０時間後、液を交換し、液を交換する時に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で各種の薬物ストック液を希釈し、最終濃度２０μＭの薬液を得て、１２ウェルプレートから原液を捨て、調製した薬液を加え、ＤＭＳＯ群を空白対照とし、投与終了後、３７℃、ＣＯ２インキュベータに移して、培養を続けた。
３）Ｋ−Ｒａｓタンパク質レベルの検出：投与して２４時間培養後、ウェル内の液を捨てて、通常のように細胞を収集し、１×ＰＢＳで２回リンスし、細胞溶解液を加えて細胞総タンパク質を抽出し、ＢＣＡ法でタンパク質濃度を測定し、タンパク質サンプル３０μｇを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い膜へ転写し、膜を順次ブロックし、それぞれＦｌａｇ抗体（１：２０００）及び内部参照抗体β−ａｃｔｉｎ（１：２０００）を用いて４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで５ｍｉｎ×３回リンスした後、対応するワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（１：５０００）を加えて１〜２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで膜を５ｍｉｎ×３回洗浄し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを用いて、化学発光画像を収集した。
４）単点Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率の計算：Ｉｍａｇｅ−Ｌａｂソフトウェアを用いてＦｌｇ−Ｋ−Ｒａｓとβ−ａｃｔｉｎを定量して校正分析し、単点Ｆｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率（％）＝（対照群−投薬群）／対照群×１００％の式により細胞内のＦｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓ分解率を算出した。
ＳＷ６２０細胞における内因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖレベルを低下させ得る化合物のスクリーニング
１）細胞プレーティング：対数成長期のＳＷ６２０細胞を２×１０で４／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
２）細胞への薬物投与：２４時間培養後、ＦＢＳを１０％含むＲＰＭＩ−１６４０培地で各種の薬物ストック液を希釈し、最終濃度２０μＭの薬液を得て、２４ウェルプレートから原液を捨て、調製した薬液を加え、ＤＭＳＯ群を空白対照とし、投与終了後、３７℃、ＣＯ２インキュベータに移して、培養を続けた。
３）Ｋ−Ｒａｓタンパク質レベルの検出：投与して２４時間培養後、ウェル内の液体を捨てて、通常のように細胞を収集し、１×ＰＢＳで細胞を２回リンスし、細胞溶解液を加えて細胞総タンパク質を抽出し、ＢＣＡ法でタンパク質濃度を測定し、タンパク質サンプル３０μｇを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアシルゲル電気泳動を行い膜へ転写し、膜を順次ブロックし、それぞれＫ−Ｒａｓ抗体（１：１０００）及び内部参照抗体β−ａｃｔｉｎ（１：２０００）を用いて４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで５ｍｉｎ×３回リンスした後、対応するワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（１：５０００）を加えて１〜２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで膜を５ｍｉｎ×３回洗浄し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを用いて、化学発光画像を収集した。
４）単点Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率の算出：Ｉｍａｇｅ−Ｌａｂソフトウェアを用いてＫ−Ｒａｓとβ−ａｃｔｉｎを定量して校正分析し、単点Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率（％）＝（対照群−投薬群）／対照群×１００％の式により細胞内のＫ−Ｒａｓ分解率を算出した。
【００７２】
３．実験結果
結果を図２に示す。図２（ａ）は、ドットブロットによるハイスループットスクリーニングで２８種類の化合物をスクリーニングし、２９３Ｔ細胞でＦｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２ＶとＦｌａｇ−Ｎｅｄｄ４−１−ＷＴを過剰発現させ、薬物添加処理により外因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質レベルを低下させ得る７種類の化合物をスクリーニングしたことを示す。図２（ｂ）は、外因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖを低下させ得る７種類の化合物（構造は下記の表に示す）をＳＷ６２０細胞でさらにスクリーニングし、内因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質レベルを低下させ得る３種類の化合物を選択したことを示す。図２（ｃ）は、内外因性スクリーニングによる３種類の化合物について、Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質レベルを低下させるのがＮｅｄｄ４−１タンパク質の存在に依存しているか否かを検出したことを示す。最終的に選択された化合物番号３（化合物コード：ＺＴ−１０−１５８−０１）の化合物について次の実験を行った。
2021518751.tif 000007
【００７３】
実施例３：小分子化合物ＺＴ−１０−１５８−０１がＫ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖタンパク質レベルを阻害し、濃度とは正の相関性を示す。
１．実験材料及び主要試薬
細胞株：
ヒト結腸癌細胞ＳＷ６２０（ｃａｔ．ＣＣＬ−２２７）、ＡＴＣＣより購入。ヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ｃａｔ．ＣＲＬ−３２１６）、ＡＴＣＣより購入。
ベクターｐＣＭＶ６（ｃａｔ．ＰＳ１００００１）、ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入。
トランスフェクション試薬：ＰＥＩ（ｃａｔ．１１６６８−０２７）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入。
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．１１９６５）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．３１８０００２２）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。
ウエスタンブロットに使用されている一次抗体：
抗−Ｆｌａｇ抗体、Ｓｉｇｍａ社より購入；抗−Ｋ−Ｒａｓ抗体、Ａｂｃａｍ社より購入；抗−Ｎｅｄｄ４−１抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より購入；抗−β−ａｃｔｉｎ抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社より購入。
ウエスタンブロットに使用されている二次抗体：
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。
【００７４】
２．実験方法
ＳＷ６２０細胞における内因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖレベルの阻害
１）細胞プレーティング：対数成長期のＳＷ６２０細胞を２×１０４／ウェルで２４ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
２）細胞への薬物投与：２４培養時間後、ＦＢＳを１０％含むＲＰＭＩ−１６４０培地で各種の薬物ストック液を希釈し、最終濃度がそれぞれ２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭの薬液を得て、２４ウェルプレートから原液を捨て、調製した薬液を加え、ＤＭＳＯ群を空白対照とし、投与終了後、３７℃、ＣＯ２インキュベータに移して、培養を続けた。
３）Ｋ−Ｒａｓタンパク質レベルの検出：投与して２４時間培養後、ウェル内の液体を捨てて、通常のように細胞を収集し、１×ＰＢＳで細胞を２回リンスし、細胞溶解液を加えて細胞総タンパク質を抽出し、ＢＣＡ法でタンパク質濃度を測定し、タンパク質サンプル３０μｇを用いてＳＤＳ−ポリアクリロイルアンモニアゲル電気泳動を行い膜へ転写し、膜を順次ブロックし、それぞれＫ−Ｒａｓ抗体（１：  １０００）及びβ−ａｃｔｉｎ内部参照抗体（１：２０００）を用いて４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで５ｍｉｎ×３回リンスした後、対応するワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（１：５０００）を加えて１〜２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで膜を５ｍｉｎ×３回洗浄し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを用いて、化学発光画像を収集した。
４）単点Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率の算出：Ｉｍａｇｅ−Ｌａｂソフトウェアを用いてＫ−Ｒａｓとβ−ａｃｔｉｎを定量して校正分析し、単点Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率（％）＝（対照群−投薬群）／対照群×１００％の式により細胞内のＫ−Ｒａｓ分解率を算出した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における外因性Ｋ−Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖレベルの阻害
１）細胞プレーティング：対数成長期のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、播種量については、翌日トランスフェクション時の細胞密度が７０〜９０％であることが好ましい。
２）細胞トランスフェクション及び投与：２４時間培養後、トランスフェクションするプラスミド（前記プラスミドは、すべて市販品のプラスミドベクター及び従来の分子生物学的方法により構築された）を０．１μｇ／μＬに希釈し、トランスフェクション系に従ってトランスフェクション緩衝液を調製し、ボルテックス振とう器で１０秒振とうさせた後、室温で３０分間静置し、その間にトランスフェクション対象の細胞をＦＢＳ不含ＤＭＥＭ培地に交換し、３０分後、細胞に１滴ずつ添加し、６〜１０時間後、液を交換し、液を交換する時に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で各種の薬物ストック液を希釈し、最終濃度がそれぞれ２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭの薬液を得て、１２ウェルプレートから原液を捨てて、調製した薬液を加え、ＤＭＳＯ群を空白対照とし、投与終了後、３７℃、ＣＯ２インキュベータに移して、培養を続けた。
３）Ｋ−Ｒａｓタンパク質レベルの検出：投与して２４時間培養後、ウェル内の液体を捨てて、通常のように細胞を収集し、１×ＰＢＳで細胞を２回リンスし、細胞溶解液を加えて細胞総タンパク質を抽出し、ＢＣＡ法でタンパク質濃度を測定し、タンパク質サンプル３０μｇを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアシルゲル電気泳動を行い膜へ転写し、膜を順次ブロックし、それぞれＦｌａｇ抗体（１：２０００）及びβ−ａｃｔｉｎ内部参照抗体（１：２０００）を用いて４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで５ｍｉｎ×３回リンスした後、対応するワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（１：５０００）を加えて１〜２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで膜を５ｍｉｎ×で３回洗浄し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを用いて、化学発光画像を収集した。
４）単点Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率の算出：Ｉｍａｇｅ−Ｌａｂソフトウェアを用いてＦｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓとβ−ａｃｔｉｎを定量して校正分析し、単点Ｆｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓタンパク質分解率（％）＝（対照群−投薬群）／対照群×１００％の式により細胞内のＦｌａｇ−Ｋ−Ｒａｓ分解率を算出した。
【００７５】
３．実験結果
図３に示すように、実験結果から、化合物ＺＴ−１０−１５８−０１は細胞中のＫ−Ｒａｓタンパク質レベルを効果的に低下させ、濃度とは正の相関性を示すことが示された。
【００７６】
実施例４：小分子化合物ＺＴ−１０−１５８−０１の処理によって、軟寒天上での癌細胞のコロニー形成能を効果的に抑制することができる。
１．実験材料及び主要試薬
細胞株：
ヒト結腸癌細胞ＳＷ６２０（ｃａｔ．ＣＣＬ−２２７）、ＡＴＣＣより購入。
ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９（ｃａｔ．ＨＴＢ−３８）、ＡＴＣＣより購入。
ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７（ｃａｔ．ＨＴＢ−２２）、ＡＴＣＣより購入。
寒天粉（ｃａｔ．Ａ１００６３７）、生工社より購入。
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．１１９６５）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より購入。
【００７７】
２．実験方法
１）．底層寒天
i．１％寒天を調製して高圧殺菌し、使用前に１％寒天を沸騰水浴で加熱溶融した後、４０℃の水浴鍋で冷却した（寒天の温度が４０℃になるまで、少なくとも３０分以上放置する）。また、２×ＤＭＥＭ／ＦＢＳを温浴上に置いた。
ii．無菌チューブ内で１％寒天と２×ＤＭＥＭ／ＦＢＳを１：１の体積比で混合して、０．５％底層寒天を調製した。混合液を６ウェルプレートに１ウェルあたり１．５ｍＬずつ急速に加え、軽く振動させ、室温で凝固させた（凝固後４℃で１週間保存可能。使用前に室温で少なくとも３０分放置すると、室温に戻す）。
２）．上層寒天
ｉ．温度４０℃の１％寒天、２×ＤＭＥＭ／ＦＢＳ及び無菌水を用いて、最終濃度０．３％寒天＋１×ＤＭＥＭ／ＦＢＳ混合液を無菌チューブ内で調製した。調製した混合液を４０℃の水浴鍋に入れて、使用に備えた。
ｉｉ．パンクレアチンで細胞を消化して細胞を計数し、実験の必要に応じて細胞密度を調整した。
３）．４０℃の水浴鍋から、調製済みの０．３％寒天＋１×ＤＭＥＭ／ＦＢＳ混合液を取り出し、対応する数の細胞と一定量のＤＭＳＯ／ＺＴ−１０−１５８−０１を加え、ピペットで軽く均一に吹き、すでに凝固した底層寒天に、１ウェルあたり１．５ｍＬで加えた。
４）．細胞ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベータに入れて、１０〜３０日間培養し、３〜６日ごとに新鮮培地を１ウェル当たり２００μＬ補充した。
５）．寒天における細胞クローン形成の様子を毎日観察し、細胞クローンの大きさが撮影に十分になると、撮像して記録し、ＤＭＳＯ群とＺＴ−１０−１５８−０１処理実験群との細胞クローン形成数及びクローンサイズの違いを観察して比較した。
【００７８】
３．実験結果
図４に示すように、実験結果から、化合物ＺＴ−１０−１５８−０１は、ＭＣＦ−７細胞やＳＷ６２０細胞など、シグナル経路を活性化するためにＲａｓタンパク質を必要とする腫瘍細胞のコロニー形成を選択的に阻害でき、一方、Ｒａｓシグナル経路下流のＲａｆキナーゼに突然変異を起こし、このシグナル経路を活性化するためにＲａｓタンパク質を必要としないＨＴ−２９細胞のコロニー形成については、有意な阻害作用がなかったことが示された。
【００７９】
本発明の具体的な実施形態は詳細に説明されているが、当業者が理解できるように、開示されたすべての教示に基づいて、これらの詳細を、本発明の保護範囲内で様々な修正及び置換を行うことができる。本発明のすべての範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によって定められる。
【図１−１】
2021518751.tif 000010
【図１−２】
2021518751.tif 000011
【図１−３】
2021518751.tif 000012
【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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