(57)【要約】ナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を適用して、組織試料からの少量の可溶化液中の発がんシグナル伝達経路または代謝シグナル伝達経路に関与するタンパク質およびタンパク質のアイソフォームを非限定的に含む、分析物を定量化する。ＮＩＡの関心対象の試料には、細針吸引液（ＦＮＡ）または循環腫瘍細胞などの血液または固形腫瘍微小生検試料が非限定的に含まれる。試料は、単一の時点で採取されても、複数の時点で採取されてもよい。試料は、１００，０００個の細胞、５０００個の細胞、１０００個の細胞、１００個の細胞、５０個の細胞、２５個以下の細胞ほど小さくあってもよい。ＮＩＡ検出方法は、タンパク質または等電タンパク質のサイズ分離と、微少流体系中の抗体検出とを組み合わせる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん治療に対する応答を監視するための方法であって、
個体からのがん細胞を関心対象の治療で処置することと、
処置されたがん細胞の試料に対してナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を実行することと、
関心対象のタンパク質のタンパク質分布パターンを判定することと、
前記タンパク質分布パターンを参照タンパク質分布パターンと比較して、前記がん細胞が前記治療に対して応答性であるかを判定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記応答性の判定に従って、前記個体を治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記がん細胞が、インビボで処置される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記がん細胞が、エクスビボで処置される生検試料である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記処置されたがん細胞の試料が、血液試料である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記処置されたがん細胞の試料が、血液試料である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記処置されたがん細胞の試料が、細針吸引液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記参照タンパク質分布パターンが、同じ個体からの未処置の試料である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、４〜４８時間の期間にわたって冷媒中に保管される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、保管後に急速凍結される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記処置することが、がん細胞を、カボザンチニブ、アキシチニブ、トラメチニブ、リゴセルチブ、およびＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチドから選択される標的治療薬と接触させることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記処置することが、放射線単独、または放射線との組み合わせである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記関心対象のタンパク質が、ヒトグルタミナーゼ１（ＧＬＳ１）、ヒトペルオキシレドキシン−６（ＰＲＤＸ６）、ヒト炭酸脱水酵素９、ヒトアルファ−チューブリン、ヒトサイクリンＤ１、ヒトｐ２１、ヒトｐ２７、ヒト網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）、ヒト受容体チロシンキナーゼＡＸＬ、ヒト血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ヒトＰＡＸ８、ヒトＰＤＬ１から選択される、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＩＡが、ＥＲＫ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ３、ＭＥＫ２、ＰＲＤＸ６、ｐ７０Ｓ６Ｋ１、Ｓ６、ＰＣＮＡ、サイクリンＤ１、切断型ＰＡＲＰ−１から選択される関心対象のタンパク質のアイソフォーム分布を分析する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
腫瘍細胞の形質転換および成長は、特定の組織型においてすら可変的であり得る複雑なプロセスである。腫瘍細胞の表現型を定義することができる分析方法は、適切な治療の判定に有用であり、したがって臨床的な関心対象となる。加えて、がん治療が作用する機構の知識は、そのような薬剤の最適な製剤および用量の判定、がんの治療に有効な薬剤のスクリーニング、ならびに治療経過を通した患者の経過観察に有用である。
【０００２】
タンパク質発現および翻訳後修飾における様々な変化は、発がん中に、かつ治療に応答して生じる。例えば、細胞内シグナルが伝達される分子機構であり得る可逆的リン酸化である。
【０００３】
かなりの数のシグナル伝達タンパク質は、セリン、スレオニン、およびチロシン残基に作用するキナーゼまたはホスファターゼである。キナーゼをコードすると予測される２０００超のヒト遺伝子、および各キナーゼが複数の標的に作用する潜在性により、シグナル伝達ネットワークは、非常に複雑なものとなっている。
【０００４】
この複雑さを解き明かすための重要なステップは、シグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を多重様式で定量的に監視することができる新たなプロテオミクス技術の開発である。そのような技術は、網羅的な視点でのシグナル伝達経路の詳細な分析、および治療剤に応答して生じ得る以前には認識されていなかったシグナル伝達事象の迅速な特定を可能にする。
【０００５】
治療剤に応答した、タンパク質、特にタンパク質アイソフォームの変化を追跡することができるタンパク質検出における感受性方法は、大きな臨床的な関心対象となる。本発明は、この必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００６】
特定の実施形態では、ナノ流体プロテオミックイムノアッセイ（ＮＩＡ）を適用して、組織試料からの少量の可溶化液中の、タンパク質量、タンパク質アイソフォーム、発がんシグナル伝達経路に関与するタンパク質ホスホアイソフォームなどの分析物を非限定的に含む、分析物を定量化する。ＮＩＡの関心対象の試料には、血漿もしくは血液からの細胞などの血液およびその誘導体、または細針吸引液（ＦＮＡ）もしくは循環腫瘍細胞などの固形腫瘍微小生検試料が非限定的に含まれる。試料は、単一の時点で採取されても、複数の時点で採取されてもよい。試料は、１００，０００個の細胞、５０００個の細胞、１０００個の細胞、１００個の細胞、５０個の細胞、２５個以下の細胞ほど小さくあってもよい。ＮＩＡ検出方法は、サイズまたは等電タンパク質電気泳動と、ナノ流体系中の抗体検出とを組み合わせる。血液細胞は、可変性を低減するために試料中に保持され得る。ＮＩＡは、最小量の検体のみを必要とするため、分析は、最小侵襲的であり、これは、例えば、処置開始前後の連続タンパク質プロファイルの取得を可能にし、処置を開始する患者におけるタンパク質活性の早期変化を定量化することによる予測タンパク質バイオマーカーの判定などを可能にする。
【０００７】
いくつかの実施形態では、臨床試料は、細針吸引によって得られる。いくつかの実施形態では、臨床試料は、インビボで試料採取されるか、またはエクスビボで培養される固形腫瘍の細針吸引液（ＦＮＡ）である。いくつかの実施形態では、本方法は、ＦＮＡを隣接する非腫瘍組織と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＮＩＡ検出は、最大約２５℃、例えば、約４℃〜約２５℃の温度で維持された試料に対して実行される。臨床的細針吸引液（ＦＮＡ）検体などの試料中のリン酸化タンパク質、例えば、ＥＲＫリン酸化の安定性に対する重要な懸念は、実験室におけるＦＮＡの収集と、例えば、−８０°以下の温度でのＦＮＡの急速凍結との間に経過する時間間隔であり、この間隔は、ＦＮＡ保管時間と称されることがある。ＦＮＡ保管時間は、最大１２時間、最大１８時間、最大２４時間、最大３６時間、最大４８時間、またはそれ以上であることがあり、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間であることがある。ＦＮＡ保管は、約４℃〜約１０℃、通常約４℃の冷媒（例えば、ＲＰＭＩ、ＤＭＥ、ＰＢＳなど）中であり得る。これらの懸念に対処するために、我々は、腎臓がんを有する患者からのＦＮＡ中のタンパク質リン酸化の安定性を検証するためのベンチマーク実験を実行した。ＥＲＫのリン酸化および非リン酸化アイソフォームの相対的存在量は、著しく安定していることが示され、これは、最大２日間の保管時間であっても、ＦＮＡ処理の方法によって測定値が有意に変化しないことを示した。いくつかの実施形態では、臨床試料は、ＦＮＡ保管時間の後に急速凍結される。
【０００９】
分析のためのタンパク質には、グルタミナーゼ１（ＧＬＳ１）のＫＧＡおよびＧＡＣアイソフォーム、ペルオキシレドキシン−６（ＰＲＤＸ６）、ヒト炭酸無水物酵素９、ヒトアルファ−チューブリン、ヒトサイクリンＤ１、ヒトｐ２１、ヒトｐ２７、ヒト網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）、ヒト受容体チロシンキナーゼＡＸＬ、ヒト血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ヒトＰＡＸ８、ヒトＰＤＬ１が非限定的に含まれる。分析は、発現のレベル、および／またはアイソフォームの分布のレベルを対象とし得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＮＩＡを使用して、がん細胞試料、例えば、患者試料の治療に対する応答を監視する。いくつかの実施形態では、治療は、放射線治療である。いくつかの実施形態では、治療は、標的治療、例えば、キナーゼ阻害剤である。本明細書に例示される特定の薬物には、例えば、カボザンチニブ、アキシチニブ、トラメチニブ、リゴセルチブ、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチドなどが含まれる。放射線治療および／または免疫治療は、全身治療のいずれかと組み合わされてもよい。処置後に試料をＮＩＡによって分析して、関心対象のアイソフォームを含む関心対象のタンパク質の存在量および分布を判定する。具体的には、薬物治療は、ＥＲＫ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ３、ＭＥＫ２、ＰＲＤＸ６、ｐ７０Ｓ６Ｋ１、Ｓ６、ＰＣＮＡ、サイクリンＤ１、切断型ＰＡＲＰ−１を含むタンパク質アイソフォームのＮＩＡによって検出可能な差動分布をもたらすことが示されており、これらは、処置した試料と未処置の試料との間に別個の分布パターンを有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、患者は、薬物で治療され、治療後に生検試料が得られる。他の実施形態では、生検試料をエクスビボで処置して、関心対象の治療に対するがんの応答性を判定し、次いで個々の試料が応答性であることが実証される場合に、治療が患者に施される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】１Ａは、同じ日（組織収集の１時間以内、「０日目」）のＦＮＡ処理と、２４時間後（「１日目」）のＦＮＡ処理とを比較する、２つのヒトＲＣＣ腫瘍（Ｔ１およびＴ２）ならびに１つの正常な腎臓（Ｎ）内のＥＲＫ２ホスホアイソフォーム（抗ＥＲＫ２抗体［ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０６−１８２］を１：３００の希釈で使用して電荷分離ＮＩＡによって測定、２つの技術的複製物の平均）の相対的存在量を示し、１Ｂは、組織収集と同じ日（組織収集の１時間以内、「０日目」）のＦＮＡ処理と、２日後（収集の４０時間後、「２日目」）のＦＮＡ処理とを比較する、同じヒトＲＣＣ腫瘍および隣接する正常な腎臓（Ｎ）からの２つの領域（Ｔ１およびＴ２）内のＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量（ＮＩＡによって測定、２つの技術的複製の平均）を示す。
【図２】室温対氷上でのＦＮＡ輸送および処理を比較する、同じヒトＲＣＣ腫瘍の２つの領域（領域Ｔ１：左パネル、領域Ｔ２：右パネル）内の、抗ＥＲＫ２抗体［ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０６−１８２］を１：３００の希釈で使用して電荷分離ＮＩＡによって測定した、ＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量を示す。ＦＮＡは、収集後１時間以内に処理した。
【図３】同じヒトＲＣＣ腫瘍（Ｔ１およびＴ２）ならびに隣接する腎臓組織（Ｎ）の２つの領域の細針吸引液を、腎臓がんを有する４人の患者から得て、電荷分離ＮＩＡを使用して、これらの試料中のグルタミナーゼ１（ＧＬＳ１）のＫＧＡおよびＧＡＣアイソフォームの両方のレベルを、抗ＧＬＳ１抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、カタログ番号Ｔ３４７２）を使用して測定した、左：ＦＮＡからのＮＩＡグルタミナーゼ痕跡の例、右：腫瘍（Ｔ１、Ｔ２）からの２つのＦＮＡ、および隣接する非腫瘍組織（Ｎ）からの１つのＦＮＡを各々有する、４人の患者のグラフデータを示す。
【図４】Ｍａｇ−Ｓｉｆｔｅｒ技術を使用して、循環腫瘍細胞を１０人の患者から単離し、各患者からの細胞をペレット中で凍結し、各患者からの細胞ペレットを、電荷分離ＮＩＡを使用して分析して、抗ＰＲＤＸ６抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号７３３５０）を用いてペルオキシレドキシン６（ＰＲＤＸ６）アイソフォームを測定した結果を示す。患者は、ＥＧＦＲ変異（ＭＵＴ）、野生型（ＷＴ）、または不明のＥＧＦＲ状態（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）のいずれかを有した。
【図５Ａ】ヒト炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）およびヒトアルファ−チューブリン（チューブリン）のサイズ分離によるナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を示す。フォンヒッペル・リンダウ腫瘍抑制因子（ＶＨＬ）を欠損させたヒト腎臓がん細胞株７８６−Ｏ（７８６−Ｏ、陽性対照）またはＶＨＬで再構成したヒト腎臓がん細胞株７８６−Ｏ（７８６−Ｏ  ＶＨＬ、陰性対照）を、全細胞タンパク質可溶化液のＮＩＡサイズ分離後に、示される希釈の抗ＣＡ９（ＧｅｎｅＴｅｘ、クローンＧＴ１２、カタログ番号ＧＴＸ７００２０）または抗チューブリン抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、クローンＤＭ１Ａ、カタログ番号ＭＡＢＴ２０５）でプローブした。予想される分子量は、ＣＡ９：５５〜６０ｋＤａ、チューブリン：５５ｋＤａである。
【図５Ｂ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）からのタンパク質可溶化液のＮＩＡサイズ分離による、チューブリンの検出を示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗チューブリン抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、クローンＤＭ１Ａ、カタログ番号ＭＡＢＴ２０５、１：１００の希釈）でプローブした。Ｋ５６２は、未処置の細胞株対照、または２９時間にわたって１０μＭのイマチニブで処置した細胞株対照（＋ｉｍａｔ．）である。
【図５Ｃ】ヒトサイクリンＤ１のサイズ分離によるナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を示す。示されるタンパク質濃度のヒトｈＴＥＲＴ  ＲＰＥ−１全細胞可溶化液を、抗サイクリンＤ１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、クローンＳＰ４、カタログ番号ＲＭ−９１０４−Ｓ１、１：５０の希釈）でプローブした。左パネルがアッセイの直線性を実証するためにタンパク質濃度に対してプロットしたＮＩＡからの化学発光シグナル、Ｒ２が相関係数、右パネルがＮＩＡシグナルのゲル図であり、サイクリンＤ１の予想される分子量は３６ｋＤａである。
【図５Ｄ】ヒトｐ２１のサイズ分離によるナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を示す。示されるタンパク質濃度のヒトｈＴＥＲＴ  ＲＰＥ−１全細胞可溶化液を、抗ｐ２１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローン１２Ｄ１、カタログ番号２９４７、１：２００の希釈）でプローブした。左パネルがアッセイの直線性を実証するためにタンパク質濃度に対してプロットしたＮＩＡからの化学発光シグナル、Ｒ２が相関係数、右パネルがＮＩＡシグナルのゲル図であり、ｐ２１の予想される分子量は２１ｋＤａである。
【図５Ｅ】ヒトｐ２７のサイズ分離によるナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を示す。示されるタンパク質濃度のヒトｈＴＥＲＴ  ＲＰＥ−１全細胞可溶化液（２ｄＳＳ：培養培地からの血清枯渇の２日後に調製）を、抗ｐ２７抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローン６９Ｃ１２、カタログ番号３６８６、１：１００の希釈）でプローブした。左パネルがアッセイの直線性を実証するためにタンパク質濃度に対してプロットしたＮＩＡからの化学発光シグナル、Ｒ２が相関係数、右パネルがＮＩＡシグナルのゲル図であり、ｐ２７の予想される分子量は２７ｋＤａである。
【図５Ｆ】ヒト網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）のサイズ分離によるナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を示す。示されるタンパク質濃度のヒトｈＴＥＲＴ  ＲＰＥ−１全細胞可溶化液を、抗ｐＲｂ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＤ２０、カタログ番号９３１３、１：５０の希釈）でプローブした。左パネルがアッセイの直線性を実証するためにタンパク質濃度に対してプロットしたＮＩＡからの化学発光シグナル、Ｒ２が相関係数、右パネルがＮＩＡシグナルのゲル図であり、ｐＲｂの予想される分子量は１１０ｋＤａである。
【図５Ｇ】ヒト受容体チロシンキナーゼＡＸＬのサイズ分離によるナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を示す。ヒト腎臓がん細胞株ＳＮ１２Ｌ１全細胞可溶化液を、抗ＡＸＬ抗体でプローブした。ＡＸＬの予想される分子量は１３８ｋＤａおよびより高い分子量形態である。
【図５Ｈ】ヒト血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）のサイズ分離によるナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を示す。示されるタンパク質濃度のヒト腎臓がん細胞株７８６−Ｏ全細胞可溶化液を、抗ＶＥＧＦＲ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローン５５Ｂ１１、カタログ番号２４７９、１：１００の希釈）でプローブした。左パネルがアッセイの直線性を実証するためにタンパク質濃度に対してプロットしたＮＩＡからの化学発光シグナル、Ｒ２が相関係数、右パネルがＮＩＡシグナルのゲル図であり、ＶＥＧＦＲ２の予想される分子量は２１０および２３０ｋＤａである。
【図５Ｉ】ヒトＰＡＸ８のサイズ分離によるナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）を示す。示されるタンパク質濃度のヒト腎臓がん細胞株７８６−Ｏ（陽性対照）およびヒト細胞株ＨＥＫ２９３（陰性対照）全細胞可溶化液を、３つの異なる抗ＰＡＸ８抗体（Ｐ１２：Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＮＢＰ１−３２４４０、Ｐ１３：ＧｅｎｅＴｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ１０１５８３、Ｐ１４：Ａｂｃａｍ、クローンＥＰＲ１８７１５、カタログ番号ａｂ１９１８７０）でプローブした。ＰＡＸ８の予想される分子量は４８ｋＤａである。
【図６Ａ】カボザンチニブ（１μＭ）またはＤＭＳＯ（陰性対照）で１日間処置し、細胞溶解前にＶＥＧＦまたはＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で１０分間刺激したヒト７８６−Ｏ細胞内のＥＲＫ１およびＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量の定量化、ＮＩＡを使用した電荷によるタンパク質分離、ならびに抗汎ＥＲＫ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０６−１８２、１：３００の希釈）でのプローブを示す。誤差バーは技術的３連の標準偏差（ＳＤ）である。
【図６Ｂ】前の図６Ａと同じデータであるが、優勢な非リン酸化ＥＲＫアイソフォームを有しないものを示す。赤色のボックスは、ＨＧＦでの刺激下、カボザンチニブで処置した細胞と対照で処置した細胞との間の特定のＥＲＫホスホアイソフォームの存在量における最も顕著な差異を表す。
【図７Ａ】抗ＡＫＴ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＤ６Ｇ４、カタログ番号３０６３）でプローブした、ヒト腎臓がんおよびヒト正常腎臓からの組織タンパク質可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。ＡＫＴ２の異なる荷電のアイソフォームが特定され、これらは、おそらく非リン酸化、単リン酸化、および多リン酸化ＡＫＴ２を表す。
【図７Ｂ】抗ＭＥＫ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号９１２５、１：５０の希釈）でプローブした、ヒト腎臓がんおよびヒト正常腎臓からの組織タンパク質可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。ＭＥＫ２の異なる荷電のアイソフォームが特定され、これらは、おそらく非リン酸化およびリン酸化ＭＥＫ２を表す。
【図７Ｃ】外科手術中にインビボで、外科腫瘍除去後に再度エクスビボで生検し、抗汎ＥＲＫ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０６−１８２、１：３００の希釈）でプローブした、ヒト腎臓がんからの組織タンパク質可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。全体的なＥＲＫリン酸化プロファイルは、優勢なＥＲＫアイソフォームである非リン酸化ＥＲＫ２（ＥＲＫ２）および単リン酸化ＥＲＫ２（ｐＥＲＫ２）の両方の組織試料中で類似している。
【図７Ｄ】ヒト腎臓がん患者からの血液から単離した細胞からの全細胞可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。細胞を、外科腎臓腫瘍除去の日に採取した血液から、および外科手術後１日目に採取した血液から再度単離した。細胞を培養し、ＶｉｔａＡｓｓａｙプレート上で拡大し、可溶化液を抗汎ＥＲＫ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０６−１８２、１：３００の希釈）でプローブした。
【図７Ｅ】ヒト非小細胞肺がん患者からの血液から単離した細胞からの全細胞可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。細胞を、放射線治療開始の日に採取した血液から、および放射線治療開始の３日目に採取した血液から再度単離した。細胞を培養し、ＶｉｔａＡｓｓａｙプレート上で拡大し、可溶化液を抗ＰＲＤＸ６抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号７３３５０）でプローブした。異なる電荷の複数のＰＲＤＸ６アイソフォームが特定され、プロファイルは、処置前および処置後で異なる。
【図８Ａ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大し、カボザンチニブまたはビヒクル（陰性対照）のいずれかで２日間処置した、ヒトリンパ腫組織からの全細胞可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。組織タンパク質可溶化液を、抗汎ＥＲＫ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢＳ４４、１：５０の希釈）でプローブした。
【図８Ｂ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大し、カボザンチニブまたはビヒクル（陰性対照）のいずれかで２日間処置した、ヒトリンパ腫組織からの全細胞可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。組織タンパク質可溶化液を、抗ＡＫＴ３抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０７−３８３、１：５０の希釈）でプローブした。
【図８Ｃ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒトリンパ腫組織からの全細胞可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。組織タンパク質可溶化液を、ＡＫＴ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ１７７５、１：５０の希釈）、ＡＫＴ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＤ６Ｇ４、カタログ番号３０６３、１：５０の希釈）、およびＡＫＴ３（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０７−３８３、１：５０の希釈）に特異的な抗体でプローブし、各ＡＫＴアイソフォームの差動的な荷電（おそらくリン酸化）のアイソフォームを特定した。
【図８Ｄ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒトリンパ腫組織からの全細胞可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。組織タンパク質可溶化液を、おそらくタンパク質の異なるリン酸化状態を表すｐ７０  Ｓ６キナーゼ１の２つの異なる荷電のアイソフォームを特定する抗ｐ７０Ｓ６Ｋ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＨ−８、カタログ番号ｓｃ−８４１８、１：５０の希釈）でプローブした。
【図８Ｅ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒトリンパ腫組織からの全細胞可溶化液のＮＩＡ電荷分離を示す。組織タンパク質可溶化液を、リン酸化Ｓ６タンパク質の３つの異なる荷電のアイソフォームを特定する抗ホスホＳ６抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＤ６８Ｆ８、カタログ番号５３６４、１：５０の希釈）でプローブした。
【図８Ｆ】ＮＩＡ電荷アッセイによって定量化した相対的ＥＲＫホスホアイソフォーム存在量を示す。ヒトリンパ腫を、患者からの異種移植片（ＣＤＸ第１世代）としてマウスにおいて拡大し、第２世代ＰＤＸマウスのコホート（ＣＤＸ第２世代）に継代培養した。次いで、第２世代ＰＤＸマウスを、カボザンチニブ、アキシチニブ、またはビヒクル（陰性対照）のいずれかで２日間処置し、次いで組織を収集し、タンパク質可溶化液をＮＩＡ電荷アッセイによって分離し、抗汎ＥＲＫ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢＳ４４、１：５０の希釈）でプローブした。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の各ホスホアイソフォームの相対的存在量をそれぞれ、総ＥＲＫ１またはＥＲＫ２の画分として定量化した。誤差バーは３つの技術的複製にわたる平均の標準誤差である。
【図８Ｇ】ＮＩＡ電荷アッセイによって定量化したホスホ−ＥＲＫ発現レベルを示す。患者からの異種移植片（前のスライドと同じ試料）としてマウスにおいて拡大したヒトリンパ腫におけるＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化アイソフォームの定量的ＥＲＫ測定値（「正規化面積」）を、ＨＳＰ７０（「ハウスキーピング」遺伝子、抗体：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＷ２７、カタログ番号ｓｃ−２４、１：５００の希釈）に正規化した。誤差バーは３つの技術的複製にわたる平均の標準誤差である。
【図８Ｈ】ＮＩＡ電荷アッセイによって定量化した総ＥＲＫ発現レベルを示す。患者からの異種移植片（前のスライドと同じ試料）としてマウスにおいて拡大したヒトリンパ腫におけるＥＲＫ１およびＥＲＫ２の総量の定量的ＥＲＫ測定値（「正規化面積」）を、ＨＳＰ７０（「ハウスキーピング」遺伝子、抗体：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＷ２７、カタログ番号ｓｃ−２４、１：５００の希釈）に正規化した。誤差バーは３つの技術的複製にわたる平均の標準誤差である。
【図９Ａ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）からのタンパク質可溶化液のＮＩＡサイズ分離による切断ＰＡＲＰ−１（アポトーシスマーカー）の検出を示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗ｃｌ．ＰＡＲＰ−１抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢＣ２６、１：１００の希釈）でプローブした。Ｋ５６２は、未処置の細胞株対照（陰性対照）、または２９時間にわたって１０μＭのイマチニブで処置した細胞株対照（＋ｉｍａｔ．、陽性対照）である。
【図９Ｂ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）からのタンパク質可溶化液のＮＩＡサイズ分離によるＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原、細胞周期のＳ／Ｇ２相にある増殖細胞のマーカー）の検出を示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗ＰＣＮＡ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＰＣ１０、カタログ番号２５８６、１：５０の希釈）でプローブした。Ｋ５６２は、未処置の細胞株対照（陽性対照）、または２９時間にわたって１０μＭのイマチニブで処置した細胞株対照（＋ｉｍａｔ．、陰性対照）である。
【図９Ｃ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）からのタンパク質可溶化液のＮＩＡサイズ分離によるサイクリンＤ１（細胞周期のＧ１相にある増殖細胞のマーカー）の検出を示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗サイクリンＤ１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、クローンＳＰ４、カタログ番号ＲＭ−９１０４−Ｓ０）でプローブした。Ｋ５６２は、未処置の細胞株対照、または２９時間にわたって１０μＭのイマチニブで処置した細胞株対照（＋ｉｍａｔ．）である。
【図９Ｄ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）中のＮＩＡ電荷アッセイによって定量化したＥＲＫホスホアイソフォームの発現レベルを示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗汎ＥＲＫ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢＳ４４、１：５０の希釈）でプローブした。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の各ホスホアイソフォームの発現レベルを、ＨＳＰ７０（「ハウスキーピング」遺伝子、抗体：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＷ２７、カタログ番号ｓｃ−２４、１：５００の希釈）への正規化によって定量化した。誤差バーは３つの技術的複製にわたる平均の標準誤差である。
【図９Ｅ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）中のＮＩＡ電荷アッセイによって定量化したＥＲＫホスホアイソフォームの相対的存在量を示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗汎ＥＲＫ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢＳ４４、１：５０の希釈）でプローブした。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の各リンアイソフォームの相対的存在量をそれぞれ、総ＥＲＫ１またはＥＲＫ２の画分として定量化した。誤差バーは３つの技術的複製にわたる平均の標準誤差である。
【図９Ｆ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）中のＮＩＡサイズアッセイによって定量化した切断型ＰＡＲＰ−１（アポトーシスマーカー）の発現レベルを示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗ｃｌ．ＰＡＲＰ−１抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢＣ２６、１：１００の希釈）でプローブし、発現レベルを、チューブリン（「ハウスキーピング」遺伝子）への正規化によって定量化した。Ｋ５６２は、未処置の細胞株対照（陰性対照）、または２９時間にわたって１０μＭのイマチニブで処置した細胞株対照（＋ｉｍａｔ．、陽性対照）である。
【図９Ｇ】患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）中のＮＩＡサイズアッセイによって定量化したＰＣＮＡおよびサイクリンＤ１（増殖マーカー）の発現レベルを示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗ＰＣＮＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＰＣ１０、カタログ番号２５８６、１：５０の希釈）または抗サイクリンＤ１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、クローンＳＰ４、カタログ番号ＲＭ−９１０４−Ｓ０）でプローブし、発現レベルを、チューブリン（「ハウスキーピング」遺伝子）への正規化によって定量化した。Ｋ５６２は、未処置の細胞株対照（陽性対照）、または２９時間にわたって１０μＭのイマチニブで処置した細胞株対照（＋ｉｍａｔ．、陰性対照）である。ＮＩＡを使用して、エクスビボで処置したヒトがん組織中のアポトーシスおよび増殖マーカーのパネルを測定して、薬物がどのように機能するか、または機能しないかを比較することができる。トラメチニブは、細胞周期増殖を減少させ（ＰＣＮＡ）、アポトーシスを変化させなかった（切断型ＰＡＲＰ−１）が、ＷＷペプチドは、アポトーシスおよび細胞周期の増加（ＰＣＮＡ）の両方を誘導した。
【図１０Ａ】ＭＹＣ不活性化は、Ｔ−ＡＬＬ４１８８細胞株内のｐＥｒｋ１、ｐｐＥｒｋ２、およびＥｒｋ２レベルを増加させる。Ｔ−ＡＬＬマウスからの細胞株４１８８（緑色）内のテトラサイクリンの処置による２４時間のＭＹＣ不活性化は、高ＭＹＣ（青色）と比較して、ＮＩＡ電荷アッセイによって検出して、ホスホ−Ｅｒｋ変化を示す。
【図１０Ｂ】ＭＹＣ不活性化は、バーキットＰ４９３−６細胞株内のＥｒｋ１レベルを減少させる。ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｐ４９３−６（緑色）内のテトラサイクリンの処置による２４時間のＭＹＣ不活性化は、高ＭＹＣ（青色）およびＨｅｌａ細胞（灰色）と比較して、Ｎａｎｏ  Ｉｍｍｕｎｏサイズアッセイによって検出して、ＭＹＣ不活性化時のＥｒｋ１の減少を示す。
【図１１】ＮＩＡを使用して、薬物標的ＰＤＬ１およびＶＥＧＦＲ２を測定することができる。左：ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞株（陽性対照、「＋」）およびＲＣＣ−４細胞株（陰性対照、「−」）を、抗ヒトＰＤＬ１抗体（Ａｂｃａｍ、クローン２８−８、カタログ番号ａｂ２０５９２１、１：５０の希釈）でＰＤ−Ｌ１についてプローブした。ＰＤ−Ｌ１は、陽性対照細胞株内で特異的に検出される。右：ＴＩＭＥ（ＶＥＧＦＲ２の強発現、「＋」）およびＲＣＣ−４細胞株（ＶＥＧＦＲ２の弱発現、「−」）を、抗ヒトＶＥＧＦＲ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローン５５Ｂ１１、カタログ番号２４７９、１：５０の希釈）でＶＥＧＦＲ２についてプローブした。ＲＣＣ−４と比較して、ＴＩＭＥ細胞内でより高いレベルのＶＥＧＦＲ２が検出される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、および試薬は、異なり得るため、本発明は、それらに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないこともまた理解されたい。
【００１４】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段文脈が明示的に示さない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、複数のそのような化合物を含み、「薬剤」への言及は、１つ以上の薬剤および当業者に既知のそれらの等価物への言及を含む、などである。本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、別段明示的に示されない限り、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００１５】
ＮＩＡ。いくつかの実施形態では、がんの連続分析を含むナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）のための方法が提供される。ＮＩＡ検出は、特にリン酸化において異なるタンパク質アイソフォームを含む限られた臨床検体における腫瘍性タンパク質発現および活性化を正確に測定する。ＮＩＡ検出方法は、等電タンパク質電気泳動と、ナノ流体系中の抗体検出とを組み合わせる。タンパク質のアイソフォームを含むタンパク質は、ＮＩＡ等電電気泳動またはサイズ分離によって検出することができる。
【００１６】
試料は、単一の時点で採取されても、複数の時点で採取（例えば、少なくとも２つの時点から採取）されてもよい。試料は、１００，０００個の細胞、５０００個の細胞、１０００個の細胞、５００個の細胞、１００個の細胞、５０個以下の細胞ほど小さくあってもよい。いくつかの実施形態では、試料は、５００個未満の細胞、４００個の細胞、３００個の細胞、２００個の細胞、１００個の細胞、９０個の細胞、８０個の細胞、７０個の細胞、６０個の細胞、５０個の細胞、４０個の細胞、３０個の細胞、２０個の細胞、または１０個の細胞などの、１０００個未満の細胞である。いくつかの実施形態では、試料は、細針吸引液（ＦＮＡ）である。ＦＮＡは、医師の裁量で実行される。この手順は、小ゲージ針、通常２１〜２５ゲージ針を腫瘤に挿入して、顕微鏡評価のために細胞試料を除去することを伴う。この手順は、最小の負圧を印加しながら、１つ以上のミシンのような可動域を使用することによって実行されるべきである。いくつかの実施形態では、０．５ｃｃ以下の吸引が必要とされる。
【００１７】
患者に関する「試料」という用語は、血液および生物学的起源の他の液体試料、生検検体などの固体組織試料、または組織培養物もしくはそれらに由来する細胞およびそれらの子孫を包含する。この定義には、試薬での処置、洗浄、またはがん細胞などの特定の細胞集団の濃縮などによって、調達後に任意の方法で操作された試料もまた含まれる。この定義には、特定の種類の分子、例えば、核酸、ポリペプチドなどについて濃縮された試料もまた含まれる。「生体試料」という用語は、臨床試料を包含し、外科切除によって得られる組織、生検によって得られる組織、培養物中の細胞、細胞上清、細胞可溶化液、組織試料、器官、骨髄、血液、血漿、血清などもまた含む。「生体試料」は、患者のがん細胞から得られる試料、例えば、患者のがん細胞から得られるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む試料（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む細胞可溶化液または他の細胞抽出物）、ならびに患者からのがん細胞を含む試料を含む。患者からのがん細胞を含む生体試料はまた、非がん細胞も含むことができる。
【００１８】
生検試料。生検試料、および特に細針吸引液（ＦＮＡ）は、約４℃および最大室温まで上げて、例えば、患者から得た後に約２５℃で、最大３日、最大２日、最大１日、最大１２時間、最大６時間の期間にわたって維持することができる。試料は、細胞または赤血球の溶解なしで維持することができる。試料、またはその可溶化液は、約−８０℃での凍結保管時に長期間にわたって安定している。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、分析は、以前に凍結された試料に対して実行される。
【００１９】
関心対象の薬剤または状態に曝露した後の細胞であり得る細胞は、分析前に溶解される。超音波処理、非イオン性界面活性剤などを含む溶解方法が、当該技術分野で既知である。非イオン性界面活性剤には、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）洗剤ファミリー、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−３５、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１６５などが含まれる。Ｂｒｉｊ（商標）洗剤もまた、疎水性鎖に結合した異なる長さのポリオキシエチレン鎖を有するという点で、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ洗剤と構造が類似している。Ｔｗｅｅｎ（商標）洗剤は、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステルである非変性非イオン性洗剤である。Ｔｗｅｅｎ（商標）８０は、Ｃ１８鎖を有するオレイン酸に由来する一方で、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０は、Ｃ１２鎖を有するラウリン酸に由来する。双性イオン性洗剤であるＣＨＡＰＳは、コリン酸のスルホベタイン誘導体である。ＢＩＣＩＮＥ（ジエチロルグリシン）は、ＣＨＡＰＳで製剤化され得る双性イオン性アミノ酸緩衝液である。この双性イオン性洗剤および緩衝液は、タンパク質活性が重要である場合の膜タンパク質可溶化に有用である。界面活性剤は、細胞を溶解し、系から追加の接着細胞を除去するために十分な期間にわたって、細胞と接触される。
【００２０】
細胞分画の方法もまた、当該技術分野で既知である。細胞内分画は、２つの主要なステップ、つまり細胞組織化の破壊（溶解）と、小器官の異なる集団を分離するためのホモジネートの分画とからなる。そのようなホモジネートは、次いで（１）核、重ミトコンドリア、細胞骨格ネットワーク、および細胞膜と、（２）軽ミトコンドリア、リソソーム、およびペルオキシソームと、（３）ゴルジ装置、エンドソームおよびマイクロソーム、ならびに小胞体（ＥＲ）と、（４）サイトゾルとを主に含有するいくつかの画分へと、分画遠心分離によって分解することができる。小器官の各集団は、サイズ、密度、電荷、および分離が依存する他の特性によって特徴付けられる。
【００２１】
等電電気泳動またはサイズ分離されたタンパク質は、特定の結合部材に結合する。相対比測定のために、タンパク質の全てのアイソフォームを認識する単一の汎特異的抗体、例えば、汎特異的抗体などを使用してもよい。タンパク質、例えば、ＥＲＫ２、Ｅｒｋ１などの総量を判定し、ＮＩＡを使用して、リン酸化されているパーセントを計算する。ＮＩＡはピークを生成し、ピーク開始時および終了時にベースラインに垂直線を落とし、開始点と終了点との間の面積を合計することによって、各ピークの面積を計算する。正規化された値を測定するためには、類似のプロセスが使用されるが、加えて、アッセイは、関心対象のタンパク質のための抗体、例えば、汎特異的抗体、および正規化のためのローディング対照抗体、例えば、ＨＳＰ−７０抗体、チューブリンなどを利用する。ＮＩＡを利用して、異なるアイソフォームを判別する。
【００２２】
比較は、腫瘍組織であることが疑われる組織と、対となる正常または腫瘍上対照組織、例えば、疑われる腫瘍試料対隣接する非腫瘍皮膚試料などとの間で実行され得る。比較はまた、参照腫瘍組織を用いて、（例えば、処置前後の）時系列の試料などを用いて、実行されてもよい。比は、非腫瘍／腫瘍であっても、腫瘍／非腫瘍であってもよい。いくつかの実施形態では、比は、腫瘍または正常組織の単一の測定値よりも予測的または診断的なバイオマーカーを提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＮＩＡを使用して、リン酸化の変化を監視する。リン酸化の大部分は、タンパク質の生物学的活性を制御するための機構として生じるため、一過性である。動物細胞内では、セリン、スレオニン、およびチロシンは、リン酸化の関心対象のアミノ酸である。最大のキナーゼ群は、セリンまたはスレオニンのいずれかをリン酸化するものであるため、セリン／スレオニンキナーゼと称される。３つの異なるアミノ酸のリン酸化の比は、セリン／スレオニン／チロシンについて約１０００／１００／１である。チロシンリン酸化のレベルはわずかであるが、このアミノ酸のリン酸化の重要性は大きなものである。一例として、多数の成長因子受容体の活性は、チロシンリン酸化によって制御される。
【００２４】
本発明の目的のための「患者」は、ヒトおよび他の動物、特に哺乳動物（ペットおよび実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギなどを含む）の両方を含む。したがって、本方法は、ヒト治療および獣医学的用途の両方に適用可能である。一実施形態では、患者は、哺乳動物、好ましくは霊長類である。他の実施形態では、患者は、ヒトである。
【００２５】
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、治療のために評価される哺乳動物、および／または治療される哺乳動物を指すように、本明細書においては同義的に使用される。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、がんを有する個体を非限定的に包含する。対象は、ヒトであり得るが、他の哺乳動物、特にヒト疾患のための実験モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラットなどもまた含む。
【００２６】
「がん」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は、無制御の自律成長を示すことで、細胞増殖に対する制御の有意な喪失を特徴とする異常な成長表現型を示す細胞を指すように、本明細書においては同義的に使用される。本出願における検出、分析、または処置の関心対象の細胞には、前がん性（例えば、良性）、悪性、転移前、転移性、および非転移性細胞が含まれる。実質的に全ての組織のがんが、既知である。「がん負荷」という語句は、対象におけるがん細胞の量子またはがん体積を指す。したがって、がん負荷の低減は、対象におけるがん細胞の数またはがん体積の低減を指す。本明細書で使用される場合、「がん細胞」という用語は、がん細胞であるか、またはがん細胞に由来する（例えば、がん細胞のクローン）任意の細胞を指す。細胞腫、肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、骨髄腫などの固形腫瘍、および白血病などの循環がんを含む、多くの種類のがんが、当業者に既知である。がんの例には、卵巣がん、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、肝細胞がん、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、甲状腺がん、腎臓がん、細胞腫、黒色腫、頭頸部がん、および脳がんが非限定的に含まれる。
【００２７】
がんの「病理」には、患者の幸福を損なう全ての現象が含まれる。これには、異常または制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症または免疫学的応答の抑制または悪化、腫瘍、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、リンパ節などの周囲または遠隔の組織または器官の浸潤などが非限定的に含まれる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「がん再発」および「腫瘍再発」という用語、ならびにそれらの文法的変形は、がんの診断後の新生物細胞またはがん性細胞のさらなる成長を指す。特に、再発は、がん性組織中でさらなるがん性細胞成長が発生するときに生じ得る。「腫瘍伝播」は、同様に、腫瘍の細胞が局所または遠隔の組織および器官に汎発するときに生じ、したがって腫瘍伝播は、腫瘍転移を包含する。「腫瘍浸潤」は、腫瘍成長が局所的に伝播して、正常な器官機能の圧迫、破壊、または予防によって関与する組織の機能を損なうときに生じる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「転移」という用語は、元のがん性腫瘍の器官に直接は接続されていない器官または身体部分におけるがん性腫瘍の成長を指す。転移は、元のがん性腫瘍の器官に直接は接続されていない器官または身体部分における検出不能な量のがん性細胞の存在である、微小転移を含むと理解される。転移はまた、元の腫瘍部位からのがん細胞の出発、ならびに身体の他の部分へのがん細胞の移入および／または浸潤などの、プロセスのいくつかのステップとしても定義することができる。
【００３０】
「診断」という用語は、本明細書では、乳がん、前立腺がん、または他の種類のがんの分子亜型の特定などの、分子もしくは病理学的状態、疾患、または病態の特定を指すために使用される。
【００３１】
「予後診断」という用語は、本明細書では、卵巣がんなどの新生物疾患の再発、転移伝播、および薬物耐性を含む、がんに起因する死亡または進行の可能性の予測を指すために使用される。「予測」という用語は、本明細書では、観察、経験、または科学的推理に基づいて、予告または推定する行為を指すために使用される。一例では、医師は、原発性腫瘍の外科除去および／または化学治療の後に、がんが再発することなく患者が一定期間にわたって生存する可能性を予測することができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「処置すること」、「処置する」などという用語は、効果を得る目的で、薬剤を投与すること、または手順を実施することを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防することに関して予防的であってもよく、かつ／または疾患および／もしくはその疾患の症状の部分的もしくは完全な治癒をもたらすことに関して治療的であってもよい。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける腫瘍の処置を含むことができ、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有するとは診断されていない（例えば、原因疾患に関連し得るか、またはそれによって引き起こされる疾患を含む）対象において疾患または疾患の症状が生じることを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を抑止すること、および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００３３】
治療は、緩解、寛解、症状の減少もしくは疾患病態を患者にとってより許容できるようにすること、変性もしくは低下速度の減速、または最終的な変性点をより衰弱なものすることなどの任意の客観的または主観的パラメータを含む、がんの治療または寛解または予防における成功の任意の指標を指し得る。症状の治療または寛解は、医師による検査の結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。したがって、「治療する」という用語は、本発明の化合物または薬剤を投与して、がんまたは他の疾患に関連する症状または病態の発症を、予防もしくは遅延、緩和、または抑止もしくは阻害することを含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の低減、排除、または予防を指す。
【００３４】
新生物疾患の治療において有用であると当該技術分野で特定されている治療剤の例には、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ、Ａｄｒｕｃｉｌ、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アントラサイクリン、アザシチジン、アザチオプリン、ＢｉＣＮＵ、Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ、ブスルファン、ブレオマイシン、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ、シタラビン、Ｃｙｔｏｓａｒ、シクロホスファミド、Ｃｙｔｏｘａｎ、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、Ｅｌｌｅｎｃｅ、Ｅｌｓｐａｒ、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、Ｆｌｕｄａｒａ、ゲムシタビン、Ｇｅｍｚａｒ、Ｈｙｃａｍｔｉｎ、ヒドロキシ尿素、Ｈｙｄｒｅａ、Ｉｄａｍｙｃｉｎ、イダルビシン、イホスファミド、Ｉｆｅｘ、イリノテカン、Ｌａｎｖｉｓ、Ｌｅｕｋｅｒａｎ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ、Ｍａｔｕｌａｎｅ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ、Ｍｙｌｅｒａｎ、Ｍｙｌｏｓａｒ、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ、Ｎｉｐｅｎｔ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ、Ｏｎｃｏｖｉｎ、オキサリプラチン、パクリタキセル、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ、ペントスタチン、Ｐｌａｔｉｎｏｌ、プリカマイシン、プロカルバジン、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ、Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ、Ｔａｘｏｔｅｒｅ、Ｔａｘｏｌ、テニポシド、チオグアニン、Ｔｏｍｕｄｅｘ、トポテカン、バルルビシン、Ｖｅｌｂａｎ、Ｖｅｐｅｓｉｄ、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、およびＶｕｍｏｎが非限定的に含まれる。
【００３５】
標的治療薬には、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ、ＳＴＩ−５７１としても知られる）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ、ＺＤ１８３９としても知られる）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａとして市販）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）、およびボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、Ｊａｋａｆｉ（ルキソリチニブ）などのチロシンキナーゼ阻害剤、トファシチニブなどのヤヌスキナーゼ阻害剤、クリゾチニブなどのＡＬＫ阻害剤、オバトクラクス、ベネクレクスタ、およびゴシポールなどのＢｃｌ−２阻害剤、ミドスタウリン（Ｒｙｄａｐｔ）などのＦＬＴ３阻害剤、ＡＧ−２２１などのＩＤＨ阻害剤、イニパリブおよびオラパリブなどのＰＡＲＰ阻害剤、ペリフォシンなどのＰＩ３Ｋ阻害剤、アパチニブなどのＶＥＧＦ受容体２阻害剤、［Ｄ−Ｌｙｓ（６）］−ＬＨＲＨに連結したＡＮ−１５２（ＡＥＺＳ−１０８）ドキソルビシン、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、およびＬＧＸ８１８などのＢｒａｆ阻害剤、トラメチニブなどのＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−０３３２９９１およびＬＥＥ０１１などのＣＤＫ阻害剤、サリノマイシンなどのＨｓｐ９０阻害剤、ならびに／またはビンタフォリドなどの小分子薬物コンジュゲー、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）、トラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ）、およびダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ）などのセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤が含まれ得る。
【００３６】
新生物疾患の処置において有用であると当該技術分野で特定される生物学的薬剤の例には、ＩＬ−１２、ＩＮＦα、または抗上皮成長因子受容体、放射線治療、イリノテカンなどのサイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、ペメトレキセドなどのテトラヒドロ葉酸抗代謝産物、腫瘍抗原に対する抗体、モノクローナル抗体および毒素の複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、もしくは抗原提示細胞（例えば、樹状細胞治療）、抗腫瘍ワクチン、複製能ウイルス、シグナル伝達阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）もしくはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、または腫瘍成長の付加的もしくは相乗的抑制を達成するための免疫調節剤、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、ステロイド、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標））、インターフェロン−β１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））、およびインターフェロン−β１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））、ならびに当業者によって容易に理解される既知の化学療法治療レジメンで実施される前述のものの１つ以上の組み合わせが非限定的に含まれる。
【００３７】
腫瘍特異的モノクローナル抗体には、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａまたはＲｉｔｕｘａｎとして市販）、アレムツズマブ、パニツムマブ、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）などが非限定的に含まれ得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、処置は、免疫チェックポイント治療を含む。免疫チェックポイント治療の例には、ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への結合の阻害剤が含まれる。ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への阻害剤は、当該技術分野で周知である。ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への結合に干渉する市販のモノクローナル抗体の例には、ニボルマブ（ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ＮＪから市販されているＯｐｄｉｖｏ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６）、ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ  ＮＪから市販されているＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）ＭＫ−３４７５、ランブロリズマブ）、およびアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）が含まれる。ＰＤ１阻害抗体の追加の例には、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ１１０５、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ならびにＳＨＲ−１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ）が含まれるが、これらに限定されない。追加の抗体ＰＤ１経路阻害剤は、２０１２年７月１０日に発行された米国特許第８，２１７，１４９号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）、２０１２年５月１日に発行された米国特許第８，１６８，７５７号（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．）、２０１１年８月３０日に発行された米国特許第８，００８，４４９号（Ｍｅｄａｒｅｘ）、２０１１年５月１７日に発行された米国特許第７，９４３，７４３号（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ）に記載されている。加えて、低分子ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への阻害剤は、当該技術分野で既知である。例えば、ＳａｓｉｋｕｍａｒらのＷＯ２０１６／１４２８３３Ａ１、ＳａｓｉｋｕｍａｒらのＷＯ２０１６／１４２８８６Ａ２、ＢＭＳ−１１６６およびＢＭＳ−１００１（Ｓｋａｌｎｉａｋ，ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ８（４２）：７２１６７−７２１８１）を参照されたい。
【００３９】
特に関心対象となるのは、中でも特に甲状腺髄様がんの処置、および腎細胞がんの第２選択処置に使用される薬物であるＣａｂｏｍｅｔｙｘおよびＣｏｍｅｔｒｉｑという商品名で販売されるカボザンチニブを含み得る、標的治療薬である。それは、チロシンキナーゼｃ−ＭｅｔおよびＶＥＧＦＲ２の小分子阻害剤であり、ＡＸＬおよびＲＥＴもまた阻害する。アキシチニブは、Ｐｆｉｚｅｒによって開発された小分子チロシンキナーゼ阻害剤である。それは、動物（異種移植片）モデルにおいて乳がんの成長を有意に阻害することが示されており、腎細胞がん（ＲＣＣ）およびいくつかの他の腫瘍型を用いた臨床試験において部分応答を示している。トラメチニブは、抗がん活性を有するＭＥＫ阻害剤薬物である。それは、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を阻害する。トラメチニブは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を保有する転移性黒色腫について良好な結果を有した。リゴセルチブは、ＲＡＳエフェクター経路を標的とすることによって細胞シグナル伝達を遮断すると考えられている小分子剤である。
【００４０】
特定の実施形態では、「と組み合わせて」、「組み合わせ治療」、および「組み合わせ生成物」は、第１の治療薬および本明細書で使用される化合物の患者への同時投与を指す。組み合わせで投与される場合、各構成要素は、異なる時点で任意の順序で、同時にまたは順次投与され得る。したがって、各構成要素は、所望の治療効果をもたらすために、別個にではあるが時間的に十分に密接して投与され得る。
【００４１】
がん治療薬、免疫腫瘍剤、腫瘍指向性抗体などと、別の薬剤とを組み合わせた「併用投与」とは、本発明の薬物、抗体、および組成物の両方が治療効果を有するような時間での投与を意味する。そのような同時投与は、薬物、または本発明の化合物の投与に関する抗体の同時発生的な（すなわち、同時の）、事前、または後続する投与を伴い得る。当業者であれば、本発明の特定の薬物および組成物の適切な投与タイミング、順序、および投与量を判定することは困難ではない。
【００４２】
本明細書で使用される場合、処置のエンドポイントには、当該技術分野で既知であり、かつ食品医薬品局によって使用される意味が与えられる。
【００４３】
全生存期間は、ランダム化から任意の原因による死亡までの時間として定義され、処置企図集団において測定される。生存期間は、最も信頼性が高いがんエンドポイントと見なされ、研究を実施して、生存期間を十分に評価することができる場合、それが通常、好ましいエンドポイントとなる。このエンドポイントは、死亡日時によって記述され、正確で測定が容易である。バイアスは、エンドポイント測定の要因ではない。生存期間の改善を危険度−利益分析として分析して、臨床的利益を評価するべきである。全生存期間は、ランダム化対照研究で評価することができる。毒性プロファイルが許容される場合、全生存期間における統計学的に有意な改善の実証は、臨床的に有意であると見なすことができ、しばしば新薬承認を支持している。本発明の方法の利益には、患者の全生存期間の増加が含まれ得る。
【００４４】
腫瘍評価に基づくエンドポイントには、ＤＦＳ、ＯＲＲ、ＴＴＰ、ＰＦＳ、および処置成功期間（ＴＴＦ）が含まれる。これらの時間依存的エンドポイントに関するデータの収集および分析は、間接的な評価、計算、および推定（例えば、腫瘍測定値）に基づく。無病生存期間（ＤＦＳ）は、ランダム化から任意の原因による腫瘍の再発または死亡までの時間として定義される。このエンドポイントの最も頻繁な使用は、根治外科手術または放射線治療後のアジュバント設定におけるものである。ＤＦＳはまた、大きなパーセンテージの患者が化学治療で完全奏効を達成した場合、重要なエンドポイントでもあり得る。
【００４５】
客観的奏効率（ＯＲＲ）。ＯＲＲは、所定量の、かつ最短期間にわたる腫瘍サイズの低減を有する患者の割合であると定義される。応答持続時間は通常、初期応答の時点から記述された腫瘍進行まで測定される。一般に、ＦＤＡは、ＯＲＲを部分奏効と完全奏効との合計として定義している。この様式で定義される場合、ＯＲＲは、単一群研究で評価され得る薬物抗腫瘍活性の直接的な尺度である。
【００４６】
無増悪期間（ＴＴＰ）および無増悪生存期間（ＰＦＳ）。ＴＴＰおよびＰＦＳは、薬剤承認の主要エンドポイントとして機能している。ＴＴＰは、ランダム化から客観的な腫瘍進行までの時間として定義され、ＴＴＰは、死亡を含まない。ＰＦＳは、ランダム化から客観的な腫瘍進行または死亡までの時間として定義される。腫瘍進行の正確な定義が、重要であり、プロトコルにおいて慎重に詳述されるべきである。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「相関する」または「と相関する」などの用語は、２つの事象の実例間の統計学的関連性を指し、事象には、数、データセットなどが含まれる。例えば、事象が数に関与する場合、正の相関（本明細書では「直接相関」とも称される）は、一方が増加するにつれて、他方もまた増加することを意味する。負の相関（本明細書では「逆相関」とも称される）は、一方が増加するにつれて、他方が減少することを意味する。
【００４８】
「投薬単位」は、処置される特定の個体の単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果（複数可）を生成するように計算された所定量の活性化合物（複数可）を含有することができる。投薬単位の仕様は、（ａ）活性化合物（複数可）の特有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果（複数可）、ならびに（ｂ）そのような活性化合物（複数可）の調合の当該技術分野において固有の制限によって指示され得る。
【００４９】
「薬学的に許容される賦形剤」は、一般に安全、無毒性、かつ望ましい薬学的組成物の調製に有用な賦形剤を意味し、獣医学的使用およびヒト薬学的使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合、気体であってもよい。
【００５０】
「薬学的に許容される塩およびエステル」は、薬学的に許容され、かつ所望の薬理学的特性を有する塩およびエステルを意味する。そのような塩には、化合物中に存在する酸性陽子が無機塩基または有機塩基と反応することができる場合に形成され得る塩が含まれる。好適な無機塩には、アルカリ金属、例えば、ナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウム、ならびにアルミニウムで形成されるものが含まれる。好適な有機塩には、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎメチルグルカミンなどの有機塩基で形成されるものが含まれる。そのような塩はまた、無機酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）ならびに有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにアルカンスルホン酸およびアレーンスルホン酸（メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸など））で形成される酸付加塩も含む。薬学的に許容されるエステルには、化合物中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシ、およびホスホノキシ基から形成されるエステル、例えば、Ｃ１−６アルキルエステルが含まれる。２つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩またはエステルは、一酸−単塩もしくはエステル、または二塩もしくはエステルであってもよく、同様に、３つ以上の酸性基が存在する場合、そのような基の一部または全部が、塩化またはエステル化されてもよい。本発明で命名される化合物は、非塩化もしくは非ステル化形態、または塩化および／またはエステル化形態で存在することができ、そのような化合物の命名は、元の（非塩化および非ステル化）化合物、ならびにその薬学的に許容される塩およびエステルの両方を含むことが意図される。また、本発明で命名される特定の化合物は、２つ以上の立体異性体形態で存在してもよく、そのような化合物の命名は、そのような立体異性体の全ての単一の立体異性体および全ての混合物（ラセミであるか否かに関わらず）を含むことが意図される。
【００５１】
「薬学的に許容される」、「生理学的に許容される」という用語、およびそれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤、および試薬を指す場合、同義的に使用され、材料が、その組成物の投与を禁止する程度の望ましくない生理学的効果を生成することなく、ヒトに対して投与することができることを表す。
【００５２】
「治療有効量」とは、疾患の治療のために対象に投与されるときに、その疾患の治療をもたらすために十分である量を意味する。
【００５３】
方法
原発性または転移性がんの分析、診断、および治療、またはその成長の低減のための方法が提供される。がん細胞は、異なるアイソフォーム、例えば、タンパク質のリン酸化形態のパターンを含む、細胞内に存在するタンパク質の特定のパターンを検出することによって、正常な対応する組織と区別することができる。そのようなタンパク質は、細胞成長、複製、転移などを制御するシグナル伝達経路の構成要素であり得る。
【００５４】
個体は、がん細胞の表現型を判定することによって、治療のために監視されてもよく、かつ／または治療のために選択されてもよい。一実施形態では、ナノ流体プロテオミックイムノアッセイ（ＮＩＡ）を適用して、腫瘍からの少量の可溶化液中のホスホアイソフォームを定量化する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、アイソフォームの特定の変化は、治療剤に対する応答と相関する。評価応答性は、疾患の初期段階で、治療作用が必要とされ得る場所を示すことによって、ケアの改善を可能にする。個体を分析し、治療に対して応答性であることが見出された場合、処置を継続しても、患者を好適な応答の後に回復させてもよい。個体を治療し、応答性ではないことが見出された場合、代替治療が施される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、個体は、治療用量の薬剤、例えば、がん化学治療剤を投与することによって、治療剤に対する応答性について評価される。応答に十分な期間の後、例えば、１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、最大３週間以上、最大２週間、最大１０日、最大７日、最大５日、最大３日、最大４８時間、最大２４時間の時点で、生検試料が得られる。生検試料は、任意で凍結され、分析前に−８０℃で保管される。
【００５７】
次いで、試料は、ＮＩＡによって、関心対象のタンパク質アイソフォームについて分析される。処置された腫瘍細胞内のアイソフォーム分布のパターンを、正常細胞、参照がん細胞などと比較することができる。いくつかの実施形態では、隣接する組織試料、例えば、２つの腫瘍試料、１つの腫瘍試料および対応する正常組織などが得られる。いくつかの実施形態では、一連の腫瘍組織、例えば、単一の腫瘍から２、３、４つ以上の試料が得られる。いくつかの実施形態では、試料は、参照試料、例えば、治療に応答することが既知である細胞のアイソフォームパターンと比較される。
【００５８】
がんの治療のために療法レジメンで治療された個体を含む、経時的に個体から複数の試料を得、分析してもよい。複数の試料もまた、例えば、臨床試験の文脈で、患者コホート群にわたって得、分析してもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、アイソフォーム分布は、通常マッチさせた対照を用いて、処置前および処置後にマッチさせた試料について判定される。既知の疾患症例の試料は、時間間隔のうちのどれにアイソフォーム分布が最も強く関連するかを判定するために実行される、処置後の時間間隔およびロジスティック回帰分析に分けることができる。
【００６０】
タンパク質分布パターンは、任意の好都合なＮＩＡプロトコルを使用して、生体試料から生成することができる。読み出しは、平均値、平均、中央値、もしくは分散、または測定値に関連する他の統計学的もしくは数学的に導出された値であり得る。読み出し情報は、対応する参照または対照パターンと直接比較することによってさらに精製することができる。パターンをいくつかの点で評価して、データマトリックスの任意の時点で統計学的に有意な変化があるか、変化がアイソフォームの蔓延率の増加または減少であるかなどを判定することができる。絶対値は、生きた生物系に固有の可変性を表示する。
【００６１】
アッセイされる試料からタンパク質分布パターンを得た後、それを参照または対照プロファイルと比較して、試料が得られた／由来する患者の表現型に関する分析（例えば、個体が治療に応答性であるか）を行う。典型的には、上記の試料または試料のセットと比較を行う。加えて、参照または対照シグネチャーパターンは、応答性であることが既知である試料から得られるシグネチャーパターンであってもよく、したがって正の参照または対照プロファイルであってもよい。
【００６２】
特定の実施形態では、得られたタンパク質分布パターンを単一の参照／対照プロファイルと比較して、アッセイされる患者の表現型に関する情報を得る。さらに他の実施形態では、得られたタンパク質分布パターンを２つ以上の異なる参照／対照プロファイルと比較して、患者の表現型に関するより深い情報を得る。例えば、得られたタンパク質分布パターンを、正および負の参照プロファイルと比較して、患者が関心対象の表現型を有するかに関する確認された情報を得ることができる。
【００６３】
治療に対する応答性に関して異なる分類にある個体間で頑強に判別するアルゴリズム、ならびに交絡変数および評価する潜在的相互作用の対照が、予後診断の目的で使用される。
【００６４】
タンパク質分布パターンは、上記の方法によって判定される。次いで、このようにして得られた定量的データは、分析分類プロセスに供される。そのようなプロセスでは、生データは、アルゴリズムに従って操作され、このアルゴリズムは、例えば、本明細書に提供される実施例に記載のように、訓練データセットによって予め定義されている。アルゴリズムは、本明細書に提供される訓練データセットを利用しても、本明細書に提供されるガイドラインを利用して、異なるデータセットを有するアルゴリズムを生成してもよい。
【００６５】
分析分類プロセスは、様々な統計学的分析方法のうちのいずれか１つを使用して、定量的データを操作し、試料の分類を提供することができる。有用な方法の例には、線形判別分析、再帰特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズムなどが含まれる。これらの方法のうちのいずれか１つを使用し、タンパク質分布パターンを使用して、予測モデルを生成してもよい。そのようなモデルの生成では、対照、罹患、治療に応答性、治療に非応答性などを含むデータセットが、訓練セットとして使用され得る。訓練セットは、関心対象の１つ以上の異なるアイソフォーム分布のデータを含有する。
【００６６】
分類は、ある試料が所与のクラス、すなわち、応答性、非応答性などに属する確率を判定するための閾値を設定する予測モデリング方法に従って行うことができる。確率は、好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％以上である。分類はまた、得られたタンパク質分布パターンと参照タンパク質分布パターンとの比較が、統計学的に有意な差を生じるかを判定することによっても行うことができる。そのような比較が、参照タンパク質分布パターンと統計学的に有意差がない場合、タンパク質分布パターンが得られた試料は、参照タンパク質分布パターンクラスに属するものとして分類される。
【００６７】
あるモデルの予測能力は、それが特定の値、または様々な値の品質測定基準、例えば、ＡＵＣまたは精度を提供する能力に従って評価することができる。いくつかの実施形態では、所望の品質閾値は、試料を、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、少なくとも約０．９５、またはそれ以上の精度で分類する予測モデルである。代替的な尺度として、所望の品質閾値は、試料を、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれ以上のＡＵＣ（曲線下面積）で分類する予測モデルを指し得る。
【００６８】
当該技術分野で既知であるように、予測モデルの相対感度および特異性は、選択性測定基準または感度測定基準のいずれかに有利になるように「調整する」ことができ、これら２つの測定基準は、逆関係を有する。上記のモデルにおける制限は、実行される試験の特定の要件に応じて、選択された感度または特異性レベルを提供するように調整することができる。感度および特異性の一方または両方は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれ以上であってもよい。
【００６９】
生データは、通常、３連または複数の３連で、各マーカーの値を測定することによって最初に分析され得る。データは、操作されてもよく、例えば、生データは、標準曲線を使用して変換されてもよく、３連の測定値の平均が、各患者の平均および標準偏差の計算に使用されてもよい。これらの値は、モデルにおける使用前に変換（例えば、対数変換、ボックス・コックス変換（Ｂｏｘ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（１９６４）Ｊ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ，２６：２１１−−２４６を参照されたい）など）されてもよい。次いで、データは、試料を状態に従って分類する予測モデルに入力される。結果として生じる情報は、患者または医療従事者に送信されてもよい。
【００７０】
一実施形態では、階層クラスタリングは、予測モデルの導出において実行され、ピアソン相関が、クラスタリング測定基準として用いられる。１つのアプローチは、患者タンパク質分布パターンを「監督学習」の問題における「学習試料」として考慮することである。ＣＡＲＴは、医学への適用における標準であり（Ｓｉｎｇｅｒ（１９９９）Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、これは、あらゆる定性的特徴を定量的特徴に変換することと、それらを、ホテリングのＴ２統計の試料再使用方法によって評価される達成された有意性レベルによって選別することと、ラッソ法を好適に適用することとによって、修正することができる。予測における問題は、実際に回帰の品質を評価する上でジニ分類基準を好適に利用することによって、予測を見失うことなく回帰の問題に転じる。
【００７１】
このアプローチは、ＦｌｅｘＴｒｅｅと称されるものをもたらした（Ｈｕａｎｇ（２００４）ＰＮＡＳ１０１：１０５２９−１０５３４）。ＦｌｅｘＴｒｅｅは、ＳＮＰおよびその他の形態のデータへの適用時に、シミュレーションにおいて非常に優れた性能を発揮した。ＦｌｅｘＴｒｅｅを自動化するソフトウェアが、開発されている。代替的に、ＬＡＲＴｒｅｅまたはＬＡＲＴを使用してもよく、Ｔｕｒｎｂｕｌｌ（２００５）Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｒｅｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｓｅｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌａｓｓｏ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙを参照されたい。この名称は、ＣＡＲＴおよびＦｌｅｘＴｒｅｅ、既に記述した通りｌａｓｓｏ、ならびにＥｆｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ３２：４０７−４５１によってＬＡＲＳと称されるものによるｌａｓｓｏの実装におけるような二分木を反映する。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０１（２９）：１０５２９−３４もまた参照されたい。
【００７２】
使用され得る他の分析方法には、論理回帰が含まれる。論理回帰の１つの方法が、Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ１２：４７５−５１２に開示されている。論理回帰は、その分類子が二分木として表示され得るという点で、ＣＡＲＴに類似している。それは、各ノードが、ＣＡＲＴによって生成される単純な「ａｎｄ」ステートメントよりも一般的な特徴に関するブール式ステートメントを有するという点で異なる。
【００７３】
別のアプローチは、最短収縮重心法のアプローチである（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ（２００２）ＰＮＡＳ９９：６５６７−７２）。この技術は、ｋ平均法のようなものであるが、クラスタ中心を収縮することによって、（ｌａｓｓｏにおけるように）特徴を自動的に選択して、情報価値がある少数のものに注目するという利点を有する。このアプローチは、ＰＡＭソフトウェアとして利用可能であり、広く使用されている。２つのさらなるアルゴリズムのセットは、ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ（２００１）Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ４５：５−３２）およびＭＡＲＴ（Ｈａｓｔｉｅ（２００１）Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）である。この２つの方法は、既に「コミッティー法（ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」である。したがって、それらは、結果に「投票」する予測因子に関与する。
【００７４】
有意性の順序付けを提供するために、偽発見率（ＦＤＲ）が判定され得る。まず、非類似値のヌル分布のセットが生成される。一実施形態では、観察されたタンパク質分布パターンの値を並べ替えて、偶然に得られた相関係数の分布の配列を作製し、それによって相関係数の適切なヌル分布のセットを作製する（参照により本明細書に組み込まれるＴｕｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ９８，５１１６−２１を参照されたい）。ヌル分布のセットは、全ての利用可能なタンパク質分布パターンについて各タンパク質分布パターンの値を並べ替えることと、全てのタンパク質分布パターンについて対での相関係数を計算することと、この並べ替えについて相関係数の確率密度関数を計算することと、Ｎ回（Ｎは、大きな数、通常３００である）にわたってこの手順を繰り返すこととによって得られる。Ｎ分布を使用して、それらの値が所与の有意性レベルで実験的に観察された類似性値の分布から得られる（類似性の）値を超える相関係数値の数値の適切な尺度（平均値、中央値など）を計算する。
【００７５】
ＦＤＲは、（ランダム化されたデータのセットにおけるこの選択されたピアソン相関よりも大きい相関から推定される）予想される偽有意な相関の数と経験的データにおけるこの選択されたピアソン相関よりも大きい相関の数（有意な相関）との比である。このカットオフ相関値は、実験タンパク質分布パターン間の相関に適用され得る。
【００７６】
前述の分布を使用して、有意性のための信頼度が選択される。これを使用して、偶然に得られた結果を超える相関係数の最小値を判定する。この方法を使用して、正の相関、負の相関、またはこれらの両方の閾値を得る。この閾値（複数可）を使用して、ユーザは、対での相関係数の観察された値をフィルタリングし、閾値（複数可）を超えない値を排除することができる。さらに、所与の閾値について偽陽性率の推定を得ることができる。個々の「ランダム相関」分布の各々について、閾値範囲外にある観察結果の数を見出すことができる。この手順は、数値の配列を提供する。この配列の平均値および標準偏差は、潜在的な偽陽性の平均数およびその標準偏差を提供する。
【００７７】
分類モデルを構築するためのいくつかの情報価値があるアイソフォームの選択は、性能測定基準の定義、およびこの測定基準に基づく治療に対する個々の応答性の有用な予測能力を有するモデルを生成するためのユーザ定義の閾値を利用してもよい。例えば、性能測定基準は、ＡＵＣ、予測の感度および／または特異性、ならびに予測モデルの全体的な精度であってもよい。
【００７８】
分析のためのデータベースおよびコンピュータシステムもまた提供される。データベースは、典型的には、様々な処置に対する細胞の応答などの様々な条件からの分布パターン情報を含むことができる。結果およびそれらのデータベースを様々な媒体に提供して、それらの使用を容易にすることができる。
【００７９】
「媒体」は、分布パターン情報を含有する製造物、および上記の分析方法を指し得る。データベースおよび比較アルゴリズムは、コンピュータ可読媒体、例えば、コンピュータによって直接読み取りおよびアクセスが可能な任意の媒体に記録することができる。そのような媒体には、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープなどの磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭなどの光学記憶媒体、ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気記憶媒体、ならびに磁気／光学記憶媒体などのこれらのカテゴリのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、現在既知のコンピュータ可読媒体のいずれかを使用して、本データベース情報の記録を含む製造物を作製することができる方法を容易に理解することができる。「記録された」は、当該技術分野で既知の任意のそのような方法を使用して、コンピュータ可読媒体に情報を記憶するためのプロセスを指す。記憶された情報へのアクセスに使用される手段に基づいて、任意の好都合なデータ記憶構造を選択することができる。記憶には、様々なデータプロセッサプログラムおよびフォーマット、例えば、ワード処理テキストファイル、データベースフォーマットなどを使用することができる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「コンピュータベースのシステム」は、本明細書で提供される情報を分析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータベースのシステムの最小ハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を備える。当業者であれば、現在利用可能なコンピュータベースのシステムのいずれか１つが分析における使用に好適であることを容易に理解することができる。データ記憶手段は、上記の本情報の記録を含む任意の製造物、またはそのような製造物にアクセスすることができるメモリアクセス手段を備えてもよい。
【００８１】
入力手段および出力手段のための様々な構造フォーマットを使用して、情報を本発明のコンピュータベースのシステムに入力および出力することができる。そのような提示は、当業者に類似性のランク付けを提供し、試験発現レパートリに含有される類似性の程度を特定する。
【００８２】
データ分析は、ハードウェアもしくはソフトウェア、またはそれらの両方の組み合わせで実装することができる。一実施形態では、機械可読記憶媒体が提供され、この媒体は、該データを使用するための指示がプログラムされた機械の使用時に、本発明のデータセットおよびデータ比較のいずれかを表示することができる、機械可読データでコードされたデータ記憶材料を含む。そのようなデータは、薬物発見、細胞構成要素間の相互作用の分析などの様々な目的のために使用することができる。いくつかの実施形態では、分析は、プロセッサと、データ記憶システム（揮発性および不揮発性メモリならびに／または記憶素子を含む）と、少なくとも１つの入力デバイスと、少なくとも１つの出力デバイスとを備える、プログラム可能なコンピュータ上で実行されるコンピュータプログラムにおいて実装される。プログラムコードを入力データに適用して、上記の機能を実行し、出力情報を生成する。出力情報は、既知の様式で１つ以上の出力デバイスに適用される。コンピュータは、例えば、パーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、または従来設計のワークステーションであってもよい。
【００８３】
各プログラムは、コンピュータシステムと通信するように、高レベルの手続き型またはオブジェクト指向プログラミング言語で実装することができる。しかしながら、プログラムは、所望される場合、アセンブリ言語または機械言語で実装することができる。いずれにしても、言語は、コンパイラ型言語またはインタプリタ型言語であり得る。そのような各コンピュータプログラムは、コンピュータが記憶媒体またはデバイスを読み取って、本明細書に記載の手順を実行するときに、コンピュータを構成および操作するために、汎用または専用プログラム可能コンピュータによって読み取ることができる記憶媒体またはデバイス（例えば、ＲＯＭまたは磁気フロッピー（登録商標）ディスク）に記憶され得る。システムはまた、コンピュータプログラムで構成されたコンピュータ可読記憶媒体として実装されるものと見なされてもよく、そのように構成された記憶媒体は、本明細書に記載の機能を実行するように、コンピュータを特定の所定の様式で動作させる。
【００８４】
入力手段および出力手段のための様々な構造フォーマットを使用して、情報をコンピュータベースのシステムに入力および出力することができる。出力用の１つのフォーマットは、信頼できるレパートリとは異なる程度の類似性を有するデータセットを試験する。そのような提示は、当業者に類似性のランク付けを提供し、試験レパートリに含有される類似性の程度を特定する。
【００８５】
本明細書に開示される方法によって収集されたデータを、コンピュータを介して記憶および／または送信する方法が、本明細書にさらに提供される。ソフトウェアおよび記憶デバイスを含むがこれらに限定されない、任意のコンピュータまたはコンピュータアクセサリを利用して、本発明を実施することができる。データは、ユーザによって直接または間接的にコンピュータに入力することができる。加えて、データがコンピュータおよび／またはコンピュータ適合記憶デバイスに転送されるように、ＮＩＡの実行または分析に使用することができるデバイスのいずれも、コンピュータに連結されてもよい。データは、コンピュータまたは好適な記憶デバイス（例えば、ＣＤ）に記憶されてもよい。データはまた、当該技術分野で周知の方法（例えば、インターネット、陸上便、航空便）を介して、コンピュータから別のコンピュータまたはデータ収集先に送信されてもよい。したがって、本明細書に記載の方法によって収集されたデータは、任意の位置または地理的場所で収集され、任意の他の地理的場所に送信されてもよい。
【００８６】
上述の方法のうちの１つ以上を実施するための試薬およびそれらのキットもまた提供される。主題の試薬およびそれらのキットは、大いに異なり得る。関心対象の試薬には、がん細胞に関連する上記のタンパク質分布パターンの生成および治療に対するそれらの応答性に使用するために特異的に設計された試薬が含まれる。
【００８７】
実験
以下の実施例は、当業者に本発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を提供するために示されるのであって、本発明と見なされるものの範囲を限定することは意図されない。使用される数（例えば、量、温度、濃度など）に関して精度を確保するように努力がなされてはいるが、いくらかの実験誤差および偏差が許容されるべきである。別段示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は、摂氏度であり、圧力は、大気圧または大気圧付近である。
【００８８】
実施例１
検体保管の時間および温度がＥＲＫリン酸化に及ぼす影響
検体保管の時間がＥＲＫリン酸化に及ぼす影響。臨床細針吸引液（ＦＮＡ）検体におけるＥＲＫリン酸化の安定性に関する重要な懸念は、実験室におけるＦＮＡの収集とＦＮＡの急速凍結との間に経過する時間間隔である。我々は、この間隔をＦＮＡ保管時間と呼ぶ。加えて、ＦＮＡ保管の温度は、ＥＲＫリン酸化に影響を与え得る。これらの懸念に対処するために、我々は、腎臓がんを有する患者からのＦＮＡ中のＥＲＫリン酸化の安定性を検証するためのベンチマーク実験を実行した（以下を参照されたい）。リン酸化および非リン酸化ＥＲＫアイソフォームの相対的存在量は、著しく安定しており、これは、最大２日間の保管時間であっても、ＦＮＡ処理の方法によって我々の測定値が有意に変化しないことを示唆する。
【００８９】
異なる患者からの３つのＦＮＡについて、ＦＮＡの一方の部分を処理し、組織収集と同日に急速凍結し、他方の部分を培地中で４℃で保管し、収集の翌日または２日後いずれかに処理した。ＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量を、技術的２連でＮＩＡによって測定した。コホート全体について、ＥＲＫ１は、ほとんどリン酸化を示さず、したがってこの分析からは除外した。
【００９０】
結論：ＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量は、ＦＮＡを低温培地中に２日間保管した後であっても、ほとんど変化を示さない。
【００９１】
図１ＡおよびＢは、試料保管温度がＥＲＫリン酸化に及ぼす影響を示す。１つの腫瘍からの２つのＦＮＡについて、輸送および処理（再懸濁、アリコート作製、および遠心分離）を、室温および氷上で並べて実行した。ＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量を、技術的２連でＮＩＡによって測定し、比較した。コホート全体について、ＥＲＫ１は、ほとんどリン酸化を示さず、したがってこの分析からは除外した。
【００９２】
結論：ＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量は、収穫後少なくとも１時間にわたって、室温対氷上でのＦＮＡ輸送および処理の間でほとんど差を示さない。
【００９３】
方法
組織取得および臨床パラメータ。腎腫瘤の根治的または部分的な腎摘除術を受けている、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの泌尿器科腫瘍クリニックの全ての患者をスクリーニングし、全ての臨床腫瘍段階（Ｔ１〜Ｔ４）および腫瘍縮小腎摘除術を表す組織収集のための症例を選択した。インフォームドコンセントを示す患者を、組織の取得、バンキング、および分子分析を可能にするＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＲＢ承認の研究プロトコルに登録した。部分的または根治的な腎摘除術を受けている患者からの腎臓腫瘍は、腎臓の外科摘出術の直後に病理学者の援助を受けて、二弁にした。ＦＮＡは、１０ｍＬのシリンジに２１ゲージ針を使用して実行し、これを穏やかな負圧下で組織に２０回通過させた。ＦＮＡをＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に収集し、遠心分離し、上清を廃棄した。記載のように、ＦＮＡを室温または氷上のいずれかで輸送した。異なる輸送時間を試験した。ペレットを液体窒素中で急速凍結し、バッチ分析まで−８０℃で保管した。
【００９４】
ナノイムノアッセイ（ＮＩＡ）。ＦＮＡを、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を含有するビシン／ＣＨＡＰＳ緩衝液中で溶解し、ＮａｎｏＰｒｏ１０００またはＰｅｇｇｙＳｕｅ機器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）で、ナノ流体キャピラリ内の等電電気泳動による電荷分離を使用して、技術的２連または３連で分析した。ＥＲＫアイソフォームは、汎ＥＲＫ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０６−１８２、Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）およびＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ二次抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用する化学発光によって検出した。化学発光強度は、様々な曝露時間（３０秒〜９６０秒）にわたって測定した。
【００９５】
化学発光シグナル強度の定量化。化学発光シグナル強度の定量化は、Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて行った。まず、アッセイのダイナミックレンジ内の最適なシグナル対ノイズ比の曝露時間を判定し、ベースライン適合を使用してバックグラウンド強度を減算した。次いで、各適合ピークについてキャピラリにわたる適合化学発光強度プロファイルの下面積を計算し、その等電点（ｐＩ）を、内部ｐＩ標準（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）の助けを借りて判定した。最後に、ピークを、ｐＩに従って特定のＥＲＫアイソフォームに割り当てた。ＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量は、適合ピークの面積の比を判定することによって判定した。ＦＮＡ輸送および処理は、室温対氷上で同等である。
【００９６】
実施例２
図３に示されるように、同じヒトＲＣＣ腫瘍（Ｔ１およびＴ２）ならびに隣接する腎臓組織（Ｎ）の２つの領域の細針吸引液を、腎臓がんを有する４人の患者から得、試料間のグルタミナーゼレベルの分布を提供した。電荷分離ＮＩＡを使用して、これらの試料中のグルタミナーゼ１（ＧＬＳ１）のＫＧＡおよびＧＡＣアイソフォームの両方のレベルを、抗ＧＬＳ１抗体を使用して測定した。これは、代謝に関与するタンパク質アイソフォームのＮＩＡ分析を実証した。
【００９７】
図４に示されるように、ＮＩＡは、凍結試料からの抗酸化タンパク質ペルオキシレドキシン−６（ＰＲＤＸ６）のアイソフォームの分布を測定することができる。各患者からの細胞を、抗ＰＲＤＸ６抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号７３３５０）で分析した。患者は、ＥＧＦＲ変異（ＭＵＴ）、野生型（ＷＴ）、または不明のＥＧＦＲ状態（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）のいずれかを有した。
【００９８】
ヒト炭酸無水物酵素９、ヒトアルファ−チューブリン（チューブリン）のアイソフォーム分布に関する一連のＮＩＡ分析が、図５Ａ〜５Ｉに示される。いくつかの条件では、ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置し、チューブリンへの影響を判定した。ヒトサイクリンＤ１の分析が図５Ｃに示され、ヒトｐ２１の分析が図５Ｄに示され、ヒトｐ２７の分析が図５Ｅに示され、ヒト網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）の分析が図５Ｆに示され、ヒト受容体チロシンキナーゼＡＸＬの分析が図５Ｇに示され、ヒト血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の分析が図５Ｈに示され、ヒトＰＡＸ８の分析が図５Ｉに示されている。これらのデータは、ＮＩＡの様々なタンパク質への適用可能性を示す。
【００９９】
図６Ａは、カボザンチニブ（１μＭ）またはＤＭＳＯ（陰性対照）で１日間処置し、細胞溶解前にＶＥＧＦまたはＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で１０分間刺激したがん細胞内のＥＲＫ１およびＥＲＫ２ホスホアイソフォームの相対的存在量の定量化を示す。同じデータが、図６Ｂに示されるが、これは、最も豊富なアイソフォームを有しない尺度について調整したものである。これらのデータは、特定のＥＲＫアイソフォームが、処置した試料と未処置の試料との間に異なる分布パターンを有することを示す。
【０１００】
図７Ａは、がん組織およびマッチする正常組織中の非リン酸化、単リン酸化、および多リン酸化ＡＫＴ２からのＡＫＴ２アイソフォームのＮＩＡ分析を示す。図７Ｂでは、ＭＥＫ２の異なる荷電のアイソフォームが特定され、これらは、おそらく非リン酸化およびリン酸化ＭＥＫ２を表す。図７Ｃおよび図７Ｄは、優勢なＥＲＫアイソフォームである非リン酸化ＥＲＫ２（ＥＲＫ２）および単リン酸化ＥＲＫ２（ｐＥＲＫ２）の両方の組織試料中で類似しているＥＲＫリン酸化プロファイルを示す。図７Ｅは、処置前および処置後に異なるプロファイルを有する、放射線治療後の異なる電荷の複数のＰＲＤＸ６アイソフォームの分析を示す。
【０１０１】
図８Ａ〜８Ｈは、異種移植片として拡大し、カボザンチニブまたはビヒクル（陰性対照）で２日間処置したリンパ腫組織からのＮＩＡ分析を示す。組織タンパク質可溶化液を、抗汎ＥＲＫ抗体、抗ＡＫＴ３抗体、各ＡＫＴアイソフォームの差動的な荷電（おそらくリン酸化）のアイソフォームを特定するＡＫＴ１に特異的な抗体、抗ｐ７０Ｓ６Ｋ１抗体、リン酸化Ｓ６タンパク質の３つの異なる荷電アイソフォームを特定する抗リンＳ６抗体でプローブした。次いで、第２世代ＰＤＸマウスを、カボザンチニブ、アキシチニブ、またはビヒクル（陰性対照）のいずれかで２日間処置し、次いでＮＩＡ電荷アッセイによって分離し、抗汎ＥＲＫ抗体でプローブした。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の各ホスホアイソフォームの相対的存在量をそれぞれ、総ＥＲＫ１またはＥＲＫ２の画分として定量化した。マウスにおける患者からの異種移植片として拡大したヒトリンパ腫におけるＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化アイソフォームの定量的ＥＲＫ測定値（「正規化面積」）を、ＨＳＰ７０に正規化した。
【０１０２】
図９Ａ〜９Ｇは、患者からの異種移植片としてマウスにおいて拡大したヒト腎臓がん組織からの組織切片培養物（ＴＳＣ）からのタンパク質可溶化液のＮＩＡサイズ分離による切断ＰＡＲＰ−１（アポトーシスマーカー）の検出を示す。ＰＤＸマウスからの腫瘍組織の切片をインビトロで培養し、ＩＱＧＡＰ１  ＷＷドメインペプチド（ＷＷ）、スクランブルペプチド（ｓｃｒ．、ＷＷの陰性対照）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、トラメチニブの陰性対照）のいずれかで２日間処置した。組織タンパク質可溶化液を、抗ｃｌ．ＰＡＲＰ−１抗体でプローブした。ＰＣＮＡ、サイクリンＤ１、ＥＲＫホスホアイソフォームの検出もまた実行し、ＨＳＰ７０への正規化によって定量化した。
【０１０３】
これらのデータは、ＮＩＡを使用して、インビボまたはエクスビボで処置されたヒトがん組織中のアポトーシスおよび増殖マーカー、ならびにシグナル伝達タンパク質アイソフォームのパネルを測定して、関心対象の薬物に対する個々の試料の応答を比較することができることを示す。トラメチニブは、細胞周期増殖（ＰＣＮＡ）を減少させ、アポトーシス（切断型ＰＡＲＰ−１）を変化させなかったが、ＷＷペプチドは、アポトーシスおよび細胞周期の増加（ＰＣＮＡ）の両方を誘導した。
【０１０４】
図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、ＭＹＣ不活性化は、Ｔ−ＡＬＬ４１８８細胞株内のｐＥｒｋ１、ｐｐＥｒｋ２、およびＥｒｋ２レベルを増加させる。ＭＹＣ不活性化は、バーキットＰ４９３−６細胞株内のＥｒｋ１レベルを減少させる。
【０１０５】
図１１に示されるように、ＮＩＡを使用して、薬物標的ＰＤＬ１およびＶＥＧＦＲ２を測定することができる。
【０１０６】
方法
ナノ流体プロテオミックイムノアッセイ（ＮＩＡ）。ＮＩＡ実験は、Ｐｅｇｇｙ  Ｓｕｅ機器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｉｎｃ．）を使用して実行した。細胞または組織からのタンパク質可溶化液を、製造業者の説明書に従って、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（水性阻害剤およびＤＭＳＯ阻害剤、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｉｎｃ．）の専売混合物を含む２５ｍＭのビシンｐＨ７．６／０．６％のＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｉｎｃ．）で調製した。次いで、タンパク質可溶化液を、製造業者の説明書に従って、０．０２５〜０．８ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるまで、既知の等電点（電荷アッセイ）または分子量（サイズアッセイ）の蛍光標準（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｉｎｃ．）と予め混合した。簡潔には、各キャピラリ分析について、４００ナノリットル（電荷分離アッセイの場合）または４０ナノリットル（サイズ分離アッセイの場合）のタンパク質可溶化液−蛍光標準混合物（８〜２４ｎｇの総タンパク質に対応）を、マイクロキャピラリに自動的に充填し、電荷またはサイズによって電気泳動的に分離した。分離および光活性化キャピラリ内固定化後、抗体を用いてタンパク質を検出し、化学発光によって可視化した。
【０１０７】
ＮＩＡピーク面積の定量化。特定のピークの定量化を、Ｃｏｍｐａｓｓピーク分析ソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｉｎｃ，）を使用して実行した。（バックグラウンド減算のための）適合ピークおよび適合ベースラインを、ソフトウェアによって自動的に選択し、必要に応じて手動で確認および調整した。各適合ピーク下面積を判定することによって、シグナル強度を定量化した。
【０１０８】
ＮＩＡ疑似ブロット生成。シグナル強度をグレースケール画像に対して線形マッピングすることによって、疑似ブロットを作製した。各疑似ブロットレーンは、単一のキャピラリを表し、キャピラリのその位置に存在するシグナル強度に比例対応する水平バンドからなる。シグナルの欠如は、白色である一方で、増加するシグナルは、増加する濃色のバンドとして見られる。
【０１０９】
ヒト腫瘍試料。Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＲＢ承認のプロトコルに従って、患者から組織を得、全ての対象からインフォームドコンセントを得た。組織試料および培養細胞をペレット化し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。分析のために、溶解直前に検体を氷上で解凍した。
【０１１０】
データおよび統計学的分析。ＮＩＡ  Ｍｕｌｔｉｐｅａｋ適合およびピーク面積計算は、前述のように可変幅を有するガウスピークを使用して、Ｃｏｍｐａｓｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて行った。Ｒ２相関係数を得るために、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）で線形適合を行った。
【０１１１】
ＮＩＡサイズ分離データの正規化。ＮＩＡデータの正規化は、ローディング対照／「ハウスキーピング」タンパク質と同じ可溶化液中のチューブリンシグナルを定量化し、関心対象のタンパク質の測定されたピーク面積をチューブリンの測定されたピーク面積によって除算し、比として表現することによって実行した。様々な実験にわたって、標準化された可溶化液対照を、機器および実行の較正に使用した。
【０１１２】
相互参照
本出願は、２０１８年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４０，０１３号、および２０１８年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６４４，３０３号の利益を主張し、これらの出願の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
連邦政府の支援による研究および開発
本発明は、国立保健研究所によって付与された契約ＣＡ１９６５８５の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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