(57)【要約】  いくつかの実施形態は、その遺伝的活性が宿主に利点を付与する第一の核酸配列を含む自己複製性染色体外核酸分子を用いた微生物宿主を使用して目的産物を生産するための方法であって、前記第一の核酸分子の遺伝的活性が制御されてもよい、前記方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）その遺伝的活性が宿主に利点を付与する第一の核酸配列を含む自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主を提供するステップであって、前記第一の核酸配列の遺伝的活性が制御される、前記ステップ；
ｂ）前記自己複製性染色体外核酸分子は前記目的産物の生産に関与する第二の核酸配列を含んでいてもよく、ここで、前記第二の核酸配列の遺伝的活性は第一の配列のものから独立して制御される；
ｃ）前記形質転換微生物宿主が自己複製性染色体外分子を維持するための所与のレベルまで第一の核酸配列を発現することを可能にする条件下で前記形質転換微生物宿主を培養することで増殖中の微生物集団とし、同時に前記目的産物をコードする第二の配列を遺伝的に制御するステップ
を含む、微生物宿主を使用して目的産物を生産するための方法。
【請求項２】
ステップａ）の前またはステップａ）中に、ステップｂ）の第二の核酸配列を含んでもよい前記自己複製性染色体外核酸分子で微生物宿主を形質転換すること、それによって自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）の少なくとも一部において、条件が、第一の核酸配列が前記遺伝的活性を呈さないようなものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
目的産物が、培養ステップｃ）の終了時に精製される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
目的産物が、微生物バイオマス、自己複製性染色体外核酸分子、前記第二の核酸配列の転写産物、前記第二の配列によりコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドにより直接的もしくは間接的に生産される代謝物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
微生物宿主が、細菌、酵母、糸状真菌または藻類である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第一の核酸配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第一の核酸配列が、その発現がその宿主に培地中の特定のバクテリオシンの存在に対する抵抗性を付与する免疫遺伝子をコードする配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第一の核酸配列によりコードされる配列が、その宿主に培地中の少なくとも２つの別個のバクテリオシンの存在に対する抵抗性を付与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
バクテリオシンがＢ１７、Ｃ７またはＣｏｌＶであって、Ｂ１７に対する抵抗性を付与する免疫性がＭｃｂＧであり、Ｃ７に対する抵抗性を付与する免疫性がＭｃｃＥまたはＣ末端ＭｃｃＥのいずれかであり、およびＣｏｌＶに対する抵抗性を付与する免疫性がＣｖｉである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
自己複製性染色体外核酸分子がプラスミドである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
その遺伝的活性が微生物宿主に利点を付与する第一の核酸配列を含み、ここで前記第一の核酸配列の遺伝的活性は制御され、および目的産物の生産に直接的または間接的に関与する第二の核酸配列を含んでもよい、自己複製性染色体外核酸分子。
【請求項１３】
第一の核酸配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結される、請求項１２に記載の自己複製性染色体外核酸分子。
【請求項１４】
プラスミドである、請求項１２または１３に記載の自己複製性染色体外核酸分子。
【請求項１５】
第一の核酸配列が、その発現がその宿主に培地中の特定のバクテリオシンの存在に対する抵抗性を付与する免疫遺伝子をコードする配列を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の自己複製性染色体外核酸分子。
【請求項１６】
第一の核酸配列によりコードされる配列が、その宿主に培地中の少なくとも２つの別個のバクテリオシンの存在に対する抵抗性を付与する、請求項１５のいずれか一項に記載の自己複製性染色体外核酸分子。
【請求項１７】
バクテリオシンがＢ１７、Ｃ７またはＣｏｌＶであって、Ｂ１７に対する抵抗性を付与する免疫調節因子がＭｃｂＧであり、Ｃ７に対する抵抗性を付与する免疫調節因子がＭｃｃＥまたはＣ末端ＭｃｃＥのいずれかであり、およびＣｏｌＶに対する抵抗性を付与する免疫調節因子がＣｖｉである、請求項１６に記載の自己複製性染色体外核酸分子。
【請求項１８】
微生物宿主が、細菌、酵母、糸状真菌または藻類であってもよい、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中の実施形態は、その遺伝的活性が宿主に利点を付与する第一の核酸配列を含む自己複製性染色体外核酸分子を用いた微生物宿主を使用して目的産物を生産するための方法であって、前記第一の核酸分子の遺伝的活性が制御されてもよい、前記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質は、微生物細胞中での目的産物の生産のための選択剤として広く用いられている。しかしながら、抗生物質の使用に関連して、例えば環境中での抗生物質の大規模な拡散などのいくつかの欠点がある。加えて、ＤＮＡコンストラクト中の抗生物質抵抗性をコードする配列は、細胞にとってエネルギー的な負担となり、したがって産物の収量に悪影響を及ぼす。このエネルギー的な負担は、抵抗性付与遺伝子が大きい遺伝子である場合、高レベルで発現している場合および／または構成的に発現している場合にとりわけ関連がある。
【０００３】
したがって、既存の方法の全ての欠点を持たない、代替的でさらに改良された方法へのニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第一の態様において、
ａ）第一の核酸配列を含む自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主を提供するステップであって、前記第一の核酸配列の遺伝的活性が制御されてもよい、前記ステップ；
ｂ）前記自己複製性染色体外核酸分子が前記目的産物の生産に関与する第二の核酸配列を含んでもよいステップであって、前記第二の核酸配列の遺伝的活性が第一の配列から独立して制御される、前記ステップ；
ｃ）前記微生物宿主が自己複製性染色体外分子を維持するための所与のレベルまで第一の核酸配列を発現することを可能にする条件下で前記微生物宿主を培養することで増殖中の微生物集団とし、同時に前記目的産物をコードする第二の配列を遺伝的に制御するステップ
を含む、微生物宿主を使用して目的産物を生産するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図1はｐＳｙｎ２−ＭｃｂＥ／Ｆの構成を示す。
【図２】図２はｐＳｙｎ２−ＭｃｂＧの構成を示す。
【図３】図３はｐＭｃｂＧ  １．１の構成を示す。
【図４】図４はｐＭｃｂＧ  １．０の構成を示す。
【図５】図５はｐＢＡＣＴ５．０ベクターを示す。
【図６】図６はｐＢＡＣＴ２．０ベクターを示す。
【図７】図７はｐＢＡＣＴ５．０−ｍｃｈｅｒｒｙベクターを示す。
【図８】図８はプロモーターの調整を示す。
【図９】図９はＫａｎＲ（ｐＫａｎ−ｐＬａｃ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ６．０−ｐＬａｃ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるタンパク質Ｘの過剰発現の比較を示す。
【図１０】図10はＫａｎＲ（ｐＫａｎ−Ｔ７ｐｒｏｍ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ５．０−Ｔ７ｐｒｏｍ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるイオタ−カラギナーゼタンパク質の過剰発現の比較を示す。
【図１１】図11はＫａｎＲ（ｐＫａｎ−Ｔ７ｐｒｏｍ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ５．０−Ｔ７ｐｒｏｍ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるラムダ−カラギナーゼタンパク質の過剰発現の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
ステップａ）
ステップａ）は、その遺伝的活性が宿主に利点を付与する第一の核酸配列を含む自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主を提供することを含み、ここで前記第一の核酸配列の遺伝的活性が制御されてもよい。自己複製性染色体外核酸分子は、微生物宿主（例として、本明細書中に記載される微生物細胞）中に提供されることができる。例えば、宿主または宿主の前身は、予め自己複製性染色体外核酸分子で形質転換されたものであり得る。かくして、いくつかの実施形態において、ステップａ）は、その遺伝的活性が宿主に利点を付与する第一の核酸配列を含む自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物細胞宿主を提供することを含み、ここで前記第一の核酸配列の遺伝的活性が制御されてもよい。
【０００７】
任意選択の形質転換ステップ
いくつかの実施形態において、微生物宿主は、前記自己複製性染色体外核酸分子を受け取った宿主のみが生存することを可能にする条件下で、自己複製性染色体外核酸分子で形質転換され、このようにして自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主が提供される。かくして、いくつかの実施形態において、この方法は、前記自己複製性染色体外核酸分子を受け取った宿主のみが生存することを可能にする条件下、ステップａ）の前またはステップａ）中に微生物宿主を前記自己複製性染色体外核酸分子で形質転換すること、このようにして自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主を提供することをさらに含む。
【０００８】
微生物宿主中に形質転換される自己複製性染色体外核酸分子は、ステップｂ）の第二の核酸配列を含んでもよい。自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主は、続いてステップｃ）に従って培養することができる。
【０００９】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の関連の中で、第一の核酸配列を含む自己複製性染色体外核酸分子が提供される。自己複製性染色体外核酸分子は、ゲノムを含まずに存在することができ、プラスミドまたはエピソーム、ミニ染色体または同様のものに由来し得て、またはこれらを含み得て、これらから本質的になり得て、またはこれらからなり得る。この態様は、高コピー数（用いられるプラスミドに応じて１から数百コピーまたは１０から５０コピー）のかかる核酸分子を微生物細胞宿主中に導入して維持することができることから、魅力的である。加えて、任意の宿主を、本明細書中の実施形態の方法において用いることができる。いくつかの実施形態において、宿主のゲノムを改変する必要はない。本明細書中の実施形態の方法を実施するために必要な遺伝的エレメントは、自己複製性染色体外核酸分子中に存在する。かかる自己複製性染色体外核酸分子は、通常、複製起点、目的である第一の核酸配列および調節領域を含む。いくつかの実施形態において、理論により限定されるものではないが、免疫調節因子をコードする第一の核酸配列は、宿主細胞中で自己複製性染色体外核酸の存在および機能を維持するための選択可能マーカーとして働く。いくつかの実施形態において、免疫調節因子をコードする第一の核酸配列は、産物を生産することができるように自己複製性染色体外核酸の存在を維持する。産物は、例えば環境中で物質を発酵させて１または複数の新たな物質を生産することにより、宿主が存在する環境を変えることができる。いくつかの実施形態において、変異を獲得した自己複製性染色体外核酸に対する選択圧を与えることにより遺伝的浮動が最小化され、機能的な免疫調節因子を産生せず、機能が低減された免疫調節因子を産生し、および／または変異（複数可）を獲得していない自己複製性染色体外核酸よりも低レベルの免疫調節因子を産生した。
【００１０】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の関連の中で、第一の核酸配列により表される第一の核酸分子は、遺伝的活性を呈することが可能であり、前記遺伝的活性は、それが存在してこの遺伝的活性が発現した微生物宿主細胞に選択的な利点を付与する。この遺伝的活性は、第一の核酸分子によりコードされる産物により提供される。そのうえ、この遺伝的活性は、制御することができ、または低いレベルで構成的に発現し、または調整可能であり、または弱い構成的プロモーターの制御下にある。前記活性の制御は、宿主にとってのエネルギー的な負担を制限する利点を提供するものと考えられる。同様に、宿主のエネルギー的な負担を制限する利点は、遺伝的活性が低いレベルで構成的に発現し、または調整可能であり、または弱い構成的プロモーターの制御下にあるときに得られ得る。出願文の全体を通じて、「利点を付与すること」という概念は、「バクテリオシンに対する免疫性を付与すること」または「バクテリオシンに対する抵抗性を付与すること」により置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、第一の核酸配列は、本明細書中に記載される免疫調節因子をコードし、それによって宿主に利点を付与する。
【００１１】
第二の核酸配列は、直接的または間接的に目的産物をコードする。同じ記述が、本明細書中に記載される第二の核酸分子の遺伝的活性についても成立する。いくつかの実施形態において、目的産物は、工業プロセス、例えば発酵プロセスにおいて有用な酵素を含む。発酵プロセスは、培養培地中で少なくとも１つの化合物を発酵させることができる。いくつかの実施形態において、目的産物は、産業上有用な分子、例えば炭水化物、脂質、有機分子、栄養素、肥料、バイオ燃料、化粧品（またはその前駆体）、医薬もしくは生物製剤（またはその前駆体）、または列挙された項目のいずれか２つ以上を含む。
【００１２】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の関連の中で、遺伝的活性は、微生物宿主中の第一の核酸分子の存在により引き起こされるまたはこれと連鎖する任意の活性を意味し得る。前記活性の利点は、所与の条件（ｐＨ、温度、所与の分子、例えば本明細書中に記載されるバクテリオシンまたは２つ以上のバクテリオシンの組み合わせなどの存在．．．）下で生存するまたは生存して増殖する能力であり得る。したがって、前記活性の利点は、自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物細胞／宿主の数を決定することにより評価され得る。評価は、任意選択の形質転換ステップの終了時および／もしくはこのステップの間に（しかし培養ステップｃ）の前、またはステップａ）および培養ステップｃ）の前に）、ならびに／または培養ステップｃ）の前に実施され得る。ある実施形態において、存在する自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物宿主細胞の数は、前記自己複製性染色体外核酸分子を受け取った微生物宿主が生存することを可能にする条件下で培養されている場合、（例として、本明細書中に記載され、かつ所与の条件中に存在する１または複数のバクテリオシンに対する免疫性を保有することにより）最初の微生物細胞／宿主の数と比較して減少しておらず、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれより多く増加し得る。この評価ステップの持続時間は、少なくとも６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間またはそれより長いものであり得て、この持続時間には、列挙された値のいずれか２つの間の範囲が包含される。
【００１３】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の関連の中で、遺伝的活性の制御は、核酸分子（すなわち第一および／または第二の核酸分子）の活性の増加または減少のいずれかを意味し得る。したがって、遺伝的活性の制御は、制御することができ、または低いレベルで構成的に発現し、または調整可能であり、または弱い構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、遺伝的活性が調節／制御されるコーディング産物は、免疫調節因子を含む、これらから本質的になる、もしくはこれらからなるか、または目的産物の生産に関与する。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は、遺伝子発現レベルで調節／制御される。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は、転写レベルで、例えばプロモーターを活性化または抑制することにより調節される。いくつかの実施形態において、この関連でのプロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態において、この関連でのプロモーターは、弱プロモーターである。理論により限定されるものではないが、いくつかの実施形態の弱プロモーターは、宿主に付与される利点（例として免疫調節因子活性）がプロモーターの制御下にある遺伝子産物（複数可）のレベルおよび／または活性の変化に感受性であるように、転写レベルをアップレキュレートまたはダウンレギュレートするよう修正可能であることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、配列番号７０７により表されるＰ２４プロモーターおよび／または配列番号７０８により表されるＰｒｏＣプロモーターおよび／またはＰ２４  ＬａｃＯハイブリッドプロモーターを含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる。Ｐ２４ＬａｃＯハイブリッドプロモーターは、調整可能な／制御されたプロモーターである。いくつかの実施形態において、遺伝子活性は、転写後レベルで、例えばＲＮＡ安定性の調節を通じて調節／制御される。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は、翻訳レベルで、例えば翻訳開始の調節を通じて調節／制御される。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は、翻訳後レベルで、例えばポリペプチド安定性の調節、ポリペプチドの翻訳後修飾またはポリペプチドへの阻害剤の結合を通じて調節／制御される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、遺伝的活性は増加する。いくつかの実施形態において、免疫調節因子および／または目的産物の生産に関与する第二の核酸分子のコーディング産物のうちの少なくとも１つの活性が増加する。概念的には、遺伝的活性は、遺伝的活性を直接的に活性化することにより、または遺伝子活性の阻害物質の活性を減少させることにより、増加させることができる。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は、プロモーター活性を誘導すること、転写リプレッサーを阻害すること、ＲＮＡの安定性を増加させること、転写後阻害物質を阻害すること（例えば、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを阻害すること）、翻訳を誘導すること（例えば、調節可能なｔＲＮＡを介して）、所望の翻訳後修飾を生成させること、または翻訳後阻害物質を阻害すること（例えば遺伝子によりコードされるポリペプチドを対象とするプロテアーゼ）のうちの少なくとも１つにより活性化される。いくつかの実施形態において、所望の環境中に存在する化合物は、プロモーターを誘導する。例えば、培養培地中の鉄の存在は、本明細書中に記載される鉄感受性プロモーターによる転写を誘導することができる。いくつかの実施形態において、所望の培養培地中に存在する化合物は、転写リプレッサーを阻害する。例えば、環境中のテトラサイクリンの存在は、ｔｅｔリプレッサーを阻害することができ、それゆえにｔｅｔＯプロモーターからの活性を可能にする。いくつかの実施形態において、所望の培養培地外でのみ見出される化合物は、転写を誘導する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、遺伝的活性は減少する。概念的には、遺伝的活性は、遺伝的活性を直接的に阻害することにより、または遺伝的活性の活性化物質の活性を減少させることにより、減少させることができる。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は低減されるが、いくらかのレベルの活性は残る。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は完全に阻害される。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は、プロモーター活性を阻害すること、転写リプレッサーを活性化すること、ＲＮＡの安定性を減少させること、転写後阻害物質を活性化すること（例えば、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させること）、翻訳を阻害すること（例えば、調節可能なｔＲＮＡを介して）、必要とされる翻訳後修飾を生成させないこと、ポリペプチドを不活性化すること（例えば阻害物質と結合させることにより、またはポリペプチドに特異的なプロテアーゼを介して）、またはポリペプチドを適当に局在させないことのうちの少なくとも１つにより減少する。いくつかの実施形態において、遺伝的活性は、遺伝子を所望の位置から取り除くことによって、例えばＦＬＰ−ＦＲＴもしくはｃｒｅ−ｌｏｘカセット、相同組換えもしくはＣＲＩＰＲ−ＣＡＳ９活性を用いて、またはプラスミドの欠損もしくは分解を通じて遺伝子を切除することによって減少する。いくつかの実施形態において、遺伝子産物（例としてポリペプチド）または遺伝子産物により生産される産物（例として酵素反応生成物）は、遺伝子活性をさらに阻害する（例としてネガティブフィードバックループ）。
【００１６】
いくつかの実施形態において、第一の核酸分子の遺伝的活性により微生物宿主に付与される利点は、バクテリオシン（またはバクテリオシンの混合物）を含む培地中で生存するまたは生存して増殖する能力である。本明細書中で用いられるとき、「バクテリオシン」は、かかるポリペプチドの細胞を含まないまたは化学合成のバージョンを包含する。「バクテリオシン」およびこの語根のバリエーションは、宿主細胞により分泌されたポリペプチドをも指し得る。したがって、バクテリオシンは、同類または近縁の細菌株（複数可）の増殖を阻害するために細菌により生産されるタンパク質性毒素を包含する。これらは酵母およびゾウリムシの殺傷因子と類似しており、構造的、機能的および生態学的に多様である。バクテリオシンはまた、宿主細胞により分泌されるバクテリオシンの合成バリアントも包含する。バクテリオシンの合成バリアントは、合成バリアントが宿主細胞により分泌される対応するバクテリオシンの活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％をなお呈するかぎり、何らかの方法で宿主細胞により分泌されるバクテリオシンに由来し得る。
【００１７】
抗生物質の詳細な記述は、本明細書の最後にある一般的記述に特化した部分の中で提供される。
【００１８】
「バクテリオシン」は、ポリペプチドが生成された個々の宿主細胞以外の、宿主細胞とクローン的に関係している細胞および他の微生物細胞を包含する少なくとも１つの細胞を無力化することができる。
【００１９】
特定の「免疫調節因子」（本明細書中でより詳細に論じられる）を発現する細胞は、特定のバクテリオシンまたはバクテリオシングループの無力化効果に対する免疫性がある。かくして、バクテリオシンは、バクテリオシンを産生する細胞および／または他の微生物細胞を、これらの細胞が適切な免疫調節因子を産生しないかぎり、無力化することができる。かくして、バクテリオシンは、複数の他の微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）に対する細胞傷害効果または増殖阻害効果を発揮することができる。ある実施形態において、バクテリオシンは、微生物細胞の翻訳機構（例としてリボソームなど）により産生される。別の実施形態において、バクテリオシンは、化学合成される。いくつかのバクテリオシンは、ポリペプチド前駆体に由来することができる。ポリペプチド前駆体は、切断（例えばプロテアーゼによるプロセシング）を受けることでバクテリオシンポリペプチド自体をもたらすことができる。かくして、いくつかの実施形態において、バクテリオシンは、前駆体ポリペプチドから生産される。いくつかの実施形態において、バクテリオシンは、翻訳後修飾、例えば切断を受けたまたは１つもしくは複数の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる。
【００２０】
バクテリオシンの無力化活性としては、微生物複製の停止または細胞傷害を挙げることができる。いくつかのバクテリオシンは、細胞傷害活性（例として「殺菌」効果）を持ち、それゆえに微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）、例えば細菌、酵母、藻類、合成微生物（ｍｉｃｏｏｒｇａｎｉｓｍ）などを殺傷することができる。いくつかのバクテリオシンは、例えば細胞周期を停止させることにより、微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）、例えば細菌、酵母、藻類、合成微生物（ｍｉｃｏｏｒｇａｎｉｓｍ）などの複製を阻害することができる（例として「静菌」効果）。
【００２１】
いくつものバクテリオシンが同定されて性質決定されている（表１．１および１．２を参照されたい）。何らかの特定の理論により限定されるものではないが、例示的なバクテリオシンは、典型的に翻訳後修飾を受ける「クラスＩ」バクテリオシン、および典型的に非修飾である「クラスＩＩ」バクテリオシンに分類することができる。加えて、各クラス中の例示的なバクテリオシンは、表１．１中にまとめられるように様々なサブグループにカテゴリー分けすることができ、この出典であるＣｏｔｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．“Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ−  ａ  ｖｉａｂｌｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １  １：９５−１０５は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２２】
何らかの特定の理論により限定されるものではないが、バクテリオシンは、様々な方法で標的微生物細胞の無力化をもたらすことができる。例えば、バクテリオシンは細胞壁を透過することができ、それゆえに細胞壁を脱分極させて呼吸を妨げることができる。表１．１：例示的なバクテリオシンの分類。
【００２３】
表１．１：例示的なバクテリオシンの分類
【表１】
2021506328.tif 000002
2021506328.tif 000003
【００２４】
いくつものバクテリオシンが、本明細書中の実施形態に従って用いることができる。例示的なバクテリオシンは、表１．２中に示される。いくつかの実施形態において、表１．２のポリペプチド配列を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる、少なくとも１つのバクテリオシンが提供される。表１．２中に示されるように、いくつかのバクテリオシンは、分子対として機能する。かくして、特に明示的に述べられないかぎり、機能的な「バクテリオシン」または「バクテリオシンを提供すること」などが本明細書中で論じられる場合、個々で機能するバクテリオシンと一緒に機能的なバクテリオシン対が包含されることが理解される。表１．２に関して、括弧内に収載された「起源生物」は、指示されたバクテリオシンを産生することが知られている生物の別の名称および／または株の情報を指し示す。
【００２５】
本明細書中の実施形態はまた、表１．２中に記載されるバクテリオシンとの同一性を有するペプチドおよびタンパク質を包含する。用語「同一性」は、核酸またはタンパク質の配列相同性または３次元的相同性を包含するような意味を持つ。ポリペプチドに対する核酸またはタンパク質の配列相同性および／または３次元的相同性を決定するためのいくつかの技術が存在する。これらの方法は、１つの配列、ドメインまたはモデルが持つ、標的の配列、ドメインまたはモデルとの同一性の程度を見出すためにルーチン的に使用される。非常に広い範囲の機能的バクテリオシンが本明細書中に開示されるバクテリオシンの特徴を取り込むことができ、それゆえに表１．２中のバクテリオシンとの非常に広い程度の同一性を提供することができる。いくつかの実施形態において、バクテリオシンは、表１．２のポリペプチドのいずれか１つと少なくとも５０％の同一性を、例えば、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を持つ。パーセント同一性は、ＢＬＡＳＴソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  “Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．”  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０、ワールドワイドウェブ上、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいてアクセス可能）をデフォルトのパラメーターで用いることにより決定され得る。
【００２６】
表１．２中のバクテリオシンは天然起源のものであるが、当業者は、表１．２のバクテリオシンのバリアント、表１．２のバクテリオシンもしくはそのバリアント以外の天然起源のバクテリオシン、または合成のバクテリオシンを、本明細書中のいくつかの実施形態に従って用いることができることを理解する。いくつかの実施形態において、かかるバリアントは、野生型タンパク質と比べて、同じまたは異なる微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）または微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の種に対する細胞傷害性または増殖阻害活性のレベルが高められているか、または減少している。いくつかのモチーフは、バクテリオシンの特質として認識されている。例えば、モチーフＹＧＸＧＶ（配列番号２）（ここでＸは任意のアミノ酸残基である）は、クラスＩｌａバクテリオシンのＮ末端コンセンサス配列の特質である。したがって、いくつかの実施形態において、合成のバクテリオシンは、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有する、例えば配列番号２と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＮ末端配列を含む。いくつかの実施形態において、合成のバクテリオシンは、配列番号２を含むＮ末端配列を含む。加えて、いくつかのクラスｌｉｂバクテリオシンは、ＧｘｘｘＧモチーフ（ｘは任意のアミノ酸を意味する）を含む。何らかの特定の理論により限定されるものではないが、ＧｘｘｘＧモチーフは、細胞膜の中でヘリックスタンパク質間の会合を媒介することで、例えば、細胞膜相互作用を通じたバクテリオシン媒介性の無力化を促すことができると考えられる。かくして、いくつかの実施形態において、バクテリオシンは、細胞膜との相互作用を促すモチーフを含む。いくつかの実施形態において、バクテリオシンは、ＧｘｘｘＧモチーフを含む。任意選択で、ＧｘｘｘＧモチーフを含むバクテリオシンは、ヘリックス構造を含むことができる。本明細書中に記載される構造に加えて、本明細書中で用いられる「バクテリオシン」は、微生物細胞に対して、本明細書中に明示的に提供されるバクテリオシンのうちのいずれかと実質的に同じ効果を持つ構造も包含する。
【００２７】
２つ以上のバクテリオシンまたはその部分を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる融合ポリペプチドは、いずれか個々のバクテリオシンよりも幅広い範囲の微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）に対する無力化活性を持つことができることが示されている。例えば、ハイブリッドバクテリオシンであるＥｎｔ３５−ＭｃｃＶ（ＧＫＹＹＧＮＧＶＳＣＮＫＫＧＣＳＶＤＷＧＲＡＩＧＩＩＧＮＮＳＡＡＮＬＡＴＧＧＡＡＧＷＫＳＧＧＧＡＳＧＲＤＩＡＭＡＩＧＴＬＳＧＱＦＶＡＧＧＩＧＡＡＡＧＧＶＡＧＧＡＩＹＤＹＡＳＴＨＫＰＮＰＡＭＳＰＳＧＬＧＧＴＩＫＱＫＰＥＧＩＰＳＥ  ＡＷＮＹＡＡＧＲＬＣＮＷＳＰＮＮＬＳＤＶＣＬ、配列番号３）は、病原性のグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対して抗微生物活性を呈示することが示されている（Ａｃｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２），ＦＥＢＳ  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏ，２：１２−１９）。なお、Ｅｎｔ３５−ＭｃｃＶ融合バクテリオシンは、Ｎ末端からＣ末端までに、Ｎ末端のグリシン、エンテロシンＣＲＬ３５、３つのグリシンを含むリンカー、およびＣ末端のミクロシンＶを含む。本明細書において、バクテリオシンは、バクテリオシン活性を持つ２つ以上のポリペプチドの融合体を含むことができると考えられる。いくつかの実施形態において、２つ以上のバクテリオシンの融合ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、２つ以上のバクテリオシンは、表１．２からのポリペプチドまたはその改変体を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、２つ以上のバクテリオシンを含む融合ポリペプチドは、いずれか個々のバクテリオシンよりも幅広い活性スペクトルを、例えば、より多くの微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）に対する無力化活性、より幅広い範囲の環境条件下での無力化活性、および／またはより高効率の無力化活性を持つ。いくつかの実施形態において、２つ以上のバクテリオシン、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のバクテリオシンの融合体が提供される。いくつかの実施形態において、２つ以上のバクテリオシンポリペプチドは、共有結合、例えばペプチド結合を介して互いに融合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、２つのバクテリオシンポリペプチドの間に位置する。いくつかの実施形態において、リンカーは、１または複数のグリシン、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のグリシンを含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内で切断されて、融合タンパク質中に包含される個々のバクテリオシンを産生する。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるバクテリオシンは、改変されていないバクテリオシンと比べて所望の活性スペクトルを提供するように改変される。例えば、改変バクテリオシンは、改変されていないバクテリオシンと同じ生物に対して、高められたまたは減少した活性を持ち得る。あるいは、改変バクテリオシンは、改変されていないバクテリオシンが弱い活性しか持たないまたは全く活性を持たない生物に対し��、高められた活性を持ち得る。
【００２８】
表１．２：例示的なバクテリオシン
【表２】
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【００２９】
例えば、いくつかの実施形態において、抗真菌活性（例えば抗酵母活性など）が望まれる。抗真菌活性を有するいくつものバクテリオシンが同定されている。例えば、バチルスからのバクテリオシンは、酵母株に対して無力化活性を持つことが示されており｛Ａｄｅｔｕｎｊｉ  ａｎｄ  Ｏｌａｏｙｅ  （２０１３）  Ｍａｌａｙｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１３０−１３を参照されたい。この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）、エンテロコッカス・フェカリスのペプチド（ＷＬＰＰＡＧＬＬＧＲＣＧＲＷＦＲＰＷＬＬＷＬＱ  ＳＧＡＱＹ  ＫＷＬＧＮＬＦＧＬＧＰＫ、配列番号１）は、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）に対して無力化活性を持つことが示されており｛Ｓｈｅｋｈ  ａｎｄ  Ｒｏｙ  （２０１２）  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：１３２を参照されたい。この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）、シュードモナスからのバクテリオシンは、真菌、例えばカーブラリア・ルナータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ヘルミントスポリウム属種（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）およびビオポラリス属種（Ｂｉｏｐｏｌａｒｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）などに対して無力化活性を持つことが示されている（Ｓｈａｌａｎｉ  ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  （２００８）  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ５  Ｎｕｍｂｅｒ  ２．  ＤＯＩ：１０．５５８０／２７ｄｄ  −  ワールドワイドウェブ上、アーカイブｉｓｐｕｂ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｔｈｅ−ｉｎｔｅｒｎｅｔ−ｊｏｕｒｎａｌ−ｏｆ−ｍｉｃｒｏ  ｂｉｏ  ｌｏｇｙ／ｖｏｌｕｍｅ−５−ｎｕｍｂｅｒ−２／ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ−  ｆｏｒ−ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ−ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｏｆ−ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ−ａｇａｉｎｓｔ−ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ−  ｆｕｎｇｉ．ｈｔｍｌ＃ｓｔｈａｓｈ．ｄ０Ｙｓ０３ＵＯ．ｌＤＫｕＴｌＵＳ．ｄｐｕｆにおいてアクセス可能。この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。例として、５．サチリス（５．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのボトリシジン（ｂｏｔｒｙｃｉｄｉｎ）ＡＪ１３１６｛Ｚｕｂｅｒ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．  Ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｄ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．８９７−９１６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい。この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）およびアリリンＢｌ｛Ｓｈｅｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ａｎｔｉｂｉｏｔ  Ｋｈｉｍｉｏｔｅｒ  ５０：３−７を参照されたい。この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）は、抗真菌活性を持つことが示されている。かくして、いくつかの実施形態において、��えば真菌微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の無力化が望まれる実施形態において、バクテリオシンは、ボトリシジンＡＪ１３１６またはアリリンＢ１のうちの少なくとも１つを含む。
【００３０】
例えば、いくつかの実施形態において、ラン藻の培養におけるバクテリオシンの活性が望ましい。いくつかの実施形態において、バクテリオシンは、ラン藻を無力化するために提供される。いくつかの実施形態において、バクテリオシンは、ラン藻の培養環境中に典型的に見出される侵入性の微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）を無力化するために提供される。保存されたバクテリオシンポリペプチドのクラスターが、多種多様なラン藻の種において同定されている。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ  ｉｎ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（７）：ｅ２２３８４（この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）中に報告されるように、少なくとも１４５個の推定バクテリオシン遺伝子クラスターが、少なくとも４３種のラン藻において同定されている。例示的なラン藻のバクテリオシンは、表１．２中に配列番号４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８および４５０として示される。
【００３１】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の関連の中で、バクテリオシンが微生物細胞に対して本明細書中で説明されるものと異なるメカニズムを介して作用し得るとしても、微生物宿主がバクテリオシンを含む培地で培養されているとき、最初の微生物宿主数と比較して、微生物宿主の数が少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれより多く減少した場合、バクテリオシンは活性があると言われ得る。この培養ステップの持続時間は、存在する微生物宿主の数をカウントすることによりバクテリオシンの活性を評価する前の、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間またはそれより長いものであり得る。活性は、顕微鏡下で細胞をカウントすることにより、または任意の公知の微生物技術により評価され得る。いくつかの実施形態において、微生物宿主がバクテリオシンを含む培地で培養されているとき、最初の微生物宿主集団と比較して、少なくとも指定された数またはパーセンテージ（ｐａｅｒｃｅｎｔａｇｅ）の微生物宿主において増殖が停止した場合、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の微生物宿主が停止した場合、バクテリオシンは活性がある。
【００３２】
本明細書中のいくつかの実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の関連の中で、バクテリオシンは、それぞれ配列番号１９８または２００を含むまたはこれらからなるアミノ酸配列により表されるＢ１７またはＣ７である。Ｂ１７およびＣ７は、本明細書中のいくつかの実施形態に従って、簡単に生産でき、使い易く、培養培地中で安定な選択剤であることが実験的に確認されている（実施例１を参照されたい）。本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸のうちのいくつかはまた、配列番号１９８または２００と少なくとも５０％の同一性を持つ、例えば配列番号１９８または２００と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を持つバクテリオシンの使用を包含する。Ｂ１７またはＣ７のかかるバリアントは、それらが少なくとも実質的なＢ１７またはＣ７の活性を呈するかぎり、本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸において用いられ得る。この関連において、「実質的な」とは、例えば、配列番号１９８または２００を持つＢ１７またはＣ７の活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０５、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも１００％またはそれより大きいことを意味する。バクテリオシンの活性は、本明細書中で先に記載されている。
【００３３】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の関連の中で、ならびに標的の微生物宿主および用いられるバクテリオシンに応じて、当業者は、培地中または寒天ペトリプレート中で用いられることになるバクテリオシンの濃度がわかる。バクテリオシンＢ１７またはＣ７を用いて、発明者らは、本明細書中の実施形態の方法および使用を実施することを可能にする、すなわち前記遺伝的活性の発現の利点を観察または可視化することを可能にする濃度で前記バクテリオシンを含む培養培地を調製することができた。前記活性の利点が自己複製性染色体外核酸分子を含む宿主の増殖を可能にすることであるならば、前記培地または寒天プレート中のバクテリオシンの量は、前記自己複製性染色体外核酸分子を受け取った微生物宿主が生存し増殖することを可能にする条件下で培養されている場合、最初の微生物細胞／宿主の数と比較して、前記自己複製性染色体外を含まない宿主の数が少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれより多く減少しているような量である。この評価ステップの持続時間は、少なくとも６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間またはそれより長いものであり得る。前記培養培地は、実質的なバクテリオシン活性を失うことなく滅菌され得る。この関連において、「実質的な」とは、例えば、滅菌前の培養培地中に存在するバクテリオシン活性の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超を意味する。
【００３４】
本明細書中のいくつかの実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸に適した第一の核酸配列、およびバクテリオシンに免疫性を提供するその産物が表２中に示される。
【００３５】
表２：バクテリオシンに対する免疫性を提供する例示的な核酸配列
【表３】
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【００３６】
表２のバクテリオシンに対する免疫性を提供する配列は天然起源であるが、当業者は、かかる分子のバリアント、表２のもの以外の天然起源の分子、または合成のものを、本明細書中のいくつかの実施形態に従って用いることができることを理解する。いくつかの実施形態において、特定のバクテリオシン、バクテリオシンの特定のクラスもしくはカテゴリーまたはバクテリオシンの特定の組み合わせに対する免疫性を付与する特定の分子または免疫性を付与する分子の特定の組み合わせ。分子が免疫性を付与することができる例示的なバクテリオシンは、表２中に同定される。表２は免疫性を付与する分子についての「起源生物」を同定しているが、免疫性を付与するこれらの分子は、本明細書中のいくつかの実施形態に従って、所望のバクテリオシン免疫活性を提供するために、他の天然起源の、遺伝子改変の、または合成の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）中で容易に発現させることができる。かくして、本明細書中で用いられるとき、「免疫調節因子」または「バクテリオシンに対する免疫性を付与または提供する分子」は、本明細書中に明確に提供される構造だけでなく、完全合成の免疫調節因子および本明細書中に開示されるバクテリオシンと機能的に等価であるバクテリオシンに対する免疫性を提供する免疫調節因子といった本明細書中に記載される「免疫調節因子」構造と実質的に同じ効果を持つ構造も包含する。
【００３７】
表２のポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、表２中に指し示される。当業者は、遺伝暗号は縮重され、そのうえ、コドン使用頻度は遺伝子産物が発現している特定の生物に基づいて変わり得て、かくして、特定のポリペプチドが１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされることができることを容易に理解する。いくつかの実施形態において、バクテリオシン免疫調節因子をコードするポリヌクレオチドは、バクテリオシン免疫調節因子を発現する生物のコドン使用頻度に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、バクテリオシン免疫調節因子をコードするポリヌクレオチドは、バクテリオシン免疫調節因子を発現する特定の生物に基づいてコドン最適化される。非常に広い範囲の機能的免疫調節因子が本明細書中に開示される免疫調節因子の特徴を取り込むことができ、それゆえに表２中の免疫調節因子との非常に広い程度の同一性を提供することができる。いくつかの実施形態において、免疫調節因子は、表２のポリペプチドのいずれか１つと少なくとも約５０％の同一性を、例えば、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を持つ。
【００３８】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の関連の中で、バクテリオシンに対する抵抗性または免疫性は、細胞がバクテリオシンを含む培地で培養されているとき、バクテリオシンを使用した培養ステップ終了時の微生物細胞の数が最初の微生物細胞の数と比較して減少しておらず、いくつかの実施形態において少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれより多く増加したことを意味し得る。この培養ステップの持続時間は、存在する微生物細胞の数をカウントすることによりバクテリオシンの活性を評価する前の、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間またはそれより長いものであり得る。
【００３９】
本明細書中のいくつかの実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸に適しており、そのコーディング産物が免疫性を付与する核酸分子は、ＭｃｂＧ（バクテリオシンＢ１７に対する免疫性）であり、これは配列番号６９９により表される。ＭｃｂＧは、本明細書中のいくつかの実施形態に従って、構成的または誘導的に選択可能マーカーとして有用であることが実験的に確認されている（実施例３を参照されたい）。別の好適な核酸は、配列番号７００により表されるＭｃｃＥ（バクテリオシンＣ７に対する免疫性）、または配列番号７０１により表されるそのｃ末端部分である。ＭｃｃＥは、ミクロシン／バクテリオシンに対して感受性である株におけるベクター選択マーカーとして用いられている（実施例２を参照されたい）。いくつかの実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸はまた、そのコーディング産物がバクテリオシンＢ１７および／またはＣ７に対する免疫性を付与し、かつ配列番号６９９、７００または７０１と少なくとも５０％の同一性を、例えば配列番号６９９、７００または７０１と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を持つ核酸分子の使用を包含する。かかるＭｃｂＧおよび／またはＭｃｃＥバリアントは、それらが少なくとも実質的なＭｃｂＧ（それぞれＭｃｃＥ）の活性を呈するかぎり、本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸において用いられ得る。この関連において、「実質的な」とは、例えば、配列番号６９９、７００または７０１を持つＭｃｂＧ（それぞれＭｃｃＥ）の活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％またはそれより大きいことを意味する。ＭｃｂＧ（それぞれＭｃｃＥ）のコーディング産物により付与される免疫性は、本明細書中で先に記載されている。
【００４０】
驚くべきことに、配列番号７０１により表されるＭｃｃＥのＣ末端部分は、バクテリオシンＣ７に対する抵抗性を付与するために十分であることが見出された。この関連において、部分は、例えば元の核酸分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより大きいものであることを意味する。これは、かかる短い核酸分子がバクテリオシンに対する抵抗性を付与することができる点で相当に魅力的であり、驚くべきことである。かかる短い核酸分子を含む自己複製性染色体外核酸分子は、微生物細胞に何らの負担を生じさせないものと予想される。
【００４１】
本明細書中のいくつかの実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸にさらに適しており、その産物がバクテリオシンに対する免疫性を提供する核酸分子は、その単一の産物が少なくとも２つの別個のバクテリオシンに対して免疫性を提供する単一の核酸分子である。いくつかの実施形態において、かかる核酸分子のかかる産物は、Ｂ１７およびＣ７に対する、またはＣｏｌＶおよびＣ７に対する、またはＣｏｌＶおよびＢ１７に対する、またはＢ１７、Ｃ７およびＣｏｌＶに対する免疫性を提供する。ＣｏｌＶをコードする核酸は、配列番号６５として同定され、対応するコーディングアミノ酸配列は、配列番号６４として同定される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、その産物がＢ１７およびＣ７に対する免疫性を提供する核酸分子は、配列番号７１５または７１６と少なくとも５０％の同一性を持つ、例えば配列番号７１５または７１６と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を持つ配列により表される。配列番号７１５は、ＭｃｃＥと融合したＭｃｂＧの核酸分子である。配列番号７１６は、本明細書中で先に記載される、ＭｃｃＥのＣ末端部分と融合したＭｃｂＧの核酸分子である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、その産物がＣｏｌＶおよびＣ７に対する免疫性を提供する核酸分子は、配列番号７１７または７１８と少なくとも５０％の同一性を持つ、例えば配列番号７１７または７１８と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を持つ配列により表される。配列番号７１７は、ＭｃｃＥと融合したＣｖｉの核酸分子である。配列番号７１８は、本明細書中で先に記載される、ＭｃｃＥのＣ末端部分と融合したＣｖｉの核酸分子である。
【００４４】
コア配列のかかる同一性バリアントは、本明細書中で先に記載される、それらが由来する分子の少なくとも実質的な活性を呈するかぎり、本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸において用いられ得る。
【００４５】
本明細書中のいくつかの実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸において、本明細書中に記載される、その産物が単一の、または１つ以上の、または少なくとも２つのバクテリオシンに対して免疫性を付与するこれらの核酸分子の各々は、本明細書中に記載されるプロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、弱プロモーターである。いくつかの実施形態において、弱プロモーターは、配列番号７０８により表されるｐｒｏＣプロモーター、または配列番号７０７により表されるＰ２４プロモーターであり、これは、実験的に確認されている（例として実施例３を参照されたい）。
【００４６】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸において有用である好適なコンストラクトは、その産物がバクテリオシンに対する免疫性を付与する第一の核酸分子を含むことができ、これらのコンストラクトは、配列番号７０２、７０３、７１０、７１１、７０４、７０５、７１２、７１３または７１４を含み得る、これらから本質的になり得る、またはこれらからなり得る。これらのコンストラクトの各々は、本出願の実験部の中に広範に記載されており、この実験部は、本明細書中のいくつかの実施形態に従って、これらのコンストラクトの各々が実際に構築されて好適であることが確認されたことを記している（例として、実施例１および２および３を参照されたい）。
【００４７】
いくつかの実施形態の方法において、培養培地に加えられるバクテリオシンは、本明細書中で同定されるＢ１７および／またはＣ７および／またはＣｏｌＶである。
【００４８】
この方法は、任意の目的産物の生産を可能にし得る。いくつかの実施形態の方法において、目的産物は、微生物バイオマス、自己複製性染色体外核酸分子、前記第二の核配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の転写産物、前記第二の配列によりコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドにより直接的もしくは間接的に生産される代謝物である。
【００４９】
いくつかの実施形態の方法において、目的産物は、培養ステップｃ）の終了時に精製される。これは、当業者に公知の技術を用いて実施され得る。
【００５０】
自己複製性染色体外核酸分子の存在に関連したエネルギー的な負担が最小化されているため、目的産物の収量は最適になると予想される。
【００５１】
この方法は、任意の好適な微生物細胞を、例えば宿主として用い得る。好適な微生物細胞は、一般的記述というタイトルの明細書の部分の中に収載される。それ自体が適した、および本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物および宿主における使用に適した微生物細胞としては、限定されるものではないが、細菌（例えば、グラム陰性細菌、例えばＥ．コリ種）、酵母、糸状真菌または藻類が挙げられる。いくつかの実施形態において、微生物細胞は、合成の微生物細胞である。
【００５２】
ある方法において、自己複製性染色体外核酸分子上に存在する第一の核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、誘導性である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い誘導性プロモーターである。前記プロモーターの誘導能は、第一の核酸配列の遺伝的活性の存在を制御する手段である。プロモーターは、当該技術分野で周知である。詳細な記述は、本明細書の一般的記述に特化した部分の中で提供される。プロモーターは、１または複数のコーディング配列の転写を駆動するために用いることができる。前記自己複製性染色体外核酸分子は、目的産物の生産に関与する第二の核酸配列を含んでもよく、ここで前記第二の核酸配列の遺伝的活性は、第一の配列のものから独立して制御される。
【００５３】
ある実施形態において、前記第二の核酸配列の遺伝的活性の制御は、第一の配列の遺伝的活性の制御から独立していない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、第二のプロモーターは、本明細書中に記載される目的産物の生産に関与している前記第二の核酸配列の発現を駆動する。ある実施形態において、第一のプロモーターは、本明細書中に記載される免疫調節因子ポリヌクレオチドの発現を駆動する。
【００５５】
本明細書中で用いることができるプロモーターは、それが作動可能に連結される核酸分子にとってネイティブでないものであり得て、すなわち、それが作動可能に連結される核酸分子（コーディング配列）にとって異種であるプロモーターであり得る。いくつかの実施形態のプロモーターは、それが作動可能に連結されるコーディング配列にとって異種であるが、いくつかの実施形態において、プロモーターは、同種、例として、微生物細胞にとって内因性である。いくつかの実施形態において、（ヌクレオチド配列にとって）異種のプロモーターは、コーディング配列にとってネイティブであるプロモーターよりも、コーディング配列を含む転写産物を高い定常状態レベルで生産する能力がある（または単位時間あたりより多くの転写産物分子、すなわちｍＲＮＡ分子を生産する能力がある）。いくつかのプロモーターは、いつでも変わらず転写を駆動することができる（「構成的プロモーター」）。いくつかのプロモーターは、例えば環境条件、化合物、遺伝子産物、細胞周期ステージなどの存在または不存在に応じて、選択環境下でのみ転写を駆動することができる（「コンディショナルプロモーター」または「誘導性プロモーター」）。
【００５６】
当業者は、所望の発現活性に応じて、適切なプロモーターを選択し、発現させる配列とシスに置くことができる（すなわち、つまりこれと作動可能に連結される）ことを理解する。例示的な活性を有する例示的なプロモーターは、本明細書中の表３．１〜３．１１中に提供される。当業者は、いくつかのプロモーターには特定の転写機構（例としてＲＮＡポリメラーゼ、基本転写因子など）との適合性があることを理解する。かくして、本明細書中に記載されるいくつかのプロモーターについて適合性のある「種」が同定されるが、本明細書中のいくつかの実施形態によると、これらのプロモーターは同定された種以外の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）において、例えば適合性のある内因性の転写機構を有する種、適合性のある転写機構を含む遺伝子改変種、または適合性のある転写機構を含む完全合成の微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）において容易に機能することができると考えられる。
【００５７】
本明細書中の表３．１〜３．１１のプロモーターは、Ｂｉｏｂｒｉｃｋｓ財団から公的に入手可能である。なお、Ｂｉｏｂｒｉｃｋｓ財団は、これらのプロモーターをＢｉｏＢｒｉｃｋ（商標）  Ｐｕｂｌｉｃ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ（ＢＰＡ）に従って使用することを奨励している。
【００５８】
本明細書中に記載される「コーディング」ポリヌクレオチド（例えば第一の核酸配列および／または目的産物（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｉｔｎｅｒｅｓｔ）の生産に関与する第二の核酸配列）のいずれも、一般に、所望のプロモーターの制御下で発現させることを受け入れられることが理解されるものである。ある実施形態において、第一の核酸配列は、第一のプロモーターの制御下にある。ある実施形態において、目的産物の生産に関与する第二の核酸配列は、第二のプロモーターの制御下にある。
【００５９】
一般に、特定の転写産物についての翻訳開始は、転写産物のコーディング配列の５‘末端における特定の配列により調節される。例えば、コーディング配列は、イニシエーターｔＲＮＡと対になるように構成された開始コドンから始まることができる。天然起源の翻訳系は典型的にＭｅｔ（ＡＵＧ）を開始コドンとして用いるが、イニシエーターｔＲＮＡは任意の所望のトリプレット（複数可）に結合するように設計することができ、したがって、ある種の実施形態において、ＡＵＧ以外のトリプレットも開始コドンとして機能することができることが容易に理解される。加えて、開始コドン付近の配列、例えば典型的な真核生物の翻訳系におけるコザック配列（（ｇｃｃ）ｇｃｃＮｃｃＡＵＧＧ、配列番号５４２、ここでＮは「Ａ」または「Ｇ」を表す）もしくは配列内リボソーム進入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ、ＩＲＥＳ）、または典型的な原核生物の翻訳系におけるシャイン・ダルガーノ配列（ＧＧＡＧＧＵ、配列番号５４３）は、リボソームのアセンブリを促すことができる。かくして、いくつかの実施形態において、「コーディング」ポリヌクレオチド配列、例えば第一の核酸配列、または発酵産物の生産に関与する第二の核酸配列を含む転写産物は、適切な開始コドンおよび翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態において、例えば、２つ以上の「コーディング」ポリヌクレオチド配列が転写産物上でシスに置かれたら、各ポリヌクレオチド配列は、適切な開始コドンおよび翻訳開始配列（複数可）を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、例えば、２つ以上の「コーディング」ポリヌクレオチド配列が転写産物上でシスに置かれたら、この２つの配列は単一の翻訳開始配列の制御下にあり、シスにコードされるポリペプチドの両方を伴って機能することができる単一のポリペプチドを提供するか、またはシスにコードされる２つのポリペプチドを分離するための手段、例えば２Ａ配列などを提供する。いくつかの実施形態において、免疫調節因子または産業上有用な分子の翻訳開始を調節するために、翻訳イニシエーター（ｉｎｔｉａｔｏｒ）ｔＲＮＡは調節可能である。
【００６１】
表３．１：例示的な金属感受性プロモーター
【表４】
2021506328.tif 000029
【００６２】
表３．２：例示的な細胞シグナル伝達応答性プロモーター
【表５】
2021506328.tif 000030
2021506328.tif 000031
【００６３】
表３．３：例示的な構成的Ｅ．コリσ７０プロモーター
【表６】
2021506328.tif 000032
2021506328.tif 000033
2021506328.tif 000034
【００６４】
表３．４：例示的な構成的Ｅ．コリσ８プロモーター
【表７】
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【００６５】
表３．５：例示的な構成的Ｅ．コリσ３２プロモーター
【表８】
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【００６６】
表３．６：例示的な構成的Ｂ．サチリスσＡプロモーター
【表９】
2021506328.tif 000037
【００６７】
表３．７：例示的な構成的Ｂ．サチリスσＢプロモーター
【表１０】
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【００６８】
表３．８：種々の原核生物からの例示的な構成的プロモーター
【表１１】
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【００６９】
表３．９：バクテリオファージＴ７からの例示的な構成的プロモーター
【表１２】
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【００７０】
表３．１０：酵母からの例示的な構成的プロモーター
【表１３】
2021506328.tif 000041
【００７１】
表３．１１：種々の真核生物からの例示的な構成的プロモーター
【表１４】
2021506328.tif 000042
【００７２】
上で参照されるプロモーターは、限定されない例としてのみ、提供される。プロモーターは、合成のプロモーターであり得る。本明細書中のいくつかの実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸に適したプロモーターは、本明細書中で先に記載されており、例として、本明細書中のいくつかの実施形態に従って実験的に確認されている配列番号７０８により表されるｐｒｏＣ（実施例２を参照されたい）、および本明細書中のいくつかの実施形態に従って実験的に確認されている配列番号７０７により表されるＰ２４（実施例３を参照されたい）である。いくつかの実施形態において、好適な誘導性プロモーターは、Ｐ２４  ＬａｃＯハイブリッドプロモーターであり、これは、ＬａｃＩの存在下で抑制され、ＩＰＴＧの存在下で活性がある。このプロモーターは、本明細書中のいくつかの実施形態に従って実験的に確認されている（実施例３を参照されたい）。
【００７３】
当業者は、上で参照されるプロモーターの多くのバリアントおよび多くの他のプロモーター（天然に存在する生物から単離されたプロモーター、そのバリエーション、および完全合成のまたは操作されたプロモーターを包含する）を、本明細書中のいくつかの実施形態に従って容易に用いることができることを容易に認識する。バリアント、完全合成または合成のプロモーター、またはエンジニアプロモーター（ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は、転写産物をコードする核酸分子と作動可能に連結されている対照または参照プラスミド中で試験したとき、前記プラスミドが細胞中に存在すると検出可能な量の前記転写産物分子が存在する場合に活性があるまたは機能すると言われ、したがって、本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸において用いることができる。バリアント、完全合成または合成のプロモーター、またはエンジニアプロモーターは、それが由来するプロモーターの活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％を持ち得る。
【００７４】
この方法は、前記自己複製性染色体外核酸分子を受け取った宿主が生存することを可能にする条件下で、前記微生物宿主を前記自己複製性染色体外核酸分子で形質転換することを含んでもよい。なお、いくつかの実施形態において、自己複製性染色体外核酸分子は微生物細胞中に提供され得て（例として、微生物細胞またはその前身が自己複製性染色体外核酸分子で形質転換された場合）、かくして、いくつかの実施形態において、形質転換ステップはこの方法において必要ではない。形質転換ステップは、ステップｃ）の培養の前に実施することができる。いくつかの実施形態において、形質転換ステップは、自己複製性染色体外核酸分子を含む宿主細胞を提供するためにステップａ）の前に提供される。いくつかの実施形態において、形質転換ステップにおいて用いられる自己複製性染色体外核酸分子は、任意選択ステップｂ）の第二の核酸をさらに含む。
【００７５】
微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）を遺伝子改変する技術は、当該技術分野で周知である（例えばＭ．Ｒ．ＧｒｅｅｎおよびＪ  ＳａｍｂｒｏｏｋによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌを参照されたい、この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、前記第一の核酸配列を含む自己複製性染色体外核酸分子を、および任意選択で目的産物の生産に関与する分子を含むように遺伝子改変される。ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に送達され得る。
【００７６】
ある実施形態において、微生物細胞は、前記自己複製性染色体外核酸分子を受け取った細胞が生存することを可能にする少なくとも１つの所与の条件に対応する第一の核酸配列の遺伝的活性によりポジティブに選択され、前記条件は環境条件であることができる。環境条件は、培養培地であり得る。
【００７７】
微生物細胞を柔軟に遺伝子改変すること、例えば、遺伝的活性の所望のタイプおよび／またはスペクトルを持つように微生物細胞を設計または再設計することは、有用であり得る。いくつかの実施形態において、１または複数の所望の別個の第一の核酸配列を挿入するためのカセットが提供される。例示的なカセットとしては、限定されるものではないが、Ｃｒｅ／ｌｏｘカセットまたはＦＬＰ／ＦＲＴカセットが挙げられる。
【００７８】
ある実施形態において、微生物細胞は、本明細書中に記載される第一の核酸配列を含む異なる自己複製性染色体外核酸分子を１つより多く（２つより多く、３つより多く、・・・）含み、このことは、前記細胞が１つより多く（２つより多く、３つより多く、・・・）の遺伝的活性を呈することができ、各遺伝的活性は細胞に利点を付与することを意味する。第一のプロモーターが各々の異なる自己複製性染色体外核酸分子の中に存在するならば、各々の前記第一のプロモーターは、異なるものであっても同一のものであってもよい。したがって、目的産物を生産するための方法であって、微生物宿主が１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの別個の染色体外核酸分子を含み、各々が前記微生物宿主に対して別個の遺伝的活性を付与する前記方法において、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの別個のバクテリオシンを用いることは、本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の範囲内である。あるいは、その産物が少なくとも別個のバクテリオシンに対する免疫性を提供する単一の核酸分子が用いられることは、本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸の範囲内である。かかる核酸分子は、本明細書中に記載されている。
【００７９】
いくつかの実施形態において、所望のプラスミドを「ドナー」微生物細胞からレシピエント微生物細胞に導入するため、プラスミド接合を用いることができる。Ｇｏｎｉ−Ｍｏｒｅｎｏ，ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｗｉｒｉｎｇ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（６）：ｅ６５９８６、この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、プラスミド接合は、接合プラスミドをドナー微生物細胞からレシピエント微生物細胞に導入することにより、レシピエント微生物細胞を遺伝子改変することができる。何らかの特定の理論により限定されるものではないが、同じまたは機能的に同じ複製遺伝子セットを含む接合プラスミドは、典型的には、同じ微生物細胞の中で共存することができない。かくして、いくつかの実施形態において、プラスミド接合は、レシピエント細胞中に存在していた別の接合プラスミドにとって代えるために新たな接合プラスミドを導入することにより、レシピエント微生物細胞を「リプログラム」する。いくつかの実施形態において、プラスミド接合は、第一の核酸分子（いくつかの実施形態において免疫調節因子をコードすることができる）の特定の組み合わせを使用して微生物細胞を設計する（または再設計する）ために用いられる。いくつかの実施形態によると、第一の酸配列（ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（いくつかの実施形態において免疫調節因子をコードすることができる）の異なる組み合わせを含む様々な接合プラスミドが提供される。プラスミドは、本明細書中に記載される付加的な遺伝的エレメント、例えばプロモーター、翻訳開始部位などを含むことができる。いくつかの実施形態において、所望のプラスミドを含むドナー細胞をプラスミド接合のために選択することができるように、様々な接合プラスミドがドナー細胞のコレクション中に提供される。いくつかの実施形態において、免疫調節因子の特定の組み合わせが選択され、組み合わせを含む接合プラスミドをレシピエント細胞に導入するため、適切なドナー細胞が目的の微生物細胞と接合される。いくつかの実施形態において、レシピエント細胞は、例えば、培養の中に導入するための、または培養を始めるために導入するための、「新たに設計された」細胞である。
【００８０】
ステップｂ）
ステップａ）に加えて、いくつかの実施形態において、この方法は、前記自己複製性染色体外核酸分子が前記目的産物の生産に関与する第二の核酸配列を含む任意選択のステップｂ）であって、前記第二の核酸配列の遺伝的活性が第一の配列のものから独立して制御される、前記ステップをさらに含む。
【００８１】
本明細書中の実施形態の方法、使用、組成物、宿主および核酸との関連で、表現「独立して制御される」は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、第一および第二の核酸配列の遺伝的活性を制御するために別個の方法が用いられることを意味することを包含する。核酸配列の遺伝的活性を制御する方法は、既に本明細書中に詳細に記載されている。
【００８２】
ステップｃ）
いくつかの実施形態において、ステップａ）（本明細書中に記載される形質転換を包含してもよい）および任意選択のステップｂ）の後にステップｃ）が続き、これは、前記形質転換微生物宿主が自己複製性染色体外分子を維持するための所与のレベルまで第一の核酸配列を発現することを可能にする条件下で前記形質転換微生物宿主を培養することで増殖中の微生物集団とすることを含む。いくつかの実施形態において、任意選択で前記目的産物をコードする第二の配列を制御すること。
【００８３】
いくつかの実施形態の方法において、ステップｃ）の少なくとも一部の条件は、第一の核酸配列が前記遺伝的活性を呈さないようなものである。「ステップｃ）の一部」は、例えば、ステップｃ）の持続時間のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％または１００％までを意味する。方法のこの実施形態は、第一の核酸配列の遺伝的活性の存在なくしてステップｃ）の一部が実施されることから、相当に魅力的である。前記遺伝的活性の存在は、微生物宿主細胞にとってエネルギー的な負担となり、目的産物の好適な産生レベルを保つために必ずしも必要ではない。いくつかの実施形態において、第一の核酸配列の遺伝的活性を伴わないステップｃ）の部分があり、その後に前記活性を伴う部分があることが想定される。これらの２つの部分は、ステップｃ）の間に１または複数回、繰り返され得る。
【００８４】
微生物細胞は、任意の好適な微生物培養環境中で培養され得る。微生物培養環境は、多種多様な培養培地、例えば原料を含むことができる。具体的な培養培地の選択は、所望の用途に依存し得る。培養培地の条件としては、化学的組成だけでなく、温度、光量、ｐＨ、ＣＯ２レベルなども挙げられる。培養培地は、バクテリオシンを含むことができる。ある実施形態において、バクテリオシンの活性を誘導する化合物は、原料の中ではなく原料の外部に存在する。
【００８５】
ある実施形態において、本明細書中に記載される遺伝子改変または形質転換微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、少なくとも１つの原料を含む培養培地に添加される。ある実施形態において、培養培地は、免疫調節因子の活性または発現を誘導する化合物を含む。
【００８６】
用語「原料」は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、例えば工業プロセスとの関連で、微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）により消費され、発酵され、精製され、改変され、あるいは処理され得る材料を包含する。かくして、「原料」は食品または食品製品に限定されない。本明細書中で用いられるとき、「原料」は、培養培地のカテゴリーである。したがって、本明細書中で用いられるとき、「培養培地」は、限定されるものではないが原料を包含する。かくして、本明細書中で「培養培地」に言及されるとき、常に原料もまた明確に考えられる。
【００８７】
形質転換微生物細胞を培養する前に、効果を決定すること、またはもしあるならば、前記自己複製性染色体外核酸分子を受け取った宿主が生存することおよび任意選択で増殖することを可能にする条件を最適化することが有用であり得る。
【００８８】
いくつかの実施形態において、その遺伝的活性が微生物宿主に利点を付与する第一の核酸配列を含み、ここで前記第一の核酸配列の遺伝的活性は制御され、および目的産物の生産に直接的または間接的に関与する第二の核酸配列を含んでもよい、自己複製性染色体外核酸分子を含む微生物細胞または微生物宿主または微生物宿主細胞または合成の微生物宿主細胞が提供される。
【００８９】
いくつかの実施形態において、その遺伝的活性が微生物宿主に利点を付与する第一の核酸配列を含み、ここで前記第一の核酸配列の遺伝的活性は制御され、および目的産物の生産に直接的または間接的に関与する第二の核酸配列を含んでもよい、自己複製性染色体外核酸分子が提供される。
【００９０】
この微生物宿主およびこの自己複製性染色体外核酸分子の各特徴は、本明細書中に既に記載されている。
【００９１】
一般的記述
本明細書中で用いられる用語は、本開示を考慮して読んだときに当業者により理解される慣例的かつ普通の意味を持ち、次の一般的記述を包含することができる。
【００９２】
微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）
本明細書中で用いられるとき、「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」、「微生物細胞」または「微生物宿主」およびこれらの語根のバリエーション（例えば複数化など）は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、任意の天然起源の種または合成もしくは完全合成の原核生物もしくは真核生物の単細胞生物、同様に古代種（Ａｒｃｈａｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）を包含する。それゆえに、この表現は、細菌種、真菌種および藻類の細胞を指すことができる。本明細書中の実施形態に従って用いることができる例示的な微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）としては、限定されるものではないが、細菌、酵母、糸状菌および藻類、例えば光合成性微細藻類が挙げられる。さらには、完全合成の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）ゲノムを合成して単一の微生物細胞内に移植することで、連続的な自己複製能力がある合成の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を生産することができる（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），“Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９：５２−５６を参照されたい、この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。かくして、いくつかの実施形態において、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は完全合成である。遺伝子発現を調節するエレメントおよび遺伝子産物をコードするエレメント（例えば免疫調節因子、毒素、解毒物質および産業上有用な分子であり、目的産物とも呼ばれる）といった遺伝的エレメントの所望の組み合わせは、所望のシャシーに載せて、部分的または完全合成の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）内にアセンブルすることができる。産業用途のための遺伝子改変された微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の記述は、Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  “Ｂｕｉｌｄｉｎｇ−ｉｎ  ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５９：１２２１−１２３５中にも見出すことができる。遺伝的エレメントの好適な実施形態は、本明細書中で後に記載される。
【００９３】
様々な細菌の種および株を本明細書中の実施形態に従って用いることができ、遺伝子改変バリアントまたは公知の種の「シャシー」をベースとした合成細菌を提供することができる。本明細書中の実施形態に従って用いることができる、産業上利用可能な特質を有する例示的な細菌としては、限定されるものではないが、バチルス属種（例えばバチルス・コアグランス、バチルス・サチリスおよびバチルス・リケニホルミス）、パエニバチルス属種、ストレプトマイセス属種、ミクロコッカス属種、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ラン藻の種、サルモネラ属種、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、シュードモナス属種、ラクトバチルス属種、エンテロコッカス属種、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、クレブシエラ属種、パエニバチルス属種、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、コリネバクテリウム属種、ブレビバクテリウム属種、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、クロストリジウム・サーモセルス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｓ）およびエシェリキア・コリが挙げられる。
【００９４】
様々な酵母の種および株を本明細書中の実施形態に従って用いることができ、遺伝子改変バリアントまたは公知の種の「シャシー」をベースとした合成酵母を提供することができる。本明細書中の実施形態に従って用いることができる、産業上利用可能な特質を有する例示的な酵母としては、限定されるものではないが、サッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、カンジダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ））、シゾサッカロマイセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シゾサッカロマイセス・ジャポニカス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃａｓ））、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）またはハンゼヌラ属種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはハンゼヌラ・ポリモルフド（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｄ））、およびブレタノマイセス属種（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、ブレタノマイセス・クラウセニイ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ））が挙げられる。
【００９５】
様々な藻類の種および株を本明細書中の実施形態に従って用いることができ、遺伝子改変バリアントまたは公知の種の「シャシー」をベースとした合成藻類を提供することができる。いくつかの実施形態において、藻類は、光合成微細藻類を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる。バイオ燃料のために有用であることができて、本明細書中の実施形態に従って用いることができる例示的な藻類としては、ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）、クロレラ属種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、グラシラリア属種（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、プレウロクリシス・カルテラエ（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｃａｒｔｅｒａｅ）、およびサルガッサム属種（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が挙げられる。加えて、多くの藻類が、食品製品、肥料製品、廃棄物の中和、環境浄化、および炭水化物の製造（例えば、バイオ燃料）のために有用であることができる。
【００９６】
様々な糸状菌の種および株を本明細書中の実施形態に従って用いることができ、遺伝子改変バリアントまたは公知の種の「シャシー」をベースとした合成糸状菌を提供することができる。本明細書中の実施形態に従って用いることができる、産業上利用可能な特質を有する例示的な糸状菌としては、限定されるものではないが、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスパエリア（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリフォネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシジア（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペクス（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルプス（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス（メリピルス）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカフィマスティクス（Ｎｅｏｃａｆｆｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペキロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシフィウム（Ｐｅｎｉｃｉｆｆｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニンファ（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）またはキシラリア（Ｘｙｌａｒｉａ）が挙げられる。
【００９７】
種としては、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナ・ターン（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａ  ｔｕｒｎ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・サルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナトルン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｒｎ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌ��  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペクス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プロプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・オウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメチ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・サブサーモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられる。
【００９８】
抗生物質
「抗生物質」およびこの語根のバリエーションは、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、少なくとも１つの微生物細胞を殺傷するまたは増殖を停止させることができる代謝物または代謝経路の中間体を包含する。いくつかの抗生物質は、微生物細胞、例えば細菌に生産させることができる。いくつかの抗生物質は、化学的に合成することができる。少なくとも、バクテリオシンは遺伝子産物（いくつかの実施形態においては、付加的な翻訳後プロセシングを受けたもの）またはその合成アナログを指し、抗生物質は代謝経路の中間体もしくは産物またはそれらの合成アナログを指す点で、バクテリオシンは抗生物質と別個のものと理解される。
【００９９】
配列同一性および類似性
配列同一性は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、配列を比較することにより決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係を包含する。通常、配列同一性または類似性は、比較される配列の全長にわたって比較される。当該技術分野において、「同一性」も、場合によってはかかる配列のストランド間のマッチにより決定される、アミノ酸または核酸配列間の配列の関連性の程度に言及することができる。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換を第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定することができる。「同一性」および「類似性」は、当業者に公知の様々な方法により容易に計算することができる。いくつかの実施形態において、配列同一性は、本明細書中で同定される配列の全長を比較することにより決定される。
【０１００】
同一性を決定するためのいくつかの方法は、試験される配列間の最大マッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラム中に成文化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するためのコンピュータープログラム方法としては、例として、ＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に入手可能なＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０）が挙げられる（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４）。用いられるアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳ（ワールドワイドウェブ上、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎにおいてアクセス可能）であることができる。ＥＭＢＯＳＳを用いたアミノ酸配列比較のためのパラメーターとしては、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列を挙げることができる。ＥＭＢＯＳＳを用いた核酸配列比較のためのパラメーターとしては、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、ＤＮＡ完全行列（ＤＮＡ同一性行列）を挙げることができる。
【０１０１】
任意選択で、アミノ酸類似性の程度の決定において、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることもあり得て、これは当業者に明らかである。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を持つ残基の交換可能性を指す。例えば、脂肪族側鎖を持つアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を持つアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を持つアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を持つアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を持つアミノ酸のグループはリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を持つアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換グループとしては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンが挙げられる。本明細書中に開示されるアミノ酸配列の置換的バリアントは、開示される配列中の少なくとも１つの残基が取り除かれ、異なる残基がその場所に挿入されているものである。いくつかの実施形態において、アミノ酸の変化は保存的である。天然起源アミノ酸の各々に適した保存的置換としては、Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；  Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕまたはｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎまたはｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅ；およびＶａｌからｉｌｅまたはｌｅｕが挙げられる。
【０１０２】
同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）
用語「同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子および所与の宿主生物または宿主細胞間の関係を指し示すために用いられる場合を包含して、天然において核酸またはポリペプチド分子が同じ種の、任意選択で同じ品種または株である宿主細胞または生物により産生されることを意味するものと理解することができる。宿主細胞と同種であるならば、ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的には、その天然の環境中よりも別のプロモーター配列に作動可能に連結される。２つの核酸配列の関連性を指し示すために用いられる場合、用語「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズし得る１つの一本鎖核酸配列を指すことができる。ハイブリダイゼーションの程度は、先に提示したように、配列間の同一性の量ならびにハイブリダイゼーション条件、例えば温度および塩濃度などといったいくつもの要因に依存し得る。同一性の領域は約５ｂｐより大きいものであることができ、同一性の領域は１０ｂｐより大きいものであることができる。いくつかの実施形態において、２つの核酸またはポリペプチド配列は、８０％超の同一性を持つ場合に相同であると言われる。
【０１０３】
異種
用語「異種」は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質に関して用いられた場合を包含して、それが存在する生物、細胞、ゲノムもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の一部として天然にはない、または天然においてそれが見出されるものとは異なる細胞もしくはゲノムもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列中の位置（複数可）において見出される核酸またはタンパク質（ポリペプチドまたは酵素とも称される）を指すことができる。異種の核酸またはタンパク質は、それが導入される細胞にとって内因性ではないが、別の細胞から得られており、または合成的もしくは組換え的に生産されている。一般に、必然的ではないが、かかる核酸は、ＤＮＡが転写または発現した細胞により普通は生産されないタンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞において普通は発現しないタンパク質をコードする。異種の核酸およびタンパク質はまた、外来核酸またはタンパク質とも呼ばれ得る。それが発現する細胞にとって異種または外来であると当業者が認識する任意の核酸またはタンパク質は、異種の核酸またはタンパク質という用語により本明細書中に包含される。異種という用語はまた、核酸またはアミノ酸配列の非天然の組み合わせ、すなわち組み合わせ配列の少なくとも２つが互いにとって外来である組み合わせにも当てはまる。
【０１０４】
作動可能に連結される
本明細書中で用いられるとき、用語「作動可能に連結される」は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメント（またはコーディング配列または核酸配列または核酸分子）の連結を指すことができる。核酸配列は、別の核酸配列と機能的関係になるように置かれたとき、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を与えるならば、コーディング配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、連結される核酸配列が典型的には近接することを意味し、２つのタンパク質のコーディング領域をつなぐことが必要な場合は、近接してリーディングフレームに入ることを意味する。
【０１０５】
プロモーター
本明細書中で用いられるとき、用語「プロモーター」は、本開示を考慮して当業者により理解されるような慣例的かつ普通の意味を持ち、１または複数の核酸分子の転写を制御するように機能する、核酸分子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置する核酸断片を指すことができ、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、ならびに限定されるものではないが転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクティベータータンパク質結合部位といった任意の他のＤＮＡ配列、並びにプロモーターからの転写の量を調節／制御するように直接的または間接的に作用することが当業者に公知である任意の他のヌクレオチド配列の存在により構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、大半の環境および発生条件下で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境および発生的な調節の下で活性があるプロモーターである。
【０１０６】
本書類およびその特許請求の範囲において、動詞「含むこと」およびその活用形は、限定されない意味で、その言葉に続く項目が包含されるが、具体的に言及されない項目が除外されないことを意味するように用いられる。加えて、動詞「なること」は、「から本質的になること」により置き換えられ得て、本明細書中で定義される自己複製性染色体外核酸分子、微生物宿主（または方法）が具体的に同定されたものよりも付加的な構成成分（複数可）（または付加的なステップ）を含み得て、前記付加的な構成成分（複数可）（または付加的なステップ）は本発明の固有の性質を変えないことを意味する。加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」によるエレメントへの言及は、エレメントがただ１つであることを文脈が明確に必要としないかぎり、エレメントが１つより多く存在する可能性を除外しない。それゆえに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【０１０７】
本明細書中で引用される全ての特許および参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。次の例は、説明の目的のみのために提示され、本発明の範囲を限定することを全く意図しない。
【０１０８】
配列表（特に指示がない限りＤＮＡ）
配列番号１  エンテロコッカス・フェカリス  ペプチド
配列番号２  バクテリオシンのモチーフ特質
配列番号３  ハイブリッドバクテリオシン、Ｅｎｔ３５−ＭｃｃＶ
配列番号４〜６９８、７２０〜７５９：表１〜３中の配列（表中に指し示されるように、半分はＤＮＡ／半分はタンパク質）
配列番号６９９  ＭｃｂＧ
配列番号７００  ＭｃｃＥ
配列番号７０１  ＭｃｃＥのＣ末端部分
配列番号７０２  ｐＳｙｎ２−ＭｃｂＧ
配列番号７０３  ｐＳｙｎ２−ＭｃｂＥ／Ｆ
配列番号７０４  ｐＭｃｂＧ１．０
配列番号７０５  ｐＭｃｂＧ．１．１．
配列番号７０６  ＭｃｃＥのＣ末端部分（アミノ酸）
配列番号７０７  Ｐ２４プロモーター
配列番号７０８  ｐｒｏＣプロモーター
配列番号７０９  Ｃｖｉ
配列番号７１０  ｐｒｏＣ−ＭｃｂＧ−ＣｔｅｒＭｃｃＥ（ｐｒｏｃ）（ＣｔｅｒはＣ末端により置き換えることができる）
配列番号７１１  ｐｒｏＣ−Ｃｖｉ−Ｃｔｅｒ−ＭｃｃＥ（ｐｒｏｃ）（ＣｔｅｒはＣ末端により置き換えることができる）
配列番号７１２  ｐＢＡＣＴ５．０
配列番号７１３  ｐＢＡＣＴ２．０
配列番号７１４  ｐＢＡＣＴ５．０−ｍｃｈｅｒｒｙ
配列番号７１５  ＭｃｂＧ−ＭｃｃＥ
配列番号７１６  ＭｃｂＧ−Ｃｔｅｒ部分ＭｃｃＥ（ＣｔｅｒはＣ末端により置き換えることができる）
配列番号７１７  Ｃｖｉ−ＭｃｃＥ
配列番号７１８  Ｃｖｉ−Ｃｔｅｒ部分ＭｃｃＥ（ＣｔｅｒはＣ末端により置き換えることができる）
配列番号７１９：ベクターｐＵＣ−ＣｏｌＶ
図の説明
図１：構成：ｐＳｙｎ２−ＭｃｂＥ／Ｆ：Ｐｔａｃの下に遺伝子ＭｃｂＥおよびＦを含有する。
【０１０９】
図２：構成：ｐＳｙｎ２−ＭｃｂＧ：Ｐｔａｃの下に遺伝子ＭｃｂＧを含有する。
【０１１０】
図３：構成：ｐＭｃｂＧ  １．１：Ｐ２４の下に遺伝子ＭｃｂＧを含有する。
【０１１１】
図４：構成：ｐＭｃｂＧ  １．０：Ｐ２４  ＬａｃＯの下に遺伝子ＭｃｂＧを含有する。
【０１１２】
図５：ｐＢＡＣＴ５．０ベクター
図６：ｐＢＡＣＴ２．０ベクター
図７：ｐＢＡＣＴ５．０−ｍｃｈｅｒｒｙベクター
図８：プロモーターの調整。インダクターの非存在下では（上部）、リプレッサーはオペレーターと結合して選択遺伝子の発現を妨げることができる。インダクターの存在下では（下部）、リプレッサーはオペレーターと結合することができず、選択遺伝子の発現が可能になる。
【０１１３】
図９：ＫａｎＲ（ｐＫａｎ−ｐＬａｃ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ６．０−ｐＬａｃ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるタンパク質Ｘの過剰発現の比較。５ｍｇの総抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した。
【０１１４】
図１０：ＫａｎＲ（ｐＫａｎ−Ｔ７ｐｒｏｍ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ５．０−Ｔ７ｐｒｏｍ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるイオタ−カラギナーゼタンパク質の過剰発現の比較。５ｍｇの総抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した。
【０１１５】
図１１：ＫａｎＲ（ｐＫａｎ−Ｔ７ｐｒｏｍ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ５．０−Ｔ７ｐｒｏｍ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるラムダ−カラギナーゼタンパク質の過剰発現の比較。５ｍｇの総抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：選択剤としてのバクテリオシンＢ１７およびＣ７の使用剤
１．バクテリオシンＢ１７、Ｃ７およびＣｏｌＶの生産
使用した株：Ｃ６００：Ｆ−  ｔｏｎＡ２１  ｔｈｉ−１  ｔｈｒ−１  ｌｅｕＢ６  ｌａｃＹ１  ｇｌｎＶ４４  ｒｆｂＣ１  ｆｈｕＡ１  λ−
Ａｐｐｌｅｙａｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９（１９５４），４４０−４５２中に記載されている。
【０１１７】
Ｍｉｃ  Ｂ１７の生産のために使用したベクターは下の表中に記載される。
【０１１８】
表Ｘ：Ｍｉｃ  Ｂ１７の生産のために使用したベクター
使用したコンストラクト  ｐＣＩＤ９０９
ｍｃｃＢ１７産生遺伝子（ｍｃｂＡＢＣＤＥＦＧ）を含有するｐＡＣＹＣ１８４、クロラムフェニコール抵抗性
これらのコンストラクトは、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｓａｉｎｚ，Ｍ．Ｃ．，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：１９２１−１９３２中に詳細に記載されたものである。
【０１１９】
Ｍｉｃ  Ｃ７を生産するために使用したベクターは、Ｐｐ７０である。このベクターはｐＢＲ３２２ベースであり、ｍｃｃ遺伝子クラスターを有する約６０００ｂｐのＤＮＡ断片を保有する（Ｚｕｋｈｅｒ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．１９  １１８９１−１１９０２中に記載される）。
【０１２０】
ＣｏｌＶを生産するために使用したベクターは、ｐＵＣ−ＣｏｌＶ（配列番号７１９）である。このベクターはｐＵＣ５７ベースであり、ＣｏｌＶ遺伝子クラスターを有する約５０００ｂｐのＤＮＡ断片を保有する。
【０１２１】
これらの組換えベクターを宿した株を、ＬＢ培地中、３７℃で増殖させた。一晩培養後、発酵培地を遠心分離し、上清を０．２ミクロンのフィルターでろ過した（ｆｌｉｔ  ｒｅｄ）。
【０１２２】
上清中に存在するバクテリオシン活性を、感受性株を含有するプレート上の拡散阻害増殖（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ）のサイズにより推定した。
【０１２３】
２．結果
本発明者らは、Ｂ１７、Ｃ７またはＣｏｌＶ活性を呈する上清を、培養培地中に加えられる古典的抗生物質、例えばＡｍｐ、ＫａｎまたはＣｈｌｏなどとして用いることができることを実証した。かかるバクテリオシン活性を提示する上清を数ヶ月間（少なくとも１２ヶ月間）−２０℃で保存したが、活性の著しい減少は認められなかった。かかるバクテリオシン活性を有する培地を含有するペトリプレートを＋４℃で数週間（少なくとも４週間）保存した。本発明者らは、活性の減少を認めなかった。したがって、本発明者らは、培養培地中に存在するかかるＢ１７、Ｃ７またはＣｏｌＶ活性は安定であることを実証した。
【０１２４】
３．結論
実験室中での発酵により産生されるバクテリオシンＢ１７、Ｃ７およびＣｏｌＶは、簡単に生産でき、使い易く、培養培地中で安定な選択剤である。これらの性質は、古典的な選択剤として用いられる抗生物質のものと同様である。
【０１２５】
実施例２：Ｃ７およびＢ１７に対する抵抗性の付与に必要とされる最小の遺伝的エレメントの同定
１．必要なベクターの構築
文献は、Ｂ１７バクテリオシン：Ｂ１７のための配列番号６９９により表されるＭｃｂＧおよびポンプ（Ｂ１７のためのＭｃｂＥおよびＭｃｂＦ、配列番号７０３により表される）の場合にも、それ自身のバクテリオシンの生産に対する宿主の生産のために必要なエレメントを決定することを可能にした。これらの遺伝子は、必要である（またはより正確には、バクテリオシンＢ１７の作用に対する保護に関与する）ことが知られている。Ｂ１７遺伝子座についての文献は、それがどれであるか、または抵抗性を与えるために十分なエレメントはどれであるかを同定していない。
【０１２６】
本発明者らは、Ｂ１７免疫性構造から遺伝子を分離し、これらをベクター中で、誘導性プロモーター（Ｐｔａｃ）の後ろにそれらをクローニングした。
【０１２７】
構築物：ｐＳｙｎ２−ＭｃｂＧ（図２、配列番号７０２）：Ｐｔａｃの下に遺伝子ＭｃｂＧを含有する
構築物：ｐＳｙｎ２−ＭｃｂＥ／Ｆ（図１、配列番号７０３）：Ｐｔａｃの下に遺伝子ＭｃｂＥおよびＦを含有する
本発明者らは、Ｂ１７免疫性構造から遺伝子を分離し、それらをベクター中で、誘導性プロモーター（Ｐｔａｃ）の後ろにクローニングした。
【０１２８】
本発明者らは、ＭｃｂＧの低発現（Ｐｔａｃは誘導されない）は株に対する抵抗性の表現型を与えるために十分であること、他方、ＭｃｂＥ／Ｆの存在は毒性であり、Ｂ１７の存在に関係して提供される保護についての応答を与えさせなかったことを示した。
【０１２９】
２．結果
驚くべきことに、配列番号７０１により表されるＭｃｃＥのＣ末端部分は、バクテリオシンＣ７に対する抵抗性を付与するために十分であることが見出された。
【０１３０】
本発明者らは、それぞれＢ１７およびＣ７に対する抵抗性を与えるためにベクター中にクローニングした場合にＭｃｂＧおよびＭｃｃＥ遺伝子（または配列番号７０１により表されるトランケートのＭｃｃＥ）のプラスミドからの発現が可能であること、ならびに、これらのタンパク質をこれらのミクロシン／バクテリオシンに感受性である株においてベクター選択マーカーとして用いることができることを実証した。使用したベクターは、ｐＢＡＣＴ２．０（図６、配列番号７１３）である。
【０１３１】
配列番号７１０は、コンストラクトｐｒｏＣ−ＭｃｂＧ−ＣｔｅｒＭｃｃＥを表す。
【０１３２】
本発明者らは、それぞれＣｏｌＶおよびＣ７に対する抵抗性を与えるためにベクター中にクローニングした場合にＣｖｉおよびＭｃｃＥ遺伝子のＣ末端部分のプラスミドからの発現が可能であること、ならびに、これらのタンパク質をこれらのミクロシン／バクテリオシンに感受性である株においてベクター選択マーカーとして用いることができることを実証した。使用したベクターは、ｐＢＡＣＴ５．０（図５、配列番号７１２）である。
【０１３３】
配列番号７１１は、コンストラクトｐｒｏＣ−Ｃｖｉ−ＣｔｅｒＭｃｃＥを表す。
【０１３４】
３．結論
したがって、配列番号７０１により表される小さいサイズの単一セグメントをＣ７に対する選択マーカーとして用いることが可能である。
【０１３５】
実施例３：細菌からのエネルギーをほとんどまたは全く用いない選択可能マーカーをＭｃｂＧから作成することができるか？
１．構築したベクター
この疑問に答えるため、ＭｃｂＧ遺伝子を弱プロモーターＰ２４（配列番号７０７）の下にクローニングした。Ｐ２４プロモーターは、Ｂｒａａｔｓｃｈ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ２００８  Ｓｅｐ；４５（３）：３３５−７中に記載されたものである。
【０１３６】
本発明者らは、Ｂ１７  ＭｃｂＧ免疫性構造遺伝子を挿入し、後者をベクター中で弱い構成的プロモーター（Ｐ２４）の後ろにクローニングした。ＬａｃＩの存在下で抑制され、ＩＰＴＧの存在下で活性がある誘導性プロモーターであるＰ２４  ＬａｃＯハイブリッドプロモーターを使用して、第二のコンストラクトを作成した。
【０１３７】
構築物：Ｐ２４  ＬａｃＯの下に遺伝子ＭｃｂＧを含有するｐＭｃｂＧ  １．０（図４、配列番号７０４）
構築物：Ｐ２４の下に遺伝子ＭｃｂＧを含有するｐＭｃｂＧ  １．１（図３、配列番号７０５）
使用した株は以下のものである：
ＢＬ２１（ＤＥ３）：ｆｈｕＡ２［ｌｏｎ］  ｏｍｐＴ  ｇａｌ（λ  ＤＥ３）［ｄｃｍ］ΔｈｓｄＳ
λ  ＤＥ３＝λ  ｓＢａｍＨＩｏ  ΔＥｃｏＲＩ−Ｂ  ｉｎｔ：：（ｌａｃＩ：：ＰｌａｃＵＶ５：：Ｔ７遺伝子１）ｉ２１  Δｎｉｎ５
ＢＬ２１（ＤＥ３）株をベクターｐＭｃｂＧ１．０またはｐＭｃｂＧ１．１（図３または４を参照されたい）で形質転換した。形質転換後、形質転換体を、Ｂ１７を含有するプレート上で選択した。単離コロニーを再度増殖させ、それらが含有したプラスミドを、適切な制限酵素での処理の後にゲル電気泳動により分析した。
【０１３８】
２．結果
本発明者らは、ＭｃｂＧの弱い転写はＢ１７に対する抵抗性を与えるために十分であることを示した。加えて、本発明者らは、この選択マーカーはＰ２４  ＬａｃＯプロモーターを介して誘導可能であること、およびこの遺伝子を含有するベクターはＩＰＴＧの存在下でのみ抵抗性の表現型を与えることを示している。
【０１３９】
３．結論
ＭｃｂＧ遺伝子は、構成的または誘導的に選択可能なマーカーとして用いることが可能である。それゆえに、プロセス中の必要に応じた低レベルでの構成的発現および誘導性発現は、産生細胞からプラスミドを喪失することなく、産生細胞にとってのエネルギー的な負担を低減することを可能にすることが示される。
【０１４０】
実施例４：ｍ−ｃｈｅｒｒｙタンパク質の生産
配列番号７１４は、ｍ−ｃｈｅｒｒｙタンパク質を生産するために用いられるコンストラクトを表す。このコンストラクトは図７中に表現される。
【０１４１】
ｍ−ｃｈｅｒｒｙタンパク質は産生され、ＩＰＴＧの存在下、ペトリ皿上で赤色になる細菌コロニーとして可視化された。
【０１４２】
実施例５：プロモーターの調整
本発明者らは、調整可能な免疫性選択を有するベクターを調製した（図８を参照されたい）。プロモーターの調整は、選択を「オン」または「オフ」に切り替えることを可能にする。これは、初めて、例えば宿主による組換えプラスミドの喪失に応じて、選択圧を発酵プロセス中の必要性に適応させることを可能にする。これは、宿主にとってのエネルギーの負担を制限することにより利点を提供する。それゆえに、かかるベクターは工業的結果物（組換え産物）を改良する。そのうえ、これらはどのような株においても使い易く（宿主ゲノム中の特別な特徴は必要とされない）、抗生物質を必要としない。
【０１４３】
実施例６：抗生物質（カナマイシン）選択と免疫性選択との比較
本発明者らは、異なる組換えタンパク質に対して免疫性選択を適用した。
【０１４４】
図９は、ＫａｎＲ（ｐＫａｎ−ｐＬａｃ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ６．０−ｐＬａｃ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるタンパク質Ｘの過剰発現の比較を示す。５ｍｇの総抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した。
【０１４５】
図１０は、ＫａｎＲ（ｐＫａｎ−Ｔ７ｐｒｏｍ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ５．０−Ｔ７ｐｒｏｍ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるイオタ−カラギナーゼタンパク質の過剰発現の比較を示す。５ｍｇの総抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した。使用したベクターは、ｐＢＡＣＴ５．０ベクター（配列番号７１２）をベースとする。
【０１４６】
図１１は、ＫａｎＲ（ｐＫａｎ−Ｔ７ｐｒｏｍ）を有し、ミクロシンＣ７およびＣｏｌＶ（ｐＢＡＣＴ５．０−Ｔ７ｐｒｏｍ）に対する２つの免疫性を有するＥ．コリにおけるラムダ−カラギナーゼタンパク質の過剰発現の比較を示す。５ｍｇの総抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した。使用したベクターは、ｐＢＡＣＴ５．０ベクター（配列番号７１２）をベースとする。
【０１４７】
この例において用いられる弱い構成的ｐｒｏＣプロモーターは、宿主にとってのエネルギー的負担を低減することを可能にする。
【図１】
2021506328.tif 000043
【図２】
2021506328.tif 000044
【図３】
2021506328.tif 000045
【図４】
2021506328.tif 000046
【図５】
2021506328.tif 000047
【図６】
2021506328.tif 000048
【図７】
2021506328.tif 000049
【図８】
2021506328.tif 000050
【図９】
2021506328.tif 000051
【図１０】
2021506328.tif 000052
【図１１】
2021506328.tif 000053
【配列表】
2021506328000001.app
【国際調査報告】
2021506328.tif 000054
2021506328.tif 000055
2021506328.tif 000056