(57)【要約】本発明は、細胞であって、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに（ｉｉ）キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を含む細胞に関する。本発明によって提供されるキメラＴＮＦＲを使用すると、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）へ改善された生存シグナルが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞であって、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（ｉｉ）キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含む、キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）
を含む、細胞。
【請求項２】
抗原結合ドメインが、ＴＮＦＲのリガンド結合ドメインを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
抗原結合ドメインが、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、またはＦｎ１４のリガンド結合ドメインを含む、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記シグナル伝達ドメインが、ＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）を介してシグナル伝達することができるシグナル伝達ドメインのような活性化シグナル伝達ドメインである、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
前記シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢエンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、またはＧＩＴＲエンドドメインのシグナル伝達部分を含む、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
前記シグナル伝達ドメインが、前記４−１ＢＢエンドドメインのシグナル伝達部分を含む、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
前記シグナル伝達ドメインが細胞内でシグナル１を産生できない、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３エンドドメインを含まない、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータエンドドメインを含まない、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記キメラＴＮＦＲが、Ｄ３Ｒ−４−１ＢＢ（配列番号１）、ＨＶＥＭ−４−１ＢＢ（配列番号２）、ＣＤ２７−４−１ＢＢ（配列番号３）、ＲＡＮＫ−４−１ＢＢ（配列番号４）、Ｆｎ１４−４−１ＢＢ（配列番号５）、およびＣＤ２７−Ｄ３Ｒ（配列番号６）、または配列番号１〜６のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントから選択される、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
細胞であって、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；および
（ｉｉ）ＴＮＦＲリガンド結合ドメインへのリガンドの結合後に細胞に共刺激を与えることができるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を発現する外因性ポリヌクレオチド
を含む、細胞。
【請求項１２】
前記外因性ポリヌクレオチドがＣＤ２７またはＣＤ４０を発現する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、アルファ−ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞である、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項１４】
キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）シグナル１を産生できないＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含む、キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）。
【請求項１５】
前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３エンドドメインを含まない、請求項１４に記載のキメラＴＮＦＲ。
【請求項１６】
前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータエンドドメインを含まない、請求項１４に記載のキメラＴＮＦＲ。
【請求項１７】
抗原結合ドメインがＣＤ７０に結合することができない、請求項１３〜１５のいずれかに記載のキメラＴＮＦＲ。
【請求項１８】
核酸構築物であって、
（ｉ）第１の核酸配列であって、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；ならびに
（ｉｉ）第２の核酸配列であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする、第２の核酸配列
を含む、核酸構築物。
【請求項１９】
前記第２の核酸配列が、請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラＴＮＦＲをコードする、請求項１７に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
前記第１および第２の核酸配列が同時発現部位によって分離されている、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれかに記載のキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする核酸配列。
【請求項２２】
核酸配列のキットであって、
（ｉ）第１の核酸配列であって、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；ならびに
（ｉｉ）第２の核酸配列であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）請求項１〜１７のいずれかに記載のＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする、第２の核酸配列
を含む、核酸配列のキット。
【請求項２３】
請求項１８〜２０のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２４】
ベクターのキットであって、
（ｉ）第１のベクターであって、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含む、第１のベクター；ならびに
（ｉｉ）第２のベクターであって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）請求項１〜１７のいずれかに記載のＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする核酸配列を含む、第２のベクター
を含む、ベクターのキット。
【請求項２５】
複数の請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞、請求項１８〜２１のいずれかに記載の核酸構築物、請求項２２に記載の第１の核酸配列および第２の核酸配列、請求項２３に記載のベクター、または請求項２４に記載の第１および第２のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
疾患の処置および／または予防に使用するための、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２５に記載の医薬組成物を必要とする被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防する方法。
【請求項２８】
以下：
（ｉ）細胞を含む試料を単離する工程；
（ｉｉ）請求項１８〜２０のいずれかに記載の核酸構築物、請求項２３に記載のベクターまたは請求項２４に記載の第１および第２のベクターで前記細胞を形質導入またはトランスフェクトする工程；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与する工程
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が自家性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が同種性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項２５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３２】
前記疾患が癌である、請求項２６に記載の使用のための医薬組成物、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法、または請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
請求項１８〜２０のいずれかに記載の核酸構築物、請求項２２に記載の第１の核酸配列および第２の核酸配列、請求項２３に記載のベクター、または請求項２４に記載の第１および第２のベクターを、前記細胞に導入する工程を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞を作製する方法。
【請求項３４】
前記細胞が被験体から単離した試料に由来する、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する操作された細胞；および、特に、かかる細胞の増殖および生存を調節するアプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗原特異的Ｔ細胞を、生得的に標的抗原に特異的な末梢血Ｔ細胞の選択的拡大によって生成することができる。しかし、ほとんどの癌抗原に特異的な多数のＴ細胞を選択して拡大することは困難であり、かつほぼ不可能である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現が末梢血Ｔ細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏウイルスベクター形質導入によって任意の表面抗原に特異的な多数のＴ細胞を生成可能であるので、組み込みベクターを用いた遺伝子治療は、この問題の解決策となる。
【０００３】
ＴＮＦファミリー共刺激分子は、その個体発生中にＴ細胞に生存シグナルおよび拡大シグナルを提供する。これらのＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）は、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）セカンドメッセンジャーを介して、シグナルを発する。しかし、これらの共刺激シグナルが置かれる状況が重要かつ特徴的である：Ｔ細胞がかかるシグナルを受け取るには、受容体およびリガンドの両方が同時かつ同一の場所で発現されなければならない。例えば、Ｔ細胞がＣＤ２７シグナルを受け取るには、このＴ細胞がＣＤ２７受容体を発現しなければならず、かつ同族リガンドＣＤ７０は、Ｔ細胞自体またはＴ細胞と接触している他の細胞によって発現されなければならない。これは非常に精緻に制御されている：例えば、４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌはともに、抗原が存在する場合に限り、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞／抗原提示細胞上での活性化から短期間で発現される。
【０００４】
この調和的統合は、例えば、ウイルス感染に対する生理学的免疫応答への鍵である。しかし、ＣＡＲ  Ｔ細胞応答は、典型的には一連のアクセサリー免疫細胞に関与せず、むしろ、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、免疫学的指示がほとんどない敵対的な微小環境という状況で生存しなければならない。ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および生着に依存する。
【０００５】
したがって、適切な免疫学的指示を提供できない微小環境において操作された細胞が増殖し、生存し、そして／または生着するように有効度を改善するためのアプローチが依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
第１の態様では、本発明は、細胞であって、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに（ｉｉ）キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含む、キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を含む、細胞を提供する。
【０００７】
本発明によって提供されるキメラＴＮＦＲを使用すると、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）へ改善された生存シグナルが提供されるように、ＴＮＦＲシグナル伝達の精緻な時間的および／または空間的な制御を切り離すことができる。したがって、本発明のキメラＴＮＦＲは、腫瘍微小環境における生理学的免疫応答の欠如を補って完全にすることができる。例として、キメラＴＮＦＲは、抗原結合ドメインが会合し、それ故に、操作された細胞の活性が必要であると期待される微小環境で必要な共刺激シグナルが誘導されるように構築することができる。
【０００８】
キメラＴＮＦＲの抗原結合ドメインは、ＴＮＦＲのリガンド結合ドメインを含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、またはＦｎ１４のリガンド結合ドメインを含み得る。
【０００９】
キメラＴＮＦＲのシグナル伝達ドメインは、活性化シグナル伝達ドメインであり得る。例えば、シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）を介してシグナル伝達することが可能であり得る。例えば、活性化シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢエンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、またはＧＩＴＲエンドドメインのシグナル伝達部分を含み得る。
【００１０】
活性化シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢエンドドメインのシグナル伝達部分を含み得る。
【００１１】
シグナル伝達ドメインは、細胞内でシグナル１を産生できない場合がある。例えば、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３エンドドメインを含まない場合がある。シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含まない場合がある。
【００１２】
１つの実施形態では、キメラＴＮＦＲは、Ｄ３Ｒ−４−１ＢＢ（配列番号１）、ＨＶＥＭ−４−１ＢＢ（配列番号２）、ＣＤ２７−４−１ＢＢ（配列番号３）、ＲＡＮＫ−４−１ＢＢ（配列番号４）、Ｆｎ１４−４−１ＢＢ（配列番号５）、およびＣＤ２７−Ｄ３Ｒ（配列番号６）、または配列番号１〜６のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントから選択される。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、細胞であって、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；および（ｉｉ）ＴＮＦＲリガンド結合ドメインへのリガンドの結合後に細胞に共刺激を提供することができるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を発現する外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を含む。
【００１４】
外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ２７、ＣＤ４０、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＲＡＮＫ、またはＦｎ１４を発現することができる。
【００１５】
外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ２７またはＣＤ４０を発現することができる。
【００１６】
細胞は、アルファ−ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞であり得る。
【００１７】
別の態様では、本発明は、キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）シグナル１を産生できないＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を提供する。
【００１８】
シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３エンドドメインを含まない場合がある。シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含まない場合がある。
【００１９】
キメラＴＮＦＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ７０に結合することができない場合がある。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、核酸構築物であって、
（ｉ）第１の核酸配列であって、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；ならびに
（ｉｉ）第２の核酸配列であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする、第２の核酸配列
を含む、核酸構築物を提供する。
【００２１】
第２の核酸配列は、本発明によって提供された任意のキメラＴＮＦＲをコードし得る。
【００２２】
第１および第２の核酸配列は、同時発現部位によって分離され得る。
【００２３】
本発明は、さらに、本発明のキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする核酸配列を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、核酸配列のキットであって、
（ｉ）第１の核酸配列であって、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；ならびに
（ｉｉ）第２の核酸配列であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする、第２の核酸配列
を含む、核酸配列のキットを提供する。キメラＴＮＦＲは、本発明によって提供された任意のキメラＴＮＦＲであり得る。
【００２５】
本発明はまた、本発明の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、ベクターのキットであって、
（ｉ）第１のベクターであって、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含む、第１のベクター；ならびに
（ｉｉ）第２のベクターであって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）本発明によって定義されたＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする核酸配列を含む、第２のベクター
を含む、ベクターのキットを提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、複数の本発明の細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列；ベクターまたは第１および第２のベクターを含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防に使用するための本発明の医薬組成物を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を必要とする被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防する方法に関する。
【００３０】
方法は、以下：
（ｉ）試料を含む細胞を単離する工程；
（ｉｉ）本発明の核酸構築物、ベクターまたは第１および第２のベクターで細胞を形質導入またはトランスフェクトする工程；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与する工程
を含み得る。
【００３１】
細胞は自家性（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。細胞は同種性（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）であり得る。
【００３２】
別の態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用に関する。
【００３３】
疾患は、癌であり得る。
【００３４】
別の態様では、本発明は、本発明の細胞を作製する方法であって、本発明の核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列、ベクターまたは第１および第２のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法に関する。
【００３５】
細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ａ）古典的なＣＡＲを示す概要図。（ｂ）〜（ｄ）：異なる世代および順序のＣＡＲエンドドメイン：（ｂ）ＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３ζエンドドメインを介してＩＴＡＭシグナルのみが伝達される初期デザイン、一方、同一化合物のエンドドメイン中にさらなる（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激シグナルが伝達される後期デザイン。
【図２】ＴＮＦＲを示す概要図。
【図３】ＴＮＦスーパーファミリーの概略。
【図４】リガンドＬＩＧＨＴを提供する細胞の存在下または非存在下、および標的抗原を発現するか標的抗原を発現しない細胞の存在下での、ＨＶＥＭ−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体を同時発現するかしないＧＤ２  ＣＡＲを発現する細胞の活性の比較：ａ）増殖；ｂ）標的細胞に対する細胞傷害性。
【図５】リガンドＲＡＮＫＬを提供する細胞の存在下または非存在下、および標的抗原を発現するか標的抗原を発現しない細胞の存在下での、ＲＡＮＫ−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体を同時発現するかしないＧＤ２  ＣＡＲを発現する細胞の活性の比較：ａ）増殖；ｂ）標的細胞に対する細胞傷害性。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）
第１の態様では、本発明は、細胞であって、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに（ｉｉ）キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含む、キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を含む、細胞を提供する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、キメラＴＮＦＲは、（ａ）第１のＴＮＦＲのＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）第２のＴＮＦＲのＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むＴＮＦＲを指す。
【００３９】
したがって、典型的には第１のＴＮＦＲに結合するＴＮＦＲリガンドによる会合後、本発明のキメラＴＮＦＲは、典型的には第２のＴＮＦＲによって提供される共刺激シグナルを伝達することができる。これにより、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）へ改善された生存シグナルが提供されるように、ＴＮＦＲシグナル伝達の精緻な時間的および／または空間的な制御を切り離すことができる。
【００４０】
例として、本発明のキメラＴＮＦＲは、ＴＮＦＲリガンド（ＣＤ７０、ＲＡＮＬ、またはＴＷＥＡＫなど）および異なるＴＮＦＲの活性化シグナル伝達ドメイン（４１−ＢＢまたはＯＸ４０など）に結合することができる結合ドメインを含み得る。
【００４１】
かかるキメラＴＮＦＲは、腫瘍微小環境中に豊富なＴＮＦＲリガンドの認識と、典型的には精緻に制御された様式のみにおいて提供される第２のＴＮＦＲの共刺激シグナルを結びつけることにより、一定の癌の標的において有用であり得る。例えば、４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌは共に、抗原が存在する場合に限り、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞／抗原提示細胞上の活性化後に短期間に発現される。例として、リンパ腫では、ＣＤ７０が豊富であるので、ＣＤ２７−４−１ＢＢキメラが発現され得る；溶解性骨転移では、ＲＡＮＫＬが豊富であるので、ＲＡＮＫ−４−１ＢＢが発現され得る。固形癌では、ＴＷＥＡＫが豊富であるので、Ｆｎ１４−４−１ＢＢが発現され得る。
【００４２】
理論に拘束されることを望まないが、腫瘍微小環境中に存在するリガンドの存在に応答して生存および／または増殖シグナルを伝達するキメラＴＮＦＲを発現する操作された細胞は、キメラＴＮＦＲを持たない対応する操作された細胞と比較して、生着および拡大が改良されるであろう。
【００４３】
ＴＮＦ受容体
ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーは、典型的には、Ｉ型膜貫通糖タンパク質（Ｎ末端が細胞外部に存在する）である。ＴＮＦスーパーファミリーの細胞質ドメイン内の構造モチーフは、そのシグナル伝達性に基づいて２つの群に分類される：デスドメイン（ＤＤ）を含むものおよびＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）に会合するもの。第３群が存在し、これは、膜−アンカードメインを欠き、タンパク質分解によって表面から切断されるか、糖脂質結合を介して係留され、「デコイ受容体」と呼ばれる。
【００４４】
ＴＮＦＲは、ＴＮＦＲが細胞内に発現されたときに細胞膜の細胞外側に配置される結合ドメインおよびＴＮＦＲが細胞内に発現されたときに細胞膜の細胞質側に発現されるシグナル伝達ドメインを含む。
【００４５】
ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０）、およびＴＮＦＲＳＦ１４（ＧＩＴＲ）は、Ｔ細胞に生存シグナルを伝達する。ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）およびＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）は、ナイーブＴ細胞によって発現される。ＯＸ４０および４−１ＢＢの発現は抗原刺激に応答して誘導され、これらのＴＮＦＲは、エフェクターＴ細胞のマーカーであることが提案されている。ＣＤ２７およびＧＩＴＲが従来のＴ細胞によって構成性に発現され得るのにもかかわらず、これらの発現はまた、ＯＸ４０および４−１ＢＢの発現の上方制御と並行して、Ｔ細胞活性化後に強く上方制御される。
【００４６】
ＯＸ４０、４−１ＢＢ、およびＧＩＴＲの発現の誘導または上方制御は、ナイーブＴ細胞による抗原認識およびその活性化後２４時間以内に生じ、記憶Ｔ細胞ではより一層迅速に生じる；これらの受容体の発現は、数時間または実に数日間継続し得る。
【００４７】
ＴＮＦ受容体ＴＮＦＲＳＦ３５／細胞死受容体３（Ｄ３Ｒ）は、炎症組織によって一過性に上方制御されるＴＬ１Ａによって活性化され、この相互作用は、確立された免疫応答後のＴ細胞活性の後期に重要なようである。
【００４８】
ＣＤ４０はＴ細胞によって発現されないが、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞の分化および拡大に特に重要である。
【００４９】
ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）はＴ細胞によって発現されないが、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫ−Ｌ経路は免疫発達に重要であり、破骨細胞活性の重要な経路でもあり、骨転移中で活性である。
【００５０】
ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（Ｆｎ１４）はＴ細胞によって発現されないが、損傷組織または炎症組織およびほとんどの癌においてそのリガンドＴＷＥＡＫと共に発現される。
【００５１】
ＴＮＦファミリーリガンド
ＴＮＦ関連サイトカイン（ＴＮＦファミリーリガンド）は、短い細胞質側尾部（１５〜２５残基長）および受容体結合部位が存在するシグネチャーＴＮＦ相同ドメインを含むより大きな細胞外領域（約５０アミノ酸）を有するタイプＩＩ膜貫通タンパク質（細胞内Ｎ末端）である。
【００５２】
ＴＮＦ相同ドメインは、三量体（リガンドの機能単位）に組み立てられる。いくつかのファミリーメンバーの原子分析から、リガンドがβシートサンドイッチに折りたたまれている高度に保存された三次構造を有するが、アミノ酸配列保存は、ファミリーメンバー間で３５％未満に制限されることが明らかとなった。
【００５３】
このスーパーファミリーを定義する保存残基は、主に分子足場を形成する内部βストランド内に存在し、三量体への組み立てを促進する。外部βストランド間のループ内の残基は可変であり、特定のループ内で受容体と接触する。
【００５４】
ＴＮＦＲおよびそのリガンドの概要を、表２に提供する。
【表２】
2021506275.tif 000002
【００５５】
ＴＮＦＲ結合ドメイン
キメラＴＮＦＲ結合ドメインは、ＴＮＦＲリガンドに結合することができる任意のドメインであり得る。結合ドメインは、例えば、ＴＮＦＲリガンドに結合することができるＴＮＦＲのリガンド結合ドメインまたはその抗体もしくは一部を含み得る。
【００５６】
結合ドメインは、表２に列挙したＴＮＦＲリガンドに結合することが可能であり得る。結合ドメインは、腫瘍微小環境中に存在するＴＮＦＲリガンドに結合することが可能であり得る。
【００５７】
結合ドメインは、ＣＤ７０、ＮＦκＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、アポトーシスのＴＮＦ関連弱誘導（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ）、ＴＮＦＳＦ１（ＬＴＡ）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、およびＣＤ４０Ｌから選択されるＴＮＦＲリガンドに結合することが可能であり得る。
【００５８】
結合ドメインは、ＣＤ７０に結合することが可能であり得る。
【００５９】
結合ドメインは、ＲＡＮＫＬに結合することが可能であり得る。
【００６０】
結合ドメインは、ＴＷＥＡＫに結合することが可能であり得る。
【００６１】
結合ドメインは、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＢＴＬＡ、および／またはＣＤ１６０に結合することが可能であり得る。
【００６２】
適切には、結合ドメインは、ＴＮＦＲリガンドに結合するＴＮＦＲのリガンド結合ドメインを含み得る。ＴＮＦＲ／ＴＮＦＲリガンド相互作用の概要を、表２および図３に提供する。
【００６３】
結合ドメインは、ＣＤ２７、ＲＡＮＫＬ、Ｆｎ１４、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、またはＣＤ４０リガンド結合ドメインから選択されるリガンド結合ドメインを含み得る。
【００６４】
結合ドメインは、ＣＤ２７のリガンド結合ドメインを含み得る。ＣＤ２７発現は、初期Ｔ細胞分化中に精緻に制御される。ＣＤ７０（ＣＤ２７のリガンド）は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ上に広く発現される。ＣＤ７０はまた、悪性細胞（Ｂ細胞リンパ腫、白血病、および神経膠腫、ならびにいくつかの他の腫瘍の細胞など）上に発現される。
【００６５】
ＣＤ２７の例示的なリガンド結合ドメインを、配列番号７として示す。適切には、ＣＤ２７のリガンド結合ドメインは、配列番号７またはＣＤ７０への結合能力を有するそのバリアントを含み得る。配列番号７バリアントは、配列番号７に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号７として示した配列と等価であるか改善されたＣＤ７０結合能を有し得る。
【化１】
2021506275.tif 000003
【００６６】
結合ドメインは、ＲＡＮＫのリガンド結合ドメインを含み得る。ＲＡＮＫシステムは、免疫系（リンパ節の発達、リンパ球の分化、樹状細胞の生存、およびＴ細胞活性化、ならびに寛容誘導が含まれる）において重要な役割を果たす。ＲＡＮＫＬは、いくつかの組織および器官（骨格筋、胸腺、肝臓、結腸、小腸、副腎、骨芽細胞、乳腺上皮細胞、前立腺、および膵臓が含まれる）中に発現される。ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫシステムの重要な役割は、破骨細胞依存性骨リモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）の媒介であり、それ故、骨への転移性疾患における病理過程であり、乳癌、肺癌、および前立腺癌の骨への転移ならびに原発性骨髄疾患（すなわち、骨髄腫）が含まれる全ての溶骨性骨腫瘍で活性である。ＲＡＮＫは、通常は、例えば、Ｔ細胞上に発現しない。ＣＡＲ  Ｔ細胞上のＲＡＮＫリガンド結合ドメインの発現は、例えば、特に骨髄転移が認められたときに広範な活性化に至る可能性がある。
【００６７】
ＲＡＮＫの例示的なリガンド結合ドメインを、配列番号８として示す。適切には、ＲＡＮＫのリガンド結合ドメインは、配列番号８またはＲＡＮＫＬへの結合能力を有するそのバリアントを含み得る。配列番号８バリアントは、配列番号８に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号８として示した配列と等価であるか改善されたＲＡＮＫＬ結合能を有し得る。
【化２】
2021506275.tif 000004
【００６８】
結合ドメインは、Ｆｎ１４のリガンド結合ドメインを含み得る。Ｆｎ１４は、リンパ球以外のほとんど全ての組織上に誘導性に発現することができる。Ｆｎ１４のリガンドは、組織傷害の際に組織中に上方制御されるＴＷＥＡＫである。ＴＷＥＡＫは、活性化された単球によって産生される。ＴＷＥＡＫはまた、腫瘍微小環境中にほとんど普遍的に発現される。Ｔ細胞がＦｎ１４を発現しないことを考慮すると、Ｔ細胞は、微小環境中のＴＷＥＡＫを解釈することができない。ＴＷＥＡＫに結合することができるキメラＴＮＦＲは、例えば、腫瘍微小環境内のＣＡＲ  Ｔ細胞に活性化シグナルおよび生存シグナルを伝達するであろう。
【００６９】
Ｆｎ１４の例示的なリガンド結合ドメインを、配列番号９として示す。適切には、Ｆｎ１４のリガンド結合ドメインは、配列番号９またはＴＷＥＡＫへの結合能力を有するそのバリアントを含み得る。配列番号９バリアントは、配列番号９に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号９として示した配列と等価であるか改善されたＴＷＥＡＫ結合能を有し得る。
【化３】
2021506275.tif 000005
【００７０】
結合ドメインは、ＨＶＥＭのリガンド結合ドメインを含み得る。大部分のＴＮＦ受容体が単一または多くとも２つのリガンドを有する一方で、ＨＶＥＭは、複数のリガンドを有するという点で独特である。これらには、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＢＴＬＡ、およびＣＤ１６０が含まれる。共に、これらのリガンドは、広範な免疫細胞によって発現される。ＨＶＥＭは、通常はナイーブＴ細胞および静止Ｔ細胞上に発現されるが、活性化されたＴ細胞によって発現されない。ＨＶＥＭリガンド結合ドメインを含むキメラＴＮＦＲの発現により、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、例えば、その活性化中に複数のリガンドシグナルを受け取る。
【００７１】
ＨＶＥＭの例示的なリガンド結合ドメインを、配列番号１０として示す。適切には、ＨＶＥＭのリガンド結合ドメインは、配列番号１０またはＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＢＴＬＡ、および／もしくはＣＤ１６０に結合する能力を有するそのバリアントを含み得る。配列番号１０バリアントは、配列番号１０に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１０として示した配列と等価であるか改善されたＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＢＴＬＡ、およびＣＤ１６０結合能を有し得る。
【化４】
2021506275.tif 000006
【００７２】
結合ドメインは、ＤＲ３のリガンド結合ドメインを含み得る。ＤＲ３は、Ｔ細胞活性化を共刺激し、細胞質内デスドメインおよびアダプタータンパク質ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦＲ関連デスドメイン）を介してシグナルを伝達する。ＴＬ１Ａは、Ｔ細胞を共刺激して広範なサイトカインを産生し、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性化されたＴ細胞および抑制性Ｔ細胞の拡大を促進することができる。ＤＲ３はまた、自己免疫疾患モデルにおいて、組織炎症部位でのエフェクターＴ細胞増殖を増強する。ＤＲ３リガンド結合ドメインを含むキメラＴＮＦＲにより、例えば、炎症性の腫瘍微小環境内のＣＡＲ  Ｔ細胞中に活性化シグナルおよび生存シグナルを伝達することが可能になる。
【００７３】
ＤＲ３の例示的なリガンド結合ドメインを、配列番号１１として示す。適切には、ＤＲ３のリガンド結合ドメインは、配列番号１１またはＴＬ１Ａへの結合能力を有するそのバリアントを含み得る。配列番号１１バリアントは、配列番号１１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１１として示した配列と等価であるか改善されたＴＬ１Ａ結合能を有し得る。
【化５】
2021506275.tif 000007
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合部位を有するポリペプチドを意味する。抗体は、３つのＣＤＲを含み、ドメイン抗体（ｄＡｂ）の抗原結合部位と等価な抗原結合部位を有し得る。抗体は、６つのＣＤＲを含み、古典的な抗体分子の抗原結合部位と等価な抗原結合部位を有し得る。ポリペプチドの残部は、抗原結合部位に適切な足場を提供し、抗原結合部位に抗原が結合するのに適切な様式で抗原結合部位を提示する任意の配列であり得る。抗体は、免疫グロブリン分子全体またはその一部（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメント、ナノボディ、または単鎖可変ドメイン（３つのＣＤＲを有するＶＨ鎖またはＶＬ鎖であり得る）など）であり得る。抗体は、二機能性抗体であり得る。抗体は、二機能性抗体であり得る。抗体は、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。
【００７５】
キメラＴＮＦＲ結合ドメインは、免疫グロブリンに由来せず、免疫グロブリンに基づかない結合ドメインを含み得る。非抗体ポリペプチドの結合能を利用するために、いくつかの「抗体模倣性の」設計された反復タンパク質（ＤＲＰ）が開発されている。かかる分子には、アンキリンまたはロイシンリッチ反復タンパク質（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ａｖｉｍｅｒ、およびＶｅｒｓａｂｏｄｙ）が含まれる。
【００７６】
結合ドメインは、本明細書中に定義のＴＮＦＲリガンドに「特異的に結合」し得る。本明細書中で使用される場合、「特異的に結合する」は、結合ドメインがＴＮＦＲリガンドに結合するが、他のペプチドに結合しないか、他のペプチドにより低い親和性で結合することを意味する。
【００７７】
２分子間（例えば、ＴＮＦＲ結合ドメインとＴＮＦＲリガンドとの間）の結合親和性を、例えば、解離定数（ＫＤ）の決定によって定量することができる。ＫＤを、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））によるＴＮＦＲ結合ドメインとＴＮＦＲリガンドとの間の複合体の形成および解離の動態の測定によって決定することができる。複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）および解離速度定数ｋｄ（またはｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによってｋａおよびｋｄに関連付けられる。
【００７８】
異なる分子の相互作用に関連する結合親和性（例えば、異なるＴＮＦＲ結合ドメインとＴＮＦＲリガンドとの結合親和性）の比較を、個別のＴＮＦＲ結合ドメインおよびＴＮＦＲリガンドのＫＤ値の比較によって比較することができる。
【００７９】
ＴＮＦＲシグナル伝達ドメイン
本キメラＴＮＦＲは、ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【００８０】
適切には、ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインは、活性化シグナル伝達ドメインであり得る。活性化シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）を介してシグナルを伝達することができる。
【００８１】
ＴＲＡＦは、ＴＮＦＲをシグナル伝達経路に結びつけるアダプタータンパク質である。ＴＲＡＦファミリーの６つのメンバーが同定されている（ＴＲＡＦ１〜６）。全てのＴＲＡＦタンパク質は、受容体の細胞質ドメインおよび他のＴＲＡＦタンパク質に結合することができるＴＲＡＦドメインと呼ばれるＣ末端相同領域を共有している。さらに、ＴＲＡＦ２〜６は、シグナル伝達の下流事象に重要なＲＩＮＧおよび亜鉛フィンガーモチーフを有する。
【００８２】
シグナル伝達ドメインは、表２に列挙したＴＮＦＲ由来のシグナル伝達ドメインに基づいたドメインを含み得る。
【００８３】
シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＲＡＮＫ、およびＦｎ１４から選択されるＴＮＦＲ由来のシグナル伝達ドメインに基づいたドメインを含み得る。
【００８４】
シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、およびＤ３Ｒから選択されるＴＮＦＲ由来のシグナル伝達ドメインに基づいたドメインを含み得る。
【００８５】
シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインに基づき得る。４−１ＢＢは、活性化されたＴ細胞に共刺激活性を提供する共刺激免疫チェックポイント分子である。４−１ＢＢシグナル伝達は、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２分泌、生存活性、および細胞溶解活性を増強する。４−１ＢＢは、ＴＲＡＦ２を介してシグナルを伝達することが示されている。
【００８６】
例示的な４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを、配列番号１２として示す。適切には、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後に４−１ＢＢ共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号１２またはそのバリアントを含み得る。配列番号１２バリアントは、配列番号１２に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１２と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化６】
2021506275.tif 000008
【００８７】
シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０のシグナル伝達ドメインに基づき得る。ＯＸ４０は、休止ナイーブＴ細胞上に構成性に発現されないが、活性化から２４〜７２時間後に発現される。Ｔ細胞中でのＯＸ４０シグナル伝達は、例えば、活性化後のＴ細胞生存およびサイトカイン産生の維持に重要である。ＯＸ４０シグナル伝達ドメインは、ＴＲＡＦ２、３、および５ならびにＰＩ３キナーゼに結合する。
【００８８】
例示的なＯＸ４０シグナル伝達ドメインを、配列番号１３として示す。適切には、ＯＸ４０シグナル伝達ドメインは、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後にＯＸ４０共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号１３またはそのバリアントを含み得る。配列番号１３バリアントは、配列番号１３に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１３と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化７】
2021506275.tif 000009
【００８９】
シグナル伝達ドメインは、ＧＩＴＲのシグナル伝達ドメインに基づき得る。ＧＩＴＲ発現は、Ｔ細胞活性化後に増加し、ＣＤ３駆動Ｔ細胞活性化およびプログラム細胞死の制御に関与する。特に、ＧＩＴＲ発現は、Ｔ制御性細胞の抑制活性の阻害およびＴエフェクター細胞生存の延長に関与する。
【００９０】
例示的なＧＩＴＲシグナル伝達ドメインを、配列番号１４として示す。適切には、ＧＩＴＲシグナル伝達ドメインは、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後にＧＩＴＲ共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号１４またはそのバリアントを含み得る。配列番号１４バリアントは、配列番号１４に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１４と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化８】
2021506275.tif 000010
【００９１】
シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインに基づき得る。ＣＤ２７は、Ｔ細胞免疫の生成および長期維持に必要である。ＣＤ２７はリガンドＣＤ７０に結合し、Ｂ細胞活性化および免疫グロブリン合成の制御で重要な役割を果たす。この受容体は、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫ８／ＪＮＫを活性化させるシグナルを伝達する。アダプタータンパク質であるＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ５は、この受容体のシグナル伝達を媒介することが示されている。
【００９２】
例示的なＣＤ２７シグナル伝達ドメインを、配列番号１５として示す。適切には、ＣＤ２７シグナル伝達ドメインは、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後にＣＤ２７共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号１５またはそのバリアントを含み得る。配列番号１５バリアントは、配列番号１５に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１５と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化９】
2021506275.tif 000011
【００９３】
シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４０のシグナル伝達ドメインに基づき得る。ＣＤ４０は、抗原提示細胞上に見出される共刺激タンパク質であり、これらの細胞の活性化に必要である。ＴＨ細胞上のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）にＣＤ４０が結合すると、抗原提示細胞が活性化され、種々の下流効果を誘導する。ＣＤ４０シグナル伝達ドメインは、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、およびＴＲＡＦ６と相互作用する。
【００９４】
例示的なＣＤ４０シグナル伝達ドメインを、配列番号１６として示す。適切には、ＣＤ４０シグナル伝達ドメインは、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後にＣＤ４０共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号１６またはそのバリアントを含み得る。配列番号１６バリアントは、配列番号１６に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１６と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化１０】
2021506275.tif 000012
【００９５】
シグナル伝達ドメインは、Ｄ３Ｒのシグナル伝達ドメインに基づき得る。
【００９６】
例示的なＤ３Ｒシグナル伝達ドメインを、配列番号１７として示す。適切には、Ｄ３Ｒシグナル伝達ドメインは、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後にＤ３Ｒ共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号１７またはそのバリアントを含み得る。配列番号１７バリアントは、配列番号１７に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１７と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化１１】
2021506275.tif 000013
【００９７】
本明細書中に記載のバリアントシグナル伝達ドメインが親配列と同一の様式でシグナル伝達することができることを判定するために使用することができるアッセイには、Ｔ細胞の産生機能を特徴づける標準的な免疫学的アッセイが含まれる。これらには、例えば、フローサイトメトリーによる分化、消耗、および活性化の解析；細胞傷害性アッセイ；増殖アッセイ；放出されたサイトカインの測定、および転写プロファイリング（ＲＮＡｓｅｑ）が含まれる。
【００９８】
適切には、本キメラＴＮＦＲのシグナル伝達ドメインは、例えば、Ｔ細胞中で発現するときに「シグナル１」を提供することができない。したがって、キメラＴＮＦＲは、ＴＮＦＲリガンドに結合することができるが、キメラＴＮＦＲの会合により、細胞中に産生シグナル１を伝達しない。換言すれば、キメラＴＮＦＲの会合は細胞に共刺激シグナルを伝達することができるが、操作された細胞の完全な活性化を誘導するには十分ではない（シグナル１を提供しないため）。
【００９９】
したがって、本発明の細胞において、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの会合の際にシグナル１が提供され、キメラＴＮＦＲの会合の際にさらなる共刺激シグナルが提供される。
【０１００】
キメラＴＮＦＲのシグナル伝達ドメインは、本明細書中に記載のＴＮＦＲシグナル伝達ドメインから本質的になり得るか、このドメインからなり得る。
【０１０１】
適切には、キメラＴＮＦＲは、ＣＤ３エンドドメインを含まない。適切には、キメラＴＮＦＲは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含まない（例示的なＣＤ３ゼータエンドドメインを、配列番号３１として示す）。
【０１０２】
膜貫通ドメイン
キメラＴＮＦＲは、膜にまたがる膜貫通ドメインをさらに含む。膜貫通ドメインは、膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを使用して、膜貫通部分を供給することができる。当業者は、タンパク質の膜貫通ドメインの存在および全長を、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して決定することができる。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが相対的に単純な構造（すなわち、膜をまたぐのに十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成することが予想されるポリペプチド配列）であることを考慮すると、人工的に設計されたＴＭドメインも使用することができる（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は、膜貫通構成要素を記載している）。
【０１０３】
膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、受容体に良好な安定性をもたらすＣＤ２８に由来し得る。膜貫通ドメインは、配列番号１８として示した配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【化１２】
2021506275.tif 000014
【０１０４】
バリアントは、バリアント配列が膜を横断する能力を保持することを条件として、配列番号１８と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し得る。
【０１０５】
膜貫通ドメインは、ＴＮＦＲ（例えば、本明細書中に記載のＴＮＦＲ）由来の膜貫通ドメインに基づき得る。適切には、膜貫通ドメインは、キメラＴＮＦＲ中に存在するシグナル伝達ドメインと同一のＴＮＦＲに基づき得る。
【０１０６】
適切には，膜貫通ドメインは、配列番号１９〜２４のうちのいずれか１つまたは少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。バリアントは、バリアント配列が膜を横断する能力を保持することを条件として、配列番号１９〜２４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し得る。
【化１３】
2021506275.tif 000015
【０１０７】
第１のＴＮＦＲのＴＮＦＲリガンドに結合する結合ドメインと第２のＴＮＦＲ由来のシグナル伝達ドメインとの任意の組み合わせが、本発明に適切であり得る。
【０１０８】
理論に拘束されることを望まないが、以下の組み合わせは、例えば、操作されたＴ細胞の機能に特定の利点を有すると見なされ得る。例えば、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＲＡＮＫ、およびＦｎ１４のリガンドとの非生理学的相互作用は、生理学的ＴＮＦリガンド相互作用とは明白に異なる。シグナル伝達ドメインに関して、４−１ＢＢは、Ｔ細胞機能に特に重要な共刺激シグナルを提供することが公知である。
【０１０９】
本キメラＴＮＦＲは、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＲＡＮＫ、ＤＲ３、またはＦｎ１４のリガンドに結合する結合ドメインおよび４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み得る。
【０１１０】
キメラＴＮＦＲは、ＨＶＥＭ結合ドメインおよび４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み得る。例示的なＨＶＥＭ／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲを、配列番号２として示す。適切には、ＨＶＥＭ／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲは、ＨＶＥＭリガンドに結合し、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後に４−１ＢＢ共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号２またはそのバリアントを含み得る。配列番号２バリアントは、配列番号２に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号２と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化１４】
2021506275.tif 000016
ＨＶＥＭエクトドメインを通常の文字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ９２９５６）
４−１ＢＢ膜貫通ドメインを太字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
４−１ＢＢエンドドメインを斜体で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
【０１１１】
キメラＴＮＦＲは、ＣＤ２７リガンド結合ドメインおよび４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み得る。例示的なＨＶＥＭ／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲを、配列番号３として示す。適切には、ＣＤ２７／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲは、ＣＤ２７リガンドに結合し、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後に４−１ＢＢ共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号３またはそのバリアントを含み得る。配列番号３バリアントは、配列番号３に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号３と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化１５】
2021506275.tif 000017
ＣＤ２７エクトドメインを通常の文字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｐ２６８４２）
４−１ＢＢ膜貫通ドメインを太字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
４−１ＢＢエンドドメインを斜体で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
【０１１２】
キメラＴＮＦＲは、ＲＡＮＫリガンド結合ドメインおよび４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み得る。例示的なＲＡＮＫ／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲを、配列番号４として示す。適切には、ＲＡＮＫ／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲは、ＲＡＮＫリガンドに結合し、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後に４−１ＢＢ共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号４またはそのバリアントを含み得る。配列番号４バリアントは、配列番号４に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号４と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化１６】
2021506275.tif 000018
ＲＡＮＫエクトドメインを通常の文字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ９Ｙ６Ｑ６）
４−１ＢＢ膜貫通ドメインを太字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
４−１ＢＢエンドドメインを斜体で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
【０１１３】
キメラＴＮＦＲは、Ｆｎ１４リガンド結合ドメインおよび４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み得る。例示的なＦｎ１４／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲを、配列番号５として示す。適切には、Ｆｎ１４／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲは、Ｆｎ１４リガンドに結合し、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後に４−１ＢＢ共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号５またはそのバリアントを含み得る。配列番号５バリアントは、配列番号５に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号５と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化１７】
2021506275.tif 000019
Ｆｎ１４エクトドメインを通常の文字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ９ＮＰ８４）
４−１ＢＢ膜貫通ドメインを太字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
４−１ＢＢエンドドメインを斜体で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
【０１１４】
キメラＴＮＦＲは、Ｄ３Ｒリガンド結合ドメインおよび４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み得る。例示的なＤ３Ｒ／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲを、配列番号１として示す。適切には、Ｄ３Ｒ／４−１ＢＢキメラＴＮＦＲは、Ｄ３Ｒリガンドに結合し、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後に４−１ＢＢ共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号１またはそのバリアントを含み得る。配列番号１バリアントは、配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号１と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化１８】
2021506275.tif 000020
ＴＮＦＲＳＦ２５（Ｄ３Ｒ）エクトドメインを通常の文字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ９３０３８）
４−１ＢＢ膜貫通ドメインを太字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
４−１ＢＢエンドドメインを斜体で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ０７０１１）
【０１１５】
キメラＴＮＦＲは、ＣＤ２７結合ドメインおよびＤＲ３シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的なＣＤ２７／ＤＲ３キメラＴＮＦＲを、配列番号６として示す。適切には、ＣＤ２７／ＤＲ３キメラＴＮＦＲは、ＣＤ２７リガンドに結合し、キメラＴＮＦＲ結合ドメインの会合後にＤＲ３共刺激シグナルを提供する能力を有する配列番号６またはそのバリアントを含み得る。配列番号６バリアントは、配列番号６に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、配列番号６と等価なシグナル伝達特性を有し得る。
【化１９】
2021506275.tif 000021
ＣＤ２７エクトドメインを通常の文字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｐ２６８４２）
ＴＮＦＲＳＦ２５（Ｄ３Ｒ）膜貫通ドメインを太字で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ９３０３８）
ＴＮＦＲＳＦ２５（Ｄ３Ｒ）エンドドメインを斜体で示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｑ９３０３８）
【０１１６】
１つの態様では、本発明は、本明細書中に定義のキメラＴＮＦＲを提供する。
【０１１７】
適切には、本発明の細胞は、複数の異なる、本発明によって提供されたキメラＴＮＦＲを含み得る。例えば、細胞は、２、３、４、または５つの異なる本発明のキメラＴＮＦＲを含み得る。「異なるＴＮＦＲ」は、第１のキメラＴＮＦＲが、第２のＴＮＦＲと比較して異なるリガンド結合ドメインおよび／または異なるシグナル伝達ドメインを含み得ることを意味する。
【０１１８】
ＴＮＦＲ過剰発現
１つの態様では、本発明は、細胞であって、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；および（ｉｉ）ＴＮＦＲリガンド結合ドメインへのリガンドの結合後に細胞に共刺激を与えることができるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を発現する外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、用語「外因性ポリヌクレオチド」は、ＴＮＦＲを発現するポリヌクレオチドが細胞の内因性ゲノムの一部ではないことを意味する。例えば、外因性ポリヌクレオチドは、操作された核酸構築物またはベクターであり得る。
【０１２０】
外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ２７、ＣＤ４０、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＲＡＮＫ、またはＦｎ１４を発現することができる。１つの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ２７またはＣＤ４０を発現し得る。
【０１２１】
細胞は、本明細書中に定義の任意の細胞であり得る。適切には、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞であり得る。
【０１２２】
ＣＤ２７、ＣＤ４０、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＲＡＮＫ、およびＦｎ１４のリガンドは、典型的には、炎症性腫瘍微小環境中に存在する。しかし、これらのＴＮＦＲは、例えば、精緻に制御される様式で（例えば、特にＴ細胞発生期間の）Ｔ細胞によって発現されるか、一般にＴ細胞によって発現されない。
【０１２３】
したがって、Ｔ細胞中でのＣＤ２７、ＣＤ４０、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＲＡＮＫ、またはＦｎ１４の外因性発現は、例えば、本発明のキメラＴＮＦＲと類似の利点を得ることができる。例えば、典型的にＴＮＦＲに結合するＴＮＦＲリガンドによる会合後、外因性ポリヌクレオチドから発現されるＴＮＦＲは、共刺激シグナルを伝達することができる。これにより、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）へ改善された生存シグナルが提供されるように、ＴＮＦＲシグナル伝達の精緻な時間的および／または空間的な制御を切り離すことができる。
【０１２４】
例として、リンパ腫では、ＣＤ７０が豊富であるため、ＣＤ２７を過剰発現する細胞を得ることができる；溶解性骨転移では、ＲＡＮＫＬが豊富であるため、ＲＡＮＫを過剰発現する細胞が得られ得る。固形癌では、ＴＷＥＡＫが豊富であるため、ＴＷＥＡＫを過剰発現する細胞を得ることができる。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、「過剰発現した」または「過剰発現」は、ＴＮＦＲを発現することができる外因性ポリヌクレオチドを含まない対応する非改変細胞と比較したＴＮＦＲの発現レベルの増加を指す。発現レベルを、当該分野で公知の方法（例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ、ウェスタンブロット、および／またはフローサイトメトリー）によって決定することができる。
【０１２６】
本発明の細胞は、対応する非改変細胞と比較して、レベルが少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍のＴＮＦＲを発現し得る。
【０１２７】
適切には、外因性ポリヌクレオチドによって発現されたＴＮＦＲは、対応する非改変細胞中で検出できない場合がある。
【０１２８】
ＣＤ２７、ＣＤ４０、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＲＡＮＫ、およびＦｎ１４の例示的なアミノ酸配列を、配列番号２５〜３０として示す。外因性ポリヌクレオチド配列は、配列番号２５〜３０のうちの１つまたは配列番号２５〜３０のうちの１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントとして示した配列を含むポリペプチドを発現することが可能であり得る。
【０１２９】
バリアントは、配列番号２５〜３０に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、対応する親配列番号２５〜３０と等価なリガンド結合特性およびシグナル伝達特性を有し得る。
【０１３０】
バリアントは、配列番号２５に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、対応する親配列番号２５と等価なリガンド結合特性およびシグナル伝達特性を有し得る。
【０１３１】
バリアントは、配列番号２６）に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し、対応する親配列番号２６と等価なリガンド結合特性およびシグナル伝達特性を有し得る。
【化２０】
2021506275.tif 000022
【０１３２】
外因性ポリヌクレオチドを、例えば、核酸構築物またはベクターとして提供することができる。核酸構築物およびベクターを、当該分野で公知の方法（例えば、ウイルス形質導入）を使用して、細胞に導入することができる。
【０１３３】
１つの態様では、本発明は、核酸構築物であって、（ｉ）第１の核酸配列であり、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；および（ｉｉ）第２の核酸配列であり、ＴＮＦＲリガンド結合ドメインへのリガンドの結合後に細胞に共刺激を提供することができるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を発現することができる外因性ポリヌクレオチドである、第２の核酸配列を含む、核酸構築物を提供する。
【０１３４】
ＴＮＦＲを発現する外因性ポリヌクレオチドは、本明細書中に定義の外因性ポリヌクレオチドであり得る。
【０１３５】
本発明は、さらに、キットであって、（ｉ）第１の核酸配列であり、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；および（ｉｉ）第２の核酸配列であり、ＴＮＦＲリガンド結合ドメインへのリガンドの結合後に細胞に共刺激を提供することができるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を発現することができる外因性ポリヌクレオチドである、第２の核酸配列を含む、キットを提供する。
【０１３６】
第１の核酸配列および第２の核酸配列は、第１の核酸配列であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；および第２の核酸配列であって、ＴＮＦＲリガンド結合ドメインへのリガンドの結合後に細胞に共刺激を提供することができるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を発現することができる外因性ポリヌクレオチドである、第２の核酸配列を単一の核酸構築物から発現することが可能な同時発現部位によって分離することができる。
【０１３７】
適切には、同時発現部位は、本明細書中に定義の同時発現部位であり得る。
【０１３８】
本発明はまた、ベクターまたはベクターのキットであって、（ｉ）第１の核酸配列であり、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；および（ｉｉ）第２の核酸配列であり、ＴＮＦＲリガンド結合ドメインへのリガンドの結合後に細胞に共刺激を提供することができるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を発現することができる外因性ポリヌクレオチドである、第２の核酸配列を含む１またはそれを超える核酸配列（単数または複数）または核酸構築物（単数または複数）を含む、ベクターまたはベクターのキットを提供する。
【０１３９】
ベクターは、本明細書中に定義のベクターであり得る。
【０１４０】
核酸構築物またはベクターは、本明細書中に記載の治療に使用するための核酸構築物またはベクターであることができる。
【０１４１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１に模式的に示した古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）が細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続しているキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式または標的抗原のリガンドに基づき得る。スペーサードメインは、バインダーを膜から隔離し、適切に配向するのに必要であり得る。一般に使用されるスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。抗原に応じて、例えば、ＣＤ８α由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみには、より小型のスペーサーで十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜中のタンパク質を係留し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【０１４２】
初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。従って、これらの第１世代の受容体は、免疫学的シグナル１を伝達し、同族標的細胞のＴ細胞死滅を誘発するのに十分であったが、Ｔ細胞が増殖および生存するように完全に活性化することはできなかった。この限界を克服するために、化合物エンドドメインが以下のように構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分をＣＤ３ζの細胞内部分と融合することにより、抗原認識後に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が得られる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これにより、最も強力な共刺激シグナル（すなわち、Ｔ細胞増殖を誘発する免疫学的シグナル２）が供給される。ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４−１ＢＢなど）を含むいくつかの受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナル、および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにより強力な第３世代のＣＡＲをここに記載している。
【０１４３】
ＣＡＲをコードする核酸を、例えば、レトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入することができる。このようにして、多数の抗原特異的Ｔ細胞を、養子細胞移入のために生成することができる。ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、この結合により、ＣＡＲが発現されるＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的にされた抗原を発現する細胞に仕向ける。
【０１４４】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識する古典的ＣＡＲの一部である。
【０１４５】
多数の抗原結合ドメインが当該分野で公知であり、抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づいたものが含まれる。例えば、抗原結合ドメインは、以下を含み得る：モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；ラクダ科動物などの単一ドメインバインダー；Ｄａｒｐｉｎなどの人工バインダー；またはＴ細胞受容体由来の単鎖。
【０１４６】
以下の表１に示すように、種々の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。本発明で使用される抗原結合ドメインは、本明細書中に記載のＴＡＡに結合することができるドメインであり得る。
【表１】
2021506275.tif 000023
【０１４７】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがる古典的ＣＡＲの配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、受容体に良好な安定性をもたらすＣＤ２８に由来し得る。
【０１４８】
シグナルペプチド
ＣＡＲは、シグナルペプチドがＴ細胞などの細胞中で発現されたときに新生タンパク質が小胞体に向かい、その後に細胞表面に向かい、細胞表面で発現するようにシグナルペプチドを含み得る。
【０１４９】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファ−ヘリックスを形成する傾向がある長いストレッチの疎水性アミノ酸を含み得る。シグナルペプチドは、短い正電荷のアミノ酸ストレッチから始まってよく、このストレッチは、転位置中にポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのに役立つ。シグナルペプチドの最後に、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸ストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位置中または転位置の完了後のいずれかに切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。
【０１５０】
スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続するスペーサー配列を含み得る。可動性スペーサーにより、抗原結合ドメインを結合が容易になるように異なる方向に配向することが可能である。
【０１５１】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはヒトＣＤ８ストークもしくはマウスＣＤ８ストークを含み得る。スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替リンカー配列を代替的に含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーを、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更することができる。
【０１５２】
細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。
【０１５３】
最も一般的に使用されているシグナル伝達ドメインの構成要素は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータエンドドメインの構成要素である。これは、抗原への結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要であり得る。例えば、増殖／生存シグナルを伝達するために、キメラのＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３−ゼータと共に使用することができるか、３つ全てを共に使用することができる（図１Ｂに示す）。
【０１５４】
細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、これを含み得る。
【０１５５】
細胞内シグナル伝達ドメインは、１またはそれを超える免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み得る。ＩＴＡＭは、免疫系の一定の細胞表面タンパク質の細胞質側尾部中に２回反復された４アミノ酸の保存配列である。このモチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含み、シグネチャーＹｘｘＬ／Ｉが与えられる。これらのシグネチャーのうちの２つが、典型的には、分子の尾部中で６アミノ酸と８アミノ酸との間のアミノ酸によって分離されている（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉ）。
【０１５６】
ＩＴＡＭは、免疫細胞におけるシグナル伝達に重要である。それ故、ＩＴＡＭは、重要な細胞シグナル伝達分子（Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３およびζ鎖、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９アルファ鎖およびベータ鎖、ならびに一定のＦｃ受容体など）の尾部に見出される。これらのモチーフ内のチロシン残基は、受容体分子のそのリガンドとの相互作用後にリン酸化されるようになり、細胞のシグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のためのドッキング部位を形成する。
【０１５７】
細胞内シグナル伝達ドメインの構成要素は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ζエンドドメインを含み得るか、これから本質的になり得るか、これからなり得る。古典的には、ＣＤ３−ζエンドドメインは、抗原結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。しかし、本発明の文脈では、ＣＤ３−ζエンドドメインは、操作されたＢ２Ｍを含むＭＨＣ／ペプチド複合体が異なるＴ細胞上のＴＣＲに結合した後に、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。
【０１５８】
細胞内シグナル伝達ドメインは、さらなる共刺激シグナル伝達を含み得る。例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても公知）をＣＤ３−ζと共に使用するか、ＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３−ζと共に使用して、増殖／生存シグナルを伝達することができる。
【０１５９】
したがって、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζエンドドメインのみ、４−１ＢＢエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、もしくはＯＸ４０エンドドメインから選択される１またはそれを超える共刺激ドメインと組み合わせたＣＤ３−ζエンドドメイン、および／または４−１ＢＢ、ＣＤ２８、もしくはＯＸ４０のうちのいくつかまたは全ての組み合わせを含み得る。
【０１６０】
エンドドメインは、１またはそれを超える以下を含み得る：ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、またはＣＤ４０エンドドメイン。
【０１６１】
エンドドメイン（ｅｎｄｏｍａｉｎ）は、配列番号３１〜３４として示した配列または、バリアント配列が細胞に活性化シグナルを伝達する能力を保持することを条件として、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【０１６２】
２ポリペプチド配列間の同一率を、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で自由に利用可能）などのプログラムによって容易に判定することができる。適切には、同一率を、基準および／またはクエリー配列の全体にわたって判定する。
【化２１】
2021506275.tif 000024
【０１６３】
適切には、ＣＡＲは、以下の一般的な形式を有し得る：抗原結合ドメイン−ＴＣＲエレメント。
【０１６４】
本明細書中で使用される場合、「ＴＣＲエレメント」は、ＴＣＲ受容体複合体の構成要素のドメインまたはその一部を意味する。ＴＣＲエレメントは、細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメイン（例えば、ＴＣＲエレメントの細胞内シグナル伝達ドメイン）を含み得る（例えば、有し得る）。
【０１６５】
ＴＣＲエレメントを、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖から選択することができる。
【０１６６】
適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の細胞外ドメインを含み得る。
【０１６７】
適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の膜貫通ドメインを含み得る。
【０１６８】
適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の細胞内ドメインを含み得る。
【０１６９】
適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖を含み得る。
【０１７０】
トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原のフラグメントを主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして認識することを担うＴ細胞表面上に見出される分子である。
【０１７１】
ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロ二量体である。ヒトでは、９５％のＴ細胞において、ＴＣＲはアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）からなるのに対して、５％のＴ細胞において、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）からなる。
【０１７２】
ＴＣＲが抗原ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と会合するとき、シグナル伝達を介してＴリンパ球が活性化される。
【０１７３】
従来の抗体指向標的抗原と対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、プロセシングされてペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に送達される潜在的な細胞内タンパク質のアレイ全体を含み得る。
【０１７４】
細胞中にＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を人為的に導入するか；細胞中にベクターを使用してＴＲＧ遺伝子およびＴＲＤ遺伝子を導入することによって異種（すなわち、非天然）ＴＣＲ分子を発現するように細胞を操作することが可能である。例えば、操作したＴＣＲの遺伝子を自家性Ｔ細胞に再導入し、Ｔ細胞養子療法のために患者に戻すことができる。かかる「異種」ＴＣＲを、本明細書中で「トランスジェニックＴＣＲ」と呼ぶこともできる。
【０１７５】
細胞
本発明の細胞は、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞など））であり得る。
【０１７６】
Ｔ細胞は、アルファ−ベータＴ細胞またはガンマ−デルタＴ細胞であり得る。
【０１７７】
細胞は、患者自身の末梢血（第１のパーティ）、または造血幹細胞移植の状況におけるドナー由来の末梢血（第２のパーティ）、または無関係のドナー由来の末梢血（第３のパーティ）に由来し得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、例えば、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（単数または複数）を形質導入する前に、活性化および／または拡大することができる。
【０１７８】
あるいは、細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、その溶解機能を保持している不死化Ｔ細胞株を使用することができる。
【０１７９】
細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。ＨＳＣを、薬理学的用量のＧ−ＣＳＦ（末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ））などのサイトカインの投与による動員後の末梢血の白血球分離瀉血による適切に適合したドナーの骨髄から、または、分娩後の胎盤から回収した臍帯血（ＵＣＢ）から移植のために得ることができる。骨髄、ＰＢＳＣ、またはＵＣＢを処理せずに移植することができるか、ＨＳＣを、ＣＤ３４表面抗原に対するモノクローナル抗体での免疫選択によって富化することができる。
【０１８０】
本発明の細胞は、操作された細胞である。したがって、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲおよびキメラＴＮＦＲは、対応する非改変細胞（例えば、非改変のアルファ−ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、またはサイトカイン誘導キラー細胞）によって天然に発現されない。
【０１８１】
核酸構築物／核酸配列のキット
本発明は、核酸構築物であって、（ｉ）第１の核酸配列であって、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；ならびに（ｉｉ）第２の核酸配列であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲ活性化シグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする、第２の核酸配列を含む、核酸構築物を提供する。
【０１８２】
適切には、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲ活性化シグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を、単一の核酸配列にコードすることができる。
【０１８３】
本発明はさらに、本発明の核酸配列を含むキットを提供する。例えば、キットは、（ｉ）第１の核酸配列であって、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、第１の核酸配列；ならびに（ｉｉ）第２の核酸配列であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）本発明のＴＮＦＲ活性化シグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードする、第２の核酸配列を含み得る。
【０１８４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、相互に同義であることが意図される。
【０１８５】
適切には、核酸構築物は、本発明によって提供された異なるキメラＴＮＦＲをコードする複数の核酸配列を含み得る。例えば、核酸構築物は、本発明の異なるキメラＴＮＦＲをコードする２、３、４、または５つの核酸配列を含み得る。適切には、複数の核酸配列を、本明細書中に定義の同時発現部位によって分離することができる。
【０１８６】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が遺伝暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコードすることができると当業者に理解されるであろう。さらに、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさずにヌクレオチドを置換することができると理解すべきである。適切には、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞、特に、本明細書中に記載の免疫エフェクター細胞中で発現できるようにコドン最適化される。
【０１８７】
本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の核酸はまた、本発明の核酸内に合成または改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当該分野で公知である。これらの改変には、メチルホスホナート骨格およびホスホロチオアート骨格、分子の３’末端および／または５’末端でのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載の使用のために、当該分野で利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを改変することができると理解すべきである。かかる改変を、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を向上させるように行うことができる。
【０１８８】
ヌクレオチド配列に関連する用語「バリアント」、「ホモログ」、または「誘導体」には、ヌクレオチド配列に対する１（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変形、改変、置き換え、欠失、または付加が含まれる。
【０１８９】
同時発現部位
同時発現部位を、本明細書中に定義の、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに（ｉｉ）キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）であって、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲ活性化シグナル伝達ドメインを含む、キメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）の両方を同時発現することができる核酸配列を指すために本明細書中で使用する。
【０１９０】
同時発現部位は、操作されたポリヌクレオチドが切断部位（単数または複数）によって連結されたトランスジェニック合成生物経路の酵素をコードするように切断部位をコードする配列であり得る。典型的には、同時発現部位は、トランスジェニック合成生物経路の個別の酵素をコードする隣接するポリヌクレオチド配列の間に存在する
【０１９１】
適切には、複数の同時発現部位が操作されたポリヌクレオチド中に存在する実施形態では、同一の同時発現部位を使用することができる。
【０１９２】
好ましくは、同時発現部位は切断部位である。切断部位は、２つのポリペプチドが分離するようになることが可能な任意の配列であり得る。切断部位は、ポリペプチドが産生されたときにいかなる外部の切断活性も必要とせずに個別のペプチドに直ちに切断されるように自己切断し得る。
【０１９３】
用語「切断」を本明細書中で便宜上使用するが、切断部位により、古典的な切断以外の機序によってペプチドを個別の実体に分離することができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）について、以下の「切断」活性を説明するための種々のモデルが提案されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解活性、自己タンパク質分解活性、または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。かかる「切断」の正確な機序は、切断部位がタンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに個別の実体としてタンパク質を発現する限り、本発明の目的には重要でない。
【０１９４】
切断部位は、フューリン切断部位であり得る。フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在的な前駆体タンパク質をその生物学的に活性な生成物にプロセシングするプロタンパク質転換酵素である。フューリンは、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼであり、その対となる塩基性アミノ酸プロセシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断することができる。フューリン基質の例には、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロ−ベータ−セクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニット、およびフォンウィルブランド因子が含まれる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（規範的に、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）のすぐ下流のタンパク質を切断し、ゴルジ装置中に豊富に存在する。
【０１９５】
切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得る。
【０１９６】
ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において融合タンパク質の切断を制御するために頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、
【化２２】
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である。哺乳動物細胞（ヒト細胞など）は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞中で発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼは哺乳動物細胞中でも発現されなければならない。
【０１９７】
切断部位は、自己切断ペプチドをコードし得る。「自己切断ペプチド」は、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性も必要とせずに個別かつ分離した第１および第２のポリペプチドに直ちに「切断される」か分離されるように機能するペプチドを指す。
【０１９８】
自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体がＣ末端で「切断している」２Ａによって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）（口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなど）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短い部分であり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントを示す（上記のＤｏｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ（２００１））。
【０１９９】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルス（ａｐｔｈｏ−）またはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、タイプＣロタウイルス、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ内の反復配列および上記の細菌配列（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）で見出されている。
【０２００】
同時発現配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。同時発現配列は、内部プロモーターであり得る。
【０２０１】
ベクター
本発明はまた、１またはそれを超える本発明の核酸配列（単数または複数）または核酸構築物（単数または複数）を含むベクター、またはベクターのキットを提供する。かかるベクターを使用して、宿主細胞がＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲならびに（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲ活性化シグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を発現するように、核酸配列（単数または複数）または構築物（単数または複数）を宿主細胞中に導入することができる。
【０２０２】
適切には、ベクターは、本発明によって提供された異なるキメラＴＮＦＲをコードする複数の核酸配列を含み得る。例えば、ベクターは、本発明の異なるキメラＴＮＦＲをコードする２、３、４、または５つの核酸配列を含み得る。適切には、複数の核酸配列を、本明細書中に定義の同時発現部位によって分離することができる。
【０２０３】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２０４】
ベクターは、細胞にトランスフェクトするか形質導入することが可能であり得る。
【０２０５】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列；ベクターまたは第１および第２のベクターを含む医薬組成物に関する。特に、本発明は、本発明の細胞を含む医薬組成物に関する。
【０２０６】
医薬組成物は、さらに、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０２０７】
処置方法
本発明は、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列；ベクターまたは第１および第２のベクターを被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防する方法を提供する。
【０２０８】
適切には、本発明の疾患を処置および／または予防する方法は、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の細胞を被験体に投与する工程を含み得る。
【０２０９】
疾患を処置する方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。この態様では、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和、軽減、または改善し、そして／または疾患の進行を遅延、軽減、または遮断するために、既存の疾患または容態を有する被験体に細胞を投与することができる。
【０２１０】
疾患を予防する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。この態様では、未だ罹患しておらず、そして／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に、疾患の原因を予防するか損なわせるか、疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を軽減または予防するために細胞を投与することができる。被験体は、疾患の素因を有し得るか、発症リスクがあると考えられ得る。
【０２１１】
本方法は、以下：
（ｉ）細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）かかる細胞を、本発明によって提供された核酸配列またはベクターで形質導入するかトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与する工程
を含み得る。
【０２１２】
本発明は、疾患の処置および／または予防に使用するための本発明の細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列、ベクター、または第１および第２のベクターを提供する。特に、本発明は、疾患の処置および／または予防に使用するための本発明の細胞を提供する。
【０２１３】
本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の本発明の細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列、ベクター、または第１および第２のベクターの使用に関する。特に、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における細胞の使用に関する。
【０２１４】
本発明の方法によって処置および／または予防すべき疾患は、癌であり得る。
【０２１５】
癌は、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（腎細胞）、白血病、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、および甲状腺癌などであり得る。
【０２１６】
本発明の細胞、特にＣＡＲ細胞は、標的細胞（癌細胞など）を死滅させることが可能であり得る。標的細胞は、ＴＡＡの発現（例えば、上の表１に提供したＴＡＡの発現）によって認識可能であり得る。癌は、表１に列挙した癌であり得る。
【０２１７】
細胞の作製方法
本発明のＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲ発現細胞を、多数の手段（ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションが含まれる）のうちの１つによってＣＡＲまたはＴＣＲおよび（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲ活性化シグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成することができる。
【０２１８】
本発明の細胞を、以下：
（ｉ）被験体または上に列挙の他の供給源のうちの１つから細胞を含む試料を単離すること；および
（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにて１またはそれを超える上記定義の核酸配列（単数または複数）または核酸構築物で細胞を形質導入またはトランスフェクトすること
によって作製することができる。
【０２１９】
次いで、細胞を、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて精製する（例えば、選択する）ことができる。
【０２２０】
本開示は、本明細書中に開示の例示的な方法および材料に制限されず、本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値の範囲は、範囲を定義する数字を含む。別段の指示がない限り、それぞれ、任意の核酸配列を、左から右に５’から３’への方向で記載し；アミノ酸配列を、左から右にアミノからカルボキシへの方向に記載する。
【０２２１】
値の範囲を提供する場合、文脈上明確に別段の指示がない限り、前述の範囲の上限と下限との間の各々の介在値も、最小単位の１０分の１まで具体的に開示されていると理解される。任意の所定の値または所定の範囲内の介在値と任意の他の所定の値またはその所定の範囲内の介在値との間の各々のより小さい範囲が本開示に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して前述の範囲内に含まれても除外されてもよく、限度のいずれかまたは両方がより小さな範囲に含まれるか、含まれない各範囲も本開示内に含まれ、但し、所定の範囲内に任意の具体的に除外される限度があるものとする。所定の範囲が限度の一方または両方を含む場合、含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【０２２２】
本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上そうでないと明確に示されない限り、複数形が含まれることに留意しなければならない。
【０２２３】
本明細書中で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「〜から構成される」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」と同義であり、包括的または非制限であり、さらなる列挙されていない部材、要素、方法の工程を排除しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「〜から構成される」には、用語「〜からなる」も含まれる。
【０２２４】
本明細書中で考察した刊行物を、本発明の出願日より前の開示のみを目的として提供している。本明細書において、かかる刊行物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することを承認すると解釈されるべきではない。
【０２２５】
本発明を、ここに、実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の実施において当業者を補助することを意図し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【実施例】
【０２２６】
実施例１−ＣＤ２７−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を発現するように形質導入し、ＣＤ２７−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体を同時発現するようにさらに操作する。ＣＤ２７−４−１ＢＢを同時発現するＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｒａｊｉ腫瘍細胞株と共培養する。ＣＤ７０を発現する自家性単球または樹状細胞を、ＣＡＲ  Ｔ細胞／Ｒａｊｉ細胞と共培養する。標的細胞の死滅を、フローサイトメトリーによって標的細胞の生存数をカウントすることによって判定する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および表現型を、フローサイトメトリーによって判定する。
【０２２７】
実施例２−ＣＤ２７−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
マウスに、同系Ａ２０マウスリンパ腫操作細胞株（ホタルルシフェラーゼを発現するように操作）を尾静脈注射によって移植する。１０〜１４日後、Ａ２０細胞株は、骨髄、脾臓、およびリンパ節組織中に生着する。マウスＴ細胞を、抗（マウス）ＣＤ１９  ＣＡＲで形質導入するか、抗（マウス）ＣＤ１９  ＣＡＲを（マウス）ＣＤ２７−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体と共に同時発現するバイシストロン性ベクターで形質導入する。Ａ２０負荷マウスの３つのコホートに、ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与しないか、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与するか、抗ＣＤ１９／ＣＤ２７−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与する。Ａ２０腫瘍の進行を、連続生物発光画像化によって測定する。実験終了時に、マウスを屠殺し、剖検を行う。ＣＡＲ  Ｔ細胞の生着を、血液、髄、脾臓、およびリンパ節組織のフローサイトメトリーによって判定する。残存する腫瘍負荷も、これらの組織のフローサイトメトリーおよび骨髄の免疫組織化学によって判定する。
【０２２８】
実施例３−ＲＡＮＫ−４−１ＢＢキメラのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを発現するように操作された骨髄腫細胞株（ＭＭ１）を尾静脈注射する。この細胞株はマウスの骨髄に帰巣し、溶解性骨病変を引き起こす。初代ヒトＴ細胞を、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲまたはＢＣＭＡ  ＣＡＲをＲＡＮＫ−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体と共に同時発現するカセットのいずれかで形質導入する。１２日後、マウスに、非形質導入Ｔ細胞、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＢＣＭＡ−ＣＡＲ／ＲＡＮＫ−４−１ＢＢキメラＴ細胞のいずれかを投与する。腫瘍の進行を、連続生物発光画像化によって判定する。マイクロＣＴによって骨溶解性病変も測定する。実験終了時に動物を屠殺する。疾患負荷を、フローサイトメトリーおよび骨髄の免疫組織化学によって判定する。骨溶解性病変を、骨髄の組織化学によって測定することもできる。Ｔ細胞の生着および持続を、髄、脾臓、血液、およびリンパ節のフローサイトメトリーによって判定する。
【０２２９】
実施例４−ｆｎ１４−４−１ＢＢキメラのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
初代ヒトＴ細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲおよびｆｎ１４−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体を同時発現するバイシストロン性ベクターで形質導入する。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するように操作されたヒト神経膠腫細胞株（Ａ１７２細胞株、ＬＮ−１８細胞株、またはＬｎ−２２９細胞株など）を含むように、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＣＡＲ／ｆｎ１４−４−１ＢＢ  Ｔ細胞のいずれかと共培養する。ＴＷＥＡＫを分泌する間質細胞を添加した共培養も同様に並行して行う。標的細胞の死滅およびＴ細胞の増殖／分化を、フローサイトメトリーによって判定する。
【０２３０】
実施例５−ｆｎ１４−４−１ＢＢキメラのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
マウスに、定位注射を使用してマウスＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するマウス神経膠腫細胞株ＧＬ２６１を同所性に移植する。腫瘍の生着および進行を、マイクロＭＲＩを使用して判定および測定する。同系脾細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲおよびｆｎ１４−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体を同時発現するバイシストロン性ベクターで形質導入する。脾細胞を、ホタルルシフェラーゼを発現するようにさらに形質導入する。ＧＬ２６１保有マウスに、低線量（５Ｇｙ）の全身照射を行い、以下の３つのコホートに分ける：ＣＡＲ  Ｔ細胞なし、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ／ｆｎ１４−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞。Ｔ細胞の輸送、拡大、および増殖を、連続生物発光画像化による実験によって判定する。腫瘍応答を、マイクロＭＲＩを使用して判定する。実験終了時にマウスを屠殺する。Ｔ細胞の生着を、骨髄、血液、脾臓、およびリンパ節のフローサイトメトリーによって全身性に判定する。マウスの脳を採取する。半分を固定し、腫瘍応答／Ｔ細胞浸潤を免疫組織化学によって決定する。他方のマウス脳をホモジナイズし、パーコールを使用してＴ細胞を単離する。単離したＴ細胞の数および量を、フローサイトメトリーによって判定する。
【０２３１】
実施例６−ＲＡＮＫ−４−１ＢＢまたはＨＶＥＭ−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
初代ヒトＴ細胞を、第１世代ＧＤ２  ＣＡＲのみを発現するか、ＧＤ２  ＣＡＲをＲＡＮＫ−４−１ＢＢまたはＨＶＥＭ−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体のいずれかと同時発現するように形質導入した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、キメラＴＮＦ受容体のリガンドを提供する細胞の存在下または非存在下で、特異的腫瘍抗原（標的細胞）を発現する標的細胞または発現しない標的細胞（非標的細胞）と共培養した。標的細胞の死滅を、フローサイトメトリーによって標的細胞の生存数をカウントすることによって判定した。ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖も、フローサイトメトリーによって判定した。
【０２３２】
結果を図４および５に示す。ＨＶＥＭ−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体（図４Ａ）およびＲＡＮＫ−４−１ＢＢキメラＴＮＦ受容体（図５Ａ）の両方について、キメラＴＮＦ受容体の発現が、特にＴＮＦ受容体のリガンドを提供する細胞の存在下で、Ｔ細胞の増殖を増加させた。キメラＴＮＦ受容体の発現が、この場合も特にＴＮＦ受容体のリガンドを提供する細胞の存在下で、ＣＡＲ媒介性の標的細胞の死滅（図４Ｂおよび５Ｂ）も増加させた。
【０２３３】
細胞培養および試薬
実験で使用した全ての細胞株および初代Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｂｉｏｓｅｒａ）および１％Ｌ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ，Ｇｉｂｃｏ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。ＳｕｐＴ１細胞を、ＡＴＣＣから購入した。Ｔ細胞を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（ＮＨＳＢＴ；Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ，ＵＫ）から入手したＰＢＭＣから生成した。形質導入したＴ細胞を、１００Ｕ／ｍＬのインターロイキン−２（ＩＬ−２）をさらに添加した前述と同一の培地中で培養した。
【０２３４】
レトロウイルスおよびプラスミドの構築物
分子クローニングを、重複オリゴヌクレオチドを使用したコドン最適化配列のｄｅ  ｎｏｖｏ遺伝子合成混合物を使用して行い、ＣＡＲ骨格にクローン化した。各読み取り枠を、ＳＦＧレトロウイルス移入ベクターにクローン化した。ＴＮＦ−４−１ＢＢ配列を、口蹄疫２Ａ自己切断ペプチドベースの（２Ａペプチド）多遺伝子発現系のインフレームクローンングによって同時発現させた。ＷＯ２０１３／１５３３９１号に記載のように、ＲＱＲ８マーカー遺伝子も使用した。ＲＱＲ８は、ＱＢＥＮＤ／１０抗ＣＤ３４ｍＡｂによって認識される。これらのマーカーを、コドンゆらぎ２Ａペプチドを有する構築物に配置ＲＱＲ８＿ＣＡＲ＿ＴＮＦ−４−１ＢＢで導入した。
【０２３５】
形質導入
レトロウイルスを、ｇａｇ−ｐｏｌをコードするプラスミド（ｐＥＱ−Ｐａｍ３−Ｅ３６）、ＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミド（ＲＤＦ３７）、および所望のレトロウイルス移入ベクタープラスミドと共にＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって産生した。以前に記載のようにＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ）を使用して形質導入を行った。異なる構築物の形質導入効率を、ＱＢＥＮＤ／１０ｍＡｂを使用して行ったＲＱＲ８染色の発現に基づいたフローサイトメトリーによって評価した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してフローサイトメトリー分析を行った。ＢＤ  ＦＡＣＳを使用してフローソーティングを行った。
【０２３６】
Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）染色を、ＴＮＦリガンド提供細胞（図中で認められるように、「ＲＡＮＫＬ」または「ＬＩＧＨＴ」）の存在下で、標的細胞ＳｕｐＴ１−ＧＤ２（または対照としてのＳｕｐＴ１−ＮＴ細胞）との共培養においてＣＡＲおよびＣＴＮＦＲ配列（またはＣＡＲのみ）を発現するＴ細胞の増殖を評価するために行った。異なるＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞（対照として使用したＮＴ  Ｔ細胞）を、標的細胞との共培養の設定前にＣＴＶで標識した。製造者の説明書にしたがってＣＴＶ色素を含む新鮮なＰＢＳ中にＴ細胞を再懸濁することによって染色した。エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：２で共培養した。５日後にフローサイトメトリーによって増殖を評価した。死細胞の排除およびＴ細胞の検出のために、細胞を、７−ＡＡＤおよびＣＤ３でそれぞれ染色した。ＣＴＶ染色細胞を使用して、死細胞の色素希釈範囲によって増殖を測定した。
【０２３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
ＣＡＲおよびＴＮＦ−４−１ＢＢタンパク質（またはＣＡＲのみ）を発現するＴ細胞から、製造者の説明書に従ってＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ５６ポジティブ選択キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＤ５６発現ナチュラルキラー細胞を除去した。次いで、５日後および７日後に、細胞を細胞傷害性アッセイで使用した。ＴＮＦリガンド提供細胞（図中で認められるように、「ＲＡＮＫＬ」または「ＬＩＧＨＴ」）の存在／非存在下で、標的を発現するＳｕｐＴ１を使用して、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：２で細胞傷害性アッセイを設定した。ＳｕｐＴ１  ＷＴ細胞を、対照として同一条件で使用した。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞を、ネガティブコントロールとして標的との共培養物中で使用した。ＣＡＲ媒介細胞傷害性を、５日後のフローサイトメトリーによって評価した。Ｔ細胞を、ＣＤ３および染色によって標的細胞から同定した。死細胞を排除するために７−ＡＡＤ生存色素を使用した。各共培養条件について生存標的細胞を計数した。標的細胞の残存率を、各条件の生存標的細胞数をＮＴ  Ｔ細胞を使用して行った共培養から回収した細胞数（１００％）に対して正規化することによって計算した。
【０２３８】
上記明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明を特定の実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載の発現がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな本発明の実施のための記載の様式の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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