(57)【要約】  本発明は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及びこの種々の実施形態を用いた核酸の等温増幅に基づく分子生物アッセイのデザイン並びに改良方法に関する。この発明では、反応の指数関数的動態及び特異性を向上させ、固体表面上での増幅を可能とする、エンドヌクレアーゼ媒介移動平衡増幅（ＥＭ−ＳＥｑ）と名付けられたＳＤＡのための新規の方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸配列の集団の鎖置換増幅のための方法であって、
ａ．該集団における鎖の末端を、該末端の少なくとも１つが、３７〜８０℃の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含むように修飾するステップと、
ｂ．低融点末端を有する核酸分子の集団を、該低融点末端とハイブリダイズする１つ又は複数の増幅プライマーを使用して複製するステップであって、該プライマーが、核酸分子の鋳型集団の３’末端を越えて５’一本鎖区画を有し、これにより該鋳型の３’末端が伸長してエンドヌクレアーゼの完全認識部位を形成し、該プライマーの３’末端が鎖置換により伸長して該鋳型を複製する、ステップと、
ｃ．該エンドヌクレアーゼの該完全認識部位を使用して、伸長した該鎖をニッキングし、これにより該プライマーにおける遊離３’−ＯＨ基を遊離させるステップと、
ｄ．該遊離３’−ＯＨ基を鎖置換により伸長して該鋳型を再複製するステップと
を含み、ステップｂ、ｃ及びｄが、等温的に実施され、これにより二本鎖核酸配列の該集団の該鎖置換増幅が生じる、方法。
【請求項２】
前記集団における鎖の末端は、該末端の少なくとも１つが、３７〜６５℃の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融解領域の配列を含むように修飾される、請求項１、ステップａに記載の方法。
【請求項３】
前記増幅が、単一の増幅プライマーを用いて実行され、これにより前記二本鎖核酸配列の集団の一方の鎖を複製する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅が、２つの増幅プライマーを用いて実行され、これにより前記二本鎖核酸配列の集団の両鎖を複製する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅プライマーの１つ又は複数が、固体支持体上に固定化されている、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
一方の鎖の前記増幅プライマーのみが、固体支持体上に固定化されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
伸長ステップｂ及びｄが、鎖置換ポリメラーゼを使用して実施される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、Ｂｓｔポリメラーゼ又はクレノウ断片ポリメラーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記集団における鎖の末端が、アダプターライゲーションにより修飾されている、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記集団における鎖の前記修飾末端が、前記修飾を有するプライマーの伸長を使用して得られる、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾末端が、エンドヌクレアーゼの認識部位の一部を含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記鋳型集団の３’末端を越えて５’一本鎖区画を有する前記増幅プライマーの配列が、エンドヌクレアーゼの認識部位の完全鎖を該一本鎖区画に有し、完全二本鎖認識部位が、鎖伸長により生成される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記低融点領域が、ミスマッチ塩基対を含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記低融点領域が、３０％未満のＧＣ含量を有する２０ヌクレオチドの領域を含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーが、天然の塩基よりも高い融解温度に上昇させる塩基を含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記低融点領域が、等温増幅温度で一本鎖である、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記等温増幅温度が、５０〜６５℃である、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記低融点領域が、天然には存在しない配列を有する、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記伸長した鎖のニックが、ニッキングエンドヌクレアーゼを使用して生成される、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ又はＮｂ．ＢｓｍＩから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記伸長が、切断不可能な核酸骨格を生成する非天然ｄＮＴＰを使用して実施される、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プライマーが、ブロッキング部分により、これらの３’末端でブロッキングされて、ニッキングが生じるまでは、３’末端伸長が防がれる、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記固定化した伸長生成物が、引き続いてシーケンシングされる、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅が、２つの固定化プライマーを使用して実施され、両鎖がシーケンシングされ、これにより、それぞれ前記二本鎖核酸配列の集団の各鎖からの１つの読取り配列である、一対の読取り配列を生成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
核酸配列の修飾のためのキットであって、
ａ．二本鎖核酸配列の集団の末端を修飾するための核酸アダプター分子の第１の対であって、該アダプター対の第１の鎖の５’末端が、エンドヌクレアーゼの認識部位の一部を含み、該アダプター対の中央部が、３７〜８０℃の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含み、該アダプター対の第１の鎖の３’末端及び該アダプター対の第２の鎖の５’末端が、該二本鎖核酸配列の集団の両鎖とのライゲーションを受け得る、第１の対と、
ｂ．リガーゼ酵素と
を含むキット。
【請求項２６】
１つ又は複数の増幅プライマーをさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記増幅プライマーの１つ又は複数が、固定化されている、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記アダプター対の前記中央部が、５０〜６５℃の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含む、請求項２４から２８までのいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤＡ）を用いた核酸の等温増幅に基づく分子生物アッセイのデザイン並びにその種々の実施形態及び改良方法に関する。この発明では、反応の指数関数的動態及び特異性を向上させ、固体表面上での増幅を可能とする、エンドヌクレアーゼ媒介移動平衡増幅（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｈｉｆｔｉｎｇ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＥＭ−ＳＥｑ）と名付けられたＳＤＡのための新規の方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）
ＳＤＡは、迅速且つ効率的な等温核酸増幅方法であり、この方法では、配列特異性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、制限酵素又はニッキング酵素を、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、遊離の３’末端を鋳型鎖にわたって伸長する間に下流で接触する相補ＤＮＡ鎖を置換（分解ではなく）することが可能なＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用する。ＳＤＡは、元々、当時利用可能な酵素の温度プロファイルのため、摂氏３７〜４０度の温度で操作するように説明されていたが、高レベルのオフターゲット増幅を生じる。しかし、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）では、熱安定性酵素を使用し、摂氏５０度以上で反応を実行することが可能と記載されている。
【０００３】
ＳＤＡの機構
天然に見出される多くの配列のようなエンドヌクレアーゼ認識部位を欠く標的配列を増幅する場合、反応は、最初の温度変性ステップにより典型的に開始し、これにより２つの一本鎖プライミングオリゴヌクレオチド（後にプライマーと呼ぶ）が、標的ＤＮＡ配列の２つの末端に特異的に結合することが可能となる。２つのプライマーは、これらの５’末端に、反応において使用される所与のＤＮＡエンドヌクレアーゼの結合部位として作用する、短い（典型的には６〜８ヌクレオチド長）認識配列を有する。ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長時、二本鎖ＤＮＡ種が生成され、これは、選択されたＤＮＡエンドヌクレアーゼ認識配列と両端で隣接する標的ＤＮＡ配列を含む。次いで、この分子は、引き続くＳＤＡ反応のための基質として作用する（図１Ａ）。
【０００４】
ＳＤＡの増幅サイクルは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、その認識部位に結合し、優先的に、ＤＮＡ二重鎖の一つの骨格鎖（近位５’末端を有する鎖）だけで、ホスホジエステル結合を切断して実施される。両鎖におけるＤＮＡの切断に代わる、このような一本鎖切断部（後に「ニック」と呼ぶ）の生成は、少なくとも２つの方法により達成され得る。第一に、ある特定の修飾ヌクレオチドに対して感受性を示す、非回文構造制限酵素を使用し得る。例えば、最初に文書化された応用では、ＳＤＡは、制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いて実証されており、これは、非回文構造認識配列ＧＴＴ＊ＧＡＣを有し、ここで、アスタリスクは、切断部位を表す。ＧＴＣＡＡＧ配列を有する相補鎖の切断を回避するために、デオキシアデノシン５’−［α−チオ］三リン酸（ｄＡＴＰαＳ）を標準的アデノシン５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）の代わりに、プライマー合成と増幅反応の両方において使用する。結果として、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素は、相補性ＧＴＣＡＡＧ配列におけるＣと最初のＡとの間に形成されたチオエステル結合を切断することが不可能であるが、第１の鎖の標的ＧＴＴＧＡＣ配列における２番目のＴとＧとの間にニックを導入する能力を保持する。
【０００５】
修飾ヌクレオチドの使用の代替として、天然に見出されるか又は唯一のＤＮＡ鎖を切断するように人工的に改変した（ニッキング酵素としても知られる）制限酵素を、標準的制限酵素の代わりに使用し得る。このようなＳＤＡの実施形態は、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）又はニッキングエンドヌクレアーゼ依存的増幅（ＮＤＡ）としても知られる。多数の適するニッキング酵素が記載されており、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ他多数を含む。ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖をニッキングすると、新たに形成した遊離３’末端にヒドロキシ基が残り、次いで、ＳＤＡの間に、鎖置換活性を有する前述のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｂｓｔポリメラーゼにより、これが伸長する。結果として、ニックの鎖の下流が、溶液中に遊離する。新たな相補鎖が合成されるため、エンドヌクレアーゼ認識部位が再生成され、ニックの形成及び伸長のサイクルが可能となり、これにより、導入されたニックの下流に相補性一本鎖が直線的に生成される。標的配列がエンドヌクレアーゼ認識部位と両端で隣接するため、反応により、２種類の「増幅単位」から両方の鎖が同時に生じる（図１Ｂ）。
【０００６】
しかし、このプロセスにおいて生成されたＤＮＡ鎖は、トランケート（切断された）エンドヌクレアーゼ認識部位と隣接し、したがって、さらに増幅することができない（図１Ｃ）。指数関数的増幅を達成するために、認識部位は、再生成する必要がある。最も一般的には、これは、相補性３’末端を有する生成鎖に結合する、２つのプライマーの存在により達成される（図１Ｅ、Ｆ）。生成鎖を、この３’末端から伸長すると、プライマーが結合する場合、切断されたエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの１つが再生成され、切断された生成物が「増幅単位」となる。
【０００７】
重要なことには、切断された認識部位を有する直線的に生成されたＤＮＡ鎖の両方が、完全に相補性であり、遊離のプライマーへ結合しないため、これらはまた、容易に相互にアニーリングすることができ（再生）、増幅不可能な「デッドエンド（行き止まり）」二本鎖生成分子が生じる（図１Ｄ）。高いプライマー濃度が、生成物の再生を克服するのに必要とされる。その上、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは対照的に、反応は、等温的に生じ、系は、熱変性により各サイクルでリセットして、プライマー結合を再試行することができない。結果として、ＳＤＡにより、少なくとも３つの異なる種類の生成分子が生成され、生成物対プライマー比が高くなる場合、デッドエンド生成物が、後の反応ステップにおいて支配的となることが多い。このようなデッドエンド生成物はまた、５’プライマー末端に存在する任意の配列又は化学的部分を欠く。これは、例えば、固定化プライマーの使用により表面で増幅を試みる場合、ＳＤＡのアウトプットに著しい制限を加える。
【０００８】
典型的なニッキング及び伸長反応は、例えば、米国特許出願公開第２００９／００１７４５３号において確認することができる。このような条件では、生成されたアンプリコンは短く（すべての例では約２５塩基対の長さ）、また、増幅された物質の存在の検出が可能となるように、この方法において増幅を実施可能とするために、引き続く解析に必要とされる、最初の増幅アダプターをアンプリコンの大部分は含まず、この方法を使用し、アンプリコンを調製して、さらなるシーケンシングを行うことができない。
【０００９】
真性等温ＳＤＡ（ｉＳＤＡ）と名付けられた、あるバージョンのＳＤＡでは、そのうちの１つが「フラップ」として作用する２つのプライマー対を用いる、最初の熱変性ステップを省略することが可能であることが、Ａｎａｌｙｓｔ（２０１５）ｖｏｌ  １４０  ｎｏ  ２２、７５４０〜７５４９頁に記載されている。この方法では、前指数関数的プライマーをゲノム配列に挿入して伸長するために、試料のブリージング（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）を最初に必要とする。これにより、最初の伸長プライマーをハイブリダイズするために、熱変性させる必要性が回避される。最初の前指数関数的生成物が、形成されて、伸長した鎖を置換するバンパープライマーの伸長により、制限部位を使用せずに置換されると、この二本鎖生成物は、標準的ＳＤＡにより増幅される。したがって、増幅された物質の大部分が、さらなる増幅にアダプター付加末端の欠如により、さらにシーケンシングすることができないため、記載したＳＤＡの問題は、克服されない。
【００１０】
配列特異性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、制限酵素又はニッキング酵素を、５’−３’ エキソヌクレアーゼ活性を欠く鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用するＳＤＡとは対照的に、他の等温増幅技術が報告されている。例としては、米国特許出願公開第２００７／００５４３０１号が挙げられ、これは、鋳型がブリージング可能な末端を有し、これにより新たなプライマーが鎖侵入し、したがって伸長可能である方法を記載している。これは、伸長のための遊離３’末端を付与するプライマーをニッキングする、配列特異性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用するＳＤＡとは対照的である。既にハイブリダイズしたプライマーをニッキングして伸長するのではなく、プライマー全体を鎖侵入させて伸長する必要性は、この方法を、ＳＤＡとは異なるものとし、ＳＤＡよりも非効率なものとしている。
【００１１】
本明細書では、プライマーデザインにより、デッドエンド生成物の生成を制限し、これにより反応の指数関数的動態が向上し、生成される生成物種の数が減少して、生成物間のバランスが５’末端プライマー配列を含むものへ変化する、エンドヌクレアーゼ媒介移動平衡増幅（ＥＭ−ＳＥｑ）と名付けられた好熱性ＳＤＡのための方法を記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
核酸の等温増幅のための改良した方法を記載する。方法では、さらなる使用に適する適切にアダプター付加末端を有する生成物に対して完全に相補性である、デッドエンドを有する二本鎖生成物由来の、生成物のバランスを変化させる。この方法は、プライマーとハイブリダイズしてスナップ伸長を受けるのに、等温増幅温度で十分に一過性の一本鎖である、ブリージング可能な末端領域の組込みに依存する。このような低融解でブリージング可能な末端領域は、不安定な末端として見ることができ、増幅を開始する前に鎖に導入する。次いで、他の鎖置換増幅方法と同一の方法で、伸長において鎖置換ポリメラーゼを使用するニッキング及び伸長の反復ステップを介して、伸長を進めることができる。しかし、鋳型上に導入された低融解末端は、デッドエンドアンプリコンの蓄積を妨げる。
【００１３】
二本鎖核酸配列の集団の鎖置換増幅のための方法であって、
ａ．該集団における鎖の末端を、該末端の少なくとも１つが、３７℃よりも高く８０℃未満の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含むように修飾するステップと、
ｂ．該低融点末端を有する核酸分子の集団を、該低融点末端とハイブリダイズする１つ又は複数の増幅プライマーを使用して複製するステップであって、該プライマーが、核酸分子の鋳型集団の３’末端を越えて５’一本鎖区画を有し、これにより鋳型の３’末端が伸長してエンドヌクレアーゼの完全認識部位を形成し、該プライマーの３’末端が鎖置換により伸長して鋳型を複製する、ステップと、
ｃ．該エンドヌクレアーゼの完全認識部位を使用して、伸長した鎖をニッキングし、これによりプライマーにおける遊離３’−ＯＨ基を遊離させるステップと、
ｄ．遊離３’−ＯＨ基を鎖置換により伸長して鋳型を再複製するステップと
を含み、ステップｂ、ｃ及びｄが、等温的に実施され、これにより二本鎖核酸配列の集団の鎖置換増幅が生じる、方法を記載する。
【００１４】
方法では、単一の増幅プライマーを使用して実施し、これにより二本鎖核酸配列の集団の一方の鎖を複製することができる。或いは、方法では、２つの増幅プライマーを使用して実施し、これにより二本鎖核酸配列の集団の両方の鎖を複製することができる。増幅プライマーは、固体支持体上に固定化され得る。
【００１５】
増幅プライマーと名付けられた分子は、適するブロッキング部分により、これらの３’末端でブロッキングされていてもよく、プライマーをエンドヌクレアーゼによりニッキングして、ブロッキングしたプライマーを短縮し、これにより増幅を可能とするまでは、このブロッキングにより、プライマーの３’末端伸長が防がれる。
【００１６】
鎖置換の任意の方法を使用することができる。例えば、伸長ステップｂ及びｄは、鎖置換ポリメラーゼを使用して実施され得る。ポリメラーゼは、Ｂｓｔポリメラーゼ又はクレノウ断片ポリメラーゼであり得る。二本鎖試料を生じさせる増幅のために、試料は、プライマーハイブリダイゼーションにおいて等温増幅温度で生じさせるのに十分な一本鎖である低融解末端とは別の二本鎖でなければならない。
【００１７】
鎖の末端は、適する任意の方法を使用して修飾することができる。例えば、集団の鎖の末端は、アダプターライゲーションにより修飾され得る。或いは、集団の鎖の修飾末端は、この修飾を有するプライマーの伸長を使用して得られ得る。
【００１８】
低融点領域は、適する核酸配列を使用して調製することができる。２つの領域種の融解温度における所望の差は、多数の方法により達成され得る。例えば、（ｉ）著しく異なるＧＣ％含量、（ｉｉ）ＤＮＡ二重鎖の熱安定性を変更する修飾塩基、例えば、これらに限定されないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）又は８−アザ−７−デアザグアノシンの使用、及び（ｉｉｉ）プライマー分子及び鋳型ＤＮＡに存在するＬＬ領域とＬＲ領域との間の部分的相補性による。例えば、低融点領域は、ミスマッチ塩基対を含み、これにより配列が、完全には相補性でないことがある。例えば、低融点末端は、３０％未満のＧＣ含量を有し得る。例えば、末端は、３０％未満のＧＣ含量を有する２０ヌクレオチド長のＤＮＡ配列であり得る。
【００１９】
方法は、プライマーのハイブリダイゼーションが増幅温度で生じ得る一本鎖である、十分な量の低融点末端領域に依存する。増幅温度は、一般に、３７℃よりも高く８０℃未満である。末端が少なくとも一過性に一本鎖である温度は、増幅温度と同一であり得る。低融点領域は、等温増幅温度で一本鎖であり得る。温度は、３７〜６５℃であり得る。等温増幅温度は、５０〜６５℃であり得る。低融点領域は、天然には存在しない配列であり得る。
【００２０】
プライマー分子と鋳型の一過性一本鎖低融点領域との効率的なハイブリダイゼーションを促進するために、相補性プライマー配列は、二重鎖形成を安定化する修飾塩基を有するヌクレオチドで構成することができる。プライマーは、５’の突出を有する。プライマーが一過的にハイブリダイズすると、鋳型の３’末端を伸長するスナップ伸長が生じ、したがって、ハイブリダイズした領域の長さを増大させることによりハイブリダイズしたプライマーの安定性が高まる。
【００２１】
伸長したプライマーにより、二本鎖制限エンドヌクレアーゼ部位の完全配列が生成される。二本鎖制限エンドヌクレアーゼ部位の配列の一部は、修飾低融解末端に存在し得る。或いは、完全配列は、プライマーに存在し得る。例として、６塩基二本鎖認識部位が選択される場合、３塩基は、集団の修飾低融点末端に由来してもよく、３塩基は、一本鎖プライマーに存在してもよい。低融解領域の３’末端からの鎖伸長では、鋳型を伸長して、最初の３塩基に完全認識部位を構成させる。或いは、すべての６塩基が、一本鎖プライマーに存在し得る。低融解領域の３’末端からの鎖伸長では、鋳型を伸長して、最初の６塩基に完全認識部位を構成させる。
【００２２】
完全二本鎖認識部位が鋳型分子の末端に結合しない場合、鋳型の３’末端を伸長して、突出するプライマーを二本鎖とするステップなしに、他の鎖伸長が生じ得ることは、有益である。この方法は、鋳型の３’末端の伸長により生成された完全二本鎖認識部位に依存する。プライマーとは逆の鋳型の伸長により、等温増幅を通じて二本鎖のままである配列の領域が生成される。
【００２３】
伸長した鎖のニックは、酵素を使用して生成することができる。伸長した鎖のニックは、ニッキングエンドヌクレアーゼを使用して生成され得る。ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ又はＮｂ．ＢｓｍＩから選択され得る。
【００２４】
ニックは、生成することができ、この場合、一方の鎖は切断可能であり、一方の鎖は切断に対して抵抗性である。切断抵抗性鎖は、切断不可能な核酸骨格を生成する非天然ｄＮＴＰを使用して伸長が実施される場合、生成することができる。このような非天然ｄＮＴＰは、切断抵抗性チオエステル結合を付与する、５’−［α−チオ］三リン酸を含む。
【００２５】
エンドヌクレアーゼ認識配列は、
３’−ＣＡＧＴＴＧ−５’
５’−ＧＴＣＡＡＣ−３’
であり得る。
【００２６】
エンドヌクレアーゼ認識配列は、
３’−ＣＡＧ＊ＴＴＧ−５’
５’−ＧＴＣＳＡＡＣ−３’
であり、ここで、＊は、切断部位であり、Ｓは、ホスホチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）であり得る。
【００２７】
エンドヌクレアーゼ認識配列が上に示すものである場合、修飾５’鎖の末端の配列は、５’−ＧＡＣであり得る。修飾鎖の３’末端の配列は、３’−ＣＴＧであり得る。
【００２８】
このようなスキームにおける各プライマーは、内部配列３’−ＣＡＧＴＴＧ−５’を必要とする。修飾５’鎖の末端の配列は、３’−ＣＡＧＴＴＧ−５’配列の前に存在してもよく、このため、この配列は、鋳型伸長により複製されるまで完全に一本鎖である。或いは、プライマーは、３’−ＣＡＧＴＴＧ−５’が完全な二本鎖でない限り、配列内の一点でハイブリダイズすることができる。
【００２９】
増幅した物質は、例えば、シーケンシングにより、さらに解析することができる。したがって、開示する方法では、固定化した伸長生成物は、引き続いてシーケンシングされ得る。２つの固定化プライマーを使用して増幅を実施する場合、両鎖は複製される。したがって、両鎖をシーケンシングすることができる。第１の鎖からの第１のシーケンシング読取りデータ、及び他方の鎖からの第２の読取りデータの、一対の読取りデータを生成することができ、これにより、二本鎖核酸配列の集団の各鎖から１つの読取りデータである、一対の読取りデータを生成する。
【００３０】
また、この方法を実施するためのキットを開示する。核酸配列の修飾のためのキットであって、ａ．二本鎖核酸配列の集団の末端を修飾するための核酸アダプター分子の第１の対であって、アダプター対の第１の鎖の５’末端が、エンドヌクレアーゼの認識部位の一部を含み、アダプター対の中央部が、３７℃よりも高く８０℃未満の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含み、アダプター対の第１の鎖の３’末端及びアダプター対の第２の鎖の５’末端が、二本鎖核酸配列の集団の両鎖とのライゲーションを受け得る、第１の対、並びに
ｂ．リガーゼ酵素
を含むキットを開示する。
【００３１】
キットは、さらなる成分、例えば、１つ又は複数の増幅プライマー或いは１つ又は複数の酵素を含み得る。キットは、鎖置換ポリメラーゼを含み得る。試薬の１つ又は複数を固定化してもよく、例えば、増幅プライマーを固定化し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】標準的な指数関数的鎖置換増幅（ＳＤＡ）の方法を示す図である。垂線は、塩基対間の水素結合を表す。（Ａ）この最も基本的形態では、ＳＤＡ反応は、最初の変性ステップにより開始し、これにより、エンドヌクレアーゼ認識部位をそれらの５末端に含む２つのプライマー分子、例えば、非回文構造制限酵素又はニッキング酵素の結合部位（ＨｉｎｃＩＩ制限酵素部位ＧＴＴ＊ＧＡＣ（アスタリスクは切断部位を表す）を例として示す）への鋳型ＤＮＡの結合が可能となる。ＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長により、標的ＤＮＡ二重鎖の相補鎖に認識部位が組み込まれる。（Ｂ）反応は、エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡ鎖のうちの１つのみを切断できるようにデザインする。これは、例えば、非回文構造制限酵素及び修飾ヌクレオチド、又はニッキング酵素の使用により達成することができる。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖を切断する。同一の制限部位が両端に存在する場合、両端を反対端においてニッキングする。ニックは、鎖置換ポリメラーゼ、例えば、Ｂｓｔにより伸長可能な遊離３’末端を有する。（Ｃ）切断及び伸長の連続的サイクルにより、標的配列、両方のプライマー配列及びトランケート（切断された）エンドヌクレアーゼ認識部位を両端に含む、２つの相補鎖が直線状に生成される。（Ｄ）このような一本鎖生成物は、容易に再生して、もはや増幅不可能な二本鎖生成物を形成し得る。（Ｅ、Ｆ）或いは、生成物が、代わりに相補プライマーに結合する場合、切断されたエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの１つが、再生成され得る。生成分子における認識部位の再生成は、指数関数的増幅を達成するのに必要である。生成物の再生成（Ｄに示す）が、デッドエンドであるため、反応動態は半指数関数的であり、反応により、少なくとも３つの異なる種類の二本鎖生成分子及び一本鎖生成物が生成される。
【図２】エンドヌクレアーゼ媒介移動平衡増幅（ＥＭ−ＳＥｑ）のための鋳型ＤＮＡ及びプライマーのデザインを示す図である。垂線は、塩基対間の水素結合を表す。（Ａ）ＥＭ−ＳＥｑ増幅において基質として作用する鋳型ＤＮＡである。白色の四角形は、標的配列であり、斜線の四角形は、Ｌｏｗ−Ｔｍ  Ｌｅｆｔ（低融解温度左、ＬＬ）領域であり、市松模様の四角形は、Ｌｏｗ−Ｔｍ  Ｒｉｇｈｔ（低融解温度右、ＬＲ）領域である。ＨｉｎｃＩＩ制限酵素部位ＧＴＴ＊ＧＡＣ（アスタリスクは切断部位を表す）を例として示す。（Ｂ）一部の実施形態では、ＤＮＡ（上部）に最初に存在した認識部位の一部も存在しないことがあり、この組込みは、ＥＭ−ＳＥｑ反応が進行するにつれて生じ得る。他の実施形態では、部分的又は完全な認識部位が、鋳型ＤＮＡ（下部）に既に存在し得る。図は、二本鎖である鋳型ＤＮＡを示す。しかし、一部の実施形態では、一本鎖鋳型ＤＮＡを使用し得る。（Ｃ）ＥＭ−ＳＥｑ反応において使用するプライマーである。濃灰色で塗潰した四角形は、Ｈｉｇｈ−Ｔｍ  Ｌｅｆｔ（高融解温度左、ＨＬ）領域であり、淡灰色で塗潰した四角形は、Ｈｉｇｈ−ＴＭ  Ｒｉｇｈｔ（高融解温度右、ＨＲ）領域である。
【図３】ＥＭ−ＳＥｑにおける移動平衡動態の原理を示す図である。（Ａ）標的配列に隣接する低融解温度領域ＬＬ及びＬＲにより、ＤＮＡ二重鎖の末端が一過的に開くことが、鋳型ＤＮＡの両端において可能となる（ＤＮＡブリージング）。（Ｂ）鋳型ＤＮＡ分子と増幅プライマーとの間の動的結合平衡である。（Ｃ）ルシャトリエの原理によるＥＭ−ＳＥｑの動態である。Ａは、自己結合状態であり、Ｂは、プライマー結合状態であり、Ｃは、スナップ伸長生成物である。
【図４Ａ】ＥＭ−ＳＥｑの増幅サイクルを示す図である。（Ａ）標準的ＳＤＡと同様に、連続的切断及び鎖置換により、２つの相補性一本鎖ＤＮＡ分子が生成され、これは、ＥＭ−ＳＥｑにおいて、低融解領域ＬＬ及びＬＲと隣接する標的配列並びにトランケート（切断された）エンドヌクレアーゼ認識部位を両端に含む。（Ｂ）標準的ＳＤＡとは対照的に、再生された生成物は、スナップ伸長により、再生成エンドヌクレアーゼ認識部位を有する生成物に変換される。これにより、指数関数的に増幅することが可能な分子を目的として生成された生成物間のバランスが変化する。
【図４Ｂ】エンドヌクレアーゼ使用した切断により生成されたプライマーを使用した伸長を示す図である。
【図５】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを有するＥＭ−ＳＥｑにより生成されたアンプリコンの完成を示す図である。鎖置換ポリメラーゼと制限酵素の両方の熱不活化により、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼが同時に活性化され、引き続いてこれにより、ニックトランスレーションを介してＤＮＡニック（アスタリスク）がフィリングされる。活性酵素は、太字で示す。
【図６】表面結合プライマーを用いたＥＭ−ＳＥｑにより、ペアエンド次世代シーケンシングのためのアンプリコンが生成され得ることを示す図である。（Ａ）鋳型ＤＮＡ及び表面結合プライマーに存在する相補性低融解温度領域ＬＬ／ＬＲ間の一過的アニーリングにより、スナップ伸長及び鎖置換が可能となり（図３に示す）、２種類の増幅単位が生成される（図４に示す）。図は、二本鎖鋳型ＤＮＡを示すが、他の実施形態では、一本鎖鋳型ＤＮＡをインプットとして使用し得る。（Ｂ）増幅が完了し、ＤＮＡニックがフィリングされた後、相補ＤＮＡ鎖を表面結合ＤＮＡ鎖から脱ハイブリダイズして、第１のシーケンシングプライマーをハイブリダイズし、フォワード鎖のシーケンシングを可能とする。（Ｃ）フォワード読取りが完了した後、第２のシーケンシングプライマーをハイブリダイズし、リバース鎖のシーケンシングを可能とする。図は、低融解領域ＬＬ及びＬＲがシーケンシングプライマーとして使用されることを示すが、他の実施形態では、シーケンシングプライマー結合部位は、生成されたアンプリコンの境界域のいずれかに位置し得る。
【図７】２種の温度を使用した固相ＥＭ−ＳＥｑのバージョンを示す図である。
【図８】２０％、３０％、４０％又は５０％ＧＣ含量のいずれかを有する１６種の異なる２０ヌクレオチド長ＤＮＡ配列を示す図である。
【図９】（Ａ）図８の１６種の異なる配列を８５ヌクレオチド長の標的に対で加えて、標的末端ＧＣ含量を修飾する隣接モチーフ（ＬＬ及びＬＲ）として作用させる方法を示す図である。（Ｂ）７０ｍＭのモノカチオン塩及び２ｍＭのバイカチオン塩並びに蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素ＥｖａＧｒｅｅｎを含むバッファーの存在下で試験した、生成された構築物の融解プロファイルを示す図である。
【図１０】プライマー配列を８０ヌクレオチド長大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＵ断片の両端にそれぞれ結合させることによりデザインした２つの完全長増幅鋳型配列を示す図である。Ｔ＾は、逆位ｄＴブロック部分を表す。
【図１１】（Ａ）２０％ＧＣの低融点温度領域を含むプライマー及び鋳型デザインを用いて実施したナイーブアッセイ由来の生成物のリアルタイム蛍光データ及びゲル電気泳動を示す図である。（Ｂ）５０％ＧＣの隣接領域を含むプライマー及び鋳型デザインを用いて実施したナイーブアッセイ由来の生成物のリアルタイム蛍光データ及びゲル電気泳動を示す図である。
【図１２】（Ａ）２０％ＧＣの低融点温度領域を含むプライマー及び鋳型デザインを用いて実施した最適化アッセイ由来の生成物のリアルタイム蛍光データ及びゲル電気泳動を示す図である。（Ｂ）５０％ＧＣの隣接領域を含むプライマー及び鋳型デザインを用いて実施した最適化アッセイ由来の生成物のリアルタイム蛍光データ及びゲル電気泳動を示す図である。
【図１３】３０ヌクレオチド長で６６％ＧＣ含量の高融点領域を５’末端に（ＨＬ及びＨＲ、太字）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩニッカーゼの認識部位、２０ヌクレオチド長で２０％ＧＣ含量の低融点領域を標的配列に隣接して含む完全長鋳型、及び２０ヌクレオチド長で２０％ＧＣ含量の低融点領域のみを標的配列に隣接して含むデッドエンド生成分子の配列を示す図である。
【図１４】デッドエンド生成物が、ＥＭ−ＳＥｑ反応において、鋳型として作用し得ることを示し、分子の一過性一本鎖末端にＥＭ−ＳＥｑプライマーが侵入したことを実証するリアルタイム蛍光データを示す図である。
【図１５】非修飾フォワード及びリバースプライマー並びにハイブリッド侵入フォワード及びリバースプライマーの配列を示す図である。
【図１６】（Ａ）ハイブリッド侵入プライマーを含む反応により、生成物のバンドのパターンが生じ、この場合、非修飾プライマーを用いて実施した反応と比較して、高分子量生成物は大きな比率を占め、一方、低分子量生成物は少量しか存在しなかったことを示す生成物のゲル電気泳動を示す図である。（Ｂ）可能性のある生成物形態の予想を示す図である。
【図１７】（Ａ）ガラススライド上のＥＭ−ＳＥｑ反応生成物の可視化を示す図である。（Ｂ）半導体チップの表面上のＥＭ−ＳＥｑ反応生成物の可視化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
エンドヌクレアーゼ媒介移動平衡増幅（ＥＭ−ＳＥｑ）の一例は、一対のプライマー及び特定の方法に従ってデザインしたインプットＤＮＡを用いて達成される（図２）。
【００３４】
増幅する前に、標的ＤＮＡ配列は、２つの領域、（ｉ）近位に配置された低融解温度領域ＬＬ及びＬＲ（Ｌｏｗ−Ｔｍ  Ｌｅｆｔ及びＬｏｗ−Ｔｍ  Ｒｉｇｈｔ）並びに（ｉｉ）トランケートエンドヌクレアーゼ認識部位、例えば、非回文構造制限酵素又はニッキング酵素に対する結合部位で構成されるアダプター配列と両端で隣接するように修飾する（図２Ａ）。一部の実施形態では、鋳型ＤＮＡに最初に存在した認識部位の一部も存在しないことがあり、この組込みは、ＥＭ−ＳＥｑ反応が進行するにつれて生じ得る。他の実施形態では、完全認識部位は、鋳型ＤＮＡに既に存在し得る（図２Ｂ）。鋳型ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖のいずれかであり得る。
【００３５】
ＥＭ−ＳＥｑでは、３つの領域、（ｉ）５’末端高融解温度領域ＨＬ又はＨＲ（Ｈｉｇｈ−Ｔｍ  Ｌｅｆｔ及びＨｉｇｈ−Ｔｍ  Ｒｉｇｈｔ）、（ｉｉ）鋳型ＤＮＡに存在するトランケート認識部位に適合する、中央に配置されたエンドヌクレアーゼ認識部位、並びに（ｉｉｉ）鋳型ＤＮＡに存在する領域に対して完全又は部分的に相補性である３’末端低融解温度領域ＬＬ又はＬＲでそれぞれ構成されるプライマーを使用する（図２Ｃ）。
【００３６】
増幅される鎖の末端が一過性一本鎖（ブリージング可能な）末端により修飾されているため、プライマーは、試料を熱変性させることなく、ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズすると、プライマー、及び鋳型のアダプター付加３’末端は、ともに伸長を受ける。伸長すると、末端は、ブリージング可能な領域が配列に対して今や内部に存在するため、もはやブリージング可能ではなくなる。
【００３７】
低及び高融解温度領域ＬＬ、ＬＲ、ＨＬ及びＨＲは、天然に見出される配列又は部分的若しくは完全に人工であり得る配列のいずれかから選択され得る。標的配列が低融解温度領域ＬＬ及びＬＲ領域を含むように修飾する代わりに、標的配列はまた、ＬＬ及びＬＲが、天然に見出される標的配列の一部であるように選択され得る。
【００３８】
２つの領域種の融解温度における所望の差は、多数の方法により達成され得る。例えば、（ｉ）著しく異なるＧＣ％含量、（ｉｉ）ＤＮＡ二重鎖の熱安定性を変更する修飾塩基、例えば、これらに限定されないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）又は８−アザ−７−デアザグアノシンの使用、及び（ｉｉｉ）プライマー分子及び鋳型ＤＮＡに存在するＬＬ領域とＬＲ領域との間の部分的相補性による。
【００３９】
典型的には、摂氏５０〜６５度である好熱性ＳＤＡの反応温度では、標的配列に隣接する低融解温度領域ＬＬ及びＬＲは、鋳型ＤＮＡの両端において、ＤＮＡ二重鎖を一過的に開くこと（「ＤＮＡブリージング」）が可能となる（図３Ａ）。ＬＬ及びＬＲに対する配列相補性を有するＥＭ−ＳＥｑプライマーの存在下では、鋳型ＤＮＡ末端のそれぞれは、２つの代替状態で存在し、これ自体と又はこの適合プライマーとアニーリングされ得る（図３Ｂ）。このような相互作用の一過性及び不安定な性質のため、系は、非常に動的な動態平衡により支配され、この場合、ＬＬ及びＬＲ領域は、連続的に結合及び解離する。このような結合平衡の動態は、鋳型ＤＮＡの２つの相補鎖上のＬＬ及びＬＲ領域が物理的に密接しているため、自己アニーリング状態となる傾向が強い。
【００４０】
しかし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下では、一部の鋳型分子の、適合プライマー上のＬＬ及びＬＲ領域との一過的且つ低頻度なアニーリングにより「スナップ伸長」現象が促進されることがあり、この場合、このような鋳型分子の３’末端が、高融解温度領域ＨＬ及びＨＲにわたって伸長する。動的結合平衡を生じる会合及び解離現象とは対照的に、このような伸長現象は、不可逆的である。３’末端伸長時には、分子は、片側を高融解温度領域ＨＬ又はＨＲ及びもう片側を標的配列により囲まれているため、一次的にアニーリングされたままである。
【００４１】
スナップ伸長により、ルシャトリエの原理に従って移動平衡作用が生じ、これにより、例えば、この反応物の濃度変化に供した、平衡状態にある任意の系は、自己調整し直して、適用した変化の作用に反作用し、新たな平衡が確立される。移動平衡作用により、鋳型分子の大部分の制限部位再生成状態への変換が促進される（図３Ｃ）。
【００４２】
ＳＤＡの増幅サイクルに適用した場合、低及び高融解温度領域の差次的親和性により可能となった移動平衡作用は、デッドエンド自己アニーリング生成物に作用し、切断されたエンドヌクレアーゼ認識部位を再生成する（図４）。これにより、指数関数的に増幅することが可能な分子を目的として生成される生成物間のバランスが変化し、したがって、反応速度が増加して、使用されるプライマーの５’末端に存在する配列又は部分をともに含む２つの主要な生成物に至るまで生成されるアンプリコン分子の種類の数が減少する。
【００４３】
プライマーと低融点温度との相互作用の性質が一過性且つ低頻度であることにより、再生成エンドヌクレアーゼ認識部位及び完全長プライマー配列を５’末端に含む生成物に、プライマーが変換される割合が制限される。このプロセスの非効率性は、プライマー鋳型二重鎖を含む配列の名目上の融点温度が、二本鎖生成物における相補性末端低融点領域（ＬＬ及びＬＲ）の自己アニーリング鎖により形成された二重鎖を含む配列のものと同一であるということに起因する。プライマー分子の、鋳型の一過性単鎖低融点領域とのさらに効率的なハイブリダイゼーションを促進するために、ＬＬ又はＬＲ領域に対して相補性のプライマー配列は、プライマー鋳型二重鎖形成を安定化して、この融点温度を、等価なＧ／Ｃ又はＡ／Ｔ塩基対よりも高く上昇させる、修飾塩基を有するヌクレオチドで構成され得る。
【００４４】
ある特定の実施形態では、プライマー上の伸長可能な３’−ヒドロキシ基は、さらに長い配列の鎖切断により生成することができる。さらに長い配列は、伸長不可能なブロッキングした３’末端を有し得る。さらに長い配列は、エンドヌクレアーゼの完全認識配列を含み、遊離３’末端が伸長した後にプライマーを切断するエンドヌクレアーゼにより切断することができる（図４ｂ）。
【００４５】
ＥＭ−ＳＥｑにより、再生成エンドヌクレアーゼ認識部位を有する分子を目的として生成された生成物間のバランスが変化するため、増幅試薬が枯渇するにつれて、ニッキングされた分子による反応プラトーが、反応において支配的に存在するようになる。ニッキングアンプリコン分子の生成を回避するために、ポリメラーゼ活性が失われて試薬が完全に枯渇する前に、エンドヌクレアーゼを（例えば、熱失活により）不活化しなければならない。
【００４６】
これを達成するために、熱安定性鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。或いは、熱感受性ポリメラーゼを反応において使用する場合、ＥＭ−ＳＥｑは、鎖置換活性（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を必要とせずに、ホットスタート熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの追加により準備し得る。このような実施形態では、鎖置換ポリメラーゼと制限酵素の両方の熱不活化により、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼが同時に活性化され、これは、引き続いて「ニックトランスレーション」として知られるプロセスを介してＤＮＡニックをフィリングする（図５）。
【００４７】
次世代ＤＮＡシーケンシングデバイスのための固相増幅におけるＥＭ−ＳＥｑ
生成されたアンプリコン分子においてＤＮＡニックがフィリングされると、ＥＭ−ＳＥｑ生成物のほとんどが、二本鎖となり、使用される２つのＥＭ−ＳＥｑプライマーのうちの１つの５’末端配列を含む。これにより、固定化したプライマーが反応において存在する場合、表面結合アンプリコンの生成におけるＥＭ−ＳＥｑの使用が可能となる（図６）。
【００４８】
重要なことには、他の等温増幅方法とは対照的に、切断及び鎖置換の連続的サイクルによるアンプリコンの直線状生成は、結合したアンプリコン分子の遠位末端のプライマーのアニーリングを必要としない。このため、両方のＥＭ−ＳＥｑプライマーは、表面に固定化することができ、反応において溶液プライマーが存在する必要はない。これは、体積の制約のために可溶性プライマーの量が制限される場合、特に有用である。また、溶液からのプライマーの除去は、プライマーダイマーのために生じるオフターゲット増幅を大いに減少させると予想される。
【００４９】
次世代ＤＮＡシーケンシングデバイスに関しては、両方のＥＭ−ＳＥｑプライマーの固定化により、標的配列の両鎖の固相増幅が、同一の反応において同時に可能となる。増幅により、溶液中の鎖の数の増加が生じ、このそれぞれは、固定化プライマーにより捕捉することができる。ＤＮＡニックのフィリング及び相補鎖の変性の後に、各固定化プライマーは、シーケンシングのための鋳型鎖とすることができる。２つの異なる配列を有する固定化プライマーを使用すると、連続的ペアエンド読取りを両鎖において実施することが可能となる（図６）。
【００５０】
上記のＥＭ−ＳＥｑ反応では、自己アニーリングデッドエンド生成物の低融点領域へのプライマーの結合、並びに結果として生じる、再生成エンドヌクレアーゼ認識部位及び完全プライマー配列を有する伸長生成物への、このような生成物の変換は、このようなデッドエンド生成物のさらなる複製物を生成する、切断及び鎖伸長プロセスと同時に生じる。反応温度で一過的に開く低融点温度領域間の非特異的相互作用を克服するために、ＥＭ−ＳＥｑの一実施形態では、反応は、２つの段階に分割し、第１段階において切断及び鎖伸長プロセスが生じた後、反応の第２段階において生成物の変換が生じ、このため、第２段階は、第１段階よりも高い温度で生じる。このような実施形態では、低融点温度領域は、これらが、第１段階の間、大部分は自己アニーリングしたままであり、一方、第２段階において反応温度を上げると、プライマーの結合及び生成物の変換が可能となるようなデザインである。ＥＭ−ＳＥｑの別の実施形態では、２つの段階は、ニッカーゼ不活化ステップ及びギャップフィリングポリメラーゼ活性化ステップにより分割し、このため、ギャップフィリング及びデッドエンド生成物の変換はともに、ギャップフィリングポリメラーゼの活性により駆動される第２段階において生じる（図７）。
【００５１】
本明細書において開示する方法では、ＮＧＳ（次世代シーケンシング）「シーケンスレディ（シーケンシングの準備ができている）」ＤＮＡ断片の生成を可能とする。この断片は、試料由来の集団全体を代表し得るか、又は元々の鋳型ＤＮＡ試料に存在するＤＮＡ全体の標的サブセットであり得る。目的のこれらの遺伝子座のみが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、このため、生成されたアンプリコンは、既知の配列の末端と隣接する目的の鋳型ＤＮＡを有する。このような既知の末端配列は、所与の遺伝子座から生成されたすべてのアンプリコンについて同一であるか又は実質的に同一であり、計画的且つ制御可能に非対称であり、別個の配列は、増幅された断片の２つの末端のそれぞれに適用し得る。第１の既知の末端は、第１のプライマー即ち「フォワード」プライマーの５’領域から生じ、第２の既知の末端は、第２のプライマー即ち「リバース」プライマーの５’領域から生じる。したがって、生成されたアンプリコンは、従来のＮＧＳ方法において生成されたアダプターライゲーション断片と機能的に等価であり得るが、生成の容易さ、時間及びコスト、並びに引き続いて生成されるシーケンシングデータの質に関して明白な利点を提供する。アンプリコンの末端は、引き続く操作、例えば、クローン増幅及びＤＮＡシーケンシングにおいて、これらが生じる遺伝子座にかかわらず、一般的「ｏｎｅ−ｓｉｚｅ−ｆｉｔｓ−ａｌｌ（汎用サイズ）」生化学に適し得る。
【００５２】
原料核酸は、ゲノムポリヌクレオチドであり得る。原料物質は、真核生物、原核生物、又は古細菌であり得る。１つ又は複数の原料物質が提供され得る。原料核酸は、ゲノムの断片、例えば、単染色体、又は単一のゲノム遺伝子座を代表し得る（例えば、対立遺伝子多型の迅速なシーケンシングのため）。特定の実施例では、増幅は、試料中の病原性物質に対して特異的であり得る。例えば、増幅では、ヒト試料中に存在する細菌又はウイルスの核酸を選択し得る。鋳型は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらのｃＤＮＡの複製物であり得る。
【００５３】
方法及びプライマーは、クローン的に増幅した生成物のプールを生成する、引き続く操作に依存しない（表面、ビーズの両方上又は溶液中でのクローン集団の生成に適する）。また、技術は、ＮＧＳデータを生成するために引き続いて使用する技術に依存せず、（例えば、）Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＳＢＳ技術、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ又はＲｏｃｈｅ４５４「ｏｎｅ  ｂａｓｅ  ａｔ  ａ  ｔｉｍｅ（一度に１塩基）」技術、或いは他のＮＧＳ技術、例えば、ナノポア（ｎａｎｏｐｏｒｅ）シーケンシングとともに使用され得る。一般には、本明細書に開示する方法は、特異的に増幅した生成物の末端（単数又は複数）に定義の配列を導入することが望ましい場合に有利であり得る。
【００５４】
また、方法を実施するためのキットを開示する。核酸配列の修飾のためのキットであって、
ａ．二本鎖核酸配列の集団の末端を修飾するための核酸アダプター分子の第１の対であって、アダプター対の第１の鎖の５’末端が、エンドヌクレアーゼの認識部位の一部を含み、アダプター対の中央部が、３７℃よりも高く８０℃未満の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含み、アダプター対の第１の鎖の３’末端及びアダプター対の第２の鎖の５’末端が、二本鎖核酸配列の集団の両鎖とのライゲーションを受け得る、第１の対、並びに
ｂ．リガーゼ酵素
を含むキットを開示する。
【００５５】
キットは、さらなる成分、例えば、１つ又は複数の増幅プライマー或いは１つ又は複数の酵素を含み得る。キットは、鎖置換ポリメラーゼを含み得る。試薬の１つ又は複数を固定化してもよく、例えば、増幅プライマーを固定化し得る。
【００５６】
増幅は、固体支持体上又は固体支持体のウェル内で実行し得る。２つのプライマー配列を有するアレイであって、各プライマー配列が、３つの領域、５’末端高融解温度領域ＨＬ又はＨＲ（Ｈｉｇｈ−Ｔｍ  Ｌｅｆｔ及びＨｉｇｈ−Ｔｍ  Ｒｉｇｈｔ）、（ｉｉ）鋳型ＤＮＡに存在するトランケート認識部位に適合する、中央に配置されたエンドヌクレアーゼ認識部位、並びに（ｉｉｉ）鋳型ＤＮＡに存在する領域に対して完全又は部分的に相補性である３’末端低融解温度領域ＬＬ又はＬＲで構成される、アレイを開示する（図２Ｃ）。
【００５７】
任意選択で、固定化プライマーは、低融解領域に修飾塩基を有し、これにより、天然の塩基と比較して、安定性を高め得る。任意選択で、プライマーは、３’ブロックを有し得る。任意選択で、プライマーは、中央のエンドヌクレアーゼ認識部位で切断された後、伸長し得る。
【００５８】
また、本発明に従って生成した増幅したポリヌクレオチドのアレイを開示する。慎重に調製したウェルにおける生成物の増幅により、１ウェルあたり単一の鋳型からのクローン増幅が可能となる。ウェルは、センサー系、例えば、ＩＳＦＥＴセンサーの一部であって、プロトンの放出を検出し得る。センサー系は、例えば、ヌクレオチド三リン酸組込み反応の間に確認されるような、ｐＨの変化を検出することができる。
【００５９】
本発明の方法を使用する実施例は、次のステップを含み得る。
【００６０】
核酸試料を採取するステップ。試料を修飾して、本明細書に記載するブリージング可能な低融解末端を含むステップ。本明細書に開示する２つのプライマー配列を有するアレイを採取するステップであって、アレイが、ＩＳＦＥＴセンサーを有するウェルの収集物である、ステップ。試料をアレイに配置し、これにより、試料中の分子濃度が、１ウェルあたり１分子未満の平均占有率を生じるステップ。分子を増幅して、分子を有するウェルにおいて鎖の複数の複製物を生成するステップであって、両鎖が、増幅され得る、ステップ。アレイを処理して、鎖伸長により任意のニックを除去するステップ。ハイブリダイズされた鎖を除去して、一本鎖の固定化された鎖を生成するステップ。第１のシーケンシングプライマーを第１の固定化鎖とハイブリダイズし、第１のシーケンシング読取りデータを得るステップ。第１の読取りデータを除去するステップ。第２のシーケンシングプライマーを第２の固定化鎖とハイブリダイズし、第２のシーケンシング読取りデータを得るステップであって、２つの読取りデータが、元々の二本鎖の鋳型の反対端由来である、ステップ。
【実施例】
【００６１】
標的分子末端が一過的に開く原理を試験するために、２０％、３０％、４０％又は５０％ＧＣ含量のいずれかを有する１６種の異なる２０ヌクレオチド長ＤＮＡ配列を調製した（図８）。配列を、８５ヌクレオチド長の標的に対で加えて、標的末端のＧＣ含量を修飾する隣接モチーフ（ＬＬ及びＬＲ）として作用させた（図９Ａ）。生成した構築物の融解プロファイルを、７０ｍＭのモノカチオン塩及び２ｍＭのバイカチオン塩並びに蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素ＥｖａＧｒｅｅｎを含むバッファーの存在下で試験した。記録した蛍光強度のマイナスの示差（−ｄＦ）を、各構築物について、３０℃〜９０℃の範囲のインキュベーション温度に対してプロットした。得られる曲線により、低ＧＣ％含量の配列により修飾した構築物について、５０℃〜７０℃の−ｄＦにおける上昇が明らかとなり、構築物末端が一過的に開くことが示される（図９Ｂ）。
【００６２】
３０ヌクレオチド長で６６％ＧＣ含量の高融点領域を５’末端に（ＨＬ及びＨＲ、太字）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩニッカーゼの認識部位、及び２０ヌクレオチド長で２０％ＧＣ含量の低融点領域を３’末端に（ＬＬ及びＬＲ、下線）含むＥＭ−ＳＥｑプライマー対のデザインである。また、２０ヌクレオチド長で５０％ＧＣ含量の領域を３’末端に含むコントロールプライマーの対をデザインした。加えて、２つの完全長増幅鋳型配列は、それぞれのプライマー配列を、８０ヌクレオチド長の大腸菌ｙｄｆＵ遺伝子断片の両端に結合させることによりデザインした。Ｔ＾は、逆位ｄＴブロック部分を表す（図１０）。
【００６３】
ナイーブ増幅アッセイを、２０％ＧＣのＬＬを有するフォワードプライマー、２０％ＧＣのＬＲを有するリバースプライマー並びに２０％ＧＣのＬＬ及びＬＲを有する完全長鋳型、又は５０％ＧＣのＬＬを有するフォワードプライマー、５０％ＧＣのＬＲを有するリバースプライマー並びに５０％ＧＣのＬＬ及びＬＲを有する完全長鋳型のいずれかを有する溶液において、１×等温増幅バッファー（ＮＥＢ社）、０．３２のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、６ｍＭのＭｇＳＯ４、１．４ｍＭのｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μｌのＢｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ（ＮＥＢ社）及び０．４Ｕ／μｌのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ社）の存在下で実施した。指示量の鋳型複製物を含む反応物又は無鋳型対照反応物（ＮＴＣ）２５μｌを、ｑＰＣＲサーモサイクラーにおいて、６０℃で１５分間インキュベートした。生成物のリアルタイム蛍光データ及びゲル電気泳動は、２０％ＧＣの低融点温度領域を含むプライマー及び鋳型デザインを用いて実施したアッセイにより（図１１Ａ）、５０％ＧＣの隣接領域を含むプライマー及び鋳型デザインを用いて実施した対照アッセイに対して、少なくとも１０倍高い感受性及び特異性の向上が示されたことを実証する（図１１Ｂ）。
【００６４】
最適化ＥＭ−ＳＥｑアッセイを、２０％ＧＣのＬＬを有するフォワードプライマー、２０％ＧＣのＬＲを有するリバースプライマー並びに２０％ＧＣのＬＬ及びＬＲを有する完全長鋳型、又は５０％ＧＣのＬＬを有するフォワードプライマー、５０％ＧＣのＬＲを有するリバースプライマー並びに５０％ＧＣのＬＬ及びＬＲを有する完全長鋳型のいずれかを有する溶液において、１×等温増幅バッファー（ＮＥＢ社）、０．３２のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．７ｍＭのｄＮＴＰ、３５ｍＭのＫＣｌ、５％のＰＥＧ  ８０００ｋ、０．３７Ｕ／μｌのＢｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ（ＮＥＢ社）及び０．４Ｕ／μｌのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ社）の存在下で実施した。指示量の鋳型複製物を含む反応物又は無鋳型対照反応物（ＮＴＣ）２５μｌを、ｑＰＣＲサーモサイクラーにおいて、６０℃で１５分間インキュベートした。生成物のリアルタイム蛍光データ及びゲル電気泳動は、２０％ＧＣの低融点温度領域を含むプライマー及び鋳型デザインを用いて実施したアッセイにより（図１２Ａ）、５０％ＧＣの隣接領域を含むプライマー及び鋳型デザインを用いて実施した対照アッセイとは非常に異なる能力が実証されたことを示す（図１２Ｂ）。
【００６５】
ＥＭ−ＳＥｑ反応を、上記の溶液において、３０ヌクレオチド長で６６％ＧＣ含量の高融点領域を５’末端に（ＨＬ及びＨＲ、太字、図１３）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩニッカーゼの認識部位、２０ヌクレオチド長で２０％ＧＣ含量の低融点領域を標的配列に隣接して含む完全長鋳型の存在下、又は２０ヌクレオチド長で２０％ＧＣ含量の低融点領域のみを標的配列に隣接して含む、異型としてのデッドエンド生成物分子のいずれかの存在下で実施した。リアルタイム蛍光データは、デッドエンド生成物が、ＥＭ−ＳＥｑ反応において、鋳型として作用し得ることを示し、分子の一過性一本鎖末端にＥＭ−ＳＥｑプライマーが侵入したことを実証する（図１４）。
【００６６】
ＥＭ−ＳＥｑ反応を、上記の溶液において、３０ヌクレオチド長で６６％ＧＣ含量の高融点領域を５’末端に（ＨＬ及びＨＲ、太字、図１５）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩニッカーゼの認識部位及び２０ヌクレオチド長で２０％ＧＣ含量の低融点領域を３’末端に（ＬＬ及びＬＲ、下線）含む非修飾ＥＭ−ＳＥｑプライマー、又は２０％ＧＣ含量の低融点領域内の６個のチミジン塩基がＳｕｐｅｒＴ塩基（５−ヒドロキシブチル−２’−デオキシウリジン、Ｔ＊で表す）と置換されたハイブリッド侵入プライマーのいずれかの存在下で実施した。生成物のゲル電気泳動は、ハイブリッド侵入プライマーを含む反応により、生成物のバンドのパターンが生じ、この場合、非修飾プライマーを用いて実施した反応と比較して、高分子量生成物は大きな比率を占め、一方、低分子量生成物は少量しか存在しなかったたことを示す（図１６Ａ）。これにより、ハイブリッド侵入ＥＭ−ＳＥｑ反応により、再生成末端を有する分子の生成が促進されたことを示す。図１６Ｂでは、予想される生成物形態を列挙する。
【００６７】
ＥＭ−ＳＥｑ反応を、１：１の比で表面に点をつけた２つのＥＭ−ＳＥｑプライマーの存在下のガラススライド上で、上記のように実施した（図１７Ａ）。２つのＥＭ−ＳＥｑプライマーの混合物を含む点は、オリゴヌクレオチドの表面への固定化に必要とされる種々のデザインのリンカー部分に変化する。反応の後に、スライドを洗浄し、相補ＤＮＡ鎖を、ＮａＯＨにより脱ハイブリダイズし、増幅した標的に対して特異性の蛍光プローブのハイブリダイゼーションにより、増幅したＤＮＡを可視化した。
【００６８】
また、ＥＭ−ＳＥｑ反応を、プロトン放出の検出によるＤＮＡシーケンシングを支持することが可能な半導体チップの表面で、上記のように実施した（図１７Ｂ）。矢は、固定化されたＥＭ−ＳＥｑプライマーである４×５の点のアレイを示す。ＥＭ−ＳＥｑプライマー、陽性対照オリゴヌクレオチド又は基準を除くすべての領域は、無関係のプライマーを含む。反応の後に、スライドを洗浄し、相補ＤＮＡ鎖をＮａＯＨにより脱ハイブリダイズし、増幅した標的に対して特異性の蛍光プローブのハイブリダイゼーションにより、増幅したＤＮＡを可視化した。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１７：＜２２３＞２０％ＧＣのＬＬを有するフォワードプライマー
配列番号１８：＜２２３＞２０％ＧＣのＬＲを有するリバースプライマー
配列番号１９：＜２２３＞５０％ＧＣのＬＬを有するフォワードプライマー
配列番号２０：＜２２３＞５０％ＧＣのＬＲを有するリバースプライマー
配列番号２１：＜２２３＞２０％ＧＣのＬＬ及びＬＲを有する完全長鋳型
配列番号２２：＜２２３＞５０％ＧＣのＬＬ及びＬＲを有する完全長鋳型
配列番号２３：＜２２３＞完全長鋳型
配列番号２４：＜２２３＞鋳型としてのデッドエンド生成物
配列番号２５：＜２２３＞非修飾フォワードプライマー
配列番号２６：＜２２３＞非修飾リバースプライマー
配列番号２７：＜２２３＞ハイブリッド侵入フォワードプライマー
配列番号２８：＜２２３＞ハイブリッド侵入リバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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