(57)【要約】  本発明は、植物育種の分野、特に細胞および他の組織からの植物体の生成に関する。より具体的には、本発明は、特に形質転換または遺伝子改変された植物細胞からの植物体再生を向上させるための方法および手段を提供する。
2021510069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞を形質転換する方法であって、
（ａ１）
ｉ．少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列；および
ｉｉ．ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくはＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセット
を植物細胞内に同時にまたは連続して導入するステップ、または
（ａ２）少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列を植物細胞内に導入し、前記植物細胞内で、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを同時にまたは連続して誘導するステップと、
（ｂ）任意選択的に、（ａ１）もしくは（ａ２）の前記植物細胞または（ａ１）もしくは（ａ２）の前記植物細胞に由来する植物細胞を培養するステップであって、ここで、前記植物細胞内で、前記ＧＲＦ５ポリペプチドが、前記発現カセットから発現される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、導入されたｍＲＮＡから翻訳される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、前記内因性遺伝子から発現増強される条件、またはＧＲＦ５ポリペプチドが存在する条件下で培養するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
植物細胞のゲノムを改変する方法であって、
（ａ１）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくはＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットを植物細胞内に導入するステップ；または
（ａ２）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを植物細胞内に誘導するステップと、
（ｂ）（ａ１）もしくは（ａ２）の前記植物細胞または（ａ１）もしくは（ａ２）の前記植物細胞に由来する植物細胞を培養するステップであって、ここで、前記植物細胞内で、前記ＧＲＦ５ポリペプチドが、前記発現カセットから発現される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、導入されたｍＲＮＡから翻訳される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、前記内因性遺伝子から発現増強される条件、またはＧＲＦ５ポリペプチドが存在する条件下で培養するステップと、
（ｃ）好ましくは前記細胞のゲノム内の所定の部位を認識する二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）誘導酵素と、任意選択的に修復核酸分子とを用いて、（ｂ）の前記植物細胞のゲノムを改変するステップと
を含み、ここで、前記所定の部位における前記ゲノムの改変は、
ｉ．少なくとも１つのヌクレオチドの置換；
ｉｉ．少なくとも１つのヌクレオチドの欠失；
ｉｉｉ．少なくとも１つのヌクレオチドの挿入；または
ｉｖ．ｉ．〜ｉｉｉ．の任意の組合せ
から選択され、かつ
ステップ（ｃ）は、ステップ（ａ１）／（ａ２）および／もしくは（ｂ）と同時に、ステップ（ａ１）／（ａ２）の前に、ステップ（ａ１）／（ａ２）と（ｂ）との間に、またはステップ（ｂ）の後に実施される、方法。
【請求項３】
トランスジェニック植物体を作製する方法であって、
（ａ）請求項１において記載される植物細胞を形質転換するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記植物細胞または（ａ）の前記植物細胞に由来する植物細胞から、少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列を導入遺伝子として含む少なくとも１つの細胞を含む植物体を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項４】
遺伝子改変された植物体を作製する方法であって、
（ａ）請求項２において記載される植物細胞のゲノムを改変するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記植物細胞または（ａ）の前記植物細胞に由来する植物細胞から、少なくとも１つの細胞内にゲノムの改変を含む植物体を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項５】
半数体植物胚を作製する方法であって、
（ａ１）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくはＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットを未成熟な雄性配偶体内もしくは小胞子内に導入するステップ；または
（ａ２）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを未成熟な雄性配偶体内もしくは小胞子内に誘導するステップと、
（ｂ）（ａ）の未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子を培養するステップであって、ここで、未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子内で、前記ＧＲＦ５ポリペプチドが、前記発現カセットから発現される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、導入されたｍＲＮＡから翻訳される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、前記内因性遺伝子から発現増強される条件、またはＧＲＦ５ポリペプチドが存在する条件下で培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子に由来する半数体植物胚を選抜するステップと
を含む、方法。
【請求項６】
前記ＧＲＦ５ポリペプチドが、ＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０およびＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９を含み、好ましくは、ここで、前記ＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０は、前記ＧＲＦ５ポリペプチドのＮ末端またはその近傍で、少なくとも９０％のカバレッジのマッチが見られ、前記ＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９は、前記ＧＲＦ５ポリペプチドの前記ＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０に対してＣ末端側の位置で、少なくとも９０％のカバレッジのマッチが見られる、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
両方のマッチするアミノ酸ストレッチが、前記ＧＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の半分に位置しており、好ましくは、前記マッチするアミノ酸ストレッチＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０が、前記ＧＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の４分の１に位置している、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＲＦ５ポリペプチドが、モチーフ：［Ｄ］−［ＰＬ］−［Ｅ］−［Ｐ］−［Ｇ］−［Ｒ］−［Ｃ］−［Ｒ］−［Ｒ］−［Ｔ］−［Ｄ］−［Ｇ］−［Ｋ］−［Ｋ］−［Ｗ］−［Ｒ］−［Ｃ］−［ＳＡ］−［ＲＫ］−［ＥＤ］−［Ａ］−［ＹＨ］−［Ｐ］−［Ｄ］−［Ｓ］−［Ｋ］−［Ｙ］−［Ｃ］−［Ｅ］−［ＫＲ］−［Ｈ］−［Ｍ］−［Ｈ］−［Ｒ］−［Ｇ］−［ＲＫ］−［Ｎ］−［Ｒ］（配列番号１７７）を最大３個のミスマッチ数とともに含み、ここで、好ましくは、前記モチーフは、アミノ酸配列の配列番号４１〜配列番号１０４または配列番号１１３〜配列番号１７６のいずれかからなり、かつ／または好ましくは、前記モチーフは、マッチするアミノ酸ストレッチＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９のサブ領域を含む、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＲＦ５ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、１０６、１０８、１１０、１１２もしくは２０９を含むアミノ酸配列；または
（ｉｉ）（ｉ）の前記アミノ酸と少なくとも７０％が同一である配列を含むアミノ酸配列
を含む、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、１０５、１０７、１０９、１１１、２０７、２０８または２１０を含むヌクレオチド配列；
（ｉｉ）（ｉ）の前記ヌクレオチド配列と少なくとも７０％が同一である配列を含むヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）遺伝暗号の縮重の範囲内で（ｉ）もしくは（ｉｉ）によってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；または
（ｖ）（ｉｖ）のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
を含む、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む前記発現カセットを植物体細胞内に導入することにより、前記植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれるか、またはＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、もしくはＧＲＦ５ポリペプチドを含む前記発現カセットを植物細胞内に導入することにより、もしくはＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを植物細胞内に誘導することにより、前記植物細胞内もしくはその子孫細胞内でＧＲＦ５ポリペプチドの一過性の出現がもたらされる、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、前記植物細胞内での前記ＧＲＦ５ポリペプチドの発現に適した少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結されている、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ１）または（ａ２）の前記植物細胞が、体細胞組織、カルス組織、分裂組織もしくは胚組織の細胞、またはプロトプラストである、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項３または４記載の方法によって得られるかもしくは得ることができる植物、またはその子孫植物。
【請求項１５】
請求項１４記載の植物細胞または種子であって、前記植物細胞または前記種子が、少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列を導入遺伝子として含むか、またはゲノム内に改変を含む、請求項１４記載の植物細胞または種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物育種およびバイオテクノロジーの分野、特に細胞および他の組織からの植物体の生成に関する。より具体的には、本発明は、特に形質転換または遺伝子改変された植物細胞からの植物体再生を向上させるための方法および手段を提供する。
【０００２】
植物育種では、特定の目的で所望の遺伝子型および表現型を作出するために、植物種を操作するプロセスが人類文明の開始頃から実践されてきた。遺伝子工学の発展に伴い、ここ数十年の間に、この農業分野は大きく変化してきた。植物遺伝子工学のための様々な方法が開発されてきた。形質転換法の選択は、主に形質転換される植物種、実験の目的および必要な装置の利用可能性といった多くの可変部に依存する。植物形質転換技術の大部分は、出発物質として高い再生能力を持つ外植片の使用を必要とする。さらに、遺伝子編集は、特定の改変、例えば挿入、欠失もしくは点突然変異またはそれらの組合せを植物体のゲノムに導入することができる新しい分子生物学的方法を構成する。このために、まず第一にヌクレアーゼ活性を有し、何よりも特異的かつ部位指定の突然変異誘発をプログラムして実行するのに十分な特異性でもって改変されるべき標的配列に誘導することができる特定の分子機器が必要とされる。ここ数年、植物バイオテクノロジーの分野では、特定のゲノム編集が従来の育種およびトランスジェニック戦略に代わるものとして発展してきた。しかしながら、現在利用可能なツール、例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）またはＣＲＩＳＰＲシステムは、編集された植物体の出発材料の再生能力が限られているため、植物バイオテクノロジーでは限られた範囲でしか利用されていない。
【０００３】
半数性配偶体細胞、例えば花粉および胚嚢の細胞(Forster,B.P.,et al.(2007)Trends Plant Sci.12:368-375およびSegui-Simarro,J.M.(2010) Bot.Rev.76:377-404参照)、ならびに植物体の３つの基本組織層すべてに由来する体細胞(Gaj,M.D.(2004)Plant Growth Regul.43:27-47またはRose,R.,et al.(2010) Plant Developmental Biology-Biotechnological Perspectives,Pua E-C and Davey MR,Eds.(Berlin Heidelberg:Springer),pp.3-26の“Developmental biology of somatic embryogenesis”)を含む多種多様な細胞が胚に発育する可能性を有している。
【０００４】
植物体に再生する能力は、多くの場合、ある植物種における特定の遺伝子型に限られ、形質転換および遺伝子改変された植物細胞および他の前駆体組織において弱体化される。植物細胞を形質転換して遺伝子改変を行うステップが成功したとしても、これは改変された細胞から所望の植物体が実際に得られることを必ずしも意味するものではない。遺伝子改変を達成するために植物細胞および他の前駆体組織に施される処理は、植物体の発育および再生に影響を与えることが想定される。したがって、本発明の目的は、トランスジェニックで遺伝子改変された植物体を生成するための従来公知の方法の有効性を向上させ、改変された植物細胞および他の植物前駆体からの植物体再生を支援することである。
【０００５】
本発明では、驚くべきことに、アラビドプシス(Arabidopsis)遺伝子ＧＲＦ５（ＧＲＯＷＴＨ−ＲＥＧＵＬＡＴＩＮＧ  ＦＡＣＴＯＲ５）が、この遺伝子またはＧＲＦ遺伝子ファミリーのその対応する遺伝子について報告されたことのない植物体再生を促進する効果を有していることが見出された。
【０００６】
Van der Knaap et al.(2000;“A novel gibberellin-induced gene from rice and its potential regulatory role in stem growth”,Plant physiology,122(3),695-704.)の中で、著者らは、イネのＧＲＦ遺伝子ファミリーの最初のメンバー（ＯｓＧＲＦ１）を同定し、特徴付けた。これは、ジベレリン酸により誘導された遺伝子として介在分裂組織に存在する。アラビドプシスにおける過剰発現が原因で、茎の生長障害、雌性不稔性および雄性稔性の低下が生じた。ジベレリン酸を適用しても、形質転換された植物体の茎伸長欠陥を回復できなかったことは、ＧＡにより誘導された茎伸長にＯｓＧＲＦ１が関わっている可能性があることを示唆していた。２００３年に、Kim et al.（“The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis in Arabidopsis”,The Plant Journal,36(1),94-104）は、アラビドプシスのＧＲＦファミリーを特徴付け、その遺伝子は主に活発に生長する組織で発現していることを確かめた。ＡｔＧＲＦ１およびＡｔＧＲＦ２を過剰発現するヌル変異体およびトランスジェニック植物体の解析により、ＧＲＦファミリーの一部のメンバーが葉および子葉の生長時の細胞拡張の制御に関与していることが分かった。さらに、過剰発現体植物は、抽だい時間の遅延を示すことで、開花における想定される役割が明らかになった。発育中の葉における細胞増殖を調整する分子メカニズムを決定する研究において、Rodriguez et al.は、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)においてｍｉＲ３９６がその標的であるＧＲＦ転写因子の発現パターンに拮抗することを発見した((2010),“Control of cell proliferation in Arabidopsis thaliana by microRNA miR396”,Development,137(1),103-112.)。このように、ｍｉＲ３９６とＧＲＦとの間のバランスが葉の最終的な細胞数を制御している。さらに、著者らは、ｍｉＲ３９６を標的としたＧＲＦがシュート分裂組織の大きさを制御できることを示した。
【０００７】
２００５年に、Horiguchi et al.（“The transcription factor AtGRF5 and the transcription coactivator AN3 regulate cell proliferation in leaf primordia of Arabidopsis thaliana”,The Plant Journal,43(1),68-78.）は、ＡｔＧＲＦ５とその相互作用パートナーであるＡＮＧＵＳＴＩＦＯＬＩＡ３（ＡＮ３）との特徴を初めて明らかにした。ノックアウト変異体であるａｔｇｒｆ５とａｎ３とは細胞数の減少のために細い葉を発育させたが、ＡｔＧＲＦ５とＡＮ３の過剰発現体系統では葉の原基において細胞増殖が増強された。Kuijt et al.（(2014),“Interaction between the GROWTH-REGULATING FACTOR and KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX Families of Transcription Factors”,Plant physiology,164(4),1952-1966.）は、ＧＲＦファミリーのメンバーが、シュート分裂組織における細胞分化の制限に関与するＫＮＯＴＴＥＤ１−ＬＩＫＥ  ＨＯＭＥＢＯＸ（ＫＮＯＸ）遺伝子の発現を制御するネットワークのプレイヤーとして機能することを示した。ＡｔＧＲＦ４、ＡｔＧＲＦ５およびＡｔＧＲＦ６は、ＫＮＯＸ遺伝子のプロモーターに結合し、その発現を抑制することができる。ＡｔＧＲＦ４、ＡｔＧＲＦ５またはＡｔＧＲＦ６を過剰発現するアラビドプシスの実生は、シュート分裂組織における発育異常を示す。Vercruyssen et al.の最近の研究((2015),“Growth regulating factor 5 stimulates Arabidopsis chloroplast division, photosynthesis,and leaf longevity”,Plant physiology,pp-114)では、ＧＲＦ５を過剰発現するアラビドプシスの葉は、細胞１個当たりのより多くの葉緑体数、葉緑素含量の増加および葉の老化の遅れを示していた。
【０００８】
要約すると、アラビドプシス遺伝子であるＡｔＧＲＦ５および他のＧＲＦ遺伝子が葉の形態形成および茎の発育に役割を果たすことはよく知られている。さらに、ＧＲＦ遺伝子は、開花、種子および根の発育において機能し、ストレス条件下での植物体の生長を制御し、植物体の寿命を調節することが報告されている。しかしながら、本発明の発明者らは、研究の過程で、驚くべきことに、この遺伝子ファミリーの別の新規な機能を発見した。ＧＲＦ５は、植物体再生を促進し、ひいてはトランスジェニック植物体のより効率的な回収を可能にすることができる。本発明は、多様な組織または細胞（例えば小胞子）からの再生を向上させることを可能にし、植物体再生に対する抵抗性、特に遺伝子型依存性を克服し、例えば対象遺伝子とＧＲＦ５との共発現によるトランスジェニック植物体の回収や例えばゲノム編集コンポーネントとＧＲＦ５との一過性の共発現によるゲノム操作された植物体の回収を向上させるだけでなく、トランスジェニック系統の作製および回収のために時間を短縮することができる。したがって、本発明の第１の態様は、植物体の再生能力を向上させるためのＧＲＦ５ポリペプチドの使用である。
【０００９】
本発明の方法において有用なポリペプチドまたはタンパク質に関する以下のあらゆる言及は、本明細書で定義されるＧＲＦ５ポリペプチドまたはＧＲＦ５タンパク質を意味すると解釈される。本発明の方法において有用な核酸またはポリヌクレオチド（形質転換される対象ヌクレオチド配列または植物体のゲノムを改変するための修復テンプレートとして任意選択的に使用される核酸分子を除く）に関する以下のあらゆる言及は、そのようなＧＲＦ５ポリペプチドまたはＧＲＦ５タンパク質をコードすることができる核酸またはポリヌクレオチドを意味すると解釈される。一実施形態では、本発明の方法において有用なポリペプチド／タンパク質または核酸／ポリヌクレオチドに関するあらゆる言及は、本発明の方法、コンストラクト、発現カセット、植物細胞、植物体、種子、収穫可能な部分および作製物において有用なタンパク質または核酸を意味すると理解されるべきである。植物細胞または植物体に導入される（したがって本発明の方法を行うのに有用である）（複数の）ｍＲＮＡを含む核酸／ポリヌクレオチドは、次に記載されるタイプのポリペプチド／タンパク質をコードする任意の核酸／ポリヌクレオチドであり、以下では「ＧＲＦ５核酸」、「ＧＲＦ５ポリヌクレオチド」、「ＧＲＦ５遺伝子」または「ＧＲＦ５  ｍＲＮＡ」などとも称される。
【００１０】
本明細書で定義される「ＧＲＦ５ポリペプチド」または「ＧＲＦ５タンパク質」とは、任意の転写因子、好ましくは１４−３−３様タンパク質ＧＦ１４  ｕｐｓｉｌｏｎを指し、より好ましくは、Ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎソフトウェア（www.ebi.ac.uk/interpro）を用いて解析した場合、ＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０（ＱＬＱドメインとしても知られている）およびＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９（ＷＲＣドメインとしても知られている）を含み、さらにより好ましくは、ＧＲＦ５ポリペプチドのＮ末端またはその近傍で、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のカバレッジのマッチが見られるＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０と、ＧＲＦ５ポリペプチドのＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０に対してＣ末端側の位置で、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のカバレッジのマッチが見られるＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９を含み、すなわち、マッチするアミノ酸ストレッチＰＦ０８８７９は、マッチするアミノ酸ストレッチＰＦ０８８８０の後ろの翻訳方向に位置している。好ましくは、マッチ部分の少なくとも１つは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のカバレッジを有する。
【００１１】
一実施形態では、両方のマッチするアミノ酸ストレッチは、ＧＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の半分に位置しており、好ましくは、マッチするアミノ酸ストレッチＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０は、ＧＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の４分の１に位置している。好ましくは、ＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０は、ＧＲＦ５ポリペプチドの残基５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５、好ましくは残基９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１から始まるＧＲＦ５ポリペプチドのアミノ酸残基とマッチし、ＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９は、ＧＲＦ５ポリペプチドの残基６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９、好ましくは残基７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５から始まるアミノ酸残基とマッチする。好ましくは、マッチするアミノ酸ストレッチＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０の開始アミノ酸残基と、マッチするアミノ酸ストレッチＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９の開始アミノ酸残基との間の距離は、ＧＲＦ５ポリペプチド内で６０〜８２アミノ酸、ＧＲＦ５ポリペプチド内でより好ましくは６０〜７５アミノ酸、より好ましくは６１〜７５アミノ酸、さらにより好ましくは６２〜７３アミノ酸である。
【００１２】
更なる実施形態では、本明細書で使用されるＧＲＦ５ポリペプチドは、指標モチーフ：［Ｄ］−［ＰＬ］−［Ｅ］−［Ｐ］−［Ｇ］−［Ｒ］−［Ｃ］−［Ｒ］−［Ｒ］−［Ｔ］−［Ｄ］−［Ｇ］−［Ｋ］−［Ｋ］−［Ｗ］−［Ｒ］−［Ｃ］−［ＳＡ］−［ＲＫ］−［ＥＤ］−［Ａ］−［ＹＨ］−［Ｐ］−［Ｄ］−［Ｓ］−［Ｋ］−［Ｙ］−［Ｃ］−［Ｅ］−［ＫＲ］−［Ｈ］−［Ｍ］−［Ｈ］−［Ｒ］−［Ｇ］−［ＲＫ］−［Ｎ］−［Ｒ］を含み、ここで、ＧＲＦ５ポリペプチドは、指標モチーフと比較して最大３個のミスマッチ数を示すことが許容可能(allowable/tolerable)であり、すなわち、３個までのミスマッチが、それぞれのＧＲＦ５ポリペプチドと指標モチーフとの間の配列アラインメントに現れてもよく、好ましくは、指標モチーフと比較して最大２個のミスマッチ数が現れてもよく、すなわち、２個までのミスマッチが、それぞれのＧＲＦ５ポリペプチドと指標モチーフとの間の配列アラインメントに現れてもよく、より好ましくは、指標モチーフと比較して最大１個のミスマッチ数が現れてもよく、すなわち、１個のミスマッチのみが、それぞれのＧＲＦ５ポリペプチドと指標モチーフとの間の配列アラインメントに現れてもよく、より好ましくは、指標モチーフと比較してミスマッチがない。特に好ましい実施形態では、ミスマッチのうちの１つまたは単独のミスマッチは、指標モチーフの位置２に位置しており、より好ましくは、ミスマッチは、［Ｐ］ではなく［Ａ］である。ミスマッチとは、指標モチーフに従ったある位置のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されているか、または少なくとも１つの付加的なアミノ酸の挿入によって欠失もしくはシフトされていることを意味する。角括弧内の指標モチーフの文字は、アミノ酸残基（１文字コード）を示し、モチーフは、本発明の任意のＧＲＦ５ポリペプチドに存在するようなＮ末端からＣ末端への方向におけるアミノ酸残基の順序を表す。１つの角括弧内に２つの文字がある場合、それらは選択肢を表す。このモチーフは、単子葉植物体および双子葉植物体を含む１６個の異なる植物種に由来するＧＲＦ５ポリペプチドの配列の包括的な比較から導き出されており、ＧＲＦ１のようなＧＲＦタンパク質ファミリーの他のメンバーとＧＲＦ５ポリペプチドを区別することが可能である（図５Ａ参照）。ミスマッチの数を決定するための配列アラインメント／比較による例示的なモチーフ解析が図５Ｂに示されている。好ましくは、モチーフは、ＧＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の半分に位置し、より好ましくは、モチーフは、ＧＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の半分に位置し、マッチするアミノ酸ストレッチＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９のサブ領域を含み、すなわち、モチーフは、マッチするアミノ酸ストレッチＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９と連続する重複部を有する。好ましくは、指標モチーフは、アミノ酸配列の配列番号４１〜配列番号１０４または配列番号１１３〜配列番号１７６のいずれかからなる。それに対応して、ＧＲＦ５ポリペプチドは、好ましくは、アミノ酸配列の配列番号４１〜配列番号１０４または配列番号１１３〜配列番号１７６のいずれかからなる１つの連続したモチーフを含む。
【００１３】
本発明の方法において有用な様々な植物種からのＧＲＦ５ポリペプチドの例をさらに以下で記載する。表１では、ＰＦＡＭドメインＰＦ０８８８０およびＰＦＡＭドメインＰＦ０８８７９の位置ならびに提示されたＧＲＦ５配列のいずれかにおける個々のカバレッジを示す。
【００１４】
【表１】
2021510069.tif 000003
【００１５】
一態様によれば、本発明は、
（ａ１）
（ｉ）少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする（複数の）ｍＲＮＡもしくはＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットを植物細胞内に導入し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、同時にまたは任意の順序で(in parallel or sequentially)連続して導入することができるステップ、または
（ａ２）少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列を植物細胞内に導入し、前記植物細胞内で、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを同時にまたは連続して誘導するステップと、
（ｂ）任意選択的に、（ａ１）もしくは（ａ２）の植物細胞または（ａ１）もしくは（ａ２）の植物細胞に由来する植物細胞を培養するステップであって、ここで、植物細胞内で、ＧＲＦ５ポリペプチドが、発現カセットから発現される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、導入された（複数の）ｍＲＮＡから翻訳される条件、（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドが、内因性遺伝子から発現増強／増加される条件、または（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドが存在する条件、好ましくは、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする（複数の）ｍＲＮＡもしくは（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットが、ステップ（ａ１）に従って導入されていないか、もしくはＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現レベルの増強が、ステップ（ａ２）に従って誘導されていない野生型植物細胞もしくは植物細胞における量と比較して増強された量で存在する条件下で培養するステップと
を含む、植物細胞を形質転換する方法を提供する。
【００１６】
本発明による方法は、ＧＲＦ５の存在もしくは増強された量のＧＲＦ５の存在のために、向上した再生能力を有する改変または形質転換された植物細胞を生じる。しかしながら、改変された植物細胞内で、ＧＲＦ５の存在または増強された量のＧＲＦ５の存在は一過性であることが好ましい。
【００１７】
植物細胞の形質転換とは、植物細胞のゲノム内への安定した組込み、または例えば、特定の（複数の）組織もしくはある（複数の）発育段階などに構成的、時間的もしくは特異的に関連する核酸配列の発現につながる植物細胞内での一過性の出現を引き起こす方法で核酸分子を植物細胞内に導入することを意味する。単子葉植物細胞および双子葉植物細胞の両方の形質転換および再生は、今日では日常的に行われており、最も適切な形質転換技術の選択は、当業者によって決定されるであろう。方法の選択は、形質転換される植物体または遺伝子型の種類によって異なるであろう。当業者であれば、所定の植物体の種類または遺伝子型に対する特定の方法の適合性を認識するであろう。適切な方法として、植物プロトプラストのエレクトロポレーション；リポソーム媒介形質転換；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介形質転換；ウイルスを用いた形質転換；植物細胞のマイクロインジェクション；植物細胞のマイクロプロジェクタイルボンバードメント；真空浸潤；およびアグロバクテリウム媒介形質転換を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１８】
少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列を導入するステップ（ａ１）（ｉ）または（ａ２）は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて行うことができる。対象核酸を植物細胞内に導入するために、多くの方法が利用可能である。例示的なベクター媒介方法は、トウモロコシについては、例えば、Lindsay & Gallois,1990,Journal of Experimental BotanyおよびKischenko et al.,2005,Cell Biology International for sugar beet、Ishida et al.,2007,(“Agrobacterium-mediated transformation of maize.”Nature protocols,2(7),1614-1621)に記載されているようなアグロバクテリウム媒介形質転換であり、コムギについては、日本タバコ産業株式会社からのＰｕｒｅＷｈｅａｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるものである。他の適切な技術として、パーティクル・ガン法およびエレクトロポレーションが挙げられる。
【００１９】
本発明による対象ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであってもよい。より具体的には、対象ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの表現型形質をコードする。好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡによって付与される表現型形質は、生物的ストレスに対する抵抗性／耐性であって、病原体抵抗性／耐性を含むもの（ここで、病原体は、ウイルス、細菌、真菌もしくは動物病原体であってもよい）、非生物的ストレスに対する抵抗性／耐性であって、耐寒性／耐凍性、干ばつストレス抵抗性／耐性、浸透圧抵抗性／耐性、熱ストレス抵抗性／耐性、寒冷もしくは霜ストレス抵抗性／耐性、酸化ストレス抵抗性／耐性、重金属ストレス抵抗性／耐性、塩類ストレスもしくは浸水抵抗性／耐性、倒伏抵抗性／耐性、脱粒抵抗性／耐性、またはグリホサート、グルホシネート、２，４−Ｄ、ジカンバ、ＡＬＳ阻害剤などのような１種以上の除草剤に対する抵抗性／耐性を含むものからなる群から選択され得る。少なくとも１つの対象表現型形質はまた、収量の増加、開花時期の変化、種子の色の変化、内胚乳組成の変化、栄養含有量の変化、または対象経路の代謝工学の変化を含む、更なる対象農業形質の変化からなる群から選択され得る。
【００２０】
本発明の文脈では、ＧＲＦ５は、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットとして、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡもしくは前駆体ｍＲＮＡも含む）として、またはＧＲＦ５ポリペプチドとして導入することができる。核酸分子を導入するための例示的な技術は、上記に記載している。あるいは、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を活性化することによって、植物細胞内にＧＲＦ５を提供することもできる。これは、内因性ＧＲＦ５遺伝子の発現レベルの増強、すなわち、植物細胞内でのＧＲＦ５ポリペプチドの増強された量の存在または発生につながるであろう。内因性遺伝子の発現の活性化は、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子のプロモーターの活性または構造を改変することによって達成され得る。例として、エンハンサー因子を、遺伝子編集によってプロモーターに導入することができる；またはプロモーターを調節するエンハンサー因子をさらに強化することができるか、もしくはプロモーターを調節するサイレンサー因子を、例えば標的化された突然変異誘発／改変によって弱めることができる；または改変を、ＣＲＩＳＰＲシステムのような遺伝子編集ツールによって、エンハンサーに関連するエピゲノム内に導入することができる(Hilton et al.(2015).Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.Nature biotechnology,33(5),510-517)；または、例えばＴＡＬＥアクチベーターまたはｄＣａｓ９アクチベーターに基づく合成転写因子を、プロモーター上またはその近傍の標的認識部位に結合してＧＲＦ５遺伝子の転写を活性化することができる細胞内に導入することができる(Cheng et al.(2013).Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on,an RNA-guided transcriptional activator system.Cell research,23(10),1163)；または転写後阻害によってＧＲＦ５遺伝子の発現を調節する植物細胞内でのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の量を、例えば、植物細胞内のＧＲＦ５ポリペプチドの翻訳量を増加させるためにノックアウト（ヌル変異体）またはノックダウンによって減少させることができる−例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（２０１０）（上記参照）は、アラビドプシスにおいて、ＧＲＦ５の発現に拮抗し、したがって、植物細胞内でのＧＲＦ５ポリペプチドの量に影響を与えるのに適した標的を表すマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ３９６を同定していた。
【００２１】
植物種および細胞型に応じて、再生が行われるときに植物細胞内に適切な量のＧＲＦ５ポリペプチドが存在するようにするためには、異なるレベルの遺伝子または発現活性化が必要である。内因性遺伝子または導入された遺伝子の実際の発現レベルを測定するために、当業者であれば利用可能な様々な技術、例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットまたはマイクロアレイがある。サトウダイコン植物(Beta vulgaris plant)に導入されたＡｔＧＲＦ５遺伝子の発現レベルの測定は、図４に示されている。これらの方法により、当業者は日常的に行われる作業によって、多様な組織または体細胞および生殖細胞（例えば小胞子）からの再生能力の向上に影響を与えるＧＲＦ５遺伝子の発現レベルを調整することが可能になる。好ましい実施形態では、植物細胞内で、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現レベルは、少なくとも２倍、３倍、または５倍、好ましくは１０倍、２５倍または５０倍、より好ましくは１００倍、２００倍または５００倍に増える。
【００２２】
上記でさらに記載しているように、植物細胞内での内因性遺伝子の増強された発現レベルの誘導は、１種以上のアクチベーターまたはその前駆体の適用によって行うことができる。これらは、植物細胞が培養される培地に適用することができ、次いで植物細胞によって能動的または受動的に吸収される。さらに、１種以上のアクチベーターまたはその前駆体は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはバインダーポリマー・ボンバードメント法(biolistic bombardment)によって植物細胞内に直接導入することができる。上記の合成転写アクチベーターの他に、内因性遺伝子の発現レベル、特に内因性ＧＲＦ５遺伝子の発現レベルを増加させるために使用することができる多数の更なるアクチベーターが当該技術分野から知られている：近年では、生物系を低分子で処理して細胞機能を特異的に擾乱させる化学植物遺伝学および化学植物生物学の技術分野が登場してきている。低分子は、薬物、除草剤および殺菌剤として種々の系で商業的に使用されているが、近年では、遺伝子制御のためのツールとしてもますます利用されるようになってきている。例として、化学遺伝学には、化合物ライブラリーのスクリーニングを通して様々な細胞機能の低分子エフェクターの発見が含まれている(Dejonghe & Russinova (2017).Plant Chemical Genetics:From Phenotype-Based Screens to Synthetic Biology.Plant Physiology,pp-01805;Kawasumi,M.,& Nghiem,P.(2007).Chemical genetics:elucidating biological systems with small-molecule compounds.Journal of Investigative Dermatology,127(7),1577-1584)。ＧＲＦ５のような標的遺伝子の発現の活性化に適したそのような低分子エフェクターは、種々の戦略に従った化学スクリーニングによって同定することができる(Dejonghe & Russinova,2017)。無数の低分子を簡単にスクリーニングし、ＧＲＦ５のような遺伝子の発現の活性化に使用することができるエフェクターの同定を可能にする包括的な化合物ライブラリーが利用可能である。上述したように、ＧＲＦ５のような内因性遺伝子の発現レベルを増強するための別のアプローチは、いわゆる合成転写アクチベーターの適用である。それらは典型的には、認識ドメインと少なくとも１つの活性化ドメインとの融合によって設計されている。認識ドメインは、ジンクフィンガー、ＴＡＬエフェクターまたはＣＲＩＳＰＲのような既知のシステムに由来し得る；活性化のために、例として単純ヘルペスウイルスに由来するＶＰ−１６またはＶＰ−６４活性化ドメインを認識ドメインに融合させると、転写の増加を引き起こすことができる。より弱い活性化ドメイン、例えばヒトＮＦ−κＢのＡＤでは、遺伝子活性化のための多様な選択肢が与えられる。さらに、内因性プロモーター上で示されるように、アクチベーターの組合せを、相乗効果の導入のために使用することができる(Moore et al.(2014).“Transcription activator-like effectors: a toolkit for synthetic biology.”ACS synthetic biology,3(10),708-716.;米国特許出願公開第2002/0046419号明細書; Lowder et al.(2017).“Multiplexed transcriptional activation or repression in plants using CRISPR-dCas9-based systems.”Plant Gene Regulatory Networks:Methods and Protocols,167-184.)。合成転写アクチベーターは、植物細胞に送達されてもよいし、前駆体としても、すなわち、そのような人工もしくは合成転写アクチベーターもしくはそのドメインをコードするＤ���ＡもしくはＲＮＡ分子として、または細胞内もしくは細胞の特定の区画で後に活性化される転写アクチベーターの不活性型として植物細胞内に導入されてもよい。最後に、ＧＲＦ遺伝子の発現の増強はまた、上流のネガティブレギュレーター（すなわち、ｍｉＲ３９６）を不活性化することによって、またはそのようなネガティブレギュレーターに対して耐性があるＧＲＦ遺伝子の変異体変種を作製することによって達成され得る。
【００２３】
好ましくは、本発明のＧＲＦ５ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、１０６、１０８、１１０、１１２もしくは２０９からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、１０６、１０８、１１０、１１２もしくは２０９と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、１０６、１０８、１１０、１１２もしくは２０９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、本明細書に記載される指標モチーフ、特に好ましくは、アミノ酸配列番号４１〜配列番号１０４または配列番号１１３〜配列番号１７６のいずれかからなる指標モチーフを含む。例えば内因性遺伝子によってコードされるＧＲＦ５ポリペプチドは、配列番号２（アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)）、配列番号４（サトウダイコン(Beta vulgaris)）、配列番号６（トウモロコシ(Zea mays)）、配列番号８（パンコムギ(Triticum aestivum)）、配列番号１０（セイヨウアブラナ(Brassica napus)）、配列番号１２（ブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)）、配列番号１４（ヤセイカンラン(Brassica oleracea)）、配列番号１６（ダイコン(Raphanus sativus)）、配列番号１８（モロコシ(Sorghum bicolor)）、配列番号２０（ヒマワリ(Helianthus annuus)）、配列番号２２（ジャガイモ(Solanum tuberosum)）、配列番号２４（オオムギ(Hordeum vulgare)）、配列番号２６（ライムギ(Secale cereale)）、配列番号２８（ダイズ(Glycine max)）、配列番号３０（アメリカワタ(Gossypium hirsutum)）、配列番号３２（イネ(Oryza sativa)）、配列番号１０６（ダイズ(Glycine max)）、配列番号１０８（セイヨウアブラナ(Brassica napus)）、配列番号１１０（ヒマワリ(Helianthus annuus)）、配列番号１１２（トウモロコシ(Zea mays)）または配列番号２０９（トウモロコシ(Zea mays)）からなる群から選択されるアミノ酸を含み得る。
【００２４】
本発明のＧＲＦ５ポリペプチドをコードする外因性（外来）または内因性ポリヌクレオチドは、
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、１０５、１０７、１０９、１１１、２０７、２０８または２１０を含むヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、１０５、１０７、１０９、１１１、２０７、２０８または２１０を含むヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が同一である配列を含むヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）上記で定義されるＧＲＦ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、もしくは遺伝暗号の縮重の範囲内で（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）によってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；および／または
（ｖ）（ｉｖ）のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
を含む。
【００２５】
ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特にＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１（アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)）、配列番号３（サトウダイコン(Beta vulgaris)）、配列番号５（トウモロコシ(Zea mays)）、配列番号７（パンコムギ(Triticum aestivum)）、配列番号９（セイヨウアブラナ(Brassica napus)）、配列番号１１（ブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)）、配列番号１３（ヤセイカンラン(Brassica oleracea)）、配列番号１５（ダイコン(Raphanus sativus)）、配列番号１７（モロコシ(Sorghum bicolor)）、配列番号１９（ヒマワリ(Helianthus annuus)）、配列番号２１（ジャガイモ(Solanum tuberosum)）、配列番号２３（オオムギ(Hordeum vulgare)）、配列番号２５（ライムギ(Secale cereale)）、配列番号２７（ダイズ(Glycine max)）、配列番号２９（アメリカワタ(Gossypium hirsutum)）、配列番号３１（イネ(Oryza sativa)）、配列番号１０５（ダイズ(Glycine max)）、配列番号１０７（セイヨウアブラナ(Brassica napus)）、配列番号１０９（ヒマワリ(Helianthus annuus)）、配列番号１１１（トウモロコシ(Zea mays)）、配列番号２０７（トウモロコシ(Zea mays)）、配列番号２０７（synthetic）、配列番号２０８（synthetic）または配列番号２１０（synthetic）の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００２６】
本発明の目的のために、百分率で表される２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」とは、２つの最適にアラインメントされた配列に同一の残基を有する位置の数を、比較した位置の数で割った値（ｘ１００）を指す。ギャップ、すなわち、一方の配列には残基が存在するが他方の配列には存在しないアラインメントの位置は、非同一残基を有する位置とみなされる。２つの配列のアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch 1970）によって行われる。上記のコンピューター支援配列アラインメントは、標準ソフトウェアプログラム、例えば欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート（ＥＭＢＯＳＳ）に実装されているＮＥＥＤＬＥプログラム、例えばバージョン６．３．１．２(Trends in Genetics 16 (6),276 (2000))を使用して、そのデフォルトパラメーター、例えば、タンパク質マトリックス＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２、ｇａｐｏｐｅｎ＝１０．０およびｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．５の設定により、手際よく行うことができる。
【００２７】
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」という用語は、互いに十分な相補性を有するヌクレオチド配列が通常ハイブリダイズしたままである条件を指す。これらのストリンジェントな条件は当業者に知られており、例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989) 6.3.1-6.3.6に記載されている。当業者は、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory,1989に基づいて、必要なハイブリダイゼーション条件を決定する方法を知っている。この点に関して「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸の実際の凝集の際に一般的な実際の条件だけでなく、その後の洗浄ステップの際に一般的な条件も指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、主に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸分子のみがハイブリダイゼーションを受ける条件が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば：６５℃での４×ＳＳＣおよびその後の６５℃にて約１時間にわたる０．１×ＳＳＣでの複数回の洗浄である。本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語はまた、０．２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１％ＢＳＡで６８℃にて１６時間にわたりハイブリダイゼーションし、その後に２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６８℃にて２回洗浄することを意味し得る。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行われる。
【００２８】
「操作可能に連結された」という表現は、キメラ遺伝子の前記因子が、それらの機能が協調し、コード配列の発現を可能にするように、すなわち、それらが機能的に連結される方法で互いに連結されていることを意味する。例として、プロモーターは、他のヌクレオチド配列の転写および最終的には発現を実現することができる場合、この別のヌクレオチド配列に機能的に連結される。ヌクレオチド配列をコードする２つのタンパク質が機能的または操作可能に互いに連結されているとは、それらが第１および第２のタンパク質またはポリペプチドの融合タンパク質を形成することができる方法で接続されている場合である。
【００２９】
遺伝子は、発現産物の形成につながるときに発現すると言われている。発現産物は、そのような産物をコードする核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えば、本明細書に記載される第２の核酸の転写および任意選択的に翻訳から生じる中間産物または最終産物を示す。転写プロセス中に、調節領域、特にプロモーターの制御下にあるＤＮＡ配列がＲＮＡ分子に転写される。ＲＮＡ分子は、それ自体が発現産物を形成してもよいし、それがペプチドまたはタンパク質に翻訳されることができる場合には中間産物であってもよい。遺伝子の発現の最終産物としてのＲＮＡが、例えば、別の核酸またはタンパク質と相互作用することができる場合、遺伝子はＲＮＡ分子を発現産物としてコードすると言われる。ＲＮＡ発現産物の例として、阻害性ＲＮＡ、例えば、センスＲＮＡ（コサプレッション）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡが挙げられる。遺伝子の発現の最終産物がタンパク質またはペプチドである場合、遺伝子はタンパク質を発現産物としてコードすると言われる。
【００３０】
本明細書で使用される核酸（分子）またはヌクレオチド（配列）またはポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を指す。ＤＮＡには、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡも含まれる。核酸分子は、一本鎖もしくは二本鎖であり得、化学的に合成され得るか、またはインビトロもしくはインビボでも生物学的発現によって作製され得る。
【００３１】
ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列が、対応するＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を参照して定義される場合は必ず、ヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されるべきであることは明確であろう。ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に言及しているかどうかは、本出願の文脈から明確であろう。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「含む」などは、言及されている記載された特徴、整数、ステップもしくは成分の存在を特定するものと解釈されるべきであるが、１つ以上の特徴、整数、ステップもしくは成分、またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。したがって、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に挙げたものよりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでいてもよく、すなわち、より大きな核酸またはタンパク質に埋め込まれていてもよい。機能的または構造的に定義されたＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ領域などを含み得る。
【００３３】
ＧＲＦ５によって、向上した再生能力を有する植物細胞または他の植物前駆体組織を提供することができる。これは、遺伝子改変された植物細胞、特にゲノムが編集された植物細胞に特に役立つ。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列およびＧＲＦ５を導入するステップ（ａ１）または少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列を導入し、ＧＲＦ５をコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを誘導するステップが、植物細胞の一過性形質転換を生じる。本発明に関して、「一過性形質転換」とは、挿入された配列が植物細胞のゲノム内に（安定的に）組み込まれていないことを意味する。別の実施形態では、安定した形質転換が行われ、本明細書に開示される形質転換する方法のステップ（ａ１）および（ａ２）における対象ヌクレオチド配列および／または本明細書に開示されるゲノムを改変する方法のステップ（ａ１）におけるＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、植物細胞のゲノム内に挿入される。本発明の特に好ましい実施形態によれば、対象ヌクレオチド配列は、細胞のゲノム内に安定して形質転換され、ＧＲＦ５をコードするヌクレオチド配列は、細胞内に一過性形質転換される。
【００３５】
植物細胞のゲノム改変は、好ましくは前記細胞のゲノム内の所定の部位を認識する二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）誘導酵素によって達成することができる。
【００３６】
したがって、本発明の別の実施形態は、
（ａ１）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする（複数の）ｍＲＮＡ（（複数の）ｐｒｅ−ｍＲＮＡを含む）もしくは（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットを植物細胞内に導入するステップ；または
（ａ２）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを植物細胞内に誘導するステップと、
（ｂ）（ａ１）もしくは（ａ２）の植物細胞または（ａ１）もしくは（ａ２）の植物細胞に由来する植物細胞を培養するステップであって、ここで、植物細胞内で、ＧＲＦ５ポリペプチドが、発現カセットから発現される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、導入された（複数の）ｍＲＮＡから翻訳される条件、（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドが、内因性遺伝子から発現増強／増加される条件、または（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドが存在する条件、好ましくは、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする（複数の）ｍＲＮＡもしくは（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットが、ステップ（ａ１）に従って導入されていない、もしくはＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現レベルの増強が、ステップ（ａ２）に従って誘導されていない野生型植物細胞もしくは植物細胞における量と比較して増強された量で存在する条件下で培養するステップと、
（ｃ）好ましくは前記細胞のゲノム内の所定の部位を認識する二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）誘導酵素と、任意選択的に修復核酸分子とを用いて、（ｂ）の植物細胞のゲノムを改変するステップと
を含み、ここで、前記所定の部位における前記ゲノムの改変は、
ｉ．少なくとも１つのヌクレオチドの置換；
ｉｉ．少なくとも１つのヌクレオチドの欠失；
ｉｉｉ．少なくとも１つのヌクレオチドの挿入；または
ｉｖ．ｉ．〜ｉｉｉ．の任意の組合せ
から選択され、かつ
ステップ（ｃ）は、ステップ（ａ１）／（ａ２）および／もしくは（ｂ）と同時に、ステップ（ａ１）／（ａ２）の前に、ステップ（ａ１）／（ａ２）と（ｂ）との間に、またはステップ（ｂ）の後に行われる、
植物細胞のゲノムを改変する方法である。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素」または「ＤＳＢＩ酵素」とは、「認識部位」と呼ばれる特定のヌクレオチド配列に二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる酵素である。二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）誘導酵素は、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１またはＣＲＩＳＰＲ／ＭＡＤ７のようなＣＲＩＳＰＲシステムからなる群から選択することができる。希少切断エンドヌクレアーゼは、好ましくは約１４〜７０個の連続したヌクレオチドの認識部位を有し、したがって、ほとんどの植物体ゲノムのようなより大きなゲノム内であっても非常に低い頻度で切断されるＤＳＢＩ酵素である。メガヌクレアーゼとも呼ばれるホーミングエンドヌクレアーゼは、そのような希少切断エンドヌクレアーゼのファミリーを構成する。これらの酵素は、イントロン、独立遺伝子または介在配列によってコードされている場合があり、より古典的な制限酵素、通常は細菌のＩＩ型制限修飾システムとそれらを区別する顕著な構造的および機能的特性を呈示する。それらの認識部位は、ほとんどの制限酵素認識部位の特徴的な二回転対称と対照的な一般的な非対称性を有している。イントロンまたはインテインによってコードされるいくつかのホーミングエンドヌクレアーゼは、対立遺伝子のイントロンのないまたはインテインのない部位へのこれらの酵素のそれぞれの遺伝因子のホーミングを促進することが示されている。これらのヌクレアーゼは、イントロンのないまたはインテインのない対立遺伝子の部位特異的な二本鎖を切断することによって、コード配列を複製し、ＤＮＡレベルでのイントロンまたは介在配列の挿入につながる遺伝子変換プロセスに関与する組換え末端を作出する。他の希少切断メガヌクレアーゼおよびこれらの酵素のそれぞれの認識部位のリストが、国際公開第０３／００４６５９号（第１７頁〜第２０頁）の表Ｉに提供されている（参照により本明細書に援用される）。
【００３８】
さらに、基本的に任意の標的ヌクレオチド配列を認識する、カスタム調整された希少切断エンドヌクレアーゼを設計するための方法が利用可能である。簡単に言うと、特異的ヌクレオチド配列を認識するように設計されたジンクフィンガードメインと、ＦｏｋＩなどの天然の制限酵素からの非特異的ＤＮＡ開裂ドメインとの間のハイブリッドを使用してキメラ制限酵素を調製することができる。そのような方法は、例えば、国際公開第０３／０８０８０９号、国際公開第９４／１８３１３号または国際公開第９５／０９２３３号およびIsalan et al.(2001).A rapid,generally applicable method to engineer zinc fingers illustrated by targeting the HIV-1 promoter.Nature biotechnology,19(7),656; Liu et al.(1997).Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes.Proceedings of the National Academy of Sciences,94(11),5525-5530に記載されている。
【００３９】
カスタム設計されたエンドヌクレアーゼの別の例として、ヌクレアーゼの触媒ドメインに融合したキサントモナス細菌属からの転写活性化様エフェクター（ＴＡＬＥ）に基づくＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる（例えば、ＦｏｋＩまたはそのバリアント）。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ結合特異性は、タンデム配置された３４／３５アミノ酸反復単位の反復可変二残基（ＲＶＤ）によって、１つのＲＶＤが標的ＤＮＡの１つのヌクレオチドを特異的に認識する形で定義される。繰り返し単位は、基本的に任意の標的配列を認識するように組み立てられ、ヌクレアーゼの触媒ドメインに融合されて配列特異的なエンドヌクレアーゼを作出することができる(例えば、Boch et al.(2009).Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.Science,326(5959),1509-1512; Moscou & Bogdanove (2009).A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science,326(5959),1501-1501;および国際公開第２０１０／０７９４３０号、国際公開第２０１１／０７２２４６号、国際公開第２０１１／１５４３９３号、国際公開第２０１１／１４６１２１号、国際公開第２０１２／００１５２７号、国際公開第２０１２／０９３８３３号、国際公開第２０１２／１０４７２９号、国際公開第２０１２／１３８９２７号、国際公開第２０１２／１３８９３９号参照)。国際公開第２０１２／１３８９２７号はさらに、様々な触媒ドメインおよびそれらの組合せを有するモノマー（コンパクト）ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥを記載している。
【００４０】
近年、新しいタイプのカスタマイズ可能なエンドヌクレアーゼシステム、いわゆるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが記載されている。自然環境におけるＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼまたは特定のＤＮＡ二本鎖切断を生成することができるＣｐｆ１ヌクレアーゼのような別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ(Zetsche et al.,“Cpf1 Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”,Cell,163,pp.1-13,October 2015)と組み合わさって少なくとも１つの小さな個々のノンコーディングＲＮＡを含む分子複合体を表している。現在、ＣＲＩＳＰＲシステムは、例として、Ｃａｓ９をエフェクターとして使用するＩＩ型システムと、Ｃｐｆ１をエフェクター分子として使用するＶ型システムとの５つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステムを含む２つのクラスに分類されている(Makarova et al.,Nature Rev.Microbiol.,2015)。人工ＣＲＩＳＰＲシステムでは、合成ノンコーディングＲＮＡとＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび／または任意選択的にニッカーゼとして機能するように改変されたもしくはいかなるヌクレアーゼ機能も欠いている改変されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの機能を兼ね備えた少なくとも１つの合成もしくは人工のガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと組み合わせて使用することができる(Makarova et al.,2015,上記参照)。自然系におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって媒介される免疫応答は、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を必要とし、ここで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの特異的活性化を制御するこの誘導ＲＮＡの成熟は、これまでに特徴付けられた様々なＣＲＩＳＰＲシステムの間で大幅に異なる。まず、スペーサーとしても知られている侵入ＤＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位端にある２つの隣接する反復領域の間に組み込まれる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、干渉ステップのための鍵となる酵素としてのＣａｓ９ヌクレアーゼをコードし、このシステムは、ガイドモチーフとしてｃｒＲＮＡとそれにトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との両方を含む。これらはハイブリダイズして二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ領域を形成し、これらの領域は、ＲＮＡｓｅＩＩＩによって認識され、成熟したｃｒＲＮＡを形成するために切断されることができる。次いで、これらはまたヌクレアーゼを標的核酸領域に特異的に指向させるためにＣａｓ分子と会合する。組換えｇＲＮＡ分子は、可変ＤＮＡ認識領域とそれにＣａｓ相互作用領域との両方を含むことができ、ひいては特異的標的核酸および所望のＣａｓヌクレアーゼとは無関係に、特異的に設計することができる。更なる安全メカニズムとして、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）が標的核酸領域に存在していなければならない；これらは、Ｃａｓ９／ＲＮＡ複合体認識ＤＮＡから直接続くＤＮＡ配列である。ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿性連鎖球菌）(Streptococcus pyogenes)に由来するＣａｓ９のＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」または「ＮＡＧ」であると記載されている（標準ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）(Jinek et al,“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”,Science 2012,337:816-821)。スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）(Staphylococcus aureus)のＣａｓ９のＰＡＭ配列は「ＮＮＧＲＲＴ」または「ＮＮ��ＲＲ（Ｎ）」である。更なるバリアントＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが知られている。したがって、ナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎菌）(Neisseria meningitidis)Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴを切断する。ストレプトコッカス・サーモフィルス（サーモフィルス菌）(Streptococcus thermophilus)Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを切断する。近年、更なるＰＡＭモチーフＮＮＮＮＲＹＡＣが、カンピロバクター属のＣＲＩＳＰＲシステムについて記載されている（国際公開第２０１６／０２１９７３号）。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについて、ｔｒａｃｒＲＮＡがないＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９システムによって認識される一般にＧリッチなＰＡＭとは対照的に短いＴリッチなＰＡＭによって生ずる標的ＤＮＡを効率的に認識して切断する(Zetsche et al.,上記参照)。さらに、改変されたＣＲＩＳＰＲポリペプチドを使用することによって、特異的な一本鎖切断を得ることができる。Ｃａｓニッカーゼとさまざまな組換えｇＲＮＡとの併用により、ＤＮＡダブルニッキングによって非常に特異的なＤＮＡ二本鎖切断を誘導することもできる。さらに、２つのｇＲＮＡを使用することによって、ＤＮＡ結合ひいてはＤＮＡ開裂の特異性を最適化することができる。一方で、細菌について当初記載されていたＣａｓＸおよびＣａｓＹエフェクターのような更なるＣＲＩＳＰＲエフェクターが利用可能であり、ゲノム操作の目的で使用することができる更なるエフェクターを表す(Burstein et al.,“New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes”,Nature,2017,542,237-241)。
【００４１】
ＤＳＢＩ酵素の開裂部位は、二本鎖ＤＮＡ切断が誘導されるＤＮＡ上の正確な位置に関連している。開裂部位は、ＤＳＢＩ酵素の認識部位に（と重複して）含まれていても含まれていなくてもいてもよく、したがって、ＤＳＢＩ酵素の開裂部位はその認識部位に位置するまたはその近くに位置すると言われている。結合部位とも呼ばれることがあるＤＳＢＩ酵素の認識部位は、ＤＳＢＩ酵素によって（特異的に）認識され、その結合特異性を決定するヌクレオチド配列である。例えば、ＴＡＬＥＮまたはＺＮＦモノマーは、それぞれＲＶＤリピートまたはＺＦリピートによって決定される認識部位を有するが、その開裂部位は、そのヌクレアーゼドメイン（例えばＦｏｋＩ）によって決定され、通常は認識部位の外側に位置する。二量体ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮの場合、開裂部位は、それぞれのモノマーの２つの認識／結合部位の間に位置し、開裂が発生するこの介在ＤＮＡ領域はスペーサー領域と呼ばれる。
【００４２】
当業者であれば、ある認識部位を認識するＤＳＢＩ酵素を選択し、予め選択された／予め決定された部位もしくはその付近の開裂部位でＤＳＢを誘導するか、またはそのようなＤＳＢＩ酵素を操作することができる。あるいは、ＤＳＢＩ酵素認識部位は、従来の任意の形質転換法を使用して、またはそのゲノム内にＤＳＢＩ酵素認識部位を有する生物との交配によって、標的ゲノム内に導入し、その後、任意の所望のＤＮＡを、そのＤＳＢＩ酵素の開裂部位にもしくはその付近に導入することもできる。
【００４３】
この実施形態の特に好ましい態様では、修復核酸分子が植物細胞内に追加的に導入される。本明細書で使用される場合、「修復核酸分子」とは、開裂部位の付近もしくは開裂部位の予め選択された部位においてゲノムＤＮＡを修飾するためのテンプレートとして使用される一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。本明細書で使用される場合、「ゲノムＤＮＡを修飾するためのテンプレートとして使用する」とは、修復核酸分子が、予め選択された部位に隣接する標的ゲノム内の（複数の）フランキング領域と対応する（複数の）相同領域との間の相同組換えによって、任意選択的に修復核酸分子の２つの末端のうちの一方（例えば、フランキング領域が１つしか存在しない場合）の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と組み合わせて、予め選択された部位でコピーまたは組み込まれることを意味する。相同組換えによる組込みにより、修復核酸分子は、標的ゲノムにヌクレオチドレベルまで正確に結合させることが可能になり、ＮＨＥＪは、修復核酸分子とゲノムＤＮＡとの間の結合部に小さな挿入／欠失を生じ得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ゲノムの改変」とは、ゲノムが少なくとも１つのヌクレオチドだけ変化したことを意味する。これは、少なくとも１つのヌクレオチドの置換および／または少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または少なくとも１つのヌクレオチドの挿入によって、改変前の予め選択されたゲノム標的部位のヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの全体的な変化を生じる限りにおいて起こり得、それによって、例えば、配列決定またはＰＣＲ解析などの技術によって、当業者であれば熟知しているであろう改変の同定が可能になる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「予め選択された部位」、「所定の部位」または「予め定義された部位」とは、１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換および／または欠失が所望される位置にあるゲノム（例えば、核ゲノムもしくは葉緑体ゲノム）内の特定のヌクレオチド配列を示す。これは、例えば、前もって導入された外来ＤＮＡもしくは導入遺伝子内のもしくはそれらに連結された内因性遺伝子座または特定のヌクレオチド配列であり得る。予め選択された部位は、１つ以上のヌクレオチドを挿入することが意図される特定のヌクレオチド位置（の下流）であり得る。予め選択された部位はまた、交換（置換）または欠失されるべき１つ以上のヌクレオチドの配列を含み得る。
【００４６】
本出願の文脈で使用される場合、「約」という用語は、列挙された値の＋／−１０％、好ましくは列挙された値の＋／−５％を意味する。例えば、約１００ヌクレオチド（ｎｔ）は、９０〜１１０ｎｔ、好ましくは９５〜１０５ｎｔの値として理解されるものとする。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「フランキング領域」とは、予め選択された部位の隣接する（すなわち、上流または下流の）ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と相同であるヌクレオチド配列を有する修復核酸分子の領域である。フランキング領域の長さおよび百分率配列同一性(percentage sequence identity)は、予め選択された部位の上流または下流の前記フランキング領域とそれらの対応するＤＮＡ領域との間の相同組換えを可能にするように選択されるべきであることは明らかであろう。修復核酸分子の１つまたは複数のフランキングＤＮＡ領域と相同性を有する予め選択された部位に隣接する１つ以上のＤＮＡ領域は、ゲノムＤＮＡ内の１つまたは複数の相同領域とも呼ばれる。
【００４８】
組換えのための十分な相同性を有するために、修復核酸分子のフランキングＤＮＡ領域は長さが異なっていてもよく、少なくとも約１０ｎｔ、約１５ｎｔ、約２０ｎｔ、約２５ｎｔ、約３０ｎｔ、約４０ｎｔまたは５０ｎｔの長さであることが望ましい。しかしながら、フランキング領域は、実際には可能な限り長くてもよい（例えば、完全細菌人工染色体（ＢＡＣ）のように約１００〜１５０ｋｂまで）。好ましくは、フランキング領域は、約５０ｎｔ〜約２０００ｎｔ、例えば、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、５００ｎｔまたは１０００ｎｔであろう。さらに、対象ＤＮＡに隣接する領域は、相同領域（予め選択された部位に隣接するＤＮＡ領域）と同一である必要はなく、予め選択された部位に隣接するＤＮＡ領域と約８０％〜約１００％の配列同一性、好ましくは約９５％〜約１００％の配列同一性を有し得る。フランキング領域が長ければ長いほど、相同性の要件は厳しくない。さらに、隣接するＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を変化させずに、予め選択された部位における標的ＤＮＡ配列の交換を達成するために、好ましくは、フランキングＤＮＡ配列は、予め選択された部位に隣接する上流および下流のＤＮＡ領域と同一であることが望ましい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「上流」とは、前記核酸分子の５’末端により近い核酸分子上の位置を示す。同様に、「下流」という用語は、前記核酸分子の３’末端により近い核酸分子上の位置を指す。誤解を避けるために、核酸分子およびそれらの配列は、典型的には５’から３’の方向（左から右）に表される。
【００５０】
予め選択された部位で配列改変を標的とするために、上流のフランキング領域の３’末端および／または下流側のフランキング領域の５’末端が、予め選択された部位の末端とアラインメントするようにフランキング領域を選択しなければならない。このように、上流のフランキング領域の３’末端は、予め定義された部位の５’末端を決定し、下流側のフランキング領域の５’末端は、予め定義された部位の３’末端を決定する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、前記予め選択された部位が前記開裂（および／または認識）部位の外側または離れた位置にあるということは、ゲノム改変を行うことが意図される部位（予め選択された部位）が、ＤＳＢＩ酵素の開裂部位および／または認識部位を含まないこと、すなわち、予め選択された部位が、開裂（および／または認識）部位と重複しないことを意味する。したがって、この点に関して外側／離れているとは、開裂（および／または認識）部位の上流または下流を意味する。
【００５２】
本発明の方法に従って形質転換または遺伝子編集されており、場合によっては改変されたゲノムを有する改変された植物細胞は、完全な（稔性）植物体内に再生され得る。植物細胞内に追加のＧＲＦ５が存在するために、それらの再生能力は大幅に向上する。したがって、本発明の好ましい態様では、植物細胞の形質転換または植物細胞のゲノムの改変のそれぞれの後に、植物体を再生するステップが続く。したがって、本発明は、
（ａ）上記に記載される植物細胞を形質転換するステップと、
（ｂ）（ａ）の植物細胞または（ａ）の植物細胞に由来する植物細胞から、少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列を導入遺伝子として含む少なくとも１つの植物細胞を含む植物体を再生するステップと
を含むトランスジェニック植物体を作製する方法を提供する。
【００５３】
さらに、本発明はまた、
（ａ）上記に記載される植物細胞のゲノムを改変するステップと、
（ｂ）（ａ）の植物細胞または（ａ）の植物細胞に由来する植物細胞から、少なくとも１つの細胞内にゲノムの改変または改変された植物細胞を含む植物体を再生するステップと
を含む、遺伝子改変された植物体を作製する方法を提供する。
【００５４】
再生技術は、ある植物ホルモンを組織培養生長培地中で操作することに依存し、所望の対象ヌクレオチド配列と一緒に導入することができる殺生物剤および／または除草剤マーカーに依存することもある。培養されたプロトプラストからの植物体再生は、Evans et al.,Protoplasts Isolation and Culture,Handbook of Plant Cell Culture,pp.124-176,MacMillilan Publishing Company,New York,1983;およびBinding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植片、プロトプラスト、未成熟胚もしくは成熟胚、胚組織、分裂組織、器官またはそれらの一部から得ることができる。そのような再生技術は、一般的に、Klee(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467486に記載されている。未成熟胚などのトランスジェニック組織から植物全体を得るために、それらを栄養素およびホルモンを含む一連の培地中で制御された環境条件下に生長させることができる（組織培養として知られているプロセス）。植物全体が発生し、種子が生成されると、子孫の評価が開始される。
【００５５】
本発明によれば、形質転換または遺伝子改変された植物細胞の再生能力を向上させることが可能なだけでなく、再生能力が低い他のタイプの感受性細胞の再生能力も向上させることができる。特に、未成熟の雄性配偶体または小胞子のような前駆体からの半数体植物胚の作製は、ＧＲＦ５によって改善することができる。
【００５６】
したがって、本発明の別の態様は、
（ａ１）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする（複数の）ｍＲＮＡもしくは（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットを未成熟な雄性配偶体内もしくは小胞子内に導入するステップ；または
（ａ２）ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを未成熟な雄性配偶体内もしくは小胞子内に誘導するステップと、
（ｂ）（ａ）の未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子を培養するステップであって、ここで、未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子内で、ＧＲＦ５ポリペプチドが、発現カセットから発現される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、導入された（複数の）ｍＲＮＡから翻訳される条件、ＧＲＦ５ポリペプチドが、内因性遺伝子から発現増強／増加される条件、または（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドが存在する条件、好ましくは、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードする（複数の）ｍＲＮＡもしくはＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットが、ステップ（ａ１）に従って導入されていない、もしくはＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現レベルの増強が、ステップ（ａ２）に従って誘導されていない野生型植物細胞もしくは植物細胞における量と比較して増強された量で存在する条件下で培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子に由来する半数体植物胚を選抜するステップと
を含む、半数体植物胚を作製する方法である。
【００５７】
本発明はまた、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたは（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットに半数体植物材料を曝露して半数体胚を作製し、次いで半数体胚を実生に変換（すなわち発芽）させることを含む、半数体実生を作製する方法も含む。したがって、本発明は、前述の方法に従って作製された実生を生長させることを含む、半数体植物体を作製する方法を含む。本発明はまた、ＧＲＦ５の存在下で半数体植物材料を一定期間培養し、自然発生的な染色体倍加を刺激または可能にし、二重半数体植物材料を実生、苗木または植物体に生長させることを含む、二重半数体植物体を作製する方法を提供する。ある実施形態では、半数体胚形成と染色体倍加とは、実質的に同時に起こり得る。他の実施形態では、半数体胚形成と染色体倍加との間に時間遅延があり得る。半数体の実生、植物体または小植物体の生長が自然発生的な染色体倍加イベントを万が一伴わない場合、化学的染色体倍加剤、例えばコルヒチンを使用してもよい。多くの手順において、植物細胞をコルヒチン、抗微小管剤もしくは抗微小管除草剤、例えばプロナミド、亜酸化窒素、または任意の有糸分裂阻害剤と接触させる必要がある。その結果、ホモ接合型の倍加半数体細胞が得られる。コルヒチンが使用される場合、培地中の濃度は、一般的に０．０１％〜０．２％であり得る。コルヒチン濃度の範囲は、約４００〜６００ｍｇ／Ｌであり得る。
【００５８】
小胞子が（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドに曝露されると、カルスが形成され、これは器官形成を経て胚を形成する。したがって、本発明は、（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドに未成熟の雄性配偶体もしくは小胞子を曝露すること、またはＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくは（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットを未成熟の雄性配偶体内もしくは小胞子内に導入することを含む、半数体植物カルスを作製する方法を含む。
【００５９】
培養ステップ中の未成熟の雄性配偶体または小胞子のＧＲＦ５への曝露は、好ましくは、半数体胚形成を誘導するのに十分な時間にわたって行われる。必要とされる期間は、該当する植物体の種に依存する可能性があり、これらはすべて当業者によって容易に確かめられる。ＧＲＦ５曝露の好ましい範囲は、約１〜約２０時間であり、より好ましくは、約２〜約２０時間である。
【００６０】
本発明のある態様では、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたは（複数の）ＧＲＦ５ポリペプチドを含む発現カセットの導入に先だって、物理的ストレスが半数体植物材料に適用される。物理的ストレスは、例えば、温度、暗闇、光または電離放射線、飢餓もしくは浸透圧ストレスのいずれであってもよい。光は、フルスペクトルの太陽光、または可視スペクトル、赤外線スペクトルもしくはＵＶスペクトルから選択される１つ以上の周波数であってもよい。ストレスは、連続的または断続的（周期的）；規則的または経時的にランダムであってもよい。
【００６１】
本発明は、単子葉植物体でも双子葉植物体でも、あらゆる植物種に適用可能である。好ましくは、本発明の方法および使用に供され得る植物体は、オオムギ属(Hordeum)、モロコシ属(Sorghum)、サトウキビ属(Saccharum)、トウモロコシ属(Zea)、セタリア属(Setaria)、イネ属(Oryza)、コムギ属(Triticum)、ライムギ属(Secale)、ライコムギ属(Triticale)、リンゴ属(Malus)、ミナトカモジグサ属(Brachypodium)、エギロプス属(Aegilops)、ニンジン属(Daucus)、フダンソウ属(Beta)、ユーカリ属(Eucalyptus)、タバコ属(Nicotiana)、ナス属(Solanum)、コーヒーノキ属(Coffea)、ビチス属(Vitis)、ミゾホオズキ属(Erythrante)、ゲンリセア属(Genlisea)、キュウリ属(Cucumis)、セネシオ属(Marus)、ナズナ属(Arabidopsis)、クルシヒマラヤ属(Crucihimalaya)、タケツケバナ属(Cardamine)、マメグンバイナズナ属(Lepidium)、ナズナ属(Capsella)、オリマラビドプシス属(Olimarabidopsis)、アラビス属(Arabis)、アブラナ属(Brassica)、ルッコラ属(Eruca)、ダイコン属(Raphanus)、ミカン属(Citrus)、ナンヨウアブラギリ属(Jatropha)、ポプラ属(Populus)、ウマゴヤシ属(Medicago)、ヒヨコマメ属(Cicer)、キマメ属(Cajanus)、インゲンマメ属(Phaseolus)、ダイズ属(Glycine)、ワタ属(Gossypium)、ゲンゲ属(Astragalus)、ミヤコグサ属(Lotus)、ツルウリクサ属(Torenia)、ネギ属(Allium)またはヒマワリ属(Helianthus)からなる群から選択される属の植物である。より好ましくは、植物体は、オオムギ(Hordeum vulgare)、ホルデウム・バルボーサム(Hordeum bulbusom)、モロコシ(Sorghum bicolor)、サッカルム・オフィシナルム(Saccharum officinarium)、トウモロコシ(Zea mays)を含むトウモロコシ種(Zea spp.)、セタリア・イタリカ(Setaria italica)、オリザ・ミヌタ(Oryza minuta)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、オリザ・アウストラリエンシス(Oryza australiensis)、オリザ・アルタ(Oryza alta)、コムギ(Triticum aestivum)、トリティクム・ドゥルム(Triticum durum)、ライムギ(Secale cereale)、トリティカーレ(Triticale)、マルス・ドメスティカ(Malus domestica)、ミナトカモジグサ(Brachypodium distachyon)、ホルデウム・マリナム(Hordeum marinum)、アエギロプス・タウシィ(Aegilops tauschii)、ゴウシュウヤブジラミ(Daucus glochidiatus)、サトウダイコン(Beta vulgaris)を含むビート種(Beta spp.)、ゴウシュウヤブジラミ(Daucus pusillus)、ダウクス・ムリカツス(Daucus muricatus)、ノラニンジン(Daucus carota)、ユーカリプタス・グランディス(Eucalyptus grandis)、ニコチアナ・シルベストリス(Nicotiana sylvestris)、ニコチアナ・トメントシフォルミス(Nicotiana tomentosiformis)、タバコ(Nicotiana tabacum)、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、トマト(Solanum lycopersicum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ロブスタコーヒーノキ(Coffea canephora)、ブドウ(Vitis vinifera)、エリスランテ・グタタ(Erythrante guttata)、ゲンセリア・アウレア(Genlisea aurea)、キュウリ(Cucumis sativus)、マルバグワ(Marus notabilis)、アラビドプシス・アレノサ(Arabidopsis arenosa)、アラビドプシス・リラタ(Arabidopsis lyrata)、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)、クルシヒマラヤ・ヒマライカ(Crucihimalaya himalaica)、クルシヒマラヤ・ワリチイ(Crucihimalaya wallichii)、タネツケバナ(Cardamine nexuosa)、マメグンバイナズナ(Lepidium virginicum)、ナズナ(Capsella bursa pastoris)、オリマラビドプシス・プミラ(Olmarabidopsis pumila)、ヤマハタザオ(Arabis hirsute)、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、ブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea)、ブラシカ・ラパ(Brassica rapa)、ダイコン(Raphanus sativus)、ブラシカ・ユンカセア(Brassica juncacea)、ブラシカ・ニグラ(Brassica nigra)、ルッコラ(Eruca vesicaria subsp.sativa)、オレンジ(Citrus sinensis)、ナンヨウアブラギリ(Jatropha curcas)、ブラックコットンウッド(Populus trichocarpa)、タルウマゴヤシ(Medicago truncatula)、シセル・ヤマシタ(Cicer yamashitae)、シセル・ビユグム(Cicer bijugum)、ヒヨコマメ(Cicer arietinum)、シセル・レチクラツム(Cicer reticulatum)、シセル・ユダイクム(Cicer judaicum)、カヤヌス・カヤニフォリウス(Cajanus cajanifolius)、ビロードヒメクズ(Cajanus scarabaeoides)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)、ダイズ(Glycine max)、ワタ(Gossypium sp.)、ゲンゲ(Astragalus sinicus)、ミヤコグサ(Lotus japonicas)、ハナウリクサ(Torenia fournieri)、タマネギ(Allium cepa)、ネギ(Allium fistulosum)、ニンニク(Allium sativum)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、キクイモ(Helianthus tuberosus)および／またはニラ(Allium tuberosum)からなる群から選択される。特に好ましいのは、サトウダイコン(Beta vulgaris)、トウモロコシ(Zea mays)、コムギ(Triticum aestivum)、オオムギ(Hordeum vulgare)、ライムギ(Secale cereale)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、モロコシ(Sorghum bicolor)、ブラシカ・ラパ(Brassica rapa)、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、ブラシカ・ユンカセア(Brassica juncacea)、ブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea)、ダイコン(Raphanus sativus)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ダイズ(Glycine max)および／またはワタ(Gossypium sp.)である。
【００６２】
本発明による適切な植物細胞は、特にカルス組織、好ましくは砕けやすいカルス、分裂組織、生殖組織（例えば小胞子）または胚組織の細胞ならびにプロトプラストである。
【００６３】
植物体の部分または複数の部分が、無傷の植物全体に付着していてもよいし、それとは分離していてもよい。植物体のそのような部分として、植物体の器官、組織および細胞、好ましくは種子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明の主題はまた、上記の方法によって得られるかまたは得ることができる植物である。したがって、本発明の一実施形態は、植物細胞を形質転換し、前記細胞から植物体を再生する上記の方法によって得られるかまたは得ることができるトランスジェニック植物、ならびにその子孫または部分であり、ここで、子孫または部分は、少なくとも１つの対象ヌクレオチド配列を導入遺伝子として含む。本発明の別の実施形態は、植物細胞のゲノムを改変し、前記細胞から植物体を再生する上記の方法によって得られるかまたは得ることができる遺伝子改変されたトランスジェニック植物、ならびにその子孫または部分であり、ここで、子孫または部分は、上記の改変方法によって導入されたゲノム内の改変を含む。
【００６５】
本発明の更なる主題は、上記のトランスジェニック植物体もしくは遺伝子改変された植物体に由来する植物細胞または種子である。そのような植物細胞は、好ましくは、一過的または安定的に組み込まれたＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）誘導酵素を含み、これは好ましくは前記細胞のゲノム内の所定の部位および任意選択的に修復核酸分子を認識する。ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、植物細胞がＧＲＦ５ポリペプチドを発現することができるように、適切な調節配列に操作可能に連結されている。調節配列とは、例えば、通常そのコード配列の上流（５’）にあるヌクレオチド配列を指す「プロモーター」を意味し、これはＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写に必要な他の因子の認識を提供することによってコード配列の発現を制御する。「構成的プロモーター」とは、ほぼすべての組織で常に遺伝子発現を誘導するプロモーターを指す。構成的プロモーターの例として、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、二重ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（７０Ｓプロモーター）、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター、ＢｄＥＦ１プロモーター、またはＰｃＵｂｉ４もしくはＺｍＵｂｉ１のようなユビキチンプロモーターが挙げられる。「調節されたプロモーター」とは、構成的にではなく、時間的および／または空間的に調節された方法で遺伝子発現を誘導するプロモーターを指し、組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方を含む。それは、天然配列および合成配列、ならびに合成配列と天然配列との組合せであり得る配列を含む。異なるプロモーターは、異なる組織型もしくは細胞型において、または異なる発育段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を誘導することができる。植物細胞内で有用な様々なタイプの新しいプロモーターが絶えず発見されており、当業者には周知である。「組織特異的プロモーター」とは、すべての植物細胞内で発現するのではなく、特定の器官（例えば葉もしくは種子）、特定の組織（例えば胚もしくは子葉）または特定の細胞型（例えば葉の柔組織もしくは種子貯蔵細胞）の１つ以上の細胞型内でのみ発現する調節されたプロモーターを指す。これらにはまた、発育中の種子もしくは果実における果実の成熟期、完全に分化した葉の中、または老化の開始時に一時的に調節される（例えば初期胚発生もしくは後期胚発生）プロモーターも含まれる。「誘導性プロモーター」とは、外部刺激（例えば、化学物質、光、ホルモン、ストレスまたは病原体）によって１つ以上の細胞型においてオンにすることができる調節されたプロモーターを指す。誘導性プロモーターの例として、エクジソン、デキサメタゾン、エタノールによって誘導可能なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、当業者には周知である(例えば、Samalova et al.(2005).pOp6/LhGR:a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.The Plant Journal,41(6),919-935; Gatz & Lenk(1998).Promoters that respond to chemical inducers.Trends in Plant Science,3(9),352-358.)。
【００６６】
本発明の更なる主題は、本発明の方法によって得られるかまたは得ることができる半数体植物胚である。
【００６７】
本発明の別の主題は、一過的または安定的に組み込まれたＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、好ましくは前記細胞のゲノム内の所定の部位を認識する二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）誘導酵素と、任意選択的に修復核酸分子とを含む触媒細胞であって、ここで、好ましくは、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、植物細胞がＧＲＦ５ポリペプチドを発現することができるように、適切な調節配列に操作可能に連結されている。そのような植物細胞は、植物細胞のゲノムを改変する上記の方法を行った場合に得ることができる。
【００６８】
本発明の更なる態様は、植物細胞の形質転換方法における、好ましくは上記のような形質転換方法における、植物細胞のゲノムを改変する方法における、好ましくは上記のようなゲノムを改変する方法における、植物もしくは半数体植物の胚を作製する方法における、好ましくは上記のように植物もしくは半数体植物の胚を作製する方法における、または植物体を再生する方法における、好ましくは上記のように植物体を再生する方法における、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＧＲＦ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＧＲＦ５ポリペプチド、またはＧＲＦ５ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現のアクチベーターの使用である。
【００６９】
実施例に別段の記載がない限り、すべての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NYおよびAusubel et al.(1994) Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USAの第１巻および第２巻に記載されている標準的なプロトコルに従って行われる。植物分子作用のための標準材料および方法は、R.D.D.Cray著Plant Molecular Biology Labfax (1993)(BIOS Scientific Publications Ltd (UK)およびBlackwell Scientific Publications,UKによる共同出版)に記載されている。標準的な分子生物学的手法のための他の参考文献として、Sambrook and Russell(2001) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,Brown (1998) Molecular Biology LabFax,Second Edition,Academic Press(UK) の第１巻および第２巻が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応のための標準的な材料および方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Pressおよび McPherson at al.(2000)PCR - Basics:From Background to Bench,First Edition,Springer Verlag,Germanyに見出すことができる。
【００７０】
本明細書で参照または引用されているすべての特許、特許出願、および出版物または公開情報（インターネット上の出版物を含む）は、その全体が参照により援用される。
【００７１】
本明細書に記載される以下の図面および実施例を参照して、本発明をさらに説明する。しかしながら、本発明はそのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】各選抜ステップ（Ｓ１〜Ｓ４）における発育中のシュートの総数を示す図である。対照コンストラクトｐＺＦＮ−ｔｄＴ−ｎｐｔＩＩまたはｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５のいずれかを用いて行った５つの独立した形質転換実験から得られたデータ（表３を比較）。
【図２】対照実験（Ａ）およびｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５を用いて行われた実験（Ｂ）における１４個の独立して形質転換されたカルスの選抜ステップ３（Ｓ３）の開始時のシュートの再生を示す図である。矢印は発育中のシュートを示す。２．１の方法に従って実験を行った。
【図３】ｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５（Ａ）および対照プラスミドｐＡＢＭ７０Ｓ−ＴｕｒｂｏＹＦＰ（Ｂ）で弾丸導入後１０日目のテンサイカルス内でのシュートの再生を示す図である。カルスをｐＵｂｉ４−ｔＤＴプラスミドと一緒に弾丸導入することで、赤色蛍光によって一過性の発現レベルを制御した。２．２の方法に従って実験を行った。３個の独立して弾丸導入されたカルスが示されている。
【図４】１１の独立したテンサイトランスジェニックイベントにおけるＧＲＦ５の発現レベルを示す図である。
【図５Ａ】１６種類の異なる植物種に由来するＧＲＦ５ポリペプチドの配列の配列比較およびＧＲＦ５特異的指標モチーフ（配列番号１７７）の推定を示す図である；示されるＧＲＦ５ポリペプチドの配列の部分配列が、配列番号１７８〜２０６に記載される。
【図５Ｂ】最大１０個のミスマッチを許容する、１６種類の異なる植物種に由来する完全なタンパク質配列の配列アラインメント／比較によるモチーフ解析を示す図である。「開始」および「停止」の列は、指標モチーフに対応するＧＲＦ５ポリペプチドの配列断片の開始および終了位置を示す；「ミスマッチ」の列は、それぞれのＧＲＦ５ポリペプチドと指標モチーフとの間のミスマッチの数を示す；示されているＧＲＦ５ポリペプチドの配列の部分配列は、配列番号１７８〜１８４および配列番号１８６〜２０６に記載される。ＡｔＧＲＦ１＿ＡＴ２Ｇ２２８４０．１（配列番号３３）；ＡｔＧＲＦ２＿ＡＴ４Ｇ３７７４０．１（配列番号３４）；ＡｔＧＲＦ３＿ＡＴ２Ｇ３６４００．１（配列番号３５）；ＡｔＧＲＦ４＿ＡＴ３Ｇ５２９１０．１（配列番号３６）；ＡｔＧＲＦ６＿ＡＴ２Ｇ０６２００．１（配列番号３７）；ＡｔＧＲＦ７＿ＡＴ５Ｇ５３６６０．１（配列番号３８）；ＡｔＧＲＦ８＿ＡＴ４Ｇ２４１５０．１（配列番号３９）；ＡｔＧＲＦ９＿ＡＴ２Ｇ４５４８０．１（配列番号４０）。
【図６】対照コンストラクト７０Ｓ：：ｔｄＴ、ＡｔＧＲＦ５を過剰発現するコンストラクト（ｃＤＮＡ−配列番号１；アミノ酸配列−配列番号２）、およびテンサイＧＲＦ５のオルソログであるＢｖＧＲＦ５（合成ＤＮＡ−配列番号２０７；アミノ酸配列−配列番号４）を用いて得られたテンサイ内での形質転換頻度を示す図である。
【図７】ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔＤＴ）（対照）およびＡｔＧＲＦ５（ｃＤＮＡ−配列番号１；アミノ酸配列−配列番号２）のいずれかを過剰発現するコンストラクトを使用した形質転換実験において得られた、接種されたテンサイカルス１個当たりのトランスジェニックシュートの本数。
【図８】対照コンストラクト７０Ｓ−ｔＤＴ（対照）およびＡｔＧＲＦ５（７０Ｓ−ＧＲＦ５）を過剰発現するコンストラクトのいずれかを用いた形質転換実験から得られたテンサイカルス１個当たりのトランスジェニックシュートの平均数を示す図である。２つの抵抗性遺伝子型ＡおよびＢを使用した。遺伝子型Ａのシュートを再生する抵抗性レベルは非常に高いが、遺伝子型ＢはＡよりも穏やかな抵抗性を示している。
【図９】テンサイ内でＡｔＧＲＦ５を過剰発現するトランスジェニック系統のカルス再生実験を示す図である。カルス形成頻度（Ａ）およびシュート再生頻度（Ｂ）は、Kischenko et al.,2005に記載されるカルス誘導培地およびシュート再生培地を使用してスコア化した（例１も参照）。ＡｔＧＲＦ５を過剰発現する計５つの独立したイベントをアッセイした（ＡｔＧＲＦ５−３６、ＡｔＧＲＦ５−４１、ＡｔＧＲＦ５−１４、ＡｔＧＲＦ５−９４、ＡｔＧＲＦ５−５０）。対照として、非トランスジェニックテンサイシュート（ＷＴ１およびＷＴ２）ならびにｔＤＴレポータータンパク質（ｔＤＴ−イベント）を過剰発現するトランスジェニックシュートを使用した。ＡｔＧＲＦ５の発現レベルは、アッセイで使用されたＧＲＦ５トランスジェニックイベントから切り離されたサンプルのｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（Ｃ）。
【図１０】対照コンストラクト７０Ｓ：：ｔＤＴ、またはＡｔＧＲＦ５を過剰発現するコンストラクト（ｃＤＮＡ−配列番号１；アミノ酸配列−配列番号２）、２つのＧＲＦ５トウモロコシオルソログ［ＺｍＧＲＦ５バージョンＡ（合成ＤＮＡ−配列番号２０８；アミノ酸配列−配列番号）およびＺｍＧＲＦ５バージョンＢ（合成ＤＮＡ−配列番号２１０；アミノ酸配列−配列番号１１２）］のいずれかを用いた、トウモロコシ内での形質転換頻度を示す図である。形質転換効率は、トランスジェニックイベントの数を接種された未成熟胚の数で割ったものとして計算した。
【図１１】形質転換後２１日目のダイズ外植片上でのシュート発育およびＤｓＲｅｄ蛍光を示す図である。ＤｓＲｅｄ対照、ＡｔＧＲＦ５およびＧｍＧＲＦ５からの外植片の代表的な写真は、（Ａ）一次節におけるシュート発育および（Ｂ）シュートのＤｓＲｅｄ蛍光を示している。ＤｓＲｅｄの写真は、複数の写真を合成したものであり、方向付けのためにおおよその位置に配置している。
【図１２】「良好な」シュート生長の形成が、選抜の１６日目〜２２日目にかけて急速に増加し続けた。３つのコンストラクトを用いて形質転換された外植片の選抜時にシュートの急速な生長を強調するために、外植片の割合を２つの時点でスコア化した。
【図１３】ＧＲＦ５バリアントの有無にかかわらず形質転換されたダイズ外植片のシュート形成を示す図である。１回の繰り返しにより上面から撮った写真と側面から撮った写真を、３つの処理（コンストラクト）について示している。ＡｔＧＲＦ５（中央のパネル）およびＧｍＧＲＦ５（下のパネル）を用いて形質転換された外植片では、ＤｓＲｅｄ対照（上のパネル）と比較してシュートの生長がより顕著である。
【図１４】ＡｔＧＲＦ５またはＧｍＧＲＦ５のいずれかを用いて形質転換された外植片におけるトランスジェニックシュートの再生の有意な増加を、選抜の１６日目と２２日目に可視化した箱ひげ図を示す。
【図１５】形質転換後２１日目のキャノーラ外植片上でのシュート発育およびＤｓＲｅｄ蛍光を示す図である。ＤｓＲｅｄ対照、ＡｔＧＲＦ５およびＢｎＧＲＦ５からの外植片の代表的な写真は、（Ａ）胚軸切片におけるカルスの発育および（Ｂ）外植片上のＤｓＲｅｄ蛍光を示している。
【図１６】ＡｔＧＲＦ５、ＢｎＧＲＦ５およびＤｓＲｅｄ対照を用いて形質転換された５つのセイヨウアブラナ(Brassica napus)実験全体でＤｓＲｅｄを発現する外植片の割合を、箱ひげ図で描写している図である。ＤｓＲｅｄを発現する外植片の割合は、ＡｔＧＲＦ５およびＢｎＧＲＦ５の方が対照コンストラクトと比較して有意に高く、平均で３倍近く増加する。
【図１７】テンサイカルスと対照コンストラクト７０Ｓ−ｔＤＴおよび７０Ｓ−ＡｔＧＲＦ５との共形質転換を示す図である。共形質転換実験におけるカルスの接種は、各コンストラクトを個別に含むアグロバクテリウム株の１：１混合物を用いて行った。
【００７３】
実施例
１．サトウダイコン(Beta vulgaris)の実験
バイナリープラスミドの作製：
バイナリーベクターｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５を、標準的なクローニング手順に従って作製した。このベクターのＴ−ＤＮＡ内に、ＧＲＦ５（Ａｔ３ｇ１３９６０）をコードするｃＤＮＡを、ＧＲＦ５タンパク質の高い異所性発現レベルを確保するための二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素（ＮＯＳ）ターミネーターとの間でクローニングした。Ｔ−ＤＮＡはまた、カナマイシンまたはパロモマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質の範囲に対して耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子を含み、トランスジェニック植物細胞および組織の選抜に使用した。ＮＯＳプロモーターとｐＡＧ７ターミネーターとがｎｐｔＩＩ遺伝子に隣接する。バイナリーベクターのバックボーンは、大腸菌およびアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)におけるプラスミド複製のためのｃｏｌＥ１およびｐＶＳ１それぞれの起点；ならびに細菌選抜のためのストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性を付与するａａｄＡ遺伝子を含む。ｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５プラスミドを、標準的な手順でＡＧＬ−１  アグロバクテリウム株に形質転換した。
【００７４】
マイクロプロパゲーションされたシュートの形質転換：
テンサイのシュートを異なる方法で形質転換した：
ａ）Kischenko et al.,2005 Cell Biology Internationalに基づくアグロバクテリウム媒介形質転換：
１．遺伝子型Ｓ７０６のマイクロプロパゲーションされたシュートを出発原料として使用した。３０ｇ／ｌのスクロースおよび０．２５ｍｇ／ｌのベンジルアデニン（ＢＡＰ）を補充したＭＳ塩中でシュートを増殖させた。
２．砕けやすいカルスを誘導するために、１５ｇ／ｌのスクロースおよび２ｍｇ／ｌのＢＡＰを含むＭＳ塩中で数週間にわたり約３０℃で培養した。
３．砕けやすいカルスを収穫した。
４．ベクターｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５を含むアグロバクテリウムＡＧＬ−１を、適切な抗生物質を補充した適切な培地中で増殖させた。
５．カルスにアグロバクテリウム懸濁液を接種した。カルス組織とアグロバクテリウムとの共培養は、４４０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７０ｍｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１９００ｍｇ／ｌのＫＮＯ３、３７０ｍｇ／ｌのＭｇＳＯ４、１６５０ｍｇ／ｌのＮＨ４ＮＯ３、２ｍｇ／ｌのＢＡＰ、４０μｇ／ｌのアセトシリンゴン、２０ｇ／ｌのスクロースおよび２ｇ／ｌのグルコースを含む培地中で少なくとも２日間行った。
６．カルスを、３０ｇ／ｌのスクロース、１ｍｇ／ｌのＧＡ３、１ｍｇ／ｌのＴＤＺおよび５００ｍｇ／ｌのチメンチンを補充したＭＳ塩に継代培養し、暗所で約１週間インキュベートした。
７．トランスジェニック細胞の選抜のために、カルスを、１００ｍｇ／ｌのパロマイシンを補充したステップ６の培地に移し、明所で数週間インキュベートした。
８．トランスジェニックカルスを選抜し、同じ培地および条件で数回継代培養した。
９．再生シュートを単離し、３０ｇ／ｌのスクロース、０．２５ｍｇ／ｌのＢＡＰおよび１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＳ塩中で増殖させた。
１０．緑色のシュートを、３０ｇ／ｌのスクロース、０．１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、２５０ｍｇ／ｌのチメンチンおよび２００ｍｇ／ｌのパロマイシンを補充したＭＳ塩に移して選抜段階を終了し、この培地中で数回定期的に繁殖させた。
１１．ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ解析のために、緑色に生長するシュートから葉を単離し、想定される形質転換系統の確認を行った。
１２．選抜されたシュートを、０．５ｍｇ／ｌのＩＢＡ、１００ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび１０ｍｇ／ｌのＰＰＴを補充したＭＳ塩で発根させ、種子作製のために温室に移した。
【００７５】
ｂ）テンサイカルスのパーティクル・ガン法
１．２．１の方法の箇所で先に記載したように、砕けやすいカルスを作製した。
２．浸透圧処理を数時間行った。
３．金粒子の調製およびＤＮＡコーティングを、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ取扱説明書に記載されているように、標準的な手順で行った。プラスミドｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５およびｐＵｂｉ４−ｔＤＴ（赤色蛍光レポーターを含む）を金粒子と共沈させた。対照として、金粒子をｐＵｂｉ４ｔＤＴおよびｐＡＢＭ７０ＳＴｕｒｂｏＹＦＰ（黄色蛍光レポーターを含む）でコーティングした。
４．カルスを、１ショットあたり５００ｎｇのＤＮＡでコーティングされた３０ｎｇの金粒子を用いて、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅユニット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により弾丸導入した。
５．シュート再生頻度におけるＧＲＦ５の一過性発現の影響を評価するために、弾丸導入されたカルスを、３０ｇ／ｌのスクロース、１ｍｇ／ｌのＧＡ３および１ｍｇ／ｌのチジアズロンを補充したＭＳ塩中で約２週間にわたり光条件においてインキュベートした。シュート数は標準的な双眼鏡を用いてスコア化した。
【００７６】
結果：
コンストラクトｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５を用いたテンサイのマイクロプロパゲーションされたシュートに由来するカルスのアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換は、選抜ステップの終了時における再生されたシュートの本数を有意に増加させる（表２）。対照として、赤色蛍光レポーターを含むコンストラクトｐＺＦＮ−ｔｄＴ−ｎｐｔＩＩ（対照）を使用した。５つの独立した実験は、５．０％から３３．９％への平均的な形質転換頻度の増加を示す。さらに、ＰＣＲで確認されたトランスジェニックイベントの数は、１回の形質転換実験当たり平均４．８のイベントから２５．４のイベントへと増加した。
【００７７】
【表２】
2021510069.tif 000004
【００７８】
カルス形質転換実験では、個々の選抜ステップごとのシュートの再生も測定した。各選抜ステップにおけるシュートの再生量の定量化により、テンサイカルス内でのＧＲＦ５の過剰発現がシュートの器官形成を促進することがわかる（表３、図１および２）。別のカルス形質転換実験では、２つの抵抗性テンサイ遺伝子型についてシュートの再生を測定した（図８）。コンストラクトｐＺＦＮ−ｔｄＴ−ｎｐｔＩＩ（対照）を用いた形質転換の結果、遺伝子型Ａではトランスジェニックシュートは得られず、遺伝子型Ｂではカルス１個当たり平均０．３本のシュートのみが得られた。ＡｔＧＲＦ５過剰発現を７０Ｓプロモーター下で使用することにより、トランスジェニックシュートの平均本数が遺伝子型Ａでは０本から１．６７本まで増加し、遺伝子型Ｂでは０．３本から４．８２本までシュート数が増加する。これはＡｔＧＲＦ５のポテンシャルを印象的に明示しており、標準的な形質転換法による遺伝子型に依存せず作用する可能性を切り開くものである。
【００７９】
更なる実験では、サトウダイコンカルス(Beta vulgaris calli)内でＡｔＧＲＦ５を過剰発現するためのコンストラクトを使用することにより、接種されたカルス１個当たりのトランスジェニックイベントの数を９倍に増やせることが実証された（図９）。対照として、赤色蛍光レポーターを含むコンストラクトｐＺＦＮ−ｔｄＴ−ｎｐｔＩＩ（対照）を使用した。ＧＲＦ遺伝子およびレポーター遺伝子は、構成的７０Ｓプロモーター（カリフラワーモザイクウイルスに由来する二重増強構成的３５Ｓプロモーター）の制御下にあった。
【００８０】
ＧＲＦ５の発現レベルは、テンサイのランダムに選抜された１１の独立したトランスジェニックイベントにおいて決定された。発現解析は、ＮＯＳターミネーターの３’−ＵＴＲに結合するプライマーを用いて行った。解析されたすべてのトランスジェニックイベントにおいて、高レベルのＧＲＦ５発現が検出された（図４参照）。
【００８１】
【表３】
2021510069.tif 000005
【００８２】
更なるカルス再生実験では、テンサイ内でＡｔＧＲＦ５を過剰発現する５つの異なるトランスジェニックイベントを解析した。対照として、一方では２つの非トランスジェニックテンサイ系統（ＷＴ１およびＷＴ２）と、他方ではｔｄＴレポータータンパク質を過剰発現するトランスジェニック系統を使用した。図９Ａは、対照系統およびトランスジェニックＡｔＧＲＦ５イベントにおける平均カルス形成頻度がほぼ同等であり、おそらくトランスジェニックイベントではわずかに増強されたことを示している。図９Ｂでは、トランスジェニックシュートの平均数が示されている。５つのＡｔＧＲＦ５イベントのうちの４つは、２つの対照と比較してシュート形成に有意な増加を示している。図９Ｃからは、シュート形成に及ぼす好ましい効果が、トランスジェニックイベントにおけるＡｔＧＲＦ５の発現レベルに関係していることが明らかになる。
【００８３】
対照コンストラクト７０Ｓ−ｔＤＴと７０Ｓ−ＡｔＧＲＦ５との共形質転換実験では、テンサイカルス細胞のゲノム内に安定的に組み込まれていた。共形質転換実験におけるカルスの接種は、各コンストラクトを個別に含むアグロバクテリウム株の１：１混合物を用いて行った。共形質転換頻度の平均は３１．５％であった。図１７に示されるように、赤色蛍光（ｔＤＴ陽性）イベントの数は、共形質転換実験の方が単一形質転換実験よりも約８倍多い。
【００８４】
２．２の方法によるパーティクル・ガン法による形質転換の結果、ＧＲＦ５の一過性（過剰）発現であっても形質転換頻度が有意に増加することがわかった。弾丸導入されたカルスは、再生能力の向上を示す。図３からは、コンストラクトｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＧＲＦ５を用いてバイオリスティックに形質転換されたカルスが、対照コンストラクトによるカルスと比較して再生シュート本数の増加を示していることがわかる。
【００８５】
追加のカルス形質転換実験では、テンサイ内の形質転換頻度は、同じコンストラクトと比較してコンストラクトｐＺＦＮ−ｎｐｔＩＩ−ＡｔＧＲＦ５を使用するが、サトウダイコン(Beta vulgaris)（ＢｖＧＲＦ５）に由来するＧＲＦホモログも発現させて決定した。対照として、赤色蛍光レポーターを含むコンストラクトｐＺＦＮ−ｔｄＴ−ｎｐｔＩＩ（対照）を使用した。ＧＲＦ遺伝子およびレポーター遺伝子は、構成的７０Ｓプロモーターの制御下にあった。図６に示される実験は、初期の選抜段階で停止した。これは、ｔＤＴコンストラクトの形質転換効率が０％である理由を説明している。コンストラクトＡｔＧＲＦ５では７０％の平均形質転換頻度を、コンストラクトＢｖＧＲＦ５では３２．５％の平均形質転換頻度を達成することができた。
【００８６】
２．オリザ・サティバ(Oryza sativa)の実験
バイナリープラスミドで使用したコンストラクト：
バイナリーベクターは、標準的なクローニング手順で作製した。このベクターのＴ−ＤＮＡ内に、ＧＲＦ５（Ａｔ３ｇ１３９６０）をコードするｃＤＮＡを、イネにおけるＧＲＦ５タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保するための適切なプロモーターとターミネーターとの間でクローニングした（＝単一コンストラクト）。Ｔ−ＤＮＡには、トランスジェニック植物細胞および組織の選抜に使用したＧＦＰ遺伝子も含まれている。さらに、イネにおけるＧＲＦ５タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーターとターミネーターとを含むＧＲＦ５（Ａｔ３ｇ１３９６０）をコードするｃＤＮＡに加えて、プロモーターおよびターミネーターの制御下にある更なる対象遺伝子を運ぶバイナリーベクターを作製した（＝二重（スタック）コンストラクト）。
【００８７】
種子の殺菌および播種：
野生型の緑色の種子を７０％エタノール中でインキュベートし、約１分間振とうした。エタノールの除去後、種子を滅菌ｍＱ水で１回洗浄した。次に、３０ｍｌの６％次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え、種子を４０〜６０分間振とうした。次亜塩素酸ナトリウム溶液の除去後、種子を滅菌ｍＱで３〜５回洗浄した。
【００８８】
滅菌終了後（０〜３時間）、種子を滅菌ろ紙で乾燥し、誘導培地Ｒ００１の表面上に置床した。インキュベーションは、３２℃の連続光（３０００ルクス）の下で６日間にわたり行った。
【００８９】
形質転換および共培養：
外植片の準備のために、形質転換に適した野生型種子からの膨らんだ胚（胚盤に由来するカルス）を選抜し、植物細胞に１．５分間組み込んだプラスミドで形質転換されたアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を含む液体感染培地（Ｒ００２）に移し、次いで共培養プレート（Ｒ００３）に移した。プレートを暗所で２５℃にて３日間インキュベートした。
【００９０】
耐性組織の選抜：
共培養から３日後、カルスを種子から取り出し、滅菌ｍＱ水で数回洗浄し、２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシムを含む滅菌ｍＱ水で１回洗浄し、Ｒ００４選抜培地に移した。インキュベーションは、３２℃の連続光（３０００ルクス）の下で２週間にわたり行った。
【００９１】
マイクロカルスの単離および再生：
滅菌鉗子を使用して、マイクロカルスをＲ００５に移し、３２℃の連続光（３０００ルクス）の下で１週間にわたりインキュベートした。その後、選抜マーカーとして使用したＧＦＰを暗室で確認した。ＧＦＰ陽性の健康なカルスをＲ００６に移し、さらに３２℃の連続光（３０００ルクス）の下で１週間にわたりインキュベーションした。連続的な再生のために、カルスをＲ００７に移し、３２℃の連続光（３０００ルクス）の下で３週間にわたりインキュベーションした。滅菌鉗子を用いて、健康な苗木を引き出し、Ｒ００８に移し、３２℃の連続光（３０００ルクス）の下で２週間にわたりインキュベーションしてから、苗木を温室に搬入した。
【００９２】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【００９３】
結果：
ＧＲＦ５を含む異なるコンストラクトを有するイネの未成熟胚に由来するアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換は、平均形質転換頻度の有意な増加につながる。対照として、または比較として、ＧＲＦ５なしのランダムに選抜された２８の他のコンストラクトについて観察された形質転換効率は、６３％の平均形質転換効率を示すものを使用した。「単一」コンストラクトの場合、形質転換効率は平均して６３％から７８％へと増加し、「二重」コンストラクトの場合でも６３％から８４％へと増加し得た（表５）。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
３．トウモロコシ(Zea mays)の実験
バイナープラスミド内で使用したコンストラクト：
バイナリーベクターは、標準的なクローニング手順で作製した。これらのベクターのＴ−ＤＮＡ内に、ａ）ＡｔＧＲＦ５をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）、ｂ）ＺｍＧＲＦ５（バージョンＡ）をコードする合成ＤＮＡ（配列番号２０８）、およびｃ）ＺｍＧＲＦ５（バージョンＢ）をコードする合成ＤＮＡ（配列番号２１０）を、トウモロコシにおけるＧＲＦ５タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーター（例えば、ＢｄＥＦ１プロモーター）とターミネーターとの間でクローニングした。対照として、ＺｍＵｂｉイントロンを有する７０Ｓプロモーターの制御下にあるｔＤＴレポーター遺伝子を含むコンストラクトを使用した。
【００９６】
形質転換：
アグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換は、未成熟胚の胚盤を使用することによって単子葉植物体を形質転換する標準的な方法で行われてきた（例えば、国際公開第９５／０６７２２２号）。
【００９７】
結果：
図１０に示されるように、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)に由来するＧＲＦを含むコンストラクトを有する未成熟胚のアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換は、８％から１４％への平均形質転換頻度の有意な増加につながる。これに対して、異なるトウモロコシ(Zea mays)遺伝子型に由来するＺｍＧＲＦ５の両方のバージョンを使用することで、形質転換効率はより強力に増大した。バージョンＡのＺｍＧＲＦ５では８％から５２％へと、バージョンＢのＺｍＧＲＦ５では８％から４８％へと形質転換効率が増加した。
【００９８】
４．Glycine max（ダイズ）の実験
ダイズの形質転換：
Glycine max（ダイズ）の形質転換を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を用いて、栽培品種「Ｊａｋｅ」のダイズ実生の一次節に位置する上胚軸の腋芽分裂組織細胞にＴ−ＤＮＡを送達するために行った(Olhoft P.M.,Bernal L.M.,Grist L.B.,Hill D.S.,Mankin S.L.,Shen Y.,Kalogerakis M.,Wiley H.,Toren E.,Song H.-S.,Hillebrand H.,and Jones T.2007,A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 43:536-549;米国特許出願公開第2014237688号明細書、国際公開第2006024509号、国際公開第2005121345号に記載)。
【００９９】
バイナリープラスミドの作製：
３つのバイナリープラスミドを、標準的なクローニング手順に従うことで作製した。第１のバイナリープラスミドは、実験に使用した対照プラスミド（ＤｓＲｅｄ対照と呼ばれる）であり、他のベクターに使用したベースベクターである。このプラスミドには、Ｔ−ＤＮＡ内に、トランスジェニック植物細胞および組織の表現型スコアリングに使用したＤｓＲｅｄ遺伝子と、トランスジェニック細胞の優先的選抜に使用したＡｔＡＨＡＳ遺伝子とが含まれる。両方の遺伝子を、上述の目的を果たすのに十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーターおよびターミネーターでクローニングした。第２のバイナリープラスミドには、ダイズにおけるＧＲＦ５タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーターとターミネーターとの間でクローニングされたＡｔＧＲＦ５をコードするｃＤＮＡ（配列番号２）を有するベースベクターが含まれる。第３のバイナリープラスミドには、ダイズにおけるＧＲＦ５タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーターとターミネーターとの間でクローニングされたＧｍＧＲＦ５をコードするｃＤＮＡ（配列番号１０６）を有するベースベクターが含まれる。
【０１００】
種子の滅菌および発芽：
「Ｊａｋｅ」栽培品種のダイズ種子を、１００ｍｌの漂白剤に３．５ｍｌの１２Ｎ  ＨＣｌを添加して生成された塩素ガスを用いてチャンバー内で滅菌した。滅菌後、約６５粒の種子を、ＰｌａｎｔＣｏｎｓ（商標）の固体発芽培地（１ｘＢ５塩類およびビタミン類、２％スクロース、０．８％ノーブル寒天（Ａ５４３１  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））；ｐＨ５．８）に置床した。この実生を２６℃の光（１５０μｍ−２ｓ−２）で７日間にわたり発芽させ、形質転換のための外植材として使用した。
【０１０１】
アグロバクテリウムの調製：
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)（国際公開第２００６０２４５０９号）を、以下を含むベクターのうちの１つを用いて形質転換した：（１）対照としてのｐＳＵＰＥＲ：ＤｓＲｅｄおよびｐＰｃＵＢＩ：ＡＨＡＳ選別可能マーカー、または対照ベクターに（２）ｐＰｃＵｂｉ−ＡｔＧＲＦ５もしくは（３）ｐＰｃＵＢＩ−ＧｍＧＲＦ５のいずれかを加えたもの。アグロバクテリウム・リゾゲネス(A.rhizogenes)を増殖させ、５０ｍｌの液体接種培地（１／１０ｔｈＢ５塩類（Ｇ７６８  Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ社製）、３％スクロース、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｘガンボーグビタミン類、２００μＭアセトシリンゴン、１．４４μＭジベレリン酸、５．０μＭカイネチン；ｐＨ５．４）にファルコンチューブ内でＯＤ６００が１．５になるまで再懸濁させた。次いで、アグロバクテリウム懸濁液を、調製された外植片を回収するための深型ペトリ皿に入れた。
【０１０２】
外植片の調製および形質転換：
実生外植片を、８日齢の実生から、根および胚軸の大部分、子葉１枚、子葉節の腋芽組織の生長、およびすべての事前に形成された葉を含む一次節の上の上胚軸を取り出すことによって調製した。外植片を調製した後、約４５〜５０個の外植片をペトリ皿のアグロバクテリウム懸濁液と一緒に３０分間インキュベートした。次いで、外植片を、共培養培地（１／１０ｔｈＢ５塩類（Ｇ７６８  Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ社製）、３％スクロース、２０ｍＭ  ＭＥＳ、０．５％ノーブル寒天（Ａ５４３１  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、１ｘガンボーグビタミン類、２００μＭアセトシリンゴン、１．４４μＭジベレリン酸、５．０μＭカイネチン、４．１ｍＭ  Ｌ−システイン、０．５ｍＭジチオトレイトール、０．５ｍＭチオ硫酸ナトリウム；ｐＨ５．４）を含むペトリ皿内の湿ったろ紙に置き、室温で５日間容器に封入した。
【０１０３】
シュート発育および選抜：
５日後、外植片を選抜培地（１ｘＢ５塩類およびビタミン類（Ｇ３９８  Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ社製）、３％スクロース、３ｍＭ  ＭＥＳ、１μＭ６−ベンジルアミノプリン、５μＭカイネチン、２５０ｍｇ／ｌチメンチンＳＴＫ、３μＭイマザピル、０．８％ノーブル寒天（Ａ５４３１  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））；ｐＨ５．６）にプレート１つあたり５つを移し、２６℃で培養した。外植片は、選抜の１６日後に一次節の腋芽分裂組織で有意な生長を示し、最初にシュート発育（再生）のスコア化を行った。選抜の２２日後（選抜終了後）に、外植片を固体培地から取り出し、Ｏａｓｉｓ（登録商標）培地に置床した後、（１）シュート形成の品質および（２）一次節で発育するシュートのＤｓＲｅｄ蛍光についてスコア化を行った。
【０１０４】
実験デザインおよび結果：
４人の研究員と３つのコンストラクトを対象に１つの実験を行った（表６）。ダイズ一次節腋芽分裂組織を、ＤｓＲｅｄ対照、ＡｔＧＲＦ５およびＧｍＧＲＦ５を用いて形質転換した。計５２４個の実生外植片を形質転換し、選抜の１６日後（形質転換後２１日目）と選抜の２２日後（形質転換後２７日目）にスコア化した。選抜の１６日後のシュートは、一次節で急速に生長し、小さくてコンパクトなシュートパッドと、より大きく伸長したシュートとが組み合わさったものであった（図１１）。標的組織である一次節での再生率［（シュートを有する外植片の数）／全外植片×１００］は、すべてのコンストラクトで８０〜１００％であり、選抜の１６日間固定していた。１６日目〜２２日目の間、外植片のシュートは急速に生長し続けていた。両方の時点で、発根したトランスジェニック植物体の形成が成功したことを予測する形態（「良好」）を有する、健康的で伸長したシュート生長の存在について主観的にスコア化した（図１２）。特にＡｔＧＲＦ５およびＧｍＧＲＦ５を用いて形質転換された外植片では、２つの時点から３つのコンストラクトすべてを用いて形質転換された外植片の「良好な」シュート形成が増加していた。４回の複製にわたり、ＧＲＦ５のいずれかの形態で形質転換された外植片は、ＤｓＲｅｄ対照と比較して、より高度なシュート形成（より大きなシュート、より伸長したシュート）を示す傾向が見られた（図１３）。
【０１０５】
形質転換効率の初期の測定値を得るために、選抜の１６日目および２２日目に、ＤｓＲｅｄタンパク質を発現するトランスジェニック細胞に起因する一次節でのＤｓＲｅｄ蛍光シュートの有無についてスコア化した。ＤｓＲｅｄの発現は、両方の時点でＡｔＧＲＦ５またはＧｍＧＲＦ５を含むコンストラクトの方がＤｓＲｅｄ対照よりも顕著に強かったが、選抜の１６日目により一層強まる（図１１）。「良好な」シュート形態を有すると特徴付けられた外植片は、一般的に、ＤｓＲｅｄ発現を有するシュートを有していた（図１１）。ＤｓＲｅｄを発現するシュートを有する外植片の割合は、ＡｔＧＲＦ５またはＧｍＧＲＦ５のいずれかを用いて形質転換された外植片の方が、ＤｓＲｅｄ対照を用いて形質転換された外植片と比較して両方の時点で有意に高かった（α＝０．０５）（表６；図１４）。ＤｓＲｅｄ対照コンストラクトを用いて形質転換された外植片のうち、選抜から２２日目に５４．５％はＤｓＲｅｄを発現するシュートを示したのに対し、ＡｔＧＲＦ５では７０．２％、ＧｍＧＲＦ５では７４．６％であった（表６）。このデータは、形質転換後２７日目に、ＡｔＧＲＦ５またはＧｍＧＲＦ５のいずれかを用いて形質転換されたダイズ外植片の方が、ＧＲＦ５のいずれかの形態を用いて形質転換されていない外植片よりも、一次節で再生するトランスジェニックシュートの本数が有意に多いことを示している。
【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
５．セイヨウアブラナ(Brassica napus)（キャノーラ）の実験
キャノーラの形質転換：
セイヨウアブラナ(Brassica napus)の形質転換を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を使用して、遺伝子型ＢＮＳ３のセイヨウアブラナ(B.napus)実生の胚軸切片にＴ−ＤＮＡを送達するために行った。
【０１０８】
種子の滅菌および発芽：
種子を、５０ｍＬのファルコンチューブ内の７０％エタノール中に２００〜３００個の種子を２分間入れて表面滅菌した。２分間穏やかに振とうした後、エタノールを除去し、４０〜５０ｍｌの３０％クロロックス漂白剤を１滴のＴｗｅｅｎとともに加えた。種子を時折混合しながら１０分間インキュベートした。液体を除去し、次いで種子を滅菌水で３回すすいだ後、種子をＰｌａｎｔＣｏｎボックス内の発芽培地（１／２ｘＭＳ塩類／ビタミン類、１０ｇｌ−１スクロース、Ｐｈｙｔｏ寒天(Phyto Agar)７ｇｌ−１；ｐＨ５．８）上に置床した。ボックスは、２３℃の暗所で４〜５日間チャンバー内に入れた。
【０１０９】
アグロバクテリウムの調製：
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を、以下のベクターのうちの１つを用いて形質転換した：（１）対照としてのｐＳＵＰＥＲ：ＤｓＲｅｄおよびＰｃＵＢＩ：ＡＨＡＳ選別可能マーカー、または対照ベクターに（２）ＰｃＵｂｉ−ＡｔＧＲＦ５もしくは（３）ＰｃＵＢＩ−ＧｍＧＲＦ５（配列番号１０８）のいずれかを加えたもの。アグロバクテリウム・リゾゲネス(A.rhizogenes)をＯＤ６００が１．０になるまで増殖させ、その後、液体接種培地（１ｘＭＳ塩類／ビタミン類、３０ｇｌ−１スクロース；ｐＨ５．８）を用いて０．１になるまで希釈した。次いで、アグロバクテリウム懸濁液を、調製された胚軸外植片を回収するための皿に入れた。
【０１１０】
外植片の調製および形質転換：
胚軸外植片を、４〜５日齢の黄化実生から調製するにあたり、発芽ボックスから取り出し、アグロバクテリウムを含まない感染培地で湿らせた滅菌ろ紙上に置いて、実生が膨れた状態を保った。根、子葉および上胚軸を取り出した後、長さ７〜１０ｍｍの胚軸切片を調製した。切断後、この外植片をアグロバクテリウム懸濁液に浸漬し、乾燥した滅菌ろ紙にブロッティングし、最後にプレート中の共培養培地（１ｘＭＳ塩類／ビタミン類、３０ｇｌ−１スクロース、０．６ｇｌ−１ＭＥＳ、１８ｇｌ−１マンニトール、７ｇｌ−１Ｐｈｙｔｏ寒天(Phyto Agar)、１ｍｇｌ−１２，４−Ｄ、１００ｍｇｌ−１アセトシリンゴン、２００ｍｇｌ−１Ｌ−システイン；ｐＨ５．６）の上のろ紙に置いた。約５０個の外植片をプレーティングしたら、プレートをマイクロポアテープで密封し、２３℃の光の中で１６時間の明期／８時間の暗期の光周期にて３日間培養した。
【０１１１】
カルスの発育およびシュートの開始：
３日後、すべての外植片を回収培地（１ｘＭＳ塩類／ビタミン類、３０ｇｌ−１スクロース、０．６ｇｌ−１ＭＥＳ、１８ｇｌ−１マンニトール、７ｇｌ−１Ｐｈｙｔｏ寒天(Phyto Agar)、１ｍｇｌ−１２，４−Ｄ、３００ｍｇｌ−１チメンチン；ｐＨ５．６）に移し、マイクロポアテープで密封し、２３℃で７日間培養した。外植片を選抜培地＃１（１ｘＭＳ塩類／ビタミン類、３０ｇｌ−１スクロース、０．５ｇｌ−１ＭＥＳ、７ｇｌ−１Ｐｈｙｔｏ寒天(Phyto Agar)、３ｍｇｌ−１ＢＡＰ、０．１ｍｇｌ−１ＮＡＡ、０．１ｍｇｌ−１ＧＡ３、２．５ｍｇｌ−１ＡｇＮＯ３、１００ｎＭイマゼタピル、３００ｍｇｌ−１チメンチン；ｐＨ５．８）に１週間後に移し、２３℃で１６時間の明期／８時間の暗期の光周期にて１４日間培養した。２週間の選抜後、外植片を選抜培地２（１ｘＭＳ塩類／ビタミン類、３０ｇｌ−１スクロース、０．５ｇｌ−１ＭＥＳ、７ｇｌ−１Ｐｈｙｔｏ寒天(Phyto Agar)、０．５ｍｇｌ−１ＢＡＰ、０．１ｍｇｌ−１ＧＡ３、２．５ｍｇｌ−１ＡｇＮＯ３、１００ｎＭイマゼタピル、３００ｍｇｌ−１チメンチン；ｐＨ５．８）に移した。
【０１１２】
実験計画および結果：
時間をかけて５つの実験を、３人の研究員を対象に、研究員１人につき最低１回の複製を伴って行った（表のキャノーラ−１）。実験１では、セイヨウアブラナ(Brassica napus)の胚軸を、実験１の場合に限られるＤｓＲｅｄ対照およびＢｎＧＲＦ５コンストラクトを用いて形質転換した；他の実験では、外植片を、ＤｓＲｅｄ対照、ＡｔＧＲＦ５およびＢｎＧＲＦ５コンストラクトを用いて形質転換した。計３，１５６個の外植片を接種し、１６日〜２２日後にＤｓＲｅｄ蛍光のスコア化を行った。この時点で、特に胚軸の切断端において、外植片は急速にカルスを発育させていた。外植片は、単一外植片の大きさ、強度および頻度に関係なく、外植片のＤｓＲｅｄ蛍光の有無についてスコア化した。ＤｓＲｅｄを発現するセクターの頻度は、処置に対する形質転換効率の初期の指標である。
【０１１３】
ＤｓＲｅｄの発現は、ＡｔＧＲＦ５またはＢｎＧＲＦ５を含むコンストラクトの方がＤｓＲｅｄ対照よりも顕著に強かった（図１５）。ＤｓＲｅｄを発現するシュートを有する外植片の割合は、ＡｔＧＲＦ５またはＢｎＧＲＦ５のいずれかを用いて形質転換された外植片の方が、ＤｓＲｅｄ対照を用いて形質転換された外植片と比較して有意に高かった（表７；図１６）。ＤｓＲｅｄ対照コンストラクトを用いて形質転換された外植片のうち、２０．１％はＤｓＲｅｄを発現するシュートを示したのに対し、ＡｔＧＲＦ５では５６．６％、ＢｎＧＲＦ５では５８．５％であった。このデータは、形質転換後２１日目に、ＡｔＧＲＦ５またはＢｎＧＲＦ５のいずれかを用いて形質転換されたセイヨウアブラナ(B.napus)外植片の方が、ＧＲＦ５のいずれかの形態を用いて形質転換されていない外植片よりも、３倍近くのトランスジェニックセクターを有することを示している（統計学的に有意α＝０．０５）。研究員と実験との間の有意差は、処理（コンストラクト）全体で検出されなかった。
【０１１４】
【表７】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2021510069.tif 000018
【図５Ｂ】
2021510069.tif 000019
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021510069.tif 000033
2021510069.tif 000034