(57)【要約】  枯草菌ＣＪＢＳ３０３（Bacillus subtilis ＣＪＢＳ３０３）菌株、及びその用途に係わるものであり、畜産糞尿由来悪臭の低減効果を有する菌株、該菌株を含む組成物及び微生物製剤、並びに該組成物を含む飼料組成物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＫＣＣＭ１２４３５Ｐで寄託された枯草菌ＣＪＢＳ３０３（Bacillus subtilis ＣＪＢＳ３０３）菌株。
【請求項２】
前記菌株は、畜産糞尿由来悪臭の低減効果を有するものである、請求項１に記載の枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株。
【請求項３】
前記菌株は、アンモニア、硫化水素、メチルメルカプタン、インドール類、フェノール類、揮発性脂肪酸（ＶＯＣｓ）からなる群のうちから選択される少なくとも１つの悪臭ガスのレベルを低下させるものである、請求項１に記載の枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株。
【請求項４】
請求項１に記載の枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株、前記菌株の培養物、前記培養物の濃縮物、または前記濃縮物の乾燥物を含む、組成物。
【請求項５】
前記組成物は、凍結保護剤または賦形剤を追加して含むものである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記凍結保護剤は、グリセロール、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳及び澱粉からなる群から選択される１以上である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項４に記載の組成物を含む、飼料組成物。
【請求項８】
組成物全体の重量を基準に、１．０×１０７ないし１．０×１０１１ｃｆｕ／ｋｇの枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を含む、請求項７に記載の飼料組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を含む、畜舎悪臭除去用微生物製剤。
【請求項１０】
前記微生物製剤は、アンモニア、硫化水素、メチルメルカプタン、インドール類、フェノール類、揮発性脂肪酸（ＶＯＣｓ）からなる群のうちから選択される少なくとも１つの悪臭ガスのレベルを低下させるものである、請求項６に記載の微生物製剤。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のうちいずれか１項に記載の菌株、組成物または微生物製剤を個体に投与する段階を含む、個体糞尿の悪臭低減方法。
【請求項１２】
ＫＣＣＭ１２４３５Ｐで寄託された枯草菌ＣＪＢＳ３０３（Bacillus subtilis ＣＪＢＳ３０３）菌株を培養する段階と、
回収された菌株を添加剤と混合する段階と、を含む微生物製剤を製造する方法。
【請求項１３】
前記添加剤は、凍結保護剤であり、前記混合段階後、得られた混合物を凍結乾燥する段階を追加して含む、請求項１２に記載の微生物製剤を製造する方法。
【請求項１４】
前記凍結乾燥する段階で得られた凍結乾燥された微生物製剤内菌株は、生菌状態である、請求項１３に記載の微生物製剤を製造する方法。
【請求項１５】
前記微生物製剤は、微生物製剤全体の重量を基準に、１．０×１０７ないし１．０×１０１１ｃｆｕ／ｋｇの枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を含むものである、請求項１２に記載の微生物製剤を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、畜産糞尿由来悪臭の低減効果を有する枯草菌ＣＪＢＳ３０３、及びそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、畜産農家で発生している悪臭は、環境汚染はもとより、周辺地域の民願発生率上昇、及び疾病発生の原因として、社会的に大きい問題になっている。畜産農家で発生する悪臭の主な原因としては、家畜の糞尿生産と、それを保存して処理する過程での嫌気発酵によって発生したガスがある。それにより、環境部と大韓韓豚協会は、アンモニア、メチルメルカプタン、硫化水素などを含んだ１２個の悪臭物質を指定し、２０１０年には、最終２２個の指定悪臭物質及び排出許容基準を制定した。また、大韓韓豚協会では、２０１５〜２０１６年の２年間、１３３農家を分析した結果を基にし、畜産農家の悪臭管理基準を提示し、それらのうち一つとして、農場内部の複合悪臭希釈排水を、１，０００倍以下に管理することを要求している。ここで、複合悪臭というのは、２以上の悪臭物質が複合的に存在しながら、人の嗅覚を刺激し、不快感と嫌悪感とを与えるにおいを言う。
【０００３】
豚舎内の代表的な有害ガスであり、かつまた悪臭物質のうち一つであるアンモニア（ＮＨ３）は、刺激性がある無色の流動性ガスであり、比較的低濃度でも、それを感知することができる。アンモニアは、アミノ酸が、脱アミノ化する過程で生成すると知られており、また、他のアンモニア発生源としては、尿素と硝酸とがある。アンモニアガスは、湿った体組織を刺激し、作業者の目をちくちくさせ、豚の目を充血させる。豚舎内アンモニア濃度による豚生産性影響に係わる研究資料によれば、アンモニアが５０ｐｐｍ以上である場合、子豚区間において、約１２％の成長遅滞が起こり、１００〜１５０ｐｐｍにおいては、豚の３０％が成長阻害、呼吸器疾患症状を示す。
【０００４】
また、他の主要悪臭ガスとしては、揮発性硫黄化合物があり、硫化水素（Ｈ２Ｓ）とメチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）とがそれに該当する。そのような揮発性硫黄化合物は、硫酸塩の還元過程、及び硫黄を含むアミノ酸の代謝過程で生成される。硫化水素は、有毒性ガスであり、空気より重く、豚舎のスラリー表面に敷かれていると知られており、作業者の頭痛、めまい、吐き気などを誘発し、豚の場合、食欲低下、呼吸器疾病などを誘発させる。それら以外にも、畜産農家の悪臭ガスとしては、インドール・スカトール・ｐ−クレゾールのようなインドール類及びフェノール類と、プロピオン酸・酪酸・酢酸のような揮発性脂肪酸（ＶＯＣｓ）とがあり、それら悪臭ガスの発生を低減させることができる技術の開発が必要な実情である。
【０００５】
そのような背景下において、本発明者らは、畜産農家で発生する悪臭を低減させるために鋭意努力した結果、畜産糞尿に由来するアンモニア、硫化水素などの悪臭ガスを格段に低減させることができるバシラス属菌株を分離及び同定し、それに基づき、本出願を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−１２２９８６５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本出願の一目的は、受託番号ＫＣＣＭ１２４３５Ｐで寄託された枯草菌ＣＪＢＳ３０３（Bacillus subtilis ＣＪＢＳ３０３）菌株を提供することである。
【０００８】
本出願の他の目的は、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株、前記菌株の培養物、前記培養物の濃縮物、または前記濃縮物の乾燥物を含む組成物を提供することである。
【０００９】
本出願のさらに他の目的は、前記組成物を含む飼料組成物を提供することである。
【００１０】
本出願のさらに他の目的は、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を含む畜舎悪臭除去用微生物製剤を提供することである。
【００１１】
本出願のさらに他の目的は、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株、前記組成物、または前記微生物製剤を個体に投与する段階を含む個体糞尿の悪臭低減方法を提供することである。
【００１２】
本出願のさらに他の目的は、ＫＣＣＭ１２４３５Ｐで寄託された枯草菌ＣＪＢＳ３０３（Bacillus subtilis ＣＪＢＳ３０３）菌株を培養する段階と、回収された菌株を添加剤と混合する段階と、を含む微生物製剤を製造する方法を提供することである。
【００１３】
本出願の他の目的及び利点は、添付された特許請求の範囲、及び図面と共に、下記の詳細な説明によってさらに明確になるであろう。本明細書に記載されていない内容は、本出願の技術分野、または類似した技術分野内の熟練者であるならば、十分に認識して類推することができるものであるので、その説明を省略する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施例は、それぞれの他の説明及び実施例にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された多様な要素の全組み合わせが、本出願の範疇に属する。また、下記に記述された具体的な敍述により、本出願の範疇が制限されると見ることができない。
【００１５】
本出願は、一様相として、受託番号ＫＣＣＭ１２４３５Ｐで寄託された枯草菌ＣＪＢＳ３０３（Bacillus subtilis ＣＪＢＳ３０３）菌株を提供する。
【００１６】
前記菌株は、畜産糞尿由来悪臭の低減効果を有するものでもある。例えば、前記菌株は、アンモニア、硫化水素、メチルメルカプタン、インドール類、フェノール類、揮発性脂肪酸（ＶＯＣｓ）からなる群のうちから選択される少なくとも１つの悪臭ガスのレベルを低下させるものでもある。
【００１７】
本発明で使用される用語「畜産糞尿由来悪臭」は、「畜産糞尿に由来する悪臭」、または「家畜糞尿に由来する悪臭」と相互交換的にも使用される。前記悪臭は、家畜糞尿に由来する悪臭ガスから発生するものでもあり、例えば、家畜糞尿の処理過程において、嫌気発酵による悪臭ガスから発生するものでもある。
【００１８】
一実施例によれば、韓国伝統醤類である味噌、コチュジャン及び味噌麹のような試料から分離した総４５６種の菌株において、アンモニア消耗率が最も高いＣＪＢＳ３０３菌株を選別した。前記選別された菌株に対する１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列分析を行い、配列番号１の塩基配列を確認し、それは、枯草菌と９９％相同性を示すものであった。従って、前記菌株を枯草菌ＣＪＢＳ３０３と命名し、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を、韓国微生物保存センターに２０１９年２月１３日付けで寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２４３５Ｐを付与された。
【００１９】
一具現例において、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株は、畜産糞尿に由来する悪臭ガスのレベルを低下させることができる。前記悪臭ガスは、アンモニア；硫化水素；メチルメルカプタン；インドール、スカトール、ｐ−クレゾールなどのインドール類及びフェノール類；及びプロピオン酸、酪酸及び酢酸などの揮発性脂肪酸（ＶＯＣｓ）などでもあり、例えば、アンモニア、硫化水素、メチルメルカプタン、インドール類、フェノール類、揮発性脂肪酸からなる群のうちから選択される少なくとも１つの悪臭ガスでもある。
【００２０】
一実施例によれば、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株の添加は、養豚糞便スラリー由来のアンモニアレベルを低下させ、前記菌株の供与も、糞尿由来のアンモニア及び硫化水素のレベルを低下させることを確認することができた。従って、本出願は、畜産糞尿由来悪臭の低減効果を有する新規菌株を提供することができる。
【００２１】
本出願は、他の様相として、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株、前記菌株の培養物、前記培養物の濃縮物、または前記濃縮物の乾燥物を含む組成物を提供する。
【００２２】
前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株は、前述の通りである。
【００２３】
一具現例において、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株の培養物は、微生物培養培地に、前記菌株を接種し、当業界に公知の微生物培養方法（例えば、静置培養、撹拌培養）によっても製造される。また、前記菌株培養物の濃縮物、及びそれらの乾燥物も、当業界に公知の、微生物または培養液の処理、濃縮または乾燥の方法によっても容易に製造される。
【００２４】
一実施例によれば、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株の供与は、糞尿由来のアンモニア及び硫化水素のレベルを低下させることにより、畜家環境の改善、及び家畜の生産性向上に寄与することができた。従って、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株、前記菌株の培養物、前記培養物の濃縮物、または前記濃縮物の乾燥物は、組成物に含まれ、飼料添加剤としても活用される。
【００２５】
本出願の組成物は、粉末状または顆粒状にも製造され、必要によっては、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、りんご酸のような有機酸；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸塩、ポリリン酸塩などのリン酸塩；ポリフェノール、カテキン、アルファ−トコフェロール、ローズマリー抽出物、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸のような天然抗酸化剤のうちいずれか一つまたは１以上を追加して含んでもよい。
【００２６】
本出願の組成物は、穀物、例えば、粉砕または破砕された小麦、燕麦、麦、とうもろこし及び米；植物性タンパク質飼料、例えば、アブラナ、豆及びひまわりを主成分にする飼料；動物性タンパク質飼料、例えば、血粉、肉粉、骨粉及び魚粉；糖分及び乳製品、例えば、各種粉乳及び乳漿粉末からなる乾燥成分などをさらに含んでもよく、それ以外にも、栄養補充剤、消化向上剤及び吸収向上剤、成長促進剤などをさらに含んでもよい。
【００２７】
本出願の組成物は、動物に単独で投与するか、あるいは食用担体のうち、他の飼料添加剤と組み合わせて投与することもできる。また、前記組成物は、トップドレッシングとして、あるいはそれらを飼料に直接混合したり、飼料と別途の経口剤形にしたりして、容易に動物に投与することができる。前記組成物を飼料と別途に投与する場合、当該技術分野に周知されているように、薬剤学的で許容可能な食用担体と組み合わせ、直ちに放出するか、あるいは徐放性剤形に製造することができる。そのような食用担体は、固体または液体、例えば、とうもろこし澱粉、ラクトース、スクロース、豆フレーク、落花生油、オリーブ油、胡麻油及びプロピレングリコールでもある。固体担体が使用される場合、前記組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤または含糖錠剤、あるいは微分散性形態のトップドレッシングでもある。液体担体が使用される場合、前記組成物は、ゼラチン軟質カプセル剤、あるいはシロップ剤、懸濁液、エマルジョン剤または溶液剤の剤形でもある。
【００２８】
本出願の組成物は、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤；溶液促進剤、凍結保護剤または賦形剤などを含んでもよい。前記凍結保護剤は、グリセロール、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳及び澱粉からなる群から選択される１以上でもある。
【００２９】
前述の保存剤、安定化剤または賦形剤は、前記組成物に含まれる枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株の低下（deterioration）を低減させるのに十分な有効量で組成物に含まれるものでもある。また、前記凍結保護剤は、前記組成物が乾燥された状態であるとき、組成物に含まれる枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株の低下を低減させるのに十分な有効量で組成物に含まれるものでもある。
【００３０】
前記組成物は、浸注、噴霧または混合し、動物の飼料に添加しても利用される。
【００３１】
本出願の組成物は、哺乳類及び家擒を含む多数の動物食餌に適用することができる。前記哺乳類として、豚、牛、羊、山羊、実験用齧歯動物または愛玩動物（例：犬、猫）などに使用することができ、前記家擒類として、ニワトリ、七面鳥、鴨、ガチョウ、きじ及びうずらなどにも使用することができる。
【００３２】
本出願は、さらに他の様相として、前記組成物を含む飼料組成物を提供する。
【００３３】
本出願の飼料組成物は、通常の飼料形態にも製剤化され、通常の飼料成分を共に含んでもよい。
【００３４】
本明細書で使用される用語「飼料組成物」は、動物に供与されるえさを指称する。前記飼料組成物は、動物の生命を維持させるか、あるいは肉、乳などを生産するのに必要な有機または無機の栄養素を供給する物質を言う。前記飼料組成物は、動物の生命維持、または肉、乳などの生産に必要な栄陽性分を追加して含んでもよい。
【００３５】
本出願の飼料組成物内に含まれる前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株、前記菌株の培養物、前記培養物の濃縮物、または前記濃縮物の乾燥物を含む組成物の含量は、適用家畜の種類、及び年齢、適用形態、目的とする効果などによって適切に調節可能であり、例えば、０．０１ないし１％（ｗ／ｗ）、０．０１ないし０．５％（ｗ／ｗ）、または０．１５ないし０．５％（ｗ／ｗ）でも使用される。
【００３６】
一具現例において、本出願の飼料組成物は、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を組成物全体の重量を基準に、１．０×１０７ないし１．０×１０１１ｃｆｕ／ｋｇの含量で含んでもよい。前記菌株の含量は、１．０×１０７ないし５．０×１０１０，１．０×１０７ないし１．０×１０１０，１．０×１０７ないし５．０×１０９，１．０×１０７ないし１．０×１０９，１．０×１０７ないし５．０×１０８，１．０×１０７ないし１．０×１０８，１．０×１０７ないし５．０×１０７，１．０×１０８ないし５．０×１０１０，１．０×１０８ないし１．０×１０１０，１．０×１０８ないし５．０×１０９，１．０×１０８ないし１．０×１０９，１．０×１０８ないし５．０×１０８，１．０×１０９ないし５．０×１０１０，１．０×１０９ないし１．０×１０１０、または１．０×１０９ないし５．０×１０９ｃｆｕ／ｋｇでもあるが、家畜の種類、及び年齢、適用形態、目的とする効果などによって適切に調節可能である。
【００３７】
本出願の飼料組成物は、投与のために、追加して、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸のような有機酸；リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、重合リン酸塩のようなリン酸塩；ポリフェノール、カテチン、トコフェロール、ビタミンＣ、緑茶抽出物、キトサン、タンニン酸のような天然抗酸化剤のうち１種以上を混合して使用することができるが、必要によっては、抗インフルエンザ剤、緩衝剤、静菌剤のような他の一般的な添加剤を添加することができる。また、本出願の飼料組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤または潤滑剤を付加して添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液のような注射用剤形、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。また、本出願の飼料組成物は、補助成分として、アミノ酸、無機塩類、ビタミン、抗酸化剤、抗真菌剤、抗菌剤のような各種補助剤；並びに粉砕または破砕された小麦、麦、とうもろこしのような植物性タンパク質飼料；血粉、肉粉、魚粉のような動物性タンパク質飼料；動物性脂肪及び植物性脂肪のような主成分以外にも、栄養補充剤、成長促進剤、消化吸収促進剤、疾病予防剤と共に使用されうる。
【００３８】
本出願の飼料組成物は、家畜飼料に、乾燥重量基準で、１ｋｇ当たり約１０ないし５００ｇ、例えば、１０ないし１００ｇの量で混合することができ、完全に混合した後、メッシュで供給するか、あるいは追加加工工程を介して、ペレット化、膨脹化または押出工程を経ることができる。
【００３９】
本出願は,さらに他の様相として、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を含む畜舎悪臭除去用微生物製剤を提供する。
【００４０】
一実施例によれば、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株の供与は、糞尿由来のアンモニア及び硫化水素のレベルを低下させることができ、畜舎内のアンモニア、硫化水素、メチルメルカプタン、揮発性有機化合物及び複合悪臭を有意的に低減させることができた。従って、本出願の菌株は、畜舎悪臭除去のための微生物製剤として活用することができる。
【００４１】
一具現例において、本出願の微生物製剤は、アンモニア、硫化水素、メチルメルカプタン、揮発性脂肪酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの悪臭ガスのレベルを低下させるものでもある。
【００４２】
一具現例において、本出願の微生物製剤は、当業界に知られた方法によって製造された固体または液状の形態でもある。本出願の微生物製剤が、例えば、固体形態である場合、前記菌株を担体に付着させた後、微生物製剤全体重量を基準に、水分含量が、０．１ないし１０重量％になるように乾燥させ、ビード（bead）状に製品化するか、あるいは粉砕して粉末状に製品化することができる。前記担体としては、粉末上の粘土類、活性炭、コークス、火山灰及び燃焼材によって構成される群のうちから選択された１以上が使用され、前記粘土類としては、ゼオライト、蛭石、珪藻土、高嶺土、甕器土、長石、チァジ土及び滑石からなる群のうちから選択された１以上を使用することができるが、それらに制限されるものではない。また、前記固体形態の微生物製剤には、賦形剤が追加されうる。前記賦形剤の場合、アミノ酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、キトサン及びブドウ糖を単独で使用するか、あるいは２種以上混合して使用することができるが、それらに制限されるものではない。
【００４３】
本出願の微生物製剤が、例えば、液体形態である場合、前記菌株の培養物を混合し、微生物を安定化させるために、ブドウ糖やグリセリンを混合しても製造される。微生物製剤全体重量を基準に、培養物の最終濃度が、５ないし４０重量％になるように製造することができ、例えば、最終濃度が１０ないし２０重量％になるように製造することができるが、それらに制限されるものではない。
【００４４】
本出願は、さらに他の様相として、前記枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株、前記組成物、または微生物製剤を個体に投与する段階を含む、個体糞尿の悪臭低減方法を提供する。
【００４５】
本明細書で使用される用語「個体」は、糞尿の悪臭を低減させる対象を意味し、さらに具体的には、非ヒト動物でもある。例えば、前記非ヒト動物は、哺乳類及び家擒類を含んでもよく、前記哺乳類は、豚、牛、羊、山羊、犬、猫などを含んでもよく、実験用齧歯類または愛玩動物などを含んでもよく、前記家擒類は、ニワトリ、七面鳥、鴨、ガチョウ、きじ及びうずらなどを含んでもよいが、それらに制限されるものではない。
【００４６】
本出願は、さらに他の様相として、ＫＣＣＭ１２４３５Ｐで寄託された枯草菌ＣＪＢＳ３０３（Bacillus subtilis ＣＪＢＳ３０３）菌株を培養する段階と、回収された菌株を添加剤と混合する段階と、を含む微生物製剤を製造する方法を提供する。
【００４７】
前記菌株の培養は、当業界に知られた方法によっても遂行され、前記培養の方法は、回分式、連続式及び流加式の培養からなる群から選択される１以上の培養を含んでもよい。
【００４８】
前記培養に使用される培地は、特定微生物の要求条件を満足させることができる培地でもある。前記培地は、炭素源、窒素源、微量元素成分、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される培地でもある。
【００４９】
前記炭素源は、炭水化物、脂肪、脂肪酸、アルコール、有機酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される炭素源でもある。前記炭水化物は、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロース、及びそれらの組み合わせでもある。前記脂肪は、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油、及びそれらの組み合わせでもある。前記脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、またはそれらの組み合わせでもある。前記アルコールは、グリセロールまたはエタノールでもある。前記有機酸は、酢酸を含んでもよい。
【００５０】
前記窒素源は、有機窒素源、無機窒素源、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記有機窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液（ＣＳＬ）、大豆粕、及びそれらの組み合わせからなる群からも選択される。前記無機窒素源は、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせからなる群からも選択される。
【００５１】
前記培地は、リン、金属塩、アミノ酸、ビタミン、前駆体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものを含んでもよい。前記リンの供給源は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、またはそれらに相応するナトリウム含有塩を含んでもよい。前記金属塩は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄でもある。
【００５２】
前述の培地、またはそれをなす個別成分は、回分式、連続式または流加式の培養にも添加される。
【００５３】
前記微生物製剤を製造する方法は、前記菌株を培養する段階後、前記菌株を培養した培養物から、前記菌株を回収する段階をさらに含むものでもある。前記菌株の回収は、当業界に知られた方法によっても遂行され、例えば、前記培養物を遠心分離した後、発生する沈澱を回収する方法によっても遂行される。
【００５４】
前記微生物製剤を製造する方法において、前記添加剤は、凍結保護剤でもあり、前記回収された菌株を添加剤と混合する段階後、得られた混合物を凍結乾燥する段階を追加して含むものでもある。前記凍結乾燥は、当業界に知られた方法によっても遂行される。
【００５５】
前記凍結乾燥する段階で得られた凍結乾燥された微生物製剤内菌株は、生菌状態であるものでもある。また、前記凍結乾燥された微生物製剤は、製剤内に含まれた前記菌株の低下を低減させるのに十分な有効量で凍結保護剤を含むことにより、前記生菌状態である菌株の低下が低減されたものでもある。
【００５６】
前記微生物製剤を製造する方法において、前記微生物製剤は、微生物製剤全体の重量を基準に、１．０×１０７ないし１．０×１０１１ｃｆｕ／ｋｇの枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を含むものでもあり、例えば、１．０×１０７ないし５．０×１０１０，１．０×１０７ないし１．０×１０１０，１．０×１０７ないし５．０×１０９，１．０×１０７ないし１．０×１０９，１．０×１０７ないし５．０×１０８，１．０×１０７ないし１．０×１０８，１．０×１０７ないし５．０×１０７，１．０×１０８ないし５．０×１０１０，１．０×１０８ないし１．０×１０１０，１．０×１０８ないし５．０×１０９，１．０×１０８ないし１．０×１０９，１．０×１０８ないし５．０×１０８，１．０×１０９ないし５．０×１０１０，１．０×１０９ないし１．０×１０１０、または１．０×１０９ないし５．０×１０９ｃｆｕ／ｋｇの枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株を含むものでもあるが、適用する家畜の種類、及び年齢、適用形態、目的とする効果などによって適切に調節可能である。
【発明の効果】
【００５７】
本出願による枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株は、畜産糞尿、または畜舎に由来する悪臭ガスの発生を効果的に低減させることができる。
【００５８】
従って、前記菌株を含む組成物及び微生物製剤は、悪臭低減を介した畜家環境の改善に寄与するだけではなく、家畜生産を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】一実施例によるアンモニア消耗能評価結果を示したものであり、アンモニアの消耗有無による培養液の発色反応を肉眼で確認した結果である。
【図２】アンモニア含有培地で培養されたＣＪ１０９，ＣＪ２５１，ＣＪ２６８及びＣＪＢＳ３０３菌株のアンモニア消耗率を定量的に比較した結果である。
【図３】ＣＪＢＳ３０３菌株の形態学的特性を、電子顕微鏡を介して確認した結果である。
【図４】ＣＪＢＳ３０３菌株の溶血性いかんを肉眼で確認した結果である。
【図５】ＣＪＢＳ３０３菌株の添加による養豚糞便スラリー由来のアンモニア発生量変化を確認した結果である。
【図６】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による糞尿由来のアンモニア及び硫化水素の発生量変化を確認した結果である。
【図７Ａ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を示したものであり、豚舎内複合悪臭レベルを経時的に確認した結果である。
【図７Ｂ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を示したものであり、豚舎内アンモニアのレベルを経時的に確認した結果である。
【図７Ｃ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を示したものであり、豚舎内硫化水素レベルを経時的に確認した結果である。
【図７Ｄ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を示したものであり、豚舎内揮発性脂肪酸（ＶＯＣｓ）レベルを経時的に確認した結果である。
【図７Ｅ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を示したものであり、豚舎内メチルメルカプタンレベルを経時的に確認した結果である。
【図８Ａ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を検証するものであり、豚舎内アンモニアレベルを比較した結果である。
【図８Ｂ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を検証するものであり、豚舎内硫化水素レベルを比較した結果である。
【図８Ｃ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を検証するものであり、豚舎内メチルメルカプタンレベルを比較した結果である。
【図８Ｄ】ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果を検証するものであり、豚舎内複合悪臭のレベルを比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００６１】
実施例１．畜産糞尿由来悪臭の低減効果を有する菌株の分離及び同定
（１）試料の確保及び菌株の分離
韓国伝統醤類である味噌、コチュジャン及び味噌麹などの試料を確保し、前記試料を段階的に希釈した後、それらを、３％塩化ナトリウムが添加されたＢＨＩ（Brain Heart Infusion，Difco）固体培地に塗抹した後、３７℃で２４時間培養した。各試料から分離した菌株は、コロニーによってグループ化して分離した。選別されたコロニーは、三次にわたって新たな培地に移して培養する方法で純粋分離し、純粋分離されて培養された総４６５種の菌株を、２０％グリセロールが添加された培地に入れ、零下７０℃以下で保管した。
【００６２】
（２）アンモニア消耗能評価による菌株の選抜
悪臭の主要原因であるアンモニアを消耗する菌株を選別するために、前記菌株のアンモニア消耗能を評価した。該アンモニア消耗能は、アンモニアの酸化物である亜硝酸と発色反応を行う試薬（スルファニル酸、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−ナフチルアミン）を使用し、定性的な方法で確認した。具体的には、アンモニアが添加されたイオン培地（４．９５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８．８２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．１ｍｌ／Ｌの１Ｍ ＭｇＳＯ４溶液、０．３ｍｌ／Ｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液、０．５ｍｌ／Ｌの３０ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液、０．０４ｍｌ／Ｌの５０ｍＭ ＣｕＳＯ４溶液、０．７ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４、及び１２ｍｌ／Ｌの５％（Ｗ／Ｖ）無水Ｎａ２ＣＯ３を含む）を製造した後、前記製造された１０ｍｌの培地に、前記菌株をそれぞれ０．０１％濃度に接種し、それを、３０℃で１４日間培養した。その後、前記培養液を遠心分離し、上澄み液を１ｍｌずつそれぞれ採取した後、そこに前記亜硝酸と発色反応を行う指示薬を１００μｌずつ添加した。前記指示薬が添加された培養上澄み液を、２５℃で１０分間反応させて発色反応を誘導した後、それによる培養液の発色いかんを観察した。一方、以下の実施例において、標準菌株としては、大韓民国公開特許第１０−２０１２−００８８４３６号で公知された枯草菌ＫＣＣＭ１１１４３Ｐを使用した。
【００６３】
図１に示されているように、アンモニアの消耗または酸化によって亜硝酸が生成された場合、培養液は、濃い紫色に発色し、そのような発色反応を基準に、アンモニア消耗能を有する菌株を一次的に選別した。その結果、試料から分離された総４５６種の菌株のうち、有意的なアンモニア消耗能を有する４種の菌株、具体的には、ＣＪ１０９，ＣＪ２５１，ＣＪ２６８及びＣＪＢＳ３０３を選抜した。
【００６４】
また、一次的に選抜された前記４種の菌株を対象に、それらのアンモニア消耗量を定量的に比較した。具体的には、前記菌株を、ＢＨＩ液体培地に０．１％ずつ接種した後、それらを、３７℃で２００ｒｐｍで１５時間培養し、菌株を活性化させた。アンモニア含有培地（０．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３．５ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４、０．７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１８ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．０１４ｇ／ＬのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌのグルコースを含む）に、前記活性化菌株を１％ずつ接種した後、それらを３７℃で２００ｒｐｍで６時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、それらから培養上澄み液だけを回収した。初期培地内アンモニア含量と、回収された培養上澄み液とからアンモニア残余量を定量し、数式１によってアンモニア消耗率を算出した。
【００６５】
【数１】
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【００６６】
その結果、図２に示されているように、一次的に選抜された４種の菌株のうち、ＣＪＢＳ３０３菌株のアンモニア消耗率が７４．３％と最も高く観察された。従って、アンモニア消耗率が最も高いＣＪＢＳ３０３を、畜産糞尿由来悪臭の低減効果を有する菌株に最終選抜した。
【００６７】
（３）形態学的及び生化学的な特性分析
ＣＪＢＳ３０３菌株に対する形態学的及び生化学的な特性分析を実施した。具体的には、グラム染色法及び電子顕微鏡観察を介し、菌株の形態学的特性分析を実施し、ＡＰＩ ５０ ＣＨＢ system（biomerieux Vitek，Ｉｎｃ、フランス）を介して、菌株の糖発酵パターンを確認することにより、菌株の生化学的特性を確認した。
【００６８】
その結果、ＣＪＢＳ３０３菌株は、グラム陽性菌株として、図３に示されているように、杆菌であることを確認した。また、表１に示されているように、ＣＪＢＳ３０３菌株は、枯草菌と類似した糖発酵パターンを示すことを確認した。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
（４）菌株の同定
菌株同定のために、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的分析を実施した。そのために、ＰＣＲ premix（バイオニア、大韓民国）、ユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’）及び１４９２Ｒ（５’ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３’）を使用し、１６ｓ ｒＤＮＡの遺伝子を増幅させた。前記遺伝子の増幅時、総反応液は、２０μｌに設定し、９４℃１分、５６℃１分及び７２℃１分の条件で、総３０回反復して実施した。ＣＪＢＳ３０３菌株の１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、配列番号１の通りであり、それは、枯草菌と９９％相同性を示すものであった。以下の実施例においては、前記分離された菌株を「枯草菌ＣＪＢＳ３０３」または「ＣＪＢＳ３０３菌株」と命名した（受託番号ＫＣＣＭ１２４３５Ｐ）。
【００７１】
実施例２．ＣＪＢＳ３０３菌株の安全性評価
ＣＪＢＳ３０３菌株の安全性を確認するために、菌株の溶血性を評価した。具体的には、血液寒天平板培地（sheep blood ５％、（株）ハニルコメッド、大韓民国）に、ＣＪＢＳ３０３菌株を線形接種（streaking）した後、それらを３７℃で２４時間培養した。その後、前記培養された培地における溶血いかんを肉眼で観察した。
【００７２】
その結果、図４に示されているように、ＣＪＢＳ３０３菌株は、溶血性を示さず、それを介して、枯草菌ＣＪＢＳ３０３菌株の安全性を確認した。
【００７３】
実施例３．ＣＪＢＳ３０３菌株の畜産糞尿の悪臭低減効果評価
（１）糞便スラリー内悪臭ガス低減効果
ＣＪＢＳ３０３菌株の養豚糞便スラリー内悪臭ガスの低減効果を、標準菌株と比較することにした。具体的には、ＣＪＢＳ３０３菌株を、ＴＳＢ（trypticase soy broth）培地で培養した後、４００ｍｌの養豚糞尿スラリーに、１Ｘ１０８ｃｆｕ／ｋｇのＣＪＢＳ３０３菌株が含まれた４ｍｌの溶液を添加し、それを、１２０ｒｐｍ、３９℃の通性好気性条件で、総４８時間振盪培養した。培養した時点から、２４時間目及び４８時間目、総２回にわたり、アンモニアガス量を、携帯悪臭ガス測定機器（ＭｕｌｔｉＲＡＥ）を使用して測定した。各処理区別に２回測定されたガス量を合算し、アンモニアの全て発生量を比較した。
【００７４】
その結果、図５に示されているように、ＣＪＢＳ３０３菌株は、無添加対照区に比べ、アンモニアガスの総発生量が４１％ほど減少し、それは、標準菌株に比べ、４倍以上低減効果があるものであった。
【００７５】
（２）糞尿由来悪臭ガス低減効果
養豚に、ＣＪＢＳ３０３菌株を含む生菌剤を供与した場合、糞尿由来悪臭ガスの発生量に及ぼす影響を確認した。総３２頭の肥育豚を２個のグループに分類し、飼養試験を進めた。無添加飼料を供与した群を対照区に設定し、１pen当たり４頭ずつ、総４penの肥育豚に対照区飼料を５週間供与した。一方、飼料内に１ｘ１０９ｃｆｕ／ｋｇのＣＪＢＳ３０３菌株が含まれた飼料を供与した群を処理区に設定し、１pen当たり４頭ずつ、総４penの肥育豚に５週間、前記飼料を供与した。供与２週目から対照区及び処理区に由来する糞尿を毎週サンプリングし、そこから発生した悪臭ガスを測定した。対照区及び処理区からそれぞれサンプリングした糞尿を、一定比率（糞便６００ｇ＋１２．５％希釈された尿１．２Ｌ）で混ぜた後、それをボトルに３００ｍｌずつ小分けし、３９℃、通性好気性条件で、総４２時間静置培養した。培養した時点から、１２時間目、１８時間目、３６時間目及び４２時間目、総４回にわたり、発生したガス、すなわち、硫化水素及びアンモニアガスの量を、携帯悪臭ガス測定機器（ＭｕｌｔｉＲＡＥ）を使用して測定した。糞尿培養実験は、毎週糞尿のサンプリングを実施するたびに進め、５週目までのデータを平均化し、対照区対比で低減率を計算した。
【００７６】
その結果、表２及び図６に示されているように、処理区は、供与２週目から対照区に比べ、アンモニアと硫化水素ガスとの濃度が低く観察され、５週目まで発生したガスの濃度を平均化して比較したとき、ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による悪臭ガス低減率が、アンモニアは、３８．３％、硫化水素は、８８．９％であることを確認した。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
（３）豚舎内悪臭ガス低減効果
養豚に、ＣＪＢＳ３０３菌株を含む生菌剤を供与した場合、豚舎内悪臭ガスの発生量に及ぼす影響を確認した。総９６頭の７４日齢肥育豚を、２個グループに分類し、飼養試験を進めた。無添加飼料を供与した群を対照区に設定し、１pen当たり４頭、総１２penの育成豚に、対照区飼料を４週間供与した。一方、飼料内に１ｘ１０９ｃｆｕ／ｋｇのＣＪＢＳ３０３菌株が含まれた飼料を供与した群を処理区に設定し、１pen当たり４頭ずつ、総１２penの育成豚に、４週間、前記飼料を供与した。対照区と処理区は、それぞれ独立した豚舎で飼育し、既存に残っている豚舎内スラリーによる影響を排除するために、試験開始前、対照区と処理区との豚舎スラリーを同時に空にして試験を進めた。試験開始４日前から、毎日午前９時と午後４時とに、対照区及び処理区の豚舎を対象に、豚舎内ガスを測定した。アンモニア、硫化水素、複合悪臭及び揮発性脂肪酸（ＶＯＣｓ）は、精密悪臭測定機器（Odor Catch、ＳＬＣ−ＯＰ−１３５０、科学技術分析センター）を使用して測定し、メチルメルカプタンは、携帯悪臭ガス測定機器（ＭｕｌｔｉＲＡＥ）を使用して測定し、毎日測定されたデータは、週別にそれらの平均値を算出した。
【００７９】
その結果、表３、及び図７Ａないし図７Ｅに示されているように、全ての測定項目において、ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による悪臭ガス低減効果が観察され、そのような効果は、それぞれの飼料を供与してから４週目に、さらに確実に示された。特に、処理区において、硫黄系列の悪臭ガスである硫化水素とメチルメルカプタンは、５０％以上（Duncan、ｐ＞０．０１）、複合悪臭は、２０％以上の低減率を示し（Duncan、ｐ＞０．０５）、アンモニア、揮発性脂肪酸も、それぞれ１７％、２０％レベルの低減率を示した。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
実施例４．ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による養豚生産性評価
養豚に、ＣＪＢＳ３０３菌株を含む生菌剤を供与した場合、養豚生産性に及ぼす影響を確認した。前記実施例３の（３）と同一条件で、総９６頭の７４日齢肥育豚を、２個グループに分類して飼養試験を進めた。飼養試験開始前及び４週目試験終了後、個体の体重を測定し、日当たり増体量（ＡＤＧ：average daily gain）を算出し、毎日、飼料供与量と残量とを測定し、総日当たり飼料摂取量（ＡＤＦＩ：average daily feed intake）と飼料効率（ＦＣＲ：feed conversion ratio）とを算出した。
【００８２】
その結果、表４に示されているように、ＣＪＢＳ３０３菌株を供与した処理区は、対照区に比べ、日当たり飼料摂取量は、７．３％（Duncan、ｐ＜０．１）、日当たり増体量は、９．０％（Duncan、ｐ＜０．０３）ほど改善され、ＦＣＲも、０．０３ほど改善された。そのような試験結果は、ＣＪＢＳ３０３菌株の供与が、悪臭ガスの発生量を低減させるだけでなく、それによる養豚生産性にも、肯定的な効果を示すということを示すものである。
【００８３】
【表４】
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【００８４】
実施例５．ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果の検証
ＣＪＢＳ３０３菌株の供与による豚舎内悪臭ガス低減効果に対する再現性を確認するために、養豚場２ヵ所を対象に供与テストを進めた。最初農家（Ａ）は、育成豚舎（Ａ−１）と肥肉豚舎（Ａ−２）とに選定し、２番目農家（Ｂ）は、肥肉豚舎に選定し、各農家別の試験対象及び個体数は、表５の通りである。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
前記２つの農家のいずれも、育成豚または肥育豚に、飼料内に２ｘ１０９ｃｆｕ／ｋｇのＣＪＢＳ３０３菌株を含む試験飼料を３週間供与し、試験飼料供与前及び供与３週目の豚舎内悪臭ガス濃度を測定して低減率を計算した。アンモニア、硫化水素及びメチルメルカプタンは、携帯悪臭測定機器（ＭｕｌｔｉＲＡＥ）を使用して測定し、複合悪臭は、精密悪臭測定機器（Odor Catch、ＳＬＣ−ＯＰ−１３５０、科学技術分析センター）を使用し、午前９時に測定した。
【００８７】
その結果、図８Ａないし図８Ｄに示されているように、ＣＪＢＳ３０３菌株を供与した処理区において、アンモニアは、３９％以上、硫化水素は、２６％以上、メチルメルカプタンは、２４％以上、複合悪臭は、２１％以上の低減率を示した。また、そのような悪臭ガス低減効果は、養豚の成長段階である育成区間または肥肉区間にかかわらず、供与３週目から確認することができた。
【００８８】
前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明の技術的思想や、必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述した実施例は、全ての面において、例示的なものであり、限定的ではないと理解されなければならない。
【００８９】
寄託機関人：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２４３５Ｐ
受託日付け：２０１９０２１３
【００９０】
特許出願のための微生物寄託の
国際的承認に係わるブダペスト条約
国際的様式
Ｔｏ．ＣＪ第一製糖
大韓民国ソウル市中区東湖路３３０ ＣＪ第一製糖センター
１００−４００
本ページの下側に確認された国際寄託機関により、規則７．１に依拠して発行された寄託証原本
【表６】
2021517818.tif 000009
１ 規則６．４（ｄ）が適用される場合、そのような日時は、国際寄託機関の地位を獲得した日時である。
様式 ＢＰ／４
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2021517818.tif 000016
【図７Ｂ】
2021517818.tif 000017
【図７Ｃ】
2021517818.tif 000018
【図７Ｄ】
2021517818.tif 000019
【図７Ｅ】
2021517818.tif 000020
【図８Ａ】
2021517818.tif 000021
【図８Ｂ】
2021517818.tif 000022
【図８Ｃ】
2021517818.tif 000023
【図８Ｄ】
2021517818.tif 000024
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021517818.tif 000026
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