(57)【要約】  本発明は、細胞内のＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡを標的とし、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現低下は、特定の医学的障害、例えば、心血管関連疾患または障害の治療に有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ型デルタ(ＣＡＭＫ２Ｄ)転写物内の核酸配列に相補的、例えば完全に相補的である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)。
【請求項２】
少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％が、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の核酸配列に相補的である、請求項１記載のＡＳＯまたはその連続するヌクレオチド配列。
【請求項３】
ＣＡＭＫ２Ｄ転写物が、配列番号：１および配列番号：２からなる群から選択される、請求項１または２記載のＡＳＯ。
【請求項４】
ＡＳＯが、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を発現しているヒト細胞(例えば、ＨＥＫ２９３細胞)におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を低下させることができる、請求項１〜３いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項５】
ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現が、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質発現と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％低下する、請求項４記載のＡＳＯ。
【請求項６】
ＣＡＭＫ２Ｄ転写物を発現しているヒト細胞(例えば、ＨＥＫ２９３細胞)におけるＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現を低下させることができる、請求項１〜５いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項７】
ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現と比較して、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現が、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％低下する、請求項６記載のＡＳＯ。
【請求項８】
ＡＳＯがギャップマーである、請求項１〜７いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項９】
ＡＳＯが、ＬＬＬＤｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤｎＬＬＬＬまたはＬＬＬＬＬＤｎＬＬＬＬＬのデザインを有しており、ここでＬはヌクレオシドアナログであり、ＤはＤＮＡであり、ｎは４〜２４の間の任意の整数であり得る、請求項１〜８いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項１０】
ｎが、６〜１４の間の任意の整数であり得る、請求項９記載のＡＳＯ。
【請求項１１】
ｎが、８〜１２の間の任意の整数であり得る、請求項９記載のＡＳＯ。
【請求項１２】
ヌクレオシドアナログが、２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ；２'−Ｏ−メチルＲＮＡ(２'−ＯＭｅ)；２'−アルコキシ−ＲＮＡ；２'−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ(２'−ＭＯＥ)；２'−アミノ−ＤＮＡ；２'−フルオロ−ＲＮＡ；２'−フルオロ−ＤＮＡ；アラビノ核酸(ＡＮＡ)；２'−フルオロ−ＡＮＡ；または二環式ヌクレオシドアナログ(ＬＮＡ)を含む、請求項９〜１１いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項１３】
１以上のヌクレオシドアナログが、糖修飾ヌクレオシドである、請求項９〜１２いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項１４】
糖修飾ヌクレオシドが、親和性増強２'糖修飾ヌクレオシドである、請求項１３記載のＡＳＯ。
【請求項１５】
１以上のヌクレオシドアナログが、二環式糖を含有しているヌクレオシドを含む、請求項９〜１２いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項１６】
親和性増強２'糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡである、請求項１４記載のＡＳＯ。
【請求項１７】
ＬＮＡが、拘束性エチルヌクレオシド(ｃＥｔ)、２',４'−拘束性２'−Ｏ−メトキシエチル(ｃＭＯＥ)、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２'−Ｏ,４'−Ｃ−エチレン架橋核酸(ＥＮＡ)、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１６記載のＡＳＯ。
【請求項１８】
ＡＳＯが、１以上の５'−メチル−シトシン核酸塩基を含む、請求項１〜１７いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項１９】
ＡＳＯが、(ｉ)ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)におけるＣＡＭＫ２ＤをコードするｍＲＮＡレベルを低下させることができる；(ｉｉ)ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＣＡＭＫ２Ｄのタンパク質レベルを低下させることができる；(ｉｉｉ)心血管疾患または障害の１つ以上の症状を低下、改善または治療することができる；および(ｉｖ)それらを任意に組み合わせることができる、請求項１〜１８いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２０】
連続するヌクレオチド配列が、(ｉ)配列番号：１のヌクレオチド６２５〜８４２；(ｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド１,３９８〜５９,７５５；(ｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド６１,８１７〜１０４,７２５；(ｉｖ)配列番号：１のヌクレオチド１１２,１６２〜１１８,０２１；配列番号：１のヌクレオチド１１９,４４０〜１３５,２１９；(ｖｉ)配列番号：１のヌクレオチド１３７,５８７〜１５７,８５６；(ｖｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド１５９,１９１〜２６６,１７４；または(ｖｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド２７２,７８８〜３１０,９４９を含んでいる核酸配列に相補的である、請求項１〜１９いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２１】
連続するヌクレオチド配列が、(ｉ)配列番号：１の６７５〜７９２のヌクレオチド；(ｉｉｉ)配列番号：１の１,４４８〜５９,７０５のヌクレオチド；(ｉｉｉｉ)配列番号：１の６１,８６７〜１０４,６７５のヌクレオチド；(ｉｖ)配列番号：１の１１２,２１２〜１１７,９７１のヌクレオチド；(ｖ)配列番号：１の１１９,４９０〜１３５,１６９のヌクレオチド；(ｖｉ)配列番号：１の１３７,６３７〜１５７,８０６のヌクレオチド；(ｖｉｉ)配列番号：１の１５９,２４１〜２６６,１２４のヌクレオチド；または(ｖｉｉｉ)配列番号：１の２７２,８３８〜３１０,８９９のヌクレオチドを含んでいる核酸配列に相補的である、請求項１〜１９いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２２】
連続するヌクレオチド配列が、(ｉ)配列番号：１の７２５〜７４２のヌクレオチド；(ｉｉｉ)配列番号：１の１,４９８〜５９,６５５のヌクレオチド；(ｉｉｉ)配列番号：１の６１,９１７〜１０４,６２５のヌクレオチド；(ｉｖ)配列番号：１の１１２,２６２〜１１７,９２１のヌクレオチド；(ｖ)配列番号：１の１１９,５４０〜１３５,１１９のヌクレオチド；(ｖｉ)配列番号：１の１３７,６８７〜１５７,７５６のヌクレオチド；(ｖｉｉ)配列番号：１の１５９,２９１〜２６６,０７４；または(ｖｉｉｉ)配列番号：１の２７２,８８８〜３１０,８４９のヌクレオチドを含んでいる核酸配列に相補的である、請求項１〜１９いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２３】
連続するヌクレオチド配列が、１つまたは２つのミスマッチを有する配列番号：４〜配列番号：１７１３を含む、請求項１〜２２いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２４】
連続するヌクレオチド配列が、図１Ａおよび１Ｂの配列(配列番号：４〜配列番号：１７１３)から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２３いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２５】
連続するヌクレオチド配列が、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：１１４、配列番号：１５８、配列番号：１９０、配列番号：３２７、配列番号：４６３、配列番号：５１３、配列番号：５１６、配列番号：５１９、配列番号：６５７、配列番号：６５９、配列番号：８２７、配列番号：１２４９、配列番号：１３２６、配列番号：１４０９、配列番号：１５２４、配列番号：１５３０、配列番号：１６６２または配列番号：１６７６を含む、請求項１〜２４いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２６】
連続するヌクレオチド配列が、配列番号：５５、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：９２、配列番号：１０２、配列番号：１０５、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３３、配列番号：１３８、配列番号：１６１、配列番号：１７８、配列番号：１８０、配列番号：１８６、配列番号：１９５、配列番号：２００、配列番号：２０２、配列番号：２３４、配列番号：２６４、配列番号：３８７、配列番号：３９０、配列番号：３９６、配列番号：４４１、配列番号：４４６、配列番号：４５７、配列番号：４６７、配列番号：５２３、配列番号：５２４、配列番号：６３６、配列番号：６４０、配列番号：７００、配列番号：７４０、配列番号：８３２、配列番号：９６５、配列番号：１０１５、配列番号：１０６５、配列番号：１０７１、配列番号：１１５５、配列番号：１４７５、配列番号：１５０８、配列番号：１６８５、配列番号：１６８６、配列番号：１６８７、配列番号：１６８８または配列番号：１６９０を含む、請求項１〜２４いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２７】
大文字が糖修飾ヌクレオシドであり、小文字がＤＮＡである、図３のデザインからなる群から選択されるデザインを有する、請求項１または２６記載のＡＳＯ。
【請求項２８】
ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を発現しているｈｉＰＳＣ−ＣＭ細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を低下させることができる、請求項１〜２７いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項２９】
ＡＳＯに曝露されていない細胞と比較して、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現が、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低下する、請求項２８記載のＡＳＯ。
【請求項３０】
ＣＡＭＫ２Ｄ転写物を発現しているｈｉＰＳＣ−ＣＭ細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現を低下させることができる、請求項１〜２９いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項３１】
ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現が、ＡＳＯに曝露されていない細胞と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低下する、請求項３０記載のＡＳＯ。
【請求項３２】
約１４〜約２０ヌクレオチド長を有する、請求項１〜３１いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項３３】
ヌクレオチド配列が、１以上の修飾されたインターヌクレオシド結合を含む、請求項１〜３２いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項３４】
１以上の修飾されたインターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項１〜３３いずれか１項記載のＡＳＯ。
【請求項３５】
少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％のインターヌクレオシド結合が修飾されている、請求項３３または３４記載のＡＳＯ。
【請求項３６】
ＡＳＯ中のインターヌクレオシド結合の各々が、ホスホロチオエート結合である、請求項３５記載のＡＳＯ。 
【請求項３７】
ＡＳＯが、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合している、請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯを含むコンジュゲート。
【請求項３８】
非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分が、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３７記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯあるいは請求項３７または３８のコンジュゲートと、医薬的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項４０】
医薬的に許容される塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４１】
少なくとも１つの治療剤をさらに含む、請求項３９または４０記載の医薬組成物。
【請求項４２】
さらなる治療剤が、ＣＡＭＫ２Ｄアンタゴニストである、請求項４１記載の医薬組成物。
【請求項４３】
ＣＡＭＫ２Ｄアンタゴニストが、抗ＣＡＭＫ２ｄ抗体またはそのフラグメントである、請求項４２記載の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８記載のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物、および使用説明書を含む、キット。
【請求項４５】
請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８記載のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物、および使用説明書を含む、診断用キット。
【請求項４６】
細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を阻害または低下させる方法であって、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を発現する細胞に、請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８記載のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物を投与することを特徴とし、投与後に細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現が阻害または低下される、方法。
【請求項４７】
細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を阻害または低下させるインビトロ方法であって、請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物を、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を発現する細胞に接触させることを特徴とし、細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現が、接触後に阻害または低下される、方法。
【請求項４８】
ＡＳＯが、投与後に細胞内のＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現を阻害または低下させる、請求項４６または４７記載の方法。
【請求項４９】
ＡＳＯに曝露されていない細胞と比較して、投与後に、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現が、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低下する、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ＡＳＯに曝露されていない細胞と比較して、投与後に、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現が、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％減少する、請求項４６〜４９いずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
細胞が、心臓細胞、例えばｈｉＰＳＣ−ＣＭである、請求項４６〜５０いずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８記載のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物の有効量を、それが必要な対象に投与することを特徴とする、対象における心血管系疾患または障害の１以上の症状を低下、改善または治療する方法。
【請求項５３】
医薬品の製造のための請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８記載のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物の使用。
【請求項５４】
必要がある対象における心血管疾患または障害を治療するための医薬品の製造のための、請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８記載のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物の使用。
【請求項５５】
治療における使用のための請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８記載のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５６】
必要がある対象における心血管疾患または障害の治療に使用するための、請求項１〜３６いずれか１項記載のＡＳＯ、請求項３７もしくは３８記載のコンジュゲートまたは請求項３９〜４３いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５７】
心血管系疾患または障害が、冠動脈疾患、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜症性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、静脈血栓症またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１９記載のＡＳＯ、請求項５２記載の方法、請求項５４記載の使用または請求項５６記載の使用。
【請求項５８】
心血管系疾患または障害が、心不全である、請求項５７記載の方法、使用またはＡＳＯ。
【請求項５９】
心不全が、左心不全、右心不全、うっ血性心不全、駆出率低下型心不全(ＨＦｒＥＦ)、駆出率保存型心不全(ＨＦｐＥＦ)、駆出率中間型心不全(ＨＦｍｒＥＦ)、肥大型心筋症(ＨＣＭ)、高血圧性心疾患(ＨＨＤ)または高血圧性肥大型心筋症を含む、請求項５８記載の方法、使用またはＡＳＯ。
【請求項６０】
対象がヒトである、請求項５２および５７〜５９いずれか１項記載の方法、請求項５４および５７〜５９いずれか１項記載の使用または請求項５６〜５９いずれか１項記載の使用のためのＡＳＯ。
【請求項６１】
ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物が、心臓内、経口的、非経口的、髄腔内、脳室内、肺動脈内、局所的または静脈内に投与される、請求項５２および５７〜６０いずれか１項記載の方法、請求項５４および５７〜６０いずれか１項記載の使用または請求項５６〜６０いずれか１項記載の使用のためのＡＳＯの使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
ＥＦＳ−ＷＥＢ経由による電子出願を行った配列表の参照
本願において提出した電子書式により提出済の配列表の内容(名称：3338_102PC04_SequenceListing_ST25.txt, サイズ：７４６,３０２バイト；および作成日：２０１９年２月２０日)は、出典明示によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本明細書は、細胞内のカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ型δ(ＣＡＭＫ２Ｄ)転写物を標的とし、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を低下させるアンチセンスオリゴマー化合物(ＡＳＯ)に関する。ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現の低下は、心血管関連疾患または障害などの様々な医学的障害に有益であり得る。
【背景技術】
【０００３】
カルシウム／カルモジュリン(Ｃａ２＋／ＣａＭ)依存性セリン／スレオニンキナーゼ(ＣａＭＫ)は、ヒトプロテアソームの８１個のタンパク質ファミリーからなり、Ｃａ２＋シグナルを伝達することにより、細細胞シグナル伝達において中心的な役割を果たしている。約３０のスプライス変異体に加えて、４つのＣａＭＫＩＩアイソザイム(α、β、γ、δ)が、ヒトにおいて発現している[Braun, A.P., et al., Annual Review of Physiology 57:417-445(1995)]。これらの中で、ＣａＭＫＩＩδ(「ＣＡＭＫ２Ｄ」)タンパク質は、心臓に最も多く存在するアイソフォームであり、正常な心臓生理学の興奮収縮結合(ＥＣＣ)および弛緩プロセスにおいて重要な役割を果たしている[Mattiazzi A., et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 308:H1177-H1191 (2015)]。ＣＡＭＫ２Ｄ活性は、特定の心臓関連傷害(例えば、虚血再灌流傷害)後の回復プロセスにおいて重要であることも記載されている[Said M., et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 285:H1198-205 (2003)]。
【０００４】
様々な科学的進歩にも拘らず、心臓関連疾患は、依然として世界中の男女共に死亡原因の第一位である。米国心臓協会は、２０３０年までに米国の人口の４０％近くが何らかの心血管疾患に罹患し、その直接的な医療費は８,１８０億ドルに達すると予測している(Benjamin, E.J., et al., Circulation 135:e146-e603 (2017)を参照されたい)。しかし、Mattiazziらは、「ＣａＭＫＩＩの遍在性および様々なタンパク質のターゲットに対するその効果は、治療ツールとしてＣａＭＫＩＩ阻害剤を使用することへの難題である」と示している(Am J Physiol Heart Circ Physiol 308:H1177-H1191 (2015))。従って、非常に強力で費用対効果の高い新規の治療オプションが強く望まれている。
【０００５】
(発明の要旨)
本明細書は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ型δ(ＣＡＭＫ２Ｄ)転写物内の核酸配列に相補的である(例えば、完全に相補的である)１０〜３０ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)に関する。ある実施態様において、本願ＡＳＯまたはその連続するヌクレオチド配列は、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％相補的である。ある実施態様においては、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物は、配列番号：１および配列番号：２からなる群から選択される。
【０００６】
ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を発現しているヒト細胞(例えば、ＨＥＫ２９３細胞)におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を低下させることができる。ある実施態様において、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質発現は、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現に比べて、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％低下される。
【０００７】
ある実施態様において、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物を発現しているヒト細胞(例えば、ＨＥＫ２９３細胞)におけるＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現を低下させることができる。ある実施態様において、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現は、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現に比べて、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％低下される。
【０００８】
ある実施態様において、本明細書に開示されるＡＳＯはギャップマーである。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＬＬＬＤｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤｎＬＬＬＬまたはＬＬＬＬＬＤｎＬＬＬＬＬ(ここで、Ｌはヌクレオシドアナログであり、ＤはＤＮＡであり、ｎは４〜２４の間の任意の整数であり得る)のデザインを有する。ある実施態様において、ｎは、６〜１４の間の任意の整数であり得る。ある実施態様において、ｎは、８〜１２の間の任意の整数であり得る。
【０００９】
ある実施態様において、本明細書に開示されるＡＳＯのヌクレオシドアナログは、２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ；２'−Ｏ−メチルＲＮＡ(２'−ＯＭｅ)；２'−アルコキシ−ＲＮＡ；２'−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ(２'−ＭＯＥ)；２'−アミノ−ＤＮＡ；２'−フルオロ−ＲＮＡ；２'−フルオロ−ＤＮＡ；アラビノ核酸(ＡＮＡ)；２'−フルオロ−ＡＮＡ；または二環式ヌクレオシドアナログ(ＬＮＡ)を含む。ある実施態様において、ＡＳＯのヌクレオシドアナログのうちの１つ以上は、糖修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、糖修飾ヌクレオシドは、親和性増強２'糖修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、１以上のヌクレオシドアナログは、二環式糖を含んでいるヌクレオシドを含む。ある実施態様において、親和性増強２'糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡである。ある実施態様において、ＬＮＡは、拘束性エチルヌクレオシド(ｃＥｔ)、２',４'−拘束性２'−Ｏ−メトキシエチル(ｃＭＯＥ)、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２'−Ｏ,４'−Ｃ−エチレン架橋核酸(ＥＮＡ)、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、ＡＳＯは、１または複数の５'−メチル−シトシン核酸塩基を含む。
【００１０】
ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＳＯは、(ｉ)ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)において、ＣＡＭＫ２ＤをコードするｍＲＮＡレベルを低下させること；(ｉｉ)ｈｉＰＳＣ-ＣＭにおけるＣＡＭＫ２Ｄのタンパク質レベルを低下させること；(ｉｉｉ)心血管疾患または障害の１または複数の症状を軽減、改善または治療すること；および(ｉｖ)それらの任意に組み合わせが可能である。
【００１１】
ある実施態様において、ＡＳＯの連続するヌクレオチド配列は、(ｉ)配列番号：１のヌクレオチド６２５〜８４２；(ｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド１,３９８〜５９,７５５；(ｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド６１,８１７〜１０４,７２５；(ｉｖ)配列番号：１のヌクレオチド１１２,１６２〜１１８,０２１；(ｖ)配列番号：１のヌクレオチド１１９,４４０〜１３５,２１９；(ｖｉ)配列番号：１のヌクレオチド１３７,５８７−１５７,８５６；(ｖｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド１５９,１９１〜２６６,１７４；または(ｖｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド２７２,７８８〜３１０,９４９を含む核酸配列に相補的である。ある実施態様において、ＡＳＯの連続するヌクレオチド配列は、(ｉ)配列番号：１のヌクレオチド６７５〜７９２；(ｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド１,４４８〜５９,７０５；(ｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド６１,８６７〜１０４,６７５；(ｉｖ)配列番号：１のヌクレオチド１１２,２１２〜１１７,９７１；(ｖ)配列番号：１のヌクレオチド１１９,４９０〜１３５,１６９；(ｖｉ)配列番号：１のヌクレオチド１３７,６３７〜１５７,８０６；(ｖｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド１５９,２４１〜２６６,１２４；または(ｖｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド２７２,８３８〜３１０,８９９を含む核酸配列に相補的である。ある実施態様において、ＡＳＯの連続するヌクレオチド配列は、(ｉ)配列番号：１のヌクレオチド７２５〜７４２；(ｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド１,４９８〜５９,６５５；(ｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド６１,９１７〜１０４,６２５；(ｉｖ)配列番号：１のヌクレオチド１１２,２６２〜１１７,９２１；(ｖ)配列番号：１のヌクレオチド１１９,５４０〜１３５,１１９；(ｖｉ)配列番号：１のヌクレオチド１３７,６８７〜１５７,７５６；(ｖｉｉ)配列番号：１の１５９,２９１〜２６６,０７４；または(ｖｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド２７２,８８８〜３１０,８４９を含む核酸配列に相補的である。
【００１２】
ある実施態様において、ＡＳＯの連続するヌクレオチド配列は、１または２つのミスマッチを含む配列番号：４〜配列番号：１７１３を含む。ある実施態様において、ＡＳＯの連続するヌクレオチド配列は、図１Ａおよび１Ｂ(配列番号：４〜配列番号：１７１３)の配列から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＡＳＯの連続するヌクレオチド配列は、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：１１４、配列番号：１５８、配列番号：１９０、配列番号：３２７、配列番号：４６３、配列番号：５１３、配列番号：５１６、配列番号：５１９、配列番号：６５７、配列番号：６５９、配列番号：８２７、配列番号：１２４９、配列番号：１３２６、配列番号：１４０９、配列番号：１５２４、配列番号：１５３０、配列番号：１６６２または配列番号：１６７６を含む。ある実施態様において、ＡＳＯの連続するヌクレオチド配列は、配列番号：５５、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：９２、配列番号：１０２、配列番号：１０５、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３３、配列番号：１３８、配列番号：１６１、配列番号：１７８、配列番号：１８０、配列番号：１８６、配列番号：１９５、配列番号：２００、配列番号：２０２、配列番号：２３４、配列番号：２６４、配列番号：３８７、配列番号：３９０、配列番号：３９６、配列番号：４４１、配列番号：４４６、配列番号：４５７、配列番号：４６７、配列番号：５２３、配列番号：５２４、配列番号：６３６、配列番号：６４０、配列番号：７００、配列番号：７４０、配列番号：８３２、配列番号：９６５、配列番号：１０１５、配列番号：１０６５、配列番号：１０７１、配列番号：１１５５、配列番号：１４７５、配列番号：１５０８、配列番号：１６８５、配列番号：１６８６、配列番号：１６８７、配列番号：１６８８または配列番号：１６９０を含む。
【００１３】
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、図３のデザインからなる群から選択されるデザインを有し、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡである。
【００１４】
ある実施態様において、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を発現しているｈｉＰＳＣ−ＣＭ細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を低下させることができる。ある実施態様において、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現は、ＡＳＯに曝露されていない細胞と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低下される。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物を発現しているｈｉＰＳＣ−ＣＭ細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現を低下させることができる。ある実施態様において、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現は、ＡＳＯに曝露されていない細胞と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低下される。
【００１５】
ある実施態様において、ＡＳＯは、１４〜２０のヌクレオチド長を有する。ある実施態様において、ＡＳＯのヌクレオチド配列は、１以上の修飾されたインターヌクレオシド結合を含む。ある実施態様において、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％のインターヌクレオシド結合が修飾されている。特定の実施態様においては、本願ＡＳＯにおけるインターヌクレオチド結合の各々は、ホスホロチオエート結合である。
【００１６】
本明細書は、本明細書に開示されるＡＳＯを含むコンジュゲートを提供し、ここで該ＡＳＯは、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部位に共有結合的に結合している。ある実施態様において、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部位は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１７】
また、本明細書において提供されるものは、本明細書に開示されるＡＳＯまたはそのコンジュゲートと、医薬的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む医薬組成物である。特定の実施態様において、医薬的に許される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩を含む。ある実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１つの別の治療剤をさらに含む。ある実施態様において、別の治療剤とは、ＣＡＭＫ２Ｄアンタゴニストである。ある実施態様において、ＣＡＭＫ２Ｄアンタゴニストは、抗ＣＡＭＫ２Ｄ抗体またはそのフラグメントである。
【００１８】
本明細書は、本明細書に開示されるＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物およびその使用説明書を含むキットをさらに提供する。また、本明細書は、当該ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物およびその使用説明書を含む診断用キットも提供する。
【００１９】
本明細書は、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を発現する細胞に、本明細書に開示されるＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することを特徴とする、細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を阻害または低下させる方法であって、この投与後に、細胞中のＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現が、阻害または低下される方法に関する。ある実施態様において、本発明は、細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を阻害または低下させるインビトロの方法であって、本明細書に開示されるＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物を、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を発現する細胞に接触させることを含み、この接触後に細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現が、阻害または低下される方法に関する。ある実施態様では、ＡＳＯは、投与後の細胞内のＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現を阻害または低下させる。ある実施態様において、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現は、ＡＳＯに曝露されていない細胞と比較して、投与後に少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低下される。ある実施態様において、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現は、ＡＳＯに暴露されていない細胞と比較して、投与後に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％低下される。ある実施態様において、細胞は、心臓の細胞(例えば、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)である。
【００２０】
本明細書で提供される方法は、対象における心血管疾患または障害の１つ以上の症状を、軽減、改善または治療する方法であって、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物の有効量を対象に投与することを特徴とする方法に関する。本明細書は、医薬品製造のための本明細書のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物の使用もまた提供する。ある実施態様では、医薬品は、それを必要とする対象における心血管疾患または障害を治療するためのものである。ある実施態様において、本願ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、治療に使用するためのものである。ある実施態様において、本願ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、それを必要とする対象における心血管疾患または障害の治療における使用のためのものである。
【００２１】
ある実施態様において、心血管疾患または障害は、冠動脈疾患、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜症性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、静脈血栓症またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施態様において、心血管疾患または障害は、心不全である。ある実施態様において、心不全は、左心不全、右心不全、うっ血性心不全、駆出率低下型心不全(ＨＦｒＥＦ)、駆出率保存型心不全(ＨＦｐＥＦ)、駆出率中間型心不全(ＨＦｍｒＥＦ)、肥大型心筋症(ＨＣＭ)、高血圧性心疾患(ＨＨＤ)または高血圧性肥大型心筋症からなる。
【００２２】
ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様では、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、心臓内、経口的、非経口的、髄腔内、脳室内、肺動脈内、局所的または静脈内に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とするＡＳＯの例を示す。図１Ａは、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内の単一部位を標的とするＡＳＯを示す。図１Ｂは、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内の複数の部位(すなわち、２または３)を標的とするＡＳＯを示す。図１Ａおよび図１Ｂの各列は、ＡＳＯの配列のみに指定された配列番号、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列上の標的開始位置および終了位置(図１Ｂの場合、複数の標的部位は＃１、＃２または＃３として特定される)、いずれの特定のデザインまたは化学構造も持たないＡＳＯ配列、ＡＳＯ番号(ＡＳＯ Ｎｏ.)および化学構造を持つＡＳＯ配列を示す。
【図２】図２は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ発現の低下パーセント(ｙ軸)およびＣＡＭＫ２Ｄ転写物上のＡＳＯの相対位置(ｘ軸)の両方を示す。各丸印は、個々のＡＳＯを表す。実施例２にさらに記載したように、ＨＥＫ２９３細胞をＡＳＯ(２５ μＭ)で処理して、ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ発現(ＧＡＰＤＨに対して正規化)を対照のパーセンテージとして示す。
【図３】図３は、特定の例示的なＡＳＯをそのデザインにより示す。図３の各列は、ＡＳＯ配列のみに対する配列番号、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ-ｍＲＮＡ配列上の標的開始位置および終了位置(ＡＳＯが複数の部位に結合する場所(図１Ｂを参照されたい)、例示的な標的開始位置および終了位置が提供される)、ＡＳＯデザイン番号、デザインによるＡＳＯ配列およびＡＳＯ番号(ＡＳＯ Ｎｏ.)を示す。
【図４】図４は、実施例２および３に記載された通りの様々なＡＳＯを用いてインビトロで培養した後のＨＥＫ２９３細胞およびヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)双方におけるＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ発現パーセントの低下を示す。細胞を、２５μＭ(ＨＥＫ２９３)または５００ｎＭ(ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)のＡＳＯで処理して、ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ発現(ＧＡＰＤＨに対して正規化)を対照のパーセントとして示す。値が示されていない場合には、特定のＡＳＯは、特定の条件下で試験されていない。
【図５】図５は、皮下投与１週間後のＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍマウスにおけるＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ発現レベルに対する例示的なＡＳＯの効力を示す。ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ発現レベルを、ＧＡＰＤＨに対して正規化して、その後対照群(即ち、生理食塩水で処理したサンプル)との比較により示した。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
Ｉ．定義
用語「ａ」または「ａｎ」冠詞は、その実体の１つ以上を指すことに留意されたい；例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すものと理解される。このように、用語「ａ」(または「ａｎ」)、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００２５】
さらに、本明細書で使用される場合の「および／または」は、他のものを有するか、またはそれを伴わない、２つの特定の特徴または構成要素夫々の具体的な開示として理解されるべきである。従って、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」のような語句を使用した用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独で)および「Ｂ」(単独で)を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」のような語句で使用される用語「および／または」は、以下の各側面を包含することが意図される。Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)である。
【００２６】
本明細書において「含む」なる用語を用いて記載されている場合は、いずれも「からなる」および／または「本質的にからなる」という用語で記載されている別の類似した態様を提供されることも理解されよう。
【００２７】
別段の記載が無い限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本明細書に関連する当業者が、一般的に理解するのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressが、本明細書において使用される多くの用語についての一般的な辞書として提供される。
【００２８】
単位、接頭辞および記号は、Systeme International de Unites (SI)が認める形式で示される。数値範囲とは、範囲を規定するその数字を含んでいる。別段の記載が無い限り、ヌクレオチド配列は、５'から３'の方向に左から右に記載される。アミノ酸配列は、アミノ配向からカルボキシ配向にて左から右に記載される。本明細書において示される見出しは、本明細書全体として参照として存在し得るものであり、本明細書の様々な態様を制限するものではない。従って、以下に定義される用語は、本明細書の参照することによって、その全体をさらに完全に定義される。
【００２９】
本明細書における用語「約」は、おおよそ、大体、辺り、または領域内で存在することを意味するよう使用される。用語「約」が、数値の範囲と一緒に使用される場合、規定された数値の上下の境界を拡張することによりその範囲を修正する。一般的に、用語「約」とは、例えば１０％の変動、上下(高いまたは低い)の変動によって、記載された数値の上と下を修正することができる。例えば、「ＡＳＯは、ＡＳＯの投与後の細胞におけるＣＡＭＫ２ｄタンパク質の発現を、少なくとも約６０％低下させる」と記載されている場合、ＣＡＭＫ２ｄレベルが５０％〜７０％の範囲で低下していることを示している。
【００３０】
用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、複数の核酸を包含することが意図される。ある実施態様において、用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、標的配列、例えば、インビボまたはインビトロでのｐｒｅ ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＤＮＡを指す。この用語が標的配列中の核酸またはヌクレオチドを指す場合、核酸またはヌクレオチドは、細胞内で天然に存在する配列であり得る。別の実施態様において、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本明細書のＡＳＯ中の配列を指す。この用語がＡＳＯ中の配列を指す場合、核酸またはヌクレオチドは、天然に存在しない、即ち化学的に合成されたもの、酵素的に作成されたもの、組換え的に作成されたもの、またはそれらの任意の組み合わせである。一実施態様において、ＡＳＯ中の核酸またはヌクレオチドは、合成的または組換え的に生成されるが、天然に存在する配列またはその断片ではない。別の実施態様において、ＡＳＯ中の核酸またはヌクレオチドは、天然には存在しない少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含んでいるという理由から、それらは天然には存在しないものである。用語「核酸」または「ヌクレオシド」は、ポリヌクレオチド中に存在する単一の核酸セグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのアナログを指す。「核酸」または「ヌクレオシド」は、天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸を含む。ある実施態様において、用語「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は、互換的に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列を示す場合、引用されるのは、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵなどの塩基の配列およびそれらのアナログであることは認識されよう。
【００３１】
本明細書において使用される用語「ヌクレオチド」は、糖部位、塩基部位およびリン酸塩またはホスホロチオエートインターヌクレオチド結合基のような共有結合により結合された基(連結基)を含む配糖体を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡのような天然に存在するヌクレオチドならびに修飾された糖部位および／または塩基部位からなる天然に存在しないヌクレオチドの両方を包含し、これらは本明細書では「ヌクレオチドアナログ」とも呼ばれる。ここでは、単一のヌクレオチド(単位)は、モノマーまたは核酸単位とも呼ばれ得る。特定の実施態様において、「ヌクレオチドアナログ」という用語は、修飾糖部位を有するヌクレオチドを指す。修飾糖部位を有するヌクレオチド(例えば、ＬＮＡ)の非限定的な例は、本明細書の別の個所に開示されている。別の実施態様において、「ヌクレオチドアナログ」という用語は、修飾核酸塩基部位を有するヌクレオチドを指す。修飾された核酸塩基部位を有するヌクレオチドには、５−メチル−シトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本明細書において使用される用語「ヌクレオシド」は、糖部位と塩基部位からなるグリコシドを示すために使用され、そのためＡＳＯのヌクレオチド間のインターヌクレオチド結合によって共有結合されたヌクレオチド単位を指す場合に使用することができる。バイオテクノロジーの分野では、「ヌクレオチド」という用語は、核酸モノマーまたは核酸単位を指すために使用されることが多い。ＡＳＯに関する文脈において、用語「ヌクレオチド」とは、塩基単独、即ちシトシン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、グアニン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、アデニン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、チミン(ＤＮＡ)およびウラシル(ＲＮＡ)からなる核酸塩基配列を指し得る；この場合、糖骨格およびヌクレオチド間連結の存在は暗黙的である。この様に、特に、１つ以上のインターヌクレオチド連結基が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」を指すことができる。例えば、ヌクレオシド間の連結の存在または性質を特定する場合であっても、用語「ヌクレオチド」を使用することができる。
【００３３】
本明細書において使用される用語「ヌクレオチド長」とは、所定の配列中のヌクレオチド(モノマー)の総数を意味する。例えば、ｔａｃａｔａｔａｔａｔｔａｃｔｃｃｔｃ(配列番号：１５８)の配列は、２０個のヌクレオチドを有する；従って、この配列のヌクレオチド長は２０となる。従って、用語「ヌクレオチド長」は、本明細書において「ヌクレオチド数」と互換的に使用される。
【００３４】
当業者には認識されようが、オリゴヌクレオチドの５'末端ヌクレオチドは、５'末端基を含み得るが、５'インターヌクレオチド連結基を含んでいない。
【００３５】
本明細書において使用されるように、用語「アルキル」は、単独で、または組み合わせにおいて、１〜８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基、特に１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基、より特に１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基を意味する。直鎖または分岐鎖Ｃ１−Ｃ８アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル異性体、ヘキシル異性体、ヘプチル異性体およびオクチル異性体が挙げられ、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルが挙げられる。アルキルの特に例はメチルである。別のアルキルの例は、モノ、ジまたはトリフルオロメチル、エチルまたはプロピル、例えばシクロプロピル(ｃＰｒ)、あるいはモノ、ジまたはトリフルオロシクロプロイルである。
【００３６】
用語「アルコキシ」は、単独で、または組み合わせにおいて、式：アルキル−Ｏ−の基を意味し、式中の「アルキル」という用語は、前段に記載した意味、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ.ブトキシおよびｔｅｒｔ.ブトキシを示すことを意味する。特に「アルコキシ」とは、メトキシである。
【００３７】
用語「オキシ」は、単独で、または組み合わせにおいて、−Ｏ−基を意味する。
【００３８】
用語「アルケニル」は、単独で、または組み合わせにおいて、オレフィン結合および最大８個、好ましくは最大６個、特に好ましくは最大４個の炭素原子を含んでいる直鎖または分枝鎖の炭化水素基を意味する。アルケニル基の例としては、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニルおよびイソブテニルが挙げられる。
【００３９】
用語「アルキニル」は、単独で、または組み合わせにおいて、三重結合および最大８個、好ましくは最大６個、特に好ましくは最大４個の炭素原子を含んでいる直鎖または分枝鎖の炭化水素基を意味する。
【００４０】
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、単独で、または組み合わせにおいて、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味し、特にフッ素、塩素または臭素、より好ましくはフッ素および塩素、例えばフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基との組み合わせにおいて、少なくとも１つのハロゲン、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜４個のハロゲン、すなわち１、２、３または４個のハロゲンで置換された該基を意味する。用語「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」は、単独で、または組み合わせにおいて、−ＯＨ基を意味する。
【００４１】
用語「チオヒドロキシル」および「チオヒドロキシ」は、単独で、または組み合わせにおいて、−ＳＨ基を意味する。
【００４２】
用語「カルボニル」は、単独で、または組み合わせにおいて、−Ｃ(Ｏ)−基を意味する。
【００４３】
用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、単独で、または組み合わせにおいて、-ＣＯＯＨ基を意味する。
【００４４】
用語「アミノ」は、単独で、または組み合わせにおいて、第一級アミノ基(−ＮＨ２)、第二級アミノ基(−ＮＨ−)または第三級アミノ基(−Ｎ−)を表す。
【００４５】
用語「アルキルアミノ」は、単独で、または組み合わせにおいて、上記で定義されているように、１つまたは２つのアルキル基で置換されたアミノ基を意味する。
【００４６】
用語「アミノカルボニル」は、単独でまたは組み合わせて、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ２基を意味する。
【００４７】
用語「スルホニル」は、単独で、または組み合わせにおいて、−ＳＯ２基を意味する。
【００４８】
用語「スルフィニル」は、単独で、または組み合わせにおいて、−ＳＯ−基を意味する。
【００４９】
用語「スルファニル」は、単独で、または組み合わせにおいて、−Ｓ−基を意味する。
【００５０】
用語「シアノ」は、単独で、または組み合わせにおいて、−ＣＮ基を意味する。
【００５１】
用語「アジド」は、単独で、または組み合わせにおいて、−Ｎ３基を意味する。
【００５２】
用語「ニトロ」は、単独で、または組み合わせにおいて、ＮＯ２基を意味する。
【００５３】
用語「ホルミル」は、単独で、または組み合わせにおいて、−Ｃ(Ｏ)Ｈ基を意味する。
【００５４】
用語「アリール」は、単独で、または組み合わせにおいて、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で任意に置換されている６〜１０個の炭素環原子を含んでいる、一価の芳香族炭素環の単環系または二環系を表す。アリールの例としては、フェニルおよびナフチル、特にフェニルが挙げられる。
【００５５】
用語「ヘテロアリール」は、単独で、または組み合わせにおいて、５〜１２個の環原子の一価の芳香族ヘテロ環の単環系または２環系を表し、これらは、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含んでおり、残りの環原子は、炭素であって、これらはハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で任意に置換されていてもよい。ヘテロアリールの例としては、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリルまたはアクリジニルなどが挙げられる。
【００５６】
用語「ヘテロサイクル」は、単独で、または組み合わせにおいて、５〜１２個の環原子の一価の非芳香族ヘテロ環の単環系または二環系を示しており、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含んでおり、残りの環原子は炭素であり、これらは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００５７】
用語「保護基」は、単独で、または組み合わせにおいて、多官能性化合物の反応性部位を選択的に遮断し、保護されていない別の反応性部位で化学反応を選択的に行うことができるような基を意味する。保護基は、除去することができる。保護基の例は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。
【００５８】
本発明の出発物質または化合物のうちの１つが、１つ以上の反応ステップの反応条件下において安定でないか、または反応性である１つ以上の官能基を含む場合、適切な保護基(例えば、"Protective Groups in Organic Chemistry" by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New Yorkに記載されている)を、当技術分野において既知の方法を適用する重要な工程の前に導入することができる。そのような保護基は、文献に記載されている標準的な方法を用いて、合成後の段階で除去することができる。保護基の例としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル(Ｂｏｃ)、９−フルオレニルメチルカルバメート(Ｆｍｏｃ)、２−トリメチルシリルエチルカルバメート(Ｔｅｏｃ)、カルボベンジルオキシ(Ｃｂｚ)およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル(Ｍｏｚ)が挙げられる。
【００５９】
本明細書に記載される化合物は、複数の不斉中心を含むことが可能であり、光学純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体、ジアステレオアイソマーの混合物、ジアステレオアイソマーのラセミ体、またはジアステレオアイソマーのラセミ体の混合物などのエナンチオマーの混合物の形で存在することができる。
【００６０】
用語「不斉炭素原子」とは、４つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。カーン・インゴルド・プレローグ順位則に従い、不斉炭素原子は、「Ｒ」または「Ｓ」の立体配置であり得る。
【００６１】
本明細書において使用される場合、用語「二環式糖」は、４〜７員環の２つの原子を連結して第２の環を形成し、二環式構造をもたらす架橋を含んでいる４〜７員環を含む修飾糖部分を指す。ある実施態様において、架橋は、ＬＮＡヌクレオシドにおいて見られるように、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２'およびＣ４'を連結する(即ち、２'−４'架橋)。
【００６２】
本明細書において使用される場合、用語「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」(ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ)は、通常、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられ、フランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「ＵＴＲ」)などは、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は、通常、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５'末端の開始コドンならびに得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３'末端の翻訳終止コドンによって決定される。
【００６３】
本明細書で使用されるような用語「非コード領域」は、コード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例としては、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「ＵＴＲ」)、非コードエクソンなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。エクソンの一部は、各転写物の５'非翻訳領域(５'ＵＴＲ)の全部または一部であってもよいし、３'非翻訳領域(３'ＵＴＲ)の一部であってもよい。未翻訳領域は、転写物の効率的な翻訳のために重要であり、転写物の翻訳速度や半減期を制御するために重要である。
【００６４】
ヌクレオチド配列の表現において使用される場合の「領域」なる用語は、その配列の一部分を指す。例えば、「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補体内の領域」という表現は、各々、ヌクレオチド配列より短いが、特定のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補体内に位置する少なくとも１０ヌクレオチドより長い配列を指す。用語「下位配列」または「サブシークエンス」とは、ヌクレオチド配列のある領域を指すこともできる。
【００６５】
ヌクレオチド配列を指す場合、用語「下流」は、核酸またはヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に対して３'に位置することを意味する。特定の実施態様においては、下流のヌクレオチド配列は、転写の開始点に後続する配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
【００６６】
「上流」なる用語は、参照ヌクレオチド配列に対して５'に位置するヌクレオチド配列を指す。
【００６７】
本明細書で使用されるように、用語「調節領域」とは、コード領域の上流(５'非コード配列)、内部または下流(３'非コード配列)に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響を与える。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ＵＴＲおよびステムループ構造を含むことができる。コード領域が真核生物細胞での発現を目的としている場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に対して３'の位置にある。
【００６８】
本明細書で使用される用語「転写物」は、ＤＮＡの転写によって合成され、プロセシング後にメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)となる一次転写物、即ち、前駆体メッセンジャーＲＮＡ(ｐｒｅ−ｍＲＮＡ)およびプロセシング後のｍＲＮＡ自体を指すことができる。用語「転写物」は、「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」および「ｍＲＮＡ」と互換的に使用することができる。ＤＮＡ鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、いくつかの方法で修飾され、成熟した機能的な形態に変換され、様々なタンパク質およびＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを生成する。従って、「転写物」という用語には、エクソン、イントロン、５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲが含まれ得る。
【００６９】
本明細書で使用される用語「発現」とは、ポリヌクレオチドが、遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。これには、限定するものではないが、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)への転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発現により、「遺伝子産物」が生じる。本明細書で使用されるように、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡまたは転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化またはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、別のタンパク質サブユニットとの結合またはタンパク質分解的切断を伴うポリペプチドをさらに含む。
【００７０】
２つ以上の核酸の表現において「同一性」または％「同一性」という用語は、保存的なアミノ酸置換を配列同一性の一部として考慮せず、最大の対応性を得るために比較およびアラインメント(必要に応じてギャップを導入する)したときに、同一であるか、または同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する２つ以上の配列を指す。％同一性は、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを用いて、または目視により測定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用できる様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当技術分野で知られている。
【００７１】
配列アライメントアルゴリズムに関するそのような非限定的な例の１つは、Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268に記載されたアルゴリズム、Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877を改変したアルゴリズムおよびＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)に組み込まれたアルゴリズムである。特定の実施態様において、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されている通りに使用することができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２(Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480)、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２(Genentech, South San Francisco, California)またはＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)は、配列を対応させるために使用することができる追加の公衆利用可能なソフトウェアプログラムである。特定の実施態様において、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム(例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリックスを使用して、４０、５０、６０、７０または９０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを用いる)を使用して決定される。別の特定の実施態様においては、NedleldermanおよびWunchのアルゴリズムを組み込んでいるＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)、２つのアミノ酸配列間の％同一性を決定することができる(例えば、BLOSUM 62 マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５のレングスウェイトを用いる)。あるいは、ある実施態様において、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の％同一性は、マイヤーズおよびミラー(CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して決定される。例えば、％同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)を使用して、加重残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップ長ペナルティを含むＰＡＭ１２０を使用して決定することができる。当業者は、特定のアライメントソフトウェアを使用して、最大アライメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施態様においては、アライメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【００７２】
特定の実施態様において、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との％同一性「Ｘ」は、１００×(Ｙ／Ｚ)として計算され、Ｙは、第１および第２の配列のアラインメント(目視または特定の配列アラインメントプログラムによってアラインメントされたもの)において、同一であり一致するとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列と第２の配列の％同一性の割合は、第１の配列と第２の配列の％同一性の割合よりも高くなる。
【００７３】
ポリヌクレオチドの参照配列とアラインメントされた単一のポリヌクレオチド標的配列内の異なる領域は、各々、それ自体の％配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性の値は、十分の一が四捨五入されていることに留意されたい。例えば、８０.１１、８０.１２、８０.１３および８０.１４は８０.１に切り捨てられ、８０.１５、８０.１６、８０.１７、８０.１８および８０.１９は８０.２に切り上げられる。また、長さの値が常に整数になることにも留意されたい。
【００７４】
本明細書で使用されるように、用語「相同」および「相同性」は、用語「同一」および「同一性」と互換性がある。
【００７５】
用語「その天然の変異体」は、定義された分類群、例えば、マウス、サルおよびヒトなどの哺乳類において自然に存在するＣＡＭＫ２Ｄポリペプチド配列またはＣＡＭＫ２Ｄ核酸配列(例えば、転写物)の変異体を指す。通常、ポリヌクレオチドの「天然の変異体」と言う場合、この用語は、染色体転座または複製によって染色体位置４ｑ２６(即ち、GenBank Accession No. NC_000004.12の残基113,451,032から113,761,927)に存在するＣＡＭＫ２Ｄコード化ゲノムＤＮＡの任意の対立遺伝子変異およびそれにより得られるｍＲＮＡなどのＲＮＡも含むことが可能である。「天然の変異体」は、ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡの代替スプライシングから得られる変異体も含むことができる。特定のポリペプチド配列を参照する場合、例えば、前記用語は、タンパク質の天然の形態も含んでいるため、これは、共翻訳または翻訳後修飾(例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解的切断、グリコシル化など)によりプロセシングされ得る。
【００７６】
本明細書のＡＳＯ(またはその領域)および本明細書に開示された哺乳類のＣＡＭＫ２Ｄをコードする核酸(例えば、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子)の標的領域の間の「相補性」の程度を決定する際に、「相補性」(また、「相同性」または「同一性」)の程度は、ＡＳＯ(またはその領域)の配列と、それに最も良くアラインメントする標的領域の配列(または標的領域の逆相補体)との間の％同一性(または％の相同性)として表現される。％は、２つの配列間にて同一であるアラインメントされた塩基数を計測し、ＡＳＯ中の連続するモノマーの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、ギャップが存在する場合、そのギャップは、ギャップ内のモノマーの数が本明細書のＡＳＯと標的領域との間で異なる領域ではなく、単なるミスマッチであることが好ましい。
【００７７】
本明細書で使用される用語「相補性」は、参照配列に相補的な配列を示す。相補性とは、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列の間で共有される性質であり、それらが互いに反平行に配列されたときに、配列の各位置のヌクレオチド塩基が相補的となるようものであり、ＤＮＡの複製および転写の基本原理であることはよく知られており、鏡を見て物事の逆が見える事によく似ている。従って、例えば、５'"ＡＴＧＣ"３'の配列の相補体は、３'"ＴＡＣＧ"５'または５'"ＧＣＡＴ"３'と書くことができる。本明細書で使用される用語「逆相補体」、「逆相補性」および「逆相補的」とは、「相補体」、「相補性」および「相補的」という用語と互換性がある。ある実施態様において、用語「相補的」とは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の連続する核酸配列と１００％一致または相補性(すなわち、完全に相補的)であることを指す。ある実施態様においては、用語「相補的」とは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の連続する核酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の一致または相補性を指す。
【００７８】
２つの別々の核酸またはヌクレオチド配列を参照する場合、「対応する」および「に対応している」という用語は、特定の配列のヌクレオチドに異なる番号を付けることができるが、相同性および／または機能性に基づいて互いに対応するか、または互いに類似している配列の領域を明確にするために使用することができる。例えば、遺伝子転写物の様々なアイソフォームは、類似または保存された部分を有し得るが、この各アイソフォームにおける番号付けは、別のスプライシングおよび／または他の改変に基づいて異なり得る。また、核酸またはヌクレオチド配列(例えば、遺伝子転写物および翻訳開始コドンから番号付けを開始するか、または５'ＵＴＲを含む)の特徴付けを行う場合、異なる番号付けシステムを採用し得ることが認識されている。さらに、遺伝子または遺伝子転写物が異なる変異体の核酸またはヌクレオチド配列は変わり得ることも認識される。しかし、本明細書で使用されるように、核酸またはヌクレオチド配列の相同性および／または機能性を共有する変異体の領域は、互いに「対応する」とみなされる。例えば、配列番号：１のヌクレオチドＸ〜Ｙに対応するＣＡＭＫ２Ｄ転写物のヌクレオチド配列(「参照配列」)は、配列番号：１のヌクレオチドＸからＹと同一の配列または類似の配列を有するＣＡＭＫ２Ｄ転写物配列(例えば、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ)を指し、ここで、Ｘは開始部位であり、Ｙは終了部位である(図１Ａおよび１Ｂに示す通り)。当業者は、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の配列を配列番号：１とアラインメントすることにより、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の配列中の対応するＸおよびＹ残基を同定することができる。
【００７９】
「対応するヌクレオチドアナログ」および「対応するヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドアナログ中の核酸塩基と天然に存在するヌクレオチドが、同じ対合を形成する能力、即ちハイブリダイゼーション能を有することを示すことを意図している。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンと結合されている場合、「対応するヌクレオチドアナログ」は、アデニンと結合されたペントース単位(２−デオキシリボースとは異なる)を含む。
【００８０】
本明細書で使用されるような用語「ＤＥＳ番号」または「ＤＥＳ Ｎｏ.」は、ヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)およびヌクレオシドアナログ(例えば、ＬＮＡ)の特異的なパターンを有するヌクレオチド配列に与えられる固有の番号を指す。本明細書で使用される通り、ＡＳＯのデザインは、大文字と小文字の組み合わせによって示される。例えば、ＤＥＳ−０２３１は、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬ(即ち、ＴＡＣａｔａｔｔａｔａｔｔａｃｔｃＣＴＣ)のＡＳＯデザインを有するｔａｃａｔａｔａｔａｔｔａｃｔｃｃｔｃ(配列番号：１５８)のＡＳＯ配列を指し、Ｌ(即ち、大文字)はヌクレオシドアナログ(例えば、ＬＮＡ)を示し、Ｄ(即ち、小文字)はヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)を示す。
【００８１】
ＡＳＯ化学の注釈は以下の通りである：β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオチドは、ＯｘｙＢにより表され、ここでＢは、ヌクレオチド塩基、例えばチミン(Ｔ)、ウリジン(Ｕ)、シトシン(Ｃ)、５−メチルシトシン(ＭＣ)、アデニン(Ａ)またはグアニン(Ｇ)などを指定し、ＯｘｙＡ、ＯｘｙＴ、ＯｘｙＭＣ、ＯｘｙＣおよびＯｘｙＧが含まれる。ＤＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡｂにより表され、ここで小文字のｂは、ヌクレオチド塩基、例えばチミン(Ｔ)、ウリジン(Ｕ)、シトシン(Ｃ)、５−メチルシトシン(Ｍｃ)、アデニン(Ａ)またはグアニン(Ｇ)などを指定するもので、ＤＮＡａ、ＤＮＡｔ、ＤＮＡおよびＤＮＡｇが含まれる。Ｃまたはｃの前の文字「Ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。文字「ｓ」は、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を示す。
【００８２】
本明細書で使用される「ＡＳＯ番号」または「ＡＳＯ Ｎｏ.」という用語は、構成要素、例えばヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)、ヌクレオシドアナログ(例えば、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ)、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＭＣ)およびバックボーン構造(例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジエステル)の詳細な化学構造を有するヌクレオチド配列に与えられた固有の番号を指す。例えば、ＡＳＯ−０２３１は、ＯｘｙＴｓ  ＯｘｙＡｓ  ＯｘｙＭＣｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｃｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡｃｓ  ＯｘｙＭＣｓ  ＯｘｙＴｓ  ＯｘｙＭＣを示すことができる。
【００８３】
「力価」とは、別段の断りのない限り、通常、ＩＣ５０またはＥＣ５０値として、μＭ、ｎＭまたはｐＭで表される。また、力価は、阻害率で表すこともできる。ＩＣ５０は、治療分子の阻害濃度の中央値である。ＥＣ５０は、ビヒクルまたはコントロール(例えば、生理食塩水)に対する治療分子の有効濃度の中央値である。機能的アッセイにおいて、ＩＣ５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の転写を、その治療分子によって達成される生物学的応答の５０％低下させる治療分子の濃度である。機能的アッセイにおいて、ＥＣ５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の転写の５０％をもたらす治療分子の濃度である。ＩＣ５０またはＥＣ５０は、当分野で既知のいずれの手段によっても計算することができる。
【００８４】
本明細書で使用されるように、用語「阻害」とは、例えば、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子転写物および／またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を阻害するとは、細胞または組織におけるＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子転写物および／またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を低下させるＡＳＯを指す。ある実施態様においては、用語「阻害」は、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子転写物またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の完全な阻害(１００％阻害または検出不可能なレベル)を指す。他の実施態様において、用語「阻害」は、細胞または組織におけるＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子転写物および／またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害を指す。
【００８５】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によって、診断、予後または治療が望まれるあらゆる対象、特に哺乳類の対象を意味する。哺乳類の対象には、ヒト、家畜、農業用動物、スポーツ用動物および動物園の動物が含まれ、例えば、ヒト、非ヒトの霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどが含まれる。
【００８６】
用語「医薬組成物」とは、有効成分の生物学的活性が有効となり得るような形態であり、かつ組成物が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加成分を含まない組成物を指す。かかる組成物は、無菌であり得る。
【００８７】
本明細書に開示されるＡＳＯの「有効量」は、具体的に記載された目的を遂行するのに十分な量である。「有効量」とは、明示した目的に関連して、経験的かつ常法的に決定され得る。
【００８８】
「治療すること」または「治療」または「治療する」または「緩和すること」または「緩和する」などの用語は、(１)診断された病理学的状態または障害の治癒、減退、症状の軽減および／または進行の停止を行う治療手段、および(２)標的とする病理学的状態または障害の発症を予防および／または遅らせる予防的または防御的手段の両方を指す。従って、治療を必要とする人々には、既に障害を有する人々；障害に罹患し易い人々；および障害を予防すべき人々が含まれる。特定の実施態様において、対象は、患者が、例えば、疾患または障害に関連する症状の全体的、部分的または一過的な緩和または除去を示す場合に、本明細書に提供される方法に従って、別の箇所に開示される疾患または症状に対して正常に「治療」される。
【００８９】
ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書は、哺乳類のＣＡＭＫ２Ｄをコードする核酸分子、例えばＣＡＭＫ２Ｄ核酸、例えばＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ-ｍＲＮＡおよびＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡを含むＣＡＭＫ２Ｄ転写物、または哺乳類のＣＡＭＫ２Ｄをコードする前記核酸分子の天然に存在する変異体の機能調節に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)を用いる。本明細書で「ＡＳＯ」という用語は、２つ以上のヌクレオチド(すなわち、オリゴヌクレオチド)の共有結合によって形成される分子を指す。
【００９０】
ＡＳＯは、約１０〜約３０、例えば１０〜２０、１４〜２０、１６〜２０または１５〜２５ヌクレオチド長のような、連続したヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される用語「アンチセンスＡＳＯ」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、用語「ＡＳＯ」と互換的に使用され得る。
【００９１】
配列番号の数字の参照には、特定の核酸塩基配列を含むが、あらゆるデザインまたは完全な化学構造を含むものではない。さらに、本明細書に開示されたＡＳＯは、代表的なデザインを示しているが、別段の記載がない限り、図に示された特定のデザインに限定されるものではない。本明細書において、単一ヌクレオチド(単位)は、モノマーまたはユニットとも呼ばれ得る。本明細書で特定のＡＳＯ番号を参照する場合、その参照には、配列、特定のＡＳＯデザインおよび化学構造が含まれる。本明細書が特定のＤＥＳ番号を参照する場合、参照は、その配列および特定のＡＳＯのデザインを含む。例えば、請求項(または本明細書)が、配列番号：１５８を参照する場合、それは、ｔａｃａｔａｔｔａｔａｔｔａｃｔｃｃｔｃヌクレオチド配列のみを含む。請求項(または本明細書)がＤＥＳ-０２３１を参照する場合、それはＴＡＣａｔａｔｔａｔａｔｔａｃｔｃＣＴＣのデザインによるｔａｃａｔａｔｔａｔａｔｔａｃｔｃｃｔｃのヌクレオチド配列を含む。あるいは、ＡＳＯ−０２３１のデザインは、配列番号：１５８として記述することもができ、ここで５'末端から、第１番目のヌクレオチド、第２番目のヌクレオチド、第３番目のヌクレオチド、第１８番目のヌクレオチド、第１９番目のヌクレオチドおよび第２０番目のヌクレオチドの各々は、修飾ヌクレオチド(例えば、ＬＮＡ)であり、他のヌクレオチドの各々は、非修飾ヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)である。ＡＳＯ番号は、配列およびＡＳＯのデザイン、ならびにＡＳＯの具体的な詳細情報を含む。従って、例えば、本願で参照されるＡＳＯ−０２３１は、ＯｘｙＴｓ  ＯｘｙＡｓ  ＯｘｙＭＣｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡａｓ  ＤＮＡｃｓ  ＤＮＡｔｓ  ＤＮＡｃｓ  ＯｘｙＭＣｓ  ＯｘｙＴｓ  ＯｘｙＭＣを示し、「ｓ」はホスホロチオエート結合を示している。
【００９２】
様々な実施態様においては、本願ＡＳＯは、ＲＮＡ(単位)を含まない。ある実施態様において、本願のＡＳＯは、１以上のＤＮＡ単位を含む。ある実施態様において、本願ＡＳＯは、直鎖状分子であるか、または直鎖状分子として合成される。ある実施態様において、ＡＳＯは一本鎖分子であり、同じＡＳＯ内の等価領域(すなわち、二重鎖)に相補的なヌクレオチドの短い領域、例えば少なくとも３、４または５個の連続するヌクレオチドを含まない−この点で、ＡＳＯは(本質的に)二本鎖ではない。ある実施態様において、ＡＳＯは本質的に二本鎖ではない。ある実施態様において、ＡＳＯはｓｉＲＮＡではない。様々な実施態様においては、本願ＡＳＯは、連続するヌクレオチド領域の全体から構成され得る。従って、ある実施態様において、ＡＳＯは実質的に自己相補的ではない。
【００９３】
別の実施態様において、本明細書は、ＡＳＯの断片を含む。例えば、本明細書は、本願ＡＳＯの少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも２つの連続するヌクレオチド、少なくとも３つの連続するヌクレオチド、少なくとも４つの連続するヌクレオチド、少なくとも５つの連続するヌクレオチド、少なくとも６つの連続するヌクレオチド、少なくとも７つの連続するヌクレオチド、少なくとも８つの連続するヌクレオチドまたは少なくとも９つの連続するヌクレオチドを含む。本明細書に開示された配列いずれかのフラグメントは、本明細書の一部と意図される。
【００９４】
ＩＩ.Ａ．ターゲット
好適には、本願ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現をダウンレギュレート(例えば、低下または除去)することができる。これに関して、本願ＡＳＯは、通常、哺乳動物の細胞、例えば、心筋細胞などのヒト細胞において、ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡレベルの低下により、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の阻害に間接的に影響を与えることができる。特に、本発明は、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ-ｍＲＮＡの１つ以上の領域(例えば、イントロン領域、エクソン領域および／またはエクソン−イントロン結合領域)を標的とするＡＳＯに関する。別段の記載がない限り、本明細書で使用される用語「ＣＡＭＫ２Ｄ」は、１つ以上の種(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシおよびクマ)由来のＣＡＭＫ２Ｄを指すことができる。
【００９５】
カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ型δ(ＣＡＭＫ２Ｄ)は、ＣａＭキナーゼＩＩサブユニットδおよびＣａｍＫ−ＩＩサブユニットδとしても知られている。ＣＡＭＫ２Ｄの同義語は、既知であり、ＣａＭＫＩＩＩδまたはＣＡＭＫＤを含む。ヒトＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子の配列は、公開されているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ０００００４.１２として見ることができる。ヒトＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ-ｍＲＮＡ転写物(配列番号：１)の配列は、ＮＣ＿０００００４.１２の残基１１３,４５１,０３２〜１１３,７６１,９２７の逆相補体に対応する。ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡの配列(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２２１.３)は、配列番号：２のヌクレオチド「ｔ」が、ｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号：２に示されている。ヒトＣＡＭＫ２Ｄタンパク質についての配列は、公的に利用できるアクセッション番号：Ｑ１３５５７(カノニカル配列、配列番号：３)、Ａ８ＭＶＳ８、Ｑ５２ＰＫ４、Ｑ５９Ｇ２１、Ｑ８Ｎ５５３、Ｑ９ＵＧＨ６、Ｑ９ＵＱＥ９として見出すことができ、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９６】
ヒトＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子産物の天然変異体が知られている。例えば、ヒトＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の天然の変異体は、Ｄ１６７Ｅ、Ｑ４６３ＥおよびＴ４９３Ｉ、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む可能性がある。別のスプライシングにより生じるヒトＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の別の変異体も、当分野において既知である。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ３(ＵｎｉＰｒｏｔにおける識別子：Ｑ１３５５７−３)は、次の通り：３２８〜３２８：Ｋ→ＫＫＲＫＳＳＳＳＶＱＭＭ、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ４(識別子：Ｑ１３５５７−４)の配列は、次の通り：３２８〜３２８：Ｋ→ＫＩＮＮＫＡＮＶＶＴＳＰＫＥＮＩＰＴＰＡＬ、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ６(識別子：Ｑ１３５５７−８)の配列は、次の通り：４７９〜４９９：欠失、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ７(識別子：Ｑ１３５５７−９)の配列は、次の通り：Ｋ→ＫＫＲＫＳＳＳＳＶＱＭＭおよび４７９〜４９９：欠失、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ８(識別子：Ｑ１３５５７−５)の配列は、次の通り：３２８〜３２８：Ｋ→ＫＩＮＮＫＡＮＶＶＴＳＰＫＥＮＩＰＴＰＡＬおよび４７９〜４９９：欠失、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ９(識別子：Ｑ１３５５７−６)の配列は、次の通り：３２９〜３２９：Ｅ→ＥＰＱＴＴＶＩＨＮＰＤＧＮＫＥ、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ１０(識別子：Ｑ１３５５７−１０)の配列は、次の通り：３２９〜３２９：Ｅ→ＥＰＱＴＴＶＩＨＮＰＤＧＮＫＥおよび４７９〜４９９：欠失、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ１１(識別子：Ｑ１３５５７−１１)の配列は、次の通り：２８〜３２８：Ｋ→ＫＫＲＫＳＳＳＳＶＱＭＭＥＰＱＴＴＶＩＨＮＰＤＧＮＫ、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ１２(識別子：Ｑ１３５５７−１２)の配列は、次の通り：４７８−４７８：Ｋ→Ｎおよび４７９−４９９：欠失、カノニカル配列(配列番号：３)とは異なる。従って、本願ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の天然変異体の発現を低下または阻害するためにデザインされ得る。
【００９７】
ＡＳＯの標的核酸配列の例は、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ-ｍＲＮＡである。配列番号：１は、ヒトＣＡＭＫ２Ｄゲノム配列(即ち、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ０００００４.１２のヌクレオチド１１３,４５１,０３２〜１１３,７６１,９２７の逆相補体)を示す。配列番号：１は、配列番号：１中のヌクレオチド「ｔ」が、ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおいて「ｕ」として示されること以外はＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ-ｍＲＮＡ配列と同一である。特定の実施態様においては、「標的核酸」は、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質をコードする核酸のイントロンまたはその天然に存在する変異体およびそれらから得られるＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ-ｍＲＮＡを含む。別の実施態様において、標的核酸は、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質をコードする核酸のエクソン領域またはその天然に存在する変異体、ならびにそれらから得られるＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ-ｍＲＮＡを含む。また別の実施態様において、標的核酸は、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質をコードしている核酸のエクソン−イントロン結合部またはその天然に存在する変異体およびそれらから得られるＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ-ｍＲＮＡを含む。ある実施態様において、例えば、研究または診断に使用される場合、「標的核酸」は、上記のＤＮＡまたはＲＮＡ核酸標的から得られるｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る。ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ−ｍＲＮＡによりコードされるヒトＣＡＭＫ２Ｄタンパク質配列は、配列番号：３として示されている。別の実施態様においては、標的核酸は、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質をコードする核酸またはその天然に存在する変異体、例えば、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲまたはその両方の非翻訳領域を含む。
【００９８】
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物のイントロン内の領域、例えば、配列番号：１にハイブリダイズする。特定の実施態様においては、本願ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物のエクソン内の領域、例えば、配列番号：１にハイブリダイズする。別の実施態様において、本願ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写体のエクソン−イントロン結合部内の領域、例えば、配列番号：１にハイブリダイズする。ある実施態様において、本願ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物(例えば、イントロン、エクソンまたはエクソン−イントロン結合部)内の領域、例えば、配列番号：１にハイブリダイズし、ここでＡＳＯは、本明細書中の他の場所に記載されているように(例えば、セクションＩＩ．Ｇ)、式：５'Ａ−Ｂ−Ｃ３'に関するデザインを有している。
【００９９】
ある実施態様において、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の特定のアイソフォーム(例えば、アイソフォームδ３〜１２)をコードするｍＲＮＡを標的とする。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の全てのアイソフォームを標的とする。別の実施態様においては、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の２つのアイソフォーム(例えば、アイソフォームδ３およびアイソフォームδ７、アイソフォームδ４およびアイソフォームδ８、およびアイソフォームδ９およびアイソフォームδ１０)を標的とする。
【０１００】
ある実施態様において、ある実施態様において、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の核酸配列、例えば配列番号：１に対応する領域内の核酸配列に相補的な、連続するヌクレオチド配列(例えば、１０〜３０ヌクレオチド長)を含む。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の核酸配列または配列内の領域(「標的領域」)にハイブリダイズする連続するヌクレオチド配列を含んでおり、ここで該核酸配列は、(ｉ)配列番号：１のヌクレオチド６２５〜８４２；(ｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド１,３９８〜５９,７５５；(ｉｉｉ)配列番号：１のヌクレオチド６１,８１７〜１０４,７２５；(ｖｉ)配列番号：１のヌクレオチド１１２,１６２〜１１８,０２１；(ｖ) 配列番号：１のヌクレオチド１１９,４４０〜１３５,２１９；(ｖｉ)配列番号：１のヌクレオチド１３７,５８７〜１５７,８５６；(ｖｉｉ)配列番号：１の１５９,１９１〜２６６,１７４のヌクレオチド；および(ｖｉｉｉ)配列番号：１の２７２,７８８〜３１０,９４９のヌクレオチドであり、ここで、任意に、ＡＳＯは、本明細書に記載されたデザインの内の１つを有する(例えば、セクションＩＩ.Ｇ)、または本明細書の別の場所に示される化学構造(例えば、図１Ａおよび１Ｂ)を有する。
【０１０１】
ある実施態様においては、標的領域は、配列番号：１のヌクレオチド７２５〜７４２に対応する。他の実施態様においては、標的領域は、配列番号：１のヌクレオチド１,４９８〜５９,６５５に対応する。特定の実施態様においては、標的領域は、配列番号：１のヌクレオチド６１,９１７〜１０４,６２５に対応する。ある実施態様においては、標的領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１２,２６２〜１１７,９２１に対応する。ある実施態様においては、標的領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１９,５４０〜１３５,１１９に対応する。さらなる実施態様においては、標的領域は、配列番号：１のヌクレオチド１３７,６８７〜１５７,７５６に対応する。特定の実施態様においては、標的領域は、配列番号：１のヌクレオチド１５９,２９１〜２６６,０７４に対応する。ある実施態様においては、標的領域は、配列番号：１のヌクレオチド２７２,８８８〜３１０,８４９に対応する。
【０１０２】
ある実施態様においては、標的領域は、３'末端および／または５'末端の、配列番号：１のヌクレオチド７２５〜７４２±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。別の実施態様においては、標的領域は、３'末端および／または５'末端の配列番号：１のヌクレオチド１,４９８〜５９,６５５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。特定の実施態様においては、標的領域は、３'末端および／または５'末端の配列番号：１のヌクレオチド６１,９１７〜１０４,６２５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様においては、標的領域は、３'末端および／または５'末端の配列番号：１のヌクレオチド１１２,２６２〜１１７,９２１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様においては、標的領域は、３'末端および／または５'末端の配列番号：１のヌクレオチド１１９,５４０〜１３５,１１９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。さらなる実施態様においては、標的領域は、３'末端および／または５'末端の配列番号：１のヌクレオチド１３７,６８７〜１５７,７５６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。特定の実施態様においては、標的領域は、３'末端および／または５'末端の配列番号：１のヌクレオチド１５９,２９１〜２６６,０７４±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様においては、標的領域は、３'末端および／または５'末端の、配列番号：１のヌクレオチド２７２,８８８〜３１０,８４９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。
【０１０３】
ある実施態様においては、本願ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の複数の標的領域(例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、配列番号：１)にハイブリダイズする。ある実施態様においては、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の２つの異なる標的領域にハイブリダイズする。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の３つの異なる標的領域にハイブリダイズする。複数の標的領域にハイブリダイズする例示的なＡＳＯの配列、および異なる標的領域の開始／終了部位は、図１Ｂに示される。ある実施態様においては、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の複数の領域(例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、配列番号：１)にハイブリダイズするＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物内の一つの領域(例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、配列番号：１)にハイブリダイズするＡＳＯと比較して、ＣＡＭＫ２Ｄ発現を低下させる点でより強力である(例えば、より低いＥＣ５０を有する)。
【０１０４】
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、生理学的条件下、すなわちインビボ条件下において、標的核酸(例えば、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物)にハイブリダイズできる。ある実施態様においては、本願ＡＳＯは、インビトロで標的核酸(例えば、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物)にハイブリダイズすることが可能である。ある実施態様においては、本願ＡＳＯは、ストリンジェントな条件下においてインビトロで標的核酸(例えば、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物)にハイブリダイズすることができる。インビトロでのハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件は、特に、産生細胞の取り込み、ＲＮＡアクセシビリティー、温度、結合の自由エネルギー、塩濃度および時間に依存する(例えば、Stanley T Crooke, Antisense Drug Technology: Principles, StrategiesおよびApplications, 2nd Edition, CRC Press (2007)を参照されたい)。一般的に、インビトロでのハイブリダイゼーションには、実質的に類似した核酸間のハイブリダイゼーションは可能であるが、異なる核酸間のハイブリダイゼーションは不可能となるように、高から中程度のストリンジェンシー条件が使用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、５Ｘ 食塩−クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)緩衝液(０.７５Ｍ 塩化ナトリウム／０.０７５Ｍ クエン酸ナトリウム)中において、４０℃で１時間ハイブリダイゼーションを行い、その後サンプルを、４０℃で１Ｘ ＳＳＣ緩衝液にて１０回、室温で１Ｘ ＳＳＣ緩衝液により５回洗浄することが挙げられる。インビボでのハイブリダイゼーション条件とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的配列とのハイブリダイゼーションを制御する細胞内条件(例えば、生理学的ｐＨおよび細胞内イオン条件)を含む。インビトロ条件は、比較的低いストリンジェンシー条件により模倣することができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、２Ｘ ＳＳＣ(０.３Ｍ 塩化ナトリウム／０.０３Ｍ クエン酸ナトリウム)、０.１％ＳＤＳにおいて、３７℃でインビトロにて実施することができる。４Ｘ ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳを含む洗浄液を、３７℃で使用して、最終的に１Ｘ ＳＳＣにおいて４５℃で洗浄することができる。
【０１０５】
ある実施態様においては、本願ＡＳＯは、１以上の種(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシおよびクマ)のＣＡＭＫ２Ｄ転写物を標的とすることができる。特定の実施態様においては、本明細書に開示されたＡＳＯは、ヒトおよびげっ歯類(例えば、マウスまたはラット)のＣＡＭＫ２Ｄ転写物の両方を標的とすることができる。従って、ある実施態様においては、ＡＳＯは、ヒトおよびげっ歯類(例えば、マウスまたはラット)の両方において、ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現をダウンレギュレート(例えば、低下または除去)することができる。
【０１０６】
マウスＣＡＭＫ２Ｄ転写物の配列は、当分野では既知である。例えば、マウスＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子の配列は、公知のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００６９.６に記載されている。マウスＣＡＭＫ２Ｄｐｒｅ-ｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＣ＿００００６９.６の残基１２６,５９６,３５４〜１２６,８４６,３２６に対応する。マウスＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ転写物(カノニカルおよび変異体の両方)の配列は既知であり、アクセッション番号ＮＭ＿００１０２５４３８.２(カノニカル配列)、ＮＭ＿００１０２５４３９.２、ＮＭ＿００１２９３６６３.１、ＮＭ＿００１２９３６６４.１、ＮＭ＿０２３８１３.４、ＮＭ＿００１３４６６３５.１、ＮＭ＿００１３４６６３６.１、ＮＭ＿００１２９３６６５.１、ＸＭ＿００６５００８３６.３、ＸＭ＿００６５００８３３.３、ＸＭ＿００６５００８３５.３、ＸＭ＿０１７３１９４１５.１、ＸＭ＿００６５００８１８.３、ＸＭ＿０１７３１９４１７.１、ＸＭ＿０１７３１９４１８.１、ＸＭ＿０１７３１９４２０.１、ＮＭ＿００１２９３６６６.１、ＸＭ＿００６５００８１９.３、ＸＭ＿０１７３１９４１６.１、ＸＭ＿００６５００８２０.３、ＸＭ＿００６５００８２２.３、ＸＭ＿００６５００８２３.３、ＸＭ＿００６５００８２４.３、ＸＭ＿０１７３１９４１９.１、ＸＭ＿００６５００８２６.３、ＸＭ＿００６５００８２５.３、ＸＭ＿００６５００８２９.３、ＢＣ０５２８９４.１、ＸＭ＿００６５００８３１.３、ＸＭ＿００６５００８３２.３、ＸＭ＿０１７３１９４２２.１、ＸＭ＿００６５００８３４.３、ＸＭ＿００６５００８３９.３およびＸＭ＿０１７３１９４２１.１として利用できる。マウスＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の配列は、公的に利用可能なＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｑ６ＰＨＺ２(標準配列)、Ｑ３ＵＦ８７、Ｑ３ＵＱＨ９、Ｑ５ＤＴＫ４、Ｑ８ＣＡＣ５およびＱ９ＣＺＥ２として見出すことができ、これらの各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。マウスＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の３つのアイソフォームは既知である。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ６の配列は、次の通り：４７８〜４７８：Ｋ→Ｎおよび４７９〜４９９：欠失、カノニカル配列とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ１０の配列は、次の通り：３２９〜３２９：Ｅ→ＥＰＱＴＴＶＩＨＮＰＤＧＮＫＥ；４７８〜４７８：Ｋ→Ｎおよび４７９〜４９９：欠失、カノニカル配列とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ５の配列は、次の通り：３２８〜３２８：Ｋ→ＫＩＮＮＫＡＮＶＶＴＳＰＫＥＮＩＰＴＰＡＬＥＰＱＴＴＶＩＨＮＰＤＧＮＫ；４７８〜４７８：Ｋ→Ｎ；および４７９〜４９９：欠失、カノニカル配列とは異なる。
【０１０７】
ラットＣＡＭＫ２Ｄ転写物の配列も当分野において既知である。ラットＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子は、公知のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００５１０１.４に記載されている。ラットＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＣ＿００５１０１.４の残基２３０,９００,９０７〜２３１,１３２,２０７に対応する。ラットＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ転写物(カノニカル配列および変異体配列の両方)の配列は既知であり、アクセッション番号ＮＭ＿０１２５１９.２(カノニカル配列)、ＢＣ１０７５６２.１、ＸＭ＿０１７５９０６２１.１、ＸＭ＿０１７５９０６０５.１、ＸＭ＿００８７６１４５２.１、ＸＭ＿０１７５９０６０６.１、ＸＭ＿０１７５９０６０７.１、ＸＭ＿０１７５９０６０８.１、ＸＭ＿０１７５９０６１０.１、ＸＭ＿０１７５９０６１１.１、ＸＭ＿０１７５９０６１２.１、ＸＭ＿００６２３３２８５.３、ＸＭ＿０１７５９０６１４.１、ＸＭ＿０１７５９０６１５.１、ＸＭ＿０１７５９０６１６.１、ＸＭ＿０１７５９０６１３.１、ＸＭ＿０１７５９０６１７.１、ＸＭ＿０１７５９０６１８.１、ＸＭ＿０１７５９０６０４.１、ＸＭ＿０１７５９０６０９.１、ＸＭ＿０１７５９０６２４.１、ＸＭ＿０１７５９０６２５.１、ＸＭ＿０１７５９０６１９.１、ＸＭ＿０１７５９０６２０.１、ＸＭ＿０１７５９０６２２.１およびＸＭ＿０１７５９０６２３.１として利用できる。ラットＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の配列は、公的に利用できるアクセッション番号：Ｐ１５７９１(カノニカル配列)、Ｐ９７９１５、Ｐ９７９１６、Ｑ３Ｂ７Ｌ０、Ｑ６３９０４、Ｑ６３９０５、Ｑ６３９０６、Ｑ６３９０７およびＱ６３９０８として見出すことができ、これらの各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ラットＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の６つのアイソフォームが知られている。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ２の配列は、次の通り：３２９〜３６２：欠失、カノニカル配列とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ３の配列は、次の通り：３２９〜３３５：ＩＮＮＫＡＮＶ→ＫＲＫＳＳＳＶ；３３７〜３５９：欠失；および３６０〜３６２：ＧＮＫ→ＱＭＭ、カノニカル配列とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ４の配列は、次の通り：３４９〜３６２：欠失、カノニカル配列とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ５の配列は、次の通り：３２９〜３６２：欠失および５１２〜５３３：ＫＰＰＣＩＰＮＧＫＥＮＦＳＧＧＴＳＬＷＱＮＩ→Ｎ、カノニカル配列とは異なる。ＣＡＭＫ２Ｄアイソフォームδ６の配列は、次の通り：５１２〜５３３：ＫＰＰＣＩＰＮＧＫＥＮＦＳＧＧＴＳＬＷＱＮＩ→Ｎ、カノニカル配列とは異なる。
【０１０８】
ＩＩ.Ｂ．ＡＳＯ配列
本願ＡＳＯは、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の領域の相補体に対応する連続するヌクレオチド配列、例えば配列番号：１に対応するヌクレオチド配列を含んでいる。
【０１０９】
特定の実施態様において、本明細書は、１０〜３０ヌクレオチド長、例えば１０〜１５ヌクレオチド長、１０〜２０ヌクレオチド長または１０〜２５ヌクレオチド長のＡＳＯを提供し、ここで連続するヌクレオチド配列は、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物、例えば配列番号：１またはその天然の変異体の相補体内の領域と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％の配列同一性を有する。従って、例えば、ＡＳＯは、配列番号：１またはその一部の配列を有する一本鎖核酸分子にハイブリダイズする。
【０１１０】
ＡＳＯは、哺乳類ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質をコードする核酸の等価領域(例えば、配列番号：１)に完全に相補的である(完全な相補性の)連続するヌクレオチド配列を含むことができる。ＡＳＯは、哺乳類ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質をコードする核酸の等価領域(例えば、配列番号：１)に完全に相補的である(完全な相補性の)連続するヌクレオチド配列を含むことができる。ＡＳＯは、図１Ａおよび１Ｂに示されるように、ＸおよびＹが、各々開始部位および終了部位である配列番号：１のヌクレオチドＸ−Ｙに対応している核酸配列またはその配列内の領域と完全に相補的である(完全な相補性の)連続するヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１１１】
ある実施態様においては、本願ＡＳＯのヌクレオチド配列または連続するヌクレオチド配列は、配列番号：４〜１７１３から選択される配列(即ち、図１Ａおよび１Ｂの配列)に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性(相同性)を有する。ある実施態様において、本明細書の別の場所に示された化学構造(例えば、図１Ａおよび１Ｂ)を有する。
【０１１２】
ある実施態様においては、ＡＳＯ(またはその連続ヌクレオチド部分)は、配列番号：４〜１７１３、またはその少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、またはそれらを含んでおり、ここで該ＡＳＯ(またはその連続するヌクレオチド部分)は、対応するＣＡＭＫ２Ｄ転写物と比較した場合、１、２、３または４つのミスマッチを所望により含んでいてもよい。
【０１１３】
ある実施態様において、ＡＳＯは、配列番号：２５４、配列番号：２７、配列番号：１１４、配列番号：１５８、配列番号：１９０、配列番号：３２７、配列番号：４６３、配列番号：５１３、配列番号：５１６、配列番号：５１９、配列番号：６５７、配列番号：６５９、配列番号：８２７、配列番号：１２４９、配列番号：１３２６、配列番号：１４０９、配列番号：１５２４、配列番号：１５３０、配列番号：１６６２および配列番号：１６７６からなる群から選択される配列を含む。
【０１１４】
ある実施態様において、ＡＳＯは、配列番号：５５、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：９２、配列番号：１０２、配列番号：１０５、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３３、配列番号：１３８、配列番号：１６１、配列番号：１７８、配列番号：１８０、配列番号：１８６、配列番号：１９５、配列番号：２００、配列番号：２０２、配列番号：２３４、配列番号：２６４、配列番号：３８７、配列番号：３９０、配列番号：３９６、配列番号：４４１、配列番号：４４６、配列番号：４５７、配列番号：４６７、配列番号：５２３、配列番号：５２４、配列番号：６３６、配列番号：６４０、配列番号：７００、配列番号：７４０、配列番号：８３２、配列番号：９６５、配列番号：１０１５、配列番号：１０６５、配列番号：１０７１、配列番号：１１５５、配列番号：１４７５、配列番号：１５０８、配列番号：１６８５、配列番号：１６８６、配列番号：１６８７、配列番号：１６８８および配列番号：１６９０からなる群から選択される配列を含む。
【０１１５】
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、標的核酸配列(例えば、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物)に結合して、細胞内の正常な(即ち、対照の)発現レベルと比較して、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現を、少なくとも約１０％または約２０％阻害するかまたは低下させることができる、例えば、正常な発現レベル(即ち、ＡＳＯに暴露されていない細胞内の発現レベル)と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％阻害するかまたは低下させることができる。
【０１１６】
ある実施態様においては、本願ＡＳＯは、ＡＳＯと接触していないＨＥＫ２９３細胞と比較して(例えば、生理食塩水との接触)、細胞が２５μＭのＡＳＯと接触している場合、ＨＥＫ２９３細胞において、インビトロでのＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡの発現を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、減少させることができる。少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％低下させることができる。
【０１１７】
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、ＡＳＯと接触していないｈｉＰＳＣ−ＣＭ細胞と比較して(例えば、生理食塩水との接触)、細胞が５００ｎＭのＡＳＯと接触している場合、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)において、インビトロでのＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡの発現を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％低下させることができる。
【０１１８】
特定の実施態様において、本願ＡＳＯは、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する：(ｉ)ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)におけるＣＡＭＫ２ＤをコードするｍＲＮＡレベルを低下させること；(ｉｉ)ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＣＡＭＫ２Ｄのタンパク質レベルを低下させること；(ｉｉｉ)心血管系疾患または障害の１つ以上の症状を、低下、改善または治療すること；ならびに(ｉｖ)それらの任意の組み合わせ。
【０１１９】
ある実施態様において、ＡＳＯは、標的配列にハイブリダイズする場合に、１、２、３または４(または、それ以上)のミスマッチを許容し得るが、所望の効果、すなわち標的ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のダウンレギュレーションを示すために十分に標的と結合することができる。ミスマッチは、例えば、本明細書の別の場所に開示されているＡＳＯヌクレオチド配列の長さを増やすこと、および／またはヌクレオチドアナログの数を増加することにより補うことができる。
【０１２０】
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、標的配列にハイブリダイズする場合に、３つ以下のミスマッチを含む。別の実施態様において、連続するヌクレオチド配列は、標的配列にハイブリダイズする場合に、２以上のミスマッチを含まない。別の実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、標的配列にハイブリダイズする際に１以上のミスマッチを含まない。
【０１２１】
ＩＩ.Ｃ．ＡＳＯ長
ＡＳＯは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の全長の連続するヌクレオチドを含み得る。範囲がＡＳＯまたは連続するヌクレオチド配列長について示される場合、この範囲は、範囲に示される上限と下限の長さを含み、例えば、１０〜３０(またはその間)には、１０と３０の両方が含まれることが理解されるべきである。
【０１２２】
ある実施態様において、ＡＳＯは、約１４〜２０の全長の連続するヌクレオチド配列、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の連続するヌクレオチド長を含む。
【０１２３】
ＩＩ．Ｄ．ヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログ
本開示の一態様において、ＡＳＯは、１つ以上の天然に存在しないヌクレオシドアナログを含む。「ヌクレオチドアナログ」は、糖および／または塩基部位の修飾により、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドなどの天然ヌクレオシドの変異体である。アナログは、基本的に、オリゴヌクレオチドという表現において天然ヌクレオシドに対して単に「サイレント」または「等価」であり得る、即ち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するように作用する際に機能的な効果を有さない。にも拘わらず、そのような「等価な」アナログは、例えば、製造が容易であるか、または安価である場合、または貯蔵または製造条件に対してより安定である場合、またはタグまたはラベルを表す場合に有用であり得る。しかし、ある実施態様において、アナログは、ＡＳＯが発現を阻害するように作用する際に、機能的な効果を有する；例えば、標的に対する結合親和性を増加させること、および／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性を増加させること、および／または細胞内への輸送容易性を増加させることにより、機能的な効果を有するであろう。ヌクレオシドアナログの具体的な例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213およびスキーム１に記載されている。本願ＡＳＯは、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１８以上、１９以上または２０以上のヌクレオシドアナログを含むことができる。ある実施態様において、ＡＳＯ中のヌクレオシドアナログは同一物である。別の実施態様において、ＡＳＯ中のヌクレオシドアナログは異なるものである。ＡＳＯ中のヌクレオシドアナログは、以下のヌクレオシドアナログのいずれか１つまたは組み合わせであり得る。
【０１２４】
ＩＩ．Ｄ．１．核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン)部位を含む。本明細書において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なるが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能する修飾核酸塩基も包含する。ある実施態様では、核酸塩基部位は、核酸塩基を修飾または置換することによって修飾される。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基、ならびに天然に存在しない変異体の両方を指す。そのような変異体は、例えば、Hirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記述されている。
【０１２５】
ある実施態様では、核酸塩基部位は、プリンまたはピリミジンを、例えば置換されたプリンまたは置換されたピリミジンのような修飾されたプリンまたはピリミジへと変更することにより修飾される(例えば、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−メチル−シトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル、５−チアゾロ−ウラシル、２−チオウラシル、２'チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２,６−ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基)。
【０１２６】
核酸塩基部位は、対応する各核酸塩基の文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵによって示されてもよく、各文字は、所望により、同等の機能を有する修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの例において、核酸塩基部位は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５−メチル−シトシンから選択される。所望により、ＬＮＡギャップマーには、５−メチル−シトシンのＬＮＡヌクレオシドを使用してもよい。
【０１２７】
ＩＩ．Ｄ．２．糖修飾
本願ＡＳＯは、修飾された糖部位を有する１つ以上のヌクレオシド、即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡに存在するリボース糖部位と比較した場合に、糖部位の修飾を有するヌクレオシドを含むことができる。リボースの糖部位を修飾したヌクレオシドは、主にオリゴヌクレオチドの特定の特性(例えば、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性など)を向上させる目的で、数多く作られてきた。
【０１２８】
そのような修飾には、リボースの環構造が修飾されるもの、例えば、ヘキソース環(ＨＮＡ)との置換によるもの、またはリボース環上のＣ２'とＣ４'炭素の間に通常ビラジカル架橋を有する二環式環(ＬＮＡ)との置換によるもの、またはＣ２'とＣ３'炭素の間の結合を欠いた非結合リボース環(例えば、ＵＮＡ)との置換によるものが含まれる。別の糖修飾ヌクレオシドとしては、例えば、ビシクロヘキソース核酸(ＷＯ２０１１／０１７５２１)または三環核酸(ＷＯ２０１３／１５４７９８)が挙げられる。修飾されたヌクレオシドには、糖の部分が、糖でない部分で置換されたヌクレオシド、例えばペプチド核酸(ＰＮＡ)、またはモルホリノ核酸の場合も含まれる。
【０１２９】
糖修飾は、リボース環上の置換基を、水素以外の基またはＲＮＡヌクレオシドにおいて天然に存在する２'−ＯＨ基に変化させることによって行われる修飾を含む。置換基は、例えば、２'、３'、４'または５'位置に導入されてもよい。修飾糖部位を有するヌクレオシドには、２'置換ヌクレオシドなどの２'修飾ヌクレオシドも含まれる。実際に、２'置換ヌクレオシドの開発に多くの焦点が費やされており、多くの２'置換ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、有益な特性(例えば、強化されたヌクレオシド耐性および増強された親和性など)を有することが判っている。
【０１３０】
ＩＩ．Ｄ．２．ａ  ２'修飾ヌクレオシド
２'糖修飾ヌクレオシドとは、２'位置にＨまたは−ＯＨ以外の置換基を有するか(２'置換ヌクレオシド)、または２'結合ビラジカルを含むヌクレオシドであり、２'置換ヌクレオシドおよびＬＮＡ(２'−４'ビラジカル架橋)ヌクレオシドが含まれる。例えば、２'修飾糖は、増強された結合親和性(例えば、親和性増強２'糖修飾ヌクレオシド)および／またはオリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ耐性の増大を提供し得る。２'置換された修飾ヌクレオシドの例としては、２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２'−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２'−アルコキシ−ＲＮＡ、２'−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ(ＭＯＥ)、２'−アミノ−ＤＮＡ、２'−フルオロ−ＲＮＡ、２'−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸(ＡＮＡ)および２'−フルオロ−ＡＮＡヌクレオシドが挙げられる。さらなる例については、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443;Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213;and Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照されたい。以下に、いくつかの２'置換された修飾ヌクレオシドを示す。
【化１】
2021513861.tif 000002
【０１３１】
ＩＩ.Ｄ.２.ｂ  架橋型核酸ヌクレオシド(ＬＮＡ)
ＬＮＡヌクレオシドは、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２'とＣ４'の間(即ち、２'−４'架橋)にリンカー基(ビラジカルまたは架橋と呼ばれる)を含む２'−糖修飾ヌクレオシドであり、これによりリボース環の立体構造が制限または固定(ロック)される。これらのヌクレオシドは、文献では架橋型核酸または二環式核酸(ＢＮＡ)と呼ばれている。リボースの立体構造の固定は、ＬＮＡが相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの高い親和性(二重安定化)と関連する。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重体の融解温度を測定することにより、ルーティーンに決定することができる。
【０１３２】
非限定的なＬＮＡヌクレオシドの例は、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, and Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4),1225-1238に開示されている。
【０１３３】
２'−４'架橋は、１〜４つの架橋原子を含んでおり、特に、式−Ｘ−Ｙ−である：
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)、−Ｃ(＝ＣＲａＲｂ)−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ、−Ｓｉ(Ｒａ)２−、−ＳＯ２−、−ＮＲａ−、−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−Ｏ−、＞Ｃ＝Ｊ、Ｓｅ、−ｃＰｒ−、−Ｏ−ＮＲａ−、ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ(Ｒａ)−Ｏ−または−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり；
Ｙは、酸素、硫黄、−(ＣＲａＲｂ)ｎ−、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ、−Ｓｉ(Ｒａ)２−、−ＳＯ２−、−ＮＲａ−、または＞Ｃ＝Ｊ、Ｓｅ、−ｃＰｒ−、−Ｏ−ＮＲａ−、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−またはＮＲａ−ＣＲａＲｂ−であり；式中、ｎは１または２であり；
但し、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｏ−、Ｓｉ(Ｒａ)２−Ｓｉ(Ｒａ)２−、−ＳＯ２−ＳＯ２−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ−または−Ｓｅ−Ｓｅ−ではない；
Ｊは、酸素、硫黄、ＣＨ２または＝Ｎ(Ｒａ)であり；
ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロ環、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホンアルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオールスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、−ＯＣ(＝Ｘａ)Ｒｃ、−ＯＣ(＝Ｘａ)ＮＲｃＲｄおよび−ＮＲｅＣ(＝Ｘａ)ＮＲｃＲｄ;または２つの隣接するＲａおよびＲｂは、一緒になって、任意に置換されたメチレンを形成し；ここで、置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアルコキシおよび置換されたメチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロサイクル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される１〜３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり；
Ｘａは、酸素、硫黄または−ＮＲｃであり；
Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅは、独立して、水素またはアルキルであり；ならびに
ｎは、１、２または３である。
【０１３４】
ある実施態様において、Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲａ−、−ＣＲａＲｂ−または−Ｃ(＝ＣＲａＲｂ)−であり、特に、酸素、硫黄、−ＮＨ−、−ＣＨ２−または−Ｃ(＝ＣＨ２)−、より具体的には酸素である。
【０１３５】
ある実施態様において、Ｙは、−ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−または−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−であり、特に−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−、−ＣＨＣＨ３−ＣＨ２−、ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１３６】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−(ＣＲａＲｂ)ｎ−、−Ｓ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ(Ｒａ)ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ(＝ＣＲａＲｂ)−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ(Ｒａ)ＣＲａＲｂ−、−Ｏ−Ｎ(Ｒａ)ＣＲａＲｂ−または−Ｎ(Ｒａ)−Ｏ−ＣＲａＲｂ−である。
【０１３７】
ある実施態様において、ＲａおよびＲｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、アルキルおよびアルコキシアルキルからなる基から独立して選択される。
【０１３８】
ある実施態様において、ＲａおよびＲｂは、水素、ハロゲン、例えば、フルオロ、ヒドロキシル、メチルおよび−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３から独立して選択され、特に水素、メチルおよび−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３からなる基から独立して選択される。
【０１３９】
ある実施態様において、Ｒａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。
【０１４０】
ある実施態様において、Ｒｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。ある実施態様において、ＲａおよびＲｂの一方または両方が、水素である。特定の実施態様において、ＲａおよびＲｂのうちの一方のみが水素である。ある実施態様において、ＲａおよびＲｂの一方が、メチルであり、もう一方は水素である。別の実施態様において、ＲａおよびＲｂは両方が、同時にメチルである。
【０１４１】
本発明の特別な実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ(ＣＨ３)−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３)−、−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２ＣＨ３)−、−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ(＝ＣＨ２)ＣＨ２−、−Ｃ(＝ＣＨ２)ＣＨ(ＣＨ３)−、−Ｎ(−Ｏ−ＣＨ３)−または−Ｎ(ＣＨ３)−である。
【０１４２】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここでＲａおよびＲｂは、独立して、水素、アルキルおよびアルコキシアルキルからなる群から選択され、特に水素、メチルおよび−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３である。
【０１４３】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−であり、特に−Ｏ−ＣＨ２−である。
【０１４４】
２'−４'架橋は、式(Ａ)および式(Ｂ)に各々示される通り、リボース環の平面の下方(β−Ｄ−立体配置)、または環の平面の上方(α−Ｌ−立体配置)のいずれかに存在し得る。
【０１４５】
ある実施態様において、本願ＡＳＯの修飾ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドは、式ＩＩまたはＩＩＩの一般式を有する：
【化２】
2021513861.tif 000003
式中、
Ｗは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ(Ｒａ)−、−Ｃ(ＲａＲｂ)−、特に−Ｏ−から選択され；
Ｂは、核酸塩基または修飾された核酸塩基であり；
Ｚは、隣接するヌクレオシドまたは５'−末端基とのインターヌクレオシド結合であり；
Ｚ＊は、隣接するヌクレオシドまたは３'−末端基とのインターヌクレオシド結合であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アジド、ヘテロサイクルおよびアリールから選択され；および
Ｘ、Ｙ、ＲａおよびＲｂは、本明細書に規定される通りである。
【０１４６】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−、Ｒａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。−Ｘ−Ｙ−のある実施態様では、Ｒｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。Ｘ−Ｙ−の別の実施態様では、ＲａおよびＲｂの一方または両方が水素である。Ｘ−Ｙ−のさらなる実施態様では、ＲａおよびＲｂのうちの一方のみが水素である。Ｘ−Ｙ−の特定の実施態様では、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。Ｘ−Ｙ−の特定の実施態様では、ＲａおよびＲｂの両方が同時にメチルである。
【０１４７】
ある実施態様において、−Ｘ−、Ｒａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。−Ｘ−のある実施態様では、Ｒｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。−Ｘ−の特定の実施態様では、ＲａおよびＲｂの一方または両方が水素である。−Ｘ−の特定の実施態様では、ＲａおよびＲｂのうちの一方のみが水素である。Ｘ−の特定の実施態様では、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。−Ｘ−の別の実施態様では、ＲａおよびＲｂは同時にメチルである。
【０１４８】
ある実施態様では、−Ｙ−、Ｒａは水素またはアルキルであり、特に水素またはメチルである。−Ｙ−の特定の実施態様では、Ｒｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。−Ｙ−の別の実施態様では、ＲａおよびＲｂの一方または両方が水素である。−Ｙ−のある実施態様では、ＲａおよびＲｂのうちの一方のみが水素である。−Ｙ−の別の実施態様では、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。−Ｙ−のある実施態様では、ＲａおよびＲｂは同時にメチルである。
【０１４９】
ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、独立して、水素およびアルキル、特に水素およびメチルから選択される。
【０１５０】
ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、全て同時に水素である。
【０１５１】
ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、全て同時に水素であり、Ｒ５およびＲ５＊のうちの一方が水素であり、もう一方は上記に規定されており、特にアルキル、より具体的にはメチルである。
【０１５２】
ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、全て同時に水素であり、Ｒ５およびＲ５＊のうちの一方が水素であり、もう一方はアジドである。
【０１５３】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊のうちの１つは同時に全て水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれ、β−Ｄ−オキシＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして当技術分野において一般的に知られているものを含む。
【０１５４】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｓ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、-ＮＨ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ００／０４７５９９およびMorita et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12, 73-76に開示されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれており、２'−Ｏ−４'Ｃ−エチレン架橋核酸(ＥＮＡ)として当技術分野において一般的に知られているものを含む。
【０１５７】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の一方は水素であり、他方は水素ではない、例えばメチルなどのアルキルである。このような５'置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２００７／１３４１８１に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
ある実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、ＲａおよびＲｂの一方または両方は水素ではなく、特にメチルなどのアルキルであり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は同時に全て水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の一方は水素であり、他方は水素ではなく、特にメチルなどのアルキルである。このようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２０１０／０７７５７８に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３)−("2' O-メトキシエチル二環式核酸",  Seth et al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81)である。
【０１６０】
ある実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は同時に全て水素である。そのような６'−置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２０１０／０３６６９８およびＷＯ２００７／０９００７１に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。そのような６'−置換ＬＮＡヌクレオシドにおいて、Ｒａは、特にメチルなどのＣ１−Ｃ６アルキルである。
【０１６１】
ある実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３)−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、環状ＭＯＥ(ｃＭＯＥ)としても当技術分野で知られており、ＷＯ２００７／０９００７１に開示されている。
【０１６２】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−である。
【０１６３】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−(Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.)である。
【０１６４】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は同時に全て水素である。このような６'−メチルＬＮＡヌクレオシドは、ｃＥＴヌクレオシドとして当技術分野で知られており、ＷＯ２００７／０９００７１(β−Ｄ)およびＷＯ２０１０／０３６６９８(α−Ｌ)に開示されている通りの(Ｓ)−ｃＥＴまたは(Ｒ)−ｃＥＴジアステレオマーのいずれかであってもよく、これら両方が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、ＲａおよびＲｂのいずれも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。特定の実施態様では、ＲａおよびＲｂは、同時に両方ともアルキルであり、特に両方ともメチルである。このような６'−ジ−置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２００９／００６４７８に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｓ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。そのような６'−置換チオＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２０１１／１５６２０２に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。そのような６'−置換チオＬＮＡの特定の実施態様では、Ｒａはアルキル、特にメチルである。
【０１６７】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｃ(＝ＣＨ２)Ｃ(ＲａＲｂ)−であり、例えば、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。このようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２００８／１５４４０１およびＷＯ２００９／０６７６４７に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｎ(ＯＲａ)−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。ある実施態様では、Ｒａはメチルなどのアルキルである。このようなＬＮＡヌクレオシドは、Ｎ置換ＬＮＡとしても知られており、ＷＯ２００８／１５０７２９に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＮＣＨ３−(Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.)である。
【０１７０】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、ＯＮ(Ｒａ)−、−Ｎ(Ｒａ)−Ｏ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−または−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全て水素である。特定の実施態様において、Ｒａは、メチルなどのアルキルである(Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.)。
【０１７１】
ある実施態様において、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に双方が水素である。他の実施態様において、Ｒ５およびＲ５＊の一方は水素であり、他方はメチルなどのアルキルである。そのような実施態様では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、特に、水素であり、−Ｘ−Ｙ−は、特に−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨＣ(Ｒａ)３−、例えば−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−であり得る。
【０１７２】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−のような−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、すべて同時に水素である。そのような実施態様では、Ｒａは、特にメチルなどのアルキルであり得る。このようなＬＮＡヌクレオシドは、立体構造が制限されたヌクレオチド(ＣＲＮ)としても知られており、ＷＯ２０１３／０３６８６８８に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる
【０１７３】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、同時に全てが水素である。特定の実施態様において、Ｒａは、特にメチルなどのアルキルであり得る。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
指定されない限り、ＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄまたはα−Ｌ立体異性体であってもよいことは認識されるであろう。
【０１７５】
ＬＮＡヌクレオシドの特定の例をスキーム１に示す。
【化３】
2021513861.tif 000004
【化４】
2021513861.tif 000005
【０１７６】
他の箇所において示された通り、本願のある実施態様では、オリゴヌクレオチド中のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドである。
【０１７７】
ＩＩ．Ｅ．ヌクレアーゼ媒介性分解
ヌクレアーゼ媒介性分解とは、相補的なヌクレオチド配列との二重鎖を形成する際に、相補的なヌクレオチド配列の分解を媒介することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。
【０１７８】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介性分解により作用してもよく、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)、例えばＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる。ヌクレアーゼ媒介メカニズムを介して作動するオリゴヌクレオチドのデザインの例は、通常、少なくとも５または６つのＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、片側または両側に親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマーおよびテールマーに隣接されているオリゴヌクレオチドである。
【０１７９】
ＩＩ．Ｆ．ＲＮａｓｅ Ｈの活性および動員(リクルート)
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的なＲＮＡ分子との二重鎖においてＲＮａｓｅ Ｈをリクルートし、相補的なＲＮＡ分子の分解を誘導する能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮａｓｅ Ｈをリクルートする能力を決定するために使用され得るＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。通常、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列が提供された場合、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力があると考えられ、その能力は、ｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定され、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含んでおり、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１〜９５に提供される方法を用いた場合に決定される初速度(initial rate)の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％または２０％以上の初速度を有する。
【０１８０】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された時に、ｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定されたＲＮａｓｅ Ｈ初速度が、例えば、試験されるオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含んでおり、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを用いて、またＷＯ０１／２３６１３の実施例９１〜９５に提供される方法を用いた場合に決定される初速度の少なくとも２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満である場合、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することが本質的に不可能であるとみなされる。
【０１８１】
ＩＩ．Ｇ．ＡＳＯのデザイン
本開示のＡＳＯは、ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログの両方を含むヌクレオチド配列を含むことができ、ギャップマー、ブロックマー、ミキサマー、ヘッドマー、テールマーまたはトータマーの形態で存在し得る。本願ＡＳＯと一緒に使用することができるギャップマー、ブロックマー、ミックスマー、ヘッドマー、テールマーまたはトータマーの立体配置の例は、米国特許出願公開第２０１２／０３２２８５１号に記載されている。
【０１８２】
本明細書で使用される用語「ギャップマー」は、１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシド(フランク：flanks)により５'および３'が挟まれたＲＮａｓｅ Ｈリクルーティングオリゴヌクレオチドの領域(ギャップ)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。用語「ヘッドマー」および「テールマー」は、該フランクの１つが欠失している、即ち、オリゴヌクレオチドの１つの末端のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含んでいるＲＮａｓｅ Ｈをリクルートすることが可能なオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーについては、３'フランクが欠失しており(即ち、３'フランクは親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)、テールマーについては、５'フランクが欠失している(即ち、３'フランクが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)。用語「ＬＮＡギャップマー」は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。用語「混合型ウィングガパー」とは、フランク領域が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドまたは非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも１つの２'置換修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも１つの２'置換された修飾ヌクレオシド、例えば、２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２'−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２'−アルコキシ−ＲＮＡ、２'−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ(ＭＯＥ)、２'−アミノ−ＤＮＡ、２'−フルオロ−ＲＮＡ、２'−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸(ＡＮＡ)および２'−フルオロ−ＡＮＡヌクレオシドを含んでいるＬＮＡギャップマーをいう。
【０１８３】
「ミックスマー」と呼ばれる別の「キメラ」ＡＳＯは、(ｉ)ＤＮＡモノマーまたはヌクレオシドアナログモノマーが、ＲＮａｓｅによって認識でき、かつ切断可能なもの；および(ｉｉ)非ＲＮａｓｅリクルーティングヌクレオシドアナログモノマーの互換的組成物を含む。
【０１８４】
「トータマー」とは、天然に存在していないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのみを含む一本鎖のＡＳＯである。
【０１８５】
ある実施態様において、標的領域に対するＡＳＯの親和性を高めることに加えて、いくつかのヌクレオシドアナログは、ＲＮａｓｅ(例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ)の結合および開裂を媒介する。α−Ｌ−ＬＮＡモノマーは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性をある程度まで増強するので、ある実施態様においては、α−Ｌ−ＬＮＡモノマーを含有しているＡＳＯのギャップ領域(例えば、本明細書で言及される領域Ｂ)は、ＲＮａｓｅ Ｈにより認識可能かつ開裂可能なより小さなモノマーを含み、このミキサマー構築体に高い柔軟性が組み込まれる。
【０１８６】
ＩＩＩ．ギャップマーのデザイン
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、ギャップマーであり、領域Ｂ(Ｂ)として本明細書において言及されるＲＮａｓｅ ＨなどのＲＮａｓｅを動員できるヌクレオチド(例えば、１つまたは複数のＤＮＡ)に隣接したストレッチを含み、ここで領域Ｂは、領域Ｂのヌクレオチドの近接ストレッチに対してヌクレオシドアナログの領域５'および３'により、５'および３'両方で挟まれている−これらの領域は、それぞれ領域Ａ(Ａ)およびＣ(Ｃ)として示される。ある実施態様において、ヌクレオシドアナログは、糖修飾ヌクレオシド(例えば、高親和性糖修飾ヌクレオシド)である。特定の実施態様では、領域ＡおよびＣの糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するＡＳＯの親和性を増強する(すなわち、親和性増強２'糖修飾ヌクレオシド)。ある実施態様において、糖修飾ヌクレオシドは、高親和性の２'糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡまたは２'−ＭＯＥである。
【０１８７】
ギャップマーでは、領域Ｂの５'および３'の大部分のヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドであり、領域ＡおよびＣのヌクレオシドアナログ(例えば、高親和性糖修飾ヌクレオシド)に各々隣接して配置されている。ある実施態様において、領域ＡおよびＣは、領域Ｂから最も離れている末端(即ち、領域Ａの５'末端および領域Ｃの３'末端)にヌクレオシドアナログを有することによりさらに規定され得る。
【０１８８】
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、式(５'から３'まで)Ａ−Ｂ−Ｃのヌクレオチド配列を含んでいる：式中の(Ａ)(５'領域または第１のウイング配列)は、少なくとも１つのヌクレオシドアナログ(例えば、３〜５のＬＮＡ単位)を含み；(Ｂ)は、ＲＮａｓｅを動員することができる(ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡターゲットのような相補的なＲＮＡ分子と二重鎖が形成される場合)少なくとも４個の連続するヌクレオシド(例えば、４〜２４のＤＮＡ単位)を含み；および(Ｃ)(３'領域または第２のウイング配列)は、少なくとも１つのヌクレオシドアナログ(例えば、３〜５のＬＮＡ単位)を含む。
【０１８９】
ある実施態様において、領域Ａは、ＬＮＡなどの３〜５個のヌクレオチドアナログを含み、領域Ｂは、６〜２４(例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４)個のＤＮＡ単位を含み、領域Ｃは、ＬＮＡなどの３または４つのヌクレオチドアナログを含む。そのようなデザインは、(Ａ−Ｂ−Ｃ)３−１４−３、３−１１−３、３−１２−３、３−１３−３、４−９−４、４−１０−４、４−１１−４、４−１２−４および５−１０−５を含む。ある実施態様では、ＡＳＯは、ＬＬＬＤｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤｎＬＬＬＬまたはＬＬＬＬＬＤｎＬＬＬＬＬのデザインを有しており、Ｌはヌクレオシドアナログであり、ＤはＤＮＡであり、ｎは、４〜２４の任意の整数であり得る。ある実施態様においては、ｎは、６〜１４の間の任意の整数であり得る。ある実施態様では、ｎは８〜１２の間の任意の整数であり得る。
【０１９０】
更なるギャップマーのデザインは、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００７／１４６５１１およびＷＯ２００８／１１３８３２に開示されており、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
ＩＩ．Ｈ．インターヌクレオチド結合
本明細書に記載されるＡＳＯのモノマーは、連結基を介して結合している。好適には、各モノマーは、連結基を介して３'隣接モノマーに連結されている。
【０１９２】
当業者は、本明細書の内容から、ＡＳＯの末端の５'モノマーは、５'末端基を含んでも良いか、または含まなくも良いが、５'連結基を含まないことを理解するであろう。
【０１９３】
用語「連結基」または「インターヌクレオシド結合」とは、２つのヌクレオシドを一体として共有結合できる基を意味することが意図される。具体的かつ好ましい例としては、ホスフェート基およびホスホロチオエート基が挙げられる。
【０１９４】
本願ＡＳＯのヌクレオシドまたはその連続するヌクレオシド配列は、連結基により一体となって結合されている。好適には、各ヌクレオシドは、連結基を介して３'隣接ヌクレオシドに結合される。
【０１９５】
ある実施態様において、インターヌクレオシド結合は、その通常のホスホジエステルから、ヌクレアーゼの攻撃に対してより耐性のあるものに、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈにより切断可能なホスホロチオエートへと改変され、これにより標的遺伝子の発現を低下させる際にアンチセンス阻害の経路も可能となる。ある実施態様において、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のインターヌクレオシド結合が改変される。
【０１９６】
ＩＩ．Ｉ．コンジュゲート
本明細書で使用される用語「コンジュゲート」は、非ヌクレオチド部位(コンジュゲート部位または領域Ｃまたは第三領域)に共有結合しているＡＳＯを指す。
【０１９７】
本願ＡＳＯを、１以上の非ヌクレオチド部分とコンジュゲーションすることにより、ＡＳＯの薬理特性を、例えば、ＡＳＯの活性、細胞内分布、細胞内取り込み、または安定性に影響を与えることにより改善することができる。ある実施態様では、非ヌクレオチド部分は、ＡＳＯの細胞分布、バイオアベイラビリティー、代謝、排出、透過性および／または細胞取り込みを改善することによって、ＡＳＯの薬物動態特性を変更または増強する。特定の実施態様において、非ヌクレオチド部位により、特定の器官、組織または細胞のタイプがＡＳＯの標的となり、それにより、その器官、組織または細胞のタイプにおけるＡＳＯの有効性を増強することができる。別の実施態様では、非ヌクレオチド部位は、非標的細胞型、組織または器官におけるＡＳＯの活性を低下させ、例えば、標的外の活性または非標的細胞型、組織または器官における活性を低下させる。ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は、好適なコンジュゲート部分を提供する。さらなる好適なコンジュゲート部分は、アシアロ糖プロテイン受容体(ＡＳＧＰｒ)に結合することが可能なものである。特に、３価のＮ−アセチルガラクトサミンコンジュゲート部位は、ＡＳＧＰｒと結合するのに適しており、例えば、ＷＯ２０１４／０７６１９６、ＷＯ２０１４／２０７２３２およびＷＯ２０１４／１７９６２０を参照されたい。これら各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９８】
ある実施態様において、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬剤、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば、細菌毒素)、ビタミン、ウイルスタンパク質(例えば、カプシド)およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１９９】
ＩＩ．Ｊ．活性化ＡＳＯ
本明細書で使用される用語「活性化ＡＳＯ」という用語は、本明細書に記載されたコンジュゲートを形成するために、１つ以上のコンジュゲート部位、即ちそれ自体が核酸またはモノマーではない部位へのＡＳＯの共有結合を可能にする少なくとも１つの官能基部位と共有結合されている(即ち、官能化されている)ＡＳＯを指す。通常、官能基部位は、例えば、３'−ヒドロキシル基またはアデニン塩基の環外ＮＨ２基、スペーサー(親水性であり得る)およびコンジュゲート部位(例えば、アミノ基、スルフィドリル基またはヒドロキシル基)に結合できる末端基を介して、ＡＳＯに共有結合することが可能な化学基を含む。ある実施態様において、この末端基、例えば、ＮＨ２基は保護されていない。別の実施態様において、この末端基は、任意の適切な保護基により、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載された保護基により保護されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２００】
ある実施態様において、本願ＡＳＯは、ＡＳＯの５'末端へのコンジュゲート部位と共有結合できるように、５'末端で官能化されている。別の実施態様では、本願ＡＳＯは、３'末端で官能化され得る。まだ別の実施態様では、本願ＡＳＯは、バックボーンに沿って、または複素環塩基の部位上で官能化され得る。さらなる別の実施態様では、本願ＡＳＯは、５'末端、３'末端、バックボーンおよび塩基から独立して選択される１以上の位置で官能化され得る。
【０２０１】
ある実施態様において、本願の活性化ＡＳＯは、合成中に官能基部位に共有結合される１以上のモノマーを組み込むことにより合成される。別の実施態様において、本願の活性化ＡＳＯは、官能化されていないモノマーを用いて合成して、このＡＳＯを合成の完了時に官能化する。
【０２０２】
ＩＩＩ．医薬組成物および投与経路
本願ＡＳＯは、医薬組成物および組成物において使用することができる。ある実施態様では、そのような組成物は、医薬的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。特定の実施態様では、医薬的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩を含む。
【０２０３】
本願ＡＳＯは、治療される患者に重篤な副作用を引き起こすことなく、治療上有効な量を患者に送達するのに十分量で医薬的に許容される担体または希釈剤のような単位製剤中に含まれ得る。しかし、ある実施態様では、重篤な副作用は、治療的処置の肯定的な結果を確実にするという点では許容され得る。
【０２０４】
製剤化された薬剤は、医薬的に許容される結合剤およびアジュバントを含んでもよい。カプセル剤、錠剤または丸剤は、例えば以下の化合物：結合剤として微結晶セルロース、ガムまたはゼラチン；賦形剤としてデンプンまたは乳糖；滑沢剤としてステアリン酸塩；各種甘味料または香料を含むことができる。カプセル剤の場合、投与単位は、脂肪油のような液体担体を含むことができる。同様に、糖衣または腸管剤は、投与単位の一部分とすることができる。ＡＳＯ製剤は、有効な医薬成分およびミセル状エマルジョンを形成する脂質エマルジョンであってもよい。
【０２０５】
本願の医薬組成物は、局所的または全身的な治療が望まれるかどうかに応じて、また治療領域に応じて多くの方法で投与することができる。投与とは、(ａ)経口投与；(ｂ)肺投与、例えば、散剤またはエアロゾルの吸入または吹送、例えばネブライザーによる投与；気管内、鼻腔内投与；(ｃ)局所投与、例えば、表皮、経皮、点眼、および経膣および直腸送達を含む粘膜への局所投与など；または(ｄ)非経口投与、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴など；または(ｄ)静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入を含む非経口投与；または頭蓋内投与を含む非経口投与、例えば、髄腔内、脳室内または心室内投与であり得る。ある実施態様において、ＡＳＯは、静脈内、腹腔内、経口、局所またはボーラス注射として投与されるか、または標的臓器に直接投与される。ある実施態様において、ＡＳＯは、ボーラス注射として心腔内または静脈内に投与される。ある実施態様において、ＡＳＯは皮下投与される。ある実施態様では、ＡＳＯは経口投与される。
【０２０６】
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、目薬、噴霧、坐薬、液体および粉体を含むことができる。従来の医薬用担体、水溶液、粉末または油性基材、増粘剤などを必要としてもよく、または望ましい場合がある。局所用製剤の例には、本願ＡＳＯは、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、界面活性剤などの局所送達剤との混和物にて存在している製剤が挙げられる。経口投与用の組成物および製剤には、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋、錠剤またはミニタブレットが含まれるが、これらに限定されない。非経口投与、髄腔内投与、脳室内投与または心室内投与のための組成物および製剤は、無菌水溶液を含むことができ、この水溶液は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤、例えば、浸透促進剤、担体化合物および他の医薬的に許容される担体または賦形剤を含むことができるが、これらに限定されない。
【０２０７】
本願の医薬組成物には、溶液、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、次のものに限定しないが事前に形成された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体を含む様々な成分から生成され得る。標的組織への薬物の送達は、次のものに限定しないがカチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレニミンポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアを含めたキャリア媒介性の送達によって増強され得る(Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(l):3-27)。)
【０２０８】
本願の医薬製剤は、有利には、単位用量形態で示すことができ、製薬業界でよく知られている従来技術に従って調製することができる。このような技術には、活性成分を医薬用担体または賦形剤と混合する工程が含まれる。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または細かく粉砕された固体担体またはその両方と均一かつ充分に混合することにより、また必要に応じて成形することにより製造される。
【０２０９】
非経口投与、皮下投与、皮内投与または局所投与の場合、製剤は、無菌希釈剤、緩衝剤、浸透圧調整剤および抗菌剤を含むことができる。活性なＡＳＯは、体内からの分解または即時排出を防ぐ担体、例えば、放出制御特性を有する担体(例えば、インプラントまたはマイクロカプセルなど)を用いて調製することができる。静脈内投与のためには、担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水であり得る。２００７年３月２２日に公開された国際公開第ＷＯ２００７／０３１０９１号(Ａ２)は、医薬的に許容される適切な希釈剤、担体およびアジュバントをさらに提供しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
ＩＶ．診断
本明細書は、心血管系疾患、例えば心不全の診断中に有用な診断方法をさらに提供する。本願ＡＳＯを用いて診断することができる心血管系疾患の非限定的な例としては、冠動脈疾患、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜症性心疾患心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症および静脈血栓症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様において、心不全は、左心不全、右心不全、うっ血性心不全、駆出率低下型心不全(ＨＦｒＥＦ)、駆出率保存型心不全(ＨＦｐＥＦ)、駆出率中間型心不全(ＨＦｍｒＥＦ)、肥大型心筋症(ＨＣＭ)、高血圧性心疾患(ＨＨＤ)または高血圧性肥大型心筋症を含む。
【０２１１】
本願ＡＳＯは、個人から得た組織または体液中のＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現を実測して、測定された発現レベルを、正常な組織または体液中の標準的なＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現レベルと比較するために使用することができ、それの結果により、標準的な発現レベルと比較された発現レベルの増加が、本願ＡＳＯにより治療可能な疾患の指標となる。
【０２１２】
本願ＡＳＯは、当業者には既知のあらゆる方法を用いて、生物学的試料中のＣＡＭＫ２Ｄ転写物レベルをアッセイするために使用することができる(Touboul et. al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et. al., Mutat. Res.(2000) 640: 127-38);Stowe et. al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91)。
【０２１３】
「生物学的試料」という用語は、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物を発現する可能性のある個体、細胞株、組織培養物または細胞の他の供給源から得られるあらゆる生物学的試料を指す。哺乳動物由来のそのような生物学的試料を得るための方法は、当技術分野では周知である。
【０２１４】
Ｖ．ＡＳＯを含むキット
本発明は、本明細書に記載された本願ＡＳＯを含むキットをさらに提供し、本明細書に記載された方法を実行するために使用することができる。特定の実施態様では、キットは、１以上の容器に入った少なくとも１つのＡＳＯを含む。ある実施態様では、キットは、検出アッセイを実行するために必要および／または十分な成分のすべてを含み、これには、全てのコントロール、アッセイを実行するための指示書および結果を分析かつ提示するために必要な任意のソフトウェアなどが含まれる。当業者であれば、本願ＡＳＯを、当技術分野では周知の確立されたキットの形態に組み込むことができることは容易に理解されるであろう。
【０２１５】
ＶＩ．使用方法
本願ＡＳＯは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用することができる。
【０２１６】
研究において、そのようなＡＳＯは、細胞および実験動物におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の合成を特異的に阻害するために使用することができ(通常、ｍＲＮＡを分解または阻害し、それによりタンパク質の形成を阻害する)、これにより標的の機能分析または治療的介入のための標的としてのその有用性を容易に評価することができる。さらに、インビトロまたはインビボで、１以上の本願ＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物の有効量を細胞または組織に接触させることを特徴とする、細胞または組織におけるＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡおよび／またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現をダウンレギュレートする方法が提供される。
【０２１７】
診断において、ＡＳＯは、ノーザンブロッティング、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションまたは同様の技術により、細胞または組織におけるＣＡＭＫ２Ｄ転写物の発現を検出かつ定量するために使用することができる。
【０２１８】
治療薬としては、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物および／またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を調節することによって治療できる疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、本願ＡＳＯを投与することによって治療することができる。さらに提供される方法は、本願ＡＳＯまたは組成物の１以上のＡＳＯまたは組成物の治療的または予防的に有効な量を投与することによって、ＣＡＭＫ２Ｄ転写物および／またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現増加に関連した疾患または症状に罹患しているか、または罹患し易いと考えられる哺乳動物を治療する(例えば、ヒトを治療する)方法である。本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、通常、有効量で投与される。ある実施態様では、本願ＡＳＯまたはコンジュゲートは、治療に使用される。
【０２１９】
本発明は、本明細書で言及される１以上の心血管系疾患、例えば、冠動脈疾患、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜症性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患および静脈血栓症から選択される疾患を治療するために使用する本願ＡＳＯをさらに提供する。
【０２２０】
特定の実施態様では、疾患、障害または症状は、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子転写物および／またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の過剰発現と関連している。
【０２２１】
本発明は、細胞または組織におけるＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子転写物および／またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の発現を阻害する(例えば、低下させる)方法も提供し、インビトロまたはインビボで、細胞または組織に、１つ以上の本願ＡＳＯ、コンジュゲートまたはそれらの医薬組成物の有効量を接触させて、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子転写物の発現の分解に影響を及ぼして、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を低下させることを特徴とする方法をさらに提供する。
【０２２２】
本発明は、本明細書で言及されるような障害の治療のための医薬製造、または本明細書で言及されるような障害としての治療の方法のための、本願ＡＳＯまたはコンジュゲートの使用を提供する。
【０２２３】
本発明は、本願ＡＳＯまたはそのコンジュゲートを細胞に投与することにより、細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の阻害または低下に影響を与えることを特徴とする、ＣＡＭＫ２Ｄを発現している細胞においてＣＡＭＫ２Ｄタンパク質を阻害または低下させるための方法をさらに提供する。
【０２２４】
本発明は、本願ＡＳＯまたはコンジュゲートを投与することを特徴とする、必要な対象における運動ニューロン(例えば、心筋細胞に存在するようなもの)の過剰な興奮性を低下、改善、予防または治療する方法を含む。
【０２２５】
本発明は、本明細書に記載した本願ＡＳＯまたはそのコンジュゲートおよび／または本願医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを特徴とする、本明細書に記載の障害を治療するための方法も提供する。
【０２２６】
本願ＡＳＯおよび他の組成物は、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の過剰発現に関連する症状を治療するために使用することができる。
【０２２７】
一般的に、本発明の一態様は、ＣＡＭＫ２Ｄの異常なレベルに関連した症状に罹患している、または異常なレベルに関連した症状に罹患し易い哺乳動物を治療する方法に関し、１以上のＬＮＡ単位を含むＣＡＭＫ２Ｄ転写物を標的としたＡＳＯの治療的に有効な量をその哺乳動物に投与することを特徴とする。本明細書に関するＡＳＯ、そのコンジュゲートまたは医薬組成物は、有効量で通常投与される。
【０２２８】
本開示の興味深い態様は、本明細書において規定されるようなＡＳＯ(化合物)または本明細書で規定されるようなコンジュゲートを、本明細書で言及されるような疾患、障害または症状を治療するための医薬製造のために使用することに関する。
【０２２９】
本願方法は、異常なＣＡＭＫ２Ｄタンパク質レベルによって引き起こされる疾患を治療または予防するために用いることができる。ある実施態様では、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の異常なレベルによって引き起こされる疾患が、心血管疾患である。特定の実施態様では、心血管疾患は、冠動脈疾患、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜症性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症および静脈血栓症を含むことができる。
【０２３０】
特定の実施態様において、心血管系疾患は、心不全であり、これには、左心不全、右心不全、うっ血性心不全、駆出率低下型心不全(ＨＦｒＥＦ)、駆出率保存型心不全(ＨＦｐＥＦ)、駆出率中間型心不全(ＨＦｍｒＥＦ)、肥大型心筋症(ＨＣＭ)、高血圧性心疾患(ＨＨＤ)または高血圧性肥大型心筋症を治療するための方法にも関する。
【０２３１】
あるいは、ある実施態様において、本明細書は、さらにＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の異常なレベルを治療するための方法に関し、この方法は、本願ＡＳＯまたは本願コンジュゲートまたは本願医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０２３２】
本発明は、医薬品として使用するための、本明細書に規定されたＡＳＯ、組成物またはそのコンジュゲートに関する。
【０２３３】
本発明は、さらに、ＣＡＭＫ２Ｄタンパク質またはＣＡＭＫ２Ｄタンパク質の変異体(例えば、対立遺伝子変異体、該対立遺伝子変異体は、本明細書で言及される１の疾患と関連している)の発現の異常なレベルを治療するための医薬品製造のための、本明細書に規定される化合物、組成物またはコンジュゲートの使用に関する。
【０２３４】
治療を必要としている患者とは、疾患または障害に罹患しているか、または罹患する可能性のある患者をいう。
【０２３５】
本発明の実施態様は、別段の指示がない限り、当技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養学、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を利用する。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照されたい。
【０２３６】
上記で引用した全ての参考文献、および本明細書で引用した全ての参考文献は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定を目的とするものではない。
【実施例】
【０２３８】
実施例１：ＡＳＯの構築
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＡＭＫ２Ｄ ｐｒｅ-ｍＲＮＡ(配列番号：１)中の様々な領域を標的とするようにデザインされた。配列番号：１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００４.１２の残基１１３,４５１,０３２〜１１３,７６１,９２７の逆相補体に対応するゲノムＣＡＭＫ２Ｄ配列を示す。例えば、ＡＳＯを、図１Ａおよび１Ｂに示されるように、配列番号：１の開始部位および終了部位を用いて示される領域を標的とするように構築した。本願ＡＳＯの配列の例は、図１Ａおよび１Ｂにおいて提供される。ある実施態様においては、ＡＳＯを、図３に示されるようにギャップマーであるようにデザインした。本明細書のギャップマーは、架橋核酸−ＬＮＡ(大文字)を含むようデザインされた。例えば、ギャップマーは、５'末端および３'末端にβ−デオキシＬＮＡを有し、ホスホロチオエート骨格を有し得る。しかし、ＬＮＡは、その他のヌクレオシドアナログで置換されていてもよく、骨格は別のタイプのバックボーン(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミダート結合またはそれらの任意の組み合わせ)であってもよい。
【０２３９】
ＡＳＯは、当分野において既知の方法を用いて合成された。そのようなＡＳＯを製造する方法の例は、Barciszewski et al., Chapter 10- "Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)に記載されており、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４０】
実施例２：ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡの低下を測定するためのｑＰＣＲアッセイ
本願ＡＳＯを、ヒト胚性腎細胞(ＨＥＫ２９３)(European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)、カタログ番号：８５１２０６０２)におけるＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ発現を低下させる能力について試験した。ＨＥＫ２９３細胞は、細胞培養培地(ＤＭＥＭ ＡＱ Ｄ０８１９, １０％ＦＢＳ, Ｐｅｎ/Ｓｔｒｅｐ)中で増殖させた。５日ごとに、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、その後０.２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を加えて、３７℃で２〜３分間インキュベーションして、細胞播種前にトリチュレートして、トリプシン処理を行った。細胞は１５回までの継代培養にて維持された。
【０２４１】
実験のために、１００μＬの増殖培地に９６ウェルプレートで３,５００個／ウェルの細胞を播種した。ＡＳＯを、７５０μＭのストックから調製し、ＰＢＳに溶解した。細胞を播種してから約２４時間後、ＡＳＯを最終濃度２５μＭで細胞に添加した。その後、細胞を、培地の変更なしに３日間インキュベートした。インキュベーション後、１２５μＬのＰＵＲＥＬＩＮＫ(登録商標)Ｐｒｏ ９６ 溶解緩衝液および１２５μＬの７０％エタノールを添加した後、培地を除去して、細胞を回収した。次いで、製造者指示書に従ってＲＮＡを精製し、最終容量５０μＬの水で溶出し、ＲＮＡ濃度を１０〜２０ｎｇ／μＬとした。その後、ＲＮＡを水で１０倍に希釈した後、ワンステップｑＰＣＲ反応を行った。
【０２４２】
ワンステップｑＰＣＲ反応のために、ｑＰＣＲ−ｍｉｘ(qScriptTMXLE 1-step RT-qPCR TOUGHMIX(登録商標)Low ROX, QauntaBio社)および２つのＴａｑｍａｎプローブを、１０：１：１：１の比率で混合し、マスターミックスを生成した(ｑＰＣＲｍｉｘ：プローブ１：プローブ２)。Ｔａｑｍａｎプローブは、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した：ＣＡＭＫ２Ｄ＿Ｈｓ００９９４３５３８＿ｍ１；ＧＡＰＤＨ４３２５７９２。次いで、マスターミックス(６μＬ)およびＲＮＡ(４μＬ、１〜２ｎｇ／μＬ)を、ｑＰＣＲプレート(MICROAMP(登録商標)optical 384 well, カタログ番号4309849)中で混合した。プレートを密封した後、プレートを高速回転に付して(１０００ｇ, ＲＴで１分)、ＶｉｉａＴＭ ７システム(Applied Biosystems, Thermo)に移した。以下のＰＣＲ条件を用いた：５０℃で１５分間；９５℃で３分間；９５℃で５秒、次いで１．６℃／秒の温度低下、次いで６０℃で４５秒の４０サイクル。データを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ(登録商標)Ｒｅａｌ＿ｔｉｍｅＰＣＲソフトウェアを用いて解析した。ＡＳＯ処理したサンプルの阻害率を、コントロール処理したサンプルと比較して計算した。結果を、図２および図４に示した。
【０２４３】
実施例３．ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)におけるＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡの低下量を測定するためのＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(登録商標)分析(９６ウェルアッセイ)
ヒトＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡを低下させるＡＳＯの能力を、ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(登録商標)分析によりインビトロで測定した。セルラー・ダイナミクス・インターナショナル("iCell2")から得たヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(ｈｉＰＳＣ−ＣＭ)を、製造元の指示書に従って解凍して、播種し、培養した。これらの心筋細胞は、２００９年に機能的な心筋細胞への分化に初めて成功したヒト誘導性の多能性幹細胞から得られたものである(Zhang et al., Circ Res 104(4):230-41 (2009))。それ以来、ｈｉＰＳＣ−ＣＭは、ヒトの心臓や関連疾患の様々な側面を研究するために使用されてきた。これらの細胞は、それらが得られたヒトのドナーの遺伝的形質を担持しているため、既存の動物モデルと比較して、ヒトの生理学または病態生理学に関するより優れた予測因子となることが多い(Blazeski et al., Prog Biophys Mol Biol 110:166-177 (2012))。
【０２４４】
ワークフロー：細胞の播種前に、プレコラーゲンコート９６ウェルプレートを以下のようにフィブロネクチンでコーティングした。フィブロネクチン(１ｍｇ／ｍＬ)を、ＰＢＳ(−Ｃａ２＋，−Ｍｇ２＋)で１：１００に希釈して、５０μＬの希釈フィブロネクチン溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、水平に静かに振盪して、各ウェルの底面にフィブロネクチンを均一にコーティングした。その後、プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。製造者の指示書の通りに、フィブロネクチン溶液を吸引した直後に、細胞をプレートに加えた。細胞を、３０,００００細胞／ウェルにて、メーカーの１００μＬの播種用培地に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。次いで、播種用培地を吸引し、１００μＬの維持培地と交換した後、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２にて、１日おきに培地交換しながらインキュベートした。ＡＳＯを水で希釈し、ＤＩＶ０８(即ち、播種後８日目)に細胞に添加した。その後、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２にてＡＳＯ添加後３日間インキュベートして、ｍＲＮＡの定常状態での低下を達成した。
【０２４５】
インキュベーション後に、培地を除去し、以下のように細胞を溶解した。処理用細胞溶解緩衝液は、ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(登録商標)３ｘ溶解緩衝液の９９部に、プロテイナーゼＫを１部添加し、ｄＨ２Ｏで１：３に希釈して、作成した。処理用細胞溶解緩衝液を、２２０ｕＬ／ウェルでプレートに添加した。溶解緩衝液を添加した後、プレートを、プレートシェーカー上で１０分間中速(即ち、１０のうち５〜６の速度)で振盪した。次いで、プレートを、５５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーションの後に、溶解物を−８０℃で凍結するか、または直ぐアッセイした。溶解物のｍＲＮＡの測定は、特異的にデザインされた標的ＲＮＡ捕捉プローブのセットを用いるＤＮＡシグナル増幅方法を用いてＲＮＡを定量するＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(登録商標)２.０ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ(ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ(登録商標))を用いて行った。
【０２４６】
アッセイ：捕捉プレート(捕捉プローブでコーティングされた９６ウェルポリスチレンプレート)の各ウェルには、処理用プローブセットの２０ｕＬを重層した。処理用プローブセットの試薬は、製造元指示書に従い(ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(登録商標)２.０ ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ(登録商標))、ヌクレアーゼ不含水(１２.０５μＬ)、溶解液(６.６５μＬ)、ブロッキング試薬(１μＬ)および特異的な２.０プローブセット(０.３μＬ)(ヒトのＣＡＭＫ２Ｄカタログ＃ＳＡ−３０００４２８またはヒトＰＯＬＲ２Ａカタログ＃ＳＡ−１０００４)を組み合わせて調製した。次いで、細胞溶解液(または、バックグラウンドコントロール用のブランクウェルで使用するための１ｘ溶解バッファー)を、８０μＬ／ウェルの容量で捕捉プレートに添加し、１ウェルあたり１００μＬの全液量とした。プレートを、ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(登録商標)ホイルシールとハンドクランクシーラーを組み合わせて密封した。プレートを、２４０ｇで６０秒間の遠心分離の後、５５℃で１６〜２０時間インキュベートしてハイブリダイズさせた(ターゲットＲＮＡ捕捉)。
【０２４７】
シグナル増幅と標的ＲＮＡの検出は、洗浄バッファーを３回(２００、３００および３００μＬ／ウェルの系で、バッファーを各ステップ間で除去)用いてプレートを洗浄して、任意の結合していない物質を除去した後、２４０ｇで１分間、天地を逆にして遠心分離を行い、ウェルを乾燥させた。次いで、２.０事前増幅化ハイブリダイゼーション試薬(１００μＬ／ウェル)を添加し、５５℃で１時間インキュベートした後、吸引して、洗浄バッファーを添加し、吸引を３回(２００、３００および３００ｕＬ／ウェルの系で、バッファーを各ステップ間で除去)行い、その後２４０ｇで１分間、天地を逆にして遠心分離を行い、ウェルを乾燥させた。次いで、２.０ 増幅化ハイブリダイゼーション試薬を添加し(１００μＬ／ウェル)、５５℃で１時間インキュベートし、次いで洗浄、吸引および乾燥の工程を上記のように繰り返した。次に、２.０ 標識プローブハイブリダイゼーション試薬(１００μＬ／ウェル)を添加し、５０℃で１時間インキュベートした後、前記したように、洗浄、吸引、乾燥の工程を繰り返した。次に、２.０基質(１００μＬ／ウェル)をプレートに添加した。プレートを、室温で５分間インキュベートし、１５分以内にルミノメーターモードでＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー上で画像化した。
【０２４８】
データの決定：目的とする遺伝子について、各反復実験の平均シグナルからアッセイの平均バックグラウンドシグナルを減算した。次いで、目的遺伝子のバックグラウンドを差し引いた平均シグナルを、ハウスキーピングＰＯＬＲ２Ａ ｍＲＮＡのバックグラウンドを差し引いた平均シグナルに対して正規化した。処理したサンプルの阻害％は、コントロール処理したサンプル溶解液と比較して計算した。５００ ｎＭの濃度のＡＳＯで処理した細胞に対するＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(登録商標)アッセイの結果を、図４に示した。
【０２４９】
実施例４：ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡ低下のインビボ解析
図５に示されたＡＳＯの内の１つを、メスのＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍマウスに皮下投与して、ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡレベルをインビボで低下させるＡＳＯの効力を評価した。ＡＳＯを、３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で３日間連続投与した(１日目、２日目、３日目)。マウスの行動および体重の変化を観察した。８日目にマウスを屠殺して、以下に記載したようなＲＮＡを単離および分析するために心臓組織を採取した。
【０２５０】
ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ 組織溶解緩衝液(Roche)を、心臓組織切片に加えて、ステンレススチールビーズを用いて、均一な溶解物が得られるまでホモジナイズした。室温で３０分間インキュベーションして、溶解を完了させた。Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ ＫｉｔとＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ９６(Roche)を用いて、ＲＮＡを単離した。
【０２５１】
ＲＮＡ濃度を５ｎｇ／μｌに正規化し、２０ｎｇ ＲＮＡ、ｑＰＣＲ Ｔａｑｍａｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘおよび以下のＴａｑｍａｎプローブ：ＣＡＭＫ２Ｄ(Thermo Mm00499266_m1)およびＧＡＰＤＨ(Thermo 4352339E)を用いて１ステップｑＰＣＲを行った。
【０２５２】
ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：５０℃で１５分；９５℃で３分；９５℃で５秒間の４０サイクル。データを、ＱＵＡＮＴＳＴＵＤＩＯ(登録商標)リアルタイムＰＣＲソフトウェアを用いて解析した。ＡＳＯ処理したサンプルの阻害率は、生理食塩水で処理したサンプルと比較して計算した。
【０２５３】
図５に示した通りに、試験した全てのＡＳＯは、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍマウスに投与した場合、ＣＡＭＫ２Ｄ ｍＲＮＡレベルを低下させることができた。これらの得られた結果から、インビトロおよびインビボの両方でＡＳＯの効力が実証され、ＣＡＭＫ２Ｄ特異的ＡＳＯが、心血管関連疾患および障害などの様々な医学的障害を治療するための疾患を調節する治療薬であることを支持するものである。
【０２５４】
本願のＰＣＴ出願は、２０１８年２月２１日に出願された米国仮出願第６２／６３３，５０２号、２０１８年２月２７日に出願された第６２／６３５,９５４号、２０１８年５月２日に出願された第６２／６６５,９９８号および２０１８年１２月１２日に出願された第６２／７７８,６７９号の優先権の利益を主張するものであり、これらの各出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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