(57)【要約】  細胞内のグレリンの発現を阻害する方法であって、方法が、細胞にＲＮＡｉを導入することを含み、ＲＮＡｉが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１から配列番号４２のいずれかを含み、センス鎖がアンチセンス鎖に相補的である方法。また、細胞内のグレリンｏ−アシルトランスフェラーゼの発現を阻害する方法であって、方法が、細胞にＲＮＡｉを導入することを含み、ＲＮＡｉが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４３から配列番号６８のいずれかを含み、センス鎖がアンチセンス鎖に相補的である方法。
2021512119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のグレリンの発現を阻害する方法であって、前記細胞にＲＮＡｉを導入することを含み、該ＲＮＡｉが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖は、配列番号１から配列番号４２のいずれかを含み、
前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖に相補的である、方法。
【請求項２】
ＲＮＡｉのアンチセンス鎖及びセンス鎖が、それぞれ１９〜２５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡｉが少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡｉがデンドリマーと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡｉがナノ粒子と結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡｉがｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡｉがカプセル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
導入がトランスフェクションを介する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
導入が受動的取り込みを介する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞内のグレリンｏ−アシルトランスフェラーゼの発現を阻害する方法であって、前記方法が、前記細胞にＲＮＡｉを導入することを含み、前記ＲＮＡｉが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号４３から配列番号６８のいずれかを含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖に相補的である方法。
【請求項１２】
ＲＮＡｉのアンチセンス鎖及びセンス鎖が、それぞれ１９〜２５ヌクレオチド長である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡｉが少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡｉがデンドリマーと結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡｉがナノ粒子と結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡｉがｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はそれらの組合せである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡｉがカプセル化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞がヒト細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
導入がトランスフェクションを介する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
導入が受動的取り込みを介する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
細胞内のグレリンの発現を阻害するための組成物であって、ＲＮＡｉを含み、該ＲＮＡｉが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
該アンチセンス鎖は、配列番号１から配列番号６８のいずれかを含み、
前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖に相補的である、組成物。
【請求項２２】
緩衝液、希釈剤、浸透促進剤、担体化合物及び／又は薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の引用
「４９８３．０１２０１．ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題され、１０．０ＫＢのサイズであり、２０１９年２月１日に作成され、ＵＳＰＴＯの「ＥＦＳ−Ｗｅｂ」特許出願及び文書送信システムを介して電子的に送信された配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が複製されるかのように参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｈｎ  Ｍａｎｓｅｌｌによって２０１８年２月２日に出願され、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」と題された米国仮特許出願第６２／６２５，６８８号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、肥満及び肥満関連障害の治療のための組成物及び方法に関する。さらに具体的には、本開示は、グレリン及びグレリン関連分子を阻害するための組成物及び方法に関する。
【０００３】
背景
肥満（過度の肥満症）は、主要な公衆衛生問題である。２００３〜２００４年の全国健康栄養調査（ＮＨＡＮＥＳ）の結果は、米国成人の推定６６％が過体重又は肥満であり、米国小児の１７％が過体重であることを示した。過度の肥満症は深刻な問題であり、インスリン抵抗性、脂質異常症、軽度の炎症、ならびに糖尿病、アテローム性動脈硬化症及びある種の癌の発症に何らかの役割を果たす成長因子及び他のホルモンのレベルの変化に関連している。さらに、過度の肥満症は老化の加速に関連しているという証拠が蓄積されつつある。試験では、体重のわずかな減少であっても、心血管リスク因子にプラスの影響を及ぼし、２型糖尿病及び糖尿病関連合併症を発症するリスクの低下と関連していることが示されている。
【０００４】
体重管理の一次アプローチとして、行動の変化を通してカロリーを減らし、身体活動を増加させることを目的としたライフスタイル介入が現在推奨されている。ただし、これらの戦略のみでは、体重減少を維持するための薬理学的介入（６〜１２カ月）と比較して成功率が低い。残念なことに、肥満治療のために承認された薬物のほとんどは、それらの副作用のために使用を中止されている。食欲に不可欠な生体分子、例えば、胃由来のペプチドホルモンであるグレリンを標的とする可能性が存在する。
【０００５】
グレリンはレノモレリン（ＩＮＮ）としても知られており、消化管のグレリン作動性細胞（ｇｈｒｅｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｃｅｌｌ）により産生される２８アミノ酸のセリン‐３アシル化ペプチドホルモンである。ヒトグレリンのアミノ酸配列は、アミノ酸のためのＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  １文字表記法を使用して図１に示されている。図１は、グレリン（１００）のアミノ酸配列を示し、活性タンパク質でアシル化されるセリン−３（１１０）を同定している。グレリンは、食欲に加えて、脂肪細胞の分化と、脂肪組織内のカロリー貯蔵の優先とを促進する。グレリンは、末梢レベルでは、グルコースと脂質代謝とを調節する。実際、グレリンは糖尿病誘発作用を有し、グルコース刺激によるインスリン分泌を抑制し、耐糖能を低下させる。栄養感知、食事開始及び食欲の重要な調節因子としてのグレリンの役割に加えて、グレリンシグナル伝達も、グルコース及びエネルギー恒常性、心保護、筋萎縮、骨代謝ならびに癌に重要な役割を果たしている。
【０００６】
過度の肥満症及びそれに関連する疾患を治療する組成物及び方法に対する継続的な必要性が存在する。
【０００７】
概要
一態様では、細胞内のグレリンの発現を阻害する方法である。該方法は、細胞にＲＮＡｉを導入することを含み得る。該ＲＮＡｉは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み得る。該アンチセンス鎖は、配列番号１から配列番号４２のいずれかを含み得る。前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖に相補的であり得る。
【０００８】
一態様では、細胞内のグレリンｏ−アシルトランスフェラーゼの発現を阻害する方法である。該方法は、細胞にＲＮＡｉを導入することを含み得る。該ＲＮＡｉは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み得る。該アンチセンス鎖は、配列番号４３から配列番号６８のいずれかを含み得る。前記センス鎖は前記アンチセンス鎖に相補的である。
【０００９】
一態様では、細胞内のグレリンの発現を阻害するための組成物である。該組成物はＲＮＡｉを含み得る。該ＲＮＡｉは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み得る。該アンチセンス鎖は、配列番号１から配列番号６８のいずれかを含み得る。前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖に相補的であり得る。
【００１０】
本開示をさらに完全に理解するために、添付の図面及び詳細な説明に関連して、以下の簡単な説明を参照する。ここで、同様の参照番号は同様の部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒトグレリンのアミノ酸配列の描写である。
【００１２】
発明の詳細な説明
本明細書では、組成物を投与することにより、肥満及び肥満関連疾患、例えば糖尿病に罹患している対象を治療する方法ならびにグレリン発現の作用を阻害、低減又は改善する方法が開示される。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、治療、観察又は実験の対象である動物を指す。ほんの一例として、対象は、限定するものではないが、ヒトを含む哺乳動物であり得るが、これに限定されない。場合によっては、対象は、１つ以上の病状の治療を受けている患者である。本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患もしくは状態又はその症状を軽減、緩和又は改善すること、疾患もしくは状態又はその症状を管理すること、追加の症状を予防すること、症状の根本的な代謝原因を改善又は予防すること、疾患又は状態を阻害すること、例えば、疾患又は状態の進行を止めること、疾患又は症状を緩和すること、疾患又は状態の退行を引き起こすこと、疾患又は状態によって引き起こされる症状を緩和すること、及び／又は疾患又は状態の症状を止めることを含む。本明細書で使用される場合、治療とは、本明細書の組成物の任意の医薬的使用又は医学的使用も包含する。
【００１４】
一態様では、対象は、病状、障害、疾患又は機能不全、例えば、肥満又は肥満関連障害の１つ以上の症状を治療、予防及び／又は改善するのに十分な治療有効量で、本明細書に開示される組成物を投与される。以下では、簡単にするために、病状、障害、疾患及び機能不全という用語と区別なく使用されている望ましくない状態をまとめて「病状」と呼ぶ。本明細書で使用される場合、本明細書に開示されるタイプの特定の組成物の投与による病状の症状の改善は、本明細書に開示されるタイプの組成物の投与に起因するか関連し得る、持続性又は一過性のいずれかである任意の軽減を指す。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、病状の１つ以上の症状を治療、予防及び／又は改善するための、本明細書に開示される組成物の十分な量を意味する。治療有効量はまた、産業基準及び／又は規制基準に基づいて、本明細書に開示される組成物の安全かつ許容可能な量を含み得る。当業者によって理解されるように、所与の場合に、特定の対象について「治療有効量」であることが判明した量は、そのような投与量が、通常の熟練した開業医によって「治療有効量」と判断されたとしても、当該病状について同様の治療を受けた対象の１００％には有効でない可能性がある。特定の個体に対する治療有効量は、病状の性質、病状の重篤度、対象の体重、対象の年齢、及び対象の全般的な健康状態などの多数の因子に依存して変化し得る。治療有効量は、対象に影響を与える特定の因子を考慮して、１人以上の医療専門家によって最適化され得ることが企図される。
【００１６】
一態様では、本明細書に開示される方法又は組成物のいずれかを使用するグレリンの遺伝子サイレンシングは、グレリンの循環濃度の低下をもたらす。したがって、本明細書に開示される材料は、グレリンの破壊物質（ＤＯＧ）とまとめて称される。「遺伝子サイレンシング」という語句は、特定の遺伝子産物の発現が減少するか減弱されるプロセスを指す。遺伝子サイレンシングは様々な経路により起こり得る。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、遺伝子サイレンシングとは、ＲＮＡのサイレンシング型が宿主タンパク質（例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体、ＲＩＳＣ）と協調して作用して、配列依存的にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解すると定義され、部分的に特徴付けられている経路であるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に起因する、遺伝子産物発現の減少を指す。遺伝子サイレンシングのレベルは、限定するものではないが、ノーザンブロット解析、Ｂ−ＤＮＡ技術、転写感受性レポーター構築物、発現プロファイリング（例えば、ＤＮＡチップ）及び関連技術による転写物レベルの測定を含む様々な手段によって測定することができる。あるいは、サイレンシングのレベルは、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを評価することによって測定することができる。これは、ウエスタン分析を含む多数の試験を行うこと、例えば、蛍光特性（例えば、ＧＦＰ）もしくは酵素活性（例えば、アルカリホスファターゼ）を有するレポータータンパク質の発現のレベルを測定すること、又はいくつかの他の手順によって達成することができる。
【００１７】
一態様では、サイレンシング機構は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、あるいは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、あるいはマイクロＲＮＡ、あるいは二機能性ｓｈＲＮＡによって誘発される。「遺伝子サイレンシング」という語句は、特定の遺伝子産物の発現が減少するか減弱されるプロセスを指す。遺伝子サイレンシングは様々な経路により起こり得る。一態様では、本開示は、短い干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡを指し、長さが１９塩基対、あるいは長さが２０塩基対、あるいは長さが２１塩基対、あるいは長さが２２塩基対、あるいは長さが２３塩基対、あるいは長さが２４塩基対、あるいは長さが２５塩基対であり得る二本鎖ＲＮＡ分子のクラスであるｓｉＲＮＡの形態でのＲＮＡｉの利用を企図する。本明細書に開示されるＲＮＡｉの配列は、一部のユーザー及び／又はプロセスの目標を達成するのに矛盾のない任意の好適な形態（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）で利用され得ることを理解されたい。一態様では、本明細書に開示されるタイプのＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡの形態である。さらに別の態様では、本明細書に開示されるタイプのＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡの形態である。
【００１８】
遺伝子サイレンシングのレベルは、限定するものではないが、ノーザンブロット解析、Ｂ−ＤＮＡ技術、転写感受性レポーター構築物、発現プロファイリング（例えば、ＤＮＡチップ）及び関連技術による転写物レベルの測定を含む様々な手段によって測定することができる。あるいは、サイレンシングのレベルは、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを評価することによって測定することができる。これは、ウエスタン分析を含む多数の試験を行うこと、例えば、蛍光特性（例えば、ＧＦＰ）もしくは酵素活性（例えば、アルカリホスファターゼ）を有するレポータータンパク質の発現のレベルを測定すること、又はいくつかの他の手順によって達成することができる。
【００１９】
一態様では、ＤＯＧは、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ誘導体又はそれらの構築物を含む。本明細書に開示されるＤＯＧは、細胞の内因性処理機構を利用し、低いコピー数を使用して高い効力及び持続可能な効果を可能にし、結果としてオフターゲット効果を少なくすると考えられる。一態様では、本明細書に開示されるＤＯＧは、ＧＨＲＬ遺伝子の実質的なサイレンシングをもたらし、その結果、グレリンの産生を減少させる。あるいは、本明細書に開示されるＤＯＧは、グレリンの活性化に必要とされるグレリンｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＧＯＡＴ）遺伝子の実質的なサイレンシングをもたらす。本明細書で使用される場合、用語「実質的なサイレンシング」は、導入されたＤＯＧの存在により標的対立遺伝子の（例えば、ＧＨＲＬの）ｍＲＮＡが阻害及び／又は分解され、その結果、ＤＯＧが存在しない場合に見られる発現レベルと比較して、標的対立遺伝子の発現が約１０％〜約１００％減少することを意味する。一般に、対立遺伝子が実質的にサイレンシングされると、ＤＯＧが存在しない場合に得られる発現レベルと比較して、少なくとも４０％、５０％、６０％〜７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％〜７９％、一般に少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％発現が減少する。
【００２０】
本明細書に開示されるＤＯＧは、核酸又はヌクレオチドを含む。用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド又はそれらの修飾形態、及びそれらの類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及びそれらの誘導体及び類似体、ならびにピリミジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、及びそれらの誘導体及び類似体を含む種が含まれる。ヌクレオチド類似体には、限定するものではないが、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、及び５−ブロモ−ウラシルの置換；ならびに限定するものではないが、２’−ＯＨがＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２又はＣＮ（式中、Ｒはアルキル部分である）などの基により置換されている糖修飾リボヌクレオチドを含む２’位糖修飾を含む、塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造に修飾を有するヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド類似体とはまた、イノシン、キューオシン、キサンチンなどの塩基、２’−メチルリボースなどの糖、メチルホスホナート、ホスホロチオアート及びペプチドなどの非天然ホスホジエステル結合を有するヌクレオチドを含むことを意味する。本明細書で使用される場合、用語「核酸」又は「核酸分子」は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成される断片を指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）であるモノマー、天然に存在するヌクレオチド（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー型）の類似体、又はその両方の組合せから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン塩基部分又はプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が含まれるか、エーテル又はエステルとして糖を官能化することができる。さらに、いくつかの態様では、アザ糖及び炭素環式糖類似体などの立体的及び電子的に類似した構造により糖部分全体を置換することができる。本開示で利用され得る塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリン及びアルキル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、又は他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合、又はそのような結合の類似体によって結合することができる。ホスホジエステル結合の類似体には、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニリダート、ホスホルアミダートなどが含まれる。用語「核酸分子」はまた、ポリアミド骨格に結合した天然に存在するか修飾された核酸塩基を含むいわゆる「ペプチド核酸」を含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００２１】
一態様では、ＤＯＧは、ｓｈＲＮＡ、あるいはベクターの成分としてｓｈＲＮＡを含むｓｈＲＮＡ構築物である。ベクターは、典型的には、外来ＤＮＡ（例えば、ＤＯＧ）が挿入される伝達性物質のＤＮＡを含む。あるＤＮＡのセグメントを別のＤＮＡのセグメントに挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（特定のヌクレオチド群）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素を使用することを含む。「カセット」は、規定された制限部位でベクターに挿入することができる発現産物をコードするＤＮＡコード配列又はＤＮＡのセグメントを指す。カセット制限部位は、カセットが適切なリーディングフレームに確実に挿入されるように設計される。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１つ以上の制限部位に挿入され、その後、ベクターによって、伝達可能なベクターＤＮＡとともに宿主細胞に運ばれる。発現ベクターなど、挿入又は付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメント又は配列はまた、「ＤＮＡ構築物」と呼ばれ得る。一般的なタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドは、一般に二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、通常は細菌由来であり、付加的な（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、好適な宿主細胞に容易に導入することができる。
【００２２】
本開示の一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ又は修飾ｐｏｌ  ＩＩプロモーターによって転写されるｓｈＲＮＡをコードするプラスミドベクターの成分であり、かつこのプラスミドベクターとしてトランスフェクトされ得るだけでなく、ウイルス産生ベクターによる細胞の感染を介して哺乳動物細胞に送達され得る。本明細書に開示されるタイプのＤＯＧはＤＮＡ組み込みが可能であり、約４ｂｐ〜約１１ｂｐ、あるいは４ｂｐ、あるいは５ｂｐ、あるいは６ｂｐ、あるいは７ｂｐ、あるいは８ｂｐ、あるいは９ｂｐの範囲のサイズの短いループによって連結された約１９塩基対（ｂｐ）〜約２２ｂｐ、あるいは１９ｂｐ、あるいは２０ｂｐ、あるいは２１ｂｐ、あるいは２２ｂｐの範囲のサイズの２つの相補的ＲＮＡ配列からなる。開示される配列に使用するのに適したｓｈＲＮＡループは、ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ又は実験的設計パラメーターを使用して設計することができるか、ヘアピン構造のライブラリーから、例えば、ＲＮＡｉレポーターアッセイのレトロウイルスのヘアピン−ループ−ライブラリーから得ることができる。一態様では、ｓｈＲＮＡループ配列は、ｎｔ配列５’−ＵＧＵＧＣＵＵ−３’を含む。理論に制限されることを望むものではないが、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、標的ｍＲＮＡに結合し、標的特異的ｍＲＮＡ分解のためにＲＩＳＣ複合体に組み込まれる。そのような態様では、標的遺伝子（例えば、ＧＨＲＬ）の翻訳は、本明細書に開示される量まで低減される。さらに別の態様では、標的遺伝子（例えば、ＧＨＲＬ）では翻訳が低減しており、形成される遺伝子産物（例えば、グレリン）の量が減少している。
【００２３】
代替の態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、現在知られているか、知られるようになり、この開示を読むことから、ＲＮＡｉが細胞膜を通過することを可能にする点で本開示に関連して有用であると当業者が判断するであろう任意の方法によって、細胞（例えば、ヒト細胞）に導入され得る。これらの方法には、限定するものではないが、トランスフェクション、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、リポソーム、ミセル、圧力の操作、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、イムノポレーション、ウイルス、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなどのベクターの使用、細胞融合、及び抗体、抗原又は受容体などの特定のコンジュゲート又はリガンドへのポリヌクレオチドのカップリング、受動的導入、その取り込みを促進するｓｉＲＮＡへの部分の付加などを使用するトランスフェクションなどの任意の方法が含まれる。一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、受動的取り込みによって細胞（例えば、ヒト細胞）に導入される。配列表に示されるように、配列番号０１から配列番号４２は、グレリンの発現を阻害するか、グレリンの活性化を代替的に阻害する、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧのセンス鎖の代表である。したがって、本開示は、配列番号０１から配列番号４２のいずれかのセンス鎖及びその相補鎖を含むｓｈＲＮＡの使用を企図する。一態様では、本開示のｓｈＲＮＡは、配列番号０１から配列番号４２のいずれかのポリヌクレオチド及びその完全な補体、あるいは配列番号０１から配列番号４２のいずれかのポリヌクレオチド及び相補鎖を含む。配列表に示されるように、配列番号４３から配列番号６８は、ＧＯＡＴの発現を阻害する、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧのセンス鎖の代表である。したがって、本開示は、配列番号４３から配列番号６８のいずれかのセンス鎖及びその相補鎖を含むｓｈＲＮＡの使用を企図する。一態様では、本開示のｓｈＲＮＡは、配列番号４３から配列番号６８のいずれかのポリヌクレオチド及びその完全な補体、あるいは配列番号４３から配列番号６８のいずれかのポリヌクレオチド及び相補鎖を含む。用語「相補的」は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック型（例えば、Ａ〜Ｔ、Ａ〜Ｕ、Ｃ〜Ｇ）、又は二重鎖の形成を可能にする任意の他の方法で塩基対合することができる。当業者であれば、ＤＮＡに対してＲＮＡを使用する場合、チミンではなくウラシルが、アデノシンと相補的であると考えられる塩基であることは認識している。ただし、本開示の文脈では、Ｕが示される場合、別途記載のない限り、Ｔを置換する能力が暗示される。
【００２４】
完全な相補性又は１００％の相補性とは、１つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が、第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合することができる状況を指す。完全ではない相補性とは、２つの鎖の全部ではないが、いくつかのヌクレオチド単位が互いに水素結合することができる状況を指す。例えば、２つの２０量体の場合、各鎖の２つの塩基対のみが互いに水素結合することができれば、このポリヌクレオチド鎖は、１０％の相補性を示す。同じ例で、各鎖の１８塩基対が互いに水素結合することができれば、このポリヌクレオチド鎖は、９０％の相補性を示す。
【００２５】
一態様では、ＤＯＧは、ｓｈＲＮＡ、その機能的変異体又はそれらの組合せを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されるｓｈＲＮＡの機能的変異体は、本明細書に開示される任意の配列と少なくとも７０％の配列同一性、あるいは本明細書に開示される任意の配列と少なくとも７５％の配列同一性、あるいは本明細書に開示される任意の配列と少なくとも８０％の配列同一性、あるいは本明細書に開示される任意の配列と少なくとも８５％の配列同一性、あるいは本明細書に開示される任意の配列と少なくとも９０％の配列同一性、あるいは本明細書に開示される任意の配列と少なくとも９５％の配列同一性を含む。
【００２６】
一般に、「同一性」は、２つのオリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドの対応を指す。パーセント同一性は、配列をアラインメントし、２つのアラインメントした配列間の正確な一致数を計数し、短い方の配列の長さで割り、その結果に１００を掛けることによって、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存するＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰプログラムなど、容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、分析を支援することができる。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、上記で言及したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されているデフォルトのパラメーターを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列のパーセント同一性は、デフォルトのスコア表と、６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティとを伴うＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００２７】
あるいは、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、及び消化された断片のサイズ決定によって相同性を決定することができる。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について定義されているように、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件は、任意の好適な方法を使用して定義され得る。
【００２８】
いくつかの態様では、ｓｈＲＮＡに存在するヌクレオチドのうちの１つ以上を修飾して、安定性の向上などの１つ以上のユーザー及び／又はプロセスの目標を達成してもよい。修飾塩基とは、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン及びキューオシンなど、１つ以上の原子又は基の置換又は付加によって修飾されているヌクレオチド塩基を指す。本開示に使用するのに適した塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドを含むことができる修飾のタイプのいくつかの例には、限定するものではないが、個別に、又は組み合わせて、アルキル化塩基、ハロゲン化塩基、チオール化塩基、アミノ化塩基、アミド化塩基又はアセチル化塩基が挙げられる。本開示に使用するのに適した修飾塩基のさらに具体的な例には、限定するものではないが、例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、及び５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば、２−チオウリジン及び４−チオウリジン及び２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、キューオシン、アーケオシン、ナフチル及び置換ナフチル基、任意のＯ−及びＮ−アルキル化プリン及びピリミジン、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル及び修飾フェニル基、例えば、アミノフェノール又は２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８置換アデニン及びグアニン、５置換ウラシル及びチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、ならびにアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。本明細書では、修飾ヌクレオチドとはまた、糖部分に関して修飾されているヌクレオチド、及び糖、又はリボシルではないその類似体を有するヌクレオチドを指す。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、及び他の糖、複素環又は炭素環であってもよく、それらに基づいていてもよい。ヌクレオチドという用語はまた、当技術分野でユニバーサル塩基として知られているものを含むことを意味する。例として、ユニバーサル塩基には、限定するものではないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール又はネブラリンが含まれる。用語「ヌクレオチド」はまた、アミン基によるリボシル３’酸素の置換から生じる、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダートを含むことを意味する。さらに、ヌクレオチドという用語はまた、検出可能な標識、例えば、ヌクレオチドに結合した放射性部分もしくは蛍光部分、又は質量標識を有する種を含む。
【００２９】
理論に制限されることを望むものではないが、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧの利用は、グレリンｍＲＮＡの効率的な転写を減少させ、翻訳へのガイド鎖ｍＲＮＡの移動の成功を減少させ、グレリンを産生するｍＲＮＡの効率的な翻訳を妨害する。理論に制限されることを望むものではないが、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧの利用は、グレリンｏ−アシルトランスフェラーゼｍＲＮＡの効率的な転写を減少させ、翻訳へのガイド鎖ｍＲＮＡの移動の成功を減少させ、グレリンｏ−アシルトランスフェラーゼを産生するｍＲＮＡの効率的な翻訳を妨害する。
【００３０】
一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、キットの構成要素であり得、医薬組成物として製剤化され得る。例えば、ＤＯＧは、コロイド状薬物担体系、例えば、ミセル溶液、小胞及び液晶分散物、ならびに粒径が直径約１０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の小さな粒子からなるナノ粒子分散物と結合し得る。いくつかの態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧを含むキットは、緩衝液、希釈剤、浸透促進剤、担体化合物及び／又は薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含み得る。
【００３１】
一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、リポソーム又はニオソームと結合する。リポソームは、多くの、少数の、又はただ１つのリン脂質二重層からなる小胞の形態である。リポソームコアの極性特性により、極性薬物分子をカプセル化することが可能になる。両親媒性分子及び親油性分子は、リン脂質に対するそれらの親和性に従ってリン脂質二重層内で可溶化される。二重層形成にリン脂質の代わりに非イオン性界面活性剤を関与させると、ニオソームがもたらされる。本明細書に開示されるタイプのｓｈＲＮＡ（すなわち、ＤＯＧ）は、小胞膜の疎水性ドメイン内にそれらの活性を失うことなく組み込まれ得、サイズ選択フィルターとして機能し、イオン、栄養素及び抗生物質などの小さな溶質の受動拡散のみを可能にする。したがって、ＤＯＧはナノケージ内にカプセル化され得、タンパク質分解酵素による早期分解から効果的に保護される。一態様では、本開示に使用するのに適した材料は、カプセル化されたＤＯＧである。
【００３２】
一態様では、ＤＯＧはデンドリマーと結合する。デンドリマーは、対称的な構造を有するナノメートルサイズの高度に分岐した単分散高分子である。それらは中心コア、分岐ユニット及び末端官能基からなる。コアは、内部ユニットとともにナノキャビティの環境を決定し、その結果、それらの溶解特性を決定するのに対して、外部基はこれらのポリマーの溶解性と化学的挙動とを決定する。デンドリマーの外部表面に標的化リガンドを結合させることによって標的化の有効性が影響を受けるのに対して、単核貪食細胞系（ＭＰＳ）由来のそれらの安定性及び保護は、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）によるデンドリマーの官能化によって達成される。一態様では、本開示に使用するのに適した材料は、デンドリマーと結合したＤＯＧ、あるいは標的化リガンドを含むデンドリマーと結合したＤＯＧである。
【００３３】
一態様では、ＤＯＧは液晶と結合する。液晶は、液体及び固体の両方の性質を兼ね備えている。それらは、水性薬物溶液が含まれ得る代替の極性層及び非極性層（すなわち、ラメラ相）を用いて、様々な形状を形成するように作製され得る。一態様では、本開示に使用するのに適した材料は、液晶と結合したＤＯＧである。
【００３４】
一態様では、ＤＯＧはナノ粒子と結合する。ナノ粒子（１０〜２００ｎｍのサイズのナノスフェア及びナノカプセルを含む）は固体であり、非晶質又は結晶性のいずれかである。それらは、薬物を吸着及び／又はカプセル化することができ、したがって化学的分解及び酵素的分解から薬物を保護する。ナノカプセルは、独特の高分子膜によって囲まれた空洞に薬物が閉じ込められた小胞系であるのに対して、ナノスフェアは薬物が物理的かつ均一に分散したマトリックス系である。薬物担体としてのナノ粒子は、生分解性ポリマー及び非生分解性ポリマーの両方から形成することができる。近年、生分解性高分子ナノ粒子は、薬物の制御放出、特定の臓器／組織を標的とすること、遺伝子治療でのＤＮＡの担体として、ならびに経口経路を介してタンパク質、ペプチド及び遺伝子を送達するそれらの能力におけるそれらの用途を考慮して、潜在的な薬物送達装置としてかなりの注目を集めている。一態様では、本開示に使用するのに適した材料は、ナノ粒子と結合したＤＯＧである。
【００３５】
一態様では、ＤＯＧは、ヒドロゲルと結合する。ヒドロゲルは、大量の水又は生物学的流体を吸収することができる三次元の親水性の高分子ネットワークである。ネットワークは、ホモポリマー又はコポリマーから構成され、化学的架橋（タイポイント、ジャンクション）又は物理的架橋、例えば、絡み合い又は微結晶の存在により不溶性である。ヒドロゲルは水との熱力学的適合性を示し、これにより、水性媒体中で膨潤することが可能になる。これらは、リザーバーベースの制御放出系での薬物放出を調節するために、又は膨潤可能制御放出装置及び膨潤制御放出装置での担体として使用される。制御された薬物送達の最前線では、環境に優しい刺激感受性ゲル系としてのヒドロゲルは、ｐＨ、温度、イオン強度、電場、又は特定の分析物濃度差に応答して放出を調節する。これらの系では、放出は、身体の特定領域内（例えば、消化管の特定のｐＨ内）で起こるように、又は特定部位を介して（ヒドロゲル表面からの連結された鎖を介した接着性ゲル又は細胞受容体特異的ゲル）起こるように設計することができる。薬物送達系としてのヒドロゲルは、分子インプリンティング技術と組み合わせると非常に有望な材料であり得る。一態様では、本開示に使用するのに適した材料は、ヒドロゲルと結合したＤＯＧである。
【００３６】
本明細書に開示される送達系のうちの１つ以上と結合したＤＯＧＳは、パッケージされた治療剤と考えられ得、本明細書では「ｐ−ＤＯＧ」と示される。ｐ−ＤＯＧは、任意の好適な方法（例えば、標的化分子とのコンジュゲーション）を使用して、パッケージング（例えば、）を改変することにより、生物学的利用能などの特性を改善するためにさらに改変され得る。
【００３７】
一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、肥満又は肥満関連障害に罹患している対象に投与されてもよい。本明細書に開示されるタイプのＤＯＧの送達経路の選択は、患者の受容性、ＤＯＧの特性（その溶解性など）、疾患部位へのアクセス、又は特定の疾患を扱う際の有効性によって促進される。一態様では、薬物送達経路は経口経路である。一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、例えば、生理食塩水と混合した後、静脈内注射、吸入、くも膜下腔内注射又は皮下注射を介して送達される。
【００３８】
一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、肺送達を介して投与される。肺送達は、リポソーム、ミセル、ナノ粒子及びデンドリマーなどのナノ構造をいずれも含み得るエアロゾル、定量噴霧式吸入器システム（ＭＤＩ）、粉末（乾燥粉末吸入器、ＤＰＩ）及び溶液（ネブライザー）を介して、様々な方法で影響を受け得る。肺薬物送達は、呼吸器疾患の治療のための両方の局所標的化を提供し、薬物の全身送達のための実行可能な選択肢であるとますます思われる。
【００３９】
一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは経皮送達される。経皮的薬物送達は、胃腸刺激、代謝、送達速度の変動、及び食物の存在による干渉などの問題を回避する。経皮的薬物送達は、意識不明の患者にも適している。この技法は一般に非侵襲的で美的に許容できるものであり、数日間にわたる局所送達を提供するのに使用することができる。本開示の一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、例えば、糖尿病患者がインスリンを自己投与する際に従来行われているように、自己投与され得る。
【００４０】
一態様では、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧは、経組織送達系及び局所送達系の使用などを通じて非経口的に送達される。このような系の目的は、全身投与に関連する毒性を最小限に抑えながら、薬理学的効果を増加させることである。経組織系には、インサイチュで形成され、切除された組織に付着し、薬物、タンパク質又は遺伝子コード化アデノウイルスを放出する薬物添加ゼラチン状ゲル；標的組織上でその組織へのサイトカインの浸透を防ぐことができる障壁を形成する抗体固定ゼラチン状ゲル（サイトカイン障壁）；遺伝子導入口腔粘膜上皮細胞（ＯＭＥＣ）移植シートを含む細胞ベース送達；装置指向性送達（くも膜下腔内注射又は腹腔内注射などによって標的部位に取り付けることができる再充電可能な薬物注入装置）が含まれる。
【００４１】
一態様では、本開示の方法は、それを必要とする対象に、本明細書に開示されるタイプのＤＯＧを投与することを含む。別の態様では、本開示の方法は、ヒト細胞などの細胞に、本明細書に開示されるタイプの少なくとも１つのＤＯＧを導入することを含む。あるいは、本開示の方法は、ヒト細胞などの細胞に、本明細書に開示されるタイプの複数のＤＯＧを導入することを含む。あるいは、本開示の方法は、ヒト細胞などの細胞に、本明細書に開示されるタイプの単一のＤＯＧを導入することを含む。
【００４２】
本明細書では様々な組成物及び方法を説明してきたが、例示的な実施形態又は態様は、限定するものではないが、以下を含むことができる。
【００４３】
第１の態様は、細胞内のグレリンの発現を阻害する方法であって、細胞にＲＮＡｉを導入することを含む方法であり、ＲＮＡｉは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１から配列番号４２のいずれかを含み、センス鎖はアンチセンス鎖に相補的である。
【００４４】
第２の態様は、第１の態様の方法であり、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖及びセンス鎖は、それぞれ１９〜２５ヌクレオチド長である。
【００４５】
第３の態様は、第１から第２の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【００４６】
第４の態様は、第１から第３の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉは、デンドリマーと結合する。
【００４７】
第５の態様は、第１から第４の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉは、ナノ粒子と結合する。
【００４８】
第６の態様は、第１から第５の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はそれらの組合せである。
【００４９】
第７の態様は、第１から第６の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉはカプセル化される。
【００５０】
第８の態様は、第１から第７の態様のいずれかの方法であり、細胞はヒト細胞である。
【００５１】
第９の態様は、第１から第８の態様のいずれかの方法であり、該導入はトランスフェクションを介する。
【００５２】
第１０の態様は、第１から第９の態様のいずれかの方法であり、該導入は受動的取り込みを介する。
【００５３】
第１１の態様は、細胞内のグレリンｏ−アシルトランスフェラーゼの発現を阻害する方法であって、細胞にＲＮＡｉを導入することを含む方法であり、ＲＮＡｉは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号４３から配列番号６８のいずれかを含み、センス鎖はアンチセンス鎖に相補的である。
【００５４】
第１２の態様は、第１１の態様の方法であり、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖及びセンス鎖は、それぞれ１９〜２５ヌクレオチド長である。
【００５５】
第１３の態様は、第１１から第１２の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【００５６】
第１４の態様は、第１１から第１３の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉは、デンドリマーと結合する。
【００５７】
第１５の態様は、第１１から第１４の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉは、ナノ粒子と結合する。
【００５８】
第１６の態様は、第１１から第１５の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はそれらの組合せである。
【００５９】
第１７の態様は、第１１から第１６の態様のいずれかの方法であり、ＲＮＡｉはカプセル化される。
【００６０】
第１８の態様は、第１１から第１７の態様のいずれかの方法であり、細胞はヒト細胞である。
【００６１】
第１９の態様は、第１１から第１８の態様のいずれかの方法であり、該導入はトランスフェクションを介する。
【００６２】
第２０の態様は、第１１から第１９の態様のいずれかの方法であり、該導入は受動的取り込みを介する。
【００６３】
第２１の態様は、細胞内のグレリンの発現を阻害するための組成物であり、組成物はＲＮＡｉを含み、ＲＮＡｉは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１から配列番号６８のいずれかを含み、センス鎖はアンチセンス鎖に相補的である。
【００６４】
第２２の態様は、緩衝液、希釈剤、浸透促進剤、担体化合物及び／又は薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、第２１の態様の組成物である。
【図１】
2021512119.tif 000003
【配列表】
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【国際調査報告】
2021512119.tif 000004
2021512119.tif 000005