(57)【要約】  トル様受容体９（ＴＬＲ９）を刺激するための組成物及び方法が提供される。より詳細には、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を増強する方法及び免疫応答を誘導する方法が開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＣｐＧモチーフ及び３’コレステリル部分を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にホスホジエステル結合を含む、請求項１記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
コレステリル部分がリンカーを介して免疫刺激オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに共有結合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
多数のチミンヌクレオチドを含む３’末端配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
多数のチミンヌクレオチドが連続したチミンヌクレオチドを含む、請求項５記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
多数のチミンヌクレオチドが４〜６個の間の連続したチミンヌクレオチドを含む、請求項５又は６記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
３’末端配列が配列番号９を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、配列番号２、３、４、５、６又は８を含む、請求項１又は２に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
３’末端配列がＴＴＴＴである請求項５〜８のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
免疫刺激オリゴヌクレオチドの３’末端配列が多数のグアニンヌクレオチドを含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
多数のグアニンヌクレオチドが連続したグアニンヌクレオチドを含む、請求項１１記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
３’末端配列がＧＧＧＧＧである、請求項１１又は１２記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが配列番号７を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが（ＴＣＧ）ｎを含み、ここでｎは３と１０の間である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
リンカーが炭素鎖を含む、請求項４〜１５のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
炭素鎖が３〜１２個の間の炭素原子を含む、請求項１６に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
リンカーがヘキサンジオールを含む、請求項４〜１７のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
次の構造を有するコレステリル−リンカー部分を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド：
【化１】
2021506246.tif 000027
【請求項２０】
リンカーが反復化学単位を含む、請求項４〜１７のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
反復化学単位が２回から１２回の間で反復される、請求項２０に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
反復化学単位がエチレングリコールである、請求項２０に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
リンカーがヘキサエチレングリコールを含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
コレステリル部分が、リンカーと共有結合してコレステリル−リンカー部分を形成する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
以下の構造を有するコレステリル−リンカー部分を含む、請求項２４記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド：
【化２】
2021506246.tif 000028
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物。
【請求項２７】
感染性疾患を予防又は治療するためのワクチンをさらに含む、請求項２６記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２８】
ベクターをさらに含む、請求項２６又は２７記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２９】
ベクターがウイルスベクターである、請求項２８記載の免疫刺激組成物。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドがウイルスベクター内に包まれる、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３１】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体とが共有結合されている、請求項３１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３３】
ハプテンをさらに含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチドとハプテンとが共有結合されている、請求項３３に記載の免疫刺激組成物。
【請求項３５】
リンカーを介してコレステリル部分をＴＬＲ９リガンドの３’末端に付着させることを含む、ＴＬＲ９リガンドの免疫原性を増強する方法であって、ここで、
ＴＬＲ９リガンドは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項３６】
コレステリル部分が、リンカーに共有結合してコレステリル−リンカー部分を形成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
コレステリル−リンカー部分が、
【化３】
2021506246.tif 000029
を含む、請求項３６記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
コレステリル−リンカー部分が、
【化４】
2021506246.tif 000030
を含む、請求項３６記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、又は請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の免疫刺激性組成物を、対象に投与する工程を包含する、対象におけるＴＬＲ９媒介免疫応答を誘導する方法。
【請求項４０】
投与が、静脈内、筋肉内、乳房内、皮内、腹腔内、皮下、スプレー、エアロゾル、卵内、粘膜内、経皮、浸漬、経口、眼内、気管内又は鼻腔内で行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
対象が動物である、請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４２】
対象が哺乳動物である、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
対象が水生種である、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
対象が、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ又はヒトである、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれ２０１７年１２月１５日に出願された欧州特許出願ＥＰ１７２０７７４０．６、ＥＰ１７２０７７４６．３、及びＥＰ１７２０７７５０．５の優先権及び利益を主張し、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列リストを含む。２０１８年１１月２７日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、１０３９７６．０００１１９ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で、サイズは２，２３３バイトである。
【０００３】
トル様受容体９（ＴＬＲ９）を刺激するための組成物及び方法が提供される。より詳細には、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を増強する方法及び免疫応答を誘導する方法が本明細書に開示されている。
【背景技術】
【０００４】
抗生物質耐性は、多くの産業に悪影響を及ぼしている世界的な問題である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）やその他の「スーパーバグ」（ｓｕｐｅｒ  ｂｕｇｓ）は、病院や医師のオフィスで大混乱を引き起こし、ヘルスセンターへの訪問が致命的となる。農業業界も同様の問題を抱えている。限られたスペースと非滅菌環境のため、群れ全体が病原性感染のリスクがある。例えば、1頭の病気の牛が群れのすぐ近くにいると、罹患率と死亡率が指数関数的に増加し得る。感染のリスクがあるにもかかわらず、抗生物質による治療は、コストの増加、抗生物質にさらされていない肉や乳製品の消費者の要求により、より不利になっている。そして、抗生物質療法を使用するそれらの生産者は、広範囲の抗生物質でさえ、群れと接触するかもしれないすべての病原体に対して完全に効果的ではないことを理解している。
【０００５】
したがって、動物における感染を治療または予防するための非抗生物質ベースの治療法が必要とされている。開示された組成物および方法は、これらおよび他の重要なニーズに向けられている。
【０００６】
発明の要約
本明細書に開示されるのは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフおよび３’コレステリル部分を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。
【０００７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物も、本明細書で提供される。
【０００８】
リンカーを介してコレステリル部分をＴＬＲ９リガンドの３’末端に結合することを含む、ＴＬＲ９リガンドの免疫原性を増強する方法も開示され、ここで、ＴＬＲ９リガンドは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
本明細書に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたは免疫刺激性組成物のいずれか１つを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む、対象においてＴＬＲ９媒介免疫応答を誘発するための方法も提供される。
【００１０】
概要および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとさらに理解される。開示された組成物および方法を例示する目的で、組成物および方法の例示的な実施形態が図面に示されている。しかしながら、組成物および方法は、開示された特定の実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ヘキサンジオールリンカーに結合したコレステリル部分の化学構造を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、オリゴヌクレオチドＰＴＯ−２００６、３’ＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号９）配列を有するオリゴヌクレオチドＰＤＥ−２００６（２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４）、及び、図１に示されるヘキサンジオールリンカーを介して結合された３’コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチド２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４（２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４３Ｃ）の、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９刺激活性を比較する。
【図３】図３は、３’ＴＴＴＴ配列を有するオリゴヌクレオチドＰＤＥ−２００６（２００６−Ｔ４−ＰＤＥ）、及び、図１のヘキサンジオールリンカーを介してオリゴヌクレオチドの３’末端に結合したコレステリル部分を有するオリゴヌクレオチド２００６−Ｔ４−ＰＤＥ（３Ｃｈｏｌ−２００６−Ｔ４−ＰＤＥ）の、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９媒介性免疫応答を誘発する能力を示す。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、オリゴヌクレオチド２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４及びオリゴヌクレオチド２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４ＣのＴＬＲ９刺激特性を比較する。
【図５】図５は、オリゴヌクレオチド２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４及びオリゴヌクレオチド２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４ＣのＴＬＲ９刺激特性を比較する。
【図６】図６は、ヘキサエチレングリコールリンカーに結合したコレステリル部分の化学構造を示す。
【図７】図７は、オリゴヌクレオチド２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４と、その３’末端に図６のコレステリル−リンカー部分を有するオリゴヌクレオチド２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４（「２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈｏｌ」又は「２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃ」）とのＴＬＲ９刺激能を比較する。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、３’コレステリル修飾の有無によるオリゴヌクレオチドの免疫原性を比較する。図８Ａは、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞において、ＴＬＲ９媒介性免疫応答を誘導するオリゴヌクレオチド２００７−ＰＤＥ−Ｔ４オリゴヌクレオチドの能力を、図１のヘキサンジオールリンカーを介して結合されたコレステリル部分を有するオリゴヌクレオチドである２００７−ＰＤＥ−Ｔ４オリゴヌクレオチド（２００７−ＰＤＥ−Ｔ４−３Ｃｈ）の能力と比較し、図８Ｂは、３’ＧＧＧＧＧＴＴＴＴ配列を有するオリゴヌクレオチド２００７−ＰＤＥ−Ｔ４（２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４）及び図１に示されるヘキサンジオールリンカーを介して結合されたコレステリル部分を有するオリゴヌクレオチド２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４（２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈｏｌ）の能力を、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞において比較する。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、３’コレステリル修飾の有無によるオリゴヌクレオチドの免疫原性を比較する。より具体的には、図９Ａは、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＴＬＲ９媒介免疫応答を介した２００６−ＰＴＯ、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４及び２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４Ｃオリゴヌクレオチドの免疫原性を示し、図９Ｂは、より狭い濃度範囲にわたって図９Ａに示される結果を示す。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞においてＴＬＲ９媒介免疫応答を誘発するために、ヘキサンジオールリンカーを介して結合された３’コレステリル部分の有無によるオリゴヌクレオチドの能力を比較する。より具体的には、図１０Ａは、ＴＬＲ９媒介免疫応答を誘発するオリゴヌクレオチド２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４及び２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４Ｃの相対的能力を示す。図１０Ｂは、より狭い濃度範囲にわたる図１０Ａの結果を示す。
【図１１】図１１は、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ中での、オリゴヌクレオチド２００６−Ｔ４−ＰＤＥと、図１に示すヘキサンジオールリンカーを介して結合された３’コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチド２００６−Ｔ４−ＰＤＥ（３Ｃｈｏｌ−２００６−Ｔ４−ＰＤ）との免疫原性を比較する。
【図１２】図１２は、オリゴヌクレオチド２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４及びオリゴヌクレオチド２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４−３ＣｈｏｌのＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＴＬＲ９媒介性免疫応答を誘発する能力を比較する。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞においてＴＬＲ９を刺激するために、オリゴヌクレオチドの３’末端に結合したコレステリル部分の有無による、２００７−ＰＤＥ−Ｔ４、２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４及びＴＣＧ８−Ｔ４オリゴヌクレオチドの能力を比較する。図１３Ａは、オリゴヌクレオチド２００７−ＰＤＥ−Ｔ４及び２００７−ＰＤＥ−Ｔ４−Ｃｈ３の異なる免疫原性を示す。図１３Ｂは、オリゴヌクレオチド２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４及び２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈの異なる免疫原性を示す。図１３Ｃは、オリゴヌクレオチドＴＣＧ８−Ｔ４及びＴＣＧ８−Ｔ４−Ｃｈ３の異なる免疫原性を示す。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ及び１４Ｄは、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｍＴＬＲ９細胞におけるマウスＴＬＲ９（ｍＴＬＲ９）上のいくつかのオリゴヌクレオチド及びコレステリル修飾オリゴヌクレオチドの刺激活性を比較する。図１４Ａは、未修飾２００７−ＰＤＥ−Ｔ４オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド２００７−ＰＤＥ−Ｔ４−３Ｃｈの、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｍＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９媒介性応答を誘発する能力を比較する。図１４Ｂは、非修飾２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈの、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｍＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９媒介性応答を誘発する能力を比較する。図１４Ｃは、オリゴヌクレオチドＴＣＧ８−Ｔ４及びオリゴヌクレオチドＴＣＧ８−Ｔ４−３Ｃｈの、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｍＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９媒介応答を誘発する能力を比較する；そして図１４Ｄは、図１に示されるヘキサンジオールリンカーを介して結合された３’コレステリル部分を有するＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４オリゴヌクレオチド「ＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈ」及びオリゴヌクレオチドＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４の、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｍＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９媒介性応答を誘発する能力を比較する。
【図１５】図１５は、ヘキサエチレングリコールリンカーに結合したコレステリル部分の化学構造を示す。
【図１６】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ及び１６Ｄは、ＴＬＲ９媒介免疫応答を誘発するオリゴヌクレオチドの能力に対する、コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端のいずれかを修飾する効果を示す。図１６Ａは、オリゴヌクレオチド２００６−ＰＤＥ−Ｔ４、２００６−ＰＤＥ−Ｔ４−Ｃｈｏｌ、及び図１５に示されるヘキサエチレングリコールリンカーを介して結合された５’コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチド２００６−ＰＤＥ−Ｔ４（２００６−ＰＤＥ−Ｔ４−５Ｃｈｏｌ）の、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９を刺激する能力をグラフで示す。図１６Ｂは、オリゴヌクレオチド２００６−ＰＴＯ、ＧＧＧＧＧ３’末端配列を有するオリゴヌクレオチド２００６−ＰＤＥ（２００６−Ｇ５）、図６に示すヘキサエチレングリコールリンカーを介して結合された３’コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチド２００６−Ｇ５（２００６−Ｇ５−３Ｃｈｏｌ）、及び図１５に示すヘキサエチレングリコールリンカーを介して結合された５’コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチド２００６−Ｇ５（２００６−Ｇ５−５Ｃｈｏｌ）の、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９を刺激する能力をグラフで示す。図１６Ｃは、図１５に示すヘキサエチレングリコールリンカーを介して結合された５’コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチド２００６−ＰＴＯ（２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−５Ｃｈｏｌ）、２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈｏｌ、及びオリゴヌクレオチド２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４の、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９媒介性免疫応答を刺激する能力をグラフで示す。図１６Ｄは、オリゴヌクレオチドＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、図６に示されるヘキサエチレングリコールリンカーを介して結合された３’コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチドＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４（ＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈｏｌ）、及び図１５に示されるヘキサエチレングリコールリンカーを介して結合された５’コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチドＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４（ＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−５Ｃｈｏｌ）のＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９媒介免疫応答を刺激する能力をグラフで示す。
【図１７】図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ及び１７Ｄは、コレステリル部分を用いてオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端を修飾する効果を示す。図１７Ａは、オリゴヌクレオチド２００６−ＰＤＥ−Ｔ４、２００６−ＰＤＥ−Ｔ４−Ｃｈｏｌ及び２００６−ＰＤＥ−Ｔ４−５Ｃｈｏｌの、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＴＬＲ９を刺激する能力をグラフで示す。図１７Ｂは、オリゴヌクレオチド２００６−ＰＴＯ、２００６−Ｇ５、２００６−Ｇ５−３Ｃｈｏｌ及び２００６−Ｇ５−５Ｃｈｏｌの、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＴＬＲ９を刺激する能力をグラフで示す。図１７Ｃは、オリゴヌクレオチド２００６−ＰＴＯ、２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈｏｌ及びオリゴヌクレオチド２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−５Ｃｈｏｌの、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＴＬＲ９媒介免疫応答を刺激する能力をグラフで示す。図１７Ｄは、オリゴヌクレオチドＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、ＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−３Ｃｈｏｌ及びＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−５Ｃｈｏｌの、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＴＬＲ９媒介免疫応答を刺激する能力をグラフで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
開示された組成物及び方法は、本開示の一部を形成する添付の図面に関連してとられる以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解され得る。開示された組成物及び方法は、本明細書に記載及び／又は示された特定の組成物及び方法に限定されず、本明細書で使用される用語は、例としてのみ特定の実施形態を記載する目的であり、特許請求の範囲に記載された組成物及び方法を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【００１３】
特に明記しない限り、可能なメカニズム又は作用機序又は改善の理由に関する説明は、例示のみを意図しており、開示された組成物及び方法は、そのような示唆されたメカニズム又は作用機序又は改善の理由の正当性又は不正確性によって制約されるものではない。
【００１４】
このテキスト全体を通して、説明は、組成物及び該組成物を使用する方法に言及する。開示が組成物に関連する特徴又は実施形態を記載又は請求する場合、そのような特徴又は実施形態は、その組成物を使用する方法に等しく適用可能である。同様に、開示が組成物を使用する方法に関連する特徴又は実施形態を記載又は請求する場合、そのような特徴又は実施形態は、組成物に等しく適用可能である。
【００１５】
値の範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から及び／又は他の特定の値までを含む。さらに、範囲に記述された値への参照は、その範囲内の各値を含む。すべての範囲が包括的であり、組み込み可能である。値が先行する「約」を使用することによって近似として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。特定の数値への言及は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、少なくともその特定の値を含む。
【００１６】
別個の実施形態に関連して本明細書に記載される、開示される組成物及び方法の特定の特徴は、明らかに単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解されるべきである。逆に、開示された組成物及び方法の種々の特徴は、簡潔には、単一の実施形態の文脈において記載されるが、別個に又は任意のサブコンビネーションとして提供されてもよい。
【００１７】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数形を含む。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ＣｐＧモチーフ」は、シトシン−グアニンジヌクレオチド配列を指す。本明細書に記載される免疫刺激性核酸は、１以上のＣｐＧモチーフを含有し、非メチル化されると、トル様受容体タンパク質（ＴＬＲ）と相互作用し、免疫応答を誘発することができる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」とは、任意の動物、特に哺乳動物を意味することが意図され、任意のタイプの鳥類、哺乳動物又は水生種が開示された方法を使用して処置され得る。
【００２０】
明細書の態様に関連する種々の用語は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用される。そのような用語は、別段の指示がない限り、当該技術分野における通常の意味を有する。他の具体的に定義された用語は、本明細書に提供される定義と一致する方法で解釈されるべきである。
【００２１】
本明細書には、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ及び３’末端コレステリル部分を含む免疫刺激オリゴヌクレオチドが開示される。オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）中のＣｐＧモチーフは、ほ乳類において免疫応答を誘発することが以前に示されている。いくつかの例では、ＣｐＧモチーフは、トル様受容体（ＴＬＲ）により認識される。ＣｐＧ認識ＴＬＲの例としては、ＴＬＲ９の哺乳動物相同体（ホモログ）を含み、これらに限定されない。したがって、本開示のいくつかの局面において、ＣｐＧ認識ＴＬＲは、マウス、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ又はヒツジのＴＬＲ９相同体である。ＯＤＮの免疫原性は、感受性集団又は感染個体において感染を回避できる免疫応答を誘発するのに十分ではない可能性がある。本明細書に示されるように、ＯＤＮの免疫刺激特性は、オリゴヌクレオチドを修飾することによって、特に、ＯＤＮの３’末端におけるチミンラン（ｔｈｙｍｉｎｅ  ｒｕｎ）、グアニンラン（ｇｕａｎｉｎｅ  ｒｕｎ）、及び／又はコレステリル部分の付加によって増強され得る。
【００２２】
本開示の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、１と１０の間のＣｐＧモチーフを含む。他の実施形態において、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、２０個のＣｐＧモチーフさえも含み得る。したがって、いくつかの態様において、本開示の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のＣｐＧモチーフを含む。他の実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、１１と１５の間のＣｐＧモチーフ、又はさらには１５と２０の間のＣｐＧモチーフを含む。
【００２３】
ヌクレオチド間にホスホジエステル結合及び／又はホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドが、本明細書で意図される。いくつかの局面において、本開示のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にホスホジエステル結合を含む。他の局面において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。他の結合もまた、本明細書において意図される。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、ホスホアセテート、メチルホスホネート及びホスホノカルボキシレート結合を含む他の結合を含み得る。いくつかの結合は、他の結合よりも、生産コスト、生産の容易さ及び／又は品質、及び免疫刺激効果の増強のような望ましい利点を提供し得る。
【００２４】
本開示のいくつかの局面において、ＣｐＧモチーフによるオリゴヌクレオチドの免疫原性は、非ＣｐＧ配列によってさらに増強され得る。実施例に示すように、オリゴヌクレオチドの３’末端へのチミンランの付加は、ＴＬＲ９媒介免疫応答を誘発するオリゴヌクレオチドの能力を改善することができる。このため、本開示のいくつかの実施形態において、免疫刺激オリゴヌクレオチドの３’末端配列は、３’末端配列として多数のチミンヌクレオチドを含む。いくつかの局面において、この多数のチミンヌクレオチドは、連続したチミンヌクレオチドを含む。ある局面では、多数のチミンヌクレオチドは４から６の間の連続したチミンヌクレオチドを含む。例えば、本開示のいくつかの態様において、３’末端配列は配列番号９を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６又は８を含む。そしていくつかの態様において、オリゴヌクレオチド配列の３’末端配列はＴＴＴＴである。
【００２５】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドの３’末端に対する他の配列改変もまた、免疫原性の増強に寄与し得る。例えば、本開示のいくつかの態様において、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、３’末端配列又はその近くに多数のグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの局面において、免疫刺激オリゴヌクレオチドの３’末端配列は、多数のグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの局面において、多数のグアニンヌクレオチドは、ＧＧＧＧＧの３’末端配列を有する本開示によるオリゴヌクレオチドのような連続グアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号7を含む。
【００２６】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫原性の増加は、オリゴヌクレオチドの３’末端の修飾に限定されない。例えば、ＣｐＧモチーフの数を増加させるために、内部配列を改変することもできる。いくつかの局面において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端との間のさらなるＣｐＧモチーフを含むように合成され得る。いくつかの局面において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、配列（ＴＣＧ）ｎを含み、ここでｎは、３〜１０の間である。したがって、本開示のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列（ＴＣＧ）ｎを含み、ここでｎは、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【００２７】
本開示のいくつかの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの免疫原性特性を増強するために、３’末端に脂質部分を含み得る。したがって、いくつかの態様において、コレステリル部分は、リンカーを介して免疫刺激オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに共有結合される。コレステリル部分は、分解を防止し、溶解性を増大させ、高次構造（例えばミセル）を形成することによりリガンド多価性を生成し、医薬組成物中のオリゴヌクレオチドの安定性を増大させ、オリゴヌクレオチドの免疫原性を増大させる可能性が高いか、又はそれらの任意の組合せである。共有結合を形成することができる少なくとも２つの部分を有するリンカーは、コレステリル部分及びオリゴヌクレオチドと結合することができる。例えば、いくつかの態様において、リンカーは、コレステリル部分のヒドロキシル基と相互作用して共有結合を形成し、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドと相互作用する。いくつかの態様において、コレステリル部分は、リンカーに共有結合してコレステリル−リンカー部分を形成する。いくつかの態様において、リンカーは、最初にコレステリル部分に結合され、次いで、得られたコレステリル−リンカーは、オリゴヌクレオチドに結合される。他の態様において、リンカーは、まずオリゴヌクレオチドに、次いでコレステリル部分に結合される。いくつかの態様において、コレステリル−リンカーは市販されている。
【００２８】
オリゴヌクレオチド及びコレステリル部分に結合し得る部分を有することに加えて、リンカーのいくつかの態様は、炭素鎖を含み、いくつかの態様において、炭素鎖は、３〜１２個の間の炭素原子を含む。例えば、末端ヒドロキシル基はオリゴヌクレオチド及びコレステリル部分のヒドロキシル基と共有結合できるので、ジオールをコレステリル部分とオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして使用することができる。いくつかの態様において、リンカーはヘキサンジオールを含む。いくつかの態様において、コレステリル−リンカー部分は、図１に示される化学構造を有する。他の実施形態では、反復化学単位を含むリンカーを提供する。化学単位は、ある面では、２回から１２回の間で繰り返される。いくつかの態様において、反復化学単位はエチレングリコールを含み、エチレングリコール化学単位が６回反復される場合、リンカーはヘキサエチレングリコールを含む。ヘキサエチレングリコールを含むリンカーは、図６に示される化学構造を有し得る。
【００２９】
ある状況では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に送達することが望ましい。オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性組成物として送達することができる。本明細書に開示されたオリゴヌクレオチドのいずれかを含む免疫刺激性組成物が提供される。いくつかの局面において、これらの免疫刺激性組成物は、オリゴヌクレオチド、並びに組成物の免疫原性、有効性及び効率に影響を及ぼす他の成分を含む。本開示のいくつかの実施形態において、免疫刺激性組成物は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドに加えて、感染性疾患を予防又は治療するためのワクチン、対象にオリゴヌクレオチドを送達するためのベクター、薬学的担体、又はそれらの任意の組合せを含み得る。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的化送達を可能にするウイルスベクターに包まれる。いくつかの局面において、オリゴヌクレオチドは、カチオン性リポソーム送達ビヒクルに添加されて、脂質細胞膜及び／又はＴＬＲ９を含有する細胞オルガネラの膜を横断するオリゴヌクレオチドの能力を増強し得る。
【００３０】
本明細書に記載される免疫刺激オリゴヌクレオチド又は免疫刺激組成物の投与によって治療又は予防され得る感染性疾患としては、ウイルス性、細菌性、真菌性、蠕虫性又は他の寄生性感染を含み、これらに限定されない。本開示の免疫刺激性オリゴヌクレオチド又は組成物を投与すると、侵入する病原体に敵対する環境を作り出す免疫応答が生じることが意図される。したがって、侵入する病原体は、宿主生物の健康状態を悪化させるのに十分な感染を確立することができないかもしれない。免疫刺激オリゴヌクレオチド及び／又は組成物の投与は、侵入する病原体に対する抗原特異的免疫応答を増大させるか又はそれと並行して作用する非抗原特異的免疫応答を提供し得る。
【００３１】
いくつかの局面において、オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物は、感染性疾患を予防又は治療するためのワクチンをさらに含み得る。オリゴヌクレオチドとワクチンの組み合わせは、複数の薬剤を別々に送達することが治療のコストを増加させるので、効率的な理由で行われ得る。オリゴヌクレオチド及びワクチンはまた、任意の現在の感染に対して非抗原特異的免疫応答を誘発するため、並びに抗原特異的免疫応答の発生を開始するために、単一の免疫刺激組成物として送達され得る。
【００３２】
本発明では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される担体を含む免疫刺激性組成物も意図される。ある局面では、薬学的に許容される担体は、任意の薬学的に許容される担体である。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、乳房内、皮内、腹腔内、皮下、スプレー、エアロゾル、卵内、粘膜、経皮、浸漬、経口、眼内、気管内、鼻腔内、肺、直腸、又は当業者に公知の他の手段から選択される経路による投与のために、組成物に適合させる。薬学的に許容される担体は、免疫刺激性組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルであり得る。そのようなビヒクルは、水及び油のような液体であり得、石油、動物、植物又は合成起源のものを含み、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などである。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒子状物質を含まない。それらは、従来の周知の滅菌技術（例えば濾過）によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤及び着色剤などのような生理学的条件を近似するために必要とされるような薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。このような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は広く変動し、すなわち、約０．５％未満、通常は少なくとも約１％から１５又は２０％重量の範囲であるが、選択される特定の投与方法に従って、主に必要な投与量、流体容積、粘度等に基づいて選択される。他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む適切なビヒクル及び製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：
Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｒｏｙ、Ｄ．Ｂ．ｅｄ．、Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ  ２００６、Ｐａｒｔ５、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ６９１−１０９２（特に９５８〜９８９ページ）参照のこと。
【００３３】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド及び担体は、例えば、化学的に結合される。オリゴヌクレオチドと担体との間の関係を記述するために使用されるように、「連結」は、オリゴヌクレオチドと担体との物理的結合を指す。オリゴヌクレオチド及び担体が互いに結合しているか、相互作用しているか、又は結合しているか、又は他の方法で結合している場合、それらはカップリングしているとみなすことができる。
【００３４】
本明細書に記載される免疫刺激組成物は、いくつかの態様においてハプテンをさらに含む。いくつかの局面において、免疫刺激オリゴヌクレオチドはハプテンに連結される。ハプテンは、大腸菌又はサルモネラのような特定の微生物に対して免疫応答を誘発し得るが、一方、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドとのＴＬＲ９相互作用によって媒介される非特異的免疫応答を誘発する。これら及び他の感染性微生物は、ウシ、ヒツジ及びブタ生産者のような大きな農業生産者に特に関心がある。
【００３５】
コレステリル部分をリガンドに付着させることを含むＴＬＲ９リガンドの免疫原性を増強するための方法も提供され、ここで、リガンドは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、そしてここで、コレステリル部分は、リンカーを介して、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに付着される。
【００３６】
本明細書に開示される他の方法では、多数のＣｐＧモチーフ及びオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに結合したコレステリル−リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、ＴＬＲ９を介した免疫応答をそれを必要とする対象において誘導する方法を提供する。ＴＬＲ９媒介免疫応答を誘導するための方法のいくつかの局面において、オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性組成物として投与される。
【００３７】
本開示のある態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチド又は免疫刺激性組成物が投与される対象は、動物である。ある局面では、動物は、病原体、特にＣｐＧベース病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を有する病原体による感染のリスクが高まっている。免疫刺激性オリゴヌクレオチド及び／又は免疫刺激性組成物をそのような動物に投与すると、ＴＬＲ９媒介性免疫応答が、病原体による感染の予防又は病原体によって引き起こされる症状の緩和を支援する。本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、特定の病原体に特異的である必要はなく、むしろ非抗原特異的免疫応答を刺激することは当業者には理解されよう。オリゴヌクレオチドはまた、特定の動物に特異的である必要はない。したがって、本開示のいくつかの局面において、対象は哺乳動物である。ある局面では、対象は、ブタ、ウシ、ウマ又はヒツジのような群又は農場動物である。家畜群への投与は、畜舎及び／又は共通の餌や水源を共有しているような混雑した条件において、動物の大規模な集団への感染の拡大を防ぐのに役立つ。本開示のオリゴヌクレオチドは、抗生物質の使用が特に抗生物質治療に対する細菌耐性の出現とともにより好ましくなくなりつつあるという点で、感染の伝統的な予防的治療の形態よりも明確な利点を提供する。
【００３８】
ある態様において、対象は、ヒトであり得る。家畜と同様に、ヒトが摂取する抗生物質に対する耐性が細菌でも一般的になりつつあり、耐性感染症の治療選択肢は限られている。本開示のオリゴヌクレオチド及び方法は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のようないわゆる「スーパーバグ」（ｓｕｐｅｒ−ｂｕｇｓ）への非常に必要な解決を提供する。
【００３９】
免疫刺激性オリゴヌクレオチド又は組成物が投与される対象は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ又は他の齧歯類であってもよいことも本明細書では意図されている。対象は、非哺乳動物であってもよい。例えば、ある局面では、対象は水生種である。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態のいくつかをさらに説明するために提供される。実施例は、開示された実施形態を説明するためのものであり、限定するものではない。
【００４１】
実施例１：ＯＤＮの３’−コレステリル修飾は、ＴＬＲ９刺激活性を強く増加させる
【００４２】
ＨＥＫＢｌｕｅにおけるヒトＴＬＲ９組換え過剰発現、
ＰＤＥ−ＯＤＮ（Ｉ）の３’−コレステリル修飾
【００４３】
３’‐コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９に対してかなりの活性を有するＰＤＥ‐ＯＤＮ（表１、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４）に適用した。修飾型及び非修飾型を、ヒトＴＬＲ９を発現する細胞系であるＨＥＫＢｌｕｅ‐ｈＴＬＲ９細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【００４４】
2021506246.tif 000002
【００４５】
2021506246.tif 000003
【００４６】
結果は、２００６‐３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４のＴＬＲ９刺激活性がＥＣ５０に関して３’‐コレステリル修飾によりかなり改善し、これは２００６‐３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４３Ｃについてほぼ３０倍低いことを示唆する（表２、図２Ａ、２Ｂ）。
【００４７】
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾（ＩＩ）
【００４８】
コレステリル部分（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９の弱い活性化リガンドであることが知られている２００６−Ｔ４−ＰＤＥの３’末端ヌクレオチドに結合させた（配列番号３、表３）。修飾及び非修飾２００６−Ｔ４−ＰＤＥオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与して、３’−コレステリル修飾の免疫刺激効果を測定した。
【００４９】
2021506246.tif 000004
【００５０】
結果は、２００６‐Ｔ４‐ＰＤＥのヒトＴＬＲ９刺激活性が３’‐コレステリル修飾によりかなり改善することを示唆する（表２、図３）。
【００５１】
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾（ＩＩＩ）
【００５２】
３’−コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４に対してかなりの活性を有するＰＤＥ−ＯＤＮに適用した（表４）。修飾型と非修飾型を、ＨＥＫＢｌｕｅ‐ｈＴＬＲ９細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【００５３】
2021506246.tif 000005
【００５４】
2021506246.tif 000006
【００５５】
結果は、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４のＴＬＲ９刺激活性がＥＣ５０に関して３’−コレステリル修飾によりかなり改善し、これは２００６‐３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４３Ｃについて３倍以上低いことを示唆する（表５、図４Ａ、４Ｂ）。
【００５６】
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾（ＩＶ）
【００５７】
３’−コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９に対してかなりの活性を有するＰＤＥ−ＯＤＮ、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４に適用した（表８）。修飾型と非修飾型を、ＨＥＫＢｌｕｅ‐ｈＴＬＲ９細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【００５８】
2021506246.tif 000007
【００５９】
2021506246.tif 000008
【００６０】
結果は、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４のＴＬＲ９刺激活性がＥＣ５０に関して３’‐コレステリル修飾によりかなり改善し、これは２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４３Ｃについて３６倍を超えて低いことを示唆する（表９、図５）。
【００６１】
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾（Ｖ）
【００６２】
ＰＤＥ−ＯＤＮに適用される３’−コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図６を参照）は、ヒトＴＬＲ９、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４に対して非常に弱い活性を有する（表１０）。修飾型と非修飾型を、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【００６３】
2021506246.tif 000009
【００６４】
2021506246.tif 000010
【００６５】
結果は、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４のＴＬＲ９刺激活性が、３’−コレステリル修飾により、実質的に無しから６８ｎＭのＥＣ５０まで大幅に改善することを示唆する（表１１、図７）。
【００６６】
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾（ＶＩ）
【００６７】
３’‐コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９、２００７‐ＰＤＥ‐Ｔ４又は２００７‐ＰＤＥ‐Ｔ４Ｇ５Ｔ４に対して非常に低い活性又は活性を示さないＰＤＥ‐ＯＤＮに適用した（表１２）。修飾型と非修飾型を、ＨＥＫＢｌｕｅ‐ｈＴＬＲ９細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【００６８】
2021506246.tif 000011
【００６９】
2021506246.tif 000012
【００７０】
結果は、２００７‐ＰＤＥ‐Ｔ４と２００７‐ＰＤＥ‐Ｔ４Ｇ５Ｔ４の両方のＴＬＲ９刺激活性が、３’‐コレステリル修飾（図８Ａ及び８Ｂ）により、２００７‐Ｔ４Ｇ５Ｔ４‐３Ｃｈの場合はＥＣ５０が２４．９ｎＭに大きく改善することを示唆する（表１３）。
【００７１】
実施例２：Ｒａｍｏｓ‐ＢｌｕｅＢ細胞での、ヒトＴＬＲ９、天然発現
３’−コレステリル修飾（Ｉ）
【００７２】
３’−コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９、に対してかなりの活性を有するＰＤＥ−ＯＤＮ  ２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４に適用した（表１４）。修飾型と非修飾型を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞で試験した。Ｒａｍｏｓ‐ＢｌｕｅＢリンパ球系（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）は、ＮＦ‐κＢ／ＡＰ‐１誘導性レポーター遺伝子を安定に発現し、ＴＬＲ９シグナル伝達の検出を可能にする。
【００７３】
2021506246.tif 000013
【００７４】
2021506246.tif 000014
【００７５】
結果は、２００６‐３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４のＴＬＲ９刺激活性がＥＣ５０に関して３’‐コレステリル修飾によりかなり改善し、これは２００６‐３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４３Ｃについて８倍以上低いことを示唆する（表１５、図９Ａ、９Ｂ）。また、改変されたＯＤＮ２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４３Ｃは、「業界標準」ＯＤＮ  ２００６−ＰＴＯの活性を上回る。
【００７６】
３’−コレステリル修飾（ＩＩ）
【００７７】
３’−コレステリル修飾（コレステリル−リンカー基の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９に対してかなりの活性を有するＰＤＥ−ＯＤＮ  ２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４に適用した（表１６）。修飾型と非修飾型を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞で試験した。
【００７８】
2021506246.tif 000015
【００７９】
2021506246.tif 000016
【００８０】
結果は、２００６‐３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４のＴＬＲ９刺激活性がＥＣ５０に関して３’‐コレステリル修飾によりかなり改善し、これは２００６‐３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４３Ｃについて７倍以上低いことを示唆する（表１７、図１０Ａ、１０Ｂ）。
【００８１】
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾（ＩＩＩ）
【００８２】
３’‐コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９、２００６‐Ｔ４‐ＰＤＥに対して活性が低いＰＤＥ‐ＯＤＮに適用した（表１８）。修飾型と非修飾型を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞で試験した。
【００８３】
2021506246.tif 000017
【００８４】
結果は、２００６‐Ｔ４‐ＰＤＥのヒトＴＬＲ９刺激活性が３’‐コレステリル修飾をかなり改善することを示唆する（表１８、図１１）。
【００８５】
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾（ＩＶ）
【００８６】
３’−コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図６を参照）を、ヒトＴＬＲ９、２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４に対して非常に低い活性を有するＰＤＥ−ＯＤＮに適用した（表１９）。修飾型と非修飾型を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞で試験した。
【００８７】
2021506246.tif 000018
【００８８】
2021506246.tif 000019
【００８９】
結果は、Ｒａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞に対する２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４のヒトＴＬＲ９刺激活性が、３’−コレステリル修飾によって、ＥＣ５０に関して１３の係数でかなり改善されることを示唆する（表２０、図１２）。
【００９０】
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾（Ｖ）
【００９１】
３’‐コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、ヒトＴＬＲ９に対して非常に低い活性又は活性を示さないＰＤＥ‐ＯＤＮ、２００７‐ＰＤＥ‐Ｔ４又は２００７‐ＰＤＥ‐Ｔ４Ｇ５Ｔ４に適用した（表２１）。修飾型と非修飾型を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞で試験した。
【００９２】
2021506246.tif 000020
【００９３】
2021506246.tif 000021
【００９４】
結果は、Ｒａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞における２００６−３ｄＴ４Ｇ５Ｔ４のヒトＴＬＲ９刺激活性が、この実験において考慮された全てのＯＤＮの３’−コレステリル修飾をかなり改善することを示唆する（２００７−ＰＤＥ−Ｔ４、２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、ＴＣＧ８−Ｔ４、表２２、図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃ）。２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４−Ｃｈの場合、その非修飾同族体と比較して、ＥＣ５０に関してほぼ１４の係数で活性の改善が認められた。
【００９５】
実施例３：ＨＥＫＢｌｕｅにおけるマウスＴＬＲ９組換え過剰発現
ＰＤＥ−ＯＤＮの３’−コレステリル修飾
３’−コレステリル修飾（コレステリル−リンカー部分の化学構造については図１を参照）を、２００７−ＰＤＥ−Ｔ４、２００７−ＰＤＥ−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、及びヒトＴＬＲ９に対して非常に低い活性又は活性を有さないＴＣＧ８−Ｔ４に適用した（表２３）。修飾型と非修飾型を、ＨＥＫＢｌｕｅ‐ｍＴＬＲ９細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験した。
【００９６】
2021506246.tif 000022
【００９７】
結果は、ＨＥＫＢｌｕｅ−ｍＴＬＲ９におけるこの実験で考慮された全てのＯＤＮ（２００７−ＰＤＥ−Ｔ４、２００７−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、ＴＣＧ８−Ｔ４、表２３）のマウスＴＬＲ９刺激活性が、三つの例において３’−コレステリル修飾によりかなり改善し（図１４Ａ、１４Ｂ及び１４Ｃ）、そして第四の例においてわずかに低濃度で改善することを示唆する（図１４Ｄ）。
【００９８】
実施例４：ＨＥＫＢｌｕｅ‐ｈＴＬＲ９及びＲａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞における未修飾３’‐コレステリル修飾及び５’‐コレステリル修飾ＯＤＮの系統的研究：構造活性相関（ＳＡＲ）
ＨＥＫＢｌｕｅ−ｈＴＬＲ９
【００９９】
３’‐コレステリル又は５’‐コレステリル修飾（それぞれ図６及び１５を参照、コレステリル−リンカー部分の化学構造）を、４つの異なるＯＤＮに適用した（表２４）。修飾型と非修飾型を、ＨＥＫＢｌｕｅ‐ｈＴＬＲ９細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
この実験では、バックグラウンド測定値が比較的高いため、ＥＣ５０及びＶｍａｘ計算のすべてのデータポイントから０（ゼロ）ＯＤＮ値が差し引かれた。
【０１０３】
この実験で調べたすべてのＯＤＮについて、３’−コレステリル修飾は、ＨＥＫｂｌｕｅ細胞において発現されたヒトＴＬＲ９に対する活性に最も有益であった（表２４、図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ）。ＥＣ５０／Ｖｍａｘの計算が可能な場合（２００６−Ｇ５、２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、表２５）、未修飾ＯＤＮのＥＣ５０は低く（それぞれ２．５と４８倍）、一方、５’−コレステリル修飾では活性が低下することがわかった。２００６‐Ｇ５‐３Ｃｈｏｌ及び２００６‐Ｔ４Ｇ５Ｔ４‐３ＣｈｏｌのＥＣ５０は、「業界標準」２００６‐ＰＴＯのＥＣ５０よりも低く、免疫調節干渉の候補となる。
【０１０４】
Ｒａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ
【０１０５】
３’‐コレステリル又は５’‐コレステリル修飾（それぞれ図６及び１５を参照、コレステリル−リンカー部分の化学構造）を４つの異なるＯＤＮに適用した（表２６）。修飾型と非修飾型を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞で試験した。
【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
この実験では、表２５との整合を保つために、ＥＣ５０及びＶｍａｘ計算のすべてのデータ点から０（ゼロ）ＯＤＮ値が減算された。
【０１０９】
この実験で調べたすべてのＯＤＮについて、３’−コレステリル修飾は、Ｒａｍｏｓ‐Ｂｌｕｅ細胞中に内在的に存在するヒトＴＬＲ９に対する活性に最も有益であった（表２６、図１７Ａ−１７Ｄ）。ＥＣ５０／Ｖｍａｘの計算が可能な場合（２００６−Ｇ５、２００６−Ｔ４Ｇ５Ｔ４、表２５）、非修飾ＯＤＮのＥＣ５０は低く（それぞれ３及び１０倍）、一方、５’−コレステリル修飾は、両方の誘導体化が活性の改善をもたらしたＴＣＧ８−Ｔ４Ｇ５Ｔ４を除いて、活性の損失をもたらしたが、３’−コレステリルの方が５’−コレステリルよりも活性が高かったことがわかった（図１７Ｄ、表２６）。２００６‐Ｇ５‐３Ｃｈｏｌ及び２００６‐Ｔ４Ｇ５Ｔ４‐３ＣｈｏｌのＥＣ５０は、「業界標準」２００６‐ＰＴＯのＥＣ５０よりも低く、免疫調節干渉の候補となる。
【０１１０】
当業者は、本発明の好ましい実施形態に対して多くの変更及び修正を行うことができ、そのような変更及び修正を本発明の精神から逸脱することなく行うことができることを理解するであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲内にあるような全ての等価な変形を保護することが意図される。
【０１１１】
本明細書に引用又は記載されている各特許、特許−出願、及び刊行物の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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