(57)【要約】対象からの無細胞核酸を含む試料中の治療用核酸構築物を非侵襲的に検出および／またはモニタリングするための方法、システムおよび組成物。無細胞核酸を含む試料中の治療用核酸構築物の検出により、治療用核酸構築物の投与の検証、治療用核酸構築物の持続性もしくは生物学的有効性の判定、および／または対象における治療法の有効性の確認が可能となる。少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、コンピューターによって受容するステップと、コンピューターによって、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法。
2021518106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、
前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、
前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、
前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、
前記コンピューターによって、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする第１の参照配列情報と実質的にアライメントしない前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、１つまたは複数の非アライメント配列リードを識別するステップと、
前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物を起源とする第２の鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記非アライメント配列リードのうちの少なくともいくつかを識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項３】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、
前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、
前記コンピューターによって、前記試験配列情報から、１つもしくは複数のイントロン領域および／またはエクソン−イントロンジャンクションにまたがる１つもしくは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、
前記コンピューターによって、前記フィルタリングされた試験配列情報において、前記治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項４】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、
前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、
前記コンピューターによって、前記試験配列情報から、エクソン−エクソンジャンクションにまたがる１つまたは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、濃縮された試験配列情報を生成するステップと、
前記コンピューターによって、前記濃縮された試験配列情報中の、前記治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項５】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、
前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、
前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物のベクター部分を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項６】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、
前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、
前記コンピューターによって、互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別して、それによって、配列リードの候補セットを識別するステップと、
前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードの前記候補セットの少なくとも一部のメンバーを識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項７】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象を起源とする核酸分子を検出する方法であって、
前記試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記試験配列情報を受容する前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記コンピューターによって、前記試験配列情報から、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、
前記コンピューターによって、前記フィルタリングされた試験配列情報において、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象を起源とする前記核酸分子を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項８】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の外因性核酸分子を検出する方法であって、
前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、
前記コンピューターによって、互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記外因性核酸分子を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項９】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象における治療有効性をモニタリングする方法であって、
第１の時点および第２の時点において、前記試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量し、それによって、前記試験対象における前記治療有効性をモニタリングするステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象における治療有効性をモニタリングする方法であって、
第１の時点および第２の時点において、前記試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップであって、少なくとも１つの対照核酸および少なくとも１つの治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記対照核酸および／または前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量し、それによって、前記試験対象における前記治療有効性をモニタリングするステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、
前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、
前記コンピューターによって、前記配列リード間における単峰型サイズ分布を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
前記第１の参照配列情報が、ヒトゲノムからである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、ヒトであり、前記参照配列情報が、ヒトゲノムからである、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
複数の前記配列リードが、単峰型サイズ分布で存在している、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験対象からの前記生物学的試料を得るステップをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的試料が、血液、血漿、血清、喀痰、尿、精液、膣液、糞便、滑液、脊髄液、粘膜排泄物、喀痰、涙液、および唾液からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子から前記試験配列情報を生成するステップをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子の１つまたは複数のセグメントを増幅して、増幅された核酸分子を生成するステップをさらに含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅された核酸分子をシーケンシングして、前記試験配列情報を生成するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験配列情報が、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子の標的化配列から得られ、前記標的化配列が、シーケンシングの前に、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子からの１つまたは複数の領域を選択的に濃縮することによって得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記得られた標的化配列を、シーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
シーケンシングの前に、バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを、前記無細胞核酸分子に結合させるステップをさらに含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記シーケンシングが、標的化シーケンシング、イントロンシーケンシング、エクソームシーケンシング、および全ゲノムシーケンシングからなる群から選択される、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験対象が、哺乳動物対象である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験対象が、前記治療用核酸構築物で処置することができる疾患または障害を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患が、がんである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害が、遺伝子障害である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患が、ウイルス疾患である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患または障害が、免疫不全障害、血友病、サラセミア、鎌状細胞疾患、血液疾患、慢性肉芽腫性障害、先天性盲目、リソソーム蓄積症、筋ジストロフィー、がん、神経変性疾患、ウイルス感染、細菌感染、表皮水疱症、心疾患、脂質代謝障害、および糖尿病、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療用核酸構築物が、ＤＮＡに基づく治療法において使用される構築物である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＤＮＡに基づく治療用構築物が、プラスミド、アプタマー、ＤＮＡザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ウイルスベクター、およびアンチジーンオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療用核酸構築物が、ＲＮＡに基づく治療法において使用される構築物である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＮＡに基づく治療用核酸構築物が、アプタマー、ＲＮＡデコイ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療用核酸構築物が、天然のヌクレオチド配列、前記天然のヌクレオチド配列のバリアント、もしくは合成のヌクレオチド配列、またはこれらの組合せを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療用核酸構築物が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の一部である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療用核酸構築物が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ療法の一部である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物学的試料が、前記治療用核酸構築物の断片を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療用核酸構築物の標的配列を選択的に濃縮するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的配列が、天然のヌクレオチド配列、前記天然のヌクレオチド配列のバリアント、もしくは合成のヌクレオチド配列、またはこれらの組合せを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的配列が、ＴＰ５３、ＨＢＢ、ＲＰＥ６５、およびＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子遺伝子、ＤＭＤ、ＵＬ１２３、ＡＰＯＢ、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＩＣＡＭ−１、ＴＬＲ９、ＩＲＳ−１、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ、ならびにＴＴＲからなる群から選択される遺伝子またはそのバリアントを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記治療用核酸構築物が、ヒトアデノウイルス核酸配列の一部分を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項４４】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする第１の参照配列情報と実質的にアライメントしない前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、１つまたは複数の非アライメント配列リードを識別するステップと、
治療用核酸構築物を起源とする第２の鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記非アライメント配列リードのうちの少なくともいくつかを識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項４５】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
前記試験配列情報から、１つもしくは複数のイントロン領域および／またはエクソン−イントロンジャンクションにまたがる１つもしくは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、
前記フィルタリングされた試験配列情報において、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項４６】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
前記試験配列情報から、エクソン−エクソンジャンクションにまたがる１つまたは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、濃縮された試験配列情報を生成するステップと、
前記濃縮された試験配列情報中の、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項４７】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
治療用核酸構築物のベクター部分を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項４８】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別して、それによって、配列リードの候補セットを識別するステップと、
治療用核酸構築物を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードの前記候補セットの少なくとも一部のメンバーを識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項４９】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記試験配列情報を受容する前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記試験配列情報から、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、
前記フィルタリングされた試験配列情報において、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項５０】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別するステップであって、外因性核酸分子が、前記遺伝子座を含む、ステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項５１】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項５２】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、少なくとも１つの対照核酸および少なくとも１つの治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記第１および第２の時点において、前記対照核酸および／または前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【請求項５３】
前記コントローラーに作動可能に接続され、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子からの前記試験配列情報を提供するように構成される、核酸シーケンサーを含む、請求項４３から５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記核酸シーケンサーが、前記無細胞核酸分子に、パイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーション、またはシーケンシングバイハイブリダイゼーションを実施して、シーケンシングリードを生成するように構成される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
前記コントローラーに作動可能に接続され、核酸シーケンサーによってシーケンシングしようとする前記無細胞核酸分子を調製するように構成される、試料調製コンポーネントを含む、請求項４３から５４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５６】
前記試料調製コンポーネントが、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子からの領域を選択的に濃縮するように構成される、請求項５５に記載のシステム。
【請求項５７】
前記試料調製コンポーネントが、バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを、前記無細胞核酸分子に結合させるように構成される、請求項５５に記載のシステム。
【請求項５８】
前記コントローラーに作動可能に接続され、前記無細胞核酸分子を増幅させるように構成される、核酸増幅コンポーネントを含む、請求項４３から５７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５９】
前記核酸増幅コンポーネントが、選択的に濃縮された、生物学的ＤＮＡ試料中の前記無細胞核酸分子からの領域を増幅させるように構成される、請求項５８に記載のシステム。
【請求項６０】
前記コントローラーに作動可能に接続され、核酸シーケンサーと試料調製コンポーネントとの間で、１つまたは複数の材料を輸送するように構成される、材料輸送コンポーネントを含む、請求項４３から５３または５９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６１】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項６２】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする第１の参照配列情報と実質的にアライメントしない前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、１つまたは複数の非アライメント配列リードを識別するステップと、
治療用核酸構築物を起源とする第２の鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記非アライメント配列リードのうちの少なくともいくつかを識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項６３】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
前記試験配列情報から、１つもしくは複数のイントロン領域および／またはエクソン−イントロンジャンクションにまたがる１つもしくは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、
前記フィルタリングされた試験配列情報において、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項６４】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
前記試験配列情報から、エクソン−エクソンジャンクションにまたがる１つまたは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、濃縮された試験配列情報を生成するステップと、
前記濃縮された試験配列情報中の、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項６５】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
治療用核酸構築物のベクター部分を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項６６】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別して、それによって、配列リードの候補セットを識別するステップと、
治療用核酸構築物を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードの前記候補セットの少なくとも一部のメンバーを識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項６７】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記試験配列情報を受容する前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記試験配列情報から、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、
前記フィルタリングされた試験配列情報において、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項６８】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、
互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別するステップであって、外因性核酸分子が、前記遺伝子座を含む、ステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項６９】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項７０】
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、少なくとも１つの対照核酸および少なくとも１つの治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、
前記第１および第２の時点において、前記対照核酸および／または前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
前記電子プロセッサーに作動可能に接続された試料調製コンポーネントに、増幅および／またはシーケンシングしようとする前記無細胞核酸分子を調製させるステップと、
前記電子プロセッサーに作動可能に接続された核酸増幅コンポーネントに、前記無細胞核酸分子を増幅させるステップと、
前記電子プロセッサーに作動可能に接続された核酸シーケンサーに、前記無細胞核酸分子をシーケンシングさせるステップと、
前記電子プロセッサーに作動可能に接続された材料輸送コンポーネントに、前記試料調製コンポーネント、前記核酸増幅コンポーネント、および／または前記核酸シーケンサー間で１つまたは複数の材料を輸送させるステップと
を実施する、非一時的コンピューター実行可能命令をさらに含む、請求項６１から７０のいずれか一項に記載のコンピューター可読媒体。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
前記配列リードのうちの１つまたは複数を、参照配列情報とアライメントするステップであって、前記電子プロセッサーに作動可能に接続された１つまたは複数のデータベースが、前記参照配列情報を含む、ステップを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令をさらに含む、請求項６１から７１のいずれか一項に記載のコンピューター可読媒体。
【請求項７３】
前記少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、
前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードのうちの１つもしくは複数、および／またはそれに由来するデータを、前記電子プロセッサーに作動可能に接続された少なくとも１つのディスプレイに表示するステップを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令をさらに含む、請求項６１から７２のいずれか一項に記載のコンピューター可読媒体。
【請求項７４】
対象を処置するための方法であって、
コンピューターによって、第１の時点および第２の時点において、前記対象に由来する生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、試験対象に投与されている、ステップと、
前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと、
前記治療用核酸構築物を起源とする配列リードの量が、前記第２の時点において、閾値を下回る場合に、前記治療用核酸構築物のさらなる投薬量を、前記対象に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項７５】
対象を処置するための方法であって、
コンピューターによって、第１の時点および第２の時点において、前記対象に由来する生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、試験対象に投与されている、ステップと、
前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと、
前記治療用核酸構築物を起源とする配列リードの量が、前記第２の時点において、閾値を下回る場合に、前記治療用核酸構築物のさらなる投薬量を、前記対象に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項７６】
対象を処置するための方法であって、
コンピューターによって、第１の時点および第２の時点において、前記対象に由来する生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、少なくとも１つの対照核酸および少なくとも１つの治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、試験対象に投与されている、ステップと、
前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記対照核酸および／または前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと、
前記対照核酸および／または治療用核酸構築物を起源とする配列リードの量が、前記第２の時点において、閾値を下回る場合に、前記治療用核酸構築物のさらなる投薬量を、前記対象に投与するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本国際特許出願は、２０１８年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６４２，５２０号および２０１８年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６５６，４１６号に基づく優先権を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
無細胞核酸（ｃｆＮＡ）は、治療法の選択に関する情報を得るためのゲノム改変検出に利用されており、新しく出現した非侵襲的疾患モニタリングツールである。治療用核酸（ＴＮＡ）は、治療効果のためにＤＮＡまたはｍＲＮＡ転写産物のレベルを直接的または間接的に操作する。ｃｆＮＡが日常的に臨床で使用されており、ＴＮＡは臨床試験数が増加しているが、この外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの源を認識するためのｃｆＮＡの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の必要性を含め、これらの技術の相互作用の可能性については、ほとんど知られていない。
【０００３】
天然の核酸と同様に、ＴＮＡにおいて使用される核酸構築物は、末梢血に流れ出し、無細胞画分において見出され得る（すなわち、インタクトな細胞は見出されない）。この材料は、抽出およびシーケンシングすることができ、合成構築物は、固有な合成配列または天然の配列の過剰出現を通じて、検出することができる。この検出および定量化は、合成構築物の投与の有効性、持続性、もしくは生物学的有効性、または治療の有効性を確認するためを含め、いくつかの方法において使用することができる。しかしながら、そのような、無細胞核酸を含む試料中のＴＮＡの検出方法は、依然として確立されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、前記生物学的試料中の核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法に関する。
【０００５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法に関する。
【０００６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする第１の参照配列情報と実質的にアライメントしない前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、１つまたは複数の非アライメント配列リードの存在を識別するステップと、前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物を起源とする第２の鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記非アライメント配列リードのうちの少なくともいくつかを識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法に関する。一部の実施形態では、第１の参照配列情報は、ヒトゲノムからである。
【０００７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、前記試験配列情報から、１つもしくは複数のイントロン領域および／またはエクソン−イントロンジャンクションにまたがる１つもしくは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、前記コンピューターによって、前記フィルタリングされた試験配列情報において、前記治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法に関する。
【０００８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、前記試験配列情報から、エクソン−エクソンジャンクションにまたがる１つまたは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、濃縮された試験配列情報を生成するステップと、前記コンピューターによって、前記濃縮された試験配列情報中の、前記治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数の存在を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法に関する。
【０００９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物のベクター部分を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法に関する。
【００１０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物を検出する方法であって、前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別して、それによって、配列リードの候補セットを識別するステップと、前記コンピューターによって、前記治療用核酸構築物を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードの前記候補セットの少なくとも一部のメンバーを識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法に関する。
【００１１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象を起源とする核酸分子を検出する方法であって、前記試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記試験配列情報を受容する前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記コンピューターによって、前記試験配列情報から、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、前記コンピューターによって、前記フィルタリングされた試験配列情報において、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別し、それによって、前記試験対象を起源とする前記核酸分子を検出するステップとを含む、方法に関する。一部の実施形態では、参照配列情報は、ヒトゲノムからである。一部の実施形態では、除去ステップは、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードを識別することを含む。
【００１２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の外因性核酸分子を検出する方法であって、前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットの存在を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記外因性核酸分子を検出するステップとを含む、方法。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象における治療有効性をモニタリングする方法であって、第１の時点および第２の時点において、前記試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量し、それによって、前記試験対象における前記治療有効性をモニタリングするステップとを含む、方法に関する。
【００１４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象における治療有効性をモニタリングする方法であって、第１の時点および第２の時点において、前記試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップであって、少なくとも１つの対照核酸および少なくとも１つの治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記対照核酸および／または前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量し、それによって、前記試験対象における前記治療有効性をモニタリングするステップとを含む、方法に関する。
【００１５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在を検出する方法であって、前記生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、前記コンピューターによって受容するステップと、前記コンピューターによって、前記配列リード間におけるサイズ分布を識別し、それによって、前記試験対象からの前記生物学的試料中の前記治療用核酸構築物の存在を検出するステップとを含む、方法に関する。ある特定の実施形態では、サイズ分布を識別することは、治療用核酸構築物には典型的であるが、無細胞核酸分子には非典型的な断片サイズを有する配列リードの存在を判定することを含む。ある特定の実施形態では、サイズ分布は、単峰型サイズ分布である。ある特定の実施形態では、サイズ分布は、二峰型サイズ分布である。
【００１６】
ある特定の実施形態では、配列リードと、所与の治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報との間に実質的なアライメントが識別されない試料において、これは、一般に、少なくとも特定の事例において、その試料中の所与の治療用核酸構築物の存在の根拠が少なくとも不在であることを示唆する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記試験対象からの前記生物学的試料を得るステップまたはそれを提供するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、喀痰、尿、精液、膣液、糞便、滑液、脊髄液、粘膜排泄物、喀痰、涙液、および唾液からなる群から選択される。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、生物学的試料中の前記無細胞核酸分子から試験配列情報を生成するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子の１つまたは複数のセグメントを増幅して、増幅された核酸分子を生成するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記増幅された核酸分子をシーケンシングして、前記試験配列情報を生成するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記試験配列情報は、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子の標的化配列から得られ、前記標的化配列が、シーケンシングの前に、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子からの１つまたは複数の領域を選択的に濃縮することによって得られる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記得られた標的化配列を、シーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記シーケンシングは、標的化シーケンシング、イントロンシーケンシング、エクソームシーケンシング、および全ゲノムシーケンシングからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、シーケンシングの前に、バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを、無細胞核酸分子に結合させるステップをさらに含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、前記試験対象は、哺乳動物対象である。ある特定の実施形態では、前記哺乳動物対象は、ヒト対象である。ある特定の実施形態では、前記試験対象は、前記治療用核酸構築物で処置することができる疾患または障害を有する。ある特定の実施形態では、前記疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、前記障害は、遺伝子障害である。ある特定の実施形態では、前記疾患は、ウイルス疾患である。ある特定の実施形態では、前記疾患または障害は、免疫不全障害、血友病、サラセミア、鎌状細胞疾患、血液疾患、慢性肉芽腫性障害、先天性盲目、リソソーム蓄積症、筋ジストロフィー、がん、神経変性疾患、ウイルス感染、細菌感染、表皮水疱症、心疾患、脂質代謝障害、および糖尿病、またはこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、前記治療用核酸構築物は、ＤＮＡに基づく治療法において使用される構築物である。ある特定の実施形態では、ＤＮＡに基づく治療用構築物は、プラスミド、アプタマー、ＤＮＡザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ウイルスベクター、およびアンチジーンオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、前記治療用核酸構築物は、ＲＮＡに基づく治療法において使用される構築物である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡに基づく治療用核酸構築物は、アプタマー、ＲＮＡデコイ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択される。
【００２１】
ある特定の実施形態では、前記治療用核酸構築物は、天然に存在するヌクレオチド配列、前記天然に存在するヌクレオチド配列のバリアント、もしくは合成のヌクレオチド配列、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、前記治療用核酸構築物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の一部である。ある特定の実施形態では、前記治療用核酸構築物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ療法の一部である。ある特定の実施形態では、治療用核酸構築物は、ヒトアデノウイルス核酸配列の一部分を含む。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、治療用核酸構築物の断片を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記治療用核酸構築物の標的配列を選択的に濃縮するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記標的配列は、ＴＰ５３、ＨＢＢ、ＲＰＥ６５、およびＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子遺伝子、ＤＭＤ、ＵＬ１２３、ＡＰＯＢ、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＩＣＡＭ−１、ＴＬＲ９、ＩＲＳ−１、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ、ならびにＴＴＲからなる群から選択される遺伝子またはそのバリアントを含む。
【００２３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００２４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする第１の参照配列情報と実質的にアライメントしない前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、１つまたは複数の非アライメント配列リードを識別するステップと、治療用核酸構築物を起源とする第２の鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記非アライメント配列リードのうちの少なくともいくつかを識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００２５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、前記試験配列情報から、１つもしくは複数のイントロン領域および／またはエクソン−イントロンジャンクションにまたがる１つもしくは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、前記フィルタリングされた試験配列情報において、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００２６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、前記試験配列情報から、エクソン−エクソンジャンクションにまたがる１つまたは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、濃縮された試験配列情報を生成するステップと、前記濃縮された試験配列情報中の、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００２７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、治療用核酸構築物のベクター部分を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００２８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別して、それによって、配列リードの候補セットを識別するステップと、治療用核酸構築物を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードの前記候補セットの少なくとも一部のメンバーを識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システム。
【００２９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記試験配列情報を受容する前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記試験配列情報から、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、前記フィルタリングされた試験配列情報において、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００３０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別するステップであって、外因性核酸分子が、前記遺伝子座を含む、ステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００３１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００３２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、少なくとも１つの対照核酸および少なくとも１つの治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記第１および第２の時点において、前記対照核酸および／または前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムに関する。
【００３３】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるシステムは、前記コントローラーに作動可能に接続され、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子からの前記試験配列情報を提供するように構成される、核酸シーケンサーを含む。ある特定の実施形態では、前記核酸シーケンサーは、前記無細胞核酸分子に、パイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーション、またはシーケンシングバイハイブリダイゼーションを実施して、シーケンシングリードを生成するように構成される。ある特定の実施形態では、試料調製コンポーネントは、前記コントローラーに作動可能に接続され、核酸シーケンサーによってシーケンシングしようとする前記無細胞核酸分子を調製するように構成される。ある特定の実施形態では、前記試料調製コンポーネントは、前記生物学的試料中の前記無細胞核酸分子からの領域を選択的に濃縮するように構成される。ある特定の実施形態では、前記試料調製コンポーネントは、バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを、前記無細胞核酸分子に結合させるように構成される。
【００３４】
ある特定の実施形態では、前記システムは、前記コントローラーに作動可能に接続され、前記無細胞核酸分子を増幅させるように構成される、核酸増幅コンポーネントを含む。ある特定の実施形態では、前記核酸増幅コンポーネントは、選択的に濃縮された、生物学的ＤＮＡ試料中の前記無細胞核酸分子からの領域を増幅させるように構成される。
【００３５】
ある特定の実施形態では、前記システムは、前記コントローラーに作動可能に接続され、核酸シーケンサーと試料調製コンポーネントとの間で、１つまたは複数の材料を輸送するように構成される、材料輸送コンポーネントを含む。
【００３６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００３７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする第１の参照配列情報と実質的にアライメントしない前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、１つまたは複数の非アライメント配列リードを識別するステップと、治療用核酸構築物を起源とする第２の鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記非アライメント配列リードのうちの少なくともいくつかを識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００３８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、前記試験配列情報から、１つもしくは複数のイントロン領域および／またはエクソン−イントロンジャンクションにまたがる１つもしくは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、前記フィルタリングされた試験配列情報において、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００３９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、前記試験配列情報から、エクソン−エクソンジャンクションにまたがる１つまたは複数の領域を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別して、濃縮された試験配列情報を生成するステップと、前記濃縮された試験配列情報中の、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００４０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、治療用核酸構築物のベクター部分を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００４１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別して、それによって、配列リードの候補セットを識別するステップと、治療用核酸構築物を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードの前記候補セットの少なくとも一部のメンバーを識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００４２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記試験配列情報を受容する前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記試験配列情報から、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードのうちの１つまたは複数を除去して、フィルタリングされた試験配列情報を生成するステップと、前記フィルタリングされた試験配列情報において、前記試験対象と同じ種の１つまたは複数の参照対象を起源とする参照配列情報と実質的にアライメントする前記配列リードのうちの１つまたは複数を識別するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００４３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、互いに共通している少なくとも１つの遺伝子座を含む、前記配列リードの少なくとも１つのセットであって、閾値を上回るカバレッジを含む、少なくとも１つのセットを識別するステップであって、外因性核酸分子が、前記遺伝子座を含む、ステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００４４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００４５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、少なくとも１つの対照核酸および少なくとも１つの治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、前記試験対象に投与されている、ステップと、前記第１および第２の時点において、前記対照核酸および／または前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体に関する。
【００４６】
ある特定の実施形態では、前記コンピューター可読媒体は、前記少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、前記電子プロセッサーに作動可能に接続された試料調製コンポーネントに、増幅および／またはシーケンシングしようとする前記無細胞核酸分子を調製させるステップと、前記電子プロセッサーに作動可能に接続された核酸増幅コンポーネントに、前記無細胞核酸分子を増幅させるステップと、前記電子プロセッサーに作動可能に接続された核酸シーケンサーに、前記無細胞核酸分子をシーケンシングさせるステップと、前記電子プロセッサーに作動可能に接続された材料輸送コンポーネントに、前記試料調製コンポーネント、前記核酸増幅コンポーネント、および／または前記核酸シーケンサー間で１つまたは複数の材料を輸送させるステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令をさらに含む。
【００４７】
ある特定の実施形態では、前記コンピューター可読媒体は、前記少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、前記配列リードのうちの１つまたは複数を、参照配列情報とアライメントするステップであって、前記電子プロセッサーに作動可能に接続された１つまたは複数のデータベースが、前記参照配列情報を含む、ステップを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令をさらに含む。ある特定の実施形態では、前記コンピューター可読媒体は、前記少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードのうちの１つもしくは複数、および／またはそれに由来するデータを、前記電子プロセッサーに作動可能に接続された少なくとも１つのディスプレイに表示するステップを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令をさらに含む。
【００４８】
ある特定の態様では、本開示は、対象を処置するための方法であって、コンピューターによって、第１の時点および第２の時点において、前記対象に由来する生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、試験対象に投与されている、ステップと、前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと、前記治療用核酸構築物を起源とする配列リードの量が、前記第２の時点において、閾値を下回る場合に、前記治療用核酸構築物のさらなる投薬量を、前記対象に投与するステップとを含む、方法に関する。
【００４９】
ある特定の態様では、本開示は、対象を処置するための方法であって、コンピューターによって、第１の時点および第２の時点において、前記対象に由来する生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、試験対象に投与されている、ステップと、前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと、前記治療用核酸構築物を起源とする配列リードの量が、前記第２の時点において、閾値を下回る場合に、前記治療用核酸構築物のさらなる投薬量を、前記対象に投与するステップとを含む、方法に関する。
【００５０】
ある特定の態様では、本開示は、対象を処置するための方法であって、コンピューターによって、第１の時点および第２の時点において、前記対象に由来する生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップであって、少なくとも１つの対照核酸および少なくとも１つの治療用核酸構築物が、前記第１および／または第２の時点よりも前に、試験対象に投与されている、ステップと、前記コンピューターによって、前記第１および第２の時点において、前記対照核酸および／または前記治療用核酸構築物を起源とする前記配列リードが存在する場合に、その相対量を定量するステップと、前記対照核酸および／または治療用核酸構築物を起源とする配列リードの量が、前記第２の時点において、閾値を下回る場合に、前記治療用核酸構築物のさらなる投薬量を、前記対象に投与するステップとを含む、方法に関する。
【００５１】
ある特定の態様では、本開示は、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物を検出する方法における、無細胞核酸分子の使用であって、この方法が、試験対象から生物学的試料を得るステップと、生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を生成するステップと、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードのうちの１つまたは複数の存在を識別し、それによって、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物を検出するステップとを含む、使用に関する。
【００５２】
ある特定の態様では、本開示は、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物を検出する方法における、無細胞核酸分子の使用であって、この方法が、生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を受容するステップと、治療用核酸構築物を起源とする鑑別参照配列情報と実質的にアライメントする配列リードのうちの１つまたは複数の存在を識別し、それによって、試験対象からの生物学的試料中の治療用核酸構築物を検出するステップとを含む、使用に関する。
【００５３】
ある特定の態様では、本開示は、試験対象における治療用核酸構築物の治療有効性をモニタリングする方法における使用のための、対照核酸および治療用核酸構築物を含む、組成物であって、この方法が、第１の時点および第２の時点において、試験対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む試験配列情報を、コンピューターによって受容するステップであって、この組成物が、第１および／または第２の時点よりも前に、試験対象に投与されている、ステップと、コンピューターによって、第１および第２の時点において、対照核酸および／または治療用核酸構築物を起源とする配列リードが存在する場合に、その相対量を定量し、それによって、試験対象における治療有効性をモニタリングするステップとを含む、組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、リポソーム封入ＴＰ５３発現ベクターを含む、治療用核酸構築物の実施形態を示す。
【００５５】
【図２】図２は、ベースライン測定と比較した、第１７染色体上のＴＰ５３の増幅カバレッジの増加を示すグラフを示す。
【００５６】
【図３】図３は、マッピングされたＴＰ５３の配列リードの図を示す。配列リードの一部分は、参照配列のイントロンにマッピングされず、イントロン欠失を示す。
【００５７】
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、治療用核酸構築物の検出において使用される、ＴＰ５３発現ベクターのマッピングされた配列リードおよびマッピングされない配列リードの図を示す。図４Ａでは、マッピングされない配列リード（外来配列）は、ＴＰ５３エクソン１に隣接して位置していると判定される。図４Ｂでは、マッピングされない配列リード（外来配列）は、ＴＰ５３エクソン１１に隣接して位置していると判定される。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、治療用核酸構築物の検出において使用される、ＴＰ５３発現ベクターのマッピングされた配列リードおよびマッピングされない配列リードの図を示す。図４Ａでは、マッピングされない配列リード（外来配列）は、ＴＰ５３エクソン１に隣接して位置していると判定される。図４Ｂでは、マッピングされない配列リード（外来配列）は、ＴＰ５３エクソン１１に隣接して位置していると判定される。
【００５８】
【図５】図５は、細胞起源のｃｆＤＮＡ分子（実線）の長さと比較した、ＴＰ５３治療用核酸構築物（破線）の単峰型サイズ分布グラフを示す。
【００５９】
【図６】図６は、ある特定の実施形態での使用に好適な例示的なシステムの概略図である。
【００６０】
【図７】図７は、外来ＴＰ５３隣接配列の、６００３ｂｐの環状構築物へのアセンブリーワークフローを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
定義
本開示の様々な実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が単なる例示として提供されていることが、当業者には理解されるであろう。当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変化形、変更、および置換を想起し得る。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する様々な代替形を、用いることができることを理解されたい。
【００６２】
「対象」または「患者」という用語は、動物、例えば、哺乳動物種（好ましくは、ヒト）もしくは鳥類（例えば、鳥）種、または他の生物を指す。より具体的には、対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、霊長類、サル、またはヒトであり得る。動物には、家畜動物、競技動物、およびペットが含まれる。対象は、健康な個体、症状もしくは徴候を有するか、または疾患もしくは疾患の傾向を有することが疑われる個体、または治療を必要とするかもしくは治療を必要とすることが疑われる個体であり得る。一部の実施形態では、対象は、ヒト、例えば、がんを有するかまたはがんを有することが疑われるヒトである。
【００６３】
「無細胞核酸」または「ｃｆＮＡ」という語句は、細胞内に含まれていないかもしくは細胞に結合していない核酸、または換言すると、インタクトな細胞を除去した後に試料中に残存している核酸を指す。無細胞核酸は、対象に由来する体液（例えば、血液、尿、ＣＳＦなど）から得られたすべての非封入核酸と称され得る。無細胞核酸としては、ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、およびそれらのハイブリッドが挙げられ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長い非コーディングＲＮＡ（長いｎｃＲＮＡ）、またはこれらのうちのいずれかの断片が含まれる。無細胞核酸は、二本鎖であっても、一本鎖であっても、部分的に二本鎖および一本鎖であってもよい。無細胞核酸は、分泌または細胞死プロセス、例えば、細胞壊死およびアポトーシスを通じて、体液中に放出され得る。一部の無細胞核酸、例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、がん細胞から、体液中に放出される。その他のものは、健常細胞から放出される。ｃｔＤＮＡは、非封入腫瘍由来断片化ＤＮＡであり得る。無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）は、母体血流中に自由に循環している胎児ＤＮＡである。無細胞核酸は、１つまたは複数の関連するエピジェネティックな改変、例えば、アセチル化、５−メチル化、ユビキチン化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、リボシル化、および／またはシトルリン化を有し得る。一部の実施形態では、無細胞核酸は、ｃｆＤＮＡであり、これは、通常、二本鎖ｃｆＤＮＡを含む。
【００６４】
「タグ」という用語は、短い核酸（例えば、５００未満、１００未満、５０未満、または１０未満のヌクレオチド長）を指し、核酸を、異なる種類または異なるプロセシングを受けた、異なる試料（例えば、試料インデックスを提示する）、または同じ試料中の異なる核酸分子（例えば、分子バーコードを提示する）と区別するために、核酸分子を標識するのに使用される。タグは、一本鎖であっても、二本鎖であっても、少なくとも部分的に二本鎖であってもよい。タグは、同じ長さを有してもよく、または変動した長さを有してもよい。タグは、平滑末端であってもよく、またはオーバーハングを有してもよい。タグは、核酸の一方の末端または両方の末端に結合され得る。タグは、デコードされると、核酸の起源試料、種類（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、鎖の配向など）、またはプロセシングなどの情報を示し得る。タグを使用して、異なる分子バーコードおよび／または試料インデックスを有する核酸を含む複数の試料のプールおよび並行したプロセシングを可能にすることができ、核酸は、後でタグを読み取ることによりデコンボリューションされる。追加または代替として、タグは、同じ試料中の異なる分子を区別するために使用することができる。これには、分子バーコードを使用して、試料中の異なる分子を固有にバーコード化することまたは分子を非固有にバーコード化することが含まれる。非固有バーコード化の場合には、異なる分子が、少なくとも１つのバーコードと組み合わせて、参照ゲノム上にマッピングされるそれらの開始／終止位置に基づいて区別され得るように、限られた数の異なるバーコードを使用して、分子をタグ付けしてもよい。そのため、典型的には、同じ開始／終止を有する任意の２つの分子が、同じバーコードも有する確率が低くなるように（例えば、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満）、十分な数の異なるタグが使用される。一部のタグは、複数の試料、１つの試料内の複数の分子形態、ならびに同じ開始点および終止点を有する１つの形態内の複数の分子を標識するための複数の分子識別子を含む。そのようなタグは、形式Ａ１ｉで存在し得、ここで、文字は、試料の種類を示し、アラビア数字は、試料内の分子の形態を示し、ローマ数字は、形態内の分子を示す。
【００６５】
「アダプター」という用語は、通常、試料核酸分子のいずれかの末端または両方の末端への連結のために、少なくとも部分的に二本鎖になっている、短い核酸（例えば、５００未満、１００未満、または５０未満のヌクレオチド長）を指す。アダプターは、両方の末端においてアダプターが隣接した核酸分子の増幅を可能にするプライマー結合部位、および／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のためのプライマー結合部位を含むシーケンシングプライマー結合部位を含み得る。アダプターはまた、捕捉用プローブ、例えば、フローセル支持体に結合したオリゴヌクレオチドの結合部位も含み得る。アダプターはまた、上述のようなタグも含み得る。タグがアンプリコンおよび核酸分子のシーケンシングリードに含まれるように、タグは、好ましくは、プライマーおよびシーケンシングプライマー結合部位に対して位置付けられる。同じかまたは異なるヌクレオチド配列を有するアダプターが、核酸分子のそれぞれの末端に連結され得る。同じ配列のアダプターが、それぞれの末端に連結されることがあるが、ただし、タグは異なる。好ましいアダプターは、Ｙ字型アダプターであり、その場合、一方の末端が、平滑末端であるかまたは本明細書に記載されるように核酸分子への結合のための尾部があり、この核酸分子もまた、平滑末端であるかまたは１つもしくは複数の相補的ヌクレオチドを有する尾部がある。別の好ましいアダプターは、釣鐘型アダプターであり、同様に、平滑末端または分析しようとする核酸への結合のための尾部を有する末端を有する。他の例示的なアダプターには、Ｔ尾部およびＣ尾部アダプターが含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「シーケンシング」または「シーケンサー」は、生体分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子の配列を決定するために使用されるいくつかの技術のうちのいずれかを指す。例示的なシーケンシング方法として、これらに限定されないが、ターゲットシーケンシング、単分子リアルタイムシーケンシング、エクソンシーケンシング、電子顕微鏡に基づくシーケンシング、パネルシーケンシング、トランジスター媒介型シーケンシング、直接シーケンシング、ランダムショットガンシーケンシング、サンガーのジデオキシ末端シーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、パイロシーケンシング、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、デュプレックスシーケンシング、サイクルシーケンシング、一塩基伸長シーケンシング、固相シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、超並列署名シーケンシング、エマルジョンＰＣＲ、低変性温度における共増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、可逆的色素ターミネーターによるシーケンシング、ペアドエンドシーケンシング、短期シーケンシング、エクソヌクレアーゼシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、短リードシーケンシング、単分子シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス、リアルタイムシーケンシング、リバースターミネーターシーケンシング、ナノポアシーケンシング、４５４シーケンシング、Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザーシーケンシング、ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシング、ＭＳ−ＰＥＴシーケンシング、およびこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、シーケンシングは、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている遺伝子アナライザーなどの遺伝子アナライザーにより実施することができる。
【００６７】
表現「次世代シーケンシング」またはＮＧＳは、従来のサンガーおよびキャピラリー電気泳動に基づく手法と比較してスループットが増加したシーケンシング技術を指し、例えば、一度に数十万もの比較的小さな配列リードを作成する能力を有する。次世代シーケンシング技法のいくつかの例として、これらに限定されないが、シーケンシングバイシンセシス、シーケンシングバイライゲーション、およびシーケンシングバイハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００６８】
「ＤＮＡ」（デオキシリボ核酸）という用語は、それぞれが４つの核酸塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、またはグアニン（Ｇ）のうちの１つを含む、デオキシリボヌクレオシドを含む、ヌクレオチドの鎖を指す。「ＲＮＡ（リボ核酸）」という用語は、それぞれが４つの核酸塩基、すなわち、Ａ、ウラシル（Ｕ）、Ｇ、またはＣのうちの１つを含む、４つの種類のリボヌクレオシドを含む、ヌクレオチドの鎖を指す。ある特定のヌクレオチド対は、相補的様式で互いに特異的に結合する（相補的塩基対合と称される）。ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。第１の核酸鎖が、第１の鎖におけるヌクレオチドと相補的であるヌクレオチドから構成される第２の核酸鎖に結合する場合、２つの鎖は結合して二本鎖を形成する。本明細書で使用される場合、「核酸シーケンシングデータ」、「核酸シーケンシング情報」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ゲノム配列」、「遺伝子配列」、「配列リード」または「断片配列」、または「核酸シーケンシングリード」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子（例えば、全ゲノム、全トランスクリプトーム、エキソーム、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または断片）におけるヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンまたはウラシル）の順序を表示する任意の情報またはデータを示す。本発明の教示によって、これらに限定されないが、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ、ライゲーションに基づくシステム、ポリメラーゼに基づくシステム、ハイブリダイゼーションに基づくシステム、直接的または間接的なヌクレオチド同定システム、パイロシーケンシング、イオンまたはｐＨベース検出システム、および電子署名ベースのシステムを含む技法、プラットフォームまたは技術のすべての利用可能な変形を使用して得られた配列情報が考慮されることが理解されるべきである。
【００６９】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の連結によって接合されたヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはその類似体を含む）の線状ポリマーを指す。典型的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドのサイズは、少数のモノマー単位、例えば、３〜４から数百のモノマー単位の範囲である場合が多い。ポリヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字配列で表される場合は常に、ヌクレオチドは、別段に注記されていなければ、左から右への５’から３’の順であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことが理解されよう。当技術分野の標準であるように、塩基自体、塩基を含むヌクレオシド、またはヌクレオチドを指すために、文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを使用することができる。
【００７０】
「参照配列」という語句は、実験的に決定された配列と比較するために使用される公知の配列を指す。例えば、公知の配列は、ゲノム全体、染色体、遺伝子、治療用核酸構築物、またはその任意のセグメントであり得る。参照は、典型的には、少なくとも２０、５０、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１０００、またはそれより多いヌクレオチドを含む。参照配列は、ゲノムもしくは染色体の単一の連続配列とアライメントし得るか、またはゲノムもしくは染色体の異なる領域とアライメントする非連続的セグメントを含み得る。一部の実施形態では、参照配列は、ヒトゲノムである。参照ヒトゲノムとして、例えば、ｈＧ１９およびｈＧ３８が挙げられる。一部の実施形態では、参照配列は、公知または部分的に公知の配列であり、それに対して、治療用核酸構築物の少なくとも一部分がアライメントする。これには、一部の事例では、ヒトゲノムにアライメントする配列を含む、治療用核酸構築物の一部分が含まれ得る。他の事例では、これには、ヒトゲノムの配列以外の公知または部分的に公知の配列にアライメントする配列を含む、治療用核酸構築物の一部分が含まれ得る（例えば、プロモーター配列の一部分を含む参照配列にアライメントするベクターのプロモーター配列）。一部の実施形態では、１つを上回る参照配列が、治療用核酸構築物を検出するために使用される。
【００７１】
「遺伝子療法」という語句は、いくつかがペプチドまたはタンパク質をコードし得る核酸を含む治療用核酸構築物による、対象の身体または対象の身体の単離された要素、例えば、単離された組織／細胞の処置を指す。これは、典型的に、ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでの対象の細胞のトランスフェクションをもたらす、治療用核酸構築物の、あらゆる投与経路（本明細書において考察される）による患者への直接的な投与または対象の単離された細胞／組織へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの投与のステップ、ｂ）導入された治療用核酸構築物の転写および／または翻訳のステップ、ならびに必要に応じてｃ）治療用核酸構築物が対象に直接的に投与されなかった場合には、単離されたトランスフェクト細胞の対象への再投与のステップのうちの少なくとも１つを含み得る。
【００７２】
「治療用核酸構築物」という語句は、疾患、障害、または状態を処置するために使用される、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／または改変もしくは類似体のヌクレオチドを含む、ポリマーを指す。治療用核酸構築物において使用される改変または類似体のヌクレオチドには、典型的に、改変された塩基、改変された糖、および／または改変されたリン酸部分が含まれる。改変または類似体のヌクレオチドの一部の例としては、メチルホスホン酸、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、キラル−メチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）などが挙げられる。例示的な治療用核酸構築物としては、プラスミド、アプタマー、ＤＮＡザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ウイルスベクター、アンチジーンオリゴヌクレオチド、アプタマー、ＲＮＡデコイ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡなどが挙げられる。一部の実施形態では、治療用核酸構築物は、対象への投与のために、細胞、リポソームまたは他の脂質含有粒子、ウイルスベクターなどに封入される。
【００７３】
本明細書で使用される「生物学的試料」という語句は、一般に、対象に由来する組織または流体試料を指す。生物学的試料は、対象から直接的に得ることができる。生物学的試料は、１つまたは複数の核酸分子、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得るか、またはそれを含み得る。生物学的試料は、任意の器官、組織、または生物学的流体に由来し得る。生物学的試料は、例えば、体液または固体組織試料を含み得る。固体組織試料の例は、例えば、固形腫瘍生検に由来する腫瘍試料である。体液としては、例えば、血液、血清、血漿、腫瘍細胞、唾液、尿、リンパ液、前立腺液、精液、乳、喀痰、糞便、涙液、およびこれらの誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、生物学的試料は、血液であるか、または血液に由来する。
【００７４】
「ＴＰ５３遺伝子」という語句は、細胞周期を制御し、腫瘍抑制に関与する、タンパク質（ＥＣ：２．７．１．３７）をコードする遺伝子を指す。ヒトｐ５３遺伝子は、第１７染色体（１７ｐ１３．１）に位置している。
【００７５】
核酸配列のアライメントの文脈における「実質的にアライメントする」という語句は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の少なくとも部分配列との少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらには１００％の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、例えば、所与の配列リードは、所与の配列リードが、参照配列の少なくとも部分配列もしくは領域、またはその全体との、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する場合に、参照配列と実質的にアライメントする。
【００７６】
治療用核酸構築物の文脈における「鑑別参照配列情報」という語句は、所与の治療用核酸構築物を、所与の対象に由来する所与の生物学的試料において観察される他の核酸配列と識別または区別する、その所与の治療用核酸構築物の１つまたは複数の配列領域を意味する。ある特定の実施形態では、鑑別参照配列情報は、ヒトゲノムに対して類似性を有さない治療用核酸構築物の配列を含み得る（本明細書において、「外来配列」または「外因性核酸分子」と称されることもある）。ある特定の実施形態では、鑑別参照配列情報は、ヒトゲノムに対して部分的な類似性を有する治療用核酸構築物の配列を含み得る（例えば、イントロンが欠失したヒト遺伝子配列のセグメント）。
【００７７】
治療剤（例えば、治療用核酸構築物）の文脈における「投与する」という語句は、その薬剤を、対象に与えること、対象に適用すること、または対象と接触させることを意味する。投与は、例えば、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内、および皮内を含む、いくつかの経路のうちのいずれかによって達成することができる。
【００７８】
目的の、１つまたは複数の値または要素に適用される「約」または「およそ」という語句は、言及された参照値または要素に類似である値または要素を指す。ある特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、別途示されない限りまたは文脈から明らかでない限り、言及された参照値または要素のいずれかの方向で（より大きいかまたは小さい）、２５％以内、２０％以内、１９％以内、１８％以内、１７％以内、１６％以内、１５％以内、１４％以内、１３％以内、１２％以内、１１％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれよりも小さい範囲に入る値または要素の範囲を指す（ただし、そのような数が可能な値または要素の１００％を超える場合を除く）。
【００７９】
詳細な説明
Ｉ．概要
近年の米国食品医薬品局による新しい遺伝子療法の承認は、遺伝子薬の分野における転機である。多くの他の遺伝子療法が臨床試験中であるため、これらの処置において使用される治療用核酸構築物を検出およびモニタリングする能力は、今後、安全性および有効性の目的で重要であろう。したがって、本明細書に開示される方法、システム、および組成物は、患者に由来する無細胞核酸を含む試料中の治療用核酸構築物を検出し、これらの構築物の有効性をモニタリングするための非侵襲的な手段を提供する。
【００８０】
治療用核酸構築物は、疾患、障害、または状態を処置するために使用される、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／または改変もしくは類似体のヌクレオチドを含む、ポリマーである。構築物の組成は、それが設計される治療法の種類に応じて変動し得る。例えば、構築物は、ＤＮＡに基づく治療法において使用することができ、したがって、構築物としては、ＤＮＡアプタマー、プラスミド、ウイルスベクター、ＤＮＡザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびアンチジーンオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。他の事例では、構築物は、ＲＮＡに基づく治療法において使用することができ、構築物としては、ＲＮＡアプタマー、ＲＮＡデコイ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、または環状ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。治療用核酸構築物が、対象のゲノムの少なくとも一部分と区別することができない配列からなり得る一部の実施形態（例えば、ある特定のアンチセンスＲＮＡ構築物などを含む、ある特定のアンチセンス構築物の場合など）では、本開示の方法による構築物の検出は、ある特定の実施形態において、それらの配列にマッピングされるかまたはそれと実質的にアライメントする所与の試料において観察される配列リードの過剰出現（例えば、非典型的な存在度）によって行われる。
【００８１】
治療用核酸構築物は、生殖細胞または体細胞療法を含む、遺伝子療法において使用することができる。一部の事例では、治療法は、ウイルス療法、例えば、Ｉｍｌｙｇｉｃ（商標）またはＬｕｘｔｕｒｎａを含み得る。一部の事例では、治療法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ホルミビルセン（ｆｏｒｍｉｖｉｒｓｅｎ）、ミポメルセン、エテプリルセン、ヌシネルセン、アイカホルセン（ａｉｃａｆｏｒｓｅｎ）、アガニルセンなどを含み得る。一部の事例では、治療法は、アプタマー、例えば、ペガプタニブまたはペグプレラニブを含み得る。一部の事例では、治療法は、ｓｉＲＮＡ、例えば、パチシランおよびＱＰＩ−１００２を含み得る。
【００８２】
一部の事例では、治療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、例えば、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）またはＹｅｓｃａｒｔａ（商標）を含み得る。ある特定の実施形態では、治療用核酸構築物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療プロセスの一部として使用されるベクター（例えば、ガンマレトロウイルス（ＲＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）、または他の好適なベクター）の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、治療用核酸構築物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ療法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体）などの遺伝子編集療法の一部であり得る。
【００８３】
治療用核酸は、当該技術分野において公知の任意の様式において対象に投与され得る。そのような方法としては、ウイルス送達（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、偽型ウイルスなど）または非ウイルス送達（例えば、注射、エレクトロポレーション、ソノポレーション、マグネトフェクション、ナノ粒子、リポプレックス、点眼など）が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、任意の公知の経路、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｓｉｔｕ送達によって生じてもよい。
【００８４】
治療用核酸構築物の代表的な非限定的な例が、図１に示される。この図を参照すると、構築物は、複製起点配列（ｐＭＢ１  ｏｒｉおよびＳＶ４０  ｏｒｉ）、ＳＶ４０プロモーター、Ｔｎ５ネオマイシン耐性配列、ＨＳＶ−ＴＫポリＡ終止配列、ヒトアデノウイルスに由来する配列、ＣＭＶプロモーター配列、ＴＰ５３  ｃＤＮＡまたは遺伝子配列、およびＳＶ４０ポリＡ終止配列を含む、６００３ｂｐの環状リポソーム封入ＴＰ５３発現ベクターである。図１における内側の円グラフは、構築物の異なる構成要素のシーケンシングカバレッジを示す。
【００８５】
本方法、システム、および組成物は、無細胞核酸分子の分析に特に有用であり得る。一部の事例では、無細胞核酸分子は、対象に由来する生物学的試料から抽出および単離することができる。生物学的試料としては、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜抽出物、喀痰、糞便、および涙液を含むがこれらに限定されない群から選択される、体液試料を挙げることができる。無細胞核酸分子は、イソプロパノール沈降および／またはシリカに基づく精製を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の様々な方法を使用して抽出することができる。
【００８６】
生物学的試料は、いくつかの対象、例えば、疾患を有さない対象、疾患、例えば、がんもしくはウイルス感染の危険性にあるか、その症状を示すか、もしくはそれを有する対象、または遺伝子障害の危険性にあるか、その症状を示すか、もしくはそれを有する対象から採取され得る。一部の実施形態では、疾患または障害は、免疫不全障害、血友病、サラセミア、鎌状細胞疾患、血液疾患、慢性肉芽腫性障害、先天性盲目、リソソーム蓄積症、筋ジストロフィー、がん、神経変性疾患、ウイルス感染、細菌感染、表皮水疱症、心疾患、脂質代謝障害、および糖尿病、またはこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、疾患は、がんである。
【００８７】
無細胞核酸分子を得た後、シーケンシングのための核酸分子を調製するためのいくつかの異なるライブラリー調製手順のうちのいずれかを、無細胞核酸分子に実施することができる。無細胞核酸分子は、シーケンシングの前に、１つまたは複数の試薬（例えば、酵素、アダプター、タグ（例えば、バーコード）、プローブなど）で処理されてもよい。タグ付けされた分子を、次いで、下流の適用、例えば、個々の分子を追跡することができるシーケンシング反応において使用してもよい。
【００８８】
一部の実施形態では、本方法は、シーケンシングの前に、タグ付けされた分子の領域が選択的または非選択的に濃縮される、濃縮ステップをさらに含んでもよい。これらの配列は、本明細書において「標的配列」または「標的化配列」と称される。標的配列は、本方法を実行する前に、判明していてもよく、部分的に判明していてもよく、または不明であってもよい。一部の実施形態では、標的配列は、参照配列の少なくとも一部分にマッピング可能な（例えば、それと実質的にアライメントする）配列を含む。一部の事例では、標的配列は、対象のゲノムまたはトランスクリプトームに由来する領域を含み得る。他の事例では、標的配列は、対象のゲノムまたはトランスクリプトームに由来する領域以外の配列を含む、治療用核酸構築物に由来する領域を含み得る。一部の事例では、標的配列は、ＴＰ５３、ＨＢＢ、ＲＰＥ６５、およびＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子遺伝子、ＤＭＤ、ＵＬ１２３、ＡＰＯＢ、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＩＣＡＭ−１、ＴＬＲ９、ＩＲＳ−１、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ、ならびにＴＴＲを含むがこれらに限定されない、遺伝子の部分またはそのバリアントを含み得る。一部の事例では、標的配列は、遺伝子またはそのバリアント、例えば、前述の遺伝子によってコードされるタンパク質を阻害または遮断するように設計される構築物の配列を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子またはＣＡＲ−Ｔ細胞プロセスにおいて使用されるベクターの配列が、標的配列を構成し得る。図１に戻って参照すると、標的配列の例は、ベクター内のＴＰ５３  ｃＤＮＡまたは遺伝子配列である。
【００８９】
無細胞核酸分子のシーケンシングデータが収集されると、１つまたは複数のバイオインフォマティクスプロセスを、配列データに適用して、治療用核酸構築物またはその断片の存在または不在を検出することができる。そのようなプロセスは、所与の配列の増幅カバレッジを定量すること、すべての配列リードの中である特定の配列の過剰出現もしくは増幅を判定すること、マッピングされる配列の近傍におけるマッピングされない配列を識別すること、マッピングされるリード内のイントロン欠失を検出すること、マッピングされないリードの起源を確認すること、マッピングされないリードの高信頼性コンティグをアセンブルすること、および配列リードのサイズ分布を分析すること、またはこれらの方法の任意の組合せを含み得るが、これらに限定されない。一部の事例では、シーケンシング反応により生成された配列リードは、バイオインフォマティクス分析を実行するために、参照配列にアライメントすることができる。一部の事例では、リードは、核酸構築物の完全なまたは部分的な配列にアライメントすることができる。バイオインフォマティクス分析の様々な態様では、１つまたは複数の閾値は、品質を確保するように設定され得る。例えば、アライメント閾値は、高度に類似する配列リード（例えば、参照配列と配列リードとの間のミスマッチが１０個またはそれよりも少ない）だけが、参照配列にマッピングされるように、設定され得る。一部の事例では、例えば、配列リードのクロマトグラムに基づいて、品質閾値を通過できない配列リードは、除去され得る。一部の事例では、所与の配列のコピー数または量は、所与の配列にマッピングまたはアライメントする配列リードの数に基づいて、定量され得る。一部の事例では、配列の過剰出現は、すべての配列リード間で異なる配列のコピー数または量を比較することによって判定され得る。一部の事例では、アライメントのために設定された閾値に基づいて、マッピングされない配列リードを、さらに分析してもよい。一部の事例では、配列リードの一部分が、参照配列にマッピングする。これらのリードについては、配列リードのマッピングされない部分を、分析してもよい。一部の事例では、参照ゲノム上にマッピングされる配列リードの座標を、判定してもよい。例えば、参照配列の染色体上の位置を、判定することができる。一部の事例では、マッピングされない配列リードのコンセンサス配列は、高信頼性コンティグをアセンブルすることによって（例えば、マッピングされないリードの鎖の両方の配列リードをアセンブルすることによって）判定することができる。一部の事例では、マッピングされない配列リードのサイズ分布は、マッピングされる配列リードのサイズ分布と比較され得る。一部の事例では、マッピングされない配列リードのサイズ分布は、単峰型であり得る。一部の事例では、マッピングされる配列リードのサイズ分布は、二峰型であり得る。ある特定の実施形態では、治療用核酸起源のものである無細胞核酸分子の配列リードのサイズ分布は、単峰型であり得る。ある特定の実施形態では、細胞起源のものである無細胞核酸分子の配列リードのサイズ分布は、二峰型であり得る。一部の事例では、１つを上回る種類のバイオインフォマティクス分析を使用して、治療用核酸構築物の存在または不在を検出してもよい。
【００９０】
ある特定の実施形態では、治療用核酸構築物のヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法を実行する前に、判明していてもよく、部分的に判明していてもよく、または不明であってもよい。ある特定の実施形態では、治療用核酸構築物は、その配列の一部が、参照配列と共通していてもよい。参照配列は、一部の実施形態では、ヒトゲノムの配列であり得る。代替的または追加の参照配列は、治療用核酸構築物の公知のセグメントの配列であってもよい。ある特定の実施形態では、追加または代替的な参照配列は、ヒトゲノムと共通している（例えば、それと実質的にアライメントする）配列を除外し得る。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を実装する前に判明しているか、部分的に判明しているか、または不明である、治療用核酸構築物の配列に応じて、適切な参照配列が、配列リードのマッピングに使用され得る。具体的には、試料中の治療用核酸構築物を区別することができる参照配列（すなわち、鑑別参照配列情報）が、他の核酸配列よりも、選択され得る。例えば、発現ベクターに関して、ベクターを患者に投与する前に、ベクターの配列の一部分、例えば、プロモーター領域が、判明していてもよい。ベクターのプロモーター領域の配列を含むことが判明している参照配列は、プロモーター領域から得られた配列リードを、参照配列にマッピングし、それによって、ベクターの存在または不在を検出するために使用することができる。
【００９１】
ある特定の実施形態では、ヒトゲノムを起源とする第１の参照配列とアライメントしないシーケンシングリードが、識別される。これらの非アライメント配列リードを、次いで、治療用核酸構築物を起源とする第２の参照配列にマッピングして、治療用核酸構築物の存在を検出することができる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、配列リードは、治療用核酸構築物を起源とする第２の参照配列の識別部分にマッピングする（例えば、それと実質的にアライメントする）配列を含み得る。次いで、これらの配列は、対象を起源とする配列（例えば、標的化体細胞変異を含む断片）の検出の感度を改善するために、フィルタリングにより除去され得る。
【００９３】
ある特定の実施形態では、核酸構築物と共通する参照配列の部分にアライメントまたはマッピングする配列リードの数を、定量してもよい。この定量値に基づいて、この値を予測閾値と比較することによって、目的の配列のカバレッジの増加を判定することができる。閾値を上回る値は、配列のカバレッジの増加を表し得る。この方法の例は、図２に示されており、ここで、カバレッジの増加（５を上回る）は、第１７染色体上のＴＰ５３遺伝子（破線の円）について、ベースライン（約２）と比較して測定された。したがって、過剰出現値は、試料中に治療用核酸構築物が存在することを示す。
【００９４】
他の実施形態では、それぞれの配列リードの一部分だけが、参照配列にアライメントまたはマッピングし得る。一部の事例では、配列リードは、参照配列のエクソンのみにアライメントまたはマッピングし得るが、イントロンにはアライメントまたはマッピングしない場合がある。これは、典型的に、図１のＴＰ５３遺伝子配列など、エクソンの配列またはｃＤＮＡ配列を含む構築物の場合に生じる。イントロン欠失の検出の例は、図３に提供されており、ここで、配列リードは、参照配列にマッピングされる。確認することができるように、配列リードの一部分は、参照配列のイントロン配列にはアライメントしない。代わりに、欠失したイントロンの片側に隣接するエクソン配列が、欠失したイントロンの反対側に隣接するエクソン配列の一部となっている。したがって、イントロン欠失の検出は、試料中に治療用核酸構築物が存在することを示し得る。
【００９５】
他の事例では、それぞれの配列リードの一部分のみが、参照配列にアライメントまたはマッピングし得る場所は、配列リードが、マッピングされる配列とマッピングされない配列との間のジャンクション（例えば、ブレイクポイント）とオーバーラップする場所である。一般的なジャンクションは、例えば、遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）または一般的な制限酵素によって標的化される位置において見出され得る。図４Ａおよび図４Ｂは、酵素制限部位（Ｘｂａ１）に隣接する外来の（マッピングされない）配列が、マッピングされる配列リードＴＰ５３エクソン１（図４Ａ）およびＴＰ５３エクソン１１（図４Ｂ）の近傍に見出された、マッピング図を示す。したがって、マッピングされない配列リードのマッピングされる配列リードに対する位置および近傍性を、治療用核酸構築物の存在を判定するために使用することができる。
【００９６】
ある特定の実施形態では、配列リードのうちのいくつかは、参照配列にアライメントもマッピングもしない場合がある。マッピングされないリードは、その起源を判定するために、さらに調査してもよい。そのような方法には、例えば、ＢＬＡＳＴ検索を実施することが含まれ得る。検索により得られた結果は、マッピングされないリードが、治療用核酸構築物において使用される配列に関連することを示し得る。マッピングされないリードは、非ゲノム配列であり得る。例えば、マッピングされない配列リードが、治療用核酸構築物において使用される複製起点配列（例えば、ＳＶ４０  ｏｒｉ）に関連することが、判定され得る。マッピングされない配列リードを使用するためのさらなる方法には、例えば、連続的なマッピングされないリードのアセンブリを形成することが含まれ得る。ある特定の数のマッピングされないリードのアセンブリは、治療用核酸構築物の存在を示すのに十分な品質／高い信頼性のものであり得る。
【００９７】
さらなる実施形態では、配列リードのサイズ分布が判定され、無細胞核酸の予測サイズ分布と比較され得る。予測サイズ分布からの逸脱は、治療用核酸構築物の存在を示し得る。そのような逸脱の例は、図５に示されており、ここでは、ＴＰ５３ベクターが、細胞起源のｃｆＤＮＡの配列リード（実線）の様々なサイズ分布を、生物学的試料中の無細胞核酸分子の一部として見出されたＴＰ５３プラスミド配列リード（破線）に対して比較することによって、検出される。この分析は、マッピングありまたはなしで実施することができる。
【００９８】
ある特定の態様では、本開示はまた、対象に投与するための組成物であって、公知の配列を有するポリヌクレオチド（例えば、対照核酸など）および治療用核酸構築物を含む組成物を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、公知の配列は、合成配列である。一部の実施形態では、公知の配列は、対象の参照配列にアライメントしない配列である。一部の実施形態では、公知の配列は、治療用核酸構築物にアライメントしない配列である。
【００９９】
一部の実施形態では、公知の配列を有するポリヌクレオチド（例えば、対照核酸など）は、治療用組成物の品質を評価するために使用することができる。例えば、特定の濃度で公知の配列を有するポリヌクレオチドを、治療用組成物中の治療用核酸構築物に比例する量で、添加してもよい。公知の配列を有するポリヌクレオチドを、シーケンシングし、公知の配列を有するポリヌクレオチドの量を使用して、保管条件、試薬、試料緩衝液など、異なる条件下における組成物の安定性を、例えば、時間の関数として、判定することができる。別の例では、異なる調製物中の公知の配列を有するポリヌクレオチドの量は、ロットごとの変動性を評価するために判定することができ、したがって、調製物間での治療用核酸構築物の濃度における違いを推測することができる。
【０１００】
一部の実施形態では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、組成物を対象に投与した場合に、治療用核酸構築物の濃度を正確に判定するために使用することができる。例えば、特定の濃度で公知の配列を有するポリヌクレオチドを、治療用組成物中の治療用核酸構築物に比例する量で、添加してもよい。公知の配列を有するポリヌクレオチドの量が判明しているため、これを使用して、治療用核酸構築物をシーケンシングすることなく、対象における治療用核酸構築物の量を判定することができる。別の例では、公知の配列を有するポリヌクレオチドの量は、治療用核酸構築物の量を正規化するために使用することができる。これは、異なる時点または異なる個体間で、治療用核酸構築物の量を比較する場合に有用である。これは、処置の有効性を評価する場合に有用であり得る。例えば、異なるコホート間での異なる治療用核酸構築物の量を、公知の配列を使用して正確に判定することができる。次いで、処置の有効性を、公知の配列を有するポリヌクレオチドおよび／または治療用核酸構築物の量を、異なる処置レジメンを受けたコホート間で比較することによって、判定することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、公知の配列は、治療用核酸構築物または無細胞核酸分子から得られたシーケンシングリードの不在の原因を判定するのに有用であり得る。例えば、公知の配列に由来する配列リードの存在により、シーケンサーが機能していることを確認することができる。逆に、公知の配列に由来する配列リードの不在は、シーケンシングエラーを示し得る。
【０１０２】
一部の実施形態では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、少なくとも約１ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１０００ｎｔであり得る。一部の事例では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、約１０ｎｔ〜約８００ｎｔであり得る。一部の事例では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、約２０ｎｔ〜約６００ｎｔであり得る。一部の事例では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、約３０ｎｔ〜約４００ｎｔであり得る。一部の事例では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、約４０ｎｔ〜約３００ｎｔであり得る。一部の事例では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、約５０ｎｔ〜約２００ｎｔのヌクレオチドであり得る。一部の事例では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、約６０ｎｔ〜約１００ｎｔであり得る。一部の事例では、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、およそで無細胞核酸の平均の長さの長さである。例えば、公知の配列を有するポリヌクレオチドは、約２００ｎｔであり得る。
【０１０３】
本開示はさらに、本明細書に開示される方法ステップが、必要に応じて、本明細書に開示されるシステムおよび／またはコンピューター可読媒体を使用して、性能に関して適合されることを提供する。ある特定の態様では、システムは、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、本明細書に記載される方法のうちの少なくとも１つを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む、コンピューター可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含み得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、配列リードは、シーケンサー、例えば、ＤＮＡシーケンサーによって生成される。一部の実施形態では、シーケンサーは、高スループットシーケンシング、例えば、次世代シーケンシングを実施するように設計される。一部の実施形態では、システムは、シーケンサーに、アダプターがタグ付けされた無細胞核酸分子を含む。一部の実施形態では、アダプターがタグ付けされた無細胞核酸分子は、１つの対象または複数の対象から得られる。一部の実施形態では、試料に由来する無細胞核酸分子は、固有または非固有のバーコードを有する。
【０１０５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法およびシステムは、デジタル処理デバイスを利用する。さらなる実施形態では、デジタル処理デバイスは、デバイスの機能を実行する１つまたは複数のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）または汎用グラフィック処理装置（ＧＰＧＰＵ）を含む。なおもさらなる実施形態では、デジタル処理デバイスは、実行可能な命令を実施するように構成されるオペレーティングシステムをさらに含む。一部の実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、コンピューターネットワークに接続されている。さらなる実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、ワールドワイドウェブにアクセスするように、インターネットに接続されている。なおもさらなる実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、クラウドコンピューティングインフラストラクチャに接続されている。他の実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、イントラネットに接続されている。他の実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、データ保存デバイスに接続されている。本明細書の説明によると、好適なデジタル処理デバイスとしては、非限定的な例として、サーバーコンピューター、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、ノートブックコンピューター、ハンドヘルドコンピューター、インターネット機器、モバイルスマートフォン、およびタブレットコンピューターが挙げられる。
【０１０６】
一部の実施形態では、デジタル処理デバイスは、実行可能な命令を実施するように構成されるオペレーティングシステムを含む。オペレーティングシステムは、例えば、デバイスのハードウェアを管理し、アプリケーションの実行のためのサービスを提供する、プログラムおよびデータを含む、ソフトウェアである。当業者であれば、好適なサーバーオペレーティングシステムとしては、非限定的な例として、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ  Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｅｌｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）が挙げられることを認識するであろう。当業者であれば、好適なパーソナルコンピューターオペレーティングシステムとしては、非限定的な例として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、およびＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）などのＵＮＩＸ（登録商標）様オペレーティングシステムが挙げられることを認識するであろう。一部の実施形態では、オペレーティングシステムは、分散型コンピューティング、例えば、クラウドコンピューティングによって提供される。当業者であれば、好適なモバイルスマートフォンオペレーティングシステムとしては、非限定的な例として、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎ  Ｍｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  Ｐｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  Ｍｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、およびＰａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）が挙げられることを認識するであろう。
【０１０７】
一部の実施形態では、デバイスには、保存および／またはメモリーデバイスが含まれる。保存および／またはメモリーデバイスは、データまたはプログラムを、一時的または恒久的に保存するために使用される１つまたは複数の物理的装置である。一部の実施形態では、デバイスは、揮発性メモリーであり、保存された情報を維持するために電力を必要とする。一部の実施形態では、デバイスは、不揮発性メモリーであり、デジタル処理デバイスが電力供給を受けていない場合にも保存された情報を保持する。さらなる実施形態では、不揮発性メモリーは、フラッシュメモリーを含む。一部の実施形態では、不揮発性メモリーは、動的ランダムアクセスメモリー（ＤＲＡＭ）を含む。一部の実施形態では、不揮発性メモリーは、強誘電体ランダムアクセスメモリー（ＦＲＡＭ（登録商標））を含む。一部の実施形態では、不揮発性メモリーは、相変化ランダムアクセスメモリー（ＰＲＡＭ）を含む。他の実施形態では、デバイスは、保存デバイスであり、これには、非限定的な例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリーデバイス、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光学ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングに基づくストレージが含まれる。さらなる実施形態では、保存および／またはメモリーデバイスは、本明細書に開示されるものなど、デバイスの組合せである。
【０１０８】
一部の実施形態では、デジタル処理デバイスには、視覚的情報をユーザーに送信するための電子ディスプレイが含まれる。一部の実施形態では、ディスプレイは、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。さらなる実施形態では、ディスプレイは、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ−ＬＣＤ）である。一部の実施形態では、ディスプレイは、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。様々なさらなる実施形態では、ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブマトリックスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブマトリックスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）ディスプレイである。一部の実施形態では、ディスプレイは、プラズマディスプレイである。他の実施形態では、ディスプレイは、ビデオプロジェクターである。なおも他の実施形態では、ディスプレイは、デジタル処理デバイスと通信する頭部装着型ディスプレイ、例えば、ＶＲヘッドセットである。さらなる実施形態では、好適なＶＲヘッドセットとしては、非限定的な例として、ＨＴＣ  Ｖｉｖｅ、Ｏｃｕｌｕｓ  Ｒｉｆｔ、Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｇｅａｒ  ＶＲ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＨｏｌｏＬｅｎｓ、Ｒａｚｅｒ  ＯＳＶＲ、ＦＯＶＥ  ＶＲ、Ｚｅｉｓｓ  ＶＲ  Ｏｎｅ、Ａｖｅｇａｎｔ  Ｇｌｙｐｈ、Ｆｒｅｅｆｌｙ  ＶＲ  ｈｅａｄｓｅｔなどが挙げられる。なおもさらなる実施形態では、ディスプレイは、本明細書に開示されるものなど、デバイスの組合せである。
【０１０９】
一部の実施形態では、デジタル処理デバイスは、ユーザーから情報を受容するための入力デバイスを含む。一部の実施形態では、入力デバイスは、キーボードである。一部の実施形態では、入力デバイスは、非限定的な例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラー、またはスタイラスを含む、ポインティングデバイスである。一部の実施形態では、入力デバイスは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである。他の実施形態では、入力デバイスは、音声または他の音による入力を捕捉するためのマイクである。他の実施形態では、入力デバイスは、動きまたは視覚的入力を捕捉するためのビデオカメラまたは他のセンサである。さらなる実施形態では、入力デバイスは、Ｋｉｎｅｃｔ、Ｌｅａｐ  Ｍｏｔｉｏｎなどである。なおもさらなる実施形態では、入力デバイスは、本明細書に開示されるものなど、デバイスの組合せである。
【０１１０】
さらに例示するために、図６は、少なくとも本出願において開示される方法の態様の実装で使用するのに好適な例示的なシステムの概略図を提供する。示されるように、システム６００は、プロセッサー６０４およびメモリー、保存デバイス、またはメモリーコンポーネント６０６を含む、少なくとも１つのコントローラーまたはコンピューター、例えば、サーバー６０２（例えば、検索エンジンサーバー）と、リモートサーバー６０２から離れて位置付けられ、電子通信ネットワーク６１２、例えば、インターネットまたは他のインターネットワークを通じてそれと通信する、１つまたは複数の他の通信デバイス６１４および６１６（例えば、クライアントサイドコンピューター端末、電話、タブレット、ラップトップ、他のモバイルデバイスなど）とを含む。通信デバイス６１４および６１６は、典型的に、ネットワーク６１２上で、例えば、サーバー６０２コンピューターと通信する、電子ディスプレイ（例えば、インターネット対応コンピューターなど）を含み、ここで、電子ディスプレイは、本明細書に記載される方法を実装したときに、結果を表示するためのユーザーインターフェース（例えば、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）、ウェブベースユーザーインターフェースなど）を含む。ある特定の実施形態では、通信ネットワークは、例えば、ハードドライブ、サムドライブ、または他のデータ保存機構を使用した、１つの位置から別の位置へのデータの物理的輸送も包含する。システム６００はまた、例えば、１つまたは複数の他の通信デバイス、例えば、６１４（デスクトップまたはパーソナルコンピューターとして概略的に示される）および６１６（タブレットコンピューターとして概略的に示される）による誘導検索アプリケーションまたは他の実行可能なアプリケーションを容易にするために、サーバー６０２によって可読である、コンピューターまたはマシン可読媒体、例えば、例として、様々な種類のメモリーのうちの１つまたは複数、例えば、サーバー６０２のメモリー６０６に保存された、プログラム製品６０８も含む。一部の実施形態では、システム６００は、必要に応じて、直接的または検索エンジンサーバー６０２を通じてのいずれかで検索可能なデータが保存された（例えば、参照配列情報など）、少なくとも１つのデータベースサーバー、例えば、例として、オンラインウェブサイトと関連付けられたサーバー６１０も含む。システム６００は、必要に応じてサーバー６０２から遠隔に位置付けられた１つまたは複数の他のサーバーも含み、そのそれぞれが、必要に応じて、他のサーバーのそれぞれに対して遠隔に位置するかまたはローカルに位置する１つまたは複数のデータベースサーバー６１０と関連付けられている。他のサーバーは、有益なことに、地理的にリモートであるユーザーにサービスを提供するか、または地理的に分散したオペレーションを強化することができる。
【０１１１】
当業者には理解されるように、サーバー６０２のメモリー６０６は、必要に応じて、とりわけ、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、および磁気または光学ディスクを含む、揮発性および／または不揮発性メモリーを含む。また、単一のサーバーとして例示されているが、例示されたサーバー６０２の構成は、例として提供されるに過ぎず、様々な他の手法またはアーキテクチャにより構成された他の種類のサーバーまたはコンピューターもまた使用され得ることが、当業者には理解される。図６に概略的に示されているサーバー６０２は、サーバーまたはサーバークラスターまたはサーバーファームを表し、任意の個別の物理的サーバーに限定されない。サーバーサイトは、サーバーホスティングプロバイダーによって管理されるサーバーファームまたはサーバークラスターとして配置されてもよい。サーバーの数ならびにそれらのアーキテクチャおよび構成は、システム６００の使用量、需要、および容量要件に基づいて、増加させてもよい。また、当業者には理解されるように、これらの実施形態における他のユーザー通信デバイス６１４および６１６は、例えば、ラップトップ、デスクトップ、タブレット、携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、サーバー、または他の種類のコンピューターであってもよい。当業者には公知であり、理解されるように、ネットワーク６１２は、通信ネットワークを通じて１つもしくは複数の他のコンピューターと通信する複数のコンピューター／サーバーのインターネット、イントラネット、電気通信ネットワーク、エクストラネット、もしくはワールドワイドウェブ、および／またはローカルもしくは他のエリアネットワークの部分を含み得る。
【０１１２】
さらに、当業者には理解されるように、例示的なプログラム製品またはマシン可読媒体６０８は、必要に応じて、ハードウェアの機能を制御し、そのオペレーションを誘導する、１つまたは複数の秩序型オペレーションのセットを提供する、マイクロコード、プログラム、クラウドコンピューティングフォーマット、ルーチン、および／または記号型言語の形式である。例示的な実施形態によると、プログラム製品６０８もまた、その全体が揮発性メモリーに存在する必要はなく、必要に応じて、当業者に公知であり理解されている様々な手法によって、選択的にロードされてもよい。
【０１１３】
さらに、当業者には理解されるように、「コンピューター可読媒体」または「マシン可読媒体」という用語は、実行のためにプロセッサーに命令を提供することに関与する、任意の媒体を指す。例示するために、「コンピューター可読媒体」または「マシン可読媒体」という用語は、例えば、コンピューターによる読み取りのために、本開示の様々な実施形態の機能性またはプロセスを実装するプログラム製品６０８を保存することができる、配布媒体、クラウドコンピューティングフォーマット、中間保存媒体、コンピューターの実行メモリー、および任意の他の媒体またはデバイスを包含する。「コンピューター可読媒体」または「マシン可読媒体」は、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体を含むがこれらに限定されない、多数の形態をとり得る。不揮発性媒体としては、例えば、光学または磁気ディスクが挙げられる。揮発性媒体としては、動的メモリー、例えば、所与のシステムの主メモリーが挙げられる。伝送媒体としては、同軸ケーブル、バスを含むワイヤを含む、銅線および光学ファイバーが挙げられる。伝送媒体は、とりわけ、電波および赤外線データ通信中に生成されるものなど、音波または光波の形態もとり得る。コンピューター可読媒体の例示的な形態としては、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、フラッシュドライブ、もしくは任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリーチップもしくはカートリッジ、搬送波、またはコンピューターが読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられる。
【０１１４】
プログラム製品６０８は、必要に応じて、コンピューター可読媒体から、ハードディスクまたは類似の中間保存媒体へとコピーされる。プログラム製品６０８またはその部分を実行しようとするとき、それは、必要に応じて、それらの配布媒体、それらの中間保存媒体などから、１つまたは複数のコンピューターの実行メモリーへとロードされ、コンピューターが様々な実施形態の機能性または方法に応じて作動するように構成する。すべてのそのようなオペレーションは、例えば、コンピューターシステムの当業者に周知である。
【０１１５】
さらに例示するために、ある特定の実施形態では、本出願は、１つまたは複数のプロセッサー、およびプロセッサーと通信する１つまたは複数のメモリーコンポーネントを含む、システムを提供する。メモリーコンポーネントは、典型的に、実行されると、プロセッサーに、試験配列情報、参照配列情報などを表示させる情報を提供させ（例えば、通信デバイス６１４、６１６などを介して）、かつ／または他のシステムコンポーネントからおよび／もしくはシステムユーザーから（例えば、通信デバイス６１４、６１６などを介して）情報を受容させる、１つまたは複数の命令を含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、プログラム製品６０８は、電子プロセッサー６０４によって実行されると、少なくとも、（ｉ）通信ネットワーク上で、核酸シーケンサーによって生成されたシーケンシングリードを受容するステップと、（ｉｉ）前記シーケンシングリードを、ヒトゲノムに由来する参照配列にアライメントするステップと、（ｉｉｉ）イントロンの領域を除くシーケンシングリードの参照配列へのアライメントに基づいて、核酸構築物の存在を検出ステップとを実施する、非一時的コンピューター実行可能命令を含む。追加のコンピューター可読媒体の実施形態が、本明細書に記載される。
【０１１７】
システム６００はまた、典型的に、本明細書に記載される方法の様々な態様を実施するように構成される、追加のシステムコンポーネントを含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、これらの追加のシステムコンポーネントのうちの１つまたは複数は、リモートサーバー６０２から離れて位置付けられ、電子通信ネットワーク６１２を通じてそれと通信するが、他の実施形態では、これらの追加のシステムコンポーネントのうちの１つまたは複数は、ローカルに位置付けられ、サーバー６０２と通信するか（すなわち、電子通信ネットワーク６１２の不在下において）、または例えばデスクトップコンピューター６１４と直接的に通信する。
【０１１８】
一部の実施形態では、例えば、追加のシステムコンポーネントは、コントローラー６０２に作動可能に接続された（直接的または間接的に（例えば、電子通信ネットワーク６１２を介して））、試料調製コンポーネント６１８を含む。試料調製コンポーネント６１８は、核酸増幅コンポーネント（例えば、サーマルサイクラーなど）および／または核酸シーケンサーによって増幅および／またはシーケンシングしようとする試料中の核酸を調製する（例えば、核酸のライブラリーを調製する）ように構成される。これらの実施形態のうちのある特定のものでは、試料調製コンポーネント６１８は、例えば、試料中の他の成分から核酸を単離し、本明細書に記載されるようにバーコードを含む１つまたは複数のアダプターを核酸に結合させ、シーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームに由来する１つまたは複数の領域を選択的に濃縮させるように構成される。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、システム６００はまた、コントローラー６０２に作動可能に接続された（直接的にまたは間接的に（例えば、電子通信ネットワーク６１２を介して））、核酸増幅コンポーネント６２０（例えば、サーマルサイクラーなど）を含む。核酸増幅コンポーネント６２０は、対象に由来する試料中の核酸を増幅するように構成される。例えば、核酸増幅コンポーネント６２０は、必要に応じて、本明細書に記載されるように、試料中のゲノムまたはトランスクリプトームに由来する選択的に濃縮された領域を増幅させるように構成される。
【０１２０】
システム６００はまた、典型的には、コントローラー６０２に作動可能に接続された（直接的にまたは間接的に（例えば、電子通信ネットワーク６１２を介して））、少なくとも１つの核酸シーケンサー６２２を含む。核酸シーケンサー６２２は、対象に由来する試料中の核酸（例えば、増幅された核酸）から得られた配列情報を提供するように構成される。本質的に、あらゆる種類の核酸シーケンサーが、これらのシステムにおける使用に適合され得る。例えば、核酸シーケンサー６２２は、必要に応じて、核酸に、パイロシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーション、シーケンシングバイハイブリダイゼーション、または他の技法を実施して、シーケンシングリードを生成するように構成される。必要に応じて、核酸シーケンサー６２２は、配列リードを、配列リードのファミリーに分類するように構成され、それぞれのファミリーが、所与の試料中の核酸から生成された配列リードを含む。一部の実施形態では、核酸シーケンサー６２２は、シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用して、シーケンシングリードを生成する。ある特定の実施形態では、核酸シーケンサー６２２は、シーケンシングライブラリーをシーケンシングしてシーケンシングリードを生成するための、マイクロウェルのアレイを有する少なくとも１つのチップを含む。
【０１２１】
完全または部分的なシステムの自動化を促進するために、システム６００はまた、典型的に、コントローラー６０２に作動可能に接続された（直接的にまたは間接的に（例えば、電子通信ネットワーク６１２を介して））、材料輸送コンポーネント６２４を含む。材料輸送コンポーネント６２４は、１つまたは複数の材料（例えば、核酸試料、アンプリコン、試薬など）を、核酸シーケンサー６２２、試料調製コンポーネント６１８、および核酸増幅コンポーネント６２０へおよび／またはそこから輸送するように構成される。
【０１２２】
コンピューターシステムおよびネットワーク、データベース、ならびにコンピュータープログラム製品に関するさらなる詳細はまた、例えば、Peterson, Computer Networks: A Systems Approach, Morgan Kaufmann,5th Ed. (2011)、Kurose, Computer Networking: A Top-Down Approach, Pearson, 7thEd. (2016)、Elmasri, Fundamentals of Database Systems, Addison Wesley, 6th Ed.(2010)、Coronel, Database Systems: Design, Implementation, & Management,Cengage Learning, 11th Ed. (2014)、Tucker, Programming Languages,McGraw-Hill Science/Engineering/Math, 2nd Ed. (2006)、およびRhoton, Cloud ComputingArchitected: Solution Design Handbook, Recursive Press (2011)にも提供されており、これらは、それぞれが、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１２３】
ＩＩ．方法の一般的な特徴
Ａ．試料
試料は、対象から単離された任意の生物学的試料であり得る。試料としては、体組織、例えば、公知または疑いのある固形腫瘍、全血、血小板、血清、血漿、糞便、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）もしくは白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）、内皮細胞、組織生検、脳脊髄液、関節液、リンパ液、腹水、間質液もしくは細胞外液、細胞間の空間の流体が挙げられ、歯肉溝滲出液、骨髄、胸水、脳脊髄液、唾液、粘液、喀痰、精液、汗、尿が挙げられる。試料は、好ましくは、体液、特に、血液およびその比率、ならびに尿である。試料はまた、腫瘍から流出した核酸、例えば循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含むことができる。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡを挙げることができ、二本鎖形態および一本鎖形態であり得る。試料はまた、治療用核酸構築物を含むことができる。試料は、対象からもともと単離した形態であってもよく、または成分、例えば、細胞を除去もしくは追加するため、１つの成分を別の成分と比べて濃縮するため、もしくは１つの形態の核酸を別のものに、例えば、ＲＮＡからＤＮＡに、もしくは一本鎖核酸から二本鎖に変換するために、さらなるプロセシングに供されていてもよい。したがって、例えば、分析のための体液は、無細胞核酸、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、血漿または血清である。
【０１２４】
血漿の体積は、シーケンシングされる領域の所望されるリード深度に依存し得る。例示的な体積は、０．４〜４０ｍｌ、５〜２０ｍｌ、１０〜２０ｍｌである。例えば、体積は、０．５ｍｌ、１ｍＬ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、または４０ｍｌであり得る。サンプリングされる血漿の体積は、５〜２０ｍｌであり得る。
【０１２５】
試料は、ゲノム等価物を含む様々な量の核酸を含み得る。例えば、約３０ｎｇのＤＮＡの試料は、約１０，０００（１０４）個のハプロイドヒトゲノム等価物を含み得、ｃｆＤＮＡの場合には、約２０００億（２×１０１１）個の個々のポリヌクレオチド分子を含み得る。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡの試料は、約３０，０００個のハプロイドヒトゲノム等価物を含み得、ｃｆＤＮＡの場合には、約６０００億個の個々の分子を含み得る。
【０１２６】
試料は、異なる源、例えば、細胞または異物からの核酸を含み得る。試料は、変異を有する核酸を含み得る。例えば、試料は、生殖細胞系列変異および／または体細胞変異を有するＤＮＡを含み得る。試料は、がん関連変異（例えば、がん関連体細胞変異）を有するＤＮＡを含み得る。
【０１２７】
増幅前の試料中の無細胞核酸の例示的な量は、約１ｆｇ〜約１μｇ、例えば、１ｐｇ〜２００ｎｇ、１ｎｇ〜１００ｎｇ、１０ｎｇ〜１０００ｎｇの範囲である。例えば、量は、最大約６００ｎｇ、最大約５００ｎｇ、最大約４００ｎｇ、最大約３００ｎｇ、最大約２００ｎｇ、最大約１００ｎｇ、最大約５０ｎｇ、または最大約２０ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。量は、少なくとも１ｆｇ、少なくとも１０ｆｇ、少なくとも１００ｆｇ、少なくとも１ｐｇ、少なくとも１０ｐｇ、少なくとも１００ｐｇ、少なくとも１ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１５０ｎｇ、または少なくとも２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。量は、最大１フェムトグラム（ｆｇ）、１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ピコグラム（ｐｇ）、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、または２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。本方法は、１フェムトグラム（ｆｇ）〜２００ｎｇを得ることを含み得る。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、試料中の無細胞核酸の量は、約５ｎｇ〜３００ｎｇの間である。
【０１２９】
細胞起源の無細胞核酸は、約１００〜５００ヌクレオチドの例示的なサイズ分布を有し、１１０〜約２３０ヌクレオチドの分子が、分子の約９０％に相当し、最頻値は約１６８ヌクレオチドであり、第２のマイナーピークは、２４０〜４４０ヌクレオチドの範囲にある。細胞起源の無細胞核酸は、約１６０〜約１８０ヌクレオチド、または約３２０〜約３６０ヌクレオチド、または約４４０〜約４８０ヌクレオチドであり得る。
【０１３０】
無細胞核酸は、溶液中に見出される無細胞核酸を、インタクトな細胞および体液の他の不溶性成分から分離する、分割ステップによって、体液から単離することができる。分割には、遠心分離または濾過などの技法が含まれ得る。あるいは、体液中の細胞を、溶解し、無細胞核酸および細胞核酸を、一緒にプロセシングしてもよい。一般に、緩衝液の添加および洗浄ステップの後に、無細胞核酸は、アルコールで沈降させることができる。混入物質または塩を除去するために、シリカベースカラムなどのさらなる洗浄ステップを使用してもよい。手順のある特定の態様、例えば、収率を最適化するために、例えば、非特異的バルク担体核酸を、反応全体にわたり添加してもよい。そのようなプロセシングの後、試料は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＲＮＡを含む、様々な形態の核酸を含み得る。必要に応じて、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡは、後続のプロセシングおよび分析ステップに含められるように、二本鎖形態に変換してもよい。
【０１３１】
Ｂ．タグ
分子識別子を提供するタグ（本明細書では「分子バーコード」ともいう）は、他の方法の中でもとりわけ、化学合成、ライゲーション、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって、アダプターに組み込まれ得るか、またはそれ以外では結合され得る。一般に、反応における固有または非分子バーコードの割当ては、米国特許出願第２００１００５３５１９号、同第２０１１０１６００７８号、ならびに米国特許第６，５８２，９０８号および同第７，５３７，８９８号およびＵＳ９，５９８，７３１に記載される方法およびシステムに従う。
【０１３２】
タグは、ランダムまたは非ランダムで、試料核酸に連結され得る。一部の場合には、それらは、予測される分子バーコード比（例えば、分子バーコードの組合せ）で導入される。分子バーコード集団は、固有であってもよく、例えば、すべてのバーコードが、同じヌクレオチド配列を有する。分子バーコード集団は、非固有であってもよく、例えば、バーコードのうちの一部が、同じヌクレオチド配列を有し、バーコードのうちの一部が、異なるヌクレオチド配列を有する。例えば、ゲノム試料当たり１個を上回る、２個を上回る、３個を上回る、４個を上回る、５個を上回る、６個を上回る、７個を上回る、８個を上回る、９個を上回る、１０個を上回る、２０個を上回る、５０個を上回る、１００個を上回る、５００個を上回る、１０００個を上回る、５０００個を上回る、１００００個を上回る、５０，０００個を上回る、１００，０００個を上回る、５００，０００個を上回る、１，０００，０００個を上回る、１０，０００，０００個を上回る、５０，０００，０００個を上回る、または１，０００，０００，０００個を上回るバーコードがロードされるように、バーコードがロードされ得る。一部の場合には、ゲノム試料当たり２個を下回る、３個を下回る、４個を下回る、５個を下回る、６個を下回る、７個を下回る、８個を下回る、９個を下回る、１０個を下回る、２０個を下回る、５０個を下回る、１００個を下回る、５００個を下回る、１０００個を下回る、５０００個を下回る、１００００個を下回る、５０，０００個を下回る、１００，０００個を下回る、５００，０００個を下回る、１，０００，０００個を下回る、１０，０００，０００個を下回る、５０，０００，０００個を下回る、または１，０００，０００，０００個を下回るバーコードがロードされるように、バーコードがロードされ得る。一部の場合には、試料ゲノム当たりのロードされるバーコードの平均数は、ゲノム試料当たり約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、５０，０００個、１００，０００個、５００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、５０，０００，０００個、または１，０００，０００，０００個のバーコードを下回るか、または上回る。
【０１３３】
好ましい形式は、標的分子の両方の末端にライゲーションされる２０〜５０個の異なるタグを使用し、２０〜５０×２０〜５０個のタグが作製される。そのような数のタグは、同じ開始点および終止点を有する異なる分子が、高い確率（例えば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、９９．９９９％）で異なる組合せのタグを受容するのに十分である。
【０１３４】
一部の場合には、分子バーコードは、所定のまたはランダムなまたはセミランダムな配列のオリゴヌクレオチドであり得る。他の場合には、バーコードが複数の中で必ずしも互いに固有とならないような、複数のバーコードが使用されてもよい。この例では、バーコードは、バーコードおよびそれが結合され得る配列の組合せが、個別にトラッキングすることができる固有の配列を作製するように、（例えば、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅によって）個々の分子に結合され得る。本明細書に記載されるように、
無細胞核酸分子の配列リードの最初の（開始）点および終わりの（終止）部分の配列データ、または参照配列に対してマッピングされたゲノム座標と組み合わせて非固有にタグ付けされたバーコードの検出により、特定の分子に固有の同一性を割り当てることが可能となり得る。個々の配列リードの長さまたは塩基対の数もまた、そのような分子に固有の同一性を割り当てるために使用することができる。本明細書に記載されるように、固有の同一性が割り当てられた核酸の一本鎖に由来する断片は、それによって、それに続く親鎖に由来する断片および／または相補鎖の識別を可能にし得る。
【０１３５】
従来的な核酸増幅方法を使用して、核酸分子に、タグ、例えば、分子バーコードおよび／または試料インデックスを導入するために、１回または複数回の増幅を適用することができる。増幅は、１つまたは複数の反応混合物中で行うことができる。分子バーコードおよび試料インデックスは、同時、または任意の逐次的順序で導入することができる。分子バーコードおよび試料インデックスは、配列捕捉（例えば、濃縮）の前および／または後に導入することができる。一部の実施形態では、分子バーコードのみが、プローブ捕捉の前に導入され、一方で試料インデックスは、配列捕捉の後に導入される。一部の事例では、分子バーコードおよび試料インデックスの両方が、プローブ捕捉の前に導入される。一部の事例では、試料インデックスは、配列捕捉の後に導入される。通常、配列捕捉は、標的化配列に相補的な一本鎖核酸分子を導入することを伴う。典型的に、増幅により、２００ｎｔ〜７００ｎｔ、２５０ｎｔ〜３５０ｎｔ、または３２０ｎｔ〜５５０ｎｔの範囲のサイズで、分子バーコードおよび試料インデックスを有する非固有または固有にタグ付けされた複数の核酸アンプリコンが生成される。一部の実施形態では、アンプリコンは、約３００ｎｔのサイズを有する。一部の実施形態では、アンプリコンは、約５００ｎｔのサイズを有する。
【０１３６】
Ｃ．増幅
アダプターが隣接する試料核酸を、ＰＣＲ、および典型的に、増幅させようとする核酸分子に隣接するアダプターにおけるプライマー結合部位にプライマーが結合することによりプライミングされる他の増幅方法によって増幅させることができる。増幅方法は、サーマルサイクリングの結果としての伸長、変性、およびアニーリングのサイクルを含み得るか、または転写に媒介される増幅にあるような等温のものであってもよい。他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、および自己持続性配列に基づく複製が挙げられる。
【０１３７】
Ｄ．濃縮
配列は、シーケンシングの前に濃縮させることができる。濃縮は、特定の標的領域に実施してもよく、または非特異的に実施してもよい（すなわち、標的配列）。一部の実施形態では、目的の標的化領域は、差次的タイリングおよび捕捉スキームを使用して、１つまたは複数のベイトセットパネルに選択される捕捉プローブ（「ベイト」）を用いて濃縮され得る。差次的タイリングおよび捕捉スキームは、異なる相対濃度のベイトセットを使用して、ベイトと関連するゲノム領域全体に差次的にタイリングし（例えば、異なる「分解能」で）、拘束セット（例えば、シーケンサー拘束、例えば、シーケンシングロード、それぞれのベイトの有用性など）に供され、下流シーケンシングに所望されるレベルで、それらを捕捉する。これらの目的の標的化ゲノム領域は、核酸構築物の天然または合成のヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の目的の領域に対するプローブを有するビオチン標識化ビーズを使用して、標的配列を捕捉し、必要に応じて、目的の領域の濃縮のために、これらの領域の増幅が続く。
【０１３８】
配列捕捉は、典型的に、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を伴う。プローブセット戦略は、目的の領域全体にプローブをタイリングすることを含み得る。そのようなプローブは、例えば、約６０〜１２０塩基の長さであり得る。セットは、約２×、３×、４×、５×、６×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、５０×、またはそれを上回る深度を有し得る。配列捕捉の有効性は、部分的に、プローブの配列に相補的である（またはほぼ相補的である）標的分子内の配列の長さに依存する。
【０１３９】
Ｅ．シーケンシング
前の増幅の有無にかかわらず、アダプターが隣接している試料核酸は、シーケンシングに供することができる。シーケンシング方法としては、例えば、サンガーシーケンシング、高スループットシーケンシング、パイロシーケンシング、シーケンシングバイシンセシス、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーション、シーケンシングバイハイブリダイゼーション、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代シーケンシング、合成による単分子シーケンシング（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列シーケンシング、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシーケンシング、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、またはＮａｎｏｐｏｒｅプラットフォームを使用したシーケンシングが挙げられる。シーケンシング反応は、様々な試料プロセシングユニットで行うことができ、これは、複数レーン、複数チャネル、複数ウェル、または複数の試料セットを実質的に同時にプロセシングする他の手段であり得る。試料プロセシングユニットにはまた、複数の実行を同時にプロセシングすることを可能にする複数の試料チャンバが含まれ得る。
【０１４０】
シーケンシング反応は、他の疾患のがんのマーカーを含むことが既知の１つまたは複数の断片型に行うことができる。シーケンシング反応はまた、試料中に存在する任意の核酸断片に行うこともできる。シーケンシング反応は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または１００％のゲノムの配列カバレッジを提供し得る。他の場合には、ゲノムの配列カバレッジは、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、９５％未満、９９％未満、９９．９％未満、または１００％未満であり得る。
【０１４１】
多重シーケンシングを使用して、同時のシーケンシング反応を行ってもよい。一部の場合には、無細胞ポリヌクレオチドは、少なくとも１０００回、２０００回、３０００回、４０００回、５０００回、６０００回、７０００回、８０００回、９０００回、１００００回、５００００回、１００，０００回のシーケンシング反応でシーケンシングされ得る。他の事例では、無細胞ポリヌクレオチドは、１０００回未満、２０００回未満、３０００回未満、４０００回未満、５０００回未満、６０００回未満、７０００回未満、８０００回未満、９０００回未満、１００００回未満、５００００回未満、１００，０００回未満のシーケンシング反応でシーケンシングされ得る。シーケンシング反応は、逐次的に行われてもよく、または同時に行われてもよい。後続のデータ分析は、シーケンシング反応のすべてまたは一部に行われ得る。一部の場合には、データ分析は、少なくとも１０００回、２０００回、３０００回、４０００回、５０００回、６０００回、７０００回、８０００回、９０００回、１００００回、５００００回、１００，０００回のシーケンシング反応に行われ得る。他の場合には、データ分析は、１０００回未満、２０００回未満、３０００回未満、４０００回未満、５０００回未満、６０００回未満、７０００回未満、８０００回未満、９０００回未満、１００００回未満、５００００回未満、１００，０００回未満のシーケンシング反応に行われ得る。例示的なリード深度は、遺伝子座（塩基）１つ当たり１０００〜５００００リードである。
【０１４２】
Ｆ．分析
一部の実施形態では、未加工のシーケンシングデータは、配列リードのセットを含み得、これは、様々なファイル形式、例えば、ＦＡＳＴＱ、ＶＣＦ、ＣＲＡＭ、またはＢＡＭで提供され得る。未加工のシーケンシングデータを有するファイルは、例えば、ペアエンドリードのような、一方の鎖または両方の鎖の配列データを含み得る。１つの例では、未加工のシーケンシングデータは、両方の鎖、すなわち、ペアエンドシーケンシング手順によって生成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖について、ＦＡＳＴＱファイルで提供される。ファイルは、リードの品質に関する情報を提供する追加の記号を含み得、品質スコアも提供し得る。それぞれのポリヌクレオチド分子の未加工のシーケンシングデータは、ローカルドライブ、クラウド、またはサーバーに保存することができる。
【０１４３】
一部の事例では、シーケンシング反応により生成された配列リードは、バイオインフォマティクス分析を実行するために、参照配列にアライメントまたはマッピングすることができる。参照配列は、既知の配列、例えば、目的物由来の既知の全ゲノム配列または部分的ゲノム配列、ヒト対象の全ゲノム配列であることが多い。参照配列は、ｈＧ１９であってもよい。シーケンシングされた核酸は、上述のように、試料中の核酸に対して直接的に決定される配列、またはこのような核酸の増幅産物の配列のコンセンサスを示すことができる。比較は、参照配列の１つまたは複数の指定された位置で実施することができる。
【０１４４】
配列リードは、マッピングツールを使用して、参照配列にアライメントすることができ、その非限定的な例としては、Ｂｕｒｒｏｗ’ｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（ＢＷＡ）、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ、Ｂｏｗｔｉｅを挙げることができる。マッピングツールは、使用されたアライメントパラメーター、参照配列に対する配列リードの位置（例えば、座標）、およびマッピングの品質スコアを示すアライメントファイルを生成する。アライメントパラメーター、例えば、シーケンシングリードと参照配列との間で許容される差の数、許容されるギャップの数およびギャップ開始ペナルティ、ギャップ伸長の数などは、ユーザーによって定義され得る。１つの事例では、ＢＷＡマッピングツールをデフォルトのアライメントパラメーターで使用して、リードを、ヒト参照ゲノム、例えば、ｈｇ１９にアライメントする。ＢＷＡツールは、出力ファイル、アライメント統計を含むＢＡＭファイルを提供する。アライメント統計は、処理されたリードがアライメントされる参照配列の座標を含み得る。アライメント統計はまた、参照配列にマッピングされる場合のリードの固有性の情報を示すＭａｐＱスコアも提供し得る。処理されたリードは、次いで、分子バーコードおよび参照配列上の座標を使用して分類され得る。
【０１４５】
参照配列の指定された位置に対応する位置を含むシーケンシングされた核酸のサブセットは、各配列が最大限に配列された場合に識別することができる。このようなサブセット内で、存在する場合、どのシーケンシングされた核酸が指定された位置にヌクレオチド変異を含むか、および必要に応じて、存在する場合、どれが参照ヌクレオチドを含むか（すなわち、参照配列におけるものと同じか）を決定することができる。比較は、参照配列における目的の任意の指定された位置に対して繰り返すことができる。しばしば、比較は、参照配列における少なくとも２０、１００、２００、または３００の連続する位置、例えば、２０〜５００、または５０〜３００の連続する位置を占める指定された位置に対して実施できることもある。
【０１４６】
試料は、同じ核酸の任意の２つのコピーが、一方の末端または両方の末端に連結されたアダプターから、分子バーコードを含有するアダプターの同じ組合せを受容する確率が低くなるように（例えば、１％未満または０．１％未満）十分な数の異なる分子バーコードと接触され得る。アダプターをこの様式で使用することにより、参照配列にアライメント（またはマッピング）される同じ開始点および終止点を有し、同じ分子バーコードの組合せに連結された配列リードを、同じもとの分子から生成されたリードのファミリーにグループ分けすることが可能となる。そのようなファミリーは、増幅前の試料中の核酸の増幅産物の配列を表し得る。
【０１４７】
ファミリーメンバーの配列をコンパイルして、平滑末端化およびアダプター結合によって改変された、もとの試料中の核酸分子のコンセンサスヌクレオチドまたは完全なコンセンサス配列を導出することができる。換言すると、試料中の核酸の特定の位置を占有しているヌクレオチドは、ファミリーメンバー配列においてその対応する位置を占有しているヌクレオチドのコンセンサスであると決定され得る。コンセンサスヌクレオチドは、２つの非限定的で例示的な方法を挙げると、投票または信頼性スコアなどの方法によって、決定することができる。ファミリーには、二本鎖核酸の一方の鎖または両方の鎖の配列が含まれ得る。ファミリーのメンバーが、二本鎖核酸由来の両方の鎖の配列を含む場合、一方の鎖の配列を、すべての配列をコンパイルする目的でそれらの相補物に変換して、コンセンサスヌクレオチドまたは配列を導出する。一部のファミリーは、単一メンバー配列のみを含み得る。この場合には、この配列は、増幅前の試料中の核酸の配列として解釈され得る。あるいは、単一メンバー配列のみを有するファミリーは、後続の分析から排除してもよい。
【０１４８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステムおよび方法の結果は、インプットとして使用され、レポートが作成される。レポートは、紙形式であってもよい。例えば、レポートは、生物学的試料中の治療用核酸構築物の存在または不在の指標を提供し得る。一部の実施形態では、レポートは、生物学的試料中の治療用核酸構築物のレベルの指標を含み得る。
【０１４９】
本明細書に開示される方法の様々なステップ、または本明細書に開示されるシステムによって実行されるステップは、同じかもしくは異なる時点で、同じかもしくは異なる地理的位置、例えば、国において、および／または同じかもしくは異なる人々によって実行され得る。
Ｇ．適用
【０１５０】
本方法は、対象における治療用核酸構築物の存在または不在を検出するために使用することができる。本方法はまた、異なる時点における治療用核酸構築物の相対量によって、処置の有効性を判定またはモニタリングするためにも使用することができる。一部の事例では、治療用核酸構築物の量は、第１の時点と比較して、第２の時点において、高くなり得る。これは、対象の体内における構築物の複製および／または構築物の発現の強化を示し得る。一部の事例では、治療用核酸構築物の量は、第１の時点と比較して、第２の時点において、低くなり得る。これは、対象の体内における構築物の分解を示し得、対象は、代替的な処置を必要とし得る。一部の事例では、治療用核酸構築物の量は、複数の時点の間で同じであり得る。これは、体内における治療用核酸構築物のレベルの安定を示し得る。同様に、異なるコホートにおける異なる処置の有効性を、時点間で一致する、または互いに異なる、異なる治療用核酸構築物の相対量によって判定することができる。これは、対象の体内の構築物の安定性を示し得る。異なる時点における相対量は、推奨を行うために、処置の予後と併せて評価してもよい。
【０１５１】
一部の事例では、複数の時点間の期間は、対象が受けている治療法によって決定され得る。例えば、対象は、治療法の有効性を改善するために、化学療法または放射線療法の期間にのみ治療用構築物を必要とし得る。この事例では、治療用構築物は、特定の期間の間必要とされ、時点は、治療法をカバーするように離間され得る。一部の事例では、治療用構築物は、身体の特定の位置、例えば、ある器官または組織で、必要とされ得る。この事例では、構築物は、所望されない位置への構築物の浸透を評価するために、所望される位置および所望されない位置の両方において、異なる時点で定量され得る。本方法は、対象に投与された薬物を示すためにも使用することができる。一部の実施形態では、治療用核酸構築物は、処置の予後を改善するために、薬物、例えば、化学療法薬および／または治療法と併せて投与される。治療用核酸構築物と薬物または治療法との組合せにより、強化された治療効果を得ることができる。この事例では、治療用核酸構築物の存在は、組合せ薬物または治療法の存在を示し得る。例えば、改変された腫瘍溶解性アデノウイルス（例えば、ＯＮＹＸ−０１５）を、放射線および／またはテモゾロミド化学療法と組み合わせて使用することができる。したがって、腫瘍溶解性アデノウイルスの存在は、対象が受けている可能性のある組合せ治療法を推測するために使用することができる。
【実施例】
【０１５２】
（実施例１）
がん対象におけるＴＰ５３発現ベクターの検出
体重減少および腹部疼痛を有するヒト対象は、膵臓の頭部における腫瘍および転移性肝臓病変部を有することが見出された。腫瘍の微細針吸引により、膵臓の粘液性腺癌が確認されたが、試料は、分子試験には不十分であった。ｃｆＤＮＡ  ＮＧＳを実施して（Ｇｕａｒｄａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ、ＣＡ）、ゲノム改変（例えば、ＢＲＣＡ、ＥＧＦＲ改変、ＥＲＢＢ２増幅）を識別した。
【０１５３】
Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０（登録商標）（Ｇ３６０）は、主として、１）ＦＤＡに承認されている標的化療法、２）臨床試験の後期にある標的化療法、３）公知の予測もしくは予後の値、または４）ｃｆＤＮＡの存在の情報と関連するゲノム改変に焦点を当てた、７３個の遺伝子を評価する、血漿に基づく包括的なｃｆＤＮＡ  ＮＧＳアッセイである。単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）を、７３個の遺伝子において評価し、コピー数増幅（ＣＮＡ）を、１８個の遺伝子において評価し、挿入欠失バリアント（インデル）を、２３個の遺伝子において評価し、融合を、６個の遺伝子において評価する（表１）。
【表１】
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【０１５４】
コピー数バリアントのＧ３６０報告可能領域の一部ではないＴＰ５３遺伝子における大型（５０＋）のコピー数増加により、さらなるフォローアップが促された。ｃｆＤＮＡ  ＮＧＳデータにより、非典型的なインサートサイズおよび分布、リードの開始／終止位置、ならびにクリッピング後のリード長を有するＴＰ５３に由来する配列の動的な過剰出現（予測された１．５％と比較して、すべてのリードの４１％）が明らかとなった。非典型的な配列は、ＴＰ５３コーディング配列のみを含み、イントロンを有さなかった。マッピングされないリードを、反復的な短いリードのゲノムアセンブリアルゴリズムであるＳＰＡｄｅｓ（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ）を使用して、非典型的なエクソンのＴＰ５３配列を含有する６００３ｂｐの環状コンティグにアセンブリした（図７）。ＴＰ５３配列の外部には、ヒトゲノムにマッピングされる環状コンティグの配列は存在しなかった。
【０１５５】
処置医師との相談により、患者が、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸへと進み、続いて、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルとともにリポソーム封入ＴＰ５３発現ベクターを利用した臨床試験に登用されたことが明らかとなった。対象の初回の実験処置は、ｃｆＤＮＡ試料採取の４日前であった。重要なことに、この合成構築物の過剰出現により、天然のＴＰ５３配列が不明瞭となり、標準的な性能測定が正常範囲内にあるにもかかわらず、予測されるアッセイ検出限界に４７％の増加が生じた。発現ベクターリードの非典型的な特徴により、本明細書に記載されるものよりも有意に低い濃度でさえも、検出および定量を自動化することが可能となる。発現ベクターは、ヒトゲノム相同性を有さず、マッピングによるリード識別を可能にする。ＴＰ５３イントロン「欠失」が、欠失検出アルゴリズムによって検出された。最後に、インサートの長さおよびリードの開始−終止分布は、天然の配列と合成の配列との間で著しく異なる。
【０１５６】
（実施例２）
臨床結果におけるベクターの存在の影響
核酸に基づく治療法（またはＮＡＴ）は、液体生検における固有かつこれまで認識されていなかった干渉源である。治療用核酸に特有の特徴を使用して、そのような干渉物を識別し、自動化可能かつ汎用化可能なバイオインフォマティクス技法を使用して、それをフィルタリングすることができる（表２）。
【表２】
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【０１５７】
上記または下記で引用されるすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各個別の項目が参照によってそのように組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、すべての目的で、参照によりその全体が組み込まれる。様々な配列バージョンが、異なる時点の受託番号に関連する場合、この出願の有効出願日の受託番号に関連するバージョンを意味する。有効出願日は、該当する場合、実際の出願日または受託番号に言及する優先出願の出願日の早いほうを意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、別段示されていなければ、本出願の有効出願日に最も近く公開されたバージョンを意味する。本開示の任意の構成、ステップ、エレメント、実施形態、または態様は、別段具体的に示されていなければ、いずれかの他のものと組み合わせて使用することができる。本開示は、明確化および理解を目的として、例証および実施例によって幾分詳細に記載されているが、特定の変更および修正が添付の特許請求の範囲の範囲内で実践され得ることは明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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