(57)【要約】  本発明は、個体におけるアルツハイマー病の予防又は治療に使用するための、次の式（Ｉ）：2021517124.tif 000039の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物に関する。
2021517124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるアルツハイマー病の予防又は治療に使用するための、次の式（Ｉ）：
2021517124.tif 000028
［上式中、
−  Ｒ１は、−Ｈ又は次の式：
2021517124.tif 000029
｛上式中、
・  Ｒ６は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ９又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ９（ここで、Ｒ９はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜１２個の炭素原子を有するアリール基である）を表し；
・  Ｒ７は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ１０又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１０（ここで、Ｒ１０はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜１２個の炭素原子を有するアリール基である）；デオキシリボ核酸基；又はリボ核酸基を表し；
・  Ｒ８は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ１１又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１１（ここで、Ｒ１１はＨ、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜２０個の炭素原子を有するアリール基である）；ホスフェート基；ジホスフェート基；トリホスフェート基；デオキシリボ核酸基；又はリボ核酸基を表す｝
のリボシル基を表し、
−  Ｒ１２は、
・  １〜２０個の炭素原子を有するアルキル基、
・  ３〜２０個の炭素原子を有するアリール又はヘテロアリール基、
・  ３〜２０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基、
・  ヒドロキシル基、
・  １〜２０個の炭素原子を有するカルボニル又はカルボキシル基、
・  エポキシ基、
・  −Ｏ−Ｒ４基（ここで、Ｒ４はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基、グリコシル基又はアミノアシル基である）、
・  −Ｏ−ＣＯ−Ｒ５基（ここで、Ｒ５は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基又はグリコシル基である）
からなる群から選択される少なくとも一つの基によって置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又はエーテル基を表す］
の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物が、次の式（ＩＩ）：
2021517124.tif 000030
［上式中、
−  ａは二重結合又はエポキシ基を表し、かつ
−  Ｒ１は、−Ｈ又は次の式：
2021517124.tif 000031
｛上式中、
・  Ｒ６は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ９又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ９（ここで、Ｒ９はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜１２個の炭素原子を有するアリール基である）を表し；
・  Ｒ７は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ１０又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１０（ここで、Ｒ１０はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜１２個の炭素原子を有するアリール基である）；デオキシリボ核酸基；又はリボ核酸基を表し；
・  Ｒ８は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ１１又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１１（ここで、Ｒ１１はＨ、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜２０個の炭素原子を有するアリール基である）；ホスフェート基；ジホスフェート基；トリホスフェート基；デオキシリボ核酸基；又はリボ核酸基を表す｝
のリボシル基を表し、
−  同一又は異なるＲ２及びＲ３は、−Ｏ−Ｒ４（ここで、Ｒ４はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基、グリコシル基又はアミノアシル基である）；又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ５（ここで、Ｒ５は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基又はグリコシル基である）を表す］
のものである、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項３】
−  同一又は異なるＲ２及びＲ３が、−ＯＨ、−Ｏ−マンノシル基、−Ｏ−ガラクトシル基又は−Ｏ−グルタミル基を表し；
−  Ｒ６が−ＯＨを表し；
−  同一又は異なるＲ７及びＲ８が、−ＯＨ又はリボ核酸基を表す、
請求項１又は２に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項４】
化合物が、キューイーン、ｅｎｔ−キューイーン、キューオシン、エポキシキューイーン、エポキシキューオシン、マンノシル−キューイーン、ガラクトシル−キューイーン、グルタミル−キューイーン、ガラクトシル−キューオシン、マンノシル−キューオシン、グルタミル−キューオシン、キューイーン−ｔＲＮＡ及びエポキシキューイーン−ｔＲＮＡからなる群から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項５】
化合物が、次の式：
2021517124.tif 000032
2021517124.tif 000033
2021517124.tif 000034
2021517124.tif 000035
2021517124.tif 000036
2021517124.tif 000037
2021517124.tif 000038
の化合物からなる群から選択される、請求項１から４の何れか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項６】
５〜１５００ｍｇ／ｋｇの単位用量で投与される、請求項１から５の何れか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項７】
０．０１〜４０ｍｇ／ｋｇ／ｄの投薬レジメンでの投与のための、請求項１から６の何れか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項８】
経口経路、皮内経路、静脈内経路、筋肉内経路又は皮下経路による投与に適した形態の、請求項１から７の何れか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項９】
アルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の追加の化合物と組み合わされる、請求項１から８の何れか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項１０】
ドネペジル、ガランタミン、メマンチン及びリバスチグミンからなる群から選択されるアルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の追加の化合物と組み合わされる、請求項１から９の何れか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物。
【請求項１１】
アルツハイマー病の予防又は治療において使用するために、場合によっては少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルと組み合わされて、請求項１から５の何れか一項に記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物を活性物質として含む薬学的組成物。
【請求項１２】
場合によっては少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルと組み合わされて、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の追加の化合物を更に含む、請求項１から５の何れか一項に記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物を活性物質として含む薬学的組成物。
【請求項１３】
ドネペジル、ガランタミン、メマンチン及びリバスチグミンからなる群から選択されるアルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の追加の化合物を含む、場合によっては少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルと組み合わされて、請求項１から５の何れか一項に記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物を活性物質として含む薬学的組成物。
【請求項１４】
個体におけるアルツハイマー病の予防又は治療における同時、別個、又は逐次の使用のための組み合わせ製剤として、
−  請求項１から５の何れか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、
−  アルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の追加の化合物
を含む製品。
【請求項１５】
個体におけるアルツハイマー病のリスクを低減するための使用のための、請求項１から５の何れか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を含む栄養補助食品。
【請求項１６】
ビタミン、ミネラル、脂肪酸、アミノ酸及び抗酸化剤からなる群から選択される追加の化合物を含む、請求項１５に記載の栄養補助食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病を治療するための化合物、組成物、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、最も一般的な神経変性疾患であり、高齢者の認知症の最も一般的な原因である。２０１５年９月までに、世界中で４７５０万人がこの疾患に罹患した。その有病率は６５歳以降５％であり、年齢と共に指数関数的に増加する（８０歳以上の人々の２５％が罹患する）が、更に早く発症する場合もある。
【０００３】
アルツハイマー病は、進行性で不可逆的なニューロンの喪失によって特徴付けられる。この喪失は、記憶、言語、思考力などの認知能力の低下、並びに時間と空間における方向付け能力の消失につながる。最終的に、患者は身近な人を認識したり、日常的な作業を実行したりすることができなくなる。
【０００４】
アルツハイマー病は、少なくとも部分的には、いわゆるアミロイドプラークを形成するβ−アミロイドペプチドの細胞外沈着物が脳内に存在することが原因であると思われる。これらのプラークは周囲のニューロンの機能不全を引き起こし、最終的にはニューロンの死をもたらす。β−アミロイドペプチドは、３６〜４３アミノ酸を含み、β−セクレターゼ及びγ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常な酵素的切断に由来する。このペプチドは不溶性で、ほとんど分解されない。このプロセスは通常、海馬で始まり、大脳皮質の様々な領域に徐々に広がる。
【０００５】
現時点で、この病気に対する薬物治療はない。
【０００６】
実際、抗コリンエステラーゼであるドネペジル（Rogers等 (1998) Arch Intern Med. 158: 1021-3）など、この文脈で承認されている現在の薬剤は、疾患の症候の進行を遅らせることを目的としているが、ニューロンの変性と死を防げない。
【０００７】
従って、アルツハイマー病におけるこれらの化合物の代替治療、特に症状の治療に加えてこの病気の病理学的機序を変える治療が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、本発明者等による、アルツハイマー病の予防又は治療における神経保護剤としてのキューイーン（queuine）の可能性の認識から生じる。特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者等は、キューイーンが、アミロイドプラーク形成につながる病理学的機序に関与するタンパク質のミスフォールディングを防止し又はそれに対して有益な作用を発揮できると考えている。
【０００９】
而して、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療に使用するための、キューイーン、キューイーンの前駆体、キューイーンの誘導体又はキューイーンの立体異性体、キューイーンのアナログ（類似体）、又はそれらの薬学的に許容される塩又は水和物に関する。
【００１０】
本発明は、個体におけるアルツハイマー病の予防又は治療に使用するための、次の式（Ｉ）：
2021517124.tif 000003
［上式中、
−  Ｒ１は、−Ｈ又は次の式：
2021517124.tif 000004
｛上式中、
・  Ｒ６は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ９又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ９（ここで、Ｒ９はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜１２個の炭素原子を有するアリール基である）を表し；
・  Ｒ７は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ１０又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１０（ここで、Ｒ１０はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜１２個の炭素原子を有するアリール基である）；デオキシリボ核酸基；又はリボ核酸基を表し；
・  Ｒ８は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ１１又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１１（ここで、Ｒ１１はＨ、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜２０個の炭素原子を有するアリール基である）；ホスフェート基；ジホスフェート基；トリホスフェート基；デオキシリボ核酸基；又はリボ核酸基を表す｝
のリボシル基を表し、
−  Ｒ１２は、
・  １〜２０個の炭素原子を有するアルキル基、
・  ３〜２０個の炭素原子を有するアリール又はヘテロアリール基、
・  ３〜２０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基、
・  ヒドロキシル基、
・  １〜２０個の炭素原子を有するカルボニル又はカルボキシル基、
・  エポキシ基、
・  −Ｏ−Ｒ４基（ここで、Ｒ４はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基、グリコシル基又はアミノアシル基である）、
・  −Ｏ−ＣＯ−Ｒ５基（ここで、Ｒ５は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基又はグリコシル基である）
からなる群から選択される少なくとも一つの基によって置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又はエーテル基を表す］
の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物に関する。
【００１１】
本発明はまた個体におけるアルツハイマー病の予防又は治療に使用するための、次の式（ＩＩ）：
2021517124.tif 000005
［上式中、
−  ａは二重結合又はエポキシ基を表し、かつ
−  Ｒ１は、−Ｈ又は次の式：
2021517124.tif 000006
｛上式中、
・  Ｒ６は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ９又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ９（ここで、Ｒ９はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜１２個の炭素原子を有するアリール基である）を表し；
・  Ｒ７は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ１０又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１０（ここで、Ｒ１０はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜１２個の炭素原子を有するアリール基である）；デオキシリボ核酸基；又はリボ核酸基を表し；
・  Ｒ８は−Ｈ；−Ｏ−Ｒ１１又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１１（ここで、Ｒ１１はＨ、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基又は３〜２０個の炭素原子を有するアリール基である）；ホスフェート基；ジホスフェート基；トリホスフェート基；デオキシリボ核酸基；又はリボ核酸基を表す｝
のリボシル基を表し、
−  同一又は異なるＲ２及びＲ３は、−Ｏ−Ｒ４（ここで、Ｒ４はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基、グリコシル基又はアミノアシル基である）；又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ５（ここで、Ｒ５は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基又はグリコシル基である）を表す］
である式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物に関する。
【００１２】
本発明の一実施態様では、上で定義された使用のための式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩又は水和物は、アルツハイマー病の予防又は治療のために有用な少なくとも一種の追加の化合物と組み合わせられる。
【００１３】
本発明はまた、アルツハイマー病の予防又は治療に使用するための、場合によっては少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルと組み合わされて、上で定義された式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩又は水和物を活性物質として含む薬学的組成物に関する。
【００１４】
本発明の一実施態様では、上で定義された薬学的組成物は、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の追加の化合物を更に含む。
【００１５】
本発明はまた、場合によっては少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルと組み合わされて、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の追加の化合物を更に含む、上で定義された式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩又は水和物を活性物質として含む薬学的組成物に関する。
【００１６】
本発明はまた個体のアルツハイマー病の予防又は治療における同時、分離、又は逐次使用のための組み合わせ製剤として、
−  上で定義された式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩又は水和物、
−  アルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の追加の化合物
を含む製品（プロダクト）に関する。
【００１７】
本発明はまた、アルツハイマー病のリスクを低減するために使用するための、上で定義された、式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩又は水和物を含む栄養補助食品に関する。
【００１８】
本発明の一実施態様では、上で定義された栄養補助食品は、好ましくはビタミン、ミネラル、脂肪酸、アミノ酸及び抗酸化剤からなる群から選択される、追加の化合物を場合によっては含む。
【００１９】
本発明はまた、上で定義された、有効量の式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩又は水和物を個体に投与することを含む、個体におけるアルツハイマー病の予防又は治療のための方法に関する。
【００２０】
本発明の一実施態様では、上で定義された方法は、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の化合物の投与を更に含む。
【００２１】
本発明はまた、個体におけるアルツハイマー病の予防又は治療を目的とする医薬の製造のための、上で定義された式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物の使用に関する。
【００２２】
本発明の一実施態様では、上で定義された医薬は、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な少なくとも一種の化合物を更に含む。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
［式（Ｉ）の化合物］
上で定義された式（Ｉ）の化合物は、その全てが出典明示によりここに援用される、Barnett及びGrubb (2000), Tetrahedron 56: 9221-9225、Oxenford等 (2004) Tetrahedron Letters 45:9053-9055、Brooks等 (2010) Tetrahedron Letters 51: 4163-4165、Gerber等 (2012) Org. Biomol. Chem. 10: 8660-8668, the thesis by Allen Brook entitled “Synthesis of Tritium Labeled Queuine, PreQ1 and Related Azide Probes Toward Examining the Prevalence of Queuine” (2012, University of Michigan)、Akimoto等 (1986) J. Med. Chem., 29: 1749-1753、Kelly等 (2016) Nucleic Acids Research, 1-11、及び国際出願ＷＯ２０１６／０５０８０６に特に記載されているように、当業者によって容易に化学的に合成されうる。
【００２４】
簡潔に言えば、例として、キューイーンは、次の反応スキームに従って合成することができる。
2021517124.tif 000007
【００２５】
加えて、上で定義された式（Ｉ）の化合物は、天然源、例えば微生物、特に細菌から、又は植物、特にリゾビウム、メソリゾビウム、及びシノリゾビウム属の細菌などのアルファプロテオバクテリアで結節された植物から抽出され、場合によっては精製されうる。
【００２６】
例として、キューオシンは、次の通りに調製されたｔＲＮＡ、特にｔＲＮＡＡｓｎ、ｔＲＮＡＡｓｐ、ｔＲＮＡＨｉｓ及びｔＲＮＡＴｙｒから得ることができる：
［酸性条件下での全ＲＮＡの調製］
枯草菌株（又は他の関連する細菌）を、一定の通気と共に３７℃において適切なサプリメントを含むＥＤ液体培地で増殖させる。新鮮な一晩培養物を１５ｍｌのＥＤ培地に６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．１になるように播種する。細胞を３７℃においてＯＤ６００が１になるまで増殖させ、−８０℃において７０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、等量の６０％メタノールで冷却する。その後の全ての工程は低温で実施し、調製した粗ＲＮＡの溶液をジエチルピロカーボネートで処理し、滅菌する。細胞を４℃においてペレット化し、水で洗浄し、０．５ｍｌの１０％グルコース、１１ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁させる。懸濁液を、酸洗浄した０．１ｇのガラスビーズ（ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ４６４９）を含むチューブに移す。チューブを、５０ｇのドライアイスを含むＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４機器（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）のＣｏｏｌＰｒｅｐアダプターに配する。次のパラメータを使用して、３サイクル後に細胞を破壊する：４５秒間で毎秒６メートル。各サイクルの後、懸濁液を氷上に１分間保持する。１００００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、上清を新しいエッペンドルフチューブに移す。０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加し、酸性条件下で全ＲＮＡを単離する。１容量の酸フェノール：クロロホルムとイソアミルアルコール（１２５：２４：１）ｐＨ４．５（Ａｍｒｅｓｃｏ、ＡＭ９７２０）を添加する。サンプルを１０秒間ボルテックスして混合し、６５℃の水浴で３分間インキュベートする。１４０００ｒｐｍで５分間回転させることにより相を分離させ、ついで同じ熱酸フェノール手順で水性相を１回再抽出する。水性相を新しいチューブに移し、１容量の冷酸性フェノールを補充する。１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、−８０℃において１時間２．５容量の無水エタノールでＲＮＡを沈殿させる。ＲＮＡを１４０００ｒｐｍで１５分間４℃においてペレット化し、７０％エタノールで洗浄する。ＲＮＡペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に溶解させる。
【００２７】
［ｔＲＮＡの濃縮］
次に、全ＲＮＡ調製物を、０．０１ｍＭの最終濃度の酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と塩化リチウム８Ｍ（ｐＨ４．５）の１容量と混合する。このＲＮＡ溶液を−８０℃において２時間インキュベートする。１４０００ｒｐｍで１５分間、４℃において遠心分離すると、ｔＲＮＡが上清中に残った。塩分汚染を除去するために、０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と２．５容量の無水エタノールを添加してｔＲＮＡを−８０℃において１時間沈殿させる。次に、ｔＲＮＡを１４０００ｒｐｍで１５分間、４℃において遠心分離してペレット化し、７０％エタノールで洗浄する。ｔＲＮＡペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に溶解させる。
【００２８】
本発明に係るキューイーンの立体異性体は、任意のタイプでありうる。好ましくは、キューイーンの立体異性体は、ｅｎｔ−キューイーンである。
【００２９】
本発明に係る薬学的に許容される塩又は水和物は、任意のタイプのものでありうる。しかし、本発明に係る薬学的に許容される塩は塩酸塩であることが好ましい。
【００３０】
好ましくは、本発明に係るグリコシル基は、マンノシル基、ガラクトシル基又はグルタミル基からなる群から選択される。
【００３１】
好ましくは、アミノアシル基は、アラニン（ａｌａ、Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）から選択される。
【００３２】
本発明の一実施態様では、本発明に係る式（Ｉ）、特に式（ＩＩ）の置換基は一緒に連結されうる。
【００３３】
上で定義された式（Ｉ）の化合物の好ましい実施態様では、
−  Ｒ１はＨであり、かつ
−  Ｒ１２は、
・  １〜２０個の炭素原子を有するアルキル基、
・  ３〜２０個の炭素原子を有するアリール又はヘテロアリール基、
・  ３〜２０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基、
・  ヒドロキシル基、
・  １〜２０個の炭素原子を有するカルボニル又はカルボキシル基、
・  エポキシ基、
・  −Ｏ−Ｒ４基（ここで、Ｒ４はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基、グリコシル基又はアミノアシル基である）、
・  −Ｏ−ＣＯ−Ｒ５基（ここで、Ｒ５は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基又はグリコシル基である）
からなる群から選択される少なくとも一つの基によって置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又はエーテル基を表す。
【００３４】
上で定義された式（Ｉ）の化合物の別の好ましい実施態様では、
−  Ｒ１２は、次の式：
2021517124.tif 000008
｛上式中、
・  ａは二重結合又はエポキシ基を表し、かつ
・  同一又は異なるＲ２及びＲ３は、−Ｏ−Ｒ４（ここで、Ｒ４はＨ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基、グリコシル基又はアミノアシル基である）；又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ５（ここで、Ｒ５は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１２個の炭素原子を有するアリール基又はグリコシル基である）を表す｝
の基を表す。
【００３５】
上で定義された式（Ｉ）の化合物の別の好ましい実施態様では、
−  Ｒ１は、−Ｈであり、かつ
−  Ｒ１２は、ヒドロキシル基の少なくとも一つによって置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アルキル基を表す。
【００３６】
上で定義された式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物の別の好ましい実施態様では、
−  同一又は異なるＲ２及びＲ３は、−ＯＨ、−Ｏ−マンノシル基、−Ｏ−ガラクトシル基又は−Ｏ−グルタミル基を表し；
−  Ｒ６は−ＯＨを表し；
−  同一又は異なるＲ７及びＲ８は、−ＯＨ又はリボ核酸基を表す。
【００３７】
好ましくは、Ｒ７とＲ８の両方がリボ核酸基を表す場合、本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、ｔＲＮＡのリボヌクレオシドとして転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に含まれる。より好ましくは、本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、ｔＲＮＡのアンチコドンのリボヌクレオシド、最も好ましくは、アンチコドンの第１ヌクレオシド、すなわち、アンチコドンの５’ヌクレオシド又はアンチコドンのゆらぎ位置のヌクレオシドである。本発明に係る好ましいｔＲＮＡは、ｔＲＮＡＡｓｎ、ｔＲＮＡＡｓｐ、ｔＲＮＡＨｉｓ及びｔＲＮＡＴｙｒからなるリストから選択される。
【００３８】
好ましくは、上で定義された式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物は、次の式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）によって表される：
2021517124.tif 000009
2021517124.tif 000010
【００３９】
好ましくは、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）の化合物がｔＲＮＡＡｓｐに含まれる場合、Ｒ３はＯＨであり、Ｒ２はＯ−マンノースである。
【００４０】
また、好ましくは、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）の化合物がｔＲＮＡＴｙｒに含まれる場合、Ｒ３はＯＨであり、Ｒ２はＯ−ガラクトースである。
【００４１】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物、特に本発明に係る式（ＩＩ）の化合物は、次の式（ＶＩ）によって表される：
2021517124.tif 000011
【００４２】
当業者には明らかであるように、本発明に係る化合物の全ての立体化学的構成は、ここに示される式によってカバーされることが意図される。特に、ここで意図されるように、結合の立体配置が指定されていない場合、結合は、上向き結合、下向き結合、及び２つの混合結合、特に２つの１／１混合結合の何れかを表しうる。
【００４３】
従って、本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、次の式（Ｖａ）及び（Ｖｂ）によって表されるエナンチオマーなどの式（Ｖ）の化合物の光学活性形態、又はそれらの混合物、特にそれらのラセミ混合物にも関する：
2021517124.tif 000012
【００４４】
式（ＶＩａ）の化合物はキューイーンである。キューイーンはまた７−（３，４−トランス−４，５−シス−ジヒドロキシ−１−シクロペンテン−３−イルアミノメチル）−７−デアザグアニンとしても知られている。式（ＶＩｂ）の化合物はｅｎｔ−キューイーンである。
【００４５】
好ましくは、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物は、次の式（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）（ＩＸｂ）、（Ｘ）によって表される：
2021517124.tif 000013
2021517124.tif 000014
2021517124.tif 000015
2021517124.tif 000016
2021517124.tif 000017
2021517124.tif 000018
2021517124.tif 000019
【００４６】
好ましくはまた、本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、次の式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩｂ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）又は（ＸＶＩＩＩ）によって表される：
2021517124.tif 000020
2021517124.tif 000021
2021517124.tif 000022
2021517124.tif 000023
2021517124.tif 000024
【００４７】
式（ＶＩＩａ）の化合物は、７−（５−［３，４−エポキシ−２，５−ジヒドロキシシクロペント−１−イル）アミノ］メチル）−７−デアザグアニンとしても知られているエポキシキューイーンである。
【００４８】
式（ＶＩＩＩａ）の化合物は、２−アミノ−５−（｛［（１Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ジヒドロキシシクロペント−２−エン−１−イル］アミノ｝メチル）−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）−１，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンとしても知られているキューオシンである。
【００４９】
式（ＩＸａ）の化合物は、５ ７−（５−［（３，４−エポキシ−２，５−ジヒドロキシシクロペント−１−イル）アミノ］メチル）−７−デアザグアノシンとしても知られているエポキシキューオシンである。
【００５０】
好ましくは、本発明に係る式（ＩＩ）の化合物は、マンノシル−キューイーン、ガラクトシル−キューイーン、グルタミル−キューイーン、ガラクトシル−キューオシン、マンノシル−キューオシン、グルタミル−キューオシン、キューイーン−ｔＲＮＡ、及びエポキシキューイーン−ｔＲＮＡからなる群から選択される。
【００５１】
式（ＸＩＩＩ）の化合物は、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミンである。
化合物（ＸＩＶ）は、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−プロパン−１−アミンである。
化合物（ＸＶＩＩ）は、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−ブタン−１−アミンである。
化合物（ＸＶＩＩＩ）は、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−ヘキサン−１−アミンである。
【００５２】
好ましくはまた、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物は、キューイーン−ｔＲＮＡＡｓｐ、キューイーン−ｔＲＮＡＴｙｒ、エポキシキューイーン−ｔＲＮＡＡｓｐ、エポキシキューイーン−ｔＲＮＡＴｙｒ、キューイーン−ｔＲＮＡＡｓｎ、キューイーン−ｔＲＮＡＨｉｓ、エポキシキューイーン−ｔＲＮＡＡｓｎ、エポキシキューイーン−ｔＲＮＡＨｉｓ、マンノシル−キューイーン−ｔＲＮＡＡｓｐ、ガラクトシル−キューイーン−ｔＲＮＡＴｙｒ、マンノシル−エポキシキューイーン−ｔＲＮＡＡｓｐ、及びガラクトシル−エポキシキューイーン−ｔＲＮＡＴｙｒからなる群から選択される。
【００５３】
最も好ましくはまた、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物は、キューイーン、ｅｎｔ−キューイーン、キューオシン、エポキシキューイーン、エポキシキューオシン、マンノシル−キューイーン、ガラクトシル−キューイーン、グルタミル−キューイーン、ガラクトシル−キューオシン、マンノシル−キューオシン、グルタミル−キューオシン、キューイーン−ｔＲＮＡ及びエポキシキューイーン−ｔＲＮＡ、式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）及び（ＸＩＩｂ）の化合物からなる群から選択される。
【００５４】
［アルツハイマー病］
アルツハイマー病は当業者によく知られている。これは特に世界保健機関によって設定された国際疾病分類（ＩＣＤ−１０）２０１６年版の第１０改訂版のクラスＧ３０によって定義されている。加えて、アルツハイマー病は、ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ（ＤＳＭ−５）（２０１３）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの第５版（ｐ６１１−６１４）に次の診断基準によって定義されている：
Ａ．  重度又は軽度神経認知障害について基準が満たされている。
Ｂ．  一又は複数の認知領域に潜行性発症と機能障害の緩徐進行がある（重度神経認知障害の場合、少なくとも二領域が障害されていなければならない）。
Ｃ．  ｐｒｏｂａｂｌｅ又はｐｏｓｓｉｂｌｅアルツハイマー病の基準が次のように満たされている：
重度神経認知障害の場合：
次の何れかが存在する場合、ｐｒｏｂａｂｌｅアルツハイマー病が診断され；それ以外の場合は、ｐｏｓｓｉｂｌｅアルツハイマー病が診断されるべきである。
１．  家族歴又は遺伝子検査からの原因となるアルツハイマー病の遺伝子変異の証拠。
２．  次の３項目全てが該当する：
ａ．（詳細な履歴又は一連の神経心理学的検査に基づく）記憶力と学習力並びに少なくとも一つの他の認知機能の低下の明らかな証拠。
ｂ．プラトーが拡大することなく、着実に進行する、徐々の認知力の低下。
ｃ．混在病因の証拠がない（すなわち、認知機能低下に寄与する可能性がある他の神経変性もしくは脳血管疾患、又は他の神経学的、精神的、もしくは全身性疾患又は状態の欠如）。
軽度神経認知障害の場合：
遺伝子検査又は家族歴の何れかから原因となるアルツハイマー病の遺伝子変異の証拠がある場合、ｐｒｏｂａｂｌｅアルツハイマー病が診断される。
遺伝子検査又は家族歴の何れかから原因となるアルツハイマー病の遺伝子変異の証拠がなく、次の３項目全てが該当する場合、ｐｏｓｓｉｂｌｅアルツハイマー病が診断される：
１．  記憶力と学習力の低下の明確な証拠。
２．  プラトーが拡大することなく、着実に進行する、徐々の認知力の低下。
３．  混在病因の証拠がない（すなわち、認知機能低下に寄与する可能性がある他の神経変性もしくは脳血管疾患、又は他の神経学的もしくは全身性疾患又は状態の欠如）。
Ｄ．  この障害は、脳血管疾患、別の神経変性疾患、物質の影響、又は別の精神障害、神経障害、もしくは全身性障害によってうまく説明されない。
【００５５】
本発明に従って予防され又は治療されるアルツハイマー病は、特に、初期のアルツハイマー病、中期のアルツハイマー病、進行期のアルツハイマー病、前臨床アルツハイマー病、アルツハイマー病による認知症、アルツハイマー病による軽度認知障害、アルツハイマー病による軽度神経認知障害、アルツハイマー病による重度神経認知障害、ｐｒｏｂａｂｌｅアルツハイマー病、又はｐｏｓｓｉｂｌｅアルツハイマー病でありうる。
【００５６】
好ましくは、本発明に係るアルツハイマー病の予防又は治療は、特に記憶障害又は学習障害からなる群から選択される、アルツハイマー病に起因する少なくとも一つの認知障害又は神経認知障害の予防又は治療に関する。
本発明はまたアルツハイマー病の症状の予防又は治療に関する。
【００５７】
［個体］
本発明に係る個体は、好ましくはヒトである。
本発明の好ましい実施態様では、本発明に係る個体は６５歳以上である。本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に係る個体は６５歳未満である。
発明に係る個体は、認知症の一又は複数の症状を示しうるか、又は認知症を有しうる。
【００５８】
本発明に係る個体は、認知症を有していない場合がある。特に、本発明に係る個体は、認知障害、特に当業者によく知られており、特にPetersen等 (1999) Arch Neurol 56:303-308によって定義されているアングロサクソン命名の軽度認知障害（ＭＣＩ）に対応する軽度認知障害を有しうる。個体は、認知的及び全体的知的機能と日常生活の活動の完全性のセービングを伴う記憶能力の不足の客観的証拠を伴う自覚症状の場合にＭＣＩを有していると一般に定義される。好ましくは、本発明に係るＭＣＩを有する個体は、その年齢とその社会文化的レベルに応じて、５パーセンタイルに対応するスコアよりも高い、特にＧｒｏｕｐｅ ｄｅ Ｒｅｆｌｅｘｉｏｎ ｓｕｒ ｌｅｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ＣＯｇｎｉｔｉｖｅｓ（ＧＲＥＣＯ）（認知評価群に関する研究）のコンセンサス版におけるミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）スコアを有する。
その上、本発明に係る個体はまた認知障害を有していない場合がある。
【００５９】
［追加の化合物］
本発明に係るアルツハイマー病の予防又は治療に有用な追加の化合物は、当業者に知られている任意のタイプのものでありうる。好ましくは、本発明に係る追加の化合物は、ドネペジル、ガランタミン、メマンチン、及びリバスチグミンからなる群から選択される。
【００６０】
好ましくは、栄養補助食品中の追加の化合物は、ビタミン、ミネラル、脂肪酸、アミノ酸、抗酸化剤、及びそれらの誘導体又は前駆体からなる群から選択される。
【００６１】
好ましくは、ビタミンは、ピリドキシン、ピリドキサールホスフェート（ビタミンＢ６）、リボフラビン、チアミン、ビタミンＥ、ビタミンＫ３、ビタミンＣ、ナイアシン、ＣｏＱ１０及びβ−カロテンからなる群から選択される。
好ましくは、ミネラルは、カルシウム、マグネシウム、セレン及びリンからなる群から選択される。
好ましくは、アミノ酸はＬ−ＤＯＰＡ（レボドパ）である。
好ましくは、脂肪酸は、レボ−カルニチン及びアセチル−Ｌ−カルニチンからなる群から選択される。
【００６２】
［投与］
ここで意図されるところでは、「組み合わされた（combined）」又は「組み合わせて（in combination）」は、上で定義された式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物が、別の化合物又は生成物と同時に、一緒に、つまり同じ投与部位に、又は別々に、又は異なる時間に、投与されることを意味し、但し、上で定義された式（Ｉ）の化合物が個体にその効果を及ぼす期間と、追加の薬剤又は生成物が個体にその薬理学的効果を及ぼす期間とは少なくとも部分的に交差する。好ましくはまた、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩又は水和物は、０．０１〜４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／ｄ、最も好ましくは０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ／ｄの投薬レジメンで投与されるためのものか、又は投与される。
【００６３】
好ましくは、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩又は水和物は、経口経路、皮内経路、静脈内経路、筋肉内経路又は皮下経路による投与に適した形態であるか、又はそれらの経路によって投与される。好ましくは、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特に式（ＩＩ）の化合物、又はそれを含む薬学的組成物、医薬、製品又は栄養補助食品は、皮下インプラントによる投与に適した形態であるか、又はそれによって投与される。
【００６４】
好ましくは、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、又はそれを含む薬学的組成物、医薬、製品又は栄養補助食品は、粉末、小袋、錠剤、ゼラチン、カプセル、又は液体又はゲル溶液の形態である。
【００６５】
好ましくはまた、本発明に係る薬学的組成物、医薬、製品又は栄養補助食品は、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特にキューイーン、ｅｎｔ−キューイーン、キューオシン、式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、又は（ＸＩＩｂ）の化合物を、少なくとも０．１５ｍｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ又は１０００ｍｇの単位用量で含む。
【００６６】
好ましくはまた、本発明に係る薬学的組成物、医薬、製品又は栄養補助食品は、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、特にキューイーン、ｅｎｔ−キューイーン、キューオシン、式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、又は（ＸＩＩｂ）の化合物を、特に少なくとも０．１５ｍｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ又は１０００ｍｇの単位用量で含む、微生物及び／又は植物からの抽出物、特に精製抽出物を含む。
【００６７】
本発明を、次の非限定的な実施例においてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、Ａβ１−４２による中毒化後の、５通りの異なる濃度（３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、及び３μＭ）のキューイーンが皮質生存率に及ぼす効果をビヒクル群の百分率で表して示している。各値は平均±標準誤差を表す（１００％＝Ａβ１−４２なし）。（＊）はｐ＜０．０５を表す。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）が参照化合物である。
【図２】図２は、Ａβ１−４２による中毒化後の、５通りの異なる濃度（３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、及び３μＭ）のキューイーンが神経突起ネットワークに及ぼす効果をビヒクル群の百分率で表して示している。各値は平均値±標準誤差を表す（１００％＝Ａβ１−４２なし）。（＊）はｐ＜０．０５を表す。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）が参照化合物である。
【図３】図３は、Ａβ１−４２による中毒化後の、５通りの異なる濃度（３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、及び３μＭ）のキューイーンがタウ／神経突起の比率に及ぼす効果をビヒクル群の百分率で表して示している。各値は平均±標準誤差を表す（１００％＝Ａβ１−４２なし）。（＊）はｐ＜０．０５を表す。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）が参照化合物である。
【実施例】
【００６９】
実施例１：アルツハイマー病のインビトロモデルにおける本発明に係る化合物の効果の評価
この実施例の目的は、Callizot等 (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-16；Chumakov等 (2015) Nature Scientific Reports 5: 7608；Combs等 (2000) J. Neurosci. 20: 558-67；Cummings等 (1998) Neurology. 51(Suppl 1): S2-17, discussion S65-7；Harrison (1990) J. Physiol. 422: 433-446；Kawahara等 (2000) Brain Res. Bull. 53: 389-97；Pike等 (1991) Brain Res. 563: 311-4；Sakono等 (2010) FEBS J. 277: 1348-58；Singer等 (1999) J. Neurosci. 19: 2455-2463；Sisodia等 (1990) Science. 248: 492-5に従って、アミロイドβ１−４２ペプチドによる皮質ニューロンの中毒化に由来するアルツハイマー病のインビトロモデルにおいて本発明に係る化合物の効果を評価することである。
【００７０】
Ａ．材料と方法
１．皮質ニューロン培養
ラット皮質ニューロンを、 Singer等 (1999) J. Neurosci. 19: 2455-2463によって記載されているように培養する。簡潔に言えば、妊娠１５日の妊娠した雌ラットを、頸椎脱臼により殺し、胎仔を子宮から取り出す。皮質を取り出し、２％のペニシリンとストレプトマイシン（ＰＳ）及び１％のウシ血清アルブミンを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚの氷冷培地に入れる。皮質を、３７℃において２０分間のトリプシン処理（０．０５％）によって解離させる。ＤＮＡａｓｅ ＩグレードＩＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を添加することにより、反応を停止させる。次に、細胞を１０ｍｌピペットに３回通すことにより機械的に解離させる。次に、細胞を４℃において５１５×ｇで１０分間、遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットの細胞を、２％のＢ２７サプリメント、２ｍＭのＬ−グルタミン、２％のＰＳ溶液、及び１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌからなる限定培地に再懸濁させる。生細胞を、トリパンブルー排除試験を使用してＮｅｕｂａｕｅｒサイトメーターでカウントする。細胞を、ポリ−Ｄ−リジンでプレコートされた９６ウェルプレートに３００００細胞／ウェルの密度で播種し、加湿空気（９５％）／ＣＯ２（５％）雰囲気下で３７℃において培養する。
【００７１】
２．皮質ニューロンにおけるβ−アミロイド損傷後のニューロン細胞死に対するキューイーンの効果
２．１．中毒化６日前のキューイーンのインキュベーション
５日間の培養後、細胞をキューイーン（７濃度）と共にインキュベートする。キューイーンとの６日間のインキュベーション後、細胞を、キューイーンの存在下で、Callizot等 (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-16によって定義された培地中、１０μＭのアミロイドβ１−４２オリゴマーで中毒化する。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照及び参照化合物として使用する。
【００７２】
次の条件を試験する：
−  ビヒクル溶液
−  アミロイドβ１−４２、１０μＭ、２４時間
−  アミロイドβ１−４２、１０μＭ、２４時間＋ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）
−  アミロイド−β１−４２、１０μＭ、２４時間＋キューイーン（０．０００１μＭ；０．００１μＭ；０．０１μＭ；０．０３μＭ；０．１００μＭ；０．３００μＭ；１μＭ）、中毒化６日前に添加。
条件毎に６つのウェルと３つの培養を実施する。
【００７３】
２．２．中毒化２４時間前のキューイーンのインキュベーション
簡潔に言えば、１０日目にキューイーン（７濃度）を加える。２４時間後、細胞を、１０μＭのアミロイドβ１−４２で２４時間中毒化する。
【００７４】
次の条件を試験する：
−  対照培地
−  アミロイドβ１−４２、１０μＭ、２４時間
−  アミロイドβ１−４２、１０μＭ、２４時間＋ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）
−  アミロイド−β１−４２、１０μＭ、２４時間＋キューイーン（０．００１μＭ；０．０１μＭ；０．０３μＭ；０．１００μＭ；０．３００μＭ；１μＭ；３μＭ）、中毒化の２４時間前に添加。
条件毎に６つのウェルと３つの培養を実施する。
【００７５】
３．エンドポイント評価：ラット皮質ニューロンの総数の測定
中毒化の２４時間後、細胞をエタノール（９５％）と酢酸（５％）の冷溶液で５分間固定する。次に、細胞を透過処理し、０．１％のサポニンと１％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液で、室温において１５分間、非特異的部位をブロックする。次に、細胞を、モノクローナル抗体抗微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２）と共にインキュベートする。この抗体はニューロンの細胞体と神経突起を特異的に染色する。この抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧで明らかになる。ニューロンの核を、蛍光マーカー（ヘキスト溶液）で標識する。
【００７６】
ニューロン生存率を評価する（ＭＡＰ−２陽性ニューロン細胞体の数をカウントする）。
培養の各ウェルについて、２０倍の倍率でＩｎＣｅｌｌ ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウェル当たり２０枚の写真を撮る。全ての画像を同じ条件で撮る。全ての値は平均±ｓ．ｅ平均として表す。統計分析を異なる条件で行う（ＡＮＯＶＡとそれに続くダネット検定）。
キューイーンなしの状態と比較して、キューイーンと共にインキュベートしたニューロンの生存率が高いことは、キューイーンが抗アルツハイマー病特性を有していることを示している。
【００７７】
実施例２：アミロイドβ２５−３５ペプチドの投与によるアルツハイマー病マウスモデルにおける本発明に係る化合物の効果のインビボ評価
この実施例の目的は、Maurice等 (1996) Brain Res. 706:181-193；Maurice等 (1998) Neuroscience 83:413-428；Meunier等 (2006) J. Pharmacol. Exp. Ther. 317:1307-1319；Meunier等 (2013) Genome Research 23:34-45；Villard等 (2009) Neurophsychopharmacologie 34:1552-1566；Villard等 (2011) J. Psychopharmacol. 25:1101-1117によるアミロイドβ２５−３５ペプチドの投与によるアルツハイマー病マウスモデルにおける本発明に係る化合物のインビボ評価である。
【００７８】
Ａ．材料と方法
１．動物
５週齢で体重３０〜３５ｇの雄のスイスマウス（JANVIER, Saint Berthevin, France）を飼育する。動物を、行動実験中を除いて、餌と水を自由に摂取させて群で収容する。それらを、１２時間／１２時間の明／暗サイクル（午後７時に消灯）で温度と湿度が制御された動物施設に維持する。マウスに、油性マーカーペンを使用してその尾に印を付けることによって番号を付す。
【００７９】
２．プロトコル
７２匹の雄のスイスマウス（３０〜３５ｇ）を使用する。６群の動物を構成し、異なる処置に供する：
2021517124.tif 000025
【００８０】
１日目：アミロイドβ２５−３５ペプチド（Ｓｃ．Ａβ、陰性対照）又はアミロイドβ２５−３５ペプチド（Ａβ２５−３５）をスクランブル化したものを脳室内（ＩＣＶ）に注射する（Ａβ２５−３５ペプチドは細胞中毒化を引き起こす）。１日目から１０日目まで、治療剤を１日１回腹腔内（ＩＰ）投与する。
８〜１０日目に２種の異なる行動試験を使用する：
−  ８日目（ペプチド注射の７日後）のＹ迷路での自発的交替手順（空間作業記憶の評価）；
−  ９日目の訓練と１０日目の保持セッションを伴う受動回避反応（文脈的長期記憶の評価）。
行動試験後の１０日目に、動物を断頭により犠牲にする。血漿サンプルを各動物で収集する。海馬と前頭皮質を解剖し、液体窒素で凍結する。
１群当たりｎ＝６匹の動物では、一つの半海馬を使用して、比色法を使用して脂質過酸化レベルを決定する。
１群当たりｎ＝６匹の動物では、一つの半海馬を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して４種の生化学的マーカーのレベルを決定する。
他の脳構造は−８０℃で保存し、補足の生化学的アッセイに利用できる。
【００８１】
３．生成物
３．１．化合物
ドネペジルをＮａＣｌ０．９％に可溶化する
−  名称：ドネペジル
−  ＩＵＰＨＡＲ名：２−［（１−ベンジル−４−ピペリジル）メチル］−５，６−ジメトキシ−２，３−ジヒドロインデン−１−オン，塩酸塩，水和物（１：１：１）
−  ＣＡＳ：１２００１４−０６−４
−  サプライヤー：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（仏国）
−  参照：Ｄ６８２１
【００８２】
Ａβ２５−３５：
−  名称：アミロイド−βタンパク質（２５−３５）、ヒト、マウス、ラット
−  ＣＡＳ：１３１６０２−５３−４
−  サプライヤー：Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ（仏国）
−  参照：ＳＣ４８９
【００８３】
Ｓｃ．Ａβ：
−  名称：スクランブル化されたアミロイド−βタンパク質（２５−３５）、ヒト、マウス、ラット
−  ＣＡＳ：ＮＡ
−  サプライヤー：Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ（仏国）
−  参照：ＳＣ９４２
【００８４】
キューイーンは、Ｓｙｎｔｈｅｎｏｖａ ＳＡＳ（１５ ｒｕｅ Ｊ．Ｂａｐｔｉｓｔｅ Ｌａｍａｒｃｋ，１４２００ Ｈｅｒｏｕｖｉｌｌｅ Ｓａｉｎｔ Ｃｌａｉｒから得られる。
【００８５】
３．２．アミロイドペプチド投与
各マウスを２．５％のイソフルランで麻酔し、最終容量３μＬ／マウスでＡβ２５−３５ペプチド（９ｎｍｏｌ／マウス）又はＳｃ．Ａβペプチド（９ｎｍｏｌ／マウス）をＩＣＶ注射する。これらの注射は、Maurice等 (1996) Brain Res. 706:181-193；Maurice等 (1998) Neuroscience 83:413-428；Meunier等 (2006) J. Pharmacol. Exp. Ther. 317:1307-1319；Meunier等(2013) Genome Research 23:34-45；Villard等(2009) Neurophsychopharmacologie 34:1552-1566；Villard等 (2011) J. Psychopharmacol. 25:1101-1117によると、アルツハイマー病のマウスモデルを樹立するのに役立つ。
【００８６】
４．試験の実施
４．１．行動及び生化学的分析
４．１．１．自発的交替能力
８日目に、全ての動物を、空間作業記憶の指標であるＹ迷路での自発的交替能力について試験する。Ｙ迷路は灰色のポリ塩化ビニル製である。各アームは長さ４０ｃｍ、高さ１３ｃｍ、下部の幅３ｃｍ、上部の幅１０ｃｍであり、等しい角度で収束する。各マウスを片方のアームの端に置き、８分のセッション中に迷路の中を自由に移動させる。同じアームへのありうる戻りを含む一連のアームへの進入を視覚的にチェックする。交替とは、３つのアーム全てに連続して進入することと定義される。従って、最大交替数は、アーム進入の総数から２を引いたものであり、交替の割合は（実際の交替／最大交替）×１００として計算される。パラメーターには、交替の割合（記憶指数）とアーム進入の総数（探索指数）を含めた（Maurice等 (1996) Brain Res. 706:181-193；Maurice等 (1998) Neuroscience 83:413-428；Meunier等 (2006) J. Pharmacol. Exp. Ther. 317:1307-1319；Meunier等 (2013) Genome Research 23:34-45；Villard等 (2009) Neurophsychopharmacologie 34:1552-1566；Villard等 (2011) J. Psychopharmacol. 25:1101-1117）。極端な行動（交替率＜２０％又は＞９０％あるいはアーム進入数＜１０）を示す動物は計算から除外する。
【００８７】
４．１．２．受動回避試験
装置は二区画（１５×２０×１５ｃｍ高さ）のボックスで、一区画は白いポリ塩化ビニル壁で明るくされ、もう一区画は黒いポリ塩化ビニル壁とグリッド床で暗くされている。ギロチンドアが各区画を分けている。装置の４０ｃｍ上に位置させた６０Ｗランプが、実験中に白い区画を明るく照らす。スクランブル化されたフットショック（０．３ｍＡ、３秒間）を、ショックジェネレータスクランブラー（Lafayette Instruments, Lafayette, USA）を使用してグリッド床に送る。ギロチンドアは、訓練セッション中は最初は閉じる。訓練セッション中、各マウスを白い区画に置く。５秒後、ドアを上げる。マウスが暗い区画に進入し、その肢全てをグリッド床に置くと、ドアが閉じられ、フットショックが３秒間送られる。ステップスルー潜時、つまり、暗い区画に入るのに費やされた待ち時間、及び啼鳴の数を記録する。保持試験は、訓練の２４時間後に実行する。各マウスを再び白い区画に置く。５秒後、ドアを上げる。ステップスルー及びエスケープ潜時（暗い区画から再び出ることに対応）を最大３００秒まで記録する（Meunier等 (2006) J. Pharmacol. Exp. Ther. 317:1307-1319；Villard等 (2009) Neurophsychopharmacologie 34:1552-1566；Villard等 (2011) J. Psychopharmacol. 25:1101-1117）。
訓練及び保持両セッション中に１０秒未満の潜時を示した動物は、手順に応答しないとみなし、計算から除外する。
【００８８】
４．２．脂質過酸化の測定
各群の全てのマウスを断頭により犠牲にし、両方の海馬を迅速に取り出し、重量を測定し、分析するまで液体窒素に維持する。解凍後、マウス１匹当たり一つの海馬を冷メタノール（１／１０ｗ／ｖ）でホモジナイズし、１０００ｇで５分間遠心分離し、上清をエッペンドルフチューブに入れる。各ホモジネートの反応容量を１ｍＭのＦｅＳＯ４、０．２５ＭのＨ２ＳＯ４、１ｍＭのキシレノールオレンジに加え、室温において３０分間インキュベートする。５８０ｎｍ（Ａ５８０１）での吸光度を読み取った後、１０μｌのクメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）１ｍＭをサンプルに添加し、室温において３０分間インキュベートして、最大酸化レベルを決定する。吸光度は５８０ｎｍで測定する（Ａ５８０２）。脂質過酸化のレベルを、ＣＨＰＥ＝Ａ５８０１／Ａ５８０２×［ＣＨＰ（ｎｍｏｌ）］に従ってＣＨＰ当量として決定し、組織１ｍｇ当たりのＣＨＰ当量として、また対照群データ（Ｖ処置Ｓｃ．Ａβ投与マウス）の百分率として表す。
【００８９】
４．３．ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＧＦＡＰ及びカスパーゼ−３の含量をＥＬＩＳＡアッセイによって分析する。
キットは次の通りである：
・ミトコンドリア機能障害／アポトーシス
カスパーゼ−３：  サプライヤー：ＵＳＣＮＫ    参照：ＳＥＡ６２６Ｍｕ
Ｂａｘ：          サプライヤー：ＵＳＣＮＫ    参照：ＳＥＢ３４３Ｍｕ
Ｂｃｌ２：        サプライヤー：ＵＳＣＮＫ    参照：ＳＥＡ７７８Ｍｕ
・炎症過程
ＧＦＡＰ：        サプライヤー：ＵＳＣＮＫ    参照：ＳＥＡ４２５Ｍｕ
【００９０】
全てのアッセイで、Ｔｒｉｓバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で解凍した後、皮質をホモジナイズし、２０秒間、超音波処理する。遠心分離（１６１００ｇ、１５分間、４℃）後、上清を、製造元の指示に従ってＥＬＩＳＡアッセイに使用する。各アッセイでは、４５０ｎｍで吸光度を読み取り、検量線を使用してサンプル濃度を計算する。結果を、組織１ｍｇ当たりのマーカーのｐｇ又はｎｇ、かつＳｃ．Ａβ＋ビヒクル溶液のパーセントで表す。１群当たり６サンプル（ｎ＝３６／ＥＬＩＳＡキット）を二組アッセイする。
【００９１】
キューイーンを投与しなかったマウスと比較して、キューイーンを投与したマウスの試験した行動的及び生化学的特性の改善は、キューイーンが抗アルツハイマー病特性を有することを示している。
【００９２】
実施例３：アルツハイマー病のインビトロモデルにおける本発明に係る化合物の効果の評価
この実施例の目的は、Callizot等 (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-16；Chumakov等 (2015) Nature Scientific Reports 5: 7608；Combs等 (2000) J. Neurosci. 20: 558-67；Cummings等 (1998) Neurology. 51(Suppl 1): S2-17, discussion S65-7；Harrison (1990) J. Physiol. 422: 433-446；Kawahara等 (2000) Brain Res. Bull. 53: 389-97；Pike等 (1991) Brain Res. 563: 311-4；Sakono等 (2010) FEBS J. 277: 1348-58；Singer等 (1999) J. Neurosci. 19: 2455-2463；Sisodia等 (1990) Science. 248: 492-5、Jan等, (2010) Nat. Protoc., 5: 1186-1209に従って、アミロイドβ１−４２ペプチドによる皮質ニューロンの中毒化に由来するアルツハイマー病のインビトロモデルにおける本発明に係る化合物の効果を評価することである。
【００９３】
Ａ．材料と方法
１．皮質ニューロン
ラット皮質ニューロンを、変更を加えてＣａｌｌｉｚｏｔ等（２０１３）に記載されているようにして培養する。簡潔には、妊娠１５日の妊娠雌ラット（Ｗｉｓｔａｒ）を殺す。胎仔を収集し、２％のペニシリン（１００００Ｕ／ｍＬ）とストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液（ＰＳ）と１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む氷冷Ｌ１５Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地に直ちに入れる。皮質を、最終濃度０．０５％のトリプシンと０．０２％のＥＤＴＡのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で３７℃において２０分間処理する。ＤＮＡｓｅ ＩグレードＩＩ（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を添加することにより、解離を停止させる。細胞は、１０ｍｌピペットの先端を３回強制的に通過させることにより機械的に解離させる。次に、細胞を５１５×ｇで１０分間４℃において遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを、Ｂ２７サプリメントの２％溶液、２ｍｍｏｌ／リットルのＬ−グルタミン、２％のＰＳ溶液、１０ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、２％の熱不活化ウマ血清、２％の熱不活化ＦＣＳ、１ｇ／Ｌのグルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１００μＭの非必須アミノ酸を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地からなる限定培地に再懸濁させる。生細胞を、トリパンブルー排除試験を使用して、Ｎｅｕｂａｕｅｒサイトメーターでカウントする。細胞は、ポリ−Ｌ−リジンでプレコートされた９６ウェルプレート（免疫染色用）にウェル当たり４５０００個の密度で播種し、空気（９５％）−ＣＯ２（５％）インキュベーター内で３７℃において培養する。９６ウェルプレートの場合、６０ウェルのみを使用する。最初と最後の行と列のウェルは（エッジ効果を回避するために）使用しないで、滅菌水で満たす。培地は２日毎に交換する。
【００９４】
２．試験化合物及びヒトＡβ１−４２曝露
培養の１０日目に、キューイーンを培地に溶解させ、Ａβ１−４２曝露前に、初代皮質ニューロンと共に２４時間プレインキュベートする。次に、培養の１１日目に、皮質ニューロンをＡβ溶液で中毒化する。Ａβ１−４２の調製は、Ｃａｌｌｉｚｏｔ等（２０１３）によって記述された手順に従って行う。簡潔には、Ａβ１−４２ペプチドを、４０μｍｏｌ／Ｌの初期濃度で上記の限定培地に溶解させる。この溶液を暗所で３７℃において３日間穏やかに撹拌し、培地で使用濃度（５μＭ、０．５μＭのオリゴマー）に適切に希釈した後、直ぐに使用する。
Ａβ１−４２調製物を、キューイーンの存在下で対照培地で希釈して５μＭ（０．５μＭのオリゴマー、ＡβＯ）の最終濃度まで７２時間添加する。
【００９５】
３．培養プレートの構成
各化合物を、９６ウェルプレートでの１培養で試験する（条件毎に６ウェル）。９６ウェルプレートの場合、６０ウェルのみを使用する。最初と最後の行と列のウェルは（エッジ効果を回避するために）使用せず、滅菌水で満たす。キューイーンをＡβ１−４２適用の２４時間前に添加する。次の条件を評価する：
2021517124.tif 000026
【００９６】
４．評価
４．１．免疫染色
Ａβ１−４２適用から７２時間後、細胞培養上清をサイトカイン定量化（例えばＴＮＦα）のために収集し、皮質ニューロンを、エタノール（９５％）と酢酸（５％）の冷溶液で−２０℃において５分間固定する。０．１％のサポニンで透過処理した後、細胞を以下のものと共に２時間インキュベートする：
ａ）１％のウシ胎仔血清と０．１％のサポニンを含むＰＢＳで１／１０００に希釈したニワトリポリクローナル抗体抗微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）（この抗体は細胞体と神経突起を特異的に染色し、ニューロン細胞死及び神経突起ネットワークの研究を可能にする）。
ｂ）１％のウシ胎仔血清と０．１％のサポニンを含むＰＢＳで１／１００に希釈したマウスモノクローナル抗タウ蛍光体（Ｔｈｒ２１２，Ｓｅｒ２１４）。
ｃ）１％のウシ胎仔血清と０．１％のサポニンを含むＰＢＳで１／４００に希釈したウサギポリクローナル抗体抗ＳＩＲＰアルファ／ＣＤ１７２ａ（この抗体はミクログリアを特異的に染色し、ミクログリア細胞の活性化を評価することができる）。
【００９７】
これらの抗体は、１％のＦＣＳ、０．１％のサポニンを含むＰＢＳで１／４００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒと結合させた二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧ及びヤギ抗ニワトリＩｇＧで室温において１時間暴露される。
【００９８】
各条件に対して、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して２０倍の倍率で３０枚の写真／ウェル（全ウェル領域を表す）を自動的に撮影する。全ての画像は同じ条件で自動的に取得される。次の分析は、カスタムモジュールエディター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で実施する：
−  ニューロンの総生存率（ＭＡＰ−２陽性ニューロンの数）
−  総神経突起ネットワーク（ＭＡＰ−２陽性神経突起の長さ）
−  ニューロン細胞質におけるタウの過剰リン酸化（ＡＴ１００、重複するタウ／ＭＡＰ−２、重複のμｍ２）
−  総ミクログリア活性化（ミクログリア細胞の面積、ＯＸ−４１染色のμｍ２）。
【００９９】
４．２  ＴＮＦ−αの評価
細胞培養におけるミクログリアの活性化を評価するために、ＴＮＦ−αのレベルを、ＥＬＩＳＡによって７２時間後（培養の終わり）の細胞培養上清で定量化する。
【０１００】
５．統計分析
全ての値は平均＋／−ＳＥＭとして表す。統計分析は、一元配置分散分析、続いてダネット又はＰＬＳＤフィッシャー検定によって実施する。ｐ＜０．０５は有意であると考えられる。
【０１０１】
６．結果
図１は、対照条件と比較して、ペプチドＡβ１−４２（５μＭ）の存在下で皮質ニューロンの数が有意に減少することを示している。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は、ＭＡＰ−２のニューロン染色レベルを回復させる。
キューイーンは、Ａβ１−４２ペプチドで中毒化した皮質ニューロンに対して神経保護効果を有している。実際、キューイーンは１００ｎＭ（＊、ｐ＜０．０５）、３００ｎＭ（＊、ｐ＜０．０５）及び１μＭ（＊、ｐ＜０．０５）でニューロンの生存率を有意に回復させる。
【０１０２】
図２は、対照条件と比較して、ペプチドＡβ１−４２（５μＭ）の存在下で神経突起ネットワークが減少することを示している。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は、神経突起ネットワークを回復させる。キューイーンは、Ａβ１−４２ペプチドで中毒化したニューロンに対して神経保護効果を有している。実際、キューイーンは３００ｎＭ（＊、ｐ＜０．０５）、１μＭ（＊、ｐ＜０．０５）及び３μＭ（＊、ｐ＜０．０５）で神経突起ネットワークを有意に回復させる。
【０１０３】
図３は、ペプチドＡβ１−４２（５μＭ）がタウ過剰リン酸化の有意な増加を誘導することを示している。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は、タウ過剰リン酸化を減少させる。１００ｎＭ（＊、ｐ＜０．０５）、３００ｎＭ（＊、ｐ＜０．０５）、及び１μＭ（＊、ｐ＜０．０５）及び３μＭ（＊、ｐ＜０．０５）のキューイーンがタウの過剰リン酸化のレベルを回復させる。
【０１０４】
ＴＮＦ−α評価の結果を次の表１に示す：
2021517124.tif 000027
【０１０５】
表１は、ペプチドＡβ１−４２（５μＭ）がＴＮＦαの有意な増加を誘導することを示している。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）はＴＮＦαのレベルを低下させる。３００ｎＭ（＊、ｐ＜０．０５）、１μＭ（＊、ｐ＜０．０５）、及び３μＭ（＊、ｐ＜０．０５）のキューイーンは、ＴＮＦαのレベルを回復させる。
【図１】
2021517124.tif 000040
【図２】
2021517124.tif 000041
【図３】
2021517124.tif 000042
【国際調査報告】
2021517124.tif 000043
2021517124.tif 000044
2021517124.tif 000045