(57)【要約】  本発明は、ａ）  架橋剤と二糖単位の充填比（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）が０．１５未満である、第一のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を第一の架橋剤と架橋してゲルを生成する工程；ｂ）  工程ａ）からゲルの粒子を調製する工程；ｃ）  工程ｂ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子を第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と混合して混合物を提供する工程；ｄ）  工程ｃ）の混合物を第二の架橋剤で架橋して、第二の外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）間の架橋を取得し、それによって、第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む第二の外相のゲルに埋め込まれた、架橋したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を有するゲルを提供する工程；およびｅ）  工程ｄ）からの注入可能なゲルの粒子を調製する工程を含む、注入可能なゲル製品を製造する方法を提供する。そのような各粒子は、第一の内相の複数の架橋ＧＡＧゲル粒子を含む。本発明はさらに、注入可能なゲル製品、水性組成物、およびプレフィルドシリンジを提供する。
2021506869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  二糖単位に対する架橋剤の充填比（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）が０．１５未満である、第一のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を第一の架橋剤と架橋してゲルを生成する工程；
ｂ）  工程ａ）からゲルの粒子を調製する工程；
ｃ）  工程ｂ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子を第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と混合して混合物を提供する工程；
ｄ）  工程ｃ）の混合物を第二の架橋剤で架橋して、第二の外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）間の架橋を取得し、それによって、第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む第二の外相のゲルに埋め込まれた、架橋したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を有するゲルを提供する工程、および
ｅ）  工程ｄ）からのゲルの注入可能な粒子を調製し、そのような各粒子は、第一の内相の複数の架橋ＧＡＧゲル粒子を含む工程
を含む、注入可能なゲル製品を製造する方法。
【請求項２】
前記工程ｄ）における二糖単位に対する架橋剤の充填比（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）は、前記工程ａ）の充填比（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）よりも小さい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｄ）における二糖単位に対する架橋剤の充填比（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）は、０．０５未満である、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｄ）の架橋は、第一の内相と第一の外相のゲル間の架橋を得ることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ｃ）は、前記工程ｂ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子を第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と乾燥状態で混合することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｂ）の粒子を調製する工程は、前記工程ａ）のゲルから調製された粒子を沈殿させ、乾燥させることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ｃ）で提供される混合物は、乾燥重量で少なくとも５０％の前記工程ｂ）で得られたＧＡＧゲル粒子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ａ）および／または工程ｂ）における架橋は、エーテル結合をもたらす、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程ａ）および／または工程ｂ）における架橋は、ＧＡＧ分子が、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖からなる群から選択されるスペーサー基を含む架橋を介して共有結合的に架橋される結果となる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記架橋の少なくとも７５％は、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖からなる群から選択されるスペーサー基を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スペーサー基は、ヒアルロン酸四糖、ヒアルロン酸六糖、トレハロース、ラクトース、マルトース、スクロース、セロビオースまたはラフィノース残基である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記スペーサー基は、二糖、三糖、および四糖からなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記グリコサミノグリカン分子と架橋との間の結合の少なくとも９０％がアミド結合である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記グリコサミノグリカン分子と架橋との間の結合の５％未満がエステル結合である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲルの第二の外相に埋め込まれた複数の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を含む、注入可能なゲル製品であって；
ここで、前記第二の外相は粒子の形態である；
ここで、前記第一の内相のゲルの修飾度（ＭｏＤ）は０．１５以下である、および
ここで、前記第二の外相のゲルのＭｏＤは、前記第一の内相のゲルのＭｏＤより低い、および
ここで、ＭｏＤは、反復ＧＡＧ二糖単位の総モル量に対する、結合した架橋剤のモル量である、注入可能なゲル製品。
【請求項１６】
第二の外相のゲルの修飾度（ＭｏＤ）は、０．１０以下である、請求項１５に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項１７】
第二の外相のゲルの膨張係数（ＳｗＦ）は、３．０を超える、請求項１５または１６に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項１８】
前記第一の内相および前記第二の外相のゲルは、互いに架橋されている、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項１９】
前記修飾度（ＭｏＤ）は、第二の外相全体で実質的に均一であり、第一の内相全体で実質的に均一である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２０】
前記外側のゲル粒子の大きさは、前記内側の粒子の大きさの少なくとも３倍である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２１】
前記第一の内相の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の乾燥重量含有量は、内相および外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の総乾燥重量含有量の少なくとも５０％である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２２】
前記グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）はヒアルロン酸である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２３】
前記架橋はエーテル結合である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２４】
前記第一の内相のグリコサミノグリカン分子および／または第二の外相のグリコサミノグリカン分子は、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖からなる群から選択されるスペーサー基を含む架橋を介して共有結合により架橋されている、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２５】
前記架橋の少なくとも７５％は、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖からなる群から選択されるスペーサー基を含む、請求項２４に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２６】
前記スペーサー基は、ヒアルロン酸四糖、ヒアルロン酸六糖、トレハロース、ラクトース、マルトース、スクロース、セロビオースまたはラフィノース残基である、請求項２４または２５に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２７】
前記スペーサー基は、二糖、三糖、および四糖からなる群から選択される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２８】
前記グリコサミノグリカン分子と架橋との間の結合の少なくとも９０％がアミド結合である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項２９】
前記グリコサミノグリカン分子と架橋との間の結合の５％未満はエステル結合である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品、および任意に緩衝液を含む、水性組成物。
【請求項３１】
請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の注入可能なゲル製品が予め充填され、次いで滅菌される、または請求項３０に記載の滅菌された水性組成物が予め充填された、プレフィルドシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖ゲルの分野に関する。より具体的には、本発明は、美容整形で使用するための注入可能なゲル製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療用途で最も広く使用されている生体適合性ポリマーの一つはヒアルロン酸である。これは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の群に属する天然多糖である。ヒアルロン酸（ＨＡ）および他のＧＡＧは負に帯電したヘテロ多糖鎖であり、大量の水を吸収する能力を有する。ヒアルロン酸およびヒアルロン酸に由来する製品は、たとえば、粘弾性外科手術（ｖｉｓｃｏｓｕｒｇｅｒｙ）中および皮膚充填剤として、生物医学および美容の分野で広く使用されている。
【０００３】
注入可能なフィラーとして使用される場合、堅く、密に架橋された材料は、「リフティング能力」と呼ばれる、より強い臨床効果を有するとしばしば考えられている。また、これらの材料は、組織内で長い寿命を有しうることも示唆されている。同時に、非常に堅い材料は、望ましくない組織反応、たとえば異物拒絶反応を引き起こす場合があると疑われているが、軟らかい材料は、この意味で問題が少ないと考えられている。
【０００４】
欧州特許第４６６  ３００  Ａ２号は、第一相がポリマーの粘弾性溶液の第二相に分散した膨潤したポリマーゲル粒子を含む、二相ゲルスラリーを開示している。
【０００５】
米国特許第２００７／０１９６４２６  Ａ１号は、架橋が少なくなる（ｌｅｓｓ  ａｎｄ  ｌｅｓｓ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ）ゲル、すなわち架橋の量が徐々に減少するゲルによって相互接続された多くの協力に架橋されたハブを含む架橋ゲルを開示している。
【０００６】
米国特許第２０１６／０１４３９４３  Ａ１号は、中心から表面に向かって膨潤能力が徐々に増加するコアシェルＨＡゲル粒子を開示している。
【０００７】
欧州特許出願第０２０１１８１６  Ａ１号は、わずかに架橋されたゲルに結合された、高度に架橋されたゲル粒子を有する共架橋された注入可能なゲルを開示している。目的は、注入後の二重のアクション；第一の即時充填、および二番目の段階では、わずかに架橋されたゲルが組織で生分解される際に高度に架橋された粒子に対する穏やかな異物反応に続く線維芽細胞の再活性化現象を提供することである。
【発明の概要】
【０００８】
グリコサミノグリカンフィラー材料、たとえばヒアルロン酸は、細い針から注入できるように小さい粒子で構成されている。本発明者らは、粒子が組織に注入されると、粒子が互いに分散し（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅ）、ある程度分離するため、注入のために堅い材料と軟らかいフィラー材料を混合するだけでは、生体内で二重機能性を提供しないことを見出した。したがって、堅い粒子および軟らかい粒子の混合物で構成される注入可能な材料を使用する場合、軟らかい粒子と堅い粒子が分離し、最終的に異なる場所に行きつくため、組織は注入時にすぐに堅い粒子に曝される可能性がある。
【０００９】
本発明の目的は、フィラー材料のリフティング能力を改善することである。以下の開示から当業者に明らかとなるこの目的および他の目的のために、本発明は、第一の態様に従って、架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲルの第二の外相に埋め込まれた複数の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を含み；
ここで、前記第二の外相は粒子の形態である；
ここで、前記第一の内相のゲルの修飾度（ＭｏＤ）は０．１５以下である、および
ここで、前記第二の外相のゲルのＭｏＤは、前記第一の内相のゲルのＭｏＤより低い、および
ここで、ＭｏＤは、反復ＧＡＧ二糖単位の総モル量に対する、結合した架橋剤のモル量である、
注入可能なゲル製品を提供する。
【００１０】
本発明の第一の態様は、注入可能なゲル製品では、組織内の粒子の分布に関係なく、各粒子が組織に対して軟質材料として存在し、それにより組織反応が少なくなるという見識に基づく。軟らかい外相は時間とともに分解するため、内相の分解は比較的少なくなる。時間とともに、外相は、組織液によって溶解されて注入部位から運び去られる程度にまで分解される。この間に、最初は内側のより堅い相の材料がより軟らかい材料まで分解するため、注入部位に残った材料は、最初の内相の材料よりも軟らかくなる。これにより、埋め込まれた材料が組織内で機能する第二の期間を提供できるようになり、堅さが減少するために組織の反応が少なくなる。言い換えると、外側のゲルが軟らかくなるように内側のゲルと外側のゲルの堅さを選択することにより、組織は最初に外側の軟らかいゲルに曝されうるが、このゲルはゆっくりと分解されるため、組織は最終的に外側のゲルの分解中に柔らかくなった最初はより堅い内側のゲルに曝される、すなわち、内側のゲルは、組織が内側のゲルと直接接触する前に、生体内で膨潤することが許容されている。
【００１１】
さらに、注入可能なゲル製品は、組織が、より長い期間の間に、たとえば、膨潤または堅さに関して同様の特性を有するゲルに曝されるように調製されうる。したがって、特定の用途では、外側のゲルの分解後、露出した内側のゲルが最初の外側のゲルと同じくらい軟らかいことが望ましい場合がある。しかしながら、他の用途では、露出した内側のゲルは、最初の外側のゲルほど軟らかくなくてもよい。内側のゲルの露出が大幅に遅延し、長時間にわたって発生するため、組織反応は、堅いゲルを直接注入する場合よりもはるかに弱い場合がある。
【００１２】
本発明は、第二の態様に従って、下記の工程を含む、注入可能なゲル製品を製造する方法をさらに提供する：
ａ）  二糖単位に対する架橋剤の充填比（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）が０．１５未満である、第一のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を第一の架橋剤と架橋してゲルを生成する工程；
ｂ）  工程ａ）からゲルの粒子を調製する工程；
ｃ）  工程ｂ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子を第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と混合して混合物を提供する工程；
ｄ）  工程ｃ）の混合物を第二の架橋剤で架橋して、第二の外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）間の架橋を取得し、それによって、第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む第二の外相のゲルに埋め込まれた、架橋したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を有するゲルを提供する工程、および
ｅ）  工程ｄ）からのゲルの注入可能な粒子を調製し、そのような各粒子は、第一の内相の複数の架橋ＧＡＧゲル粒子を含む工程。
【００１３】
本発明の第三の態様として、上記の本発明の第一の態様による注入可能なゲル製品、および任意に緩衝剤を含む水性組成物が提供される。
【００１４】
さらに、本発明の第四の態様として、上記の本発明の第一の態様による注入可能なゲル製品を予め充填し、次いで滅菌したか、または本発明の第三の態様による滅菌した水性組成物を事前に充填した、プレフィルドシリンジが提供される。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の第一の態様として、架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲルの第二の外相に埋め込まれた複数の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を含み；
ここで、前記第二の外相は粒子の形態である；
ここで、前記第一の内相のゲルの修飾度（ＭｏＤ）は０．１５以下である、および
ここで、前記第二の外相のゲルのＭｏＤは、前記第一の内相のゲルのＭｏＤより低い、および
ここで、ＭｏＤは、反復ＧＡＧ二糖単位の総モル量に対する、結合した架橋剤のモル量である、
注入可能なゲル製品が提供される。
【００１６】
注入可能なゲル製品は、一般に美容整形で必要とされるような、細い直径の針を有するシリンジなどのシリンジを介して流れ、注入することができるゲルを指す。針は、２７型のゲージでもよい。したがって、注入可能なゲル製品は、シリンジに包装する準備ができている場合がある。
【００１７】
注入可能なゲル製品は、二相性、すなわち、第二の外側ゲル相に埋め込まれた複数のゲル粒子を含む第一の内相を含むと見なすことができる。内相は、より高い濃度のＧＡＧを有し、より堅く、および／またはより高い程度の架橋を有しうる。
【００１８】
注入可能なゲル製品は、たとえば国際公開第１１０８６４５８  Ａ１号に定義されているように、粘着性であっても、または粘着性を示してもよい。
【００１９】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は負に帯電したヘテロ多糖鎖であり、大量の水を吸収する能力がある。ＧＡＧは、たとえば、硫酸化または非硫酸化グリコサミノグリカン、たとえばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパロサン、ヘパリン、デルマタン硫酸、およびケラタン硫酸であってもよい。一部の実施形態では、ＧＡＧはヒアルロン酸、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸である。
【００２０】
内相および／または外相のゲルは、ヒドロゲルであってもよい。すなわち、それらは、液体、典型的には水性液体に曝されたとき、非水溶性であるが実質的に希薄な、架橋されたＧＡＧ分子の系と見なすことができる。
【００２１】
第一の内相のゲルと第二の外相のゲルは架橋されている。したがって、ゲルは、共有架橋結合、ＧＡＧ鎖の物理的な絡み合い、および様々な相互作用、たとえば水素結合、ファンデルワールス力、および静電相互作用によって結合された、ＧＡＧ分子の連続した形状のネットワークを構成する。
【００２２】
修飾度（ＭｏＤ）は、架橋度の尺度である。ＭｏＤは、モル／モル、無次元数、またはモル％としてあらわされる。ＭｏＤは、ＧＡＧに結合している一つ以上の架橋剤の量、すなわち、反復ＧＡＧ二糖単位の総モル量に対する、一つ以上の結合した架橋剤のモル量を表す。したがって、ＭｏＤは、ＧＡＧが架橋剤によって化学修飾されている度合いを反映している。
【００２３】
架橋度を測定するための別の量は、充填比、すなわち、反応容器に添加される架橋剤の数と、架橋反応を行うときに反応容器に添加される二糖単位の総数との間の比である。
【００２４】
一例として、ゲル製品の架橋度は、第一の内相と第二の外相の両方のゲルを調製するとき、充填比が０．１未満、好ましくは０．０２以下であるようなものであってもよい。
【００２５】
第一の内相のゲルおよび第二の外相のゲルは、さらに粒子の形態、すなわち、規則的または不規則な任意のタイプの形状を有しうる断片の形態である。サイズは不均一であってもよく、すなわち、ゲル製品は異なるサイズの粒子を含んでもよい。さらに、外相のゲル粒子は、複数の内側のゲル粒子を含む。言い換えれば、外側のゲルの粒子サイズは内側のゲルの粒子サイズより大きい。
【００２６】
第二の外相のゲル粒子は、０．１  ｍｍ以上のサイズを有してもよい。
【００２７】
本発明の第一の態様は、密に架橋された、したがって堅い材料を、軽く架橋された、したがって軟らかい材料に埋め込むと、組織内により強力なリフティング能力をもたらすという見識に基づく。しかしながら、本発明者らは、内相のゲルにおいて０．１５未満のＭｏＤを有し、外相のゲルにおいてさらに低いＭｏＤを有することは、組み合わせゲルを注入に理想的にするという点で有利であることを見出した。したがって、本発明のゲル製品は、注入時にほとんど組織反応を引き起こさないほど十分に軟らかい。時間とともに、軟質材料は組織液によって溶解されて注入部位から運び去られる程度にまで分解される。ＭｏＤが０．１５未満であるため、この間に、最初はより堅い内部材料がより軟らかい材料まで分解する。したがって、注入部位に残った材料は、最初の堅い材料よりも軟らかくなる。これにより、埋め込まれた材料が組織内で機能する第二の期間を提供できるようになり、組織の反応が少なくなるために硬度が低下する。言い換えると、内相のゲルのＭｏＤが０．１５未満であり、外相のゲルのＭｏＤはさらに低いため、組織は長期間にわたって軟らかいゲルに曝される。
【００２８】
複数の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子自体の第一の内相は、さらなる相、たとえば複数の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相に埋め込まれた小さな粒子を含んでもよく、そのようなより小さな粒子は、その中に埋め込まれたさらにより小さな粒子を有しうることを理解されたい。
【００２９】
実施形態では、第一の内相のゲルの修飾度（ＭｏＤ）は、０．１０以下、たとえば０．０５以下、たとえば０．０２以下である。
【００３０】
実施形態では、第二の外相のゲルの修飾度（ＭｏＤ）は、０．１０以下である。このような軟らかさを備えたゲルは、注入後の組織との接触に適している場合がある。
【００３１】
しかしながら、第二の外相のＭｏＤは、０．０５を超えてもよく、たとえば、０．０５を超えるが、内相のゲルのＭｏＤよりも小さい。一例として、第二の外相のゲルのＭｏＤは、０．０８〜０．０９５の間であってもよい。そのようなＭｏＤを有するゲルは、粘着性ゲルとしてまとまる（ｈｏｌｄ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ）のに十分に堅いが、それでも注入時に軟らかく知覚されることが見出されている。
【００３２】
架橋ＧＡＧゲル製品の関連する物理的特性は、ゲルが吸収できる液体の容量であり、しばしばゲル強度または硬度と呼ばれる、ゲルの構造安定性に関連している。液体吸収の従来の表現は、膨潤、膨潤能力、液体保持能力、膨潤度、膨張係数、最大の液体取り込みおよび最大の膨潤である。本明細書全体で、膨張係数（ＳｗＦ）という用語を使用する。
【００３３】
ゲルが非沈殿条件に曝されている場合、その膨張係数、または逆にその最小濃度（Ｃmin）、すなわちゲル製品が完全に膨潤したときのＧＡＧ濃度を決定することができる。さらに液体を追加しても、ゲルがさらに希釈されることはない。すなわち、ゲルは、遊離分子の溶液のように無制限に希釈することはできない。より堅い（低膨潤性）ゲルは、一般に、軟らかい（高膨潤性）ゲルよりもｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が長いと予想されている。
【００３４】
実施形態では、第二の外相のゲルの膨張係数（ＳｗＦ）は、３．０を超え、たとえば４．０を超える。そのようなゲルは、組織にとって軟らかく感じられる可能性がある。
【００３５】
しかしながら、第二の外相のゲルの膨張係数は、依然として１０．０未満、すなわち３．０〜１０．０の間、たとえば３．０〜５．０の間でありうる。そのような膨張係数を有するゲルは、軟らかく感じることができるほど十分に軟らかく、外側のゲルの粒子サイズ減少（ＰＳＲ）後等の製造中にゲルに埋め込まれた複数の内側のゲル粒子を保持するのに十分に堅くてもよい。ＰＳＲは、ゲルをグリッドを通して押し出し、それにより、ゲルをグリッドの貫通孔に対応する平均粒子サイズを有する粒子に砕くプロセスである。
【００３６】
実施形態では、第一の内相および第二の外相のゲルは、互いに架橋されている。
【００３７】
したがって、内側のゲル粒子が外側のゲルに分散しているのとは対照的に、ゲルを互いに架橋して（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｅｄ）、単一の凝集性ゲルを形成することができる。内側と外側のゲル間の架橋は、外側のゲルを架橋しながら行うことができる。これは、注入後に外側のゲルが完全に溶解する前に、内側のゲル粒子が外側のゲルから分離するのを防ぐことができるという点で有利でありうる。
【００３８】
実施形態では、修飾度（ＭｏＤ）は、第二の外相全体にわたって実質的に均質であり、第一の内相全体にわたって実質的に均質である。
【００３９】
したがって、架橋の程度は、両方のゲル相において実質的に均一であってもよく、たとえば、ゲルの中心から外向きの方向で見た場合に一定でありうる。したがって、これは、ゲル内で架橋度が変化するゲルとは対照的である。
【００４０】
外部ゲル粒子は、少なくとも５つの内側のゲル粒子、たとえば少なくとも１０個の内側のゲル粒子、たとえば少なくとも２０個の内側のゲル粒子を含んでもよい。
【００４１】
実施形態では、外側のゲルの粒子サイズは、内側の粒径の大きさの少なくとも３倍である。
【００４２】
さらに、内側の粒子は、０．２００  ｍｍ未満の平均的大きさを有してもよい。
【００４３】
実施形態では、第一の内相の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の乾燥重量含有量は、内相および外相中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の総乾燥重量含有量の少なくとも２５％、たとえば内相および外相におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の総乾燥重量含有量の少なくとも５０％である。
【００４４】
そのようなゲルは、生体内で初期の軟らかさを提供するのに十分に軟らかくてもよいが、外側のゲルが溶解すると、第二の機能を提供するのに十分に高い内側の粒子含量を有する。
【００４５】
一例として、第一の内相の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の乾燥重量含有量は、内相および外相中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の総乾燥重量含有量の少なくとも６０％であってもよい。
【００４６】
さらなる例として、第一の内相の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の乾燥重量含有量は、内相および外相中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の総乾燥重量含有量の６５％〜９５％の間であってもよい。
【００４７】
実施形態では、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）はヒアルロン酸である。
【００４８】
特に明記しない限り、用語「ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）」は、様々な鎖長および電荷状態、ならびに様々な化学修飾のヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）またはヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）のすべてのバリアントおよびバリアントの組み合わせを包含する。つまり、この用語はヒアルロン酸の様々なヒアルロン酸塩、たとえばヒアルロン酸ナトリウムも包含する。ヒアルロン酸の様々な修飾、たとえば酸化、例としてＣＨ2ＯＨ基のＣＯＯＨへの酸化；ビシナルヒドロキシル基の過ヨウ素酸酸化、任意にそれに続く還元またはイミン形成等；還元、たとえばＣＯＯＨのＣＨ2ＯＨへの還元；硫酸化；脱アミド化、任意にそれに続く新しい酸による脱アミノ化またはアミド形成；エステル化；たとえば、架橋剤またはカルボジイミドを使用する、様々な化合物での置換；異なる分子、たとえばタンパク質、ペプチド、および活性薬物成分のヒアルロン酸への結合を含む；および脱アセチル化も前記用語に包含される。
【００４９】
一例として、ヒアルロン酸は、０．１〜１０  ＭＤａ、好ましくは０．８〜５  ＭＤａ、より好ましくは０．８〜１．２  ＭＤａの範囲の平均分子量を有する、化学的に修飾されていないヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウムであってもよい。ヒアルロン酸は、非動物起源、好ましくは細菌から得られることが好ましい。
【００５０】
一部の実施形態では、内側および／または外側のゲルの架橋は、ジビニルスルホン、マルチエポキシド（ｍｕｌｔｉｅｐｏｘｉｄｅ）およびジエポキシドからなる群から個別に選択される一つまたは複数の多官能性架橋剤を使用して行われる。特定の実施形態では、多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなる群から個別に選択される。特定の実施形態では、多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である。
【００５１】
したがって、実施形態では、架橋はエーテル結合である。
【００５２】
実施形態では、グリコサミノグリカンの架橋は、グリコサミノグリカン分子のアミドカップリングによって達成される。アミドカップリングは、二求核剤（ｄｉｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）または多求核剤（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）の官能性架橋剤を使用して行うことができる。
【００５３】
カップリング剤と共にジアミン官能性架橋剤またはマルチアミン官能性架橋剤を使用するアミドカップリングは、本発明において有用な架橋グリコサミノグリカン分子を調製するための魅力的な経路である。
【００５４】
架橋は、非炭水化物ベースの二求核剤または多求核剤の架橋剤、たとえばヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）、または炭水化物ベースの二求核剤または多求核剤の架橋剤、たとえばジアミノトレハロース（ＤＡＴＨ）とグリコサミノグリカンを一緒に使用して得られる。
【００５５】
したがって、少なくとも二つの求核性官能基を含む架橋剤は、たとえば、非炭水化物ベースの二求核性架橋剤または多求核性架橋剤、または炭水化物ベースの二求核性架橋剤または多求核性架橋剤であってもよい。
【００５６】
二求核剤または多求核剤官能性架橋剤の好ましい群は、ホモまたはヘテロ二官能性一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、カルバゼート（ｃａｒｂａｚａｔｅ）、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼート（ｔｈｉｏｃａｒｂａｚａｔｅ）およびアミノキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）を含む。
【００５７】
二求核剤または多求核剤官能性二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖は、求核剤官能性多糖、たとえばキチンに由来するキトビオースに由来してもよい。二求核剤または多求核剤官能性二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖は、また、二つ以上の求核剤官能基の導入により修飾された二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖であってもよい。
【００５８】
炭水化物ベースの二求核性架橋剤または多求核性架橋剤は、完全に炭水化物タイプの構造またはその誘導体に基づくヒドロゲル製品を提供し、グリコサミノグリカンの本来の特性に対する架橋の妨害を最小限にするため、有利でありうる。架橋剤自体も、たとえば、ヒアルロン酸に関連する構造と架橋する場合、または高い保水性の構造と架橋する場合、ヒドロゲルの持続または増加した特性に寄与しうる。
【００５９】
実施形態では、二求核剤または多求核剤の架橋剤は、少なくとも部分的に脱アセチル化された多糖、すなわち、遊離アミン基を有する多糖を提供するために少なくとも部分的に脱アセチル化されたアセチル化多糖である。少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンは、単独で、または第二のグリコサミノグリカンと組み合わせて架橋することができ、それによって脱アセチル化グリコサミノグリカン自体が二求核剤または多求核剤の架橋剤として機能する。
【００６０】
本発明の第一の態様の実施形態では、第一の内相のグリコサミノグリカン分子および／または第二の外相のグリコサミノグリカン分子は、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖からなる群から選択されるスペーサー基を含む架橋を介して共有結合により架橋される。
【００６１】
架橋は、典型的には、ｉ）スペーサー基、およびｉｉ）架橋剤の官能基とＧＡＧ上のカルボン酸基との反応により形成される結合基からなる。スペーサー基は、たとえば、ヒアルロン酸四糖、ヒアルロン酸六糖、トレハロース、ラクトース、マルトース、スクロース、セロビオースまたはラフィノース残基を含んでもよい。
【００６２】
二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖からなる群から選択されたスペーサー基を含む架橋剤による架橋は、完全に炭水化物タイプの構造またはその誘導体に基づくヒドロゲル製品を提供し、グリコサミノグリカンの本来の特性に対する架橋の妨害を最小限にする。糖、三糖、四糖、またはオリゴ糖は、好ましくは、構造および分子量に関して明確に定義されている。好ましくは、スペーサーは、特定の二糖、三糖、四糖、またはオリゴ糖構造から選択される。好ましくは、二糖、三糖、四糖、またはオリゴ糖は、単分散であるか、または狭い分子量分布を有する。明確に定義された二糖、三糖、四糖、またはオリゴ糖ベースの架橋剤と高効率の縮合反応を併用することで、制御された方法で製品を構築する（ａｓｓｅｍｂｌｅ）ことができる。架橋剤自体も、たとえばヒアルロン酸に関連する構造（たとえば、ジアミノヒアルロン酸四糖）と架橋する場合、または高い保水性を有する構造（たとえば、トレハロース）と架橋する場合、ヒドロゲルの持続または増加した特性に寄与しうる。
【００６３】
一例として、架橋の少なくとも７５％は、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖からなる群から選択されるスペーサー基を含んでもよい。
【００６４】
さらに、スペーサー基は、ヒアルロン酸四糖、ヒアルロン酸六糖、トレハロース、ラクトース、マルトース、スクロース、セロビオースまたはラフィノース残基であってもよい。
【００６５】
さらに、スペーサー基は、二糖、三糖および四糖からなる群から選択されてもよい。
【００６６】
本発明の第一の態様の実施形態では、グリコサミノグリカン分子と架橋との間の結合の少なくとも９０％は、アミド結合である。
【００６７】
さらに、グリコサミノグリカン分子と架橋との間の結合の５％未満は、エステル結合であってもよい。
【００６８】
第一および／または第二のグリコサミノグリカンは、ペプチドカップリング剤を使用してさらに架橋されてもよい。ペプチドカップリング剤を使用した架橋は、グリコサミノグリカン分子の分解を最小限に抑えて中性ｐＨで架橋できるため、他の多くの一般的な架橋方法（たとえば、ＢＤＤＥ架橋）よりも有利である。
【００６９】
一部の実施形態によれば、ペプチドカップリング剤は、トリアジンベースのカップリング剤、カルボジイミドカップリング剤、イミダゾリウム由来カップリング剤、ＯｘｙｍａおよびＣＯＭＵからなる群から選択される。
【００７０】
一部の実施形態によれば、ペプチドカップリング剤は、トリアジンベースのカップリング剤である。一部の実施形態によれば、トリアジンベースのカップリング剤は、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）、および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）からなる群から選択される。一部の実施形態によれば、トリアジンベースのカップリング剤はＤＭＴＭＭである。
【００７１】
一部の実施形態によれば、ペプチドカップリング剤はカルボジイミドカップリング剤である。一部の実施形態によれば、カルボジイミドカップリング剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と組み合わされたＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）である。
【００７２】
注入可能なゲル製品はまた、架橋されていない、すなわち三次元架橋されたＧＡＧ分子ネットワークに結合されていないＧＡＧ分子の一部を含んでもよい。しかしながら、ＧＡＧ分子の少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、最も好ましくは少なくとも８０重量％の注入可能なゲル製品が、架橋ＧＡＧ分子ネットワークの部分を形成することが好ましい。
【００７３】
本発明の第二の態様として、
ａ）  二糖単位に対する架橋剤の充填比（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）が０．１５未満である、第一のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を第一の架橋剤と架橋してゲルを生成する工程；
ｂ）  工程ａ）からゲルの粒子を調製する工程；
ｃ）  工程ｂ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子を第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と混合して混合物を提供する工程；
ｄ）  工程ｃ）の混合物を第二の架橋剤で架橋して、第二の外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）間の架橋を取得し、それによって、第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む第二の外相のゲルに埋め込まれた、架橋したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を有するゲルを提供する工程、および
ｅ）  工程ｄ）からのゲルの注入可能な粒子を調製し、そのような各粒子は、第一の内相の複数の架橋ＧＡＧゲル粒子を含む工程
を含む、注入可能なゲル製品を製造する方法が提供される。
【００７４】
本発明の第二の態様に関連して使用する用語および定義は、上記の第一の態様に関連して説明した通りである。
【００７５】
実施形態では、工程ｅ）で生成された注入可能な粒子は、上記の第一の態様の任意の実施形態に関連して開示されたゲル製品である。
【００７６】
第二の態様の方法は、それが組み合わせゲルを製造するための、すなわち密に架橋された、したがって堅い材料を軽く架橋された、したがって軟らかい材料に埋め込むための、簡便なプロセスであるという点で有利である。このような組み合わせゲルは、組織により強力なリフティング能力を与えることができる。本発明者らは、工程ａ）における充填比が０．１５未満、すなわち「内部」ＧＡＧゲル粒子を生成するとき、および工程ｄ）においてさらに低い充填比、すなわち内側のＧＡＧゲル粒子を外側のマトリックスに埋め込むとき、組織に強力なリフティング能力を与えることができるゲル製品の形成を促進することを見出した。
【００７７】
さらに、本発明の第二の態様の方法は、少量の架橋剤を使用することができるため、注入可能なゲル製品を生成するための効果的なプロセスを可能にするという点で有利である。
【００７８】
後で架橋されるゲル内に既に架橋された粒子を埋め込む工程は、何回でも、たとえば少なくとも２回または少なくとも３回、繰り返すことができる。したがって、工程ｄ）は、提供されたゲルの粒子を調製することをさらに含んでもよく、これらの調製された粒子は、たとえば第三のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と混合されて混合物を提供する反復工程ｃ）で使用されてもよく、これはその後、反復工程ｄ）で架橋されてゲルを形成する。このゲルの粒子は、さらに他のＧＡＧ等と再び混合してもよい。確認不要（ｄｏ  ｎｏｔ  ｃｈｅｃｋ）
【００７９】
したがって、工程ｃ）及びｄ）は何度でも繰り返すことができる。架橋工程で使用される架橋剤は、上記の本発明の第一の態様で説明した通りであってよい。
【００８０】
一例として、工程ａ）および／または工程ｂ）における架橋は、エーテル結合をもたらしうる。
【００８１】
さらなる例として、工程ａ）および／または工程ｂ）における架橋は、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖からなる群から選択されるスペーサー基を含む架橋を介して共有結合的に架橋されるＧＡＧ分子をもたらしうる。
【００８２】
工程ｄ）における架橋は、工程ａ）における架橋と同じ架橋条件を使用して行ってもよい。工程ｄ）における充填比は、工程ａ）と同じであっても異なっていてもよい。
【００８３】
さらに、工程ｄ）の架橋は、工程ａ）と同じ架橋剤を使用して、または工程ａ）で使用した架橋剤とは異なる架橋剤を使用して行うことができる。したがって、第一および第二の架橋剤は、同じであっても異なっていてもよい。
【００８４】
さらに、工程ａ）および／またはｄ）の架橋は、第一および／または外側のゲルにおける架橋の均一性を増加させるために、架橋剤の初期添加によって行われうる。
【００８５】
工程ａ）の充填比は、０．１０未満、たとえば０．０５であってもよい。
【００８６】
一例として、工程ａ）の充填比は、０．００２〜０．１０の間、たとえば０．００５〜０．１０の間、たとえば０．００５〜０．０５の間、たとえば０．００５〜０．０３の間、たとえば０．０１〜０．３の間であってもよい。
【００８７】
実施形態では、工程ｄ）における二糖単位に対する架橋剤の充填比は、０．１０未満、たとえば０．０５未満である。本発明者らは、外側のゲルマトリックスを製造するときのそのような低い充填比が、ｉｎ  ｓｉｔｕで好適な分解特性を有するゲル製品を依然として提供できることを見出した。
【００８８】
実施形態では、工程ｄ）における二糖単位に対する架橋剤の充填比は、工程ａ）の充填比よりも小さい。
【００８９】
実施形態では、工程ｄ）の架橋は、第一の内相と第二の外相のゲル間の架橋を得ることをさらに含む。したがって、工程ｄ）で使用される第二の架橋剤は、外側のゲルマトリックスを包埋ゲル粒子に架橋するのをさらに補助し、したがって、工程ｅ）で注入可能粒子を調製するときに、包埋ゲル粒子をゲル内に保持するのを補助することができる。
【００９０】
実施形態では、工程ｃ）は、乾燥状態の工程ｂ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子を、乾燥状態の第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と混合することを含む。乾燥状態のゲル粒子は、たとえば、粉末形態または乾燥した絡み合った紐（ｅｎｔａｎｇｌｅｄ  ｓｔｒｉｎｇ）の形態であってもよい。乾燥状態での混合は、第一のＧＡＧと第二のＧＡＧとの間の良好な混合を提供する、すなわち、外相内の第一の内相のゲル粒子の均一な分布を提供するという点で有利でありうる。
【００９１】
しかしながら、工程ｃ）は、最初に工程ｂ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子を溶解し、溶液を第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む溶液と混合することを含んでもよい。
【００９２】
実施形態では、工程ｂ）の粒子を調製する工程は、工程ａ）のゲルから調製された前記粒子を沈殿させ、乾燥させることをさらに含む。
【００９３】
内部ゲル粒子の沈殿は、たとえば、未反応の架橋剤等の副産物の数を減らすため、第一の内部相のゲル粒子を洗浄する可能性をさらに高めるという点で有利である。沈殿自体が洗浄工程として機能する場合がある；すなわち、実際の沈殿中に、不要な副産物がゲル粒子から分離する場合がある。
【００９４】
さらに、内部ゲル粒子の沈殿は、架橋の第二工程の間、すなわち、工程ｄ）の間に、内部ゲル粒子を架橋剤により接近しやすくすることができる。これは、第二の架橋工程で使用する架橋剤の量を少なくできることを意味する。すなわち、沈殿により架橋剤の効果的な使用が増加し、方法全体の有効性が増加する。
【００９５】
さらに、沈殿した粉末を保存することができ、したがって、工程ｄ）の第二の架橋を、沈殿の直後に行う必要がない。したがって、工程ｃ）は、沈殿後少なくとも１時間、たとえば少なくとも５時間、たとえば少なくとも１０時間、たとえば少なくとも２４時間、たとえば少なくとも４８時間の沈殿後に行われてもよい。したがって、工程ａ）のゲルから調製された粒子を沈殿させて乾燥させる工程は、プロセスの柔軟性を高める。
【００９６】
その結果、沈殿の工程は、ゲル粒子の洗浄を可能にするという点で有利である。２つの架橋工程がより明確で別個の架橋工程に分割され、より少量の架橋剤を使用することにより工程の全体的な有効性が増加するという点で、プロセスはより柔軟になる。
【００９７】
第二の態様の実施形態では、工程ｃ）の混合物は、工程ｂ）で得られたＧＡＧゲル粒子の少なくとも４５乾燥重量％、たとえば工程ｂ）で得られたＧＡＧゲル粒子の少なくとも５０乾燥重量％を含む。したがって、第一の内相の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の乾燥重量含有量は、工程ｃ）におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の総乾燥重量含有量の少なくとも５０％であってもよい。
【００９８】
例として、工程ｃ）の混合物は、工程ｂ）で得られたＧＡＧゲル粒子を少なくとも乾燥重量で６０％含んでもよい。
【００９９】
さらなる例として、工程ｃ）の混合物は、工程ｂ）で得られたＧＡＧゲル粒子を乾燥重量で６５％〜９５％の間で含んでもよい。したがって、第一の内相の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の乾燥重量含有量は、内相および外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の総乾燥重量含有量の６５％〜９５％の間である。
【０１００】
本発明の第三の態様として、上記の第一の態様のいずれかの実施形態による注入可能なゲル製品、および任意に緩衝剤を含む水性組成物が提供される。
【０１０１】
水性組成物は注入に好適な場合がある。水性組成物は、典型的には生理食塩緩衝液を含んでもよい。組成物は、他の好適な添加剤、たとえば、局所麻酔薬（たとえば、塩酸リドカイン）、抗炎症薬、抗生物質、および他の好適な支持薬（ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）、たとえば骨成長因子または細胞をさらに含んでもよい。
【０１０２】
注入可能なゲル製品または水性組成物の投与は、好適なサイズの標準的なカニューレおよび針からの注入または外科的挿入を介する等、任意の好適な方法で行うことができる。投与は、軟組織、たとえば顎、頬、または顔や体の他の場所の増強が望まれる場所で行われる。
【０１０３】
したがって、本発明の第四の態様として、上記の第一の態様の任意の実施形態による滅菌された注入可能なゲル製品または上記の第三の態様による滅菌された水性組成物で事前充填されたプレフィルドシリンジが提供される。
【０１０４】
ゲル製品は、シリンジ内で沈殿した形態で維持されてもよく、注入前に、または注入後に体内で非沈殿形態にされてもよい。
【０１０５】
最終製品を滅菌する最も簡便な方法であるため、ゲル製品はさらにオートクレーブ可能であってもよい。これは、滅菌された注入可能なゲル製品の調製を可能にする。
【０１０６】
特定の実施形態では、上記の第一および第三の態様による注入可能なゲル製品または水性組成物は、医療または外科的方法における医薬品または医療デバイスとして有用である。
【０１０７】
さらなる態様によれば、美容整形または医療手術における、上記の第一の態様による注入可能なゲル製品または上記の第三の態様による水性組成物の使用が提供される。言い換えれば、美容または医療手術で使用するための注入可能なゲル製品または水性組成物が提供される。
【０１０８】
一部の実施形態では、使用は、皮膚充填（ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｌｌｉｎｇ）および体形矯正から選択される美容整形での使用である。一部の他の実施形態では、使用は、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の予防、チャネルの形成、失禁治療、および整形外科用途の治療および／または医療手術における医薬品としてである。
【０１０９】
一つの態様によれば、上記の第一の態様による注入可能なゲル製品または上記の第三の態様による水性組成物の、それを必要とする対象への投与を含む、美容整形または医療手術を受ける対象の治療方法が提供される。
【０１１０】
特定の実施形態では、対象は、皮膚充填および体形矯正から選択される美容整形を受けている。特定の他の実施形態では、対象は、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の予防、チャネルの形成、失禁治療、および整形外科用途から選択される疾患（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）のために、医療手術または内科的治療を受けている。
【０１１１】
グリコサミノグリカンは、たとえば脱アセチル化グリコサミノグリカンを使用した場合、それ自体が架橋ゲルとして作用する場合がある。そのような場合、グリコサミノグリカン自体以外の架橋剤を使用する場合に関連する特性である修飾度（ＭｏＤ）は、グリコサミノグリカンの脱アセチル化の程度に対応しうる。したがって、グリコサミノグリカン自体が架橋剤として作用するが、グリコサミノグリカンの脱アセチル化の程度として作用する場合、上記の以前の態様に関連して論じたＭｏＤのすべての実施形態および実施例も関連しうる。
【０１１２】
したがって、本発明の一般的な態様として、架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲルの第二の外相に埋め込まれた複数の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を含む注入可能なゲル製品が提供される；
ここで、第二の外相は粒子の形態である；
ここで、前記第一の内相のゲルの反復ＧＡＧ二糖単位の総モル量に対する架橋の最大量は０．１５以下である、および
ここで、前記第二の外相のゲルの反復ＧＡＧ二糖単位の総モル量に対する架橋の最大量は、前記第一の内相のゲルの反復ＧＡＧ二糖単位の総モル量に対する架橋の最大量より低い。
【０１１３】
反復ＧＡＧ二糖単位の総モル量に対する架橋の最大量は、たとえば、架橋にＧＡＧ自体以外の別の架橋剤が使用される場合はＭｏＤであり、ＧＡＧ自体が架橋剤として作用する場合は脱アセチル化の程度でありうる。さらに、グリコサミノグリカン自体を架橋ゲルの架橋剤として使用する場合、以下で説明する代替の態様が関連する可能性がある。これらの代替の態様に関連して使用される用語および定義は、上記の以前の態様に関連して説明した通りである。
【０１１４】
したがって、本発明の代替の態様として、架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲルの第二の外相に埋め込まれた複数の架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を含む注入可能なゲル製品が提供される；
ここで、第二の外相は粒子の形態である；
およびここで、第一の内相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）および／または第二の外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、グリコサミノグリカン自体が二求核剤または多求核剤の架橋剤として作用する架橋を含む。
【０１１５】
実施形態では、第一の内相のゲルの脱アセチル化度は０．１５以下であり、
ここで、第二の外相のゲルの脱アセチル化度は、第一の内相のゲルの脱アセチル化度よりも低い。
【０１１６】
一つの実施形態では、第一の内相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のみが、グリコサミノグリカン自体が二求核剤または多求核剤の架橋剤として作用する架橋を含む。
【０１１７】
一つの実施形態では、第二の外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のみが、グリコサミノグリカン自体が二求核剤または多求核剤の架橋剤として作用する架橋を含む。
【０１１８】
一つの実施形態では、第一の内相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）および第二の外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、グリコサミノグリカン自体が二求核剤または多求核剤の架橋剤として作用する架橋を含む。
【０１１９】
一例として、脱アセチル化グリコサミノグリカン自体が二求核剤または多求核剤の架橋剤として作用しうる。
【０１２０】
したがって、二求核剤または多求核剤の架橋剤として作用するグリコサミノグリカン自体は、少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカン、すなわち、遊離アミン基を有するグリコサミノグリカンを提供するために少なくとも部分的に脱アセチル化されたアセチル化グリコサミノグリカンであってもよい。少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンは、単独で、または第二のグリコサミノグリカンと組み合わせて架橋することができ、それによって脱アセチル化グリコサミノグリカン自体が二求核剤または多求核剤の架橋剤として作用する。
【０１２１】
本発明のさらなる代替の態様として、以下の工程を含む、注入可能なゲル製品を製造する方法が提供される：
ａ）  第一のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を架橋してゲルを生成する工程；
ｂ）  工程ａ）からゲルの粒子を調製する工程；
ｃ）  工程ｂ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子を第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と混合して混合物を提供する工程；
ｄ）  工程ｃ）の混合物を架橋して、第二の外相のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）間の架橋を取得し、それによって、第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む第二の外相のゲルに埋め込まれた、架橋したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ゲル粒子の第一の内相を有するゲルを提供する工程、および
ｅ）  工程ｄ）からのゲルの注入可能な粒子を調製し、そのような各粒子は、第一の内相の複数の架橋ＧＡＧゲル粒子を含む工程。
【０１２２】
工程ａ）および／または工程ｄ）の架橋は、少なくとも部分的に脱アセチル化されたグルコサミノグリカンを単独で、または第二のグリコサミノグリカンと組み合わせて使用して得られてもよく、それによって脱アセチル化グリコサミノグリカン自体が二求核剤または多求核剤の架橋剤として作用する。
【０１２３】
工程ａ）における第一のグリコサミノグリカンの脱アセチル化の程度は、０．１５未満であってもよい。工程ｄ）における第二のグリコサミノグリカンの脱アセチル化の程度は、第一のグリコサミノグリカンの脱アセチル化の程度よりも低くてもよい。
【０１２４】
グリコサミノグリカンに関して本明細書で使用される用語「少なくとも部分的に脱アセチル化された」は、Ｎ−アセチル基の少なくとも一部が切断され、グリコサミノグリカンの遊離アミン基が形成される、Ｎ−アセチル基を含むグリコサミノグリカンを意味する。本明細書で使用される「少なくとも部分的に脱アセチル化された」は、グリコサミノグリカンのＮ−アセチル基のかなりの部分、特にグリコサミノグリカンのＮ−アセチル基の少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％が遊離アミン基に変換されていることを意味する。より好ましくは、グリコサミノグリカンのＮ−アセチル基の少なくとも３％が遊離アミン基に変換されている。
【０１２５】
一部の実施形態によれば、少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンは、９９％未満、好ましくは９８％未満、９７％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満または９３％未満のアセチル化度を有しうる。
【０１２６】
脱アセチル化グリコサミノグリカンの架橋は、ペプチドカップリング剤などのカップリング剤を用いて行うことができる。
【０１２７】
一部の実施形態によれば、ペプチドカップリング剤は、トリアジンベースのカップリング剤、カルボジイミドカップリング剤、イミダゾリウム由来カップリング剤、Ｏｘｙｍａ及びＣＯＭＵからなる群から選択される。
【０１２８】
一部の実施形態によれば、ペプチドカップリング剤は、トリアジンベースのカップリング剤である。一部の実施形態によれば、トリアジンベースのカップリング剤は、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）、および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）からなる群から選択される。一部の実施形態によれば、トリアジンベースのカップリング剤はＤＭＴＭＭである。
【０１２９】
一部の実施形態によれば、ペプチドカップリング剤はカルボジイミドカップリング剤である。一部の実施形態によれば、カルボジイミドカップリング剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と組み合わされたＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）である。
【０１３０】
したがって、工程ａ）は、以下のサブ工程で構成される：
ｉ）  少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンおよび任意にさらなるグリコサミノグリカンを含む溶液を提供すること；
ｉｉ）  少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンおよび／または任意のさらなるグリコサミノグリカン上のカルボキシル基をカップリング剤で活性化して、活性化グリコサミノグリカンを形成すること；
ｉｉｉ）  活性化グリコサミノグリカンをそれらの活性化カルボキシル基を介して、少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンのアミノ基を使用して架橋し、アミド結合によって架橋されたグリコサミノグリカンのゲルを提供する。
【０１３１】
さらなる例として、第二のグリコサミノグリカンは、少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンであってもよく、そして工程ｄ）は、以下のサブ工程を含んでもよい。
ｉ）  少なくとも部分的に脱アセチル化された第二のグリコサミノグリカンのカルボキシル基をカップリング剤で活性化して、活性化グリコサミノグリカンを形成すること；
ｉｉ）  少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンのアミノ基を使用して、活性化されたカルボキシル基を介して活性化グリコサミノグリカンを架橋し、アミド結合によって架橋された第二のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む第二の外相を提供すること。
【０１３２】
他の実施形態では、工程ａ）および／または工程ｄ）で架橋されたＧＡＧは、以下によって得られる：
１）  カップリング剤の存在下で、少なくとも部分的に脱アセチル化されたＧＡＧに存在する遊離アミンおよびカルボン酸基を使用して、少なくとも部分的に脱アセチル化されたＧＡＧを架橋すること；または
２）少なくとも部分的に脱アセチル化されたＧＡＧに存在する遊離アミン基およびＧＡＧに存在するカルボン酸基を使用して、カップリング剤の存在下で少なくとも部分的に脱アセチル化されたＧＡＧを非脱アセチル化ＧＡＧに架橋すること。
【０１３３】
実施形態では、少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンは、９９％以下、好ましくは９８％以下、好ましくは９７％以下、好ましくは９６％以下、好ましくは９５％以下、好ましくは９４％以下、好ましくは９３％以下のアセチル化度、および０．１ＭＤａ以上、好ましくは０．５ＭＤａ以上の重量平均分子量を有する。
【０１３４】
一部の実施形態によれば、少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンは、グリコサミノグリカンを少なくとも部分的に脱アセチル化するための方法によって得られ、当該方法は以下を含む。
ａ１）  アセチル基を含むグリコサミノグリカンを提供すること；
ａ２）  アセチル基を含むグリコサミノグリカンをヒドロキシルアミン（ＮＨ2ＯＨ）またはその塩と１００℃以下の温度で２〜２００時間反応させて、少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンを形成すること；および
ａ３）  少なくとも部分的に脱アセチル化されたグリコサミノグリカンを回収すること。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、本開示の方法の実施形態の概略図を示す。ＰＳＲ＝粒子サイズの減少。
【図２】図２は、分解度試験の結果を示す。
【図３】図３は、分解度試験の結果を示す。
【図４】図４は、埋め込まれたゲル粒子を有するゲル粒子を１０倍の倍率で示す。
【図５】図５は、１０倍の倍率での、実施例６で得られたゲル粒子の顕微鏡画像を示す。
【図６】図６は、実施例９で得られたゲル粒子の顕微鏡画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
実験例
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するであろう。これらの実施例では、使用されるＧＡＧはＨＡと表示され、ヒアルロン酸ナトリウムを指すヒアルロン酸である。
【０１３７】
分析的試験方法
ゲル含有量（ＧｅｌＣ）
ＧｅｌＣは、ゲルの形で結合している総ＨＡの割合を％で表す。ゲル含有量は、０．２２  μｍフィルターを通過しないサンプル中のＨＡの量として定義する。ＧｅｌＣは、濾液に収集されたＨＡの量から計算し、ゲルサンプル中のＨＡの総量のパーセントで示す。
【０１３８】
ＭｏＤ（修飾度）
ＭｏＤは、反復ＨＡ二糖単位の総数に対する、結合した架橋剤のモル量を表す。この測定では、単結合された（ｍｏｎｏ−ｌｉｎｋｅｄ）架橋剤と実際に架橋された架橋剤を区別しない。すなわち、少なくとも一つの共有結合を介してＨＡに結合されているすべての架橋剤を含む。たとえば、ＢＤＤＥで架橋されたＨＡゲルのＭｏＤが１％の場合、ＨＡゲルの二糖単位１００あたり１つの結合（単結合（ｍｏｎｏｌｉｎｋｅｄ）または架橋）ＢＤＤＥ分子があることを意味する。
【０１３９】
ＭｏＤは、酵素分解されたゲル製品においてＮＭＲ分光法を使用して決定できる。０．２２  μｍフィルターでの濾過によるゲルの分解前に、可溶性ＨＡ、残留（非結合）架橋剤およびその誘導体を洗い流す。ゲル製品を、アルスロバクター・アウレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）由来のコンドロイチナーゼＡＣを用いた酵素処理により３７℃で分解する。分解したゲル製品を、標準の５  ｍｍプローブを備えた４００  ＭＨｚ分光計で一次元1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録することにより、ＮＭＲ分光法にかける。
【０１４０】
ＮＭＲスペクトルは、リンクされたＢＤＤＥ分子の４つのプロトンに由来するδH  １．６  ｐｐｍの信号、およびＨＡ二糖のＮ−アセチルグルコサミン残基のＣＨ3基の３つのプロトンに由来するδH  ２．０  ｐｐｍの信号の積分によって評価できる。これらの２つの信号の積分の比は、各信号に関与するプロトンの数を補正した後、結合したＢＤＤＥおよび二糖のモル量の比に比例し、したがってＭｏＤが得られる。
【０１４１】
【化１】
2021506869.tif 000003
【０１４２】
充填比（Ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）
架橋度を測定するための別の量は、充填比、すなわち、反応容器に添加される架橋剤の数と、架橋反応を行うときに反応容器に添加される二糖単位の総数との間の比である。架橋反応が不完全である可能性がある、すなわち、すべての架橋剤が反応して架橋を形成していない可能性があるため、充填比は、ＭｏＤと同じでない可能性がある。
【０１４３】
膨張係数（ＳｗＦ）
架橋後のゲルネットワークの強度または密度は、たとえば、ゲルに水または生理食塩水を吸収させて平衡状態にさせることにより、推定／決定することができる。ゲルの分解中に鎖が切断される結果、ネットワークは弱くなり、密度は低くなる。これは、膨張係数（ＳｗＦ）の増加によって検出できる。ＳｗＦは、次のプロトコルに従って測定する：約１  ｇのゲル製品を計量ガラスに量り入れる。生理食塩水を加え、ゲルを完全に分散させ、平衡状態になるまで水を吸収させる。沈殿後、飽和ゲルの容量を読み取る。初期体積に対する最終体積の比率を、膨張係数（ＳｗＦ）で表す。
【実施例】
【０１４４】
実施例１−組み合わせゲルを作成するための一般的なプロセスの概要
ＢＤＤＥで架橋された注入可能なゲル製品を製造する方法の実施形態は、図１に図示されている。このプロセスでは、第一の粒子サイズ減少工程（ＰＳＲ）の後にバルクを沈殿させ、乾燥する。続いて、乾燥した架橋ゲル粉末をＨＡ、ＢＤＤＥ、ＮａＯＨと混合して第二の架橋を行い、以前に架橋したゲル粒子を第二のゲル材料に埋め込む。次に、第二の材料を、通常のプロセスと同じプロセス工程にかける。第一のＰＳＲ由来の粒子は、第二のＰＳＲ由来の粒子よりも小さく、内側のゲルが外側のゲルに入る余地がある。
【０１４５】
第一および第二の架橋は、典型的には、摂氏１０〜７５度の温度で、たとえば、摂氏１０〜４０度、例として摂氏１０〜３５度または摂氏１０〜３０度で行われるが、工程は摂氏１５〜３５度、たとえば摂氏１５〜３０度、そして特に室温、たとえば摂氏２０〜２５度で行うことが望ましい。好ましい温度範囲は、摂氏１０〜５０度、たとえば摂氏１８〜４０度である。
【０１４６】
反応時間は、好適には２〜４０時間、例えば４〜３６時間の範囲である。２時間より長い反応時間は、特に大規模での再現性に有用である。反応時間が４０時間より長いと、ゲルの強度が低下する、またはゲルが完全に破壊される場合がある。反応時間は、好ましくは、８〜３０時間、たとえば１２〜２４時間、たとえば１６〜２４時間の範囲である。
【０１４７】
一例として、架橋工程は、摂氏１５〜３５度で２〜４０時間、たとえば室温で１６〜２４時間、実行することができる。
【０１４８】
図４は、本開示の方法により得られたゲル粒子の１０倍の倍率での顕微鏡画像を示し、より小さな粒子が大きな粒子に埋め込まれている。
【０１４９】
実施例２−一成分ゲルの調製
一成分ゲルは以下のように調製した：１００  ｇのＨＡ（Ｍｗ  １ＭＤａ）を混合し、２００  ｇのＮａＯＨ  ３％ｗ／ｗおよび１．８  ｇのＢＤＤＥと反応させた結果、０．０３６の充填比が得られた。架橋後、ゲルを中和し、熱処理して残留架橋剤を不活性化した。粒子サイズの低減（ＰＳＲ）は、８０  μｍメッシュを使用して行った。ゲルをＥｔＯＨで沈殿させてゲル粉末を得て、これを洗浄して乾燥させた。
【０１５０】
実施例３−一成分ゲルの調製
実施例２と同様に行うが、ＨＡ  ３０  ｇ、ＮａＯＨ  ７３．５  ｇ、２．５％ｗ／ｗ、およびＢＤＤＥ  ０．２２  ｇを使用し、０．０１５の充填比となった。
【０１５１】
実施例４−二成分ゲルの調製
二成分ゲルは以下のように調製した：実施例２のゲル粉末５  ｇを混合し、ＨＡ  ５  ｇ（分子量１ＭＤａ）、ＮａＯＨ  ４５．５  ｇ  １．３３％ｗ／ｗおよびＢＤＤＥ  ９０  ｍｇと反応させ、０．０３６の充填比となった。実施例２のＰＳＲを繰り返したが、３１５  μｍメッシュを使用した。二成分ゲル粉末をリン酸塩緩衝液中で最終濃度２０  ｍｇ／ｍｌになるよう水和し、オートクレーブした。ゲルを９０℃に曝し、ゲル含有量を１６時間間隔で測定した（図２参照）。したがって、実施例４では、第一および第二の架橋反応の両方における充填比は０．０３６であった。
【０１５２】
実施例５−二成分ゲルの調製
実施例４と同様に行ったが、実施例２由来の７  ｇのゲル粉末および３  ｇのＨＡを用いて、０．０４３の充填比となった。ゲルを９０℃に曝し、ゲル含有量を１６時間間隔で測定した（図２）。参照として、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ  Ｌｙｆｔ（Ｇａｌｄｅｒｍａから）を使用した。このように、実施例５では、充填比は、第一の架橋反応で０．０３６、第二の架橋反応で０．０４３であった。
【０１５３】
実施例４および５のゲルは、以下の初期特性を有していた：
【０１５４】
【表１】
2021506869.tif 000004
【０１５５】
図２に示すように、７０％の組み合わせゲルは、外側のゲルがなくなるまで分解され、その後、残りの約７０％のゲルで横ばいになり、より遅い速度で分解される。同じタイプの挙動が５０％の組み合わせゲルで観察されたが、このゲルは５０％で横ばいになる。単一のゲルタイプのみを含む参照ゲルは、より一定の速度で分解される。これらの結果は、組み合わせゲルの概念、すなわち、内側のゲルが分解し始める前に最初に分解する外側のゲルを備えた組み合わせゲルを明確に示している。生体内でも同じタイプの挙動が予想される。
【０１５６】
実施例６−二成分ゲルの調製
実施例４と同様に行ったが、実施例３由来の２．５  ｇのゲル粉末および２．５  ｇのＨＡ（Ｍｗ  １ＭＤａ）、１５  ｇのＮＡＯＨ  ２％ｗ／ｗ、および３５  ｍｇのＢＤＤＥを使用し、０．０２２の充填比となった。ゲルを９０℃に曝し、膨張係数を１６時間間隔で測定した（図３）。参考として、実施例３のゲル粉末をもう一度架橋して、実施例６および７の内部ゲルに対応させた。図５は、実施例６で得られたゲル粒子の顕微鏡画像を１０倍の倍率で示している。
【０１５７】
したがって、実施例６では、充填比は、第一の架橋反応で０．０１５、第二の架橋反応で０．０２２であった。
【０１５８】
実施例７−二成分ゲルの調製
実施例６と同様に行ったが、実施例３由来の３．５  ｇのゲル粉末および１．５  ｇのＨＡを含み、０．０２５の充填比となった。ゲルを９０℃に曝し、膨張係数を１６時間間隔で測定した（図３）。このように、実施例７では、充填比は、第一の架橋反応で０．０１５、第二の架橋反応で０．０２５であった。
【０１５９】
実施例６および７のゲルは、以下の初期特性を有していた：
【０１６０】
【表２】
2021506869.tif 000005
【０１６１】
５０％組み合わせゲルは、他のゲルよりも膨潤が増加する。これは、このゲルが、主に膨潤の一因となる、より軟らかい外側のゲルの大部分を構成するためである。一定期間後（５０％組み合わせゲルの場合は約４０時間）、外側のゲルはなくなり、より堅い内側のゲルのみが膨張に寄与する可能性がある。これにより、測定されたＳｗＦが低下し、内部のゲルが膨潤するため、ゆっくりと上昇する。７０％の組み合わせゲルは、外側のゲルの含有量が少ないため、似ているがそれほど明確ではない挙動を示す。内側のゲル（単一ゲル）のみを有するゲルは、膨潤挙動のより一定した増加を示す。したがって、内側のゲルは、外側のゲルの分解後、最初の組み合わせゲルと同様の膨潤係数を示す。
【０１６２】
以下の表は、上記の実験例４〜７で二成分ゲルを調製するために使用される充填比をまとめたものである。
【０１６３】
【表３】
2021506869.tif 000006
【０１６４】
さらに、上記の表に従って充填率を有する第一および第二の架橋反応を行うと、実験例４〜７で調製された二成分ゲルの内側および外側ゲルについて、以下の修飾度（ＭｏＤ）となった：
【０１６５】
【表４】
2021506869.tif 000007
【０１６６】
したがって、すべての実施例における内側のゲルのＭｏＤは、外側のゲルのＭｏＤよりも高くなっている。これは、第二の架橋反応中に架橋剤が内部ゲルに拡散してこのゲルをさらに架橋し、それによって第二の架橋工程中に内部ゲルのＭｏＤが増加するためである。
【０１６７】
実施例８−アミド結合で架橋された一成分ゲルの調製
ゲルをまた、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ＤＡＴＨ（ジアミノトレハロース）およびＤＭＴＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド）を混合して反応させるアミド結合による架橋を使用して調製した。ＤＭＴＭＭはカップリング剤として機能し、ＤＡＴＨは架橋剤として機能する。
【０１６８】
一成分ゲルは以下のように調製した：ＨＡを混合し、適量のＤＡＴＨおよびＤＭＴＭＭを水に溶かして反応させた。架橋後、ゲルを生理食塩水で２０  ｍｇ／ｇに希釈し、７０℃で約２０時間加熱した。粒子サイズの低減（ＰＳＲ）は、１２５  μｍメッシュを使用して行った。ゲルをＥｔＯＨで沈殿させてゲル粉末を得て、これを洗浄して乾燥させた。
【０１６９】
実施例９−アミド結合で架橋された二成分ゲルの調製
実施例８のように調製した、アミド結合で架橋したＨＡの乾燥した架橋ゲル粉末を、続いて混合し、以前に架橋したゲル粒子が第二のゲル材料に埋め込まれる第二の架橋のために水に溶解した適切な量のＨＡ、ＤＡＴＨ、およびＤＭＴＭＭと反応させた。
【０１７０】
第二の架橋後、生理食塩水でゲルを２０  ｍｇ／ｇに希釈し、７０℃で約２０時間加熱した。３１５  μｍメッシュを使用して、粒子サイズの低減（ＰＳＲ）を行った。ゲルをＥｔＯＨで沈殿させてゲル粉末を得て、これを洗浄して乾燥させた。二成分ゲル粉末をリン酸塩緩衝液中で最終濃度２０  ｍｇ／ｍｌになるよう水和し、オートクレーブした。
【０１７１】
実施例９の調製した二成分ゲルの顕微鏡写真を図６に示す。
【０１７２】
アミド結合で架橋したゲルのゲル特性を以下の表に示す。
【０１７３】
【表５】
2021506869.tif 000008
【０１７４】
当業者は、本発明が上記の好ましい実施形態に決して限定されないことを理解する。それどころか、添付の特許請求の範囲内で多くの修正および変更が可能である。さらに、開示された実施形態に対する変形は、請求された発明を実施する当業者によって、図面、開示、および添付の特許請求の範囲の検討から理解され、達成されうる。特許請求の範囲において、用語「含む」は、他の要素または工程を除外せず、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は複数を除外しない。特定の測定値が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの測定値の組み合わせが有利に使用できないことを示すものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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