(57)【要約】  本発明は、細胞の機械的恒常性を破壊する方法およびその使用に関し、特にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を使用して細胞の機械的恒常性を破壊し、細胞の軟化、および組織器官線維化の減少をもたらす方法に関する。また、組織器官の再生と修復を促進する方法およびその使用に関する。Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊し、病理学的状態の組織と器官の剛性を低減し、下等生物の再生プロセスと同様のストレス応答と再生反応を刺激し、これらの特徴を利用して器官損傷時の線維化を大幅に阻害し、組織器官の再生と修復を促進することができる。それと同時に、ストレス応答を利用して細胞の遺伝的修復能力を大幅に改善することができる。前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、好ましくは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたはその誘導体（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである。上記方法は、単一の小分子または単一因子のみにより処理すればよく、操作が単純であり、再現性が良く、ストレス応答や再生反応を刺激し、細胞の遺伝的修復能力を改善する、および／または組織器官の再生修復を促進する新しい方法として使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の機械的ストレスシステムの恒常性の破壊、細胞の機械的硬度の破壊、細胞の軟化、あるいは組織または器官の線維化の低減におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項２】
細胞の機械的ストレスシステムの恒常性の破壊、細胞の機械的硬度の破壊、細胞の軟化、あるいは組織または器官の線維化の低減のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項３】
細胞の機械的ストレスシステムの恒常性障害、細胞の機械的硬度障害、あるいは組織または器官の線維化に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項４】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記線維化は、任意の組織または器官の線維化である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記線維化は、肝線維化、肺線維化、筋線維化、皮膚瘢痕または神経組織瘢痕である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記肝線維化は、アルコール性肝炎によって引き起こされる肝線維化、ウイルス性肝炎によって引き起こされる肝線維化、非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる肝線維化、毒素または薬物によって引き起こされる肝線維化、自己免疫性肝疾患によって引き起こされる肝線維化、肝うっ血によって引き起こされる肝線維化、遺伝性代謝疾患によって引き起こされる肝線維化、または他の原因によって引き起こされる肝線維化である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記肺線維化は、無機粉塵の吸入、放射線損傷、有機粉塵の吸入、薬物損傷などの原因によって引き起こされる肺線維化、および特発性肺線維化を含む、複数の原因によって引き起こされる肺線維化である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記筋線維化は、遺伝的要因または先天的要因によって引き起こされる筋線維化である、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記皮膚瘢痕は、物理的、生物学的、化学的などの要因による皮膚損傷、または遺伝的要因によって引き起こされる皮膚線維化である、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
前記神経組織瘢痕は、機械的損傷、低酸素症、低血糖症、感染症、中毒などによる中枢神経系の損傷によって引き起こされるグリア細胞の増殖などの要因によって引き起こされる神経組織の線維化である、請求項６に記載の使用。
【請求項１２】
前記中枢神経系は脳組織または脊髄を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
細胞の機械的ストレスシステムの恒常性の破壊、細胞の機械的硬度の破壊、細胞の軟化、あるいは組織または器官の線維化の低減の方法であって、それを必要とする被験者にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記線維化は、任意の組織または器官の線維化であり、好ましくは、前記線維化は、肝線維化、肺線維化、筋線維化、皮膚瘢痕または神経組織瘢痕である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記肝線維化は、アルコール性肝炎によって引き起こされる肝線維化、ウイルス性肝炎によって引き起こされる肝線維化、非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる肝線維化、毒素または薬物によって引き起こされる肝線維化、自己免疫性肝疾患によって引き起こされる肝線維化、肝うっ血によって引き起こされる肝線維化、遺伝性代謝疾患によって引き起こされる肝線維化、または他の原因によって引き起こされる肝線維化であり、
前記肺線維化は、無機粉塵の吸入、放射線損傷、有機粉塵の吸入、薬物損傷などの原因によって引き起こされる肺線維化、および特発性肺線維化を含む、複数の原因によって引き起こされる肺線維化であり、
前記筋線維化は、遺伝的要因または先天的要因によって引き起こされる筋線維化であり、
前記皮膚瘢痕は、物理的、生物学的、化学的などの要因による皮膚損傷、または遺伝的要因によって引き起こされる皮膚線維化であり、
前記神経組織瘢痕は、機械的損傷、低酸素症、低血糖症、感染症、中毒などによる中枢神経系の損傷によって引き起こされるグリア細胞の増殖などの要因によって引き起こされる神経組織の線維化であり、
前記中枢神経系は脳組織または脊髄を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性障害、細胞の機械的硬度障害、あるいは組織または器官の線維化に関連する疾患を治療する薬剤。
【請求項１８】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記線維化は、任意の組織または器官の線維化であり、好ましくは、前記線維化は、肝線維化、肺線維化、筋線維化、皮膚瘢痕または神経組織瘢痕である、請求項１７または１８に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記肝線維化は、アルコール性肝炎によって引き起こされる肝線維化、ウイルス性肝炎によって引き起こされる肝線維化、非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる肝線維化、毒素または薬物によって引き起こされる肝線維化、自己免疫性肝疾患によって引き起こされる肝線維化、肝うっ血によって引き起こされる肝線維化、遺伝性代謝疾患によって引き起こされる肝線維化、または他の原因によって引き起こされる肝線維化であり、
前記肺線維化は、無機粉塵の吸入、放射線損傷、有機粉塵の吸入、薬物損傷などの原因によって引き起こされる肺線維化、および特発性肺線維化を含む、複数の原因によって引き起こされる肺線維化であり、
前記筋線維化は、遺伝的要因または先天的要因によって引き起こされる筋線維化であり、
前記皮膚瘢痕は、物理的、生物学的、化学的などの要因による皮膚損傷、または遺伝的要因によって引き起こされる皮膚線維化であり、
前記神経組織瘢痕は、機械的損傷、低酸素症、低血糖症、感染症、中毒などによる中枢神経系の損傷によって引き起こされるグリア細胞の増殖などの要因によって引き起こされる神経組織の線維化であり、
前記中枢神経系は脳組織または脊髄を含む、請求項１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項２２】
ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項２３】
前記ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成されることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ストレス応答の刺激は、高い遺伝的損傷修復反応を刺激し、それによって本体相同組換え修復遺伝子のアップレギュレーションを増加させ、組換え能力を高めることを特徴とする、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
組織器官の再生と修復を促進することにおけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項２６】
組織器官の再生と修復を促進するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項２７】
前記組織器官の再生と修復は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成される、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項２８】
ストレス応答、再生反応、および／または細胞の遺伝的修復能力に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項２９】
組織器官の再生と修復に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項３０】
前記疾患は強皮症であることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記器官が肝臓であることを特徴とする、請求項２５〜２７、２９〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善の方法であって、それを必要とする被験者にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成され、
さらに好ましくは、前記ストレス応答の刺激は、高い遺伝的損傷修復反応を刺激し、それによって本体相同組換え修復遺伝子のアップレギュレーションを増加させ、組換え能力を高める、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
組織器官の再生と修復を促進する方法であって、それを必要とする被験者にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組織器官の再生と修復を促進することは、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
ストレス応答、再生反応、および／または細胞の遺伝的修復能力に関連する疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験者にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項４０】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患は強皮症である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善のための薬剤。
【請求項４３】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項４２に記載の薬剤。
【請求項４４】
前記ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成され、
さらに好ましくは、前記ストレス応答の刺激は、高い遺伝的損傷修復反応を刺激し、それによって本体相同組換え修復遺伝子のアップレギュレーションを増加させ、組換え能力を高める、請求項４２または４３に記載の薬剤。
【請求項４５】
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、組織器官の再生と修復を促進する薬剤。
【請求項４６】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項４５に記載の薬剤。
【請求項４７】
前記組織器官の再生と修復を促進することは、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成される、請求項４５または４６に記載の薬剤。
【請求項４８】
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、ストレス応答、再生反応、および／または細胞の遺伝的修復能力に関連する疾患を治療する薬剤。
【請求項４９】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項４８に記載の薬剤。
【請求項５０】
前記疾患は強皮症である、請求項４８または４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ技術分野に関し、具体的には細胞の機械的恒常性を破壊する方法およびその関連使用に関する。本発明はさらに、組織器官の再生と修復を促進する方法およびその関連使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物の組織と器官は、実質細胞と間質細胞およびそれらが分泌した細胞外マトリックスで構成される。実質細胞とは、組織や器官の主要な構造と機能的細胞（例えば、脳の実質細胞はニューロンであり、肝臓の実質細胞は肝細胞である）をいい、間質細胞と細胞外マトリックスは組織と器官の間質部分（主に間質細胞、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカンがある）を構成し、主に機械的なサポートと接続の役割を果たす。細胞外マトリックスは、細胞の生理学的活動の微小環境を構成して維持し、細胞間のシグナル伝達の架け橋であり、複数の生理学的および病理学的プロセスに参与して調節し、組織の創傷の修復、再生、および線維化プロセスで重要な役割を果たす。
【０００３】
下等生物の再生の過程で、損傷は迅速なストレス応答を引き起こす。熱ショックタンパク質ファミリーなどの一連のストレスタンパク質の発現はアップレギュレーションされ、ストレス応答は損傷から２４時間以内に発生する。損傷後２〜２．５日で再生反応が開始させられ、再生の開始に関連するいくつかの遺伝子および組織特異的遺伝子はアップレギュレーションされ、再生の最終段階には特定の分化した組織細胞が現れ、新しい組織が再生される。
【０００４】
進化論上の理由から、哺乳動物の再生能力は非常に限られている。高等哺乳動物の組織細胞の損傷は、組織細胞の変性や壊死を引き起こし、炎症反応も伴われる。損傷が小さい場合、損傷した組織細胞の周囲の正常な実質細胞は増殖して修復し、それにより正常な組織構造と機能を完全に回復する。しかし、損傷が大きい場合、あるいは繰り返して損傷して周囲の実質細胞の再生修復能力を超えた場合、過剰な出血を防ぎ、感染のリスクを低減するために、生体は重度のストレス保護メカニズムを起こし、凝固、免疫および炎症反応を引き起こし、間質部分の線維性結合組織（細胞外マトリックス）の大量の増殖を促進して欠損組織を修復し、これに伴って線維化の病理学的な変化が発生する。過形成した線維性結合組織は欠損を修復して組織器官の相対的な完全性を最大限に保護するが、この修復は正常な再生修復を阻害して元の器官の構造と機能を持たなくなるだけではなく、この過剰で強力な、且つ制御されていない修復反応により、器官の線維化、硬化および機能の喪失が引き起こされることもある。
【０００５】
世界中で、組織器官の線維化は、多くの疾患による障害や死亡の主な原因であり、組織器官の線維化は、人体の各主要な器官における関連疾患の発生及び進展において重要な役割を果たす。関連する統計資料によると、米国の各疾患で亡くなった患者のほぼ４５％は、組織器官の繊維増殖性疾患に起因する可能性がある。したがって、哺乳動物の線維化のプロセスを制御することは、複数の疾患を治療する重要な考えである。
【０００６】
ストレスファイバーは、真核細胞に広く存在するマイクロフィラメント構造であり、大量のマイクロフィラメントが平行に並んで構成されており、細胞間または細胞とマトリックス表面との接着に密接に関係しており、細胞の形態形成、細胞分化、および組織の形成などにおいて重要な役割を果たす。その成分は、アクチン、ミオシン、トロポミオシンおよびαアクチニンである。ストレスファイバー、細胞外マトリックス、細胞膜受容体（インテグリンなど）、核骨格および細胞骨格のリンカー複合体、核繊維層、染色体骨格などが細胞の主要な機械的ストレスシステムを構成する。機械的ストレスシステムは、細胞に機械的硬度調節を付与し、細胞内外の機械的力の感応、伝達および生成に参加し、遺伝物質の組立、分布および発現を調節する。機械的ストレスシステムの恒常性は、特定の細胞の特性インデックスの一つである。細胞の機械的ストレスシステムの恒常性は、特定の細胞属性の維持と確立、細胞の特定の遺伝調節および発現特性の維持と安定化に寄与し、細胞損傷として細胞の機械的恒常性を破壊して細胞のストレス応答を刺激し、細胞損傷修復の強い能力を刺激する。
【０００７】
本発明は、無損失および非出血の方法を使用して、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することにより、細胞の機械的硬度を破壊し、細胞を軟化し、細胞の運命の再構築性を改善し、特定の条件下で、幹細胞と類似的に、運命の異なる細胞に転換することができる。
【０００８】
本発明はさらに、無損失および非出血の方法を使用して、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することにより、下等生物の再生プロセスと類似したストレス応答と再生反応を刺激し、ストレス応答を利用して細胞の遺伝的修復能力を大幅に改善することができる。本発明は処理が単純であるため、哺乳動物が病変損傷の過程において体細胞を動員して細胞再生に参加し、組織線維化を阻害し、組織修復および器官再生能力を改善する新しい方法として使用できる。また、細胞本体の相同組換え能力および二本鎖切断媒介の相同組換え能力を改善するための新しい手段として使用することもできる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊し、細胞の機械的硬度を破壊し、細胞の軟化を引き起こし、組織器官の線維化を低減することができるという、本発明者らの発見に基づいてなされた。
【００１０】
したがって、一実施形態では、本発明は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性の破壊におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１１】
一実施形態では、本発明はまた、細胞の機械的硬度の破壊におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１２】
一実施形態では、本発明はまた、細胞の軟化におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１３】
一実施形態では、本発明はまた、組織、器官の線維化の低減におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１４】
一実施形態では、本発明はまた、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性の破壊のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１５】
一実施形態では、本発明はまた、細胞の機械的硬度の破壊のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１６】
一実施形態では、本発明はまた、細胞の軟化のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１７】
一実施形態では、本発明はまた、組織、器官の線維化の低減のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１８】
一実施形態では、本発明はまた、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性障害、細胞の機械的硬度障害、または組織、器官の線維化に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００１９】
一実施形態では、前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎであり、ＢｌｅまたはＢｌｅｂもしくはＢｌｅｂｂと略す。
【００２０】
一実施形態では、前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅであり、Ｓ−Ｂｌｅｂ−ＯＢと略す。
【００２１】
本発明で使用される（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（（Ｓ）−（−）−ＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたはＳ−Ｂｌｅｂとも表される）は、非ミオシンＩＩＡＴＰａｓｅに作用する細胞透過性阻害剤であり、ミオシン軽鎖キナーゼを阻害せず、分裂溝の収縮を阻害し、有糸分裂または収縮環の組立を妨害しない。その構造式は式（Ｉ）で表され、分子量は２９２．３３である。
【００２２】
本発明で使用される（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅ（（Ｓ）−（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−ＢｅｎｚｏａｔｅまたはＳ−Ｂｌｅｂ−ＯＢとも表される）は（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎの誘導体であり、その構造式は式（ＩＩ）で表される。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
一実施形態では、前記線維化は、任意の組織または器官の線維化である。
【００２５】
一実施形態では、前記線維化は、肝線維化、肺線維化、筋線維化、皮膚瘢痕または神経組織瘢痕である。
【００２６】
一実施形態では、前記肝線維化は、アルコール性肝炎によって引き起こされる肝線維化、ウイルス性肝炎によって引き起こされる肝線維化、非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる肝線維化、毒素または薬物によって引き起こされる肝線維化、自己免疫性肝疾患によって引き起こされる肝線維化、肝うっ血によって引き起こされる肝線維化、遺伝性代謝疾患によって引き起こされる肝線維化、または他の原因によって引き起こされる肝線維化である。
【００２７】
一実施形態では、前記肺線維化は、無機粉塵の吸入、放射線損傷、有機粉塵の吸入、薬物損傷などの原因によって引き起こされる肺線維化、および特発性肺線維化を含む、複数の原因によって引き起こされる肺線維化である。
【００２８】
一実施形態では、前記筋線維化は、遺伝的要因または先天的要因によって引き起こされる筋線維化である。
【００２９】
一実施形態では、前記皮膚瘢痕は、物理的、生物学的、化学的などの要因による皮膚損傷、または遺伝的要因によって引き起こされる皮膚線維化である。
【００３０】
一実施形態では、前記神経組織瘢痕は、機械的損傷、低酸素症、低血糖症、感染症、中毒などによる中枢神経系の損傷によって引き起こされるグリア細胞の増殖などの要因によって引き起こされる神経組織の線維化である。
【００３１】
一実施形態では、前記中枢神経系は脳組織または脊髄を含む。
【００３２】
本発明の方法は、単一の小分子または単一因子により処理すればよく、操作が単純であり、再現性が良く、哺乳動物の病変損傷の過程において組織、器官の線維化を阻害する新しい方法として使用できる。
【００３３】
本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊し、下等生物の再生プロセスと同様のストレス応答および再生反応を刺激し、ストレス応答を利用して細胞の遺伝的修復能力を大幅に改善できるという、本発明者らの発見に基づいてなされた。
【００３４】
したがって、一実施形態では、本発明は、ストレス応答の刺激におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによってストレス応答を刺激することにおけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００３６】
一実施形態では、本発明はまた、再生反応の刺激におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって再生反応を刺激することにおけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００３８】
一実施形態では、本発明はまた、細胞の遺伝的修復能力の改善におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって細胞の遺伝的修復能力を改善することにおけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００４０】
一実施形態では、前記ストレス応答の刺激は、高い遺伝的損傷修復反応を刺激し、それによって本体相同組換え修復遺伝子のアップレギュレーションを増加させ、組換え能力を高める。
【００４１】
一実施形態では、本発明はまた、組織器官の再生と修復を促進することにおけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって組織器官の再生と修復を促進することにおけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００４３】
一実施形態では、本発明はまた、ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、細胞の遺伝的修復能力の改善、および／または組織器官の再生と修復の促進のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００４４】
一実施形態では、本発明はまた、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによるストレス応答の刺激、再生反応の刺激、細胞の遺伝的修復能力の改善、および／または組織器官の再生と修復の促進のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００４５】
一実施形態では、本発明はまた、ストレス応答、再生反応、細胞の遺伝的修復能力、および／または組織器官の再生と修復に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００４６】
一実施形態では、前記疾患は強皮症である。
【００４７】
一実施形態では、前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎであり、ＢｌｅまたはＢｌｅｂまたはＢｌｅｂｂと略す。
【００４８】
一実施形態では、前記器官は肝臓である。
【００４９】
本発明の方法は、単一の小分子または単一因子のみにより処理すればよく、操作が単純であり、再現性が良く、ストレス応答や再生反応を刺激し、細胞の遺伝的修復能力を改善する、および／または組織器官の再生修復を促進する新しい方法として使用できる。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性の破壊、細胞の機械的硬度の破壊、細胞の軟化、または組織または器官の線維化の低減の方法であって、それを必要とする被験者にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を投与することを含む、方法に係る。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性障害、細胞の機械的硬度障害、または組織または器官の線維化に関連する疾患を治療する薬剤に係る。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善の方法であって、それを必要とする被験者にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を投与することを含む、方法に係る。
【００５３】
一実施形態では、本発明は、組織器官の再生と修復を促進する方法であって、それを必要とする被験者にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を投与することを含む、方法に係る。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、ストレス応答、再生反応、および／または細胞の遺伝的修復能力に関連する疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験者にＭｙｏｓｉｎ阻害剤を投与することを含む、方法に係る。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善のための薬剤に係る。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、組織器官の再生と修復を促進する薬剤に係る。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、ストレス応答、再生反応、および／または細胞の遺伝的修復能力に関連する疾患を治療する薬剤に係る。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１−１】図１は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が細胞の機械系の恒常性を破壊し、細胞の軟化を誘導することを示す図である。
【図１−２】図１は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が細胞の機械系の恒常性を破壊し、細胞の軟化を誘導することを示す図である。
【図２】図２は、ＣＣｌ４によって誘導された軽度の肝線維化の阻害における細胞軟化の使用、およびＣＣｌ４によって誘導された軽度の肝損傷の修復の治療において線維化を阻害し、再生修復を促進することにおける、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されたストレス応答の使用を示す図である。図２Ａは、慢性軽度肝線維化モデルの治療における投与計画を示す図である。図２Ｂは、シリウスレッド免疫組織化学（左）とＣＣｌ４によって誘導された軽度の肝損傷モデルの肝組織のシリウスレッド染色の定量分析（右）（ｎ＝３匹のマウスを油処理群に使用し、ｎ＝５匹のメスマウスをＣＣｌ４モデリング群に使用する）を示す図である。図２Ｃは、Ｈ＆Ｅ（上の図）とシリウスレッド（下の図）免疫組織化学分析の治療効果（ｎ＝各群で６匹のマウス）を示す図である。図２Ｄは、シリウスレッド染色結果の偏光解析を示す図である。データは平均値±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ−検定）。
【図３−１】図３は、ＣＣｌ４によって誘導された慢性重度の肝線維化の阻害における細胞軟化の使用、およびＣＣｌ４によって誘導された慢性重度の肝損傷の修復の治療において線維化を阻害し、再生修復を促進することにおける、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されたストレス応答の使用を示す図である。図３Ａは、慢性重度肝線維化モデルの治療における投与計画を示す図である。図３Ｂは、シリウスレッド染色によるＣＣｌ４モデリングの効果の分析（ｎ＝５匹のマウスを油処理群に使用し、ｎ＝４匹のマウスをＣＣｌ４モデリング群に使用する）を示す図である。図３Ｃ〜３Ｄは、それぞれシリウスレッド組織化学染色とタイプＩコラーゲン免疫蛍光染色を用いた治療効果の分析（３Ｃでは、ｎ＝各群で少なくとも５匹のマウス；３Ｄでは、ｎ＝各群で３匹のマウス）を示す図である。図３Ｅ〜３Ｆは、治療過程における、転写レベルから分析された線維化関連指標の変化を示す図である（ｎ＝各群で３匹のマウス、有意性分析はＲＮＡｓｅｑデータに由来）。データは平均値±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ−検定）。
【図３−２】図３Ｅ〜３Ｆは、治療過程における、転写レベルから分析された線維化関連指標の変化を示す図である（ｎ＝各群で３匹のマウス、有意性分析はＲＮＡｓｅｑデータに由来）。データは平均値±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ−検定）。
【図４−１】図４は、細胞の軟化が組織の線維化を阻害し、肝細胞の増殖を促進し、肝臓の再生を促進し、およびＭｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されたストレス応答が組織の線維化を阻害し、肝細胞の増殖を促進し、肝臓の再生を促進することを示す図である。図４Ａは、治療群と対照群における肝損傷及び肝機能に関連する指標の血液生化学分析を示す図である（ｎ＝各群で３匹のマウス）。図４Ｂは、Ａｌｂ  Ｃｒｅマウスを使用して追跡した、治療群と対照群の肝細胞におけるＡＬＢタンパク質の発現状況をを示す図である。図４Ｃは、ＡＬＢとＫｉ−６７を共染色することによる、治療群と対照群における肝細胞の増殖状況の分析を示す図である。図４Ｄは、ＴＵＮＥＬ染色を使用した、治療群と対照群の肝組織のアポトーシスの分析を示す図である。
【図４−２】図４Ｅは、転写レベルにより定量された治療群と対照群の肝組織の肝機能の関連指標を示す図である（ｎ＝各群で３匹のマウス）。データは平均値±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５】図５は、肝損傷の過程中の組織器官の硬化の低減における細胞軟化の使用、およびＭｙｏｓｉｎ阻害剤が肝損傷の過程中の組織剛性を低減することを示す図である。図５Ａは、Ｍａｒｋ  １０  ＥＳＭ３０３を使用して、治療前後の新鮮な肝臓組織の機械的剛性を測定したことを示す図である（ＷＴ群、ｎ＝４匹のマウス、ｎ＝他の群で少なくとも６匹のマウス）。図５Ｂは、第２高調波を使用してインビボスキャンした、治療群と対照群の線維含有量およびトポロジー分布を示す図である（ｎ＝各群で５匹のマウス）。データは平均値±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ−検定）。
【図６】図６は、胆管結紮によって誘導された肝線維化の阻害における細胞軟化の使用、および胆管結紮によって引き起こされた肝損傷における、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されたストレス応答の使用を示す図である。図６Ａは、胆管結紮によって誘導された肝損傷をＢｌｅｂで治療するフローチャートである。図６Ｂは、治療群と対照群のマウス状態を示す図である。図６Ｃは、治療の１５日後に、シリウスレッド組織化学染色およびαＳＭＡ免疫蛍光による、コラーゲン繊維の堆積と筋線維芽細胞の活性化の分析を示す図である（シリウスレッド、ｎ＝各群で６匹のマウス；αＳＭＡ、ｎ＝各群で少なくとも４匹のマウス）。図６Ｄは、治療の３０日後に、シリウスレッド組織化学染色によって示されたコラーゲン繊維の堆積状況を示す図である（ｎ＝各群で少なくとも３匹のマウス）。図６Ｅは、治療群と対照群における肝組織細胞の増殖状況を示す図である。データは平均値±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ−検定）。
【図７−１】図７は、皮膚線維化の阻害および強皮症の治療における細胞軟化の使用、および強皮症の治療における、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されたストレス応答の使用を示す図である。図７Ａは、ブレオマイシンによって誘導された強皮症をＢｌｅｂで治療するフローチャートである。図７Ｂは、７日間治療した後の皮膚構造の変化を示す図である。図７Ｃは、治療後のメラニンの蓄積と新しい毛髪の成長状況を示す図である。図７Ｄは、Ｈ＆Ｅ組織化学およびＭａｓｓｏｎ染色による、硬化領域での皮膚構造と繊維の堆積の分析を示す図である。図７Ｅは、治療後の硬化領域の表皮および真皮の厚さを示す図である（ｎ＝各群で少なくとも３匹のマウス）。図７Ｆは、治療後の硬化領域の毛包の数の分析を示す図である（ｎ＝各群で少なくとも３匹のマウス）。図７Ｇは、治療後の硬化領域の増殖の分析を示す図である。
【図７−２】図７Ｈは、毛包と腺の再生の同定を示す図である。図７Ｉは、毛包の増殖の同定を示す図である。図７Ｊ〜Ｋは、免疫蛍光によるＦＧＦ９およびＮｅｕＮの発現の分析を示す図である。
【図８】図８は、肺線維化の阻害における細胞軟化の使用を示す図である。図８Ａは、ブレオマイシンによって誘導された肺線維化をＢｌｅｂで治療するフローチャートである。図８Ｂは、Ｂｌｅｂでの治療が肺線維化マウスの生存率を有意に改善したことを示す図である。図８Ｃ〜８Ｄは、小動物ＣＴイメージングでは、Ｂｌｅｂでの治療が非容積減少を有意に阻害したことを示す図である。図８Ｅの上の図は、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色法では、Ｂｌｅｂでの治療が肺損傷の程度を軽減したことを示す図である。図８Ｅの下の図は、シリウスレッド染色（Ｓｉｒｕｓ  Ｒｅｄ）では、Ｂｌｅｂでの治療が肺線維化を軽減したことを示す図である。
【図９−１】図９（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が細胞の機械系の恒常性を破壊し、再生関連のストレス応答及び再生の開始と組織の発生関連反応を破壊することを示す図である。
【図９−２】図９（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が細胞の機械系の恒常性を破壊し、再生関連のストレス応答及び再生の開始と組織の発生関連反応を破壊することを示す図である。
【図１０−１】図１０は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが刺激したストレス応答によって活性化された高い遺伝的損傷修復反応が、本体相同組換え修復の遺伝子のアップレギュレーションを高めたことを示す図である。図１０（Ａ）は、５〜５０μｍоｌ（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎでヒト線維芽細胞を処理し、６時間のトランスクリプトーム解析を経て、ＤＮＡ複製と相同組換えに関連する遺伝子、ミスマッチ修復関連遺伝子、ヌクレオチド切除修復および塩基切除修復遺伝子が有意にアップレギュレーションされたことを示す図である。
【図１０−２】図１０（Ｂ）は、更なる分析では、相同組換えに関与するほとんどすべての重要な遺伝子が有意にアップレギュレーションされたことを示す図である。
【図１１−１】図１１（Ａ）〜（Ｅ）は、本体相同組換え修復の遺伝子のアップレギュレーションにおける、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが刺激したストレス応答によって活性化された高い遺伝的損傷修復反応の使用を示す図である。ストレス応答の刺激に伴われる高い遺伝的損傷修復反応が、本体相同組換え遺伝子の修復を改善することを示す図である。
【図１１−２】図１１（Ａ）〜（Ｅ）は、本体相同組換え修復の遺伝子のアップレギュレーションにおける、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが刺激したストレス応答によって活性化された高い遺伝的損傷修復反応の使用を示す図である。ストレス応答の刺激に伴われる高い遺伝的損傷修復反応が、本体相同組換え遺伝子の修復を改善することを示す図である。
【図１２−１】図１２（Ａ）〜（Ｃ）は、ヒト肝細胞のインビトロでの増殖の促進における、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって刺激されたストレス応答の使用を示す図である。
【図１２−２】図１２（Ａ）〜（Ｃ）は、ヒト肝細胞のインビトロでの増殖の促進における、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって刺激されたストレス応答の使用を示す図である。
【図１２−３】図１２（Ａ）〜（Ｃ）は、ヒト肝細胞のインビトロでの増殖の促進における、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって刺激されたストレス応答の使用を示す図である。
【図１３−１】図１３（Ａ）〜（Ｆ）は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が、ＴＧＦ−β１によって誘導されたマウス星状細胞ｍＨＳＣｓの筋線維芽細胞への転換および細胞外マトリックスの合成を阻害することを示す図である。その中で、図１３（Ａ）は、実施例９−１の具体的なスキームを示し、図１３（Ｂ）には、ＴＧＦ−β１のない誘導群を陰性対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「Ｃｏｎ」と表記し、ＴＧＦ−β１誘導群をＤＭＳＯとＢｌｅｂでそれぞれ処理して「ＴＧＦＢ＋ＤＭＳＯ」と「ＴＧＦＢ＋Ｂｌｅｂ」と表記し、Ｉは免疫蛍光染色結果であり、ＩＩは定量ＰＣＲ同定結果である。
【図１３−２】３回繰り返して、図１３（Ｃ）は、Ｂｌｅｂが、ＴＧＦ−β１によって誘導されたマウスＭＥＦｓの筋線維芽細胞への転換および細胞外マトリックスの合成を有意に阻害することを示す図である。
【図１３−３】図１３（Ｄ）は、Ｂｌｅｂが、ＴＧＦ−β１によって誘導されたマウスの異なる臓器の初代間質細胞の筋線維芽細胞への転換および細胞外マトリックスの合成を有意に阻害することを示す図である。
【図１３−４】図１３（Ｅ）には、ＴＧＦ−β１のない誘導群を陰性対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「Ｃｏｎ」と表記し、ＴＧＦ−β１誘導群をＤＭＳＯとＢｌｅｂでそれぞれ処理して「ＴＧＦＢ＋ＤＭＳＯ」と「ＴＧＦＢ＋Ｂｌｅｂ」と表記し、３回繰り返した。
【図１３−５】図１３（Ｆ）と図１３（Ｇ）は、ＢｌｅｂとＳ−Ｂｌｅｂ−ＯＢｄなどを含む異なる化合物が、ＴＧＦ−β１によって誘導された筋線維芽細胞の活性化に対する阻害作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下、図面を参照して本発明の具体的な実施例をより詳細に説明する。本発明の具体的な実施例は図面に示されているが、ここで説明する実施例に制限せずに、本発明は様々な形で実施できることを理解されたい。逆に、これらの実施例は、本発明をよりよく理解し、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるために提供されたものである。
【００６０】
なお、明細書および特許請求の範囲では、特定の構成要素を指すために特定の用語が使われている。技術者が同じ構成要素を指すために異なる用語を使用する場合があることを、当業者は理解するのであろう。本明細書および特許請求の範囲は、構成要素を区別する方法として用語の違いを使用せず、構成要素の機能の違いをその区別の基準として使用する。例えば、明細書および特許請求の範囲全文で言及されている「含む」または「備える」はオープンな用語であるため、「含むがそれらに限定されない」と解釈すべきである。以下の明細書の説明は、本発明を実施するための好ましい実施形態であるが、その説明は、明細書の一般的な原則を説明することを目的としており、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されるものに従うものとする。
【００６１】
本文で使用されているように、特定の成分について、「実質的に含まない」とは、特定の成分が意図的に組成物に配合されておらず、および／または汚染物としてまたは痕跡量でのみ存在することをいう。よって、組成物の偶発的な汚染によって引き起こされる特定の成分の総量は、０．０５％未満、好ましくは０．０１％未満である。もっとも好ましいのは、特定の成分の量が標準的な分析方法では検出できない組成物である。
【００６２】
本明細書で使用されているように、「一」または「一つ」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲で使用されているように、「含む」という単語とともに使用される場合、「一」または「一つ」は、１つまたは複数を意味することができる。
【００６３】
代替案のみを指すこと、または代替案が相互に排他的であると明確に述べられている場合以外に、特許請求の範囲では「または」という用語を使用して「および／または」を表すが、本開示内容は代替案のみを指すことおよび「および／または」の定義をサポートしている。本文で使用されているように、「もう一つの／別の」は、少なくとも２つめの、またはそれ以上を意味することができる。
【００６４】
本願全体を通して、「約／くらい」という用語は、その値がデバイスのエラーの固有の変動を含むことを示すために使用され、その方法は、その値または研究対象間に存在する変動を測定するために使用される。
【００６５】
本文では、「分化」とは、あまり特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスをいう。「脱分化」とは、一部または最終的に分化した細胞が、多能性または多潜在性などのより初期の発生段階に戻る細胞プロセスをいう。「分化転換」とは、あるタイプの分化細胞が別のタイプの分化細胞に転換するプロセスをいう。典型的には、細胞は中間多能性段階を通過せずに、プログラミングすることによって分化転換が発生し、すなわち、細胞は、あるタイプの分化細胞から別のタイプの分化細胞に直接にプログラミングされる。
【００６６】
本文で使用されているように、「被験者」または「必要とする被験者」という用語は、細胞または組織の移植を必要とする任意の年齢のオスまたはメスの哺乳動物を指し、好ましくはヒトを指す。通常、被験者は細胞または組織の移植を必要とし（本文ではレシピエントとも呼ばれる）、これは、細胞または組織移植を介した治療に適した病症または病状または望ましくない状況、状態または症候群、若しくは物理的、形態学的、または生理学的異常によるものである。
【００６７】
本文に係るいくつかの用語の定義は次の通りである。
ＢＭＰ４：骨形成タンパク質４（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｍｐ４）。
高グルコースＤＭＥＭ：高グルコースＤＭＥＭ培地（ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）、すなわち、ＭＥＭ培地をベースにして開発された、様々なグルコースとアミノ酸を含む市販の培地。
Ｎ２Ｂ２７：ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地とｎｅｕｒｏｂａｓａｌ基礎培地を１：１で混合した、Ｎ２添加剤とＢ２７添加剤を含む、成分がはっきりしている細胞培養液である。マウス胚肝細胞の神経系への分化に寄与すると報告されている。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２：クローン密度培養に適した、ＤＭＥＭ培地とＦ１２培地を１：１で混合した市販の基礎培養液。
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ：神経細胞培養に寄与する市販の基礎培地。
ＧｌｕｔａＭＡＸ：細胞培地中のＬ−グルタミンを直接に置き換えることができる細胞培養添加剤。
二重抗生：ペニシリンとストレプトマイシンは、細胞培養中に細菌の混入を防ぐために細胞培養で一般的に使用される２つの抗生物質である。
Ｎ２添加剤：市販の無血清細胞培養添加剤。
Ｂ２７添加剤：市販の無血清細胞培養添加剤。
ＫＯＳＲ：市販の血清の代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ＫＯＳＲ）。
ＣＨＩＲ９９０２１：Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤としてよく使用されるＧＳＫ−３α／β阻害剤。
Ａ８３−０１：ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及びＡＬＫ７の活性を顕著に阻害できる選択的ＴＧＦ−β阻害剤。
ＣＣｌ４：四塩化炭素のことであり、肝損傷を誘導するための試薬として使用される有機化合物。
ブレオマイシン：皮膚強皮症と肺線維化モデルを誘導するための試薬として使用される化学療法薬。
Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ：強酸性染料であるシリウスレッドのことであり、コラーゲン分子と結合して複屈折減少を強化し、異なる色と形のコラーゲン繊維を区別付ける。
Ｍａｓｓｏｎ染色：コラーゲン繊維を同定する方法であり、２つまたは３つのアニオン染料から混合してなり、コラーゲン繊維は青色を呈し、筋線維は赤色を呈する。組織の線維および炎症性因子を示すために使用される染色方法の一つ。
α−ＳＭＡ：α平滑筋アクチンであり、Ａｃｔａ２とも呼ばれ、繊維化組織において、筋線維芽細胞（主にコラーゲン繊維などの細胞外マトリックスを合成および分泌する細胞）のマーカータンパク質として、筋線維芽細胞の活性化を同定するために使用される。正常な生理機能は血管平滑筋細胞にも発現されている。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、有機溶媒。
ＰＥＧ４００：ポリエチレングリコール４００のことであり、液体であり、各種の溶媒との相溶性が高く、良溶剤・可溶化剤であり、経口液剤や点眼剤などの液剤に広く使用されている。
Ｔｗｅｅｎ８０：注射剤や経口液剤の可溶化剤または乳化剤として使用される、ソルビタンモノオレエートポリオキシエチレンエーテル。
【００６８】
本発明は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性の破壊、細胞の機械的硬度の破壊、細胞の軟化、または組織または器官の線維化の低減におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。
【００６９】
本発明の一つの具体的な実施形態では、器官線維化は、例えば、肝線維化である。肝線維化は、病理生理学的プロセスにおいて様々な生理学的および病原性因子によって引き起こされる肝臓の結合組織の異常な増殖であり、しかも肝組織に大量の細胞外マトリックスの蓄積が伴われる。如何なるタイプの肝臓損傷は、肝臓の修復と治癒の過程で異なる程度の肝線維化を伴う。損傷要因を長期間取り除くことができない場合、肝臓の再生と修復および肝臓の正常な機能に影響を与えるだけではなく、線維化の過程が長期間続くと肝硬変、さらに肝癌に発展する。抗肝線維化の治療は主に、抗肝炎ウイルス治療、住血吸虫症などの抗寄生虫治療、禁酒および良好な生活習慣の養成など、原発性疾患の病原因子の除去を含む。線維化自体の治療では、炎症、脂質過酸化を阻害し、または、肝星細胞の増殖活性化を阻害し、およびコラーゲンの分解を促進することによって達成できる。しかし、臨床において肝線維化を治療および予防するための安全で効果的な手段はまだない。よって、新しい抗繊維化標的とその制御方法を見つけて開発することが急務である。本文では、肝線維化の原因については具体的な限定はない。例えば、肝線維化は、アルコール性肝炎によって引き起こされる肝線維化、ウイルス性肝炎によって引き起こされる肝線維化、非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる肝線維化、毒素または薬物によって引き起こされる肝線維化、自己免疫性肝疾患によって引き起こされる肝線維化、肝うっ血によって引き起こされる肝線維化、遺伝性代謝疾患によって引き起こされる肝線維化、または他の原因によって引き起こされる肝線維化などがある。本願は、Ｍｙｏｓｉｎの阻害を使用して細胞骨格の恒常性を破壊し、細胞の軟化を実現し、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（Ｂｌｅ、ＢｌｅｂまたはＢｌｅｂｂと略す）または（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−ＢｅｎｚｏａｔｅのようなＭｙｏｓｉｎの小分子化合物阻害剤が、複数のタイプの肝損傷モデルにおいて線維化を阻害して再生修復を促進できる効果を検証した。
【００７０】
本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤の使用が軽度の肝損傷の過程における肝線維化を有意に阻害できることを示している。本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤の使用が慢性重度の肝損傷の過程における肝線維化を有意に阻害できることを示している。本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤の使用が肝損傷後の細胞増殖を有意に促進し、肝損傷の過程における細胞アポトーシスを低減できることを示している。本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が、肝損傷線維化を阻害することにより、肝細胞増殖を促進し、細胞アポトーシスを低減し、肝臓の再生を促進し、これによって肝機能を維持できることを示している。さらに、本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されるストレス応答の使用が、組織線維化を阻害し、肝細胞増殖を促進し、肝臓の再生を促進することを示している。本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤の使用が肝損傷の過程における組織の剛性を低減できることを示している。
【００７１】
さらに、本発明は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤の使用が、胆管結紮によって引き起こされるコラーゲン繊維の蓄積を有意に阻害し、胆管結紮の過程で肝細胞の増殖を促進できることを示している。
【００７２】
本発明の一つの具体的な実施形態では、器官線維化とは、肺線維化をいう。肺線維化は、線維芽細胞の増殖および大量の細胞外マトリックスの堆積を特徴とする病理学的な変化であり、しかも炎症性損傷と組織構造の破壊が伴われる。つまり、正常な肺胞組織が損傷し、異常な修復を経て構造異常（瘢痕形成）を引き起こす。肺線維化は、ヒトの呼吸機能に深刻な影響を及ぼし、さまざまな呼吸困難として現れ、病状や肺損傷の悪化および患者の呼吸機能の持続的な悪化が伴われる。報告によると、特発性肺線維化の罹患率と死亡率は世界中で年々増加しており、診断後の平均生存期間は３年未満であり、ほとんどの腫瘍よりも高いため、「腫瘍様疾患」とも呼ばれる。したがって、肺線維化を効果的に阻害可能な新しい標的および薬剤を見つけることは、肺線維化関連疾患の治療および予防において重要な使用価値がある。本発明において、肺線維化の原因は特に限定されていないが、本発明でいう肺線維化とは、無機粉塵の吸入、放射線損傷、有機粉塵の吸入、薬物損傷などの原因によって引き起こされる肺線維化、および特発性肺線維化を含む、複数の原因によって引き起こされる肺線維化のことである。
【００７３】
本発明において、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤により、肺損傷の過程での組織損傷及び線維化を阻害することができる。
【００７４】
本発明は、ストレス応答、再生反応、および／または細胞の遺伝的修復能力に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用に係る。一つの具体的な実施形態では、組織器官の再生と修復に関連する疾患は強皮症である。本発明において、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤の使用は、硬化領域におけるメラニンの蓄積および新しい毛髪の成長を促進し、間質繊維の蓄積を有意に減少させ、毛包または腺の数を促進することができる。本発明において、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤の使用は、毛包細胞の増殖を促進し、それによって毛包の形成を促進することができる。さらに、本発明において、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤の使用は強皮症を治療することができる。
【００７５】
本発明において、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤により、一般的なストレス応答に関連する遺伝子の発現をアップレギュレーションすることができ、ＦＳＴなどの再生開始に関連する遺伝子および神経発生関連遺伝子を有意にアップレギュレーションすることができる。
【００７６】
本発明において、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤により、ＤＮＡ複製と相同組換えに関連する遺伝子、ミスマッチ修復関連遺伝子、ヌクレオチド切除修復および塩基切除修復遺伝子の発現を有意にアップレギュレーションすることができる。
【実施例】
【００７７】
次は具体的な実施例を用いて本発明の実施形態を詳しく説明する。ただし、以下の内容は、本発明に対するいかなる制限として解釈されるべきではない。特に明記しない限り、実施例で使用される材料は市販の製品である。
【００７８】
実施例１
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤による細胞の機械系の恒常性の破壊および細胞軟化の誘導
図１Ａは共焦点レーザースキャンを示す図である。図１Ｂは、ＤＭＳＯ（対照）、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（ＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたはＢｌｅとも略す）（２０μｍоｌ）で処理されたヒト線維芽細胞を示し、ファロイジンで染色され、対照群（上の行）の細胞には、豊富なストレスファイバーが平行に配置されており、細胞核はその縁が滑らかで円形または楕円形を呈し、実験群をＢｌｅで処理した後、ストレスファイバーは分解し、細胞核にはしわが出て不規則な形になる。図１Ｃは、ラミンＡ／ＣがＤＮＡの外周に強く均一に分布しており、基底−舌先の方向に明らかな極性を持っており、舌先部分のラミンＡ／Ｃが明らかに基底部分より高いことを示す図である。ヘテロクロマチンＨＰ１タンパク質では、対照群が実験群より有意に強いことが示される。図１Ｄに示す結果は、実験群の９０％を超える細胞の中で、ストレスエフェクトタンパク質ＹＡＰ１／ＴＡＺは核に位置するシグナルが細胞質に位置するシグナルより有意に強く、実験群の薬剤処理では３５％の細胞のみが明らかに核に位置していることを示す。図１Ｅは、定量ＰＣＲ測定によって細胞の機械的硬度の調節に関連するタンパク質が、小分子による処理後に有意にダウンレギュレーションされたことを示す図である。フルオロウラシルヌクレオシドを使用してリボソーム転写ＲＮＡを標識すると、図１Ｆに示すように、対照群の転写活性領域は主に細胞核の中心付近に集中しているが、実験群では、フルオロウラシルヌクレオシドにより標記されたアクティブな転写領域が細胞核の外周近くにも分布している。３回で生物学的に繰り返した。エピジェネティックに対する免疫蛍光染色Ｂｌｅｂの影響の結果、図１Ｇに示すように、Ｂｌｅｂが４日目にＨ３Ｋ２７トリメチル化の修飾を大幅に低減したことは示され、さらにＨ３Ｋ２７トリメチル化修飾複合体の成分ＥＺＨ２を検証すると、図１Ｈに示すように、対照群ＥＺＨ２の明らかに核に位置していることが発見され、Ｂｌｅで処理されたＥＺＨ２タンパク質レベルがダウンレギュレーションされ、細胞質に位置していることが示された。
【００７９】
実施例２
肝線維化関連疾患の治療における、肝線維化を阻害する細胞軟化の使用
肝線維化は、病理生理学的プロセスにおいて様々な生理学的および病原性因子によって引き起こされる肝臓の結合組織の異常な増殖であり、しかも肝組織に大量の細胞外マトリックスの蓄積が伴われる。如何なるタイプの肝臓損傷は、肝臓の修復と治癒の過程で異なる程度の肝線維化を伴う。損傷要因を長期間取り除くことができない場合、肝臓の再生と修復および肝臓の正常な機能に影響を与えるだけではなく、線維化の過程が長期間続くと肝硬変、さらに肝癌まで発展する。抗肝線維化の治療は主に、抗肝炎ウイルス治療、住血吸虫症などの抗寄生虫治療、アルコールの禁欲および良好な生活習慣の養成など、原発性疾患の病原因子の除去を含む。線維化自体の治療では、炎症、脂質過酸化を阻害し、または、肝星細胞の増殖活性化を阻害し、およびコラーゲンの分解を促進することによって達成できる。しかし、臨床において肝線維化を治療および予防するための安全で効果的な手段はまだない。よって、新しい抗繊維化標的とその制御方法を見つけて開発することが急務である。本願の発明者らは、Ｍｙｏｓｉｎを阻害することにより細胞骨格の恒常性を破壊し、細胞を軟化することを発見し、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（Ｂｌｅ、ＢｌｅｂまたはＢｌｅｂｂと略す）のようなＭｙｏｓｉｎの小分子化合物阻害剤が、複数のタイプの肝損傷モデルにおいて線維化を阻害して再生修復を促進できる効果を検証した。
【００８０】
実施例２−１
ＣＣｌ４によって誘導された軽度の肝線維化の阻害における細胞軟化の使用
実験で使用されたＩＣＲ、Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＳＰＦ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入され、四塩化炭素はＡｌａｄｄｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入され（Ｃ１３１５８３−１Ｌ）、コーンオイルはＳｉｇｍａから購入された（Ｃ８２６７）。ＣＣｌ４軽度肝損傷の実験フローを図２Ａに示す。８週齢のメスマウスを選択して１週間バリア内で飼育し、ランダムに２つの群に分け、それぞれＣＣｌ４／コーンオイル（配合容量２：５）とコーンオイルを注射した。ＣＣｌ４投与量は０．５ｍｌ／ｋｇであり、週に２回、４週間連続して投与した。４週間後、マウスを５％抱水クロラールで麻酔し、肝小葉の一部を取り出して４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水してワックスに浸し、シリウスレッド（Ｙ−Ｙ−Ｒ２０３８４−１００ＭＬ）キットを使用して繊維化染色をした。図２Ｂに示すように、コラーゲン繊維は赤色を呈する。同定モデリングが成功した後、腹腔内注射または尾静脈注射により薬剤を投与して治療した。小分子をジメチルスルホキシドに溶解し、１日当たり１ｍｇまたは３ｍｇ／ｋｇの濃度で、２〜５％ＤＭＳＯ＋３０％プロピレングリコール＋２％Ｔｗｅｅｎ８０＋ｄｄＨ２Ｏを順に添加した。対照群は「Ｃｏｎｔｒｏｌ」であり、図において「Ｃｏｎ」と略す。腹腔内注射の方法は次の通りである。１ｍｌの注射器で薬剤を吸引し、横隔膜や他の臓器を傷つけないように皮下注射器で皮膚と腹部の筋肉を刺して液体を腹腔内に注射し、液体が漏れないようにしばらく待ってから針を抜いた。尾静脈注射の方法は次の通りである。マウスを固定器内に固定し、尾を真っすぐにして締め、注射後に綿を用いて出血を止めた。１〜２週間連続して注射した後、注射を停止した。再度シリウスレッド染色による同定を行った結果、図２Ｃと２Ｄに示すように、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎは線維化を有意に阻害した。上記実験から、ＣＣｌ４によって誘導された軽度の肝損傷の修復の治療において線維化を阻害し、再生修復を促進することにおける、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されたストレス応答の使用が分かる。
【００８１】
実施例２−２
ＣＣｌ４によって誘導された慢性重度の肝線維化の阻害における細胞軟化の使用
実験で使用されたＩＣＲ、Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＳＰＦ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入され、四塩化炭素はＡｌａｄｄｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入され（Ｃ１３１５８３−１Ｌ）、コーンオイルはＳｉｇｍａから購入された（Ｃ８２６７）。ＣＣｌ４軽度肝損傷の実験フローを図３Ａに示す。８〜１０週齢のメスマウスを選択して１週間バリア内で飼育し、ランダムに２つの群に分け、それぞれＣＣｌ４／コーンオイル（配合容量１：２）とコーンオイルを注射した。ＣＣｌ４投与量は２ｍｌ／ｋｇであり、週に２回、４週間連続して投与した。６週間後、マウスを５％抱水クロラールで麻酔し、肝小葉の一部を取り出して４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水してワックスに浸し、シリウスレッド（Ｙ−Ｙ−Ｒ２０３８４−１００ＭＬ）キットを使用して繊維化染色をした。図３Ｂに示すように、コラーゲン繊維は赤色を呈する。同定モデリングが成功した後、腹腔内注射または尾静脈注射により薬剤を投与して治療した。小分子をジメチルスルホキシドに溶解し、１日当たり１ｍｇまたは３ｍｇ／ｋｇの濃度で、２〜５％ＤＭＳＯ＋３０％プロピレングリコール＋２％Ｔｗｅｅｎ８０＋ｄｄＨ２Ｏを順に添加した。対照群は「Ｃｏｎｔｒｏｌ」であり、図において「Ｃｏｎ」と略す。腹腔内注射の方法は次の通りである。１ｍｌの注射器で薬剤を吸引し、横隔膜や他の臓器を傷つけないように皮下注射器で皮膚と腹部の筋肉を刺して液体を腹腔内に注射し、液体が漏れないようにしばらく待ってから針を抜いた。尾静脈注射の方法は次の通りである。マウスを固定器内に固定し、尾を真っすぐにして締め、注射後に綿を用いて出血を止めた。６〜８週間連続して注射した後、注射を停止した。再度シリウスレッド染色（コラーゲン繊維の同定のため）によって同定を行い、その結果を図３Ｃに示す。タイプＩコラーゲンＣｏｌ  Ｉ染色を行い、その結果を図３Ｄに示す。さらに、線維化関連遺伝子Ａｃｔａ２（筋線維芽細胞マーカータンパク質）、Ｃｏｌ１ａ１（タイプＩコラーゲンを表す）、Ｃｏｌ１ａ２（タイプＩコラーゲンを表す）、Ｃｏｌ６ａ１（コラーゲンを表す）、Ｃｏｌ６ａ２（コラーゲンを表す）、Ｖｉｍ（線維芽細胞を表す）の発現を定量ＰＣＲで同定し、その結果を図３Ｅ、図３Ｆ（続）に示す。Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎは、ＣＣｌ４によって誘導された慢性重度の肝損傷の過程でのコラーゲン繊維の堆積と筋線維芽細胞の活性化を阻害し、これによって組織の線維化を阻害したことが分かる。それとともにに、ＣＣｌ４によって誘導された慢性重度の肝損傷の修復の治療において線維化を阻害し、再生修復を促進することにおける、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されたストレス応答の使用も分かる。
【００８２】
実施例２−３
組織の線維化の阻害、肝細胞の増殖の促進、肝臓の再生の促進における細胞軟化の使用
図４Ａに示すように、血液生化学分析（サンプリングの前に１２〜１６時間断食）により、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−ＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎがＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴなどの肝損傷指標の含有量を低減できることは実証された。さらにＡｌｂ−ｃｒｅ×ｍＴｍＧハイブリッドマウスを使用し、その成熟肝細胞はＧＦＰを発現し、ＣＣｌ４は線維化モデリングに用いられ、薬剤による治療処理後、ＧＦＰを発現する細胞のほとんどはＡｌｂを発現するが、ＤＭＳＯでＧＦＰを発現する細胞の一部はＡｌｂを発現しない。これは、図４Ｂに示すように、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが肝損傷の過程における肝機能の喪失を阻止できることは示されている。さらに染色同定すると、図４Ｃに示すように、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが肝損傷後の細胞増殖を有意に促進できることが分かり、図４Ｄに示すように、肝損傷の過程における細胞アポトーシスが低減された。さらに肝機能関連指標を転写レベルにより分析した結果、図４Ｅ（続）に示すように、対照群と比べて、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎで処理された後、肝臓細胞関連遺伝子（Ａｌｂ、Ｇ６Ｐ、Ｈｎｆ４ａ、Ｈｎｆｌａ、ＴＦ、Ｃｙ３ａｌ）、胆管関連遺伝子（ＣＫ１９、Ｈｎｆｌｂ）、および増殖関連遺伝子（Ｋｉ６７）などの高レベルの発現を有意に維持できることが分かった。以上によって、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎは、肝損傷の線維化を阻害し、肝細胞の増殖を促進し、細胞アポトーシスを減少させて肝臓の再生を促進することによって肝機能を維持する。上記結果からも、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されたストレス応答は、組織の線維化を阻害し、肝細胞の増殖を促進し、肝臓の再生を促進することが分かる。
【００８３】
実施例２−４
肝損傷の過程中の組織器官の硬化の軽減における細胞軟化の使用
実験で使用されたＩＣＲ、Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＳＰＦ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入され、肘ピンセット、指ピンセット、はさみ、持針器、縫合針、縫合糸はアスワン商貿有限公司から購入され、抗生物質はＧｉｂｃｏ（１５２４０−０６２）から購入された。ＣＣｌ４によって誘導された慢性重度肝損傷を構築し（実施例４と同じ）、モデリング後、頸椎脱臼でマウスを殺処分し、新鮮な肝組織のヤング率をＭａｒｋ−１０  ＥＳＭ３０３で測定した。非モデリング群と比較して、ＣＣｌ４モデリング群の肝臓では、肝組織のヤング率が有意に増加した（図６Ａの「ＷＴ」と「ＣＣｌ４モデリング」）。モデリングが成功したマウスを２つの群に均等に分け、それぞれＤＭＳＯ（図中「Ｃｏｎ」）で処理し、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎで治療された。治療後の７日目に、頸椎脱臼でマウスを殺処分し、新鮮な肝組織のヤング率をＭａｒｋ−１０  ＥＳＭ３０３で測定した結果、図５Ａの「７日間治療−Ｃｏｎ」と「７日間治療−Ｂｌｅｂ」に示すように、Ｍｙｏｓｉｎが７日目に肝組織の剛性を有意に低下させたことが示されている。それと共に、第２高調波を使用してインビボスキャンした結果、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ治療群（図５Ｂ右）では、肝組織の大量の平行に配置された繊維が低減され（図５Ｂ、中央の矢印により示される）、正常なマウスにより近いグリッド形状を呈した。上記の結果から、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤が肝損傷の過程での組織剛性を低減することが分かる。
【００８４】
実施例２−５
胆管結紮によって誘導された線維化の阻害における細胞軟化の使用
実験で使用されたＩＣＲ、Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＳＰＦ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入され、肘ピンセット、指ピンセット、はさみ、持針器、縫合針、縫合糸はアスワン商貿有限公司から購入され、抗生物質はＧｉｂｃｏ（１５２４０−０６２）から購入された。
８週齢のメスマウスを選択し、実験の前に２４時間断食禁水し、マウスを８ｍｌ／ｋｇの腹腔内注射により５％抱水クロラールで麻酔し、麻酔後にマウスを固定し、腹部を切開し、臓器を露出させ、胃の端付近の十二指腸を見つけてゆっくり引っ張って胆管を見つけ、ピンセットで慎重に胆管を剥し、縫合糸で胆管を結紮し、抗生物質を滴下してから縫合糸で腹腔を閉じた。手術後に１２時間断食禁水した。
手術の１４〜２０日後に、マウスの皮膚が黄緑色を呈することが観察され、薬剤を投与して治療した。モデリング群を２つの群に均等に分け、実験群に（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを腹腔内注射した。投与方法として、ＤＭＳＯに溶解した（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎに２〜５％ＤＭＳＯ（最終濃度、容量比）＋３０％ＰＥＧ４００（最終濃度、容量比）＋２％Ｔｗｅｅｎ８０（最終濃度、容量比）を順に加え、対照群には小分子を加えずに同量のＤＭＳＯを含有する溶剤を注射した（「Ｃｏｎ」と表記）。
図６Ａは、胆管結紮によって引き起こされた肝損傷線維化を（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（以下においてＢｌｅｂと略す）で治療するフローチャートである。その結果、図６Ｂは、肝線維化モデル対照群のジメチルスルホキシドで処理されたマウスが緩慢で弱体化しており、それと比べて、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤Ｂｌｅｂで阻害された処理群のマウスがより活発でエネルギーに満ちた状態を示している。図６Ｃは、シリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）およびα−ＳＭＡ染色した結果、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎで１５日間治療した後、胆管結紮によるコラーゲン繊維の堆積（６Ｃ、上層）と筋線維芽細胞の増殖（６Ｃ、下層）が有意に阻害されたことを示す。３０日間治療した後、対照群（対照群は「Ｃｏｎｔｒｏｌ」であり、図において「Ｃｏｎ」と略す）と比べて、Ｂｌｅｄは依然として、胆管結紮によるコラーゲン繊維の堆積（図６Ｄ）を有意に阻害した。細胞増殖タンパク質Ｋｉ−６７染色の結果、Ｂｌｅｂが胆管結紮の過程における肝細胞の増殖を促進したことは示されている（図６Ｅ）。
以上の結果によって、胆管結紮による肝損傷における、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されるストレス応答の使用が示されている。
【００８５】
実施例３
強皮症の治療における皮膚線維化を阻害する細胞軟化の使用
強皮症は、皮膚および内臓器官の限局性またはびまん性線維化が発展して硬化および萎縮することをを特徴とする結合組織疾患である。この疾患は複数のシステムに損傷を与えることができ、現在のところ、その確実な病因と発症メカニズムはまだ不明であり、効果的な治療手段もない。本発明は、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ＢＬＭ）をＩＣＲまたはＣ５７Ｂ１／６マウスの背中に局所注射してマウスの皮膚硬化症を誘発し、治療のためにＭｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを腹腔内投与した。実験フローを図７Ａに示す。
ブレオマイシンを注射してから１週間後、マウスの背部の注射部位の皮膚は厚くて硬くなり、弾力性が劣り、注射が終わるまで毛髪には成長の変化は見られなかった。それと共に、注射部位には、表在性潰瘍を伴う硬結とかさぶたが現れた。図７Ｂに示すように、生理食塩水対照群のマウス背部の、剃毛した注射領域の毛髪は成長し続け、明らかな皮膚の硬化や肥厚は見られなかった。治療群（Ｂｌｅｂ）：Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（１〜３ｍｇ／ｋｇ／日、２〜５％ＤＭＳＯ＋３０％ＰＥＧ４００＋２％Ｔｗｅｅｎ８０＋ｄｄＨ２Ｏに溶解）を腹腔内投与した。対照群（ｃｏｎ）：（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを含まず、同量のＤＭＳＯを含む。図７Ｂに示すように、３週間治療した後、治療群では硬結とかさぶたの程度が明らかに軽減され、表在性潰瘍の程度がより小さくなった。図７Ｃに示すように、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが硬結領域のメラニンの蓄積と新しい毛髪の成長を促進することは、更なる実験により実証された。図７Ｄに示すように、Ｈ＆ＥおよびＭａｓｓｏｎ繊維染色の結果、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが間質繊維の蓄積を有意に低減した。図７Ｅに示すように、さらに分析した結果、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ治療が表皮と真皮の厚さを有意に減少させ、また、図７Ｆに示すように、毛包または腺の数を促進した。図７Ｇに示すように、Ｋｉ−６７染色の結果、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎは毛包細胞の増殖を促進し、これによって毛包の形成を促進した。図７Ｈ（続）に示すように、さらに免疫染色によって同定した結果、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ治療群ＫＲＴ１７（毛包マーカータンパク質）陽性細胞はＫＲＴ１８（腺マーカータンパク質）陽性細胞よりはるかに多かった。図７Ｉ（続）に示すように、ＫＲＴ１７と増殖マーカータンパク質ＰＣＮＡを共に免疫染色することにより、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが毛包細胞の増殖を促進することで毛包の再生を促進することが分かった。さらに、図７Ｊ（続）に示すように、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ治療群はより多くの、毛包の再生を促進することが報告されたＦＧＦ９を発現したことが発見された。意外なことに、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎは硬結領域の神経運命の出現を促進でき、一部の細胞は（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ治療により、図７Ｋに示すように、核に位置している成熟ニューロンのＭａｒｋｅｒ  ＮｅｕＮを発現し、これは、神経運命の誘導の発生が損傷の修復と組織の再生に寄与するか否かについて更なる研究が必要であることを示唆している。上記の結果も、強皮症の治療における、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤によって誘導されるストレス応答の使用を示している。
【００８６】
実施例４
肺線維化関連疾患の治療における肺線維化を阻害する細胞軟化の使用
肺線維化は、線維芽細胞の増殖および大量の細胞外マトリックスの堆積を特徴とする病理学的な変化であり、しかも炎症性損傷と組織構造の破壊が伴われる。つまり、正常な肺胞組織が損傷し、異常な修復を経て構造異常（瘢痕形成）を引き起こす。肺線維化は、ヒトの呼吸機能に深刻な影響を及ぼし、さまざまな呼吸困難として現れ、病状や肺損傷の悪化および患者の呼吸機能の持続的な悪化が伴われる。報告によると、特発性肺線維化の罹患率と死亡率は世界中で年々増加しており、診断後の平均生存期間は３年未満であり、ほとんどの腫瘍よりも高いため、「腫瘍様疾患」とも呼ばれる。したがって、肺線維化を効果的に阻害可能な新しい標的および薬剤を見つけることは、肺線維化関連疾患の治療および予防において重要な使用価値がある。
本発明は、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ＢＬＭ）をＩＣＲまたはＣ５７Ｂ１／６マウスの肺気管に点滴注射して肺線維化のマウスモデルをうまく構築し、治療のためにＭｙｏｓｉｎ阻害剤（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを腹腔内投与した。（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが肺線維化を阻害し、肺線維化マウスの生存を有意に促進できることは実証された。具体的な実験フローを図８Ａに示す。具体的なブレオマイシンの注射プロセスは次の通りである。
（１）ブレオマイシン希釈：母液５０ｍｇ／ｍｌを２５倍に希釈して最終濃度は２ｍｇ／ｍｌであった；
（２）０．５％ペントバルビタールナトリウム（１００μｌ／１０ｇ  ｂ．ｗ．）の腹腔内注射によりマウスを麻酔した；
（３）首の皮膚を７５％アルコールで消毒し、首の皮膚を切り、上部気管粘膜と筋肉を丸く切り離（Blunt separation、鈍い分離）して、甲状腺に損傷を与えないように気管を露出させた；
（４）ブレオマイシン５０μｌ（２０ｇ体重）をインスリン注射器で５ｍｇ／ｋｇの用量で気管軟骨スペースに注入し、針を抜いた後、直ちに手術台を直立させ、１分間左右に回転させ、皮膚を縫合した。マウスが自然に目覚めた後、自由に飲水と食事をした。
（５）手術７日後に、小動物ＣＴでスキャンした結果、図８Ｃと８Ｄに示すように、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎは、ブレオマイシンによって誘導された肺損傷の過程における肺の体積の減少を阻害した。同定して２つの群に均等に分け、それぞれＤＭＳＯ（図８中にＣｏｎと表記）と（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（図８中にＢｅｂ、１〜３ｍｇ／ｋｇ／日）を腹腔内注射し、それぞれ２〜５％ＤＭＳＯ＋３０％ＰＥＧ４００＋２％Ｔｗｅｅｎ８０＋ｄｄＨ２Ｏに溶解した。腹腔内注射／日、尾静脈注射／３日で、マウスの生存状態を記録した。その結果、図８Ｂに示すように、対照群は治療後８日目にすべて死亡したが、Ｂｌｅｂ治療群は治療後１５日目に生存率が４０％であった。統計分析した結果、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎはブレオマイシンによって誘導された肺線維化を有意に増加させた。各群で１０匹のマウスであった。
（６）Ｄ８（モデリングＤ１４）に小動物のＣＴスキャンを行い、心臓に灌流し、取材して固定し、切片してＨ＆Ｅおよびシリウスレッド染色をした。その結果、図８Ｄに示すように、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎは、ブレオマイシンによって誘導された肺損傷の過程における組織の損傷及び線維化を阻害することが示された。
【００８７】
実施例５
細胞の機械系の恒常性の破壊は再生関連のストレス応答と再生開始および組織発生関連反応を誘導すること
（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎでヒト線維芽細胞を処理し、トランスクリプトームシーケンシングのためにそれぞれ０時間、６時間、１日、および２日間処理したサンプルを収集した。データ分析は図９（Ａ）に示すように、誘導初期の６時間に、大量のＨＳＰ７０ファミリーやＨＳＰ９０などの一般的なストレス応答に関連する遺伝子がアップレギュレーションされた。１日と２日目にこれらの遺伝子のｍＲＮＡ発現はダウンレギュレーションされ始めた。神経誘導システムで２２日間誘導した後、図９（Ｂ）と図９（Ｃ）に示すように、ＦＳＴなどの再生開始に関連する遺伝子および神経発生関連遺伝子が有意にアップレギュレーションされた。
【００８８】
実施例６
（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが刺激したストレス応答によって活性化された高い遺伝的損傷修復反応が、本体相同組換え修復の遺伝子のアップレギュレーションを高めたこと
図１０Ａに示すように、５〜５０μｍоｌ（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎでヒト線維芽細胞を処理し、６時間のトランスクリプトーム解析を経て、ＤＮＡ複製と相同組換えに関連する遺伝子、ミスマッチ修復関連遺伝子、ヌクレオチド切除修復および塩基切除修復遺伝子が有意にアップレギュレーションされた。図１０Ｂに示すように、更なる分析では、相同組換えに関与するほとんどすべての重要な遺伝子が有意にアップレギュレーションされたことが明らかになった。
【００８９】
実施例７
本体相同組換え修復の遺伝子のアップレギュレーションにおける、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが刺激したストレス応答によって活性化された高い遺伝的損傷修復反応の使用
実験フローは図１１Ａに示すように、まず相同組換え修復用のレポータープラスミドシステムを構築した。外因性相同配列と細胞の相同断片が相同組換えを起こす場合のみ、細胞は緑色の蛍光を発した。同時に、細胞のトランスフェクションの効率を表記するためにｍＲｕｂｙ赤色蛍光タンパク質を導入し、フローサイトメトリーによる緑色蛍光タンパク質とｍＲｕｂｙの比率で相同組換えの発生効率を判断した。対照群をトランスフェクションして溶液を交換して１８時間後にＤＭＳＯで４時間処理し、実験群について、トランスフェクションして溶液を交換してからそれぞれ１８時間、２４時間、３６時間後に（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎで４時間処理し、トランスフェクションして７２時間後にＨＤＲ効率をフローサイトメトリーで分析した。その結果、図１１（Ｂ）〜（Ｃ）に示すように、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎが本体相同組換え遺伝子の効率を有意に向上させた。Ｎｒｆ２は酸化ストレス応答において有意にアップレギュレーションされる遺伝子であり、酸化ストレスのエフェクタータンパク質であるため、小分子Ｎｒｆ活性化剤による酸化ストレスのシミュレーションは、図１１（Ｄ）〜（Ｅ）に示すように、ストレス応答が相同組換えの能力を改善できることをさらに検証した。実験フローは次の通りである。トランスフェクションして溶液を交換した後、対照群をＤＭＳＯで処理し、実験群について、トランスフェクションして溶液を交換した後に２５０ｎＭ  ＲＴＡ４０８で処理し、トランスフェクションして７２時間後にＨＤＲ効率をフローサイトメトリーで分析した。
【００９０】
実施例８
インビトロでのヒト肝細胞の増殖促進における、ストレス応答を刺激するＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用
実施例１〜６は、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤がストレス応答を刺激し、異なるマウスの肝損傷または皮膚損傷モデルにおいて肝または皮膚の線維化を阻害し、肝細胞または毛包細胞の増殖を促進して肝臓または毛包の再生を促進できることを示した。本実施例はさらに、Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤がヒト肝細胞の線維化を阻害し、肝細胞の増殖を促進することを検証し、これは、ヒト肝損傷及び関連疾患の治療におけるこの方法のさらなる使用について更なる証拠サポートを提供する。
【００９１】
実施例８−１
ヒト胚性肝細胞の培養
ヒト胚性肝細胞の回復：液体窒素タンクからヒト胚性肝細胞（流産した胎児、凍結保存の日付けは２０１４年１月１５日、凍結保存溶液はｃｅｌｌ  ｂａｎｋｅｒ２、凍結保存細胞数は２×１０７／チューブ）を取り出してすぐに３７℃の水浴ナベに入れ、溶解した後すぐに５ｍＬ肝細胞培地（対照群）が入った１５ｍＬの遠心チューブに吸い取り、５０ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上澄を捨て、５００μｌ肝細胞培地で再懸濁してカウントすると１．１６×１０６となり、細胞回復率は５．８％であった。
ヒト胚性肝細胞の播種：播種密度は、１×１０５／２４ウェルのプレートのウェルに、それぞれ５００μｌ肝細胞培地（対照群）を加えた。１０μＭ小分子を含む肝細胞培地および２０μＭ小分子を含む肝細胞培地で播種してから２４時間後、各群から３つのウェルで消化した細胞をカウントし、壁への付着率を計算した。播種から７２時間後、各群で３つのウェルの細胞を消化してカウントした。７２時間の細胞数を２４時間の細胞数で割ると、細胞数の変化倍数を得ることができる。各ウェルから一部の細胞（細胞数の２／５）を取って、ＲＮＡの抽出およびヒト肝細胞関連遺伝子の発現の検出に使用した。
ヒト胚性肝細胞の初代継代：７２時間初代培養中の細胞数の３／５の播種密度で、細胞をそれぞれマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに播種した（上述のように）。各群で３つのウェルであった。細胞培養の７２時間後に消化してカウントした。この細胞数と播種時の細胞数との比は、初代継代の増殖倍数となる。各ウェルから一部の細胞（細胞数の２／５）をＲＮＡの抽出およびヒト肝細胞関連遺伝子の発現の検出に使用した。
ヒト胚性肝細胞の二世代の継代：７２時間初代継代培養中の細胞数の３／５の播種密度で、細胞をそれぞれマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに播種した（上述のように）。対照群の初代継代培養の７２時間後にほとんどの細胞が死亡し、少数の細胞しか残っていなかったため、これらの細胞はすべて播種された。２日ごとに培養液を交換し、１４４時間（６日）培養を続けた後、細胞を消化してカウントし、この時の細胞数と播種時の細胞数との比は、二世代の継代の増殖倍数となる。各ウェルの細胞培養上澄を取ってヒトアルブミンの濃度を検出し、一部の細胞（細胞数の２／５）をＲＮＡの抽出およびヒト肝細胞関連遺伝子の発現の検出に使用した。
結果：ヒト胚性肝細胞を液体窒素で３年半凍結保存した後の回復率は約５．８％であった。図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）に示すように、小分子培地で１２日間継代（合計３世代）培養した後、１０μＭの小分子培地は約２２．１倍（ＳＤ＝４．２）で増幅させることができ、２０μＭのＢｌｅｂ培地は約１３．０倍（ＳＤ＝３．３９）で増幅させることができた（図１２（Ｂ））。この時、細胞形態は依然として典型的な肝細胞形態であり、不規則な多角形を呈した。しかし、対照群の培地で継代培養した後、初代継代培養後にほとんどの細胞が死亡したため、残った小部分の細胞は培養されて１２日に増幅倍数が５８．３倍になった（ＳＤ＝１３．９）が、この時の細胞は、細長い扁平な典型的な肝細胞形態を呈した（図１２（Ａ））。図１２（Ｃ）に示すようにヒト肝細胞特異的遺伝子アルブミン（ＡＬＢ、ＡＬＢＵＭＩＮ）とアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ、Ａｌｐｈａ  ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）をリアルタイムＰＣＲで検出した。その結果、ヒト肝細胞は１０μＭと２０μＭ小分子培地で１２日間継代培養した後、依然としてヒト肝細胞特異的遺伝子を発現し、これに対して、ｃｏｎｔｒｏｌの培地で１２日間継代して得られた細胞から、非常に低いアルブミン発現が検出され、アルファフェトプロテイン遺伝子の発現が検出できず、この時の細胞がもはや肝細胞ではないことは示されている。これは、図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）の結果と一致している。
【００９２】
実施例８−２
ヒト成体肝細胞の小分子増幅
ヒト成体肝細胞（成人肝細胞）の回復と培養：液体窒素タンクからヒト成体肝細胞（Ｍ００９９５−Ｐ  Ｍａｌｅ  ｈｕｍａｎ、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＩＶＴ）を取り出してすぐに３７℃の水浴ナベに入れ、溶解した後すぐに３７℃に予熱した５ｍＬ肝細胞播種培地（Ｉｎ  ＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰ  Ｍｅｄｉｕｍ）に加え、カウントした後、９×１０４／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、肝細胞が壁に２〜４時間付着した後、肝細胞播種培地を吸引して捨て、それぞれ肝臓細胞培養対照培地、１０μｍ小分子培地、および２０μｍ小分子培地を加えた。２日ごとに培養液を交換した。２日目に写真から細胞数を推算した。４日後に２０μｍ小分子培地群を１０μｍ小分子培地に変更して培養した。共培養の６日目に細胞をカウントした。一部の細胞を取り、ＲＮＡの抽出およびヒト肝細胞特異的遺伝子の発現の検出に使用した。
ヒト成体肝細胞の継代：上記対照群で培養した肝細胞４．７×１０４および１０μｍ小分子培地で培養した肝細胞８×１０４をそれぞれマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに再播種し、２日ごとに培養液を交換して６日間培養し、写真を撮って細胞成長状況を記録した。
小分子培地で増幅されたヒト成体肝細胞のＣＹＰ１Ａ２誘導：３×１０５肝細胞をマウス尾コラーゲンでコーティングした２４ウェルプレートに播種し、１０μｍ小分子培地で２４時間培養した後、５０μｍオメプラゾール（Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）を含む１０μｍ小分子培地に置き換え、対照群はＤＭＳＯを含む１０μｍ小分子培地であり、４８時間後に細胞を収集してＣＹＰ１Ａ２遺伝子の発現を検出した。
結果：ヒト成体肝細胞の播種後５時間の壁への付着率はほぼ同じであり、２日後には、対照群、１０μｍ小分子群、および２０μｍ小分子群の細胞はいずれも大量に死亡した。写真を撮って細胞の壁への付着率を推算した（２．５３×１０４、ＳＤ＝０．０９）。４日目に、小分子群の細胞には増幅クローンが現れたが、対照群には明らかな増幅はなかった。この時、２０μｍ培地群は１０μｍ小分子培地に変更された（ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃と命名され、すなわち、２０μｍで４日間培養し、１０μｍで２日間培養した）。引き続き２日間培養した後、小分子群の細胞クローンはさらに増幅したが、対照群には明らかな変化はなかった（図１２（Ｄ））。６日間培養した後、細胞数はそれぞれ、対照群では１．５９×１０４（ＳＤ＝０．２８）、１０μｍ群では６．４７×１０４（ＳＤ＝１．２４）、＃群では９．４７×１０４（ＳＤ＝０．９８）であった。６日目の細胞数と２日目の細胞数との比は、細胞増幅倍数となる。その結果、小分子がヒト成体肝細胞に対して有意な増幅効果を用いてることは示された（図１２（Ｄ）と図１２（Ｅ））。小分子群の増殖細胞核抗原遺伝子（ＰＣＮＡ）の発現は、対照群より有意に高く、小分子が細胞増殖に影響を与えることはさらに証明された（図１２（Ｆ））。小分子によって増幅されたヒト成体肝細胞は、依然としてヒト肝細胞特異的遺伝子ＡＬＢＵＭＩＮ、ＡＦＰ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４を発現した（図１２（Ｇ））。１０μｍ小分子培地はヒト肝細胞を継代培養できたが、対照群培地はヒト成体肝細胞を継代培養できなかった（図１２（Ｈ））。継代培養されたヒト成体肝細胞をオメプラゾールによって誘導した後、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の発現を増加させることができる。これは、小分子によって増幅された肝細胞が依然として機能を有することを示唆している（図１２（Ｉ））。
【００９３】
実施例９−１
Ｂｌｅｂが、ＴＧＦ−ｂｅｔａ媒介の筋線維芽細胞の活性化および線維化関連タンパク質の発現を阻害すること
線維化における筋線維芽細胞の過剰な活性化は、線維化の症状につながる主要な細胞メカニズムである。サイトカインや炎症因子などの線維芽細胞増殖因子は、損傷過程において損傷部位付近の繊維細胞、周皮細胞、成体幹細胞または前駆細胞、内皮細胞、および上皮細胞の、筋線維芽細胞への転換を促進する。このような筋線維芽細胞は過剰に増殖し、収縮して主にコラーゲンなどを含む大量の細胞外マトリックスを合成して分泌する。これにより、組織が硬化して線維化を形成し、組織または器官の再生と修復を妨げ、組織または器官の機能に深刻な損傷を与える。その中で、転換成長因子ｂｅｔａ  １（ＴＧＦ−β１）は、筋線維芽細胞の活性化および線維化を引き起こす最も重要で効果的な成長因子の一つである。
本実施例では、それぞれ、ＴＧＦ−β１によって誘導された、マウスの肝星状細胞（ｍｏｕｓｅ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  Ｃｅｌｌｓ，ｍＨＳＣｓ、図１３（Ｂ））、マウス胎児線維芽細胞（Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＭＥＦｓ、図１３（Ｃ））、マウス成体肝臓、肺、心臓由来の間質細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ｐｒｉＭＣｓ、図１３（Ｄ））、およびヒト肝星状細胞（ｈＬＸ−２、図１３（Ｅ））の筋線維芽細胞への活性化のインビトロ線維化の細胞モデルを構築した。具体的な実験フローは図９Ａに示すように、１０％血清を含む培地で細胞培養を開始し、２４時間後に低血清培地に変更し（または予め１６時間飢餓処理した）、それと共に３ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１とＤＭＳＯまたはＢｌｅｂ（２０μＭ）を加え、７日後に筋線維芽細胞活性化マーカータンパク質（Ａｃｔａ２）、コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｃｏｌ１ａ２）、およびマトリックスメタロプロテイナーゼおよび阻害剤（コラゲナーゼ：ＭｍＰ８、ＭｍＰ１３；ゼラチナーゼ：ＭｍＰ２、ＭｍＰ９；メタロプロテイナーゼ阻害剤：Ｔｉｍｐ１／２／３）の発現を同定した。
上記の実験の結果、図１３（Ｂ）に示すように、Ｂｌｅｂは、ＴＧＦ−β１によって誘導されたマウス星状細胞ｍＨＳＣｓの筋線維芽細胞への転換および細胞外マトリックスの合成を有意に阻害した。また、図１３（Ｃ）は、Ｂｌｅｂが、ＴＧＦ−β１によって誘導されたマウスＭＥＦｓの筋線維芽細胞への転換および細胞外マトリックスの合成を有意に阻害したことを示している。図１３（Ｄ）に示すように、Ｂｌｅｂは、ＴＧＦ−β１によって誘導されたマウスの異なる臓器の初代間質細胞の筋線維芽細胞への転換および細胞外マトリックスの合成を有意に阻害した。図１３（Ｅ）に示すように、Ｂｌｅｂは、ＴＧＦ−β１によって誘導されたヒト星状細胞ｈＬＸ−２の筋線維芽細胞への転換および細胞外マトリックスの合成を有意に阻害し、同時に細胞外マトリックスを分解させたメタロプロテイナーゼ発現のアップレギュレーションおよびメタロプロテイナーゼの阻害剤のダウンレギュレーションを促進した。
以上によって、Ｂｌｅｂは、マウスまたはヒトの複数種類の間質細胞（肝星状細胞、線維芽細胞、臓器間質細胞などを含む）の筋線維芽細胞への転換および細胞外マトリックスの合成を有意に阻害し、それと共に細胞外マトリックスを分解させたメタロプロテイナーゼ発現のアップレギュレーションおよび阻害剤のダウンレギュレーションを促進し、これによって損傷の過程における線維化を阻害する。この効果は、異なる種や異なる間質細胞の種類の間で保存的である。
【００９４】
実施例９−２
Ｂｌｅｂ誘導体および繊維状アクチン（Ｆ−ａｃｔｉｎ）組み立て阻害剤が、ＴＧＦ−ｂｅｔａ媒介の筋線維芽細胞の活性化および線維化関連タンパク質の発現を阻害できること
実施例９−１で説明された評価スキームにより、Ｂｌｅｂ（（Ｓ）−（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ）誘導体の影響をさらに評価した。その結果、ＤＭＳＯと比較して、ＢｌｅｂがＭＥＦｓ細胞の伸長状態を破壊できることが分かった（図１３（Ｆ）の中のＩとＩＩ）。図１３（Ｇ）に示すように、不活性なエナンチオマー（Ｒ）−（＋）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（Ｒ−Ｂｌｅｂと略す）はＭＥＦｓの繊維状形態に影響せず、ＴＧＦ−β１によって誘導された筋線維芽細胞の活性化に対して阻害効果はない。これは、Ｂｌｅｂのキラルヒドロキシル基が線維化活性を阻害するために必要であることを示している（図１３（Ｆ）の中のＩＩＩ）。実験の結果、別の誘導体（Ｓ）−（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅ（Ｓ−Ｂｌｅｂ−ＯＢ）（２０μＭ）も良好な活性を有し、ＭＥＦｓ細胞の伸長状態を破壊でき（図１３（Ｆ）の中のＩＶ）、また、図１３（Ｇ）に示すように、ＴＧＦ−β１によって誘導された筋線維芽細胞の活性化を阻害することもできることは示されている。これは、Ｂｌｅｂを修飾することによって生成される新しい誘導体がＢｌｅｂよりも優れた生物学的活性を持っている可能性があることを示している。
ＢｌｅｂはＭｙｏｓｉｎを標的としており、Ｍｙｏｓｉｎはアクトミオシン（ａｃｔｏｍｙｏｓｉｎ）の主要な成分の一つであり、アクトミオシンは、細胞が収縮力を生み出すための主要な構造基盤である。これは、Ｍｙｏｓｉｎがアクトミオシン細胞骨格系を構成し、筋線維芽細胞の活性化および組織器官の線維化を阻害する効果的な標的として使用できることを示している。
【００９５】
以上は本発明の原理のみを示したにすぎず、本発明の範囲は本明細書に記載の例示的な態様に限定されるものではなく、現在知られているおよび将来開発される同等物をすべて含むべきである。なお、本発明の技術的原理から逸脱することなく、いくつかの改善および変更を行うことができ、これらの改善および変更も本発明の範囲と見なされるべきである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月25日(2020.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の機械的ストレスシステムの恒常性障害、細胞の機械的硬度障害、あるいは組織または器官の線維化に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項２】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記線維化は、任意の組織または器官の線維化であり、
好ましく、前記線維化は、肝線維化、肺線維化、筋線維化、皮膚瘢痕または神経組織瘢痕であり、
好ましく、前記肝線維化は、アルコール性肝炎によって引き起こされる肝線維化、ウイルス性肝炎によって引き起こされる肝線維化、非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる肝線維化、毒素または薬物によって引き起こされる肝線維化、自己免疫性肝疾患によって引き起こされる肝線維化、肝うっ血によって引き起こされる肝線維化、遺伝性代謝疾患によって引き起こされる肝線維化、または他の原因によって引き起こされる肝線維化であり、
好ましく、前記肺線維化は、無機粉塵の吸入、放射線損傷、有機粉塵の吸入、薬物損傷などの原因によって引き起こされる肺線維化、および特発性肺線維化を含む、複数の原因によって引き起こされる肺線維化であり、
好ましく、前記筋線維化は、遺伝的要因または先天的要因によって引き起こされる筋線維化であり、
好ましく、前記皮膚瘢痕は、物理的、生物学的、化学的などの要因による皮膚損傷、または遺伝的要因によって引き起こされる皮膚線維化であり、
好ましく、前記神経組織瘢痕は、機械的損傷、低酸素症、低血糖症、感染症、中毒などによる中枢神経系の損傷によって引き起こされるグリア細胞の増殖などの要因によって引き起こされる神経組織の線維化であり、前記中枢神経系は脳組織または脊髄を含む、
請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性障害、細胞の機械的硬度障害、あるいは組織または器官の線維化に関連する疾患を治療する薬剤。
【請求項５】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
前記線維化は、任意の組織または器官の線維化であり、好ましくは、前記線維化は、肝線維化、肺線維化、筋線維化、皮膚瘢痕または神経組織瘢痕であり、
前記肝線維化は、アルコール性肝炎によって引き起こされる肝線維化、ウイルス性肝炎によって引き起こされる肝線維化、非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる肝線維化、毒素または薬物によって引き起こされる肝線維化、自己免疫性肝疾患によって引き起こされる肝線維化、肝うっ血によって引き起こされる肝線維化、遺伝性代謝疾患によって引き起こされる肝線維化、または他の原因によって引き起こされる肝線維化であり、
前記肺線維化は、無機粉塵の吸入、放射線損傷、有機粉塵の吸入、薬物損傷などの原因によって引き起こされる肺線維化、および特発性肺線維化を含む、複数の原因によって引き起こされる肺線維化であり、
前記筋線維化は、遺伝的要因または先天的要因によって引き起こされる筋線維化であり、
前記皮膚瘢痕は、物理的、生物学的、化学的などの要因による皮膚損傷、または遺伝的要因によって引き起こされる皮膚線維化であり、
前記神経組織瘢痕は、機械的損傷、低酸素症、低血糖症、感染症、中毒などによる中枢神経系の損傷によって引き起こされるグリア細胞の増殖などの要因によって引き起こされる神経組織の線維化であり、
前記中枢神経系は脳組織または脊髄を含む、
請求項４または５に記載の薬剤。
【請求項７】
ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善のための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用であって、
前記ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成され、
前記ストレス応答の刺激は、高い遺伝的損傷修復反応を刺激し、それによって本体相同組換え修復遺伝子のアップレギュレーションを増加させ、組換え能力を高めることを特徴とする、前記使用。
【請求項８】
組織器官の再生と修復を促進するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用であって、
前記組織器官の再生と修復は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成されることを特徴とする、前記使用。
【請求項９】
ストレス応答、再生反応、および／または細胞の遺伝的修復能力に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項１０】
組織器官の再生と修復に関連する疾患を治療するための薬剤または試薬の調製におけるＭｙｏｓｉｎ阻害剤の使用。
【請求項１１】
前記疾患は強皮症であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記器官が肝臓であることを特徴とする、請求項８、１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善のための薬剤。
【請求項１５】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅである、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記ストレス応答の刺激、再生反応の刺激、および／または細胞の遺伝的修復能力の改善は、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成され、
さらに好ましくは、前記ストレス応答の刺激は、高い遺伝的損傷修復反応を刺激し、それによって本体相同組換え修復遺伝子のアップレギュレーションを増加させ、組換え能力を高める、請求項１４または１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、組織器官の再生と修復を促進する薬剤。
【請求項１８】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅであり、
好ましく、前記組織器官の再生と修復を促進することは、細胞の機械的ストレスシステムの恒常性を破壊することによって達成される、
請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤を含む、ストレス応答、再生反応、および／または細胞の遺伝的修復能力に関連する疾患を治療する薬剤。
【請求項２０】
前記Ｍｙｏｓｉｎ阻害剤は、（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎまたは（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ  Ｏ−Ｂｅｎｚｏａｔｅであり、
好ましく、前記疾患は強皮症である、
請求項１９に記載の薬剤。
【国際調査報告】
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