(57)【要約】フマル酸およびマレイン酸含有化合物の提供であり、前記化合物を含む組成物および、特にがんおよび腫瘍細胞である細胞において、インターフェロン感受性ウイルスの産生、増殖、拡散または力価を高めるためにそのような化合物を用いるための方法を提供する。前記化合物および組成物を投与することによって、対象の腫瘍またはがん細胞を治療する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化細胞、がん細胞、または腫瘍細胞におけるインターフェロン感受性ウイルスの産生、感染、増殖、拡散、または力価を高める方法であり、前記方法は不死化細胞、がん細胞、腫瘍細胞にインターフェロン感受性ウイルスを感染させる前に、同時にまたは後にフマル酸エステルおよびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥ）含有化合物またはその誘導体を不死化細胞、がん細胞または腫瘍細胞に投与することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記インターフェロン感受性ウイルスは遺伝的にインターフェロン感受性にした非インターフェロン感受性ウイルス、弱毒化インターフェロン感受性ウイルス、インターフェロン感受性腫瘍溶解性ウイルス、または非複製インターフェロン感受性ウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インターフェロン感受性腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞または腫瘍細胞において腫瘍溶解活性、細胞死活性、および／または傷害活性を高めるまたは増加することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インターフェロン感受性腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞または腫瘍細胞において免疫治療活性を高める、増加または強化し、ウイルスにエンコードされたトランスジーンおよび／またはサイトカインのアップレギュレーションを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＭＡＥ含有化合物が、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、フマル酸ジエチル（ＤＥＦ）、マレイン酸ジメチル（ＤＭＭ）、マレイン酸ジエチル（ＤＥＭ）、マレイン酸モノエチル、マレイン酸モノメチル、フマル酸モノエチル、またはフマル酸モノメチル（ＭＭＦ）の構造である、またはその構造を含み、薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、還元、または酸化型を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記インターフェロン感受性ウイルスが、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、マラバウイルス（ＭＧ−１のような）、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはラブドウイルス、またはその変異型または派生型であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インターフェロン感受性腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルスまたはその派生型または変異体であるラブドウイルスを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法
【請求項８】
前記インターフェロン感受性ウイルスが、組み換え技術を用いた遺伝子改変、またはそれらの任意の組み合わせの一つ以上の選択圧さらされる、特異的な増殖条件下でウイルスが選択されることを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がヒト細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記不死化細胞、がん細胞、または腫瘍細胞が２９３−Ｔ細胞，ＢＨＫ２１細胞，またはＭＤＣＫ細胞，Ｖｅｒｏ細胞，ＨＥＫ−２９３細胞，ＥＢ−６６細胞，ＥＢ−ｂＸ細胞，ＰＥＲ−．Ｃ６細胞，ＡＧＥ１．ＣＲ細胞，Ａｇｅｌ．ＣＳ細胞，Ａｇｅｌ．ＨＮ細胞，Ａｇｅｌ．ＲＯ細胞，ＱＯＲ２／２Ｅ１１細胞，ＵＭＮＳＡＨ−ＤＦ１細胞，ＣＨＯ細胞，ｈｙｂｒｉｄｏｍａ細胞，ｓｆ９細胞，またはＲ４細胞であり、２９３−Ｔ細胞、ＢＨＫ２１細胞、またはＭＤＣＫ細胞がリンパ芽球性白血病、骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、小脳星細胞腫、脳星細胞腫／悪性神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、髄芽腫、中間分化の松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍および松果体芽腫、視覚経路および視床下部神経膠腫、脊髄腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胚性腫瘍、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃（胃）がん、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外、外性、卵巣、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症、ランゲルハンス細胞がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、唇および口腔がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨および骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体実質腫瘍、松果体芽腫および上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、腎および尿管がん、移行上皮がん、気道がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、子宮肉腫、皮膚がん、メルケル細胞がん、小腸がん、軟部肉腫、扁平上皮がん、扁平上皮がん、胃（胃）がん、テント上、原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、胸腺がん、甲状腺がん、栄養芽腫、尿道がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、またはウィルムス腫瘍を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
それを必要とする対象の腫瘍またはがんを治療する方法であって、
対象にインターフェロン感受性ウイルスを投与する前、した後、またはそれと同時に、対象にフマル酸エステルおよびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥ）含有化合物またはそれらの誘導体を投与することを含むことを特徴とする上記方法。
【請求項１３】
少なくとも一つのフマル酸エステルおよびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥ）含有化合物またはそれらの誘導体、または薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む組成物であって、ウイルス増強に用いることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
インターフェロン感受性ウイルスおよび少なくとも一つのフマル酸エステルおよびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥ）含有化合物、またはその誘導体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
インターフェロン感受性ウイルスを産生する方法であって、
少なくともフマル酸エステルおよびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥ）含有化合物またはその誘導体存在下で、適切な溶媒で、インターフェロン感受性ウイルスまたはその成分と不死化細胞、がん細胞、または腫瘍細胞を培養すること、および、
その不死化細胞、がん細胞、腫瘍細胞からインターフェロン感受性ウイルスを産生すること、を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１６】
上記インターフェロン感受性ウイルスが、弱毒化ウイルス、遺伝子改変ウイルス、非複製ウイルス、または腫瘍溶解性ウイルスであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記インターフェロン感受性ウイルスが、がんワクチンを調製するために用いられるものであって、ウイルスがワクチンであるまたはワクチンがウイルスに感染した細胞を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記産生されたウイルスがインターフェロン感受性ウイルスベースの遺伝子治療ベクターであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターフェロン感受性ウイルスの産生、感染、増殖および／または拡散を高める、および／または腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解性および免疫治療活性を高める化合物、その方法、およびその組成物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
遺伝的に弱毒化されたウイルスは増加するバイオテクノロジーと製薬プラットフォーム基盤を形成している。遺伝的に弱毒化されたウイルスは直接的な遺伝子操作、あるいは間接的な遺伝的選択によって作製され得る。例えば、限定を意味するわけではないが、弱毒化は種特異的であり、それはある宿主（例えば、卵）において増殖に適応したウイルスが、連続継代によって他の宿主（例えば、ヒト）に対する適応不全や、それに伴う弱毒化をもたらすことを含んでいる。同様に、ウイルスの遺伝的選択はがん細胞で行われ、前記遺伝的選択はウイルスが正常細胞における複製に適応不全を与えることである。そのような複製ウイルスを、正常細胞における弱毒化のために適応させるまたは遺伝子操作をするが、がん細胞で最適に増殖するものは腫瘍溶解性ウイルスとしてたびたび挙げられる。しばしば、弱毒化は選択または操作されたウイルスの能力のないことに関係し、それは意図された宿主細胞の抗ウイルス防御メカニズムを克服するためであり、前記抗ウイルス防御メカニズムにおいて重要な媒体は抗ウイルスサイトカインインターフェロン（ＩＦＮ）である。広範囲に弱毒化されたウイルスが存在し、それらは複数のアプリケーションや目的に用いられている。これはウイルス株を含み、前記ウイルス株は、生存している弱毒化または不活化ワクチン（例えば、インフルエンザ、改変ワクシニアアンカラ）の製造における安全性を提供している。これはウイルス遺伝子を部分的に除去（例えば、アデノウイルス）あるいは完全に除去（例えば、レンチウイルスまたはレトロウイルス）した複製欠損であるウイルスベクターも含み、それは必須なウイルス遺伝子／トランスの機能（例えば、共導入したプラスミドからウイルスタンパク質の発現）の補填に頼ったウイルスの作製である。前記ウイルスはたびたび遺伝子治療のベクターとして用いられる場合に、前記ベクターが何らかの治療的トランスジーンを運ぶ。複製能力のないウイルスまたは複製欠損ウイルスとも呼ばれる非複製ウイルスは、非ウイルス成分によって補填された、第一の細胞から産生され得るウイルスとして定められており、例えば限定するわけではないが、前記非複製ウイルスが第二の細胞に感染できるが、第二の細胞でそのあとに複製できないようなウイルス粒子形態を最終的にもたらすプラスミドのようなものである。
【０００３】
がん治療の分野に現れた、腫瘍溶解性ウイルス療法は過去１０年間顕著な見込みを示している。小さなＲＮＡウイルス（例えば、ラブドウイルス）から大きなＤＮＡウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス）までの幅広い範囲をベースとする、多くの腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、様々な種類のがんの治療に関して、現在臨床試験で評価段階である。この形態のがん治療にしっかりとした興奮をもたらすために、黒色腫治療のためのクラス初の単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）をベースとするＯＶの認可が２０１５年にＦＤＡによって承認された。
【０００４】
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶｓ）はがん細胞優先的に感染して死滅するように選択または操作された自己増幅型生物治療薬剤である。有効な場合、ＯＶｓはがん細胞を直接溶解することだけでなく、抗がん免疫応答の下流形成、血管遮断および治療トランスジーン発現を介して、がんの根絶を導く。上記の理由から、それらは免疫療法としてみなされている。それらのがん選択性の基礎として、ＯＶｓはがんの表現型に固有である細胞の欠点を利用している。これは１型インターフェロン応答や免疫回避、増加した細胞増殖や代謝、穴のある腫瘍血管系のように正常に機能しない抗ウイルス応答を含んでいる。腫瘍形成のその後の生物学的環境は、正常細胞に無害であるにもかかわらず、遺伝的に弱毒化されたＯＶｓの増殖をサポートすることに非常に適している。
【０００５】
それらの治療は潜在性を有し、急性インフルエンザ様症状に達するような比較的マイルドな副作用であるため、ＯＶｓはがん治療における魅力的な治療様式である。しかし、数回のヒト臨床試験で示されたように、ＯＶｓの臨床反応での不均一性は克服すべき重要な障害のままである。応答での不均一性は、効果的なＯＶ送達や腫瘍内での拡散を妨げる要因に起因するのかもしれない。
【０００６】
弱毒化されたウイルスや腫瘍溶解性ウイルスは一つの薬剤として機能するが、多くの研究は、ウイルスの拡散、全体的な有効性および／または腫瘍溶解性は薬理学的化合物を用いることによって改善され得ることを示している［１−３］。腫瘍細胞への腫瘍溶解効果のほかに、ＯＶｓが腫瘍に対する免疫応答を誘導することによって、抗腫瘍免疫を高めることも可能となる［４−７］。この免疫刺激効果は近年米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって黒色腫の治療に承認された単純ヘルペスウイルス１型ベースのＯＶである、Ｔ−ＶＥＣのようなウイルスゲノム［６−９］に免疫刺激性遺伝子を挿入することによってさらに増強され得る［１０−１２］。ＯＶｓと他の形態の免疫治療との併用はヒト患者での有望なアプローチとして現在浮上している［５−７］。
【０００７】
フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）などのフマル酸エステル（ＦＡＥ）はフマル酸のエステル型である［１３］。フマル酸は、ミトコンドリア内のエネルギーを生成する基本的な細胞内プロセスである、クエン酸回路の中間体である。フマル酸エステル（ＦＡＥ）は抗炎症および神経保護効果で知られている部類の化合物である［１４，１５，１７］。関連のメカニズムはまだ完全には解明されていないが、グルタチオン（ＧＳＨ）の機能的枯渇ならびにＮＦ−κＢの阻害［１６］を行う、抗酸化転写因子核内因子（赤血球由来２）様２（ＮＲＦ２）経路［１５］の活性化を介して媒介されていると考えられている［１８−１９］。
【０００８】
ＦＡＥｓ（Ｆｕｍａｄｅｒｍ（登録商標），Ｐｓｏｒｉｎｏｖｏ（登録商標）として販売）はドイツで乾癬の治療薬として最初に承認された。近年、Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ（登録商標）として販売されているＦＡＥであるフマル酸ジメチル（ＤＭＦ）は、多発性硬化症の再発型および再発寛解型多発性硬化症の治療薬として、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）と欧州医薬品庁で承認された［２０］。ＤＭＦの長期使用に関する臨床研究では、深刻な長期間の副作用は確認されなかった［２０−２２］。最近の報告ではＤＭＦが腫瘍発育および転移を抑制することを示し［２３−２８］、それに加え、腫瘍が化学療法に対して感受性を示している［２６−２９］ように、抗がん剤となり得る可能性を秘めていることが示唆されている。さらに、ＤＭＦは慢性リンパ性白血病と皮膚Ｔ細胞リンパ腫（例えば、ＮＣＴ０２５４６４４０，ＮＣＴ０２７８４８３４）の治療薬として現在臨床評価段階である。
【０００９】
ウイルスの増殖や拡散を高める化合物や組成物の特定は当該分野で必要である。ウイルス療法の抗がん効果を高める化合物や組成物の特定も当該分野で必要である。さらに、インビボおよび／またはインビトロでのがん細胞治療のための新規な方法が当該分野で必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明はインターフェロン感受性ウイルスの産生、感染、増殖および／または拡散を高める、および／または腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解および免疫治療活性を高める組成物および方法、組成物に関する。
【００１１】
本明細書に記載されている結果は、フマル酸およびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥｓ）の一つ以上の未報告の効果を示しており、それは複製および非複製インターフェロン感受性ウイルスの産生、感染、増殖および／または拡散を高める能力、あるいは抵抗するがんに対する腫瘍溶解性ウイルスの治療効果を増加する能力であり、例えばがん細胞への先天的抗ウイルス応答を阻害することを含み得る。
【００１２】
実施形態において、インターフェロン感受性ウイルスに感染する前、同時にまたは感染した後の不死化したがん細胞または腫瘍細胞にＦＭＡＥ化合物を投与することを含む、不死化細胞、がん細胞または腫瘍細胞におけるインターフェロン感受性ウイルスの産生、増殖、感染、拡散または力価を高めるまたは増加する方法が本明細書に提供される。
【００１３】
他の実施形態において、以下のグループから選択される一つ以上のＦＭＡＥ含有化合物を含み、がんまたは腫瘍細胞における腫瘍溶解性ウイルスの産生、感染、拡散、力価または腫瘍溶解活性を増強、増加または強化する方法が本明細書に提供される。前記ＦＭＡＥ含有化合物は、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、フマル酸ジエチル（ＤＥＦ）、マレイン酸ジメチル（ＤＭＭ）、マレイン酸ジエチル（ＤＥＭ）、マレイン酸モノエチル、フマル酸モノエチル、フマル酸モノメチル（ＭＭＦ）およびその誘導体である。
【００１４】
ある特定の実施形態において、ウイルス増強のための化合物は式（Ｉ）、式（ＩＩ）、その組み合わせ、フマル酸エステルまたはマレイン酸エステル、薬理学的に許容されるその塩またはラセミ体またはその立体化学的異性体であり、式中のＲ１およびＲ２は同一または異なり、例えば、ＯＨ、Ｏおよび（Ｃ１−６）アルコキシまたは薬理学的に許容されるその塩のような、独立的に選択された形であるものを含み得る。
【００１５】
【化１】
2021504293.tif 000002
【００１６】
【化２】
2021504293.tif 000003
【００１７】
他の非限定実施形態において、ウイルス増強のための化合物は一つ以上の式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）によって表される化合物を含み、式中のＲ１およびＲ２は同一または異なり、直鎖、分岐鎖または環状、飽和または不飽和（Ｃ１−２）アルコキシまたは（Ｃ３−２０）アルコキシから独立的に選択され、その基は例えばハロゲン、ヒドロキシ、（Ｃ１−４）アルキル、ニトロ、シアノに任意に置換されたものである。
【００１８】
特定の非限定実施形態において、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）の組成物はエノール型、ケト型およびその混合型を含むいくつかの互異性型も存在する。それに応じて、化学構造は取り得る全ての互異性型を表す。
【００１９】
非限定実施形態において、化合物は同位元素に標識された式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）の化合物から選択され、一つ以上の原子は自然界の従来の原子量とは異なる原子量を持つ。本明細書に開示される化合物に組み込まれ得る同位体の例は、限定するわけではないが、２Ｈ，３Ｈ，１１Ｃ，１３Ｃ，１４Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，１７Ｏなどを含む。
【００２０】
他の非限定実施形態において、化合物の例はＲ１およびＲ２は共にＯＨまたはＯ−を含む、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）によって表される化合物を含み得る。
【００２１】
特定の実施形態において、本明細書に記載された化合物または本明細書に記載された化合物の一つ以上の混合物、または本明細書に記載された少なくとも一つの化合物を含む組成物は、ウイルスに細胞が感染する前、同時、または後に細胞に投与し得る。その後、その細胞、一つ以上の化合物およびウイルスは増殖または培養される。
【００２２】
本明細書に記載の任意の一つの方法のさらに別の実施形態において、ＦＭＡＥ含有化合物または化合物の混合物はその化合物および一つ以上のキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物で存在し得る。
【００２３】
他の実施形態において、一つ以上のＦＭＡＥ含有化合物を含み、ａ）インターフェロン感受性ウイルス、遺伝子改変インターフェロン感受性ウイルス、弱毒化インターフェロン感受性ウイルス、腫瘍溶解性インターフェロン感受性ウイルス、インターフェロン感受性ウイルスベースのがんワクチンまたはがん遺伝子治療ベクター、ｂ）一つ以上のがん細胞、ｃ）薬理学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤、ｄ）非がん細胞；ｅ）細胞培養培地；ｆ）一つ以上のがん治療；またはａ）−ｆ）の任意の組み合わせを含む組成物を提供する。本発明は任意の一つまたはａ）−ｆ）の組み合わせは組成物またはキットから特別に除外される実施形態も意図される。任意の化合物または化合物のグループは必要に応じて除外され得る。
【００２４】
さらに他の実施形態において、一つ以上のＦＭＡＥ含化合物を含み、ａ）インターフェロン感受性ウイルス、遺伝子改変インターフェロン感受性ウイルス、弱毒化インターフェロン感受性ウイルス、腫瘍溶解性インターフェロン感受性ウイルス、インターフェロン感受性ウイルスベースのがんワクチン、またはがん遺伝子治療ベクター、ｂ）一つ以上のがん細胞、ｃ）薬理学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤、ｄ）非がん細胞；ｅ）細胞培養培地；ｆ）一つまたはそれ以上のがん治療、ｇ）細胞培養プレートまたはマルチウェルディッシュ；ｈ）化合物を細胞、培地または実験材料に届ける装置；ｉ）化合物またはキットの化合物を使用するための説明書のａ）−ｉ）を含むキットの提供。  本発明は任意の一つまたはａ）−ｉ）の任意の組み合わせは特別に除外されることを含むキットでもあることを意図している。
【００２５】
他の実施形態において、細胞はインビボまたはインビトロのがん細胞である。
【００２６】
さらなる実施形態において、インビボのがん細胞は哺乳類被験体由来であり得る。
【００２７】
またさらなる実施形態において、哺乳類被験体はヒト被験体であり得る。
【００２８】
他の実施形態において、細胞はインビトロの非がん細胞である。
【００２９】
さらに別の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスの前に、同時にまたは後に前記のがんまたは腫瘍細胞へＦＭＡＥ含有化合物またはＦＭＡＥ含有化合物の混合物の投与を含む、がんまたは腫瘍細胞において腫瘍溶解性インターフェロン感受性腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解活性の増加の方法も提供する。
【００３０】
他の実施形態において、がんまたは腫瘍細胞はインビボまたはインビトロである。
【００３１】
さらに他の実施形態において、インビボのがんまたは腫瘍細胞は哺乳類被験体由来である。
【００３２】
またさらに他の実施形態において、哺乳類被験体はヒト被験体である。
【００３３】
他の実施形態において、がんまたは腫瘍細胞における腫瘍溶解性インターフェロン感受性ウイルスの感染、拡散、力価、細胞傷害性、免疫治療活性を高めるまたは増加のための薬剤の製造におけるＦＭＡＥ含有化合物の使用を本明細書に提供する。
【００３４】
また他の実施例において、上記または本明細書全体に記載の組成物または方法のいずれかにおいて、ＦＭＡＥ含有組成物は感染抵抗性細胞においてインターフェロン感受性ウイルスの感染、増殖、拡散またはその任意の組み合わせを高めるまたは増加する。
【００３５】
また他の実施例において、上記または本明細書全体に記載の組成物または方法のいずれかにおいて、ＦＭＡＥ含有組成物は主要器官へのウイルスの拡散を引き起こさずに、インビボのがんまたは腫瘍細胞においてインターフェロン感受性ウイルスの感染、増殖、拡散またはその任意の組み合わせを高めるまたは増加する。
【００３６】
さらなる実施例において、上記または本明細書全体に記載の組成物または方法のいずれかにおいて、ＦＭＡＥ含有組成物はウイルスにより誘導されるインビボおよび／またはインビトロのがん細胞死を高める。
【００３７】
本明細書または本明細書全体に記載される方法の任意の実施形態では、インターフェロン感受性ウイルスはインターフェロン感受性またはインターフェロン感受性にされた当該分野において知られている任意の適当なウイルスであってもよく、例えば、限定するわけではないが、複製または非複製ウイルス；ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、マラバウイルス（ＭＧ−１のような）、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、レンチウイルス、複製レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはラブドウイルス、またはそれらの派生型または変異体でもよい。
【００３８】
上記または本明細書で説明される任意の方法の実施形態では、インターフェロン感受性ウイルスは腫瘍溶解性インターフェロン感受性ウイルスである。代表例は非がん細胞または正常細胞と比較して、がんまたは腫瘍細胞に優先的に感染および溶解することが当該分野において知られている任意の適当な腫瘍溶解性ウイルスであり得る。腫瘍溶解性ウイルスとして用いるために設計され得る当該分野におけるウイルスの例として、限定なしで、レトロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ラブドウイルスや、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはその派生型／変異体がここで使用され、含まれ得る。好ましい実施形態は、ウイルスは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）または、例えば、特定の増殖条件下で選択されたラブドウイルスに関連した変異体／派生型であり、ある範囲に選択圧力にさらされたもの、当該分野で知られている組み換え技術を用いて遺伝子改変をしたもの、またはそれらを組み合わせたものである。他の好ましい実施形態において、ウイルスはＶＳＶΔ５１である［３０］。他の派生型または変異体はマラバ（例えば、ＭＧ−１）、狂犬病、ロタ、インフルエンザ、Ａ型肝炎、ムンプス、麻疹、風疹、レオウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、レンチウイルス、または複製レトロウイルスなどのウイルスをベースとし得る。
【００３９】
上記または本明細書全体で説明した任意の方法の一実施形態では、一つ以上の種類の不死化細胞として、限定はしないが、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、霊長類、ウマなど、例えば限定はしないが、Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ−２９３細胞、ＥＢ−６６細胞、ＥｂＸ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＡＧＥ１．ＣＲ、Ａｇｅｌ．ＣＳ、Ａｇｅｌ．ＨＮ、Ａｇｅｌ．ＲＯ、ＱＯＲ２／２Ｅ１１、ＵＭＮＳＡＨ−ＤＦ１、ＣＨＯ、ハイブリドーマ細胞、ｓｆ９細胞、またはＲ４細胞のような細胞、細胞株または組織由来のインビトロまたはインビボの不死化細胞であり得る。
【００４０】
他の実施形態において、一つ以上の種類のがんまたは腫瘍細胞はどの細胞、細胞株、組織、または器官由来のインビトロまたはインビボのがんまたは腫瘍細胞であり得る。例えば、限定はしないが、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、霊長類およびウマなどがあり、例えば腫瘍形成細胞としては、制限しないが、２９３−Ｔ細胞、ＢＨＫ２１細胞またはＭＤＣＫ細胞がある。好ましい実施形態において、ヒトがんまたは腫瘍細胞は一つ以上のがんまたは腫瘍細胞を含み、例えば、限定するわけではないが、リンパ芽球性白血病、脊髄性白血病、副腎皮質がん、エイズ関連のがん、エイズ関連のリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型的奇形様／横紋筋肉腫様腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、小脳性星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、髄芽細胞腫、中間分化の松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍と松果体芽腫、視覚経路および視床下部神経膠腫、脊髄腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性脊髄増殖性障害、大腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胚芽腫、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管ガン、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、消化管間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外、性腺外、卵巣、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症、ランゲルハンス細胞がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、唇および口腔空洞がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨および骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、眼内黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、転移性扁平上皮がん、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、鼻腔がんおよび副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体実質腫瘍、松果体芽腫および上胚神経原発神経外胚葉腫瘍、原発神経外胚葉腫瘍、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、腎および尿管がん、移行上皮がん、気道がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、子宮肉腫、皮膚がん、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮癌、胃癌、絨毛腫瘍、尿道がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、またはウィルムス腫瘍を含む。しかし、化合物および本明細書に記載されている組成物はインビボまたはインビトロの他のがんまたは腫瘍の治療に用いることができる。
【００４１】
本発明は本明細書に記載したＦＭＡＥ含有化合物と、許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物も提供する。さらなる実施形態において、キャリアは薬理学的に許容されるキャリアである。
【００４２】
細胞におけるウイルスの感染、拡散および／または力価、および／または細胞傷害性を高めるまたは増加の方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載されるＦＭＡＥ含有化合物をウイルスの前、後または同時に細胞に投与すること、および前記細胞内のウイルスの感染、拡散および／または力価、または細胞傷害性を高めるまたは増加のためにウイルスおよび細胞を培養することを含む。好ましくは、細胞はがん細胞、腫瘍細胞または不死化細胞である。より好ましくは、細胞は哺乳類由来インビボがん細胞であり、よりさらに好ましくは、ヒト被験体由来であり、その方法はインビボで行われる。他の別の実施形態は、細胞はインビトロの不死化細胞である。
【００４３】
がん細胞において腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解活性を高めるまたは増加する方法の提供であり、前記方法が、腫瘍溶解性ウイルスの前、同時または後にがん細胞または対象に本明細書に記載された化合物を投与すること、および腫瘍溶解性ウイルスおよびがん細胞を培養することも含む。さらなる実施形態において、がん細胞はインビボがん細胞である。別の実施形態において、がん細胞はインビトロがん細胞である。細胞は哺乳類被験体由来であり、好ましくはヒト被験体である。
【００４４】
特定の実施形態において、いかなる方法でも限定を意味するわけではないが、任意でウイルスおよび／または一つ以上のウイルスによる感染が可能である一つ以上の細胞を増殖、培養またはウイルスに感染させるための、ＦＭＡＥ含有化合物および培地を含むキットを提供する。キットは任意の成分または成分の組み合わせによって使用されること、および／または本明細書に記載されたような任意の方法で行うことの説明書も含んでいる。
【００４５】
本発明はウイルスの前、後、または同時に細胞に本明細書に記載のＦＭＡＥ含有化合物を投与することを含む、細胞におけるウイルスの感染、拡散、および／または力価、または腫瘍溶解活性を高めるまたは増加する方法を提供する。方法はインビボまたはインビトロで行われる。
【００４６】
本発明は腫瘍溶解性ウイルスの前、後、または同時にがん細胞または腫瘍細胞に上記に記載した化合物の投与を含み、腫瘍またはがん細胞において腫瘍溶解性ウイルスの拡散を高めるまたは増加する方法も提供する。がん細胞または腫瘍細胞はインビトロまたはインビボであり、好ましくは、限定するわけではないが、ヒト被験体のような哺乳類被験体由来である。
【００４７】
腫瘍溶解性ウイルスの前、同時、または後にがんまたは腫瘍細胞に上記に記載された化合物の投与を含むがんまたは腫瘍細胞における腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解活性を高めるまたは増加する方法も提供される。がんまたは腫瘍細胞はインビボまたはインビトロであり、好ましくは、限定しないが、ヒト被験体のような哺乳類被験体由来である。
【００４８】
本発明は上記に記載されたＦＭＡＥ含有化合物の存在下での適切な培地でのウイルスの増殖によるウイルスの産生の方法も意図している。
【００４９】
本発明は上記に記載されたＦＭＡＥ含有化合物の存在下での適切な培地でのウイルスの増殖による弱毒化インターフェロン感受性ウイルスの産生の方法も意図している。
【００５０】
本発明は上記に記載されたＦＭＡＥ含有化合物の存在下での適切な培地でのウイルスの増殖による遺伝子改変ウイルスの産生の方法も意図している。
【００５１】
本発明は上記に記載されたＦＭＡＥ含有化合物の存在下での適切な培地でのウイルスの増殖による腫瘍溶解性ウイルスの産生の方法も意図している。
【００５２】
本発明は上記に記載されたＦＭＡＥ含有化合物の存在下での適切な培地でのウイルス増殖によって生ウイルスワクチンを産生する方法も意図している。
【００５３】
本発明は上記に記載されたＦＭＡＥ含有化合物の存在下での適切な培地でのウイルスの増殖によるウイルスベースの遺伝子治療ベクターを産生する方法も意図している。
【００５４】
本発明のこの概要は発明の全ての特徴を必要以上に記載しているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
発明のこれらおよび他の特徴は添付された図の引用において次に述べることからより明確になるであろう。
【００５６】
【図１Ａ】ＤＭＦががん細胞株においてウイルスの感染および腫瘍溶解活性を高めたことを示している。フマル酸ジメチルの構造。
【図１Ｂ】抵抗性ヒト腎臓がん細胞株７８６−０および、様々なヒトおよびマウス細胞株をＤＭＦで４時間前処理し、その後にＶＳＶΔ５１（ＭＯＩ＝０．０１）に感染させ、感染から２４時間後の感染したがん細胞の蛍光イメージである。
【図１Ｃ】抵抗性ヒト腎臓がん細胞株７８６−０をＶＳＶΔ５１（ＭＯＩ＝０．０１）に感染させ、感染から４８時間後の上清からウイルス力価を評価した。（Ｎ＝３−４；エラーバーはＳＤ（標準偏差）を示す；一元配置分散分析；未処理条件対象物と比較して*ｐ＜０．０５、***ｐ＜０．００１）
【図１Ｄ】抵抗性ヒト腎臓がん細胞株７８６−０および、様々なヒトおよびマウス細胞株をＤＭＦで４時間前処理し、その後にＶＳＶΔ５１（ＭＯＩ＝０．０１）に感染させ、感染から４８時間後の上清からウイルス力価を評価した。（Ｎ＝３−４；エラーバーはＳＤ（標準偏差）を示す；両側ｔ検定；互いの細胞株の未処理対象物と比較してｐ＜０．０５）
【図１Ｅ】抵抗性ヒト腎臓がん細胞株７８６−０をＨＳＶ（ＭＯＩ＝０．０１）に感染させ、感染から４８時間後の上清からウイルス力価を評価した。（Ｎ＝３−４；エラーバーはＳＤ（標準偏差）を示す；両側ｔ検定；互いの細胞株の未処理対象物と比較してｐ＜０．０５）
【図１Ｆ】抵抗性ヒト腎臓がん細胞株７８６−０をＳｉｎｄｂｉｓ（ＭＯＩ＝１０）に感染させ、感染から４８時間後の上清からウイルス力価を評価した。（Ｎ＝３−４；エラーバーはＳＤ（標準偏差）を示す；両側ｔ検定；互いの細胞株の未処理対象物と比較してｐ＜０．０５）
【図１Ｇ】図１Ｂと同様の前処理を行い、ＭＯＩ＝１でファイアフライルシフェラーゼ発現アデノウイルス（Ａｄ５）に感染させたヒトがん細胞株Ａ５４９である。ルシフェラーゼ活性は７日間測定した。結果は相対的光単位として表現し、バックグラウンドは黒線で示した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す；２日目から５日目に顕著な増強。二元配置分散分析によりｐ＜０．０５）
【図１Ｈ】ＤＭＦで前処理して、ＶＳＶΔ５１をＭＯＩ＝０．００１、０．０１または３で感染させた７８６−０の多段階および一段階増殖曲線であり、上清はプラークアッセイによって力価測定を行った。（Ｎ＝３；エラーバーまたはバーはＳＤを示す）
【図１Ｉ】７８６−０をＤＭＦで４時間前処理して、ＶＳＶΔ５１（ＭＯＩ＝０．０００１）で感染させ、感染から１時間後にオーバーレイアガロースを加えた。感染から４８時間後のプラーク標本の蛍光顕微鏡像である。飽和クマシーブルー染色の対応画像であり、ＤＭＦの存在下でのプラーク直径を高めることが示されている平均プラーク直径である。（Ｎ＝２０；バーは平均を示す；一元配置分散分析；Ｍｏｃｋ条件対象物との比較により*ｐ＜０．０５、***ｐ＜０．００１。）
【図１Ｊ】７８６−０、ＣＴ２６ＷＴおよびＢ１６Ｆ１０細胞株は（Ｂ）のように前処理して感染させた。細胞生存率は感染してから４８時間後に測定した。結果は対応する非感染、未処理細胞から得られた値の平均値によって標準化した。（Ｎ＝８；エラーバーはＳＤを示す。；一元配置分散分析により***ｐ＜０．００１；ＶＳＶΔ５１条件と比較により）
【図１Ｋ】７８６−０細胞をＶＳＶΔ５１（ＭＯＩ＝０．０１）で感染前または後に様々な時間で１５０μＭのＤＭＦで処理したものまたはＭｏｃｋ未処理であり、上清を感染から２４時間後に回収し、プラークアッセイによって力価を測定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す；両側ｔ検定；Ｍｏｃｋ条件対象物と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。）
【図２Ａ】ＤＭＦがエクスビボおよびヒト臨床検体において、腫瘍溶解性ウイルスの感染性を選択的に高めたことを示している。ＣＴ２６ＷＴおよびＢ１６Ｆ１０腫瘍をＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて顕著に皮下で増殖させ、切除した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓、筋肉、肺および脳組織も回収し、コアを採取した。腫瘍および正常組織のコアを１５０μＭのＤＭＦで４時間前処理し、その後１×１０４ＰＦＵのＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させ、腫瘍または正常組織のコアの感染から２４時間後の蛍光画像を撮影した。各トリプリケイトのセットから代表的な画像を示している。
【図２Ｂ】ＣＴ２６ＷＴおよびＢ１６Ｆ１０腫瘍をＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて顕著に皮下で増殖させ、切除した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓、筋肉、肺および脳組織も回収し、コアを採取した。腫瘍および正常組織のコアを１５０μＭのＤＭＦで４時間前処理し、その後１×１０４ＰＦＵのＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させ、ウイルス力価を感染から４８時間後に測定した。（Ｎ＝３〜４；エラーバーはＳＤを示す；両側ｔ検定；ｎｓは統計学的有意差がないことを示す；未処理対象物と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）
【図２Ｃ】ヒト腫瘍組織のコアをＤＭＦで４時間処理し、その後１×１０４ＰＦＵのＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させ、ウイルス力価を感染から４８時間後に測定した。（Ｎ＝３〜４；エラーバーはＳＤを示す；両側ｔ検定；ｎｓは統計学的有意差がないことを示す；未処理対象物と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）
【図２Ｄ】ヒト腫瘍組織のコアをＤＭＦで４時間処理し、その後１×１０４ＰＦＵのＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させ、腫瘍または正常組織のコアの感染から２４時間後の蛍光画像を撮影した。各トリプリケイトのセットから代表的な画像を示している。
【図２Ｅ】患者由来細胞株をＤＭＦで４時間処理し、その後ＭＯＩ＝０．０１のＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させ、ウイルス力価を感染から４８時間後に測定した。（Ｎ＝３〜４；エラーバーはＳＤを示す；両側ｔ検定；ｎｓは統計学的有意差がないことを示す；未処理対象物と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）
【図２Ｆ】ヒト正常組織のコアをＤＭＦで４時間処理し、その後１×１０４ＰＦＵのＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させ、ウイルス力価を感染から４８時間後に測定した。（Ｎ＝３〜４；エラーバーはＳＤを示す；両側ｔ検定；ｎｓは統計学的有意差がないことを示す；未処理対象物と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）
【図３Ａ】様々なフマル酸エステルおよびマレイン酸エステルが腫瘍溶解性ウイルスＶＳＶΔ５１の感染を促進することを示している。フマル酸エステル（ＤＥＦ、ＤＭＦ）およびマレイン酸エステル（ＤＥＭ，ＤＭＭ）の構造を示している。
【図３Ｂ】ＤＭＦの代謝：ＤＭＦは次々にフマル酸（ＦＡ）に代謝されることによりフマル酸モノメチル（ＭＭＦ）に加水分解される。ＦＡはその後ＴＣＡ回路に入る。
【図３Ｃ】７８６−０細胞を様々なＦＭＡＥｓまたは類似体で４時間前処理して、その後ＭＯＩ＝０．０１のＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させ、感染から２４時間後に蛍光イメージを撮影し、対応するウイルス力価は感染してから４８時間後の上清から測定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す；一元配置分散分析；未処理対象物と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。）
【図３Ｄ】ＣＴ２６ＷＴエクスビボ腫瘍のコアを様々なＦＭＡＥｓまたは類似体で４時間前処理して、その後１×１０４ＰＦＵのＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させ、感染から２４時間後に蛍光イメージを撮影し、対応するウイルス力価は感染してから４８時間後の上清から測定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す；一元配置分散分析；未処理対象物と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。）
【図３Ｅ】７８６−０細胞とＣＴ２６ＷＴ細胞を示した濃度で様々なＦＭＡＥｓで４時間処理し、その後ＶＳＶΔ５１（ＭＯＩ＝０．０１）に感染させ、感染してから４８時間後に上清を回収し、プラークアッセイによって力価を測定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示している。）
【図３Ｆ】７８６−０細胞を様々なＦＭＡＥｓで４時間処理し、その後ＧＦＰ発現ＶＳＶΔ５１に感染させ、感染から１時間後にオーバーレイアガロースを加えた。感染から２４時間後に現れたプラークの蛍光顕微鏡像、飽和したクマシーブルー染色に対応するイメージとＤＭＦ存在下でのプラークの直径を表した平均プラーク直径である。（Ｎ＝２０；バーは平均を示す；一元配置分散分析；Ｍｏｃｋ条件対象物との比較による***ｐ＜０．００１）
【図４Ａ】フマル酸ジメチルが同種および異種移植腫瘍モデルにおけるＶＳＶΔ５１の治療の有効性を高めることを示している。ＣＴ２６ＷＴ、Ｂ１６Ｆ１０およびＨＴ２９、担癌マウスは溶媒（ＤＭＳＯ）または５０または２００ｍｇ／ｋｇ（Ａに示したように）のＤＭＦで４時間腫瘍内処理し、その後１×１０４ＰＦＵファイアフライルシフェラーゼ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１または溶媒（ＰＢＳ）を腫瘍内に注入した。この処理は図４Ｃの矢印に示されているように２回または３回行われた。感染から２４時間後に、ウイルス複製をモニターした。マウスに現れた対応する生物発光イメージである。
【図４Ｂ】図４Ａの時の発光の定量化。光子の存在する規模である。（Ｎ＝１０〜１８；バーは平均を示している；ｎｓは統計学的有意差がないことを示す；両側ｔ検定により**ｐ＜０．０１；ＶＳＶΔ５１感染条件と比較して）
【図４Ｃ】図４Ａの時の腫瘍体積をグラフ化したものである。（Ｎ＝９〜１５；エラーバーはＳＥＭ（標準誤差）を示している；二元配置分散分析によって、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１；ＤＭＳＯのみの条件とＤＭＦ＋ＶＳＶΔ５１との比較により）
【図４Ｄ】生存率は時間と共にモニターした。ログ・ランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定は併用治療がＶＳＶΔ５１単独よりも顕著に延命したことを示している。（ＣＴ２６ＷＴ  Ｎ＝１０〜１３、ｐ＝０．０００８；Ｂ１６Ｆ１０  Ｎ＝９〜１４、ｐ＝０．００３９；ＨＴ２９  Ｎ＝１０〜１５、ｐ＝０．０００３）
【図４Ｅ】腫瘍体積と生存率はＤから治療したマウスおよびナイーブマウスにおいてＣＴ２６ＷＴの再移植後にモニターした。（Ｎ＝３〜５、エラーバーはＳＤを示す）
【図４Ｆ】腫瘍体積はＣＴ２６ＷＴ−治療マウスおよびナイーブマウスにおける４Ｔ１細胞の移植後にモニターした。（Ｎ＝３、エラーバーはＳＤを示す）
【図５Ａ】フマル酸エステルおよびマレイン酸エステルが抗ウイルスサイトカイン産生および１型インターフェロン応答を阻害することを示している。ＦＭＡＥｓ処理してＧＦＰ発現ＶＳＶΔ５１に感染した７８６−０の細胞溶解液は、感染してから２４時間後に回収し、ＲＮＡまたはタンパク質を抽出した。散布図は、ＤＭＦ存在下または非存在下における、感染した７８６−０間で特異に発現した遺伝子の発現レベルを示している。
【図５Ｂ】図５Ａの時の遺伝子オントロジー関係の概要。
【図５Ｃ】図５Ａの時のウイルス感染時のＦＭＡＥｓによって最もダウンレギュレートされたＧＯタームのリスト。
【図５Ｄ】図５Ａの時の特異に発現した「ウイルスに反応する」ＧＯターム遺伝子の発現レベルを示すヒートマップである。
【図５Ｅ】図５Ａの時のタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットで示したタンパク質を調べた。
【図５Ｆ】７８６−０細胞はＤＭＦまたはｍｏｃｋ処理で４時間前処理し、ＶＳＶΔ５１またはｗｔＶＳＶ（ＭＯＩ＝０．０１）に感染させた。対応するウイルス力価は感染してから４８時間後の上清から決定した。（Ｎ＝３，エラーバーはＳＤを示す）
【図５Ｇ】７８６−０細胞をＤＭＦ、ＭＭＦ、またはｍｏｃｋ処理で４時間処理し、ＭＯＩ＝１のＶＳＶΔ５１ΔＧに感染させた。感染してから１２時間後または１６時間後の上清を回収し、プレコンディションの４時間処理した７８６−０細胞を用い、その後ＶＳＶΔ５１またはｗｔＶＳＶに感染させた。対応するウイルス力価は感染してから４８時間後の上清から決定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す）
【図５Ｈ】７８６−０は図５Ａのように処理し、感染から１６時間後に上清を回収し、その後ＥＬＩＳＡでＩＦＮβを測定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す）
【図５Ｉ】図５Ｈの時の感染から３６時間後の上清を回収し、その後ＩＦＮαをＥＬＩＳＡで測定した。
【図５Ｊ】７８６−０細胞をＦＭＡＥｓで６時間処理し、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−αで４時間処理し、その後ＭＯＩ＝０．１のＶＳＶΔ５１に感染させた。対応するウイルス力価は感染して４８時間後の上清から測定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す）
【図５Ｋ】７８６−０細胞を２００μＭのＤＭＦで１時間または４時間前処理し、ＩＮＦβ（２５０Ｕ／ｍＬ）で３０分処理した。タンパク質を抽出し、その後ウエスタンブロットでｐＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ１およびアクチンを調べた。
【図６Ａ】ＤＭＦが感染でのＮＦ−κＢのトランスロケーションを阻害することを示している。ＤＭＳ、ＭＭＳ、Ｓの構造。
【図６Ｂ】７８６−０は示したＤＭＦ類似体で４時間前処理し、その後ＭＯＩ＝０．０１のＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させた。感染から２４時間後の感染した７８６−０細胞の蛍光イメージである。
【図６Ｃ】図６Ｂの時の対応するウイルス力価は感染から４８時間後の上清から決定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す；一元配置分散分析；未処理対象物と比較して***ｐ＜０．００１）
【図６Ｄ】ＧＳＨレベルはＦＭＡＥｓで４時間処理後の７８６−０細胞から決定をした。（Ｎ＝４；エラーバーはＳＤを示す；一元配置分散分析；未処理対象物と比較して***ｐ＜０．００１）
【図６Ｅ】ヒートマップは左次的に発現した酸化ストレス遺伝子の発現レベルを示す。遺伝子の発現レベルは未処理感染コントロールから得られた値を正規化した。
【図６Ｆ】ｈｍｏｘ１発現レベルはＦＭＡＥｓで６時間処理後の７８６−０細胞からｑＰＣＲで定量化した。
【図６Ｇ】７８６−０をＢＳＯ（２ｍＭ）存在下で７日間増殖させ、ＤＭＦ（２００μＭ）で４時間前処理し、その後ＭＯＩ＝０．０１のＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に感染させた。対応するウイルス力価は感染から４８時間後の上清から決定した。
【図６Ｈ】ｓｉＮＲＦ２ノックダウン７８６−０細胞はＤＭＦで処理し、（図６Ｇ）のように感染させた。対応するウイルス力価は感染から４８後の上清から決定した。ＲＮＡを抽出し、ｎｒｆ２遺伝子およびｉｆｉｔｍ１遺伝子の発現をｑＰＣＲで定量化した。
【図６Ｉ】細胞質および核のタンパク質画分はＤＭＦ（２００μＭ）で４時間処理し、その後ＭＯＩ＝１でＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１に８時間感染させた７８６−０細胞から抽出した。細胞溶解液からは、ウエスタンブロットで示されるように多数のタンパク質が検出された。
【図６Ｊ】細胞質および核のタンパク質画分はＤＭＦ（２００μＭ）で４時間処理し、その後ＴＮＦα（３０ｎｇ／ｍＬ）で３０分処理した。細胞溶解液からは、ウエスタンブロットで示されるように多数のタンパク質が検出された。
【図６Ｋ】７８６−０をＮＦ−κＢ阻害剤（ＩＫＫ１６［１０μＭ］、ＴＰＣＡ１［４０μＭ］）で４時間前処理し、その後ＤＭＦ（１５０μＭ）とＭＯＩ＝０．０１のＧＦＰ発現腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１で共処理した。対応するウイルス力価は感染から２４時間後の上清から決定した。（Ｎ＝３；エラーバーはＳＤを示す；一元配置分散分析；未処理対象物と比較して***ｐ＜０．００１）
【図７】図７は、ＭＭＦが２９３−Ｔ細胞から産生されたレンチウイルスを増加したことを示している。２９３Ｔ細胞はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを用い９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞は３ウェルずつＭＭＦ、溶媒のみ（ＤＭＳＯ）で処理またはｍｏｃｋは培養液で処理し、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、４つのプラスミドを三世代型レンチウイルスルシフェラーゼレポーター遺伝子システムで導入し、その後３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。インキュベーション後に、上清を新しい９６ウェルプレートに移し、粘着性プレート密封剤で密閉し、すぐに−８０℃で凍らせた。レンチウイルス産生量を測定するため：ＨＴ１０８０細胞を９６ウェルプレートにＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを用いて１００μＬのボリュームで５ｅ３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。翌朝、８０μＬの増殖培地を取り除き、３０μＬの解凍されたレンチウイルス含有上清を２ウェルずつ置換した。プレートは８９０Ｇで１０分間遠心し、その後３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞にその後１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現は各ウェルにルシフェリン（２ｍｇ／ｍＬ；１ウェルあたり２５μＬ）を加えた後に、Ｂｉｏｔｅｃｋプレートリーダーを用いて測定した。データはｍｏｃｋ処理に対する条件ごとの６つの同条件のウェルから算出された平均ＲＬＵの倍率変化で表した。ｍｏｃｋとＭＭＦ条件間の違いは分散分析（ｐ＜０．０００１）において顕著であった。
【図８】図８は、ＶＥＲＯ−ＳＦ細胞におけるＥＬＩＳＡでのインフルエンザＡ／ＦＭ／１／４７のＤＭＦの効果を示している。ＶｅｒｏＳＦ（無血清培地に適応させたＶｅｒｏ細胞）を９６ウェルプレートに播種し、溶媒単独処理、ＤＭＦ処理およびＭＯＩ＝０．０１でインフルエンザＡ／ＦＭ／１／４７を感染させた。三日後、感染性の上清を回収し、プール（条件あたりＮ＝３ウェル）し、ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔ＃  ＩＡＶ１４２，Ｖｉｒｕｓｙｓ）を行った。吸光度の値をプラークアッセイで前もって力価測定したＦＭ／１／４７ストックから作成した標準曲線を基準としたｐｆｕ／ｍＬに変換した。データは２〜４回の実験の平均で示している。
【発明の詳細な説明】
【００５７】
以下の説明は一つ以上の好ましい実施形態である。いくつかの発明は組成物または同一の、類似の、または異なる使用または使用方法を提供するキットと共に本明細書に記載される。
【００５８】
最初の態様において、産生、感染、拡散、または力価、および／または細胞におけるインターフェロン感受性ウイルスの腫瘍溶解活性または免疫治療活性の一つ以上を高めるまたは増加する方法を本明細書に提供し、その方法はウイルスを細胞に感染させる前、後または同時に前述の細胞にＦＭＡＥ含有化合物の投与を含んでいる。
【００５９】
他の態様において、限定するわけではないが、インビトロにおいて、不死化細胞でのインターフェロン感受性ウイルスの産生、感染、拡散、力価を高めるまたは増加する方法を本明細書に提供し、その方法は細胞をウイルスに感染させる前、後、または同時に前述の細胞にＦＭＡＥ含有化合物を投与することを含む。
【００６０】
さらなる態様において、限定するわけではないが、インターフェロン感受性ウイルスの産生、感染、拡散、力価はＦＭＡＥ含有化合物の非存在下のウイルスの感染、拡散、力価と比較して増強されている。
【００６１】
さらなる態様において、がん細胞または腫瘍細胞における腫瘍溶解性インターフェロン感受性ウイルスの産生、感染、拡散、力価、または腫瘍溶解性活性または免疫治療活性を高めるまたは増加の方法を本明細書に提供し、その方法は細胞にウイルスを感染させる前、後、同時に前述の細胞にＦＭＡＥ含有化合物の投与を含む。
【００６２】
さらなる態様において、限定するわけではないが、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解活性はウイルス単独の腫瘍溶解活性またはＦＭＡＥ含有化合物単独の治療活性と比較してがんまたは腫瘍細胞において増強される。
【００６３】
組成物の任意のさらに別の実施形態では、上記に記載した方法または手法である、ＦＭＡＥ含有化合物は感染抵抗性細胞においてインターフェロン感受性ウイルスの感染、増殖または拡散を高める。
【００６４】
本開示は処置の結果が感染すること（形質導入を含む）、細胞で増殖または複製すること、一つ以上の組織に拡散すること、細胞からトランスジーンをエンコードしたウイルスを産生すること、ウイルスにエンコードされた成分から直接または免疫応答を介して間接的に感染細胞またはその細胞付近の未感染細胞の細胞死を誘導するためのウイルスの能力の向上であることを示すウイルス増強を意図している。ウイルス増強によって、処置がウイルスの固有の感染、複製または拡散能力またはトランスに働く追加成分（例えば、遺伝子導入されたプラスミド）の助けと共に産生する能力を向上することによって、細胞からのウイルス産生収率の増加を誘導する。
【００６５】
組成物の任意のさらに別の実施形態では、方法または手法は上記に記載した、ＦＭＡＥ含有化合物はウイルスが主要器官に拡散させずに、インビボにおいてがん細胞または腫瘍細胞におけるインターフェロン感受性ウイルスの感染、増殖、または拡散を高めるまたは増加する。
【００６６】
任意の組成物のさらなる実施形態において、方法または手法は上記に記載され、ＦＭＡＥ含有化合物はインビボおよびインビトロでウイルスに誘導されるがん細胞死を高めるまたは増加する。
【００６７】
さらなる実施形態において、限定するわけではないが、一つ以上のＦＭＡＥ含有化合物、および一つ以上の、ａ）インターフェロン感受性ウイルス、遺伝子改変インターフェロン感受性ウイルス、弱毒化インターフェロン感受性ウイルス、腫瘍溶解性インターフェロン感受性ウイルス、インターフェロン感受性ウイルスベースのワクチンまたは遺伝子治療ベクター、ｂ）一つ以上のがん細胞、ｃ）溶媒、希釈剤または賦形剤、ｄ）薬理学的に許容されたキャリア、希釈剤または賦形剤、ｅ）非がん細胞、ｆ）細胞培養培地、ｇ）一つ以上のがん療法；またはａ）〜ｇ）の任意の組み合わせも含む組成物を提供する。本発明はどれか一つまたはａ）〜ｇ）の組み合わせは組成物またはキットから特に除外されることを含む実施形態も意図している。任意の成分または成分のグループは必要に応じて除かれ得る。
【００６８】
他の実施形態において、一つ以上のＦＭＡＥ含有化合物、および一つ以上のａ）インターフェロン感受性ウイルス、遺伝子改変インターフェロン感受性ウイルス、弱毒化インターフェロン感受性ウイルス、腫瘍溶解性インターフェロン感受性ウイルス、インターフェロン感受性ウイルスベースのワクチンまたは遺伝子治療ベクター、ｂ）一つ以上のがん細胞、ｃ）薬理学的に許容されたキャリア、希釈剤、または賦形剤、ｄ）非がん細胞、ｅ）細胞培養培地；ｆ）一つ以上のがん治療、ｇ）細胞培養プレートまたはマルチウェルディッシュ、ｈ）化合物を細胞、培地または対象に運ぶ装置、；ｉ）化合物またはキット内のいかなる成分を使用するための説明書、ｊ）溶媒、希釈剤または賦形剤、またはａ）〜ｊ）のいかなる組み合わせも含むキットが本明細書に提供される。本発明は任意の一つまたはａ）〜ｊ）を組み合わせたものが特に除かれるキットも意図している。
【００６９】
一つ以上の化合物を使われていない時と比較することで、ウイルス活性、産生、腫瘍溶解活性、または細胞傷害性を高めるまたは増加することは、少なくとも一つのウイルス感染および／またはその比率、ウイルス産生および／またはその比率、最高の力価に届き得るウイルス力価および／またはその比率、細胞溶解および／またはその比率、ウイルスの細胞傷害性および／またはその比率、またはその任意の組み合わせを高めるまたは増加することを含み、本明細書に指示されることに注意することで当該分野の技術を持つ者によって理解され得る。
【００７０】
腫瘍溶解性ウイルスの免疫治療活性を高めるまたは増加することは、ＦＭＡＥ含有化合物の存在下においてウイルスによって誘導または発現したサイトカインの高発現を含む、多くのサイトカインのアップレギュレーションを介して全身の抗腫瘍免疫応答を高めるまたは増加することを含むことは、本明細書に指示されることに注意することで当該分野の技術を持つ者によって理解され得る。
【００７１】
理解されるように、特定の実施形態において、ＦＭＡＥ含有化合物はマレイン酸またはフマル酸のメチルエステルまたはエチルエステルのシスまたはトランス同位体であり得る天然の化合物を含み得る。シスおよびトランス同位体の混合物も意図される。
【００７２】
特定の実施形態において、適切なフマル酸エステルおよびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥ）化合物の特定の例には以下が含まれる；
【００７３】
【化３】
2021504293.tif 000004
【００７４】
【化４】
2021504293.tif 000005
【００７５】
【化５】
2021504293.tif 000006
【００７６】
【化６】
2021504293.tif 000007
または、
【００７７】
【化７】
2021504293.tif 000008
【００７８】
理解されるように、特定の実施形態において、フマル酸エステルとマレイン酸エステル（ＦＭＡＥ）化合物は少なくとも一つのエステル部分と、α−β不飽和炭素を含む任意の適切なフマル酸またはマレイン酸誘導体も含み得る。特定の実施形態において、ＦＭＡＥ化合物は式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）のものを含み得る。
【００７９】
【化８】
2021504293.tif 000009
ＲａおよびＲｂは同一または異なり、少なくとも一つのＲａまたはＲｂはインビボで加水分解されるエステル機能性を提供するために選択されたものを含む。
【００８０】
特定の実施形態において、ＦＭＡＥ化合物は式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のものを含み得る；
【００８１】
【化９】
2021504293.tif 000010
ＲａおよびＲｂは同一または異なり、ＲａおよびＲｂは互いに独立的に選択された形である：  水素；直鎖、分鎖、環状飽和または不飽和アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ１０アルキルのような）、それは任意に置換され得る（例えば、一つ以上のハロゲン、水酸基、ニトロ、またはシアノに）；または非存在であり得る（すなわち、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）のカルボキシル化をする）および、ＲａまたはＲｂの一つが不在または水素のとき、一方は存在し、水素ではない。
【００８２】
理解されるように、特定の実施形態において、ＦＭＡＥ化合物は任意の適する塩、エステル、プロドラッグ、機能的模倣体、前駆体、または他の適する上記のＦＭＡＥ化合物の誘導体も含み得る。
【００８３】
腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくは非がん細胞または正常細胞がん細胞と比較してがん細胞または腫瘍を形成できる任意の細胞も含む腫瘍細胞に感染および溶解するウイルスを含み得る。当該分野において既知である腫瘍溶解性ウイルスの例は、限定しないが、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、ワクチニアウイルス、水疱性口内炎ウイルスやその派生型／変異体のようなラブドウイルスを含む。好ましい実施形態において、ＦＭＡＥ含有化合物またはその誘導体の存在下のウイルスは本明細書に記載したように、ウイルス単独との比較、および正常細胞単独との比較、またはＦＭＡＥ含有化合物または誘導体の存在下でがん細胞または腫瘍細胞を優先的に感染または溶解する。
【００８４】
インターフェロン感受性ウイルスはインターフェロン感受性として、またはインターフェロン感受性にされたものとして当該分野で既知である任意の適切なウイルスでもあり得る。例えば、限定はしないが、のような複製または非複製ウイルスを含む。ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、マラバウイルス（ＭＧ−１のような）、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、レンチウイルス、複製レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはラブドウイルスまたはその派生形を含むことが意図されている。好ましい実施形態において、本明細書に記載されているように、ＦＭＡＥ含有化合物またはその誘導体の存在下のウイルス。
【００８５】
特定の実施形態において、インターフェロン感受性ウイルスは正常細胞またはインターフェロン感受性がん細胞において、抗ウイルスＩ型またはＩＩＩ型インターフェロンの作用によって、ウイルス複製が制御または阻害されているウイルスを含み得る。
【００８６】
インターフェロン感受性によって、前述のウイルスに許容される細胞の生物学的に関連のあるインターフェロン処理の後に、前述のインターフェロン処理に応答する正常な能力を示し、野生型または遺伝子操作および／または選択を介して弱毒化した派生型株のどちらかであり得るウイルスが前述の細胞に導入、感染、複製、増殖、拡散、トランスジーン発現、ウイルス子孫の産生、または殺すことを意味する。図５Ｊはウイルスのインターフェロン感受性を試験する手段の例を示しており、感染細胞において、インターフェロン存在下または非存在下で生存ウイルスが増殖するかどうかがウイルスのインターフェロン感受性を決定する。例えば、限定するわけではないが、Ｉ型インターフェロンを含む任意のインターフェロンで前処理した細胞では増殖せず、未処理細胞では増殖するウイルスはインターフェロン感受性だと考えられる。インターフェロン処理後のインターフェロン感受性細胞におけるウイルス増殖の減少は検出可能な減少の可能性があり、小さな減少は弱い効果に関連し、大きな減少は強い効果に関連する。
【００８７】
ウイルスの細胞傷害／腫瘍溶解活性はインビトロ、インビボ、または両方で存在し、観測され、発揮され得る。実施形態において、限定を意味するわけではないが、ウイルスはインビボで細胞傷害／腫瘍溶解活性を示す。
【００８８】
ウイルスの派生型または変異体によって、異なる増殖条件下で選択されることによって得られるウイルスを意味し、ある範囲の選択圧力にさらされ、当該分野で既知の組み換え技術を用いて遺伝子操作されたもの、または複製に欠損のあるおよび／または変異遺伝子の発現で作られたもの、またはその任意の組み合わせである。そのようなウイルスの例は当該分野においてよく知られており、例えば、米国の特許出願の２００４０１１５１７０、２００４０１７０６０７、２００２００３７５４３、ＷＯ  ００／６２７３５；米国の特許７，０５２，８３２、７，０６３，８３５、７，１２２，１８２（参照により本明細書に統合される）およびその他。好ましいウイルスは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはラブドウイルスに関連するその変異体／派生型であり、例えば、特異的な増殖条件下で選択された、ある範囲の選択圧にあてられたもの、当該分野で知られている組み換え技術を用いて遺伝子改変したもの、またはそれを組み合わせたもの。好ましい実施形態において、ウイルスはＶＳＶΔ５１である［３０］。
【００８９】
がんまたは腫瘍細胞の一つ以上のタイプは任意の細胞、細胞株、組織または器官由来のインビトロまたはインビボのがんまたは腫瘍または腫瘍形成細胞であり得る。好ましい実施例において、一つ以上のがんまたは腫瘍細胞はヒトがんまたは腫瘍細胞を含み、例えば、限定しないが、リンパ芽球性白血病、骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連がん、エイズ関連リンパ腫、肛門がん虫垂がん、星状細胞腫、異型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、小脳星細胞腫、脳星細胞腫/悪性神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、髄芽腫、中分化の松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫、視覚経路および視床下部神経膠腫、脊髄腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、皮膚T細胞リンパ腫、胚性腫瘍、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃（胃）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外、性腺外、卵巣、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症、ランゲルハンス細胞がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、唇および口腔がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、眼内黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、転移性扁平上皮頸部がん、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体実質腫瘍、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、腎および尿管がん、移行上皮がん、気道がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、子宮肉腫、皮膚がん、メルケル細胞皮膚がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、扁平上皮がん、胃（胃）がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、T細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺がん、栄養芽腫、尿道がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、またはウィルムス腫瘍である。しかしながら、本明細書に記載された化合物または組成物はインビボまたはインビトロの他のがんまたは腫瘍に用いられ得る。
【００９０】
インビボの治療応用のために、好ましくは一つ以上のＦＭＡＥ含有化合物および薬学的に許容される溶媒、希釈剤、または賦形剤を含み、任意に塩などに溶解した他の溶質を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態において、溶液は等張液を作るための十分な生理食塩水、グルコースなどを含む。医薬組成物または方法を用意する方法は当該分野で既知であり、記載され、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（以前は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）に；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌｉｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）、参照により本明細書に統合される。
【００９１】
このような組成物の投与は、局所および／または全身の治療が望ましいかどうか、および治療するエリアに依存して任意の数のルートを介し得る。第一の実施形態において、限定を意味するわけではないが、化合物は治療するエリアに局所投与される。投与は局所（目を含み、膣と直腸送達を含む粘膜へ）、肺（例えば、ネブライザーによることを含む、粉末またはエアゾールの吸入または注入によって）、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与は静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入、または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内または脳室内投与。また腫瘍内注射、灌流、または腫瘍の付近一般への送達、または腫瘍を占める脈管構造への注射も意図している。あるいは、ＦＭＡＥ含有化合物は経口投与のために錠剤またはカプセルに配合され得る。他の剤型は、その分野において知られている緩効性、徐放性、持続放出性を含むものも意図している。
【００９２】
吸入または注入による投与のために、化合物は水または部分的に水溶液に配合でき、それはその後エアゾールの形で利用できる。局所使用の為に、修飾因子は肌の患部に適用される薬学的に許容される溶媒で散布剤、クリームまたはローションとして配合できる。
【００９３】
限定することを望まないが、本発明のＦＭＡＥ含有化合物の投薬量条件は使用される特定の組成物、投与のルート、治療する特定の対象で変更し得る。投薬量条件は当該分野で技術を持つ者には既知である標準的な臨床技術によって決定できる。典型的には、治療は化合物または化合物／ウイルスの適正量よりも少ない少量で一般的に開始されるであろう。その後、投薬量はその状況下で適正または満足のいく効果が得られるまで増加させる。一般的に、ＦＭＡＥ含有化合物またはＦＭＡＥ含有化合物を含む医薬組成物は顕著に有害または有毒な副作用を引き起こすことのない、効果的な結果を与え得る濃度で投与される。投与は一回単位または必要に応じて行える。投薬量は一日中適する回数で投与される扱い易いサブユニットに分割され得る。
【００９４】
ＦＭＡＥ含有化合物は連続投与で行われ得て、例えば、インターフェロン感受性ウイルスの投与の前、後または前後両方、例えば限定はしないが、弱毒化ウイルス、遺伝子操作ウイルス、ワクチンウイルス、遺伝子治療ベクターまたは腫瘍溶解性ウイルスであり得る。あるいは、ＦＭＡＥ含有化合物は上記に記載したようなウイルスを例えば、腫瘍溶解性ウイルスの混合物で、同時または組み合わせて投与され得る。それに加え、ＦＭＡＥ含有化合物は上記に記載したような腫瘍溶解性ウイルスと共にまたは当該分野の技術を持つ人に知られている一つ以上のがん治療またはがん療法と併用して用いられ得る。例えば、限定ではないが、インターフェロン療法、インターロイキン療法、コロニー刺激因子療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤療法、化学療法薬、例えば限定しないが、５−フルオロデオキシウリジンアムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グリアデル、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、タクシリン、ミトマイシン、ミトマイシン、ミトマイシン、ミトマイシン、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフールウラシル、エテモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、オビンデシン、ビノレルビンまたはそれらの組み合わせ。さらに、例えば限定しないが、モノクローナル抗体などのような抗がん生物学も行われる。
【００９５】
本発明は、インターフェロン感受性ウイルスの拡散を増加または高めることについて本明細書に記載した組成物の方法や使用も意図しており、例えば、一つ以上の細胞において、遺伝子操作ウイルス、弱毒化ウイルス、ワクチンウイルス、遺伝子治療ベクター、または腫瘍溶解性ウイルス、例えば限定しないが、不死化、がんまたは腫瘍細胞の一つ以上のタイプであり、一つ以上のがんまたは腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスの細胞傷害／腫瘍溶解活性の増加または増強、ウイルスの産生、収量、生殖能力の増加または増強、例えば、遺伝子操作ウイルス、弱毒化ウイルス、ワクチンウイルス、遺伝子治療ベクター、腫瘍溶解性ウイルス、または、上記の任意の組み合わせ。実施形態において、限定を意味するわけではないが、組成物はがん細胞または腫瘍細胞を殺すまたはある期間その増殖を制限することにより、がんまたは腫瘍細胞の生存率を減少させる。
【００９６】
他の実施形態において、細胞はインビボまたはインビトロのがん細胞であり得る。さらなる実施形態において、インビボがん細胞は哺乳類検体由来であり得る。またさらなる実施形態において、哺乳類検体はヒト検体であり得る。他の実施形態において、細胞はインビトロの不死化細胞である。
【００９７】
本発明はインターフェロン感受性ウイルスの産生、感染、増殖および拡散の増加または増強について本明細書に記載した組成物の方法または使用も意図しており、例えば、一つ以上の細胞における遺伝子操作ウイルス、弱毒化ウイルス、ワクチンウイルス、遺伝子治療ベクター、または腫瘍溶解性ウイルス、例えば、限定しないが、一つ以上のタイプの不死化、がんまたは腫瘍細胞、ウイルスの産生、収量、または生殖能力の増加または増強、例えば、遺伝子改変ウイルス、弱毒化ウイルス、ワクチンウイルス、遺伝子治療ベクター、腫瘍溶解性ウイルス、または上記の任意の組み合わせ。
【００９８】
次の例において、ＤＭＦおよび様々なフマル酸エステルおよびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥｓ）が、がん細胞株ならびにヒト腫瘍生検において、様々な腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）のウイルス感染を高め、抵抗性同種および異種移植腫瘍モデルにおける治療結果の改善をすることが観測された。高められた拡散または腫瘍溶解性を含む恒久性の反応は、ＯＶおよび薬剤の単剤療法に抵抗性であるにもかかわらず、モデル例においても観測された。理論につなげることを望まないが、ＤＭＦのウイルス拡散を高める観測された能力は、Ｉ型ＩＦＮ産生および応答の阻害能力の結果に起因し、それは転写因子ＮＦ−κＢの核内転移の防ぐ能力に関連し、それによって、先天性がん細胞免疫応答を克服する手助けをしているのかもしれない。実験的結果の特定の非限定実施形態において、ＦＭＡＥｓは例えば、標的がんにおいて有利になり得る、正常組織のウイルス増殖と比較して、腫瘍細胞において、ウイルス拡散.／増殖を改善した。以下の研究において、ＦＭＡＥ処理は腫瘍溶解性ウイルスの感染に対する自然免疫応答が減少し、それによりウイルスの有効性を高めることが観測された。
【００９９】
追加の例はＤＭＦおよびＭＭＦを含む様々なフマル酸エステルおよびマレイン酸エステル（ＦＭＡＥｓ）は不死化非がん細胞においてウイルスの産生、収量または生殖能力を増加または高めることができる。ある実施形態において、ＤＭＦ処理は不死化非がん性Ｖｅｒｏアフリカミドリザル腎臓細胞において弱毒化した複製可能インターフェロン感受性インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１  ＦＭ／１／４７ウイルスの産生能を高めることがわかった。他の実施形態において、２９３Ｔ細胞のウイルスパッケージングタンパク質をエンコードするプラスミドのトランスフェクションの後に、ＭＭＦは複製欠陥レンチウイルスの産生を高めることが観測された。
【０１００】
本発明を以下の実施例でさらに説明する。
【実施例１】
【０１０１】
実施例１：フマル酸ジメチルは腫瘍特異的にウイルスの拡散または腫瘍溶解性を高める。
【０１０２】
私たちはまず、腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶΔ５１）の増殖におけるＤＭＦ（図１Ａの構造）の効果を調べた。とりわけ、ＶＳＶおよびマラバに近く関連したものは近年臨床試験段階であるが、がんのおよそ３分の１が感染に抵抗性であることに直面している［３０−３１］、７８６−０腎臓癌細胞はＶＳＶΔ５１感染の高い難治性であるが、しかしながら、５０μＬと２００μＬの間の投薬量のＤＭＦで４時間前処理することで、１００倍以上の低い多重度感染（ＭＯＩ）でＶＳＶΔ５１ウイルス増殖は増加した（図１Ｃ）。ウイルスにエンコードされたＧＦＰの発現は顕微鏡で可視化されたように非常に高められた（図１Ｂ）。この効果は感染前の２４時間までの前処理時間、および感染してから８時間まで観測された（図１Ｋ）。より一般的に、ＤＭＦはＶＳＶΔ５１に対する幅広い感受性でヒトおよびマウスがん細胞株（肉腫、骨肉腫、乳房、結腸、黒色腫、卵巣）のパネルにおいて、感染が強く高められた（図１Ｄ）。ＤＭＦは７８６−０細胞の処理後に腫瘍溶解性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１変異体Ｎ２１２）およびシンドビスウイルスのウイルス放出も示した（図１ＥおよびＦ）。さらに、私たちは腫瘍溶解性ウイルス療法に加え、遺伝子治療ベクターとして広範囲に用いられるアデノウイルスにおけるＤＭＦの効果も試験した［３２］。ＤＭＦでヒト肺腺癌Ａ５４９細胞の前処理は非複製アデノウイルスのルシフェラーゼトランスジーン発現を増加させ、７Ｅ１Ａ欠損Ａｄ５では７日間のコースで２０倍まで増加させた（図１Ｇ）７８６−０細胞で行われた単一段階または多段階増殖曲線は高いＭＯＩを用いたときではなく低いＭＯＩを用いたときＤＭＦがＶＳＶΔ５１のウイルス放出を高めることを示した（図１Ｈ）。それはＤＭＦが感染細胞あたりのウイルス放出よりもむしろウイルス拡散に影響を与えるメカニズムを阻害したことを示した。ウイルス拡散におけるＤＭＦの効果のさらなる調査のために、７８６−０細胞単層にＶＳＶΔ５１を感染させ、ウイルス複製ｆｏｃｉの定義されたプラークを作るために、アガロースをオーバーレイした。ＤＭＦは感染細胞単層の蛍光イメージおよびクマシーブルー染色でＶＳＶΔ５１の平均プラーク直径を増加させた（図１Ｉ）。ＤＭＦ存在下におけるＶＳＶΔ５１の腫瘍溶解性効果をさらに調べるために、私たちは低いＭＯＩのＶＳＶΔ５１で感染前にＤＭＦでがん細胞を前処理し、細胞生存率は感染から４８時間後に代謝染料ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）で測定した。ＤＭＦとＶＳＶΔ５１の併用処置はヒト７８６−０と同様にマウスＣＴ２６ＷＴおよびＢ１６Ｆ１０細胞における細胞生存率の相乗的現象を誘導した（図１Ｊ）。
【実施例２】
【０１０３】
実施例２：フマル酸ジメチルはエクスビボおよびヒト臨床検体において、腫瘍特異的感染を高める。
【０１０４】
私たちはマウス由来組織のエクスビボにおいてＶＳＶΔ５１の感染を高めるＤＭＦの能力を調べた。ＣＴ２６ＷＴマウス大腸癌細胞またはＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫がん細胞皮下に移植したマウスの腫瘍中心並びに正常肺、筋肉および脾臓のコアを回収し、その後１５０μＭのＤＭＦの存在下または非存在下でＶＳＶΔ５１−ＧＦＰを感染させた。ＤＭＦは腫瘍ＣＴ２６ＷＴおよびＢ１６Ｆ１０コアにおけるウイルスの増殖をそれぞれ３１倍および１３倍に強く増加させたが、正常組織コアにおけるウイルスの増殖は増加しなかった（図２ＡおよびＢ）。さらに、ＤＭＦはプラークアッセイおよび顕微鏡検査で、原発性ヒト黒色腫、肺、前立腺、卵巣腫瘍検体（図２ＣおよびＤ）並びに様々な黒色腫および卵巣の患者由来がん細胞株（図２Ｅ）のエクスビボにおいて、１０倍以上でＶＳＶΔ５１の感染を増加した。マウス正常組織コアに類似している、ＤＭＦは様々な患者由来のヒト正常肺および筋組織においてウイルスの増殖を示さなかった（図２Ｆ）。
【実施例３】
【０１０５】
ＤＭＦに加えて、様々なフマル酸エステルまたはマレイン酸エステル（ＦＭＡＥｓ）は抗炎症特性および免疫調節特性を示すことがわかった［３３］。私たちはそれゆえ他のＦＡＥｓおよびそれらのシスおよびトランス異性体（マレイン酸エステル）（図３ＡおよびＢ）ががん細胞のウイルス感染におけるＤＭＦに類似した影響を有するか調べた。実際、フマル酸ジエチル（ＤＥＦ）およびマレイン酸エステル、マレイン酸ジメチル（ＤＭＭ）、およびマレイン酸ジエチル（ＤＥＭ）のような細胞透過性ＦＡＥはインビトロの７８６−０細胞およびＣＴ２６ＷＴ細胞におけるＶＳＶΔ５１感染、拡散、および腫瘍溶解性を強く高めた（図３Ｃ、Ｅ、Ｆ）。高められた感染はエクスビボで感染したＣＴ２６ＷＴ腫瘍コアでのＦＭＡＥｓでも観測された（図３Ｄ）。ＤＭＦはインビボでエステラーゼによってフマル酸モノメチル（ＭＭＦ）に急速に加水分解され、その後フマル酸（ＦＡ）に加水分解される（図３Ｂに示したように）［３４］。実際、ＭＭＦは多発性硬化症の治療において、ＤＭＦの活性代謝物であると考えられてきた［３４］。７８６−０細胞において、ＭＭＦは効果的投薬量より高いにもかかわらず、ＤＭＦと同程度のＶＳＶΔ５１の感染を大幅に高めた。細胞浸透性エステルＭＭＦおよびＤＭＦと対照的にフマル酸（ＦＡ）は、ウイルス増殖には何も影響を及ぼさなかった（図３Ｃ、Ｅ）。まとめると、我々のデータはＤＭＦおよび他の細胞浸透性ＦＭＡＥｓはマウスおよびヒト細胞株両方とがん組織移植においてＯＶｓの拡散を劇的に高めることを示している。
【実施例４】
【０１０６】
実施例４：フマル酸ジメチルはマウス前臨床モデルにおいて、腫瘍溶解性ラブドウイルスの治療効果を改善する。
【０１０７】
ＤＭＦは薬剤として臨床的に承認されて以来、および本明細書に記載した研究においてヒトおよびマウスの腫瘍移植インビボでＶＳＶΔ５１の増殖および活性を広く強く高めたこと以来、そして正常細胞に対して腫瘍細胞にとても優先的であり、私たちは次に、インビボにおいてＤＭＦと腫瘍溶解性ＶＳＶΔ５１の混合による潜在的な治療的効果を評価した。この目的を達成するために、私たちは単一療法として効果のないＶＳＶΔ５１を示した同種および異種マウス腫瘍モデルの両方を用いた［３５−３８］。マウスＣＴ２６ＷＴ、Ｂ１６Ｆ１０およびヒト大腸癌ＨＴ２９細胞をＢａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６またはヌードマウスのそれぞれにおいて増殖させた。マウスの腫瘍内にＤＭＦを４時間注射し、その後ルシフェラーゼ発現ＶＳＶΔ５１を感染させた。Ｂ１６Ｆ１０モデルを除き、ＤＭＦはインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて調べた結果、最初のウイルス注入の２４時間後に腫瘍で特異的にウイルス関連ルシフェラーゼ遺伝子の発現を高めた（図４Ａ、Ｂ）。それでも、全ての三種類のモデルにおいて、併用療法は腫瘍の進行の大幅な遅延をもたらし（図４Ｃ）、同様に一方の単独療法と比較して顕著に生存を延長した（図４Ｄ）。併用療法はＣＴ２６ＷＴおよびＢ１６Ｆ１０モデルの両方において、マウスのおよそ２０％の完全寛解をもたらせた。併用療法を受けて治療されたＣＴ２６ＷＴ関連マウスはその後同様のがん細胞の再攻撃に対して免疫性になった（図４Ｅ）。しかしながら、治療されたＣＴ２６ＷＴを有するマウスは外来腫瘍（マウス４Ｔ１乳がん）で攻撃されたとき、治療されたＣＴ２６ＷＴマウスはナイーブマウスと同様の速度で４Ｔ１腫瘍を増殖させた（図３Ｆ）。完全に特異的かつ長期にわたる抗腫瘍免疫の効果的な生成を示す。
【実施例５】
【０１０８】
実施例５：フマル酸エステルおよびマレイン酸エステルは抗ウイルス反応を阻害する。
【０１０９】
ＤＭＦおよび他のＦＭＡＥｓによるＯＶｓの増強を媒介する可能なメカニズムにさらなる洞察を得るために、ＤＭＦ、ＤＥＭ、ＤＥＦ、ＤＭＭの存在下または非存在下でＶＳＶΔ５１の感染から２４時間後にマイクロアレイ遺伝子発現解析を７８６−０細胞で行った。ＶＳＶΔ５１の感染において、複数の抗ウイルス遺伝子は予測のようにアップレギュレートしたが、ＤＭＦはそれらの多く（ｉｆｉｔｉｍ１，ｍｘ２，ｇｂｐ４，ｉｆｉ２７，ｉｆｎａ，ｃｘｃｌ１０）の阻害を引き起こし、様々な遺伝子（ｃｙｐ４ｆ１１，ｃｄｋ５ｒａｐ２，ａｎｘａｌＯ  ｈｍｏｘ１，ｏｓｇｉｎ１，ｔｘｎｒｄ１，ａｋｒ１ｂ１０，ａｋｒ１ｂ１５，ａｋｒ１ｃ１，ａｋｒ１ｃ２）をアップレギュレートした（図Ａ，Ｄ）。ＧＯターム解析は感染した７８６−０細胞のＦＭＡＥｓ処理がＩ型ＩＦＮシグナルと同様にウイルスに対する応答の阻害を引き起こした（図５Ｂ、Ｃ、Ｄ）。Ｉ型ＩＦＮ応答の抑制と一致して、ＤＭＦは感染してから２４時間後にＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２の両方の活性化（リン酸化）を減少させた（図５Ｅ）。加えて、抗ウイルスタンパク質ＩＦＩＴＭ１の発現レベルはＶＳＶウイルスタンパク質が増加した一方、ＤＭＦによる潜在的に抑制された（図５Ｅ）が、野生型ＶＳＶ（ｗｔＶＳＶ）による７８６−０細胞の感染における影響はなかった（図５Ｆ）。ＶＳＶΔ５１とは異なり、ｗｔＶＳＶはＩ型ＩＦＮ産生を強く阻害することは既知であり、それゆえもしＩ型ＩＦＮ応答がＤＭＦのプロウイルス効果の誘発に実際関わっているのならば、ＤＭＦの効果がｗｔＶＳＶの環境下で余剰となり得ることが考えられ得る。抗ウイルス応答におけるＦＭＡＥｓの効果の機能的洞察を得るために、私たちはウイルス攻撃、およびＩＦＮ媒介抗ウイルスシグナルに対して保護する能力を調べた。ＦＭＡＥｓ（またはｍｏｃｋ）処理後に、私たちはｄｅ  ｎｏｖｏ粒子の形成を抑制するためにウイルスのＧタンパク質（ウイルス放出、宿主細胞結合およびウイルス侵入に関与する糖タンパク質；ＶＳＶΔ５１ΔＧ）をエンコードしないＶＳＶΔ５１の拡散欠損型を細胞に感染させた［３９］。細胞上清は感染してから１２時間または１６時間に回収し、ＶＳＶΔ５１またはｗｔＶＳＶに感染する前に標的細胞の前処理に使用した。私たちの結果はＶＳＶΔ５１ΔＧに感染した細胞の上清はＶＳＶΔ５１またはｗｔＶＳＶのその後のウイルス感染から保護できるが、ＤＭＦまたはＭＭＦの添加はＶＳＶΔ５１およびｗｔＶＳＶ両方のこの抑制効果を完全に克服できることを示している（図５Ｇ）。実際、私たちはＥＬＩＳＡを通して、ＦＭＡＥｓの存在下の感染後にＩＦＮβおよびＩＦＮαの産生を減少させたことを観測している（図５Ｈ，Ｉ）。さらに、ＤＭＦまたは他のＦＭＡＥｓでの細胞の処理はＶＳＶΔ５１感染においてＩ型ＩＦＮ前処理の抗ウイルス効果を弱めた。まとめると、それらのデータはＦＭＡＥｓがＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介してＩ型ＩＦＮおよび下流シグナリングの産生を抑制する抗ウイルスシグナリングに影響することを示唆している。これと一致して、ウエスタンブロット実験はＶＳＶΔ５１感染を高める投薬量のＩＦＮβの条件の細胞において、ＤＭＦおよびＤＥＭはウイルス感染後のＩ型ＩＦＮの転写および応答に関するＳＴＡＴ１リン酸化を阻害したことを明らかにした（図５Ｋ）。
【実施例６】
【０１１０】
実施例６：フマル酸エステルまたはマレイン酸エステルは、ＧＳＨ枯渇とは無関係にＮＦ−κＢ阻害を介して感染を促進する。
【０１１１】
私たちのデータが、抗ウイルス応答における多数のＦＭＡＥｓの効果が明らかに関係しているようであるため、それら効果を引き起こす現象の分子鎖をさらに調査した。ＤＭＦ、ＤＥＭ、ＤＥＦおよびＭＭＦはマイケル付加反応でＧＳＨによって攻撃され、細胞のＧＳＨ枯渇または抗酸化反応を活性化するそれら化合物の能力に関係する共通のリン不飽和炭素を共有している。私たちはそれゆえに、この機能性部分を欠くコハク酸ジメチル（ＤＭＳ）の影響を調べた（図６Ａ）。私たちはＤＭＳがウイルスの放出において影響がないことがわかった（図６Ｂ，Ｃ）だけでなく、ＤＭＳ，コハク酸（Ｓ）の加水分解型がわかった。ＦＡ，ＤＭＳおよびＳと対照的に、全てのＦＭＡＥｓはＧＳＨの枯渇ができた（図６Ｄ）。しかしながら、ＧＳＨの合成に要求されるグルタミン酸システインリガーゼ（ＧＣＬ）の阻害剤であるブチオニンスルホキシイミン（ＢＳＯ）存在下で１０日間培養した細胞によって、ＧＳＨの細胞レベルの事前の枯渇後は、ＤＭＦのプロウイルス活性はいまだ明らかであった（図６Ｇ）。マイクロアレイによって、抗ウイルス遺伝子発現のそれらの影響に並行して、ＦＭＡＥｓは抗酸化反応に関する多数の遺伝子の強い発現を誘導した（図６Ｅ）。特に、リアルタイムＰＣＲによって決められたｈｍｏｘ１発現はＦＭＡＥｓによって、一貫して１００倍以上アップレギュレートされたが（図６Ｆ）、ＦＡ、ＤＭＳ、またはＳの処理ではアップレギュレートされなかった（図６Ｆ）。ＤＭＦおよび他のＦＭＡＥｓはＮＲＦ２の抗酸化遺伝子の誘導をもたらすＫＥＡＰ１の共有結合修飾を介して核内転移を誘導したことを示した［４１］。これはＦＭＡＥｓによるｈｍｏｘ１と他のＮＲＦ２標的遺伝子の誘導である私たちの観測と一致するが、ＦＡ、ＤＭＳ、またはＳとは一致しない（図６Ｅ、Ｆ）。ＤＭＦのプロウイルス効果がＮＲＦ２活性に依存するかどうか調べるために、ＮＲＦ２をノックアウトするｓｉＲＮＡが行われた。私たちはＮＲＦをノックダウンすることはＶＳＶΔ５１感染を高める、また抗ウイルス因子ｉｆｉｔｍ１を阻害するＤＭＦの能力を防がないことがわかった（図６Ｈ）。さらに、ＤＭＦはＫＥＡＰ１変異の入った細胞株のいくつか（Ａ５４９［４２］、ＣＴ２６ＷＴ［４３］）で、感染を高めることができた（図１Ｄ）。合わせてこれらのデータは、感染を高めるＦＭＡＥｓの能力がＧＳＨ枯渇に関係するα、β−不飽和鎖を要求することを示唆したが、ＧＳＨ枯渇、またＮＲＦ２活性はこの現象のカギとなるようなメディエーターではなかった。ＤＭＦを与えることはＮＦ−κＢの核内侵入の阻害を介してＬＰＳで刺激したときに、サイトカイン産生の阻害を明らかに示していた［４４−４５］ので、私たちは感染細胞の核および細胞質画分を調べた。ＮＦ−κＢのサブユニットのｐ６５を確かめることは、感染またはＴＦＮα刺激でのＤＭＦは特にＩＦＮβの転写だけでなくＩ型ＩＦＮの応答にも関連するこの転写因子のリン酸化および転移を阻害したことを明らかにした（図６Ｉ、Ｊ）。
【実施例７】
【０１１２】
実施例７：ＭＭＦは２９３Ｔからのレンチウイルス産生を増加する。
【０１１３】
図７はルシフェラーゼをエンコードする結果として生じるレンチウイルスを含む、４つのプラスミドを含んだ３世代型複製欠損レンチウイルスシステムで感染させた２９３Ｔ細胞のＭＭＦ処理を示しており、培地または溶媒（ＤＭＳＯ）のみと比較してウイルスの収率が２．４倍増加した結果であった。ウイルスの力価は任意のＨＴ１０８０細胞にレンチウイルス含有の上清を移した後にルシフェラーゼ発現によって決定した。これはＭＭＦが不死化細胞におけるプラスミドの共トランスフェクションによって作られた複製欠損レンチウイルスの産生を顕著に増加した。
【実施例８】
【０１１４】
実施例８：ＤＭＦはＶｅｒｏＳＦ細胞におけるインフルエンザウイルス力価を増加する。
【０１１５】
図８は、ＶｅｒｏＳＦ細胞のＤＭＦ処理がインフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１  ＦＭ／１／４７の収率を（ＤＭＳＯ溶媒および培地のみと比較して）３．０〜３．８倍増加させたことを示しており、前記ＶｅｒｏＳＦ細胞は無血清培地で増殖するよう適応させたＶｅｒｏ細胞である。この実施例において、ウイルス核タンパク質抗原は標準物質と比較してＥＬＩＳＡによって定量化し、このデータはウイルス力価を推定するために用いた。これらのデータはＤＭＦがインフルエンザウイルスタンパク質抗原の産生を高めたことを直接示し、インフルエンザウイルスの収量は同様に改善されたことを間接的に示している。
【材料および方法】
【０１１６】
薬剤、化学物質およびサイトカイン：薬剤、化学物質およびサイトカインおよびそれらそれぞれの仕入れ先と溶媒は以下の通りである。
【０１１７】
【表１】
2021504293.tif 000011
【０１１８】
細胞株：Ｂ１６Ｆ１０（黒色腫），ＣＴ２６ＷＴ（大腸），７６−９（肉腫），２９３−Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ＥＭＴ６（乳線），Ｋ７Ｍ２（骨肉腫）マウスがん細胞株；Ｖｅｒｏサル腎臓細胞（および無血清培地適応Ｖｅｒｏ細胞）；および７８６−０（大腸），Ａ５４９（肺），ＨＴ２９（大腸），Ｍ１４（黒色腫），ＯＶＣＡ４３３（卵巣），  ＳＫＯＶ３（卵巣），  ＥＫＶＸ（肺），  ＨＴ１０８０（肉腫）、ヒトがん細胞は１０％ウシ胎児血清（ＣａｎＳｅｒａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＨｙＱ  ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ‘ｓ培地（ＤＭＥＭ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）またはＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養した。全ての細胞株は３７℃、５％ＣＯ２条件の加湿インキュベーターでインキュベートした。全ての細胞はマイコプラズマ汚染のないことを確認した。
【０１１９】
ヒト由来細胞株：卵巣がんの初代培養はＯｔｔａｗａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ（ＯＨＳＮ−ＲＥＢ）プロトコル番号  ２０１４００７５−０１Ｈにより、ルーチン穿刺術の間、卵巣がんの個人の腹水由来である。これら細胞は１０％ウシ胎児血清を添加したｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地で維持した。これらの培養は実験モデルとして用いるために特徴づけられ、凍結保存した。黒色腫初代培養は切除された外科的標本由来である。手術はＯｔｔａｗａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで行われ、標本はＯＨＳＮ−ＲＥＢ  ＃２０１２０５５９−０１により、患者の同意を得たのちに得られた。初代培養は１０％ウシ胎児血清を添加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地で維持した。初代細胞は腫瘍標本をメスでホモジナイズし、７０μｍのナイロンメッシュセルストレーナーを通してホモジネートをフィルタリングした後に確立した。ホモジネートは実験目的に生じる十分な細胞増殖まで定期的に培地交換することで培養を維持した。初代黒色腫培養は特徴づけ、実験モデルとして使うまで凍結保存した。
【０１２０】
ウイルスおよび定量化：ラブドウイルス：インディアナのＶＳＶ（ＶＳＶΔ５１または野生型）は本研究を通して用いられ、Ｖｅｒｏ細胞に伝播した。ＧＦＰまたはファイアフライルシフェラーゼ発現ＶＳＶΔ５１は前述のＶＳＶΔ５１組換え誘導体である［３０］。全てのウイルスはＶｅｒｏ細胞に伝播させ、５〜５０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）勾配で精製し、全てのウイルス力価は前述のＶｅｒｏ細胞での標準プラークアッセイによって定量化した［４６］。感染性ウイルス粒子数は１ミリリットル（ｍＬ）当たりのプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）として示した。アデノウイルス。Ａｄ５−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ファイアフライルシフェラーゼを発現する５血清型アデノウイルス）はこれらの研究で用いた。単純ヘルペスウイルス。ＧＦＰ発現ＨＳＶ−１  Ｎ２１２。ＨＳＶウイルス力価は前述のＶｅｒｏ細胞における標準プラークアッセイで定量化した。シンドビスウイルス。シンドビスウイルスはＶｅｒｏ細胞における標準プラークアッセイで定量化した。プラークは感染してから３日後にカウントした。レンチウイルス。ルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを有するレンチウイルスは上清にルシフェリンを添加した後にＢｉｏｔｅｋプレートリーダーを用いて定量化した。インフルエンザ。インフルエンザＡ／ＦＭ／１／４７ウイルスを用い、ＥＬＩＳＡによって吸光度値を得た。
【０１２１】
細胞生存率アッセイ：細胞の代謝活性はａｌａｍａｒＢｌｕｅＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてメーカーのプロトコルに従って評価した。蛍光はＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５３０ｎｍの励起に基づき、５９０ｎｍで測定した。
【０１２２】
マイクロアレイおよび解析：７８６−０細胞は６ウェルディッシュで１×１０６の密度で播種し、一晩接着させた。翌日、細胞はＤＥＭ（３５０μＭ）、ＤＥＦ（３５０μＭ）、ＤＭＭ（３００μＭ）、ＤＭＦ（２００μＭ）または溶媒で４時間前処理した。前処理後に、細胞はＭＯＩ＝０．０１のＶＳＶΔ５１またはｍｏｃｋ感染で感染させた。感染から２４時間後、ＲＮＡはＲＮＡ−ｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い回収した。生物学的な３組をその後プールし、ＲＮＡ純度はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  ＰｒｉｍｅＶｉｅｗ  Ａｒｒａｙ（Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｔｈｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）でハイブリダイゼーションする前にａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。マイクロアレイのデータはＧｅｎｅ  Ｌｅｖｅｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＡｎａｌｙｓｉｓのデフォルトパラメーターのもとでＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（ＴＡＣ）３．０を用いて行われた。遺伝子発現における倍率変換は非感染、未処理コントロールと関連する互いの遺伝子で計算した。正常化した発現値のヒートマップはＲ  ｐａｃｋａｇｅ  ｐｈｅａｔｍａｐを用いて作製した。遺伝子発現値のＶｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔｓはＲを用いて作製した。遺伝子オントロジーエンリッチメント解析は多重仮説検定（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）の補正後にＧＯｒｉｌｌ［４７］を用いて評価した。生および処理済みのマイクロアレイデータはＮＣＢＩ−Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＧＳＥ９７３２８）に預けた。
【０１２３】
マウス腫瘍モデル：ＣＴ２６ＷＴモデル：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られた６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスは１００μＬのＰＢＳでサスペンドした５×１０５の同種のＣＴ２６ＷＴ細胞を注射することで皮下腫瘍を与えた。移植から１１日後に腫瘍は２００  ｍｇ／ｋｇのＤＭＦ（ＤＭＳＯに溶解した）または溶媒のみで腫瘍内（ｉ．ｔ．）に一度処理した。４時間後、腫瘍はファイアフライルシフェラーゼ発現ＶＳＶΔ５１の１×１０８ＰＦＵ（２５μＬのＰＢＳ中に）を腫瘍内注射した。ＨＴ２９モデル。６週齢メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは１μＬの無血清ＤＭＥＭおよび１００μＬのＧｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）でサスペンドされた５×１０６の同種のＨＴ２９細胞の注射によって皮下腫瘍を与えられた。腫瘍がおよそ５ｍｍ×５ｍｍ（移植から１１日後）に発育した時、マウスは２００ｍｇ／ｋｇのＤＭＦ（ＤＭＳＯで溶解）または示された溶媒で一度腫瘍内処理した。４時間後、腫瘍は１×１０８ＰＦＵでファイアフライルシフェラーゼ発現ＶＳＶΔ５１を腫瘍内注射した。Ｂ１６Ｆ１０モデル。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで得られた６週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスは１００μＬのＰＢＳにサスペンドした５×１０５同種Ｂ１６Ｆ１０細胞の注射によって皮下腫瘍を得た。移植から１１日後に、腫瘍は５０ｍｇ／ｋｇのＤＭＦ（ＤＭＳＯで溶解）または溶媒のみで一度腫瘍内（ｉ．ｔ．）処理した。４時間後、腫瘍に１×１０８ＰＦＵ（２５μＬのＰＢＳ中の）のファイアフライルシフェラーゼ発現ＶＳＶΔ５１を腫瘍内注射した。腫瘍サイズは電子ノギスを用いて１日おきに測定した。腫瘍体積は（長さ２×幅）／２として計算した。生存率の研究について、マウスは腫瘍が１，５００ｍｍ３に達したときに殺処分した。インビボイメージングについて、ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）は前述のように用いた［３６］。各マウスの生物発光シグナル強度はＬｉｖｉｎｇ  ＩｍagｅＲ  ｖ２．５０．１  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量化した。全ての動物実験のサンプルサイズはｎ＞５よりも優れていた。マウスは全ての実験における腫瘍サイズによって異なる処理グループに無作為化した。初期処理日に触知可能な腫瘍のないマウスは研究から除外した。観測者は実験中に配分を見失わず、治療成績評価をした。全ての実験はｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｔｔａｗａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＯＨＲＩ−２２６５  ａｎｄ  ＯＨＲＩ−２２６４に従って行われた。
【０１２４】
エクスビボマウスモデル：ＢＡＬＢ／ｃマウスはＣＴ２６ＷＴを皮下移植した。マウスは腫瘍が少なくとも１０ｍｍ×１０ｍｍのサイズに達した後に生贄として捧げた。腫瘍、肺、脾臓および脳組織はマウスから抽出し、厚さ２ｍｍのスライスにカットし、パンチ生検を用いて２ｍｍ×２ｍｍの断片にコアをくりぬいた。各組織コアは１０％ウシ胎児血清、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加した１ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）でインキュベートし、３７℃、５％ＣＯ２条件の加湿インキュベーターでインキュベートした。コアは化学物質の示された濃度で４時間処理した。続いて、コアをその後ＶＳＶΔ５１−ＧＦＰに感染させた。ＧＦＰ写真は感染してから２４時間後の各コアで撮影した。
【０１２５】
エクスビボヒトサンプル：腫瘍サンプルは手術中に同意した個人から取得し、標本は前述のように操作した［４８］。ヒト組織サンプル（ＯＨＳＮ−ＲＥＢ  ＃２００３１０９−０１ＨおよびＯＨＳＮ−ＲＥＢ  ＃２０１２０５５９−０１）の全ての研究の認可はｔｈｅ  Ｏｔｔａｗａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄによって与えられた。患者はヘルシンキ宣言のガイドラインに則り、書面によるインフォームドコンセントを提供した。
【０１２６】
免疫ブロット法：細胞はペレット化して５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１００ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）および１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて氷上で３０分間溶解した。核および細胞質の抽出のために、ＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）を提供されたプロトコルに従って用いた。ブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）によってタンパク質の決定をした後、２０μＬの澄んだ細胞溶解物をＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（登録商標）  ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＮｕＰａｇＥＲ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で電気泳動し、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。ブロットは５％ＢＳＡまたはミルクでブロッキングし、リン酸化Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１，＃９１７１，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：１０００希釈）およびＳｔａｔ１（＃９１７２，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：１０００希釈），Ｓｔａｔ２（＃７２６０４，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：１０００希釈），リン酸化Ｓｔａｔ２（＃８８４１０Ｓ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：１０００希釈），ＩＦＩＴＭ１（＃６００７４−ｌ−Ｉｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，５％ｍｉｌｋで１：１０００希釈），ＶＳＶ（Ｄｒ  Ｅａｒｌ  Ｂｒｏｗｎから提供された，１：２０００希釈），ＨＭＯＸｌ（＃７００８１，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：２０００希釈）またはβ−Ａｃｔｉｎ（＃４９７０，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：１０００希釈）特異的抗体でプローブした。ブロットはヤギ抗ウサギまたはマウスペルオキシダーゼ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）でその後プローブした。バンドはＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて可視化した。
【０１２７】
ＥＬＩＳＡ：１２ウェルディッシュに播種した７８６−０細胞は化合物または溶媒で４時間前処理し、その後示したＭＯＩでＶＳＶΔ５１−ＧＦＰを感染させるまたは感染させず置いた。細胞上清は示した感染後の異なる時間に回収した。ＩＦＮアルファおよびＩＦＮベータの定量化は製造元の指示に従ってＶｅｒｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ  ａｌｐｈａ  ｏｒ  ＩＦＮ  ｂｅｔａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＰＢＬ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。４５０ｎＭの吸光度値はＭｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＭＸＴ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
【０１２８】
定量リアルタイムＰＣＲ：７８６−０細胞は示した化学物質または溶媒で６時間処理した。細胞を回収し、ＲＮＡ抽出はＱｉagｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。ＲＮＡの定量および純度はＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて評価した。ＲＮＡはＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でｃＤＮＡに変換した。リアルタイムＰＣＲ反応は７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）の製造元のプロトコールに従って行った。ＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンと比較した遺伝子発現。誘導倍率は各遺伝子の未処理／未感染サンプルとの比で計算した。
使用したｑＰＣＲプライマーのリスト：
gapdh (For -ACAGTCAGCCGCATCTTCTT (SEQ ID NO: 1); Rev-
GTTAAAAGCAGCCCTGGTGA) (SEQ ID NO:2)
hmox1 (For-ACTGCGTTCCTGCTCAACAT (SEQ ID NO:3); Rev-
GGGGCAGAATCTTGCACTTT) (SEQ ID NO:4)
nrf2 (For-CAACTACTCCCAGGTTGCCC (SEQ ID NO:5); Rev-
AGTGACTGAAACGTAGCCGA) (SEQ ID NO:6)
ifitm1 (For-CCGTGAAGTCTAGGGACAGG (SEQ ID NO:7); Rev-
GGTAGACTGTCACAGAGCCG) (SEQ ID NO:8)
【０１２９】
上清トランスファー実験。１２ウェルディッシュに播種した７８６−０細胞をＦＭＡＥｓまたは溶媒で４時間前処理し、その後ＭＯＩ＝１でＶＳＶΔ５１ΔＧ−ＧＦＰに感染させた。このウイルスは細胞に感染でき、そのゲノムを複製できるが、放出または拡散ができず、さらにウイルスＧタンパク質を欠損しているため、上清へのウイルス粒子の放出を妨げられている。感染してから１時間後の上清は残余の薬剤およびウイルスを取り除くために取り除き、１０％ウシ胎児血清を添加した成長培地で補充した。感染から１２時間後または１６時間後の上清を回収してから、新鮮な７８６−０細胞に移し、さらなる解析を行った。
【０１３０】
ｓｉＲＮＡ。１２ウェルプレートに播種した７８６−０細胞にＮＲＦ２（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＮＦＥ２Ｌ２  ｓｉＲＮＡ  ＃Ｌ−００３７５５−００−０００５，ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）またはｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ（ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）に対するｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ（１００ｎＭ）をトランスフェクションした。トランスフェクションは製造元のプロトコール（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って行った。
【０１３１】
グルタチオンアッセイ。９６ウェルプレートに播種した７８６−０細胞をＦＭＡＥｓまたは溶媒で４時間前処理し、グルタチオンレベルを製造元の指示に従いＧＳＨ−Ｇｌｏ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて決定した。発光ベースのアッセイはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によって触媒されたグルタチオン存在下でルシフェリン誘導体のルシフェリンへの変換に基づいている。ファイアフライルシフェラーゼの結合反応で作られるシグナルはサンプルに存在するグルタチオン量に比例している。アッセイ結果はキットで提供されたＧＳＨ標準溶液を用いて正常化した。ルシフェラーゼ発現はその後ＳｙｎｅｒｇｙＭｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて測定した。
【０１３２】
統計。統計的有意性はウェルチが補正したスチューデントのＴ検定を用いて計算し、一元配置または二元配置分散分析試験は図の説明に示したように行った。全ての統計解析について、差異はＰ値が０．０５以下であるとき、有意であると考えられる。エラーバーは平均の標準誤差を示す。ログ・ランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定は生存研究におけるプロットの顕著な差を決定するために用いる。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０およびマイクロソフト  エクセルを用いて行った。
【０１３３】
参考文献
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［１４］  Ｌ．  Ｋａｐｐｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＧ−１２  Ｐｈａｓｅ  ｌｉｂ  Ｓｔｕｄｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ａ  ｍｕｌｔｉ−ｃｅｎｔｒｅ，  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｌｉｂ  ｓｔｕｄｙ，  Ｌａｎｃｅｔ  ３７２，  １４６３−１４７２  （２００８）．
［１５］  Ｒ．  Ａ．  Ｌｉｎｋｅｒ，  Ｄ．−Ｈ．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｒｙａｎ，  Ａ．  Ｍ．  ｖａｎ  Ｄａｍ，  Ｒ．  Ｃｏｎｒａｄ，  Ｐ．  Ｂｉｓｔａ，  Ｗ．  Ｚｅｎｇ，  Ｘ．  Ｈｒｏｎｏｗｓｋｙ，  Ａ．  Ｂｕｋｏ，  Ｓ．  Ｃｈｏｌｌａｔｅ，  Ｇ．  Ｅｌｌｒｉｃｈｍａｎｎ，  Ｗ．  Ｂｒｉｉｃｋ，  Ｋ．  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｓ．  Ｇｏｅｌｚ，  Ｓ．  Ｗｉｅｓｅ，  Ｒ．Ｈ．  Ｓｃａｎｎｅｖｉｎ，  Ｍ．  Ｌｕｋａｓｈｅｖ，  Ｒ．  Ｇｏｌｄ，  Ｆｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒｓ  ｅｘｅｒｔ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｒｆ２  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ，  Ｂｒａｉｎ  １３４，  ６７８−６９２  （２０１１）．
［１６ａ］  Ｒ．  Ｌｏｅｗｅ，  Ｗ．  Ｈｏｌｎｔｈｏｎｅｒ，  Ｍ．  Ｇｒｏｇｅｒ，  Ｍ．  Ｐｉｌｌｉｎｇｅｒ，  Ｆ．  Ｇｒｕｂｅｒ，  Ｄ．  Ｍｅｃｈｔｃｈｅｒｉａｋｏｖａ，  Ｅ．  Ｈｏｆｅｒ，  Ｋ．  Ｗｏｌｆｆ，  Ｐ．  Ｐｅｔｚｅｌｂａｕｅｒ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｕｍａｒａｔｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＴＮＦ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ＮＦ−ＫＢ／ｐ６５  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６８，  ４７８１−４７８７  （２００２）．
［１７］  Ｐ．  Ａｌｂｒｅｃｈｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｏｎ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ９，  １６３  （２０１２）
［１８］  Ｊ．  Ｃ．  Ｕ．  Ｌｅｈｍａｎｎ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｌｉｓｔｏｐａｄ，  Ｃ．  Ｕ．  Ｒｅｎｔｚｓｃｈ，  Ｆ．  Ｈ．  Ｉｇｎｅｙ，  Ａ．  ｖｏｎ  Ｂｏｎｉｎ，  Ｈ．  Ｈ．  Ｈｅｎｎｅｋｅｓ，  Ｋ．  Ａｓａｄｕｌｌａｈ，  Ｗ．−Ｄ．  Ｆ．  Ｄｏｃｋｅ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １２７，  ８３５−８４５  （２００７）．
［１９］  Ｓ．  Ｘ．  Ｌｉｎ，  Ｌ．  Ｌｉｓｉ，  Ｃ．  Ｄｅｌｌｏ  Ｒｕｓｓｏ，  Ｐ．  Ｅ．  Ｐｏｌａｋ，  Ａ．  Ｓｈａｒｐ，  Ｇ．  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｋａｌｉｎｉｎ，  Ｄ．  Ｌ．  Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ，  Ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ａｎｄ  ｈａｅｍ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１，  ＡＳＮＮｅｕｒｏ  ３  （２０１１），  ｄｏｉ：１０．１０４２／ＡＮ２０１０００３３．
［２０］  Ｃ．  Ｂ．  Ｂｕｒｎｅｓｓ，  Ｅ．  Ｄ．  Ｄｅｅｋｓ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  ＣＮＳ  Ｄｒｕｇｓ  ２８，  ３７３−３８７  （２０１４）．
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［２３］  ８．  Ｘ．  Ｘｉｅ，  Ｙ．  Ｚｈａｏ，  Ｃ．−Ｙ．  Ｍａ，  Ｘ．−Ｍ．  Ｘｕ，  Ｙ．−Ｑ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．−Ｇ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｊｉｎ，  Ｘ．  Ｓｈｅｎ，  Ｊ．−Ｌ．  Ｇａｏ，  Ｎ．  Ｌｉ，  Ｚ．−Ｊ．  Ｓｕｎ，  Ｄ．−Ｌ．  Ｄｏｎｇ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＧＳＨ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ／ＲＯＳ  ｉｎｃｒｅａｓｅ／ＭＡＰＫｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １７２，  ３９２９−３９４３  （２０１５）．
［２４］  Ｎ．  Ｅ．  Ｂ．  Ｓａｉｄｕ，  Ｇ．  Ｎｏｅ，  Ｏ．  Ｃｅｒｌｅｓ，  Ｌ．  Ｃａｂｅｌ，  Ｎ．  Ｋａｖｉａｎ−Ｔｅｓｓｌｅｒ，  Ｓ．  Ｃｈｏｕｚｅｎｏｕｘ，  Ｍ．  Ｂａｈｕａｕｄ，  Ｃ．  Ｃｈｅｒｅａｕ，  Ｃ．  Ｎｉｃｃｏ，  Ｋ．  Ｌｅｒｏｙ，  Ｂ．  Ｂｏｒｇｈｅｓｅ，  Ｆ．  Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，  Ｆ．  Ｂａｔｔｅｕｘ，  Ｊ．  Ａｌｅｘａｎｄｒｅ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｆｕｍａｒａｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ＮＲＦ２／ＤＪ−１  Ａｘｉｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  １６，  ５２９−５３９  （２０１７）．
［２５］  Ｒ．  Ｌｏｅｗｅ，  Ｔ．  Ｖａｌｅｒｏ，  Ｓ．  Ｋｒｅｍｌｉｎｇ，  Ｂ．  Ｐｒａｔｓｃｈｅｒ，  Ｒ．  Ｋｕｎｓｔｆｅｌｄ，  Ｈ．  Ｐｅｈａｍｂｅｒｇｅｒ，  Ｐ．  Ｐｅｔｚｅｌｂａｕｅｒ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｍｅｌａｎｏｍａｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６，  １１８８８−１１８９６  （２００６）．
［２６］  Ｔ．  Ｖａｌｅｒｏ，  Ｓ．  Ｓｔｅｅｌｅ，  Ｋ．  Ｎｅｕｍｉｉｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｂｒａｃｈｅｒ，  Ｈ．  Ｎｉｅｄｅｒｌｅｉｔｈｎｅｒ，  Ｈ．  Ｐｅｈａｍｂｅｒｇｅｒ，  Ｐ．  Ｐｅｔｚｅｌｂａｕｅｒ，  Ｒ．  Ｌｏｅｗｅ，  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ  ａｎｄ  ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｕｍａｒａｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １３０，  １０８７−１０９４  （２０１０）．
［２７］  Ｉ．  Ｋａｌｕｚｋｉ，  Ｉ．  Ｈｒｇｏｖｉｃ，  Ｔ．  Ｈａｉｌｅｍａｒｉａｍ−Ｊａｈｎ，  Ｍ．  Ｄｏｌｌ，  Ｊ．  Ｋｌｅｅｍａｎｎ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｖａｌｅｓｋｙ，  Ｓ．  Ｋｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｒ．  Ｋａｕｆｍａｎｎ，  Ｎ．  Ｚｏｅｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｐ２１  ａｎｄ  ｐ５３  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｃｌ−２  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ３７，  １３６２７−１３６３５  （２０１６）．
［２８］  Ｉ．  Ｋａｓｔｒａｔｉ，  Ｍ．  Ｉ．  Ｓｉｋｌｏｓ，  Ｅ．  Ｌ．  Ｃａｌｄｅｒｏｎ−Ｇｉｅｒｓｚａｌ，  Ｌ．  Ｅｌ−Ｓｈｅｎｎａｗｙ，  Ｇ．  Ｇｅｏｒｇｉｅｖａ，  Ｅ．  Ｎ．  Ｔｈａｙｅｒ，  Ｇ．  Ｒ．  Ｊ．  Ｔｈａｔｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ｆｒａｓｏｒ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｆｕｍａｒａｔｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｋＢ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ６５  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２９１，  ３６３９−３６４７（２０１６）．
［２９］  Ｂ．  Ｇｕ，  Ｌ．  Ｍ．  ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  agｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １６，  １６７−１７４  （２００５）．
［３０］  Ｄ．  Ｆ．  Ｓｔｏｊｄｌ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｌｉｃｈｔｙ，  Ｂ．  Ｒ．  ｔｅｎＯｅｖｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  Ａ．  Ｔ．  Ｐｏｗｅｒ，  Ｓ．  Ｋｎｏｗｌｅｓ，  Ｒ．  Ｍａｒｉｕｓ，  Ｊ．  Ｒｅｙｎａｒｄ，  Ｌ．  Ｐｏｌｉｑｕｉｎ，  Ｈ．  Ａｔｋｉｎｓ，  Ｅ．  Ｇ．  Ｂｒｏｗｎ，  Ｒ．  Ｋ．  Ｄｕｒｂｉｎ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｄｕｒｂｉｎ，  Ｊ．  Ｈｉｓｃｏｔｔ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｅｌｌ，  ＶＳＶ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｓｈｕｔｄｏｗｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，  ２６３−２７５  （２００３）．
［３１］  Ｆ．  Ｌｅ  Ｂｏｅｕｆ，  Ｍ．  Ｓｅｌｍａｎ，  Ｈ．  Ｈｅｅ  Ｓｏｎ，  Ａ．  Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，  Ａ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｄ．  Ｂｕｔｔｅｒｗｉｃｋ，  Ｒ．  Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍ，  Ｎ．  Ｅ．  Ｆｏｒｂｅｓ，  Ｆ．  Ｔｚｅｌｅｐｉｓ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｅｌｌ，  Ｊ．  Ｗｅｒｉｅｒ，  Ｈ．  Ａｂｄｅｌｂａｒｙ，  Ｊ．−Ｓ．  Ｄｉａｌｌｏ，  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｍａｒａｂａ  ｖｉｒｕｓ  ＭＧ１  ａｓ  ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓａｒｃｏｍａ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （２０１７），  ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．３０８１３．
［３２］  Ｃ．  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｉｎｄｓ  ｉｔｓ  ｎｉｃｈｅ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２９，  １２１−１２８  （２０１１）．
［３３］  Ｄ．  Ｍｏｈａｒｒｅｇｈ−Ｋｈｉａｂａｎｉ，  Ｒ．  Ａ．  Ｌｉｎｋｅｒ，  Ｒ．  Ｇｏｌｄ，  Ｍ．  Ｓｔａｎｇｅｌ，  Ｆｕｍａｒｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｓｔｅｒｓ：  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７，  ６０−６４  （２００９）．
［３４］  Ｒ．  Ｂｏｍｐｒｅｚｚｉ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，  Ｔｈｅｒ．  Ａｄｖ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  （２０１５），  ｄｏｉ：  １０．１１７７／１７５６２８５６１４５６４１５２．
［３５］  Ｃ．  Ｇ．  Ｌｅｍａｙ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｒｉｎｔｏｕｌ，  Ａ．  Ｋｕｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  Ｖ．  Ｇａｒｃｉａ，  Ｔ．  Ｊ．  Ｆａｌｌｓ，  Ｌ．  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，  Ｂ．  Ｗ．  Ｂｒｉｄｌｅ，  Ｄ．  Ｐ．  Ｃｏｎｒａｄ，  Ｖ．  Ａ．  Ｔａｎｇ，  Ｊ．−Ｓ．  Ｄｉａｌｌｏ，  Ｒ．  Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍ，  Ｆ．  Ｌｅ  Ｂｏｅｕｆ，  Ｋ．  Ｇａｒｓｏｎ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ，  Ｄ．  Ｆ．  Ｓｔｏｊｄｌ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｌｉｃｈｔｙ，  Ｈ．  Ｌ．  Ａｔｋｉｎｓ，  Ｋ．  Ａ．  Ｐａｒａｔｏ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｅｌｌ，  Ｒ．  Ｃ．  Ａｕｅｒ，  Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎｅ，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０，  １７９１−１７９９  （２０１２）．
［３６］  Ｍ．  Ｈ．  Ｄｏｒｎａｎ，  Ｒ．  Ｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ａ．  Ｍ．  Ｍａｃｋｌｉｎ，  Ｍ．  Ｓｅｌｍａｎ，  Ｎ．  Ｅｌ  Ｓａｙｅｓ，  Ｈ．  Ｈ．  Ｓｏｎ，  Ｃ．  Ｄａｖｉｓ，  Ａ．  Ｃｈｅｎ，  Ｋ．  Ｋｅｉｌｌｏｒ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｌｅ，  Ｃ．  Ｍｏｉ，  Ｐ．  Ｏｕ，  Ｃ．  Ｐａｒｄｉｎ，  Ｃ．  Ｒ．  Ｃａｎｅｚ，  Ｆ．  Ｌｅ  Ｂｏｅｕｆ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．−Ｓ．  Ｄｉａｌｌｏ，  Ｃ．  Ｎ．  Ｂｏｄｄｙ，  Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｃｌａｓｓ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ６，  ２６７８６  （２０１６）．
［３７］  Ｍ．−Ｃ．  Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ−Ｄａｉｇｎｅａｕｌｔ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｒｏｙ，  Ｔ．  Ｆａｌｌｓ，  Ｋ．  Ｔｗｕｍａｓｉ−Ｂｏａｔｅｎｇ，  Ｌ．  Ｅ．  Ｓｔ−  Ｇｅｒｍａｉｎ，  Ｍ．  Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ，  Ｖ．  Ｇａｒｃｉａ，  Ｍ．  Ｓｅｌｍａｎ，  Ｖ．  Ａ．  Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｊ．  Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗ，  Ｓ．  Ａｍｏｓ，  Ｊ．−Ｓ．  Ｄｉａｌｌｏ，  Ｂ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｅｌｌ，  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｏ  ｈａｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  −  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ  ３，  １６００１  （２０１６）．
［３８］  Ｍ．  Ｓｅｌｍａｎ，  Ｃ．  Ｒｏｕｓｓｏ，  Ａ．  Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，  Ｈ．  Ｈ．  Ｓｏｎ，  Ｒ．  Ｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｎ．  Ａ．  Ｅｌ−Ｓａｙｅｓ，  Ｏ．  Ｖａｒｅｔｔｅ，  Ａ．  Ｃｈｅｎ，  Ｆ．  Ｌｅ  Ｂｏｅｕｆ，  Ｆ．  Ｔｚｅｌｅｐｉｓ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｅｌｌ，  Ｄ．  Ｃｒａｎｓ，  Ｊ．−Ｓ．  Ｄｉａｌｌｏ，  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄａｌ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｖａｎａｄｉｕｍ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ０  （２０１７），  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．１０．０１４．
［３９］  Ｃ．  Ｓ．  Ｒｏｂｉｓｏｎ，  Ｍ．  Ａ．  Ｗｈｉｔｔ，  Ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４，  ２２３９−２２４６  （２０００）．
［４０］  Ｌ．  Ｂ．  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｅ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，  Ｈ．  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｍｕｌｌｅｎ，  Ｅ．  Ｄｕｆｏｕｒ，  Ｓ．  Ｓｕｄａｒｓｈａｎ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｌｉｃｈｔ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄｅｂｅｒａｒｄｉｎｉｓ，  Ｎ．  Ｓ．  Ｃｈａｎｄｅｌ，  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｂｉｎｄｓ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ＲＯＳ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ５１，  ２３６−２４８  （２０１３）．
［４１］  Ｍ．  Ｓ．  Ｂｒｅｎｎａｎ，  Ｍ．  Ｆ．  Ｍａｔｏｓ，  Ｂ．  Ｌｉ，  Ｘ．  Ｈｒｏｎｏｗｓｋｉ，  Ｂ．  Ｇａｏ，  Ｐ．  Ｊｕｈａｓｚ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｒ．  Ｈ．Ｓｃａｎｎｅｖｉｎ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｆｕｍａｒａｔｅ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  Ｆｕｍａｒａｔｅ  Ｅｘｈｉｂｉｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ＫＥＡＰ１，  ＮＲＦ２  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，  ｅ０１２０２５４  （２０１５）．
［４２］  Ｂ．  Ｅ．  Ｈａｓｔ，  Ｅ．  Ｗ．  Ｃｌｏｅｒ，  Ｄ．  Ｇｏｌｄｆａｒｂ，  Ｈ．  Ｌｉ，  Ｐ．  Ｆ．  Ｓｉｅｓｓｅｒ，  Ｆ．  Ｙａｎ，  Ｖ．  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｎ．  Ｚｈｅｎｇ，  Ｄ．  Ｎ．  Ｈａｙｅｓ，  Ｍ．  Ｂ．  Ｍａｊｏｒ，  Ｃａｎｃｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＫＥＡＰ１  ｉｍｐａｉｒ  ＮＲＦ２  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７４，  ８０８−８１７  （２０１４）．
［４３］  Ｊ．  Ｃ．  Ｃａｓｔｌｅ，  Ｍ．  Ｌｏｅｗｅｒ，  Ｓ．  Ｂｏｅｇｅｌ，  Ｊ．  ｄｅ  Ｇｒａａｆ，  Ｃ．  Ｂｅｎｄｅｒ，  Ａ．  Ｄ．  Ｔａｄｍｏｒ，  Ｖ．  Ｂｏｉｓｇｕｅｒｉｎ，  Ｔ．  Ｂｕｋｕｒ，  Ｐ．  Ｓｏｒｎ，  Ｃ．  Ｐａｒｅｔ，  Ｍ．  Ｄｉｋｅｎ，  Ｓ．  Ｋｒｅｉｔｅｒ，  Ｏ．  Ｔｉｉｒｅｃｉ，  Ｕ．  Ｓａｈｉｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃ，  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴ２６  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５，  １９０  （２０１４）．
［４４］  Ｖ．  Ａ．  ＭｃＧｕｉｒｅ，  Ｔ．  Ｒｕｉｚ−Ｚｏｒｒｉｌｌａ  Ｄｉｅｚ，  Ｃ．  Ｈ．  Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，  Ｓ．  Ｓｔｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｍ．  Ｓ．  Ｒｉｔｏｒｔｏ，  Ｒ．  Ｖ．  Ｓｕｔａｖａｎｉ，  Ａ．  Ｗｅｉｐ，  Ｋ．  Ｆ．  Ｈｏｕｓｌａｙ，  Ａ．  Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｍｅａｋｉｎ，  Ｉ．  Ｒ．  Ｐｈａｉｒ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｊ．  Ａｓｈｆｏｒｄ，  Ｍ．  Ｔｒｏｓｔ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｃ．  Ａｒｔｈｕｒ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｂｌｏｃｋｓ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＬＲ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｌ  ａｎｄ  Ｋ６３  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ６，  ３１１５９  （２０１６）．
［４５］  Ｈ．  Ｐｅｎｇ，  Ｍ．  Ｇｕｅｒａｕ−ｄｅ−Ａｒｅｌｌａｎｏ，  Ｖ．  Ｂ．  Ｍｅｈｔａ，  Ｙ．  Ｙａｎｇ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｈｕｓｓ，  Ｔ．  Ｌ．  Ｐａｐｅｎｆｕｓｓ，  Ａ．  Ｅ．  Ｌｏｖｅｔｔ−Ｒａｃｋｅ，  Ｍ．  Ｋ．  Ｒａｃｋｅ，  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋＢ  （ＮＦ−ｋＢ）  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １  ａｎｄ  ２  （ＥＲＫ１／２）  ａｎｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １  （ＭＳＫ１）  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８７，  ２８０１７−２８０２６  （２０１２）．
［４６］  Ｊ．−Ｓ．  Ｄｉａｌｌｏ，  Ｍ．  Ｖａｈａ−Ｋｏｓｋｅｌａ，  Ｆ．  Ｌｅ  Ｂｏｅｕｆ，  Ｊ．  Ｂｅｌｌ，  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７９７，  １２７−１４０  （２０１２）．
［４７］  Ｅ．  Ｅｄｅｎ，  Ｒ．  Ｎａｖｏｎ，  Ｉ．  Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ，  Ｄ．  Ｌｉｐｓｏｎ，  Ｚ．  Ｙａｋｈｉｎｉ，  ＧＯｒｉｌｌａ：  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ＧＯ  ｔｅｒｍｓ  ｉｎ  ｒａｎｋｅｄ  ｇｅｎｅ  ｌｉｓｔｓ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １０，  ４８  （２００９）．
［４８］  Ｊ．−Ｓ．  Ｄｉａｌｌｏ，  Ｄ．  Ｒｏｙ，  Ｈ．  Ａｂｄｅｌｂａｒｙ，  Ｎ．  Ｄｅ  Ｓｉｌｖａ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｅｌｌ，  Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｗｉｔｈ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｊ．  Ｖｉｓ．  Ｅｘｐ．  （２０１１），  ｄｏｉ：  １０．３７９１／２８５４．
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【図１Ａ】
2021504293.tif 000012
【図１Ｂ】
2021504293.tif 000013
【図１Ｃ】
2021504293.tif 000014
【図１Ｄ】
2021504293.tif 000015
【図１Ｅ】
2021504293.tif 000016
【図１Ｆ】
2021504293.tif 000017
【図１Ｇ】
2021504293.tif 000018
【図１Ｈ】
2021504293.tif 000019
【図１Ｉ】
2021504293.tif 000020
【図１Ｊ】
2021504293.tif 000021
【図１Ｋ】
2021504293.tif 000022
【図２Ａ】
2021504293.tif 000023
【図２Ｂ】
2021504293.tif 000024
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021504293.tif 000036
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2021504293.tif 000053
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
2021504293.tif 000059
【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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