(57)【要約】がんを患う患者の処置に対する応答を予想するための方法であって、がん患者から採取された白血球サンプル中の少なくとも１種の免疫マーカーの発現を測定するステップと、所定値に対する少なくとも１種の免疫マーカーの発現に基づいて、患者サンプルを、（ｉ）選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）、又は（ｉｉ）（ＳＩＲＴ）に対する一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）に分類するステップと、ＳＩＲＴに対する持続性応答者（ＳＲ）を、ＳＩＲＴ又はＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物で処置するステップとを含む、方法。好ましい一実施形態において、本方法は、患者から採取された白血球サンプルにおける、ＰＤ−１若しくはＴｉｍ−３とＣＣＲ５の共発現、又はＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＸＣＲ６、若しくはそれらの組み合わせの発現を検出することを含む、肝細胞がん（ＨＣＣ）患者の処置に対する応答を予想するためのものである。【選択図】  図１
2021504682.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを患う患者の処置に対する応答を予想するためのインビトロ方法であって、
がん患者から採取された白血球サンプル中の少なくとも１種の免疫マーカーの発現を測定するステップと、
所定値に対する少なくとも１種の免疫マーカーの発現に基づいて、患者サンプルを、（ｉ）選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）、又は（ｉｉ）（ＳＩＲＴ）に対する一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）に分類するステップと
を含む、インビトロ方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも１種の免疫マーカーの発現を測定するステップの前に、
複数のがん患者から採取されたサンプル中の複数の免疫マーカーの発現を測定することと、
（ＳＩＲＴ）での処置に対する、処置の３か月後及び／又は６か月後における、がん患者の臨床応答を評価することであり、臨床応答が、（ＳＲ）及び（ＴＲ／ＮＲ）から選択される、評価することと、
各免疫マーカーと臨床応答（ＳＲ）又は臨床応答（ＴＲ／ＮＲ）のいずれかとの間に相関性があるかどうかを決定することと、
各免疫マーカーが臨床応答の精度に正の影響を与える確率を１つずつ決定することと、
臨床応答の精度に正の影響を与える免疫マーカーの数に基づいて、各サンプルに確率スコアを割り当てることと、
新たながん患者から採取された白血球サンプル中の各免疫マーカーに同じ確率スコアを割り当てて、新たな患者を、予測されるＳＲ又は予測されるＴＲ／ＮＲに分類することと
を含む、予測モデルが作成される、方法。
【請求項３】
予測されるＳＲ又は予測されるＴＲ／ＮＲを、所定値に対する少なくとも１種の免疫マーカーの発現に基づいた患者サンプルの分類と比較して、患者が（ＳＩＲＴ）での処置に応答するかどうかを予測するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
複数の免疫マーカーが、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８、Ｔ−ｂｅｔ、ＣＤ２８、ＰＤ−１、ＣＤ４、ＣＤ１５４、ＣＤ１０３、ＣＸＣＲ６、ＴＮＦ−α、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ１５２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２４４、ＩＬ−１０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＸＣＲ３、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、ＫＩ６７、ＣＤ８０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ、ＥＯＭＥＳ、グランザイムＢ、ＣＤ３７、ＣＣＲ５、又はＣＤ６９を含む群から選択される２種以上の免疫マーカーの任意の組み合わせである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
高い確率スコアを割り当てられる免疫マーカーが、前記少なくとも１種の免疫マーカーを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種の免疫マーカーが、ＰＤ−１若しくはＴｉｍ−３とＣＣＲ５の共発現、又はＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＸＣＲ６、若しくはそれらの組み合わせの発現から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
白血球サンプルが、腫瘍浸潤白血球サンプルを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
白血球サンプルが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）サンプルを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが、飛行時間によるマススペクトロメトリー（ＣｙＴＯＦ）を使用して分析される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
白血球サンプルが、ＣＤ８を発現するＴ細胞を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
がんが、肝細胞がんである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉｉ）ＳＲと分類されたがん患者から採取された白血球サンプルが、ＳＩＲＴ又はＳＩＲＴと免疫療法との組み合わせを用いる処置を必要とするものとして特定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＳＩＲＴが、Ｙ９０−ＲＥである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
がんを患う患者の処置に対する応答を予想するためのシステムであって、
がん患者から採取された白血球サンプル中の免疫マーカー発現プロファイルのデータセットを取得することと、白血球サンプル中の複数の細胞の免疫マーカー発現が、選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に応答するがん患者、又はＳＩＲＴに応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者に対応する確率に基づいて、データセットをソートすることと、（ｉ）ＳＩＲＴに応答する、又は（ｉｉ）ＳＩＲＴ処置に応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者から採取されたサンプルに確率スコアを割り当てることとを行うように操作可能である、処理ユニットを備え、
ＳＩＲＴに応答するがん患者に対応する免疫マーカー発現か、又はＳＩＲＴに応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者に対応する免疫マーカー発現を、複数の細胞のうちの大多数が有することから、サンプルの確率スコアが取得される、
システム。
【請求項１５】
がん患者から採取された白血球サンプル中の免疫マーカーの発現を測定するためのデバイスをさらに備える、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
デバイスが、サイトメーターである、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
デバイスが、次世代シーケンサー又はサーモサイクラーである、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予見される患者のがんの処置において使用するための薬物の製造における、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物の使用。
【請求項１９】
ＳＩＲＴが、Ｙ９０−ＲＥである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
がんが、肝細胞がんである、請求項１８又は１９に記載の使用。
【請求項２１】
選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予想されるがん患者を処置する方法であって、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物を治療有効量で患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
ＳＩＲＴが、Ｙ９０−ＲＥである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
がんが、肝細胞がんである、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予見される患者のがんの処置において使用するための、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん患者を処置群に分類して、特定のがん処置、特定すると放射線療法、特に選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）による処置単独、又は免疫療法を含有する他の療法との組み合わせに対する応答を予見及び予測するための、システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景に関する以下の記述は、本発明の理解を容易にすることを意図するものである。しかしながら、この記述は、参照される資料のうちのいずれかが、優先出願日時点で、いずれかの法域において公表されていたこと、公知であったこと、又は一般知識の一部であったことを認めるものでも承認するものでもないことを理解されたい。
【０００３】
２０１５年において、がんは、ヒトの死のうち１５．７％の原因であった。この死亡者数の大部分は、後期に診断され切除することができないステージにあったがん、及び／又はがんの周りに血管過多腫瘤が発達したがんを含有する。がんの周りの血管過多腫瘤は、その血液供給の大部分を、既存の動脈（例えば肝細胞がん（ＨＣＣ）の場合は肝動脈）から新たに生じた分枝部を通して受ける。血管過多のがんに対する一般的な処置は、新たに生じた分枝部に塞栓を行うことである。選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）（放射線塞栓術（ＲＥ）とも呼ばれる）は、放射性物質でコーティングされたマイクロスフェアを放射線学的ガイド下で経動脈カテーテルによって血管過多のがんに直接送達する療法の一形態である。腫瘍に供給を行う分枝部を通してのみ放射線療法が送達され、健康な組織を温存しつつ、マイクロスフェアからの放射線が限定された放射領域内の腫瘍細胞を破壊するため、この精確な送達様式は、非悪性器官を温存する。
【０００４】
肝細胞がん（ＨＣＣ）は、高悪性度疾患であり、世界的に見て、がん関連死の２番目に一般的な原因である（Ｆｅｒｌａｙら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １３６、Ｅ３５９〜３８６（２０１５））。ＨＣＣに対する最も有効な治療選択肢は腫瘍切除又は肝臓移植であるが、これらは、初期疾患に限定される（Ｂｒｕｉｘ及びＳｈｅｒｍａｎ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）５３、１０２０〜１０２２（２０１１））。局所進行性疾患を有する患者の大多数は、経動脈的化学塞栓術、又はイットリウム−９０（Ｙ９０）放射線塞栓術（ＲＥ）、別称、選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）などの局所領域的療法で処置される（Ｒａｚａ及びＳｏｏｄ、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：ＷＪＧ  ２０、４１１５〜４１２７（２０１４））。
【０００５】
肝臓は通常、免疫抑制性の微小環境として維持される。肝臓がこのように進化した主な理由は、動脈循環及び腸からの血液が肝臓に入り、肝臓内で毒素及び腸由来菌生成物が捕捉され排除されるからである。継続的な病原体への曝露に応じた異常免疫を防止するため、肝臓は、特有の免疫調節システムを有する。肝細胞は、共刺激の非存在下でナイーブＴ細胞を予備刺激することによって肝臓固有の免疫寛容原性に寄与し、細胞傷害性欠損及びクローン除去をもたらす。これは、免疫療法、特に肝臓内のＴ細胞の予備刺激が、ＨＣＣの処置に有用とならないことを示唆する。さらに、肝臓は毒素を処理するため、一般に、化学療法剤に対する感受性が低い。
【０００６】
イットリウム−９０（Ｙ９０）放射線塞栓術（ＲＥ）は、局所進行性肝細胞がん（ＨＣＣ）を著しく退縮させ、疾患の進行を遅延させる。その有効性にもかかわらず、持続的な治療応答を引き起こすＹ９０−ＲＥの免疫学的影響は、十分に理解されていない。Ｙ９０−ＲＥは、腫瘍ステージの低下及び疾患の進行の遅延によって疾患制御を引き起こすことが示されている（Ｋａｌｌｉｎｉら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３３、６９９〜７１４（２０１６））。Ｙ９０同位体の半減期は約６４．２時間であるが、最大の臨床応答、すなわち、腫瘍退縮及び血清アルファ−フェトタンパク質の減少は、処置の３〜６か月後に初めて見られる（Ｓａｌｅｍら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３８、５２〜６４（２０１０））。この遅延性だが長期にわたる抗腫瘍効果の基礎をなす機構は、依然として説明困難である。
【０００７】
上で言及した問題のうちの少なくとも１つを改善するためには、誰が処置に応答するかを理解する必要性がある。
【０００８】
〔発明の概要〕
本発明の目的は、がん患者を処置群に分類して、特定のがん処置に対する応答、特定すると放射線療法、特に選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）による処置単独、又は免疫療法を含有する他の療法との組み合わせが、適切ながん処置であるかどうかを予見及び予測するための、システム及び方法を提供することである。
【０００９】
したがって、本発明の一態様は、がんを患う患者の処置に対する応答を予想のためのインビトロ方法であって、
がん患者から採取された白血球サンプル中の少なくとも１種の免疫マーカーの発現を測定するステップと、
所定値に対する少なくとも１種の免疫マーカーの発現に基づいて、患者サンプルを、（ｉ）選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）、又は（ｉｉ）（ＳＩＲＴ）に対する一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）に分類するステップと
を含む、インビトロ方法を提供する。
本発明の別の態様は、がんを患う患者の処置に対する応答を予見するためのシステムであって、
がん患者から採取された白血球サンプル中の免疫マーカー発現プロファイルのデータセットを取得することと、白血球サンプル中の複数の細胞の免疫マーカー発現が、選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に応答するがん患者、又はＳＩＲＴに応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者に対応する確率に基づいて、データセットをソートすることと、（ｉ）ＳＩＲＴに応答する、又は（ｉｉ）ＳＩＲＴ処置に応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者から採取されたサンプルに確率スコアを割り当てることとを行うように操作可能である、処理ユニットを備え、
ＳＩＲＴに応答するがん患者に対応する免疫マーカー発現か、又はＳＩＲＴに応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者に対応する免疫マーカー発現を、複数の細胞のうちの大多数が有することから、サンプルの確率スコアが取得される、
システムを提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予見される患者のがん、好ましくは肝細胞がんの処置において使用するための薬物の製造における、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物の使用を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予見されるがん患者を処置する方法であって、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物を治療有効量で患者に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予見される患者のがんの処置において使用するための、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明の他の態様は、続く本発明の特定の実施形態の説明を添付の図面と併せて概観することにより、当業者にとって明らかとなるであろう。
【００１４】
以降、単なる例として、以下の添付の図面を参照しながら、本発明について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｙ９０放射線塞栓術後のＨＣＣ患者における持続的応答の予測のためのモデルの流れ。３７種のマーカーを用いた単一細胞ＣｙＴＯＦデータを使用して、応答者又は非応答者としての各個別の患者に関する最終的な予測クラスステータスを取得した。
【図２Ａ】ランダムフォレスト予測法を使用した、Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答の予測モデル。（Ａ）ランダムフォレスト予測モデルに基づく訓練コホートｎ＝２２及びテストコホートｎ＝８におけるサンプル間の距離を示すデンドログラム。（Ｂ）ランダムフォレスト予測法を使用した訓練モデルに関するｍｔｒｙ（ランダム変数の数）及びｎｔｒｅｅ（ツリーの数）に基づく精度曲線。選択された最も正確なパラメータは、７６．８％の精度でｍｔｒｙ＝１０及びｎｔｒｅｅ＝２０００であった。（Ｃ）臨床アウトカムがどのように予測されるかの表現。（Ｄ）訓練コホートｎ＝２２及び検証／テストコホートｎ＝８におけるＹ９０−ＲＥ後の持続的応答を予測するためのランダムフォレスト予測法から得た受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。ＡＵＣ＝曲線下面積。
【図２Ｂ】ランダムフォレスト予測法を使用した、Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答の予測モデル。（Ａ）ランダムフォレスト予測モデルに基づく訓練コホートｎ＝２２及びテストコホートｎ＝８におけるサンプル間の距離を示すデンドログラム。（Ｂ）ランダムフォレスト予測法を使用した訓練モデルに関するｍｔｒｙ（ランダム変数の数）及びｎｔｒｅｅ（ツリーの数）に基づく精度曲線。選択された最も正確なパラメータは、７６．８％の精度でｍｔｒｙ＝１０及びｎｔｒｅｅ＝２０００であった。（Ｃ）臨床アウトカムがどのように予測されるかの表現。（Ｄ）訓練コホートｎ＝２２及び検証／テストコホートｎ＝８におけるＹ９０−ＲＥ後の持続的応答を予測するためのランダムフォレスト予測法から得た受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。ＡＵＣ＝曲線下面積。
【図２Ｃ】ランダムフォレスト予測法を使用した、Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答の予測モデル。（Ａ）ランダムフォレスト予測モデルに基づく訓練コホートｎ＝２２及びテストコホートｎ＝８におけるサンプル間の距離を示すデンドログラム。（Ｂ）ランダムフォレスト予測法を使用した訓練モデルに関するｍｔｒｙ（ランダム変数の数）及びｎｔｒｅｅ（ツリーの数）に基づく精度曲線。選択された最も正確なパラメータは、７６．８％の精度でｍｔｒｙ＝１０及びｎｔｒｅｅ＝２０００であった。（Ｃ）臨床アウトカムがどのように予測されるかの表現。（Ｄ）訓練コホートｎ＝２２及び検証／テストコホートｎ＝８におけるＹ９０−ＲＥ後の持続的応答を予測するためのランダムフォレスト予測法から得た受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。ＡＵＣ＝曲線下面積。
【図２Ｄ】ランダムフォレスト予測法を使用した、Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答の予測モデル。（Ａ）ランダムフォレスト予測モデルに基づく訓練コホートｎ＝２２及びテストコホートｎ＝８におけるサンプル間の距離を示すデンドログラム。（Ｂ）ランダムフォレスト予測法を使用した訓練モデルに関するｍｔｒｙ（ランダム変数の数）及びｎｔｒｅｅ（ツリーの数）に基づく精度曲線。選択された最も正確なパラメータは、７６．８％の精度でｍｔｒｙ＝１０及びｎｔｒｅｅ＝２０００であった。（Ｃ）臨床アウトカムがどのように予測されるかの表現。（Ｄ）訓練コホートｎ＝２２及び検証／テストコホートｎ＝８におけるＹ９０−ＲＥ後の持続的応答を予測するためのランダムフォレスト予測法から得た受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。ＡＵＣ＝曲線下面積。
【図３】ランダムフォレスト予測モデリングからの最終的な予測モデルを使用した、単一細胞レベルにおける訓練セットモデル及びテストセットモデルのＲＯＣ曲線。訓練セットｎ＝２２：ＡＵＣ＝０．８４６１及び精度＝０．７６８６；テストセットｎ＝８：ＡＵＣ＝０．６７６９及び精度＝０．７０８２。ＡＵＣ＝曲線下面積。
【図４】腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びＰＢＭＣにおけるＹ９０−ＲＥによって誘導された一連の免疫応答を示す、Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答の予測モデル。Ｙ９０−ＲＥで処置した腫瘍から得たＴＩＬにおいて（切除は、ステージの低下に成功した後、Ｙ９０−ＲＥの３〜６か月後に行った）、ＧＢ発現ＣＤ８＋、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＮＫＴ細胞の浸潤がＹ９０−ＲＥ後に観察されたのに対し、処置ナイーブ対照腫瘍ではＴＲＥＧがより多かった。Ｙ９０−ＲＥによって誘導された腫瘍微小環境内のケモカインの上方制御は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の動員及び活性化に関係すると仮定される。その一方で、ＰＢＭＣにおいては、Ｙ９０−ＲＥの１か月後（１ｍｏ）及び３か月後（３ｍｏ）時点で、ＴＮＦα発現免疫サブセット及びグランザイムＢ（ＧＢ）発現免疫サブセット並びに抗原提示細胞（ＡＰＣ）の免疫活性化が観察された。
【図５】Ｙ９０−ＲＥで処置した腫瘍及び処置ナイーブ腫瘍から単離された腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）の免疫プロファイル。（Ａ）サンプル収集及び分析のパイプライン。ＰＢＭＣは、Ｙ９０−ＲＥ前（Ｙ９０前）及びＹ９０−ＲＥ後（Ｙ９０後）の様々な時点で収集した（ｎ＝３１患者）。ＴＩＬは、Ｙ９０−ＲＥ後の（療法によってステージが低下した）患者又は処置ナイーブ患者（対照、Ｃｔｌ）（各群でｎ＝７）から切除されたＨＣＣ腫瘍から収集した。ＣｙＴＯＦを使用してＰＢＭＣ及びＴＩＬの両方を分析し、Ｙ９０−ＲＥ後の患者及び処置ナイーブ患者（各群でｎ＝４）から得た腫瘍組織にＮＧＳを行った。（Ｂ）Ｙ９０−ＲＥ後のＨＣＣ腫瘍（左上のバー）又は処置ナイーブＨＣＣ腫瘍（対照；右上のバー）から単離されたＴＩＬにおいて濃縮されていたノードによる免疫マーカーの示差的発現を示す２Ｄヒートマップ。Ｙ９０−ＲＥ後のＴＩＬにおいて濃縮されていた免疫サブセットは、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ８＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞であり、制御性Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞は、対照ＨＣＣから得たＴＩＬにおいて濃縮されていた（グレースケールでコードされた線）。各群ｎ＝７。
【図６Ａ】Ｙ９０−ＲＥ後（Ｙ９０）及び対照のＨＣＣ腫瘍から単離されたＴＩＬにおける、（Ａ）グランザイムＢ（ＧＢ）及び（Ｂ）Ｔｉｍ−３の発現の２Ｄ表現。インハウスの改良版ＡＣＣＥＮＳＥソフトウェアを使用して画像を生成した。
【図６Ｂ】Ｙ９０−ＲＥ後（Ｙ９０）及び対照のＨＣＣ腫瘍から単離されたＴＩＬにおける、（Ａ）グランザイムＢ（ＧＢ）及び（Ｂ）Ｔｉｍ−３の発現の２Ｄ表現。インハウスの改良版ＡＣＣＥＮＳＥソフトウェアを使用して画像を生成した。
【図７】Ｙ９０−ＲＥ後（Ｙ９０）又は対照のＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞でのＧＢのゲーティングを示す代表的プロット（上パネル）。Ｙ９０−ＲＥ後及び対照のＴＩＬにおけるＧＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｉｍ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（下パネル）。
【図８】Ｙ９０−ＲＥ後（Ｙ９０）及び対照のＴＩＬにおけるＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞、ＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、及びＧＢ＋ＣＤ８＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞の割合。グラフデータは平均±標準偏差を表し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図９Ａ】Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍又は処置ナイーブ腫瘍から得たＴＩＬの免疫プロファイル。（Ａ）代表的なノードである、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍から得たＴＩＬにおいて濃縮されていたＣＤ４＋集団を表すノード２４４における、ＣＸＣＲ３及びＣＤ４５ＲＯの発現を示す密度プロット。灰色のプロットは、選択されたノードにおける発現プロファイルを示し、黒色のプロットは、すべてのノードの発現プロファイルを示す。灰色及び黒色の線は、各マーカーの平均発現レベルを表す。（Ｂ）グラフは、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍（Ｙ９０）及び処置ナイーブ（対照）腫瘍から得たＴＩＬにおけるＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の割合を示す。グラフは平均±ＳＤを表し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図９Ｂ】Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍又は処置ナイーブ腫瘍から得たＴＩＬの免疫プロファイル。（Ａ）代表的なノードである、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍から得たＴＩＬにおいて濃縮されていたＣＤ４＋集団を表すノード２４４における、ＣＸＣＲ３及びＣＤ４５ＲＯの発現を示す密度プロット。灰色のプロットは、選択されたノードにおける発現プロファイルを示し、黒色のプロットは、すべてのノードの発現プロファイルを示す。灰色及び黒色の線は、各マーカーの平均発現レベルを表す。（Ｂ）グラフは、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍（Ｙ９０）及び処置ナイーブ（対照）腫瘍から得たＴＩＬにおけるＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の割合を示す。グラフは平均±ＳＤを表し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図１０】Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍又は処置ナイーブ腫瘍から得たＴＩＬの免疫プロファイル。Ｙ９０  ＲＥ後のＴＩＬ（Ｙ９０）及び処置ナイーブ（対照）ＴＩＬにおける、予めゲーティングされた（ｐｒｅ−ｇａｔｅｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞での、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇ細胞のゲーティングを示す代表的プロット。右のグラフは、Ｔｒｅｇ細胞の割合を示す。データは平均±ＳＤを示し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図１１Ａ】Ｙ９０−ＲＥによって誘導されるＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６が関与する走化性経路。（Ａ）定量的ＰＣＲ分析による、Ｙ９０で処置した腫瘍組織（ｎ＝８）と対照腫瘍組織（ｎ＝６）におけるＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６のＲＮＡ発現。（Ｂ）ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６のＲＮＡ発現と、腫瘍浸潤ＧＢ＋ＣＤ８＋活性化Ｔ細胞（ｎ＝１４）の割合との間の相関性。グラフデータは平均±標準偏差を表す。Ｐ値及び相関係数（ｒ）は、ピアソンの相関検定を使用して算出した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１１Ｂ】Ｙ９０−ＲＥによって誘導されるＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６が関与する走化性経路。（Ａ）定量的ＰＣＲ分析による、Ｙ９０で処置した腫瘍組織（ｎ＝８）と対照腫瘍組織（ｎ＝６）におけるＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６のＲＮＡ発現。（Ｂ）ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６のＲＮＡ発現と、腫瘍浸潤ＧＢ＋ＣＤ８＋活性化Ｔ細胞（ｎ＝１４）の割合との間の相関性。グラフデータは平均±標準偏差を表す。Ｐ値及び相関係数（ｒ）は、ピアソンの相関検定を使用して算出した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１２Ａ】Ｙ９０  ＲＥに対する応答者と非応答者とから得た、Ｙ９０−ＲＥ後１か月及び３か月時点での末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において検出された臨床応答に関係する、ＰＢＭＣの免疫プロファイル。（Ａ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおける、ＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞のゲーティング（上パネル）、及びこれらのＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞でゲーティングしたＴＮＦ−α発現（下パネル）を示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１〜６ｍｏ）の持続性応答者（ＳＲ）又は非応答者（ＮＲ）及び一過性応答者（ＴＲ）におけるＴＮＦ−α発現ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｂ）Ｙ９０療法前（Ｐｒｅ）又はＹ９０療法の１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、ＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｃ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの３か月後（３ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１ｍｏ〜６ｍｏ）のＳＲ及びＮＲ／ＴＲにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ＋抗原提示細胞の割合を示す。グラフデータは平均±標準偏差を表す。対応ありのスチューデントｔ検定（療法前（ｐｒｅ）と１ｍｏ又は３ｍｏの対比のため）又は対応なしのスチューデントｔ検定（３ｍｏ  ＳＲとＮＲ／ＴＲの対比のため）によってデータを分析した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）代表的なノードである、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍から得たＴＩＬにおいて濃縮されていたＡＰＣを表すノード２９３における、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲの発現を示す密度プロット。赤色のプロットは、選択されたノードにおける発現プロファイルを示し、黒色は、すべてのノードの発現プロファイルを示す。赤色及び黒色の線は、各マーカーの平均発現レベルを表す。（Ｅ）代表的プロットは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後３か月におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のゲーティングを示す。右のグラフは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後の様々な時点での持続性応答者（ＳＲ）及び非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を示す。データは平均±ＳＤを示し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図１２Ｂ】Ｙ９０  ＲＥに対する応答者と非応答者とから得た、Ｙ９０−ＲＥ後１か月及び３か月時点での末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において検出された臨床応答に関係する、ＰＢＭＣの免疫プロファイル。（Ａ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおける、ＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞のゲーティング（上パネル）、及びこれらのＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞でゲーティングしたＴＮＦ−α発現（下パネル）を示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１〜６ｍｏ）の持続性応答者（ＳＲ）又は非応答者（ＮＲ）及び一過性応答者（ＴＲ）におけるＴＮＦ−α発現ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｂ）Ｙ９０療法前（Ｐｒｅ）又はＹ９０療法の１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、ＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｃ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの３か月後（３ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１ｍｏ〜６ｍｏ）のＳＲ及びＮＲ／ＴＲにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ＋抗原提示細胞の割合を示す。グラフデータは平均±標準偏差を表す。対応ありのスチューデントｔ検定（療法前（ｐｒｅ）と１ｍｏ又は３ｍｏの対比のため）又は対応なしのスチューデントｔ検定（３ｍｏ  ＳＲとＮＲ／ＴＲの対比のため）によってデータを分析した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）代表的なノードである、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍から得たＴＩＬにおいて濃縮されていたＡＰＣを表すノード２９３における、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲの発現を示す密度プロット。赤色のプロットは、選択されたノードにおける発現プロファイルを示し、黒色は、すべてのノードの発現プロファイルを示す。赤色及び黒色の線は、各マーカーの平均発現レベルを表す。（Ｅ）代表的プロットは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後３か月におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のゲーティングを示す。右のグラフは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後の様々な時点での持続性応答者（ＳＲ）及び非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を示す。データは平均±ＳＤを示し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図１２Ｃ】Ｙ９０  ＲＥに対する応答者と非応答者とから得た、Ｙ９０−ＲＥ後１か月及び３か月時点での末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において検出された臨床応答に関係する、ＰＢＭＣの免疫プロファイル。（Ａ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおける、ＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞のゲーティング（上パネル）、及びこれらのＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞でゲーティングしたＴＮＦ−α発現（下パネル）を示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１〜６ｍｏ）の持続性応答者（ＳＲ）又は非応答者（ＮＲ）及び一過性応答者（ＴＲ）におけるＴＮＦ−α発現ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｂ）Ｙ９０療法前（Ｐｒｅ）又はＹ９０療法の１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、ＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｃ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの３か月後（３ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１ｍｏ〜６ｍｏ）のＳＲ及びＮＲ／ＴＲにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ＋抗原提示細胞の割合を示す。グラフデータは平均±標準偏差を表す。対応ありのスチューデントｔ検定（療法前（ｐｒｅ）と１ｍｏ又は３ｍｏの対比のため）又は対応なしのスチューデントｔ検定（３ｍｏ  ＳＲとＮＲ／ＴＲの対比のため）によってデータを分析した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）代表的なノードである、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍から得たＴＩＬにおいて濃縮されていたＡＰＣを表すノード２９３における、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲの発現を示す密度プロット。赤色のプロットは、選択されたノードにおける発現プロファイルを示し、黒色は、すべてのノードの発現プロファイルを示す。赤色及び黒色の線は、各マーカーの平均発現レベルを表す。（Ｅ）代表的プロットは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後３か月におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のゲーティングを示す。右のグラフは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後の様々な時点での持続性応答者（ＳＲ）及び非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を示す。データは平均±ＳＤを示し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図１２Ｄ】Ｙ９０  ＲＥに対する応答者と非応答者とから得た、Ｙ９０−ＲＥ後１か月及び３か月時点での末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において検出された臨床応答に関係する、ＰＢＭＣの免疫プロファイル。（Ａ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおける、ＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞のゲーティング（上パネル）、及びこれらのＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞でゲーティングしたＴＮＦ−α発現（下パネル）を示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１〜６ｍｏ）の持続性応答者（ＳＲ）又は非応答者（ＮＲ）及び一過性応答者（ＴＲ）におけるＴＮＦ−α発現ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｂ）Ｙ９０療法前（Ｐｒｅ）又はＹ９０療法の１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、ＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｃ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの３か月後（３ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１ｍｏ〜６ｍｏ）のＳＲ及びＮＲ／ＴＲにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ＋抗原提示細胞の割合を示す。グラフデータは平均±標準偏差を表す。対応ありのスチューデントｔ検定（療法前（ｐｒｅ）と１ｍｏ又は３ｍｏの対比のため）又は対応なしのスチューデントｔ検定（３ｍｏ  ＳＲとＮＲ／ＴＲの対比のため）によってデータを分析した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）代表的なノードである、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍から得たＴＩＬにおいて濃縮されていたＡＰＣを表すノード２９３における、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲの発現を示す密度プロット。赤色のプロットは、選択されたノードにおける発現プロファイルを示し、黒色は、すべてのノードの発現プロファイルを示す。赤色及び黒色の線は、各マーカーの平均発現レベルを表す。（Ｅ）代表的プロットは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後３か月におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のゲーティングを示す。右のグラフは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後の様々な時点での持続性応答者（ＳＲ）及び非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を示す。データは平均±ＳＤを示し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図１２Ｅ】Ｙ９０  ＲＥに対する応答者と非応答者とから得た、Ｙ９０−ＲＥ後１か月及び３か月時点での末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において検出された臨床応答に関係する、ＰＢＭＣの免疫プロファイル。（Ａ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおける、ＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞のゲーティング（上パネル）、及びこれらのＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞でゲーティングしたＴＮＦ−α発現（下パネル）を示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１〜６ｍｏ）の持続性応答者（ＳＲ）又は非応答者（ＮＲ）及び一過性応答者（ＴＲ）におけるＴＮＦ−α発現ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｂ）Ｙ９０療法前（Ｐｒｅ）又はＹ９０療法の１か月後（１ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、ＴＮＦ−α発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。（Ｃ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥの３か月後（３ｍｏ）に単離されたＰＢＭＣにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞でのゲーティングを示す代表的プロット。右パネルは、Ｙ９０−ＲＥ療法前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ療法後（１ｍｏ〜６ｍｏ）のＳＲ及びＮＲ／ＴＲにおけるＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ＋抗原提示細胞の割合を示す。グラフデータは平均±標準偏差を表す。対応ありのスチューデントｔ検定（療法前（ｐｒｅ）と１ｍｏ又は３ｍｏの対比のため）又は対応なしのスチューデントｔ検定（３ｍｏ  ＳＲとＮＲ／ＴＲの対比のため）によってデータを分析した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）代表的なノードである、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍から得たＴＩＬにおいて濃縮されていたＡＰＣを表すノード２９３における、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲの発現を示す密度プロット。赤色のプロットは、選択されたノードにおける発現プロファイルを示し、黒色は、すべてのノードの発現プロファイルを示す。赤色及び黒色の線は、各マーカーの平均発現レベルを表す。（Ｅ）代表的プロットは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後３か月におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のゲーティングを示す。右のグラフは、Ｙ９０  ＲＥ前及びＹ９０  ＲＥ後の様々な時点での持続性応答者（ＳＲ）及び非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）におけるＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を示す。データは平均±ＳＤを示し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図１３Ａ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）グラフは、Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）でのＳＲ又はＮＲ／ＴＲ患者から単離されたＰＢＭＣにおける、ＣＸＣＲ６＋Ｔ細胞又はＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＸＣＲ６＋Ｔ細胞又はＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３  Ｔ細胞の割合を示す。グラフデータは平均±標準偏差を表し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ後３か月（３ｍｏ）時点でＳＲ患者又はＮＲ／ＴＲ患者から単離されたＰＢＭＣにおけるＰＤ−１及びＴｉｍ−３に関する２Ｄでの細胞の描写。ＡＣＣＥＮＳＥソフトウェアを使用して画像を生成した。
【図１３Ｂ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）グラフは、Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）でのＳＲ又はＮＲ／ＴＲ患者から単離されたＰＢＭＣにおける、ＣＸＣＲ６＋Ｔ細胞又はＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＸＣＲ６＋Ｔ細胞又はＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３  Ｔ細胞の割合を示す。グラフデータは平均±標準偏差を表し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ後３か月（３ｍｏ）時点でＳＲ患者又はＮＲ／ＴＲ患者から単離されたＰＢＭＣにおけるＰＤ−１及びＴｉｍ−３に関する２Ｄでの細胞の描写。ＡＣＣＥＮＳＥソフトウェアを使用して画像を生成した。
【図１３Ｃ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）グラフは、Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）でのＳＲ又はＮＲ／ＴＲ患者から単離されたＰＢＭＣにおける、ＣＸＣＲ６＋Ｔ細胞又はＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＸＣＲ６＋Ｔ細胞又はＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３  Ｔ細胞の割合を示す。グラフデータは平均±標準偏差を表し、対応なしのスチューデントｔ検定によって分析した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ後３か月（３ｍｏ）時点でＳＲ患者又はＮＲ／ＴＲ患者から単離されたＰＢＭＣにおけるＰＤ−１及びＴｉｍ−３に関する２Ｄでの細胞の描写。ＡＣＣＥＮＳＥソフトウェアを使用して画像を生成した。
【図１４Ａ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）グラフは、Ｙ９０−ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）でのＳＲ及びＮＲ／ＴＲから得た免疫サブセット：ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｉｍ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇの割合を示す。（Ｂ）ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｉｍ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す代表的プロット。（Ｃ）ＰＤ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞で予めゲーティングした）の割合を示す代表的プロット。（Ｄ）Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞で予めゲーティングした）の割合を示す代表的プロット。（Ｂ〜Ｄ）持続性応答者（ＳＲ）と非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）とのＹ９０  ＲＥ前のＰＢＭＣにおける免疫サブセット。
【図１４Ｂ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）グラフは、Ｙ９０−ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）でのＳＲ及びＮＲ／ＴＲから得た免疫サブセット：ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｉｍ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇの割合を示す。（Ｂ）ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｉｍ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す代表的プロット。（Ｃ）ＰＤ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞で予めゲーティングした）の割合を示す代表的プロット。（Ｄ）Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞で予めゲーティングした）の割合を示す代表的プロット。（Ｂ〜Ｄ）持続性応答者（ＳＲ）と非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）とのＹ９０  ＲＥ前のＰＢＭＣにおける免疫サブセット。
【図１４Ｃ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）グラフは、Ｙ９０−ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）でのＳＲ及びＮＲ／ＴＲから得た免疫サブセット：ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｉｍ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇの割合を示す。（Ｂ）ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｉｍ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す代表的プロット。（Ｃ）ＰＤ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞で予めゲーティングした）の割合を示す代表的プロット。（Ｄ）Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞で予めゲーティングした）の割合を示す代表的プロット。（Ｂ〜Ｄ）持続性応答者（ＳＲ）と非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）とのＹ９０  ＲＥ前のＰＢＭＣにおける免疫サブセット。
【図１４Ｄ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）グラフは、Ｙ９０−ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）でのＳＲ及びＮＲ／ＴＲから得た免疫サブセット：ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｉｍ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇの割合を示す。（Ｂ）ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｉｍ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す代表的プロット。（Ｃ）ＰＤ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞で予めゲーティングした）の割合を示す代表的プロット。（Ｄ）Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞で予めゲーティングした）の割合を示す代表的プロット。（Ｂ〜Ｄ）持続性応答者（ＳＲ）と非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）とのＹ９０  ＲＥ前のＰＢＭＣにおける免疫サブセット。
【図１５Ａ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ後３か月（３ｍｏ）時点でＳＲ患者及びＮＲ／ＴＲ患者から単離されたＰＢＭＣにおけるＣＸＣＲ６及びＣＣＲ５に関する２Ｄでの細胞の描写。ＡＣＣＥＮＳＥソフトウェアを使用して画像を生成した。（Ｂ）ＣＣＲ５＋Ｔ細胞又はＣＸＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す代表的プロット。持続性応答者（ＳＲ）と非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）のＹ９０  ＲＥ前のＰＢＭＣにおける免疫サブセット。
【図１５Ｂ】Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者（ＳＲ）と非応答者（ＮＲ）／一過性応答者（ＴＲ）とにおける特徴的な免疫サブセット。（Ａ）Ｙ９０−ＲＥ前（Ｐｒｅ）及びＹ９０−ＲＥ後３か月（３ｍｏ）時点でＳＲ患者及びＮＲ／ＴＲ患者から単離されたＰＢＭＣにおけるＣＸＣＲ６及びＣＣＲ５に関する２Ｄでの細胞の描写。ＡＣＣＥＮＳＥソフトウェアを使用して画像を生成した。（Ｂ）ＣＣＲ５＋Ｔ細胞又はＣＸＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す代表的プロット。持続性応答者（ＳＲ）と非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）のＹ９０  ＲＥ前のＰＢＭＣにおける免疫サブセット。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本明細書における主題が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で使用される以下の定義は、本発明の理解を容易にするために供給される。
【００１７】
本文書の随所において、反対の記載がある場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、非包括的であるものとして、又は言い換えれば、「〜を含有するがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味するものとして解釈される。
【００１８】
さらに、本明細書の随所において、文脈上他の解釈が必要な場合を除き、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という言葉、又は「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」若しくは「含有している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変化形態は、記載された整数又は整数群の包含を示唆するが、いかなる他の整数又は整数群の除外も暗示しないものと理解されよう。
【００１９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、「ａ」及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明記されていない限り、複数の参照対象を含有する。
【００２０】
Ｙ９０−ＲＥによってステージが低下していた、外科的に切除されたＨＣＣの免疫プロファイルを分析した。高次元の詳細なイムノフェノタイピングのために飛行時間型マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）を使用して、臨床応答の基礎をなし得る、Ｙ９０−ＲＥによって誘導される重要な抗腫瘍免疫応答が特定された。Ｙ９０−ＲＥ後の患者から得た腫瘍組織の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により、複数の免疫サブセット、及び活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の動員を誘導する可能性のある経路の活性化が特定された。また、Ｙ９０−ＲＥ前及びＹ９０−ＲＥ後の様々な時点における患者から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の免疫プロファイルを調査したところ、Ｙ９０−ＲＥに応答した者において、チェックポイント受容体ＰＤ−１及びＴｉｍ−３並びにホーミング受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を含有している、重要な免疫サブセットが特定された。さらに、Ｙ９０−ＲＥに対する潜在的な持続性応答者を特定するために、療法前のＰＢＭＣの免疫プロファイルを使用して、予測モデルを構築した。
【００２１】
したがって、本発明の一態様は、がんを患う患者の処置に対する応答を予想するためのインビトロ方法であって、がん患者から採取された白血球サンプル中の少なくとも１種の免疫マーカーの発現を測定するステップと、所定値に対する少なくとも１種の免疫マーカーの発現に基づいて、患者サンプルを、（ｉ）選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）、又は一過性（ｉｉ）ＳＩＲＴに対する一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）に分類するステップとを含む、インビトロ方法を提供する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「予想する」、「予想」、「予想される」、「予見する」、「予見される」、又は「予想すること」という用語は、選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）を用いた処置後のがんの高尤度アウトカム（ｌｉｋｅｌｙ  ｏｕｔｃｏｍｅ）の見通し又は予測を立てることに関する。ＳＩＲＴは、がんを処置するためにインターベンショナルラジオロジーにおいて使用される放射線療法の一形態である。ＳＩＲＴは通常、外科的に切除不可能ながんを有する選択された患者のためのものである。その処置は、腫瘍に供給を行う動脈中に、放射性物質、好ましくはイットリウム９０同位体（Ｙ−９０）を含有する微小なガラス又は樹脂のマイクロスフェアを注射することを伴う。この処置は放射線療法を塞栓術と組み合わせるため、放射線塞栓術とも呼ばれる。選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）を用いた処置後のがんの高尤度アウトカムの見通し又は予測は、１か月、又は３か月、又は６か月、又は１２か月、又は２４か月の期間にわたる、選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）又はＳＩＲＴに対する一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）のいずれかのアウトカムの予測であり得る。様々な実施形態において、選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）を用いた処置後のがんの高尤度アウトカムの見通し又は予測は、固形がん効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）１．１のガイドライン（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５、２２８〜２４７（２００９））に基づいてもよく、ここで、持続性応答者（ＳＲ）は、Ｙ９０  ＲＥの６か月（１８０日）後まで疾患進行なし（非ＰＤ）の高尤度アウトカムを有する患者と定義され、一方で、非応答者（ＮＲ）は、３か月時点でも疾患進行（ＰＤ）の高尤度アウトカムを有する患者と定義され、又は、一過性応答者（ＴＲ）は、Ｙ９０  ＲＥの３か月後の時点で初期応答（非ＰＤ）を示すが６か月後までに進行する（ＰＤ）高尤度アウトカムを有する患者であった。
【００２３】
本明細書で使用される場合、がんを患う患者とは、切除不可能ながん及び／又は血管過多のがんと診断された対象を指す。様々な実施形態において、がんは、次の切除不可能ながん及び／又は血管過多のがん：肝細胞がん（ＨＣＣ）、肝臓がん、結腸直腸がん、神経内分泌腫瘍、肝臓移植に現在不適応なＨＣＣ患者、転移性肝臓がん、転移性結腸直腸がん、転移性神経内分泌腫瘍；がんの周りに血管過多腫瘤が発達したがん、又は患者が少なくとも３か月の平均余命を有する任意の他のがんのうちの１つであり得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「分類する」、「分類される」、又は「分類」という用語は、規定の基準に従って患者集団を分集団に分けること、又は患者から採取されたサンプルの免疫マーカープロファイルに応じて患者を決定するか、若しくは患者を特定の群にまとめるプロセス、又は選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）若しくはＳＩＲＴに対する一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）などの特定の予想が立てられるものとして患者をソートするプロセスを指す。様々な実施形態において、患者は、ＳＩＲＴ単独での処置、又はＳＩＲＴと免疫療法との組み合わせでの処置といった、異なる処置プロトコールのために分類されてもよく、これにより、選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）と分類された患者は、ＳＩＲＴ単独又はＳＩＲＴと免疫療法との組み合わせで処置されよう。
【００２５】
様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーの発現は、飛行時間によるマススペクトロメトリー（ＣｙＴＯＦ）又は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、又は免疫マーカーの発現レベルを測定するための当技術分野で公知の任意の他の方法を使用して測定される。
【００２６】
様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＰＤ−１（配列番号９）、Ｔｉｍ−３（配列番号２１）、ＣＸＣＲ６（配列番号１２）、又はそれらの組み合わせ、ＰＤ−１（配列番号９）又はＴｉｍ−３（配列番号２１）とＣＣＲ５（配列番号３４）の共発現から選択される。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＰＤ−１（配列番号９）を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、Ｔｉｍ−３（配列番号２１）を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＣＸＣＲ６（配列番号１２）を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＰＤ−１（配列番号９）とＣＣＲ５（配列番号３４）の共発現を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、Ｔｉｍ−３（配列番号２１）とＣＣＲ５（配列番号３４）の共発現を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＰＤ−１（配列番号９）とＣＸＣＲ６（配列番号１２）の共発現を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、Ｔｉｍ−３（配列番号２１）とＣＸＣＲ６（配列番号１２）の共発現を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４Ｔ細胞におけるＰＤ−１（配列番号９）、Ｔｉｍ−３（配列番号２１）、ＣＣＲ５（配列番号３４）、又はＣＸＣＲ６（配列番号１２）のうちのいずれか１つの共発現である。
【００２７】
様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーの発現を測定するステップの前に、
複数のがん患者から採取されたサンプル中の複数の免疫マーカーの発現を測定することと、
（ＳＩＲＴ）での処置に対する、処置の３か月後及び／又は６か月後における、がん患者の臨床応答を評価することであり、臨床応答が、（ＳＲ）及び（ＴＲ／ＮＲ）から選択される、評価することと、
各免疫マーカーと臨床応答（ＳＲ）又は臨床応答（ＴＲ／ＮＲ）のいずれかとの間に相関性があるかどうかを決定することと、
各免疫マーカーが臨床応答の精度に正の影響を与える確率を１つずつ決定することと、
臨床応答の精度に正の影響を与える免疫マーカーの数に基づいて、各サンプルに確率スコアを割り当てることと、
新たながん患者から採取された白血球サンプル中に存在する各免疫マーカーに同じ確率スコアを割り当てて、新たな患者を、予測されるＳＲ又は予測されるＴＲ／ＮＲに分類することと
を含む、予測モデルが作成される。
【００２８】
様々な実施形態において、複数の免疫マーカーは、ＣＤ１４（配列番号１）、ＣＤ３（配列番号２）、ＣＤ１９（配列番号３）、ＣＤ４５ＲＯ（配列番号４）、ＨＬＡ−ＤＲ（配列番号５）、ＣＤ８（配列番号６）、Ｔ−ｂｅｔ（配列番号７）、ＣＤ２８（配列番号８）、ＰＤ−１（配列番号９）、ＣＤ１５４（配列番号１０）、ＣＤ１０３（配列番号１１）、ＣＸＣＲ６（配列番号１２）、ＴＮＦ−α（配列番号１３）、ＣＤ２５（配列番号１４）、ＣＤ２７（配列番号１５）、ＣＤ１５２（配列番号１６）、ＰＤ−Ｌ１（配列番号１７）、ＣＤ２４４（配列番号１８）、ＩＬ−１０（配列番号１９）、ＬＡＧ−３（配列番号２０）、ＴＩＭ−３（配列番号２１）、ＣＣＲ７（配列番号２２）、ＣＤ５６（配列番号２３）、ＣＸＣＲ３（配列番号２４）、ＧＩＴＲ（配列番号２５）、ＦｏｘＰ３（配列番号２６）、ＫＩ６７（配列番号２７）、ＣＤ８０（配列番号２８）、ＩＦＮ−γ（配列番号２９）、ＩＬ−１７Ａ（配列番号３０）、ＥＯＭＥＳ（配列番号３１）、グランザイムＢ（配列番号３２）、ＣＤ３７（配列番号３３）、ＣＣＲ５（配列番号３４）、ＣＤ４（配列番号４２）、又はＣＤ６９（配列番号３５）を含有する、表３に列挙する免疫マーカーの２種以上の任意の組み合わせである。様々な実施形態において、複数の免疫マーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８、Ｔ−ｂｅｔ、ＣＤ２８、ＰＤ−１、ＣＤ４、ＣＤ１５４、ＣＤ１０３、ＣＸＣＲ６、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ１５２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２４４、ＩＬ−１０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＸＣＲ３、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、ＫＩ６７、ＣＤ８０、ＩＬ−１７Ａ、ＥＯＭＥＳ、グランザイムＢ、ＣＤ３７、ＣＣＲ５、又はＣＤ６９を含有する、表３に列挙する免疫マーカーの３種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの４種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの５種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの６種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの７種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの８種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの９種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの１０種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの１１種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの１２種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの１３種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの１４種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの１５種以上、又は表３に列挙する免疫マーカーの１６種以上、の任意の組み合わせである。複数のがん患者から採取されるサンプル中の複数の免疫マーカーの発現は、がん患者がＳＩＲＳで処置される前に取得される。
【００２９】
様々な実施形態において、複数のがん患者は、３〜１０００名の患者、３〜５００名の患者、３〜２００名の患者、３〜１００名の患者、３〜９０名の患者、３〜８０名の患者、３〜７０名の患者、３〜６０名の患者、３〜５０名の患者、３〜４０名の患者、３〜３０名の患者、３〜２０名の患者、３〜１０名の患者、又は、上で言及した（ＳＩＲＴ）での処置に患者が応答するかどうかを予測するための、所定値に対する少なくとも１種の免疫マーカーの発現に基づいた患者サンプルの分類と少なくとも同等に正確である予測モデルを作成するのに好適である３以上の任意の数の患者を含有し得る。
【００３０】
様々な実施形態において、（ＳＩＲＴ）での処置に対するがん患者の臨床応答の評価は、固形がん効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）１．１のガイドライン（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５、２２８〜２４７（２００９））に基づき、ここで、持続性応答者（ＳＲ）は、Ｙ９０  ＲＥの６か月（１８０日）後まで疾患進行なし（非ＰＤ）の高尤度アウトカムを有する患者と定義され、一方で、非応答者（ＮＲ）は、３か月時点でも安定（ＳＤ）の応答が最低限である高尤度アウトカムを有する患者と定義され、又は、一過性応答者（ＴＲ）は、Ｙ９０  ＲＥの３か月後の時点で初期応答を示すが６か月後までに進行する高尤度アウトカムを有する者であった。
【００３１】
様々な実施形態において、各免疫マーカーと臨床応答（ＳＲ）又は臨床応答（ＴＲ／ＮＲ）のいずれかとの間の相関性の決定、各免疫マーカーが臨床応答の精度に正の影響を与える確率の決定、及び臨床応答の精度に正の影響を与える免疫マーカーの数に基づいた各サンプルへの確率スコアの割り当ては、ランダムフォレスト予測モデルランダムフォレストなどの機械学習アルゴリズムを使用して達成される。他の同様の重み付き近傍スキームを使用してもよい。様々な実施形態において、ランダムフォレストは、次式：
｛ｘｉ，ｙｉ｝ｎｉ＝１  （１）
として数学的に表現される訓練セットから構築されるモデルを含み、式中、ｘは、免疫マーカーを指し、ｙは、臨床応答を指し、ｉは、細胞数を指し、ｎは、ツリーの数を指す。
これは、新たな点ｘ’の予測を、次式：
【数１】
2021504682.tif 000003
として数学的に表現される重み関数Ｗによって形式化される、点の「近傍」を見ることによって行う。
【００３２】
ここで、Ｗ（ｘｉ，ｘ’）は、同じツリーにおける新たな点ｘ’に対してｉ’番目の訓練点の非負重みである。いかなる特定のｘ’についても、点ｘｉに対する重みは、合計で１にならなければならない。重み関数は、次のように与えられる。
【００３３】
ｋ−ＮＮにおいて、重みは、ｘｉがｘ’に最も近いｋ点のうちの１つである場合は、
【数２】
2021504682.tif 000004
であり、さもなければゼロである。
【００３４】
ツリーにおいては、ｘｉがｘ’と同じリーフにおけるｋ’点のうちの１つである場合は、
【数３】
2021504682.tif 000005
であり、さもなければゼロである。
【００３５】
フォレストは、個々の重み関数Ｗｊを用いてｍ個のツリーのセットの予測を平均するため、その予測は、次式のとおりである。
【数４】
2021504682.tif 000006
【００３６】
これが示すのは、フォレスト全体もまた、個々のツリーの予測を平均する重みを用いる重み付き近傍スキームであるということである。この解釈におけるｘ’の近傍点は、任意のツリーｊにおける同じリーフを共有する点Ｘｉである。このようにして、ｘ’の近傍は、ツリーの構造、ひいては訓練セットの構造に、複雑な様式で依存する。ランダムフォレストによって使用される近傍の形状は、各特徴のローカルな重要度に適合し、ここでｍは、ランダム変数の数を指す。様々な実施形態において、ｎは１０であり、ｍは２０００である。
【００３７】
様々な実施形態において、各免疫マーカーが臨床応答の精度に正の影響を与える確率の決定は、個々の細胞に関して発現される免疫マーカーがＳＩＲＴに対する持続的応答を有するであろうか否かの確率を決定する、細胞レベルにおけるものである。様々な実施形態において、ランダムに選択されたがん患者のうちの各患者から得た複数の免疫マーカーを含む約１０，０００個の単一細胞の単一細胞発現データが使用され得る。様々な実施形態において、単一細胞発現データは、単一細胞レベルの精度を向上させるために、約１０，０００個の単一細胞までダウンサンプリングされる。
【００３８】
様々な実施形態において、臨床応答の精度に正の影響を与える免疫マーカーの数に基づいた各サンプルへの確率スコアの割り当ては、各サンプルの近傍細胞発現プロファイルを比較し、臨床応答の精度に正の影響を与える免疫マーカーの数に基づいて各サンプルに確率スコアを割り当てる、サンプルレベルにおけるものである。様々な実施形態において、サンプルのそれぞれについて、ＳＲ又はＮＲと分類される細胞の割合を計算し、確率スコアのための投票システムとして使用した（ここで、ＳＲとして≧５０％は、サンプルをＳＲ群に分類し、一方で、ＳＲとして＜５０％は、サンプルをＮＲ群に分類する）（図２Ｃ）。この投票システムの最終ステップは、高精度の予測アウトカムを生成する。単一細胞訓練モデル及びサンプルベースの投票システムは、いずれの他の臨床パラメータよりも高精度でＳＩＲＴ  Ｙ９０  ＲＥに対する応答の予測を行う。
【００３９】
様々な実施形態において、新たな患者又は複数の新たな患者が次いで訓練セットになる。新たな患者は、１名若しくは複数名の新たな患者、又は任意の数の新たな患者であり得る。様々な実施形態において、新たな患者は、サンプルが採取されるとき、ＳＩＲＴで処置されたことがないものである。
【００４０】
様々な実施形態において、本方法は、予測されるＳＲ又は予測されるＴＲ／ＮＲを、所定値に対する少なくとも１種の免疫マーカーの発現に基づいた患者サンプルの分類と比較して、患者が（ＳＩＲＴ）での処置に応答するであろうかどうかを予測するステップをさらに含む。
【００４１】
患者が（ＳＩＲＴ）での処置に応答するであろうかどうかを予測するための、新たな患者のテストセットと、所定値に対する少なくとも１種の免疫マーカーの発現に基づいた患者サンプルの分類との比較は、予測の精度を調べて、新たな患者が最も適切な処置を確実に受けることができるようにし、これにより、選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予測された患者は、ＳＩＲＴ単独又はＳＩＲＴと免疫療法との組み合わせで処置されることになる。同様に、一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）であると予測された患者は、ＳＩＲＴで処置されず、代わりに、ＴＡＣＥ、ソラフェニブ、又は免疫療法単独で処置されることになろう。
【００４２】
様々な実施形態において、臨床応答の精度に正の影響を与える高い確率が割り当てられる免疫マーカーは、少なくとも１種の免疫マーカーを含む。
【００４３】
様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＸＣＲ６、又はそれらの組み合わせ、ＰＤ−１又はＴｉｍ−３とＣＣＲ５の共発現から選択される。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＰＤ−１を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、Ｔｉｍ−３を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＣＸＣＲ６を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＰＤ−１とＣＣＲ５の共発現を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、Ｔｉｍ−３とＣＣＲ５の共発現を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＰＤ−１とＣＸＣＲ６の共発現を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、Ｔｉｍ−３とＣＸＣＲ６の共発現を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の免疫マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＣＲ５、又はＣＸＣＲ６のうちのいずれか１つの共発現である。
【００４４】
様々な実施形態において、白血球サンプルは、腫瘍浸潤白血球サンプルを含む。様々な他の実施形態において、白血球サンプルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）サンプルを含む。様々な実施形態において、白血球サンプルは、ＣＤ８を発現するＴ細胞を含む。様々な実施形態において、白血球サンプルは、ＣＤ４を発現するＴ細胞を含む。様々な実施形態において、サンプルは、飛行時間によるマススペクトロメトリー（ＣｙＴＯＦ）を使用して分析される。
【００４５】
様々な実施形態において、がんは、肝細胞がんである。
【００４６】
様々な実施形態において、持続性応答者（ＳＲ）であると予測又は分類されたテストがん患者を含有する、がん患者から採取された白血球サンプルは、ＳＩＲＴ単独又はＳＩＲＴと免疫療法との組み合わせでの処置を必要とするものと特定される。
【００４７】
ＳＩＲＴ及び免疫療法は、他の療法と同様に、副作用を有し、任意の処置のコストを増加させる。したがって、がん患者がＳＩＲＴに応答するであろうかどうかを初めに予測することの利点は、ＳＩＲＴ処置に対して持続的応答を有するであろうがん患者のみに、ＳＩＲＴ単独か、又はＳＩＲＴとさらなる免疫療法剤が与えられるであろうことである。同様に、一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）であると予測される患者は、ＳＩＲＴで処置されず、代わりに、ＴＡＣＥ、ソラフェニブ、又は免疫療法単独で処置されることになろう。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「免疫療法」という用語は、能動免疫療法、受動免疫療法、又は能動免疫療法と受動免疫療法とのハイブリッドを指す場合がある。能動免疫療法は、免疫系に腫瘍細胞を攻撃させるものであり、血液又は腫瘍から免疫細胞を除去することを伴い得る。腫瘍に対して特異的な免疫細胞を培養し、患者に戻し、患者の体内で免疫細胞が腫瘍を攻撃するか、或いは、腫瘍特異的受容体を発現するように免疫細胞を遺伝子操作し、培養し、患者に戻してもよい。様々な実施形態において、能動免疫療法には、養子Ｔ細胞療法が含まれ得る。受動免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強させるものであり、モノクローナル抗体、リンパ球、又はサイトカインの使用を含有する。様々な実施形態において、免疫療法剤は、チロシンキナーゼ、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、別称、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３（Ｔｉｍ−３）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、又はリンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ−３）を阻害する抗体を含み得る。好適な抗体は、スニチニブ、エルロチニブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びベバシズマブから選択され得る。様々な実施形態において、免疫療法剤は、サイトカイン又はケモカイン、例えばＴＮＦαなどのインターフェロン、又はＩＬ−２などのインターロイキンを含み得る。様々な実施形態において、免疫療法剤は、上に列挙する免疫療法剤のうちのいずれかの組み合わせを含み得る。
【００４９】
本発明の別の態様は、がんを患う患者の処置に対する応答を予想するためのシステムであって、
【００５０】
がん患者から採取された白血球サンプル中の免疫マーカー発現プロファイルのデータセットを取得することと、白血球サンプル中の複数の細胞の免疫マーカー発現が、選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に応答するがん患者、又はＳＩＲＴに応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者に対応する確率に基づいて、データセットをソートすることと、（ｉ）ＳＩＲＴに応答する、又は（ｉｉ）ＳＩＲＴ処置に応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者から採取されたサンプルに確率スコアを割り当てることとを行うように操作可能である、処理ユニットを備え、
ＳＩＲＴに応答するがん患者に対応する免疫マーカー発現か、又はＳＩＲＴに応答しないか若しくは一過性にのみ応答するがん患者に対応する免疫マーカー発現を、複数の細胞のうちの大多数が有することから、サンプルの確率スコアが取得される、
システムを提供する。
【００５１】
処理ユニットは、本明細書に記載のようにデータセットを取得し、ソートし、割り当てることができる任意の公知の処理ユニットであり得る。
【００５２】
様々な実施形態において、本システムは、がん患者から採取された白血球サンプル中の免疫マーカーの発現を測定するためのデバイスをさらに備える。
【００５３】
様々な実施形態において、処理ユニットは、がん患者から採取された白血球サンプル中の免疫マーカーの発現を測定するためのデバイスの一部を形成する。
【００５４】
様々な実施形態において、デバイスは、サイトメーターである。様々な実施形態において、サイトメーターは、結合プラズママススペクトロメトリー及び飛行時間型マススペクトロメトリーに好適なマスサイトメーターである。このアプローチでは、抗体を同位体的に純粋な元素にコンジュゲートさせ、これらの抗体を使用して、遍在する免疫マーカーと、白血球タンパク質などの標的の免疫マーカーとの両方を標識する。細胞を噴霧してアルゴンプラズマに通し、アルゴンプラズマが、金属コンジュゲート抗体をイオン化する。次いで、金属信号を飛行時間型マススペクトロメーターによって分析する。様々な他の実施形態において、サイトメーターは、同位体ではなくコンジュゲートされたフルオロフォアを使用するフローサイトメーターであってもよいし、又は、白血球中の免疫マーカーの発現の検出及び／又は測定を行う当技術分野で公知の任意の他のサイトメーターであってもよい。
【００５５】
様々な実施形態において、デバイスは、次世代シーケンサー、例えばパイロシーケンサー、Ｈｉ−Ｓｅｑゲノムシーケンサー（ｉｌｌｕｍｉｎａ）、大規模並列シグネチャーシーケンサー、又は白血球中の免疫マーカーのｍＲＮＡ発現の検出及び／又は測定を行う当技術分野で公知の任意の他のハイスループットシーケンシングデバイス若しくはシステムである。様々な実施形態において、デバイスは、サーモサイクラーである。様々な実施形態において、サーモサイクラーは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はリアルタイムｑＰＣＲ（ＲＴ  ｑＰＣＲ）を測定するために使用することができる。様々な実施形態において、デバイスは、白血球中の免疫マーカーのｍＲＮＡ発現の検出及び／又は測定を行う当技術分野で公知の任意のデバイス若しくはシステムである。
【００５６】
本発明の別の態様は、選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予見される患者のがんの処置において使用するための、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物を提供する。
【００５７】
ＳＩＲＴは、放射性物質を含有する微小なガラス又は樹脂のマイクロスフェアを含み得る。様々な実施形態において、ＳＩＲＴは、イットリウム９０同位体（Ｙ−９０）である。様々な実施形態において、免疫療法剤は、養子Ｔ細胞療法を含有し得る。様々な実施形態において、免疫療法剤は、腫瘍抗原に対して指向されるように操作されたＴ細胞を含有し得る。様々な実施形態において、免疫療法剤は、チロシンキナーゼ、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、別称、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３（Ｔｉｍ−３）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、又はリンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ−３）を阻害する抗体を含み得る。好適な抗体は、スニチニブ、エルロチニブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びベバシズマブから選択され得る。様々な実施形態において、免疫療法剤は、サイトカイン又はケモカイン、例えばＴＮＦαなどのインターフェロン、又はＩＬ−２などのインターロイキンを含み得る。様々な実施形態において、免疫療法剤は、上に列挙する免疫療法剤のうちのいずれかの組み合わせを含み得る。
【００５８】
様々な実施形態において、免疫療法剤は、イットリウム９０同位体（Ｙ−９０）と共にマイクロスフェアに含まれ得る。様々な他の実施形態において、免疫療法剤は、イットリウム９０同位体（Ｙ−９０）を含むマイクロスフェアとは別々に用意され得る。
【００５９】
様々な実施形態において、本組成物は、がんの処置において使用するのに好適である。様々な実施形態において、がんは、肝細胞がんである。
【００６０】
本発明の別の態様は、選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予見される患者のがん、好ましくは肝細胞がんの処置において使用するための薬物の製造における、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物の使用を提供する。ここで、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物は、本明細書において上記したものである。
【００６１】
本発明の別の態様は、選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）に対する持続性応答者（ＳＲ）であると予想されるがん患者を処置する方法であって、ＳＩＲＴ又はＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物を治療有効量で患者に投与するステップを含む、方法を提供する。ここで、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物は、本明細書において上記したものである。同様に、選択的内部照射療法剤（ＳＩＲＴ）に対する一過性応答者／非応答者（ＴＲ／ＮＲ）であると予想されるがん患者を処置する方法は、ＳＩＲＴ以外の他の療法剤、例えばＴＡＣＥ若しくはソラフェニブ、又は免疫療法剤を患者に投与するステップを含む。
【００６２】
様々な実施形態において、がん患者は、肝細胞がん患者を含む。
【００６３】
様々な実施形態において、免疫療法剤は、ＳＩＲＴと共に投与され得る。
【００６４】
様々な他の実施形態において、免疫療法剤は、ＳＩＲＴとは別々に投与され得る。
【実施例】
【００６５】
飛行時間型マスサイトメトリー及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、Ｙ９０−ＲＥの前及び後の様々な時点における腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）、腫瘍組織、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の免疫ランドスケープを分析した。
【００６６】
Ｙ９０−ＲＥ後に単離したＴＩＬは、グランザイムＢ（ＧＢ）の高発現、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、及びＣＤ８＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞の浸潤を含有している、局所免疫の活性化を示すマーカーを呈した。ＮＧＳによって、Ｙ９０−ＲＥで処置した腫瘍における自然免疫及び適応免疫の活性化に関与する遺伝子の上方制御が確認された。ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６が関与する走化性経路は、Ｙ９０−ＲＥで処置した腫瘍への、活性化されたＧＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の動員と相関した。Ｙ９０−ＲＥの前と後とでＰＢＭＣを比較すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との両方におけるＴＮＦαの増大、並びにＹ９０−ＲＥ後の抗原提示細胞の割合の増大が観察され、全身的な免疫活性化が示唆された。高い割合のＰＤ−１＋／Ｔｉｍ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がホーミング受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６を共発現することは、Ｙ９０−ＲＥ応答者を意味した。また、処置前のＰＢＭＣの免疫プロファイルに基づいて、Ｙ９０−ＲＥに対する持続性応答者を特定するために、予測モデルを構築した。
【００６７】
腫瘍及び全身的な免疫ランドスケープの高次元分析により、Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答の説明となり得る局所的及び全身的な免疫活性化が特定された。正の臨床応答に関連する可能性のあるバイオマーカーを特定し、処置前に持続性応答者を特定するための予測モデルを構築した。
患者及びサンプル処理
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ及びＳｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて、過去にＹ９０  ＲＥ療法での処置を受けた者と受けていない者とで合計４１名のＨＣＣ患者から、腫瘍組織及び血液サンプルを取得した。そのうちｎ＝１４は、ＨＣＣの外科的切除を受け、１４名の患者の切除されたＨＣＣ組織（表１）から、酵素消化によって腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）が単離された。
【００６８】
【表１】
2021504682.tif 000007
【００６９】
従来のＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）による単離方法を製造元の説明に従って使用して、Ｙ９０  ＲＥ前（ｐｒｅ）及びＹ９０  ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）で、別の３１名の患者のコホート（表２には、Ｙ９０  ＲＥ後に続いて切除を受けた４名のＨＣＣ患者が含まれており、この４名のＨＣＣ患者のＴＩＬも分析し、表１に含めた）から採取された血液から、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。
【００７０】
【表２】
2021504682.tif 000008
2021504682.tif 000009
【００７１】
様々な分析のために使用したサンプルを表１及び２に示してある。
【００７２】
固形がん効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）１．１のガイドライン（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５、２２８〜２４７（２００９））を使用して、腫瘍応答を評価した。持続性応答者（ＳＲ）は、Ｙ９０  ＲＥの６か月（１８０日）後まで疾患進行がまったくなかった患者（非ＰＤ）として定義され、一方で、非応答者（ＮＲ）は、３か月時点でも安定（ＳＤ）の最低限の応答をまったく有しなかった者であり、又は、一過性応答者（ＴＲ）は、Ｙ９０  ＲＥの３か月後の時点で初期応答を有したが６か月後までに進行した者であった（表２）。この研究は、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ−Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによって承認され、すべての患者にインフォームドコンセントを提供した。
【００７３】
飛行時間型マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）
ＣｙＴＯＦを過去に説明されているように使用して（Ｃｈｅｗら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１４、Ｅ５９００〜Ｅ５９０９（２０１７））、３７種の金属コンジュゲート抗体（表３）でＴＩＬ及びＰＢＭＣを分析した。簡潔に述べると、シスプラチン生存染色（ＤＶＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）、並びに、過去に説明されているトリプルバーコードシステムである（Ｌａｉら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ  ８７、３６９〜３７４（２０１５））、ランタニド金属８９、１１５及び１７２にそれぞれコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ４５白血球マーカーで免疫細胞を染色した。バーコード化された免疫細胞を組み合わせ、次いで、表面マーカーを標的とする抗体で染色した。細胞を１．６％のパラホルムアルデヒドで固定し、細胞内抗体染色を可能にするために、１００％メタノールで透過処理した。最後に、Ｈｅｌｉｏｓマスサイトメーター（Ｆｌｕｄｉｇｍ、ＵＳＡ）での分析の前に、細胞可視化のためにＤＮＡインターカレーター（ＤＶＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を添加した。
【００７４】
【表３】
2021504682.tif 000010
【００７５】
ＥＱＴＭ  Ｆｏｕｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓ（カタログ番号２０１０７８、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を製造元の説明に従って使用して、Ｈｅｌｉｏｓにより生成された出力ファイルを正規化し（Ｆｉｎｃｋら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ  ８３、４８３〜４９４（２０１３））、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン１０．２；ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ、ＵＳＡ）においてブールゲーティング戦略によってマニュアルでバーコード解除した（ｄｅ−ｂａｒｃｏｄｅｄ）。Ｂａｒｎｅｓ−Ｈｕｔ  ＳＮＥ非線形次元削減アルゴリズムと、ｋ平均クラスタリングアルゴリズム（Ｓｈｅｋｈａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１、２０２〜２０７（２０１４））との組み合わせに基づく、インハウスの改良版ＡＣＣＥＮＳＥ（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）ソフトウェアを使用した分析を行う前に、各サンプルを１０，０００個の生きた免疫細胞までダウンサンプリングし、各群につき等しい数のサンプルを選択した。２Ｄのｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）マップのセル及びノードビュー、並びに各ノードにおける個々のマーカーの発現に関する密度プロットを同時に生成した。いずれかの群において有意に濃縮されていたノード（Ｐ＜０．０５）を、対応あり又は対応なしのマン−ホイットニーのＵ検定によって特定した。データはすべて、ＦｌｏｗＪｏを使用し、独立して検証した。データ可視化のために、Ｒスクリプトを使用し、すべての有意なノードに基づいて、２Ｄ及び３Ｄの両方のヒートマップをプロットした。
【００７６】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）
各患者から得た腫瘍組織を、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）中に保存し、さらに処理するまで−８０℃で保管した。ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡを単離し、製造元のプロトコールに従ってＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ（登録商標）ｖ４Ｕｌｔｒａ（商標）Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＵＳＡ）を使用して増幅したｃＤＮＡから、Ｉｌｌｕｍｉｎａ対応のｃＤＮＡライブラリーを生成し、２×１０１ｂｐのシーケンシングのためにマルチプレックス化した。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅにおいて、ＨｉＳｅｑ高出力プラットフォームで、ＮＧＳを外的に行った。
【００７７】
ＥｎｓｅｍｂｌのＨｕｍａｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＧＲＣｈ３８．ｐ７．を参照し、ＨＩＳＴＡＴ（Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｉｎｄｅｘｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）によって生シーケンシングリードをマッピングした。次いで、ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用してリードアライメントをソートし、ハイスループットシーケンシングデータ（ＨＴＳｅｑ）を用いて生の遺伝子カウントを抽出した。２つのサンプル群間の示差的遺伝子発現分析のために、ＲパッケージＥｄｇｅＲツールを使用した。遺伝子関連（ｇｅｎｅ−ｗｉｓｅ）統計分析のための一般化線形モデルパイプライン（Ｌｕｎｄら、Ｓｔａｔ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１、（２０１２））において、経験ベイズ法疑似尤度Ｆ検定を使用した。変化倍率が＞２であり、Ｐ＜０．０１であった遺伝子を選択した。次いで、Ｒスクリプトを使用したヒートマップにおいてこのデータを可視化し、Ｐ＜０．０１及びｂｅｎｊａｍｉｎｉ＜０．０５の選択基準に基づいて、ＤＡＶＩＤ６．７  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌを使用し、Ｙ９０  ＲＥ後の腫瘍において濃縮されていた遺伝子に関する生物学的機能分析を行った。Ｒｅａｃｔｏｍｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｃｒｏｆｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９、Ｄ６９１〜６９７（２０１１））を使用し、濃縮されていた遺伝子のさらなる機能的経路分析を行った。
【００７８】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
上述のように腫瘍組織からＲＮＡを単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造元の説明に従って使用して、ｃＤＮＡの変換を行った。標的遺伝子のプライマー配列を表４に提示する。ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（登録商標）４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してｑＰＣＲを行い、ライトサイクラー（登録商標）４８０  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してデータを収集した。技術的三連実験（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）を行い、結果をＧＡＰＤＨ発現に対して正規化して、相対遺伝子発現の平均を得た。
【００７９】
【表４】
2021504682.tif 000011
【００８０】
予測モデリングアルゴリズム
Ｙ９０  ＲＥに対する臨床応答を予測するモデルを構築するために、ランダムフォレストアルゴリズム（Ｂｒｅｉｍａｎ、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ４５、５〜３２（２００１））を使用した。ｎ＝２２のランダムに選択された患者の各患者から得た単一細胞ＣｙＴＯＦデータ（３７種のマーカーの発現がある１０，０００個の単一細胞）を、アルゴリズムのチューニング及び訓練のために使用し、次いで、ｎ＝８の患者の独立した検証コホート又はテストコホートにおいてテストした（図１）。最適な精度のために、ｍｔｒｙ（各ツリー内のランダム変数の数）及びｎｔｒｅｅ（ツリーの数）という２つのパラメータに基づくランダムフォレストのチューニング及び訓練において、Ｃａｒｅｔ（Ｋ．Ｍ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２８、（２００８））及びＲａｎｇｅｒ（Ｗｒｉｇｈｔ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７７、（２０１７））のＲパッケージを使用した（７６．８％の最大精度をもたらした、ｍｔｒｙ＝１０及びｎｔｒｅｅ＝２０００を選択してチューニング及びモデリングを行った。図２）。サンプルのそれぞれについて、ＳＲ又はＮＲと分類される細胞の割合を計算し、確率スコアのための投票システムとして使用した（ここで、ＳＲとして≧５０％は、サンプルをＳＲ群に分類し、一方で、ＳＲとして＜５０％は、サンプルをＮＲ群に分類した）。結果を実際の臨床アウトカムと比較し、真陽性率及び偽陽性率を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線上にプロットした。
【００８１】
単一細胞レベルで訓練データ及びテストデータについて得られた精度は、それぞれ０．７６８６及び０．７０８２であり（図３）、曲線下面積（ＡＵＣ）値は、それぞれ０．８４６及び０．６７７である。訓練データに関し、これが意味するのは、訓練モデルが、ランダムに選択された正のＲクラスの単一細胞データを、ランダムに選択された負のクラスＮＲの単一細胞データよりも高くランク付けする尤度が８４．６％であり、訓練データセット中の単一細胞データのうちの７６．９％が、実際の臨床アウトカムが示すものに対して正しく分類されているということである。訓練データセットにおいては、単一細胞データの７０．８％が正しく分類されている。次いで、単一細胞レベルの確率スコアを使用して、サンプルレベルの確率スコアを獲得する（図１、表５及び６）。訓練コホート又はテスト／検証コホートにおけるサンプルのそれぞれについて、クラスＳＲ及びクラスＮＲと分類される細胞の数を計算する。各サンプルについて、クラスＳＲ及びクラスＮＲと分類される細胞の割合を計算し（図１、表５及び６）、これを投票システムとして使用して、全サンプルレベルにおけるクラスＳＲ及びクラスＮＲの確率スコアとして処理する。この最終ステップにおいて、サンプルがクラスＳＲと分類されるためには、サンプルデータに関する正のクラスＳＲの確率スコアが５０％以上である必要があり、さもなければ、サンプルはクラスＮＲと分類される。この投票システムの最終ステップは、高精度の予測アウトカムを生成し、訓練データセットでは０．９５５、テストデータセットでは０．７５０の精度がもたらされた。訓練データセットとテストデータセットとの両方で、１のＲＯＣ曲線下のＡＵＣ値が得られた（図２Ｄ）。これは、訓練セットサンプルの９５．５％が正しく分類され、訓練モデルが、ランダムに選択された正の応答者ＳＲクラスサンプルを、ランダムに選択された負のクラスＮＲサンプルよりも高くランク付けする確率が、１００％であることを意味する。これには、すべてのＮＲクラスが、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む適切な組成物で処置される見込みが高く、ＳＲが、ＳＩＲＴ単独による処置で十分であるようなＮＲであると予測される場合にも、ＳＩＲＴ及び免疫療法剤を含む組成物の併用処置が依然として応答をもたらすはずであるという、明らかな利点がある。図２Ａには、訓練コホートとテスト／検証コホートとの両方におけるサンプル間の距離を示すデンドログラムが示されている。個々のマーカーの発現中央値を使用している。
【００８２】
【表５】
2021504682.tif 000012
【００８３】
【表６】
2021504682.tif 000013
【００８４】
単一細胞訓練モデル及びサンプルベースの投票システムは、いずれの他の臨床パラメータよりも高精度でＳＩＲＴ  Ｙ９０  ＲＥに対する応答の予測を行う。
【００８５】
Ｙ９０前のＰＢＭＣの免疫プロファイルに基づく持続的応答の予測モデル
末梢血の免疫マーカーの発現における差に基づいて、持続的応答を示した患者を、Ｙ９０−ＲＥに対する応答を示さなかった患者又は一過性応答を示した患者から分離した。次に、Ｙ９０前のＰＢＭＣの単一細胞免疫プロファイル（３７種のマーカーの発現がある１０，０００個の単一細胞から得たＣｙＴＯＦデータ）に基づいて、持続的応答を予測するためのランダムフォレストを使用して（図２Ａ）、予測モデルを構築した。最適な精度をもたらしたｍｔｒｙ（ランダム変数の数）及びｎｔｒｅｅ（ツリーの数）のパラメータ（ｍｔｒｙ＝１０及びｎｔｒｅｅ＝２０００は、７６．８％の最大精度をもたらした。図２Ｂ）に基づいて、予測モデルを選択した。訓練コホート（ｎ＝２２）においてこのモデルのクロスバリデーションを行うと、９５．５％の高い精度が見出され、テストコホート（ｎ＝８）において独立してテストすると、７５．０％の精度が見出された（図２Ｄ並びに表５及び６）。まとめると、この綿密なイムノフェノタイピングアプローチは、局所的及び全身的なレベルにおけるＹ９０−ＲＥ後の免疫応答の性質を示した。Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答を示したＨＣＣ患者を分類し予測する可能性のある全身性バイオマーカーが特定された（図４）。
【００８６】
多変量分散分析
Ｙ９０−ＲＥに対する臨床アウトカム又は応答に影響を与える可能性のある他の臨床パラメータを検討するために、多変量分散分析を行って、本明細書に記載の予測モデルを用いた実際の臨床応答、並びにアウトカム／応答に影響を与え得る他の臨床パラメータの間の関係を分析した。多変量分散分析（Ｍａｎｏｖａ−Ｘｕ及びＣｕｉ。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００８；２４：１０５６〜６２）では、Ｆ値及びｐ値を、Ｐｉｌｌａｉ−Ｂａｒｔｌｅｔｔのトレース統計量（Ｍｕｌｌｅｒ及びＮｅｗ。Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｇｒａｐｈ  Ｓｔａｔ  １９９８；７：１３１〜７）に基づいて算出した。これらのパラメータは、ステージ、腫瘍多重度、腫瘍サイズ、門脈腫瘍塞栓（ＰＶＴＴ）、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）レベル、肝炎ステータス、及び療法前又は療法後、Ｙ９０−ＲＥ前又はＹ９０−ＲＥ後を含有する（表７）。
【００８７】
【表７】
2021504682.tif 000014
2021504682.tif 000015
2021504682.tif 000016
【００８８】
表８に示すように、本明細書に記載の予測モデルは、ステージ（ｐ＝０．００１２）、又は腫瘍多重度（ｐ＝０．０１４）、又は有意な予測力を有しない他のパラメータのうちのいずれと比較しても、予測力において優れていた（ｐ＝１．００６ｅ−０７）。これは、Ｙ９０−ＲＥ前のＰＢＭＣの免疫ステータスが、Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答を予測するにあたり、他の臨床パラメータよりも良好なバイオマーカーとして機能し得ることを示した。したがって、本明細書に記載の予測モデルは非常に優れている。
【００８９】
【表８】
2021504682.tif 000017
【００９０】
統計分析
ＣｙＴＯＦデータについては、ノンパラメトリックな対応あり又は対応なしのマン−ホイットニーのＵ検定を使用して、２つの群間で示差的なノードを特定した。示してあるように、対応あり又は対応なしのスチューデントｔ検定又はマン−ホイットニーのＵ検定、及びピアソンの相関検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖ．６．０ｆ）を使用して、ＦｌｏｗＪｏ及びｑＰＣＲのデータを分析した。
【００９１】
Ｙ９０−ＲＥ処置に対する全体的な応答
ＨＣＣ患者の切除された腫瘍組織及びＰＢＭＣを分析することから取得されたデータは、Ｙ９０−ＲＥが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞の活性化、抗原提示、並びに免疫細胞の運動性を伴う局所的及び全身的な免疫応答を誘導することの強力な証拠を提示する。Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答を示した患者に特有の全身的免疫サブセットは、疲弊マーカー（ＰＤ−１及びＴｉｍ−３）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞、並びにホーミング受容体（ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞を含有した。Ｙ９０−ＲＥによって誘発される、活性化されたＧＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６を介する走化性経路も発見された。重要なことに、本研究は、Ｙ９０−ＲＥ前のＰＢＭＣの免疫プロファイルに基づいた、持続的な臨床応答の予測モデルを提示した。
【００９２】
ＴＩＬの綿密なイムノフェノタイピングは、Ｙ９０−ＲＥ後の、活性化された、又はＧＢを発現する、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、及びＣＤ８＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞の増大、並びにＴＲＥＧ細胞の低減など、局所的な腫瘍微小環境における著しい免疫活性化を示した。腫瘍組織から得たＮＧＳデータの分析はまた、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞の活性化の増強に関する、説得力のある証拠を提示した。例えば、Ｔ細胞の活性化及び増殖を正に制御することが過去に示されている（Ｃｈａｒｖｅｔ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７７、５０２４〜５０３１（２００６））、ＣＤ２８共刺激性及びＣＤ２８依存性のＶａｖ１及びＡｋｔ経路の誘導が、Ｙ９０−ＲＥを受けた患者において観察された。また、ＣｙＴＯＦ分析及びＮＧＳ分析により、自然免疫応答の増強が、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞の活性化を伴うＹ９０−ＲＥの結果であると特定された。
【００９３】
Ｙ９０−ＲＥは局所免疫応答を活性化させる
ＣｙＴＯＦ及びＮＧＳに基づく綿密な分析パイプラインを設計して、Ｙ９０−ＲＥを受ける前及び後のＨＣＣ患者から取得したＴＩＬ、腫瘍組織、及びＰＢＭＣの免疫表現型を調査した（図５Ａ）。局所免疫応答の性質を理解するために、Ｙ９０−ＲＥ後の患者、又は処置ナイーブであった患者（整合した臨床パラメータを有するもの、対照（Ｃｔｌ）として、表１）から、ＴＩＬを単離した。ＣｙＴＯＦを使用してＴＩＬを分析し（表３）、Ｙ９０−ＲＥ後の腫瘍と対照腫瘍とから示差的に発現されたノード／免疫サブセットを特定した（図５Ｂ）。
【００９４】
Ｙ９０−ＲＥ後の腫瘍から単離されたＴＩＬにおける、特異的なＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットの濃縮が観察された（図５Ｂ）。２種の免疫マーカー、グランザイムＢ（ＧＢ）及びＴｉｍ−３の発現は、対照（Ｃｔｌ）腫瘍と比べてＹ９０−ＲＥ後の腫瘍から得たＴＩＬにおいて高かった（図６Ａ＆Ｂ）。実際、ＦｌｏｗＪｏのマニュアルゲーティングを使用して確認したところ、より高い割合のＧＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｉｍ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｙ９０−ＲＥ後のＴＩＬにおいて検出された（図７）。Ｙ９０−ＲＥ後のＴＩＬでは、対照ＴＩＬよりも有意に多くのＧＢを発現した、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞の全体的な濃縮も観察された（図８）。さらに、Ｙ９０−ＲＥ後のＴＩＬにおいてＣＸＣＲ３を発現した高い割合のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞が観察された（図５Ｂ及び図９）。反対に、対照ＴＩＬは、Ｙ９０−ＲＥ  ＴＩＬと比較して高い割合のＦｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋ＣＤ４＋ＴＲＥＧ細胞を示した（図５Ｂ及び図１０）。まとめると、これらのデータは、Ｙ９０−ＲＥ後の腫瘍の免疫微小環境には、複数の活性化された免疫サブセットが浸潤し、ＴＲＥＧ細胞が濃縮されていた対照腫瘍と比較して免疫抑制性が低かったことを示す。
【００９５】
Ｙ９０−ＲＥでの処置後、腫瘍組織中に免疫活性化経路が誘導される
対照として事前にいかなる処置も受けなかった患者（表１）と比較して、Ｙ９０−ＲＥ後にステージが低下したＨＣＣ患者から収集された切除腫瘍組織に、ＮＧＳを行った。全体的に見て、複数の遺伝子が示差的に発現したことが観察され、そのうち８８％は、対照腫瘍と比較してＹ９０−ＲＥ後の腫瘍において高発現した。ＤＡＶＩＤ経路分析ツールを使用した機能的分析により、これらの濃縮されていた遺伝子のほとんどが、自然免疫応答又は適応免疫応答に関連していたことが見出された。反対に、対照腫瘍において濃縮されていた遺伝子は、免疫経路に関連していなかった。
【００９６】
Ｙ９０−ＲＥ後に濃縮されていたこれらの遺伝子に関する、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用したさらなるデータ分析により、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原提示、ＣＤ２８共刺激性及びＣＤ２８依存性のＶａｖ１及びＡｋｔ経路に関連したＴ細胞活性化経路を含有する経路が特定された。Ｙ９０−ＲＥ後の腫瘍と対照腫瘍とを比較すると、ＣＤ２４４及びＣＤ４８を介するＮＫ細胞活性化経路の上方制御のみならず、ＮＫＴ細胞の発達及びＮＫＴ細胞の肝臓への動員に必要とされるＬＦＡ−１及びＩＣＡＭ−１結合の濃縮も検出された。まとめると、これらの所見は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞の活性化の増強、並びにこれらの細胞のＹ９０−ＲＥ後の腫瘍への動員に関する、ＣｙＴＯＦによる観察を補完する。
【００９７】
Ｙ９０−ＲＥは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍微小環境への走化作用を誘導する
Ｙ９０−ＲＥ後に濃縮されていた遺伝子のＲｅａｃｔｏｍｅによる分析は、ＣＸＣＬ１６及びＣＣＬ５の上方制御を伴う走化活性の増大も示した（図１１）。この結果を所与として、走化性経路はＹ９０−ＲＥによって誘導され得ると仮定した。
【００９８】
次いで、同じ患者から取得された腫瘍サンプル（表１）にｑＰＣＲを行って、ＮＧＳ結果を検証したところ、この結果は実際、それぞれＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６に結合する２種のケモカインであるＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６の発現における増大を示した（図１１Ａ）。活性化されたＴ細胞に対する走化性効果を確認するために、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６のＲＮＡ発現を、ＴＩＬ中に見出された免疫サブセットと相関を見せ、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６が、活性化されたＧＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と正の相関を見せたことを確認した（図１１Ｂ）。これらの所見は、腫瘍−細胞死のみならず、療法後のＴ細胞の動員及び活性化を誘導することによって、ＨＣＣ腫瘍の微小環境を形成するＹ９０−ＲＥの能力を示した。
【００９９】
Ｙ９０放射線塞栓術によって初期及び後期の免疫応答が誘導される
Ｙ９０−ＲＥによって誘導された全身的な免疫応答を捕らえるため、別の３１名のＨＣＣ患者から、Ｙ９０−ＲＥ前及びＹ９０−ＲＥ後の様々な時点（１か月、３か月、及び６か月）で、ＰＢＭＣを収集した（表２）。
【０１００】
Ｙ９０−ＲＥを受けた３１名の患者を、持続性応答者（ＳＲ）と、非応答者又は一過性応答者（ＮＲ／ＴＲ）との２つの群に分離し（表２；ＳＲは、Ｙ９０  ＲＥ後６か月時点でいずれの部位にも疾患進行がない患者（非ＰＤ）であり、ＮＲは、３か月時点での安定（ＳＤ）さえ示さなかった患者であり、ＴＲは、３か月時点で初期応答を示したが６か月までに進行した患者である）、特にＳＲに対して、ペアワイズの時点毎のＣｙＴＯＦ分析を行った（図４）。免疫活性化の初期徴候は、特にＳＲにおける、Ｙ９０−ＲＥの１か月後のＣＤ８＋Ｔｉｍ３＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＮＦα発現の増大によって表された（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。注目すべきことに、これらのＴ細胞サブセットにおけるＴＮＦα発現は、療法の１か月後及び３か月後において、ＮＲ／ＴＲよりもＳＲにおいて有意に高かった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。
【０１０１】
３か月時点とＹ９０−ＲＥ前との間で同じ比較を行い、療法の３か月後、特にＳＲにおいて、有意に高い割合のＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）を観察した（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）。ＧＢ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞も３か月時点で有意に増強されていたが、この上昇は、Ｙ９０−ＲＥの１か月後におけるＳＲにのみ特異的であった（図１２Ｅ）。ＡＰＣを除いて、Ｙ９０−ＲＥ前と６か月時点のＰＢＭＣを比較したとき、免疫細胞サブセットにおけるさほど特徴的でない差が特定された（図１２Ｃ）。
【０１０２】
Ｙ９０＿ＲＥ処置に対する応答の予測
ＣｙＴＯＦによるＹ９０−ＲＥ前及びＹ９０−ＲＥ後のＰＢＭＣの分析により、療法によって誘発された全身的な免疫応答を捕らえ、臨床アウトカムを予測する可能性のあるバイオマーカーを特定することができた。Ｙ９０−ＲＥ後１か月時点で初めて検出された免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカインＴＮＦα発現の増大であり、これに、Ｙ９０−ＲＥ後３か月のＡＰＣの増大が続いた（図１２）。Ｙ９０−ＲＥ前にＰＤ−１及びＴｉｍ−３を発現した全身的なＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の高い割合は、療法後に持続的応答を引き起こし、腫瘍進行までの時間が≧６か月に増大した患者を意味した。同じ免疫サブセットであるＣＤ８＋Ｔｉｍ−３＋Ｔ細胞もまた、腫瘍中のＴＩＬにおいてＹ９０−ＲＥ後から濃縮されていた主要なサブセットのうちの１つであった（図７）。
【０１０３】
Ｔｉｍ−３は、免疫細胞疲弊のマーカーであり、ＨＣＣを含有する様々ながんの進行に関連している（Ｌｉら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５６、１３４２〜１３５１（２０１２））。ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の共発現は、Ｔ細胞の機能障害を増強させることがあり、腫瘍の進行にも関連している（Ｆｏｕｒｃａｄｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０７、２１７５〜２１８６（２０１０））。しかしながら、Ｔｉｍ−３の発現は、過去のＴ細胞活性化の徴候でもあり（Ｈａｓｔｉｎｇｓら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３９、２４９２〜２５０１（２００９））、実際、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴｉｍ−３及びＰＤ−１の共発現は、腫瘍抗原に対してしかけられた過去の免疫応答を示す場合がある。亢進したＴ細胞活性化の別の徴候は、Ｙ９０−ＲＥ後の患者のＴＩＬ又はＰＢＭＣにおける、炎症促進性ＧＢ及びＴＮＦαの共発現であった（図７及び図１２Ａ）。マウスがんモデルにおいて、Ｔｉｍ−３及びＰＤ−１の両経路を標的とすると、Ｔ細胞の疲弊を元に戻し、抗腫瘍免疫応答を回復させることができる（Ｓａｋｕｉｓｈｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０７、２１８７〜２１９４（２０１０））。これらのデータを所与とすると、特に持続性応答者では、Ｙ９０−ＲＥに続いて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１又はＴｉｍ−３経路に対するチェックポイント阻害剤を使用した免疫療法を行う連続的療法が、ＨＣＣにおける臨床応答を増強させ得ると推論される。
【０１０４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞における、Ｔｉｍ−３とホーミング受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６との共発現は、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６ケモカインに対してホーミングするその能力を示した。このデータは、ＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＸＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＣＲ５＋／ＣＸＣＲ６＋Ｔｉｍ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｙ９０−ＲＥに対する応答者の他のバイオマーカーであることを示した（図１３Ａ）。
【０１０５】
興味深いことに、ＮＧＳ及びｑＰＣＲは、Ｙ９０−ＲＥ後の腫瘍微小環境におけるＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６の上方制御を示した（図１１）。これらの結果は、Ｙ９０−ＲＥによって誘導されたケモカイン発現が、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１６経路を介した腫瘍部位への細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の動員に必要であること、並びに、この作用が、Ｙ９０−ＲＥに対する臨床応答をもたらすことを示唆する（図１１Ｂ）。
【０１０６】
高深度のイムノフェノタイピング及びトランスクリプトーム分析は、Ｙ９０−ＲＥに対する持続的応答を示したＨＣＣ患者の腫瘍微小環境内で局所的に、且つ末梢血中で全身的に、ロバストな免疫活性化を示した。このアプローチにより、免疫活性化が捕らえられ、ＨＣＣ患者のための処置選択の指針となり得る、持続的な臨床応答の予測的バイオマーカーが末梢血中で特定された。
【０１０７】
ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の高発現は、Ｙ９０＿ＲＥに対する持続的応答を特定及び予測する
ＳＲ対ＮＲ／ＴＲの全身的な免疫プロファイルを、Ｙ９０−ＲＥ前とＹ９０−ＲＥの３か月後とで比較した。ＳＲに特異的である特徴的なＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が観察された。ＰＤ−１及びＴｉｍ−３は、Ｙ９０−ＲＥ前とＹ９０−ＲＥの３か月後との両方で、ＳＲにおいてより高い発現を示した（図１３Ｂ）。
【０１０８】
ＦｌｏｗＪｏのマニュアルゲーティングによって検証したところ、両方の時点において、ＳＲにおいて、より高い割合のＰＤ−１及びＴｉｍ−３を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞が示された（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。療法前及び療法の３か月後のＳＲにおいて、より高い割合のＰＤ−１＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞も観察された（図１３Ａ及び図１４Ｃ）。なお、Ｔｉｍ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、最長でＹ９０−ＲＥの６か月後まで、ＳＲにおいて高い状態を維持した（図１４Ａ）。
【０１０９】
こうした疲弊マーカーの明らかな高発現は、療法前と療法の３か月後又は６か月後との両方でＳＲに特異的である、より高いレベルのＴ細胞活性化を意味し得る。これは、後のＹ９０−ＲＥに対する持続的応答を部分的に媒介し得る。対照的に、Ｙ９０−ＲＥ前又はＹ９０−ＲＥの３か月後におけるＮＲ／ＴＲにおいて濃縮されていた免疫サブセットは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１５２＋Ｔｒｅｇ（図１４Ｂ及び図１４Ｄ）、ＰＤ−１を発現しないＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、及びＰＤ−１もＴｉｍ−３も発現しないＣＤ８＋Ｔ細胞を含有した。
【０１１０】
Ｙ９０−ＲＥの持続性応答者から得たＴ細胞は、特異的なホーミング受容体を発現する
Ｙ９０−ＲＥ前及びＹ９０−ＲＥの３か月後のＳＲをＮＲ／ＴＲと比較すると、ケモカイン受容体発現、具体的にはＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６における特徴的な差が観察された（図１５Ａ）。すべてのサンプルに対するＦｌｏｗＪｏのマニュアルゲーティングにより、両時点でＳＲにおいて有意に高い割合のＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＸＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が確認された（図１３Ａ及び図１５Ｂ）。興味深いことに、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６の発現も、ＳＲにおいて濃縮されていたＴｉｍ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットで有意に高かった（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の高い割合は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞がＹ９０−ＲＥに応じて腫瘍微小環境に動員されたことを示す過去の結果とも一致した（図１１Ｂ）。さらに、Ｙ９０−ＲＥ後１か月時点で観察された、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔｉｍ−３＋Ｔ細胞におけるＣＣＲ５及びＣＸＣＲ６の両方の割合の低下は、活性化されたＴ細胞がＹ９０−ＲＥに応じて腫瘍部位に動員されたことをさらに示唆した（図１３Ａ）。
【０１１１】
上述の特徴の代替物でも代理物でもない変化形態及び組み合わせが、意図される本発明の範囲内に属するなおもさらなる実施形態を形成するように組み合わされてもよいことは、当業者にはさらに理解されるべきである。
【０１１２】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１７年１１月３０日に出願されたシンガポール国特許出願第１０２０１７０９９２４Ｔ号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021504682.tif 000018
【図２Ａ】
2021504682.tif 000019
【図２Ｂ】
2021504682.tif 000020
【図２Ｃ】
2021504682.tif 000021
【図２Ｄ】
2021504682.tif 000022
【図３】
2021504682.tif 000023
【図４】
2021504682.tif 000024
【図５】
2021504682.tif 000025
【図６Ａ】
2021504682.tif 000026
【図６Ｂ】
2021504682.tif 000027
【図７】
2021504682.tif 000028
【図８】
2021504682.tif 000029
【図９Ａ】
2021504682.tif 000030
【図９Ｂ】
2021504682.tif 000031
【図１０】
2021504682.tif 000032
【図１１Ａ】
2021504682.tif 000033
【図１１Ｂ】
2021504682.tif 000034
【図１２Ａ】
2021504682.tif 000035
【図１２Ｂ】
2021504682.tif 000036
【図１２Ｃ】
2021504682.tif 000037
【図１２Ｄ】
2021504682.tif 000038
【図１２Ｅ】
2021504682.tif 000039
【図１３Ａ】
2021504682.tif 000040
【図１３Ｂ】
2021504682.tif 000041
【図１３Ｃ】
2021504682.tif 000042
【図１４Ａ】
2021504682.tif 000043
【図１４Ｂ】
2021504682.tif 000044
【図１４Ｃ】
2021504682.tif 000045
【図１４Ｄ】
2021504682.tif 000046
【図１５Ａ】
2021504682.tif 000047
【図１５Ｂ】
2021504682.tif 000048
【配列表】
2021504682000001.app
【国際調査報告】
2021504682.tif 000049
2021504682.tif 000050
2021504682.tif 000051