(57)【要約】  運動精子ドメイン含有タンパク質２（ＭＯＳＰＤ２）およびＴ細胞特異的またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片、それを含む医薬組成物およびキット、ならびにそれを作製し、使用する方法が本明細書で開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に対する１つ以上の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子が、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ９５である、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
ＭＯＳＰＤ２に対する前記１つ以上の抗原結合ドメインが、抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ断片、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、または軽鎖ＣＤＲ３である、請求項１または２に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子がＣＤ３であり、およびＣＤ３に対する１つ以上の抗原結合ドメインが、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ断片、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、または軽鎖ＣＤＲ３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
以下の抗原結合ドメイン：
（ｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
（ｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域
の１つ以上を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
以下の抗原結合ドメイン：
（ｉ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
（ｉｉ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域
の１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
以下の抗原結合ドメイン：
（ｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；
（ｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
（ｉｖ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインの１つ以上がペプチドリンカーによって連結されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
少なくとも１つの抗原結合ドメインがヒトである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
少なくとも１つの抗原結合ドメインがヒト化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片が一本鎖ポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片が、約６０，０００ダルトン以下の分子量を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記二重特異性抗体が、ナノボディ、ダイアボディ、デュオボディ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、二価抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）、トリプルボディ、ミニ抗体、ＴｒｉＢｉミニボディ、イントラボディ、またはクアドローマである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片が、約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）でＭＯＳＰＤ２および／またはＣＤ３に特異的に結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記二重特異性抗体もしくは抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインが、配列番号１〜４の１つ以上、またはその機能的変異体に特異的に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記二重特異性抗体もしくは抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインが、配列番号５〜８の１つ以上、またはその機能的変異体によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記二重特異性抗体もしくは抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインが、約１０−６Ｍ〜約１０−１２ＭのＫＤでＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
全身投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
局所投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
経口投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
経鼻投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
腹腔内投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍内投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
静脈内投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
筋肉内投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
皮下投与に適する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、癌を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、前記対象における癌を治療または予防する方法。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、癌転移を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、前記対象における癌転移を治療または予防する方法。
【請求項３０】
前記対象に有効量の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗癌剤が、アビラテロン酢酸エステル、アビトレキサート（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ−ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ−Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブベドチン）、ＡＤＥ、アドトラスツズマブエムタンシン、アドリアマイシン（塩酸ドキソルビシン）、アドルシル（フルオロウラシル）、ジマレイン酸アファチニブ、アフィニトール（エベロリムス）、アキンゼオ（ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩）、アルダラ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、アロキシ（パロノセトロン塩酸塩）、アンボクロリン（Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ）（クロラムブシル）、アンボクロリン（Ａｍｂｏｃｌｏｒｉｎ）（クロラムブシル）、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アラノン（ネララビン）、三酸化ヒ素、アーゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンテミ（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、アバスチン（ベバシズマブ）、アキシチニブ、アザシチジン、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベセナム（カルムスチン）、ベレオダク（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベキサール（トシツモマブおよびＩ  １３１ヨウ素トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ブリンサイト（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、ボシュリフ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、ブスルフェクス（ブスルファン）、カバジタキセル、カボザンチニブ‐Ｓ‐リンゴ酸塩、ＣＡＦ、キャンパス（アレムツズマブ）、カンプトサール（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カルボプラチン、カルボプラチン‐タキソール、カルフィルゾミブ、カルムブリス（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント、カソデックス（ビカルタミド）、ＣｅｅＮＵ（ロムスチン）、セリチニブ、セルビジン（ダウノルビシン塩酸塩）、サーバリックス（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル−プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラフェン（シクロホスファミド）、クロファラビン、ＣＭＦ、コメトリク（カボザンチニブ−Ｓ−リンゴ酸塩）、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ−ＡＢＶ、コスメゲン（ダクチノマイシン）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、サイフォス（イホスファミド）、サイラムザ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビン、リポソーマル、シトサール‐Ｕ（シタラビン）、シトキサン（シクロホスファミド）、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダコゲン（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デポサイト（リポソーマルシタラビン）、デポフォーム（リポソーマルシタラビン）、デクスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ‐ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、エフデックス（フルオロウラシル）、エリテック（ラスブリカーゼ）、エレンス（エピルビシン塩酸塩）、エロキサチン（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、イメンド（アプレピタント）、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（セツキシマブ）、メシル酸エリブリン、エリベッジ（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、エルウィナーゼ（アスパラギナーゼエルウィニアクリサンテミ）、エトポホス（リン酸エトポシド）、エトポシド、リン酸エトポシド、エバセット（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、エビスタ（ラロキシフェン塩酸塩）、エキセメスタン、フェアストン（トレミフェン）、ファリーダック（パノビノスタット）、ファスロデックス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマラ（レトロゾール）、フィルグラスチム、フルダラ（リン酸フルダラビン）、リン酸フルダラビン、フルオロプレックス（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、フォレックス（メトトレキサート）、フォレックスＰＦＳ（メトトレキサート）、フォルフィリ、フォルフィリ‐ベバシズマブ、フォルフィリ−セツキシマブ、フォルフィリノックス、フォルフロックス、フォロチン（プララトレキサート）、ＦＵ‐ＬＶ、フルベストラント、ガーダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ガーダシル９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、ガジバ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン−シスプラチン、ゲムシタビン−オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、ジオトリフ（ジマレイン酸アファチニブ）、グリベック（イマチニブメシル酸塩）、ギリアデル（カルムスチンインプラント）、ギリアデルウエハー（カルムスチンインプラント）、グルカルピダーゼ、酢酸ゴセレリン、ハラベン（メシル酸エリブリン）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、組換えＨＰＶ二価ワクチン、組換えＨＰＶ九価ワクチン、組換えＨＰＶ四価ワクチン、ハイカムチン（塩酸トポテカン）、Ｈｙｐｅｒ‐ＣＶＡＤ、イブランス（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、アイクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、イダマイシン（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、イフェックス（イホスファミド）、イホスファミド、イホスファミダム（イホスファミド）、メシル酸イマチニブ、イムブルビカ（イブルチニブ）、イミキモド、インライタ（アキシチニブ）、イントロンＡ（組換えインターフェロンα−２ｂ）、ヨウ素１３１トシツモマブおよびトシツモマブ、イピリムマブ、イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イストダックス（ロミデプシン）、イクサベピロン、イグゼンプラ（イクサベピロン）、ジャカフィ（リン酸ルキソリチニブ）、ジェブタナ（カバジタキセル）、カドサイラ（アドトラスツズマブエムタンシン）、ケオキシフェン（ラロキシフェン塩酸塩）、ケピバンス（パリフェルミン）、キイトルーダ（ペムブロリズマブ）、カイプロリス（カルフ���ルゾミブ）、酢酸ランレオチド、二トシル酸ラパチニブ、レナリドマイド、メシル酸レンバチニブ、レンビマ（メシル酸レンバチニブ）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイケラン（クロラムブシル）、酢酸ロイプロリド、レブラン（アミノレブリン酸）、リンフォリジン（クロラムブシル）、リポドックス（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、リポソーマルシタラビン、ロムスチン、ルプロン（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ−Ｐｅｄ（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ３ヶ月製剤（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ４ヶ月製剤（酢酸ロイプロリド）、リムパーザ（オラパリブ）、マルキボ（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、マチュレーン（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲース（酢酸メゲストロール）、酢酸メゲストロール、メキニスト（トラメチニブ）、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（メスナ）、メタゾラストン（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メキサート（メトトレキサート）、メキサート‐ＡＱ（メトトレキサート）、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、ミトザイトレックス（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサフォル）、ムスタルゲン（メクロレタミン塩酸塩）、ムタマイシン（マイトマイシンＣ）、ミレラン（ブスルファン）、マイロサール（アザシチジン）、マイロターグ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネララビン、ネオサール（シクロホスファミド）、ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ネクサバール（ソラフェニブトシル酸塩）、ニロチニブ、ニボルマブ、ノルバデックス（タモキシフェンクエン酸塩）、Ｎプレート（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オマセタキシンメペサクシネート、オンキャスパー（ペグアスパルガーゼ）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、オプジーボ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、パラプラット（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ペグアスパルガーゼ、ペグインターフェロンα‐２ｂ、ＰＥＧ‐イントロン（ペグインターフェロンα‐２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、プラチノール（シスプラチン）、プラチノール‐ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサフォル、ポマリドミド、ポマリスト（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン（アルデスロイキン）、プロリア（デノスマブ）、プロマクタ（エルトロンボパグオラミン）、プロベンジ（シプロイセルＴ）、プリネトール（メルカプトプリン）、プリキサン（メルカプトプリン）、二塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ‐ＣＨＯＰ、Ｒ‐ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンα‐２ｂ、レゴラフェニブ、Ｒ‐ＥＰＯＣＨ、レブリミド（レナリドミド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リツキサン（リツキシマブ）、リツキシマブ、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、ルキソリチニブリン酸塩、スクレロゾール胸膜内エアロゾル（タルク）、シルツキシマブ、シプロイセルＴ、ソマチュリンデポ（ランレオチド酢酸塩）、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル（ダサチニブ）、スタンフォードＶ、滅菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（タルク）、スチバーガ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（スニチニブリンゴ酸塩）、シラトロン（ペグインターフェロンα‐２ｂ）、シルバント（シルツキシマブ）、シノビール（サリドマイド）、シンリボ（オマセタキシンメペサクシネート）、ＴＡＣ、タフィンラー（ダブラフェニブ）、タルク、タモキシフェンクエン酸塩、タラビンＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テモダール（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、チオテパ、トポサール（エトポシド）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル（テムシロリムス）、トシツモマブおよびＩ１３１ヨウ素トシツモマブ、トテクト（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレアンダ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリセノックス（三酸化ヒ素）、タイケルブ（二トシル酸ラパチニブ）、ユニツキシン（ジヌツキシマブ）、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、ベクチビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ベルサール（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、ベペシド（エトポシド）、ビアデュール（酢酸ロイプロリド）、ビダーザ（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、ビンカサールＰＦＳ（ビンクリスチンサルフェート）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸
塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデギブ、ボラクサーゼ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ヴォトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、ウェルコボリン（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、エクスジバ（デノスマブ）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ザルトラップ（Ｚｉｖ‐アフリベルセプト）、ゼルボラフ（ベムラフェニブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブチウキセタン）、ザインカード（デクスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ‐アフリベルセプト、ゾラデックス（酢酸ゴセレリン）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、ザイデリグ（イデラリシブ）、ジカディア（セリチニブ）、またはザイティガ（酢酸アビラテロン）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象において腫瘍細胞を阻害または低減する方法。
【請求項３３】
前記腫瘍細胞の数が、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象においてＣＤ３を発現する細胞によるサイトカインの産生を増加させる方法。
【請求項３５】
Ｔ細胞を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させることを含む、前記Ｔ細胞におけるＩＬ−２、ＣＤ６９、および／またはＩＦＮ−γの産生または濃度を増加させる方法。
【請求項３６】
ＩＦＮ−γ産生が、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％増加する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＩＦＮ−γ濃度が、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約６０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約７０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約８０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約９０００ｐｇ／ｍｌ、または少なくとも約１００００ｐｇ／ｍｌ増加する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＤ６９産生が、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％増加する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象における免疫応答を刺激する方法。
【請求項４０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象における癌細胞に対するＴ細胞媒介性細胞傷害性免疫応答を刺激する方法。
【請求項４１】
Ｔ細胞を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させることを含む、Ｔ細胞増殖を増加させる方法。
【請求項４２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象の腫瘍における制御性Ｔ細胞の数を減少または枯渇させる方法。
【請求項４３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定することを含む、前記対象における癌または癌転移の予測、診断、または予後判定のための方法。
【請求項４４】
（ｉ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定または定量化すること、および（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記発現レベルを対照値または参照値と比較することを含み、ここで、前記対照値または参照値に対するＭＯＳＰＤ２の発現レベルの増加が、癌、癌を発症する高いリスク、または癌の予後不良を示す、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定することを含む、前記対象における腫瘍進行または腫瘍浸潤性の予測、診断、または予後判定のための方法。
【請求項４６】
（ｉ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定または定量化すること、および（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記発現レベルを対照値または参照値と比較することを含み、ここで、前記対照値または参照値に対するＭＯＳＰＤ２の発現レベルの増加が、腫瘍進行または腫瘍浸潤性の予後不良を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
以下の工程：
前記試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを定量化するように実験室に指示すること；
実験室から前記試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルの報告を得ること；および／または
治療有効量のＭＯＳＰＤ２の阻害剤を前記対象に投与すること
の１つ以上をさらに含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料が、前記対象からの組織生検、腫瘍生検、または血液試料である、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記対照値または参照値が、正常組織または正常隣接組織（ＮＡＴ）におけるＭＯＳＰＤ２の発現レベルである、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記対照値または参照値が、検出可能なＭＯＳＰＤ２発現がないか、または有意なＭＯＳＰＤ２発現がないことである、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ＭＯＳＰＤ２発現腫瘍を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、前記対象におけるＭＯＳＰＤ２発現腫瘍を治療または予防する方法。
【請求項５２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ＭＯＳＰＤ２発現腫瘍関連マクロファージを有する腫瘍を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、前記対象におけるＭＯＳＰＤ２発現腫瘍関連マクロファージを有する腫瘍を治療または予防する方法。
【請求項５３】
（ｉ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）使用説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願と共に電子出願された配列表（名称：３１８２０８９ＰＣ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：３４，５９７バイト；作成日：２０１９年３月１２日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、運動精子ドメイン含有タンパク質２（ＭＯＳＰＤ２）およびＴ細胞特異的またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片、それを含む医薬組成物およびキット、ならびにそれを作製し、使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＭＯＳＰＤ２は、５１８アミノ酸長の高度に保存されたタンパク質であり、ヒトとマウスの間で９０％の相同性がある。バイオインフォマティクス解析から、ＭＯＳＰＤ２は、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）およびＴＲＩＯタンパク質にちなんで名付けられたＣＲＡＬ−ＴＲＩＯ領域を含むことが示されている。ＭＯＳＰＤ２はまた、線虫の主要な精子タンパク質に構造的に関連する領域および１つの膜貫通領域を含む。
【０００４】
ＭＯＳＰＤ２は、炎症を起こした組織に浸潤した単球および様々な種類の腫瘍に発現する（特許文献１）。ＭＯＳＰＤ２は癌細胞の転移に関連し、単球の遊走を促進する（特許文献１）。したがって、ＭＯＳＰＤ２の阻害（例えば抗ＭＯＳＰＤ２抗体による）は、炎症性疾患および障害（特許文献２）ならびに癌および癌転移（特許文献１）の治療として記載されている。
【０００５】
抗体は、腫瘍を認識し、攻撃するためにＴ細胞を活性化するのに使用されてきた。例えば、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体に対する抗体は、Ｔ細胞を活性化すると報告されている。非特許文献１。さらに、腫瘍細胞上の抗原とＴＣＲ／ＣＤ３複合体の両方を認識する二重特異性抗体は、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞を介した腫瘍細胞の溶解を引き起こすことが報告されている。非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５。ＭＯＳＰＤ２に対する二重特異性抗体が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１７／０２１８５７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１７／０２１８５５号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３７５８−３７６７（１９８６）
【非特許文献２】Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４６１１−４６１５（１９８７）
【非特許文献３】Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ９：２５７−２６０（１９８８）
【非特許文献４】Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：６２８−６３１（１９８５）
【非特許文献５】Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：３５４−３５６（１９８５）
【発明の概要】
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）運動精子ドメイン含有タンパク質２（ＭＯＳＰＤ２）に対する１つ以上の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に対する１つ以上の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片に関する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子は、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ９５である。いくつかの実施形態では、ＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ断片、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、または軽鎖ＣＤＲ３である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子はＣＤ３であり、ＣＤ３に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ断片、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、または軽鎖ＣＤＲ３である。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下の抗原結合ドメインの１つ以上を含む：
【０００９】
（ｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
【００１０】
（ｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域。
【００１１】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下の抗原結合ドメインの１つ以上を含む：
【００１２】
（ｉ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
【００１３】
（ｉｉ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域。
【００１４】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下の抗原結合ドメインを含む：
【００１５】
（ｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；
【００１６】
（ｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域；
【００１７】
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
【００１８】
（ｉｖ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域。
【００１９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、Ｎ末端からＣ末端への順序で以下の抗原結合ドメインを含む：
【００２０】
（ｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；
【００２１】
（ｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域；
【００２２】
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
【００２３】
（ｉｖ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域。
【００２４】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインの１つ以上は、ペプチドリンカー（１つ）によって連結されている。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインの１つ以上は、ペプチドリンカー（複数）によって連結されている。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインのすべてが、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２５】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ヒトまたはヒト化である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、一本鎖ポリペプチドである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、約６０，０００ダルトン以下の分子量を有する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ナノボディ、ダイアボディ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、デュオボディ、二価抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）、トリプルボディ、ミニ抗体、ＴｒｉＢｉミニボディ、イントラボディ、またはクアドローマである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）でＭＯＳＰＤ２および／またはＣＤ３に特異的に結合する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくは抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、配列番号１に従って番号付けされた、ＭＯＳＰＤ２の以下のアミノ酸領域の１つ以上に特異的に結合する：約５０５〜約５１５、約５００〜約５１５、約２３０〜約２４０、約５１０〜約５２０、約２１０〜約２２０、約１５〜約２５、約５０５〜約５２０、約５０５〜約５１５、約９０〜約１００、約５０５〜約５２５、約２３０〜約２４５、約５０５〜約５１０、約１３０〜約１４０、約２２０〜約２３０、約１５〜約３０、約８０〜約９５、約４０〜約５０、約４６０〜約４７５、約３４０〜約３５０、約５００〜約５１５、約４６０〜約４７０、約３２５〜約３３５、約２０〜約３５、約２１５〜約２２５、約５１０〜約５２０、約１７５〜約１９０、約５００〜約５１０、約５０５〜約５３０、約６０〜約７５、約５００〜約５２０、約１４５〜約１６０、約５０２〜約５１５、約８５〜約１００、約２０５〜約２２０、約１７５〜約１９０、約５００〜約５０５、約５００〜約５２５、約４９５〜約５０５、約４９５〜約５１０、約１９０〜約２００、約１９０〜約１９８、約５０２〜約５１５、約１〜約６０、約８０〜約２４０、約９０〜約２３５、約３３０〜約４４５、約３３０〜約４３０、約４９５〜約５１５、約１４５〜約２４０、約１４５〜約２２０、約１４５〜約２００、約１６０〜約２４０、約１６０〜約２２０、約１６０〜約２００、約１７５〜約２４０、約１７５〜約２２０、約１７５〜約２００、約１７０〜約１９０、約１７８〜約１８５、約８５〜約１４０、約８５〜約１３０、約９０〜約１４０、約９０〜約１３０、約９５〜約１４０、約９５〜約１３０、約１００〜約１３０、約１００〜約１４０、約１１０〜約１３０、または約１１５〜約１２７。
【００３１】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくは抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、配列番号１〜４の１つ以上、もしくはその機能的変異体、または配列番号５〜８の１つ以上によってコードされるポリペプチド、もしくはその機能的変異体に特異的に結合する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくは抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、約１０−６Ｍ〜約１０−１２ＭのＫＤでＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身または局所投与に適する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経鼻、経口、腹腔内、または腫瘍内投与に適する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与に適する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を、癌を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象における癌を治療または予防する方法に関する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を、癌転移を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象における癌転移を治療または予防する方法に関する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、方法は、対象に有効量の抗癌剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗癌剤は、アビラテロン酢酸エステル、アビトレキサート（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ−ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ−Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブベドチン）、ＡＤＥ、アドトラスツズマブエムタンシン、アドリアマイシン（塩酸ドキソルビシン）、アドルシル（フルオロウラシル）、ジマレイン酸アファチニブ、アフィニトール（エベロリムス）、アキンゼオ（ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩）、アルダラ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、アロキシ（パロノセトロン塩酸塩）、アンボクロリン（Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ）（クロラムブシル）、アンボクロリン（Ａｍｂｏｃｌｏｒｉｎ）（クロラムブシル）、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アラノン（ネララビン）、三酸化ヒ素、アーゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンテミ（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、アバスチン（ベバシズマブ）、アキシチニブ、アザシチジン、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベセナム（カルムスチン）、ベレオダク（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベキサール（トシツモマブおよびＩ  １３１ヨウ素トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ブリンサイト（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、ボシュリフ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、ブスルフェクス（ブスルファン）、カバジタキセル、カボザンチニブ‐Ｓ‐リンゴ酸塩、ＣＡＦ、キャンパス（アレムツズマブ）、カンプトサール（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カルボプラチン、カルボプラチン‐タキソール、カルフィルゾミブ、カルムブリス（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント、カソデックス（ビカルタミド）、ＣｅｅＮＵ（ロムスチン）、セリチニブ、セルビジン（ダウノルビシン塩酸塩）、サーバリックス（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル−プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラフェン（シクロホスファミド）、クロファラビン、ＣＭＦ、コメトリク（カボザンチニブ−Ｓ−リンゴ酸塩）、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ−ＡＢＶ、コスメゲン（ダクチノマイシン）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、サイフォス（イホスファミド）、サイラムザ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビン、リポソーマル、シトサール‐Ｕ（シタラビン）、シトキサン（シクロホスファミド）、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダコゲン（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デポサイト（リポソーマルシタラビン）、デポフォーム（リポソーマルシタラビン）、デクスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ‐ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、エフデックス（フルオロウラシル）、エリテック（ラスブリカーゼ）、エレンス（エピルビシン塩酸塩）、エロキサチン（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、イメンド（アプレピタント）、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（セツキシマブ）、メシル酸エリブリン、エリベッジ（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、エルウィナーゼ（アスパラギナーゼエルウィニアクリサンテミ）、エトポホス（リン酸エトポシド）、エトポシド、リン酸エトポシド、エバセット（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、エビスタ（ラロキシフェン塩酸塩）、エキセメスタン、フェアストン（トレミフェン）、ファリーダック（パノビノスタット）、ファスロデックス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマラ（レトロゾール）、フィルグラスチム、フルダラ（リン酸フルダラビン）、リン酸フルダラビン、フルオロプレックス（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、フォレックス（メトトレキサート）、フォレックスＰＦＳ（メトトレキサート）、フォルフィリ、フォルフィリ‐ベバシズマブ、フォルフィリ−セツキシマブ、フォルフィリノックス、フォルフロックス、フォロチン（プララトレキサート）、ＦＵ‐ＬＶ、フルベストラント、ガーダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ガーダシル９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、ガジバ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン−シスプラチン、ゲムシタビン−オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、ジオトリフ（ジマレイン酸アファチニブ）、グリベック（イマチニブメシル酸塩）、ギリアデル（カルムスチンインプラント）、ギリアデルウエハー（カルムスチンインプラント）、グルカルピダーゼ、酢酸ゴセレリン、ハラベン（メシル酸エリブリン）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、組換えＨＰＶ二価ワクチン、組換えＨＰＶ九価ワクチン、組換えＨＰＶ四価ワクチン、ハイカムチン（塩酸トポテカン）、Ｈｙｐｅｒ‐ＣＶＡＤ、イブランス（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、アイクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、イダマイシン（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、イフェックス（イホスファミド）、イホスファミド、イホスファミダム（イホスファミド）、メシル酸イマチニブ、イムブルビカ（イブルチニブ）、イミキモド、インライタ（アキシチニブ）、イントロンＡ（組換えインターフェロンα−２ｂ）、ヨウ素１３１トシツモマブおよびトシツモマブ、イピリムマブ、イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イストダックス（ロミデプシン）、イクサベピロン、イグゼンプラ（イクサベピロン）、ジャカフィ（リン酸ルキソリチニブ）、ジェブタナ（カバジタキセル）、カドサイラ（アドトラスツズマブエムタンシン）、ケオキシフェン（ラロキシ���ェン塩酸塩）、ケピバンス（パリフェルミン）、キイトルーダ（ペムブロリズマブ）、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、酢酸ランレオチド、二トシル酸ラパチニブ、レナリドマイド、メシル酸レンバチニブ、レンビマ（メシル酸レンバチニブ）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイケラン（クロラムブシル）、酢酸ロイプロリド、レブラン（アミノレブリン酸）、リンフォリジン（クロラムブシル）、リポドックス（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、リポソーマルシタラビン、ロムスチン、ルプロン（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ−Ｐｅｄ（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ３ヶ月製剤（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ４ヶ月製剤（酢酸ロイプロリド）、リムパーザ（オラパリブ）、マルキボ（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、マチュレーン（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲース（酢酸メゲストロール）、酢酸メゲストロール、メキニスト（トラメチニブ）、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（メスナ）、メタゾラストン（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メキサート（メトトレキサート）、メキサート‐ＡＱ（メトトレキサート）、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、ミトザイトレックス（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサフォル）、ムスタルゲン（メクロレタミン塩酸塩）、ムタマイシン（マイトマイシンＣ）、ミレラン（ブスルファン）、マイロサール（アザシチジン）、マイロターグ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネララビン、ネオサール（シクロホスファミド）、ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ネクサバール（ソラフェニブトシル酸塩）、ニロチニブ、ニボルマブ、ノルバデックス（タモキシフェンクエン酸塩）、Ｎプレート（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オマセタキシンメペサクシネート、オンキャスパー（ペグアスパルガーゼ）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、オプジーボ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、パラプラット（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ペグアスパルガーゼ、ペグインターフェロンα‐２ｂ、ＰＥＧ‐イントロン（ペグインターフェロンα‐２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、プラチノール（シスプラチン）、プラチノール‐ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサフォル、ポマリドミド、ポマリスト（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン（アルデスロイキン）、プロリア（デノスマブ）、プロマクタ（エルトロンボパグオラミン）、プロベンジ（シプロイセルＴ）、プリネトール（メルカプトプリン）、プリキサン（メルカプトプリン）、二塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ‐ＣＨＯＰ、Ｒ‐ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンα‐２ｂ、レゴラフェニブ、Ｒ‐ＥＰＯＣＨ、レブリミド（レナリドミド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リツキサン（リツキシマブ）、リツキシマブ、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、ルキソリチニブリン酸塩、スクレロゾール胸膜内エアロゾル（タルク）、シルツキシマブ、シプロイセルＴ、ソマチュリンデポ（ランレオチド酢酸塩）、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル（ダサチニブ）、スタンフォードＶ、滅菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（タルク）、スチバーガ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（スニチニブリンゴ酸塩）、シラトロン（ペグインターフェロンα‐２ｂ）、シルバント（シルツキシマブ）、シノビール（サリドマイド）、シンリボ（オマセタキシンメペサクシネート）、ＴＡＣ、タフィンラー（ダブラフェニブ）、タルク、タモキシフェンクエン酸塩、タラビンＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テモダール（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、チオテパ、トポサール（エトポシド）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル（テムシロリムス）、トシツモマブおよびＩ１３１ヨウ素トシツモマブ、トテクト（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレアンダ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリセノックス（三酸化ヒ素）、タイケルブ（二トシル酸ラパチニブ）、ユニツキシン（ジヌツキシマブ）、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、ベクチビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ベルサール（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、ベペシド（エトポシド）、ビアデュール（酢酸ロイプロリド）、ビダーザ（アザシチジン）、ビンブラスチ
ン硫酸塩、ビンカサールＰＦＳ（ビンクリスチンサルフェート）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデギブ、ボラクサーゼ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ヴォトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、ウェルコボリン（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、エクスジバ（デノスマブ）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ザルトラップ（Ｚｉｖ‐アフリベルセプト）、ゼルボラフ（ベムラフェニブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブチウキセタン）、ザインカード（デクスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ‐アフリベルセプト、ゾラデックス（酢酸ゴセレリン）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、ザイデリグ（イデラリシブ）、ジカディア（セリチニブ）、ザイティガ（酢酸アビラテロン）、またはそれらの組み合わせである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくは抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象において腫瘍細胞を阻害または低減する方法に関する。この方法のいくつかの実施形態では、腫瘍細胞の数は、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象においてＣＤ３を発現する細胞によるサイトカインの産生を増加させる方法に関する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ‐２、ＣＤ６９、および／またはＩＦＮ‐γの産生または濃度を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−γ産生は、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−γ濃度は、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約６０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約７０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約８０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約９０００ｐｇ／ｍｌ、または少なくとも約１００００ｐｇ／ｍｌ増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ６９産生は、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％増加する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法に関する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における癌細胞に対するＴ細胞媒介性細胞傷害性免疫応答を刺激する方法に関する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む、Ｔ細胞増殖を増加させる方法に関する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の腫瘍における制御性Ｔ細胞の数を減少または枯渇させる方法に関する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定することを含む、対象における癌または癌転移の予測、診断、または予後判定のための方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定または定量化すること、および（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた発現レベルを対照値または参照値と比較することを含み、ここで、対照値または参照値に対するＭＯＳＰＤ２の発現レベルの増加は、癌、癌を発症する高いリスク、または癌の予後不良を示す。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定することを含む、対象における腫瘍進行または腫瘍浸潤性の予測、診断、または予後判定のための方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定または定量化すること、および（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた発現レベルを対照値または参照値と比較することを含み、ここで、対照値または参照値に対するＭＯＳＰＤ２の発現レベルの増加は、腫瘍進行または腫瘍浸潤性の予後不良を示す。
【００４８】
いくつかの実施形態では、予測、診断、または予後判定のための方法は、以下の工程の１つ以上をさらに含む：
【００４９】
試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを定量化するように実験室に指示すること；
【００５０】
実験室から試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルの報告を得ること；および／または
【００５１】
治療有効量のＭＯＳＰＤ２の阻害剤（例えば抗ＭＯＳＰＤ２抗体）を対象に投与すること。
【００５２】
いくつかの実施形態では、予測、診断、または予後判定のための方法における試料は、対象からの組織生検、腫瘍生検、または血液試料である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、予測、診断、または予後判定のための方法における対照値または参照値は、正常組織または正常隣接組織（ＮＡＴ）におけるＭＯＳＰＤ２の発現レベルである。いくつかの実施形態では、予測、診断、または予後判定のための方法における対照値または参照値は、検出可能なＭＯＳＰＤ２発現または有意なＭＯＳＰＤ２発現がないことである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を、ＭＯＳＰＤ２発現腫瘍を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるＭＯＳＰＤ２発現腫瘍を治療または予防する方法に関する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を、ＭＯＳＰＤ２発現腫瘍関連マクロファージを有する腫瘍を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるＭＯＳＰＤ２発現腫瘍関連マクロファージを有する腫瘍を治療または予防する方法に関する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の核酸または本明細書に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、および（ｉｉ）発現された二重特異性抗体またはその抗原結合断片を収集し、精製することを含む、本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を生産する方法に関する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）使用説明書を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態を、例としてのみ、添付の図面を参照して本明細書で説明する。ここで詳細な図面に関して特に、示されている詳細は例としてのものであり、本発明の実施形態の例示的な考察を目的とすることが強調される。
【図１】図１は、ＭＯＳＰＤ２が転移性乳癌および黒色腫細胞の遊走を促進することを示す。ＭＤＡ−２３１乳癌およびＡ２０５８黒色腫細胞におけるＭＯＳＰＤ２発現を、ｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子で細胞を形質導入することによってサイレンシングした。図１のウエスタンブロットは、ｓｈ−ＭＯＳＰＤ２で形質導入された細胞がＭＯＳＰＤ２タンパク質発現を減少させたことを示す。図１はまた、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およびＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）に向かうトランスウェル遊走アッセイにおいて、ｓｈ‐対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子で形質導入された細胞の遊走試験結果も示す。
【図２】図２は、ＭＯＳＰＤ２のサイレンシングがＭＤＡ−２３１細胞の細胞生存率または増殖に影響を及ぼさないことを示す。ｓｈ−対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子で形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞を播種し、収集し、２４時間ごとに３日間連続して計数した。細胞増殖率を測定し、３回の平均±標準偏差として図２に表示した。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ＭＯＳＰＤ２をサイレンシングした場合またはしなかった場合のＭＤＡ−２３１細胞の転移のインビボ試験結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａでは、ｓｈ−対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子で形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞をＳＣＩＤマウス（ｎ＝１０／群）の尾静脈に注射した（１０６）。２８日目にマウスを犠死させ、Ｈ＆Ｅ染色のために肺を採取し、腫瘍面積を決定した。図３Ａに示す結果は、測定された転移サイズの平均±標準誤差として表している（＊ｐ＜０．０５）。    （図３Ｂおよび３Ｃ）図３Ｂおよび３Ｃでは、ｓｈ−対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子（それぞれｎ＝１３およびｎ＝８）で形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞をＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に注射した（５×１０６）。５６日目にマウスを犠死させた。同側の鼠径リンパ節を切除し（図３Ｂ）、Ｈ＆Ｅ染色のために肺を採取し、腫瘍面積を決定した（図３Ｃ）。図３Ｃに示す結果は、測定された転移サイズの平均±標準誤差として表している。ｓｈ‐対照形質導入細胞の腫瘍面積は、ｓｈ−ＭＯＳＰＤ２形質導入細胞の５５０．０±３２６．２（ｎ＝８）と比較して、１３７６．９±７５２．６（ｎ＝１３）である。    （図３Ａ〜３Ｃ）図３Ａ〜３Ｃは、ＭＯＳＰＤ２がインビボでＭＤＡ−２３１乳癌細胞の転移を促進することを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、様々なヒト癌組織におけるＭＯＳＰＤ２発現レベルと、それらのそれぞれの正常組織対応物のレベルとの比較を示す。様々な正常および癌性ヒト組織を含むスライドを、対照または抗ＭＯＳＰＤ２抗体で染色した。ＭＯＳＰＤ２で陽性に染色された癌組織を示す。図４Ａ〜４Ｅは、ＭＯＳＰＤ２が様々なヒト癌組織で発現されることを示す。    （図５Ａおよび５Ｂ）図５Ａおよび５Ｂは、トランスウェル遊走アッセイで試験した、対照またはＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９レンチウイルス粒子で形質導入された癌細胞の結果を示す。細胞を上部区画に播種し、１０％ＦＣＳおよびＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地を使用して下部区画に誘引した。図５Ａに示すグラフは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定し、結果を３回の平均±標準偏差として表している。図５Ｂに示す画像は、視覚的記録からのものである。図５Ａおよび５Ｂでは、ＭＤＡ−２３１細胞を、対照またはＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを含有するプラスミドを有するレンチウイルス粒子で形質導入した。ウエスタンブロットは、ＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システム（差し込み図）で形質導入された細胞におけるＭＯＳＰＤ２タンパク質発現の低下を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９で駆動されるＭＯＳＰＤ２遺伝子編集が乳癌細胞の遊走を阻害することを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、細胞遊走に関連するリン酸化事象に対するＭＯＳＰＤ２サイレンシングの効果を示す。対照またはＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９レンチウイルス粒子で形質導入されたＭＤＡ−２３１を、１０％ＦＣＳおよびＥＧＦ（４００ｎｇ／ｍｌ）と共に１０分間インキュベートした。ＥＲＫ、ＡＫＴ、およびＦＡＫのリン酸化を、ウエスタンブロットを使用して決定した。ＨＳＰ９０を負荷対照として使用した。図５Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９で駆動される遺伝子編集によるＭＯＳＰＤ２サイレンシングが、細胞遊走に関連するリン酸化事象を阻害することを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、対照またはＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９レンチウイルス粒子で形質導入されたＭＤＡ−２３１乳癌細胞の転移のインビボ試験結果を示す。図５Ｄでは、１０６の対照またはＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９レンチウイルスで形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞を、８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｓｒａｅｌ）の尾静脈に注射した。３週間後にマウスを犠死させ、組織病理学的検査のために肺を切除した。図５Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムによるＭＯＳＰＤ２のサイレンシングが、肺における転移性乳癌細胞の存在を９５％超（転移面積）有意に阻害することを示す。Ｐ＝０．００２。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂがＡ２０５８黒色腫およびＨｅｐＧ２肝癌細胞株上のＭＯＳＰＤ２に結合することを示す。
【図７】図７は、抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂが、ＭＤＡ−２３１細胞のＥＧＦ誘導性トランスウェル遊走を有意に阻害したことを示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、異なる病理学的段階由来、または腫瘍に隣接する正常組織（正常隣接組織；ＮＡＴ）由来のヒト乳癌試料の組織学的画像を示す。試料をスライドに封入し、抗ＭＯＳＰＤ２抗体で染色した。図８Ａ〜８Ｆは、ＭＯＳＰＤ２の発現が、原極性腫瘍から浸潤性および転移性腫瘍への乳癌細胞の移行と関連していたことを示す。
【図９】図９は、乳癌または正常隣接組織（ＮＡＴ）の異なる段階由来の試料におけるＭＯＳＰＤ２発現強度のスコアリング（０〜３のスケールで、０は発現なし、３は非常に高い発現）を示す（＊ｐ＜０．００１）。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、結腸（図１０Ａ〜１０Ｂ）または肝臓（図１０Ｃ〜１０Ｄ）から収集された様々な正常および癌性ヒト組織におけるＭＯＳＰＤ２発現レベルを比較する画像を示す。ＭＯＳＰＤ２は、結腸腺癌の６７％および肝細胞癌試料の４５％で発現したが、正常な結腸および肝臓組織では発現は検出されなかった。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、ヒト肝臓から収集された異なるグレードの正常組織、ＮＡＴおよび癌性組織におけるＭＯＳＰＤ２発現レベルの比較を示す。試料をスライドに封入し、抗ＭＯＳＰＤ２抗体で染色した。図１１Ｃ〜１１Ｅは、肝細胞癌の腫瘍グレードが増加するにつれて、ＭＯＳＰＤ２染色強度が増加したことを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、肝細胞癌から収集された試料におけるＭＯＳＰＤ２発現強度を示す。試料をスライドに封入し、抗ＭＯＳＰＤ２抗体で染色した。
【図１２Ａ】図１２Ａは、正常およびＮＡＴ試料と比較して、悪性肝細胞癌から収集された試料においてＭＯＳＰＤ２発現が有意に増加した（ｐ≦０．００１）ことを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＭＯＳＰＤ２染色強度が肝細胞癌の進行と相関して有意に増加したことを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、漸増濃度の抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｉＴＥ）の投与が、固形腫瘍由来細胞株の生存率の用量依存的減少およびＴ細胞活性化の増加をもたらすことを示す。＊＝Ｐ＜０．０１。    （図１３Ｂおよび１３Ｃ）図１３Ｂおよび１３Ｃは、漸増濃度のＢｉＴＥの投与が、それぞれＨＥＬＡおよびＡ２０５８培養物に添加されたＣＤ８エフェクタＴ細胞からのＩＦＮ−γ放出の用量依存的増加ももたらすことを示す。Ｎ．Ｄ＝検出されず。
【図１４Ａ】図１４Ａは、抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｉＴＥ）の投与が、単球細胞株の生存率の減少およびＴ細胞活性化の増加をもたらすことを示す。＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＴＨＰ−１およびＵ９３７培養物に添加されたＴ細胞のＣＤ３およびＣＤ６９の染色を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＢｉＴＥの投与が、ＴＨＰ−１およびＵ９３７培養物に添加されたＴ細胞からのＩＦＮ−γ放出の増加ももたらすことを示す。Ｎ．Ｄ＝検出されず。
【図１５】図１５は、抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与が、ＭＤＡ−２３１乳癌細胞の生存率の有意な減少をもたらすことを示す。事前に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、それぞれ５：１の比率のＭＤＡ−２３１細胞、および対照抗体（ＩｇＧ）または抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（二重特異性Ａｂ１〜二重特異性Ａｂ４）と共インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、細胞を収集し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用して計数した。示されている結果は、各処理の平均細胞数±３つのウェルからの標準誤差である。＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示される詳細に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実行もしくは実施することができる。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明を目的とするものであり、限定と見なされるべきではないことが理解されるべきである。
一般的定義
【００６０】
「含む」、「含むこと」、「含有する」、「含有すること」、「有すること」という用語、およびそれらの複合語は、「含むが限定されない」ことを意味する。
【００６１】
「からなる」という用語は、「含み、および限定される」ことを意味する。
【００６２】
「から本質的になる」という用語は、組成物の指定された材料、または方法の指定された工程、および前記材料または方法の基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない追加の材料または工程を意味する。
【００６３】
「例示的」という語は、本明細書では、「例、事例、または実例としての役割を果たす」ことを意味するために使用される。「例示的」と記載される実施形態は、他の実施形態よりも好ましいもしくは有利であると必ずしも解釈されるべきではなく、および／または他の実施形態からの特徴の組み込みを必ずしも排除しない。
【００６４】
本明細書では、「任意で」という用語は、「一部の実施形態では提供され、他の実施形態では提供されない」ことを意味するために使用される。本発明の特定の実施形態は、複数の「任意の」特徴を、そのような特徴が矛盾しない限り、含むことができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの」、および「その」は、文脈で特に明白に指示されない限り、複数への言及を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、本発明に関連する量を修飾する「約」という用語は、例えば、日常的な試験および取り扱いを通じて、そのような試験および取り扱いでの故意ではない誤りを通じて、本発明で使用される成分の製造、原料、または純度の差異を通じてなどで起こり得る数量の変動を指す。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、請求項は、列挙される量の等価物を含む。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内を意味する。別の実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の５％以内を意味する。
【００６７】
この出願全体を通じて、本発明の様々な実施形態を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学、医療分野の当業者に公知であるかまたは当業者によって公知の方法、手段、技法および手順から容易に開発される方法、手段、技法および手順を含むがこれらに限定されない、所与のタスクを達成するための方法、手段、技法および手順を指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態の進行を抑止する、実質的に阻害する、遅らせるもしくは逆転させる、状態の臨床症状もしくは審美的症状を実質的に改善する、または状態の臨床症状もしくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ＭＯＳＰＤ２」は、運動精子ドメイン含有タンパク質２として分類されるまたは等価の機能を有する任意のポリペプチドを指す。ＭＯＳＰＤ２の例としては、配列番号１〜４のいずれか１つのポリペプチド、またはその機能的変異体（例えば配列番号１〜４のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を有する）が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＯＳＰＤ２の他の例としては、配列番号５〜８のいずれか１つのポリヌクレオチド、またはその機能的変異体（例えば配列番号５〜８のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のポリヌクレオチド）によってコードされるポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。ＭＯＳＰＤ２の他の例としては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０１７１００９号に開示されている脂質関連分子（「ＬＩＰＡＭ」）が挙げられる。ＬＩＰＡＭ−５は、アミノ酸残基４８２がアルギニンの代わりにセリンであることを除いて、配列番号１と１００％同一である。ＭＯＳＰＤ２の他の例は、当業者に周知のように、公的データベース（例えばＢＬＡＳＴ）を検索することによって同定することができる。
【００７１】
本明細書に記載の実施形態のいずれでも、ＭＯＳＰＤ２は、癌細胞、例えばヒト癌細胞によって発現されるＭＯＳＰＤ２であり得る。また、本明細書に記載の実施形態のいずれでも、ＭＯＳＰＤ２は、哺乳動物ＭＯＳＰＤ２またはヒトＭＯＳＰＤ２であり得る。
【００７２】
「抗体」または抗体の「抗原結合断片」としては、ポリクローナル、モノクローナル、マウス、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一方鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）または重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、ならびにＦａｂ発現ライブラリによって作製された断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体または抗体の抗原結合断片は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。抗体の抗原結合断片を作製する方法は公知であり、例えば抗体の化学的またはプロテアーゼ消化が含まれる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」は、抗原に特異的に結合する抗体またはその断片のポリペプチド領域である。抗原結合ドメインの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ断片、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、または軽鎖ＣＤＲ３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子」は、Ｔ細胞特異的受容体もしくはＮＫ細胞特異的受容体に特異的に結合する、または別の分子、化合物もしくはペプチドに、Ｔ細胞特異的受容体もしくはＮＫ細胞特異的受容体に特異的に結合するように指令する任意の分子、化合物またはペプチドを指す。例としては、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ９５が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
「特異的に結合する」とは、一般に、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体がその抗原結合ドメインによってエピトープに結合すること、およびその結合が抗原結合ドメインとエピトープの間に何かしらの相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してあるエピトープに結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合」すると言われる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、抗体が特異的に結合することができる抗原の局在領域を指す。エピトープは、例えばポリペプチドの連続アミノ酸であり得る（線状または隣接エピトープ）か、またはエピトープは、例えば１つまたは複数のポリペプチドの２つ以上の非隣接領域が一緒になり得る（立体配座、非線状、不連続、または非隣接エピトープ）。特定の実施形態では、抗体が結合するエピトープは、文献および本明細書に記載の方法、例えばＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶構造解析、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析（例えばＭＡＬＤＩ質量分析）と組み合わせた水素／重水素交換、アレイに基づくオリゴペプチドスキャニングアッセイ、および／または変異誘発マッピング（例えば部位特異的変異誘発マッピング）によって決定することができる。
【００７７】
「同一性パーセント」という用語は、当技術分野で公知のように、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当技術分野では、「同一性」および「配列同一性」は、場合によって、そのような一続きの配列間の一致によって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、以下に記載されているものを含むがこれらに限定されない、公知の方法および公的に利用可能なリソースによって容易に計算することができる：（１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；（２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；（３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；（４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および（５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）。
【００７８】
明確にするために別個の実施形態の文脈で記載されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態に組み合わせて提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴はまた、別々に、または任意の適切な小組み合わせで、または本発明の他の記載されている実施形態で適切に提供され得る。様々な実施形態の文脈で記載される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
二重特異性抗体およびその抗原結合断片
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＭＯＳＰＤ２およびＴ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片に関連する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）ＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に対する１つ以上の抗原結合ドメインを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＭＯＳＰＤ２は、配列番号１〜４のいずれか１つのポリペプチド、またはその機能的変異体（例えば配列番号１〜４のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を有する）である。他の実施形態では、ＭＯＳＰＤ２は、配列番号５〜８のいずれか１つのポリヌクレオチド、またはその機能的変異体（例えば配列番号５〜８のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を有するポリヌクレオチド）によってコードされるポリペプチドである。他の実施形態では、ＭＯＳＰＤ２は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０１７１００９号に開示されている脂質関連分子（「ＬＩＰＡＭ」）である。ＬＩＰＡＭ−５は、アミノ酸残基４８２がアルギニンの代わりにセリンであることを除いて、配列番号１と１００％同一である。他の例示的なＭＯＳＰＤ２は、当業者に周知のように、公的データベース（例えばＢＬＡＳＴ）を検索することによって同定することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子は、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ９５である。他の例示的なＴ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子は、当業者に周知のように、公的データベース（例えばＢＬＡＳＴ）を検索することによって同定することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＭＯＳＰＤ２および／またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞特異的受容体分子に対する抗原結合ドメインは、抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ断片、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、または軽鎖ＣＤＲ３である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下の抗原結合ドメインの１つ以上を含む：
【００８４】
（ｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
【００８５】
（ｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域。
【００８６】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下の抗原結合ドメインの１つ以上を含む：
【００８７】
（ｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片）の重鎖可変領域；および
【００８８】
（ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片）の軽鎖可変領域。
【００８９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下の抗原結合ドメインを含む：
【００９０】
（ｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；
【００９１】
（ｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域；
【００９２】
（ｉｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片）の重鎖可変領域；および
【００９３】
（ｉｖ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片）の軽鎖可変領域。
【００９４】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体または抗原結合断片は、Ｎ末端からＣ末端への順序で以下の抗原結合ドメインを含む：
【００９５】
（ｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；
【００９６】
（ｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域；
【００９７】
（ｉｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片）の重鎖可変領域；および
【００９８】
（ｉｖ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片）の軽鎖可変領域。
【００９９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体または抗原結合断片は、Ｎ末端からＣ末端への順序で以下の抗原結合ドメインを含む：
【０１００】
（ｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片）の重鎖可変領域；
【０１０１】
（ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片）の軽鎖可変領域；
【０１０２】
（ｉｉｉ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域；および
【０１０３】
（ｉｖ）抗ＭＯＳＰＤ２抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインの１つ以上は、ペプチドリンカー（１つ）によって連結されている。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインのすべてが、ペプチドリンカーによって連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さ（例えば約５アミノ酸〜約４０アミノ酸、約５アミノ酸〜約３０アミノ酸、約５アミノ酸〜約２０アミノ酸、約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さ）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、または約５０アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、セリン（Ｓ）およびグリシン（Ｇ）残基、またはアラニン（Ａ）およびグリシン残基からなる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＳＧＧＧＧ）ｎ、または（ＧＧＧＧＧＧＧＧ）ｎであり、ここで、ｎは約１〜約１０の整数である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体または抗原結合断片の少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ヒトまたはヒト化である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、一本鎖ポリペプチドである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、約６０，０００ダルトン以下の分子量を有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ナノボディ、ダイアボディ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、デュオボディ、二価抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）、トリプルボディ、ミニ抗体、ＴｒｉＢｉミニボディ、イントラボディ、またはクアドローマである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、配列番号１〜４の１つ以上、もしくはその機能的変異体、または配列番号５〜８の１つ以上、もしくはその機能的変異体によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）でＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、約１０−６Ｍ〜約１０−１２ＭのＫＤでＴ細胞もしくはＮＫ細胞特異的受容体分子（例えばＣＤ３）および／またはＣＤ３に特異的に結合する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍ、またはその任意の範囲の値（例えば約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−８Ｍ、または約１０−７Ｍ〜約１０−８）のＫＤでＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、約１０−６Ｍ、約１０−７Ｍ、約１０−８Ｍ、約１０−９Ｍ、約１０−１０Ｍ、約１０−１１Ｍ、または約１０−１２ＭのＫＤでＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、ＭＯＳＰＤ２上の１つ以上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＤは、いくつかの実施形態では３７℃で、スキャッチャード分析、表面プラズモン共鳴によって決定される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、約１０３１／Ｍｓ〜約１０６１／Ｍｓ、またはその任意の範囲の値（例えば約１０３１／Ｍｓ〜約１０５１／Ｍｓ、約１０４１／Ｍｓ〜約１０５１／Ｍｓ、約１０４１／Ｍｓ〜約１０６１／Ｍｓ、約１０５１／Ｍｓ〜約１０６１／Ｍｓ、または約１０３１／Ｍｓ〜約１０４１／Ｍｓ）のＫｏｎでＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する。他の実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、約１０３１／Ｍｓ、約１０４１／Ｍｓ、約１０５１／Ｍｓ、または約１０６１／ＭｓのＫｏｎを有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、約１０−３１／ｓ〜約１０−６１／ｓ、またはその任意の範囲の値（例えば約１０−３１／ｓ〜約１０−５１／ｓ、約１０−４１／ｓ〜約１０−５１／ｓ、約１０−４１／ｓ〜約１０−６１／ｓ、約１０−５１／ｓ〜約１０−６１／ｓ、または約１０−３１／ｓ〜約１０−４１／ｓ）のＫｏｆｆでＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する。他の実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、約１０−３１／ｓ、約１０−４１／ｓ、約１０−５１／ｓ、または約１０−６１／ｓのＫｏｆｆを有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、配列番号１に従って番号付けされた、ＭＯＳＰＤ２の以下のアミノ酸領域の１つ以上に特異的に結合する：約５０５〜約５１５、約５００〜約５１５、約２３０〜約２４０、約５１０〜約５２０、約２１０〜約２２０、約１５〜約２５、約５０５〜約５２０、約５０５〜約５１５、約９０〜約１００、約５０５〜約５２５、約２３０〜約２４５、約５０５〜約５１０、約１３０〜約１４０、約２２０〜約２３０、約１５〜約３０、約８０〜約９５、約４０〜約５０、約４６０〜約４７５、約３４０〜約３５０、約５００〜約５１５、約４６０〜約４７０、約３２５〜約３３５、約２０〜約３５、約２１５〜約２２５、約５１０〜約５２０、約１７５〜約１９０、約５００〜約５１０、約５０５〜約５３０、約６０〜約７５、約５００〜約５２０、約１４５〜約１６０、約５０２〜約５１５、約８５〜約１００、約２０５〜約２２０、約１７５〜約１９０、約５００〜約５０５、約５００〜約５２５、約４９５〜約５０５、約４９５〜約５１０、約１９０〜約２００、約１９０〜約１９８、約５０２〜約５１５、約１〜約６０、約８０〜約２４０、約９０〜約２３５、約３３０〜約４４５、約３３０〜約４３０、約４９５〜約５１５、約１４５〜約２４０、約１４５〜約２２０、約１４５〜約２００、約１６０〜約２４０、約１６０〜約２２０、約１６０〜約２００、約１７５〜約２４０、約１７５〜約２２０、約１７５〜約２００、約１７０〜約１９０、約１７８〜約１８５、約８５〜約１４０、約８５〜約１３０、約９０〜約１４０、約９０〜約１３０、約９５〜約１４０、約９５〜約１３０、約１００〜約１３０、約１００〜約１４０、約１１０〜約１３０、または約１１５〜約１２７。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、またはＭＯＳＰＤ２に対する１つ以上の抗原結合ドメインは、配列番号１に従って番号付けされた、ＭＯＳＰＤ２の以下のアミノ酸領域の１つ以上に特異的に結合する：約５０８〜約５１７、約５０１〜約５１４、約２３３〜約２４１、約５０９〜約５１７、約２１２〜約２２１、約１３〜約２４、約５０５〜約５１７、約５０５〜約５１４、約８９〜約１００、約５０６〜約５１７、約２３３〜約２４５、約５０４〜約５１４、約１２８〜約１３６、約２１８〜約２２６、約１５〜約２４、約８３〜約９６、約４２〜約５０、約４６２〜約４７４、約３４０〜約３５１、約５０４〜約５１７、約４６２〜約４７０、約３２７〜約３３７、約２１〜約３２、約２１７〜約２２６、約５１０〜約５１７、約１７８〜約１９０、約４９７〜約５０９、約５０４〜約５１６、約６４〜約７７、約５０４〜約５１５、約１４７〜約１５９、約５０３〜約５１５、約８８〜約９７、約２０８〜約２１８、約１７８〜約１９１、約５０２〜約５１５、約５０３〜約５１６、約４９７〜約５０５、約５００〜約５０９、約１８９〜約２０２、約１８９〜約１９７、約５０５〜約５１６、約１〜約６３、約８２〜約２３９、約９３〜約２３４、約３２７〜約４４５、約３２７〜約４３１、および約４９７〜約５１７。
【０１１８】
本発明の二重特異性抗体で使用することができる、ＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する抗体は、文献、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０２１８５５号および国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されている。
【０１１９】
本発明の二重特異性抗体で使用することができる、Ｔ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子（例えばＣＤ３）に特異的に結合する抗体は、文献、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１１２，３２４号、同第７，２６２，２７６号、同第７，６３５，４７２号、同第９，２４９，２１７号、および同第９，６７６，８５８号に記載されている。
【０１２０】
さらに、ＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する抗体および抗原結合ドメインならびにＴ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する抗体および抗原結合ドメインを使用して、本発明の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を得る方法も、文献、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１１２，３２４号、同第７，２６２，２７６号、同第７，６３５，４７２号、同第９，２４９，２１７号、および同第９，６７６，８５８号に記載されている。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
医薬組成物およびキット
【０１２３】
本発明の他の実施形態は、ＭＯＳＰＤ２およびＴ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される二重特異性抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む。「薬学的に許容される担体」という用語は、賦形剤、潤滑剤、緩衝剤、抗菌剤、増量剤（例えばマンニトール）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）、希釈剤、アジュバント、ビヒクルなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身、局所、経鼻、経口、腹腔内、腫瘍内、非経口、経粘膜、直腸、口腔、吸入、静脈内、筋肉内、または皮下投与に適する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＳＰＤ２およびＴ細胞またはＮＫ細胞特異的受容体分子に特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片の治療有効量、例えば約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、またはそれらの任意の範囲の値（例えば約２μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌ、または約１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ）を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌである。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、またはそれらの任意の範囲の値（例えば約１５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ）である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、または約４０ｍｇ／ｋｇである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体もしくは抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）使用説明書を含むキットに関する。いくつかの実施形態では、説明書における使用は、本明細書に記載されている使用方法の１つ以上である。
使用および生産の方法
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を、癌を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象における癌を治療または予防する方法に関する。二重特異性抗体またはその抗原結合断片の有効量は、本明細書の他の部分に記載されている。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を、癌転移を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象における癌転移を治療または予防する方法に関する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかの癌は、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌、皮膚癌、造血器癌、舌癌、間葉起源の癌、中枢もしくは末梢神経系の癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、または悪性腹水である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、肺癌は、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、皮膚癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、黒色腫、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、角化棘細胞腫、紡錘細胞腫瘍、脂腺癌、微小嚢胞性付属器癌、乳房のパジェット病、異型線維黄色腫、平滑筋肉腫、または血管肉腫である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、造血器癌は、リンパ系の造血器癌である。いくつかの実施形態では、リンパ系の造血器癌は、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、またはバーキットリンパ腫である。いくつかの実施形態では、造血器癌は、骨髄細胞系列の造血器癌である。いくつかの実施形態では、骨髄細胞系列の造血器癌は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、または前骨髄球性白血病である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、間葉起源の癌は、線維肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、または骨肉腫である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、中枢または末梢神経系の癌は、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、または神経鞘腫である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、癌は、肛門癌、骨癌、消化管間質癌、妊娠性絨毛性疾患、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、角化棘細胞腫、悪性中皮腫、多中心性キャッスルマン病、多発性骨髄腫および他の形質細胞新生物、骨髄増殖性腫瘍、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌、陰茎癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、セミノーマ、軟部組織肉腫、胃癌、精巣癌、奇形癌、甲状腺濾胞癌、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍および他の小児腎癌、または色素性乾皮症である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、癌または癌転移を治療または予防する方法は、対象に有効量の抗癌剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗癌剤は、アビラテロン酢酸エステル、アビトレキサート（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ−ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ−Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブベドチン）、ＡＤＥ、アドトラスツズマブエムタンシン、アドリアマイシン（塩酸ドキソルビシン）、アドルシル（フルオロウラシル）、ジマレイン酸アファチニブ、アフィニトール（エベロリムス）、アキンゼオ（ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩）、アルダラ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、アロキシ（パロノセトロン塩酸塩）、アンボクロリン（Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ）（クロラムブシル）、アンボクロリン（Ａｍｂｏｃｌｏｒｉｎ）（クロラムブシル）、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アラノン（ネララビン）、三酸化ヒ素、アーゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンテミ（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、アバスチン（ベバシズマブ）、アキシチニブ、アザシチジン、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベセナム（カルムスチン）、ベレオダク（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベキサール（トシツモマブおよびＩ  １３１ヨウ素トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ブリンサイト（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、ボシュリフ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、ブスルフェクス（ブスルファン）、カバジタキセル、カボザンチニブ‐Ｓ‐リンゴ酸塩、ＣＡＦ、キャンパス（アレムツズマブ）、カンプトサール（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カルボプラチン、カルボプラチン‐タキソール、カルフィルゾミブ、カルムブリス（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント、カソデックス（ビカルタミド）、ＣｅｅＮＵ（ロムスチン）、セリチニブ、セルビジン（ダウノルビシン塩酸塩）、サーバリックス（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル−プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラフェン（シクロホスファミド）、クロファラビン、ＣＭＦ、コメトリク（カボザンチニブ−Ｓ−リンゴ酸塩）、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ−ＡＢＶ、コスメゲン（ダクチノマイシン）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、サイフォス（イホスファミド）、サイラムザ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビン、リポソーマル、シトサール‐Ｕ（シタラビン）、シトキサン（シクロホスファミド）、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダコゲン（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デポサイト（リポソーマルシタラビン）、デポフォーム（リポソーマルシタラビン）、デクスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ‐ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、エフデックス（フルオロウラシル）、エリテック（ラスブリカーゼ）、エレンス（エピルビシン塩酸塩）、エロキサチン（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、イメンド（アプレピタント）、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（セツキシマブ）、メシル酸エリブリン、エリベッジ（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、エルウィナーゼ（アスパラギナーゼエルウィニアクリサンテミ）、エトポホス（リン酸エトポシド）、エトポシド、リン酸エトポシド、エバセット（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、エビスタ（ラロキシフェン塩酸塩）、エキセメスタン、フェアストン（トレミフェン）、ファリーダック（パノビノスタット）、ファスロデックス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマラ（レトロゾール）、フィルグラスチム、フルダラ（リン酸フルダラビン）、リン酸フルダラビン、フルオロプレックス（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、フォレックス（メトトレキサート）、フォレックスＰＦＳ（メトトレキサート）、フォルフィリ、フォルフィリ‐ベバシズマブ、フォルフィリ−セツキシマブ、フォルフィリノックス、フォルフロックス、フォロチン（プララトレキサート）、ＦＵ‐ＬＶ、フルベストラント、ガーダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ガーダシル９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、ガジバ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン−シスプラチン、ゲムシタビン−オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、ジオトリフ（ジマレイン酸アファチニブ）、グリベック（イマチニブメシル酸塩）、ギリアデル（カルムスチンインプラント）、ギリアデルウエハー（カルムスチンインプラント）、グルカルピダーゼ、酢酸ゴセレリン、ハラベン（メシル酸エリブリン）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、組換えＨＰＶ二価ワクチン、組換えＨＰＶ九価ワクチン、組換えＨＰＶ四価ワクチン、ハイカムチン（塩酸トポテカン）、Ｈｙｐｅｒ‐ＣＶＡＤ、イブランス（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、アイクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、イダマイシン（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、イフェックス（イホスファミド）、イホスファミド、イホスファミダム（イホスファミド）、メシル酸イマチニブ、イムブルビカ（イブルチニブ）、イミキモド、インライタ（アキシチニブ）、イントロンＡ（組換えインターフェロンα−２ｂ）、ヨウ素１３１トシツモマブおよびトシツモマブ、イピリムマブ、イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イストダックス（ロミデプシン）、イクサベピロン、イグゼンプラ（イクサベピロン）、ジャカフィ（リン酸ルキソリチニブ）、ジェブタナ（カバジタキセル）、カドサイラ（アドトラスツズマブエムタ���シン）、ケオキシフェン（ラロキシフェン塩酸塩）、ケピバンス（パリフェルミン）、キイトルーダ（ペムブロリズマブ）、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、酢酸ランレオチド、二トシル酸ラパチニブ、レナリドマイド、メシル酸レンバチニブ、レンビマ（メシル酸レンバチニブ）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイケラン（クロラムブシル）、酢酸ロイプロリド、レブラン（アミノレブリン酸）、リンフォリジン（クロラムブシル）、リポドックス（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、リポソーマルシタラビン、ロムスチン、ルプロン（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ−Ｐｅｄ（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ３ヶ月製剤（酢酸ロイプロリド）、ルプロンデポ４ヶ月製剤（酢酸ロイプロリド）、リムパーザ（オラパリブ）、マルキボ（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、マチュレーン（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲース（酢酸メゲストロール）、酢酸メゲストロール、メキニスト（トラメチニブ）、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（メスナ）、メタゾラストン（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メキサート（メトトレキサート）、メキサート‐ＡＱ（メトトレキサート）、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、ミトザイトレックス（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサフォル）、ムスタルゲン（メクロレタミン塩酸塩）、ムタマイシン（マイトマイシンＣ）、ミレラン（ブスルファン）、マイロサール（アザシチジン）、マイロターグ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネララビン、ネオサール（シクロホスファミド）、ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ネクサバール（ソラフェニブトシル酸塩）、ニロチニブ、ニボルマブ、ノルバデックス（タモキシフェンクエン酸塩）、Ｎプレート（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オマセタキシンメペサクシネート、オンキャスパー（ペグアスパルガーゼ）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、オプジーボ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、パラプラット（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ペグアスパルガーゼ、ペグインターフェロンα‐２ｂ、ＰＥＧ‐イントロン（ペグインターフェロンα‐２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、プラチノール（シスプラチン）、プラチノール‐ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサフォル、ポマリドミド、ポマリスト（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン（アルデスロイキン）、プロリア（デノスマブ）、プロマクタ（エルトロンボパグオラミン）、プロベンジ（シプロイセルＴ）、プリネトール（メルカプトプリン）、プリキサン（メルカプトプリン）、二塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ‐ＣＨＯＰ、Ｒ‐ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンα‐２ｂ、レゴラフェニブ、Ｒ‐ＥＰＯＣＨ、レブリミド（レナリドミド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リツキサン（リツキシマブ）、リツキシマブ、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、ルキソリチニブリン酸塩、スクレロゾール胸膜内エアロゾル（タルク）、シルツキシマブ、シプロイセルＴ、ソマチュリンデポ（ランレオチド酢酸塩）、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル（ダサチニブ）、スタンフォードＶ、滅菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（タルク）、スチバーガ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（スニチニブリンゴ酸塩）、シラトロン（ペグインターフェロンα‐２ｂ）、シルバント（シルツキシマブ）、シノビール（サリドマイド）、シンリボ（オマセタキシンメペサクシネート）、ＴＡＣ、タフィンラー（ダブラフェニブ）、タルク、タモキシフェンクエン酸塩、タラビンＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テモダール（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、チオテパ、トポサール（エトポシド）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル（テムシロリムス）、トシツモマブおよびＩ１３１ヨウ素トシツモマブ、トテクト（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレアンダ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリセノックス（三酸化ヒ素）、タイケルブ（二トシル酸ラパチニブ）、ユニツキシン（ジヌツキシマブ）、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、ベクチビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ベルサール（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、ベペシド（エトポシド）、ビアデュール（酢酸ロイプロリド）、ビダ
ーザ（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、ビンカサールＰＦＳ（ビンクリスチンサルフェート）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデギブ、ボラクサーゼ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ヴォトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、ウェルコボリン（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、エクスジバ（デノスマブ）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ザルトラップ（Ｚｉｖ‐アフリベルセプト）、ゼルボラフ（ベムラフェニブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブチウキセタン）、ザインカード（デクスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ‐アフリベルセプト、ゾラデックス（酢酸ゴセレリン）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、ザイデリグ（イデラリシブ）、ジカディア（セリチニブ）、ザイティガ（酢酸アビラテロン）、またはそれらの組み合わせである。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象において腫瘍細胞を阻害または低減する方法に関する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の数は、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象においてＣＤ３を発現する細胞によるサイトカインの産生を増加させる方法に関する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ‐２、ＣＤ６９、および／またはＩＦＮ‐γの産生または濃度を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−γ産生は、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−γ濃度は、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約６０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約７０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約８０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約９０００ｐｇ／ｍｌ、または少なくとも約１００００ｐｇ／ｍｌ増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ６９産生は、対照値または参照値と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％増加する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法に関する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における癌細胞に対するＴ細胞媒介性細胞傷害性免疫応答を刺激する方法に関する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む、Ｔ細胞増殖を増加させる方法に関する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の腫瘍における制御性Ｔ細胞の数を減少または枯渇させる方法に関する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定することを含む、対象における癌または癌転移の予測、診断、または予後判定のための方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定または定量化すること、および（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた発現レベルを対照値または参照値と比較することを含み、ここで、対照値または参照値に対するＭＯＳＰＤ２の発現レベルの増加は、癌、癌を発症する高いリスク、または癌の予後不良を示す。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定することを含む、対象における腫瘍進行または腫瘍浸潤性の予測、診断、または予後判定のための方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象の試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを決定または定量化すること、および（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた発現レベルを対照値または参照値と比較することを含み、ここで、対照値または参照値に対するＭＯＳＰＤ２の発現レベルの増加は、腫瘍進行または腫瘍浸潤性の予後不良を示す。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、予測、診断、または予後判定のための方法は、以下の工程の１つ以上をさらに含む：
【０１５１】
試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルを定量化するように実験室に指示すること；
【０１５２】
実験室から試料中のＭＯＳＰＤ２の発現レベルの報告を得ること；および／または
【０１５３】
治療有効量のＭＯＳＰＤ２の阻害剤を対象に投与すること。
【０１５４】
予測、診断、または予後判定のための方法のいくつかの実施形態では、試料は、対象からの組織生検、腫瘍生検、または血液試料である。
【０１５５】
予測、診断、または予後判定のための方法のいくつかの実施形態では、対照値または参照値は、正常組織または正常隣接組織（ＮＡＴ）におけるＭＯＳＰＤ２の発現レベルである。
【０１５６】
予測、診断、または予後判定のための方法のいくつかの実施形態では、対照値または参照値は、検出可能なＭＯＳＰＤ２発現がないか、または有意なＭＯＳＰＤ２発現がないことである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を、ＭＯＳＰＤ２発現腫瘍を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるＭＯＳＰＤ２発現腫瘍を治療または予防する方法に関する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書に記載の医薬組成物を、ＭＯＳＰＤ２発現腫瘍関連マクロファージを有する腫瘍を治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるＭＯＳＰＤ２発現腫瘍関連マクロファージを有する腫瘍を治療または予防する方法に関する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかの対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかの対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかの対象は、獣医動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシまたはヤギ）である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸または発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、および発現された二重特異性抗体またはその抗原結合断片を収集し、精製することを含む、本明細書に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片を生産する方法に関する。
実施例
【０１６１】
ここで、上記の説明と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で例示する、以下の実施例を参照する。
材料および方法
ＭＯＳＰＤ２サイレンシング
【０１６２】
ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（以下、ＭＤＡ−２３１）（ＨＴＢ−２６）およびヒト悪性黒色腫細胞株Ａ２０５８（ＣＲＬ−１１１４７）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。細胞（２ｍｌ中２×１０６）を１５ｍｌチューブに入れた。対照の短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＡ）（２ｘ１０５ウイルス粒子）またはヒトＭＯＳＰＤ２  ｓｈ−ＲＮＡ（２ｘ１０６ウイルス粒子）を発現するレンチウイルス粒子を細胞に適用し、次いでこれらを８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）の存在下に室温で、２０００ｒｐｍで６０分間遠心した。次に、細胞を６ウェルプレートに播種した。７２時間後、形質導入された細胞の選択のために、ピューロマイシンを含む新鮮な培地（４μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）を添加した。ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９を介したサイレンシングのために、ＭＤＡ−２３１細胞を、上述したようにＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９非標的対照またはＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９ヒトＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子で形質導入した。形質導入された細胞で単一細胞のクローニングを行い、ＭＯＳＰＤ２タンパク質の発現がサイレンシングされ、遊走が阻害された細胞を単離した。
ウエスタンブロット法
【０１６３】
ｓｈ‐対照もしくはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルスで形質導入されたＡ２０５８もしくはＭＤＡ−２３１細胞、または対照もしくはＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９レンチウイルス粒子で形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞（１０６）を洗浄し、１：１００のジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する溶解緩衝液に再懸濁した。試料をプレキャストＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）に充填し、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットを、トリス緩衝生理食塩水中の５％乳またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＴｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）で１時間ブロックし、続いて一次および二次抗体と共にインキュベートした。ＥＣＬキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して膜を現像した。以下の抗体を免疫ブロット法のために使用した：
【０１６４】
一次抗体：Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｇｅｎｉｃｓ  Ｌｔｄ．によって生成されたウサギ抗ＭＯＳＰＤ２（１：５０００）。ホスホ細胞外調節キナーゼ（ｐ−ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ１８３およびＴｙｒ１８５、１：４０００）をＳｉｇｍａ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３、１：１０００）をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。ホスホ−ＦＡＫ（１：２０００）をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０（１：１０００）をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から購入した。
【０１６５】
二次抗体：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ロバ抗ウサギ（１：５０００）およびＨＲＰヤギ抗マウス（１：５０００）抗体をＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。
Ｑ−ＰＣＲ
【０１６６】
サイレンシングの有効性を判定するために、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＶａｌｅｎＶＢａ，ＣＡ）を使用して、ｓｈ‐対照およびｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルスで形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞からＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの調製のために、２μｇのＲＮＡをｑＳｃｒｉｐｔ反応ミックスおよびｑＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と組み合わせた。反応物をサーマルサイクラ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に入れ、製造者の指示に従って実行プログラムを設定した。ヒトＭＯＳＰＤ２のためのプライマセット、ＲＮＡレベルを正規化するための２８Ｓ（ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｐｅｔａｌｕｍａ，ＣＡ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）でリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
免疫組織化学染色
【０１６７】
癌組織におけるＭＯＳＰＤ２の発現レベルを評価するために、乳癌（Ｔ０８８ＢおよびＢＲ２０２８ａ）、肝臓癌（ＢＣ０３１１６ａ）、および多臓器腫瘍（ＭＣ６１６３）のＢｉｏｍａｘアレイ（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、ウサギ抗ＭＯＳＰＤ２抗体または対照ウサギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＡＢ−１０５−Ｃ）で染色し、続いて抗ウサギＨＲＰ（カタログ番号０３９９  ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共にインキュベートした。
実施例１
ＭＯＳＰＤ２と転移性細胞株の遊走
【０１６８】
癌細胞の遊走におけるＭＯＳＰＤ２の役割を評価するために、Ａ２０５８黒色腫およびＭＤＡ−２３１乳癌の２つの転移性細胞株におけるＭＯＳＰＤ２の発現を、国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されているようにｓｈ−対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子を使用してサイレンシングした。
【０１６９】
詳細には、あらかじめ０．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０中で３時間飢餓状態にしたｓｈ−対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２で形質導入されたＡ２０５８もしくはＭＤＡ−２３１細胞（３ｘ１０５）を、ＱＣＭ  ２４ウェル、５μｍ細孔の遊走アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の上部チャンバに播種し、続いて、下部チャンバで１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０およびＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｓｒａｅｌ）の存在下に２４時間インキュベートした。その後、下部区画に遊走した細胞をクリスタルバイオレットで染色した後、画像を撮影した。
【０１７０】
図１は、ｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子がタンパク質発現を大幅に減少させ、インビトロでの癌細胞遊走を阻害したことを示す。
実施例２
ＭＯＳＰＤ２と細胞増殖
【０１７１】
ＭＯＳＰＤ２サイレンシング後の細胞遊走に対する阻害作用が、増殖などの基本的細胞機能に続発するかどうかを判定するために、国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されているように、ｓｈ‐対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子で形質導入されたＭＤＡ−２３１乳癌細胞を３日間にわたって増殖について試験した。
【０１７２】
具体的には、ｓｈ‐対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス形質導入ＭＤＡ−２３１細胞を６ウェルプレートに播種した（ウェルあたり１０４個）。細胞を、連続３日間、三つ組で２４時間ごとにＦＡＣＳで計数した。
【０１７３】
図２に示すデータは、ＭＯＳＰＤ２がこれらの細胞の増殖に必須ではないことを示しており、特に遊走におけるＭＯＳＰＤ２の調節的役割を示唆する。
実施例３
ＭＯＳＰＤ２と細胞転移
【０１７４】
癌細胞が癌の原発部位を超えて臓器に播種する際のＭＯＳＰＤ２の役割を評価するために、国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されているように、ｓｈ‐対照またはｓｈ‐ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子形質導入ＭＤＡ‐２３１乳癌細胞の肺転移の程度を免疫不全マウスに養子移入した。発生部位が乳房である別のモデルでは、免疫不全マウスに対して、ｓｈ‐対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス粒子形質導入ＭＤＡ−２３１乳癌細胞を乳房脂肪体に接種した。
【０１７５】
病理検査：組織学スライドをヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。ホルマリン固定組織を脱水し、パラフィンに包埋し、厚さ４μｍの切片にした。Ｈ＆Ｅ染色をＬｅｉｃａ染色モジュールで検定した。スライドを９０°Ｃで７分間温め、次いで完全自動化プロトコルに従って処理した。切片を脱ろうし、再水和した後、スライドをギルヘマトキシリンＮｏ．３（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）で７分間染色し、洗浄し、酸性アルコールに浸し、洗浄した。７０％エタノールおよび９６％エタノールに短時間浸した後、スライドをエオシン（Ｓｉｇｍａ）で４分間染色し、９６％エタノールで脱水し、次いで１００％エタノールで１分間ずつ２回脱水した。自動染色機での実施が完了した後、切片をキシレン中で１０秒間透徹し、エンテランで封入した。平均腫瘍面積は、各マウスについて測定された最大肺腫瘍面積を含む。
【０１７６】
全身性：１０６のｓｈ‐対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルスで形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞を、８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｓｒａｅｌ）の尾静脈に注射した。４週間後にマウスを犠死させた。組織病理学的検査のために肺を切除した。図３Ａの結果は、ＭＯＳＰＤ２発現のサイレンシングが肺における転移性乳癌細胞の存在を５０％超（転移面積）、有意に（ｐ＝０．０２３）阻害することを示す。
【０１７７】
同所性：５ｘ１０６のｓｈ‐対照またはｓｈ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルス形質導入ＭＤＡ−２３１細胞を、８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｓｒａｅｌ）の乳房脂肪体に注射した。１０週間後にマウスを犠死させた。同側の鼠径リンパ節と肺を検査のために切除した。肉眼的検査は、ｓｈ−対照細胞を移入されたマウスから切除されたリンパ節の大部分が、ｓｈ−ＭＯＳＰＤ２処理細胞を移入されたマウスからのものよりも圧倒的に大きいことを示した（図３Ｂ）。さらに、ｓｈ−ＭＯＳＰＤ２処理細胞を移入されたマウスの肺で測定された平均転移面積は、対照群と比較して５０％超、減少した（図３Ｃ）。
【０１７８】
材料および方法に記載されているようにＱ−ＰＣＲで測定した場合、ｓｈ−ＭＯＳＰＤ２注入細胞におけるＭＯＳＰＤ２  ｍＲＮＡサイレンシングの割合は約８０％であった。
【０１７９】
これらの結果は、ＭＯＳＰＤ２が乳癌の転移に重要な役割を果たすことを実証する。
実施例４
様々な種類の癌におけるＭＯＳＰＤ２発現
【０１８０】
ＭＯＳＰＤ２発現が細胞の正常から癌性への形質転換に関連するかどうかを判定するために、正常および癌性組織を担持するスライドを、材料および方法の項ならびに国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されているように抗ＭＯＳＰＤ２抗体を使用してスクリーニングした。
【０１８１】
図４Ａは、正常および癌性乳房組織の代表的な染色を示す。正常および癌性乳房組織は対照ＩｇＧ抗体で陰性染色されたが、抗ＭＯＳＰＤ２抗体は癌性組織のみを明確に染色した。同様に、ＭＯＳＰＤ２は、正常な膀胱、脳、結腸、食道、舌、腎臓、および肝臓組織では発現されないが、これらの組織が癌性になると上方制御される（図４Ｂ〜４Ｅ）。これらの結果は、様々な組織において、ＭＯＳＰＤ２の発現が正常組織から癌性組織への形質転換に関連することを示唆する。
実施例５
ＭＯＳＰＤ２遺伝子ノックダウンと癌細胞遊走
【０１８２】
インビトロ：ＭＯＳＰＤ２の持続可能なノックダウンを達成するために、ＭＤＡ−２３１乳癌細胞を、材料および方法の項ならびに国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されているように、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９遺伝子編集システムを含有するレンチウイルス粒子で形質導入した。対照またはＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９レンチウイルス粒子で形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞を、上記の方法で遊走について試験した。対照またはＭＯＳＰＤ２  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９レンチウイルス粒子形質導入ＭＤＡ−２３１細胞（３ｘ１０５）を上部チャンバに播種し、続いて２〜４時間インキュベートした。その後、下部区画に遊走した細胞の数をＦＡＣＳによって測定した。
【０１８３】
図５Ａおよび５Ｂは、ＭＤＡ−２３１癌細胞にＭＯＳＰＤ２用のＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを導入すると、タンパク質発現が消失し、その結果、トランスウェルアッセイで細胞の遊走が大幅に阻害されたことを示す。
【０１８４】
ケモカイン受容体が駆動するシグナル伝達事象に対するＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９によるＭＯＳＰＤ２サイレンシングの効果を試験するために、ＥＲＫ、ＡＫＴ、およびＦＡＫのリン酸化レベルを、材料および方法に記載されているように検討した。遊走アッセイの結果によれば、対照と比較してＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムによるＭＯＳＰＤ２のサイレンシングは、ＥＧＦに曝された細胞でＡＫＴのリン酸化を完全に防止し、ＥＲＫおよびＦＡＫのリン酸化を明確に阻害した（図５Ｃのウエスタンブロット参照）。
【０１８５】
インビボ：１０６のＣＲＩＳＰＲ−対照またはＣＲＩＳＰＲ−ＭＯＳＰＤ２レンチウイルスで形質導入されたＭＤＡ−２３１細胞を、８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｓｒａｅｌ）の尾静脈に注射した。次に、３週間後にマウスを犠死させた。組織病理学的検査のために肺を切除した。図５Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムによるＭＯＳＰＤ２のサイレンシングが、肺における転移性乳癌細胞の存在を９５％超（転移領域）、有意に阻害したことを示す。
実施例６
抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂはヒト乳癌細胞上の内因性ＭＯＳＰＤ２に特異的に結合する
【０１８６】
国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されているように、抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂを作製し、Ａ２０５８黒色腫およびＨｅｐＧ２肝癌細胞株で表面発現された内因性ＭＯＳＰＤ２への結合について試験した。細胞を抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂで染色し、ＭＯＳＰＤ２への結合について試験した。図６Ａ〜６Ｂは、抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂが黒色腫および肝癌細胞上の内因性ＭＯＳＰＤ２に特異的に結合することを示す。
実施例７
抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂはＭＤＡ−２３１癌細胞のＥＧＦ誘導性遊走を阻害する
【０１８７】
ＭＤＡ−２３１癌細胞のＥＧＦ誘導性遊走に対する抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂの効果を、国際公開第２０１７／０２１８５７で説明されているようにトランスウェル遊走で分析した。ＭＤＡ−２３１乳癌細胞（３ｘ１０５）を、０．５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地で４〜５時間飢餓状態にし、次いで抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂと共に１時間インキュベートした。ＥＧＦを溶解し、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地を含むＱＣＭ  ２４ウェル遊走アッセイプレート（８μｍ細孔）（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の下部チャンバに入れた（４００ｎｇ／ｍｌ）。細胞を上部チャンバに播種し、続いて一晩インキュベートした後、下部区画に遊走した細胞の数をＦＡＣＳによって測定した。
【０１８８】
図７に示すように、抗ＭＯＳＰＤ２  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂは、ＭＤＡ−２３１乳癌細胞のＥＧＦ誘導性トランスウェル遊走を有意に阻害した。
実施例８
抗ＭＯＳＰＤ２抗体のエピトープマッピング
【０１８９】
抗ＭＯＳＰＤ２抗体がヒトＭＯＳＰＤ２上で特異的に結合する可能性があるエピトープ（１つまたは複数）を決定するために、本明細書に記載されるように、ストレプトアビジン（ＳＡ）チップにあらかじめ固定化されたＳＡを介してＮ末端ビオチン化ＭＯＳＰＤ２断片を捕捉し、ＭＯＳＰＤ２表面を横切って力価測定した抗ＭＯＳＰＤ２抗体の結合動態を測定することによって（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）、様々なヒトＭＯＳＰＤ２断片への結合親和性を測定する。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイは、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖポリソルベートＰ２０）中で行われる。ＭＯＳＰＤ２表面を、Ｎ−ビオチン化ＭＯＳＰＤ２をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に希釈して０．００１ｍｇ／ｍＬ未満の濃度にし、様々な接触時間を用いてＳＡセンサチップを横切って注入することによって調製する。捕捉レベルが＜５０応答単位（ＲＵ）に対応する低能力表面を高分解能動態試験に使用し、一方高能力表面（約８００ＲＵのＭＯＳＰＤ２捕捉）は、濃度試験、スクリーニング、および溶液親和性の決定に使用する。
【０１９０】
抗体Ｇ１  Ｆａｂを２倍または３倍ずつ段階希釈して、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度（推定ＫＤの０．１〜１０倍を目指す）にすることによって動態データを得る。試料は、典型的には１００μＬ／分で１分間注入し、少なくとも１０分の解離時間とする。各結合サイクル後に、２５％ｖ／ｖエタノール中の２５ｍＭ  ＮａＯＨで表面を再生させ、この表面は数百回のサイクルに耐えられる。全力価測定シリーズ（典型的には２つ組で作製）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して１：１ラングミュア結合モデルに全体的に適合させる。これは、各結合相互作用について、結合と解離の速度定数（それぞれ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）の固有の対をもたらし、その比が平衡解離定数（ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）となる。
【０１９１】
抗ＭＯＳＰＤ２抗体は、配列番号１（アミノ酸残基１〜５１８）に従って番号付けされた、ヒトＭＯＳＰＤ２の以下のアミノ酸領域の１つ以上に特異的に結合し得る：５０８〜５１７、５０１〜５１４、２３３〜２４１、５０９〜５１７、２１２〜２２１、１３〜２４、５０５〜５１７、５０５〜５１４、８９〜１００、５０６〜５１７、２３３〜２４５、５０４〜５１４、１２８〜１３６、２１８〜２２６、１５〜２４、８３〜９６、４２〜５０、４６２〜４７４、３４０〜３５１、５０４〜５１７、４６２〜４７０、３２７〜３３７、２１〜３２、２１７〜２２６、５１０〜５１７、１７８〜１９０、４９７〜５０９、５０４〜５１６、６４〜７７、５０４〜５１５、１４７〜１５９、５０３〜３１５、８８〜９７、２０８〜２１８、１７８〜１９１、５０２〜５１５、５０３〜５１６、４９７〜５０５、５００〜５０９、１８９〜２０２、１８９〜１９７、５０５〜５１６、１〜６３、８２〜２３９、９３〜２３４、３２７〜４４５、３２７〜４３１、４９７〜５１７、１４５〜２４０、１４５〜２２０、１４５〜２００、１６０〜２４０、１６０〜２２０、１６０〜２００、１７５〜２４０、１７５〜２２０、１７５〜２００、１７０〜１９０、１７８〜１８５、８５〜１４０、８５〜１３０、９０〜１４０、９０〜１３０、９５〜１４０、９５〜１３０、１００〜１３０、１００〜１４０、１１０〜１３０、または１１５〜１２７。
実施例９
さらなる抗ＭＯＳＰＤ２抗体
【０１９２】
本明細書または国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されている方法に従って、１つ以上のＭＯＳＰＤ２エピトープを認識するさらなる抗ＭＯＳＰＤ２抗体を作製する。
【０１９３】
簡単に述べると、本明細書または国際公開第２０１７／０２１８５７号でＭＯＳＰＤ２エピトープとして同定されたＭＯＳＰＤ２の部分をヒトＦｃに融合し、固体支持体に固定化する。ファージ粒子上に提示されたＨｕＣＡＬ（登録商標）ライブラリ（ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）プラットフォーム；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＧｍｎＨ）を、固定化された抗原と共にインキュベートする。非特異的抗体を徹底的な洗浄によって除去し、還元剤を添加することによって特異的抗体ファージを溶出する。抗体ＤＮＡをプールとして単離し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターにサブクローニングして、二価Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂを作製する。コロニーを採取し、マイクロタイタプレートで増殖させる。培養物を溶解して抗体分子を放出させ、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって特異的抗原結合についてスクリーニングする。一段階アフィニティクロマトグラフィを使用して固有の抗体を発現させ、精製し、次いで、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって特異性について再度試験する。
実施例１０
ＭＯＳＰＤ２の発現は、様々な種類の癌において腫瘍グレードと相関して増加する
【０１９４】
ＭＯＳＰＤ２の発現が腫瘍の進行と関連するかどうかを判定するために、正常組織および異なる腫瘍グレードの癌性組織を担持するスライドを、国際公開第２０１７／０２１８５７号に記載されているように抗ＭＯＳＰＤ２抗体を使用してスクリーニングした。ＭＯＳＰＤ２の存在量を、０〜３のスケールで染色強度に従ってスコアリングした。単一コア内の不均一染色が観察された場合は、カバー度が最も高い領域のスコアを割り当てた。
【０１９５】
図８Ａ〜８Ｆは、乳癌および対照組織における代表的なＭＯＳＰＤ２染色を示す。正常隣接組織（ＮＡＴ）は陰性対照としての役割を果たし、高くなっていく腫瘍病期には、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、非浸潤性乳管内癌（ＩＤＩＳ）、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）、浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）および転移性浸潤性乳管癌（ＭＩＤＣ）が含まれた。代表的なＮＡＴ、ＬＣＩＳおよびＩＤＩＳ染色はＭＯＳＰＤ２について陰性染色であったが、ＩＤＣ、ＩＬＣおよびＭＩＤＣの代表的な染色は強い陽性ＭＯＳＰＤ２染色を示した。
【０１９６】
図９は、浸潤性および転移性乳癌におけるＭＯＳＰＤ２染色強度の増加を示す。ＮＡＴ内では、試料の１８％（２／１１）のみが１の染色強度を示したが、非浸潤性癌腫試料（ＩＤＩＳ＋ＬＣＩＳ）の２１％（４／１９）は１または２のスコアであった。しかしながら、浸潤性および転移性組織の分析は、ＮＡＴおよび非浸潤性癌（ＩＤＩＳ＋ＬＣＩＳ）と比較して、スコア２の頻度がより高く、染色強度が最大でスコア３に増加することを示した。したがって、ＩＬＣ、ＩＤＣ、およびＭＩＤＣについてのスコア２と３を合わせたパーセントは、それぞれ６３％（１２／１９）、７７％（５０／６５）および８１％（２５／３１）であった。
【０１９７】
ＭＯＳＰＤ２の発現は、結腸および肝組織においても正常から癌性への細胞の形質転換と相関していた。図１０Ａ〜１０Ｄは、試験した結腸癌試料の６７％および肝細胞癌試料の４５％で、陽性ＭＯＳＰＤ２染色があったことを示す。試験した正常結腸または肝臓組織では、ＭＯＳＰＤ２染色は検出されなかった（０％）。
【０１９８】
ＭＯＳＰＤ２発現も悪性度と相関していた。図１１Ａ〜１１Ｅは、腫瘍グレードと共に増加する肝細胞癌における強いＭＯＳＰＤ２染色を示しており、一方正常およびＮＡＴ試料は、ＭＯＳＰＤ２染色について陰性であった。
【０１９９】
図１２Ａ〜１２Ｂは、悪性肝臓組織または対照におけるＭＯＳＰＤ２染色の強度を要約する。ＭＯＳＰＤ２染色強度は、正常試料およびＮＡＴと比較して、悪性試料ではそれぞれ３．２倍または４倍、有意に増加した（ｐ≦０．００１）。図１２Ｂは、肝細胞癌の異なる病期におけるＭＯＳＰＤ２染色強度の増加を示す。
実施例１１
抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、固形腫瘍由来の細胞を死滅させ、Ｔ細胞を活性化する
【０２００】
黒色腫（Ａ２０５８）および子宮頸（Ｈｅｌａ）癌細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地の４８ウェルプレート（４ｘ１０４細胞／ウェル）に一晩播種した。１日後、ヒトＴ細胞活性化／増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＧｍｂＨカタログ番号１３０−０９１−４４１）でプライミングしたＣＤ８エフェクタＴ細胞を、１０：１（エフェクタ細胞：Ｔ細胞）の比率で、図１３Ａに示す濃度の抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｉＴＥ）の存在下または非存在下で７２時間、プレートに添加した。次に上清と細胞を収集し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、試験するまで凍結保存した。
【０２０１】
上清を、ＤｕｏｓｅｔヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＹ−２８５）を使用して、ＩＦＮ−γ分泌について酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。癌細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％）で分離し、１０％ＦＣＳを含有するＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋０．０２％ナトリウムアジド）に再懸濁した。各試料を２分間ＦＡＣＳにかけて、生細胞の数を評価した。試料は三つ組みで実施した。
【０２０２】
図１３Ａは、漸増濃度の抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｉＴＥ）の投与が、固形腫瘍由来細胞株の生存率の用量依存的減少をもたらすことを示す。結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。＊＝Ｐ＜０．０１。
【０２０３】
上清を、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌についても分析した。試料は２つ組で実施した。
【０２０４】
（図１３Ｂおよび１３Ｃ）図１３Ｂおよび１３Ｃは、漸増濃度のＢｉＴＥの投与が、それぞれＨＥＬＡおよびＡ２０５８培養物に添加されたＣＤ８エフェクタＴ細胞からのＩＦＮ−γ放出の用量依存的増加ももたらすことを示す。Ｎ．Ｄ＝検出されず。結果を３つの試料の平均±ＳＤとして示す。
【０２０５】
したがって、ＢｉＴＥの存在下では、Ｔ細胞は活性化され、ＩＦＮ−γの分泌によって証明され、用量依存的に腫瘍細胞死を媒介した。
実施例１２
抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は骨髄由来の癌細胞を死滅させ、Ｔ細胞を活性化する
【０２０６】
ＴＨＰ−１およびＵ９３７骨髄由来癌細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地の４８ウェルプレート（４ｘ１０４細胞／ウェル）に一晩播種した。ヒトパンＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＧｍｂＨカタログ番号１３０−０９６−５３５）を使用して、採取直後の血液試料からＴ細胞を単離した。１０μｇ／ｍｌの抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｉＴＥ）の存在下または非存在下で、Ｔ細胞を１０：１（エフェクタ細胞：Ｔ細胞）の比率で４８時間、プレートに添加した。次に上清と細胞を収集し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、試験するまで凍結保存した。
【０２０７】
上清を、ＤｕｏｓｅｔヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＹ−２８５）を使用して、ＩＦＮ−γ分泌についてＥＬＩＳＡで試験した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中、抗ヒトＣＤ３−ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２−００３８）および抗ヒトＣＤ６９−ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｎｏ．１７−０６９９）で３０分間染色した。各試料を２分間ＦＡＣＳにかけて、生存癌細胞の数および活性化Ｔ細胞の割合を評価した。
【０２０８】
上清を、ＤｕｏｓｅｔヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＹ−２８５）を使用して、ＩＦＮ−γ分泌について酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。癌細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％）で分離し、１０％ＦＣＳを含有するＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋０．０２％ナトリウムアジド）に再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中、抗ヒトＣＤ３−ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２−００３８）および抗ヒトＣＤ６９−ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｎｏ．１７−０６９９）で３０分間染色した。各試料細胞を２分間ＦＡＣＳにかけて、生存癌細胞の数および活性化Ｔ細胞の割合を評価した。各試料を２分間ＦＡＣＳにかけて、生細胞の数を評価した。試料は２つ組で実施した。
【０２０９】
図１４Ａは、抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｉＴＥ）の投与が単球細胞株の生存率の減少をもたらすことを示す。＊＊＝Ｐ＜０．００１。図１４Ｂは、ＴＨＰ−１およびＵ９３７培養物に添加されたＴ細胞のＣＤ３およびＣＤ６９の染色を示す。図１４Ｃは、ＢｉＴＥの投与が、ＴＨＰ−１およびＵ９３７培養物に添加されたＴ細胞からのＩＦＮ−γ放出の増加ももたらすことを示す。Ｎ．Ｄ＝検出されず。
【０２１０】
したがって、ＢｉＴＥの存在下では、Ｔ細胞は活性化され、ＣＤ３およびＣＤ６９の染色ならびにＩＦＮ−γの分泌によって証明され、腫瘍細胞死を媒介した。
実施例１３
抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体はＭＤＡ−２３１乳癌細胞を死滅させる
【０２１１】
あらかじめ活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を２ｘ１０５細胞／ウェルの濃度で４８ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ抗体または抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体の存在下にＭＤＡ−２３１乳癌細胞と４ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で共インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、トリプシンで処理した。次に細胞を収集し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用して計数した。得られた細胞数を、三つ組みのウェルからの平均細胞数±標準誤差として図１５に示す。＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．００１。図１５は、抗ＭＯＳＰＤ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与が乳癌細胞の生存率の有意な減少をもたらすことを示す。
【０２１２】
本出願で言及されるすべての出版物、特許および特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。項の見出しが使用される限りにおいて、それらは必ずしも限定として解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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