(57)【要約】  マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に由来する１種以上の抗原を含む第１のワクチン成分と、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）活性化剤を含む第２のワクチン成分とを含む、鼻腔内投与用に製剤化されたマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ワクチン。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトへのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の予防的または治療的ワクチン接種方法であって、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に由来する１種以上の抗原を含む第１のワクチン成分を鼻腔内投与すること、およびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）活性化剤を含む第２のワクチン成分を鼻腔内投与することを含む方法。
【請求項２】
第１のワクチン成分が、マイコバクテリウム・ボビスおよび／またはマイコバクテリウム・バッカエを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のワクチン成分が、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のワクチン成分が、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに由来する抗原を含む１種以上の組換え発現タンパク質を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１のワクチン成分が、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに由来する抗原を含む１種以上のタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第１のワクチン成分が、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＲｐｆＤ、ＲｐｆＢ、ＣＦＰ−１０、ＭＰＴ−６４、Ｐｓｔ−Ｓ１、Ａｐａ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＥｓｐＣ、ＰｈｏＹ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ１０．４、ＨｓｐＸ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１８８６、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８からなる群から選択される抗原を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第１のワクチン成分が、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＲｐｆＤ、ＲｐｆＢ、ＣＦＰ−１０、ＭＰＴ−６４、Ｐｓｔ−Ｓ１、Ａｐａ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＥｓｐＣ、ＰｈｏＹ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ１０．４、ＨｓｐＸ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１８８６、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８からなる群から選択される複数種（２種、４種、８種もしくは１２種）の抗原、特に、これらの複数種を含む融合タンパク質、特に、Ａｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６からなる２種の抗原の融合体、Ａｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６とＣＦＰ−１０からなる３種の抗原の融合体、またはＡｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６とＲｖ１７３３ｃとＲｖ２６２６ｃとＲｖ２３８９ｃ（ＲｐｆＤ）からなる５種の抗原の融合体を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＴＩＮＧ活性化剤が環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤＮが、環状ジグアノシンリン酸（ＣＤＧ）または環状グアノシンリン酸−アデノシンリン酸（ｃＧＡＭＰ）である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤＮが、ホスホジエステラーゼ抵抗性を有する合成ＣＤＮ、例えば、非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されたＲ，Ｒ立体配置を有するＲＲ−ＣＤＮ、例えば、ＲＲ−ＣＤＧまたはＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤＮが、ＲＲ−ＣＤＧまたはＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第１のワクチン成分および第２のワクチン成分が、１つの組成物として投与される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、生理食塩水などの水性溶媒を用いて投与される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
鼻腔内投与用の前記ワクチン組成物が、アジュバントである第３のワクチン成分を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記アジュバントが、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、ＲＩＢＩアジュバント、Ｑｕｉｌ−Ａサポニン、ＭＦ５９、ＭＰＬ、ＩＣ３１、ＬＴＫ６３、ＣＡＦ０１、ＣｐＧオリゴ、ＤＥＡＥ−デキストランおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
プライム・ブーストワクチン接種法により、第１のワクチン成分がプライミングワクチンとして投与され、第２のワクチン成分がブースター成分として投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
プライム・ブーストワクチン接種法により、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分がプライミングワクチンとして投与される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
プライム・ブーストワクチン接種法により、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分がブースター成分として投与され、例えば、プライミングワクチンとしてＢＣＧが投与される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
鼻腔内投与用に製剤化されたワクチンであって、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に由来する１種以上の抗原を含む第１のワクチン成分と、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）活性化剤を含む第２のワクチン成分とを含み、第１のワクチン成分と第２のワクチン成分が水性溶媒中で混合されているワクチン。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法用に構成された、請求項１９に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所より交付された助成番号ＡＩ０９１９７６の助成に基づき、米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を有する。
【０００２】
序論
結核菌の感染は、効果的なワクチンの不足などの理由から、依然として世界的に主要な死亡原因の１つである（Young & Dye 2006）。結核菌としてカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を用いたワクチンが現在広く接種されているが（Floyd 2016）、成人の肺結核（ＴＢ）に対するこのワクチンの防御効果は個人差が大きく、臨床試験において０〜８０％と幅がある（Andersen & Doherty 2005）。さらに、ＢＣＧは弱毒化生ワクチンであるため、ＨＩＶに感染している乳児などの免疫力の弱い対象には推奨されていない（Marais et al. 2016）。肺結核に対して防御的な免疫応答を誘導するワクチンとして、ＢＣＧに代わるワクチンやＢＣＧのブーストワクチンの開発に大きな力が注がれている。現在、１２種類のＴＢワクチン候補で臨床試験が進められており、このうち８種類は新規のタンパク質サブユニットワクチンである（Kaufmann et al. 2017）。サブユニットワクチンの利点の１つは、免疫が低下している対象には投与できない場合がある弱毒化生ワクチンに比べて、一般的に優れた安全性プロフィールを示すという点が挙げられる。サブユニットワクチンでは、ワクチン抗原に対する強力な記憶免疫応答を誘導させるためにアジュバントが必要であるが、抗原特異的なエフェクターで長期生存可能なメモリーＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導するアジュバントとして臨床的に承認されているものはない（Iwasaki & Medzhitov 2010）。
【０００３】
環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）は、微生物に共通して存在するセカンドメッセンジャーであり（Tamayo et al. 2007）、細胞質内のサーベイランス経路により認識される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として最初に発見された（McWhirter et al. 2009; Burdette et al. 2012）。ＣＤＮは細胞質内の受容体であるインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を活性化し、その結果、ＴＢＫ１／ＩＲＦ３からＩ型ＩＦＮに至る経路、ＮＦ−κＢを介する古典的炎症応答経路、およびＳＴＡＴ６依存性遺伝子発現といった複数の免疫経路を介してシグナル伝達が行われる（Burdette & Vance 2012; Burdette et al. 2012; McWhirter et al. 2009; Chen et al. 2011）。ヒトＳＴＩＮＧの活性化作用を有する合成ＣＤＮ（ＡＤＵ−Ｓ１００）は、現在、がん治療薬として単独での第Ｉ相臨床試験が進行中であり、また、チェックポイント阻害薬との併用による第Ｉ相臨床試験も進行中である（Clinical trials.gov #NCT02675439および#NCT03172936）。また、その他にも様々なＣＤＮ分子が知られている（Corrales et al. 2015; Corrales et al. 2016）。
【０００４】
ＣＤＮを用いた処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、生得の免疫細胞を刺激して、肺炎桿菌や黄色ブドウ球菌の感染を抑制することが報告されている（Karaolis, Means, et al. 2007; Karaolis, Newstead, et al. 2007）。また、モデル抗原とＣＤＮで免疫を行うと、接種経路によって異なる免疫応答が誘導され、皮下投与ではＴｈ１／Ｔｈ２応答、粘膜投与ではＴｈ１７応答が起こる（Ebensen et al. 2011）。また、ＣＤＮを黄色ブドウ球菌や肺炎連鎖球菌などの細胞外病原菌のワクチンアジュバントとして使用すると、防御抗体による免疫が誘導されることも分かっている（Ebensen, Schulze, Riese, Morr, et al. 2007; Ebensen, Schulze, Riese, Link, et al. 2007; Madhun et al. 2011; Libanova et al. 2010; Ogunniyi et al. 2008; Hu et al. 2009; Dubensky et al. 2013; Yan et al. 2009）。さらに、ＣＤＮは、有望ながん免疫療法剤としても研究が進められている（Woo et al. 2014; Chandra et al. 2014; Hanson et al. 2015）。しかし、これまでの研究で、ＣＤＮアジュバントによって、Ｔ細胞による細胞内病原菌に対する防御免疫が誘導されることは確認されていない。
【０００５】
ＣＤＮは、結核菌やその他の細胞内病原体と同様に細胞質内のサーベイランス経路を活性化する（Watson et al. 2015; Wassermann et al. 2015; Dey et al. 2015）。ＴＢ用に現在開発中の、ＣＤＮ以外のワクチンアジュバントとしては、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストやＴＢ細胞壁脂質を利用したもの（Agger 2016）が挙げられるが、これらがＳＴＩＮＧやその他の細胞質内のサーベイランス経路を活性化するかは不明である。また、ＢＣＧは重要な病原性発現機構が欠損しているため、ＳＴＩＮＧを活性化しない（Watson et al. 2015）。また、Ｔｈ１７ Ｔ細胞は、マウスにおいて、ＢＣＧによって得られる防御能に関して重要な役割を担っている（Khader et al. 2007）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒトへのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のワクチン接種方法および当該ワクチン接種用の組成物を提供する。
【０００７】
一態様において、本発明は、ヒトへのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の予防的または治療的ワクチン接種方法を提供する。当該方法は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に由来する１種以上の抗原を含む第１のワクチン成分を鼻腔内投与すること、およびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）活性化剤を含む第２のワクチン成分を鼻腔内投与することを含む。
【０００８】
別の一態様において、本発明は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の予防的または治療的ワクチンを提供する。当該ワクチンは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に由来する１種以上の抗原を含む第１のワクチン成分、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）活性化剤を含む第２のワクチン成分、および鼻腔内投与用の医薬用添加剤、例えば、緩衝生理食塩水などの水性溶媒を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、
【００１０】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ボビスおよび／またはマイコバクテリウム・バッカエを含み；
【００１１】
−第１のワクチン成分は、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を含み；
【００１２】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエまたはマイコバクテリウム・ボビスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上の組換え発現タンパク質を含み；
【００１３】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上の組換え発現タンパク質を含み；
【００１４】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエまたはマイコバクテリウム・ボビスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上のタンパク質を発現する組換えウイルスベクターを含み；
【００１５】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上のタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを含み；
【００１６】
−第１のワクチン成分は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＲｐｆＤ、ＲｐｆＢ、ＣＦＰ−１０、ＭＰＴ−６４、Ｐｓｔ−Ｓ１、Ａｐａ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＥｓｐＣ、ＰｈｏＹ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ１０．４、ＨｓｐＸ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１８８６、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８からなる群から選択される１種以上の抗原を含み；
【００１７】
−第１のワクチン成分は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＲｐｆＤ、ＲｐｆＢ、ＣＦＰ−１０、ＭＰＴ−６４、Ｐｓｔ−Ｓ１、Ａｐａ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＥｓｐＣ、ＰｈｏＹ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ１０．４、ＨｓｐＸ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１８８６、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８からなる群から選択される複数種（少なくとも２種、４種、８種もしくは１２種）の抗原、特に、これらの複数種を含む融合タンパク質、特に、Ａｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６からなる２種の抗原の融合体、Ａｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６とＣＦＰ−１０からなる３種の抗原の融合体、またはＡｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６とＲｖ１７３３ｃとＲｖ２６２６ｃとＲｖ２３８９ｃ（ＲｐｆＤ）からなる５種の抗原の融合体を含み；
【００１８】
−前記ＳＴＩＮＧ活性化剤は環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）であり；
【００１９】
−前記ＣＤＮは、環状ジグアノシンリン酸（ＣＤＧ）または環状グアノシンリン酸−アデノシンリン酸（ｃＧＡＭＰ）であり；
【００２０】
−前記ＣＤＮは、ホスホジエステラーゼ抵抗性を有するジチオＣＤＮなどの合成ＣＤＮ、例えば、非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されたＲ，Ｒ立体配置を有するＲＲ−ＣＤＮ、例えば、ＲＲ−ＣＤＧもしくはＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰ、または非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されたＲ，Ｓ立体配置を有するＲＳ−ＣＤＮ、Ｓ，Ｒ立体配置を有するＳＲ−ＣＤＮもしくはＳ，Ｓ立体配置を有するＳＳ−ＣＤＮであり；
【００２１】
−前記ＣＤＮは、ＲＲ−ＣＤＧまたはＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰ、好ましくはＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰであり；
【００２２】
−第１のワクチン成分および第２のワクチン成分は、別々の組成物として同時に投与され；
【００２３】
−第１のワクチン成分および第２のワクチン成分は、１つの組成物として投与され；
【００２４】
−前記組成物は、水性溶媒を用いて投与され；
【００２５】
−鼻腔内投与用の前記ワクチン組成物は、アジュバントである第３のワクチン成分を含み；
【００２６】
−前記アジュバントは、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、ＲＩＢＩアジュバント、Ｑｕｉｌ−Ａサポニン、ＭＦ５９、ＭＰＬ、ＩＣ３１、ＬＴＫ６３、ＣＡＦ０１、ＣｐＧオリゴ、ポリＩ：Ｃ、ＤＥＡＥ−デキストランおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択され；
【００２７】
−プライム・ブーストワクチン接種法により、第１のワクチン成分はプライミングワクチンとして投与され、第２のワクチン成分はブースター成分として投与され；かつ／あるいは
【００２８】
−プライム・ブーストワクチン接種法により、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分はプライミングワクチンとして投与される。
【００２９】
−プライム・ブーストワクチン接種法により、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分はブースター成分として投与される。
【００３０】
−プライム・ブーストワクチン接種法により、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分はブースター成分として投与され、プライミングワクチンとしてＢＣＧが投与される。
【００３１】
別の一態様において、本発明は、鼻腔内投与用に製剤化されたワクチンを提供する。当該ワクチンは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に由来する１種以上の抗原を含む第１のワクチン成分と、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）活性化剤を含む第２のワクチン成分とを含み、第１のワクチン成分と第２のワクチン成分は水性溶媒中で混合されている。
【００３２】
いくつかの実施形態において、
【００３３】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ボビスおよび／またはマイコバクテリウム・バッカエを含み；
【００３４】
−第１のワクチン成分は、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を含み；
【００３５】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエまたはマイコバクテリウム・ボビスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上の組換え発現タンパク質を含み；
【００３６】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上の組換え発現タンパク質を含み；
【００３７】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエまたはマイコバクテリウム・ボビスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上のタンパク質を発現する組換えウイルスベクターを含み；
【００３８】
−第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上のタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを含み；
【００３９】
−第１のワクチン成分は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＲｐｆＤ、ＲｐｆＢ、ＣＦＰ−１０、ＭＰＴ−６４、Ｐｓｔ−Ｓ１、Ａｐａ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＥｓｐＣ、ＰｈｏＹ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ１０．４、ＨｓｐＸ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１８８６、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８からなる群から選択される１種以上の抗原を含み；
【００４０】
−第１のワクチン成分は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＲｐｆＤ、ＲｐｆＢ、ＣＦＰ−１０、ＭＰＴ−６４、Ｐｓｔ−Ｓ１、Ａｐａ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＥｓｐＣ、ＰｈｏＹ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ１０．４、ＨｓｐＸ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１８８６、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８からなる群から選択される複数種（２種、４種、８種もしくは１２種）の抗原、特に、これらの複数種を含む融合タンパク質、特に、Ａｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６からなる２種の抗原の融合体、Ａｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６とＣＦＰ−１０からなる３種の抗原の融合体、またはＡｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６とＲｖ１７３３ｃとＲｖ２６２６ｃとＲｐｆＤからなる５種の抗原の融合体を含み；
【００４１】
−前記ＳＴＩＮＧ活性化剤は環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）であり；
【００４２】
−前記ＣＤＮは、環状ジグアノシンリン酸（ＣＤＧ）または環状グアノシンリン酸−アデノシンリン酸（ｃＧＡＭＰ）であり；
【００４３】
−前記ＣＤＮは、ホスホジエステラーゼ抵抗性を有する合成ＣＤＮ、例えば、非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されたＲ，Ｒ立体配置を有するＲＲ−ＣＤＮ、例えば、ＲＲ−ＣＤＧまたはＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰであり；
【００４４】
−前記ＣＤＮは、ＲＲ−ＣＤＧまたはＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰであり；
【００４５】
−前記組成物は、水性溶媒を用いて投与され；
【００４６】
−鼻腔内投与用の前記ワクチン組成物は、アジュバントである第３のワクチン成分を含み；
【００４７】
−前記アジュバントは、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、ＲＩＢＩアジュバント、Ｑｕｉｌ−Ａサポニン、ＭＦ５９、ＭＰＬ、ＩＣ３１、ＬＴＫ６３、ＣＡＦ０１、ＣｐＧオリゴ、ＤＥＡＥ−デキストランおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択され；
【００４８】
−前記ワクチンは、プライム・ブーストワクチン接種法により、ブースター成分として投与され；かつ／あるいは
【００４９】
−前記ワクチンは、プライム・ブーストワクチン接種法により、プライミングワクチンとして投与される。
【００５０】
本発明は、本明細書に記載された個々の実施形態のあらゆる組み合わせを包含するものであり、それらはすべて本明細書に記載されているものとする。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下の記載および本明細書全体を通して、別異に解される場合または別段の記載がある場合を除き、「ａ」および「ａｎ」という用語は１以上のものを表し、「または」という用語は「および／または」を表し、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている反対の鎖および代替骨格も包含するものとする。
【００５２】
本明細書に記載されている実施例および実施形態は、単に本発明を説明するためのものであり、これらの実施例および実施形態に基づいて、当業者により様々な変形または変更が示唆されるものであり、またそのような変形または変更は本願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲内に含まれるものである。本明細書に引用されたすべての出版物、特許および特許出願、またこれらに記載の引用文献は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５３】
本明細書に記載の通り、細胞質内受容体であるインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）の活性化剤は、吸入薬として、特に鼻腔内用吸入薬として送達されるワクチン製剤に用いるアジュバントとして有用である。本明細書において、「ＳＴＩＮＧ活性化剤」は、「ＳＴＩＮＧアゴニスト」と称されることもあり、ＳＴＩＮＧと結合してＳＴＩＮＧを活性化する化合物を表す。ＳＴＩＮＧ活性の増強としては、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βなどの１型インターフェロン、ＩＦＮ−γなどの３型インターフェロンを含むインターフェロン、その他の様々な炎症誘発性サイトカインなどの炎症性サイトカインの活性化が挙げられ、また、以下に限定されないが、ＩＰ１０、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ８などのケモカインの活性化も例として挙げられる。また、ＳＴＩＮＧアゴニスト活性としては、ＴＡＮＫ結合キナーゼ（ＴＢＫ）１のリン酸化、ＳＴＩＮＧのリン酸化、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）の活性化（例えば、ＩＲＦ３の活性化）、ＮＦκＢの活性化、ＳＴＡＴ６の活性化、またはインターフェロン−γ誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）などの炎症性タンパク質や炎症性サイトカインの分泌など、を促進する作用が挙げられる。ＳＴＩＮＧアゴニストとして好適な化合物は、例えば、ＳＴＩＮＧタンパク質に対する結合親和性を測定することにより確認することができる。また、ＳＴＩＮＧアゴニスト活性は、例えば、当技術分野で公知の方法により、ＳＴＩＮＧ経路の活性化を促進する作用を指標として測定することができる。例えば、化合物のＳＴＩＮＧに対する結合親和性は、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）または等温滴定型熱量測定法（ＩＴＣ）を用いた結合アッセイにより測定することができる。化合物のＳＴＩＮＧアゴニスト活性を測定する方法としては、例えば、インターフェロン刺激アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ（例えば、ｈＳＴＩＮＧ  ｗｔを用いたアッセイ、またはＴＨＰ−１  Ｄｕａｌを用いたアッセイ）、ＴＢＫ１活性化アッセイ、ＩＰ−１０アッセイ、ＳＴＩＮＧの生化学的［３Ｈ］ｃＧＡＭＰ競合アッセイなどの当業者に公知の試験法が挙げられる。また、ＳＴＩＮＧアゴニスト活性は、ＳＴＩＮＧまたはＳＴＩＮＧ経路により活性化されるタンパク質をコードする遺伝子の転写レベルを増加させる作用を指標として測定することもできる。また、ＳＴＩＮＧアゴニスト活性は、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、Ｎａｎｏ  Ｓｔｒｉｎｇ、またはマウスや細胞で分泌されたタンパク質を検出する様々な試験法（サイトカインビーズアレイ、ＥＬＩＳＡ）などを用いて確認してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧノックアウト細胞株を用いて化合物の活性を調べる試験法により、当該化合物がＳＴＩＮＧに特異的であるか否かを確認してもよい。ＳＴＩＮＧに特異的な化合物であれば、ＳＴＩＮＧ経路が部分的または完全に欠損している細胞株では活性を示さないことが予想される。ＳＴＩＮＧアゴニスト化合物の具体例、合成方法、ＳＴＩＮＧアゴニストを同定する試験法は、例えば以下のＰＣＴ文献に記載されている：WO 2014/189805；WO 2014/093936；WO 2016/145102；WO 2017/075477；WO 2018009466；WO 2014/179335；WO 2005/030186；WO 2007/054279；WO 2011/003025；WO 2015/074145；WO 2015/185565；WO 2016/120305；WO 2017/093933；WO 2016/096174；WO 2016/096577；WO 2017/027645；WO 2017/027646；WO 2017/123657；WO 2017/123669；WO 2018/009648；WO 2018/009652；WO 2007/070598；WO 2017/004499；WO 2017/011622；WO 2018/013908；および WO 2017/011920。好ましいＳＴＩＮＧアゴニストとしては、WO 2014/189805；WO 2016/145102；WO 2017/075477；WO 2018009466；WO 2005/030186；WO 2007/054279；WO 2011/003025；WO 2015/074145；WO 2015/185565；WO 2016/120305；WO 2017/093933；WO 2016/096174；WO 2016/096577；WO 2017/027645；WO 2017/027646；WO 2017/123657；WO 2017/123669；WO 2018/009648；および WO 2018/009652などのＰＣＴ文献に記載の環状ジヌクレオチド、これらの薬学的に許容される塩、これらの薬学的に許容される溶媒和物、またはこれらの薬学的に許容される水和物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記環状ジヌクレオチドは、アデニン（Ａ）および／またはグアニン（Ｇ）を含み、例としては、環状ジアデノシンリン酸（ＣＤＡ）、環状ジグアノシンリン酸（ＣＤＧ）、もしくは環状グアノシンリン酸−アデノシンリン酸（ｃＧＡＭＰ）（例えば、３’３’結合（例えば、３’３’−（Ｇ）（Ａ））、２’２’結合（例えば、２’２’−（Ｇ）（Ａ））、もしくは混合型結合（ＭＬ、例えば、２’３’−（Ｇ）（Ａ）もしくは３’２’−（Ｇ）（Ａ））などのｃＧＡＭＰ）、またはこれらの誘導体、さらに、これらの薬学的に許容される塩、これらの薬学的に許容される溶媒和物、またはこれらの薬学的に許容される水和物が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、３’３’−ＲＲ−（Ｇ）（Ｇ）もしくはジチオ［ＲＰ、ＲＰ］−環状−［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］とも称されるＲＲ−ＣＤＧ、または２’３’−ＲＲ−（Ｇ）（Ａ）もしくはジチオ［ＲＰ、ＲＰ］−環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］とも称されるＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰ、さらに、これらの薬学的に許容される塩、これらの薬学的に許容される溶媒和物、またはこれらの薬学的に許容される水和物が挙げられるが、これらに限定されない。なお、ＲＲ−ＣＤＧおよびＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰの構造は下記の通りである。
ＲＲ−ＣＤＧ
2021512144.tif 000002
ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰ
2021512144.tif 000003
【００５４】
本明細書に記載のワクチン、すなわち、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に由来する１種以上の抗原を含む第１のワクチン成分と、ＳＴＩＮＧ活性化剤を含む第２のワクチン成分とを少なくとも含み、アジュバントである第３のワクチン成分を任意で含むワクチンは、吸入薬として、好ましくは鼻腔内送達用の吸入薬として投与するために製剤化されていてもよい。このような製剤は、当業者に一般に知られており、上記のワクチン成分をそれぞれ別々に生理学的に許容される担体、添加剤もしくは安定化剤と混合することにより、または上記のワクチン成分を合わせて、生理学的に許容される担体、添加剤もしくは安定化剤と混合して１つの製剤とすることにより、例えば、凍結乾燥散剤、スラリー状製剤、水溶液剤または懸濁液剤として調製することができる（例えば、Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA; and Nielloud and Marti-Mestres, Pharmaceutical Emulsions and Suspensions: 2nd Edition, Marcel Dekker, Inc, New Yorkを参照のこと）。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の前記ワクチン成分は、鼻腔内噴霧剤、吸入剤および／またはその他のエアロゾル送達ビヒクルなどにより送達される医薬組成物として製剤化される。いくつかの実施形態において、前記鼻腔内用製剤は、無菌の水性製剤である。上記のワクチン成分は、すべてを合わせて１つの製剤として製剤化してもよく、または、それぞれ別々に製剤化して同時に投与するか、プライム・ブーストレジメンなどのある特定の投与レジメンにより投与してもよい。上記のワクチン成分は、防腐剤、粘性調整剤、乳化剤もしくは緩衝剤などの添加剤の溶液または混合液に溶解または懸濁して、定量用量を含む噴霧剤として送達するという方法で投与してもよい。前記鼻腔内送達用製剤において、前記ＳＴＩＮＧ活性化剤成分は、その他のワクチン成分と混合して製剤化される場合も、各ワクチン成分がそれぞれ別々に製剤化される場合も、１回分の用量として、例えば、０．１〜１００００μｇ、０．１〜５０００μｇ、０．５〜５０００μｇ、０．５〜２０００μｇ、１〜２０００μｇ、１〜１０００μｇ、１〜８００μｇ、１〜６００μｇ、１〜４００μｇ、１〜２００μｇ、１〜１００μｇまたは１〜５０μｇが送達されるように製剤化される。
【００５５】
第１のワクチン成分の送達用量は、送達する１種以上の抗原の組成によって異なる。例えば、第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ボビスの弱毒化株であるカルメット・ゲラン桿菌株を生きたまま培養して調製した、ＢＣＧワクチンであってもよく、この場合、例えば、標準的な方法により経皮投与してもよく、あるいは鼻腔内投与してもよい。鼻腔内投与する場合は、例えば、１×１０３〜１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０４〜１×１０９ＣＦＵ、５×１０４〜１×１０９ＣＦＵ、５×１０４〜１×１０８ＣＦＵ、または１×１０５〜１×１０８ＣＦＵの用量で投与される。第１のワクチン成分は、カルメット・ゲラン桿菌株以外に、マイコバクテリウム・バッカエ、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスの弱毒化株を生きたまま培養して調製したものであってもよく、その場合も、上記と同様の用量で投与することができる（例えば、臨床試験で用いられているＭＴＢＶＡＣは、病原性遺伝子ｐｈｏＰとｆａｄＤ２６に安定した欠失変異を有するマイコバクテリウム・ツベルクローシスのヒト分離株である）。第１のワクチン成分に含まれる前記１種以上の抗原は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエまたはマイコバクテリウム・ボビスに由来する１種以上の抗原を含む１種以上のタンパク質を発現する組換えウイルスベクターを用いて送達することができる。好適なウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス（例えば、ＭＶＡ）、インフルエンザウィルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス５型、ヒトアデノウイルス２６型、ヒトアデノウイルス３５型、サルアデノウイルス３型、サルアデノウイルス６３型などのサルアデノウイルス）、ポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、サイトメガロウイルス（例えば、ｒＣＭＶ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この場合、前記ウイルスベクターは、例えば、１×１０４〜１×１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）もしくは感染単位（ＩＦＵ）、５×１０４〜１×１０９ＰＦＵもしくはＩＦＵ、１×１０５〜１×１０９ＰＦＵもしくはＩＦＵ、１×１０５〜５×１０９ＰＦＵもしくはＩＦＵ、または１×１０５〜１×１０８ＰＦＵもしくはＩＦＵの用量で鼻腔内に投与される。第１のワクチン成分は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエまたはマイコバクテリウム・ボビスに由来する１種以上の抗原を含む融合タンパク質などのポリペプチドとして投与してもよく、該ポリペプチドは、例えば、０．１〜１００００μｇ、０．１〜５０００μｇ、０．５〜５０００μｇ、０．５〜２０００μｇ、１〜２０００μｇ、１〜１０００μｇ、１〜８００μｇ、１〜６００μｇ、１〜４００μｇ、１〜２００μｇ、１〜１００μｇまたは１〜５０μｇの用量で鼻腔内に投与される。
【００５６】
上記のマイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエまたはマイコバクテリウム・ボビスに由来する１種以上の抗原は、当業者に公知の１種以上の抗原であってもよく、また、ＴＢに対する免疫応答の誘導に適したものとしてまだ認識されていない抗原であってもよい。前記１種以上の抗原は、例えば１〜２０種、１〜１８種、１〜１６種、１〜１４種、１〜１２種、１〜１１種、１〜１０種、１〜９種、１〜８種、１〜７種、１〜６種、１〜５種、１〜４種、１〜３種、１種もしく２種、または１種の抗原であってもよい。ＴＢワクチンでの使用に適した抗原としては、例えば、Zvi et al. 2008およびKassa et al. 2012に記載の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記抗原は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バッカエまたはマイコバクテリウム・ボビスで発現しているタンパク質の抗原性部分を含み、例えば、好適な長さの抗原性ポリペプチドフラグメント、例えば、８〜５０００個、８〜４０００個、８〜３０００個、８〜２０００個、８〜１０００個、８〜９００個、８〜８００個、８〜７００個、８〜６００個、８〜５００個、８〜４００個、８〜３００個、８〜２００個、または８〜１００個のアミノ酸残基で構成される抗原性ポリペプチドフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、前記抗原は、ｒｐｆ、ａｌｄ、ａｐａ、ａｃｒ、ａｃｇ、ｇｒｏ、ｇｒｏ、ｄｅｖｓ、ｄｎａ、ｅｓｐ、ｐｈｏ、ｆｄｘ、ｈｒｐ、ｈｓｐ、ｅｓｘ、ｅｓｘ、ｅｓｘ、ｅｓｘ、ｉｃｌ、ｔｕｆ、ｔｇｓ、ｂｆｎ、ｄｅｓ、ｐｒｐ、ＰＥ、ＰＰＥ、ｐｓｐ、ｐｓｔ、ｓａｋ、ｉｒｔ、ｆｂｐ、ｋａｔ、ｍｐｔおよびｍｂｐからなる群から選択される遺伝子から発現されるタンパク質の抗原性フラグメント、好ましくは、ｒｐｆＡ、ｒｐｆＢ、ｒｐｆＣ、ｒｐｆＤ、ｒｐｆＥ、ａｌｄ、ａｐａ、ａｃｒ、ａｃｇ、ｇｒｏＥＳ、ｇｒｏＥＬ、ｄｅｖｓ、ｄｎａＫ、ｅｓｐＣ、ｐｈｏＹ２、ｆｄｘＡ、ｈｒｐ１、ｈｓｐＸ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、ｅｓｘＨ、ｅｓｘＮ、ｉｃｌ、ｔｕｆ、ｔｇｓ１、ｂｆｎＢ、ｄｅｓＡ１、ｐｒｐＤ、ＰＥ１１、ＰＥ３５、ＰＰＥ４２、ＰＰＥ５５、ＰＰＥ６８、ｐｓｐＡ、ｐｓｔＳ１、ｓａｋ５、ｉｒｔＢ、ｆｂｐＡ、ｆｂｐＢ、ｋａｔＧ、ｍｐｔ６３およびｍｂｐ６４からなる群から選択される遺伝子から発現されるタンパク質の抗原性フラグメントである。いくつかの実施形態において、前記１種以上の抗原は、MTB32A、MTB39A、Rv0079、Rv0081、Rv0140、Rv0288 (TB10.4)、Rv0384c、Rv0440 (HSP65)、Rv0467、Rv0574c、Rv0577、Rv0685、Rv0824c、Rv0867c、Rv1009、Rv1130、Rv1169c、Rv1174c (TB8.4)、Rv1196、Rv1349、Rv1626、Rv1733c、Rv1734c、Rv1735c、Rv1737c、Rv1738、Rv1793、Rv1813c、Rv1884c、Rv1886c (Ag85B)、Rv1908c、Rv1926c (MPT63)、Rv1980c (MPT64)、Rv1996、Rv1998、Rv2005c、Rv2006、Rv2007c、Rv2028c、Rv2029c、Rv2030c、Rv2031c (HSP16.3)、Rv2032、Rv2389c、Rv2450c、Rv2608、Rv2620c、Rv2623、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv2629、Rv2630、Rv2660、Rv2662、Rv2744c、Rv2780、Rv2875、Rv3044、Rv3127、Rv3130c、Rv3131、Rv3132c、Rv3223c、Rv3307、Rv3347c、Rv3407、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv3804c (Ag85A)、Rv3862c、Rv3873、Rv3874 (CFP-10)、およびRv3875 (ESAT-6)、ならびにこれらの抗原性フラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前��１種以上の抗原は、MTB32A、MTB39A、Rv0079、Rv0288 (TB10.4)、Rv0867c、Rv1196、Rv1174c (TB8.4)、Rv1733c、Rv1813c、Rv1886c (Ag85B)、Rv1908c、Rv1980c (MPT64)、Rv2029c、Rv2030c、Rv2031c (HSP16.3)、Rv2032、Rv2389c、Rv2608、Rv2626c、Rv2627c、Rv2660、Rv2780、Rv2875、Rv3127、Rv3130c、Rv3132c、Rv3619、Rv3620、Rv3804c、Rv3873、Rv3874 (CFP-10)、およびRv3875 (ESAT-6)、ならびにこれらの抗原性フラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のワクチン成分は、複数種の抗原を含む融合タンパク質を含み、該融合タンパク質は、MTB32A、MTB39A、Rv0288、Rv1174c、Rv1733c、Rv1813c、Rv1886c、Rv1980c、Rv2389c、Rv2608、Rv2626c、Rv2660、Rv3619、Rv3620、Rv3804c、Rv3874およびRv3875、ならびにこれらの抗原性フラグメントからなる群から選択される少なくとも１種の抗原を含む。
【００５７】
本明細書に記載のワクチン接種方法およびワクチン組成物は、アジュバントを含む第３のワクチン成分を任意で含む。ワクチンアジュバントは当業者に公知であり、ワクチンの免疫応答の誘発作用、増強作用または延長作用を増強するために使用される。前記アジュバントとしては、例えば、サイトカイン、ケモカイン、細菌由来核酸配列（ＣｐＧオリゴなど）、ＴＬＲアゴニスト（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、リポタンパク質、ＬＰＳ、モノホスホリル脂質Ａ、リポテイコ酸、イミキモド、レシキモドなど）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）アゴニスト（ポリＩ：Ｃなど）、脂質、リポソーム、リポタンパク質、リポポリペプチド、ペプチドグリカン（例えば、ムラミルジペプチド）、無毒化エンドトキシン、鉱油、界面活性物質（例えば、リポレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油、炭化水素エマルジョンなど）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、ＲＩＢＩアジュバント、Ｑｕｉｌ−Ａサポニン、ＭＦ５９、リポ多糖（例えば、ＭＰＬ）、ＩＣ３１、ＬＴＫ６３、ＣＡＦ０１、ＤＥＡＥ−デキストラン、ミョウバン、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
第１のワクチン成分および第２のワクチン成分が対象の鼻腔内に投与される本明細書に記載のワクチン接種方法には、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分が１つの製剤として投与される方法、ならびに第１のワクチン成分および第２のワクチン成分がそれぞれ別々の製剤として同時に投与される方法が含まれる。第１のワクチン成分および第２のワクチン成分が同時に投与されるとは、２つの成分が同時期に投与される、すなわち、１時間以内、３０分以内、１０分以内、５分以内、または１分以内の時間差で２つの成分が投与されることを意味する。いくつかの実施形態において、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分は、プライム・ブーストレジメンで投与される、すなわち、２つの成分の１つの成分が投与された数日後または数週間後にもう１つの成分が投与される。いくつかの実施形態において、第１のワクチン成分は、第２のワクチン成分が投与される１〜２８日前に投与される。いくつかの実施形態において、第１のワクチン成分は、第２のワクチン成分が投与された１〜２８日後に投与される。いくつかの実施形態において、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分を含み、任意で第３のワクチン成分を含む前記ワクチンは、プライム・ブーストレジメンでプライミング成分またはブースト成分として用いられる。例えば、第１のワクチン成分および第２のワクチン成分を含み、任意で第３のワクチン成分を含む製剤として鼻腔内投与用に製剤化された本発明のワクチン組成物は、ＢＣＧワクチンなどの別のＴＢワクチンが投与される１〜２８日前または１〜２８日後に投与され、ＢＣＧワクチンなどの別のＴＢワクチンは皮内、皮下または鼻腔内などの任意の好適な経路で投与される。
【００５９】
ＳＴＩＮＧ活性化作用を有するアジュバントにより、抗原特異的なＴｈ１応答およびＴｈ１７応答、実質組織にホーミングするＣＸＣＲ３＋ＫＬＲＧ１− Ｔ細胞の動員、ならびにマイコバクテリウム・ツベルクローシスに対する防御能が誘導される（後述）。下記の実施例に記載の通り、ＲＲ−ＣＤＧを２Ａｇ融合タンパク質Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６または５Ａｇ融合タンパク質とともに単独のワクチンとして使用した場合、病原性マイコバクテリウム・ツベルクローシス（エルドマン株）のエアロゾル曝露（チャレンジ）に対する防御効果が得られ、防御能は対数値で１．５であった。また、ＣＤＮアジュバントを含有する実験的な５Ａｇ融合タンパク質ワクチンによる防御能は、類似のワクチンである、Ｔｈ１アジュバントのジメチルジオクタデシルアンモニウム／モノホスホリル脂質Ａリポソーム（ＤＤＡ／ＭＰＬ）とともに製剤化した２Ａｇタンパク質サブユニットワクチン（Carpenter et al. 2017）とは異なり、曝露１２週間後まで持続した。
【００６０】
このレベルの持続効果は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのタンパク質サブユニットワクチン用のアジュバントとしてこれまで試験に用いられてきたワクチンアジュバント（Skeiky et al. 2004; Aagaard et al. 2011; Bertholet et al. 2010; Baldwin et al. 2012; Billeskov et al. 2012）のいずれよりも優れており、ＣＤＮは、他のワクチンアジュバントより長期に生存するメモリーＴ細胞を誘導できることが示唆される。さらに、ＣＤＮアジュバント含有ワクチンによりマウスでＴＢ疾患の発症が抑制されることが確認され、この抑制がＴ細胞依存性メカニズムを介すると考えられることから、ＣＤＮアジュバントが他の細胞内病原体に対するワクチン接種にも適していることが示唆される。
【００６１】
ＣＤＮによりＳＴＩＮＧが活性化されると、３つの異なる自然免疫経路を介してシグナル伝達が行われるが（Burdette & Vance 2012）、このうち、最もよく説明されているのは、ＴＢＫ１／ＩＲＦ３を介してＩ型ＩＦＮが誘導される経路である（Ishikawa & Barber 2008）。我々は、皮下接種で免疫を行ったマウスにおいて、ＣＤＮのワクチンアジュバントとしての効果がＩ型ＩＦＮではなく、ＳＴＩＮＧに依存していることを確認した。また、他の研究者によっても、経粘膜送達されたＣＤＧに対する免疫応答にＩ型ＩＦＮが必要でないことが示されている（Blaauboer et al. 2014）。また、ＳＴＩＮＧは、ＣＤＮアジュバントの効果に寄与する可能性のあるＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２などの古典的な炎症誘発性サイトカインを誘導するＮＦ−κＢを活性化する（Blaauboer et al. 2014）。さらに、ＳＴＩＮＧは、ＳＴＩＮＧの抗ウイルス応答に必要なケモカインのＳＴＡＴ−６依存性発現を活性化する（Chen et al. 2011）。
【００６２】
実験的な５Ａｇ融合タンパク質ワクチンには、特性が明らかになっている２種の免疫優性抗原Ａｇ８５ＢおよびＥＳＡＴ−６（Weinrich Olsen et al. 2001; Horwitz et al. 1995; Baldwin et al. 1998; Brandt et al. 2000; Olsen et al. 2004; Langermans et al. 2005; Skjot et al. 2000）を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの５種のタンパク質が含まれている。また、この５Ａｇには、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃおよびＲｐｆＤが含まれており、これらは、細菌の潜在性および／または潜在性から再活動性への移行に関する役割を担うＴ細胞抗原と考えられている（Zvi et al. 2008）。我々は、ＥＳＡＴ−６およびＡｇ８５Ｂに対する有意なＴ細胞応答が見られたことから、ＥＳＡＴ−６とＡｇ８５Ｂのみで構成される融合タンパク質でも、上記の５Ａｇによる防御効果と同等の防御効果が得られることを確認したが、ＥＳＡＴ−６およびＡｇ８５Ｂの代わりに、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃおよびＲｐｆＤをＣＤＮアジュバント含有ワクチンとともに用いてもよい。
【００６３】
マイコバクテリウム・ツベルクローシスに感染したマウスに、メモリーＴ細胞集団を養子免疫移植すると防御効果が得られる（Sakai et al. 2014）ことから、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのワクチンとしては、メモリーＴ細胞の肺組織への移行を誘導するものであれば理想的である。我々は、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンの接種により、曝露４週間後にＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＫＬＲＧ１− Ｔ細胞が増加することを確認した。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＫＬＲＧ１− Ｔ細胞は、肺実質組織にホーミングすることが報告されている（Sakai et al. 2014）。この５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンの接種により、実質組織にホーミングするＴ細胞は増加したが、これらの細胞のうちＩＦＮ−γを産生する細胞の割合（％）は、ＰＢＳを接種した動物より低かったことから、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを接種したマウスにおいて、新規のＴ細胞サブセットが制御に関与している可能性が示唆される。
【００６４】
タンパク質サブユニットワクチン（５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧ）に配合された、ＳＴＩＮＧ活性化作用を有する環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに対する持続的防御免疫を誘導する。このワクチンの皮下投与による防御能は、弱毒化生ワクチンとして使用されるカルメット・ゲラン桿菌株（ＢＣＧ）による防御能と同等であった。この防御効果は、ＳＴＩＮＧ依存性であって、Ｉ型ＩＦＮには依存せず、近年報告された、肺実質組織に局在するＣＸＣＲ３発現Ｔ細胞サブセットの出現頻度の増加との相関が示された。
【００６５】
また、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの鼻腔内送達によって、ＢＣＧより優れた防御能が得られ、ＢＣＧによる免疫が有意にブーストされ、Ｔｈ１とＴｈ１７の免疫応答が誘導された。Ｔｈ１７の免疫応答については、防御能の増強との相関が示された。さらに、ヒトＳＴＩＮＧアゴニストであるＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰは、タンパク質サブユニットワクチンに配合して用いた場合に、ＲＲ−ＣＤＧと同等の防御効果を示した。したがって、ＣＤＮアジュバント含有タンパク質サブユニットワクチンは、細胞内病原体の感染を防御する免疫応答を多面的に誘導する能力を有している。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例で使用するＲＲ−ＣＤＧおよびＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰは、Aduro Biotechから提供されたものである（WO 2014/093936およびWO 2014/189805に記載の方法で合成されたもの）。抗原とＣＤＮで構成されるワクチン接種用製剤に、Ａｄｄａｖａｘ（Invivogen, San Diego, CA）を使用した。５Ａｇ融合タンパク質およびペプチドプールは、Aeras（Rockville, MD）から提供されたものである。ワクチン接種実験には、ＣＢ６Ｆ１マウスもしくはＣ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）、またはＩｆｎａｒ−／−マウスもしくはＳｔｉｎｇｇｔ／ｇｔマウス（それぞれUC BerkeleyのVance研究室、Raulet研究室から提供を受けた）を我々の研究室で飼育して使用した。実験個体と同性同齢のコントロール動物をワクチン実験において使用した。
【００６７】
細菌培養−
曝露実験では、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのエルドマン株を使用した。ワクチン接種には、マイコバクテリウム・ボビスのＢＣＧ株（Pasteur）を使用した。マイコバクテリウム・ツベルクローシスおよびＢＣＧは、１０％アルブミン・デキストロース生理食塩水（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）または１０％ＯＡＤＣ（ＢＣＧ）、０．４％グリセリンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９液体培地、または１０％Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ＯＡＤＣ（BD Biosciences）および０．４％グリセリンを含む固形の７Ｈ１０寒天プレートで増殖した。ＢＣＧの凍結ストックは、同じ培養物から作製したものをすべての実験で使用した。
【００６８】
ワクチン接種−
ＣＤＮ（５μｇ）および５Ａｇ（３μｇ）を２％Ａｄｄａｖａｘ含有ＰＢＳに加えて製剤化した。群分けした６〜１０週齢のマウス（ＢＣＧワクチン接種群は除く）の尾根部両側に、ＲＲ−ＣＤＧを１００μLずつ（各側に５０μＬずつ）４週間おきに３回投与し、ワクチン接種を行った。ＢＣＧワクチン接種群のマウスには、１００μLのＰＢＳに２．５〜５×１０５ＣＦＵ／マウスの用量を加えて、後頸部皮下に１回接種した。免疫感作後の所定の週で、マウスから血液（眼窩後方；２００μＬ）を採取し、免疫学的アッセイ（ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴおよび／またはＩＣＳ）に供した。
【００６９】
マイコバクテリウム・ツベルクローシスによる曝露実験−
最終のワクチン接種から４週間後、マウスにマイコバクテリウム・ツベルクローシスのエルドマン株をエアロゾル経路で感染させた。エアロゾル感染は、ネブライザーおよび全身吸入曝露システム（Full Body Inhalation Exposure System）（Glas-Col, Terre Haute, IN）を用いて行った。９ｍＬの培養物をネブライザーに充填し、感染１日後にマウスのそれぞれの肺に、ＣＦＵとして１００〜２００個の細菌が送達されるようにネブライザーを調整した（データ示さず）。特に明記しない限り、曝露４週間後および１２週間後に、各群５匹のマウスを屠殺し、肺のＣＦＵと免疫応答（４週間後のみ）を測定した。細菌数を計測するために、１つの肺葉（最大のもの）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳに加えてホモジネートし、段階希釈して、７Ｈ１０プレートに播種した。播種２１日後に、ＣＦＵを計数した。残りの肺葉はＩＣＳに用いた。
【００７０】
曝露前のＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＣＳアッセイ−
５匹のマウスから採取したヘパリン添加血液をそれぞれ解析に供し、あるいはプールし、リンパ球を単離した（Lympholyte-Mammal, Cedar Lane, cat #CL5115）。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うために、ＩＦＮ−γキャプチャー抗体（BD Biosciences #551881）でコーティングしたプレートに脾細胞（１×１０５細胞／ウェル）とペプチド（２μｇ／ｍＬ）を添加し、これにリンパ球（Ａｇ８５Ｂ用およびＥＳＡＴ６用に１×１０５細胞／ウェルまたは１×１０４細胞／ウェル）を添加した。このプレートを一晩インキュベートした後、洗浄し、使用したBD Biosciences製キットのプロトコールに従って発色を行った。CTL製イムノスポットアナライザーを用いてスポット数を数えた。ＩＣＳアッセイを行うために、非感染マウスのＣＦＳＥ標識脾細胞（フィーダー細胞：１×１０５細胞／ウェル）、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐの存在下、ＥＳＡＴ６ペプチド（２μｇ／ｍＬ）もしくはＡｇ８５Ｂペプチド（２μｇ／ｍＬ）を加えて、または加えずに、３７℃、５時間インキュベートして細胞を再刺激した。細胞を４℃で一晩維持し、その後洗浄して、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｓｔａｉｎ（Thermofisher, L34970）、ＣＤ４（BD, #564933）、ＣＤ８（BD, #563898）、ＣＤ９０．２（BD, #561616）、ＭＨＣＩＩ（Biolegend, #107606）、Ｌｙ６Ｇ（BD, #551460）、ＩＦＮ−γ（eBioscience, #12-73111-81）、ＴＮＦ−α（BD, 506324）、ＩＬ−１７（Biolegend, #506904）で染色した。FACSDivaソフトウェア（BD）を搭載したBD製LSR Fortessaフローサイトメーターを用いて、データを収集し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc., Ashland, OR）で解析した。
【００７１】
曝露後の細胞内サイトカイン染色−
曝露４週間後に肺（小葉）を採取して、ｃＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ＨＥＰＥＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび５０μＭ  ＢＭＥを含むＲＰＭＩ−１６４０）に加え、細胞に分散した後、４０μｍストレーナーで篩過した。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐの存在下、Ａｇ８５Ｂペプチド（２μｇ／ｍＬ）を加えて、または加えずに、３７℃で５時間インキュベートして細胞を再刺激した。細胞を洗浄して、曝露前のＩＣＳで用いた抗体、ＣＸＣＲ３（Biolegend, #126522）およびＫＬＲＧ１（Biolegend, #107606）で染色した。細胞の固定・透過処理を室温で２０分間行い、ＢＳＬ３施設から取り出した。データの収集および解析は上記と同様に行った。
【００７２】
実施例１
ＳＴＩＮＧ活性化作用を有するＲＲ−ＣＤＧアジュバントを含有するタンパク質サブユニットワクチンはマイコバクテリウム・ツベルクローシスの感染を防御する
【００７３】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス抗原用のアジュバントとしてのＣＤＮの有効性を、宿主細胞のホスホジエステラーゼによる切断および失活を回避するために非架橋酸素原子を硫黄原子で置換したＲ，Ｒ立体配置を有する合成ＣＤＧ（ＲＲ−ＣＤＧ）（Corrales et al. 2015）を用いて検証した。ＲＲ−ＣＤＧと、抗原である５Ａｇ、すなわち、マイコバクテリウム・ツベルクローシスタンパク質であるＡｎｔｉｇｅｎ−８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ１８８６ｃ）、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、ＲｐｆＤ（Ｒｖ２３８９ｃ）の５種（Zvi et al. 2008）からなる融合体とを組み合わせて用いた。Ａｇ８５ＢおよびＥＳＡＴ−６は、免疫原性を有することが十分に認識されているＴＢ抗原であり、これまで様々なサブユニットワクチンで試験されており、ヒトにおいてＴ細胞応答を誘導することが確認されている（Weinrich Olsen et al. 2001; Horwitz et al. 1995; Baldwin et al. 1998; Brandt et al. 2000; Olsen et al. 2004; Langermans et al. 2005）。Ｒｖ１７３３、Ｒｖ２６２６ｃおよびＲｐｆＤは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの遺伝子発現データに基づいて潜在的なＴ細胞エピトープを同定するバイオインフォマティクス解析で同定されたものである（Zvi et al. 2008）。ＲＲ−ＣＤＧと５Ａｇを、市販のスクワレン系水中油型ナノエマルジョンＡｄｄａｖａｘ（Ott et al. 1995）を用いて製剤化し、実験的ワクチン５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを作製した。標準的なワクチンスケジュールに従って、マウスにワクチン接種を行った。５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの場合は、４週間おきに３回免疫感作を行い、ＢＣＧの場合は、低用量のマイコバクテリウム・ツベルクローシスの病原性エルドマン株でエアロゾル曝露を行う１２週間前に、１回免疫感作を行った。
【００７４】
５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧによりＴｈ１免疫が誘導されるか否かを確認するために、各ブースト免疫後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴを行った。５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧにより、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６およびＲｖ１７３３ｃに対するＴ細胞特異的な応答が誘導された。これらの応答はＲＲ−ＣＤＧ依存性を示し、また、２回目のブースト免疫後の応答は１回目より増大した。ＢＣＧは、５Ａｇの５種の抗原のうち４種（ＥＳＡＴ−６以外）を発現するものの、抗原特異的なＴ細胞応答を誘導する能力は５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧより有意に低かった。初回接種から１２週間後に、マウスにマイコバクテリウム・ツベルクローシスを曝露した。曝露４週間後、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを接種したマウスにおける肺の細菌数は、ＰＢＳを接種したマウスより対数値で１少なく、ＢＣＧによる防御能と同等の効果が得られた。重要なことに、このレベルの防御能が曝露１２週間後まで持続した。この結果より、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを接種したマウスにおいて、メモリー由来ＣＤ４＋ Ｔ細胞が増加した状態で維持される（Carpenter et al. 2017）可能性が示唆された。
【００７５】
他のワクチンアジュバントとの比較が容易に行えるように、ＲＲ−ＣＤＧを、ワクチン実験で一般に用いられるＥＳＡＴ−６とＡｇ８５Ｂの２種類の抗原からなる融合タンパク質（Weinrich Olsen et al. 2001; Agger et al. 2008）と組み合せて製剤化した。感染１２週間後、ＲＲ−ＣＤＧとＥＳＡＴ−６／Ａｇ８５Ｂ融合タンパク質による防御能は、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの場合と同等であった。以上より、ＲＲ−ＣＤＧをＴＢタンパク質と組み合わせることにより、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの曝露に対して有意な防御効果が得られ、ＲＲ−ＣＤＧは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのタンパク質サブユニットワクチンにおいてこれまで試験されてきた他のアジュバント（Aagaard et al. 2011; Skeiky et al. 2004; Bertholet et al. 2010; Baldwin et al. 2012; Billeskov et al. 2012; Ma et al. 2017）と同様に効果的なアジュバントであることが分かった。
【００７６】
５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンの接種により、ＰＢＳまたはＢＣＧワクチンを接種したマウスと比べて肺実質組織にホーミングするＴ細胞の割合（％）が高くなる。
【００７７】
免疫応答がピークに達する曝露４週間後の時点において、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを接種したマウスの肺のＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）は、ＰＢＳを接種したマウスより有意に高く、それに応じてＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合（％）が減少していた。この結果から、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧは、感染後にＣＤ４＋ Ｔ細胞の動員および／または増殖を特異的に促進することが示唆された。抗原特異的なＴ細胞応答を調べるために、感染した肺の細胞に対して、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて抗原性ペプチドプールで再刺激した。Ａｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６により強力な応答が誘導されたことから、これらの抗原のペプチドを、曝露後の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析に用いた。Ａｇ８５Ｂ特異的なＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答は、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧで免疫したマウスのみで確認された。ＥＳＡＴ−６特異的なＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞集団の誘導は、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧで免疫したマウスで明らかに確認されたものの、ＰＢＳを接種したマウスより細胞数は少なかった。多機能Ｔ細胞でも同様の傾向が見られた。上記の結果から、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを接種したマウスにおいてＣＤ４＋ Ｔ細胞全体の出現頻度は増加したが、肺におけるＡｇ８５Ｂ特異的またはＥＳＡＴ−６特異的なＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋ Ｔ細胞の存在と防御能との間に強い相関は見られなかった。
【００７８】
これまでの研究により、ＴＢ感染時のＣＤ４＋ Ｔ細胞を機能的に分類すると、下記の２種類に分けられることが分かっている：肺血管に局在し、ＩＦＮ−γ産生量が高いＣＸＣＲ３−ＫＬＲＧ１＋細胞、および肺実質組織に局在し、ＩＦＮ−γの産生量は低いが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染の制御により優れたＣＸＣＲ３＋ＫＬＲＧ１−細胞（Sakai et al. 2014; Woodworth et al. 2017）。曝露４週間後、ＣＸＣＲ３−ＫＬＲＧ１＋血管ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）において群間の有意差は認められなかった。しかし、肺におけるＣＸＣＲ３＋ＫＬＲＧ１−実質組織ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）は、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを接種したマウスにおいて、ＰＢＳ対照群より有意な増加が見られた。５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧで免疫したマウスの肺におけるＣＸＣＲ３＋ＫＬＲＧ１−ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）は、ＰＢＳを接種したマウスより高かったが、これらの細胞のうち、Ａｇ８５ＢまたはＥＳＡＴ−６の再刺激によりＩＦＮ−γを産生する細胞の割合（％）は、ＰＢＳを接種したマウスと比べて低かった。以上より、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンにより、マイコバクテリウム・ツベルクローシスに対して防御効果を示すことが知られているＣＤ４＋ Ｔ細胞集団およびＣＸＣＲ３＋ＫＬＲＧ１− Ｔ細胞集団の肺における出現頻度が増加することが分かった。
【００７９】
５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧにより誘導される抗原特異的なＴ細胞応答と防御効果が、ＳＴＩＮＧシグナル伝達および／またはＩ型ＩＦＮ受容体（ＩＦＮＡＲ）を介するＩ型ＩＦＮシグナル伝達に依存しているか否かを調べるために、ＳＴＩＮＧの機能的コピーを持たないマウス（Ｓｔｉｎｇｇｔ／ｇｔ）（Sauer et al. 2011）またはＩＦＮＡＲ（Ｉｆｎａｒ−／−）の機能的コピーを持たないマウスに、下記のスケジュールで免疫を行った：１２週間前にＢＣＧ接種、ＣＤＮでプライミング；８週間前、４週間前にＣＤＮでブースト；７週間前、３週間前にＥＬＩＳＰＯＴ／ＩＣＳ；４週間後にＣＦＵ／ＩＣＳ；１２週間後にＣＦＵ。２回目のブースト免疫から７日後、Ａｇ８５Ｂ特異的なＴ細胞応答もＥＳＡＴ−６特異的なＴ細胞応答もＳｔｉｎｇｇｔ／ｇｔマウスのＰＢＭＣにおいて検出されなかった。この結果より、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧにより促進される抗原特異的なＴ細胞応答は、ＳＴＩＮＧに依存していることが示唆された。興味深いことに、野生型マウスとＩｆｎａｒ−／−マウスとで同等の抗原特異的なＴ細胞応答が見られた。これより、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧによる応答は、ＩＦＮＡＲを介するシグナル伝達に依存していないことが示唆された。
【００８０】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス曝露４週間後および１２週間後の肺におけるＣＦＵは、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧで免疫したＳｔｉｎｇｇｔ／ｇｔマウスと、ＰＢＳを接種したＳｔｉｎｇｇｔ／ｇｔマウスとで同等であったことから、ＲＲ−ＣＤＧの防御効果がＳＴＩＮＧに依存していることが確認された。一方、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧで免疫したＩｆｎａｒ−／−マウスと、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを接種した野生型マウスとで同等の防御能が示された。以上より、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧによる防御能はＳＴＩＮＧ依存性であり、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを接種したマウスにおける、マイコバクテリウム・ツベルクローシス曝露に対する防御的な免疫応答の発現には、ＩＦＮＡＲを介するシグナル伝達は必要ではないことが分かった。
【００８１】
実施例２
ＢＣＧ接種後の５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの鼻腔内接種（皮下接種でない）によるブースト免疫は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス曝露に対する防御能を増強する
【００８２】
ＢＣＧでプライミングしたマウスに、ワクチン接種スケジュール（１２週間前にＣＤＮでプライミング；８週間前、４週間前にＣＤＮでブースト；７週間前にＩＣＳ；３週間前にＥＬＩＳＰＯＴ／ＩＣＳ；４週間後にＣＦＵ／ＩＣＳ；１２週間後にＣＦＵ）に従って、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧまたは５Ａｇのみを２回皮下注射してブースト免疫を行い、上記と同様の方法で５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを３回注射したマウスと比較した。２回目のブースト免疫後のＥＬＩＳＰＯＴ解析により、ＢＣＧで免疫したマウスに５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを皮下接種してブースト免疫を行った場合、ＢＣＧのみで免疫したマウスと比較して、Ａｇ８５Ｂ特異的なＴ細胞応答およびＥＳＡＴ−６特異的なＴ細胞応答が増強されることが示された。しかし、ＢＣＧで免疫した後、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを皮下接種してブースト免疫を行ったマウスと、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧのみを３回皮下投与したマウスとでＩＦＮ−γ量に差は見られなかった。さらに、ＢＣＧ接種後に５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを皮下接種してブースト免疫を行っても、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのエアロゾル曝露に対する防御能は増強されなかった。
【００８３】
この結果を、鼻腔内経路で５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを粘膜投与した場合と比較することを試みた。そこで、ＢＣＧ接種後に鼻腔内接種でブースト免疫を行う、ＢＣＧ／ＣＤＮまたはＣＤＮを用いたワクチン接種スケジュール（いずれも上記を参照のこと）に従い、マイコバクテリウム・ツベルクローシス感染に対する防御能が、鼻腔内接種でブースト免疫を行った場合に増強されるか否かを調べた。Ａｄｄａｖａｘは鼻腔内ワクチン接種に適さないため、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧはＰＢＳを用いて製剤化した。２回目のブースト免疫から７日後、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの鼻腔内投与により、ＰＢＳを接種したマウスと比べて、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γを産生するＡｇ８５Ｂ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞が増加した。しかし、鼻腔内ワクチン接種では、皮下ワクチン接種より、誘導されるＩＦＮ−γ産生細胞数は有意に少なかった。一方、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを鼻腔内投与した場合、Ａｇ８５Ｂペプチドプールで再刺激した後にＣＤ４＋ Ｔ細胞の強力なＩＬ−１７応答が誘導された。この応答は、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの皮下投与またはＢＣＧ接種では見られなかった。
【００８４】
鼻腔内に送達されたＣＤＮワクチンの防御効果を確認するために、ワクチン接種したマウスをマイコバクテリウム・ツベルクローシスに曝露した。予想された通り、ＢＣＧ接種したマウスまたは５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチンを皮下接種したマウスでは、いずれも肺における防御能は対数値で約１であった。一方、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを鼻腔内投与した場合の曝露４週間後の制御能は、対数値でさらに約０．５高く、曝露１２週間後も制御能が他群より高い傾向はみられたが、統計学的に有意ではなかった。注目すべき点として、ＢＣＧワクチンを接種したマウスに５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを鼻腔内接種してブースト免疫を行った場合、ＢＣＧを単独接種した場合と比較して、曝露１２週間後の肺におけるＣＦＵは有意に低く、感染防御能は対数値で２より大きかったことが挙げられる。皮下にワクチン接種した場合と同様、鼻腔内にワクチン接種したマウスの肺における曝露４週間後のＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞の割合（％）は、ＰＢＳを接種したマウスにおいて感染で誘導された応答レベルを超えることはなかった。しかし、曝露前に血液中で確認されたＴｈ１７細胞の増加は、曝露後、肺でＩＬ−１７を産生するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）が高いことに反映されていた。５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを鼻腔内接種して免疫感作を行った場合、またはＢＣＧ接種後に５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧを鼻腔内接種してブースト免疫を行った場合のＩＬ−１７＋ Ｔ細胞数は、ＢＣＧ単独で接種した場合、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧ単独で皮下投与した場合、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧをブースターワクチンとして皮下投与した場合のいずれの場合と比較しても、有意に増加していた。以上より、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの鼻腔内送達により、感染に対する強力な防御能が得られ、ＢＣＧとの併用により、相加作用が得られることが分かった。さらに、鼻腔内経路で誘導される防御能は、Ｔｈ１細胞の増加とは相関が認められなかったが、Ｔｈ１７ Ｔ細胞の増加とは相関が認められた。
【００８５】
野生型マウスおよびＩＬ−１７欠損マウス（Ｉｌ１７ａ−／−）に、５Ａｇとともに製剤化されたＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰを鼻腔内経路または皮下経路で接種して免疫感作を行い、その後、マイコバクテリウム・ツベルクローシスを曝露した。ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰでも、ＲＲ−ＣＤＧと同等の防御能が野生型マウスで認められた。皮下経路で送達した場合、このワクチンによる防御能は、ＩＬ−１７非依存性であった。しかし、ＩＬ−１７欠損マウスでは、鼻腔内投与による追加の防御能が減弱したことから、鼻腔内経路のワクチン接種で誘導される防御能はＩＬ−１７により増強されることが分かった。
【００８６】
実施例３
ヒトＳＴＩＮＧアゴニストであるＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰはＴｈ１７応答を誘導し、マイコバクテリウム・ツベルクローシス曝露に対する防御能を付与する
【００８７】
ＲＲ−ＣＤＧは、マウスＳＴＩＮＧを効率的に活性化するが、ヒト集団で一般的に見られる５種類のＳＴＩＮＧ対立遺伝子のすべてに関与するものではない（Corrales et al. 2015; Yi et al. 2013）。ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰは、非標準の２’−５’ホスホジエステル結合と標準の３’−５’ホスホジエステル結合を有する（混合型結合を表す、ＭＬ）、ｃＧＡＭＰのジチオ置換ジアステレオマーであり、ホスホジエステラーゼによる加水分解に対する抵抗性を有し、一般的な５種類のヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子の強力な活性化剤である（Corrales et al. 2015）。そこで、このＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰのアジュバント活性を調べた。マウスに５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧまたは５Ａｇ／ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰを鼻腔内経路または皮下経路で接種して免疫感作を行い、１回目のブースト免疫から７日後、ＩＬ−１７またはＩＦＮ−γを産生するＡｇ８５Ｂ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の血中の出現頻度を測定した。５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧワクチン、５Ａｇ／ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰワクチンのいずれを鼻腔内接種した場合も、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＩＬ−１７産生ＣＤ４＋ Ｔ細胞が誘導された。５Ａｇ／ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰを皮下接種した場合は、ＩＬ−１７産生Ｔ細胞は誘導されなかったが、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞は、鼻腔内接種で免疫感作を行った場合より多く誘導された。この傾向は、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの皮下接種による免疫感作と鼻腔内接種による免疫感作を比較した際に見られた傾向と同様である。
【００８８】
５Ａｇ／ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰワクチンを接種したマウスに、病原性マイコバクテリウム・ツベルクローシスを曝露し、曝露４週間後の肺におけるＣＦＵを指標として防御能を評価した。重要なことに、５Ａｇ／ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰを単独のワクチンとして鼻腔内接種して免疫感作を行った場合、防御能は対数値で約１．５であり、５Ａｇ／ＲＲ−ＣＤＧの場合と同等の効果が得られた。これらのデータから、ＳＴＩＮＧ活性化作用を有し、ヒトワクチンへの橋渡しの可能性を有する化合物であるＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰは、タンパク質サブユニットワクチンでアジュバントとして使用した場合に、ＲＲ−ＣＤＧと同様の作用を示すことが分かる。
【００８９】
参考文献
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