(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬に関し、式中Ｍは一価のアルカリ金属である。本発明はまた、式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬の製造方法、それを含有する医薬組成物及びＣＣＲ４の治療に使用される医薬の調製におけるその使用に関する  【選択図】    化３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬：
【化２０】
2021510383.tif 000026
式中、Ｍは一価のアルカリ金属である。
【請求項２】
ＭがＬｉ、Ｎａ、Ｋ、ＲｂまたはＣｓである、請求項１に記載の化合物またはその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬。
【請求項３】
ＭがＮａまたはＫである、請求項２に記載の化合物またはその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬ならびにそれと混合される医薬上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬を投与することを含む、それを必要としている対象におけるＣＣＲ４を介する疾患の治療方法。
【請求項６】
ＣＣＲ４を介する疾患の治療のための薬物の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬の使用。
【請求項７】
請求項６に記載の式Ｉ化合物またはその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬の使用であって、前記ＣＣＲ４を介する疾患は以下を含む：
（１）呼吸器疾患：例えば以下を含む気道の閉塞性疾患：気管支、アレルギー性、内因性、外因性、運動誘発性、薬剤誘発性（アスピリンおよびＮＳＡＩＤ誘発性を含む）および粉塵誘発性喘息、および間欠性および永続性両方の喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；感染性および好酸球性気管支炎を含む気管支炎；気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；過敏性肺炎；原因不明線維化肺胞炎、特発性間質性肺炎、抗新生物治療ならびに慢性感染に合併する線維症を含む肺線維症；肺脈管構造の血管炎性および血栓性障害、および肺高血圧；薬物性鼻炎および血管運動神経性鼻炎を含む急性および慢性鼻炎；神経性鼻炎を含む通年性アレルギー性および季節性アレルギー性鼻炎；普通の風邪、および呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルスおよびアデノウイルスが原因の感染を含む急性ウイルス感染；
（２）骨および関節の炎症：例えば骨関節症／変形性関節症に関連するまたはそれらを含む関節炎；頚部および腰部脊椎炎、および背下部および頚部痛；骨粗鬆症；慢性関節リウマチ；尿酸痛風、ピロリン酸カルシウム沈着疾患、およびカルシウムアパタイト関連腱、滑液包および滑膜炎症を含む急性および慢性滑膜炎；皮膚筋炎および多発性筋炎を含む炎症性ミオパシー；リウマチ性多発筋痛症；任意の関節に分布する特発性炎症性関節炎を含む若年性関節炎および関連症候群、およびリウマチ性熱およびその全身性合併症；薬剤誘発性関節痛、腱炎、およびミオパシー；
（３）乾癬と炎症性皮膚病、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、風疹と掻痒症；
（４）眼炎と眼瞼炎：通年性および春季アレルギー性結膜炎を含む結膜炎；虹彩炎；前部および後部ブドウ膜炎；脈絡膜炎；自己免疫；網膜を影響する変性または炎症性障害；交感神経性眼炎；サルコイドーシス；ウイルス、真菌、および細菌感染症を含む眼炎；
（５）その他のＣＣＲ４に関連する疾患、例えば胃腸炎症、生殖泌尿系炎症、および免疫系炎症など。
【請求項８】
請求項７に記載の式Ｉ化合物またはその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬の使用であって、前記ＣＣＲ４を介する疾患は呼吸器疾患：例えば以下を含む気道の閉塞性疾患：気管支、アレルギー性、内因性、外因性、運動誘発性、薬剤誘発性（アスピリンおよびＮＳＡＩＤ誘発性を含む）および粉塵誘発性喘息、および間欠性および永続性両方の喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；感染性および好酸球性気管支炎を含む気管支炎；気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；過敏性肺炎；原因不明線維化肺胞炎、特発性間質性肺炎、抗新生物治療ならびに慢性感染に合併する線維症を含む肺線維症；肺脈管構造の血管炎性および血栓性障害、および肺高血圧；薬物性鼻炎および血管運動神経性鼻炎を含む急性および慢性鼻炎；神経性鼻炎を含む通年性アレルギー性および季節性アレルギー性鼻炎；普通の風邪、および呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルスおよびアデノウイルスが原因の感染を含む急性ウイルス感染であり；
好ましいは、前記ＣＣＲ４を介する疾患は喘息、ＣＯＰＤと鼻炎である。
【請求項９】
式Ｉ化合物を製造する方法であって、
【化２１】
2021510383.tif 000027
ここで、Ｍは一価のアルカリ金属、例えばＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ又はＣｓであり、好ましくはＮａ又はＫであり、
この方法は、有機溶媒中で、下式化合物６を
【化２２】
2021510383.tif 000028
前記アルカリ金属Ｍの強アルカリと攪拌反応させた後、濾過乾燥し、
中でも、化合物６と前記アルカリ金属Ｍの強アルカリとのモル比が１：０．５〜２であることが好ましく、約１：１であることがより好ましい。
【請求項１０】
前記Ｍの強アルカリがＭの水素化物またはＭのアルコール塩基であり、前記化合物６を有機溶媒に溶解させ、ＭＨまたはＭのアルコール塩基を加え、攪拌反応した後、濾過乾燥することを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１８年１月１２日に出願した、出願番号２０１８１００３２４１０．２、発明の名称が「化合物及びその製造方法並びに用途」である中国特許出願の優先権を主張し、その内容全体が参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、新規化合物またはその医薬上許容可能な塩、溶媒和物もしくは前薬に関する。本発明はまた、当該新規化合物またはその医薬上許容可能な塩、溶媒和物または前薬を製造する方法、それを含有する医薬組成物、およびＣＣＲ４を介する疾患の治療に用いる薬物の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＣＲ４（ケモカイン受容体４）は、１９９５年Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ａ．Ｐｏｗｅｒらに最初に発見された（クリスティンＡＰら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．１９９５，２７０（８）：１９４９５−１９５００）ケモカイン受容体（ＣＣＲ）ファミリーの一員で、７回膜貫通のＧ−タンパク質共役受容体である。ＣＣＲ４には、ＭＤＣ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）とＴＡＲＣ（ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）という天然に存在する特異的なリガンドが２つある（Ｓａｄａｔｏｓｈｉ  Ｍａｅｄａ等ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００２（９０）：１４５−１５４）。最近発見されたケモカイン様因子１（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ  １、ＣＫＬＦ１）もそのリガンドの一つである（Ｈａｎ  ＷＬらＢｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、２００１、３５７（ｐｔ１）：１２７−１３５）。
【０００４】
ＣＣＲ４は末梢血白血球、胸腺細胞、好塩基性白血球、単球、マクロファージ、血小板、ＩＬ−活性化ＮＫ細胞、脾と脳に発現でき、多くの疾患に重要な役割を果たす。例えば、人アレルギー性皮膚炎（ＡＤ）が発生する場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＣＣＲ４は末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣｓ）で発現が増加し、血清中のＴＡＲＣレベルもそれに応じて増加する。これはＣＣＲ４の細胞発現のケモカイン現象がＴＡＲＣによって誘導され、人間のアトピー性皮膚炎時にＴｈ２細胞を選択的に損傷皮膚に移行させることを示している。アレルギー性皮膚炎を治療する薬は主に抗ヒスタミン薬、気管支拡張剤が挙げられるが、症状を改善するしかなく、病気の発展には役立たない。また、皮質ステロイド化合物はアレルギー性皮膚炎にも一定の作用があるが、安全上の問題がある。ＭＤＣやＴＡＲＣに対する拮抗はＴ細胞の炎症部位への集積を減少させ、ＣＣＲ４拮抗剤はアレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎を含むアレルギー性炎症の治療に有効である可能性があるとの研究がある。
【０００５】
ＣＣＲ４は、例えば慢性閉塞性肺炎、慢性気管支炎と喘息などの肺疾患にも大きな関係があることがわかった。ＣＣＲ４は喘息反応に関与する細胞に制限的に発現でき、喘息治療の良い標的とされている。そのため、ＣＣＲ４拮抗薬を開発することは良い応用の見通しがある。
【０００６】
ＣＮ１０１３７０７９３Ａは、下式を有する化合物とＣＣＲ４拮抗薬としてのその用途を開示し、ＣＣＲ４拮抗薬に関連する治療におけるその使用を含む、
【化１】
2021510383.tif 000003
その中の各置換基は、この出願に開示されているように定義されている。
【０００７】
ＣＮ１０２３８８０３９Ａは、ある種類のインダゾール化合物とそのＣＣＲ４拮抗薬としての用途を開示し、ＣＣＲ４拮抗薬に関する治療への応用を含んでいる。
【化２】
2021510383.tif 000004
その中の各置換基は、この出願に開示されているように定義されている。
【０００８】
当分野では、より良いＣＣＲ４阻害剤依然として必要であり、例えば、より良いＣＣＲ４阻害活性を持っているか、水や他の溶媒に対する溶解度がより高いか、生物利用度がより高いかなどが依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、式Ｉの化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬を提供する。
【化３】
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式中、Ｍは一価のアルカリ金属である。例えば、ＭはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ又はＣｓである。好ましいは、ＭはＮａまたはＫである。
本発明の第一の態様では、前記式Ｉの化合物は下記式ＩＩの化合物である。
【化４】
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本発明の第二の態様では、前記式Ｉの化合物は下記式ＩＩＩの化合物である。
【化５】
2021510383.tif 000007
【００１０】
本発明の式Ｉ化合物の適切な医薬上許容可能な塩としては、例えば無機酸または有機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸またはマレイン酸）との酸付加塩、アンモニウム塩、または有機塩基（メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリンまたはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミンなど）との塩を挙げることができる。
【００１１】
本発明の式Ｉ化合物の適切な医薬上許容可能な溶媒和物としては、水和物などが挙げられ、例えば半水和物、一水和物、二水和物または三水和物、あるいはその選択可能な組合せ量である。
【００１２】
本発明の化合物は、人や動物の体内で分解して本発明の化合物を放出する前薬として投与することができる。前薬の例としては、式Ｉ化合物のカルボキシル基または水酸基に形成可能な体内で分解できるエステル誘導体と、式Ｉ化合物のカルボキシル基またはアミノ基に形成可能な体内で分解できるアミド誘導体を挙げることができる。
【００１３】
式Ｉ化合物の医薬上許容可能な前薬は、例えば、その体内で分解可能なエステルやエーテルを挙げることができる。水酸基を含む式Ｉ化合物の体内で分解可能なエステルまたはエーテルは、例えば、ヒトや動物の体内で分解して母体水酸基化合物を産生する医薬上許容可能なエステルまたはエーテルである。水酸基に対して、適切な薬学的に許容されるエステル形成基としては、リン酸エステル（アミノリン酸環エステルを含む）などの無機エステルが挙げられる。水酸基に対して、適切な医薬上許容可能なエステル形成基としては、（１−１０Ｃ）アルカノイル基（例えばアセチル基、ベンゾイル基、フェニルアセチル基、置換ベンゾイル基とフェニルアセチル基など）、または（１−１０Ｃ）アルコキシカルボニル基（例えばエトキシカルボニル基、Ｎ，Ｎ−［ジ−（１−４Ｃ）アルキル］カルバモイル基、２−ジアルキルアミノアセチル基、２−カルボキシアセチル基など）が挙げられる。フェニルアセチル基及びベンゾイル基上の環置換基としては、アミノメチル基、Ｎ−アルキルアミノメチル基、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノメチル基、モルホリノメチル基、ピペラジン−１−イルメチル基、４−（１−４Ｃ）アルキルピペラジン−１−イルメチル基などが挙げられる。水酸基には、適切な医薬上許容可能なエーテル形成基としては、アセトキシメチル基やピバロイルオキシメチル基などのα−アシルオキシアルキル基が挙げられる。
【００１４】
本発明の式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬はＣＣＲ４阻害剤の活性を有する。従って、本発明の式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬は、ＣＣＲ４を介する疾患の治療またはＣＣＲ４を介する疾患の治療のための薬物の調製に使用することができる。具体的には、本発明の式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬は、ＣＣＲ４の調節（例えばＣＣＲ４の活性を抑制する）が患者に有利な疾患の治療に用いることができる。
【００１５】
本発明の１つの態様では、上記式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬と、それと混合する医薬上許容可能な賦形剤例えば希釈剤又は担体とを含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物はＣＣＲ４を介する疾患の治療に用いられる。
【００１６】
本発明の医薬組成物は、当分野でよく知られている従来の薬用賦形剤を用いて通常の方法により得られる。例えば、経口的に使用したい組成物に含まれ得る賦形剤は、着色剤、甘味剤、矯味剤及び／又は防腐剤の１種又は２種以上である。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、経口投与に適した形式（例えば、錠剤、トローチ、ハードまたはソフトカプセル、水または油懸濁液、乳剤、分散可能な粉剤または顆粒剤、シロップ剤またはエリキシル剤）、局所使用に適した形式（例えばクリーム剤、ソフトペースト、ゲル剤または水または油性溶液または懸濁液）、吸入投与に適した形式（例えば微細分散粉剤または液体エアロゾル）、吹き込み投与に適した形式（例えば微細分散粉剤）、胃腸外投与に適した形式（例えば静脈内、皮下、腹膜内あるいは筋肉内投与のための無菌水や油性溶液、あるいは直腸投与のための坐剤）を採用することができる。
【００１８】
１種類または複数種類の賦形剤と組み合わせて単一の剤形を形成する活性成分の量は必要に応じて変化し、治療の対象と特定の投与経路に依存する。例えば、経口投与したい製剤は、通常、例えば適切で便利な量の賦形剤と混合した活性成分０．１ｍｇ〜１ｇ（より好ましくは１−２５０  ｍｇ、例えば１−１００  ｍｇ）を含有し、前記賦形剤は全組成物重量の約５−９８％を占める。
【００１９】
治療や予防の目的に用いられる式Ｉ化合物やその医薬上許容可能な塩、溶媒和物や前薬の量は、通常、病気の性質や重症度、動物や患者の年齢や性別や投与経路によって、よく知られている医学原則によって変わる。
【００２０】
本発明の１つの態様では、上記で定義した式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬を提供し、ＣＣＲ４を介する疾患を治療（又は予防）するために使用する。
【００２１】
本発明のさらに別の態様では、ＣＣＲ４を介する疾患の治療（又は予防）のための薬物の製造における、上記で定義した式Ｉ化合物又はその医薬上許容可能な塩、溶媒和物又は前薬の使用を提供する。
【００２２】
ＣＣＲ４を介する病気は炎症や感染に関連する病気および状態でもよい。ＣＣＲ４を介する疾患は以下を含む：
（１）呼吸器疾患：以下を含む気道の閉塞性疾患：気管支、アレルギー性、内因性、外因性、運動誘発性、薬剤誘発性（アスピリンおよびＮＳＡＩＤ誘発性を含む）および粉塵誘発性喘息、および間欠性および永続性両方の喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；感染性および好酸球性気管支炎を含む気管支炎；気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；過敏性肺炎；原因不明線維化肺胞炎、特発性間質性肺炎、抗新生物治療ならびに慢性感染に合併する線維症を含む肺線維症；肺脈管構造の血管炎性および血栓性障害、および肺高血圧；薬物性鼻炎、および血管運動神経性鼻炎を含む急性および慢性鼻炎；神経性鼻炎を含む通年性アレルギー性および季節性アレルギー性鼻炎；普通の風邪、および呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルスおよびアデノウイルスが原因の感染を含む急性ウイルス感染；
（２）骨および関節：骨関節症／変形性関節症に関連するまたはそれらを含む関節炎；頚部および腰部脊椎炎、および背下部および頚部痛；骨粗鬆症慢性関節リウマチ；尿酸痛風、ピロリン酸カルシウム沈着疾患、およびカルシウムアパタイト関連腱、滑液包および滑膜炎症を含む急性およ  び慢性結晶誘発性滑膜炎；皮膚筋炎および多発性筋炎を含む炎症性ミオパシー；リウマチ性多発筋痛症；どんな関節分布であれ特発性炎症性関節炎を含む若年性関節炎および関連症候群、およびリウマチ性熱およびその全身性合併症；薬剤誘発性関節痛、腱炎、およびミオパシー；
（３）乾癬と炎症性皮膚病、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、風疹と掻痒症
（４）眼炎と眼瞼炎；通年性および春季アレルギー性結膜炎を含む結膜炎；虹彩炎；前部および後部ブドウ膜炎；脈絡膜炎；自己免疫；網膜に影響する変性または炎症性障害；交感神経性眼炎；サルコイドーシス；ウイルス、真菌、および細菌感染症を含む眼炎；
（５）その他ＣＣＲ４に関連する疾患、例えば胃腸炎症、生殖泌尿系炎症および免疫系炎症など。
【００２３】
本発明のさらに別の態様では、式Ｉ化合物を製造する方法を提供する。
【化６】
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ここで、Ｍは一価のアルカリ金属、例えば、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ又はＣｓである。好ましいはＮａまたはＫである。前記方法は、有機溶媒中で、下記式６化合物を
【化７】
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【００２４】
１価のアルカリ金属Ｍの強アルカリと攪拌反応してから、濾過乾燥させる。好ましいは、前記化合物６と前記一価のアルカリ金属Ｍの強アルカリとのモル比は１：０．５〜２である。より好ましいは、前記化合物６と前記一価のアルカリ金属Ｍの強アルカリのモル比は約１：１である。
【００２５】
この反応は、適当な有機溶媒中で行われる。例えば、前記有機溶媒は、エステル類、芳香族炭化水素類、エーテル類、アルコール類又はその他の水溶性極性溶媒である。前記エステル類溶媒は、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル又は酢酸ブチルが挙げられ；前記芳香族炭化水素系溶媒はベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、イソプロピルベンゼンまたはキシレンが挙げられ；前記エーテル系溶剤はエーテル、イソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル又はジエチレングリコールジメチルエーテルが挙げられ；前記アルコール系溶媒はメタノール、エタノール、プロパノール、ｎ−ブタノール又はエチレングリコールが挙げられ；前記他の水溶性極性溶媒はアセトン、メチルエチルケトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド又はジメチルスルホキシドが挙げられる。前記一価のアルカリ金属Ｍの強アルカリは、Ｍの水素化物、例えばＮａＨやＫＨでもよい。前記一価のアルカリ金属Ｍの強アルカリは、Ｍのアルコール塩基、例えばｔ−ブチルアルコールナトリウムやｔ−ブチルアルコールカリウムでもよい。前記強アルカリには、このアルカリ金属Ｍの酸化物、水酸化物または炭酸水素酸塩なども含まれる。本発明のさらに別の側面では、前記方法は、前記化合物６を有機溶媒に溶解させた後、ＭＨまたはＭのアルコール塩基を加え、攪拌反応（例えば、１５℃〜３５℃で、１〜３．５時間攪拌反応）  させた後、濾過乾燥することを含む。好ましいは、前記化合物６と前記ＭＨ又はＭのアルコール塩基とのモル比は１：０．５〜２であり、より好ましいは、前記化合物６と前記ＭＨ又はＭのアルコール塩基とのモル比は約１：１である。
【００２６】
本発明の一態様では、下記式ＩＩの化合物を製造する方法が提供される。
【化８】
2021510383.tif 000010
ここで、前記化合物６を有機溶媒に溶解した後、ＮａＨを加え、撹拌反応（例えば、１５℃〜３５℃の温度で１〜３．５時間撹拌反応）させた後、ろ過乾燥する。好ましいは、化合物６とＮａＨのモル比は１：０．５〜２、より好ましくは約１：１である。
【００２７】
本発明の一態様では、下記式ＩＩＩの化合物を製造する方法が提供される。
【化９】
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ここで、前記化合物６を有機溶媒に溶解した後、ＫＨを加え、撹拌反応（例えば、１５℃〜３５℃の温度で１〜３．５時間撹拌反応）させた後、ろ過乾燥する。好ましいは、化合物６とＫＨのモル比は１：０．５〜２、より好ましくは約１：１である。
【００２８】
本発明の一態様では、下記式ＩＩＩの化合物を製造する方法が提供される。
【化１０】
2021510383.tif 000012
【００２９】
ここで、前記化合物６を有機溶媒に溶解した後、ｔ−ブチルアルコールカリウムを加え、攪拌反応（例えば、１５℃〜３５℃の温度で１〜３．５時間攪拌反応）させた後、濾過乾燥する。好ましいは、化合物６とｔ−ブチルアルコールカリウムのモル比は１：０．５〜２、より好ましくは約１：１である。
【００３０】
従来技術のＣＣＲ４抑制剤は溶解度が低く、それによって薬物製剤の難度を増加し、薬物活性成分の釈放を影響し、生物利用が低すぎることを招き、最大の安全な用量では体内で予期した効果のある血中濃度を達成できない問題が存在し、薬物の治療効果を影響することが知られている。本発明が提供する式Ｉ化合物、特に式ＩＩと式ＩＩＩ化合物は、より良いＣＣＲ４阻害剤であり、従来技術と比較して明らかな優位性を有し、その優位性は以下の通りである。
１．顕著に増強された溶解度。式ＩＩ化合物と式ＩＩＩ化合物は化合物６と比べて、同じ条件で有意に高い溶解度を持っている。例えば、室温水溶液では、式ＩＩ化合物と式ＩＩＩ化合物の溶解度は５００ｍｇまたは４０ｍｇ／ｍｌであり、同様の条件で化合物６の溶解度は０．０２ｍｇ／ｍｌであり、比較して溶解度は２０００−２５０００倍向上した。
２．より優れた生物利用度。標準的なＣａＣＯ−２体外透膜評価結果によると、化合物６のＰａｐｐ（見かけの浸透係数）は０．１３×１０−６で、難吸収性化合物である。それに対し、式ＩＩ化合物と式ＩＩＩ化合物の同じ実験条件でのＰａｐｐは６８．８２〜１０１．３３×１０−６であり、透膜性が５３０〜７８０倍向上し、易吸収性化合物である。
３．より優れた内外活性。放射標識実験は、本発明の式ＩＩ化合物と式ＩＩＩ化合物のＩＣ５０が２．２６×１０−９ｍｏｌ／Ｌ〜７．４７×１０−１０ｍｏｌ／Ｌであり、活性が同じ実験条件で化合物６により６と２１０倍向上したことを証明した。
【００３１】
以下、実施例により本発明の本質的な内容と有益な効果をさらに説明する。実施形態は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
実施例１    Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チェニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアミドの調製
【００３２】
下記式６の化合物Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チェニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアミドを調製する。
【化１１】
2021510383.tif 000013
【００３３】
プロセス１    中間体化合物１      ４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−アミンの調製
【化１２】
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【００３４】
６−フルオロ−２−（メチルオキシ）ベンゾニトリル（５０ｇ、０．３３ｍｏｌ）とヒドラジン水和物（５０ｇ、０．９９ｍｏｌ）をｎ−ブタノール４００ｍｌに溶解し、窒素雰囲気下で２０ｈ還流反応させた。溶液を冷却した後、水４００ｍｌを添加して均一に攪拌し、有機層を分離し、水相中に析出した固体を収集した。有機層の溶媒を減圧留去し、残渣と水相および水相に析出した固体を混合し、酢酸エチルを用いて抽出した（３×４００ｍｌ）。有機層を水で逆洗（２×４００ｍｌ）、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して灰白色固体（４６．３２ｇ、収率８５．８％）を得た。ＭＳ  ＥＳＩ＋  １６４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００３５】
プロセス２      中間体化合物２        ３−｛［３−アミノ−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝ベンゾニトリルの調製
【化１３】
2021510383.tif 000015
【００３６】
水酸化カリウム（９ｇ，１６０．７ｍｍｏｌ）とＤＭＳＯ（２００ｍｌ）を混合し、均一に攪拌した。４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−アミン（１０．４８ｇ、６４．３ｍｍｏｌ）を加え、溶液が濃い紫色になった。室温で１０分間攪拌した後、３−（クロロメチル）ベンゾニトリル（１１．８ｇ、６４．３ｍｍｏｌ）を加え、引き続き２ｈ攪拌した。反応液に水５００ｍｌを加え、反応混合物をエマルジョンを形成させた。塩化メチレン用いて抽出した（３×４００ｍｌ）、水逆洗（２×４００ｍｌ）、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／酢酸エチル＝５／１）で処理し、溶媒を減圧留去し、真空乾燥させた。淡黄色固体（１３．２２ｇ、収率７３．９％）を得た。ＭＳ  ＥＳＩ＋２７９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００３７】
プロセス３      中間体化合物３      ５−クロロ−Ｎ−｛１−［（３−シアノフェニル）メチル］−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル｝−２−チオフェンスルホンアミドの調製
【化１４】
2021510383.tif 000016
【００３８】
室温および窒素雰囲気中で、５−クロロ−２−チオフェンスルホニルクロリド（７．９６ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）のピリジン（１２ｍｌ）溶液を、３−｛［３−アミノ−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝ベンゾニトリル（１０．２ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）を入れた両口瓶に滴下した。反応系は濃い赤色になった。１ｈ後、反応液を塩酸５００ｍｌ（２ｍｏｌ／Ｌ）に注ぎ、塩化メチレンで抽出（４×５００ｍｌ）し、水を逆洗（３×５００ｍｌ）、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／酢酸エチル＝１００／１）で処理し、溶媒を減圧留去し、真空乾燥させた。白色固体（１３．４３ｇ、収率７９．９％）を得た。ＭＳ  ＥＳＩ＋４５９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００３９】
プロセス４    中間体化合物４      Ｎ−［１−｛［３−（アミノメチル）フェニル］メチル｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−５−クロロ−２−チオフェンスルホンアミド塩酸塩の調製
【化１５】
2021510383.tif 000017
【００４０】
５−クロロ−Ｎ−｛１−［（３−シアノフェニル）メチル］−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル｝−２−チオフェンスルホンアミド（１５．７５ｇ，３４．４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２００ｍｌに溶解し、０℃で放置した。窒素雰囲気中で、反応系に温度を１０℃以下に維持しつつ１．０Ｍリチウム四水素アルミニウムのＴＨＦ溶液（８６ｍｌ、８６ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下終了後、反応系を室温に移して２ｈ撹拌を続けた。水１０ｍｌ、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液６０ｍｌを添加して急冷させた（急冷過程は大量に発熱し、氷水浴中で行った）。３０分撹拌後、固体を濾過して除去し、ＴＨＦでケーキを洗浄し、濾液を合併した。ろ液はシリカゲルカラムで処理し、これを濾過してメタノールで洗浄し、続いて２．５Ｌ中の１０％２Ｎ塩酸で洗浄した。必要な留分を併合し、濃縮した。生成固体を濾過して収集し、水で洗浄した。固体を真空乾燥させ、白色固体（１２．６ｇ、収率７３．６％）を得た。ＭＳ  ＥＳＩ＋４６３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００４１】
プロセス５      中間体化合物５          ２−｛［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ基｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］アミノ基｝−１，１−ジメチル−２−オキシエチルアセテートの調製
【化１６】
2021510383.tif 000018
【００４２】
氷水浴条件下で、Ｎ−［１−｛［３−（アミノメチル）フェニル］メチル｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５−クロロ−２−チオフェンスルホンアミド塩酸塩（１５．６ｇ，３１．３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９．６ｇ，９５ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン４００ｍｌを混合し、均一に攪拌した。その後、２−クロロ−１，１−ジメチル−２−オキシエチルアセテート（５．２ｇ，３１．３ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下終了後、室温かつ窒素雰囲気中で２ｈ撹拌を続けた。塩酸２ｍｏｌ／Ｌ（１５０ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５０ｍｌ）、飽和食塩水（１５０ｍｌ）  をそれぞれ用いて洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１／１）で処理し、溶媒を減圧留去し、真空乾燥して白色フォーム状固体（１４．１ｇ、収率７６．３％）を得た。ＭＳ  ＥＳＩ＋５９１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００４３】
プロセス６      化合物６        Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアミドの調製
【化１７】
2021510383.tif 000019
【００４４】
２−｛［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］アミノ｝−１，１−ジメチル−２−オキシエチルアセテート（６．５５ｇ，１１．１ｍｍｏｌ）を溶かしたメタノール（３５０ｍｌ）溶液に炭酸カリウム（４．６ｇ，３３．３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４ｈ攪拌し、系内に大量の固体を析出した。溶媒を減圧留去し、蒸して乾かした後、水１００ｍｌを加え、２ｍｏｌ／Ｌの塩酸でＰＨを酸性になるまで調整した。酢酸エチルで抽出（２００ｍｌ×２）し、水層が中性になるまで抽出液を水で逆洗（２００ｍｌ×２）した。有機層は無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１／１．５）で処理し、溶媒を減圧留去し、真空乾燥して白色固体（５．０８ｇ、収率８３．５％）を得た。
ＭＳ  ＥＳＩ＋５４９（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１０．４０（ｓ，１Ｈ），８．１３（ｔ，１Ｈ），７．３３（ｄ，１Ｈ），７．２４−７．０８（ｍ，６Ｈ），６．９３（ｄ，１Ｈ），６．４６（ｄ，１Ｈ），５．４５（ｓ，２Ｈ），５．３３（ｓ，１Ｈ），４．１７（ｄ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），１．２０（ｓ，６Ｈ）。
【００４５】
実施例２      式ＩＩ化合物        Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドナトリウム塩の調製
【化１８】
2021510383.tif 000020
【００４６】
式６の化合物Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（２．５ｇ，４．５６ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン３０ｍｌに溶解させ、溶液が清澄になるまで撹拌した。系内にＮａＨ（６０％）（１８２ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で１．０ｈ攪拌した。系内に大量の白色固体が発生し、ろ過して白色固体を得て、テトラヒドロフランで洗浄し、真空乾燥箱に移して乾燥した。白色固体（２．０９ｇ、収率８０．４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．０８（ｔ，１Ｈ），７．２０（ｄ，１Ｈ），７．１４−６．７８（ｍ，７Ｈ），６．２０（ｄ，１Ｈ），５．３３（ｓ，１Ｈ），５．１９（ｓ，２Ｈ），４．１６（ｄ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），１．２１（ｓ，６Ｈ）。
【００４７】
実施例３    式ＩＩＩ化合物    Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドカリウム塩の調製
【化１９】
2021510383.tif 000021
【００４８】
方法１：式６の化合物Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（２．５ｇ，４．５６ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン３０ｍｌに溶解させ、溶液が清澄になるまで撹拌した。系内にＫＨ（３０％）（６００ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を加え、１５℃で３．５ｈ攪拌した。系内に大量の白色固体が発生し、ろ過して白色固体を得て、テトラヒドロフランで洗浄し、真空乾燥箱に移して乾燥した。白色固体（２．２１ｇ、収率８３．１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．１０（ｔ，１Ｈ），７．２２（ｄ，１Ｈ），７．１７−６．７９（ｍ，７Ｈ），６．２１（ｄ，１Ｈ），５．３５（ｓ，１Ｈ），５．１９（ｓ，２Ｈ），４．１８（ｄ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），１．２２（ｓ，６Ｈ）。
【００４９】
方法２：式６の化合物Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（１．３７ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン１５ｍｌに溶解させ、溶液が清澄になるまで撹拌した。系内にｔ−ブタノールカリウム（２８０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌した。系内に大量の白色固体が発生し、ろ過して白色固体を得て、テトラヒドロフランで洗浄し、真空乾燥箱に移して乾燥した。白色固体（１．３５ｇ、収率９２．１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．０９（ｔ，１Ｈ），７．２０（ｄ，１Ｈ），７．１３−６．７８（ｍ，７Ｈ），６．２０（ｄ，１Ｈ），５．３４（ｓ，１Ｈ），５．１８（ｓ，２Ｈ），４．１６（ｄ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），１．２１（ｓ，６Ｈ）。
【００５０】
実施例４      溶解度試験
２０１０版薬局方第二部凡例に制定された方法に基づいて化合物の溶解度を測定する。実施例１で調製された化合物６，Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアミドをそれぞれ１０、１００、１０００ｍｇずつ正確に秤量し、２５℃±２℃で５００ｍｌの容量瓶に入れ、水を加えて目盛りまで薄め、５分間ごとに３０秒間強く振って、３０分間内の溶解状況を観察したところ、１０ｍｇのサンプルだけに溶質が見られない、得られたその水への溶解度は０．０２ｍｇ／ｍｌであった。
【００５１】
実施例２で調製された化合物ＩＩ，Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドナトリウム塩をそれぞれ１０，１００，１０００，２０００ｍｇずつ正確に秤量し、２５℃±２℃で２ｍｌの容量瓶に入れ、水を加えて目盛りまで薄め、５分間ごとに３０秒間強く振って、３０分間内の溶解状況を観察したところ、２０００ｍｇ以外のサンプルには溶質が見られない、得られたその水への溶解度は５００ｍｇ／ｍｌであった。
【００５２】
実施例３で調製された化合物ＩＩＩ，Ｎ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドカリウム塩をそれぞれ８、８０、８００、１６００ｍｇずつ正確に秤量し、２５℃±２℃で２ｍｌの容量瓶に入れ、水を加えて目盛りまで薄め、５分間ごとに３０秒間強く振って、３０分間内の溶解状況を観察したところ、８００ｍｇと１６００ｍｇ以外のサンプルには溶質が見られない、得られたその水への溶解度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【００５３】
結果を表１に示す。
【表１】
2021510383.tif 000022
【００５４】
化合物６のＮ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアミドと比較して、式ＩＩ化合物と式ＩＩＩ化合物は同じ条件で顕著に増強された溶解度を有する。室温で水溶液中、式ＩＩ化合物と式ＩＩＩ化合物の溶解度は５００ｍｇ／ｍｌと４０ｍｇ／ｍｌであり、同じ条件でＮ−［（３−｛［３−｛［（５−クロロ−２−チエニル）スルホニル］アミノ｝−４−（メチルオキシ）−１Ｈ−インダゾール−１−イル］メチル｝フェニル）メチル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアミドの溶解度が０．０２ｍｇ／ｍｌであるのに対して、溶解度は２０００−２５０００倍向上した。
【００５５】
実施例５      体外ＣＣＲ４拮抗活性試験
放射性リガンド［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ競争試験により拮抗剤の効力を測定する。簡単に言えば、ＣＣＲ４を発現するＣＨＯ膜を２３Ｇ針で均一にする。その後、測定緩衝液（２０ｍＭ    ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＢＳＡ、４０ｕｇ／ｍｌ  サポニン，ＫＯＨ  ５Ｍを用いてｐＨを７．４に調整させた）にこれらの膜をＷＧＡ−被覆のＬｅａｄｓｅｅｋｅｒ  ＳＰＡビーズに付着させ、３μｇ／孔最終測定濃度（ＦＡＣ）の膜と２５０μｇ／孔のＦＡＣビーズ溶液を生成した。氷の上で６０分間プリカップリングした後、ＧＤＰを加えて４．４ｕＭ  ＦＡＣを得た。次に、測定緩衝液で調製された［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳをビーズ／膜溶液に加え、０．３３ｎＭＦＡＣを得た。人ＭＤＣをビーズ／膜／［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ懸濁液に加え、最大のアゴニスト応答を示す８０％  （ＥＣ８０）のＦＡＣを得た。ビーズ／膜／［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ／アゴニスト懸濁液を白色Ｇｒｅｉｎｅｒポリプロピレン３８４−オリフィス（４５μｌ／オリフィス）に分配し、その中に０．５μｌ化合物を含む。その後、最終測定溶液（４５．５μｌ）を密封し、遠心分離機で遠心し、室温で３〜６時間インキュベートした。そして、Ｖｉｅｗｌｕｘ計でボードを読み取り、発光をＩＣ１００標準拮抗剤による最大抑制応答に対する百分率としてプロットした。評価結果を表２に示す。
【表２】
2021510383.tif 000023
【００５６】
実施例６体外透膜性試験
Ｃａｃｏ−２細胞モデルはヒトクローン結腸腺癌細胞で、構造と機能は分化した小腸上皮細胞に似ており、微絨毛などの構造を有し、小腸ブラシ状の縁上皮に関連する酵素系を含んでいる。体内腸輸送を模擬する実験を行うことができ、すでに薬物の人体小腸吸収を予測するや、薬物輸送のメカニズムを研究するための標準的な体外スクリーニングツールとなっている。薬物吸収能力の判定する方法：Ｐａｐｐ（見かけの浸透係数）、Ｐａｐｐ＞２×１０−６は吸収の良い薬物である。
【００５７】
１．実験材料と器械
Ｃａｃｏ−２細胞（浙江大学薬学部贈呈）、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ＵＳＡ）、標準胎牛血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）、ペニシリン（華北製薬株式会社）、ストレプトマイシン（華北製薬株式会社）  、ＨＥＰＥＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ＵＳＡ）、ＥＤＴＡ−Ｎａ（北京化学工場）、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ、１：２５０、Ａｍｒｅｓｃｏ、ＵＳＡ）、グルタミン（Ｓｉｇｍａ社、ＵＳＡ）、Ｇ４１８（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）、ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ超純水。
Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ挿入式培養皿（ポリカーボネート膜、０．４μｍ、１２ｍｍ径、ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ、ＵＳＡ）、細胞培養板（ＣＯＳＴＡＲ、ＵＳＡ）、細胞抵抗計（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ、ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ、ＵＳＡ）、クリーンワークベンチ（ＳＷ−ＣＪ−ＩＦＤ、蘇州安泰空気技術有限公司）、二酸化炭素培養箱（Ｓａｎｙｏ、Ｊａｐａｎ）、倒立顕微鏡（ＣＫ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ）、培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）。超純水機（Ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ、ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ、ＵＳＡ）、蛍光分光光度計（Ｆ−４５００、ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｊａｐａｎ）、万分の一電子天秤（ＢＳ  １１０Ｓ、北京セドーリス天秤有限公司）、ＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＬＣ−ＭＳＤ＿ＶＬ、ＤＥ、ＵＳＡ）。
【００５８】
２．実験方法
２．１溶液調製
培養液の調製：使用時、ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１００Ｕ・ｍＬ−１ペニシリンとストレプトマイシンのダブル抗体溶液、１％非必須アミノ酸、Ｇ４１８  １．２ｍｇ・Ｌ−１を加えた。
消化液の調製：１ｇトリプシン、８０ｍｇ  ＥＤＴＡの重さを量り、４００ｍＬリン酸塩緩衝液を加え、０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過滅菌し、後で使用するために−２０℃で冷凍保存しておく。
グルタミン予備液の調製：  ２．９２ｇグルタミンを１００ｍＬ  ＰＢＳバッファーに加え、０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過滅菌し、１ｍＬサブパッケージ、後で使用するために−２０℃で冷凍保存しておく。
ペニシリン−ストレプトマイシン予備液の調製：８０万Ｕペニシリンを２０ｍＬ生理食塩水に加え、１００万Ｕストレプトマイシンを２５ｍＬ生理食塩水に加えた。両者を１：１に混ぜ合わせ、０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過滅菌し、１ｍＬサブパッケージ、後で使用するために−２０℃で冷凍保存しておく。
ＨＢＳＳ液の調製：ＮａＣｌ８．０ｇ、ＫＣｌ０．４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．０４７５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．０６ｇ、Ｈａｐｅｓ６ｇを超純水に加えて溶解させ、ｐＨを７．２−７．４に調整し、１Ｌまで水を加え、０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過滅菌し、−２０℃で保存しておく。
【００５９】
２．２細胞培養
冷凍保存しているＣａｃｏ−２細胞を採取し、３７℃の水浴で急速に解凍した。蘇生した細胞は、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭ培地に加え、３７℃で５％ＣＯ２、相対湿度９０％インキュベーターで培養し、翌日培地を交換した。成長１−２日細胞融合後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２％）混合消化液を用いて、３７℃で消化し、一定の割合で継代培養し、実験用の細胞代数は４０−６０代であった。
細胞は８０％融合し、消化後に完全培地で細胞を懸濁させ、１×１０６個・ｍＬ−１でＭｉｌｌｉｃｅｌｌ板に接種した。その後、２日ごとに１回培養液を交換し、１週間後には１日ごとに１回培養液を交換した。５日間育成し、抵抗値がプラトー（＞２００Ω・ｃｍ２）に達したことで、膜透過実験に利用できる。
【００６０】
２．３  Ｃａｃｏ−２単層細胞の品質管理：
２．３．１膜貫通上皮細胞抵抗（ＴＥＥＲ）の測定
膜貫通抵抗を測定するときは、まず電極をＤＭＥＭ培養液に浸して２４時間平衡した後、取り出して７０％アルコールに１５分間浸して消毒し、室温で放置して電極を自然乾燥させ、無菌のＤＭＥＭ培養液に入れて１５分間平衡する。実験時に、電極の両端を２４穴Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ培養板の各穴の上下池に順次挿入して抵抗値を測定し、穴ごとに任意の点で３回測定し、抵抗値を記録するとともに、空白穴の抵抗値を測定し、以下の式によって膜貫通抵抗値（ＴＥＥＲ）を計算した。
ＴＥＥＲ＝（Ｒｔ−Ｒ０）×Ｓ
式中、Ｒｔは測定された抵抗値であり、Ｒ０は空白穴の抵抗値で、Ｓは有効膜面積である。
【００６１】
２．３．２  陽性化合物の品質管理：
Ｒｈｏ−１２３をポジティブな品質管理化合物として使用する。この化合物をＨＢＳＳで５μｍｏｌ・Ｌ−１に希釈し、実験前に各ウェルの培地を吸引して廃棄し、３７℃のＨＢＳＳ液で２回洗浄した後、３７℃のインキュベーターでインキュベートし、上池にＲｈｏ−１２３を加え、下池にＨＢＳＳ液を加え、恒温ロッキングベッドでインキュベートし、０、３０、９０、１２０ｍｉｎ各時点で、下池の溶液を集め、測定のために−２０°Ｃで保存しておく。蛍光分光光度計で下池中のＲｈｏ−１２３透過量を測定した。その中で、発光波長は４３０ｎｍ、励起波長は５３０ｎｍとした。本実験ではＲｈｏ−１２３のＰａｐｐ値は文献報道と一致した。
【００６２】
２．４薬物透過膜実験
試験前に細胞を接種したＭｉｌｌｉｃｅｌｌを３７℃のＨＢＳＳ液で適当な時間浸漬し、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌを軽微に洗浄し、細胞表面の付着物を除去した。腔面から基底面への透過性：頂側（ＡＰ）に薬を含むＨＢＳＳ液０．３５ｍＬを加え、基底側（ＢＬ）にブランクＨＢＳＳ液１．２  ｍＬを加え、３７℃に置き、５０ｒ・ｍｉｎ−１で振盪し、それぞれ０、３０、９０、１２０ｍｉｎで下層に５０μＬをサンプリングし、同じ量のブランクＨＢＳＳ溶液を補充した。濃度ごとに３つのウェルを繰り返し、採取したサンプルに内部標準液５０μＬ、酢酸エチル３５０μＬを精密に加え、振動混合、１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み３００μＬを取り、蒸発乾固させ、５０μＬアセトニトリルで再溶解、１０μＬサンプルを採取して測定した。基底面から腔面への透過性については、基底側（ＢＬ）に薬物を加え、頂側（ＡＰ）にブランクＨＢＳＳ液を加え、その後の手順は腔面から基底面への透過性実験操作と同じです。
【００６３】
薬物の見かけの透過係数（Ｐａｐｐ）は、薬物が単層細胞を透過する能力と薬物吸収の速度と程度を反映している。次の式で計算できる。
2021510383.tif 000024
式中、△Ｑは△ｔ時間帯に薬物が透過した量、Ａは細胞表面積、このモデルではサポート膜の面積（０．６ｃｍ２）、Ｃ０は初期濃度である。Ｐａｐｐの単位は通常、ｃｍ／時間（ｃｍ・ｈ−１）またはｃｍ／秒（ｃｍ・ｓ−１）で表されることが多い。
２．５サンプル検測
ＬＣ／ＭＳで検測する。各サンプルの濃度はその標準曲線（５０ｎＭ−１００００ｎＭ）を使用して定量する。
【００６４】
３．実験結果
【表３】
2021510383.tif 000025
【００６５】
本願の発明者は、ＣＣＲ４阻害剤としての式Ｉ化合物を意外に発見して提供した。この化合物は従来技術に対して顕著に増強された溶解度、より優れた生物利用度およびより優れたｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＣＲ４阻害活性を持ってる。従来技術のＣＣＲ４阻害剤の溶解度が低く、薬物活性成分の釈放に影響を及ぼし、生物利用度が低く、最大安全用量で体内で期待される有効血中濃度を達成できないという問題を解決した。
【００６６】
以上、本発明について説明したが、本発明を限定するものとは考えられない。本発明の実施は、特に言及しない限り、有機化学、ポリマー化学、生物技術などの通常の技術を使用し、本発明は、上記の開示および実施形態における特定の説明以外の方法で実現できることは明らかである。本願の範囲内の他の態様および改善は、当業者には明らかであろう。
【００６７】
本願の教示に基づいて、多くの変更および変形が可能であり、したがって、それらは本願の範囲内に含まれる。
【００６８】
特に明記しない限り、本願における温度単位「度」は、摂氏度、すなわち℃を意味する。
【００６９】
前文引用した文献はその全体が本願に組み込まれて開示される。
【国際調査報告】
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