(57)【要約】  サンプル中の単一又は多重リン酸化ｐ２１７＋タウタンパク質の量を測定する方法が提供される。また、タウオパチーを検出又は診断する方法、タウオパチーの治療の有効性を判定する方法、及び対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適しているどうかを判定する方法も提供される。当該方法において使用するための抗体及び当該抗体を含む、キットも記載される。
2021517239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを測定する方法であって、
（ｉ）前記サンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、前記サンプル中の前記ｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、
（ｉｉ）前記捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体及びタウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含有するエピトープに対する第２の検出抗体のうちの少なくとも１つと接触させて、それぞれ、前記ｐ２１７＋タウペプチドの量及びロングｐ２１７＋タウペプチドの量のうちの少なくとも１つを測定することと、を含み、
前記アミノ酸の付番が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する、方法。
【請求項２】
前記捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを前記第１の検出抗体及び前記第２の検出抗体と接触させて、それぞれ前記ｐ２１７＋タウペプチドの量及び前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、任意選択で、前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量の前記ｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比を求めることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）前記ｐ２１７＋タウペプチドの量から前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことを介して、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量を求めることと、
（ｉｉ）任意選択で、前記ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の前記ｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又は前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量の前記ショートｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比を求めることと、を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを測定する方法であって、
（ｉ）前記サンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、前記サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉し、前記サンプルを、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のエピトープ、好ましくはタウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と接触させて、前記サンプル中の総タウペプチドを捕捉することと、
（ｉｉ）
ａ．前記捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを、前記第１の検出抗体と接触させて、総タウペプチドの量を測定し、前記ｐ２１７＋タウペプチドの量の前記総タウペプチドの量に対する比を求めること、及び
ｂ．前記捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、前記捕捉された総タウペプチドを、前記第２の検出抗体と接触させて、総ロングタウペプチドの量を測定し、前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量の前記総ロングタウペプチドの量に対する比を求めること、
のうちの少なくとも１つを実行することと、を含み、
前記アミノ酸の付番が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する、方法。
【請求項５】
前記ｐ２１７＋タウペプチドの量から前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことを介してショートｐ２１７＋タウペプチドの量を求めることと、前記総タウペプチドの量から前記総ロングタウペプチドの量を差し引くことを介して総ショートタウペプチドの量を求めることと、前記ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の前記総ショートタウペプチドの量に対する比を求めることと、を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、対象由来の血液、脳ホモジネート、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される前記対象由来の生体サンプルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生体サンプルが血液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体サンプルがＣＳＦである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記生体サンプルが、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）を使用して分画されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ａ．前記対象がタウオパチーに罹患しているかどうか又はタウオパチーを発症するリスクがあるかどうかを判定すること、
ｂ．前記対象が、抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療に適しているかどうかを判定すること、
ｃ．前記対象におけるタウオパチーの治療の有効性を判定すること、又は
ｄ．対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすること、
を更に含み、
前記判定又はモニタリングが、前記対象由来の前記ｐ２１７＋タウペプチドの量、前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量、前記ショートｐ２１７＋タウペプチドの量、及びこれらの比のうちの少なくとも１つを、対応するベースライン値と比較すること、を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすること、を含む、請求項１０に記載の方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記対象から生体サンプルを得ることと、
（ｉｉ）前記生体サンプルを、前記抗ｐ２１７＋タウ抗体を含まないｐ２１７＋タウペプチドを含有する第１のサンプル、及び前記抗ｐ２１７＋タウ抗体に結合しているｐ２１７＋タウペプチドを含有する第２のサンプルに分離することと、
（ｉｉｉ）好ましくはｒｐＨＰＬＣを介して、前記第２のサンプルを分離して、抗ｐ２１７＋タウ抗体を含まないｐ２１７＋タウペプチドを含有する第３のサンプルを得ることと、
（ｉｖ）前記第１のサンプル及び前記第３のサンプルのそれぞれを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、前記第１のサンプル及び前記第３のサンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、
（ｖ）（ａ）前記捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、前記第１のサンプル及び前記第３のサンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、及び（ｂ）前記捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、前記第１のサンプル及び前記第３のサンプルのそれぞれにおけるロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つと、任意選択で、（ｃ）前記第１のサンプル及び前記第３のサンプルのそれぞれにおける前記ｐ２１７＋タウペプチドの量から前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことを介してショートｐ２１７＋タウペプチドの量を求めることと、を実行することと、
（ｖｉ）前記第１のサンプル及び前記第３のサンプルのそれぞれにおける前記ｐ２１７＋タウペプチドの量、前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量、前記ショートｐ２１７＋タウペプチドの量、及びこれらの比のうちの少なくとも１つに基づいて、前記抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすることと、を含む、方法。
【請求項１２】
対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすること、を含む、請求項１０に記載の方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記対象から生体サンプルを得ることと、
（ｉｉ）総ｐ２１７＋タウペプチドを含有する生体サンプルから半変性サンプルを得ることであって、その際、前記半変性サンプルを加熱して前記サンプル中の前記抗体を変性させる、こと、及び前記抗ｐ２１７＋タウ抗体を含まないｐ２１７＋タウペプチドを含有する生体サンプルから非変性サンプルを得ることと、
（ｉｉｉ）前記半変性サンプル及び前記非変性サンプルのそれぞれを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、前記サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、
（ｉｖ）（ａ）前記捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、前記サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、及び（ｂ）前記捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、前記サンプルのそれぞれにおけるロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つと、任意選択で、（ｃ）前記第１のサンプル及び前記第３のサンプルのそれぞれにおける前記ｐ２１７＋タウペプチドの量から前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことを介してショートｐ２１７＋タウペプチドの量を求めることと、を実行することと、
（ｖ）前記サンプルのそれぞれにおける前記ｐ２１７＋タウペプチドの量、前記ロングｐ２１７＋タウペプチドの量、前記ショートｐ２１７＋タウペプチドの量、及びこれらの比のうちの少なくとも１つに基づいて、前記抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすることと、を含む、方法。
【請求項１３】
前記捕捉抗体がビーズにコンジュゲートされており、前記検出抗体がビオチン化されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法の定量下限が、約４０ｆｇ／ｍＬの前記ｐ２１７＋タウペプチドであり、前記方法の検出下限が、約２ｆｇ／ｍＬの前記ｐ２１７＋タウペプチドである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記タウオパチーが、家族性アルツハイマー病、散発性アルツハイマー病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択され、好ましくは、前記タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記捕捉抗体が、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記捕捉抗体が、配列番号２８のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の検出抗体が、それぞれ配列番号２、３、及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号５、６、及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記第１の検出抗体が、配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の検出抗体が、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記検出抗体が、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
キットであって、
ａ．ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体、任意選択で、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のタウエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と、
ｂ．タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０又は１１６〜１２７を含むタウタンパク質エピトープに対する少なくとも１つの検出抗体と、を含む、キット。
【請求項２０】
前記捕捉抗体が、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記捕捉抗体が、配列番号２８のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を有し、前記リン酸化非依存性捕捉抗体が、タウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むタウエピトープに対する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
ａ．前記第１の検出抗体が、それぞれ配列番号２、３、及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号５、６、及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記第１の検出抗体が、配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含み、
ｂ．前記第２の検出抗体が、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記検出抗体が、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１９又は２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性を検出するための組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、生体サンプル中の単一又は多重リン酸化ｐ２１７＋タウタンパク質種の量を測定する方法、及びその使用、並びに当該方法で使用するための抗体及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、徐々に激しい精神機能低下を導き、最終的には死に至らしめる、記憶、認知、論理的思考、判断力、及び情動安定性の進行性喪失を臨床的特徴とする、退行性脳障害である。ＡＤは、高齢者の進行性精神機能不全（認知症）の非常に一般的な原因であり、米国では４番目に多い医学的死亡原因を表すと考えられている。ＡＤは、世界中の民族で観察され、現在及び未来の、主たる公衆の健康上の問題を提示する。
【０００３】
ＡＤ個体の脳は、老人性（又はアミロイド）斑、アミロイド血管症（血管におけるアミロイド沈着）及び神経原線維変化と呼ばれる特徴的な病変を呈する。これら病変の大多数、特にアミロイド斑及び対らせん状細線維の神経原線維変化は、一般にＡＤ患者の記憶及び認知機能に重要なヒトの脳のいくつかの領域でみられる。
【０００４】
神経原線維変化は主に、高リン酸化タウタンパク質の凝集体で構成される。タウの主な生理学的機能は、微小管の重合及び安定化である。タウの微小管への結合は、タウの微小管結合領域における正電荷と、微小管格子における負電荷とのイオン性相互作用により発生する（Ｂｕｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５（３）：７１７−３０，１９９１）。タウタンパク質は、８５個の可能なリン酸化部位を含有し、これらの部位の多くにおけるリン酸化が、タウの一次機能を妨げる。軸索の微小管格子に結合しているタウは、低リン酸化状態にあるが、ＡＤにおける凝集したタウは高リン酸化状態にあり、タウの生理学的に活性なプールとは異なる独自のエピトープをもたらす（Ｉｑｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．７（８）：６５６−６６４，２０１０）。
【０００５】
ＡＤ脳におけるタウオパチーの進行は、異なる拡大パターンに従う。ヒトの脳におけるタウオパチー進行のＢｒａａｋステージ及び前臨床タウモデルにおけるタウ凝集体注射後のタウオパチーの拡大に基づいて、タウオパチーの伝播及び拡大仮説が説明されている（Ｆｒｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８４：１２８４５−５２，２００９；Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：９０９−１３，２００９）。タウオパチーはある脳の領域から次の領域に、プリオンのように拡大し得ると考えられている。この拡大プロセスには、近くのニューロンにより取り込まれることができ、更なるタウオパチーを引き起こし得るタウシードの外在化が伴う。
【０００６】
神経原線維変化におけるタウタンパク質の断片は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に移動し、そこで、腰椎穿刺によって採取し、高感度アッセイによって測定することができる。したがって、ＣＳＦにおけるタウタンパク質由来の断片を認識するアッセイを使用して、神経疾患の存在を検出することができる。このようなタウアッセイは、神経変性状態に特徴的なタウ種を認識する能力を必要とする。多重リン酸化タウは、ＡＤ関連タウタンパク質の主要例である。したがって、ＣＳＦにおける多重リン酸化タウタンパク質を検出するアッセイは、ＡＤの存在を検出するのに最も有効であり得る。
【０００７】
リン酸化は、タウの測定において考慮される唯一の翻訳後修飾ではない。最近の研究では、ＣＳＦにおいて、タウタンパク質は、完全長タンパク質としてではなく主に断片として存在することが実証されている（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８（１０）：ｅ７６５２３，２０１３）。更に、病的状態ではタンパク質分解が異常であることが多いので、タウ断片化パターンは、疾患によって影響され得る。したがって、神経変性についてのタウベースのアッセイは、リン酸化状態（例えばリン酸化部位）のみならず、測定されるタウ断片の性質（例えば、タウ断片の長さ、極性）に関する情報も提供する必要がある。しかしながら、この概念の橋渡し（translation）は、特に健常対象由来のサンプルにおいて、リン酸化タウの内因性レベルが低いことによって妨げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
要約すると、生物学的流体中の多重リン酸化タウを検出するための高感度、高精度、かつ正確な方法が依然として必要とされている。このような方法は、ＡＤ及び他のタウオパチーなどの神経変性疾患の疾患進行を有効に検出、診断、ステージ分類、及び追跡するのに有用であろう。当該方法はまた、総、遊離、及び治療用抗体に結合している多重リン酸化タウのレベルを測定するための薬力学的マーカーとしても有用であろう。多重リン酸化タウ断片を検出及び測定する能力は、伝播性タウ種が１つ以上のタウ断片であり得るため、当該分野にとって更に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、神経変性疾患に関連するＣＳＦ中のタウの形態を検出する必要性を満たす。本発明は、単一又は多重リン酸化タウの検出、並びにタウ断片の検出を可能にする。
【００１０】
本発明の実施形態による高感度酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を開発し、（２１２）Ｒ（ｐＴ）ＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２５）、（２１７）ＲＴＰＳＬＰ（ｐＴ）ＰＰＴＲ（配列番号２６）、又は（２１２及び２１７）Ｒ（ｐＴ）ＰＳＬＰ（ｐＴ）ＰＰＴＲ（配列番号２７）の配列を有するリン酸化残基Ｔ２１２及び／又はＴ２１７を含むリン酸化タウエピトープを含むｐ２１７＋タウ（「ｐ２１７＋タウエピトープ」又は「ｐＴ３エピトープ」）の測定について認定した。
【００１１】
本発明の実施形態によるアッセイは、ＣＳＦ、間質液（ＩＳＦ）、脳ホモジネート、血清、血漿、及びこれらの変性又は富化型を含むがこれらに限定されない、様々な流体マトリックス中のｐ２１７＋タウ種を測定することができる。本発明の実施形態によるアッセイは、捕捉抗体としてタウのｐＴ３エピトープに対する第１のモノクローナル抗体、及び検出抗体としてタウの第２のエピトープに対する第２のモノクローナル抗体を使用する。アッセイは、高感度、高精度、正確、ラボ間で移転可能、希釈線形性、かつ多くのサンプルタイプに適用可能である。未加工の生物学的流体中のｐ２１７＋タウ種の測定に加えて、アッセイを使用して、変性している若しくは変性していないサンプルを測定することができ、又は免疫沈降の後に、遊離ｐ２１７＋タウ又は内因性の若しくは治療的に投与された抗体に結合しているｐ２１７＋タウの量を定量するための２つの補完的な技術を使用することができる。アッセイを、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）と並行して使用して、分画されたＣＳＦを測定することによって、ｐ２１７＋タウの断片プロファイルの分析が可能になる。
【００１２】
一般的な一態様では、本発明は、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量を測定する方法に関する。方法は、（ｉ）サンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６、例えばアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープ、又はタウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含有するエピトープに対する検出抗体と接触させて、それぞれ、ｐ２１７＋タウペプチドの量又はロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、を含み、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。
【００１３】
具体的な一態様では、本発明は、サンプル中のロングｐ２１７＋タウペプチド又はショートｐ２１７タウペプチド断片の相対量を求める方法に関する。方法は、（ｉ）サンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、（ｉｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、（ｉｖ）当該ｐ２１７＋タウペプチドの量及び当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量に基づいてロングｐ２１７＋タウペプチド又はショートｐ２１７＋タウペプチドの相対量を求めることと、を含み、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。
【００１４】
本発明の一実施形態では、サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量は、例えば、ｐ２１７＋タウペプチドの量からロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量及びロングｐ２１７＋タウペプチドの量に基づいて計算される。別の実施形態では、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量とｐ２１７＋タウペプチドの量との比、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量とｐ２１７＋タウペプチドの量との比、又はロングｐ２１７＋タウペプチドの量とショートｐ２１７＋タウペプチドの量との比は、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量及びロングｐ２１７＋タウペプチドの量に基づいて求められる。本発明の実施形態によれば、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量及び／又はロングｐ２１７＋タウペプチドの量、並びにショートｐ２１７＋タウペプチドの計算された量及び上記比のうちの１つ以上などの、測定された量に基づく情報を、１つ以上の診断目的のために使用することができる。
【００１５】
したがって、具体的な一態様では、本発明は、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの総タウペプチドに対する比を求める方法に関する。方法は、（ｉ）サンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉し、当該サンプルを、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のエピトープ、好ましくはタウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中の総タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを当該第１の検出抗体と接触させて、総タウペプチドの量を測定すること；及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを当該第２の検出抗体と接触させて、総ロングタウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、（ｉｉｉ）ｐ２１７＋タウペプチドの量の総タウペプチドの量に対する比、又はロングｐ２１７＋タウペプチドの量の総ロングタウペプチドの量に対する比を求めることと、を含み、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。一実施形態では、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量は、ｐ２１７＋タウペプチドの量からロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって計算され、総ショートタウペプチドの量は、総タウペプチドの量から総ロングタウペプチドの量を差し引くことによって計算され、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比が求められる。
【００１６】
具体的な態様によれば、本発明の方法は、（ｉ）対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること；及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、（ｉｉｉ）ｐ２１７＋タウペプチドの量、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量、ｐ２１７＋タウペプチドの量からロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって得られるショートｐ２１７＋タウペプチドの量、及びこれらの比のうちの少なくとも１つに基づいて、当該対象がタウオパチーに罹患しているかどうか又はタウオパチーを発症するリスクがあるかどうかを判定することと、を含み、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。一実施形態では、方法は、タウオパチーを治療又は予防するための治療薬を対象に投与すること、を更に含む。
【００１７】
具体的な態様によれば、本発明の方法は、（ｉ）対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉し、当該サンプルを、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のエピトープ、好ましくはタウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中の総タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを当該第１の検出抗体と接触させて、総タウペプチドの量を測定すること；及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを当該第２の検出抗体と接触させて、総ロングタウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、（ｉｉｉ）（ａ）ｐ２１７＋タウペプチドの量の総タウペプチドの量に対する比、（ｂ）ロングｐ２１７＋タウペプチドの量の総ロングタウペプチドの量に対する比、及び（ｃ）ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比のうちの少なくとも１つに基づいて、当該対象がタウオパチーに罹患しているかどうか又はタウオパチーを発症するリスクがあるかどうかを判定することと、を含み、当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量は、当該ｐ２１７＋タウペプチドの量から当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって得られ、当該総ショートタウペプチドの量は、当該総タウペプチドの量から当該総ショートタウペプチドの量を差し引くことによって得られ、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。一実施形態では、方法は、タウオパチーを治療又は予防するための治療薬を対象に投与すること、を更に含む。
【００１８】
具体的な別の態様によれば、本発明の方法は、（ｉ）治療中の対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること；及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、（ｉｉｉ）ｐ２１７＋タウペプチドの量、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量、当該ｐ２１７＋タウペプチドの量から当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって得られるショートｐ２１７＋タウペプチドの量、及びこれらの比のうちの少なくとも１つに基づいて、当該対象における当該治療の有効性を判定することと、を含み、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。一実施形態では、方法は、タウオパチーを治療又は予防するための治療薬を対象に投与すること、を更に含む。
【００１９】
具体的な別の態様によれば、本発明の方法は、（ｉ）治療中の対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉し、当該サンプルを、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のエピトープ、好ましくはタウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中の総タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを当該第１の検出抗体と接触させて、総タウペプチドの量を測定すること；及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを当該第２の検出抗体と接触させて、総ロングタウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、（ｉｉｉ）（ａ）ｐ２１７＋タウペプチドの量の総タウペプチドの量に対する比、（ｂ）ロングｐ２１７＋タウペプチドの量の総ロングタウペプチドの量に対する比、及び（ｃ）ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比のうちの少なくとも１つに基づいて、当該対象における当該治療の有効性を判定することと、を含み、当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量は、当該ｐ２１７＋タウペプチドの量から当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって得られ、当該総ショートタウペプチドの量は、当該総タウペプチドの量から当該総ショートタウペプチドの量を差し引くことによって得られ、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。一実施形態では、方法は、タウオパチーを治療又は予防するための治療薬を対象に投与すること、を更に含む。
【００２０】
具体的な別の態様によれば、本発明の方法は、（ｉ）対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること；及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、（ｉｉｉ）当該ｐ２１７＋タウペプチドの量、当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量、当該ｐ２１７＋タウペプチドの量から当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって得られるショートｐ２１７＋タウペプチドの量、及びこれらの比のうちの少なくとも１つに基づいて、当該対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体に適しているかどうかを判定することと、を含み、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。一実施形態では、方法は、タウオパチーを治療又は予防するための抗ｐ２１７＋タウ抗体を対象に投与すること、を更に含む。
【００２１】
具体的な別の態様によれば、本発明の方法は、（ｉ）対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉し、当該サンプルを、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のエピトープ、好ましくはタウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中の総タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを当該第１の検出抗体と接触させて、総タウペプチドの量を測定すること；及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、捕捉された総タウペプチドを当該第２の検出抗体と接触させて、総ロングタウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、（ｉｉｉ）（ａ）当該ｐ２１７＋タウペプチドの量の当該総タウペプチドの量に対する比、（ｂ）当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量の当該総ロングタウペプチドの量に対する比、及び（ｃ）ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比のうちの少なくとも１つに基づいて、当該対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適しているかどうかを判定することと、を含み、当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量は、当該ｐ２１７＋タウペプチドの量から当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって得られ、当該総ショートタウペプチドの量は、当該総タウペプチドの量から当該総ショートタウペプチドの量を差し引くことによって得られ、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。一実施形態では、方法は、タウオパチーを治療又は予防するための抗ｐ２１７＋タウ抗体を対象に投与すること、を更に含む。
【００２２】
別の具体的な態様では、本発明は、対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングする方法であって、（ｉ）当該対象から生体サンプルを得ることと、（ｉｉ）当該生体サンプルを、好ましくはＩｇＧ由来の抗ｐ２１７＋タウ抗体を含まないｐ２１７＋タウを含有する第１のサンプル、及び抗ｐ２１７＋タウ抗体に結合しているｐ２１７＋タウペプチドを含有する第２のサンプルに分離することと、（ｉｉｉ）好ましくはｒｐＨＰＬＣを介して、当該第２のサンプルから抗ｐ２１７＋タウ抗体を含まないｐ２１７＋タウを含有する第３のサンプルを得ることと、（ｉｖ）当該第１のサンプル及び当該第３のサンプルのそれぞれを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｖ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、（ｖｉ）当該サンプルのそれぞれにおける当該ｐ２１７＋タウペプチドの量及び当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量のうちの少なくとも１つに基づいて、当該抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすることと、を含み、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する、方法に関する。例えば、抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療は、第１のサンプル中のロングｐ２１７＋タウペプチドの量の第３のサンプル中のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、第１のサンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量の第３のサンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又は第１のサンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量（ｐ２１７＋タウペプチドの量からロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって計算することができる）の第３のサンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比に基づいてモニタリングすることができる。一実施形態では、方法は、タウオパチーを治療又は予防するための抗ｐ２１７＋タウ抗体を対象に投与すること、を更に含む。
【００２３】
別の一般的な態様では、本発明は、対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングする方法であって、（ｉ）当該対象から生体サンプルを得ることと、（ｉｉ）総ｐ２１７＋タウを含有する生体サンプルから半変性サンプルを得ることであって、その際、当該半変性サンプルを加熱して当該サンプル中の当該抗体を変性させる、こと、及び抗ｐ２１７＋タウ抗体を含まないｐ２１７＋タウを含有する生体サンプルから非変性サンプルを得ることと、（ｉｉｉ）当該半変性サンプル及び当該非変性サンプルのそれぞれを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｖ）（ａ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、及び（ｂ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、ｖｉ）当該サンプルのそれぞれにおける当該ｐ２１７＋タウペプチドの量及び当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量のうちの少なくとも１つに基づいて、当該抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすることと、を含み、当該アミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する、方法に関する。例えば、抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療は、半変性サンプル中のロングｐ２１７＋タウペプチドの量の非変性サンプル中のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、半変性サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量の非変性サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又は半変性サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量（ｐ２１７＋タウペプチドの量からロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって計算することができる）の非変性サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比に基づいてモニタリングすることができる。一実施形態では、方法は、タウオパチーを治療又は予防するための抗ｐ２１７＋タウ抗体を対象に投与すること、を更に含む。
【００２４】
具体的な態様によれば、タウオパチーとしては、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
好ましくは、タウオパチーは、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、ＦＴＤＰ−１７、又は進行性核上麻痺である。
【００２６】
最も好ましくは、タウオパチーは、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）である。
【００２７】
具体的な態様によれば、本発明の方法の定量下限は、約４０ｆｇ／ｍＬのｐ２１７＋タウペプチドであり、本発明の方法の検出下限は、約２ｆｇ／ｍＬのｐ２１７＋タウペプチドである。
【００２８】
具体的な態様によれば、サンプルは、それを必要としている対象由来の血液、脳ホモジネート、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルなどの生体サンプルである。好ましくは、生体サンプルは、タウオパチーの診断、タウオパチー治療の有効性のモニタリング、又は抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に対する適合性の判定を必要としている対象由来のＣＳＦサンプルである。
【００２９】
具体的な態様によれば、本発明の方法に有用な捕捉抗体は、ｐ２１７＋タウエピトープ、好ましくは、配列番号２５、２６、又は２７のアミノ酸配列を含有するｐ２１７＋タウエピトープに対する。一実施形態では、本発明の方法に有用な捕捉抗体は、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、捕捉抗体は、配列番号２８又は３０のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９又は３１のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を有する。
【００３０】
具体的な態様によれば、本発明の方法に有用な検出抗体は、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープ、好ましくは配列番号１１のアミノ酸配列などの配列番号１０のアミノ酸配列を含むエピトープに対する。一実施形態では、本発明の方法に有用な検出抗体は、それぞれ配列番号２、３、及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号５、６、及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、検出抗体は、配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｐＴ８２抗体である。
【００３１】
具体的な別の態様によれば、本発明の方法に有用な検出抗体は、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含有するエピトープ、好ましくは配列番号２０のアミノ酸配列を有するエピトープに対する。一実施形態では、本発明の方法に有用な検出抗体は、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、検出抗体は、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｈＴ４３抗体である。
【００３２】
別の具体的な態様によれば、本発明に有用なリン酸化非依存性捕捉抗体は、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のエピトープ、好ましくは、タウタンパク質のアミノ酸２１１〜２２１を含むエピトープ、又はタウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むエピトープ、より好ましくは配列番号２１のアミノ酸配列を有するエピトープに対する。一実施形態では、本発明に有用なリン酸化非依存性捕捉抗体は、ｈＴ７抗体である。
【００３３】
具体的な別の態様によれば、本発明の方法で使用されるサンプルは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）を使用して生体サンプルを分画した後に得られる。
【００３４】
別の一般的な態様では、本発明は、（ａ）それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに（ｂ）それぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片に関する。具体的な態様によれば、単離された検出抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する単離された検出抗体又はその抗原結合断片は、ｈＴ４３抗体である。
【００３５】
別の一般的な態様では、本発明は、（ａ）ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と、（ｂ）タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０又は１１６〜１２７を含むタウタンパク質エピトープに対する検出抗体と、を含む、キットに関する。任意選択で、キットは、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のタウエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体を更に含む。キットは、例えば、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比などを測定するために使用することができる。キットはまた、様々な診断又はモニタリング目的のため、例えば、対象がタウオパチーに罹患しているかどうか又はタウオパチーを発症するリスクがあるかどうかを判定するため、タウオパチーに対する治療、例えば、抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療の有効性をモニタリングして、対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体に適しているかどうかを判定するためのものであってもよい。
【００３６】
具体的な態様によれば、本発明のキットは、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する捕捉抗体を含む。好ましくは、捕捉抗体は、配列番号２８のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を有する。
【００３７】
具体的な別の態様によれば、本発明のキットは、それぞれ配列番号２、３、及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号５、６、及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する検出抗体を含む。好ましくは、検出抗体は、配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｐＴ８２抗体である。
【００３８】
具体的な別の態様によれば、本発明のキットは、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む検出抗体を含む。好ましくは、検出抗体は、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｈＴ４３抗体である。
【００３９】
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
上述の「発明の概要」及び以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解されるべきである。
【図１】較正ペプチドを使用して作成されたｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの代表的な標準曲線を示し、デュープリケートの測定値の平均±ＳＤを各点に示す。
【図２Ａ】（Ａ、Ｃ、及びＥ）希釈補正されたｐｇ／ｍＬで又は（Ｂ及びＤ）１：４測定値の希釈補正された％として示される測定値を用いたＣＳＦサンプルにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの希釈線形性を示し、破線は１：４測定値の±２０％を示す。
【図２Ｂ】（Ａ、Ｃ、及びＥ）希釈補正されたｐｇ／ｍＬで又は（Ｂ及びＤ）１：４測定値の希釈補正された％として示される測定値を用いたＣＳＦサンプルにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの希釈線形性を示し、破線は１：４測定値の±２０％を示す。
【図２Ｃ】（Ａ、Ｃ、及びＥ）希釈補正されたｐｇ／ｍＬで又は（Ｂ及びＤ）１：４測定値の希釈補正された％として示される測定値を用いたＣＳＦサンプルにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの希釈線形性を示し、破線は１：４測定値の±２０％を示す。
【図２Ｄ】（Ａ、Ｃ、及びＥ）希釈補正されたｐｇ／ｍＬで又は（Ｂ及びＤ）１：４測定値の希釈補正された％として示される測定値を用いたＣＳＦサンプルにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの希釈線形性を示し、破線は１：４測定値の±２０％を示す。
【図２Ｅ】（Ａ、Ｃ、及びＥ）希釈補正されたｐｇ／ｍＬで又は（Ｂ及びＤ）１：４測定値の希釈補正された％として示される測定値を用いたＣＳＦサンプルにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの希釈線形性を示し、破線は１：４測定値の±２０％を示す。
【図３】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの試験内及び試験間の精度を示す。
【図４Ａ】シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）としてグラフ化されたデータを用いたｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの試験施設間の精度を示す。
【図４Ｂ】シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）としてグラフ化されたデータを用いたｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの試験施設間の精度を示す。
【図５Ａ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイにおける可溶性ｐ２１７＋タウを標的とする抗体によるｐＴ３ベースのアッセイのシグナルの競合を示す。
【図５Ｂ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイにおける可溶性ｐ２１７＋タウを標的とする抗体によるｐＴ３ベースのアッセイのシグナルの競合を示す。
【図６】ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイのリン酸化依存性を示す。
【図７】ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを使用して測定されたＡＤ  ＣＳＦのｐ２１７＋タウ断片プロファイルを示し、データをシグナルマイナスノイズとしてグラフ化する。
【図８Ａ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｂ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイを用いたＡＤ  ＣＳＦサンプル中のｐ２１７＋タウシグナルの温度及び凍結解凍安定性を示す。
【図８Ｂ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｂ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイを用いたＡＤ  ＣＳＦサンプル中のｐ２１７＋タウシグナルの温度及び凍結解凍安定性を示す。
【図９】−７０℃で保存した後のＣＳＦサンプル中のｐ２１７＋タウシグナルの長期安定性を示す。シグナルの変化は検出されなかった。
【図１０Ａ】（Ａ〜Ｃ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｄ〜Ｆ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイによって測定したときの、ｐ２１７＋タウと、古典的なＡＤバイオマーカーＡβ４２、ｔタウ（総タウ）、及びｐタウ１８１との間の相関を示す。
【図１０Ｂ】（Ａ〜Ｃ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｄ〜Ｆ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイによって測定したときの、ｐ２１７＋タウと、古典的なＡＤバイオマーカーＡβ４２、ｔタウ（総タウ）、及びｐタウ１８１との間の相関を示す。
【図１０Ｃ】（Ａ〜Ｃ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｄ〜Ｆ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイによって測定したときの、ｐ２１７＋タウと、古典的なＡＤバイオマーカーＡβ４２、ｔタウ（総タウ）、及びｐタウ１８１との間の相関を示す。
【図１０Ｄ】（Ａ〜Ｃ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｄ〜Ｆ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイによって測定したときの、ｐ２１７＋タウと、古典的なＡＤバイオマーカーＡβ４２、ｔタウ（総タウ）、及びｐタウ１８１との間の相関を示す。
【図１０Ｅ】（Ａ〜Ｃ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｄ〜Ｆ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイによって測定したときの、ｐ２１７＋タウと、古典的なＡＤバイオマーカーＡβ４２、ｔタウ（総タウ）、及びｐタウ１８１との間の相関を示す。
【図１０Ｆ】（Ａ〜Ｃ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｄ〜Ｆ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイによって測定したときの、ｐ２１７＋タウと、古典的なＡＤバイオマーカーＡβ４２、ｔタウ（総タウ）、及びｐタウ１８１との間の相関を示す。
【図１１Ａ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイによって測定したときの、脳生検ＩＨＣ分析とｐ２１７＋タウとの間の相関を示す。
【図１１Ｂ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３及び（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイによって測定したときの、脳生検ＩＨＣ分析とｐ２１７＋タウとの間の相関を示す。
【図１２Ａ】ＡＤ患者及びＨＶ患者由来の粗ＣＳＦの（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析の結果を示す。
【図１２Ｂ】ＡＤ患者及びＨＶ患者由来の粗ＣＳＦの（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析の結果を示す。
【図１２Ｃ】ＡＤ患者及びＨＶ患者由来の粗ＣＳＦの（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析の結果を示す。
【図１２Ｄ】ＡＤ患者及びＨＶ患者由来の粗ＣＳＦの（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析の結果を示す。
【図１３】ＡＤ対象とＨＶ対象とを区別する際のｐＴ３ｘｈＴ４３（「３４３」）、ｐＴ３ｘｐＴ８２（「３８２」）、及びｈＴ７ｘｐＴ８２（「７８２」）アッセイの予測力を示す。
【図１４Ａ】（Ａ、Ｃ、Ｅ）ＡＤ対象及び（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＨＶ対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ、Ｂ）ｐＴ３ｘｈＴ４３（「３４３」）、（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（「３８２」）、及び（Ｅ、Ｆ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（「７８２」）アッセイからのシグナルを示す。
【図１４Ｂ】（Ａ、Ｃ、Ｅ）ＡＤ対象及び（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＨＶ対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ、Ｂ）ｐＴ３ｘｈＴ４３（「３４３」）、（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（「３８２」）、及び（Ｅ、Ｆ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（「７８２」）アッセイからのシグナルを示す。
【図１４Ｃ】（Ａ、Ｃ、Ｅ）ＡＤ対象及び（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＨＶ対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ、Ｂ）ｐＴ３ｘｈＴ４３（「３４３」）、（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（「３８２」）、及び（Ｅ、Ｆ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（「７８２」）アッセイからのシグナルを示す。
【図１４Ｄ】（Ａ、Ｃ、Ｅ）ＡＤ対象及び（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＨＶ対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ、Ｂ）ｐＴ３ｘｈＴ４３（「３４３」）、（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（「３８２」）、及び（Ｅ、Ｆ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（「７８２」）アッセイからのシグナルを示す。
【図１４Ｅ】（Ａ、Ｃ、Ｅ）ＡＤ対象及び（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＨＶ対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ、Ｂ）ｐＴ３ｘｈＴ４３（「３４３」）、（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（「３８２」）、及び（Ｅ、Ｆ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（「７８２」）アッセイからのシグナルを示す。
【図１４Ｆ】（Ａ、Ｃ、Ｅ）ＡＤ対象及び（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＨＶ対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ、Ｂ）ｐＴ３ｘｈＴ４３（「３４３」）、（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（「３８２」）、及び（Ｅ、Ｆ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（「７８２」）アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ａ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｂ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｃ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｄ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｅ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｆ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｇ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｈ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｉ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｊ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｋ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｌ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｍ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｎ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１５Ｏ】ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ０．５対象由来のＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実行した（Ａ〜Ｅ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｆ〜Ｊ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｋ〜Ｏ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイからのシグナルを示す。
【図１６Ａ】ＭＭＳＥスコアと比較した、ＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分の（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析（ｐタウショート）又はｐＴ３ｘｈＴ４３対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析（ｐタウロング）、及び（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析の結果を示し、全て、ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ１対象の盲検コホート由来である。
【図１６Ｂ】ＭＭＳＥスコアと比較した、ＣＳＦのｒｐ−ＨＰＬＣ画分の（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析（ｐタウショート）又はｐＴ３ｘｈＴ４３対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析（ｐタウロング）、及び（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の比の分析の結果を示し、全て、ＣＤＲ０対象及びＣＤＲ１対象の盲検コホート由来である。
【図１７Ａ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｂ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｃ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｄ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｅ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｆ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｇ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｈ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｉ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｊ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｋ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｌ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｍ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｎ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｏ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｐ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｑ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｒ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｓ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１７Ｔ】粗ＣＳＦにおける（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２，及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２分析、（Ｄ）粗ＣＳＦにおける２回のｐＴ３アッセイの相関、（Ｅ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２の相関、（Ｆ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウの相関、（Ｇ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｐタウ１８１の相関、（Ｈ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２の相関、（Ｉ）粗ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３対Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２／４０比の相関；（Ｊ、Ｍ、Ｑ）全てのｒｐ−ＨＰＬＣ画分、（Ｋ、Ｎ、Ｒ）全ての画分の合計、（Ｏ、Ｓ）早期ピーク画分の合計（ショートタウ断片）、又は（Ｌ、Ｐ、Ｔ）後期ピーク画分の合計（より大きなタウ断片）における、（Ｊ〜Ｉ）ｐＴ３ｘｈＴ４３シグナル、（Ｍ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｐＴ８２シグナル、又は（Ｑ〜Ｔ）ｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルの結果を示し、全て、ＨＶ対象、ＭＣＩ対象、及びＡＤ対象のコホート由来である。
【図１８Ａ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｂ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｃ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｄ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｅ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｆ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｇ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｈ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｉ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｊ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｋ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｌ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｍ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｎ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｏ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１８Ｐ】（Ａ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋ショート）対ｐＴ３ｘｈＴ４３（ｐ２１７＋ロング）、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウショート）、（Ｃ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対ＮＦＬ、及び（Ｄ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、又は（Ｅ）ｐＴ３ｘｐＴ８２対アミロイド状態、並びに（Ｆ〜Ｉ、Ｎ〜Ｐ）ｐＴ３ｘｈＴ４３又は（Ｊ〜Ｍ）ｐＴ３ｘｐＴ８２の（Ｆ〜Ｍ）様々な認知スコア又は（Ｎ〜Ｐ）７８週間にわたるこれらスコアの変化との相関の結果を示し、全て、軽度〜中等度のＡＤ対象に対するＪａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２からの２３５人の対象のコホート由来である（そのうち９０人を７８週間経過観察した）。対象は、認知に基づいて最初に登録（及びＡＤとして分類）されたが、生化学的評価（ＡＢ４０及びＡＢ４２）の際、対象のうち２７人がアミロイド陰性であり、したがって、ＡＤが原因ではない認知症を表す可能性が高いと判定された。これらの対象は、上記の図において別個のコホートとして分析され、アミロイド陰性＝０と命名され、一方アミロイド陽性対象＝１と命名された。
【図１９】ＩｇＧ、ｐＴ３  ｍＡｂ、ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂ、又はモック対照でスパイクし（spiked）、続いて、免疫沈降を行って、抗体に結合しているｐ２１７＋タウを回収した、ＡＤ  ＣＳＦサンプルのｒｐ−ＨＰＬＣ画分に対して実施したｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイからのシグナルを示す。
【図２０Ａ】（Ａ）抗体を含まない及び（Ｂ）抗体に結合しているｐ２１７＋タウを定量するための免疫捕捉／ｒｐＨＰＬＣ方法の抗体用量依存性を示し、データは、ｒｐＨＰＬＣ画分１２〜１６におけるシグナルの合計としてグラフ化する。
【図２０Ｂ】（Ａ）抗体を含まない及び（Ｂ）抗体に結合しているｐ２１７＋タウを定量するための免疫捕捉／ｒｐＨＰＬＣ方法の抗体用量依存性を示し、データは、ｒｐＨＰＬＣ画分１２〜１６におけるシグナルの合計としてグラフ化する。
【図２１Ａ】熱によって変性させた（Ａ、Ｃ）又はさせていない（Ｂ）、抗体対ｐ２１７＋タウの損傷の差分動力学（differential kinetics）を示す。（Ａ）ヒト化ＰＴ３  ｍＡｂ／ＣＳＦ混合物；（Ｂ）未処理のＣＳＦ；（Ｃ）ヒト化ＰＴ３  ｍＡｂである。
【図２１Ｂ】熱によって変性させた（Ａ、Ｃ）又はさせていない（Ｂ）、抗体対ｐ２１７＋タウの損傷の差分動力学（differential kinetics）を示す。（Ａ）ヒト化ＰＴ３  ｍＡｂ／ＣＳＦ混合物；（Ｂ）未処理のＣＳＦ；（Ｃ）ヒト化ＰＴ３  ｍＡｂである。
【図２１Ｃ】熱によって変性させた（Ａ、Ｃ）又はさせていない（Ｂ）、抗体対ｐ２１７＋タウの損傷の差分動力学（differential kinetics）を示す。（Ａ）ヒト化ＰＴ３  ｍＡｂ／ＣＳＦ混合物；（Ｂ）未処理のＣＳＦ；（Ｃ）ヒト化ＰＴ３  ｍＡｂである。
【図２２Ａ】抗体を含まない対抗体に結合しているｐ２１７＋タウを定量するための（Ａ）熱による変性、及び（Ｂ）免疫捕捉／ｒｐＨＰＬＣ方法を示し；（Ｃ）方法の比較を示す。
【図２２Ｂ】抗体を含まない対抗体に結合しているｐ２１７＋タウを定量するための（Ａ）熱による変性、及び（Ｂ）免疫捕捉／ｒｐＨＰＬＣ方法を示し；（Ｃ）方法の比較を示す。
【図２２Ｃ】抗体を含まない対抗体に結合しているｐ２１７＋タウを定量するための（Ａ）熱による変性、及び（Ｂ）免疫捕捉／ｒｐＨＰＬＣ方法を示し；（Ｃ）方法の比較を示す。
【図２３】カニクイザルＣＳＦにおけるｐ２１７＋タウのｐＴ３ベースのアッセイ認識の欠如を示す。
【図２４Ａ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイを使用して求められたマーモセットＣＳＦにおけるｐ２１７＋タウの測定値を示す。
【図２４Ｂ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイを使用して求められたマーモセットＣＳＦにおけるｐ２１７＋タウの測定値を示す。
【図２４Ｃ】（Ａ）ｐＴ３ｘｈＴ４３、（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２、及び（Ｃ）ｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイを使用して求められたマーモセットＣＳＦにおけるｐ２１７＋タウの測定値を示す。
【図２５Ａ】４人のＡＤ対象及び４人のＨＶ対象由来の粗血清中の（Ａ、Ｂ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウ）又は（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋タウ）の測定値を示す。測定は、（Ａ、Ｃ）１：４又は（Ｂ、Ｄ）１：１６希釈で行われ、希釈線形性及び感度の欠如に留意されたい。
【図２５Ｂ】４人のＡＤ対象及び４人のＨＶ対象由来の粗血清中の（Ａ、Ｂ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウ）又は（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋タウ）の測定値を示す。測定は、（Ａ、Ｃ）１：４又は（Ｂ、Ｄ）１：１６希釈で行われ、希釈線形性及び感度の欠如に留意されたい。
【図２５Ｃ】４人のＡＤ対象及び４人のＨＶ対象由来の粗血清中の（Ａ、Ｂ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウ）又は（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋タウ）の測定値を示す。測定は、（Ａ、Ｃ）１：４又は（Ｂ、Ｄ）１：１６希釈で行われ、希釈線形性及び感度の欠如に留意されたい。
【図２５Ｄ】４人のＡＤ対象及び４人のＨＶ対象由来の粗血清中の（Ａ、Ｂ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウ）又は（Ｃ、Ｄ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋タウ）の測定値を示す。測定は、（Ａ、Ｃ）１：４又は（Ｂ、Ｄ）１：１６希釈で行われ、希釈線形性及び感度の欠如に留意されたい。
【図２６Ａ】図２５Ａ〜２５Ｄで評価したのと同じ４人のＡＤ対象及び４人のＨＶ対象由来の、ＮａＯＡｃで前処理し、熱変性させた血清中の（Ａ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウ）又は（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋タウショート）の測定値を示す。
【図２６Ｂ】図２５Ａ〜２５Ｄで評価したのと同じ４人のＡＤ対象及び４人のＨＶ対象由来の、ＮａＯＡｃで前処理し、熱変性させた血清中の（Ａ）ｈＴ７ｘｐＴ８２（ｔタウ）又は（Ｂ）ｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋タウショート）の測定値を示す。
【図２７】図２５Ａ〜２５Ｄ及び図２６Ａ〜２６Ｂで評価したのと同じ４人のＡＤ対象及び４人のＨＶ対象由来の血清のｐＴ３免疫沈降（ＩＰ）におけるｐＴ３ｘｐＴ８２（ｐ２１７＋タウショート）の測定値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【００４２】
定義
別の定義がなされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によって恰もその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。
【００４３】
特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」なる語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は広い意味で用いられ、ポリクローナル抗体を含む免疫グロブリン又は抗体分子、マウス、ヒト、ヒト適合、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体及び抗体断片を含むモノクローナル抗体を含む。
【００４５】
一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、公知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。したがって、本発明の抗体は、５つの主要なクラス又は対応する下位クラスのいずれかのものであることができる。本発明の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であることが好ましい。いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちκ及びλのうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態に従うと、本発明の抗体は、マウス抗体又はヒト抗体の重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。
【００４６】
重鎖及び軽鎖定常領域に加えて、抗体は軽鎖及び重鎖可変領域を含有する。免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、「抗原結合部位」が割り込んだ「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下のとおり様々な用語及び符番スキームを用いて定義される：
（ｉ）Ｋａｂａｔ：「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、配列の変動性に基づく（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２：２１１−５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は、各可変領域に３つのＣＤＲ（例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を有する。
（ｉｉ）Ｃｈｏｔｈｉａ：用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７，１９８７）により定義されているように、構造中の超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗原結合部位は、各ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの超可変領域を有する。符番システム、並びにＣＤＲ及びＨＶＲのアノテーションは、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３８３２−９，２００８）により改訂されている。
（ｉｉｉ）ＩＭＧＴ：抗原結合部位を形成する領域の別の定義が、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体由来のＶドメインの比較に基づいて、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７，２００３）によって提案されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これら領域についての標準化された付番及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶＲ、及びＩＭＧＴの記述間の対応については、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，同上に記載されている。
（ｉｖ）抗原結合部位はまた、「特異性決定残基の使用」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２−４３，２００４）に基づいて記述することもでき、この場合、ＳＤＲは、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。
【００４７】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位の配列であると定義されるもの以外の、抗体の可変領域内の残りの配列である。抗原結合部位の正確な定義は、上述したような様々な描写により決定され得るため、正確なフレームワーク配列は、抗原結合部位の定義に依存する。フレームワーク領域（ＦＲ）は、より高度に保存された可変ドメインの部分である。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、３つの超可変ループにより接続された、βシート構成を一般的に用いる４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含む。各鎖の超可変ループはＦＲにより互いに緊密に折りたたまれ、他の鎖の超可変ループと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造分析により、相補性決定領域により形成される、配列と結合部位の形状との関係が明らかとなった（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７，１９９２；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５−１８２，１９９０）。これらの高い配列変動性にもかかわらず、６つのループのうち５つだけが、「標準構造」と言われる、小さなレパートリーの主鎖構造を採用する。これらの構造はまず、ループの長さにより決定され、次に、折りたたみ、水素結合、又は異常な主鎖構造を推定する能力により構造が決定される、ループ及びフレームワーク領域の特定の位置における鍵となる残基の存在により決定される。
【００４８】
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合断片」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される多重特異的抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片などの抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片が結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態に従うと、抗原結合断片は、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖の定常領域のＦｄセグメントを含む。他の特定の実施形態に従うと、抗原結合断片はＦａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリン、抗体又はその抗原結合断片が特異的に結合する、抗原上の部位を意味する。エピトープは、タンパク質の三次折りたたみにより並置された連続アミノ酸から、又は非連続アミノ酸からの両方で形成することができる。連続アミノ酸から形成したエピトープは、典型的には、変性溶媒にさらして保持されるが、三次折りたたみにより形成したエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理で喪失される。エピトープは、典型的には、独自な空間構造の中に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間構造を決定する方法としては、例えば、ｘ線結晶構造解析、及び２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「タウ」又は「タウタンパク質」とは、複数のアイソフォームを有する、多くある中枢神経系及び末梢神経系のタンパク質を意味する。ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）では、選択的スプライシングにより、３５２〜４４１アミノ酸長のサイズ範囲の６つの主要なタウアイソフォームが存在する（Ｈａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１５：１１２−９，２００９）。これらアイソフォームは、０〜２個のＮ末端挿入及び３又は４個のタンデムに配置された微小管結合反復配列が制御されて含まれることにより互いに異なっており、０Ｎ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ、２Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ、及び２Ｎ４Ｒと称される。本明細書で使用するとき、用語「対照タウ」とは、リン酸化及び他の翻訳後修飾されていない、配列番号１のタウアイソフォームを指す。本明細書で使用する場合、用語「タウ」は、完全長野生型タウの変異（例えば点変異、フラグメント、挿入、欠失、及びスプライスバリアント）を含むタンパク質を含む。用語「タウ」はまた、タウアミノ酸配列の翻訳後修飾を包含する。翻訳後修飾としては、リン酸化が挙げられるが、これに限定されない。
【００５１】
別途記載のない限り、本明細書で使用するとき、タウタンパク質又はその断片におけるアミノ酸の付番は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照する。
【００５２】
本明細書で使用するとき、用語「ｐ２１７＋タウペプチド」、「ｐ２１７＋タウ」、又は「ｐ２１７＋タウタンパク質」は、タウタンパク質の残基２１７（ｐＴ２１７）及び残基２１２（ｐＴ２１２）のうちの一方又は両方でリン酸化されたヒトタウタンパク質又はタウ断片を意味し、位置の付番は配列番号１の付番に従う。
【００５３】
本明細書で使用するとき、用語「ｐ２１７＋タウエピトープ」は、リン酸化Ｔ２１７及びリン酸化Ｔ２１２のうちの少なくとも１つを含有するタウエピトープを指し、位置の付番は、配列番号１の付番に従う。ｐ２１７＋タウエピトープの例としては、例えば、ｐＴ３エピトープが挙げられる。本明細書で使用するとき、用語「ｐＴ３エピトープ」は、ヒトタウのＴ２１７及びＴ２１２の少なくとも１つの残基でリン酸化されたヒトタウタンパク質のアミノ酸２１０〜２２０を含有するエピトープを指し、位置の付番は、配列番号１の付番に従う。ｐＴ３エピトープの例としては、例えば、配列番号２５、２６、及び２７が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用するとき、用語「ロングｐ２１７＋タウペプチド」、「ロングｐ２１７＋タウ」、「ロング形態のｐ２１７＋タウペプチド」、又は「ロングｐ２１７＋タウペプチド断片」はそれぞれ同じ意味を有し、ｐ２１７＋タウエピトープ及びタウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープを含むｐ２１７＋タウペプチドを指す。本発明の実施形態による「ロングｐ２１７＋タウペプチド」は、異なる長さを有し得る。例えば、「ロングｐ２１７＋タウペプチド断片」のアミノ末端は、タウタンパク質のアミノ酸残基１、２、４、５、６、又は７であり得る。
【００５５】
本明細書で使用するとき、用語「ショートｐ２１７＋タウペプチド」、「ショートｐ２１７＋タウ」、「ショート形態のｐ２１７＋タウペプチド」、又は「ショートｐ２１７＋タウペプチド断片」はそれぞれ同じ意味を有し、ｐ２１７＋タウエピトープ及びタウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープを含むが、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープを含有しない、ｐ２１７＋タウペプチドを指す。本発明の実施形態による「ショートｐ２１７＋タウペプチド」は、異なる長さを有し得る。例えば、「ショートｐ２１７＋タウペプチド」のアミノ末端は、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープと、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープとの間のアミノ酸残基のいずれであってもよい。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「ロングタウペプチド」、「ロングタウ」、「ロング形態のタウペプチド」、又は「ロングタウペプチド断片」はそれぞれ同じ意味を有し、リン酸化非依存性捕捉抗体によって認識されるタウエピトープと、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープとを含むタウペプチドを指す。本発明の実施形態による「ロングタウペプチド断片」は、異なる長さを有し得る。例えば、「ロングタウペプチド断片」のアミノ末端は、タウタンパク質のアミノ酸残基１、２、４、５、６、又は７であり得る。
【００５７】
本明細書で使用するとき、用語「ショートタウペプチド」、「ショートタウ」、「ショート形態のタウペプチド」、又は「ショートタウペプチド断片」はそれぞれ同じ意味を有し、リン酸化非依存性捕捉抗体によって認識されるタウエピトープと、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むが、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープを含有しないエピトープとを含むタウペプチドを指す。本発明の実施形態による「ショートタウペプチド断片」は、異なる長さを有し得る。例えば、「ショートタウペプチド」のアミノ末端は、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープと、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープとの間のアミノ酸残基のいずれであってもよい。
【００５８】
本明細書で使用するとき、用語「捕捉抗体」は、目的の抗原に結合し、固体担体に直接又は間接的に結合している抗体を指す。固体担体の例としては、マイクロ粒子又は磁気ビーズなどのビーズが挙げられるが、これらに限定されない。捕捉抗体の例としては、ｐ２１７＋タウエピトープに結合するモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態によれば、捕捉抗体は、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３５、３６及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体であり得る。具体的な実施形態では、捕捉抗体は、ｐＴ３である。本明細書で使用するとき、用語「ｐＴ３」は、ｐ２１７＋タウペプチドに結合し、配列番号２８の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号２９の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体を指す。一実施形態では、ｐＴ３モノクローナル抗体は、マウス−ハイブリドーマによって発現される。別の実施形態では、捕捉抗体は、配列番号３０の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号３１の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するヒト化抗体である。
【００５９】
本発明の他の実施形態によれば、捕捉抗体は、リン酸化非依存的にタウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０、好ましくはヒトタウタンパク質のアミノ酸２１１〜２２１又はアミノ酸１５９〜１６３のエピトープに結合するモノクローナル抗体であってよく、位置の付番は、配列番号１の付番に従う。具体的な実施形態では、捕捉抗体は、ｈＴ７である。本明細書で使用するとき、用語「ｈＴ７」は、ヒトタウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むエピトープに結合する公に入手可能なモノクローナル抗体を指し、位置の付番は、配列番号１の付番に従う。ｈＴ７モノクローナル抗体は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（例えば、カタログ番号：ＭＮ１０００）から市販されている。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「検出抗体」は、目的の抗原に結合し、検出可能な標識を有するか又は二次検出システムに連結する抗体を指す。検出可能な標識の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられるが、これらに限定されない。検出抗体の例としては、タウタンパク質、好ましくはヒトタウタンパク質のアミノ酸７〜２０又は１１６〜１２７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されず、位置の付番は、配列番号１の付番に従う。アミノ酸７〜２０を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合するモノクローナル抗体を、捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドの検出抗体として使用する場合、ロングタウ断片が検出される。アミノ酸１１６〜１２７を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合するモノクローナル抗体を、捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドの検出抗体として使用する場合、ショート及びロングタウ断片が検出される。
【００６１】
具体的な実施形態では、検出抗体は、ｈＴ４３である。本明細書で使用するとき、用語「ｈＴ４３」は、ヒトタウタンパク質のアミノ酸７〜２０を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体を指し、位置の付番は、配列番号１の付番に従い、当該抗体は、配列番号８の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号９の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する。別の具体的な実施形態では、検出抗体は、ｐＴ８２である。本明細書で使用するとき、用語「ｐＴ８２」は、ヒトタウタンパク質のアミノ酸１１９〜１２６、好ましくは１１６〜１２７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体を指し、位置の付番は、配列番号１の付番に従い、当該抗体は、配列番号１８の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する。
【００６２】
本明細書で使用するとき、用語「ｐＴ３ベースのアッセイ」は、ｐＴ３抗体を捕捉抗体として使用する、本発明の実施形態によるアッセイを指す。本明細書で使用するとき、用語「ｐＴ３ｘｈＴ４３」は、ｐＴ３抗体を捕捉抗体として使用し、ｈＴ４３抗体を検出抗体として使用する、本発明の実施形態によるアッセイを指す。本明細書で使用するとき、用語「ｐＴ３ｘｐＴ８２」は、ｐＴ３抗体を捕捉抗体として使用し、ｐＴ８２抗体を検出抗体として使用する、本発明の実施形態によるアッセイを指す。
【００６３】
本明細書で使用するとき、用語「ｈＴ７ベースのアッセイ」は、ｈＴ７抗体を捕捉抗体として使用する、本発明の実施形態によるアッセイを指す。本明細書で使用するとき、用語「ｈＴ７ｘｐＴ８２」は、ｈＴ７抗体を捕捉抗体として使用し、ｐＴ８２抗体を検出抗体として使用する、本発明の実施形態によるアッセイを指す。
【００６４】
本明細書で使用するところの「対象」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物を指す。具体的な実施形態によれば、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモット、マーモセット、又はマウス）、又は霊長類（例えば、サル、チンパンジー、又はヒト）を含む哺乳動物である。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【００６５】
本明細書で使用するとき、「タウオパチー」は、脳内のタウの病理学的凝集を伴う任意の神経変性疾患を包含する。家族性及び散発性ＡＤに加えて、他の例示的なタウオパチーは、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン症候群認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質大脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維濃縮による非ガマニアン（Guamanian）運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、及び、拳闘家認知症（ボクサー病）などの慢性外傷性脳症である（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，７０：４１０−２６，２０１１）。
【００６６】
本明細書で使用するとき、用語「判定する」、「測定する」、「評価する」、及び「アッセイする」は、互換的に使用され、定量的及び定性的判定の両方を含む。これらの用語は、任意の形態の測定を指し、特性、形質、又は特徴が存在するか否かを判定することを含む。評価は、相対的であっても絶対的であってもよい。「の存在を評価する」は、存在する何かの量を決定すること、並びに存在するか不在であるかを判定することを含む。
【００６７】
本明細書で使用するとき、用語「診断」とは、疾患若しくは障害を検出すること、又はタウオパチーなどの疾患若しくは障害のステージ若しくは程度を判定することを意味する。通常、疾患又は障害の診断は、当該疾患を示す１つ以上の因子及び／又は症状の評価に基づく。診断は、疾患又は病態の有無を示す因子、例えば、ｐ２１７＋タウの存在、不在、又は量に基づいて行うことができる。特定の疾患の診断を示すと考えられる各因子又は症状は、当該特定の疾患にのみ関連している必要はない、すなわち、診断因子又は症状から推測され得る異なる診断が存在し得る。同様に、特定の疾患を示す因子又は症状が、特定の疾患を有さない個体に存在する例もあり得る。用語「診断」はまた、薬物療法、例えば、抗ｐ２１７＋タウ抗体療法の治療効果を判定すること、又は薬物療法、例えば、抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に対する応答のパターンを予測することも包含する。診断方法は、独立して使用してもよく、又は特定の疾患若しくは障害、例えばアルツハイマー病のための医学分野において既知の他の診断及び／若しくはステージ分類方法と組み合わせて使用してもよい。
【００６８】
本明細書で使用するとき、用語「増加する」及び「減少する」は、対照又は基準レベルと比較した、サンプル中の特定のバイオマーカーの量の差を指す。例えば、特定のペプチドの量は、基準レベルと比較して、疾患を有する患者のサンプル中に増加した量又は減少した量で存在し得る。一実施形態では、「レベルの上昇」又は「レベルの低下」は、対照と比較したとき、サンプル中に存在するバイオマーカーのレベル間の差が少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、又はそれ以上であることであり得る。一実施形態では、「レベルの上昇」又は「レベルの低下」は、対照と比較したとき、サンプル中に存在するバイオマーカーのレベル間の差が統計的に有意であることであり得る。例えば、測定されたバイオマーカーのレベルが、任意の対照群又は基準群の平均の約１．０標準偏差、約１．５標準偏差、約２．０標準偏差、又は約２．５の標準偏差だけ外側にある場合、差は統計的に有意であり得る。基準又は対照は、例えば、健常個体由来のサンプル、又は治療薬の投与前の時点若しくは治療レジメン中のより早い時点などの、より早い時点で同じ個体から採取されたサンプルであり得る。
【００６９】
本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、生物学的構成成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの構成成分が天然に生じる生物の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質）から実質的に分離されたか、これらの他の成分とは別に生成されたか、又はこれらの他の成分から精製されたものであることを意味する。このため、「単離」された核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。
【００７０】
本明細書で使用するとき、「タウタンパク質に結合する単離された抗体」又は「単離された抗タウ抗体」は、タウタンパク質に特異的に結合し、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、単離された抗タウ検出抗体は、タウ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、単離された抗タウ検出抗体は、例えば他の種由来の他の関連抗原（タウ種のホモログなど）に対して交差反応性を有する場合がある。
【００７１】
本明細書で使用するとき、用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、本発明の抗タウ抗体が、約１×１０−６Ｍ又はそれより緊密な、例えば、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０Ｍ−１０以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、若しくは約１×１０−１３Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で所定の標的に結合する能力を指す。ＫＤは、Ｋａに対するＫｄの比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて決定することができる。例えば、抗タウ抗体のＫＤ値は、表面プラズモン共鳴を用いることにより、例えば、バイオセンサシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム、Ｐｒｏｔｅｏｎ機器（ＢｉｏＲａｄ）、ＫｉｎＥｘＡ機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に既知の競合結合アッセイを用いることにより求めることができる。典型的には、抗タウ抗体は、例えばＰｒｏｔｅｏｎ機器（ＢｉｏＲａｄ）を使用した表面プラズモン共鳴によって測定したとき、非特異的標的に対するＫＤよりも少なくとも１０倍低いＫＤで所定の標的（すなわち、タウ）に結合する。しかし、タウに特異的に結合する抗タウ抗体は、他の関連標的、例えば他の種（ホモログ）、例えば、マウス、ラット、マーモセット、イヌ、又はブタ由来の所定の同一標的に対する交差反応性を有する場合がある。
【００７２】
本明細書で使用するところの「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
【００７３】
本明細書で使用するところの「ベクター」なる用語は、別の核酸セグメントを機能的に挿入することによってそのセグメントの複製又は発現を行うことができるレプリコンのことである。
【００７４】
本明細書で使用するところの「宿主細胞」なる用語は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞のいずれのタイプの細胞であってもよい。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子をトランスフェクトした細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」は、かかるトランスフェクトされた細胞の子孫又は潜在的な子孫である。ある細胞の子孫は、例えば、後続の世代で生じ得る変異若しくは環境の影響、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みによって、親細胞との同一性を有していない場合がある。
【００７５】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。タウに結合する、発現した検出抗体又はその抗原結合断片は、宿主細胞の細胞質内にある場合もあり、細胞培養物の増殖培地などの細胞外環境に入る場合もあり、細胞膜に固着している場合もある。
【００７６】
抗タウ抗体
一般的な一態様では、本発明は、捕捉抗体によって固定化されているタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片に関する。このような抗タウ抗体は、タウにおけるリン酸化エピトープに結合するか又はタウにおける非リン酸化エピトープに結合する特性を有し得る。抗タウ検出抗体は、生体サンプル中のタウを検出するための研究又は診断試薬として有用であり得る。
【００７７】
具体的な態様によれば、本発明は、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６、好ましくはアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７８】
具体的な態様によれば、タウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）それぞれ配列番号２、３、及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに（ｂ）それぞれ配列番号５、６、及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００７９】
具体的な態様によれば、タウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。
【００８０】
好ましくは、タウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片は、ｐＴ８２抗体である。
【００８１】
具体的な態様によれば、本発明は、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００８２】
具体的な態様によれば、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに（ｂ）それぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００８３】
具体的な態様によれば、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１９と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。
【００８４】
好ましくは、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する、単離された検出抗体又はその抗原結合断片は、ｈＴ４３抗体である。
【００８５】
本発明の抗体は様々な技術により、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ．２５６：４９５−７，１９７５）により製造することができる。アクセプター抗体（典型的にはヒトなどの別の哺乳類種）に由来する軽鎖及び重鎖定常領域と会合しているドナー抗体（典型的にはマウス）に由来する軽鎖及び重鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４８１６５６７号に記載されている方法により調製することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（典型的にはマウス）に由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来するＣＤＲグラフト化ｍＡｂは、例えば米国特許第５２２５５３９号に開示されている、当業者に既知の技術により調製することができる。任意の非ヒト配列を欠く完全ヒトｍＡｂは、（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３６８：８５６−９，１９９４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−５１，１９９６；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６，１９９７）において言及されている技術によって、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製することができる。また、ヒトｍＡｂは、ファージディスプレイライブラリから調製及び最適化することもできる（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７−８４，２００１；Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３９７：３８５−９６，２０１０）。
【００８６】
タウに結合する検出抗体及びその抗原結合断片の機能活性は、当該技術分野において既知の方法により特徴付けることができる。タウに結合する抗体及びその抗原結合断片を特徴付ける方法としては、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、及びＦＡＣＳ分析、免疫組織化学分析などを含む親和性及び特異性アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
幾つかの周知の方法を用いて本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。例えば、両方の個別の構成成分の構造が既知である場合、インシリコでタンパク質−タンパク質ドッキングを行って、適合する相互作用部位を特定することができる。抗原抗体複合体を用いて水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって、抗体が結合する抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点変異誘導を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与する残基を特定することができる。
【００８８】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の検出抗体又はその抗原結合断片をコードしている、単離ポリヌクレオチドに関する。タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができることが、当業者には理解されよう。したがって、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、本発明の検出抗体又はその抗原結合断片をコードしている核酸配列を変更できることが当業者には理解されるであろう。例示的な単離ポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号２、３、及び４に示す免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むポリペプチド、又はそれぞれ配列番号５、６、及び７に示す免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。他の例示的な単離ポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４に示す免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むポリペプチド、又はそれぞれ配列番号１５、１６、及び１７に示す免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。他の例示的な単離ポリヌクレオチドは、本発明の抗体可変領域をコードしているポリヌクレオチドである。遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの選好性を考慮すると、本発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明の単離核酸は、公知の組み換え又は合成技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法を用いて容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマが生成される場合、そのような細胞はそれらのＤＮＡの供給源として機能することができる。あるいは、コード配列と翻訳生成物が結合したディスプレイ技術、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリーを使用することができる。
【００８９】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の検出抗体又はその抗原結合断片をコードしている単離ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどの、本開示の観点から当業者に公知の任意のベクターも使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組み換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモーターは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモーターであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当技術分野において知られており、細胞内で抗体又はその抗原結合断片を生成するために、本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成を使用して、本発明の実施形態に従った組み換え発現ベクターを生成することができる。
【００９０】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の検出抗体又はその抗原結合断片をコードしている単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本開示の観点から、当業者に知られている任意の宿主細胞を、本発明の抗体又は抗原結合断片の組み換え発現に使用することができる。そのような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってよい。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（アメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ヨーロッパ細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）ネズミ細胞株などといった、ハイブリドーマ又は骨髄腫の細胞株などの不死化細胞株が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はＤＧ４４などのチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【００９１】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の検出抗体又はその抗原結合断片の生成方法であって、本発明の検出抗体又はその抗原結合断片を生成する条件下において、当該検出抗体又はその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含む細胞を培養することと、当該細胞又は細胞培養物から（例えば、上清から）当該抗体又はその抗原結合断片を回収することと、を含む、方法に関する。発現した抗体又はその抗原結合断片を細胞から回収して、当該技術分野において通常的な技術に従い精製することができる。
【００９２】
診断方法
本発明は、例えば、捕捉されたｐ２１７＋タウ種の検出を可能にするレポーターエレメントで標識された抗タウ検出抗体と組み合わせて、ｐ２１７＋タウ種を選択的に固定化するｐＴ３などの捕捉抗体を使用することによる、ＡＤにおいて多く含まれるｐ２１７＋タウ種の測定に関する。本発明の方法は、例えば、対象のＡＤ又は他のタウオパチーを診断するため、治療の有効性をモニタリングするため、抗ｐ２１７＋タウ治療に適している対象を特定するためなど、様々な診断目的に使用することができる。
【００９３】
本発明の実施形態によれば、目的のサンプル中のｐ２１７＋タウペプチドは、配列番号２５、２６又は２７のアミノ酸配列を有するエピトープなどのｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体で捕捉される。捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドは、全てｐ２１７＋タウエピトープを含有するが、異なる長さを有し得、これを異なるエピトープに結合する検出抗体によって検出することができる。例えば、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する検出抗体は、依然としてタウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含有する、捕捉されたｐ２１７＋タウペプチド又はその断片（「ロングｐ２１７＋タウペプチド」）だけを検出することができ、一方、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する検出抗体は、ロングｐ２１７＋タウペプチドだけでなく、ショートｐ２１７＋タウペプチドも検出することができる。捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０又は１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、サンプル中のロングｐ２１７＋タウペプチド又はｐ２１７＋タウペプチド（ロング及びショートｐ２１７＋タウペプチド）の量を検出及び測定することができる。サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量は、ｐ２１７＋タウペプチドの量からロングｐ２１７＋タウペプチドの量を差し引くことによって計算される。
【００９４】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量を捕捉及び測定することに加えて、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のエピトープに対する抗体、好ましくはタウタンパク質のアミノ酸１５９〜１６３を含むエピトープに対する抗体などのリン酸化非依存性捕捉抗体で、サンプル中の総タウペプチドを捕捉する。捕捉された総タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０又は１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、サンプル中の総ロングタウペプチド又は総タウペプチド（ロング及びショートタウペプチド断片）の量を検出及び測定することができる。サンプル中のショート総タウペプチドの量は、総タウペプチドの量からロング総タウペプチドの量を差し引くことによって計算される。
【００９５】
本発明の実施形態によれば、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドに関連する値、例えば、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量及びロングｐ２１７＋タウペプチドの量、任意選択で総タウペプチドの量及び総ロングタウ断片の量、並びに測定量に基づく情報、例えば、計算されたショートｐ２１７＋タウペプチド及びショート総タウペプチド、又はｐ２１７＋タウペプチドに関連する比、例えば、ショートタウペプチド断片の量のロングタウペプチド断片の量に対する比、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のショートタウ断片の総量に対する比、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量のロングタウ断片の総量に対する比などを、１つ以上の診断目的のために使用することができる。
【００９６】
診断は、対象由来のサンプル中のｐ２１７＋タウペプチドに関連する値を、対応するベースライン値と比較することによって行われる。ベースライン値は、健常な個体の集団における平均レベルを表し得る。また、ベースライン値は、同じ対象において決定された以前のレベルを表す。一実施形態では、対象由来の生体サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドに関連する値、例えば、ロング又はショートｐ２１７タウペプチドの量、又はｐ２１７＋タウペプチドに関連する比、例えば、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比が、対応するベースライン値よりも有意に高い場合、対象はタウオパチーに罹患していると判定される。本明細書で使用するとき、「有意に高い」は、０．０５以下のｐ値を有する、偶然のみに起因しない、統計的に有意なより高い値を指す。「有意に高い」は、０．０５、０．０４、０．０３、０．０１、０．００５、０．００１未満などのｐ値で、健常ボランティアでみられるものよりも少なくとも約１％、２％、５％、又は１０％高くてよい。
【００９７】
一実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、リン酸化ｐ２１７＋タウを含むエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、アミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、及び／又はタウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、サンプル中のロング及びショートｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、（ｉｉｉ）ｐ２１７＋タウペプチドの量、又はショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比に基づいて、対象がタウオパチーに罹患しているかどうか又はタウオパチーを発症するリスクがあるかどうかを判定することと、を含む。診断は、対象由来のサンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量又は濃度を、対応するベースライン値と比較することによって行うことができる。また、診断は、対象由来のサンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比を、対応するベースライン値と比較することによっても行うことができる。
【００９８】
別の実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉すること、又はタウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のタウエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中の総タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチド又は捕捉された総タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、当該サンプル中のロング及びショートｐ２１７＋タウペプチドの量又は総ショートタウタンパク質の量を測定することと、（ｉｉｉ）当該生体サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比の量に基づいて、対象がタウオパチーに罹患しているかどうか又はタウオパチーを発症するリスクがあるかどうかを判定することと、を含む。診断は、対象由来のサンプル中の、ｐＴ３抗体、すなわち、タウのアミノ酸２１１〜２２１によって認識されるのと同じ、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の、タウタンパク質の領域を含む総ショートタウペプチドの量に対する比を、対応するベースライン値と比較することによって行うことができる。
【００９９】
別の実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、アミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、及び／又はタウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、サンプル中のロング及びショートｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、（ｉｉｉ）ｐ２１７＋タウペプチドの量、又はショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比に基づいて、対象における治療の有効性を判定することと、を含む。
【０１００】
更に別の実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉すること、又はタウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のタウエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中の総タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチド又は捕捉された総タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、当該サンプル中のロング及びショートｐ２１７＋タウペプチドの量又は総ショートタウタンパク質の量を測定することと、（ｉｉｉ）当該生体サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比の量に基づいて、対象における治療の有効性を判定することと、を含む。
【０１０１】
更に別の実施形態では、対象における治療の有効性は、ｐ２１７＋タウペプチドの量、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又は治療前、治療中、若しくは治療後の、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比をモニタリングすることによって判定される。ベースラインに対する値の減少は、治療に対する陽性応答を示す。また、値は、病理学的タウが脳からクリアランスされたとき、生物学的流体において一時的に増加する場合がある。
【０１０２】
具体的な態様によれば、タウオパチーとしては、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
好ましくは、タウオパチーは、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、ＦＴＤＰ−１７、又は進行性核上麻痺である。
【０１０４】
最も好ましくは、タウオパチーは、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）である。
【０１０５】
一実施形態によれば、本発明の方法は、（ｉ）生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、アミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、及び／又はタウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、当該サンプル中のロング及びショートｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、（ｉｉｉ）ｐ２１７＋タウペプチドの量、又はショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比に基づいて、対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適しているかどうかを判定することと、を含む。
【０１０６】
具体的な態様によれば、生体サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量、又は生体サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比が、対応するベースライン値よりも有意に高い場合、対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適していると判定される。
【０１０７】
別の具体的な態様によれば、本発明の方法は、（ｉ）生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉すること、又はタウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のタウエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中の総タウペプチドを捕捉することと、（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチド又は捕捉された総タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、当該サンプル中のロング及びショートｐ２１７＋タウペプチドの量又は総ショートタウタンパク質の量を測定することと、（ｉｉｉ）当該生体サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比の量に基づいて、対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適しているかどうかを判定することと、を含む。
【０１０８】
一実施形態によれば、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比が、対応するベースライン値よりも有意に高い場合、対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適していると判定される。
【０１０９】
本発明はまた、生体サンプル中の抗体と複合体を形成しているｐ２１７＋タウ、並びに抗体に結合していないサンプル中の遊離ｐ２１７＋タウの測定にも関する。一実施形態では、総抗体は、親和性技術を用いて捕捉され、続いて、カオトロープ、熱不活性化、又は他のタンパク質破壊技術を含む変性条件に供される。ｐ２１７＋タウは、ｒｐＨＰＬＣを使用して抗体から分離され、本発明の方法を使用して測定され、これによって、抗体に結合しているｐ２１７＋タウの定量が可能になる。
【０１１０】
一般的な態様によれば、本発明は、対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングする方法であって、（ｉ）対象から生体サンプルを得ることと、（ｉｉ）当該生体サンプルを、抗体に結合しているｐ２１７＋タウを含有するＩｇＧ富化サンプルと、抗体を含まないｐ２１７＋タウを含有するＩｇＧ枯渇サンプルとに分離することと、（ｉｉｉ）ｒｐＨＰＬＣによってＩｇＧから当該ｐ２１７＋タウを精製して、抗体を含まないｐ２１７＋タウサンプルを得ることと、（ｉｖ）当該ＩｇＧ富化サンプル及び当該抗体を含まないｐ２１７＋タウサンプルのそれぞれを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｖ）当該サンプルのそれぞれにおける捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、アミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、又はタウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるロング及びショートｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、（ｖｉ）抗体に結合しているｐ２１７＋タウの量の抗体を含まないｐ２１７＋タウの量に対する比を計算することと、（ｖｉｉ）計算された比に基づいて、当該対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすることと、を含む、方法に関する。
【０１１１】
別の一般的な態様によれば、本発明は、対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングする方法であって、（ｉ）対象から生体サンプルを得ることと、（ｉｉ）総ｐ２１７＋タウを含有する生体サンプルから半変性サンプルを得、抗体を含まないｐ２１７＋タウを含有する生体サンプルから非変性サンプルを得ることであって、その際、当該半変性サンプルを加熱して当該サンプル中の当該抗体を変性させる、ことと、（ｉｉｉ）当該半変性サンプル及び当該非変性サンプルのそれぞれをｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、（ｉｖ）当該サンプルのそれぞれにおける捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、アミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定すること、又はタウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるロング及びショートｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、（ｖ）総ｐ２１７＋タウの量から抗体を含まないｐ２１７＋タウの量を差し引くことによって、当該サンプル中の抗体に結合しているｐ２１７＋タウの量を計算することと、（ｖｉ）当該抗体に結合しているｐ２１７＋タウの当該抗体を含まないｐ２１７＋タウに対する比を計算することと、（ｖｉｉ）計算された比に基づいて、当該対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすることと、を含む、方法に関する。
【０１１２】
具体的な態様によれば、対象における治療の有効性は、治療前、治療中、又は治療後に、抗体に結合している、及び抗体を含まないｐ２１７＋タウペプチドの量をモニタリングすることによって判定される。ベースラインに対する抗体を含まないｐ２１７＋タウの値の減少、又はベースラインに対する抗体に結合しているｐ２１７＋タウの値の増加、したがって、ベースラインに対する当該抗体に結合しているｐ２１７＋タウの当該抗体を含まないｐ２１７＋タウに対する比の増加は、治療に対する陽性応答を示す。また、抗体を含まないｐ２１７＋タウの値は、病理学的タウが脳からクリアランスされるとき、生物学的流体において一時的に増加する場合もある。
【０１１３】
具体的な態様によれば、本発明の方法の捕捉抗体は、磁気ビーズなどのビーズにコンジュゲートされている。他の具体的な態様によれば、検出抗体はビオチン化されている。
【０１１４】
具体的な態様によれば、本発明の方法で測定されるｐ２１７＋タウペプチドの量は、ＥＬＩＳＡ及び単一分子アレイプラットフォームを含む当該技術分野において既知の任意の好適な技術を使用して求めることができる。具体的な態様によれば、本発明の方法では、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ  Ｓｉｍｏａ又はＭＳＤ  Ｓ−ｐｌｅｘなどの高感度アレイプラットフォームを使用して、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量を測定する。具体的な態様によれば、本発明の方法の定量下限は約４０ｆｇ／ｍＬであり、当該方法の検出下限は約２ｆｇ／ｍＬである。
【０１１５】
具体的な態様によれば、本発明の方法で使用されるサンプルは、血液、脳ホモジネート、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルなどの生体サンプルである。好ましくは、サンプルはＣＳＦサンプルである。具体的な態様によれば、サンプルは粗ＣＳＦサンプルである。別の具体的な態様によれば、サンプルは、完全長タウタンパク質と差分化サイズのタウ断片とを分離する逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）を使用して、ＣＳＦなどの生体サンプルを分画した後に得られる。
【０１１６】
具体的な態様によれば、本発明の方法の捕捉抗体は、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、捕捉抗体は、配列番号２８のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｐＴ３抗体である。
【０１１７】
具体的な態様によれば、本発明の方法の検出抗体は、それぞれ配列番号２、３、及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号５、６、及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、検出抗体は、配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｐＴ８２抗体である。
【０１１８】
別の具体的な態様によれば、本発明の方法の検出抗体は、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、検出抗体は、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｈＴ４３抗体である。
【０１１９】
キット
別の一般的な態様では、本発明は、（ａ）ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体、任意選択で、タウタンパク質のアミノ酸１５０〜２５０のタウエピトープに対するリン酸化非依存性捕捉抗体と、（ｂ）タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０又は１１６〜１２７を含むタウタンパク質エピトープに対する少なくとも１つの検出抗体と、を含む、キットに関する。キットを使用して、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定し、これは、サンプル中のショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、及び／又はショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比に使用される。
【０１２０】
検出抗体は、直接検出可能であるか又は二次反応（例えば、ストレプトアビジンとの反応）を介して検出可能である、任意の検出可能な標識（例えば、蛍光標識、ビオチンなど）を含有していてよい。あるいは、検出可能な標識を含有する第２の試薬を使用してもよく、この場合、第２の試薬は、一次抗体に対する結合特異性を有する。生体サンプルにおけるｐ２１７＋タウを測定するのに好適な診断キットでは、キットの抗体は、マイクロタイターディッシュのウェル又はビーズなどの固相に予め結合した状態で供給され得る。
【０１２１】
具体的な態様によれば、本発明のキットの捕捉抗体は、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、捕捉抗体は、配列番号２８のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｐＴ３抗体である。
【０１２２】
具体的な態様によれば、本発明のキットの検出抗体は、それぞれ配列番号２、３、及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号５、６、及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、検出抗体は、配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｐＴ８２抗体である。
【０１２３】
別の具体的な態様によれば、本発明のキットの検出抗体は、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、検出抗体は、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むｈＴ４３抗体である。
【０１２４】
別の具体的な態様によれば、本発明のキットは、本発明の方法を使用して、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量、これは、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、及び／又はショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比を測定するために使用される。
【０１２５】
本出願全体で引用した全ての引用参考文献（論文参考文献、交付済み特許、公開された特許出願、及び同時係属の特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
【０１２６】
実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
【０１２７】
実施形態１は、サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量を測定する方法であって、
（ｉ）当該サンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、
（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６、例えばアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープ、又はタウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含有するエピトープに対する検出抗体と接触させて、それぞれ、ｐ２１７＋タウペプチドの量又はロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、を含む、方法である。
【０１２８】
実施形態２は、サンプル中のロングｐ２１７＋タウペプチド又はショートｐ２１７タウペプチド断片の相対量を求める方法であって、
（ｉ）当該サンプルを、ｐ２１７＋タウエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、
（ｉｉ）捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基１１９〜１２６を含むエピトープに対する第１の検出抗体と接触させて、ｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、
（ｉｉｉ）当該捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープに対する第２の検出抗体と接触させて、ロングｐ２１７＋タウペプチドの量を測定することと、
（ｉｖ）当該ｐ２１７＋タウペプチドの量及び当該ロングｐ２１７＋タウペプチドの量に基づいてロングｐ２１７＋タウペプチド又はショートｐ２１７＋タウペプチドの相対量を求めることと、を含む、方法である。
【０１２９】
実施形態３は、当該捕捉抗体がビーズにコンジュゲートされており、当該検出抗体がビオチン化されている、実施形態１又は２に記載の方法である。
【０１３０】
実施形態４は、当該サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量が、高感度プラットフォームを使用して測定される、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法である。
【０１３１】
実施形態５は、当該方法の定量下限が、約４０ｆｇ／ｍＬの当該ｐ２１７＋タウペプチドであり、当該方法の検出下限が、約２ｆｇ／ｍＬの当該ｐ２１７＋タウペプチドである、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法である。
【０１３２】
実施形態６は、当該サンプルが、対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルであり、当該方法が、当該生体サンプル中の当該ｐ２１７＋タウペプチドの量、ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又はショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比に基づいて、当該対象がタウオパチーに罹患しているかどうか又はタウオパチーを発症するリスクがあるかどうかを判定すること、を更に含む、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法である。
【０１３３】
実施形態７は、当該生体サンプル中の当該ｐ２１７＋タウペプチドの量、当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又は当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比が、対応するベースライン値、例えば、健常ボランティアの対応する平均値よりも有意に高い場合、当該対象がタウオパチーに罹患しているか又はタウオパチーを発症するリスクがあると判定される、実施形態６に記載の方法である。
【０１３４】
実施形態８は、当該サンプルが、タウオパチーの治療中の対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルであり、当該方法が、当該生体サンプル中の当該ｐ２１７＋タウペプチドの量、当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又は当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比に基づいて、当該対象における当該治療の有効性を判定すること、を更に含む、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法である。
【０１３５】
実施形態９は、当該生体サンプル中の当該ｐ２１７＋タウペプチドの量が治療の過程にわたって減少する場合、当該治療が有効であると判定される、実施形態８に記載の方法である。
【０１３６】
実施形態１０は、当該タウオパチーが、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される、実施形態６〜９のいずれかに記載の方法である。
【０１３７】
実施形態１１は、当該タウオパチーが、アルツハイマー病である、実施形態１０に記載の方法である。
【０１３８】
実施形態１２は、当該サンプルが、ヒト対象由来の生体サンプル、好ましくはＣＳＦサンプルであり、当該方法が、当該生体サンプル中の当該ｐ２１７＋タウペプチドの量、当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又は当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比に基づいて、当該対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適しているかどうかを判定すること、を更に含む、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法である。
【０１３９】
実施形態１３は、当該生体サンプル中の当該ｐ２１７＋タウペプチドの量、当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量のロングｐ２１７＋タウペプチドの量に対する比、又は当該ショートｐ２１７＋タウペプチドの量の総ショートタウペプチドの量に対する比が、対応するベースライン値、例えば、健常ボランティアの対応する平均値よりも有意に高い場合、当該対象が抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適していると判定される、実施形態１２に記載の方法である。
【０１４０】
実施形態１４は、対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングする方法であって、
ｉ．当該対象から生体サンプルを得ることと、
ｉｉ．当該生体サンプルを、抗体に結合しているｐ２１７＋タウを含有するＩｇＧ富化サンプルと、抗体を含まないｐ２１７＋タウを含有するＩｇＧ枯渇サンプルとに分離することと、
ｉｉｉ．当該ＩｇＧ富化サンプル及び当該ＩｇＧ枯渇サンプルのそれぞれを、当該タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２及び／又はリン酸化Ｔ２１７を含むエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおけるｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、
ｉｖ．捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０又は１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、当該生体サンプル中の当該抗体に結合しているｐ２１７＋タウの量及び当該抗体を含まないｐ２１７＋タウの量を測定することと、
ｖ．当該抗体に結合しているｐ２１７＋タウの当該抗体を含まないｐ２１７＋タウに対する比を計算することと、
ｖｉ．計算された比に基づいて、当該対象における当該抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすることと、を含む、方法である。
【０１４１】
実施形態１５は、対象における抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングする方法であって、
ｉ．当該対象から生体サンプルを得ることと、
ｉｉ．総ｐ２１７＋タウを含有する生体サンプルから半変性サンプルを得、抗体を含まないｐ２１７＋タウを含有する生体サンプルから非変性サンプルを得ることであって、その際、当該半変性サンプルを加熱して当該サンプル中の当該抗体を変性させる、ことと、
ｉｉｉ．当該半変性サンプル及び当該非変性サンプルのそれぞれを、当該タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２及び／又はリン酸化Ｔ２１７を含むエピトープに対する捕捉抗体と接触させて、当該サンプルのそれぞれにおける当該ｐ２１７＋タウペプチドを捕捉することと、
ｉｖ．捕捉されたｐ２１７＋タウペプチドを、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０又は１１６〜１２７を含むエピトープに対する検出抗体と接触させて、当該生体サンプル中の当該総ｐ２１７＋タウの量及び当該抗体を含まないｐ２１７＋タウの量を測定することと、
ｖ．当該総ｐ２１７＋タウの量から当該抗体を含まないｐ２１７＋タウの量を差し引くことによって、当該サンプル中の抗体に結合しているｐ２１７＋タウの量を計算することと、
ｖｉ．当該抗体に結合しているｐ２１７＋タウの当該抗体を含まないｐ２１７＋タウに対する比を計算することと、
ｖｉｉ．計算された比に基づいて、当該対象における当該抗ｐ２１７＋タウ抗体による治療をモニタリングすることと、を含む、方法である。
【０１４２】
実施形態１６は、当該捕捉抗体が、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、当該捕捉抗体が、配列番号２８のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を有する、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４３】
実施形態１７は、当該検出抗体が、それぞれ配列番号２、３、及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号５、６、及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、当該検出抗体が、配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４４】
実施形態１８は、当該検出抗体が、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１５、１６、及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、当該検出抗体が、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４５】
実施形態１９は、当該サンプルが、血液、脳ホモジネート、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルである、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４６】
実施形態２０は、当該サンプルが、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）を使用して生体サンプルを分画した後に得られる、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４７】
実施形態２１は、タウタンパク質のアミノ酸残基１１６〜１２７を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する単離された検出抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ．それぞれ配列番号２、３及び４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、
ｂ．それぞれ配列番号５、６及び７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む、単離された検出抗体又はその抗原結合断片である。
【０１４８】
実施形態２２は、好ましくは、配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態２１に記載の単離された検出抗体又はその抗原結合断片である。
【０１４９】
実施形態２３は、タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０を含むエピトープにおいてタウタンパク質に結合する単離された検出抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ．それぞれ配列番号１２、１３及び１４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、
ｂ．それぞれ配列番号１５、１６及び１７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む、単離された検出抗体又はその抗原結合断片である。
【０１５０】
実施形態２４は、好ましくは、配列番号１８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態２３に記載の単離された検出抗体又はその抗原結合断片である。
【０１５１】
実施形態２５は、実施形態２１〜２４のいずれかに記載の検出抗体又はその抗原結合断片をコードしている、単離された核酸である。
【０１５２】
実施形態２６は、実施形態２５に記載の核酸を含む、ベクターである。
【０１５３】
実施形態２７は、実施形態２５に記載の核酸を含む、宿主細胞である。
【０１５４】
実施形態２８は、実施形態２１〜２４のいずれか１つに記載の検出抗体又はその抗原結合断片を生成する方法であって、当該抗体又は抗原結合断片をコードしている核酸を含む細胞を、当該抗体又は抗原結合断片を生成する条件下において培養することと、当該細胞又は細胞培養物から当該抗体又は抗原結合断片を回収することと、を含む、方法である。
【０１５５】
実施形態２９は、
ａ．タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２及び／又はリン酸化Ｔ２１７を含む、単一又は多重リン酸化タウタンパク質エピトープに対する捕捉抗体と、
ｂ．タウタンパク質のアミノ酸残基７〜２０又は１１６〜１２７を含むタウタンパク質エピトープに対する検出抗体と、を含む、キットであって、
サンプル中のｐ２１７＋タウペプチドの量を測定するために使用される、キットである。
【０１５６】
実施形態３０は、当該捕捉抗体が、それぞれ配列番号３２、３３、及び３４のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、当該捕捉抗体が、配列番号２８のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を有する、実施形態２９に記載のキットである。
【０１５７】
実施形態３１は、当該検出抗体が、実施形態２０〜２３のいずれか１つに記載の単離された検出抗体である、実施形態２９又は３０に記載のキットである。
【実施例】
【０１５８】
以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定められる点を理解されたい。
【０１５９】
実施例１．ｐ２１７＋タウを検出するための高感度アッセイ
アッセイ特異的な試薬は、以下のとおりであった：Ｓｉｍｏａ  Ｈｏｍｅｂｒｅｗキット（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、カタログ番号１０１３５１）、ヘルパービーズ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、カタログ番号１０１７３２）、ｐＴ３マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ｈＴ４３  ｍＡｂ、ｐＴ８２  ｍＡｂ、及びｈＴ７  ｍＡｂ。ｐＴ３は、ｐ２１７＋タウを認識する、Ｊａｎｓｓｅｎで開発された親抗体であり、そのヒト化バージョンを本明細書ではヒト化ｐＴ３  ｍＡｂと称する。
【０１６０】
サンプルを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％ウシ血清アルブミン、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０５％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００、ｐＨ７．８で希釈した。
【０１６１】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅによって作製された３つのカスタムペプチドを使用して、アッセイを較正した（較正ペプチド）。
【０１６２】
ペプチドｐＴ３ｘｈＴ４３は、ＰＥＧ４リンカーによって連結されたｈＴ４３、ＰＴ５１、及びｐＴ３エピトープを含有し、６８９３ｇ／モルの分子量を有する。ペプチドｐＴ３ｘｈＴ４３のアミノ酸配列は、ＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲ（ｄＰＥＧ４）ＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧ（ｄＰＥＧ４）ＧＳＲＳＲ（ｐＴ）ＰＳＬＰ（ｐＴ）ＰＰＴＲＥＰＫＫＶ−アミド（配列番号２２）である。
【０１６３】
ペプチドｐＴ３ｘｐＴ８２は、ＰＥＧ４リンカーによって連結されたｐＴ８２及びｐＴ３エピトープを含有し、４５５１ｇ／モルの分子量を有する。ペプチドｐＴ３ｘｐＴ８２のアミノ酸配列は、Ａｃ−ＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫ（ｄＰＥＧ４）ＧＳＲＳＲ（ｐＴ）ＰＳＬＰ（ｐＴ）ＰＰＴＲＥＰＫＫＶ−アミド（配列番号２３）である。
【０１６４】
ペプチドｈＴ７ｘｐＴ８２は、ＰＥＧ４リンカーによって連結されたｐＴ８２及びｈＴ７エピトープを含有し、３６１９ｇ／モルの分子量を有する。ペプチドｈＴ７ｘｐＴ８２のアミノ酸配列は、Ａｃ−ＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫ（ｄＰＥＧ４）ＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡ−アミド（配列番号２４）である。
【０１６５】
試薬の調製
Ｑｕａｎｔｅｒｉｘマニュアルに提供されているプロトコルに従って、捕捉ビーズを０．３ｍｇ／ｍＬ捕捉Ａｂでコーティングした。コーティングされた捕捉ビーズをビーズ希釈バッファで２００，０００ビーズ／ｍＬに希釈し、ビーズの総濃度が４００，０００ビーズ／ｍＬとなるように２００，０００ビーズ／ｍＬのヘルパービーズを添加した。
【０１６６】
Ｑｕａｎｔｅｒｉｘマニュアルに提供されているプロトコルに従って、検出抗体を６０倍でビオチン化し、Ｈｏｍｅｂｒｅｗ検出剤／サンプル希釈剤で１．８μｇ／ｍＬに希釈した。
【０１６７】
較正ペプチドを０．１％リン酸／水で５ｍｇ／ｍＬに再構成し、２０μＬにアリコート化し、凍結させた。使用準備が整ってから、較正ペプチドのアリコートを解凍し、１：１０００（例えば、１．５μＬから１４９８．５μＬに）希釈し、ペプチドの最終濃度が５０００ｐｇ／ｍＬとなるように希釈物を１：１０００希釈した。３０ｐｇ／ｍＬで出発して、３倍ジャンプの標準曲線を作製した。
【０１６８】
ＣＳＦサンプルをサンプル希釈剤で少なくとも１：４希釈した。健常ボランティア（ＨＶ）サンプルを１：５又は１：１０希釈し、ＡＤサンプルを少なくとも１：２０希釈した。
【０１６９】
Ｓｉｍｏａアッセイ
捕捉Ａｂ、サンプル、及び検出Ａｂと共に３５分間、及び洗浄、続いて、ストレプトアビジンβ−ガラクトシダーゼ（ＳＢＧ）と共に５分間を含む２工程プロトコルを含む、カスタムＳｉｍｏａアッセイを作成した。各反応は、２５μＬのビーズ溶液、１００μＬのサンプル又は較正物質、２０μＬの検出溶液、１００μＬのＳＢＧを含んでいた。抗体に名前を割り当て、最大５つの捕捉抗体及び５つの検出抗体を一度にロードすることができた。機器によってＳｉｍｏａキュベット内で反応を実施し、最後に１回洗浄し、β−ガラクトシダーゼ基質（ＲＧＰ）を有する測定ディスクにロードした後、機器によって測定を行った。
【０１７０】
実施例２．ｒｐＨＰＬＣでのネイティブタウ断片の分離
試薬は以下のとおりであった：トリフルオロ酢酸（ＨＰＬＣグレード）、水（ＨＰＬＣグレード）、アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）、リン酸（分析グレード）、及びＨＰＬＣ二成分勾配系、イムノアッセイバッファ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、及びＢＳＡ、ｐＨ７．８）。
【０１７１】
プロトコルは以下のとおりであった：５００μＬの凍結ＣＳＦを氷上で３０分間解凍した。解凍したＣＳＦを、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）１．５ｍＬに添加し、混合した。得られた混合物１．８ｍＬを、水中０．１％トリフルオロ酢酸中で平衡化したＣ１８又は同様の逆相クロマトグラフィーカラムに適用した。次いで、アセトニトリルの漸増勾配におけるＨＰＬＣカラムを展開した。溶出の間に画分を回収した。画分を、グアニジンＨＣｌで１０ｍＭに調整し、次いで、真空濃縮装置で乾燥させた。乾燥画分をイムノアッセイバッファに再懸濁させ、本発明の抗タウ捕捉及び検出抗体対に基づいて、画分中のタウペプチドの測定に供した。
【０１７２】
実施例３．抗体を含まないか又は抗体に結合しているｐ２１７＋タウの定量
追加の上流サンプル操作を用いて、患者内で産生されるか又は外因的に投与されるかのいずれかの抗体、例えばヒト化ｐＴ３  ｍＡｂによって、ｐ２１７＋タウの結合を測定するために、高感度ｐＴ３ベースのアッセイを使用することができる。この技術は、治療用抗ｐ２１７＋タウ抗体、例えば、ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂを研究するための薬物動態アッセイとして使用することができる。例えば、以下の方法を使用して、抗体を含まない対抗体に結合しているｐ２１７＋タウを測定することができる。
【０１７３】
アッセイ１：免疫捕捉／枯渇、続いてｒｐＨＰＬＣを使用する、生物学的流体中の遊離対結合ｐ２１７＋タウの定量
生物学的流体（例えば、ＣＳＦ）を、タンパク質Ａ／Ｇでコーティングされた磁気ビーズ（ＣＳＦ  ０．５ｍＬ当たり１５μＬのビーズスラリー）と共に室温で揺動させながら２時間インキュベートして、サンプル中の免疫グロブリンを捕捉した。ビーズを磁石によって沈殿させ、上清を第２のチューブに移した（サンプル＝「ＩｇＧ枯渇上清」）。ビーズを、１ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄した。次いで、０．５ｍＬの６Ｍ  ＧｕＨＣｌを、（ａ）洗浄したビーズ及び（ｂ）ＩｇＧ枯渇上清を含有するチューブに添加し、室温で揺動させながら当該チューブを２０分間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石によって沈殿させ、得られた上清を第３のチューブ（サンプル＝「ＩｇＧ濃縮上清」）に移した。最後に、実施例２と同様に実施したｒｐＨＰＬＣによる分離の前に、０．１Ｍリン酸（ｐＨ２）を２つの溶液に添加した（１．０ｍＬのリン酸を変性ＩｇＧ枯渇上清に添加し、１．５ｍＬのリン酸をＩｇＧ濃縮上清に添加して、サンプルの最終体積を２．０ｍＬにした）。得られたｒｐＨＰＬＣ画分を実施例２に記載のとおりに再構成し、実施例１のＳｉｍｏａ  ｐ２１７＋タウアッセイを用いて測定した。ＩｇＧ枯渇上清からのシグナルは、遊離ｐ２１７＋タウ（すなわち、抗体に結合していない）を表し、一方、ＩｇＧ濃縮上清からのシグナルは、結合ｐ２１７＋タウ（すなわち、ヒト化ｐＴ３ｍＡｂなどの抗体に結合している）を表す。対照として又は遊離及び結合測定のための正規化因子として、総ｐ２１７＋タウシグナルを評価するために、免疫捕捉／枯渇プロセスに供されなかった同じ親生物学的流体（例えば、ＣＳＦ）のｒｐＨＰＬＣ分離及びＳｉｍｏａ  ｐ２１７＋測定を同時に分析した。
【０１７４】
アッセイ２：抗体の熱変性を使用する、生物学的流体中の遊離対結合ｐ２１７＋タウの定量
目的の生物学的流体（例えば、ＣＳＦ）のアリコートを９５℃で４分間加熱し、続いて、氷上で４分間冷却した（サンプル＝「半変性流体」）。並行して、同じ流体の第２のアリコートを、氷上で８分間冷却した（サンプル＝非変性流体」）。次いで、実施例１のＳｉｍｏａ  ｐ２１７＋タウアッセイを用いて、両サンプルを測定した。半変性流体シグナルは、総ｐ２１７＋タウを表し、一方、非変性流体は、遊離ｐ２１７＋タウを表す。前者から後者を差し引くと、結合タウの測定値が得られる。正確な加熱時間及び温度は、Ｓｉｍｏａ  ｐ２１７＋タウアッセイをそれ以上妨げることができないように流体中の任意の抗体を不可逆的に修飾するように決定したが、ｐ２１７＋タウシグナル自体には、いかなる影響も残らなかった。このアッセイは、抗体がｐ２１７＋タウに結合しているかどうかの直接的な尺度ではなく、アッセイ競合抗体が存在することを実証する。しかしながら、このアッセイからは、より面倒なアッセイ１の結果と同様の結果が得られた。
【０１７５】
実施例４．生体サンプル
アッセイの開発及び技術的認定に使用されるサンプル
実施例１〜３のアッセイは、高いタウレベルを有するヒト対象からプールしたＣＳＦを使用して開発した。いくつかの実験はまた、第１相試験における健常ボランティアの試験に必要とされるアッセイ感度を確保するために、低いタウレベルを有するヒト対象からプールしたＣＳＦを用いて行った。Ｎｅｕ  Ｅｎｃｅｐｈａｒｍ  ＧｍｂＨ（動物試験ＣＲＯ）から入手したカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）及びコマンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）由来のＣＳＦも、実施例１〜３のアッセイを用いて測定した。加えて、認知的に正常なヒト対象及びコモンマーモセット由来の急速凍結した脳サンプルをホモジナイズし、実施例１及び３のアッセイを用いて測定した。いくつかの実験は、臨床的に定義されたＨＶ対象及びＡＤ対象由来の個々の血清を用いて実施した。
【０１７６】
予備臨床認定に使用されるサンプル
コホート１（「アッセイ間補正コホート」）：正常圧水頭症（ＮＰＨ）を有する対象（ｎ＝１１）から、脳室液（ＶＦ）及び腰椎液（ＬＦ）ＣＳＦサンプルを入手した（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｕｏｐｉｏ、Ｖｉｌｌｅ  Ｌｅｎｏｉｎｅｎ教授）。これらのサンプルを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ（Ｋａｊ  Ｂｌｅｎｎｏｗ教授）で実施されたＩｎｎｏｔｅｓｔアッセイによって求められたＣＳＦ  Ａβ４２、総タウ（ｔタウ）、及びｐタウ１８１測定値によって、並びに脳生検アミロイド及びタウ免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）測定値によって分別した。ｒｐＨＰＬＣ及びＳｉｍｏａ  ｐ２１７＋タウ測定は、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）で行った。
【０１７７】
コホート２（「明らかなＨＶ対明らかなＡＤコホート」）：生化学的に定義されたアルツハイマー病（ＡＤ）対健常ボランティア（ＨＶ）対象（ｎ＝２０／群）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｏｆ  Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ（ＫａＪ  Ｂｌｅｎｎｏｗ教授）から入手した。ＩｎｎｏｔｅｓｔアッセイによるＣＳＦ  Ａβ４２、ｔタウ、及びｐタウ１８１測定は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａで行った。所定のＡＤ対ＨＶカットオフ測定値への分離に基づいてサンプルの大きなパネルからサンプルを選択した（ＡＤ＝ＣＳＦ  Ａβ４２＜４００ｐｇ／ｍＬかつＣＳＦ  ｔタウ＞６００ｐｇ／ｍＬ、ＨＶ＝ＣＳＦ  Ａβ４２＞４００ｐｇ／ｍＬかつＣＳＦ  ｔタウ＜６００ｐｇ／ｍＬ）。ｒｐＨＰＬＣ及びＳｉｍｏａ  ｐ２１７＋タウ測定は、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）で行った。
【０１７８】
コホート３（「ＨＶ対ＡＲＡＤ対初期ＡＤコホート」）：臨床的に定義された正常（臨床的認知症尺度０；ＣＤＲ０）対軽度記憶愁訴（ＣＤＲ０．５）対象（ｎ＝２０／群）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、ＪＡＮＳＳＥＮ研究ＡＬＺ１００５／１００２から入手した。ＩｎｎｏｔｅｓｔアッセイによるＣＳＦ  Ａβ４２、ｔタウ、及びｐタウ１８１測定は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａで行った。ＣＤＲ及びＣＳＦ  Ａβ４２スコアに基づいて、対象を、（ａ）ＨＶ＝ＣＤＲ０かつＡβ４２＞６００ｐｇ／ｍＬ、（ｂ）ＡＤのリスク（ＡＲＡＤ）＝ＣＤＲ０かつＡβ４２＜６００ｐｇ／ｍＬ、（ｃ）潜在的に非ＡＤ認知症＝ＣＤＲ０．５かつＡβ４２＞６００ｐｇ／ｍＬ、及び（ｄ）初期ＡＤ＝ＣＤＲ０．５かつＡβ４２＜６００ｐｇ／ｍＬに分類した。ｒｐＨＰＬＣ及びＳｉｍｏａ  ｐ２１７＋タウ測定は、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）で行った。
【０１７９】
コホート４（「ＣＤＲ０対ＣＤＲ１コホート」）：臨床的に定義された正常（臨床的認知症尺度０；ＣＤＲ０）対軽度記憶愁訴（ＣＤＲ１）対象（ｎ＝５／群）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した。ＣＤＲ及びＭＭＳＥ、並びにＩｎｎｏｔｅｓｔアッセイによるＣＳＦ  Ａβ４２、ｔタウ、及びｐタウ１８１の測定値は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで得た。発送前に、Ｊａｎｓｓｅｎにサンプルのアイデンティティ又は特徴が分からないようにサンプルにコードを付けた。Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）でｒｐＨＰＬＣ並びにＳｉｍｏａ  ｔタウ及びｐ２１７＋タウ測定を行い、分析のためにＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに送付した。
【０１８０】
コホート５（「ＨＶ対ＭＣＩ対ＡＤコホート」）：臨床的及び生化学的に（Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２＞６００ｐｇ／ｍＬ）定義されたＨＶ（ｎ＝７）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から入手した。臨床的及び生化学的に（Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２＜６００ｐｇ／ｍＬ）定義されたＭＣＩ（ｎ＝２８）及びＡＤ（ｎ＝１２）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐから入手した。ｒｐＨＰＬＣ及びＳｉｍｏａ  ｐ２１７＋タウ測定は、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）で行った。
【０１８１】
コホート６（「疾病重症度及び進行コホート」）：臨床的に定義されたＡＤ（臨床的認知症尺度１＋）対象（ｎ＝２３５）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、Ｊａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２から入手した。これらのサンプルは、治験における全ての対象由来のベースライン（投与前）サンプルであった。加えて、プラセボ対象（ｎ＝９０）の７８週間経過観察後のＣＳＦサンプルを含めて、疾患進行のバイオマーカーを評価した。認知評価（ＡＤＡＳ−ＣＯＧ、ＭＭＳＥ、ＮＴＢ、ＣＤＲ．ＳＯＢ）、ＡｐｏＥ遺伝子型、性別、及び年齢を治験から得た。Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２、Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４０、Ｓｉｍｏａ  ＮＦＬ、ｐＴ３ｘｐＴ８２、ｐＴ３ｘｈＴ４３、及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイは、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）で行った。対象は、０．０９のＡＢ４２／４０比カットオフに基づいてアミロイド陽性又は陰性であると確認された（例えば、＜０．０９の比を有する対象＝アミロイド陽性＝ＡＤ、一方、＞０．０９の対象＝アミロイド陰性＝ＡＤ以外の原因による認知症。２３５人の対象のうち２７人がアミロイド陰性と判定され、両群を別々に分析した。
【０１８２】
抗ｐ２１７＋剤による治療後の標的会合の評価に使用したサンプル
プラセボ又はＪＮＪ６３７３３６５７（単回ＩＶ注射）で治療したＨＶ対象（ｎ＝４０）由来のＬＦ  ＣＳＦをＪａｎｓｓｅｎ治験ＪＮＪ６３７３３６５７ＥＤＩ１００１から入手した。ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイは、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）で行った。ｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイは、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ）で行った。
【０１８３】
実施例５．Ｓｉｍｏａプラットフォームを使用した捕捉及び検出抗体対のスクリーニング
Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによる以前のレポート及び文献（例えば、Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８（１０）：ｅ７６５２３，２０１３；Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．５１（４）：１０３３−４３，２０１６；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．５５（１）：３０３−３１３，２０１７；Ｈａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２（３２）：２３６４５−５４，２００７）は、アミノ酸２００〜２２０を含有するタウ断片、特にアミノ酸２１２、２１４、２１７におけるリン酸化の何らかの組み合わせがＡＤにおいて多く含まれることを示している。したがって、この特定のタウ種（「ｐ２１７＋タウ」）を測定するアッセイを開発することにより、ＡＤ診断及び／若しくはステージ分類のための改善されたバイオマーカーに加えて、このタウ部分を標的とする新たな薬物についての潜在的予測及び／又は薬力学的アッセイを得ることができた。しかしながら、タウは、健常ボランティアにおいて低レベル（＜２００ｐｇ／ｍＬ）で存在し得、ｐ２１７＋タウは総タウの少数構成成分であるため、ｐ２１７＋タウアッセイは、最適な抗体対及び高感度を必要とする。
【０１８４】
この目的を達成するために、Ｊａｎｓｓｅｎで発見された抗タウｍＡｂのセット、並びに幾つかの高親和性の市販の抗タウｍＡｂを、ｐＴ３と対にしたときにサンドイッチＥＬＩＳＡ（ｓＥＬＩＳＡ）フォーマットにおいてシグナルを産生する能力について評価した。抗体対をＳｉｍｏａ  ＨＤ−１  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォーム（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でスクリーニングして、ＡＤ対象由来のＣＳＦのプールの連続希釈を使用して、必要とされる感度を提供した。アッセイ性能は、シグナル／ノイズ＝サンプル希釈剤で希釈したサンプルのビーズ当たりの平均酵素（ＡＥＢ）／アッセイ希釈剤のみのＡＥＢに基づくものであった。ｐＴ３と対をなすのに最適な検出抗体は、感度の順にｈＴ４３、ｐＴ８２、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘタウ２．０検出剤試薬、及びＢＴ２であった（表１）。ｈＴ４３及びＱｕａｎｔｅｒｉｘタウ２．０検出剤試薬は、タウのＮ末端領域を認識し、一方、ｐＴ８２及びＢＴ２は、タウの中央領域により近い配列を認識する。最良のＮ末端（ｈＴ４３）及び中央領域（ｐＴ８２）ｍＡｂを、更なる最適化のために選択した。Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ及びＱｕａｎｔｅｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで、並行してスクリーニングを行ったところ、同様の結果が得られた。
【０１８５】
【表１】
2021517239.tif 000003
ＡＤ対象由来のプールされたＣＳＦの測定におけるタウの抗体エピトープ及びシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を示す。ＮＴ＝未試験。
【０１８６】
実施例６．ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの最適化
一連の最適化実験は、Ｓｉｍｏａプラットフォームにおける最適化アッセイと共に、一般的なＱｕａｎｔｅｒｉｘ経験に基づいて行った。１０％マウス血清又は５００μｇ／ｍＬマウスＩｇＧを検出剤希釈剤に添加したが、アッセイ感度は改善しなかった。検出剤ｍＡｂ濃度（０．１５、０．３、０．６、１．２、及び１．８μｇ／ｍＬ）、ＳβＧ濃度（１００、２００、又は３００ｐＭ）、及び捕捉ｍＡｂビーズ濃度（３００Ｋ／ウェル、１５０Ｋ＋２００Ｋヘルパービーズ）の用量設定について評価した。プロトコルのインキュベーション時間（６５分間対３５分間）及びサンプル体積（１００対１５０μＬ）についても評価した。両アッセイについての理想的な試薬濃度は、それぞれ、１５０Ｋの捕捉ビーズ＋２００Ｋのヘルパービーズ、１．８μｇ／ｍＬの検出剤、及び２００ｐＭのＳＢＧであった。サンプルの体積及びインキュベーション時間は、アッセイに最小限の影響しか及ぼさなかったので、１００μＬのサンプル及び３５分間のインキュベーションの下方条件を選択した。
【０１８７】
実施例７．ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの技術的認定
較正物質の線形範囲
実施例１に記載の較正ペプチドを作製した。較正ペプチドは、ＰＥＧ４リンカーによって分離されたｐＴ３及びｈＴ４３又はｐＴ３及びｐＴ８２のコアエピトープを含有しており、これらを使用して標準曲線を作成した。代表的な標準曲線を図１に示す。アッセイバッファで１：３ジャンプにて３０ｐｇ／ｍＬから０．０４１ｐｇ／ｍＬまで較正ペプチドを用量設定し、ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイで測定した。４パラメータ曲線フィットデータ整理方法（４ＰＬ、１／ｙ２重み付け）を使用して較正曲線を作成した。検出下限（ＬＬＯＤ）を計算された較正レベルとして定義し、１０％変動係数（ＣＶ）を含む、ゼロ較正子の平均＋２．５標準偏差（ＳＤ）に等しいＡＥＢを得た。これらの基準により、代表的なデータから約０．００２ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＤが得られた。アッセイの線形範囲、定量下限（ＬＬＯＱ）、及び定量上限（ＵＬＯＱ）は、予想されるＣＶ＜２０％及び回収率８０〜１２０％を達成する最低及び最高の標準曲線点として定義した。これらの基準によれば、ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの両方についての線形範囲は０．０４１〜３０ｐｇ／ｍＬであった（図１、表２）。
【０１８８】
【表２】
2021517239.tif 000004
【０１８９】
ＣＳＦによる希釈線形性
希釈の線形性を評価し、ＣＳＦサンプルを試験するための理想的な希釈を決定するために、ＡＤ対象（高タウ、低ＡＢ４２）由来の４つのＣＳＦサンプルのパネルを、アッセイバッファにおける１：２希釈から１：４０９６希釈まで用量設定し、ｐ２１７＋タウアッセイで測定した。１：５１２を超えて希釈されたサンプルは、典型的には、ＬＬＯＱ未満と測定された。１：４〜１：５１２のサンプル測定値は、希釈線形であり、その結果、ＣＳＦサンプルを測定するための規定の範囲であった。認知正常対象で確認するために、低タウ及び高ＡＢ４２の対象由来のＣＳＦのプールを同様に測定した。ここでも、１：４〜１：２５６希釈について希釈線形性が観察され、この範囲を超えると、測定値はＬＬＯＱ未満に低下した（図２）。
【０１９０】
精度
測定値の精度を評価するために、ｐＴ３ｘｈＴ４３の標準曲線を準備し、別個の３つの日に測定した（図３及び表３）。較正ペプチドを、３０から０．０４１ｐｇ／ｍＬに連続１：３ジャンプで希釈し、ｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイにおいて重複測定した。同じ施設で、同じ技術者によって、連続する３日間にわたって手順を繰り返した。曲線の中央の４点（ＣＳＦサンプルが測定される）の分析は、ラン内の精度（試験内ＣＶ％）が常に＜１０％であり、平均して２．４６〜５．１８％  ＣＶであり、試験間精度は平均して６．４６％  ＣＶであったことを示した。これらは、研究用途に限る（research use only、ＲＵＯ）アッセイについては十分に２０％  ＣＶの許容限度の範囲内であり、部分的には、Ｓｉｍｏａ  ＨＤ−１  Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて全てのＥＬＩＳＡ工程が自動化されているという性質に起因する。
【０１９１】
【表３】
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【０１９２】
ラボ間の移行可能性
試験施設間のｐ２１７＋タウアッセイの精度を評価するために、同じＡＤ  ＣＳＦプールを、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ及びＱｕａｎｔｅｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにおいて同じロットの試薬を用いて適正用量設定にて測定した。図４は、２つの試験施設におけるｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイについて測定値が非常に類似していることを示す。
【０１９３】
正確度
アッセイの正確度を評価するために、２つの異なるプールのＨＶ  ＣＳＦに既知の濃度の較正ペプチド（０、２、又は２０ｐｇ／ｍＬ）をスパイクし、推奨される１：４希釈に希釈し、次いで、ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイで測定した。これは、サンプルマトリックスの構成成分によって提示される潜在的干渉の１つの尺度である。２及び２０ｐｇ／ｍＬのスパイク測定値から内因性シグナルのレベルを差し引き、次いで、較正物質の観察濃度を予想濃度と比較して回収率を計算した。測定濃度を予想濃度と比較して、スパイク回収率を計算し、１１４％の平均回収率を得た（表４）。これは、十分にＲＵＯアッセイについての回収率８０〜１２０％の許容限度の範囲内であり、これは、≧１：４希釈で試験したときにＣＳＦにおいて有意な干渉のないことを示す。
【０１９４】
【表４】
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【０１９５】
ＣＳＦにおけるｐ２１７＋に対する抗体によるシグナルの競合
ＣＳＦにおけるｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイシグナルの正確度を確認し、ｐ２１７＋タウに対する抗体の臨床試験における薬力学的アッセイとしてのその潜在的な有用性を評価するために、ＡＤ  ＣＳＦのプールに適正用量設定のｐＴ３  ｍＡｂ又はヒト化ｐＴ３  ｍＡｂをスパイクし、室温で２時間インキュベートした後にｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイで測定した（図５）。可溶性ｐＴ３及びヒト化ｐＴ３抗体の投与によって、ｐＴ３ベースのアッセイにおけるシグナルが用量依存的に低下した。同等の濃度でｍｓＩｇＧ（陰性対照）をスパイクしても、いずれの測定にも影響がなかった。ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂ対ｐＴ３の競合能がより低いことは、ｐ２１７＋タウに対するｐＴ３の親和性がより高いことに起因し得る。
【０１９６】
リン酸化依存性
ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイで得られたＣＳＦ中のシグナルを確認することは、実際には、リン酸化エピトープに基づいており、ＡＤのＣＳＦをアルカリホスファターゼで処理して全ての残基を脱リン酸化した。次いで、サンプルをｐＴ３アッセイ及び２つのｈＴ７ベースのアッセイ、ｈＴ７ｘｐＴ８２又はｈＴ７ｘＢＴ２で分析した。ｈＴ７はリン酸化に依存しないことが知られているので、陰性対照として使用した。
【０１９７】
ＡＤ患者由来のプールされたＣＳＦを、塩化亜鉛及び塩化マグネシウム含有バッファ中で、３７℃で４時間にわたって、漸増量のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で処理した。ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを使用して、ｐＴ３に対するエピトープに対する効果を測定した。ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２シグナルは、アルカリホスファターゼ処理によって用量依存的に低下した。しかしながら、非リン酸化依存性アッセイｈＴ７ｘｐＴ８２又はｈＴ７ｘＢＴ２は、シグナル低下を示さず、実際には、ｐＴ７結合がリン酸化により低減されるため、予想どおり増加を示した（図６）。
【０１９８】
ｐ２１７＋タウ断片プロファイル
粗ＣＳＦの測定から得られたｐ２１７＋タウシグナルの性質を調べるために、Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８（１０）：ｅ７６５２３，２０１３に記載の方法と同様の方法を介して、ＡＤ  ＣＳＦのサンプルをｒｐＨＰＬＣによって分画した。画分を回収し、ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを用いて測定した（図７）。このクロマトグラフィーフォーマットでは、より小さなタウ画分がより早く溶出し（より小さい画分番号）、一方、より大きな画分はより後に溶出する（より大きい画分番号）。完全長タウは、画分１９において溶出する。タウ断片プロファイルは、以前のレポート（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８（１０）：ｅ７６５２３，２０１３，Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．５１（４）：１０３３−４３，２０１６）と一致して、アッセイのいずれかによって検出された完全長タウが非常に少ないことを示した。ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイは、完全長タウ（画分１２及び１４）よりも小さい２つの主なピーク（タウ種）を検出したが、ｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイは、これらの主ピークのうちの１つのみを検出した（画分１４）。これは、ＣＳＦ中のｐ２１７＋タウが少なくとも２つの断片で存在することを示し、より大きな断片は、少なくともｈＴ４３からｐＴ３までの領域（タウのａａ７〜２２０）をコードしており、より小さな断片は、少なくともｐＴ８２からｐＴ３までの領域（タウのａａ１１６〜２２０）をコードしているが、はるかに遠くのｈＴ４３エピトープまでは到達しない。すなわち、任意の所与の時点でタウ分子のサブセットにおいてのみ切断される、ａａ２０とａａ１１６との間にタンパク質分解切断部位が存在する可能性が高い。プロファイルは、ｐ２１７＋特異的ではなく、それは、タウの類似の領域を認識するが、リン酸化特異的ではない他のタウアッセイでの測定から同様の所見が得られるためである（データは示さない）。
【０１９９】
アナライトの安定性
内因性ｐ２１７＋タウエピトープの安定性を様々な温度で評価した。ＡＤ  ＣＳＦのプールをアリコート化し、各アリコートを４℃、２２℃、又は３７℃で１、２、又は４時間保管した。また、アリコートのサブセットを２又は３回凍結解凍（−８０℃〜２２℃）した。次いで、全てのサンプルを１：２０希釈し、ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイを用いて分析した（図８）。試験した条件のいずれにおいてもシグナルの有意な変化は観察されず、これは、これらのアッセイによって認識される４つのエピトープ全てが、標準的な保管／試験手順を可能にするのに十分に安定であることを示す。最後に、ＣＳＦを４人のドナーから前向きに採取し、次いで、アリコート化し、−７０℃で凍結させ、ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイで測定するために３ヶ月毎にサンプルを取り出した。３、６、又は９ヶ月の時点では、シグナルの有意な変化は観察されなかった（図９）。
【０２００】
実施例８．ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの臨床的認定
ＡＤの診断及びステージ分類におけるｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイの有用性を評価するために、ｐ２１７＋タウを測定するためのＣＳＦサンプルの３つのコホートを得た。認知スコアと他の古典的なＡＤバイオマーカーとの相関について測定値を分析した。
【０２０１】
コホート１：「アッセイ間相関コホート」
ＣＳＦサンプル、ＶＦ及びＬＦ、並びに脳生検（脳室）を、脳内での過剰な間質液産生を特徴とし、ＡＤでは高頻度で存在する病態である、神経変性障害の正常圧水頭症（ＮＰＨ）を有する１０人の対象から入手した。ｐ２１７＋タウ測定を粗ＣＳＦに対して実施し、従来のＡＤバイオマーカーとの相関について分析した。
【０２０２】
ＶＦ中のＡβ４２（図１０Ａ、１０Ｄ）、ｔタウ（図１０Ｂ、１０Ｅ）、ｐタウ１８１（図１０Ｃ、１０Ｆ）のレベルを、Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＥＬＩＳＡ（古典的測定）によって求めた。同じサンプルを、ｐＴ３ｘｈＴ４３（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ）及びｐＴ３ｘｐＴ８２（図１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ）アッセイで測定し、相関を評価した。ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２の両アッセイから、ＣＳＦ  Ａβ４２と負の相関を示し（それぞれｒ２＝０．６０９、ｐ＝０．００７７、及びｒ２＝０．５９０、ｐ＝０．００９５）、ＣＳＦ  ｔタウと正の相関を示す（それぞれｒ２＝０．５２５、ｐ＝０．０１７７、及びｒ２＝０．４３５、ｐ＝０．０３８１）が、ＣＳＦ  ｐタウ１８１とは有意には相関しないことが明らかになった（図１０）。
【０２０３】
同じ１０人のＮＰＨ対象由来の脳生検をＩＨＣにより分析し、病理学者がアミロイド陽性／陰性及びタウ陽性／陰性とスコア付けした。両方について陽性である場合、サンプルを「生検＋」と命名し、古典的なＡＤの診断であった。両方について陰性である場合、サンプルを「生検−」と命名し、古典的な非ＡＤの診断であった。「生検＋（アミロイド）」と命名されたサンプルは、アミロイドについては陽性であるが、タウについては陰性であった。脳室穿刺（ＶＦ＝黒色ドット）又は腰椎穿刺（ＬＦ＝赤色ドット）から得たＣＳＦを、ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイで測定し、相関を評価した（図１１）。ｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイ及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイはいずれも、脳生検陽性サンプル（アミロイド＋／タウ＋）から陰性サンプル（アミロイド−／タウ−）を分離することができた（それぞれｐ＝０．０４及び０．０２）。アミロイドについて陽性であるが、タウについては陽性ではないサンプルは、多くの場合、生検＋サンプル及び生検−サンプル間で測定された。脳内のアミロイド斑はタウのもつれに先行すると考えられるため、アミロイド＋／タウ−サンプルは、初期ＡＤ又は別の疾患を表す可能性がある。
【０２０４】
コホート２：「ＨＶ対ＡＤコホート」
生化学的に定義されたＡＤ対象対ＨＶ対象由来のＣＳＦサンプル（ＬＦ）（ｎ＝２０／群）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａから入手した。Ａβ４２及びｔタウのレベルをＩｎｎｏｔｅｓｔ  ＥＬＩＳＡ（古典的測定）によって求めて、群を細分類した（ＡＤ＝ＣＳＦ  Ａβ４２＜４００ｐｇ／ｍＬかつＣＳＦ  ｔタウ＞６００ｐｇ／ｍＬ、ＨＶ＝ＣＳＦ  Ａβ４２＞４００ｐｇ／ｍＬかつＣＳＦ  ｔタウ＜６００ｐｇ／ｍＬ）。粗ＣＳＦに対するｐＴ３ｘｈＴ４３、ｐＴ３ｘｐＴ８２、及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイ、並びにｒｐＨＰＬＣで分画されたＣＳＦのサブセットを使用して、測定を実施した。結果を従来のＡＤバイオマーカーとの相関について分析した（図１２）。図１２のパネルＡ及びＢのデータは、ｐＴ３エピトープが、初期ＡＤ（insipient AD）に急速に進行するリスクが高い患者の指標であることを実証した。ｐＴ３エピトープは、高総タウ及び低Ａβ４２を示す患者において大きく上昇した。逆に、ｐＴ３エピトープは、低総タウ及び高Ａβ４２を有する対象では低レベルで存在していた。図１１Ｃでは、ｈＴ７ｘｐＴ８２総タウアッセイによって実証されるように、上昇したｐＴ３エピトープ含有タウが、総タウレベルの上昇によって少なくとも部分的に推進されたが、全てではないことを確認した（図１２Ｄ）。これは、タウの量、及びｐ２１７＋エピトープでリン酸化される程度の両方がＡＤで上昇することを示す。
【０２０５】
図１１からのデータを使用して、ｐＴ３ｘｈＴ４３、ｐＴ３ｘｐＴ８２、及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイの、ＡＤサンプルをＨＶサンプルと識別する能力についてのＲＯＣ曲線を作成した。３つのアッセイは全て、優れた特異性及び感度を示した。しかしながら、２つのｐＴ３ベースのアッセイ（ｐ２１７＋タウを検出するｐＴ３ｘｈＴ４３、ｐＴ３ｘｐＴ８２）は、ｈＴ７ベースのアッセイよりも改善された診断力を有していた（図１３）。
【０２０６】
図１２で測定した同じＣＳＦサンプルのサブセット（ｎ＝１１／群）をｒｐＨＰＬＣによって分画し、次いで、ｐＴ３ｘｈＴ４３、ｐＴ３ｘｐＴ８２、及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイで測定した（後者は、リン酸化非依存的な同じタウ断片の測定であった）（図１４）。観察されたタウ断片のプロファイルは、実施例７及び図７にみられるものと同様であった。すなわち、ｐＴ８２ベースのアッセイの両方、ｐＴ３ｘｐＴ８２及びｈＴ７ｘｐＴ８２では２つの主な種がみられたが、ｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイではピークの一方のみしかみられなかった。主な種は、両方ともＨＶ群よりもＡＤ群において高濃度で存在していた。更に、ｐＴ３ベースのアッセイ（ｐ２１７＋タウ）は、粗ＣＳＦ分析において検出されたとき、ｈＴ７ベースのアッセイ（総タウ）よりも群間の差が大きいことを示した。より大きなｐ２１７＋タウ種（画分１３〜１４）は、最大のＡＤ対ＨＶ差をもたらした（図１４）。
【０２０７】
図１４の全ての主なタウ断片の合計（画分１１〜１４）を計算し、次いで、ＡＤサブグループとＨＶサブグループとの間で比較した。ＡＤにおけるｐＴ３エピトープ含有タウ（ｐＴ３ｘｈＴ４３又はｐＴ３ｘｐＴ８２）の増加率は、非ｐＴ３エピトープ含有タウ（ｈＴ７ｘｐＴ８２）でみられたものの２倍を超えていた（表５）。
【０２０８】
【表５】
2021517239.tif 000007
【０２０９】
表５で行ったとおり合計としての分析に対して、各図１４の画分におけるシグナルの分析を独立して行って、どの画分から最大のＡＤ対ＨＶシグナルが得られたかを明らかにした。最も情報的価値のある断片プールを、断片プール１３及び１４においてｐＴ３抗体を使用して検出した（表６）。
【０２１０】
【表６】
2021517239.tif 000008
【０２１１】
コホート３：「ＨＶ対ＡＲＡＤ対初期ＡＤコホート」
臨床的に定義された正常（ＣＤＲ０）対軽度記憶愁訴（ＣＤＲ０．５）対象（ｎ＝２０／群）由来のＣＳＦサンプル（ＬＦ）を、Ｊａｎｓｓｅｎ研究ＡＬＺ１００５／２００２から入手した。Ａβ４２、ｔタウ、及びｐタウ１８１のレベルをＩｎｎｏｔｅｓｔ  ＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＤＲ及びＣＳＦ  Ａβ４２スコアに基づいて、対象を、（ａ）ＨＶ＝ＣＤＲ０かつＡβ４２＞６００ｐｇ／ｍＬ、（ｂ）ＡＲＡＤ＝ＣＤＲ０かつＡβ４２＜６００ｐｇ／ｍＬ、（ｃ）潜在的に非ＡＤ認知症＝ＣＤＲ０．５かつＡβ４２＞６００ｐｇ／ｍＬ、及び（ｄ）初期ＡＤ＝ＣＤＲ０．５かつＡβ４２＜６００ｐｇ／ｍＬに分類した。
【０２１２】
また、ＣＳＦサンプルをｒｐＨＰＬＣによって分画し、ｐＴ３ベース（ｐＴ３ｘｈＴ４３、図１５Ａ〜１５Ｅ、及びｐＴ３ｘｐＴ８２、図１５Ｆ〜１５Ｊ）及び総タウ（ｈＴ７ｘｐＴ８２、図１５Ｋ〜１５Ｏ）アッセイで測定した。ｐＴ３ベース及びｈＴ７ベースのアッセイは全て、ＣＤＲ０対０．５（図１５Ａ、１５Ｆ、及び１５Ｋ）、及びＡβ４２＜６００ｐｇ／ｍＬ対＞６００ｐｇ／ｍＬのサンプル（図１５Ｂ、１５Ｇ、及び１５Ｌ）において、シグナルの上昇を示した。ＣＤＲ×Ａβ４２レベルによる分析結果を図１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｈ、１５Ｉ、１５Ｍ及び１５Ｎに示し、全ての画分にわたって合計したシグナルを図１５Ｅ、１５Ｊ及び１５Ｏに示す。シグナルレベルは、Ａβ４２＜６００ｐｇ／ｍＬ＋ＣＤＲ０．５サブグループにおいて最も高く、初期ＡＤ対ＨＶ又はＡＲＡＤにおけるｐ２１７＋タウシグナルの上昇と一致していた。サブグループ間の分離は、ｈＴ７ベースのアッセイに対してｐＴ３ベースのアッセイにおいて優れており、このことは、ｐＴ３エピトープの高リン酸化が、疾患において特に多く含まれている（単純な総タウ上昇よりも高い）ことを示す。
【０２１３】
コホート４（「ＣＤＲ０対ＣＤＲ１コホート」）
臨床的に定義された正常（臨床的認知症尺度０；ＣＤＲ０）対軽度記憶愁訴（ＣＤＲ１）の対象（ｎ＝５／群）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した。ＣＤＲ及びＭＭＳＥ、並びにＩｎｎｏｔｅｓｔアッセイによるＣＳＦ  Ａβ４２、ｔタウ、及びｐタウ１８１の測定値は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで得た。発送前に、Ｊａｎｓｓｅｎにサンプルのアイデンティティ又は特徴が分からないようにサンプルにコードを付けた。Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）でｒｐＨＰＬＣ並びにＳｉｍｏａ  ｔタウ及びｐ２１７＋タウ測定を行い、分析のためにＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに送付した。
【０２１４】
ｐＴ３ベースのアッセイ（ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２）及びｔタウ（ｈＴ７ｘｐＴ８２）の両方を使用して、ＣＳＦサンプルを粗のまま又はｒｐＨＰＬＣ分画後に測定した。このデータを、ショートタウ種の相対的な影響を評価するために２つのｐＴ３アッセイ間の比（表７）として、又はこのリン酸化事象の相対的な影響を評価するためにｐＴ３アッセイ及びｔタウのいずれかとの間の比として（図１６Ａ〜１６Ｂ）表した。両方の場合において、結果は、１０人の対象のうち９人についてＣＤＲ状態を正確に予測した。１人の外れ値の対象は、Ｉｎｎｏｔｅｓｔによって異常に低いタウを有すると判定されたため、タウオパチーが原因ではない認知症を表している可能性がある。興味深いことに、ｐ２１７＋タウ／ｔタウ比とＭＭＳＥとの間の相関が観察され、これは、ｐＴ３アッセイによって検出されたシグナルによって認知を追跡し得ることを示唆する。
【０２１５】
【表７】
2021517239.tif 000009
＊ＣＤＲ１及びＡβは陽性であるが、Ｉｎｎｏｔｅｓｔ及びＳｉｍｏａにおいて低いタウ及びｐタウを有する
【０２１６】
コホート５：「ＨＶ対ＭＣＩ対ＡＤコホート」）
臨床的及び生化学的に（Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２＞６００ｐｇ／ｍＬ）定義されたＨＶ（ｎ＝７）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。臨床的及び生化学的に（Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２＜６００ｐｇ／ｍＬ）定義されたＭＣＩ（ｎ＝２８）及びＡＤ（ｎ＝１２）由来のＬＦ  ＣＳＦサンプルを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐから入手した。ｒｐＨＰＬＣ及びＳｉｍｏａ  ｐ２１７＋タウ測定は、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）で行った。
【０２１７】
ｐＴ３ベースのアッセイ（ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２）及びｔタウ（ｈＴ７ｘｐＴ８２）の両方を使用して、ＣＳＦサンプルを粗のまま又はｒｐＨＰＬＣ分画後に測定した。ｐＴ３ベース及びｈＴ７ベースのアッセイは全て、ＨＶ対ＭＣＩ対ＡＤ群においてシグナルが次第に増加するシグナルの上昇を示し（図１７Ａ〜Ｃ）、互いに良好に相関していた（コホート１、図９にみられるように）（図１７Ｄ及び１７Ｅ）。ｐＴ３アッセイはまた、Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ｔタウ及びｐタウ１８１ともある程度相関していたが（図１７Ｆ及び１７Ｇ）、Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２又はＡＢ４２／４０比とは相関していなかった（図１７Ｈ及び１７ＩＩ）。粗ＣＳＦ測定（図１７Ａ〜１７Ｃ）又はｒｐＨＰＬＣで分画された物質（図１７Ｊ〜１７Ｔ）において診断ステージ分類について同様の結果が観察された。コホート３にみられるように、ｔタウアッセイよりもｐＴ３ベースのアッセイを用いた方がＨＶ対ＭＣＩ対ＡＤの分離がより顕著であり（統計的有意性が大きい）、これによって、このｐＴ３アッセイ測定の病理学的関連性が強調される。
【０２１８】
コホート６（「疾病重症度及び進行コホート」）
臨床的に定義されたＡＤ（臨床認知症尺度１＋）対象（ｎ＝２３５）由来のサンプルを、Ｊａｎｓｓｅｎ研究ＥＬＮ１１５７２７３０１／３０２から入手した。これらのサンプルは、治験における全ての対象由来のベースライン（投与前）サンプルであった。加えて、プラセボ対象（ｎ＝９０）の７８週間経過観察後のＣＳＦサンプルを含めて、疾患進行のバイオマーカーを評価した。認知評価（ＡＤＡＳ−ＣＯＧ、ＭＭＳＥ、ＮＴＢ、及びＣＤＲ．ＳＯＢ）、ＡｐｏＥ遺伝子型、性別、及び年齢を治験から得た。Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４２、Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＡＢ４０、Ｓｉｍｏａ  ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｌｉｇｈｔ（ＮＦＬ）、ｐＴ３ｘｐＴ８２、ｐＴ３ｘｈＴ４３、及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイは、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）で行った。対象は、０．０９のＡＢ４２／４０比カットオフに基づいてアミロイド陽性又は陰性であると確認された（例えば、＜０．０９の比を有する対象＝アミロイド陽性＝ＡＤ、一方、＞０．０９の対象＝アミロイド陰性＝ＡＤ以外の原因による認知症）。２３５人の対象のうち２７人がアミロイド陰性と判定されたので、各群を別々に分析した。
【０２１９】
この場合も、粗ＣＳＦ測定からのシグナルは、２つのｐＴ３アッセイ間及びｔタウアッセイとは良好に相関するが（図１８Ａ及び１８Ｂ）、全身的神経変性の疑いのあるマーカーであるＮＦＬとは相関しない（図１８Ｃ）ことが明らかになったが、これは、ｐＴ３アッセイが神経変性の特定の形態又はステージを認識し得ることを示唆している。
【０２２０】
この場合も、ｐＴ３ベースのアッセイから、アミロイド陽性対陰性対象においてより高いシグナルが明らかになった（図１８Ｄ〜１８Ｅ）。
【０２２１】
ｐＴ３ベースのアッセイから、いくつかの認知スコア（ＡＤＡＳ−ＣＯＧ、ＭＭＳＥ、ＮＴＢ、ＣＤＲ．ＳＯＢ、図１８Ｆ〜１８Ｍ）との中程度の相関が明らかになり、これはコホート４における知見を裏付けた（図１６Ｃ）。興味深いことに、ｐＴ３ベースのアッセイのベースラインシグナルは、同様に１８ヶ月間の経過期間にわたる認知スコアの変化と中程度に相関しており、これは、認知低下を予測する能力を示唆していた（図１８Ｎ〜１８Ｐ）。
【０２２２】
ｐＴ３ベースのシグナルのｔタウシグナルに対する比（ｐ２１７＿タウ／ｔタウ）からも同様の結果が得られたが、データは示さない。
【０２２３】
認知と認知の変化との相関は、アミロイド陽性群及び陰性群の両方でみられたが、後者の群は小さなサンプルセットであった。確認された場合、これは、ｐ２１７＋対認知の関連が、ＡＤ特異的ではない場合があることを示唆する。
【０２２４】
実施例９．抗体を含まない対抗体に結合しているｐ２１７＋タウの定量
実施例３に記載のアッセイを、以下のとおり実施した。
【０２２５】
アッセイ１：免疫捕捉／枯渇、続いてｒｐＨＰＬＣを介した、生物学的流体中の遊離対結合ｐ２１７＋タウの定量
アッセイは、抗体をＣＳＦサンプルにスパイクすることによって試験した。プールしたＡＤ  ＣＳＦに、１０μｇのｐＴ３  ｍＡｂ、ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂ、ｍｓＩｇＧ、又は同等の体積のＰＢＳ（モック）をスパイクし、４℃で２４時間インキュベートした後、免疫捕捉した。サンプル、並びに免疫捕捉に供されていない親ＣＳＦをｒｐＨＰＬＣで分画し、各画分についてｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイを用いて測定して、総及び結合ｐ２１７＋タウの量を評価した。親サンプル（総ｐ２１７＋タウ）及びｐＴ３  ｍＡｂ又はヒト化ｐＴ３  ｍＡｂ免疫捕捉（結合ｐ２１７＋タウ）では、実施例７及び図７にみられたものと同様に、１つの主要なピークにおいて実質的なシグナルが観察されたが、モック又はＩｇＧ免疫捕捉では観察されなかった（図１９）。
【０２２６】
プールしたＡＤ  ＣＳＦに適正用量設定のヒト化ｐＴ３  ｍＡｂをスパイクし、２２℃で２時間インキュベートし、続いて、免疫捕捉、ｒｐＨＰＬＣ、及びｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイを行って、結合ｐ２１７＋タウを評価した（図２０Ａ）。ＩｇＧ枯渇上清も分画し、測定して、遊離ｐ２１７＋タウを評価した（図２０Ｂ）。ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂのスパイクによって、用量依存的に、測定された結合ｐ２１７＋タウの量が増加し、遊離ｐ２１７＋タウの量が減少した。
【０２２７】
総合すれば、この結果は、標的会合の直接測定であるこの方法が、ｐ２１７＋タウエピトープを標的とする抗体に特異的であり（図１９）、標的抗体用量依存性であることを示す（図２０）。
【０２２８】
アッセイ２：抗体の選択的変性を介した、生物学的流体中の遊離対結合ｐ２１７＋タウの定量
生体サンプル（例えば、ＣＳＦ）を、沸点付近で４分間加熱し、続いて、氷上で冷却し、その後、ｐＴ３ｘｈＴ４３及び／又はｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイで測定した。このプロセスの正確な時間は、アッセイを妨げることはできないが、ｐ２１７＋タウシグナル自体には影響を与えない（図２１）ように、サンプル中の抗体に不可逆的に損傷を与えるように決定された（図２１）。これは、タウタンパク質において特定の三次構造が欠如していることに起因しているので、それを高温で特に安定にすることができると考えられる。このサンプルを総ｐ２１７＋タウと命名し、一方、熱処理に供されなかった並行測定のサンプルを、遊離ｐ２１７＋タウと命名した。総濃度から遊離を差し引いて、結合ｐ２１７＋タウの測定値を得た。
【０２２９】
アッセイに対する熱の影響を以下のとおり決定した。
【０２３０】
ＣＳＦ／ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂ混合物に対する熱の影響：プールしたＡＤ  ＣＳＦのアリコートに１μｇ／ｍＬまでヒト化ｐＴ３  ｍＡｂをスパイクし、２２℃で２時間インキュベートし、９５℃で０〜２０分間加熱し、４℃に冷却し、次いで、１：１０希釈でｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを使用して測定した（図２１Ａ）。ｐ２１７＋タウシグナルは、〜２分間の熱処理によって低くなり、次いで、スパイクされていないＣＳＦでみられるレベルに戻り、滴下前の約１０分間の加熱を通じて安定であった。
【０２３１】
ナイーブＣＳＦの熱の影響：プールしたＣＳＦのアリコートを９５℃で０〜２０分間加熱し、次いで、４℃まで冷却した後、１：１０希釈でｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを使用して測定した（図２１Ｂ）。ｐ２１７＋タウシグナルは、滴下前の約１０分間の加熱を通じて安定であった。
【０２３２】
ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂがｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを妨げる能力に対する熱の影響：ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬのヒト化ｐＴ３  ｍＡｂのアリコートを９５℃で０〜２０分間加熱し、次いで、４℃まで冷却した。次いで、これらのサンプルをプールしたＡＤ  ＣＳＦと（ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂの最終濃度が１μｇ／ｍＬまで）混合し、２２℃で２時間インキュベートした後、１：１０希釈でｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを使用して測定した（図２１Ｃ）。ｐ２１７＋タウシグナルは、〜２分間のＪＮＪ熱処理によって低くなり、次いで、スパイクされていないＣＳＦでみられるレベル（図２１Ｂを参照）に戻り、少なくとも２０分間の加熱を通じて安定であった。
【０２３３】
プールしたＡＤ  ＣＳＦの並行アリコートをヒト化ｐＴ３  ｍＡｂで用量設定し、２２℃で２時間インキュベートし、次いで、熱変性プロセス（４分間の熱による）（図１２２Ａ）又は免疫捕捉／ｒｐＨＰＬＣ（図２２Ｂ）のいずれかに供した後、ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを使用して測定した。両方法は、ヒト化ｐＴ３  ｍＡｂが、用量依存的に結合では増加し、遊離では減少し、総ｐ２１７＋タウシグナルでは変化しないことを示した。更に、熱による変性法により、アッセイ１のより面倒な免疫捕捉／ｒｐＨＰＬＣ法を使用して得られたものと同等のヒト化ｐＴ３  ｍＡｂ用量依存性、及び相対的な遊離対結合対総ｐ２１７＋測定値が得られた（図２２Ｃ）。したがって、標準的なサンプル分析には、熱方法が推奨される。
【０２３４】
実施例１０．前臨床動物モデルにおけるｐ２１７＋タウシグナル
前臨床試験をサポートするために、様々な一般的な実験動物由来のナイーブサンプルを、ｐＴ３ベースのアッセイを用いて評価し、及び／又は配列をアラインメントして交差反応性を予測した。
【０２３５】
カニクイザル（Cynomolgus Macaque）
２頭のカニクイザル由来のＣＳＦを、ｐＴ３ベース及びｈＴ７ベースのアッセイを使用して様々な希釈度で測定した（図２３）。比較するために、同じ検出抗体を２つの捕捉抗体のそれぞれと対にした。一部の場合には、２つの個々のＣＳＦを別々に試験し（カニクイザル１又はカニクイザル２）、他の場合には、ＣＳＦサンプルをプールして体積を節約した。検出抗体にかかわらず、捕捉抗体としてｈＴ７を使用した全てのアッセイにおいて実質的なシグナル（ＡＥＢ）がみられたが、捕捉抗体としてｐＴ３を使用したアッセイのいずれにおいてもシグナルは検出されなかった。更に、ｐＴ３によるプレートベースのアッセイは、ＡＤヒト脳における大きなシグナルにもかかわらず、カニクイザルの脳のホモジネートであっても、ｐＴ３ベースのシグナルがほとんど又は全く存在しないことが示された（データは示さない）。これは、高いレベルのタウにもかかわらず、ｐＴ３エピトープがこの種において保存されていないことを示唆する。実際に、公開されているタンパク質配列の解析は、ｐＴ３コアエピトープにおいてヒトとカニクイザルとの間で１つのアミノ酸が異なることを示唆し、タウを有するヒト化ｐＴ３  ｍＡｂの結晶構造に基づく構造モデリングは、この変化によってｐＴ３が結合しなくなり得ることを示唆している（データは示さない）。
【０２３６】
コモンマーモセット
コモンマーモセット由来のＣＳＦを、ｐＴ３ベース及びｈＴ７ベースのアッセイを使用して試験した（図２４）。３頭のコモンマーモセット由来のＣＳＦを、ｐＴ３ｘｈＴ４３、ｐＴ３ｘｐＴ８２、及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイを用いて様々な希釈度で測定した。比較のために、プールしたカニクイザルＣＳＦ（陰性対照）及びプールしたＡＤヒトＣＳＦ（陽性対照）を同時に試験した。ｐＴ３ｘｐＴ８２（図２４Ｂ）及びｈＴ７ｘｐＴ８２（図２０Ｃ）アッセイを使用したマーモセットＣＳＦでは実質的なシグナル（ＡＥＢ）がみられたが、ｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイではみられなかった（図２４Ａ）。
【０２３７】
これは、この種においてｈＴ４３エピトープが欠損していることを示唆しており、実際に、タンパク質配列のアラインメントは、ｈＴ４３エピトープにおいてヒトとコモンマーモセットとの間で１つのアミノ酸が異なるが、ｐＴ３、ｈＴ７、及びｐＴ８２エピトープは保存されていることを示す。同じアッセイによるマーモセット脳ホモジネートの測定により、ｐＴ３ｘｐＴ８２及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイでは実質的なシグナルが存在するが、ｐＴ３ｘｈＴ４３アッセイでは非常に小さいことが確認された（データは図示せず）。したがって、マーモセットにおけるｐ２１７＋タウシグナルの分析は、ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを使用して達成された。
【０２３８】
マウス、ラット、イヌ、ブタ
マウス、ラット、イヌ、又はブタ（それぞれ、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０３３６９８．１、ＮＰ＿０５８９０８．２、ＮＰ＿００１１０４２７１．１、及びＡＧＪ２６５１７．１）におけるヒト配列による予測タウタンパク質配列のアラインメントは、ｐＴ３がこれらの種において１００％保存されていることを示唆する。しかしながら、マウス、ラット、イヌ、及びブタのｈＴ４３及びｐＴ８２配列は、ヒトの配列と同一ではなく、したがって、これら由来のサンプルは、ｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイを使用して評価する必要がある。
【０２３９】
総合すれば、本明細書に提示されるデータは、ＣＳＦ測定のためのＳｉｍｏａプラットフォーム上で開発されたｐＴ３ｘｈＴ４３及びｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイが高感度であり、フェムトグラム感度を有し、高精度、正確、希釈線形性、かつアナライト安定性であることを示す。アッセイは、古典的なＡＤバイオマーカー及び認知症スコアと良好に相関していると考えられ、ＡＤ対象の特定及びステージ分類において測定よりも優れている可能性がある。
【０２４０】
アッセイは、ＣＳＦ中の総ｐ２１７＋タウのレベルを測定するために、又はｒｐＨＰＬＣで分画されたＣＳＦ中のｐ２１７＋の断片プロファイルを評価するために使用することができる。アッセイはまた、抗体を含まないｐ２１７＋タウに対して内因性又は外因的に投与された抗体に結合しているｐ２１７＋タウのレベルを測定するために、分析前操作と組み合わせてもよい。したがって、アッセイは、高レベルのｐ２１７＋タウ標的を有する対象を特定することによって、抗ｐ２１７＋タウ抗体療法に適した対象を特定するための予測バイオマーカーとして使用することができる。総、遊離、及び治療抗体に結合しているｐ２１７＋タウのレベルを測定することによって、アッセイを薬力学マーカーとして使用することもできる。
【０２４１】
実施例１１．血液中のｐ２１７＋タウシグナル
ＣＳＦ中のタウの測定は、神経変性障害の診断及びステージ分類において大きな有用性が示されているが、ＣＳＦの採取は、制約（例えば、患者の負担、臨床施設の経験、採取体積、及び頻度の制約）を有する。したがって、血液産物（例えば、血清、血漿）に対して使用するためにタウ測定を適応させることは大変興味深い。しかしながら、最近の文献は、粗血清又は血漿中のタウ測定が理想的な診断性能を示さず、感度及びマトリクス干渉のハードルに悩まされる場合があることを示している。しかし、ｐＴ３ベースのアッセイは、その高い感度及び特異性から新たな好機となり得る。
【０２４２】
臨床的に定義されたＡＤ及びＨＶ対象（それぞれｎ＝４）由来の血清を、Ｄ’Ａｂｒａｍｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１６のように、様々な希釈度の粗サンプル（「粗」、図２５Ａ〜２５Ｄ）、酸（ＮａＯＡｃ、ｐＨ５）処理し、変性させたサンプル（「煮沸」、図２６Ａ〜２６Ｂ）のいずれかで、ｐＴ３ｘｐＴ８２及びｈＴ７ｘｐＴ８２アッセイを用いて測定して、ほとんどのマトリクス干渉を除去し、ｐＴ３ビーズを用いて免疫沈降（ＩＰ）した後、溶出液を熱変性させた（「ｐＴ３  ＩＰ」、図２７）。
【０２４３】
粗血清中の測定値からは、ほとんどのサンプルが定量限界（ＬＯＱ）未満であることが明らかになり、わずかな外れ値サンプルでははるかに高いレベルが報告された。しかしながら、シグナルは、中程度の希釈に耐えられず、したがって干渉アーチファクトであると考えられた。試験された最も高い希釈度（図２５Ｂ及び２５Ｄ）、ひいては、干渉による最も少ない影響の評価は、ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイが、ＡＤサンプル中のわずかに多くのシグナルを検出することはできるが、全てがＬＯＱ未満であるため、正確及び／又は高精度でない場合があることを示唆した。
【０２４４】
酸処理（タンパク質−タンパク質相互作用を解離させるため）及び加熱（ほとんどの非タウタンパク質を変性させるため）後の血清における測定では、全てのｐＴ３ｘｐＴ８２及びｈＴ７ｘｐＴ８２シグナルがＬＯＱ付近又はＬＯＱ未満に低下した（図２６Ａ〜２６Ｂ）。この場合も、ｐＴ３ｘｐＴ８２アッセイは、ＡＤサンプルにおいてわずかに多くのシグナルを検出することができるが、全てがＬＯＱ付近であるため、正確及び／又は高精度でない場合がある。
【０２４５】
ほとんどの干渉物質を除去し、ｐ２１７＋タウを濃縮するためのｐＴ３−ＩＰ及び変性後の血清における測定から、ＨＶサンプルよりもＡＤサンプルにおいてレベルがはるかに高いことが明らかになった（図２７）。Ｐ２１７＋レベルは、粗測定又は煮沸測定よりも約４倍高かったため、ＨＶサンプルはここではＬＯＱであり、ＡＤサンプルは、ここでは全て線形範囲内であった。
【０２４６】
これらの結果は、本明細書に記載されるｐＴ３ベースのアッセイが、特にＩＰなどの富化戦略と対にした場合、病理学的タウの血液ベースの測定として有用であり得ることを示した。
【０２４７】
以上、本発明を詳細に、かつその具体的な実施形態を参照して説明したが、当業者には、発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改変を行い得る点は明らかであろう。
【０２４８】
参考文献
Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３８３２−９，２００８
Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２−４３，２００４
Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．５１（４）：１０３３−４３，２０１６
Ｂｕｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５（３）：７１７−３０，１９９１
Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７，１９８７
Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７，１９９２
Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：９０９−１３，２００９
Ｄ’Ａｂｒａｍｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．３７：５８−６５，２０１６
Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）
Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−５１，１９９６
Ｆｒｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８４：１２８４５−５２，２００９
Ｈａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２（３２）：２３６４５−５４，２００７
Ｈａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１５：１１２−９，２００９
Ｉｑｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．７（８）：６５６−６６４，２０１０
Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００
Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ．２５６：４９５−７，１９７５
Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７−８４，２００１
Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７，２００３
Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３６８：８５６−９，１９９４
Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６，１９９７
Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８（１０）：ｅ７６５２３，２０１３
Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，７０：４１０−２６，２０１１
Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．５５（１）：３０３−３１３，２０１７
Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３９７：３８５−９６，２０１０
Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５−１８２，１９９０
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２：２１１−５０，１９７０
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１５Ｋ】
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【図１５Ｌ】
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【図１５Ｍ】
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【図１５Ｎ】
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【図１５Ｏ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１７Ｏ】
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【図１７Ｐ】
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【図１７Ｑ】
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【図１７Ｒ】
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【図１７Ｓ】
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【図１７Ｔ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１８Ｋ】
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【図１８Ｌ】
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【図１８Ｍ】
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【図１８Ｎ】
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【図１８Ｏ】
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【図１８Ｐ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
2021517239.tif 000109
【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【配列表】
2021517239000001.app
【国際調査報告】
2021517239.tif 000118
2021517239.tif 000119