(57)【要約】ＭＴＡ／ＡＤＯ分解酵素活性を有するタンパク質の操作に関係する方法および組成物について記載する。例えば、特定の態様において、ＭＴＡ／ＡＤＯを分解可能なＭＴａｓｅが開示され得る。更に、本発明の特定の態様は、開示したタンパク質または核酸を使用する、ＭＴａｓｅによる癌またはＳＣＩＤの治療のための組成物および方法を提供する。2021506320.tif 000008
2021506320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体にコンジュゲートされている、単離された改変ＭＴａｓｅ酵素。
【請求項２】
前記ＭＴａｓｅが原核生物のＭＴＡＮである、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
前記原核生物のＭＴＡＮが、配列番号３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の酵素。
【請求項４】
前記原核生物のＭＴＡＮが、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の酵素。
【請求項５】
前記原核生物のＭＴＡＮが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の酵素。
【請求項６】
前記ＭＴａｓｅが哺乳類のＭＴＡＰである、請求項１に記載の酵素。
【請求項７】
前記哺乳類のＭＴＡＰが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の酵素。
【請求項８】
前記哺乳類のＭＴＡＰが、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の酵素。
【請求項９】
前記哺乳類のＭＴＡＰが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の酵素。
【請求項１０】
前記抗体がｓｃＦｖ抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１１】
前記抗体またはｓｃＦｖ抗体が抗ＭＵＣ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤＬ１抗体である、請求項１または１０に記載の酵素。
【請求項１２】
異種ペプチドセグメントを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１３】
前記異種ペプチドセグメントがＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、請求項１２に記載の酵素。
【請求項１４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１５】
１つ以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧに結合している、請求項１４に記載の酵素。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項１７】
細菌、真菌、昆虫、または哺乳類での発現に最適化されたコドンである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＭＴａｓｅ−抗体コンジュゲートを含む、医薬製剤。
【請求項２２】
薬学的に許容できる担体中にＭＴａｓｅポリペプチドを含む有効量の医薬製剤を患者に投与することを含む、腫瘍を有する患者の治療方法であって、前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号１または３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドがＭＴａｓｅ活性を有する、前記方法。
【請求項２３】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが配列番号１または３に対して少なくとも９５％の同一性を有し、前記ポリペプチドがＭＴａｓｅ活性を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが配列番号１または３の配列を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭＴａｓｅが原核生物のＭＴＡＮであり、前記原核生物のＭＴＡＮが、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＭＴａｓｅ活性を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＴａｓｅがヒトＭＴＡＰであり、前記ヒトＭＴＡＰが、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＭＴａｓｅ活性を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号３の配列を有する原核生物のＭＴＡＮである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号１の配列を有する原核生物のＭＴＡＰである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＭＴａｓｅがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＴａｓｅが、１つ以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧと結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＴａｓｅが異種ペプチドセグメントを更に含む、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記異種ペプチドセグメントがＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＭＴａｓｅが抗体にコンジュゲートされている、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体がｓｃＦｖ抗体である、請求項３３に記載の酵素。
【請求項３５】
前記抗体またはｓｃＦｖ抗体が抗ＭＵＣ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤＬ１抗体である、請求項３３または３４に記載の酵素。
【請求項３６】
前記腫瘍が充実性腫瘍である、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍が血液腫瘍である、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍が骨肉腫、膵癌、脊索腫、中皮腫、Ｔ細胞ＡＬＬ、膠腫、腎細胞癌、黒色腫、扁平上皮細胞癌、胆嚢癌、胃癌、または肝細胞癌である、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍が、参照レベルに対して低下したレベルのＭＴＡＰを有する、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記腫瘍がＭＴＡＰ欠損を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍が、参照サンプルに対して増加したレベルのＣＤ７３を有する、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍が、参照レベルに対して低下したレベルのＭＴＡＰを有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍が、参照サンプルに対して増加したレベルのＣＤ３９を有する、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍が、参照レベルに対して増加したレベルのＭＴＡを有する、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍が、参照レベルに対して増加したレベルのＡＤＯを有する、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記参照レベルが、前記患者の健全な組織におけるレベルである、請求項３９および４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記参照レベルが健全な対象におけるレベルである、請求項３９および４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者がヒト患者である、請求項２２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記製剤が、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流により、カテーテルを介して、または洗浄により、腫瘍内投与、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜内投与、気管内投与、眼内投与、鼻孔内投与、硝子体内投与、腟内投与、直腸内投与、筋肉内投与、皮下投与、結膜下投与、膀胱内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、経口投与される、請求項２２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
免疫療法に対する感度を増加させるための方法として更に定義される、請求項２２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者が、以前に免疫チェックポイント阻害剤の投与に対して応答しなかった、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象に、少なくとも第２の抗癌治療法を施すことを更に含む、請求項２２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の抗癌治療法が外科療法、化学療法、放射線療法、凍結治療、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の抗癌治療法が、養子Ｔ細胞療法、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−０３６５５９、またはＣＫ−３０１を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗ＰＤ１抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２３、ＡＭＰ−５１４、セミプリマブ、またはＰＤＲ−００１を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗ＣＴＬＡ−４治療法が、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
転移の予防法として更に定義される、請求項２２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
複合有効量のＭＴａｓｅポリペプチドと免疫チェックポイント阻害剤を用いて治療するための腫瘍を有する患者を選択するための方法であって、
（ａ）前記患者の腫瘍が、参照レベルに対して、低下したレベルのＭＴＡＰ、増加したレベルのＣＤ７３、増加したレベルのＣＤ３９、増加したレベルのＭＴＡ、または、増加したレベルのＡＤＯを有するか否かを判定することと、
（ｂ）前記患者の腫瘍が、参照レベルに対して、低下したレベルのＭＴＡＰ、増加したレベルのＣＤ７３、増加したレベルのＣＤ３９、増加したレベルのＭＴＡ、または、増加したレベルのＡＤＯを有する場合、治療のために前記患者を選択することと
を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号１または３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドがＭＴａｓｅ活性を有する、前記方法。
【請求項６０】
複合有効量のＭＴａｓｅポリペプチドおよび免疫チェックポイント阻害剤を、前記選択した患者に投与することを更に含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記患者が、以前に免疫チェックポイント阻害剤の投与に対して応答しなかった場合、治療のために前記患者を選択することを更に含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記患者が、以前に少なくとも一回の抗癌治療を受けている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが配列番号１または３に対して少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＭＴａｓｅポリペプチドがＭＴａｓｅ活性を有する、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが配列番号１または３の配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＭＴａｓｅが原核生物のＭＴＡＮであり、前記原核生物のＭＴＡＮが、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＭＴａｓｅ活性を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＭＴａｓｅがヒトＭＴＡＰであり、前記ヒトＭＴＡＰが、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＭＴａｓｅ活性を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号３の配列を有する原核生物のＭＴＡＮである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号１の配列を有する原核生物のＭＴＡＰである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＭＴａｓｅがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項５９〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＭＴａｓｅが、１つ以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧと結合している、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＭＴａｓｅが異種ペプチドセグメントを更に含む、請求項５９〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記異種ペプチドセグメントがＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＭＴａｓｅが抗体にコンジュゲートされている、請求項５９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗体がｓｃＦｖ抗体である、請求項７３に記載の酵素。
【請求項７５】
前記抗体またはｓｃＦｖ抗体が抗ＭＵＣ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤＬ１抗体である、請求項７３または７４に記載の酵素。
【請求項７６】
前記腫瘍が充実性腫瘍である、請求項５９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記腫瘍が血液腫瘍である、請求項５９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記腫瘍が骨肉腫、膵癌、脊索腫、中皮腫、Ｔ細胞ＡＬＬ、膠腫、腎細胞癌、黒色腫、扁平上皮細胞癌、胆嚢癌、胃癌、または肝細胞癌である、請求項５９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記腫瘍が、参照レベルに対して低下したレベルのＭＴＡＰを有する、請求項５９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記腫瘍がＭＴＡＰ欠損を有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記腫瘍が、参照サンプルに対して増加したレベルのＣＤ７３を有する、請求項５９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記腫瘍が、参照レベルに対して低下したレベルのＭＴＡＰを有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記腫瘍が、参照サンプルに対して増加したレベルのＣＤ３９を有する、請求項５９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記腫瘍が、参照レベルに対して増加したレベルのＭＴＡを有する、請求項５９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記腫瘍が、参照レベルに対して増加したレベルのＡＤＯを有する、請求項５９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記参照レベルが、前記患者の健全な組織におけるレベルである、請求項７９および８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記参照レベルが健全な対象におけるレベルである、請求項７９および８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記患者がヒト患者である、請求項５９〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流により、カテーテルを介して、または洗浄により、腫瘍内投与、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜内投与、気管内投与、眼内投与、鼻孔内投与、硝子体内投与、腟内投与、直腸内投与、筋肉内投与、皮下投与、結膜下投与、膀胱内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、経口投与される、請求項６０〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
免疫療法に対する感度を増加させるための方法として更に定義される、請求項６０〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記患者が、以前に免疫チェックポイント阻害剤の投与に対して応答しなかった、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象に、少なくとも第２の抗癌治療法を施すことを更に含む、請求項５９〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記第２の抗癌治療法が外科療法、化学療法、放射線療法、凍結治療、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第２の抗癌治療法が、養子Ｔ細胞療法、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−０３６５５９、またはＣＫ−３０１を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記抗ＰＤ１抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２３、ＡＭＰ−５１４、セミプリマブ、またはＰＤＲ−００１を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗ＣＴＬＡ−４治療法が、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
転移の予防法として更に定義される、請求項５９〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
薬学的に許容できる担体中にＭＴａｓｅポリペプチドを含む有効量の医薬製剤を対象に投与することを含む、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を有する患者の治療方法であって、前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号１または３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドがＭＴａｓｅ活性を有する、前記方法。
【請求項１００】
前記患者がアデノシンデアミナーゼ遺伝子に少なくとも１つの変異を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが配列番号１または３に対して少なくとも９５％の同一性を有し、前記ポリペプチドがＭＴａｓｅ活性を有する、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが配列番号１または３の配列を有する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＭＴａｓｅが原核生物のＭＴＡＮであり、前記原核生物のＭＴＡＮが、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＭＴａｓｅ活性を有する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＭＴａｓｅがヒトＭＴＡＰであり、前記ヒトＭＴＡＰが、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＭＴａｓｅ活性を有する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号３の配列を有する原核生物のＭＴＡＮである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号１の配列を有する原核生物のＭＴＡＰである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＭＴａｓｅがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項９９〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＭＴａｓｅが、１つ以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧと結合している、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＭＴａｓｅが異種ペプチドセグメントを更に含む、請求項９９〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記異種ペプチドセグメントがＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＭＴａｓｅが抗体にコンジュゲートされている、請求項９９〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記患者がヒト患者である、請求項９９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記製剤が、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流により、カテーテルを介して、または洗浄により、腫瘍内投与、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜内投与、気管内投与、眼内投与、鼻孔内投与、硝子体内投与、腟内投与、直腸内投与、筋肉内投与、皮下投与、結膜下投与、膀胱内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、経口投与される、請求項９９〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
薬学的に許容できる担体中にＭＴａｓｅポリペプチドを含む有効量の医薬製剤で治療するためのＳＣＩＤを有する患者を選択するための方法であって、
（ａ）前記患者が、アデノシンデアミナーゼ遺伝子に少なくとも１つの変異を有するか否かを判定することと、
（ｂ）前記患者がアデノシンデアミナーゼ遺伝子に少なくとも１つの変異を有する場合、治療のために前記患者を選択することと
を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号１または３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドがＭＴａｓｅ活性を有する、前記方法。
【請求項１１５】
薬学的に許容できる担体中の有効量のＭＴａｓｅポリペプチドを、前記選択した患者に投与することを更に含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが配列番号１または３に対して少なくとも９５％の同一性を有し、前記ポリペプチドがＭＴａｓｅ活性を有する、請求項１１４または１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが配列番号１または３の配列を有する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＭＴａｓｅが原核生物のＭＴＡＮであり、前記原核生物のＭＴＡＮが、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＭＴａｓｅ活性を有する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ＭＴａｓｅがヒトＭＴＡＰであり、前記ヒトＭＴＡＰが、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＭＴａｓｅ活性を有する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号３の配列を有する原核生物のＭＴＡＮである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ＭＴａｓｅポリペプチドが、配列番号１の配列を有する原核生物のＭＴＡＰである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ＭＴａｓｅがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項１１４〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ＭＴａｓｅが、１つ以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧと結合している、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＭＴａｓｅが異種ペプチドセグメントを更に含む、請求項９９〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記異種ペプチドセグメントがＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ＭＴａｓｅが抗体にコンジュゲートされている、請求項９９〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記患者がヒト患者である、請求項９９〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記製剤が、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流により、カテーテルを介して、または洗浄により、腫瘍内投与、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜内投与、気管内投与、眼内投与、鼻孔内投与、硝子体内投与、腟内投与、直腸内投与、筋肉内投与、皮下投与、結膜下投与、膀胱内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、経口投与される、請求項９９〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１７年１２月２１日に出願された、米国特許仮出願番号第６２／６０９，０００号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって認可された助成金番号Ｒ０１  ＣＡ１８９６２３のもとで、政府の支援によってなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
１．分野
本発明は概して、医学および生物学分野に関する。より具体的には、本発明は、アデノシンおよび／またはメチルチオアデノシン（ＭＴＡ）を枯渇させる酵素による、癌またはＳＣＩＤを治療するための組成物に関する。更により具体的には、本発明は、ヒトの治療法に好適な、アデノシンおよび／またはＭＴＡ分解活性を有する、原核生物の酵素およびヒト酵素の改変、薬理学的最適化、および使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の記載
メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）の染色体９ｐ２１における、ホモ接合の遺伝子欠失は、骨肉腫、肝癌、および脊索腫の約３０〜４０％において観察される、一般的な事象であり、中皮腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、および膠腫においては、より多くの喪失（６０〜７５％）が伴う（Ｂｅｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＭＴＡＰは、ポリアミン合成の副産物であるメチルチオアデノシン（ＭＴＡ）を、メチルチオリボース−１’−ホスフェート（ＭＴＲ−１’−Ｐ）およびアデニンに分解し、これらはメチオニンおよびプリンサルベージ経路に再利用される。ＭＴＡＰの喪失は、侵襲性の疾患およびより悪い転帰と相関している。充実性腫瘍およびリンパ腫におけるＭＴＡＰの枯渇は、その基質であるＭＴＡの蓄積、および分泌の増加をもたらす（Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。通常の組織よりも、腫瘍における著しく高いＭＴＡの濃度は、一層顕著な、侵襲性および悪性の特徴と相関することを、黒色腫細胞における研究は報告した（Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。同様に、肝細胞癌（ＨＣＣ）におけるＭＴＡＰの欠損も、ＭＴＡ量の増加およびＨＣＣ増殖との強力な相関を示し、肝臓の星細胞における、プロ腫瘍発生遺伝子発現プロファイルを増加させた（Ｋｉｒｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００５】
ＭＴＡＰ遺伝子の喪失は一般的に、染色体９ｐ２１に隣接していることから、細胞周期制御因子であるＣＤＫＮ２との、単純なバイスタンダー同時欠失であると考えられていた。しかし、胃癌および皮膚Ｔ細胞リンパ腫の研究において、ＭＴＡＰの枯渇は、ＣＤＫＮ２の喪失とは無関係に生じ、より悪い転帰と相関することが発見された（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｗｏｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。マウスノックアウトモデルにおいて、ホモ接合ＭＴＡＰ−／−ヌルマウスは胎生致死表現型を持っている一方で、ＭＴＡＰ＋／−ヘテロ接合体は、通常発達するが、Ｔ細胞リンパ腫の早期に死ぬことが発見された（Ｋａｄａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。これらの発見と共に、常染色体優性遺伝悪性疾患、悪性線維性組織球腫を伴う骨幹髄質狭窄（ＤＭＳＭＦＨ）が、エクソンスキッピング、選択的スプライシング、および最終的に機能障害性ＭＴＡＰ遺伝子産物をもたらす、ＭＴＡＰ遺伝子内での変異から生じ、これは、ＣＤＫＮ２とは独立した腫瘍抑制の役割を示す（Ｃａｍａｃｈｏ−Ｖａｎｅｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００６】
ＭＴＡＰの欠失または抑制により、ＭＴＡの増加および分泌がもたらされ、これは強力な免疫抑制の性質を有することが、最近示されている。ＭＴＡによるインキュベーションは、ナイーブリンパ球の増殖および分化を停止し、活性化ヒトＴ細胞に対して細胞傷害性である。特に、ＭＴＡは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張を停止し、ＣＤ２５およびＣＤ６９などの、活性化マーカーの上方制御を防止し、予め刺激された細胞傷害性Ｔリンパ球におけるアポトーシスを誘導する（Ｈｅｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＭＴＡ非含有の細胞を洗浄することにより逆転可能な効果である、外来性ＭＴＡは、ＤＮＡ合成、タンパク質合成、および、抗原または同種異系細胞で刺激されたヒトリンパ球培養液の増殖を阻害することもまた、より初期の報告にて示されている（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。ＭＴＡがその効果を実行する方法のメカニズムは、完全には解明されていないものの、ＭＴＡが、アデノシン受容体Ａ２ａおよびＡ２ｂのアゴニストとして機能することができ、マクロファージで寛容原性表現型を作製する、という証拠が存在する（Ｋｅｙｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。同様に、悪性黒色腫の実験において、ＭＴＡは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）の誘発により、線維芽細胞中で腫瘍を促進する役割を引き起こすことが観察された（Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＭＴＡＰ欠失の結果により、免疫エフェクター細胞を抑制し、ＭＴＡの増加により寛容原性ストローマ細胞表現型を促進する役割を果たすという証拠は今や、これが癌の最も一般的な遺伝子欠失の１つである理由に対する、明確なメカニズムを示唆している。腫瘍が排出したＭＴＡは、腫瘍細胞が免疫監視および異物除去を避けるのに役立つ、免疫チェックポイントと考えることができる。
【０００７】
加えて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）免疫抑制におけるその役割故に、アデノシン作動性経路が、癌治療のための主要な治療標的として現れている。細胞外アデノシン（ＡＤＯ）は、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３の作用により、かつ／または、死細胞からの放出により生じ、ＡＤＯは、アデノシン受容体を結合することにより、免疫抑制シグナル伝達分子として作用する。ＣＤ３９はＡＴＰとＡＤＰをＡＭＰに転換し、ＣＤ７３はＡＭＰをＡＤＯに転換する。これは転じて、既知の４つのＧタンパク質が結合したＡＤＯ受容体（Ａ１Ｒ、Ａ２ＡＲ、Ａ２ＢＲ、およびＡ３Ｒ）のうちの１つに結合することができる（Ｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。抗ＰＤ／Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４などの、抗体免疫チェックポイント阻害剤に対する先天性耐性および獲得耐性のメカニズムの１つは、腫瘍微小環境におけるＡＤＯの蓄積によるものであることを、積み重なった証拠は示す（Ｖｉｊａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ニボルマブで治療されている転移性黒色腫患者の個別研究において、高濃度のＣＤ７３の腫瘍発現が、全体の不十分な生存、および無進行生存と有意に関連することが発見された（Ｍｏｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。同様に、高いＣＤ７３発現を有する腎細胞癌（ＲＣＣ）患者は、低いＣＤ７３発現患者と比較して、３．５年短い中央生存を示すことが発見された（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。更に、高いＣＤ７３発現は、胃癌、胆嚢癌、および頭頸扁平上皮細胞癌におけるリンパ節転移と有意に相関することが示されており（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）、腫瘍由来のＡＤＯが、免疫回避および疾患進行において果たす役割を全体的に強調している。そのために、腫瘍微小環境において、ＭＴＡおよび／またはＡＤＯ量を低下させるための組成物および方法が、必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の態様は、ＡＤＯおよび／またはＭＴＡを分解可能な、細菌および哺乳類ポリペプチド配列を含む新規の酵素を提供することにより、当該技術分野における主要な欠乏を克服し、これは、癌治療、および、改善された薬理学的性質を有するのに好適であり得る。いくつかの態様では、治療は、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｈｓ−ＭＴＡＰ）などの哺乳類酵素に、あるいは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）酵素であるメチルチオアデノシンヌクレオシダーゼ（ｓｅ−ＭＴＡＮ）などの原核生物の酵素に由来することができる。別の態様において、ＡＤＯおよび／またはＭＴＡを分解可能な、天然または改変ヒトまたは哺乳類のＭＴＡＰのいずれかを含むポリペプチドが存在することができる。更に別の態様において、ＡＤＯおよび／またはＭＴＡを分解可能な、天然または改変ｓｅ−ＭＴＡＮまたは原核生物のＭＴＡＮのいずれかを含むポリペプチドが存在することができる。いくつかの態様では、ポリペプチドは、生理的条件下にてＡＤＯおよび／またはＭＴＡを分解可能であり得る。
【０００９】
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）の多数の変異が、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）において発生し、もたらされることが知られている。ＡＤＡ欠損症は、細胞内および細胞外ＡＤＯの増加をもたらし、胸腺アポトーシスおよび深刻なパンリンパ球減少をもたらす。ＡＤＡ欠損症により生じる、ＡＤＯおよび他の代謝産物の増加は、リンパ球毒性の主たる原因と考えられている。ＡＤＡ欠損症の患者は多くの場合、発達遅延、慢性下痢、皮膚発疹、肺炎、および広範な皮膚炎などの症状を更に示す。現在の治療としては、同種異系の造血幹細胞移植、ＰＥＧ化ウシＡＤＡ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）を用いる酵素補充療法、および、自己遺伝子修正多能性造血幹細胞による遺伝子治療が挙げられる（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。本発明の態様は、ＡＤＯを分解可能な細菌および哺乳類ポリペプチド配列を含む酵素を提供し、これは、毒性量のＡＤＯを取り除く／分解することにより、ＡＤＡ  ＳＣＩＤ治療法に好適であり得る。
【００１０】
本発明は、ＡＤＯおよび／またはＭＴＡが、血清および腫瘍微小環境から効率的に分解されることができるように、哺乳類のＭＴＡＰまたは原核生物のＭＴＡＮ酵素（即ち、ＭＴａｓｅ酵素）を改変すること、ならびに、ヒトの癌治療および／またはＳＣＩＤ治療に好適な製剤で、改変ＭＴａｓｅ酵素を提供することに関する。本明細書に記載したように改変したＡＤＯ分解酵素およびＭＴａｓｅ酵素は、天然酵素と比較して、ＡＤＯおよび／またはＭＴＡ分解触媒活性を有する、ヒト、霊長類、哺乳類、または原核生物のポリペプチド配列を含む、新規の酵素を提供する。そのために、これらの改変酵素は、癌治療および／またはＳＣＩＤ治療に好適であり得、低い免疫原性および改善された血清安定性を有する。
【００１１】
したがって、一実施形態において、改変ポリペプチド、特に、ＡＤＯ／ＭＴＡ分解活性を有する酵素多様体を提供する。例えば、酵素多様体は、配列番号１または３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、多様体は、ヒトＭＴＡＰなどのヒト酵素に、または、サルモネラ・エンテリカＭＴＡＮなどの原核生物の酵素に由来することができる。特定の態様において、ＡＤＯ／ＭＴＡを分解可能な改変ＭＴａｓｅを含むポリペプチドが存在することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、生理的条件下にてＡＤＯ／ＭＴＡを分解可能であってよい。例えば、ポリペプチドは、少なくとも、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０４、１０５、１０６ｓ−１Ｍ−１、またはこれらの中に導き出せる任意の範囲の、ＡＤＯ／ＭＴＡに対する触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有することができる。
【００１２】
未改変ポリペプチドは、天然ＭＴＡＰおよびＭＴＡＮであってよい。例えば、天然ＭＴａｓｅは、配列番号１または３の配列を有することができる。例示的な天然ポリペプチドは、配列番号１または３に対して約、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性（またはこれらの中に導き出せる任意の範囲）を有する配列、あるいはその断片を含む。例えば、天然ポリペプチドは、配列番号５〜４０のいずれか１つに記載のＭＴＡＰ配列を有することができる、または、配列番号４１〜５０のいずれか１つに記載のＭＴＡＮ配列を有することができる。例えば、天然ポリペプチドは、配列番号１または３の配列の、少なくとも、または最大約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、または３００残基（またはこれらの中に導き出せる任意の範囲）を含むことができる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、天然ＭＴａｓｅは、１つ以上の他の改変、例えば化学修飾、置換、挿入、欠失、および／または切断により改変されてよい。特定の実施形態では、天然ＭＴａｓｅは、置換により改変されてよい。例えば、置換の数は１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上であってよい。更なる実施形態では、天然ＭＴａｓｅは、基質認識部位、または、基質特異性に影響を及ぼし得る、もしくは触媒活性を向上し得る任意の位置において改変されてよい。
【００１４】
いくつかの態様では、ＭＴａｓｅ酵素は、抗体にコンジュゲートされることにより改変される。抗体はｓｃＦｖ抗体であってよい。抗体またはｓｃＦｖ抗体は、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤＬ１抗体であることができる。
【００１５】
上述した改変ポリペプチドは、未改変ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチド）、または本明細書にて開示した任意のポリペプチド配列と比較して、特定のパーセンテージの同一性を有することを特徴としてよい。例えば、未改変ポリペプチドは、天然ＭＴＡＰまたはＭＴＡＮの、少なくとも、または最大約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、または３００残基（またはこれらの中に導き出せる任意の範囲）を含んでよい。同一性パーセンテージは、改変ポリペプチドの未改変部分と、対応する天然ポリペプチドとの間で、約、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこれらの中に導き出せる任意の範囲）であってよい。上述の同一性パーセンテージは、ポリペプチドの未改変領域と比較したポリペプチドの特定の改変領域に関し得ることもまた企図される。例えば、ポリペプチドは、同一種、または種をまたいだ未改変または変異ＭＴａｓｅのアミノ酸配列の同一性に対する、ＭＴａｓｅの改変または変異基質認識部位のアミノ酸配列の同一性に基づき特性決定可能な、ＭＴａｓｅの改変または変異基質認識部位を含有することができる。例えば、未改変ＭＴａｓｅに対して少なくとも９０％の同一性を有するものとして特徴付けられる、改変または変異体ヒトポリペプチドとは、その改変または変異体ヒトポリペプチドにおけるアミノ酸の少なくとも９０％が、未改変ポリペプチドのアミノ酸と同一であることを意味する。
【００１６】
いくつかの態様では、本発明は、異種アミノ酸配列に結合した改変ＭＴａｓｅを含むポリペプチドもまた企図する。例えば、改変ＭＴａｓｅは、融合タンパク質として異種アミノ酸配列に結合することができる。特定の実施形態では、改変ＭＴａｓｅは、アミノ酸配列、例えばＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、またはインビボ半減期を増加させるためのＸＴＥＮポリペプチドに結合することができる。
【００１７】
血清安定性を増加させるために、改変ＭＴａｓｅは、１つ以上のポリエーテル分子に結合することができる。特定の実施形態では、ポリエーテルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってよい。改変ポリペプチドは、特定のアミノ酸残基、例えばリジンまたはシステインを介してＰＥＧに結合することができる。治療用投与のために、改変ＭＴａｓｅを含むこのようなポリペプチドを薬学的に許容できる担体に分散させることができる。
【００１８】
いくつかの態様では、このような改変ＭＴａｓｅをコードする核酸が企図される。一態様では、核酸は、細菌内での発現のためにコドン最適化されている。特定の実施形態では、細菌はＥ．ｃｏｌｉである。別の態様において、核酸は、真菌（例えば、酵母菌）、昆虫細胞、または哺乳類細胞内での発現のためにコドン最適化されている。本発明は更に、このような核酸を含有するベクター、例えば発現ベクターを企図する。特定の実施形態では、改変ＭＴａｓｅをコードする核酸は、異種プロモーターを含むがこれらに限定されないプロモーターに作用可能に結合している。一実施形態では、改変ＭＴａｓｅは、ベクター（例えば、遺伝子治療ベクター）により標的細胞に送達されることができる。このようなウイルスは、組み換えＤＮＡ技術により改変され、標的細胞内での改変ＭＴａｓｅをコードする核酸の発現が可能となっている。これらのベクターは、非ウイルス（例えばプラスミド）、またはウイルス（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはワクシニアウイルス）起源のベクターに由来してもよい。非ウイルスベクターは、作用物質と複合体を形成し、細胞膜を通ってＤＮＡが流入するのを容易にするのが好ましい。このような非ウイルスベクター複合体の例としては、ＤＮＡの縮合を促進するポリカチオン性作用物質、および脂質ベースのデリバリーシステムとの製剤が挙げられる。脂質ベースのデリバリーシステムの例としては、核酸のリポソームベースの送達が挙げられる。
【００１９】
また更なる態様において、本発明は更に、このようなベクターを含む宿主細胞を企図する。宿主細胞は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞（例えば、酵母菌）、昆虫細胞、または哺乳類細胞であってよい。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ベクターは、改変ＭＴａｓｅを発現するために宿主細胞に導入される。タンパク質は、任意の好適な方法で発現することができる。一実施形態では、タンパク質は細胞内で、タンパク質がグリコシル化されるように発現される。別の実施形態において、タンパク質は宿主細胞内で、タンパク質が非グリコシル化されるように発現される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドまたは核酸は、薬学的に許容できる担体を含む医薬製剤中に存在する。ポリペプチドは、天然ＭＴａｓｅポリペプチドまたは改変ＭＴａｓｅポリペプチドであってよい。核酸は、天然ＭＴａｓｅポリペプチドまたは改変ＭＴａｓｅポリペプチドをコードすることができる。
【００２２】
一実施形態では、癌を有する、または癌の進行リスクを有する患者の治療方法であって、対象に、ＭＴａｓｅ活性を有する、単離した改変ＭＴａｓｅポリペプチドを含む、治療的有効量の製剤を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、ＭＴａｓｅポリペプチドは、配列番号１または３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、ＭＴａｓｅポリペプチドは、配列番号１または３に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの態様では、ＭＴａｓｅポリペプチドは、配列番号１または３の配列を有する。いくつかの態様では、ＭＴａｓｅは原核生物のＭＴＡＮであり、原核生物のＭＴＡＮは、配列番号３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＭＴａｓｅはヒトＭＴＡＰであり、ヒトＭＴＡＰは、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
いくつかの態様では、酵素は、異種ペプチドセグメント、例えばＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドを更に含む。いくつかの態様では、酵素はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合している。いくつかの態様では、酵素は、１つ以上のリジンまたはシスチン残基を介してＰＥＧに結合している。
【００２４】
いくつかの態様では、ＭＴａｓｅポリペプチドは、ｓｃＦｖ抗体などの抗体にコンジュゲートしている。抗体またはｓｃＦｖ抗体は、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤＬ１抗体であることができる。
【００２５】
患者は任意の動物、例えばマウスであることができる。例えば、患者は哺乳類、特に霊長類、より詳細にはヒト患者であってよい。
【００２６】
いくつかの態様では、腫瘍は充実性腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍は血液腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍は、骨肉腫、膵癌、脊索腫、中皮腫、Ｔ細胞ＡＬＬ、膠腫、腎細胞癌、黒色腫、扁平上皮細胞癌、胆嚢癌、胃癌、または肝細胞癌である。
【００２７】
いくつかの態様では、腫瘍は低下したレベルのＭＴＡＰを有する。特定の態様において、腫瘍はＭＴＡＰ欠損を有する。いくつかの態様では、腫瘍は、参照サンプルに対して、増加したレベルのＣＤ７３を有する。いくつかの態様では、腫瘍は、参照レベルに対して、増加したレベルのＣＤ７３、場合により、低下したレベルのＭＴＡＰを有する。いくつかの態様では、腫瘍は、参照サンプルに対して、増加したレベルのＣＤ３９を有する。いくつかの態様では、腫瘍は、参照レベルに対して、増加したレベルのＭＴＡを有する。いくつかの態様では、腫瘍は、参照レベルに対して、増加したレベルのＡＤＯを有する。いくつかの態様では、参照レベルは、患者の健全な組織におけるレベルである。いくつかの態様では、参照レベルは、健全な対象におけるレベルである。
【００２８】
いくつかの態様では、患者は以前に癌を治療しており、癌の再発を防止するために、酵素が投与されている。いくつかの態様では、方法は、転移の予防方法である。いくつかの態様では、方法は、免疫療法に対する感度の増加方法である。いくつかの態様では、患者は、以前に免疫チェックポイント阻害剤の投与に対して応答しなかった。いくつかの態様では、方法は、少なくとも第２の抗癌治療法を対象に投与することを更に含む。いくつかの態様では、第２の抗癌治療法は、免疫チェックポイントの遮断、養子Ｔ細胞療法、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である。いくつかの態様では、第２の抗癌治療法は、養子Ｔ細胞療法、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。特定の態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−０３６５５９、またはＣＫ−３０１を含む。特定の態様において、抗ＰＤ１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２３、ＡＭＰ−５１４、セミプリマブ、またはＰＤＲ−００１を含む。特定の態様において、抗ＣＴＬＡ−４治療法は、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む。
【００２９】
本発明の特定の態様はまた、天然ＭＴａｓｅペプチド、遺伝子治療ベクター内で天然ＭＴａｓｅペプチドをコードする核酸、改変ＭＴａｓｅペプチド、遺伝子治療ベクター内で改変ＭＴａｓｅをコードする核酸、または、本発明の製剤を投与することによる治療法、および特に、癌を有する腫瘍細胞または対象の治療方法も企図する。対象は任意の動物、例えばマウスであってよい。例えば、対象は哺乳類、特に霊長類、より詳細にはヒト患者であってよい。いくつかの実施形態において、方法は、癌の患者を選択することを含むことができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、癌はＭＴＡの枯渇に対して感受性のある任意の癌である。一実施形態では、本発明は、このようなポリペプチドを含む製剤を投与することを含む、腫瘍細胞または癌患者の治療方法を企図する。いくつかの実施形態において、投与は、癌細胞の少なくとも一部が殺傷されるような条件下にて発生する。別の実施形態において、製剤は、生理学的条件にてＭＴＡ分解活性を有し、結合したポリエチレングリコール鎖を更に含む、改変ＭＴａｓｅを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、上述したＭＴａｓｅ多様体のいずれか、および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬製剤である。そのような薬学的に許容できる賦形剤は、当業者には周知である。上記ＭＴａｓｅ多様体は全て、ヒトの治療法に有用であると企図され得る。
【００３１】
更なる実施形態において、ＭＴＡ分解活性を有する、非細菌性（哺乳類、例えば、霊長類またはマウス）の改変ＭＴａｓｅ、またはそれをコードする核酸を含む製剤を投与することを含む腫瘍細胞の治療方法もまた提供され得る。
【００３２】
インビボ用途において、腫瘍細胞を治療することは、腫瘍細胞の集団用の栄養媒体を、ＭＴａｓｅと接触させることを含む。本実施形態において、媒体は、血液、リンパ液、脊髄液、および、ＭＴＡの枯渇が所望される同様の体液とすることができる。
【００３３】
本発明の特定の態様に従うと、改変ＭＴａｓｅを含有するこのような製剤は、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜内投与、滑液包内投与、気管内投与、鼻孔内投与、硝子体内投与、腟内投与、直腸内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、皮下投与、結膜下投与、膀胱内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、眼内投与、経口投与、局所投与、吸入、注入、連続注入、局所潅流、カテーテルを介した投与、洗浄投与、脂質組成物（例えば、リポソーム）中に入れての投与、もしくは、当業者に知られている他の方法、または前述の任意の組み合わせによる投与を行うことができる。
【００３４】
一実施形態では、改変ＭＴａｓｅ、または改変ＭＴａｓｅをコードする核酸を含む組成物が、対象の腫瘍治療での使用のために提供される。別の実施形態では、腫瘍治療のための薬剤の製造における、改変ＭＴａｓｅ、または改変ＭＴａｓｅをコードする核酸の使用が提供される。上記改変ＭＴａｓｅは、実施形態の任意の改変ＭＴａｓｅであってよい。
【００３５】
一実施形態では、（ａ）患者の腫瘍が、参照レベルに対して、低下したレベルのＭＴＡＰ、増加したレベルのＣＤ７３、増加したレベルのＣＤ３９、増加したレベルのＭＴＡ、または、増加したレベルのＡＤＯを有するか否かを判定することと、（ｂ）患者の腫瘍が、参照レベルに対して、低下したレベルのＭＴＡＰ、増加したレベルのＣＤ７３、増加したレベルのＣＤ３９、増加したレベルのＭＴＡ、または、増加したレベルのＡＤＯを有する場合、治療のために患者を選択することと、を含む方法が、複合有効量のＭＴａｓｅポリペプチドと免疫チェックポイント阻害剤を用いて治療するための腫瘍を有する患者を選択するために提供され、前記ＭＴａｓｅポリペプチドは、配列番号１または３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドは、ＭＴａｓｅ活性を有する。
【００３６】
いくつかの態様では、方法は、複合有効量のＭＴａｓｅポリペプチドと免疫チェックポイント阻害剤とを、選択した患者に投与することを更に含む。いくつかの態様では、方法は、患者が、以前に免疫チェックポイント阻害剤の投与に対して応答しなかった場合、治療のために患者を選択することを更に含む。いくつかの態様では、患者は、以前に少なくとも一回の抗癌治療を受けている。
【００３７】
一実施形態では、薬学的に許容できる担体中にＭＴａｓｅポリペプチドを含む有効量の医薬製剤を対象に投与することを含む方法が、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を有する患者を治療するために提供され、前記ＭＴａｓｅポリペプチドは、配列番号１または３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドは、ＭＴａｓｅ活性を有する。いくつかの態様では、患者が、アデノシンデアミナーゼ遺伝子に少なくとも１つの変異を有する場合、治療のために患者が選択される。
【００３８】
一実施形態では、（ａ）患者が、アデノシンデアミナーゼ遺伝子に少なくとも１つの変異を有するか否かを判定することと、（ｂ）患者がアデノシンデアミナーゼ遺伝子に少なくとも１つの変異を有する場合、治療のために患者を選択することと、を含む方法が、薬学的に許容できる担体にＭＴａｓｅポリペプチドを含む有効量の医薬製剤で治療するためのＳＣＩＤを有する患者を選択するために提供され、前記ＭＴａｓｅポリペプチドは、配列番号１または３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＭＴａｓｅポリペプチドは、ＭＴａｓｅ活性を有する。いくつかの態様では、方法は、有効量の、薬学的に許容できる担体中のＭＴａｓｅポリペプチドを、選択した患者に投与することを更に含む。
【００３９】
本発明の方法および／または組成物との関係において論じられる実施形態は、本明細書で記載される任意の他の方法または組成物と共に使用することができる。したがって、一方法または組成物に関する実施形態を、本発明の他の方法および組成物に同様に適用してよい。
【００４０】
本明細書で使用する場合、核酸に関しての用語「コードする（ｅｎｃｏｄｅ）」または「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」は、本発明が当業者により速やかに理解されるようにするために用いられる。しかし、これらの用語はそれぞれ、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同じ意味で用いられてよい。
【００４１】
本明細書で使用される場合、具体的な構成要素に関して「本質的に含まない」は、具体的な構成要素が、組成物に意図的に配合されていないか、および／または混入物質として、または痕跡量のみが存在することを意味するために本明細書で使用される。したがって、ある組成物の意図しない混入から生じる具体的な構成要素の合計量は、０．０５％より十分に低く、好ましくは、０．０１％より低い。最も好ましいのは、具体的な構成成分の量が標準的な分析方法を用いて分析できない組成物である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味していてもよい。特許請求の範囲で使用される場合、「〜を含む」との用語と組み合わせて使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」といった用語は、１つ、または１つより多くを意味していてもよい。
【００４３】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみ、または代替物が相互に排他的であることを指すように明白に示されていない限り、「および／または」を意味するために用いられるが、本開示は、代替物のみ、および「および／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはより多くを意味していてもよい。
【００４４】
本明細書全体で、「約」の用語は、ある値が、値を決定するために使用されるデバイス、方法に関する誤差の固有の偏差、または試験対象の中に存在する偏差を含むことを示すために用いられる。
【００４５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし、本発明の趣旨および範囲内での種々の変化および変更が、この詳細の説明より当業者には明らかとなるため、詳細の説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているものの、実例としてのみ与えられることが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を更に示すために含まれている。本発明は、本明細書に提示する具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら１つ以上の図面を参照することによって、よりよく理解されるだろう。
【００４７】
【図１】Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓタンパク質ＭＷ標準（Ｂｉｏｒａｄ；レーン１）、精製ｈｓ−ＭＴＡＰ（レーン２）、およびＰＥＧ５，０００ＭＷ改変ｈｓ−ＭＴＡＰ（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【００４８】
【図２】Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓタンパク質ＭＷ標準（Ｂｉｏｒａｄ；レーン１）、精製ｓｅ−ＭＴＡＮ（レーン２）、およびＰＥＧ５，０００ＭＷ改変ｓｅ−ＭＴＡＮ（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【００４９】
【図３】１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて、３７℃でインキュベートした、経時的なｈｓ−ＭＴＡＰの活性（Ｔ１／２は５７時間）。
【００５０】
【図４】１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて、３７℃でインキュベートした、経時的なｓｅ−ＭＴＡＮの活性（Ｔ１／２は５６時間）。
【００５１】
【図５】図５Ａ  −  ＭＴＡ分解酵素の存在下または不存在下における、ＭＴＡ濃度に応じたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。図５Ｂ  −  ＭＴＡ分解酵素の存在下または不存在下における、ＭＴＡに応じたマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖。各パネルに報告する数字は、実験の終了時に残った生存細胞のパーセントである。
【００５２】
【図６】図６Ａ  −  ＰＥＧ−ｓｅ−ＭＴＡＮまたはＰＢＳビヒクル対照で処理した、Ｌ１２１０マウス白血病腫瘍の増殖。閉じた円は「ビヒクル対照」を表す。閉じた正方形は「ＰＥＧ−ｓｅ−ＭＴＡＮ」を表す。図６Ｂ  −  処理および未処理マウスの生存のカプランマイヤープロット（ｐ＜０．００３５）。実線は「ビヒクル対照」を表す。破線は「ＰＥＧ−ｓｅ−ＭＴＡＮ」を表す。
【００５３】
【図７】図７Ａ〜Ｆ：ＰＥＧ−ｓｅ−ＭＴＡＮで処理したＬ１２１０白血病同種異系移植片の腫瘍およびＴＤＬＮからの、リンパ球亜型の評価。図７Ａ  −  腫瘍中のＣＤ４５＋生存細胞中のＴＣＲβ＋のパーセント。図７Ｂ  −  腫瘍中のＣＤ４＋Ｋｉ６７＋のパーセント。図７Ｃ  −  腫瘍中のＣＤ８＋Ｋｉ６７＋のパーセント。図７Ｄ  −  ＴＤＬＮ中の全ての細胞における、ＴＣＲβ＋のパーセント。図７Ｅ  −  ＴＤＬＮ中のＣＤ１１ｂ＋のパーセント。図７Ｆ  −  ＴＤＬＮ中のＦ４／８０＋のパーセント。
【００５４】
【図８】図８Ａ〜Ｂ：Ｂ１６ＷＴおよびＢ１６−ＭＴＡＰ−／−黒色腫腫瘍モデル中での、ＰＥＧ−ｈｓ−ＭＴＡＰの有効性。図８Ａ  −  Ｂ１６−Ｆ１０増殖。図８Ｂ  −  Ｂ１６−ＭＴＡＰ  ＫＯ増殖。
【００５５】
【図９】図９Ａ〜Ｃ：Ｂ１６−ＭＴＡＰ−／−黒色腫腫瘍モデルにおける、免疫表現型でのＰＥＧ−ｈｓ−ＭＴＡＰの有効性。図９Ａ  −  ＴＣＲβ＋細胞中での、ＣＤ４＋細胞のパーセント。図９Ｂ  −  ＣＤ４５＋中での、ＴＣＲβ−、ＮＫ１．１のパーセント。図９Ｃ  −  Ｋｉ６７＋であるＣＤ８＋／グランザイムＢのパーセント。
【００５６】
【図１０】図１０Ａ〜Ｂ：マウス４Ｔ１乳癌同種異系移植片の、ＰＥＧ−ＭＴＡＮ／抗ＣＴＬＡ４処理の有効性。図１０Ａ  −  ビヒクルの、ＰＥＧ−ＭＴＡＮ（５０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＴＬＡ４（１０ｍｇ／ｋｇ、クローンＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ）のいずれかの、またはＰＥＧ−ＭＴＡＮ／抗ＣＴＬＡ４の組み合わせでの処理後の腫瘍増殖。図１０Ｂ  −  ビヒクルの、ＰＥＧ−ＭＴＡＮ（５０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＴＬＡ４（１０ｍｇ／ｋｇ、クローンＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ）のいずれかの、またはＰＥＧ−ＭＴＡＮ／抗ＣＴＬＡ４の組み合わせでの処理後の肺転移。
【００５７】
【図１１】マウスＣＴ２６コドン癌同種異系移植片（ＭＴＡＰｌｏｗＣＤ７３＋）のＰＥＧ−ＭＴＡＮ／抗ＰＤ１処理の有効性。アイソタイプ対照抗体の、ＰＥＧ−ＭＴＡＮ（５０ｍｇ／ｋｇ  ３ｘ週）、抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ  ＃  ＢＥ０１４６、１０ｍｇ／ｋｇ  ２ｘ週）のいずれか、またはＰＥＧ−ＭＴＡＮおよび抗ＰＤ１の組み合わせでの、合計２週間の処理後の腫瘍増殖。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
詳細な説明
本発明は、腫瘍微小環境中、および／または血液中で、ＭＴＡおよび／またはＡＤＯを特異的に枯渇させるための酵素の使用を開示する。ＭＴＡ／ＡＤＯ枯渇酵素を使用して、ＭＴＡＰ欠損またはプロモーター抑制ＭＴＡＰを有する腫瘍の処理のために、ＭＴＡ／ＡＤＯ濃度を低下させることで、腫瘍が媒介する寛容原性効果を防止し、代わりに、腫瘍切断プロ炎症性応答を媒介する。ＭＴＡ／ＡＤＯ枯渇酵素はまた、腫瘍が、ＣＤ３９の量を増加して発現する癌患者、および／または、疾患が、アデノシンデアミナーゼ遺伝子の変異と関連する、ＣＤ７３もしくはＳＣＩＤ患者の治療のためにも使用される。そのために、本発明は、アデノシンデアミナーゼの変異により引き起こされる癌またはＳＣＩＤなどの疾患を治療するための、ＭＴＡ／ＡＤＯを分解する治療用酵素の使用方法を提供する。これらの方法は、腫瘍微小環境から、および／または血液循環から、ＭＴＡ／ＡＤＯを取り除く。
【００５９】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸を含む化合物を意味し、これらは同じ意味で用いられる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」とは、非天然的に作用可能に結合したタンパク質またはタンパク質断片を含有するキメラタンパク質を意味する。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「半減期」（１／２期；Ｔ１／２）とは、例えば哺乳類への注射の後で、インビトロまたはインビボで、タンパク質のポリペプチドの濃度が半分にまで低下するのに必要な時間を意味する。
【００６２】
用語「作用可能な組み合わせで」「作用可能な順番で」および「作用可能に結合した」とは、記載した構成成分が、意図した方法で機能することを可能にする関係にある結合、例えば、所与の遺伝子の転写および／もしくは所望のタンパク質分子の合成を指令することが可能な核酸分子となるような核酸配列の結合、または、融合タンパク質が作製されるようなアミノ酸配列の結合を意味する。
【００６３】
用語「リンカー」とは、分子架橋として作用し、２つの異なる分子を作用可能に結合するように機能する化合物または部分を意味し、ここでは、リンカーの一部分が第１の分子に作用可能に結合し、リンカーの別の部分が第２の分子に作用可能に結合した化合物を指す。
【００６４】
用語「ＰＥＧ化」とは、その生体適合性の高さおよび改変の容易性を考慮して薬剤担体として幅広く使用されている、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲーションを意味する。ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシ基を介して、化学的方法により活性薬剤とカップリング（例えば共有結合）することが可能であるが、ＰＥＧそのものは、１分子あたり多くても２つの活性薬剤に制限されている。異なるアプローチにおいては、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーは、ＰＥＧの生体適合性を維持するものの、１分子あたりで多数の結合点を有するという更なる利点を有し（したがって、より多くの薬剤使用量をもたし）、かつ、合成により、多様な用途に適するように設計されることができる新規のバイオマテリアルとして見出されている。
【００６５】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド、またはその前駆体の作製に必要な調節配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列を意味する。ポリペプチドは、完全長コード配列、または所望の酵素活性が維持されるようなコード配列の任意の部分によりコードされることができる。
【００６６】
用語「天然」とは、天然源から単離した場合の、遺伝子、遺伝子産物、またはその遺伝子もしくは遺伝子産物の特性の典型的形態を意味する。天然形態は、天然集団にて最も頻繁に見られ、したがって恣意的に通常形態または野生型形態と呼ばれるものである。対照的に、用語「改変した」「多様体」または「変異体」とは、天然の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列および機能的性質において改変（すなわち、変化した特性）を示す遺伝子または遺伝子産物を意味する。
【００６７】
用語「ベクター」とは、複製可能な細胞内への導入のために核酸配列を挿入可能な担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は「外来性」であることができ、これは、ベクターが導入される細胞に対して外来であるか、または、配列が細胞内の配列に対して相同であるが、配列が通常発見されない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えばＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準的な組み換え技術（例えばＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４（両方が参照により本明細書に組み込まれている）を参照）によりベクターを構築するのに十分な装備を有している。
【００６８】
用語「発現ベクター」とは、転写可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物を意味する。場合によっては、ＲＮＡ分子は次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生において、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、種々の「調節配列」を含有することができ、「調節配列」とは、特定の宿主細胞内で作用可能に結合したコード配列での転写、および場合により翻訳に必要な核酸配列を意味する。転写および翻訳を司る調節配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは他の機能を果たす核酸配列を含有してよく、これらは以下に記載する。
【００６９】
本明細書で使用する場合、用語「治療上有効量」とは、治療効果を達成するために方法で用いられる、治療用組成物（例えば、治療用ポリヌクレオチドおよび／または治療用ポリペプチド）の量を意味する。「治療上の利益」または「治療上有効な」の用語は、本明細書全体で使用される場合、この状態の医学的治療に関し、対象の良好な状態を促進するか、または向上させるあらゆるものを指す。これには、疾患の徴候または症状の頻度または重篤度の減少が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の治療には、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍の除去、または、腫瘍形成の防止を伴う場合がある。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「ＫＭ」とは、酵素に対するミカエリス・メンテン定数を意味し、所与の酵素が、酵素触媒反応における最大速度の半分となる、特異的基質の濃度として定義される。本明細書で使用する場合、用語「ｋｃａｔ」とは、ターンオーバー数、即ち、各酵素部位が単位時間あたりで産生物に転換し、酵素が最大効率で作用する、基質分子の数を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ｋｃａｔ／ＫＭ」は特異性定数を意味し、これは、酵素がどれほど効率的に、基質を生成物に転換するかの尺度である。
【００７１】
用語「ＭＴａｓｅ」は、ＭＴＡがメチルチオリボース−１’−ホスフェート（ＭＴＲ−１’−Ｐ）またはメチルチオリボース（ＭＴＲ）およびアデニンに加リン酸分解または加水分解すること、加えて、アデノシンがリボース−１’−ホスフェートまたはリボースおよびアデニンに加リン酸分解または加水分解することを触媒するあらゆる酵素を意味する。例えば、ＭＴＡＰは、霊長類型のＭＴＡＰ、または特に、ヒト型のＭＴＡＰ、および原核生物型のＭＴＡＮを含む。
【００７２】
「治療」および「治療すること」とは、疾患または健康に関係する状態の治療的効果を得る目的のために、対象に治療薬を投与することもしくは適用すること、または対象において手順もしくは様式を実施することを意味する。例えば、治療は、薬学的有効量のＭＴａｓｅを投与することを含んでもよい。
【００７３】
「対象」および「患者」とは、ヒトまたは非ヒト（例えば霊長類、哺乳類、および脊椎動物）のいずれかを意味する。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００７４】
ＩＩ．  ＭＴａｓｅ操作
ヒトは、機能がポリアミン合成の副生物であるメチルチオアデノシン（ＭＴＡ）の、メチルチオリボース−１’−ホスフェート（ＭＴＲ−１’−Ｐ）およびアデニンへの転換を触媒することである、メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）と呼ばれる酵素を有する。原核生物は、メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼ（ＭＴＡＮ）と呼ばれる酵素を有し、これは、ポリアミン合成の副産物であるメチルチオアデノシン（ＭＴＡ）の、メチルチオリボース（ＭＴＲ）およびアデニンへの転換を触媒する機能を持つ。これらの酵素は、アデノシン（ＡＤＯ）を分解することもまた可能である。
【００７５】
いくつかの実施形態は、改変タンパク質およびポリペプチドに関する。特定の実施形態は、未改変版に相当する少なくとも１つの機能活性、好ましくはＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性を示す改変タンパク質またはポリペプチドに関する。更なる態様において、タンパク質またはポリペプチドを更に改変して、血清安定性を増加させることができる。したがって、本出願が、「改変タンパク質」または「改変ポリペプチド」の機能または活性に言及する場合、これには、例えば、未改変タンパク質またはポリペプチドを超える更なる利点、例えばＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性を有する、タンパク質またはポリペプチドが含まれることを、当業者は理解するであろう。特定の実施形態において、未改変タンパク質またはポリペプチドは天然ＭＴａｓｅ、好ましくはヒトＭＴａｓｅである。非ヒトタンパク質治療薬を用いると、望ましくない免疫原性効果が臨床上見られることから、発明者らは、治療上関係するＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性をヒト酵素に組み込む（即ち、ＭＴＡ／ＡＤＯに対して高いｋｃａｔおよび低いＫＭ値を有し、好ましい特異性もまた示す酵素を改変する）ことを追求した。「改変タンパク質」に関する実施形態は「改変ポリペプチド」に対しても実施され得、その逆も同様であることが、具体的に企図される。
【００７６】
活性の測定は、当業者に知られている、特に、タンパク質の活性に関するアッセイを使用して達成することができ、比較目的のために、例えば、改変、または未改変タンパク質またはポリペプチドのいずれかの、天然および／または組み換え版の使用を含むことができる。例えば、ＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性は、アデニンの検出などの、ＭＴＡ／ＡＤＯの分解から生じる生成物を検出するあらゆるアッセイにより測定することができる。
【００７７】
特定の実施形態において、改変ＭＴａｓｅなどの改変ポリペプチドは、ＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性の増加に基づいて識別することができる。例えば、未改変ポリペプチドの基質の基質認識部位が識別されてよい。この識別は、構造分析または相同性分析に基づいてよい。このような基質認識部位の改変に関与する変異体の集団を生成することができる。更なる実施形態において、ＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性が増加した変異体が、変異体集団から選択されてよい。所望の変異体の選択としては、ＭＴＡ／ＡＤＯ分解による副産物または生成物の検出法を挙げることができる。
【００７８】
改変タンパク質はアミノ酸の欠失および／または置換を有し得る。したがって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質、および、欠失と置換を有するタンパク質は、改変タンパク質である。いくつかの実施形態において、これらの改変タンパク質は、例えば融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質と同様に、挿入または追加のアミノ酸を更に含んでもよい。「改変欠失タンパク質」は、天然タンパク質の１つ以上の残基を欠いているが、天然タンパク質の特異性および／または活性を有し得る。「改変欠失タンパク質」はまた、低下した免疫原性または抗原性を有し得る。改変欠失タンパク質の例は、アミノ酸残基が、少なくとも１つの抗原領域、即ち、特定の生命体、例えば、改変タンパク質を投与され得る生命体の種類において抗原性であると測定されたタンパク質の領域から欠失されたタンパク質である。
【００７９】
置換または置き換え多様体は通常、タンパク質内の１つ以上の部位において、あるアミノ酸の別のアミノ酸との交換を含有し、ポリペプチドの１つ以上の性質、特にエフェクター機能および／または生物学的利用能を制御するように設計されてよい。置換は、保存的、すなわち、あるアミノ酸が類似の形状および電荷のアミノ酸で置き換えられているものであっても、またはなくてもよい。保存的置換は当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの；アルギニンのリジンへの；アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの；アスパルテートのグルタメートへの；システインのセリンへの；グルタミンのアスパラギンへの；グルタメートのアスパルテートへの；グリシンのプロリンへの；ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの；イソロイシンのロイシンまたはバリンへの；ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの；リジンのアルギニンへの；メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの；フェニルアラニンのチロシン、ロイシン、またはメチオニンへの；セリンのスレオニンへの；スレオニンのセリンへの；トリプトファンのチロシンへの；チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの；および、バリンのイソロイシンまたはロイシンへの変更が挙げられる。
【００８０】
欠失または置換に加えて、改変タンパク質は残基の挿入を有してよく、これは通常、ポリペプチドへの少なくとも１つの残基の添加を伴う。挿入は、標的化ペプチドもしくはポリペプチド、または単純に１つの残基の挿入を含んでよい。融合タンパク質と呼ばれる末端付加を以下で論じる。
【００８１】
用語「生物学的に機能が等価な」は当該技術分野において十分に理解されおり、本明細書で更に詳細を規定する。したがって、タンパク質の生物活性が維持される場合、対照ポリペプチドのアミノ酸に同一または機能的に等価なアミノ酸の約７０％〜約８０％、または約８１％〜約９０％、または更に約９１％〜約９９％を有する配列が含まれる。改変タンパク質は、特定の態様において、相当する天然のタンパク質に生物学的に機能が等価であり得る。
【００８２】
アミノ酸および核酸配列は、追加の残基、例えば追加のＮもしくはＣ末端アミノ酸、または５’もしくは３’配列を含み得、かつ、配列が、タンパク質発現が関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む、上述の基準を満たす限り、依然として、本明細書にて開示した配列の１つで説明されるものと事実上同じであることもまた理解されよう。末端配列の付加は特に、例えば、コード領域の５’もしくは３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得るか、または、遺伝子内で発生することが知られている種々の内部配列、すなわちイントロンを含み得る核酸配列に適用される。
【００８３】
ＩＩＩ．  治療のための酵素ＡＤＯ／ＭＴＡ分解
特定の態様において、ＭＴＡ／ＡＤＯを分解する酵素と共に、ポリペプチドを癌またはＳＣＩＤなどの疾患の治療に使用することができる。そのために、ＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性を有するＭＴａｓｅを使用する治療方法を、本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、治療効果を増加させるための、ＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性を有する酵素を本明細書において提供する。抗癌応答は、腫瘍増殖の阻害；腫瘍細胞死の誘導；腫瘍の退縮；腫瘍再発、腫瘍増殖、腫瘍拡大の防止もしくは遅延；または腫瘍の除去であることができる。
【００８４】
本発明の特定の態様は、腫瘍またはＳＣＩＤなどの疾患を治療するための、ＭＴＡ／ＡＤＯ分解活性を有する改変ＭＴａｓｅを提供する。一実施例において、改変ポリペプチドはヒトポリペプチド配列を有してよく、それ故、ヒト患者でのアレルギー反応を防ぎ得、反復投与を可能にし得、治療効果を増加させることができる。
【００８５】
本発明の方法が有用である腫瘍としては、任意の悪性細胞型、例えば、充実性腫瘍または血液腫瘍にみられるものが挙げられる。例示的な充実性腫瘍としては、限定されないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、胆嚢、皮膚、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、咽頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺および乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができる。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、Ｔ細胞またはＢ細胞の悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書において提供する方法を使用して治療され得る癌の更なる例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌など）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌および消化管間質腫瘍など）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、胆嚢癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、腎細胞癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々な種類の頭頸癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、およびＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ性ＮＨＬ；高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、毛様細胞性白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ならびに慢性骨髄芽球性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
癌は特に、以下の組織学的種類を有していてもよいが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌腫；小細胞癌腫；乳糖癌腫；扁平上皮細胞癌腫；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌腫；石灰化上皮癌腫；移行細胞癌腫；乳糖移行細胞癌腫；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌腫；肝細胞癌腫；肝細胞がん胆管細胞がんの混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌腫；腺腫性ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌腫；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支−肺胞腺癌；乳糖腺癌；色素嫌性癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞状腺癌；乳糖および濾胞状腺癌；非被包性硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳糖嚢胞腺癌；乳糖漿液性嚢胞腺癌；粘液嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌腫；浸潤性導管癌腫；髄様癌腫；小癌腫；炎症性癌腫；ページェット病、乳房；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；男性胚腫、悪性；セルトリ細胞癌腫；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨ユーイング肉腫の巨細胞腫瘍；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞状；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ヘアリー細胞白血病；およびヘアリー細胞白血病。
【００８７】
ＭＴａｓｅは本明細書で、癌を有する哺乳類の腫瘍細胞、腫瘍組織、もしくは血液循環からＭＴＡ／ＡＤＯを枯渇させるための、または、枯渇が望ましいと考えられる場合において、ＭＴＡ／ＡＤＯを枯渇させるための様々な様式における抗癌剤として使用することができる。更に、ＭＴａｓｅは、ＳＣＩＤを有する哺乳類の血液循環からＡＤＯを枯渇させるための、アデノシンデアミナーゼ変異と関連するＳＣＩＤの治療として使用することができる。
【００８８】
枯渇は、哺乳類の血液循環内のインビボ、組織培養液または他の生物学的培地でのＭＴＡ／ＡＤＯの枯渇が望まれる場合のインビトロ、および、生物学的流体、細胞、または組織が体外で操作され、続いて患者哺乳類の体内に戻されるエクスビボ操作にて実施することができる。血液循環、培養培地、生物学的流体、または細胞からＭＴＡ／ＡＤＯを枯渇させることにより、治療される物質に到達可能なＭＴＡ／ＡＤＯの量を低下させる。それ故、この操作は、接触させている物質にて、周囲にあるＭＴＡ／ＡＤＯを分解するためのＭＴＡ／ＡＤＯ分解条件下において、ＭＴＡ／ＡＤＯを分解する量のＭＴａｓｅを、枯渇される物質と接触させることを含む。
【００８９】
ＭＴＡ／ＡＤＯを分解する効果は用途に応じて広範囲にわたり変更することができ、通常、物質内に存在するＭＴＡ／ＡＤＯの量、所望の枯渇速度、およびＭＴａｓｅに曝される物質の耐性に応じて変化する。物質中のＭＴＡ／ＡＤＯレベル、およびそれ故、物質からのＭＴＡ／ＡＤＯ枯渇速度は、当該技術分野において周知の様々な化学的および生化学的方法により、速やかに監視することができる。例示的なＭＴＡ／ＡＤＯ分解量は本明細書で更に説明され、治療される物質１ミリリットル（ｍＬ）あたり、０．００１〜１００ユニット（Ｕ）のＭＴａｓｅ、好ましくは約０．０１〜１０Ｕ、およびより好ましくは約０．１〜５ＵのＭＴａｓｅの範囲とすることができる。
【００９０】
ＭＴＡ／ＡＤＯ分解条件は、ＭＴａｓｅ酵素の生物活性に適合する緩衝液および温度条件であり、適度な温度、塩、および酵素と適合するｐＨ条件（例えば生理学的条件）が挙げられる。例示的な条件としては、約４〜４０℃、約０．０５〜０．２Ｍ  ＮａＣｌに等しいイオン強度、および約５〜９のｐＨが挙げられるが、生理学的条件が含まれる。
【００９１】
一実施形態では、インビボで接触させることは、ＭＴａｓｅを含む治療上有効量の生理学的に許容される組成物を患者に、静脈内注射または腹腔内注射により投与することにより、患者に存在する。循環しているＭＴＡ／ＡＤＯを枯渇させることにより、達成される。
【００９２】
治療上有効量のＭＴａｓｅとは、所望の効果を達成する、即ち、患者の血液循環内でのＭＴＡ／ＡＤＯを枯渇させるために計算された所定量である。したがって、ＭＴａｓｅを投与するための用量範囲は、所望の効果を生み出すのに十分大きい範囲である。用量は、例えば、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などの、副作用を引き起こすほど多いものであってはならない。通常、用量は、患者の年齢、状態、性別、および病気の程度により変化し、当業者により決定することができる。合併症の場合、用量は個々の医師により調節することが可能である。
【００９３】
例えば、治療上有効量のＭＴａｓｅは、生理学的に許容される組成物に投与される際、１ｍＬ当たり、約０．００１〜約１００ユニット（Ｕ）、好ましくは約０．１Ｕ超、そしてより好ましくは、１ｍＬ当たり、１Ｕを超えるＭＴａｓｅの、血管内（血漿）または局所濃度を達成するのに十分な量であってよい。典型的な用量は、体重に基づいて投与されることが可能であり、約５〜１０００Ｕ／キログラム（ｋｇ）／日、好ましくは約５〜１００Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０〜５０Ｕ／ｋｇ／日、およびより好ましくは約２０〜４０Ｕ／ｋｇ／日の範囲である。
【００９４】
ＭＴａｓｅは、注射により、または経時的に徐々に注入することにより非経口投与することができる。ＭＴａｓｅは、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、膣内投与、経皮的投与、経皮投与することが可能であり、蠕動手段により送達することが可能であり、尿路に直接注入することができ、または、ＭＴＡ／ＡＤＯ用の潜在的な生体内感知装置を含有し得るカテーテルに接続したポンプにより投与することができる。
【００９５】
ＭＴａｓｅを含有する治療用組成物は例えば、単位用量を注射することにより従来的に静脈内投与される。用語「単位用量」とは、治療用組成物に関して使用する場合、対象にとって一体型用量として好適な物理的に個別の単位であって、各単位が、必要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共同で所望の治療効果をもたらすように計算された、所定の量の活性物質を含有する単位を意味する。
【００９６】
組成物は、投与製剤に適合した方法で、治療に有効な量投与される。投与される量は、治療される対象、酵素を利用する対象の系の能力、および所望の治療効果の程度に左右される。投与されるのに必要な酵素の正確な量は、施術者の判断に応じて変わり、各個体で固有である。しかし、全身適用のための好適な用量範囲が本明細書にて開示され、この範囲は投与経路に応じて変化する。初期投与および追加投与に好適なレジメンもまた企図され、これらは初期投与、続いて後続の注射または他の投与により１時間以上の間隔で繰り返される反復投薬により典型的に表される。例示的な複数の投与が本明細書で記載され、これらは特に、ＭＴａｓｅの血清での濃度および組織での濃度を持続的に高く維持し、ＭＴＡ／ＡＤＯの血清および組織での濃度を逆に低く維持するのが好ましい。あるいは、インビボ治療のために指定した範囲に血液内での濃度を十分に維持するための連続的静脈内注入が企図される。
【００９７】
ＩＶ．  コンジュゲート
本発明の組成物および方法は、例えば、異種ペプチドセグメントまたはポリマー（例えばポリエチレングリコール）とコンジュゲートを形成することによる改変ＭＴａｓｅを伴う。更なる態様において、ＭＴａｓｅをＰＥＧに結合させ、酵素の流体力学的半径を増加させることにより血清耐性を増加させることができる。特定の態様において、開示したポリペプチドを、任意の標的化剤、例えば、特異的に、そして安定して、標的細胞の外部受容体または結合部位に結合する能力を有するリガンド（例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０４６６６号）とコンジュゲートしてよい。
【００９８】
Ａ．  融合タンパク質
本発明の特定の実施形態は、融合タンパク質に関する。これらの分子は、ＮまたはＣ末端にて異種ドメインに結合した、改変ＭＴａｓｅを有することができる。例えば、融合には他の種からのリーダー配列もまた用いて、異種宿主におけるタンパク質の組み換え発現を可能にすることができる。別の有用な融合としては、タンパク質親和性タグ（例えば血清アルブミン親和性タグもしくは６個のヒスチジン残基）、または、好ましくは切断可能であり、融合タンパク質の精製を促進する免疫活性ドメイン（例えば抗体エピトープ）の付加が挙げられる。非限定的な親和性タグとしては、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００９９】
特定の実施形態では、ＭＴａｓｅは、インビボでの半減期を増大させるペプチド、例えばＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドに結合してよい。
【０１００】
融合タンパク質を生成する方法は、当業者には周知である。このようなタンパク質は、例えば、完全な融合タンパク質の新規合成により、または、異種ドメインをコードするＤＮＡ配列の結合に続く、インタクトな融合タンパク質の発現により、作製することができる。
【０１０１】
親タンパク質の機能活性を回復させる融合タンパク質の作製は、一列に接続したポリペプチドの間でスプライシングされたペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントに遺伝子を接続することにより促進され得る。リンカーは、得られる融合タンパク質の適切な折り畳みを可能にするのに十分な長さである。
【０１０２】
ＭＴａｓｅの融合タンパク質改変は、細胞標的化部分、例えば、抗体、増殖因子、ホルモン、ペプチド、アプタマー、またはサイトカインにより形成することができる。例えば、本実施形態の細胞標的化部分は、黒色腫細胞などの皮膚癌細胞に結合することができる。ｇｐ２４０抗原は、種々の黒色腫で発現するが、正常な組織では発現しないことが示されている。したがって、実施形態の特定の態様において、ＭＴａｓｅおよびｇｐ２４０に結合する細胞標的化部分を含む細胞標的構築物が提供される。場合によっては、ｇｐ２４０結合分子は、ＺＭＥ−０１８（２２５．２８Ｓ）抗体または９．２．２７抗体などの抗体であることができる。更により好ましい実施形態では、ｇｐ２４０結合分子は、ｓｃＦｖＭＥＬ抗体などの一本鎖抗体であることができる。したがって、本発明の非常に特定の実施形態において、ｓｃＦｖＭＥＬにコンジュゲートしたＭＴａｓｅを含む細胞標的構築物が提供される。
【０１０３】
本発明のまた更なる本発明の実施形態において、細胞標的構築物を、乳癌細胞に向けることができる。例えば、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体などのＨｅｒ−２／ｎｅｕに結合する、細胞標的化部分が、ＭＴａｓｅにコンジュゲートすることができる。このような細胞標的構築物の一例は、一本鎖抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体ｓｃＦｖ２３およびＭＴａｓｅを含む融合タンパク質である。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに結合するｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）などの、その他のｓｃＦｖ抗体もまた、現在の実施形態の組成物および方法で使用することができる（ｖｏｎ  Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１０４】
特定の更なる実施形態では、癌細胞標的化部分が、多種類の癌細胞に結合することが想定される。例えば、８Ｈ９モノクローナル抗体およびこれから誘導される一本鎖抗体は、乳癌、肉腫および神経芽細胞腫で発現する糖タンパク質に結合する（Ｏｎｄａ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。他の例は、様々な種類の癌で発現する抗原のＭＵＣ−１に結合する、米国特許出願公開第２００４／００５６４７号、およびＷｉｎｔｈｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００３に記載されている、細胞標的化剤である。したがって、特定の実施形態では、本実施形態の細胞標的化構築物は、複数種類の癌または腫瘍に対して標的化されてもよいことが理解されるだろう。
【０１０５】
更に、特定の細胞表面分子は、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン受容体およびゴナドトロピン放出ホルモン受容体などのホルモン受容体を含め、腫瘍細胞中で高度に発現する（Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。したがって、対応するホルモンは、癌治療において細胞特異的な標的化部分として使用されてもよい。
【０１０６】
特定の追加の実施形態において、免疫チェックポイント遮断阻害剤を使用して、ＭＴａｓｅとの融合物を形成することが把握されている。例えば、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、またはＰＤＬ−２に対して拮抗性である抗体またはその断片（例えばｓｃＦｖ）（例えば、米国特許第８，７３５，５５３号、同第８，３５４，５０９号、および同第８，００８，４４９号；国際特許出願公開第２００９／１０１６１１号および同第２００９／１１４３３５号に記載されている抗体）を、ＭＴａｓｅに融合することができる。別の例において、ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第８，１１９，１２９号、および国際特許出願公開第０１／１４４２４号、同第９８／４２７５２号、および同第００／３７５０４号）を認識する抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｃ）を、ＭＴａｓｅに融合することができる。更なるチェックポイント遮断分子を以下で論じる。
【０１０７】
Ｂ．  リンカー
特定の実施形態において、ＭＴａｓｅは、二官能性架橋試薬を用いて化学的にコンジュゲートされるか、またはペプチドリンカーによりタンパク質レベルで融合されることができる。
【０１０８】
二官能性架橋試薬は、親和性マトリクスの調製、多様な構築物の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の識別、ならびに構造研究等の種々の目的で幅広く用いられている。好適なペプチドリンカー（例えばＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー）はまた、ＭＴａｓｅを結合させるために使用してもよい。
【０１０９】
２つの同一の官能基を有するホモ二官能性試薬は、同一および異なる巨大分子または巨大分子のサブユニット間での架橋の誘発、ならびに、ポリペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させることにおいて非常に効率的であることが証明された。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる官能基を含有する。２つの異なる官能基の異なる反応性を利用することにより、架橋を選択的かつ逐次的の両方で調節可能である。二官能性架橋試薬は、その官能基（例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジン、インドール、カルボキシル特異基）の特異性に従い分けることができる。これらのうち、遊離アミノ基に向けられる試薬が、その商業的入手可能性、合成の容易性、および適用される穏やかな反応条件のために特に人気となっている。
【０１１０】
ヘテロ二官能性架橋試薬の大部分は、第一級アミン反応性基およびチオール反応性基を含有する。別の例において、ヘテロ二官能性架橋試薬、および架橋試薬の使用方法が記載される（米国特許第５，８８９，１５５号、具体的にその全体が本明細書に参照により組み込まれる）。架橋試薬は求核性ヒドラジド残基を救電子性マレイミド残基と組み合わせることで、一例ではアルデヒドを遊離チオールに結合させることが可能となる。架橋試薬を修飾して、種々の架橋官能基にすることができる。
【０１１１】
更に、当業者に既知の任意の他の結合／カップリング剤、および／またはメカニズム、例えば、抗体−抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、リン酸エステル結合、ホスホラミド結合、無水物結合、ジスルフィド結合、イオンおよび疎水性相互作用、二重特異性抗体および抗体断片、またはこれらの組み合わせを使用して、ＭＴａｓｅを結合させてよい。
【０１１２】
血液中にて合理的な安定性を有する架橋剤を使用することが好ましい。標的化剤、および治療／予防剤をコンジュゲートするのに首尾よく使用可能な、様々な種類のジスルフィド結合を含有するリンカーが知られている。立体障害のあるジスルフィド結合を含有するリンカーは、インビボにてより大きな安定性を付与することが証明され得る。これらのリンカーはしたがって、結合剤の１グループである。
【０１１３】
立体障害を有する架橋剤に加えて、立体障害のないリンカーもまた、本明細書においては使用可能である。保護されたジスルフィドを含有するかまたは生成すると考えられない他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、および２−イミノチオラン（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，１９８７）が挙げられる。このような架橋剤の使用は、当該技術分野において十分に理解されている。他の実施形態は、柔軟なリンカーの使用に関する。
【０１１４】
化学的にコンジュゲートされると、ペプチドは一般に精製され、コンジュゲートを非コンジュゲート剤および他の汚染物質と分離する。化学的に有用とするためにコンジュゲートに十分な精度を付与して使用するために、多数の精製技術が利用可能である。
【０１１５】
ゲル濾過、ゲル浸透、または高速液体クロマトグラフィー等のサイズ分離に基づく精製方法が、通常最も有用である。ブルーセファロース分離等の他のクロマトグラフ技術もまた、使用してよい。Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＬＳ）などの弱い洗剤の使用などの、封入体から融合タンパク質を精製する従来の方法が有用であり得る。
【０１１６】
Ｃ．  ＰＥＧ化
特定の本発明の態様において、ＭＴａｓｅのＰＥＧ化に関係する方法および組成物が開示される。例えば、本明細書で開示される方法に従いＭＴａｓｅをＰＥＧ化することができる。
【０１１７】
ＰＥＧ化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖の、別の分子（通常、薬剤または治療用タンパク質）への共有結合プロセスである。ＰＥＧ化は、標的巨大分子によるＰＥＧの反応性誘導体のインキュベーションによりルーチン的に達成される。ＰＥＧを薬剤または治療用タンパク質に共有結合することにより、宿主免疫系（免疫原性および抗原性が低下）から作用物質を「マスク」することができるか、または作用物質流体力学的サイズ（溶液中でのサイズ）を増加させて、腎クリアランスを低下させることにより循環時間を延ばすことができる。ＰＥＧ化はまた、疎水性薬剤およびタンパク質に水溶性を付与することもできる。
【０１１８】
ＰＥＧ化の第１工程は、ＰＥＧポリマーの一端または両端を好適に官能基化することである。各末端が同じ反応性部位で活性化されたＰＥＧは「ホモ二官能性」として知られる一方、存在する官能基が異なる場合、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼ばれる。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な、または活性化された誘導体は、ＰＥＧに所望の分子を付加して調製される。
【０１１９】
ＰＥＧ誘導体での好適な官能基の選択は、ＰＥＧに結合する分子において利用可能な反応性基の種類に基づく。タンパク質に関して、典型的な反応性アミノ酸としては、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、およびチロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸もまた使用可能である。
【０１２０】
第１世代のＰＥＧ誘導体の形成に使用する技術は通常、ＰＥＧポリマーをヒドロキシル基、通常は無水物、酸塩化物、クロロホルメート、および炭酸塩と反応する群である。第２世代のＰＥＧ化化学反応では、より効率的な官能基、例えばアルデヒド、エステル、アミドなどが、コンジュゲーションに利用可能となる。
【０１２１】
ＰＥＧ化の用途はより一層発達し洗練されているため、コンジュゲーション用のヘテロ二官能性ＰＥＧの必要性が増加している。親水性で柔軟、かつ生体適合性のスペーサーが必要とされる場合において、これらのヘテロ二官能性ＰＥＧは２つの構成要素を結合するのに非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧに対する好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、およびＮＨＳエステルである。
【０１２２】
最も一般的な修飾剤、またはリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子をベースにする。これらの活性は、アルコール末端へのタンパク質修飾基の付加に依存する。場合によっては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）を前駆体分子として使用する。ジオールはその後、ヘテロまたはホモ二量体ＰＥＧ結合分子を作製するために、両端が修飾される。
【０１２３】
タンパク質は通常、求核性部位、例えば非プロトン化チオール（システイニル残基）またはアミノ基にてＰＥＧ化される。システイニル特異的修飾剤の例としては、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨードアセテート、ＰＥＧチオール、およびＰＥＧビニルスルホンが挙げられる。これら４つ全ては、穏やかな条件下にて非常にシステイニル特異的であり、中性からわずかにアルカリ性のｐＨであるが、それぞれ、いくつかの欠点を有する。マレイミドを用いて形成されるチオエーテルは、アルカリ性条件下でいくぶん不安定となり得、これにより、このリンカーを用いる製剤化オプションには若干の制限が存在し得る。ヨードＰＥＧを用いて形成したカルバモチオエート結合はより安定しているが、遊離ヨウ素がいくつかの条件下でチロシン残基を修飾する可能性がある。ＰＥＧチオールはタンパク質チオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合もまた、アルカリ性条件下にて不安定となり得る。ＰＥＧ−ビニルスルホン反応性は、マレイミドおよびヨードＰＥＧと比較して遅いが、形成されるチオエーテル結合は極めて強力である。この、より遅い反応速度によってもまた、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応の制御を一層容易にすることができる。
【０１２４】
天然システイニル残基における部位特異的ＰＥＧ化は、これらの残基が通常、ジスルフィド結合の形態をとっているか、または生物活性のために必要とされるため、滅多に行われない。他方では、部位特異的突然変異誘発を使用して、チオール特異的リンカーのためにシステイニルＰＥＧ化部位を組み込むことができる。システイン変異は、ＰＥＧ化試薬が到達可能であり、かつＰＥＧ化後も依然として生物学的に活性であるように設計されなければならない。
【０１２５】
アミン特異的改変試薬としては、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート、およびいくつかの他の試薬が挙げられる。これらは全て、穏やかな条件下で反応し、アミノ基に対して非常に特異的である。ＰＥＧ  ＮＨＳエステルは恐らく、より反応性の高い試薬の１つであるが、その高反応性により、大規模ではＰＥＧ化反応の制御が困難となり得る。ＰＥＧアルデヒドはアミノ基と共にイミンを形成し、これが次に、シアノ水素化ホウ素ナトリウムにより二級アミンに還元される。ホウ化水素ナトリウムとは異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムはジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学物質は非常に毒性があり、特に揮発性となる低ｐＨにおいては、注意深く取り扱われなければならない。
【０１２６】
大部分のタンパク質に存在する複数のリジン残基により、部位特異的ＰＥＧ化は困難であり得る。幸運なことに、これらの試薬は、非プロトン化アミノ基と反応するため、低いｐＨにて反応を実施することにより、ＰＥＧ化を低ｐＫアミノ基に向けることが可能である。一般的に、αアミノ基のｐＫは、リジン残基のεアミノ基よりも１〜２ｐＨ単位低い。ｐＨ７以下で分子をＰＥＧ化することにより、Ｎ末端に対する高選択性を頻繁に得ることができる。しかし、このことは、タンパク質のＮ末端部分が生物活性のために必要とされない場合にのみ実行可能である。依然として、ＰＥＧ化による薬物動態上の利点は頻繁に、インビトロ生物活性の著しい損失よりも優り、ＰＥＧ化化学反応に関係なく、はるかに大きいインビボ生物活性を有する生成物をもたらす。
【０１２７】
ＰＥＧ化手順を開発する際には、考えるべきいくつかのパラメータが存在する。幸運なことに、鍵となるパラメータは通常、４個または５個以下である。ＰＥＧ化条件の最適化のための「実験の設計」アプローチは、非常に有用であることができる。チオール特異的ＰＥＧ化反応に関しては、考慮するパラメータとしては、タンパク質濃度、タンパク質に対するＰＥＧの比率（モル基準）、温度、ｐＨ、反応時間、および場合によっては、酸素の除外が挙げられる。（酸素は、タンパク質による分子間ジスルフィド形成に寄与することができ、これにより、ＰＥＧ化生成物の収率が低下する。）ｐＨが、特にＮ末端アミノ基を標的化する場合には更に一層重要となり得ることを除いて、アミン特異的改変についても同じ因子（酸素は除外）が考慮されなければならない。
【０１２８】
アミン特異的およびチオール特異的改変の両方に関して、反応条件はタンパク質の安定性に影響を及ぼし得る。これは温度、タンパク質濃度、およびｐＨを制限し得る。加えて、ＰＥＧリンカーの反応性は、ＰＥＧ化反応を開始する前に知られていなければならない。例えば、ＰＥＧ化剤が７０％のみ活性である場合、使用するＰＥＧの量は、活性なＰＥＧ分子のみがタンパク質−ＰＥＧ反応での化学量論で計数されるようにしなければならない。
【０１２９】
Ｖ．  タンパク質およびペプチド
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１種のタンパク質またはペプチド、例えばＭＴａｓｅを含む新規組成物に関する。これらのペプチドは、融合タンパク質に含まれるか、または上述の作用物質にコンジュゲートされてよい。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、タンパク質またはペプチドは一般に、遺伝子から翻訳された、約２００個超のアミノ酸〜完全長配列までのタンパク質；約１００個のアミノ酸より大きいポリペプチド；および／または約３〜約１００個のアミノ酸のペプチドを意味するが、これらに限定されない。便宜上、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸残基」とは、任意の自然に生じるアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または、当該技術分野において公知の任意のアミノ酸模倣物を意味する。特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドの残基は、アミノ酸残基の配列を中断する、あらゆる非アミノ酸が存在せず、連続している。別の実施形態において、配列は、１つ以上の非アミノ酸部分を含んでよい。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１つ以上の非アミノ酸部位により中断されてよい。
【０１３２】
したがって、用語「タンパク質またはペプチド」は、自然に生じるタンパク質に見出される、２０種類の共通のアミノ酸のうち少なくとも１つ、または、少なくとも１種の改変もしくは普通でないアミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
【０１３３】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学技術による、タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、タンパク質もしくはペプチドの天然源からの単離、または、タンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技術により作製することができる。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチド、ならびにペプチド配列は以前に開示されており、当業者に知られている、コンピュータ化されたデータベースにて発見することができる。このようなあるデータベースは、国立生物工学情報センターのＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で利用可能）である。既知の遺伝子のコード領域を、本明細書にて開示した技術、または当業者に既知の技術を使用して増幅および／または発現することができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの様々な商業的調製が、当業者に既知である。
【０１３４】
ＶＩ．  核酸およびベクター
ある種の本発明の態様において、ＭＴａｓｅをコードする核酸配列またはＭＴａｓｅを含有する融合タンパク質が開示され得る。使用する発現系に応じて、核酸配列を、従来の方法に基づいて選択することができる。例えば、ＭＴａｓｅが霊長類ＭＴＡＰまたは原核生物のＭＴＡＮに由来し、Ｅ．ｃｏｌｉではほとんど利用されない複数のコドンを含有する場合、このことは、発現を妨げる場合がある。したがって、対応する遺伝子またはその多様体は、Ｅ．ｃｏｌｉの発現に最適化されたコドンであってよい。様々なベクターもまた使用して、対象のタンパク質、例えばＭＴａｓｅを発現することができる。例示的なベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソーム系ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
ＶＩＩ．  宿主細胞
宿主細胞は、ＭＴａｓｅとそのコンジュゲートの発現および分泌を可能にするよう形質転換され得る、任意の宿主細胞であってよい。宿主細胞は細菌、哺乳類細胞、酵母菌、または糸状菌であってよい。様々な細菌としては、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＢａｃｉｌｌｕｓが挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｉｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＰｉｃｈｉａ属に属する酵母菌は、適切な宿主細胞としての使用が見出される。以下の属を含む様々な種の糸状菌を、発現宿主として使用してよい：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ａｃｈｌｙａ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｅｎｄｏｔｈｉａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、およびＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ。
【０１３６】
利用可能な宿主生物の例としては、細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＢＲＢ１の誘導体（Ｓｉｂａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＳＡＩ１２３（Ｌｏｒｄａｎｅｓｃｕ，１９７５）、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）；酵母菌、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ  ２２（Ｍｅｌｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；および糸状菌、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ（Ｗａｒｄ，１９８９）、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）が挙げられる。
【０１３７】
哺乳類宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、およびマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。前述のものは例示的なものであり、当該技術分野において公知の多くの可能な宿主生物を制限するものではない。原則として、分泌可能な全ての宿主は、原核生物であれ真核生物であれ使用可能である。
【０１３８】
ＭＴａｓｅおよび／またはこれらの融合タンパク質を発現する哺乳類の宿主細胞を、通常は親細胞株を培養するために用いる条件下にて培養する。一般的に、細胞は、通常は５％〜１０％血清（例えば、ウシ胎児血清）を補充した、標準的なＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、またはＤＭＥＭなどの、生理学的塩および栄養素を含有する標準的な培地で培養される。培養条件もまた標準的である。例えば、培養物は、所望のレベルのタンパク質がもたらされるまで、静止培養液またはローラー培養液にて３７℃でインキュベーションされる。
【０１３９】
ＶＩＩＩ．  タンパク質の精製
タンパク質の精製技術は当業者には周知である。これらの技術は、あるレベルにおいて、細胞、組織または臓器の、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への、均質化および粗分画を伴う。別途記載のない限り、対象のポリペプチドを、クロマトグラフおよび電気泳動技術を使用して更に精製し、部分的または完全な精製（または、精製による均質化）をもたらすことができる。純粋なペプチドの調製に特に適している分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。特に効率的なペプチドの精製方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、または更に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
【０１４０】
精製タンパク質またはペプチドは、そのタンパク質またはペプチドが、自然に入手可能な状態に対して任意の程度で精製されている、他の構成成分から単離可能な組成物を意味することを意図している。それ故、単離または精製タンパク質またはペプチドもまた、自然に発生し得る環境には存在しないタンパク質またはペプチドを意味する。一般的に、「精製した」とは、分画を行い、様々な他の成分を取り除き、発現した生物活性を実質的に保持している、タンパク質またはペプチド組成物を意味する。用語「実質的に精製した」が用いられる場合、この標記は、タンパク質またはペプチドが組成物の主たる構成成分を形成する、例えば、組成物中で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上のタンパク質を構成する組成物を意味する。
【０１４１】
タンパク質精製での使用に好適な様々な技術は、当業者には周知である。これらとしては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などによる、または熱変性による精製、その後の遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、および親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびに、これらおよび他の技術の組み合わせが挙げられる。当該技術分野において一般に公知であるように、様々な精製工程を行う順序は変更可能であり、または、その特定の工程を省略することが可能であり、かつ、依然として、実質的に精製したタンパク質またはペプチドの精製を行うのに好適な方法がもたらされると考えられている。
【０１４２】
タンパク質またはペプチドの精製度を定量化するための様々な方法は、本開示の観点から、当業者に既知である。これらとしては、例えば、活性画分の特異的活性の測定、または、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による、画分内でのポリペプチドの量の評価が挙げられる。画分の精度の評価をするための好ましい方法は、画分の特異的活性を計算し、最初の抽出物の特異的活性と比較し、およびそれ故、「倍の精製数」として評価される、精製度を計算することである。活性量を示すために使用される実際の単位はもちろん、精製後に選択される特定のアッセイ技術、および、発現したタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに左右される。
【０１４３】
タンパク質またはペプチドが常に、最も精製された状態で提供されるという一般的な必要条件は、存在しない。実際、実質的にさほど精製されていない生成物が、ある種の実施形態においては活用され得ることが企図される。部分精製は、組み合わせにより、より少ない精製工程を使用することにより、または、同じ通常の精製スキームの異なる形態を利用することにより、達成することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施するカチオン交換カラムクロマトグラフィーは通常、低圧クロマトグラフィー系を利用する同じ技術よりも、より大きな「倍」精製をもたらすと理解されている。相対的に低い精製度を示す方法は、タンパク質生成物の全回収、または、発現タンパク質の活性の維持において利点を有し得る。
【０１４４】
特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドは、単離または精製された、例えばＭＴａｓｅ、ＭＴａｓｅ含有融合タンパク質、またはＰＥＧ化後のＭＴａｓｅであることができる。例えば、Ｈｉｓタグまたは親和性エピトープは、精製を容易にするために、このようなＭＴａｓｅを含むことができる。親和性クロマトグラフィーは、単離される基質と、その基質が特異的に結合可能な分子との特異的親和性に依存するクロマトグラフ手順である。これは受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの１つを、不溶性マトリックスに共有結合させることにより合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸着することができる。条件を、結合が生じないものに変更すること（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度などの変更）により、溶出が生じる。マトリックスは、分子を任意の大規模で吸着せず、かつ広範囲の化学安定性、物理安定性、および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドは、結合特性に影響を与えないような方法で結合されなければならない。リガンドは、比較的強固な結合もまたもたらさなければならない。サンプルまたはリガンドを破壊することなく、物質を溶出可能でなければならない。
【０１４５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子が、サイズ、またはより専門的な用語では、流体力学体積に応じて分離されるクロマトグラフ法である。この方法は通常、大型分子または巨大分子複合体、例えばタンパク質および工業用ポリマーに適用される。通常、水溶液を使用してサンプルをカラム内で輸送する場合、この技術は、有機溶媒を移動相として使用する場合に用いられるゲル透過クロマトグラフィーという名称に対して、ゲル濾過クロマトグラフィーとして知られている。
【０１４６】
ＳＥＣの基本原理は、異なるサイズの粒子が、異なる速度で固定相を通って溶出（濾過）するというものである。これにより、サイズに基づいた粒子溶液の分離がもたらされる。全ての粒子が同時、またはほぼ同時に装入された場合、同じサイズの粒子は共に溶出するはずである。各サイズ排除カラムは、分離可能な、様々な分子量を有する。排除限界は、この範囲の上限における分子量を定義し、これは、分子が大きすぎて固定相にトラップできない点である。透過限界は、分離範囲の下端における分子量を定義し、これは、十分小さいサイズの分子が、固定相の孔を完全に貫通することができる点であり、この分子量を下回る分子全ては、単一のバンドとして溶出するほど小さい。
【０１４７】
高性能液体クロマトグラフィー（または、高圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）は、化合物を分離、同定、および定量化するために、生化学および分析化学にて頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの形態である。ＨＰＬＣは、クロマトグラフ充填材料を保持するカラム（固定相）、カラムを通して移動相（移動相）を移動させるポンプ、および、分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、固定相と、分析する分子と、使用する溶媒（複数可）との相互作用に応じて変化する。
【０１４８】
ＩＸ．  医薬組成物
ＭＴａｓｅは、全身投与または局所投与し得ると企図されている。これらは、静脈内投与、髄腔内投与、および／または腹腔内投与することができる。
【０１４９】
本発明が、治療用調製物の特定の性質により限定されることを意図するものではない。例えば、このような組成物は、生理学的に許容される液体、ゲル、または固体担体、希釈剤、および賦形剤と共に製剤中に提供することができる。これらの治療用調製物は、他の治療薬に類似の方法で、獣医学用の哺乳類（例えば家庭用動物）、および、ヒトでの臨床的用途で投与することができる。一般に、治療効果のために必要な用量は、使用の種類および投与方法、ならびに、個々の対象での特定の必要条件に従い変化する。
【０１５０】
このような組成物は通常、注射液として、溶液または懸濁液として調製される。好適な希釈剤および賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびこれらの組み合わせである。加えて、所望する場合、組成物は、微量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、安定化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してよい。
【０１５１】
通常、医薬組成物は、薬学的に許容できる担体中に溶解または分散した、有効量の１つ以上のＭＴａｓｅまたは追加の作用物質を含んでよい。語句「製薬上または薬理学上許容される」とは、動物、例えばヒトに適切に投与された場合に、副反応、アレルギー反応、または他の副作用を生み出さない、分子要素および組成物を意味する。本明細書にて開示した方法で単離した少なくとも１つのＭＴａｓｅ、または追加の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０（参照により本明細書に組み込まれている）に例示されているように、本開示の観点から当業者に既知である。更に、動物（例えば、ヒト）投与に関して、調製物は、生物学規格のＦＤＡオフィスにより必要とされる、生殖不能性、発熱原性、一般的な安全性、および純度規格を満たさなければならないことが理解されよう。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」としては、当業者に既知の全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌物質、抗カビ剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、染料、かかる類似の材料およびこれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０を参照のこと：参考として本明細書に組み込まれている）。任意の従来の担体が活性成分と非相溶性である場合を除いて、医薬組成物での使用が企図される。
【０１５３】
本発明の特定の実施形態は、固体、液体、またはエアゾール形態のどれで投与されるのか、そして、注射などの投与経路に対して滅菌する必要があるのか否かに応じて、異なる種類の担体を含んでよい。組成物は、吸入（例えばエアゾール吸入）により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流により、カテーテルにより、洗浄により、脂質組成物（例えばリポソーム）内で、もしくはその他の方法によって、または当業者に既知の前述の方法の任意の組み合わせにより、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻孔内、腟内、直腸内、筋肉内、皮下、粘膜、経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）投与されることができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０を参照のこと：参考として本明細書に組み込まれている）。
【０１５４】
改変ポリペプチドを、遊離塩基、中性、または塩形態で組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容できる塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク様組成物の遊離アミノ基と形成したもの、または、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、もしくは、有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸）と形成したものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成した塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基、または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基に由来することができる。製剤化の際、溶液は、投薬形態と適合性のある方法で、そして、治療的有効量で投与される。製剤は、様々な投薬形態で容易に投与される、例えば、非経口的投与用に、例えば、注射可能な溶液、もしくは肺送達用のエアゾールに製剤化される、または、消化管投与用に、例えば薬物放出カプセルなどに製剤化される。
【０１５５】
本発明の特定の態様に更に従うと、投与に好適な組成物は、不活性希釈剤と共に、または不活性希釈剤無しで、薬学的に許容できる担体中に提供されてよい。担体は同化可能でなければならず、液体、半固体（即ち、ペースト）、または固体担体を含む。任意の従来の培地、作用物質、希釈剤、または担体がレシピエント、または中に含有される組成物の治療効果に対して有害である場合を除いて、本方法の実践に使用するために、投与可能な組成物を使用することは、適切である。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油類、水、食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、フィラーなど、またはこれらの組み合わせが挙げられる。組成物は、１種以上の構成成分の酸化を遅延させるための、様々な酸化防止剤もまた含むことができる。更に、微生物の作用の防止を、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々な抗菌および抗カビ剤などの防腐剤によりもたらすことができる。
【０１５６】
本発明の特定の態様に従うと、組成物を、任意の従来の、そして実践的な方法で、即ち、溶解、懸濁、乳化、混合、封入、吸収などにより、担体と組み合わせる。このような手順は、当業者には日常的なものである。
【０１５７】
本発明の特定の実施形態においては、組成物を、半固体または固体担体と、完全に組み合わせる、または混合する。任意の従来の方法、例えば粉砕により、混合を実施することができる。治療活性の喪失、即ち胃での変性から組成物を保護するために、安定化剤もまた、混合プロセスに添加することができる。組成物中で使用するための安定剤の例としては、緩衝剤、アミノ酸（グリシンおよびリジンなど）、炭化水素（例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マニトールなど）が挙げられる。
【０１５８】
更なる実施形態では、本発明は、ＭＴａｓｅ、１種以上の脂質、および水性溶媒を含む薬剤用脂質ビヒクル組成物の使用に関し得る。本明細書で使用する場合、用語「脂質」は、性質的に非水溶性であり、有機溶媒で抽出可能な、広範囲の物質のいずれかを含むように定義される。この広い分類の化合物は当業者に公知であり、用語「脂質」を本明細書で使用する場合、これは任意の特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、自然に生じる、または合成であってよい（即ち、人により設計されたもしくは作製されてよい）。しかし、脂質は通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当該技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、グリコスフィンゴリピド、糖脂質、サルファタイド、エーテルおよびエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。もちろん、当業者により脂質として理解される、本明細書で具体的に記載するもの以外の化合物もまた、組成物および方法により包含される。
【０１５９】
当業者は、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるのに使用可能な技術の範囲に精通しているであろう。例えば、ＭＴａｓｅまたはその融合タンパク質は、脂質を含有する溶液に分散するか、脂質と共に溶解させるか、脂質と共に乳化するか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせるか、脂質に共有結合させるか、脂質中に懸濁液として含有させるか、ミセルもしくはリポソームと共に含有させるかもしくは複合体を形成するか、または別様では、当業者に既知の任意の方法により、脂質もしくは脂質構造体と会合させてよい。分散体はリポソームの形成をもたらしても、もたらさなくてもよい。
【０１６０】
動物患者に投与される組成物の、実際の投与量は、物理的および生理学的因子、例えば、体重、状態の深刻度、治療中の疾患の種類、以前または同時発生の治療的介入、患者の突発性疾患、および投与経路により決定することができる。用量および投与経路に応じて、好ましい用量の投与数および／または有効量は、対象の応答によって変化し得る。投与の責任を負う施術者はいずれにせよ、組成物中での活性成分（複数可）の濃度、および、個体対象に対する適切な投与量（複数可）を決定する。
【０１６１】
特定の実施形態において、医薬組成物は例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでよい。別の実施形態において、活性化合物は、例えば、単位の体重の約２％〜約７５％、または約２５％〜約６０％、およびこれらの中に導き出せる任意の範囲を占めてよい。自然には、治療上有用な各組成物の活性化合物（複数可）の量は、好適な用量が、化合物の任意の所与の単位用量で得られるように準備してよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、生成物の貯蔵寿命、および他の薬理学的考慮などの因子が、このような医薬製剤を調製する当業者により企図され、そのために、様々な用量および治療レジメンが望ましい場合がある。
【０１６２】
別の非限定例において、用量はまた、１回の投与あたり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、から約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重まで、またはそれ以上、およびこれらの中に導き出せる任意の範囲を含んでよい。本明細書で列挙する数から誘導可能な範囲の非限定例において、上記の数に基づいて、約５ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。
【０１６３】
Ｘ．  併用治療
特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、第２の、または追加の治療法と組み合わせたＭＴａｓｅの投与を伴う。併用療法を含む方法および組成物は、治療効果もしくは予防効果を高め、かつ／または別の治療の治療効果を増加させる。治療および予防方法および組成物を、所望の効果を達成するのに有効な組み合わせた量で提供することができる。本プロセスには、ＭＴａｓｅおよび第２の治療法の両方を投与することを伴ってよい。組織、臓器、または細胞を、１種以上の作用物質（即ち、ＭＴａｓｅもしくは第２の作用物質）を含む、１種以上の組成物または薬理学製剤（複数可）に曝露することができる、または、組織、臓器、および／もしくは細胞と、２種以上の異なる組成物もしくは配合物と接触させることができ、ここで、１つの組成物は、１）ＭＴａｓｅ、２）第２の作用物質、または３）ＭＴａｓｅと第２の作用物質の両方を提供する。また、このような併用療法を、外科療法と組み合わせて使用することができると企図されている。
【０１６４】
細胞に適用される場合の用語「接触した」および「曝露された」は、本明細書で、治療用構築物が標的の臓器に送達される、または標的細胞のすぐ近くに配置されるプロセスを説明するために使用される。
【０１６５】
ＭＴａｓｅを、第２の治療の前、間、後、または、治療に関係する様々な組み合わせで投与することができる。投与は、同時から、数分から数日間、また数週間までの範囲の間隔でされてもよい。ＭＴａｓｅが、第２の作用物質とは別に患者に提供される実施形態において、通常は、２つの治療が依然として、患者において有利に組み合わされた効果を発揮することができるように、各送達の時間の間に、著しい期間が確実に開かないようにしなければならない。このような例において、患者に、ＭＴａｓｅおよび第２の治療法を、互いに約１２〜２４、または７２時間以内、より詳細には、互いに約６〜１２時間以内で、提供することができると企図されている。ある状況では、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６または７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）が経過するように治療のための期間を顕著に延ばすことが望ましい場合がある。
【０１６６】
特定の実施形態において、治療の過程は、１〜９０日、またはそれ以上続く（このような範囲には間の日も含む）。ＭＴａｓｅは、１日目〜９０日目（このような範囲には間の日も含む）、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかの日に投与することができ、別の治療は、１日目〜９０日目（このような範囲には間の日も含む）、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかの日に投与されると企図されている。１日（２４時間の期間）内に、患者には、１つまたは複数の治療（複数可）の投与がなされてよい。更に、一連の治療の後に、治療が投与されない期間が存在すると企図されている。この期間は、患者の状態、例えば予後、強度、健康状態などに応じて、１〜７日、および／または１〜５週間、および／または１〜１２週間、またはそれ以上（このような範囲には間の日も含む）続き得る。治療サイクルは必要に応じて繰り返されると予想される。
【０１６７】
種々の組み合わせが使用されてもよい。以下の例において、ＭＴａｓｅは「Ａ」であり、第２の治療法は「Ｂ」である：
2021506320.tif 000003
【０１６８】
患者に対する本発明の実施形態の任意の化合物または治療の投与は、もし存在する場合には作用物質の毒性を考慮して、このような化合物の投与についての一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニタリングする工程が存在する。
【０１６９】
Ａ．  化学療法
多種多様な化学療法剤を、本発明の実施形態にしたがって使用してもよい。「化学療法」との用語は、癌を治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を暗示するために使用される。これらの作用物質または薬剤は、例えば、細胞周期に影響を与える段階で、細胞内のこれらの活性態様に分類される。または、ある作用物質は、ＤＮＡを直接的に架橋する能力、ＤＮＡにインターカレーションする能力、または核酸合成を行うことによって染色体および有糸分裂の異常を誘発する能力に基づいて特徴付けられてもよい。
【０１７０】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチラメラミン、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリューセロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特に、カリケアミシンガンマＩおよびカリケアミシンオメガＩ１）；ダイネミシン、ダイネミシンＡを含む；ビスホスホネート、例えば、クロンドロネート；エスペラミシン；およびネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、プテロプテリンおよびトリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリンおよびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン；抗副腎剤、例えば、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エフロールニチン；酢酸エリプチニウム；エポシロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロキソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位複合体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビンブラスチン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン，プリコマイシン、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、および上述のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０１７１】
Ｂ．  放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範囲に使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ腺として一般的に知られているもの、および／または腫瘍細胞への放射線同位体の指向性送達が挙げられる。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、ならびにＵＶ照射など、ＤＮＡ損傷因子の他の形態も想定される。これらの因子の全てが、ＤＮＡに対し、ＤＮＡの前駆体に対し、ＤＮＡの複製および修復に対し、染色体のアセンブリおよび管理に対し、広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の投薬範囲は、長期間にわたって（３〜４週間）１日線量が５０〜２００レントゲンから、１回の線量が２０００〜６０００レントゲンまでの範囲である。放射線同位体の投薬範囲は、非常に様々であり、同位体の半減期、発せられる放射線の強度および種類、新生物性細胞による取り込みに依存する。
【０１７２】
Ｃ．  免疫療法
当業者は、免疫療法を、実施形態の方法と組み合わせて、または共に使用してよいことを理解するであろう。癌治療の観点で、免疫療法は、一般的に、癌細胞を標的とし、破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、このような一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であってもよい。抗体のみが、治療のエフェクターとして役立ってもよく、または細胞の殺傷に実際に影響を与えるように、他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬剤または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に抱合され、単に標的化剤として役立ってもよい。または、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【０１７３】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化（すなわち、他の細胞の大部分には存在しない）のために修正可能ないくつかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが、本発明の実施形態の観点での標的化に適している場合がある。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替的な態様は、抗癌効果と免疫刺激効果を合わせることである。サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮ、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、および成長因子、例えば、ＦＬＴ３リガンドを含む、免疫刺激分子も存在する。
【０１７４】
現在調査中または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２およびｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−ＷａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；およびモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１つ以上の抗癌療法を、本明細書に記載の抗体療法と共に使用してもよいことが想定される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。免疫チェックポイントは、シグナルを上向きにするか（例えば、共刺激分子）、またはシグナルを下向きにする。免疫チェックポイントの遮断によって標的とされ得る阻害性免疫チェックポイントとしては、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られる）、インドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）およびＴ細胞活性化（ＶＩＳＴＡ）のＶ−ドメインＩｇサプレッサーが挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１軸および／またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
【０１７６】
免疫チェックポイント阻害剤は、リガンドまたは受容体の低分子組み換え形態などの薬剤であってもよく、または特に、抗体、例えば、ヒト抗体である（例えば、国際特許出願公開第２０１５０１６７１８号；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２−６４，２０１２。両方とも本明細書に参照により組み込まれる）。免疫チェックポイントタンパク質またはそのアナログの既知の阻害剤を使用してもよく、特に、キメラ化、ヒト化またはヒト形態の抗体を使用してもよい。当業者は知っているだろうが、本開示で述べられる特定の抗体について、代替的および／または等価な名称が使用される場合がある。このような代替的および／または等価な名称は、本開示の内容において相互に置き換え可能である。例えば、ラムブロリズマブは、代替的および等価な名称でＭＫ−３４７５およびペンブロリズマブとしても知られていることが知られている。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のそのリガンド結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ−１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ−１および／またはＢ７−１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであってもよい。例示的な抗体は米国特許第８，７３５，５５３号、同第８，３５４，５０９号、および同第８，００８，４４９号に記載されており、全てが参照により本明細書に組み込まれている。米国特許出願第２０１４０２９４８９８号、同第２０１４０２２０２１号、および同第２０１１０００８３６９号に記載されているもの（全てが参照により本明細書に組み込まれている）などの、本明細書において提供する方法で使用するための他のＰＤ−１軸アンタゴニストが当該技術分野において公知である。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびＣＴ−０１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ−２２４である。ニボルマブは、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られており、国際特許出願公開第２００６／１２１１６８号に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５、ラムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＳＣＨ−９００４７５としても知られており、国際特許出願公開第２００９／１１４３３５号に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ＣＴ−０１１は、ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ−１としても知られており、国際特許出願公開第２００９／１０１６１１号に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ＡＭＰ−２２４は、Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られており、国際特許出願公開第２０１０／０２７８２７号および同第２０１１／０６６３４２号に記載されるＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０１７９】
本明細書で提供される方法で標的にされ得る別の免疫チェックポイントは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）であり、ＣＤ１５２としても知られている。ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞表面で見出され、抗原提示細胞の表面にあるＣＤ８０またはＣＤ８６に結合すると、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面で発現し、Ｔ細胞に阻害性シグナルを伝える、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質、ＣＤ２８に似ており、両分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれＢ７−１およびＢ７−２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝え、一方、ＣＤ２８は、刺激シグナルを伝える。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞で見出され、その機能にとって重要な場合がある。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８によるＴ細胞活性化によって、Ｂ７分子の阻害性受容体であるＣＴＬＡ−４の発現が増加する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。
【０１８１】
本発明の方法で使用するのに適した抗ヒト−ＣＴＬＡ−４抗体（またはこれらに由来するＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン）は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて作成することができる。または、当該技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用してもよい。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、以下に開示されている。米国特許第８，１１９，１２９号、国際特許出願公開第０１／１４４２４号、同第９８／４２７５２号；同第００／３７５０４号（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブ；以前のティチリムマブとしてもまた知られている）、米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（１７）：１００６７−１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（１４５）：要約番号２５０５（抗体ＣＰ−６７５２０６）；およびＭｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：５３０１−５３０４を、本明細書で開示される方法で使用することができる。上述の刊行物それぞれの教示は、本明細書に参考として組み込まれる。ＣＴＬＡ−４に対する結合について、これらの当該技術分野で認識されている任意の抗体と競争する抗体も使用可能である。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ−４抗体は、国際特許出願公開第２００１０１４４２４号、同第２００００３７５０４号および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、全て本明細書に参考として組み込まれる。
【０１８２】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標））またはその抗原結合フラグメントおよび多様体である（例えば、国際特許出願公開第０１／１４４２４号を参照）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたはＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインと、イピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と同様に、ＣＴＬＡ−４上の同じエピトープとの結合について競争し、および／またはこれに結合する。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性を有する（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、または９９％の可変領域同一性）。
【０１８３】
ＣＴＬＡ−４を調整する他の分子としては、ＣＴＬＡ−４リガンド、および米国特許第５８４４９０５号、同第５８８５７９６号および国際特許出願公開第１９９５００１９９４号および同第１９９８０４２７５２号（全て本明細書に参照により組み込まれる）に記載されるような受容体、ならびに本明細書に参照により組み込まれる米国特許第８３２９８６７号に記載されるようなイムノアドヘシンが挙げられる。
【０１８４】
いくつかの実施形態においては、免疫療法は養子免疫療法であることができ、これは、エクスビボで産生した自己抗原特異的Ｔ細胞の伝達を伴う。遺伝子操作による、抗原特異的Ｔ細胞の拡大、またはＴ細胞のリダイレクションのいずれかにより、養子免疫療法で用いるためのＴ細胞を産生することができる（Ｐａｒｋ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および伝達は、黒色腫の治療において成功したことが示されている。トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝的伝達により、Ｔ細胞内で新規の特異性の発生が成功している（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。ＣＡＲは、１つの融合分子中に、１つ以上のシグナル伝達ドメインと関連した標的部分からなる、合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は、柔軟なリンカーにより結合したモノクローナル抗体の軽可変フラグメントを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインをベースにする結合部分もまた、上手く使用されている。第１世代のＣＡＲに対するシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃ受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。ＣＡＲにより、リンパ腫および充実性腫瘍を含む様々な悪性腫瘍の腫瘍細胞の表面において発現した抗原に対してＴ細胞がリダイレクトさせることが、成功している（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【０１８５】
一実施形態では、本出願は、癌治療のための併用療法であって、養子Ｔ細胞療法およびチェックポイント阻害剤を含む併用療法を提供する。一態様では、養子Ｔ細胞療法は、自己および／または同種異系Ｔ細胞を含む。別の態様においては、自己および／または同種異系Ｔ細胞は、腫瘍抗原に対して標的化される。
【０１８６】
Ｄ．  手術
癌を有するヒトの約６０％が、いくつかの外科手術を受けており、予防手術、診断手術、または病気診断、治療、緩和の手術が含まれる。治療の手術は、癌組織の全てまたは一部を物理的に除去し、切除し、および／または破壊する切除術を含み、他の治療、例えば、本発明の実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法などと組み合わせて使用されてもよい。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍切除に加え、外科手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡下手術（モース手術）が挙げられる。
【０１８７】
癌性細胞、組織または腫瘍の一部または全てを切除すると、体内に空洞が作られる場合がある。治療は、更なる抗癌療法を用いた灌流、直接的な注射、または領域への局所的な適用によって達成されてもよい。このような治療は、例えば、１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、または７日ごと、または１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、または１ヶ月ごと、２ヶ月ごと、３ヶ月ごと、４ヶ月ごと、５ヶ月ごと、６ヶ月ごと、７ヶ月ごと、８ヶ月ごと、９ヶ月ごと、１０ヶ月ごと、１１ヶ月ごと、または１２ヶ月ごとに繰り返されてもよい。これらの治療は、同様に様々な投薬量であってもよい。
【０１８８】
Ｅ．  他の作用物質
他の作用物質を、治療の治療効能を高めるために、本発明の実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してもよいことが想定される。これらの更なる作用物質としては、細胞表面受容体およびＧＡＰ接合部の上方制御に影響を与える作用物質、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘発剤に対する過剰増殖性細胞の感度を高める作用物質、または他の生物学的作用物質が挙げられる。ＧＡＰ接合部の数を増やすことによる、細胞内シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖する細胞集団に対する抗過剰増殖効果を高めるだろう。他の実施形態では、治療の抗過剰増殖効能を高めるために、細胞増殖抑制剤および分化剤を、本発明の実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してもよい。細胞接着の阻害剤は、本発明の実施形態の効能を高めると考えられる。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感度を高める他の作用物質、例えば、抗体ｃ２２５を、治療効能を向上させるために、本発明の実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してもよいことが更に想定される。
【０１８９】
ＸＩ．  キット
本発明の特定の態様は、治療用キットなどのキットを提供してよい。例えば、キットは、本明細書に記載した１種以上の医薬組成物、および場合により、それらの使用のための取扱説明書を含んでよい。キットは、このような組成物の投与を成し遂げるための、１種以上のデバイスを更に含んでよい。例えば、対象キットは、医薬組成物、および組成物を癌性腫瘍の直接静脈内注射を達成するためのカテーテルを含んでよい。別の実施形態において、対象キットは、送達デバイスと共に使用するために、ＭＴａｓｅが予充填された、場合により薬剤として製剤化された、または凍結乾燥したアンプルを含んでよい。
【０１９０】
キットは、標識を付けた容器を含んでよい。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル瓶、および試験管が挙げられる。容器を、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、上述したものなどの、治療用途または非治療用途に効果的なＭＴａｓｅを含む組成物を保持することができる。容器の標識は、特定の治療法、または非治療用途に使用される組成物を示すことができ、前述したもののような、インビボまたはインビトロ使用のいずれかのための指示もまた、示すことができる。本発明のキットは通常、商業的に、そして使用者の視点から望ましい材料、例えば緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および、使用のための取扱説明書が付いた添付文書を含む、上述した容器、および１つ以上の他の容器を含む。
【実施例】
【０１９１】
ＸＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように本願発明者によって開発された技術を表し、そのため、その実施のための好ましい態様を構成すると考えることができることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示の観点で、開示される具体的な実施形態において、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同じまたは同様の結果が依然として得られる多くの変更をなし得ることを理解するべきである。
【０１９２】
実施例１−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓからのＭＴＡＰの遺伝子構築物、発現、および精製
ＩＤＴソフトウェアを使用して設計した、Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化遺伝子ブロックのオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＭＴＡＰ酵素（ｈｓ−ＭＴＡＰ；配列番号１）の発現のための遺伝子を構築した。完全長遺伝子は、Ｎ末端ＮｃｏＩ制限酵素部位、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ、Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化ｈｓ−ＭＴＡＰ遺伝子、終止コドン、および、Ｃ末端ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む。上述の制限酵素部位を使用して、組み立てた遺伝子をｐＥＴ−２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。この構築物を使用して次に、発現用のＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地内で２１０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００が約１．０に到達した際に、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭの終濃度）を加え、３７℃で引き続き一晩撹拌することにより発現を誘発した。次に、細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、および１μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅからなる細胞溶解緩衝液内に再懸濁させた。細胞溶解をフレンチプレスにより完了させ、溶解物を２０，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離することにより、微粒子をきれいにした。次に上清を５μｍの注射器フィルターに通して濾過し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ中で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ／アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。溶解物をカラム上にロードした後、樹脂を５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール緩衝液で洗浄した。次に、細菌発現系での典型的な汚染物質であるあらゆるリポ多糖体（ＬＰＳ、即ち内毒素）を取り除くために、１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４を含有する、１００ＣＶの内毒素非含有のＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、カラムをゆっくりと洗浄するように流速を設定した。洗浄した酵素を次に、２５０ｍＭのイミダゾールを含む内毒素非含有のＰＢＳ（５ＣＶ）に溶出し、樹脂を、内毒素非含有ＰＢＳの第２の部分（５ＣＶ）で洗い流した。この時点で、酵素を新鮮なＰＢＳに緩衝液交換してイミダゾールを取り除き、１０％グリセロールを添加した。保存のために、アリコートを液体窒素中で−８０℃で急速に凍結した。あるいは、酵素の緩衝液を速やかに、新鮮に作られた滅菌した１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）に交換して、共にイミダゾールを取り除き、ＰＥＧ化のために調製した（実施例３に記載）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づくと通常の酵素純度は＞９５％であり、典型的な収率は平均で６５ｍｇ／Ｌの培養物であった。Ａｂｓ２８０ｎｍを測定し、計算した酵素減衰係数２９，９５０Ｍ−１ｃｍ−１を使用してタンパク質の量を測定した。
【０１９３】
実施例２−サルモネラ・エンテリカからの遺伝子構築物、発現、および精製
ＩＤＴ製のソフトウェアを使用して設計した、Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化遺伝子ブロックのオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、サルモネラ・エンテリカからのＭＴＡＮ酵素（ｓｅ−ＭＴＡＮ；配列番号３）の発現のための遺伝子を得た。完全長遺伝子は、Ｎ末端ＮｃｏＩ制限酵素部位、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ、Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化ｓｅ−ＭＴＡＮ遺伝子、終止コドン、および、Ｃ末端ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む。上述の制限酵素部位を使用して、組み立てた遺伝子をｐＥＴ−２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。この構築物を使用して次に、発現用のＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地内で２１０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００が約１．０に到達した際に、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭの終濃度）を加え、３７℃で引き続き一晩撹拌することにより発現を誘発した。次に、細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、および１μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅからなる細胞溶解緩衝液内に再懸濁させた。細胞溶解をフレンチプレスにより完了させ、溶解物を２０，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離することにより、微粒子をきれいにした。次に上清を５μｍの注射器フィルターに通して濾過し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ中で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ／アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。溶解物をカラム上にロードした後、樹脂を５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール緩衝液で洗浄した。次に、細菌発現系での典型的な汚染物質であるあらゆるリポ多糖体（ＬＰＳ、即ち内毒素）を取り除くために、１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４を含有する、１００ＣＶの内毒素非含有のＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、カラムをゆっくりと洗浄するように流速を設定した。洗浄した酵素を次に、２５０ｍＭのイミダゾールを含む内毒素非含有のＰＢＳ（５ＣＶ）に溶出し、樹脂を、内毒素非含有ＰＢＳの第２の部分（５ＣＶ）で洗い流した。この時点で、酵素を新鮮なＰＢＳに緩衝液交換してイミダゾールを取り除き、１０％グリセロールを添加した。保存のために、アリコートを液体窒素中で−８０℃で急速に凍結した。あるいは、酵素の緩衝液を速やかに、新鮮に作られた滅菌した１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）に交換して、共にイミダゾールを取り除き、ＰＥＧ化のために調製する（実施例４に記載）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づくと通常の酵素純度は＞５％であり、典型的な収率は平均で７０ｍｇ／Ｌの培養物であった。Ａｂｓ２８０ｎｍを測定し、計算した酵素減衰係数６，２１０Ｍ−１ｃｍ−１を使用してタンパク質の量を測定した。
【０１９４】
実施例３−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓからのＭＴＡＰの薬理学的調製
インビボでのヒト酵素の循環時間を向上させるために、ｈｓ−ＭＴＡＰの流体力学的半径を、タンパク質内の表面反応性基をＰＥＧにコンジュゲートすることにより官能化することで増加させた。一実施形態では、表面リジン残基をメトキシＰＥＧサクシニミジルカーボネート５０００ＭＷ（ＮＡＮＯＣＳ）と反応させることによりｈｓ−ＭＴＡＰを官能化させた。精製した内毒素非含有酵素の緩衝液を、新鮮に調製した１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）に完全に交換し、５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。得られた溶液を、１００：１でモル過剰の固体ＰＥＧ試薬に直接加え、室温で１時間反応させた（図１）。１００ｋＤａのカットオフ遠心分離濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）内で緩衝液を新鮮な内毒素非含有のＰＢＳに完全に交換することにより、未反応のＰＥＧを溶液から取り除いた。Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬカイネティック比色式内毒素試験キット（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）を使用して内毒素の濃度を定量化した。上述の方法で洗浄した酵素は通常、精製したｈｓ−ＭＴＡＰにおいて＜１０ＥＵ／ｍｇの内毒素レベルが得られた。
【０１９５】
実施例４−サルモネラ・エンテリカからのＭＴＡＮの薬理学的調製
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ酵素のインビボでの循環滞留時間を改善するために、ｓｅ−ＭＴＡＮの流体力学的半径を、タンパク質内の表面反応性基をＰＥＧにコンジュゲートすることにより官能化することで増加させた。一実施形態では、表面リジン残基をメトキシＰＥＧサクシニミジルカーボネート５０００ＭＷ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と反応させることによりｓｅ−ＭＴＡＮを官能化させた。精製した内毒素非含有酵素の緩衝液を、新鮮に調製した１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）に完全に交換し、５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。得られた溶液を、１００：１でモル過剰の固体ＰＥＧ試薬に直接加え、室温で１時間反応させた（図２）。１００ｋＤａのカットオフフィルター（Ａｍｉｃｏｎ）内で緩衝液を新鮮な内毒素非含有のＰＢＳに完全に交換することにより、未反応のＰＥＧを溶液から取り除いた。Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬカイネティック比色式内毒素試験キット（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）を使用して内毒素の濃度を定量化した。上述の方法で洗浄した酵素は通常、精製したｓｅ−ＭＴＡＮにおいて＜１０ＥＵ／ｍｇの内毒素レベルが得られた。
【０１９６】
実施例５−ＭＴＡＰおよびＭＴＡＮの動態パラメータを測定するためのアッセイ
分光光度アッセイにより、ｓｅ−ＭＴＡＮおよびｈｓ−ＭＴＡＰの動態パラメータを定量化した。ここでは、酵素基質であるＭＴＡの最大吸光度の減衰を、他の箇所で記載したとおりに時間の関数として監視した。（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＭＴＡ溶液を調製し、６μＭ〜２００μＭの範囲の終濃度を得た。ＭＴＡは、２７５ｎｍのλｍａｘにおいて、このＭＴＡＰ／ＭＴＡＮ分解生成物のアデニンから、１，６００Ｍ−１ｃｍ−１の減衰係数の変化がある一方で、反応の他の生成物であるメチルチオリボース−１’−ホスフェート／メチルチオリボースは、２７５ｎｍにて認識可能な程度にて吸収しない。酵素溶液（最終は約１０ｎＭ）を加えることにより反応を開始し、酵素溶液を基質溶液と混合し、３７℃における基質ＭＴＡの喪失を、時間の経過と共にＡｂｓ２７５ｎｍを測定することにより監視した。得られたデータを加工し、反応速度定数を決定するためのミカエリス・メンテン式に当てはめた。これらの条件下にて、ｈｓ−ＭＴＡＰ酵素の動態は、１．０×１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを有することが分かり、ｓｅ−ＭＴＡＮは、３．０×１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを有することが分かった。
【０１９７】
実施例６−ｈｓ−ＭＴＡＰおよびｓｅ−ＭＴＡＮの動態安定性
精製したｈｓ−ＭＴＡＰおよびｓｅ−ＭＴＡＮ酵素の動態安定性を、酵素を３７℃にて１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中でインキュベートすることにより測定した。４日間にわたって、ｈｓ−ＭＴＡＰおよびｓｅ−ＭＴＡＮのアリコートをインキュベーションから取り除き、実施例５に記載したＭＴＡの分解能を評価した。得られたデータを処理し、指数方程式に当てはめて減衰率を測定した。これらの条件下にて、ｈｓ−ＭＴＡＰ酵素は５７時間の半減期（Ｔ１／２）を有することが分かり（図３）、ｓｅ−ＭＴＡＮは５６時間の、同様のＴ１／２を有することが分かった（図４）。
【０１９８】
実施例７−ＭＴＡで処理したマウスＴ細胞の増殖の回復における、ｈｓ−ＭＴＡＰおよびｓｅ−ＭＴＡＮの有効性
健全な８週齢のＣ５７ＢＬ６マウスから解剖した脾臓を、７０μｍのＦａｌｃｏｎ（商標）で粉砕して単一細胞を得、これを、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）を使用して、更に単離した。単離したＴ細胞を、ＰＢＳ中で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度にし、各細胞分裂による染料希釈に応じた増殖として測定する、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に従い処理した。標識した細胞を次に再計数し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＲＰＭＩ培地に移動して、１ｍＬ／ウェルで配置し、この後、キットのプロトコルに従い、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製の、Ｔ細胞膨張および活性化用のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８）を添加して、Ｔ細胞を活性化した。続いて、３つの異なるＭＴＡ濃度（０μＭのＭＴＡ、１２５μＭのＭＴＡ、または２５０μＭのＭＴＡ）を、配置した細胞に添加した。最後に、ＭＴＡＰおよびＭＴＡＮを、５μＭ酵素の終濃度において適切なウェルに添加し、ＰＢＳを対照ウェルに添加した。５日間インキュベーションした後、細胞を収集して抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、およびＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。使用した抗体は、全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製であった：ＰＥ抗マウスＣＤ３（１７Ａ２）、ＡＰＣ抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ（商標）７５０抗マウスＣＤ８ａ（５３−６．７）、およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（商標）抗マウスＫｉ−６７（１６Ａ８）。Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒからＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０を購入した。
【０１９９】
これらの条件下にて、ＭＴＡは用量依存的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および生存能を強力に阻害し（図５Ａ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対してはより低く阻害した（図５Ｂ）。この効果は、ｈｓ−ＭＴＡＰまたはｓｅ−ＭＴＡＮを添加することにより、完全に逆転した（図５Ａおよび５Ｂ）。
【０２００】
実施例８−自己Ｌ１２１０マウス白血病モデルにおけるＰＥＧ−ｓｅ−ＭＴＡＮの有効性
皮下脇腹注射により、非常に侵襲性のＬ１２１０マウス白血病細胞株の、５×１０４細胞を、ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝１７）にそれぞれ播種した。更なる８日間で腫瘍を確立させた後（腫瘍平均＝９０ｍｍ３）、マウスを２つの群に分けた。腫瘍のサイズが≧２５００ｍｍ３に達するまで、３日ごとの腫瘍周囲注射により、対照群（ｎ＝８）をＰＢＳビヒクル対照で処理した。腫瘍のサイズが≧２５００ｍｍ３のエンドポイントに達するまで、３日ごとの腫瘍範囲注射により、５０ｍｇ／ｋｇの活性ＰＥＧ−ｓｅ−ＭＴＡＮで処理したことを除いて、実験群（ｎ＝９）を同じ方法で処理した。Ｌ１２１０白血病腫瘍の増殖速度は、ビヒクル対照群と比較して、ＰＥＧ−ｓｅ−ＭＴＡＮを投与した治療群で３．５倍著しく遅くなり（図６Ａ）、統計的に有意な寿命延長（ｐ＜０．００３５）がもたらされた（図６Ｂ）。
【０２０１】
実施例９−腫瘍標的化のための、ＭＴＡＰ−ｓｃＦｖおよびＭＴＡＮ−ｓｃＦｖ融合タンパク質
いくつかの態様では、本発明はまた、異種アミノ酸配列に結合した改変細菌ＭＴＡＮまたは哺乳類のＭＴＡＰを含むポリペプチドを企図する。例えば、天然または改変ＭＴＡＮ／ＭＴＡＰは、特異的細胞表面腫瘍抗原を結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体に結合してよい。本実施形態において、既知の腫瘍抗原、好ましくは、より低速で内在化する腫瘍特異的抗原、例えばＭＵＣ−１に対して特異的親和性を有するタンパク質のｓｃＦｖ部分とのｓｃＦｖ−ＭＴＡＰ／ＭＴＡＮ融合タンパク質は、融合タンパク質のＭＴＡＮ／ＭＴＡＰ部分が腫瘍細胞に送達され、ＭＴＡを分解することを可能にさせる。一例は、ｓｃＦｖ部分が、ある種の乳癌において上方制御されるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的化して結合する、ｓｃＦｖ−ＭＴＡＮ／ＭＴＡＰ融合タンパク質である。本実施形態において、天然または改変ＭＴＡＮ／ＭＴＡＰ−抗ＨＥＲ２−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ＭＴＡＮ／ＭＴＡＰを腫瘍表面に直接標的化して濃縮する役割を果たし、腫瘍が産生したＭＴＡを分解する役割を果たす。
【０２０２】
実施例１０−ＭＴＡＰおよびＭＴＡＮ−抗ＣＴＬＡ４−ｓｃＦｖ融合タンパク質
いくつかの態様では、本発明はまた、異種アミノ酸配列に結合した改変細菌ＭＴＡＮまたは哺乳類のＭＴＡＰを含むポリペプチドを企図する。例えば、天然または改変ＭＴＡＰ／ＭＴＡＮは、ＴヘルパーおよびＴ制御性細胞上にて細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）受容体に結合する、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体に結合することができる。Ｔ細胞は表面受容体ＣＤ２８を表し、これは、その共受容体に結合したとき、Ｔ細胞活性化のための刺激性シグナルとして機能する。対照的に、表面受容体ＣＴＬＡ−４は、その共受容体に結合したときに、阻害シグナルを、Ｔ細胞活性化を下方制御し、Ｔ細胞の、癌細胞の認識および攻撃を防止する細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に伝達する。拮抗化抗体または抗体断片によるＣＴＬＡ−４の遮断により、阻害性Ｔ細胞シグナルの逆転が可能となり、ＣＤ２８が継続してＴ細胞活性化を行うことが可能となる。本実施形態において、天然または改変ＭＴＡＰ／ＭＴＡＮ−抗ＣＴＬＡ４−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、阻害性ＣＴＬＡ−４シグナル伝達と阻害性ＭＴＡシグナル伝達の両方を取り除く役割を果たす。別の実施形態において、天然または改変ＭＴＡＰ／ＭＴＡＮ−抗ＣＴＬＡ４−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、阻害性ＣＴＬＡ−４シグナル伝達と阻害性ＡＤＯシグナル伝達の両方を取り除く役割を果たす。天然または改変ＭＴＡＰ／ＭＴＡＮ−抗ＣＴＬＡ４−ｓｃＦｖ融合タンパク質の本実施形態は、Ｔ細胞活性化を潜在的に上方制御し、抗腫瘍応答を強力に促進することが予想される。
【０２０３】
実施例１１−ＭＴＡＰおよびＭＴＡＮによるアデノシンの動態パラメータを測定するためのアッセイ
分光光度アッセイにより、ｓｅ−ＭＴＡＮおよびｈｓ−ＭＴＡＰの動態パラメータを定量化した。ここでは、酵素基質であるアデノシン（ＡＤＯ）の最大吸光度の減衰が、時間の関数として監視された。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＡＤＯ溶液を調製し、６μＭ〜８００μＭの範囲の終濃度を得た。ＡＤＯは、２７５ｎｍのλｍａｘにおける、このＭＴＡＰ／ＭＴＡＮ分解生成物のアデニンから、６１５Ｍ−１ｃｍ−１の減衰係数の変化を有する一方で、反応の他の生成物であるリボース−１’−ホスフェート／リボースは、２７５ｎｍにて認識可能な程度にて吸収しない。酵素溶液（最終は約２０ｎＭ）を加えることにより反応を開始し、酵素溶液を基質溶液と混合し、３７℃における基質ＭＴＡの喪失を、時間の経過と共にＡｂｓ２７５ｎｍを測定することにより監視した。得られたデータを加工し、反応速度定数を決定するためのミカエリス・メンテン式の形式に当てはめた。これらの条件下にて、ｈｓ−ＭＴＡＰ酵素の動態は、５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを有することが分かり、ｓｅ−ＭＴＡＮは、１．０×１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを有することが分かった。
【０２０４】
実施例１２−自己Ｌ１２１０マウス白血病モデルにおける、免疫表現型でのＰＥＧ−ｓｅ−ＭＴＡＮの有効性
Ｌ１２１０同種異系移植片を有するＤＢＡ／２マウスの腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）からのＦＡＣＳ分析により、リンパ球パネルを観察し、続けて、ＰＥＧ−ＭＴＡＮまたはビヒクル対照の３つの処理を評価した。ＰＥＧ−ＭＴＡＮ投与により、インビトロ観察に一致する、ＣＤ４＋および特にＣＤ８＋Ｔ細胞にて非常に増殖が強化された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団の大きな増加がもたらされた。（図７Ａ〜Ｃ）非常に重要なことに、処理したＴＤＬＮは、Ｔ細胞の大きな増加もまた示し、強化されたＴ細胞の活性化を示す、骨髄由来細胞の集団の減少（図７Ｄ〜Ｆ）もまた示した。
【０２０５】
実施例１３−モデル系としてのＢ１６黒色腫ＭＴＡＰノックアウト細胞株の構築
代謝、および宿主免疫系との相互作用の点において、Ｂ１６は非常に良く特性決定されている細胞株であるため、この株におけるＭＴＡＰの枯渇により、腫瘍および宿主免疫系上の両方に対して代謝的に、ＭＴＡが蓄積した結果を評価する、関係するモデルが作られるという仮説が立てられた。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒを通して購入したＣａｓ９タンパク質（ＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖ２）および合成一本鎖ガイドＲＮＡを、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）Ｃａｓ９  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用して、Ｂ１６−Ｆ１０ＷＴ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、制限希釈法を使用して、１０個の９６ウェルプレートに細胞を配置した。単一細胞クローンに関してプレートを毎日調査し、コンフルエンシーに達した後（トランスフェクションの１０〜１４日後）、クローンを更に膨張し、ウェスタンブロッティングによりＭＴＡＰ発現を分析し、ＭＴＡＰ発現を欠くクローンを、クローニングおよび配列決定により遺伝子破壊について確認した。
【０２０６】
実施例１４−Ｂ１６ＷＴおよびＢ１６−ＭＴＡＰ−／−黒色腫腫瘍モデル中での、ＰＥＧ−ｈｓ−ＭＴＡＰの有効性
Ｃ５７／ＢＬ６マウスのそれぞれの２つのコホートに、５０，０００ＷＴ  Ｂ１６−Ｆ１０またはＢ１６−Ｆ１０  ＭＴＡＰ−／−細胞のいずれかを、皮下に播種した。５５ｍｍ３の平均サイズに腫瘍が達したときに、２週間、腫瘍周辺注射により、ビヒクル（ＰＢＳ）または５０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＭＴＡＰのいずれかを３回／週で、マウスに処理した。ＭＴＡＰを非常に発現する腫瘍から予想されるように、ＷＴ  Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖において、ＰＥＧ−ＭＴＡＰ処理は効果がないことが観察された（図８Ａ）。しかし、ＰＥＧ−ＭＴＡＰをＢ１６−Ｆ１０  ＭＴＡＰ−／−同種異系移植片に投与することによって、腫瘍増殖が劇的に遅くなり、治療群において４３％の完全寛解（ＣＲ）がもたらされた（３／７のＣＲ）（図８Ｂ）。
【０２０７】
実施例１５−Ｂ１６−ＭＴＡＰ−／−黒色腫腫瘍モデルにおける、免疫表現型でのＰＥＧ−ｈｓ−ＭＴＡＰの有効性。
Ｂ１６−Ｆ１０  ＭＴＡＰ−／−腫瘍サンプルを有するＣ５７／ＢＬ６マウスをＦＡＣＳ分析して観察されたリンパ球パネルを、２用量のＰＥＧ−ＭＴＡＰまたはビヒクルで処理した後に評価した（投与の２４時間後に分析）。処理群は、ビヒクルで処理した対照と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫ１．１＋ナチュラルキラー細胞のパーセンテージの大きな増加、ならびに、増殖ＣＤ８＋グランザイムＢ＋Ｔ細胞のパーセンテージの大きな増加を示した（図９Ａ〜Ｃ）。
【０２０８】
実施例１６−マウス４Ｔ１乳癌同種異系移植片のＰＥＧ−ＭＴＡＮ／抗ＣＴＬＡ４処理の有効性
ＡＤＯの枯渇による腫瘍増殖の制御、および、抗ＣＴＬＡ４免疫チェックポイント阻害との組み合わせの有効性を評価するために、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの４つのコホートに、乳房脂肪パッド内で５０，０００個の４Ｔ１細胞を播種し、腫瘍を確立した。４Ｔ１は、腫瘍微小環境にてＭＴＡではなくＡＤＯを有することが予想される場合において、ＭＴＡＰｈｉｇｈＣＤ７３＋腫瘍細胞である。ビヒクルの、ＰＥＧ−ＭＴＡＮ（５０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＴＬＡ４（１０ｍｇ／ｋｇ、クローンＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ）のいずれか、またはＰＥＧ−ＭＴＡＮ／抗ＣＴＬＡ４の組み合わせで、マウスを処理した。ＰＥＧ−ＭＴＡＮおよび抗ＣＴＬＡ４単剤群の両方が原発腫瘍増殖を遅らせ、組み合わせはより効果的であり、少なくとも治療上の加算性を示す（図１０Ａ）。４Ｔ１は転移性肺腫瘍を形成するため、肺組織を調査して、腫瘍のコロニー形成を定量化した。ビヒクル対照群と比較して、処理群は全て、著しく少ない転移性肺腫瘍節を示し（図１０Ｂ）、転移の際のＡＤＯの役割を例示している。
【０２０９】
実施例１７−マウスＣＴ２６結腸癌同種異系移植片（ＭＴＡＰｌｏｗＣＤ７３＋）のＰＥＧ−ＭＴＡＮ／抗ＰＤ１処理の有効性。
ＣＴ２６細胞株は、ＣＤＫＮ２に対してホモ接合型ヌルであることが知られており（Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、これは通常、ＭＴＡＰと共に欠損されている。しかし、ＭＴＡＰは欠損していないが、その発現は非常に損なわれていることが発見された。更に、この細胞株はＣＤ７３を発現する（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）が故に、腫瘍微小環境においてアデノシンを産生することが予想されている。単剤として、または、抗ＰＤ１免疫チェックポイント阻害剤療法と組み合わせて、ＭＴＡＰｌｏｗＣＤ７３＋腫瘍モデルにおけるＡＤＯおよび／またはＭＴＡ枯渇の、あらゆる潜在的な有効性を調査するために、ＣＴ２６腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスの４つの群を、アイソタイプ対照抗体、ＰＥＧ−ＭＴＡＮ（５０ｍｇ／ｋｇで３週）、抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ  ＃  ＢＥ０１４６、１０ｍｇ／ｋｇで２週）、またはＰＥＧ−ＭＴＡＮと抗ＰＤ１の組み合わせ（合計２週間）で処理した。対照と比較して、抗ＰＤ１およびＰＥＧ−ＭＴＡＮは共に、分散不均一効果を誘発したが、重要なことに、両方の単剤群においては、完全な寛解（ＣＲ）が得られた。印象的なことに、抗ＰＤ１／ＰＥＧ−ＭＴＡＮの組み合わせは、群全体における腫瘍増殖阻害を示し、加算または相乗効果を示唆する、３つの完全寛解（図１１）をもたらした。
【０２１０】
本明細書に開示され、特許請求される全ての方法は、本開示の観点で過度な実験を行うことなく、なされ、実行されてもよい。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点で記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の方法、工程または工程の順序に変化が加えられてもよいことは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連する特定の作用物質を、同じ結果または同様の結果が達成されつつ、本明細書に記載される作用物質に交換されてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような同様の代替物および改変は、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【０２１１】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されるものに対して補助的に例示的な手順または他の詳細を与える程度まで、本明細書に参照により組み込まれる。
米国特許第４，８７０，２８７号
米国特許第５，７３９，１６９号
米国特許第５，７６０，３９５号
米国特許第５，８０１，００５号
米国特許第５，８２４，３１１号
米国特許第５，８３０，８８０号
米国特許第５，８４６，９４５号
米国特許第５，８８９，１５５号
米国特許出願公開第２００９／０３０４６６６号
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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