(57)【要約】  本書は、脳の損傷を処置するための方法及び材料を提供する。例えば、脳（例えば、大脳皮質）内の反応性アストロサイトを機能的なニューロン（例えば、生きた哺乳動物（例えば、ヒト）の脳内に機能的に組み込まれ得るニューロン）に変換するために、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を使用するための方法及び材料が提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きた哺乳動物の脳の大脳皮質においてグリア瘢痕組織を修復する方法であって、前記方法が、ニューロン分化1（neuronal differentiation 1：NeuroD1）ポリペプチドをコードする核酸を前記大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、前記NeuroD1ポリペプチドが前記アストロサイトによって発現され、前記アストロサイトが前記大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、かつ、前記グリア瘢痕組織が神経組織へと戻る、前記方法。
【請求項２】
前記大脳皮質において、NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸の投与後に、グリア線維性酸性タンパク質（Gfap）、リポカリン-2（Lcn2）、及び/又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の発現が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記大脳皮質において、NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸の投与後に、アネキシンA2（Anax2）、トロンボスポンジン1（Thbs1）、グリピカン6（Gpc6）、及び/又は脳由来神経栄養因子（Bdnf）の発現が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生きた哺乳動物の脳の大脳皮質においてニューロン：グリア比を再平衡化（rebalancing）する方法であって、前記方法が、ニューロン分化1（NeuroD1）ポリペプチドをコードする核酸を前記大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、前記NeuroD1ポリペプチドが前記アストロサイトによって発現され、前記アストロサイトが前記大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、かつ、前記ニューロン：グリア比が増加する、前記方法。
【請求項５】
前記ニューロン：グリア比が、アストロサイトの数を減少させること、及び/又はニューロンの数を増加させることによって増加する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ニューロン:グリア比が、アストロサイトの数を減少させることによって、及びニューロンの数を増加させることによって増加する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において神経炎症を減弱させる方法であって、前記方法が、ニューロン分化1（NeuroD1）ポリペプチドをコードする核酸を前記大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、前記NeuroD1ポリペプチドが前記アストロサイトによって発現され、前記アストロサイトが前記大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、かつ、前記神経炎症が減弱する、前記方法。
【請求項８】
前記大脳皮質において、NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸の投与後に、腫瘍壊死因子α（TNFa）、インターロイキン1ベータ（interleukin 1 beta：IL-1b）、及び/又は指定分類68（cluster of designation 68：CD68）の発現が減少する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において血液脳関門を回復させる（restore）方法であって、前記方法が、ニューロン分化1（NeuroD1）ポリペプチドをコードする核酸を前記大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、前記NeuroD1ポリペプチドが前記アストロサイトによって発現され、前記アストロサイトが前記大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、かつ、前記血液脳関門が回復される、前記方法。
【請求項１０】
前記大脳皮質において、NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸の投与後に、血管でAQP4シグナル伝達が増加する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
生きた哺乳動物の脳の大脳皮質においてA1アストロサイトを形質転換する方法であって、前記方法が、ニューロン分化1（NeuroD1）ポリペプチドをコードする核酸を前記大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、前記NeuroD1ポリペプチドが前記アストロサイトによって発現され、前記アストロサイトが前記大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、かつ、前記A1アストロサイトがより害の少ないアストロサイトに形質転換される、前記方法。
【請求項１２】
前記大脳皮質において、NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸の投与後に、グアニル酸結合タンパク質2（Gbp2）及び/又はセルピンファミリーGメンバー1（Serping1）の発現が減少する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において毒性M1ミクログリアの量を低下させる方法であって、前記方法が、ニューロン分化1（NeuroD1）ポリペプチドをコードする核酸を前記大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、前記NeuroD1ポリペプチドが前記アストロサイトによって発現され、前記アストロサイトが前記大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、かつ、毒性M1ミクログリアの量が低下する、前記方法。
【請求項１４】
前記毒性M1ミクログリアが、NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸の投与後に、休止ミクログリアの形態を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記アストロサイトが反応性アストロサイトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記NeuroD1ポリペプチドがヒトNeuroD1ポリペプチドである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記大脳皮質が運動皮質である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸が、ウイルスベクターの形で前記アストロサイトに投与される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アデノ随伴ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
リコンビナーゼをコードする核酸を、前記大脳皮質内のアストロサイトに投与することをさらに含み、前記リコンビナーゼポリペプチドが前記アストロサイトによって発現され、NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸がリコンビナーゼ標的部位に挟まれている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記リコンビナーゼがCreリコンビナーゼであり、かつ、前記リコンビナーゼ標的部位がLoxP部位である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸が反転（inverted）核酸配列である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記リコンビナーゼをコードする前記核酸がプロモーター配列に機能的に連結され、前記プロモーター配列がアストロサイト特異的プロモーター配列である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記アストロサイト特異的プロモーター配列が、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）プロモーター配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記NeuroD1ポリペプチドをコードする前記核酸が、プロモーター配列に機能的に連結され、前記プロモーター配列が恒常的プロモーター配列である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記恒常的プロモーター配列がCAGプロモーター配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与が、前記生きた哺乳動物の脳の大脳皮質への直接注射を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、筋肉内、又は経口投与を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において機能的ニューロンを形成するための組成物であって、前記組成物が、
（a）リコンビナーゼ標的部位に挟まれたニューロン分化1（neuronal differentiation 1：NeuroD1）ポリペプチドをコードする反転（inverted）核酸配列を含む核酸ベクター、及び
（b）リコンビナーゼをコードする核酸配列を含む核酸ベクター
を含む、前記組成物。
【請求項３２】
NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸配列を含む前記核酸ベクターがウイルスベクターである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクターである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記NeuroD1ポリペプチドをコードする前記反転核酸配列がプロモーター配列に機能的に連結され、前記プロモーター配列が恒常的プロモーター配列である、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記恒常的プロモーター配列がCAGプロモーター配列を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
リコンビナーゼをコードする核酸配列を含む前記核酸ベクターがウイルスベクターである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクターである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記リコンビナーゼをコードする前記核酸配列がプロモーター配列に機能的に連結され、前記プロモーター配列がアストロサイト特異的プロモーター配列である、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記アストロサイト特異的プロモーター配列が、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）プロモーター配列を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記リコンビナーゼがCreリコンビナーゼであり、かつ、前記リコンビナーゼ標的部位がLoxP部位である、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において機能的ニューロンを形成するためのベクターであって、前記ベクターが、
（a）リコンビナーゼ標的部位に挟まれたニューロン分化1（neuronal differentiation 1：NeuroD1）ポリペプチドをコードする反転（inverted）核酸配列、及び
（b）リコンビナーゼをコードする核酸配列
を含む、前記ベクター。
【請求項４４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクターである、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
前記NeuroD1ポリペプチドをコードする前記反転核酸配列がプロモーター配列に機能的に連結され、前記プロモーター配列が恒常的プロモーター配列である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４８】
前記恒常的プロモーター配列がCAGプロモーター配列を含む、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
前記リコンビナーゼをコードする前記核酸配列がプロモーター配列に機能的に連結され、前記プロモーター配列がアストロサイト特異的プロモーター配列である、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５０】
前記アストロサイト特異的プロモーター配列が、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）プロモーター配列を含む、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
前記リコンビナーゼがCreリコンビナーゼであり、かつ、前記リコンビナーゼ標的部位がLoxP部位である、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年2月2日に出願された米国特許出願第62/625,533号の利益を主張するものである。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる（また、参照により本出願に組み込まれる）。
【０００２】
連邦支援に関する声明
本発明は、米国国立医薬品食品衛生研究所によって授与されたAG045656及びMH083911の下で、政府の支援を得て行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（１．技術分野）
本書は、哺乳動物において脳損傷を処置するための方法及び材料に関する。例えば、本書は、ニューロン分化1（NeuroD1）ポリペプチドをコードする核酸を用いて、生きた哺乳動物（例えば、ヒト）の脳内において（例えば、ニューロン：グリア比を再平衡化（rebalance）するために）、脳（例えば、脳の大脳皮質）の中の反応性アストロサイトを、機能的なニューロンに変換するための方法及び材料に関する。
【背景技術】
【０００４】
（２．背景情報）
中枢神経系（CNS）はニューロンとグリア細胞の両方を含み、正常な脳機能を維持するために微妙なバランスを形成している。CNS損傷は、神経細胞の脱落又はグリア瘢痕（glial scar）のいずれかとの関連で研究されることが多い。数十年の研究にもかかわらず、成体哺乳動物のCNSにおける神経損傷後の新たなニューロンの生成は困難である（Cregg et al., 2014 Exp Neurol 253:197-207；He et al., 2016 Neuron 90:437-451；及びYiu et al., 2006 Nat Rev Neurosci 7:617-627）。グリア瘢痕は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）及びリポカリン-2（LCN2）などの神経抑制因子、並びにTNFα及びインターロイキン-1β（IL-1β）などの炎症性サイトカインを蓄積することにより、神経再生において、物理的障害になるだけでなく、化学的障害にもなる（Ferreira et al., 2015 Prog Neurobiol 131:120-136；Koprivica et al., 2005 Science 310:106-110；及びSilver et al., 2004 Nat Rev Neurosci 5:146-156）。
【発明の概要】
【０００５】
（要約）
本書は脳内で機能的なニューロンを生成するための方法と材料を提供する。例えば、本書は、脳内（例えば、大脳皮質内）のアストロサイト（例えば、反応性アストロサイト）を機能的なニューロン（例えば、生きた哺乳動物（例えば、ヒト）の脳内に機能的に組み込まれ得るニューロン）に変換するために、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を使用するための方法及び材料を提供する。場合によっては、本明細書で提供される材料及び方法を、脳損傷を処置するために使用することができる。例えば、NeuroD1が媒介するアストロサイト−ニューロン（AtN）変換は、反応性アストロサイトの機能的なニューロンへの変換、ニューロン：グリア比の再平衡化、損傷した脳組織の修復（例えば、グリア瘢痕組織を神経組織に戻すことによるグリア瘢痕組織の修復）、神経炎症の減弱、血液脳関門の回復、A1アストロサイトの形質転換（例えば、毒性A1アストロサイトの、より害の少ないアストロサイトへの形質転換）、及び/又は毒性M1ミクログリアの量の低下によって、脳損傷を処置するために（例えば、脳損傷の後に）使用することができる。
【０００６】
本明細書で示されるように、グリア−ニューロン変換は、ニューロン−グリア比を再平衡化し、グリア瘢痕を神経組織に戻す。運動皮質の反応性アストロサイトにおけるNeuroD1の異所性発現により、ニューロン変換の前に、グリア反応性を低下させ、毒性A1アストロサイトをより害の少ないアストロサイトに形質転換した。反応性アストロサイトをニューロンに変換することで、ミクログリアが媒介する神経炎症を減弱させ、血液脳関門を回復させ、また、損傷部位のシナプス密度を回復させた。
【０００７】
神経損傷はしばしば神経細胞の脱落とグリア細胞の増殖を引き起こし、脳内のニューロンとグリア細胞の微妙なバランスを崩壊させる。そのため、本書に記載されているように、反応性アストロサイトを機能的なニューロンに変換することが出来れば、独自の、かつ実現されたことのない脳傷害を処置する機会を提供することができる。
【０００８】
概して、本書の1つの態様は、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質においてグリア瘢痕組織を修復する方法を特徴とする。この方法は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を生きた哺乳動物の脳の大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、又は本質的にこれからなり、ここで、NeuroD1ポリペプチドはアストロサイトによって発現され、アストロサイトは大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、生きた哺乳動物の脳内のグリア瘢痕組織は神経組織に戻される。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の投与後に、大脳皮質では、グリア線維性酸性タンパク質（Gfap）、リポカリン-2（Lcn2）、及び/又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の発現が減少し得る。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の投与後に、大脳皮質では、アネキシンA2（Anax2）、トロンボスポンジン1（Thbs1）、グリピカン6（Gpc6）、及び/又は脳由来神経栄養因子（Bdnf）の発現が増加し得る。哺乳動物はヒトであってもよい。アストロサイトは反応性アストロサイトであってもよい。NeuroD1ポリペプチドは、ヒトNeuroD1ポリペプチドであってもよい。大脳皮質は運動皮質であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターの形でアストロサイトに投与してもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であってもよい。この方法はまた、大脳皮質内のアストロサイトにリコンビナーゼをコードする核酸を投与することも含んでいてもよく、ここで、リコンビナーゼポリペプチドはアストロサイトによって発現され、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸はリコンビナーゼ標的部位に挟まれている。リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであってもよく、リコンビナーゼ標的部位はLoxP部位であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は反転（inverted）核酸配列であってもよい。リコンビナーゼをコードする核酸は、アストロサイト特異的なプロモーター配列のようなプロモーター配列と機能的に連結していてもよい。アストロサイト特異的プロモーター配列は、GFAPのプロモーター配列を含んでもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、恒常的プロモーター配列などのプロモーター配列に機能的に連結していてもよい。恒常的プロモーター配列はCAGプロモーター配列を含んでもよい。投与には、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質への直接注射を含んでもよい。投与には、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、筋肉内又は経口投与を含んでもよい。
【０００９】
別の態様において、本書は、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質においてニューロン：グリア比を再平衡化する方法を特徴とする。この方法は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を生きた哺乳動物の脳の大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、又は本質的にこれからなり、ここで、NeuroD1ポリペプチドはアストロサイトによって発現され、アストロサイトは大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、生きた哺乳動物の脳においてニューロン：グリア比が増加する。ニューロン：グリア比は、アストロサイトの数を減少させることによって増加させてもよい。ニューロン：グリア比は、ニューロンの数を増加させることによって増加させてもよい。ニューロン：グリア比は、アストロサイトの数を減少させることと、ニューロンの数を増加させることとの両方によって増加させてもよい。哺乳動物はヒトであってもよい。アストロサイトは反応性アストロサイトであってもよい。NeuroD1ポリペプチドは、ヒトNeuroD1ポリペプチドであってもよい。大脳皮質は運動皮質であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターの形でアストロサイトに投与してもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であってもよい。この方法はまた、大脳皮質内のアストロサイトにリコンビナーゼをコードする核酸を投与することも含んでいてもよく、ここで、リコンビナーゼポリペプチドはアストロサイトによって発現され、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸はリコンビナーゼ標的部位に挟まれている。リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであってもよく、リコンビナーゼ標的部位はLoxP部位であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は反転（inverted）核酸配列であってもよい。リコンビナーゼをコードする核酸は、アストロサイト特異的なプロモーター配列のようなプロモーター配列と機能的に連結していてもよい。アストロサイト特異的プロモーター配列は、GFAPのプロモーター配列を含んでもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、恒常的プロモーター配列などのプロモーター配列に機能的に連結していてもよい。恒常的プロモーター配列はCAGプロモーター配列を含んでもよい。投与には、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質への直接注射を含んでもよい。投与には、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、筋肉内又は経口投与を含んでもよい。
【００１０】
別の態様において、本書は、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において神経炎症を減弱させる方法を特徴とする。この方法は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を生きた哺乳動物の脳の大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、又は本質的にこれからなり、ここで、NeuroD1ポリペプチドはアストロサイトによって発現され、アストロサイトは大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、生きた哺乳動物の脳において神経炎症が減弱する。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の投与後に、大脳皮質では、腫瘍壊死因子α（TNFa）、インターロイキン1β（IL-1b）、及び/又は指定分類68（CD68）の発現が減少し得る。哺乳動物はヒトであってもよい。アストロサイトは反応性アストロサイトであってもよい。NeuroD1ポリペプチドは、ヒトNeuroD1ポリペプチドであってもよい。大脳皮質は運動皮質であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターの形でアストロサイトに投与してもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であってもよい。この方法はまた、大脳皮質内のアストロサイトにリコンビナーゼをコードする核酸を投与することも含んでいてもよく、ここで、リコンビナーゼポリペプチドはアストロサイトによって発現され、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸はリコンビナーゼ標的部位に挟まれている。リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであってもよく、リコンビナーゼ標的部位はLoxP部位であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は反転（inverted）核酸配列であってもよい。リコンビナーゼをコードする核酸は、アストロサイト特異的なプロモーター配列のようなプロモーター配列と機能的に連結していてもよい。アストロサイト特異的プロモーター配列は、GFAPのプロモーター配列を含んでもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、恒常的プロモーター配列などのプロモーター配列に機能的に連結していてもよい。恒常的プロモーター配列はCAGプロモーター配列を含んでもよい。投与には、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質への直接注射を含んでもよい。投与には、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、筋肉内又は経口投与を含んでもよい。
【００１１】
別の態様では、本書は、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において血液脳関門を回復する方法を特徴としている。この方法は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を生きた哺乳動物の脳の大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、又は本質的にこれからなり、ここで、NeuroD1ポリペプチドはアストロサイトによって発現され、アストロサイトは大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、生きた哺乳動物の脳において血液脳関門が回復する。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の投与後に、大脳皮質では、血管においてAQP4シグナル伝達が増加し得る。哺乳動物はヒトであってもよい。アストロサイトは反応性アストロサイトであってもよい。NeuroD1ポリペプチドは、ヒトNeuroD1ポリペプチドであってもよい。大脳皮質は運動皮質であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターの形でアストロサイトに投与してもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であってもよい。この方法はまた、大脳皮質内のアストロサイトにリコンビナーゼをコードする核酸を投与することも含んでいてもよく、ここで、リコンビナーゼポリペプチドはアストロサイトによって発現され、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸はリコンビナーゼ標的部位に挟まれている。リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであってもよく、リコンビナーゼ標的部位はLoxP部位であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は反転（inverted）核酸配列であってもよい。リコンビナーゼをコードする核酸は、アストロサイト特異的なプロモーター配列のようなプロモーター配列と機能的に連結していてもよい。アストロサイト特異的プロモーター配列は、GFAPのプロモーター配列を含んでもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、恒常的プロモーター配列などのプロモーター配列に機能的に連結していてもよい。恒常的プロモーター配列はCAGプロモーター配列を含んでもよい。投与には、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質への直接注射を含んでもよい。投与には、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、筋肉内又は経口投与を含んでもよい。
【００１２】
別の態様では、本書は、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質においてA1アストロサイトを形質変換する方法を特徴とする。この方法は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、又は本質的にこれからなり、ここで、NeuroD1ポリペプチドはアストロサイトによって発現され、アストロサイトは大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、A1アストロサイトがより害の少ないアストロサイトに形質変換される。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の投与後に、大脳皮質では、グアニル酸結合タンパク質2（Gbp2）及び/又はセルピンファミリーGメンバー1（Serping1）の発現が減少し得る。哺乳動物はヒトであってもよい。アストロサイトは反応性アストロサイトであってもよい。NeuroD1ポリペプチドは、ヒトNeuroD1ポリペプチドであってもよい。大脳皮質は運動皮質であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターの形でアストロサイトに投与してもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であってもよい。この方法はまた、大脳皮質内のアストロサイトにリコンビナーゼをコードする核酸を投与することも含んでいてもよく、ここで、リコンビナーゼポリペプチドはアストロサイトによって発現され、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸はリコンビナーゼ標的部位に挟まれている。リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであってもよく、リコンビナーゼ標的部位はLoxP部位であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は反転（inverted）核酸配列であってもよい。リコンビナーゼをコードする核酸は、アストロサイト特異的なプロモーター配列のようなプロモーター配列と機能的に連結していてもよい。アストロサイト特異的プロモーター配列は、GFAPのプロモーター配列を含んでもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、恒常的プロモーター配列などのプロモーター配列に機能的に連結していてもよい。恒常的プロモーター配列はCAGプロモーター配列を含んでもよい。投与には、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質への直接注射を含んでもよい。投与には、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、筋肉内又は経口投与を含んでもよい。
【００１３】
別の態様において、本書は、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において毒性M1ミクログリアの量を低下させる方法を特徴としている。この方法は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を生きた哺乳動物の脳の大脳皮質内のアストロサイトに投与することを含み、又は本質的にこれからなり、ここで、NeuroD1ポリペプチドはアストロサイトによって発現され、アストロサイトは大脳皮質内で機能的なニューロンを形成し、生きた哺乳動物の脳において毒性M1ミクログリアの量が低下する。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の投与後に、毒性M1ミクログリアは、休止ミクログリアの形態を有し得る。哺乳動物はヒトであってもよい。アストロサイトは反応性アストロサイトであってもよい。NeuroD1ポリペプチドは、ヒトNeuroD1ポリペプチドであってもよい。大脳皮質は運動皮質であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターの形でアストロサイトに投与してもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であってもよい。この方法はまた、大脳皮質内のアストロサイトにリコンビナーゼをコードする核酸を投与することも含んでいてもよく、ここで、リコンビナーゼポリペプチドはアストロサイトによって発現され、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸はリコンビナーゼ標的部位に挟まれている。リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであってもよく、リコンビナーゼ標的部位はLoxP部位であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は反転（inverted）核酸配列であってもよい。リコンビナーゼをコードする核酸は、アストロサイト特異的なプロモーター配列のようなプロモーター配列と機能的に連結していてもよい。アストロサイト特異的プロモーター配列は、GFAPのプロモーター配列を含んでもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、恒常的プロモーター配列などのプロモーター配列に機能的に連結していてもよい。恒常的プロモーター配列はCAGプロモーター配列を含んでもよい。投与には、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質への直接注射を含んでもよい。投与には、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、筋肉内又は経口投与を含んでもよい。
【００１４】
別の態様において、本書は、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において機能的なニューロンを形成するための組成物を特徴とする。組成物は、リコンビナーゼ標的部位に挟まれたNeuroD1ポリペプチドをコードする反転（inverted）核酸配列を含む核酸ベクター、及びリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む核酸ベクターを含む、又は本質的にこれらからなる。リコンビナーゼ標的部位に挟まれたNeuroD1ポリペプチドをコードする反転（inverted）核酸配列を含む核酸ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする反転（inverted）核酸配列は、恒常的プロモーター配列などのプロモーター配列に機能的に連結していてもよい。恒常的プロモーター配列はCAGプロモーター配列を含んでもよい。リコンビナーゼをコードする核酸配列を含む核酸ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）である。リコンビナーゼをコードする核酸配列は、アストロサイト特異的プロモーター配列のようなプロモーター配列と機能的に連結していてもよい。アストロサイト特異的プロモーター配列は、GFAPのプロモーター配列を含んでもよい。リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであってもよく、リコンビナーゼ標的部位はLoxP部位であってもよい。
【００１５】
別の態様では、本書は、生きた哺乳動物の脳の大脳皮質において機能的なニューロンを形成するためのベクターを特徴とする。ベクターは、リコンビナーゼ標的部位に挟まれたNeuroD1ポリペプチドをコードする反転（inverted）核酸配列、及びリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、又は本質的にこれらからなる。ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であってもよい。NeuroD1ポリペプチドをコードする反転（inverted）核酸配列は、恒常的プロモーター配列などのプロモーター配列に機能的に連結していてもよい。恒常的プロモーター配列はCAGプロモーター配列を含んでもよい。 リコンビナーゼをコードする核酸配列は、アストロサイト特異的プロモーター配列のようなプロモーター配列と機能的に連結していてもよい。アストロサイト特異的プロモーター配列は、GFAPのプロモーター配列を含んでもよい。リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであってもよく、リコンビナーゼ標的部位はLoxP部位であってもよい。
【００１６】
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載されているものと類似の又は同等の方法及び材料を使用することができるが、適切な方法及び材料は以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、その全てが参照により組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書（定義を含む）が優先される。さらに、材料、方法、及び実施例はあくまで例示であり、限定する意図はない。
【００１７】
本発明の1以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、これら説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】重度の刺傷後のアストロサイトの顕著な増殖。（a）マウス運動皮質における重度の刺傷は、反応性アストロサイト及び組織の脱落を誘導した。上段は、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）::GFPマウスの、損傷なしの皮質組織における正常なアストロサイトを示す。複雑な突起を持ち、隣接するアストロサイトとは重なり合っていない。下段は、刺傷10日後（dps）の、マウス運動皮質における刺傷によって誘導された顕著な組織の脱落、及び多数の肥はん（hypertrophic）反応性アストロサイトを示す（スケールバー：100μm（左：低倍率（mag）パネル）、20μm（右：高倍率パネル））。定量的解析（右の棒グラフ）によって、刺傷後のアストロサイト数の増加が示される（NI：損傷なし、n = 4匹のマウス、*** P < 0.001、スチューデントのt検定）。（b）刺傷後のアストロサイトの増殖。10 dpsまでの間毎日、5-ブロモ-2′-デオキシウリジン（BrdU）をGFAP::GFPマウスに腹腔内注射した。多くのGFP+細胞がBrdU（赤色で染色）とGFAP（シアン色で染色）で共標識され、刺傷後のアストロサイトにおける細胞分裂を示した。定量的解析では、GFP+アストロサイトのうち38.7±2.5%がBrdU+であることがわかり、損傷部位での高い増殖率が示唆された（n = 4匹のマウス、スケールバー：50μm（左上）、10μm（右上と左下））。
【図２】レトロウイルスによるNeuroD1の過剰発現によって、刺傷後に、反応性アストロサイトは効率的にニューロンに変換された。4dpsに、CAG::NeuroD1-IRES-GFP又はCAG::GFP（対照）を担持するレトロウイルスを、刺傷した運動皮質に注射した。ウイルス注射14日後（dpi）にマウスを屠殺し、免疫染色に供した。GFP感染細胞はグリア形態を示し、NeuNは免疫陰性であったが（上段）、NeuroD1感染細胞の大部分はNeuN+ニューロンであった（下段）。右の棒グラフは、NeuroD1感染細胞の約90%がニューロンに変換されたことを示す（スケールバー：10μm）。
【図３】模式図は、AAV9 Cre-FLEX系の作業モデルを示す。GFAP::CreウイルスはアストロサイトでCreを発現し、ここでCreはFLEX-CAG::NeuroD1-P2A-mCherry（反転配列）のloxP型組換え部位で作用する。Creが媒介する組換えの後は、NeuroD1がCAGプロモーターの制御下で発現する。
【図４Ａ−Ｃ】NeuroD1が媒介するin vivo AtN変換によるニューロン：アストロサイト比のレスキュー（rescue）。（a）模式図は、マウス運動皮質における刺傷及びAAV注射と、続く様々な時点での解析を示す。NeuroD1処置の効果を評価するために、刺傷4日後（dps）に、GFAP::Creと、FLEX-CAG::NeuroD1-P2A-mCherry又はFLEX-CAG::mCherry-P2A-mCherry（対照）とを担持するアデノ随伴ウイルス血清型9（AAV9）を損傷部位に注射した。ウイルス注射3、7、又は14日後（dpi）にマウスを屠殺して解析した。NeuroD1-AAV9注射を受けた脳の切片では、運動皮質領域周辺に広範なウイルス感染が認められた（右上）。（b）NeuroD1は刺傷脳において反応性アストロサイトを効率的にニューロンに変換した。低倍率画像（左のパネル）は刺傷皮質における効率的なウイルス感染を示す（スケールバー：100μm）。高倍率画像（右のパネル）では、対照AAV感染細胞が明瞭なアストロサイト形態を有するのに対し（7 dpi）、NeuroD1-AAV感染細胞（矢尻）は、NeuroD1の発現レベルが高く（緑色染色）、ニューロン形態が認められることを示す。NeuNとGFAPとの共免疫染色により、mCherry対照AAV感染細胞（赤色染色）はGFAP+アストロサイト（上段、シアン色染色）であるのに対し、NeuroD1-AAV感染細胞（下段、矢尻）のほとんどはNeuN+ニューロン（マゼンタ色染色）であることが確認された。NeuroD1群のアストロサイト形態も対照群と比較して肥はん性が低くなった（スケールバー：20μm）。（c）NeuroD1変換領域において、アストロサイトは枯渇していない。対照AAV感染損傷領域では、肥はん形態を伴う強いGFAPシグナル（緑色染色）が認められた（上段、7 dpi）。対照的に、NeuroD1感染損傷領域ではGFAP発現が顕著に低下し、アストロサイト形態は、反応性が低く、健康なものに近かった（下段、矢尻）。重要なことに、アストロサイトは、多くのNeuroD1変換ニューロン（赤色染色）と共にこの領域に残っていた（スケールバー：200μm（低倍率）、20μm（高倍率））。定量的解析では、NeuroD1感染損傷領域において、GFAP強度とGFAPで覆われた領域の両方の有意な低下が明らかになった（右の棒グラフ）。NeuroD1群のGFAPシグナルは対照群の半分に低下したが、損傷なしの脳よりも依然として高く、アストロサイトがNeuroD1変換後にも枯渇しないことが示された（各群n = 4〜6匹のマウス、** P < 0.01、*** P < 0.001、二元配置分散分析の後、ボンフェローニ事後検定（Bonferroni post-hoc test）。
【図４Ｄ−Ｅ】NeuroD1が媒介するin vivo AtN変換によるニューロン：アストロサイト比のレスキュー（rescue）。（d）NeuroD1が媒介する細胞変換後のアストロサイト増殖の増加。細胞変換のタイムウィンドウ（time window）であるウイルス注射7〜14日後の間、BrdUをGFAP::GFPマウスに毎日投与し、細胞増殖を評価した。NeuroD1変換ニューロン（赤）の近傍に、BrdU（マゼンタ色染色）とGFP（緑色染色）とで共標識された多くの増殖中のアストロサイトが検出された（スケールバー：20μm）。定量的解析では、対照群と比較して、NeuroD1感染損傷領域における増殖中のアストロサイト（BrdU+/GFAP+）の数が有意に増加していることが明らかになった（n = 3匹のマウス、* P < 0.05、スチューデントのt検定）。（e）NeuroD1が媒介するAtN変換後のニューロン：アストロサイト比のレスキュー。左の画像は、損傷なしの脳、mCherry対照群及びNeuroD1群における、ニューロン（NeuN、赤色染色）及びアストロサイト（S100β、緑色染色；GFAP、シアン色染色）を示す（スケールバー：100μm）。定量的解析（右の棒グラフ）は、損傷なしの群、mCherry対照群及びNeuroD1群の、NeuN+ニューロン、及びGFAP+又はS100b+アストロサイトの数、並びにニューロン：アストロサイト比を示す。ニューロン：アストロサイト比は損傷なしのマウス運動皮質において4:1と測定されたが、刺傷後には0.6と有意に減少し、そしてNeuroD1が媒介するAtN変換により2.6に戻った（各群n = 3〜6匹のマウス、* P < 0.05、*** P < 0.001、二元配置分散分析及びシダック検定）。
【図５】ウイルス感染後の細胞変換効率の定量的解析。（a）NeuroD1感染細胞の大部分（90%）はNeuN+だがGFAP-であったのに対し、対照のmCherry AAV感染細胞はほとんどがGFAP+（80%）であった。NeuroD1が媒介するAtN変換は7〜14 dpiでほぼ完了した（各群n=4〜6匹のマウス、*** P < 0.001、二元配置分散分析の後、ボンフェローニ検定）。（b）代表的な画像は、刺傷後のマウス運動皮質における組織の脱落を示し、これがNeuroD1感染後に顕著に修復されたことを示す（スケールバー：100μm）。
【図６Ａ−Ｃ】NeuroD1によって、A1型の有害な反応性アストロサイトが神経細胞変換前の初期の時点で形質転換された。（a）定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）解析によって、刺傷後に反応性アストロサイト遺伝子であるGfap及びLcn2が劇的に増加するが、NeuroD1感染領域では有意に低下することが明らかになった（n = 4匹のマウス、** P < 0.01、*** P < 0.001、一元配置分散分析の後、シダック検定）。（b）毒性A1型アストロサイト特異的遺伝子であるグアニル酸結合タンパク質2（Gbp2）及びセルピンファミリーGメンバー1（Serping1）は、刺傷皮質において、損傷なしの皮質と比較して数百倍に上方制御（upregulate）されたが、NeuroD1感染皮質では著しく低下した（n = 4匹のマウス、*** P < 0.001、一元配置分散分析の後、シダック検定）。（c）qRT-PCRを用いたさらなる定量的解析では、NeuroD1感染皮質において、mCherry対照群と比較して、アストロサイトの機能遺伝子の有意な上方制御が明らかになった（* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、スチューデントのt検定）。
【図６Ｄ−Ｅ】NeuroD1によって、A1型の有害な反応性アストロサイトが神経細胞変換前の初期の時点で形質転換された。（d）代表的な画像は、対照AAV感染損傷部位であることを示す。神経損傷マーカーであるリポカリン-2（LCN2）の発現は高かった（上段、矢尻；3 dpi）。対照的に、NeuroD1感染細胞ではLCN2シグナルがはるかに低下した（下段、矢尻；スケールバー：20μm）。定量的解析（右の棒グラフ）では、対照AAV感染細胞と比較して、NeuroD1感染細胞におけるLCN2発現の低下が明らかになった（n = 3匹のマウス、* P < 0.05、スチューデントのt検定）。（e）代表的な画像では、対照AAV感染損傷部位の反応性アストロサイトにおいて、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の発現が高いのに対し（上のパネル、矢尻；7 dpi）、NeuroD1感染領域ではCSPGシグナルが顕著に低下していることが明らかになった（下のパネル；スケールバー：200μm（低倍率）、10μm（高倍率））。右の棒グラフは、対照群及びNeuroD1群におけるCSPGシグナルの定量的解析を示す（n = 3匹のマウス、* P < 0.05、スチューデントのt検定）。
【図７】AAV9 Cre-FLEX系を用いた刺傷領域におけるNeuroD1の高効率発現。（a）代表的な画像（左のパネル）は、刺傷皮質領域における広範なAAV感染を示す。定量的解析（右の棒グラフ）は、NeuroD1-mCherry感染細胞の約90%が高レベルのNeuroD1を発現していることを示す（スケールバー：100μm、*** P < 0.001、一元配置分散分析及びシダック検定）。（b）代表的な画像は、感染アストロサイトにおけるNeuroD1の初期発現を示す（3 dpi）。定量的には、NeuroD1-mCherry感染細胞のうち、92.8±2.8%がGFAP陽性アストロサイト（シアン色染色）であり、87.4±2.5%がNeuroD1陽性（緑色染色）である。
【図８】アストロサイトの感染後のGFAP発現低下におけるNeuroD1の初期効果。（a）定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって、NeuroD1-AAV感染3日後（dpi）にNeuroD1発現の劇的な増加が確認された（n = 4匹のマウス、*** P < 0.001、一元配置分散分析及びシダック検定）。（b）定量的RT-PCRの結果は、A2-アストロサイトマーカーであるS100a10又はTm4f1の発現に有意な変化はないことを示唆する（n = 4匹のマウス、統計的有意性なし、一元配置分散分析及びシダック検定）。（c）左の画像は、mCherry感染アストロサイト（上段、矢尻）と比較して、NeuroD1感染アストロサイト（下段、矢尻）における反応性の低い形態及びGFAP発現の少なさを示す。右の棒グラフに定量結果を示す。
【図９Ａ−Ｃ】NeuroD1処置はミクログリア炎症反応を減弱させた。（a）損傷なしの脳のミクログリア（Iba1、緑色染色）は網目状の分枝（ramified branch）を示したが（上段）、刺傷領域では肥はんアメーバ状形状を示した（中段、7 dpi）。しかし、NeuroD1感染損傷領域では、ミクログリアは再度網目状の形態に戻った（下段）。このようなミクログリアの形態的変化はアストロサイト（左列、GFAP::GFP標識）の形態的変化と一致した（スケールバー：20μm）。（b）代表的な画像は、3 dpiにおける、mCherry感染アストロサイト（左のパネル、赤色染色）又はNeuroD1-mCherry感染アストロサイト（右のパネル、赤色染色）と接触したミクログリアの形態（Iba1、緑色染色）を詳しく見た様子（close look）を示す。ミクログリアは、ニューロン変換の前の3 dpiという早い時期にNeuroD1感染アストロサイトに接触すると、明らかな形態的相違を示した（スケールバー：20μm）。下の棒グラフは、損傷なしの皮質組織と比較して、炎症因子である腫瘍壊死因子α（Tnfa）及びインターロイキン1β（Il1b）の遺伝子発現量が刺傷皮質で有意に増加したが、そのような増加がNeuroD1感染損傷領域（3 dpi）では大幅に低下したことを示す（n = 4匹のマウス、* P < 0.05、*** P < 0.001、一元配置分散分析の後、シダック検定）。（c）代表的な画像は、対照AAV感染損傷領域においてアメーバ様形態を有する一酸化窒素合成酵素（iNOS）で標識された多くの炎症性M1ミクログリアを示す（上のパネル、3 dpi）。対照的に、NeuroD1感染アストロサイトと密接したミクログリアははるかに低いiNOS発現と、網目状の形態を示した（下のパネル、矢印；3 dpi；スケールバー：10μm）。定量的解析は、NeuroD1感染細胞と密接したIba1+細胞のiNOSシグナルが有意に低下することを示す（各群n = 3〜4匹のマウス、*** P < 0.001、スチューデントのt検定）。
【図９Ｄ−Ｅ】NeuroD1処置はミクログリア炎症反応を減弱させた。（d）損傷なしの脳ではiNOSシグナルがなく（上のパネル）、刺傷皮質組織ではIba1及びiNOSシグナルが高い（中央のパネル、7 dpi）ことを示す代表的な画像である。しかし、NeuroD1感染皮質では、Iba1及びiNOSシグナルの両方が顕著に低下した（下のパネル、7 dpi；スケールバー：50μm）。定量的解析（右の棒グラフ）は、3、7及び14 dpiの、損傷なし（白色の棒）、mCherry対照（黒色の棒）、又はNeuroD1 AAV感染皮質（灰色の棒）におけるIba1及びiNOSの免疫蛍光シグナルを示す（** P < 0.01、*** P < 0.001、二元配置分散分析の後、ボンフェローニ事後検定、各群n = 5〜6匹のマウス）。（e）代表的な画像は、NeuroD1感染皮質組織において顕著に低下した、マクロファージマーカーである指定分類68（CD68）の免疫反応性を示す。（スケールバー：50μm）。右の棒グラフは定量的解析の結果を示し、3及び7 dpiでNeuroD1感染皮質（灰色の棒）においてCD68蛍光シグナルが有意に低下することが明らかになった（各群n = 5〜6匹のマウス、** P < 0.01、*** P < 0.001、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定）。
【図１０】マウス皮質では、刺傷後にミクログリア及びアストロサイトが活性化するが、成体神経新生（adult neurogenesis）が起きない。（a）代表的な画像は、刺傷4日後及び10日後の、損傷皮質領域周辺へのミクログリア（Iba1、赤色染色）の劇的な蓄積を示す。アストロサイト（GFP、緑色染色）もまた、損傷部位周辺で活性化された（スケールバー：200μm）。（b）刺傷マウス皮質におけるミクログリア及びアストロサイトの両方の増殖。刺傷後にBrdUを毎日投与した。代表的な画像は、多くのIba1+（緑色染色）細胞におけるBrdU（赤色染色）標識を示し、損傷後のミクログリアの高い増殖を示唆した（スケールバー：20μm）。（c）左の画像は損傷なしのGFAP::GFPマウス皮質における休止ミクログリア（シアン色染色）とアストロサイト（緑色染色）を示す。右の画像は、刺傷後（4 dps）に、アストロサイト（緑色染色）及びミクログリア（Iba1、シアン色染色）の両方がBrdU+であったことを示す。（d）刺傷後の成体マウス皮質における非常に低い内的な（internal）神経新生能力。刺傷後の内的な新生ニューロンを標識するために、BrdUを2日毎に1カ月間にわたって投与した。BrdU+細胞がNeuNと共標識されることはほとんどなく（<1%）、マウス皮質において内因性成体神経新生が非常に低いことが示された（スケールバー：20μm）。
【図１１Ａ−Ｂ】NeuroD1が媒介するin vivo細胞変換による刺傷後の血管及び血液脳関門の修復。（a）代表的な画像は、損傷なしのマウス皮質におけるアストロサイト−血管ユニットを示す。アストロサイト（GFAP::GFPで標識、緑色染色）は、血管（血管内皮細胞マーカーであるLY6Cで標識、マゼンタ色染色）の周りに終足（endfeet）を巻きつける。水チャンネルタンパク質アクアポリン4（AQP4、青色染色）は静止状態において、血管に巻きついたアストロサイトの終足に高度に密集（highly concentrating）していた（スケールバー：20μm）。（b）低倍率（上段）と高倍率（下段）の代表的な画像は、刺傷により崩壊した血管形態を示す。NeuroD1感染領域では、肥はん血管形態が部分的に戻っており、損傷なしの脳のものに近かった（スケールバー：100μm（低倍率）、20μm（高倍率））。
【図１１Ｃ−Ｄ】NeuroD1が媒介するin vivo細胞変換による刺傷後の血管及び血液脳関門の修復。（c）上段は、刺傷後のAQP4シグナル（緑色染色）の誤った局在（mislocalization）、及びアストロサイトの終足の血管からの脱離（detachment）（LY6C、マゼンタ色染色）を示す。AQP4シグナルは血管周辺に集中することなく実質組織（parenchyma tissue）全体に広がっていた。下段は、NeuroD1感染領域において、AQP4シグナル（緑色染色）が血管（LY6C、マゼンタ色染色）と再会合（re-associate）していたことを示す（スケールバー：100μm（低倍率）、20μm（高倍率））。（d）上段は、刺傷後の実質組織へのビオチンの顕著な漏出を示しており、血液脳関門（BBB）の完全性の崩壊が示唆された（7 dpi）。ビオチンのシグナルは血管の内側のみならず、血管の外側にも認められた。下段は、NeuroD1感染領域では、ビオチンはほとんどが血管の内側に限局していることを示しており、BBBの完全性の回復が示唆された（スケールバー：100μm（低倍率）、20μm（高倍率））。
【図１２Ａ−Ｂ】NeuroD1が媒介するAtN変換による機能的レスキュー。（a）左の画像は、樹状突起マーカーSMI32（緑色染色）が刺傷後に劇的に低下したが（中央のパネル）、NeuroD1感染損傷領域では顕著にレスキューされたことを示す（下のパネル）。NeuroD1変換された新しいニューロン（下のパネル、赤色染色）はSMI32により共標識され、新しく生成されたニューロンが神経修復に寄与していることが示された。右の棒グラフは、7及び14 dpiにおいてSMI32シグナルが部分的に回復したことを示す（スケールバー：20μm、各群n = 3〜4匹、*** p < 0.001、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定）。（b）NeuroD1が媒介する細胞変換による刺傷後のシナプス脱落のレスキュー。左の画像は、刺傷後にグルタミン酸作動性シナプス（Vglut1、赤色染色）及びGABA作動性シナプス（GAD67、緑色染色）の両方が顕著に減少したことを示す（中央のパネル、30 dpi）。しかし、NeuroD1処置の後、グルタミン酸作動性及びGABA作動性シナプスの両方が顕著な回復を示した（スケールバー：20μm）。右の棒グラフは定量的解析の結果を示す。NeuroD1処置損傷領域ではシナプス斑（puncta）の数と覆われた領域（covered area）の両方がレスキューされた（各群n = 4〜5匹のマウス、*** P < 0.001、二元配置分散分析及び事後検定）。
【図１２Ｃ】NeuroD1が媒介するAtN変換による機能的レスキュー。（c）電気生理学的解析により、NeuroD1変換ニューロンが機能的であることが示された。左の画像は、皮質スライスのNeuroD1-mCherry感染細胞に対して実施されたパッチクランプ記録を示す（30 dpi）。右のトレースは、大きなNa+及びK+電流、反復性（repetitive）活動電位、並びに興奮性（EPSC）及び抑制性（IPSC）シナプス後電流の典型的な記録を示す（n = 15細胞（3匹のマウスから））。
【図１２Ｄ】NeuroD1が媒介するAtN変換による機能的レスキュー。（d）NeuroD1が媒介するAtN変換による組織の脱落のレスキュー。上段は、刺傷によって誘導される皮質組織損傷を、損傷中心を横切る一連の脳切片（7 dpi）のニッスル染色で示す。下段は、NeuroD1群の組織の脱落がはるかに少ないことを示す（スケールバー：200μm）。右の線グラフは定量的解析の結果を示す。損傷領域全体にわたって、皮質組織の脱落はNeuroD1感染領域全体で有意にレスキューされた。クリスタルバイオレットのシグナルのない組織領域を定量した（n = 5匹のマウス、** P < 0.01、二元配置分散分析の後、ボンフェローニ事後検定）。
【図１３】図１３は、ヒトNeuroD1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）の一覧である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（詳細な説明）
本書は脳内で機能的なニューロンを生成するための方法と材料を提供する。例えば、本書は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を用いて、脳内のグリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）を、生きた哺乳動物（例えば、ヒト）の脳内で機能的なニューロンを形成するように誘因する（trigger）ための方法と材料を提供する。本明細書に記載の機能的なニューロンの形成には、脳内の反応性アストロサイトを機能的なニューロンに変換することを含み得る。本明細書で使用される「機能的なニューロン」という用語は、生きた哺乳動物（例えば、ヒト）の脳内に機能的に組み込まれたニューロンを指す。例えば、機能的なニューロンは、グルタミン酸作動性ニューロン及び/又はGABA作動性ニューロンであり得る。場合によっては、本明細書に提供される材料及び方法は、脳損傷を処置するために使用することができる。例えば、NeuroD1が媒介するアストロサイト−ニューロン（AtN）変換は、反応性アストロサイトの機能的なニューロンへの変換、ニューロン：グリア比の再平衡化、損傷した脳組織の修復（例えば、グリア瘢痕組織を神経組織に戻すことによるグリア瘢痕組織の修復）、神経炎症の減弱、血液脳関門の回復、A1アストロサイトの形質転換（例えば、毒性A1アストロサイトの、より害の少ないアストロサイトへの形質転換）、及び/又は毒性M1ミクログリアの量の低下によって、脳損傷を処置するために（例えば、脳損傷の後に）使用することができる。
【００２０】
任意の適切な哺乳動物を、本明細書に記載のように処置することができる。本明細書に記載のように処置することができる哺乳動物の例としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、及びマウスが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、生きた哺乳動物の脳内で機能的なニューロンを生成するために、哺乳動物を本明細書に記載のように処置することができる。場合によっては、脳損傷を有するヒトを本明細書に記載のように処置して、ヒトの損傷脳において機能的なニューロンを生成することができる。哺乳動物は、任意の適切な診断技術を用いて、脳損傷を有するものと判定することができる。例えば、神経学的試験、神経画像検査、神経心理学的評価、心電図（EKG）、認知検査、言語検査、行動検査、血液検査、及び/又は尿検査を実施することによって、哺乳動物（例えば、ヒト）が脳損傷を有することを判定することができる。
【００２１】
任意の種類の脳損傷を、本明細書に記載のように処置することができる。場合によっては、本明細書に記載のように処置される脳損傷は、後天性脳損傷（ABI）であってもよい。場合によっては、本明細書に記載のように処置される脳損傷は、外傷性脳損傷（TBI）であってもよい。本明細書に記載のように処置される脳損傷の例としては、脳震盪、挫傷、直撃‐対側衝撃損傷（coup-contrecoup injury）、びまん性軸索損傷、穿通（penetration）、爆傷（blast）、感染、遺伝子突然変異、及び昏睡が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、本明細書に記載のように処置される脳損傷は、反応性アストロサイトの存在を含んでもよい。場合によっては、本明細書に記載のように処置される脳損傷は、組織脱落を含んでもよい。脳損傷の原因の例としては、外傷、脳卒中、腫瘍、感染、薬物乱用、低酸素症、酸素欠乏症、動脈瘤、神経疾患、毒素、塞栓症、血腫、脳出血、遺伝性疾患、及び昏睡が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書に記載のように処置される脳損傷は、脳内の任意の適切な位置にあってよい。例えば、本明細書に記載のように処置される脳損傷は、大脳皮質（例えば、運動皮質、感覚皮質、及び関連皮質）、線条体、海馬、視床、視床下部、扁桃体、小脳、又は脳幹にあってよい。場合によっては、本明細書に記載のように処置される脳損傷は、哺乳動物（例えば、ヒト）の運動皮質にあってもよい。
【００２３】
本明細書に記載のように、NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸（例えば、NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸を含む組成物）を、反応性アストロサイトが機能的なニューロンを形成するように誘因する様式で、哺乳動物の脳内（例えば、大脳皮質内）の反応性アストロサイトに投与することによって哺乳動物（例えば、脳損傷を有する哺乳動物）を処置することができる。NeuroD1ポリペプチドの例としては、GenBank（登録商標）アクセッション番号NP_002491に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。場合によっては、NeuroD1ポリペプチドは、配列番号１（例えば、図１３を参照）に記載のものでもよい。NeuroD1ポリペプチドは、GenBank（登録商標）アクセッション番号NM_002500に記載の核酸配列によってコードされていてもよい。
【００２４】
生きた哺乳動物の脳内のグリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）にNeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸を送達するためには、任意の適切な方法を使用することができる。例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターのような1以上のベクターを用いて哺乳動物に投与してもよい。反応性アストロサイトに核酸（例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸）を投与するためのベクターは、適切な材料（例えば、パッケージング細胞株、ヘルパーウイルス、及びベクターコンストラクト）を用いて調製することができる。例えば、Gene Therapy Protocols （Methods in Molecular Medicine）, Jeffrey R. Morgan編, Humana Press, Totowa, NJ （2002）、及びViral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, Curtis A. Machida編, Humana Press, Totowa, NJ （2003）を参照。場合によっては、ウイルスベースのベクターを用いて、分裂細胞において核酸を発現させてもよい。場合によっては、ウイルスベースのベクターを用いて、非分裂細胞において核酸を発現させてもよい。場合によっては、ウイルスベースのベクターを用いて、分裂細胞及び非分裂細胞の両方において核酸を発現させてもよい。生きた哺乳動物の脳内の反応性アストロサイトにNeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸を送達するためのウイルスベースの核酸送達ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、及びパピローマウイルスなどの動物ウイルスに由来してもよい。場合によっては、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を反応性アストロサイトに送達するために、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型2ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス血清型5ウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はポックスウイルスベクターを用いてもよい。例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物に投与して、分裂細胞及び非分裂細胞の両方においてNeuroD1ポリペプチドを発現させることができる。
【００２５】
NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸に加えて、ウイルスベクターは、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された1以上の調節エレメント及び/又は1以上の部位特異的リコンビナーゼエレメントを含むことができる。本明細書中で使用される「機能的に連結された」とは、コードされたポリペプチドの発現を可能にするか又は促進するように、ベクター中の調節エレメントを核酸に対して（relative to）配置することを指す。調節エレメントの例としては、核酸の発現（例えば、転写又は翻訳）を調節する、プロモーター配列、エンハンサー配列、反応エレメント、シグナルペプチド、内部リボソーム侵入配列、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、又は誘導性エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。部位特異的組み換えエレメントの例としては、核酸の部位特異的な組み換えをモジュレートする、リコンビナーゼ（例、Creリコンビナーゼ）、組み換え標的部位（例、LoxP部位）、又はflip-excision（FLEx）スイッチが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターに含まれ得るエレメントの選択は、限定するものではないが、誘導性、標的化（targeting）、所望の発現量、及び所望の組み換え部位を含むいくつかの因子に依存する。例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の転写を促進するために、プロモーターをウイルスベクターに含めることができる。プロモーターは、恒常的であっても、又は誘導的（例えば、テトラサイクリンの存在下で）であってもよく、そして全身的又は組織特異的な様式でポリペプチドをコードする核酸の発現に影響し得る。グリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）におけるNeuroD1ポリペプチドの発現を駆動するために使用できる細胞特異的及び/又は組織特異的プロモーターの例としては、NG2、GFAP、Olig2、CAG、EF1a、Aldh1L1、及びCMVプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、CAGプロモーターをウイルスベクターに含めて、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の転写を促進することができる。例えば、loxP型組み換え部位は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸の配列（例えば、反転配列）を挟んでウイルスベクターに含めることができる。場合によっては、GFAPプロモーターをウイルスベクターに含めて、アストロサイトにおいてリコンビナーゼをコードする核酸の転写を促進することができる。
【００２６】
場合によっては、本明細書に記載の方法は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸とリコンビナーゼ（例えば、Creリコンビナーゼ）をコードする核酸との両方を用いて行うことができる。場合によっては、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸及びリコンビナーゼをコードする核酸を同じウイルスベクター上に配置することができる。このような場合、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクターなど）であってもよい。場合によっては、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸及びリコンビナーゼをコードする核酸を別のウイルスベクター上に配置し、それぞれ別のウイルスベクターをグリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）に投与することができる。このような場合、それぞれ別のウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス血清型9ウイルスベクター）であり得る。例えば、第一のウイルスベクターは、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された恒常的なCAGプロモーターの反転配列であって、この反転配列がloxP部位に挟まれているものを含むことができ、第二のウイルスベクターは、Creリコンビナーゼに機能的に連結されたアストロサイト特異的なGFAPプロモーターを含むことができる。この場合、GFAPプロモーターは、アストロサイトにおいて、Creリコンビナーゼの転写を駆動することができ、ここでCreが媒介する組み換えが、強力で恒常的なCAGプロモーターによって駆動されるNeuroD1の高い発現をもたらす。
【００２７】
場合によっては、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸（例えば、NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸を含む組成物）を、非ウイルスベクターを用いて哺乳動物に投与することができる。核酸送達のための非ウイルスベクターの使用方法は、別の所に記載されている。例えば、Gene Therapy Protocols （Methods in Molecular Medicine）, Jeffrey R. Morgan編, humana Press, Totowa, NJ （2002）を参照。例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子（例えば、プラスミド）の直接注射によって、及び/又は、脂質、ポリマー、若しくはナノスフェアと複合体化した核酸分子を投与することによって、哺乳動物に投与することができる。場合によっては、CRISPR/Cas9が媒介する遺伝子編集（例えば、米国特許第8,697,359号；8,771,945号；8,871,445号；8,795,965号；9,738,908号；9,809,814号；9,803,194号；9,725,714号；9,410,198号；及び9,260,752号を参照）又はTALEN遺伝子編集（例えば、米国特許第8,586,363号；8,450,471号；8,440,431号；及び8,440,432号を参照）などのゲノム編集技術を用いて、NeuroD1ポリペプチドをコードする外因性核酸を細胞内に導入し、及び/又は細胞内の内因性NeuroD1遺伝子の発現を活性化することができる。
【００２８】
場合によっては、生きた哺乳動物の脳内のグリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）にNeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸を送達することにより、グリア細胞内での効率的なNeuroD1発現をもたらすことができる。例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むウイルスベクターに感染した反応性アストロサイトの約10%〜約95%（例えば、約10%〜約90%、約10%〜約85%、約10%〜約80%、約10%〜約75%、約10%〜約60%、約10%〜約50%、約10%〜約35%、約20%〜約95%、約30%〜約95%、約40%〜約95%、約50%〜約95%、約60%〜約95%、約70%〜約95%、約80%〜約95%、約90%〜約95%、約20%〜約85%、約25%〜約75%、約30%〜約65%、又は約40%〜約55%）が、NeuroD1を発現することができる。例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むウイルスベクターに感染した反応性アストロサイトの約90〜95%（例えば、92.8±2.8%）が、NeuroD1を発現することができる。
【００２９】
NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸は、限定するものではないが、分子クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、化学的核酸合成技術、及びこのような技術の組み合わせを含む技術によって製造することができる。例えば、PCR又はRT-PCRは、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ゲノムDNA又はRNA）を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用することができる。
【００３０】
場合によっては、NeuroD1ポリペプチド（例えば、NeuroD1ポリペプチドを含む組成物）を、NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸に加えて、又はその代わりに投与することができる。例えば、NeuroD1ポリペプチドを哺乳動物に投与して、脳内の反応性アストロサイトを機能的なニューロンを形成するように誘因することができる。
【００３１】
NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸（又はNeuroD1ポリペプチド）は、ナノ粒子、及び/又は薬物錠剤、カプセル剤、若しくは丸剤で、直接頭蓋内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、又は経口投与によって、脳内（例えば、大脳皮質内）のグリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）に送達することができる。NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸（又はNeuroD1ポリペプチド）は、任意の適切な方法（例えば、注射）によって、脳内（例えば、大脳皮質内）のグリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）に送達することができる。
【００３２】
本明細書に記載されるように、NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸（例えば、NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸を含む組成物）を、脳損傷を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、脳損傷を処置することができる。例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、血清型9アデノ随伴ウイルスベクター）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計することができ、この設計されたウイルスベクターは、脳損傷を有するヒトに投与して脳損傷を処置することができる。場合によっては、NeuroD1が媒介するAtN変換は、グリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）の機能的なニューロンにへの変換、ニューロン：グリア比の再平衡化、損傷した脳組織の修復（例えば、グリア瘢痕組織を神経組織に戻すこと）、神経炎症の減弱、血液脳関門の回復、及び/又は毒性M1ミクログリアの量の低下によって、脳損傷を処置することができる。場合によっては、NeuroD1が媒介するAtN変換は、NeuroD1ポリペプチドを発現するように設計された核酸の投与後、約7〜約14日を要し得る。場合によっては、NeuroD1が媒介する効果（例えば、反応性アストロサイトの機能的なニューロンへの変換、ニューロン：グリア比の再平衡化、損傷した脳組織の修復（例えば、グリア瘢痕組織を神経組織に戻すこと）、神経炎症の減弱、血液脳関門の回復、A1アストロサイトの形質転換、及び/又は毒性M1ミクログリアの量の低下）は、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を送達した後、又はNeuroD1ポリペプチドを含む組成物を送達した後、約3日で観察され得る。場合によっては、反応性アストロサイトがニューロンに変換される前に、反応性アストロサイトの中でNeuroD1が媒介する効果を観察することができる。
【００３３】
場合によっては、本明細書で提供される方法並びに材料（例えば、脳損傷を有する哺乳動物（例えば、ヒト）への、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸の投与、及び/又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの投与）は、グリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）の機能的なニューロンへの変換に使用することができる。例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むウイルスベクターに感染した反応性アストロサイトの約50%〜約95%（例えば、約50%〜約90%、約50%〜約85%、約50%〜約80%、約50%〜約75%、約50%〜約65%、約60%〜約95%、約70%〜約95%、約75%〜約95%、約80%〜約95%、約85%〜約95%、約90%〜約95%、約60%〜約90%、約65%〜約85%、又は約70%〜約80%）で、NeuroD1が媒介するAtN変換が起こり得る。場合によっては、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むウイルスベクターに感染した反応性アストロサイトの約85〜約98%（例えば、90.6±5.2%）で、NeuroD1が媒介するAtN変換が起こり得る。場合によっては、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むウイルスベクターに感染した反応性アストロサイトの約80〜約98%（例えば、89.2±4.7%）で、NeuroD1が媒介するAtN変換が起こり得る。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、約200の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2（例えば、約200の機能的なニューロン/mm2〜約775の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約750の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約725の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約700の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約650の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約600の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約550の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約500の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約450の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約400の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約350の機能的なニューロン/mm2、約200の機能的なニューロン/mm2〜約300の機能的なニューロン/mm2、約150の機能的なニューロン/mm2〜約400の機能的なニューロン/mm2、約250の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約300の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約350の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約400の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約450の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約500の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約550の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約600の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約650の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約700の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約750の機能的なニューロン/mm2〜約800の機能的なニューロン/mm2、約250の機能的なニューロン/mm2〜約750の機能的なニューロン/mm2、約300の機能的なニューロン/mm2〜約725の機能的なニューロン/mm2、約350の機能的なニューロン/mm2〜約700の機能的なニューロン/mm2、約400の機能的なニューロン/mm2〜約650の機能的なニュー���ン/mm2、約450の機能的なニューロン/mm2〜約600の機能的なニューロン/mm2、又は約500の機能的なニューロン/mm2〜約550の機能的なニューロン/mm2）を形成し得る。場合によっては、NeuroD1が媒介するAtN変換は、NeuroD1感染の後に、約150〜約300（例えば、219.7±19.3）の機能的なニューロン/mm2を形成し得る。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、NeuroD1感染後に、神経機能を補助するアストロサイト遺伝子（例えば、アネキシンA2（Anax2）、トロンボスポンジン1（Thbs1）、グリピカン6（Gpc6）、及び脳由来神経栄養因子（Bdnf））の発現が増加した機能的なニューロンを形成し得る。場合によっては、NeuroD1が媒介するAtN変換の後にアストロサイトが枯渇しない。場合によっては、NeuroD1が媒介するAtN変換に続いて、アストロサイトが再増殖する（例えば、内的な増殖能によって）。
【００３４】
場合によっては、本明細書で提供される方法及び材料（例えば、脳損傷を有する哺乳動物（例えば、ヒト）への、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸（又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の投与）は、ニューロン：グリア比の再平衡化に使用することができる。脳損傷後には、ニューロン：アストロサイト比が低下する（例えば、実施例１を参照）。場合によっては、NeuroD1感染後のNeuroD1が媒介するAtN変換は、哺乳動物の脳内のニューロン：グリア比を増加させることができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、アストロサイトの数を減少させることによってニューロン：グリア比を増加させることができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、ニューロンの数を増加させることによってニューロン：グリア比を増加させることができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、アストロサイトの数を減少させること、及びニューロンの数を増加させることの両方によってニューロン：グリア比を増加させることができる。
【００３５】
場合によっては、本明細書で提供される方法並びに材料（例えば、脳損傷を有する哺乳動物（例えば、ヒト）への、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸の投与、及び/又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの投与）は、損傷した脳組織の修復（例えば、グリア瘢痕組織を神経組織に戻すこと）に使用することができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、汎反応性アストロサイト遺伝子（例えば、Gfap）のような、損傷において上方制御されるアストロサイト遺伝子、並びに/又は損傷脳におけるグリア瘢痕と関連するマーカー（例えば、Lcn2及びCSPG）の発現の減少を誘導することができる（例えば、損傷なしの脳における同じアストロサイト遺伝子の典型的な発現と相対的に）。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、損傷脳におけるニューロン機能を補助するアストロサイト遺伝子（例えば、Anax2、Thbs1、Gpc6、及びBdnf）の発現の増加を誘導することができる（例えば、損傷なしの脳における同じアストロサイト遺伝子の典型的な発現と相対的に）。
【００３６】
場合によっては、本明細書で提供される方法並びに材料（例えば、脳損傷を有する哺乳動物（例えば、ヒト）への、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸の投与、及び/又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの投与）は、神経炎症の減弱に使用することができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、損傷脳におけるサイトカイン（例えば、TNFa及びIL-1b）、並びに/又はマクロファージ及び単球のマーカー（例えば、CD68）の発現の減少を誘導することができる（例えば、損傷なしの脳における同じサイトカインの典型的な発現と相対的に）。
【００３７】
場合によっては、本明細書で提供される方法並びに材料（例えば、脳損傷を有する哺乳動物（例えば、ヒト）への、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸の投与、及び/又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの投与）は、血液脳関門の回復に使用することができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、哺乳動物の脳において、損傷脳において血管に沿ったAQP4の発現の増加（例えば、AQP4シグナル伝達の増加）を誘導することができる（例えば、損傷なしの脳における血管に沿ったAQP4の典型的な発現と相対的に）。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、哺乳動物の脳において、損傷脳と血管との間でAQP4シグナル伝達の増加を誘導することができる。
【００３８】
場合によっては、本明細書で提供される方法並びに材料（例えば、脳損傷を有する哺乳動物（例えば、ヒト）への、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸の投与、及び/又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの投与）は、A1アストロサイトの形質転換（例えば、毒性A1アストロサイトのより害の少ないアストロサイトへの形質転換）に使用することができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、損傷脳におけるA1アストロサイトに特徴的な遺伝子（例えば、Gbp2及びSerping1のような毒性A1型アストロサイト特異的な遺伝子）の発現の減少を誘導することができる（例えば、損傷なしの脳におけるA1アストロサイトに特徴的な同じ遺伝子の典型的な発現と相対的に）。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、損傷脳におけるGbp2及び/又はSerping1の発現の減少を誘導することができる。
【００３９】
場合によっては、本明細書で提供される方法並びに材料（例えば、脳損傷を有する哺乳動物（例えば、ヒト）への、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸の投与、及び/又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの投与）は、ミクログリアの低下（例えば、毒性M1ミクログリアの量の低下）に使用することができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、休止ミクログリアの形態を有する機能的なニューロンを形成することができる。例えば、NeuroD1が媒介するAtN変換は、哺乳動物の脳内のミクログリアの形態を戻すことができる（例えば、哺乳動物の脳内のミクログリアの形態を休止ミクログリアの形態に戻すことができる）。
【００４０】
場合によっては、アミノ酸配列に1〜10個（例えば、10個、1〜9個、2〜9個、1〜8個、2〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、2個、又は1個）のアミノ酸の付加、欠失、置換、又はそれらの組合せを含む、配列番号１に記載のアミノ酸配列全体を含むポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）を本明細書に記載のように使用することができる。例えば、1〜10個のアミノ酸の付加、欠失、置換、又はそれらの組合せを伴う、配列番号１に記載のアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、脳損傷を有するヒトに投与して脳損傷を処置することができる。
【００４１】
配列番号１に記載の任意の適切なアミノ酸残基を欠失させることができ、任意の適切なアミノ酸残基（例えば、従来型の（conventional）20アミノ酸残基のいずれか、又はオルニチン若しくはシトルリンのような他の型のアミノ酸のいずれか）を、配列番号１に記載の配列に付加するか、又は配列内で置換することができる。天然に存在するアミノ酸の大部分はL-アミノ酸であり、天然に存在するポリペプチドはほとんどL-アミノ酸から構成される。D-アミノ酸はL-アミノ酸の鏡像異性体である。場合によっては、本明細書で提供されるポリペプチドは、1以上のD-アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ε-アミノヘキサン酸；水酸化アミノ酸（3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、(5R)-5-ヒドロキシ-L-リシン、アロ‐ヒドロキシリシン、及び5-ヒドロキシ-L-ノルバリンなど）；又はグリコシル化アミノ酸（単糖（例えば、D-グルコース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-グルコサミン、及びD-ガラクトサミン）又は単糖の組み合わせを含むアミノ酸など）などの化学構造を含むことができる。
【００４２】
アミノ酸置換は、場合によっては、（a）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（b）特定の部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は（c）側鎖の嵩（bulk）、の維持における効果に顕著な違いのない置換を選択することによって行うことができる。例えば、天然に存在する残基は側鎖の特性に基づいて群に分けることができる：（1）疎水性アミノ酸（ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン）；（2）中性親水性アミノ酸（システイン、セリン、及びトレオニン）；（3）酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；（4）塩基性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、及びアルギニン）；（5）鎖の配向性に影響するアミノ酸（グリシン及びプロリン）；並びに（6）芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニン）。これらの群内で行われる置換は、保存的置換と考えることができる。本発明において配列番号１に対して使用することができる置換（例えば、1〜10個のアミノ酸置換）の非限定的な例としては、バリンのアラニンへの、リシンのアルギニンへの、グルタミンのアスパラギンへの、グルタミン酸のアスパラギン酸への、セリンのシステインへの、アスパラギンのグルタミンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、プロリンのグリシンへの、アルギニンのヒスチジンへの、ロイシンのイソロイシンへの、イソロイシンのロイシンへの、アルギニンのリシンへの、ロイシンのメチオニンへの、ロイシンのフェニルアラニンへの、グリシンのプロリンへの、トレオニンのセリンへの、セリンのトレオニンへの、チロシンのトリプトファンへの、フェニルアラニンのチロシンへの、及び/又はロイシンのバリンへの置換が挙げられるが、これらに限定されない。配列番号１内の任意の適切な位置で行うことができる保存的置換のさらなる例を表１に記載する。
【００４３】
【表１】
2021512095.tif 000003
【００４４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列（ただし、1つ以上の非保存的置換を含む）を含むように設計することができる。非保存的置換は、典型的には、上述のうちの1つの群のメンバーを別の群のメンバーに交換することを必要とする。あるアミノ酸変化によって機能的ポリペプチドが得られるかどうかは、例えば、本明細書中に開示される方法を使用して、ポリペプチドの比活性をアッセイすることによって決定することができる。
【００４５】
場合によっては、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも85%（例えば、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99.0%）の配列同一性を有し、但し配列番号１に関して少なくとも1つの相違（例えば、少なくとも1つのアミノ酸付加、欠失、又は置換）を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90%〜99%の間の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するように設計された核酸を、脳損傷を有するヒトに投与して脳損傷を処置することができる。
【００４６】
配列同一性の割合%は、アラインメントされたアミノ酸配列中の一致した位置の数を決定し、一致した位置の数をアラインメントされたアミノ酸の総数で割り、そして100をかけることによって計算される。一致した位置とは、アラインメントされたアミノ酸配列の同じ位置に同一のアミノ酸が生じる位置を指す。また、任意の核酸配列についても、配列同一性の割合%を決定することができる。
【００４７】
特定の核酸又はアミノ酸配列と、特定の配列識別番号（例えば、配列番号１）によって参照される配列との間の配列同一性の割合%は、以下のように決定される。まず、BLASTN（バージョン2.0.14）及びBLASTP（バージョン2.0.14）を含むスタンドアローン版のBLASTZ由来のBLAST 2配列（Bl2seq）プログラムを用いて、核酸又はアミノ酸配列を特定の配列識別番号で記載される配列と比較する。このスタンドアローン版のBLASTZは、fr.com/blast又はncbi.nlm.nih.gov.においてオンラインで入手することができる。Bl2seqプログラムの使用方法を説明する説明書は、BLASTZに添付のリードミーファイルに記載されている。Bl2seqは、BLASTN又はBLASTPアルゴリズムのいずれかを用いて、2つの配列間の比較を実施する。BLASTNは核酸配列の比較に用いられるのに対し、BLASTPはアミノ酸配列の比較に用いられる。2つの核酸配列を比較するためには、選択項目は以下のように設定する：-iは比較する第1の核酸配列を含むファイルに設定する（例えば、C:\seq1.txt）；-jは比較する第2の核酸配列を含むファイルに設定する（例えば、C:\seq2.txt）；-pはblastnに設定する；-oは任意の望ましいファイル名に設定する（例えば、C:\output.txt）；-qは-1に設定する；-rは2に設定する；そして他の全ての選択項目はそれらの初期設定のままにする。例えば、以下のコマンドを使用して、2つの配列間の比較を含む出力ファイルを生成できる：C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q - 1 -r 2。2つのアミノ酸配列を比較するためには、Bl2seqの選択項目は以下のように設定する：-iは比較する第1のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、C:\seq1.txt）に設定する；-jは比較する第2のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、C:\seq2.txt）に設定する；-pはblastpに設定する；-oは任意の望ましいファイル名（例えば、C:\output.txt）に設定する；そして他の全ての選択項目はそれらの初期設定のままにする。例えば、以下のコマンドを使用して、2つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを生成できる：C: \Bl2seq -i c: \seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt。比較した2つの配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルには、それらの相同領域はアラインメントされた配列として提示されるであろう。比較された2つの配列が相同性を共有していない場合、指定された出力ファイルにはアラインメントされた配列は提示されない。
【００４８】
アラインメントした後、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が両方の配列中に提示される位置の数を数えることによって、一致の数が決定される。配列同一性の割合%は、一致の数を、識別配列（例えば、配列番号１）に記載の配列の長さで割り、続いて得られた値に100をかけることによって決定される。例えば、配列番号１に記載の配列とアラインメントしたときに340の一致を有するアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列と95.5%同一である（つまり、340÷356×100 = 95.5056）。配列同一性の割合%の値は、最も近い1/10に丸められる（rounded）ことに注意されたい。例えば、75.11、75.12、75.13、及び75.14は75.1に切り捨てるのに対し、75.15、75.16、75.17、75.18、及び75.19は75.2に切り上げる。また、長さの値は常に整数であることにも注意されたい。
【００４９】
特定の例（instance）において、哺乳動物（例えば、生きた哺乳動物）内の脳（例えば、大脳皮質）をモニターして、本明細書に記載の処置の有効性を評価することができる。任意の適切な方法を用いて、哺乳動物内に存在する脳損傷が処置されるかどうかを決定することができる。例えば、画像化技術及び/又は試験室アッセイを用いて、哺乳動物の脳内に存在する反応性アストロサイト数及び/又は機能的なニューロンの数を評価することができる。場合によっては、画像化技術及び/又は試験室アッセイを用いて、任意のNeuroD1が媒介する効果（例えば、グリア細胞（例えば、反応性アストロサイト）の機能的なニューロンへの変換、ニューロン：グリア比の再平衡化、損傷した脳組織の修復（例えば、グリア瘢痕組織を神経組織に戻すこと）、神経炎症の減弱、血液脳関門の回復、A1アストロサイトの形質転換、及び/又は毒性M1ミクログリアの量の低下）が観察されるかどうかを評価することができる。場合によっては、画像化技術及び/又は試験室アッセイは、NeuroD1が媒介する効果を評価するために、実施例１に記載されているように使用することができる。
【００５０】
また、本明細書中に記載のNeuroD1ポリペプチドをコードする核酸を使用することを含むキット（例えば、IL-6、IL-8、及びEGFを阻害する抗癌剤）も本明細書において提供される。場合によっては、キットは、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸とリコンビナーゼ（例えば、creリコンビナーゼ）をコードする核酸とを含んでもよい。例えば、キットは、同じベクター（例えば、ウイルスベクター）上に位置する、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸とリコンビナーゼをコードする核酸とを含んでもよい。例えば、キットは、別のウイルスベクター上に位置する、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸とリコンビナーゼ（例えば、creリコンビナーゼ）をコードする核酸とを含んでもよい。また、キットは、本明細書に記載の任意の方法を実施するための説明書を含んでもよい。場合によっては、キットは、本明細書に記載の任意の組成物（例えば、NeuroD1ポリペプチドをコードする核酸、及び任意でリコンビナーゼをコードする核酸を含む組成物）を少なくとも1用量含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の任意の組成物を投与するための手段（例えば、注射器）を提供することができる。
【００５１】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１：NeuroD1が媒介するアストロサイト‐ニューロン変換によってグリア瘢痕を神経組織に戻す
この実施例では、in vivoにおけるグリア‐ニューロン変換を調べる。マウス運動皮質における重度の刺傷モデルを用いて、損傷脳の微小環境に対する細胞変換の影響を調べた。反応性アストロサイトを死滅させたときの結果とは異なり、反応性アストロサイトをニューロンに変換することで、グリア瘢痕を神経組織に戻した。アストロサイトは神経変換後に枯渇せず、むしろ変換後に再増殖した。反応性アストロサイトにおけるNeuroD1の異所性発現は、A1型毒性アストロサイトをより反応性の低いアストロサイトに変換した。反応性ミクログリアもまた改善され、NeuroD1が媒介するアストロサイト‐ニューロン（AtN）変換後に神経炎症が減弱した。さらに、AtN変換後に、血液脳関門（BBB）は回復し、神経のシナプス結合は再確立した。したがって、本実施例で提供される結果は、NeuroD1が媒介する細胞変換が、損傷後のニューロン：グリア比の再平衡化により、グリア瘢痕を神経組織に戻すことができることを実証する。
【００５３】
（方法と材料）
刺傷のマウスモデルとウイルス注射
動物の手順（precedure）は米国国立衛生研究所の動物保護ガイドラインに準拠して実施し、全ての実験プロトコールはペンシルベニア州立大学動物実験委員会（IACUC）の承認を受けた。野生型（WT）C57BL/6J及びFVB/N-Tg(GFAP::GFP) 14Mes/JトランスジェニックマウスはJackson Laboratoryから購入した。マウスを12時間の明/暗サイクルの中で飼育し、十分な食物と水を供給した。両方の性別の成体マウス（20〜30グラム）を3〜6か月齢で実験に動員した。マウス運動皮質は、一部改変して他の所に記載されているように鈍針（外径0.95mm）で損傷された（例えば、Bardehle et al., 2013 Nat Neurosci 16:580-586；Bush et al., 1999 Neuron 23:297-308；及びGuo et al., 2014 Cell Stem Cell 14:188-202を参照）。簡単に説明すると、ケタミン/キシラジン（100mg/kgケタミン；12mg/kgキシラジン）を腹腔内注射により投与した。麻酔下で、正中切開により頭蓋骨とブレグマ（bregma）を露出させたマウスを、定位装置に留置した。運動皮質の頭蓋骨に約1.2mmの穴を掘った（調整：ブレグマと相対的に、前後（AP）+1.0mm；内側‐外側（ML）±1.5mm）。鈍針（0.95mm）を背腹（DV）-1.8mmの深さまで各部位に留置し、3分間維持した（stay still）。刺傷後4又は10日（dps）で、マウスを無作為に、同じ部位へのNeuroD1又は対照のウイルス注射に供した。ウイルス注射の手順は、他の所に記載されているものと同様であり（例えば、Guo et al., 2014 Cell Stem Cell 14:188-202を参照）、5μLのマイクロシリンジ及び34ゲージ針（Hamilton）を用いて、各注射部位に1.5μLのAAV又はレトロウイルスを注入した。0.1mm/分の速度で徐々に針を上方に移動しながら、ウイルス注入速度は0.15μL/分で制御された。注射後、針をさらに3分間維持した後、完全に抜去（withdrawn）した。術後、自由運動が観察されるまで加熱パッド上でマウスを回復させた。マウスを単独飼育し、少なくとも1週間にわたり、毎日注意深くモニターした。
【００５４】
AAVベクターの構築
hGFAPプロモーターはpDRIVE-hGFAPプラスミド（InvivoGen Inc.）から入手し、pAAV-MCS（Cell Biolab）のMluIとSacIIの間に挿入してCMVプロモーターを置き換えた。Cre遺伝子は、Addgeneプラスミド番号40591（Dr.Albee Messingから入手）からPCR法によって入手し、pAAV MCSのEcoRI部位とSal1部位の間に挿入してpAAV-hGFAP::Creベクターを作製した。pAAV-FLEX-mCherry-P2A-mCherry及びpAAV-FLEX-NeuroD1-P2A-mCherryベクターを構築するために、NeuroD1又はmCherryをコードするcDNAを、他の所に記載されているように、レトロウイルスコンストラクトを用いたPCR法によって入手した（例えば、Guo et al., 2014 Cell Stem Cell 14:188-202を参照）。NeuroD1遺伝子をP2A-mCherryと融合させ、pAAV-FLEX-GFPベクター（Addgeneプラスミド番号28304）のKpn1部位とXho1部位の間にサブクローニングした。プラスミドコンストラクトはシーケンシングにより確認した。
【００５５】
AAVウイルスの生成
組み換えAAV血清型（stereotype）9は293AAV細胞（Cell Biolabs）で生成した。簡単に説明すると、三重のプラスミド（pAAV発現ベクター、pAAV9-RC（Cell Biolab）、及びpHelper（Cell Biolab））をポリエチレンイミン（PEI、直鎖状、MW 25,000）によってトランスフェクトした。トランスフェクション後72時間において、細胞を掻きとり（scrap）、遠心分離した。細胞ペレットをドライアイス/エタノールと37℃の水浴とに交互に留置して4回凍結融解をした。AAVライセートを、不連続イオジキサノール勾配（Beckman SW55Tiロータ）中で、54,000rpmで1時間の超遠心分離により精製した。ウイルスを含む層を採取した後、Milliporeアミコンウルトラ遠心フィルターで濃縮した。ウイルス力価は当初（initially）、QuickTiterTM AAV定量キット（Cell Biolabs）で測定した：hGFAP::Creは1.2×10^12 GC/mL、FLEX-NeuroD1-P2AmCherryは1.4×10^12 GC/mL、FLEX-mCherry-P2A-mCherryは1.6×10^12 GC/mLであった。
【００５６】
レトロウイルスの生成
pCAG::GFP-IRES-GFPのレトロウイルスベクターを入手した。マウスNeuroD1配列を上記ベクターに挿入してpCAG::NeuroD1-IRES-GFPベクターを作製した（Guo et al., 2014 Cell Stem Cell 14:188-202）。レトロウイルス粒子をパッケージングするために、標的ベクターを、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（VSV‐G）ベクターと共に、gpgヘルパーフリーヒト胎児腎（HEK）細胞に、PEIによってトランスフェクトした。レトロウイルス粒子の力価は約107粒子/mLと決定された。
【００５７】
組織の採取
脳試料は、他の所に記載されているように採取した（例えば、Guo et al., 2014 Cell Stem Cell 14:188-202を参照）。簡単に説明すると、麻酔のために、動物に2.5%アベルチンを注射した。人工脳脊髄液（ACSF）による経心潅流を実施し、全身的に血液を洗い流した。次に、脳を切り出し、免疫組織化学での使用のためには、脳を4%パラホルムアルデヒド（PFA）中で4℃で一晩、後固定した。RNA抽出での使用のためには、損傷部位周辺の脳組織（約1.5×1.5mm四方）を切り出し、-80℃で急速冷凍した。
【００５８】
免疫組織化学
固定後、Leica-1000ビブラトームを用いて40μm切片で脳組織を切断した。脳切片をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄後、PBS中の2% Triton X-100で1時間透過処理した。次に、脳切片をPBS中の5%正常ロバ血清及び0.3% Triton X-100で1時間ブロッキングした。一次抗体をブロッキング緩衝液に添加し、脳切片とともに4℃で一晩インキュベートした。一次抗体をPBSで3回すすいだ後、室温（RT）で2時間、二次抗体のインキュベーションをした。PBSで洗浄後、脳切片をDAPI（Invitrogen）を含む退色防止封入溶液でスライドガラス上に封入した。画像は共焦点顕微鏡（Olympus FV1000又はZeiss LSM800）で取得した。抗体特異性を確保するため、左右対照（side-by-side control）としての免疫染色には二次抗体のみを用いたが、目立った（distinct）シグナルは検出されなかった。
【００５９】
BrdU標識
脳損傷後の増殖性アストロサイトの標識のためには、GFAP-GFPトランスジェニックマウスを用い、1 dps〜4 dps又は10 dpsまでの間、BrdU（BrdU標識試薬、Invitrogen）の腹腔内注射を、0.1ml/10gの用量で毎日行った。変換後に新しく生成したアストロサイトを特徴付けるためには、BrdUを7〜14 dpiの間毎日投与した。DNA変性のために、固定した脳切片を37℃で30分間、2M HClによる処理に供した。PBSで5回洗浄後、脳切片を2% Triton-PBSで1時間透過させ、ブロッキング緩衝液（PBS中5%正常ロバ血清及び0.3% triton）中で、室温でさらに1時間インキュベートした。一次抗体をブロッキング溶液に混合し、脳切片と共に4℃で一晩インキュベートした。
【００６０】
クレシルバイオレット染色（ニッスル染色）
一連の冠状切片を採取し、組織の損傷の解析を行った。針損傷の中心を採取し、ゼロ点に設定した；損傷部位の前方と後方の2切片（200μm間隔）も選択した。脳切片をまずキシレン中に5分間留置し、その後アルコール（水中95%、70%、及び0%）で3分間ずつ一連の段階的な水和を行った。試料を60℃で8分間、クレシルバイオレート緩衝液（NaAc緩衝液中0.121mg/mLクレシルバイオレット酢酸、pH 3.5）に移した。完了すると、染色液をすすぎ、アルコール（0%、70%、95%、及び100%）で30秒間ずつ連続して脱水した。最後に、試料をキシレン中で1時間清澄化し（clear）、DPXマウンタント（Sigma-Aldrich）中に封入した。画像はOlympus BX61顕微鏡を用いて取得した。
【００６１】
RNA抽出と定量的リアルタイムPCR
RNA抽出はMacherey-NagelヌクレオスピンRNAキットを用いて行った。RNA濃度と純度はナノドロップで測定した。cDNA合成のためには、500ngのRNAをQuanta Biosciences qScript cDNA supermixと混合し、25℃で5分間、42℃で30分間、85℃で5分間インキュベートし、4℃で保持した。完了すると、cDNAをRNase/DNaseを含まない水で5倍に希釈した。リアルタイムqPCR用のプライマーは、Applied Biosystems Primer Expressソフトウェアを用いて設計し、IDTで合成した。qRT-PCRの各反応のために、6.25μLのSYBR Green Supermix （Quanta Biosciences PerfeCTa、ROX）、2μLのcDNA、及び3.75μLの水をよく混合し96ウェルプレート（Applied Biosystem Inc）に充填（load）した。Gapdhを内部対照として用いた。全ての比較は、健常マウス由来の損傷なしの皮質組織に対して行った。倍数変化の計算には比較Ct法を用いた。
【００６２】
BBB透過性試験
マウスを麻酔し、上記のようにACSFで潅流した後、PBS中0.5mg/mLのスルホ-NHS-LC-ビオチンを15mL加えた。免疫組織化学のためには、一次抗体インキュベーションの後、脳切片をFITCストレプトアビジン（1:800；PBS + 0.3% triton +2.5%正常ヤギ又はロバ血清で希釈）と共に室温で1時間インキュベートし、続いて通常の封入手順を行った。
【００６３】
電気生理学
脳切片記録は、他の所に記載されているように実施した（例えば、Guo et al., 2014 Cell Stem Cell 14:188-202を参照）。簡単に説明すると、NeuroD1-AAV注射の1ヵ月後に、マウスを2.5%アベルチンで麻酔し、次いでNMDGベースの切断溶液（（mMで）：93 NMDG、93 HCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、15グルコース、12 N-アセチル-L-システイン、5 アスコルビン酸ナトリウム、2 チオ尿素、3 ピルビン酸ナトリウム、7 MgSO4、0.5 CaCl2；pH 7.3〜7.4、300 mOsmo、95% O2 / 5% CO2でバブリング）で潅流した。300μm厚の冠状切片には、AAV注射された皮質領域周辺を、ビブラトーム（VT1200S、Leica、ドイツ）を用いて室温で切断した。切片を採取し、酸素添加NMDG切断溶液中で、33.0±1.0℃で10〜15分間インキュベートした。次に、切片を、95% O2 / 5% CO2で連続してバブリングした保持溶液（（mMで）：92 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、15 グルコース、12 Nアセチル-L-システイン、5 アスコルビン酸ナトリウム、2 チオ尿素、3 ピルビン酸ナトリウム、2 MgSO4、及び2 CaCl2）に移した。脳切片は、室温で少なくとも0.5時間、保持溶液中で回復させた。パッチクランプ記録のために、単一切片を記録チャンバーに移し、95% O2 / 5% CO2で飽和させた33.0±1.0℃の標準ACSF（（mMで）：124 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、10 グルコース、1.3 MgSO4、及び2.5 CaCl2）で連続潅流した。活動電位とイオン電流を記録するためには、ホールセルでの記録をピペット溶液（（mMで）：135K‐グルコネート、10 KCl、5 Na‐ホスホクレアチン、10 HEPES、2 EGTA、4 MgATP、及び0.3 Na2GTP含有；KOHでpH 7.3に調整、280〜290 mOsm）を用いて実施した。活動電位を引き出すために、電流クランプモデル（model）下で脱分極電流を注入した。自発性興奮性シナプス後電流（sEPSC）及び自発性抑制性シナプス後電流（sIPSC）を記録するためには、ピペット溶液は以下を含んだ（mMで）：120 Cs‐メタンスルホン酸塩、10 KCl、10 Na‐ホスホクレアチン、10 HEPES、5 QX-314、1 EGTA、4 MgATP、及び0.3 Na2GTP；KOHでpH 7.3に調整、280〜290 mOsm。細胞膜電位はsEPSC記録のためには-70mV（イオンチャネル型グルタミン酸受容体の反転電位）、sIPSC記録のためには0 mV（GABAA受容体の反転電位）でそれぞれ保持した。MultiClamp 700A増幅器でデータを収集し、pCLAMP10ソフトウェア（Molecular Devices）で解析した。
【００６４】
データ解析と統計
統計解析及び棒グラフにはPrism 6 GraphPadソフトウェアを用いた。2つのデータセットの比較のためには、スチューデントのt検定を行った。3つのデータセットの比較のためには、一元配置又は二元配置分散分析（ANOVA）を実施し、続いて事後検定を行った。統計学的有意性はp<0.05とした。データは平均値±標準誤差で示した。
【００６５】
抗体とプライマー
本研究で使用した抗体を表２に、本研究で使用したプライマーを表３に記載する。
【００６６】
【表２】
2021512095.tif 000004
【００６７】
【表３】
2021512095.tif 000005
【００６８】
（結果）
重度の刺傷モデルにおける、NeuroD1が媒介する高い効率のアストロサイト‐ニューロン変換
反応性グリア細胞は、単一の転写因子NeuroD1（Guo et al., 2014 Cell Stem Cell 14:188-202）によって、マウス脳内で直接的に機能的なニューロンに変換することができる。グリア瘢痕によって軸索再生が促進（aid）されるか、そしてアストロサイトの機能的なニューロンへの変換によって何らかの有害な作用が生じるかを明らかにするため、成体マウス（3〜6か月齢、両方の性別を含む）において重度の刺傷モデルを確立し、損傷領域の微小環境に対するNeuroD1が媒介するAtN変換の影響を調べた。具体的には、鈍針（外径0.95mm）を用いてマウス運動皮質に重度の刺傷を作製したところ、損傷部位において、反応性アストログリア増殖症と共に顕著な組織の脱落が誘導された（図１Ａ）。予想された通り、刺傷後10日（dps）で刺傷領域におけるアストロサイトの数が有意に増加した（図１Ａ、右の棒グラフ）。これは、細胞分裂中のブロモデオキシウリジン（BrdU）の取り込みによって示される、神経損傷後のアストロサイトの内的な増殖能力と一致する（図１Ｂ：BrdU+アストロサイト、38.7±2.5%；n = 4匹のマウス、10 dps）。
【００６９】
グリア細胞をニューロンに変換するために、他の所に記載されているように（例えば、Guo et al., 2014 Cell Stem Cell 14:188-202を参照）、NeuroD1を発現するレトロウイルスを分裂している反応性グリア細胞に使用した。グリア細胞におけるNeuroD1-GFPの効率的な（90.6±5.2%）異所性発現によって、それらはNeuN+ニューロンに変換されたが、対照群ではGFP感染細胞のいずれもNeuNによって同時標識されなかった（図２、n = 4匹のマウス）。高い変換効率にもかかわらず、レトロウイルスの注入中にたまたま分裂していたグリア細胞の数が限定されるため、レトロウイルス感染後に新たに変換されたニューロンの総数は限定されていた。AAVは分裂細胞と非分裂細胞の両方で標的遺伝子を発現できることから（Ojala et al., 2015 Neuroscientist 21:84-98）、治療的修復のために損傷部位において新たに変換されるニューロンの総数を増加させるため、より広範なウイルス感染と細胞変換を達成するためのAAV Cre-FLEX系を開発した。アストロサイト特異的に標的化するために、CreリコンビナーゼをアストロサイトプロモーターGFAPの制御下で発現させた（GFAP:::Cre）。Creは、別のAAVベクター（FLEX-CAG::NeuroD1-P2A-mCherry）においてCAGプロモーターの後ろでNeuroD1-P2A-mCherryの反転配列を挟んでいるloxP型組み換え部位に作用した（図３）。したがって、NeuroD1の発現は、GFAPプロモーターの活性が高い反応性アストロサイトを標的とし、その後のCreが媒介する組み換えにより、強力なプロモーターCAGによって駆動されるNeuroD1の高い発現が導かれた。このAAV Cre-FLEX系は、刺傷皮質領域におけるNeuroD1-mCherryの広範な発現によって示されるように、非常に効率的であった（図４Ａ）。ウイルス注射（4 dpsで注射）後7日（dpi）では、対照mCherry AAV感染細胞はほとんどがGFAP+アストロサイトであったが、NeuroD1-mCherry感染細胞の大部分はNeuN+ニューロンになっていた（図４Ｂ）。NeuroD1が媒介するアストロサイト‐ニューロン変換の効率は89.2±4.7%（7 dpi、n = 4匹のマウス）であったが、対照群ではmCherry AAV感染細胞の80%がアストロサイトであった（図５Ａ）。損傷領域におけるNeuroD1変換ニューロンの数は、14 dpiで219.7±19.3/mm2と定量された。総合すると、反応性アストロサイトにおいてNeuroD1を高発現させるAAV Cre-FLEX系を開発することにより、刺傷マウス皮質において高い効率のAtN変換が達成された。
【００７０】
変換後もアストロサイトは枯渇しなかった
高い効率のAtN変換によって、ニューロン変換後のアストロサイトの枯渇が生じるかどうかを明確にするためにGFAP染色を実施したところ、対照群と比較してNeuroD1群のGFAPシグナルの全体的な低下が観察された（図４Ｃ）。予想外なことに、GFAPシグナルが低下しただけでなく、アストロサイト形態がNeuroD1群において顕著な変化を示し、対照群と比較して肥はん突起がはるかに少ないことが示され、（図４Ｃ、左の画像の矢尻）NeuroD1変換領域のアストロサイトの反応性が低くなったことが示唆された。定量的解析によって、対照群では刺傷後にGFAPシグナルが有意に（5〜10倍）増加したが（図４Ｃ、黒色の棒）、NeuroD1感染領域では有意に（半分に）減少することが認められた（図４Ｃ、灰色棒）。NeuroD1群におけるGFAPシグナルの減少は、反応性アストロサイトのニューロンへの変換と一致していた。一方、NeuroD1感染領域においてGFAPシグナルが有意なレベルで検出されることから、反応性アストロサイトが変換後に枯渇しないことが示唆された。アストロサイトは内的な増殖能力を有するため、神経変換によって残りのアストロサイトの増殖が誘因されるかどうかを調査した。この考えを試験するために、対照群とNeuroD1群の両方で細胞増殖をモニターするため、細胞分裂の間にDNAに取り込まれ得るBrdUを7 dpi〜14 dpi（4 dpsでウイルス注射）の間毎日注射した（図４Ｄ、左の模式図）。興味深いことに、NeuroD1群におけるBrdU標識アストロサイトの数が対照群の3倍以上であることが分かった（図４Ｄ、右パネル及び定量用棒グラフ）。BrdU標識アストロサイトの多くはNeuroD1変換ニューロンに隣接しており（図４Ｄ、矢尻）、アストロサイトはAtN変換後に自己再生できることが示唆された。したがって、アストロサイトはAtN変換により枯渇せず、むしろ再増殖した。
【００７１】
変換後にニューロン：アストロサイト比は再平衡化した
脳機能はニューロンとグリア細胞の間の微妙なバランスに依存している。神経損傷の後、ニューロンは死滅するが、グリア細胞は増殖し、損傷領域におけるニューロン：グリア比の変化が導かれる。これは重度の刺傷モデルに明らかに反映され、健常なニューロン（NeuN+細胞）の数は損傷後に顕著に減少したが、アストロサイト（GFAP+/s100b+）の数は顕著に増加した（図４Ｅ）。興味深いことに、NeuroD1が媒介するAtN変換の後、NeuN+ニューロンは顕著に増加したが、アストロサイトの数は減少し（図４Ｅ）、損傷から明確に逆転した。定量的解析によって、マウス運動皮質のニューロン：アストロサイト比は休止条件で約4:1（4つのニューロン対1つのアストロサイト）であることがわかった（図４Ｅ、右の棒グラフの白色の棒）。刺傷後には、ニューロン：アストロサイト比は1未満に低下した（図４Ｅ、黒色の棒）。NeuroD1変換後には、ニューロン：アストロサイト比は14 dpiで2.6に戻った（図４Ｅ、灰色の棒）。このようなニューロン：アストロサイト比の有意な逆転は、損傷脳の機能的回復に関与し得る。
【００７２】
変換中にA1反応性アストロサイトは形質転換した
NeuroD1が媒介する変換後にアストロサイトが持続する（persist）か明らかにし、それらが対照群における反応性アストロサイトと異なるかどうかを評価するために、ニューロン変換前の初期段階である3 dpiにおいて、A1アストロサイト及び神経炎症に関する様々な遺伝子のRT-PCR解析を実施した。損傷なし（NI）の群と比較して、刺傷によってGfapなどの汎反応性アストロサイト遺伝子の37倍のアップレギュレーションが引き起こされ（図６Ａ）、NeuroD1群で有意に減弱した（一元配置分散分析、シダック検定、** P<0.01、n = 4対）。損傷後の反応性アストロサイトに関連する神経炎症マーカーであるLcn2は、刺傷後に700倍増加したが、NeuroD1群では劇的に低下した（図６Ａ、一元配置分散分析、シダック検定、*** P<0.001、n = 4対）。さらに、Gbp2やSerping1などのA1アストロサイトに特徴的な遺伝子は刺傷後に300〜900倍アップレギュレートされたが（一元配置分散分析、シダック検定、*** P<0.001、n = 4対）、NeuroD1処置後には大きく減弱した（図６Ｂ）。NeuroD1感染後の3 dpiでは、アストロサイトはまだ完全にニューロンに変換されていないため、この著しい変化は予想外であった（図７Ａ、Ｂ）。3 dpiでの免疫染色により、NeuroD1が実際に感染アストロサイトで発現していることが確認された（図７Ｂ：mCherry+細胞の87.4±2.5%がNeuroD1+；mCherry+細胞の92.8±2.8%がGFAP+；n = 6匹のマウス）。それにもかかわらず、神経変換の前にA1アストロサイトは既に阻害又は形質転換されていた。さらに、NeuroD1処置により、Anax2、Thbs1、Gpc6、Bdnfなどの神経機能を補助するアストロサイト遺伝子が増加したようであった（図６Ｃ）。このRT-PCRの結果の検証として、NeuroD1の過剰発現がRT-PCR解析によって確認された（図８Ａ）。NeuroD1感染後にGFAP発現が減少したにもかかわらず、A2アストロサイト遺伝子は変化しなかった（図８Ｂ、Ｃ）。
【００７３】
図６ＡのRT-PCR解析と一致して、NeuroD1陽性アストロサイトはまた、対照群の反応性アストロサイトと比較してLcn2の発現レベルが有意に減少した（図６Ｄ、スチューデントのt検定、* P<0.05、n = 3対）。さらに、CSPGは神経損傷後の反応性アストロサイトに広く関連し、グリア瘢痕形成中の神経抑制（neuroinhibition）に寄与していた。重度の刺傷モデルでは、損傷領域において高いレベルのCSPGが検出された（図６Ｅ、上段）；しかし、NeuroD1処置群では、CSPGのレベルは有意に低下した（図６Ｅ、下段；棒グラフで定量化、スチューデントのt検定、* P <0.05、n = 5対）。総合すると、これらの結果から、反応性アストロサイトにおけるNeuroD1の異所性発現によって、その反応性及び神経炎症性を有意に減弱されることが示唆された。重要なことに、アストロサイトがニューロンに変換される前であっても、NeuroD1感染後3日という早い時期にこのような有益な効果が生じた。
【００７４】
ニューロン変換中のアストロサイト‐ミクログリア相互作用
次に、ミクログリアに対するAtN変換の影響を調べた。損傷なしの脳の休止ミクログリア（図９Ａ、上段）と比較して、刺傷で誘導された反応性ミクログリアは肥はん性でアメーバ状形状であった（図９Ａ、中段）。BrdU標識（図１０Ａ‐Ｃ）で示されたように刺傷後はミクログリア、アストロサイトともに増殖性が高かったが、刺傷後の成体マウス皮質では新生ニューロンは検出されなかった（図１０Ｄ）。しかし、NeuroD1感染領域では、ミクログリア形態は戻り、網目状突起を有する休止ミクログリアに近かった（図９Ａ、下段）。このような形態的変化は、3 dpiという早い時期に始まり（図９Ｂ）、NeuroD1感染アストロサイトに接触したミクログリアは、mCherry感染アストロサイトに接触したミクログリアと比較して、反応性がはるかに低かった。RT-PCR解析によって、刺傷後にサイトカインであるTNFαとIL-1bはいずれも有意に増加したが、NeuroD1群ではいずれも減弱することが明らかになった（図９Ｂ、棒グラフ、一元配置分散分析の後、トゥーキー（Turkey）検定、* P<0.05、*** P<0.001、n = 4対）。AtN変換中のこのようなサイトカインの劇的な減少によって、NeuroD1群でミクログリアの反応性が低かった理由が説明できるかもしれない。これに一致して、iNOSに対して免疫陽性であった毒性M1ミクログリアは、対照群と比較してNeuroD1群で有意な減少を示した（図９Ｃ、スチューデントのt検定、*** P<0.001、n = 4対）。iNOS標識M1ミクログリアの低下は、NeuroD1感染後の3 dpiで検出されたような毒性A1アストロサイトの低下と合致しており、アストロサイトとミクログリアの間の密接な相互作用が示唆された。7 dpiでは、対照群と比較して、NeuroD1群におけるiNOSの低下はさらに顕著であり、Iba1シグナルの減少をも伴っていた（図９Ｄ、二元配置分散分析、** P<0.01、*** P<0.001、3 dpi及び7 dpiにはn = 6対、14 dpiにはn = 5対）。加えて、刺傷によって、マクロファージ及び単球、並びにいくつかの反応性ミクログリアのマーカーであるCD68の発現レベルの著しい増加が誘導された（図９Ｅ）。しかし、NeuroD1感染領域では、CD68の発現レベルが有意に減弱していた（図９Ｅ、棒グラフ、二元配置分散分析、** P<0.01、*** P<0.001、n = 6対）。総合すると、これらの結果から、アストロサイト‐ニューロン変換に伴い、毒性M1ミクログリアが低下し、神経炎症が緩和されたことが示唆された。
【００７５】
in vivo細胞変換中のアストロサイト‐血管相互作用
脳内でのアストロサイトの機能は、血管と相互作用して、血液脳関門（BBB）に寄与することで、細菌・ウイルス感染を予防し、化学的毒性を低下させることである（Obermeier et al., 2013 Nat Med 19:1584-1596）。健常な脳内では、アストロサイトの終足が血管の周りに巻きつくことにより、BBBが引き締められる（図１１Ａ）。損傷なしの脳における均等に分布した血管（内皮マーカーLy6Cで標識）と比較して（図１１Ｂ、左パネル）、刺傷によって血管は膨張した（図１１Ｂ、中央パネル）。しかし、NeuroD1処置群では、血管はより低い肥はん形態を示し、健常な脳のそれに近かった（図１１Ｂ、右パネル）。刺傷後の血管の形態変化に伴って、AQP4シグナルの誤った局在化によって明らかなように、BBBの破壊が認められた。AQP4は水チャンネルタンパク質であり、正常では血管の周りに巻きついた休止状態のアストロサイトの終足に集中する（図１１Ａを参照）。刺傷後、AQP4シグナルは血管から解離し、代わりに損傷領域全体に分布した（図１１Ｃ、上段）。NeuroD1処置領域では、AQP4シグナルは血管との再会合を示し、正常な状態に戻った（図１１Ｃ、下段）。また、NeuroD1処置群ではアストロサイト形態は反応性がはるかに低いように思われた（図１１Ｃ、下段）。BBBの完全性をさらに評価するために、BBBの破たん後に漏れ出しやすい分子であるビオチンでマウスを潅流した。刺傷後、mCherryだけを発現させた対照群では、損傷領域におけるビオチンの有意な漏出が観察された（図１１Ｄ、上段）。しかし、NeuroD1群では、ビオチンは主に血管の内側で検出され、実質組織における漏出は有意に減少しており（図１１Ｄ、下段）、BBBの完全性の回復が示された。総合すると、これらの結果から、NeuroD1が媒介する細胞変換の後、アストロサイトは再度血管と相互作用して、神経損傷によって引き起こされた破壊されたBBBを回復することが示唆された。
【００７６】
NeuroD1が媒介するニューロン変換後の機能的回復
NeuroD1が媒介するAtN変換後のグリア環境の実質的な変化と共に、損傷領域における樹状突起の形態、シナプス密度、電気生理学的機能などのニューロン特性を調べた。刺傷によって、樹状突起マーカーであるSMI32で示されるような重度の樹状突起損傷が生じた（図１２Ａ、左の画像、緑シグナル）。しかし、NeuroD1感染領域では、樹状突起シグナルSMI32の顕著な増加が検出された（図１２Ａ、下の画像）。定量的には、SMI32で標識されたニューロンの樹状突起は刺傷害後に重度に損傷し、損傷なしのレベルの25%にまで減少したが、NeuroD1処置によって、14 dpiに樹状突起シグナルが損傷なしのレベルの50%超にまでレスキューされた（図１２Ａ；棒グラフ、二元配置分散分析、*** P<0.001、n = 4対）。樹状突起損傷と一致して、刺傷によって、グルタミン酸作動性シナプスマーカーvGluT1及びGABA作動性シナプスマーカーGAD67によって示されるように、損傷領域におけるシナプスの重度の低下も引き起こされた（図１２Ｂ、左の画像）。NeuroD1処置後（30 dpi）、損傷領域におけるグルタミン酸作動性及びGABA作動性シナプスの密度はいずれも、対照群と比較して有意な増加を示した（図１２Ｂ、棒グラフ）。
【００７７】
次に、NeuroD1変換ニューロンが生理学的に機能するかどうかを調べた。皮質脳切片を作製し、NeuroD1-mCherry変換ニューロンでパッチクランプ記録を行った（図１２Ｃ、左の画像）。1か月間の変換後、NeuroD1‐mCherry陽性ニューロンは、大きなナトリウム及びカリウム電流（>5 nA）、並びに反復性活動電位を示した（図１２Ｃ、左のトレース）。さらに重要なことに、グルタミン酸作動性シナプス事象（周波数（frequency）：0.96±0.5Hz；振幅：24.4±6.3pA；保持電位 = -70mV）及びGABA作動性シナプス事象（周波数：0.74±0.16Hz；振幅：55.9±7.7pA；保持電位 = 0mV）の両方が記録され（図１２Ｃ、右のトレース）、図１２Ｂに示したvGluT1及びGAD67の免疫斑の回復と一致した。
【００７８】
重度の刺傷後における顕著な組織脱落が、様々な免疫染色解析中に観察されたが、NeuroD1処置群では著しい組織の修復が観察された（図１１Ｂ）。組織脱落のレベルを定量的に評価するために、mCherry対照群とNeuroD1処置群の両方において、損傷中心周辺の連続した皮質切片をNisslで染色した。Nissl染色によって、刺傷後にmCherry対照群の連続した脳切片にわたって大きな組織脱落が明らかになった（図１２Ｄ、上段）。対照的に、NeuroD1処置群では、全ての脳切片にわたって組織脱落がはるかに少なかった（図１２Ｄ、下段）。定量的には、NeuroD1群の損傷領域周辺の組織脱落は、対照群と比較して有意に（60%）減少した（図１２Ｄ、右線グラフ、二元配置分散分析、** P<0.01、n = 5対）。総合すると、これらの結果から、反応性アストロサイトのニューロンへの変換によって、組織脱落が有意に減少し、損傷脳の修復に成功したことが示唆された。
【００７９】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と組み合わせて記載してきたが、前述の説明の意図は例示であり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲を限定することではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修飾は、続く特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図９Ｄ−Ｅ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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