(57)【要約】  本発明は、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／又はブドウ球菌属細菌関連疾患を治療又は予防するための抗体に関する。とりわけ、本発明は、Ｓ．インターメディウス群細菌の感染症及び疾患に関する。さらには、本発明は、抗黄色ブドウ球菌α溶血素タンパク質抗体を含むそれぞれの医薬組成物及び医薬の製造方法に関する。【選択図】図２
2021518382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ球菌属細菌の感染症及び／又はブドウ球菌属細菌関連疾患の治療に使用するための天然に存在する抗体。
【請求項２】
ブドウ球菌属細菌の感染症及び／又はブドウ球菌属細菌関連疾患の予防において使用するための天然に存在する抗体。
【請求項３】
前記抗体が、天然に存在する抗体供給源から得られる請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、前記のとおりの分離されたブドウ球菌属細菌、分離されたその一部分、単離されたブドウ球菌属細菌タンパク質、及び／又は単離されたその一部分若しくは画分を用いた動物の免疫を伴わないプロセスによって得られるものである請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が組成物の中にあり、前記組成物の中の前記抗体の濃度が、前記抗体を得る由来の組成物と比較して高められている請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記天然に存在する抗体供給源が、分離されたブドウ球菌属細菌、分離されたその一部分、単離されたブドウ球菌属細菌タンパク質、及び／又は単離されたその一部分若しくは画分で免疫されなかった動物である請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がポリクローナル抗体である請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が局所投与により投与される請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌群の細菌由来である請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ブドウ球菌がＳ．インターメディウス群の細菌由来である請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、黄色ブドウ球菌のα毒素、β毒素、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＦ及び／又はＨｌｇＢと免疫反応性である請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
ブドウ球菌属細菌の感染症及び／若しくはブドウ球菌属細菌関連疾患の治療又は予防において使用するための、黄色ブドウ球菌α毒素、β毒素、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＦ、及びＨｌｇＢと免疫反応性であるポリクローナル抗体。
【請求項１３】
前記ブドウ球菌属細菌が抗生物質耐性株である請求項１２に記載のポリクローナル抗体。
【請求項１４】
前記動物がヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ又はウシ抗体であり、かつ／又は
前記抗体がウシの初乳又は乳汁から得られたものである請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記ブドウ球菌属細菌関連疾患が膿皮症である請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、アミノ酸配列ＡＴＫＱＱＳＮ、ＫＫＩＬＶＩＲＴＫ、ＩＤＶＩＹＥＲＶ、ＫＡＡＤＮＦＬＤＰ及び／又はＤＳＤＩＮＩＫを含むエピトープから選択される少なくとも１つのエピトープに結合する請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がイヌ、ネコ、ウマ又はヒトにおける感染症又は疾患の治療のためのものである請求項１から請求項１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記医薬組成物がヒドロゲルを含む請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
アミノ酸配列ＫＩＧＧＬＩＧ、ＡＴＫＱＱＳＮ、ＫＫＩＬＶＩＲＴＫ、ＩＤＶＩＹＥＲＶ、ＫＡＡＤＮＦＬＤＰ及び／又はＤＳＤＩＮＩＫを含むエピトープから選択される少なくとも１つのエピトープに結合する抗体であって、最も好ましくは、前記抗体は、少なくとも前記アミノ酸配列ＫＩＧＧＬＩＧを含む前記エピトープに結合してもよい抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／若しくはブドウ球菌属細菌関連疾患を治療又は予防するための抗体に関する。とりわけ、本発明は、スタフィロコッカス・インターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）群細菌の感染症及び疾患に関する。さらには、本発明は、それぞれの医薬組成物及び医薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）（Ｓ．シュードインターメディウス）は、グラム陽性でコアグラーゼ陽性の細菌である。それは、イヌにおいて皮膚及び粘膜に常在しており、臨床上のイヌ科動物の検体から分離される最も頻度が高い細菌性病原体である。
【０００３】
Ｓ．シュードインターメディウスは、スタフィロコッカス・インターメディウス（Ｓ．インターメディウス）群（ＳＩＧ）に属し、このＳ．インターメディウス群は、３つの別個の種、Ｓ．インターメディウス、Ｓ．シュードインターメディウス及びＳ．デルフィニ（Ｓ．ｄｅｌｐｈｉｎｉ）を含む。ＳＩＧ群はブドウ球菌属に属する。
【０００４】
Ｓ．シュードインターメディウスは、ほとんどのイヌの正常なマイクロバイオームに一部は存在する日和見病原体である。宿主の抵抗性が低下して、アトピー性皮膚炎、医療処置及び外科手技、並びに／又は免疫抑制障害若しくは引っ掻き及び噛みつきによる身体的傷害等の病因によって皮膚バリアが変化しない限りは、Ｓ．シュードインターメディウスは、何ら疾患を引き起こさない。しかしながら、これらの因子のうちの１つと一致すると、Ｓ．シュードインターメディウスは、いくつかの疾患の原因となる可能性があり、そのような疾患のうちで膿皮症が最も頻繁に現れる疾患である。イヌの膿皮症は、表在性毛包炎、深部毛嚢炎及びフルンケル症、細菌過剰症候群、化膿性外傷性毛包炎／フルンケル症（サテライト病変を伴う「ホットスポット」）、間擦疹（皮膚ひだ皮膚炎（ｓｋｉｎ  ｆｏｌｄ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ））、粘膜皮膚膿皮症、水疱性膿痂疹、肢端舐性肉芽腫及び毛包炎／フルンケル症、鼻内毛包炎及びフルンケル症、顎アクネ（鼻口部毛包炎及びフルンケル症）、ブドウ球菌属性の壊死性筋膜炎及びブドウ球菌トキシックショック様症候群（Ｓｃｈｍｉｄｔ、２０１０）等の臨床症状において観察される。臨床徴候としては、掻痒、紅斑、膿疱及び丘疹、小胞、潰瘍斑、小結節、出血性水疱、面皰、せつ（フルンケル）、びらん、潰瘍、浮腫、表皮襟及び痂皮性びらんが挙げられる。これらの病変は、疼痛を伴うことがあり、動物は、発熱及びリンパ節腫脹等の全身性疾病の徴候を示すこともある。さらなる症候としては、苔癬化、色素沈着過度及び鱗屑が挙げられる。
【０００５】
膿皮症に加えて、Ｓ．シュードインターメディウスは、イヌの耳感染症及び創傷感染症から分離されることも多く、歯肉炎、肝炎、呼吸器感染症、関節炎、腹膜炎、敗血症を引き起こすことがあり、免疫調節薬応答性リンパ球性形質細胞性足皮膚炎（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ−ｐｌａｓｍａｃｙｔｒｉｃ  ｐｏｄｏｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）の複雑な因子であることがある（Ｐｏｍｂａら、２０１７）。また、Ｓ．シュードインターメディウスは、イヌの尿路感染症から最も一般に分離される種である。Ｓ．シュードインターメディウスは、イヌにおける人工関節の後の感染症の原因因子として、及びイヌの壊死性筋膜炎の致命的な原因としても特定されている。
【０００６】
Ｓ．シュードインターメディウス感染症は、一般に、抗生物質による局所療法又は全身療法によって治療される。しかしながら、ＳＩＧ分離株の抗生物質感受性は様々であるということが示されており、このことが正しい抗生物質の選択に問題を引き起こす。一般に使用される抗生物質としては、第１世代の抗生物質としてヴァリセファドロキシル（ｖａｒｙｃｅｆａｄｒｏｘｉｌ）、セファレキシン、アモキシシリン・クラブラン酸、クリンダマイシン、リンコマイシン、テトラサイクリン類及びスルホンアミド類、第２世代の抗生物質としてセフォベシン、セフポドキシム、ジフロキサシン、エンロフロキサシン、マルボフロキサシン、オルビフロキサシン、フルオロキノロン類及びプラドフロキサシン、第３世代の抗生物質としてアミノグリコシド類、アジスロマイシン、セフタジジム、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、フロルフェニコール、イミペネム、ホスホマイシン、ピペラシリン、リファンピン、チアンフェニコール及びチカルシリンが挙げられる（Ｂｅｃｏら、２０１３）。
【０００７】
しかしながら、抗生物質療法の有効性は、抗生物質耐性のＳ．シュードインターメディウス群菌株又はさらには多剤耐性のＳ．シュードインターメディウス群菌株の発生によって妨げられる。メチシリン耐性（ＭＲＳＰ）株又はさらには少なくとも５つの抗菌薬のクラスに耐性がある可能性がある多剤耐性株が特定されている（Ｐｏｍｂａら、２０１７；Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、２００７）。
【０００８】
抗生物質耐性のＳ．シュードインターメディウスは、獣医学上の医療に主要な問題を引き起こすだけではなく、しばしば観察されているように細菌感染症のイヌからヒトへの伝染に起因して、ヒトにとっての健康リスクを表す。ヒトにおけるＳ．シュードインターメディウス感染症は、とりわけ心内膜炎、局所病変、菌血症、脳膿瘍又は肺炎についての原因として形成された（Ｌｏｚａｎｏら、２０１７）。
【０００９】
抗生物質耐性が頻繁に観察されるブドウ球菌属由来の別の病原菌種は、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、コンパニオンアニマルにおける創傷感染症の重要な原因であり（Ｗａｌｔｈｅｒら、２０１７）、ヒトにおける院内感染及び市中感染を引き起こす（Ｐｏｍｂａら、２０１７）。
【００１０】
ＭＲＳＡによって引き起こされる罹患率の上昇を考慮して、黄色ブドウ球菌毒素抗原に対するいくつかのワクチンが黄色ブドウ球菌感染と戦うために評価された。免疫のための抗原として試験されてきた１つの毒素は、黄色ブドウ球菌α溶血素（Ｈｌａ；α毒素としても知られる）である。α溶血素は、多量体化して膜貫通小孔を形成する溶血活性を有する膜傷害性の細胞外タンパク質である。Ｈｌａは、リンパ球、マクロファージ、肺胞上皮細胞、肺内皮及び赤血球に小孔を形成する（Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ及びＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、２００８）。α溶血素の溶血活性は、ヒスチジン３５をロイシンで置換（Ｈ３５Ｌ）することにより完全に弱化する。α溶血素の変異形態Ｈ４８Ｌ、Ｈ１４４Ｌ及びＨ２５９Ｌは低下した溶血活性を呈する（Ｍｅｎｚｉｅｓ及びＫｅｒｎｏｄｌｅ、１９９４）。Ｈｌａ（Ｈ３５Ｌ）というＨ３５Ｌ変異形態を用いた能動免疫は、マウスモデルにおいて、ブドウ球菌性肺炎に対して、抗原特異的免疫グロブリンＧ応答及び獲得された保護を生成することが示されている。さらには、Ｈｌａ特異的抗体の受動伝達は、黄色ブドウ球菌抗原接種に対して無感作の動物を保護した（Ｗａｄｅｎｂｕｒｇ及びＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、２００８）。しかしながら、他のブドウ球菌種に対する効果は示されていない。さらには、ワクチン手法は、すでに罹患している感染症の治療には好適ではなく、防御対策としてのみ役立つ。抗体の受動伝達には、大量の抗体が必要であり、さらには全身投与が必要である。従って、受動免疫は高価な療法であり、簡単には投与できない。受動伝達又は／及びポリクローナルの抗α溶血素抗体組成物の投与に基づく療法に関しては、それぞれの抗体組成物は、それぞれの抗原による免疫から又はモノクローナルのハイブリドーマからしか得ることができないということが主な短所である。それゆえ、これらの抗体は容易に得ることができず、比較的高価であり、このことは、治療費がふつうは医療保険の補償対象に入っていない動物の治療にとりわけ関係する。
【００１１】
Ｚａｋｏｕｒ及び共同研究者は、Ｓ．シュードインターメディウス菌株の全ゲノム配列を最初に報告した（Ｚａｋｏｕｒら、２０１１）。そのゲノムは、β溶血素、δ溶血素（溶血素ＩＩＩ）及びロイコトキシンＬｕｋ−Ｉの予測された相同体をコードするが、α溶血素又は他のロイコトキシンの相同体は開示されていない。
【００１２】
Ｓ．インターメディウス群細菌感染症の防御のためのいくつかのワクチンが当該技術分野で公知である。
【００１３】
国際公開第２０１０／０９４１０１Ａ１号パンフレットは、イヌにおける膿皮症の防御のためのワクチン組成物を開示する。このワクチン組成物は、Ｓ．インターメディウスの病原性因子、例えばプロテインＡ、コアグラーゼ、溶血素、エンテロトキシン及び表皮剥脱毒素を含む。β型及びδ型の溶血素は開示されているが、Ｓ．インターメディウスα溶血素、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＦ又はＨｌｇＢは抗原として開示されていない。開示された受動ワクチン組成物は、イヌにおいて膿皮症を予防するために好適である可能性はあるが、受動ワクチン組成物は、イヌにおいてすでに罹患した膿皮症を治療することには好適ではない。
【００１４】
米国特許出願公開第２０１２／０２８２２８９Ａ１号明細書は、ワクチン組成物において使用するためのいくつかのＳ．シュードインターメディウス表面抗原の使用を開示する。ＳｐｓＤ（黄色ブドウ球菌Ｍｕ５０のＦｎｂｐタンパク質相同体に対する相同性を有するタンパク質）、ＳｐｓＬ（黄色ブドウ球菌Ｍｕ５０のＦｎｂｐタンパク質相同体に対する相同性を有する別のタンパク質）及びＳｐｓＡ（黄色ブドウ球菌ＣＯＬのＬＰＸＴＧ細胞壁表面アンカーファミリータンパク質に対する相同性を有するタンパク質）由来のドメインを用いてワクチン接種を受けたマウスがＳ．シュードインターメディウスを用いた抗原接種の後に病変の減少を示した。しかしながら、開示されているのは感染の予防だけであり、すでに罹患した膿皮症の治療は開示されていない。
【００１５】
細菌抗原に特異的な抗血清を用いた腹腔内注入による受動免疫が、それ以降のそれぞれの病原菌株への感染に対して防御を生成する可能性があることは当該技術分野で公知である。
【００１６】
例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ及びＩｃｈｉｍａｎによる刊行物では、病原菌株に対する特異的免疫反応性を特徴とするヒト血清が、熱殺菌した病原菌細胞に結合することにより濃縮された。その濃縮された血清の腹腔内注入は、それ以降の細菌抗原接種に対して防御をもたらした。しかしながら、検討されたのは予防的処置だけであり、治療的処置ではなく、従って感染後の治療又はさらには感染の臨床徴候の発生後の治療は検討されなかった。さらには、著者らは腹腔内注入による投与（施用）だけを検討した（Ｙｏｓｈｉｄａ及びＩｃｈｉｍａｎ、１９８４）。
【００１７】
Ｋｅｎｎｅｄｙら（２０１０）は、ＭＲＳＡ菌株ＵＳＡ３００を用いたマウス感染モデルにおいて、腹腔内注入によりＨｌａ特異的ウサギ抗血清で前処置された動物が、ＵＳＡ３００黄色ブドウ球菌によるそれ以降の感染の際に、未処置の動物よりも重症度が軽い皮膚疾患を示したことを開示する。しかしながら、検討されたのは予防的処置だけであり、治療的処置ではなく、従って感染後の治療又はさらには皮膚病変の発生後の治療は検討されなかった。ここでも、著者らは、腹腔内注入による投与だけを検討したが、腹腔内注入は、ペットの所有者による投与にとって好適な投与経路ではない。さらには、免疫前の血清もいくらかの効果をもたらすことが認められた。しかしながら、免疫前の血清の効果についての対照は提供されなかった。
【００１８】
要約すれば、ブドウ球菌感染症、とりわけＳ．インターメディウス群細菌及び黄色ブドウ球菌に関連する感染症は、動物及びヒトの健康へのリスクを代表する。このリスクは、これらの細菌における抗生物質耐性の発生によってさらに高まる。現在の非抗生物質治療は、ブドウ球菌感染症の予防のための能動的又は受動的なワクチン接種に限られている。さらには、ブドウ球菌感染症の局所的治療のためにペットの所有者又はヒト患者によって習慣的に簡便に投与されることが可能な非抗生物質治療で利用可能なものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０９４１０１Ａ１号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／０２８２２８９Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｄ  Ｖ，  Ｃａｎｉｎｅ  ｐｙｏｄｅｒｍａ  Ｐａｒｔ  １：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．  ＵＫ  Ｖｅｔ．  ２０１０，１５（８）：１７−２１
【非特許文献２】Ｐｏｍｂａ  Ｃ，  Ｒａｎｔａｌａ  Ｍ，  Ｇｒｅｋｏ  Ｃ，  Ｂａｐｔｉｓｔｅ  ＫＥ，  Ｃａｔｒｙ  Ｂ，  ｖａｎ  Ｄｕｉｊｋｅｒｅｎ  Ｅ，  Ｍａｔｅｕｓ  Ａ，  Ｍｏｒｅｎｏ  ＭＡ，  Ｐｙｏｒａｌａ  Ｓ，  Ｒｕｚａｕｓｋａｓ  Ｍ，  Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｐ，  Ｔｅａｌｅ  Ｃ，  Ｔｈｒｅｌｆａｌｌ  ＥＪ，  Ｋｕｎｓａｇｉ  Ｚ，  Ｔｏｒｒｅｎ−Ｅｄｏ  Ｊ，  Ｊｕｋｅｓ  Ｈ，  Ｔｏｒｎｅｋｅ  Ｋ．  Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｓ．  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２０１７，７２（４）：９５７−９６８
【非特許文献３】Ｂｅｃｏ  Ｌ，  Ｇｕａｇｕｅｒｅ  Ｅ，  Ｌｏｒｅｎｔｅ  Ｍｅｎｄｅｚ  Ｃ，  Ｎｏｌｉ  Ｃ，  Ｎｕｔｔａｌｌ  Ｔ，  Ｖｒｏｏｍ  Ｍ．  Ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｋｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：  ｐａｒｔ  ２−−  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｈｏｉｃｅ，  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ．  Ｖｅｔ  Ｒｅｃ．  ２０１３，１７２（６）：１５６−６０
【非特許文献４】Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  Ａ，  Ｌｉｎｅｋ  Ｍ，  Ｍｏｏｄｌｅｙ  Ａ，  Ｇｕａｒｄａｂａｓｓｉ  Ｌ，  Ｓｕｎｇ  ＪＭ，  Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｍ，  Ｗｅｉｓｓ  Ｒ，  Ｌｌｏｙｄ  ＤＨ．  Ｆｉｒｓｔ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｒｅｓｉｓｔａｎｔ，  ｍｅｃＡ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ：  １２  ｃａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ｒｅｆｅｒｒａｌ  ｃｌｉｎｉｃ  ｉｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ．  Ｖｅｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００７，１８（６）：４１２−２１
【非特許文献５】Ｌｏｚａｎｏ  Ｃ，  Ｒｅｚｕｓｔａ  Ａ，  Ｆｅｒｒｅｒ  Ｉ，  Ｐｅｒｅｚ−Ｌａｇｕｎａ  Ｖ，  Ｚａｒａｚａｇａ  Ｍ，  Ｒｕｉｚ−Ｒｉｐａ  Ｌ，  Ｒｅｖｉｌｌｏ  ＭＪ，  Ｔｏｒｒｅｓ  Ｃ．  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｓｅｓ  ｉｎ  Ｓｐａｉｎ：  Ｄｏｇ−ｔｏ−Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｏｒｎｅ  Ｚｏｏｎｏｔｉｃ  Ｄｉｓ．  ２０１７，１７（４）：２６８−２７０．
【非特許文献６】Ｗａｌｔｈｅｒ  Ｂ，  Ｔｅｄｉｎ  Ｋ，  Ｌｕｂｋｅ−Ｂｅｃｋｅｒ  Ａ．  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１７，２００：７１−７８
【非特許文献７】Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  Ｊ，  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ  Ｏ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２００８，１８；２０５（２）：２８７−９４
【非特許文献８】Ｍｅｎｚｉｅｓ  ＢＥ，  Ｋｅｒｎｏｄｌｅ  ＤＳ．  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｏｘｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９４，６２（５）：１８４３−７
【非特許文献９】Ｚａｋｏｕｒ  ＮＬＢ，  Ｂａｎｎｏｅｈｒ  Ｊ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ  ＡＨ，  Ｔｈｏｄａｙ  ＫＬ，  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＪＲ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ２０１１，１９３（９）：２３６３−４
【非特許文献１０】Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｋ，  Ｉｃｈｉｍａｎ  Ｙ．  Ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｏｌｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒａ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９８４  Ｓｅｐ；２０（３）：４６１−４
【非特許文献１１】Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＡＤ，  Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  Ｊ，  Ｇａｒｄｎｅｒ  ＤＪ，  Ｌｏｎｇ  Ｄ，  Ｗｈｉｔｎｅｙ  ＡＲ，  Ｂｒａｕｇｈｔｏｎ  ＫＲ，  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ  Ｏ，  ＤｅＬｅｏ  ＦＲ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｏｒ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ＵＳＡ３００  ｓｋｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１０  Ｏｃｔ  １；２０２（７）：１０５０−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
先行技術を考慮して、先行技術の上記の短所を克服するための薬学的活性剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、組成物、方法及び使用を提供することが本発明の根底にある全般的な課題であった。とりわけ、すでに罹患したブドウ球菌関連の感染症及び疾患の非抗生物質治療を提供するために好適な薬剤、組成物及び方法が提供されるべきである。具体的には、Ｓ．インターメディウス群細菌関連の感染症及び疾患の治療又は予防のための薬剤、組成物及び方法が提供されるべきである。とりわけ、その薬剤及び組成物は、比較的低いコストで容易に入手できるべきである。さらには、その薬剤及び組成物は、簡便に投与できて安全であるべきである。
【００２２】
さらなる態様では、その薬剤及び組成物を投与するための好適な処方物が提供されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
驚くべきことに、本発明の根底にある上記課題は、請求項に係る抗体、組成物及び方法によって解決されるということが見出された。本発明のさらなる実施形態は、明細書の全体にわたって記載されている。
【００２４】
第１の態様では、本発明は、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／若しくはブドウ球菌属細菌関連疾患の治療又は予防において使用するための少なくとも１種の天然に存在する抗体に関する。好ましくは、この少なくとも１種の抗体はポリクローナル抗体である。
【００２５】
本発明に関しては、「天然に存在する抗体」は、自然の状態下で対象の中に存在する抗体である。本発明に関しては、「自然の状態」は、対象が抗原に対する抗体を産生するためにこの抗原で意図的に免疫されていない状態を指す。とりわけ、その対象は、分離されたブドウ球菌属細菌、分離されたその一部分、単離されたブドウ球菌属細菌タンパク質、及び／又は単離されたその一部分若しくは画分で免疫されていない。とりわけ、その対象は、組み換え細菌タンパク質、及び／又はその一部分で免疫されていない。ブドウ球菌属細菌の分離された一部分は、細菌細胞の濃縮又は分離された一部分若しくは画分、例えば小器官、サイトゾル、又は細胞／小器官膜画分を含む組成物であってもよい。
【００２６】
このように、本発明に係る抗体は、天然に存在する抗体供給源から得られてもよい。本発明によれば、「天然に存在する抗体供給源」は、上記のとおりの分離されたブドウ球菌属細菌、分離されたその一部分、単離されたブドウ球菌属細菌タンパク質、及び／又は単離されたその一部分若しくは画分で意図的に免疫されていない動物であってもよい。
【００２７】
従って、上記天然に存在する抗体は、上記のとおりの分離されたブドウ球菌属細菌、分離されたその一部分、単離されたブドウ球菌属細菌タンパク質、及び／又は単離されたその一部分若しくは画分を用いた動物の免疫を伴わないプロセスによって得られる抗体であってもよい。本発明に係るポリクローナル抗体は、組成物中、好ましくは液体組成物中の抗体であってもよく、その組成物に含まれる抗体の濃度は、その抗体を得た由来の（つまり、その抗体の供給源である）組成物と比較して高められている。好ましくは、その抗体を得た由来の組成物は、本明細書に記載される動物の体液である。好ましくは、上記抗体の本発明に係る抗体の濃度は、その抗体を得た由来の組成物の中の濃度と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１００００倍、少なくとも１０００００倍高められている。抗体の濃度を高めることは、本明細書に記載されるように、例えばクロマトグラフィーによって成し遂げられてもよい。
【００２８】
本発明によれば、ブドウ球菌細菌属は、少なくとも黄色ブドウ球菌（Ｓ．アウレウス）群；Ｓ．アウリクラーリス（ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）群、Ｓ．アウリクラーリス、Ｓ．カルノーサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）群、Ｓ．エピデルミディス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）群、Ｓ．ヘモリチカス（ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）群、Ｓ．ヒカス（ｈｙｉｃｕｓ）群、Ｓ．インターメディウス、Ｓ．ルグドゥネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）群、Ｓ．サプロフィチカス（ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）群、Ｓ．シウリ（ｓｃｉｕｒｉ）群、Ｓ．シミュランス（ｓｉｍｕｌａｎｓ）群、Ｓ．ワーネリ（ｗａｒｎｅｒｉ）群を含む。
【００２９】
本発明によれば、黄色ブドウ球菌群は、少なくともＳ．アルゲンテウス（ａｒｇｅｎｔｅｕｓ）、Ｓ．アウレウス（黄色ブドウ球菌）、Ｓ．シュバイツェリ（ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒｉ）及びＳ．シミアエ（ｓｉｍｉａｅ）を含む。Ｓ．アウリクラーリス群は、少なくともＳ．アウリクラーリスを含む。Ｓ．カルノーサス群は、少なくともＳ．カルノーサス、Ｓ．コンディメンティ（ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ）、Ｓ．マシリエンシス（ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ピスシフェルメンタンス（ｐｉｓｃｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｓ．シミュランスを含む。Ｓ．エピデルミディス群は、少なくともＳ．カピティス（ｃａｐｉｔｉｓ）、Ｓ．カプレ（ｃａｐｒａｅ）、Ｓ．エピデルミディス、Ｓ．サッカロリティカス（ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）を含む。Ｓ．ヘモリチカス群は、少なくともＳ．デブリエセイ（ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ）、Ｓ．ヘモリチカス、Ｓ．ホミニス（ｈｏｍｉｎｉｓ）を含む。Ｓ．ヒカス群は、少なくともＳ．アグネティス（ａｇｎｅｔｉｓ）、Ｓ．クロモゲネス（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．フェリス（ｆｅｌｉｓ）、Ｓ．ヒカス、Ｓ．ルトレ（ｌｕｔｒａｅ）、Ｓ．マクロティ（ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｓ．ムスセ（ｍｕｓｃａｅ）、Ｓ．ロストリ（ｒｏｓｔｒｉ）、Ｓ．スクレイフェリ（ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）を含む。Ｓ．ルグドゥネンシス群は、少なくともＳ．ルグドゥネンシスを含む。Ｓ．サプロフィチカス群は、少なくともＳ．アルレッテ（ａｒｌｅｔｔａｅ）、Ｓ．コーニー（ｃｏｈｎｉｉ）、Ｓ．エクオラム（ｅｑｕｏｒｕｍ）、Ｓ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｓ．クローシー（ｋｌｏｏｓｉｉ）、Ｓ．レーイ（ｌｅｅｉ）、Ｓ．ネパレンシス（ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、Ｓ．サプロフィチカス、Ｓ．サシナス（ｓｕｃｃｉｎｕｓ）、Ｓ．キシロサス（ｘｙｌｏｓｕｓ）を含む。Ｓ．シウリ群は、少なくともＳ．フレウレティ（ｆｌｅｕｒｅｔｔｉｉ）、Ｓ．レンタス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｓ．シウリ、Ｓ．ステパノビシー（ｓｔｅｐａｎｏｖｉｃｉｉ）、Ｓ．ビツリヌス（ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）を含む。Ｓ．シミュランス群は、少なくともＳ．シミュランスを含む。Ｓ．ワーネリ群は、少なくともＳ．パステウリ（ｐａｓｔｅｕｒｉ）、Ｓ．ワーネリを含む。Ｓ．インターメディウス群（ＳＩＧ）は、少なくとも種Ｓ．インターメディウス、Ｓ．シュードインターメディウス及びＳ．デルフィニを含むか、又はこれらからなる。
【００３０】
好ましい実施形態では、ブドウ球菌細菌は、黄色ブドウ球菌又はＳ．インターメディウス群の細菌由来であり、最も好ましくはＳ．インターメディウス群の細菌由来である。
【００３１】
本発明に関しては、ブドウ球菌属細菌感染症の感染又はブドウ球菌属細菌関連疾患を「治療又は予防すること」は、（ａ）感染、疾患又はその症候に罹りやすく、かつ／若しくはその感染、疾患又はその症候を獲得する可能性があるが、まだそれらを有していると診断されていない対象において、その感染、疾患若しくはその症候が発生することを防止するため、（ｂ）その感染若しくは疾患の症候を阻害するため、すなわちその進行を阻むため、又は（ｃ）その感染症又は疾患の症候を軽減又は解消するため、すなわちその感染、疾患若しくはその症候の退縮を引き起こすための、化合物又は組成物、具体的には本明細書に記載されるポリクローナル抗体及び組成物の投与に関する。
【００３２】
本発明に関しては、「ブドウ球菌属細菌関連疾患」は、ブドウ球菌属の細菌又はブドウ球菌属細菌の構成物若しくは産物によって、とりわけブドウ球菌属細菌によって発現される毒性タンパク質によって直接的に又は間接的に引き起こされる病態である。ブドウ球菌属細菌感染症又は関連疾患は、全身性又は現局性の感染症又は疾患であってよい。好ましくは、その状態は、黄色ブドウ球菌又はＳ．インターメディウス群の細菌によって引き起こされ、最も好ましくはＳ．インターメディウス群の細菌由来のものである。
【００３３】
驚くべきことに、分離されたＳ．シュードインターメディウス細菌、分離されたその一部分、単離されたＳ．シュードインターメディウスタンパク質、及び／又は単離されたその一部分若しくは画分で意図的に免疫されていない雌ウシ由来のポリクローナル抗体が、薬物耐性Ｓ．シュードインターメディウス細菌の表面に結合することが見出された。
【００３４】
実施例６で示されるように、上記のとおりの分離されたブドウ球菌属細菌、分離されたその一部分、単離されたブドウ球菌属細菌タンパク質、及び／又は単離されたその一部分若しくは画分で意図的に免疫されていない雌ウシ由来のポリクローナル抗体は、Ｓ．シュードインターメディウスが誘導する赤血球細胞溶解を、単離された組み換えＨｌａで免疫された雌ウシから得られたポリクローナル抗体と少なくとも同程度に阻害した。
【００３５】
さらには、実施例４は、驚くべきことに、単離された組み換えＨｌａで免疫された雌ウシから得られたポリクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌α溶血素と免疫反応性であるだけでなく、黄色ブドウ球菌β溶血素、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＦ、及びＨｌｇＢとも免疫反応性であったということを示す。黄色ブドウ球菌成熟α溶血素は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｄａｔａｂａｓｅエントリー番号Ｐ０９６１６．２のアミノ酸２７〜３１９に対応するポリペプチドである。黄色ブドウ球菌β溶血素は、アミノ酸ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＳ１９５７４に対応するポリペプチドである。黄色ブドウ球菌ＬｕｋＤは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＢＡ２４４５４．１に対応する黄色ブドウ球菌ロイコトキシン、ＬｕｋＤを指す。ＬｕｋＥは、受入番号ＢＢＡ２４４５４．１に対応する黄色ブドウ球菌ロイコシジンＬｕｋＥを指す。ＬｕｋＦは、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ５１２５２のアミノ酸２５〜３２５に対応する黄色ブドウ球菌ロイコシジンＬｕｋＦを指す。ＨｌｇＢは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ２６６３９のアミノ酸２６〜３２５に対応する黄色ブドウ球菌γ溶血素成分Ｂを指す。
【００３６】
従って、別の実施形態では、本発明は、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／若しくはブドウ球菌属細菌関連疾患の治療又は予防において使用するための、黄色ブドウ球菌α溶血素、β溶血素、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＦ、及び／又はＨｌｇＢと免疫反応性であるポリクローナル抗体に関する。
【００３７】
驚くべきことに、実施例１１は、本発明に係る天然に存在する抗体が、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＯＺＸ４９８７５．１に対応する細胞外マトリクス及び血漿結合タンパク質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅｂｈ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦＷ３４３０８．１に対応する免疫グロブリン結合タンパク質ｓｂｉ、とりわけその中のエピトープＡＳＥＮＴＱＱＴＳＴＫ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＯ６６０７７．１に対応するペニシリン結合タンパク質２Ｍｅｃａ、とりわけエピトープＲＫＩＫＫＶＳＫＮＫＫ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＰＮＱ２８３７２．１に対応するセリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｃ  Ｓｄｒｃ、とりわけその中のエピトープＴＡＮＱＳＴＴＫＴ；ヒアルロン酸リアーゼ、とりわけその中のエピトープＬＮＴＤＥＮＫ；スーパー抗原様タンパク質ｓｅｔ１／スーパー抗原様タンパク質ｓｅｔ３、とりわけその中のエピトープＬＱＴＮＲＭＳ並びに図１７に示されるタンパク質及びエピトープと免疫反応性であることを示す。
【００３８】
従って、さらに別の実施形態では、本発明は、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／若しくはブドウ球菌属細菌関連疾患の治療又は予防において使用するための、黄色ブドウ球菌α溶血素、及び上述のタンパク質又はエピトープのうちの少なくとも１つと免疫反応性であるポリクローナル抗体に関する。この抗体は、記載されたタンパク質／ペプチドのうちの複数のものとも免疫反応性であってよい。
【００３９】
後述する実施例９において、さらに驚くべきことに、本発明に係るポリクローナル抗体を含む医薬組成物が、イヌにおける膿皮症の治療のための治療効果を有することを示すことができた。従って、本発明に係る天然に存在するポリクローナル抗体は、有利なことに、そして驚くべきことに、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／若しくはブドウ球菌属細菌関連疾患の治療又は予防において、とりわけＳ．インターメディウス群細菌感染症の感染症及び／又はＳ．インターメディウス群細菌関連疾患の治療又は予防において非抗生物質活性薬剤として使用できる。
【００４０】
驚くべきことに、すでに、ブドウ球菌属由来の細菌を持つ例えば雌ウシ等の動物の自然の細菌コロニー形成が、治療への応用に好適なポリクローナル抗体の単離を可能にするポリクローナル抗体価を誘導するようである。従って、本発明者らは、驚くべきことに、単離された抗原による動物の免疫は、治療への応用に好適なポリクローナル抗体を得るためには必要ではないことを示す。
【００４１】
本発明に係る天然に存在するポリクローナル抗体が、毒素産生性ではないＳ．インターメディウス菌株に対して、単離された組み換えＨｌａで免疫された雌ウシから得られた抗体と比べてより有効であることも、実施例１２に係る実験において驚くべきことに示された。
【００４２】
本発明に関しては、「ポリクローナル抗体」は、異なるＢ細胞系譜によって分泌される異なる抗体分子の集団である。ポリクローナル抗体は、好ましくは、所定のタンパク質内のいくつかの異なる特異的抗体エピトープに結合することができてもよい。本発明に関しては、エピトープ又はタンパク質に「結合する」抗体は、そのタンパク質／エピトープと「免疫反応性」である抗体と呼ばれることがある。ポリクローナル抗体に含まれる異なる抗体分子は、特にＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域に異なる可変領域を有してもよい。
【００４３】
本発明に係る全身性の感染症又は疾患は、血流中にあるか又は全身に影響を及ぼす感染症又は疾患である。全身性のＳ．インターメディウス群細菌感染症又は関連疾患は、例えば関節炎、敗血症、菌血症又はブドウ球菌トキシックショック様症候群であってもよい。
【００４４】
本発明に係る現局性の感染症又は疾患は、身体の一部分又は器官だけに影響を及ぼす。現局性のＳ．インターメディウス群細菌感染症又は関連疾患は、耳感染症又は創傷感染症、歯肉炎、呼吸器感染症、例えば肺炎；腹膜炎又は膿皮症であってもよい。好ましい実施形態では、現局性の感染症は、皮膚、粘膜又は軟部組織の感染症又は疾患である。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明に従って治療される感染症又は疾患は膿皮症である。膿皮症は、表在性毛包炎、深部毛嚢炎及びフルンケル症、細菌過剰症候群、化膿性外傷性毛包炎及び／又はフルンケル症（サテライト病変を伴う「ホットスポット」）、間擦疹（皮下脂肪皮膚炎）、粘膜皮膚膿皮症、水疱性膿痂疹、肢端舐性肉芽腫、肢端舐性毛包炎及び／又はフルンケル症、鼻内の毛包炎及びフルンケル症、顎アクネ（鼻口部の毛包炎及びフルンケル症）及び／又はブドウ球菌属性の壊死性筋膜炎であってもよい。膿皮症の治療される症候は、掻痒、紅斑、膿疱及び丘疹、小胞、潰瘍斑、せつ（フルンケル）、小結節、出血性水疱面皰、膿疱、丘疹、せつ、びらん、潰瘍、浮腫、表皮襟、痂皮性びらん、苔癬化、色素沈着過度及び鱗屑であってもよい。
【００４６】
本発明によれば、哺乳動物及び鳥類は、本明細書に記載されるポリクローナル抗体で治療されてもよい。好ましくは、上記哺乳動物は、ヒト又は家畜である。好ましくは、上記家畜は、イヌ、ネコ又はウマである。最も好ましくは、ヒト又はイヌが治療される。
【００４７】
ブドウ球菌属の異なる種、とりわけＳ．インターメディウス群の細菌の異なる種は、様々な方法によって識別されてもよい。Ｓ．シュードインターメディウスをイヌから分離された他のブドウ球菌種と区別するための識別のための表現型試験としては、Ｂａｎｏｅｈｒら、２０１７によると、陽性コアグラーゼ表現型、陰性アセトイン産生表現型、陰性ピロリドニルアリールアミダーゼ表現型、陽性β−ガラクトシダーゼ表現型、陰性ポリミキシンＢ耐性及び遅延性Ｄ−マンニトール酸性化を挙げてもよい。Ｓ．インターメディウスは、陰性のアルゲニン（ａｒｇｅｎｉｎ）ヒドロラーゼ反応、好気性条件における陽性Ｂ−ゲンチオビオース試験及び陽性嫌気性Ｄ−マンニトール試験からの酸生成によってＳ．シュードインターメディウス及びＳ．デルフィニから表現型的に区別されてもよい（Ｂａｎｏｅｈｒら、２００７）。ブドウ球菌種の特定のためのより正確な方法は、ポリメラーゼ連鎖−制限酵素切断断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）（Ｂａｎｏｅｈｒら、２０１７）等の分子的機構、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による細菌性分類に基づいて行われてもよい。ＰＣＲ−ＲＦＬＰも、Ｓ．インターメディウス群の緊密に関連したメンバー、例えばＳ．デルフィニ、及びヒト及びイヌの他の重要なブドウ球菌属の病原体からＳ．シュードインターメディウスを識別することを可能にする（Ｂａｎｏｅｈｒら、２００７）。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、Ｓ．インターメディウス群細菌はＳ．シュードインターメディウスである。
【００４９】
本発明の別の好ましい実施形態では、ブドウ球菌属細菌、とりわけＳ．インターメディウス群細菌は、薬物耐性株、好ましくは抗生物質耐性株である。薬物耐性株は、所定の薬物に対する感受性が低下しているか又はない菌株である。好ましい実施形態では、薬物耐性株は抗生物質耐性株である。抗生物質耐性の菌株では、細菌増殖の阻害は、それぞれの抗生物質によって阻害されないか、又は増殖の阻害は、非抗生物質耐性の菌株と比べてより高い抗生物質濃度でのみ観察される。抗生物質耐性は、ＤＩＮ  ５８９４０に従う寒天拡散アッセイにおいて、一般に試験されてもよい。抗生物質耐性株は、好ましくはメチシリン耐性（ＭＲＳＰ）菌株であってもよい。このメチシリン耐性株は、ｍａｃＡ遺伝子陽性菌株であってもよい。ｍａｃＡ遺伝子は、β−ラクタム抗生物質に対する耐性を与える。菌株におけるｍａｃＡ遺伝子の存在は、ｍａｃＡ特異的プライマーを用いるＰＣＲによって試験されてもよい（Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、２００７）。従って、この菌株は、β−ラクタム抗生物質に対して耐性がある菌株であってもよい。このβ−ラクタムは、ペニシリン、ペネム、カルバペネム、セファロスポリン又はセファマイシン等のセフェム；モノバクタム又はβ−ラクタマーゼ阻害剤であってもよい。このペニシリンは、ベンジルペニシリン、ベンザチン、ベンジルペニシリン、プロカイン  ベンジルペニシリン、ベンジルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、プロピシリン、フェネチシリン、アジドシリン、クロメトシリン、ペナメシリン、アモキシシリン、アンピシリン、例えばピバンピシリン、ヘタシリン、バカンピシリン、メタンピシリン、タランピシリン；エピシリン、チカルシリン、カルベニシリン／カリンダシリン、テモシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メズロシリン、メシリナム、スルベニシリン、クロキサシリン（ｓｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、例えばジクロキサシリン又はフルクロキサシリン、オキサシリン、ナフシリン又はメチシリンであってもよい。上記ペネムは、ファロペネム又はリチペネムであってもよい。上記カルバペネムは、エルタペネム、抗シュードモナス薬（ａｎｔｉｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｌ）、例えばドリペネム、イミペネム又はメロペネム、ビアペネム又はパニペネムであってもよい。上記セファロスポリン又はセファマイシンは、セファゾリン、セファレキシン、セファドロキシル、セファピリン、セファゼドン、セファザフル、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファログリシン、セファセトリル、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファトリジン、セファクロル、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セファマンドール、セフミノクス、セフォニシド、セフォラニド、セフォチアム、セフブペラゾン、セフゾナム、セフメタゾール、カルバセフェム、セフィキシム、セフトリアキソン、抗シュードモナス薬、例えばセフタジジム又はセフォペラゾン；セフジニル、セフカペン、セフダロキシム、セフチゾキシム、セフメノキシム、セフォタキシム、セフピラミド、セフポドキシム、セフチブテン、セフジトレン、セフェタメト、セフォジジム、セフピミゾール、セフスロジン、セフテラム、セフチオレン、オキサセフェム、例えばフロモキセフ又はラタモキセフ；セフチオフル、セフキノム、セフタロリンフォサミル、セフトロザン、セフトビプロール、セフェピム、セフォゾプラン、セフピロム、又はセフキノムであってもよい。上記モノバクタムは、アズトレオナム、チゲモナム、カルモナム又はノカルディシンＡであってもよい。上記βラクタマーゼ阻害剤は、スルバクタム、タゾバクタム、クラブラン酸（アモキシシリン）、アビバクタム又はバボルバクタムであってもよい。耐性は、フルオロキノロン  シプロフロキサシン抗生物質、例えばオフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、レボフロキサシン、バロフロキサシン、グレパフロキサシン、パズフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、ベシフロキサシン、ガチフロキサシン、フィナフロキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、クリナフロキサシン、ガレノキサシン、プルリフロキサシン、シタフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エンロフロキサシン、イバフロキサシン、マルボフロキサシン、オルビフロキサシン、プラドフロキサシン、又はサラフロキサシンに対するものであってもよい。
【００５０】
好ましくは、薬物耐性株は、メチシリン、セファレキシン、エンロフロキサシン、ペニシリン、アンピシリン、クラブラン酸（アモキシシリン）、オキサシリン、セファレキシン、セファロチン、クリンダマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、リファンピシン、テトラサイクリン、トリメトプリム、カナマイシン又はシプロフロキサシンに対して耐性がある菌株である。さらなる好ましい実施形態では、上記菌株は、少なくとも２種の抗生物質、より好ましくは少なくとも３種、少なくとも５種又は少なくとも６種の抗生物質に対して耐性がある多剤耐性株である。メチシリン耐性Ｓ．シュードインターメディウス菌株は、一般にＭＲＳＰとして知られている。
【００５１】
好ましい実施形態では、薬物耐性Ｓ．シュードインターメディウス菌株は、Ｌｏｚａｎｏら、２０１７により開示された菌株Ｃ８１８７、Ｃ８３８６、Ｃ８１８８、Ｃ８４７７、Ｃ８１８９、Ｃ８４７８若しくはＣ８４７０；又はＭｃＣａｒｔｈｙら、２０１５により開示された６９６８７、６９８７６、ＨＨ１５、ＧＬ  １１９Ａ、ＧＬ１５１Ａ、２３９２９、１７２６、ＢＮＧ１、ＢＮＧ３、ＧＬ１１７Ｂ、ＧＬ１１８Ｂ、４６３９４９、ＨＫＵ１０−０３、Ｅ１４０若しくはＥＤ９９から選択される菌株；又は実施例７に開示される菌株２３９３９、６９６８７、ＭＲＳＰＨＨ１５、ＢＮＧ  Ｉのうちのいずれかのうちの少なくとも１つから選択される菌株であってもよい。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、薬物耐性株は黄色ブドウ球菌（Ｓ．アウレウス）株である。この薬物耐性黄色ブドウ球菌株は、例えばＥ２１２５、ＨＰＶ１０７、Ｆ−１８２、Ｍｕ３、Ｍｕ５０、Ｍｕ５０、２９４７、４０６、１２４７８、ＮＹＢＫ２４６、ＨＦＨ−２９９９４、ＨＦＨ−２９７５３、ＨＦＨ−３０１０６、ＨＦＨ−３０００８、ＨＦＨ−２９７４４、ＨＦＨ−３０１２３、ＨＦＨ−３０１７２、ＨＦＨ−３０２３９、ＨＩＰ  １０７８７、ＭＲＳＡ２５２、９６：２８１、１４８−９９、１８６２６、１０７−０３、ＧＡ２０１、１０６３、ＣＰＳ２２、３０８１１８Ｌ、３２８、１２１７、ＨＵＳＡ３０４、ＨＳＪ２１６、ＦＰＲ３７５７、ＨＦＨ−２９５６８、ＨＦＨ−３０３６４、ＨＦＨ−３０６７６、ＨＦＨ−３０１３７、ＨＦＨ−３０１０２、ＨＦＨ−３０４９３、ＨＦＨ−３０６２６、ＨＦＨ−３３７９８、ＨＦＨ−３１０７６、ＭＷ２†、ＴＣＨ１５１６、９４：１０１３、１８２−９９、００：５０、０−２５−４、０−２５−３７、１−１−８１、１−１−４９３、ＧＡ２１７、ＧＡ２２９、７０３１、５１０−０４、２７−０５、ＣＡ４６、Ｎ４１５１、ＣＬ６０４、ＨＦＨ−３００３２、８−０３、Ｂ８−３１、ＨＤＥ２８８、Ｍ１０／００６１、及び／又はＭ１０／０１４８であってもよい。
【００５３】
驚くべきことに、本発明に係る天然に存在する抗体が抗生物質耐性Ｓ．インターメディウス菌株に結合することが見出された。従って、本発明に係る天然に存在するポリクローナル抗体は、抗生物質耐性Ｓ．インターメディウス群細菌の感染症及び／又は抗生物質耐性Ｓ．インターメディウス群細菌関連疾患を治療又は予防するための非抗生物質活性薬剤として有利に使用することができる。活性薬剤としての抗体の使用は、一般に、抗生物質耐性Ｓ．シュードインターメディウス菌株の感染症の治療のために有利である。というのも、抗体は、非抗生物質活性薬剤であり、従って、抗生物質とは異なる作用機序に依拠する活性薬剤であるからである。さらに、ポリクローナル抗体の使用は、モノクローナル抗体よりも有利である可能性がある。というのも、ポリクローナル抗体は、通常、抗原内のいくつかの側に結合するからである。従って、細菌ゲノムにおいて頻繁に現れる単独の変異に基づく抗体に対する耐性の発生は、実質的に低下する。さらには、活性薬剤としてのモノクローナル及びポリクローナル抗体の使用は、特定の抗生物質に対してアレルギー性である対象の治療にとって有利である。
【００５４】
本発明に係る抗体は、アミノ酸配列ＫＩＧＧＬＩＧ（配列番号２）、ＡＴＫＱＱＳＮ（配列番号３）、ＫＫＩＬＶＩＲＴＫ（配列番号４）、ＩＤＶＩＹＥＲＶ（配列番号５）、ＫＡＡＤＮＦＬＤＰ（配列番号６）及び／又はＤＳＤＩＮＩＫ（配列番号（配列番号７）を含むエピトープから選択される少なくとも１つのエピトープに結合してもよい。最も好ましくは、当該抗体は、アミノ酸配列ＫＩＧＧＬＩＧを含むエピトープに少なくとも結合してよい。
【００５５】
さらに驚くべきことに、本願の実施例１１に係る実験において、本発明に係る天然に存在する抗体が、とりわけ表１に開示される黄色ブドウ球菌タンパク質に結合し、これらのタンパク質には、それぞれ選択されたエピトープが含まれていることが見出された。
【００５６】
【表１（１）】
2021518382.tif 000003
【００５７】
【表１（２）】
2021518382.tif 000004
【００５８】
【表１（３）】
2021518382.tif 000005
【００５９】
【表１（４）】
2021518382.tif 000006
【００６０】
好ましくは、ポリクローナル抗体は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つのエピトープに結合する。
【００６１】
上記抗体は、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＹから選択される免疫グロブリンであってもよい。ＩｇＧは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２のうちの少なくとも１つから選択されてもよい。好ましくは、上記抗体は、上記ＩｇＧクラスからの少なくとも１種の免疫グロブリンを含む。
【００６２】
好ましくは、上記抗体は、アミノ酸配列ＫＩＧＧＬＩＧ、ＡＴＫＱＱＳＮ、ＫＫＩＬＶＩＲＴＫ及び／又はＩＤＶＩＹＥＲＶを含むエピトープから選択される少なくとも１つのエピトープに結合する免疫グロブリンＧである。上記抗体は、いくつかのエピトープ、好ましくはＫＩＧＧＬＩＧ及びＡＴＫＱＱＳＮに結合してもよい。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＩＤＶＩＹＥＲＶ、ＫＡＡＤＮＦＬＤＰを含むエピトープから選択される少なくとも１つのエピトープに結合する免疫グロブリンＡ又は免疫グロブリンＭである。
【００６４】
抗体はインタクトな四量体抗体であってもよい。さらなる実施形態では、上記抗体は、抗体の抗体結合断片であってもよい。抗体断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｖ断片及び一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）が挙げられる。Ｆａｂ断片は、パパイン消化によって得てもよい。
【００６５】
上記抗体は、ニワトリ抗体又は哺乳類抗体であってもよい。哺乳類抗体は、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ヤギ、ウサギ、ウマ、ラマ又はウシの抗体であってもよい。好ましい実施形態では、上記抗体はウシ抗体である。本発明の範囲では、抗体の上記の種の起源がそれぞれの種の動物で発現された抗体を規定してもよい。
【００６６】
本発明に係るポリクローナル抗体は、動物の体液からポリクローナル抗体を単離することにより得らもよい。好ましくは、上記抗体は、血液から、好ましくは血清、乳汁（母乳）又は初乳から単離されてもよい。初乳は、子の誕生の後に雌動物によって産生される最初の乳状の流体である。あとで産生される乳汁と比較して、初乳は多量の免疫グロブリン、とりわけＩｇＧを含む。従って、初乳の使用は、とりわけ有利である。このように、本発明に係る抗体は単離された抗体であってもよい。
【００６７】
好ましい実施形態では、上記ポリクローナル抗体はウシの乳汁又は初乳から得られる。
【００６８】
初乳又は乳汁からのポリクローナル抗体の単離は、好ましくは、本明細書に記載される抗体を含む濃縮組成物を得るための、Ｐｉｏｔｔら、２００４に開示された方法による膜濾過法によるＩｇＧの濃縮を含んでもよい。
【００６９】
好ましい実施形態では、当該抗体は、クロマトグラフィー技術によって精製又は部分的に精製されてもよい。抗体を精製するためのクロマトグラフィー技術は、当該技術分野で周知である。クロマトグラフィー技術は、例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又はこれらの技術の組み合わせであってよい。好ましい実施形態では、抗体は、最初の工程で、好ましくは中性ｐＨでカチオン交換クロマトグラフィーによって精製される。好ましくは、ＳＰセファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）又はＣＭセファロースがカチオン交換材料として使用されてもよい。別の好ましい実施形態では、マルチモードカチオン性クロマトグラフィー材料、例えばＣａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ジーイー・ヘルスケア・ライフサイエンシーズ）、ピッツバーグ、米国）が使用されてもよい。中性ｐＨで、不純物、例えば乳清タンパク質、ラクトペルオキシダーゼ又はラクトフェリン、は、カチオン交換材料に結合することにより上記抗体から分離される可能性があるが、上記抗体は、実質的には、カチオン交換材料に結合しない。
【００７０】
当該抗体は、中性ｐＨで、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー／ＨＣＩＣによってさらに精製されてもよい。好ましくは、この疎水性電荷誘導クロマトグラフィーは、４−メルカプトエチル−ピリジン（ＭＥＰ）クロマトグラフィー樹脂、例えばＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒ  ＣＥＬ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ポール・コーポレーション）、ニューヨーク、米国）を用いて実施される。中性ｐＨで、当該抗体は疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に結合されるが、他のタンパク質は、それぞれのクロマトグラフィー材料に結合しないことによって分離される可能性がある。当該抗体は、酸性ｐＨで溶出される可能性がある。
【００７１】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗体は、カチオン交換クロマトグラフィーを伴うクロマトグラフィー工程の後に、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー／ＨＣＩＣを実施することにより精製されてもよい。
【００７２】
驚くべきことに、本発明に係る抗体により、その抗体が局所的に投与されるときであっても、膿皮症等のブドウ球菌属細菌関連疾患の治療が可能になることが見出された。
【００７３】
従って、さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体の局所投与によりブドウ球菌属細菌の感染症及びブドウ球菌属細菌関連疾患を治療又は予防するための本明細書に記載される抗体に関する。好ましくは、上記感染症又は疾患は、黄色ブドウ球菌又はＳ．インターメディウス群細菌の感染症又は関連疾患である。より好ましくは、上記感染症又は疾患は、上記のＳ．シュードインターメディウスの感染症又は関連疾患である。最も好ましくは、上記疾患は膿皮症である。
【００７４】
上記感染症又は疾患は、本明細書に記載される抗体及び／又は医薬組成物を投与することにより、治療又は予防されてもよい。最も好ましくは、上記感染症又は疾患は、後述するように、ヒドロゲルの中にある当該抗体を局所投与することにより治療される。
【００７５】
当該技術分野で公知の受動免疫による全身性のブドウ球菌属細菌感染症の予防とは対照的に、局所的な治療はいくつかの利点をもたらす。第１に、受動免疫のような全身治療には、獣医又は医師等の医療専門家による薬物の投与が必要である。これとは対照的に、局所投与は、動物の所有者又はヒト患者自身によって簡便に反復的に投与されることが可能である。また、副作用又は治療効果の減弱につながる投与された抗体に対する免疫学的反応は、抗体の局所投与の際には起こる可能性はより低い。さらには、局所治療によって通常処置される身体表面は限られているため、全身治療と比べて少量の抗体しか必要とされない。
【００７６】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体を、任意に薬学的に許容できる担体と共に含む医薬組成物に関する。
【００７７】
上記薬学的に許容できる担体としては、用いられる投薬量及び濃度において曝露されることになる細胞又は哺乳動物に対して無毒である薬剤、例えば希釈剤、安定剤、アジュバント（佐剤）又は他の種類の賦形剤を挙げてもよい。薬学的に許容できる担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション、例えば油／水エマルション、クリーム、軟膏剤及びゲルが挙げられる。好ましい実施形態では、ゲルは、ヒドロゲルであってもよい。
【００７８】
上記クリーム、軟膏剤又はゲルは、少なくとも１種の滑沢剤を含んでもよい。この滑沢剤は、例えばセチルエステルワックス、硬化植物油、ステアリン酸メチル、鉱油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、白ろう、又は上記のものの２以上の混合物から選択されてもよい。
【００７９】
クリーム、軟膏剤又はゲルは、少なくとも１種のアジュバントを含んでもよく、このアジュバントは、抗菌剤、酸化防止剤、湿潤剤若しくは乳化剤、又はこれらの２以上の混合物から選択されてもよい。
【００８０】
さらなる態様では、本発明はヒドロゲルに関する。このヒドロゲルは、本発明に係る抗体を含んでもよい。
【００８１】
別の実施形態では、ヒドロゲルは、本発明に係る抗体を含まなくてもよいが、異なる抗体、とりわけ局所投与用の抗体を含んでもよい。
【００８２】
本発明に係るヒドロゲルは、水及びゲル化剤を含んでもよい。通常、上記ヒドロゲルは、約０．５重量％〜約５重量％のゲル化剤を含んでもよい。好ましくは、このヒドロゲルは、約１重量％〜約２．５重量％、より好ましくは約１重量％〜約２重量％を含む。最も好ましくは、上記ヒドロゲルは、約１．５重量％のゲル化剤を含む。
【００８３】
ゲル化剤は、例えば、アルギン酸ナトリウム、デンプン、タンパク質、ゼラチン、ヒアルロン酸、キチン、キサンタンガム、アラビアゴム、ペクチン及び／又はこれらの誘導体であってもよい。好ましくは、ゲル化剤はセルロース誘導体である。好ましくは、そのセルロース誘導体は、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）である。
【００８４】
最も好ましくは、上記セルロース誘導体はカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）である。好ましくは、このＣＭＣは、約０．５〜約１、好ましくは約０．６５〜約０．９の置換度を有する。好ましくは、このＣＭＣは高粘度ＣＭＣである。このＣＭＣは、例えばＢｌａｎｏｓｅ  ７Ｈ４Ｆ、Ｂｌａｎｏｓｅ  ７ＨＯＰＨ、Ａｑｕａｌｏｎ  ７Ｈ３ＳＦ、Ａｑｕａｌｏｎ  ７Ｍ８ＳＦ、及び／又はＢｌａｎｏｓｅ  ７ＬＰ（すべてアシュランド、ケンタッキー州、米国）から選択されてもよい。
【００８５】
ＣＭＣは、２５０ｋＤａ〜２５００ｋＤａ、好ましくは４００ｋＤａ〜１５００ｋＤａ、より好ましくは６００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、最も好ましくは７００ｋＤａ〜８００ｋＤａの分子量を有してもよい。特定の実施形態では、ＣＭＣは約７２５ｋＤａの分子量を有してもよい。
【００８６】
好ましい実施形態では、ヒドロゲルは、２５℃で１０００ｍＰａ＊ｓ〜９０００ｍＰａ＊ｓ、より好ましくは２５℃で２０００ｍＰａ＊ｓ〜６０００ｍＰａ＊ｓ、最も好ましくは２５００ｍＰａ＊ｓ〜４５００ｍＰａ＊ｓの粘度を有する。好ましくは、上記の粘度を特徴とするヒドロゲルは、１重量％のＣＭＣ濃度を有する。
【００８７】
非常に好ましい実施形態では、上記ヒドロゲルは、チキソトロピー挙動を特徴としてもよい。これらのチキソトロピー特性は、剪断速度が上昇するときにはゲルの剪断応力が上昇し、剪断速度の低下に応答して剪断応力が低下することを特徴とする。このヒドロゲルは、約６００  １／ｓの剪断速度において約５０Ｐａ〜約３５０Ｐａ、約６０Ｐａ〜約３００Ｐａ、約７０Ｐａ〜約２５０Ｐａ、又は約８０Ｐａ〜約２３０Ｐａの剪断応力を特徴としてもよい。好ましくは、このヒドロゲルは、約６００  １／ｓの剪断速度において、約１５０Ｐａ〜約２５０Ｐａ、より好ましくは１８０Ｐａ〜約２２０Ｐａ、最も好ましくは約２００Ｐａの剪断応力を特徴としてもよい。好ましくは、このヒドロゲルは、約６００  １／ｓの剪断速度において約３５０Ｐａ未満、約３００Ｐａ未満、約２５０Ｐａ未満、又は約２２０Ｐａ未満の剪断応力を特徴としてもよい。それぞれのチキソトロピー特性は、有利なことに、そのゲルの噴霧プロセスの間のずり流動化、並びにあとの皮膚の上でのヒドロゲル構造及びその高粘性の再配置が可能になる。
【００８８】
抗体を含むヒドロゲルは、さらに、約３２℃で、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度、最も好ましくは約１２．５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度での約５００ｍＰａ＊ｓ〜約１０００ｍＰａ＊ｓ、より好ましくは約６００ｍＰａ＊ｓ〜約８００ｍＰａ＊ｓの粘度、及び／又は約８℃及び約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの組み込まれた抗体の濃度、最も好ましくは約１２．５ｍｇ／ｍＬの抗体の濃度での約１２５０ｍＰａ＊ｓ〜約２０００ｍＰａ＊ｓ、より好ましくは約１４００ｍＰａ＊ｓ〜約１７００ｍＰａ＊ｓの粘度を特徴としてもよい。
【００８９】
本発明に係るヒドロゲルは、好ましくは、無菌条件下で少なくとも２ヶ月、より好ましくは４ヶ月超、最も好ましくは６ヶ月超の間、安定である可能性がある。安定性の１つの態様によれば、上記の粘度の特徴は、それぞれの時間にわたって維持される。
【００９０】
ノズルを通した本発明のヒドロゲルの噴霧を開始するために必要とされる押圧は、ゲル化剤の濃度、ヒドロゲルに含まれるゲル化剤の種類及びノズルに依存する。好ましくは、本発明のヒドロゲルの噴霧を開始するために必要とされる力は、約１０〜３５Ｎ、好ましくは２０〜３５Ｎ、３０Ｎ〜３２Ｎ、より好ましくは３０Ｎ〜３１Ｎである。好ましくは、当業者にとっては周知であるＵｒｓａｔｅｃ  ３Ｋ噴霧装置（Ｕｒｓａｔｅｃ  Ｖｅｒｐａｃｋｕｎｇ  ＧｍｂＨ（ウルサテック・フェアパックング社）、ザンクト・ヴェンデル、ドイツ）又は類似の噴霧装置が、本発明に係る処方物の噴霧のために使用されてもよい。
【００９１】
本発明のヒドロゲル処方物は、有利なことに、より高い粘度及び接着に起因して投与の領域、例えば皮膚、又は創傷部位又は他の局所的な身体部位に留まるが、他方で、噴霧可能であり、明確な用量の非常に簡便で無痛の投与を可能にする。用量は、用量ポンプを使用することにより十分明確にすることができ、このような用量ポンプは、粘度の所定範囲内で良好に動作する。さらには、より高い、チキソトロピー性粘度は、噴霧ノズル及び関連する噴霧力を適用するときであっても、その噴霧が標的領域から離れて拡散することができる非常に小さい液滴へと微細に分散せず、標的の身体部位に衝突し、最終的にゲル状の処方物の融合した膜層を形成するより大きい液滴を形成するように、処方物を調整することを可能にする。
【００９２】
抗体は、その単量体形態において主に反応性であるので、抗体を含むヒドロゲルの安定性のさらなる態様は、ゲルの中での抗体の二量化又は凝集を特徴とする。安定な組成物は、単量体の抗体を高い量で維持し、微量の程度の抗体の二量化又はさらには凝集を呈する。本発明に係るヒドロゲルは、２℃〜８℃で保存した場合、約８０％超、好ましくは約８５％超の単量体抗体を少なくとも約５週間、好ましくは１１週間、最も好ましくは少なくとも約６ヶ月間を含む。本発明に係るヒドロゲルは、２℃〜８℃で保存した場合、少なくとも約５週間、好ましくは約１１週間、最も好ましくは約６ヶ月間、約１０重量％未満、好ましくは約５重量％未満の凝集した抗体を含む。抗体の二量化及び凝集は、一般に当該技術分野で公知のように、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定されてもよい。
【００９３】
要約すれば、このように、本発明に係るヒドロゲルは、驚くべきことに、皮膚での最大の接着性を成し遂げるために、良好な噴霧可能性を提供するチキソトロピーの特徴を高粘度と組み合わせる。これは、一定の投与及び高い安定性を可能にする可能性がある。
【００９４】
当該ヒドロゲルは、ヒドロゲル１ｇあたり２ｍｇ〜５０ｍｇ、４ｍｇ〜２０ｍｇ、又は好ましくは５ｍｇ〜１５ｍｇの抗体を含んでもよい。最も好ましくは、このヒドロゲルは、ヒドロゲル１ｇあたり約１０ｍｇの１５ｍｇ抗体を含む。
【００９５】
当該ヒドロゲルは、アルコール、好ましくはグリセロール又はプロピレングリコール等のポリオールをさらに含んでもよい。このヒドロゲルは、さらに好ましくは、皮膚科学的に許容できるｐＨを維持するために少なくとも１種の緩衝剤を含んでもよい。一般に、このヒドロゲルは、約３〜約８又は約６〜約８の範囲のｐＨを有するように緩衝剤で処理されてもよい。緩衝剤は、医薬処方物を調製する上で有用であると当該技術分野ですでに公知のもののいずれか、例えば２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４であってもよい。さらなる好適な緩衝液としては、酢酸／酢酸塩緩衝液；塩酸／クエン酸塩緩衝液；クエン酸塩−リン酸緩衝液；リン酸緩衝液；クエン酸／クエン酸塩緩衝液；乳酸緩衝液；酒石酸緩衝液；リンゴ酸緩衝液；グリシン／ＨＣｌ緩衝液；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、Ｔｗｅｅｎ緩衝生理食塩水（ＴＮＴ）等の生理食塩水緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液は加えられておらず薬物タンパク質自身がｐＨ安定化成分として作用しうる自己緩衝処方物は、本発明の別の実施形態である。
【００９６】
さらには、上記ヒドロゲルは、医薬処方物を調製する上で有用であると当該技術分野ですでに公知の少なくとも１種の酸化防止剤又は他の防腐剤を含んでもよい。
【００９７】
本発明に係るヒドロゲルは、必要量のゲル化剤を緩衝化水溶液と混合することにより得てもよい。この混合物は、ゲル化剤を溶解するために撹拌されてもよい。さらには、この混合物は、ゲル化剤の溶液を促進するために加熱されてもよい。好ましくは、溶液は、約３０℃〜約５０℃、より好ましくは約３５℃〜約４５℃に加熱されてもよい。溶液は、ゲル化をさらに向上させるために冷却されてもよい。得られたヒドロゲルは、その後、好ましくは熱又は照射により滅菌されてもよい。例えば、このヒドロゲルは、約１２１℃及び約２ｂａｒで１５分間、蒸気滅菌されてもよい。
【００９８】
本発明に係るヒドロゲルは、当該抗体を含む最終のヒドロゲル組成物の中のゲル化剤の濃度よりも高いゲル化剤の濃度を含むストックヒドロゲルを製造することにより得てもよい。ストックヒドロゲルが上記のように調製された後で、ストックヒドロゲルは、無菌の抗体溶液で適切な最終濃度に希釈される。別の実施形態では、このヒドロゲルは、ゲル化剤及び／又はゲル化剤を含む溶液を抗体溶液と混合し、その後で滅菌することにより得てもよい。この実施形態では、後で行われる滅菌は、好ましくは、照射によって実施されてもよい。
【００９９】
本明細書に記載されるポリクローナル抗体及び／又は組成物の投与は、様々な方法によって、例えば静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、局所投与、鼻腔内投与又は気管支内投与によって局所的に又は全身的に行われてもよい。好ましくは、当該抗体又は組成物は、皮膚又は粘膜に局所投与される。
【０１００】
用法・用量は、臨床的因子に基づいて主治医によって決定されてもよい。全身感染症又は全身的な疾患に対しては、当該ポリクローナル抗体及び／又は組成物は、好ましくは全身に、好ましくは静脈内に又は腹腔内に投与される。現局性の感染症又は疾患に対しては、抗体及び／又は組成物は、好ましくは局所的に、最も好ましくは局所投与又は皮内投与によって投与される。当該ポリクローナル抗体及び／又は組成物は、同時に局所的に、及び全身的に投与されてもよい。最も好ましくは、当該抗体及び／又は組成物は局所投与される。当該抗体は、洗口液の形態で、又はうがいにより経口投与されてもよい。上記のクリーム、軟膏剤又はゲルのような局所投与形態に加えて、当該抗体は、点眼薬の形態で局所投与されてもよい。眼での投与のための処方物では、上記のとおりのセルロース誘導体、ヒアルロン酸及び他の親水性のゲル形成剤のようなゲル形成剤又は増粘剤は、最終的には、皮膚用の局所ゲルについての濃度と同等又はより低い濃度で使用されてもよい。眼用の軟膏剤の場合には、そのような配合物は、皮膚での局所使用のためのゲルと同じ又はより高い粘度を有してもよい。
【０１０１】
本発明は、必要とする対象への本明細書に開示される抗体及び／又は上記医薬組成物の投与をも包含する。いずれの１人の患者に対する投薬量も、患者の体格、身体表面及び領域、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的な健康状態又は現在投与されている他の薬物等の多くの因子に依存することは一般に知られている。進行は、投与の間の定期評価によってモニタリングすることができる。数日以上にわたる反復投与については、治療されるべき状態に応じて、疾患又は症候の所望の抑制が起こるまで、治療は持続される。
【０１０２】
本発明に係る抗体は、単独療法として、又は少なくとも１種の他の活性薬剤と共に投与されてもよい。この他の活性薬剤は、別個に、又は当該ポリクローナル抗体と共に本発明の医薬組成物の一部として投与されてもよい。好ましくは、他の活性薬剤は、抗菌剤、最も好ましくは上記の抗生物質剤である。
【０１０３】
従って、さらなる態様では、本発明に係る医薬組成物は、上記抗体に加えて少なくとも１種の他の活性薬剤を含んでもよい。好ましくは、この他の活性薬剤は、抗菌剤、消炎剤、ファージ又はファージ酵素である。最も好ましくは、上記の抗生物質である。
【０１０４】
上記消炎剤は、非ステロイド系抗炎症剤、又は好ましくはステロイドであってもよい。このステロイドは、ヒドロコルチゾンタイプ、アセトニド、ベタメタゾンタイプ、ハロゲン化ステロイドエステル又は不安定なステロイドプロドラッグから選択されてもよい。ヒドロコルチゾンタイプステロイドは、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン及びトリアムシノロンから選択されてもよい。アセトニドは、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、ハルシノニド及びトリアムシノロンアセトニドから選択されてもよい。ベタメタゾンタイプステロイドは、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フルオコルトロン、ハロメタゾン及びモメタゾンから選択されてもよい。ハロゲン化ステロイドエステルエステルは、プロピオン酸アルクロメタゾン、プロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾン、酢酸フルプレドニデン及びフロ酸モメタゾンから選択されてもよい。不安定なステロイドプロドラッグは、シクレソニド、酢酸コルチゾン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、吉草酸ヒドロコルチゾン、プレドニカルベート及びピバル酸チキソコルトールから選択されてもよい。好ましくは、上記ステロイドは、ヒドロコルチゾンタイプステロイド、より好ましくはプレドニゾロンである。
【０１０５】
なおさらなる実施形態では、本発明は、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／若しくはブドウ球菌属細菌関連疾患を治療又は予防する方法に関する。当該方法は、必要とする対象に本明細書に記載される抗体又は医薬組成物を投与する工程を備える。この抗体又は医薬組成物は、治療上活性量で対象に投与される。好ましくは、上記ブドウ球菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．アウレウス）由来、最も好ましくはＳ．インターメディウス群の細菌由来である。好ましくは、当該抗体又は医薬組成物は局所投与される。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗体を含む医薬に関する。
【０１０７】
さらなる実施形態では、本発明は、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／若しくはブドウ球菌属細菌関連疾患を治療並びに／又は予防するための治療のための医薬の製造における上記の抗体の使用に関する。
【０１０８】
さらに別の実施形態では、本発明は、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／又はブドウ球菌属細菌関連疾患を予防することにおいて使用するための医薬の製造方法であって、
（ａ）天然に存在する抗体供給源からポリクローナル抗体を得る工程と、
（ｂ）任意に、上記ポリクローナル抗体をクロマトグラフィー技術によって精製又は部分的に精製する工程と
を備える方法に関する。
【０１０９】
この実施形態の範囲内では、天然に存在する抗体供給源からポリクローナル抗体を得る工程（ａ）は、上記のとおりに実施されてよい。この実施形態の範囲内では、上記ポリクローナル抗体をクロマトグラフィー技術によって精製又は部分的に精製する工程（ｂ）は、上記のとおりに実施されてよい。この製造方法は、上記ポリクローナル抗体を含む医薬組成物を調製する工程も備えてよい。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、ブドウ球菌属の細菌、好ましくは黄色ブドウ球菌、最も好ましくはＳ．インターメディウス群の細菌の増殖の阻害方法であって、上記細菌を上記の抗体に曝露する工程を少なくとも備える方法に関する。
【０１１１】
さらなる態様では、本発明は、Ｓ．インターメディウス群細菌の感染症及び／又はＳ．インターメディウス群細菌関連疾患を治療又は予防するための方法において使用するための、ポリクローナル抗黄色ブドウ球菌α溶血素タンパク質抗体（抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質抗体とも呼ばれる）に関する。
【０１１２】
上記ポリクローナル抗黄色ブドウ球菌α溶血素タンパク質抗体は、上記の医薬組成物又は医薬に含まれてもよい。
【０１１３】
ポリクローナルの「抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質抗体」又は「抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体」は、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質内のエピトープに特異的に結合する抗体であると考えられ、「特異的に結合する」は、同じ抗体濃度及び同じ量の抗原タンパク質のもとで、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質ではないタンパク質に抗体が大きい百分率では結合しない可能性があることを意味する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質ではないタンパク質の、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、５％超、４％超、３％超、２％超、１％超又は０．５％超の結合を回避してもよい。さらなる実施形態では、エピトープに特異的に結合する抗体は、１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満、さらに好ましくは１ｎＭ未満の結合定数で結合する。黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質内のエピトープに特異的に結合する抗体分子に加えて、「ポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質抗体」は、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質内のエピトープに結合しない抗体分子も含んでよい。好ましくは、ポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体は、少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２％、最も好ましくは少なくとも２．５％の、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質内のエピトープに特異的に結合する抗体分子を含む。
【０１１４】
本発明に係る黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ０９６１６．２に係る配列の断片、一部分、バリアント、誘導体又は変異体であってもよい。このような変異体は、一次配列において１以上の欠失又は１以上の保存的アミノ酸置換を含んでもよい。「誘導体」は、アセチル化、メチル化、ヒドロキシル化、アミド化、リン酸化、及び炭水化物又は脂質部分、補因子などの結合を含めた側鎖修飾、骨格修飾並びにＮ末端修飾及びＣ末端修飾など、１以上のアミノ酸において化学的に及び／又は酵素により誘導体化されているＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ０９６１６．２に係るポリペプチドであってもよい。
【０１１５】
非常に好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質は、低下した溶血活性を有するＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ０９６１６．２に係る黄色ブドウ球菌Ｈｌａの変異形態である。より好ましくは、この変異体は溶血活性を欠く。本発明に関しては、Ｍｅｎｚｉｅｓ及びＫｅｒｎｏｄｌｅ、１９９４で公開されている溶血活性決定アッセイにおいてタンパク質が溶血活性を持たないときに、タンパク質は「溶血活性を欠く」と考えられる。刊行物Ｍｅｎｚｉｅｓ及びＫｅｒｎｏｄｌｅ、１９９４は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ０９６１６．２のアミノ酸２７〜３１９に係るポリペプチドの変異形態を開示し、この変異形態では、位置３５、４８、１４４又は２５９におけるヒスチジンがロイシンによって置換されている（変異体Ｈ３５Ｌ、Ｈ４８Ｌ、Ｈ１４４Ｌ及びＨ２５９Ｌ）。変異体Ｈ４８Ｌ、Ｈ１４４Ｌ及びＨ２５９Ｌは、７％、１６％及び４６％低下した溶血活性を呈し、本発明に係る黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質として使用されてもよい。本発明の非常に好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質は、ロイシンによるヒスチジン３５の置換（Ｈ３５Ｌ）を含む配列番号１に係るポリペプチドである。Ｍｅｎｚｉｅｓ及びＫｅｒｎｏｄｌｅ、１９９４によれば、この変異体は溶血活性を欠く。
【０１１６】
ポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体は、動物を本明細書に記載される黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質で免疫することにより得てもよい。抗体は、動物を免疫する工程がポリクローナル黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体の産生に含まれるときに、動物を黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質で免疫することにより得られると考えられる。動物を免疫することにより得られる抗体の産生は、当然、例えばその抗体を単離及び／又は精製するための付加的な工程を備えてよい。ポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体は、例えば、齧歯動物、哺乳動物、とりわけ有蹄類、鳥類を免疫することにより得てもよい。この哺乳動物は、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ヤギ、ウサギ、ウマ又はウシであってもよい。好ましくは、抗体は、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ又はウシ、最も好ましくはウシを免疫することにより得られる。動物を本発明に係る黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質で免疫するために、上記タンパク質は上記動物に投与される。
【０１１７】
動物を黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質で免疫することによりポリクローナル抗体を得ることはとりわけ有利である。というのも、それは、抗体を得るための迅速で比較的安価なプロセスを代表するからである。
【０１１８】
ポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体を得るために使用される黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質は、好ましくは、上記のＨ３５Ｌ変異を含む黄色ブドウ球菌Ｈｌａの変異形態であってもよい。免疫のために、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質は、担体ポリペプチド及び１以上の黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質を含む融合タンパク質の形態で使用されてもよい。黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質が担体タンパク質自体であってもよい。担体ポリペプチドは、上記融合タンパク質と反応するように免疫系を刺激し、これにより生物において免疫応答を発生させる抗原性であってもよい。抗原性担体ポリペプチドは、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ロコガイヘモシアニン（ＣＣＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）であってもよい。担体タンパク質との融合は、配列番号１の短い黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質断片だけが使用されるときに、とりわけ使用されてもよい。
【０１１９】
別の実施形態では、動物は、ポリヌクレオチドワクチンを投与することにより免疫されてもよい。このポリヌクレオチドワクチンは、本明細書に記載される黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質をコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡ断片を含んでもよい。このポリヌクレオチドは、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の転写を調節する調節エレメント、例えばプロモーターをさらに含んでもよい。このプロモーターは、誘導性プロモーター又は構成的プロモーターであってもよい。この構成的プロモーターは、例えば初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであってもよい。
【０１２０】
動物を黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質で免疫するためのタンパク質又はポリヌクレオチドは、いずれの好適な経路によって投与されてもよい。好ましくは、このタンパク質又はポリヌクレオチドは、経口で、鼻腔内に、又は腹腔内注入若しくは筋肉内注入により、若しくは乳腺若しくは乳腺上リンパ節への注入により投与されてもよい。非常に好ましい実施形態では、動物を免疫するためのタンパク質は、皮下注入によって投与される。
【０１２１】
非常に好ましい実施形態では、Ｈ３５Ｌ変異を含む黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質が皮下注入によりウシに投与される。
【０１２２】
動物を黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質で免疫するためのタンパク質又はポリヌクレオチドは、特に免疫促進物質として１以上のアジュバントと組み合わせて投与されてもよい。アジュバントは、投与の方法に基づいて選択されてよく、例として鉱油ベースのアジュバント、例えばフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）及びフロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、モンタナイド不完全セピックアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｅｐｐｉｃ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、例えばＩＳＡ、とりわけモンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ５１、水中油エマルションアジュバント、例えばＲｉｂｉアジュバントシステム、ムラミルジペプチドを含有するシンタックス（ｓｙｎｔａｘ）アジュバント処方物又はアルミニウム塩アジュバントを挙げてもよい。好ましい実施形態では、アジュバントは、サポニンアジュバント、より好ましくはキラヤサポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニンアジュバントであり、最も好ましくは、アジュバントはＱｕｉｌ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）、サンディエゴ、米国）である。
【０１２３】
動物を黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質で免疫するためのタンパク質又はポリヌクレオチドは、１回又は数回投与されてもよい。一般に、免疫スケジュールは、黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質、使用される動物種及び免疫のために使用されるタンパク質又はヌクレオチドの量に応じて、当業者によって決定されてよい。好ましくは、このタンパク質は、初回刺激投与において、及び追加的に５〜２０日、好ましくは７〜１４日の間隔を空けたさらなる追加投与において投与される。より好ましくは、１回目の追加投与は、刺激投与の５〜１０日後に投与され、２回目の追加投与は、刺激投与の１６〜２６日後に投与される。最も好ましくは、１回目の追加投与は刺激投与の７日後に投与され、２回目の追加投与は刺激投与の２１日後に投与される。一般に、免疫した動物の血液中で黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体の所望の力価が決定されるまで、タンパク質のさらなる追加投与分が投与されてもよい。
【０１２４】
動物を黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質で免疫するためのタンパク質又はポリヌクレオチドは、それぞれの動物において黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質への抗体応答を生成するために必要ないずれの好適な量で投与されてもよい。黄色ブドウ球菌Ｈｌａタンパク質は、免疫した動物の体重１ｋｇあたり０．００１μｇ〜１００μｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０μｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１μｇ、最も好ましくは体重１ｋｇあたり０．３μｇ〜０．７μｇの量で投与されてもよい。
【０１２５】
本発明に係るポリクローナル抗体、使用、組成物及び製造方法は、本発明の根底にある課題を解決する。本発明に係る抗体及び組成物は、有利なことに、Ｓ．インターメディウス群細菌感染症及び関連疾患、とりわけＳ．シュードインターメディウスの感染症及び関連疾患に対して有効な治療を提供する。上記のポリクローナル抗体に基づく治療は、有利なことに非抗生物質治療であり、従って、薬物耐性細菌に関連する感染症及び疾患の治療及び予防にも好適である。
【０１２６】
特に、当該ポリクローナル抗体は動物を単離された抗原で免疫することを必要としないため、当該ポリクローナル抗体は、容易に得られる可能性がある。この抗体は分離されたブドウ球菌属細菌、分離されたその一部分、単離されたブドウ球菌属細菌タンパク質、及び／又は単離されたその一部分若しくは画分で免疫されない動物から得てもよいため、乳汁又は初乳等の大量の材料が利用可能である。従って、ポリクローナル抗体及びその抗体を含むそれぞれの組成物を製造するためのコストは低い。低い製造コストは一般に有利であるが、ペット用医薬の製造においては、低コストはとりわけ有利である。
【０１２７】
有利なことに、本発明に係る抗体及び組成物は、局所投与によって治療効果を奏する。受動免疫等の全身性の抗菌抗体治療は、獣医又は医師等の医療専門家による薬物の投与を必要とする。これとは対照的に、本発明の局所投与される抗体及び組成物は、動物の所有者又はヒト患者自身によって簡便に反復的に投与されることが可能である。また、副作用又は治療効果の減弱につながる投与された抗体に対する免疫学的反応は、抗体の局所投与の際には起こる可能性はより低い。さらには、局所治療によって通常処置される身体表面は限られているため、全身治療と比べて少量の抗体しか必要とされない。
【０１２８】
さらなる態様では、本発明は、全体として、アミノ酸配列ＫＩＧＧＬＩＧ（配列番号２）、ＡＴＫＱＱＳＮ（配列番号３）、ＫＫＩＬＶＩＲＴＫ（配列番号４）、ＩＤＶＩＹＥＲＶ（配列番号５）、ＫＡＡＤＮＦＬＤＰ（配列番号６）及び／又はＤＳＤＩＮＩＫ（配列番号７）を含むエピトープから選択される少なくとも１つのエピトープに結合する抗体に関する。最も好ましくは、当該抗体は、少なくともアミノ酸配列ＫＩＧＧＬＩＧを含むエピトープに結合する。好ましくは、当該抗体は、アミノ酸配列ＫＩＧＧＬＩＧ、ＡＴＫＱＱＳＮ、ＫＫＩＬＶＩＲＴＫ及び／又はＩＤＶＩＹＥＲＶを含むエピトープから選択される少なくとも１つのエピトープに結合する免疫グロブリンＧである。この抗体は、ＡＴＫＱＱＳＮ、ＫＫＩＬＶＩＲＴＫ及びＩＤＶＩＹＥＲＶに結合する抗体であってもよい。別の好ましい実施形態では、この抗体は、アミノ酸配列ＩＤＶＩＹＥＲＶ、ＫＡＡＤＮＦＬＤＰを含むエピトープから選択される少なくとも１つのエピトープに結合する免疫グロブリンＡ又は免疫グロブリンＭである。この態様に係る抗体はさらに、上記の特性及び特徴を特徴としてもよく、上記のとおり使用されてよく、上記のとおり組成物に含まれてもよい。特定の実施形態では、当該抗体は、ＫＩＧＧＬＩＧに結合しない抗体であってもよい。
【０１２９】
さらに驚くべきことに、本願の実施例１１に係る実験において、単離されたＨｌａ  Ｈ３５タンパク質で免疫した雌ウシ由来のポリクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌Ｈｌａと免疫反応性であるだけではなく、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＯＢＹ０１７４２．１に対応する黄色ブドウ球菌クランピング因子Ａ、とりわけその中のエピトープＶＰＥＱＰＤＥＰＧ（配列番号８）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＯＱ１３２１８．１に対応するセリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｅ、セリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｅ、とりわけその中のエピトープＥＫＫＡＰＮＮＴＮＮＤ（配列番号９）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＩＵ８６６１４．１に対応するコラーゲンアドヘシン、とりわけその中のエピトープＹＴＴＨＶＤＮＮＤ（配列番号１０）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＱ２５９５１．１に対応するブドウ球菌エンテロトキシンＫ、とりわけその中のエピトープＴＦＨＬＮＮＮＤＴ（配列番号１１）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ２ＦＺＦ０．１に対応する鉄制御表面決定因子タンパク質Ｂ、とりわけその中のエピトープＤＳＫＰＥＩＥＬＧ（配列番号１２）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＯＺＸ４９８７５．１に対応する細胞外マトリクス及び血漿結合タンパク質、とりわけその中のエピトープＴＡＭＰＴＮＬＡＧＧＳＴＴ（配列番号１３）、並びに図１８に示されるタンパク質及びエピトープと免疫反応性であることが見出された。
【０１３０】
さらに驚くべきことに、本願の実施例１１に係る実験において、単離されたＨｌａ  Ｈ３５タンパク質で免疫した雌ウシ由来のポリクローナル抗体が、表２に開示される黄色ブドウ球菌タンパク質に、とりわけこれらのタンパク質に含まれるそれぞれの選択されたエピトープと結合することが見出された。
【０１３１】
【表２（１）】
2021518382.tif 000007
【０１３２】
【表２（２）】
2021518382.tif 000008
【０１３３】
【表２（３）】
2021518382.tif 000009
【０１３４】
【表２（４）】
2021518382.tif 000010
【０１３５】
従って、本発明は、上記のタンパク質／エピトープのうちの少なくとも１つに結合するポリクローナル抗体にも関する。好ましくは、当該抗体は、表２に記載されるタンパク質／エピトープのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個に結合する。この態様に係る抗体は、さらに、上記の特性及び特徴を特徴とし、上記のとおりに使用され、上記のとおり組成物に含まれてもよい。
【０１３６】
驚くべきことに、本願の実施例１２に係る実験において、後者のポリクローナル抗体、単離されたＨｌａ  Ｈ３５タンパク質で免疫した雌ウシ由来のポリクローナル抗体は、毒素産生性のブドウ球菌株の処理においてとりわけ活性であるが、無毒なブドウ球菌株に対してはあまり効果的ではないことが見出された。従って、このポリクローナル抗体は、毒性の、とりわけ薬物耐性の、ブドウ球菌属細菌の感染症及び／又はブドウ球菌属細菌関連疾患の治療又は予防において使用されることが好ましい。
【０１３７】
本発明は、以下の図及び実施例によってより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌカラムでのポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体のアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡアッセイにおける、黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌへのポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体試料の結合を示す。
【図３】図３Ａは、処方の前後で、ウサギ赤血球細胞のＨｌａに誘導される溶解が免疫した雌ウシから得られたポリクローナル抗体によって阻害されることを示す。図３Ｂ及び図３Ｃは、Ｓ．シュードインターメディウス菌株培養液６９６８７（図３Ｂ）及び４６３９９４９（図３Ｃ）の上清によって誘導されるウサギ赤血球細胞の溶解、並びに異なるＩｇＧ調製物による溶解の阻害を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、異なるＳ．シュードインターメディウス菌株の表面へのポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体の結合のＦＡＣＳ図を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、異なるＳ．シュードインターメディウス菌株の表面へのポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体の結合のＦＡＣＳ図を示す。
【図５】図５は、子ブタ皮膚へのポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体の浸透を示す。Ａ）無処置の皮膚の蛍光染色。ｂ）レーザー穿孔された皮膚のＨＥ染色。ｃ）レーザー穿孔された皮膚の蛍光染色。
【図６】図６は、異なるＣＭＣ濃度を有するヒドロゲルのレオグラムを示す。
【図７】図７は、Ｕｒｓａｔｅｃ  ３Ｋ水平噴霧システムからの異なるＣＭＣ濃度の噴霧プロセスを起動させるために必要とされる噴霧力を示す。
【図８】図８は、調製直後及び２か月又は６か月の保存の後の、保存温度（８℃）及び皮膚温度（３２℃）におけるプラセボ及び抗体含有ヒドロゲルの粘度を示す。
【図９】図９は、調製直後及び保存後の、２つの異なるバッチのＣＭＣヒドロゲルの中の単量体、二量体及びより大きい凝集体の相対含有量、並びにｐＩｇＧの回収を示す。
【図１０】図１０は、２℃〜８℃で７週間の保存の前後でのＰＢＳ及びヒドロゲルの中の抗体のＣＤスペクトルを示す。
【図１１】図１１は、ヒトの皮膚のモルホロジー及び細胞生存率に対する黄色ブドウ球菌及び抗ＡＴ抗体の効果を示す。
【図１２】図１２は、実施例１０の前染色及び二次抗体についてのマイクロアレイ解析を示す。Ａ）前染色、１：２０００；Ｂ）調整後のスキャン；Ｃ）抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（１：２０００）、抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００（１：２０００）。
【図１３】図１３は、実施例１０の試料Ａのマイクロアレイを示す。Ａ）試料Ａ、１０μｇ／ｍＬ（ＩｇＧ）；Ｂ）試料Ａ、１０μｇ／ｍＬ（Ｉｇ）；Ｃ）試料Ａ（免疫前のポリクローナル抗体のプール）、１０μｇ／ｍＬ。
【図１４】図１４は、実施例１０の試料Ｂのマイクロアレイを示す。Ａ）試料Ｂ、１０μｇ／ｍＬ（ＩｇＧ）；Ｂ）試料Ｂ、１０μｇ／ｍＬ（Ｉｇ）；Ｃ）試料Ｂ（免疫前のポリクローナル抗体のプール）、１０μｇ／ｍＬ。
【図１５】図１５は、実施例１０の試料Ｃのマイクロアレイを示す。Ａ）試料Ｃ、１０μｇ／ｍＬ（ＩｇＧ）；Ｂ）試料Ｃ、１０μｇ／ｍＬ（Ｉｇ）；Ｃ）試料Ｃ（免疫前のポリクローナル抗体のプール）、１０μｇ／ｍＬ。
【図１６】図１６は、実施例１０のマイクロアレイ結果の比較を示す。
【図１７】図１７は、実施例１１からのポリクローナルウシ抗体試料Ａ強度の上位３５種の相互作用を示す。
【図１８】図１８は、実施例１１からのポリクローナルウシ抗体試料Ｂ強度の上位３５種の相互作用を示す。
【図１９】図１９は、実施例１１のマイクロアレイ結果の比較を示す。
【図２０】図２０は、試料Ａ（Ａ）及び試料Ｂ（Ｂ）についての実施例１２からのイヌ皮膚感染モデルの定量的結果を示す。
【図２１】図２１は、単独アプローチ及び組み合わせアプローチにおける、抗生物質耐性Ｓ．シュードインターメディウスの増殖に対するウシＩｇＧの効果を示す。
【図２２】図２２は、Ｓ．シュードインターメディウスと共に培養された皮膚生検（Ａ）及び１０ｍｇ／ｍＬウシＩｇＧで処置された皮膚生検（Ｂ）の走査型電子顕微鏡画像を示す。
【図２３】図２３は、イヌの皮膚での付着細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。
【図２４】図２４は、菌種６９６８７を伴うイヌの皮膚におけるＴｈ２サイトカインＩＬ−１３（Ａ）及びＴｈ１サイトカインＴＮＦα（Ｂ）の発現を示す。ＢｏｖＩｇＧ＝ウシＩｇＧ、ＣＭ＝クリンダマイシン。
【発明を実施するための形態】
【０１３９】
実施例１：ＩｇＧの単離及び精製
１．１  乳汁の収集
乳汁を、分娩後７日間にわたって集めた。集めた乳汁は、約−２０℃で保存した。
【０１４０】
この乳汁は、単離された抗原調製物で免疫しなかった雌ウシから得たか、又は黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５タンパク質で免疫した雌ウシから得たかのいずれかであった。
【０１４１】
免疫のために、アジュバントとしてのＱｕｉｌ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）、サンディエゴ、米国）を伴うＰＢＳの中の３００μｇの組み換え成熟黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌタンパク質で、妊娠中の雌ウシを免疫した。Ｈ３５Ｌ変異を含む黄色ブドウ球菌Ｈｌａは、Ｍｅｎｚｉｅｓ及びＫｅｒｎｏｄｌｅ、１９９４及びＷａｒｄｅｎｂｕｒｇ及びＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ  ２００８に開示されるクローニング、大腸菌での発現及び精製によって得た。全体で、２ｍＬの量を皮下注射した。初回刺激免疫を０日目に投与し、２回の追加免疫を１４日目及び２１日目に投与した。この雌ウシは４２日目に分娩した。
【０１４２】
１．２  乳汁処理
凍結した乳汁を解凍し、一般に公知の方法に従ってディスク型分離機の中で、５０℃、８，０００ｇで０．１重量％未満の脂肪含有量まで脱脂した。
【０１４３】
脱脂した乳汁を、０．１４μｍ小孔径の精密濾過膜及びカットオフサイズが１０ｋＤの限外濾過膜を用いた２ｂａｒの一定圧力差（ΔｐＴＭ）での７サイクルの透析濾過にかけた。この工程の間に、カゼインミセル、細菌及び小分子化合物が分離された。
【０１４４】
透析濾過から得た乳清を約−２０℃で保存した。
【０１４５】
１．３  キャプチャークロマトグラフィー
乳清画分からポリクローナル抗体を捕捉するために、乳清を室温で１２時間かけて解凍した。
【０１４６】
この乳清（２０ｇ／Ｌ免疫グロブリン）を２０ｍＭリン酸カリウムナトリウム緩衝液  ｐＨ７．５；２５０ｍＭ  ＮａＣｌに調整し、総容積が１０Ｌ（４０ｃｍ×８ｃｍ）のＣａｐｔｏ−ＭＭＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ジーイー・ヘルスケア・ライフサイエンシーズ）、ピッツバーグ、米国）にロードした。素通り画分は、当該ポリクローナル抗体を含んでいたが、ラクトペルオキシダーゼ及びラクトフェリンのようなタンパク質はカラムに結合した。その後、集めた素通り画分を、総容積が３０Ｌ（４０ｃｍ×２４ｃｍ）のＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ポール・コーポレーション）、ニューヨーク、米国）にロードした。このカラムを５カラム容積分の緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＫＣＯ３  ｐＨ７．５；２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。その後、２カラム容積分の緩衝液Ｂ（５０ｍｍ  ＭＥＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ６．０）を用いて予備溶出を実施した。その後、結合したＩｇを、３カラム容積分の緩衝液Ｃ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ  ｐＨ４）を用いて溶出した。ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムクロマトグラフィーを５Ｌ／分の流量で実施した。このＩｇＧを含む溶出画分をプールした。
【０１４７】
あるいは、上記乳清からβ−ラクトグロブリンを分離するために、上記乳清を、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｑクロマトグラフィーにかけた。手短に言えば、１体積分の乳清を３体積分のＮａ−ＰＦＡ−緩衝液（３０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭギ酸Ｎａ、６０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５）で希釈した。希釈した乳清を１ｍＬ／分の流量でＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードした。ＩｇＧを含む素通り画分をさらに処理したが、一方でβ−ラクトグロブリンはカラムに結合した。
【０１４８】
プールした画分を７℃で、ＰＥＳ膜（１００ｋＤカットオフ）を用いてＰＢＳ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して透析することにより緩衝液交換を実施した。その後、プールしたポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌ  ＩｇＧ画分をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  ０．５／０．２μｍ二重膜で滅菌濾過し、−２０℃で凍結した。
【０１４９】
実施例２：ヒドロゲル処方物
２．１．  処方
２．５重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）  Ｂｌａｎｏｓｅ（登録商標）７Ｈ４Ｆ（Ａｓｈｌａｎｄ（アシュランド）、ケンタッキー州、米国）を、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、９．０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）に激しく撹拌しながら加えた。この混合物を４０℃に加熱し、２４時間にわたって撹拌した。その後、このヒドロゲルを蒸気滅菌した（１２１℃、２ｂａｒ、１５分）。
【０１５０】
タンパク質濃度が４０〜８０ｍｇ／ｍＬの実施例１で得た解凍したポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌ  ＩｇＧを、撹拌下、室温で５〜１０分かけて上記ＣＭＣ原液に加え、ＣＭＣ濃度が１．５重量％でタンパク質濃度が１０〜１２ｍｇ／ｇのヒドロゲルを得た。
【０１５１】
２．２．  ヒドロゲル処方物の分析
２．２．１．  レオロジー挙動
０重量％、０．５重量％、１重量％、１．５重量％、２重量％及び２．５重量％のＣＭＣを含むヒドロゲルのゲル特性を、ステンレス鋼プレート／プレートシステム（直径２５ｍｍ）を備えたＭＣＲ１００レオメータ（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ（アントンパール）、グラーツ（Ｇｒａｚ）、オーストリア共和国）を用いて測定した。粘度測定を、０．５％の一定変形及び１０ｓ−１の一定角周波数を用いて振動モードで実施した。これらの試料を、それぞれ８℃（保存温度）及び３２℃（皮膚温度）の温度で平衡化させた。ヒドロゲルのレオロジー特性を、剪断速度の１から９００ｓ−１の急激な上昇のあとの剪断速度の９００から１０ｓ−１への急激な下降を伴う回転モードで測定した。レオロジー特性を、室温の２０℃で、及び保存温度の８℃で検討した。それぞれのレオグラムを図６に示す。剪断速度を上昇させることにより、剪断応力は上昇したが、一方、剪断速度が低下すると、プロセスは逆になる。ヒステリシスループ、つまり上昇曲線及び下降曲線によって取り囲まれた面積、は、チキソトロピー挙動の典型的な特徴である。上記ヒドロゲルのこの挙動は、噴霧プロセスの間のずり流動化並びにその後の皮膚の上でのヒドロゲル構造の再配置及びその粘性特性を可能にする。
【０１５２】
２．２．２  噴霧力
ＴＡ．ＸＴ  Ｐｌｕｓテクスチャーアナライザー（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ステーブル・マイクロ・システムズ））を使用して噴霧力を試験した。ステンレス鋼プレートを機械に取り付け、Ｕｒｓａｔｅｃ  ３Ｋ噴霧ポンプを加圧するために使用し、ゲルを放出するために必要なその力を測定した。０％、０．５％、１％、１．５％、２％及び２．５％ＣＭＣのＣＭＣ濃度を有するヒドロゲルについての結果を図７に示す。データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）として提示されている。
【０１５３】
２．２．３  粘度
１．５重量％のＣＭＣ及び１２．５ｍｇ／ｍＬの上記のように得たポリクローナル抗体を含むヒドロゲル処方物の８℃及び３２℃での粘度を、調製後並びに２か月及び６．５か月の保存後に測定した。比較のために、抗体を含まないプラセボ処方物の粘度を測定した。結果を図８に示す。データは平均±標準偏差（ｎ＝３）として提示されている。
【０１５４】
２．２．４  ＳＥＣ分析
凝集の可能性をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した。ＳＥＣ分析はＷａｔｅｒｓ  ２６９５システム（Ｗａｔｅｒｓ  ＧｍｂＨ（ウォーターズ）、エシュボルン（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）、ドイツ）で行った。ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の流量は０．５ｍＬ／分であり、２５μＬの各試料をＹＭＣＰａｃｋ−ジオール３００カラムに注入し、２８０ｎｍでのＵＶ検出を用いて検出した。タンパク質濃度は、標準曲線を使用してＳＥＣにより決定した。結果を図９に示す。２．１に従って調製したヒドロゲルの新しく調製したバッチにおける凝集をｔ０で測定し、２℃〜８℃で３週間、５週間及び１１週間の保存後に測定し、第２のヒドロゲルバッチについては６．５か月の保存後に測定した。結果を図９に示す。
【０１５５】
二量体の相対量は、経時的にごくわずかに変動しただけであった。６か月を超える保存の後でさえも、少量の凝集体を観察しただけであった。
【０１５６】
このデータから、上記ｐＩｇＧの二次構造は、インビボ研究のために望まれる濃度（１０ｍｇ／ｇ）において、ゲル処方物の中で安定であると結論できる。
【０１５７】
２．２．４．  円二色性（ＣＤ）分析
二次構造は抗体の活性にとって重要な特質である。調製後及び２℃〜８℃で７週間の保存の後の、ＰＢＳと比べたヒドロゲル中の二次構造の防止を分析した。遠紫外ＣＤ領域（１８０〜２４０ｎｍ）は、ペプチド結合吸収に対応し、タンパク質の二次構造に関する情報を与える。遠紫外ＣＤのために、当該抗体ヒドロゲル処方物を、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で０．１５９ｍｇ／ｍＬ〜０．２０９ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１５分光旋光計（Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ジャスコインタナショナル）、東京、日本）を用いて、２０℃で石英キュベットの中で、０．１ｃｍの経路長を用いて測定した。遠紫外ＣＤスペクトルを、５０ｎｍ／分の走査速度、１ｓの応答時間、１ｎｍの帯域幅、０．１ｎｍのステップ（刻み幅）及び４回のスキャンの積算で１９０〜２５０ｎｍの範囲で連続走査法で集めた。スペクトル分析ソフトウェア（Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、東京、日本）を使用して、スペクトルを、それぞれの緩衝液又はプラセボのゲルのスペクトルについてバックグラウンド補正し、曲線を平滑化（スムージング）した。データは、波長の関数として、千分の１°単位の楕円率で記録する。得られたスペクトルを図１０に示す。データは、上記のとおりの調製直後及び２〜８℃で７週間の保存の後のＰＢＳ、及び１．５％ＣＭＣゲルとして処方したそれぞれの試料の中の抗体の遠紫外スペクトルを示す。
【０１５８】
スペクトルは、高いβシート含有量を示す免疫グロブリンの典型的な曲線を示す。これは、約２１７ｎｍの負の最大値、約２１０ｎｍのゼロ楕円率及び約２００ｎｍの正の最大値から結論できる。振幅の差は、濃度のばらつき及び抗体バッチの不均質性によって引き起こされる。
【０１５９】
ＰＢＳ  ｐＨ７．４又は１．５％ＣＭＣゲルの中での保存に際し、ｐＩｇＧの二次構造の変化はないと結論できる。
【０１６０】
ＣＤ及びＳＥＣのデータから、本発明に係る抗体の二次構造は本発明に係るゲル処方物において安定であると結論できる。
【０１６１】
実施例３．  アフィニティークロマトグラフィー
３．１  カラム調製
黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌを含む１ｍＬのアフィニティーカラムを以下のように調製した。１０μｍｏｌ  ＮＨＳ／ｍＬセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を有するＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１ｍＬを６ｍＬの冷たい１ｍＭ  ＨＣｌで洗浄した。その後、このカラムを２回平衡化し、１ｍＬの組み換えα溶血素Ｈ３５Ｌタンパク質溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）を加えて、室温で１５分間インキュベーションした。その後、このカラムを、１ｍＬ  ＰＢＳ、６ｍＬ  ０．５Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．１、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）、６ｍＬ  ０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）、６ｍＬ  ０．５Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．１、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いる逐次洗浄に供し、室温で１５分間インキュベーションした。この逐次洗浄を、最後の洗浄工程で６ｍＬ  ＰＢＳを用いて繰り返した。すべて、流量は約１ｍＬ／分であった。クロマトグラフィーの前に、このカラムを２０ｍＬの緩衝液Ａ（０．１Ｍグリシン／Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０）を用いて平衡化した。
【０１６２】
試料調製：実施例１で得たポリクローナル黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌ抗体（ＰＢＳ中７５ｍｇ／ｍＬタンパク質）１．６ｍＬを１０．４ｍＬ緩衝液Ａで希釈した。
【０１６３】
３．２  クロマトグラフィー
クロマトグラフィーを１ｍＬ／分の流量で実施した。１０ｍＬの試料溶液を上記アフィニティーカラムにロードした。ローディングの間の素通り画分を画分１に集めた。その後、カラムを１０ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。洗浄の間の素通り画分を画分２に集めた。その後、緩衝液Ｂ（０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．７、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて溶出を行った。溶出物を１ｍＬ画分の試料３〜１２に集めた。上記素通り画分のタンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度としてモニタリングした。２つのピーク画分５及び６をプールした。１５μＬの１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８を加えてｐＨを７に調整した。この試料を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−２、１００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア））セルを用いて、４８００ｒｐｍ、回転子（ローター）Ｓ４１８０（Ｂｅｃｋｍａｎ（ベックマン））で５分にわたる遠心分離によって濃縮した。
【０１６４】
３．３  結果
クロマトグラムを図１に示す。ローディングの間の素通り画分の２８０ｎｍのＡＵＣとアフィニティーカラムの溶出画分のＡＵＣとの関係から、ポリクローナル抗体試料は、黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌタンパク質に特異的に結合するポリクローナルＩｇＧを約３％含んでいたと結論できる。
【０１６５】
実施例４：  ＥＬＩＳＡによる毒素結合の測定
９６穴プレートを０．３μｇ／ｍＬの組み換え黄色ブドウ球菌Ｈｌａでコーティングした。ＢＳＡを用いたブロッキング及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを用いた洗浄の後、実施例１に従って免疫した雌ウシから得られた精製したポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  ＩｇＧのプール（図２「抗体溶液」を参照）をプレートに加えた。黄色ブドウ球菌は、１００μｇ／ｍＬで始まり１：２希釈系列で希釈した。検出は、ペルオキシダーゼ複合体ヤギ抗ウシＩｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（ジャクソン・イムノリサーチ））を用いて行った。ＴＭＢを基質として使用し、反応はＨ２ＳＯ４（１Ｎ）を用いて停止した。吸光度を４５０ｎｍで測定した。このアッセイを、実施例２．１で得たヒドロゲル処方物からの抗体を用いて繰り返した（図２「抗体ゲル」を参照）。
【０１６６】
図２に示すように、ポリクローナル黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  ＩｇＧは、組み換え黄色ブドウ球菌Ｈｌａへの濃度依存的な結合を示した。
【０１６７】
このＥＬＩＳＡアッセイを、黄色ブドウ球菌β溶血素、ロイコトキシンＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、ＬｕｋＣ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＳ、γ溶血素成分Ａ（ＨｌｇＡ）及びＢ（ＨｌｇＢ）を用いて繰り返した。これらのアッセイで得られたＩＤ５０値についての結果を表１にまとめる。
【０１６８】
【表３】
2021518382.tif 000011
【０１６９】
驚くべきことに、α溶血素で免疫した雌ウシから得たＩｇＧプールは、かなりの量の抗α溶血素抗体を含んでいただけではなく、β溶血素、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＦ及びＨｌｇＢに対して反応性である抗体も含んでいた。
【０１７０】
実施例６：ウサギ赤血球細胞のＨｌａ依存的溶解の中和
６．１  組み換えα溶血素に誘導される溶解の阻害
実施例１及び実施例２で得た黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌで免疫した雌ウシから得た精製したＩｇＧを、赤血球細胞ベースの中和アッセイで分析した。処方前（図３Ａ、「抗体溶液」）及び処方後（図３Ａ、「抗体ゲル」）のポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  ＩｇＧ（ＰＩｇＧ）がウサギ赤血球（ＲＢＣ）を溶解する能力を９６穴様式で試験した。具体的には、各抗体試料からの１４０μＬを第１ウェルにロードし、次いで１：２０４８まで連続的に２倍希釈した。各試料の希釈の後、１４０μＬのＨｌａ（１０ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベーションした。１×ＰＢＳ中の５×１０６ウサギＲＢＣを各ウェルに加え、室温で２時間のインキュベーション後、プレートを５分間遠心分離し、１００μＬの上清を新しいマイクロタイタープレートに優しく取り出し、４１５ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１７１】
図３Ａに示すように、このポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  ＩｇＧ（ＰＩｇＧ）は、ＲＢＣの濃度依存的な阻害を示した。アッセイにおけるＨｌａ濃度及び加えたポリクローナルＩｇＧの量に基づいて、３７．５％の抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  ＩｇＧ（ＰＩｇＧ）が中和していると結論できる。
【０１７２】
６．２  Ｓ．シュードインターメディウス上清に誘導される溶解の阻害
単離した抗原で免疫しなかった雌ウシ由来ＩｇＧ（天然のＩｇＧプール）を、６．１に上記のとおりの赤血球細胞べースの中和アッセイにおいて、実施例１で得た黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌで免疫した雌ウシ由来の精製したＩｇＧ（ａＡＴプール）及び実施例３で得たＨｌａ  Ｈ３５Ｌアフィニティー精製したＩｇＧ（ａＡＴ  ｓｐｅｃ  ＡＢ）と比較した。６．１のアッセイとは対照的に、溶解の誘導のために、組み換えＨｌａの代わりに、Ｓ．シュードインターメディウス菌株６９６８７及び４６３９９４９の培養液由来の培養液上清を使用した。
【０１７３】
図３Ａ及び図３Ｂに示すように、単離した抗原で免疫しなかった雌ウシ由来のＩｇＧ（天然のＩｇＧプール）及び黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌで免疫した雌ウシ由来の精製したＩｇＧ（ａＡＴプール）は、驚くべきことに、Ｓ．シュードインターメディウス誘導の細胞溶解の同様の阻害を示すが、一方で、実施例３で得たＨｌａ  Ｈ３５Ｌアフィニティー精製したＩｇＧ（ａＡＴ  ｓｐｅｃ  ＡＢ）は、より低い細胞溶解の阻害を呈した。このように、溶血の阻害は、ポリクローナル抗体の抗Ｈｌａ活性に部分的に依存するだけである。
【０１７４】
実施例７：  薬物耐性Ｓ．シュードインターメディウス菌株に結合する抗体
実施例１で誘導したポリクローナル抗体を用いたＳ．シュードインターメディウスの表面染色のために、この細菌を１ウェルあたり１５μＬで５×１０７ｃ／ｍＬに希釈し（ＯＤ０．５＝５×１０８細菌／ｍＬ）、Ａｂ希釈物を、ＰＢＳ（０．１ＢＳＡ）中で２×最終濃度まで調製した。
【０１７５】
１５μＬ抗体溶液を１５μＬ細菌溶液に加え、７５０ｒｐｍ  １７０μＬで振盪しながら４℃で３０分間インキュベーションした。洗浄するためにＰＢＳ緩衝液を加えた。３５００ｒｐｍで７分間の遠心分離後、上清を除いた。その後、２５μＬの抗ウシＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  １／３５０（Ｊａｃｋｓｏｎ（ジャクソン））を含む染色溶液を加え、試料を７５０ｒｐｍで振盪しながら４℃で３０分間インキュベーションした。この試料を２００μＬの緩衝液で洗浄した。３５００ｒｐｍで７分間の遠心分離後、上清を除き、ペレットを１５０μＬの１％  ＰＦＡ（ストック原液１０％から１／１０×）で固定した。その後、ＦＡＣＳ測定を実施した。表２は、分析したＳ．シュードインターメディウスを示す。
【０１７６】
【表４】
2021518382.tif 000012
【０１７７】
結果：  抗Ｈｌａ抗体は、種々のｓ．シュードインターメディウス菌株の表面上に濃度依存的に結合する。得られたＦＡＣＳ図を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
【０１７８】
実施例８：  子ブタの皮膚及びヒトの皮膚でのインビボ投与
８．１  子ブタの皮膚
８．１．１．  材料及び方法：
実施例２で得たポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体をビオチン化し、実施例３に従ってヒドロゲル中に処方した。このヒドロゲルを移植した子ブタ皮膚に投与した。このヒドロゲルの投与に先だって、Ｐ．Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｓ．Ｅ装置（Ｐａｎｔｅｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ（パンテック・バイオソリューション）、ルッゲル（Ｒｕｇｇｅｌｌ）、リヒテンシュタイン）を用いてこの皮膚試料の一部を１０７μｍの深さまでレーザー穿孔した。
【０１７９】
その後、この皮膚をフランツセルの中で２４時間培養した。２４時間後、この皮膚を冷凍保存し、クライオトームの中でスライスした。このビオチン化した抗体をストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で可視化した。その後、皮膚スライドを共焦点レーザー顕微鏡検査によって調べた。
【０１８０】
８．１．２．  結果：
示したように、投与したヒドロゲルに含まれる抗体は、無処理の皮膚に浸透せず、皮膚表面で現局的であった（図５Ａ）。皮膚のレーザー穿孔した部分では、この抗体は、真皮への浸透及び分布を示す（図５Ｃ）。図３Ｂは、ＨＥ染色による皮膚のモルホロジーを示す。
【０１８１】
８．２．  ヒトの皮膚
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株ＵＳＡ３００でコロニー形成したヒトの皮膚切片における表皮及び表皮バリアの構造に対する本発明に係るポリクローナル抗体の効果を検討した。正常なヒトの皮膚の８ｍｍ生検での黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００のコロニー形成及びＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬの上記のとおりのポリクローナルＩｇＧの共投与の後、その皮膚をトランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌ）システムの中で、ＣＯ２培養器の中で２４時間にわたって培養した。その後、この生検を−１４０で凍結し、凍結切片を染色してモルホロジーを検討した。結果を図１０に示す。図１０ａ）は、表皮及び真皮のモルホロジーを調べるための皮膚切片のＨ＆Ｅ染色、拡大倍率：２０×を示す。図１０ｂ）は、細胞−細胞接合部上の損傷を可視化するための皮膚切片上でのＥ−カドヘリンの免疫蛍光染色を示す。緑色：ヤギ抗マウスＥ−カドヘリン＋ロバ−抗ヤギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８。赤色：ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３核酸（核）対比染色。スケールバー：５０μｍ拡大倍率。
【０１８２】
実施例９：  臨床試験
イヌにおける間擦疹及び化膿性外傷性皮膚炎の治療のための、実施例２に従って得たポリクローナル抗体処方物の効果を評価するために、臨床研究を実施した。以下のプロトコルに従って研究を実施した。
９．１  研究プロトコル
緒言
この研究の目的は、２つの障害、つまり間擦疹（パート１）及び化膿性外傷性皮膚炎（パート２）の治療における抗ポリクローナル黄色ブドウ球菌抗体の使用を評価することである。
【０１８３】
研究プロトコル：
研究設計−パート１：
これは、イヌにおける間擦疹の治療のためにポリクローナル抗ポリクローナル黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体を使用する研究である。所有者は、研究に参加する前にインフォームドコンセント様式（付録１）に署名することになる。
【０１８４】
試験対象患者基準：
間擦疹を患っている２０匹のイヌがこの研究に参加することになる。間擦疹は、病歴、臨床検査並びに存在する好中球及び多くの球菌細菌を示すひだの圧痕塗抹標本の細胞診によって診断されることになる。
【０１８５】
除外基準：
参加後の最初の２週間以内に改善がない場合、イヌは本研究から取り消されることになる。さらには、イヌは、本治療に付随する何らかの重篤な副作用があれば、除外されることになる。最後に、所有者のコンプライアンスの欠如は、除外の理由と考慮されることになる。
【０１８６】
介入：
すべての所有者は、臨床歴及びイヌの間擦疹の発症に関する質問票に記入することを求められる。治療の開始の前に、ブドウ球菌に対する既存の抗体を分析するために血液が採取される。間擦疹病変は、１日２回、実施例２で得たポリクローナル抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体処方物を用いて処置されることになる。この処置に関与していない臨床医が臨床的に及び細胞学的に改善を判断することになる。改善は、紅斑及び滲出物の臨床徴候について０〜３（０−正常；１−軽症；２−中等症；３−重症）で、球菌、桿菌及び酵母に対する処置領域及び対照領域についての細胞診結果について０〜４（０＝細菌／酵母／炎症細胞なし；１＝細菌／酵母／炎症細胞が所々に存在するが、検出のためには、スライドを注意深くスキャンする必要がある；２＝細菌／酵母／炎症細胞が少数で存在するが、困難なくすぐに検出可能である；３＝細菌／酵母／炎症細胞が多く存在し、何の困難もなくすぐに検出可能である；４＝大量の細菌／酵母／炎症細胞が存在し、困難なくすぐに検出可能である）で判断されることになる。
【０１８７】
臨床評価：
各患部の写真が撮影され、間擦疹＿所有者名＿イヌ名＿日付．ｊｐｇで標識される。皮膚の細胞診は、各来診において各患部から得られる。細胞診検体は風乾されＤｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋで染色される。それらは、この処置に関与していない獣医によって盲検方式で、以前に報告された判定量的な尺度（Ｂｕｄａｃｈら２０１２）を使用して評価されることになる。
【０１８８】
研究設計−パート２：
これは、イヌにおける化膿性外傷性皮膚炎の治療のためにポリクローナル抗ポリクローナル黄色ブドウ球菌Ｈｌａ抗体を使用する研究である。所有者は、研究に参加する前にインフォームドコンセント様式に署名することになる。
【０１８９】
試験対象患者基準：
化膿性外傷性皮膚炎を患っている１０匹のイヌがこの研究に参加することになる。状態は、病歴、臨床検査並びに好中球及び球菌細菌を示す病変の細胞診によって診断されることになる。
【０１９０】
ノミアレルギー性皮膚炎等の他の同時発生的な疾患を治療するための薬物療法は、本研究の間も続けることができる。
【０１９１】
除外基準：
参加後の最初の２週間以内に改善がない場合、イヌは本研究から取り消されることになる。さらには、イヌは、本治療に付随する何らかの重篤な副作用があれば、除外されることになる。最後に、所有者のコンプライアンスの欠如は、除外の理由と考慮されることになる。
【０１９２】
介入：
すべての所有者は、臨床歴及びイヌのホットスポットの発症に関する質問票に記入することを求められる。患部は、滅菌した番号＃４０の刈り取り刃を用いて刈られ、防腐剤で清浄にされる。すべてのイヌは、１日０．５〜１ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンで３日間処置され、すべてのイヌは、１０ｍｇ／ｍＬの実施例３で得たポリクローナルの抗黄色ブドウ球菌Ｈｌａを含むヒドロゲルスプレーとして抗ポリクローナル黄色ブドウ球菌Ｈｌａで１日２回、１４日間治療される。この治療期間が終了した後、抗ブドウ球菌抗体を分析するために血液が採取される。
【０１９３】
臨床評価：
病変の写真が撮影され、ｐｏｄｏ＿所有者名＿イヌ名＿日付．ｊｐｇで標識される。皮膚の細胞診は、参加に先だって、及び２週間後に病変から得られる。細胞診検体は風乾されＤｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋで染色される。それらは、獣医によって盲検方式で、以前に報告された判定量的な尺度（Ｂｕｄａｃｈら２０１２））を使用して評価されることになる。
【０１９４】
９．２．  結果
本研究に参加したホットスポットを患っていた最初のイヌは、症候の改善を示し、治療後に副作用を示さなかった。治療の効果は、８匹の他のイヌ患者において確認された。
【０１９５】
実施例１０：ポリクローナル抗体の立体構造エピトープマッピング
１０．１．  材料及び方法
マイクロアレイ内容物：
切断されたペプチドを回避するために、黄色ブドウ球菌α毒素の配列をＣ末端及びＮ末端において中性のＧＳＧＳＧＳＧリンカーによって伸長した。伸長した抗原配列を、６アミノ酸、９アミノ酸及び１２アミノ酸のペプチド−ペプチド重複を有する線状の７アミノ酸、１０アミノ酸及び１３アミノ酸のペプチドへと翻訳した。ペプチド合成後、すべてのペプチドを、Ｃ末端システインと適切に修飾したＮ末端との間のチオエーテル結合によって環化した。得られた立体構造α毒素ペプチドマイクロアレイは、二重にプリントされた９６３種の異なるペプチド（１，９２６個のペプチドスポット）を含んでおり、追加のＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ、９８スポット）対照ペプチドによって縁取りされていた。
試料：
実施例２に従って分離された抗原によって免疫しなかった雌ウシから得たポリクローナル抗体（試料Ａ）；黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５タンパク質で免疫した雌ウシから得たポリクローナル抗体；実施例３に従って得たアフィニティー精製したポリクローナル抗体（試料Ｃ）。
洗浄緩衝液：
０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４（各アッセイ後２×１０秒）
ブロッキング緩衝液：
Ｒｏｃｋｌａｎｄブロッキング緩衝液ＭＢ−０７０（最初のアッセイの３０分前）
インキュベーション緩衝液：
１０％ブロッキング緩衝液を含む洗浄緩衝液
アッセイ条件：
インキュベーション緩衝液中１０μｇ／ｍＬの抗体濃度；４℃で、１４０ｒｐｍで振盪しながら１６時間インキュベーション
二次抗体：
ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００（１：２０００）及び抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（１：２０００）；インキュベーション緩衝液中、室温で４５分間染色
対照抗体：
マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（１：２０００）及びマウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００（１：２０００）；インキュベーション緩衝液中、室温で４５分間染色
スキャナー：
ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ撮像システム；走査オフセット０．６５ｍｍ、解像度２１μｍ、７／７（赤色＝６８０ｎｍ／緑色＝８００ｎｍ）の走査強度
【０１９６】
ＩｇＧ分析用に二次ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体（１：２０００）又は二次抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０抗体（１：２０００）を用いて、及び主アッセイに干渉する可能性がある環状の立体構造規制抗原由来ペプチドとのバックグラウンド相互作用を調べるために、全Ｉｇ分析用に対照マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体（１：２０００）を用いて立体構造α毒素ペプチドマイクロアレイの前染色を実施した。インキュベーション緩衝液中１０μｇ／ｍＬの濃度のポリクローナル抗体試料Ａ、Ｂ及びＣとの他のα毒素ペプチドマイクロアレイのその後のインキュベーションの後に、二次抗体及び対照抗体による染色、並びに７／７（赤色／緑色）の走査強度での読み取りを行った。ペプチドマイクロアレイを縁取る追加のＨＡペプチドを同時に（ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体）又はその後に（抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０抗体）内部品質対照として染色し、このアッセイの品質及びペプチドマイクロアレイの整合性を確認した。
【０１９７】
スポット強度の定量化及びペプチド注釈は、２４ビットのカラーのｔｉｆｆファイルよりも高いダイナミックレンジを呈する７／７の走査強度の１６ビットのグレースケールｔｉｆｆファイルに基づいた。マイクロアレイ画像解析を、ＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて実施した。ソフトウェアアルゴリズムは、各スポットの蛍光強度を未加工の、フォアグラウンドシグナル及びバックグラウンドシグナルに分解し、平均のメジアンフォアグラウンド強度及び２つ組のスポットのスポット間の偏差を算出した。平均のメジアンフォアグラウンド強度に基づいて、強度マップを生成し、このペプチドマップにおける相互作用を、高スポット強度については赤色及び低スポット強度については白色の強度色コードによって強調した。４０％の最大スポット間偏差を許容し、それ以外の場合は対応する強度値をゼロにした。
【０１９８】
加えて、上記抗体試料を用いたアッセイの平均のスポット強度を、黄色ブドウ球菌α毒素のＮ末端からＣ末端への抗原配列に対してプロットして、全体のスポット強度及び信号対ノイズ比を可視化した。この強度プロットを、ペプチド及び強度マップと、並びにマイクロアレイスキャンの目視検査と相関させ、抗体試料によって認識されるエピトープを特定した。特定のアミノ酸が抗体結合に寄与するか否か明らかではない場合には、対応する文字を灰色で記載した。よりよいデータ概観のために、強度プロットのベースラインを平らにした。
【０１９９】
１０．２  抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（１：２０００）、抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００（１：２０００）
上記α毒素ペプチドマイクロアレイを、（１）二次ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体（１：２０００）及び（２）二次抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０抗体（１：２０００）及び対照マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体（１：２０００）を用いてインキュベーションし、その後、７／７（赤色／緑色）の走査強度で読み取った。図１２に示すように、７００ｎｍの赤色チャネルにおいては二次抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０抗体のバックグラウンド相互作用はなく、８００ｎｍの緑色チャネルにおいて二次ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体とコンセンサスモチーフＫＫＩＬＶＩＲＴＫ及びＫＩＤＷＥＫＫＫを有する塩基性ペプチドとの弱いバックグラウンド相互作用を観察した。ＨＡ対照ペプチドの明確な染色を観察した。
【０２００】
１０．３．  試料Ａ（免疫前のポリクローナル抗体のプール）、１０μｇ／ｍＬ
α毒素ペプチドマイクロアレイを、１０μｇ／ｍＬの濃度の試料Ａを用いてインキュベーションし、続いて二次抗体及び対照抗体による染色、並びに７／７（赤色／緑色）の走査強度での読み取りを行った。図１３に示すように、すべてのペプチド長さのコンセンサスモチーフＫＩＧＧＬＩＧを有する隣接するペプチドによって形成されるエピトープ様スポットパターンに対する弱いＩｇＧ応答、二次抗体と塩基性のＫＫＩＬＶＩＲＴＫを有するペプチドとの弱いバックグラウンド相互作用、Ｃ末端ＡＴＫＱＱＳＮモチーフを有するペプチドに対するさらなる弱いそしておそらくはあまり特異的ではない非ＩｇＧ応答を観察した。中程度の信号対ノイズ比を観察した。また、ＨＡ対照ペプチドの明確なその後の染色を観察した。
【０２０１】
１０．４  試料Ｂ（α毒素免疫後のポリクローナル抗体プール）、１０μｇ／ｍＬ
α毒素ペプチドマイクロアレイを、１０μｇ／ｍＬの濃度の試料Ｂを用いてインキュベーションし、続いて二次抗体及び対照抗体による染色、並びに７／７（赤色／緑色）の走査強度での読み取りを行った。図１４に示すように、すべてのペプチド長さのコンセンサスモチーフＫＩＧＧＬＩを有する隣接するペプチドによって形成されるエピトープ様スポットパターンに対する非常に強いＩｇＧ応答、二次抗体と塩基性のＫＫＩＬＶＩＲＴＫモチーフを有するペプチドとの弱いバックグラウンド相互作用を観察し、さらなる非ＩｇＧ応答は観察しなかた。また、高信号対ノイズ比及びＨＡ対照ペプチドの明確なその後の染色を観察した。
【０２０２】
１０．５  試料Ｃ（α毒素免疫後のポリクローナル抗体プール）、１０μｇ／ｍＬ
α毒素ペプチドマイクロアレイを、１０μｇ／ｍＬの濃度の試料Ｃを用いてインキュベーションし、続いて二次抗体及び対照抗体による染色、並びに７／７（赤色／緑色）の走査強度での読み取りを行った。図１５に示すように、すべてのペプチド長さのコンセンサスモチーフＫＩＧＧＬＩを有するペプチドに対する非常に強いＩｇＧ応答、ＩＤＶＩＹＥＲＶモチーフを有するペプチドに対する弱いさらなるＩｇＧ応答、二次抗体と塩基性のＫＫＩＬＶＩＲＴＫを有するペプチドとの弱いバックグラウンド相互作用、コンセンサスモチーフＫＡＡＤＮＦＬＤＰ及びＤＳＤＩＮＩＫを有するペプチドに対するさらなる弱い非ＩｇＧ応答を観察した。また、高信号対ノイズ比及びＨＡ対照ペプチドの明確なその後の染色を観察した。
【０２０３】
１０．６  結果の要約
実施例２に従って単離した抗原によって免疫しなかった雌ウシから得たポリクローナル抗体（試料Ａ）、黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５Ｌタンパク質で免疫した雌ウシから得たポリクローナル抗体、及び実施例３に従って得たアフィニティー精製したポリクローナル抗体（試料Ｃ）のＰＥＰｐｅｒＭＡＰ（登録商標）立体構造エピトープマッピングを、６アミノ酸、９アミノ酸及び１２アミノ酸のペプチド−ペプチド重複を有する環状の立体構造規制の７アミノ酸、１０アミノ酸及び１３アミノ酸ペプチドへと翻訳した黄色ブドウ球菌のα毒素に対して実施した。対応するα毒素ペプチドマイクロアレイを、インキュベーション緩衝液中１０μｇ／ｍＬの濃度の抗体試料を用いてインキュベーションし、続いて二次抗体及び対照抗体による染色、並びにＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ撮像システムを用いた読み取りを行った。スポット強度の定量化及びペプチド注釈をＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。
【０２０４】
二次ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体を用いた、又は二次抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０抗体及び対照マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体を用いたα毒素ペプチドマイクロアレイの前染色は、二次ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体とコンセンサスモチーフＫＫＩＬＶＩＲＴＫ及びＫＩＤＷＥＫＫＫを有する塩基性ペプチドとの非常に弱いバックグラウンド相互作用を強調した。上記抗体試料のインキュベーションから以下の観察結果を得た。
試料Ａ（単離された抗原によって免疫しなかった雌ウシから得たポリクローナル抗体）は、試料Ｂ及び試料Ｃと比べて約２０倍低いスポット強度及び信号対ノイズ比ではあったが、コンセンサスモチーフＫＩＧＧＬＩＧを有するペプチドに対する弱いＩｇＧ応答を示した。さらに、本発明者らは、Ｃ末端ＡＴＫＱＱＳＮモチーフを有するペプチドに対する弱くそしておそらくはあまり特異的ではない非ＩｇＧ応答を観察した。
試料Ｂ（黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５タンパク質で免疫した雌ウシから得たポリクローナル抗体）は、コンセンサスモチーフＫＩＧＧＬＩを有するペプチドに対する非常に強いＩｇＧ応答を示した。他のペプチドについては、本発明者らは、二次ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体と塩基性のコンセンサスモチーフＫＫＩＬＶＩＲＴＫを有するペプチドとの弱いバックグラウンド相互作用のみを観察した。さらなるＩｇＡ応答又はＩｇＭ応答は特定しなかった。
試料Ｃ（アフィニティー精製したポリクローナル黄色ブドウ球菌Ｈｌａ  Ｈ３５抗体）も、コンセンサスモチーフＫＩＧＧＬＩを有するペプチドに対する非常に強いＩｇＧ応答、及びコンセンサスモチーフＩＤＶＩＹＥＲＶを有するペプチドに対するより弱いＩｇＧ応答を示した。さらに、本発明者らは、コンセンサスモチーフＫＡＡＤＮＦＬＤＰ及びＤＳＤＩＮＩＫを有するペプチドに対するさらなる弱いＩｇＡ応答又はＩｇＭ応答を観察した。
【０２０５】
実施例１１：  １２２種の黄色ブドウ球菌抗原に対するウシポリクローナル抗体プールＢ及びプラセボ対照のＩｇＧ応答プロファイリング
１１．１：  材料及び方法
マイクロアレイ内容物：
切断されたペプチドを回避するために中性のＧＳＧＳＧＳＧリンカーを用いて伸長した１２２種の黄色ブドウ球菌抗原に対してＩｇＧ応答プロファイリングを行った。連結し伸長した抗原配列を１１アミノ酸のペプチド−ペプチド重複を有する１３アミノ酸のペプチドへと翻訳した。ペプチド合成後、すべてのペプチドを、Ｃ末端システイン側鎖と適切に修飾したＮ末端との間のチオエーテル生成によって環化した。得られた立体構造ＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）黄色ブドウ球菌発見マイクロアレイは、二重にプリントされた２９，５１９種の異なるペプチド（５９，０３８個のペプチドスポット）を含んでおり、追加のＨＡ対照ペプチド（７８２スポット）によって縁取りされていた。陽性対照抗原α溶血素（ＵｎｉＰｒｏｔ識別番号：Ｐ０９６１６）を５回組み込んだ。
試料：
ウシ抗体である試料Ａ（免疫前のポリクローナル抗体のプール）及び試料Ｂ（α毒素免疫後のポリクローナル抗体プール）。
洗浄緩衝液：
０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４（各アッセイ後２×３０秒又は２×１０秒）
ブロッキング緩衝液：
Ｒｏｃｋｌａｎｄブロッキング緩衝液ＭＢ−０７０（最初のアッセイの３０分前）
インキュベーション緩衝液：
１０％ブロッキング緩衝液を含む洗浄緩衝液
アッセイ条件：
インキュベーション緩衝液中１０μｇ／ｍＬの抗体濃度；４℃で、１４０ｒｐｍで振盪しながら１６時間インキュベーション
二次抗体：
ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００（１：２０００）；インキュベーション緩衝液中、室温で４５分間染色
対照抗体：
マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（１：２０００）；インキュベーション緩衝液中、室温で４５分間染色
スキャナー：
ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ撮像システム；走査オフセット０．６５ｍｍ、解像度２１μｍ、７／７の走査強度（赤色＝７００ｎｍ／緑色＝８００ｎｍ）
マイクロアレイ識別番号：
００１８４６＿０１Ｖ、００１８４６＿０２Ｖ
【０２０６】
洗浄緩衝液中での１５分間の予備膨潤及びブロッキング緩衝液中での３０分間の後、主アッセイに干渉する可能性がある環状の立体構造規制抗原由来ペプチドとのバックグラウンド相互作用を分析するために、ＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）黄色ブドウ球菌発見マイクロアレイを、最初に、二次ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体（１：２０００）を用いてインキュベーションした。その後、ＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）黄色ブドウ球菌発見マイクロアレイを、インキュベーション緩衝液中１０μｇ／ｍＬの濃度のポリクローナルウシ抗体試料Ｂ及びプラセボＣｏｌＢｉｏｔを用いてインキュベーションし、続いて二次抗体及び対照抗体による染色並びに７／７（赤色／緑色）の走査強度でのＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ撮像システムを用いた読み取りを行った。その後、このペプチドマイクロアレイを縁取る追加のＨＡペプチドを、内部品質対照として染色し、このアッセイの品質及びペプチドマイクロアレイの整合性を確認した。
【０２０７】
スポット強度の定量化及びペプチド注釈は、２４ビットのカラーのｔｉｆｆファイルよりも高いダイナミックレンジを呈する７（緑色）の走査強度の１６ビットのグレースケールｔｉｆｆファイルに基づいた。マイクロアレイ画像解析を、ＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）を用いて行った。ソフトウェアアルゴリズムは、各スポットの蛍光強度を未加工の、フォアグラウンドシグナル及びバックグラウンドシグナルに分解し、平均のメジアンフォアグラウンド強度及び２つ組のスポットのスポット間の偏差を算出した。４０％の最大スポット間偏差を許容し、それ以外の場合は対応する強度値をゼロにした。平均のメジアンフォアグラウンド強度に基づいて、強度マップを生成し、このペプチドマップにおける相互作用を、高スポット強度については赤色及び低スポット強度については白色の強度色コードによって強調した。
【０２０８】
試料Ａ及び試料Ｂのポリクローナルウシ抗体の上位のＩｇＧ応答を特定するために、平均し補正した強度値をスポット強度の降順によってソートした。アッセイの平均のスポット強度を、チップの左上から右下へマイクロアレイ内容物に対してウシ試料でスポット化し、全体のスポット強度及び信号対ノイズ比を可視化した。強度プロットを、ペプチド及び強度マップと、並びにマイクロアレイスキャンの目視検査と相関させ、ポリクローナル雌ウシ抗体である試料Ａ及び試料Ｂによって認識されたエピトープを特定した。
【０２０９】
１１．２．  試料Ａ（免疫前のポリクローナル抗体のプール）、１０μｇ／ｍＬ
データ定量化に続いて、ポリクローナルウシ抗体試料Ａ（１０μｇ／ｍＬ）とＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）黄色ブドウ球菌発見マイクロアレイの２９，５１９種の環状の立体構造規制ペプチドとのＩｇＧ応答プロファイルを強調した強度プロットの生成を行った。
【０２１０】
強度プロットの中の対応するシグナルの隣の注釈したコンセンサスモチーフを有するペプチドに対するいくつかの中程度の及び少しの強いＩｇＧ応答を観察した。
【０２１１】
ポリクローナルウシ抗体試料Ａの上位３５種の相互作用をスポット強度の降順にソートし、図１７に示す。
【０２１２】
コンセンサスモチーフＡＡＫＫＫＫＫ（細胞外マトリクス及び血漿結合タンパク質Ｅｂｈ）を有するリジンリッチのペプチドとの非常に強いＩｇＧ応答、並びに免疫グロブリン結合タンパク質ｓｂｉ、ペニシリン結合タンパク質２  Ｍｅｃａ、セリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｃ  Ｓｄｒｃ及びヒアルロン酸リアーゼの主として塩基性のエピトープとの他の中程度の応答を観察した。
【０２１３】
１１．３  試料Ｂ（α毒素免疫後のポリクローナル抗体プール）、１０μｇ／ｍＬ
データ定量化に続いて、ポリクローナルウシ抗体試料Ｂ（１０μｇ／ｍＬ）とＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）黄色ブドウ球菌発見マイクロアレイの２９，５１９種の環状の立体構造規制ペプチドとのＩｇＧ応答プロファイルを強調した強度プロットの生成を行った。
【０２１４】
強度プロットの中の対応するシグナルの隣の注釈したコンセンサスモチーフを有するペプチドに対するいくつかの強い〜非常に強いＩｇＧ応答を観察した。
【０２１５】
ポリクローナルウシ抗体試料Ｂの上位３５種の相互作用をスポット強度の降順にソートし、図１８に示す。
【０２１６】
陽性対照α溶血素のエピトープ並びにクランピング因子Ａ、セリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｅ、コラーゲンアドヘシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＫ、鉄制御表面決定因子タンパク質Ｂ  Ｉｓｄｂ又は細胞外マトリクス及び血漿結合タンパク質Ｅｂｈのエピトープとの強い〜非常に強いＩｇＧ相互作用を伴う複雑な応答を観察した。
【０２１７】
１１．４  要約
二次抗体のバックグラウンド相互作用を伴う、インキュベーション緩衝液中１０μｇ／ｍＬの濃度で対照アッセイした試料Ｂ（α毒素免疫後のポリクローナル抗体プール）及び試料Ａ（免疫前のポリクローナル抗体のプール）のＩｇＧ応答の比較。
【０２１８】
上記二次抗体のバックグラウンド相互作用は広い範囲で無視できるということが判明した。試料Ｂは、試料Ａと比べてより強くかつより複雑なＩｇＧ応答を呈した。主要な応答を強度プロットにおいて注釈した。試料Ｂと試料Ａ及び二次抗体との上位４０の相互作用の比較。
【０２１９】
試料Ｂの上位のＩｇＧ応答のほとんどは、もっぱら見出され、又は試料Ａと比べて有意により高いスポット強度を呈した（クランピング因子Ａ、セリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｅ、コラーゲンアドヘシンのエピトープ）。二次抗体のバックグラウンド相互作用はまったく干渉しなかった。
【０２２０】
ポリクローナルウシ抗体試料Ｂ及び試料ＢのＩｇＧ応答プロファイリングを、１１アミノ酸のペプチド−ペプチド重複を有する環状の立体構造規制１３アミノ酸ペプチドへと翻訳した１２２種の黄色ブドウ球菌抗原の多重化立体構造エピトープマッピングを用いて行った。得られた立体構造ＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）黄色ブドウ球菌発見マイクロアレイは、二重にプリントされた２９，５１９種の抗原由来の環状の立体構造規制ペプチド及び追加のＨＡ対照ペプチド（７８２スポット）を含んでいた。陽性対照として、α溶血素のペプチドを５回組み込んだ。ＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）黄色ブドウ球菌発見マイクロアレイを、インキュベーション緩衝液中１０μｇ／ｍＬの濃度のウシ抗体である試料を用いてインキュベーションし、続いて、二次抗体及び対照抗体による染色並びにＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ撮像システムを用いた読み取りを行った。スポット強度の定量化及びペプチド注釈をＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。
【０２２１】
二次ウサギ抗ウシＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体によるＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）黄色ブドウ球菌発見マイクロアレイの前染色は、おそらくは非特異的なイオン結合に起因する、二次抗体とＫＰＩＰＶＲＬＩＫＲＫＫＹ、ＲＫＩＫＫＶＳＫＮＫＫＲＶ、ＫＳＴＡＰＫＲＬＮＴＲＭＲ、ＹＬＴＲＨＹＬＶＫＮＫＫＬ、ＡＬＧＳＬＬＬＦＧＲＲＫＫ、ＫＨＬＰＬＬＦＡＫＲＲＲＫ、ＫＶＫＨＴＰＦＦＬＰＫＲＲ及びＳＳＩＶＡＦＶＬＰＲＫＲＫ等のアルギニンリッチ及びリジンリッチの塩基性ペプチドとの少しの弱いバックグラウンド相互作用を強調した。ウシ抗体である試料のＩｇＧ応答と比べて、これらのバックグラウンド相互作用は広い範囲で無視できるということが判明した。
【０２２２】
ポリクローナルウシ抗体試料Ａは、コンセンサスモチーフＡＡＫＫＫＫＫ（細胞外マトリクス及び血漿結合タンパク質Ｅｂｈ）を有する塩基性ペプチドとの非常に強いＩｇＧ応答、並びに免疫グロブリン結合タンパク質ｓｂｉ（ＡＳＥＮＴＱＱＴＳＴＫ）、ペニシリン結合タンパク質２  Ｍｅｃａ（ＲＫＩＫＫＶＳＫＮＫＫ）、セリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｃ  Ｓｄｒｃ（ＴＡＮＱＳＴＴＫＴ）、ヒアルロン酸リアーゼ（ＬＮＴＤＥＮＫ）及びスーパー抗原様タンパク質ｓｅｔ１／スーパー抗原様タンパク質ｓｅｔ３（ＬＱＴＮＲＭＳ）の主として塩基性のエピトープとの他の中程度の応答を呈した。
【０２２３】
試料Ｂは、試料Ａよりも有意により複雑かつより強いＩｇＧ応答を呈した。最も強い応答は、陽性対照α溶血素のコンセンサスモチーフＴＧＫＩＧＧＬＩＧを有するペプチドに起因した。他の強いＩｇＧ応答は、クランピング因子Ａ（ＶＰＥＱＰＤＥＰＧ）、セリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｅ（ＥＫＫＡＰＮＮＴＮＮＤ）、コラーゲンアドヘシン（ＹＴＴＨＶＤＮＮＤ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＫ（ＴＦＨＬＮＮＮＤＴ）、鉄制御表面決定因子タンパク質Ｂ  Ｉｓｄｂ（ＤＳＫＰＥＩＥＬＧ）又は細胞外マトリクス及び血漿結合タンパク質Ｅｂｈ（ＴＡＭＰＴＮＬＡＧＧＳＴＴ）の推定エピトープに帰属された。試料Ｂの上位のＩｇＧ応答のほとんどは、もっぱらこの試料で見出され、又は試料Ｂ由来のウシポリクローナル抗体と比べて有意により高いスポット強度を呈した（クランピング因子Ａ、セリン−アスパラギン酸反復タンパク質Ｅ、コラーゲンアドヘシンのエピトープ）。
【０２２４】
抗体応答の比較を図１９に示す。
【０２２５】
実施例１２：  イヌ皮膚感染症モデル：組織学的スライドでの上皮皮膚損傷
方法論：健康なエキソビボのイヌの皮膚由来の周囲長８ｍｍの穴が開いた生検を得た。この生検を、１ウェルあたり６．５ｍｍの直径及び０．４μｍの膜細孔径を有するトランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）システム（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング））に移した。その後、１×１０８ＣＦＵ／ｍＬスタフィロコッカス・シュードメディウス（毒素産生性菌株６９６８７若しくは非毒素産生性菌株ＧＬ１５１Ａのいずれか）及び／又は１０ｍｇ／ｍＬの、Ｈ３５Ｌによる免疫をしていない若しくは免疫をした雌ウシ由来のＩｇＧ（それぞれ試料Ａ及び試料Ｂ）を培養物に投与した。ＣＯ２培養器の中で下側のチャンバーで４８時間にわたってウイリアム（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）Ｅ培地を用いて培養した。
【０２２６】
上記皮膚生検をトランズウェルシステムから取り出し、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。
【０２２７】
細胞の核、細胞外物質及び細胞質内タンパク質を染色するために、Ｈ＆Ｅを用いて皮膚切片の染色を実施した。Ｈ＆Ｅ染色したスライドを走査し、３０倍拡大で周囲長５００μｍ及び面積０．０１６ｍｍ２の１０個の領域を無作為にピックアップし、生細胞及び死細胞並びに濃縮核を示す細胞の数を数えた。
【０２２８】
結果：細胞計数の定量的結果を図２０に示す。要約すれば、Ｈ３５Ｌがない雌ウシ由来の抗体は、非毒素産生性菌株による皮膚損傷のより良好な防御を示すが、一方で、Ｈ３５Ｌで免疫した雌ウシ由来の抗α毒素抗体は、毒素産生性菌株による皮膚損傷のより良好な防御を示す。
【０２２９】
実施例１３：抗生物質耐性Ｓ．シュードインターメディウスの増殖に対するウシＩｇＧの効果
１３．１  方法：最小阻害濃度アッセイ
診療所で使用される標準的な抗生物質であるクリンダマイシンに対するスタフィロコッカス・シュードメディウスの抗生物質耐性を試験するために、最小阻害濃度を評価した。菌株６９６８７、ＨＨ１５、ＧＬ１５１Ａ及び２３９２９由来の細菌を、１２ｍＬチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ（グライナー・バイオワン・インターナショナル）、ドイツ）の中で無菌のＴ−Ｈｅｗｉｔｔ培地を用いて３７℃（Ｅｌｂａｎｔｏｎ  ＬＴ６５０インキュベーター、Ｇｅｍｂｉｎｉ  ＢＶ（ジェミニ）、オランダ）及び６００ｒｐｍ（ＶＷＲ  Ｍｉｎｉ  Ｓｈａｋｅｒ、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ブイダブリューアール・インターナショナル）、米国）で一晩増殖させた。ＯＤ６００を測定し、細菌濃度を１０６細菌／ｍＬに調整した。２０μｇ／ｍＬクリンダマイシンを秤量し、Ｔ−Ｈｅｗｉｔｔ培地に溶解した。９６穴の底部がｕ字型のマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ、ドイツ）で三重のアッセイを実施した。クリンダマイシンを、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ  ＸＬＳ＋（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（メトラー・トレド・インターナショナル）、米国）マルチチャンネルピペットを用いて連続的に希釈し（１：２）、細菌を加えた。代替として、対照としてのウシＩｇＧ又はＢＳＡを６．３ｍｇ／ｍＬの出発濃度で滴定し、一定濃度（６．３ｍｇ／ｍＬ）の対照としてのウシＩｇＧ又はＢＳＡを、クリンダマイシンの希釈系列と共インキュベーションした。陽性対照は抗生物質を含んでおらず、陰性対照は抗生物質も細菌も含んでいなかった。このプレートを、振盪せずに３７℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、マイクロプレートをＥｐｓｏｎ  Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  Ｖ７００フォトスキャナー（Ｓｅｉｋｏ  Ｅｐｓｏｎ  Ｋ．Ｋ（セイコーエプソン株式会社）、日本）を用いて走査し、クリンダマイシンの希釈段階に従って最小阻害濃度を算出した。
【０２３０】
結果：イヌのＳ．シュードインターメディウスに対するウシＩｇＧの効果を評価するために、ＭＩＣアッセイ及び薬理学的試験の組み合わせを開発した。このアッセイの範囲内で、クリンダマイシンの増殖阻害効果、抗生物質及びウシＩｇＧの併用療法並びに濃度依存的なウシＩｇＧの単独効果を決定することができた。対照として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をアッセイに加えた。
【０２３１】
クリンダマイシンに対するＭＤＲ  ＭＲＳＰ最小阻害濃度を決定することができた。６９６８７、ＨＨ１５、ＧＬ１５１Ａ及び２３９２９は、０．６２５ｍｇ／ｍＬクリンダマイシンにそのブレークスルー点を示す（図２１Ａ、上側パネル）。一定濃度の６．３ｍｇ／ｍＬウシＩｇＧを加えたとき、コロニーは、変形及び異なるモルホロジーを示した（図２１Ａ、下側パネル）。これは、抗体が細菌増殖を妨げたことを示唆する。細菌増殖に対するウシＩｇＧの効果は濃度依存的である。６９６８７の増殖は、ウシＩｇＧの全体の希釈系列にわたって変化した。ＨＨ１５、ＧＬ１５１Ａ及び２３９２９は、特定の抗体希釈物において変容し減少したコロニー形成を示した（図２１Ｂ）。クリンダマイシン及びＢＳＡの組み合わせ並びにＢＳＡの希釈は変容を示さず、これは、ウシＩｇＧの増殖阻害効果は特異的であるという仮定を導く（図２１Ｃ）。
【０２３２】
実施例１４：皮膚の走査型電子顕微鏡分析
１４．１．  方法：走査型電子顕微鏡法
皮膚生検をＳ．シュードインターメディウスと培養し、代替的に実施例１２に従って１０ｍｇ／ｍＬウシＩｇＧで処理した。皮膚組織を４℃のＰＢＳの中で１％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（シグマアルドリッチ・コーポレーション）、米国）で固定した。次の工程で、この試料を、ＰＢＳの中で希釈した１０％（ｖ／ｖ）、２５％（ｖ／ｖ）及び５０％（ｖ／ｖ）のエタノール（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（メルク）、ドイツ）との３０分間のインキュベーションで連続的に脱水した。その後、７５％（ｖ／ｖ）及び９０％（ｖ／ｖ）エタノール−水希釈物とのインキュベーションを行い、続いて９６％エタノールとの２回のインキュベーションを行った。最後に、この組織を５０％（ｖ／ｖ）エタノール−ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）及び１００％  ＨＭＤＳで処理した。この試料を室温で一晩風乾し、１２ｍｍ検体台（Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．（アガー・サイエンティフィック）、英国）の上に載せた。Ｑｕｏｒｕｍ  Ｑ１５０Ｒスパッターコーター（Ｑｕｏｒｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．（クオラム・テクノロジーズ）、英国）を使用して５ｎｍの金のコーティングを実施した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）Ｓｃｉｏｓ（商標）ＤｕａｌＢｅａｍ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、米国）を用いて画像を撮影し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６ソフトウェアを使用して着色した。
【０２３３】
１４．２．  結果：イヌの皮膚でのブドウ球菌の局在化及びコロニー形成を理解するために、走査型電子顕微鏡法を利用した。抗体処理を伴うか又は伴わない、細菌との２４時間のコロニー形成の後、この皮膚試料を連続的に脱水して金でコーティングした。図２２Ａに示すように、処理を伴わない皮膚試料は大量の細菌コロニーを示した。Ｓ．シュードインターメディウスは、個々の細胞の形態で見つかることは稀であり、むしろ広範囲のパッチとして見つかった。さらには、そのパッチは毛包の近くに現れた。図２２Ｂに示すように、１０ｍｇ／ｍＬのウシＩｇＧの存在下で、この細菌は、変容した挙動を示した。広範囲の細菌コロニー形成は特定できなかった。逆に、角質層の死細胞の下に、細菌の小さいパッチが非常に頻繁に隠れていた。
【０２３４】
実施例１５：皮膚での細菌コロニー形成の阻害
１５．１．  方法：イヌの皮膚組織を用いた細菌接着アッセイ
イヌの皮膚を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔｒｅｃｈｔ（ユトレヒト大学）の獣医診療所からの末期の動物実験からの廃棄物として得て、生検をこれまでに記載されたとおりに切り出した。この組織を、１×１０６ＧＬ  １５１Ａ  Ｓ．シュードインターメディウス細菌を、単独で、又は１０ｍｇ／ｍＬウシＩｇＧ若しくは対照として化学物質２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）に対する抗体と組み合わせて用いて、３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした。培養後、この生検を無菌のＰＢＳで３回洗浄し、付着していない細菌を除去した。その後、この試料を１２個の無菌のビーズビータービーズ（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｅｒ  ｂｅａｄｓ）が入っているクライオチューブに入れ、１ｍＬの無菌の生理食塩水を加えた。この細胞を、ビーズバグマイクロチューブホモジナイザー（Ｂｅａｄ  Ｂｕｇ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ベンチマーク・サイエンティフィック）、米国）を用いて全速で４５秒間溶解した。均質化の後、溶解した組織を、無菌のＭＱ水の中で１：１０及び１：１００に希釈した。１００μＬのこれらの希釈物をＭＲＳＡ  Ｃｏｌｏｒｅｘ（商標）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｍｅｄｉａ（ｂｉｏＴＲＡＤＩＮＧ  Ｂｅｎｅｌｕｘ  Ｂ．Ｖ．（バイオトレーディング・ベネルクス）、オランダ）にプレーティングした。このプレートを３７℃で一晩インキュベーションした。コロニー形成単位を数え、希釈物に従って、哺乳類細胞に接着した細菌の量を算出した。
【０２３５】
１５．２．  結果：イヌの皮膚への付着細菌を定量するために接着アッセイを実施した。図２３のグラフは、ウシＩｇＧの存在下でのコロニー形成単位の減少を示す。抗ＤＮＰ対照抗体も細菌コロニーの非特異的な減少を示した。
【０２３６】
実施例１６：Ｔｈ２サイトカインＩＬ−１３及びＴｈ１サイトカインＴＮＦの発現
１６．１．  方法：イヌの皮膚生検を、１×１０６  ６９６８７  Ｓ．シュードインターメディウス細菌と、単独で、又は１０ｍｇ／ｍＬウシＩｇＧ若しくはクリンダマイシンと組み合わせて共培養した。３０時間後、生検を−１５０℃で凍結し、２０μｍサイズの凍結切片を切り出した。２０μｍのイヌの皮膚切片の５０〜６０個のスライスからＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ（キアゲン）、ドイツ）を使用してＲＮＡを単離した。リボヌクレアーゼの存在を減らすために、単離を始める前に、作業スペース及び使用した滅菌していない材料をＲＮＡｓｅＺＡＰを用いて清浄にした。キットプロトコルに従う前に、試料を氷上で解凍し、ボルテックスにかけ、０．６ｍｍ針が付いた１ｍＬシリンジの中で６回上げ下げして試料を均質にした。次の工程で、５８０μＬのリボヌクレアーゼフリーの水を試料にピペッティングし、２０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを加えた。この切片を加熱ブロックの上で５５℃で１０分間インキュベーションし、１２０００ｒｐｍ（Ｈｅｔｔｉｃｈ（登録商標）ＭＩＫＲＯ  １２０遠心分離機、Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｂｅｎｅｌｕｘ  Ｂ．Ｖ．（ヘティッチ・ベネルクス）、米国）で８分間沈降させた。上清を新しい２ｍＬチューブに移し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔについての標準的な手順を実行した。
【０２３７】
いずれかのイヌの皮膚組織に由来する単離したＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（バイオラッド・ラボラトリーズ）、米国）を用いてｃＤＮＡへと転写した。すべての試料のＲＮＡを最低のＲＮＡ含有量を有する試料の濃度に希釈した。
【０２３８】
リアルタイム定量ＰＣＲを、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、米国）を使用してＳｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライドバイオシステムズ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、米国）を用いて実施した。ゲノムＤＮＡを１０ｐｇ／μＬの濃度に希釈した。
【０２３９】
分析のために、試料のサイクル閾値（Ｃｔ）は、ハウスキーピング遺伝子（ＲＰＳ１９）を基準にした。ウシＩｇＧ又はクリンダマイシン処理の効果を理解するために、処理試料の算出したΔＣｔ値を処理していない値と比較した（ΔΔＣｔ）。未処理の試料と比べた発現倍率は、２−ΔΔＣｔを算出することにより求めることができた。
ΔＣ＿ｔ＝Ｃ＿（ｔ標的）−Ｃ＿（ｔハウスキーピング遺伝子）
ΔΔＣ＿ｔ＝Ｃ＿（ｔ処理）−Ｃ＿（ｔ未処理）
増加倍率＝２＾（−ΔΔＣ＿ｔ）
【０２４０】
１６．１．  結果：ｑＰＣＲを用いて、Ｓ．シュードインターメディウスとの３０時間の培養の間にイヌの外植片皮膚により産生したサイトカインの発現を研究した。基準試料と比べた発現倍率の定量化を算出した。イヌエキソビボ皮膚をＳ．シュードインターメディウス菌株６９６８７に感染させた。図２４Ｂに示すように、炎症促進性サイトカインＴＮＦαの発現は、未感染の未処理の基準試料と比較しておよそ３倍に高まった。ウシＩｇＧによる処理は、発現レベルを下方制御することができ、クリンダマイシンは、より大きな程度にその発現を低下させた。図２４Ａに示すように、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−１３は異なる発現パターンを示した。６９６８７への感染はその発現を４倍上方制御した。ウシＩｇＧは上記サイトカイン量を強く下方制御したが、一方で、クリンダマイシン処理は産生を上方制御した。このように、ＴＮＦαは、６９６８７への感染への間にＩＬ−１３よりも少ない量で産生された。クリンダマイシンはＴＮＦαに対する下方制御効果を有していたが、一方で、ＩＬ−１３は６９６８７への感染の間に上方制御された。
【０２４１】
参考文献
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【図１】
2021518382.tif 000013
【図２】
2021518382.tif 000014
【図３】
2021518382.tif 000015
【図４Ａ】
2021518382.tif 000016
【図４Ｂ】
2021518382.tif 000017
【図５Ａ）】
2021518382.tif 000018
【図５Ｂ）】
2021518382.tif 000019
【図５Ｃ）】
2021518382.tif 000020
【図６】
2021518382.tif 000021
【図７】
2021518382.tif 000022
【図８】
2021518382.tif 000023
【図９】
2021518382.tif 000024
【図１０】
2021518382.tif 000025
【図１１】
2021518382.tif 000026
【図１２】
2021518382.tif 000027
【図１３】
2021518382.tif 000028
【図１４】
2021518382.tif 000029
【図１５】
2021518382.tif 000030
【図１６】
2021518382.tif 000031
【図１７】
2021518382.tif 000032
【図１８】
2021518382.tif 000033
【図１９】
2021518382.tif 000034
【図２０】
2021518382.tif 000035
【図２１】
2021518382.tif 000036
【図２２Ａ）】
2021518382.tif 000037
【図２２Ｂ）】
2021518382.tif 000038
【図２３】
2021518382.tif 000039
【図２４】
2021518382.tif 000040
【配列表】
2021518382000001.app
【国際調査報告】
2021518382.tif 000041
2021518382.tif 000042
2021518382.tif 000043