(57)【要約】本発明は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法を提供し、その方法は、被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップを含み、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である。本発明の方法は更に、サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を参照標準中の同じアミノ酸付加物の濃度と比較するステップと、参照標準に対するサンプル中の前記アミノ酸付加物の濃度差の有無を識別するステップとを含み、前記濃度差の有無はＡＳＤの有無と相関する。本発明の方法で用いる診断アルゴリズムも提供される。
2021513058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法であって：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．前記サンプル中の前記アミノ酸付加物の前記濃度を参照標準中の同じアミノ酸付加物の濃度と比較するステップと；
ｃ．前記参照標準に対する前記サンプル中の前記アミノ酸付加物の濃度差の有無を識別するステップであって、前記濃度差の有無はＡＳＤの有無と相関する、前記識別するステップと；を備える、
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法。
【請求項２】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の予後を特定するための方法であって：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．前記サンプル中の前記アミノ酸付加物の前記濃度を参照標準中の同じアミノ酸付加物の濃度と比較するステップと；
ｃ．前記参照標準に対する前記サンプル中の前記アミノ酸付加物の濃度差の有無を識別するステップであって、前記濃度差の有無は、良好な予後又は不良な予後と相関する、前記識別するステップと；を備える、
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の予後を特定するための方法。
【請求項３】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法であって：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．前記サンプル中に検出された前記アミノ酸付加物の前記濃度に基づき、診断アルゴリズムによって、前記被験者の健康状態を分類するステップであって、前記診断アルゴリズムは、既知の疾病状態を有する被験者の母集団から取得した同じアミノ酸付加物についての対応する濃度に関して訓練され、それにより前記被験者におけるＡＳＤの有無を診断する、前記分類するステップと；を備える、
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法。
【請求項４】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置するための方法であって：
ａ．請求項１又は請求項３の方法の成績を要求する、又は、請求項１又は請求項３の方法の結果を取得するステップと；
ｂ．ＡＳＤであると診断された被験者に、ＡＳＤに対する療法を施用するステップと；を備える、
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置するための方法。
【請求項５】
ＡＳＤの処置に適する療法を識別するための方法であって：
ａ．候補の療法を施用された被験者からの単離サンプルを提供するステップと；
ｂ．前記サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）で検出された前記アミノ酸付加物の前記濃度を、前記候補の療法の施用前の前記被験者からの単離サンプル中のアミノ酸付加物の濃度と比較することによって、前記アミノ酸付加物の相対的な濃度変化を特定するステップと；を備え、
前記候補の療法を施用した後に濃度変化が検出される場合、前記候補の療法はＡＳＤの処置に適しており、
前記候補の療法を施用した後に濃度変化が検出されない場合、前記候補の療法はＡＳＤの処置に適していないとする、
ＡＳＤの処置に適する療法を識別するための方法。
【請求項６】
ＡＳＤ療法の有効性をモニタリングするための方法であって：
ａ．前記療法を施用された患者からの単離サンプルを提供するステップと；
ｂ．前記サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）で検出された前記アミノ酸付加物の前記濃度を、以前の時点での被験者からの単離サンプル中のアミノ酸付加物の濃度と比較することによって、アミノ酸付加物の相対的な濃度変化を特定し、
濃度変化が検出された場合、有効性の存在を確認し、
濃度変化が検出されなかった場合、有効性の非存在を確認するステップと；を備える、
ＡＳＤ療法の有効性をモニタリングするための方法。
【請求項７】
請求項１若しくは請求項２のステップ（ｂ）及び／若しくは（ｃ）、又は、請求項５若しくは請求項６のステップ（ｃ）は、診断アルゴリズムによって／診断アルゴリズムを用いて行われるステップであり、
好ましくは、前記診断アルゴリズムは、前記サンプル中に検出された前記アミノ酸付加物の前記濃度に基づき、前記ＡＳＤの有無を診断するように構成されており、前記診断アルゴリズムは、１つ又は複数（好ましくは複数）の参照標準中の同じアミノ酸付加物についての対応する濃度に関して訓練される、又は、
好ましくは、前記診断アルゴリズムは、前記サンプル中に検出された前記アミノ酸付加物の前記濃度に基づき、前記被験者の健康状態を分類するように構成されており、前記診断アルゴリズムは、既知の疾病状態を有する被験者の母集団から取得した前記同じアミノ酸付加物についての前記対応する濃度に関して訓練される、
請求項１から請求項２又は請求項５から請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ．ＡＳＤを診断すること；
ｂ．ＡＳＤの予後を特定すること；
ｃ．ＡＳＤの処置に適する療法を識別すること；
ｄ．ＡＳＤ療法の有効性をモニタリングすること；及び／又は、
ｅ．ＡＳＤ診断アルゴリズムにおける特徴としての使用；のための、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、ニトロ化アミノ酸付加物、又はこれらの組合せの使用。
【請求項９】
前記サンプルは、血液、血漿、血漿限外ろ過液、尿、血清、滑液、及び／又は痰のうちの１種又は複数種から選択される、
請求項１から請求項８の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
前記アミノ酸付加物は、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、ピラリン、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、Ｎε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、Ｎε−（１−カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びメチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）から選択される１種又は複数種である、
請求項１から請求項９の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
前記アミノ酸付加物は、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、ジチロシン（ＤＴ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、ピラリン、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、Ｎε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、Ｎε−（１−カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びメチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）から選択される少なくとも２種である、
請求項１から請求項１０の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１２】
非ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種の前記濃度は増加し；及び／又は、
ｂ．３ＤＧ−Ｈ及びＧ−Ｈ１（遊離付加物）から選択される１種又は複数種の前記濃度は減少し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１１の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１３】
ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種の前記濃度は同じである又は増加し；及び／又は、
ｂ．３ＤＧ−Ｈ及びＧ−Ｈ１（遊離付加物）から選択される１種又は複数種の前記濃度は同じである又は減少し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１２の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１４】
非ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、ＤＴ、及びＧＳＡから選択される２種以上の前記濃度は増加し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１３の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１５】
ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、ＤＴ、及びＧＳＡから選択される２種以上の前記濃度は同じである又は増加し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１４の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１６】
非ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ａ．ＣＭＬ、及びＣＭＡから選択される１種又は複数種の前記濃度は増加し；及び／又は、
ｂ．３ＤＧ−Ｈの前記濃度は減少し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１５の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１７】
ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ａ．ＣＭＬ、及びＣＭＡから選択される１種又は複数種の前記濃度は同じである又は増加し；及び／又は、
ｂ．３ＤＧ−Ｈの前記濃度は同じである又は減少し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１６の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１８】
非ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＤＴから選択される２種以上の前記濃度は増加し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１７の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１９】
ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＤＴから選択される２種以上の前記濃度は同じである又は増加し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１８の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２０】
非ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ＣＭＬ及び／又はＣＭＡの前記濃度は増加し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項１９の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２１】
ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ＣＭＬ及び／又はＣＭＡの前記濃度は同じである又は増加し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項２０の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２２】
前記サンプルは、血液サンプルである、
請求項１２から２１の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２３】
非ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ＧＳＡ及び／又はピラリンの前記濃度は増加し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項２２の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２４】
ＡＳＤ参照標準と比較したときに、
ＧＳＡ及び／又はピラリンの前記濃度は同じである又は増加し；
ＡＳＤの存在を指し示す、
請求項１から請求項２３の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２５】
前記サンプルは、尿サンプルである、
請求項２３又は請求項２４に記載の方法又は使用。
【請求項２６】
前記アミノ酸付加物は、安定同位体希釈分析液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析、反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、逆相質量分析、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析、同位体希釈質量分析、サイズ透過（ゲルろ過）、イオン交換、親和性、高速液体クロマトグラフィ、超速液体クロマトグラフィ、一次元ゲル電気泳動（１−ＤＥ）、及び／又は二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）によって検出される、
請求項１から請求項２５の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２７】
前記アミノ酸付加物は、質量分析によって検出される、
請求項１から請求項２６の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２８】
前記アミノ酸付加物は、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析によって検出される、
請求項１から請求項２７の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２９】
前記自閉症スペクトラム障害は、自閉症、アスペルガ症候群、特定不能な広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、及び幼児期崩壊性障害のうちの１種又は複数種から選択される、
請求項１から請求項２８の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項３０】
サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップで取得されるデータを、適切なデータ記録媒体に記録するステップ；を更に備える、
請求項１から請求項２９の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項３１】
アミノ酸付加物の前記検出された濃度が診断アルゴリズムに入力され、前記診断アルゴリズムがＡＳＤの有無を指し示す、
請求項１から請求項３０の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項３２】
請求項１から請求項３１の何れか一項に記載の方法又は使用に従ってサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップにおいて取得されるデータを含む、
データ記録媒体。
【請求項３３】
自閉症スペクトラム障害を診断するための方法に用いるための、
請求項３２に記載のデータ記録媒体。
【請求項３４】
サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するための試薬であって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、ニトロ化アミノ酸付加物又はこれらの組合せから選択される１種又は複数種である、試薬と；前記試薬の使用説明書と；を備える、
キット。
【請求項３５】
前記アミノ酸付加物は、Ｎε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、ピラリン、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、及び３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）から選択される１種又は複数種である、
請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記アミノ酸付加物は、Ｎε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、ピラリン、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、ジチロシン（ＤＴ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、及び３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）から選択される２種以上である、
請求項３４又は請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
サンプル中のアミノ酸の濃度を検出するための試薬であって、前記アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、又はこれらの組合せのうちの１種又は複数種から選択される、前記試薬と；
任意選択で前記試薬の使用説明書と；を更に備える、
請求項３４から請求項３６の何れか一項に記載のキット。
【請求項３８】
サンプル中のクレアチニンの濃度を検出するための試薬；を更に備える、
請求項３４から請求項３７の何れか一項に記載のキット。
【請求項３９】
前記試薬は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、逆相質量分析、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析、同位体希釈質量分析、サイズ透過（ゲルろ過）、イオン交換、親和性、高速液体クロマトグラフィ、超速液体クロマトグラフィ、一次元ゲル電気泳動（１−ＤＥ）、及び／又は二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）によってアミノ酸付加物及び／又はアミノ酸の濃度を検出するための試薬である、
請求項３４から請求項３８の何れか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記試薬は、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析によってアミノ酸付加物の前記濃度を検出するための試薬である、
請求項３４から請求項３９の何れか一項に記載のキット。
【請求項４１】
液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析によるアミノ酸付加物の前記濃度の検出に用いるための標準；を更に備える、
請求項３４から請求項４０の何れか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸付加物の使用を含む、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症スペクトラム障害（自閉的スペクトラム障害、自閉スペクトラム症、ＡＳＤ）は、主として社会的相互作用及び関心の範囲に影響を及ぼし、言語障害、反復及び／又は脅迫行動、多動性、不安及び新しい環境への適応困難性など、広い範囲の他の障害を引き起こす発達障害であると定義され、認知機能障害を伴うこともあれば伴わないこともある。臨床所見の不均一性が高いため、特に成長の初期段階では、ＡＳＤの診断は困難で不確実である。自閉症は小児の約１％に及び、その有病率は、通常、女児（０．５％）よりも男児（１．５％）の方が高い。
【０００３】
ＡＳＤは、今では、患者の症状に関する臨床医の知見に基づいて診断される。標準化された活動での患者の成績を評価することから導き出された各種スコアが使われるが、それには、自閉症診断観察スケジュール（Autism Diagnostic Observation Schedule、ＡＤＯＳ）スコア、小児自閉症評定尺度（Childhood Autism Rating Scale、ＣＡＲＳ）、乳幼児期自閉症チェックリスト（Checklist for Autism in Toddlers、ＣＨＡＴ）、及び対人コミュニケーション質問紙（Social Communication Questionnaire、ＳＣＱ）が含まれる。しかし、これらの評価は主観的であり、より重篤な症状への進行リスクの評価や療法に対する反応の評価に関する情報は提供されない。これらの方法の能力はよいものではなく、その感度は２０％から７０％、及び、５０％から８０％に過ぎない。また、実施には、専門家、即ち経験豊富な医療従事者が必要となる。したがって、患者の自閉症を診断する改善された方法に対する必要性が存在する。
【０００４】
現在、自閉症のための臨床化学も画像検査も存在しない。診断は、上記のように、社会的相互作用の障害と関心の範囲とについての臨床評価に基づいている。ＡＳＤの診断のために、トランスクリプトーム、プロテオーム、及びメタボロームプロファイリングが提案されており、受信者（レシーバ）動作特性の曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）プロットによって判断される診断能は、０．７３から０．９１である。しかし、こうした先行技術の方法は、特異度が低い。最近のこうした展開にもかかわらず、高い感度と特異度でＡＳＤ被験者を診断する安価で侵襲性の低い試験に対する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、血漿タンパク質中の化学的に定義された酸化、ニトロ化及び糖化アミノ酸残基並びに血漿及び尿中の関連する酸化、ニトロ化、及び糖化アミノ酸の痕跡レベル（例えば、発達が正常で、ＡＳＤ児と年齢及び性別が一致する小児における）の検出に基づく診断方法を提供することにより、上記の問題の少なくとも１つを解決する。更に、ＡＳＤを持つ小児と持たない小児を判別するための機械学習ステップ（アルゴリズムにおけるこれらの代謝産物の最適な組合せのデータドリブン（データ駆動）選択）が提供される。
【０００６】
本発明者らは、ＡＳＤ児と健全な対象の血漿タンパク質中のタンパク質糖化、酸化、及びニトロ化付加物と、血漿及び尿中の関連する遊離付加物との濃度を定量化することが、ＡＳＤに対する確固たる診断的有用性を有することを発見した。
【０００７】
有利なことに、今では、ＡＳＤの診断を血液又は尿サンプルの測定によって行うことができる。本診断方法は客観的であり、感度及び／又は特異度及び／又は精度が高い。短時間（例えば、３０分）の決められた臨床化学訓練を受けた非専門家が実施してもよい。この試験は、小児（例えば、ＡＳＤの疑いがある、又はＡＳＤの素因がある小児）のスクリーニングに適している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
従って、本発明は、一の態様において、自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法を提供し、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を参照標準中の同じアミノ酸付加物の濃度と比較するステップと；
ｃ．参照標準に対するサンプル中のアミノ酸付加物の濃度差の有無を識別するステップと；を備え、
濃度差の有無はＡＳＤの有無と相関する。
【０００９】
有利なことに、前記アミノ酸付加物の濃度の変化は、ＡＳＤの有無と相関する。
【００１０】
ＡＳＤの有無を検出するステップは、更に、予後が良好であるか不良であるかを判定できるようにしてもよい。ＡＳＤが有ることは、不良な予後の判定を可能とする一方、ＡＳＤが無いことは、良好な予後の判定を可能とする。したがって、一の態様において、本発明は、自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）の予後を判定するための方法を更に提供し、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を参照標準中の同じアミノ酸付加物の濃度と比較するステップと；
ｃ．参照標準に対するサンプル中のアミノ酸付加物の濃度差の有無を識別するステップと；を備え、
濃度差の有無は、良好な予後又は不良な予後と相関する。
【００１１】
用語「自閉的スペクトラム障害」又は「自閉症スペクトラム障害」（ＡＳＤ）は、本明細書で用いられる場合、典型的には社会的相互作用と関心の範囲に影響を及ぼし、言語障害、反復及び／又は脅迫行動、多動性、不安及び新しい環境への適応困難性などの広範囲の他の障害を引き起こす発達障害の多様な群を含み、認知機能障害を伴うことも伴わないこともある。こうした障害として、自閉症、アスペルガ症候群、特定不能な広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、及び幼児期崩壊性障害が挙げられる。好ましくは、用語ＡＳＤは自閉症を意味する。
【００１２】
用語「被験者」、「個体」及び「患者」は、本明細書においては互いに交換可能に用いられ、哺乳類の被験者を指す。一の実施の形態において、「被験者」はヒト、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ、及びウサギなどのペット）、家畜（例えば、ブタ、ヒツジ、ウシ、及びヤギ）、並びにウマである。好ましい実施の形態において、被験者はヒト、例えば小児（human child）、である。本発明の方法において、被験者は、以前に、ＡＳＤであると診断されたことがなくてもよく、被験者は、以前に、ＡＳＤであると診断されたことがあってもよい。被験者は、疾患リスク因子を呈する者であってもＡＳＤの症状がない者であってもよい。被験者は、ＡＳＤに罹患していてもＡＳＤを発症するリスクを負っていてもよい。一の実施の形態において、被験者は定型発達（Typically Developing）被験者である。当業者は理解することであるが、定型発達被験者は、ＡＳＤを有する又は発症するリスクが高い被験者である。したがって、一の実施の形態において、本発明の方法を用いて被験者にＡＳＤが有ることを確認してもよい。例えば、被験者は、以前に、被験者が呈する症状の分析を通じてＡＳＤが有ると診断されたことがあってもよい。
【００１３】
検出するステップ（例えば、アミノ酸付加物の）は、当該技術分野で公知である適切で任意な方法を用いて実行してもよい。例えば、質量分析を用いてもよい。一の実施の形態において、検出するステップは、安定同位体希釈分析液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）などの液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析を用いて実行される。別の実施の形態において、検出するステップは、免疫学的検定によって実行される。前記免疫学的検定は、本明細書で述べるアミノ酸付加物のうちの１種又は複数種に結合する１種又は複数種の抗体の使用を採用してもよい。したがって、一の態様において、被験者における自閉的スペクトラム障害の診断に用いるための抗体組成物が提供され、前記抗体組成物は、本明細書で述べるアミノ酸付加物の１種又は複数種に結合させる。本発明の方法は、本発明のキット又はその一部の使用を含んでもよい。例えば、本方法は、本明細書で述べる試薬（好ましくは同位体試薬）の使用を含んでもよく、好ましくは、本明細書で述べる標準（例えば、同位体標準）の使用を含む。
【００１４】
サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップは、好ましくは、例えばその相対量又は絶対量を特定することによってアミノ酸付加物を定量化するステップを含む。言うまでもなく、本発明の多くの用途には相対値で十分な場合があるため、解析方法は、所望されない限り、アミノ酸付加物の絶対濃度の測定を必ずしも必要としない。したがって、「濃度」は、サンプル中に検出されるアミノ酸付加物の（絶対）総濃度とすることもでき、「相対」濃度、例えば、サンプル中に検出されるアミノ酸付加物と、例えばサンプルの別の構成物質との差とすることもできる。実施の形態によっては、アミノ酸付加物の濃度を、サンプル中のその濃度によって、又はアミノ酸付加物を検出する試薬の濃度によって表してもよい。一の実施の形態において、本発明の方法は、サンプル中のクレアチニンの濃度を検出するステップを更に含んでもよい。したがって、本発明の方法でアミノ酸付加物の濃度を検出する場合、アミノ酸付加物の濃度を、サンプル中に検出されるクレアチニンの濃度に正規化してもよい。
【００１５】
本発明の方法又は使用は、濃度の増加又は減少を検出するステップを含んでもよい。本発明の方法又は使用は、濃度の不変（又は実質的に不変）を検出するステップを更に含んでもよい。
【００１６】
増加は、参照標準と比較して、アミノ酸付加物の濃度の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％又は１５０％の増加であってもよい。前記アミノ酸付加物の濃度の増加は、好ましくは統計的に有意である。実施の形態によっては、前記増加は、濃度の倍率変化（例えば、ｌｏｇ２で表される）によって識別してもよい。一の実施の形態において、濃度の増加は、参照標準と比較して、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．２５倍、又は１．５倍、高くてもよい。
【００１７】
減少は、参照標準と比較した場合、アミノ酸付加物の濃度の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％であってもよい。前記アミノ酸付加物の濃度差は、好ましくは統計的に有意である。実施の形態によっては、前記減少は、濃度の倍率変化（例えば、ｌｏｇ２で表される）によって識別してもよい。一の実施の形態において、濃度の減少は、参照標準と比較して、少なくとも約−１．１倍、−１．２倍、−１．２５倍、又は−１．５倍であってもよい。
【００１８】
本発明の方法は、好ましくは、診断アルゴリズム又は他のデータドリブン組合せアプローチの使用を含む。一の実施の形態において、アミノ酸付加物の検出された濃度は、診断アルゴリズム（例えば、一の態様において本発明により提供され得るコンピュータソフトウェアプログラムの一部としての）に入力され、前記診断アルゴリズムは、ＡＳＤの有無を指し示す。一の態様において、本発明の診断アルゴリズム又は診断方法を提供するように適合させたソフトウェアが提供される。本発明は、前記ソフトウェア、診断アルゴリズム、及び／又は診断方法を提供するように適合されたプロセッサにも及ぶ。
【００１９】
当業者は理解することであるが、任意の適切なアルゴリズム（本明細書で述べるアルゴリズムの何れかを含む）を用いることができる。一の実施の形態において、診断アルゴリズムは、ランダムフォレスト、ロジスティック回帰、アンサンブル分類器、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、一般線形モデル（ＧＬＭ）、及びＧＬＭＮＥＴ、のうちから選択される１種又は複数種である。好ましくは、アルゴリズムはＳＶＭである。
【００２０】
一の実施の形態において、ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）は、サンプル中に検出されたアミノ酸付加物の濃度に基づきＡＳＤの有無を診断するように構成された診断アルゴリズムを用いて行われ、前記診断アルゴリズムは、１又は複数（好ましくは複数）の参照標準中の同じアミノ酸付加物についての対応する濃度に関して訓練される。参照標準は、好ましくはＡＳＤ及び非ＡＳＤの参照標準であってもよい。実施の形態によっては、アルゴリズムは、診断方法の特異度及び／又は感度及び／又は精度を向上させるため、異なるアミノ酸付加物に異なる予測重み付けを提供する。前記実施の形態は、予後を特定するための方法などの他の方法に適用できる。
【００２１】
したがって、一の態様において、自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法が提供され、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中に検出されたアミノ酸付加物の濃度に基づきＡＳＤの有無を診断するために、診断アルゴリズムを用いるステップであって、前記診断アルゴリズムは、１つ又は複数（好ましくは複数）の参照標準における同じアミノ酸付加物についての対応する濃度に関して訓練される、前記用いるステップと；を含む。
【００２２】
同様に、予後を特定するため、ＡＳＤの処置に適する療法を識別するため、及びＡＳＤ療法の有効性をモニタリングするための方法も提供される。
【００２３】
ＡＳＤ療法を識別するための方法に関する実施の形態において、ＡＳＤが無いことを検出することは、ＡＳＤの処置に適した候補療法の指標となる可能性があり、一方、ＡＳＤの有ることを検出することは、ＡＳＤの処置に適さない候補療法の指標となる可能性がある。
【００２４】
ＡＳＤ療法の有効性をモニタリングするための方法に関する実施の形態において、ＡＳＤが無いことを検出することは、有効性が有ることの指標となる可能性があり、一方、ＡＳＤの有ることを検出することは、有効性が無いことの指標となる可能性がある。
【００２５】
一の実施の形態において、ステップ（ｂ）及び／又は（ｃ）は、前記診断アルゴリズムによってサンプル中に検出されたアミノ酸付加物の濃度に基づき、被験者の健康状態を分類するように構成された診断アルゴリズムによって／を用いて行われ、前記診断アルゴリズムは、既知の疾病状態を有する被験者の母集団から取得した同じアミノ酸付加物（即ち、参照標準）についての対応する濃度に関して訓練される。実施の形態によっては、アルゴリズムは、本発明の特異度及び／又は感度及び／又は精度を向上させるため、異なるアミノ酸付加物に異なる予測重み付けを提供する。
【００２６】
本発明のために用いられるサンプルは、アミノ酸付加物を含有する可能性のある任意のサンプルである。適切には、サンプルは、ＡＳＤの疑いがある被験者から単離されてもよい。実施の形態によっては、サンプルは、ＡＳＤであると診断された被験者から単離される。適切には、サンプルは、血液、尿、眼液、リンパ液、唾液、滑液、精液、脳脊髄液、皮脂腺分泌物、及び／又は痰のうちの１種又は複数種から選択されてもよい。当業者は理解することであるが、前記サンプルは、本明細書で述べられ当業者に公知であるような従来手法によって、分析のために前処理されてもよい。例えば、サンプルを、検出に先立って加水分解してもよい。一の実施の形態において、加水分解は酵素的に実行される。酵素消化によるタンパク質の加水分解は、分析前処理中のサンプルの被検物質含有量を損なうことがある酸加水分解の厳しい条件を回避するため、有利である。一の実施の形態において、酵素消化は、ペプシンによる処理と、任意の選択でそれに続くプロナーゼＥ、プロリダーゼ、及びアミノペプチダーゼによる処理とを含んでもよい。限定するものではないが、加えて、特に、解析すべきタンパク質が細胞外基質中に存在する場合、コラゲナーゼを用いてもよい。自動化された完全な酵素加水分解により、厳しい分析前処理を回避してもよい。一の実施の形態において、加水分解に先立って、先ず、タンパク質を限外ろ過によって洗浄して遊離アミノ酸を除去してもよく、残ったタンパク質を加水分解用に収集する。一の実施の形態において、残ったタンパク質を脱脂してから加水分解してもよい。
【００２７】
好ましくは、サンプルは血液サンプルである。用語「血液サンプル」は、全血だけでなく、血液を１つ又は複数の処理ステップ（例えば、血液画分を得るための分画）に供した後に取得されるサンプルも含んでいる。例えば、血液は、血漿であっても血清サンプルであってもよい。前記サンプルは、タンパク質（任意選択でアミノ酸を除く）を含有する血液サンプル（例えば、血清タンパク質サンプル）であってもよく、タンパク質が除去された血液サンプル（例えば、限外ろ過液などのろ液）であってもよい。一の実施の形態において、サンプルは血漿サンプルであり、前記血漿サンプルは、好ましくはポリペプチド配列に含まれるアミノ酸付加物を含み、遊離アミノ酸付加物を欠く。
【００２８】
本発明の方法において血液、血漿、血清及び／又は尿を用いる重要な利点は、これらのサンプルを容易に入手可能であり、低侵襲手法を用いて取得できることである。これは、敏感な被験者（例えば、小児）に対してＡＳＤの診断を試みる場合は特に有利である。
【００２９】
一の実施の形態において、サンプルは、サンプル中の前記アミノ酸付加物の濃度を検出する前に、限外ろ過により処理してサンプルから遊離アミノ酸付加物を単離してもよい。限外ろ過液サンプル（遊離アミノ酸付加物を含有する）は、本発明に従って収集し、用いることができる。
【００３０】
一の実施の形態において、酸化、ニトロ化、及び糖化遊離付加物は、マイクロスピン限外ろ過によって収集される。少なくとも約１０ｋＤａの分画分子量（molecular weight cut off）を限外ろ過ステップに用いてもよい。一の実施の形態において、分画分子量は、少なくとも約５ｋＤａ（例えば、少なくとも約６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、又は１５ｋＤａ）である。限外ろ過ステップは、約２℃と１０℃との間の温度、例えば約４℃、で実行してもよい。
【００３１】
したがって、用語「血漿限外ろ過液」は、本明細書において用いられる場合、血漿を限外ろ過に供して（例えば、上記のように）遊離アミノ酸付加物を単離することによって得られるサンプルを指す。同様に、用語「尿限外ろ過液」は、本明細書において用いられる場合、尿を限外ろ過に供して遊離アミノ酸付加物を単離することによって得られるサンプルを指す。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、用語「アミノ酸付加物」は、酸化、ニトロ化、又は糖化されたアミノ酸を指す。アミノ酸付加物は、ポリペプチド配列（例えば、「付加物残基」）に含まれていてもよい。或いは、アミノ酸付加物は、「遊離付加物」（例えば、ポリペプチド配列に含まれていない）であってもよい。実施の形態によっては、「遊離付加物」は、アミノ酸付加物を含むポリペプチド配列のタンパク質分解後に被験者の体液（例えば、血液及び／又は尿）中に放出されるタンパク質分解消化産物であってもよい。実施の形態によっては、遊離付加物の濃度が検出される。これに代えて、又はこれに加えて、ポリペプチド配列中に存在するアミノ酸付加物の濃度が検出される。
【００３３】
本発明は、アミノ酸付加物又はその任意の異性体（例えば、構造異性体）の検出を包含する。例えば、３ＤＧ−Ｈは、３種の構造異性体として存在し、一の実施の形態において、３種の構造異性体全てが検出される。ＭＧ−Ｈ１及びＧ−Ｈ１も、３種の構造異性体として存在する。一の実施の形態において、ＭＧ−Ｈ１及びＧ−Ｈ１の３種の構造異性体全てが検出され、好ましくは、ＭＧ−Ｈ１及びＧ−Ｈ１の異性体１が検出される。
【００３４】
タンパク質毒性ストレス及び折りたたみ不全タンパク質応答（Unfolded Protein Response、ＵＰＲ）の活性化につながるタンパク質恒常性の障害は、ＡＳＤの存在に関連することが発見されている。タンパク質の質を悪化させる要因は、糖化、酸化、及びニトロ化による自発的修飾の増加である。タンパク質の糖化は、タンパク質と、グルコース、反応性ジカルボニル代謝産物、グリオキサル、メチルグリオキサル（ＭＧ）、及び３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）、並びに、他の単糖類及び単糖誘導体との自然反応によって生ずる。タンパク質糖化付加物は、グルコースによるタンパク質の糖化によって形成されるＮε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）残基などの初期段階の糖化付加物と；ＦＬ残基の分解によって形成されるＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）及びグルコセパン（ＧＳＰ）残基、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）及び３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）（それぞれグリオキサルＭＧ及び３−ＤＧによるアルギニン残基の修飾によって形成される）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）（同様にグリオキサルとアルギニン残基との反応によって形成される）、並びにメチルグリオキサル由来リジン架橋体（ＭＯＬＤ）などの糖化最終産物（ＡＧＥ）として公知の後期段階の付加物と；に分類される。タンパク質の酸化は、タンパク質と活性酸素種（ＲＯＳ）との反応によって生じ、酸化的ストレス中で増加する。タンパク質酸化付加物の例は、ジチロシン（ＤＴ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）残基である。酸化ストレス及び神経炎症に伴う酸化的損傷の増加は、ＡＳＤ（例えば、小児における）の一般的な特徴となり得る。タンパク質のニトロ化は、タンパク質と、ペルオキシ亜硝酸などの反応性窒素種との反応によって生ずる。タンパク質のニトロ化によって形成される主な付加物は、３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）残基（図１Ｂ）である。これらのメカニズムによるタンパク質損傷の増加は、タンパク質毒性の脅威及び関連する炎症反応に抗するためのＵＰＲの活性化につながり得る。糖化、酸化、及びニトロ化タンパク質は、タンパク質分解を受けて関連する糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸を形成し、これらは、糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物とも呼ばれる。糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸は血漿中に放出され、尿に排せつされる。糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物の尿中排せつは、それぞれタンパク質の糖化、酸化、及びニトロ化の全身フラックスのおおよその尺度である。アミノ酸の直接糖化、酸化、及びニトロ化、並びに消化後の食品からの損傷タンパク質の吸収、によるこれらの代謝産物の貯蔵へのわずかな寄与も存在する。
【００３５】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物は糖化アミノ酸付加物である。
【００３６】
糖化アミノ酸付加物は、Ｎε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、Ｎε−（１−カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、ピラリン、グルコセパン（ＧＳＰ）、及びメチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）から選択される１種又は複数種であってもよい。
【００３７】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物は酸化アミノ酸付加物である。
【００３８】
酸化アミノ酸付加物は、ジチロシン（ＤＴ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＮＦＫ、ＡＡＳＡ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種）であってもよい。
【００３９】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物はニトロ化アミノ酸付加物である。ニトロ化アミノ酸付加物は、３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）であってもよい。
【００４０】
実施の形態によっては、本発明は、糖化アミノ酸、酸化アミノ酸、及び／又はニトロ化アミノ酸の濃度を検出するステップを含む。好ましくは、本発明は、糖化アミノ酸及び酸化アミノ酸の濃度を検出するステップを含む。実施の形態によっては、従来の（標準的）アミノ酸の濃度を検出してもよい（例えば、本明細書における「従来のアミノ酸」の項に記載されているように）。前記従来のアミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、ピロリシン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから選択される１種又は複数種であってもよい。
【００４１】
好ましくは、アミノ酸付加物は、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、ジチロシン（ＤＴ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、ピラリン、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、Ｎε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、Ｎε−（１−カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びメチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）から選択される１種又は複数種（より好ましくはＣＭＬ、３ＤＧ−Ｈ、ＣＭＡ、ＧＳＡ、Ｇ−Ｈ１、ピラリン、ＭＧ−Ｈ１、ＦＬ、ＣＥＬ、ＡＡＳＡ、及びＭＯＬＤから選択される１種又は複数種）である。
【００４２】
より好ましくは、アミノ酸付加物は、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、ジチロシン（ＤＴ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、及びピラリンから選択される１種又は複数種（更により好ましくはＣＭＬ、３ＤＧ−Ｈ、ＧＳＡ、Ｇ−Ｈ１、及びピラリンから選択される１種又は複数種）である。
【００４３】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、ＤＴ、及びＧＳＡ（好ましくはＣＭＬ、ＣＭＡ、及び／又はＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくは全て）の濃度は増加し；及び／又は（好ましくは、及び）、
ｂ．３ＤＧ−Ｈ及びＧ−Ｈ１（遊離付加物）から選択される１種又は複数種（好ましくは全て）の濃度は減少し；
好ましくは、ＡＳＤの存在を指し示す（例えば、前記濃度プロファイルがＡＳＤの存在と相関がある）。当業者は理解することであるが、先に詳述したアミノ酸付加物濃度プロファイルが検出されない場合、それは、好ましくはＡＳＤの非存在を指し示す。好ましくは、サンプルは血液サンプルである。
【００４４】
別の実施の形態において、ＡＳＤ参照標準と比較した場合、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、ＤＴ、及びＧＳＡ（好ましくはＣＭＬ、ＣＭＡ、及び／又はＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくは全て）の濃度は、同じであるか増加し；及び／又は（好ましくは、及び）、
ｂ．３ＤＧ−Ｈ及びＧ−Ｈ１（遊離付加物）から選択される１種又は複数種（好ましくは全て）の濃度は、同じであるか減少し；
好ましくは、ＡＳＤの存在を指し示す（例えば、前記濃度プロファイルがＡＳＤの存在と相関する）。当業者は理解することであるが、先に詳述したアミノ酸付加物濃度プロファイルが検出されない場合、それは、好ましくはＡＳＤの非存在を指し示す。好ましくは、サンプルは血液サンプルである。
【００４５】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＤＴ（好ましくはＣＭＬ及び／又はＣＭＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくは全て）の濃度は増加し；及び／又は（好ましくは、及び）、
ｂ．３ＤＧ−Ｈの濃度は減少し；
好ましくは、ＡＳＤの存在を指し示す（例えば、前記濃度プロファイルがＡＳＤの存在と相関する）。当業者は理解することであるが、先に詳述したアミノ酸付加物濃度プロファイルが検出されない場合、それは、好ましくはＡＳＤの非存在を指し示す。好ましくは、サンプルは血漿タンパク質サンプルである。
【００４６】
一の実施の形態において、ＡＳＤ参照標準と比較した場合、
ａ．ＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＤＴ（好ましくはＣＭＬ及び／又はＣＭＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくは全て）の濃度は同じであるか増加し；及び／又は（好ましくは、及び）、
ｂ．３ＤＧ−Ｈの濃度は同じであるか減少し；
好ましくは、ＡＳＤの存在を指し示す（例えば、前記濃度プロファイルがＡＳＤの存在と相関する）。当業者は理解することであるが、先に詳述したアミノ酸付加物濃度プロファイルが検出されない場合、それは、好ましくはＡＳＤの非存在を指し示す。好ましくは、サンプルは血漿タンパク質サンプルである。
【００４７】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、ＣＭＬ及び／又はＣＭＡ（好ましくはＣＭＬ及びＣＭＡ）の濃度は増加する。好ましくは、サンプルは血漿限外ろ過液サンプルである。
【００４８】
一の実施の形態において、ＡＳＤ参照標準と比較した場合、ＣＭＬ及び／又はＣＭＡ（好ましくはＣＭＬ及びＣＭＡ）の濃度は同じであるか増加する。好ましくは、サンプルは血漿限外ろ過液サンプルである。
【００４９】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、ＧＳＡ及び／又はピラリン（好ましくはＧＳＡ及びピラリン）の濃度は増加する。一の実施の形態において、ＡＳＤ参照標準と比較した場合、ＧＳＡ及び／又はピラリン（好ましくはＧＳＡ及びピラリン）の濃度は同じであるか増加する。好ましくは、サンプルは尿サンプルである。
【００５０】
一の実施の形態において、先に示したアミノ酸付加物濃度プロファイルは、ＡＳＤの存在を指し示す（例えば、前記濃度プロファイルは、ＡＳＤの存在と相関する）。当業者は理解することであるが、先に詳述したアミノ酸付加物濃度プロファイルが検出されない場合、それは、好ましくはＡＳＤの非存在を指し示す。
【００５１】
一の実施の形態において、用語「１種又は複数種」は、本明細書で述べるアミノ酸付加物の文脈において用いられる場合、アミノ酸付加物のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１種を意味する。
【００５２】
一の実施の形態において、用語「１種又は複数種」は、本明細書で述べるアミノ酸付加物の文脈において用いられる場合、アミノ酸付加物のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５種を意味する。
【００５３】
好ましい実施の形態において、用語「１種又は複数種」は、本明細書で述べるアミノ酸付加物の文脈において用いられる場合、アミノ酸付加物のうちの少なくとも２種を意味する。
【００５４】
特に好ましい実施の形態において、用語「１種又は複数種」は、本明細書で述べるアミノ酸付加物の文脈において用いられる場合、アミノ酸付加物の全て（例えば、アミノ酸付加物のそれぞれの組合せ）を意味する。
【００５５】
本発明者らは、ある特定のアミノ酸付加物は、それと相関するアミノ酸付加物によって代用できることを発見した（図１７から図２１参照）。アミノ酸付加物間の正の相関は、アミノ酸付加物の一方の濃度が増加すると、他方のアミノ酸付加物の濃度も増加することを指し示し；アミノ酸付加物間の負の相関は、アミノ酸付加物の一方の濃度が増加すると他方が減少することを指し示す。したがって、当業者は、相関する適切なアミノ酸付加物を選んで上記と代用することができ、正又は負の相関によって指し示されるように、参照標準に対して前記アミノ酸の濃度が増加するか減少するかを特定できる。一の実施の形態において、適切なスケーリング定数が決定され、代用されるアミノ酸付加物に適用される。
【００５６】
例えば、アミノ酸付加物は、以下の表に示すように相関する（代用される）：
2021513058.tif 000003
【００５７】
参照標準は、ＡＳＤ参照標準であっても非ＡＳＤ参照標準であってもよい。
【００５８】
「非ＡＳＤ参照標準」は、ＡＳＤではない被験者（例えば、健全な被験者）から取得したサンプルを指す。例えば、「非ＡＳＤ参照標準」は、ＡＳＤであると診断されたことがなく、ＡＳＤの症状を呈していない被験者から取得してもよい。
【００５９】
或いは、「ＡＳＤ参照標準」は、ＡＳＤである被験者から取得したサンプルを指す。例えば、「ＡＳＤ参照標準」は、ＡＳＤであると診断されたことがあり、１つ又は複数のＡＳＤ症状を呈する被験者から得てもよい。こうした診断は、患者の症状に関する臨床医の知見に基づくなど、１つ又は複数の従来方法を用いて実行されてきたものでもよく、そこでは、標準化された活動における患者の成績（能力）の評価から導き出されるスコアが用いられ、それには、自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）スコア、小児自閉症評定尺度（ＣＡＲＳ）、乳幼児期自閉症チェックリスト（ＣＨＡＴ）、及び対人コミュニケーション質問紙（ＳＣＱ）が含まれる。
【００６０】
本発明の方法において用いられる参照標準は、本発明の方法に用いられるサンプルを取得する被験者と一致する年齢及び／又は性別であってもよい。
【００６１】
一の実施の形態において、本発明の方法は、先に参照した従来のＡＳＤ診断方法のうちの１つと組み合わせて実行される。
【００６２】
参照標準中の検出されたアミノ酸付加物の濃度は、本発明の方法に先立って取得されていた（例えば、定量化されていた）ものであってもよい。
【００６３】
参照標準は、好ましくは、試験をするサンプルの種類と同じサンプルの種類に由来するものであり、そうすれば、その２つ（又はそれ以上）の適切な比較が可能となる。したがって、例として、サンプルが尿に由来する場合、参照標準も尿に由来するものである。或いは、サンプルが血液サンプル（例えば、血漿又は血清サンプル）である場合、参照標準も血液サンプル（例えば、必要に応じて血漿サンプル又は血清サンプル）とする。
【００６４】
サンプルと参照標準を比較する場合、濃度を表す方法は、サンプルと参照標準とで一致させる。したがって、絶対濃度は絶対濃度と比較でき、相対濃度は相対濃度と比較できる。同様に、診断アルゴリズムによる分類のための濃度を表す方法（以下に記載するような）は、診断アルゴリズムを訓練するための濃度を表す方法と一致させる。
【００６５】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物の濃度は、同じサンプルで検出されたクレアチニンの濃度対して正規化される。
【００６６】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物の濃度は、それらのアミノ酸残基（例えば、未修飾アミノ酸残基）前駆体に対して正規化され、好ましくは、アミノ酸１モル当たりのアミノ酸付加物のｍｍｏｌ（ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）として表される。
【００６７】
参照標準は、本発明の方法の範囲内で取得する（即ち、本発明の方法のステップを構成する）ものとしても、本発明の方法の外部で取得する（即ち、本発明の方法のステップを構成しない）ものとしてもよい。一の実施の形態において、本発明の方法は、参照標準を取得するステップを含んでもよい。一の実施の形態において、参照標準は、本発明の方法の外部で取得され、本発明の比較するステップの際にアクセスされる。
【００６８】
一の実施の形態において、参照標準は、一人の被験者に由来する１つ又は複数のサンプル中のアミノ酸付加物の濃度である。或いは、参照標準は、多数（複数）の被験者から取得したデータを蓄積し、各アミノ酸付加物について平均（例えば、平均値又は中央値）濃度を計算することによって得られるものであってもよい。したがって、参照標準は、多数（複数）の被験者におけるアミノ酸付加物の平均濃度を反映し得る。
【００６９】
実施の形態によっては、サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップは、サンプル中のアミノ酸付加物の非存在を検出するステップを含む。
【００７０】
アミノ酸付加物（又はアミノ酸）の濃度差の有無を検出することは、ＡＳＤの有無に相関する。
【００７１】
参照標準が非ＡＳＤ参照標準である実施の形態において、濃度差の存在を検出することは、ＡＳＤの存在を指し示し得るものであり、濃度差の非存在を検出することは、ＡＳＤの非存在を指し示し得るものである。しかし、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合のアミノ酸付加物の濃度増加がＡＳＤの存在と相関することが確立されている場合、当業者は理解することであるが、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合の前記濃度の減少（又は不変）は、ＡＳＤの存在を指し示し得ていない場合がある。同様に、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合のアミノ酸付加物の濃度減少がＡＳＤの存在と相関することが確立されている場合、当業者は理解することであるが、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合の前記濃度の増加（又は不変）は、ＡＳＤの存在を指し示し得ていない場合がある。
【００７２】
参照標準がＡＳＤ参照標準である実施の形態において、濃度差の存在を検出することは、ＡＳＤの非存在を指し示し得るものであり、濃度差の非存在を検出することは、ＡＳＤの存在を指し示し得るものである。しかし、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合のアミノ酸付加物（又はアミノ酸）の濃度増加がＡＳＤの存在と相関することが確立されている場合、当業者は理解することであるが、ＡＳＤ参照標準と比較した場合の前記濃度の（更なる）増加は、依然としてＡＳＤの存在を指し示している場合がある。同様に、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合のアミノ酸付加物（又はアミノ酸）の濃度減少がＡＳＤの存在と相関することが確立されている場合、当業者は理解することであるが、ＡＳＤ参照標準と比較した場合の前記濃度の（更なる）減少は、依然としてＡＳＤの存在を指し示している場合がある。
【００７３】
関連する態様において、自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法が提供され、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中に検出されたアミノ酸付加物の濃度に基づき、診断アルゴリズムによって被験者の健康状態を分類するステップであって、診断アルゴリズムは、既知の疾病状態を有する被験者の母集団から取得した同じアミノ酸付加物についての対応する濃度に関して訓練され、それにより被験者におけるＡＳＤの有無を診断する、前記分類するステップと；を含む。
【００７４】
一の実施の形態において、本発明のこの態様は、機械学習アプローチを介して展開される診断アルゴリズムを用い、診断アルゴリズムは２分割交差検証によって訓練され、例えば、５０％のＡＳＤ及び非ＡＳＤ（対照、Control）被験者（訓練部分集合）において検出されたアミノ酸付加物の濃度に基づいて訓練され、その後、残りの５０％の被験者（試験集合）について疾病状態を予測するために用いられる−例えば図２を参照。
【００７５】
一の実施の形態において、本発明のこの態様は、機械学習アプローチを介して展開される２クラス診断アルゴリズムを用い、診断アルゴリズムは、既知のＡＳＤ被験者及び既知の非ＡＳＤ被験者からのサンプル中のアミノ酸付加物の濃度に基づいて訓練され、その後、試験被験者の健康状態を分類するために用いられる。
【００７６】
異なるアミノ酸付加物の一団の試験を行うことにより、本発明者らは、被験者におけるＡＳＤの有無の高感度で特異的な特定を提供するアミノ酸付加物の様々な部分集合を識別した。実施例５並びに図１３及び図１４に示すように、本発明のこの方法は、高レベルの感度と特異度で被験者におけるＡＳＤの有無の診断を可能とする。
【００７７】
用語「疾病状態」は、「ＡＳＤ状態」（即ち、被験者におけるＡＳＤの有無の状態）と同義に用いられる場合がある。
【００７８】
本明細書で用いられる場合、「サンプル中に検出されたアミノ酸の濃度に基づき、診断アルゴリズムによって被験者の健康状態を分類する」というフレーズは、統計プロセス又は機械学習分類プロセスを指し、そのプロセスにより、試験サンプル中のアミノ酸付加物の濃度が、診断アルゴリズム、典型的には、統計アルゴリズム又は機械学習分類アルゴリズムによって健康状態のカテゴリを特定するために用いられる。用語「被験者の健康状態を分類する」は、本明細書で用いられる場合、被験者をＡＳＤであると分類すること、或いは、被験者をＡＳＤではないと分類することを指す。
【００７９】
診断アルゴリズムによる分類は、それぞれの可能性があるカテゴリに属するアミノ酸付加物濃度の一団の尤度を採点すること、及び、最高得点のカテゴリを特定することを含んでもよい。診断アルゴリズムによる分類は、距離関数によってアミノ酸付加物濃度の一団を以前の観察値と比較するステップを含んでもよい。分類に適する診断アルゴリズムの例としては、サポートベクターマシン、アンサンブル分類器アルゴリズム、ランダムフォレスト、ロジスティック回帰（例えば、多クラス又は多項ロジスティック回帰、及び／又はスパースロジスティック回帰に適合させたアルゴリズム）が挙げられる。当業者に公知のように、分類に適する多種多様な他の診断アルゴリズムを用いてもよい。
【００８０】
一の実施の形態において、「診断アルゴリズムを訓練する」というフレーズは、既知のＡＳＤ健康状態を有する被験者の母集団から取得した各アミノ酸付加物についての濃度に基づく診断アルゴリズムの管理された（supervised）学習を指す場合がある。「診断アルゴリズムを訓練する」というフレーズは、既知のＡＳＤ健康状態を有する被験者の母集団から取得した各アミノ酸付加物についての濃度に基づく統計的モデルにおける変数選択を指す場合がある。診断アルゴリズムを訓練することは、例えば、各カテゴリのための特徴空間において重み付けベクトルを特定すること、又は、関数又は関数パラメータを特定することを含む。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、用語「被験者の母集団」は、１人又は複数の被験者を意味する。一の実施の形態において、被験者の母集団は、１人の被験者からなる。一の実施の形態において、被験者の母集団は、多数の被験者を含む。本明細書で用いられる場合、用語「多数」は、少なくとも２人（例えば、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０人）の被験者を意味する。一の実施の形態において、被験者の母集団は、少なくとも３０人の被験者を含む。
【００８２】
診断アルゴリズムの訓練は、本発明の方法の範囲内で取得する（即ち、本発明の方法のステップを構成する）ものとしても、本発明の方法の外部で取得する（即ち、本発明の方法のステップを構成しない）ものとしてもよい。一の実施の形態において、本発明の方法は、診断アルゴリズムを訓練するステップを含んでもよい。一の実施の形態において、診断アルゴリズムは、本発明の方法の外部で訓練され、本発明の分類するステップの間にアクセスされる。
【００８３】
診断アルゴリズムは、健全な被験者（複数可）の母集団から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出することによって訓練されてもよい。本明細書で用いられる場合、用語「健全な被験者」は、ＡＳＤの症状を何ら示したことがない、ＡＳＤであると診断されたことがない、及び／又はＡＳＤを発症する可能性が低い、個々の被験者又は被験者群を指す。好ましくは、前記健全な被験者（複数可）は、疾患に影響を与える投薬を受けておらず、他の疾患があると診断されたことがない。１人又は複数の健全な被験者は、試験被験者と比較して、性別、年齢、及び体格指数（ＢＭＩ）が類似していてもよい。
【００８４】
診断アルゴリズムは、ＡＳＤに罹患している被験者（複数可）の母集団から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出することによって訓練されてもよい。より好ましくは、こうした被験者（複数可）は、試験被験者と比較して、性別、年齢、及び体格指数（ＢＭＩ）が類似していてもよい。
【００８５】
ＡＳＤに特徴的なアミノ酸付加物濃度プロファイルが特定されると（参照プロファイルを提供することとなり）、被験者から取得したサンプルからの濃度のプロファイルをこの参照プロファイルと比較して、試験被験者もＡＳＤであるか否か特定してもよい。診断アルゴリズムがＡＳＤを分類するために訓練されたら、被験者から取得したサンプルからの濃度のプロファイルを診断アルゴリズムによって分類して、試験被験者もＡＳＤであるか否か特定してもよい。
【００８６】
一の実施の形態において、ＡＳＤを診断するための方法を実行する場合、診断アルゴリズム用の参照標準を取得するために用いられる被験者の母集団、及び／又は診断アルゴリズムを訓練するために用いられる被験者の母集団は、ＡＳＤではない少なくとも１人の（健全な）被験者、及び／又はＡＳＤである少なくとも１人の被験者を含んでもよい。一の実施の形態において、被験者の母集団は、ＡＳＤではない複数（例えば、少なくとも１０人）の（健全な）被験者、及び／又はＡＳＤである複数（例えば、少なくとも１０人）の被験者を含んでもよい。
【００８７】
試験の被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を、既知のＡＳＤ健康状態を有する（例えば、ＡＳＤであることが既知、及び／又はＡＳＤでないことが既知の）被験者の母集団から取得した参照標準用のアミノ酸付加物の濃度と比較することによって、被験者のＡＳＤ健康状態を特定することが可能となる。
【００８８】
既知の健康状態を有する被験者の母集団から取得した対応する濃度に関して訓練された診断アルゴリズムによって、アミノ酸付加物の濃度に基づき健康状態を分類することにより、被験者がＡＳＤであるか否か特定することが可能となる。方法は、被験者が参照母集団に属するか否かの分類が可能である（即ち、被験者におけるアミノ酸付加物の濃度が、統計的に参照母集団に類似しているか、又は参照母集団から統計的に逸脱しているか特定することによって）。したがって、被験者の濃度プロファイル（即ち、検出された濃度について観察された変化の全体的パターン）が特定の参照母集団に由来するプロファイルに対応するという分類は、被験者が参照母集団に該当する（又は該当しない）ことを予測する。
【００８９】
一の実施の形態において、被験者は、検出されたアミノ酸付加物の濃度がＡＳＤの被験者の母集団において検出された対応するアミノ酸付加物濃度について特定された濃度に統計的に類似する場合、ＡＳＤであると診断されてもよい。一の実施の形態において、被験者は、検出されたアミノ酸付加物の濃度がＡＳＤではない被験者の母集団において検出された対応するアミノ酸付加物濃度について特定された量に統計的に類似している場合、ＡＳＤでないと診断されてもよい。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、用語「統計的に類似」は、試験の被験者について検出されたアミノ酸付加物濃度が、参照母集団について検出されたものと統計的に有意なレベルまで類似していることを意味する。用語「統計的に有意」は、偶然によってのみ起こる（例えば、ｐ＝＜０．０５）と予想されるよりも変化が大きいことを意味する。統計的有意性は、当該技術分野で公知の任意の方法によって特定することができる。
【００９１】
一の実施の形態において、被験者は、検出されたアミノ酸付加物の濃度がＡＳＤでない被験者の母集団から取得した対応する濃度について特定された量から統計的に逸脱している場合、ＡＳＤであると診断されてもよい。一の実施の形態において、被験者は、検出されたアミノ酸付加物の濃度がＡＳＤである被験者の母集団から取得した対応するアミノ酸付加物について特定された濃度から統計的に逸脱している場合、ＡＳＤでないと診断されてもよい。
【００９２】
本明細書で用いられる場合、用語「統計的に逸脱」は、試験の被験者について検出されたアミノ酸付加物の濃度が、参照母集団について検出されたものと統計的に有意なレベルまで異なることを意味する。マーカー存在度の偏差は、増加でも減少でもよい。
【００９３】
したがって、本発明の方法における被験者の分類は、診断アルゴリズムを用いて実行してもよい。本発明の方法に用いられる診断アルゴリズムは、分類アルゴリズムである。一の実施の形態において、分類アルゴリズムは、サポートベクターマシンアルゴリズムを含む。一の実施の形態において、分類アルゴリズムは、様々な種類の分類アルゴリズムを含むアンサンブルアルゴリズムである。一の実施の形態において、分類アルゴリズムは、決定木（デシジョンツリー）に基づくアルゴリズムを含む。回帰アルゴリズム及びニューラルネットワークなどの他の種類のアルゴリズムを用いることもできる。一の実施の形態において、分類アルゴリズムは、ランダムフォレストアルゴリズムを含む。
【００９４】
診断アルゴリズムによる被験者の分類は、完璧な分類を必要としない。分類は、その「感度」を特徴としてもよい。分類の「感度」は、ＡＳＤであると正しく識別された被験者のパーセンテージに関する。「感度」は、本技術分野において、真陽性と偽陰性との合計で除した真陽性の数と定義される。
【００９５】
本発明の方法の感度は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、７７％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、又は９２％であってもよい。
【００９６】
本発明の方法の「特異度」は、ＡＳＤではないと正しく識別された患者のパーセンテージであると定義される。「特異度」は、真陰性と偽陽性の合計で除した真陰性の数に関する。本発明の方法の特異度は、少なくとも約６７％、７０％、７５％、８０％、８４％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％であってもよい。
【００９７】
本発明は、サンプル中に検出されたアミノ酸付加物の濃度に基づき、診断アルゴリズムによって被験者の健康状態を分類するように適合させた診断アルゴリズムに基づく計算モデルを更に提供し、前記診断アルゴリズムは、既知の疾病状態を有する被験者の母集団から取得したアミノ酸付加物についての対応する濃度に関して訓練される。本発明は、前述のような計算モデルを生成するように適合させたソフトウェアにも及ぶ。本発明は、前述のような計算モデルを生成するように適合させたプロセッサにも及ぶ。
【００９８】
更なる態様において、本発明は、被験者における自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置するための方法を提供し、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を参照標準中の同じアミノ酸付加物の濃度と比較するステップと；
ｃ．参照標準に対するサンプル中の前記アミノ酸付加物の濃度差の有無を識別するステップであって、濃度差の有無がＡＳＤの有無と相関する、前記識別するステップと；
ｄ．ＡＳＤであると診断された被験者に、ＡＳＤに対する療法を施用するステップと；を含む。
【００９９】
本発明は、被験者における自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置するための方法を更に提供し、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中に検出されたアミノ酸付加物の濃度に基づき、診断アルゴリズムによって被験者の健康状態を分類するステップであって、診断アルゴリズムは、既知の疾病状態を有する被験者の母集団から取得した同じアミノ酸付加物についての対応する濃度に関して訓練され、それにより被験者におけるＡＳＤの有無を診断する、前記分類するステップと；
ｃ．ＡＳＤであると診断された被験者に、ＡＳＤ対する療法を施用するステップと；を含む。
【０１００】
一の実施の形態において、本発明のこの態様は、機械学習アプローチを介して展開される診断アルゴリズムを用い、診断アルゴリズムは、２分割交差検証によって訓練され、例えば、５０％のＡＳＤ及び非ＡＳＤ（対照、Control）被験者（訓練部分集合）において検出されたアミノ酸付加物の濃度に基づいて訓練され、その後、残りの５０％の被験者（試験集合）について疾病状態を予測するために用いられる−例えば図２参照。
【０１０１】
一の実施の形態において、前記方法は、機械学習アプローチを介して展開される２クラス診断アルゴリズムを用い、診断アルゴリズムは、既知のＡＳＤ被験者及び既知の非ＡＳＤ被験者からのサンプル中のアミノ酸付加物の濃度に基づいて訓練され、その後、試験被験者の健康状態を分類するために用いられる。
【０１０２】
異なるアミノ酸付加物の一団の試験を行うことにより、本発明者らは、被験者におけるＡＳＤの有無の高感度で特異的な特定を提供するマーカーの様々な部分集合を識別した。実施例５並びに図１３及び図１４に示すように、本発明のこの方法は、高レベルの感度と特異度で被験者におけるＡＳＤの有無の診断を可能とする。
【０１０３】
本発明の方法は、ＡＳＤに対する公知の処置全てを包含することを意図している。当業者は、ＡＳＤに対する処置に精通しているはずである。
【０１０４】
一の態様において、本発明は、ＡＳＤの処置に適する療法を識別するための方法を提供し、前記方法は：
ａ．候補の療法を施用された被験者からの単離サンプルを提供するステップと；
ｂ．前記サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）で検出されたアミノ酸付加物の濃度を、候補の療法の施用前の被験者からの単離サンプル中のアミノ酸付加物の濃度と比較することによって、アミノ酸付加物の相対濃度変化を特定するステップと；を含み、
候補療法を施用した後に濃度変化が検出された場合、候補療法はＡＳＤの処置に適しており、
候補療法を施用した後に濃度変化が検出されない場合、候補療法はＡＳＤの処置に適していない。
【０１０５】
別の態様は、ＡＳＤ療法の有効性をモニタリングするための方法を提供し、前記方法は：
ａ．前記療法を施用された患者からの単離サンプルを提供するステップと；
ｂ．前記サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、又はニトロ化アミノ酸付加物である、前記検出するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）で検出されたアミノ酸付加物の濃度を、以前の時点での被験者からの単離サンプル中のアミノ酸付加物の濃度と比較することによって、アミノ酸付加物の相対濃度変化を特定し、
濃度変化が検出された場合、有効性の存在を確認し、
濃度変化が検出されない場合、有効性の非存在を確認する、ステップと；を含む。
【０１０６】
用語「以前の時点」は、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも８週、少なくとも１２週、少なくとも１６週、少なくとも２０週、少なくとも３０週、少なくとも４０週、少なくとも５２週、少なくとも２年、少なくとも３年、又は少なくとも４年以前の時点を指してもよい。
【０１０７】
本発明は、別の態様において、
ａ．ＡＳＤを診断すること；
ｂ．ＡＳＤの予後を特定すること；
ｃ．ＡＳＤの処置に適する療法を識別すること；
ｄ．ＡＳＤ療法の有効性をモニタリングすること；及び／又は、
ｅ．ＡＳＤ診断アルゴリズムにおける特徴としての使用；のために、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、ニトロ化アミノ酸付加物、又はこれらの組合せの使用を提供する。
【０１０８】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物は、Ｎε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、ピラリン及び／又はメチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、ジチロシン（ＤＴ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、並びにグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＦＬ、Ｇ−Ｈ１、３ＤＧ−Ｈ、ＣＭＬ、ＣＭＡ、ＭＧ−Ｈ１、ピラリン及び／又はＭＯＬＤ、ＮＦＫ、ＡＡＳＡ、並びにＧＳＡから選択される１種又は複数種）である。
【０１０９】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物は、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、ジチロシン（ＤＴ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくは３ＤＧ−Ｈ、ＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種）である。
【０１１０】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、ピラリン、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、及びジチロシン（ＤＴ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ、ＣＭＡ、ＭＧ−Ｈ１、ＡＡＳＡ、Ｇ−Ｈ１、ＭＯＬＤ、ピラリン、ＮＦＫ、ＡＡＳＡ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度が増加する。当業者は理解することであるが、検出された濃度が非ＡＳＤ参照標準中の濃度と同じかそれ未満である場合、ＡＳＤは診断されない。
【０１１１】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中の３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、及びグルコセパン（ＧＳＰ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物の濃度は減少する。当業者は理解することであるが、検出された濃度が非ＡＳＤ参照標準中の濃度と同じであるかそれを超える場合、ＡＳＤは診断されない。
【０１１２】
実施例５並びに図１３及び図１４に示すように、本明細書で述べる複数種のアミノ酸付加物が、本発明のアルゴリズムの診断能を確実にするのに特に有用であることが識別されている。
【０１１３】
したがって、一の実施の形態において、アミノ酸付加物は、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、ピラリン、ジチロシン（ＤＴ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＧ−Ｈ１、３ＤＧ−Ｈ、ＣＭＬ、ＣＭＡ、ピラリン、ＡＡＳＡ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種）である。
【０１１４】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物は、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、及びジチロシン（ＤＴ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ、ＣＭＡ、及び３ＤＧ−Ｈから選択される１種又は複数種）である。
【０１１５】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物は、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）及びＮω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）から選択される１種又は複数種である。
【０１１６】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物は、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、ジチロシン（ＤＴ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ、ＣＭＡ、３ＤＧ−Ｈ、Ｇ−Ｈ１、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種）である。
【０１１７】
一の実施の形態において、アミノ酸付加物は、ピラリン及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種である。
【０１１８】
実施例２並びに図４及び図１２Ａに示すように、本明細書で述べるポリペプチド配列内に含まれる複数種のアミノ酸付加物が、血漿サンプル中に検出された場合、ＡＳＤの診断において特定の統計的有意性を有すると識別される。
【０１１９】
したがって、一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、グルコセパン（ＧＳＰ）、ジチロシン（ＤＴ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＦＬ、ＣＭＬ、Ｇ−Ｈ１、ＭＧ−Ｈ１、ＣＭＡ、ＧＳＰ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加する。
【０１２０】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、及びジチロシン（ＤＴ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＭＧ−Ｈ１から選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加する。
【０１２１】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、及びジチロシン（ＤＴ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ及びＣＭＡから選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加する。
【０１２２】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−（１−カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、又は３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物の濃度は減少する。
【０１２３】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のアミノ酸付加物３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）の濃度は減少する。
【０１２４】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、及びジチロシン（ＤＴ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＭＧ−Ｈ１から選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加し、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のアミノ酸付加物３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）の濃度は減少する。
【０１２５】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、及びジチロシン（ＤＴ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ及びＣＭＡから選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加し、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のアミノ酸付加物３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）の濃度は減少する。
【０１２６】
実施例３並びに図５及び図１２Ｂに示すように、本明細書で述べる複数種のアミノ酸付加物が、血漿サンプル（例えば、血漿限外ろ過液）中に検出された場合、ＡＳＤの診断において特定の統計的有意性を示すものと識別される。
【０１２７】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照サンプルと比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎε−（１−カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、グルコセパン（ＧＳＰ）、ジチロシン（ＤＴ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、及び３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ、ＣＥＬ、ＭＧ−Ｈ１、ＣＭＡ、ＧＳＰ、ＡＡＳＡ、ＧＳＡ、及び３−ＮＴから選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加する。
【０１２８】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照サンプルと比較した場合、サンプル中のＮω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物の濃度は増加する。
【０１２９】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照サンプルと比較した場合、サンプル中のアミノ酸Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）の濃度は増加する。
【０１３０】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照サンプルと比較した場合、サンプル中のＮε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、及びＮ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物の濃度は減少する。
【０１３１】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照サンプルと比較した場合、サンプル中のＮε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、及びＮ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物の濃度は減少する。
【０１３２】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のアミノ酸付加物グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）の濃度は減少する。
【０１３３】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物の濃度は増加し、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、及びＮ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物の濃度は減少する。
【０１３４】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）及びＮω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物の濃度は増加し、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のアミノ酸付加物グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）の濃度は減少する。
【０１３５】
実施例４並びに図６及び図１２Ｃに示すように、本明細書で述べる複数種のアミノ酸付加物が、尿サンプル（例えば、尿限外ろ過液）中に検出された場合、ＡＳＤの診断において特定の統計的有意性を示すものと識別される。
【０１３６】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−フルクトシル−リジン（ＦＬ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎε−（１−カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、メチルグリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、３−デオキシグルコソン由来ヒドロイミダゾロン（３ＤＧ−Ｈ）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、ジチロシン（ＤＴ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）、及び３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＦＬ、ＣＭＬ、ＣＥＬ、Ｇ−Ｈ１、ＭＧ−Ｈ１、３ＤＧ−Ｈ、ＣＭＡ、ＭＯＬＤ、ＮＦＫ、ＡＡＳＡ、ＧＳＡ、及び３−ＮＴから選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加する。
【０１３７】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、ピラリン、ジチロシン（ＤＴ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ、Ｇ−Ｈ１、ＣＭＡ、ＭＯＬＤ、ピラリン、ＮＦＫ、ＡＡＳＡ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加する。
【０１３８】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のジチロシン（ＤＴ）及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種のアミノ酸付加物（好ましくはＧＳＡ）の濃度は増加する。
【０１３９】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のアミノ酸付加物グルコセパン（ＧＳＰ）は減少する。
【０１４０】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、グリオキサル由来ヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）、ピラリン、ジチロシン（ＤＴ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）、及びグルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）から選択される１種又は複数種（好ましくはＣＭＬ、Ｇ−Ｈ１、ＣＭＡ、ＭＯＬＤ、ピラリン、ＮＦＫ、ＡＡＳＡ、及びＧＳＡから選択される１種又は複数種）のアミノ酸付加物の濃度は増加し、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、サンプル中のアミノ酸付加物グルコセパン（ＧＳＰ）の濃度は減少する。
【０１４１】
一の実施の形態において、先に示したアミノ酸付加物濃度プロファイルは、ＡＳＤの存在を指し示す（例えば、前記濃度プロファイルは、ＡＳＤの存在と相関する）。当業者は理解することであるが、先に詳述したアミノ酸付加物濃度プロファイルが検出されない場合、それは、好ましくは、ＡＳＤの非存在を指し示す。
【０１４２】
腎臓によるアミノ酸の腎処理への洞察は、血漿及び尿中のアミノ酸濃度から腎クリアランス（ＣＬ）を推定することによって得られる。アミノ酸などの低分子量代謝産物の場合、ＣＬは、アミノ酸膜輸送体が仲介するアミノ酸の腎尿細管再摂取に主に影響されると考えられる。
【０１４３】
一の実施の形態において、腎クリアランスアミノ酸付加物は、下記の等式に従って、血漿及び尿サンプル中に検出されるアミノ酸付加物の濃度から推定される：ＣＬ（μｌ／ｍｇクレアチニン、又は、ｍｌ／ｍｇクレアチニン）＝［被検物質］尿（ｎｍｏｌ／ｍｇクレアチニン）／［被検物質］血漿（ｐｍｏｌ／ｍｌ、又は、ｎｍｏｌ／ｍｌ）。
【０１４４】
したがって、一の実施の形態において、アミノ酸付加物の腎クリアランスが測定される。
【０１４５】
実施例４並びに図９及び図１２Ｄに示すように、前記アミノ酸の腎クリアランスが検出された場合、本明細書で述べる複数種のアミノ酸付加物が、ＡＳＤの診断において特定の統計的有意性を有すると識別される。
【０１４６】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、アミノ酸付加物Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）の腎クリアランスは減少する。
【０１４７】
一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、ジチロシン（ＤＴ）及びＮ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）から選択されるアミノ酸付加物（好ましくはＮＦＫ）の腎クリアランスは増加する。
【０１４８】
したがって、一の実施の形態において、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、アミノ酸付加物Ｎω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）の腎クリアランスは減少し、非ＡＳＤ参照標準と比較した場合、ジチロシン（ＤＴ）及びＮ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）から選択されるアミノ酸付加物（好ましくはＮＦＫ）の腎クリアランスは増加する。
【０１４９】
一の実施の形態において、先に示したアミノ酸付加物濃度プロファイルは、ＡＳＤの存在を指し示す（例えば、前記濃度プロファイルは、ＡＳＤの存在と相関する）。当業者は理解することであるが、先に詳述したアミノ酸付加物濃度プロファイルが検出されない場合、それは、好ましくは、ＡＳＤの非存在を指し示す。
【０１５０】
好ましくは、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ法）であってもよい。したがって、本発明は、被験者から事前に取得された単離サンプルに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行してもよい。
【０１５１】
適切には、本発明の方法又は使用は、適切なデータ記録媒体に、サンプル中のアミノ酸付加物及び／又はアミノ酸（以下に記載するような）の濃度を検出するステップで取得されるデータを記録するステップを更に含んでもよい。
【０１５２】
一の態様において、本発明は、本発明の方法又は使用による、サンプル中のアミノ酸付加物及び／又はアミノ酸の濃度を検出するステップで取得されるデータを含むデータ記録媒体を提供する。好ましくは、前記データ記録媒体は、ＡＳＤを診断するための方法に用いられてもよい。
【０１５３】
別の態様において、本発明は、サンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するための試薬であって、前記アミノ酸付加物は、糖化アミノ酸付加物、酸化アミノ酸付加物、ニトロ化アミノ酸付加物又はこれらの組合せから選択される１種又は複数種である、前記試薬と；その使用説明書（例えば、ＡＳＤを診断する際の）と；を含むキットを提供する。
【０１５４】
一の実施の形態において、本発明のキットは、サンプル中のクレアチニンの濃度を検出するための試薬を更に含む。
【０１５５】
一の実施の形態において、本発明のキットは、安定同位体希釈分析液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析、反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、逆相質量分析、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析、同位体希釈質量分析、サイズ透過（ゲルろ過）、イオン交換、親和性、高速液体クロマトグラフィ、超速液体クロマトグラフィ、一次元ゲル電気泳動（１−ＤＥ）、及び／又は二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）から選択される方法によってアミノ酸付加物の濃度を検出するための試薬を含む。好ましくは、本発明のキットは、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析によってアミノ酸付加物の濃度を検出するための試薬を含む。より好ましくは、本発明のキットは、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析によってアミノ酸付加物の濃度を検出するための試薬を含む。
【０１５６】
一の実施の形態において、試薬は、同位体希釈分析によってサンプル中のアミノ酸付加物の濃度を検出するためのものである。
【０１５７】
一の実施の形態において、ＮＦＫを定量化するための試薬は、［１５Ｎ２］ＮＦＫである。一の実施の形態において、ＤＴを定量化するための試薬は、ｒｉｎｇ−［２Ｈ６］ＤＴである。一の実施の形態において、３−ＮＴを定量化するための試薬は、ｒｉｎｇ−［２Ｈ３］３−ＮＴである。一の実施の形態において、ＣＥＬを定量化するための試薬は、リシル−［１３Ｃ６］ＣＥＬである。一の実施の形態において、ＣＭＬを定量化するための試薬は、リシル−［１３Ｃ６］ＣＭＬである。一の実施の形態において、ＦＬを定量化するための試薬は、リシル−［１３Ｃ６］ＦＬである。一の実施の形態において、ＣＭＡを定量化するための試薬は、カルボキシメチル−［１３Ｃ２］ＣＭＡである。一の実施の形態において、Ｇ−Ｈ１を定量化するための試薬は、グアニジノ［１５Ｎ２］Ｇ−Ｈ１である。一の実施の形態において、ＭＧ−Ｈ１を定量化するための試薬は、グアニジノ−［１５Ｎ２］ＭＧ−Ｈ１である。一の実施の形態において、３ＤＧ−Ｈを定量化するための試薬は、グアニジノ−［１５Ｎ２］３ＤＧ−Ｈである。一の実施の形態において、ＡＡＳＡを定量化するための試薬は、［２Ｈ３］α−アミノアジピン酸である。一の実施の形態において、ＧＳＡを定量化するための試薬は、［２Ｈ３］α−アミノアジピン酸である。一の実施の形態において、ＧＳＰを定量化するための試薬は、［１３Ｃ６］グルコセパンである。一の実施の形態において、ピラリンを定量化するための試薬は、［１３Ｃ６，１５Ｎ２］ピラリンである。一の実施の形態において、メチルグリオキサル由来リジン二量体（ＭＯＬＤ）を定量化するための試薬は、［２Ｈ８］ＭＯＬＤ、例えば、重水素−ＭＯＬＤである。安定同位体希釈分析の当業者によって選択されるように、これらの化合物において、代替的な安定同位体置換を用いてもよい。
【０１５８】
一の実施の形態において、同位体希釈分析のための試薬は、［１５Ｎ２］ＮＦＫ、ｒｉｎｇ−［２Ｈ６］ＤＴ；ｒｉｎｇ−［２Ｈ３］３−ＮＴ；リシル−［１３Ｃ６］ＣＥＬ、リシル−［１３Ｃ６］ＣＭＬ、リシル−［１３Ｃ６］ＦＬ、カルボキシメチル−［１３Ｃ２］ＣＭＡ、グアニジノ［１５Ｎ２］Ｇ−Ｈ１、グアニジノ−［１５Ｎ２］ＭＧ−Ｈ１、グアニジノ−［１５Ｎ２］３ＤＧ−Ｈ、［２Ｈ３］α−アミノアジピン酸、［１３Ｃ６］グルコセパン、及び［１３Ｃ６，１５Ｎ２］ピラリンからなる群から選択される少なくとも１種（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３種）の試薬を含んでもよい。
【０１５９】
本発明のキットは、標準（例えば、参照標準）として用いるための既知の量又は濃度の本明細書で述べるアミノ酸付加物（又はその関連する安定アイソタイプ置換化合物（同位体異性体））を更に含んでもよい。
【０１６０】
本発明のキットは、本明細書で述べる本発明の方法及び使用を実行するための使用説明書を更に含んでもよい。キットは、本明細書で述べるソフトウェアを使用するためのソフトウェアライセンス又はキーを更に含んでもよく、さもなければ、前記キットが、本明細書で述べるソフトウェアを含んでもよい。
【０１６１】
従来のアミノ酸
本発明者らは、ＡＳＤの診断に有用であるとして、複数のアミノ酸（例えば、従来のアミノ酸又は未修飾アミノ酸）の識別もした。前記従来のアミノ酸を、上記のアミノ酸付加物に代えて、又は加えて採用してもよい。
【０１６２】
アミノ酸付加物に関する態様、実施の形態及び定義は全て、下記の態様／実施の形態にも適用可能であり、そこでは、用語「アミノ酸付加物」は、単に「アミノ酸」で置き換えられている。
【０１６３】
したがって、一の態様において、本発明は、自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法を提供し、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、又はこれらの組合せから選択される１種又は複数種である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中のアミノ酸の濃度を参照標準中の同じアミノ酸の濃度と比較するステップと；
ｃ．参照標準に対するサンプル中の前記アミノ酸の濃度差の有無を識別するステップであって、濃度差の有無がＡＳＤの有無と相関する、前記識別するステップと；を含む。
【０１６４】
別の態様において、自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）の予後を特定するための方法が提供され、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、又はこれらの組合せから選択される１種又は複数種である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中のアミノ酸の濃度を参照標準中の同じアミノ酸の濃度と比較するステップと；
ｃ．参照標準に対するサンプル中の前記アミノ酸の濃度差の有無を識別するステップであって、濃度差の有無が良好な予後又は不良な予後と相関する、前記識別するステップと；を含む。
【０１６５】
別の態様において、自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法が提供され、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、又はこれらの組合せから選択される１種又は複数種である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中に検出されたアミノ酸の濃度に基づき、診断アルゴリズムによって被験者の健康状態を分類するステップであって、診断アルゴリズムは、既知の疾病状態を有する被験者の母集団から取得した同じアミノ酸についての対応する濃度に関して訓練され、それにより被験者におけるＡＳＤの有無を診断する、前記分類するステップと；を含む。
【０１６６】
別の態様において、被験者における自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置するための方法が提供され、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、又はこれらの組合せから選択される１種又は複数種である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中のアミノ酸の濃度を、参照標準中の同じアミノ酸の濃度と比較するステップと；
ｃ．参照標準に対するサンプル中の前記アミノ酸の濃度差の有無を識別するステップであって、濃度差の有無はＡＳＤの有無と相関する、前記識別するステップと；
ｄ．ＡＳＤであると診断された被験者に、ＡＳＤに対する療法を施用するステップと；を含む。
【０１６７】
別の態様において、被験者における自閉的スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置するための方法が提供され、前記方法は：
ａ．被験者から取得したサンプル中のアミノ酸の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、又はこれらの組合せから選択される１種又は複数種である、前記検出するステップと；
ｂ．サンプル中に検出されたアミノ酸の濃度に基づき、診断アルゴリズムによって被験者の健康状態を分類するステップであって、診断アルゴリズムは、既知の疾病状態を有する被験者の母集団から取得した同じアミノ酸についての対応する濃度に関して訓練され、それにより被験者におけるＡＳＤの有無を診断する、前記分類するステップと；
ｃ．ＡＳＤであると診断された被験者に、ＡＳＤに対する療法を施用するステップと；を含む。
【０１６８】
別の態様において、ＡＳＤの処置に適する療法を識別するための方法が提供され、前記方法は：
ａ．候補療法を施用された被験者からの単離サンプルを提供するステップと；
ｂ．前記サンプル中のアミノ酸の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、又はバリンから選択される、前記検出するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）で検出されたアミノ酸の濃度を、候補療法の施用前の被験者からの単離サンプル中のアミノ酸の濃度と比較することによって、アミノ酸の相対濃度変化を特定するステップであって、
候補療法を施用した後に濃度変化が検出される場合、候補療法はＡＳＤの処置に適しており、
候補療法を施用した後に濃度変化が検出されない場合、候補療法はＡＳＤの処置に適していない、前記特定するステップと；を含む。
【０１６９】
別の態様において、ＡＳＤ療法の有効性をモニタリングするための方法が提供され、前記方法は：
ａ．前記処置又は療法を施用された患者からの単離サンプルを提供するステップと；
ｂ．前記サンプル中のアミノ酸の濃度を検出するステップであって、前記アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、又はバリンである、前記検出するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）で検出されたアミノ酸の濃度を、以前の時点での被験者からの単離サンプル中のアミノ酸の濃度と比較することによって、アミノ酸の相対濃度の変化を特定し、
濃度変化が検出される場合、有効性の存在を確認し、
濃度変化が検出されない場合、有効性の非存在を確認する、ステップと；を含む。
【０１７０】
別の態様において、
ａ．ＡＳＤを診断すること；
ｂ．ＡＳＤの予後を特定すること；
ｃ．ＡＳＤの処置に適する療法を識別すること；
ｄ．ＡＳＤ療法の有効性をモニタリングすること；及び／又は、
ｅ．ＡＳＤ診断アルゴリズムにおける特徴としての使用；のために、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、又はこれらの組合せから選択される１種又は複数種のアミノ酸の使用が提供される。
【０１７１】
有利なことに、前記アミノ酸の濃度の変化は、ＡＳＤの有無と相関する。
【０１７２】
実施例３及び図７に示すように、本明細書で述べる複数種のアミノ酸が、血漿限外ろ過液サンプル中に検出された場合、ＡＳＤの診断において特定の統計的有意性を示していると識別される。
【０１７３】
したがって、好ましい実施の形態において、アミノ酸は、グルタミン、グルタミン酸塩、及び／又はトレオニンから選択される。一の実施の形態において、アミノ酸はトリプトファンである。
【０１７４】
実施例４並びに図８及び図１２Ｃに示すように、本明細書で述べる複数種のアミノ酸が、尿サンプル中に検出された場合、ＡＳＤの診断において特定の統計的有意性有していると識別される。
【０１７５】
一の実施の形態において、アミノ酸は、アスパラギン、プロリン、セリン、トリプトファン、及び／又はバリンから選択される。好ましくは、アミノ酸は、アスパラギン、プロリン、セリン、及び／又はバリンから選択されてもよい。
【０１７６】
実施例４並びに図９及び１２Ｄに示すように、本明細書で述べる複数のアミノ酸付加物は、前記アミノ酸の腎クリアランスが検出された場合、ＡＳＤの診断において特定の統計的有意性を示していると識別される。
【０１７７】
一の実施の形態において、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、又はトレオニンである。一の実施の形態において、アミノ酸は、グルタミン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、又はトレオニンである。別の実施の形態において、アミノ酸はトリプトファンである。好ましい実施の形態において、アミノ酸はアルギニンである。
【０１７８】
別段に定めのない限り、本明細書において用いられる技術的及び科学的用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ他、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２０版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）は、本開示に用いられる用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供している。
【０１７９】
本開示は、本明細書に開示の例示的な方法及び材料によって限定されず、本明細書で述べるものと同様又は均等の方法及び材料はいずれも、本開示の実施の形態の実践又は試験に用いることができる。数値範囲は、範囲を規定する数値を含む。本明細書において提供される見出しは、本開示の様々な態様又は実施の形態を限定するものではない。
【０１８０】
アミノ酸は、本明細書において、アミノ酸の名称、３文字略語又は１文字略語を用いて引用される。用語「タンパク質」は、本明細書で用いられる場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。場合によっては、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。場合によっては、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書においては交換可能に用いられる。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基に対して従来の１文字及び３文字コードを用いることがある。アミノ酸用の３文字コードは、ＩＵＰＡＣＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  （ＪＣＢＮ）に準拠して定義される。同様に理解されることであるが、ポリペプチドは、遺伝暗号の縮重のために、２以上のヌクレオチド配列によってコード化される場合もある。
【０１８１】
用語の他の定義が、本明細書を通じて出現する場合がある。例示的実施の形態についてより詳細に述べる前に、理解すべきことであるが、本開示は、記載する特定の実施の形態に限定されないので、変化し得る。同様に理解すべきことであるが、本開示の範囲は付帯する特許請求の範囲によってのみ定義されるため、本明細書で用いられる用語の目的は、単に特定の実施の形態の説明のためであり、限定を意図するものではない。
【０１８２】
値の範囲が提供される場合、理解されることであるが、その範囲の上限と下限の間に介在する各値は、文脈上明確に他の指示がある場合を除き、下限の単位の１０分の１まで具体的に開示される。記載された範囲内の任意の記載された値又は仲介値とその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は仲介値との間のより小さなそれぞれの範囲も、本開示の範囲に包含される。これらのより小さな範囲の上限値及び下限値は、独立してその範囲に含まれても範囲から除外されてもよく、そのより小さな範囲内に限界値のどちらか一方が含まれる、どちらも含まれない、又は両方とも含まれるそれぞれの範囲も、記載された範囲内に具体的に除外される限定値がない限り、この開示の範囲内に包含される。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれた限界値の一方又は両方を除外する範囲も、この開示に含まれる。
【０１８３】
留意すべきことであるが、本明細書及び付帯する特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に他の指示がある場合を除き、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「アミノ酸付加物」についての言及は、複数のそうしたアミノ酸付加物を含み、「そのアミノ酸付加物」についての言及は、１種又は複数種のアミノ酸付加物及び当業者に公知であるその均等物などについての言及を含む。
【０１８４】
本明細書において論じられた出版物は、単に本願の出願日以前にそれらが開示されているというだけの理由で提供されたものである。本明細書において、何ものも、こうした出版物が本明細書に付帯する特許請求の範囲に対する先行技術を構成することを認めるものと解釈すべきではない。
【０１８５】
略語
ＡＡＳＡ、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド；ＡＤＯＳ、自閉症診断観察スケジュール；ＡＧＥ、糖化最終産物；ＡＳＤ、自閉症スペクトラム障害；ＡＵＲＯＣ、受信者動作特性の曲線下面積のプロット；ｂ０，＋ＡＴ、溶質キャリア７、メンバー９；ＣＡＲＳ、小児自閉症評定尺度；ＣＡＴ−３、カチオン性アミノ酸輸送体−３；ＣＤ９８ｈｓ、分化重鎖サブユニットのクラスタ；ＣＥＬ、Ｎε−（１−カルボキシエチル）リジン；ＣＬ、腎クリアランス；ＣＭＡ、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン；ＣＭＬ、Ｎε−カルボキシメチル−リジン；３−ＤＧ、３−デオキシグルコソン；３ＤＧ−Ｈ、３−デオキシグルコソンに由来するヒドロイミダゾロンＡＧＥ；ＤＴ、ジチロシン；ＤＵＯＸ、デュアルオキシダーゼ；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＦＬ、Ｎε−フルクトシル−リジン；Ｇ−Ｈ１、グリオキサルに由来するヒドロイミダゾロンＡＧＥ；ＧＳＡ、グルタミン酸セミアルデヒド；ＧＳＰ、グルコセパン；ｈＬＡＴ−１、大型中性アミノ酸輸送体サブユニット−１；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析；Ｌｅｉｔｅｒ−Ｒ、リーター国際作業スケール改訂版；ＭＧ、メチルグリオキサル；ＭＧ−Ｈ１、メチルグリオキサルに由来するヒドロイミダゾロンＡＧＥ；ＭＯＬＤ、メチルグリオキサル由来リジン架橋体；ＭＲＭ、多重反応モニタリング；ＮＦＫ、Ｎ−ホルミルキヌレニン；３−ＮＴ、３−ニトロチロシン；ＰＥＰ−３、心理教育プロフィール−３；ｒＢＡＴ、中性及び塩基性アミノ酸輸送タンパク質；ＲＯＳ、活性酸素種；ＳＬＣ７Ａ５、溶質キャリアファミリー７、メンバー５；ＳＶＭ、サポートベクターマシン；ＴＤ、定型発達；ＵＰＲ、折りたたみ不全タンパク質応答；ｙ＋ＬＡＴ−１、溶質キャリアファミリー７メンバー７；ｙ＋ＬＡＴ−２、溶質キャリアファミリー７メンバー６。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
図
本発明の実施の形態を、下記の図及び実施例を参照して、単なる例として説明する。
【図１Ａ】図１Ａは、初期糖化付加物ＦＬの構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ニトロ化付加物３−ＮＴの構造を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、糖化最終産物ＣＭＬ、ＣＥＬ、ピラリン、Ｇ−Ｈ１、ＭＧ−Ｈ１、３ＤＧ−Ｈ、ＣＭＡ、グルコセパン、及びＭＯＬＤの構造を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、酸化付加物ＤＴ、ＮＦＫ、３−ＮＴ、ＡＡＳＡ、及びＧＳＡの構造を示す。
【図２】図２は、自閉的スペクトラム障害を検出するための診断アルゴリズムの訓練群及び検証対象群のスキームを示す。
【図３−１】図３は、自閉症児群の人口統計学的及び臨床的特徴を示す。†発症パターンは、Ｏｚｏｎｏｆｆ他（Ａｕｔｉｓｍ  Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００８；１（６）：３２０−８）に従って定義した。‡実験バイオマーカーデータより導出した診断アルゴリズムから推定した被験者が自閉症である確率（アルゴリズム性能は図１４に示す）。
【図３−２】図３の続き。
【図３−３】図３の続き。
【図４】図４は、血漿タンパク質の糖化、酸化、及びニトロ化付加物残基含有量を示す。データは、中央値（下位−上位四分位点）である；健全な対照、ｎ＝２１、及びＡＳＤ、ｎ＝２７。有意性（マンホイットニーＵ）；＊、＊＊、及び＊＊＊、１４のボンフェローニ補正適用後Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、及びＰ＜０．００１。
【図５】図５は、血漿ろ液中の血漿糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物含有量を示す。データは、中央値（下位−上位四分位点）である；健全な対照、ｎ＝２１から３１、及びＡＳＤ、ｎ＝２７から３８。有意性（マンホイットニーＵ）；＊、１５のボンフェローニ補正適用後Ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、尿中糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物含有量を示す。データは、中央値（下位−上位四分位点）である；健全な対照、ｎ＝２１から３１、及びＡＳＤ、ｎ＝２７から３８。有意性（マンホイットニーＵ）；＊、１５のボンフェローニ補正適用後Ｐ＜０．０５。
【図７】図７は、血漿アミノ酸メタボローム含有量を示す。データは、平均値±ＳＤ又は中央値（下位−上位四分位点）である；健全な対照、ｎ＝２１、及びＡＳＤ、ｎ＝２７。有意性：パラメトリックデータの場合はｔ−検定、ノンパラメトリックデータの場合はマンホイットニーＵ。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、２０のボンフェローニ補正適用後Ｐ＜０．０１。
【図８】図８は、尿中アミノ酸メタボローム含有量を示す。データは、平均値±ＳＤ又は中央値（下位−上位四分位点）である；健全な対照、ｎ＝２１、及びＡＳＤ、ｎ＝２７。有意性：パラメトリックデータの場合はｔ−検定、ノンパラメトリックデータの場合はマンホイットニーＵ。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、２０のボンフェローニ補正適用後Ｐ＜０．０１。
【図９】図９は、糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物の腎クリアランス値を示す。データは、平均値±ＳＤ又は中央値（下位−上位四分位点）である；健全な対照、ｎ＝２１、及びＡＳＤ、ｎ＝２７。有意性：パラメトリックデータの場合はｔ−検定、ノンパラメトリックデータの場合はマンホイットニーＵ。＊、１４のボンフェローニ補正適用後ｐ＜０．０５。＃、ｍｌ／ｍｇクレアチニン。
【図１０】図１０は、アミノ酸の腎クリアランス値を示す。データは、平均値±ＳＤ又は中央値（下位−上位四分位点）である；健全な対照、ｎ＝２１、及びＡＳＤ、ｎ＝２７。有意性：パラメトリックデータの場合はｔ−検定、ノンパラメトリックデータの場合はマンホイットニーＵ。＊、２０のボンフェローニ補正適用後ｐ＜０．０５。
【図１１】図１１Ａは、血漿及び尿中の糖化、酸化、及びニトロ化付加物とアミノ酸メタボロームの濃度変化を示すヒートマップを提供する。図１１Ｂは、血漿及び尿中のアミノ酸メタボロームの変化を示すヒートマップである。図１１Ａに示す凡例（Δｌｏｇ２）が同様に図１１Ｂにも適用される。
【図１２Ａ】図１２は、ボンフェローニ補正後の、ＡＳＤ研究群における変化が有意に異なるバイオマーカーのデータ分布を示す。図１２Ａは、タンパク質付加物残基ＣＭＬ、ＣＭＡ及びＤＴである。有意性：アスタリスク１つ、アスタリスク２つ、及びアスタリスク３つは、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、及びＰ＜０．００１を示す。
【図１２Ｂ】図１２は、ボンフェローニ補正後の、ＡＳＤ研究群における変化が有意に異なるバイオマーカーのデータ分布を示す。図１２Ｂは、血漿遊離付加物ＣＭＡである。有意性：アスタリスク１つ、アスタリスク２つ、及びアスタリスク３つは、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、及びＰ＜０．００１を示す。
【図１２Ｃ】図１２は、ボンフェローニ補正後の、ＡＳＤ研究群における変化が有意に異なるバイオマーカーのデータ分布を示す。図１２Ｃは、尿遊離付加物ＤＴ及びＧＳＡ；並びにアミノ酸Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＶａｌである。有意性：アスタリスク１つ、アスタリスク２つ、及びアスタリスク３つは、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、及びＰ＜０．００１を示す。
【図１２Ｄ】図１２は、ボンフェローニ補正後の、ＡＳＤ研究群における変化が有意に異なるバイオマーカーのデータ分布を示す。図１２Ｄは、ＣＭＡ及びＡｒｇの腎クリアランスである。有意性：アスタリスク１つ、アスタリスク２つ、及びアスタリスク３つは、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、及びＰ＜０．００１を示す。
【図１３】図１３は、タンパク質糖化及び酸化付加物による自閉的スペクトラム障害の検出のための診断アルゴリズムの受信者動作特性プロットを示す。（Ａ）アルゴリズム−１、血漿タンパク質付加物残基。ＡＵＲＯＣ＝０．９６。（Ｂ）アルゴリズム−２、血漿遊離アミノ酸付加物。ＡＵＲＯＣ＝０．７８。（Ｃ）アルゴリズム−３、血漿タンパク質付加物残基及び遊離付加物。ＡＵＲＯＣ＝０．９９．（Ｄ）アルゴリズム−４、尿遊離アミノ酸付加物。ＡＵＲＯＣ＝０．７８。ＲＯＣプロットは、分類実験１回の実行からの代表的な結果である。無作為の結果は、ＡＵＲＯＣ＝０．５０である。
【図１４】図１４は、血漿及び尿の被検物質から自閉的スペクトラム障害用に展開された診断アルゴリズムの詳細を示す。ＳＶＭを用いた２分割交差検証（頑健性のため、ランダム化した繰り返し試行１０回）の場合のアルゴリズムの結果（９５％ＣＩを括弧内に示す）。
【図１５】図１５は、ＡＳＤにおいてタンパク質損傷及びアミノ酸に見られる変化を概略説明する。（Ａ）血漿タンパク質糖化及び酸化付加物に見られる観察された変化の提案されたメカニズム。（Ｂ）腎尿細管上皮を横断するＡｒｇ及びＣＭＡの輸送と腎ＣＬの増加（Ａｒｇ及びＣＭＡの再取り込みの増加）の提案メカニズム。凡例：灰色に塗られた矢印はプロセスを示す；黒色に塗られた矢印は、ＡＳＤにおいて観察された変化（Ａ）と予想される変化（Ｂ）を示す。
【図１６−１】図１６は、タンパク質糖化、酸化、及びニトロ化付加物と、アミノ酸の質量分析多重反応モニタリング検出を示す。
【図１６−２】図１６の続き。
【図１６−３】図１６の続き。
【図１６−４】図１６の続き。
【図１７】図１７は、血漿タンパク質糖化、酸化、及びニトロ化付加物残基の相関分析を示す。相関係数；スピアマン（Ｐ＜０．０１）。
【図１８】図１８は、血漿タンパク質糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物の相関分析を示す。相関係数；スピアマン（Ｐ＜０．０１）。
【図１９】図１９は、血漿アミノ酸の相関分析を示す。相関係数；スピアマン（Ｐ＜０．０１）。
【図２０】図２０は、尿中タンパク質糖化、酸化及びニトロ化遊離付加物の相関分析を示す。相関係数；スピアマン（Ｐ＜０．０１）。
【図２１】図２１は、尿中アミノ酸の相関分析を示す。相関係数；スピアマン（Ｐ＜０．０１）。
【図２２】図２２は、自閉的スペクトラム障害を識別するためのアルゴリズムの混同行列を示す。図示の混同行列は、実行１回の分類実験からの代表的な結果である。
【実施例】
【０１８７】
実施例
材料及び方法
被験者の採用
合計で６９人の小児が採用された。このうち、３８人がＡＳＤと診断され（男性２９人、女性９人）、３１人が定型発達（ＴＤ）児に分類された（男性２３人、女性８人）−図２。２つの被験者群の年齢に有意差はなかった。被験者年齢は、ＡＳＤ群、７．６±２．０歳、５歳から１２歳の範囲、ＴＤ群、８．６歳±２．０歳、５歳から１２歳の範囲であった。ＡＳＤ被験者は全て、Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｅｌｌａｒｉａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｂｏｌｏｇｎａ（ＩＲＣＣＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の幼児の発育についての専門家２人により、精神疾患の診断・統計マニュアルＶ（ＤＳＭ５基準）、自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）、小児自閉症評定尺度（ＣＡＲＳ）及び先に定義したＡＳＤの発症パターンの特徴に従ってＡＳＤとの診断を受けた。発達及び認知レベルを、心理教育プロフィール−３（ＰＥＰ−３）及びリーター国際作業スケール改訂版（Ｌｅｉｔｅｒ−Ｒ）によって評価した。ＡＳＤ及びＴＤ被験者両方に対し、除外基準は、炎症性又は感染性疾患の存在、及び調査時点の抗酸化サプリメントの摂取であった。血液と尿の採取前４カ月に何らかの外科的インターベンションを受けた被験者はいなかった。血液と尿のサンプリング時に活動性てんかんを起こしたＡＳＤ被験者はいなかった。医学的及び神経学的共存疾患が確認された被験者は、脳波記録（覚醒中及び睡眠中に記録）、脳磁気共鳴イメージング、標準的な臨床及び神経学的検査、神経代謝及び遺伝子検査（比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ、脆弱Ｘ及びＭＥＣＰ２に対する分子解析を含む）を含む医学的精密検査を通じて除外された。この研究のために採用された被験者は、薬剤投与を受けていなかった。ＴＤ小児は、地域社会で採用され、認知的、学習的及び精神医学的関与の兆候はなかった。彼らは普通学校に通っていて、ストレスの多い出来事にさらされてはいなかった。食習慣を、Ｅｍｉｌｉａ−Ｒｏｍａｇｎａ保健局が発行したガイドラインに従って構築された食物質問票によって評価した。グルテン又はカゼインを含まない食事をしているＡＳＤ児はいなかった。患者と対照の両方が、単炭水化物と複合炭水化物の両方が多いこと、オリーブ油の使用、及び多量の果実によって定義されるような典型的な地中海式の食事をしていた。患者及び対照の両方で、野菜の消費は所望未満であったが、野菜摂取は、ＡＳＤ患者の方が少なかった。ＡＳＤの人口統計学的及び臨床的特徴を、図３に要約する。被験者は全て、Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｅｌｌａｒｉａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｂｏｌｏｇｎａ、Ｂｏｌｏｇｎａ、Ｉｔａｌｙ（イタリア、ボローニャにあるボローニャのベッラリア病院の小児神経及び精神科病棟）にて採用された。
【０１８８】
３８人のＡＳＤ児がこの研究のために採用された。この被験者群におけるＡＳＤの重症度の分布（症例数）は、軽度（６）、中程度（６）、及び重度（２６）であった。認知／発達障害の分布（症例数）は、正常／境界線ＩＱ（１１）、軽度（３）、中程度（１２）、及び重度（１２）であった。ＡＳＤの発症パターンの分布（症例数）は、初期（２２）、退行（６）、及び混合（１０）であった。ＡＤＯＳスコア範囲は１３から２２であり、ＣＡＲＳ合計スコア範囲は３１．５から４８．５であった。
【０１８９】
血液と尿のサンプリング
血液は、空腹時の小児から朝に採取した。随時尿（スポット尿）サンプルは、朝の最初の尿であった。血液サンプルは、抗凝血剤としてのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて収集した。血漿と血液細胞を遠心分離（２０００ｇ、１０分）によって即座に分離し、血漿サンプルは、分析まで−８０℃で保存し、連携する実験室間をドライアイスに載せて移動した。
【０１９０】
タンパク質糖化、酸化、及びニトロ化のマーカーの解析
血漿タンパク質中の糖化、酸化、及びニトロ化付加物残基の含有量を、安定同位体希釈分析液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、完全酵素消化物中で定量化し、加水分解酵素の自己加水分解について補正した。血漿及び尿中の関連する糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸遊離付加物（糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸）の濃度を、血漿及び尿の限外ろ過液でそれぞれ同様に特定した。血漿の限外ろ過液（５０μｌ）は、４℃でマイクロスピン限外ろ過（１０ｋＤａ分画）によって収集した。保持されたタンパク質を水で５００μｌに希釈し、マイクロスピン限外ろ過装置上で５０μｌへの濃縮と水での５００μｌへの希釈を４℃で４サイクル行うことにより、洗浄した。最終的な洗浄したタンパク質（１００μｌ）は、記載されているように（Ｒａｂｂａｎｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２０１４；４２（２）：５１１−７；Ａｈｍｅｄ他、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５；５：９２５９）脱脂し、酵素的に加水分解した。尿の限外ろ過液（５０μｌ）は、４℃でマイクロスピン限外ろ過（３ｋＤａ分画）によって収集した。
【０１９１】
タンパク質加水分解物（２５μｌ、３２μｇ当量）又は限外ろ過液（５μｌ）を安定同位体標準被検物質と混合し、Ｘｅｖｏ−ＴＱＳタンデム質量分光計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）を備えたＡｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣシステムを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。バッチ分析中、サンプルをオートサンプラで４℃に維持する。カラムは、２．１×５０ｍｍ及び２．１ｍｍ×２５０ｍｍ、粒径５μｍのＨｙｐｅｒｃａｒｂ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、プログラムされたスイッチングと直列に配置され、３０℃であった。酸化した被検物質をそのアミノ酸前駆体から分離して質量分析検出器のエレクトロスプレーイオン化源における後者の部分的酸化による干渉を回避するため、クロマトグラフ保持が用いられた。被検物質は、エレクトロスプレー陽イオン化及び質量分析多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードによって検出され、このモードでは、被検物質検出反応が、被検物質分子イオンと質量分光計の衝突セルにおける衝突誘起解離によって生成される主要フラグメントイオンとの質量／電荷比に対して特異的であった。イオン化源と脱溶媒和ガスの温度はそれぞれ１２０℃及び３５０℃であり、コーンガスと脱溶媒和ガスの流量は、９９ｌ／ｈ及び９００ｌ／ｈであり、キャピラリ電圧は、０．６０ｋＶであった。アルゴンガス（５．０×１０−３ｍｂａｒ）が、衝突セルに入っていた。ＭＲＭ検出では、それぞれ±０．１Ｄａ及び±１ｅＶに最適化された分子イオンとフラグメントイオンの質量及び衝突エネルギーがプログラムされた−図１６。
【０１９２】
特定された被検物質は、以下の通りである：
・  糖化付加物−ＦＬ、並びにＡＧＥ、ＣＭＬ、ＣＥＬ、ピラリン、ＣＭＡ、Ｇ−Ｈ１、ＭＧ−Ｈ１、３ＤＧ−Ｈ、ＭＯＬＤ、及びＧＳＰ；
・  酸化付加物−ＤＴ、ＮＦＫ、ＡＡＳＡ、ＧＳＡ；
・  ニトロ化付加物、３−ＮＴ；並びに
・  全ての主要なアミノ酸。
【０１９３】
酸化、ニトロ化、及び糖化付加物残基は、それらのアミノ酸残基前駆体に正規化され、ｍｍｏｌ／ｍｏｌ修飾アミノ酸として与えられ；関連する遊離付加物は、ｎＭで与えられる。これらの被検物質の化学構造と生化学的及び臨床的重要性は、他の文献に記載されている（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ＆Ｒａｂｂａｎｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１４；１８４０（２）：８１８−２９；及びＡｈｍｅｄ他、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５；５（９２５９）：９２５１−７）。糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物と未修飾アミノ酸の腎クリアランス（ＣＬ）は、血漿及び随時尿の収集物から推定された：ＣＬ（μｌ／ｍｇクレアチニン又はｍｌ／ｍｇクレアチニン）＝［被検物質］尿（ｎｍｏｌ／ｍｇクレアチニン）／［被検物質］血漿（ｐｍｏｌ／ｍｌ又はｎｍｏｌ／ｍｌ）。
【０１９４】
機械学習分析
目的は、ＡＳＤ児と健全な対照とを判別することであった。全ての症例において、診断アルゴリズムは、症例の５０％と対照（訓練部分集合）に関して訓練され、その後、残りの被験者（試験集合）における各サンプルについて疾患クラスを予測することに、２分割交差検証として用いられた。その結果は、各試験集合サンプルについて、ＡＳＤ群／対照群のそれぞれに対応する一組の確率を割り当てることであった−前記群の割り当ては、確率が最も高くなるものであった。試験データはアルゴリズム訓練とは別に保持され；アルゴリズムの設定は、試験集合データの分析が開始されてからは、調整しなかった−これにより過剰適合から保護され、そのため、予測性能の正確な推定が得られた。
【０１９５】
性能について、ランダムフォレスト、ロジスティック回帰、アンサンブル分類器、及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）の４種類のアルゴリズムの試験が行われた。
【０１９６】
アルゴリズムの訓練中、タンパク質糖化、酸化、及びニトロ化付加物の完全な一団を特徴として用い、各被検物質の種類、即ち、血漿タンパク質付加物残基、血漿遊離付加物及び尿中遊離付加物についてアルゴリズムを展開した。後者の２つについては、未修飾アミノ酸も特徴として含まれている。訓練中の目的は、最高の性能を達成する特徴の集合を選択することであった。機械学習実験は当初、全ての代謝産物の特徴を用いて研究された。有利なことに、それに続く判別バイオマーカー特徴の部分集合の選択が、アルゴリズム性能を向上させた（図１４参照）。バイオマーカー（例えば、アミノ酸付加物）の選択には、逐次特徴選択アプローチが用いられた。バイオマーカー特徴の選択と分類子の選択は、分類精度、感度、特異度、受信者動作特性曲線の曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）、陽性尤度比、陰性尤度比、陽性的中率、陰性的中率、及びＦ値によって定義されるアルゴリズム性能に基づいてなされた。各性能測定基準について、平均値及び９５％ＣＩが特定され、報告された。アルゴリズムパラメータを変更することなく、５０％データ分割でアルゴリズムの訓練及び試験を１０回繰り返し、データ分割の偏りに対するアルゴリズムの頑健性の試験を行った。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  のツールボックス（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ，米国）を用い、線形カーネルＳＶＭと逐次最小問題最適化法（ＳＭＯ）によってコンピュータプログラムを展開した。
【０１９７】
統計分析
データは、パラメトリック分布の場合は平均値±ＳＤとして、ノンパラメトリック分布の場合は中央値（下位−上位四分位点）として提示される。適用されたデータ分布の正規性検定は、コルモゴルフ・スミルノフ検定であった。有意性は、パラメトリック又はノンパラメトリック分布のデータについて、それぞれスチューデントｔ−検定又はマンホイットニーＵ検定によって評価した。多数（複数）の被検物質の分析には、仮説を立てることなくボンフェローニ補正を行った。連続型変数を用い、スピアマンのロー法によって相関分析を行った。６カテゴリ以上の臨床カテゴリ変数には、連続型変数への近似を仮定してスピアマン相関を行い；他のカテゴリ変数の場合は、カテゴリ間のバイオマーカーデータ分布の差の有意性を、パラメトリックデータ用の一元配置ＡＮＯＶＡとクラスカル・ワリスＨ検定によって評価した。ＳＰＳＳ、バージョン２４．０を用いてデータを分析した。
【０１９８】
研究設計時の検定力分析のため、血漿タンパク質中の不可逆的酸化的損傷マーカーＤＴのレベルを選択した。健全なヒト被験者では、血漿タンパク質ＤＴは、以前の研究では、０．０２８７±０．００２７ｍｍｏｌ／ｍｏｌ  ｔｙｒ（ｎ＝２９）であった。この研究は、血漿タンパク質ＤＴの５０％の増加を０．０１％の有意水準で検出するように設計されており、それには、１８以上の症例と対照サンプルが必要であった。事後の分析で、２７の症例と２１の対照での１４のボンフェローニ補正後、Ｐ＝０．０００１７で８８％の増加が明らかとなり、この研究は、この重要な標的となる分析物に対して十分な検定力を有することを指し示した。
【０１９９】
実施例１
この研究のために採用された自閉的スペクトラム障害児
３８人のＡＳＤ児がこの研究のために採用された。この被験者群におけるＡＳＤの重症度の分布（症例数）は、軽度（６）、中程度（６）、及び重度（２６）であった。認知／発達障害の分布（症例数）は、正常／境界線ＩＱ（１１）、軽度（３）、中程度（１２）、及び重度（１２）であった。ＡＳＤの発症パターンの分布（症例数）は、初期（２２）、退行（６）、及び混合（１０）であった。ＡＤＯＳスコア範囲は１３から２２であり、ＣＡＲＳ合計スコア範囲は３１．５から４８．５であった。
【０２００】
実施例２
血漿タンパク質の糖化、酸化、及びニトロ化
血漿タンパク質中、ＡＳＤ児では、健全な対照に関してＡＧＥ−ＣＭＬ、ＭＧ−Ｈ１、及びＣＭＡ−のタンパク質含有量は増加し；一方、ＡＳＤ児では、健全な対照に関してＡＧＥである３ＤＧ−Ｈの血漿タンパク質含有量は減少した。ＡＳＤ児では、健全な対照に関して酸化的損傷付加物ＤＴの血漿タンパク質含有量は増加した。有利なことに、ＣＭＬ、ＣＭＡ、及びＤＴの変化は、多数（複数）の被検物質の測定のためのボンフェローニ補正後も有意なままであった（図４）。相関分析において、高度に有意な正の相関（Ｐ＜０．０１、スピアマン）が、ＣＭＬとＤＴ、Ｇ−Ｈ１とＭＧ−Ｈ１及びＤＴ、ＭＧ−Ｈ１とＣＭＡ、ＣＭＡとＤＴ、並びにＡＡＳＡとＧＳＡに存在した−図１７。糖化、酸化、及びニトロ化付加物残基の人口統計学的及び臨床的特徴との相関又は関連は認められなかった。ＡＳＤの有無に関わらず、性別の異なる被験者群間で、これらの変数に有意差はなかった。
【０２０１】
実施例３
血漿糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸とアミノ酸メタボローム
血漿中の糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸濃度については、ＡＳＤ児では、健全な対照に関してＦＬ、Ｇ−Ｈ１及びＮＦＫは減少した一方、ＣＭＡ、ＡＡＳＡ、及びＧＳＡは増加した。有利なことに、ＣＭＡの増加は、ボンフェローニ補正後も有意なままであった（図５）。相関分析において、高度に有意な正の相関が、ピラリンとＭＧ−Ｈ１及び３ＤＧ−Ｈ；ＦＬとＣＭＬ、Ｇ−Ｈ１及びＭＧ−Ｈ１；ＣＥＬとＭＧ−Ｈ１及びＣＭＡ、ＭＧ−Ｈ１と３ＤＧ−Ｈ、並びに、ＣＭＡとＡＡＳＡに存在した。ピラリンとＮＦＫ；ＣＭＡとＭＯＬＤ；及びＭＯＬＤとＡＡＳＡに高度に有意な負の相関が存在した−図１８。
【０２０２】
従来のアミノ酸メタボロームについては、ＡＳＤ児では、健全な対照に関してａｒｇ、ｇｌｎ、ｇｌｕ及びｔｈｒの増加と、ｔｒｐの減少とが存在した。血漿アミノ酸濃度間には、多くの高度に有意な正の相関が存在した−図１９。糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物とアミノ酸の人口統計学的及び臨床的特徴との相関又は関連は認められなかった。性別間でこれらの変数に有意差はなかった。
【０２０３】
実施例４
尿中の糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸とアミノ酸メタボローム、並びに腎クリアランス
糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸の尿フラックスについては、ＡＳＤ児は、ＣＭＬ、Ｇ−Ｈ１、ＣＭＡ、ＭＯＬＤ、ピラリン、ＤＴ、ＮＦＫ、ＡＡＳＡ及びＧＳＡの尿中排せつの増加を示した。有利なことに、ＤＴ及びＧＳＡの尿中排せつは、ボンフェローニ補正後も有意なままであった（図６）。未修飾アミノ酸の尿フラックスについては、ＡＳＤ児は、ａｓｐ、ｃｙｓ、ｌｙｓ、ｐｈｅ、及びｔｙｒを除く全てのアミノ酸の尿中排せつの増加を示した。有利なことに、ａｓｎ、ｐｒｏ、ｓｅｒ、及びｖａｌの尿中排せつの増加は、ボンフェローニ補正後も有意なままであった（図８）。糖化、酸化、及びニトロ化付加物とアミノ酸の尿中排せつとの間には、いくつかの高度に有意な正の相関が存在した−図２０及び図２１参照。
【０２０４】
ＡＳＤ児では、健全な対照に関してＣＭＡ、ＧＳＰ、ＤＴ、ａｒｇ、ｇｌｕ、ｌｅｕ、ｐｈｅ、及びｔｈｒの腎クリアランスは減少し、ＮＦＫ及びｔｒｐの腎クリアランスは増加した。有利なことに、ａｒｇ及びＣＭＡの腎クリアランスの減少は、ボンフェローニ補正後も有意なままであり：ＡＳＤ児では、健全な対照と比較してＣＬａｒｇは３２％減少し、ＣＬＣＭＡは５０％減少した；Ｐ＜０．００１（図９及び１０）。これらの糖化、酸化、及びニトロ化遊離付加物とアミノ酸変数の人口統計学的及び臨床的特徴との相関又は関連は認められなかった。性別間でこれらの変数に有意差はなかった。
【０２０５】
血漿及び尿中の糖化、酸化、及びニトロ化付加物とアミノ酸メタボロームの変化を、ヒートマップ（図１１Ａ及び図１１Ｂ）に要約する。図１２Ａ−Ｄに、ボンフェローニ補正後のＡＳＤ研究群で変化が有意に異なるバイオマーカー（アミノ酸付加物及びアミノ酸）のデータ分布を示す。
【０２０６】
実施例５
自閉的スペクトラム障害用の診断アルゴリズムの展開
ＡＳＤに対するタンパク質糖化、酸化、及びニトロ化測定の診断的有用性を探求するため、血漿及び尿中アミノ酸被検物質データを機械学習アプローチによって分析した。ＳＶＭは、調査した４つのアルゴリズムの中で、最も性能の良い方法であった。２分割交差検証から最適化されたアルゴリズムは、以下の通りである：
（ｉ）アルゴリズム−１、血漿タンパク質糖化、酸化、及びニトロ化付加物残基の被検物質から展開。
以下の特徴を有する：ＣＭＬ、３ＤＧ−Ｈ、ＣＭＡ、及びＤＴ；分類精度は８８％であった；感度は９２％；特異度は８４％；ＡＵＲＯＣは０．９４。無作為の結果は０．５０である。
（ｉｉ）アルゴリズム−２、血漿糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸と、従来のアミノ酸メタボロームから展開。
以下の特徴を有する：ＣＭＬ及びＣＭＡ；分類精度は７５％であった；感度は８１％；特異度は６７％；ＡＵＲＯＣは０．８０。
（ｉｉｉ）アルゴリズム−３、血漿タンパク質糖化、酸化、及びニトロ化付加物残基と、血漿糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸並びに従来のアミノ酸メタボロームとの組合せから展開。
以下の特徴を有する：血漿タンパク質ＣＭＬ、３ＤＧ−Ｈ、ＣＭＡ、及びＤＴ残基、並びに、血漿Ｇ−Ｈ１及びＧＳＡ遊離付加物；分類精度は８９％であった。感度は９０％；特異度は８７％；ＡＵＲＯＣは０．９５。
（ｉｖ）アルゴリズム−４、尿中糖化、酸化、及びニトロ化アミノ酸から展開。
以下の特徴を有する：ＧＳＡ及びピラリン遊離付加物；分類精度は７７％であった；感度は７７％；特異度は７６％；ＡＵＲＯＣは０．７９（図１３、図１４、及び図２２）。
【０２０７】
臨床症状によってＡＳＤであると診断された各患者について、診断アルゴリズムを用いてＡＳＤである確率を推定した（図３）。これらの確率と臨床的特徴との関連及び相関について探求した。これらの確率と臨床的特徴（年齢、ＡＤＯＳ、合計ＣＡＲＳ、ＣＡＲＳ多動性及びＣＡＲＳ身体使用スコア、自閉症重症度、認知／発達障害、及びＡＳＤ発症パターン）との有意な関連又は相関は認められなかった。
【０２０８】
理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らの発見は、ＡＳＤにおける糖化最終産物（ＡＧＥ）のジカルボニル前駆体の代謝障害及びデュアルオキシダーゼ（ＤＵＯＸ）の活性化を暗示している。本明細書に示す最初の証拠は、血漿タンパク質ＡＧＥとジチロシン（ＤＴ）の濃度の組合せの検出が、ＡＳＤの診断に最適な血液ベースの試験を提供し得ることを指し示す。アルギニンとＣＭＡの腎クリアランスの減少は、ＡＳＤ発症の要因としてのニューロンのアミノ酸の可用性の証拠の増加を踏まえ、ＡＳＤにおけるアミノ酸輸送体の機能障害に関連していることが提案される。
【０２０９】
上記の説明で言及した出版物は全て、参照することにより本明細書に組み込まれる。記載した本発明の方法及びシステムの様々な改変及び変形は、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施の形態に関連して本発明を説明してきたが、当然ながら、請求される本発明は、そうした特定の実施の形態に過度に限定すべきではない。実際、生化学及び生命工学又は関連する分野の当業者にとっては明らかな、記載した本発明を実施するための形態の様々な改変は、下記の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【図１Ａ】
2021513058.tif 000004
【図１Ｂ】
2021513058.tif 000005
【図１Ｃ】
2021513058.tif 000006
【図１Ｄ】
2021513058.tif 000007
【図２】
2021513058.tif 000008
【図３−１】
2021513058.tif 000009
【図３−２】
2021513058.tif 000010
【図３−３】
2021513058.tif 000011
【図４】
2021513058.tif 000012
【図５】
2021513058.tif 000013
【図６】
2021513058.tif 000014
【図７】
2021513058.tif 000015
【図８】
2021513058.tif 000016
【図９】
2021513058.tif 000017
【図１０】
2021513058.tif 000018
【図１１】
2021513058.tif 000019
【図１２Ａ】
2021513058.tif 000020
【図１２Ｂ】
2021513058.tif 000021
【図１２Ｃ】
2021513058.tif 000022
【図１２Ｄ】
2021513058.tif 000023
【図１３】
2021513058.tif 000024
【図１４】
2021513058.tif 000025
【図１５】
2021513058.tif 000026
【図１６−１】
2021513058.tif 000027
【図１６−２】
2021513058.tif 000028
【図１６−３】
2021513058.tif 000029
【図１６−４】
2021513058.tif 000030
【図１７】
2021513058.tif 000031
【図１８】
2021513058.tif 000032
【図１９】
2021513058.tif 000033
【図２０】
2021513058.tif 000034
【図２１】
2021513058.tif 000035
【図２２】
2021513058.tif 000036
【国際調査報告】
2021513058.tif 000037
2021513058.tif 000038
2021513058.tif 000039
2021513058.tif 000040
2021513058.tif 000041