(57)【要約】タンパク質のサブドメインレベルで、二量体化インターフェースを特徴解析するシステムおよび方法が提供される。方法例は、タンパク質二量体サンプルをサブドメインへと消化する工程と、消化されたタンパク質サンプルを標識する工程と、標識された二量体サブドメイン断片および単量体サブドメイン断片を単離する工程と、標識されたサンプルにペプチドマッピングを行い、二量体断片が標識された部位、および二量体断片が標識されていない部位を決定する工程と、を含む。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。【選択図】図１
2021512300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質医薬中の非共有結合性相互作用部位または二量体化インターフェースを特定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
ネイティブ条件下でタンパク質医薬の制限消化を行い、単量体と非共有結合性二量体とを含有するタンパク質医薬二量体サンプル混合物を形成させる、工程；
前記タンパク質医薬二量体サンプル混合物の前記二量体および前記単量体に、検出可能な修飾を導入して、修飾二量体および修飾単量体を生成する、工程；
ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーを使用して前記修飾二量体および前記修飾単量体を、修飾二量体分画および修飾単量体分画へと分離させる、工程；
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画を消化して、ペプチドサンプルを形成させる、工程；
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用して前記ペプチドサンプルを分離させ、前記ペプチドサンプルの質量分析データを取得する、工程；および
前記タンパク質医薬の各ペプチドおよび修飾ペプチドの質量を算出することにより、前記タンパク質医薬の公知の質量データと比較された前記ペプチドの前記質量分析データを使用して、前記ペプチドサンプル中の各ペプチドの修飾部位を決定する、工程。
【請求項２】
ネイティブ制限消化条件が、ポリペプチド間のジスルフィド結合、および二量体間の非共有結合性相互作用を保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二量体および前記単量体が、迅速光化学酸化により修飾されて、前記二量体および前記単量体内に検出可能な酸化修飾を形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質医薬が、抗体もしくはその抗原結合断片、組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記二量体が本質的に２つの相互作用するＦ（ａｂ’）断片またはＦ（ａｂ）断片からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記単量体が本質的にＦ（ａｂ）断片およびＦｃ断片からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾が、アミノ酸側鎖の修飾である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、モノクローナル抗体、二特異性抗体、またはその抗原結合断片である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーが、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムを含有する移動相を使用して実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記消化されたタンパク質サンプルが、逆相液体クロマトグラフィーを用いて分離される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾が、酸化、二酸化、三酸化、キヌレニン、ジチオメチル、脱炭酸、ヒドロキシキヌレニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質医薬が、酵素で消化される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素が、パパイン、フィカイン、エンドプロテアーゼのＬｙｓ−ＣおよびＩｄｅＳ、またはそれらの改変型からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画が、２つの連続アミノ酸残基を結合させる共有結合性化学結合を切断してペプチドを形成させる酵素により消化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質医薬サンプルが、流加培養、精製プロセスステップ、または製剤化原薬からのサンプルである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
前記抗体を産生する細胞を、前記抗体を産生するのに適した条件下で細胞培養において培養する、工程；
前記抗体を、前記抗体を抽出するのに適した条件下で精製する、工程；
前記抗体と賦形剤を、前記抗体を安定化するのに適した条件下で混合する、工程；
（ｉ）前記細胞培養から、（ｉｉ）前記細胞培養から前記抗体を精製した後に、または（ｉｉｉ）前記精製された抗体に賦形剤を添加した後に、前記抗体のサンプルを取得する、工程；
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法に従い、前記抗体の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程；および
１つもしくは複数の細胞培養、精製、または賦形剤の条件を変更して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させる、工程。
【請求項１７】
二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させるために変更される前記１つまたは複数の条件が、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、溶存酸素、金属イオン、ガス分圧、アフィニティマトリクス、クロマトグラフィー樹脂、緩衝剤、界面活性剤、安定剤またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎細胞（例えばＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ  ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ  ８０６５細胞、ＨＬ−６０細胞、リンパ球細胞、例えば自己Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ−０細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法により作製される抗体。
【請求項２１】
改変抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法を使用して、前記抗体中の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程；および
前記二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位のアミノ酸を改変して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用を減少させる、工程。
【請求項２２】
請求項２１に記載の改変抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項２１または２２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６２５，７３２号明細書、および２０１８年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／７３８，０５１号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、両出願はその全体で参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、タンパク質およびその断片中の非共有結合性相互作用を特徴解析するための分析的方法およびシステムを目的とする。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
過去２０年にわたり、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を採用して広範な治療領域を標的とすることに成功している（Ｗａｌｓｈ  Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２：９９２−１０００（非特許文献１）；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７；２５：３８０−２（非特許文献２））。タンパク質凝集は、モノクローナル抗体および他の治療用タンパク質の製造において未だ主要な懸念点である。有効性と免疫原性に影響を与える可能性があるために、凝集メカニズムを理解し、適切な制御戦略を実装して製品の質を保証できるようにすることが重要である。
【０００４】
ｍＡｂ分子中の二量体化インターフェースのマッピングは、ｍＡｂ二量体のその複雑性と不均一性のために未だ困難な課題である。水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ  ＭＳ：ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により、タンパク質−タンパク質の相互作用の解明には成功しているが、ｍＡｂ二量体化インターフェースの解明にはほとんど至っておらず、恐らくこれはタンパク質側鎖の相互作用を検出する方法に限界があるためと思われる。
【０００５】
ゆえに本発明の目的は、タンパク質の不均一な二量体化インターフェースをマッピングするためのシステムおよび方法を提供することである。
【０００６】
本発明のもう１つの目的は、二量体化レベルが減少したタンパク質医薬を提供することである。
【０００７】
本発明のさらにもう１つの目的は、二量体化が減少したタンパク質医薬を製造する方法を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗａｌｓｈ  Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２：９９２−１０００
【非特許文献２】Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７；２５：３８０−２
【発明の概要】
【０００９】
タンパク質のペプチド／残基のレベルで、タンパク質二量体化インターフェースを特徴解析するシステムおよび方法が提供される。方法の例としては、タンパク質二量体サンプルをサブドメインへと消化する工程と、消化されたタンパク質サンプル混合物を標識する工程と、標識された二量体サブドメイン断片および単量体サブドメイン断片を単離する工程と、標識されたサンプルにペプチドマッピングを行い、二量体中、および単量体中の標識度を決定および比較する工程と、を含む。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
【００１０】
１つの実施形態では、非共有結合性二量体が単離され、ペプチドマッピングにより分析されて、非共有結合性相互作用部位の場所が決定される。ペプチド／残基レベルで、非共有結合性二量体化インターフェースの場所を決定する別の実施形態では、富化ｍＡｂ二量体サンプルが、Ｆ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］ホモ二量体、Ｆ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］単量体、およびＦｃの単量体の混合物へと消化され、標識実験が行われる。次いで分別、トリプシン消化、およびＬＣ−ＭＳ分析が行われて、ペプチド／残基レベルでの標識度の定量と比較が行われた。本開示方法の工程の詳細は以下に提示される。
【００１１】
さらに別の実施形態は、抗体を作製する方法を提供するものであり、当該方法は、細胞培養において当該抗体を産生する細胞を培養する工程、当該細胞培養からサンプルを取得する工程、当該抗体サンプル中の二量体化インターフェースを上記の方法に従い特徴解析する工程、および当該細胞培養の１つまたは複数の培養条件を変更して、細胞培養中に産生される抗体の二量体化または非共有結合性相互作用／凝集の量を減少させる工程、を含む。一部の実施形態では、当該サンプルは、任意の間隔で細胞培養中に採取される。他の実施形態では、当該サンプルは、産生培養の後、タンパク質回収の後、または精製の後に採取される。二量体化または凝集の量を減少させるために変更される細胞培養の１つまたは複数の条件は、温度、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、ガス分圧、界面活性剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。細胞は、真核生物または原核生物であってもよい。細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、またはＶｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎細胞（例えばＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ  ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ  ８０６５細胞、ＨＬ−６０細胞、リンパ球細胞、例えば自己Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ−０細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株であってもよい。１つの実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である。
【００１２】
さらに別の実施形態は、抗体を作製する方法を提供するものであり、当該方法は、細胞培養において当該抗体を産生する細胞を培養する工程、次いで抗体を精製および製剤化して、製剤化原薬（ＦＤＳ：ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を取得する工程、抗体を製剤化する前および／または後に精製抗体のサンプルを取得する工程、当該抗体サンプル中またはＦＤＳサンプル中の二量体化インターフェースを上記の方法に従い特徴解析する工程、および当該抗体の精製もしくは製剤化の１つまたは複数の条件を変更して、細胞培養中に産生される抗体の二量体化または非共有結合性相互作用／凝集の量を減少させる工程、を含む。二量体化または凝集の量を減少させるために変更される抗体精製の１つまたは複数の条件は、温度、ｐＨ、アフィニティマトリクス、クロマトグラフィー樹脂、緩衝剤、フィルターまたはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。二量体化または凝集の量を減少させるために変更される抗体製剤化の１つまたは複数の条件は、ｐＨ、抗体濃度、賦形剤濃度、緩衝剤、界面活性剤、安定剤、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。ＦＤＳの１つまたは複数の賦形剤を変更して、二量体化または凝集の量を減少させてもよく、および当分野に公知の賦形剤のいずれかから選択される。
【００１３】
さらに別の実施形態は、本明細書に記載の方法により作製された抗体を提供するものである。
【００１４】
非改変のタンパク質医薬品と比較して、二量体化または非共有結合性相互作用が減少した改変タンパク質医薬品を提供するための方法も提供される。１つの実施形態では、タンパク質医薬は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ｍＡｂ二量体化インターフェースマッピングのための制限消化およびシングル標識戦略の例のワークフロー図である。
【図２】指定される鎖／残基に対するグリシンエチルエステル塩酸塩（ＧＥＥ：ｇｌｙｃｉｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃｈｏｌｏｒｉｄｅ）（単量体−二量体）の百分率グラフであり、富化ＨＭＷサンプルの制限Ｌｙｓ−Ｃ消化から生成されたｍＡｂ−１  Ｆａｂ二量体とＦａｂ単量体の間の差次的なＧＥＥ標識チャートを示す。
【図３】図３Ａは、ｍＡｂ−１の指定される抗体断片に対する、ペプチドレベルでのＧＥＥ百分率の棒グラフである。図３Ｂは、ｍＡｂ−２の指定される抗体断片に対する、アミノ酸残基レベルでのＧＥＥ百分率の棒グラフである。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、制限ＬｙｓＣ消化されたｍＡｂ１  ＨＭＷサンプルに対する、酸化種のポアソン適合を示す散布図である。図４ＡはＦｃ領域を示し、図４ＢはＬＣ領域を示し、そして図４ＣはＦｄ領域を示す。線は、各グラフに対するポアソン適合を示す。
【図５Ａ】ｍＡｂ−１の指定される断片に対する、ペプチドレベルでのＦＰＯＰ修飾度の棒グラフである。
【図５Ｂ】ｍＡｂ−１の指定される断片に対する、残基レベルでのＦＰＯＰ修飾度の棒グラフである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、様々な焦点位置およびレーザー出力条件でのリゾチームタンパク質の酸化種に対するポアソン適合を示す散布図である。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、様々な濃度のスカベンジャー（５００μＭ、３５０μＭ、または２００μＭ  Ｈｉｓ）および様々なレーザー出力設定（９７ｍＪまたは１５６ｍＪ）でのリゾチームタンパク質の酸化種に関するポアソン適合を示す散布図である。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、様々な濃度のスカベンジャー（５００μＭまたは２００μＭ  Ｈｉｓ）および様々なタンパク質濃度（１ｍｇ／ｍＬまたは０．１ｍｇ／ｍＬ）でのリゾチームタンパク質の酸化種に関するポアソン適合を示す散布図である。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ｍＡｂ１（図９Ａ）または脱グリコシル化ｍＡｂ１（図９Ｂ）に関する、酸化種のポアソン適合を示す散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書に別段の示唆がない限り、または文脈から相反することが明白でないかぎり、本明細書において請求される本発明を記載する文脈（特に請求の範囲の文脈）において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および類似の指示対象の用語の使用は、単数および複数の両方を包含するとみなされる。
【００１７】
本明細書において別段の示唆が無い限り、本明細書において値の範囲の列挙は単に、当該範囲内にある別個の値のそれぞれを個々に言及するための簡潔表現法としての機能を果たすことが意図されており、個々の値のそれぞれが、それらが個々に本明細書において列挙されているように本明細書内に組み込まれる。
【００１８】
「約」という用語の使用は、記述される値のおよそ±１０％の範囲で上回る、または下回る値を記述することが意図されている。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±５％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±２％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±１％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。先行する範囲は、文脈で明白となることが意図されており、さらなる限定は示唆されない。本明細書において別段の示唆が無い限り、または文脈から相反することが明白でない限り、本明細書に記載のすべての方法は、任意の適切な順序で実施されることができる。本明細書に提示される任意の、およびすべての例の使用、または例示的文言（例えば）は単に本発明をより詳細に解説することが意図されており、別段であることが請求されない限り、本発明範囲に対して限定を与えるものではない。本明細書において、請求されていない要素を、本発明の実施に必須の要素であると示唆すると解釈されるべき文言はない。
【００１９】
「タンパク質」とは、ペプチド結合によって相互に結合された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質にはポリペプチドとペプチドが含まれ、さらに例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化などの改変も含まれ得る。タンパク質は、タンパク質系薬剤を含む科学的または商業的な対象のタンパク質であってもよく、特に酵素、リガンド、受容体、抗体およびキメラタンパク質または融合タンパク質を含む。タンパク質は公知の細胞培養法を使用して様々なタイプの組み換え細胞により産生される。一般的に、遺伝子操作ヌクレオチドベクターのトランスフェクションにより細胞内に導入され（例えばキメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロンレス配列など）、そこで当該ベクターはエピソームとして存在し、または当該細胞のゲノム内に統合され得る。
【００２０】
「抗体」とは、四つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）と重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域とＶＬ領域はさらにフレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられたより保存的な領域と、その間に配置された相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性の領域に分けられ得る。ＶＨとＶＬはそれぞれ３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各ＶＨ／ＣＨ１鎖とＶＬ／ＣＬ鎖が（例えばジスルフィド架橋により）会合してペア、すなわちそのＮ末端に抗原結合部位を有するＦ（ａｂ）を形成する。ゆえに制限酵素消化の後のＦ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］断片は、抗原に結合することができるが、一価であり、Ｆｃ部分を有さない抗体断片である。通常、抗体は抗原結合に関して二価であり、Ｆ（ａｂ’）２と呼称される２つのＦ（ａｂ）部分を含み、上部ヒンジにおいてジスルフィド架橋により互いに連結される。Ｆ（ａｂ’）２断片は全抗体の制限消化により生成され、Ｆｃ領域の大部分が除去されているが、ヒンジ領域の一部は損なわれずに残されており、そしてＦ（ａｂ’）断片へとさらに削減され得る。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化された免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの組換え手段によって調製される、発現される、生成される、または単離される抗体分子を含む。抗体という用語はさらに、複数の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む、二特異性抗体も含む。二価抗体の構造は、異なる抗原に対する各抗原結合部位の特異性に関し、二特異性であってもよい。二特異性抗体は米国特許出願公開２０１０／０３３１５２７に概要が記載されており、当該特許出願は本明細書に参照により援用される。
【００２１】
「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部またはすべてを含み、そのうちの１つは免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、他方は自然界では一緒には存在しないものである。抗体に由来するポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，１９９０；ａｎｄ  Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ  １０．１９．１−１０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合された受容体の細胞外ドメインを１つまたは複数含み、一部の実施形態では、ヒンジ領域の後に免疫グロブリンのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つまたは複数のリガンドに結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含有する。例えばＦｃ融合タンパク質は、ＩＬ−１トラップまたはＶＥＧＦトラップなどのトラップである。
【００２２】
「細胞培養」とは、例えばフラスコまたはバイオリアクターなどの容器中での細胞の拡張または増殖を指し、限定されないが、流加培養、連続培養、灌流培養などを含む。
【００２３】
「ＭＳ／ＭＳ」という用語は、２つの質量分析計をタンデムに使用する質量分析技術を指す。２つの分析計（ＭＳ１とＭＳ２）の間には、衝突ガスセルがある。ＭＳ１により選択された前駆イオンは、セル中で高圧ガス（通常、Ｈｅ）と衝突して断片化を受ける。
【００２４】
「ＬＣ−ＭＳ」という用語は、液体クロマトグラフィー−質量分析計を指し、液体クロマトグラフィー（またはＨＰＬＣ）の物理的な分離能力と、質量分析計（ＭＳ）の質量分析能力を組み合わせた分析化学技術である。
【００２５】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸を、類似した性質を有する別のアミノ酸で置き換えることを指す。このタイプの置換は、対応するタンパク質の機能障害を滅多に起こさないと予測される。
【００２６】
ＩＩ．タンパク質医薬
１つの実施形態は、タンパク質医薬の二量体化または非共有結合性相互作用を減少させるために改変されたタンパク質医薬を提供する。そうした改変は、保存的アミノ酸置換であり得る。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸は、類似した性質を有する別のアミノ酸へと交換される。このタイプの置換は、対応するタンパク質の機能障害を滅多に起こさないと予測される。
【００２７】
Ａ．対象タンパク質
１つの実施形態では、タンパク質医薬は、原核細胞または真核細胞での発現に適した、１つまたは複数の対象タンパク質を含有してもよい。例えば対象タンパク質としては、限定されないが、抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体もしくはその抗原結合断片、ＳｃＦｖもしくはその断片、Ｆｃ融合タンパク質もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片が挙げられる。対象タンパク質は、単一のサブユニットからなる単一ポリペプチドであってもよく、または２つ以上のサブユニットを含む複合的なマルチサブユニットタンパク質であってもよい。対象タンパク質は、バイオ医薬、食品添加物もしくは保存剤、または精製および品質標準に供される任意のタンパク質製品であってもよい。
【００２８】
一部の実施形態では、タンパク質製品（対象タンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、二特異性抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディもしくはテトラボディ、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ：ｄｕａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）と名付けられる二重特異性の四価免疫グロブリンＧ様分子、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。１つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。１つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。１つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。別の実施形態では、抗体は、キメラヒンジを含有する。さらに他の実施形態では、抗体は、キメラＦｃを含有する。１つの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。１つの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。１つの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
【００２９】
一部の実施形態では、抗体は、抗Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  １抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１に記載される抗ＰＤ１抗体）、抗Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン−２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載される抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載される抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載される抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載される抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体Ｃ５抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３１３１９４Ａ１に記載される抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗表皮成長因子受容体抗体（例えば米国特許第９，１３２，１９２号に記載される抗ＥＧＦＲ抗体、または米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２５９４２３Ａ１に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｋｅｘｉｎ−９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００４４７３０Ａ１に記載される抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号または第９，２６０，５１５号に記載される抗ＧＤＦ８抗体。抗ミオスタチン抗体としても知られる）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３３７０４５Ａ１またはＵＳ２０１６／００７５７７８Ａ１に記載される抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは第８，９４５，５５９号に記載される抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、第８，０４３，６１７号または第９，１７３，８８０号に記載される抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２７１６５８Ａ１またはＵＳ２０１４／０２７１６４２Ａ１に記載される抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２７１６５３Ａ１に記載される抗ＲＳＶ抗体）、抗Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１、ならびに米国特許出願６２／２２２，６０５に記載される抗ＣＤ３抗体）、抗Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載される抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載される抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ  ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載される）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３３７０２９Ａ１に記載される抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１６／０２１５０４０に記載される）、抗ジカウイルス抗体、抗Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  ３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１６／００１７０２９ならびに米国特許第８，３０９，０８８号および第９，３５３，１７６号に記載される抗NGF抗体）、および抗Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、二特異性抗体は、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二特異性抗体（米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１に記載される）、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃｉｎ  １６二特異性抗体（たとえば抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃ１６二特異性抗体）、および抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二特異性抗体（たとえば抗ＣＤ３ｘ抗ＰＳＭＡ二特異性抗体）からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象タンパク質は、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アダリムマブ−ａｔｔｏ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ−ａｔｔｏ）、ａｄｏ−トラスツズマブ（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アリロクマブ（ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブ  ベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブロダルマブ（ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カプロマブ  ペンデチド（ｃａｐｒｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セルトリズマブ  ペゴル（ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、デュピリマブ（ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、エクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ−ｋｘｗｈ（ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ−ｋｘｗｈ）、エムタンシンアリロクマブ（ｅｍｔａｎｓｉｎｅａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、（エビナクマブ（ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ファシヌマブ（ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、グセルクマブ（ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、イブリツモマ��  チウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イダルシズマブ（ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、インフリキシマブ−ａｂｄａ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ−ａｂｄａ）、インフリキシマブ−ｄｙｙｂ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ−ｄｙｙｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イキセキズマブ（ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバクマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、オビルトキサキシマブ（ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リヌクマブ（ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、サリルマブ（ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、セクキヌマブ（ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トレボグルマブ（ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、およびベドリズマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）からなる群から選択される。
【００３０】
一部の実施形態では、対象タンパク質は、Ｆｃ部分と別のドメインを含有する組み換えタンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質）である。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、受容体Ｆｃ融合タンパク質であり、Ｆｃ部分に連結された受容体の細胞外ドメインを１つまたは複数含有する。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジ領域、それに続いてＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する。一部の実施形態では、受容体Ｆｃ融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含有する。例えばＦｃ融合タンパク質は、ＴＲＡＰタンパク質であり、例えばＩＬ−１トラップ（例えば、リロナセプト（ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）であり、これはｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩｌ−１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有する；米国特許第６，９２７，００４号を参照のこと。当該特許はその全体で参照により本明細書に援用される）、またはＶＥＧＦトラップ（例えばアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）またはｚｉｖ−アフリベルセプト（ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）であり、これはｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有する；米国特許第７，０８７，４１１号および第７，２７９，１５９号を参照のこと）である。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質であり、これは例えばＦｃ部分に連結された抗体の可変重鎖断片および可変軽鎖断片などの１つまたは複数の抗原結合ドメインのうちの１つまたは複数を含有する。
【００３１】
Ｂ．タンパク質の製造方法
１つの実施形態では、タンパク質医薬は、流加細胞培養で製造される。タンパク質製造において、「流加細胞培養」または「流加培養」とは、細胞と培養培地が最初に培養管に供給され、そして追加の培養栄養素が個別の増分で培養中にゆっくりと培養物に供給される回分培養のことを指す。培養終了前に定期的な細胞および／または産生物の回収を伴う場合と伴わない場合がある。流加培養には「半連続的流加培養」が含まれる。この培養では定期的に全培養物（細胞と培地を含み得る）が除去され、新たな培地で置き換えられる。流加培養は、シンプルな「回分培養」とは区別される。回分培養では、細胞培養のためのすべての構成要素（動物細胞とすべて培養栄養素を含む）が、培養プロセスの開始時に培養管に供給される。標準的な流加培養プロセス中に培養管から上清が除去されない限りにおいては、流加培養は「灌流培養」とは異なり得る。灌流培養では、細胞は例えばろ過により培養物中に残され、培養培地が連続的に、または断続的に導入され、培養管から除去される。しかし検証目的で流加細胞培養中にサンプルが取り出されることは予期される。流加培養プロセスは、最大作動量および／または最大タンパク質産生に達したと決定されるまで継続され、その後、タンパク質が回収される。
【００３２】
１つの実施形態では、連続的細胞培養で製造されるタンパク質医薬を提供する。「連続的細胞培養」という文言は、細胞を連続的に増殖させるために使用される、通常は特に増殖期で使用される技術に関する。例えば細胞の定常供給が必要とされる場合、または特定の対象タンパク質の産生が必要とされる場合、細胞培養は特定の増殖期に維持される必要がある場合がある。ゆえに細胞をその特定の相に維持するためには、その状態は連続的にモニタリングされ、状況に応じて調整されなければならない。
【００３３】
タンパク質医薬の製造に使用される細胞培養には、細胞培養培地が含まれる。「細胞培養培地」および「培養培地」という用語は、哺乳動物細胞の増殖に使用される栄養溶液を指し、典型的には、細胞増殖を強化するために必要な栄養素、例えば炭水化物エネルギー源、必須アミノ酸（例えばフェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リシンおよびヒスチジン）および非必須アミノ酸（例えばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリンおよびチロシン）、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなどを供給する。細胞培養培地は、抽出物、例えば血清またはペプトン（加水分解物）を含有してもよく、それらは細胞増殖をサポートする原材料を供給する。培地は、動物由来の抽出物の代わりに酵母由来抽出物または大豆抽出物を含有してもよい。化学的に規定された培地とは、化学的構成要素がすべて判明している（すなわち公知の化学的構造を有する）細胞培養培地を指す。化学的に規定された培地は、例えば血清由来ペプトンまたは動物由来ペプトンなどの動物に由来する構成要素を完全に含まない。１つの実施形態では、培地は、化学的に規定された培地である。
【００３４】
溶液は、ホルモンおよび成長因子をはじめとする、最小比率を超える増殖および／または生存を強化する構成要素も含有してもよい。培養される特定の細胞の生存と増殖に最適なｐＨと塩濃度に溶液は製剤化されてもよい。
【００３５】
「細胞株」とは、細胞の連続的な継代を介した、または細胞の継代培養を介した特定の系統に由来する細胞を指す。「細胞」という用語は、「細胞群」と相互交換可能に使用される。
【００３６】
「細胞」という用語は、組み換え型核酸配列の発現に好適な任意の細胞を含む。細胞には、原核細胞および真核細胞の細胞、例えば細菌細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、またはハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が含まれる。ある一定の実施形態では、細胞は，ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。他の実施形態では、細胞は、以下の細胞から選択される：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えばＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えばＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、リンパ球、例えばＪｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む。例えば網膜細胞は、ウイルス遺伝子を発現する（例えばＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ  Ｋ１細胞である。
【００３７】
タンパク質を精製する方法は当分野において公知である。細胞培養を行い、タンパク質の回収を行った後、医薬に多数の精製工程を行って不純物を取り除いてもよく、不純物としては細胞培養プロセスと関連した宿主細胞タンパク質、および医薬の異常型が挙げられる。クロマトグラフィーの形態は公知であり、例えば「アフィニティークロマトグラフィー」は、等電点、疎水性、またはサイズといったタンパク質の一般的な性質ではなく、タンパク質間の特異的で可逆的な相互作用を利用して、クロマトグラフィー分離を行うクロマトグラフィー法である。「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー」または「プロテインＡクロマトグラフィー」とは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に対するプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのアフィニティを利用する特異的アフィニティークロマトグラフィー法を指す。このＦｃ部分には、ヒトまたは動物の免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ２およびＣＨ３、またはそれらに実質的に類似している免疫グロブリンドメインが含有される。クロマトグラフィー法または分離方法の他の形態としては、限定されないが、以下が挙げられる：プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、Ｈｉｓタグ化アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換（弱カチオン、弱アニオン、強カチオン、強アニオン）クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー。それぞれの方法には、限定されないが、樹脂の電荷およびサイズ、洗浄条件、ｐＨ、ロード量、ロード濃度などをはじめとする適切条件の最適化が必要である。限外ろ過法および透析ろ過法も、精製プロセスにおいて予期される。
【００３８】
タンパク質を製剤化する方法は当分野において公知である。本発明の医薬には、本発明の抗原結合分子（例えば抗体）を含有する液状医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤、および輸送、送達、忍容性などの改善をもたらす他の剤とともに製剤化される。数多くの適切な製剤が、すべての薬剤師に公知の以下の処方集に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ。例えば賦形剤としては、安定剤、緩衝剤、張性調節剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）、界面活性剤、有機溶媒、塩またはそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、安定剤は、ポリオール、糖、アミノ酸、非イオン性界面活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、張性調節剤は、糖、アミノ酸、塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、医薬品は、当該医薬の液状製剤、または再構成される凍結乾燥製剤である。一部の実施形態では、医薬は、共製剤であり、２種以上の異なる抗体を含有する。
【００３９】
ＩＩＩ．タンパク質中の二量体化インターフェースを特徴解析するための方法
タンパク質の凝集は、モノクローナル抗体の製造において未だ主要な懸念点である。純度、有効性、および免疫原性に影響を与える可能性があるために、凝集メカニズムを理解し、適切な制御戦略を実装して製品の質を保証できるようにすることが重要である。ｍＡｂ分子中の二量体化インターフェースのマッピングは、ｍＡｂ二量体のその複雑性と不均一性のために未だ困難な課題である。水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ  ＭＳ：ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により、タンパク質−タンパク質の相互作用の解明には成功しているが、ｍＡｂ二量体化インターフェースの解明にはほとんど至っておらず、恐らくこれはタンパク質側鎖の相互作用を検出する方法に限界があるためと思われる。
【００４０】
これらの障害を克服するために、包括的なＭＳをベースとした方法により、タンパク質の不均一な二量体化インターフェース（共有結合性と非共有結合性の両方）のマッピングを成功させるための新たな方法とシステムが提供される。二量体化インターフェースのマッピングのための戦略例を、図１に提示する。タンパク質は、抗体、その抗原結合断片、組み換えタンパク質、または融合タンパク質であってもよい。
【００４１】
Ａ．非共有結合性相互作用部位の特徴解析方法
１つの実施形態は、タンパク質のペプチド／残基レベルで二量体化インターフェースを決定する方法を提供するものである。方法の例としては、タンパク質二量体サンプルをサブドメインへと消化する工程と、消化されたタンパク質サンプル混合物を標識する工程と、標識された二量体サブドメイン断片および単量体サブドメイン断片を単離する工程と、標識されたサンプルにペプチドマッピングを行い、二量体中、および単量体中の標識度を決定および比較する工程と、を含む。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
【００４２】
１つの実施形態では、ペプチドが単離され、そしてペプチドマッピングにより分析されて、非共有結合性相互作用部位の場所が決定される。ペプチド／残基レベルで、非共有結合性二量体化インターフェースの場所を決定する別の実施形態では、富化ｍＡｂ二量体サンプルが、Ｆ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］ホモ二量体、Ｆ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］単量体、およびＦｃの単量体の混合物へと消化され、次いで共有結合性標識実験が行われ、そのあとにＳＥＣ−分別、トリプシン消化、およびＬＣ−ＭＳ分析が行われて、ペプチド／残基レベルでの標識度の定量と比較が行われた。ペプチド／残基レベルで、非共有結合性二量体化インターフェースの場所を決定するさらに別の実施形態では、富化ｍＡｂ二量体サンプルが、Ｆ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］ホモ二量体、Ｆ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］単量体、およびＦｃの単量体の混合物へと消化され、次いでシングルＦＰＯＰ（ｆａｓｔ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：タンパク質の迅速光化学的酸化）標識実験が行われ、そのあとにＳＥＣ−分別、トリプシン消化、およびＬＣ−ＭＳ分析が行われて、ペプチド／残基レベルでの標識度の定量と比較が行われた。本開示方法の工程の詳細は以下に提示される。
【００４３】
１．タンパク質二量体の断片化
１つの実施形態では、例えば抗体などのタンパク質医薬は細胞培養から取得され、二量体が富化されて、富化二量体サンプルが提供される。富化二量体サンプルは、限定されないが、液体クロマトグラフィーをはじめとする様々な富化技術を使用して製造され得る。好ましい液体クロマトグラフィー法としては、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。一部の実施形態では、富化二量体サンプルは、二量体以外のいくつかのタンパク質凝集物を含有する。ゆえに富化二量体サンプルは二量体のみで構成される必要はない。１つの実施形態では、富化二量体サンプルは、５０％超の二量体を含有する。
【００４４】
例えばｍＡｂ二量体を形成する非共有結合性相互作用が保存されているタンパク質製品の断片化または消化は、化学的および酵素的な技術を含む、しばしば制限消化と呼ばれる従来技術を使用して実現することができる。１つの実施形態では、ｍＡｂ二量体サンプルは、ネイティブ条件下でプロテアーゼを使用して消化され、例えばＦ（ａｂ）ホモ二量体、Ｆ（ａｂ）単量体およびＦｃ単量体の混合物などの様々なＦａｂ断片およびＦｃ断片を生成する。プロテアーゼの例は、エンドプロテアーゼのＬｙｓＣである。他のプロテアーゼとしてはパパインとフィカイン（ｆｉｃａｉｎ）が挙げられる。１つの実施形態では、ｍＡｂ二量体は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で希釈され、次いでエンドプロテアーゼのＬｙｓ−Ｃ（タンパク質：酵素＝４００：１）とともにインキュベートされてもよい。この制限消化処置により、２つのヒンジ領域ジスルフィド結合に対してＮ末端側にあるＬｙｓ残基で重鎖が特異的に切断され、Ｆａｂ断片とＦｃ断片が生成される。混合物中で、二量体種に由来する任意の非共有結合性の二量体相互作用（最も普遍的なものはＦ（ａｂ）−Ｆ（ａｂ））が維持される。
【００４５】
別の実施形態では、ｍＡｂ二量体サンプルは、ネイティブ条件下で、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）という名称で販売されているＩｄｅＳプロテアーゼで、Ｆ（ａｂ’）２と、Ｆｃ＊断片（すなわち非共有結合性相互作用により相互作用する２つのＦｃポリペプチド。本明細書においてＦｃ単量体と呼称される）とに消化される。ｍＡｂ二量体は最初に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で希釈され、次いでＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）（タンパク質１μｇ当たり１ＩＵＢミリ単位）で消化されてもよい。この制限消化処置は、２つのヒンジ領域ジスルフィド結合に対してＣ末端側の部位の２つのＧｌｙ残基の間で特異的に切断する。この処置によって、１つのＦ（ａｂ’）２断片と、非共有結合性相互作用を介して相互に結合する２つの同一のＦｃ／２断片（Ｆｃ＊）が生じる。次いで消化混合物を還元剤とともにインキュベートして、鎖間ジスルフィド結合を還元しながら、鎖内ジスルフィド結合は損なわずに維持してもよい。結果として、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つのＦ（ａｂ’）断片へと還元され、ＦｄとＬＣは非共有結合性相互作用を介して相互に結合する。混合物中で、二量体種に由来する非共有結合性の二量体相互作用（最も普遍的なものはＦ（ａｂ’）−Ｆ（ａｂ’））もまた維持される。
【００４６】
使用され得る還元剤の例としては、限定されないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＣＡＳ  ３４８３−１２−３）、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ、２ＢＭＥ、２−ＭＥ、ｂ−ｍｅｒ、ＣＡＳ  ６０−２４−２）、２−アミノエタンチオール（２−ＭＥＡ−ＨＣｌ、システアミン−ＨＣｌとも呼ばれる、ＣＡＳ  １５６−５７−０）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、ＣＡＳ  ５９６１−８５−３）、塩酸システイン（Ｃｙｓ−ＨＣｌ、ＣＡＳ  ５２−８９−１）、または２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）が挙げられる。タンパク質結合を還元する他の方法も当分野に公知であり、例えば固定化還元カラムが挙げられ、このカラムはチオール系還元剤が固定化された樹脂を含有しており、ペプチドおよびタンパク質のジスルフィド結合の固相還元が可能である。ポリペプチド間の化学的相互作用の減少に適した酸化剤を含む還元剤も予期される。
【００４７】
２．タンパク質断片の標識
ｉ．カルボキシル基の標識
１つの実施形態では、消化されたｍＡｂサンプルは、カルボキシル基標識を使用して標識される。カルボキシル基のフットプリンティングは、タンパク質の立体構造、および相互作用の研究に普遍的に使用されている共有結合標識技術であり、Ａｓｐ残基およびＧｌｕ残基の側鎖を、グリシンエチルエステル塩酸塩（ＧＥＥ：ｇｌｙｃｉｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）で標識する。ＧＥＥ標識反応において、タンパク質の表面に配置されたＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基のカルボキシル基は容易に修飾される一方で、タンパク質構造の内部に埋もれた場合にはほとんど、または全く修飾を受けない。１つの実施形態では、消化サンプルを０．２Ｍの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および２ＭのＧＥＥと混合し、１時間室温でインキュベートしてもよい。ＧＥＥ標識反応は、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を添加することでクエンチされ得る。１つの実施形態では、その後、サンプル溶液を濃縮してもよい。サンプルを濃縮する方法は当分野に公知である。例示的な方法としては、限定されないが、膜透析、沈殿または塩析、セルロース膜濃縮装置、および遠心分離が挙げられる。好ましい実施形態では、サンプルは例えばＵｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ遠心フィルターを使用した遠心分離により濃縮される。
【００４８】
ｉｉ．タンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ：ｆａｓｔ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）
１つの実施形態では、消化されたｍＡｂサンプルは、ＦＰＯＰを使用して標識される。ＦＰＯＰは、確立されたヒドロキシルラジカル標識法であり、マイクロ秒の時間スケールでタンパク質をアミノ酸残基の側鎖で標識し、タンパク質−タンパク質／リガンドの相互作用の研究に広く適用されている。１つの実施形態では、ｍＡｂ断片と非共有結合断片二量体を含有する消化されたｍＡｂ二量体は、例えばＰＢＳ（ｐＨ７．４）などの適切な緩衝液へと緩衝液交換される。クエンチ剤は素早くＯＨラジカルと反応し、そして標識中には回避されなければならないため、緩衝液交換が必要な場合がある。普遍的なクエンチ剤としては、限定されないが、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌなどの特定の緩衝溶液、ならびにグリセロールおよびＤＴＴなどの化学物質が挙げられる。
【００４９】
・ＯＨ標識は、タンパク質の天然立体構造に対して立体構造変化をもたらす場合がある。１つの実施形態では、スカベンジャーを使用してＯＨラジカルの持続時間を制御してもよく、それによりタンパク質は過度に標識されず、立体構造変化を受けた過剰標識タンパク質ではなく、天然立体構造が確実に捕捉されるようになる。使用され得るスカベンジャーの例としては、限定されないが、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ＴｈｒおよびＬｙｓが挙げられる。好ましい実施形態では、スカベンジャーは、Ｈｉｓである。緩衝液交換された混合物は、ＰＢＳおよび濃縮スカベンジャー溶液およびＨ２Ｏ２ストック溶液と最初に混合されてもよい。Ｈｉｓは、２００〜５００μＭの濃度で添加されてもよい。Ｈｉｓ濃度は、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５または５００μＭであってもよい。例示的混合物は、１ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ消化混合物、３５０μＭのＨｉｓおよび２０ｍＭのＨ２Ｏ２を含有して、１００μＬの最終溶液を生成する。１つの実施形態では、Ｈ２Ｏ２は、ＦＰＯＰ用の管への溶液の注入の直前に添加されてもよい。
【００５０】
タンパク質の酸化標識は、ポアソン分布による、非修飾、＋１６Ｄａ種、＋３２Ｄａ種、および＋４８Ｄａ種の強度のモデリングによりモニタリングされてもよい。酸素付加状態の分布値は、ポアソン分布に対する適合度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）に関して検証されてもよい。１つの実施形態では、予測ポアソン分布に適合しないデータは、タンパク質の過剰標識を示唆する。あるいは、データがポアソンモデルに適合する場合、タンパク質の過剰標識を伴わずに、充分な標識がなされている。
【００５１】
１つの実施形態では、サンプルは、１００μＬの気密シリンジにロードされ、１５０μｍ内径の石英シリカ管に連結されたシリンジポンプを介して導入されてもよい。管は、レーザービームに面する中心に透明な窓を有してもよい。レーザーは、例えばＫｒＦエキシマレーザーなどのエキシマレーザーであってもよい。任意の市販のエキシマレーザー、例えばＣＯＭＰｅｘ  ５０レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｉｎｃ．）を使用してもよい。ＫｒＦエキシマレーザーの出力は、約１００〜１５０ｍＪ／パルスであってもよい。好ましい実施形態では、レーザーの出力は、約１００〜１２０ｍＪ／パルスであってもよい。レーザーのパルス周波数は、６Ｈｚで設定されてもよい。サンプル管の透明窓でのレーザービームの幅は、約１．５ｍｍ〜３．０ｍｍであってもよい。レーザーの幅は、１．５ｍｍ、１．７５ｍｍ、２ｍｍ、２．２５ｍｍ、２．５ｍｍ、２．７５ｍｍまたは３ｍｍであってもよい。レーザーの出力は、経時的に変動してもよい。ゆえに１つの実施形態では、標識の一貫性を最大化するために、同じ設定の標識実験を同じ日に実施してもよい。別の実施形態では、実行ごとの標識効率の変動をモニタリングするために線量計を加えてもよい。
【００５２】
パルスレーザーをオンにした後、サンプル溶液を、例えば２３．８６μＬ／分の流速で管に注入してもよい。流速は、管内径、レーザー周波数、および測定されるレーザービームの幅に従い調整されてもよい。流速は、・ＯＨ曝露と反応の反復を回避するために、２０％の排泄量が適切に確保されなければならない。１つの実施形態では、キャピラリーのアウトフローは、残留Ｈ２Ｏ２を還元させる溶液を含有するバイアルへと集められてもよい。残留Ｈ２Ｏ２の還元は、還元剤、抗酸化剤、またはそれらの組み合わせを使用して実施されてもよい。非酵素的抗酸化剤の例としては、限定されないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、カロテン、タウリン、ヒポタウリン、グルタチオン、セレニウム、亜鉛、メチオニン、およびユビキノンが挙げられる。酵素的抗酸化剤としては、限定されないが、ＳＯＤ、カタラーゼ、グルタレドキシン、およびグルタチオンレダクターゼが挙げられる。好ましい実施形態では、残留Ｈ２Ｏ２を還元する溶液は、メチオニンとカタラーゼを含有する。標識されたサンプルのアウトフロー溶液は、例えばＵｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ遠心フィルターを使用した遠心分離により濃縮されてもよい。
【００５３】
ｉｉｉ．標識されたｍＡｂ断片の二量体および単量体の単離
１つの実施形態では、共有結合標識されたサンプル混合物は、例えばＢＥＨ（登録商標）ＳＥＣカラムなどのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して分離されてもよい。ＳＥＣ分離およびＵＶ検出（２８０ｎｍ）の後、二量体断片と単量体断片が収集されトリプシンペプチドマッピング分析が行われてもよい
【００５４】
本開示方法は、本明細書に提示される分別（制限消化）および標識の工程の任意の特定の順序に限定されないことを理解されたい。
【００５５】
ｉｖ．標識された二量体断片のペプチドマッピング
１つの実施形態では、二量体分画と単量体分画に、トリプシンペプチドマッピングが行われてもよい。トリプシンペプチドマッピングの方法は当分野に公知である。１つの実施形態では、二量体分画と単量体分画は、例えばＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥され、８Ｍの尿素、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する溶液中で再構成され、その後にトリプシンペプチドマッピングが行われる。変性され、還元されたサンプルは、暗室において３０分間、１０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ：ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）でアルキル化されてもよい。次いでサンプル溶液は、尿素濃度を下げるために０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈され、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素：基質の比率で一晩、３７℃でトリプシン消化されてもよい。消化は、１０％のギ酸（ＦＡ：ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ）を各消化タンパク質サンプルに添加することで停止され得る。次いで逆相ＵＰＬＣでサンプルが分離され、その後にオンライン質量分析が為されて、ペプチドの質量が決定され、ペプチドのアイデンティティが確認されてもよい。１つの実施形態では、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ実験は、ＭＳ／ＭＳ実験中のペプチド断片化に採用される高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ：ｈｉｇｈｅｒ−ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＭＳシステム上で実施される。
【００５６】
ｖ．二量体化インターフェースの特定と特徴解析
カルボン酸基標識に関する１つの実施形態では、ＧＥＥ標識トリプシンペプチドの特定のために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータは、例えばＢＹＯＮＩＣ（商標）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｒｉｃｓ社）などのソフトウェアを利用して、Ａｓｐ残基とＧｌｕ残基に限定したＧＥＥ１（＋８５．０５２２）およびＧＥＥ２（＋５７．０２０９）の可変修飾を伴う対応ｍＡｂタンパク質配列を含有するデータベースまたはサーチエンジンに対して検索される。Ａｓｐ／Ｇｌｕ残基を含有する各トリプシンペプチド上のＧＥＥ標識度を定量するために、ＧＥＥ標識ペプチドと天然ペプチドの両方の最初のアイソトープピークのｍ／ｚに基づき、抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ：ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）を作成し、抽出ピーク面積を積分する。各ＧＥＥ標識ペプチドの百分率は、対応するＥＩＣピーク面積を使用し、標識ペプチドと天然ペプチドのピーク面積の総計と比較して算出される。トリプシンペプチドが複数のＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基を含有する場合には、異なる保持時間で溶出するＧＥＥ標識ペプチドを最初にＭＳ／ＭＳスペクトルに対して検証して標識部位を確認し、その後に対応するＥＩＣピーク面積を使用して、部位特異的な標識百分率を算出する。最後に、各トリプシンペプチドまたは残基に関して、ＧＥＥ標識度を二量体分画と単量体分画の間で比較する。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
【００５７】
ＦＰＯＰ標識の１つの実施形態では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータは、すべて公知の酸化標識産物を含む対応ｍＡｂタンパク質配列を含有するデータベースに対して最初に検索され（表１）、すべての標識産物／ペプチドが特定される。ペプチド上の修飾部位は、ＭＳ／ＭＳ情報に基づき特定され、精密なｍ／ｚにより確認される。特定ペプチドに対する修飾度は、以下のように算出された：
2021512300.tif 000003
式中、Ｉｏｘは、修飾ペプチドの強度であり（Ｍｅｔ酸化は、非標識サンプルの操作の間に導入されたＭｅｔに対する酸化の可能性があるために除外された）、Ｉは、非修飾ペプチドの強度である。残基レベルでの酸化標識の定量的分析は、二量体と単量体の間の修飾度の差異をペプチドレベルで示すペプチド、およびＭｅｔ残基を含有するペプチドに対しても実施される。ペプチド上の修飾部位は、ＭＳ２情報を割り当てられる。一部の実施形態では、ＭＳ２からの断片化情報が限定的であるために、またはペプチド異性体の共溶出による干渉があるために、一残基に対する修飾の部位決定が不可能であり、その場合、修飾は、可能性のある残基のセット上に存在すると示される。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
【００５８】
１つの実施形態は、ネイティブな制限消化条件下で、タンパク質医薬の富化二量体サンプルを消化し、非共有結合性二量体サブドメイン（例えばＦ（ａｂ）二量体）および単量体サブドメインを含有するタンパク質医薬混合物サンプルを形成させること、ならびに当該タンパク質医薬混合物サンプルの二量体および単量体に検出可能な修飾を導入し、修飾二量体および修飾単量体を生成すること、によってタンパク質医薬中の非共有結合性相互作用部位または二量体インターフェースを特定する方法を提供する。当該方法は、ネイティブサイズ排除クロマトグラフィー法を使用して当該修飾二量体および当該修飾単量体を、修飾二量体分画および修飾単量体分画へと分離させること、ならびに当該修飾二量体分画および当該修飾単量体分画の多数のペプチド結合を消化し、消化ペプチドサンプルを形成させること、を含む。当該方法はさらに、液体クロマトグラフィー／質量分析法を使用して、当該消化ペプチドサンプルを分析し、当該消化ペプチドサンプルの質量分析データを取得すること、および特定の残基修飾が当該タンパク質医薬に導入された公知の当該タンパク質医薬の質量分析データと比較された当該消化ペプチドの質量分析データを使用し、当該消化ペプチドサンプルの消化ペプチド中の修飾部位を決定すること、を含む。
【００５９】
１つの実施形態では、当該二量体および当該単量体は、迅速光化学酸化により修飾されて、当該二量体および当該単量体内に検出可能な酸化修飾を形成する。当該修飾は、アミノ酸側鎖の修飾であってもよい。
【００６０】
上述のように、タンパク質医薬は、抗体もしくはその抗原結合断片、組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせであってもよい。好ましいタンパク質医薬は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【００６１】
１つの実施形態では、ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーは、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムを含有する移動相を使用して実施される。別の実施形態では、消化されたタンパク質サンプルは、逆相液体クロマトグラフィーを用いて分離される。
【００６２】
１つの実施形態では、修飾は、酸化、二酸化（ｄｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、三酸化（ｔｒｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、キヌレニン（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎ）、ジチオメチル、脱炭酸、ヒドロジキヌレニン（ｈｙｄｒｏｚｙｋｙｎｕｒｅｎｉｎ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００６３】
典型的には、タンパク質医薬は酵素で消化される。例えばタンパク質医薬は、プロテアーゼで消化される。制限消化で利用されるプロテアーゼの例としては、限定されないが、パパイン、フィカイン、エンドプロテアーゼのＬｙｓ−Ｃ、およびＩｄｅＳが挙げられる。多数のペプチドを形成させるためのペプチド結合消化に利用されるプロテアーゼの例としては、限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびｒＬｙｓ−Ｃが挙げられる。
【００６４】
一部の実施形態では、タンパク質医薬サンプルは、流加培養からのサンプルである。
【００６５】
Ｂ．非共有結合性相互作用または凝集が減少したタンパク質医薬の製造方法
１つの実施形態は、抗体の作製方法を提供するものであり、当該方法は、抗体を産生させるのに適した条件下で抗体を産生する細胞を培養する工程、抗体を抽出するのに適した条件下で抗体を精製する工程、抗体を安定化させるのに適した条件下で抗体と賦形剤を混合する工程、（ｉ）細胞培養から、（ｉｉ）細胞培養から抗体を精製した後に、または（ｉｉｉ）精製抗体に賦形剤を添加した後に、抗体のサンプルを取得する工程、本明細書に開示されるシステムおよび方法を使用して抗体の二量体化インターフェースを特徴解析する工程、および抗体産生の条件を変更して、または抗体の二量体化インターフェースを改変して、非改変抗体と比較して二量体化および非共有結合性相互作用を減少させる工程、を含む。抗体産生条件の変更は、上記に解説されている。
【００６６】
１つの実施形態では、改変は、二量体化インターフェースの保存的アミノ酸置換または化学的改変であってもよい。
【実施例】
【００６７】
実施例１：共有結合性標識による、二量体と単量体の混合物のシングル標識
方法
ｍＡｂ−１の制限消化
ＩｇＧ１アイソタイプであるｍＡｂ−１は、ネイティブ条件下でエンドプロテアーゼＬｙｓＣにより、Ｆ（ａｂ）断片とＦｃ断片に消化された。最初にｍＡｂ−１二量体は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、１μｇ／μＬに希釈され、その後、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃとともに３７℃で１時間インキュベートされた（タンパク質：酵素＝４００：１）。この制限消化処置により、２つのヒンジ領域ジスルフィド結合に対してＮ末端側にあるＬｙｓ残基で重鎖が特異的に切断され、Ｆ（ａｂ）断片とＦｃ断片の両方が生成される。混合物中で、二量体種に由来する任意の非共有結合性の二量体相互作用（最も普遍的なものはＦ（ａｂ）−Ｆ（ａｂ））が維持される。
【００６８】
ｍＡｂ−２の制限消化
ＩｇＧ４アイソタイプであるｍＡｂ−２は、ネイティブ条件下で化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＩｄｅＳ酵素であるＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）により、Ｆ（ａｂ’）２断片とＦｃ＊断片へと消化された。最初にｍＡｂ−２二量体は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、１μｇ／μＬに希釈され、その後、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）で３７℃にて１時間消化された（タンパク質１μｇあたり、１ＩＵＢミリ単位）。この制限消化処置は、２つのヒンジ領域ジスルフィド結合に対してＣ末端側の部位の２つのＧｌｙ残基の間で特異的に切断する。この処置によって、１つのＦ（ａｂ’）２断片と、非共有結合性相互作用を介して相互に結合する２つの同一のＦｃ／２断片（Ｆｃ＊）が生じた。次いで消化混合物を５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）とともに３７℃で３０分間、インキュベートして、鎖間ジスルフィド結合を還元しながら、鎖内ジスルフィド結合は損なわずに維持される。結果として、Ｆａｂ２断片は、２つのＦ（ａｂ’）断片へと還元され、ＦｄとＬＣは非共有結合性相互作用を介して相互に結合する。混合物中で、二量体種に由来する非共有結合性の二量体相互作用（最も普遍的なものはＦ（ａｂ’）−Ｆ（ａｂ’））もまた維持される。
【００６９】
上記で生成されたｍＡｂ断片と、非共有結合性に結合した断片二量体の混合物は、約２ｍｇ／ｍＬまで、最初に１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）へ緩衝液交換される。
【００７０】
カルボキシル基の標識
カルボキシル基のフットプリンティングは、タンパク質の立体構造、および相互作用の研究に普遍的に使用されている共有結合性標識技術であり、Ａｓｐ残基およびＧｌｕ残基の側鎖を、ＧＥＥで標識する。ＧＥＥ標識反応において、タンパク質の表面に配置されたＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基のカルボキシル基は容易に修飾される一方で、タンパク質構造の内部に埋もれた場合にはほとんど、または全く修飾を受けない。標識を行うために、１００μＬのｍＡｂ−１の消化サンプルを、５０μＬの０．２Ｍ  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および５０μＬの２Ｍグリシンエチルエステル塩酸塩（ＧＥＥ：ｇｌｙｃｉｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃｈｏｌｏｒｉｄｅ）と混合し、室温で１時間インキュベートした。５００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を加えることでＧＥＥ標識反応をクエンチした後、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ遠心分離フィルターを使用した遠心分離により、サンプル溶液を約４０μＬに濃縮した。
【００７１】
タンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ：ｆａｓｔ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）
ＦＰＯＰは、確立されたヒドロキシルラジカル標識法であり、マイクロ秒の時間スケールでタンパク質をアミノ酸残基の側鎖で標識し、タンパク質−タンパク質／リガンドの相互作用の研究に広く適用されている。標識プロセスにおいて、上記の緩衝液交換済み混合液５０μＬは最初に１ｘＰＢＳおよび濃縮Ｈｉｓ溶液およびＨ２Ｏ２ストック溶液と混合され、１ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ−２消化混合物、３５０μＭ  Ｈｉｓ、および２０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含有する１００μＬの最終溶液が作製された。Ｈ２Ｏ２は、ＦＰＯＰ用の管への溶液の注入の直前に添加された。１００μＬの気密シリンジ内にサンプルをロードし、レーザービームに面する中心に透明窓を備えた、１５０μｍ内径の石英ガラス管に連結されたシリンジポンプを介して導入した。ＫｒＦエキシマレーザーの出力は１００〜１２０ｍＪ／パルスに調整され、そのパルス周波数は６Ｈｚに設定された。サンプル管の透明窓でのレーザービームの幅は、３．０ｍｍと測定された。パルスレーザーをオンにした後、サンプル溶液を２３．８６μＬ／分の流速で管内に注入し（管内径、レーザー周波数、および測定されたレーザービーム幅に従い調整された）、・ＯＨ曝露と反応の反復を回避するための２０％の排泄量が確保された。キャピラリーのアウトフローは、２０μＬの１００ｍＭ  Ｍｅｔおよび２μＬの１ｍｇ／ｍＬ  カタラーゼを含有するバイアル中に集められ、残留Ｈ２Ｏ２が還元された。最後に、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ遠心フィルターを使用した遠心分離により標識サンプル溶液が約４０μＬに濃縮された。
【００７２】
ＳＥＣ／ＭＳ
共有結合性に標識されたサンプル混合物は、ＢＥＨ（登録商標）ＳＥＣカラム（３００ｍｍｘ４．６ｍｍ、２００Å、１．７μｍ）上に０．２ｍＬ／分の流速で注入された。当該カラムは移動相（１４０ｍＭの酢酸アンモニウムと１０ｍＭの重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．４）で前もって平衡化された。ＳＥＣ分離およびＵＶ検出（２８０ｎｍ）の後、二量体断片および単量体断片が収集され、トリプシンペプチドマッピング分析が行われた。
【００７３】
ペプチドマッピング
トリプシン消化の前に、すべての二量体分画および単量体分画がＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥され、８Ｍの尿素、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する溶液中で再構成され、５０℃で３０分間維持された。変性され、還元されたサンプルは、暗室において３０分間、１０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ：ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）でアルキル化された。次いでサンプル溶液は、尿素濃度を０．８Ｍまで下げるために０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０倍希釈され、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素：基質の比率で一晩、３７℃で、トリプシンで消化された。その後、１０％のＦＡを添加し、最終０．２％のＦＡを生成することで消化を停止させた。その後、各消化タンパク質サンプルの分注物（約５μｇ）は逆相ＵＰＬＣで分離され、次いでオンライン質量分析が為されてペプチドの質量が決定され、ペプチドのアイデンティティが確認された。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ実験は、ＭＳ／ＭＳ実験中のペプチド断片化に採用される高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ：ｈｉｇｈｅｒ−ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＭＳシステム上で実施された。
【００７４】
結果
カルボキシル（Ｃａｒｂｏｘｙｌ）基の標識
カルボン酸基標識について、ＧＥＥ標識トリプシンペプチドを特定するために、Ａｓｐ残基とＧｌｕ残基に限定したＧＥＥ１（＋８５．０５２２）およびＧＥＥ２（＋５７．０２０９）の可変修飾を伴う対応ｍＡｂタンパク質配列を含有するデータベースに対して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータは検索された。Ａｓｐ／Ｇｌｕ残基を含有する各トリプシンペプチド上のＧＥＥ標識度を定量するために、ＧＥＥ標識ペプチドと天然ペプチドの両方の最初のアイソトープピークのｍ／ｚに基づき、抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ：ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）を作成し、抽出ピーク面積が積分された。各ＧＥＥ標識ペプチドの百分率は、対応するＥＩＣピーク面積を使用し、標識ペプチドと天然ペプチドのピーク面積の総計と比較して算出された。トリプシンペプチドが複数のＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基を含有する場合には、異なる保持時間で溶出するＧＥＥ標識ペプチドを最初にＭＳ／ＭＳスペクトルに対して検証して標識部位を確認し、その後に対応するＥＩＣピーク面積を使用して、部位特異的な標識百分率を算出した。最後に、各トリプシンペプチドまたは残基に関して、ＧＥＥ標識度を二量体分画と単量体分画の間で比較した。単量体分画よりも二量体分画において標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される（図２、３Ａおよび３Ｂ）。
【００７５】
ＦＰＯＰ標識
ＦＰＯＰ標識について、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータは、すべて公知の酸化標識産物を含む対応ｍＡｂタンパク質配列を含有するデータベースに対して最初に検索され（表１）、すべての標識産物が特定された。ペプチド上の修飾部位は、ＭＳ／ＭＳ情報に基づき特定され、精密なｍ／ｚにより確認された。特定ペプチドに対する修飾度は、以下のように算出された：
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式中、Ｉｏｘは、修飾ペプチドの強度であり（Ｍｅｔ酸化は、非標識サンプルの操作の間に導入されたＭｅｔに対する酸化の可能性があるために除外された）、Ｉは、非修飾ペプチドの強度である。残基レベルでの酸化標識の定量的分析は、二量体と単量体の間の修飾度の差異をペプチドレベルで示したペプチド、およびＭｅｔ残基を含有するペプチドに対しても実施された。ペプチド上の修飾部位は、ＭＳ２情報を割り当てられた。数例において、ＭＳ２からの断片化情報が限定的であるために、またはペプチド異性体の共溶出による干渉があるために、一残基に対する修飾の部位決定が不可能であり、その場合、修飾は、可能性のある残基のセット上に存在すると示された。サブドメインレベルで＋０、＋１６、＋３２、＋４８などの標識種のポアソン分布は、過剰標識が発生していないことを示す（図４Ａ〜４Ｃ）。単量体分画よりも二量体分画において標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される（図５Ａおよび５Ｂ）。
【００７６】
（表１）可能性のある酸化標識産物
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【００７７】
実施例２：ＦＰＯＰ最適化
方法：
実施例１のＦＰＯＰプロトコールに従った。プロトコールの様々な構成要素、すなわちレーザー位置、スカベンジャー濃度およびクエンチャーの含有を操作して、アッセイに対する影響を決定した。
【００７８】
結果：
表２は、図６Ａおよび図６Ｂの実験パラメーターを示す。図６Ａおよび図６Ｂに認められるように、位置とレーザー出力は、リゾチームタンパク質の標識効率に影響を与える。近接焦点位置および１２２ｍＪのレーザー出力を含む、図６Ｂのパラメーターを使用して分析されたサンプル中の酸化種は、ポアソン分布に対し、＋０、＋１６、＋３２．．．の状態生成品分布の優れた適合を示す。これは、標識効率の上昇を示す。
【００７９】
（表２）実験パラメーター
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【００８０】
図７Ａ〜７Ｆおよび図８Ａ〜８Ｄのポアソン分布デート（Ｐｏｉｓｓｏｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｄａｔｅ）に示されるように、レーザー出力とスカベンジャー濃度は、タンパク質濃度よりもずっと高いレベルでタンパク質の標識効率に影響を与える。
【００８１】
緩衝液交換を行わない脱グリコシル化ｍＡｂ１（図９Ｂ）は、緩衝液交換を行ったｍＡｂ１（図９Ａ）と比較して標識度の低下を示す。このことから、クエンチャーは、タンパク質酸化標識に干渉し得ることが示唆される。
【００８２】
前述の記載において、本発明はその特定の実施形態に関連付けて記載され、解説を目的として多くの詳細が提示されているが、当業者であれば、本発明はさらなる実施形態を受け入れることができること、および本明細書に記載される詳細の特定部分は、本発明の基礎となる主旨から逸脱することなく大きく変化し得ることが明白であろう。
【００８３】
本開示全体を通じて言及されるすべての参照文献は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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