(57)【要約】  本発明は、２つ以上のペプチドループがスキャフォールドへの結合点の間に張られるように非芳香族分子スキャフォールドに共有結合的に結合したポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼＡ２（ＥｐｈＡ２）の高親和性バインダーであるペプチドを記載する。本発明はまた、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物ならびに疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療における前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのループ配列により分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および非芳香族分子スキャフォールド上に少なくとも２つのポリペプチドループが形成されるように前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する前記分子スキャフォールドを含む、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンドであって、アミノ酸配列：
Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号１）
（ＨｙＰはヒドロキシプロリンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）または薬学的に許容されるその塩を含む、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンド。
【請求項２】
前記分子スキャフォールドが、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）である、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３】
前記ペプチドリガンドが、以下のアミノ酸配列：
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９）
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）
を有する、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項４】
前記薬学的に許容される塩が、遊離酸またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム塩から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項５】
前記ＥｐｈＡ２がヒトＥｐｈＡ２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項６】
細胞傷害剤などの、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲート。
【請求項７】
前記細胞傷害剤がＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される、請求項６に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項８】
前記細胞傷害剤がＭＭＡＥから選択される、請求項７に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項９】
前記ペプチドリガンドと前記細胞傷害剤との間のリンカーを追加的に含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
前記細胞傷害剤がＭＭＡＥであり、かつ、前記リンカーが、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−、Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、または−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ−Ｇｌｙ−ｈＰｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−（配列番号３）から選択される、請求項９に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
前記細胞傷害剤がＭＭＡＥであり、かつ、前記リンカーが−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−である、請求項１０に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
前記細胞傷害剤がＤＭ１であり、かつ、前記リンカーが、−Ｓ−Ｓ−、−ＳＳ（ＳＯ３Ｈ）−、−ＳＳ−（Ｍｅ）−、−（Ｍｅ）−ＳＳ−（Ｍｅ）−、−ＳＳ−（Ｍｅ２）−、または−ＳＳ−（Ｍｅ）−ＳＯ３Ｈ−から選択される、請求項９に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
前記細胞傷害剤がＤＭ１であり、かつ、前記リンカーが−Ｓ−Ｓ−および−ＳＳ（ＳＯ３Ｈ）−から選択される、請求項１２に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
ＢＣＹ６０２７、ＢＣＹ６０２８、ＢＣＹ６１５３５、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１７４およびＢＣＹ６１７５のいずれか１つから選択される、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
ＢＣＹ６０３１、ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６１３５、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１７４およびＢＣＹ６１７５のいずれか１つから選択される、請求項１４に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
ＢＣＹ６１３６である、請求項１４または請求項１５に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とともに、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項６〜１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項１８】
疾患組織におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
がんの予防、抑制または治療において使用するための、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
前記がんが、前立腺がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、胃がん、卵巣がん、食道がん、多発性骨髄腫および線維肉腫から選択される、請求項１９に記載の使用のための薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
がんを予防、抑制または治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項６から１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲートを投与することを含み、前記患者が、ＥｐｈＡ２の増加したコピー数多型（ＣＮＶ）を有するとして同定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つ以上のペプチドループがスキャフォールドへの結合点の間に張られるように非芳香族分子スキャフォールドに共有結合的に結合したポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼＡ２（ＥｐｈＡ２）の高親和性バインダーであるペプチドを記載する。本発明はまた、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物ならびに疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療における前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
環状ペプチドは、高い親和性および標的特異性でタンパク質標的に結合することができ、それゆえ、治療剤の開発のための魅力的な分子クラスである。実際、例えば、抗菌性ペプチドであるバンコマイシン、免疫抑制薬であるシクロスポリン、または抗がん薬物であるオクトレオチドのようないくつかの環状ペプチドは、診療所において既に成功裡に使用されている（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７  （７），  ６０８−２４）。良好な結合特性は、ペプチドと標的との間に形成される比較的大きい相互作用表面の他に、環状構造の低減したコンホメーション柔軟性の結果としてもたらされる。典型的には、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，  １０６６−７１）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å２）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６  （５５５６５），  １５１−５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ｕｐａｉｎ−１（６０３Å２；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １６０  （１），  １−１０）のように、大環状分子は数百平方オングストロームの表面に結合する。
【０００３】
環状の構成に起因して、ペプチド大環状分子は直鎖状ペプチドより柔軟性が低く、標的への結合時におけるエントロピーのより小さい損失に繋がり、結果としてより高い結合親和性をもたらす。低減した柔軟性はまた、標的特異的なコンホメーションのロッキングに繋がり、直鎖状ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。この効果は、その環が開いた時に他のＭＭＰに対するその選択性を喪失するマトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力かつ選択的な阻害剤により例示されている（Ｃｈｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４１  （１１），  １７４９−５１）。大環状化を通じて達成される好都合な結合特性は、例えば、バンコマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシンにおけるように１つより多くのペプチド環を有する多環ペプチドにおいてよりいっそう顕著になる。
【０００４】
異なる研究チームはこれまでに、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造にテザー連結してきた（Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  ＭｃＮａｍａｒａ  （１９８５），  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造的模倣のための合成スキャフォールド上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。候補薬物化合物がシステイン含有ポリペプチドを、例えばＴＡＴＡ（１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン、Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ，  Ｉｎｔ  Ｅｄ．  ２０１４；  ５３：１６０２−１６０６）のような分子スキャフォールドに連結することにより生成される、前記化合物の生成のための方法。
【０００５】
目的の標的に対する二環ペプチドの大きいライブラリーを生成およびスクリーニングするためのファージディスプレイに基づいたコンビナトリアルアプローチが開発されている（Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５  （７），  ５０２−７およびＷＯ２００９／０９８４５０）。簡潔に述べれば、３つのシステイン残基および６つのランダムなアミノ酸（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ）の２つの領域を含有する直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリーがファージ上に提示され、システイン側鎖を小分子スキャフォールドに共有結合的に連結することにより環化される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、少なくとも２つのループ配列により分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および少なくとも２つのポリペプチドループが非芳香族分子スキャフォールド上に形成されるように前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する前記分子スキャフォールドを含む、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンドであって、アミノ酸配列：
Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号１）
（ＨｙＰはヒドロキシプロリンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）または薬学的に許容されるその塩を含む、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンドが提供される。
【０００７】
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている本明細書において定義されるようなペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】二環薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）の調製の概念を示す一般的な概略図である。
【図２】ＨＴ１０８０異種移植マウスにおけるＢＣＹ６１３６についての平均腫瘍体積対時間のプロットである。用量（２、３および５ｍｇ／ｋｇ）を０および７日目に投与した。
【図３】ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植マウスにおけるＢＣＹ６１３６についての平均腫瘍体積対時間のプロットである。用量（１、２および３ｍｇ／ｋｇ）を０、７、１４、２１、２８および３５日目に投与した。
【図４】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植マウスにおけるＢＣＹ６１３６についての平均腫瘍体積対時間のプロットである。用量（１、２および３ｍｇ／ｋｇ）を０、７、１４、２１、２８、３５および４５日目に投与した。
【図５】ＰＣ−３異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図６】ＰＣ−３異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＡＤＣの投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図７】ＰＣ−３異種移植片を有する雄Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６、ＥｐｈＡ２−ＡＤＣまたはドセタキセルの投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図８】ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積を表す。
【図９】ＬＵ−０１−０２５１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６およびＡＤＣの投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図１０】ＬＵ−０１−０２５１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６およびＡＤＣの投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図１１】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図１２】ＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルを有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６またはＡＤＣの投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図１３】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図１４】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７３の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図１５】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７５の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図１６】ＬＵ−０１−０４１２異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６（図１６においてＢＴ５５２８と称される）、ＢＣＹ８２４５またはＢＣＹ８７８１の投与後の腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積を表す。
【図１７】ＬＵ−０１−０４８６異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図１８】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積を表す。
【図１９】ＥＭＴ−６同系移植片（ＥＭＴ−６  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）を有する雌ＢＡＬＢ／ｃマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。群３および群４の投与量を１４日目から５ｍｐｋおよび３ｍｐｋに変化させた。
【図２０】ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２１】ＳＫ−ＯＶ−３異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２２】ＯＥ２１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２３】ＭＯＬＰ−８異種移植片を有する雌ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２４】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７３の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２５】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３５の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２６】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２７】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７４の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２８】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７５の投与後の腫瘍体積の追跡である。
【図２９】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＡＤＣの投与後の腫瘍体積の追跡である。エラーバーが上記の図中に存在する場合、これらは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一実施形態では、ペプチドリガンドは、アミノ酸配列：
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９）
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）を含む。
【００１２】
一実施形態では、分子スキャフォールドは１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）である。
【００１３】
さらなる実施形態では、分子スキャフォールドは１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）であり、かつ、ペプチドリガンドは、アミノ酸配列：
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９）
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）を含む。
【００１４】
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学などの技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。標準技術が、分子生物学、遺伝学および生化学的方法のために使用され、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ２００１，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照）参照により本明細書に組み込まれる。
【００１５】
＜命名法＞
ナンバリング
本発明のペプチド内のアミノ酸残基位置を指す場合、システイン残基（Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ）は不変であるのでナンバリングから省略し、したがって、本発明のペプチド内のアミノ酸残基のナンバリングは、以下：
−Ｃｉ−ＨｙＰ１−Ｌ２−Ｖ３−Ｎ４−Ｐ５−Ｌ６−Ｃｉｉ−Ｌ７−Ｈ８−Ｐ９−（Ｄ−Ａｓｐ）１０−Ｗ１１−（ＨＡｒｇ）１２−Ｃｉｉｉ−（配列番号１）
のように称される。
【００１６】
この記載の目的のために、全ての二環ペプチドは、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）と共に環化されて三置換１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパン−１−オン構造をもたらすものと仮定される。ＴＡＴＡとの環化は、Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉにおいて起こる。
【００１７】
分子フォーマット
二環コア配列へのＮまたはＣ末端伸長は、ハイフンにより分離されて、配列の左または右側に付加される。例えば、Ｎ末端（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａｌａテイルは、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ−（配列番号Ｘ）
として表される。
【００１８】
反転ペプチド配列
Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０（３），  １３６２−１３７３の開示に照らして、本明細書に開示されるペプチド配列はまた、レトロインベルソ形態において有用性を有することが想定される。例えば、配列が逆転され（すなわち、Ｎ末端はＣ末端となり、逆もまた成り立つ）、立体化学もまた同様に逆転する（すなわち、Ｄ−アミノ酸はＬ−アミノ酸となり、逆もまた成り立つ）。
【００１９】
＜ペプチドリガンド＞
ペプチドリガンドは、本明細書において称されるように、分子スキャフォールドに共有結合的に結合したペプチド、ペプチド性化合物（ｐｅｐｔｉｄｉｃ）またはペプチド模倣物を指す。典型的には、そのようなペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物は、天然または非天然アミノ酸、スキャフォールドへの共有結合を形成できる２つ以上の反応性基（すなわち、システイン残基）、および前記反応性基の間に張られる配列を有するペプチドを含み、前記反応性基の間に張られる配列は、ペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物がスキャフォールドに結合した場合にループを形成するので、ループ配列と称される。本発明の場合において、ペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物は、少なくとも３つのシステイン残基（本明細書においてＣｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉのように称される）を含み、かつスキャフォールド上に少なくとも２つのループを形成する。
【００２０】
＜ペプチドリガンドの利点＞
本発明のある特定の二環ペプチドは、注射、吸入、経鼻、眼、経口または局所投与のために好適な薬物様分子として該二環ペプチドを考えることを可能とする多数の有利な特性を有する。そのような有利な特性としては以下が挙げられる。
−  種交差反応性。これは、前臨床の薬力学および薬物動態評価のための典型的な要件である；
−  プロテアーゼ安定性。二環ペプチドリガンドは、ほとんどの状況において、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー」）プロテアーゼ、胃および腸プロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、ならびに細胞内プロテアーゼなどに対して安定性を実証するべきである。二環ペプチドリード候補を動物モデルにおいて開発できることの他に、ヒトに対して信頼性と共に投与できるように、プロテアーゼ安定性は異なる種間で維持されるべきである；
−  望ましい溶解性プロファイル。これは、疎水性残基に対する荷電性および親水性残基の割合ならびに分子内／分子間Ｈ結合の関数であり、配合および吸収目的のために重要である；
−  循環中での最適な血漿中半減期。臨床的適応および治療レジメンに依存して、慢性または急性のいずれかの病態の管理のために短いまたは長いインビボ曝露時間を有する二環ペプチドの開発が必要とされることがある。最適な曝露時間は、薬剤への持続的な曝露から生じる毒物学的効果を最小化するための短い曝露時間の要件に対する持続的な曝露（最大の治療効率のため）の要件により支配される；
−  選択性。本発明のある特定のペプチドリガンドは、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＢ１、ＸＩＩＡ因子、炭酸脱水酵素９およびＣＤ３８などの他のＥｐｈ受容体チロシンキナーゼに対して良好な選択性を実証する（本発明の選択されるペプチドリガンドについての選択性データを表１１および表１２に見出すことができる）。本発明の選択されるペプチドリガンドは他の種（例えば、マウスおよびラット）との交差反応性を呈して、動物モデルにおける試験を可能とすることもまた留意されるべきである（表３、７〜８、１０および表１２）；ならびに
−  安全性。出血事象が、ＥｐｈＡ２抗体薬物コンジュゲートを用いた前臨床インビボモデルおよび臨床試験において報告されている。例えば、ＭＥＤＩ−５４７を用いた第１相オープンラベル研究は、６人の患者のうち５人において起こった出血および凝固事象に起因して中止された（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  （２０１３）  ３１：７７−８４）。患者において観察された出血事象は、ラットおよびサルの前臨床研究において観察された凝固システムへの効果、すなわち、活性化部分トロンボプラスチン時間の増加およびフィブリノーゲン／フィブリン分解生成物の増加に合致した（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ、同書）。明白な出血事象がサルにおける毒物学研究において見られたことが報告されている（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ、同書）。これらの結果を合わせると、ＭＥＤＩ−５４７は前臨床種および患者の両方において播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を引き起こすことが暗示される。本明細書において報告するＢＤＣは、短いインビボ半減期（＜３０分）を有し、したがって、患者においてＤＩＣを生じさせる可能性が本来的により低い。本明細書において示す結果（生物学的データのセクション５および６ならびに表１５を参照）は、本発明の選択される二環薬物コンジュゲートは、凝固パラメーターに対して効果を有さず、かつ前臨床研究において出血事象を生じさせなかったことを実証する。
【００２１】
＜薬学的に許容される塩＞
塩形態は本発明の範囲内にあり、ペプチドリガンドへの言及は前記リガンドの塩形態を含むことが理解されるであろう。
【００２２】
本発明の塩は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ，  Ｐ．  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  ＩＳＢＮ：  ３−９０６３９−０２６−８，  Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，  ３８８  ｐａｇｅｓ，  Ａｕｇｕｓｔ  ２００２に記載される方法などの従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中または有機溶媒中、または２つの混合物中で適切な塩基または酸と反応させることにより調製され得る。
【００２３】
酸付加塩（単塩または二塩）は、無機および有機の両方の、多様な酸と共に形成されてもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）ショウノウ酸、ショウノウ−スルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸および吉草酸の他に、アシル化されたアミノ酸およびカチオン交換樹脂からなる群から選択される酸と共に形成される単塩または二塩が挙げられる。
【００２４】
塩の１つの特定の群は、酢酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラクトビオン酸から形成される塩からなる。１つの特定の塩は塩酸塩である。別の特定の塩は酢酸塩である。
【００２５】
化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性であり得る（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−であり得る）官能基を有する場合、塩は、有機または無機塩基と共に形成されて、好適な陽イオンを生成してもよい。好適な無機カチオンの例としては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋などのアルカリ土類金属カチオン、ならびにＡｌ３＋またはＺｎ＋などの他のカチオンが挙げられるがそれに限定されない。好適な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられるがそれに限定されない。一部の好適な置換アンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミンの他に、リジンおよびアルギニンなどのアミノ酸に由来するものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
【００２６】
本発明のペプチドがアミン官能基を含有する場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法によるアルキル化剤との反応により、第四級アンモニウム塩を形成してもよい。そのような第四級アンモニウム化合物は本発明のペプチドの範囲内である。
【００２７】
＜同位体バリエーション＞
本発明は、１つまたは複数の原子が、同じ原子数を有するが天然に通常見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子により置き換えられた、本発明の全ての薬学的に許容される（放射性）同位体標識されたペプチドリガンド、および、関連する（放射性）同位体を保持することができる金属キレーティング基（「エフェクター」と称される）が取り付けられた本発明のペプチドリガンド、および、ある特定の官能基が、関連する（放射性）同位体または同位体標識された官能基により共有結合的に置き換えられた本発明のペプチドリガンドを含む。
【００２８】
本発明のペプチドリガンドに含めるために好適な同位体の例は、２Ｈ（Ｄ）および３Ｈ（Ｔ）などの水素、１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃなどの炭素、３６Ｃｌなどの塩素、１８Ｆなどのフッ素、１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉなどのヨウ素、１３Ｎおよび１５Ｎなどの窒素、１５Ｏ、１７Ｏおよび１８Ｏなどの酸素、３２Ｐなどのリン、３５Ｓなどの硫黄、６４Ｃｕなどの銅、６７Ｇａまたは６８Ｇａなどのガリウム、９０Ｙなどのイットリウム、１７７Ｌｕなどのルテチウム、ならびに２１３Ｂｉなどのビスマスの同位体を含む。
【００２９】
同位体標識された本発明のある特定のペプチドリガンド、例えば、放射活性同位体を組み込んだものは、薬物および／または基質の組織分布研究において、ならびに疾患組織におけるＥｐｈＡ２標的の存在および／または非存在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチドリガンドは、標識された化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体との間の複合体の形成を検出または同定するために使用され得るという点で価値のある診断特性をさらに有し得る。検出または同定方法は、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）などの標識化剤を用いて標識された化合物を使用し得る。放射活性同位体トリチウム、すなわち、３Ｈ（Ｔ）、および炭素−１４、すなわち、１４Ｃは、組込みの容易さおよび検出の手段が用意されていることを考慮してこの目的のために特に有用である。
【００３０】
重水素、すなわち、２Ｈ（Ｄ）などのより重い同位体による置換は、より大きい代謝安定性、例えば、増加したインビボでの半減期または低減した投与量の必要性の結果としてもたらされるある特定の治療的な利点が得られることがあり、それゆえ、一部の状況において好ましいことがある。
【００３１】
１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎなどのポジトロン放出同位体による置換は、標的占有を調べるためのポジトロン断層法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）研究において有用であり得る。
【００３２】
本発明のペプチドリガンドの同位体標識された化合物は、一般的に、当業者に公知の従来技術によりまたは以前に用いられた非標識化試薬の代わりに適切な同位体標識された試薬を使用する本明細書中の実施例において記載されるものに類似の方法により調製され得る。
【００３３】
＜非芳香族分子スキャフォールド＞
「非芳香族分子スキャフォールド」という用語への本明細書における言及は、芳香族（すなわち、不飽和）炭素環式または複素環式環系を含有しない本明細書において定義されるような任意の分子スキャフォールドを指す。
【００３４】
非芳香族分子スキャフォールドの好適な例は、Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０１４）  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ５３（６）  １６０２−１６０６に記載されている。
【００３５】
以上の文献において記載されているように、分子スキャフォールドは、小有機分子などの小分子であってもよい。
【００３６】
一実施形態では、分子スキャフォールドは高分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）であってもよい。一実施形態では、分子スキャフォールドは、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される高分子である。
【００３７】
一実施形態では、分子スキャフォールドは、ポリペプチドの官能基と反応して共有結合を形成できる反応性基を含む。
【００３８】
分子スキャフォールドは、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの、ペプチドと連結を形成する化学基を含んでもよい。
【００３９】
α不飽和カルボニル含有化合物の例は、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）である（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１４），  ５３（６），  １６０２−１６０６）。
【００４０】
＜エフェクターおよび官能基＞
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている本明細書において定義されるようなペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【００４１】
エフェクターおよび／または官能基は、例えば、ポリペプチドのＮおよび／もしくはＣ末端、ポリペプチド内のアミノ酸、または分子スキャフォールドに取り付けられ得る。
【００４２】
適切なエフェクター基としては、抗体およびその部分または断片が挙げられる。例えば、エフェクター基は、１つまたは複数の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメイン、または任意のその組合せを含み得る。エフェクター基はまた、抗体のヒンジ領域を含んでもよい（そのような領域は通常、ＩｇＧ分子のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に見出される）。
【００４３】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基はＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上または７日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合物を含むまたはからなる。より有利には、本発明によるペプチドリガンドは、１日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合物を含むまたはからなる。
【００４４】
官能基としては、一般に、結合性基、薬物、他の実体の取付けのための反応性基、および細胞への大環状ペプチドの取込みを補助する官能基などが挙げられる。
【００４５】
細胞中に透過するペプチドの能力は、細胞内標的に対してペプチドが効果的となることを可能とする。細胞中に透過する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的としては、転写因子、チロシンキナーゼおよびアポトーシス経路に関与する分子などの細胞内シグナル伝達分子が挙げられる。細胞の透過を可能とする官能基としては、ペプチドまたは分子スキャフォールドのいずれかに付加されたペプチドまたは化学基が挙げられる。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００７）  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５，  ｐａｒｔ  ４，  ｐ８２１；  Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００４）  Ｖｏｌｕｍｅ  ５７  ９６３７に記載されるような、ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）などに由来するものなどのペプチド。細胞膜を通る移行において効率的であることが示されている短いペプチドの例としては、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質からの１６アミノ酸ペネトラチンペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９  ｐ１０４４４）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １４１４  ｐ１２７）およびＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチとしては、生体分子に容易に取り付けることができる小分子模倣体またはＳＭＯＣの使用が挙げられる（Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  ｐ１５３）。分子にグアニジニウム基を付加する他の化学的戦略はまた、細胞透過を増進する（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８２  ｐ１３５８５）。ステロイドなどの低分子量分子は、細胞への取込みを増進するために分子スキャフォールドに付加されてもよい。
【００４６】
ペプチドリガンドに取り付けられ得る官能基の１つのクラスとしては、抗体およびＦａｂ、Ｆｖまたは単一ドメイン断片などのその結合断片が挙げられる。特に、インビボにおいてペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体が使用されてもよい。
【００４７】
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上または２０日以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基または組成物は、１２〜６０時間のｔβ範囲を有する。さらなる実施形態では、それは１日以上のｔβ半減期を有する。いっそうさらなる実施形態では、それは１２〜２６時間の範囲内である。
【００４８】
本発明の１つの特定の実施形態では、官能基は、医薬的関連性のある金属放射性同位体を錯化させるために好適な金属キレーターから選択される。
【００４９】
可能なエフェクター基としては酵素もまた挙げられ、酵素は、例えば、ペプチドリガンドがＡＤＥＰＴにおいて抗体を置き換える酵素／プロドラッグ療法において使用するためのカルボキシペプチダーゼＧ２などである。
【００５０】
本発明の１つの特定の実施形態では、官能基は、がん療法用の細胞傷害剤などの薬物から選択される。好適な例としては、シスプラチンおよびカルボプラチンの他に、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドなどのアルキル化剤；プリンアナログであるアザチオプリンおよびメルカプトプリンまたはピリミジンアナログを含む抗代謝物；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンなどのビンカアルカロイドを含む植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド；元々はタキソールとして公知のパクリタキセルを含むタキサン；イリノテカンおよびトポテカンといったカンプトテシン類を含むトポイソメラーゼ阻害剤；ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、およびテニポシドを含むＩＩ型阻害剤が挙げられる。さらなる薬剤としては、免疫抑制剤ダクチノマイシン（腎臓移植において使用される）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎｓ）、およびその他を含む抗腫瘍性抗生物質を挙げることができる。
【００５１】
本発明の１つのさらなる特定の実施形態では、細胞傷害剤は、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）またはモノメチルアウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ）から選択される。
【００５２】
ＤＭ１は、メイタンシンのチオール含有誘導体である細胞傷害剤であり、以下の構造を有する。
【００５３】
【化１】
2021506936.tif 000002
【００５４】
モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は合成の抗新生物剤であり、以下の構造を有する。
【００５５】
【化２】
2021506936.tif 000003
【００５６】
一実施形態では、細胞傷害剤は、ジスルフィド結合またはプロテアーゼ感受性結合などの切断可能な結合により二環ペプチドに連結される。さらなる実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する基は、ジスルフィド結合の障害、ならびにこれにより切断および細胞傷害剤の付随的な放出の速度を制御するように修飾される。
【００５７】
公開された研究は、ジスルフィド結合のいずれかの側に立体障害を導入することにより還元に対するジスルフィド結合の感受性を修飾する可能性を確立した（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２２，  ７１７）。より大きい程度の立体障害は、細胞内グルタチオン、そしてまた細胞外（全身性）の還元剤による還元の速度を低減し、結果的に、細胞の内部および外部の両方において、毒素が放出される容易さを低減する。したがって、細胞内環境における効率的な放出（これは治療効果を最大化する）と対比した循環中のジスルフィド安定性（これは毒素の望ましくない副作用を最小化する）における最適条件の選択は、ジスルフィド結合のいずれかの側における障害の程度の注意深い選択により達成され得る。
【００５８】
ジスルフィド結合のいずれかの側における障害は、標的化実体（ここでは、二環ペプチド）または分子構築物の毒素側のいずれか上に１つまたは複数のメチル基を導入することを通じてモジュレートされる。
【００５９】
一実施形態では、薬物コンジュゲートは、前記ペプチドリガンドと前記細胞傷害剤との間のリンカーを追加的に含む。
【００６０】
一実施形態では、細胞傷害剤およびリンカーは、ＷＯ２０１６／０６７０３５（その細胞傷害剤およびリンカーは参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものの任意の組合せから選択される。
【００６１】
一実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥである。
【００６２】
一実施形態では、前記細胞傷害剤と前記二環ペプチドとの間のリンカーは１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。したがって、一実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥであり、かつ、リンカーは、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−、Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ−Ｇｌｙ−ｈＰｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−（配列番号３）から選択される。さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥであり、かつ、リンカーは、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−または−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択される。いっそうさらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥであり、かつ、リンカーは−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−または−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−である。よりいっそうさらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥであり、かつ、リンカーは−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−である。
【００６３】
代替的な実施形態では、前記細胞傷害剤（ｃｙｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）の間のリンカーは、切断性ジスルフィド結合などのジスルフィド結合を含む。したがって、さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、リンカーは、−Ｓ−Ｓ−、−ＳＳ（ＳＯ３Ｈ）−、−ＳＳ−（Ｍｅ）−、−（Ｍｅ）−ＳＳ−（Ｍｅ）−、−ＳＳ−（Ｍｅ２）−または−ＳＳ−（Ｍｅ）−ＳＯ３Ｈ−から選択される。さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、リンカーは、（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＢ）などの−Ｓ−Ｓ−部分、またはＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢなどの−ＳＳ（ＳＯ３Ｈ）−部分を含む。いっそうさらなる実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、リンカーは、−Ｓ−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−（ＳＯ３Ｈ）−などの−Ｓ−Ｓ−部分を含む。
【００６４】
一実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、式（Ａ）：
【化３】
2021506936.tif 000004
の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０９９である。
【００６５】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、式（Ｂ）：
【化４】
2021506936.tif 000005
の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０９９である。
【００６６】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ａ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０９９から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＣＹ６０２７として知られる。表４および表８に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＣＹ６０２７について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【００６７】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ｂ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０９９から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＣＹ６０２８として知られる。表４および表８に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＣＹ６０２８について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【００６８】
さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥまたはＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７３から選択される。表１１および表１２に示すように、これらの２つの二環薬物コンジュゲートは、密接に関連するヒトホモログＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＢ４；マウスＥｐｈＡ３およびＥｐｈＡ４；ならびにラットＥｐｈＡ３およびＥｐｈＢ１への有意な結合を呈しなかったことを示すデータが本明細書において提示される。
【００６９】
いっそうさらなる実施形態では、薬物コンジュゲートは、ＢＣＹ６１３５、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１７４およびＢＣＹ６１７５のいずれか１つから選択される。
【００７０】
【化５−１】
2021506936.tif 000006
【００７１】
【化５−２】
2021506936.tif 000007
【００７２】
【化５−３】
2021506936.tif 000008
【００７３】
【化５−４】
2021506936.tif 000009
【００７４】
【化５−５】
2021506936.tif 000010
【００７５】
よりいっそうさらなる実施形態では、薬物コンジュゲートはＢＣＹ６１３６である。ＢＣＹ６１３６はＰＣ−３異種移植前立腺がんモデルにおいて有意かつ強力な抗腫瘍活性を示したことを示すデータが、本明細書の研究７および８において提示される（図５および図６ならびに表１６〜１９を参照）。ＢＣＹ６１３６がＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書において提供される（図８および表２０〜２５を参照）。ＢＣＹ６１３６が大腫瘍サイズおよび小腫瘍サイズの両方のＬＵ−０１−０２５１ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を実証し（図９および図１０ならびに表２６〜２９を参照）、完全な腫瘍退縮が観察されたことを示すデータも、また本明細書の研究１０および１１において提示される。ＢＣＹ６１３６がＬＵ−０１−００４６ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて有意な抗腫瘍効果を実証し（図１１ならびに表３０および表３１を参照）、完全な腫瘍退縮がＢＣＹ６１３６について観察されたことを示すデータも、また本明細書の研究１２において提示される。ＢＣＹ６１３６がＬＵ−０１−００４６ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書の研究１３において提示される（図１２ならびに表３２および表３３を参照）。ＢＣＹ６１３６がＬＵ−０１−００４６ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて腫瘍を根絶したことを示すデータも、また本明細書の研究１４において提示される（図１３〜１５および表３４〜３７を参照）。低い／ごくわずかなＥｐｈＡ２発現を有する細胞株（すなわち、Ｌｕ−０１−０４１２およびＬｕ−０１−０４８６）を利用する２つのモデルにおいてＢＣＹ６１３６の効果を実証するデータも、また本明細書の研究１５および１６において提示される。このデータは、図２３および図２４ならびに表３８〜４１において示され、ＢＣＹ６１３６はいずれの細胞株においても腫瘍退縮に対して効果を有しなかったが、Ｌｕ−０１−０４１２細胞株において高発現される標的に結合するＢＣＹであるＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１は腫瘍を完全に根絶したことを実証する。ＢＣＹ６１３６がＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植乳がんモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが、本明細書の研究１７において提示される（図１８および表４２〜４５を参照）。低い／ごくわずかなＥｐｈＡ２発現を有する細胞株（すなわち、ＥＭＴ６）を利用する乳がんモデルにおいてＢＣＹ６１３６の効果を実証するデータも、また本明細書の研究１８において提示される。このデータは、図１９ならびに表４６および表４７において示され、ＢＣＹ６１３６はこの細胞株において腫瘍退縮に対して効果を有しなかったことを実証する。ＢＣＹ６１３６がＮＣＩ−Ｎ８７異種移植胃がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書の研究１９において提示される（図２０ならびに表４８および表４９を参照）。ＢＣＹ６１３６が、中等度の抗腫瘍活性を実証したＡＤＣ  ＭＥＤＩ−５４７と比較して、ＳＫ−ＯＶ−３異種移植卵巣がんモデ���において有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書の研究２０において提示される（図２１ならびに表５０および表５１を参照）。ＢＣＹ６１３６がＯＥ−２１異種移植食道がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書の研究２１において提示される（図２２ならびに表５２および表５３を参照）。ＢＣＹ６１３６がＭＯＬＰ−８異種移植多発性骨髄腫モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書の研究２２において提示される（図２３ならびに表５９および表６０を参照）。ＢＣＹ６１３６がＨＴ−１０８０異種移植線維肉腫モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書の研究２３において提示される（図２４〜２８ならびに表５６および表５７を参照）。
【００７６】
＜合成＞
本発明のペプチドは、標準技術による合成の後に、インビトロでの分子スキャフォールドとの反応により製造されてもよい。これが行われる場合、標準的な化学が使用されてもよい。これは、さらなる下流の実験または検証のために可溶性の材料の迅速な大規模の調製を可能とする。そのような方法は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（上掲）に開示されるものなどの従来の化学を使用して達成され得る。
【００７７】
したがって、本発明はまた、本明細書において示されるような選択されるポリペプチドまたはコンジュゲートの製造であって、以下において説明するような任意選択のさらなるステップを含む製造に関する。一実施形態では、これらのステップは、化学合成により作製された最終生成物のポリペプチド／コンジュゲートに対して実行される。
【００７８】
任意選択的に、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を製造する時に置換されてもよい。
【００７９】
ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、したがって複数の特異性を導入するために伸長され得る。
【００８０】
ペプチドを伸長するために、それは単純に、標準的な固相または溶液相化学を使用して直交的に保護されたリジン（およびアナログ）を使用してそのＮ末端もしくはＣ末端においてまたはループ内において化学的に伸長されてもよい。標準的な（生物）コンジュゲーション技術を使用して、活性化されたまたは活性化可能なＮまたはＣ末端を導入してもよい。あるいは、付加は、例えば（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）に記載されるような断片凝縮もしくは天然の化学的ライゲーションにより、または、例えば（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９４  Ｄｅｃ  ２０；  ９１（２６）：１２５４４−８もしくはＨｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８，  Ｉｓｓｕｅ  ２２，  １５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８，  Ｐａｇｅｓ  ６０００−６００３）に記載されるようなサブチリガーゼを使用して、酵素により為されてもよい。
【００８１】
あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を通じたさらなるコンジュゲーションにより伸長または修飾されてもよい。これは、第１および第２のペプチドが、細胞の還元性環境内に入ると互いに解離することを可能とするという追加の利点を有する。この場合、分子スキャフォールドは、３つのシステイン基と反応するように第１のペプチドの化学合成の間に付加されてもよく、さらなるシステインまたはチオールは次に、第１のペプチドのＮまたはＣ末端に付加されてもよく、それにより、このシステインまたはチオールは第２のペプチドの遊離のシステインまたはチオールとのみ反応して、ジスルフィド連結した二環ペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成する。
【００８２】
類似の技術は、２つの二環二重特異性大環状分子の合成／連結に等しく適用され、四重特異性分子を潜在的に作製する。
【００８３】
さらには、他の官能基またはエフェクター基の付加は、適切な化学を使用して、ＮもしくはＣ末端においてまたは側鎖を介して連結させて、同様に達成されてもよい。一実施形態では、連結は、いずれの実体の活性も遮断しないような方式において実行される。
【００８４】
＜医薬組成物＞
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【００８５】
一般的に、本発明のペプチドリガンドは、薬理学的に適切な賦形剤または担体と共に精製された形態において利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体は、生理食塩水および／または緩衝化媒体を含む、水性またはアルコール／水性溶液、エマルションまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸リンゲル液が挙げられる。好適な生理的に許容される佐剤は、ポリペプチド複合体を懸濁状態に保つために必要な場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどの増粘剤から選択されてもよい。
【００８６】
静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液および電解質補充液、例えば、リンゲルのデキストロースに基づくものが挙げられる。防腐剤ならびに他の添加物、例えば、抗菌物質、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスもまた存在してもよい（Ｍａｃｋ  （１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【００８７】
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物としてまたは他の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。これらとしては、抗体、抗体断片および様々な免疫療法薬物、例えば、シクロスポリン（ｃｙｌｃｏｓｐｏｒｉｎｅ）、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチナムおよび免疫毒素を挙げることができる。医薬組成物は、本発明のタンパク質リガンドと組み合わせて様々な細胞傷害剤もしくは他の薬剤の「カクテル」、または、投与前にプールされるか否かによらず、異なる標的リガンドを使用して選択されるポリペプチドなどの、異なる特異性を有する本発明による選択されるポリペプチドの組合せさえも含み得る。
【００８８】
本発明による医薬組成物の投与の経路は、当業者に一般的に公知の任意のものであってもよい。療法のために、本発明のペプチドリガンドは、標準技術にしたがって任意の患者に投与され得る。投与は、任意の適切な様式によるものであり得、該様式としては、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺経路を介して、または適宜、カテーテルを用いる直接注入によるものが挙げられる。好ましくは、本発明による医薬組成物は吸入により投与される。投与の量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時的な投与、禁忌および臨床医により考慮される他のパラメーターに依存する。
【００８９】
本発明のペプチドリガンドは、貯蔵のために凍結乾燥され、使用の前に適切な担体中で再構成されてよい。この技術は効果的であることが示されており、当該技術分野において公知の凍結乾燥および再構成技術が用いられ得る。凍結乾燥および復元は様々な程度の活性損失に繋がることがあり、補償のためにレベルを上方に調整する必要があり得ることが当業者により理解されるであろう。
【００９０】
本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防および／または治療処置のために投与され得る。ある特定の治療応用では、選択される細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、モジュレーション、殺傷、または何らかの他の測定可能なパラメーターを達成するために充分な量は、「治療有効量」として定義される。この投与量を達成するために必要とされる量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の全般的状態に依存するが、概ね体重１キログラム当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択されるペプチドリガンドの範囲内であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。予防応用のために、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、類似のまたはわずかにより低い投与量において投与されてもよい。
【００９１】
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択標的細胞集団の変化、不活性化、殺傷または除去を補助するために予防的および治療的な設定において利用されてもよい。加えて、本明細書に記載のペプチドリガンドは、細胞の異成分集合物から標的細胞集団を選択的に殺傷し、枯渇させまたは他に効果的に除去するために生体外またはインビトロにおいて使用されてもよい。哺乳動物からの血液を選択されるペプチドリガンドと生体外において合わせることにより、望まない細胞を殺傷し、またはそれ以外に標準技術にしたがって哺乳動物に戻すために血液から除去してもよい。
【００９２】
＜治療的使用＞
本発明の二環ペプチドは、ＥｐｈＡ２結合剤として特定の有用性を有する。
【００９３】
Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼ（Ｅｐｈ）は、チロシン残基においてタンパク質をリン酸化するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の大きなグループに属する。Ｅｐｈおよびその膜結合型エフリンリガンド（エフリン）は、細胞の位置決めおよび組織編成を制御する（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ７，  ４６５−８０）。機能的および生化学的なＥｐｈ応答は、より高いリガンドオリゴマー化状態において起こる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２，  ６６７−６７８）。
【００９４】
他のパターニング機能の中で、様々なＥｐｈおよびエフリンは血管発生において役割を果たすことが示されている。ＥｐｈＢ４およびエフリン−Ｂ２のノックアウトは、毛細血管床を血管に再モデル化する能力の欠如（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）および胚致死性を結果としてもたらす。一部のＥｐｈ受容体およびエフリンの持続性の発現もまた、新たに形成された成体微小血管において観察されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １０，  ３４３１−４２；  Ａｄａｍｓ  （２００３）  Ｊ  Ａｎａｔ  ２０２，  １０５−１２）。
【００９５】
成体における一部のエフリンおよびその受容体の脱調節された再出現はまた、腫瘍浸潤、転移および血管新生に寄与することが観察されている（Ｎａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ５９，  ５８−６７；Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）。さらには、一部のＥｐｈファミリーメンバーは、様々なヒト腫瘍からの腫瘍細胞上に過剰発現されることが見出されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）；Ｍａｒｍｅ  （２００２）  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８１  Ｓｕｐｐｌ  ２，  Ｓ６６；  Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，  １３６０−１）。
【００９６】
ＥＰＨ受容体Ａ２（エフリンＡ型受容体２）は、ヒトにおいてＥＰＨＡ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。
【００９７】
ＥｐｈＡ２は、ヒトにおける複数のがんにおいて上方調節されており、多くの場合に、疾患進行、転移および予後不良と相関する。例えば、乳房（Ｚｅｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ２３０１−２３０６；  Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７０，  ２９９−３０８；  Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ２４４２６）、肺（Ｂｒａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）  ２，  １０３９−１０４９；  Ｋｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ６１３−６１８；  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ．  ８，  ３０１−３０８）、胃（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ９６，  ４２−４７；  Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  ５４，  ２４１０−２４１７）、膵臓（Ｍｕｄａｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２３，  ３５７−３６５）、前立腺（Ｗａｌｋｅｒ−Ｄａｎｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４１，  ２７５−２８０）、肝臓（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｒｅｓ．  ３９，  １１６９−１１７７）および膠芽腫（Ｗｙｋｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３，  ５４１−５５１；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ３１，  ４７７−４８８）。
【００９８】
がんの進行におけるＥｐｈＡ２の全体的役割は依然として定義されていないが、腫瘍細胞の増殖、生存、浸潤および血管新生を含むがんの進行の多数のステージにおける相互作用について証拠が存在する。ＥｐｈＡ２発現の下方調節は腫瘍のがん細胞繁殖を抑制し（Ｂｉｎｄａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２，  ７６５−７８０）、ＥｐｈＡ２の遮断は、ＶＥＧＦ誘導性の細胞遊走（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ３２５０−３２５５）、出芽および血管新生（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １，  ２−１１；  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  １０９，  ３３２−４０）ならびに転移の進行（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９，  １８８４−１８８６）を阻害する。
【００９９】
ＥｐｈＡ２への抗体薬物コンジュゲートは、ラットおよびマウス異種移植モデルにおいて腫瘍成長を有意に減少させることが示されており（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８，  ９３６７−９３７４）、類似のアプローチが男性において試みられたが、治療関連有害事象のために治療は中止されなければならなかった（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ３１，  ７７−８４）。
【０１００】
本発明の方法により選択されるポリペプチドリガンドは、インビボでの治療および予防応用、インビトロおよびインビボでの診断応用、インビトロアッセイならびに試薬応用などにおいて用いられてもよい。選択されるレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望まれる非ヒト動物における試験を伴う応用、または、ホモログもしくはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断応用において有用である。ワクチン応用などの一部の応用では、予め決定された範囲の抗原に対し免疫応答を誘発する能力を活用して、特定の疾患および病原体に対するワクチンを調整することができる。
【０１０１】
少なくとも９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なペプチドリガンドが哺乳動物への投与のために好ましく、９８〜９９％またはより高い均質性は、特に哺乳動物がヒトである場合に、医薬的使用のために最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均質になるまで精製されると、選択されるポリペプチドは、診断的もしくは治療的（生体外を含む）にまたはアッセイ手順および免疫蛍光染色などの開発および実行において使用され得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，  （１９７９  ａｎｄ  １９８１）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）。
【０１０２】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための、本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートが提供される。
【０１０３】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害を予防、抑制または治療する方法であって、それを必要とする患者に本明細書において定義されるようなペプチドリガンドのエフェクター基および薬物コンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。
【０１０４】
一実施形態では、ＥｐｈＡ２は哺乳動物ＥｐｈＡ２である。さらなる実施形態では、哺乳動物ＥｐｈＡ２はヒトＥｐｈＡ２である。
【０１０５】
一実施形態では、疾患組織におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害はがんから選択される。
【０１０６】
治療（または阻害）され得るがん（およびその良性の対応物）の例としては、上皮起源の腫瘍（腺がん、扁平がん、移行細胞がんおよび他のがん腫を含む様々な種類の腺腫およびがん腫）、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管（食道、胃、小腸、結腸、直腸および肛門を含む）、肝臓（肝細胞がん）、胆嚢および胆汁系、外分泌膵臓、腎臓、肺（例えば、腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支肺胞上皮がんおよび中皮腫）、頭頸部（例えば、舌、頬腔、喉頭、咽頭、鼻咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および副鼻腔のがん）、卵巣、卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内膜、甲状腺（例えば、甲状腺濾胞がん）、副腎、前立腺、皮膚および付属器（例えば、黒色腫、基底細胞がん、扁平細胞がん、ケラトアカントーマ、形成異常母斑）のがん腫；血液学的悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）および前悪性血液学的障害およびリンパ系列の血液学的悪性腫瘍および関連する状態を含む境界型悪性腫瘍の障害（例えば、急性リンパ性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明のモノクローナルガンマグロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、および移植後リンパ増殖性障害）、および骨髄系列の血液学的悪性腫瘍および関連する状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増多症候群、骨髄増殖性障害、例えば、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、および前骨髄球性白血病）；間葉起源の腫瘍、例えば軟組織肉腫、骨または軟骨の腫瘍、例えば、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、消化管間質腫瘍、良性および悪性組織球腫、および隆起性皮膚線維肉腫；中枢または末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫および膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍および神経鞘腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、膵島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺の髄様がん）；目および付属器の腫瘍（例えば、網膜芽腫）；生殖細胞および栄養膜腫瘍（例えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛がん）；ならびに小児性および胎児性腫瘍（例えば、髄芽腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、および未分化神経外胚葉性腫瘍）；または患者を悪性腫瘍にかかりやすくする症候群、先天性もしくはその他（例えば、色素性乾皮症）が挙げられるがそれに限定されない。
【０１０７】
さらなる実施形態では、がんは、乳がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、肝臓がん、膠芽腫および血管新生から選択される。
【０１０８】
さらなる実施形態では、がんは、前立腺がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、胃がん、卵巣がん、食道がん、多発性骨髄腫および線維肉腫から選択される。
【０１０９】
いっそうさらなる実施形態では、がんは前立腺がんである。ＢＣＹ６１３６がＰＣ−３異種移植前立腺がんモデルにおいて有意かつ強力な抗腫瘍活性を示したことを示すデータが、本明細書の研究７および８において提示される（図５および図６ならびに表１６〜１９を参照）。
【０１１０】
いっそうさらなる実施形態では、薬物コンジュゲートは、線維肉腫および乳房、および非小細胞肺がんなどの固形腫瘍を予防、抑制または治療するために有用なものである。
【０１１１】
いっそうさらなる実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）などの肺がんから選択される。ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいてＢＣＹ６１３６が強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書の研究９において提示される（図８および表２０〜２５を参照）。ＢＣＹ６１３６が大腫瘍サイズおよび小腫瘍サイズの両方のＬＵ−０１−０２５１ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を実証し（図９および図１０ならびに表２６〜２９を参照）、完全な腫瘍退縮が観察されたことを示すデータも、また本明細書の研究１０および１１において提示される。ＢＣＹ６１３６がＬＵ−０１−００４６ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて有意な抗腫瘍効果を実証し（図１１ならびに表３０および表３１を参照）、ＢＣＹ６１３６について完全な腫瘍退縮が観察されたことを示すデータも、また本明細書の研究１２において提示される。ＢＣＹ６１３６がＬＵ−０１−００４６ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータも、また本明細書の研究１３において提示される（図１２ならびに表３２および表３２を参照）。ＬＵ−０１−００４６ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいてＢＣＹ６１７３が抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７５は腫瘍を根絶したことを示すデータも、また本明細書の研究１４において提示される（図１３〜１５および表３４〜３７を参照）。低い／ごくわずかなＥｐｈＡ２発現を有する細胞株（すなわち、Ｌｕ−０１−０４１２およびＬｕ−０１−０４８６）を利用する２つのモデルにおいてＢＣＹ６１３６の効果を実証するデータも、また本明細書の研究１５および１６において提示される。このデータは図２３および図２４ならびに表３８〜４１において示され、ＢＣＹ６１３６はいずれの細胞株においても腫瘍退縮に対して効果を有しなかったが、Ｌｕ−０１−０４１２細胞株において高発現される標的に結合するＢＣＹであるＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１は、腫瘍を完全に根絶したことを実証する。さらなる実施形態では、がんは乳がんである。いっそうさらなる実施形態では、乳がんはトリプルネガティブ乳がんである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植乳がんモデルにおいてＢＣＹ６１３６が強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが、本明細書の研究１７において提示される（図１８および表４２〜４５を参照）。低い／ごくわずかなＥｐｈＡ２発現を有する細胞株（すなわち、ＥＭＴ６）を利用する乳がんモデルにおいてＢＣＹ６１３６の効果を実証するデータも、また本明細書の研究１８において提示される。このデータは図１９ならびに表４６および表４７において示され、ＢＣＹ６１３６はこの細胞株において腫瘍退縮に対して効果を有しなかったことを実証する。代替的な実施形態では、乳がんはハーセプチン抵抗性乳がんである。理論により縛られるものではないが、ＥｐｈＡ２は、ハーセプチンへの抵抗性に関係があると考えられ、したがって、ＥｐｈＡ２標的化実体は、ハーセプチンに応答しなかった患者において潜在的な有用性を有する。
【０１１２】
さらなる実施形態では、がんは胃がんである。ＢＣＹ６１３６がＮＣＩ−Ｎ８７異種移植胃がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが、本明細書の研究１９において提示される（図２０ならびに表４８および表４９を参照）。
【０１１３】
さらなる実施形態では、がんは卵巣がんである。ＢＣＹ６１３６が、中等度の抗腫瘍活性を実証したＡＤＣ  ＭＥＤＩ−５４７と比較して、ＳＫ−ＯＶ−３異種移植卵巣がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが、本明細書の研究２０において提示される（図２１ならびに表５０および表５１を参照）。
【０１１４】
さらなる実施形態では、がんは食道がんである。ＢＣＹ６１３６がＯＥ−２１異種移植食道がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが、本明細書の研究２１において提示される（図２２ならびに表５２および表５３を参照）。
【０１１５】
さらなる実施形態では、がんは多発性骨髄腫である。ＢＣＹ６１３６がＭＯＬＰ−８異種移植多発性骨髄腫モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６０８２が有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが、本明細書の研究２２において提示される（図２３ならびに表５９および表６０を参照）。
【０１１６】
さらなる実施形態では、がんは線維肉腫である。ＨＴ−１０８０異種移植線維肉腫モデルにおいてＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１３５、ＢＣＹ６１７４およびＢＣＹ６１７５は用量依存的な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６１３６が強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが、本明細書の研究２３において提示される（図２４〜２８ならびに表５６および表５７を参照）。
【０１１７】
「予防」という用語への本明細書における言及は、疾患の誘導前の保護的な組成物の投与を伴う。「抑制」は、誘導性の事象の後であるが疾患の臨床的出現の前の組成物の投与を指す。「治療」は、疾患症状が現れた後の保護的な組成物の投与を伴う。
【０１１８】
疾患からの保護または疾患の治療におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用され得る動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は本発明により促進され、本発明は、ヒトおよび動物標的と交差反応して、動物モデルの使用を可能とし得るポリペプチドリガンドの開発を可能とする。
【０１１９】
さらには、複数の腫瘍種からのＥｐｈＡ２についてのコピー数多型（ＣＮＶ）と遺伝子発現との関連性を実証するデータが本明細書の研究３において提示される。したがって、本発明のさらなる態様によれば、がんを予防、抑制または治療する方法であって、それを必要とする患者に本明細書において定義されるようなペプチドリガンドのエフェクター基および薬物コンジュゲートを投与することを含み、前記患者が、ＥｐｈＡ２の増加したコピー数多型（ＣＮＶ）を有するとして同定される、方法が提供される。
【０１２０】
一実施形態では、がんは、ＥｐｈＡ２の増加したＣＮＶを有するとして本明細書において同定されるものから選択される。さらなる実施形態では、がんは乳がんである。
【０１２１】
以下の実施例を参照して本発明を以下においてさらに記載する。
【実施例】
【０１２２】
【表１】
2021506936.tif 000011
【０１２３】
［材料および方法］
ペプチド合成
ペプチドを固相合成により合成した。Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  Ｒｅｓｉｎを使用した。Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ（０．４〜０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（３．０当量）を含有する混合物にＤＭＦを加えた後、ＤＩＣ（３当量）およびＨＯＡｔ（３当量）を加え、１時間混合した。ＤＭＦ中の２０％のピペリジンをデブロッキングのために使用した。その後の各アミノ酸をＤＭＦ中の活性化試薬、ＤＩＣ（３．０当量）およびＨＯＡＴ（３．０当量）を使用して３当量を用いて連結させた。反応をニンヒドリン呈色反応またはテトラクロル呈色反応によりモニターした。合成完了後に、ＤＭＦ×３、ＭｅＯＨ×３を用いてペプチド樹脂を洗浄した後、Ｎ２バブリング下で終夜乾燥した。次に、９２．５％のＴＦＡ／２．５％のＴＩＳ／２．５％のＥＤＴ／２．５％のＨ２Ｏを用いてペプチド樹脂を３時間処理した。冷イソプロピルエーテルを用いてペプチドを沈殿させ、遠心分離した（３０００ｒｐｍで３分）。イソプロピルエーテルを用いてペレットを２回洗浄し、粗ペプチドを真空下で２時間乾燥した後に凍結乾燥した。凍結乾燥粉末をＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０：５０）中に溶解し、ＡＣＮ中の１００ｍＭのＴＡＴＡの溶液の後にＨ２Ｏ中の重炭酸アンモニウム（１Ｍ）を加え、溶液を１時間混合した。環化が完了したら、１Ｍの水性塩酸システイン（ＴＡＴＡに対して１０当量）を用いて反応を停止させた後に混合し、１時間静置した。溶液を凍結乾燥して粗生成物を得た。粗ペプチドを分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して生成物を得た。
【０１２４】
他に記載しなければ、全てのアミノ酸はＬ配置において使用した。
【０１２５】
ＢＣＹ６０９９
【化６】
2021506936.tif 000012
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号２）−ＣＯＮＨ２
【０１２６】
８．０ｇの樹脂を使用して２．１ｇのＢＣＹ６０９９（９９．２％の純度；１６．３％の収率）を白色固体として生成した。
【０１２７】
【表２】
2021506936.tif 000013
【０１２８】
二環ペプチド薬物コンジュゲートの調製
二環薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）を調製するための概略図を図１に示し、表Ａは、各ＢＤＣ内の成分標的化二環およびリンカー／毒素を記載する。
【０１２９】
【表３】
2021506936.tif 000014
【０１３０】
＜ＢＣＹ６１３５＞
【化７】
2021506936.tif 000015
【０１３１】
ＢＣＹ６０９９（１１４．１ｍｇ、３５．８４μｍｏｌ）を二環試薬として使用した。２２．４ｍｇの化合物ＢＣＹ６１３５（５．３０μｍｏｌ、１７．７４％の収率、９５．１４％の純度）を白色固体として得た。
【０１３２】
【表４】
2021506936.tif 000016
【０１３３】
＜ＢＣＹ６１３６＞
【化８】
2021506936.tif 000017
【０１３４】
ＢＣＹ６０９９（７１．５ｍｇ、２２．４８μｍｏｌ）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６１３６（４０．９ｍｇ、９．０５μｍｏｌ、４０．２７％の収率、９７．４２％の純度）を白色固体として得た。
【０１３５】
【表５】
2021506936.tif 000018
【０１３６】
＜ＢＣＹ６１７３＞
【化９】
2021506936.tif 000019
【０１３７】
ＢＣＹ６０９９（２００．１５ｍｇ、６２．８９μｍｏｌ）を二環試薬として使用した。５７．１ｍｇの化合物ＢＣＹ６１７３（３．４０μｍｏｌ、２２．７９％の収率、９５．８０％の純度）を白色固体として得た。
【０１３８】
【表６】
2021506936.tif 000020
【０１３９】
＜ＢＣＹ６１７４＞
【化１０】
2021506936.tif 000021
【０１４０】
ＢＣＹ６０９９（３８９．７７ｍｇ、１２２．４７μｍｏｌ、１．２当量）を二環試薬として使用した。Ｄｄｅ−ＢＣＹ６１７４（０．２５０ｇ、５５．１０μｍｏｌ、５３．９９％の収率）を白色固体として得た。
【０１４１】
【表７】
2021506936.tif 000022
【０１４２】
一般的手順にしたがってヒドラジンを使用してＤｄｅ−ＢＣＹ６１７４（０．２５０ｇ、５５．１０μｍｏｌ、１．０当量）を脱保護してＢＣＹ６１７４（０．１２０６ｇ、２７．４５μｍｏｌ、４９．８２％の収率）を白色固体として得た。
【０１４３】
【表８】
2021506936.tif 000023
【０１４４】
＜ＢＣＹ６１７５＞
【化１１】
2021506936.tif 000024
【０１４５】
＜化合物１０Ａの調製のための一般的手順＞
ＤＭＡ（３ｍＬ）中のＢＣＹ６０９９（１９５．１５ｍｇ、６１．３２μｍｏｌ、１．１当量）の溶液にＤＩＥＡ（２１．６１ｍｇ、１６７．２３μｍｏｌ、２９．１３μＬ、３当量）および化合物９（０．０８５ｇ、５５．７４μｍｏｌ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物９は完全に消費され、所望のｍ／ｚを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去することにより残留物（淡黄色油）を得た。反応液を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物１０Ａ（０．１６０ｇ、３４．８４μｍｏｌ、６２．５０％の収率）を白色固体として得た。
【０１４６】
＜ＢＣＹ６１７５の調製のための一般的手順＞
ＤＣＭ（４．５ｍＬ）中の化合物１０Ａの溶液にＴＦＡ（４．５ｍＬ）を加えた。混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１０Ａは完全に消費され、所望のｍ／ｚを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去することにより残留物を得、それを分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物ＢＣＹ６１７５（６１．４０ｍｇ、１３．５６μｍｏｌ、３１．１３％の収率）を白色固体として得た。
【０１４７】
［生物学的データ］
＜研究１：蛍光偏光測定＞
（ａ）直接結合アッセイ
蛍光タグ（フルオレセイン、ＳＩＧＭＡ；またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのいずれか）が付されたペプチドを、０．０１％のｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳまたは１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０１％のｔｗｅｅｎを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（共にアッセイ緩衝液と称する）を用いて２．５ｎＭに希釈した。これをペプチドと同じアッセイ緩衝液中のタンパク質の滴定と合わせて、黒壁および黒底の低結合低体積３８４ウェルプレート中の２５μＬの総体積の１ｎＭのペプチド、典型的には、５μＬのアッセイ緩衝液、１０μＬのタンパク質（表１）、そして１０μＬの蛍光ペプチドを得た。２倍の段階希釈を使用して、既知の高親和性結合剤のための５００ｎＭから低親和性結合剤および選択性アッセイのための１０μＭまでの範囲内の最高濃度を有する１２の異なる濃度を得た。測定は、４８５ｎｍにおいて励起されて５２０ｎｍにおいて平行および垂直な放射を検出する「ＦＰ  ４８５  ５２０  ５２０」の光学モジュールを備えたＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳにより実行した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳを２５℃においてウェル当たり２００のフラッシュおよび０．１秒の配置遅延で設定し、各ウェルを５〜１０分間隔で６０分間測定した。ウェル中にタンパク質が存在しない６０分の終わりに各トレーサーについて解析のために使用される増加を決定した。Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０を使用してデータを解析した。ｍＰ値をユーザー定義の二次式にフィッティングしてＫｄ値を生成した：ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（ｘ＋Ｌｉｇ＋Ｋｄ）／２−ｓｑｒｔ（（（（ｘ＋Ｌｉｇ＋Ｋｄ）／２）＾２）−（Ｌｉｇ＊ｘ）））。「Ｌｉｇ」は、使用したトレーサーの濃度の定義された値であった。
【０１４８】
（ｂ）競合結合アッセイ
蛍光タグを有しないペプチドを蛍光タグおよび既知のＫｄを有するペプチドとの競合において試験した（表２）。参照化合物Ａは配列Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−ＡＣＰＷＧＰＡＷＣＰＶＮＲＰＧＣＡ（Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−（配列番号４））を有する。参照化合物Ｂは配列Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−ＡＣＰＷＧＰＦＷＣＰＶＮＲＰＧＣＡ（Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−（配列番号５））を有する。参照化合物Ｃは配列Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−ＡＤＶＴＣＰＷＧＰＦＷＣＰＶＮＲＰＧＣＡ（Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−（配列番号６）を有する。参照化合物Ａ、ＢおよびＣのそれぞれはＴＢＭＢ分子スキャフォールドを含有する。最大５％のＤＭＳＯを用いて直接結合アッセイにおいて記載したようなアッセイ緩衝液中に、適切な濃度までペプチドを希釈した後、２倍に段階希釈した。５μＬの希釈したペプチドをプレートに加えた後に使用する蛍光ペプチドに依存する固定濃度（表２）の１０μＬのヒトまたはマウスＥｐｈＡ２（表１）、次に１０μＬの蛍光ペプチドを加えた。直接結合アッセイと同様に測定を実行したが、最初の測定の前に増加を決定した。データ解析をＳｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０において行い、ｍＰ値をユーザー定義の三次式にフィッティングしてＫｉ値を生成した：
ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（Ｌｉｇ＊（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）））／（（３＊Ｋｌｉｇ）＋（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ））））。
「Ｌｉｇ」、「ＫＬｉｇ」および「Ｐｒｏｔ」はいずれも、それぞれ蛍光ペプチド濃度、蛍光ペプチドのＫｄおよびＥｐｈＡ２濃度に関する定義された値であった。
【０１４９】
【表９】
2021506936.tif 000025
【０１５０】
【表１０】
2021506936.tif 000026
【０１５１】
本発明のある特定のペプチドリガンドを上記のアッセイにおいて試験し、結果を表３および４に示す。
【０１５２】
【表１１】
2021506936.tif 000027
【０１５３】
【表１２】
2021506936.tif 000028
【０１５４】
＜研究２：蛍光偏光測定（代替的なプロトコール）＞
（ａ）競合結合
蛍光タグを有しないペプチドを蛍光タグおよび既知のＫｄを有するペプチドとの競合において試験した（表９）。５μＬの増加（２倍）濃度の試験化合物をプレートに加えた後に使用する蛍光ペプチドに依存する固定濃度（表９）の１０μＬのＥｐｈＡ２タンパク質（表８）、次に１０μＬの蛍光ペプチドを加えた。緩衝液は、ＤＭＳＯ＜１％の上記のようなアッセイ緩衝液であった。測定は、４８５ｎｍにおいて励起されて５２０ｎｍにおいて平行および垂直な放射を検出する「ＦＰ  ４８５  ５２０  ５２０」の光学モジュールを備えたＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳにより実行した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳを２５℃においてウェル当たり２００回のフラッシュおよび０．１秒の配置遅延で設定し、各ウェルを５〜１０分間隔で６０分間測定した。代替的に、測定は、３０回のフラッシュおよび１．２のＧ係数を有するＦＩＴＣ  ＦＰ  Ｄｕａｌ  Ｍｉｒｒｏｒ、ＦＩＴＣ  ＦＰ  ４８０励起フィルターならびにＦＩＴＣ  ＦＰ  Ｐ−ｐｏｌ  ５３５およびＦＩＴＣ  ＦＰ  Ｓ−ｐｏｌ発光フィルターを備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎにおいて類似の時間間隔で行った。データ解析をＳｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０または１３．０において行い、６０分におけるｍＰ値をユーザー定義の三次式にフィッティングしてＫｉ値を生成した：
ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（Ｌｉｇ＊（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）））／（（３＊Ｋｌｉｇ）＋（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ））））。
「Ｌｉｇ」、「ＫＬｉｇ」および「Ｐｒｏｔ」はいずれも、それぞれ蛍光ペプチド濃度、蛍光ペプチドのＫｄおよびＥｐｈＡ２濃度に関する定義された値であった。
【０１５５】
【表１３】
2021506936.tif 000029
【０１５６】
【表１４】
2021506936.tif 000030
【０１５７】
本発明のある特定のペプチドリガンドおよび二環薬物コンジュゲートを上記の競合結合アッセイにおいて試験し、結果を表７に示す。
【０１５８】
【表１５】
2021506936.tif 000031
【０１５９】
表７における競合結合アッセイの結果は、ヒトＥｐｈＡ２標的化二環ペプチド（ＢＣＹ６０９９）は、マウスおよびラットＥｐｈＡ２に高い親和性で結合することを示す。これらの結果は、本発明のペプチドをインビボでのマウスおよびラット有効性および毒物学モデルにおいて使用できることを示す。
【０１６０】
【表１６】
2021506936.tif 000032
【０１６１】
表８は、本発明のある特定の二環薬物コンジュゲートは、ヒト、マウスおよび齧歯動物ＥｐｈＡ２の間で優れた交差反応性を呈することを示す。本発明のペプチドは、したがって、マウスおよびラット有効性および毒物学インビボモデルにおいて使用することができる。
【０１６２】
（ｂ）ＳＰＲ測定
タンパク質に対して３倍モル過剰のビオチンを用いてｐＨ５．４の４ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ中で１時間、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを用いて非Ｆｃ融合タンパク質をビオチン化した。反応混合物のＰＢＳへの透析後にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して標識化の程度を決定した。ペプチド結合の解析のために、ＸａｎＴｅｃ  ＣＭＤ５００Ｄチップを利用してＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて２５℃において標準的なアミン連結化学を使用してストレプトアビジンをチップ上に固定化した。簡潔に述べれば、１０μｌ／分の流速において１：１の比の０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の７分の注入を用いてカルボキシメチルデキストラン表面を活性化させた。ストレプトアビジンの捕捉のために、タンパク質を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、活性化させたチップ表面上に１２０μｌを注入することにより捕捉した。残留の活性化した基を１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）：ＨＢＳ−Ｎ（１：１）の７分の注入を用いて遮断した。緩衝液をＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０に変更し、緩衝液中への０．２μＭまでのタンパク質の希釈を使用してビオチン化ＥｐｈＡ２を５００〜１５００ＲＵのレベルまで捕捉した。０．５％の最終のＤＭＳＯ濃度を用い、５０または１００ｎＭの最高ペプチド濃度および６つのさらなる２倍希釈を用いてこの緩衝液中のペプチドの希釈系列を調製した。６０秒の会合および９００〜１２００秒の解離を用いて９０μｌ／分の流速において２５℃でＳＰＲ分析を実行した。データをＤＭＳＯ除外体積効果について補正した。標準的な処理手順およびデータ処理を使用して全てのデータをブランク注入および参照表面について二重参照化し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア、バージョン２．０ｃ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して速度論的フィッティングを行った。単純な１：１の結合モデルを使用してデータをフィッティングして、適切な場合に物質輸送効果を可能とした。
【０１６３】
二環薬物コンジュゲートの結合についてＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を使用した。ビオチン化タンパク質について固定化レベルは１５００ＲＵであり、最高濃度は１００ｎＭであった。それ以外に、方法は、ＣＭＤ５００ＤまたはＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかを使用する上記したものと同じであった。Ｆｃタグ化タンパク質について、ＣＭ５チップを上記のように活性化させた後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｈ１０５００）をｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中に２０μｇ／ｍｌまで希釈し、約３０００ＲＵまで捕捉した。表面を次に上記のように遮断した。その後にＦｃタグ化タンパク質の捕捉を実行して約２００〜４００ＲＵの標的タンパク質を得た。使用したタンパク質を以下に記載する。製造者の示唆する緩衝液および濃度にしたがって全てのタンパク質を復元し、ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０中の５〜１０μｇ／ｍｌのタンパク質を使用して捕捉した。
【０１６４】
【表１７】
2021506936.tif 000033
【０１６５】
本発明のある特定のペプチドリガンドおよび二環薬物コンジュゲートを上記の競合結合アッセイにおいて試験し、結果を表１０〜１２に示す。
【０１６６】
【表１８】
2021506936.tif 000034
【０１６７】
表１０は、ＳＰＲアッセイを使用して決定したヒトＥｐｈＡ２への選択された二環薬物コンジュゲートの結合についての結合親和性および速度論的パラメーター（ＫｏｆｆおよびＫｏｎ）を詳述する。
【０１６８】
【表１９】
2021506936.tif 000035
【０１６９】
表１１は、密接に関連するヒトエフリンホモログを用いたＳＰＲアッセイにおいて４つの二環薬物コンジュゲート（ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７３）を用いた結合性の結果を示す。結果は、本発明の化合物は、密接に関連するヒトホモログであるＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＢ４への有意な結合を呈しないことを示す。
【０１７０】
【表２０】
2021506936.tif 000036
【０１７１】
表１２の結果は、本発明のある特定の二環薬物コンジュゲート（ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７３）もまたマウスおよびラットＥｐｈＡ２に選択的であり、密接に関連するホモログであるマウスＥｐｈＡ３およびＥｐｈＡ４、ならびにラットＥｐｈＡ３およびＥｐｈＢ１への有意な結合を呈しないことを示す。
【０１７２】
＜研究３および７〜２３＞
研究３および７〜２３のそれぞれにおいて、以下の方法論を各研究のために採用した。
（ａ）材料
（ｉ）動物および飼育条件
動物
種：ハツカネズミ（Ｍｕｓ  Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
株：Ｂａｌｂ／ｃヌードまたはＣＢ１７−ＳＣＩＤ
齢：６〜８週
体重：１８〜２２ｇ
動物の数：９〜９０匹のマウス
動物供給業者：Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．Ｌｉｍｉｔｅｄ
飼育条件
マウスを各ケージ中に３〜５匹の動物で一定の温度および湿度において個々の換気ケージ中に維持した。
・温度：２０〜２６℃
・湿度  ４０〜７０％
ケージ：ポリカーボネート製。サイズは３００ｍｍ×１８０ｍｍ×１５０ｍｍである。ベッド材料はトウモロコシの穂軸であり、週に２回交換する。
食餌：動物は、全研究期間の間に照射滅菌した乾燥顆粒食品に自由にアクセスできた。
水：動物は、無菌の飲料水に自由にアクセスできた。
ケージの同定：各ケージの同定ラベルは以下の情報：動物の番号、性別、系統、受入日、処置、研究番号、群番号および処置の開始日を含有した。
動物の同定：動物は耳の符号化により印をした。
【０１７３】
（ｉｉ）試験および陽性対照物品
【０１７４】
【表２１】
2021506936.tif 000037
【０１７５】
（ｂ）実験の方法および手順
（ｉ）観察
本研究における動物の取扱い、世話および処置に関する全ての手順は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスにしたがって、ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたガイドラインにしたがって行った。ルーチンのモニタリングの時点において、可動性などの正常な挙動、食料および水の消費（視認によってのみ）、体重の増加／減少、目／毛のマッティングおよびプロトコールにおいて述べられるような任意の他の異常な効果に関する腫瘍成長および処置の任意の効果について動物を連日チェックした。死亡および観察された臨床徴候を各サブセット内の動物の番号に基づいて記録した。
【０１７６】
（ｉｉ）腫瘍の測定およびエンドポイント
主要なエンドポイントは、腫瘍成長が遅延され得るかまたはマウスが治癒され得るかを見ることであった。カリパスを使用して２つの次元において腫瘍体積を週に３回測定し、式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径および短径である）を使用してｍｍ３において表した。腫瘍サイズを次にＴ／Ｃ値の算出のために使用した。Ｔ／Ｃ値（パーセント）は、抗腫瘍有効性の指標であり、ＴおよびＣは、所与の日における、それぞれ治療群および対照群の平均体積である。ＴＧＩを式：ＴＧＩ（％）＝［１−（Ｔｉ−Ｔ０）／（Ｖｉ−Ｖ０）］×１００（Ｔｉは所与の日における治療群の平均腫瘍体積であり、Ｔ０は処置開始日における治療群の平均腫瘍体積であり、ＶｉはＴｉと同日におけるビヒクル対照群の平均腫瘍体積であり、Ｖ０は処置開始日におけるビヒクル群の平均腫瘍体積である）を使用して各群について算出した。
【０１７７】
（ｉｉｉ）試料収集
研究の終了時に全ての群の腫瘍をＦＦＰＥのために収集した。
【０１７８】
（ｉｖ）統計解析
平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を含む要約統計量を各時点における各群の腫瘍体積について提供する。
群間の腫瘍体積の差異の統計解析を最終投与後の最良の治療的時点において得られたデータに対して実行した。
一元配置分散分析を行って群間で腫瘍体積を比較し、有意なＦ統計量（誤差分散に対する治療分散の比）が得られた場合、Ｇａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ検定を用いて群間の比較を実行した。全てのデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を使用して解析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意と考えた。
【０１７９】
＜研究３：複数の腫瘍の種類からのＥｐｈＡ２についてのコピー数多型（ＣＮＶ）と遺伝子発現との関連性の研究＞
方法
１．ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／）において全ての研究を選択し、ＥＰＨＡ２について検索する。
（ａ）暫定的な研究を除去する。
（ｂ）重なり合う試料を用いた研究を選択しないようにして試料バイアスを防止する（ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌにおける警告に基づく）。このオプションの場合、ＰａｎＣａｎｃｅｒの研究を常に残す。
（ｃ）解析のために選択した研究（表１３）。
【０１８０】
【表２２−１】
2021506936.tif 000038
【表２２−２】
2021506936.tif 000039
【表２２−３】
2021506936.tif 000040
【０１８１】
２．ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌからのＣＮＶおよびＲＮＡ発現データをエクスポートする。
３．ＣＮＶがＥｐｈＡ２についてのｍＲＮＡ発現の変化と統計的に有意に関連付けられるかどうかを試験する（ｌｏｇ２は適用しない）。
（ａ）ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（７．０４）およびＲ／Ｒ  ｓｔｕｄｉｏにおいてノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定を実行する（有意性の閾値：ｐ＜０．０１）。
（ｉ）ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ：カラムテーブルを設定し、マッチングおよびペアリングのいずれもなしでノンパラメトリック検定を実行し、ガウス分布は仮定しない。
（ｉｉ）Ｒにおいて使用されるパッケージ：
１．ＸＬＣｏｎｎｅｃｔ
２．ｄｐｌｙｒ
３．Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｔｅｓｔ：  Ｋｒｕｓｋａｌ．ｔｅｓｔ。
４．Ｄｕｎｎ検定を使用してＲ／Ｒｓｔｕｄｉｏにおいて多重比較（群内でｎ＝１であったとしても全ての可能な比較を含む）のために調整する（有意性のための閾値：ｐ＜０．０２５）。
（ａ）多重比較方法＝「ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ」を用いるｄｕｎｎ．ｔｅｓｔ。
【０１８２】
結果
結果を以下の表１４に示す。ＥｐｈＡ２についてコピー数多型（ＣＮＶ）およびｍＲＮＡ遺伝子発現の両方を報告するｃＢｉｏＰｏｒｔａｌにおいて編纂された４１の公開されているデータセットにわたり、ＥｐｈＡ２浅欠失（ｓｈａｌｌｏｗ−ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（＜２コピー）を有する症例が報告されている多数のがんの種類がある。より頻度が低いが、これらの同じがんの種類において腫瘍のサブセットはＥｐｈＡ２深欠失（ｄｅｅｐ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（＞１コピーの喪失もしくは両アレルの喪失）、ＥｐｈＡ２増加（２〜３コピー）またはＥｐｈＡ２増幅（＞３コピー）を有した。＞３３％の腫瘍がＥｐｈＡ２において浅欠失または深欠失のいずれかを有した適応症は、色素嫌性腎臓、胆管がん、褐色細胞腫および傍神経節腫、肺扁平がん、乳房、直腸、脳の低グレード神経膠腫、肝臓、副腎皮質がん、中皮腫、食道腺がんおよび結腸がんを含んだ。対照的に、＞３３％の試料がＥｐｈＡ２において増加または増幅のいずれかを有した研究はなかった。合わせると、これらの結果は、ＥｐｈＡ２  ＤＮＡにおける欠失は様々な適応症にわたり見出されることを実証する。
【０１８３】
４１の研究において解析した全ての試料の約３分の１はＥｐｈＡ２  ＣＮＶを有した。研究にわたるこの高いパーセンテージのＣＮＶ、および特定の腫瘍種内の浅欠失の高いパーセンテージに基づいて、統計的検定を行って、コピー数変化とＲＮＡ発現とのあり得る関連性を同定した。適応症当たりの腫瘍を５つのクラスのうちの１つに割り当てた。
ａ）深欠失、
ｂ）浅欠失、
ｃ）二倍体、
ｄ）増加、
ｅ）増幅。
【０１８４】
クラスカル−ウォリス検定を次に行って、クラス当たりのｍＲＮＡ発現値の分布がクラス間で異なるかどうかを検出した（Ｐ＜０．０１）。Ｐ＜０．０１のＴＣＧＡデータセットのためおよびいずれのクラスが互いに異なるかを同定するために、算出された調整Ｐ値（ボンフェローニ）を用いてＺ統計量を算出することにより事後検定を行った。解釈の簡便性のために、適応症当たりの二倍体に対するペアワイズ比較を検討した（但し、全てのペアワイズＰ値を算出した）。これらの４１の研究のうちの１９は、＜０．０１のクラスカル−ウォリスのｐ値を有し、コピー数はＲＮＡ発現と統計的に有意に関連付けられることを実証した。これらの１９の研究のうちの１７は、二倍体対浅欠失について＜０．０２５のボンフェローニ調整Ｐを有し、ＥｐｈＡ２コピー数の減少とのＥｐｈＡ２  ｍＲＮＡ発現の減少の関連性を指し示した。これらの１９の研究のうちの２つのみが、二倍体対増加について＜０．０２５のボンフェローニ調整Ｐを有し、これらは共に乳がん研究であった。さらには、これらの乳がん研究のうちの１つ（Ｂｒｅａｓｔ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＴＣＧＡ、ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ａｔｌａｓ））は、二倍体対浅欠失および二倍体対増加の両方について＜０．０２５のボンフェローニ調整Ｐを有し、コピー数変化は乳がんにおけるＥｐｈＡ２  ＲＮＡ発現に強い影響力を有し得ることを示唆した。
【０１８５】
遺伝学のセントラルドグマは、ＥｐｈＡ２のコピー数の低減はＲＮＡおよびタンパク質発現の低減に繋がることを示唆する。したがって、様々な腫瘍種におけるＥｐｈＡ２のコピー数喪失とｍＲＮＡ発現の低減との観察された関連性は、ＥｐｈＡ２タンパク質発現もまた低減し得ることを示唆する。同様に、ｍＲＮＡ発現の増加と関連付けられた乳がんにおけるＥｐｈＡ２のコピー数増加はまた、ＥｐｈＡ２タンパク質発現の増加を示唆し得る。さらに、より高いＥｐｈＡ２タンパク質発現（ＦＡＣＳにより測定される）は、前臨床インビボモデルにおける本発明のある特定のＥｐｈＡ２二環薬物コンジュゲートの有効性（腫瘍体積により測定される）の増加と関連付けられる。合わせると、ｍＲＮＡ発現変化と関連付けられるコピー数変化がタンパク質発現レベルを予測する場合、ＥｐｈＡ２のコピー数欠失を含有する腫瘍を有する患者は本発明のＥｐｈＡ２二環薬物コンジュゲートに応答する可能性がより低い可能性がある。同様に、ＥｐｈＡ２において腫瘍コピー数増加を有する（例えば、乳がん）患者は、本発明のＥｐｈＡ２二環薬物コンジュゲートに応答する可能性がより高い可能性がある。したがって、患者をＥｐｈＡ２コピー数状態により層化した場合、この情報は、有効性を増加させるために、本発明のＥｐｈＡ２二環薬物コンジュゲートを用いる治療のための患者の除外および選択の両方のために使用され得る。
【０１８６】
【表２３−１】
2021506936.tif 000041
【表２３−２】
2021506936.tif 000042
【表２３−３】
2021506936.tif 000043
【表２３−４】
2021506936.tif 000044
【表２３−５】
2021506936.tif 000045
【表２３−６】
2021506936.tif 000046
【表２３−７】
2021506936.tif 000047
【表２３−８】
2021506936.tif 000048
【表２３−９】
2021506936.tif 000049
【表２３−１０】
2021506936.tif 000050
【表２３−１１】
2021506936.tif 000051
【表２３−１２】
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【表２３−１３】
2021506936.tif 000053
【表２３−１４】
2021506936.tif 000054
【表２３−１５】
2021506936.tif 000055
【０１８７】
＜研究４：ＣＤＸ異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６のインビボでの有効性＞
本研究では、ＨＴ１０８０線維肉腫株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳がん株およびＮＣＩ−Ｈ１９７５非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）株の３つのがん細胞株由来（ＣＤＸ）モデルにおいてＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。
【０１８８】
（ａ）実験方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹の皮下に腫瘍細胞を接種し、平均平均腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ３に達した時点で薬物処置を開始した。腫瘍測定および統計解析は上記のように行った。腫瘍を有する動物をＢＣＹ６１３６またはビヒクルを用いて週に１回処置した。
【０１８９】
（ｂ）考察
図４〜６は、ＢＣＹ６１３６は週に１回の投与後に乳房、肺および線維肉腫異種移植モデルにおいて効果的であることを示す。
【０１９０】
ＨＴ１０８０線維肉腫モデル：
ＨＴ１０８０モデルにおいて、０および７日目における３および５ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６の週１回投与後、１４日目までに腫瘍成長の完全な退縮が達成された（図４）。０および７日目における２ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６の週１回の投与は腫瘍静止（部分的な退縮）を生じさせた（図２）。ＢＣＹ６１３６処置は有意な体重損失を生じさせず、研究の全体を通じて薬物処置マウスにおいて有害な臨床的所見はなかった。
【０１９１】
ＮＣＩ−Ｈ１９７５  ＮＳＣＬＣモデル：
２および３ｍｇ／ｋｇの週１回のＢＣＹ６１３６の投与後、約２８日目までにＮＣＩ−Ｈ１９７５モデルにおいて腫瘍成長の完全な退縮が観察された（図３）。３５日目における投与中止後、３５日目から３ｍｇ／ｋｇアームの測定が終了した７２日目までに３ｍｇ／ｋｇ処置動物において腫瘍再成長は観察されなかった（図３）。２ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６の投与は、このモデルにおいて約２８日目からの完全な退縮を生じさせた。３５日目における投与中止後に２ｍｇ／ｋｇの用量での約５１日目まで腫瘍再成長はなかった。この用量レベルにおいて中等度の腫瘍再成長が約５１日目から７７日目の研究終了まで観察された。１ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ６１３６での処置は腫瘍静止（部分的な退縮）を生じさせた（図３）。ＢＣＹ６１３６処置は有意な体重損失を生じさせず、研究の全体を通じて薬物処置マウスにおいて有害な臨床的所見はなかった。
【０１９２】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房モデル：
０〜４５日目の２および３ｍｇ／ｋｇでの週に１回の投与後にＭＤＡ−ＭＢ２３１モデルにおいて腫瘍静止（部分的な退縮）が観察された（図４）。２ｍｇ／ｋｇ処置動物においてある程度の体重損失（腫瘍負荷に帰せられる）が観察された。
【０１９３】
これらの結果は、ＢＣＹ６１３６は、線維肉腫、乳房および肺ＣＤＸ異種移植片を移植されたマウスにおいて１日１回の投与後に甚大な腫瘍成長阻害を生じさせることを実証する。
【０１９４】
＜研究５：ラットにおける安全性研究＞
６匹の雌ラットを２ラット／群の３群に無作為に割り当てて、１および８日目における５、７．５および１０ｍｇ／ｋｇでのＩＶボーラス注射による投与後にＢＣＹ６１３６の毒性を決定した。研究を１５日目に終了した。
【０１９５】
凝固パラメーター（プロトロンビン時間（秒）、活性化部分トロンボプラスチン時間（秒）またはフィブロギノゲン（ｆｉｂｒｏｇｉｎｏｇｅｎ）レベル（ｇ／Ｌ）に対する有意な効果は２、１２および１５日目に観察されなかった（データ示さず）。生存中の出血事象は報告されず、病理学的検査後に内出血の証拠は検出されなかった。
【０１９６】
＜研究６：カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）における安全性研究＞
ＢＣＹ６１３６を用いた２８日の毒物学研究をカニクイザルにおいて実行した。ＢＣＹ６１３６を１、８、１５および２２日目に１．０および２．０ｍｇ／ｋｇで投与した。２９日目（最終用量の７日後）に動物を安楽死させ、検死した。
【０１９７】
ベースラインと比べて凝固パラメーターに対する有意な効果は１８、２２および２５（データ示さず）および２９日目（表１５）に観察されなかった。生存中の出血事象は報告されず、病理学的検査後に内出血の証拠は検出されなかった。
【０１９８】
【表２４】
2021506936.tif 000056
【０１９９】
＜研究７：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣのインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＰＣ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０２００】
（ｂ）実験の設計
【０２０１】
【表２５】
2021506936.tif 000057
【０２０２】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱非働化ウシ胎仔血清を添加したＦ１２Ｋ培地中でＰＣ−３腫瘍細胞を維持する。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養する。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数する。
【０２０３】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにＰＣ−３（１０＊１０６）腫瘍細胞を接種する。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達した時点で処置を開始する。試験品投与および各群中の動物数を以下の実験設計の表に示す。
【０２０４】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０２０５】
【表２６】
2021506936.tif 000058
【０２０６】
（ｄ）結果
【０２０７】
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図５および図６に示す。
【０２０８】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＰＣ−３異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表１６に示す。
【０２０９】
【表２７−１】
2021506936.tif 000059
【表２７−２】
2021506936.tif 000060
【０２１０】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＰＣ−３異種移植モデルにおける試験品の腫瘍成長阻害率を処置の開始後１６日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０２１１】
【表２８】
2021506936.tif 000061
【０２１２】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＰＣ−３異種移植モデルにおける試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図５および図６ならびに表１６および表１７に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは１６日目に２０７０ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１０７ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０２．２％、ｐ＜０．００１）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝７９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０３．６％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝７０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０４．１％、ｐ＜０．００１）は強力な抗腫瘍効果を示した。この研究では、動物の体重を定期的にモニターした。全てのマウスは体重を良好に維持した。
【０２１３】
＜研究８．Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０２１４】
（ｂ）実験の設計
【０２１５】
【表２９】
2021506936.tif 000062
【０２１６】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱非働化ウシ胎仔血清を添加したＦ−１２Ｋ培地中で腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０２１７】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるために０．２ｍｌのＰＢＳ中のＰＣ−３腫瘍細胞（１０×１０６）を接種した。５２匹の動物を平均腫瘍体積が４５４ｍｍ３に達した時点で無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０２１８】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０２１９】
【表３０】
2021506936.tif 000063
【０２２０】
（ｃ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図７に示す。
【０２２１】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＰＣ−３異種移植片を有する雄Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表１８に示す。
【０２２２】
【表３１−１】
2021506936.tif 000064
【表３１−２】
2021506936.tif 000065
【０２２３】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＰＣ−３異種移植モデルにおける試験品の腫瘍成長阻害率を処置の開始後２０日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０２２４】
【表３２】
2021506936.tif 000066
【０２２５】
（ｄ）結果の要約および考察
この研究では、ＰＣ−３異種移植モデルにおける試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図７ならびに表１８および表１９に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２０日目に２３６４ｍｍ３に達した。０．１６７ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１１８８ｍｍ３、ＴＧＩ＝６１．４％、ｐ＜０．００１）、０．５ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｗ（ＴＶ＝５３０ｍｍ３、ＴＧＩ＝９６．０％、ｐ＜０．００１）、０．５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２３４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．４％、ｐ＜０．００１）および１．５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１３１ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１７．２％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は、２０日目に用量または投与頻度依存的な方式で有意な抗腫瘍活性を生じた。１．５ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１２８ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１７．０％、ｐ＜０．００１）は、１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６と同等の抗腫瘍活性を生じた。それらの中で、０．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６、または０．５ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗのＢＣＹ６１３６を用いて処置したマウスは処置の中止後に明らかな腫瘍再発を示し、５２日目からの１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６を用いたさらなる処置は腫瘍退縮に良好に働いた。１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗのＢＣＹ６１３６を用いて処置したマウスもまた処置の中止後に腫瘍再発を示したが、さらなる投与は完全な腫瘍退縮に働かなかった。１．５ｍｐｋ  ｑｗのＢＣＹ６１３６を用いて処置したマウスは４８日目までいかなる腫瘍再発も示さなかった。
０．３３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１６３７ｍｍ３、ＴＧＩ＝３８．１％、ｐ＜０．００１）、１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝９８１ｍｍ３、ＴＧＩ＝７２．２％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１８４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１４．０％、ｐ＜０．００１）でのＥｐｈＡ２−ＡＤＣは、２０日目に用量依存的な方式で有意な抗腫瘍活性を生じた。３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＥｐｈＡ２−ＡＤＣを用いて処置したマウスは５９日目までいかなる腫瘍再発も示さなかった。
１５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのドセタキセル（ＴＶ＝４１９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０１．８％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍活性を生じたが、重篤な動物の体重損失を引き起こした。処置の中止後に、マウスは明らかな腫瘍再発を示した。４２日目からの１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６を用いた処置はこれらのマウスの腫瘍退縮に良好に働いた。
【０２２６】
＜研究９．Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植モデルの処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することであった。
【０２２７】
（ｂ）実験の設計
【０２２８】
【表３３】
2021506936.tif 000067
【０２２９】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０２３０】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるために０．２ｍｌのＰＢＳ中のＮＣＩ−Ｈ１９７５腫瘍細胞（１０×１０＾６）を接種した。３６匹の動物を平均腫瘍体積が１４９ｍｍ３に達した時点で無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０２３１】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０２３２】
【表３４】
2021506936.tif 000068
【０２３３】
（ｉｖ）試料収集
ＰＧ−Ｄ４４において、ＦＦＰＥのために群２の腫瘍を固定した。
研究の終了時に、ＦＦＰＥのために群３の腫瘍をした。
【０２３４】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長を図８に示す。
【０２３５】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表２０〜２４に示す。
【０２３６】
【表３５】
2021506936.tif 000069
【０２３７】
【表３６】
2021506936.tif 000070
【０２３８】
【表３７】
2021506936.tif 000071
【０２３９】
【表３８】
2021506936.tif 000072
【０２４０】
【表３９】
2021506936.tif 000073
【０２４１】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２１日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０２４２】
【表４０】
2021506936.tif 000074
【０２４３】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図８および表２０〜２５に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２１日目に２３７１ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２０５ｍｍ３、ＴＧＩ＝９７．５％、ｐ＜０．００１）、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝９９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０２．３％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝９４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０２．４％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を生じた。２ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６は腫瘍を根絶し、または小さいサイズまで腫瘍を退縮させた。処置を３５日目から中止したところ、３ｍｇ／ｋｇ群における腫瘍はその後の５〜６週のモニタリング中に明らかな再成長を示さなかったが、２ｍｇ／ｋｇ群における腫瘍は明らかな再成長を示し、投与を再開した時点で有意な腫瘍阻害を示さなかった。この研究では、マウスは体重を良好に維持した。
【０２４４】
＜研究１０．Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０２４５】
（ｂ）実験の設計
【０２４６】
【表４１】
2021506936.tif 000075
【０２４７】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにＬＵ−０１−０２５１の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。有効性試験のために平均腫瘍体積が１７４ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０２４８】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０２４９】
【表４２】
2021506936.tif 000076
【０２５０】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図９に示す。
【０２５１】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−０２５１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける処置の開始後２８日目の平均腫瘍体積を表２６に示す。
【０２５２】
【表４３】
2021506936.tif 000077
【０２５３】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣについての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２８日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０２５４】
【表４４】
2021506936.tif 000078
【０２５５】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣの治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図９ならびに表２６および表２７に示す。
この研究では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍体積は処置の開始後２８日目に２２０８ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４９９ｍｍ３、ＴＧＩ＝８４．０％、ｐ＜０．００１）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝３２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０７．０％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．６％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝３９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０６．６％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍活性を示した。
【０２５６】
＜研究１１：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０２５７】
（ｂ）実験の設計
【０２５８】
【表４５】
2021506936.tif 000079
【０２５９】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにＬＵ−０１−０２５１の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。有効性試験のために平均腫瘍体積が９６０ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０２６０】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０２６１】
【表４６】
2021506936.tif 000080
【０２６２】
（ｉｉｉ）試料収集
マウス＃３−２の腫瘍をＦＦＰＥのために９４日目に収集した。マウス＃５−２および５−３の腫瘍を収集し、１４０日目に１つのＦＦＰＥブロックに埋め込んだ。
【０２６３】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図１０に示す。
【０２６４】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−０２５１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける処置の開始後０日目から２８日目の平均腫瘍体積を表２８に示す。
【０２６５】
【表４７】
2021506936.tif 000081
【０２６６】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣについての腫瘍成長阻害率を処置の開始後１７日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０２６７】
【表４８】
2021506936.tif 000082
【０２６８】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣの治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図１０ならびに表２８および表２９に示す。
この研究では、平均腫瘍体積が９６０ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。処置の開始後１７日目に、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍体積は２３０１ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１６７２ｍｍ３、ＴＧＩ＝４７．０％、ｐ＞０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を示さず、２ｍｇ／ｋｇ  ｑｗ（ＴＶ＝３９８ｍｍ３、ＴＧＩ＝１４２．１％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗ（ＴＶ＝２１６ｍｍ３、ＴＧＩ＝１５５．６％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は１７日目に用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
２ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＢＣＹ６１３６を用いた７０日の処置後に、これらの５匹のマウスのうちの３匹は完全な腫瘍退縮を示し、他の２匹のマウスは４２日目から７７日目まで明らかな腫瘍再発を示した。次に３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６を用いたさらなる処置を２つの再発腫瘍に７日目から行ったところ、腫瘍の１つは明らかな腫瘍退縮を示し、別の１つは処置への抵抗性を示した。
３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＢＣＹ６１３６を用いた５６日の処置後に、この群の全てのマウスは完全な腫瘍退縮を示した。
３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝１１４３ｍｍ３、ＴＧＩ＝８６．３％、ｐ＜０．０１）は１７日目に明らかな抗腫瘍活性を示し、さらなる５３日の処置後に、これらのマウスは完全ではないがさらなる腫瘍退縮を示した。
この研究では、一部のマウスは突然の体重損失を示し、これは免疫不全マウスの長期飼養と関係性を有し得る。
【０２６９】
＜研究１２：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける大きいＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸ腫瘍においてＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０２７０】
（ｂ）実験の設計
【０２７１】
【表４９】
2021506936.tif 000083
【０２７２】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにＬＵ−０１−００４６の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。平均腫瘍体積が１０３９ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０２７３】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０２７４】
【表５０】
2021506936.tif 000084
【０２７５】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図１１に示す。
【０２７６】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表３０に示す。
【０２７７】
【表５１】
2021506936.tif 000085
【０２７８】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおける試験品の腫瘍成長阻害率を２セクション研究のそれぞれについて、処置の開始後それぞれ２２日目および２８日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０２７９】
【表５２】
2021506936.tif 000086
【０２８０】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、大きいＬＵ−０１−００４６腫瘍における試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図１１ならびに表３０および表３１に示す。
この研究において、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２２日目に６１８６ｍｍ３と算出された。１ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６および３ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣは、１０００ｍｍ３の腫瘍サイズから処置を開始した場合に明らかな抗腫瘍活性を示さなかった。
３ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝２３３ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１５．６％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍抗腫瘍活性を生じた。特に、ＢＣＹ６１３６は２／５および４／５の腫瘍を完全に根絶した。
【０２８１】
＜研究１３：ＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルを有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルを有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいてＢＣＹ６１３６のインビボ治療効果を評価することであった。
【０２８２】
（ｂ）実験の設計
【０２８３】
【表５３】
2021506936.tif 000087
【０２８４】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにある特定の種類の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。平均腫瘍体積が約１９８ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０２８５】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０２８６】
【表５４】
2021506936.tif 000088
【０２８７】
（ｉｉｉ）試料収集
群は、平均腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えた時点で終了させ、群１はＰＧ−Ｄ１４、群５はＰＧ−Ｄ１８、群２＆６はＰＧ−Ｄ２１、群３＆４はＰＧ−Ｄ３１において最後の測定の後に腫瘍をＦＦＰＥのために回収した。
【０２８８】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図１２に示す。
【０２８９】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルを有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表３２に示す。
【０２９０】
【表５５】
2021506936.tif 000089
【０２９１】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルを有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける試験品の腫瘍成長阻害率をＰＧ−Ｄ１４において測定された腫瘍体積に基づいて算出した。
【０２９２】
【表５６】
2021506936.tif 000090
【０２９３】
（ｅ）結果の要約および考察
本研究では、ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおける試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図１２ならびに表３２および表３３に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズはＰＧ−Ｄ１４において２３０７ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１０５８ｍｍ３、ＴＧＩ＝５９．１％、ｐ＜０．０５）、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２６４ｍｍ３、ＴＧＩ＝９７．０％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２６ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．３％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。３ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣは明らかな抗腫瘍活性を示さなかった（ｐ＞０．０５）。
この研究では、全ての群の動物は体重を良好に維持した。
【０２９４】
＜研究１４：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６１７３およびＢＣＹ６１７５のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおいて試験品のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０２９５】
（ｂ）実験の設計
【０２９６】
【表５７】
2021506936.tif 000091
【０２９７】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにＬＵ−０１−００４６の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。平均腫瘍体積がパート１の研究について２００ｍｍ３、パート２の研究について１９２ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０２９８】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０２９９】
【表５８】
2021506936.tif 000092
【０３００】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図１３〜１５に示す。
【０３０１】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける処置の開始後２１日目の平均腫瘍体積を表３４および表３５に示す。
【０３０２】
【表５９】
2021506936.tif 000093
【０３０３】
【表６０】
2021506936.tif 000094
【０３０４】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおける試験品の腫瘍成長阻害率を処置の開始後２１日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０３０５】
【表６１】
2021506936.tif 000095
【０３０６】
【表６２】
2021506936.tif 000096
【０３０７】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおける試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図１３〜１５および表３４〜３７に示す。
パート１の研究では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは処置の開始後２１日目に２５５１ｍｍ３に達した。
１／２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１２８５ｍｍ３、ＴＧＩ＝５３．９％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍活性を生じたが、いかなる腫瘍退縮も呈しなかった。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．５％、ｐ＜０．００１）は腫瘍を完全に根絶し、ＢＣＹ６１３６  ３ｍｇ／ｋｇ群におけるそれぞれ５個の腫瘍のうちの１つは投与停止後に再成長を示し、投与を再開した時点で腫瘍はＢＩＣＹ６１３６処置に抵抗性であった。ＢＣＹ６１３６群における残存腫瘍（各群について４／５）は、投与停止の８０日後に再成長を示さなかった。
パート２の研究では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは処置の開始後２１日目に２３４２ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１７３（ＴＶ＝２１５１ｍｍ３、ＴＧＩ＝８．９％，ｐ＞０．０５）は抗腫瘍抗腫瘍活性を示さなかった。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１７３（ＴＶ＝８９０ｍｍ３、ＴＧＩ＝６７．５％、ｐ＜０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を生じた。
３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１７５（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．９％、ｐ＜０．００１）は１４日目に４／５の腫瘍を完全に根絶した。
【０３０８】
＜研究１５：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０４１２  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
プロジェクトの目的は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０４１２  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６１３６のインビボ治療効果を評価することである。
【０３０９】
（ｂ）実験の設計
【０３１０】
【表６３】
2021506936.tif 000097
【０３１１】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにＬＵ−０１−０４１２腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。平均腫瘍体積が１５９ｍｍ３に達した時点で動物を無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０３１２】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０３１３】
【表６４】
2021506936.tif 000098
【０３１４】
（ｉｉｉ）試料収集
ビヒクルならびにＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１を用いて処置した３匹の追加のマウスからの血漿を投与後３０分および２４時間に収集した。ビヒクルならびにＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１を用いて処置した３匹の追加のマウスからの腫瘍を投与後２４時間に収集した。
【０３１５】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図１６に示す。
【０３１６】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−０４１２異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表３８に示す。
【０３１７】
【表６５】
2021506936.tif 000099
【０３１８】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−０４１２異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後３２日目の腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０３１９】
【表６６】
2021506936.tif 000100
【０３２０】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−０４１２異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図１６ならびに表３８および表３９に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍体積は処置の開始後３２日目に１１０４ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×４（ＴＶ＝７５８ｍｍ３、ＴＧＩ＝３６．７％、ｐ＜０．０５）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×４（ＴＶ＝４１６ｍｍ３、ＴＧＩ＝７２．９％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な抗腫瘍活性を生じたが、いかなる腫瘍退縮も示さなかった。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×４でのＢＣＹ８２４５（ＴＶ＝１ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１６．８％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×４でのＢＣＹ８７８１（ＴＶ＝１２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１５．６％、ｐ＜０．００１）は腫瘍を明らかに退縮させた。それらの中で、３ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ８２４５を用いて処置された６つの腫瘍の内の５つおよび３ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ８７８１を用いて処置された６つの腫瘍の内の２つは３２日目に完全に根絶された。
この研究では、全ての群の動物は体重を良好に維持した。
【０３２１】
＜研究１６：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０４８６  ＰＤＸモデルの処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０４８６  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０３２２】
（ｂ）実験の設計
【０３２３】
【表６７】
2021506936.tif 000101
【０３２４】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにＬＵ−０１−０４８６の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。有効性試験のために平均腫瘍体積が１８０ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０３２５】
【表６８】
2021506936.tif 000102
【０３２６】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図１７に示す。
【０３２７】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−０４８６異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける処置の開始後１４日目の平均腫瘍体積を表４０に示す。
【０３２８】
【表６９】
2021506936.tif 000103
【０３２９】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−０４８６  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後１４日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０３３０】
【表７０】
2021506936.tif 000104
【０３３１】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−０４８６  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図１７ならびに表４０および表４１に示す。
この研究では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍体積は処置の開始後１４日目に６５１ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝６３８ｍｍ３、ＴＧＩ＝３．０％、ｐ＞０．０５）および２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝６４５ｍｍ３、ＴＧＩ＝１．２％、ｐ＞０．０５）でのＢＣＹ６１３６はいかなる抗腫瘍活性も示さなかった。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝４４９ｍｍ３、ＴＧＩ＝４３．１％、ｐ＞０．０５）は統計的有意性を伴わずにわずかな抗腫瘍活性を生じた。
【０３３２】
＜研究１７：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
【０３３３】
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植モデルの処置においてＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することであった。
【０３３４】
（ｂ）実験の設計
【０３３５】
【表７１】
2021506936.tif 000105
【０３３６】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０３３７】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるために０．１ｍｌのマトリゲルと共に０．１ｍｌのＰＢＳ中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍細胞（１０×１０＾６）を接種した。３６匹の動物を平均腫瘍体積が１５９ｍｍ３に達した時点で無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０３３８】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０３３９】
【表７２】
2021506936.tif 000106
【０３４０】
（ｉｖ）試料収集
ＰＧ−Ｄ３３において、群２の腫瘍を収集し、それをＦＦＰＥのために固定した。
研究の終了時に、群３および４の腫瘍を収集し、それをＦＦＰＥのために固定した。
【０３４１】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長を図１８に示す。
【０３４２】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表４２〜４４に示す。
【０３４３】
【表７３】
2021506936.tif 000107
【０３４４】
【表７４】
2021506936.tif 000108
【０３４５】
【表７５】
2021506936.tif 000109
【０３４６】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２１日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０３４７】
【表７６】
2021506936.tif 000110
【０３４８】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図１８および表４２〜４５に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２１日目に１６６１ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝９９４ｍｍ３、ＴＧＩ＝４４．４％、ｐ＜０．０１）は中等度の抗腫瘍活性を示し、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝３３ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．４％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１３２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０１．１％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を生じたが、腫瘍は２８日目から明らかな再成長を示した。この研究では、２ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ６１３６を用いて処置した１匹のマウスは処置スケジュールの間に１５％を超える体重を損失したが、他のマウスは体重を良好に維持した。
【０３４９】
＜研究１８：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＭＴ−６同系モデルの処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＭＴ−６同系モデルの処置においてＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することであった。
【０３５０】
（ｂ）実験の設計
【０３５１】
【表７７】
2021506936.tif 000111
【０３５２】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱非働化ウシ胎仔血清を添加したＥＭＥＭ培地中の単層培養物としてＥＭＴ−６腫瘍細胞をインビトロで維持した。腫瘍細胞を週に２回トリプシン−ＥＤＴＡ処理により通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０３５３】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるために０．１ｍｌのＰＢＳ中のＥＭＴ−６腫瘍細胞（５×１０６）を接種した。４４匹の動物を平均腫瘍体積が７５ｍｍ３に達した時点で無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０３５４】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０３５５】
【表７８】
2021506936.tif 000112
【０３５６】
【表７９】
2021506936.tif 000113
【０３５７】
（ｉｖ）試料収集
１１日目に予備のマウスから３つの腫瘍をＦＡＣＳのために収集した。データは生物学チームにより供給された。
【０３５８】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図１９に示す。
【０３５９】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＥＭＴ−６同系移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表４６に示す。
【０３６０】
【表８０】
2021506936.tif 000114
【０３６１】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＥＭＴ−６同系モデルにおけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２１日目の腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０３６２】
【表８１】
2021506936.tif 000115
【０３６３】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＥＭＴ−６同系モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図１９ならびに表４６および表４７に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２１日目に１４９９ｍｍ３に達した。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝５６１ｍｍ３、ＴＧＩ＝６６．２％、ｐ＜０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を示した。１／５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１２７２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１６．１％、ｐ＞０．０５）および０．３／３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１３９４ｍｍ３、ＴＧＩ＝７．４％、ｐ＞０．０５）はいかなる抗腫瘍活性も示さなかった。
群３および群４の投与量を１４日目から５ｍｐｋおよび３ｍｐｋに変更した。腫瘍性潰瘍形成が１４日目にマウス３〜５において見出され、抗生物質クリームを用いてマウスを処置した。この研究では、全てのマウスは体重を良好に維持した。
【０３６４】
＜研究１９：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０３６５】
（ｂ）実験の設計
【０３６６】
【表８２】
2021506936.tif 000116
【０３６７】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱非働化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中でＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０３６８】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるために０．２ｍｌのＰＢＳ中で、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍細胞（１０×１０６）をマトリゲルと共に（１：１）接種した。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１７６ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０３６９】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０３７０】
【表８３】
2021506936.tif 000117
【０３７１】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図２０に示す。
【０３７２】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表４８に示す。
【０３７３】
【表８４】
2021506936.tif 000118
【０３７４】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片におけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後３０日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０３７５】
【表８５】
2021506936.tif 000119
【０３７６】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＮＣＩ−Ｎ８７モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図２０ならびに表４８および表４９に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは３０日目に１４６５ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４２５ｍｍ３、ＴＧＩ＝８０．７％、ｐ＜０．００１）および２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２１０ｍｍ３、ＴＧＩ＝９７．４％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な方式で有意な抗腫瘍活性を生じ、３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝２０１ｍｍ３、ＴＧＩ＝９８．１％、ｐ＜０．００１）は２ｍｐｋでのＢＣＹ６１３６と同等の抗腫瘍活性を示した。
この研究では、処置スケジュールの間に全ての群において明らかな体重損失は見出されなかった。
【０３７７】
＜研究２０：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＳＫ−ＯＶ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
【０３７８】
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＳＫ−ＯＶ−３異種移植片の処置においてＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０３７９】
（ｂ）実験の設計
【０３８０】
【表８６】
2021506936.tif 000120
【０３８１】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱非働化ウシ胎仔血清を添加したＭｃＣｏｙ  ５ａ培地中にＳＫ−ＯＶ−３腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０３８２】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるために０．２ｍｌのＰＢＳ中で、ＳＫ−ＯＶ−３腫瘍細胞（１０×１０６）をマトリゲルと共に（１：１）接種した。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１８６ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０３８３】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０３８４】
【表８７】
2021506936.tif 000121
【０３８５】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図２１に示す。
【０３８６】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＳＫ−ＯＶ−３異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５０に示す。
【０３８７】
【表８８】
2021506936.tif 000122
【０３８８】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＳＫ−ＯＶ−３異種移植片におけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２８日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０３８９】
【表８９】
2021506936.tif 000123
【０３９０】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＳＫ−ＯＶ−３モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図２１ならびに表５０および表５１に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２８日目に１５６０ｍｍ３に達した。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝６８４ｍｍ３、ＴＧＩ＝６３．８％、ｐ＜０．０１）は中等度の抗腫瘍有効性を示した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１０３５ｍｍ３、ＴＧＩ＝３８．１％、ｐ＞０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を示さなかった。２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２７７ｍｍ３、ＴＧＩ＝９３．３％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２５４ｍｍ３、ＴＧＩ＝９５．０％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は有意な抗腫瘍活性を生じた。
この研究では、処置スケジュールの間に全ての群において明らかな体重損失は見出されなかった。
【０３９１】
＜研究２１：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＯＥ２１異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＯＥ２１異種移植片の処置においてＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０３９２】
（ｂ）実験の設計
【０３９３】
【表９０】
2021506936.tif 000124
【０３９４】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱非働化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中にＯＥ２１腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０３９５】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるために０．２ｍｌのＰＢＳ中で、ＯＥ２１腫瘍細胞（５×１０６）をマトリゲルと共に（１：１）接種した。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１５７ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０３９６】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０３９７】
【表９１】
2021506936.tif 000125
【０３９８】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図２２に示す。
【０３９９】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＯＥ２１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５２に示す。
【０４００】
【表９２】
2021506936.tif 000126
【０４０１】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＯＥ２１異種移植片におけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２３日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０４０２】
【表９３】
2021506936.tif 000127
【０４０３】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＯＥ２１モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図２２ならびに表５２および表５３に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２３日目に１５８６ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１１５５ｍｍ３、ＴＧＩ＝３０．４％  ｐ＜０．０５）はわずかな抗腫瘍活性を示した。２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝５３７ｍｍ３、ＴＧＩ＝７３．４％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４８９ｍｍ３、ＴＧＩ＝７６．７％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は有意な抗腫瘍活性を生じた。
この研究では、処置スケジュールの間に全ての群において明らかな体重損失は見出されなかった。
【０４０４】
＜研究２２：ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＬＰ−８異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＬＰ−８異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のインビボ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０４０５】
（ｂ）実験の設計
【０４０６】
【表９４】
2021506936.tif 000128
【０４０７】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において２０％の熱非働化ウシ胎仔血清を添加したＲＭＰＩ−１６４０中の単層培養物としてＭＯＬＰ−８腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０４０８】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるために５０％のマトリゲルと共に０．２ｍｌのＰＢＳ中のＭＯＬＰ−８腫瘍細胞（１０×１０６）を接種した。３６匹の動物を平均腫瘍体積が１４１ｍｍ３に達した時点で無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０４０９】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０４１０】
【表９５】
2021506936.tif 000129
【０４１１】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図２３に示す。
【０４１２】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＭＯＬＰ−８異種移植片を有する雌ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５４に示す。
【０４１３】
【表９６】
2021506936.tif 000130
【０４１４】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＭＯＬＰ−８異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後１４日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０４１５】
【表９７】
2021506936.tif 000131
【０４１６】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＭＯＬＰ−８異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図２３ならびに表５４および表５５に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは１４日目に２５２８ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１１４６ｍｍ３、ＴＧＩ＝４５．５％、ｐ＞０．０５）、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１２１８ｍｍ３、ＴＧＩ＝５４．９％、ｐ＜０．０５）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝９３８ｍｍ３、ＴＧＩ＝６６．７％、ｐ＜０．０１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な抗腫瘍活性を生じたが、全ての投与量はＭＯＬＰ−８異種移植片において腫瘍を退縮させなかった。この研究では、全てのマウスは体重を良好に維持した。
【０４１７】
＜研究２３：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＨＴ１０８０異種移植片の処置におけるＢＣＹのインビボ有効性試験＞
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＨＴ１０８０異種移植モデルの処置においてＢＣＹのインビボ抗腫瘍有効性を評価することであった。
【０４１８】
（ｂ）実験の設計
【０４１９】
【表９８】
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【０４２０】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱非働化ウシ胎仔血清を添加した培地中でＨＴ１０８０腫瘍細胞を維持する。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養する。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数する。
【０４２１】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍を発生させるためにＨＴ１０８０腫瘍細胞（５×１０６）を接種する。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１５０〜２００ｍｍ３に達した時点で処置を開始する。試験品投与および各群中の動物数を以下の実験設計の表に示す。
【０４２２】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０４２３】
【表９９−１】
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【表９９−２】
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【０４２４】
（ｄ）結果
（ｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図２４〜２９に示す。
【０４２５】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５６に示す。
【０４２６】
【表１００−１】
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【表１００−２】
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【０４２７】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＨＴ１０８０異種移植モデルにおけるＢＣＹについての腫瘍成長阻害率を処置の開始後１４日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０４２８】
【表１０１】
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【０４２９】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＨＴ１０８０異種移植モデルにおけるＢＣＹの治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された腫瘍体積を図２４〜２９ならびに表５６および表５７に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは１４日目に１７３７ｍｍ３に達した。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１０７４ｍｍ３、ＴＧＩ＝４２．５％、ｐ＞０．０５）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４８０ｍｍ３、ＴＧＩ＝８０．６％、ｐ＜０．０５）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝７ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．４％、ｐ＜０．０１）でのＢＣＹ６１７３は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝８７１ｍｍ３、ＴＧＩ＝５５．５％、ｐ＜０．０１）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝６２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０７．５％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．６％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３５は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝３４５ｍｍ３、ＴＧＩ＝９５．７％、ｐ＜０．００１）、３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝３ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．２％、ｐ＜０．００１）および５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．３％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を示した。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１０６６ｍｍ３、ＴＧＩ＝４３．１％、ｐ＜０．０５）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝５３２ｍｍ３、ＴＧＩ＝７７．３％、ｐ＜０．０１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１１ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１０．７％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１７４は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝７６９ｍｍ３、ＴＧＩ＝６２．１％、ｐ＜０．０１）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２９５ｍｍ３、ＴＧＩ＝９２．５％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１１ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１０．８％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１７５は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．５％）は１４日目までに腫瘍を完全に根絶した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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