(57)【要約】  本発明は、化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体、薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むループスの予防または治療用の医薬組成物、前記化合物を用いた治療方法およびループスを治療するための薬剤の製造における前記化合物の用途に関する。本発明に係る医薬組成物は、ループスの予防または治療に優れた効果を示す。
2021504368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、ループスの予防または治療用の医薬組成物。
【化１】
2021504368.tif 000049
前記式において、
Ａは
【化２】
2021504368.tif 000050
であり、
ＸａおよびＸｂは各々独立してＣＨまたはＮであり、
Ｌ１およびＬ２は各々独立して水素、ハロゲン、−ＣＦ３または−Ｃ１−３直鎖もしくは分枝鎖のアルキルであり、
ＱはＣ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）２、Ｓ（＝Ｏ）またはＣ（＝ＮＨ）であり、
Ｙは下記グループから選択され
【化３】
2021504368.tif 000051
ＭはＣ、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＳ（＝Ｏ）２であり（この時、ＭがＣである場合、ｌおよびｍは１であり、ＭがＮである場合、ｌは１であり、ｍは０であり、ＭがＯ、ＳまたはＳ（＝Ｏ）２である場合、ｌおよびｍは０である。）、
Ｒａ１およびＲａ２は各々独立して水素；ヒドロキシ；非置換もしくは一つ以上のハロゲンで置換された−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキル；−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルコール；ベンズヒドリル；Ｎ、Ｏ、Ｓ中の１〜３個のヘテロ原子を環員として含む飽和もしくは不飽和の５〜７員複素環式化合物で置換された−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキル（この時、複素環式化合物は非置換もしくは一つ以上の水素が任意にＯ
Ｈ、ＯＣＨ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３またはハロゲンで置換されてもよい。）；Ｎ、Ｏ、Ｓ中の１〜３個のヘテロ原子を環員として含む飽和もしくは不飽和の５〜７員複素環式化合物（この時、複素環式化合物は非置換もしくは一つ以上の水素が任意にＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３またはハロゲンで置換されてもよい。）；非置換もしくは一つ以上の水素がハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−２アルキルまたはヒドロキシで置換されたフェニル；非置換もしくは一つ以上の水素がハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−２アルキルまたはヒドロキシで置換されたベンジル；−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ３；ハロゲン；−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシ；−Ｃ２−６アルコキシアルキル；−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、ここで、Ｒｘは直鎖もしくは分枝鎖のＣ１−３アルキルまたはＣ３−１０シクロアルキルであり；
【化４】
2021504368.tif 000052
ここで、ＲｃおよびＲｄは各々独立して水素、Ｃ１−３直鎖もしくは分枝鎖のアルキルであり；
【化５】
2021504368.tif 000053
であり、
ｎは０、１または２の整数であり、
Ｒｂは水素；ヒドロキシ；非置換もしくは一つ以上の水素がハロゲンで置換された−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３；−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のヒドロキシアルキル；−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシ；−Ｃ２−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシアルキル；−ＣＦ３；ハロゲン；または
【化６】
2021504368.tif 000054
であり、
ＲｅおよびＲｆは各々独立して水素または−Ｃ１−３直鎖もしくは分枝鎖のアルキルであり、および
Ｚは下記グループから選択され
【化７】
2021504368.tif 000055
ＰａおよびＰｂは各々独立して
【化８】
2021504368.tif 000056
水素；ヒドロキシ；非置換もしくは一つ以上の水素がハロゲンで置換された−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキル；ハロゲン；−ＣＦ３；−ＯＣＦ３；−ＣＮ；−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシ；−Ｃ２−６直鎖もしくは分枝鎖のアルキルアルコキシ；−ＣＨ２Ｆ；または−Ｃ１−３アルコールであり、
ここで、 
【化９】
2021504368.tif 000057
はフェニル、ピリジン、ピリミジン、チアゾール、インドール、インダゾール、ピペラジン、キノリン、フラン、テトラヒドロピリジン、ピペリジンまたは下記グループから選択された環であり
【化１０】
2021504368.tif 000058
ｘ、ｙおよびｚは各々独立して０または１の整数であり、
Ｒｇ１、Ｒｇ２およびＲｇ３は各々独立して水素；ヒドロキシ；−Ｃ１−３アルキル；−ＣＦ３；−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシ；−Ｃ２−６直鎖もしくは分枝鎖のアルキルアルコキシ；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３；−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のヒドロキシアルキル；−Ｎ（ＣＨ３）２；ハロゲン；フェニル；−Ｓ（（＝Ｏ）２）ＣＨ３；または下記グループから選択される
【化１１】
2021504368.tif 000059
【請求項２】
前記化学式Ｉで表される化合物は、下記化学式Ｉａで表される化合物である、請求項１に記載の医薬組成物：
【化１２】
2021504368.tif 000060
前記式において、
Ｌ１およびＬ２は各々独立して水素またはハロゲンであり、
Ｙは
【化１３】
2021504368.tif 000061
であり、
Ｚはフェニルまたはピリジニルである（ここで、フェニルまたはピリジニルの一つ以上の水素はハロゲン、ＣＦ３またはＣＦ２Ｈで置換されてもよい。）。
【請求項３】
前記化学式Ｉａで表される化合物は、下記表に記載された化合物である、請求項２に記載の医薬組成物：
【表１】
2021504368.tif 000062
【請求項４】
前記ループスは、全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ；ＳＬＥ）、全身性ループス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ）、円板状ループス、薬剤誘発性ループス、新生児ループスおよび慢性腎炎からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記慢性腎炎は、ループス腎炎または糸球体腎炎である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物は、血清内抗−ｄｓＤＮＡ抗体濃度を減少させる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物は、タンパク尿の生成を抑制する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物は、炎症反応においてＴＮＦαの生成を抑制する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体またはその薬学的に許容される塩を治療学的有効量で投与することを含むループス治療方法。
【請求項１０】
ループス治療用医薬の製造において、請求項１に記載の化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体またはその薬学的に許容される塩の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体、薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むループスの予防または治療用の医薬組成物、前記化合物を用いた治療方法およびループスを治療するための薬剤の製造における前記化合物の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ループスは、結合組織を攻撃する抗体と関連した自己免疫疾患であって、循環性免疫複合体である抗核抗体の生成と補体システムの活性化と関連している。この疾患は、全身性として全ての器官システムにおいて発生しうるし、重症の組織損傷を誘発しうる。ループス患者は、抗−ＤＮＡ、抗−Ｒｏおよび抗−血小板特異性を有した自己抗体を生成したりもし、糸球体腎炎、関節炎、漿膜炎、新生児の完全心ブロックまたは血液学的異常のような疾患の発生を引き起こしたりもする。
【０００３】
ループスを治療しなければ、皮膚と関節攻撃から内部臓器、例えば、肺、心臓および腎臓攻撃に進むので致命的であり、その中でも最も腎臓疾患の恐れがある。尿中のタンパク尿量により測定された腎臓損傷がループスの病原性と関連した急性損傷部位のうちの一つであり、ループス疾患死亡率と発病率の５０％以上を占める。
【０００４】
現在、ループス患者に対する確実な治癒法はない。実際的な観点から見れば、医師は一般に数多くの免疫抑制剤、例えば、高用量のコルチコステロイド、プレドニゾン、アザチオプリンまたはシクロホスファミドを用いているが、これらの薬物の相当数は治療を受けている患者に潜在的な害になる副作用を示すという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】大韓民国公開特許公報第２０１４−０１２８８８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、下記化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むループスの予防または治療用の医薬組成物を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記化合物を治療学的有効量で投与するステップを含むループスの治療方法を提供することにある。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、ループスを治療するための薬剤の製造における前記化合物の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これを具体的に説明すれば次の通りである。一方、本発明に開示された各々の説明および実施形態は、各々に対する他の説明および実施形態にも適用可能である。すなわち、本発明に開示された様々な要素の全ての組み合わせは本発明の範疇に属する。また、下記に記された具体的な記述により本発明の範疇が制限されるものではない。
【００１０】
本発明は、下記化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むループスの予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【化１】
2021504368.tif 000003
前記式において、
Ａは
【化２】
2021504368.tif 000004
であり、
ＸａおよびＸｂは各々独立してＣＨまたはＮであり、
Ｌ１およびＬ２は各々独立して水素、ハロゲン、−ＣＦ３または−Ｃ１−３直鎖もしくは分枝鎖のアルキルであり、
ＱはＣ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）２、Ｓ（＝Ｏ）またはＣ（＝ＮＨ）であり、
Ｙは下記グループから選択され
【化３】
2021504368.tif 000005
ＭはＣ、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＳ（＝Ｏ）２であり（この時、ＭがＣである場合、ｌおよびｍは１であり、ＭがＮである場合、ｌは１であり、ｍは０であり、ＭがＯ、ＳまたはＳ（＝Ｏ）２である場合、ｌおよびｍは０である。）、
Ｒａ１およびＲａ２は各々独立して水素；ヒドロキシ；非置換もしくは一つ以上のハロゲンで置換された−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキル；−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルコール；ベンズヒドリル；Ｎ、Ｏ、Ｓ中の１〜３個のヘテロ原子を環員として含む飽和もしくは不飽和の５〜７員複素環式化合物で置換された−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキル（この時、複素環式化合物は非置換もしくは一つ以上の水素が任意にＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３またはハロゲンで置換されてもよい。）；Ｎ、Ｏ、Ｓ中の１〜３個のヘテロ原子を環員として含む飽和もしくは不飽和の５〜７員複素環式化合物（この時、複素環式化合物は非置換もしくは一つ以上の水素が任意にＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３またはハロゲンで置換されてもよい。）；非置換もしくは一つ以上の水素がハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−２アルキルまたはヒドロキシで置換されたフェニル；非置換もしくは一つ以上の水素がハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−
２アルキルまたはヒドロキシで置換されたベンジル；−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ３；ハロゲン；−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシ；−Ｃ２−６アルコキシアルキル；−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、ここで、Ｒｘは直鎖もしくは分枝鎖のＣ１−３アルキルまたはＣ３−１０シクロアルキルであり；
【化４】
2021504368.tif 000006
ここで、ＲｃおよびＲｄは各々独立して水素、Ｃ１−３直鎖もしくは分枝鎖のアルキルであり；
【化５】
2021504368.tif 000007
であり、
ｎは０、１または２の整数であり、
Ｒｂは水素；ヒドロキシ；非置換もしくは一つ以上の水素がハロゲンで置換された−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３；−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のヒドロキシアルキル；−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシ；−Ｃ２−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシアルキル；−ＣＦ３；ハロゲン；または
【化６】
2021504368.tif 000008
であり、
ＲｅおよびＲｆは各々独立して水素または−Ｃ１−３直鎖もしくは分枝鎖のアルキルであり、および
Ｚは下記グループから選択され
【化７】
2021504368.tif 000009
ＰａおよびＰｂは各々独立して
【化８】
2021504368.tif 000010
水素；ヒドロキシ；非置換もしくは一つ以上の水素がハロゲンで置換された−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキル；ハロゲン；−ＣＦ３；−ＯＣＦ３；−ＣＮ；−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシ；−Ｃ２−６直鎖もしくは分枝鎖のアルキルアルコキシ；−ＣＨ２Ｆ；または−Ｃ１−３アルコールであり、
ここで、
【化９】
2021504368.tif 000011
はフェニル、ピリジン、ピリミジン、チアゾール、インドール、インダゾール、ピペラジン、キノリン、フラン、テトラヒドロピリジン、ピペリジンまたは下記グループから選択された環であり
【化１０】
2021504368.tif 000012
ｘ、ｙおよびｚは各々独立して０または１の整数であり、
Ｒｇ１、Ｒｇ２およびＲｇ３は各々独立して水素；ヒドロキシ；−Ｃ１−３アルキル；−ＣＦ３；−Ｃ１−６直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシ；−Ｃ２−６直鎖もしくは分枝鎖のアルキルアルコキシ；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３；−Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のヒドロキシアルキル；−Ｎ（ＣＨ３）２；ハロゲン；フェニル；−Ｓ（（＝Ｏ）２）ＣＨ３；または下記グループから選択される
【化１１】
2021504368.tif 000013
【００１１】
本発明の化学式Ｉで表される化合物は、下記化学式Ｉａで表される化合物でであってもよい。
【化１２】
2021504368.tif 000014
前記式において、
Ｌ１およびＬ２は各々独立して水素またはハロゲンであり、
Ｙは
【化１３】
2021504368.tif 000015
であり、
Ｚはフェニルまたはピリジニルである（ここで、フェニルまたはピリジニルの一つ以上の水素はハロゲン、ＣＦ３またはＣＦ２Ｈで置換されてもよい。）。
【００１２】
本発明の具体例によれば、前記化学式Ｉａで表される化合物は、下記表に記載された化合物である。
【００１３】
【表１】
2021504368.tif 000016
【００１４】
本発明において、前記化学式Ｉで表される化合物は、大韓民国公開特許公報第２０１４−０１２８８８６号に開示された方法により製造できるが、これに制限されるものではない。
【００１５】
本発明において、薬学的に許容可能な塩は、医薬業界で通常用いられる塩を意味し、例えば、カルシウム、カリウム、ナトリウムおよびマグネシウムなどから製造された無機イオン塩、塩酸、硝酸、リン酸、臭素酸、ヨウ素酸、過塩素酸および硫酸などから製造された無機酸塩、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アルパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などから製造された有機酸塩、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホ
ン酸およびナフタレンスルホン酸などから製造されたスルホン酸塩、グリシン、アルギニン、リジンなどから製造されたアミノ酸塩、およびトリメチルアミン、トリエチルアミン、アンモニア、ピリジン、ピコリンなどから製造されたアミン塩などが挙げられるが、列挙されたこれらの塩により、本発明で意味する塩の種類が限定されるものではない。
【００１６】
本発明で用いられる用語「ループス」は、結合組織を攻撃する抗体関連の自己免疫疾患であって、自己抗体、発疹、口腔潰瘍、漿膜炎、神経疾患、低血球数、関節痛および腫れの存在を特徴とする慢性炎症性自己免疫疾患を含む。特に他の言及がなければ、本発明における用語「ループス」は、本発明が属する技術分野で通常用いられる意味を有する。本発明において、ループスは、例えば、全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ
ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ；ＳＬＥ）、全身性ループス、円板状ループス、薬剤誘発性ループスまたは新生児ループスなどを含むが、これらに制限されない様々な追加形態のループスをさらに含むことができる。また、ループス腎炎または糸球体腎炎のような慢性腎炎がループスにより引き起こされうる。
【００１７】
本発明における用語「全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）」は、本発明が属する技術分野で通常用いられる意味を有する。ＳＬＥは、多系統自己免疫疾患であって、ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体を含む抗核抗体が発生し、抗原−抗体免疫複合体が生成されて小血管に位置することによって、皮膚や腎臓の基底膜を含む様々な臓器に炎症および損傷を誘発する疾患である。
【００１８】
本発明の実施例において、化学式Ｉａで表される化合物２５５、２８０、３７４、４１６、４６１、４７６、５００、５３０または５３２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＮＦαなどの炎症性分子の産生を抑制し（図１）、反応Ｔ細胞の増殖を抑制し（図２）、調節Ｔ細胞の機能を向上させる効果（図３）に優れることが確認された。
【００１９】
また、本発明の化合物３７４の場合、ＳＬＥ疾患マウスの生存率を向上させ（図５）、タンパク尿発生率（図６）とａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体濃度（図８）、腎臓内ＩｇＧおよびＣ３浸潤レベルを減少させ（図１２）、血清内サイトカインのうちＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２２レベルを減少させ（図１３）、ＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ２レベルを減少させ（図１４）、ＴＧＦ−βレベルを上昇させ（図１３）、ＣＤ４−ＣＤ８−ｄｏｕｂｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｔ細胞の比率、ＣＤ４−ＣＤ８＋細胞レベルに対するＣＤ４＋ＣＤ８−細胞レベルの比率（図１５）、ＣＤ４＋Ｔ−ｂｅｔ＋／ＣＤ４＋ＧＡＴＡ３＋の比率（図１６）、ＣＤ４＋細胞レベルに対するＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞レベルの比率（図１７）、およびＣＤ１３８＋細胞レベル（図１９）を減少させたことを確認した。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、投与のために、前記化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体またはその薬学的に許容可能な塩の他に、薬学的に許容可能な担体を１種以上さらに含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうちの１成分以上を混合して用いることができ、必要により、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。したがって、本発明の組成物は、パッチ剤、液剤、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、坐剤などであってもよい。これらの製剤は、各疾患に応じておよび／または成分に応じて、本発明が属する技術分野で製剤化に用いられる通常の方法またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示された方法により製剤化できる。
【００２１】
本発明の医薬組成物を用いた経口投与用製剤の非制限的な例としては、錠剤、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性懸濁液、油性懸濁液、調製粉末、顆粒、エマルション、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物を経口投与用に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどのような結合剤；ジカルシウムホスフェートなどのような賦形剤；トウモコロシデンプンまたはサツマイモデンプンなどのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどのような潤滑油などを用いることができ、甘味剤、芳香剤、シロップ剤なども用いることができる。さらに、カプセル剤の場合は、上記で言及した物質の他に、脂肪油のような液体担体などをさらに用いることができる。
【００２２】
本発明の医薬組成物を用いた非経口用製剤の非制限的な例としては、注射液、坐剤、呼吸器吸入用粉末、スプレー用エアロゾル剤、軟膏、塗布用パウダー、オイル、クリームなどが挙げられる。本発明の医薬組成物を非経口投与用に製剤化するために、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、外用剤などを用いることができ、前記非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどを用いることができる。
【００２３】
本発明の医薬組成物を注射液に製剤化する場合、本発明の医薬組成物を安定剤または緩衝剤と共に水において混合して溶液または懸濁液に製造し、それをアンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）またはバイアル（ｖｉａｌ）の単位投与用に製剤化することができる。
【００２４】
本発明の医薬組成物をエアロゾル剤に製剤化する場合、水分散した濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などを添加剤と共に配合することができる。
【００２５】
本発明の医薬組成物を軟膏、クリーム、塗布用パウダー、オイル、皮膚外用剤などに製剤化する場合には、動物性オイル、植物性オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などを担体として用いて製剤化することができる。
【００２６】
本発明の化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体、薬学的に許容可能な塩の１日投与量は、例えば、約０．１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、約１〜８，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、約５〜６，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、または約１０〜４，０００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよく、好ましくは、約５０〜２，０００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これらに制限されず、１日に１回〜数回に分けて投与できる。
【００２７】
本発明の医薬組成物の薬学的有効量、有効投与量は、医薬組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間および／または投与経路などに応じて様々であり、薬学組成物の投与により達成しようとする反応の種類と程度、投与対象となる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、疾病の症状や程度、性別、食餌、排泄、該個体に同時または異時に共に用いられる薬物その他の組成物の成分などをはじめとする様々な因子および医薬分野で周知の類似因子に応じて様々であり、当該技術分野における通常の知識を有した者であれば、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定し処方することができる。
【００２８】
本発明の医薬組成物の投与は、１日に１回投与されてもよく、数回に分けて投与されてもよい。本発明の医薬組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与されてもよい。前記要
素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量をもって投与することができ、これは本発明が属する技術分野における通常の技術者により容易に決定できる。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、単独で用いても優れた効果を発揮することができるが、治療効率を増加させるためにさらにホルモン治療、薬物治療などの様々な方法と併用して用いることができる。
【００３０】
また、本発明は、前記化学式Ｉで表される化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする個体に治療学的に有効な量で投与するステップを含むループス治療方法を提供する。
【００３１】
本発明で用いられる用語「治療学的に有効な量」とは、ループスの治療に有効な前記化学式Ｉで表される化合物の量を示す。
【００３２】
本発明の治療方法において、前記化学式Ｉで表される化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩の好適な総１日使用量は正しい医学的な判断範囲内で処置医によって決定され、例えば、約０．１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、約１〜８，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、約５〜６，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、または約１０〜４，０００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよく、好ましくは、約５０〜２，０００ｍｇ／ｋｇ範囲の量を１日に１回〜数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否かをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に用いられるかまたは同時に用いられる薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野で周知の類似因子に応じて異に適用することが好ましい。
【００３３】
本発明のループス治療方法は、前記化学式Ｉで表される化合物を投与することによって、兆候の発現前に疾病そのものを取り扱うだけでなく、その兆候を阻害するか避けることもまた含む。疾患の管理において、特定の活性成分の予防的または治療学的な用量は、疾病または状態の特性と深刻度、そして活性成分が投与される経路に応じて様々である。用量および用量の頻度は、個別患者の年齢、体重および反応に応じて様々である。好適な用量用法は、このような因子を当然に考慮する本分野の通常の知識を有した者により容易に選択できる。また、本発明のループス治療方法は、前記化学式Ｉで表される化合物と共に疾患の治療に有用な追加の活性製剤の治療学的に有効な量の投与をさらに含むことができ、追加の活性製剤は、前記化学式Ｉの化合物と共にシナジー効果または相加効果を示すことができる。
【００３４】
また、本発明は、ループスを治療するための薬剤の製造において、前記化学式Ｉで表される化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供しようとする。薬剤を製造するための前記化学式Ｉで表される化合物は、薬学的に許容される補助剤、希釈剤、担体などを混合することができ、その他の活性製剤と共に複合製剤に製造されて相乗作用を有することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物、治療方法および用途において言及された事項は、互いに矛盾しない限り同様に適用される。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の化学式Ｉで表される化合物、その光学異性体またはその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物は、優れたループス治療効果を示し、ループスの予防または治療用
として広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の医薬組成物のＴＮＦα分泌抑制効果を確認した結果を示す。
【図２】本発明の医薬組成物の反応Ｔ細胞増殖抑制効果を確認した結果を示す。
【図３】本発明の医薬組成物の調節Ｔ細胞機能調節効果を確認した結果を示す。
【図４】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の体重減少症状の回復効果を示す。
【図５】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の生存率向上効果を示す。
【図６】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物のタンパク尿発生率減少効果を示す。
【図７】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物のＵＰ／Ｃ数値減少効果を示す。
【図８】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の血清内ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体濃度減少効果を示す。
【図９】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の血清内ＢＵＮおよびクレアチン濃度減少効果を示す。
【図１０】疾患動物モデルにおける腎臓の組織染色写真を示す。
【図１１】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の腎臓組織学的変化に及ぼす影響を示す。
【図１２】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の腎臓内ＩｇＧおよびＣ３沈着減少効果を示す。
【図１３】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物による血清内サイトカインパターン変化を示す。
【図１４】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の血清内ＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ２濃度減少効果を示す。
【図１５】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞発現比率に及ぼす影響を示す。
【図１６】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に及ぼす影響を示す。
【図１７】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に及ぼす影響を示す。
【図１８】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物のＴｒｅｇ、Ｔｈ１７、Ｔｈ１、Ｔｈ２細胞およびｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ発現に及ぼす影響を示す。
【図１９】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物のＣＤ１３８＋細胞に及ぼす影響を示す。
【図２０】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の骨髄内ＰｒｅＢおよびＰｒｏＢ細胞に及ぼす影響を示す。
【図２１】疾患動物モデルにおける本発明の医薬組成物の免疫グロブリンｉｓｏｔｙｐｅレベルに及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下では、本発明について製造例および実施例を通じてより詳しく説明する。但し、これらの製造例および実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの製造例および実施例に限定されるものではない。
【００３９】
本発明の化合物２５５、２８０、３７４、４１６、４６１、４７６、５００、５３０または５３２は大韓民国公開特許公報第２０１４−０１２８８８６号に記載された方法を利用して製造し、具体的な製造例は以下に記述する。各々の製造例において新たに命名された化学式は専ら該当製造例内においてのみ言及され、２以上の製造例において言及される
化学式は各々の製造例において独立に使われる。
【００４０】
製造例１．化合物２５５  ｛Ｎ−（３−ブロモフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］メチル４−（（Ｎ−（３−ブロモフェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエートの合成
【化１４】
2021504368.tif 000017
【００４１】
メチル４−（（（３−ブロモフェニル）（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（１．５ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍｌ）に溶かした後、炭酸カリウム（１．２８ｇ、９．３ｍｍｏｌ）とモルホリン（０．４０ｍｌ、４．６４ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。その後、温度を徐々に上げた後、８０℃で３時間攪拌した。温度を室温にまで下げた後、ジメチルホルムアミド（５０ｍｌ）をさらに添加し、再び温度を上げて８０℃で５時間攪拌した。反応を終了させ、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液で３回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥、濾過した後に濾過液を減圧濃縮した。濃縮液をカラムクロマトグラフィー法（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝０〜５０％）により精製して表題化合物（０．４５ｇ、３３．６％）を透明オイルの形態で得た。
【００４２】
［ステップ２］Ｎ−（３−ブロモフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化１５】
2021504368.tif 000018
【００４３】
メチル４−（（Ｎ−（３−ブロモフェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート（０．０５ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍｌ）に溶かした後、ヒドロキシルアミン塩酸（０．０４０ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。その後、水酸化カリウム（０．０６５ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１０分間攪拌した後、ヒドロキシルアミン（５０．０ｗｔ％水溶液、０．１４ｍｌ、２．３１ｍｍｏｌ）を入れた。１日間室温で攪拌した後、減圧下で有機溶媒を濃縮させ、２Ｎ塩酸を入れて中和した後、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過した後に濾過液を減圧濃縮させ、濃縮液をカラムクロマトグラフィー法（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝０〜８０％）により精製して表題化合物（０．０３６ｇ、７２％）を白色固体の形態で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d6) δ 7.63 (d, 2 H, J = 7.8 Hz), 7.27 - 7.20 (m, 4 H),
7.13 (t, 1 H, J = 7.8 Hz), 6.96 (d, 1 H, J = 7.1 Hz), 4.83 (s, 2 H), 3.49 (brs,
4 H), 3.23 (brs, 4 H); MS (ESI) m/z 436 (M+ + H).
【００４４】
製造例２．化合物２８０  ｛Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（ピリジン−２−イル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］メチル４−（（ピリジン−２−イルアミノ）メチル）ベンゾエートの合成
【化１６】
2021504368.tif 000019
【００４５】
ピリジン−２−アミン（０．２ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍｌ）に溶かした後、メチル４−ホルミルベンゾエート（０．３５ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２０分間攪拌した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．１３ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）と酢酸（０．１２ｍｌ、２．１３ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、室温で５時間攪拌した。飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過した後に濾過液を減圧濃縮した。濃縮液をカラムクロマトグラフィー法（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝０〜３０％）により精製して表題化合物（０．１０ｇ、１９％）を透明オイルの形態で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.17 (d, 1 H, J = 5.8 Hz), 8.06 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 7.8 Hz), 7.44 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 6.76 (t, 1 H, J = 6.7 Hz), 6.58 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 4.67 (d, 2 H, J = 6.0 Hz), 3.92 (s, 3 H) 
【００４６】
［ステップ２］メチル４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）（ピリジン−２−イル）アミノ）メチル）ベンゾエートの合成
【化１７】
2021504368.tif 000020
【００４７】
メチル４−（（ピリジン−２−イルアミノ）メチル）ベンゾエート（０．０４０ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶かした後、炭酸カリウム（０．０４６ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。その後、４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．０３７ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、温度を徐々に上げて５０℃で２日間攪拌した。反応終了後、エチルアセテート層を飽和塩化アンモニウム水溶液で３回洗浄した後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過した後に濾過液を減圧濃縮した。濃縮液をカラムクロマトグラフィー法（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝０〜５０％）により精製して表題化合物（０．０４８ｇ、７１％）を黄色オイルの形態で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.49 - 8.48 (m, 1 H), 8.24 (dd, 2 H, J = 7.0, 2.2 Hz), 8.17 (dd, 2 H, J = 7.2, 2.0 Hz), 8.00 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 7.78 (t, 1 H, J = 3.8 Hz), 7.44 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 6.91 (dd, 2 H, J = 7.3, 2.1 Hz), 5.39 (brs, 2 H), 3.92 (s, 3 H); MS (ESI) m/z 408 (M+ + H)
【００４８】
［ステップ３］メチル４−（（Ｎ−（ピリジン−２−イル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ））メチル）ベンゾエートの合成
【化１８】
2021504368.tif 000021
【００４９】
メチル４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）（ピリジン−２−イル）アミノ）メチル）ベンゾエート（０．０４０ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶かした後、炭酸カリウム（０．０４０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）とモルホリン（０．０１３ｍｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。その後、温度を徐々に上げた後、８０℃で３時間攪拌した。反応を終了させ、飽和塩化アンモニウム水溶液で３回洗浄した後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過した後に濾過液を減圧濃縮した。濃縮液をカラムクロマトグラフィー法（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝０〜５０％）により精製して表題化合物（０．０２２ｇ、６３％）を淡い黄色固体の形態で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.37 - 8.35 (m, 1 H), 7.95 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 7.60 - 7.58 (m, 1 H), 7.47 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 6.94 - 6.89 (m, 2 H), 5.13 (s, 2 H), 3.89 (s, 3 H), 3.53 - 3.51 (m, 4 H), 3.31 - 3.29 (m, 4 H)
【００５０】
［ステップ４］Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（ピリジン−２−イル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化１９】
2021504368.tif 000022
【００５１】
メチル４−（（Ｎ−（ピリジン−２−イル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ））メチル）ベンゾエート（０．０２２ｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２ｍｌ）に溶かした後、ヒドロキシルアミン塩酸（０．０２２ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。その後、水酸化カリウム（０．０３５ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を入れ、室温で１０分程度攪拌した後、ヒドロキシルアミン（５０．０ｗｔ％水溶液、０．０８２ｍＬ、１．２４ｍｍｏｌ）を入れた。１日間室温で攪拌した後、減圧下で有機溶媒を濃縮させ、２Ｎ  ＨＣｌを入れて中和した後、飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過して表題化合物（０．００７ｇ、３２％）を白色固体の形態で得た。
1H NMR (400 MHz, MeOD-d3) δ 8.32 (d, 1 H, J = 3.6 Hz), 7.72 (t, 1 H, J = 6.6 Hz), 7.67 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.48 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.08-7.01 (m, 2 H), 5.08 (s, 2 H), 3.52 (t, 4 H, J = 4.8 Hz), 3.29 (t, 4 H, J = 4.8 Hz); MS (ESI) m/z
357 (M++ H).
【００５２】
製造例３．化合物３７４  ｛Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］メチル４−（（３−（トリフルオロメチル）フェニルアミノ）メチル）ベンゾエート）の合成
【化２０】
2021504368.tif 000023
【００５３】
３−（トリフルオロメチル）ベンゼンアミン（０．３０ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（０．７６ｇ、５．５３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍＬ）に溶かした後、メチル４−（ブロモメチル）ベンゾエート（０．４２ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を入れた。常温で１日間反応し、エチルアセテートで薄めた。反応物を水と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝２０％）により精製して表題化合物（０．３７ｇ、６５％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.93 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.49 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.24 (t, 1 H, J = 7.9 Hz), 6.88-6.78 (m, 4 H), 4.42 (d, 2 H, J = 6.1 Hz), 3.83 (s, 3H), MS (ESI) m/z 310 (M+ + H).
【００５４】
［ステップ２］メチル４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾエートの合成
【化２１】
2021504368.tif 000024
【００５５】
メチル４−（（３−（トリフルオロメチル）フェニルアミノ）メチル）ベンゾエート（０．２６ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）と４−ニトロフェニルカルボノクロリダート（０．３３ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍｌ）に溶かし、炭酸カリウム（０．３４ｇ、２．４７ｍｍｏｌ）を入れた。常温で１日間反応し、エチルアセテートで薄めた。反応物を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝２０％）により精製して無色オイル形態の表題化合物（０．３５ｇ、８９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.20 (d, 2 H, J = 10.2 Hz), 8.01 (d, 2 H, J = 7.8 Hz), 7.56-7.46 (m, 3H), 7.35 (d, 3 H, J = 8.0 Hz), 7.26 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 5.01 (bs, 2H), 3.90 (s, 3H).
【００５６】
［ステップ３］メチル４−（（Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエートの合成
【化２２】
2021504368.tif 000025
【００５７】
メチル４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（０．２９ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶かし、炭酸カリウム（０．２５ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）とモルホリン（０．０５ｍｌ、０．６０ｍｍｏｌ）を入れた。６０℃で２日間反応させた後、飽和塩化アンモニウム溶液で薄めた。エチルアセテートで抽出した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝５０％）により精製して表題化合物（０．１５ｇ、６０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.97 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.43-7.32 (m, 5H), 7.20 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 4.94 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.50 (t, 4 H, J = 4.8 Hz), 3.25 (t, 4 H, J = 4.8 Hz); MS (ESI) m/z 423 (M+ + H).
【００５８】
［ステップ４］Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化２３】
2021504368.tif 000026
【００５９】
メチル４−（（Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート（０．１５ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍｌ）に溶かし、ヒドロキシルアミン水溶液（５０ｗｔ％、１ｍＬ）と水酸化カリウム（０．１０ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を入れて一晩攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧蒸留して除去し、エチルアセテートと水を用いて抽出（ｗｏｒｋ  ｕｐ）した。無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をジエチルエーテルにおいて攪拌して固体生成物を作り、濾過した後に乾燥して白色固体形態の表題化合物（０．０８２ｇ、５４％）を得た。
1HNMR (400 MHz, MeOD-d3) δ 11.14 (brs, 1 H), 8.99 (brs, 1 H), 7.85 (d, 2 H, J
=8.0 Hz), 7.66-7.27 (m, 6 H), 4.94 (s, 2 H), 3.41 (s, 2 H), 3.15 (s, 2 H). MS (ESI) m/z 424 (M+ + H).
【００６０】
製造例４．化合物４１６  ｛Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−４−メチルピペラジン−１−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］メチル４−（（Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−メチルピペラジン−１−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエートの合成
【化２４】
2021504368.tif 000027
【００６１】
メチル４−（（（２，４−ジフルオロフェニル）（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（０．５０ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）と１−メチルピペラジン（０．１２６ｍｌ、１．１３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶かし、６０℃で２日間加熱攪拌を行った。ジメチルホルムアミドを減圧除去し、反応混合物に水を注ぎ、エチルアセテートで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー法により精製（二酸化珪素；メタノール／ジクロロメタン＝５％）および濃縮して表題化合物（０．４６ｇ、１０１％）を黄色オイルの形態で得た。
【００６２】
［ステップ２］Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−４−メチルピペラジン−１−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化２５】
2021504368.tif 000028
【００６３】
メチル４−（（Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−メチルピペラジン−１−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート（０．２２ｇ、０．５４５ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶かした後、ヒドロキシルアミン塩酸（０．１８９ｇ、２．７３ｍｍｏｌ）と水酸化カリウム（０．３０６ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）を添加し攪拌した後、ヒドロキシルアミン（５０ｗｔ％水溶液；０．７０１ｍｌ、１０．９ｍｍｏｌ）を滴加し、その後、３時間室温攪拌を行った。反応終了後、メタノールを減圧除去し、反応混合物に水を注ぎ、エチルアセテートで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。その後、ジクロロメタンに溶かした後にヘキサンを添加して固体を析出させ、それをフィルタ乾燥して表題化合物（０．１５４ｇ、７０％）を黄色固体の形態で得た。
1HNMR (400 MHz, MeOD-d3) δ 7.65 (d, 2 H, J =8.2 Hz), 7.40 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.26 - 7.25 (m, 1 H), 7.04 - 6.96 (m, 2 H), 4.79 (s, 2 H), 
3.25 - 3.23 (m, 4 H), 2.24 - 2.21 (m, 7 H); MS (ESI) m/z 405.1 (M+ + H).
【００６４】
製造例５．化合物４６１  ｛４−エチル−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］メチル４−（（４−エチル−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエートの合成
【化２６】
2021504368.tif 000029
【００６５】
メチル４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（０．３４６ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶かし、炭酸カリウム（０．３０ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）と１−エチルピペラジン（０．０９ｍｌ、０．７３ｍｍｏｌ）を入れた。６０℃で１日間反応させた後にエチルアセテートで薄め、飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝５０％）により精製して表題化合物（０．１５ｇ、４６％）を得た。
【００６６】
［ステップ２］４−エチル−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化２７】
2021504368.tif 000030
【００６７】
メチル４−（（４−エチル−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート（０．１５ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶かし、ヒドロキシルアミン（５０ｗｔ％水溶液、０．２０ｍＬ）と水酸化カリウム（０．０９ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を入れて一晩攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧蒸留して除去し、エチルアセテートと水を用いて抽出（ｗｏｒｋ  ｕｐ）した。無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をジエチルエーテルにおいて攪拌して固体を作り、濾過した後に乾燥して黄色固体形態の表題化合物（０．０９ｇ、６１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.1 (brs, 1 H), 7.65 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.51 (t, 1 H, J = 7.9 Hz), 7.41-7.36 (m, 5 H), 4.92 (s, 2 H), 3.17-3.14 (m, 4 H), 2.25, 2.22 (ABq, 2 H, J = 12.4, 7.2 Hz), 2.18-2.15 (m, 4 H), 0.92 (t, 3 H, J = 7.2 Hz); MS (ESI) m/z 451.1 (M+ + H).
【００６８】
製造例６．化合物４７６  ｛３，３−ジフルオロ−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アゼチジン−１−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］メチル４−（（３，３−ジフルオロ−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アゼチジン−１−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエートの合成
【化２８】
2021504368.tif 000031
【００６９】
メチル４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（０．２４ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶かし、炭酸カリウム（０．２１ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）と３，３−ジフルオロアゼチジン塩酸塩（０．１３ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を入れた。６０℃で２日間反応させた後、飽和塩化アンモニウム溶液で薄めた。エチルアセテートで抽出した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝３０％）により精製して表題化合物（０．１４ｇ、６３％）を得た。
【００７０】
［ステップ２］３，３−ジフルオロ−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アゼチジン−１−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化２９】
2021504368.tif 000032
【００７１】
メチル４−（（３，３−ジフルオロ−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アゼチジン−１−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート（０．１４ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶かし、ヒドロキシルアミン水溶液（５０ｗｔ％、０．２ｍＬ）と水酸化カリウム（０．０９ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）を入れて一晩攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧蒸留して除去し、エチルアセテートと水を用いて抽出（ｗｏｒｋ  ｕｐ）した。無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をジエチルエーテルにおいて攪拌して固体生成物を作り、濾過した後に乾燥して白色固体形態の表題化合物（０．０７２ｇ、５２％）を得た。
【００７２】
製造例７．化合物５００  ｛Ｎ−（３−（フルオロメチル）フェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］メチル４−（（Ｎ−（３−（フルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエートの合成
【化３０】
2021504368.tif 000033
【００７３】
４−（（Ｎ−（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）安息香酸（１．２５ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶かし、０℃でジエチルアミノ硫黄トリフルオリド（ＤＡＳＴ、０．４２４ｍＬ、３．５８ｍｍｏｌ）を添加し、同じ温度で１時間攪拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー法により精製（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝３０〜５０％）および濃縮して表題化合物（０．６１７ｇ、４９％）を無色液体の形態で得た。
【００７４】
［ステップ２］Ｎ−（３−（フルオロメチル）フェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化３１】
2021504368.tif 000034
【００７５】
メチル４−（（Ｎ−（３−（フルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート（０．１００ｇ、０．２５９ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶かし、室温でヒドロキシルアミン（５０．０ｗｔ％水溶液、１．１１ｍＬ、１８．１ｍｍｏｌ）を添加した。その次に、水酸化カリウム（０．１４５ｇ、２．５９ｍｍｏｌ）を添加した後、同じ温度で３０分間攪拌した。その後、反応混合物を減圧下で溶媒を除去して得られた濃縮物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注ぎ、エチルアセテートで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。濃縮物にジクロロメタン（５ｍｌ）とヘキサン（３０ｍｌ）を入れて攪拌した後に析出された固体を濾過し乾燥して表題化合物（０．０８９ｇ、８９％）を白色固体の形態で得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.12 (brs, 1 H), 8.98 (brs, 1 H), 7.64 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.36 - 7.32 (m, 3 H), 7.20 (s, 1 H), 7.15 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.09 (d, 1 H, J = 7.4 Hz), 5.36 (d, 2 H, J = 47.5 Hz), 4.87 (s, 2 H), 3.39 (t, 4 H,
J = 4.6 Hz), 3.13 (t, 4 H, J = 4.6 Hz). MS (ESI) m/z 388 (M+ + H).
【００７６】
製造例８．化合物５３０  ｛Ｎ−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］メチル４−（（３−フルオロフェニルアミノ）メチル）ベンゾエートの合成
【化３２】
2021504368.tif 000035
【００７７】
メチル４−ホルミルベンゾエート（１．４７ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）とメタノール（５
０ｍｌ）に溶かした後、３−フルオロベンゼンアミン（１．０ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）を入れた。常温で３時間反応し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）（０．５６ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）と酢酸（１．０３ｍｌ、１７．９９ｍｍｏｌ）を入れた。反応物を常温で１日間反応した後に反応溶媒を減圧して除去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注ぎ、エチルアセテートで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝２０％）により精製して表題化合物（１．８４ｇ、７９％）を得た。
【００７８】
［ステップ２］メチル４−（（（３−フルオロフェニル）（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アミノ）メチル）ベンゾエートの合成
【化３３】
2021504368.tif 000036
【００７９】
メチル４−（（３−フルオロフェニルアミノ）メチル）ベンゾエート（２．７ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）と４−ニトロフェニルクロロホルメート（４．２０ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶かし、炭酸カリウム（４．３２ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）を入れた。常温で１日間反応し、エチルアセテートで薄めた。反応物を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝２０％）により精製して無色オイル形態の表題化合物（２．６５ｇ、６０％）を得た。
【００８０】
［ステップ３］メチル４−（（Ｎ−（３−フルオロフェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート）の合成
【化３４】
2021504368.tif 000037
【００８１】
メチル４−（（（３−フルオロフェニル）（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（０．３２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶かし、炭酸カリウム（０．３１ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）とモルホリン（０．１３ｍＬ、１．４９ｍｍｏｌ）を入れた。６０℃で１日間反応させた後、飽和塩化アンモニウム溶液で薄めた。エチルアセテートで抽出した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥濾過し減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝３０％）により精製して表題化合物（０．１３ｇ、４５％）を得た。
【００８２】
［ステップ４］Ｎ−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化３５】
2021504368.tif 000038
【００８３】
メチル４−（（Ｎ−（３−フルオロフェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート（０．１０８ｇ、０．２９０ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶かし、室温でヒドロキシルアミン（５０．０ｗｔ％水溶液、１．１９ｍＬ、１９．４ｍｍｏｌ）を添加した。その次に、水酸化カリウム（０．１５６ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）を添加した後、同じ温度で１６時間攪拌した。その後、反応混合物を減圧下で溶媒を除去して得られた濃縮物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注ぎ、エチルアセテートで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。析出された固体を濾過し乾燥して表題化合物（０．０６２ｇ、５７％）を白色固体の形態で得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.14 (brs, 1 H), 8.99 (brs, 1 H), 7.65 (d, 2 H, J = 7.0 Hz), 7.38-7.30 (m, 3H), 7.05-6.85 (m, 3H), 4.89 (s, 1H), 3.44-3.42 (m, 4H), 3.18-3.15 (m, 4H), 2.08 (s, 3H). MS (ESI) m/z 374 (M+ + H).
【００８４】
製造例９．化合物５３２  ｛Ｎ−（２−フルオロ−４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝の合成
［ステップ１］３−フルオロ−４−（（（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾニトリルの合成
【化３６】
2021504368.tif 000039
【００８５】
３−（トリフルオロメチル）アニリン（０．９９８ｍＬ、８．０６８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６０ｍＬ）に溶かし、室温で４−（ブロモメチル）−３−フルオロベンゾニトリル（２．０７２ｇ、９．６８２ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２．１４３ｍＬ、１２．１０２ｍｍｏｌ）を添加し、同じ温度で１日間攪拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注ぎ、エチルアセテートで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。濃縮物をカラムクロマトグラフィー法により精製（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝５〜２０％）および濃縮して表題化合物（２．３８０ｇ、６４．４％）を黄色液体の形態で得た。
【００８６】
［ステップ２］３−フルオロ−４−（（（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）安息香酸の合成
【化３７】
2021504368.tif 000040
【００８７】
３−フルオロ−４−（（（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾニトリル（２．３１０ｇ、７．８５０ｍｍｏｌ）と水酸化リチウム（３．２９４ｇ、７８．５０５ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ）／Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）に混ぜた反応混合物を１６時間加熱還流した後に室温に下げ、反応混合物を減圧下で濃縮した。２Ｍ塩酸水溶液を入れてｐＨ＝１に作り、析出された固体を濾過した後に乾燥して表題化合物（１．７００ｇ、６９．１％）を白色固体の形態で得た。
【００８８】
［ステップ３］メチル３−フルオロ−４−（（（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾエートの合成
【化３８】
2021504368.tif 000041
【００８９】
３−フルオロ−４−（（（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）安息香酸（１．７００ｇ、５．４２７ｍｍｏｌ）、メタノール（４．４０２ｍＬ、１０８．５４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．０８１ｇ、１０．８５４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．４６７ｇ、１０．８５４ｍｍｏｌ）、そしてＤＩＰＥＡ（２．８８３ｍＬ、１６．２８１ｍｍｏｌ）を室温でテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶かした反応溶液を同じ温度で１６時間攪拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。濃縮物をカラムクロマトグラフィー法により精製（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝１０〜４０％）および濃縮して表題化合物（１．５００ｇ、８４．５％）を無色液体の形態で得た。
【００９０】
［ステップ４］メチル３−フルオロ−４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾエートの合成
【化３９】
2021504368.tif 000042
【００９１】
メチル３−フルオロ−４−（（（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチ
ル）ベンゾエート（１．５００ｇ、４．５８３ｍｍｏｌ）、４−ニトロフェニルカルボノクロリダート（１．８４８ｇ、９．１６７ｍｍｏｌ）、そして炭酸カリウム（１．９００ｇ、１３．７５０ｍｍｏｌ）を室温でアセトニトリル（８０ｍＬ）に溶かした反応溶液を同じ温度で１６時間攪拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。濃縮物をカラムクロマトグラフィー法により精製（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝１０〜４０％）および濃縮して表題化合物（０．９２７ｇ、４１．１％）を無色液体の形態で得た。
【００９２】
［ステップ５］メチル３−フルオロ−４−（（Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエートの合成
【化４０】
2021504368.tif 000043
【００９３】
メチル３−フルオロ−４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（０．１２９ｇ、０．２６２ｍｍｏｌ）、モルホリン（０．０４６ｍＬ、０．５２４ｍｍｏｌ）、そして炭酸カリウム（０．１０９ｇ、０．７８６ｍｍｏｌ）を６０℃でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶かした反応溶液を同じ温度で２日間攪拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで水分を除去した後に減圧下で濃縮した。濃縮物をカラムクロマトグラフィー法により精製（二酸化珪素；エチルアセテート／ヘキサン＝３０〜６０％）および濃縮して表題化合物（０．０９４ｇ、８１．５％）を無色液体の形態で得た。
【００９４】
［ステップ６］Ｎ−（２−フルオロ−４−（ヒドロキシカルバモイル）ベンジル）−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の合成
【化４１】
2021504368.tif 000044
【００９５】
メチル３−フルオロ−４−（（Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）モルホリン−４−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）メチル）ベンゾエート（０．０９４ｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）とヒドロキシルアミン（５０．０ｗｔ％水溶液、０．０７１ｇ、２．１３４ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶かし、室温で水酸化カリウム（０．０６０ｇ、１．０６７ｍｍｏｌ）を添加し、同じ温度で２時間攪拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮した。濃縮物にジエチルエーテル（１０ｍＬ）を入れて攪拌した後に析出された固体を濾過し乾燥して化合物５３２（０．０６８ｇ、７２．２％）を明るい黄色固体の形態で得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.2 (brs, 1 H), 9.13 (brs, 1 H), 7.57 - 7.42 (m,
7 H), 4.94 (s, 2 H), 3.44 - 3.34 (m, 4 H), 3.18 - 3.12 (m, 4 H); MS (ESI) m/z 442.1 (M++ H).
【００９６】
製造例１０．ＳＬＥモデルマウスの製造
ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１雌マウス８０匹（４週齢）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ａｎｄ  ｍｉａｎｔａｉｎｅｄから購入して、ケージ当たり５匹ずつＳＰＦ飼育室で飼育した。２４週齢（投与直前）の時に体重および尿タンパクを測定して、激しい尿タンパクを示す個体は除き、尿タンパクおよび体重が均等に分布するように下記表２のように群分離をした。
【００９７】
【表２】
2021504368.tif 000045
【００９８】
その次に、マウスに２４週齢から４２週齢まで約１９週間表２に記載されたような投与を毎日実施した。
【００９９】
マウスの新鮮尿の採取を投与前および投与後２週間隔で実施し、採血を投与前および投与後４週間隔で実施した。採集された血液は遠心分離して血清を収集した後に−７０℃に保管した。
【０１００】
実施例１．免疫細胞株におけるＴＮＦα分泌抑制効果の確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
免疫反応において本発明の化合物のＴＮＦα分泌抑制効能を確認するために、ＬＰＳで刺激されたヒト単核白血球細胞株（ＴＨＰ−１）における本発明の化合物３７４、４６１、５００、５３０、５３２の処理によるＴＮＦαの生成程度を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により定量した。
【０１０１】
具体的には、ＴＨＰ−１細胞株（ＡＴＣＣ）の培養には１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた。２４ウェルプレートに各々のウェル当たり１×１０５細胞を分株した後、１００ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）を２４時間処理してマクロファージに分化させた。その後、新しい培養培地に交替し、２４時間テスト薬物を処理し、１０ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳ（Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｏ５５：Ｂ５）を４時間処理して細胞を刺激した。その後、上澄み液を取って、細胞
から分泌されたＴＮＦａの量をＨｕｍａｎ  ＴＮＦａ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＭＳ２２３ＩＮＳＴ）を用いて、製造会社が提供したプロトコルに従って測定した。
【０１０２】
その結果、全ての実験群において、ＬＰＳで炎症反応を誘発した対照群に比べて、ＴＮＦα分泌レベルが減少したことが明らかになった。特に、化合物３７４、４６１および５００は、１００ｎＭおよび３００ｎＭ濃度の全てにおいてＬＰＳで炎症反応を誘発しないレベルにＴＮＦα分泌レベルが顕著に減少した。また、化合物５３０および５３２において、１００ｎＭから３００ｎＭに化合物の処理濃度を増加させる場合、ＴＮＦα分泌レベルが急激に減少した（図１）。
【０１０３】
前記実験結果は、本発明の化合物がループスにおいて代表的に増加する炎症反応因子であるＴＮＦαの分泌を非常に効果的に抑制することにより、ループスに現れる炎症反応を効果的に抑制することを示す。
【０１０４】
実施例２．反応Ｔ細胞増殖抑制効果の確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
本発明の化合物の免疫反応において反応Ｔ細胞増殖抑制効能を確認するために、ＬＰＳで刺激されたヒト単核白血球細胞株（ＴＨＰ−１）における本発明の化合物２５５、２８０、３７４、４１６、４７６を反応Ｔ細胞と調節Ｔ細胞と共に培養した後の調節Ｔ細胞の増殖抑制効能を測定した。
【０１０５】
具体的には、６週齢のＣ５７ＢＬ６雄マウスを中央実験動物（株）から供給を受けて１週間馴化した後に実験に用いた。マウスから脾臓を分離した後、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ
Ｄ（Ｒｏｃｈｅ、１１０８８８６６００１）を処理してｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅに分離した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９１−０４１）を用いてＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５−）とＴｅｆｆ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）を製造会社が提供したプロトコルに従って分離し出した。ｅＦｌｕｏｒＲ６７０（Ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒＲ６７０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３７℃で１０分間Ｔｅｆｆ細胞を培養して細胞膜を染色した。９６ウェルプレートにＴｅｆｆとＴｒｅｇを２：１の比率で分株し、ａｎｔｉ−ＣＤ３εとａｎｔｉ−ＣＤ２８  ｍＡｂ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９３６２７）を用いて３日間Ｔ細胞を活性化させてＴｒｅｇ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを行った。テスト薬物は、ａｓｓａｙが行われる３日間同時処理された。Ｔｅｆｆ細胞膜にｌａｂｅｌｉｎｇされたｅＦｌｕｏｒＲ６７０の分割された量を測定してＴ細胞の増殖度を評価した。ｅＦｌｕｏｒＲ６７０−ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｐｌｏｔは、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した（ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。Ｔ細胞増殖抑制能は、次のような数式によって計算した。
【０１０６】
【数１】
2021504368.tif 000046
【０１０７】
その結果、全ての実験群において、反応Ｔ細胞増殖が抑制されることが明らかになった。実験に用いられた本発明の化合物は、２００ｎＭの処理時に最大２倍を越える反応Ｔ細胞増殖抑制率（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）を示し、５００ｎＭの処理時に最大４倍に達する顕著なＴ細胞増殖抑制効果を示した（図２）。
【０１０８】
前記実験結果は、本発明の化合物がループスにおいて過度に活性化した反応Ｔ細胞の分化を効果的に抑制することを示す。
【０１０９】
実施例３．調節Ｔ細胞機能調節効果の確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
本発明の化合物が免疫反応において調節Ｔ細胞の機能を調節するかを確認するために、化合物２５５、２８０、３７４、４１６、４７６の処理後、調節Ｔ細胞において免疫チェックポイント受容体ＣＴＬＡ４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）の発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。
【０１１０】
具体的には、６週齢のＣ５７ＢＬ６雄マウスを中央実験動物から供給を受けて１週間馴化した後に実験に用いた。マウスから脾臓を分離した後、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｄ（Ｒｏｃｈｅ、１１０８８８６６００１）を処理してｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅに分離した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９１−０４１）を用いてＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を分離し、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を６日間ａｎｔｉ−ＣＤ３ε／ａｎｔｉ−ＣＤ２８  ｍＡｂ  ｂｅａｄ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９３６２７）とマウス組み換えＴＧＦ−β２を６日間処理してｉＴｒｅｇに分化させた。テスト薬物は、ｉＴｒｅｇに分化する６日間同時処理された。その後、ａｎｔｉ−ＣＤ４／ａｎｔｉ−ＣＤ２５  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５−００４２−８２、１７−０２５１−８２）を用いて４℃で２０分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎしてｌａｂｅｌｉｎｇした。細胞質内染色のために、Ｆｉｘ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、００−５５２３−００）を用いてｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎし、ａｎｔｉ−ＦＯＸＰ３−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５３−５７７３−８２）とａｎｔｉ−ＣＴＬＡ４−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２−１５２２−８２）を用いてｌａｂｅｌｉｎｇした後、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ
Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてフローサイトメトリーを行った。
【０１１１】
その結果、本発明の化合物の処理後、Ｔ細胞のＣＴＬＡ４発現レベルが増加したことを確認した。特に化合物２５５、３７４および４７６化合物の場合、５００ｎＭ以上の濃度において４０％以上のＴ細胞がＣＴＬＡ４発現が増加したことが明らかになった。化合物２５５は、１０００ｎＭの処理時、細胞毒性が激しくてデータ分析を進めることができなかった（図３）。
【０１１２】
前記実験結果は、本発明の化合物が調節Ｔ細胞の機能を向上させることによって、ループスに現れる反応Ｔ細胞の過度な活性が効果的に調節できることを示す。
【０１１３】
実施例４．動物モデルでの体重回復効果
マウスの体重変化を確認した結果、初めての４週間は投与後に体重が全体的に減少する様相を示したが（エタノール＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ＋ｓａｌｉｎｅからなる溶媒による作用であると考えられる）、３６週齢以後には、陰性対照群より陽性対照群の方が明らかな体重回復効果を示した。実験群の場合、１０ｍｇ／ｋｇ用量投与群は４０週付近から陽性対照群と同じレベルに体重が回復し、３０および５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群は陽性対照群よりも優れた体重回復効果を示した（図４）。
【０１１４】
実施例５．動物モデルでの生存率改善効果
ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１雌マウスは、ヒトＳＬＥ疾患モデルとして用いられ、何の治療もしな
ければ、免疫複合体性糸球体腎炎によって１２ヶ月頃（約５２週齢）にいずれも死亡することが知られている。
【０１１５】
本発明の医薬組成物がＳＬＥ動物モデルにおいて生存率改善効果を発揮するかを確認するために、２４週齢から４２週齢まで毎日ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１雌マウスの生存率を測定した。
【０１１６】
その結果、約３２週齢以前までは全ての群において生存率に変化がなく、何の薬物処理もしていない陰性対照群の場合、３５週齢以後からマウス生存率が急激に減少して、４２週齢に達しては１５匹のうち７匹のマウスが死亡した（生存率が約５３．３％）。その反面、陽性対照群と実験群は、いずれも陰性対照群より優れた生存率回復様相を示した。特に、４２週齢において、１０ｍｇ／ｋｇ用量投与群は１５匹のうち４匹（生存率が約７３．３％）だけが死亡し、３０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群は驚くべきことに１匹（生存率が約９３．３％）のみが死亡しており、本発明の医薬組成物がＳＬＥ動物モデルにおいて顕著に優れた生存率改善効果を発揮することを確認した（図５）。
【０１１７】
実施例６．動物モデルでのタンパク尿減少効果
ＳＬＥ疾患の代表的な症状であるタンパク尿の生成に本発明の医薬組成物が治療的効果を発揮するかを確認するために、２週間隔でマウスの尿を採取してＣＢＢ（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）方法によりＵＰ／Ｃ（尿タンパク：クレアチン比率）を測定した。尿クレアチニン濃度は、尿を１００倍薄めて、血清化学分析機器（Ｄｒｉ−ＣＨＥＭ  ３０００  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）により測定した後に希釈倍数を補正して求めた。
【０１１８】
その結果、陰性対照群の場合は２４週齢から４２週齢まで３００ｍｇ／ｄｌ以上の激しいタンパク尿発生率を示す比率が急激に増加したのに対し、実験群の場合はこのような激しいタンパク尿発生率が顕著に改善されたことを確認した。特に４２週齢において３００ｍｇ／ｄｌ以上の激しいタンパク尿発生率は、陰性対照群は８０％であるのに対し、陽性対照群は２０％であり、１０、３０および５０ｍｇ／ｋｇの投与群は各々６０％、６．７％および０％として顕著に優れたタンパク尿減少効果を示した（図６）。
【０１１９】
一方、３６週齢のマウスにおけるＵＰ／Ｃは全ての実験群において顕著に減少し、４２週齢のマウスの場合も１０ｍｇ／ｋｇ投与群を除いた全ての実験群において陰性対照群よりＵＰ／Ｃ数値が減少したことを確認した（図７）。
【０１２０】
実施例７．動物モデルでの血清内ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体濃度減少効果
本発明の医薬組成物がＳＬＥモデル動物に現れる増加したａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体濃度を減少できるかを確認するために、マウスａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ  ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）ｋｉｔ（Ｓｈｉｂａｙａｇｉ）を用いて、マウス血清内ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体濃度を測定した。
【０１２１】
その結果、全ての実験群において約２８週齢以後に血清内ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体濃度が陰性対照群より減少する傾向を示し、特に５０ｍｇ／ｋｇ投与群の場合、血清内ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体濃度が陰性対照群より最大２倍以上顕著に減少することを確認した（図８）。
【０１２２】
実施例８．動物モデルでのＢＵＮおよび血清クレアチニン濃度減少効果
ＳＬＥモデルマウスでの腎臓機能を評価するために、１ヶ月間隔で採取されたマウス血清（２４、２８、３２、３６、４０週齢および剖検時）におけるＢＵＮおよびクレアチン濃度をＤｒｉ−ＣＨＥＭ  ３０００  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆ
ｕｊｉ  ｆｉｌｍ）を用いて測定した。
【０１２３】
その結果、実験群はＢＵＮおよび血清クレアチン濃度が対照群に比べて向上したことを確認し、特に４０週齢において顕著に優れたＢＵＮおよび血清クレアチン濃度減少効果を確認した（図９）。
【０１２４】
実施例９．動物モデルでの腎臓組織学的変化
ＳＬＥ疾患モデルでの本発明の医薬組成物が腎臓に及ぼす影響を調査するために、組織病理学的評価を行った。
【０１２５】
先ず、剖検時に収集したマウス左側腎臓の１／２は１０％  ｎｅｕｔｒａｌ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎに固定し、パラフィンブロックに作製した。その次に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ、ＢＢＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｏｕｎｔ
Ｖｅｒｎｏｎ、ＷＡ、ＵＳＡ）、ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−ｓｃｈｉｆｆ染色（ＰＡＳ、ＢＢＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、およびＭａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色（ＢＢＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を実施して組織病理学的評価を行った。
【０１２６】
その結果、陰性対照群は多くの炎症細胞浸潤とｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ所見が観察され、ＰＡＳ染色時、拡張されたｔｕｂｕｌｅとｔｕｂｕｌｅ内ｃａｓｔが多く観察され、Ｍａｓｓｉｏｎ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色時、ｆｉｂｒｏｓｉｓパターンが顕著に観察された（図１０）。
【０１２７】
次に、炎症細胞浸潤程度に応じて０〜４まで点数を付けた時（０：ｎｏ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、４：ｓｅｖｅｒｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、実験群マウスの腎臓の場合、炎症細胞浸潤程度が減少し、特に３０および５０ｍｇ／ｋｇ投与群の場合、顕著に優れた炎症細胞浸潤減少効果を確認した（図１１）。
【０１２８】
実施例１０．動物モデルでの腎臓内ＩｇＧおよびＣ３沈着減少効果の確認
ＳＬＥ疾患モデルでの腎臓に対する本発明の医薬組成物の治療的効果を確認するために、糸球体内ＩｇＧおよびＣ３の沈着程度を測定した。
【０１２９】
実施例９で行われた剖検時に収集した左側腎臓の残りの１／２に対し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄを用いて、ｆｒｏｚｅｎ  ｓｅｃｔｉｏｎのための凍結組織ブロックを準備し、本発明が属する技術分野で公知の方法によりＩｇＧとＣ３蛍光免疫染色を実施した。
【０１３０】
具体的には、凍結組織を４μｍの厚さにセクションして、冷たいアセトンに５分間固定させた後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で５分間２回洗浄した。非特異的反応を無くすために１％牛血清アルブミンと０．０５％のｔｗｅｅｎ−２０が添加されたＰＢＳ溶液で３０分間ブロッキングした後、ＦＩＴＣ−コンジュゲートしたヤギａｎｔｉ−マウスＩｇＧ抗体（１：２００、ＡＰ３０８Ｆ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＦＩＴＣ−コンジュゲートしたヤギａｎｔｉ−マウスＣ３抗体（１：１００、Ｃａｐｐｅｌ  ５５５００、ＭＰ  Ｂｉｏ）を用いて常温で１時間反応させた。その次に、ＰＢＳで５分間３回洗浄した後、ＤＡＰＩを含むｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍでカバーガラスを覆い、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ  ７００、ＺＥＩＳＳ）を用いて観察した。
【０１３１】
その結果、実験群はＩｇＧおよびＣ３沈着レベルが減少し、特に５０ｍｇ／ｋｇ投与群は顕著な沈着減少レベルが確認された（図１２）。
【０１３２】
実施例１１．動物モデルでの血清サイトカイン濃度
ＳＬＥ疾患マウスでの、本発明の医薬組成物が血清内サイトカインレベルの変化に及ぼす影響を分析するために、Ｍｏｕｓｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ
ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、血清内ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３レベルを測定した。その結果を表３に示す。
【０１３３】
【表３】
2021504368.tif 000047
【０１３４】
群から得られたデータは、クラスカル・ウォリス検定（†ｐ＜０．０５）、＊Ｐ＜０．０５対Ｃグループ（マン・ホイットニーのＵ検定）を使用して比較した。
【０１３５】
表３を参照すれば、陽性対照群は陰性対照群に比べてＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７およびＴＮＦ−αが減少する傾向を示し、実験群マウスにおいて血清内ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２２濃度が減少した反面、ＴＧＦ−βレベルは上昇したことを確認した。特に、対照群に比べて、５０ｍｇ／ｋｇの用量投与実験群はＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２２が有意に低く、ＴＧＦ−βが有意に高いことを確認した（図１３）。
【０１３６】
これと関連し、ＳＬＥ患者の場合、健康な人よりＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γの血清濃度が有意に高く、ＴＧＦ−βの血清濃度は有意に低いことが報告されている（文献［Ｚｉｃｋｅｒｔ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５］）。
【０１３７】
一方、３６週齢の血清においてＣＸＣＬ１０（ＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０、ＩＰ−１０）とＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）レベルを測定した時、血清内ＣＸＣＬ１０レベルは全ての実験群において減少し、ＣＣＬ２レベルは５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群において減少したことを確認した（図１４）。
【０１３８】
実施例１２．動物モデルでの脾臓内Ｔ細胞発現様相
ＳＬＥ疾患マウスでの脾臓内免疫Ｔ細胞の発現様相を評価するために、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＴＬＡ４発現比率およびＴｒｅｇ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ／Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ  ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＲＯＲ−γｔ、Ｆｏｘｐ３）発現様相を測定した。
【０１３９】
このために、先ず、マウス剖検時に得た脾臓に対して７０μｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ）を用いて脾臓細胞を得て、赤血球をＥＬ  ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血させた後、ＦＡＣＳ緩衝液（５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄した。その次に、ＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５−コンジュゲートしたａｎｔｉ−マウスＣＤ３（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＰＥ−Ｃｙａｎｉｎｅ７−コンジュゲートしたａｎｔｉ
−マウスＣＤ８ａ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＩＴＣ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−ＣＤ４（ＢＤ）、ＡＰＣ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−マウスＣＤ２５（ＢＤ）、ＰＥ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−マウスＦｏｘＰ３（ＢＤ）、ＰＥ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−マウスＲＯＲγｔ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−マウスＴ−ｂｅｔ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−マウスＧＡＴＡ３（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−マウスＣＴＬＡ４（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体を用いて製造会社が推薦する濃度で染色した。
【０１４０】
脾臓細胞とｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ抗体は直ちに反応させ、ＦｏｘＰ３、ＲＯＲγｔ、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３抗体を反応させる前にはＦｏｘＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｅｔを用いて、脾臓細胞を固定し、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせた後に抗体と反応させた。ＣＤ３細胞中のＣＤ４：ＣＤ８比率およびＣＤ４＋ＣＤ８−細胞、ＣＤ４−ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、ｄｏｕｂｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｔ細胞の比率を測定して群間比較をし、Ｔｒｅｇ、Ｔｈ１７、Ｔｈ１、Ｔｈ２のｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒであるＦｏｘＰ３、ＲＯＲγｔ、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３比率を調査するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＲＯＲγｔ＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｂｅｔ＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＧＡＴＡ３＋細胞の比率を測定した。
【０１４１】
ＣＤ４、ＣＤ８発現パターンの分析
ＳＬＥ患者の末梢血液単核球においてＣＤ４−ＣＤ８−ｄｏｕｂｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｔ細胞の比率が増加しており、この細胞が炎症性サイトカインであるＩＬ−１７とＩＦＮ−γを産生することによって、ＳＬＥ患者の腎損傷の病因論に寄与することが報告されている（文献［Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９］；文献［Ｃｒｉｓｐｉｎ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．、２００８］）。
【０１４２】
ＣＤ３＋ｃｅｌｌｓをｇａｔｉｎｇしてＣＤ４とＣＤ８の発現を測定した結果、ＣＤ４−ＣＤ＋Ｔ細胞の比率は実験群において増加し、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞の比率はその逆に減少した。ＣＤ４＋ＣＤ８−：ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率は、実験群において投与用量が増加するほど減少する傾向を示した（図１５）。
【０１４３】
Ｔｒｅｇ、Ｔｈ１７、Ｔｈ１およびＴｈ２  ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ発現パターンの分析
Ｔｒｅｇ、Ｔｈ１７、Ｔｈ１、Ｔｈ２  ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒのＦｏｘｐ３、ＲＯＲ−γｔ、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３の発現程度を調査するために、脾臓においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＲＯＲγｔ＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｂｅｔ＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＧＡＴＡ−３＋細胞の比率を比較分析した時、群間有意性は見られなかった（図１６）。
【０１４４】
一方、ＣＤ２５＋細胞比率は５０ｍｇ／ｋｇ投与用量の実験群において対照群より有意に低く、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞／ＣＤ４＋細胞比率も有意に低かった（図１７）。
【０１４５】
ＣＤ４＋細胞にｇａｔｉｎｇして、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、Ｆｏｘｐ３、ＲＯＲγｔの発現を調査した結果、Ｔ−ｂｅｔ発現は、５０ｍｇ／ｋｇ投与用量の実験群において対照群より有意に低かった。また、ＣＤ４＋Ｔ−ｂｅｔ＋／ＣＤ４＋ＧＡＴＡ−３＋比率（ＣＤ４細胞でのＴｈ１／Ｔｈ２  ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒの発現比率）も３０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ投与用量の実験群において対照群より有意に減少したことを確認した（図１８）。
【０１４６】
ＣＤ１３８発現パターンの分析
ＣＤ１３８＋細胞の比率は、陰性対照群に比べて陽性対照群は１６．３％減少した反面、１０ｍｇ／ｋｇ用量では２１．２％、３０ｍｇ／ｋｇ用量では２５．２％、そして５０ｍｇ／ｋｇ用量では３１．６％減少したことを確認した（図１９）。
【０１４７】
実施例１３．動物モデルでの骨髄内ＰｒｅＢおよびＰｒｏＢ細胞比率
マウス骨髄細胞においてｐｒｏ  Ｂ（Ｂ２２０＋、ＣＤ４３＋）およびｐｒｅ  Ｂ（Ｂ２２０＋、ＣＤ４３−）細胞の比率をＦＡＣＳを用いて測定した。このために、先ず、Ｆｅｍｕｒを５％  ＢＳＡを含有したＰＢＳでｆｌｕｓｈｉｎｇして、骨髄細胞を得た。その次に、赤血球をＥＬ  ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血させ、ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（５％
ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄して、ＦＩＴＣ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４３抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とＰＥ−コンジュゲートしたａｎｔｉ−マウスＣＤ２２０抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色して、Ｐｒｅ  Ｂ（Ｂ２２０＋ＣＤ４３−）とＰｒｏ  Ｂ（Ｂ２２０＋ＣＤ４３＋）細胞の比率を測定した。
【０１４８】
その結果、対照群に比べて、実験群はｐｒｅ  Ｂとｐｒｏ  Ｂ細胞の有意な比率変化は観察されなかった（図２０）。
【０１４９】
実施例１４．動物モデルでの血清内免疫グロブリンアイソタイプの変化
マウス剖検時に得た血清において免疫グロブリンアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ）濃度をマウスアイソタイプ用Ｌｕｍｉｎｅｘ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて測定した（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。
【０１５０】
その結果、５０ｍｇ／ｋｇ用量投与群においてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ濃度は陰性対照群に比べて減少し、特にＩｇＭの濃度は顕著に減少したことを確認した（図２１）。
【０１５１】
実施例１５．動物モデルでの血清化学の変化
ＳＬＥ動物モデルでの長期間の薬物投与に応じた血清化学的な変化有無を確認するために、剖検時に得た血清においてＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、総タンパク質、アルブミン、総コレステロール、ＴＧ、ＣＰＫ、総ビリルビンおよびＣａ濃度をＤｒｉ−ＣＨＥＭ  ３０００  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて測定した。その結果は表４に示す。
【０１５２】
【表４】
2021504368.tif 000048
【０１５３】
群から得られたデータは、クラスカル・ウォリス検定（†ｐ＜０．０５）、＊Ｐ＜０．０５対Ｃグループ（マン・ホイットニーのＵ検定）を使用して比較した,（ＡＬＴ：ａｌ
ａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＡＳＴ：ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＡＬＰ：ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＴＢＩＬ：ｔｏｔａｌ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ、ＴＣＨＯＬ：ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＴＧ：ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＴＰ：ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＰＫ：ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ）
【０１５４】
以上、実施例において調べてみた通り、本発明の医薬組成物は、ＳＬＥ疾患マウスの生存率を向上させ（図５）、タンパク尿発生率（図６）とａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ抗体濃度（図８）、腎臓内ＩｇＧおよびＣ３浸潤レベルを減少させ（図１２）、血清内サイトカインのうちＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２２レベル（図１３）とＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ２レベル（図１４）を減少させ、ＴＧＦ−βレベルを上昇させ（図１３）、ＣＤ４−ＣＤ８−ｄｏｕｂｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｔ細胞の比率、ＣＤ４−ＣＤ８＋細胞レベルに対するＣＤ４＋ＣＤ８−細胞レベルの比率（図１５）、ＣＤ４＋Ｔ−ｂｅｔ＋／ＣＤ４＋ＧＡＴＡ３＋の比率（図１６）、ＣＤ４＋細胞レベルに対するＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞レベルの比率（図１７）、およびＣＤ１３８＋細胞レベル（図１９）を減少させたことを確認したところ、前記結果から、本発明の医薬組成物は、ＳＬＥを含むループスの治療に顕著に優れた効果があることが分かる。
【０１５５】
以上で本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当該技術分野における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は添付の請求の範囲とその等価物により定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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