(57)【要約】  本発明は、修飾された腫瘍溶解性アデノウイルス；それを含む医薬組成物；およびそれを用いて癌を治療する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾アデノウイルスまたはベクターであって、
前記アデノウイルスベクターによって遺伝的にコードされることなく、ウイルスのカプシド上に共有結合または非共有結合により接続している以下に示すポリペプチド：
ｉ）  ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ [配列番号１］；
ｉｉ）  ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号２］；
ｉｉｉ）  ＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ [配列番号３］；または
ｉｖ）  それらと少なくとも６０％同一であるポリペプチド
の少なくとも１つを含む、修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、少なくとも３、４、５、６、７、８、または９個のリジンを用いて伸長されたポリリジンである、請求項１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項３】
前記リジンが前記ポリペプチドのアミノ末端に結合している、請求項２に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、
ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ[配列番号７］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号８］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ [配列番号９］：あるいは、
ＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ[配列番号４］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号：５］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ−ＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ [配列番号：６］
である、請求項１〜３のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項５】
前記アデノウイルスが、ヒトアデノウイルスである、請求項１〜４のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項６】
前記アデノウイルスが、腫瘍特異的プロモーターの挿入、少なくとも１つの遺伝子欠失および少なくとも１つの導入遺伝子の挿入を含む、Ｅ１および／またはＥ３および／またはＥ４および／またはＬ３遺伝子における修飾を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項７】
前記アデノウイルスが、血清型５である、請求項１〜６のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項８】
前記アデノウイルスが、Ａｄ５／３キメラ置換を含むようにさらに修飾され、血清型５アデノウイルス線維ノブ領域が血清型３アデノウイルスノブ領域に置換されている、請求項１〜７のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項９】
前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａ遺伝子欠失を含むようにさらに改変され、アミノ酸１２２〜１２９をコードするヌクレオチドの少なくとも１つが欠失している、請求項１〜８のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１０】
前記アデノウイルスが、１４．７ｋ遺伝子の部分的または完全な欠失を含むようにさらに改変されている、請求項１〜９のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１１】
前記アデノウイルスが、共刺激分子をコードする少なくとも１つの導入遺伝子の挿入を含むようにさらに改変されている、請求項１〜１０のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１２】
前記ウイルスが少なくとも２つの導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子の一方が先天性免疫系の活性化をもたらし、他方が適応免疫系の活性化をもたらす、請求項１１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１３】
前記ウイルスが、ＣＤ４０Ｌおよび／またはＯＸ４０Ｌをコードする導入遺伝子を含む、請求項１２に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１４】
前記導入遺伝子がヒトである、請求項１３に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１５】
前記ＯＸ４０Ｌが、Ｅ３Ｂ領域に位置し、遺伝子１４．７Ｋの欠失を置換する、請求項１３または１４に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１６】
前記ＣＤ４０Ｌ分子が、２Ａプロセッシング部位を用いてＯＸ４０Ｌのすぐ下流に挿入される、請求項１３〜１４のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１７】
ペプチド対ウイルス比が、３Ｅ＋９ウイルス粒子当たり１〜５μｇの範囲である、請求項１〜１６のいずれか１に記載の修飾アデノウイルスまたはベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つの修飾アデノウイルスまたはベクターと、適切なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、皮内、腔内もしくは腹腔内注射、または経口投与のために製剤化されている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌の治療に使用するための、請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つのアデノウイルスもしくはベクター；または、請求項１８〜１９のいずれか１に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
癌を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つのアデノウイルスまたはベクターの使用。
【請求項２２】
患者における癌を治療する方法であって、有効量の、請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つのアデノウイルスまたはベクター；または請求項１８または１９に記載の組成物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つのアデノウイルスまたはベクター；または請求項１８または１９に記載の組成物が、細胞チェックポイントモジュレーターと共に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記チェックポイントモジュレーターが、抗ＰＤ１分子、抗ＰＤ−Ｌ１分子または抗ＣＴＬＡ−４分子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、鼻咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎がん、結合組織がん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、喉がん、口腔がん、肝がん、骨がん、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、フェオクロモサイトーマ、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルシノイド、胃腸管の癌腫、線維肉腫、乳癌、パジェット病、頸部癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼がん、頸がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝がん、カポシ肉腫、前立腺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、栄養芽細胞がん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリン腫、カルチノイド症候群、体細胞スタチン腫、歯肉がん、心臓がん、唇がん、髄膜がん、口腔がん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がん、扁桃がんのいずれか１つ以上を含む、請求項２０または２１に記載のアデノウイルスもしくはベクターまたは使用、又は請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾された腫瘍溶解性アデノウイルス；それを含む医薬組成物；およびそれを用いて癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における腫瘍溶解性ウイルスの役割の認識は、癌を標的として攻撃するための免疫療法や患者自身の免疫系の刺激が普及することにつれて、過去１０年の間に劇的に変化してきた。今世紀初頭、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍溶解を介して腫瘍細胞を溶解する固有の能力を介してのみ作用し、癌治療において活性物質として認識された。最近、癌ワクチンとしての使用が関心を集めており、免疫系を活性化するための腫瘍崩壊時に癌細胞から腫瘍抗原を放出するそれらの能力は、癌に対する最終的な免疫療法をデザインする際の重要な特徴として認識されている。
【０００３】
アデノウイルスは、感染症に対する様々なワクチンアプローチにおいてベクターとしてしばしば使用される免疫原性の高いウイルスである。重要なことに、これらは、免疫応答を刺激し、増幅するという両方の並外れた能力を有する。さらに、腫瘍内に腫瘍崩壊性アデノウイルスが存在し、それが引き起こす免疫原性細胞死は、ＩＦＮγのようなＴＨ１型免疫モジュレーターの発現を引き起こすことによって、臨床的に重要な抗腫瘍免疫が生じるためのより感受性の高い状態に向かって、敵対的な腫瘍微小環境を形作る可能性が高い。しかしながら、腫瘍崩壊性アデノウイルスの免疫原性は両刃の剣である。抗ウイルス免疫はしばしば非常に圧倒的であり、腫瘍によって発現される自己抗原に対して誘発されるはるかに弱い免疫応答を無効にする。
【０００４】
ペプチドワクチンは癌の免疫療法において魅力的な概念であったが、従来のペプチドワクチンアプローチの臨床的有効性は一般に乏しいと認識されている。癌ワクチンは、抗腫瘍免疫応答を増大させるために必要な炎症シグナルを提供すべきアジュバントと組み合わせて癌抗原を送達する。しかしながら、中枢および末梢寛容、ならびに腫瘍進行時の免疫編集のプロセスは、典型的にはペプチドワクチンの候補ペプチドを選択する際にインビトロで見られるＴ細胞反応性の損失を生じる。現在のワクチンアジュバントは、たとえ腫瘍が選択された抗原を発現していても、免疫抑制された腫瘍における耐性を破壊するほど単に強力ではない。さらに、多くのペプチドワクチンアプローチは、ＭＨＣクラスＩ結合ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの正確で最小の配列に一致する短いペプチドに基づいている。前臨床腫瘍モデルにおける有望な結果にもかかわらず、短いペプチドは患者において全身性末梢性免疫寛容を引き起こすことが示されており、これは重要な補助刺激シグナルを欠く非専門的ＡＰＣまたは非成熟ＤＣによるペプチドの提示に起因すると仮定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の２つのワクチンアプローチを、両方のうちの最良のものを利用する方法で組み合わせるものである。腫瘍溶解性アデノウイルスと癌抗原を組み合わせた物理的実体は、Ａ）圧倒的に強いウイルス特異的標的および免疫細胞に対する十分な腫瘍特異的標的の欠如、ｂ）弱いアジュバントの問題、およびｃ）短いペプチドワクチンによって誘発される中枢性寛容の問題の問題を解決する。
【０００６】
したがって、本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスとペプチドワクチンという２つの臨床的に証明された癌免疫療法アプローチを組み合わせる革新的かつ独特な方法である、ペプチドで被覆された条件的複製アデノウイルス（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ：Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏａｔｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）に関する。ＰｅｐｔｉＣＲＡｄは、腫瘍特異的ペプチドの活性キャリアとして免疫原性ウイルスを使用し、免疫系に癌細胞を特異的に標的化し、殺傷するよう指示する。さらに、腫瘍抗原を遺伝的にコードする腫瘍溶解性ウイルスワクチンとは対照的に、アデノウイルスを免疫原性ペプチドでコーティングするＰｅｐｔｉＣＲＡｄ技術は、すべての癌に対して高度に適応可能であり；同じキャリアウイルスがすべての癌を処置するために使用され得、そしてウイルスを異なるポリリジン伸長ペプチドでコーティングするだけで適応が起こり得る。このユニークな技術はアデノウイルスの顕著な免疫原性を利用し、同時にＣＤ８+ T細胞応答を腫瘍組織に向ける。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、修飾アデノウイルスまたはベクターであって、
前記アデノウイルスベクターによって遺伝的にコードされることなく、ウイルスのカプシド上に共有結合または非共有結合により接続している以下に示すポリペプチド：
ｉ）  ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ [配列番号１］；
ｉｉ）  ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号２］；
ｉｉｉ）  ＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ [配列番号３］；または
ｉｖ）  それらと少なくとも６０％同一であるポリペプチド
の少なくとも１つを含む、修飾アデノウイルスまたはベクターが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明による修飾アデノウイルスの概略図を示す。
【図２】図２は、選択された２つのペプチドを示す。
【図３】図３は、図２のペプチドのＮ末端におけるポリリジン尾部が癌患者において既知の免疫活性化能力を有する臨床的に使用された未修飾ペプチドと比較した場合に、ペプチドの免疫学的特性を変化させないことを示す。
【図４】図４は、水中のＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド−ウイルス複合体および異なるペプチド濃度を有する生理的塩の両方の平均流体力学的直径を示す。
【図５】図５は、ＮＹＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド被覆修飾ウイルス（ＯＸ４０Ｌ−およびＣＤ４０Ｌ−発現ウイルス（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１）を含む５／３カプシド、またはＮＹＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド被覆（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチドのみを含まない同一ウイルスを含む、本発明によるＮＹＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド被覆修飾ウイルスで処理した場合の、処理および対側、未処理の腫瘍におけるＴ細胞の頻度を示す。
【図６】図６は、ペプチドコーティング（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチド単独を用いずにＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１または同じウイルスで処理した場合の、処理した腫瘍および対側の未処理腫瘍におけるすべての免疫細胞（ＣＤ４５＋細胞）の頻度を示す。
【図７】図７は、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄおよびＶＡＬＯ−Ｃ１の処理により、処理された腫瘍におけるすべてのＴＩＬからの制御性Ｔ細胞の割合を減少させることを示す。
【図８】図８は、ペプチドコーティング（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチド単独なしでＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１または同じウイルスで処理した場合の血液腫瘍中のＮＹ−ＥＳＯ−１（Ａ）およびＭＡＧＥ−Ａ３特異的(Ｂ)ＣＤ８+ T細胞の割合を示す。
【図９】図９は、ペプチドコーティング（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチド単独を用いずにＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１または同じウイルスで処理した場合、または対側の未処理腫瘍におけるＮＹ−ＥＳＯ−１またはＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ８+ T細胞の割合を示す。
【図１０】図１０は、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質でコーティングされたＰｅｐｔｉＣＲＡｄが大きな、十分に確立された腫瘍に対して治療を開始しても、ヒト化マウスメラノーマモデルにおいて腫瘍増殖を停止することができることを示す。
【図１１】図１１は、模擬処置動物と比較して、ＯＸ４０Ｌ−ＰｅｐｔｉＣＲＡｄが末梢血中のＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ８+ T細胞数を増加させたことを示す。
【図１２】図１２Ａ）は、滅菌水中に希釈され、流動緩衝液として滅菌水を使用するＡＰＴＥＳセンサ上での固定化したＡｄＶ調製中における３つの別々のＳＰＲ応答を示す。図１２Ｂ）は、３つの異なるペプチドコーティングの場合のＳＰＲ応答である。
【図１３】図１３ は、Ａ１９５緩衝液中で希釈されたペプチドコーティングＰＥＰ１４５５、ＰＥＰ１４５６およびＰＥＰ１５０８試料の濃度を増加により固定化ＡｄＶ粒子と相互作用させた場合のＳＰＲ応答である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、前記アデノウイルスは、標的細胞において複製し、溶解活性を有することができる。
【００１０】
さらにより好ましくは、ｉｖ）の部分の前記ポリペプチドは、ｉ）またはｉｉ）またはｉｉｉ）の部分のポリペプチドと６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。
【００１１】
有利には、前記ポリペプチドが、患者におけるペプチド特異的免疫応答を刺激することができ、さらにより有利には、前記ポリペプチドが前記アデノウイルスベクターによって遺伝的にコードされていないが、共有結合的または非共有結合的にカプシドに結合されているので、この結合は迅速かつ効率的に、すなわち宿主細胞におけるウイルス複製が起こるのを待つ必要なく、実行することができる。典型的には少なくとも１つまたは２つまたは３つのポリペプチドの結合を容易にするために、前記ポリペプチドは少なくとも４つ、理想的には５、６、７、８または９つのリジンを使用してポリリジン伸長される。最も典型的には、６または９個のリジンが使用され、最も好ましくはポリペプチドのアミノ末端に結合される。
【００１２】
従って、アデノウイルスへの付着のためのペプチドは以下である：
ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ[配列番号７］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号８］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ [配列番号９］：あるいは、
ＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ[配列番号４］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号：５］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ−ＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ [配列番号：６］
である。
【００１３】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記アデノウイルスは任意の型および種のアデノウイルスであり得、例えば、ヒトアデノウイルスに限定されないが、最も典型的にはヒトアデノウイルスである。最も好ましいのは、アデノウイルスが腫瘍に対する抗ウイルス免疫応答を転換しながら、癌細胞を複製し、殺傷することが可能であり、したがって、改変されたアデノウイルスまたはベクターは自律増殖可能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）であり、腫瘍溶解性である。
【００１４】
本発明において使用されるアデノウイルスまたはベクターは、複製に関して腫瘍特異的であることができ、例えば、アデノウイルスベクターは、腫瘍特異的プロモーターの挿入、遺伝子欠失および導入遺伝子の挿入のような、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４および／またはＬ３遺伝子における修飾を含み得る。
【００１５】
理想的には、アデノウイルスまたはベクターは、腫瘍溶解性、すなわち、腫瘍対正常細胞における選択的複製によって癌細胞を感染させ、殺傷することができる。
【００１６】
アデノウイルスまたはベクターのバックボーンは、任意の血清型であり得る。本発明の一実施形態では、アデノウイルスまたはベクター骨格の血清型が血清型３または５から選択される。本明細書中で使用される場合、「アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸バックボーン」はＡｄ５のゲノムをいい、「アデノウイルス血清型３（Ａｄ３）核酸バックボーン」は、Ａｄ３のゲノムを意味する。
【００１７】
さらに、ウイルスまたはベクターは、キメラであることができ、例えば、Ａｄ５／３、Ａｄ３／５またはＡｄ５／３５ベクターであってもよい。一例として、「Ａｄ５／３ベクター」は、Ａｄ５ベクターおよびＡｄ３ベクターの両方の一部を有するキメラウイルスまたはベクターを意味する。
【００１８】
アデノウイルスまたはベクターの「カプシド」とは、当該ウイルスのタンパク質シェルを意味する。カプシドは、プロトマーとよばれるタンパク質からなるいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。
【００１９】
最も好ましくは、前記アデノウイルスまたはベクターは、Ｔ細胞応答のプライミングおよびブーストに最適であるように選択される血清型５である。それは腫瘍を殺傷するのに必要なＣＤ８+Ｔ細胞を誘発し；腫瘍溶解性ウイルスに対する既存の免疫が腫瘍内治療の有効性を増強し、良好な臨床的安全性記録を有する。
【００２０】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記アデノウイルスまたはベクターは、以下の特徴のいずれか１つ以上（それらのいずれかおよびすべての組み合わせを含む）を含むようにさらに改変される。
【００２１】
Ａｄ５／３キメラ置換：すなわち、血清型５アデノウイルス線維ノブ領域を血清型３アデノウイルスノブ領域のものと置換したもの。これにより、ウイルスまたはベクターはＡｄ５天然受容体コクサッキー・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を回避し、代わりにＡｄ３天然受容体デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を内在化のために使用することが可能になる。ＤＳＧ２は癌細胞に豊富に存在する。
【００２２】
アデノウイルス感染は、ウイルス表面上の特殊なタンパク質、すなわちアデノウイルス繊維タンパク質、特にアデノウイルス繊維タンパク質の球状カルボキシ末端ドメイン（カルボキシ末端ノブドメインと呼ばれる）の手段による宿主細胞受容体の認識で始まる。従って、本明細書中において、アデノウイルス繊維タンパク質のノブへは、アデノウイルス繊維タンパク質の球状カルボキシ末端ドメインを意味する。
【００２３】
アミノ酸１２２〜１２９（ＬＴＣＨＥＡＣＦ）をコードするヌクレオチドの欠失であるＥ１Ａ遺伝子欠失：当該欠失は、ウイルスまたはベクターＥ１Ａ蛋白質が網膜芽細胞腫（Ｒｂ）分子に結合できず、ウイルス遺伝子転写のためにＲｂから転写因子Ｅ２Ｆを放出することができないための安全性尺度である。したがって、アデノウイルスまたはベクターは、宿主細胞中の遊離Ｅ２Ｆの存在に依存し、遊離Ｅ２Ｆが常に利用可能な分裂正常細胞または癌細胞のいずれかにおいてそのゲノムを複製することができる。したがって、修飾は非分裂細胞を相対的に保護し、分裂細胞または癌細胞に対して標的化される。
【００２４】
この遺伝子産物の免疫抑制的役割を考えると、Ｅ３遺伝子の部分的欠失は免疫原性を高める。理想的には、１４．７Ｋ遺伝子は一部または全部が削除される。
【００２５】
好ましい実施形態において、前記修飾アデノウイルスまたはベクターは、共刺激分子をコードする少なくとも１つの導入遺伝子、および理想的には２つの導入遺伝子の挿入を含み、ここで、前記遺伝子の一方は先天性免疫系の活性化をもたらし、他方は適応免疫系の活性化をもたらす。好ましい導入遺伝子には、ＣＤ８+Ｔ細胞応答を駆動するＡＰＣの使用によって自然免疫系を活性化するためのＣＤ４０Ｌ、およびクローン増殖、ＣＤ８+Ｔ細胞の生存および記憶Ｔ細胞の大きなプールの形成を増加させることによって適応免疫系を活性化するためのＯＸ４０Ｌが含まれる。
【００２６】
多数の導入遺伝子が、アデノウイルスまたはベクターの異なる位置に配置され得る。１つの導入遺伝子は例えば、Ｅ３プロモーターの下または外因性プロモーターの下のいずれかで、部分的または全体的に欠失したＥ３領域中に、またはＥ１プロモーターの下または外因性プロモーターの下のいずれかで、部分的または全体的に欠失したＥ１領域中に、またはＬ３プロモーターの下または外因性プロモーターの下の部分的または全体的に欠失したＬ３領域中に配置され得る。
【００２７】
最も好ましくは、ＯＸ４０Ｌ（理想的にはヒトＯＸ４０Ｌ）はＥ３Ｂ領域に位置し、遺伝子１４．７Ｋ欠失を置換する。
【００２８】
また、最も好ましくはＣＤ４０Ｌ、理想的にはヒトＣＤ４０Ｌはウイルスの後期領域、特に後期領域３（Ｌ３）、理想的には２３Ｋ遺伝子から下流に挿入される。
【００２９】
好ましい実施形態では、両方の導入遺伝子（すなわちＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ）が前記ウイルスに挿入される。
【００３０】
代替的に、ＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０ＬをコードするＤＮＡは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用などの公知の遺伝子工学技術を使用して、またはより好ましくは、小さいサイズであり、２Ａペプチドの上流および下流の遺伝子間で高い切断効率を有するという利点を有する自己切断２Ａペプチドの使用を介して、融合分子として結合および挿入され得る。典型的には、ＣＤ４０ＬがＯＸ４０Ｌのすぐ下流に挿入されるが、本発明を逆の構成で実施することも可能である。
【００３１】
本発明において利用されるウイルスまたはベクターはまた、上記以外の改変を含み得る。任意の追加の構成要素または修正を任意に使用することができるが、本発明にとって必須ではない。
【００３２】
続けて、本発明のアデノウイルスまたはベクターは、癌に対する免疫応答を、特に腫瘍環境において刺激するように操作されており、ここで、典型的には、免疫系が癌細胞によって使用される回避メカニズムによって損なわれる。
【００３３】
驚くべきことに、我々のデータは免疫刺激遺伝子、ヒトＯＸ４０ＬおよびヒトＣＤ４０Ｌの１４．７Ｋ座標への追加はバックボーンウイルスＡｄ５／３Ｄ２４または免疫刺激遺伝子（例えばヒトＧＭ−ＣＳＦ）を持つウイルスと比較して、本発明のウイルスのがん効能を損なうものではないことを示している。これは削除されたｇｐ１９Ｋ／７．１Ｋ遺伝子に代わるものである。導入遺伝子のサイズおよび感染した細胞に対する導入遺伝子の直接的な影響により、導入遺伝子がウイルス複製に深刻な影響を与える可能性があるため、これは驚くべきことある。さらに、１４．７Ｋ遺伝子の削除は、ｇｐ１９Ｋ／７．１Ｋ遺伝子の削除ほど広範に研究されていないため、特に１４．７Ｋ削除サイトに遺伝子を組み込む場合、ウイルスの複製機械に予期せぬ結果をもたらす可能性がある。
【００３４】
また、本発明のウイルスは、１４．７Ｋ遺伝子軌跡から機能的ヒト導入遺伝子を産生できることも示している。やや通常とは異なり、２つの導入遺伝子の間にウイルスの２Ａプロセシング部位をもつ転写カセットを用いたため、これは予想外であった。
【００３５】
さらに、本発明者らは、本発明のウイルスがＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１特異的免疫応答を誘発することができることも実証した。
【００３６】
従って、本発明は、少なくとも１つの本発明の改変されたアデノウイルスまたはベクターおよび適切な担体を含む医薬組成物にも関する。本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物が腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、腔内もしくは腹腔内注射、または経口投与のために製剤化される。
【００３７】
従って、さらなる態様において、本発明は、個体に、本発明による少なくとも１つのアデノウイルスまたはベクターを含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、個体における癌を治療する方法に関する。
【００３８】
それ加えて、または代替的に、本発明は、癌を治療する際に使用するための、本発明による少なくとも１つのアデノウイルスまたはベクターまたは組成物に関する。
【００３９】
さらに、または代替的に、本発明は、癌を治療するための、本発明による少なくとも１つのアデノウイルスまたはベクターまたは組成物の使用に関する。
【００４０】
さらに、または代替的に、本発明は、癌を治療するための医薬の製造における、本発明による少なくとも１つのアデノウイルスまたはベクターの使用に関する。
【００４１】
腫瘍が身体の免疫細胞を打ち消すためのいくつかの免疫抑制メカニズムを進化させた場合、本発明の治療はまた、チェックポイント分子の使用と組み合わせて実施される。最もよく特徴づけられているチェックポイント経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球蛋白質４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム細胞死蛋白質１経路（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１）である。従って、本発明のアデノウイルスまたはベクターは、免疫抑制腫瘍環境を阻害し、そして強力な抗免疫応答を引き起こすために、抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４分子のようなチェックポイントモジュレーターと組み合わせて使用することができる。
【００４２】
修飾されたアデノウイルスまたはベクターは、標的ペプチドに対する最適な免疫応答に必要な危険シグナルを提供するが、複製アデノウイルスまたはベクターの場合にはそれが感染してそのゲノムをその中で複製する癌細胞を溶解するその能力を保持するため、活性アジュバントとして作用する。腫瘍溶解細胞殺傷は本質的に免疫原性であり、ペプチド／腫瘍に対する免疫応答を強化する可能性がある腫瘍微小環境の変化を引き起こす。従って、長いペプチド（ｐｌｏｙ−リジン尾部を有さない２０アミノ酸）と物理的に複合体化されたペプチドである本発明の修飾アデノウイルスを使用することで、ペプチドワクチンまたは腫瘍溶解ワクチン単独のいずれかと比較した場合、優れた抗腫瘍免疫応答を生じる。
【００４３】
最も好ましくは、本明細書における癌は、以下の癌のいずれか１つ以上を含む：鼻咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎がん、結合組織がん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、喉がん、口腔がん、肝がん、骨がん、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、フェオクロモサイトーマ、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルシノイド、胃腸管の癌腫、線維肉腫、乳癌、パジェット病、頸部癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼がん、頸がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝がん、カポシ肉腫、前立腺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、栄養芽細胞がん（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胞状奇胎（ｈｙｄａｔｉｄｉｆｏｒｍ ｍｏｌｅ）、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリン腫、カルチノイド症候群、体細胞スタチン腫、歯肉がん、心臓がん、唇がん、髄膜がん、口腔がん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がん、扁桃がん。
【００４４】
本願の特許請求の範囲および本発明の前述の説明において、文脈が明示的な言葉または必要な含意のために別途必要とする場合を除いて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は包括的な意味で使用される、すなわち、記載された特徴の存在を指定するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【００４５】
本明細書に引用された、任意の特許または特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成することは許可されない。さらに、先行技術のいずれも、当該技術分野における一般的な知識の一部を構成することを認めるものではない。
【００４６】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関連して記載されるとおりであり得る。
【００４７】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるのであろう。一般的に、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物または化学部分は、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例に適合しない限り適用可能であると理解されるべきである。
【００４８】
さらに、特に断らない限り、本明細書に開示される任意の特徴は、同じまたは同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。
【００４９】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形はその状況が他のことを要求していない限り、複数形を含む。特に、不定冠詞が使用される場合は本明細書がその状況が他のことを要求していない限り、単数だけでなく複数も意図していると理解されたい。
【実施例】
【００５０】
本発明の実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。
【００５１】
図１は、本発明による修飾アデノウイルスの概略図を示す。具体的には、Ａｄ５アデノウイルスが血清型３ノブタンパク質を含むように改変される。Ａｄ３ノブおよび、理想的には本発明の２つまたは３つのポリペプチドがポリリジン尾部の使用を介して、ウイルスのカプシドに付着され、これらのポリペプチドはウイルスゲノムの一部を形成しないが、カプシドに共有結合または非共有結合で付着される。本明細書ではＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１と称するが、このイノベーションはしたがって、癌を攻撃するために、免疫系のすべての主要なアームを利用する。
【００５２】
図２は、選択された２つのペプチドを示す。それらはＭＨＣクラスＩ分子に直接結合するのではなく、提示されるためにＡＰＣによる抗原プロセシングを必要とする。したがって、ペプチドは非プロフェッショナルＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子に結合できず、一過性の活性化とそれに続くＣＤ８+Ｔ細胞のアネルギーを引き起こさない。活性化されたプロフェッショナルＡＰＣ（さらなる修飾されたアデノウイルスに存在する場合、ウイルスコード化ＣＤ４０Ｌからさらなる共刺激を受けることができる）のみが、これらのペプチドをＴ細胞に提示して、ペプチド特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の強固な活性化および増殖を導くことができる（さらなる共刺激および増強された記憶Ｔ細胞応答はさらなる修飾されたアデノウイルスに存在する場合、ウイルスコード化ＯＸ４０Ｌから提供される）。
【００５３】
図３は、図２のペプチドのＮ末端におけるポリリジン尾部が癌患者において既知の免疫活性化能力を有する臨床的に使用された未修飾ペプチドと比較した場合に、ペプチドの免疫学的特性を変化させないことを示す。
【００５４】
図４は、水中のＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド−ウイルス複合体および異なるペプチド濃度を有する生理的塩の両方の平均流体力学的直径を示す。
【００５５】
図５は、ＮＹＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド被覆修飾ウイルス（ＯＸ４０Ｌ−およびＣＤ４０Ｌ−発現ウイルス（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１）を含む５／３カプシド、またはＮＹＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド被覆（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチドのみを含まない同一ウイルスを含む、本発明によるＮＹＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド被覆修飾ウイルスで処理した場合の、処理および対側、未処理の腫瘍におけるＴ細胞の頻度を示す。ＣＤ３+Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ４+Ｔ細胞（Ｂ）およびＣＤ８+Ｔ細胞（Ｃ）の数は、各治療群の腫瘍組織１ｇ当たりの細胞として描出される。処置は、モックと比較して、全ての群においてより高いＴ細胞頻度をもたらした。最も多かったのはＶＡＬＯ−Ｃ１またはＰｅｐｔｉＣＲＡｄで治療された腫瘍であった。
【００５６】
図６は、ペプチドコーティング（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチド単独を用いずにＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１または同じウイルスで処理した場合の、処理した腫瘍および対側の未処理腫瘍におけるすべての免疫細胞（ＣＤ４５＋細胞）の頻度を示す。頻度はすべての群で類似しており、偽処置動物ではいくらか低い数であった。
【００５７】
図７は、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄおよびＶＡＬＯ−Ｃ１による処理が、処理された腫瘍におけるすべてのＴＩＬからの制御性Ｔ細胞の割合を減少させることを示す。
【００５８】
図８は、ペプチドコーティング（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチド単独なしでＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１または同じウイルスで処理した場合の血液腫瘍中のＮＹ−ＥＳＯ−１（Ａ）およびＭＡＧＥ−Ａ３特異的(Ｂ)ＣＤ８+Ｔ細胞の割合を示す。パーセンテージは、血液１ｍｌあたりのすべてのＣＤ８+Ｔ細胞から算出される。ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理はＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の最高パーセンテージをもたらし、ＶＡＬＯ−Ｃ１およびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理の両方は、模擬またはペプチド処理動物のいずれかと比較した場合、より高いパーセンテージのＭＡＧＥ−Ａ３特異的をもたらした。
【００５９】
図９は、ペプチドコーティング（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチド単独を用いずにＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１または同じウイルスで処理した場合、または対側の未処理腫瘍におけるＮＹ−ＥＳＯ−１またはＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の割合を示す。パーセンテージは、腫瘍組織１ｇ当たりの全てのＣＤ８+Ｔ細胞から算出される。ＶＡＬＯ−Ｃ１およびＰｅｐｔｉＣＲＡｄは、ペプチド特異的ＣＤ８+ＴＩＬを腫瘍に動員するのに同等に有効である。
【００６０】
図１０は、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質でコーティングされたＰｅｐｔｉＣＲＡｄが大きな、十分に確立された腫瘍に対して治療を開始しても、ヒト化マウスメラノーマモデルにおいて腫瘍増殖を停止することができることを示す。実験条件： ２ｘ１０６のＳＫ‐ＭＥＬ‐２細胞をＮＯＤ／Ｓｈｉ‐ｓｃｉｄ／ＩＬ‐２Ｒγ欠損免疫不全マウスの側面に１日目に皮下（１匹当たり１腫瘍）移植した。１３日目に、５ｘ１０６のＰＢＭＣを静脈内注射した。１６日目に、５ｘ１０４形質細胞様細胞および骨髄性樹状細胞を腫瘍内に注射した。１×１０９の用量での腫瘍内ペプチドＣＲＡｄ処置を、１６日目、１７日目、１８日目（初回投与）、および２５日目（追加免疫）に与えた。最初のＰｅｐｔｉＣＲａｄ投与は、ＤＣ注射直後に投与した。腫瘍増殖を追跡した。動物を３２日目に屠殺した。ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ = Ａｄ５／３‐Ｄ２４‐ＯＸ４０Ｌ‐ＣＤ４０Ｌ、Ｅ１Ａにおける２４ｂｐ欠損を伴うオンコリチックアデノビラス、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１およびＭＡＧＥ‐Ａ３ペプチドで被覆した１４．７Ｋ軌跡から発現した５／３キメラカプシドおよびＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌトランスジェン; ＯＸ４０ＬＰｅｐｔｉＣＲＡｄ = Ａｄ５／３‐Ｄ２４‐ＯＸ４０Ｌ、Ｅ１Ａにおける２４ｂｐ欠損を伴うオンコリチックアデノビラス、１４．７Ｋ軌跡から発現した５／３キメラカプシドおよびＯＸ４０Ｌトランスジェン、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１およびＭＡＧＥ‐Ａ３ペプチドで被覆した。
【００６１】
図１１は、模擬処置動物と比較して、ＯＸ４０Ｌ−ＰｅｐｔｉＣＲＡｄが末梢血中のＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ８+Ｔ細胞数を増加させたことを示す。ＰｅｐｔｉＣＲＡｄで処理した２匹の動物は、血液中のＭＡＧＥ‐Ａ３特異的ＣＤ８+Ｔ細胞数の増加も示した。抗ＭＡＧＥ−Ａ３ Ｔ細胞は、３２日目の前述の腫瘍増殖試験の終了時にフローサイトメトリー（五量体分析）により評価した。
【００６２】
図１２Ａ）は、滅菌水中に希釈され、流動緩衝液として滅菌水を使用するＡＰＴＥＳセンサ上での固定化したＡｄＶ調製中における３つの別々のＳＰＲ応答を示す。Ｃ = 〜１．９３×１０11 ＶＰ／ｍｌ。Ｂ)は、３つの異なるペプチドコーティングの場合のＳＰＲ応答である: ＰＥＰ１４５５＝ＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ(配列番号４); ＰＥＰ１４５６= ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ(配列番号７); ＰＥＰ１５０８= ＫＫＫＫＫＫ−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ(配列番号５）。濃度を増加させたストック溶液（滅菌水中５ｍｇ／ｍｌ）を、固定化ＡｄＶ粒子と相互作用させた。滅菌水を流動緩衝液として使用した。矢印は対応する濃度でのペプチドサンプル注入の時点を示し、星印は、ランニングバッファーでのフラッシュの開始の時点を示す。図中に記したΔmaxとΔminの値は、それぞれの状態について、ウィルス粒子当たりに相互作用するペプチドの数を計算するために使用したＳＰＲ応答に対応する（溶液中１００μＭに存在するペプチド、Δmax、および溶液中にペプチドが存在しない（Δmin））。
【００６３】
図１３ は、Ａ１９５緩衝液中で希釈されたペプチドコーティングＰＥＰ１４５５、ＰＥＰ１４５６およびＰＥＰ１５０８試料の濃度を増加により固定化ＡｄＶ粒子と相互作用させた場合のＳＰＲ応答である。矢印は対応する濃度を有するペプチドサンプル注入の時点を示し、星印は、泳動緩衝液（Ａ１９５培地）でのフラッシュの開始の時点を示す。図面中にマークされたΔmaxとΔminの値は、それぞれの状態（溶液中に１００μＭ存在するペプチド、Δmax、および溶液中にペプチドが存在しない、Δmin）においてウィルス粒子当たり相互作用するペプチドの数を計算するために使用されたＳＰＲ応答に対応する。 下付き文字「ｍｉｎ、ｍｅｄ」および「ｍａｘ、ｍｅｄ」は、対応する測定値から計算された２つの別個の測定値の中央値を指す。
【００６４】
＜方法及び材料＞
ペプチド：
ペプチドは、ヒト患者に適した塩形態である酢酸対イオンを用いて選択した。ペプチドは、ＰｅｐＳｃａｎによって製造されたものである。
【００６５】
ＰｅｐｔｉＣＲＡｄにおける臨床使用を意図した特定のペプチドは、以下のものである：
- ＭＡＧＥＡ３タンパク質（アミノ酸１６１〜１８０、配列ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ）、６（配列番号４）または９（配列番号７）のいずれかのアミノ末端から延びるリジン尾部を有する２０量体ペプチド；
- ＮＹ−ＥＳＯ−１ タンパク質（アミノ酸９１〜１１０、配列ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ）、６（配列番号５）または９（配列番号８）アミノ末端から延びるリジン尾部を有する２０量体ペプチド；
- ＮＹ−ＥＳＯ−１ タンパク質（アミノ酸８１〜１００、配列ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ）、６（配列番号６）または９（配列番号９）アミノ末端から延びるリジン尾部を有する２０量体ペプチド。
【００６６】
ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ製剤に使用されるアデノウイルス：
アデノウイルスδ２４、血清型３アデノウイルス（ＡｄＶ ５／３）由来の改変ノブを有する血清型５ウイルス。このモデルウイルスは正確には臨床使用を意図したウイルスではないが、同一のウイルスのカプシドを有している。モデルウイルスと臨床ウイルスの違いは、臨床ウイルスが理想的にはＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌをコードする遺伝的挿入物を含む点である。これらの挿入物がウイルスのカプシドおよび本明細書で研究した特性に寄与しない。
【００６７】
ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ複合体形成：
個々のペプチドを水または０．５％生理食塩水で希釈して、５ ｕｇ／μｌのペプチドストック濃度に到達させた。Ａ１９５緩衝液（１，４５Ｅ＋１２ ＶＰ／ｍｌ）中のウイルスストックを水中で希釈して、１Ｅ＋９ ＶＰ／μｌの濃度に到達させた。ウイルス−ペプチド複合体を、１または３μｌのウイルス希釈液（１Ｅ＋９または３Ｅ＋９ＶＰに等しい）を可変容量のペプチドと混合して、標的ペプチド対ウイルス比に到達させることによって調製した。
【００６８】
（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ、個々のペプチド）；ウイルスの２つの個々のアリコット（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を、単一のペプチドで別々にコーティングした。次いで、これらの２つの別々の単一ペプチドで被覆したペプチドＰｅｐｔｉＣＲＡｄ（ＮＹ−ＥＳＯ−１複合体およびＭＡＧＥ−Ａ３複合体）を、腫瘍注射の直前に混合した。別々にコーティングされたウイルスを別々の注射として与えることもできる。あるいは、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを最初に混合し、次いで、このペプチド混合物をＰｅｐｔｉＣＲＡｄ複合体形成のために使用する。
【００６９】
複素サイズと電荷のゼータサイザー測定：
ゼータサイザー（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）測定は、複合体形成直後、成分を混合した１５分後、または複合体を室温（ＲＴ）で約１．５時間静置した後に行った。ウイルス−ペプチド複合体を、まず、７００μｌの水をサンプルに添加することによって希釈し、次いで、測定キュベットに移した。流体力学的直径（ｎｍ）を測定し、続いてゼータ電位（ｍＶ）を測定した。これらのパラメーターを３回測定し、平均サイズおよびゼータ電位を記録した。
【００７０】
ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１ペプチドの免疫学的効力：
既知のＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３ Ｔ細胞活性を有する黒色腫患者由来のＣＤ８+Ｔ細胞を、未修飾ペプチド（配列番号２：ＮＹ−ＥＳＯ−１ ９１−１１０: ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ、または配列番号１：ＭＡＧＥ−Ａ３ １６１−１８０: ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ)で前刺激した。ポリ‐リジン拡張ペプチド(配列番号５： ＮＹ−ＥＳＯ−１ ９１−１１０: ＫＫＫＫＫＫＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ、または配列番号４： ＭＡＧＥ−Ａ３ １６１−１８０: ＫＫＫＫＫＫＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ)の認識を標準ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ法によって実験した。以下のＥＬＩＳＰＯＴプロトコールを実験に使用した：ＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離カラム(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）で精製したＣＤ４＋／ＣＤ８+Ｔ細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤ８+Ｔ細胞を枯渇させたペプチドパルス（１０μｇ／ｍｌ）照射自己ＰＢＭＣ（２５０００細胞／ウェル）で予備感作した。前感作ＣＤ４＋／ＣＤ８+Ｔ細胞を、ペプチドパルス（１μｇ／ｍｌ）自己抗原提示細胞（ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞またはＤＣ）の認識のために、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて１０〜１２日に試験した。１６時間のインキュベーション（３７℃）後、サイトカイン産生抗原特異的Ｔ細胞の数を、ＡＩＤ ＥｌｉＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｃｌａｓｓｉｃ ＥＬＲ０７(Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて評価した。
【００７１】
インビボ免疫化
ＮＯＤ／Ｓｈｉ‐ｓｃｉｄ／ＩＬ‐２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウスを、ヒト臍帯血から単離した造血幹細胞（ＣＤ３４＋，ＨＬＡ‐Ｂ３５＋）を用いてヒト化した。Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍を皮下に移植し（１００ ｕｌ当たり２×１０6細胞）、動物をヒト化速度および腫瘍の大きさに基づいて群に無作為化した。動物を、ペプチドコーティングなしのＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１または同じウイルス（ＶＡＬＯ−Ｃ１）（両方の群についてウイルス用量１×１０8；１×１０7の準最適用量もまた、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄについて試験した）のいずれかで処置した。ペプチドワクチン（０．１２または３０ ｕｇ）をアジュバントとしてＰｏｌｙ−ＩＣを皮内投与した。
【００７２】
処理は、シクロホスファミドのボーラス投与（１ｍｇ／マウスｉ．ｖ．）による無作為化（Ｄ０）の２５日後に開始した。治療は、１、２、３および１２日目に腫瘍内（模擬、ウイルスおよびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ）または皮内（ペプチド対照）に行った。二次腫瘍は、３回目の治療（５日目）の２日後に対側側腹部に移植した。二次性腫瘍に対する治療は行われなかった。
【００７３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および腫瘍浸潤ＣＤ８＋リンパ球（ＴＩＬ）を、ＮＹ−ＥＳＯ−１：ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ（配列番号２）およびＭＡＧＥ−Ａ３：ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ（配列番号１）特異的ＣＤ８+Ｔ細胞について、デキストラマー分析を用いたフローサイトメトリーによって分析した。ＰＢＭＣとＴＩＬの間の異なる免疫細胞サブセットを評価した。フローサイトメトリー分析は、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ(Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)で行った。
【００７４】
ＰＢＭＣマウスモデル免疫化
３５匹の８週齢のＮＯＤ−Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２／ＩＬ−２Ｒγ ２６ｅｍ Ｃｄ２２／ＮｊｕＣｒｌ免疫不全マウス（ＮＣＧ）に、２．１０6のＳＫＭＥＬ−２腫瘍細胞（ＨＬＡ−Ｂ３５＋）を右側腹部に移植した（０日目）。１３日目に、２人の異なったドナーからの５×１０6のＨＬＡ−Ｂ３５＋ヒト末梢血単核細胞を静脈内注射した。ＮＹＥＳＯ−１（配列番号２）およびＭＡＧＥ−Ａ３（配列番号１）−複合体化５／３カプシドを含み、ＯＸ４０Ｌ発現ウイルス（「ＯＸ４０L ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ」）またはＮＹＥＳＯ−１（配列番号２）およびＭＡＧＥ−Ａ３（配列番号１）−複合体化５／３カプシドを含むＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ発現ウイルス（「ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ」）−での腫瘍内処置を、それぞれのペプチドと複合体化した１×１０9 ＶＰのウイルス投与量で１６日目に開始した。最初のＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理と同時に、５００００自家形質細胞様および骨髄系樹状細胞を腫瘍内に注入した。１７日目、１８日目（初回治療でプライム）および２５日目（ブースト）に、腫瘍内ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ注射により、樹状細胞の添加なしに腫瘍を処置した。治療スキーマを図１０に示す。腫瘍の増殖を追跡した。動物を３２日目に屠殺した。ＯＸ４０Ｌ−ＰｅｐｔｉＣＲａｄとＰｅｐｔｉＣＲＡｄは、１４．７Ｋ軌跡と５／３キメリック繊維から表現されるヒトＯＸ４０Ｌトランスジーンである削除ｇｐ１９ｋ／７．１Ｋ領域、Ｅ１Ａに２４ｂｐの削除を含んでいる。
【００７５】
ウィルス−ペプチド複合体形成
ウイルス粒子の固定化およびペプチドコーティングとＡＰＴＥＳ官能化シリカセンサー表面上に固定化されたウイルス粒子との間の相互作用を、２チャネルポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）フローチャネルおよび９６ウェルプレートオートサンプラーアセンブリ（ＭＰ−ＳＰＲ ２２０Ａ）を装備したマルチパラメトリック表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置を用いて測定した。ペプチド被覆は、ＰＥＰ１４５５ = ＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ(配列番号４); PEP１４５６= ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ(配列番号７); ＰＥＰ１５０８= ＫＫＫＫＫＫ-ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ(配列番号５）であった。すべてのＳＰＲ測定に使用した温度、流速およびレーザー波長は、それぞれ＋２０℃、２０μｌ／分および６８０ｎｍであった。
【００７６】
水中での測定では、滅菌水中で希釈された５／３キメラ繊維（〜１．９３×１０11 ＶＰ／ｍｌ）を有するアデノウイルスをＡＰＴＥＳセンサ上に１２分間固定化し、それぞれの試料について３回の測定を行った。滅菌水を流動緩衝液としても使用した。Ａ１９５緩衝液中での測定のために、アデノウイルスを最初にＰＢＳ中で希釈し、ＡＰＴＥＳセンサー上に１２分間固定した。固定化後、ＰＢＳを泳動緩衝液としてＡ１９５に置き換え、測定を３回行った。
【００７７】
滅菌水中での測定では、ペプチドストック溶液を、５ｍｇのペプチドを１ｍｌの水（５ｍｇ／ｍｌ）に溶解することによって調製し、６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３（ＰＥＰ１４５５）については１．６５ｍＭ、９Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３（ＰＥＰ１４５６）については１．４６ｍＭ、および６Ｋ−ＮＹ−ＥＳＯ(ＰＥＰ１５０８）については１．６６ｍＭの対応する濃度を得た。ペプチド試料は、各試料濃度間の泳動緩衝液を用いて、６分間、増加する濃度で連続的に注入され、続いて、８分間のフラッシュ期間が行われた。使用したペプチド濃度は、０．１、０．３、１、３、１０、３０および１００μＭであった。
【００７８】
Ａ１９５緩衝液中での測定のために、３４０μｇの対応するペプチドをＡ１９５培地に溶解して１００μＭ試料溶液を形成することによってペプチドストック溶液を調製し、次いで、より低い濃度を有するペプチド試料溶液を調製するためのストックとして使用した。ペプチドサンプルを、漸増する濃度で１０分間連続的に注入し、続いて、各サンプル濃度の間にランニング緩衝液を用いて１５分間フラッシングした。使用したペプチド濃度は、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００μＭであった。
【００７９】
ウイルス粒子当たりに結合したペプチドの数を推定するための計算は、ＳＰＲセンサ表面上に固定化されたウイルス粒子の推定数およびＳＰＲ測定によって決定された吸着ペプチドの最大数の幾何学的計算を利用することに基づいた。
【００８０】
＜結果と考察＞
複合体形成に対するペプチドの正味電荷の効果
ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドは、リジン尾部がない状態で−３、９の正味電荷を有する。負電荷を与える３つの酸性アミノ酸は、アミノ末端（アミノ酸５、８および１０）の近くに位置する。我々はウイルス表面上のペプチドの適切な結合を達成するために、ペプチドの負の正味電荷が、より長い正のリジン尾部（６個のリジンの代わりに９個）で補われなければならないかどうかを調べた。複合体形成および複合体の安定性に対するリジンテール長の効果を、２０または４０μｇのいずれかのペプチドと複合体化した１Ｅ＋９ウイルス粒子を含有するペプチド被覆ウイルスサンプルのゼータ電位および平均複合体サイズを決定することによって評価した。ゼータサイザー測定は、複合体形成直後、成分を混合した１５分後、および複合体を室温（ＲＴ）で約１．５時間静置した後に行った。結果を表１に示す。
【００８１】
サイズおよびゼータ電位の結果はＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドとの複合体がリジン尾部の長さにかかわらず形成されることを示し、これは少なくともペプチド鎖の特定の位置における負に荷電したアミノ酸が複合体形成を損なわないことを示唆する。より長いリジン尾部は、より短いリジン尾部を有する対応するペプチドよりも、約１０％大きいサイズおよびわずかに低いゼータ電位を有する複合体を与えた。新たに調製したサンプルの複合体のサイズに基づいて、そしてサンプルを室温で１．５時間保持した後、いずれかのリジン尾部との複合体は安定であった。新たに調製された複合体ではサイズは複合体形成に使用されるペプチドの量によって影響されなかったが、１．５時間保持されたサンプルでは結果はわずかにインコヒーレントである。結論として、その後のゼータサイザー実験において、６つのリジンテールペプチドを使用することを決定した。
【００８２】
複合体のサイズおよびゼータ電位に対する６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド対ウイルス比の影響
３Ｅ＋９ウイルス粒子当たり１５、３０、４５および６０μｇのペプチドのペプチド対ウイルス粒子比を調製して、複合体のサイズおよびゼータ電位の決定に基づいて、複合体形成および安定性に対する比率の効果（新しく調製した複合体対室温で２時間保持した複合体）を評価した。
【００８３】
表２の結果は試験範囲内のペプチド対ウイルス比が低ければ低いほど複合体のサイズが小さくなる傾向を示し、これは、単一のウイルスから構成されるか、または一対のウイルスから形成される小さな凝集体から構成されるペプチド−ウイルス複合体を生じる最適比が決定され得ることを示唆する。複合体はまた、約＋３０ｍＶのゼータ電位で少なくとも２時間、非常に安定であった。
【００８４】
表３に示すように、６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを用いて最適なペプチド対ウイルス比を決定する試みを行った。複合体サイズの結果によりは、６．６Ｅ＋４〜３．３Ｅ＋５のモル比範囲に等しい、３Ｅ＋９ウイルス粒子当たり１〜５μｇの低い６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドが安定な複合体をもたらすことが示唆された。しかし、より低い比率では、複合体は凝集する傾向がある。
【００８５】
６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドによるウイルスコーティングが感染能に及ぼす影響
複合ウイルスの腫瘍細胞への感染能は、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄの作用機序の重要な側面の１つ。それが、ウイルス感染性に対するペプチドコーティングの効果が、異なるペプチド対ウイルス比を有する複合体を調製することによって、および免疫細胞化学アッセイ（ＩＣＣ）に基づいてＡ５４９細胞に対する複合体の感染性を決定することによって評価された理由である。表４の結果から、関連するペプチドとウイルスの比率を約１μｇとすると、ウイルスのみのサンプルの感染性の６２％が保持されており、ウイルスコーティングは感染性に劇的な影響を及ぼさないことが示唆された。
【００８６】
異なる温度での６Ｋ‐ＭＡＧＥ‐Ａ３‐ＰｅｐｔｉＣＲＡｄの安定性
異なる温度での６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３−ＰｅｐｔｉＣＲＡｄの安定性を評価するために、３Ｅ＋９ＶＰ当たり１５または３０μｇの６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドのいずれかを混合し、異なる条件で試料を保存することによって複合体を調製した。安定性は、室温、＋５、−２０、−８０oＣで１８〜２０時間保存したサンプルからゼータサイザーによって試験した。結果を表５に示す。平均流体力学的直径は１６５ｎｍ〜２７６ｎｍの範囲の異なる温度での貯蔵の間、非常に安定なままであり、これは、試験した任意の温度でかなりの凝集が起こらなかったことを示唆する。ゼータ電位はすべての試料において＋３０ｍＶのレベルを超えており、良好な安定性を示した。最小の粒サイズは−２０oＣでの貯蔵後に達成されたが、＋４oＣでの貯蔵も集約を防止するのに有利であると思われた。
【００８７】
水中で調製した複合体のサイズおよびゼータ電位に対するウイルス比に対する６Ｋ‐ＮＹ‐ＥＳＯ‐１‐ペプチド（ｐ８１‐１００）の効果
別の臨床的に興味深いペプチドであるＮＹ−ＥＳＯ−１−ペプチドを、ゼータサイザー測定によって決定される複合体形成属性、サイズおよびゼータ電位に関して研究した。結果を表６ａに示す。複合体のサイズに関して、この特定のペプチドは正弦波様曲線に従うよい、小さなペプチドにおけるより小さな複合体サイズから開始し、１μｇのペプチドで局所最大に達するように複合体サイズがより大きくなり、その後、複合体サイズが最小１８０ｎｍに達する６０μｇまで複合体サイズが減少し始めるにつれて、複合体サイズの増加に続いた。複合体の安定性に関して、ゼータ電位の結果は、６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３と比較して、より高いペプチド対ウイルス比が好ましいことを示唆する。ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、アミノ末端に近い２つの負および２つの正のアミノ酸（ペプチド配列の４位および９位の酸性アミノ酸および１位および６位の塩基性アミノ酸）を有する−１の天然電荷を有する。ＮＹ−ＥＳＯ−１の残りの配列はＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチドの場合と同様に、全く疎水性である。
【００８８】
水中で調製した複合体のサイズおよびゼータ電位に対するウイルス比に対する６Ｋ‐ＮＹ‐ＥＳＯ‐１‐ペプチド（ｐ９１‐１１０）の効果
６Ｋ‐ＮＹ‐ＥＳＯ‐１‐ペプチド（ｐ９１‐１１０）についても、ゼータサイザー測定により決定した複合体形成属性、サイズおよびゼータ電位について実験した。結果を表６ｂに示す。複合体のサイズに関して、０．５〜１μｇの範囲のペプチドは適度に凝集した複合体のみをもたらし、このペプチドとの最適比は、３Ｅ＋９ＶＰ当たり１〜５μｇの間のどこかに存在することを示唆する。対応するゼータ電位値はゼロに近いままであり、このことは、複合体の安定性が凝集傾向を伴って最適でないかもしれないことを示唆する。
【００８９】
ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド（ｐ９１−１１０）は、カルボキシ末端に近い２つの負および２つの正のアミノ酸（ペプチド配列の１１位および１３位の酸性アミノ酸および１６位および１７位の塩基性アミノ酸）を有する−１の天然電荷を有する。ＮＹ−ＥＳＯ−１の配列の残りは、全く疎水性である。Ｃ末端に近い正電荷の位置はまた、ウイルス表面へのＣ末端の結合を可能にし得る。
【００９０】
６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３−および６Ｋ−ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの両方でコーティングされたＰｅｐｔｉＣＲＡｄ
臨床的に興味深いペプチド、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１‐およびＭＡＧＥ‐Ａ３‐ペプチドの両方を、ゼータサイザー測定に基づく複合体形成属性に関して混合物として研究した。複合体は、水中および生理学的ＮａＣｌ(０．９％）中の両方で調製した。結果を表７ａおよびｂに示す。等量の各ペプチドをウイルスと混合して調製した複合体の平均サイズは、６Ｋ‐ＭＡＧＥ‐Ａ３ペプチド単独で調製した複合体の平均サイズより大きく、６Ｋ‐ＮＹ‐ＥＳＯ‐１ペプチド（ｐ８１‐１００）単独で調製した複合体の平均サイズより小さかった。３００ｎｍ未満の平均サイズは、中程度の凝集のみが複合体形成の間に生じたことを示唆する。複合体は、水中および０．９％ ＮａＣｌ中の両方で、匹敵する複合体サイズで調製することができた。
【００９１】
等量の６Ｋ‐ＭＡＧＥ‐Ａ３および６Ｋ‐ＮＹ‐ＥＳＯ‐１ペプチド（ｐ９１‐１１０）をウイルスと混合して調製した複合体の平均サイズは、６Ｋ‐ＭＡＧＥ‐Ａ３および６Ｋ‐ＮＹ‐ＥＳＯ‐１ペプチド（ｐ８１‐１００）から調製した複合体の平均サイズより大きかった。水中では複合体の平均サイズ差は約１．８倍であったが、生理学的ＮａＣｌでは１．３倍に減少した。４００〜５００ｎｍの平均サイズは、中程度の凝集のみが複合体形成の間に生じたことを示唆する。
【００９２】
生理的ＮａＣｌ中で調製した複合体のサイズおよびゼータ電位に対するＮＹ‐ＥＳＯ‐１‐ペプチド対ウイルス比の効果
水中でＮＹ‐ＥＳＯ‐１ペプチド（ｐ８１‐１００）と形成された複合体のゼータサイザーサイズの結果は、ペプチド濃度の関数としてのサイン様挙動を示唆したので、生理的塩溶液中の複合体形成段階が起こりうる非特異的相互作用を防ぐかどうかを研究した。結果を表８ａに示す。結果は、増加するペプチド濃度の関数としての複合体サイズが水中で調製された複合体と全く同様の傾向に従うことを示している。複合体サイズはより大きかったが、いずれにせよ５μｇから６０μｇまでの範囲のペプチド対ウイルス比と全く一致した。結果は、最適なペプチド対ウイルス比が３Ｅ＋９ＶＰ当たり１〜５μｇの範囲で見出され得ることを示唆する。
【００９３】
水中でＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド（ｐ９１−１１０）と形成された複合体のゼータサイザー平均サイズ結果は１μｇより高いペプチド対ウイルス比で凝集が増加し、３０００ｎｍより大きい複合体サイズを生じることを示唆した。生理食塩水中の複合体形成段階が凝集を防ぐかどうかを検討した。結果を表８ｂに示す。増加するペプチド濃度の関数としての複合体サイズが、２００〜４００ｎｍの範囲内で非常に一定であったことを示した。したがって、水中のＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド−ウイルス複合体および生理学的塩の両方のデータを提示する図１で示したように、複合体形成の間の液相中の生理学的ＮａＣｌは、凝集を極めて劇的に防止し得る。３Ｅ＋９ＶＰ当たり１〜５μｇの関連ペプチド対ウイルス比では、複合体サイズは２１７〜２４５ｎｍ内に留まった。
【００９４】
ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１ペプチドの免疫学的効力
ポリリジン伸長ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激により、癌患者由来抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を、非修飾ペプチドと同程度に効果的に誘発し（図３）、このことは、ポリリジン修飾が機能に影響を及ぼさないことを示している。
【００９５】
ＰｅｐｔｉＣＲＡｄはヒト化マウスモデルにおいてペプチド特異的免疫応答を誘発する
全ての活性処理（ペプチド単独、ペプチド被覆を伴わないウイルス［ＶＡＬＯ−Ｃ１］、およびＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド被覆を伴うウイルス［ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ］）は、模擬処理動物と比較して、原発腫瘍における免疫細胞数を増加させた。ＶＡＬＯ−Ｃ１およびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１処置動物の両方は処置後にペプチドワクチンまたは模擬処置動物と比較して、原発腫瘍においてより多くのＴ細胞（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）を示したが、全体的な浸潤免疫細胞（ＣＤ４５）の数はすべての群で類似していた（それぞれ、図５および６）。
【００９６】
さらに、Ｔ調節細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋）の数は、ペプチドワクチンまたは模擬処置動物由来の原発腫瘍と比較して、ＶＡＬＯ−Ｃ１およびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１処置原発腫瘍で少なかった（図７）。このことは、腫瘍内に投与された免疫原性アデノウイルス（裸のウイルスＶＡＬＯ−Ｃ１またはＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１のいずれか）が局所の免疫抑制を低下させることによって腫瘍微小環境を調節することを示唆している。
【００９７】
ＶＡＬＯ−Ｃ１処置動物とは異なり、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１処置動物は処置された原発腫瘍よりも未処置の二次腫瘍においてより多くのＣＤ４＋およびＣＤ８+Ｔ細胞を示したことから、ウイルスのペプチドコーティングを介した腫瘍標的化が、遠隔未処置腫瘍における効果の誘導に極めて重要であることが示唆された（表９）。さらに、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１処理動物は、プライミング後の血液中のＮＹＥＳＯ特異的ＣＤ８+ T細胞（総ＣＤ８＋細胞の平均＝４．３％）がＯＶ処理動物（平均＝０．６％）またはペプチドワクチン処理動物（平均＝０．６％）と比較して多かった（図８）。ＰｅｐｔｉＣＲＡｄおよびＶＡＬＯＣ１処理動物におけるＭＡＧＥ特異的ＣＤ８+ＴＩＬの頻度−処理および未処理腫瘍における−は、ペプチド処理動物におけるＭＡＧＥ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度よりも高かった（図９）。興味深いことに、ＭＡＧＥ固有ＣＤ８+Ｔ細胞の高い頻度はＮＹ−ＥＳＯ−１−固有ＣＤ８+ Ｔ細胞よりもＶＡＬＯＣ１−及びＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理されたｔｕｍｏｒｓで見られたが、血中では逆であった。
【００９８】
ＰｅｐｔｉＣＲＡｄはＰＢＭＣマウスモデルにおいてペプチド特異的免疫応答を誘発する
ＮＹ−ＥＳＯ−１−およびＭＡＧＥ−Ａ３−複合体化ＰｅｐｔｉＣＲＡｄによる治療は、大きな十分に確立された腫瘍に対して治療を開始した場合でも、ヒト化マウスメラノーマモデルにおいて腫瘍増殖停止をもたらした（図１０）。ＯＸ４０Ｌ−ＰｅｐｔｉＣＲＡｄで処理したマウスは、模擬処理マウスよりもＰＢＭＣの全ＣＤ８+ T細胞の中でＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ８+ T細胞が有意に多く、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理がヒト化マウスにおいてペプチド特異的応答を誘発できることを示した（図１１）。
【００９９】
５／３キメラカプシドを有するアデノウイルスは、最適な複合体形成条件でＮＹ−ＥＳＯ−ＩおよびＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと複合体形成することができる
ペプチドコーティングとアデノウイルス粒子（ＡｄＶ）との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて研究した。主な目的は、１）ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの異なる培地（無菌水およびＡ１９５培地、ウイルス調製に一般的に使用される培地）中でのウイルスとの結合力学を決定すること、２）１つのウイルス粒子が各培地中で結合できるペプチド分子の数を推定すること、および３）ペプチド−ウイルス複合体の安定性を評価することであった。ペプチド被覆は、ＰＥＰ１４５５ = ＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ(配列番号４); PEP１４５６= ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ(配列番号７); PEP１５０８= ＫＫＫＫＫＫ−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ(配列番号５）であった。
【０１００】
滅菌水中のＡｄＶ粒子に対するＳＰＲ反応は０．７°以下であり、これは、検出領域をカバーするウイルスの５０％に相当し（１．４°が１００％のカバレージに相当する）（表１０）、５×１０7のウイルス粒子が検出領域内に吸着されると推定される。ＡｄＶ粒子をＡ１９５緩衝液中で流した場合、ＳＰＲ応答は１．２°以下であり、これは検出表面の８６％の被覆率に相当する（図１２）。これらの結果は、検知領域内に吸着された８．６×１０7のウィルス粒子の推定値を与える。これらの結果は、ウイルスの構造が無菌水中よりもＡ１９５緩衝液中で良好に保存されること、またはＡ１９５緩衝液がＡＰＴＥＳ表面へのウイルスの吸着を促進することを示すものといえる。
【０１０１】
ペプチド１４５５および１５０８は、Ａ１９５培地よりも無菌水中の固定化ウイルス粒子により良好に吸着する（図１２Ｂおよび１３）。反対のことは、固定化されたウイルス粒子上に吸着されるペプチド１４５６については水中よりもＡ１９５緩衝液中で有意に良好に当てはまる。ウイルス当たりに吸着されたペプチドの数を表１０に示す。
【０１０２】
以上の結果に基づくと、ＰＥＰ１４５５はＡ１９５緩衝液に完全には溶解せず、ＰＥＰ１４５６はＡ１９５緩衝液中のペプチド対ウイルス比によって判断されるように、溶解度およびコーティング効率に関して、より潜在的な修飾であると思われる。これらの結果は、ペプチドウイルス複合体が、適切な緩衝環境において５／３キメラカプシドおよび６／９Ｋペプチドを有するアデノウイルス構築物を使用して調製され得ることを示す。複合体はＳＰＲの結果によって示されるように、遊離ペプチド環境なしで非常に安定である。さらに、ペプチド対ウイルス粒子比はペプチド配列特異的因子であり、複合体形成のための最適条件の存在にも依存する。
【０１０３】
＜まとめ＞
３つの試験されたペプチド、１つの６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３および２つの６Ｋ−ＮＹ−ＥＳＯ−１では、複合体サイズはペプチド対ウイルス比に依存し、各ペプチドおよびペプチドおよびウイルスの各組み合わせについて決定されるペプチド特異的特性であると考えられる。６Ｋ‐ＮＹ‐ＥＳＯ‐１（ｐ９１‐１１０）の場合には、水の代わりに生理的塩溶液中で複合体を調製することにより、複合体形成中の凝集および起こりうる非特異的相互作用をある程度防ぐことができる。６Ｋ‐ＮＹ‐ＥＳＯ‐１（ｐ８１‐１００）ではかかる挙動はないため、ペプチド特異的な挙動であることが示唆された。
【０１０４】
６Ｋ−ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドとの複合体形成は関連ペプチド／ウイルス比を用いた場合、６２％の感染能が残存し、ウイルスの感染能を有意に悪化させなかった。
【０１０５】
ＭＡＧＥ‐Ａ３複合体安定性に基づいて、複合体の最適な貯蔵状態は＋４oＣまたは−２０oＣのいずれかであると考えられる。
【０１０６】
ペプチドコーティングを伴うペプチドＣＲＡｄは、全身性腫瘍標的ＣＤ８+Ｔ細胞応答および未治療の遠隔腫瘍へのＣＤ８+ＴＩＬの浸潤の誘発において、裸の腫瘍崩壊性アデノウイルス（ＶＡＬＯ−Ｃ１）または標準的ペプチドワクチン接種よりも優れている。このデータは、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄが標準的な腫瘍崩壊性ウイルスの腫瘍標的特異性を改善することを示唆するものである。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月16日(2019.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾アデノウイルスであって、
アデノウイルスベクターによって遺伝的にコードされることなく、ウイルスのカプシド上に共有結合または非共有結合により接続している以下に示すポリペプチド：
ｉ）  ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ [配列番号１］；
ｉｉ）  ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号２］；
ｉｉｉ）  それらと少なくとも９０％同一であるポリペプチド
の少なくとも１つを含む、修飾アデノウイルス。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、少なくとも３、４、５、６、７、８、または９個のリジンを用いて伸長されたポリリジンである、請求項１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項３】
前記リジンが前記ポリペプチドのアミノ末端に結合している、請求項２に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、
ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ[配列番号７］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ（ＫＫＫ）−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号８］；あるいは、
ＫＫＫＫＫＫ−ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ[配列番号４］；および／または
ＫＫＫＫＫＫ−ＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ [配列番号：５］
である、請求項１〜３のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項５】
前記アデノウイルスが、ヒトアデノウイルスである、請求項１〜４のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項６】
前記アデノウイルスが、腫瘍特異的プロモーターの挿入、少なくとも１つの遺伝子欠失および少なくとも１つの導入遺伝子の挿入を含む、Ｅ１および／またはＥ３および／またはＥ４および／またはＬ３遺伝子における修飾を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項７】
前記アデノウイルスが、血清型５である、請求項１〜６のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項８】
前記アデノウイルスが、Ａｄ５／３キメラ置換を含むようにさらに修飾され、血清型５アデノウイルス線維ノブ領域が血清型３アデノウイルスノブ領域に置換されている、請求項１〜７のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項９】
前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａ遺伝子欠失を含むようにさらに改変され、アミノ酸１２２〜１２９をコードするヌクレオチドの少なくとも１つが欠失している、請求項１〜８のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１０】
前記アデノウイルスが、１４．７ｋ遺伝子の部分的または完全な欠失を含むようにさらに改変されている、請求項１〜９のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１１】
前記アデノウイルスが、共刺激分子をコードする少なくとも１つの導入遺伝子の挿入を含むようにさらに改変されている、請求項１〜１０のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１２】
前記ウイルスが少なくとも２つの導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子の一方が先天性免疫系を活性化する共刺激分子をコードし、他方が適応免疫系を活性化する共刺激分子をコードする、請求項１１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１３】
前記ウイルスが、ＣＤ４０Ｌおよび／またはＯＸ４０Ｌをコードする導入遺伝子を含む、請求項１２に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１４】
前記導入遺伝子がヒトである、請求項１３に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１５】
前記ＯＸ４０Ｌが、Ｅ３Ｂ領域に位置し、遺伝子１４．７Ｋの欠失を置換する、請求項１３または１４に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１６】
前記ＣＤ４０Ｌ分子が、２Ａプロセッシング部位を用いてＯＸ４０Ｌのすぐ下流に挿入される、請求項１３〜１４のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１７】
ペプチド対ウイルス比が、３Ｅ＋９ウイルス粒子当たり１〜５μｇの範囲である、請求項１〜１６のいずれか１に記載の修飾アデノウイルス。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つの修飾アデノウイルスと、適切なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、皮内、腔内もしくは腹腔内注射、または経口投与のために製剤化されている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌の治療に使用するための、請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つのアデノウイルス；または、請求項１８〜１９のいずれか１に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
癌を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つのアデノウイルスの使用。
【請求項２２】
患者における癌を治療する方法であって、有効量の、請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つのアデノウイルス；または請求項１８または１９に記載の組成物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１に記載の少なくとも１つのアデノウイルス；または請求項１８または１９に記載の組成物が、細胞チェックポイントモジュレーターと共に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記チェックポイントモジュレーターが、抗ＰＤ１分子、抗ＰＤ−Ｌ１分子または抗ＣＴＬＡ−４分子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、鼻咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎がん、結合組織がん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、喉がん、口腔がん、肝がん、骨がん、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、フェオクロモサイトーマ、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルシノイド、胃腸管の癌腫、線維肉腫、乳癌、パジェット病、頸部癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼がん、頸がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝がん、カポシ肉腫、前立腺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、栄養芽細胞がん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリン腫、カルチノイド症候群、体細胞スタチン腫、歯肉がん、心臓がん、唇がん、髄膜がん、口腔がん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がん、扁桃がんのいずれか１つ以上を含む、請求項２０または２１に記載のアデノウイルスまたは使用、又は請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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