(57)【要約】  ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンドであって、前記ペプチドリガンドが、システイン、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｎ−ベータ−アルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）およびＮ−ベータ−ハロアルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＨＡｌｋＤａｐ）から選択される３つの残基を含み、但し、前記３つの残基のうちの少なくとも１つが、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐから選択されることを条件とし、前記３つの残基が、少なくとも２つのループ状配列によって分離されており、前記ペプチドリガンドが分子足場を含み、ペプチドが、ポリペプチドのＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基との共有結合によるアルキルアミノ連結によって、および前記３つの残基がシステインを含む場合には、ポリペプチドのシステイン残基とのチオエーテル連結によって、２つのポリペプチドループが分子足場上に形成されるように、足場に連結されている、ペプチドリガンド。
2021528433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンドであって、前記ペプチドリガンドが、システイン、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｎ−ベータ−アルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）およびＮ−ベータ−ハロアルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＨＡｌｋＤａｐ）から選択される３つの残基を含むポリペプチドを含み、但し、前記３つの残基のうちの少なくとも１つが、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐから選択されることを条件とし、前記３つの残基が、少なくとも２つのループ配列及び分子足場によって分離されており、前記ペプチドが、ポリペプチドの前記ＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基との共有結合によるアルキルアミノ連結によって前記足場に連結され、および前記３つの残基がシステインを含む場合には、前記ポリペプチドのシステイン残基とのチオエーテル連結によって前記足場に連結され、２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されている、ペプチドリガンド。
【請求項２】
前記ペプチドリガンドが、
Ａ１−Ｘ１−Ａ２−Ｘ２−Ａ３
（式中、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して、システイン、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｎ−ベータ−アルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）、またはＮ−ベータ−ハロアルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＨＡｌｋＤａｐ）であり、但し、Ａ１、Ａ２、およびＡ３のうちの少なくとも１つが、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐであることを条件とし、
Ｘ１およびＸ２は、システイン、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基の間のアミノ酸残基を表し、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、独立して、４、５、６または７個のアミノ酸残基を含む）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３】
Ａ１、Ａ２およびＡ３のうちの２つが、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐから選択され、３番目のＡ１、Ａ２およびＡ３のうちの１つがシステインであり、好ましくはＡ２がシステインである、請求項１または２に記載のペプチドリガンド。
【請求項４】
Ａ１、Ａ２、およびＡ３がそれぞれ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐである、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項５】
前記分子足場が、芳香族分子足場、例えば、１，３，５−トリス（メチレン）ベンゼンである、請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項６】
表３から１０の１つもしくは複数に列挙されたペプチドリガンド配列１〜３０８の１つもしくは複数から選択されるアミノ酸配列、またはその薬学的に許容される塩を含み、但し、前記ペプチドリガンド配列１〜３０８におけるシステイン残基の１つまたは複数が、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐによって置き換えられていることを条件とする、請求項５に記載のペプチドリガンド。
【請求項７】
前記ペプチドリガンド配列が、
［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰＡ１ＰＷＧＰＦＷＡ２ＰＶＮＲＰＧＡ３
または
［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰＡ１［Ａｉｂ］［１Ｎａｌ］Ｇ［Ａｉｂ］Ｆ［１Ｎａｌ］Ａ２Ｐ［ｔＢｕＧｌｙ］Ｎ［ＨＡｒｇ］Ｐ［ｄＤ］Ａ３
（式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、請求項２に定義された通りである）
から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項８】
Ａ２がシステインであり、Ａ１およびＡ３がＤａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ、好ましくはＤａｐである、請求項７に記載のペプチドリガンド。
【請求項９】
前記分子足場が、非芳香族分子足場であり、好ましくは１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０】
表１１〜１３の化合物１〜９８またはその薬学的に許容される塩のうちのいずれか１つから選択され、但し、前記ペプチドリガンド配列１〜９８におけるシステイン残基の１つまたは複数が、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐで置き換えられている、請求項９に記載のペプチドリガンド。
【請求項１１】
前記ＥｐｈＡ２が、ヒトＥｐｈＡ２である、請求項１から１０のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１２】
ヒトＥｐｈＡ２に対して選択的であるが、ヒトＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３またはＥｐｈＡ４と交差反応しない、請求項１から１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１３】
１つまたは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートした、請求項１から１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
前記細胞毒性剤が、ＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される、請求項１３に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項１３もしくは１４のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲートを、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせ得て含む医薬組成物。
【請求項１６】
罹患組織におけるＥｐｈＡ２の過剰発現によって特徴付けられる、疾患または障害を予防する、抑制するまたは処置する際に使用するための、請求項１から１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項１３もしくは１４に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
がんを予防する、抑制するまたは処置する際に使用するための、請求項１から１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項１３もしくは１４のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
肺がんを予防する、抑制するまたは処置する際に使用するための、請求項１から１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項１３もしくは１４のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
非小細胞肺癌を予防する、抑制するまたは処置する際に使用するための、請求項１から１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項１３もしくは１４のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼＡ２（ＥｐｈＡ２）に対して高い結合親和性を示すペプチドリガンドに関する。本発明はまた、１つまたは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートした前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびに罹患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害を予防する、抑制するまたは処置する際の前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。
【０００２】
詳細には、本発明は、ペプチドと足場分子の間に２つ以上の結合を形成するための新規化学を有するこの種のペプチドリガンドに関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な研究チームは、以前に、ペプチドのシステイン残基と足場分子の適切な官能基の間に２つまたはそれより多いチオエーテル結合を形成することによって、ペプチドを足場部分に係留してきた。例えば、トリス（ブロモメチル）ベンゼンのように、システイン含有ペプチドを分子足場に連結させることによる、候補薬物化合物の生成のための方法がＷＯ２００４／０７７０６２およびＷＯ２００６／０７８１６１に開示されている。
【０００４】
環化を達成することを目的として、共有結合によるチオエーテル連結を生じさせるためにシステインチオールを利用する利点は、システインチオールの選択的かつ生体直交型の反応性にある。チオール含有直鎖状ペプチドは、１，３，５トリス−ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢ）などのチオール反応性足場化合物を用いて環化され、二環性ペプチドを形成する場合があり、得られた生成物はベンジル位に３つのチオエーテルを含有する。チオエーテル連結を有するループ状二環性ペプチドを形成するための、直鎖状ペプチドのＴＢＭＢを用いる反応全体は、図１に示される。
【０００５】
ペプチドを足場部分にカップリングさせて、チオエーテル部位の適切な置き換えを用いるループ状ペプチド構造を形成し、それによって、異なるペプチドとの適合性、溶解度の改善などの物理化学特性の変化、生体分布の変化および他の利点を達成するための代替化学に対する需要が存在する。
【０００６】
ＷＯ２０１１／０１８２２７には、第１のペプチドリガンドまたはペプチドリガンドの群のコンホメーションを変更するための方法であって、各ペプチドリガンドが、第２のペプチドリガンドまたはペプチドリガンドの群を生成するために少なくとも２つの反応性基と共有結合を形成する分子足場に共有結合により連結した、ループ配列によって分離された前記反応性基を含み、上記方法が、ペプチド由来の前記第２の誘導体または誘導体の群と前記第１の誘導体または誘導体の群の足場とをアセンブルすることを含み、（ａ）少なくとも１つの反応性基を変更すること；または（ｂ）分子足場の性質を変更すること；または（ｃ）少なくとも１つの反応性基と分子足場の間の結合を変更すること；または（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せのうちの１つが組み込まれている方法が記載されている。
【０００７】
２０１７年１２月２０日に出願した本発明者らのより早期の係属出願であるＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８３９５３およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８３９５４には、足場分子への１つまたは複数のチオエーテル連結がアルキルアミノ連結によって置き換えられた二環性ペプチドが記載されている。
【０００８】
Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼ（Ｅｐｈ）は、チロシン残基においてタンパク質をリン酸化するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の大きな群に属する。Ｅｐｈおよびそれらの膜結合型エフリンリガンド（エフリン）は、細胞の位置決めおよび組織の組織化を制御する（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ７，  ４６５−８０）。機能的かつ生化学的なＥｐｈ応答は、より高度なリガンドオリゴマー形成状態で起こる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２，  ６６７−６７８）。
【０００９】
他のパターン形成機能の中で、種々のＥｐｈおよびエフリンは、血管発生において役割を果たすことが示されている。ＥｐｈＢ４およびエフリン−Ｂ２のノックアウトは、毛細血管床を血管にリモデリングさせる能力の喪失（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）および胚致死をもたらす。一部のＥｐｈ受容体およびエフリンの持続的発現は、新たに形成された成体微小血管でも観察されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １０，  ３４３１−４２；Ａｄａｍｓ  （２００３）  Ｊ  Ａｎａｔ  ２０２，  １０５−１２）。
【００１０】
成体において、一部のエフリンおよびそれらの受容体が調節解除されて再出現することが、腫瘍の浸潤、転移および新血管新生に寄与することも観察されている（Ｎａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ５９，  ５８−６７；Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）。さらに、一部のＥｐｈファミリーメンバーは、種々のヒト腫瘍に由来する腫瘍細胞で過剰発現することが見出されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）；Ｍａｒｍｅ  （２００２）  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８１  Ｓｕｐｐｌ  ２，  Ｓ６６；Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，  １３６０−１）。
【００１１】
ＥＰＨ受容体Ａ２（エフリンＡ型受容体２）は、ヒトでは、ＥＰＨＡ２遺伝子によってコードされているタンパク質である。
【００１２】
ＥｐｈＡ２は、ヒトの複数のがんにおいて上方調節され、疾患進行、転移および予後不良と相関する場合も多い。例えば、乳がん（Ｚｅｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ２３０１−２３０６；Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７０，  ２９９−３０８；Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ２４４２６）、肺がん（Ｂｒａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）  ２，  １０３９−１０４９；Ｋｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ６１３−６１８；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ．  ８，  ３０１−３０８）、胃がん（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ９６，  ４２−４７；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  ５４，  ２４１０−２４１７）、膵臓がん（Ｍｕｄａｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２３，  ３５７−３６５）、前立腺がん（Ｗａｌｋｅｒ−Ｄａｎｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４１，  ２７５−２８０）、肝臓がん  （Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｒｅｓ．  ３９，  １１６９−１１７７）および神経膠芽腫（Ｗｙｋｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３，  ５４１−５５１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ３１，  ４７７−４８８）。
【００１３】
がん進行におけるＥｐｈＡ２の完全な役割は未だ定義されていないが、腫瘍細胞の成長、生存、侵襲および血管新生を含むがん進行の多数のステージにおける相互作用に関するエビデンスが存在する。ＥｐｈＡ２発現を下方調節することによって、腫瘍のがん細胞増殖が抑制されるが（Ｂｉｎｄａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２，  ７６５−７８０）、一方、ＥｐｈＡ２を遮断することによって、ＶＥＧＦ誘導型細胞移動（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ３２５０−３２５５）、簇出および血管新生（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １，  ２−１１、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  １０９，  ３３２−４０）ならびに転移性進行（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９，  １８８４−１８８６）が阻害される。
【００１４】
ＥｐｈＡ２に対する抗体薬物コンジュゲートは、ラットおよびマウスの異種移植モデルにおいて腫瘍成長を有意に消失させることが示されており（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８，  ９３６７−９３７４）、同様のアプローチがヒトにおいて試されたが、処置に関連する有害事象のために処置を中止しなければならなかった（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ３１，  ７７−８４）。
【００１５】
本発明者らのより早期の係属出願である、２０１７年５月１５日に出願されたＧＢ１７０７７３４．８、ならびにいずれも２０１７年１２月１９日に出願されたＧＢ１７２１２５９．８およびＧＢ１７２１２６５．５には、ＥｐｈＡ２に対して高い結合親和性を有する二環性ペプチドリガンドが記載されている。これらの出願には、ペプチドリガンドの治療剤とのコンジュゲート、特に細胞毒性剤とのコンジュゲートについてさらに記載されている。
【発明の概要】
【００１６】
本発明者らは、ＥｐｈＡ２に対する親和性を有するループ状ペプチドにおけるチオエーテル連結のアルキルアミノ連結による置き換えによって、すべてチオエーテル連結を有するように作製された対応するコンジュゲートと同様のＥｐｈＡ２に対する親和性を示すループ状ペプチドコンジュゲートがもたらされることを見出した。アルキルアミノ連結によるチオエーテル連結の置き換えは、本発明によるコンジュゲートの溶解度の改善および／または酸化安定性の改善をもたらすことが期待される。
【００１７】
したがって、第１の態様では、本発明は、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンドであって、前記ペプチドリガンドが、システイン、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸  （Ｄａｐ）、Ｎ−ベータ−アルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）およびＮ−ベータ−ハロアルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＨＡｌｋＤａｐ）から選択される３つの残基を含むポリペプチドを含み、但し、前記３つの残基のうちの少なくとも１つは、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐから選択されることを条件とし、前記３つの残基は、少なくとも２つのループ状配列及び分子足場によって分離されており、ペプチドが、ポリペプチドのＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基との共有結合によるアルキルアミノ連結によって前記足場に連結され、および前記３つの残基がシステインを含む場合には、ポリペプチドのシステイン残基とのチオエーテル連結によって前記足場に連結され、２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されている、ペプチドリガンドを提供する。
【００１８】
適切には、ペプチドリガンドは、
Ａ１−Ｘ１−Ａ２−Ｘ２−Ａ３
（式中、
Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して、システイン、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｎ−ベータ−アルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）、またはＮ−ベータ−ハロアルキル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＨＡｌｋＤａｐ）であり、但し、Ａ１、Ａ２、およびＡ３のうちの少なくとも１つは、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐであることを条件とし、
Ｘ１およびＸ２は、システイン、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基の間のアミノ酸残基を表し、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、独立して、４、５、６または７個のアミノ酸残基のループ状配列である）
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明の誘導体は、ＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基に対する少なくとも１つのアルキルアミノ連結と、システインに対する最大２つのチオエーテル連結とによって、足場にカップリングしたペプチドループを含むことを見て取ることができる。
【００２０】
Ｎ−ＡｌｋＤａｐおよびＮ−ＨＡｌｋＤａｐにおける接頭語「アルキル」は、１から４個の炭素原子を有するアルキル基、好ましくはメチルを指す。接頭語「ハロ」は、１つまたは複数の、適切には１つの、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード置換基を有するアルキル基を特定するために、本文脈においてその通常の意味で使用される。
【００２１】
システインが存在する場合、チオエーテル連結は、以下でさらに説明されるように、環状ペプチドの形成の間にアンカーをもたらす。これらの実施形態では、チオエーテル連結は、適切には、二環性ペプチドコンジュゲートの中央の連結であり、すなわち、ペプチド配列において、ペプチドのアルキルアミノ連結を形成する２つの残基は、チオエーテル連結を形成するシステイン残基の両側と一定の距離を保ち、その両側に位置する。したがって、ループ状ペプチド構造は、中央のチオエーテル連結と２つの周辺のアルキルアミノ連結とを有する二環性ペプチドコンジュゲートである。代替の実施形態では、チオエーテル連結は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置され、中央の連結および他の末端の連結は、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐから選択される。
【００２２】
本発明の実施形態では、Ａ１、Ａ２、およびＡ３の３つすべては、適切には、ＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐであってもよい。これらの実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、適切には、中央のアルキルアミノ連結および２つの周辺のアルキルアミノ連結を有する二環性コンジュゲートであり、ペプチドは、中央のアルキルアミノ連結を共有する２つのループを形成する。これらの実施形態では、Ａ１、Ａ２、およびＡ３はすべて、アルキル化Ｄａｐに関する好ましい反応速度論により、適切には、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ、最も適切にはＮ−ＡｌｋＤａｐから選択される。
【００２３】
実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、さらに、Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置き換え（例えば、１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等配電子アミノ酸または等電子アミノ酸による置き換え、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の、等配電子アミノ酸または等電子アミノ酸による置き換え）、スペーサー基の付加、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化抵抗性アミノ酸残基による置き換え、１つまたは複数のアミノ酸残基のアラニンによる置き換え、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置き換え、二環性ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮアルキル化、１つまたは複数のペプチド結合のサロゲート結合による置き換え、ペプチド主鎖長の改変、１つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の別の化学基による置換、ならびにシステイン、リシン、グルタミン酸およびチロシンなどのアミノ酸の適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬による、合成後の生体直交型修飾から選択される１つまたは複数の修飾を含む。
【００２４】
適切には、これらの実施形態は、適切なアミノ反応性化学を使用するＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学を使用するＣ末端修飾を含んでもよい。例えば、Ｎ末端修飾は、エフェクター基のコンジュゲーションおよびその標的に対する二環性ペプチドの効力の保持を容易にする分子スペーサー基の付加を含んでもよい。スペーサー基は、適切には、Ａｌａなどの約５から約３０個のアミノ酸を含有するオリゴペプチド基、Ｇ−Ｓａｒ１０−Ａ基またはｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ基である。あるいはまたはさらに、Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾は、細胞毒性剤の付加を含む。
【００２５】
本明細書で定義されるペプチド配列のすべてにおいて、１つまたは複数のチロシン残基は、フェニルアラニンで置き換えられてもよい。これにより、ペプチドの足場分子への塩基触媒カップリングの間の二環性ペプチド産物の収率が改善されることが判明した。
【００２６】
適切には、本発明のペプチドリガンドは、ヒト、マウスおよびイヌのＥｐｈＡ２ヘモペキシンドメインの高親和性結合剤である。適切には、結合親和性Ｋｉは、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満である。本明細書の文脈における結合親和性は、以下に記載された方法によって測定される結合親和性である。
【００２７】
適切には、本発明のペプチドリガンドはＥｐｈＡ２に対して選択的であるが、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３またはＥｐｈＡ４と交差反応しない。適切には、これらのリガンドそれぞれとの結合親和性ｋｉは、約５００ｎＭを超えるか、約１０００ｎＭを超えるか、または約１００００ｎＭを超える。
【００２８】
適切には、足場は、（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分を含む。適切には、足場は、トリス置換（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分、例えば、トリスメチレン置換（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分を含む。（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分は、適切には、足場が３回対称軸を有するように、好ましくはトリス置換された、６員環構造である。よって、ある特定の好ましい実施形態では、足場は、例えば、ペプチドを１，３，５−トリス−（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）と反応させることによって得られる１，３，５−トリス−メチレンベンゼン足場である。他の好ましい実施形態では、足場は、ペプチドを、以下にさらに記載されているように１，３，５−トリス−（ブロモアセトアミド）ベンゼン（ＴＢＡＢ）にカップリングさせることによって導出され得る、１，３，５−トリス−（アセトアミド）ベンゼン基である。
【００２９】
反応性部位はまた、第３の残基がシステインである実施形態において、システインの−ＳＨ基とチオエーテル連結を形成するのに適している。システインの−ＳＨ基は求核性が高く、これらの実施形態では、最初に、足場分子の求電子中心と反応してペプチドを足場分子に固定し、その後、アミノ基は、足場分子の残りの求電子中心と反応してループ状ペプチドリガンドを形成することが期待される。
【００３０】
実施形態では、ペプチドは、アルキルアミノ連結を形成することを意図したアミノ基および−ＳＨ基（存在する場合）以外に、求核基に保護基を有する。
【００３１】
適切には、求核置換反応において、本明細書で定義されるペプチドを３つ以上の脱離基を有する足場分子と反応させることを含む方法によって、本発明のペプチドリガンドを作製することができる。
【００３２】
代替の方法では、ペプチドの２つ以上の側鎖基を脱離基に変換し、続いて、求核置換反応において、ペプチドを２つ以上のアミノ基を有する足場分子と反応させることによって、本発明の化合物を作製することができる。
【００３３】
例えば、脱離基が従来のアニオン性脱離基である求核置換反応は、塩基の存在下で実施されてもよい。本発明者らは、環化ペプチドリガンドの収率は、求核置換反応に対する溶媒および塩基の適切な選択によって大いに増加する可能性があり、さらに、好ましい溶媒および塩基は、チオエーテル連結の形成にのみ関与する従来技術の溶媒と塩基の組合せとは異なることを見出した。特に、本発明者らは、収率の改善は、トリアルキルアミン塩基、すなわち、式ＮＲ１Ｒ２Ｒ３（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基、適切には、Ｃ２〜Ｃ４アルキル基、特に、Ｃ２〜Ｃ３アルキル基である）の塩基を使用する場合に達成されることを見出した。特に適切な塩基は、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である。これらの塩基は、わずかに弱い求核性の特性を有し、この特性によって、これらの塩基に関して観察される副反応の少なさと高収率について説明されると考えられる。本発明者らは、求核置換反応に好ましい溶媒が、極性かつプロトン性の溶媒、特にＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０：５０）であることをさらに見出した。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、１つまたは複数のエフェクター基および／または官能基、例えば、細胞毒性剤または金属キレーターにコンジュゲートした本発明によるペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートを提供する。
【００３５】
適切には、コンジュゲートは、切断可能な結合、例えば、ジスルフィド結合によってペプチドリガンドに連結した細胞毒性剤を有する。適切には、細胞毒性剤は、ＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される。
【００３６】
実施形態では、薬物コンジュゲートは、以下の構造：
【化１】
2021528433.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
毒素は、任意の適切な細胞毒性剤を指し、
二環は、ループ状ペプチド構造を表し、
ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
ｍは、０から１０から選択される整数を表す）
を有する。
【００３７】
適切には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がすべてＨであるか；またはＲ１、Ｒ２、Ｒ３がすべてＨであり、かつＲ４＝メチル；またはＲ１、Ｒ２＝メチルかつＲ３、Ｒ４＝Ｈ；またはＲ１、Ｒ３＝メチルかつＲ２、Ｒ４＝Ｈ；またはＲ１、Ｒ２＝ＨかつＲ３、Ｒ４＝Ｃ１〜Ｃ６アルキルのいずれかである。
【００３８】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、アジド官能基化毒素とアルキン官能基化二環性ペプチド構造（またはその逆）の間のクリック反応によって形成されるトリアゾール基を含んでもよい。他の実施形態では、二環性ペプチドは、カルボキシレート官能基化毒素と二環性ペプチドのＮ末端アミノ基の間の反応によって形成されるアミド連結を含有してもよい。
【００３９】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、標的細胞内で毒素の選択的放出をもたらす、カテプシンにより切断可能な基を含んでもよい。適切なカテプシンにより切断可能な基は、バリン−シトルリンである。
【００４０】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、コンジュゲートに対して所望の官能性、例えば、結合親和性またはカテプシンによる切断可能性をもたらす、１つまたは複数のスペーサー基を含んでもよい。適切なスペーサー基は、バリン−シトルリン基と毒素部分の中間に位置し得るパラ−アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）である。ＰＡＢＣは、切断可能な基の切断後に、毒素から自然に離脱する、いわゆる自壊基（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）である。
【００４１】
よって、実施形態では、二環性ペプチド−薬物コンジュゲートは、毒素−ＰＡＢＣ−ｃｉｔ−ｖａｌ−トリアゾール−二環から構成される以下の構造：
【化２】
2021528433.tif 000004
を有してもよい。
【００４２】
さらなる実施形態では、二環性ペプチド−薬物コンジュゲートは、毒素−ＰＡＢＣ−ｃｉｔ−ｖａｌ−ジカルボキシレート−二環から構成される以下の構造：
【化３】
2021528433.tif 000005
を有してもよい。
【００４３】
ここで、（ａｌｋ）は、式ＣｎＨ２ｎ（式中、ｎは、１から１０であり、直鎖状または分枝状であってもよく、適切には、（ａｌｋ）は、ｎ−プロピレンまたはｎ−ブチレンである）のアルキレン基である。
【００４４】
別の態様では、本発明は、本発明による少なくともペプチドリガンドまたはコンジュゲートを含むキットをさらに提供する。
【００４５】
またさらなる態様では、本発明は、本発明のペプチドリガンドまたはコンジュゲート、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００４６】
さらに、本発明は、本発明によるペプチドリガンド、コンジュゲート、または組成物を使用する、疾患の処置のための方法を提供する。適切には、疾患は、新生物疾患、例えばがんである。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるペプチドリガンド、または組成物を使用する、疾患の診断を含む、診断のための方法を提供する。したがって、一般的に、分析物のペプチドリガンドへの結合が、薬剤を押しのけるために活用され、押しのけが生じるとシグナルの発生につながる場合がある。例えば、特に、酵素が、活性部位を介してペプチドリガンドに保持される場合、分析物（第２の標的）の結合により、ペプチドリガンドに結合した酵素（第１の標的）を押しのけることができ、これは結合アッセイの基礎となる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】先行技術によるチオエーテルにより連結した二環性ペプチドリガンドの調製に対する反応スキームを示す図である。
【図２】ＥｐｈＡ２への特異的結合を呈する参照二環性ペプチドリガンドの概略構造を示す図である。
【図３】本発明による、第１の二環性ペプチドリガンドの概略構造を示す図である。
【図４】本発明による、第２の二環性ペプチドリガンドの概略構造を示す図である。
【図５】本発明による、第３の二環性ペプチドリガンドの概略構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
別段定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学の技術分野などの当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学、遺伝学的方法および生化学的方法に対する標準的技術が使用され（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）、これらは引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００５０】
本発明は、分子足場の３つの連結間を結ぶ２つのペプチドループを含み、中央の連結は、２つのループに共通する、請求項１に定義されるループ状ペプチド構造を提供する。中央の連結は、ペプチドのシステイン残基に対して形成されたチオエーテル連結であってもよく、またはペプチドのＤａｐもしくはＮ−ＡｌｋＤａｐもしくはＮ−ＨａｌｋＤａｐ残基に対して形成されたアルキルアミノ連結である。２つの外側の連結は、適切には、ペプチドのＤａｐもしくはＮ−ＡｌｋＤａｐもしくはＮ−ＨａｌｋＤａｐ残基に対して形成されたアルキルアミノ連結であり、または外側の連結のうちの１つは、ペプチドのシステイン残基に対して形成されたチオエーテル連結であってもよい。
【００５１】
一実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、マウス、イヌ、カニクイザルおよびヒトのＥｐｈＡ２と完全に交差反応性である。またさらなる実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、ＥｐｈＡ２に対して選択的であるが、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３またはＥＰＨＡ４と交差反応しない。
【００５２】
適切には、ＥｐｈＡ２に対する結合親和性ｋｉは、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満である。適切には、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３および／またはＥｐｈＡ４との結合親和性ｋｉは、約５００ｎＭを超えるか、約１０００ｎＭを超えるか、または約１００００ｎＭを超える。
【００５３】
本発明による特定のペプチドリガンドのアミノ酸配列は、添付の特許請求の範囲において定義される。
【００５４】
本明細書で定義されるペプチドリガンドの修飾された誘導体は、本発明の範囲内にあることが認識される。このような適切な修飾された誘導体の例としては、Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置き換え（例えば、１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等配電子アミノ酸または等電子アミノ酸による置き換え、１つまたは複数の非極性アミノ酸残基の他の非天然の、等配電子アミノ酸または等電子アミノ酸による置き換え）、スペーサー基の付加、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化抵抗性アミノ酸残基による置き換え、１つまたは複数のアミノ酸残基のアラニンによる置き換え、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置き換え、二環性ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮアルキル化、１つまたは複数のペプチド結合のサロゲート結合による置き換え、ペプチド主鎖長の改変、１つまたは複数のアミノ酸残基のアルファ炭素上の水素の別の化学基による置換、システイン、リシン、グルタミン酸／アスパラギン酸およびチロシンなどのアミノ酸の、前記アミノ酸を官能基化するための適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬による修飾、ならびに官能基化に適する直交型反応を導入するアミノ酸、例えば、それぞれアルキンまたはアジド保有部分による官能基化を可能にするアジドまたはアルキン基保有アミノ酸の導入または置き換えから選択される１つまたは複数の修飾が挙げられる。
【００５５】
一実施形態では、修飾された誘導体は、Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、適切なアミノ反応性化学を使用するＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学を使用するＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、前記Ｎ末端修飾またはＣ末端修飾は、これらに限定されないが、細胞毒製剤、ラジオキレーター（ｒａｄｉｏｃｈｅｌａｔｏｒ）または発色団を含むエフェクター基の付加を含む。
【００５６】
実施形態では、Ｎ末端修飾は、エフェクター基のコンジュゲーションおよびその標的に対する二環性ペプチドの効力の保持を容易にする分子スペーサー基の付加を含む。スペーサー基は、適切には、Ａｌａなどの約５から約３０個のアミノ酸を含有するオリゴペプチド基、Ｇ−Ｓａｒ１０−Ａ基またはｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ基である。一実施形態では、スペーサー基は、ｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａから選択される。
【００５７】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置き換えを含む。この実施形態では、分解性プロテアーゼによっても認識されず標的の効力に何らの有害作用も有さない等配電子／等電子側鎖を有する非天然アミノ酸が選択されてもよい。
【００５８】
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質加水分解が立体構造的かつ立体的に妨げられるように、拘束アミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸が使用されてもよい。特に、これらは、プロリンアナログ、巨大な側鎖、Ｃ−二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）、およびシクロアミノ酸（単純な誘導体がアミノ−シクロプロピルカルボン酸である）に関係する。
【００５９】
さらなる実施形態では、非天然アミノ酸残基は、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、シクロヘキシルグリシン、フェニルグリシン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、およびホモフェニルアラニンから選択される。
【００６０】
またさらなる実施形態では、非天然アミノ酸残基は、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、および３，４−ジクロロフェニルアラニンから選択される。これらの置換基は、未修飾の野生型配列と比較して、親和性を増強する。
【００６１】
またさらなる実施形態では、非天然アミノ酸残基は、１−ナフチルアラニンから選択される。この置換基は、野生型と比較して、最も高いレベルの親和性増強（７倍を超える）をもたらした。
【００６２】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化抵抗性アミノ酸残基による置き換えを含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、トリプトファン残基のナフチルアラニンまたはアラニン残基による置き換えを含む。この実施形態は、得られる二環性ペプチドリガンドの医薬安定性プロファイルを改善するという利点をもたらす。
【００６３】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１つまたは複数の荷電アミノ酸残基の１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基による置き換えを含む。代替の実施形態では、修飾された誘導体は、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の１つまたは複数の荷電アミノ酸残基による置き換えを含む。疎水性アミノ酸残基に対する荷電アミノ酸残基の正確な均衡は、二環性ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度、すなわち、血漿における遊離した利用できる画分の濃度に影響を及ぼす一方、荷電アミノ酸残基（特に、アルギニン）は、細胞表面におけるリン脂質膜とペプチドとの相互作用に影響を及ぼす場合がある。組み合わせた両者は、半減期、分布の体積およびペプチド薬物への曝露に影響を及ぼす場合があり、臨床エンドポイントに従い目的に合わせて作製することができる。加えて、疎水性アミノ酸残基に対する荷電アミノ酸残基の正確な組合せおよび数は、注射部位における刺激作用を低下させることができる（ペプチド薬物を皮下投与した場合）。
【００６４】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置き換えを含む。この実施形態は、立体障害によりおよび  −ターンコンホメーションを安定化させるＤ−アミノ酸の傾向により、タンパク質分解に対する安定性を増加させると考えられる（Ｔｕｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  ＰＮＡＳ，  １０２（２），  ４１３−４１８）。
【００６５】
本明細書で定義されるペプチド配列のすべてにおいて、１つまたは複数のチロシン残基は、フェニルアラニンで置き換えられてもよい。これにより、ペプチドの足場分子への塩基触媒カップリングの間の二環性ペプチド産物の収率が改善されることが判明した。
【００６６】
一実施形態では、修飾された誘導体は、いずれかのアミノ酸残基の除去およびアラニンによる置換を含む。この実施形態は、潜在的なタンパク質分解による攻撃部位を除去するという利点をもたらす。
【００６７】
上述の修飾は、ペプチドの効力または安定性を計画的に改善するのに役立つことに留意すべきである。修飾に基づくさらに有効な改善は、以下の機序を通じて達成され得る。
−  より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活かし、かつより低いオフレートにつながる疎水性部分を組み込むこと、
−  長期にわたるイオン性相互作用を活用する荷電された基を組み込み、より速いオンレートおよびより高い親和性をもたらすこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｒａｐｉｄ，  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９９６），  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３，  ４２７−３１を参照されたい）、ならびに
−  このペプチドへ、例えば、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、アミノ酸の側鎖を正確に拘束すること、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、主鎖の二面角を拘束すること、および同一の理由のために分子中に追加の環化を導入することによって、追加的な拘束を組み込むこと。
（概説については、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，  （２０１０），  １６，  ３１８５−２０３、およびＮｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  （２００９），  １６，  ４３９９−４１８を参照のこと）。
【００６８】
発明は、本発明のすべての薬学的に許容される（放射性）同位体により標識された化合物、すなわち、式（ＩＩ）の化合物（式中、１つまたは複数の原子が、同じ原子数を有するが、自然界で通常見られる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている）、および式（ＩＩ）の化合物（式中、関連する（放射性）同位体を保持することが可能な金属キレート基が結合している（「エフェクター」と称される））、および式（Ｉ）の化合物（式中、特定の官能基が、関連する（放射性）同位体または同位体により標識された官能基で共有結合的に置き換えられている）を含む。
【００６９】
本発明の化合物中に含まれるのに適切な同位体の例は、水素の同位体、例えば、２Ｈ（Ｄ）および３Ｈ（Ｔ）、炭素の同位体、例えば、１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃ、塩素の同位体、例えば、３６Ｃｌ、フッ素の同位体、例えば、１８Ｆ、ヨウ素の同位体、例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉ、窒素の同位体、例えば、１３Ｎおよび１５Ｎ、酸素の同位体、例えば、１５Ｏ、１７Ｏおよび１８Ｏ、リンの同位体、例えば、３２Ｐ、硫黄の同位体、例えば、３５Ｓ、銅の同位体、例えば、６４Ｃｕ、ガリウムの同位体、例えば、６７Ｇａまたは６８Ｇａ、イットリウムの同位体、例えば、９０Ｙならびにルテチウムの同位体、例えば、１７７Ｌｕ、ならびにビスマスの同位体、例えば、２１３Ｂｉを含む。
【００７０】
式（ＩＩ）の特定の同位体により標識された化合物、例えば、放射性同位体を取り込んでいるものは、薬物および／または基質組織分布研究において、ならびに腫瘍などの罹患組織およびその他の場所におけるＥｐｈＡ２標的の存在および／または非存在を臨床的に評価するのに有用である。式（ＩＩ）の化合物は、これらを、標識された化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体の間での複合体の形成を検出または同定するために使用することができるという点で、貴重な診断特性をさらに有し得る。検出または同定の方法では、標識剤、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）などで標識された化合物を使用することができる。放射性同位体であるトリチウム、すなわち３Ｈ（Ｔ）、および炭素−１４、すなわち１４Ｃは、それらの取り込みの容易性および検出の迅速な手段を考慮して、この目的のために特に有用である。
【００７１】
より重い同位体、例えば、重水素、すなわち２Ｈ（Ｄ）による置換は、より大きな代謝安定性、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加、投与必要量の低減からもたらされる特定の治療上の利点を与えることができ、故に、一部の状況において好ましい場合がある。
【００７２】
陽電子放出同位体、例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎによる置換は、陽電子放出トポグラフィ（ＰＥＴ）研究において、標的の占有を調査するために有用であり得る。
【００７３】
６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、および１７７Ｌｕなどの同位体の金属キレートエフェクター基への組込みは、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ画像化を用いる腫瘍特異的抗原を可視化するのに有用であり得る。
【００７４】
同位体の、これらに限定されないが、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、および２１３Ｂｉなどの金属キレートエフェクター基への組込みは、標的放射線治療の選択肢であり得、それによって、式（ＩＩ）の金属−キレーター保有化合物は、標的タンパク質および作用部位に対する治療用の放射性核種を保持する。
【００７５】
式（ＩＩ）の同位体により標識された化合物は、一般的には、当業者に公知の従来技術によってまたは以前に用いられた非標識試薬の代わりに適当な同位体標識試薬を使用して、添付の実施例に記載のプロセスと同様のプロセスによって調製され得る。
【００７６】
本明細書の文脈における特異性は、標的と類似する実体を除外したその同族標的と結合するか、そうでなければ相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵素の相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの能力を指し得る。本明細書に記載のアプローチを使用して、意図される標的のホモログまたはパラログとリガンドがより相互作用できるか、または相互作用できなくなるように、特異性がモジュレートされ得る（すなわち、増加または低下され得る）。特異性は、活性、親和性またはアビディティーと同義であるとは意図されず、その標的におけるリガンドの作用の効力（例えば、結合親和性または阻害のレベルなど）は、必ずしもその特異性に関係しない。
【００７７】
結合活性は、本明細書で使用される場合、例えば、本明細書に記載されている結合アッセイから得られる定量的結合測定値を指す。したがって、結合活性は、所与の標的濃度で結合するペプチドリガンドの量を指す。
【００７８】
多重特異性は、２つ以上の標的に結合する能力である。典型的には、結合ペプチドは、それらの立体構造上の特性により、単一の標的、例えば、抗体の場合にはエピトープに結合することが可能である。しかし、２つ以上の標的に結合することができるペプチド、例えば、上記で言及されたように、当技術分野で公知の二重特異的抗体を開発することができる。本発明では、ペプチドリガンドは、２つ以上の標的に結合することが可能であり得、したがって、多重特異的である。適切には、これらは、２つの標的に結合し、二重特異的である。結合は、独立的であってもよく、これは、ペプチドにおける標的に対する結合部位が、標的の一方または他方の結合により構造的に妨げられないことを意味する。この場合、両方の標的が独立的に結合していてもよい。より一般的には、一方の標的の結合が、他方の結合を少なくとも部分的に妨害することが期待される。
【００７９】
二重特異的リガンドと２つの関連する標的を包含する特異性を有するリガンドとの間に、基本的な相違が存在する。第１の事例では、リガンドは両方の標的について個々に特異的であり、それぞれと特異的な様式で相互作用する。例えば、リガンド中の第１のループは、第１の標的に結合してもよく、第２のループは第２の標的に結合してもよい。第２の事例では、リガンドは非特異的であり、これは、リガンドが、例えば、両方に共通の標的のエピトープと相互作用することによって、２つの標的の間に差を生じないことによる。
【００８０】
本発明の文脈では、例えば、標的およびオルソログについて活性を有するリガンドは、二重特異性リガンドである可能性がある。しかし、一実施形態では、このリガンドは二重特異性ではなく、正確性の低い特異性を有し、その結果、このリガンドは、標的と１つまたは複数のオルソログの両方に結合する。一般的には、標的とそのオルソログの両方に対して選択されていないリガンドは、二重特異性に向かう選択的圧力が存在しないために、二重特異性である可能性が低い。二環性ペプチドのループ長は、関連の少ないホモログに対する高い選択性を維持したままで、良好な標的およびオルソログの交差反応性が得られるように適合された結合表面を提供するために決定的であり得る。
【００８１】
このリガンドが真に二重特異性である場合、一実施形態では、リガンドの標的特異性のうちの少なくとも１つは、選択されるリガンドついて一般的であり、その特異性のレベルは、本明細書に開示される方法によってモジュレートされ得る。第２のまたはさらなる特異性は共有される必要はなく、本明細書に示される手順の対象となる必要もない。
【００８２】
本発明のペプチドリガンド化合物は、分子足場に共有結合により結合したペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書における用語「足場」または「分子足場」は、本発明の化合物の、アルキルアミノ連結およびチオエーテル連結（システインが存在する場合）でペプチドに結合する化学的部分を指す。本明細書における用語「足場分子」または「分子足場分子」は、アルキルアミノ結合、ある特定の実施形態ではまた、チオエーテル結合を有する本発明の誘導体を形成するペプチドまたはペプチドリガンドと反応することができる分子を指す。したがって、足場分子は、分子のそれぞれの反応性基（例えば、脱離基）が、足場部分のペプチドへのアルキルアミノ結合およびチオエーテル結合によって置き換えられていることを除いて、足場部分と同じ構造を有する。
【００８３】
実施形態では、足場は、芳香族分子足場、すなわち、（ヘテロ）アリール基を含む足場である。本明細書で使用する場合、「（ヘテロ）アリール」は、芳香族環、例えば、４から１２員を有する芳香環、例えば、フェニル環を含むことを意図する。これらの芳香環、例えば、チエニル環、ピリジル環、およびフラニル環は、任意選択で、１つまたは複数のヘテロ原子（例えば、１つまたは複数のＮ、Ｏ、Ｓ、およびＰ）を含有することができる。芳香環は、任意選択で、置換され得る。「（ヘテロ）アリール」はまた、１つまたは複数の他のアリール環または非アリール環が縮合した芳香環を含むことを意味する。例えば、ナフチル基、インドール基、チエノチエニル基、ジチエノチエニル、および５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル基（そのそれぞれは、任意選択で、置換されてもよい）は、本出願の目的のためのアリール基である。上記で示したように、アリール環は、任意選択で置換されてもよい。適切な置換基として、アルキル基（任意選択で、置換されてもよい）、他のアリール基（それ自身が置換されていてもよい）、複素環（飽和または不飽和）、アルコキシ基（アリールオキシ基（例えば、フェノキシ基）を含むことを意味する）、水酸基、アルデヒド基、ニトロ基、アミン基（例えば、無置換、またはアリール基もしくはアルキル基で一置換もしくは二置換された）、カルボン酸基、カルボン酸誘導体（例えば、カルボン酸エステル、アミドなど）、ハロゲン原子（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）などが挙げられる。
【００８４】
適切には、足場は、トリス置換（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分、例えば、トリスメチレン置換（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分を含む。（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分は、適切には、６員環構造、好ましくは、足場が３回対称軸を有するトリス置換である。
【００８５】
実施形態では、足場は、トリス−メチレン（ヘテロ）アリール部分、例えば、１，３，５−トリスメチレンベンゼン部分である。これらの実施形態では、対応する足場分子は、適切には、メチレン炭素上に脱離基を有する。次いで、メチレン基は、本明細書で定義されるアルキルアミノ連結のＲ１部分を形成する。これらのメチレン置換（ヘテロ）芳香族化合物では、芳香環の電子が、求核置換の間の遷移状態を安定化させることができる。したがって、例えば、ハロゲン化ベンジルは、（ヘテロ）芳香族基に接続していないハロゲン化アルキルよりも求核置換に対して１００〜１０００倍反応性である。
【００８６】
これらの実施形態では、足場および足場分子は、一般式：
【化４】
2021528433.tif 000006
（式中、ＬＧは、足場分子について、以下にさらに説明される脱離基を表すか、またはＬＧ（アルキルアミノ基のＲ１部分を形成する隣接するメチレン基を含む）は、本発明のコンジュゲートにおけるペプチドに対するアルキルアミノ連結を表す）
を有する。
【００８７】
実施形態では、上記の基ＬＧは、これらに限定されないが、足場分子が１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）である場合の臭素原子などのハロゲンであってもよい。別の適切な分子足場分子は、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。これは、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンと同様であるが、ベンゼン環に結合したさらに３つのメチル基を含有する。この足場の場合には、さらなるメチル基はペプチドとのさらなる接触を形成することができ、それゆえ、さらなる構造上の制約を付加する。したがって、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンに関するよりも異なる多様性範囲が実現される。
【００８８】
求核置換によってペプチドと反応するための足場を形成するための別の好ましい分子は、１，３，５−トリス（ブロモアセトアミド）ベンゼン（ＴＢＡＢ）：
【化５】
2021528433.tif 000007
である。
【００８９】
他の実施形態では、足場は、非芳香族分子足場、例えば、（ヘテロ）脂環式基を含む足場である。本明細書で使用する場合、「（ヘテロ）脂環式」は、同素環または複素環の飽和環を指す。環は、置換されていなくてもよく、または１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。置換基は、飽和または不飽和、芳香族または非芳香族であってもよく、適切な置換基の例として、アルキル基およびアリール基に関する置換基に関連する議論において上記したものが挙げられる。さらに、２つ以上の環置換基を組み合わさって別の環を形成することがあり、その結果、本明細書で使用する場合、「環」は、縮合環系を含むことを意味する。これらの実施形態では、脂環式足場は、好ましくは、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）である。
【００９０】
他の実施形態では、分子足場は、コードペプチドの４つの官能基の分子足場との反応により２つ以下の生成物異性体しか生じないように四面体幾何構造を有してもよい。他の幾何構造も可能であり、実際に、ほぼ無限の数の足場の幾何構造が可能であり、ペプチドリガンド多様化に対するより大きな可能性をもたらす。
【００９１】
本発明のリガンドを形成するために使用されるペプチドは、足場へのアルキルアミノ連結を形成するためのＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基を含む。ジアミノプロピオン酸の構造は、−ＮＨ２によってシステインの末端−ＳＨ基が置き換えられた、先行技術において足場へのチオエーテル結合を形成するために使用されたシステインのアナログおよび等配電子である。
【００９２】
【化６】
2021528433.tif 000008
【００９３】
用語「アルキルアミノ」は、２つの炭素原子に結合したＮＨまたはＮ（Ｒ３）（炭素原子は、独立して、アルキル、アルキレン、またはアリール炭素原子から選択され、Ｒ３は、アルキル基である）からなる連結を示す通常の化学的意味で、本明細書において使用される。適切には、本発明のアルキルアミノ連結は、２つの飽和炭素原子、最も適切には、メチレン（−ＣＨ２−）炭素原子に結合したＮＨ部分を含む。本発明のアルキルアミノ連結は、一般式：
Ｓ−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３）−Ｒ２−Ｐ
（式中、
Ｓは、足場コア、例えば、以下でさらに説明される（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式環を表し、
Ｒ１は、Ｃ１からＣ３アルキレン基、適切にはメチレンまたはエチレン基、最も適切にはメチレン（ＣＨ２）であり、
Ｒ２は、ＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐ側鎖のメチレン基であり
Ｒ３は、アルキル基のいずれかが、任意選択でハロゲン化されている、Ｈ、または分枝状アルキルおよびシクロアルキル、例えばメチルを含むＣ１〜４アルキルであり、
Ｐは、ペプチド主鎖を表し、すなわち、上記連結のＲ２部分は、ＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基のカルボン酸炭素に隣接するペプチド主鎖の炭素原子に連結している）
を有する。
【００９４】
本発明の特定の二環性ペプチドリガンドは、注射、吸入、鼻噴投与、点眼、経口投与または局所投与に適切な薬物様分子とみなされることを可能にする、いくつかの有利な特性を有する。このような有利な特性としては、以下が挙げられる：
−  種の交差反応性。これは、前臨床の薬力学および薬物動態学的評価のための典型的な要件である。
−  プロテアーゼ安定性。二環性ペプチドリガンドは、理想的には、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー型（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）」）プロテアーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対する安定性を実証するべきである。プロテアーゼ安定性は、二環リード候補が動物モデルで開発可能であり、ヒトに対して高い信頼性で投与可能であるように、異なる種の間で維持されるべきである。
−  望ましい溶解度プロファイル。これは、製剤化および吸収の目的に重要である、荷電および親水性対疎水性残基の割合ならびに分子内／分子間のＨ結合の関数である。
−  循環中の最適血漿半減期。臨床指標および処置計画に応じて、急性の疾患管理の状況では、短い曝露用の二環性ペプチドを開発するか、または循環中で保持を増強している二環性ペプチドを開発する必要がある場合があり、したがって、より慢性の疾患状態の管理に最適である。望ましい血漿半減期を誘導する他の要因は、薬剤の持続性曝露に起因する、付随する毒物学に対する、最大の治療効率のための持続性曝露の必要性である。
【００９５】
塩形態は、本発明の範囲内にあることが認識され、本発明のペプチドリガンドへの言及は前記化合物の塩形態を含む。
【００９６】
本発明の塩は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ，  Ｐ．  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  ＩＳＢＮ：  ３−９０６３９−０２６−８，  Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，  ３８８  ｐａｇｅｓ，  Ａｕｇｕｓｔ  ２００２に記載の方法などの従来の化学的方法によって、塩基性または酸性の部分を含有する親化合物から合成され得る。一般的には、このような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基形態を適当な塩基または酸と、水中でもしくは有機溶媒中で、またはこの２つの混合物中で反応させることによって調製することができる。
【００９７】
酸付加塩（一塩または二塩）は、無機および有機の両方の広範な種々の酸と形成されてもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）ショウノウ酸、ショウノウ−スルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸および（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸および吉草酸からなる群から選択される酸、ならびにアシル化アミノ酸および陽イオン交換樹脂を用いて形成される一塩または二塩が挙げられる。
【００９８】
塩の特定の１グループは、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシレート）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラクトビオン酸から形成される塩からなる。特定の１つの塩は、塩酸塩である。特定の別の塩は、酢酸塩である。
【００９９】
化合物が陰イオン性であるか、または陰イオン性であり得る（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ−であってもよい）官能基を有する場合、塩は、有機塩基または無機塩基と共に形成されて、適切な陽イオンを生成し得る。適切な無機陽イオンの例としては、これらに限定されないが、アルカリ金属イオン、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋、アルカリ土類金属陽イオン、例えば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、ならびに他の陽イオン、例えば、Ａｌ３＋またはＺｎ＋が挙げられる。適切な有機陽イオンの例としては、これらに限定されないが、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）および置換されたアンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられる。いくつかの適切な置換されたアンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにアミノ酸、例えば、リシンおよびアルギニン由来のイオンである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
【０１００】
本発明の化合物がアミン機能を含有する場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法に従って、アルキル化剤との反応によって、第四級アンモニウム塩を形成し得る。このような第四級アンモニウム化合物は、本発明の範囲内にある。
【０１０１】
いくつかのコンジュゲートしたペプチドは、本発明に従って、同一の分子に一緒に組み込まれてもよい。例えば、同一の特異性の２つのこのようなループ状コンジュゲートは、分子足場を介して一緒に連結され、その標的に対する誘導体のアビディティーを増加させることができる。あるいは、別の実施形態では、複数のペプチドコンジュゲートを組み合わせて多量体を形成する。例えば、２つの異なるペプチドコンジュゲートを組み合わせて多重特異的分子を作出する。あるいは、同一であっても異なっていてもよい３つ以上のペプチドコンジュゲートを組み合わせて多重特異的誘導体を形成することができる。一実施形態では、多価複合体は、同一であっても異なっていてもよい分子足場を一緒に連結させることによって構築されてもよい。
【０１０２】
本発明のペプチドリガンドは、適切なペプチドおよび足場分子を準備することと、ペプチドと足場分子の間にチオエーテル連結（システインが存在する場合）およびアルキルアミノ連結を形成することとを含む方法によって作製することができる。
【０１０３】
本発明のペプチドリガンドの調製のためのペプチドは、アミノ酸出発材料から、従来の固相合成を使用して作製することができ、本明細書に記載した適当な保護基を含んでもよい。ペプチドを作製するこれらの方法は、当技術分野で周知である。
【０１０４】
適切には、ペプチドは、アルキルアミノ連結を形成することを意図した−ＳＨ基およびアミノ基以外に、求核基に保護基を有する。アミノ酸側鎖の求核性はいくつかの研究の対象とされ、降順で、システインにおけるチオレート、リシンにおけるアミン、ヒスチジンおよびトリプトファンにおける第二級アミン、アルギニンにおけるグアニジノアミン、セリン／トレオニンにおけるヒドロキシル、ならびに最後にアスパラギン酸およびグルタミン酸におけるカルボキシレートが列挙されている。したがって、一部の場合には、これらの基に関する望ましくない副反応を防ぐために、ペプチド上のより求核性の基に保護基を適用する必要がある場合がある。
【０１０５】
実施形態では、方法は、アルキルアミノ連結を形成することを意図したアミン基以外の求核性の基の保護基、およびアルキルアミノ連結を形成することを意図したアミン基の第２の保護基を有するペプチドを合成することを含み、アルキルアミノ連結を形成することを意図したアミン基の保護基は、他の求核性の基の保護基に関する条件とは異なる条件下で除去され、続いて、他の求核性の基を脱保護することなく、アルキルアミノ連結を形成することを意図したアミン基を脱保護するために選択された条件下で、ペプチドを処理することができる。次いで、足場に対するカップリング反応が実施され、続いて、残っている保護基を除去して、ペプチドコンジュゲートを得る。
【０１０６】
適切には、本方法は、求核置換反応において、反応性側鎖−ＳＨ基とアミン基を有するペプチドを、３つ以上の脱離基を有する足場分子と反応させることを含む。
【０１０７】
本明細書において、用語「脱離基」は、アミン基による求核置換を可能とする部分を意味する通常の化学的意味において使用される。ここで、任意のこのような脱離基は、アミンによる求核置換によって容易に除去されることを条件として、使用することができる。適切な脱離基は、約５未満のｐＫａを有する酸のコンジュゲート塩基である。本発明において有用な脱離基の非限定例として、ハロ、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、Ｏ−トシレート（ＯＴｏｓ）、Ｏ−メシレート（ＯＭｅｓ）、Ｏ−トリフレート（ＯＴｆ）またはＯ−トリメチルシリル（ＯＴＭＳ）が挙げられる。
【０１０８】
求核置換反応は、例えば、脱離基が従来の陰イオン性脱離基である場合、塩基の存在下で実施され得る。本発明者らは、環化ペプチドリガンドの収率が、求核置換反応のための溶媒および塩基（およびｐＨ）の適切な選択によって非常に増加する可能性があり、さらに、好ましい溶媒および塩基は、チオエーテル連結の形成にのみ関与する先行技術の溶媒および塩基の組合せと異なることを見出した。特に、本発明者らは、トリアルキルアミン塩基、すなわち、式ＮＲ１Ｒ２Ｒ３の塩基（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基、適切にはＣ２〜Ｃ４アルキル基、特にＣ２〜Ｃ３アルキル基である）を使用する場合に収率の改善が達成されることを見出した。特に、適切な塩基は、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である。これらの塩基は、ほんのわずかに求核性であるという特性を有し、この特性が、これらの塩基について観察される副反応の少なさと高い収率を説明すると考えられる。本発明者らは、求核置換反応について好ましい溶媒が、極性のプロトン性溶媒、特に体積比１：１０から１０：１、適切には２：１０から１０：２、より適切には３：１０から１０：３、特に４：１０から１０：４のＭｅＣＮとＨ２Ｏを含有するＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏであることをさらに見出した。
【０１０９】
さらなる結合または機能活性は、分子足場に共有結合による連結したペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合されてもよい。官能基は、例えば、インビボでペプチドリガンドの半減期を延長する分子に結合することができる基、およびインビボでペプチドリガンドの半減期を延長する分子からなる群から選択される。このような分子は、例えば、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質であってもよく、インビボでペプチドリガンドの半減期を延長する分子に結合することができる基は、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質に特異的な抗体または抗体断片である。このような分子はまた、高分子量ＰＥＧとのコンジュゲートであってもよい。
【０１１０】
一実施形態では、官能基は、分子足場に共有結合により連結したペプチドを含む第２のペプチドリガンドからなる群から選択される結合分子、および抗体または抗体断片である。２、３、４、５またはそれより多いペプチドリガンドは一緒に接合することができる。任意の２つ以上のこれらの誘導体の特異性は同一であっても異なっていてもよく、これらが同一である場合、多価結合構造が形成されることになり、一価の結合分子と比較して、標的に対するアビディティーが増加した。さらに、分子足場は、同一であっても異なっていてもよく、同一または異なる数のループを結んでもよい。
【０１１１】
官能基は、さらに、エフェクター基、例えば、抗体のＦｃ領域であってもよい。
【０１１２】
Ｎ末端またはＣ末端への結合は、ペプチドの分子足場への結合の前になされてもよく、または後になされてもよい。したがって、Ｎ末端またはＣ末端ペプチド基が既に存在するペプチドが生成されてもよい（合成により、または生物学的に派生させた発現系により）。しかし、好ましくは、Ｎ末端またはＣ末端への付加は、ペプチドが分子骨格と組み合わされてコンジュゲートを形成した後に起こる。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリドを使用して、ペプチドのＮ末端にＦｍｏｃ保護基を導入することができる。Ｆｍｏｃは、親和性の高いＨＳＡを含む血清アルブミンに結合し、Ｆｍｏｃ−ＴｒｐまたはＦｍｏｃ−Ｌｙｓは、親和性が増加したものに結合する。ペプチドは、残されたＦｍｏｃ保護基と合成され、次いで、アルキルアミノを介して足場にカップリングされ得る。選択肢は、ＨＳＡにも結合し、例えば、リラグルチドにおいて使用され、このＧＬＰ−１アナログの半減期を延長するパルミトイル部分である。
【０１１３】
あるいは、ペプチドの足場とのコンジュゲートが作製され、次いで、Ｎ末端において、例えば、アミンおよびスルフヒドリル反応性リンカーＮ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）で修飾され得る。このリンカーを介して、ペプチドコンジュゲートは、他のペプチド、例えば、抗体Ｆｃ断片に連結され得る。
【０１１４】
結合機能は、多量体を作出する分子足場に結合した別のペプチド、抗体もしくは抗体断片を含む別の結合タンパク質、または血清アルブミンもしくはエフェクター基、例えば、抗体Ｆｃ領域を含む任意の他の所望の実体であってもよい。
【０１１５】
さらなる結合または機能活性が、さらに、分子足場に直接結合され得る。
【０１１６】
実施形態では、足場は、さらなる活性が結合され得る反応性基をさらに含んでもよい。好ましくは、この基は、ペプチドとの相互作用を避けるために、分子足場上の他の反応性基に対して直交型である。一実施形態では、反応性基は、さらなる活性にコンジュゲートするのに必要な場合、保護されても脱保護されてもよい。
【０１１７】
したがって、本発明のさらなる態様では、１つまたは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートした、本明細書で定義されるペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０１１８】
エフェクター基および／または官能基は、例えば、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、または分子足場に結合することができる。
【０１１９】
適当なエフェクター基として、抗体およびその一部または断片が挙げられる。例えば、エフェクター基は、１つまたは複数の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメイン、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。エフェクター基はまた、抗体のヒンジ領域（このような領域は、通常、ＩｇＧ分子のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に見られる）を含んでもよい。
【０１２０】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１日間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上または７日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合を含むかまたはそれからなる。最も有利には、本発明によるペプチドリガンドは、１日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合を含むかまたはそれからなる。
【０１２１】
官能基として、一般的に、結合基、薬物、他の実体の結合のための反応性基、大環状ペプチドの細胞内への取り込みを助ける官能基などが挙げられる。
【０１２２】
細胞内へと浸透するペプチドの能力は、細胞内標的に対するペプチドを有効なものとする。細胞内へと浸透する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的は、転写因子、チロシンキナーゼなどの細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与する分子を含む。細胞の浸透を可能にする官能基は、ペプチドまたは分子足場のいずれかに付加されたペプチドまたは化学基を含む。ペプチド、例えば、ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）などに由来するペプチドは、例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００７）  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５，Ｐａｒｔ  ４，ｐ８２１；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００４）  Ｖｏｌｕｍｅ  ５７  ９６３７に記載されている。原形質膜を通した転位置において効率的であることが示された短いペプチドの例として、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の１６アミノ酸ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）ペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９  ｐ１０４４４）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １４１４  ｐ１２７）およびＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチは、生体分子に容易に付着することができる小分子模倣物またはＳＭＯＣの使用を含む（Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  ｐ１５３）。分子にグアニジウム基を付加する他の化学的戦略も、細胞浸透を増強させる（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８２  ｐ１３５８５）。ステロイド等、低分子量の分子を分子足場に付加して、細胞内への取り込みを増強させてもよい。
【０１２３】
ペプチドリガンドに結合することができる官能基の１つのクラスは、抗体およびＦａｂ、Ｆｖまたはシングルドメイン断片などの、その結合断片を含む。特に、インビボにおけるペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体を使用してもよい。
【０１２４】
多くの細胞上に存在するインテグリンに結合するＲＧＤペプチドを組み込んでもよい。
【０１２５】
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、７日間以上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上、１１日間以上、１２日間以上、１３日間以上、１４日間以上、１５日間以上または２０日間以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基または組成物は、１２から６０時間の範囲内のｔβ半減期を有することとなる。さらなる実施形態では、これは、１日間以上のｔβ半減期を有することとなる。さらなる実施形態ではまた、これは、１２から２６時間の範囲内となる。
【０１２６】
本発明の特定の一実施形態では、ループ状ペプチドにコンジュゲートした官能基は、医薬関連の複合金属放射性同位体に適切な金属キレーターから選択される。このようなエフェクターは、前記放射性同位体と複合された場合、がん療法に有用な薬剤であり得る。適切な例としては、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＨＡ、ＳａｒＡｒなどが挙げられる（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｏｄ  Ｓｐｅｅｒ，Ｗｏｌｔｅｒｓ／Ｋｌｕｖｅｒ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０１１）。
【０１２７】
可能なエフェクター基としてはまた、酵素、例えば、酵素／プロドラッグ療法での使用のためのカルボキシペプチダーゼＧ２などが挙げられ、ここで、このペプチドリガンドは、ＡＤＥＰＴにおいては抗体を置き換えられている。
【０１２８】
本発明のこの態様の特定の一実施形態では、官能基は、がん療法の細胞毒性剤のような薬物から選択される。適切な例としては、シスプラチンおよびカルボプラチンなどのアルキル化剤、ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド；プリンアナログ  アザチオプリンおよびメルカプトプリンを含む抗代謝剤またはピリミジンアナログ；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンなどのビンカアルカロイドを含む植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド；元々はタキソールとして知られた、パクリタキセルを含むタキサン；カンプトテシンを含むトポイソメラーゼ阻害剤；イリノテカンおよびトポテカン、ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート、およびテニポシドを含むＩＩ型阻害剤が挙げられる。さらなる薬剤は、免疫抑制薬ダクチノマイシン（腎臓移植において使用される）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンなどを含む抗腫瘍抗生物質を含むことができる。
【０１２９】
この態様による本発明のさらに特定の一実施形態では、細胞毒性剤はＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される。
【０１３０】
ＤＭ１は、メイタンシンのチオール含有誘導体であり、以下の構造：
【化７】
2021528433.tif 000009
を有する細胞毒性剤である。
【０１３１】
モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は、合成の抗新生物薬であり、以下の構造：
【化８】
2021528433.tif 000010
を有する。
【０１３２】
一実施形態では、細胞毒性剤は、ジスルフィド結合などの切断可能な結合によって二環性ペプチドに連結している。さらなる実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する基は、ジスルフィド結合の妨害を制御するために、そしてこれによって切断の速度および細胞毒性剤の同時の放出を制御するために修飾される。
【０１３３】
公開された研究によって、ジスルフィド結合のいずれかの側に対して立体障害を導入することによって、還元に対するジスルフィド結合の感受性を改変する能力が確立された（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，７１７）。立体障害の程度が大きいほど、細胞内グルタチオンおよびまた細胞外（全身性）還元剤による還元の速度は低下し、結果として、毒素が、細胞の内側および外側の両方で放出されにくくなる。したがって、循環中のジスルフィド安定性（毒素の望ましくない副作用を最小限にする）、対、細胞内環境における効率的な放出（治療効果を最大にする）における最適条件の選択は、ジスルフィド結合のいずれかの側における障害の程度を注意深く選択することによって達成され得る。
【０１３４】
ジスルフィド結合のいずれかの側にある障害は、分子構築物の標的化実体（ここでは、二環性ペプチド）または毒素側のいずれかに対して１つまたは複数のメチル基を導入することによりモジュレートされる。
【０１３５】
したがって、一実施形態では、細胞毒性剤は、式：
【化９】
2021528433.tif 000011
（式中、ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素またはメチル基を表す）
の化合物から選択される。
【０１３６】
上記式の化合物の一実施形態では、ｎは、１を表し、Ｒ１およびＲ２は両方、水素を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ１）。
【０１３７】
上記式の化合物の代替の実施形態では、ｎは、２を表し、Ｒ１は、水素を表し、Ｒ２は、メチル基を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ３）。
【０１３８】
化合物の一実施形態では、ｎは、２を表し、Ｒ１およびＲ２は両方、メチル基を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ４）。
【０１３９】
細胞毒性剤は、ジスルフィド結合を形成することができ、二環性ペプチドとのコンジュゲート構造では、チオール毒素とチオール二環性ペプチドの間のジスルフィド接続性は、いくつかの可能な合成スキームを介して導入されることが認識される。
【０１４０】
一実施形態では、コンジュゲートの二環性ペプチド構成要素は、以下の構造：
【化１０】
2021528433.tif 000012
（式中、ｍは、０から１０から選択される整数を表し、
二環は、本明細書に記載される任意の適切なループ状ペプチド構造を表し、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素またはメチルを表す）
を有する。
【０１４１】
Ｒ３およびＲ４が両方とも水素である、上記式の化合物を、障害を受けていないとみなし、Ｒ３およびＲ４の一方または両方がメチルを表す上記式の化合物を障害を受けているとみなす。
【０１４２】
上記式の二環性ペプチドがジスルフィド結合を形成することができ、上記の細胞毒性剤とのコンジュゲート構造において、チオール毒素とチオール二環性ペプチドの間のジスルフィド接続性は、いくつかの可能な合成スキームを通じて導入されることが認識されることとなる。
【０１４３】
一実施形態では、細胞毒性剤は、以下のリンカー：
【化１１】
2021528433.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表し、
毒素は、本明細書で定義される任意の適切な細胞毒性剤を指し、
二環は、本明細書に記載される任意の適切なループ状ペプチド構造を表し、
ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
ｍは、０から１０から選択される整数を表す）
によって、二環性ペプチドに連結される。
【０１４４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々水素である場合、ジスルフィド結合は、障害が最小であって、還元に対して最も感受性である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々アルキルである場合、ジスルフィド結合は、障害が最大であって、還元に対する感受性が最小である。水素およびアルキルの部分的置換によって、還元、ならびにそれにともなう切断および毒素の放出に対する耐性の段階的な増大が生じる。好ましい実施形態は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がすべてＨ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３がすべてＨおよびＲ４＝メチル；Ｒ１、Ｒ２＝メチルおよびＲ３、Ｒ４＝Ｈ；Ｒ１、Ｒ３＝メチルおよびＲ２、Ｒ４＝Ｈ；およびＲ１、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３、Ｒ４＝Ｃ１〜Ｃ６アルキルを含む。
【０１４５】
一実施形態では、化合物の毒素はメイタンシンであり、コンジュゲートは以下の式の化合物：
【化１２】
2021528433.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記で定義された通りであり、
二環は、本明細書で定義された任意の適切なループ状ペプチド構造を表し、
ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
ｍは、０から１０から選択される整数を表す）
を含む。
【０１４６】
毒素を有する二環性ペプチドリガンドの上述のコンジュゲートを調製するさらなる詳細および方法は、本発明者らの公開された特許出願ＷＯ２０１６／０６７０３５およびＷＯ２０１７／１９１４６０に詳細に記載されている。これらの出願の開示全体は、引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする。
【０１４７】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、アジド官能基化毒素とアルキン官能基化二環性ペプチド構造（またはその逆も同様）の間のクリック反応によって形成されるトリアゾール基を含んでもよい。他の実施形態では、二環性ペプチドは、カルボキシレート官能基化毒素と二環性ペプチドのＮ末端アミノ基の間の反応によって形成されたアミド連結を含有してもよい。
【０１４８】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、毒素の標的細胞内への選択的放出をもたらすカテプシンにより切断可能な基を含んでもよい。適切なカテプシンにより切断可能な基はバリン−シトルリンである。
【０１４９】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、所望の官能性、例えば、コンジュゲートに対する結合親和性またはカテプシン切断可能性をもたらす１つまたは複数のスペーサー基を含んでもよい。適切なスペーサー基は、バリン−シトルリン基と毒素部分の中間に位置し得るパラ−アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）である。
【０１５０】
したがって、実施形態では、二環性ペプチド−薬物コンジュゲートは、毒素−ＰＡＢＣ−ｃｉｔ−ｖａｌ−トリアゾール−二環から構成される以下の構造：
【化１３】
2021528433.tif 000015
を有してもよい。
【０１５１】
さらなる実施形態では、二環性ペプチド−薬物コンジュゲートは、毒素−ＰＡＢＣ−ｃｉｔ−ｖａｌ−ジカルボキシレート−二環から構成される以下の構造：
【化１４】
2021528433.tif 000016
（式中、（ａｌｋ）は、式ＣｎＨ２ｎ（ｎは、１から１０である）のアルキレン基であり、直鎖状または分枝状であってもよく、適切な（ａｌｋ）は、ｎ−プロピレンまたはｎ−ブチレンである）
を有してもよい。
【０１５２】
本発明によるペプチドリガンド−薬物コンジュゲートを調製するための方法についての詳細な説明は、その全内容を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、本発明者らのより早期の出願である、２０１７年１２月２０日に出願されたＷＯ２０１６／０６７０３５およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８３９５４において与えられている。
【０１５３】
本発明によるペプチドリガンドは、インビボ治療適用および予防適用、インビトロおよびインビボ診断適用、インビトロアッセイおよび試薬適用などで用いることができる。
【０１５４】
一般的に、ペプチドリガンドの使用によって、抗体の使用を置き換えることができる。本発明により選択される誘導体は、ウエスタン分析および標準的な免疫組織化学手順によるインサイチュタンパク質検出において、診断上有用であり、これらの適用における使用では、誘導体の選択されるレパートリーは、当技術分野で公知の技法に従って標識されてもよい。さらに、このようなペプチドリガンドは、クロマトグラフの支持体、例えば、樹脂と複合体を形成する場合、アフィニティークロマトグラフィー手順において予備的に使用することができる。すべてのこのような技法は、当業者に周知である。本発明によるペプチドリガンドは、抗体の結合能と同様の結合能を有し、このようなアッセイにおいて抗体を置き換えることができる。
【０１５５】
診断的使用には、試験片アッセイ、実験室アッセイおよび免疫診断アッセイを含む、抗体が通常置かれている任意の使用が含まれる。
【０１５６】
本発明に従って調製されるペプチドリガンドの治療的および予防的使用は、本発明に従って選択される誘導体のレシピエント哺乳動物、例えば、ヒトへの投与に関与する。少なくとも９０から９５％の均一性である実質的に純粋なペプチドリガンドが哺乳動物への投与に好ましく、９８から９９％またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場合に、医薬としての使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療（体外が含まれる）において、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの開発および実行において使用し得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，（１９７９  ａｎｄ  １９８１）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。
【０１５７】
一般的に、本発明のペプチドリガンドは、精製された形態で、薬理学的に適当な担体と一緒に利用される。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および／または緩衝媒体を含む、水性またはアルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが挙げられる。ペプチド複合体を懸濁液中に保つために必要な場合は、適切な生理学的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどの増粘剤から選択することができる。
【０１５８】
静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液および栄養素補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る（Ｍａｃｋ  （１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１５９】
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与する組成物として使用されてもよく、または他の薬剤と併せて使用されてもよい。これらには、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれる場合がある。医薬組成物には、それらを投与前にプールするかどうかに関わらず、様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明の選択された抗体、受容体もしくは結合タンパク質、またはさらには、様々な標的誘導体を使用して選択されたペプチドなどの様々な特異性を有する本発明によって選択されたペプチドの組合せとを併せた「カクテル」が含まれる場合がある。
【０１６０】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののうちの任意のものであり得る。限定されるものではないが、免疫療法を含む治療のために、本発明の選択された抗体、受容体または結合タンパク質は、標準の技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、また、適当には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含む任意の適当な様式によるものであり得る。投薬量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、対抗適応症ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。
【０１６１】
この発明のペプチドリガンドは、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体で復元することができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾燥および復元の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および復元は様々な度合の活性の損失をもたらす場合があり、補償するために使用レベルを上方調節する必要があり得ることが認識されよう。
【０１６２】
本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与することができる。ある特定の治療適用では、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、変調、死滅、または何らかの他の測定可能なパラメータを達成するために十分な量が、「治療上有効な用量」として定義される。この投薬量を達成するために必要な量は、疾患の重度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般的に、体重１キログラム当たり０．００５から５．０ｍｇの選択されたペプチドリガンドの範囲であり、０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。予防適用では、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様またはわずかに低い投薬量で投与してもよい。
【０１６３】
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設定で利用し得る。さらに、本明細書に記載のペプチドの選択されたレパートリーは、不均一な細胞のコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除去するために、体外またはインビトロで選択的に使用することができる。哺乳動物由来の血液を体外で選択されたペプチドリガンドと合わせ、それによって、所望しない細胞を死滅させるかまたは他の様式で血液から除去して、標準的技法に従って哺乳動物に戻すことができる。
【０１６４】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明される。
【実施例】
【０１６５】
材料および方法
【０１６６】
【表１−１】
2021528433.tif 000017
【表１−２】
2021528433.tif 000018
【表１−３】
2021528433.tif 000019
【０１６７】
さらに、以下の非天然アミノ酸前駆体を、ＤＡＰおよびＮ−ＭｅＤＡＰ修飾ペプチドの調製のために使用した。
【０１６８】
【表２】
2021528433.tif 000020
【０１６９】
ペプチド合成
ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが製造したＳｙｍｐｈｏｎｙおよびＳｙｍｐｈｏｎｙＸペプチドシンセサイザーおよびＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈが製造したＳｙｒｏ  ＩＩシンセサイザーを使用する、Ｆｍｏｃ化学に基づいた。適当な側鎖保護基を有する標準のＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）を用いた。ここで、適用可能な標準のカップリング条件を各事例で使用し、続いて、標準の方法を使用して脱保護を行った。ＨＰＬＣによってペプチドを精製し、単離後に、これらを１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）で修飾した。これに対して、直鎖状ペプチドを約３５ｍＬまでＨ２Ｏで希釈し、アセトニトリル中１００ｍＭのＴＢＭＢ  約５００μＬを添加し、反応をＨ２Ｏ中１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３  約５ｍＬで開始した。反応を室温で約３０〜６０分間進行させ、反応が完了したら（ＭＡＬＤＩによって判断した）、１Ｍのシステイン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）約５００ｕｌでクエンチした。凍結乾燥後、移動相として０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリルを使用してＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）中で修飾ペプチドを精製した。正しい環化材料を含有する純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、保存のために−２０℃に保った。
【０１７０】
別段の記載がなければ、すべてのアミノ酸をＬ−立体配置で使用した。
【０１７１】
生物学的データ
１．蛍光偏光測定
（ａ）直接結合アッセイ
蛍光タグ（フルオレセイン、ＳＩＧＭＡまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するペプチドを０．０１％のｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳまたは１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０１％のｔｗｅｅｎを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で（いずれもアッセイ緩衝液と称される）２．５ｎＭまで希釈した。これを黒色の壁および底を有する低結合低容量の３８４ウェルプレートにおいて総体積２５μＬ中１ｎＭのペプチドを与えるペプチドとして、同じアッセイ緩衝液中でタンパク質の滴定と組み合わせた（典型的には、５μＬのアッセイ緩衝液、１０μＫのタンパク質（表１）、次いで、１０μＬの蛍光ペプチド）。２つの連続希釈のうちの１つを使用して、公知の高親和性結合剤での５００ｎＭから、低親和性結合剤および選択性アッセイでの１０μＭまでの範囲の上位濃度を有する１２の異なる濃度を得た。４８５ｎｍで励起し、５２０ｎｍで平行かつ垂直な放射を検出する「ＦＰ  ４８５  ５２０  ５２０」光学モジュールを備えたＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳで測定を行った。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳを２５℃で、ウェル当たり２００フラッシュおよび０．１秒の移動待ち時間に設定し、各ウェルを５から１０分の間隔で６０分間測定した。分析に使用したゲインを、ウェル中にタンパク質が存在しない６０分の終了時に各トレーサーについて決定した。Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．０を使用してデータを分析した。ｍＰ値をユーザーが定義した二次方程式に当てはめ、Ｋｄ値を得た：ｆ  ＝  ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（ｘ＋Ｌｉｇ＋Ｋｄ）／２−ｓｑｒｔ（（（（ｘ＋Ｌｉｇ＋Ｋｄ）／２）＾２）−（Ｌｉｇ＊ｘ）））。「Ｌｉｇ」は、使用したトレーサー濃度の規定値であった。
【０１７２】
（ｂ）競合結合アッセイ
蛍光タグを有さないペプチドを蛍光タグと公知のＫｄ（表２）を有するペプチドと競合させて試験した。最大５％のＤＭＳＯを用いる直接結合アッセイにおいて記載されたように、ペプチドをアッセイ緩衝液中で適当な濃度に希釈し、次いで、２分の１に連続希釈した。希釈したペプチド５μＬをプレートに添加し、続いて、使用した蛍光ペプチドに応じた固定濃度のヒトまたはマウスのＥｐｈＡ２（表１）１０μＬ、次いで、１０μＬの蛍光ペプチドを添加した。直接結合アッセイに関して測定を行ったが、最初の測定の前にゲインを決定した。Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０でデータ分析し、ｍＰ値をユーザーが定義した三次方程式に当てはめ、Ｋｉ値を得た。
ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（Ｌｉｇ＊（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）））／（（３＊Ｋｌｉｇ）＋（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ））））．
【０１７３】
「Ｌｉｇ」、「ＫＬｉｇ」および「Ｐｒｏｔ」はすべて、それぞれ蛍光ペプチド濃度、蛍光ペプチドのＫｄおよびＥｐｈＡ２濃度に関して定義した値であった。
【０１７４】
【表３】
2021528433.tif 000021
【０１７５】
【表４】
2021528433.tif 000022
【０１７６】
本明細書に記載のペプチドリガンドを上述のアッセイにおいて試験した。
【０１７７】
［参考例１］
アルキルアミノに対するチオエーテルの足場連結の比較のために選択した第１の参照二環性ペプチドを５５−０３−０５−Ｎ２３３と示した。これは、チオエーテル形成ペプチドのトリメチレンベンゼン足場との二環性コンジュゲートである。この二環性誘導体の構造を図２に模式的に示す。コンジュゲーション前の直鎖状ペプチドは配列：
［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰＣＰＷＧＰＦＷＣＰＶＮＲＰＧＣ
を有する。
【０１７８】
１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）へのコンジュゲーションは以下のように行った。直鎖状ペプチドを約３５ｍＬまでＨ２Ｏで希釈し、アセトニトリル中１００ｍＭのＴＢＭＢ  約５００μＬを添加し、反応をＨ２Ｏ中１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３  ５ｍＬで開始した。反応を室温で約３０〜６０分間進行させ、反応が完了したら（ＭＡＬＤＩによって判断した）、凍結乾燥した。凍結乾燥後、修飾ペプチドをＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）によって精製し、酸を０．１％のトリフルオロ酢酸に変更した。正しいＴＭＢ修飾材料を含有する純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、保存のために−２０℃に保った。
【０１７９】
５５−０３−０５−Ｎ２３３と示した得られた二環性誘導体は、ＥｐｈＡ２に対する高い親和性を示した。誘導体のＥｐｈＡ２に対する親和性（Ｋｉ）の測定値は４．１２ｎＭであった。
【０１８０】
［実施例１］
５５−０３−０５−Ｎ３１４と示した二環性ペプチドを、第１および第２のシステイン残基を、ＴＢＭＢ足場に対してアルキルアミノ連結を形成するＤＡＰ残基によって置き換えた、参考例１のペプチドリガンドの二環性領域に対応するものとして作製した。この誘導体の構造を図３に模式的に示す。
【０１８１】
この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは、以下の通りであった：
［Ａｃ］［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰ［Ｄａｐ］ＰＷＧＰＦＷ［Ｄａｐ］ＰＶＮＲＰＧＣ
【０１８２】
２０１７年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８３９５３およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８３９５４により詳細に記載されているように、ＴＢＭＢとの環化は、塩基としてのＤＩＰＥＡの存在下で、アセトニトリル／水の混合物中で、１〜１６時間実施した。参考例１の環化と異なり、塩基として従来のＮａＨＣＯ３を使用する場合、収率は比較的低い。
【０１８３】
ＥｐｈＡ２に関するＫｉの測定値は１３５．５ｎＭであり、これは、参考例１のチオエーテル連結誘導体と比較して、この例のアルキルアミノ連結への変更が、結合親和性において、相対的に少ない変化しか生じなかったことを実証する。
【０１８４】
［実施例２］
５５−０３−０５−Ｎ３１６と示した二環性ペプチドを、第２および第３のシステイン残基を、ＴＢＭＢ足場に対してアルキルアミノ連結を形成するＤＡＰ残基に置き換えた、参考例１のペプチドリガンドの二環性領域に対応するものとして作製した。この誘導体の構造を図３に模式的に示す。
【０１８５】
この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは、以下の通りであった：
［Ａｃ］［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰＣＰＷＧＰＦＷ［Ｄａｐ］ＰＶＮＲＰＧ［Ｄａｐ］
【０１８６】
ＴＢＭＢによる環化は、実施例１に記載したように実施した。
【０１８７】
ＥｐｈＡ２に関するＫｉの測定値は６０４ｎＭであり、これは、この例のアルキルアミノ連結への変更が、参考例１のチオエーテル連結誘導体と比較して比較的高レベルの結合親和性を維持したことを実証する。
【０１８８】
［実施例３］
５５−０３−０５−Ｎ３１８と示した二環性ペプチドを、第１および第３のシステイン残基を、ＴＢＭＢ足場に対してアルキルアミノ連結を形成するＤＡＰ残基に置き換えた、参考例１のペプチドリガンドの二環性領域に対応するものとして作製した。この誘導体の構造を図４に模式的に示す。
【０１８９】
この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは、以下の通りであった：
［Ａｃ］［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰ［Ｄａｐ］ＰＷＧＰＦＷＣＰＶＮＲＰＧ［Ｄａｐ］
【０１９０】
ＴＢＭＢによる環化は、実施例１に記載したように実施した。
【０１９１】
ＥｐｈＡ２に関するＫｉの測定値は３１．５ｎＭであり、これは、参考例１のチオエーテル連結誘導体と比較して、この例のアルキルアミノ連結への変更が、結合親和性において、最小限の変化しか生じなかったことを実証する。
【０１９２】
参考例２
アルキルアミノに対するチオエーテルの足場連結の比較のために選択した第１の参照二環性ペプチドを５５−０３−０５−Ｎ２３８と示した。これは、チオエーテル形成ペプチドのトリメチレンベンゼン足場との二環性コンジュゲートである。コンジュゲーション前の直鎖状ペプチドは配列：
［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰＣ［Ａｉｂ］［１Ｎａｌ］Ｇ［Ａｉｂ］Ｆ［１Ｎａｌ］ＣＰ［ｔＢｕＧｌｙ］Ｎ［ＨＡｒｇ］Ｐ［ｄＤ］Ｃ
を有する。
【０１９３】
１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）へのコンジュゲーションは、実施例１に記載したように行った。
【０１９４】
５５−０３−０５−Ｎ２３８と示した得られた二環性誘導体は、ＥｐｈＡ２に対する高い親和性を示した。誘導体のＥｐｈＡ２に対する親和性（Ｋｉ）の測定値は１９．７ｎＭであった。
【０１９５】
［実施例４］
５５−０３−０５−Ｎ３１５と示した二環性ペプチドを、第１および第２のシステイン残基を、ＴＢＭＢ足場に対してアルキルアミノ連結を形成するＤＡＰ残基によって置き換えた、参考例２のペプチドリガンドの二環性領域に対応するものとして作製した。
【０１９６】
この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは、以下の通りであった：
［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰ［Ｄａｐ］［Ａｉｂ］［１Ｎａｌ］Ｇ［Ａｉｂ］Ｆ［１Ｎａｌ］［Ｄａｐ］Ｐ［ｔＢｕＧｌｙ］Ｎ［ＨＡｒｇ］Ｐ［ｄＤ］Ｃ
【０１９７】
ＴＢＭＢによる環化は、実施例１に記載したように実施した。
【０１９８】
ＥｐｈＡ２に関するＫｉの測定値は６４０ｎＭであり、これは、この例のアルキルアミノ連結への変更が、参考例２のチオエーテル連結誘導体と比較して有意な結合親和性を維持したことを実証する。
【０１９９】
［実施例５］
５５−０３−０５−Ｎ３１７と示した二環性ペプチドを、第２および第３のシステイン残基を、ＴＢＭＢ足場に対してアルキルアミノ連結を形成するＤＡＰ残基に置き換えた、参考例２のペプチドリガンドの二環性領域に対応するものとして作製した。
【０２００】
この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは、以下の通りであった：
［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰＣ［Ａｉｂ］［１Ｎａｌ］Ｇ［Ａｉｂ］Ｆ［１Ｎａｌ］［Ｄａｐ］Ｐ［ｔＢｕＧｌｙ］Ｎ［ＨＡｒｇ］Ｐ［ｄＤ］［Ｄａｐ］
【０２０１】
ＴＢＭＢによる環化は、実施例１に記載したように実施した。
【０２０２】
ＥｐｈＡ２に関するＫｉの測定値は４２５ｎＭであり、これは、この例のアルキルアミノ連結への変更が、参考例２のチオエーテル連結誘導体と比較して有意な結合親和性を維持したことを実証する。
【０２０３】
［実施例６］
５５−０３−０５−Ｎ３１９と示した二環性ペプチドを、第２および第３のシステイン残基を、ＴＢＭＢ足場に対してアルキルアミノ連結を形成するＤＡＰ残基に置き換えた、参考例２のペプチドリガンドの二環性領域に対応するものとして作製した。
【０２０４】
この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは、以下の通りであった：
［Ｂ−Ａｌａ］［Ｓａｒ］１０Ｈ［ｄＤ］ＶＰ［Ｄａｐ］［Ａｉｂ］［１Ｎａｌ］Ｇ［Ａｉｂ］Ｆ［１Ｎａｌ］ＣＰ［ｔＢｕＧｌｙ］Ｎ［ＨＡｒｇ］Ｐ［ｄＤ］［Ｄａｐ］
【０２０５】
ＴＢＭＢによる環化は、実施例１に記載したように実施した。
【０２０６】
ＥｐｈＡ２に関するＫｉの測定値は１７ｎＭであり、これは、この例のアルキルアミノ連結への変更が、参考例２のチオエーテル連結誘導体と比較して、ＥｐｈＡ２に対する親和性をわずかに増加させることを実証する。
【０２０７】
参考例Ａ１〜Ａ３０８
２０１７年１２月１９日に出願した、本発明者らのより早期の出願であるＧＢ２０１７２１２６５．５に詳細に記載されているように、特定のペプチド配列のシステイン残基に対して３つのチオエーテル連結を有するＴＢＭＢ足場を有する以下の参照ペプチドリガンドを調製し、ＥｐｈＡ２に対する親和性について評価した。
【０２０８】
実施例１〜６において上記で得られた結果を考慮して、本発明による、すなわち、参考例のチオエーテル連結のうちの１つまたは複数の代わりにアルキルアミノ連結を有する、参考例Ａ１〜Ａ３０８の誘導体もＥｐｈＡ２に対する親和性も示すことが予測される。ＴＢＭＢ以外の足場、特にＴＢＭＢ以外の芳香族の足場を有する参考例Ｂ１〜Ｂ９８の誘導体もＥｐｈＡ２に対する親和性を示すことが、さらに予測される。したがって、ＥｐｈＡ２に対する親和性を有するすべてのこのような誘導体は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２０９】
【表５−１】
2021528433.tif 000023
【表５−２】
2021528433.tif 000024
【０２１０】
【表６−１】
2021528433.tif 000025
【表６−２】
2021528433.tif 000026
【表６−３】
2021528433.tif 000027
【表６−４】
2021528433.tif 000028
【０２１１】
【表７】
2021528433.tif 000029
【０２１２】
【表８−１】
2021528433.tif 000030
【表８−２】
2021528433.tif 000031
【表８−３】
2021528433.tif 000032
【表８−４】
2021528433.tif 000033
【表８−５】
2021528433.tif 000034
【０２１３】
【表９】
2021528433.tif 000035
【０２１４】
【表１０−１】
2021528433.tif 000036
【表１０−２】
2021528433.tif 000037
【表１０−３】
2021528433.tif 000038
【表１０−４】
2021528433.tif 000039
【表１０−５】
2021528433.tif 000040
【表１０−６】
2021528433.tif 000041
【表１０−７】
2021528433.tif 000042
【表１０−８】
2021528433.tif 000043
【表１０−９】
2021528433.tif 000044
【表１０−１０】
2021528433.tif 000045
【表１０−１１】
2021528433.tif 000046
【表１０−１２】
2021528433.tif 000047
【０２１５】
【表１１−１】
2021528433.tif 000048
【表１１−２】
2021528433.tif 000049
【表１１−３】
2021528433.tif 000050
【０２１６】
【表１２】
2021528433.tif 000051
【０２１７】
参考例Ｂ１〜Ｂ９８
２０１７年１２月１９日に出願した本発明者らのより早期の出願であるＧＢ２０１７２１２５９．８に詳細に記載されているように、特定のペプチド配列のシステイン残基に対して３つのチオエーテル連結を有するＴＡＴＡ足場を有する以下の参照ペプチドリガンドを調製し、ＥｐｈＡ２に対する親和性について評価した。
【０２１８】
実施例１〜６において上記で得た結果を考慮して、本発明による、すなわち、参考例のチオエーテル連結の１つまたは複数の代わりにアルキルアミノ連結を有する、参考例Ｂ１〜Ｂ９８の誘導体もＥｐｈＡ２に対する親和性も示すことが予測される。ＴＡＴＡ以外の足場、特にＴＡＴＡ以外の非芳香族の足場を有する参考例Ｂ１〜Ｂ９８の誘導体もＥｐｈＡ２に対する親和性を示すことが、さらに予測される。したがって、ＥｐｈＡ２に対する親和性を有するすべてのこのような誘導体は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２１９】
【表１３】
2021528433.tif 000052
【０２２０】
【表１４−１】
2021528433.tif 000053
【表１４−２】
2021528433.tif 000054
【表１４−３】
2021528433.tif 000055
【表１４−４】
2021528433.tif 000056
【表１４−５】
2021528433.tif 000057
【表１４−６】
2021528433.tif 000058
【表１４−７】
2021528433.tif 000059
【表１４−８】
2021528433.tif 000060
【０２２１】
【表１５】
2021528433.tif 000061
【０２２２】
上記明細書で言及されたすべての刊行物は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明について記載した態様および実施形態の種々の修正および変更は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとって明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求された本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者に明らかである本発明を実行するために記載された方式の種々の修正は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2021528433.tif 000062
【図２】
2021528433.tif 000063
【図３】
2021528433.tif 000064
【図４】
2021528433.tif 000065
【図５】
2021528433.tif 000066
【配列表】
2021528433000001.app
【国際調査報告】
2021528433.tif 000067
2021528433.tif 000068
2021528433.tif 000069