(57)【要約】  本発明は、エプスタインバールウイルス抗原ポリヌクレオチド、ポリペプチド及びベクター、並びにそれを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、エプスタインバールウイルス感染症及びエプスタインバールウイルス関連疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ及び全身性ループスエリテマトーデスを処置及び予防するためのワクチンを生成するためのエプスタインバールウイルス抗原構築物の使用を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片、及び
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
宿主細胞において前記ポリペプチドの発現を指示する1つ以上の配列に作動可能に連結している、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片をさらに含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片
を含む、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片
を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片
を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片
を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片
を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号1の断片が互いに隣接していない、請求項3から11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号6の断片が互いに隣接していない、請求項3から12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号11の断片が互いに隣接していない、請求項3から13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号13の断片が互いに隣接していない、請求項3から14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号21の断片が互いに隣接していない、請求項3から15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、
(a)LMP1の第1及び第2の断片であって、前記LMP1の第1及び第2の断片は配列番号2〜5からなる群から選択され、前記LMP1の第1及び第2の断片は前記ポリペプチドにおいて互いに隣接していない、前記LMP1の第1及び第2の断片、
(b)LMP2の第1及び第2の断片であって、前記LMP1の第1及び第2の断片は配列番号7〜10からなる群から選択され、前記LMP2の第1及び第2の断片は前記ポリペプチドにおいて互いに隣接していない、前記LMP2の第1及び第2の断片、
(c)配列番号12からなるEBNA1の断片、並びに
(d)EBNA3Aの第1及び第2の断片であって、前記EBNA3Aの第1及び第2の断片は配列番号14〜20からなる群から選択され、前記EBNA3Aの第1及び第2の断片は前記ポリペプチドにおいて互いに隣接していない、前記EBNA3Aの第1及び第2の断片
を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号2からなるLMP1の第1の断片、
(b)配列番号3からなるLMP1の第2の断片、
(c)配列番号4からなるLMP1の第3の断片、
(d)配列番号5からなるLMP1の第4の断片、
(e)配列番号7からなるLMP2の第1の断片、
(f)配列番号8からなるLMP2の第2の断片、
(g)配列番号9からなるLMP2の第3の断片、
(h)配列番号10からなるLMP2の第4の断片、
(i)配列番号12からなるEBNA1の第1の断片、
(j)配列番号14からなるEBNA3Aの第1の断片、
(k)配列番号15からなるEBNA3Aの第2の断片、
(l)配列番号16からなるEBNA3Aの第3の断片、
(m)配列番号17からなるEBNA3Aの第4の断片、
(n)配列番号18からなるEBNA3Aの第5の断片、
(o)配列番号19からなるEBNA3Aの第6の断片、及び
(p)配列番号20からなるEBNA3Aの第7の断片
を含み、
第1、第2、第3及び第4のLMP1断片が互いに隣接していない、第1、第2、第3及び第4のLMP2断片が互いに隣接していない、並びに第1、第2、第3、第4、第5、第6、及び第7のEBNA3A断片が互いに隣接していない、
請求項1から17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、
(a)配列番号22からなるZEBRAの第1の断片、及び
(b)配列番号23からなるZEBRAの第2の断片
をさらに含み、
第1及び第2のZEBRA断片が互いに隣接していない、請求項17又は18に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、配列番号24又は配列番号26に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である、請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
断片が免疫原性断片である、請求項1〜20のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項1〜21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
アデノウイルスベクター又はワクシニアウイルスベクターである、請求項22に記載のベクター。
【請求項２４】
非ヒトサルアデノウイルスベクターである、請求項22又は23に記載のベクター。
【請求項２５】
非ヒトサルアデノウイルスベクターが、チンパンジーアデノウイルスベクターである、請求項24に記載のベクター。
【請求項２６】
改変ワクシニアアンカラベクターである、請求項22又は23に記載のベクター。
【請求項２７】
配列番号50に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である核酸配列を含むChAd155-EBV-L発現ベクターである、請求項22から25のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２８】
配列番号51と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である核酸配列を含むChAd155-EBV-LLy発現ベクターである、請求項22から25のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項22から28のいずれか一項に記載のベクターによってコードされたポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号24又は配列番号26に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である、請求項29に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項22から28のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項29若しくは30に記載のポリペプチド、及び薬学的に許容される賦形剤を含む免疫原性組成物。
【請求項３２】
アジュバントをさらに含む、請求項31に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
エプスタインバールウイルス感染によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における、請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項22から28のいずれか一項に記載のベクター、請求項29若しくは30に記載のポリペプチド、又は請求項31若しくは32に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項３４】
エプスタインバールウイルス感染によって引き起こされる疾患の処置又は予防において使用するための、請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項22から28のいずれか一項に記載のベクター、請求項29若しくは30に記載のポリペプチド、又は請求項31若しくは32に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
EBV抗原を発現することが可能である組換えウイルス粒子を生成する方法であって、宿主細胞において請求項22から28のいずれか一項に記載のベクターを発現させることを含む方法。
【請求項３６】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項22から28のいずれか一項に記載のベクター、請求項29若しくは30に記載のポリペプチド、又は請求項31若しくは32に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項３７】
対象が、エプスタインバールウイルス血清陰性である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
対象が、エプスタインバールウイルス血清陽性である、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
対象におけるEBV関連疾患を処置又は予防する方法であって、請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項22から28のいずれか一項に記載のベクター、請求項29若しくは30に記載のポリペプチド、又は請求項31若しくは32に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項４０】
EBV関連疾患が、EBV関連自己免疫疾患又はEBV関連悪性腫瘍である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
EBV関連疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ及び全身性ループスエリテマトーデスからなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、
(a)請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを投与するステップ、及び
(b)請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスベクターを投与するステップ
を含み、
ステップ(a)及び(b)がいずれかの順序で行われる、方法。
【請求項４３】
対象におけるEBV関連疾患を処置又は予防する方法であって、
(a)請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを投与するステップ、及び
(b)請求項1から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスベクターを投与するステップ
を含み、
ステップ(a)及び(b)がいずれかの順序で行われる、方法。
【請求項４４】
ステップ(b)が、ステップ(a)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週後又はそれより長い週数後に行われる、請求項42又は43に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益についての記載
本発明は、保健福祉省(Department of Health and Human Services)の一機関である国立衛生研究所(National Institutes of Health)との共同研究開発協定の履行において創出された。アメリカ合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。2018年12月5日に作成された前記ASCIIコピーは、VU66487_WO_SL.txtという名称であり、419,960バイトのサイズである。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、ウイルス感染症を処置及び予防する分野に属する。特に、本発明は、エプスタインバールウイルス抗原構築物に関する。本発明は、エプスタインバールウイルス感染症及びエプスタインバールウイルス関連疾患を処置及び予防するためのエプスタインバールウイルス抗原構築物の使用を含む。
【背景技術】
【０００４】
ヒトヘルペスウイルス4(HHV-4)としても知られているエプスタインバールウイルス(EBV)は、ヒトにおいて最も一般的なウイルスの1つであり、少なくとも90%の成人に感染する。EBVは、ほとんどの感染した個体において無症状潜伏感染となるが、伝染性単核球症の主要な病原体としても知られている。
【０００５】
より重要なことに、EBV感染は、ある種の悪性腫瘍(例えば、胃癌、上咽頭癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫)、並びに多発性硬化症(MS)、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ(RA)及びシューグレン症候群のリスクの増加に関連する。
【０００６】
ヘルペスウイルスファミリーの他のメンバーと同様に、EBVは、約85個の遺伝子をコードする約192キロベースの二本鎖DNAゲノムを含有する。EBVゲノムは、ウイルスの外被によって囲まれたタンパク質ヌクレオカプシドに包まれている。外側のエンベロープ層は、脂質、並びにウイルスの、その主要な宿主細胞であるBリンパ球及び上皮細胞への標的化に関与すると考えられる表面糖タンパク質を含む。
【０００７】
EBVウイルスの複製サイクルは十分に特徴付けられている。宿主細胞の初期感染後に、EBVは、溶解性複製段階(又は溶解性段階)と呼ばれる、感染性ビリオンの活発な産生の段階に入る。溶解性段階の間に、EBVの遺伝子発現は、ZEBRA、BRLF1、BNLF2、BCRF1、及びウイルスカプシド抗原(VCA)、並びにエンベロープ糖タンパク質、例えば、gp350及びgp110を含む1つ以上の溶解性遺伝子産物の発現を特徴とする。
【０００８】
溶解性複製期間の後に、EBVは、潜伏(又は潜伏期)と呼ばれる、活発なウイルス産生のない持続性ウイルス感染の状態に入る。潜伏EBV感染は、1つ以上の潜伏遺伝子産物、例えば、EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNAリーダータンパク質(EBNA-LP)、LMP1、及び/又はLMP2の発現を含む、特徴的な遺伝子発現プログラムを伴う。潜伏感染した細胞は、未だ理解されていないトリガーによって溶解性ウイルス産生へと再活性化され得る。
【０００９】
動物モデル及びヒト試験において、いくつかのEBVワクチン候補が評価された。ほとんどの予防的ワクチン候補は、免疫原として、主要なEBVエンベロープ糖タンパク質gp350に焦点を当ててきた。Guらは、EBVのgp350を発現する組換え生ワクシニアウイルスによって、小児において、EBV中和抗体と中程度の保護が誘発されたが、成人では誘発されなかったことを報告した。Guら、Dev. Biol. Stand. 1995;84:171〜177頁。組換えgp350ワクチンは、EBV感染に対して保護しないことが判明したが、伝染性単核球症の発症を低減した。Sokalら、J. Infect. Dis. 2007;196(12):1749〜1753頁。
【００１０】
治療用EBVワクチン候補は、EBV核抗原-1(EBNA1)及びLMP2のT細胞エピトープを主に標的としてきた。例えば、Taylorらは、全長LMP2タンパク質に融合したEBNA1のペプチド断片を発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターについて記載した。いわゆるMVA-ELワクチンは、初期臨床試験において、抗原特異的CD4+及びCD8+ T細胞応答を誘導することが報告された。Taylorら、J. Virol. Jan. 2004、768〜778頁。同様に、全長LMP2タンパク質を発現する組換えヒトアデノウイルスベクターは、インビトロ及びマウスにおいて、抗原特異的T細胞応答を誘導することが報告された。Panら、Biochem Biophys Res Commun. 2006年9月1日;347(3):551〜7頁。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
当技術分野における明確なニーズにもかかわらず、ヒトにおいて使用するために認可されたEBVワクチンは未だにない。よって、EBV感染を予防する際、並びにEBV関連悪性腫瘍及びEBV関連疾患、例えば、多発性硬化症を処置する際に使用するためのEBVワクチンに対するニーズが依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、エプスタインバールウイルス(EBV)感染に対する、対象における免疫応答の誘導のための免疫原性組成物の構成成分として有用なEBV抗原ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びベクター;EBV感染及びEBV関連疾患の防止及び処置においてそれらを使用するための方法;並びにそれらの製造のための方法を提供する。
【００１３】
(a)配列番号1のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも1個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも1個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも1個の断片、及び
(d)配列番号13のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも1個の断片
を含むEBV抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
宿主細胞における前記ポリペプチドの発現を指示する1つ以上の配列に作動可能に連結しているポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号21のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも1個の断片をさらに含む。
【００１４】
(a)互いに隣接していない、配列番号1のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも2個のLMP1断片、
(b)互いに隣接していない、配列番号6のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも2個のLMP2断片、
(c)互いに隣接していない、配列番号11のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも2個のEBNA1断片、
(d)互いに隣接していない、配列番号13のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも2個のEBNA3A断片、及び/又は
(e)互いに隣接していない、配列番号21のうちの少なくとも8アミノ酸の少なくとも2個のZEBRA断片
を含むEBV抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
宿主細胞における前記ポリペプチドの発現を指示する1つ以上の配列に作動可能に連結しているポリヌクレオチドも提供される。
【００１５】
EBV抗原ポリペプチドが、
(a)配列番号2からなるLMP1の第1の断片、
(b)配列番号3からなるLMP1の第2の断片、
(c)配列番号4からなるLMP1の第3の断片、
(d)配列番号5からなるLMP1の第4の断片、
(e)配列番号7からなるLMP2の第1の断片、
(f)配列番号8からなるLMP2の第2の断片、
(g)配列番号9からなるLMP2の第3の断片、
(h)配列番号10からなるLMP2の第4の断片、
(i)配列番号12からなるEBNA1の第1の断片、
(j)配列番号14からなるEBNA3Aの第1の断片、
(k)配列番号15からなるEBNA3Aの第2の断片、
(l)配列番号16からなるEBNA3Aの第3の断片、
(m)配列番号17からなるEBNA3Aの第4の断片、
(n)配列番号18からなるEBNA3Aの第5の断片、
(o)配列番号19からなるEBNA3Aの第6の断片、及び
(p)配列番号20からなるEBNA3Aの第7の断片
を含み、
第1、第2、第3及び第4のLMP1断片が互いに隣接していない;第1、第2、第3及び第4のLMP2断片が互いに隣接していない;並びに第1、第2、第3、第4、第5、第6、及び第7のEBNA3A断片が互いに隣接していない、上記のポリヌクレオチドも提供される。場合により、ポリペプチドは、(a)配列番号22からなるZEBRAの第1の断片、及び(b)配列番号23からなるZEBRAの第2の断片をさらに含み、第1及び第2のZEBRA断片は互いに隣接していない。
【００１６】
EBV抗原ポリペプチドが、配列番号24又は配列番号26に対して少なくとも80%同一である、上記のポリヌクレオチドも提供される。
【００１７】
例えば、アデノウイルスベクター(例えば、非ヒトサルアデノウイルスベクター)及びワクシニアウイルスベクター(例えば、改変ワクシニアアンカラ(MVA)ベクター)を含む、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。
【００１８】
本明細書に記載されているポリヌクレオチド及びベクターによってコードされたEBV抗原ポリペプチド、例えば、配列番号24又は配列番号26に対して少なくとも80%同一であるポリペプチドも提供される。
【００１９】
本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター及びポリペプチド、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む組成物も提供される。このような組成物は、場合により1つ以上のアジュバントを含む。
【００２０】
エプスタインバールウイルス感染によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における、本明細書に記載されているポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド及び組成物の使用も提供される。
【００２１】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載されているポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド及び組成物を対象に投与するステップを含む方法も記載されている。
【００２２】
対象におけるEBV関連疾患を処置又は予防する方法であって、本明細書に記載されているポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド及び組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供される。EBV関連疾患としては、例えば、EBV関連疾患(例えば、多発性硬化症、関節リウマチ及び全身性ループスエリテマトーデス)が挙げられる。
【００２３】
エプスタインバールウイルス感染によって引き起こされる疾患の処置又は予防において使用するための、本明細書に記載されているポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド及び組成物も提供される。
【００２４】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、
(a)本明細書に記載されているEBV抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスを投与するステップ、及び
(b)本明細書に記載されているEBV抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを投与するステップ
を含み、
ステップ(a)及び(b)がいずれかの順序で行われる、方法も提供される。
【００２５】
対象におけるEBV関連疾患を処置又は予防する方法であって、
(a)本明細書に記載されているEBV抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスを投与するステップ、及び
(b)本明細書に記載されているEBV抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを投与するステップ
を含み、
ステップ(a)及び(b)がいずれかの順序で行われる、方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】EBV潜伏(LMP1、LMP2、EBNA1及びEBNA3A)及び溶解性(ZEBRA)タンパク質の概略図である。付番領域は、多価EBV抗原ポリペプチドを構築するために使用される免疫原性断片を示す。英数字の識別子(例えば、a1、a2、b1、b2)は、図2A〜Bに示されている多価構築物において表された断片に対応する。
【図２】多価EBV抗原構築物の概略図である。A)LMP1(a1からa4として特定される)、LMP2(b1からb4として特定される)、EBNA1(c1として特定される)及びEBNA3A(d1からd7として特定される)に由来する免疫原性断片を含むEBV潜伏抗原構築物(EBV-L)。B)LMP1、LMP2、EBNA1、EBNA3A(図2Aにおけるようにすべて特定されている)及びZEBRA(e1からe2として特定されている)に由来する免疫原性断片を含む、EBV潜伏+溶解性抗原構築物(EBV-LLy)。同じ文字の接頭辞(すなわち、a、b、c、d、e)を有する多価抗原の領域は、同じEBVタンパク質に由来する。
【図３】CalHV3潜伏(C1、C7及びORF39)及び溶解性(ORF43)タンパク質の概略図である。付番領域は、多価CalHV3抗原ポリペプチドを構築するために使用される免疫原性断片を示す。英数字の識別子(例えば、a1、a2、b1、b2)は、図4A〜Cに示されている多価構築物において表された断片に対応する。C1、C7、ORF39及びORF43抗原は、それぞれ、EBVタンパク質LMP1、LMP2、EBNA1及びZEBRAの推定マーモセット(コモンマーモセット(Callithrix jacchus))ヘルペスウイルスオルソログであるため、選択された。
【図４】多価CalHV3抗原構築物の概略図である。A)C1、C7及びORF39に由来する免疫原性断片を含む、CalHV3潜伏抗原構築物(CalHV3-L)。B)C1、C7、ORF39及びORF43に由来する免疫原性断片を含む、CalHV3潜伏+溶解性抗原構築物(CalHV3-LLy)。C)マーモセットMHCクラスII関連不変鎖(li)に融合した、(B)由来のCalHV3-LLy構築物。同じ文字の接頭辞(すなわち、a、b、c、d)を有する多価抗原の領域は、同じCalHV3タンパク質に由来する。
【図５】(A) 106、107及び108個のウイルス粒子(vp)の用量で、EBV抗原構築物をコードするアデノウイルスベクターで免疫化したマウスにおけるT細胞応答。ChAd155-EBV-L及びChAd155-EBV-LLyは、用量依存的様式で、脾細胞からのインターフェロンガンマ(IFNγ)分泌を誘発した。LMP1、LMP2、EBNA1及びEBNA3Aをカバーするペプチドプールによる刺激に応答するT細胞活性化は、EBV-L及びEBV-LLy免疫化マウスのいずれにおいても、EBV潜伏抗原のそれぞれに対して観察された。EBV溶解性タンパク質であるZEBRAに対するT細胞応答は、EBV-LLy免疫化マウスにおいてのみ検出された。EBV接合部ペプチド(Ej)に対して又は陰性対照として使用されたペプチドプール希釈剤であるDMSO(ジメチルスルホキシド)に対して、応答は検出されなかった。(B) 106、107及び108vpの用量で、CalHV3抗原構築物をコードするアデノウイルスベクターで免疫化したマウスにおけるT細胞応答。ChAd155-CalHV3-L及びChAd155-CalHV3-LLyは、用量依存的様式で、脾細胞からのIFNγ分泌を誘発した。CalHV3潜伏抗原C1、C7及びORF39をカバーするペプチドプールに対するT細胞応答は、CalHV3-L及びCalHV3-LLy免疫化マウスのいずれにおいても検出された。しかしながら、CalHV3溶解性タンパク質であるORF43に対するT細胞応答は、CalHV3-LLy免疫化マウスにおいてのみ検出された。CalHV3接合部ペプチド(Cj)又は陰性対照であるDMSOに対して応答は検出されなかった。
【図６】マウスにおけるEBV-LLy免疫原性に対するプライム（初回免疫）-ブースト（追加免疫）投与の効果。0日目のChAd155-EBV-LLyによる免疫化の後の、21日目(3週目)のMVA-EBV-LLyによる追加免疫（ブースト）によって、ブーストなしのマウス又はEBV非関連抗原をコードするMVAベクターの「ブースト」注入を受けているマウスと比較して、EBV特異的インターフェロンガンマ放出が有意に増加した。図6Aは、すべての抗原(LMP1、LMP2、EBNA1、EBNA3A及びZEBRA)に対する累積T細胞応答を提示し、図6Bは、個々の抗原に対する及び陰性対照であるDMSOに対する応答を示す。
【図７】マウスにおけるCalHV3-LLy免疫原性に対するプライム-ブースト投与の効果。0日目のChAd155-CalHV3-LLy(「プライム」)による免疫化の後の、42日目(6週目)の同じ抗原構築物(ChAd155-CalHV3-LLy)又はMVA-CalHV3-LLyのいずれかによる追加免疫によって、ブーストなしのマウス又はCalHV3非関連抗原をコードするMVAベクターの「ブースト」注入を受けているマウスと比較して、7週目に測定されたCalHV3特異的IFNγ放出が有意に増加した。
【図８】不変鎖CalHV3-LLy融合タンパク質(ChAd155-li-CalHV3-LLy)による免疫化の2週間後のマウスにおける累積T細胞応答。より低い用量の抗原(5×106vp)では、ChAd155-li-CalHV3-LLyが、ChAd155-CalHV3-LLyよりも有意に大きなIFNγ放出及びより高い比率(100%)の応答マウスを誘発した。試験したより高い抗原用量(5×107vp)では、差は観察されなかった。
【図９】CalHV3に感染したマーモセットにおける累積T細胞応答。免疫化(w0)の前に、動物は、ベースラインCalHV3特異的T細胞応答を示し、これは、動物がウイルスキャリアであるという事実と一致した。ChAd155-CalHV3-LLy免疫化の3週間後(w3 pp)に、CalHV3免疫化動物は、既存のCalHV3特異的T細胞応答の有意な拡大を示した。T細胞応答は、MVA-CalHV3-LLyによるブーストの1週間後(w1 pb)にベースラインを超えて上昇し続け、収束後、ブーストの7週間後も依然としてベースラインを超えていた。
【図１０】図9に示されているChAd155-CalHV3-LLyに対する増強された累積T細胞応答は、多特異性、すなわち、CalHV3-LLy抗原C1、C7、ORF39及びORF43に対するものであると決定された。
【図１１】ChAd155によってコードされた抗原に対応するEBVペプチドプール及びMVA潜伏+溶解性EBVワクチンは、健康なヒトドナー由来のPBMCにおいてIFNγ放出を誘発する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
配列の説明
配列番号1 EBV LMP1タンパク質(Genbank番号P03230)
配列番号2 EBV LMP1タンパク質の免疫原性断片
配列番号3 EBV LMP1タンパク質の免疫原性断片
配列番号4 EBV LMP1タンパク質の免疫原性断片
配列番号5 EBV LMP1タンパク質の免疫原性断片
配列番号6 EBV LMP2タンパク質(Genbank番号P13285)
配列番号7 EBV LMP2タンパク質の免疫原性断片
配列番号8 EBV LMP2タンパク質の免疫原性断片
配列番号9 EBV LMP2タンパク質の免疫原性断片
配列番号10 EBV LMP2タンパク質の免疫原性断片
配列番号11 EBV EBNA1タンパク質(Genbank番号P03211)
配列番号12 EBV EBNA1タンパク質の免疫原性断片
配列番号13 EBV EBNA3Aタンパク質(Genbank番号YP401669)
配列番号14 EBV EBNA3Aタンパク質の免疫原性断片
配列番号15 EBV EBNA3Aタンパク質の免疫原性断片
配列番号16 EBV EBNA3Aタンパク質の免疫原性断片
配列番号17 EBV EBNA3Aタンパク質の免疫原性断片
配列番号18 EBV EBNA3Aタンパク質の免疫原性断片
配列番号19 EBV EBNA3Aタンパク質の免疫原性断片
配列番号20 EBV EBNA3Aタンパク質の免疫原性断片
配列番号21 EBV ZEBRAタンパク質(Genbank番号P03206)
配列番号22 EBV ZEBRAタンパク質の免疫原性断片
配列番号23 EBV ZEBRAタンパク質の免疫原性断片
配列番号24 EBV-L抗原ポリペプチド
配列番号25 EBV-L抗原ポリペプチドをコードするDNA
配列番号26 EBV-LLy抗原ポリペプチド
配列番号27 EBV-LLy抗原ポリペプチドをコードするDNA
配列番号28 CalHV3 C1タンパク質(Genbank番号NP_733852)
配列番号29 CalHV3 C1タンパク質の免疫原性断片
配列番号30 CalHV3 C1タンパク質の免疫原性断片
配列番号31 CalHV3 C1タンパク質の免疫原性断片
配列番号32 CalHV3 C7タンパク質(Genbank番号NP_733851)
配列番号33 CalHV3 C7タンパク質の免疫原性断片
配列番号34 CalHV3 C7タンパク質の免疫原性断片
配列番号35 CalHV3 C7タンパク質の免疫原性断片
配列番号36 CalHV3 ORF39(Genbank番号NP_733892)
配列番号37 CalHV3 ORF39の免疫原性断片
配列番号38 CalHV3 ORF39の免疫原性断片
配列番号39 CalHV3 ORF39の免疫原性断片
配列番号40 CalHv3 ORF43タンパク質(Genbank番号NP_733896)
配列番号41 CalHv3 ORF43タンパク質の免疫原性断片
配列番号42 CalHv3 ORF43タンパク質の免疫原性断片
配列番号43 マーモセット不変鎖ポリペプチド
配列番号44 CalHv3_L抗原ポリペプチド
配列番号45 CalHV3_L抗原ポリペプチドをコードするDNA
配列番号46 CalHV3_LLy抗原ポリペプチド
配列番号47 CalHV3_LLy抗原ポリペプチドをコードするDNA
配列番号48 Ii_CalHV3_LLy抗原ポリペプチド
配列番号49 Ii_CalHV3_LLy抗原ポリペプチドをコードするDNA
配列番号50 pChAd155(ΔE1、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-EBV-L発現ベクター
配列番号51 pChAd155(ΔE1、ΔE3、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-EBV-LLy発現ベクター
配列番号52 pChAd155(ΔE1、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-CalHV3-L発現ベクター
配列番号53 pChAd155(ΔE1、ΔE3、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-CalHV3-LLy発現ベクター
配列番号54 pChAd155(ΔE1、ΔE3、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-mli-CalHV3-LLy発現ベクター
【００２８】
発明の詳細な説明
エプスタインバールウイルス抗原ポリペプチド
本発明のEBV抗原ポリペプチドは、1個以上のEBV潜伏及び/又は溶解性タンパク質の免疫原性断片を含むポリペプチドを含む。EBV潜伏タンパク質としては、例えば、潜伏膜タンパク質(Latent Membrane Proteins) (LMP1及びLMP2);及びEBV核抗原(EBV Nuclear Antigens) (EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B及びEBNA3C)が挙げられる。EBV溶解性タンパク質としては、例えば、ZEBRA(BZLF1遺伝子によってコードされている)が挙げられる。
【００２９】
EBVタンパク質の「免疫原性断片」は、本明細書で使用される場合、免疫応答、例えば、液性(例えば、抗体)及び/又は細胞媒介性(例えば、細胞傷害性T細胞)応答を誘導することが可能である、全長EBVタンパク質よりも小さな断片を意味する。免疫原性断片は、全長タンパク質のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90及び少なくとも100アミノ酸の断片を含む。一部の実施形態では、免疫原性断片は、全長タンパク質のうちの約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90及び約100アミノ酸からなる。本発明の一態様は、潜伏EBV感染を有するB細胞に対するT細胞応答を誘導することが可能なEBV抗原ポリペプチドを提供することである。よって、一部の実施形態では、EBVタンパク質の免疫原性断片は、抗原特異的T細胞応答を誘導することが可能な1つ以上のT細胞エピトープを含む。
【００３０】
免疫原性断片は、断片が由来する全長タンパク質に対して1つ以上の置換、欠失又は挿入を有してもよい。よって、免疫原性断片は、全長タンパク質の対応する領域に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３１】
一実施形態では、本発明のEBV抗原ポリペプチドは、潜伏膜タンパク質1 (Latent Membrane Protein 1) (LMP1)抗原を含む。LMP1は、EBVのウイルス生活環の潜伏段階の間に発現される386アミノ酸タンパク質である。本発明のEBV抗原ポリペプチドにおいて使用するのに好適なLMP1の免疫原性断片は、配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90及び少なくとも100アミノ酸の断片を含む。一部の実施形態では、LMP1の免疫原性断片は、配列番号1のうちの約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90及び約100アミノ酸からなる。一部の実施形態では、LMP1の免疫原性断片は、配列番号1の対応する領域に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３２】
一部の実施形態では、LMP1の免疫原性断片は、1つ以上のT細胞エピトープを含む。好ましい実施形態では、LMP1の免疫原性エピトープは、これらに限定されないが、配列番号2〜5及び配列番号2〜5に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明のEBV抗原ポリペプチドは、潜伏膜タンパク質2 (Latent Membrane Protein 2) (LMP2)抗原を含む。LMP2は、EBVのウイルス生活環の潜伏段階の間に発現される497アミノ酸タンパク質である。本発明のEBV抗原ポリペプチドにおいて使用するのに好適なLMP2の免疫原性断片は、配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90及び少なくとも100アミノ酸の断片を含む。一部の実施形態では、LMP2の免疫原性断片は、配列番号6のうちの約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90及び約100アミノ酸からなる。一部の実施形態では、LMP2の免疫原性断片は、配列番号6の対応する領域に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、LMP2の免疫原性断片は、1つ以上のT細胞エピトープを含む。好ましい実施形態では、LMP2の免疫原性エピトープは、これらに限定されないが、配列番号7〜10、及び配列番号7〜10に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３５】
一実施形態では、本発明のEBV抗原ポリペプチドは、Epstein-Barr Nuclear Antigen 1(EBNA1)抗原を含む。EBNA1は、EBVのウイルス生活環の潜伏段階の間に発現される641アミノ酸タンパク質である。本発明のEBV抗原ポリペプチドにおいて使用するのに好適なEBNA1の免疫原性断片は、配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90及び少なくとも100アミノ酸の断片を含む。一部の実施形態では、EBNA1の免疫原性断片は、配列番号11のうちの約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90及び約100アミノ酸からなる。一部の実施形態では、EBNA1の免疫原性断片は、配列番号11の対応する領域に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３６】
一部の実施形態では、EBNA1の免疫原性断片は、1つ以上のT細胞エピトープを含む。好ましい実施形態では、EBNA1の免疫原性エピトープは、これらに限定されないが、配列番号12、及び配列番号12に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明のEBV抗原ポリペプチドは、エプスタインバール核抗原3A(Epstein-Barr Nuclear Antigen 3A) (EBNA3A)抗原を含む。EBNA3Aは、EBVのウイルス生活環の潜伏段階の間に発現される944アミノ酸タンパク質である。本発明のEBV抗原ポリペプチドにおいて使用するのに好適なEBNA3Aの免疫原性断片は、配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90及び少なくとも100アミノ酸の断片を含む。一部の実施形態では、EBNA3Aの免疫原性断片は、配列番号13のうちの約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90及び約100アミノ酸からなる。一部の実施形態では、EBNA3Aの免疫原性断片は、配列番号13の対応する領域に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、EBNA3Aの免疫原性断片は、1つ以上のT細胞エピトープを含む。好ましい実施形態では、EBNA3Aの免疫原性エピトープは、これらに限定されないが、配列番号14〜20、及び配列番号14〜20に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００３９】
一実施形態では、本発明のEBV抗原ポリペプチドは、ZEBRA抗原を含む。ZEBRAは、EBVのウイルス生活環の溶解性段階の間に発現される245アミノ酸タンパク質である。本発明のEBV抗原ポリペプチドにおいて使用するのに好適なZEBRAの免疫原性断片は、配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90及び少なくとも100アミノ酸の断片を含む。一部の実施形態では、ZEBRAの免疫原性断片は、配列番号21のうちの約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90及び約100アミノ酸からなる。一部の実施形態では、ZEBRAの免疫原性断片は、配列番号21の対応する領域に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、ZEBRAの免疫原性断片は、1つ以上のT細胞エピトープを含む。好ましい実施形態では、ZEBRAの免疫原性エピトープは、これらに限定されないが、配列番号22〜23、及び配列番号22〜23に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である断片を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、EBV抗原ポリペプチドは、多価EBV抗原ポリペプチドである。「多価」によって、2、3、4、5又はそれより多いEBVタンパク質の免疫原性断片を含むポリペプチドが意図される。「断片」によって、全長タンパク質のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の断片が意図される。
【００４２】
よって、一実施形態では、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片、及び
(d)配列番号13の少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片
を含むポリペプチドが提供される。
【００４３】
場合により、ポリペプチドは、配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸の少なくとも1個の断片をさらに含む。
【００４４】
一部の実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、1つ以上のEBVタンパク質の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10個の断片を含む。よって、一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも2個の断片
を含むポリペプチドである。
【００４５】
一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも3個の断片
を含むポリペプチドである。
【００４６】
一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも4個の断片
を含むポリペプチドである。
【００４７】
一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも5個の断片
を含むポリペプチドである。
【００４８】
一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも6個の断片
を含むポリペプチドである。
【００４９】
一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも7個の断片
を含むポリペプチドである。
【００５０】
一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも8個の断片
を含むポリペプチドである。
【００５１】
一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも9個の断片
を含むポリペプチドである。
【００５２】
一実施形態では、多価EBV抗原は、
(a)配列番号1のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片、
(b)配列番号6のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片、
(c)配列番号11のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片、
(d)配列番号13のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片、又は
(e)配列番号21のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90若しくは少なくとも100アミノ酸の少なくとも10個の断片
を含むポリペプチドである。
【００５３】
一部の実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、同じEBVタンパク質に由来する少なくとも2個の免疫原性断片を含み、少なくとも2個の免疫原性断片は、多価EBV抗原ポリペプチドにおいて互いに隣接していない。「隣接していない」によって、少なくとも2個の免疫原性断片が、EBV抗原ポリペプチドにおいて連続するアミノ酸配列を形成しないことを意味することが意図される。隣接していない免疫原性断片は、免疫原性断片と同じEBVタンパク質に由来しない、少なくとも1、2、3、4、5、10又はそれより多いアミノ酸によって互いに分離されている。
【００５４】
例えば、一実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、LMP1(配列番号1)の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10個の断片を含み、LMP1の断片は互いに隣接していない。
【００５５】
別の実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、LMP2(配列番号6)の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10個の断片を含み、LMP2の断片は互いに隣接していない。
【００５６】
別の実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、EBNA1(配列番号11)の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10個の断片を含み、EBNA1の断片は互いに隣接していない。
【００５７】
別の実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、EBNA3A(配列番号13)の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10個の断片を含み、EBNA3Aの断片は互いに隣接していない。
【００５８】
別の実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、ZEBRA(配列番号21)の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10個の断片を含み、ZEBRAの断片は互いに隣接していない。
【００５９】
一実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、
(a)LMP1の第1及び第2の断片であって、該LMP1の第1及び第2の断片は配列番号2〜5からなる群から選択され、かつ該LMP1の第1及び第2の断片はポリペプチドにおいて互いに隣接していない、該LMP1の第1及び第2の断片、
(b)LMP2の第1及び第2の断片であって、該LMP1の前記第1及び第2の断片が配列番号7〜10からなる群から選択され、かつ該LMP2の第1及び第2の断片がポリペプチドにおいて互いに隣接していない、該LMP2の第1及び第2の断片、
(c)配列番号12からなるEBNA1の断片、並びに
(d)EBNA3Aの第1及び第2の断片であって、該EBNA3Aの第1及び第2の断片が配列番号14〜20からなる群から選択され、かつ該EBNA3Aの第1及び第2の断片がポリペプチドにおいて互いに隣接していない、該EBNA3Aの第1及び第2の断片
を含む。
【００６０】
場合により、多価EBV抗原は、
(a)配列番号22からなるZEBRAの第1の断片、及び
(b)配列番号23からなるZEBRAの第2の断片
をさらに含み、
第1及び第2のZEBRA断片は互いに隣接していない。
【００６１】
一実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、
(a)配列番号2からなるLMP1の第1の断片、
(b)配列番号3からなるLMP1の第2の断片、
(c)配列番号4からなるLMP1の第3の断片、
(d)配列番号5からなるLMP1の第4の断片、
(e)配列番号7からなるLMP2の第1の断片、
(f)配列番号8からなるLMP2の第2の断片、
(g)配列番号9からなるLMP2の第3の断片、
(h)配列番号10からなるLMP2の第4の断片、
(i)配列番号12からなるEBNA1の第1の断片、
(j)配列番号14からなるEBNA3Aの第1の断片、
(k)配列番号15からなるEBNA3Aの第2の断片、
(l)配列番号16からなるEBNA3Aの第3の断片、
(m)配列番号17からなるEBNA3Aの第4の断片、
(n)配列番号18からなるEBNA3Aの第5の断片、
(o)配列番号19からなるEBNA3Aの第6の断片、及び
(p)配列番号20からなるEBNA3Aの第7の断片
を含み、
第1、第2、第3及び第4のLMP1断片は互いに隣接していない、第1、第2、第3及び第4のLMP2断片は互いに隣接していない、並びに第1、第2、第3、第4、第5、第6、及び第7のEBNA3A断片は互いに隣接していない。場合により、多価EBV抗原は、
(a)配列番号22からなるZEBRAの第1の断片、及び
(b)配列番号23からなるZEBRAの第2の断片
をさらに含み、
第1及び第2のZEBRA断片は互いに隣接していない。
【００６２】
本明細書に記載のポリペプチド及びポリヌクレオチドの明確な説明を容易にするために、特定の配列構成成分を「第1の」ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、「第2の」ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列などと称する。第1、第2などの配列は任意の所望の順序又は方向で出現することができ、特定の順序又は方向が「第1の」、「第2の」などの語によって意図されていないことが理解されるべきである。
【００６３】
一部の実施形態では、多価EBV抗原は、ヒト(すなわち、自己)タンパク質にマッピングする接合部ネオエピトープを含有しない。免疫原性接合部ネオエピトープは、2つの異種タンパク質配列の接合部に対する免疫応答を誘発するエピトープであり、エピトープは、異種タンパク質配列自体のいずれにも存在しない。接合部ネオエピトープに対するT細胞応答は、当技術分野で公知の方法、例えば、実施例4に記載されているような、使用されるすべての接合部をカバーするペプチドプールを使用する免疫学アッセイを使用して特定することができる。
【００６４】
一実施形態では、多価EBV抗原は、図2Aにおいて示される「EBV-L」構築物である。別の実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、配列番号24に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるポリペプチドである。
【００６５】
別の実施形態では、多価EBV抗原は、図2Bにおいて示される「EBV-LLy」構築物である。別の実施形態では、多価EBV抗原ポリペプチドは、配列番号26に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるポリペプチドである。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明のEBV抗原ポリペプチドは、野生型EBVタンパク質と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失及び/又は置換を含有する。
【００６７】
別の実施形態では、EBV抗原ポリペプチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドである。
【００６８】
ポリヌクレオチド
本明細書に記載のEBV抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び発現カセットも提供される。「発現カセット」によって、選択された異種遺伝子(EBV抗原ポリペプチドをコードする「導入遺伝子」)と、宿主細胞において遺伝子産物の翻訳、転写及び/又は発現を駆動するのに必要な他の調節エレメントとの組合せが意味される。
【００６９】
本発明は、本発明のEBV抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００７０】
一実施形態では、配列番号24に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号25に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である。
【００７１】
一実施形態では、配列番号26に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号27に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である。
【００７２】
好適には、本発明のポリヌクレオチドは組換え体である。組換え体は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限(restriction)、組換え若しくはライゲーションステップ、又は天然に見られるポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドをもたらす他の手順のうちの少なくとも1つの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルスである。組換えベクターは、組換えポリヌクレオチドを含むベクターである。組換えウイルスは、元の組換えウイルスの子孫を含む。「組換えベクター」は、元の組換えベクターの複製物を含む。「組換えポリヌクレオチド」は、元の組換えポリヌクレオチドの複製物を含む。本発明の組換えポリヌクレオチドは、野生型EBVゲノムと比較して、少なくとも1つの核酸の置換を含有する。
【００７３】
一部の実施形態では、本発明のEBV抗原をコードするポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドをトランスフェクトしたか又はそれに感染した細胞において、その転写、翻訳及び/又は発現を可能にする様式で、1つ以上の制御エレメントに作動可能に連結している。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結している」配列は、目的の遺伝子と連続している発現制御配列と目的の遺伝子を制御するためにtransで又は一定の距離で作用する発現制御配列との両方を含む。よって、一実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞において前記ポリペプチドの発現を指示する1つ以上の配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、発現制御配列は、EBV抗原をコードするポリヌクレオチドに対して異種性である。
【００７４】
発現制御配列は、適当な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列;効率的なRNAプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びウサギベータ-グロビンpolyAを含むポリアデニル化(poly A)シグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を増強する配列(例えば、コザックのコンセンサス配列);タンパク質の安定性を増強する配列;並びに所望の場合には、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。他の配列の中で、キメライントロンが使用されてもよい。
【００７５】
「プロモーター」は、RNAポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位に近接する、遺伝子の5'非コード領域に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とすることが多い。プロモーターの例としては、これらに限定されないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、及び哺乳動物(ヒトを含む)由来のプロモーターが挙げられる。内部プロモーター、異種プロモーター、天然のプロモーター、構成的プロモーター、誘導性及び/又は組織特異的プロモーターを含む非常に多くの発現制御配列が当技術分野において知られており、利用され得る。
【００７６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、異種発現制御配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結している。典型的には、「異種性」は、比較されている実体の残りの部分のものと遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。異種核酸配列は、アデノウイルスベクターの天然に存在する核酸配列から単離されたものではない、それに由来しない、又はそれをベースとしない任意の核酸配列を指す。
【００７７】
構成的プロモーターの例としては、限定されないが、TBGプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター(場合により、エンハンサーを含む)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(場合により、CMVエンハンサーを含む、例えば、Boshartら、Cell、41:521〜530頁(1985)を参照されたい)、CASIプロモーター(WO2012/115980)、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター、及びEF1aプロモーター(Invitrogen)が挙げられる。
【００７８】
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外から供給される化合物、環境因子、例えば、温度、又は特定の生理状態の存在(例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、又は複製している細胞のみにおいて)によって調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導系は、限定されないが、Invitrogen、Clontech及びAriadを含む、種々の商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。例えば、誘導性プロモーターとしては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン(MT)プロモーター及びデキサメタゾン(Dex)誘導性マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーターが挙げられる。他の誘導系としては、T7ポリメラーゼプロモーター系;エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系及びテトラサイクリン誘導系が挙げられる。他の系としては、FK506二量体、カストラジオールを使用するVP16又はp65、ジフェノールムリスレロン、RU486誘導系及びラパマイシン誘導系が挙げられる。いくつかの誘導性プロモーターの有効性は、経時的に増加する。このような場合には、複数のリプレッサーをタンデムに挿入すること(例えば、IRESによってTetRに連結されたTetR)によって、このような系の有効性を向上させることができる。
【００７９】
別の実施形態では、天然のEBVプロモーターを使用してもよい。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが望ましい場合、天然のプロモーターが好まれ得る。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が時間的（一時的）に若しくは発達上（発生上）、又は組織特異的に、又は特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に、使用され得る。さらなる実施形態では、他の天然の発現制御エレメント、例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位又はコザックコンセンサス配列もまた、天然の発現を模倣するために使用することができる。
【００８０】
導入遺伝子は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されていてもよい。例えば、骨格筋での発現が望ましい場合、筋肉で活性のあるプロモーターが使用されるべきである。これらは、骨格β-アクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、及び天然に存在するプロモーターより高い活性を有する合成（人工）筋肉プロモーターを含む。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝臓;B型肝炎ウイルスコア;アルファ-フェトプロテイン、骨オステオカルシン;骨シアロタンパク質、リンパ球、免疫グロブリン重鎖;T細胞受容体鎖)、ニューロンのプロモーター、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、及びニューロン特異的vgf遺伝子について知られている。
【００８１】
ベクター
本明細書に記載されているEBV抗原構築物をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターも提供される。このようなベクターは、宿主細胞への送達及び宿主細胞における発現に関して好適となる。ベクターは、複製型ベクター又は複製欠損型ベクター、例えば、ウイルスベクターの形態であり得る。免疫原性核酸を対象へと導入するのに好適な数多くのウイルスベクターが当技術分野で公知であり、DNAウイルスとRNAウイルスの両方を含む。本明細書に記載のEBV抗原をコードするのに好適なベクターの例としては、以下が挙げられる:アデノウイルスベクター(複製型又は複製欠損型)、ポックスウイルスベクター(ワクシニアウイルスベクターを含み、例えば、改変ワクシニアアンカラウイルス(MVA)、NYVAC、アビポックスベクター、カナリアポックス(ALVAC)及び鶏痘ウイルス(FPV))、アルファウイルスベクター(例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ロスリバーウイルス、及びベネズエラウマ脳炎(VEE)ウイルス)並びにそれらのキメラ及びレプリコン、ヘルペスウイルスベクター(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)由来ベクター)、アレナウイルスベクター、例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)ベクター、麻疹ウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウイルス様粒子、及びその他多数。
【００８２】
一実施形態では、ベクターはアデノウイルスである。アデノウイルスベクターの生成及び使用は、当業者に周知である。本明細書に開示されている免疫原性組合せ物との関連において、ワクチン抗原を発現するアデノウイルスベクターの設計、生成及び使用の開示例は、例えば、米国特許出願公開第US2014/0141042号(WO2012/089833)、米国特許第8,216,834号(WO2005/071093)、米国特許出願公開第US2012/0027788号(WO2010/086189)、及び米国特許出願公開第US2005/0214323号に見出すことができる。
【００８３】
典型的には、アデノウイルスベクターは、発現カセットが、選択されたアデノウイルス遺伝子に対して天然の領域中に他のアデノウイルス配列を含有する核酸分子中に位置するように設計される。発現カセットは、所望の場合、既存の遺伝子領域中にその領域の機能を破壊するように挿入され得る。あるいは、発現カセットは、部分的又は完全に欠失したアデノウイルス遺伝子の部位中に挿入され得る。例えば、発現カセットは、E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4からなる群から選択されるゲノム領域の少なくとも1種の遺伝子を非機能的にする突然変異、挿入又は欠失の部位に位置してもよい。「非機能的にする」という用語は、遺伝子領域の十分な量が除去されるか又はそうでなければ破壊され、その結果、遺伝子領域がもはや、遺伝子発現の機能的産物を生成できないことを意味する。所望の場合、全遺伝子領域が除去され得る(好適には、発現カセットと置き換えられる)。好適には、アデノウイルスのE1遺伝子が欠失し、選択されるプロモーター、目的の遺伝子のcDNA配列及びポリAシグナルからなる発現カセットと置き換えられ、複製欠損組換えウイルスをもたらす。
【００８４】
本発明において使用するアデノウイルスベクターは、ある範囲の哺乳動物宿主に由来していてもよい。種々の哺乳動物種に感染する、100を超える異なる血清型のアデノウイルスが単離され、そのうちの51種は、ヒト起源のものである。よって、アデノウイルスベクターのうちの1つ以上は、ヒトアデノウイルスに由来し得る。このようなヒト由来アデノウイルスの例は、Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、特に、Ad5、Ad11及びAd35である。ヒト及び非ヒトアデノウイルス血清型は、いくつかの生物学的、化学的、免疫学的及び構造的基準に基づいて、6つの亜族(A〜F)に分類されている。
【００８５】
Ad5ベースのベクターがいくつかの遺伝子治療試験で広く使用されているが、一般集団には自然感染による免疫が既に存在しているため、Ad5及び他のヒトグループCアデノウイルスベクターの使用には制限がある場合がある。Ad5及び他のヒトグループCメンバーは、最優勢血清型（most seroprevalent serotypes）に含まれる傾向にある。存在するベクターに対する免疫は、治療中のベクターへの曝露の結果として発生し得る。優勢血清型ベクター（seroprevalent vectors）に対する、これらの種類の既存の又は発生した免疫は、遺伝子療法又はワクチン接種の努力の有効性を制限し得る。よって、代わりとなるアデノウイルス血清型が、宿主の免疫応答を回避することが可能な遺伝子送達システムの追求において極めて重要な標的を構成する。
【００８６】
このような代替血清型の1領域は、非ヒト霊長類に由来するもの、特に、チンパンジー、ボノボ及びゴリラから単離されるアデノウイルスである。2種類のチンパンジーアデノウイルスのゲノムについて記載している米国特許第6,083,716号を参照されたい。
【００８７】
非ヒトサルアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスベクターと同じくらい効率的に導入遺伝子産物に対する強い免疫応答を誘導することが示されている(Fitzgeraldら(2003) J. Immunol. 170:1416頁;Collocaら(2012) Science Translational Medicine 4:1〜9頁;Royら(2004) Virology 324:361〜372頁;Royら(2010) J. of Gene Medicine 13:17〜25頁)。
【００８８】
非ヒトサルアデノウイルスは、動物の腸間膜リンパ節又は糞便から単離することができ、HEK 293細胞においてインビトロで複製することができる。これらの類似性にもかかわらず、非ヒトサルアデノウイルスは、より一般的なヒト血清型(Ad2及びAd5)とは系統発生学的及び免疫学的に異なる。
【００８９】
よって、一実施形態では、アデノウイルスベクターの1つ以上は、非ヒト霊長類アデノウイルス、例えば、チンパンジーアデノウイルス、例えば、血清型ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、Pan5、Pan6、Pan7(C7とも称される)及びPan9から選択されるものに由来し得る。具体的には、ウイルスは、非ヒトアデノウイルス、例えば、サルアデノウイルス、特に、チンパンジーアデノウイルス、例えば、ChAd155、Pan 5、6、7又は9であり得る。このような系統の例は、US20040241181(WO03/000283)に記載されており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection、10801 University Boulevard、Manassas、Va. 20110〜2209頁)、及び他の供給源から入手可能である。望ましいチンパンジーアデノウイルス系統としては、Pan 5 [ATCC VR-591]、Pan 6 [ATCC VR-592]、及びPan 7 [ATCC VR-593]が挙げられる。あるいは、アデノウイルスベクターは、非ヒトサルアデノウイルス由来、ボノボ由来、例えば、PanAd1、PanAd2又はPanAd3であってもよい。本明細書に記載のこのようなベクターの例は、例えば、US20110217332(WO2005/071093)、US2012/0027788(WO2010/086189)及びWO2016/198621に見出すことができる。
【００９０】
非ヒトサルアデノウイルスの使用は、標的集団におけるアデノウイルスに対する既存の免疫が低く低頻度であること、特に、交差中和抗体が欠如していることが理由で、ヒトアデノウイルス血清型の使用よりも有利であると考えられる。チンパンジーアデノウイルスと既存の中和抗体応答ととの交差反応は、特定の候補ヒトアデノウイルスベクターの場合の35%と比較して、標的集団の2%のみに存在する。Pan 6は、Pan 5、7及び9との関連性がより低い。
【００９１】
本発明のアデノウイルスは複製欠損型であり得る。これは、野生型ウイルスと比較して、非相補性細胞において複製する能力が低減していることを意味する。これは、ウイルスを変異させることによって、例えば、複製に関与する遺伝子を欠失させること、例えば、E1a、E1b、E3又はE4遺伝子の欠失によって、もたらされ得る。
【００９２】
本発明に従ったアデノウイルスベクターは、機能的E1欠失を含む複製欠損型アデノウイルスに由来し得る。よって、本発明によるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスE1a及びE1bを発現する能力が存在しないため、すなわち、E1a及びE1bが機能的に欠失されているため、複製欠損型であり得る。組換えアデノウイルスはまた、他の遺伝子に機能的欠失を有してもよく[例えば、US20040241181(WO03/000283)を参照されたい]、例えば、E3又はE4遺伝子に欠失を有してもよい。アデノウイルス遅延型初期遺伝子E3は、組換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から排除され得る。E3の機能は、組換えアデノウイルス粒子の生成に必要ではない。よって、本発明において有用な組換えアデノウイルスをパッケージングするために、この遺伝子産物の機能を置き換える必要はない。特定の一実施形態では、組換えアデノウイルスは、E1及びE3遺伝子が機能的に欠失されている。このようなベクターの構築は、Royら、(2004) Human Gene Therapy 15:519〜530頁に記載されている。
【００９３】
組換えアデノウイルスはまた、E4 ORF6機能を保持することが望ましい場合があるが、E4遺伝子の機能的欠失を有するように構築することができる。本発明によるアデノウイルスベクターはまた、遅延型初期遺伝子E2aに欠失を含有してもよい。欠失はまた、アデノウイルスゲノムの後期遺伝子L1〜L5のいずれかにおいてなされ得る。同様に、中間遺伝子IX及びIVaにおける欠失も有用であり得る。
【００９４】
他の欠失が、アデノウイルスの他の構造遺伝子又は非構造遺伝子においてなされてもよい。上記の欠失は個々に使用することができ、すなわち、本発明において使用するためのアデノウイルス配列は、E1のみの欠失を含有してもよい。あるいは、生物学的活性を破壊するのに有効な遺伝子の全体又はその一部の欠失を任意の組み合わせで使用してもよい。例えば、1つの例示的なベクターにおいて、アデノウイルス配列は、E1遺伝子及びE4遺伝子の欠失、又はE1、E2a及びE3遺伝子の欠失、又はE1及びE3遺伝子の欠失(例えば、E1a及びE1bの機能的欠失、並びにE3の少なくとも一部の欠失)、又はE3の欠失を伴う若しくは伴わないE1、E2a及びE4遺伝子の欠失などを有してもよい。このような欠失は、これらの遺伝子の部分的又は完全な欠失であってもよく、所望の結果を達成するために、他の変異、例えば、温度感受性変異と組み合わせて使用してもよい。本発明において使用するアデノウイルスベクターとしては、PanAd3(WO2010/086189)及びChAd155(WO2016/198621)が挙げられる。
【００９５】
別の実施形態では、ウイルスベクターはポックスウイルスベクターである。具体的な実施形態では、ポックスウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクター、例えば、改変ワクシニアアンカラウイルス(MVA)ベクターである。(MVA)ベクターは、ヒト及び他の哺乳動物において複製欠損型である。これは、ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞における570回を超えるワクシニアウイルスの継代によって、天然痘ワクチン接種の安全性を改善するために最初に開発され、複数の、完全に特徴付けられた欠失をもたらし、その後、ウイルスは、ヒト及び他の哺乳動物において非常に弱毒化され、複製欠損型であった。複製欠損は、ビリオンアセンブリーの後期で起こり、その結果、ウイルス及び組換え遺伝子の発現が損なわれず、MVAが、哺乳動物において感染を引き起こすことができない有効なシングルラウンド発現ベクターとなる。
【００９６】
その後、MVAは、動物モデルとヒトの両方において、導入遺伝子に対して抗原特異的免疫を誘導するウイルスベクターとして広く使用されている。MVAについての説明は、Mayr Aらの、「The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behavior in organisms with a debilitated defense mechanism.「Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA.」Zentralbl Bakteriol B. 1978 Dec;167(5-6):375〜90頁及びMayr, A.、Hochstein-Mintzel, V. & Stickl, H.(1975). Infection 3、6〜14頁において見出すことができる。
【００９７】
一実施形態では、MVAは、CEF細胞でのワクシニアウイルスの571回目の継代から得られたウイルスシードバッチ460MGに由来する。さらなる実施形態では、MVAは、1978年12月31日より前に派生させるか又は生産したものであり、プリオンの夾雑を含まない。
【００９８】
MVAベクター及びこのようなベクターの生成方法は、例えば、米国特許第6,761,893号(WO02/042480);米国特許第7,964,395号;米国特許第7,964,396号;米国特許出願公開第US2013/0183335号(WO2012/048817);及び米国特許出願公開第2015/0209421号(WO2014/019718)に記載されている。前述のそれぞれは、好適なMVAベクター及び方法を教示するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
別の実施形態では、ウイルスベクターは、アルファウイルスベクター、例えば、アルファウイルスレプリコン又は他の自己複製RNAベクターである。本明細書に開示されている免疫原性組合せ物との関連において使用するのに好適な、例示的なアルファウイルスベクター及びそれらの生成及び送達方法は、例えば、US20090104226(WO2006078294);US20110300205(WO2011005799);US20130195968(WO2012/006376);US20130177639(WO2012006377);WO2013006838;及びWO2013006842に記載されており、これらの各々は、開示された免疫原性組合せ物との関連において好適な例示的な自己複製RNAベクターの開示のために、本明細書に組み込まれる。
【０１００】
本発明のEBV抗原を発現する組換えウイルス粒子を生成する方法であって、宿主細胞において本明細書に記載のベクターを発現させることを含む方法も提供される。ウイルス粒子は、ウイルスベクターが複製することが可能である任意の好適な細胞株において生成することができる。
【０１０１】
アデノウイルスベクターは、ウイルスが複製することが可能である任意の好適な細胞株において生成することができる。特に、複製特性の欠損をもたらす、ウイルスベクターから失われている因子(例えば、E1及び/又はE4)を供給する相補性細胞株を使用することができる。限定されないが、このような細胞株は、とりわけ、HeLa[ATCCアクセッション番号CCL 2]、A549[ATCCアクセッション番号CCL 185]、HEK 293、KB[CCL 17]、Detroit[例えば、Detroit 510、CCL 72]及びWI-38[CCL 75]細胞であり得る。これらの細胞株は、すべてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 University Boulevard、Manassas、Va. 20110〜2209頁から入手可能である。他の好適な親細胞株は、他の供給源、例えば、応用微生物学研究センター(Centre for Applied Microbiology and Research(CAMR、UK))のヨーロッパ動物細胞培養物コレクション(European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC))にECACC番号96022940で寄託された細胞によって代表されるPER.C6細胞、又はHer 96細胞(Crucell社)から得ることができる。
【０１０２】
特に好適な相補性細胞株は、Procell92細胞株である。Procell92細胞株は、ヒトホスホグリセレートキナーゼ-1(PGK)プロモーターの制御下のTetリプレッサー、及びG418耐性遺伝子をトランスフェクトされた、アデノウイルスE1遺伝子を発現するHEK293細胞をベースとする(Vitelliら PLOS One(2013) 8(e55435):1〜9頁)。Procell92.Sは、浮遊条件での増殖にも適応し、毒性タンパク質を発現するアデノウイルスベクターを生成するのにも有用である(www.okairos.com/e/inners.php?m=00084、最終アクセス日2015年4月13日)。
【０１０３】
ワクシニアベクターは、当技術分野に記載の方法に従って生成することができる。例えば、MVAベクターの調製及び使用は、Ourmanovら、J. Virol.(2009) 83:5388〜5400頁;及びMartinonら Vaccine(2008) 26:532〜545頁に記載されている。
【０１０４】
組成物
本明細書に記載のEBV抗原ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びベクターは、免疫原性組成物において投与され得る。本明細書に記載されている免疫原性組成物は、哺乳動物、好適には、ヒトへの送達の後に、免疫応答、例えば、液性(例えば、抗体)及び/又は細胞媒介性(例えば、細胞傷害性T細胞)応答を誘導することが可能である1つ以上の組換えポリペプチド、ポリヌクレオチド及び/又はベクターを含む組成物である。
【０１０５】
本明細書に開示されている免疫原性組成物は、典型的には、1つ以上の薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を含有する。薬学的に許容される担体及び賦形剤は周知であり、当業者によって選択され得る。形容詞「薬学的に許容される」は、指示対象が対象(例えば、ヒト又は動物対象)への投与に好適であることを示す。E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.、第15版(1975)は、免疫原性組成物を含む、治療用及び/又は予防用組成物の薬学的送達に好適な組成物及び製剤(希釈剤を含む)を記載している。
【０１０６】
例えば、担体又は賦形剤は、好ましくは、緩衝剤を含むことができる。場合により、担体又は賦形剤はまた、溶解性及び/又は安定性を安定化させる少なくとも1つの構成成分を含有する。可溶化剤/安定化剤の例としては、界面活性剤、例えば、ラウロイルサルコシン及び/又はトゥイーンが挙げられる。代わりとなる可溶化剤/安定剤としては、アルギニン、及びガラス形成ポリオール(例えば、スクロース、トレハロースなど)が挙げられる。数多くの薬学的に許容される担体及び/又は薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で公知であり、例えば、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pa、第5版(1975)に記載されている。
【０１０７】
したがって、好適な賦形剤及び担体は、選択された投与経路で対象に送達するのに好適な製剤を製造するために、当業者によって選択され得る。
【０１０８】
好適な賦形剤としては、限定されないが、以下が挙げられる:グリセロール、ポリエチレングリコール(PEG)、ソルビトール、トレハロース、N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩、L-プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、トリメチルアミンオキシド、KCl、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+及び他の二価カチオン関連塩、ジチオトレイトール、ジチオエリトロール(Dithioerytrol)、並びに13-メルカプトエタノール。他の賦形剤は、界面活性剤(Tween80、Tween20、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-0、Zwittergent 3-2、Zwittergent 3-4、Zwittergent 3-6、CHAPS、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含む)であり得る。
【０１０９】
場合により、本発明の免疫原性組成物は、例えば、アジュバント、安定化剤、pH調整剤、保存剤などを含む他の構成成分を含有するよう製剤化されてもよい。好適なアジュバントの例は、以下の「アジュバント」に提供される。
【０１１０】
使用方法
本明細書に記載のEBV抗原ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターは、EBV感染及びEBV関連疾患の予防及び/又は処置において、例えば、免疫応答の誘導のためのワクチンとして使用することができる。本明細書で使用される場合、免疫応答の誘導とは、タンパク質の、T細胞及び/又は液性免疫応答をそのタンパク質に対して誘導する能力を指す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、免疫応答の誘導とは、「抗原」又は「免疫原」としても公知のタンパク質の、T細胞及び/又は液性免疫応答をそのタンパク質に対して誘導する能力を指す。例えば、免疫原性組成物は、特に、組成物がEBV抗原ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を含む実施形態において、組成物による免疫化後に、未処置対象と比較して、メモリーT細胞及び/又はB細胞集団を誘導することができる。一部の実施形態では、対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト又は獣医学的哺乳動物である。
【０１１２】
免疫応答は、目的の特定のリンパ球種、例えば、B細胞、T細胞、T細胞株、及びT細胞クローンの増殖又はエフェクター機能の誘導についてのアッセイを含む、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。
【０１１３】
よって、一実施形態では、対象における免疫応答を誘導する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター又は免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、対象は、エプスタインバールウイルス血清陰性である。対象は、過去又は現在にEBV感染の血清学的証拠を有さない場合、「血清陰性」である。別の実施形態では、対象は、エプスタインバールウイルス血清陽性である。対象は、過去又は現在にEBV感染の血清学的証拠を有する場合に、「血清陽性」である。
【０１１４】
また、対象におけるEBV関連疾患を処置又は予防する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター又は免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供される。一実施形態では、EBV関連疾患は、EBV関連悪性腫瘍又はEBV関連自己免疫疾患である。EBV関連疾患としては、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ及び全身性ループスエリテマトーデスが挙げられる。
【０１１５】
また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター又は免疫原性組成物の免疫原性を最大化するために設計された投与レジメンも提供される。よって、一実施形態では、対象における免疫応答を誘導する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター及び/又は免疫原性組成物の2又はそれより多い用量を対象に投与するステップを含む方法も提供される。ある特定の実施形態では、投与は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週又はそれより長い週数で隔てられる。別の実施形態では、投与は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12カ月又はそれより長い月数で隔てられる。あるいは、投与は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年又はそれより長い年数で隔てられ得る。
【０１１６】
一実施形態では、対象における免疫応答を誘導する方法であって、
(a)本発明のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを投与するステップ、及び
(b)本発明のポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスベクターを投与するステップ
を含み、
ステップ(a)及び(b)がいずれかの順序で行われる、方法が提供される。一実施形態では、アデノウイルスベクターはChAd155である。別の実施形態では、ワクシニアウイルスベクターはMVAである。一実施形態では、ステップ(b)は、ステップ(a)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週後又はそれより長い週数後に行われる。一実施形態では、ステップ(b)は、ステップ(a)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12カ月後又はそれより長い月数後に行われる。
【０１１７】
一実施形態では、対象におけるEBV関連疾患を処置又は予防する方法であって、
(a)本発明のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを投与するステップ、及び
(b)本発明のポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスベクターを投与するステップ
を含み、
ステップ(a)及び(b)がいずれかの順序で行われる、方法が提供される。一実施形態では、アデノウイルスベクターはChAd155である。別の実施形態では、ワクシニアウイルスベクターはMVAである。一実施形態では、ステップ(b)は、ステップ(a)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週後又はそれより長い週数後に行われる。一実施形態では、ステップ(b)は、ステップ(a)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12カ月後又はそれより長い月数後に行われる。
【０１１８】
また、エプスタインバールウイルス感染によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、又は免疫原性組成物の使用も提供される。
【０１１９】
アジュバント
「アジュバント」は、本明細書で使用される場合、免疫原への免疫応答を増強する組成物を指す。アジュバントを含む本発明による組成物は、例えばヒト対象に対して、ワクチンとして使用することができる。アジュバントは、抗原単独での投与と比較して、抗原/免疫原に対する免疫応答を加速し、延長し並びに/又はその質及び/若しくは強度を増強し、よって、任意の所与のワクチンに必要とされる抗原/免疫原の量、及び/又は目的の抗原/免疫原に対する適切な免疫応答を生じさせるために必要とされる注射の頻度を低減する。
【０１２０】
本発明の組成物との関連で使用され得るアジュバントの例としては、無機アジュバント(例えば、無機金属塩、例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)、水酸化アルミニウム(アラム（alum）)のゲル状沈殿;AlPO4;アルハイドロゲル;グラム陰性細菌の外膜に由来する細菌産物、特に、モノホスホリルリピドA(MPLA)、リポ多糖類(LPS)、ムラミルジペプチド及びその誘導体;フロイント不完全アジュバント;リポソーム、特に、中性リポソーム、組成物及び場合によりサイトカインを含有するリポソーム;AS01B、AS01E、AS02;非イオン性ブロック共重合体;ISCOMATRIXアジュバント;CpGジヌクレオチド(CpGモチーフ)、特に、ホスホロチオエート(PTO)骨格(CpG PTO ODN)又はホスホジエステル(PO)骨格(CpG PO ODN)を有するCpG ODNを含む非メチル化DNA;合成リポペプチド誘導体、特に、Pam3Cys;リポアラビノマンナン;ペプチドグリカン;ザイモサン;熱ショックタンパク質(HSP)、特に、HSP 70;dsRNA及びその合成誘導体、特に、Poly I:poly C;ポリカチオン性ペプチド、特に、ポリ-L-アルギニン;タキソール;フィブロネクチン;フラジェリン;イミダゾキノリン;アジュバント活性を有するサイトカイン、特に、GM-CSF、インターロイキン-(IL-2、IL-6、IL-7、IL-18、I型及びII型インターフェロン、特に、インターフェロン-ガンマ、TNF-アルファ;25-ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオール);並びに合成オリゴペプチド、特に、MHCII提示ペプチドが挙げられる。ポリオキシエチレン(POE)及びポリオキシプロピレン(POP)を含有する非イオン性ブロック重合体、例えば、POE-POP-POEブロック共重合体を、アジュバントとして使用することができる。
【０１２１】
アジュバントのさらなる例としては、無機アジュバント(例えば、無機金属塩、例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)、有機アジュバント(例えば、サポニン、例えば、QS21、又はスクアレン)、オイルベースのアジュバント(例えば、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント)、サイトカイン(例えば、IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、及びINF-γ)粒子状アジュバント(例えば、免疫刺激複合体(ISCOMS)、リポソーム、生分解性マイクロスフェア)、ビロソーム、細菌性アジュバント(例えば、モノホスホリルリピドA、例えば、3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)、又はムラミルペプチド)、合成アジュバント(例えば、モノホスホリルリピドA(MPL)、特に、3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL及びムラミルペプチド類似体、又は合成リピドA、及び合成ポリヌクレオチドアジュバント、例えば、ポリアルギニン又はポリリジンが挙げられる。
【０１２２】
サポニンもまた好適なアジュバントであり、例えば、サポニンQuil A(南米の樹木シャボンノキ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する)、及びその画分がある。Quil Aの精製画分はまた、免疫刺激剤、例えば、スクアレン、QS21、QS17及びQS7(Quil-Aの非溶血性画分)としても知られている。QS21及びポリソルベート又はシクロデキストリンの組合せもまた好適である。
【０１２３】
アジュバントの別の例は、DNA中に存在する非メチル化シトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフを含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド(「CpG」)である。CpGは、全身経路と粘膜経路のいずれでも投与される場合にアジュバントとして知られている。CpGは、ワクチン中に製剤化される場合、遊離抗原と一緒に自由溶液中で投与されてもよく、抗原に共有結合的にコンジュゲートされてもよく、又は担体、例えば、水酸化アルミニウムとともに製剤化されてもよい。
【０１２４】
特異的受容体の活性化は、免疫応答を刺激することができる。このような受容体は、当業者に公知であり、例えば、サイトカイン受容体、特に、I型サイトカイン受容体、II型サイトカイン受容体、TNF受容体;並びに転写因子として作用するビタミンD受容体;並びにToll様受容体1(TLR1)、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7、及びTLR9を含む。このような受容体に対するアゴニストは、アジュバント活性を有する、すなわち、免疫刺激性である。他の好適なアジュバントとしては、アルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)又はAGPの薬学的に許容される塩が挙げられる。いくつかのAGPはTLR4アゴニストであり、いくつかはTLR4アンタゴニストである。本発明の組成物のアジュバントは、1つ以上のToll様受容体アゴニストであってもよい。より好ましい実施形態では、アジュバントは、Toll様受容体4アゴニストである。特に好ましい実施形態では、アジュバントは、Toll様受容体9アゴニストである。
【０１２５】
アジュバント、例えば、上記のものは、担体、例えば、リポソーム、水中油エマルション、及び/又は金属塩(アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムを含む)と一緒に製剤化されてもよい。例えば、3D-MPLは、水酸化アルミニウム又は水中油エマルションとともに製剤化されてもよく、QS21は、コレステロール含有リポソーム、水中油エマルション又はアラム（alum）とともに製剤化されてもよく、CpGは、アラム（alum）とともに又は他のカチオン性担体とともに製剤化されてもよい。
【０１２６】
アジュバントの組合せ、特に、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組合せ、より特別には、QS21と3D-MPLの組合せ又はQS21がコレステロール含有リポソーム中でクエンチされる組成物(DQ)は、本発明において利用することができる。あるいは、サポニン、例えば、QS21を加えたCpGの組合せは、水中油エマルション中にQS21、3D-MPL及びトコフェロールを含む強力なアジュバント製剤と同様に、本発明における使用に好適なアジュバントである。サポニンアジュバントは、リポソーム中に製剤化され、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組み合わされてもよい。よって、好適なアジュバント系としては、例えば、モノホスホリルリピドA、好ましくは3D-MPLの、アルミニウム塩との組合せが挙げられる。さらなる例示的なアジュバントは、QS21及び/又はMPL及び/又はCpGを含む。QS21は、コレステロール含有リポソーム中でクエンチされ得る。
【０１２７】
ワクチン接種のために使用される発現系に含まれる抗原へのMHCクラスII不変鎖(CD74としても知られている)の融合は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスを用いて投与された場合に、前記抗原に対する免疫応答を増加させる。したがって、本発明の一実施形態では、免疫原性導入遺伝子は、組換えChAd155ウイルスベクターにおいて不変鎖と共発現され得る。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明は、対象にChAd155カプシドを送達することによって、免疫調節応答を誘導するための、又は別の活性剤に対する細胞傷害性T細胞応答を増強するか又はそれに対するアジュバントとなるためのChAd155のカプシドの使用を提供する(場合により、インタクトな若しくは組換えウイルス粒子又は空のカプシドが使用される)。ChAd155カプシドは、単独で又は活性剤との併用レジメンにおいて、それに対する免疫応答を増強するために送達され得る。有利には、宿主にアデノウイルスを感染させることなく、望ましい効果が達成され得る。
【０１２９】
配列同一性
配列に関する同一性は、配列を整列させ、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照アミノ酸配列と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として、本明細書において定義される。
【０１３０】
配列同一性は、2つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために一般的に使用される標準的な方法により決定することができる。コンピュータープログラム、例えば、BLAST又はFASTAを使用して、2つのポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸の最適なマッチングのために整列させる(一方若しくは両方の配列の全長に沿って又は一方若しくは両方の配列の所定の部分に沿って)。これらのプログラムは、デフォルトオープンペナルティ及びデフォルトギャップペナルティを提供し、スコアリングマトリックス、例えば、PAM250(標準的なスコアリングマトリックス)がそのコンピュータープログラムとともに使用され得る。例えば、パーセント同一性は、同一一致の総数に100を掛け、次いで、一致した範囲内のより長い配列の長さと2つの配列を整列させるためにより短い配列中に導入されたギャップの数との合計で割ったものとして計算することができる。
【０１３１】
本開示が、UniProt又はGenbankアクセッションコードを参照して配列に言及する場合、言及された配列は、本出願の出願日の現行のバージョンである。
【０１３２】
単一のアミノ酸又は少しのパーセンテージのアミノ酸を変更、追加又は欠失する、タンパク質に対する個別の置換、欠失又は付加は、その変更(複数可)が機能的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換又は免疫原性機能に実質的に影響を与えない残基の置換/欠失/付加をもたらす場合、「免疫原性誘導体」であることを当業者は認識する。
【０１３３】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。一般的に、このような保存的置換は、以下に指定したアミノ酸グループの一つに該当することになるが、状況によっては、他の置換が、抗原の免疫原特性に実質的に影響を及ぼすことなく可能である場合もある。以下の8つの群はそれぞれ、一般的に互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する:
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)。
【０１３４】
好適には、このような置換はエピトープ領域に起こらず、したがって、抗原の免疫原特性に大きな影響はない。
【０１３５】
免疫原性誘導体は、参照配列と比較して追加のアミノ酸が挿入されているものも含み得る。好適には、このような挿入はエピトープ領域に起こらず、したがって、抗原の免疫原特性に大きな影響はない。挿入の一つの例には、問題の抗原の発現及び/又は精製を補助するヒスチジン残基の短いストレッチ(例えば、2〜6残基)が含まれる。
【０１３６】
免疫原性誘導体は、参照配列と比較してアミノ酸が欠失しているものを含む。好適には、このような欠失はエピトープ領域に起こらず、したがって、抗原の免疫原特性に大きな影響はない。
【０１３７】
当業者は、特定の免疫原性誘導体が、置換、欠失及び付加(又はそれらの任意の組合せ)を含んでもよいことを認識することになる。
【０１３８】
全般
別段に説明されなければ、本明細書で使用されるすべての技術及び化学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。単数の用語「a」、「an」、及び「the」は、文脈が別段に明確に示していなければ、複数の対象を含む。同様に、「又は」という語は、文脈が別段に明確に示していなければ、「及び」を含むことが意図される。「複数」という用語は、2つ又はそれより多いことを指す。さらに、物質の濃度又はレベル、例えば、溶液構成成分の濃度又はその比率に関して与えられる数値限定、及び反応条件、例えば、温度、圧力及びサイクル数は、およそであることが意図される。本明細書で使用される「約」という用語は、量±10%を意味することが意図される。
【０１３９】
「含む(comprises)」という用語は、「含む(includes)」を意味する。よって、文脈が別段に要求しなければ、「含む(comprises)」という語、及び変形、例えば、「含む(comprise)」及び「含む(comprising)」は、記載された化合物若しくは組成物(例えば、核酸、ポリペプチド、抗原)又はステップ、あるいは化合物又はステップの群を含むことを意味すると理解されることになるが、任意の他の化合物、組成物、ステップ、又はその群を排除するものではない。「例えば、(e.g.)」という略語は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すために、本明細書で使用される。よって、「例えば、(e.g.)」という略語は、「例えば、(for example)」という用語と同義である。
【０１４０】
本発明は、以下の非限定的な実施例及び図面への参照によってさらに説明される。
【実施例】
【０１４１】
[実施例1]
抗原の設計
a.EBV抗原の設計
多価エプスタインバールウイルス抗原構築物を、以下の設計目標を念頭において合理的に設計した:
1)設計において、複数の潜伏段階の抗原を含むこと、及び場合により溶解性段階の抗原を含むことによって、EBV関連多発性硬化症(EBV-MS)において発現されるEBV抗原を広く標的とすること、
2)問題のあることが知られている領域の排除、多価抗原構築物におけるEBVタンパク質抗原の断片化及びシャッフリングにより、発癌及び免疫干渉のリスクを低減すること、
3)多価抗原構築物にT細胞エピトープを含むことによって、誘導される免疫応答の焦点をEBV特異的T細胞活性化に合わせること、並びに
4)最終的な抗原配列において、望ましくない抗自己ネオエピトープの存在を排除すること。
【０１４２】
これらの基準に合致する2つの多価EBV抗原構築物を設計した。第1の多価抗原構築物(EBV-L;図2A)は、潜伏段階のEBVタンパク質LMP1、LMP2、EBNA1及びEBNA3Aの免疫原性断片を含む。第2の構築物(EBV-LLy;図2B)は、EBV-Lと同じ潜伏抗原断片を含有し、EBV溶解性タンパク質ZEBRAの免疫原性断片も含む。抗原構築物に含まれるために選択されたEBV潜伏タンパク質は、多発性硬化症患者の死後の脳組織におけるB細胞によって発現されることが報告されている(Serafiniら、J. Exp. Medicine(2007) 204(12):2899頁;Serafiniら、J. Neuropathol. Exp. Neurol.(2010) 69(7):677頁。潜伏期から溶解性期へのEBVの切り替えの重要な調節因子である溶解性抗原ZEBRAを含むことは、ウイルスの再活性化を制御すること並びにEBVのさらなる増幅及び広がりを制限することを目的とする。
【０１４３】
全長EBVタンパク質は、免疫細胞を形質転換する能力を有する。したがって、抗原構築物の安全性を改善するために、問題のある領域を排除し、EBVタンパク質の残っている断片のみを構築物設計のために選択した。図1は、EBVタンパク質のそれぞれにおける選択された免疫原性断片の位置を示す。図2A〜Bに示されているように、選択された断片は、シャッフリングされて、同じEBVタンパク質に由来する断片が互いに隣接しないようにアセンブルされた16(EBV-L)又は18(EBV-LLy)免疫原性断片を含むポリタンパク質を生じた。
【０１４４】
最終的に、2個の免疫原性断片を一緒に接合することによって形成される望ましくない接合部エピトープのリスクを低減するために、バイオインフォマティクススクリーニングを行い、候補抗原構築物の接合部領域における潜在的な抗自己ネオエピトープを特定した。簡潔には、2個の連続する抗原断片の各対の間の境界(接合)領域をまたぐ16アミノ酸長のペプチドを、ワクチンポリペプチド配列から抽出した(各抗原断片から8アミノ酸)。接合領域の16アミノ酸長は、接合領域内の各9merの配列が両方の抗原に由来するアミノ酸を含有することを保証する。各16merの接合ペプチドについて、次いで、9merのペプチドすべてを、完全ヒトプロテオームを表す9merのペプチドのコレクション(NCBI RefSeqペプチドデータベースから得た)と比較した。いずれの場合も、ワクチンポリペプチド配列の接合領域由来の9merのペプチドは、ヒトタンパク質に存在することが見出されなかった。
【０１４５】
b.CalHV3抗原の設計
CalHV3は、一般的なコモンマーモセット(Callithrix jacchus)から単離されたガンマヘルペスウイルスである。配列及び構造、ウイルス再生サイクル及び病原性の類似性に基づいて、CalHV3は、ヒトEBVのマーモセット等価物であると考えられる。例えば、Choら、PNAS 98(3):1224〜1229頁(2001)を参照されたい。CalHV3は、一生のうちの早期に獲得され、自然の及び飼育されているマーモセットのコロニーにおいて高度に蔓延していることが報告されている。
【０１４６】
マーモセットモデルのガンマ-ヘルペスウイルスに潜伏感染した個体における潜伏及び溶解性ウイルス抗原に対する機能的T細胞応答を再度拡大する、類似するワクチンの能力を評価するために、オルソロガスなCalHV3抗原構築物を開発した。簡潔には、CalHV3潜伏抗原構築物(CalHV3-L;図4Aに示される)を、それぞれ、EBV LMP1、LMP2及びEBNA1のCalHV3オルソログである、タンパク質C1(配列番号28)、C7(配列番号32)及びORF39(配列番号36)の免疫原性断片から構築した。EBV-L抗原構築物におけるように、CalHV3-L構築物に含まれる抗原領域を断片化し、同じCalHV3タンパク質由来の断片が互いに隣接しないようにシャッフリングした。最終的なCalHV3-L抗原構築物のアミノ酸配列を配列番号44に示す(配列番号45に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)。
【０１４７】
CalHV3潜伏/溶解性抗原構築物(CalHV3-LLy;図4Bに示される)も構築した。潜伏タンパク質C1、C7及びORF39の断片を含有することに加えて、CalHV3-LLyは、EBVのZEBRAタンパク質のCalHV3オルソログであるORF43の断片も含有する。最終的なCalHV3-LLy抗原構築物のアミノ酸配列を配列番号46に示す(配列番号47に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)。
【０１４８】
最終的に、マーモセットのMHCクラスII関連不変鎖ポリペプチド(配列番号43)をCalHV3-LLyのN末端に融合させることによって、遺伝的にアジュバント化された
CalHV3-LLy(li-CalHV3-LLy)のバージョンを構築した。最終的なli-CalHV3-LLy抗原構築物のアミノ酸配列を配列番号48に示す(配列番号49に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)。
【０１４９】
[実施例2]
ベクターの構築
EBV-L(配列番号25)及びEBV-LLy(配列番号27)をコードするポリヌクレオチドを、WO2016/198621に記載された方法に従って、tetOhCMVプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGH pA)を含有する、プラスミドpvjTetOhCMV-bghpolyA中にクローニングした。次いで、EBV-L及びEBV-LLy発現カセットを、大腸菌(E. coli)のBJ5183コンピテント細胞における相同組換えによってChAd155ベクター骨格へと移入し、pChAd155(ΔE1、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-EBV-L(及びEBV-LLy)ベクターを生成した。ベクターpChAd155(ΔE1、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-EBV-Lの核酸配列を配列番号50に示す。抗原コード領域は、配列番号50のヌクレオチド1348〜4806にある。ベクターpChAd155(ΔE1、ΔE3、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-EBV-LLy発現ベクターの核酸配列を配列番号51に示す。抗原コード領域は、配列番号51のヌクレオチド1348〜5157にある。ChAd155-EBVベクターの構築を、導入遺伝子のシーケンシング及び制限解析によって確認した。同じ方法を使用して、例えば、WO2016/198621に記載されているように、代替の改変ChAd155骨格に基づいてEBVアデノウイルスベクターを調製することができる。
【０１５０】
同じ方法を続けて、ベクターChAd155-CalHV3-L、ChAd155-CalHV3-LLy、及びChAd155-li-CalHV3-LLy(それぞれ、CalHV3抗原CalHV3-L、CalHV3-LLy、及びli-CalHV3-LLyをコードする)を調製した。ベクターpChAd155(ΔE1、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-CalHV3-Lの核酸配列を配列番号52に示す(ヌクレオチド1348〜4482の抗原コード領域)。ベクターpChAd155(ΔE1、ΔE3、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-CalHV3-LLyの核酸配列を配列番号53に示す(ヌクレオチド1348〜5238の抗原コード領域)。ベクターpChAd155(ΔE1、ΔE3、ΔE4_Ad5E4 orf6) TetO hCMV-li-CalHV3-LLyの核酸配列を配列番号54に示す(ヌクレオチド1348〜5883の抗原コード領域)。
【０１５１】
EBV-LLy及びCalHV3-LLy抗原構築物をコードするMVAベクターもまた、当技術分野で公知の方法に従って調製した。例えば、Ourmanovら、J. Virol.(2009) 83:5388〜5400頁;及びMartinonら Vaccine(2008) 26:532〜545頁を参照されたい。
【０１５２】
[実施例3]
ウイルス粒子の生成
ChAd155_EBV-L及びChAD155_EBV-LLyベクターを、Vitelliら、PLOS One(2013) 8(e55435):1〜9頁に記載されているように、制限エンドヌクレアーゼPmelで直鎖化し、HEK293由来細胞株(Procell92.S)にトランスフェクトした。これらの細胞を遺伝子改変し、ウイルス生成中の導入遺伝子発現を抑制するためにTetOリプレッサーを構成的に発現させる。ウイルス増幅は小規模(振盪フラスコ)で実施し、ChAd155-EBVウイルス粒子を、1リットル規模の懸濁培養物から2倍のCsCl勾配で精製した。ChAd155-EBVウイルス粒子の力価を、tetOhCMVプロモーターを標的とするQPCRによって決定した。同じ方法を続けて、ChAd155-CalHV3-L、ChAd155-CalHV3-LLy、及びChAd155-li-CalHV3-LLyからウイルス粒子を調製した。
【０１５３】
EBV-LLy及びCalHV3-LLy抗原構築物を発現する組換えMVAを、標準的方法を使用して得た。簡潔には、規定の細胞密度のニワトリ胚線維芽細胞(CEF)の一次細胞培養物を、規定された感染の多重度で、MVA-EBV及びMVA-CalHV3ウイルスシードで感染させた。MVA-EBV及びMVA-CalHV3ウイルスの収集物を分画勾配遠心分離によって精製した。
【０１５４】
[実施例4]
マウスにおけるChAd155-EBV及びChAd155-CalHV3抗原の免疫原性
a.ChAd155-EBV
潜伏又は潜伏+溶解性抗原を発現するベクターから生成したChAd155-EBVウイルス粒子の免疫原性を、表1に示す実験設計を使用してマウスにおいて評価した。簡潔には、CB6F1マウス(1群当たり6匹)に、ベクターChAd155-EBV-L又はChAd155-EBV-LLyの単回用量(106、107又は108ウイルス粒子、筋肉内に)を投与した。
【０１５５】
免疫化の3週間後に、脾細胞を単離し、標準的IFNγ  ELISpotアッセイに従ってEBV抗原に対するT細胞応答をアッセイした。簡潔には、免疫化した動物由来の脾細胞を、5つのプールに配列された重複する15merのペプチド(それぞれ、ワクチンに含まれるEBVタンパク質のそれぞれに由来する免疫原性断片をカバーする)で刺激した(LMP1、LMP2、EBNA1、EBNA3A、ZEBRA;n=19から84のシングルペプチド/プール)。断片間の各単一の接合部をカバーする16merのペプチドの6番目のプール(EJ、n=18ペプチド)、及びDMSO(ペプチド希釈剤)も、それぞれ、接合部エピトープに対する応答をモニターするための刺激物質として、及び陰性対照として使用した。T細胞活性化は、酵素連結イムノスポット(ELISPOT)によってIFNγ-分泌ワクチンに誘発されるT細胞を数えることによって検出した。
【０１５６】
【表１】
2021507712.tif 000002
【０１５７】
結果を図5Aに示す。ChAd155-EBV-LとChAd155-EBV-LLyの両方が、用量依存的様式で、ワクチン接種済マウスにおいて、T細胞のIFNγ分泌を誘発した。EBV-L及びEBV-LLy免疫化マウスのいずれにおいても、EBV潜伏抗原(LMP1、LMP2、EBNA1及びEBNA3A)のそれぞれに対して、T細胞応答を検出した。しかし、EBV溶解性タンパク質であるZEBRAに対するT細胞応答は、EBV-LLy免疫化マウスにおいてのみ検出された。EBV接合部ペプチド(Ej)に対する又はDMSO陰性対照に対する応答は検出されなかった。
【０１５８】
結果は、ChAd155-EBV-L及びChAd155-EBV-LLyベクターから生成されたウイルス粒子が、抗原構築物内に含有される免疫原性断片に対する抗原特異的T細胞応答を誘発することが可能であることを示す。さらに、EBV-L及びEBV-LLy抗原構築物に対する一次免疫応答は、接合部エピトープを対象としない。
【０１５９】
b.ChAd155-CalHV3 
ChAd155-CalHV3ウイルス粒子の免疫原性を、ChAd155-EBVウイルス粒子に関して上記したのと同じ方法に従って評価した。ワクチン接種の3週間後の脾細胞の抗原刺激は、4つのプールに配列された重複する15merのペプチド(それぞれが、ワクチンに含まれる免疫原性断片をカバーする)で行った(C1、C7、ORF39、ORF43、n=58から96のシングルペプチド/プール)。断片間の各単一の接合部をカバーする16merのペプチドの5番目のプール(CJ、n=12ペプチド)、及びDMSO(ペプチド希釈剤)も、それぞれ、接合部エピトープに対する応答をモニターするための刺激物質として、及び陰性対照として使用した。実験設計を表2にまとめる。
【０１６０】
【表２】
2021507712.tif 000003
【０１６１】
結果を図5Bに示す。ChAd155-CalHV3-LとChAd155-CalHV3-LLyの両方が、用量依存的様式で、ワクチン接種済マウスにおいて、T細胞のIFNγ分泌を誘発した。CalHV3-L及びCalHV3-LLy免疫化マウスのいずれにおいても、CalHV3潜伏抗原C1、C7及びORF39をカバーするペプチドプールに対するT細胞応答を検出した。しかし、CalHV3溶解性タンパク質であるORF43に対するT細胞応答は、CalHV3-LLy免疫化マウスにおいてのみ検出された。CalHV3接合部ペプチド(Cj)に対する又は陰性対照DMSOに対する応答は検出されなかった。
【０１６２】
結果は、ChAd155-EBV-L及びChAd155-EBV-LLyベクターから生成されたウイルス粒子が、抗原構築物内に含有される免疫原性断片に対する抗原特異的T細胞応答を誘発することが可能であることを示す。さらに、CalHV3-L及びCalHV3-LLy抗原構築物に対する一次免疫応答は、接合部エピトープを対象としない。
【０１６３】
[実施例5]
マウスにおけるプライム（初回免疫）-ブースト（追加免疫）の効果
a. EBV-LLyプライム-ブースト
EBV-LLy抗原の1回目の投与の免疫応答をブーストする、EBV-LLy抗原の2回目の投与の能力を、表3にまとめた実験設計を使用して評価した。簡潔には、CB6F1マウス(n=5/群)の群を、0日目に、Chad155-EBV-LLyの5×107ウイルス粒子で筋肉内に免疫化した。21日目(3週間目)に、群2は、MVA-EBV-LLyの107プラーク形成単位(PFU)で2回目の免疫化を受けた。対照マウスは、さらなる免疫化を受けなかったか(群3:「ブーストなし」)又はEBV非関連抗原をコードするMVAベクターによるブースト（追加免疫）を受けた(群1:MVA-非関連)。
【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
1回目の免疫化の4週間後に、脾細胞をマウスから単離し、実施例4に記載した方法を使用して、抗原特異的T細胞応答を評価した。
【０１６６】
図6に示されているように、ChAd155-EBV-LLyによる免疫化に続く、MVA-EBV-LLyによるブースト免疫（追加免疫）によって、ブーストなしのマウス又は非関連抗原の「ブースト」注射を受けているマウスと比較して、EBV特異的インターフェロンガンマ放出が有意に増加した。図6Aは、すべての抗原(LMP1、LMP2、EBNA1、EBNA3A及びZEBRA)に対する累積T細胞応答を表し、図6Bは、個々の抗原に対する応答を示す。
【０１６７】
b. CalHV3-LLyプライム-ブースト
CalHV3抗原に対する免疫応答をブーストする能力を、表4にまとめた実験設計を使用して評価した。簡潔には、CB6F1マウス(n=6/群)の群を、0日目に、Chad155-CalHV3-LLyの5×107ウイルス粒子で筋肉内に免疫化した。42日目(6週間目)に、群4は、同じChAd155-CalHV3-LLy抗原構築物で2回目の免疫化を受け、一方、群3は、MVA-CalHV3-LLyでブースト（追加免疫）を受けた。対照マウスは、ブーストなしか(群1)又はCalHV3非関連抗原をコードするMVAによるブーストを受けた(MVA-非関連)。
【０１６８】
【表４】
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【０１６９】
1回目の免疫化の7週間後に、脾細胞をマウスから単離し、実施例4に記載した方法を使用して、抗原特異的T細胞応答を評価した。
【０１７０】
図7に示されているように、ChAd155-CalHV3-LLyによる免疫化に続く、同じ抗原構築物(ChAd155-CalHV3)又はMVA-CalHV3-LLyによるブースト（追加免疫）によって、ブーストなしのマウス又は非関連抗原の「ブースト」注射を受けているマウスと比較して、7週目に、CalHV3特異的インターフェロンガンマ放出が有意に増加した。
【０１７１】
これらの結果は、プライム-ブーストレジメンを使用して、EBV及びCalHV3抗原構築物に対する免疫応答を増強する能力を実証する。
【０１７２】
[実施例6]
不変鎖-CalHV3-LLy融合タンパク質
抗原を、主要組織適合性複合体(MHC)クラスII関連不変鎖(li)に融合させることにより、抗原特異的T細胞応答が増強されることが報告されている。例えば、Caponeら、Mol Ther. 2014年5月;22(5):1039〜1047頁を参照されたい。したがって、CalHV3-LLy抗原ポリペプチドのN末端に融合したマーモセット不変鎖(li)を発現するウイルス粒子の免疫原性を、表5に説明する研究設計に従って、CB6F1マウスにおいて評価した。抗原特異的T細胞応答を、実施例4に記載したIFNγアッセイを使用して評価した。
【０１７３】
【表５】
2021507712.tif 000006
【０１７４】
図8は、免疫化の2週間後に観察された、すべてのCalHV3-LLy抗原(C1、C7、ORF39及びORF43)に対する累積T細胞応答をまとめる。より少ない用量の抗原(5×106ウイルス粒子)、ChAd155-li-CalHV3-LLyは、ChAd155-CalHV3-LLyよりも、免疫化マウスにおいて有意に大きなIFNγ放出を誘発した。試験したより多い用量の抗原(5×107ウイルス粒子)では、差は観察されなかった。
【０１７５】
これらの結果は、CalHV3-LLy抗原ポリペプチドのMHCクラスII関連不変鎖ポリペプチドへの融合により、CalHV3潜伏及び溶解性抗原に対するT細胞免疫応答が増強されることを示す。
【０１７６】
[実施例7]
非ヒト霊長類におけるCalHV3抗原の免疫原性
CalHV3抗原構築物の免疫原性を、CalHV3血清陽性マーモセット(コモンマーモセット(Callithrix jacchus))(新世界霊長類の属である)において評価した。CalHV3感染は、マーモセットにおいて蔓延していることが知られている。例えば、Choら、PNAS 98(3):1224〜1229頁(2001)を参照されたい。CalHV3とEBVの間の構造的及び病理学的類似性に起因して、CalHV3陽性マーモセットは、ヒトEBV感染及び病理の貴重なモデルとしての役割を果たし得る。同上。
【０１７７】
ChAd155プライム/MVAブーストワクチン接種スケジュールを使用して、動物を免疫化した。簡潔には、4頭の成体動物(3頭の雄及び1頭の雌)から構成される群は、0日目に、ChAd155-CalHV3-LLy(5x1010vp)の初回免疫を、56日目(8週目)に、MVA-CalHV3-LLy(2x108)のブースト（追加免疫）を受けた。血液試料を、プライム注射の2週間前、プライム注射の3週間後、並びにブースト注射の1、4及び7週間後に採取した。末梢血単核球(PBMC)における抗原特異的T細胞応答を、実施例4に記載した方法を使用して評価した。
【０１７８】
図9は、ベースライン(w0)、プライム後3週間(w3 pp)、及びブースト後1、4及び7週間(w1、w4、w7 pb)に観察された、すべてのCalHV3-LLy抗原(C1、C7、ORF39及びORF43)に対する、個々の動物における累積T細胞応答を示す。免疫化の前に、動物は、ベースラインCalHV3特異的T細胞応答を示し、これは、動物がウイルスキャリアであるという事実に一致した。ChAd155-CalHV3-LLy免疫化の3週間後に、動物は、既存のCalHV3特異的T細胞応答の有意な拡大を示した。T細胞応答は、MVA-CalHV3-LLyによるブースト後1週間でも上昇し続け、続く2カ月間で収束したが、ほとんどの動物においてベースラインレベルを超えたままであった。図10に示されているように、CalHV3-LLyに対するT細胞応答の増強は維持され、多特異的(すなわち、C1、C7、ORF39及びORF43に対して)であった。
【０１７９】
これらの結果は、CalHV3-LLy抗原をコードするChAd155及びMVAベクターが、CalHV3陽性マーモセットにおける既存の抗原特異的T細胞応答を効率的に再拡大し、維持することができること、及びガンマヘルペスウイルスによって誘発される循環T細胞が機能を損なわれないか又は消耗されないことを示す。
【０１８０】
[実施例8]
ChAd155及びMVA潜伏+溶解性EBVワクチンによってコードされたEBV断片のヒトPBMCによる認識
ワクチンに含まれるEBV潜伏(EBNA1、EBNA3A、LMP1及びLMP2)及び溶解性(ZEBRA)抗原性断片の選択について評価するために、対応するペプチドプールに対するT細胞応答を、その他の点では健康なヒトEBVキャリアにおいて測定した。
【０１８１】
簡潔には、8名の健康なヒトドナー由来の凍結末梢血単核球(PBMC)を解凍し、標準的なIFNγ  ELISpotアッセイに従って、EBV抗原に対するT細胞応答についてアッセイした。PBMCを、2×105細胞/ウェルで三連にてプレーティングし、5プールに配列された重なり合う15-merペプチド(それぞれ、ワクチンに含まれるEBVタンパク質のそれぞれに由来する免疫原性断片をカバーする)で、一晩刺激した(LMP1、LMP2、EBNA1、EBNA3A、ZEBRA;n=19から84のシングルペプチド/プール)。DMSO(ペプチド希釈剤)による刺激を陰性対照として使用した。T細胞活性化は、酵素連結イムノスポット(ELISPOT)によってIFNγ-分泌T細胞を数えることによって検出した。
【０１８２】
図11に示されているように、結果は、EBV Lly抗原構築物内に含有された免疫原性断片に対する抗原特異的T細胞応答は、健康なEBVキャリアにおいて容易に検出することができ、EBNA3A及びZEBRAは最も高い頻度で認識され、最も高い応答を誘発することができることを示し、これは以前の報告と一致した(例えば、Taylorら Ann. Rev. Immunol. 33:787〜821頁、2015)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2021507712.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021507712.tif 000015
【図１０】
2021507712.tif 000016
【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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