(57)【要約】  本開示は、治療的に関連する組換え融合ポリペプチドを発現する操作された微生物を含む、皮膚疾患を処置するための方法および組成物を提供する。一実施形態においては、本開示は、皮膚疾患の処置を必要とする対象に、ヒトフィラグリンを分泌する黄色ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)を含む生きた生物治療製品(LBP)を含む組成物を投与することを含む、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患を処置するための方法を開示する。さらなる態様においては、本発明は、本明細書に記載のフィラグリンポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、本明細書に開示される組成物と、使用のための指示書とを含むキットを提供する。【選択図】  図１
2021528041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを分泌することができる組換え微生物であって、該ポリペプチドを発現することができる遺伝子を含む第1のコード配列と、細胞透過性ペプチドを発現することができる遺伝子を含む第2のコード配列とを含む発現ベクターを含む、組換え微生物。
【請求項２】
移行シグナルを発現することができる遺伝子を含む第3のコード配列をさらに含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列の発現が、プロモーターの制御下にある、請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列の配置が、インフレームである、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項５】
第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列が、プロモーターに機能し得る形で連結されている、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項６】
組換え微生物が、細菌、または細菌の組合せである、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項７】
ポリペプチドが、フィラグリン、またはそのバリアントである、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項８】
微生物が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ブレヴィバクテリウム(Brevibacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、もしくはオエノコッカス(Oenococcus)、またはその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項９】
組換え微生物が、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
微生物が、フィラグリン融合タンパク質を分泌する、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
フィラグリン融合タンパク質が配列番号１と９５％配列同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
生きた生物治療組成物を製造するための方法であって、
(a)細胞に、(i)治療ポリペプチドを発現することができる核酸配列を含む第1のコード配列、および(ii)細胞透過性ペプチドを発現することができる核酸配列を含む第2のコード配列をトランスフェクトすることと、
(b)トランスフェクトされた細胞に、治療ポリペプチド融合タンパク質を産生させることと、
(c)生きた生物治療組成物を取得することと、
を含む、方法。
【請求項１３】
(iii)細胞に、移行シグナルを発現することができる核酸配列を含む第3のコード配列をトランスフェクトすることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列が、単一のプラスミド中に配置される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列の配置が、プロモーターに機能し得る形で連結される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ブレヴィバクテリウム(Brevibacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、もしくはオエノコッカス(Oenococcus)、またはその組合せからなる群から選択される微生物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
治療ポリペプチド融合タンパク質が、フィラグリン融合タンパク質、またはそのバリアントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
フィラグリン融合タンパク質が配列番号１と９５％配列同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法によって得られた組成物。
【請求項２１】
水性溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル、または軟膏からなる群から選択される製薬上許容し得る担体を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
組換え微生物を含む生きた生物治療組成物であって、組換え微生物が、
(i)治療ポリペプチドを発現することができる核酸配列を含む第1のコード配列；
(ii)細胞透過性ペプチドを発現することができる核酸配列を含む第2のコード配列；
(iii)移行シグナルを発現することができる核酸配列を含む第3のコード配列；ならびに  (iv)第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列に機能し得る形で連結されているプロモーター
を含み、
第1のコード配列、第2のコード配列および第1のコード配列が、フィラグリン融合産物、またはそのバリアントを発現することができる、生きた生物治療組成物。
【請求項２３】
組換え微生物が、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
移行シグナルが、フィラグリン融合産物、またはそのバリアントを、組換え微生物から外部へ輸送する、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
フィラグリン融合タンパク質が配列番号１と９５％配列同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
細胞透過性ペプチドが、フィラグリン融合産物、またはそのバリアントの、ヒトケラチノサイトへの進入を容易にする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
水性溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル、または軟膏からなる群から選択される製薬上許容し得る担体を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の組成物、および、使用のための指示書を含む、キット。
【請求項２９】
皮膚疾患の処置を必要とする対象に、請求項１〜１０または１８〜２３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、皮膚疾患を処置する方法。
【請求項３０】
皮膚疾患が尋常性魚鱗癬(IV)である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
皮膚疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
フィラグリンポリペプチド、またはそのバリアントを含む、組成物。
【請求項３３】
フィラグリンポリペプチドが融合タンパク質である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
フィラグリン融合タンパク質が配列番号１と９５％配列同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
フィラグリン融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項３３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2018年4月5日に出願された、米国仮特許出願第62/653,021号の優先権を主張し、その内容全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
尋常性魚鱗癬(IV)は、慢性で乾燥性の鱗屑性皮膚疾患であり、その発生率および有病率は、250人に1人と推定され1、2、米国では130万人の合計患者集団をもたらす。IVの臨床的特徴は通常、約2ヶ月齢で出現し、全身の乾燥および微細な白色から灰色の鱗屑を含み、腹部、胸部、および四肢の伸筋表面で顕著である3。一部のIV患者は、乏汗症および高熱不耐性も経験する4。IVの発症は、表皮ケラトヒアリン顆粒のサイズもしくは数の減少、またはさらには、その完全な不在と長く同定されてきた5〜7。さらに、遺伝的因子のため、IVを有する患者は、アトピー性皮膚炎(AD)、喘息、およびアレルギーのリスクが高い8。
【０００３】
尋常性魚鱗癬は、フィラグリンをコードする遺伝子の機能喪失型変異によって引き起こされる常染色体半優性疾患である9。フィラグリンは、角質層でフィラグリン単量体に分解し、ケラチノサイト細胞骨格中でケラチンおよび他の中間フィラメントタンパク質に結合することによって皮膚バリアを強化する、プロフィラグリンから誘導される必須構造タンパク質である10。
【０００４】
多くの研究が、IVおよびアトピー性皮膚炎患者におけるFLGの機能喪失型変異を同定し11〜14、これらの変異は無秩序なケラチンフィラメント、皮膚バリアの欠陥15および角質層における微小破壊と関連し、経皮アレルゲン感作の増強をもたらす16〜19。さらに、フィラグリンおよびその分解産物は、皮膚の保湿(吸湿性アミノ酸または「天然保湿成分」による)20、21、抗微生物分子(特に、黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対する)の産生の実行22、および皮膚における有益な脂質プロファイル23、24と、pH24〜26との両方の維持を含む、皮膚における有意な追加の機能を有する。
【０００５】
IVのための現在の治療選択肢としては、主に局所水分蒸発抑制剤(例えば、塩化ナトリウム、尿素、乳酸、サリチル酸)、および保湿剤(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、デクスパンテノール)が挙げられる4。身体による皮膚細胞の産生を遅らせる努力においては、局所レチノイドを処方してもよいが、ビタミンA誘導体としての長期的使用は理想的ではない。特に、IVを有する多くの患者は、自意識および社会的恥ずかしさのため、QOLの有意な低下27〜29を経験し、家庭生活、教育/職業人生、さらには余暇/スポーツ活動に対する負の影響を見る28、29。IVが大きく、満たされない必要であることは明らかである。
【０００６】
多様な微生物群落が皮膚に生息し、1平方センチメートルは最大で10億の微生物を含有し得る39。細菌、真菌、ダニおよびウイルスのこれらの多様な群落は、疾患に対する保護を提供し、皮膚上に動的であるが、異なる生態的地位を形成することができる40。微生物群落の変化または皮膚における腸内毒素症と、皮膚疾患39、41、特に、AD42、43とを関連付ける証拠が増えている。操作されたプロバイオティクスは、治療目的で皮膚微生物叢を活用することに基づく新しい手法である。特に、操作されたプロバイオティクスは、患者の皮膚上での居住を確立し、治療タンパク質をin situで継続的かつ安定的に送達するため、薬物送達の他の方法よりも重要な利点を有する。さらに、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)(SE)のある特定の株は、アトピー性皮膚炎の疾患表現型および重症度と関連する、皮膚において重要で有益な免疫調節効果および抗病原体効果を示した。さらに、プロフィラグリンから誘導される構造タンパク質であるフィラグリンの送達は、皮膚バリアにおけるフィラグリンの役割および経表皮水分蒸散量を低減し、皮膚水分補給を改善する能力のため、治療手法をさらに増強する。本発明は、アトピー性皮膚炎の病態生理に対処するためのヒトフィラグリン(例えば、AZT-01)を分泌する皮膚薬物送達系として、表皮ブドウ球菌の遺伝子操作された組換え株を用いて、皮膚疾患、例えば、アトピー性皮膚炎を処置するための方法および組成物を提供する驚くべき利点を有する。皮膚に適用されたら、皮膚への安定な定着およびin situでのその後のフィラグリンの分泌は、疾患を解消することができる。本発明の利益としては、非ステロイド性治療選択肢としてのその安全性、フィラグリンの分泌に由来する利益と、表皮ブドウ球菌の局所適用の利益との本発明の組合せに起因するその効能、および低頻度の適用(1日1回以下)であっても治療的に有効であるその能力が挙げられる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明はしたがって、炎症性皮膚疾患、特に、IVのための有効な処置の長年にわたる必要に対処する。本発明はまた、皮膚疾患を処置する治療タンパク質を分泌することができる片利共生皮膚細菌の初めて報告された証明の1つでもある。
【０００８】
発明の概要
本開示は、尋常性魚鱗癬の病態生理に直接対処する、皮膚疾患、例えば、尋常性魚鱗癬(IV)のための新規治療モダリティを特徴とし、ヒトフィラグリンを分泌する表皮ブドウ球菌を含む生きた生物治療製品(LBP)からなる。本開示の目標は、有益な微生物叢に基づくシャシーシステムによる、フィラグリンの長期的で安定な送達を用いて皮膚を補完することである。本発明によって細菌の潜在的なプロバイオティクス特性が利用され、最適化されるが、疾患の改善は、基礎となる病態生理に直接対処する関連タンパク質の合理的な標的発現に基づく。さらに、異なる微生物種および株に対する応答は個体間で異なるため、治療剤送達を制御するためのモジュラー設計は、天然に存在する株を利用する現在の手法を超える、有意に改善された薬物動態および疾患解消を提供するであろう。重要なことに、ある特定の株は抗微生物ペプチドを分泌することができるため、表皮ブドウ球菌の導入は、病原体により誘導される腸内毒素症を標的化することによって皮膚恒常性を再確立するのを助けることができる。
【０００９】
かくして、本発明は、特に、治療的に関連する組換え融合ポリペプチド(すなわち、タンパク質、ペプチド、またはアミノ酸)を発現することができる操作された微生物を含む、皮膚疾患、例えば、IVを処置するための方法および組成物に関する。
【００１０】
本発明は、第1の態様において、ポリペプチドを分泌することができる組換え微生物であって、ポリペプチドを発現することができる遺伝子を含む第1のコード配列と、細胞透過性ペプチドを発現することができる遺伝子を含む第2のコード配列とを含む発現ベクターを含む、組換え微生物を特徴とする。関連する実施形態において、組換え微生物は、移行シグナル(輸出シグナル)を発現することができる遺伝子を含む第3のコード配列をさらに含む。さらに別の実施形態において、第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列の発現は、プロモーターの制御下にある。他の実施形態において、第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列の配置は、インフレームである。さらに別の関連する実施形態において、第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列は、プロモーターに機能し得る形で連結されている。一実施形態においては、組換え微生物は、細菌、または細菌の組合せである。別の実施形態においては、ポリペプチドは、フィラグリン（filaggrin）、またはそのバリアント(変異体)である。他の実施形態においては、微生物は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ブレヴィバクテリウム(Brevibacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、もしくはオエノコッカス(Oenococcus)、またはその組合せからなる群から選択される。他の実施形態においては、組換え微生物は、表皮ブドウ球菌である。いくつかの実施形態においては、微生物は、フィラグリン融合タンパク質を分泌する。さらなる実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1からなる。
【００１１】
本発明は、さらなる態様において、生きた生物治療組成物を製造するための方法であって、(a)細胞に、(i)治療ポリペプチドを発現することができる核酸配列を含む第1のコード配列、および(ii)細胞透過性ペプチドを発現することができる核酸配列を含む第2のコード配列をトランスフェクトすることと、(b)トランスフェクトされた細胞に治療ポリペプチド融合タンパク質を産生させることと、(c)生きた生物治療組成物を取得することとを含む、方法を特徴とする。関連する実施形態においては、方法は、(iii)細胞に、移行シグナルを発現することができる核酸配列を含む第3のコード配列をトランスフェクトすることをさらに含む。別の実施形態においては、第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列は、単一のプラスミド中に配置される。さらに別の実施形態においては、第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列は、プロモーターに機能し得る形で連結されている。他の実施形態においては、細胞は、Bifidobacterium、Brevibacterium、Propionibacterium、Lactococcus、Streptococcus、Staphylococcus、Lactobacillus、Enterococcus、Pediococcus、Leuconostoc、もしくはOenococcus、またはその組合せからなる群から選択される微生物からなる群から選択される。さらに別の実施形態においては、細胞は、表皮ブドウ球菌である。他の実施形態においては、治療ポリペプチド融合タンパク質は、フィラグリン融合タンパク質、またはそのバリアントである。さらなる実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1からなる。
【００１２】
別の態様においては、本開示は、フィラグリンポリペプチド、またはそのバリアントを含む組成物を特徴とする。一実施形態では、フィラグリンポリペプチドは、融合タンパク質である。さらなる実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1からなる。
【００１３】
本発明は、さらなる態様において、本明細書に開示または記載される方法のいずれか1つによって得られる組成物を特徴とする。関連する実施形態においては、組成物は、水性溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル、または軟膏からなる群から選択される製薬上許容し得る担体を含む。
【００１４】
本発明は、さらなる態様において、(i)治療ポリペプチドを発現することができる核酸配列を含む第1のコード配列；(ii)細胞透過性ペプチドを発現することができる核酸配列を含む第2のコード配列；(iii)移行シグナルを発現することができる核酸配列を含む第3のコード配列；ならびに(iｖ)第1のコード配列、第2のコード配列および第3のコード配列に機能し得る形で連結されたプロモーターを含む組換え微生物であって、第1のコード配列、第2のコード配列および第1のコード配列が、フィラグリン融合タンパク質、またはそのバリアントを発現することができる、組換え微生物を含む生きた生物治療組成物を特徴とする。さらなる実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。関連する実施形態においては、組換え微生物は、表皮ブドウ球菌である。さらなる実施形態においては、移行シグナルは、フィラグリン融合産物、またはそのバリアントを、組換え微生物から外部へ輸送する。さらに別の実施形態においては、細胞透過性ペプチドは、フィラグリン融合産物、またはそのバリアントの、ヒトケラチノサイトへの進入を容易にする。別の実施形態においては、組成物は、水性溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル、または軟膏からなる群から選択される製薬上許容し得る担体を含む。
【００１５】
本発明は、さらなる態様において、本明細書に開示または記載される組成物のいずれか1つおよび使用のための指示書を含むキットを特徴とする。
【００１６】
本発明は、さらなる態様においては、皮膚疾患の処置を必要とする対象に、本明細書に開示または記載される組成物のいずれか1つの組成物を投与することを含む、皮膚疾患を処置する方法を特徴とする。一実施形態においては、皮膚疾患は、IVである。別の実施形態においては、皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、液体培養物中での増殖株の特性評価を示すグラフである。SEのみ(黒色の実線、三角のマーカー)は、SE-GFPのみ、またはSEとSE-GFPと一緒よりも急速に増殖した。
【図２−１】図2A〜Cは、RHE中での株の増殖の特性評価を示す。(A)空のベクターを含むSE(すなわち、タンパク質産生なし)。(B)RHE上のSE-GFPのみが、24時間でより遅い増殖を示す。
【図２−２】(C)RHE上で50：50で一緒に混合した場合、SEの空のベクターは、SE-GFPを打ち負かす。
【図３】図3A〜Cは、蛍光および反射オーバーレイを示す。(A)角質層における個々の細胞の表面および輪郭上での蛍光SE(点線は例としての角質細胞の輪郭を示す)。(B〜C)ダーマローラー適用、次いで、局所GFP適用後、37℃で3.5時間でのRHEの蛍光および光波長オーバーレイであり、細菌が損傷した角質層の割れ目に局在化したことを示すが、そのレベルで表皮中には細菌の証拠がない。深さを、50μm(B)および70μm(C)で取った。
【図４】図4A〜Cは、GFP精製の結果を示す。タンパク質を、SEの225mLの培養物(2.7〜2.9OD/mL)から精製し、CellB-Lyse(Sigma)を用いて溶解した。4mLの溶出液を作製し、PBS pH7.4のバッファー中、Ni-NTAカラム上で泳動させ、0.4mgを得た。(A)SEに由来する精製されたタンパク質を用いたSDS-PAGEゲル上でのInVision Hisタグ染色。レーン(1)溶解物ペレット；(2)上清、明澄化；(3)流出液；(4)溶出液；(5)濃縮液；(6)マーカー；(7)上清、明澄化；(8)流出液；(9)溶出液；および(10)濃縮液。(C)SEに由来する精製されたGFP。
【図５−１】図5A〜Oは、RHEにおけるリポーターとして5μgのGFPを使用する、RMRシグナルを用いない、および用いないタンパク質の特性評価を示す。(A〜D)30分(A、C、E、G)または60分(B、D、F、H)でのRMRシグナルを用いる(C、D)または用いない(A、B)、局所的に適用されたGFPの2光子画像。画像は、2D平面上に投影されたコンパイルされたZスタックである。
【図５−２】(E〜H)RHEへのタンパク質透過の深さを検査するための3D表面分析。
【図５−３】(E〜H)RHEへのタンパク質透過の深さを検査するための3D表面分析。
【図５−４】(E〜H)RHEへのタンパク質透過の深さを検査するための3D表面分析。
【図５−５】(E〜H)RHEへのタンパク質透過の深さを検査するための3D表面分析。
【図５−６】(I〜N)光(L〜N)または蛍光(I〜K）波長を使用する、GFP(K、N)、GFP+RMR(J、M）またはビヒクル(I、Ｌ)の共焦点画像。(O)50μgのGFP-RMRを含むダーマローラー微小針で穿刺したRHE。画像を、適用の30分後に撮った。
【図６−１】図6A〜Eは、ヒトフィラグリンの予備バイオインフォマティクス分析を示す。(A)ヒトフィラグリンドメインの相同性。
【図６−２】(B)ヒトフィラグリンドメインの配列アラインメント。
【図６−３】(C)フィラグリン配列の対応するダイアグラムを含むヒトフィラグリンドメインの疎水性プロット。(D)hFLG 9〜10のN末端のQSGEnSGRnSFLYQVSnHEQSES(配列番号3)リピートを除去するための疎水性プロットを使用するヒトフィラグリンサル(simians)9〜10についての例示的なSAR訓練および(E)RMR細胞透過性ペプチドが付加されたこのタンパク質の得られる配列(配列番号15)。
【図６−４】(D)hFLG 9〜10のN末端のQSGEnSGRnSFLYQVSnHEQSES(配列番号3)リピートを除去するための疎水性プロットを使用するヒトフィラグリンサル(simians)9〜10についての例示的なSAR訓練および(E)RMR細胞透過性ペプチドが付加されたこのタンパク質の得られる配列(配列番号15)。
【図６−５】(F)フィラグリン構造の概観。(上)プロフィラグリンおよびフィラグリン遺伝子構造。フィラグリンの大部分は、エクソン3によってコードされる。(下)プロフィラグリンタンパク質構造。
【図７】図7A〜Eは、アッセイの開発を示す。(A〜C)様々な抗体を含むフィラグリン産生SE培養物からの培地単離物中のhFLGのウェスタンブロット。(A)Sigmaポリクローナル抗hFLG抗体。(B)SantaCruzポリクローナル抗hFLG抗体。(C)ポリクローナル抗hFLG抗体。(D)MSに基づくフィラグリン検出の方法開発のための提唱されるワークフロー。(E)hFLG9-10(配列番号16)に関する質量分析に由来する、発現されたヒトフィラグリンの同一性。色は、配列の信頼性を示す：暗青色(非常に高い信頼性)、明青色(観察された)および赤色(観察されず)。
【図８】図8は、フィラグリン活性に関するBiacore表面プラズモン共鳴(SPR)の概観を示す。
【図９−１】図9A〜Gは、フィラグリン分解産物、または天然保湿成分(NMF)に関する標準曲線を作成するパイロット結果を示す。ラマン分光法は、個々のNMF成分を検出することができる(A〜D)。
【図９−２】質量分析(E〜G)も、ピクトグラムからナノグラム範囲の定量限界(LOQ)で非常に高感度である。
【図１０】図10は、ワークフローの概観を示す。
【図１１】図11は、16S配列決定の実験的概略を示す。図11は、出現順に、それぞれ、配列番号17〜20、20〜22、22〜23、23〜29を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
別段の定義のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される多くの用語の一般的定義を提供する：Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版、1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker(編)、1988)；The Glossary of Genetics、第5版、R. Riegerら(編)、Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の特定のない限り、以下のものに帰する意味を有する。
【００１９】
冠詞「a」および「an」は、1または1より多い(すなわち、少なくとも1)のその冠詞の文法的目的語を指すように本明細書で使用される。例えば、「要素（an element）」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。
【００２０】
本明細書で使用される用語「含む（including）」は、語句「限定されるものではないが、含む（including but not limited to）」を意味し、それと互換的に使用される。
【００２１】
本明細書で使用される用語「または」は、文脈が別途明確に示さない限り、用語「および／または」を意味し、それと互換的に使用される。
【００２２】
本明細書で使用される用語「など(such as)」は、語句「限定されるものではないが、〜など(such as but not limited to)」を意味し、それと互換的に使用される。
【００２３】
本明細書で使用される用語「約」は、特定の記載される数値を参照して使用される場合、その値が記載される値から1%以下で変化してもよいことを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約100」という表現は、99および101ならびにその間の全ての値(例えば、99.1、99.2、99.3、99.4など)を含む。
【００２４】
本明細書で使用される用語「担体」、「担体系」または「ビヒクル」とは、医薬品有効成分または患者もしくは対象に局所適用される組成物中の投与のための他の材料を送達する、含有する、または「担持する」のに好適である適合性物質を指す。本明細書において有用な担体は、製薬上許容し得るものであるべきである。本明細書において有用な担体およびビヒクルは、非毒性的であり、有害な様式でそれが含有される製剤の他の成分と相互作用しない、当業界で公知の任意のそのような材料を含む。用語「水性」とは、水を含有するか、または皮膚もしくは粘膜組織への適用後に水を含有するようになる製剤を指す。「担体」のさらなる例としては、水、低級アルコール、高級アルコール、多価アルコール、単糖類、二糖類、多糖類、炭化水素油、脂肪および油、ワックス、脂肪酸、シリコーン油、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、シリコーン界面活性剤、ならびにそのような担体の水ベースの混合物およびエマルジョンベースの混合物が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用される用語「（遺伝子）操作された細菌株」または「組換え細菌株」とは、生物外で調製されたDNAの細菌株への導入によって「遺伝子改変された」または「（遺伝子）操作された」細菌の株を指す。例えば、新しい遺伝子または他の核酸配列を含有するプラスミドの細菌中への導入は、細菌に、それらの遺伝子または他の核酸配列を発現させることができる。あるいは、新しい遺伝子または他の核酸配列を含有するプラスミドを細菌に導入した後、細菌のゲノム中に組み込むことができ、そこで細菌はこれらの遺伝子または他の核酸配列を発現するであろう。
【００２６】
本明細書で使用される用語「宿主細胞」とは、外因性ポリヌクレオチド配列によって形質転換もしくはトランスフェクトされた、または形質転換もしくはトランスフェクトすることができる細胞を指すことを意味する。
【００２７】
本開示の目的のための用語「単離された」は、その元の環境(それが天然に存在する環境)から取り出された生物材料(細胞、核酸またはタンパク質)を指す。例えば、植物または動物中に天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、天然に存在する隣接する核酸から分離された同じポリヌクレオチドは、「単離された」とされる。
【００２８】
「単離された核酸分子」(例えば、単離されたプロモーターなど)は、核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子から分離されたものである。例えば、ゲノムDNAに関して、用語「単離された」は、ゲノムDNAが天然に結合した染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸分子は、該核酸分子が由来する生物のゲノムDNA中で、天然で該核酸分子の両側に存在する(フランキングする)配列を含まない。
【００２９】
本明細書で使用される用語「遺伝子エレメント（遺伝的エレメント）」は、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチドまたは複製、転写もしくは翻訳または宿主細胞中でのポリペプチドの発現にとって重要な他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、またはポリペプチドをコードする領域と、発現を調節するそれに機能し得る形で連結された領域との両方を含むポリヌクレオチドを指すことを意味する。遺伝子エレメントは、エピソームエレメントとして；すなわち、宿主細胞ゲノムとは物理的に無関係の分子として複製するベクター内に含まれていてもよい。それらは、プラスミド内に含まれていてもよい。遺伝子エレメントはまた、その天然の状態ではなく、むしろ、特に、精製されたDNAの形態で宿主細胞中での、またはベクター中での単離、クローニングおよび導入などの操作後に、宿主細胞ゲノム内に含まれていてもよい。
【００３０】
本明細書で使用される用語「生きた生物治療製品」(またはLBP)とは、細菌、酵母、および/または他の微生物を含有する製品候補を指す。
【００３１】
本明細書で使用される用語「患者」または「対象」とは、本発明の処置および組成物を受けるであろうヒトまたは動物(動物の場合、より典型的には、家畜哺乳動物などの哺乳動物、または家禽動物および魚類および他の海産物もしくは淡水食物生物などの動物)を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、アトピー性皮膚炎の1つ以上の症状もしくは兆候を示す、および/またはIVと診断された、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される語句「製薬上許容し得る」とは、正しい医学的判断の範囲内で、合理的な利益/リスク比に見合う、過剰の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織との接触における使用にとって好適である、活性化合物、材料、操作された細菌株もしくは複数の株、組成物、担体、および/または剤形を指す。
【００３４】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は一般に、非改変RNAもしくはDNAまたは改変RNAもしくはDNAであってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。かくして、例えば、本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、特に、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖、もしくはより典型的には、二本鎖、または三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよい、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を指す。さらに、本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAまたはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域を指す。そのような領域中の鎖は、同じ分子または異なる分子に由来するものであってもよい。これらの領域は、1つ以上の分子の全部を含んでもよいが、より典型的には、いくつかの分子の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の1つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、1つ以上の改変塩基を含有する上記のDNAまたはRNAを含む。かくして、安定性または他の理由のために骨格が改変されたDNAまたはRNAは、その用語が本明細書で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、ほんの2例を挙げると、イノシンなどの非通常塩基、またはトリチル化塩基などの改変塩基を含むDNAまたはRNAは、この用語が本明細書で使用されるようなポリヌクレオチドである。当業者には公知の多くの有用な目的に役立つ数多くの改変がDNAおよびRNAに対して加えられていることが理解されるであろう。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、そのような化学的、酵素的または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび特に、単数の細胞および複数の細胞を含む細胞に特徴的な、化学的形態のDNAおよびRNAを包含する。用語「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと呼ばれることも多い短いポリヌクレオチドも包含する。「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書では互換的に使用されることが多い。
【００３５】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、鎖中に一緒に結合するアミノ酸残基から構成される生体分子、または高分子を指す。本明細書で使用されるポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の1つ以上の長い鎖から構成されるタンパク質(一般的には、より高い分子量)および数個のアミノ酸の低分子(一般的には、低い分子量)を包含することが意図される。他の実施形態においては、技術的にはポリペプチドではないが、単一のアミノ酸も、本開示の範囲内にあると考えられる。
【００３６】
本明細書で使用される用語「防止すること」とは、例えば、患者または対象が異常な皮膚状態の素因があるか、または異常な皮膚状態に罹るリスクがある場合に、異常な皮膚状態(例えば、IV)が生じるのを完全に、またはほぼ完全に停止させることを指す。防止することはまた、異常な皮膚状態の発生を阻害すること、すなわち、停止させることを含んでもよい。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指令するDNA配列を指すことを意味する。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の5’領域に位置する。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤に応答して増大する。例えば、プロモーターが特定の組織型中での関連するコード領域の転写においてのみ活性であるように、組織特異的様式でそれを調節することができる。
【００３８】
本明細書で使用される用語「リスクを低減すること」とは、例えば、患者または対象が異常な皮膚状態の素因があるか、または異常な皮膚状態に罹るリスクがある場合に、異常な皮膚状態(例えば、IV)が生じる可能性または確率を低下させることを指す。
【００３９】
本明細書で使用される用語「治療有効量（治療上有効な量）」とは、薬学活性化合物、化合物もしくは組成物の組合せの量、または単独で、もしくは組み合わせて投与した場合、疾患状態もしくは状態、例えば、異常な皮膚状態(例えば、IV)を処置する、防止する、もしくはそのリスクを低減するための、操作された細菌株もしくは複数の株、例えば、皮膚処置剤もしくは複数の薬剤によって送達される、薬学活性化合物の量を指す。この用語はまた、活性化合物もしくは化合物の組合せまたは薬学活性化合物を送達する操作された細菌株もしくは複数の株を含有する医薬組成物の量も指す。例えば、有効量とは、化合物の量または生物活性、例えば、異常な皮膚状態を処置もしくは防止するための活性を惹起するのに十分なレシピエント患者もしくは対象に与えられる製剤中に存在する操作された細菌株もしくは複数の株によって送達される化合物の量を指す。
【００４０】
本明細書で使用される用語「処置すること」とは、異常な皮膚状態(例えば、IV)を治癒させる、または改善するための治療的介入を提供することを指す。
【００４１】
組成物
本発明は、皮膚疾患の処置または防止のための組換え治療ポリペプチドを発現するように遺伝的に変化した皮膚定着性微生物、例えば、細菌を提供する(図2)。遺伝子操作されたタンパク質産生微生物、例えば、細菌の使用は、皮膚疾患を処置する先行技術の方法を超えるいくつかの利点を有する。治療タンパク質は、皮膚状態をもたらす欠陥の根本的な原因を処置することができる。さらに、微生物、例えば、細菌は、挿入された核酸(例えば、遺伝子)を保持しながら自己複製して、治療タンパク質を継続的に産生することができる。
【００４２】
本発明は、治療タンパク質、例えば、ヒトフィラグリンを発現するように遺伝的に変化した、例えば、表皮ブドウ球菌などの皮膚定着性微生物、例えば、細菌を提供する。遺伝子操作されたフィラグリン産生微生物、例えば、細菌の使用は、フィラグリン補給の使用を超えるいくつかの利点を有する。第1に、微生物、例えば、細菌は、挿入されたフィラグリン核酸配列(例えば、遺伝子)を保持しながら自己複製することができる。第2に、表皮ブドウ球菌は、通常、皮膚上に存在し、アトピー性皮膚炎フレア中の皮膚微生物叢を支配する同じ分野の細菌種である黄色ブドウ球菌の増殖を阻害することが示されている。
【００４３】
細菌株
本発明は、組換え治療タンパク質を発現することができる、遺伝的に変化した微生物、例えば、細菌を提供する。広範囲の微生物が、本発明における使用にとって好適である。例としては、限定されるものではないが、非病原性細菌および片利共生細菌が挙げられる。本発明における使用にとって好適な細菌としては、限定されるものではないが、Bifidobacterium、Brevibacterium、Propionibacterium、Lactococcus、Streptococcus、Staphylococcus (例えば、S. epidermidis)、Lactobacillus (例えば、L. acidophilus)、Pediococcus、Leuconostoc、またはOenococcusが挙げられる。本発明のある特定の実施形態においては、細菌は、表皮ブドウ球菌である。本発明の好ましい実施形態においては、使用される表皮ブドウ球菌の株は、バイオフィルムを産生することができない。バイオフィルムを産生することができない表皮ブドウ球菌の株の1つのそのような例は、表皮ブドウ球菌株ATCC 12228である。しかしながら、本発明のさらに他の実施形態においては、皮膚上に見出される他の関連する、または類似する種を用いることができる。
【００４４】
治療タンパク質
本発明は、組換え治療タンパク質を発現することができる、遺伝的に変化した微生物、例えば、細菌を提供する。本発明の好ましい実施形態においては、治療タンパク質は、ヒトフィラグリンを含む。ヒトフィラグリンは、フィラグリン(FLG)をコードするヒト遺伝子によって発現される。フィラグリンは、分化しているケラチノサイトによって産生されるタンパク質であり、ケラチンフィラメントを、他の成分と共に、角化細胞エンベロープを含む細胞骨格に凝集させるように機能する。FLGは、タンパク質分解されて、機能的なフィラグリンモノマーを遊離する不溶性ポリタンパク質であるプロフィラグリンを産生する、染色体lq21上に位置する大きい遺伝子である(Armengot-Carboら、2014)。本発明の治療タンパク質(およびすなわち、タンパク質が発現される遺伝子)は、任意の哺乳動物に由来してもよい。非限定例としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、イヌ、霊長類、またはヒト遺伝子配列が挙げられる。本発明の好ましい実施形態においては、治療タンパク質は、細胞透過性タンパク質(CPP)に機能し得る形で連結されたフィラグリンを含む組換え融合タンパク質を含む。一実施形態においては、細胞透過性タンパク質は、RMRRMRRMRRである。本発明の他の実施形態においては、治療タンパク質は、組換えフィラグリンを微生物(例えば、細菌)の外部へ輸送することができる、移行または分泌シグナルに機能し得る形で連結されたフィラグリンを含む組換え融合タンパク質を含む。別の実施形態においては、治療タンパク質は、細胞透過性タンパク質(CPP)および移行または分泌シグナルに機能し得る形で連結されたフィラグリンを含む組換え融合タンパク質を含む。
【００４５】
一実施形態においては、細胞透過性タンパク質に機能し得る形で連結されたフィラグリンを含む融合タンパク質を、配列番号1に示す。
【００４６】
配列番号1
2021528041.tif 000003
【００４７】
一実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1からなる。
【００４８】
いくつかの態様においては、治療タンパク質は、微生物(例えば、細菌)によって発現されない。いくつかの態様においては、治療タンパク質は、フィラグリンポリペプチド、またはそのバリアントを含む。一実施形態においては、フィラグリンポリペプチドは、融合タンパク質である。さらなる実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1からなる。
【００４９】
分泌シグナル
分泌シグナルまたは移行シグナルは、分泌経路を介するタンパク質の輸送を容易にするタンパク質上のペプチド配列であり、最終的に、細胞からのタンパク質の分泌をもたらす。本発明においては、微生物(例えば、細菌細胞)から外部への、フィラグリンを含むタンパク質などのタンパク質の輸送を容易にする任意の分泌シグナルが、分泌シグナルとして企図される。
【００５０】
細胞透過性ペプチド
細胞透過性ペプチドは、受容体を使用することなく、また、有意な膜損傷を引き起こすことなく、in vivoで生体分子(例えば、タンパク質)の送達を容易にする、または媒介するペプチド配列である。皮膚ケラチノサイトへの進入を容易にする細胞透過性ペプチドは、本発明の細胞透過性ペプチドとして企図される。
【００５１】
ある実施形態において、細胞透過性ペプチドは、RMRRMRRMRR (配列番号2)である。
【００５２】
遺伝子構築物
本発明は、標準的な分子生物学技術、例えば、(Sambrookら、2001)に記載されたものを用いる。本発明のために用いられる遺伝子構築物の例は、機能を改善するためにプラスミド上にさらなる設計特徴をさらに含む、対立遺伝子交換大腸菌-ブドウ球菌シャトルベクターである、pJB38に基づくpAZTである(Bose, J.L., et al. Applied and environmental microbiology. 2013;79(7):2218-2224)。プラスミドは、標準的な分子生物学技術を用いて、治療タンパク質をコードする遺伝子のcDNAを制限部位に挿入することによって構築される（図２）。挿入物は、プロモーターによって駆動されるコード配列をさらに含む。そのようなプロモーターは、構成的または誘導的であってもよい。誘導的プロモーターの例としては、アルコール、糖、金属、もしくはテトラサイクリンなどの化合物によって、または光もしくは高温などの物理的因子によって活性化されるものが挙げられる。
【００５３】
ヒトFLGのmRNA配列は、Genebank受託番号NM_002016を有する。FLG cDNAの部分をpJB38の制限部位に挿入することにより、プラスミドpAZTを構築した。挿入物は、プロモーターによって駆動される核酸コード配列を含有する。構築物は、分泌シグナルおよび細胞透過性ペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、かくして、組換えフィラグリン融合タンパク質が得られる。
【００５４】
組換え細菌株の使用
処置されるべき皮膚疾患は、皮膚と関連する任意の疾患または障害であってもよいことが理解される。ある実施形態においては、障害は、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角質増殖症、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾燥肌、アレルギー、発疹、UV刺激性皮膚、洗剤刺激性皮膚(酵素および洗浄用洗剤において使用される化合物およびラウリル硫酸ナトリウムによって引き起こされる刺激を含む)、皮膚菲薄化(例えば、高齢者および小児に由来する皮膚)、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑、脱毛症、および多毛症からなる群から選択される。ある実施形態において、皮膚疾患は尋常性魚鱗癬(IV)である。
【００５５】
本発明に従って投与することができるタンパク質の例は、好ましくは、真核タンパク質である。これらのタンパク質としては、限定されるものではないが、単一のアミノ酸、小さいペプチド、および大きいタンパク質が挙げられる。より具体的には、組換え治療タンパク質として本発明において有用であるタンパク質をコードする遺伝子としては、限定されるものではないが、以下のもの：限定されるものではないが、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14およびIL-15を含む、インターロイキンファミリーの遺伝子のメンバー、ならびにその受容体アンタゴニストをコードする遺伝子が挙げられる。限定されるものではないが、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、幹細胞因子、白血病阻害因子およびトロンボポエチンを含む造血性増殖因子をコードする遺伝子も、本発明において企図される。限定されるものではないが、神経成長因子、脳由来神経栄養因子および毛様体神経栄養因子を含む、神経栄養因子をコードする遺伝子も企図される。さらに、限定されるものではないが、IFN-アルファ、IFN-ベータおよびIFN-ガンマを含むインターフェロンをコードする遺伝子が含まれる。本発明においてさらに企図されるのは、C-CファミリーおよびC-X-Cファミリーのサイトカインなどのケモカシンをコードする遺伝子、プロインスリンおよび成長ホルモン(増殖ホルモン)などのホルモンをコードする遺伝子、ならびに組織プラスミノゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼまたはトリプシン阻害因子などの他の酵素を含む、血栓溶解酵素をコードする遺伝子である。本発明は、限定されるものではないが、オンコスタチンM、血小板由来増殖因子、線維芽細胞増殖因子、表皮増殖因子、肝細胞増殖因子、骨形態形成タンパク質、インスリン様増殖因子、カルシトニンならびにトランスフォーミング増殖因子アルファおよびベータを含む、組織修復因子、増殖および調節因子をコードする遺伝子をさらに含む。さらに企図される遺伝子としては、フィラグリン、アクチン、コラーゲン、フィブリリン、エラスチン、または硬タンパク質を含む構造タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００５６】
特定の実施形態において、遺伝子はフィラグリンをコードする遺伝子である。
【００５７】
抗体
また、本開示において提供されるのは、サブドメインのすべての対に共通するhFLGのエピトープに対する抗体である。特定の実施形態において、抗体はニワトリIgYである。
【００５８】
製剤
本発明による使用のための製剤は、治療有効量の所望のポリペプチドを産生する製薬上有効量の遺伝子操作された微生物、例えば、細菌、例えば、少なくとも約0.01重量%、約0.05重量%、約0.1重量%、約0.2重量%、約0.3重量%、約0.4重量%、約0.5重量%、約0.6重量%、約0.7重量%、約0.8重量%、約0.9重量%、約1.0重量%、約1.5重量%、約2.0重量%、約3.0重量%、約4.0重量%、約5.0重量%、約6.0重量%、約7.0重量%、約8.0重量%、約9.0重量%、約10.0重量%、約11.0重量%、約12.0重量%、約13.0重量%、約14.0重量%、約15.0重量%、約16.0重量%、約17.0重量%、約18.0重量%、約19.0重量%、約20.0重量%、約25.0重量%、約30.0重量%、約35.0重量%、約40.0重量%、約45.0重量%、約50.0重量%以上の遺伝子操作された微生物、例えば、細菌を含んでもよく、その上限は、約90.0重量%の遺伝子操作された微生物、例えば、細菌である。
【００５９】
代替的な実施形態においては、本発明による使用のための製剤は、例えば、少なくとも約0.01重量%〜約30重量%、約0.01重量%〜約20重量%、約0.01重量%〜約5重量%、約0.1重量%〜約30重量%、約0.1重量%〜約20重量%、約0.1重量%〜約15重量%、約0.1重量%〜約10重量%、約0.1重量%〜約5重量%、約0.2重量%〜約5重量%、約0.3重量%〜約5重量%、約0.4重量%〜約5重量%、約0.5重量%〜約5重量%、約1重量%〜約5重量%以上の遺伝子操作された微生物、例えば、細菌を含んでもよい。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明における使用のための製剤は、任意の製薬上有効な量のフィラグリンポリペプチドまたはその変異体を含み得る。ある実施形態では、フィラグリンポリペプチドは融合タンパク質である。さらなる実施形態において、フィラグリンポリペプチドは、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、製剤は局所製剤である。本発明における使用のための局所製剤は、クリーム、ローション、スプレー、溶液剤、ゲル、軟膏、ペースト、膏薬、塗料、生体接着剤、懸濁液剤、エマルジョンなどの、体表面への適用にとって好適な任意の形態であってもよく、ならびに/またはリポソーム、ミセル、および/もしくはミクロスフェアを含有するように調製することができる。そのような製剤を、体表面から蒸発する水分が、体表面への適用時およびその後も製剤中で維持されるような、閉鎖した被覆層と組み合わせて使用することができる。製剤は、生きている生物治療組成物を含んでもよく、組換えポリペプチドを産生する、少なくとも1種の遺伝子操作された微生物、例えば、操作された細菌株を含んでもよい。この操作された生きている生物治療組成物は、異常な皮膚状態、および/または皮膚疾患(例えば、炎症性皮膚疾患)を処置または防止するために、ポリペプチドを皮膚に直接送達することができる。
【００６２】
局所製剤は、任意の他の活性成分が当業界で公知の皮膚科学的ビヒクル、例えば、水性または非水性ゲル、軟膏、油中水または水中油エマルジョン中に溶解または分散されたものを含む。そのようなビヒクルの構成物質は、水、水性バッファー溶液、非水性溶媒(エタノール、イソプロパノール、ベンジルアルコール、2-(2-エトキシエトキシ)エタノール、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノラウレート、グリコフロールまたはグリセロールなど)、油(例えば、液体パラフィンなどの鉱油、Miglyol(商標)などの天然もしくは合成トリグリセリド、またはジメチコンなどのシリコーン油)を含んでもよい。製剤の性質ならびにその意図される使用および適用部位に応じて、用いられる皮膚科学的ビヒクルは、以下のもの：可溶化剤または溶媒(例えば、ヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリンなどのβ-シクロデキストリン、またはエタノール、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのアルコールもしくはポリオール)；増粘剤(例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはカルボマー)；ゲル化剤(例えば、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマー)；保存剤(例えば、ベンジルアルコール、塩化ベンズアルコニウム、クロルヘキシジン、クロルブトール、安息香酸塩、ソルビン酸カリウムまたはEDTAもしくはその塩)；ならびにpH緩衝剤(リン酸二水素とリン酸水素塩との混合物、またはクエン酸とリン酸水素塩との混合物など)から選択される1つ以上の成分(例えば、製剤が水性ゲルである場合、水に加えた成分)を含有してもよい。
【００６３】
製薬上許容し得る担体を本発明の製剤中に含有させてもよく、それは当業界で従来使用されている任意の担体であってもよい。その例としては、水、低級アルコール、高級アルコール、多価アルコール、単糖類、二糖類、多糖類、炭化水素油、脂肪および油、ワックス、脂肪酸、シリコーン油、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、シリコーン界面活性剤、ならびにそのような担体の水ベースの混合物およびエマルジョンベースの混合物が挙げられる。本明細書で使用される用語「製薬上許容し得る」または「製薬上許容し得る担体」は、望ましくない生物学的効果または製剤の他の成分との望ましくない相互作用を引き起こすことなく、医薬製剤中に含有させることができる化合物または組成物を指し、本明細書で使用される「担体」または「ビヒクル」とは、局所適用される組成物中への組込みにとって好適な担体材料を指す。本明細書において有用な担体およびビヒクルは、非毒性的であり、有害な様式でそれが含有される製剤の他の成分と相互作用しない、当業界で公知の任意のそのような材料を含む。用語「水性」とは、水を含有するか、または皮膚もしくは粘膜組織への適用後に水を含有するようになる製剤を指す。
【００６４】
クリーム基剤は、水で洗浄可能であり、油相、乳化剤、および水性相を含有する。「内部」相とも呼ばれる油相は、一般的には、ワセリンおよびセチルまたはステアリルアルコールなどの脂肪アルコールを含む。水性相は通常、必須ではないが、体積において油相を上回り、一般的には、保湿剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は、一般的には、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性界面活性剤である。
【００６５】
ローションは、摩擦なしに皮膚表面に適用される調製物であり、典型的には、活性薬剤を含む粒子が水またはアルコール基剤中に存在する液体または半液体の調製物である。ローションは通常、固体の懸濁液であり、好ましくは、水中油型の液体油性エマルジョンを含む。ローションは、より多くの液体組成物を適用することが容易なため、大きい体面積を処置するための本明細書における好ましい製剤である。ローション中の不溶性物質が微細に分割されることが一般に必要である。ローションは、典型的には、より良好な分散をもたらすための懸濁化剤ならびに活性薬剤を皮膚と接触するように局在化させ、保持するのに有用な化合物、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチル-セルロースナトリウムなどを含有することとなる。溶液（剤）は、溶解された物質の分子が溶媒の分子の間に分散されるように、1つ以上の化学物質(溶質)を液体中に溶解することによって調製される均一な混合物である。溶液（剤）は、溶質を緩衝化する、安定化する、または保持するための他の製薬上または化粧上許容し得る化学物質を含有してもよい。溶液（剤）を調製する際に使用される溶媒の一般的な例は、エタノール、水、プロピレングリコールまたは任意の他の許容し得るビヒクルである。勿論周知の通り、ゲルは半固体の懸濁液型系である。単相ゲルは、典型的には、水性であるが、好ましくは、アルコール、および必要に応じて、油も含有する、担体液体を通じて実質的に均一に分布した有機高分子を含有する。好ましい有機高分子、すなわち、ゲル化剤は、「カルボマー」ファミリーのポリマー、例えば、Carbopolの商標の下で商業的に入手できるカルボキシポリアルキレンなどの架橋アクリル酸ポリマーである。また、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリビニルアルコールなどの親水性ポリマー；ヒドロキシ-プロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロースフタレート、およびメチルセルロースなどのセルロース系ポリマー；トラガカントおよびキサンタンゴムなどのゴム；アルギン酸ナトリウム；ならびにゼラチンも好ましい。均一なゲルを調製するために、アルコールもしくはグリセリンなどの分散剤を添加するか、またはゲル化剤を、磨砕、機械的混合もしくは撹拌、またはその組合せによって分散させることができる。軟膏は、これも当業界で周知の通り、典型的には、ワセリンまたは他の石油誘導体に基づく半固体調製物である。使用される特定の軟膏基剤は、当業者には理解されるように、いくつかの望ましい特徴、例えば、皮膚軟化性などを提供するものである。他の担体またはビヒクルと同様、軟膏基剤は、不活性であり、安定であり、非刺激性であり、非感作性であるべきである。Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版 (Easton, PA: Mack Publishing Co., 1995)、pages 1399-1404に説明されたように、軟膏基剤を、4つのクラス：脂肪性基剤；乳化性基剤；エマルジョン基剤；および水溶性基剤に分類することができる。脂肪性軟膏基剤としては、例えば、植物油、動物から得られる脂肪、および石油から得られる半固体炭化水素が挙げられる。
【００６６】
吸収性軟膏基剤としても知られる、乳化性軟膏基剤は、水をほとんど含有しないか、または全く含有せず、例えば、硫酸ヒドロキシステアリン、無水ラノリン、および親水性ワセリンを含む。
【００６７】
エマルジョン軟膏基剤は、油中水(W/O)エマルジョンまたは水中油(O/W)エマルジョンであり、例えば、アセチルアルコール、モノステアリン酸ステアリル、ラノリン、およびステアリン酸を含む。好ましい水溶性軟膏基剤は、変化する分子量のポリエチレングリコールから調製される；さらなる情報については、Remington: The Science and Practice of Pharmacyを参照されたい。
【００６８】
ペーストは、活性薬剤が好適な基剤中に懸濁された半固体剤形である。基剤の性質に応じて、ペーストは、脂肪ペーストまたは単相水性ゲルから作られたものの間に分割される。脂肪ペースト中の基剤は、一般的には、ワセリンまたは親水性ワセリンなどである。単相水性ゲルから作られたペーストは、一般的には、基剤としてカルボキシメチルセルロースなどを含む。
【００６９】
促進剤は、典型的には、「可塑化」促進剤と呼ばれる親油性共促進剤、すなわち、約150〜1000の範囲の分子量、約1wt%未満、好ましくは、約0.5wt%未満、最も好ましくは、約0.2wt%未満の水性溶解度を有する促進剤である。可塑性促進剤のヒルデブラント溶解パラメータδは、約2.5〜約10の範囲、好ましくは、約5〜約10の範囲にある。好ましい親油性促進剤は、脂肪エステル、脂肪アルコール、および脂肪エーテルである。特定の最も好ましい脂肪酸エステルの例としては、ラウリン酸メチル、オレイン酸エチル、モノラウリン酸プロピレングリコール、ジラウリン酸プロピレングリコール、モノラウリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール、イソプロピルn-デカノエート、およびミリスチン酸オクチルドデシルが挙げられる。脂肪アルコールとしては、例えば、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールが挙げられるが、脂肪エーテルとしては、ジオールまたはトリオール、好ましくは、C2〜C4アルカンジオールまたはトリオールが1個または2個の脂肪エーテル置換基で置換された化合物が挙げられる。さらなる浸透促進剤は、局所薬物送達の当業者には公知である、ならびに/または関連のある教科書および文献に記載されている。例えば、Percutaneous Penetration Enhancers、Smithら(編) (CRC Press, 1995)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
【００７０】
上記で同定されたものに加えて、様々な他の添加剤を、本発明の組成物中に含有させることができる。これらのものとしては、限定されるものではないが、酸化防止剤、収斂剤、香料、保存剤、皮膚軟化剤、色素、染料、保湿剤、推進剤、および日焼け防止剤、ならびに存在が製薬上望ましいか、または別途望ましいものであってよい他のクラスの材料が挙げられる。本発明の製剤中への含有のための必要に応じた添加剤の典型例は、以下の通りである：ソルベートなどの保存剤；イソプロパノールおよびプロピレングリコールなどの溶媒；メントールおよびエタノールなどの収斂剤；ポリアルキレンメチルグルコシドなどの皮膚軟化剤；グリセリンなどの保湿剤；ステアリン酸グリセロール、PEG-100ステアリン酸、ポリグリセリル-3-ヒドロキシラウリルエーテル、およびポリソルベート60などの乳化剤；ソルビトールおよびポリエチレングリコールなどの他のポリヒドロキシアルコール；桂皮酸オクチルメトキシル(Parsol MCXとして商業的に入手可能)およびブチルメトキシベンゾイルメタン(Parsol 1789の商標の下で入手可能)などの日焼け防止剤；アスコルビン酸(ビタミンC)、a-トコフェロール(ビタミンE)、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、δ-トコフェロール、ε-トコフェロール、ζι-トコフェロール、ΖΛ-トコフェロール、η-トコフェロール、およびレチノール(ビタミンA)などの酸化防止剤；エッセンシャルオイル、セラミド、必須脂肪酸、鉱油、植物油(例えば、大豆油、ヤシ油、シアバターの液体画分、ヒマワリ油)、動物油(例えば、ペルヒドロスクアレン)、合成油、シリコーン油またはワックス(例えば、シクロメチコンおよびジメチコン)、フッ素化油(一般的には、ペルフルオロポリエーテル)、脂肪アルコール(例えば、セチルアルコール)、およびワックス(例えば、蜜蝋、カルナバ蝋、およびパラフィン蝋)；皮膚感触改変剤；ならびに膨潤粘土およびCarbopolの商標の下で商業的に得ることができる架橋カルボキシポリアルキレンなどの増粘剤およびストラクチュラント（構造化剤）。他の添加剤としては、皮膚(特に、角質層における皮膚の上層)の調子を整え、その水分含量の低下を遅延させることによってそれを柔らかく維持する、および/または皮膚を保護する材料などの有益な薬剤を含む。そのようなコンディショナーおよび保湿剤としては、例えば、ピロリジンカルボン酸およびアミノ酸；2,4,4’-トリクロロ-2-ヒドロキシジフェニルエーテル(トリクロサン)および安息香酸などの有機抗微生物剤；アセチルサリチル酸およびグリシルレチン酸などの抗炎症剤；レチノイン酸などの抗脂漏剤；ニコチン酸などの血管拡張剤；コウジ酸などのメラニン形成のインヒビター；ならびにそれらの混合物が挙げられる。さらなる追加の活性薬剤としては、例えば、アルファヒドロキシ酸、アルファケト酸、ポリマー性ヒドロキシ酸、保湿剤、コラーゲン、海洋抽出物、ならびにアスコルビン酸(ビタミンC)、a-トコフェロール(ビタミンE)、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、δ-トコフェロール、ε-トコフェロール、ζι-トコフェロール、ζ2-トコフェロール、η-トコフェロール、およびレチノール(ビタミンA)などの酸化防止剤、ならびに/または製薬上許容し得るその塩、エステル、アミド、もしくは他の誘導体が挙げられる。好まし���トコフェロール化合物は、α-トコフェロールである。追加の薬剤としては、例えば、両方ともLancaster Group AGに割り当てられた、GrossらのWO94/00098およびGrossらのWO94/00109(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載された、皮膚組織への酸素供給を改善することができるものが挙げられる。日焼け防止剤およびUV吸収化合物を含有させることもできる。そのような日焼け防止剤およびUV吸収化合物の非限定例としては、アミノ安息香酸(PABA)、アボベンゾン、シノキサート、ジオキシベンゾン、ホモサレート、メンチルアントラニレート、オクトクリレン、メトキシ桂皮酸オクチル、サリチル酸オクチル、オキシベンゾン、パディメートO、フェニルベンズイミダゾール硫酸、スリソベンゾン、二酸化チタン、サリチル酸トロラミン、酸化亜鉛、エンスリゾール、メラジレート、オクチノキサート、オクチサレート、およびオクトクリレンが挙げられる。その全体が本明細書に組み込まれる、Title 21. Chapter 1. Subchapter D. Part 352. 「Sunscreen drug products for over-the-counter human use」を参照されたい。他の実施形態は、本発明の製剤を用いた処置を容易にする、様々な非発癌性、非刺激性の治癒材料を含んでもよい。そのような治癒材料は、栄養素、ミネラル、ビタミン、電解質、酵素、ハーブ、植物エキス、腺エキスもしくは動物エキス、または皮膚障害の治癒を容易にするために製剤に添加することができる安全な治療剤を含んでもよい。
【００７１】
本発明は、化粧品の分野で従来使用されているものと等価であり、例えば、局所製剤の総重量の約0.01%〜約20%の範囲である、これらの様々な添加剤の量を企図する。
【００７２】
本発明の製剤はまた、乳白化剤、香料、着色料、安定化剤、界面活性剤などの従来の添加剤を含んでもよい。ある特定の実施形態では、保存時の腐敗を防ぐため、すなわち、酵母およびカビなどの微生物の増殖を阻害するために、抗微生物剤などの他の薬剤を添加することもできる。
【００７３】
本発明のための好適な抗微生物剤としては、限定されるものではないが、p-ヒドロキシ安息香酸のメチルおよびプロピルエステル(すなわち、メチルおよびプロピルパラベン)、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、イミド尿素、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるものが挙げられる。他の実施形態では、リプレッサーおよびインデューサー、すなわち、目的のポリペプチドの産生を阻害する(すなわち、グリコース)または誘導する(すなわち、キシロース)ための他の薬剤を添加することもできる。そのような添加剤が製剤の機能と適合し、それを阻害しないという条件で、それらを使用することができる。
【００７４】
製剤はまた、投与される化学物質、または組成物の他の成分からもたらされる皮膚刺激または皮膚損傷の可能性を最小化するか、または除去するための刺激緩和性添加剤を含有してもよい。
【００７５】
好適な刺激緩和性添加剤としては、例えば、a-トコフェロール；モノアミンオキシダーゼインヒビター、特に、2-フェニル-1-エタノールなどのフェニルアルコール類；グリセリン；サリチル酸塩；アスコルビン酸塩；モネンシンなどのイオノフォア；両染性アミン；塩化アンモニウム；N-アセチルシステイン；カプサイシン；およびクロロキンが挙げられる。刺激緩和性添加剤は、存在する場合、刺激または皮膚損傷を緩和するのに有効な濃度で組成物中に含有させることができ、典型的には、製剤の約20wt%以下、より典型的には、約5wt%以下を占める。ある特定の実施形態において本製剤中に含有させ、かくして、活性薬剤と共に局所的に適用することができるさらなる好適な薬理活性物質としては、限定されるものではないが、以下のもの：有色素性または非有色素性の年齢によるシミ、角質繊維、およびシワを改善または根絶する薬剤；抗微生物剤；抗細菌剤；かゆみ止め剤および乾燥防止剤；抗炎症剤；局部麻酔剤および鎮痛剤；コルチコステロイド；レチノイド；ビタミン；ホルモン；ならびに代謝拮抗剤が挙げられる。局所薬理活性物質のいくつかの例としては、アシクロビル、アンホテリシン、クロルヘキシジン、クロトリマゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ミコナゾール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、ナイスタチン、ネオマイシン、カナマイシン、フェニトイン、パラアミノ安息香酸エステル、メトキシ桂皮酸オクチル、サリチル酸オクチル、オキシベンゾン、ジオキシベンゾン、トコフェロール、酢酸トコフェロール、セレンスルフィド、亜鉛ピリチオン、ジフェニルヒドラミン、プラモキシン、リドカイン、プロカイン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、クロタミトン、ヒドロキノンならびにそのモノメチルおよびベンジルエーテル、ナプロキセン、イブプロフェン、クロモリン、レチノール、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、コールタール、グリセオフルビン、エストラジオール、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン21-酢酸、ヒドロコルチゾン17-吉草酸、ヒドロコルチゾン17-酪酸、プロゲステロン、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノニド、クロベタゾールプロピオン酸エステル、ミノキシジル、ジピリダモール、ジフェニルヒダントイン、過酸化ベンゾイル、および5-フルオロウラシルが挙げられる。クリーム、ローション、ゲル、軟膏、ペーストなどを、罹患した表面上に広げ、優しく塗り込むことができる。溶液剤を同じように適用することができるが、より典型的には、スポイト、スワブなどを用いて適用し、罹患した領域に注意深く適用する。
【００７６】
適用レジメンは、状態の重症度および初期処置に対するその応答性などの、容易に決定することができるいくつかの因子に依存するが、通常は、1日あたり2回以上の適用を含まないであろう。当業者であれば、投与される製剤の最適量、投与方法および反復速度を容易に決定することができる。一般に、本発明の製剤を、週に1回または2回から最大で1日1回の範囲で適用することが企図される。
【００７７】
方法
処置方法
本発明は、皮膚疾患を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に、本発明の組換え治療融合タンパク質を発現することができる遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌を投与することによって、対象を処置することを含む、方法を提供する。いくつかの態様においては、本発明は、皮膚疾患を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に、本明細書に記載のフィラグリンポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態においては、フィラグリンポリペプチドは、融合タンパク質である。さらなる実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７８】
一実施形態においては、疾患は、アトピー性皮膚炎である。
【００７９】
一実施形態においては、疾患は、尋常性魚鱗癬(IV)である。IVの臨床的特徴は通常、約2ヶ月齢で出現し、全身の乾燥および微細な白色から灰色の鱗屑を含み、腹部、胸部、および四肢の伸筋表面で顕著である。IVは一般的に、一方または両方の親から受け継がれる遺伝子変異によって引き起こされる。魚鱗病または魚皮病とも呼ばれることもある、尋常性魚鱗癬の鱗屑は、誕生時に存在し得るが、通常は、幼児期に初めて出現する。一実施形態においては、処置される対象は、小児である。アレルギー性皮膚状態である湿疹などの他の皮膚疾患が、尋常性魚鱗癬と関連することもある。
【００８０】
さらに別の好ましい実施形態においては、組換え治療融合タンパク質は、フィラグリンを含む。他の実施形態においては、組換え治療融合タンパク質は、細胞透過性ペプチドに機能し得る形で連結されたフィラグリンを含む。一実施形態においては、フィラグリン融合タンパク質は、配列番号1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８１】
さらなる実施形態においては、組換え治療融合タンパク質は、移行シグナルに機能し得る形で連結されている。
【００８２】
キット
本発明は、キットも提供する。一態様においては、本発明のキットは、(a)本発明の組成物および(b)その使用のための指示書を含む。別の態様においては、本発明のキットは、(a)本発明の生きた生物治療組成物のいずれか1つ、および(b)その使用のための指示書を含む。本発明の組成物は、上記のものである。いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、上記のような、治療的に関連する組換え融合ポリペプチドを発現することができる、操作された微生物である。好ましい実施形態においては、組成物は、フィラグリンを含む組換え融合ポリペプチドを発現することができる、操作された細菌(例えば、表皮ブドウ球菌)を含む。
【００８３】
本発明を、さらなる限定と解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに例示する。本出願を通して引用される全ての図面ならびに全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図面は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００８４】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の範囲内にある実施形態をさらに説明および実証する。実施例は、単に例示のために与えられるものであり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その多くの変更が可能であるため、本発明の限定と解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００８５】
液体培地中での形質転換された細菌の増殖特性の定量化および比較
形質転換された表皮ブドウ球菌(SE)が野生型SEに対して競合する能力の基本的理解を得ることが重要であった。形質転換された細菌の増殖特性および組換え体であるタンパク質産生細菌の増殖動力学を理解するために、液体培地中での標準的な増殖方法を使用した。SE-sGFP、SE-chl(空のベクター対照、クロラムフェニコール(chl)に対して耐性)、および野生型SEの間の増殖差を決定するために、それぞれの株を、100mL培養物中で6時間、別々に増殖させた。45分毎に(SEのおよその倍加時間)、1mLの試料を採取し、600nmで測定して、細菌の総濃度の測定値を得た。増殖特性を理解するために、全試料にわたって光密度を比較した。
【００８６】
結果を、図1に示す。図1に示されるように、タンパク質産生は、CFU測定値によって決定された場合、SEと比較したSE-GFPの競合的増殖をわずかだけ減少させた。増殖の減少は、タンパク質産生SEにおける代謝要求の増加に起因すると予想される。
【実施例２】
【００８７】
再構成されたヒト表皮(RHE)上でのSE-GFPおよび対照株の増殖の定量化
細菌を皮膚に適用する実現可能性を特徴付けるために、in vitro皮膚モデル上に外部的に適用される細菌の増殖動力学を決定した。このモデルは、これらの細菌がヒトの皮膚上で遭遇する生態的競争の第1近似を提供した。RHE培養物を確立し、抗生物質および抗真菌剤を含まない培地(必要に応じてクロラムフェニコールを補給した)中で維持した。50%グリセロール中に懸濁したSE-sGFPを、ピペットを用いて、RHEの中心3mm直径に適用した。SE-chlおよびSE-WT細菌と共に対照RHEも、実験アームと共に適用した。所定の時点で、組織挿入物を取り出し、ホモジェナイズし、40μmフィルターを通過させて、細菌流出液の収集を可能にした。細菌懸濁液をスピンダウン（遠心沈降）し、培地中に再懸濁し、連続希釈し、塗布して、細菌のCFUを決定した。全ての測定値を、適用の15分後に存在するCFUによって決定される細菌の最大回収率に対して正規化した。
【００８８】
結果を、図2に示す。図2に示されるように、SE-GFPは、RHE上に別々に適用された場合、空のベクターを含むSEよりもゆっくりと増殖した。対照SEの増殖は24時間までにプラトーに達するが、SE-GFP細菌は48時間までにプラトーに達し、最終計数は、約1/2log低い。ヒト皮膚上での競合をシミュレートするために一緒に添加した場合、ベクターのみを含むSEは、タンパク質産生SEより多く増殖し、それをわずかに打ち負かし、少なくとも1logのCFU差を示した(図2)。これらの結果は、上記のものと共に、タンパク質産生SEが、臨床設定において皮膚に定着する時にわずかな欠点を有し、増殖および競合を容易にするためにさらなる遺伝的改変を必要とし得るという結論を導いた。しかしながら、実施例3に示されるように、これらの細菌は、皮膚モデルに良好に定着することができる。
【実施例３】
【００８９】
RHE上でのSE-GFPおよび対照株の増殖の定性的特性評価
この実験の目的は、RHEおよびVivascopeを用いて、SE-GFPの定着に関する空間的および時間的情報を追加することであった。SE-GFPを3.5時間にわたってRHEに適用し、4.75μm段階およびレーザー出力の線形増大を用いて、2mm x 2mmの幅および100μmの深さの3つの標準化された領域中で反射率および蛍光モードで試料を画像化した。超音波ゲル(Parker Laboratories)を用いて、対象物とガラス試料プレートとの間の屈折率を保持した。重要なことに、AD患者における損傷した皮膚の超構造を模倣するために、RHEをDerma Microneedleデバイスで意図的に穿刺して、損傷した皮膚の存在下での細菌の局在化を決定した。その結果、108CFUで適用され、3.5時間で増殖した細菌が、最大で70μmの深さで穿刺箇所に局在化することが示された(矢印、図3Bおよび図3C)。これは、局所適用された細菌が、損傷した皮膚の領域に向かって進むことができることを提唱する。
【００９０】
これらの実験の結果、改変された細菌が、角質層の表面および深溝に向かって進み、実験経過にわたって一定の存在を維持することが示された。これらの実験により、SEが皮膚バリアの欠陥に向かって進むことも示され、これは、本発明者らがAD患者において予想するように、本発明者らの細菌が、損傷した皮膚により深く定着することを提唱する(図3A〜C)。
【実施例４】
【００９１】
in vitroモデル系を用いた、細菌により分泌されたsGFPの皮膚への送達の特性評価
SEにより産生されるｓGFPの単離
タンパク質を、SEの225mLの培養物(2.7〜2.9OD/mL)から精製し、CellB-Lyse(Sigma)を用いて溶解した。4mLの溶出液が産生され、pH7.4のBPSバッファー中、Ni-NTAカラムから500mMイミダゾールと共に泳動したところ、225mLのSEあたり0.4mgが得られた。精製されたsGFPのSDS-PAGEゲルを、図4に示す。
【００９２】
バルク精製されたsGFPおよびsGFP+RMRのRHEへの送達の特性評価ならびにSE-GFPリポーターおよび対照株からのsGFPタンパク質の細胞コンパートメントおよび浸透の深さの特性評価
3つの重要な疑問：(1)sGFP+RMRが角質層に浸透するか（入り込むか）；(2)もしそうなら、どれぐらいの深さでそれが検出されるか；および(3)浸透の動力学が何であるかに答えるために、精製されたsGFPおよびsGFP+RMRの局在化を試験した。
【００９３】
5.0μgのGFP+/-RMRをRHEに適用した。2光子顕微鏡観察および共焦点画像化を用いて、30分および60分での効果を検査し、浸透および動力学を検査した。重要なことに、ヒト細胞に浸透するRMRの効果に起因するGFPの細胞内局在化、ならびに皮膚浸透を容易にするRMRの効果に起因するGFPの経皮局在化の両方を検査した。
【００９４】
これらの実験の結果、RMRを含まないGFPがRHEに効率的に浸透しないことが示された(図5A、B、E、F)。しかしながら、RMRシグナルを含まないGFP(図5E、F、K)と比較して、同じ量のGFP-RMRが組織中により深く送達されたが(図5G、H、J)、これは経皮浸透に関するRMRの有効性および必要性を支持している。さらに、タグを含まないGFP(図5A、B)と比較して、RMRを含むGFPがケラチノサイトに蓄積している証拠が見出され(図5C、D）、これは細胞内浸透を支持している。全体として、これらの結果は、RMRが本発明者らのタンパク質の経皮送達を促進することを示しており、これはフィラグリン産生SEで処置されたIV患者の皮膚にフィラグリンをより深い送達する上で極めて重要である。角質層をダーマローラーで破壊した後のGFPの深さおよび局在化を検査したところ、GFPが、破壊された領域に優先的に局在化し浸透することが見出された(図5O)。
【実施例５】
【００９５】
表皮ブドウ球菌からのヒトフィラグリン産生の分析方法の開発および最適化
フィラグリン定量化のための分析方法、ならびに前臨床およびその後の臨床開発に前進させるための最適なフィラグリンオリゴマーおよび配列を合理的に選択するための構造活性手法を開発した。
【００９６】
フィラグリン配列の合理的設計
両端で提唱されるリンカー領域によって挟まれた配列を含有するドメインであると考えられるものに基づくフィラグリン分子を、出発点として用いた。hFLGは、12個の反復ユニットを含み、細胞内プロテアーゼによってプロセッシングされ、個々のユニットを遊離する。フィラグリン構造の概観を、図6Eに提示する。ヒトフィラグリンドメインの相同性および配列同一性を研究するバイオインフォマティクス分析に関しては、図6A、Bを参照されたい。これらのユニット内の配列は、高度に相同性である。ユニットは「リンカー領域」で切断されることが提唱されている。これらのリンカー領域間のセグメントが個々のユニットであり、それぞれのユニットは一対のサブドメインを含有する。分子が高度に構造的に組織化されていないため、これらのユニットの空間的配向もトポグラフィーも決定されていない。Kyte-Doolittle疎水性スコアに基づいて、リンカー領域を、hFLGタンパク質中の最も親油性のアミノ酸セグメントと定義した(図6C、D)。
【００９７】
hFLGのSARを研究する努力において、そのリンカー領域によって挟まれたサブドメイン9および10を含有するユニット全体を、組換え的に生産した。したがって、ケラチン結合活性を担う最小タンパク質セグメントを同定するために、N末端領域が体系的に削り取られたタンパク質が調製されている。リンカー領域の役割も検査した。この疑問に対処するために、リンカー領域が配列内の中心にあるタンパク質を調製する。RMRペプチド配列を、図6Eに示し、図6Eは、RMRを介するGFPの送達の以前の特性評価(図5A〜N)に基づく。以下に記載されるように、同定された可能な配列の最適なフィラグリン配列を選択するための構造活性相関(SAR)に基づく手法を用いる。
【実施例６】
【００９８】
SEによって分泌されるフィラグリンの同定および定量化
フィラグリン分泌SE株のより後の前臨床および臨床開発にとって重要な、SEによって分泌されるフィラグリンを同定および定量する方法を開発した。
【００９９】
hFLGの抗体開発および免疫反応性検出
全ての対のサブドメインにわたって共通であるhFLGのエピトープに対する抗体(RL-012-001B、ニワトリIgY)を開発した。市販のフィラグリン抗体は有意な非特異的結合を示したため、これが必要であった。このIgY抗体は、フィラグリン産生SEの細胞溶解物およびその培地から単離されたフィラグリンのウェスタンブロット上でクリーンなバンドを示す(図7D)。IgYは、産生されたhFLGサブユニットのいくつかの異なる対を認識することができた(図7B〜D)。
【０１００】
質量分析(MS)
20ngのヒトフィラグリンセグメント9〜10の予備的LC-DDA(データ依存的獲得)MS/MS分析を、図7Eに提示する。フィラグリンの産生、分泌および送達がモニタリングされるため、これは、追跡することができるペプチド配列を同定する。
【０１０１】
タンパク質試料を50mMの重炭酸アンモニウムバッファー中に再懸濁し、37℃で一晩インキュベートすることによってトリプシンで消化する。次いで、試料を酸性化してトリプシン活性を停止させた後、C18スピンカラムを用いて脱塩し、次いで、その溶出液を減圧遠心分離下で乾燥し、0.1%ギ酸中に再懸濁する。得られるトリプシン消化物を、ナノ電子スプレー源を装備したOrbitrap-Fusion Tribrid質量分析装置に接続されたnanoACQUITY UPLCシステムを用いる逆相LC-DDA-MS/MSによって分析する。注入後、ペプチドを捕捉カラム中にロードした後、C18カラムを用いて分離する。
【０１０２】
3秒の最大合計サイクル時間でTop Speedデータ依存モードで動作する質量分析装置を用いて、LC-DDA-MS/MS分析を実施する。MS1フルスキャンの間に、前駆体イオンを四重極型質量分析計中で単離し、60mｓの最大注入時間、4x105の自動利得制御(AGC)標的値、およびm/z200での120,000のOrbitrap分解能を用いて記録する。フルスキャンを、300〜1500m/zの範囲で獲得した後、最も強力なイオンのMS2を獲得する。イオンを、1.6Thウィンドウで反復的に単離し、110msの最大注入時間、1x105のAGC標的で注入した後、28の高エネルギー衝突解離(HCD)を用いて断片化する。次いで、MS/MSスペクトルを、m/z200で60,000の分解能で記録する。単一の電荷を有するイオンまたは電荷状態が割り当てられていないイオンを、断片化から除外する。
【０１０３】
このアッセイの信頼性およびロバスト性（堅牢性）は、フィラグリン分泌SEを含む任意の最終的なLBPの生化学、製造、および制御にとって極めて重要である。MS分析方法の定量化は、以下の測定基準：(1)特異性；(2)感度(検出限界(LOD)および定量限界(LOQ))；および(3)直線性を用いる。これは、精製されたhFLGの参照標準および濃度範囲にわたる複数の試料の泳動を用いて達成されるであろう。図7Eに示されるように、特定のペプチドが検出可能であり、これらのいくつかを、必要に応じて、参照標準として合成的に調製することができる。
【実施例７】
【０１０４】
フィラグリンの活性を測定するためのケラチン結合アッセイ
ケラチン結合アッセイを用いて、フィラグリンの活性を測定する。これを、表面プラズモン共鳴(SPR)法(Biacore GE Healthcare)によって評価して、そのサイトケラチン相互作用に基づいて異なるフィラグリンセグメントを順位付ける。これは、結合親和性、特異性、濃度、および反応速度を測定して、フィラグリン-サイトケラチン結合動力学を検査する。この方法によってもたらされる予想される測定基準は、Kon、KoffおよびKdを含む。hFLGを相互作用することが知られる、サイトケラチン1および10から出発して、異なるヒトサイトケラチンを評価する。本発明者らの現在のフィラグリン9〜10構築物を用いてアッセイを開発し、これを用いて、さらなるフィラグリン配列を測定して、SAR分析を指導する。アッセイのワークフローを、図8に提示する。
【実施例８】
【０１０５】
構造活性相関(SAR)によるヒトフィラグリンの最適化
上記の、および図6に示される方法に基づいて、残りの11個のフィラグリンドメインを試験し、上記方法(すなわち、ウェスタンブロット、MS、および表面プラズモン共鳴(SPR)タンパク質間相互作用アッセイ)によって概略されたように、同一性および活性のマトリックスを生成する。タンパク質配列と、in vitro活性との相関は、潜在的な治療剤として生産されるタンパク質の選択を指導する。
【実施例９】
【０１０６】
分析方法開発の実行および表皮ブドウ球菌からヒト皮膚モデルへのヒトフィラグリン送達の最適化
より後の薬物動態(PK)の特性評価にとって重要な、フィラグリンの検出および分布のためのアッセイを開発する。これは、無傷の、および分解産物を検出するための、MS(上記のもの)を用いる、フィラグリン産生SEからの、ヒト皮膚モデル(再構成されたヒト表皮)ならびにマウス皮膚におけるフィラグリン分布の特性評価、ならびに免疫蛍光分析および免疫組織化学分析を含む。フィラグリン分解産物の測定もまた、フィラグリンの活性の特性評価、すなわち、フィラグリンの内在化およびプロセッシングを補完するであろう。さらに、ラマン分光法を含む、フィラグリン分解産物を検出するためのアッセイを開発する。
【０１０７】
Flg-/-再構成されたヒト表皮(RHE)
EpiDermとしてブランド化された、フィラグリンがKOされた再構成されたヒト表皮を、MatTek(Ashland、MA)から購入する。Epidermモデルは、単一のドナーの新生児包皮または成体乳房皮膚に由来する正常ヒト上皮ケラチノサイト(NHEK)から構築される。このモデルは、空気-液体境界面に露出したMillicell CM(Millipore)上で増殖させた9mm直径の組織試料として供給される。Epidermは、合計8〜12層の基底、棘状、および粒状分化ならびに10〜15層の角質層を要約する。組織学的、代謝的、および遺伝的に、Epidermはヒト皮膚との優れた一致性を提供する。モデルは、最大3週間にわたって形態を維持する。ケラチノサイトにおけるフィラグリンノックダウンは、フィラグリンのshRNAレンチウイルスに基づくノックダウンによって達成される。この目的のためには、推定で96個のRHE試料が必要であろう。
【０１０８】
マウスモデル
野生型BALB/cマウスとflg-/-マウスの両方を用いる。BALB/cマウスはJackson Laboratory, Bar Harbor, MEから購入し、flg-/-マウスはRiken Laboratory(Nagaski、Japan)からAzitraによって取得されたものである。この目的のためには、推定で22匹のBALB/cおよび22匹のflg-/-が必要であろう。
【０１０９】
免疫蛍光および免疫組織化学
SEによって分泌されるフィラグリンの吸収および生体分布を理解および特性評価するために、免疫蛍光(IF)顕微鏡観察および免疫組織化学分析(IHC)を用いて、フィラグリン産生SEに由来するフィラグリンの局在化および分布を可視化する。これを行うために、flg-/-の再構成されたヒト表皮(RHE)を用いる。簡単に述べると、106〜108の範囲のコロニー形成単位(CFU)のフィラグリン産生SEをRHEおよびマウス皮膚に適用し、抗生物質なしに24時間インキュベートする。試料を、24、48、および72時間でIFおよびIHC分析のために3重反復にて固定し、未処置のRHEおよびマウス試料はこれらの分析のための陰性対照として働く。
【０１１０】
IFのために、試料を、70%エタノール、50mMグリシンで1時間にわたって固定する。本発明者らの開発された抗フィラグリン一次抗体(RL-012-001B)を1:200で2時間インキュベートした後、Hoechst Stain Solution (Sigma)の存在下で、ラット抗ヤギローダミン二次抗体(Jackson Laboratory)と共に1:200希釈でインキュベートすることにより、免疫蛍光染色を実施する。Gel/Mount (Biomed)中で、スライドにカバースリップを載せる。
【０１１１】
IHCのために、試料を10%ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋する。パラフィン切片を脱蝋し、95%エタノール、次いで、メタノール過酸化水素で洗浄する。次いで、切片を、齧歯類Decloaker溶液(Biocare Medical、RD913)およびBiocareのクローキング解除チャンバーを用いる熱誘導エピトープ賦活化(HIER)手順を用いて処理する。Tris pH7.4中で洗浄した後、切片を、ラット血清およびFcBlock(24G2)の存在下でインキュベートした後、ブロッキング溶液中でウサギ抗表皮ブドウ球菌を希釈する。試料をTris中で洗浄した後、ヤギ抗ウサギIgG-Texas Red抗体(Invitrogen、T2767)と共にインキュベートする。次いで、組織をHOECSHTで対抗染色し、Leica DM IRBE蛍光顕微鏡を用いて画像化する。
【０１１２】
ラマン分光法
ラマン分光法は、フィラグリンのNMF分解産物を同定するための公知の方法である62。最終分化の間に、プロフィラグリンは急速に脱リン酸化され、切断されて、機能的なフィラグリンモノマーとなり、ケラチン中間フィラメントに結合し、集合する63、64。脱イミノ化されたフィラグリンモノマーの切断は、カスパーゼ1465、カルパイン1、およびブレオマイシンヒドロラーゼ66を含む、いくつかのプロテアーゼによって触媒される。次いで、フィラグリンは天然保湿成分(NMF)、特に、ウロカニン酸(UA)、ピログルタミン酸(PGA)およびシトルリン(CIT)に分解される62。
【０１１３】
ラマン分光法を用いて、flg-/-RHEモデルおよびマウス皮膚中のフィラグリン分解産物を同定する。ラマン効果は、光子と分子との非弾性衝突に起因する光子エネルギーのシフトからなる。ラマンスペクトルは、入射光と散乱光との間の周波数差の関数としての散乱強度を示す；この差異は「ラマンシフト」として知られる。初期のラマン分光法は、フィラグリンの分解産物、NMFを同定するために開発された。組織の破壊の試料調製を行うことなく、皮膚(RHE)を直接観察することができる。この時点で、市販の標準の試料を用いて、方法を試験し、この結果を図9A〜Dに示す。
【０１１４】
ラマン分光法は、最適化された場合、マイクロモル濃度を検出することができる。好適な材料(金または銀のいずれか)のナノ粒子を皮膚試料上に置くことができる、表面増強されたラマン分光法を用いて、ナノモル濃度の検出レベルが可能である。これらの粒子は表面プラズモン共鳴を受け、かくして、ラマン分析の感度を有意に増大させる。これを用いて、RHEに局所的に適用されたフィラグリン産生SEに由来するフィラグリン分解を同定する。108コロニー形成単位(CFU)のフィラグリン産生SEをRHEに適用し、抗生物質なしに24時間インキュベートする。ラマン分光法を用いて様々な時点で試料を収集および分析して、NMF分解産物を同定する。
【０１１５】
質量分析
フィラグリンの代謝を評価および特性評価するために、質量分析を用いる。NMF分子の市販の標準であるウロカニン酸(UA)、ピログルタミン酸(PGA)およびシトルリン(CIT)の検出を、AB Sciex API4000 QTrapとカップリングしたAgilent HP1200質量分析装置を用いて実施した。UA、PGAおよびCITの標準を、Sigma-Aldrichから購入し、Agilent Eclipse XDB C18カラム(3.5u、2.1x100mm)を用いて分離し、分光計に注入し、MRM(多反応モニター)および二次イオン質量分析法(SIMS)によって検出した。SIMSは、MRMよりも約10倍高感度であるようであった。UA、PCAおよびCITの定量限界(LOQ)は、それぞれ、0.5、1、および0.25ng/mLであり、標準曲線は、0.99の相関係数を示した。RHE実験においてFLGからのNMFの産生について試験する場合、RHE組織試料をホモジェナイズし、過塩素酸/アセトニトリルを用いて抽出し、得られた溶液を注入する。これらの結果の標準曲線を、図9E〜Gに示す。これらの予備的データは、おそらく、ラマン分光法よりもむしろMSを用いた場合だけで、CITが検出されるであろうことを示唆している。
【０１１６】
これらのパラメータを用いて、RHEに局所的に適用されたフィラグリン産生SEに由来するフィラグリン分解を測定する。108CFUのフィラグリン産生SEをRHEに適用し、抗生物質なしに24時間インキュベートする。MSを用いて様々な時点で試料を収集および分析して、NMF分解産物を検出する。このアッセイはまた、(1)特異性および感度；(2)正確性および精度；(3)上記の方法を用いるアッセイの限界を用いて定性化されるであろう。この結果は、2つのモデルにおけるフィラグリンの初期代謝および分布に関する情報を提供するであろう。
【実施例１０】
【０１１７】
マウスにおける候補フィラグリン分泌SEの定着動力学および活性の評価
遺伝的IVマウスモデル(Flg-/-)、ならびに野生型マウスを用いて、in vivoでFLGを産生するSEの定着動力学を評価する。
【０１１８】
マウスモデル
この手法の適用可能性を精査するために、遺伝的モデルマウス系を用いる。ファイラグリンノックアウトマウス(Flg-/-)。Flg-/-マウスは、フィラグリン欠損性であり、乾燥した、鱗状の皮膚を示す19。フィラグリン分解産物である、天然保湿成分の顕著な減少にも拘わらず、角質層(SC)の水分量およびTEWLは、Flg-/-マウスにおいて正常である。抗原はFlg-/-SCにより効率的に浸透し、ハプテン誘導性接触過敏性における増強された応答ならびに抗オブアルブミン(OVA)IgG(1)およびIgEのより高い血清レベルをもたらす。材料移動の合意を介してRIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC, Tsukuba, Ibaraki, Japan)からFlg-/-マウスが得られる。この実験においては、野生型マウス(BALB/c)も用いる。
【０１１９】
試験設計
図6Eからの設計されたフィラグリン配列を、Flg-/-およびBALB/cマウスに対してSEにおいて用いる。それぞれのマウス型における5つの群を用いて、4週にわたって試験を行う。マウスを、以下の処置群：局所ビヒクル対照(50%グリセロール、50%滅菌BHI培地)、局所野生型SE(50%グリセロール中の1.0x108CFU/cm2)、およびフィラグリン分泌SE構築物(SEFLG)のそれぞれの3つの用量(50%グリセロール中の106、107、および108CFU/cm2)に割り当てる。それぞれの溶液を、7日間にわたって毎日、それぞれのマウスの同じ耳および尾に適用し、マウスを、コロニー化動態を評価するために7、14、30および60日目に微生物叢分析について評価し、皮膚中の局在化および肉眼的変化(例えば、炎症などの有害事象の任意の兆候)などを評価するために7および14日目に顕微鏡および組織構造について評価する。マウス型あたり各アーム中12匹のマウスを用いる。試験設計の概観を図10に示す。
【実施例１１】
【０１２０】
フィラグリン分泌SEの適用後の定着動力学および持続性
微生物負荷、微生物多様性、および皮膚微生物叢の安定性に対するSEの添加の影響を理解するために、16S rRNA配列決定を用いて、微生物群の変化を測定する。皮膚微生物叢試料を、ベースライン(0日目)、7、14、30、および60日目にマウス尾皮膚に由来するフロックスワブを用いて収集する。The Jackson Laboratory for Genomic MedicineのOh Laboratoryによって開発された皮膚特異的カスタムプロトコールを用いて、DNAを抽出する。微生物負荷を測定するために、16S rRNA V1〜V3プライマーを用いるqPCRを、以前に記載されたように用いる。微生物群の動力学を検査するために、V1〜V3を増幅し、Illumina MiSeqプラットフォーム上で2x300bpのリード化学を用いて配列決定する。配列を、以前に記載されたように40、属レベルで分析し、操作的分類単位(OTU）を97%の類似性で定義する。ブドウ球菌種を区別するためのカスタムコンピューターツールを用いて、適用されるSEの相対的存在量を追跡する [Ohら、Genome Research 2013]67(図6)。
【０１２１】
生態学的測定基準および群落構造分析を用いて、腸内毒素症を測定する。第1に、腸内毒素症を、考慮する微生物群の生態学的尺度であるShannon Diversity Indexを用いて多様性の関数として評価し、適用の前後で比較する。さらに、処置の前後での局所微生物叢の群落構造を比較する。腸内毒素症を、(i)ベースライン微生物叢からの全体の逸脱(%)、および(ii)本発明者らの対照にわたる平均群落構造からの逸脱として測定する。群落構造を比較するYue-Clayton指数などの統計値を用いる。最後に、微生物叢の傾向を、種あたりのレベルで分析する。
【０１２２】
表皮ブドウ球菌は内因性微生物叢の除去をもたらすとは予想されないため、それぞれの種の長期的動力学を追跡して、50,000リード/試料の標的配列決定深度で種が群落から失われるかどうかを同定する。
【０１２３】
16S配列決定の実験的概略を、図11に示す。
【０１２４】
組織学および安全性分析
組織学分析を用いて、SEの局在化を検査し、ならびにプローブ安全性に対して評価し、炎症の任意の兆候をモニタリングする。各群の切り出された耳を4%パラホルムアルデヒド中で16h固定し、パラフィン中に包埋する。次いで、6μmの切片を、ヘマトキシリン(Sigma Aldrich、St Louis、MO、USA)およびエオシン(Sigma Aldrich、St Louis、MO、USA)(H&E)で染色する。真皮におけるリンパ球浸潤および線維化を、顕微鏡(100X、200X)によって観察する。
【０１２５】
統計分析
主要転帰の群、肉眼的臨床疾患スコア間の差異を、データが正規分布する場合、両側studentのt検定を用いて評価する。そうでない場合(例えば、微生物叢のデータ)、Wilcoxonの順位和検定などの非パラメータ等価物を用いる。群間の差異を、ANOVAまたは非パラメータ等価物(Kruskal-Wallis)を用いて評価する。TEWLおよび表皮の肥厚を評価するために、同じ技術を用いる。最後に、順序変数の差異を、カイ二乗検定を用いて評価する。偽発見率を用いる多重比較のために、必要に応じて、全てのP値を補正する。
【０１２６】
微生物叢の分析のために、サンプル間の群落変動を、定量的な、分類法に基づくYue-Clayton距離を用いて算出する。共通の種およびその存在量を加味する、2つのサンプル間の類似性を測定する測定基準である、ベータ多様性測定基準(例えば、Yue-Claytonシータ(θ)指数)を用いる。時系列内の各サンプル間のペアワイズ比較は、マウス内の長期的変化に関するベースラインを創出するであろう。連続するサンプルの各セットについて、θ指数を算出する。次いで、連続θとベースラインθとの比を、経時的な代理的不安定性に対する変動スコアとして用いる。これにより、長期的データにおける交絡因子であり得る、経時的な差異の総比較よりもむしろ、スライドウインドウに基づいて安定性をスコア化することができる。一般化されたLotka-Volterra非線形微分方程式63、64、時間依存的な一般化された付加モデル65またはGaussian Process Dynamical Model66などの非パラメータ法などの時系列データに関する動的システムモデルを精査する。個々の種について、Augmented Dickey-Fuller検定67などのモデルを用いて、種の恒常性を試験する。微生物の選択が時間的変化の大部分を占め得るため、これは、どの種が経時的な変化に寄与するかを決定する。
【０１２７】
統計分析
別途指摘しない限り、実験は3重反復にて実施し、平均および標準偏差を報告する。群間の比較のために、両側ｔ検定または分散分析を用いる。データが正規分布しない場合、これらのものを非パラメータ等価物(Wilcoxonの順位和およびKruskal-Wallis検定)と置き換える。
【０１２８】
安全性および「キルスイッチ」
臨床的使用のためのほぼ全ての組換え微生物の重要な要件は、他の個体または環境への望ましくない導入を防止する能力である。操作された株の安全性を確保するために、本発明は、一実施形態においては、生存のために重要なアミノ酸(D-ala)またはある特定の代謝遺伝子(AlaR)の補給を必要とし、選択のための抗生物質耐性株の必要性を同時に置き換える、栄養要求株を使用するが、後者は商業的に実現可能ではない。別の実施形態においては、本発明は、二重キシロース-リボスイッチプロモーターの誘導時にCRISPR/Cas9自己切断に基づく、「キルスイッチ」を組み込む。さらに別の実施形態においては、本発明は、規定の分裂回数後にAZT遺伝子座から組み換わる細胞計数器を提供するが、この方法は、ビヒクルの再適用を必要とする。本発明の操作された表皮ブドウ球菌の安全性を確保するために、キシロース誘導性であり、テオフィリンリボスイッチを用いて二重調節される、CRISPR/Cas9に基づくキルスイッチを開発した。この手法の基礎は、Cas9が標的化ガイドを与えられた染色体切断において極端に効率的であるということ、およびブドウ球菌が標準的な非相同末端結合修復経路を欠くため、ゲノム切断が、相同組換え鋳型の非存在下では細胞死をもたらすということである。CRISPRに基づく系の使用はまた、比較ゲノミクスを用いて、構築物が水平遺伝子導入によって他の微生物に拡散する場合に不活性となるような、本発明の操作された表皮ブドウ球菌株にとってユニークなガイドを設計することができるため、高い特異性を与える。最後に、一実施形態においては、本発明は、複数のゲノム領域を同時に標的化して、確実に切断し、復帰による生存を最小化するために複数のCRISPRスペーサーを発現するように設計された構築物を提供する。
【０１２９】
等価物
当業者であれば、日常的な実験を超えないものを使用して、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０１３０】
参考文献
1.  Wells RS, Kerr CB. Clinical features of autosomal dominant and sex-linked ichthyosis in an English population. British medical journal. 1966;1(5493):947-950.
2.  Hernandez-Martin A, Gonzalez-Sarmiento R, De Unamuno P. X-linked ichthyosis: an update. The British journal of dermatology. 1999;141(4):617-627.
3.  Marukian NV, Choate KA. Recent advances in understanding ichthyosis pathogenesis. F1000Research. 2016;5:F1000 Faculty Rev-1497.
4.  Oji V, Traupe H. Ichthyosis: clinical manifestations and practical treatment options. American journal of clinical dermatology. 2009;10(6):351-364.
5.  Sybert VP, Dale BA, Holbrook KA. Ichthyosis vulgaris: identification of a defect in synthesis of filaggrin correlated with an absence of keratohyaline granules. The Journal of investigative dermatology. 1985;84(3):191-194.
6.  Nirunsuksiri W, Presland RB, Brumbaugh SG, Dale BA, Fleckman P. Decreased Profilaggrin Expression in Ichthyosis Vulgaris Is a Result of Selectively Impaired Posttranscriptional Control. Journal of Biological Chemistry. 1995;270(2):871-876.
7.  Feinstein A, Ackerman AB, Ziprkowski L. Histology of autosomal dominant ichthyosis vulgaris and X-linked ichthyosis. Archives of dermatology. 1970;101(5):524-527.
8.  Osawa R, Akiyama M, Shimizu H. Filaggrin gene defects and the risk of developing allergic disorders. Allergology international : official journal of the Japanese Society of Allergology. 2011;60(1):1-9.
9.  Smith FJ, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, et al. Loss-of-function mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris. Nature genetics. 2006;38(3):337-342.
10.  Manabe M, Sanchez M, Sun TT, Dale BA. Interaction of filaggrin with keratin filaments during advanced stages of normal human epidermal differentiation and in ichthyosis vulgaris. Differentiation; research in biological diversity. 1991;48(1):43-50.
11.  Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, et al. Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis. Nature genetics. 2006;38(4):441-446.
12.  Weidinger S, Illig T, Baurecht H, et al. Loss-of-function variations within the filaggrin gene predispose for atopic dermatitis with allergic sensitizations. The Journal of allergy and clinical immunology. 2006;118(1):214-219.
13.  Marenholz I, Nickel R, Ruschendorf F, et al. Filaggrin loss-of-function mutations predispose to phenotypes involved in the atopic march. The Journal of allergy and clinical immunology. 2006;118(4):866-871.
14.  Sandilands A, Terron-Kwiatkowski A, Hull PR, et al. Comprehensive analysis of the gene encoding filaggrin uncovers prevalent and rare mutations in ichthyosis vulgaris and atopic eczema. Nature genetics. 2007;39(5):650-654.
15.  Gruber R, Elias PM, Crumrine D, et al. Filaggrin genotype in ichthyosis vulgaris predicts abnormalities in epidermal structure and function. The American journal of pathology. 2011;178(5):2252-2263.
16.  Man MQ, Hatano Y, Lee SH, et al. Characterization of a hapten-induced, murine model with multiple features of atopic dermatitis: structural, immunologic, and biochemical changes following single versus multiple oxazolone challenges. The Journal of investigative dermatology. 2008;128(1):79-86.
17.  Fallon PG, Sasaki T, Sandilands A, et al. A homozygous frameshift mutation in the mouse Flg gene facilitates enhanced percutaneous allergen priming. Nature genetics. 2009;41(5):602-608.
18.  Oyoshi MK, Murphy GF, Geha RS. Filaggrin-deficient mice exhibit TH17-dominated skin inflammation and permissiveness to epicutaneous sensitization with protein antigen. The Journal of allergy and clinical immunology. 2009;124(3):485-493, 493.e481.
19.  Kawasaki H, Nagao K, Kubo A, et al. Altered stratum corneum barrier and enhanced percutaneous immune responses in filaggrin-null mice. The Journal of allergy and clinical immunology. 2012;129(6):1538-1546.e1536.
20.  Brown SJ, McLean WH. One remarkable molecule: filaggrin. The Journal of investigative dermatology. 2012;132(3 Pt 2):751-762.
21.  Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature reviews Molecular cell biology. 2005;6(4):328-340.
22.  Miajlovic H, Fallon PG, Irvine AD, Foster TJ. Effect of filaggrin breakdown products on growth of and protein expression by Staphylococcus aureus. The Journal of allergy and clinical immunology. 2010;126(6):1184-1190.e1183.
23.  Vavrova K, Henkes D, Struver K, et al. Filaggrin deficiency leads to impaired lipid profile and altered acidification pathways in a 3D skin construct. The Journal of investigative dermatology. 2014;134(3):746-753.
24.  Jungersted JM, Scheer H, Mempel M, et al. Stratum corneum lipids, skin barrier function and filaggrin mutations in patients with atopic eczema. Allergy. 2010;65(7):911-918.
25.  Sakai T, Hatano Y, Zhang W, Fujiwara S. Defective maintenance of pH of stratum corneum is correlated with preferential emergence and exacerbation of atopic-dermatitis-like dermatitis in flaky-tail mice. Journal of dermatological science. 2014;74(3):222-228.
26.  Bandier J, Johansen JD, Petersen LJ, Carlsen BC. Skin pH, atopic dermatitis, and filaggrin mutations. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 2014;25(3):127-129.
27.  Ganemo A, Sjoden PO, Johansson E, Vahlquist A, Lindberg M. Health-related quality of life among patients with ichthyosis. European journal of dermatology : EJD. 2004;14(1):61-66.
28.  Ganemo A. Quality of life in Swedish children with congenital ichthyosis. Dermatology reports. 2010;2(1):e7.
29.  Dreyfus I, Pauwels C, Bourrat E, et al. Burden of inherited ichthyosis: a French national survey. Acta dermato-venereologica. 2015;95(3):326-328.
30.  Belkaid Y, Segre JA. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 2014;346(6212):954-959.
31.  Belkaid Y, Tamoutounour S. The influence of skin microorganisms on cutaneous immunity. Nature reviews Immunology. 2016;16(6):353-366.
32.  Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 2012;486(7402):207-214.
33.  Wikoff WR, Anfora AT, Liu J, et al. Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood metabolites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009;106(10):3698-3703.
34.  Salzman NH, Hung K, Haribhai D, et al. Enteric defensins are essential regulators of intestinal microbial ecology. Nat Immunol. 2010;11(1):76-82.
35.  Kau AL, Ahern PP, Griffin NW, Goodman AL, Gordon JI. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 2011;474(7351):327-336.
36.  Ravel J, Gajer P, Abdo Z, et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011;108 Suppl 1:4680-4687.
37.  Grice EA, Segre JA. The skin microbiome. Nature reviews Microbiology. 2011;9(4):244-253.
38.  Diaz Heijtz R, Wang S, Anuar F, et al. Normal gut microbiota modulates brain development and behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011;108(7):3047-3052.
39.  Weyrich LS, Dixit S, Farrer AG, Cooper AJ, Cooper AJ. The skin microbiome: Associations between altered microbial communities and disease. The Australasian journal of dermatology. 2015.
40.  Oh J, Byrd AL, Deming C, Conlan S, Kong HH, Segre JA. Biogeography and individuality shape function in the human skin metagenome. Nature. 2014;514(7520):59-64.
41.  Oh J, Freeman AF, Park M, et al. The altered landscape of the human skin microbiome in patients with primary immunodeficiencies. Genome research. 2013;23(12):2103-2114.
42.  Grice EA. The skin microbiome: potential for novel diagnostic and therapeutic approaches to cutaneous disease. Seminars in cutaneous medicine and surgery. 2014;33(2):98-103.
43.  Powers CE, McShane DB, Gilligan PH, Burkhart CN, Morrell DS. Microbiome and pediatric atopic dermatitis. The Journal of dermatology. 2015.
44.  Cogen AL, Yamasaki K, Sanchez KM, et al. Selective antimicrobial action is provided by phenol-soluble modulins derived from Staphylococcus epidermidis, a normal resident of the skin. J Invest Dermatol. 2010;130(1):192-200.
45.  Cogen AL, Yamasaki K, Muto J, et al. Staphylococcus epidermidis antimicrobial delta-toxin (phenol-soluble modulin-gamma) cooperates with host antimicrobial peptides to kill group A Streptococcus. PloS one. 2010;5(1):e8557.
46.  Monk IR, Shah IM, Xu M, Tan MW, Foster TJ. Transforming the untransformable: application of direct transformation to manipulate genetically Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. mBio. 2012;3(2).
47.  Wei W, Cao Z, Zhu YL, et al. Conserved genes in a path from commensalism to pathogenicity: comparative phylogenetic profiles of Staphylococcus epidermidis RP62A and ATCC12228. BMC genomics. 2006;7:112.
48.  Bose JL, Fey PD, Bayles KW. Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus. Applied and environmental microbiology. 2013;79(7):2218-2224.
49.  Siprashvili Z, Nguyen NT, Bezchinsky MY, Marinkovich MP, Lane AT, Khavari PA. Long-term type VII collagen restoration to human epidermolysis bullosa skin tissue. Hum Gene Ther. 2010;21(10):1299-1310.
50.  Johnson LN, Cashman SM, Read SP, Kumar-Singh R. Cell penetrating peptide POD mediates delivery of recombinant proteins to retina, cornea and skin. Vision Res. 2010;50(7):686-697.
51.  Hou YW, Chan MH, Hsu HR, et al. Transdermal delivery of proteins mediated by non-covalently associated arginine-rich intracellular delivery peptides. Exp Dermatol. 2007;16(12):999-1006.
52.  Aufenvenne K, Larcher F, Hausser I, et al. Topical enzyme-replacement therapy restores transglutaminase 1 activity and corrects architecture of transglutaminase-1-deficient skin grafts. Am J Hum Genet. 2013;93(4):620-630.
53.  Park J, Ryu J, Jin LH, et al. 9-polylysine protein transduction domain: enhanced penetration efficiency of superoxide dismutase into mammalian cells and skin. Mol Cells. 2002;13(2):202-208.
54.  Lim JM, Chang MY, Park SG, et al. Penetration enhancement in mouse skin and lipolysis in adipocytes by TAT-GKH, a new cosmetic ingredient. J Cosmet Sci. 2003;54(5):483-491.
55.  Schutze-Redelmeier MP, Kong S, Bally MB, Dutz JP. Antennapedia transduction sequence promotes anti tumour immunity to epicutaneously administered CTL epitopes. Vaccine. 2004;22(15-16):1985-1991.
56.  Lopes LB, Brophy CM, Furnish E, et al. Comparative study of the skin penetration of protein transduction domains and a conjugated peptide. Pharm Res. 2005;22(5):750-757.
57.  Nodake Y, Matsumoto S, Miura R, et al. Pilot study on novel skin care method by augmentation with Staphylococcus epidermidis, an autologous skin microbe - A blinded randomized clinical trial. Journal of dermatological science. 2015;79(2):119-126.
58.  Naik S, Bouladoux N, Linehan JL, et al. Commensal-dendritic-cell interaction specifies a unique protective skin immune signature. Nature. 2015;520(7545):104-108.
59.  Li D, Lei H, Li Z, Li H, Wang Y, Lai Y. A novel lipopeptide from skin commensal activates TLR2/CD36-p38 MAPK signaling to increase antibacterial defense against bacterial infection. PloS one. 2013;8(3):e58288.
60.  Lai Y, Cogen AL, Radek KA, et al. Activation of TLR2 by a small molecule produced by Staphylococcus epidermidis increases antimicrobial defense against bacterial skin infections. J Invest Dermatol. 2010;130(9):2211-2221.
61.  Naik S, Bouladoux N, Wilhelm C, et al. Compartmentalized control of skin immunity by resident commensals. Science. 2012;337(6098):1115-1119.
62.  Gonzalez FJ, Valdes-Rodriguez R, Ramirez-Elias MG, Castillo-Martinez C, Saavedra-Alanis VM, Moncada B. Noninvasive detection of filaggrin gene mutations using Raman spectroscopy. Biomedical optics express. 2011;2(12):3363-3366.
63.  Harding CR, Aho S, Bosko CA. Filaggrin - revisited. International Journal of Cosmetic Science. 2013;35(5):412-423.
64.  Sandilands A, Sutherland C, Irvine AD, McLean WH. Filaggrin in the frontline: role in skin barrier function and disease. Journal of cell science. 2009;122(Pt 9):1285-1294.
65.  Denecker G, Hoste E, Gilbert B, et al. Caspase-14 protects against epidermal UVB photodamage and water loss. Nature cell biology. 2007;9(6):666-674.
66.  Kamata Y, Taniguchi A, Yamamoto M, et al. Neutral cysteine protease bleomycin hydrolase is essential for the breakdown of deiminated filaggrin into amino acids. The Journal of biological chemistry. 2009;284(19):12829-12836.
67.  Oh J, Freeman AF, Program NCS, et al. The altered landscape of the human skin microbiome in patients with primary immunodeficiencies. Genome research. 2013;23(12):2103-2114.
【図１】
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【図２−１】
2021528041.tif 000005
【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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