(57)【要約】電気泳動の間に分子を保持するためのカセットは、その中に構成されるレーンを伴う、筐体を有する。レーンは、第１の伸長縁と、第２の伸長縁とを有し、溶出モジュールは、レーンの中に受容され、レーンを第１のチャンバと、第２のチャンバとに分割するように構成される。第１の緩衝液リザーバが、第１の伸長縁に隣接して位置付けられ、第２の緩衝液リザーバが、第２の伸長縁に隣接して位置付けられる。第１のチャンバに面する溶出モジュールの第１の側は、多孔性滅菌濾過膜を備える。第２のチャンバに面する溶出モジュールの第２の側は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する、限外濾過膜を備える。
2021510200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動の間に分子を保持するための分子保持カセットであって、前記カセットは、
筐体と、
前記筐体内に構成されるレーンであって、前記レーンは、第１の伸長縁と、第２の伸長縁とを有する、レーンと、
溶出モジュールであって、前記溶出モジュールは、前記レーンの中に受容され、前記レーンを第１のチャンバと、第２のチャンバとに分割するように構成される、溶出モジュールと、
前記第１の伸長縁に隣接して位置付けられる第１の緩衝液リザーバと、
前記第２の伸長縁に隣接して位置付けられる第２の緩衝液リザーバと
を備え、
前記第１のチャンバに面する前記溶出モジュールの第１の側は、多孔性滅菌濾過膜を備え、
前記第２のチャンバに面する前記溶出モジュールの第２の側は、限外濾過膜を備え、前記限外濾過膜は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する、カセット。
【請求項２】
前記第１のチャンバ内に構成される少なくとも１つの電極と、前記第２のチャンバ内に構成される少なくとも１つの電極とをさらに備える、請求項１に記載のカセット。
【請求項３】
前記限外濾過膜は、１５ｋＤａ限外濾過器である、請求項１に記載のカセット。
【請求項４】
前記溶出モジュールは、前記第１の緩衝液リザーバと前記第２の緩衝液リザーバとの間の中心に位置付けられる、請求項１に記載のカセット。
【請求項５】
前記溶出モジュールは、前記第１の緩衝液リザーバと前記第２の緩衝液リザーバとの間に位置付けられる、請求項１に記載のカセット。
【請求項６】
アガロースゲルをさらに含む、請求項１に記載のカセット。
【請求項７】
前記アガロースゲルは、前記多孔性滅菌濾過膜の隣に流し込まれる、請求項６に記載のカセット。
【請求項８】
前記アガロースゲルは、ゲルカラムを形成するように流し込まれ、前記ゲルカラムの寸法は、前記第１のチャンバの中への標的分子の損失を最小限にさせるように構成される、請求項７に記載のカセット。
【請求項９】
前記限外濾過膜の細孔サイズは、電気泳動の間にＤＮＡを保持するように構成される、請求項１に記載のカセット。
【請求項１０】
前記溶出モジュールは、前記溶出モジュールと、サンプルウェルとを備える、請求項１に記載のカセット。
【請求項１１】
前記溶出モジュールは、サンプルを受容するように構成される、請求項１に記載のカセット。
【請求項１２】
電気泳動の間に分子を保持するための分子保持カセットであって、前記カセットは、
筐体と、
前記筐体内に構成される複数のレーンであって、前記複数のレーンのそれぞれは、第１の伸長縁と、第２の伸長縁とを有する、複数のレーンと、
複数の溶出モジュールであって、前記複数の溶出モジュールの各溶出モジュールは、前記複数のレーンの各レーンの中に受容され、各レーンを第１のチャンバと、第２のチャンバとに分割するように構成される、複数の溶出モジュールと、
各レーンの前記第１の伸長縁に隣接して位置付けられる第１の緩衝液リザーバと、
各レーンの前記第２の伸長縁に隣接して位置付けられる第２の緩衝液リザーバと
を備え、
各レーンの前記第１のチャンバに面する前記溶出モジュールの第１の側は、多孔性滅菌濾過膜を備え、
各レーンの前記第２のチャンバに面する前記溶出モジュールの第２の側は、限外濾過膜を備え、前記限外濾過膜は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する、カセット。
【請求項１３】
標的粒子の標的区画を単離および収集するための方法であって、前記方法は、
溶出モジュールのサンプルウェルの中にサンプルを受容することと、
第１の緩衝液チャンバの中にＳＤＳ含有溶解緩衝液を受容することであって、前記第１の緩衝液チャンバは、前記溶出モジュールの第１の側に沿って構成される、ことと、
第１の電気泳動電圧を印加し、
標的粒子が、前記溶出モジュールと第２の緩衝液チャンバとの間の前記溶出モジュールの第２の側に沿って構成されるゲル区画の中で不動化され、
非標的粒子が、前記ゲル区画を通過し、前記第２の緩衝液チャンバの中に入る
ように、前記サンプルの成分を、前記溶出モジュールの第２の側に沿って構成される第２の緩衝液チャンバに向かって移行させることと、
前記第１の緩衝液チャンバ、前記第２の緩衝液チャンバ、および前記溶出モジュールを洗浄することと、
前記第１の緩衝液チャンバ、前記第２の緩衝液チャンバ、および前記溶出モジュールを、Ｃａｓ９反応緩衝液で充填することと、
前記溶出モジュールを空にすることと、
前記溶出モジュールをＣａｓ９酵素混合物で再充填し、前記ゲル区画内で不動化された前記標的粒子の区分を切断することと、
前記溶出モジュールをＳＤＳ停止液で装填することと、
第２の電気泳動電圧を印加し、前記標的粒子から前記Ｃａｓ９を解放し、Ｃａｓ９を前記第２の緩衝液チャンバの中に移行させることと、
前記第１の緩衝液チャンバ、前記第２の緩衝液チャンバ、および前記溶出モジュールを洗浄することと、
前記第１の緩衝液チャンバ、前記第２の緩衝液チャンバ、および前記溶出モジュールを溶出緩衝液で充填することと、
第３の電気泳動電圧を逆方向に印加し、前記標的粒子の切断された区分を前記ゲル区画から前記溶出モジュールの中に移行させることと
を含む、方法。
【請求項１４】
前記溶出モジュールの第１の側は、限外濾過器を備え、前記溶出モジュールの第２の側は、多孔性滅菌フィルタを備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多孔性滅菌フィルタは、前記標的粒子の切断された区分が、前記第３の電気泳動電圧の印加の間およびその後に、前記溶出モジュールから出ることを防止する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的粒子は、ＤＮＡであり、前記ＤＮＡの切断された区分は、所望されるゲノム標的を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の電気泳動電圧の印加は、前記第１の電気泳動電圧の印加より短い、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の電気泳動電圧の印加は、前記第３の電気泳動電圧の印加より短い、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の電気泳動電圧の印加は、ＳＤＳを前記溶出モジュールを通して移行させ、前記サンプルを溶解させ、前記サンプルの非標的粒子を、前記非標的粒子が、前記ゲル区画を通過し、前記第２の緩衝液チャンバの中に入るようにコーティングする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の電気泳動電圧の印加は、前記標的粒子より小さい粒子を前記第２の緩衝液チャンバの中に移行させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
電気泳動器具システムであって、前記システムは、
電気泳動ステーションと、
請求項１または請求項１２に記載の少なくとも１つの電気泳動カセットを受容するように構成される引き出しと、
液体取扱ロボットと、
前記引き出しを側方に移動させるように構成される側方延在アームであって、
前記引き出しを第１の側方向に移動させることは、前記少なくとも１つのカセットの第１の側を前記液体取扱ロボットに暴露させ、
前記引き出しを第２の側方向に移動させることは、前記引き出しを前記電気泳動ステーションの中に挿入させる、側方延在アームと
を備え、
電気泳動区分は、前記少なくとも１つのカセットに対応する電極を収容し、前記電極は、電気泳動電圧を印加するように構成される、システム。
【請求項２２】
少なくとも１つの低温貯蔵コンパートメントと、少なくとも１つの室温貯蔵コンパートメントとをさらに備える、請求項２１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年１月５日に出願され、「Ａ  Ｓｅｍｉ−Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ」と題された、米国仮出願第６２／６１４，２３９号の優先権および利益を主張する。本願は、上記に参照される出願の開示を参照することによって、その全体として本明細書に明白に組み込まれる。
【０００２】
次世代配列決定（ＮＧＳ）は、遺伝性遺伝子疾患の診断および腫瘍学における適切な療法の選択のために内科的治療においてますます使用されている。多くの遺伝性疾患および医療介入可能な癌遺伝子座が、タンパク質コード配列内で一塩基多型（ＳＮＰ）であるため、最も臨床的な配列決定（すなわち、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ製プラットフォーム）が、ハイブリダイゼーションキャプチャ標的化サンプル調製（Ａｇｉｌｅｎｔ製ＳｕｒｅＳｅｌｃｔ、Ｒｏｃｈｅ製Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ、ＩＤＴ製ｘＧｅｎ）と組み合わせられたショートリード配列決定を使用して実行される。
【０００３】
しかしながら、ショートリードＮＧＳ法は、長さ１００ｂｐを上回るハプロタイプの決定、および本明細書では、欠失、重複、逆位、転座、リピート伸長を伴う再配列として定義される、構造多型（「ＳＶ」）の検出等の長域ゲノム解析にはあまり好適ではない。ショートリード法は、特に、ＳＶ切断点およびハプロタイプが、リピート配列の領域を伴うときに不利である。
【０００４】
これは、近年の大規模な患者コホートに関する研究が、いくつかのタイプの癌が、ＳＮＰではなくＳＶによって引き起こされるドライバ異変を含有することを示唆するため、臨床的配列決定分野に関して重大な問題を提示する（４）。癌の別の集団研究（全ゲノムの汎癌分析）は、５２個の異なる遺伝子座において有意に再発したＳＶを見出した（１０）。同様に、遺伝性疾患の有意（但し、まだ未知である）な割合が、ショートリード法によっては検出され得ない欠失、リピート伸長、および他のＳＶによって引き起こされるとする認識が高まりつつある（１１、１２）。最後に、４ｍｂ  ＭＨＣ領域全体を横断して拡張するハプロタイプ構造が、多くの複雑な免疫障害を解読するために重要となるであろうという蓄積する証拠が蓄積されつつある（１３で精査される）。ここで再び、ショートリード法は、多型の離散点を同定し得るが、それらの間のつながりは、家系分析から（間接的に）推測され得るのみである。
【０００５】
ＳＶおよび拡張ハプロタイプの信頼性のある検出は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ、１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ、Ｂｉｏｎａｎｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、およびＧｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｓｉｏｎによって開発されたもの等のロングリード単一分子配列決定（または光学マッピング法）を要求する（２−１２）。ショートリード遺伝子パネルおよびエクソーム配列決定の場合におけるように、臨床環境におけるロングリード配列決定の使用が、経済的理由のために、標的化配列決定に限定されるであろう可能性が高い。残念ながら、これらのロングリード配列決定法のための標的化サンプル調製は、従来の標的化ショートリード配列決定と比較されると、労力を要し、非効率的、かつ高価なままである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
種々の装置、システム、および方法が、本明細書に説明される。いくつかの実施形態では、電気泳動の間に分子を保持するための、分子保持カセットは、筐体と、筐体内に構成される、レーンとを含む。レーンは、第１の伸長縁と、第２の伸長縁とを有し得る。溶出モジュールが、レーンの中に受容されるように構成され得、レーンを第１のチャンバと、第２のチャンバとに分割し得る。第１の緩衝液リザーバが、第１の伸長縁に隣接して位置付けられ得、第２の緩衝液リザーバが、第２の伸長縁に隣接して位置付けられ得る。第１のチャンバに面する溶出モジュールの第１の側は、多孔性滅菌濾過膜を備え得、第２のチャンバに面する溶出モジュールの第２の側は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する、限外濾過膜を備え得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、カセットはさらに、第１のチャンバ内に構成される、少なくとも１つの電極と、第２のチャンバ内に構成される、少なくとも１つの電極とを備え得る。
【０００８】
限外濾過膜は、１５ｋＤａ限外濾過器であり得る。限外濾過膜の細孔サイズは、電気泳動の間にＤＮＡを保持するように構成され得る。
【０００９】
溶出モジュールは、第１の緩衝液リザーバと第２の緩衝液リザーバとの間の中心に位置付けられ得る。溶出モジュールは、第１の緩衝液リザーバと第２の緩衝液リザーバとの間に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、溶出モジュールは、溶出モジュールと、サンプルウェルとを備え得る。溶出モジュールは、サンプルを受容するように構成され得る。
【００１０】
カセットはさらに、アガロースゲルを含み得る。アガロースゲルは、多孔性滅菌濾過膜の隣に流し込まれ得る。アガロースゲルは、ゲルカラムを形成するように流し込まれ得、ゲルカラムの寸法は、第１のチャンバの中への標的分子の損失を最小限にさせるように構成される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、電気泳動の間に分子を保持するための、分子保持カセットは、筐体と、筐体内に構成される、複数のレーンとを備える。複数のレーンはそれぞれ、第１の伸長縁と、第２の伸長縁とを有する。複数の溶出モジュールが、それぞれ、各レーンを第１のチャンバと、第２のチャンバとに分割するように、複数のレーンのあるレーンの中に受容されるように構成され得る。第１の緩衝液リザーバが、各レーンの第１の伸長縁に隣接して位置付けられ得、第２の緩衝液リザーバが、各レーンの第２の伸長縁に隣接して位置付けられ得る。各レーンの第１のチャンバに面する溶出モジュールの第１の側は、多孔性滅菌濾過膜を備え、各レーンの第２のチャンバに面する溶出モジュールの第２の側は、限外濾過膜を備える。限外濾過膜は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、標的粒子の標的区画を単離および収集するための方法は、溶出モジュールのサンプルウェルの中にサンプルを受容するステップを含み得る。ＳＤＳ含有溶解緩衝液が、第１の緩衝液チャンバの中に受容され得、第１の緩衝液チャンバは、溶出モジュールの第１の側に沿って構成される。第１の電気泳動電圧が、標的粒子が、溶出モジュールと第２の緩衝液チャンバとの間の溶出モジュールの第２の側に沿って構成される、ゲル区画の中で不動化され、非標的粒子が、ゲル区画を通過し、第２の緩衝液チャンバの中に入るように印加され、サンプルの成分を、溶出モジュールの第２の側に沿って構成される、第２の緩衝液チャンバに向かって移行させ得る。第１の緩衝液チャンバ、第２の緩衝液チャンバ、および溶出モジュールは、洗浄され、Ｃａｓ９反応緩衝液で充填され得る。溶出モジュールは、空にされ、Ｃａｓ９酵素混合物で再充填され、ゲル区画内で不動化された標的粒子の区分を切断し得る。ＳＤＳ停止液が、溶出モジュールの中に装填され得、第２の電気泳動電圧が、印加され、標的粒子からＣａｓ９を解放し、Ｃａｓ９を第２の緩衝液チャンバの中に移行させ得る。第１の緩衝液チャンバ、第２の緩衝液チャンバ、および溶出モジュールは、洗浄され、溶出緩衝液で充填され得る。第３の電気泳動電圧が、逆方向に印加され、標的粒子の切断された区分をゲル区画から溶出モジュールの中に移行させ得る。
【００１３】
溶出モジュールの第１の側は、限外濾過器を備え得、溶出モジュールの第２の側は、多孔性滅菌フィルタを備え得る。多孔性滅菌フィルタは、標的粒子の切断された区分が、第３の電気泳動電圧の印加の間およびその後に、溶出モジュールから出ることを防止し得る。
【００１４】
標的粒子は、ＤＮＡであり得、ＤＮＡの切断された区分は、所望されるゲノム標的を含み得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、第２の電気泳動電圧の印加は、第１の電気泳動電圧および／または第３の電気泳動電圧の印加より短くあり得る。
【００１６】
第１の電気泳動電圧の印加は、ＳＤＳを溶出モジュールを通して移行させ、サンプルを溶解させ、サンプルの非標的粒子を、非標的粒子が、ゲル区画を通過し、第２の緩衝液チャンバの中に入るようにコーティングし得る。第２の電気泳動電圧の印加は、標的粒子より小さい粒子を第２の緩衝液チャンバの中に移行させる。
【００１７】
電気泳動器具システムは、電気泳動ステーションと、本明細書に説明されるもの等の少なくとも１つの電気泳動カセットを受容するように構成される、引き出しとを含み得る。本システムはまた、液体取扱ロボットと、引き出しを第１の側方向に移動させるステップが、少なくとも１つのカセットの第１の側を液体取扱ロボットに暴露させ、引き出しを第２の側方向に移動させるステップが、引き出しを電気泳動ステーションの中に挿入させるように、引き出しを側方に移動させるように構成される、側方延在アームとを備え得る。電気泳動区分は、少なくとも１つのカセットに対応する、電極であって、電気泳動電圧を印加するように構成される、電極を収容する。本システムはまた、少なくとも１つの低温貯蔵コンパートメントと、少なくとも１つの室温貯蔵コンパートメントとを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、いくつかの実施形態による、ＳａｇｅＨＬＳカセットを示す。
【００１９】
【図１Ｂ】図１Ｂは、いくつかの実施形態による、ＳａｇｅＨＬＳ器具を示す。
【００２０】
【図２】図２は、いくつかの実施形態による、大きいゲノムＤＮＡ標的の単離のためのＨＬＳ−ＣＡＴＣＨワークフローを示す。
【００２１】
【図３】図３は、いくつかの実施形態による、ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨによって調製される２００ｋｂ  ＢＲＣＡ１断片の標的化１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ配列決定を示す。
【００２２】
【図４】図４は、いくつかの実施形態による、１０Ｘ  Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒソフトウェアによる処理後の、図３からのＢＲＣＡ１配列の完全に位相化された出力を示す。
【００２３】
【図５】図５は、いくつかの実施形態による、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を使用したＨＬＳ−ＣＡＴＣＨ標的上のＳＶ検出を示す。
【００２４】
【図６】図６は、いくつかの実施形態による、小型多重チャネルＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットプロトタイプのための初期概念を示す。
【００２５】
【図７】図７は、いくつかの実施形態による、ＣＡＴＣＨ−１Ｄワークフローを示す。
【００２６】
【図８】図８は、いくつかの実施形態による、例示的フローチャートを示す。
【００２７】
【図９】図９は、いくつかの実施形態による、液体取扱ロボットのデッキ上への電気泳動ステーションの統合を図示する、自動ＣＡＴＣＨ−１Ｄ器具の可能性として考えられる液体ハンドラデッキレイアウトの実施例を示し、その寸法は、典型的小型のＯＥＭ液体取扱ステーションの占有面積を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
標的化ロングリード配列決定のための、統合された高スループットの自動サンプル調製システムが、開発されている。提案されるシステムは、臨床的診断環境におけるロバストな無人自動処理を対象とする。
【００２９】
極めて高い分子量（ＨＭＷ）のＤＮＡ（１００〜２，０００ｋｂ）の抽出および酵素処理のための半自動研究器具システム（図１Ａ−Ｂ）が、提供される。本システムは、未損傷細胞または単離された核を入力サンプルとして使用する。入力サンプルが、アガロースゲルカセット（図１Ａ）の中に装填され、染色体長のＤＮＡが、サンプルウェルコンパートメントを通したＳＤＳの電気泳動によってサンプルから抽出される。ＳＤＳコーティングされたタンパク質、脂質が、中心アガロースゲルカラムを通してサンプルウェルから離れるように電気泳動されるが、染色体長のＤＮＡは、サンプルウェルのアガロースゲル壁の中でしっかりと絡まり、不動化される。サンプルウェルは、ＤＮＡのいかなる損失を伴わずに、空にされ、再充填されることができる。これは、サンプルウェルを酵素反応混合物で再充填することによって、不動化されたＤＮＡの処置を可能にする。多くの制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ、非特異的ＤＮＡクリベース、および化膿レンサ球菌Ｃａｓ９を含む、多くの一般的に使用されるＤＮＡ処理酵素は、アガロースの中に容易に拡散する。ＤＮＡ処理の後、サイズ選択電気泳動の付加的工程が、実施され、ＤＮＡ産物の、ゲル分離カラム（図１Ａ）の片側に沿って配列される、一連の６つの緩衝液で充填された溶出モジュールの中への電気泳動溶出が、後に続く。ＤＮＡ処理ステップは、所望されるＤＮＡ産物のサイズを長さ２メガベース（ｍｂ）未満に低減させるために、ある切断を含む（２ｍｂを上回るＤＮＡは、サンプルウェル内で不動化されたままとなり、電気泳動の間に移動することが不可能となるであろう）。
【００３０】
図１Ａに示されるように、各カセットは、２つの物理的に隔離されるサンプル処理面積を有する。カセットは、標準的な９６ウェルプレートの占有面積を有する。中心アガロースチャネルは、２つの装填ウェルを有する。細胞または核が、サンプルウェル内に装填され、ＳＤＳ系溶解試薬が、試薬ウェルの中に装填される。電気泳動が、実行され、細胞または核が、溶解されている、サンプルウェルコンパートメントを通してＳＤＳを駆動させる。染色体サイズのゲノムＤＮＡが、サンプルウェル壁内で不動化される一方、他の成分が、ＳＤＳとともに、底部電極チャンバに搬送される。ＤＮＡ処理およびサイズ選択電気泳動の後、ＤＮＡ産物は、アガロースチャネルの右側に沿って位置付けられる、６つの溶出モジュールのアレイの中に電気泳動溶出される。
【００３１】
図１Ｂは、器具が、幅／高さ／奥行約１フィートであり、２つのカセットを保持することを示す。総サンプルスループットは、サンプル４個であり、試験実行時間は、サイズ選択ステップのサイズ範囲および所望の分解能に応じて、３〜７時間で変動する。
【００３２】
ＳａｇｅＨＬＳシステムは、カスタマイズされたＣａｓ９ヌクレアーゼと併用され、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステム内の標的化ＤＮＡライブラリを調製するために効率的に使用され得る、特異的な大きいゲノムＤＮＡ標的を単離することができる。図２は、本明細書において「ＣＡＴＣＨ」と称される、ワークフローの概略図を示す。未損傷の細胞または核が、カセットの中に装填され、電気泳動抽出が、上記に説明されるように実行され、染色体長のゲノムＤＮＡをサンプルウェル壁内で不動化された状態で残す。酵素ＤＮＡ処理が、配列決定されるべきゲノム領域（または複数の領域）の外側を切断するように設計される、カスタマイズされたＣａｓ９クリベースを使用して実行される。Ｃａｓ９の消化後、サイズ選択電気泳動が、実行され、Ｃａｓ９によって切断された標的領域を、サンプルウェルから離れるように、かつサンプルウェル壁内に捕捉されたままである、未切断のゲノムＤＮＡから離れるように移動させる。ゲルチャネルからの電気泳動溶出の後、産物は、ｑＰＣＲによって限局化され、ライブラリ構築のために直接１０Ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステムの中で使用される。
【００３３】
ヒトＢＲＣＡ１遺伝子を包含する２００ｋｂゲノム領域の標的化配列決定のワークフロー全体が、実証されている。１５０万個のヒトの二倍体培養細胞を入力物質として使用して、Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲによって測定されるような非標的化制御遺伝子（ＲＮａｓｅＰ）の約２５倍の濃縮で、約３０，０００〜５０，０００個のＢＲＣＡ１断片の複製物が、ピーク溶出モジュールから回収された。１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステム上のライブラリの調製後、それらは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００システム上で配列決定された。試験の実行は、標的化ＢＲＣＡ１領域の１５５倍のカバレッジを生産し、ゲノムの非標的化残部は、わずか４．４倍のカバレッジであった（図３）。１０Ｘ  Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ整合ソフトウェアを使用したさらなる解析が、完全に位相化されたハプロタイプが、両方のアリルに関して決定され得ることを実証した（図４）。ＢＲＣＡ１  ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨ産物の半分を上回るものが、ｇＲＮＡ設計から予測されるような完全長標的であった。
【００３４】
並行実験では、十分に調査された細胞株ＧＭ１２８７８における４０個の既知のＳＶを標的化するｇＲＮＡが、設計されたため、ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨ標的化もまた、大きいＳＶを検出するために使用され得ることが実証されている。標的化領域は、４０個の明確に異なる１００ｋｂゲノム断片を標的化する、単一の多重ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨ手技において単離された。標的は、ｑＰＣＲによって出力されたＨＬＳカセットの中に限局化され、ＢＲＣＡ１遺伝子に関するように、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓライブラリ調製およびＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定を受けた。ＧＭ１２８７８  ｃｈｒ１上のホモ接合型の４０ｋｂ欠失の検出を実証する、ある予備的データが、図５に示される（Ｓｈｉｎ，  Ｊｉ（原稿は、準備中である））。
【００３５】
図３−５のデータは、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓライブラリ構築法と組み合わせられたＨＬＳ−ＣＡＴＣＨが、標的化された様式で、高品質の長域ハプロタイプおよびＳＶ呼出を提供し得ることを示す。これは、２０ｋｂより大きいゲノム断片を使用した標的化配列決定ワークフローの最初の成功した実証であると考える（１４）。組み合わせられた技術の成功は、ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨプロセスの効率的な標的濃縮と１０Ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍワークフローの統合された増幅およびライブラリ構築プロセスとの間の優れた相補性に由来する。
【００３６】
上記に概説されるＨＬＳ−ＣＡＴＣＨ／１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓワークフローに基づいた診断試験は、遺伝子試験および腫瘍学において説得力のある利点を有し得る。ワークフローの標的化性質は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定コストの実質的な減少を提供する（＄８，０００（１００倍に位相化されたＣｈｒｏｍｉｕｍ全ゲノム配列のためＩＬＭＮ試薬）対＄５００（図４のＢＲＣＡ１の１００倍に位相化された標的化ＣｈｒｏｍｉｕｍカバレッジのためのＩＬＭＮ試薬））。加えて、大きい標的化断片の解析は、同一アッセイにおけるＳＶおよびＳＮＰの両方を検出するための機会を提供し、ハプロタイプ決定の追加された利点も伴う。
【００３７】
アプローチ
処理されるサンプルの数が、増加および／または最大限にされるように、そのような用途のために使用されるシステムが、高いサンプルスループットを有することは、有利であり得る。加えて、再現可能な方式で、効率的かつ特異的なＣａｓ９標的化切断を達成することも、有利であり得る。マウスのＷＢＣおよびヒトの培養細胞（リンパ芽球様およびＨＥＫ２９３細胞）を用いた約３０のＨＬＳ−ＣＡＴＣＨ実験では、ＣＡＴＣＨ標的の回収が、２〜５０％の範囲にわたって広く変動している。同様に、標的濃縮は、１５〜２００倍で変動している。幸い、１０Ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍライブラリ調製は、これらの範囲の下限におけるサンプルに対して非常に良好に作用する。例えば、図３−５の高カバレッジ標的化データは、ＣＡＴＣＨ標的回収物全体のわずか約１．５％（５０，０００個の複製物）および約２５倍の濃縮を用いて生産された（両方の値が、ｑＰＣＲによって、ＲＮａｓｅＰ遺伝子複製数に対して測定された）。これは、ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨ／１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓワークフローの別の相補的特徴であり得、すなわち、ワークフロー全体の成功は、実質的な濃縮に依存し、絶対的な標的純度には依存せず、これは、後者の場合では、複数のアリルが、液滴内に共に位置し、同一のリンクされた読取バーコードで標識されるであろう、「バーコード衝突」に起因する、非効率性につながるであろう。
【００３８】
ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨを修正および拡張し、非常に少量の細胞／核入力と協働させることもまた、有利であろう。これは、サイズおよび細胞数が非常に限定され得る、生体組織検査サンプル等の遺伝子型決定診断サンプルに関する重要な課題である。少量の細胞／核入力を使用するステップの成功は、上記に議論されるようなＣａｓ９消化条件を最適化するステップの成功に依存するであろう。
【００３９】
さらに、種々のタイプの腫瘍生体組織検査物質を含む、軟膜、凍結血液、新鮮および新鮮凍結固形組織を含む、種々の組織タイプを使用するために、ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨの能力を完全に評価し、拡張することが、重要であり得る。
【００４０】
第Ｉ相では、カセットが、ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨの高い標的濃縮を遂行するように設計され得る。新たな設計は、原ＨＬＳカセットの２次元電気泳動溶出ステップを排除し、それによって、カセットの製造が、（９６ウェルプレート占有面積における）カセットあたり６〜１２個のサンプルを処理することが可能になることを可能にし得る。新しいカセットタイプは、本明細書において「ＣＡＴＣＨ−１」と称され、ＩＤは、「１次元」の略である。
【００４１】
第Ｉ相は、７５０，０００個の二倍体の哺乳類細胞（ヒトまたはマウス）のサンプルを使用し、ＣＡＴＣＨ−１Ｄプロトタイプにおける、単一複製物の２００，０００ｂｐゲノム標的断片の少なくとも２０％（３００，０００個の複製物）の回収を達成するステップを含み得る。複製物の数は、ｑＰＣＲによって測定され得る。２００，０００ｂｐゲノム標的の濃縮は、非標的化ゲノム配列バックグラウンドの少なくとも２０倍であってもよく、濃縮は、ｑＰＣＲによって測定され得る。加えて、ＣＡＴＣＨ−１Ｄプロトタイプが、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ／Ｉｌｌｕｍｉｎａワークフロー内で効率的に配列決定され得るＣＡＴＣＨ標的を生産することが、実証され得る。
【００４２】
第ＩＩ相は、完全高スループット無人自動ＣＡＴＣＨ標的調製のための液体取扱能力を伴う、ＣＡＴＣＨ−１Ｄ器具の開発を含み得る。Ｃａｓ９の消化が、ＣＡＴＣＨ−１Ｄ動作のために最適化され得る。第ＩＩ相はまた、ＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットまたはワークフローを少量の細胞または核入力と併用するために適合させるステップと、ＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットまたはワークフローを診断上重要な組織タイプとの併用のために適合させるステップとを含み得る。
【００４３】
第Ｉ相アプローチ
ＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットおよびその動作の基本概念が、図６および７に示される。ＳａｇｅＨＬＳカセット（図１Ａ）は、筐体６０５の各レーン６１０が、溶出モジュール６２０の両側に一対の緩衝液リザーバ６３５、６４０を備えるように修正される。各レーン６１０は、溶出モジュール６１５を受容するように構成されるスロットの両側に、伸長縁６１５を有する。溶出モジュール６２０が、対応するスロットの中に挿入されると、レーンは、第１のチャンバ６２５と、第２のチャンバ６３０とに分割される。第１のチャンバ６２５は、第１の緩衝液リザーバ６３５を備えてもよく、第２のチャンバ６３０は、第２の緩衝液リザーバ６４０を備えてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、溶出モジュール６２０は、緩衝液リザーバ６３５、６４０の間の中心に位置付けられる、略中心に位置付けられる、または別様に据え付けられる。溶出モジュール６２０の片側に、多孔性滅菌濾過膜６４５が、取り付けられる。アガロースゲル６６０の小さい区画が、滅菌フィルタ６４５の外側表面に対して流し込まれる。溶出モジュール６２０の他側に、限外濾過膜６５０が、取り付けられる。限外濾過器６５０は、電気泳動の間にＤＮＡを保持するであろう、細孔サイズを有する。
【００４５】
ＣＡＴＣＨ−１Ｄワークフローでは、溶出モジュール６２０は、サンプルウェル６６５および溶出モジュール６２０の両方としての役割を果たす。図７に図示され、図８のフローチャートに示されるように、細胞／核サンプルは、溶出モジュール６２０の中に装填され（８１０）、左の緩衝液チャンバ６３５は、空にされ、ＳＤＳ含有溶解緩衝液で再充填される（８１５）。電気泳動電圧が、例えば、ＳＤＳが、溶出モジュールを通して移行し、入力材料を溶解させ、タンパク質および他の非ＤＮＡ細胞成分を、それらが、小さいゲル区画６６０を通して右の緩衝液チャンバ６４０の中に移行するようにコーティングするように、１つ以上の電極６５５を介して印加される（８２０）。本周期の間に、ゲノムＤＮＡは、原ＨＬＳプロセスにおけるように、小さいゲル区画６６０の中に移行し、そこで不動化される（原プロセスは、図２に示される）。この時点で、電気泳動が、停止され、カセットの３つのコンパートメント全て（左および右の緩衝液チャンバ６３５、６４０、および溶出モジュール６２０）は、徹底的に洗浄され（８２５）、Ｃａｓ９反応緩衝液で再充填される（８３０）。溶出モジュール６２０は、次いで、空にされ（８３５）、ゲル６６０の中で不動化された、染色体長のゲノムＤＮＡから所望されるゲノム標的を特異的に切断するであろう、Ｃａｓ９酵素混合物で再充填される（８４０）。消化の後、溶出モジュール６２０は、ＳＤＳ停止液で装填され（８４５）、Ｃａｓ９が、ＤＮＡから解放され、右の緩衝液チャンバ６４０の中に移動されるように、電気泳動が、実行される（８５０）。本一掃のために要求される電気泳動周期は、変性されたＣａｓ９タンパク質が、アガロースゲル６６０内の大きいＤＮＡ  ＣＡＴＣＨ標的よりはるかに迅速に移行するであろうため、非常に短時間である。このＣａｓ９一掃の電気泳動の後、カセットは、洗浄され（８５５）、溶出緩衝液で再充填される（８６０）。電気泳動が、逆方向に実行され（８６５）、ＣＡＴＣＨ産物を小さいゲル区画６６０から溶出モジュール６２０の中に移動させ、溶出モジュール６２０の左側の限外濾過膜６５０は、標的が逃散することを防止する。
【００４６】
ＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットの設計は、原ＳａｇｅＨＬＳカセットよりはるかに単純であり、プロトタイプの加工が、実施され得る。ＣＡＴＣＨ−１Ｄプロトタイプ試験のためにカスタマイズされた電極アレイを伴う、（付属Ａに示されるもの等の）Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製ＰｉｐｐｉｎＨＴ器具が、使用されることができる。ＰｉｐｐｉｎＨＴ器具は、最大１２個のチャネルを伴うカセットを受け入れるように修正され得る。液体取扱ステップの全てが、（例えば、第Ｉ相の間）手動で実施されてもよい、または（例えば、第ＩＩ相の間）自動化されてもよい。
【００４７】
ＣＡＴＣＨ−１Ｄワークフローには、原ＨＬＳワークフローとは異なる、いくつかの試薬汚染リスクが、存在する。一実施例が、溶出モジュールの入力サンプルウェルとしての使用から生じる。入力サンプルの一部の成分は、溶出モジュール表面に付着し、溶解および洗浄ステップの間に除去しにくいことが証明され得る。同様に、初期の溶解またはＣａｓ９一掃ステップに続いて、ＳＤＳのある残留量が、溶出モジュール内に留まるというあるリスクが存在する。（原ＨＬＳカセットの溶出モジュールは、入力サンプルまたは濃縮されたＳＤＳに暴露されない。）
【００４８】
別の可能性として考えられる課題は、ＳＤＳを用いた電気泳動によるＣａｓ９一掃が、ＣＡＴＣＨ標的の右の緩衝液リザーバの中への損失を伴わずに遂行され得るように、ゲルカラム寸法を調節することである。これは、１００ｋｂを上回るＣＡＴＣＨ標的に関して深刻な課題になろうことは予期されておらず、（Ｃａｓ９一掃電気泳動の後）右のチャンバ緩衝液のｑＰＣＲによる標的損失は、測定されることができる。
【００４９】
ＣＡＴＣＨ−１Ｄワークフローに対する別の有意なリスクは、サイズ選択電気泳動ステップの不在である。原ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨワークフローでは、サイズ選択電気泳動が、実施され、溶出の直前のＣＡＴＣＨ産物の純度を増加させる。提案されるＣＡＴＣＨ−１Ｄワークフローは、サイズ選択電気泳動を省略するが、電気泳動によるＣａｓ９一掃ステップは、ＣＡＴＣＨ標的ＤＮＡより有意に迅速に移行する低分子量ＤＮＡを除去する可能性を提供する。いずれの場合も、ある非特異的に切断されたＨＭＷ  ＤＮＡは、ＣＡＴＣＨ産物とともに最終溶出において溶出されるであろう可能性が高く、ＣＡＴＣＨ産物の純度は、ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨワークフローにおけるほど高くはならないであろう。しかしながら、優れた１０Ｘの配列決定結果が、控え目な濃縮倍数（約１５〜２５倍）で取得され得るため、これは、問題になり得ない。加えて、Ｃａｓ９消化条件のさらなる最適化、より良好なｇＲＮＡ設計、および新しい変異Ｃａｓ９酵素（または類似するプログラム可能なエンドヌクレアーゼ）が、サイズ選択の重要性を低減させ得る。
【００５０】
第ＩＩ相アプローチ
第Ｉ相では、ＣＡＴＣＨ−１Ｄシステムの実行可能性が、実証される。第ＩＩ相は、完全に自動化された高スループットＣＡＴＣＨ−１Ｄシステムの開発を含む。
【００５１】
ＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットおよび器具の開発
第ＩＩ相は、電気泳動を伴う液体取扱機能の自動ＣＡＴＣＨ−１Ｄシステムへの統合に関する詳細なシステム工学研究を特徴とする。例示的自動器具が、図９に図示される。電気泳動ステーションが、小型のＯＥＭのガントリ様式液体取扱ロボットのデッキ上に直接統合される。電気泳動ステーションは、４つのＣＡＴＣＨ−１Ｄ多重チャネルカセットを保持し得る電動式引き出しを有し得る。引き出しは、側方に拡張され、液体取扱ステップ（サンプル／試薬を装填する、カセット洗浄、産物を除去する）のために、カセットの上部を暴露し、電気泳動ステップのために（電極を収容する）ステーションの内側に引き込まれることができる。カセットあたりのチャネル数に合致する数のＬＨチャネルを伴う、単一の液体取扱ヘッドが、十分であり得る（図９では、カセットあたり８個のチャネルを示している）。図９に示されるように、入力サンプルおよびＣａｓ９試薬のための低温（４Ｃ）貯蔵装置、溶解試薬および電気泳動緩衝液のためのＲＴ貯蔵装置、使い捨て可能先端のための貯蔵装置、および使用済み先端および廃液のための廃棄チャンバのための設備が、提供され得る。
【００５２】
カセットあたりの処理されるサンプルの最適数およびサンプル入力サイズを決定することを含み得る、プロトタイプ多重チャネルＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットが、加工され得る。加えて、（下記に説明されるような）チャネル／溶出モジュールの寸法の関数としてのＤＮＡ抽出およびＣａｓ９消化の効率が、決定され得る。ＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットのチャネルは、小さくてもよく、そのため、多くのサンプルが、各カセット内で処理されることができる。決定はまた、十分なＣＡＴＣＨ標的が、抽出され、診断の有用性のために十分な１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓのリンクされた読取カバレッジを入手することを確実にするために行われ得る。
【００５３】
抽出およびＣＡＴＣＨ回収に及ぼすチャネル寸法効果を評価した後、第２の、実質的に最適化されたＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットもまた、構築され得る。バージョン２カセットを用いて完全に自動化された試験を実施し得る、初期の器具プロトタイプもまた、構築され得る。生産バージョンのＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットおよび自動化器具もまた、開発され得る。最終生産バージョンのカセットおよび器具のための製造プロトコルが、決定され得、最終システムが、試験され得る。
【００５４】
ＣＡＴＣＨ−１ＤにおけるＨＭＷ  ＤＮＡ抽出の最適化
ＣＡＴＣＨ−１Ｄプロセスの全体的効率は、２つの値の複合物である。第１のものは、入力サンプルからの初期ゲノムＤＮＡ抽出の効率である。第２のものは、Ｃａｓ９によって消化されたＣＡＴＣＨ標的の回収効率である。ＣＡＴＣＨ−１Ｄにおける初期ゲノムＤＮＡ抽出の効率は、１）細胞溶解およびＤＮＡ不動化が生じる、アガロースゲルサンプルウェルの表面積（より大きいＳＡが、より良好である）、および２）抽出の間の細胞あたりの洗浄剤使用量（より多い量が、より良好である）の関数であると考えられる。本課題を調査するために、異なるアガロースゲル断面積を伴う、多重チャネルＣＡＴＣＨ−１Ｄプロトタイプが、加工され得、抽出効率が、サンプル入力の関数として評価され得る。抽出効率は、不動化されたＤＮＡを頻繁切断制限酵素で消化し、消化物を電気溶出した後の総ＤＮＡ回収量によって測定され得る。長いゲノムＤＮＡ断片（１００〜２００ｋｂ）の抽出効率は、不動化されたＤＮＡを稀有切断制限酵素で消化し、既知の長さの特異性ゲノムＤＮＡ制限断片の電気泳動溶出収率を試験することによって測定され得る。特異的ゲノムＤＮＡ断片の回収量は、ｑＰＣＲによって測定され得る。評価される最大入力装填量は、第Ｉ相の作業が、入力が、１０Ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ配列決定ワークフロー内で高カバレッジのための十分なＣＡＴＣＨ標的（少なくとも３００，０００個の複製物）を生産するであろうことを実証し得るため、７５０，０００個のヒトの二倍体細胞であり得る。
【００５５】
Ｃａｓ９消化およびＣＡＴＣＨ標的回収の最適化
いったんチャネル／溶出モジュールの断面に伴った抽出効率の増減が理解されると、Ｃａｓ９消化効率に関する調査が、開始され、入力サンプル装填量およびチャネル寸法に伴ったその増減方法を決定し得る。多くの種類の臨床サンプルが、少数の入力細胞を有するであろうため、カセットプロトタイプの性能は、少量の細胞入力で評価および最適化され得る。わずか５０，０００個の標的が回収された単一標的ＣＡＴＣＨ実験において、良好な１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ配列カバレッジ（約１００倍）を得ることが、可能である。いくつかの実験においては、Ｃａｓ９標的（２００ｋｂ  ＢＲＣＡ１遺伝子座標的）の５０％の回収を達成している。本回収値において、５０，０００個のみの未損傷細胞（または核）の入力が、同等（約１００倍）のＣｈｒｏｍｉｕｍライブラリ配列決定カバレッジのために十分であろう。より高い標的回収が、達成されると、要求される細胞入力は、比例してより低くなり、これは、多くの臨床的に関連するサンプルが、非常に少量の細胞入力を有するであろうため、重要であり得る。１０，０００個代前半の数のヒトの細胞入力を用いて、１００倍の標的化配列決定カバレッジが、達成され得る。
【００５６】
効率的な抽出およびＣＡＴＣＨ標的回収のために適切なカセットチャネル寸法を最適化するステップに加えて、ｇＲＮＡ設計、ｇＲＮＡタイプ、Ｃａｓ９酵素選定、およびカセット内Ｃａｓ９反応条件もまた、対処され得る。
【００５７】
Ｃａｓ９反応条件（酵素濃度および緩衝液）が、ＣＡＴＣＨ標的回収のための支配的要因であり、ｇＲＮＡタイプ、ｇＲＮＡ設計、およびＣａｓ９タイプは、あまり効果を及ぼさない。試験された殆ど全てのｇＲＮＡは、その意図される標的にある程度作用し、誘導体の７５％は、等モルの標的／Ｃａｓ９比（０．１〜０．４ｎＭ範囲内の濃度）におけるＰＣＲ産物の完全な消化を示す。また、いくつかの異なるｇＲＮＡ設計ツール（ｇｕｉｄｅｓｃａｎ．ｃｏｍ製、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｌａｂ  ｗｅｂｓｉｔｅ  ａｔ  ＭＩＴ製、Ａｇｉｌｅｎｔ製ＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌ）が、成功裏に使用され得る。さらに、類似する切断効率が、２部分合成ｇＲＮＡおよびＴ７ｐｏｌインビトロ転写単一ｇＲＮＡを使用して認められ得る（但し、合成ＲＮＡが、使用するためにより容易かつより確実であると考える）。商業的に利用可能なＣａｓ９変異体が、インビトロアッセイにおいてｗｔ−Ｃａｓ９酵素より特異性であるとは見出されていない。
【００５８】
これらの初期的結論にもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ族は、絶えず拡張しており、本プロセスに関して有用であり得る、新しい変異体が、操作され得る。したがって、ＣＡＴＣＨ−１Ｄカセットにおける向上された性能のためのより多くの酵素が、選別され得る。同様に、近年、商業的に利用可能になりつつある、全長合成単一誘導ＲＮＡもまた、試験され得る。単一誘導体は、Ｃａｓ９アセンブリワークフローを単純化させ得る。例えば、Ｓｙｎｔｈｅｇｏが、供給元が、それらの合成単一誘導体が、インビトロ転写単一ｇＲＮＡに対する有意に改良された特異度を有すると宣伝しているため、使用され得る。
【００５９】
ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨプロセスでは、最良の標的回収が、切断部位ウィンドウあたり２〜３個のｇＲＮＡ（切断部位あたり複数の誘導体が、使用され、単一ｇＲＮＡ認識配列内のＳＮＰが、切断部位を排除するであろう可能性を回避する）、約２ｋｂの切断部位ウィンドウ、およびサンプルウェル内における総濃度１〜４μＭのＣａｓ９酵素（Ｃａｓ９：総ｇＲＮＡ濃度比１：１でアセンブリされる）を使用して達成されている。ＳａｇｅＨＬＳプロセスでは、標的回収はまた、Ｃａｓ９酵素を、ＨＭＷ  ＤＮＡが、不動化される、サンプルウェルの中に電気泳動的に「注入」することによって有意に向上される。約５０Ｖにおける１分周期の電気泳動が、使用されてもよい。酵素濃度および電気泳動注入が、ＣＡＴＣＨ標的の収率に最大の効果を及ぼす、２つのパラメータである。
【００６０】
他の臨床サンプルタイプのためのＣＡＴＣＨ−１Ｄ法の開発
ＨＬＳワークフローは、上記の源の全てから取得される、全血、凍結全血、軟膜、新鮮固形組織、新鮮凍結組織、腫瘍生体組織、および核を含む、種々の物質のために適合され得る。ＣＡＴＣＨプロセスに関して、抽出されたＤＮＡが、アガロースゲル内での効率的な不動化が生じるために、ほぼ完全染色体長である、またはサイズが＞＞２ｍｂであることが、重要であり得る。これは、ＣＡＴＣＨプロセスが、新鮮な材料、または新鮮材料から調製される核を用いて最良に作用し得ることを意味する。これはまた、ＣＡＴＣＨプロセスが、ホルマリン固定組織に関して作用する可能性が低いことを意味する。
【００６１】
ＳａｇｅＨＬＳ開発が、哺乳類ＷＢＣまたはヒト細胞株、またはそれらの源から単離された核を用いて遂行された。ＳａｇｅＨＬＳシステムは、ＣＡＴＣＨプロセスのために十分な入力である、約２．５ｕｇのゲノムＤＮＡを含有すべきである、約５０μｌの全血からＨＭＷ  ＤＮＡを単離するために使用されている。加えて、ＳａｇｅＨＬＳは、ＨＭＷ  ＤＮＡの単離のために、凍結されたヒトの組織培養細胞（ＨＥＫ２９３）と成功裏に併用されている。これらの２個のデータを前提として、軟膜、凍結軟膜、および凍結全血を処理するためのプロトコルが、見出され得る。
【００６２】
組織作業のために、組織解離のためのいくつかの器具および試薬システムが、細胞血球計測器およびＦＡＣＳ器具の供給元（ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって開発されている。これらは、機械的および酵素処理の組み合わせを伴い、選択的濾過が、後に続き、単一細胞または核の懸濁液を生産する。これらのシステムは、新鮮な材料を用いたＣＡＴＣＨ−１Ｄ入力のために良好に性能を発揮し得る。
【００６３】
凍結組織の培養組織を用いた限定された成功に基づいて、ＣＡＴＣＨのための最も実行可能な臨床的組織サンプルは、新鮮凍結組織であろう。努力が、そのサンプルタイプに注力され得、上記で引用されたＢＤおよびＭｉｌｔｅｎｙｉ製の器具類システムを使用した調査が、開始され得る。
【００６４】
ＣＡＴＣＨ−１Ｄ試薬キットの開発のための一貫した再現可能なワークフロー
ＣＡＴＣＨ−１Ｄおよび１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓワークフローの組み合わせが、臨床的配列決定の多くの分野において広い用途を有し得る。本理由のために、ＣＡＴＣＨ−１Ｄシステムの開発および最適化は、新しいＣＡＴＣＨ試薬キットの迅速な生産のための最適な開発経路を確立するステップを含む。これは、ゲノム切断部位選択、切断部位ウィンドウ内でのｇＲＮＡ選択、ｇＲＮＡ発注およびＱＣのための合理化された供給経路、追跡可能な産物付番、在庫、およびパッケージ化のための生命情報科学の統合を含み得る。
【００６５】
臨床的な配列決定市場が、調査され、ＣＡＴＣＨ−１Ｄアプローチから恩恵を受け得る重要な診断分野を選択し得る。例えば、ＣＡＴＣＨ−１Ｄが、ＭＨＣ領域内での長域配列決定を可能にするために使用されてもよい。加えて、遺伝性疾患試験および腫瘍学には、他の魅力的なアッセイ分野も存在する。
【００６６】
ヒトゲノムの任意の領域（または領域のセット）に関するＣＡＴＣＨアッセイを作成するために適用され得る、ｇＲＮＡの設計のための最適化されたワークフローが、提供され得る。遺伝性疾患試験におけるいくつかのアッセイは、隣接している領域とともに単一遺伝子のみを伴い得る。他の試験は、ＳＶに頻繁に関わる（おそらく、１００個代前半の数の）癌遺伝子のパネルを伴い得る（１０）。なおも他のものは、ＭＨＣのような広範なゲノム領域を横断して存在するＣＡＴＣＨ産物を生産する、アッセイの設計を伴い得る（１４）。
【００６７】
標的化ＣＡＴＣＨ−１Ｄおよび１０Ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ配列決定結果の解析のために特異的に設計された１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒソフトウェアの修正、カスタマイズ、または新しいバージョンが、査定され得る。
【００６８】
新しいキットの性能を確認するための１０Ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ配列決定ワークフローおよびＱＣ法が、開発され得る。ｑＰＣＲは、回収および濃縮を査定するための安価かつ迅速な方法であるが、ある臨床的な配列決定方法が、開発され得る。
【００６９】
限定ではないが、本願において提示される、特許、特許出願、論説、ウェブページ、書籍等を含む、公開文書または他の文書への任意および全ての参照は、参照することによってそれらの全体として本明細書に組み込まれる。
【００７０】
本デバイス、システム、および方法の例示的実施形態が、本明細書に説明されている。他所に記載されるように、これらの実施形態は、例証の目的のためのみに説明されており、限定するものではない。他の実施形態もまた、可能性として考えられ、本開示によって網羅され、これは、本明細書に含有される教示から明白となるであろう。したがって、本開示の範疇および範囲は、上記に説明される実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、本開示およびそれらの均等物によってサポートされる請求項に従ってのみ定義されるべきである。また、本開示の実施形態は、分子処理に対応する任意または全ての要素を含む、任意の他の開示される方法、システム、およびデバイスからの任意および全ての要素をさらに含み得る、方法、システム、およびデバイスを含み得る。言い換えると、１つまたは別の開示される実施形態からの要素は、他の開示される実施形態からの要素と置換可能であり得る。加えて、開示される実施形態の１つ以上の特徴／要素は、除去されても、依然として、特許性のある主題をもたらし得る（したがって、本開示のさらに多くの実施形態をもたらし得る）。対応して、本開示のいくつかの実施形態は、そのような先行技術において開示されるシステム、デバイス、および／または方法の１つ以上の要素／特徴を具体的に欠くことによって、１つおよび／または別の参考文献／先行技術と特許的に明確に異なり得る。言い換えると、ある実施形態に対する請求項は、そのような特徴／要素を含む先行技術と特許的に明確に異なる実施形態をもたらす１つ以上の要素／特徴を具体的に排除するような否定的限界を含有し得る。
【化１】
2021510200.tif 000003
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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