(57)【要約】  少なくとも水、ベータ−グルコース−１−リン酸（ベータ−Ｇ１Ｐ）、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物が、本明細書中で開示される。この反応により、アルファ−１，３グリコシド結合を有するオリゴ糖及び多糖を合成することができる。さらに開示されるのは、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素、及びその使用方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも水、ベータ−グルコース−１−リン酸（ベータ−Ｇ１Ｐ）、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物。
【請求項２】
前記アルファ−１，３−グルカンは、アルファ−１，３グリコシド結合が少なくとも約５０％である、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項３】
前記アルファ−１，３−グルカンは、アルファ−１，３グリコシド結合が少なくとも約９０％である、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項４】
前記アルファ−１，３−グルカンの重合度（ＤＰ）は、少なくとも３である、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項５】
前記アルファ−１，３−グルカンのＤＰは、少なくとも約１０である、請求項４に記載の反応組成物。
【請求項６】
前記受容体分子は、二糖又はオリゴ糖を含む、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項７】
前記受容体分子は、ニゲロースを含む、請求項６に記載の反応組成物。
【請求項８】
前記受容体分子は、多糖を含む、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項９】
前記多糖は、アルファ−グルカンを含む、請求項８に記載の反応組成物。
【請求項１０】
前記アルファ−グルカンは、デキストランを含む、請求項９に記載の反応組成物。
【請求項１１】
前記ホスホリラーゼ酵素は、配列番号２又は配列番号５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項１２】
アルファ−１，３−グルカンを生成する方法であって：
（ａ）少なくとも水、ベータ−グルコース−１−リン酸（ベータ−Ｇ１Ｐ）、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素を接触させて、アルファ−１，３−グルカンを生成する工程と；
（ｂ）場合によっては、工程（ａ）において生成された前記アルファ−１，３−グルカンを単離する工程と
を含む方法。
【請求項１３】
前記アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、配列番号２又は配列番号５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベータ−Ｇ１Ｐは、第２の反応を実現することによって工程（ａ）内に用意され、前記第２の反応の生成物は、ベータ−Ｇ１Ｐを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の反応は、工程（ａ）が実行される同じ容器内で実現され、前記第２の反応は、工程（ａ）の前に、且つ／又は工程（ａ）と連続的に実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の反応は、（ｉ）水、（ｉｉ）無機ホスファート、（ｉｉｉ）グルコースを含む二糖、オリゴ糖、又は多糖、及び（ｉｖ）前記二糖、オリゴ糖、又は多糖を加リン酸分解するホスホリラーゼを接触させることによって、ベータ−Ｇ１Ｐを生成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の反応は：
（ｉ）水、無機ホスファート、マルトース、及びマルトースホスホリラーゼ、又は
（ｉｉ）水、無機ホスファート、トレハロース、及びトレハロースホスホリラーゼ
を含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、国際出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７７００４号明細書（２０１８年２月２３日出願）の利益を主張し、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、酵素反応の分野にある。例えば、本開示は、グルカンホスホリラーゼを用いてアルファ−１，３−グルカンを生成する反応及び方法に関する。
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式なコピーは、２０１９年２月２１日作成の２０１９０２２１＿ＮＢ４１４１７ＷＯＰＣＴ２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称のファイルにより、約２５キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
種々の用途に多糖類を用いることが所望されているため、研究者らは、生分解性であり、且つ再生可能に供給される原料から経済的に製造することができる多糖類を探求してきた。そのような多糖類の１つが、アルファ−１，３−グルカン、すなわちアルファ−１，３−グリコシド結合を有することを特徴とする不溶性グルカンポリマーである。このポリマーは、例えば、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素を用いて調製されてきた（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１４５１−１４６０，１９９５）。また、例えば、米国特許第７００００００号明細書は、酵素的に生成されたアルファ−１，３−グルカンからの紡糸繊維の調製を開示している。また、種々の他のグルカン材料が、新たな、又は改良された用途を開発するために研究されてきた。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書は、アルファ−１，３結合及びアルファ−１，６結合が混合された不溶性グルカンの酵素的合成を開示している。
【０００５】
この研究にもかかわらず、グルカンスクラーゼ酵素活性に必ずしも依存するわけではない、アルファ−１，３グリコシド結合を含有するグルカンを生成する新しい方法が所望されている。このニーズに対処するために、本開示は、グルカンホスホリラーゼを用いてそのようなグルカンを合成する反応及び方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態において、本開示は、少なくとも水、ベータ−グルコース−１−リン酸（ベータ−Ｇ１Ｐ）、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物に関する。
【０００７】
別の実施形態において、本開示は、アルファ−１，３−グルカンを生成する方法であって：（ａ）少なくとも水、ベータ−グルコース−１−リン酸、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素を接触させて、アルファ−１，３−グルカンを生成する工程と；（ｂ）場合によっては、工程（ａ）において生成されたアルファ−１，３−グルカンを単離する工程とを含む方法に関する。
【０００８】
【表１】
2021513862.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【０００９】
引用される全ての特許文献及び非特許文献の開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１０】
特に開示されない限り、本明細書中で用いられる用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、言及される特徴の１つ以上（すなわち少なくとも１つ）を包含することが意図される。
【００１１】
存在する場合、特に記載されない限り、全ての範囲は包括的であり、且つ組合せ可能である。例えば、「１から５」の範囲（すなわち１〜５）が挙げられる場合、挙げられた範囲は、範囲「１から４」、「１から３」、「１〜２」、「１〜２及び４〜５」、「１〜３及び５」等を含むものと解釈されるべきである。
【００１２】
本明細書において、用語「糖」及び他の同様の用語は、特に明記されない限り、単糖及び／又は二糖／オリゴ糖を指す。本明細書において、「二糖」は、２つの単糖がグリコシド結合によって連結されている炭水化物を指す。本明細書において、「オリゴ糖」は、例えば３〜１５個の単糖がグリコシド結合によって連結されている炭水化物を指す。オリゴ糖は、「オリゴマー」と呼ぶこともできる。二糖／オリゴ糖内に含まれる単糖（例えば、グルコース及び／又はフルクトース）は、「モノマー単位」、「単糖単位」、又は他の同様の用語で呼ぶことができる。
【００１３】
用語「アルファ−グルカン」、「アルファ−グルカンポリマー」等は、本明細書中で互換的に用いられる。アルファ−グルカンは、アルファ−グリコシド結合によって互いに連結されたグルコースモノマー単位を含むポリマーである。本明細書において、アルファ−グルカンは、オリゴ糖又は多糖の形態であることができる。典型的な実施形態において、本明細書中のアルファ−グルカンは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアルファ−グリコシド結合を含む。本明細書中のアルファ−グルカンポリマーの例として、アルファ−１，３−グルカンが挙げられる。本明細書中の、糖内に含まれるグルコース、アルファ−グルカン、又は他の炭水化物は、グルコースモノマー単位、グルコースモノマー、グルコース単位、又は他の同様の用語で呼ぶことができる。
【００１４】
用語「ポリアルファ−１，３−グルカン」、「アルファ−１，３−グルカン」、「アルファ−１，３−グルカンポリマー」等は、本明細書中で互換的に用いられる。アルファ−１，３−グルカンは、少なくともＤＰ３のポリマーであり、そしてグリコシド結合によって互いに連結されたグルコースモノマー単位を含み、グリコシド結合の少なくとも約５０％が、アルファ−１，３である。特定の実施形態におけるアルファ−１，３−グルカンは、約１００％のアルファ−１，３グリコシド結合を有し、又は少なくとも約９０％若しくは９５％のアルファ−１，３グリコシド結合を含む。本明細書中のアルファ−１，３−グルカンにおける他の結合は、大部分又は全てが、典型的には、アルファ−１，６であるが、いくつかの結合が、アルファ−１，２及び／又はアルファ−１，４であってもよい。
【００１５】
用語「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）」、「結合」等は、本明細書中で互換的に用いられて、炭水化物（糖）分子を、別の炭水化物等の別の群に連結する共有結合を指す。本明細書中で用いられる用語「アルファ−１，３−グリコシド結合」は、隣接するアルファ−Ｄ−グルコース環上の炭素１及び３を介してアルファ−Ｄ−グルコース分子を互いに連結する共有結合のタイプを指す。本明細書中のグルカンポリマーのグリコシド結合は、「グルコシド結合」と呼ぶこともできる。本明細書中で、「アルファ−Ｄ−グルコース」は、特に明記されない限り、「グルコース」と呼ぶ。
【００１６】
本明細書中のアルファ−グルカンのグリコシド結合プロファイルは、当該技術分野において知られているあらゆる方法を用いて求めることができる。例えば、結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば、１３Ｃ  ＮＭＲ又は１Ｈ  ＮＭＲ）を用いる方法により求めることができる。用いることができるこれらの方法及び他の方法は、例えば、Ｆｏｏｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されており、この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書中の大きいアルファ−グルカンポリマーの「分子量」は、重量平均分子量（Ｍｗ）又は数平均分子量（Ｍｎ）として表すことができ、その単位は、ダルトン又はグラム／モルである。代わりに、大きいアルファ−グルカンポリマーの分子量は、ＤＰｗ（重量平均重合度）又はＤＰｎ（数平均重合度）として表すことができる。オリゴ糖等のより小さいアルファ−グルカンポリマーの分子量は、典型的には、「ＤＰ」（重合度）として与えることができ、これは単に、アルファ−グルカン内に含まれるグルコースモノマー単位の数を指す。高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、又はゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）等によって、これらの種々の分子量の測定値を算出するための種々の手法が、当該技術分野において知られている。
【００１８】
特に開示されない限り、本明細書中で用いられる用語「ホスホリラーゼ」、「ホスホリラーゼ酵素」等は、ＣＡＺｙ（炭水化物活性酵素）データベース（ｃａｚｙ．ｏｒｇ  ｗｅｂｓｉｔｅ；Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８（参照によって本明細書に組み込まれる）参照）に従う、グリコシルヒドロラーゼ６５（ＧＨ６５）ファミリーに属する酵素の特定のクラスを指す。そのようなホスホリラーゼは、グルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）及び適切な受容体（反応基質）からの、特定のタイプの二糖、オリゴ糖、又は多糖（例えばアルファ−グルカン）、及び遊離ホスファート（反応生成物）の合成を可逆的に（そのような可逆性は、典型的に、孤立した／インビトロ条件下でのみ示される）触媒することができる。本明細書中の「アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ」（「アルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素」）は、ベータ−Ｇ１Ｐ及び適切な受容体からの、アルファ−１，３グリコシド結合含有オリゴ糖又は多糖、及び遊離ホスファートの合成を触媒する。特定の態様におけるアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２又は配列番号５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応に用いられる受容体に応じて、アルファ−１，３グリコシド結合含有オリゴ糖又は多糖生成物は、（ｉ）完全にグルコースモノマー単位で構成されてもよいし（受容体それ自体が、１つ以上のグルコース単位のみで構成される場合）、又は（ｉｉ）非グルコース単糖単位及び／又は非糖部分を、グルコース単位に加えて含んでもよい（受容体それ自体が、そのような他の単糖単位及び／又は部分を含む場合）。本明細書中で特に記載されない限り、これらの生成物型のいずれか（ｉ又はｉｉ）を、場合によっては、受容体から合成された（すなわち、生成物結合プロファイルは、受容体の結合を含まない）アルファ−１，３グリコシド結合含有オリゴ糖又は多糖に関して特徴付けることができる。そのことは、例えば、受容体としてデキストランを用いて本明細書中で合成された、約１００％のアルファ−１，３結合を有するアルファ−１，３−グルカンを記載する際にも当てはまる。
【００１９】
用語「受容体」、「受容体分子」、「受容体化合物」等は、本明細書中で互換的に用いられる。本明細書中の適切な受容体は、少なくとも１つのヒドロキシル基部分（−ＯＨ）を含む有機分子であることが意図され、このヒドロキシル基部分は、本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼの触媒活性を介した、ベータ−Ｇ１Ｐのグルコースの１−位置とのグリコシド結合（ヒドロキシル基部分の酸素原子を必要とする）の形成（ホスファート基が、結合形成中に置換される）に関与することができる。適切な受容体は、炭水化物であっても非炭水化物であってもよい。非炭水化物受容体の例として、アルコール、ポリオール、フェノール化合物、及びアミノ酸が挙げられる。炭水化物受容体の例として、二糖、オリゴ糖、及び多糖が挙げられる；一部の実施形態において、炭水化物受容体のモノマー単位の全て又は一部が、グルコース単位であってよい。炭水化物受容体の非還元末端は、典型的に、グリコシド結合形成に関与する。用語「初期の受容体」は、場合によっては、本明細書中で、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応を調製する場合に用いられる受容体を特徴付けるのに用いられてもよい。初期の受容体はまだ、これにグルコースが、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼによって連結されていない。アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応の間、受容体は典型的に、ホスホリラーゼによる以降のグルコース付加のための受容体として、繰り返し機能する。
【００２０】
本明細書中で用いられる「グルコース−１−リン酸」（Ｇ１Ｐ）は、１−炭素上にリン酸基を有するグルコース分子を指す。本明細書中でＧ１Ｐは典型的に、ベータ−Ｄ−グルコース−１−リン酸（ベータ−Ｇ１Ｐ）であり、これは、アノマー中心にベータ配置があるＤ−グルコピラノースである。特に開示されない限り、本明細書中でＧ１Ｐは、アルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸（アルファ−Ｇ１Ｐ）でない。
【００２１】
「Ｐｉ」と表記され得る「無機ホスファート」は、溶液中における遊離リン酸イオンを指し、Ｇ１Ｐ等のリン酸エステルで結合しているホスファートとは区別される。
【００２２】
用語「酵素反応」、「酵素反応組成物」、「グルカンホスホリラーゼ反応」、「アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応」等の用語は、本明細書中で互換的に用いられ、そして特に記載されない限り、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素によって実行される反応を指す。酵素反応は、通常、少なくともベータ−Ｇ１Ｐ、受容体、及び活性アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む水溶液／調製物に言及する。これは、水、ベータ−Ｇ１Ｐ、受容体、及びアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を接触させる工程が実行されるような反応である。用語「適切な反応条件下で」等の用語は、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を介した、基質（ベータ−Ｇ１Ｐ及び受容体）の、アルファ−１，３−グルカン（受容体から延長される）及び遊離ホスファート生成物への変換を支持する反応条件を指す。特定の実施形態において、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応が、不溶性のアルファ−１，３−グルカン生成物（すなわち、典型的には、ＤＰが少なくとも８又は９であるアルファ−１，３−グルカン）を生成するにつれ、そのような生成物は、溶液の外に存在する（反応物は混合液となる）ことが理解されるであろう。
【００２３】
本明細書中で用いられる「対照」酵素反応は、例えば、配列番号２又は配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含まないアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼを用いる反応を指す。対照反応の他の全ての特徴（例えば、基質濃度、温度、ｐＨ、時間）は、比較されることとなる反応と同じであり得る。
【００２４】
本明細書中で用いられる用語「ニゲロース」は、二糖である３−Ｏ−アルファ−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを指す。
【００２５】
本明細書中の用語「デキストラン」、「デキストランポリマー」、「デキストラン分子」等は、少なくとも８０％のアルファ−１，６グリコシド結合（結合の残りは、典型的には、全て又はほとんどがアルファ−１，３である）を含む水溶性アルファ−グルカンを指す。
【００２６】
本明細書中で用いられる用語「マルトース」は、二糖である４−Ｏ−アルファ−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを指す。
【００２７】
本明細書中で用いられる用語「マルトースホスホリラーゼ」は、マルトース及び無機ホスファート（基質）の、グルコース及びベータ−Ｇ１Ｐ（生成物）への反応を触媒する酵素を指す。マルトースホスホリラーゼは、ＥＣ２．４．１．８に分類される。
【００２８】
本明細書中の用語「トレハロース」、「アルファ，アルファ−トレハロース」等は、二糖アルファ−Ｄ−グルコピラノシル−（１，１）−アルファ−Ｄ−グルコピラノシドを指す。
【００２９】
本明細書中で用いられる用語「トレハロースホスホリラーゼ」は、トレハロース及び無機ホスファート（基質）の、グルコース及びベータ−Ｇ１Ｐ（生成物）への反応を触媒する酵素を指す。トレハロースホスホリラーゼは、ＥＣ２．４．１．６４に分類される。
【００３０】
本明細書中で用いられる用語「コージビオース」は、二糖である２−アルファ−Ｄ−グルコシル−Ｄ−グルコースを指す。
【００３１】
本明細書中で用いられる用語「コージビオースホスホリラーゼ」は、コージビオース及び無機ホスファート（基質）の、グルコース及びベータ−Ｇ１Ｐ（生成物）への反応を触媒する酵素を指す。コージビオースホスホリラーゼは、ＥＣ２．４．１．２３０に分類される。
【００３２】
本明細書中で用いられる用語「ニゲロースホスホリラーゼ」は、ニゲロース及び無機ホスファート（基質）の、グルコース及びベータ−Ｇ１Ｐ（生成物）への反応を触媒する酵素を指す。ニゲロースホスホリラーゼは、ＥＣ２．４．１．２７９に分類される。
【００３３】
本明細書中で用いられる「第２の反応」は、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応（「第１の反応」）に追加され、そして第１の反応にベータ−Ｇ１Ｐ基質を提供する反応を指す。本明細書中の少なくとも第１の反応及び第２の反応の組合せは、場合によっては「共役反応」と呼ぶことができる。本明細書中の第２の反応は典型的に、ホスホリラーゼ及び遊離ホスファートを用いて、二糖、オリゴ糖、又は多糖を加リン酸分解することによってベータ−Ｇ１Ｐを提供し、当該加リン酸分解は、少なくともベータ−Ｇ１Ｐを生成する。
【００３４】
用語「容量によるパーセント」、「容量パーセント」、「ｖｏｌ％」、「ｖ／ｖ％」等は、本明細書中で互換的に用いられる。溶液中の溶質の容量パーセントは、次式を用いて求めることができる：［（溶質の容量）／（溶液の容量）］×１００％。
【００３５】
用語「重量によるパーセント」、「重量パーセンテージ（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセンテージ（ｗ／ｗ％）」等は、本明細書中で互換的に用いられる。重量によるパーセンテージは、組成物、混合物、又は溶液中に含まれる場合の質量基準での物質のパーセンテージを指す。
【００３６】
本明細書中で用いられる用語「水性液体」、「水性流体」等は、水又は水溶液を指し得る。本明細書中の「水溶液」は、１種以上の溶解塩を含んでよく、最大総塩濃度は、一部の実施形態において、約３．５ｗｔ％であってもよい。本明細書の水性液体は、典型的には、液体中の唯一の溶媒として、水を含むが、水性液体は、場合によっては、水に混和する１種以上の他の溶媒（例えば極性有機溶媒）を含んでよい。ゆえに、水溶液は、少なくとも約１０ｗｔ％の水を有する溶媒を含んでよい。
【００３７】
本明細書中の「水性組成物」は、例えば、少なくとも約１０ｗｔ％の水を含む液体成分を有する。水性組成物の例として、混合液、溶液、分散系（例えばコロイド分散系）、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。特定の実施形態における水性組成物は、本明細書中に開示される不溶性アルファ−グルカンを含んでよく、この場合、アルファ−グルカンが不溶性であれば、水性組成物は、場合によっては、液体中固体組成物と特徴付けることができる。
【００３８】
本明細書中で用いられる用語「コロイド分散系」は、分散相及び分散媒体を有する、すなわち微視的に分散した不溶性粒子が別の物質（例えば、水又は水性溶液等の水性組成物）の全体にわたって懸濁されている不均一系を指す。本明細書中のコロイド分散系の例として、親水コロイドがある。親水コロイド等のコロイド状分散系の粒子の全て、又は一部が、本開示の不溶性アルファ−グルカンを含んでもよい。用語「分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ）」及び「分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」は、本明細書中で互換的に用いられて、分散系の形成及び／又は安定化を促進する物質を指す。
【００３９】
「不溶性」、「水不溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水不溶性（ｗａｔｅｒ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」（及び同様の用語）であるグルカン（例えば、不溶性アルファ−１，３−グルカン）は、水又は他の水性条件に溶解しない（又は認め得るほどに溶解しない）（ここで、水性条件はさらに、場合によっては、ｐＨが４〜９（例えば、ｐＨ６〜８）であり、且つ／又は温度が約１〜８５℃（例えば、２０〜２５℃）であることを特徴とする）。対照的に、「可溶性」、「水溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水溶性（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」等である本明細書中の特定のオリゴ糖等のグルカン（例えば、ＤＰが８未満であるアルファ−１，３−グルカン）は、これらの条件下でかなり溶解する。
【００４０】
ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に関して本明細書中で用いられる用語「配列同一性」、「同一性」等は、特定の比較ウィンドウにわたって一致が最大になるようにアラインされた場合に同じである、２つの配列内の核酸残基又はアミノ酸残基を指す。ゆえに、「配列同一性のパーセンテージ」、「同一性パーセント」等は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列を比較することによって求められる数値を指し、このとき、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントの基準配列（付加も欠失も含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含む場合がある。パーセンテージは、双方の配列内で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を求めて、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数で除して、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、算出される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列間の配列相同性を算出する場合、ＤＮＡ配列のＴ残基は、ＲＮＡ配列のＵ残基とアラインし、且つ「同一である」とみなされ得ることが理解されるであろう。第１及び第２のポリヌクレオチドの「相補性パーセント」を求めるには、例えば、（ｉ）第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドの相補配列（又はその逆）との同一性パーセント、及び／又は（ｉｉ）標準的なワトソン＆クリック塩基対を作り出すだろう第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド間の塩基のパーセンテージを求めることによって、これを得ることができる。
【００４１】
同一性パーセントは、以下に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない、知られているあらゆる方法によって容易に求めることができる：１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；及び５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）（これらは全て、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００４２】
同一性パーセントを求める好ましい方法は、試験する配列間の最良の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を求める方法は、例えば、公開されているコンピュータプログラム内にコードされている。配列アラインメント及び同一性パーセントの算出は、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて実行することができる。配列の多重アラインメントは、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載される）が挙げられ、且つＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭＥＧＡＬＩＧＮ  ｖ８．０  プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）に見出される、様々な種類のアルゴリズムを包含するＣｌｕｓｔａｌアラインメント法を用いて実行することができる。多重アラインメントについて、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０及びＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当し得る。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたタンパク質配列のペアワイズアラインメント及び同一性パーセントの算出のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であり得る。核酸について、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。加えて、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を用いることができ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）によって記載されている、これは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭＥＧＡＬＩＧＮ  ｖ８．０プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）内に見出すことができる。多重アラインメント（タンパク質／核酸）用のデフォルトパラメータは、以下であってよい：  ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０／１５、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２／６．６６、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０／３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ。
【００４３】
種々のポリペプチドアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列が、本明細書中で、特定の実施形態の特徴として開示されている。本明細書中で開示される配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％、又は９０％〜９５％同一であるこれらの配列の変異体が使用又は参照されてもよい。代わりに、変異アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列が、本明細書中で開示される配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有してもよい。変異アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、開示される配列と同じ機能／活性、又は開示される配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書中で開示されるあらゆるポリペプチドアミノ酸配列は典型的に、少なくとも、アミノ酸配列のＮ末端に開始メチオニンをさらに含んでもよい。対照的に、メチオニンで始まる、本明細書中で開示されるあらゆるポリペプチドアミノ酸配列は、場合によっては、そのようなメチオニン残基を欠失していてもよい。
【００４４】
本明細書中で用いられる用語「単離された」は、天然に存在しない形態又は環境にある物質（又はプロセス）を特徴付ける。単離された物質の非限定的な例として、天然に存在しないあらゆる物質、例えば、アルファ−１，３−グルカン、又は本明細書（並びに本開示のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応、及びその調製に用いられるプロセス）中で合成される他のあらゆるポリマーが挙げられる。本明細書中で開示される実施形態は、合成物／人工物（人間の介入／関与なしには製造され得ない）であり、且つ／又は天然に存在しない特性を有すると考えられる。
【００４５】
本明細書中で用いられる用語「増大した」は、増大した量又は活性が比較されることとなる量又は活性よりも、量又は活性が、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％、又は２００％上回ることを指し得る。用語「増大した」、「上昇した」、「増強された」、「よりも多い」、「向上した」等は、本明細書中で互換的に用いられる。
【００４６】
必ずしもグルカンスクラーゼ酵素活性に依存するわけではない、アルファ−１，３グリコシド結合を含有するグルカンを生成する新しい方法が所望される。そのようなグルカンを合成するためにグルカンホスホリラーゼを用いる反応及び方法が、本開示において、このニーズに対処するために提供される。
【００４７】
本開示の特定の実施形態は、少なくとも水、ベータ−Ｇ１Ｐ、適切な受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素（すなわち、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ）を含む反応組成物に関する。重要なことに、そのような酵素反応は、アルファ−１，３−グルカンを生成することによって、アルファ−１，３−グルカンを生成する新しい手段となると考えられるものを意味する。そのような新しい手段は、所望されるならば、アルファ−１，３−グルカンを生成するのにグルカンスクラーゼを用いることから完全に独立する。
【００４８】
本開示の酵素反応に用いるのに適している、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素は、例えば、配列番号２又は配列番号５と１００％同一である、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、これからなってもよい。一部の態様において、配列番号２又は配列番号５とのアミノ酸同一性が８０〜９９．５％であるアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、それぞれ、配列番号２又は配列番号５のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼの酵素活性の一部（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％）、又は全てを有し得る。
【００４９】
配列番号２又は配列番号５をコードする本明細書中のポリヌクレオチド配列（又はこれらに対して≧９０％の同一性を有する関連アミノ酸配列）は、場合によっては、それぞれ配列番号１又は配列番号４と１００％同一である、又は少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含んでもよい。本明細書中のそのような配列の例は、それぞれ、配列番号３及び配列番号６である。
【００５０】
あるアミノ酸同士が、互いに類似した構造的特徴及び／又は電荷の特徴を共有する（すなわち、保存されている）場合、本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ配列（及び／又は本明細書中の他のタイプのポリペプチド）の１つ以上のアミノ酸は、場合によっては、以下のように、保存アミノ酸残基で置換されてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．以下の小さい脂肪族の非極性又は弱極性の残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．以下の極性の負荷電残基及びそれらのアミドは、相互に置換することができる：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．以下の極性の正荷電残基は、相互に置換することができる：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．以下の脂肪族の非極性残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；及び
５．以下の大きい芳香族残基は、相互に置換することができる：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
【００５１】
一部の態様において、本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素を、細菌又は真菌（例えば酵母）等の微生物の源から得ることができる（又は入手可能である）。本明細書中の細菌の例として、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種及びカルディセルロシルプタ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）属種が挙げられる。本明細書中のパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種の例として、Ｐ．バレンゴルトジイ（Ｐ．ｂａｒｅｎｇｏｌｔｚｉｉ）、Ｐ．ルビンファンティス（Ｐ．ｒｕｂｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｐ．アルベイ（Ｐ．ａｌｖｅｉ）、Ｐ．アゾトフィクサンス（Ｐ．ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ）、Ｐ．デンドリティフォルミス（Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｐ．デュラム（Ｐ．ｄｕｒｕｍ）、Ｐ．コレエンシス（Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、及びＰ．ラルバエ（Ｐ．ｌａｒｖａｅ）が挙げられる。本明細書中のカルディセルロシルプタ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）属種の例として、Ｃ．ヒドロテルマリス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、Ｃ．クロノツキエンシス（Ｃ．ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ）、Ｃ．アセチゲヌス（Ｃ．ａｃｅｔｉｇｅｎｕｓ）、Ｃ．ベスシイ（Ｃ．ｂｅｓｃｉｉ）、Ｃ．オウェンセンシス（Ｃ．ｏｗｅｎｓｅｎｓｉｓ）、Ｃ．サッカロリティクス（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｃ．ラクトアセティクス（Ｃ．ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、及びＣ．クリストヤンソニイ（Ｃ．ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）が挙げられる。
【００５２】
本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素の例は、開示されるアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼアミノ酸配列、並びにさらにＮ末端及び／又はＣ末端に１〜３００（又はその範囲のあらゆる整数［例えば、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０］）個の残基を含むアミノ酸配列のいずれかであってよい。そのような付加的残基は、例えば、（Ｎ末端又はＣ末端の）エピトープタグ（例えば、６個のヒスチジンなどのＨｉｓタグ）等の異種配列、又は（Ｎ末端の）異種シグナルペプチドであってもよい。異種アミノ酸配列がＮ末端に導入されている実施形態において、そのような異種配列は、例えば、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼの元の開始メチオニンに隣接してもよいし、元の開始メチオニンを置換してもよい。後者の実施形態において、新しい開始メチオニンが異種配列のＮ末端にあってもよい。
【００５３】
本開示のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素は、通常、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く。しかしながら、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を生成する発現系が、場合によっては、細胞外分泌を指示するＮ末端シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む酵素コーディングポリヌクレオチドを使用してもよい。そのような実施形態におけるシグナルペプチドは、分泌プロセス中に酵素から切断される。本明細書中に開示されるアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素（例えば、配列番号２及び配列番号５）は、シグナルペプチドとは結合しないと考えられることから、付加されるあらゆるシグナルペプチドは、酵素とは異種であるとみなすことができる。本明細書中のシグナルペプチドの例は、細菌種（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））又は真菌種由来のシグナルペプチドである。
【００５４】
本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼは、例えば、適切に操作された微生物株の発酵によって調製することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、並びにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属（例えば、Ｔ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属（例えば、Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ））等の微生物種を用いた、発酵による組換え酵素の生成は、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｄｒｉｏ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｉｎ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ４：１１７−１３９，２０１４を参照（この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる））。アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、典型的には、当該酵素用の発現カセットを形成するために異種プロモータ配列と連結され、且つ／又はそれに合うようにコドン最適化される。そのような発現カセットは、当該技術分野において周知の方法を用いて、適切なプラスミド中に組み込まれてもよいし、微生物宿主染色体中に組み込まれてもよい。発現カセットは、アミノ酸コーディング配列に続いて転写ターミネータヌクレオチド配列を含んでよい。発現カセットは、プロモータ配列とホスホリラーゼアミノ酸コーディング配列との間に、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼの直接的な分泌のために設計されたシグナルペプチド（例えば、異種シグナルペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。発酵の終わりに、細胞は適宜破壊されてもよく（典型的には、分泌用のシグナルペプチドが採用されていない場合）、そしてホスホリラーゼは、沈殿、濾過、及び／又は濃縮等の方法を用いて単離することができる。或いは、ホスホリラーゼを含む溶解液又は抽出物を、さらに単離することなく用いることができる。アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼは、分泌されれば（すなわち、発酵ブロス中に存在するならば）、場合によっては、発酵ブロスから単離されたものとして用いられても、発酵ブロス中に含まれたままの状態で用いられてもよい。アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素の活性は、所望されるならば、生化学アッセイによって、例えば、ベータ−Ｇ１Ｐ及び適切な受容体を含有する本明細書中の反応内に（例えば、以下の実施例３に記載される条件下で）酵素を入れた場合のリン放出を測定することによって、確認することができる。一部の態様において、酵素による１単位のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性は、約１０ｍＭベータ−Ｇ１Ｐ、約５ｍＭ受容体（例えばニゲロ���ス）、及び約５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファ（約ｐＨ７．０）を含む水性反応において、約３７℃にて約１０分間インキュベートされて、１分あたり１μｍｏｌの無機リンを放出する酵素の量と定義することができる。無機ホスファート放出は、場合によっては、ＰｉＢｌｕｅ（商標）Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を用いて計量することができる。本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、例えば、マルトースホスホリラーゼ活性を有するとは考えられない。本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、オリゴ糖／多糖を生成するので、そのような酵素は、ニゲロースホスホリラーゼでないことが理解されるであろう。
【００５５】
本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応は、アルファ−１，３−グルカンを生成する。一部の実施形態において、アルファ−１，３−グルカンの構成グリコシド結合の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又は、５０％〜１００％の間のあらゆる整数）が、アルファ−１，３結合である。したがって、一部の態様において、アルファ−１，３−グルカンは、アルファ−１，３ではないグリコシド結合が、約５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又は０％（又は、０％〜５０％の間のあらゆる整数値）である。アルファ−１，３−グルカン内に存在するアルファ−１，３結合のパーセンテージが高くなるほど、ポリマー内で分岐点を形成する特定の結合の発生率は低くなるため、アルファ−１，３−グルカンが直鎖状であるパーセンテージが高くなることが理解されるはずである。ゆえに、アルファ−１，３結合が１００％であるアルファ−１，３−グルカンは、完全に直鎖状である。特定の実施形態において、アルファ−１，３−グルカンは、分岐点を有していない、又はポリマー内のグリコシド結合のパーセントとして、約５％、４％、３％、２％、若しくは１％未満の分岐点を有する。本明細書中で特に記載されない限り、所定の結合プロファイルは、受容体から合成されるアルファ−１，３−グルカンのものを特徴付けている（すなわち、結合プロファイルは、受容体の結合プロファイルを含まない）。
【００５６】
本明細書中のアルファ−１，３−グルカンは、ＤＰの分子量が、例えば、約、又は少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３〜１５、３〜２０、３〜２５、３〜３０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０、又は２５〜３０であってもよい。一部の態様において、上述のＤＰ値（例えば８以上）はいずれも、その代わりとして、ＤＰｗ又はＤＰｎに換算して表されてもよい。本明細書中で特に記載されない限り、所定の分子量は、受容体から合成されるアルファ−１，３−グルカンのものを特徴付けている（すなわち、分子量は、受容体の分子量を含まない）。
【００５７】
一部の態様におけるアルファ−１，３−グルカンは、水性条件において不溶性である。そのような不溶性は、非苛性水性条件、例えば本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応の条件（以下を参照）においてである。一般に、本明細書中での水性系中のアルファ−１，３−グルカンポリマーの溶解度は、その結合プロファイル、分子量、及び／又は分岐度に関連する。例えば、アルファ−１，３結合が≧９５％であるアルファ−１，３−グルカンは、２０℃の水性条件において、８以上のＤＰにて略不溶性である。一般に、分子量が増大するにつれて、アルファ−１，３−グルカンの不溶性に必要なアルファ−１，３結合のパーセンテージは減少する。一部の態様において、アルファ−１，３−グルカン（例えば、アルファ−１，３結合が≧９５％、そしてＤＰが７以下）は、前述の水性条件において可溶性である。非苛性水性条件（又は本明細書中の水性条件）は、例えば、水又は水溶液を含んでもよく、溶媒は、水が約、又は少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は１００ｗｔ％であり、そしてｐＨが４〜９（例えば、ｐＨ４〜８又は６〜８）である。
【００５８】
本明細書中のアルファ−１，３−グルカンは、典型的に、交互の１，３結合及び１，６結合を含まない。本明細書のアルファ−１，３−グルカンは、典型的に、不活性容器内で（典型的には無細胞条件下で）（インビトロで）酵素的に誘導され、細胞壁（例えば、真菌細胞壁）から誘導されない。一部の実施形態は、本明細書中で開示される酵素反応プロセス／条件のいずれかによって、生成されたままの状態でアルファ−１，３−グルカンに誘導され（ｄｒａｗｎ）、又は生成可能である。
【００５９】
適切な受容体分子が、本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応に用いられ、そして場合によっては、「最初の受容体」として特徴付けられてもよい。というのも、典型的には、反応を最初に調製するときに加えられるからである。
【００６０】
一部の態様において、受容体分子は、単糖、二糖、又はオリゴ糖を含む。また、一部の態様において、受容体は、単糖、二糖、又はオリゴ糖からなる（例えば、糖受容体は、化学的に誘導体化／置換されていない）。二糖又はオリゴ糖受容体分子は典型的に、１つ以上のグルコースモノマー単位を含み（例えば、モノマー単位の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％が、グルコースである）、又はグルコースモノマー単位しか含まない。二糖又はオリゴ糖は、場合によっては、典型的には１つ以上のグルコースモノマー単位に加えて、１つ以上の非グルコースモノマー単位を含んでもよい。一部の態様において、二糖又はオリゴ糖は、非グルコースモノマー単位しか含まない。二糖又はオリゴ糖（又は非グルコース単糖受容体）の非グルコースモノマー単位は、一部の態様において、フルクトース、アラビノース、キシロース、又はガラクトースであってもよい。さらに、一部の態様において、単糖受容体は、グルコース、ｐ−ニトロフェニルアルファ−Ｄ−グルコピラノシド、又はｐ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−グルコピラノシドであってもよい。一部の態様において、受容体は、フルクトースでも、マンノースでも、グルコサミンでもない。受容体は、例えば、直鎖状（枝なし）であっても分岐していてもよい。
【００６１】
本明細書中の二糖受容体分子又はオリゴ糖受容体分子は、アルファ−グリコシド結合及び／又はベータ−グリコシド結合を含んでもよい。受容体の結合は、例えば、１００％のアルファ−グリコシド結合、又は少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％のアルファ−グリコシド結合であってもよい。二糖受容体又はオリゴ糖受容体のグルコースモノマー間のアルファ−又はベータ−グリコシド結合は、以下の結合の一タイプ、又は複数タイプを含んでもよい：１，１；１，２；１，３；１，４；及び／又は１，６。実例を示すためだけに、結合は、全てアルファ−１，３グルコシド結合であっても全てアルファ−１，６グルコシド結合であってもよいし、アルファ−１，３グルコシド結合及びアルファ−１，６グルコシド結合の混合であってもよい。
【００６２】
本明細書中のオリゴ糖受容体は、例えば、少なくとも、又は最大、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のモノマー単位を有してもよい。
【００６３】
本明細書中の二糖受容体分子の特定の例は、マルトース、イソマルトース、セロビオース、ニゲロース、トレハロース、マルツロース、スクロース、イソマルツロース（Ｐａｌａｔｉｎｏｓｅ（商標））、ツラノース、ラクトース、コージビオース、ソホロース、ラミナリビオース、又はゲンチオビオースを含み、又はこれらからなる。一部の態様において、本明細書中の二糖受容体分子は、マルトース、ニゲロース、マルツロース、又はツラノースを含み、又はこれらからなる。
【００６４】
一部の態様において、受容体分子は、多糖を含む。また、一部の態様において、受容体は、多糖からなる（例えば、多糖受容体は、化学的に誘導体化／置換されていない）。多糖受容体分子は典型的に、１つ以上のグルコースモノマー単位を含み（例えば、モノマー単位の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％がグルコースである）、又はグルコースモノマー単位しか含まない（すなわちグルカン）。多糖は、場合によっては、典型的には１つ以上のグルコースモノマー単位に加えて、１つ以上の非グルコースモノマー単位を含んでもよい。多糖の非グルコースモノマー単位は、一部の態様において、フルクトース、アラビノース、キシロース、又はガラクトースであってもよい。
【００６５】
本明細書中の多糖受容体分子は、アルファ−グリコシド結合及び／又はベータ−グリコシド結合を含んでもよい。多糖受容体の結合は、例えば、１００％のアルファ−グリコシド結合（例えばアルファ−グルカン）、又は少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％のアルファ−グリコシド結合であってもよい。多糖受容体のグルコースモノマー間のアルファ−又はベータ−グリコシド結合は、以下の結合の一タイプ、又は複数タイプを含んでもよい：１，１；１，２；１，３；１，４；及び／又は１，６。実例を示すためだけに、結合は、全てアルファ−１，３グルコシド結合であっても全てアルファ−１，６グルコシド結合であってもよいし、アルファ−１，３グルコシド結合及びアルファ−１，６グルコシド結合の混合であってもよい。
【００６６】
本明細書中の多糖受容体は、例えば、ＤＰ又はＤＰｗが、約、又は少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、又は５００であってもよい。このＤＰ又はＤＰｗは、場合によっては、これらの値のいずれか２つの間の範囲として表されてもよい。単なる例として、ＤＰ／ＤＰｗは、約２０〜５０、２０〜４０、又は２０〜３０であってもよい。
【００６７】
本明細書中の多糖受容体の例は、デキストランを含んでもよいし、これからなってもよい。そのようなデキストランは、例えば、少なくとも８０％のアルファ−１，６グリコシド結合を含む水溶性アルファ−グルカンである限り、本明細書中の多糖受容体の先の特徴のいずれかを有し得る。本明細書中のデキストラン受容体の以下の態様は、単に説明のためだけに提供される。
【００６８】
本明細書中のデキストラン受容体は、例えば、約１００％のアルファ−１，６−グルコシド結合（すなわち、完全に直鎖状のデキストラン骨格）、又は約、若しくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％のアルファ−１，６−グルコシド結合を含んでもよい。そのようなアルファ−１，６結合プロファイルパーセントは、デキストラン（主鎖、及び、存在するならば分岐部の組合せ）内の全ての結合の総計を考慮に入れたものである。一部の態様において、デキストランは、アルファ−１，２−又はアルファ−１，３−結合枝を含んでもよい。
【００６９】
本明細書中のデキストラン受容体は、例えば、ＤＰ／ＤＰｗが、約、又は少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、又は５００であってもよい。このＤＰ／ＤＰｗは、場合によっては、これらの値のいずれか２つの間の範囲として表されてもよい。単なる例として、ＤＰ／ＤＰｗは、約２０〜５０、２０〜４０、又は２０〜３０であってもよい。さらに、一部の態様において、本明細書中のデキストランのＭｗ（重量平均分子量）は、例えば、約、又は少なくとも約１０００、２０００、５０００、１００００、２５０００、４００００、５００００、７５０００、１０００００、１２５０００、１５００００、１７５０００、２０００００、２４００００、２５００００、５０００００、７５００００、又は１００００００ダルトンであってもよいし、約１０００００〜２０００００、１２５０００〜１７５０００、１３００００〜１７００００、１３５０００〜１６５０００、１４００００〜１６００００、又は１４５０００〜１５５０００ダルトンの範囲内であってもよい。さらに、一部の態様において、デキストランは、Ｍｗが、約、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、又は２００百万ダルトンであってもよいし、約５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１２０、８０〜２００、８０〜１５０、又は８０〜１２０百万ダルトンの範囲内であってもよい。本明細書中のあらゆるデキストランＭｗは、場合によっては、重量平均重合度（ＤＰｗ）として表されもてよく、ＤＰｗは、１６２．１４で割られたＭｗである。
【００７０】
一部の態様において、デキストランは、化学置換があるように化学的に誘導体化されてもよい。本明細書中の誘導体化されたデキストランの例として、デキストラン硫酸、デキストランエーテル、及びデキストランエステルが挙げられる。誘導体化されたデキストランは、例えば、本開示のように、デキストランから製造することができる。
【００７１】
一部の態様において、デキストランは、例えば、以下に開示されるいずれであってもよい：米国特許出願公開第２０１６／０１２２４４５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０２８４９７２号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０２１８０９３号明細書、米国特許出願公開第２０１８／０２８２３８５号明細書、若しくは米国特許出願公開第２０１６／０１３６１９９号明細書、又は国際公開第２０１７／０７９５９５号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７１４号パンフレット、若しくは国際公開第２０１７／０９１５３３号パンフレット（これらの出願は全て、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００７２】
本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応の温度は、所望されるならば、制御されてもよい。一部の態様において、温度は、約５℃〜約５０℃である。一部の態様において、温度は、約２０℃〜約４２℃である。さらに、一部の態様において、温度は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、又は４２℃である。
【００７３】
一部の態様において、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応組成物のｐＨは、約４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜８．０、５．０〜８．０、６．０〜８．０、５．５〜７．５、又は５．５〜６．５であってよい。一部の態様において、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、又は８．０であってよい。ｐＨは、以下が挙げられるがこれらに限定されない適切なバッファの添加又は組込みによって、調整又は制御することができる：ホスファート（例えばリン酸ナトリウムバッファ）、トリス（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン；例えばトリス−ＨＣｌ）、シトラート、又はそれらの組合せ。酵素反応におけるバッファ濃度は、例えば、０ｍＭ〜約１００ｍＭ、又は約１０、２５、５０、若しくは７５ｍＭであってよい。一部の態様において、バッファは、トリスを含み、又はこれからなる；この態様及び一部の他の態様において、バッファは、場合によっては、ホスファートを含まない。
【００７４】
本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応におけるベータ−Ｇ１Ｐの初期濃度は、例えば、約、又は少なくとも約１〜１００ｍＭであってもよい。また、例えば、ベータ−Ｇ１Ｐ初期濃度は、約、又は少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｍＭ、又は約１０〜５０ｍＭであってもよい。本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応における受容体の初期濃度は、例えば、約１〜５０ｍＭであってもよい。一部の態様において、受容体の初期濃度は、約、又は少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０ｍＭ、又は約５〜１０ｍＭであってもよい。さらに、一部の態様において、受容体の初期濃度は、約、又は少なくとも約０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５、７．５、又は１０ｇ／Ｌであってもよい。基質、例えばベータ−Ｇ１Ｐ、又は受容体の「初期濃度」は、全ての反応成分が添加された直後の酵素反応（少なくとも、水、ベータ−Ｇ１Ｐ、受容体、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ）における基質濃度を指す。
【００７５】
一部の態様において、酵素反応に含まれるアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素の量は、約０．０１〜６０ｍｇ／ｍＬであってもよい。例えば、約、又は少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、８、１０、２０、３０、４０、５０、又は６０ｍｇ／ｍＬの酵素が、反応に使用されてもよい。本明細書中の反応は、例えば、１種、２種、又はそれ以上のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含んでもよい。一部の態様において、１種のみ、又は２種のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素が、反応に含まれる。本明細書中の反応組成物は、無細胞であってよく、そして典型的には無細胞である（例えば、細胞が完全に存在しない）。
【００７６】
反応組成物は、本明細書中に開示される１つ以上の反応条件を適用するのに適したあらゆる容器（例えば、不活性容器／コンテナ）内に含有されてよい。一部の態様において、不活性容器は、ステンレス鋼製であっても、プラスチック製であっても、ガラス製であっても（又はこれらの構成要素の２つ以上を含んでも）よく、且つ特定の反応物を入れるのに適したサイズのものであり得る。不活性容器は、場合によっては、撹拌装置が装備されていてもよい。例えば上記の特徴のいずれかを用いて、本明細書中の単離された反応物を特徴付けることができる。
【００７７】
一部の態様において、反応の完了は、視覚的に（例えば、不溶性の生成物の蓄積がもうない）、且つ／又は反応における基質（ベータ−Ｇ１Ｐ及び／又は受容体）の残量を測定する（例えば、経時的な基質レベルの低下がもうない）ことによって、判定することができる。本明細書中の反応は、例えば、約、又は少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４、又は１６８時間、実施されてもよい。
【００７８】
また、本開示の実施形態は、アルファ−１，３−グルカンを生成する方法であって、
（ａ）少なくとも水、ベータ−Ｇ１Ｐ、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素を接触させて、アルファ−１，３−グルカンを生成する工程と；
（ｂ）場合によっては、工程（ａ）において生成されたアルファ−１，３−グルカンを単離する工程と
を含む方法に関する。
【００７９】
アルファ−１，３−グルカンを生成する、本明細書中の方法における接触工程は、場合によっては、本開示の酵素反応を提供すると特徴付けられ得、少なくとも水、ベータ−Ｇ１Ｐ、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む。ゆえに、本明細書中の酵素反応組成物のあらゆる特徴が、同様に、本開示のアルファ−１，３−グルカン生成方法を特徴付ける。
【００８０】
アルファ−１，３−グルカン生成方法における接触工程は、あらゆる方法で実行されてもよい。例えば、所望の量のベータ−Ｇ１Ｐ及び／又は受容体を最初に水中に溶解し（場合によっては、緩衝成分等の他の成分もまた、この調製段階にて添加されてもよい）、次いで、１種以上のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を添加してもよい。反応物は、例えば、静置されてもよいし、（例えば、撹拌又はオービタル振盪を介して）撹拌されてもよい。
【００８１】
一部の態様において、アルファ−１，３−グルカンの単離は、少なくとも、遠心分離、濾過、分画、クロマトグラフィ分離、透析、蒸発、及び／又は希釈の工程を行うことを含んでもよい。不溶性のアルファ−１，３−グルカンカンの単離は、例えば、少なくとも、遠心分離工程又は濾過工程を行うことを含んでもよく、そして場合によってはさらに、遠心分離され、且つ／又は濾過されたアルファ−１，３−グルカンを、水又は他の水性液体で１回、２回、又はそれ以上洗浄することを含んでもよい。洗浄容量は、場合によっては、アルファ−１，３−グルカンを生成するのに用いられる反応組成物の容量の少なくとも約１０〜１００％であってもよい。洗浄は、必要に応じて、置換洗浄又はリスラリー洗浄等の様々な方式で行うことができる。本明細書中の単離は、場合によってはさらに、アルファ−１，３−グルカンを乾燥させること、且つ／又は不溶性のアルファ−１，３−グルカンを含む水性組成物（例えば分散系）を調製することを含んでもよい。
【００８２】
乾燥形態で提供される、本明細書中の単離されたアルファ−１，３−グルカン生成物は、例えば、２．０、１．５、１．０、０．５、０．２５、０．１０、０．０５、又は０．０１ｗｔ％以下の水を含んでもよい。一部の態様において、アルファ−１，３−グルカン生成物は、少なくとも１グラム（例えば、少なくとも２．５、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、又は１０００ｇ）の量で提供される；そのような量は、例えば、乾燥量であってもよい。
【００８３】
本明細書中の、単離された（場合によっては、「精製された」と特徴付けられる）アルファ−１，３−グルカンは、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、又は９９．９％のｗｔ％（乾燥重量基準）にて、組成物中に存在してもよい。そのような単離されたアルファ−１，３−グルカンはそれ自体、生成物／用途において、成分／構成要素として用いられてもよい。
【００８４】
本明細書中のアルファ−１，３−グルカン生成方法を実行するためのベータ−Ｇ１Ｐは、例えば、単離されたベータ−Ｇ１Ｐ（例えば、市販の源から得られたベータ−Ｇ１Ｐ）の添加を介して、直接提供されてもよい。或いは、ベータ−Ｇ１Ｐは、少なくとも第２の反応を提供することによって供給されてもよく、第２の反応の生成物は、ベータ−Ｇ１Ｐを含む（すなわち、第２の反応は、ベータ−Ｇ１Ｐを生成物として生成する）。「第２の反応」は、接触工程において行われるアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応（場合によっては、「第１の反応」と表記することができる）に加えて行われ、且つアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応にベータ−Ｇ１Ｐ基質を提供する反応を指す。第２の反応は、場合によっては、「ベータ−Ｇ１Ｐ生成酵素」を使用すると特徴付けられ得る。
【００８５】
一部の態様において、ベータ−Ｇ１Ｐを提供する第２の反応は、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素反応が実行される（場合によっては「共役反応」と特徴付けられ得る）同じ容器内で実現されてもよい。或いは、第２の反応は、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素反応が実行される容器の外側で（とは別個に）実行されてもよい。第２の反応は、例えば、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素反応の前に、且つ／又はこれと連続的に実行されてもよい。本明細書中の第２の反応の条件（例えば、時間、温度、ｐＨ）は、例えば、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応について開示される通りであってもよい。
【００８６】
一部の態様において、ベータ−Ｇ１Ｐを提供する第２の反応は、（ｉ）水、（ｉｉ）無機ホスファート、（ｉｉｉ）二糖、オリゴ糖、又は多糖（これらは全て、１つ以上のグルコースモノマー単位を含む）、及び（ｉｖ）二糖、オリゴ糖、又は多糖を加リン酸分解するホスホリラーゼを接触させることによって、ベータ−Ｇ１Ｐを生成する。この態様におけるホスホリラーゼは、本明細書中のベータ−Ｇ１Ｐ生成酵素の例である。第２の反応における二糖、オリゴ糖、又は多糖基質のモノマー単位は、例えば、全てグルコースであってもよいし、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％がグルコースであってもよい。モノマー単位間のグリコシド結合は、アルファ−結合及び／又はベータ−結合であってもよく、そして以下の結合の一タイプ、又は複数タイプであってもよい：１，１；１，２；１，３；１，４；及び／又は１，６。二糖又は三糖が典型的に、本明細書中の第２の反応に使用される。
【００８７】
本明細書中のベータ−Ｇ１Ｐ−生成酵素として適したホスホリラーゼの例として、マルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、コージビオースホスホリラーゼ、及びニゲロースホスホリラーゼが挙げられる。少なくとも水及び無機ホスファートの存在下で、これらの酵素は、それぞれ、マルトース、トレハロース、コージビオース、及びニゲロースを、ベータ−Ｇ１Ｐ及びグルコースの生成物に変換する。これらの酵素のいずれか、例えばマルトースホスホリラーゼ又はトレハロースホスホリラーゼは、例えば、起源が細菌（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属）であっても真菌であってもよい。マルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、及びコージビオースホスホリラーゼ酵素の例が、以下の参考文献に記載されており、これらは全て、参照によって本明細書に組み込まれる：米国特許第５８０７７１９号明細書、米国特許第５９３９３０８号明細書、米国特許第５９９３８８９号明細書、米国特許第５８４３７４８号明細書、米国特許第５５６５３４１号明細書、及び米国特許第５９６５４１２号明細書；米国特許出願公開第２００２／０６８３４９号明細書、米国特許出願公開第２０１３／３０２８５７号明細書、及び米国特許出願公開第２００７／１５４９９６号明細書、並びに国際公開第２００５／００３３４３号パンフレット。
【００８８】
一部の態様において、第２の反応におけるベータ−Ｇ１Ｐ生成ホスホリラーゼの基質は、本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼの受容体として作用せず、又はほとんど受容体機能を示さない（例えば、基質の５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、１重量％、又は０．５重量％未満が、受容体として、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼによって使用される）。そのような態様は、本明細書中で共役反応を行うための典型的な条件を示す。或いは、一部の態様において、第２の反応におけるベータ−Ｇ１Ｐ生成ホスホリラーゼの基質は、本明細書中のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼの受容体として作用する。そのような態様において、第２の反応は典型的に、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応とは別個に行われる（すなわち、共役反応ではない）；しかしながら、所望されるならば、ベータ−Ｇ１Ｐ生成ホスホリラーゼ及びアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼが、そのような条件下で、同じ基質について競合するという理解の下で、共役反応が行われてもよい。
【００８９】
本明細書中に開示される組成物及び方法の非限定的な例として、以下が挙げられる：
１．少なくとも水、ベータ−グルコース−１−リン酸（ベータ−Ｇ１Ｐ）、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物。
２．アルファ−１，３−グルカンは、アルファ−１，３グリコシド結合が少なくとも約５０％である、実施形態１の反応組成物。
３．アルファ−１，３−グルカンは、アルファ−１，３グリコシド結合が少なくとも約９０％である、実施形態１又は２の反応組成物。
４．アルファ−１，３−グルカンの重合度（ＤＰ）は、少なくとも３である、実施形態１、２、又は３の反応組成物。
５．アルファ−１，３−グルカンのＤＰは、少なくとも約１０である、実施形態４の反応組成物。
６．受容体分子は、二糖又はオリゴ糖を含む、実施形態１、２、３、４、又は５の反応組成物。
７．受容体分子は、ニゲロースを含む、実施形態１、２、３、４、５、又は６の反応組成物。
８．受容体分子は、多糖を含む、実施形態１、２、３、４、又は５の反応組成物。
９．多糖は、アルファ−グルカンを含む、実施形態１、２、３、４、５、又は８の反応組成物。
１０．アルファ−グルカンは、デキストランを含む、実施形態１、２、３、４、５、８、又は９の反応組成物。
１１．ホスホリラーゼ酵素は、配列番号２又は配列番号５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の反応組成物。
１２．アルファ−１，３−グルカンを生成する方法であって：（ａ）少なくとも水、ベータ−グルコース−１−リン酸（ベータ−Ｇ１Ｐ）、受容体分子、及びアルファ−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素を接触させて、アルファ−１，３−グルカンを生成する工程と；（ｂ）場合によっては、工程（ａ）において生成されたアルファ−１，３−グルカンを単離する工程とを含む方法。
１３．アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、配列番号２又は配列番号５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態１２の方法。
１４．前記ベータ−Ｇ１Ｐは、第２の反応を実現することによって工程（ａ）内に用意され、第２の反応の生成物は、ベータ−Ｇ１Ｐを含む、実施形態１２又は１３の方法。
１５．前記第２の反応は、工程（ａ）が実行される同じ容器内で実現され、前記第２の反応は、工程（ａ）の前に、且つ／又は工程（ａ）と連続的に実行される、実施形態１４に記載の方法。
１６．第２の反応は、（ｉ）水、（ｉｉ）無機ホスファート、（ｉｉｉ）グルコースを含む二糖、オリゴ糖、又は多糖、及び（ｉｖ）二糖、オリゴ糖、又は多糖を加リン酸分解するホスホリラーゼを互いに接触させることによって、ベータ−Ｇ１Ｐを生成する、実施形態１４又は１５の方法。
１７．第２の反応は：（ｉ）水、無機ホスファート、マルトース、及びマルトースホスホリラーゼ、又は（ｉｉ）水、無機ホスファート、トレハロース、及びトレハロースホスホリラーゼを含む、実施形態１６の方法。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例において、本開示をさらに例示する。これらの実施例は、本明細書中の特定の態様を示しているが、単に説明の目的でのみ示されていることが理解されるべきである。先の考察及びこれらの実施例から、当業者であれば、開示される実施形態の本質的な特徴を確認することができ、そしてその精神及び範囲を逸脱しない範囲で、開示される実施形態を様々な使用及び条件に適合させるための様々な変更及び修飾をすることができる。
【００９１】
実施例１
推定のパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼのクローニング及び発現
本実施例は、推定のパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素のクローニング及び発現を記載する。
【００９２】
推定のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ、ＰｓｐＧｐ３を、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種Ｎ０２７から同定した。ＰｓｐＧｐ３をコードする核酸配列を、ゲノムシーケンスを用いて得た。これを、配列番号１として表す。配列番号１によってコードされるＰｓｐＧｐ３のアミノ酸配列を、配列番号２として示す。
【００９３】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトのＢＬＡＳＴ検索を介したＧＥＮＢＡＮＫデータベースに対するＰｓｐＧｐ３（配列番号２）のアラインメントにより、表２にリストしたアミノ酸配列が提供された。
【００９４】
【表２】
2021513862.tif 000003
【００９５】
【表３】
2021513862.tif 000004
【００９６】
ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）をコードする核酸配列を、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での発現用に最適化した。これを、配列番号３として本明細書中で示す。この配列を、Ｇｅｎｅｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ、中国）によって合成して、プラスミドｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩの誘導体であるプラスミドｐ３ＪＭ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５５：４０−５２）（参照によって本明細書に組み込む）中に挿入して、プラスミドｐ３ＪＭ−ＰｓｐＧＰ３を生じさせた（６６９９塩基対）。このプラスミド構築体は、とりわけ、クロラムフェニコール耐性選択マーカー及びアンピシリン耐性選択マーカー、並びにａｐｒＥプロモータの下流側に配置される配列番号３を含む。
【００９７】
プラスミドｐ３ＪＭ−ＰｓｐＧＰ３を用いて、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を形質転換した。形質転換された細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補充したＬｕｒｉａ  Ａｇａｒプレート上に広げた。正確に形質転換されたコロニー（ＰＣＲ及び配列決定によって確認した）を選択して、ＰｓｐＧｐ３の発現用の発酵にかけた。次に、培地から回収した、この発現されたＰｓｐＧｐ３生成物（配列番号２）を、以下の実施例３に記載するように、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性について分析した。
【００９８】
実施例２
推定のカルディセルロシルプタ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）属アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼのクローニング及び発現
本実施例は、推定のカルディセルロシルプタ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）属アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素のクローニング及び発現を記載する。
【００９９】
推定のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ、ＣｈｙＧｐ１を、カルディセルロシルプタ・ヒドロテルマリス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）から同定した。ＣｈｙＧｐ１をコードする核酸配列を、ゲノムシーケンスを用いて得た。これを、配列番号４として示す。配列番号４によってコードされるＣｈｙＧｐ１のアミノ酸配列を、配列番号５として示す。
【０１００】
ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴ検索を介したＧＥＮＢＡＮＫデータベースに対するＣｈｙＧｐ１（配列番号５）のアラインメントにより、表３にリストしたアミノ酸配列が提供された。
【０１０１】
【表４】
2021513862.tif 000005
【０１０２】
ＣｈｙＧｐ１（配列番号５）をコードする核酸配列を、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での発現用に最適化した。これを、配列番号６として本明細書中で示す。この配列を、Ｇｅｎｅｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．によって合成して、プラスミドｐ３ＪＭ中に挿入して（実施例１）、プラスミドｐ３ＪＭ−ＣｈｙＧｐ１を生じさせた（６６７８塩基対）。このプラスミド構築体は、とりわけ、クロラムフェニコール耐性選択マーカー及びアンピシリン耐性選択マーカー、並びにａｐｒＥプロモータの下流側に配置される配列番号６を含む。
【０１０３】
プラスミドｐ３ＪＭ−ＣｈｙＧｐ１を用いて、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を形質転換した。形質転換された細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補充したＬｕｒｉａ  Ａｇａｒプレート上に広げた。正確に形質転換されたコロニー（ＰＣＲ及び配列決定によって確認した）を選択して、ＣｈｙＧｐ１の発現用の発酵にかけた。次に、培地から回収した、この発現されたＣｈｙＧｐ１生成物（配列番号５）を、以下の実施例３に記載するように、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性について分析した。
【０１０４】
実施例３
ＰｓｐＧｐ３及びＣｈｙＧｐ１のホスホリラーゼ活性の分析、並びにそれらによるグルカンの合成
本実施例は、実施例１及び実施例２（それぞれＰｓｐＧｐ３及びＣｈｙＧｐ１）において発現された推定のアルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼのホスホリラーゼ活性の測定を説明する。これらのホスホリラーゼは、アルファ−１，３−グルカンをおそらく合成するので、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼであると考えられることが見出された。
【０１０５】
表２及び表３に基づいて、それぞれ、ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）は、グリコシルヒドロラーゼ６５ファミリー（ＧＨ６５；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ［ＣＡＺｙ］データベース［ｃａｚｙ．ｏｒｇウェブサイト］を参照；Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８を参照（参照によって本明細書に組み込まれる））に属するホスホリラーゼであると思われる。特に、表２及び表３は、これらのホスホリラーゼがマルトースホスホリラーゼであることを示唆している。
【０１０６】
ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）のそれぞれの活性を、最初の受容体として１０ｍＭベータ−Ｇ１Ｐ（ベータ−Ｄ−グルコース−１−リン酸二ナトリウム塩、東京化成工業株式会社、製品番号Ｇ０３３９）及び５ｍＭニゲロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号０８６０２）を用いて測定した。各アッセイを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファを有する水、ｐＨ７．０中で、３７℃にて１０分間実行した。各酵素反応からのリン放出を、ＰｉＢｌｕｅ（商標）試薬（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を用いて定量化した。ホスホリラーゼ活性の１単位を、先の試験条件下で１分あたり１μｍｏｌの無機リンを放出する酵素の量と定義した。
【０１０７】
ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）（それぞれ８ｍｇ／Ｌ）を、１００μＬ反応液中１０ｍＭベータ−Ｇ１Ｐ及び５ｍＭニゲロースと、先のｐＨ条件及び温度条件で２時間、個々にインキュベートした。各反応由来の生成物を、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰＸ−４２Ａカラムを備えた高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）装置を用いて、重合度（ＤＰ）について分析した（溶離液：Ｈ２Ｏ、流量：０．６ｍＬ／分、温度：８５℃；検出：ＲＩ）。ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）又はＣｈｙＧｐ１（配列番号５）を用いた各反応の生成物は、ＤＰ３、ＤＰ４、及びＤＰ５のサイズのグルカンオリゴ糖を含んだ。これらの生成物は、ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）がそれぞれ、（デキストラン受容体から（ｏｆｆ））不溶性の生成物を合成することが示された、以下の実施例４に記載される所見に基づいて、アルファ−１，３−グリコシド結合を有することが考えられる。別のセットの反応を、先の条件下で一晩実行した。一晩の各反応は、ＤＰ３〜ＤＰ１０＋のグルカンオリゴ糖を生成し、ＤＰ６及びＤＰ７の生成物が支配的であった。本実施例におけるオリゴ糖生成物は、大部分が可溶性となり得た（比較的少量の基質を反応に用いたので、肉眼で検出不能であった一部の不溶性の生成物が製造されたかもしれない）一方、かなりの量の不溶性の生成物（ＤＰ８、ＤＰ９、又はより高次のＤＰのアルファ−１，３結合グルカン等）が、より長い間インキュベーション期間（例えば、≧１８又は≧２４時間）での、且つ／又はより大量の基質（すなわち、ベータ−Ｇ１Ｐ）との反応において生成され得ると考えられる。これらの結果は、表２及び表３を鑑みて、目ざましい；これらの表における注釈情報は、ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）が、マルトースをグルコース及びベータ−Ｇ１Ｐに変換することが典型的に知られている酵素であるマルトースホスホリラーゼであることを示唆している。これらの結果はまた、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼが明らかに、以前に決して認識されなかったことから、注目に値する；そのような酵素活性は、ＧＨ６５ホスホリラーゼについてのＣＡＺｙオンラインデータベース（ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／ＧＨ６５）にはない。本データは、ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）が、おそらく、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を有することを示す。
【０１０８】
実施例４
ＰｓｐＧｐ３及びＣｈｙＧｐ１ホスホリラーゼによるグルカン生成の更なる分析
本実施例は、ＰｓｐＧｐ３及びＣｈｙＧｐ１ホスホリラーゼを、最初の受容体分子としてのデキストランと共に用いた、不溶性のアルファ−１，３−グルカンの、可能性のある生成を説明する。これらの結果はさらに、先の実施例３において説明したものに対するものであり、ＰｓｐＧｐ３及びＣｈｙＧｐ１がおそらく、最初の受容体分子としてニゲロースを用いてアルファ−１，３−グルカンを合成することができることを示している。
【０１０９】
ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）（それぞれ２０ｍｇ／Ｌにて）を、水、２０ｍＭベータ−Ｇ１Ｐ、及び１ｇ／Ｌデキストラン（相対式量が約４０００のデキストラン硫酸ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号７５０２７）を含む１００μＬ反応液中に別個に用意した。各反応を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．０中で、３７℃にて２０分間実行した。ＨＰＬＣ及びＮＭＲ（核磁気共鳴）分析を用いて、生成物の分子量及び結合プロファイルをそれぞれ求めた。各反応は、明らかにアルファ−１，３結合を有し、そしてＤＰが約２０である、不溶性のグルカンを生成することが見出された。ゆえに、ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）は、アルファ−１，３−グルカンホスホリラーゼであると考えられる。これらの結果は、実施例３において説明したのと同じ理由で、目ざましい。すなわち、ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）は、マルトースホスホリラーゼ（表２及び表３をそれぞれ参照）であることが示唆され、そしてこの型のホスホリラーゼの以前の認識が、明らかになかったためである。これらの結果は、ＧＨ６５酵素ファミリーに属する２８種の他のタンパク質を本研究において分析し（データ示さず）、そしてＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）のみが、先の条件において不溶性の生成物を生成したので、さらに目ざましい。これらの他の研究されたタンパク質のうち約１０種は、ＰｓｐＧｐ３又はＣｈｙＧｐ１との配列同一性が５０％を超える。
【０１１０】
ゆえに、不溶性のアルファ−１，３−グルカンを、少なくとも水、ベータ−Ｇ１Ｐ、適切な受容体分子、例えばデキストラン、及びグルカンホスホリラーゼ、例えばＰｓｐＧｐ３（配列番号２）又はＣｈｙＧｐ１（配列番号５）を含む反応において合成することができると考えられる。
【０１１１】
実施例５
共役反応におけるＰｓｐＧｐ３ホスホリラーゼによるグルカン生成
ＰｓｐＧｐ３ホスホリラーゼ（配列番号２）による反応を実行した。これは、実施例４におけるこの酵素による先の反応と類似したが、ベータ−Ｇ１Ｐは、マルトースに及ぼすマルトースホスホリラーゼの活性によって用意した（マルトースホスホリラーゼは、マルトースをグルコース及びベータ−Ｇ１Ｐに変換する）。この共役反応を、水、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．０）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）マルトースホスホリラーゼ（０．０３ｍｇ／ｍＬ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種マルトースホスホリラーゼ（０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｍ８２８４）、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ  ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）、５００ｍＭマルトース、及び１ｇ／Ｌデキストラン（最初の受容体として；Ｔ１デキストラン［約１０００ＭＷ］）でセットアップした。共役反応を、３７℃にて約１６日間実行した。
【０１１２】
共役反応の糖生成物を特徴付けるために、２μＬのサンプルをそこからとって、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）プレート（ＳＩＬＩＣＡ  ＧＥＬ  ６０  Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、ドイツ）に適宜アプライした。乾燥後、１−ブタノール：エタノール：水（５：５：３）を移動相として用いて、ＴＬＣプレートを一晩ランさせた。次に、プレートを風乾して、現像液（ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：Ｈ２ＳＯ４、４５：４５：１０）をスプレーして、１１０℃にておおよそ１５分間現像した。この分析は、ＤＰが７を超える糖が、この共役反応において合成されたことを示した。
【０１１３】
別々に、共役反応由来の生成物を精製（氷冷した２容量の９６％エタノールの添加に続く、５５００×ｇにて５分間のスピン、及び２ｍＬ水中での材料の混合に続く、再度の第２のエタノール洗浄）して、結合分析のためにＮＭＲ分析を始めた。第１のエタノール洗浄後の平均生成物ＤＰは、約８である一方、第２のエタノール洗浄後の生成物ＤＰは、約１２である（生成物は、短い［可溶性である］ほど、おそらく十分に析出せず、ほとんどの場合、不溶性のＤＰ約１２の生成物が残る）ことが注目された。ＮＭＲ結果は、不溶性の生成物（デキストラン受容体から延長されたままの状態）のメジャーな結合が、アルファ−１，３であることを確認した。この結果は、先の実施例４において生成したＰｓｐＧｐ３ホスホリラーゼ（配列番号２）の不溶性の生成物もまたおそらく、アルファ−１，３結合を含んだことを示す。
【０１１４】
ゆえに、アルファ−１，３−グルカンを、少なくとも水、適切な受容体分子、例えばデキストラン、ＰｓｐＧｐ３ホスホリラーゼ（配列番号２）、マルトース、及びマルトースホスホリラーゼを含む共役反応において合成することができる。この反応において、マルトースホスホリラーゼは、ベータ−Ｇ１Ｐを生成するようにマルトースに作用し、これが今度は、ＰｓｐＧｐ３ホスホリラーゼ（配列番号２）によって（デキストランと共に）基質として用いられて、アルファ−１，３−グルカンが生じた。所望されるならば、共役反応においてベータ−Ｇ１Ｐを生成する他の酵素を、おそらく、マルトースホスホリラーゼの代わりに用いることができる。例えば、トレハロースホスホリラーゼ及びその基質、トレハロースを、ベータ−Ｇ１Ｐ生成に用いることができる。
【０１１５】
先の共役反応は、比較的少量の不溶性のアルファ−１，３−グルカン生成物を生成した。この所見をさらに調査するために、マルトース及びトレハロースを含む異なる受容体のパネルを、ＰｓｐＧｐ３ホスホリラーゼ（配列番号２）で、そしてＣｈｙＧｐ１ホスホリラーゼ（配列番号５）で試験した。マルトースは、双方の酵素の良好な受容体であるが、トレハロースは、不十分な受容体であることが観察された。ゆえに、先の共役反応において、マルトースは、おそらく、マルトースホスホリラーゼ（ベータ−Ｇ１Ｐを生成する）及びＰｓｐＧｐ３ホスホリラーゼ（配列番号２）の双方によって基質として（デキストラン受容体の使用と一緒に、アルファ−１，３−グルカン合成用の受容体として）、競合的に用いられていた。共役反応におけるマルトースのこの競合的使用により、おそらく、少量のアルファ−１，３−グルカンが生じた。トレハロースは、ＰｓｐＧｐ３（配列番号２）及びＣｈｙＧｐ１（配列番号５）ホスホリラーゼの双方にとって不十分な受容体であることが見出されたので、本明細書中の共役反応におけるベータ−Ｇ１Ｐ生成のためのトレハロース及びトレハロースホスホリラーゼの使用により、より良好なアルファ−１，３−グルカンの合成が可能となり得ると考えられる。
【配列表】
2021513862000001.app
【国際調査報告】
2021513862.tif 000006
2021513862.tif 000007