(57)【要約】  フルクトース６−リン酸のタガトース６−リン酸への変換、及びその逆の変換をすることができる新規タガトース６−リン酸４−エピメラーゼを開示する。該酵素のタガトース製造への応用も開示される。
2021506228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトース６−リン酸とタガトース６−リン酸との相互変換を触媒するためのタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）であって、該タガトース６−リン酸４−エピメラーゼが、以下の
（ａ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（ｂ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質中の１以上のアミノ酸残基を置換、欠失又は付加することによって形成され、フルクトース６−リン酸とタガトース６−リン酸の相互変換を触媒する活性を有する誘導タンパク質、又は
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質の配列を含む配列を有するタンパク質、又は
（ｄ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）の同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、フルクトース６−リン酸とタガトース６−リン酸との相互変換を触媒する活性を有するタンパク質
からなる群より選択される、タガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）。
【請求項２】
ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、以下の
（ａ）  配列番号１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｂ）  配列番号２に記載のヌクレオチド配列、又は
（ｃ）  配列番号２に記載のヌクレオチド配列と５０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）の同一性のヌクレオチド配列、又は
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的（好ましくは完全に相補的）であるヌクレオチド配列
からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｉｅｎｓｉｓに由来する、請求項１に記載のタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含むか、又は請求項２に記載のポリヌクレオチドをそのゲノムに組み込まれて有する宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）又は請求項５に記載の宿主細胞の、フルクトース６−リン酸とタガトース６−リン酸の相互変換の触媒作用における使用。
【請求項７】
請求項１に記載のタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）、請求項４に記載のベクター又は請求項５に記載の宿主細胞の、イン・ビトロ多酵素触媒系を構築してタガトースを調製することにおける使用。
【請求項８】
前記多酵素触媒系が、α−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、タガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）、タガトース６−リン酸ホスファターゼ（Ｔ６Ｐ）を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
多酵素触媒系が、タガトースを調製するための基質としてデンプン又はマルトデキストリンを使用する、請求項７又は８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学及び生体触媒の分野に関し、フルクトース６−リン酸の４位炭素をエピマー化し、フルクトース６−リン酸をタガトース６−リン酸に変換し、タガトース６−リン酸をフルクトース６−リン酸に変換する機能を有する新しいタガトース６−リン酸４−エピメラーゼを提供する。本発明はまた、該酵素の、タガトースの製造への応用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
六炭糖の４位エピマー化は希少糖及びその誘導体の生産に重要な役割を果たし、例えば、特許文献１は、フルクトース６−リン酸が４位でエピマー化されてタガトース６−リン酸に変換され、次いでタガトース６−リン酸がタガトースに脱リン酸化されることを報告している。この特許で報告されているタガトース６−リン酸４−エピメラーゼは大腸菌由来のフルクトース１，６−リン酸アルドラーゼであり、これは異なる反応を触媒するための２つの異なる組の触媒アミノ酸を有し（非特許文献１）、ここで、一方の組の触媒アミノ酸はフルクトース１，６−二リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸への縮合を触媒し、そして他方の組の触媒アミノ酸はタガトース６−リン酸のフルクトース６−リン酸への変換を触媒する。２組の触媒アミノ酸は互いに干渉しない。フルクトース１，６−二リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸への縮合を触媒するアミノ酸の変異は、タガトース６−リン酸のフルクトース６−リン酸への変換を触媒する酵素活性に影響しない。しかし、酵素の熱安定性が低いため、タガトースの大規模生産には適していない。さらに、ＷｉｃｈｅｌｅｃｋｉらがＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおけるアゼチトール及びガラクチトールの代謝を研究した場合、遺伝子Ａｔｕ３１６７によってコードされる酵素がタガトース６−リン酸のフルクトース６−リン酸への変換を触媒し得ることを見出した（非特許文献２）。しかし、酵素の熱安定性も高くなく、これはタガトースの大規模生産には適していない。したがって、希少糖の調製において、特に希少糖の大規模生産のプロセスにおいて、高い熱安定性を有し、単純なプロセス工程で４位エピマー化を完了することができるタガトース６−リン酸４−エピメラーゼに対する緊急の必要性があり、熱安定性酵素は、タガトースを生産するためにイン・ビトロ多酵素系に適用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開２０１５／０１６５４４号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１７；７：１９３４
【非特許文献２】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１５；２９０：２８９６３−２８９７６
【発明の概要】
【０００５】
この観点から、第１の態様において、本発明はフルクトース６−リン酸とタガトース６−リン酸との相互変換を触媒するためのタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）を提供し、ここで、該タガトース６−リン酸４−エピメラーゼは、以下からなる群より選択される：
（ａ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（ｂ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質中の１以上のアミノ酸残基を置換、欠失又は付加することによって形成され、フルクトース６−リン酸とタガトース６−リン酸の相互変換を触媒する活性を有する誘導タンパク質、又は
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質の配列を含む配列を有する誘導タンパク質、又は
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）の同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、フルクトース６−リン酸とタガトース６−リン酸との相互変換を触媒する活性を有する誘導タンパク質。
【０００６】
別の好ましい実施形態では、タガトース６−リン酸４−エピメラーゼはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｉｅｎｓｉｓに由来する。
【０００７】
別の好ましい実施形態において、タガトース６−リン酸４−エピメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１に記載されている。
【０００８】
第２の態様において、本発明はヌクレオチド配列を提供し、該ヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される。
（ａ）  配列番号１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｂ）  配列番号２に記載のヌクレオチド配列、又は
（ｃ）  配列番号２に記載のヌクレオチド配列と５０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）の同一性のヌクレオチド配列、又は
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的（好ましくは完全に相補的）であるヌクレオチド配列。
【０００９】
別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号２に記載される。
【００１０】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様によるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１１】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に従うベクターを含むか、又は本発明の第２の態様に従うポリヌクレオチドをそのゲノムに組み込んで有する宿主細胞を提供する。
【００１２】
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞、好ましくは、大腸菌）である。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）若しくはその誘導タンパク質、又は第４の態様による宿主細胞の、フルクトース６−リン酸とタガトース６−リン酸との相互変換の触媒作用における使用を提供する。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）、第３の態様によるベクター又は第４の態様による宿主細胞の、イン・ビトロ多酵素触媒系を構築してタガトースを調製することにおける使用を提供する。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、多酵素触媒系がα−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、タガトーゼ６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）、及びタガトース６−リン酸ホスファターゼ（Ｔ６Ｐ）を含む。
【００１７】
別の好ましい実施形態において、多酵素触媒系は、タガトースを調製するための基質としてデンプン又はマルトデキストリンを使用する。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチド配列は、以下の方法によって得ることができる：
１）ゲノムＤＮＡの増幅から二本鎖ＤＮＡ配列を得る工程；
２）ＤＮＡ配列を化学的に合成してポリペプチドの二本鎖ＤＮＡを得る工程。
【００１９】
本発明において、熱安定性タガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）をコードするポリヌクレオチド配列をベクターに挿入して、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを構成することができる。「ベクター」という用語は、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルス、又は当技術分野で周知の他のベクターをいう。本発明における使用に適したベクターにはｐＥＴ２０ｂベクターのようなバクテリアにおいて発現されるＴ７プロモーターベースの発現ベクター（遺伝子、１９８７、５６：１２５）；哺乳動物細胞において発現されるｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．２６３：  ３５２１、１９８８）及び昆虫細胞において発現されるバキュロウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。簡単に言えば、任意のプラスミド及びベクターを用いて、宿主中で複製し、安定である限り、組換え発現ベクターを構築することができる。発現ベクターの重要な特徴は、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子、及び翻訳調節エレメントを含むことである。当業者に周知の方法を使用して、ＴｉＴ４Ｅのポリヌクレオチド配列及び適切な転写／翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、イン・ビトロ組換ＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、イン・ビボ組換技術などが含まれる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）。ポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡ合成を誘導するために、発現ベクター中の適切なプロモーターに効果的に連結することができる。プロモーターの代表的な例は、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモーター；λファージのＰＬプロモーター；ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ及び原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルスにおける遺伝子発現を制御できる他の公知のプロモーターを含む真核生物プロモーターである。
【００２０】
さらに、発現ベクターは、好ましくは真核細胞培養において使用するための、大腸菌、テトラサイクリン、カナマイシンなどに対するアンピシリン耐性、又はジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための１以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【００２１】
当業者は適切なベクター／転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）及び選択マーカー遺伝子を選択する方法を知っている。
【００２２】
本発明に、タガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）をコードするポリヌクレオチド又はこのポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に形質転換又は形質導入して、このポリヌクレオチド又はベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞を構成することができる。「宿主細胞」という用語は、細菌細胞等の原核細胞；又は酵母細胞等の下等真核細胞；又は哺乳動物細胞等の高等真核細胞をいう。代表的な例は、大腸菌、ストレプトマイセス；ネズミチフス菌等の細菌細胞；酵母等の真菌細胞；植物細胞；ハエＳ２又はＳｆ９等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はＢｏｗｅｓ黒色腫細胞等の動物細胞が含まれる。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列を含むベクターでの宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の従来の技術によって行うことができる。宿主が大腸菌等の原核生物である場合、ＤＮＡを吸収することができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後に収集され、ＣａＣｌ２法で処理することができる。使用される手順は、当技術分野で周知である。或いは、ＭｇＣｌ２を使用してもよい。必要であれば、エレクトロポレーションによって形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、以下のＤＮＡトランスフェクション法を使用することができる：リン酸カルシウム共沈法、又はマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージング等の従来の機械的方法。
【００２４】
従来の組換えＤＮＡ技術により、本発明のポリヌクレオチド配列を用いて、組換えタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）を発現又は産生することができる。一般に、以下の工程が含まれる。
（１）本発明によるタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）をコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むベクターで、適切な宿主細胞を形質転換又は形質導入する工程；
（２）適切な培養培地中で宿主細胞を培養する工程；及び
（３）細胞からタンパク質を単離及び精製する工程。
【００２５】
工程（２）において、使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培養培地は、種々の従来の培養培地から選択することができる。培養は、宿主細胞の増殖に適した条件下で行われる。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖する場合、選択されたプロモーターは適切な方法（温度変換又は化学誘導など）によって誘導され、細胞はある期間にわたってさらに培養される。
【００２６】
工程（３）において、タンパク質は、細胞中に含まれてもよく、細胞膜上で発現されてもよく、又は細胞から分泌されてもよい。必要であれば、組換えタンパク質は、その物理的、化学的及び他の特徴を使用して、種々の分離方法によって単離及び精製することができる。これらの方法は、当業者に周知である。他の方法には従来の再生処理、タンパク質沈殿剤での処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧破壊、超音波処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び種々の他の液体クロマトグラフィー技術、並びに他の方法の組み合わせが含まれるが、他に限定されない。
【００２７】
特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される以下の用語は、以下の意味を有する。「核酸配列」という用語はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド及びそれらの断片部又は一部分を指し、また一本鎖又は二本鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖を表すゲノム性又は合成のＤＮＡ又はＲＮＡを示すことがある。同様に、「アミノ酸配列」という用語はオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びそれらの断片部又は一部分を示す。本発明中の「アミノ酸配列」が天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列を指す場合、そのような「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、アミノ酸配列を、タンパク質分子に関連する完全に天然のアミノ酸に限定するという意味ではない。
【００２８】
誘導タンパク質とは、１以上のアミノ酸又はヌクレオチドが変化したアミノ酸配列をいう。変化には、アミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、挿入又は置換が含まれる。誘導タンパク質は、置換されるアミノ酸が、イソロイシンをロイシンで置換するといった、元のアミノ酸と同様の構造的又は化学的特性を有する、「保存的」変化を有していてもよい。誘導タンパク質はまた、グリシンをトリプトファンで置換するといった、非保存的変化を有していてもよい。
【００２９】
「欠損」という用語は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列における１以上のアミノ酸又はヌクレオチドの欠損をいう。
【００３０】
「挿入」又は「付加」という用語は、天然に存在する分子と比較して、１以上のアミノ酸又はヌクレオチドの増加をもたらすアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の変化をいう。「置換」は、１以上のアミノ酸又はヌクレオチドを各アミノ酸又はヌクレオチドで置換することをいう。
【００３１】
「相補的」又は「相補性」という用語は許容される塩濃度及び温度条件下における塩基対形成によるポリヌクレオチドの天然の結合をいい、例えば、配列「Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ」は相補的配列「Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ」に結合することができる。２本の一本鎖分子は、互いに部分的又は完全に相補的であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きく影響する。
【００３２】
「同一性率」という用語は、２以上のアミノ酸配列又は核酸配列の比較において同一又は類似配列の率を指す。同一性率は、ＧｅｎｅＤｏｃプログラムなどのソフトウェアによって決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】フルクトース６−リン酸の４位炭素原子のエピマー化反応を伴う、フルクトース６−リン酸のタガトース６−リン酸への変換を示す概略図である。
【図２】大腸菌でＴｉＴ４Ｅを発現できるｐＥＴ２０ｂ−ＴｉＴ４Ｅプラスミドのベクターを示す模式図。
【図３】（Ａ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２０ｂ−ＴｉＴ４Ｅを含む大腸菌を、ＩＰＴＧを用いて１００μＭの最終濃度で異なる温度で発現させ、上清を６０℃で熱処理することによって部分精製を行った。レーンＭ、タンパク質マーカー、レーン１、ＴｉＴ４Ｅの発現が３７℃で誘導された細胞破壊液の上清、レーン３、ＴｉＴ４Ｅの発現が３７℃で誘導された細胞破壊液の上清、レーン５、ＴｉＴ４Ｅの発現が１８℃で誘導された細胞の破壊液の上清、レーン６、ＴｉＴ４Ｅの発現が１８℃で誘導された細胞の破壊液の上清の熱処理後。（Ｂ）水溶性ＴｉＴ４Ｅ蛋白質のＮｉ−ＮＴＡによる精製、レーンＭ、蛋白質マーカー、レーンＳ、ＴｉＴ４Ｅの細胞破壊上清、レーンＳ２０−５００、これは各濃度のイミダゾール（２０ｍＭから５００ｍＭ）を含む緩衝液から溶出したＴｉＴ４Ｅを表す。
【図４】フルクトース６−リン酸をタガトース６−リン酸に変換するためのＴｉＴ４Ｅの酵素活性アッセイ。
【図５】ＴｉＴ４Ｅ及びα−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）及びタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）を用いてデンプンを触媒し、タガトースを生成した。図は反応中の反応液の検出を示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）図であり、矢印はタガトースの形成を示す。
【発明の詳細な説明】
【００３４】
以下の具体例を組み合わせて、本発明をさらに説明する。本発明の利点及び特徴は、性状が進むにつれて明らかになるのであろう。しかしながら、これらの実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。当業者は本発明の技術的解決策の細部及び形態が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく修正又は置換することができ、これらの修正又は置換のすべてが、本発明の保護範囲内にあることを理解されたい。これらの実施例は、本発明を例示するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解されたい。以下の実施例に示される特定の条件を伴わない実験方法は一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような従来の条件、又は製造業者によって推奨される条件に従う。
【００３５】
実験材料
マルトデキストリン（アルドリッチ社の製品番号４１９６７２）；
ｐＥＴ２０ｂベクター（ノヴァゲン社、マディソン、ウィスコンシン；
大腸菌発現細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（インヴィトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア）；
フルクトース６−リン酸（シグマ社、製品番号Ｆ３６２７）；
タガトース６−リン酸塩（シグマ社、製品番号５０６６１）;
【００３６】
実施例１  ＴｉＴ４Ｅ遺伝子のクローニング
ポリペプチドタガトース６−リン酸４−エピメラーゼのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から得た。配列のＮＣＢＩ参照配列はＷＰ＿０１９９０７２１３．１（配列番号１）であり、ポリペプチドはＴｉＴ４Ｅと命名され、ＴｉＴ４ＥはＮＣＢＩ上の仮想タンパク質として注釈され、タガトース６−リン酸キナーゼとして分類され、これはＡＴＰの作用下でタガトースをリン酸化してタガトース６−リン酸を生成する酵素である。その後、アミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）配列をデザインし、それを大腸菌発現系のためにコドン最適化することを無錫青蘭生物科技有限公司（ｈｔｔｐ：／／ｑｉｎｇｌａｎｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）社に委託した。最適化されたポリヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
【００３７】
無錫青蘭はコドン最適化配列をｐＭＶベクターにクローニングし、ｐＭＶ−ＴｉＴ４Ｅプラスミドを形成した。続いて、ＴｉＴ４Ｅフラグメントを、順プライマーＧＡＡＣＡＴＧ ＡＡＣＣＧＡＡＴＣＣＧＣＴＧ（ＮｄｅＩ制限部位を示す下線部分）及び逆プライマーＣＣＧＣＴＧＡＡＴＴＧＡＴＴＣＡＴＣＡＣＣＧＣ（ＸｈｏＩ制限部位を示す下線部分）を用いることによって増幅し、ｐＭＶ−ＴｉＴ４Ｅプラスミドをテンプレートとして用い、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化した後、同じくＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２０ｂベクターに結像させ、ｐＥＴ２０ｂ−ＴｉＴ４Ｅ発現ベクターを得るようにした（図２）。発現ベクターでは、Ｔ７プロモーターやＴ７ターミネーターなどの要素がＴｉＴ４Ｅの発現に関与していた。発現されたＴｉＴ４ＥはＣ末端に６ＸＨｉｓタグを有し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂をタンパク質精製に使用することができる。
【００３８】
実施例２  ＴｉＴ４Ｅの発現及び精製
ｐＥＴ２０ｂ−ＴｉＴ４Ｅを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、モノクローンを選択して１００μｇ／ｍｌのピカンピリンを含む３ｍｌのＬＢ媒体中に置き、３７℃と２２０ｒｐｍで終夜培養した。１ｍｌの終夜処理細菌を１００μｇ／ｍｌのピシリンを含む２００ｍｌのＬＢ媒体に移し、３７℃と２２０ｒｐｍでＯＤ６００値が約０．８に達したとき、最終濃度１００μＭでイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクタラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、それぞれ３７℃と１８℃でタンパク質発現を誘起した。３７℃での誘導を４時間実施し、１８℃での誘導を２０時間実施した。誘導後、遠心分離により細胞を回収し、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁し、超音波により細胞を破壊して細胞破壊液を得た。酵素の発現レベルは図３Ａのレーン１及びレーン４によって示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された。細胞破壊液を高速遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）にかけ、図３Ａのレーン２及びレーン５に示すように、上清もＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出した。１８℃又は３７℃で誘導されても、ＴｉＴ４Ｅの発現はほとんど可溶性発現であったことが分かる。ＴｉＴ４Ｅは耐熱性細菌Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｉｅｎｓｉｓに由来するので、細胞破壊液の上清を６０℃で２０分間処理して部分精製し、次いで精製効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検出した（図３Ａのレーン３及びレーン６）。目的のタンパク質は部分的に精製されたが、純度は高くなかったことが分かる。その後、Ｎｉ−ＮＴＡのカラムを用いて、この酵素を精製した。図３Ｂに示すように、比較的純粋なＴｉＴ４Ｅは、５０ｍＭ〜２００ｍＭのイミダゾールを含有する３０ｍＭのリン酸緩衝液によって溶出することができることが分かる。ＴｉＴ４Ｅ含有イミダゾールを透析して過剰のイミダゾールを除去し、次の工程で酵素活性アッセイに使用した。
【００３９】
実施例３  ＴｉＴ４Ｅの酵素活性アッセイ
ＴｉＴ４Ｅの酵素活性を測定する方法は以下の通りであった。反応系はフルクトース６−リン酸、タガトース６−リン酸ホスファターゼ、緩衝液、及びマグネシウムイオンを含み、反応系中の無機リンの増加量を反応後に測定した。具体的には、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭフルクトース６−ホスフェート、１０ Ｕ／ｍｌタガトース６−ホスファターゼ（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来、ＫＥＧＧ上の遺伝子番号付けはＡＦ＿０４４４であり、この遺伝子はまた、大腸菌において異種発現され、そしてＮｉ−ＮＴＡカラムによって精製されて、大量の酵素、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．００５又は０．０２ｇ／Ｌ  ＴｉＴ４Ｅを得た）を含む反応系において、この反応を、６０℃で８分間実施した。反応後、氷浴により反応を停止させた。放出された無機リンイオンは、文献（分析化学１９５６, ２８, １７５６−１７５９）に記載されている無機リンの測定法を用いて測定した。タガトース６−リン酸ホスファターゼはフルクトース６−リン酸に対して弱いリン分解効果も有したので、対照実験群はＴｉＴ４Ｅを添加しない反応系であった。反応中に放出された無機リンイオンを図４Ａに示す。酵素反応は線形反応であり、すなわち、放出された無機リンイオン及び反応時間は酵素濃度に比例していたことが分かる。酵素の濃度及び無機リンイオンの生成速度をプロットすることによって（図４Ｂ）、６０℃でフルクトース６−リン酸をタガトース６−リン酸に変換するためのＴｉＴ４Ｅの酵素活性は、２．８２Ｕ／ｍｇであると計算された。従って、ポリペプチドＴｉＴ４Ｅは、フルクトース６−リン酸をタガトース６−リン酸に変換する活性を有する。酵素活性の１単位は、１分間で１μｍｏｌの生成物を生成するのに必要な酵素の量を表す。
【００４０】
続いて、タガトース６−リン酸をフルクトース６−リン酸に変換するためのＴｉＴ４Ｅの酵素活性を測定した。１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭのタガトース６−リン酸、５ｍＭの硫酸マグネシウム、０．００５又は０．０２ｇ／ＬのＴｉＴ４Ｅを含む反応系において、反応を６０℃で８分間行った。反応後、氷浴により反応を停止させた。最終試料に、１Ｕ／ｍｌのホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、Ｓｉｇｍａから購入、製品番号Ｐ５３８１）、５Ｕ／ｍｌのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ、Ｓｉｇｍａから購入、製品番号Ｇ６３７８）、及び５ｍＭのＮＡＤＯＢＢを添加し、ＯＤ３４０がもはや上昇しなくなるまで３７℃で反応を実施した。生成したフルクトース６−リン酸の量は、ＯＤ３４０の上昇量によって計算した。タガトース６−リン酸をフルクトース６−リン酸に変換するためのポリペプチドＴｉＴ４Ｅの酵素活性は、６０℃で３．７Ｕ／ｍｇであった。
【００４１】
このことから、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質はタガトース６−リン酸をフルクトース６−リン酸に、及びその逆に変換する酵素活性を有し、このタンパク質をタガトース６−リン酸４−エピメラーゼと定義したと結論付けることができる。
【００４２】
実施例４  ＴｉＴ４Ｅの安定性
精製したＴｉＴ４Ｅを３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍＭ硫酸マグネシウムイオンで希釈して最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌとし、７０℃で各時間（３０分〜６時間）処理した。次に、フルクトース６−リン酸をタガトース６−リン酸に変換するためのＴｉＴ４Ｅの残留活性を測定し、７０℃でのＴｉＴ４Ｅの安定性を残留活性から計算した。計算により、７０℃でのＴｉＴ４ＥのｔＯＢｔｉｍｅ（酵素活性の半分が失われる時間）は４．７時間であった。この結果は、７０℃で４．７時間処理した後に酵素がその酵素活性の５０％を失うことを示した。したがって、タガトース製造における酵素のその後の適用において、酵素の温度を６０℃に低下させて、酵素の長期安定性を確実にした。
【００４３】
実施例５  ＴｉＴ４Ｅによるタガトースの調製
α−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、タガトーゼ６−リン酸４−エピメラーゼ（ＴｉＴ４Ｅ）、及びタガトーゼ６−リン酸ホスファターゼ（Ｔ６Ｐ）を含むイン・ビトロ多酵素触媒系を構築し、デンプンを基質としてタガトースを産生した。触媒系において、αＧＰは澱粉及び無機リンイオンからグルコース１−リン酸を生成し、ＰＧＭはグルコース１−リン酸をグルコース６−リン酸に変換し、ＰＧＩはグルコース６−リン酸をフルクトース６−リン酸に変換し、ＴｉＴ４Ｅはフルクトース６―リン酸をタガトース６−リン酸に変換し、Ｔ６Ｐはタガトース６−リン酸をタガトースに変換し、リンイオンは放出された。リンイオンは、反応全体を通してバランスがとれていた。触媒系ではαＧＰはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来、ＫＥＧＧ上の遺伝子数はＴＭ１１６８、ＰＧＭはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来、ＫＥＧＧ上の遺伝子数はＴＭ０７６９、ＰＧＩはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来、ＫＥＧＧ上の遺伝子数はＣｔｈｅ０２１７、Ｔ４ｅはＴｉＴ４Ｅ、本発明由来、Ｔ６ＰはＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来、ＫＥＧＧ上の遺伝子数はＡＦ＿０４４４であった。上記酵素はすべて大腸菌中で異種発現させ、精製した。
【００４４】
４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍＭ二価マグネシウムイオン、１Ｕ／ｍｌ  αＧＰ、１Ｕ／ｍｌ  ＰＧＭ、１Ｕ／ｍｌ  ＰＧＩ、１Ｕ／ｍｌ ＴｉＴ４Ｅ、１Ｕ／ｍｌ  Ｔ６Ｐ、及び１５０ｇ／Ｌ可溶性デンプンを含む１．０ｍｌ反応系において、触媒反応を６０℃で行った。４８時間の反応後、反応溶液中の成分を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いて検出した。ＨＰＬＣ分析器は反応溶液中のタガトース、グルコース、グルコース１−リン酸又はグルコース６−リン酸を同定するために使用することができ（図５に示すように）、タガトースを定量するために使用することができ、タガトースの濃度はＨＰＬＣ図中のタガトースの特徴的なピークの強度に比例し、ＨＰＬＣの移動相は、５ｍＭ希硫酸であった。
【００４５】
図５に示すように、タガトースの濃度は、反応時間の増加と共に増加することが分かる。反応後、タガトースの最終濃度は８３ｇ／Ｌ（図１）であり、変換率は５５％であった。
【００４６】
以上より理解されるように、本発明中のＴｉＴ４Ｅはフルクトース６−リン酸をタガトース６−リン酸に変換する活性を有し、他の酵素と組み合わせて、デンプンからタガトースを産生するためのイン・ビトロ多酵素分子装置を構築することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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