(57)【要約】  本発明は、スピロノラクトンと少なくとも１種のポリマーまたはポリマー混合物を含む医薬製剤、ならびに特定の適応症におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スピロノラクトン（ＳＣ−９４２０；ＮＳＣ−１５０３３９；７α−アセチルチオスピロラクトン；７α−アセチルチオ−１７α−ヒドロキシ−３−オキソプレグナ−４−エン−２１−カルボン酸γ−ラクトンとも呼ばれる）ならびに互変異性体、幾何異性体、光学活性形態、それらの鏡像異性体混合物、それらの薬学的に許容される塩およびそれらの薬学的に活性な誘導体、１種以上のアルキル置換ポリラクチドの少なくとも１種のポリマーまたはポリマー混合物、または／および１種以上の置換または非置換Ｃ６〜Ｃ８２−ヒドロキシアルキル酸の溶融重縮合によって調製されるポリマーを含む、医薬製剤。
【請求項２】
滅菌濾過され得る、請求項１記載の医薬製剤。
【請求項３】
スピロノラクトンの改善された組織浸透特性をもたらす、請求項１記載の医薬製剤。
【請求項４】
前記スピロノラクトンが、両親媒性のシェルに自発的に埋め込まれる、請求項１記載の医薬製剤。
【請求項５】
前記ポリマーが、
ａ．ｍＰＥＧおよびアルキル置換ポリラクチドからなる１種以上のコポリマーであって、アルキル置換ポリラクチドが粘性であり、かつ以下の構造：
【化１】
2021512943.tif 000016
［式中、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２〜Ｃ３０アルキルであり、ｎは、少なくとも２であり；かつＲ３は、水素または置換または非置換のアルキルである］を有する、１種以上のコポリマー（特定の態様では、前記ポリマーは、Ｃ４〜Ｃ３２２−ヒドロキシルアルキル酸のいずれか１種以上のポリマーであってよく、ここで、Ｘは、水素または−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ−ＣＨ２であり；かつＹは、−ＯＨ、アルコキシ、ベンジルオキシ、および−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｐ−ＣＨ３からなる群から選択され；ｐは、１〜７００であり、かつ国際公開第２００７／０１２９７９号に開示されている通りである）
および／または
ｂ．国際公開第２０１２／０１４０１１号に開示されている、１種以上の置換または非置換のＣ６〜Ｃ８２−ヒドロキシアルキル酸の溶融重縮合によって製造された１種以上のポリマー
のうちの１種以上から選択される、請求項１から４までのいずれか１項記載の医薬製剤。
【請求項６】
前記活性化合物が、スピロノラクトンであり、前記ポリマーが、ｍＰＥＧおよびポリ（カプリル酸）からなるコポリマーである、請求項１から５までのいずれか１項記載の医薬製剤。
【請求項７】
眼の疾患もしくは障害、再発性角膜びらん；創傷治癒の遅延であって、特にグルココルチコイドの使用、再上皮化を促進するための角膜移植の術後治療または屈折矯正手術、または他の角膜手術、角膜外傷、角膜手術後、架橋後、屈折矯正手術（レーザーアシストまたは外科手術）後などの脱皮角膜に対するグルココルチコイドの局所投与に伴うものだけに起因しない創傷治癒の遅延；角膜ジストロフィ、眼球酒さ、抗生物質に関連する角膜膿瘍または細菌感染症、スピロノラクトンの抗線維化作用による角膜線維症および瘢痕、角膜混濁、末梢性潰瘍性角膜炎、角膜血管新生（スピロノラクトンの抗血管新生作用による）、メイボミア腺機能障害およびドライアイ症候群や眼瞼炎などの関連疾患を含む群から選択される疾患または障害を予防、抑制または治療する際に使用するための請求項１から６までのいずれか１項記載の医薬製剤。
【請求項８】
前記使用が、副作用の発生率を低下させることを特徴とする、請求項７記載の使用するための医薬製剤。
【請求項９】
眼の疾患または障害、または再発性角膜びらん；創傷治癒の遅延であって、特にグルココルチコイドの使用、再上皮化を促進するための角膜移植の術後治療、角膜外傷、角膜手術後、架橋後、屈折矯正手術（レーザーアシストまたは外科手術）後などの脱皮角膜に対するグルココルチコイドの局所投与に伴う創傷治癒の遅延；角膜ジストロフィ、眼球酒さ、抗生物質に関連する角膜膿瘍、スピロノラクトンの抗線維化作用による角膜線維症および瘢痕、対象の角膜混濁を含む群から選択される疾患または障害を予防、抑制または治療する方法であって、請求項１から６までのいずれか１項記載の医薬製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１から６までのいずれか１項記載の医薬製剤を投与することにより、ミネラルコルチコイド受容体の過度の刺激に関連する眼の疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項１１】
前記刺激が、請求項１から６までのいずれか１項記載の医薬製剤を投与することによるコルチコステロイド療法によって引き起こされる、眼の疾患または障害を治療する方法。
【請求項１２】
眼の疾患または障害を治療する方法であって、前記疾患または障害が（リスト）から選択され、請求項１から６までのいずれか１項記載の医薬製剤を投与することによる、方法。
【請求項１３】
請求項１から６までのいずれか１項記載の医薬製剤を製造する方法であって、２種の成分を室温で混合することによる、方法。
【請求項１４】
請求項７または８記載の使用のための製剤、または局所使用もしくは投与のための、または局所領域使用もしくは投与のための請求項９、１０、１１、または１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
グルココルチコステロイドまたはグルココルチコステロイド投薬の前治療または併用治療を受けている患者に使用される、請求項７または８記載の使用のための製剤、または請求項９から１２までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スピロノラクトンおよび少なくとも１種のポリマーまたはポリマー混合物を含む医薬製剤、ならびに特定の適応症におけるその使用および製造方法に関する。
【０００２】
背景
スピロノラクトンは、さまざまな医療用途や適応症で知られている。残念ながら、スピロノラクトンの全身の医学的使用は、多くの望ましくない副作用を示唆する。
【０００３】
アルキル置換ポリラクチドのようなポリマーまたはポリマー混合物または／および１種以上の置換または非置換Ｃ６〜Ｃ８２−ヒドロキシアルキル酸の溶融重縮合によって調製されたポリマー、ならびにこれらの化合物とメトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）とのブロックコポリマーは、国際公開第２００７／０１２９７９号および国際公開第２０１２／０１４０１１号から知られている。
【０００４】
また、スピロノラクトン製剤およびそれらの医学的使用は、知られているが、スピロノラクトンを含む既知の医学的製剤も、様々な欠点を示唆している。
【０００５】
創傷治癒も課題を示唆しており、これは現代医学によってとうに解決された医学的問題である。実際、創傷治癒障害は、糖尿病、鎌状赤血球症、クッシング症候群などの特定の慢性状態の合併症として、また長期のグルココルチコイド療法を受けている患者で遭遇する重大な臨床的問題である［１、２］。角膜創傷治癒障害は、角膜混濁（comeal opacity）や瘢痕化を引き起こし、大きな視覚障害、慢性感染症および潰瘍化を引き起こし、最終的には失明（眼球失明）につながり得るので、眼科での大きな懸念事項である［３，４］。
【０００６】
創傷治癒は、複雑で高度に組織化されたプロセスであり、炎症、顆粒組織の形成および再上皮化、新しいマトリックスの形成ならびにコラーゲンの蓄積などの連続した重複する段階を包含する。全体のプロセスは、細胞、成長因子、サイトカインおよび細胞外マトリックスのコンポーネントを含むさまざまな要因の正確で複雑な相互作用によって厳しく制御されている［１、２、５〜８］。創傷治癒は、全身で一様なパターンをたどるが、例えば角膜には皮膚に比べて血管がないなど、組織特有の違いから局所的な特異性が存在する［８］。
【０００７】
創傷治癒の重要な特徴は、上皮バリアの回復である。角膜の再上皮化は、異常治癒とその後の視力低下を防ぐための重要なステップである［６］。再上皮化の間、角膜上皮細胞が創傷端で増殖し、病変部を覆うように遊走し、分化して新しい組織を形成する。ケラチノサイトの遊走の欠如は、慢性の非治癒性創傷、例えば、糖尿病性潰瘍の臨床表現型に関連している。完全な再上皮化が達成されると、バリアが回復し、眼は、再び外部感染から保護される［２、３、５、６、８］。
【０００８】
合成グルココルチコイド（ＧＣ）は、世界で最も広く処方されている薬物の１つである。それらは全身的または局所的に投与され、広範囲の炎症性疾患および自己免疫疾患、アレルギーならびに眼疾患を治療する。眼科学では、ＧＣは現在、術後の眼の炎症、角膜移植片拒絶、角膜血管新生、眼感染症の予防と治療に使用されており、ドライアイを含む多くの眼表面障害の治療にも適応されている［２、７、９、１０］。
【０００９】
ＧＣの多面的な抗炎症作用は、細胞毒性および血管新生促進サイトカインおよびメタロプロテイナーゼの発現を低下させるが［１１］、上皮治癒の遅延にも関連している［２、８、１２］。デキサメタゾンなどのＧＣを使用すると、ウサギの角膜創傷治癒を遅延させる結果となったことが、いくつかの生体内試験で報告されている［４、７、１３、１４］。より有意には、ＧＣ治療はまた、ヒトにおいて創傷の再上皮化を減少させ、遅延させることにもつながる［１５］。局所リン酸プレドニゾロンを受けた４２人の患者を含む臨床試験の結果は、それらがプラセボ群よりもゆっくりと再上皮化することを示した［４］。
【００１０】
ＧＣは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合するが、密接に関連するミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）にも高い親和性で結合することができ、双方の受容体は、角膜上皮で発現する。最近の研究では、皮膚での創傷治癒の遅延は、ＧＣによるＭＲの占有に起因する可能性があると報告されている。腎臓などのミネラルコルチコイド感受性組織では、ＧＣは、１１ｂ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプＩＩ（ＨＳＤ２）によって不活性化され、それによりアルドステロンによって選択的に活性化されるＭＲへの結合が妨げられ、内因性ミネラルコルチコイド（ＭＣ）は、ＭＲに結合し、ナトリウムの恒常性維持に関与している［２、９、１２、１６〜１８］。しかしながら、ＨＳＤ２活性が低い組織（例えば、皮膚、目、心臓、およびニューロン）は、ＭＲへのオフターゲットＧＣ結合の影響を受けやすくなっている。ＨＳＤ２の活性が低い組織では、ＧＣによってＭＲが過剰に活性化されている可能性があることから、創傷治癒に対するＧＣ治療の悪影響を克服するための潜在的な治療戦略として、ＭＲ拮抗薬（ＭＲＡ）の使用が提案された。この仮説は、いくつかの試験で検証された：（ｉ）培養ヒト皮膚外植片では、クロベタゾール誘発性表皮萎縮が、ＭＲ拮抗薬、カンレノ酸カリウムおよびエプレレノンによって著しく制限された［２、９］、（ｉｉ）マウスでは、カンレノ酸カリウムにより、クロベタゾール誘発性創傷治癒の遅延が、有意に改善された［２］、および（ｉｉｉ）健康なボランティアでは、ＭＲ拮抗薬、スピロノラクトンとクロベタゾールの局所同時投与により、クロベタゾール誘発性の皮膚創傷閉鎖障害が、有意に改善された［９］。
【００１１】
最後に、スピロノラクトンは、これまで全身的に投与されており、望ましくない副作用を伴う。さらに、スピロノラクトンは、流出タンパク質の既知の標的であるため、スピロノラクトンの眼の生物学的利用能は、非常に低い。したがって、スピロノラクトンは、眼のバリアが損なわれている場合、または血管内皮の場合に疾患の主な部位である状況でのみ全身的に使用することができる。ＭＲが眼細胞で標的にされなければならない他の眼疾患では、スピロノラクトンの全身投与は、効率的ではない。［３３］。
【００１２】
さらに、望ましくない副作用は大きく、例えば、女性の生殖能力への影響や、男性の女性化（例えば、乳房組織の発達）への影響が文書化されている。
【００１３】
したがって、本出願の課題は、スピロノラクトンおよび／または既知の製剤の望ましくない副作用を示さないか、または少なくともスピロノラクトンおよび／または既知のスピロノラクトン製剤の既知の副作用を低減する医薬製剤を提供することであった。
【００１４】
この製剤は、眼の障壁のためにスピロノラクトンの全身使用では効率的に標的にできない眼組織を最適に直接標的とすることを目的としている。
【００１５】
本出願の別の課題は、標的組織に直接送達することができ、それによりスピロノラクトンの望ましくない副作用を回避することができる医薬製剤を提供することであった。
【００１６】
開示の簡単な要約
一態様では、本開示は、スピロノラクトンおよび少なくとも１種のポリマーまたはポリマー混合物を含む医薬製剤であって、ポリマーまたはポリマー混合物が、国際公開第２００７／０１２９７９号および国際公開第２０１２／０１４０１１号に開示されているものの１つまたは複数から選択される、医薬製剤に関する。
【００１７】
別の態様では、本開示は、製剤の局所または局所的投与に適した医薬製剤に関する。
【００１８】
さらに別の態様では、本開示は、眼の疾患または障害、または皮膚の疾患または障害、あるいは関連する疾患または障害を含む群から選択される疾患または障害を予防、抑制または治療する方法に関する。
【００１９】
さらに別の態様では、本開示は、眼の疾患または障害を含む群から選択される疾患または障害の予防、抑制または治療に使用するための医薬製剤に関する。
【００２０】
さらに別の態様では、本開示は、医薬組成物を製造するための方法に関する。
【００２１】
さらに別の態様では、本開示は、コルチコステロイドまたはコルチコステロイド投薬の前治療または併用治療を受けている患者に使用される、使用のための製剤に関する。
【００２２】
開示の詳細な説明
以下では、本発明を限定するものとして理解されるべきではないが、当業者には明らかである追加の変形を含み得る変形およびおそらく好ましい実施形態を参照して、開示の異なる態様をより詳細に説明する。
【００２３】
本開示の文脈において、「スピロノラクトン」は、任意の公知の形で使用されてもよく、これは、ＳＣ−９４２０；ＮＳＣ−１５０３３９；７α−アセチルチオスピロラクトン；７α−アセチルチオ−１７α−ヒドロキシ−３−オキソプレグナ−４−エン−２１−カルボン酸γ−ラクトン）、ならびに互変異性体、幾何異性体、光学活性形態、それらの鏡像異性体混合物、それらの薬学的に許容される塩および薬学的に活性な誘導体とも呼ばれている。
【００２４】
本開示による「ポリマーまたはポリマー混合物」は、以下において、本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２００７／０１２９７９号および／または国際公開第２０１２／０１４０１１号に定義され、かつ記載されているように使用される。特に、本開示による「ポリマーまたはポリマー混合物」は、ｍＰＥＧとポリ（カプリル酸）とのコポリマーである。
【００２５】
本開示によるポリ（カプリル酸）は、当該技術分野で知られている任意の重合方法によって調製されるカプリル酸のホモポリマーである。カプリル酸は、体系名のオクタン酸で知られる８炭素飽和脂肪酸の一般名である。カプリル酸は、ＧＲＡＳ（「一般に安全と認められている」）ステータスを有し、欧州の食品安全データベースではＥ５７０に指定されている。
【００２６】
ポリ（カプリル酸）は、ポリヒドロキシオクタン酸（「ｐｏｌｙＨＯＡ」）およびヘキシル置換ポリ乳酸（「ｈｅｘＰＬＡ」）としてもさまざまに知られている。
【００２７】
「使用のための適応症または製剤」は、以下に定義されており、眼科使用を意味し得るか、または上皮組織、特に角膜および角膜組織を保護または治療するために使用される。
【００２８】
開示の意味における「医薬製剤」は、以下の通りである：
本発明の医薬組成物は、有効量のスピロノラクトンを、１種以上のアルキル置換ポリラクチドまたは薬学的に許容される担体に溶解または分散した追加の薬剤と共に含む。さらに、１種以上のアルキル置換ポリラクチドを、薬学的に許容される担体においてまたは薬学的に許容される担体として、追加の薬剤と組み合わせて使用できることが認識されている。
【００２９】
「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、例えばヒトなどの動物に適切に投与された場合に、有害な、アレルギーまたは他の有害な反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。少なくとも１種のアルキル置換ポリラクチドまたは追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれている、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版. Mack Printing Company, 1990年により例示されるように、本開示に照らして当該技術分野の当業者には知られているであろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤は、ＦＤＡ生物学的基準局の要求に応じて、無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たすべきであることが理解されるであろう。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、風味付け剤、染料、当業者に知られているであろう、そのような材料およびその組み合わせが含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版. Mack Printing Company, 1990年, 1289〜1329頁を参照されたい）。従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が、検討される。
【００３１】
本開示の製剤は、好ましくは局所的に、または当業者に知られているであろう前述の任意の方法もしくは任意の組み合わせによって投与され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版. Mack Printing Company, 1990年を参照されたい）。
【００３２】
配合される場合、溶液は、投与製剤に適合する方法で、治療的に有効であるような量で投与されることになる。製剤は、様々な剤形で容易に投与される。
【００３３】
さらに本発明によれば、投与に適した本発明の組成物は、不活性な希釈剤を含むかまたは含まない、薬学的に許容される担体中で提供される。
【００３４】
本発明によれば、組成物は、任意の簡便でかつ実用的な方法で、すなわち、溶液、懸濁液、乳化、混合、カプセル化、吸収などによって担体と組み合わされる。このような手順は、当業者にとって日常的である。
【００３５】
治療活性の喪失から組成物を保護するために、安定剤を混合プロセスに加えることもでき、組成物で使用される安定剤の例には、緩衝液、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、グリシンおよびリジンなどのアミノ酸、ブドウ糖、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等の炭水化物が含まれる。
【００３６】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療される疾患のタイプ、以前のまたは同時の治療的介入、患者の特発性などの物理的および生理学的要因によって、ならびに投与経路に応じて決定され得る。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および／または有効量の投与回数は、対象の反応に応じて変動し得る。投与の責任を負う開業医は、いずれにしても、組成物中の有効成分の濃度および個々の対象に対する適切な用量を決定することになる。
【００３７】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．００１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、例えば、単位の重量の約０．１％〜約２５．０％、または約０．５％〜約１０％、およびその中で導出可能な任意の範囲を含み得る。当然のことながら、治療的に有用な各組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方法で調製することができる。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の保存寿命、ならびに他の薬理学的考慮事項などの要因は、このような医薬製剤を調製する当業者によって検討されており、したがって、様々な投与量および治療計画が望ましい場合がある。
【００３８】
ポリラクチドは、当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第６，４６９，１３３号明細書、米国特許第６，１２６，９１９号明細書には、様々なポリラクチドが記載されており、免責なしにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ポリラクチドは、生分解性であり、その有用性を高める。例えば、ポリラクチドは、対象（例えば、ヒト患者）の体内で分解されて、数週間または数年の期間にわたって形成される構成ヒドロキシカルボン酸誘導体（すなわち、乳酸）になり得る。ポリラクチドは、約２０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａの分子量を有し得る。これらの理由から、ポリラクチドは、分解性縫合糸、あらかじめ形成されたインプラント、および薬物送達用の化合物などのアイテムを生成するための魅力的な材料（例えば、徐放性マトリックス）であり得る。
【００３９】
一態様では、本開示は、スピロノラクトン（ＳＣ−９４２０；ＮＳＣ−１５０３３９；７α−アセチルチオスピロラクトン；７α−アセチルチオ−１７α−ヒドロキシ−３−オキソプレグナ−４−エン−２１−カルボン酸γ−ラクトンとも呼ばれる）ならびに互変異性体、幾何異性体、光学活性形態、それらの鏡像異性体混合物、それらの薬学的に許容される塩およびそれらの薬学的に活性な誘導体、１種以上のアルキル置換ポリラクチドの少なくとも１種のポリマーまたはポリマー混合物、または／および１種以上の置換または非置換Ｃ６〜Ｃ８２−ヒドロキシアルキル酸の溶融重縮合によって調製されるポリマー（かかるポリマーは２−ヒドロキシル酸のポリマーとｍＰＥＧとのコポリマーである）を含む、医薬製剤に関する。
【００４０】
公知の製剤の欠点および公知の用途におけるスピロノラクトンの使用は、本開示による医薬製剤により克服できることが見出された。
【００４１】
本開示による新規な製剤が提供されることで、眼の表面に局所的に適用され得る製剤の提供により、スピロノラクトンの望ましくない副作用を回避する。さらに、コルチコステロイド治療の副作用が、ここで回避され得る。
【００４２】
本開示による医薬製剤は、任意の適切な方法で、医療分野および医薬製剤の状況において通常の慣行と同様に使用され得る。製剤が滅菌濾過される方法で、本開示による医薬製剤を調製することが可能である。
【００４３】
本開示による医薬製剤は、様々な態様で有利な特徴を示す。特に、本開示による医薬製剤は、スピロノラクトンの改善された組織浸透特性を提供する。
【００４４】
本発明の医薬製剤、特に局所適用におけるその有用性は有利であるが、これは公知の望ましくない副作用のリスクなしに特定の適応症をスピロノラクトンで効率的に治療し、効率的に標的化できない角膜疾患をスピロノラクトンの全身使用により治療することがここで可能になるからである。
【００４５】
本開示による医薬製剤は、少なくとも１種のポリマーまたは／およびポリマー混合物との有利な組み合わせを提供する。特に有利なのは、２−ヒドロキシアルキル酸とｍＰＥＧとのコポリマーから形成される非常に小さなミセル構造内でスピロノラクトンを自然にカプセル化することにより、水不溶性スピロノラクトン薬物の透明な水性製剤が調製され得ることである。さらに、このようなミセル構造の親水性のシェルは、自然に水和した組織表面と有利に密接に相互作用し得る。さらに有利には、薬物を負荷したミセル構造の非常に強化された表面積は、製剤が投与される組織への薬物の迅速かつ効率的な移動を促進する。
【００４６】
本開示による医薬製剤の有利な特徴は、以下のうちの１つ以上から選択されるポリマーに部分的または完全に起因する：
ａ．ｍＰＥＧおよびアルキル置換ポリラクチドからなる１種以上のコポリマーであって、アルキル置換ポリラクチドが粘性であり、かつ以下の構造：
【化１】
2021512943.tif 000002
［式中、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２〜Ｃ３０アルキルであり、ｎは、少なくとも２であり；かつＲ３は、水素または置換または非置換のアルキルである］を有する、１種以上のコポリマー。特定の態様では、ポリマーは、Ｃ４〜Ｃ３２２−ヒドロキシルアルキル酸のいずれか１種以上のポリマーであってよく、ここで、Ｘは、水素または−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ−ＣＨ２であり；かつＹは、−ＯＨ、アルコキシ、ベンジルオキシ、および−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｐ−ＣＨ３からなる群から選択され；ｐは、１〜７００であり、かつ国際公開第２００７／０１２９７９号に開示されている通りである
および／または
ｂ．国際公開第２０１２／０１４０１１号に開示されている、１種以上の置換または非置換のＣ６〜Ｃ８２−ヒドロキシアルキル酸の溶融重縮合によって調製された１種以上のポリマー。
【００４７】
活性化合物がスピロノラクトンであり、ポリマーがｍＰＥＧおよびポリ（カプリル酸）からなるコポリマーである、本開示による医薬製剤が特に有利である。
【００４８】
上記製剤の１つの利点は、製剤が透明であり、患者の視力を物理的に妨げないという事実を考慮して、患者の視界を損なうリスクなしに眼科用途に投与できるという事実である。
【００４９】
本開示による医薬製剤は、眼の疾患または障害、再発性角膜びらん；創傷治癒の遅延であって、特にグルココルチコイドの使用、再上皮化を促進するための角膜移植の術後治療、角膜外傷、角膜手術後、架橋後、屈折矯正手術（レーザーアシストまたは外科手術）後などの脱皮角膜に対するグルココルチコイドの局所投与に伴うものだけに起因しない創傷治癒の遅延；角膜ジストロフィ、眼球酒さ、抗生物質に関連する角膜膿瘍または細菌感染症、スピロノラクトンの抗線維化作用による角膜線維症および瘢痕、角膜混濁（comeal opacification）、末梢性潰瘍性角膜炎、角膜血管新生（comeal neovascularization）（例えば、スピロノラクトンの抗血管新生作用による）、メイボミア腺機能障害およびドライアイ症候群や眼瞼炎などの関連疾患を含む群から選択される疾患または障害を予防、抑制または治療する際の使用に有利に適用され得る。
【００５０】
本発明の医薬製剤は、上記のように、それぞれ用途および適応症に使用され得る。類似の受容体組成物が眼と同様に生じるか、または／および類似のまたは同等の標的受容体が生じる上皮組織および／または皮膚を治療するために上記製剤を使用することも可能であることも当業者には理解されよう。
【００５１】
上記の用途および使用による医薬製剤は、いくつかの利点を示す。上記医薬製剤は、特に、公知の治療と少なくとも同等の有効性を維持しながら、副作用の発生率が低減されていることを特徴とする。
【００５２】
本開示の別の態様は、眼の疾患もしくは障害、または皮膚疾患もしくは障害、再発性角膜びらん；創傷治癒の遅延であって、グルココルチコイドの使用、再上皮化を促進するための角膜移植術後治療、角膜外傷、角膜手術後、架橋後、屈折矯正手術（レーザーアシストまたは外科手術）後などの脱皮角膜に対するグルココルチコイドの局所投与に伴う創傷治癒の遅延；角膜ジストロフィ、眼球酒さ、抗生物質に関連する角膜膿瘍および細菌感染症、スピロノラクトンの抗線維化作用による角膜線維症および瘢痕、対象の角膜混濁を含む群から選択される疾患または障害を予防、抑制または治療する方法であり、上記方法は、本明細書に開示されているような医薬製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００５３】
本開示の別の態様は、本明細書に開示される医薬製剤を投与することにより、ミネラルコルチコイド受容体の過度の刺激に関連する眼の疾患または障害を治療または予防する方法である。
【００５４】
本開示の別の態様は、眼の疾患または障害を治療する方法であって、刺激が、本明細書に開示された医薬製剤を投与することによるグルココルチコステロイド療法によって引き起こされる、方法である。
【００５５】
本開示の別の態様は、眼の疾患または障害を、本明細書に開示された医薬製剤を投与することによって治療する方法であって、該疾患または障害は、眼の疾患または障害、再発性角膜びらん；創傷治癒の遅延であって、特にグルココルチコイドの使用、再上皮化を促進するための角膜移植の術後治療、角膜外傷、角膜手術後、架橋後、屈折矯正手術（レーザーアシストまたは外科手術）後などの脱皮角膜に対するグルココルチコイドの局所投与に伴うものだけに起因しない創傷治癒の遅延；角膜ジストロフィ、眼球酒さ、抗生物質に関連する角膜膿瘍および細菌感染症、スピロノラクトンの抗線維化作用による角膜線維症および瘢痕、角膜混濁、末梢性潰瘍性角膜炎、角膜血管新生（スピロノラクトンの抗血管新生作用による）、メイボミア腺機能障害およびドライアイ症候群や眼瞼炎などの関連疾患を含む群から選択される疾患または障害から選択される、方法である。
【００５６】
本開示の別の態様は、２つの成分を室温で混合することにより、本明細書に開示された医薬組成物を調製する方法である。
【００５７】
本開示の別の態様は、本明細書に開示された使用のための製剤、または局所使用もしくは投与のための、または局所領域使用もしくは投与のための本明細書に開示された方法である。
【００５８】
本開示の別の態様は、本明細書で開示された使用のための製剤、または本明細書で開示された方法であり、これは、コルチコステロイドまたはコルチコステロイド投薬の前治療または併用治療を受けている患者に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、０．１％のスピロノラクトンを負荷したミセルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像であり、それらの球形および均一性を示す。
【図２】図２は、処置群ごとの角膜創傷の４日間の治療後の再上皮化の平均パーセンテージを示す。棒グラフは、平均を表し、誤差の棒グラフは、標準偏差を表す。ｐ値は、スチューデント・ニューマン・コイルス法（Student-Newman-Keuls）の事後検定；ｎｓ（ｐ＞０．０５）、非有意差、＊（ｐ＜０．０５）、有意差に続いて、ランクに関するクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析（Kruskal- Wallis one-way analysis of variance）を用いて計算された。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、Ａ，０．１％のスピロノラクトンミセルに続いてデキサメタゾン（ｎ＝１０）；Ｂ，０．０１％のスピロノラクトンミセルに続いてデキサメタゾン（ｎ＝９）；Ｃ，０．１％のカンレノ酸カリウム溶液に続いてデキサメタゾン（ｎ＝１０）；Ｄ，デキサメタゾン（ｎ＝１０）を複数回注入した５日後の右の処置した角膜および左の対照の角膜で検出された薬物の平均濃度を示す。ｐ値は、スチューデントのｔ検定；ｎｓ，ｐ＞０．９９で得られる。
【図４】図４は、０．１％のＳＰＬ−ミセルおよびＭａｘｉｄｅｘ(登録商標)（群１）で処置したウサギ＃６から得られた典型的なＳＩＲトレースを示す。Ａは、右の処置された角膜であり、Ｂは、左の対照（未処置の）角膜である。クロマトグラムは、研究に関与したウサギの処置された角膜および対照の角膜のＵＨＰＬＣ−ＭＳ分析から得られる。群１：０．１％のスピロノラクトンミセル＋Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標）。
【図５】図５は、０．０１％のＳＰＬ−ミセルおよびＭａｘｉｄｅｘ（登録商標）（群２）で処置されたウサギ＃２０から得られた典型的なＳＩＲトレースを示す。Ａは、右の処置された角膜であり、Ｂは、左の対照（未処置の）角膜である。群２：０．０１％のスピロノラクトンミセル＋Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標）。
【図６】図６は、０．１％のカンレノ酸カリウム溶液およびＭａｘｉｄｅｘ（登録商標）（群３）で処置したウサギ＃２５から得られた典型的なＳＩＲトレースを示す。Ａは、右の処置された角膜であり、Ｂは、左の対照（未処置の）角膜である。
【図７】図７は、ＰＢＳで処置したウサギ＃３８から得られた典型的なＳＩＲトレース（群４）を示す。Ａは、右の処置された角膜であり、Ｂは、左の対照（未処置の）角膜である。
【図８】図８は、Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標）（群５）で処置されたウサギ＃４２から得られた典型的なＳＩＲトレースを示す。Ａは、右の処置された角膜であり、Ｂは、左の対照（未処置の）角膜である。
【００６０】
実施例
実施例は、いかなる方法でも制限的であると理解されることを意味することなく、本開示の様々な態様および本発明の態様を例示することになる。
【００６１】
実施例は、とりわけ、本開示および本発明の製剤ならびにグルココルチコイドの使用、角膜創傷治癒、スピロノラクトン副作用の低減、有利な製剤成分としての高分子ナノ担体、前臨床の生体内許容性および上記の本発明の製剤の有効性の側面の文脈におけるそれらの使用を例示することになる。
【００６２】
以下の実施例の目的は、とりわけ、スピロノラクトンの局所ミセル製剤を使用するミネラルコルチコイド受容体の拮抗作用によって、ニュージーランド白ウサギにおけるグルココルチコイド誘発性の角膜創傷治癒の遅延を予防できるかどうかを調査することであった。平均数加重直径２０ｎｍのスピロノラクトンミセル（０．１％ｗ／ｖ）を、ｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡ（ｍＰＥＧ−ポリ（カプリル酸））ポリマーを使用して調製し、５℃で少なくとも６か月の中間安定性を有することを示した。ニュージーランド白ウサギでの前臨床試験では、０．１％のスピロノラクトンミセル製剤で、５日間の毎日の複数回の点眼後に角膜で反応が観察されなかったため、忍容性が良好であることが実証された。また、前臨床試験では、デキサメタゾンが未処置の対照群に比べて上皮創傷治癒を有意に遅延させることが確認された（４日後の再上皮化のパーセンテージ：８４．６±１３．９％対９９．５±１．０％、ｐ＜０．０５）。しかしながら、０．１％のスピロノラクトンミセル製剤を添加することで、再上皮化の程度が有意に改善され、統計学的には未処置の対照と同等の再上皮化のパーセンテージ（９６．９±７．３％対９９．５±１．０％、ｐ＞０．０５）で、デキサメタゾン誘発性の創傷治癒の遅延に対抗した。生態分布試験により、スピロノラクトンの眼内代謝に関する知見が得られ、そして親分子ならびにその２つの主要代謝物である７α−チオメチルスピロノラクトンおよびカンレノンが、観察された薬理効果に相対的に寄与しているという知見が得られた。デキサメタゾン誘発性の創傷治癒の遅延を克服する際にスピロノラクトンとカンレノン酸カリウム（カンレノンの水溶性前駆体）との有効性の比較により、前者の方が有効性が高いことが確認された。結果は、カンレノンよりも７α−チオメチルスピロノラクトンのミネラルコルチコイド受容体拮抗薬としての効力が高いことを示しており、このことにより、創傷治癒の遅延の原因であるグルココルチコイド誘発性の過剰活性化に対抗する際のその優れた能力が明らかになった。結論として、予備的な結果により、グルココルチコイド治療中の患者にミネラルコルチコイド受容体拮抗薬を併用することで、グルココルチコイドが複雑な角膜創傷治癒過程に及ぼす悪影響を防ぐ可能性があることを示唆する上記の仮説が支持された。
【００６３】
以下の実施例の１つの目的は、皮膚の場合のように、ＧＣ誘発性の角膜創傷治癒の遅延がＭＲ拮抗薬によって逆転できるかどうかを調査することであった。この仮説を検証するために、強力なＭＲ拮抗薬のスピロノラクトン（０．１％，ｗ／ｖ）の新規なミセル化製剤を開発し、眼局所投与用に特性を評価し、次いでニュージーランド白ウサギを用いて、デキサメタゾンによって誘発された角膜創傷治癒障害に対抗できるかどうかを評価した。この結果を、スピロノラクトンの低濃度ミセル製剤（０．０１％、ｗ／ｖ）と、水溶性プロドラッグ、カンレノンの前駆体であるカンレノ酸カリウム（０．１％、ｗ／ｗ）、スピロノラクトンの薬理活性代謝物を含む製剤とを局所適用した後に観察された結果と比較することが決定された。
【００６４】
１．材料および方法
２．１．材料
メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ヘキシル置換−ポリ（乳酸）、（ｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡ、５．５ｋＤａ）を、Ａｐｉｄｅｌ  ＳＡ（ジュネーブ、スイス）により供給した。スピロノラクトン（ＳＰＬ）を、Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｌａｎｇｈｕａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．（浙江省、中国）から購入した。７α−チオメチルスピロノラクトン（ＴＭＳＰＬ）を、ＴＬＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｌｔｄ．（オンタリオ、カナダ）から購入した。カンレノン（ＣＡＮ）、カンレノ酸カリウム（ＣＡＮＫ）、および内部標準（ＩＳ）として使用される１７α−メチルテストステロン（ＭｅＴ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ブフス、スイス）から購入した。デキサメタゾン（ＤＸＭ）を、Ｔｉａｎｊｉｎ  ＴｉａｎＭａｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．Ｌｔｄ（天津市、中国）から購入した。Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標）（デキサメタゾン０．１％懸濁液、Ａｌｃｏｎ）を、地元の薬局から購入した。塩化ナトリウムを、Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ  ＡＧ（ヘリザウ、スイス）から得た。超純水（Ｈ２Ｏ）を、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水浄化システム（ダルムシュタット、独国）を使用して調製した（抵抗率＞１８ＭΩ  ｃｍ）。メタノール（ＭｅＯＨ、ＨＰＬＣグレード）を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）から得て、アセトニトリル（ＡＣＮ、ＨＰＬＣグレード）およびギ酸（ＵＬＣ／ＭＳグレード）を、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ（デューズ、仏国）から得た。Ａｃｅｔｏｎｅ  Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ（登録商標）（ＨＰＬＣグレード）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ブフス、スイス）から購入し、トリフルオロ酢酸を、ＶＷＲ（ディーティコン、スイス）から得た。他のすべての化学物質は、少なくとも分析グレードのものであった。
【００６５】
Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）フィルター（Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＬ、孔径０．２２μｍ、直径１３ｍｍ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ブフス、スイス）から購入した。１０ｍＬの滅菌点眼バイアルを、Ｍｕｅｌｌｅｒ＋Ｋｒｅｍｐｅｌ  ＡＧ（ビューラハ、スイス）から購入した。
【００６６】
２．２．方法
２．２．１．分析方法
２．２．１．１．ＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣ分析法は、スピロノラクトンミセルおよびカンレノ酸カリウム溶液の双方の製剤開発および安定性試験をサポートするために開発された。ＨＰＬＣ−ＵＶによるスピロノラクトンの定量：スピロノラクトンの定量を、４０℃に加熱した逆相カラム（ＹＭＣベーシック、２５０×３．０ｍｍ、５μｍ）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣで行った。この方法では、アセトニトリルおよび０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水の勾配を使用した：アセトニトリルのパーセンテージは、５分以内に４０％から８０％に増加し、３分間一定に保たれ、その後またたく間に４０％に減少した。移動相の流量は１．０ｍＬ／分であり、ＵＶ検出器を２３８ｎｍに設定した。
【００６７】
ＨＰＬＣ−ＵＶによるカンレノ酸カリウムの定量：４０℃に加熱した逆相カラム（ＹＭＣベーシック、２５０×３．０ｍｍ、５μｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣでカンレノ酸カリウムの定量を行った。移動相は、０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（Ａ）および０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水（Ｂ）で構成されていた。分析を、５５％の溶離液Ａおよび４５％の溶離液Ｂを用いてアイソクラティックモードで行った。移動相の流量は１．０ｍＬ／分であり、ＵＶ検出器を２８６ｎｍに設定した。
【００６８】
２．２．１．２．ＵＨＰＬＣ−ＭＳ法
検証済みのＵＨＰＬＣ−ＭＳ分析法（提出された原稿）を使用して、生体内試験から得られたウサギの角膜においてさまざまな分析物の生体内分布を定量化した。簡潔に言えば、液体クロマトグラフィーシステムは、二元系溶媒マネージャ、１０μＬの注入ループ容量を有するサンプルマネージャおよびカラムマネージャを含むＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（登録商標）超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ（登録商標））システム（バーデン−デートヴィル、スイス）で構成されていた。６種の化合物の逆相クロマトグラフィー分離を、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８  Ｖａｎｇｕａｒｄプレカラム（内径５×２．１ｍｍ、２．５μｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（内径５０×２．１ｍｍ、２．５μｍ）で行った。溶出を、０．４５ｍＬ／分の流量および５分の運転時間で、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ（４８／５２、ｖ／ｖ）中の０．１％のギ酸からなる移動相を用いてアイソクラティックモードで行った。カラム温度を４０℃に保持し、サンプルマネージャの温度を室温に維持した。注入量を５μＬに設定した。質量分析（ＭＳ）システムは、Ｚスプレーエレクトロスプレーイオン化ソースを備えたＷａｔｅｒｓ  ＸＥＶＯ（登録商標）ＴＱ−ＭＳ検出器（バーデン−デートヴィル、スイス）で構成されていた。６種の化合物のＭＳ検出を、ポジティブモード（ＥＳＩ＋）でエレクトロスプレーイオン化を使用し、親イオン（水素付加物、［Ｍ＋Ｈ］＋）として各化合物の擬似分子イオンを使用して選択イオン記録（ＳＩＲ）で行った。キャピラリー電圧を２．３ｋＶに設定し、脱溶媒ガスの温度および流量を、それぞれ、３５０℃および６５０Ｌ／ｈに維持した。各化合物を個別に１μｇ／ｍＬにてＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１）中で５μＬ／分の流量で注入することにより、各分析物の特異的なＭＳパラメータを調整し、決定した。各化合物の擬似分子イオン（水素付加物、［Ｍ＋Ｈ］＋）の質量電荷比（ｍ／ｚ）に従って、各分析物の同定および定量を行った。コーン電圧の最適な設定は、ＤＸＭでは１５Ｖ、ＣＡＮＫでは３２Ｖ、ＳＰＬ、ＴＭＳＰＬ、ＣＡＮおよびＭｅＴでは３５Ｖであった。ＤＸＭ、ＣＡＮＫ、ＳＰＬ／ＣＡＮ、ＴＭＳＰＬおよびＭｅＴに対応する擬似分子親イオンは、それぞれ、３９３．１、３５９．１、３４１．０、３８９．０および３０３．０のｍ／ｚを有する。滞留時間を、３２８ｍｓのＤＸＭを除いて、すべての化合物について５ｍｓに設定した。データ処理を、Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン４．１（バーデン−デートヴィル、スイス）を使用して行った。
【００６９】
１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬの較正標準を、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１）で抽出されたブタの角膜から得られた角膜マトリックスで調製した。すべての較正曲線は、直線であった（ｒ２＞０．９９）。各分析物の検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）を第１表にまとめる。
【表１】
2021512943.tif 000003
【００７０】
２．２．２．スピロノラクトンミセル製剤の開発および最適化
スピロノラクトンを負荷したミセル化ナノキャリア（０．１％、ｗ／ｖ）を、ｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡコポリマーをさまざまなＳＰＬ：コポリマー比；１：２０、１：４０および１：６０で使用して調製した。２つの緩衝液も評価した；クエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５．５）およびＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）。製剤を、１０ｍＬのバッチサイズで調製した。簡潔に言えば、１０ｍｇのスピロノラクトンを、２ｍＬのアセトンに溶解した。次に、それぞれ１：２０、１：４０および１：６０のＳＰＬ：コポリマー比に対応する２００ｍｇ、４００ｍｇまたは６００ｍｇのｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡを、ＳＰＬを含むアセトン溶液に加え、溶解した。続いて、この溶液を、シリンジポンプ（６ｍＬ／ｈ）を用いて超音波下（振幅２０％−Ｓ  ４５０  Ｄ，ブランソン、米国）で、クエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５）またはＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）のいずれかからなる水相１０ｍＬに滴加した。次に、アセトンを減圧下で除去した（５８℃、１８０ミリバール−ビュッヒ社製のＲｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２１０；スイス）。最後に、浸透圧をＮａＣｌで２７０〜３００ｍＯｓｍに調整し、製剤を０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターで滅菌バイアルに濾過し、５℃に維持した。製剤を、濃度、薬物負荷、取り込み効率、およびミセルのサイズに関して特性評価した。また、ミセルを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ(商標)Ｇ２Ｓｐｈｅｒａ、オレゴン、米国）を使用して視覚化した。簡単に言えば、ミセル製剤を、ＭｉｌｌｉＱ水で１：１０に希釈し、次いで５μＬをグリッドに堆積させ、３０秒間放置し、過剰分を注意深く拭いた。続いて、２％の酢酸ウラニルの１滴を、３０秒間適用してコントラストを高め、過剰分を慎重に取り除いた。ＴＥＭ倍率を２５０００ｘに設定した。
【００７１】
２．２．２．１．薬物含有量および取り込み効率の決定
スピロノラクトン含有量を、ＨＰＬＣ−ＵＶによって定量化した。ＳＰＬミセルのアリコートを、ＨＰＬＣ分析の前にアセトニトリルで希釈した（１：１０）。
【数１】
2021512943.tif 000004
【００７２】
２．２．２．２．サイズの決定
ミセルの強度加重（Ｚ平均）および数加重（ｄｎ）流体力学的直径および多分散性指数（ＰＤＩ）を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を使用して測定した。ＳＰＬミセル溶液を、ＭｉｌｌｉＱ水で１：１に希釈し、後方散乱光（１７３度）で分析するために使い捨てプラスチックキュベットに充填した。
【００７３】
２．２．３．生体内試験で使用される製剤の調製および特性評価
２．２．３．１．スピロノラクトンミセル製剤（０．１％および０．０１％、ｗ／ｖ）
スピロノラクトンを負荷したミセル（０．１％、ｗ／ｖ）を、１４ｍＬのバッチスケールで調製した。簡潔に言えば、６１６ｍｇのｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡおよび１５．４ｍｇのスピロノラクトンを、２ｍＬのアセトンに溶解した。超音波処理下で水相（１０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．７％のＮａＣｌ、ｐＨ５．５）に有機相を滴加（６ｍＬ／ｈ）した（２０％の振幅−Ｓ  ４５０  Ｄ、ブランソン、米国）。続いて、アセトンを減圧下で除去した（５８℃、１８０ミリバール−ビュッヒ社製のＲｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２１０、スイス）。この製剤を、製剤プロセス中にシリンジで失われたＳＰＬおよびｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡの量を相殺するために、１０（重量）％過剰で調製した。０．０１％（ｗ／ｖ）のＳＰＬ濃度は、水相中の０．１％のＳＰＬミセルの１：１０希釈によって得られた。最終的に、製剤を、０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターで濾過し、無菌点眼バイアルに保存した。双方の製剤の予備アリコートを保管して、時間の経過に伴う製剤の安定性を評価した。
【００７４】
２．２．３．２．カンレノ酸カリウム溶液（０．１％ｗ／ｗ）
カンレノ酸カリウム溶液（０．１％ｗ／ｗ）を、５０ｍｇのカンレノ酸カリウムを５０ｇの水性緩衝液（５ｍＭのリン酸緩衝液、０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解して調製した。この溶液を、０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターで濾過し、無菌点眼バイアルに保存した。時間の経過に伴う製剤の安定性試験のために、予備のアリコートを保管した。
【００７５】
２．２．４．ウサギにおける生体内での忍容性および有効性試験
２．２．４．１．動物
体重約２．３〜３．０ｋｇの５０匹の雄アルビノニュージーランドウサギを、この試験に含めた（Ｉｒｉｓ  Ｐｈａｒｍａ、仏国）。動物を、同一の環境条件下で標準ケージに個別に収容した。温度を１５〜２１℃に維持し、相対湿度は＞４５％であった。部屋を継続的に換気した（１時間あたり１５風量以上）。温度および相対湿度を継続的に制御し、記録した。動物を、１２時間の明／暗サイクル（午前７時から午後７時まで）で、１０〜２００ｌｘの光に日常的に（ケージ内で）曝露した。動物を栄養強化し、食物を自由に摂取できるようにし（１５０ｇ／日）、水を自由に摂取させた。すべての動物は健康であり、試験を通して臨床的に観察可能な眼の異常はなかった。すべての動物は、指令２０１０／６３／ＥＵ−科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州条約−に従って、そして眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚・眼科研究協会（ＡＲＶＯ）の声明書に従って取り扱われ、動物実験のための地元の獣医当局（仏国政府のプラットフォームＡＰＡＦＩＳ−認可番号２０１６０２１２６５９３８６）によって承認された。
【００７６】
２．２．４．２．角膜創傷の誘発
動物を、ケタミン−キシラジン混合物の筋肉内注射により麻酔した。次に、１滴の０．４％のオキシブプロカインを、局所麻酔のために局所適用した。さらに、痛みを防ぐために、ブプレノルフィン（２０μｇ／ｋｇ）を、導入の３０分前に皮下注射で投与した。メスの柄を使って右目を眼窩から外れないようにし、次いでメスの刃を使って角膜上皮を完全に除去した。脱上皮化を、フルオレセイン染色によって監視した。眼を生理食塩水で洗浄し、乾いた綿棒で細胞破片を取り除き、生理食塩水で再洗浄した。
【００７７】
２．２．４．３．試験の設計
第２表に示すように、動物を無作為に５つの処置群に分けた。各群には１０匹のウサギが含まれ、０日目に１日３回、１日目から４日目まで１日６回、５日目に１日１回、右目に点眼器を使用して点眼した。
【００７８】
群１、２および３：動物を、試験項目（それぞれ、０．１％のスピロノラクトンミセル、０．０１％のスピロノラクトンミセルおよび０．１％のカンノレイン酸カリウム溶液）−１滴（約３５μＬ）の試験項目で処置し、次いで、５分後に、１滴の０．１％のデキサメタゾン（Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標））で処置した。
【００７９】
群４（正の対照群）：動物を、対照項目（ＰＢＳ）−各投与間に５分間隔で２滴のＰＢＳで処置した。
【００８０】
群５（負の対照群）：動物を、１滴のＰＢＳで処置し、次いで、５分後に、１滴の０．１％のデキサメタゾン（Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標））で処置した。
【００８１】
５日目に、忍容性の最後の評価から３０分後、試験項目、対照項目または参照項目を、両眼に点眼した（各眼に１滴）。続いて、ウサギを安楽死させ、両眼を摘出し、角膜を採取し、分析まで−８０℃で保存した。
【表２】
2021512943.tif 000005
【００８２】
２．２．４．４．角膜再上皮化の評価
角膜創傷のサイズを、眼の創傷郭清直後およびその日の最初の点眼の前に１日に１回、フルオレセイン試験を用いて評価した。脱上皮化の前にベースラインを記録した。１滴のフルオレセインを、右（病変）眼に点眼した後、角膜を青色光で照らした。角膜病変の画像（フルオレセインで染色された領域）を、ＣＣＤカメラを使用して撮影し、画像Ｊソフトウェアを使用して分析した。
【００８３】
２．２．４．５．眼の忍容性検査
結膜、角膜および虹彩を正確に検査するために検眼鏡を使用した。各ウサギの両目を、試験前の期間（ベースライン）に検眼鏡を使用して検査し、次いで、０日目から４日目までのその日の最後の投与後、１日に１回検査した。観察を、ドレイズスケール（Draize scale）を使用してスコア化した（表Ｓ１）。
【００８４】
２．２．４．６．動物の犠牲およびサンプリング
測定期間の終わりに、ケタミン−キシラジン混合物の筋肉内注射によって得られた麻酔に続いて、過剰投与されたペントバルビタールの心臓内注射によって動物を安楽死させた。この方法は、欧州当局による安楽死の推奨方法の１つである。安楽死直後、両眼を摘出し、角膜を解剖し、分析するまで−８０℃で保存した。
【００８５】
２．２．４．７．角膜中の薬物の抽出および定量
角膜からの薬物の抽出方法が検証され、これは個別に公開されることになる（提出された原稿）。−８０℃で保存された５０個の処置済み角膜および５０個の対照の角膜を、室温で解凍し、重量を測定し、手作業で細かく砕いて、１ｍＬのＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１）および１００ｎｇ／ｍＬの内部標準（ＩＳ、ｌ７α−メチルテストステロン）を含むガラス瓶に入れた。バイアルを、抽出のために３００ｒｐｍで一晩撹拌したままにした。翌日、サンプルを１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、有効なＵＨＰＬＣ−ＭＳ法を使用して上清を定量した。
【００８６】
２．２．５．統計分析
群の再上皮化のパーセンテージに関する統計分析を、ランクの分散のクラスカル・ウォリス一方向分析と、それに続くスチューデント・ニューマン・キュールスの事後分析を使用して実行した。左右の角膜に見られる平均濃度の統計分析を、スチューデントのｔ検定またはマン・ホイットニー順位和検定を使用して実行した。
【００８７】
３．結果
３．１．スピロノラクトンミセル製剤および最適化
ｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡミセルへのＳＰＬの取り込み効率は、ＳＰＬ：コポリマー比および使用する緩衝液によって異なる。全体として、ＳＰＬおよびｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡコポリマーを１：４０の比で含み、さらに水相としてクエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５．５）を含む製剤（製剤Ａ）により、２４．８±０．１ｍｇ／ｇの薬物負荷に対応する９９．２±０．２％の最良の取り込み効率が達成された（第３表）。ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）の場合、１：６０のＳＰＬ：コポリマー比（製剤Ｂ）により、１４．０±０．１ｍｇ／ｇの薬物負荷に対応する８３．６±０．６％の最良の取り込み効率が達成された（第３表）。強度加重ミセル径（Ｚ平均、Ｚａｖ）は、５０ｎｍおよび５２ｎｍであり、数加重ミセル径（ｄｎ）は、製剤ＡおよびＢについて、それぞれ、１７ｎｍおよび１９ｎｍ（ＰＤＩ＝０．２）であった（第３表）。図１は、ナノキャリアの球状でかつ均一な側面を示す。
【００８８】
図１は、０．１％のスピロノラクトンを負荷したミセルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。平均粒子径：２０ｎｍ。
【００８９】
製剤ＡおよびＢの安定性を、５℃で１か月間監視した。結果は、製剤Ａが濃度、ｐＨおよび浸透圧の点で１か月間安定したままであったのに対し、製剤Ｂは２週間であったことを示した。製剤Ａは、１ｍｇ／ｍＬのＳＰＬ濃度に対応する１００％の取り込み効率を達成するように最適化された。水溶液への添加中にシリンジ内で少量のＳＰＬおよびｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡが失われたことが分かり；これを修正するために、製剤プロセス中に失われた量に対応する、１０（重量）％過剰のスピロノラクトンおよびｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡを含む製剤を調製することが決定された。取り込み効率および優れた安定性を考慮して、製剤Ａを、さらなる試験で使用されるべきリード製剤として選択した。
【表３】
2021512943.tif 000006
【００９０】
３．２．生体内試験で使用された製剤の特性評価
製剤の特性を第４表にまとめる。０．０１％および０．１％のスピロノラクトンミセル製剤の安定性を、５℃で６か月間評価した。濃度、ｐＨおよび粒子サイズは、６か月間完全に安定したままであった。動物試験の期間中、製品の安定性を確保するために、０．１％のカンレノ酸カリウム溶液の安定性を５℃で２４日間評価した。この場合も、濃度およびｐＨは、試験期間中、安定したままであった。
【表４】
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【００９１】
３．３．ニュージーランド白ウサギにおける忍容性および有効性試験
３．３．１．眼の忍容性
４日目の動物の眼の検査を、第５表に処置群ごとに報告する。結膜の発赤、結膜浮腫、目やに、虹彩炎および角膜混濁を、ドレイズスケールに従ってスコア化した（表Ｓ２）。観察された眼球反応のほとんどは、軽微で一時的なものであり、脱上皮化モデルで一般的に観察されるため、治療に起因するものではなかった。５日目に未だ、わずかな結膜発赤（３段階でスコア１）、中等度の目やに（３段階でスコア２）を伴う軽度の結膜浮腫（４段階でスコア２）を示したＤＸＭ単独で処置した１匹の動物を除いて、すべての群で、５日目に眼球反応は観察されなかった。実際、この動物は、５日目でも顕著な角膜再上皮化欠損（−４２．６％）を示し、これはおそらく持続的な眼球反応に寄与した。
【表５】
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【００９２】
３．３．２．角膜創傷治癒
角膜上皮の創傷治癒に対する０．１％のスピロノラクトンミセルの有意な有益な効果が、４日目から観察された。４日目に達成された再上皮化の平均パーセンテージを、受けた処置に従って図２に示す。
【００９３】
予想通り、０．１％のＤＸＭ（Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標））で処置した創傷角膜の再上皮化は、ＰＢＳ単独で処置した角膜と比較して遅延した。このモデルでは、創傷領域の治癒において２日目または３日目に０．１％のＤＸＭとＰＢＳとの間で２倍の遅延があると予想された。この違いは、３日目に観察され、創傷領域のパーセンテージは、０．１％のＤＸＭで処置した動物の場合、２１．２±８．７％であるのに対して、ＰＢＳで処置した動物の場合、９．３±７．９％であり、この試験で使用したモデルを検証した（表Ｓ２）。
【００９４】
０．１％のＤＸＭと一緒に０．１％のＳＰＬミセルを複数回局所投与した後、デキサメタゾン誘発性の角膜創傷治癒の遅延の有意な抑制が４日目に観察され、再上皮化の平均パーセンテージは、９６．９±７．３％であるのに対して、０．１％のＤＸＭ単独では８４．６±１３．９％であった（ｐ＜０．０５）。さらに、０．１％のＳＰＬミセルと０．１％のＤＸＭとの同時投与で達成された再上皮化のパーセンテージは、正の対照（ＰＢＳ処置のみ−９９．５±１．０％）と統計的に同等（ｐ＞０．０５）であった。したがって、０．１％のＳＰＬミセルは、０．１％のＤＸＭが角膜の再上皮化に及ぼす悪影響を、完全に補償するように見えた。このことは、ＰＢＳ単独投与または０．１％のＳＰＬミセルの同時投与を受けた群の動物とは対照的に、０．１％のＤＸＭ群において角膜再上皮化欠陥がマークされた個体の割合が高いことを明確に示した群内の個々の結果を考慮した場合に確認された（図２）。
【００９５】
０．１％のＤＸＭと一緒に０．０１％のＳＰＬミセルまたは０．１％のＣＡＮＫ溶液を複数回局所投与した後、ＤＸＭが再上皮化に及ぼす影響が低減される傾向が観察された。０．０１％のＳＰＬミセルまたは０．１％のＣＡＮＫ溶液のいずれかを用いた同時処置で観察された、創傷領域の再上皮化の平均範囲は、４日目で０．１％のＤＸＭ単独よりも高いままであったが（８４．６±１３．９％に対してそれぞれ、９１．６±９．５％および８７．６±１３．１％）、これらの違いは、統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。したがって、このモデルとこれらの研究条件では、０．０１％のＳＰＬミセルおよび０．１％のＣＡＮＫ溶液の処置の再上皮化に対する効果は、０．１％のＳＰＬミセルの場合のように明らかではなかった（図２）。
【００９６】
図２：角膜創傷の４日間の処置後の処置群ごとの再上皮化の平均パーセンテージ。棒グラフは平均を表し、誤差の棒グラフは標準偏差を表す。ｐ値は、スチューデント・ニューマン・コイルス法（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）の事後検定；ｎｓ（ｐ＞０．０５）、非有意差、＊（ｐ＜０．０５）、有意差に続いて、ランクに関するクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析（Ｋｒｕｓｋａｌ−  Ｗａｌｌｉｓ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）を用いて計算された。
【００９７】
３．３．３．角膜における薬物の生体内分布および定量化
群１：０．１％のスピロノラクトンミセル＋０．１％のデキサメタゾン（Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標））
０．１％のＳＰＬミセルおよび０．１％のＤＸＭを、５日間１０匹の動物の右目に複数回点眼すると、スピロノラクトンならびにその代謝物である７α−チオメチルスピロノラクトンおよびカンレノンが、右角膜で検出され、平均濃度は、それぞれ、７８０２±４３８７ｎｇ／ｇ、１１４±８２ｎｇ／ｇおよび８０９±１８０ｎｇ／ｇであった。デキサメタゾンは、右角膜でも３２３３±２１９０ｎｇ／ｇの濃度で検出された。
【００９８】
図Ａ）では、興味深いことに、ＳＰＬおよびその代謝物は、０．１％のＳＰＬミセルおよび０．１％のＤＸＭが点眼されたすべての動物の左（対照）角膜でも検出され、平均濃度は、ＳＰＬ、ＴＭＳＰＬおよびＣＡＮについて、それぞれ７４０６±３０４０ｎｇ／ｇ、９５±７５ｎｇ／ｇおよび６５１±１７７ｎｇ／ｇであった。処置した角膜と対照の角膜との間で、それらの平均濃度に有意差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。しかしながら、前述の分子とは異なり、ＤＸＭは、左角膜では検出されなかった（図３Ａ）。
【００９９】
群２：０．０１％のスピロノラクトンミセル＋０．１％のデキサメタゾン（Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標））
０．０１％のＳＰＬミセルおよび０．１％のＤＸＭを、５日間、９匹の動物の右目に点眼（Ｇｒｕｂｂｓ試験によれば、ウサギ番号１８は異常値であり、群２についてデータ分析から除外した）した結果、右角膜において平均濃度７１５±４８８ｎｇ／ｇのＳＰＬ、すなわち、０．１％のＳＰＬミセルで見られる平均濃度（７８０２±４３８７ｎｇ／ｇ）の１０分の１であるＳＰＬが検出された（図３Ｂ）。代謝物であるＴＭＳＰＬおよびＣＡＮも、ＤＸＭ（４５４２±３４２８ｎｇ／ｇ）と同様に、それぞれ３６±２５ｎｇ／ｇおよび１６８±５７ｎｇ／ｇで検出された。また、０．１％のＳＰＬ製剤についても、ＳＰＬおよびその代謝物は、０．０１％のＳＰＬミセルおよび０．１％のＤＸＭを点眼したすべての動物の左角膜において、ＳＰＬ、ＴＭＳＰＬおよびＣＡＮについて、それぞれ１１４８±８６４ｎｇ／ｇ、３７±１９ｎｇ／ｇおよび１２２±７７ｎｇ／ｇの濃度で検出されたが、処置した角膜と対照の角膜との間のそれらの平均濃度に有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。群１の動物については、ＤＸＭは、左角膜で再び検出されなかった（図３Ｂ）。
【０１００】
群３：０．１％のカンレノ酸カリウム溶液＋０．１％のデキサメタゾン（Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標））
０．１％のＣＡＮＫ溶液および０．１％のＤＸＭを、５日間、１０匹の動物の右目に複数回点眼すると、カンレノ酸カリウムおよびカンレノンが、それぞれ１３４４０±６３４６ｎｇ／ｇおよび８５９６±３０９７ｎｇ／ｇで検出されたが、デキサメタゾンは、５００４±２３７６ｎｇ／ｇの濃度で検出された（図Ｃ）。ＣＡＮＫおよびＣＡＮは、それぞれ１６７２±７３９ｎｇ／ｇおよび６３４９±２３７９ｎｇ／ｇで左角膜でも検出され、右角膜と比較して有意差があった（ｐ＜０．０５）。右角膜とは異なり、ＣＡＮの平均濃度は、ＣＡＮＫの平均濃度よりも高かった。ＤＸＭは、左角膜では検出されなかった（図６（３Ｃ））。
【０１０１】
群４：ＰＢＳ（正の対照）
ＰＢＳで処置した動物から得られた角膜では薬物は検出されなかった（図７（Ｓ４））。
【０１０２】
群５：０．１％のデキサメタゾン（Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標）−負の対照）
０．１％のＤＸＭを、５日間、１０匹の動物の右目に複数回点眼すると、デキサメタゾンが右角膜に１９６５１±１３０３２ｎｇ／ｇで検出された。興味深いことに、群１〜３とは異なり、ＤＸＭは、左角膜でも６３３７±２６０３ｎｇ／ｇで検出され（図３Ｄ）、右角膜と比較して統計的に有意な差があった（ｐ＜０．０５）。
【０１０３】
各群の双方の角膜の分析から得られた典型的なクロマトグラムが、補足データで提供されている（図４〜８（Ｓ１−５））。
【０１０４】
図３のＡ〜Ｄ：５日間の複数回の点眼後の右（処置）角膜および左（対照）角膜に見られる薬物の平均濃度。Ａ：０．１％のスピロノラクトンミセルの後に０．１％のデキサメタゾン（ｎ＝１０）；Ｂ：０．０１％のスピロノラクトンミセルの後に０．１％のデキサメタゾン（ｎ＝９）；Ｃ：０．１％のカンレノ酸カリウム溶液の後に０．１％のデキサメタゾン（ｎ＝１０）；Ｄ：０．１％のデキサメタゾン（ｎ＝１０）。ｐ値を、スチューデントのｔ検定で取得する；ｎｓ：ｐ＞０．９９。
【０１０５】
４．実施例の概要
生体内試験の結果は、デキサメタゾン誘発性の角膜創傷治癒の遅延に対する０．１％のスピロノラクトンミセル製剤の有意な有益な効果および良好な忍容性を示した。０．１％および０．０１％のＳＰＬミセル製剤で処置した角膜に見られる平均ＳＰＬ濃度の比較では、１０倍の差（それぞれ７８０２±４３８７ｎｇ／ｇおよび７１５±４８８ｎｇ／ｇ）が示され、これは適用された用量の１０倍の差と一致している。これらの結果は、適用されたＳＰＬ用量と、ミセルによるＳＰＬの制御された送達を示す角膜で定量化されたＳＰＬ量との間に相関関係があることを示す。角膜における薬物の定量化に加えて、生態分布試験は、眼におけるそれらの代謝に関する情報を提供し、そしてある程度、それらの作用機序に関する情報を提供した。実際、スピロノラクトンを眼に複数回点眼すると、２つの主要代謝物、すなわち、７α−チオメチルスピロノラクトンおよびカンレノンが検出され、ウサギの眼にチオエステラーゼおよびチオールメチルトランスフェラーゼの活性の存在が確認された。カンレノ酸カリウムを複数回局所点眼した後のカンレノンの検出により、ｇ−ヒドロキシ酸基のラクトン化によるカンレノ酸塩のカンレノンへのその場での変換が確認され、ウサギの眼にパラオキソナーゼ酵素（ＰＯＮ）の存在が確認された。
【０１０６】
第６表は、０．１％のＳＰＬミセル、０．０１％のＳＰＬミセルまたは０．１％のＣＡＮＫ溶液を複数回局所点眼した後の右（処置）角膜に見られるＳＰＬ、ＴＭＳＰＬおよびＣＡＮの平均濃度ならびにそれらの対応する再上皮化の平均パーセンテージをまとめたものである。０．１％のＳＰＬミセルで得られた再上皮化の平均パーセンテージの差は、優れており、０．０１％のＳＰＬミセルおよび０．１％のＣＡＮＫ溶液で得られた再上皮化の平均パーセンテージとは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）；しかしながら、後者の２つの群間で得られた再上皮化の平均パーセンテージに有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。最も高いＣＡＮ濃度レベルは、０．１％のＣＡＮＫで処置した角膜で見られた；しかしながら、これらの角膜は、再上皮化のパーセンテージが最も低く、ＣＡＮが、ＳＰＬの適用時にミネラルコルチコイド受容体の拮抗作用に関与する主な代謝物ではないことを示唆している。０．１％および０．０１％のＳＰＬミセルで達成された再上皮化の平均パーセンテージは高く、ＣＡＮよりもＴＭＳＰＬの方がミネラルコルチコイド受容体拮抗薬としての効力が高いことを裏付け、ＧＣの副作用に対抗して創傷治癒を改善する能力を証明している。これらの発見は、以前に公開されたデータと一致している：（ｉ）Ｃｏｒｖｏｌら［１９］は、ＭＲの拮抗作用におけるＣ７側鎖の重要性を指摘し、ＳＰＬ（およびその含硫代謝物、すなわち、ＴＭＳＰＬ）と比較してＭＲに対するＣＡＮの親和性が１０倍低いこと、およびＭＲに対するＣＡＮＫの親和性が非常に低いことを報告しているが、これはカルボキシレートの負の電荷が、その近傍に補償的な正の電荷が存在しないため、受容体との結合を阻害するからである；（ｉｉ）Ｓｕｔａｎｔｏら［２０］は、ＳＰＬの効力がＣＡＮＫと比較して高く、最大阻害濃度の半分（ＩＣ５０）が、それぞれ４．９ｎＭおよび＞１０００ｎＭであると報告した。
【表６】
2021512943.tif 000009
【０１０７】
反対側の目における薬物の検出
この試験の間、動物は、右目でのみ異なる処置を受け、左目は対照として保持された。興味深いことに、異なる処置で複数回点眼した後、ＳＰＬ、ＣＡＮＫおよびそれらの代謝物が、処置したすべての動物の左（対照）角膜で検出された。さらに興味深いことに、ＤＸＭは、ＭＲ拮抗薬を受けていない動物の左（対照）角膜でのみ検出された（群５）。
【０１０８】
薬物の片眼投与が反対側の眼での検出につながることが報告されており［２１〜２４］、このことは２つの異なる方法で説明された。１つ目の説明には、特にラットやウサギ目では、リンパの広がりを介した眼窩間の連絡、または点眼されていない眼への逆行性の流れを伴う涙管系を介した眼窩間の連絡によって１つの眼から別の眼への直接の通過が起こり得る局所的な非血行経路が含まれる［２２］。実際、従来の試験では、標識されたヒト血清アルブミンを使用して、ウサギの抗原の結膜交差転移が、臨床的および組織学的に確認された［２３］。別の試験では、グルココルチコイドのラットの眼へのイオン導入により、全身通過に適合するとみなされるレベルよりもはるかに高いレベルで反対側の眼におけるＧＣの効果が観察された［２４］。２つ目の説明には、血行経路が含まれ、これには、薬物が全身循環を介して眼に戻ることが含まれる。実際、薬物の局所点眼後、前眼部への進入には、（ｉ）角膜を横切る、および（ｉｉ）結膜を横切るという、２つの主要な経路がある。薬物が結膜を通過する場合、薬物の一部が結膜の血液循環に失われ、残りは血管の多い脈絡膜に到達する前に強膜に拡散し、そこで別の部分も全身循環に出される。この現象は、ウサギで特に重要であるが、ヒトでは重要ではないようである［２１］。すべての動物の両眼で見られたＳＰＬおよびその代謝物の同等の濃度について、ウサギの足で片眼から片眼への分子の外部接触移動の可能性は除外された。
【０１０９】
別の興味深い観察は、各処置および各薬物による、右（処置した）眼対左（対照の）眼で見られた濃度間の比較であった。実際、群１および群２では、処置した角膜および対照の角膜におけるＳＰＬ、ＴＭＳＰＬおよびＣＡＮの濃度は、統計的に同等であった；しかしながら、ＤＸＭは、処置した角膜でのみ検出された。群３では、処置した角膜および対照の角膜のＣＡＮＫ濃度およびＣＡＮ濃度は、統計的に異なっていた（ＣＡＮＫおよびＣＡＮについて、それぞれ１３．４４±６．３５μｇ／ｇ対１．６７±０．７４μｇ／ｇおよび８．６０±３．１０μｇ／ｇ対５．８４±２．３８μｇ／ｇ）。ＣＡＮＫの平均濃度は、処置した眼ではＣＡＮよりも高いのに対して、反対側の眼の場合は反対であることに注意すべきである。一度投与されたＣＡＮＫは、代謝物であるカンレノンと平衡状態にあるカンレノ酸として体内で利用可能である。実際、ＣＡＮＫのＣ１７上のｇ−ヒドロキシ酸は、パラオキソナーゼ酵素（ＰＯＮ）によって、ＣＡＮに存在するｇ−ラクトンに環化により変換される。本発明者らの発見により、ウサギの眼にＰＯＮが存在することが確認されたが、反対側の眼に見られるＣＡＮＫと比較してＣＡＮの平均濃度が高いことから、血漿中および／または他の組織中のＰＯＮが、ＣＡＮＫからＣＡＮへの生体内変換に重要な役割を果たし、その結果、反対側の眼に見られるＣＡＮのレベルが高くなることが示唆されている。群１および群２のように、ＤＸＭは、右の処置した角膜でのみ検出された。
【０１１０】
デキサメタゾンのＭＲへの結合を阻害したミネラルコルチコイド受容体拮抗薬
群５では、ＤＸＭは、群１〜３とは異なり、対照の角膜でのレベルは有意に低かったが、処置した角膜および対照の角膜の双方で検出された（ｐ＝０．００１）。興味深いことに、処置した角膜のＤＸＭ平均濃度は、ＭＲ拮抗薬がない場合、少なくとも４倍高いことが分かった（群５、１、２および３について、それぞれ１９．６５±１３．０３μｇ／ｇ対３．２３±２．１９μｇ／ｇ、４．５４±３．４３μｇ／ｇおよび５．００±２．３８μｇ／ｇ）。これらの発見により、ＭＲへのＤＸＭ結合がＭＲ拮抗薬（ＳＰＬ、ＴＭＳＰＬ、ＣＡＮまたはＣＡＮＫ）の存在によって妨げられたことが実証される。
【０１１１】
このことは、群１〜３のＭＲ拮抗薬（ＳＰＬ、ＴＭＳＰＬ、ＣＡＮまたはＣＡＮＫ）によりＭＲが飽和し、ＤＸＭによるＭＲの占有率が低下し、その結果、ＤＸＭは、ウサギにおけるＤＸＭの相対的に短い血漿中半減期（１．９時間と推定される［２５］）（参考に、ＳＰＬ、ＴＭＳＰＬ、およびＣＡＮについては、それぞれ１．４時間、１３．８時間、および１６．５時間［２６、２７］）を考慮すると、より迅速に排除されることから説明できる。
【０１１２】
さらに、Ｒａｆｅｓｔｉｎ−Ｏｂｌｉｎら［２８、２９］には、ＳＰＬのＭＲへの親和性（ｋｄ＝３．６ｎＭ）が、ＤＸＭの親和性（ｋｄ＝１０ｎＭ）と比較して、高いことが報告された。Ｓｔｏｋｅｓら［３０］には、ヒトの角膜上皮および内皮におけるＭＲ濃度が、ＧＲ濃度より３倍高いことが報告された。上記を考慮すると、４倍高いＤＸＭ濃度が処置した角膜で見られ、これは群５の動物の反対側の角膜でしか検出されなかったことは、この場合、ＭＲ拮抗薬が存在しないため、ＭＲに結合するための競争がなかったという事実によって説明される可能性がある。したがって、群５で見られたＤＸＭ平均濃度は、ＧＲおよびＭＲに結合されたＤＸＭの合計であったが、群１、群２、および群３で見られた平均濃度は、ＧＲに結合されたＤＸＭの固有の割合に対応した。これらの発見により、（ｉ）ＭＲ拮抗薬の非存在下でのＤＸＭによるＭＲのオフターゲット占有率の増加、および（ｉｉ）群５で得られた再上皮化のパーセンテージを考慮した場合の創傷治癒の遅延が確認される。最後に、これらの結果は、ＧＣに伴う創傷治癒の遅延の副作用を防ぐために、長期のＧＣ治療と組み合わせてＭＲ拮抗薬の同時投与を用いることの根拠を支持している。
【０１１３】
５．最終的な結論
局所投与用の安定型スピロノラクトンミセル製剤（０．１％，ｗ／ｖ）を開発し、角膜創傷治癒モデルにおける忍容性および有効性についてニュージーランド白ウサギを用いて生体内で試験を行った。
【０１１４】
製剤は、安全であり、角膜創傷治癒の管理に有益な効果を示した、すなわち、スピロノラクトンミセルの使用は、グルココルチコイド療法によって引き起こされる創傷治癒の遅延に対抗した。これは、ＭＲの拮抗作用が、グルココルチコイドによって引き起こされる上皮治癒の遅延を効率的に防止できることを示す最初の試験であり、グルココルチコイドによるＭＲの活性化が、上皮の成長および／または分化を防止するという証拠を提供する。ＭＲの拮抗作用は、いくつかの機構の調節を通じて有益な効果を発揮することができ、単球／マクロファージおよび多形核白血球の活性化、メタロプロテアーゼの発現および活性化、ならびに線維化促進分子の発現などのＭＲの活性化によって誘導されることが知られている［１１、１７、３１］。ＭＲはまた、ＥＮＡＣなどのイオンチャネルの発現に直接影響を与え、したがって、上皮細胞の遊走に影響を与え得る［３２］。ヒトにおいて、それぞれの結果は、本開示による新規な製剤で達成され得ることが予期され得る。重要なことに、これらの生体内での前臨床試験の結果は、ＭＲの拮抗薬であるスピロノラクトンの同時投与により、創傷治癒におけるグルココルチコイド誘発性の遅延を相殺する効果を強調している。スピロノラクトンミセルの局所点滴は、通常のグルココルチコイド療法に関連する創傷治癒障害に対抗する可能性があるため、これらの結果を臨床にうまく解釈すると、グルココルチコイド治療患者の治療成績が向上する可能性がある。
【０１１５】
追加のデータは、本開示による新規な製剤の利点を示す：
時間の経過に伴う損傷領域のパーセンテージ
【表７】
2021512943.tif 000010
【０１１６】
ドレイズスケール
【表８】
2021512943.tif 000011
【０１１７】
略語
ＣＡＮ  カンレノン
ＣＡＮＫ  カンレノ酸カリウム
ｄｎ  数加重粒子径
ＤＸＭ  デキサメタゾン
ＧＣ  グルココルチコイド
ＧＲ  グルココルチコイド受容体
ＨＳＤ２  １１ｂ−ヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型
ＩＣ５０  最大阻害濃度の半分
Ｋｄ  平衡時の解離定数
ＭＣ  ミネラルコルチコイド
ＭｅＴ  １７α−メチルテストステロン
ｍＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡ  メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ヘキシル置換ポリ（乳酸）
ＭＲ  ミネラルコルチコイド受容体
ＭＲＡ  ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬
ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤＩ  多分散性指数
ＰＯＮ  パラオキソナーゼ
ＳＤ  標準偏差
ＳＰＬ  スピロノラクトン
ＴＭＳＰＬ  ７α−チオメチルスピロノラクトン
ＵＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ  エレクトロスプレーイオン化質量分析装置に結合した超高性能液体クロマトグラフィー
ＷＨ  創傷治癒
Ｚａｖ  Ｚ平均、強度加重粒子径
【０１１８】
参考資料
【表９−１】
2021512943.tif 000012
【表９−２】
2021512943.tif 000013
【表９−３】
2021512943.tif 000014
【表９−４】
2021512943.tif 000015
【図１】
2021512943.tif 000017
【図２】
2021512943.tif 000018
【図３−１】
2021512943.tif 000019
【図３−２】
2021512943.tif 000020
【図４】
2021512943.tif 000021
【図５】
2021512943.tif 000022
【図６】
2021512943.tif 000023
【図７】
2021512943.tif 000024
【図８】
2021512943.tif 000025
【国際調査報告】
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2021512943.tif 000027
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