(57)【要約】  本発明は、ウイルスおよび細菌の感染症の迅速な鑑別を有効に支援する、ウイルスおよび細菌の感染症を検出および鑑別するための臨床現場アッセイに関する。より詳細には、本発明は、ウイルスマーカーがインターフェロン誘導性Ｍｘ−Ｂタンパク質であり、細菌マーカーがＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩである、ウイルスおよび／または細菌の感染症を迅速に区別する免疫アッセイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．試料適用区画と、
ｂ．Ｍｘ−Ｂ−タンパク質（Ｍｘ−Ｂ）に対して結合親和性を有する第１の検出試薬、およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ／ＰＣＴ）に対する結合親和性を有する第２の検出試薬を有する検出区画と
を含み、対象からの試料中のＭｘ−ＢおよびＣＲＰ／ＰＣＴを検出して、細菌およびウイルスの感染症を識別するように構成されている、臨床現場（ＰＯＣ）アッセイデバイス。
【請求項２】
ＢＰＩに対する結合親和性を有する第３の検出試薬をさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記検出試薬が、合成分子、ヌクレオチド、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、酵素、および抗体から選択される、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記検出試薬が検出可能なマーカーで標識されている、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
検出可能なマーカーが、酵素標識、蛍光標識、放射標識、粒子標識、有色ラテックス粒子、有色プラスチック粒子、有色リン光体粒子、および蛍光粒子から選択される、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
試験結果の観察を可能にするように構成されている試験ウィンドウをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
検出試薬が、検出可能なマーカーと化学的にコンジュゲートして永久的で不可逆的な試薬−マーカー複合体を形成する、請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
検出試薬とコンジュゲートした検出可能なマーカーが、試料がＭｘ−Ｂおよび／またはＣＲＰおよび／またはＰＣＴおよび／またはＢＰＩに対して陽性である場合に使用者の目に見えるように構成されている、請求項１から７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
ヒト血液試料中のＭｘ−Ｂおよび／またはＣＲＰおよび／またはＰＣＴおよび／またはＢＰＩの存在を定性的および／または定量的に測定するように構成されている、請求項１から８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
対象において細菌およびウイルスの感染症を識別するための方法であって、
ａ．前記対象から試料を提供するステップと、
ｂ．請求項１から９のいずれか一項に記載の試験系を提供するステップと、
ｃ．試料を試験系に適用するステップと、
ｄ．検出可能な試薬−マーカー複合体の非存在または存在を観察して、試料がＭｘ−Ｂおよび／またはＣＲＰおよび／またはＰＣＴおよび／またはＢＰＩを含有するかどうかを決定するステップと、
ｅ．患者の感染状態を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
ａ．Ｍｘ−Ｂの存在ならびにＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩの非存在および／または低検出がウイルス感染症を示し、
ｂ．Ｍｘ−Ｂの非存在およびＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩの存在が細菌感染症を示し、
ｃ．Ｍｘ−Ｂの存在およびＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩの存在が混合感染症を示す、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
検出可能な試薬−マーカー複合体の非存在または存在をさらに観察して、試料がＢＰＩを含有するかどうかを決定する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ．Ｍｘ−Ｂの存在ならびにＣＲＰ／ＰＣＴおよびＢＰＩの非存在がウイルス感染症を示し、
ｂ．Ｍｘ−Ｂの非存在ならびにＣＲＰ／ＰＣＴおよびＢＰＩの存在が細菌感染症を示し、
ｃ．Ｍｘ−Ｂの存在ならびにＣＲＰ／ＰＣＴおよびＢＰＩの存在が混合感染症を示す、
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試料が血液試料である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｍｘ−Ｂ、ＣＲＰ／ＰＣＴ、および／またはＢＰＩの存在が裸眼で見える、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、ウイルスおよび細菌の感染症を識別するための臨床現場アッセイ（ＰＯＣ）の分野に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスおよび／または細菌の感染症を迅速に区別する免疫アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]発熱は、家族医療および小児科診療所のどちらにおいても、小児期での緊急医療施設への訪問の一般的な原因である。最も一般的には、これは呼吸器感染症または胃腸炎のどちらかに関する。小児における発熱の高い発生率および不必要な抗生物質の予防的（ｐｒｅｃａｕｔｉｏｕｓ）投与は、ウイルスおよび／または細菌の感染症を示すバイオマーカーの迅速なスクリーニング試験を開発する理由である。
【０００３】
[0003]重篤な市中肺炎は、症例の約６０％において細菌感染症によって引き起こされ、患者の約１０％で集中治療室（ＩＣＵ）への入院を必要とする。残りの４０％は呼吸器ウイルスに関連する。ほとんどの呼吸器感染症は咽頭炎に関連しており、そのうちの４０％がウイルスによって引き起こされ、２５〜５０％がＡ群ベータ型溶血性連鎖球菌によって引き起こされる。後者は急性細気管支炎および肺炎を引き起こす。
【０００４】
[0004]全抗微生物剤の約８０％が一次医療において処方されており、これらのうちの８０％までが気道適用のためのものである。気道感染症は、一次医療における咳嗽の飛び抜けて多い原因である。急性気管支炎を含めた咳嗽には、多くの場合は広域抗生物質が処方され、これらの処方の多くは、患者にとって、あるとしてもわずかな利点しかなく、副作用を引き起こす場合があり、抗生物質耐性を促進する場合がある。医師が抗生物質を与えることを促される要因には、細菌感染症の診断マーカーが十分に存在しないこと、患者の経過観察の欠如に関する懸念、および時間制約が含まれる。
【０００５】
[0005]ウイルス感染症を細菌感染症から素早く鑑別することは、依然として困難である。より最近では、多くの新しい診断マーカーが同定されている。これらのマーカーのうちのいくつかは、ウイルス感染症を細菌感染症から鑑別することにおいて高い見込みを示している。そのようなタンパク質にはＭｘ−ＧＴＰａｓｅおよびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）が含まれる。
【０００６】
[0006]Ｍｘ相同的タンパク質は高分子量ＧＴＰａｓｅのスーパーファミリーのメンバーである。したがって、これらのＧＴＰａｓｅはＩ型アルファ／ベータまたはＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）によってアップレギュレーションされる。Ｍｘ  ＧＴＰａｓｅは、ＩＦＮアルファ／ベータで処理した細胞中で排他的に発現されるが、ＩＦＮガンマで処理した細胞中ではそうではない。Ｉ型インターフェロンは自然免疫応答において重要な役割を果たし、免疫調節、抗増殖、および抗ウイルスの機能を有する。
【０００７】
[0007]本発明者らの研究により、Ｍｘ−相同的ヒトタンパク質は以下の利点を有することが示されている：１）ヒト中のＭｘ−相同的ヒトタンパク質は、ほとんど細胞内で発現される。これらは細胞内染色によってほとんどの細胞区画（ｃｏｍｐａｒｔｉｍｅｎｔ）中で目に見えることができる［１６］。２）Ｍｘ−相同的タンパク質は用量依存的な様式で誘導される［６］。３）Ｍｘ−相同的ヒトタンパク質は、細菌感染症によって、Ｉ型インターフェロンによって特異的に誘導され、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−Ｉ、ＴＮＦ−アルファ、または他のサイトカインのいずれかによっては誘導されない［８，１２］。４）Ｍｘ−相同的ヒトタンパク質は、末梢血系において、Ｉ型インターフェロンと比較してはるかに長い間検出可能である［６］。したがって、これらのタンパク質はウイルス疾患を同定するためのマーカーである［７，１４，１５］。さらに、これらのタンパク質は、Ｉ型インターフェロンを用いて処置した患者においてＩＦＮ処置が成功したかどうかを同定するためのマーカーとして使用することができる［５，９，１０，１１］。初期の研究では、本発明者らは、これらのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスタンブロッティングによって検出した。１２しかし、この手順は２日を超える時間を必要とする。したがって、本発明者らは、これらのタンパク質を２日以内に検出するためのＥＬＩＳＡを確立した［１３］。
【０００８】
[0008]Ｉ型インターフェロンが細菌感染症を有する患者において正常レベル範囲内に保たれるという、これらの事実および仮説に基づいて、末梢血中のＭｘ−相同的タンパク質発現はウイルス感染症の感受性のある特異的マーカーである。同様に、ほとんどのウイルス感染症は、急性期反応の小さな集中状態（ｌｉｔｔｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）、ならびに低いＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度、プロカルシトニン（ＰＣＴ）レベル、および殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）を引き起こすことが報告されている。したがって、これらのタンパク質を、ウイルス起源の疾病を細菌が原因のものから区別するために使用する。ＣＲＰの血漿濃度は刺激後に迅速に増加し、短い半減期で迅速に減少するため、ＣＲＰは、感染症および炎症性疾患の診断およびモニタリングにおける非常に有用なツールとなる場合がある。スカンジナビアでは、臨床現場ＣＲＰ試験は一般診療における呼吸器感染症を有する患者のルーチン評価の一部であり、その使用は対費用効果が高いことが証明されている。一般診療では、ＣＲＰは細菌病の診断ならびに細菌およびウイルスの感染症の部分的鑑別において価値が見出されている。多くの場合、ＣＲＰの診断的価値は赤血球沈降速度（ＥＳＲ）に勝り、白血球数（ＷＢＣ）に勝るまたは同等であることが見出されている。この臨床現場試験の不利点は長い検出時間である。これらの試験は最低３０分間から２時間を必要とする。
【０００９】
[0009]臨床的には、特定の全身性のウイルスおよび細菌の感染症を鑑別することは困難な場合がある。肺炎などの重篤な感染症の場合、または連鎖球菌性咽頭炎の場合など、誤診断の結果が重篤な合併症をもたらす可能性がある場合、通常は細菌培養を行う。多くの場合、培養物は獲得が困難である。残念ながら、結果の受理における著しい時間遅延が原因で、ウイルス培養はルーチン的に行われていない。新しいウイルススクリーニングＰＣＲパネルは有用であるが、それらは高価であり、結果は２４時間後にしか得られないため臨床現場で情報が提供されない。したがって、ウイルスおよび細菌の感染症を短時間で鑑別することができる単純かつ使用が容易な診断試験の必要性が依然として存在する。
【００１０】
[0010]ＷＯ２０１０／０３３９６３号は、ウイルスおよび細菌の感染症を検出および鑑別するための側方流動免疫アッセイを開示している。細菌マーカーはＣＲＰであり、ウイルスマーカーはＭｘ−Ａ−タンパク質である。このアッセイは欧州において商標名ＦｅｂｒｉＤｘ（登録商標）の下で販売されている。しかし、研究によれば、ＦｅｂｒｉＤｘ（登録商標）では、細菌およびウイルスの感染症の同定においてそれぞれ６３％および８４％の精度しかない１７。したがって、患者においてより正確かつ信頼性のある細菌およびウイルスの感染症の識別を行うための、迅速な臨床現場診断アッセイの必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
[0011]本発明の目的は、短時間で患者において信頼性のある細菌およびウイルスの感染症の識別を行うための、改善されたより正確かつ特異的な診断アッセイを提供することである。目的は本発明の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0012]本発明によれば、
ａ．試料適用区画と、
ｂ．Ｍｘ−Ｂ−タンパク質（Ｍｘ−Ｂ）に対して結合親和性を有する第１の検出試薬、およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ／ＰＣＴ）に対する結合親和性を有する第２の検出試薬を有する検出区画と
を含み、対象からの試料中のＭｘ−ＢおよびＣＲＰ／ＰＣＴを検出して、細菌およびウイルスの感染症を識別するように構成されている、臨床現場（ＰＯＣ）免疫アッセイデバイスが提供される。
【００１３】
[0013]本発明のさらなる実施形態によれば、
ａ．試料適用区画と、
ｂ．Ｍｘ−Ｂ−タンパク質（Ｍｘ−Ｂ）に対して結合親和性を有する第１の検出試薬、およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）に対する結合親和性を有する第２の検出試薬、およびプロカルシトニン（ＰＣＴ）に対する結合親和性を有する第３の検出試薬、および／または殺菌性／透過性増加タンパク質ＢＰＩに対する結合親和性を有する第４の検出試薬を有する検出区画と
を含み、対象からの試料中のＭｘ−ＢおよびＣＲＰ／ＰＣＴを検出して、細菌およびウイルスの感染症を識別するように構成されている、臨床現場（ＰＯＣ）免疫アッセイデバイスが提供される。
【００１４】
[0014]本発明の一実施形態は、ＢＰＩに対する結合親和性を有する第３の検出試薬をさらに含む、本明細書に記載のデバイスに関する。
[0015]本発明の一実施形態は、前記検出試薬が、合成分子、ヌクレオチド、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、酵素、および抗体から選択される、本明細書に記載のデバイスに関する。
【００１５】
[0016]本発明の一実施形態は、前記検出試薬が検出可能なマーカーで標識されている、本明細書に記載のデバイスに関する。
[0017]本発明のさらなる実施形態は、検出可能なマーカーが、酵素標識、蛍光標識、放射標識、粒子標識、有色ラテックス粒子、有色プラスチック粒子、有色リン光体粒子、および蛍光粒子から選択される、本明細書に記載のデバイスに関する。
【００１６】
[0018]本発明のさらなる実施形態は、試験結果の観察を可能にするように構成されている試験ウィンドウをさらに含む、本明細書に記載のデバイスに関する。
[0019]本発明のさらなる実施形態は、検出試薬が、検出可能なマーカーと化学的にコンジュゲートして永久的で不可逆的な試薬−マーカー複合体を形成する、本明細書に記載のデバイスに関する。
【００１７】
[0020]本発明のさらなる実施形態は、検出試薬とコンジュゲートした検出可能なマーカーが、試料がＭｘ−Ｂおよび／またはＣＲＰおよび／またはＰＣＴおよび／またはＢＰＩに対して陽性である場合に使用者の目に見えるように構成されている、本明細書に記載のデバイスに関する。
【００１８】
[0021]本発明のさらなる実施形態は、ヒト血液試料中のＭｘ−Ｂおよび／またはＣＲＰおよび／またはＰＣＴおよび／またはＢＰＩの存在を定性的および／または定量的に測定するように構成されている、本明細書に記載のデバイスに関する。
【００１９】
[0022]本発明の一実施形態は、対象において細菌およびウイルスの感染症を識別するための方法であって、
ａ．前記対象から試料を提供するステップと、
ｂ．本明細書に記載の試験系を提供するステップと、
ｃ．試料を試験系に適用するステップと、
ｄ．検出可能な試薬−マーカー複合体の非存在または存在を観察して、試料がＭｘ−Ｂおよび／またはＣＲＰおよび／またはＰＣＴおよび／またはＢＰＩを含有するかどうかを決定するステップと、
ｅ．患者の感染状態を決定するステップと
を含む方法に関する。
【００２０】
[0023]本発明の一実施形態は、
ａ．Ｍｘ−Ｂの存在ならびにＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩの非存在および／または低検出がウイルス感染症を示し、
ｂ．Ｍｘ−Ｂの非存在およびＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩの存在が細菌感染症を示し、
ｃ．Ｍｘ−Ｂの存在およびＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩの存在が混合感染症を示す、
本明細書に記載の方法に関する。
【００２１】
[0024]本発明のさらなる実施形態は、検出可能な試薬−マーカー複合体の非存在または存在をさらに観察して、試料がＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩを含有するかどうかを決定する、本明細書に記載の方法に関する。
【００２２】
[0025]本発明の一実施形態は、
ａ．Ｍｘ−Ｂの存在ならびにＣＲＰ／ＰＣＴおよびＢＰＩの非存在がウイルス感染症を示し、
ｂ．Ｍｘ−Ｂの非存在ならびにＣＲＰ／ＰＣＴおよびＢＰＩの存在が細菌感染症を示し、
ｃ．Ｍｘ−Ｂの存在ならびにＣＲＰ／ＰＣＴおよびＢＰＩの存在が混合感染症を示す、
本明細書に記載の方法に関する。
【００２３】
[0026]本発明のさらなる実施形態は、試料が血液試料である、本明細書に記載の方法に関する。
[0027]本発明のさらなる実施形態は、Ｍｘ−Ｂ、ＣＲＰ／ＰＣＴ、および／またはＢＰＩの存在が裸眼で見える、本明細書に記載の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】[0028]図１Ａは、標識した抗体でコーティングした３枚の試験ストリップからなる、例示的な試験設定（ｓｔｅｔ  ｕｐ）を示す図である。
【図１Ｂ】[0029]図１Ｂは、ウイルス感染症、細菌感染症、混合感染症、または疑わしい感染症の様々な試験図を示す図である。
【図２】[0030]図２は、様々なウイルスおよび細菌の病原体の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
[0031]本発明は、ウイルスおよび細菌の感染症を短時間で鑑別することができる臨床現場アッセイを提供する。具体的には、医師がウイルスおよび細菌の感染症の迅速な鑑別を行うことを有効に支援する、ウイルスおよび細菌の感染症の両方の試験マーカーを含む臨床現場診断デバイスを提供する。臨床現場アッセイは以下の利点を有する。
【００２６】
１）本アッセイは、誤診断、したがって抗生物質の使い過ぎおよび誤用を制限することによって、保健医療の費用を劇的に減らし得る。
２）本アッセイの有効性および保証は、細菌感染症が存在する場合にのみ抗生物質が使用されるため、抗生物質に対する耐性が減ることである。
【００２７】
３）本アッセイは、診療所および薬剤師の診断ポートフォリオを増加させる。
[0032]したがって、本発明は抗生物質の適切な使用に寄与する。これは、必要な場合にのみ抗生物質を使用し、必要な場合は正しく使用することを意味する。
【００２８】
[0033]抗生物質は、風邪、インフルエンザ、ほとんどの咽頭炎、および気管支炎などの、ウイルスによって引き起こされた感染症とは闘わない。多くの副鼻腔感染症および耳感染症でさえも、抗生物質なしで良くなり得る。その代わりに、これらの感染症には症状の緩和が最良の処置の選択肢であり得る。風邪、インフルエンザ、ほとんどの咽頭炎、および気管支炎などのウイルス感染症に抗生物質を摂取することは：
−感染症を治癒しない、
−他人が病気になることを防がない、
−自分または自分の子供の気分が良くなることを助けない、
−不必要かつ有害な副作用を引き起こし得る、
−細菌が抗生物質の効果に抵抗し、害を及ぼし続けることができる抗生物質耐性に寄与し得る。
【００２９】
[0034]不正確に処方された抗生物質は治療上の利点が疑わしく、患者を抗生物質療法の潜在的な合併症に曝す。したがって、臨床現場試験から得られた迅速な結果は正しい診断を可能にし、医療従事者が正しい医薬品を処方する判断を支援する。
【００３０】
[0035]臨床現場アッセイには、ＷＯ２０１６／１１６１８１号に記載のように、様々なデバイス、たとえば、モバイルコンピュータデバイスと交信するように設計されている側方流動免疫アッセイデバイスまたは光学センサーシステムが適用され得る。
【００３１】
[0036]したがって、本発明の一実施形態によれば、感染症が細菌またはウイルスであるかを決定するために、試料分析デバイス、たとえば試験ストリップを使用する。試験ストリップは試料適用区画と検出区画とを含む。この方法では、試料を採取し、試験ストリップに移す。検出区画は、細菌マーカーに特異的な少なくとも１つの試薬およびウイルスマーカーに特異的な少なくとも１つの試薬を含む。
【００３２】
[0037]一実施形態では、ウイルス感染症のマーカーはＭｘ−Ｂであり、細菌感染症のマーカーはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）である。高いＭｘ−Ｂタンパク質レベルが全身性ウイルス感染症と強く相関している。インターフェロン誘導性ミクソウイルス（Ｍｘ）タンパク質は、広範囲のウイルス感染症と闘うことにおいて重要な役割を果たす。Ｍｘ−相同的タンパク質はＲＮＡおよびＤＮＡウイルスを阻害する。
【００３３】
[0038]Ｍｘ−Ｂ−タンパク質がウイルスの構成成分を細胞から運び出す重要なタンパク質であることが、最近判明した［２］。たとえば、ＨＩＶタンパク質は、Ｍｘ−Ａ−タンパク質ではなく、Ｍｘ−Ｂタンパク質によって輸送および排除される［１］。したがって、この臨床現場アッセイではＭｘ−Ｂ−タンパク質を使用し、それは、これがＭｘ−Ａタンパク質と６３％の相同性しか有しておらず、したがってＭｘ  ＧＴＰａｓｅファミリー内の機能的Ｍｘ−タンパク質であるためである［３］。Ｍｘ−Ｂは、組み込まれたウイルスＤＮＡのレベルを減らすことによってウイルス感染症を強く阻害することが示された。さらに、Ｍｘ−Ｂタンパク質は核および細胞質内に位置する。対照的に、Ｍｘ−Ａタンパク質は細胞質内にのみ位置する［４］。この新しい発見に基づいて、Ｍｘ−Ｂがウイルス感染症の信頼性のあるマーカーとして本発明者らによって選択される。
【００３４】
[0039]感染症に応答して肝臓によって生成される急性期タンパク質であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、細菌感染症の信頼性のあるバイオマーカーである。健康な個体におけるＣＲＰレベルは０．５ｍｇ／Ｌ未満であるとみなされており、ＣＲＰレベルは感染状態では上昇する。
【００３５】
[0040]プロカルシトニン（ＰＣＴ）は１１６個のアミノ酸を有するポリペプチドホルモンである。このタンパク質は、ほとんどが甲状腺のＣ細胞によって生成される。通常は、血中には非常に限定されたレベルのＰＣＴしか存在しない。対照的に、細菌感染中では、このタンパク質が発現され、０．５ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌであることが判明する。このタンパク質の利点は、ＣＲＰは一番早くて１２〜１６時間の時点で検出されるのに対して、これは感染の６時間後に検出されるということである。
【００３６】
[0041]本発明の一実施形態によれば、本発明は、患者試料中のＭｘ−Ｂおよび／またはＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩを同定するための迅速なスクリーニング試験に関する。試料は、たとえば、末梢血試料、上咽頭吸引液、涙、脊髄液、および中耳吸引液であり得る。
【００３７】
[0042]殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）は、好中球、ならびにその抗菌機能および内毒素を中和して処分する機能によって、グラム陰性細菌およびその内毒素に対する宿主の防御において中心的な役割を果たす可能性が高い組織に位置する、多能性タンパク質である。ＢＰＩは、試験の信頼度および精度を改善させるための、改善された臨床現場試験の追加の生物学的マーカーであるとみなされる。細菌感染中にこのタンパク質は発現され、１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌであることが見出されている。
【００３８】
[0043]したがって、本発明のさらなる実施形態は、患者試料中のＭｘ−Ｂ、ＢＰＩ、および／またはＣＲＰ／ＰＣＴを同定するための臨床現場試験に関する。
[0044]本発明の一実施形態によれば、検出区画は、試料中に存在するマーカーがそのそれぞれの試薬と接触した際に、標識された複合体が形成されるように、ウイルスマーカーＭｘ−Ｂに対する結合親和性を有する少なくとも１つの試薬と、細菌マーカーＣＲＰ／ＰＣＴに対する結合親和性を有する少なくとも１つの試薬と、任意選択で、ＢＰＩに対する結合親和性を有する少なくとも１つの試薬を含む。検出区画は、第１の標識された複合体と結合する細菌マーカー結合パートナーと、第２の標識された複合体と結合するウイルスマーカー結合パートナーとを含む。その後、試料をウイルスマーカーおよび／または細菌マーカーの存在について分析する。
【００３９】
[0045]検出区画は、それぞれのマーカーと特異的に結合する様々な受容体分子を固定することによって機能させ得る。受容体分子は、天然由来、たとえば、抗体、抗体断片などから選択され得る。受容体分子は、合成により生成した分子、たとえばアプタマーであり得る。検出区画は、少なくとも１つのセンサー領域を含み、その上には、そのそれぞれのマーカーを感知するための受容体として、検出するそれぞれのマーカーと特異的に結合する抗体またはアプタマーなどの他の特異性授与受容体が配置されている。したがって、センサー領域表面の、有効で、適用が容易な機能化が達成される。
【００４０】
[0046]抗体またはたとえばアプタマーなどの他の特異性授与受容体は、特定の分析物の検出において高い選択性を有する。したがって、これらは特定の疾患マーカーの認識に特に適している。可能な受容体に関連して、センサー表面上に配置された抗体またはアプタマーなどの他の特異性授与受容体は、たとえば、検出する分析物と結合し、その過程で、特性の変化をもたらす。一部の実施形態では、より安定しており、したがって永久に機能的であるという点で、アプタマーが有利である。
【００４１】
[0047]アプタマーは抗体と同様の応用を共有するため、抗体を活用する数々の検出方法を、アプタマーに基づく方法へと発展させることができる。たとえば、小分子用のほとんどの免疫アッセイは、表面結合抗体を溶液中の分析物によって置き換えることに依存する競合的アッセイである。
【００４２】
[0048]本発明のデバイスの一実施形態は試料適用区画を含む。
[0049]本発明のさらなる実施形態は、試薬区画をさらに含むデバイスに関する。試薬区画は、試料中に存在するウイルスマーカーが前記試薬と接触した際、標識されたウイルス試薬複合体が形成されるように、ウイルス細菌マーカーに特異的な少なくとも１つの試薬を含む。さらに、試薬区画は、試料中に存在する細菌マーカーが前記試薬と接触した際、標識された細菌試薬複合体が生じるように、細菌マーカーに特異的な少なくとも１つの試薬を含む。本発明の一実施形態では、試薬区画は、試料中に存在する前記細菌マーカーが前記試薬と接触した際、標識された複合体が形成されるように、細菌マーカーＣＲＰ／ＰＣＴに特異的な１つの試薬と細菌マーカーＢＰＩに特異的な１つの試薬とを含む。
【００４３】
[0050]デバイス上の検出区画は、標識されたウイルス試薬複合体と結合するウイルスマーカー結合パートナーと、標識された細菌試薬複合体と結合する細菌マーカー結合パートナーを含む。このデバイスはクロマトグラフィー試験ストリップであり得る。
【００４４】
[0051]好ましい実施形態では、ウイルスマーカーまたは細菌マーカーの存在は、裸眼で見える試験ラインによって示される。ウイルスマーカーの存在は第１の試験ラインによって示される場合がある一方で、細菌マーカーの存在は第２および／または第３の試験ラインによって示される。一部の実施形態では、第１の試験ラインは陽性の際に第１の色を表示し、第２の試験ラインは陽性の際に第１の色とは異なる第２の色を表示し、および／または、第３の試験ラインは陽性の際に第１および第２の色とは異なる第３の色を表示する。第１、第２、および第３の試験ラインが試料分析デバイス上の同じ空間内に位置する実施形態では、第１、第２、および／または第３の試験ラインが陽性の際に異なる色が形成されることが有利である。
【００４５】
[0052]一実施形態では、２つまたは３つの試験ラインはデバイス上で互いに空間的に分離されている。そのような実施形態では、試験ラインが陽性の際に色が同じであってもよい。
【００４６】
[0053]本発明の一実施形態では、分析する試料を担体に適用する。担体は、単一のクロマトグラフィー材料から作られるか、または、好ましくは、同じもしくは異なる材料から作られ、担体の裏材上に固定された、いくつかの毛管活性材料であり得る。これらの材料は、毛細力によって駆動された液体がそれに沿って、適用区画から、試薬区画を通って、１つまたは複数の検出区画に向かって流れる、輸送経路を形成するように、互いに密に接触している。
【００４７】
[0054]好ましくは、試料は、担体の適用区画を試料内に浸すことによって、担体に直接適用する。あるいは、試料の担体への適用は、それから試料を担体の適用区画に、任意選択で湿らせた後に移すことができる、乾いたまたは濡らした拭き取り要素で試料を採取することによって、実施し得る。通常は、拭き取り要素は無菌的であり、乾いているか、または採取ステップの前に流体で前処理し得る。本発明による拭き取り要素に適した材料は、合成材料、織物、または繊維ウェブを含み得る。
【００４８】
[0055]検出方法の種類に応じて、様々な試薬が、適用区画と検出区画の間に位置する試薬区画中に存在する。サンドイッチ免疫アッセイでは、検出するウイルスおよび細菌マーカーに特異的な、標識した固定されていない試薬を試薬区画中に有することが好ましい。したがって、試料中に存在するウイルスまたは細菌マーカーが、試薬区画中に存在する対応する標識されたウイルスまたは細菌試薬と接触した際、マーカーと対応する標識された試薬との間で標識された複合体が形成される。立ち代って、標識された複合体は、検出区画中の固定されたウイルスまたは細菌マーカー結合パートナーとさらに複合体を形成することができる。競合的免疫アッセイでは、試薬区画は、好ましくは、検出区画中の固定されたマーカー結合パートナーのマーカーと競合する、標識した固定されていないマーカー類似体を含有する。試薬区画中および検出区画中のマーカー結合パートナーは、好ましくは、モノクローナル、ポリクローナル、もしくは組換え抗体、または対応するマーカーとの特異的結合が可能な抗体の断片である。
【００４９】
[0056]マーカーの検出は検出区画で達成され得る。固定された分子は、検出区画中で免疫反応または他の反応によって、標識された複合体または標識されたマーカー類似体と結合し、したがって、その過程中に検出区画内に目に見える試験ラインが蓄積される。好ましくは、標識は光学的に検出可能な標識である。検出区画で複合体を形成することで、標識が固定され、試験ラインが裸眼で見えるようになり、陽性の試験結果が示される。直接標識、たとえば、特に裸眼によって最も良好に認識されることができる金標識が適切である。さらに、電気的読出しデバイス（たとえば、測光、聴覚、インピーダンス測定、電位差測定、および／または電流測定変換器に基づいたもの）を使用して、より詳細な結果および分析物の半定量を得ることができる。他の適切な標識は、ラテックス、フルオロフォア、またはホスホロフォアであり得る。
【００５０】
[0057]一実施形態では、少量の蛍光色素または蛍光ラテックスビーズコンジュゲートを最初のコンジュゲート材料に加えることによって、視覚的に読み取った側方流動免疫アッセイ試験の感度を増強させる。可視スペクトルの試験ラインが目に見えて存在する場合、試験結果を観察し、記録する。
【００５１】
[0058]本発明の一実施形態では、試薬は、ウイルスマーカーの存在に対応する目に見える試験ラインが、細菌マーカーの存在に対応する試験ラインとは別個であるように構成されている。したがって、簡単に検出区画中の試験ラインの発色の位置によって、試料が細菌マーカーを含有していたかウイルスマーカーを含有していたか（または両方）を容易に決定することができる。別の好ましい実施形態では、異なる色の試験ラインが発色されるように試薬を選択し得る。すなわち、ウイルスマーカーの存在は、細菌マーカーの存在によって発色されるものとは異なる色のラインの発色を引き起こす。たとえば、ウイルスマーカーを認識する試薬に対応する標識は赤であってよい一方で、細菌マーカーを認識する試薬に対応する標識は緑色であってよい。固定されていない試薬に付着させ得る異なる色の標識は周知である。一部の例には、それだけには限定されないが、コロイド金、コロイドセレン、コロイド炭素、ラテックスビーズ、常磁性ビーズ、蛍光および化学発光剤、ならびにその混合物が含まれる。
【００５２】
[0059]図１は、ウイルスマーカーの存在に対応する試験ライン、第１の細菌マーカーの存在を検出する第２の別の試験ライン、および第２の細菌マーカーの存在を検出する第３の別の試験ラインを有する、クロマトグラフィー試験ストリップを示す。試料を試験ストリップの適用区画に適用する。図１に示すように、試料はその後、少なくとも１つの標識されたウイルス結合パートナーおよび少なくとも１つの標識された細菌結合パートナーを含有する試薬区画を通過する。標識されたウイルス結合パートナーは、目的のウイルスマーカーと特異的に結合してコンジュゲートを形成することができ、立ち代ってこれは、検出区画中の別の特異的な試薬または結合パートナーと特異的に結合することができる。標識された細菌結合パートナーは、目的の細菌マーカーと特異的に結合してコンジュゲートを形成することができ、立ち代ってこれは、検出区画中の別の特異的な試薬または結合パートナーと特異的に結合することができる。
【００５３】
[0060]また、試験ストリップは、ウイルスマーカーとその標識された結合パートナーとによって形成されたウイルス試薬複合体に相補的な固定された特異的結合パートナーを含めた、ウイルスマーカーを検出するための少なくとも１つの第１の区域、たとえば試験ラインを含有する検出区画も含む。したがって、試験ラインでは、検出区画結合パートナーは、試薬区画からの標識されたウイルス結合パートナーを、その結合したウイルスマーカーと共に捕捉する。このウイルスマーカーおよびその標識された結合パートナーの局在化は、試験ラインでの表示を生じさせる。試験ラインでは、ウイルスマーカーの存在は、標識された結合パートナーの蓄積から生じる、試験ラインの表示の定性的および／または定量的な読み出しによって決定される。
【００５４】
[0061]また、検出区画は、細菌マーカーとその標識された結合パートナーとによって形成された細菌試薬複合体に相補的な固定された特異的結合パートナーを含めた、少なくとも１つの細菌マーカーを検出するための少なくとも１つの区域、たとえば試験ラインも含む。したがって、試験ラインでは、検出区画結合パートナーは、試薬区画からの標識された細菌結合パートナーを、その結合した細菌マーカーと共に捕捉する。この細菌マーカーおよびその標識された結合パートナーの局在化は、試験ラインでの表示を生じさせる。試験ラインでは、細菌マーカーの存在は、標識された結合パートナーの蓄積から生じる、試験ラインの表示の定性的および／または定量的な読み出しによって決定される。
【００５５】
[0062]本発明の一実施形態では、検出区画は、第２の細菌マーカーを検出するためのさらなる試験ラインを含み得る。
[0063]ウイルスおよび細菌の感染症を区別するための臨床現場試験の一例を図１に示す。上述のように、Ｍｘ−Ｂはウイルス感染症の診断マーカーである一方で、ＣＲＰおよびＢＰＩは細菌感染症の診断マーカーである。Ｍｘ−Ｂタンパク質の陽性結果ならびにＣＲＰ／ＰＣＴおよびＢＰＩタンパク質の陰性結果はウイルス感染症を示す。ＣＲＰ／ＰＣＴおよびＢＰＩの陽性結果ならびにＭｘ−Ｂタンパク質の陰性結果は細菌感染症を示す。Ｍｘ−Ｂ、ＣＲＰ／ＰＣＴ、およびＢＰＩの弱い陽性結果は、細菌およびウイルスの両方の感染症（同時感染症）を示す。Ｍｘ−Ｂ、ＣＲＰ／ＰＣＴ、およびＢＰＩの陰性結果では、細菌またはウイルスの感染症なしが示される。特定の色のラインを本実施例中で記載するが、ウイルスまたは細菌のマーカーを示すために、他の色、または試験ストリップ上の異なる位置での同じ色が、本発明の精神内にある。
【００５６】
[0064]異なる色のラインの発色を利用する場合、ラインは空間によって分離されていても、分離されていなくてもよい。後者の場合では、両方のマーカーが存在する場合に観られる色が、個々のマーカーが存在する場合に見られる色とは異なるように、標識を選択する。たとえば、ウイルスマーカーの存在は赤色のラインによって、細菌マーカーの存在は青色のラインによって、ならびに両方の存在は紫色のライン（赤色と青色の混合）によって示され得る。
【００５７】
[0065]別の実施形態では、試験ストリップは、試験ストリップの機能性を示す対照区域も含み得る。存在する場合は、対照区域は、デバイスが作動したというシグナルを使用者に伝えるように設計することができる。たとえば、対照区域は、試薬区画からの標識された試薬と結合する試薬（たとえば抗体）を含有し得る。さらなる代替方法として、対照区域は、過剰量の試薬区画からの標識された試薬と反応する、固定されたウイルスおよび細菌マーカーを含有することができる。対照区域は検出区画から上流または下流に位置し得る。陽性の対照指標は、試料が試験デバイスを通って必要な距離を浸透したことを使用者に伝える。
【００５８】
[0066]また、Ｍｘ相同体が、発熱に関連する細菌感染症の約１０％でも検出される場合がある。試験の信頼度を増強させるために、Ｍｘ−Ｂタンパク質のカットオフを、０．０１〜０．０５Ｕ／１０，０００個の白血球、好ましくは０．０２５Ｕ／１０，０００個の白血球の範囲内に設定する。ＣＲＰでは、カットオフを、５〜１００ｍｇ／Ｌの範囲、または２５〜７５ｍｇ／Ｌの範囲、または４０ｍｇ／Ｌに設定する。ＰＣＴでは、カットオフを０．５ｎｇ／ｍｌから＞２ｎｇ／ｍｌの範囲内に設定する。ＢＰＩでは、カットオフを１μｇ／ｍｌから＞１０μｇ／ｍｌの範囲内に設定する。
【実施例】
【００５９】
[0067]以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載するものであり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定することを意図しない、かつそう解釈されるべきでない。実施例には慣用方法の詳細な説明は含まれない。そのような方法は当業者に周知である。
【００６０】
実施例１
アッセイの説明
[0068]側方流動デバイスを用いて臨床現場アッセイを行う。それぞれのアッセイに必要な適切な試薬は、カートリッジ内に既に含められている。
ステップＡ：接着力によって、１滴の血液（約０．００５ｍｌ〜０．０１０ｍｌ）をカートリッジから（ｖｏｎ）デバイス内へと移す。
ステップＢ：最初に、血液滴中の細胞を、（２０％のＮＰ−４０、１００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐｈ７．２、０．０５のアジ化ナトリウム）からなる約０．００１ｍｌの溶解緩衝液で溶解する。
ステップＣ：溶解された血液を２つの試験ストリップの上に向け、したがってインキュベートする。
ステップＤ：Ｍｘ−Ｂに対する抗体溶液１が血液中の可能な利用できるＭｘ−Ｂタンパク質と結合する。この抗体は標識されたマーカーと既にコンジュゲートしている。
ステップＤ：結合したＭｘ−Ｂタンパク質を、Ｍｘ−Ｂに対する第２の抗体が位置する第２の担体溶液上に向ける。第１の標識された抗体と既に結合したＭｘ−Ｂタンパク質のみが第２の抗体と結合する。
ステップＥ：担体溶液をすすいだ後、第１の標識および結合した抗体が、ストリップ上の呈色反応の形態で目に見えるようになる。
ステップＦ：ＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩの検出をステップＡからステップＥに記載のように行うが、ただし、ＣＲＰ／ＰＣＴに対する１つの抗体およびＢＰＩに対する１つの抗体を第２の試験ストリップ上で使用する。
【００６１】
実施例２
試験手順
[0069]２台の異なる救急車で、未知の起源の患者を、全血から、Ｍｘ−Ａタンパク質、Ｍｘ−Ｂタンパク質、ＣＲＰ／ＰＣＴ、およびＢＰＩについて試験した。すべての患者は、そのデータは研究目的のみであるというヘルシンキ協定下の同意宣言に署名した。１１３／５０００。続いて、既往歴を調査の過程で継続し、感染症の起源を決定した。したがって、１２０件のウイルス感染症および５０件の細菌感染症を区別することができた。この調査の結果を図２に記述する。Ｍｘ−Ｂタンパク質の助けにより、ウイルス感染症の９２％が検出された。対照的に、Ｍｘ−Ａタンパク質を使用しては、同一のウイルス疾患の７７％しか検出されなかった。決定タンパク質ＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩの助けにより、細菌病の検出の範囲は９０％にまで増加した。ＣＲＰおよびＰＣＴタンパク質のみを測定した場合は、細菌病の８０％しか検出されなかったであろう。したがって、ウイルス疾患のＭｘ−Ｂタンパク質および細菌病のＣＲＰ／ＰＣＴ／ＢＰＩのマーカーの組合せは、９０％を超える感度または特異性の検出をもたらす。
【００６２】
実施例３
結果
[0070]ウイルス感染症からの結果の説明：呈色反応が機能していることを証明するために、左側の両方の試験ストリップは対照である。上の中央のストリップは有色となり、下のストリップは無色のままである。右側の両方のストリップは無色のままである。
【００６３】
[0071]細菌感染症からの結果の説明：中央の両方のストリップは無色のままであり、右側の上のストリップも無色のままであるが、下は有色となる。
[0072]混合感染症からの結果の説明：上の中央のストリップおよび下のストリップも有色となる。
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【図１Ａ】
2021504723.tif 000002
【図１Ｂ】
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【図２】
2021504723.tif 000004
【国際調査報告】
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