(57)【要約】  本発明は、アルファ−シヌクレインおよびＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する二重特異抗体、および前記二重特異抗体を用いてアルファ−シヌクレインまたはその凝集体に関連する疾病であるシヌクレイン病の予防、治療および／または診断用途として使用し、ａ−ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片を血液脳関門を通過できるようにして脳でその作用を発揮することができるようにし、半減期を延長して薬効を長期間維持することができるようにする。
2021506770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片；および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を含む、抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒの二重特異抗体であって、
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号１〜配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１０〜配列番号４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５０〜配列番号８０のアミノ酸配列のうちの一つを重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号９６〜配列番号１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１４〜配列番号１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１３３〜配列番号１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含むものである、二重特異抗体。
【請求項２】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトアルファ−シヌクレインタンパク質のＣ−末端領域に特異的に結合するものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項３】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１２６のアミノ酸配列で、Ｎ−末端から１１０番残基〜１２０番残基を含む連続する少なくとも１１個のアミノ酸を含むペプチド、または１１１番残基〜１２２番残基を含む連続する少なくとも１２個のアミノ酸を含むペプチドに特異的に結合するものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項４】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１および配列番号６のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２〜４および配列番号７〜８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、配列番号５および配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）、配列番号１０および配列番号１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１および配列番号１４のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および
配列番号１２および配列番号１５のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含むものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項５】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２〜４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および
配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項６】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号７〜８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および
配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項７】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の重鎖可変領域は、
配列番号１６〜１７および配列番号３５〜４０のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号１８〜１９および配列番号４１〜４４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号２０〜３１および配列番号４５〜５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号３２〜３４および配列番号５１〜５２のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項８】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号５３〜５８および配列番号７１〜７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号５９〜６１および配列番号７８〜８１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号６２〜６７および配列番号８２〜８８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号６８〜７０および配列番号８９のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項９】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の重鎖可変領域は、
配列番号１６〜のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号１８〜１９のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号２０〜３１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号３２〜３４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものであり、
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号５３〜５８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号５９〜６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号６２〜６７のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号６８〜７０のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものである、請求項５に記載の二重特異抗体。
【請求項１０】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の重鎖可変領域は、
配列番号３５〜４０のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号４１〜４４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号４５〜５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号５１〜５２のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものであり、
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号７１〜７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号７８〜８１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号８２〜８８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号８９のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものである、請求項６に記載の二重特異抗体。
【請求項１１】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の重鎖可変領域は、
配列番号９０〜１０１または配列番号１０２〜１０８から選択されるアミノ酸配列；
配列番号９０〜１０１または配列番号１０２〜１０８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する配列；または
配列番号９０〜１０１または配列番号１０２〜１０８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１２】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号１０９〜１１５または配列番号１１６〜１２３から選択されるアミノ酸配列；
配列番号１０９〜１１５または配列番号１１６〜１２３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上；または
配列番号１０９〜１１５または配列番号１１６〜１２３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１３】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９０〜１０１のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号１０９〜１１５のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１４】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０２〜１０８のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号１１６〜１２３のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１５】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１２７重鎖可変領域と配列番号１２８の軽鎖可変領域を含み、配列番号１２９の重鎖可変領域と配列番号１３０の軽鎖可変領域を含み、配列番号１３１の重鎖可変領域と配列番号１３２の軽鎖可変領域を含み、配列番号１３３の重鎖可変領域と配列番号１３４の軽鎖可変領域を含み、配列番号１３５の重鎖可変領域と配列番号１３６の軽鎖可変領域を含み、または配列番号１３７の重鎖可変領域と配列番号１３８の軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１６】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１０〜配列番号４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５０〜配列番号８０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域と、
配列番号９６〜配列番号１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１４〜配列番号１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１３３〜配列番号１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項１７】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むタンパク質でＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、Ｇｌｕ７７９、Ｌ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、Ｌ８１３、Ｖ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０、およびＣ４８８からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸を特異的に認識して結合するものである、請求項１６に記載の二重特異抗体
【請求項１８】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むタンパク質で結合部位１〜結合部位３からなる群より選択された少なくとも一つ以上の結合部位に結合するものであり、前記結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、およびＧｌｕ７７９からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、およびＬ８１３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０、およびＣ４８８からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含むものである、請求項１７に記載の二重特異抗体。
【請求項１９】
前記重鎖可変領域は、
配列番号８１〜８４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号８５〜８６のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号８７〜９１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号９２〜９５のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものである、請求項１７に記載の二重特異抗体。
【請求項２０】
前記軽鎖可変領域は、
配列番号１６２〜１６４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号１６５のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号１６６〜１６８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号１６９〜１７１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものである、請求項１７に記載の二重特異抗体。
【請求項２１】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１６に記載の二重特異抗体。
【請求項２２】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体は完全な抗体であり、抗ＩＧＦＲ抗体は抗体のＦｖ−断片である、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項２３】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体は、完全な抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４形態である、請求項１に記載の二重特異抗体
【請求項２４】
抗ＩＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項２５】
請求項１〜２４のうちのいずれか一項による二重特異抗体を含む、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの予防または治療用薬学組成物。
【請求項２６】
前記α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２４のうちのいずれか一項による二重特異抗体を提供する段階、および前記二重抗体を含む、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの予防または治療用薬学組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２４のうちのいずれか一項による二重特異抗体を薬学的に有効な量でα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療および／またはα−ｓｙｎ凝集体の濃度調節が必要な対象体に投与する段階を含む、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療方法。
【請求項２９】
請求項１〜２４のうちのいずれか一項による二重特異抗体を薬学的に有効な量でα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療および／またはα−ｓｙｎ凝集体の濃度調節が必要な対象体に投与する段階を含む、α−ｓｙｎ凝集体の形成阻害またはα−ｓｙｎ凝集体の濃度を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファ−シヌクレインおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体、前記二重特異抗体を含むシヌクレイン病（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の予防および／または治療用薬学的組成物、および前記二重特異抗体を含むアルファ−シヌクレイン凝集体検出またはシヌクレイン病診断のための情報を提供する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルファ−シヌクレイン（α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、α−ｓｙｎ）は、ニューロンの前シナプス末端で主に発現し、正常状態では自然に折り畳まれていない状態の単量体として存在する。アルファ−シヌクレインは、随意および不随意運動の開始と停止を制御する重要な一種の神経伝達物質であるドーパミンの放出を規制することを助ける。特に、アルファ−シヌクレインの機能はシナプス活動の増加および年を取るにつれて重要であり、神経退化の重要な因子である。
【０００３】
しかし、病的な状態でアルファ−シヌクレインは、液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）、リン脂質二重膜または脂質膜などとの結合および相互作用により構造的変化を起こして折りたたまれた、またはフォールディングされたα−ヘリカル形態の２次構造を形成して、二量体（ｄｉｍｅｒ）、オリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）および／または線維状形態の分子を含む凝集体を形成するようになる。
【０００４】
このようなアルファ−シヌクレイン凝集体は、細胞に毒性を誘発することが知られており、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、その他多様な疾患の神経細胞内で発見される異常なタンパク質凝集体であるレビー小体の主成分である。また、アルファ−シヌクレインのリン酸化、またはユビキチン化のような翻訳後修飾も、アルファ−シヌクレインの凝集および神経毒性と関連があることが知られている。アルファ−シヌクレインは、動物実験および細胞実験でもドーパミン神経細胞を死滅させて炎症反応を誘発し、実験動物でパーキンソン病症と類似の運動症状を誘発することが知られている。また、アルファ−シヌクレイン凝集は、パーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、多系統萎縮症およびその他多数の神経軸索疾患を含むシヌクレイン病（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）と呼ばれる一群の神経退行性疾患の病因と関連があることが知られている。
【０００５】
アルファ−シヌクレインに対する抗体またはそのような抗体を誘導するためのアルファ−シヌクレインの切片は、シヌクレイン病に対する免疫療法の方法として提案されてきた。しかし、抗体の脳浸透は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって制限されることがある。
【０００６】
また、高度−特異性のＢＢＢ輸送体の欠乏は、脳腫瘍および神経変性疾患を含む脳から起こる疾患のための新たな治療剤および診断剤の開発を遅延させている。ＢＢＢの生理学および恒常性を崩壊させないながら、脳に薬学的に効能のある投与量で治療剤および診断剤分子を伝達するための方法に対する必要性が明らかに存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一例は、アルファ−シヌクレイン（ａ−Ｓｙｎ）に対する抗原結合部位およびＩＧＦ１Ｒに対する抗原結合部位を含むタンパク質複合体または前記タンパク質複合体の製造方法を提供する。
【０００８】
他の例は、前記タンパク質複合体をコーディングするポリヌクレオチド、これを含む組換えベクター、およびこれを含む組換え細胞を提供する。
【０００９】
また他の例は、前記タンパク質複合体から得られるａ−ＳｙｎおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその製造方法を提供する。
【００１０】
また他の例は、前記ａ−ＳｙｎおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤を含む、アルファ−シヌクレイン病（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の予防および／または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１１】
本発明による抗体または抗原結合断片を用いたアルファ−シヌクレイン病の診断、治療または予防に使用される薬物を脳に伝達する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の一例は、アルファ−シヌクレイン（ａ−Ｓｙｎ）に対する抗原結合部位およびＩＧＦ１Ｒに対する抗原結合部位を含むタンパク質複合体および前記タンパク質複合体から得られるアルファ−シヌクレイン（ａ−Ｓｙｎ）およびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体（以下、抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体）に関するものである。よって、本発明による二重特異抗体は、アルファ−シヌクレインとＩＧＦ１Ｒを全て抗原として認識および結合することができる。
【００１３】
本発明による抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片を含み、アルファ−シヌクレインを特異的に認識して結合することができ、特にアルファ−シヌクレインのＣ−末端部位に結合でき、アルファ−シヌクレインまたはその凝集体に関連する疾病であるシヌクレイン病の予防、治療および／または診断用途として使用できる。
【００１４】
本発明によれば、用語“シヌクレイン病”は、病理学的シヌクレイン凝集体を特徴とする全ての神経退行性障害を含む。パーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、レビー小体病、レビー小体を伴う認知症、認知症を伴うパーキンソン症候群、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、多発性神経系萎縮および脳鉄沈着を伴う神経変性Ｉ型（ＮＢＩＡ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）を含むいくつかの神経退行性障害は、シヌクレイン病として集合的にグループ化される。また、アルファ−シヌクレイン凝集は、二次的にアルツハイマー疾患でも発見される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４、６：７３）。
【００１５】
シヌクレイン病は、共通的な病理学的特性を共有する神経退行性障害の多様なグループである：神経病理的実験で、特有の病変は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）および希小突起神経膠（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）の選択された集団内でアルファ−シヌクレインタンパク質の異常な凝集を含んで感知されることがある。アルファ−シヌクレイン（最初にＰＡＲＫｌおよびＰＡＲＫ４と判明する）は、新皮質、海馬、歯状回、嗅球、線条体、視床および小脳で広範囲に発現する１４０個アミノ酸のタンパク質である。アルファ−シヌクレインはまた、Ｂ−、Ｔ−、およびＮＫ細胞をはじめとして蛋白球および血小板を含む造血細胞で高く発現する。このような細胞内での正確な役割は知られていないが、巨核球（血小板前駆体）の分化と関連があった。
【００１６】
本願において、“アルファ−シヌクレイン凝集体に関連する疾患”は、シヌクレイン病と呼ばれる一群の神経退行性疾患であって、ニューロンおよび膠細胞（ｇｌｉａ）集団を含む病巣でアルファ−シヌクレイン凝集体が発見され、ドーパミン性システムの退化、運動能力変化、認知障害およびレビー小体および／またはレビーニューライトの形成のような特徴を有する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４、６：７３；ＭｃＫｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４）。このような疾患には、パーキンソン疾患、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、アルツハイマーレビー小体疾患、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病、多系統萎縮症およびその他の多数の神経軸索疾患を含むが、これに制限されるのではない。一実施形態において、本願による抗体は、パーキンソン病の治療に効果的に使用される。
【００１７】
また、本発明による抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を含み、抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片を血液脳関門を通過するようにして脳でその作用を発揮することができるようにし、半減期を延長して薬効を長期間維持することができるようにする。
【００１８】
さらに、本発明による抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに結合するが、リガンドの結合に影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達経路には影響を与えない特性を有し、よって、ＩＧＦ１Ｒとそのリガンド結合およびＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制しないので、血液脳関門を通過するシャトル手段として使用できる。
【００１９】
特に本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識し、ＩＧＦ１Ｒ、特にヒトＩＧＦ１Ｒ、マウスＩＧＦ１Ｒ、ラットＩＧＦ１Ｒ、およびサルＩＧＦ１Ｒに認識および結合し、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を阻害せず、トランスサイトーシスに使用できて血液脳関門通過能を有し、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有しないため、動物に反復投与した場合にも脳のＩＧＦ１Ｒ水準を減少させなくて、毒性を有しない。
【００２０】
特に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＢＢＢを構成する脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の表面に存在するＩＧＦ１Ｒに結合して細胞内部にＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが行われる。例えば、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株（例えば、ＭＣＦ−７など）を用いて本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされるかを確認することができる。本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体、例えば１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１、そして１５６４のａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔであるＣ０４、Ｆ０６、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２、ＶＨ３５は陰性対照群に比べて高いｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示した。当該結果は、試験した抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ程度は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに特異的でるのを示唆する。また、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体はｓｃＦｖ形態であって、多様な方式で治療用抗体に結合して製作できる。例えば、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖは治療用抗体、例えばα−ｓｙｎ抗体のＣ−末端に二つが結合した二重特異抗体、即ち、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態二重抗体あるいは当該抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｓｃＦｖ形態）が治療用抗体のＣ−末端に一つが結合した二重特異抗体、即ち、１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態二重特異抗体として製作でき、当該二重特異抗体は全てＩＧＦ１Ｒを発現する細胞中にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされる。ＩＧＦ１Ｒ抗体は細胞表面の抗原に対する高い結合力がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ効果を高め、これはＢＢＢ通過能につながる。但し、当該抗体がＢＢＢ通過能を有しながらＩＧＦ１Ｒのシグナリングに干渉を与える場合、副作用を引き起こすことがあるので、ＢＢＢ  ｓｈｕｔｔｌｅとしての機能を果たすことができる結合力を有しながら、同時にＩＧＦ１Ｒシグナルに対するｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体であることが特徴である。
【００２１】
前記抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、優れた開発容易性を有する。これに関連して、前記抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＣＤＲ領域に発生して抗体の安定性と効能を減少させるｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、例えば、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎを除去しようとした。ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生するアミノ酸の置換で、抗原であるＩＧＦ１ＲのＥＣＤに対する結合力に変化がないながら、抗体の安定性と効能がｐａｒｅｎｔａｌに比べて増大される。抗体のｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生する部位は、Ａｓｎを一つずつＱ、Ｈ、Ｋを含む他のｒｅｓｉｄｕｅへの突然変異体に対して、ＩＧＦ１Ｒに対する結合力をＥＬＩＳＡで分析した時、当該突然変異の結合力はｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と類似しているのを確認した。
【００２２】
追加的に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、脳で作用する生理活性物質と連結された時、前記生理活性物質単独に比べて向上したＢＢＢ通過能および効能を誘導することができる。
【００２３】
本発明の一例による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、多様な治療用第２抗体を含む二重特異抗体として活用でき、ヒトＩＰＳＣ由来ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムの通過実験で、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べて１５倍高いＢＢＢ通過能を示した（図７ａ）。前記二重特異抗体において、前記第２抗体に結合された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）あるいは２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態に結合されたものであってもよい。例えば、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価または２価である二重特異抗体を正常ラットに単回投与後、血中抗体量およびＣＳＦでの抗体量を分析した時、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価または２価である二重特異抗体は、ｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（１５６４クローン）に比べて最大５倍増加された血中抗体量と最大５倍増加されたＣＳＦ抗体量を示した。Ｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（１５６４クローン）に比べて約３倍増加されたＣＳＦおよび約４．５倍増加されたｂｒａｉｎ通過量を示す（図７ｃ）。したがって、前記の方法で改善された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の二重特異抗体は、治療用第２抗体のみから構成される単独抗体に比べて最大約１５倍のＣＳＦおよび約２３倍のＢｒａｉｎ通過能を示すことが期待される。
【００２４】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＩＧＦ１Ｒ、特に、ヒト、サル、ラット、およびマウスを含む哺乳動物のＩＧＦ１Ｒに結合することが確認され、薬物開発のためのスクリーニング、臨床試験などに有用に使用できる。
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片である。
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）が≦１０−６Ｍの親和度で結合する時、抗原のようなその標的に“特異的に結合する”と言われる。抗体は、ＫＤが≦１ｘ１０−８Ｍである時、あるいはＥＣ５０（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０）が２ｎＭ以下である時、高い親和性で標的に特異的に結合する。一実施形態で、抗体またはその抗原結合断片はＫＤ≦１×１０−８であって、ＩＧＦ１ＲまたはヒトＩＧＦ１Ｒに結合することができる。本発明に開示された抗体は、ＩＧＦ１Ｒ、特に、ヒトＩＧＦ１Ｒ、マウスＩＧＦ１Ｒ、ラットＩＧＦ１Ｒ、およびサルＩＧＦ１Ｒに結合することが確認された。
【００２５】
本明細書において、用語“エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）”は抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体によって認知される抗原の一部分を意味すると解釈される。一具体例によれば、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の結合部位は、ＩＧＦ１Ｒタンパク質、例えば、ヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質（配列番号９９）の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）であってもよい。さらに具体的に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体、例えば１５６４クローン抗体のヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合部位は、配列番号９９のアミノ酸配列からなるタンパク質で、結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８  ａｎｄ  Ｇｌｕ７７９を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、ａｎｄ  Ｌ８１３を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０、ａｎｄＣ４８８を含む。よって、本発明によるＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープはｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅであって、前記の３個結合部位を全てあるいは一部を含むものであってもよい。
【００２６】
本発明において、“抗体”とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、生体内で生成されたもの、組換え的に生成されたもの、または人工的に合成されたものであってもよく、その種類は特に制限されない。本発明において、抗体は、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を全て含む。また、本発明において、抗体とは、抗原結合能を保有した抗体の抗原結合断片も含む。
【００２７】
前記抗体はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も含み、前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体であってもよい。前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体である。
【００２８】
本発明による抗体は、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されない。多様な抗体の構造が以下本発明で追加的に開示される。
本明細書に記載された“抗原結合断片”は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはこれを含むポリペプチドを意味する。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および／または親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部またはこれを含むポリペプチドであってもよい。このような抗原結合断片は、典型的に、一つ以上の“相補性決定部位”（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ、ｏｒ  ＣＤＲ）を含むことができ、ここに加えて、一つ以上の“フレームワーク”領域を含むことができる。ＣＤＲは抗体の抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列であり、フレームワーク領域はこれらＣＤＲの適切な形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持するのに寄与するアミノ酸配列部位であって、抗原結合領域と抗原の間に結合を促進することができる。
【００２９】
本発明において、“相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）”とは、抗体の可変領域中の抗原との結合特異性を付与する部位を意味する。
【００３０】
前記抗体は、全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、など）より選択されたものであってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプ形態であってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は二つの重鎖と二つの軽鎖を含み、それぞれの重鎖および軽鎖はジスルフィド結合を通じて結合されて二つの重鎖−軽鎖構造体（ｄｉｍｅｒ）を形成し、前記形成された二つの重鎖−軽鎖は重鎖のＦｃ部位でジスルフィド結合を通じて連結された形態を有する。前記ＩｇＧ形態の抗体は、両側重鎖−軽鎖構造体に同一な抗原に対する抗原結合部位を含んで一つの抗原を標的とする単一標的抗体、または両側重鎖−軽鎖構造体に互いに異なる抗原に対する抗原結合部位を含んで二つの抗原を標的とする二重特異抗体であってもよい。
【００３１】
本願に使用された、抗体または免疫グロブリンの鎖（重鎖または軽鎖）の“抗原結合断片”は全長鎖と比較して一部のアミノ酸が欠如したが、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含むものである。このような抗原結合断片は、標的抗原に特異的に結合でき、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的に活性があるといえる。具体的に、前記抗原結合断片は前記相補性決定領域を一つ以上含む抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよいが、これに限定しない。このような生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または、例えば、完全な抗体を酵素的または化学的切断して生産できる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、これで制限するのではない。
【００３２】
本発明において、例えば、抗原結合断片、タンパク質、または抗体のようなポリペプチドの“変異体”は、他のポリペプチド配列と比較して一つ以上のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加および／または置換が発生したポリペプチドであり、融合ポリペプチドを含む。例えば、抗体の一部は、前記重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲ配列の一つ以上の残基で保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を含む。
本発明において、ポリペプチドの“誘導体”は、挿入、欠失、付加または置換変異体とは異なる、他の化学的モイエティとのコンジュゲーションを通じて化学的に変形されたポリペプチドを意味する。
【００３３】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害しない。具体的に、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞でＩＧＦ１Ｒのリガンドが細胞膜に位置する前記ＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制せず、また細胞表面のＩＧＦ１Ｒ発現にも影響を与えない長所がある。よって、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、トランスサイトーシスを通じて血液脳関門を通過するのに効果的に使用できる。
【００３４】
ヒトＩＧＦ１Ｒは、インスリン類似成長因子、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２およびインスリン（ＩＮＳ）によって活性化できる。ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達は、ＰＩ３  Ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ経路の活性化に依存的なＩＲＳアダプタータンパク質を通じて細胞の成長と生存を促進する。ＩＧＦ１Ｒは、その主要サブストレートであるＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＩＲＳ−３およびＩＲＳ−４とＳｈｃタンパク質に信号を伝達する。その結果、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼおよびＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ信号伝達経路の活性化がもたらされる。ＩＧＦ１Ｒは、現在まで主に使用されるＢＢＢ通過能向上のための、脳の内皮細胞でその発現すると知られた他のトランスサイトーシス標的と比較して、ＩＧＦ１Ｒの発現は脳に相対的に高い発現量を示すことが明らかになった。
【００３５】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた前述のような信号伝達経路を妨害しない。また、本発明による一実施形態で、ＩＧＦ１Ｒは、治療抗体のＢＢＢ通過能向上用途として現在開発されている他の標的、例えば、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒなどと比較した時、正常脳およびｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅ、例えば肝、肺、大腸などに相対的に低い発現量を示すことが明らかになった。
【００３６】
ＩＧＦ１Ｒは、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過して有用な物質を脳の内部に伝達できるＲＭＴ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）の標的になっている。しかし、血液脳関門通過のための薬物伝達標的として使用されるためには、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに結合するが、リガンドの結合に影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達経路には影響を与えない特性を有してこそ好ましい。したがって、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒとそのリガンド結合およびＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制しないので、血液脳関門を通過するシャトル手段として使用できる。
【００３７】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、トランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）が可能であり、脳の内皮細胞を通過することができる。また、本発明による抗体は、マウスに血管注射した場合、マウスの脳血管と同一の位置に位置する。このような結果は、本発明による抗体または抗原結合断片が血液脳関門を通過する薬物伝達体として効果的に使用できるのを示すものである。
【００３８】
したがって、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、脳で作用する生理活性物質が血液脳関門を通過できるようにする。本発明において、生物学的障壁は、細胞、組織、膜または生物学的分子の効果的な通過、拡散または伝達を遮断する細胞、膜、または構造をいう。このような生物学的障壁は、神経細胞／組織、結合組織、筋肉、膜または上皮（例えば、粘膜または血管）細胞を含む。代表的な例として血液脳関門が挙げられる。
【００３９】
本発明において、“血液脳関門”またはＢＢＢは、脳および脊椎とその周辺循環系との間に存在する脳の毛細血管内皮細胞膜内にタイト結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）によって形成された障壁である。このような障壁は非常に堅固で、約６０Ｄａ分子量の低分子物質が脳に通過することも制限する。脳の血液脳関門、脊椎の血管脊髄障壁、そして網膜の血管網膜障壁は、中枢神経系内の連続的な毛細血管障壁であって、通常ＢＢＢと称する。
【００４０】
本発明において、“血液脳関門伝達体”はこのような血液脳関門を通過して、前記脳作動因子物質を伝達することができ、前記脳作動因子物質は例えば、化合物、ペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体、または低分子化合物を含む。
【００４１】
本発明による抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、目的とする特異性を有する抗原−特異的ヒトｍＡｂが遺伝子導入マウス、例えば、先に記述されたものから生成され選択され得る。このような抗体は適切なベクターおよび宿主細胞を使用してクローニングされて発現するか、または前記抗体は培養されたハイブリドーマ細胞から収穫できる。また、前記抗体は、ファージ−ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。ファージディスプレイ技術は、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）バクテリオファージの表面上で抗体レパートリーをディスプレイして、これから目的とする抗原に結合するファージを選別する一種の免疫選択（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を模倣した方法である。このようなファージ技術は本発明の実施例またはＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／１０４９４号を参照することができる。一実施形態で、本発明のヒト化ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ファージディスプレイ方法によって選別される。
【００４２】
本発明はＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片に関するものであって、前記抗体または抗原結合断片は重鎖の相補性決定部位と軽鎖の相補性決定部位を含んで、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するポリペプチド、タンパク質または抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
【００４３】
具体的に、以下、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する抗体に関する記載である。
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識し、ＩＧＦ１Ｒ、特に、ヒトＩＧＦ１Ｒ、マウスＩＧＦ１Ｒ、ラットＩＧＦ１Ｒ、およびサルＩＧＦ１Ｒに認識および結合し、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を阻害せず、トランスサイトーシスに使用できて、血液脳関門通過能を有し、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有しないので、動物に反復投与した場合にも脳のＩＧＦ１Ｒ水準を減少させなくて、毒性を有しない。
【００４４】
特に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＢＢＢを構成する脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の表面に存在するＩＧＦ１Ｒに結合して細胞内部にＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが行われる。例えば、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株（例えば、ＭＣＦ−７など）を用いて本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされるかを確認することができる。本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体、例えば、１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１、そして１５６４のａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔであるＣ０４、Ｆ０６、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２、ＶＨ３５は陰性対照群に比べて高いｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示した。当該結果は、試験した抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ程度は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに特異的であるのを示唆する。また、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体はｓｃＦｖ形態であって、多様な方式で治療用抗体に結合して製作できる。例えば、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖは治療用抗体、例えば、α−ｓｙｎ抗体のＣ−末端に二つが結合した二重特異抗体、即ち、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態二重抗体あるいは当該抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｓｃＦｖ形態）が治療用抗体のＣ−末端に一つが結合した二重特異抗体、即ち、１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態二重特異抗体として製作でき、当該二重特異抗体は全てＩＧＦ１Ｒを発現する細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされる。ＩＧＦ１Ｒ抗体は細胞表面の抗原に対する高い結合力がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ効果を高め、これはＢＢＢ通過能につながる。但し、当該抗体がＢＢＢ通過能を有しながらＩＧＦ１Ｒのシグナリングに干渉を与える場合、副作用を引き起こすことがあるため、ＢＢＢ  ｓｈｕｔｔｌｅとして機能を果たすことができる結合力を有しながら同時にＩＧＦ１Ｒシグナルに対するｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体であることが特徴である。
【００４５】
前記抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、優れた開発容易性を有する。これに関連して、前記抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＣＤＲ領域に発生して抗体の安定性と効能を減少させるｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、例えば、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎを除去しようとした。ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生するアミノ酸の置換で、抗原であるＩＧＦ１ＲのＥＣＤに対する結合力に変化がないながら、抗体の安定性と効能がｐａｒｅｎｔａｌに比べて増大される。抗体のｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生する部位は、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＦｃ領域でＡｓｎを一つずつＱ、Ｈ、Ｋを含む他のｒｅｓｉｄｕｅへの突然変異体に対して、ＩＧＦ１Ｒに対する結合力をＥＬＩＳＡで分析した時、当該突然変異の結合力はｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と類似しているのを確認した。
【００４６】
追加的に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、脳で作用する生理活性物質と連結された時、前記生理活性物質単独に比べて向上したＢＢＢ通過能および効能を誘導することができる。
【００４７】
本発明の一例による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、多様な治療用第２抗体を含む二重特異抗体として活用でき、ヒトＩＰＳＣ由来ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムの通過実験で、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べて１５倍高いＢＢＢ通過能を示した（図７ａ）。前記二重特異抗体において、前記第２抗体に結合された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）あるいは２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態に結合されたものであってもよい。例えば、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価または２価である二重特異抗体を正常ラットに単回投与後、血中抗体量およびＣＳＦでの抗体量を分析した時、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価または２価である二重特異抗体は、ｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（１５６４クローン）に比べて最大５倍増加された血中抗体量と最大５倍増加されたＣＳＦ抗体量を示した。Ｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（１５６４クローン）に比べて約３倍増加されたＣＳＦおよび約４．５倍増加されたｂｒａｉｎ通過量を示す（図７ｃおよび図７ｄ）。したがって、前記の方法で改善された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の二重特異抗体は、治療用第２抗体のみから構成される単独抗体に比べて最大約１５倍のＣＳＦおよび約２３倍のＢｒａｉｎ通過能を示すことが期待される。
【００４８】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＩＧＦ１Ｒ、特に、ヒト、サル、ラット、およびマウスを含む哺乳動物のＩＧＦ１Ｒに結合することが確認され、薬物開発のためのスクリーニング、臨床試験などに有用に使用できる。
【００４９】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片である。
【００５０】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）が≦１０−６Ｍの親和度で結合する時、抗原のようなその標的に“特異的に結合する”と言われる。抗体は、ＫＤが≦１ｘ１０−８Ｍである時、あるいはＥＣ５０（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０）が２ｎＭ以下である時、高い親和性で標的に特異的に結合する。一実施形態で、抗体またはその抗原結合断片は、ＫＤ≦１×１０−８でＩＧＦ１ＲまたはヒトＩＧＦ１Ｒに結合できる。本発明に開示された抗体は、ＩＧＦ１Ｒ、特に、ヒトＩＧＦ１Ｒ、マウスＩＧＦ１Ｒ、ラットＩＧＦ１Ｒ、およびサルＩＧＦ１Ｒに結合することが確認された。
【００５１】
本明細書において、用語“エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）”は抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体によって認知される抗原の一部分を意味すると解釈される。一具体例によれば、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の結合部位は、ＩＧＦ１Ｒタンパク質、例えば、ヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質（配列番号９９）の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）であってもよい。さらに具体的に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体、例えば、１５６４クローン抗体のヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合部位は、配列番号１７４のアミノ酸配列からなるタンパク質で、結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８  ａｎｄ  Ｇｌｕ７７９を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９  ａｎｄ  Ｌ８１３を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０  ａｎｄ  Ｃ４８８を含む。よって、本発明によるＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープはｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅとして前記の３個結合部位を全てあるいは一部を含むものであってもよい。
【００５２】
本発明において、“抗体”とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、生体内で生成されたもの、組換え的に生成されたもの、または人工的に合成されたものであってもよく、その種類は特に制限されない。本発明において、抗体は、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を全て含む。また、本発明において、抗体とは、抗原結合能を保有した抗体の抗原結合断片も含む。
【００５３】
前記抗体はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も含み、前記モノクローナル抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体であってもよい。前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体である。
【００５４】
本発明による抗体は、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されない。多様な抗体の構造が以下本発明で追加的に開示される。
【００５５】
本明細書に記載された“抗原結合断片”は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはこれを含むポリペプチドを意味する。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および／または親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部またはこれを含むポリペプチドであってもよい。このような抗原結合断片は典型的に、一つ以上の“相補性決定部位（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ、ｏｒＣＤＲ）”を含むことができ、ここに加えて、一つ以上の“フレームワーク”領域を含むことができる。ＣＤＲは抗体の抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列であり、フレームワーク領域はこれらＣＤＲの適切な形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持するのに寄与するアミノ酸配列部位であって、抗原結合領域と抗原の間に結合を促進することができる。
【００５６】
本発明において、“相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）”とは、抗体の可変領域の中の抗原との結合特異性を付与する部位を意味する。
【００５７】
前記抗体は、全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、など）より選択されたものであってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプ形態であってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は二つの重鎖と二つの軽鎖を含み、それぞれの重鎖および軽鎖はジスルフィド結合を通じて結合されて二つの重鎖−軽鎖構造体（ｄｉｍｅｒ）を形成し、前記形成された二つの重鎖−軽鎖は重鎖のＦｃ部位でジスルフィド結合を通じて連結された形態を有する。前記ＩｇＧ形態の抗体は、両側重鎖−軽鎖構造体に同一の抗原に対する抗原結合部位を含んで一つの抗原を標的とする単一標的抗体、または両側重鎖−軽鎖構造体に互いに異なる抗原に対する抗原結合部位を含んで二つの抗原を標的とする二重特異抗体であってもよい。
【００５８】
本発明に使用された、抗体または免疫グロブリンの鎖（重鎖または軽鎖）の“抗原結合断片”は、全長鎖と比較して一部アミノ酸が欠如したが、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含むものである。このような抗原結合断片は、標的抗原に特異的に結合でき、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的に活性があるといえる。具体的に、前記抗原結合断片は、前記相補性決定領域を一つ以上含む抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよいが、これに限定しない。このような生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または、例えば、完全な抗体を酵素的または化学的切断して生産できる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片にはこれで制限するのではない。
【００５９】
本発明において、例えば、抗原結合断片、タンパク質、または抗体のようなポリペプチドの“変異体”は他のポリペプチド配列と比較して一つ以上のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加および／または置換が発生したポリペプチドであり、融合ポリペプチドを含む。例えば、抗体の一部は、前記重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲ配列の一つ以上の残基で保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を含む。
【００６０】
本発明において、ポリペプチドの“誘導体”は、挿入、欠失、付加または置換変異体とは異なる、他の化学的モイエティとのコンジュゲーションによって化学的に変形されたポリペプチドを意味する。
【００６１】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害しない。具体的に、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞でＩＧＦ１Ｒのリガンドが細胞膜に位置する前記ＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制せず、また細胞表面のＩＧＦ１Ｒ発現にも影響を与えない長所がある。よって、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、トランスサイトーシスを通じて血液脳関門を通過するのに効果的に使用できる。
【００６２】
ヒトＩＧＦ１Ｒは、インスリン類似成長因子、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２およびインスリン（ＩＮＳ）によって活性化できる。ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達は、ＰＩ３  Ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ経路の活性化に依存的なＩＲＳアダプタータンパク質を通じて細胞の成長と生存を促進する。ＩＧＦ１Ｒは、その主要サブストレートであるＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＩＲＳ−３およびＩＲＳ−４とＳｈｃタンパク質に信号を伝達する。その結果、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼおよびＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ信号伝達経路の活性化がもたらされる。ＩＧＦ１Ｒは、現在まで主に使用されるＢＢＢ通過能向上のための、脳の内皮細胞でその発現すると知られた他のトランスサイトーシス標的と比較して、ＩＧＦ１Ｒの発現は脳に相対的に高い発現量を示すことが明らかになった。
【００６３】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた前述のような信号伝達経路を妨害しない。また、本発明による一実施形態で、ＩＧＦ１Ｒは、治療抗体のＢＢＢ通過能向上用途として現在開発されている他の標的、例えば、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒなどと比較した時、正常脳およびｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅ、例えば肝、肺、大腸などに相対的に低い発現量を示すことが明らかになった。
【００６４】
ＩＧＦ１Ｒは、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過して有用な物質を脳の内部に伝達できるＲＭＴ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）の標的になっている。しかし、血液脳関門通過のための薬物伝達標的として使用されるためには、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに結合するが、リガンドの結合に影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達経路には影響を与えない特性を有してこそ好ましい。したがって、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒとそのリガンド結合およびＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制しないので、血液脳関門を通過するシャトル手段として使用できる。
【００６５】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、トランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）が可能であり、脳の内皮細胞を通過できる。また、本発明による抗体は、マウスに血管注射した場合、マウスの脳血管と同一位置に位置する。このような結果は、本発明による抗体または抗原結合断片が血液脳関門を通過する薬物伝達体として効果的に使用できるのを示すものである。
【００６６】
したがって、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、脳で作用する生理活性物質が血液脳関門を通過できるようにする。本発明において、生物学的障壁は、細胞、組織、膜または生物学的分子の効果的な通過、拡散または伝達を遮断する細胞、膜、または構造をいう。このような生物学的障壁は、神経細胞／組織、結合組織、筋肉、膜または上皮（例えば、粘膜または血管）細胞を含む。代表的な例として、血液脳関門が挙げられる。
【００６７】
本発明において、“血液脳関門”またはＢＢＢは、脳および脊椎とその周辺循環系の間に存在する脳の毛細血管内皮細胞膜内にタイト結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）によって形成された障壁である。このような障壁は非常に堅固で、約６０Ｄａ分子量の低分子物質が脳に通過することも制限する。脳の血液脳関門、脊椎の血液脊髄液関門、そして網膜の血液網膜関門は、中枢神経系内の連続的な毛細血管障壁であって、通常ＢＢＢと称する。
【００６８】
本発明において、“血液脳関門伝達体”はこのような血液脳関門を通過して、前記脳作動因子物質を伝達することができ、前記脳作動因子物質は例えば、化合物、ペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体、または低分子化合物を含む。
【００６９】
本発明による抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、目的とする特異性を有する抗原−特異的ヒトｍＡｂが遺伝子導入マウス、例えば、先に記述されたものから生成され選択され得る。このような抗体は適切なベクターおよび宿主細胞を使用してクローニングされて発現するか、または前記抗体は培養されたハイブリドーマ細胞から収穫できる。また、前記抗体は、ファージ−ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。ファージディスプレイ技術は、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）バクテリオファージの表面上で抗体レパートリーをディスプレイして、これから目的とする抗原に結合するファージを選別する一種の免疫選択（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を模倣した方法である。このようなファージ技術は本発明の実施例またはＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／１０４９４号を参照することができる。一実施形態で、本発明のヒト化ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ファージディスプレイ方法によって選別される。
【００７０】
本発明はＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片に関するものであって、前記抗体または抗原結合断片は重鎖の相補性決定部位と軽鎖の相補性決定部位を含んで、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するポリペプチド、タンパク質または抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
【００７１】
具体的な一例は、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、
（ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域；
前記一つ以上の重鎖相補性決定領域および前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域の組み合わせ；または
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組み合わせ
を含むものであってもよい。
【００７２】
追加的に、前記重鎖可変領域、前記軽鎖可変領域、または前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組み合わせにおいて、前記重鎖可変領域はＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の重鎖フレームワークを含むことができ、前記軽鎖可変領域はＬ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の軽鎖フレームワークを含むことができる。
【００７３】
本発明による（ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２またはＨ−ＣＤＲ３の重鎖相補性決定部位は、下記表１に記載されたアミノ酸配列から選択されるか、前記選択されたアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含む。また、（ｉｉ）Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２またはＬ−ＣＤＲ３の軽鎖相補性決定部位は、下記表２に記載されたアミノ酸配列から選択されるか、前記選択されたアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
前記実質的同一性とは、本発明は配列変異が存在する本発明に開示された効果を維持することを意味する。一実施形態で開示された重鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。他の実施形態で開示された軽鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。例えば、本発明に開示された抗体または抗原結合断片の配列と９０％、９５％、または９９％同一性を示す変異体の場合、任意の変異はＣＤＲよりは可変領域の骨格で発生する。
【００７５】
［表１］本発明の抗体クローンと重鎖可変領域のＣＤＲ配列
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【００７６】
［表２］本発明の抗体クローンと軽鎖可変領域のＣＤＲ配列
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【００７７】
本発明によるＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の重鎖フレームワークは下記表３に記載されたアミノ酸配列から選択でき、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の軽鎖フレームワークは下記表４に記載されたアミノ酸配列から選択できる。
【００７８】
具体的に、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の重鎖可変領域は、上記表１に記載されたＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含むか、追加的に表３のＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４の重鎖フレームワークを含むことができる。本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の軽鎖可変領域は、下記表３に示すＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含むか、追加的に表４に示すＬ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４の軽鎖フレームワークを含むことができる。一例で、前記抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、表１に記載されたＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列からなる群より選択された各クローンのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域および表２に記載されたＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列からなる群より選択された各クローンのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むものであってもよい。
【００７９】
本発明の一例で、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＦｃ領域にアミノ酸変異、例えば、アミノ酸のＤｅａｍｉｎｄａｔｉｏｎ除去で、抗原であるＩＧＦ１ＲのＥＣＤに対する結合力に変化がないながら血中ｃｌｅａｒａｎｃｅ減少で抗体のｐＫが増加され、よって抗体の半減期を延長する。一例で、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体でｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが除去されたアミノ酸位置は、クローン１５６４で軽鎖ＬＣＤＲ２のＮ５１Ｄ、ＬＣＤＲ３のＮ９５ａＫ、Ｎ９５ａＨ、Ｎ９５ａＲ、Ｎ９５ａＤ、または重鎖のＨＣＤＲ２でＮ５４ＤまたはＮ５４Ｑであってもよい。
【００８０】
［表３］本発明の抗体クローンと重鎖可変領域のフレームワーク配列
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［表４］本発明の抗体クローンと軽鎖可変領域のフレームワーク配列
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【００８１】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗体であってもよく、本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は表５および表６に開示され、各クローンのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３およびフレームワーク１〜４のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯをそれぞれ記載する。
【００８２】
下記表５および表６に記載された前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、多様な形態の抗体の製造のために自由に組み合わせることができる。前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせ例を表５に示す。
【００８３】
［表５］本発明による抗体の重鎖可変領域
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【００８４】
［表６］本発明による抗体の軽鎖可変領域
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【００８５】
本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は表５および表６に開示される。このようなそれぞれの可変領域は、完全な抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を形成するために前記重鎖および軽鎖不変領域に結合できる。本発明の一例による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を構成する重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせ例は、前記表５および６に記載された同一クローン名によって重鎖可変領域と軽鎖可変領域を組み合わせたものであってもよい。
【００８６】
本発明の具体的な一例で、配列番号１〜配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、
配列番号１０〜配列番号４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、
配列番号５０〜配列番号８０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）；
配列番号９６〜配列番号１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、
配列番号１１４〜配列番号１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および
配列番号１３３〜配列番号１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）からなる群より選択された少なくとも一つを含む、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片に関するものである。
【００８７】
具体的に、本発明による抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１０〜配列番号４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５０〜配列番号８０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域と、
配列番号９６〜配列番号１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１４〜配列番号１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１３３〜配列番号１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【００８８】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むタンパク質でＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、Ｇｌｕ７７９、Ｌ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、Ｌ８１３、Ｖ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸を特異的に認識して結合するものである、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片であってもよい。具体的に、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むタンパク質で結合部位１〜結合部位３からなる群より選択された少なくとも一つ以上の結合部位に結合するものであり、前記結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８およびＧｌｕ７７９からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９およびＬ８１３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含むものであってもよい。
【００８９】
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【００９０】
本発明による抗体またはその抗原結合断片重鎖可変領域は、
配列番号８１〜８４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号８５〜８６のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号８７〜９１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号９２〜９５のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものであってもよい。
本発明による抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、
配列番号１６２〜１６４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号１６５のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号１６６〜１６８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号１６９〜１７１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものであってもよい。
【００９１】
前記表５および表６に開示された重鎖可変領域および軽鎖各可変領域はそれぞれ別途のドメイン抗体として使用されるか、互いに自由に組み合わせられて多様な抗体を形成することができ、単一鎖形態に連結されてｓｃＦｖのような単鎖抗体を形成することもできる。
【００９２】
本発明において、“ドメイン抗体”は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。一実施形態では、２個以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによる共有結合で連結されて、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）のドメイン抗体を形成する。このような２価ドメイン抗体の２個のＶＨ領域は同一または異なる抗原を標的とすることができる。
【００９３】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、相補性決定領域を一つ以上含む抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディおよびジアボディからなる群より選択できる。
【００９４】
前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、Ｆａｂで重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、２個のＦａｂ’がＦａｂ’ヒンジ領域のシステイン残基がジスルファイド結合をなしながら生成される。
【００９５】
Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体断片であって、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）および二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む。二重鎖Ｆｖは、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結され得る。単鎖Ｆｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が直接またはペプチドリンカーを通じて共有結合で連結されるか、またはＣ−末端で直ちに連結されていて、二重鎖ＦｖのようにｓｃＦｖダイマーと同じ構造（ｄｉ−ｓｃＦｖ）を成すことができる。本発明において、単鎖Ｆｖは重鎖および軽鎖可変領域が直接またはリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ、ｓｃＦｖダイマーと同じ構造（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、および重鎖可変領域、軽鎖可変領域、およびＦｃが単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ−Ｆｃなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００９６】
前記ペプチドリンカーは前述の通りであってもよく、例えば、１〜１００個、例えば、２〜５０個または５〜２５個アミノ酸長さのものであってもよく、前記ペプチドリンカーは抗体の機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。前記ペプチドリンカーに含まれているアミノ酸種類は例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＬｅｕからなる群より選択された１種以上のアミノ酸から構成でき、具体的な例として、ＧｌｙとＳｅｒ残基から構成されるか、ロイシン（Ｌｅｕ）とセリン（Ｓｅｒ）から構成できる。具体的一例で、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであってもよく、前記ｎは（Ｇ４Ｓ）の反復数であって、１〜１０の整数、例えば２〜５、特に３または４の整数で表されるものであってもよい。前記ペプチドリンカーの一例は、配列番号１７２または１７３のアミノ酸からなるペプチドであってもよい。
配列番号１７２：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１７３：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
このような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２個の可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコーディングするＤＮＡの間にペプチドリンカーをコーディングするＤＮＡを融合することによって製造できる。製造されたポリペプチドは、折りたたみによって抗原−結合単量体を形成するか、または２個の可変ドメインの間に柔軟性リンカーの長さによって、多量体（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成することができる。異なるＶＬとＶＨを含むポリペプチドを組み合せることによって、異なるエピトープに結合する多量体性ｓｃＦｖを形成することができる。
【００９７】
前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペブシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術によって製作することができる。
【００９８】
本発明に開示された単鎖抗体は、重鎖および軽鎖可変領域のドメイン組み合わせを含むｓｃＦｖ、またはＣＤＲを含む軽鎖および重鎖可変ドメインの組み合わせが含まれるが、これで制限されるわけではない。
【００９９】
また、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、前記重鎖可変領域を含む重鎖および前記軽鎖可変領域を含む軽鎖を含むことができる。具体的に、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は重鎖不変領域および軽鎖不変領域に結合でき、前記重鎖および軽鎖配列はまた、完全な抗体構造を形成するために組み合わせられ得る。
【０１００】
本発明による可変領域と組み合わせられるこのような不変領域配列は例示的であり、前記不変領域は免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）の重鎖不変領域および軽鎖不変領域から適切に選択できる。例えば、重鎖不変領域はＩｇＧ１重鎖不変領域、ＩｇＧ３重鎖不変領域、またはＩｇＧ４重鎖不変領域であってもよく、軽鎖不変領域はカッパ不変領域またはラムダ軽鎖不変領域であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【０１０１】
一例として、本発明による前記可変領域は不変領域に結合されて、下記記載された重鎖および軽鎖配列を形成することができる。前記重鎖および軽鎖の組み合わせ例を表９に示す。また、例示的な完全な抗体抗体を表１０に記載した。前記不変領域は、免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）の重鎖不変領域および軽鎖不変領域から適切に選択できる。
【０１０２】
［表９］ＩＧＧ抗体
2021506770.tif 000045
2021506770.tif 000046
【０１０３】
本発明に記載された抗体はまた、前記のような一つ以上のＣＤＲまたは一つ以上の可変領域を含む二重特異的抗体および二重機能性抗体を含む。二重特異的または二重機能性抗体は互いに関連性があるかまたはない二種類の異なる標的を認識する人工ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結のような多様な方法を用いて製造できる。
【０１０４】
本発明において、“多重特異抗原結合タンパク質”または“多重特異抗体”は、二つ以上の抗原またはエピトープを標的とするものであって、二つ以上の抗原結合部位を含む。本発明において、“二重特異”または“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二重特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知された多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生産できる。
【０１０５】
前記多重特異抗体、例えば、二重特異抗体を製造することができる、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、前述の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片を全て含むことができ、例えば、完全な抗体であってもよく、前記抗原結合断片はドメイン抗体、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよい。
【０１０６】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを媒介とするかまたはせずに連結できる。また、抗原結合断片内の重鎖部分と軽鎖部分、例えば、ｓｃＦｖ断片内の重鎖可変領域と軽鎖可変領域もペプチドリンカーを媒介とするかまたはせずに連結できる。前記ペプチドリンカーは、先に説明した通りであってもよい。
【０１０７】
前記二重特異抗体で、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、結合された異なる抗原またはエピトープを標的とする第２抗体またはその抗原結合断片を血液脳関門を通過させて脳に伝達させる機能を遂行することができる。前記第２抗体は、脳で効能を発揮する抗体であってもよいが、特に限定されるのではない。
【０１０８】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、異なる第２抗体と特定の領域または配列を共有することができる。例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、第２抗体の抗体または抗原結合断片の不変領域を共有するか、Ｆｃ領域を共有することができる。
【０１０９】
また、本発明において、二重特異的抗体の構造は、完全な免疫グロブリンの２個重鎖のＦｃ領域、例えば、重鎖の末端に直接またはリンカーを媒介として各Ｆｃに抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖが連結された形態であるｂｉｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍ二重抗体と、完全な免疫グロブリンの２個重鎖のうちの１個重鎖の末端にのみ直接またはリンカーを媒介として抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖが連結された形態であるｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体を全て含むが、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体が好ましい。
【０１１０】
具体的に、本発明の一例で、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍのクローンがｂｉｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍのクローンより半減期が向上する場合があり、この時、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍクローンの構造は完全な免疫グロブリンの形態で１個の重鎖末端にのみリンカーでＩＧＦ１Ｒに結合するドメイン抗体（ｓｃＦｖ）が連結された形態である。完全な免疫グロブリン形態で１個の重鎖にはＣ末端にリンカーが含まれているＩＧＦ１Ｒ抗原に結合するドメイン抗体が連結されており、残り１個の重鎖には不変領域Ｃ末端の後にいずれのものも連結されていない二つの互いに異なる重鎖を含むＫｎｏｂ−Ｉｎ−ｈｏｌｅ技法が適用された異種二量体の形態である。
【０１１１】
前記二重特異抗体において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片に結合する前記第２抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体であってもよい。前記第２抗体は、完全な抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されない。
【０１１２】
以下、本発明による抗−ｓｙｎ抗体およびその抗原結合断片に関するものである。
本明細書で提供される抗体が抗原として認識するアルファ−シヌクレインは、ヒトアルファ−シヌクレイン、サルアルファ−シヌクレイン（例えば、Ｒｈｅｓｕｓアルファ−シヌクレイン）、マウスアルファ−シヌクレイン、ラットアルファ−シヌクレインなどの哺乳動物アルファ−シヌクレインから選択されたものであってもよく、例えば、ヒトアルファ−シヌクレインはアルファ−シヌクレイン（ＮＣＢＩ  ＩＤ：ＮＰ＿０００３３６）であってもよいが、これに制限されるわけではない。本明細書に異なって言及されない限り、アルファ−シヌクレインはヒトアルファ−シヌクレインを指して称するものであり、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片はヒトアルファ−シヌクレインだけでなく、サル（例えば、Ｒｈｅｓｕｓ）、ラット、および／またはマウスアルファ−シヌクレインにも特異的な結合能を有するものであってもよい。
【０１１３】
前記抗体またはその抗原結合断片が結合するアルファ−シヌクレインのＣ−末端部位に結合し、具体的に、ヒトアルファ−シヌクレインタンパク質は、配列番号１２６のアミノ酸配列で、Ｃ−末端領域、例えば、１１０番残基〜１２０番残基または１１１番残基〜１２２番残基を含む連続する少なくとも１１個または１２個のアミノ酸から構成されたペプチドを含むＣ−末端領域であってもよい。本発明による抗体またはその抗原結合断片は、前記抗原認識部位を認識してアルファ−シヌクレイン凝集体に対する高い親和度で結合することが確認された。
【０１１４】
本明細書において、“親和性または親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、抗体またはその抗原結合断片と抗原の間の相互作用の強度であり、抗体または抗原結合断片のＣＤＲ配列、および／または抗体または抗原結合断片の物理化学的特性（親水性／疎水性、静電気的特性など）、抗原の大きさ、形状、および／または電荷のような抗原の特徴などによって決定できる。このような親和度を決定する方法は、当業界に公知されており、通常解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）で示すことができるが、これに制限されるわけではない。
【０１１５】
本明細書において、“アルファ−シヌクレインタンパク質またはアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的結合する”とは、アルファ−シヌクレインタンパク質またはアルファ−シヌクレイン凝集体に対する親和度が他の抗原と比較して相対的に高いことを意味するものであって、例えば、アルファ−シヌクレイン凝集体、具体的に、アミロイドフィブリル（ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ）、プロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ）およびオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ）、特にアミロイドフィブリルに対して親和度がＯｃｔｅｔおよびＳＰＲ分析でそれぞれ０．１×１０−１０Ｍ〜２×１０−１０Ｍ、または０．０５×１０−１０Ｍ〜０．３×１０−９Ｍであるが、これに制限されるわけではない。
【０１１６】
本発明の一例による軽鎖および重鎖を含むヒト化アルファ−シヌクレイン抗体、例えば、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、およびＨｕ１１Ｆ１１＿ＡＢＬ２−４の場合、キメラアルファ−シヌクレイン抗体に比べて高い食細胞作用促進活性を示す。Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、ＡＢＬ２−４の場合、キメラアルファ−シヌクレイン抗体に比べてフィブリルの神経細胞膜結合に対する高い抑制能を示し、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、ＡＢＬ２−４の場合、キメラアルファ−シヌクレイン抗体と比較して、アルファ−シヌクレイン過発現細胞から分泌されたアルファ−シヌクレインの他の神経細胞への伝播に対する高い抑制能を示す。アルファ−シヌクレイン凝集体に対する結合力、例えば、ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙでは測定した結合力は、キメラアルファ−シヌクレイン抗体と類似するか優れた活性を有する。
【０１１７】
本発明によるアルファ−シヌクレイン抗体は、適用対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の神経系で神経細胞の外に分泌されたアルファ−シヌクレイン凝集体が細胞外空間（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅ）で他の正常細胞に移動して当該神経細胞を一種の感染させる作用を抑制し（ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）、また、小膠細胞が細胞外空間に位置するアルファ−シヌクレイン凝集体に対する食細胞作用促進能を有する。アルファ−シヌクレイン凝集体は、プリオンのように、一つの細胞から他の細胞に伝播しながら当該正常細胞内にもアルファ−シヌクレイン、特にアルファ−シヌクレイン凝集体が脳全般に広がりながらシヌクレイン病を招く。したがって、アルファ−シヌクレイン凝集体は、脳神経細胞に対して毒性があり、脳神経細胞死滅（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、脳炎症反応（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を起こすことがよく知らされている。したがって、アルファ−シヌクレイン凝集体が脳の様々な部位に広がるにつれて脳細胞死滅と脳炎症反応が増加し、これによってシヌクレイン病、例えば、パーキンソン病が進行しながら確認される脳細胞死滅およびこれによる行動、認知機能の障害が現れる。
【０１１８】
よって、本発明のアルファ−シヌクレイン抗体は、アルファ−シヌクレインまたはアルファ−シヌクレイン凝集体の神経細胞間移動を抑制して、アルファ−シヌクレイン凝集体が脳の多様な領域に広がる現象を防止することができ、また、小膠細胞の食細胞作用を促進して、対象神経系で神経細胞の外部に存在するアルファ−シヌクレイン凝集体自体の減少または除去によってシヌクレイン病の重要な原因であるアルファ−シヌクレイン凝集体の水準を減少させて、脳神経細胞死滅および脳炎症反応を減らし、さらに、シヌクレイン病、例えばパーキンソン病の症状および病の進行を改善、軽減または予防する効果を期待することができる。
【０１１９】
また、本発明によるアルファ−シヌクレイン抗体は、（ｉ）アルファ−シヌクレインまたはアルファ−シヌクレイン凝集体の神経細胞間移動を抑制、および（ｉｉ）小膠細胞の食細胞作用の促進による脳神経系のアルファ−シヌクレイン凝集体の水準減少と関連して二つの機能を全て遂行できる点から優れた活性を有する（本願ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ結果参考）。特に、現在まで臨床試験が進行中であるか論文に公開されたアルファ−シヌクレイン抗体は、前記（ｉ）および（ｉｉ）活性のうちの一つの活性を有するので、これは、本願のアルファ−シヌクレイン抗体は知られたアルファ−シヌクレイン抗体に比べて優れたシヌクレイン病の予防または治療に長所があるのを示す。したがって、本願発明によるアルファ−シヌクレイン抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集体の除去および減少と、病因としての作用を抑制する効能がさらに優れており、したがって、シヌクレイン病またはこれに関連した症状的疾病（例えば、認知障害など）にさらに効果的である。
【０１２０】
アルファ−シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、アルファ−シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、脳の凝集体の濃度を低めることができる。また、アルファ−シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外でのアルファ−シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、結局、血液脳関門を境界にしたアルファ−シヌクレイン形態間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低める効果をもたらすことができる。
【０１２１】
これは、抗体を、例えばこれに制限されるのではないが、より簡便な皮下注射のような方式で投与しても十分な効能を得ることができるため、臨床で大きな長所がある。さらに、アルファ−シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、アルファ−シヌクレイン凝集体形成および／または蓄積および／または 細胞間伝達を抑制および／または減少させることができ、脳で凝集体の濃度を低めることができる。また、アルファ−シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外でのアルファ−シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、結局、血液脳関門を境界にしたアルファ−シヌクレイン形態間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低める効果をもたらすことができる。また、本理論で限定するのではないが、本願による抗体または抗原結合断片は、単量体の除去による凝集体形成抑制、または単量体と凝集体を全て除去することができる。
【０１２２】
本明細書で提供されるアルファ−シヌクレインタンパク質またはアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、自然に生産されたものでなくてもよい（ｎｏｎ−ｎａｔｙｕｒａｌｌｙ  ｏｃｕｒｒｉｎｇ；例えば、化学的合成または組み換え的に生産されたものであってもよい）。前記のような組換技術は、当該技術分野に広く公知されている。
【０１２３】
本明細書において、“抗体”は、任意のアイソタイプの完全な免疫グロブリン、または標的抗原への結合のために完全な抗体と競争できる抗原結合断片を意味する。例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒトまたは二重特異的抗体またはこれらの抗原結合断片を含む。抗体は、それ自体で抗原結合タンパク質の一種でもある。完全な抗体は、一般に少なくとも２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖を含むが、一部の場合に抗体が単に重鎖のみを含んでもよい。
【０１２４】
抗体またはその抗原結合断片は、ただの単一源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来するか、またはキメラであってもよい、キメラ抗体は、２種類の異なる抗体に由来する部分を含み、以下、より詳細に記述される。抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、組換えＤＮＡ技術または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって生産できる。他の言及がなければ、本願において、用語、抗体は、２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖を含む抗体はもちろん、これらの誘導体、変異体、断片、および突然変異体を含み、これらの例は以下の記述の通りである。
【０１２５】
一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されず、本願に開示された多様な形態の抗体を含む。一実施形態において、本願に開示された抗体の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単一体である断片（ｓｃＦｖ）、ジアボディまたは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがスペーサーを通じて連結された単一鎖の単鎖抗体分子であってもよい。
【０１２６】
本願において、“軽鎖”は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長の軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、および不変領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在する。軽鎖の種類には、カッパおよびラムダ鎖が含まれる。
【０１２７】
本願において、“重鎖”は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨドメインはカルボキシ末端に存在し、ＣＨ３がカルボキシ−末端に最も近く位置する。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプを含む。
【０１２８】
本明細書に記載された“抗原結合断片”は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはこれを含むポリペプチドを意味する。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および／または親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部またはこれを含むポリペプチドであってもよい。このような抗原結合断片は典型的に、一つ以上の“相補性決定部位”（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ、ｏｒ  ＣＤＲ）を含むことができ、ここに加えて、一つ以上の“フレームワーク”領域を含むことができる。ＣＤＲは抗体の抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列であり、フレームワーク領域はこれらＣＤＲの適切な形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持するのに寄与するアミノ酸配列部位であって、抗原結合領域と抗原の間に結合を促進することができる。
【０１２９】
本願に使用された、抗体または免疫グロブリンの鎖（重鎖または軽鎖）の“抗原結合断片”は全長鎖と比較して一部のアミノ酸が欠如したが、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含むものである。このような断片は、標的抗原に特異的に結合でき、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的に活性があるといえる。一態様において、このような断片は全長軽鎖または重鎖内に存在する少なくとも一つのＣＤＲを含み、一部の実施形態において、単鎖、重鎖および／または軽鎖、またはその一部を含む。このような生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または、例えば、完全な抗体を酵素的または化学的切断して生産できる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、これに制限されるのではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃなど）を含む。また、これに制限されるのではないが、ヒト、マウス、ラット、カメリドまたはウサギを含む任意の哺乳動物に由来し得る。本明細書に開示された一つ以上のＣＤＲのような抗体の機能的な部分は、第２のタンパク質または低分子化合物と共有結合で連結され、特定の標的に対する標的治療剤として使用できる。
【０１３０】
本願において、“Ｆａｂ断片”は、１個の軽鎖と、ＣＨ１および可変領域のみを含む１個の重鎖から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【０１３１】
本願において、“Ｆｃ”領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖断片を二分子含む。これら２個の重鎖断片は、２個以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって互いに結合されている。
【０１３２】
本願において、“Ｆａｂ’断片”は、Ｆａｂ断片に重鎖のＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に存在する領域を追加的に含んで、二分子のＦａｂ’断片の二つの重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
【０１３３】
本願において、“Ｆ（ａｂ’）２断片”は、先に記述したように、２個の軽鎖、および可変領域、ＣＨ１とＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に不変領域の一部を含む重鎖２分子を含んで、２分子の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は２個のＦａｂ’断片から構成され、前記二つのＦａｂ’断片はこれら間のジスルフィド結合によって互いに会合されている。
【０１３４】
本願において、“Ｆｖ領域”は、重鎖および軽鎖の可変領域を含むが、不変領域は含まない抗体である。
【０１３５】
本願において、“単鎖抗体”は、重鎖および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖である。例えば、前記単鎖抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、およびＦｃが単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ−Ｆｃなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。単鎖抗体は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができる。
【０１３６】
本願において、“２価の抗原結合タンパク質”または“２価抗体”は、２個の抗原結合部位を含む。このような２価抗体に含まれている２個の抗原結合部位は、同一の抗原特異性を有するか、またはそれぞれ異なる抗原に結合する二重特異的抗体であってもよい。本願において、“多重特異的抗原結合タンパク質”または“多重特異的抗体”は、二つ以上の抗原またはエピトープを標的とするものである。
【０１３７】
本願において、“二特異的”、“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知の多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生産できる。
【０１３８】
本願において、“二特異的”、“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知の多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片あるいはｓｃＦｖ断片の連結によって生産できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０、７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２、１４８：１５４７−１５５３などを参照することができる。二特異的抗原結合タンパク質または抗体の２個の抗原結合部位が結合する２個の互いに異なるエピトープは、同一または異なるタンパク質標的に配置できる。本願による一実施形態において、本願による抗体は、血液脳関門を通過して伝達されるために伝達体に対する結合を追加的に含む二重特異的抗体の形態を取ることができる。血液脳関門を通じて薬物を伝達するための一つ方法は、細胞に内在したグルコースおよびアミノ酸伝達体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介トランスサイトーシスのような伝達システムの使用を含む。
【０１３９】
本願において、“コンジュゲート”は、本願に開示された抗体またはその抗原結合断片と他の分子、特に後述する血液脳関門伝達体または治療剤とのキメラ分子をいうものである。コンジュゲートで、本願による抗体またはその抗原結合断片は、他の分子と、例えば、共有結合またはファンデルワールスまたは疎水性相互作用による物理的力、カプセル化、包埋化（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）または前記組み合わせを含む方法によって物理的に結合される。一実施形態によるコンジュゲートで、本願による抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドリンカーを通じて連結できる。
【０１４０】
本願はまた、本願に開示された一つ以上のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含む。実質的同一性とは、本願は、配列変異が存在する本願に開示された効果を維持することを意味する。一実施形態で開示された重鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。他の実施形態で開示された軽鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。例えば、本願に開示された抗体または抗原結合断片の配列と９０％、９５％、または９９％同一性を示す変異体の場合、任意の変異はＣＤＲよりは可変領域の骨格から発生する。
【０１４１】
本発明によるアルファ−シヌクレインまたはその凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の相補性決定部位を含む重鎖可変領域；およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１４２】
一具体例で、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、下記のＣＤＲ配列を含むことができる：
配列番号１および配列番号６のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、
配列番号２〜４および配列番号７〜８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、
配列番号５および配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）、
配列番号１０および配列番号１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、
配列番号１１および配列番号１４のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および
配列番号１２および配列番号１５のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）。
【０１４３】
前記重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列と軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表１および表２に整理した：
［表１］重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列
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2021506770.tif 000048
［表２］軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列
2021506770.tif 000049
一具体例において、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２〜４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１４４】
また、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号７〜８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１４５】
他の具体例において、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、
Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ１）であって、配列番号１６〜１７および配列番号３５〜４０のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）であって、配列番号１８〜１９および配列番号４１〜４４のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）であって、配列番号２０〜３１および配列番号４５〜５０のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｈ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）であって、配列番号３２〜３４および配列番号５１〜５２のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）であって、配列番号５３〜５８および配列番号７１〜７７のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）であって、配列番号５９〜６１および配列番号７８〜８１のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）であって、配列番号６２〜６７および配列番号８２〜８８のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、および／または
Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）であって、配列番号６８〜７０および配列番号８９のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含むものであってもよい。
【０１４６】
本明細書でフレームワークに使用可能なアミノ酸配列として、重鎖可変領域フレームワーク配列を表３および表４に、軽鎖可変領域フレームワーク配列を表５および表６に例示した。
【０１４７】
［表３］重鎖フレームワーク１〜２のアミノ酸配列
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2021506770.tif 000051
［表４］重鎖フレームワーク３〜４のアミノ酸配列
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［表５］軽鎖フレームワーク１〜２のアミノ酸配列
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［表６］軽鎖フレームワーク３〜４のアミノ酸配列
2021506770.tif 000055
他の具体例において、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１および配列番号６のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２〜４および配列番号７〜８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、配列番号５および配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号１６〜１７および配列番号３５〜４０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ１）、配列番号２０〜３１および配列番号４５〜５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、配列番号２０〜３１および配列番号４５〜５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および配列番号３２〜３４および配列番号５１〜５２のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むことができる。さらに詳しくは、前記重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ２、配列番号２９〜３１のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ−ＦＲ３、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ４を含むことができる。
【０１４８】
また、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０および配列番号１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１および配列番号１４のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１２および配列番号１５のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記軽鎖可変領域は、追加的に、配列番号５３〜５８および配列番号７１〜７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号５９〜６１および配列番号７８〜８１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、配列番号６２〜６７および配列番号８２〜８８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および配列番号６８〜７０および配列番号８９のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むことができる。さらに詳しくは、前記軽鎖可変領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ２、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ３、および配列番号３４のアミノ酸を含むＬ−ＦＲ４を含むことができる。
【０１４９】
但し、本発明による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、２および５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３と配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、配列番号１６、１８、２０および３２のアミノ酸配列からなる重鎖ＦＲ１−ＦＲ４と配列番号５３、５９、６２および６８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＦＲ１−ＦＲ４とを有するマウス抗体またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を含まない。また、本発明による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６、７および９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３と配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、配列番号３５、４１、４５および５１のアミノ酸配列からなる重鎖ＦＲ１−ＦＲ４と配列番号７１、７８、８２および８９のアミノ酸配列からなる軽鎖ＦＲ１−ＦＲ４とを有するマウス抗体またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を含まない。具体的な例として、配列番号９０の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＨ）と配列番号１０９の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＬ）を含む抗体または配列番号１０２の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＨ）と配列番号１１６の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＬ）を含むＣｈ３Ａ９抗体は、本発明による抗アルファ−シヌクレイン抗体に含まれない。
【０１５０】
本発明の具体的な一例による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２〜４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号１６〜１７のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ１）、配列番号１８〜１９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、配列番号２０〜３１のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および配列番号３２〜３４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号５３〜５８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号５９〜６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、配列番号６２〜６７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および配列番号６８〜７０のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むことができる。
【０１５１】
好ましくは、本発明の具体的な一例による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、配列番号２および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ２、配列番号２９〜３１のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ−ＦＲ３、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ４を含むことができ、前記軽鎖可変領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ２、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ３、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ４を含むことができる。
【０１５２】
本発明の具体的な一例による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号７〜８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号３５〜４０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ１）、配列番号４１〜４４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、配列番号４５〜５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および配列番号５１〜５３のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号７１〜７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号７８〜８１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、配列番号８２〜８８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むことができる。
【０１５３】
全長の軽鎖および重鎖で、可変領域および不変領域は約１２個以上のアミノ酸長さの“Ｊ”領域によって結合され、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の“Ｄ”領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ、Ｗ．、ｅｄ．）１９８９、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓを参照することができる。典型的に、抗体の軽鎖／重鎖対の可変領域が抗原結合部位を形成する。
【０１５４】
免疫グロブリン鎖の可変領域は一般に全体的構造が同一であり、“相補的決定部位または領域またはドメイン”またはＣＤＲと称される３個の超可変領域によってつながる比較的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。重鎖／軽鎖対を構成する各鎖由来の可変領域のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域によって整列されて標的タンパク質（アルファ−シヌクレイン）の特定エピトープと特異的に結合する構造を形成する。自然発生軽鎖および重鎖可変領域のこのような要素は、Ｎ−末端からＣ−末端まで典型的に次の順序で含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。可変領域で、これらそれぞれに該当するアミノ酸配列の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３に記載されたものに従う。
【０１５５】
本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は、表７および表８に開示される。このようなそれぞれの可変領域は、完全な抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を形成するために、前記重鎖および軽鎖不変領域に結合できる。また、このように生成されたそれぞれの重鎖および軽鎖配列はまた完全な抗体構造を形成するために組合わせられ得る。例えば、本発明による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９０〜１０１または配列番号１０２〜１０８のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と、配列番号１０９〜１１５または配列番号１１６〜１２３のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含み、さらに詳しくは、配列番号９０〜１０１のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号１０９〜１１５のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むか、配列番号１０２〜１０８のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号１１６〜１２３のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１５６】
本発明の具体的な一例で、抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９８〜１０１のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と、配列番号１１５のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含むことができるか（例、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．３）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．４）、など）、または配列番号９２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる（例、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ＡＢＬ２−４）抗体）。
【０１５７】
但し、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号１０９の軽鎖可変領域からなるもの、および配列番号１０２の重鎖可変領域および配列番号１１６の軽鎖可変領域からなるものは除外される。
【０１５８】
一実施形態による抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表７および表８に例示した。
【０１５９】
［表７］重鎖可変領域
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2021506770.tif 000058
［表８］軽鎖可変領域
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2021506770.tif 000060
また、一実施形態による抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせと不変領域を含む、例示的な抗体を表９に記載した。
【０１６０】
［表９］
2021506770.tif 000061
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2021506770.tif 000063
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本明細書に開示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、完全な抗体の重鎖および軽鎖を形成するために、それぞれ重鎖不変領域および軽鎖不変領域に結合できる。このように生成されたそれぞれの重鎖および軽鎖は適切に組み合わせられて重鎖−軽鎖組み合わせを成すことができ、前記重鎖−軽鎖組み合わせは多量体を形成（例えば、ＩｇＧタイプ抗体の場合、二量体を形成）して完全な抗体構造を成すことができる。
【０１６１】
前記不変領域は、免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）重鎖不変領域および軽鎖不変領域から適切に選択できる。例えば、重鎖不変領域はＩｇＧ１重鎖不変領域、ＩｇＧ３重鎖不変領域、またはＩｇＧ４重鎖不変領域であってもよく、軽鎖不変領域はカッパ不変領域またはラムダ軽鎖不変領域であってもよいが、これに制限されるわけではなく、抗体安定性、製造可能性、抗原親和性、および／またはその他目的とする特徴などのために、他の類型の不変領域または変形された不変領域を適切に選択して使用することができ、これは当業者が明確に分かる事項である。
【０１６２】
他の実施形態において、前記表７および表８に開示された重鎖可変領域および軽鎖各可変領域は互いに自由に組み合わせられて多様な抗体を形成することができ、単一鎖形態に連結されてｓｃＦｖのような単鎖抗体を形成することもできる。
【０１６３】
本明細書に開示された抗体は、本明細書に開示された他の抗体と特定領域または配列を共有する。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の不変領域を共有することができる。他の実施形態では、Ｆｃ領域を共有することができる。
【０１６４】
一例で、本明細書で提供される抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。他の例で、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または動物由来抗体であってもよい。他の例で、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、組み換え的または化学的に合成されたものであってもよい。
【０１６５】
一実施形態において、本明細書に開示された抗体の抗原結合断片または抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ジアボディ、およびｓｃＦｖなどの単鎖抗体分子からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【０１６６】
他の実施形態で、本願に提供された抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、多様なイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、またはＩｇＤ）であってもよく、特に、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−またはＩｇＧ４−類型、例えば、ＩｇＧ１−またはＩｇＧ２−類型であってもよい。
【０１６７】
また他の実施形態において、抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、前記記載された軽鎖または重鎖のみからなるものであってもよい。他の実施形態において、抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のみからなるものであってもよい。
【０１６８】
当業者であれば、抗体が本明細書に開示された一つ以上のＣＤＲを含む場合、開示された各ＣＤＲは互いに独立的に選択されて組み合わせられ得るのを理解するはずである。したがって、１、２、３、４、５、または６個の独立的に選択されたＣＤＲを有する抗体が生成できる。また、組み合わせのためにＣＤＲが選択される時、同じ種類のＣＤＲが反復的に使用されず、例えば、抗体は一般に二つのＣＤＲＨ２領域を含んで製造されないということを当業者であれば分かるはずである。
【０１６９】
一実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体または多クローン抗体であってもよい。本明細書に開示された抗体は、アルファ−シヌクレインに結合するモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、当該技術分野に公知された任意の技術を使用して製造できる。例えば、免疫化された形質転換動物から収穫された脾臓細胞を不滅化させることによって生産できる。ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該技術分野に公知された技術を使用して精製することができる。
【０１７０】
他の具体例において、前記抗体は、動物由来抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体（例えば、マウス−ヒトキメラ抗体）、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。抗体はまた、多様な目的のために多様な方式で変形できる。キメラおよびヒト化抗体がさらに提供される。キメラ抗体は、異なる抗体に由来するポリペプチド断片が共有結合で連結されて、免疫学的に機能的な軽鎖、重鎖またはその断片を形成する抗体である。
【０１７１】
このようなモノクローナル抗体で、典型的に抗体の非−抗原認識部分を構成する特定のアミノ酸残基がヒト抗体の相応するアイソタイプの相応する残基と相同性になるように変形する。ヒト化は、例えば、公知された多様な方法を用いて、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の相応する領域で置換することによって行われる（米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）。
【０１７２】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリンの生成が欠乏してヒト抗体を生成することができる形質転換動物（通常、マウス）を免疫化させることによって生成できる。完全ヒト抗体はまた、ファージ−ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。完全ヒト抗体を使用すれば、マウスまたはマウス−由来のｍＡｂをヒトに投与することによって誘発することがある免疫原性反応およびアレルギー反応を最少化することができる。
【０１７３】
一実施形態において、本願のヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、ファージディスプレイ方法によって選別される。ファージスクリーニングによって選別したアルファ−シヌクレイン特異的な単一クローンファージ抗体を全体ＩｇＧ（ｆｕｌｌ  ＩｇＧ）形態に変換するために組換え方法を用いた。抗−アルファ−シヌクレイン抗体の組換え製造のために各単一クローンファージ抗体の配列を確保する。確保した配列において、重鎖可変領域配列は重鎖不変領域配列に、軽鎖可変領域配列は軽鎖不変領域配列に移植した後、コドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）方法によってアミノ酸配列を核酸配列に変更する。確保した核酸配列を動物細胞培養用ベクターにクローニングした後、ＣＨＯ細胞などのタンパク質生産用宿主細胞に前記ベクターを用いて形質転換して、培養する。前記培養液に含まれている抗体を精製するために親和度クロマトグラフィーなどの精製技術を用いて組換え抗体を分離精製する。
【０１７４】
他の具体例において、前記抗体は、自然から発見される抗体の典型的な構造を有するか、変形された構造を有する抗体であってもよい。
【０１７５】
前記典型的な構造を有する抗体は、互いに異なる二つのポリペプチド鎖（即ち、重鎖および軽鎖）を含む構造的単位体を含む多量体構造を有することができる。前記互いに異なる二つのポリペプチド鎖は、全長軽鎖（約２５ｋＤａ）および全長重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を含むことができる。各鎖は、特徴的な折りたたみパターンを示し、約９０〜１１０個アミノ酸からなる、数個の免疫グロブリンドメインから構成されている。このようなドメインは、抗体ポリペプチドを構成している基本単位体である。各鎖のアミノ−末端部分は、典型的に抗原を認識する部分である可変領域またはＶ領域と称される部分を含む。カルボキシ−末端部分は、アミノ−末端より進化的により保存され、不変領域またはＣ領域と称される部分を含む。ヒト軽鎖は、一般にカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類され、これらそれぞれは、一つの可変領域および一つの不変領域を含む。重鎖は、一般にミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはエプシロン（ε）鎖として分類され、これらはそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥイソタイプと定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これに制限されない複数のサブタイプを有する。重鎖不変領域は、典型的に効果器機能を示す一つ以上のドメインを含む。重鎖不変領域ドメインの数はイソタイプによって変わる。ＩｇＧ重鎖は、例えば、それぞれＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と公知された３個のＣ領域ドメインを含む。本明細書に開示された抗体は、このようなイソタイプおよびサブタイプのうちの任意の一つであってもよい。一実施形態において、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、ＩｇＧイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブタイプであってもよい。
【０１７６】
本発明によれば、用語“シヌクレイン病”は、病理学的シヌクレイン凝集体を特徴とする全ての神経退行性障害を含む。パーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、レビー小体病、レビー小体を伴う認知症、認知症を伴うパーキンソン症候群、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、多発性神経系萎縮および脳鉄沈着を伴う神経変性Ｉ型（ＮＢＩＡ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）を含むいくつかの神経退行性障害は、シヌクレイン病として集合的にグループ化される。また、アルファ−シヌクレイン凝集は、二次的にアルツハイマー疾患でも発見される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４、６：７３）。
【０１７７】
シヌクレイン病は、共通的な病理学的特性を共有する神経退行性障害の多様なグループである：神経病理的実験で、特有の病変は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）および希小突起神経膠（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）の選択された集団内でアルファ−シヌクレインタンパク質の異常な凝集を含んで感知できる。アルファ−シヌクレイン（最初にＰＡＲＫｌおよびＰＡＲＫ４と判明する）は、新皮質、海馬、歯状回、嗅球、線条体、視床および小脳で広範囲に発現する１４０個アミノ酸のタンパク質である。アルファ−シヌクレインはまた、Ｂ−、Ｔ−、およびＮＫ細胞をはじめとして蛋白球および血小板を含む造血細胞で高く発現する。このような細胞内での正確な役割は知られていないが、巨核球（血小板前駆体）の分化と関連があった。
【０１７８】
本願によるアルファ−シヌクレイン凝集体を高い親和度で特異的に認識し、アルファ−シヌクレイン抗体がこのような疾患の診断、または検出に有用に使用できるのを示す。さらに、本願によるアルファ−シヌクレイン凝集体を特異的に認識するアルファ−シヌクレイン抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集体の形成を抑制するか、または凝集体を分解し、細胞間凝集体の伝達を抑制して、シヌクレイン病、特にパーキンソン病の治療に効果的に使用することができるのを示す。
【０１７９】
本願において、“アルファ−シヌクレイン凝集体に関連する疾患”は、シヌクレイン病と呼ばれる一群の神経退行性疾患であって、ニューロンおよび膠細胞（ｇｌｉａ）集団を含む病巣でアルファ−シヌクレイン凝集体が発見され、ドーパミン性システムの退化、運動能力変化、認知障害およびレビー小体および／またはレビーニューライトの形成のような特徴を有する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４、６：７３；ＭｃＫｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４）。このような疾患には、パーキンソン疾患、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、アルツハイマーレビー小体疾患、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病、多系統萎縮症およびその他の多数の神経軸索疾患を含むが、これで制限するのではない。一実施形態において、本願による抗体は、パーキンソン病の治療に効果的に使用される。
【０１８０】
本発明による二重特異抗体の一例は、下記の通りである。
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上記表に記載された配列１〜８１に該当するアミノ酸配列を下記表に表わす。
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【発明の効果】
【０１８１】
本発明の一例で製造された抗体は、ＩＧＦ１Ｒにｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌのｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓに最適化された結合力でＩＧＦ１Ｒ特異的に結合し、低い血液脳関門通過能で治療効能が制約的であった退行性脳疾患および脳ガン治療抗体の伝達に有用に使用できる。特に本発明に開示された単一クローン抗体は、リガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２およびそのｈｏｍｏｌｏｇであるｉｎｓｕｌｉｎがＩＧＦ１Ｒに結合することには影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒ受容体を通じた信号伝達を抑制しないなどの効果を示すので、血液脳関門通過と関連して有用性を有する。
【０１８２】
本願に開示された抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集体を効果的に除去するか、分解を促進することができ、アルファ−シヌクレインの細胞間伝達を抑制することができて、アルファ−シヌクレインの凝集体の蓄積に関連する疾患の治療に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎ抗体が凝集された形態のｎａｔｉｖｅアルファ−シヌクレインを特異的に認識するか否かを測定したドットブロット結果を示す。
【図２】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎ抗体の親和度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３ａ】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎ抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。
【図３ｂ】図３ａの結果を表で示したことである。
【図４ａ】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎ抗体がアルファ−シヌクレイン凝集体に選好的結合特異性をＯｃｔｅｔで分析した結果である。
【図４ｂ】図４ａの結果を表で示したものである。
【図５ａ】それぞれ、本発明の一例によるａ−ｓｙｎ抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。
【図５ｂ】それぞれ、本発明の一例によるａ−ｓｙｎ抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。
【図６】本発明の一例によるａ−ｓｙｎ抗体のエピトープマッピング結果を図式的に示したものであって、本願による抗体は大部分Ｃ−末端部位に結合することが明らかになった。
【図７】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体の親和度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図８】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。
【図９ａ】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎキメラ抗体がベータ−シヌクレイン、ガンマ−シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ１−４２）、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ−シヌクレイン、特にアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。
【図９ｂ】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎキメラ抗体がベータ−シヌクレイン、ガンマ−シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ１−４２）、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ−シヌクレイン、特にアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。
【図１０】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎキメラ抗体がベータ−シヌクレイン、ガンマ−シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ１−４２）、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ−シヌクレイン、特にアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。
【図１１ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合データである。
【図１１ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合データである。
【図１２ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。
【図１２ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。
【図１２ｃ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。
【図１３ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株へのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎおよびｃｅｌｌ内でのｆａｔｅ関連データである。
【図１３ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株へのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎおよびｃｅｌｌ内でのｆａｔｅ関連データである。
【図１３ｃ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株へのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎおよびｃｅｌｌ内でのｆａｔｅ関連データである。
【図１４ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはｉｎｓｕｌｉｎによるＩＧＦ１Ｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。
【図１４ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはｉｎｓｕｌｉｎによるＩＧＦ１Ｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。
【図１４ｃ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはｉｎｓｕｌｉｎによるＩＧＦ１Ｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。
【図１５ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＡＤＣＣがなく、反復投与以後にも脳内ＩＧＦ１Ｒレベルに変化を与えないというデータである。
【図１５ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＡＤＣＣがなく、反復投与以後にも脳内ＩＧＦ１Ｒレベルに変化を与えないというデータである。
【図１５ｃ−１】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＡＤＣＣがなく、反復投与以後にも脳内ＩＧＦ１Ｒレベルに変化を与えないというデータである。
【図１５ｃ−２】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＡＤＣＣがなく、反復投与以後にも脳内ＩＧＦ１Ｒレベルに変化を与えないというデータである。
【図１６ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムで治療抗体のみから構成された単独抗体よりＢＢＢをさらによく通過するというデータである。
【図１６ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムで治療抗体のみから構成された単独抗体よりＢＢＢをさらによく通過するというデータである。
【図１６ｃ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムで治療抗体のみから構成された単独抗体よりＢＢＢをさらによく通過するというデータである。
【図１７ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢを治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するというデータである。
【図１７ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢを治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するというデータである。
【図１７ｃ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢを治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するというデータである。
【図１７ｄ−１】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢを治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するというデータである。
【図１７ｄ−２】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢを治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するというデータである。
【図１７ｅ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢを治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するというデータである。
【図１８ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体から構成された二重特異抗体の優れた開発容易性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ）を示すデータである。
【図１８ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体から構成された二重特異抗体の優れた開発容易性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ）を示すデータである。
【図１９】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング結果である。
【図２０ａ】本願の一例で製造された二重特異抗体の各抗原に対する結合力を測定するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図２０ｂ】本願の一例で製造された二重特異抗体の各抗原に対する結合力を測定するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図２０ｃ】キメラ抗体とヒト化した抗体の各抗原に対する結合力を比較するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図２０ｄ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対してｍｉｃｒｏｇｌｉａの食細胞作用に対する活性を評価した結果である。
【図２１ａ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２１ｂ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２１ｃ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２１ｄ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２１ｅ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２２ａ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過能向上を確認した結果である。
【図２２ｂ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過能向上を確認した結果である。
【図２２ｃ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過能向上を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１８４】
実施例１．マウスアルファ−シヌクレイン抗体の製造
１−１：免疫化およびハイブリドーマ生産
抗原としては全長（１４０残基）またはＣ−末端２１個の残基が切断されたアルファ−シヌクレイン単量体を３７度のｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｃに入れて、１４日間１０５０ｒｐｍで振って凝集化させ、ソニケーションして使用した。前記製造された１ｍｇ／ｍｌ濃度の１４０個および１１９個残基のアルファ−シヌクレインフィブリルそれぞれをアジュバントと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合してよく混合した。
【０１８５】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎのＡｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
その次に、前記準備した混合物２００μＬを５〜７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの皮下に注射し、２週後に、同様な方法で製造した混合物２００μＬを追加的に皮下注射してブースティングさせた。ブースティング１週後に血液を採取して、投与抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を使用して免疫化滴定（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｔｅｒａｔｉｏｎ）を行った。その次に、３次ブースティングは、抗原のみを皮下注射した。
【０１８６】
その次に、前記のように免疫が完了したマウスの脾臓を除去して、これから細胞を確保した。その次に、脾臓細胞を１０％ＦＢＳが添加されたＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に懸濁させた。ハイブリドーマを製造するために、マウス骨髄腫細胞であるＳＰ２／０−Ａｇ１４と脾臓細胞を血清が含まれていないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地で混合した後、遠心分離を行って培地を除去した。その次に、細胞ペレットにＰＥＧを添加した後、３７℃で１分間培養して細胞融合を誘導した。
【０１８７】
１−２：単細胞クローニングおよび抗体精製
融合２週後に、細胞培養培地を用いてマウスに投与した抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を使用して抗体を生産するマウスＢ細胞との融合を確認した。その次に、ハイブリドーマを用いて単細胞クローニングを行って単クローン抗体を生産するハイブリドーマを総１６個選別した。全長（１４０残基）アルファ−シヌクレイン凝集体を抗原として用いて９Ｂ１１（それぞれ、ＩｇＧ１  ｋａｐｐａ）クローンを得て、Ｃ−末端２１個残基が切断されたアルファ−シヌクレイン凝集体を抗原として用いて３Ａ９および１１Ｆ１１（それぞれ、ＩｇＧ２ｂ  ｋａｐｐａ、ＩｇＧ２ｂ  ｋａｐｐａ）のクローンを得た。
【０１８８】
前記抗体の精製のために、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ１６４０培地で各ハイブリドーマを培養し、抗体生産のためにｓｅｒｕｍのないＳＦＭ培地に培養培地を交替した後、４日程度培養する。細胞培養上層液を分離して遠心分離した後、０．２２μｍフィルターでろ過した後、ＩｇＧ１タイプはｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｃｏｌｕｍｎで、残りの抗体はｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎで精製した。
【０１８９】
１−３：可変領域配列決定
可変領域およびＣＤＲ配列は、Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ２００４、１８（２）：２３７−２４１論文を参照して決定した。ハイブリドーマを培養した後、遠心分離して細胞のみを分離した。分離されたハイブリドーマにトリゾールを入れてＲＮＡを分離し、これを鋳型にしてｃＤＮＡを合成した後、塩基配列分析によって可変領域およびＣＤＲ配列を確認した。したがって、抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１を得た。
【０１９０】
実施例２．抗アルファ−シヌクレイン（キメラ）抗体の製造
２−１：抗体クローニングおよび発現
ヒト化を進行後に確保した重鎖可変領域および軽鎖可変領域の抗体ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を用いて、短い断片のｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅであるｇｂｌｏｃｋ（ｍ．ｂｉｏｔｅｃｈ）を合成し、これを用いて動物細胞培養用ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）にクローニングした。可変領域前後に重畳したｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを約２０ｂｐ程度含んでｇｂｌｏｃｋを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ｖｅｃｔｏｒの可変領域を除外した部分をＰＣＲで増幅後に準備して、Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ方法でクローニングした。
【０１９１】
前記クローニングされた抗体をＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎおよび発現するために、前記製造されたベクターをｍａｘｉ−ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）して、多量のｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを確保後、次のように細胞に導入した。形質注入前日、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣＨＯＴＭ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１００−０１）培地に３×１０Ｅ６〜４×１０Ｅ６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度を合わせた後、８％  ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日、７×１０Ｅ６〜１０×１０Ｅ６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上に育った細胞を新鮮な培地を用いて６×１０６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬで希釈して準備した。
【０１９２】
準備された母細胞への形質注入のために、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ＆  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ複合体を準備した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯＴＭＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注して、滴定濃度で準備したＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、ｍｉｘして常温で５分間定置し、母細胞に接種して形質注入後、培養を始めた。形質注入翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔに含まれているｅｎｈａｎｃｅｒおよびｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％  ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して生産を完了した。
【０１９３】
生産が完了した培養液の収得のために遠心分離用瓶に培養液を移して４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、０．２μｍの大きさのフィルターでフィルタリングを行って、浮遊物を除いた培養液を確保して、その後、精製過程を行った。
【０１９４】
２−２：抗体の精製および配列確認
ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１１−００３４−９４）を使用して培養液を精製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を使用して平衡化させた後、回収された培養液をカラムにローディングした。ローディングが完了すれば、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐＨ５．０で中間洗浄後、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐＨ３．４を用いて溶出を行った。溶出液に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０を添加してｐＨ６．０になるように中和した。その後、溶出液をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）でバッファー交換および濃縮して、使用時まで４℃に保管した。
【０１９５】
追加精製が必要な場合、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムに１Ｘ  ＰＢＳをバッファーにして１次精製分を通過させて、溶出試料の大きさに基づいて２次精製を行った。前記精製された抗体のアミノ酸配列を質量分析方法で分析し、ｍｏｕｓｅ由来単クローン抗体の可変領域と一致するのを確認した。
【０１９６】
前記方法で確認された３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１アイソタイプのｂａｃｋｂｏｎｅ可変領域部分に置換してキメラ形態のヒトＩｇＧ１抗体を製作した。前記得られたキメラ抗体のうち、特にＣｈ１１Ｆ１１抗体はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９０の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＨ）と配列番号１０９の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＬ）の組み合わせを含み、Ｃｈ  ３Ａ９抗体はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号１０２の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＨ）と配列番号１１６の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＬ）の組み合わせを含む。
【０１９７】
実施例３：ヒト化抗体の製造
３−１：ライブラリーファージ（Ｌｉｂｒａｒｙｐｈａｇｅ）準備
キメラ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３  ｒｅｓｉｄｕｅにｈｕｍａｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋを結合させながら各ＣＤＲ  ｒｅｓｉｄｕｅにｍｏｕｓｅあるいはヒト由来ｓｅｑｕｅｎｃｅが導入されたｍｉｎｉライブラリーを製作した。当該ライブラリーのｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌをクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍｌ、２％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５４００）および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２３９３）が含まれている２Ｘ  ＹＴ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ、１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ、１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）５ｇ］培地に接種後、３７℃で３時間程度培養してＯＤ６００値が０．５から０．７になるようにした後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を感染させた後、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）を添加した２Ｘ  ＹＴ培地で３０℃、１６時間培養してファージパッキングを誘導した。その次に、培養液を４５００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離した後、上澄み液に４％  ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、８１２５３）と３％  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。これを再び４℃条件で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで懸濁した後、再び４℃条件で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してライブラリーファージを含む上澄み液を得て、新しいチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。
【０１９８】
３−２：ファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
具体的に、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ  ４４４２０２）に１０μｇ／ｍｌ濃度の組換えアルファ−シヌクレイン凝集体をＰＢＳに添加して４℃で一晩試験管表面にタンパク質を吸着させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）３％溶液を試験管に添加して、アルファ−シヌクレイン凝集体が吸着していない表面を保護した。試験管を空けた後、ＢＳＡ  ３％溶液に分散した１０１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリーをアルファ−シヌクレイン単量体タンパク質の吸着している免疫試験管に入れて、常温で１時間反応させた（ネガティブ選別）。アルファ−シヌクレイン単量体に非結合したファージを回収してアルファ−シヌクレイン凝集体が付着された免疫試験管に常温で２時間結合させた。その次に、非特異的に結合したファージをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で５回〜３０回洗い落とした後、残っている抗原特異的ファージ抗体を１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いて回収した。回収されたファージを１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．４）で中和させた後、ＥＲ２５３７大腸菌に３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌をカルベニシリンを含有する２Ｘ  ＹＴ寒天培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌を４ｍｌの２Ｘ  ＹＴカルベニシリン培養液に懸濁し、１５％グリセロールを添加して、一部は−８０℃に保管し、残りは次のラウンドのパニングのためにファージを製造した。このような過程を総３ラウンド繰り返して抗原特異的な抗体を増幅させた。パニングラウンドが進行するほど、ＰＢＳ−Ｔを用いた洗浄回数を増加させて抗原特異的ファージを増幅および濃縮した。
【０１９９】
３−３：単一クローンファージ抗体選別（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
前記パニングによって得られたファージプール（ｐｈａｇｅ  ｐｏｏｌ）からアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する単クローン抗体を選別するために、次のような実験を行った。
【０２００】
濃縮されたプールから単一クローンを分離するために、ＬＢ−テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に前記ファージプールを塗抹した後、培養して単一コロニーを確保した。その次に、単一クローンをウェル当り４００μｌの２Ｘ  ＹＴ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地が入った９６ディープウェルプレートに接種して一晩育てた後、培養液１０μｌを新たな３９０μｌの２Ｘ  ＹＴ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地が含まれている９６ディープウェルプレートに入れて、３７℃で４時間培養した。前記培養液に１ｍＭ  ＩＰＴＧとなるように入れて、３０℃で一晩培養した。一晩培養した培養液を遠心分離して上澄み液を取った。
【０２０１】
その次に、次のようにＥＬＩＳＡ方法を使用してアルファ−シヌクレイン凝集体と結合する単一クローン可溶性ｓｃＦｖを発現するクローンを選択した（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ．Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ．２０００．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＮＹ．ＵＳＡ．ｐｐ．１１．９−１１．１２）。具体的に、９６ウェルプレートに実施例１−１で選別された７Ｂ７抗体を入れ、４℃で一晩コーティングした。３％  ＢＳＡを各ウェル当り２００μＬずつ入れて３７℃で２時間ブロッキングした。その次に、アルファ−シヌクレイン凝集体と単量体を１００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれローディングした後、３７℃で２時間反応させた。その次に、ＰＢＳ−Ｔ  ３００μＬで５回洗浄した。前記準備された単一クローン上澄み液は３％  ＢＳＡと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した後、これを前記凝集体および単量体と結合させたプレートに１００μＬずつローディングした後、３７℃で２時間反応させた。その次に、ＰＢＳ−Ｔ  ３００μＬで５回洗浄した後、抗−ＨＡ  ＨＲＰ結合抗体を入れて３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００μＬを入れて発色した後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μＬを入れて反応を停止した後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度が０．５以上であるクローンを結合による陽性反応と見なし、ＢＳＡ非特異的に結合するクローンは排除させた。
【０２０２】
ライブラリーで発見されたクローンのＣＤＲ  ｒｅｓｉｄｕｅは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ方式で分析を併行して、ｆｒａｍｅｗｏｒｋとの結合に深刻な問題が生じるか、ＣＤＲを除いたｆｒａｍｅｗｏｒｋ部分にＴ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅおよびＭＨＣＩＩ  ｅｐｉｔｏｐｅが存在しないクローンを選別した。
【０２０３】
その後、次のような重鎖、軽鎖の可変領域の組み合わせで形成された５個抗体に対して、ヒト化抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１アイソタイプのｂａｃｋｂｏｎｅ可変領域部分に置換して５個のＩｇＧ１  ｂａｃｋｂｏｎｅのヒト化抗体を製作した。具体的に、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ＡＢＬ２−４）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９２の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ２）と配列番号１１３の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬ４）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９８の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ１）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．２）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９９の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ２）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．３）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号１００の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ３）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）の組み合わせを含む。
【０２０４】
Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）は、配列番号１０１の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ４）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）の組み合わせであるのを確認した。
【０２０５】
実施例４．アルファ−シヌクレイン抗体の抗原結合特異性および結合力分析
４−１：抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いたドットブロット分析
本願による抗体がネイティブ状態での単量体または凝集体に結合するかを分析するために、ドットブロット実験を行った。このために、抗原として５０ｎｇあるいは１００ｎｇのアルファ−シヌクレインモノマーまたはフィブリルタンパク質（ソウル大学校のイ・スンジェ教授ｌａｂで製造する；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３２：１３４５４、２０１２）をＤｏｔ  ｂｌｏｔ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてニトロセルロースメンブレンにスポットローディングした。２倍ずつ希釈したモノマーまたはフィブリルタンパク質は、メンブレンの右から左へ順次にローディングした（１２．５、２５、５０、１００ｎｇ）。メンブレンをＴＢＳＴ組成の５％ｎｏｎ−ｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋで１時間常温でブロッキングした後、実施例１で製造したアルファ−シヌクレイン抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で１％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ含有ＴＢＳＴに入れて、メンブレンと当該抗体を１時間常温でインキュベーションした。その次に、ＴＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体および基質としてｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＮＥＮ）を製造者の方法通りに使用して信号を分析した。結果は、ＬＡＳ−３０００  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてイメージングした。結果は、図１に記載されている。
【０２０６】
図１に示されているように、本願によるアルファ−シヌクレイン抗体は、アルファ−シヌクレインモノマーと比較して、凝集体にのみ選好的に結合することが明らかになった。特に、９Ｂ１１、３Ａ９および１１Ｆ１１は、凝集体にのみ結合することが明らかになった。２７４抗体（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２  Ｓｅｐ  ２６；３２（３９）：１３４５４−１３４６９）は、単量体および凝集体に全て結合する比較抗体である。
【０２０７】
４−２：抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析
本願による抗体の抗原に対する結合力を定量的に分析するために、ＥＬＩＳＡを行った。このために、実施例１で得られたマウス抗−アルファ−シヌクレイン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにコーティングした後、ここに１０、１００、１０００、１０，０００ｎｇ／ｍｌ濃度のアルファ−シヌクレインフィブリル凝集体を処理した後、ＰＢＳで洗浄し、その次に、ビオチンが結合された２次抗体およびＨＲＰが結合されたストレプトアビジンを処理した後、基質としてＴＭＢと反応した後に吸光度を測定し、その測定結果を図２に示した。
【０２０８】
図２に示されているように、本願による抗体は、凝集体に高い結合力で選好的に結合することが明らかになった。ＥＬＩＳＡ結果を通じて抗体を分析してみれば、凝集体選好的に結合する抗体は０．１×１０−９Ｍ〜２×１０−９Ｍ程度の親和力を示し、単量体および凝集体に全て結合する抗体はこれより高い〜１×１０−１０Ｍ値を示した。本発明による抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集体に高い親和度で選好的に結合し、単一体に対しては凝集体より低いかまたは結合しないため、親和度を導出できなかった。このような結果は、パーキンソン病のようなアルファシヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去することができるか、活動を抑制することができるのを示すものである。
【０２０９】
４−３：抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ分析
実施例１で製造されたアルファ−シヌクレイン抗体の単量体および凝集体抗原結合に対する定量的分析をＢＩＡｃｏｒｅを使用して行った。
【０２１０】
機器は、Ｔ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓ／Ｎ：１５６５８８８）を使用した。ＣｈｉｐはＰｒｏｔｅｉｎ  Ａを使用し（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．２９−１２７５−５６）、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒは１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ１．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ−１００３−５４）、Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとａｎａｌｙｔｅ希釈、サンプル希釈緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰを使用した。実施例１で製造されたα−ｓｙｎ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）は１Ｘ  ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ−１００６−６９）で希釈し、α−ｓｙｎ単量体（１ｍｇ／ｍｌ）またはフィブリルタンパク質（３ｍｇ／ｍｌ）（ａｎａｌｙｔｅ）は２倍ずつ順次に希釈して、０ｎＭ含む総６個濃度（０、０．３９、１．５６、６．２５、２５、１００ｎＭ）で分析した。キャプチャの場合、単量体は標的ＲＵを８００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、フィブリルは標的ＲＵを１００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、キャプチャｐｈａｓｅをｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅを６０秒とし、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｅｒｉｏｄを１８０秒として行った。ａｓｓｏｃａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅではａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを１２０秒とし、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅではｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを３６０秒とし、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとした。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅでは、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとして、ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを２４０秒（１次）、６０秒（２次）、二回にわたって行った。１：１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌを使用してｆｉｔｔｉｎｇし、ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅはＢＩＡＣｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。結果は、図３ａおよび図３ｂに記載されている。
【０２１１】
図３ａは、本発明の一例で製造された単クローン抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。本願による抗体が高い親和度で凝集体に結合することを示す。このような結果は、パーキンソン病のようなアルファ−シヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去することができるか、活動を抑制することができるのを示すものである。図３ｂは、図３ａの結果を表で示したものである。
【０２１２】
図３ａおよび図３ｂの結果に示したように、分析した４個のアルファ−シヌクレイン抗体のうちの前述した他の方法で凝集体に選好的に結合する抗体である、３Ａ９、９Ｂ１１、および１１Ｆ１１がＢＩＡｃｏｒｅでも凝集体にのみ結合することが明らかになり、約１〜３×１０−９Ｍの高い親和度を有することが明らかになった。
【０２１３】
４−４．抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いたＯｃｔｅｔ分析
実施例１で製造されたマウスアルファ−シヌクレイン抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）の単量体および凝集体抗原結合に対する定量的分析をＯｃｔｅｔを使用して行った。
【０２１４】
具体的に、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒは１Ｘ  ＫＢ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．１８−１０９２）あるいは１Ｘ  ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを１０００ｒｐｍで使用し、ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒはｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５（１０ｍＭ、Ｃａｔ．１８−１０６８）を使用した。α−ｓｙｎモノマーはα−ｓｙｎ抗原をｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせ、フィブリルの場合、テスト抗体をｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせた。ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは、モノマーの場合、２０μｇ／ｍｌ、フィブリルの場合、０．４μｇ／ｍｌとし、ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは、モノマーの場合５０ｎＭから、フィブリルの場合１００ｎＭから２倍ずつ順次に希釈して総７個のポイントを設定した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ時間は、モノマーの場合５分／２０分、フィブリルは５分／２５分であり、ＢｉｏｓｅｎｓｏｒはＡＲＧ２を、ｆｉｔｔｉｎｇは１：１  ｆｉｔｔｉｎｇを使用した。結果は、図４に記載されている。図４は、本発明の一例で製造された単クローン抗体がα−Ｓｙｎ凝集体に選好的結合特異性をＯｃｔｅｔで分析した結果である。
【０２１５】
図４ａに示されているように、３Ａ９、９Ｂ１１および１１Ｆ１１の場合、単量体にはほとんど結合せず（赤い点線ボックス）、凝集体にはよく結合することが明らかになった（赤い点線ボックス内のグラフが上がる）。このような結果はＤｏｔ  ｂｌｏｔ、Ｏｃｔｅｔ、ＥＬＩＳＡでの結果と類似あるいは一致する結果であって、テストした４個のα−ｓｙｎ抗体のうちの前記他の方法で凝集体に選好的に結合する抗体である、３Ａ９、９Ｂ１１および１１Ｆ１１がＯｃｔｅｔでも凝集体にのみ結合することが明らかになった。図４ｂは、図４ａの結果を表で示したものである。図４ａおよび図４ｂの結果は、アルファ−シヌクレイン凝集体に選好的に結合することを示し、図１の結果と一致するものである。比較群として使用された＃２７４抗体の場合、単量体および凝集体に全てよく結合することが明らかになった。
【０２１６】
実施例５．抗−アルファ−シヌクレイン抗体のヒト脳組織でのレビー小体検出分析
１０マイクロメートルの厚さのパラフィン包埋されたパーキンソン疾患で死亡した患者の脳組織切片を実施例２で得られたキメラ抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いて組織切片内レビー小体とレビー神経突起（ｎｅｕｒｉｔｅ）を次のように染色した。９０％ギ酸で組織切片を３分間処理してａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌを進行させた後、１％  Ｈ２Ｏ２（５０％  ｅｔｈａｎｏｌ  ｂａｓｅ）を用いて組織自体のｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ活性を抑制した。組織のｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇを防止するために、１０％  ｎｏｒｍａｌ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍを処理した。その次に、リン酸緩衝液で洗浄した後、本願による３Ａ９、１１Ｆ１１および１１Ｆ１１抗体をａｄｊａｃｅｎｔ  ｓｅｃｔｉｏｎに４℃で一晩処理した。リン酸緩衝液で洗浄後、ビオチンが結合されたａｎｔｉ−ヒトＩｇＧ抗体を３７℃で３０分間処理した後、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘを常温で３０分間反応させた（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【０２１７】
その次に、０．００５％  Ｈ２Ｏ２を含むＤＡＢで発色し、当該ｓｅｃｔｉｏｎを０．５％ｃｒｅｓｙｌ  ｖｉｏｌｅｔでカウンター染色して各細胞を区分した。結果は、図図図５ａおよび図５ｂに開示されている。
【０２１８】
図５ａおよび図５ｂ図図は、それぞれ本発明の一例による単クローン抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。
【０２１９】
図５ａおよび図５ｂ図に示されているように、本願による抗体はレビー小体およびレビー神経突起に効果的に結合（矢印で表示）することが明らかになった。このような結果は、ヒト脳組織にあるレビー小体の構成成分であるアルファ−シヌクレイン凝集体に効果的に結合できるのを意味するものである。ヒト脳に伝達された抗体が効果的にアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合できるのを示すものである。このような結果は、本願の抗体が実際のヒト脳組織に存在するアルファ−シヌクレイン凝集体と特異的に結合できるのを示すものであって、アルファ−シヌクレイン病因に関連する疾患の予防および／または治療に効果的に使用できるのを示す。
【０２２０】
実施例６．抗−アルファ−シヌクレイン抗体のエピトープ分析
実施例２で得られたキメラ抗−アルファ−シヌクレイン抗体である３Ａ９および１１Ｆ１１抗体に対するエピトープマッピングは、ＰＥＰＳＣＡＮ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にペプチドアレイ分析を依頼して行われた。結果は、図６に開示されている。図６図は、本発明の一例による抗体のエピトープマッピング結果を図式的に示したものである。
【０２２１】
図６図に示されているように、本願による抗体はＣ−末端を認識することが明らかになった。本願による抗体は、大部分Ｃ−末端部位に結合することが明らかになった。Ｎ−末端を認識するアルファ−シヌクレイン抗体はアルファ−シヌクレイン関連疾患を通称するシヌクレイン病に属する多系統萎縮症のような他の疾病の凝集体は認識しないのに対し、Ｃ−末端部位を認識するアルファ−シヌクレイン抗体はパーキンソン病だけでなく、その他の多様なシヌクレイン病の凝集体も認識するという長所を有する。特に、先に説明したように、１１０番目残基〜１２２番目残基からなるペプチドを認識する場合、凝集体選好的な結合を示した。
【０２２２】
実施例７．抗−アルファ−シヌクレイン抗体のＥＬＩＳＡ分析試験
実施例４−２と実質的に同様な方法で、実施例２で得られたキメラ抗体（Ｃｈ１１Ｆ１１）および実施例３で得られたヒト化抗体（Ｈｕ１１Ｆ１１）の結合力を定量的に分析するためにｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを行った。
【０２２３】
具体的に、それぞれ抗体を０．０４〜４００ｎＭの濃度で１／１０ずつ希釈して９６ウェルプレートにコーティングした後、ここに２０００ｎｇ／ｍｌの凝集体を各ウェルに処理した。１ＸＰＢＳで洗浄後、その次にビオチンが結合されたｃａｐｔｕｒｅ抗体およびＨＲＰが結合されたストレプトアビジンを処理した後、基質としてＴＭＢと反応させた後、その吸光度を測定した。結果は、図図７に記載されている。
【０２２４】
図図７に示したように、本発明によるヒト化された抗体、特にキメラ１１Ｆ１１に由来するヒト化抗体（ヒト化１１Ｆ１１抗体）は、キメラ１１Ｆ１１クローンと同等な結合力を示すことが確認された。ヒト化抗体、特に１１Ｆ１１由来ｖａｒｉａｎｔである、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ１とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃはキメラ１１Ｆ１１クローンと類似の結合力を示すことが確認され、そのＥＣ５０は１１．５〜１５．１ｎＭであって、キメラ１１Ｆ１１抗体のＥＣ５０である１２．５ｎＭと類似の値を示した。
【０２２５】
実施例８：抗アルファ−シヌクレイン抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ分析
実施例４−３と実質的に同様な方法で、実施例２で得られたキメラ抗体および実施例３で得られたヒト化抗体の結合力をＢＩＡｃｏｒｅを使用して定量的に分析した。前記分析結果を図図８および下記表に示す。
【０２２６】
［表１０］
2021506770.tif 000118
その結果、本願に記載されたヒト化抗体、特に１１Ｆ１１のｖａｒｉａｎｔ、即ち、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）はキメラ１１Ｆ１１クローンと類似なＫＤ値を示すことが確認され、その結合程度としてはヒト化クローンが０．０２〜０．０６×１０−９ＭのＫＤ、キメラ１１Ｆ１１クローンが０．０２×１０−９Ｍの低いＫＤ値、即ち、凝集体に対する高い結合力を示した。
【０２２７】
実施例９．キメラ抗体のアルファ−シヌクレイン特異的結合評価
９−１：ベータ−シヌクレインおよびガンマ−シヌクレインとのＥＬＩＳＡ分析
実施例２によるキメラ抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１の３種を生産後、当該抗体のアルファ−シヌクレインの結合特異性をそのホモログであるベータ−シヌクレインおよびガンマ−シヌクレインとのＥＬＩＳＡと比較した。
【０２２８】
このために、ヒトベータ−シヌクレイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ１６１４３）タンパク質（ＣＵＳＡＢＩＯ、Ｃａｔ：ＣＳＢ−ＥＰ６２４０９０ＨＵ）、あるいはヒトガンマ−シヌクレイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ７６０７０）タンパク質（ＣＵＳＡＢＩＯ、Ｃａｔ：ＣＳＢ−ＥＰ０２１９１５ＨＵ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにコーティングした後、ｗａｓｈした後に５％  ＢＳＡで２時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。この時、アルファ、ベータ、ガンマ−シヌクレインに全て結合するｐａｎ−Ｓｙｎ抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、Ｃａｔ：ＦＬ−１４０、ｓｃ−１０７１７、ｒａｂｂｉｔ）を陽性対照群として使用した。Ｗａｓｈ後、ここに４００ｎＭから０．０４ｎＭまで１／１０ずつ希釈されたキメラ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）を２時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、その次に、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈＦｃ抗体にＨＲＰが結合されたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を処理した後、基質としてＴＭＢと反応した後、４５０ｎｍ、６５０ｎｍで吸光度を測定し、陽性対照群の場合、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体としてｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ抗体にＨＲＰが結合された抗体を使用した。
【０２２９】
実験結果を図図図９ａおよび９ｂに示し、これは本発明の一例によるキメラ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）のヒトベータ−シヌクレインおよびヒトガンマ−シヌクレインに対する非常に低い結合力をＥＬＩＳＡで分析した結果を示したものである。これとは反対に、陽性対照群であるｐａｎ−Ｓｙｎ抗体は、ベータ−およびガンマ−シヌクレインに対して高い結合力を示した。図９ａは、ヒトベータ−シヌクレインに関するものであり、図９ｂはヒトガンマ−シヌクレインに関するものである。
【０２３０】
９−２：アミロイドベータおよびタウ凝集体に対するドットブロット分析
実施例２によるキメラ抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１の３種をアミロイドベータ１−４２（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０５０６７；ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ：１０７７６１−４２−２）およびタウ（Ｕｎｉｐｏｒｔ：Ｐ１０６３６−８）タンパク質から形成された凝集体とドットブロットで反応させて、当該抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する特異的結合力を分析した。その理由は次の通りである。
【０２３１】
アミロイドベータ１−４２およびタウは凝集体を形成して退行性神経疾患、特にアルツハイマー病の重要な病因と思われ、当該凝集体はアルファ−シヌクレインの凝集体と同様にオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルなどの構造を有すると知られている。したがって、当該ドットブロットは、キメラ抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１がアルファ−シヌクレインの特異的なシークエンスを認識し、アルファ−シヌクレイン、アミロイドベータ、タウ由来凝集体が凝集体として有する共通的な構造を認識しないことを確認するためのものである。
【０２３２】
本実施例のドットブロット方法は前記実施例４−３と実質的に同様な方法で行われ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔアミロイドベータ１−４２およびタウタンパク質およびこれに対する凝集体はソウル大学校のイ・スンジェ教授ｌａｂで製造された。Ｓｙｎ−１、６Ｅ１０、Ｔａｕ５は、それぞれアルファ−シヌクレイン、アミロイドベータ１−４２、タウタンパク質に結合すると知られた抗体である。分析結果は、図図９ｃに記載された。
【０２３３】
実験結果を図９ｃ図に示し、これは、本願のキメラ抗体である３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１がアルファ−シヌクレイン由来凝集体にのみ特異的に結合し、アミロイドベータ１−４２およびタウ由来凝集体には結合しないのを示した結果である。これとは異なり、アミロイドベータ１−４２およびタウにそれぞれ結合すると知られた６Ｅ１０およびＴａｕ５抗体は、ドットブロット上で当該凝集体に結合するのを示した。
【０２３４】
前記の結果により、当該キメラ抗体がアルファ−シヌクレインのホモログおよび異なるタンパク質由来凝集体に結合しないのは、当該抗体がターゲットタンパク質にのみ効率的に結合してホモログおよび異なるタンパク質由来凝集体に結合する抗体あるいは薬物と比較してその効能が優れるのを示唆する。
【０２３５】
実施例１０：二重特異抗体の製造
１０−１：Ｂｉｖａｌｅｎｔ二重抗体クローニング
Ｂｉｖａｌｅｎｔ二重抗体発現ベクターを製作するために、ｐｃＤＮＡ３．４（ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターのＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）内にｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを含む抗体ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を挿入した。二重抗体発現ベクターはモノシストロン性ベクターであって、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターをそれぞれ製作した。
【０２３６】
重鎖発現ベクターに挿入された重鎖配列の場合、抗ａ−Ｓｙｎ抗体をコーディングする重鎖可変領域およびヒト重鎖不変領域が連結された免疫グロブリンＣ末端に抗ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖがリンカーで連結された形態である。軽鎖発現ベクターに挿入された軽鎖配列の場合、抗ａ−Ｓｙｎ抗体をコーディングする軽鎖可変領域およびヒト軽鎖不変領域が連結された形態である。
【０２３７】
１０−２：Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体クローニング
Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体は、抗ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖがＣ  ｔｅｒｍｉｎａｌにリンカーで接合されている抗ａ−Ｓｙｎ免疫グロブリン重鎖（ｈｏｌｅ）とｓｃＦｖが連結されていない抗ａ−Ｓｙｎ免疫グロブリン重鎖（ｋｎｏｂ）が結合した異種二量体に抗体軽鎖が接合された形態である。
【０２３８】
重鎖異種二量体の接合効率を高めるために、Ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ技法が用いられた。即ち、Ｈｏｌｅ  ｔｙｐｅ重鎖ｃｏｄｉｎｇ配列はＣＨ３部分でＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０６Ｖで置換し、ｋｎｏｂ  ｔｙｐｅ重鎖ｃｏｄｉｎｇ配列はＣＨ３部分でＴ３６６Ｗでａｍｉｎｏ  ａｃｉｄで置換した。
【０２３９】
１０−３：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
前記製造されたベクターをｍａｘｉ−ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）して、多量のｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを確保後、次のように細胞に導入した。ＢｓＡｂを生産するために、重鎖発現ベクターＤＮＡおよび軽鎖発現ベクターＤＮＡを１：１の比率で形質導入した。ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＢｓＡｂを生産するためには、ｈｏｌｅ  ｔｙｐｅ重鎖発現ベクターＤＮＡ、ｋｎｏｂ  ｔｙｐｅ重鎖発現ベクターＤＮＡおよび軽鎖発現ベクターＤＮＡを０．５：０．５：１の比率で形質導入した。
【０２４０】
形質注入前日、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣＨＯＴＭ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１００−０１）培地に３×１０Ｅ６〜４×１０Ｅ６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度を合わせた後、８％  ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日、７×１０Ｅ６〜１０×１０Ｅ６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上に育った細胞を新鮮な培地を用いて６×１０６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬで希釈して準備した。
【０２４１】
準備された母細胞への形質注入のために、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ＆  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ複合体を準備した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯＴＭＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注して、滴定濃度で準備したＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、ｍｉｘして常温で５分間定置し、母細胞に接種して形質注入後、培養を始めた。形質注入翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔに含まれているｅｎｈａｎｃｅｒおよびｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％  ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して生産を完了した。
【０２４２】
１０−４：Ｍｅｄｉｕｍ  ｈａｒｖｅｓｔ
生産が完了した培養液の収得のために遠心分離用瓶に培養液を移して４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、０．２μｍの大きさのフィルターでフィルタリングを行って、浮遊物を除いた培養液を確保して、その後、精製過程を行った。
【０２４３】
実施例１１．ＩＧＦ１Ｒ抗体製造（ｓｃＦＶ）
１１−１：ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｓｃＦＶ）の製造
ファージディスプレイ／パニング技術を用いて単一クローン抗体を製造した。
具体的に、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体製造のためのファージディスプレイパニング遂行およびその他の分析に使用される抗原を次のようなタンパク質を使用した。ヒトＩＧＦ１Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）で信号配列が除去された配列番号９９アミノ酸残基の３１番から９３２番のアミノ酸配列のＣ−末端にヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ  ｔａｇ）が結合されたものを使用した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ、３９１−ＧＲ）。また、種間交差反応性を確認するために、Ｃ末端にＨｉｓ  ｔａｇが融合されたサルＩＧＦ１Ｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）、マウスＩＧＦ１Ｒ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、６６３０−ＧＲ／ＣＦ）、およびラットＩＧＦ１Ｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）のタンパク質を抗原として使用した。
【０２４４】
多様性を有するヒト由来ＳｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリー細胞（ＯＰＡＬ  ｌｉｂｒａｒｙ、梨花女子大学校のシム・ヒョンボ教授製作）１×１０１０個をクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍｌ、２％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５４００）および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２３９３）が含まれている２Ｘ  ＹＴ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ、１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ、１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）５ｇ］培地に接種後、３７℃で３時間程度培養してＯＤ６００値が０．５から０．７になるようにした後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を感染させた後、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）を添加した２Ｘ  ＹＴ培地で３０℃、１６時間培養してファージパッキングを誘導した。その次に、培養液を４５００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離した後、上澄み液に４％  ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、８１２５３）と３％  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。これを再び４℃条件で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで懸濁した後、再び４℃条件で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してライブラリーファージを含む上澄み液を得て、新しいチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。
【０２４５】
１１−２：ファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
ヒトＩＧＦ１Ｒ抗体をスクリーニングするために、次のような方法で総３回パニングを行った。本発明に使用されたファージライブラリーは合成ヒトｓｃＦｖライブラリーであり、ファージディスプレイパニング過程および結果は次の表１１の通りである。
【０２４６】
［表１１］
2021506770.tif 000119
【０２４７】
具体的に、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ  ４４４２０２）に５ｕｇ／ｍｌ濃度の組換えヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ、３９１−ＧＲあるいはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ、１０１６４−Ｈ０８Ｈ−５０Ｒ）を１ｍｌ添加して４℃で１６時間試験管表面にコーティングした後、上澄み液を除去し、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）３％が含まれているＰＢＳ溶液を４ｍｌ添加して３７℃で１時間反応させてＩＧＦ１Ｒが吸着していない表面にＢＳＡを結合させることによって非特異的な結合を遮断した。その次に、上澄み液を除去した後、実施例１１−１で準備したファージライブラリーをＢＳＡ  １．５％溶液と混合して前記免疫試験管に３７℃で１時間反応させて、ＩＧＦ１Ｒ特異的なファージが抗原に結合するようにした。その次に、ＰＢＳ−Ｔ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）溶液で１回洗い落として、非特異的に結合されたファージを除去した後、１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いてＩＧＦ１Ｒに結合したファージを回収した。
【０２４８】
回収されたファージを１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で中和させた後、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＥＲ２７３８大腸菌に３７℃で１時間感染させた後、前記大腸菌をテトラサイクリンとカルベニシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌をテトラサイクリンとカルベニシリンを含有した５ｍｌのＳＢ（ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）培地に懸濁し同一体積の５０％グリセロールを添加して、一部は８０℃に保管し、残りの中の５０ｕｌを４０ｍｌのＳＢ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地に懸濁した後、１０１２ＰＦＵのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を入れて徐々に攪拌しながら３７℃で１時間培養した。その後、培養液にカナマイシンを添加後、３０℃で約１６時間培養してヘルパーファージが感染された大腸菌のみが培養されるようにした。
【０２４９】
翌日、培養液を遠心分離した後、上澄み液を取って４％  ＰＥＧ８０００、３％  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むバッファーを添加して４℃で約１時間反応させファージを沈殿させて遠心分離した。その次に、上澄み液を除去し沈殿したファージを１％  ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーで再懸濁して、これを次のラウンドのパニングに使用した。上記のような過程を４回繰り返し、パニングラウンドが進行するほど、ＰＢＳ−Ｔを用いた洗浄回数を増加させて抗原特異的ファージを増幅および濃縮した。
【０２５０】
１１−３：単一クローンファージ抗体選別（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
ヒトＩＧＦ１ＲのＥＣＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）に対する結合力（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）だけでなく、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞株であるＭＣＦ−７に対する結合力を示す（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）クローンを選別した。
【０２５１】
具体的に、実施例１１−２によって得られたファージプール（Ｐｈａｇｅ  ｐｏｏｌ）からＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する単一クローン抗体を選別するために次のような実験を行った。
【０２５２】
濃縮されたプールから単一クローンを分離するために、ＬＢ−テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に得られたファージプールを塗抹、培養して単一コロニーを確保した。このコロニーを９６ディープウェルプレートに接種して一晩培養した後、培養液１０ｕｌを同じ方法で９６ディープウェルプレートに再接種し３７℃で約４時間培養して滴定ＯＤ（０．５〜０．７）になるようにした。前記培養液に２０  ＭＯＩ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅを入れた後、３７℃で１時間反応させた。その後、培養液にカナマイシンを入れ、３０℃で一晩培養した。翌日、培養液を遠心分離して上澄み液を取って、ＩＧＦ１Ｒ特異的ファージを選別するためのＥＬＩＳＡを行った（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ．Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ．２０００．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＮＹ．ＵＳＡ．ｐｐ．１１．９−１１．１２）。
【０２５３】
ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅに組換えＩＧＦ１Ｒを各ウェル当り１００ｎｇ入れ、４℃で約１５時間反応させて、抗原をｐｌａｔｅ上にコーティングした。非特異的結合を防止するために３％  ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーをウェル当り２００ｕｌずつ添加した後、３７℃で約１時間反応させた。上澄み液を捨てた。
【０２５４】
前記準備した単一クローンファージが含まれている１００ｕｌの溶液を各ウェルに入れて３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ  ３００ｕｌで３回洗浄した。ＩＧＦ１Ｒ抗原に結合されたｐｈａｇｅを検出するために、３％  ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーに抗−ＨＡ  ＨＲＰを１：５０００で希釈した後、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ  ３００ｕｌを用いた洗浄過程を３回行った後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００ｕｌを入れて発色させた後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０ｕｌを入れて反応を終了した。これを４５０ｎｍで吸光度を測定して、対照群であるＢＳＡに比べて吸光度が高いクローンを抗原特異的抗体クローンとして選別した。
【０２５５】
２回のスクリーニングにわたって総７種の１５６４、４８Ｇ５、４９Ｇ１１、５４Ｈ４、６０Ａ１１、６０Ｈ６、Ｂ１１クローンを選別した。
【０２５６】
実施例１２．ＩＧＦ１Ｒ抗体の変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔ）の製造
リガンド結合力およびＢＢＢ通過能を評価して選別されたクローンに対してａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎを行って抗体を最適化した。１次試みでは１５６４  ｓｃＦｖを基にしてｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎのＣＤＲ２とｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎのＣＤＲ３をｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎするためのＮＮＳ  ｈａｎｄ−ｍｉｘ  ｐｒｉｍｅｒを製作し、ＰＣＲ技法を用いてｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ配列が含まれている１５６４  ｓｃＦｖ遺伝子を増幅させた。増幅された遺伝子はｐＣｏｍｂ３ｘ  ｖｅｃｔｏｒに挿入することによってｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙに適したライブラリー形態に作り、ｌｉｂｒａｒｙ  ｐａｎｎｉｎｇおよびＥＬＩＳＡ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇによってＩＧＦ１Ｒに結合する複数のｓｃＦｖクローンを選別することができた。選別されたクローンは遺伝子シークエンシングによって可変部位のアミノ酸配列を確認した。
【０２５７】
２番目の試みではＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３にそれぞれｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎを導入したｈｅａｖｙ、ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎに対する２個のｍｉｎｉ  ｌｉｂｒａｒｙを製作した。９６個のコロニーを分析して、そのうちの３１個のＶＬクローンと３９個のＶＨクローンが独特（ｕｎｉｑｕｅ）のシークエンスを有するのを確認した。当該クローンの生産性および抗原結合力を基にして変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔ）を選別して、最終的に表７のクローンを確保した
【０２５８】
実施例１３．Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｕｅ変異抗体製造
１３−１：Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｕｅ確認
ＣＤＲにｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生すれば、抗体が分解されながら抗原への結合が弱くなって効能低下およびｓａｍｐｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｔｙが誘発されることがあり、Ｓａｍｐｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙは向後の臨床承認などでそのｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎのため複雑性を誘発する。したがって、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析およびｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇによってｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生する位置を確認しようとした。
【０２５９】
図８ａに示したように、ｐａｒｅｎｔａｌである１５６４クローンのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析とｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇで実際ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが起こることを確認した。この時、試料を４℃あるいは４０℃に１週間保管した後に分析を行い、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２でｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生するのを確認した。実施例１２に開示されたａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔに対しても分析を行ってｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ発生位置を確認した。
【０２６０】
１３−２：変異抗体製造
Ｐａｒｅｎｔａｌ  ｃｌｏｎｅである１５６４クローンは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析でｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅが−０．７である。通常、ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅが＜０あるいは＞５．５である場合、体内でｆａｓｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅにぜい弱であると考えられる。したがって、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｕｅをｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅであるＨ、Ｒ、Ｋなどで置換すれば、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎもなくし全体ｃｈａｒｇｅを上げてｆａｓｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅを防止することができると考えた。したがって、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生する位置を図１８ｂのように置換したｍｕｔａｎｔを生産した。
【０２６１】
Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｕｅを無くす作業−以下のｒｅｓｉｄｕｅで置換したｍｕｔａｎｔ生産した。
１）アミノ酸配列で、ＡｓｎをＡｓｎと類似したＤあるいはＱに変えた。結合力に変化がないことが確認されれば、当該ｒｅｓｉｄｕｅは全てＱで置換する。
２）使用されたｐａｒｅｎｔａｌクローンのｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅは−０．７。ｆａｓｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅが誘発されるｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅは＜０あるいは＞５．５であるので、Ｃｈａｒｇｅがｐｏｓｉｔｉｖｅに変わるほど有利である。したがって、ＬＣＤＲ３のｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ発生ｒｅｓｉｄｕｅであるＮ９５ａはｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅを帯びるＨ、Ｒ、Ｋで置換した。
【０２６２】
総７個のｍｕｔａｎｔはｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４クローンと比較した時、ＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤに対する結合力に大きな変化がないながら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇでｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが無くなった。これは、図１８ｃに明示されている。さらに、Ｈ、Ｒ、Ｋに変えたｍｕｔａｎｔはｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅの上昇で体内でｃｌｅａｒａｎｃｅの減少によるＰＫ増大効能が予想される。
【０２６３】
実施例１４．多様な形態の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の製造
１４−１：抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ形態の抗体製造
実施例１１〜１３で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のｓｃＦｖ全体をＦｃのＣ−末端に連結してミニボディを製造した。このために、表１２に開示されたｓｃＦＶのアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を製造し、この配列を制限酵素で切断して、Ｆｃをコーディングする核酸を含むｐｃＤＮＡ基盤の発現ベクターにクローニングした。
【０２６４】
１４−２：抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｂｉｖａｌｅｎｔ形態の抗体製造
実施例１１〜１３で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のｓｃＦｖ全体を、治療抗体ＩｇＧ形態のＣ−末端それぞれに二つを連結したｂｉｖａｌｅｎｔ形態を製作した。このために、表１２に開示されたｓｃＦＶのアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を製造し、この配列を制限酵素で切断して、治療抗体をコーディングする核酸を含むｐｃＤＮＡ基盤の発現ベクターにクローニングした。
【０２６５】
１４−３：抗−ＩＧＦ１Ｒ  ＩｇＧ（Ｆｕｌｌ−ＩｇＧ）形態の抗体製造
実施例１１および１２で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のうち、５６４抗体およびＦ０６抗体の配列を全体ＩｇＧ１（Ｆｕｌｌ  ＩｇＧ）形態に変換するために、重鎖と軽鎖領域の遺伝子配列を合成した（ゼノテック（ｇｅｎｏｔｅｃｈ））。合成した重鎖および軽鎖遺伝子は、発現ベクターにクローニングした。抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖ一つが連結された重鎖一つ、そうでない重鎖一つ、そして共通した軽鎖から構成された構造を有するｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態が入っていてｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態の抗体を製造した。
【０２６６】
１４−４：抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態の抗体製造
実施例１４−１が重鎖二つのＦｃのＣ−末端それぞれに抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｓｃＦｖ形態に結合したｍｉｎｉｂｏｄｙ形態であれば、本実施例では重鎖中の一箇所のＦｃ  Ｃ−末端にのみｓｃＦｖ一つが結合したｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態で抗体を実施例１１〜１３で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のうちの１５６４、Ｆ０６、Ｃ０４、ＶＨ５、ＶＨ１６、ＶＨ３５、ＶＨ９、ＶＨ２、ＶＨ７、ＶＨ３２をＦｃ  Ｃ−末端中一箇所にのみ結合させたベクター、Ｃ−末端に抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合されていないベクターを製作した。当該Ｆｃ内にはｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎを導入して、細胞で抗体生産時、ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ形態が製作されるようにした。
【０２６７】
１４−５：多様な抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の発現および精製
実施例１４−１〜１４−３で製造されたベクターを次のように細胞に導入した。
具体的に、ＣＨＯ−Ｓ細胞をＣＤ−ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ、１０７４３）培地に１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで濃度を合わせた後、８％  ＣＯ２、３７℃で１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日、２．５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに育った細胞を１％  ＤＭＳＯが含まれているＣＤ−ＣＨＯ培地を用いて２．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で準備した後、８％  ＣＯ２、３７℃で３ｈｒ培養した。３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離後、上澄み液を除去した後、２．５％  ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。
【０２６８】
その次に、ベクターの組み合わせを培地ｍｌ当り１μｇずつＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に希釈し、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６、ｓｔｏｃｋ濃度：１ｍｇ／ｍｌ）は培養培地ｍｌ当り８μｇ希釈した。ＤＮＡおよびＰＥＩ混合物を混合して、常温で１０ｍｉｎ間静置した後、細胞が含まれているフラスコに入れた後、５％  ＣＯ２、３７℃、１００ｒｐｍで４ｈｒ培養した後、培養ボリュームの同一なボリュームのＣＤ−ＣＨＯ培地を入れた後、８％  ＣＯ２、３７℃、１１０ｒｐｍで４日間培養した。
【０２６９】
前記得られた培養液を、平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を通過させて平衡化したＭａｂ  ｓｅｌｅｃｔｓｕｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍＬ）に通過させて発現された抗体がカラムに結合するようにした。その後、５０ｍＭ  Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で溶出させた後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて中和させて、最終ｐＨが７．２になるようにした。その後、緩衝液をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）に交換して、純度が高い場合、製形後−２０℃に冷凍保管し、追加精製が必要な場合、追加精製時まで４℃に保管した。
【０２７０】
追加精製が必要な場合、Ｈｉｌｏａｄ  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−９８９３−３６）を使用して精製し、多様な他のｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを使用して精製することができる。平衡化バッファー（１ｘ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００１０−０２３）を使用して平衡化させた後、１次精製が完了した試料をカラムにローディングした。精製完了した試料は、製形後−２０℃に冷凍保管した。
【０２７１】
１４−６：抗ａ−Ｓｙｎ（アルファ−シヌクレイン）との二重抗体製造
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体をリンカー（配列番号１７２）を使用して重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結してｓｃＦＶに製造し、下記表に記載された抗ａ−Ｓｙｎ抗体の完全な形態のＩＧＧ抗体の重鎖不変領域のＣ末端にリンカー（配列番号１７３）によって連結して二重抗体を製造した。本実施例では、抗ａ−Ｓｙｎ抗体の完全な形態のＩＧＧ抗体１分子当り、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖ形態一つ分子を連結して製造したｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ抗体と、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖ形態二つ分子を連結して製造したｂｉｖａｌｅｎｔ抗体をそれぞれ製造した。本実施例で二重抗体製造のために使用した抗ａ−Ｓｙｎ抗体の例示的配列を下記表に示し、本件発明によって製造した二重抗体の組換え重鎖の組み合わせおよび軽鎖を下記表に記載した。その後、実施例で下記例示された二重抗体に対する実験を行った。
【０２７２】
二重抗体製造に使用されたａ−ｓｙｎ抗体の重鎖および軽鎖配列
2021506770.tif 000120
2021506770.tif 000121
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2021506770.tif 000123
2021506770.tif 000124
【０２７３】
二重抗体の組み合わせ説明
2021506770.tif 000125
2021506770.tif 000126
【０２７４】
実施例１５．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ特異的結合力分析
１５−１：Ｍｉｎｉｂｏｄｙ形態抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒに対する結合力分析（ＥＬＩＳＡ）
実施例１４−１で製作した９９６、１２２６、１５６４、ＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ形態が組換えＩＧＦ１Ｒに対する結合力および濃度依存的に結合するか否かを確認するためにＥＬＩＳＡ分析を行った。
【０２７５】
具体的に、抗体結合対象であるヒト組換えＩＧＦ１Ｒはｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ（ＥＣＤ）であって、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した（６６３０−ＧＲ／ＣＦ）。９６−ウェルＥＬＩＳＡｐｌａｔｅに（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）ヒトＩＧＦ１ＲをＰＢＳバッファーに１ｕｇ／ｍｌで希釈してウェル当り１００ｕｌ入れた後、４℃で１６時間反応してコーティング後、上澄み液を除去した。３％  ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれているＰＢＳバッファーをウェル当り２００ｕｌ入れ２時間反応させて非特異的結合を遮断させた。
【０２７６】
実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４、ＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体を最高濃度２０ｎＭを基準にして３倍ずつ希釈して１２ポイントを作った後、各ウェルに１００μｌずつ移した後、常温で１時間処理後に、Ｔｗｅｅｎ２０が０．０５％含有されたＰＢＳバッファーを用いて４回洗浄し、ｍｉｎｉｂｏｄｙに存在するｈｕｍａｎ  Ｆｃを認知する抗−ｈｕｍａｎ  ＨＲＰをブロッキングｂｕｆｆｅｒに１：５０００で希釈し各ウェルに１００ｕｌずつ移して１．５時間常温で反応させた。再びＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％）３００ｕｌを用いて４回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）を使用して発色させた。酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸によって中止させ、マイクロプレートリーダー機（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を記録および分析した。前記実験結果を図１ａに示した。
【０２７７】
ｍｉｎｉｂｏｄｙ４種クローンがヒトＩＧＦ１Ｒ組換えタンパク質に濃度依存的に結合し、具体的に、ＭＫＪＰ２が最も優れた結合力を、その次に９９６と１５６４が類似した結合力を示すのを確認し、１２２６はそれより若干落ちる結合力を示すのを確認した。
【０２７８】
１５−２：：ＩＧＦ１Ｒ抗体の種間交差反応性のＥＬＩＳＡ分析
実施例１４−２の方法によって製作した１５６４抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と、実施例１１−３で確保した抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の種間交差結合有無をＥＬＩＳＡ技法によって分析した。このために、まず、ヒト、サル、マウスおよびラットＩＧＦ１Ｒ抗原を１ｕｇ／ｍｌで希釈して各ウェルに１００ｕｌずつ入れ、４℃で１５時間反応してプレートの底にコーティングされるようにした。上澄み液を除去した後、３％  ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファー２００ｕｌを各ウェルに処理して非特異的な結合を遮断した。抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を最高濃度４００ｎＭにして、ＰＢＳＢ（ＢＳＡ３％  ｉｎ  ＰＢＳ）に５倍ずつ希釈して前記各ウェルに処理した後、３７℃で１時間反応した。その次に、ＰＢＳバッファーを用いて５回洗浄した後、結合された抗体のＦａｂ部分を認知する抗−ヒトＦａｂ  ＨＲＰを１：２００００で希釈して各ウェルに１００ｕｌ処理した後、３７℃で１時間反応させた、その次にＰＢＳバッファーで５回洗浄し、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）を使用して製造者の方法通りに発色させた。酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸によって中止させ、マイクロプレートリーダー機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ遂行時、サンプルが多い場合はプレートを２つに分けて行い、実験結果は次の表１２に示した。
【０２７９】
具体的に、表１２でヒトＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、１５６４ＩｇＧと二重特異抗体のヒトＩＧＦ１Ｒに対するＥＬＩＳＡ結果、マウスＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、ラットＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、サルＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果を下記表１２に整理した。
【０２８０】
下記の実験結果は多様な種の動物モデルを用いて効能を評価することができる長所を示すものであって、本願発明による抗体を用いて多様な種の疾患モデルを通じた治療剤の効能評価が可能であるのが分かる。
【０２８１】
［表１２］多様な種のＩＧＦ１Ｒに対する抗体結合力のＥＬＩＳＡ分析結果
2021506770.tif 000127
＊：ｎｏｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ
＊＊２０１：ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ
【０２８２】
１５−３：Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔのＩＧＦ１Ｒに対する結合力分析（ＦＡＣＳ）
実施例１２で製作されたａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔの結合力をＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対するＥＬＩＳＡ遂行およびＭＣＦ−７に対する結合力をＦＡＣＳで分析した。
【０２８３】
１次クローンに対する分析で、表１３は１次選別された当該クローンの二重特異抗体形態でのＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡ分析結果であり、表１４はＭＣＦ−７細胞株への結合をＦＡＣＳで分析した結果である。
【０２８４】
［表１３］１次選別された当該クローンの二重特異抗体形態でのＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡ
2021506770.tif 000128
【０２８５】
［表１４］ＭＣＦ−７細胞株への結合をＦＡＣＳで分析した結果
2021506770.tif 000129
【０２８６】
その結果、Ｆ０６が最もｐａｒｅｎｔａｌクローン（１５６４クローン）と比較して細胞結合において最も高い結合力を有するクローンに選定され（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ）、Ｃ０４はｐａｒｅｎｔａｌ（１５６４クローン）より細胞結合力が最も落ちるクローンに選定された（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ）。
【０２８７】
２次クローンに対する分析で、表１５は２次製作方法で製作されたクローンの二重特異抗体形態でのＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡである。
【０２８８】
［表１５］２次選別クローンのＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結果
2021506770.tif 000130
【０２８９】
２次製作されたクローンのうちの生産性および物性が顕著に落ちるクローンを除いた後、ＦＡＣＳ分析を行うクローンを表１６のように選定した。
【０２９０】
［表１６］ＦＡＣＳ分析を行うクローン
2021506770.tif 000131
【０２９１】
図１２ｃは当該クローンのＭＣＦ−７細胞株への結合をＦＡＣＳで分析した結果であり、分析クローン全てがｐａｒｅｎｔａｌクローンである１５６４に比べてＭＣＦ−７に対する結合力が落ちた。当該結果は、ＥＬＩＳＡで結合力低下を示したクローンがＦＡＣＳでも結合力低下を示すのを示す。
【０２９２】
選別された抗体クローンはＦ０６、Ｃ０４、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２＿であり、これら抗体に対する重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列は前記表５および表６に示した。
【０２９３】
１５−４：Ｈｕｍａｎ  ＩＧＦ１Ｒに対するＢＩＡｃｏｒｅ分析
本発明による抗体とヒトＩＧＦ１Ｒ間の結合力を分析しようとした。
１５６４クローンのＩｇＧ形態に対してＳＰＲ分析でヒトＩＧＦ１Ｒに対する結合程度を分析した。抗原であるヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤに結合されたＨｉｓ  ｔａｇに対する抗−ｈｉｓ抗体をａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ４．０  ｂｕｆｆｅｒに２０μｇ／ｍｌで希釈した後、ＣＭ４  ｃｈｉｐにａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ方法でｒｅｆｅｒｅｎｃｅ／ａｎａｌｙｔｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌにｔａｒｇｅｔ  ＲＵを１０，０００ＲＵにｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅした。Ｃａｐｔｕｒｅの間、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとしてはＰＢＳを使用した。Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは３０μＬ／ｍｉｎを維持した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの間、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは４０μＬ／ｍｉｎ、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとしてはＰＢＳを使用した。ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｄｉｓｓｓｏｃｉａｔｉｏｎはそれぞれ５分、２０分であった。分析は、ｂａｓｅｌｉｎｅ  １、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＥＤＣ＋ＮＨＳ）、ヒトＩＧＦ１Ｒ  ｌｏａｄｉｎｇ、ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ（１Ｍ  Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ｂａｓｅｌｉｎｅ  ２、ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ順に行われた。Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎはｂｉｖａｌｅｎｔモデルを使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０、Ｓ／Ｎ：０４Ｙ１５Ｘ１１−０１４９）を使用して分析した。
【０２９４】
分析結果、１５６４ＩｇＧ抗体のＫＤは２．５３０５×１０−９ｎＭに、Ｆ０６  ＩｇＧ抗体は４．７８０２×１０−７ｎＭに確認されて、全てヒトＩＧＦ１Ｒに高い結合力を示すのを確認した。分析の結果は図１１ｂである。特に、１５６４クローンをＩｇＧ形態に製作した時、ヒトＩＧＦ１Ｒに２．５３０５×１０−９ｎＭの解離定数を示すのを確認して、１５６４はその形態によって結合力に大きな変わりがないのを確認した
【０２９５】
実施例１６．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のヒトＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株および脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）に対する結合力分析
１６−１：ＭＣＦ−７に対するＦＡＣＳ分析
実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、および１５６４クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ形態が、細胞表面のｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＧＦ１Ｒに結合するか確認するために、ヒトＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株および脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）に対する結合力分析をＦＡＣＳで行った。Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔとＩＧＦ１Ｒが過発現すると知られたＭＣＦ−７、乳癌細胞株との結合程度をＦＡＣＳで確認した。
【０２９６】
具体的に、サンプル当り０．４３×１０Ｅ６のＭＣＦ−７細胞株に、前記３種のｍｉｎｉｂｏｄｙをそれぞれ２０ｕｇ／ｍｌで希釈後、処理して４℃で１時間反応させた。ＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄後、抗−ｈｕｍａｎ  ＦＩＴＣを１：５００で希釈して処理、４℃で１時間反応させた。再びＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を用いて抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｍｉｎｉｂｏｄｙが結合された程度を測定した。対照群としてｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙのみ処理したＭＣＦ−７細胞を使用した。前記実験結果を図１２ａに示した。
【０２９７】
実施例１２および実施例１４−２で製作されたＡ０２、Ａ０６、Ａ０７、Ｂ０１、Ｂ０２、Ｂ０９、Ｂ１０、Ｃ０４、Ｄ０３、Ｅ０６、Ｆ０６、Ｈ０４（Ｇｌｙ）、Ｈ０４（Ｖａｌ）、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２、ＶＨ３５を前記と同様な方法でＭＣＦ−７に対する結合力を分析した。１５６４クローンを実施例１４−２方法で製作してｐａｒｅｎｔａｌクローンとして比較し、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙのみ処理したＭＣＦ−７細胞を対照群として使用した。分析結果は表１４および図１２ｃに示した。
【０２９８】
前記実験結果によって、当該サンプルのＭＦＩ（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で示し、テストした３種のｍｉｎｉｂｏｄｙ内のｓｃＦｖおよび二重特異抗体形態のａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔおよびｐａｒｅｎｔａｌクローン（１５６４クローン）が細胞表面に発現されるｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。当該結果は、前記例で確保されたクローンが体内に実際に存在する形態のＩＧＦ１Ｒに結合して意図した目的で使用できるのを示す結果である。
【０２９９】
１６−２：ＪＩＭＴ−１およびＢＴ４７４に対するＦＡＣＳ分析
実施例１６−１で使用したＭＣＦ−７細胞株の代わりに、ＪＩＭＴ−１およびＢＴ４７４乳癌細胞株を使用したことを除いては実質的に同様な方法で実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、および１５６４クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ形態が、細胞表面のｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓのＩＧＦ１Ｒに結合するか確認した。前記実験結果を図１２ａに示した。
【０３００】
前記実験結果によって、当該サンプルのＭＦＩ（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で示し、テストした３種のｍｉｎｉｂｏｄｙ内のｓｃＦｖがＩＧＦ１Ｒ発現多様な細胞株表面のｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。
【０３０１】
１６−３：マウス脳内皮細胞に対するＦＡＣＳ分析
実施例１４−２方法で製作した１５６４クローンの二重特異抗体形態と実施例１４−３方法で製作した１５６４クローンのＩｇＧ形態がマウスの脳内皮細胞であるｂＥＮＤ．３に結合するかを分析した。この時、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ抗体のみ処理グループおよび治療抗体単独ＩｇＧ（ＣＨ１１Ｆ１１）処理グループを陰性対照群として使用した。ＦＡＣＳ分析法は実施例１６−１および１６−２と同様に行った。分析結果は図１２ｂに示した。
【０３０２】
試験したテストクローン全て陰性対照群を除いてｂＥＮＤ．３に対して結合力を示した。当該結果を通じて多様な形態の１５６４クローンが脳内皮細胞表面に発現するＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。
【０３０３】
実施例１７．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ分析
１７−１：ＭＣＦ−７  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ−１５６４、９９６、１２２６、ＭＫＪＰ２（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）
実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ形態が、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株でｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされ、細胞内に導入された抗体は分解されずＲＭＴ  Ｐａｔｈｗａｙを経るかを確認しようとした。抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＢＢＢ通過能を向上させるシャトルとして使用されるためには、当該抗体がＢＢＢを構成するｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされることが先行されなければならない。
【０３０４】
ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ−７細胞株を用いて発明による抗体が細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされるかを分析した。具体的に、８−ｗｅｌｌ  ｓｌｉｄｅ  ｃｈａｍｂｅｒ内に３０，０００個のＭＣＦ−７細胞株をｐｌａｔｉｎｇした後、１日間培養した。実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体をそれぞれ５μｇ／ｍｌずつ４℃で各ｗｅｌｌに２時間処理し、冷たいＤＭＥＭ培養液で３回洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体をまた４℃で１時間処理した。
【０３０５】
抗体ｃｏｍｐｌｅｘのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎをテストするために、当該ｐｌａｔｅをＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒに移して３７℃で３０分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。１００％メタノールを入れてｃｕｌｔｕｒｅを固定すると同時に反応を終了した。固定後にはＰＢＳで３回洗浄した。蛍光顕微鏡上で抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ程度をｇｒｅｅｎ  ｆｉｌｔｅｒ領域（Ａｌｅｘａ４８８）でイメージングした。イメージング時に、ＤＡＰＩを用いて細胞内核を染色して各細胞の位置を確認した。前記実験結果を図１３ａに示した。
【０３０６】
前記実験結果から、ＭＣＦ−７細胞株を用いた実験でもテストした４種抗体全てｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎがよく起こるのを確認することができ、特に、ＭＫＪＰ２と１５６４のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが他のクローンに比べて多く起こることが分かった。
【０３０７】
１７−２：ＭＣＦ−７  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ−Ｃ０４、Ｆ０６、ＶＨ５、ＶＨ１６、ＶＨ３５、ＶＨ９、ＶＨ２、ＶＨ７、ＶＨ３２
ＩＧＦ１Ｒに対する結合力を変化させた１５６４  ｖａｒｉａｎｔの細胞表面ＩＧＦ１Ｒ結合を分析するために、ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ−７細胞株を用いてＦＡＣＳ分析を行った。ｓｃＦｖ形態の二重抗体から製作されたＩＧＦ１Ｒ抗体を１０ｕｇ／ｍＬ濃度で２×１０Ｅ５のＭＣＦ７細胞に３０分間処理した。１％  ＢＳＡが添加されたＰＢＳバッファーで洗浄した後、ヒト抗体をｄｅｔｅｃｔｉｏｎするＦＩＴＣが結合された２次抗体を１時間処理した。ＰＢＳバッファーで洗浄した後、ＦＡＣＳ分析によって結合力が変化多様なｖａｒｉａｎｔの細胞外結合およびｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを確認した。
【０３０８】
表１７の結果のように、１５６４  ＩＧＦ１Ｒ抗体が含まれている二重抗体は冷蔵条件より３７℃条件でｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが増加してｉｎｔｅｎｓｉｔｙが増加するのを確認し、細胞結合程度が高かったＦ０６クローンも、ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが増加するのを確認した。このような結果は、１５６４  ｖａｒｉａｎｔが細胞によく結合して結合依存的に細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされるのを示唆するものである。
【０３０９】
［表１７］
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【０３１０】
１７−３：ヒトｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに対するｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ分析
実施例１４−２および１４−４で製作した１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔおよびｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態がヒト由来ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ（ＨＭＢＥＣ））にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされるか分析した。治療抗体ＩｇＧ（１１Ｆ１１）を陰性対照群として使用した。
【０３１１】
ＨＭＢＥＣ（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃：ＡＣＢＲＩ３７６）を１２ウェルプレートに９０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙでプレーティングした後、テスト抗体を投与した。その翌日、４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳリンス後に、３％  ＢＳＡとＴｒｉｔｏｎＸが含まれているｓｏｌｕｔｉｏｎを５０分間使用してｂｌｏｃｋｉｎｇおよびｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅした。ＰＢＳでリンス後、ヒトＦｃに対する抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ抗体）を２時間３０分間投与し、ＰＢＳリンス後、当該ｐｒｉｍａｒｙ抗体に対するｓｅｃｏｎｄａｒｙ抗体を１時間投与した。ＰＢＳリンス後、核染色のために１：１０００で希釈された濃度でＨｏｅｃｈｓｔを１０分間ｓｔａｉｎｉｎｇした。結果物は、ＬＳＭ  ７８０  ＮＬＯ  ＥＣ  Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ１００Ｘ／１．３  Ｏｉｌ条件で共焦点顕微鏡で分析した。前記実験結果を図１３ｂに示した。
【０３１２】
１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔおよびｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態は、陰性対照群である治療抗体（１１Ｆ１１）に比べて増加されたｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示した。この結果は、前述の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が治療抗体と連結された多様な形態の二重特異抗体であって、ＢＢＢを構成するｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ内に当該治療抗体を効果的にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅさせることができるのを、したがって窮極的に当該治療抗体のＢＢＢ通過能を増大させるのを示唆する。
【０３１３】
１７−４：ヒトｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ内でのｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｅの分析
万一、当該抗体がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされた後、細胞内のリソソーム関連マーカとｃｏｌｏｃａｌｉｚｅすれば、当該抗体はｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ内で分解されてしまうためＢＢＢを通過できない。これとは反対に、ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓに関連するｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅあるいはＢＢＢ通過に関連すると知られたマーカとｃｏｌｏｃａｌｉｚｅすれば、当該抗体はｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌにｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされた後、脳側に抜け出るｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓによってＢＢＢを通過すると予想される。
【０３１４】
実施例１７−２でテストされた抗体のうちの１５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔ形態を同様な方式でＨＭＢＥＣに処理した後、細胞内で当該抗体がいずれのｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔとｃｏｌｏｃａｌｉｚｅするか分析した。但し、ｂｌｏｃｋｉｎｇおよびｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ後、投与抗体をｄｅｔｅｃｔｉｏｎするＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ抗体と共に、次の抗体をそれぞれ同時に投与した。
【０３１５】
−Ａｎｔｉ−Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ：リソソームマーカ
−Ａｎｔｉ−Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１：ｃａｖｅｏｌｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓマーカ（ＢＢＢ通過の主要メカニズムと思われる）
−Ａｎｔｉ−ＥＥＡ１：ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅマーカ
残り方法は実施例１７−２と同様であるが、前記のマーカに対するｓｅｃｏｎｄａｒｙ抗体をそれぞれ処理した。
【０３１６】
分析結果は図１３ｃに示した。１５６４クローンは二重特異抗体形態で全てＣａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄとｃｏｌｏｃａｌｉｚｅせず、その代わりにｃａｖｅｏｌｉｎ−１およびＥＥＡ１と細胞膜および細胞内部でｃｏｌｏｃａｌｉｚｅした。この結果は、１５６４クローンがｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされた後、細胞内の分解メカニズムを経ずにＲＭＴを通じてＢＢＢを通過することができるのを示す。
【０３１７】
実施例１８．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ信号伝達に及ぼす影響分析
１８−１：ＭＣＦ−７細胞株のＩＧＦ１Ｒによるｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１Ｒ（ＩＧＦ１受容体）とそのリガンドであるＩＧＦ１間の結合を妨害するか否かを、ＩＧＦ１による細胞増殖効能を用いて確認した。
【０３１８】
実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体をそれぞれ４００ｎＭから５倍ずつ希釈して希釈サンプルを製作後、２０ｎｇ／ｍｌ濃度の２５μｌ  ＩＧＦ１に各２５μｌずつ処理した。ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ−７細胞株を培養し、実験当日培地を除去して継代し、ＩＧＦ１とテスト抗体が分注されている９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ当り２０，０００個ずつ（５０μｌに該当）処理した。
【０３１９】
３日間適切な温度および湿度で培養してから、細胞生長程度を測定するためにＣＣＫ−８  ｒｅａｇｅｎｔを１０μｌずつ処理し、ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで４−５時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。その後、取り出してｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒの４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【０３２０】
前記実験結果を図１４ａに示した。
前記実験結果から、本発明による抗体は、ＩＧＦ１のＩＧＦ１Ｒに対するｓｉｇｎａｌｉｎｇによるＭＣＦ−７の細胞増殖を阻害しないことが確認された。対照群として使用したＩｍｃｌｏｎｅ社の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＩＧＦ１によるＭＣＦ−７の細胞増殖を処理濃度に比例して阻害した。したがって、本発明の抗体はＢＢＢを構成するｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに発現するＩＧＦ１Ｒに結合してＢＢＢ通過能を有するが、同時に体内ＩＧＦ１によるｓｉｇｎａｌｉｎｇを阻害しない抗体であるので、本発明による抗体はＢＢＢシャトルとして使用できるのを確認した。
【０３２１】
１８−２：ＭＣＦ−７細胞株のＩＧＦ１Ｒによるｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔの阻害分析
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞と結合するＩＧＦ１がｓｉｇｎａｌｉｎｇを細胞内に伝達する時、そのｓｉｇｎａｌｉｎｇのｒｅｃｅｐｔｏｒおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔに関与するかどうかを確認するために実験した。即ち、ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ−７細胞株に抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を投与し、これによる細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量を分析した。
【０３２２】
ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌを培養してから、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を処理２０時間前にその培養液をｓｅｒｕｍが含まれていない培養液に変更した。実施例４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体をそれぞれ１００ｎＭを前記ＭＣＦ−７細胞株に処理後、１時間後に２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１を処理した。２０分後、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ｐｒｏｔｅａｓｅとｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌが添加されたＭ−ＰＥＲで細胞を溶解した。ＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用してタンパク質濃度を測定した後、１２．５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌにローディングしてｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓさせた後、ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅにｔｒａｎｓｆｅｒした。ブロッキングは５％のＢＳＡが含まれているＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）と共に１時間ｇｅｎｔｌｅ  ｓｈａｋｉｎｇで常温で行い、その後にＩＧＦ１ＲあるいはＡｋｔに対するｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを４℃で軽く揺すりながら一晩処理した。ｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙはｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌとして使用された。洗浄した後にｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを１時間常温で軽く揺すりながら処理した後に洗浄し、ＥＣＬ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｌａｓ４０００を用いてシグナルを確認した。前記実験結果を図１４ｂに示した。
【０３２３】
前記実験結果から、本発明による抗体は、細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量に影響を与えないことを確認した。
【０３２４】
１８−３：マウス脳内皮細胞のＩＧＦ１Ｒによるｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔの阻害分析
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が、マウス由来ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ細胞にＩＧＦ１がｓｉｇｎａｌｉｎｇを細胞内に伝達する時、そのｓｉｇｎａｌｉｎｇのｒｅｃｅｐｔｏｒおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔに関与するかどうかを確認するために実験した。即ち、ＩＧＦ１Ｒを発現することが確認されたｂＥＮＤ３細胞株に実施例１４−２の方法で製作された１１Ｆ１１−１５６４、３Ａ９−１５６４（ＣＨ１１Ｆ１１とｃｈ３Ａ９、ａ−ｓｙｎ単独抗体として大韓民国公開特許２０１８−００８１４６５に記載されたもの）および実施例１４−３の方法で製作された１５６４クローンのＩｇＧ形態を投与し、これによる細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量を分析した。
【０３２５】
ｂＥＮＤ３  ｃｅｌｌを培養してから、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を処理２０時間前にその培養液をｓｅｒｕｍが含まれていない培養液に変更した。実施例１４−２の１５６４およびＭＫＪＰ２クローンの二重特異抗体をそれぞれ１００ｎＭを前記ｂＥＮＤ細胞株に処理後、１時間後に２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１を処理した。２０分後、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ｐｒｏｔｅａｓｅとｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌが添加されたＭ−ＰＥＲで細胞を溶解した。ＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用してタンパク質濃度を測定した後、１２．５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌにローディングしてｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓさせた後、ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅにｔｒａｎｓｆｅｒした。ブロッキングは５％のＢＳＡが含まれているＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）と共に１時間ｇｅｎｔｌｅ  ｓｈａｋｉｎｇで常温で行い、その後にＩＧＦ１ＲあるいはＡｋｔに対するｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを４℃で軽く揺すりながら一晩処理した。ｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙはｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌとして使用された。洗浄した後にｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを１時間常温で軽く揺すりながら処理した後に洗浄し、ＥＣＬ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｌａｓ  ４０００を用いてシグナルを確認した。
【０３２６】
前記実験結果を図１４ｃに示した。
前記実験結果から、本発明による抗体は、細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量に影響を与えないことを確認した。
【０３２７】
実施例１９．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の無毒性分析
１９−１：ＩｇＧ形態ＩＧＦ１Ｒ抗体のＡＤＣＣ分析
実施例１４−３による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩｇＧ形態として、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞の表面に結合してＩＧＦ１Ｒ依存的な結合によって細胞死滅に影響を与えるか確認するために実験した。即ち、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体である１５６４クローンが結合した時、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ、ＮＫ  ｃｅｌｌ）を活性化させてＩＧＦ１Ｒ発現細胞に悪影響を与えるかをＡＤＣＣ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用して分析した。
【０３２８】
ＩＧＦ１Ｒを過発現するＭＣＦ−７細胞と低い水準で発現するＳＫＢＲ３細胞を培養した後、抗体処理２０時間前に９６ウェルプレートにｗｅｌｌ当り５０００個の細胞を分注した。培養した細胞は４％  ｌｏｗ  ＩｇＧ  ｓｅｒｕｍが含まれているＲＰＭＩ／１６４０培地に交換した後、１５６４クローンのＩｇＧ形態を１３３．３ｎＭから８倍ずつ希釈して各ｗｅｌｌに添加した。安定化させたＡＤＣＣ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞を各ｗｅｌｌに添加した後、６時間培養した後、常温で約１０分間放置する。予め準備したＢｉｏ−Ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔを各ｗｅｌｌに添加した後、ＰＨＥＲＡｓｔｅｒ  ＦＳ  ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ装備でｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ程度を測定してＡＤＣＣ誘導程度を分析した。前記実験結果を図１５ａに示した。
【０３２９】
前記実験結果から、本発明による抗体、特に１５６４クローンはＩＧＦ１Ｒ過発現細胞株であるＭＣＦ−７細胞と低い水準で発現するＳＫＢＲ３細胞に結合するが、ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞によるＡＤＣＣを誘導しないのを確認した。
【０３３０】
１９−２：抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の反復投与後の脳内ＩＧＦ１Ｒレベル分析
ＢＢＢシャトルとして使用される抗体はｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌのターゲットｒｅｃｅｐｔｏｒに結合して治療抗体の通過能を高める役割を果たすが、当該ｒｅｃｅｐｔｏｒレベルに変化を与えてはいけない。ターゲットｒｅｃｅｐｔｏｒのｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎは当該ターゲットの脳での役割に影響を与えて副作用を引き起こすことがある。
【０３３１】
本願の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が反復投与後にも脳内のＩＧＦ１Ｒレベルに影響を与えるかを分析した。実施例１４−２によってパーキンソン病治療抗体と１５６４クローンが連結されたｂｉｖａｌｅｎｔ形態の二重特異抗体とパーキンソン病治療抗体単独、そして陰性対照群としてＩｇＧをパーキンソンモデルマウスに３ヶ月間毎週反復投与した後、その脳組織でのＩＧＦ１Ｒレベルをｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで分析した。
【０３３２】
各グループ当り３匹のマウスの脳組織をＰＢＳでｐｅｒｆｕｓｉｏｎ後、ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅした後、１０ｕｇのｌｙｓａｔｅを４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌにローディングしｒｕｎｎｉｎｇした後、ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅにｔｒａｎｓｆｅｒした。残り方法は実施例１９−１と同様に行った。
【０３３３】
実験結果は図１５ｂに示した。１５６４クローンから構成された二重特異抗体は、パーキンソン病治療抗体単独およびＩｇＧ投与群と類似したレベルのＩＧＦ１Ｒを示した。この結果は、１５６４クローンが反復投与後にも脳内ＩＧＦ１Ｒレベルに深刻な変化を引き起こさず、したがって、当該抗体はＢＢＢシャトルとして使用される場合、副作用が低いことと予想される。
【０３３４】
１９−３：抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の投与後脳内分布分析
ＢＢＢシャトルはｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ表面のｒｅｃｅｐｔｏｒに結合して治療抗体を脳内に伝達するが、脳内の正常細胞表面のｒｅｃｅｐｔｏｒへの結合は少なくなければならない。万一、ＢＢＢシャトルが脳内で抗原を発現する正常細胞に多量結合すれば、それだけ当該シャトルに結合された治療抗体は疾患ターゲットに少なく到達するようになる。
【０３３５】
本願の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の脳内分布を分析するために実施例２１−２で行ったｉｎ  ｖｉｖｏ実験動物の脳で抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の分布を免疫染色法で分析した。１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ形態が投与されたＳＤ  ｒａｔをｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ方式で生理食塩水を用いてｐｅｒｆｕｓｉｏｎした。左半球を１０％ｎｅｕｔｒａｌ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎに２４時間入れて固定した。脳を１ＸＰＢＳでリンスし、３０％  ｓｕｃｒｏｓｅが含まれている溶液に２４時間冷凍させた。脳をＯＣＴに入れた後に凍らせてｓｅｃｔｉｏｎまで−８０℃で保管した。Ｓｅｃｔｉｏｎはｃｏｒｏｎａｌ方向に２５μｍ厚さで行い、２４ウェルペトリ皿に０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅを含む１Ｘ  ＰＢＳに集めた。当該組織をｆｒｅｅ  ｆｌｏａｔｉｎｇ方式で０．３％  Ｔｗｅｅｎ−２０が含まれているＤａｋｏ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋ（Ｘ０９０９、ＤＡＫＯ）と１時間常温でｉｎｃｕｂａｔｉｏｎしてｂｌｏｃｋｉｎｇおよびｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅした。Ｐｒｉｍａｒｙ抗体では１：５０比率のｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄヒトＦｃ抗体（ＢＡ３０８０、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を処理後、４℃でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。ＴＢＳで３回ｗａｓｈ後、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに対する抗体であるＲＥＣＡ−１（ａｂ９７７４、ＡｂＣａｍ）を１：２０００比率、あるいはニューロンに対する抗体であるＮｅｕＮ（ＭＡＢ３７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１：２５０の比率で、２時間処理した。Ｗａｓｈ後、Ａｌｅｘａ４８８が結合され各抗体に対するｓｅｃｏｎｄａｒｙ抗体を４５分間処理した。ｗａｓｈ以後、ｓｅｃｔｉｏｎをガラスｓｌｉｄｅに載せた後、Ｄａｐｉが含まれているＰｒｏＬｏｎｇ  ＧｏｌｄあるいはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８が含まれているＤａｋｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａを添加して核を染色した。共焦点顕微鏡で大脳皮質および海馬を適切な蛍光波長を用いて分析した。分析結果は、図１５ｃに示した。
【０３３６】
当該結果は、１５６４クローンが結合された二重特異抗体は正常ニューロンに結合せず、その代わりにｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに特異的に結合するのを示した。従って、本源の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は脳内の正常細胞に結合せず、治療抗体のＢＢＢ通過能のみを増大させて副作用が殆どなく、治療抗体の治療効能の向上をもたらすと予想される。
【０３３７】
実施例２０．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能分析
２０−１．ｓｖ−ＡＲＢＥＣ由来ＢＢＢモデルでｂｉｖａｌｅｎｔ抗体のＢＢＢ通過能分析
実施例１１および１２由来抗体を実施例１４−２で製作した二重特異抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能をＳｖ−ＡＲＢＥＣから構成されたＢＢＢモデルで評価した。Ｓｖ−ＡＲＢＥＣをｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅの上に単一層でプレーティングし、当該ＢＢＢシステムの抵抗値（ＴＥＥＲ）およびｓｕｃｒｏｓｅ通過程度を基にして当該システムのｉｎｔｅｇｒｉｔｙを予め評価した。この時、ｓｖ−ＡＲＢＥＣは当該システムのｉｎｔｅｇｒｉｔｙに役立つことが確認されたラットａｓｔｒｏｃｙｔｅ培養ｍｅｄｉｕｍ（ＲＡＳ−ＣＭ）を処理した。テスト抗体である１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１のｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体をｍｅｍｂｒａｎｅの上に処理した後、９０分後にｂｏｔｔｏｍ  ｃｈａｍｂｅｒでの抗体量を質量分析で分析した。質量分析のために、各抗体ＦｃおよびｓｃＦｖでのｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅが分析された後、使用された。この時、パーキンソン病治療抗体単独（１１Ｆ１１）および当該抗体にＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭのバイオシミラーのｓｃＦｖ形態を結合させた二重特異抗体を陰性対照群として使用した。当該システムにはＢＢＢを通過しないと知られたＡ２０．１抗体（ｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｕｎｃｉｌ製作）を通過させて当該システムの検量限界線を決めた。質量分析で導出された結果値を先行文献で知られた公式に代入してＰａｐｐ値を決定し、この値はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＢＢ通過能程度を示す。
【０３３８】
分析結果は、図１６ａに示した。Ｂ１１を除いたテスト抗体は陰性対照群に比べて高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能を示した。特に、１５６４クローンは他のクローンに比べて高いＢＢＢ通過能を示した。これは、１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６クローンおよびクローンを連結した二重特異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能が単独抗体に比べて高いことが可能であるのを示す。
【０３３９】
２０−２．ｓｖ−ＡＲＢＥＣ由来ＢＢＢモデルでｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ抗体のＢＢＢ通過能分析
２０−１と同一のモデルで、実施例１４−４を基にして製作したｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ抗体とｂｉｖａｌｅｎｔ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能を分析した。１５６４クローンから製作したｂｉｖａｌｅｎｔ、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ抗体および陰性対照群であるパーキンソン病治療抗体（３Ａ９）をｓｖ−ＡＲＢＥＣ  ＢＢＢシステムに通過させた後、通過量を分析した。分析結果は、図１６ｂに示した。
【０３４０】
１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態は単独抗体である３Ａ９に比べて全て高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能を示し、特に、ｂｉｖａｌｅｎｔ形態の通過能がｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態より高かった。これは、１５６４クローンは多様な形態にそれに連結された治療抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能を向上させることができるのを示す。
【０３４１】
２０−３．ヒトＩＰＳＣ由来ＢＢＢモデルで抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＢＢＢ通過能分析
ヒトｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ由来ＢＢＢモデルは、ラットあるいはマウス細胞由来ＢＢＢシステムに比べて高い抵抗値（ＴＥＥＲ）を示し、ＢＢＢで確認された多様なマーカを全て発現する。したがって、ヒトｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ由来モデルのＢＢＢ  ｔｉｇｈｔｎｅｓｓは動物細胞由来ＢＢＢに比べて高く、当該モデルはヒトＢＢＢをよく再現している。
【０３４２】
ヒトの羊水に由来した細胞（ＡＦ−ｉＰＳＣ）にｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１  ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ  ａｎｄ  ＬＩＮ２８などのベクターを導入してｉＰＳＣにｒｅｐｒｏｇｒａｍした。生成されたコロニーにＫＯ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫＯＳＲ、ｇｌｕｔａｍａｘ、ＮＥＡＡ、ｂｅｔａ  ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを処理してｐｒｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ状態のｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌを製作した後、ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍおよび１％ＰＤＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを処理してｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに分化させた。羊水細胞の獲得および当該細胞を用いたＢＢＢシステムの確立は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌで行われた。抵抗値およびｓｕｃｒｏｓｅ通過値でシステムのｉｎｔｅｇｒｉｔｙを確認した後、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がパーキンソン病治療抗体とｓｃＦｖ形態に結合された二重特異抗体形態で通過能を分析した。テスト抗体は、１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ形態、１５６４クローンのｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態、Ｆ０６クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ形態、Ｃ０４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ形態であった。パーキンソン病治療抗体である１１Ｆ１１は、陰性対照群として使用された。ＢＢＢシステムを通過した抗体は、実施例２０−１と同様な方法で分析した。
【０３４３】
分析結果は、図１６ｃに示した。テストクローンは陰性対照群に比べて全て高いＢＢＢ通過能を示し、特に、Ｆ０６  ｂｉｖａｌｅｎｔおよびＣ０４  ｂｉｖａｌｅｎｔは単独抗体に比べて最大１５倍の高いＢＢＢ通過能を示した。当該結果は、本願の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がヒト由来ＢＢＢシステムを単独抗体に比べて効率的に通過するのを示す。
【０３４４】
実施例２１．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能分析（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
２１−１．ｍｉｎｉｂｏｄｙのｂｒａｉｎ  ｖｅｓｓｅｌとのｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでｂｒａｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅに沿って分布するかどうかを確認するために次のような実験を行った。
【０３４５】
具体的に、６−８週齢ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ雄の尾静脈にＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒあるいは１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ ｃｏｎｔｒｏｌおよび実施例１４−１で製造した９９６、１２２６および１５６４クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体をそれぞれ単回投与した。４時間後、ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎを十分な量の０．９％  ＮａＣｌ溶液および４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅでｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｌｌｙｐｅｒｆｕｓｅした。固定されたｂｒａｉｎは摘出して２０μｍにｓｅｃｔｉｏｎ後、脳血管とＩＧＦ１Ｒテストのｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを確認するために血管マーカであるａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ３１およびａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙでｃｏ−ｓｔａｉｎｉｎｇした。ＣＤ３１はＡｌｅｘａ４８８がｃｏｎｊｕｇａｔｅされたｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙで、ｈｕｍａｎ  ＦｃはＡｌｅｘａ  ５９４がｃｏｎｊｕｇａｔｅされたｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを用いて、蛍光顕微鏡下でイメージングした。
【０３４６】
前記実験結果は、図１７ａに示した。
前記実験結果から、本発明によるリガンド結合非阻害クローン（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は優れたＢＢＢ通過能を有するのを確認し、抗体が脳血管とｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎする程度を免疫染色で分析する方法（Ｎｅｕｒｏｎ（２０１６）Ｙｕ−Ｚｕｃｈｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）によって、脳組織を血管マーカ（ａｎｔｉ−ＣＤ３１、緑色）とヒト抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ、赤色）で染色した結果、本願の一例によるリガンド結合非阻害クローンはＩｇＧ対照群に比べて高いｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ程度を示した。
【０３４７】
２１−２．二重特異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能分析
本願抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能をｎｏｒｍａｌ  ｒａｔで確認しようとした。ＳＤ  ｒａｔに１０ｍｇ／ｋｇあるいは３０ｍｇ／ｋｇのパーキンソン病治療単独抗体（１１Ｆ１１）あるいは１５６４クローンがｂｉｖａｌｅｎｔ形態に結合された二重特異抗体（１１Ｆ１１−１５６４）を尾静脈に単回投与後、２４時間目にそのＣＳＦおよびｂｒａｉｎでの抗体量を質量分析で分析した。質量分析方法は実施例２０−１での方法と同一であった。
【０３４８】
１５６４クローンが結合された二重特異抗体は、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合していない治療抗体に比べて高いＣＳＦ、ｂｒａｉｎ通過能を示し、当該効能を１０、３０ｍｇ／ｋｇ  ｄｏｓｅ全てで確認された。二重特異抗体は、３０ｍｇ／ｋｇ  ｄｏｓｅで単独抗体に比べて最大約４．５倍以上のｂｒａｉｎへの通過能を示した。
【０３４９】
１５６４クローンを実施例１４−２および１４−４によってｂｉｖａｌｅｎｔおよびｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態に製作した後、前記と同様な方式で３０ｍｇ／ｋｇあるいは６０ｍｇ／ｋｇで投与後、２４時間目にＣＳＦとｂｒａｉｎでの抗体量を分析した。１５６４クローンが結合された２つ形態の二重特異抗体は、単独抗体に比べて高いＣＳＦ、ｂｒａｉｎ通過能を示した。特に、ｂｉｖａｌｅｎｔ形態はｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態に比べて高いＢＢＢ通過能を示し、これは最大約５倍のｂｒａｉｎ通過能増大であった。
【０３５０】
図１７ｂの結果は、１５６４クローンが多様な形態に治療抗体に結合された時にも当該治療抗体の体内ＢＢＢ通過能を向上させるのを示す。
【０３５１】
実施例２によって製作された１５６４クローンのａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔは、ｐａｒｅｎｔａｌクローンに比べてｓｅｒｕｍ  ＰＫの増大が予想された。したがって、ｓｅｒｕｍ内に長期間残存し、継続してＢＢＢ流入量を維持することによって、そのＢＢＢ通過能が向上されることと期待された。実施例１４−２によってｂｉｖａｌｅｎｔ形態あるいは４−４によってｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態に製作されたａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔをＳＤ  ｒａｔに３０ｍｇ／ｋｇで尾静脈投与した後、０、２４、４８時間目に血液を眼窩静脈叢から採取した。テスト抗体は治療抗体のｂａｃｋｂｏｎｅによって２つ実験に分けられ、実験に使用された当該ｖａｒｉａｎｔの二重特異抗体は下記表１８の通りである。
【０３５２】
［表１８］
2021506770.tif 000133
【０３５３】
血液内抗体量は、ＥＬＩＳＡで分析した。９６ウェルプレートにｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体をコーティングした後、適当量希釈された試料を処理後、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗体でｄｅｔｅｃｔｉｏｎした。分析結果は、図１７ｄに示した。
【０３５４】
その結果、１次試験群では、１５６４のｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ、Ｆ０６のｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ、Ｃ０４のｍｏｎｏｖａｌｅｎｔがｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔに比べて長くなったｓｅｒｕｍ  ＰＫを示した。２次試験群では、ＶＨ３５  ｂｉｖａｌｅｎｔ群を除いてＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２のｂｉｖａｌｅｎｔ形態がｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて増大されたｓｅｒｕｍ  ＰＫを示した。
【０３５５】
当該グループのＢＢＢ通過能を分析するために、４８時間目に当該ラットからＣＳＦを抽出して同一なＥＬＩＳＡで分析した。分析結果は、図１７ｅに示した。
【０３５６】
１次試験群では増大されたｓｅｒｕｍ  ＰＫを示した１５６４  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ、Ｆ０６  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ、Ｃ０４  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態がｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて増大されたＣＳＦ抗体量を示した。２次試験群でもまた増大されたｓｅｒｕｍ  ＰＫを示したＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２のｂｉｖａｌｅｎｔがｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて増大されたＣＳＦ抗体量を示した。ＶＨ３５は、ｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて短くなったｓｅｒｕｍ  ＰＫおよびＣＳＦ抗体量を示した。
【０３５７】
図１７ｄおよび図１７ｅの結果は、ｓｅｒｕｍでのＰＫが持続的な抗体のＢＢＢ流入によって抗体のＢＢＢ通過能において重要な要素であり、ＢＢＢシャトルを有しｓｅｒｕｍ  ＰＫが増大された二重特異抗体のＢＢＢ通過能が増加するのを示す。特に、ＣＳＦ抗体量が最も高いＦ０６  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態の場合、ｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて約５倍程度高いＣＳＦ通過能を示した。実施例１８−２および１８−３で１５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔ抗体がＣＳＦで単独抗体に比べて約３倍増加されたＣＳＦ通過能を示すので、Ｆ０６  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態は単独抗体に比べて最大約１５倍増加されたＢＢＢ通過能を示すことが予想される。
【０３５８】
実施例２２．ＩＧＦ１Ｒ抗体の脱アミド化
脱アミド化反応は例えば、アスパラギンの側鎖ペプチド結合を攻撃して対称構造のスクシンイミド中間産物を作ることを意味し、この中間産物は加水分解によってアスパラギン酸あるいはイソアスパラギン酸のうちの一つに変わるようになる。このような脱アミン化反応はタンパク質の持続的な活性に影響を与えることがあるため、軽鎖および重鎖アミノ酸を他のアミノ酸で置換して脱アミン化を防止すると同時に、長期間の安定性を確保しようとした。
【０３５９】
Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏによって確認した脱アミン化部位を確認するために、４０℃で１５６４  ＩＧＦ１Ｒ抗体を放置した後、Ｍａｓｓ分析によって脱アミン化程度を確認した結果、図１８ａのように、軽鎖ＣＤＲ２とＣＤＲ３、そして重鎖ＣＤＲ２部位で４．６〜４７．３％の脱アミン化反応が起こるのを確認した。脱アミン化を防止するために、図１８ｂのように、各部位別にアミノ酸を置換し、各アミノ酸置換によるＩＧＦ１Ｒタンパク質との結合力変化を確認した。ＷＴ  １５６４と同一の結合力を示す突然変異体を選別し、３個または４個の突然変異を適用した突然変異体がＩＧＦ１Ｒ結合力においてＷＴ  １５６４と同一であるのを確認した。このような突然変異体の導入は、製形バッファー保存条件で結合力を維持し、長期的に安定した形態を維持することができるのを意味することである。分析結果は、表１９に示した。
【０３６０】
［表１９］
2021506770.tif 000134
【０３６１】
実施例２３．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング
２３−１．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体とｂｏｉｌｅｄ、ｎａｔｉｖｅ  ＩＧＦ１Ｒタンパク質のＥＬＩＳＡ
抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が線状あるいはｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅを認識するか確認しようとした。１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１のｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体とｎａｔｉｖｅ  ヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質あるいは当該タンパク質に熱を加えたタンパク質（ｂｏｉｌｅｄ  ＩＧＦ１Ｒ）に対するＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡ方法は、実施例１５に示された方法と同一であった。分析結果は表２０に示した。
【０３６２】
［表２０］
2021506770.tif 000135
＊Ｎ／Ａ：Ｎｏｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ
【０３６３】
前記クローンはｎａｔｉｖｅ  ヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤに実施例１５での結果と類似した結合力を示した反面、熱を加えて３次構造を破壊したｂｏｉｌｅｄ  ヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤには全て結合しなかった。これは、本願の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が線状でないｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅに結合するのを意味する。
【０３６４】
２３−２．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング
１５６４クローンのＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅを分析するために、次のようにａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇを行った。ＩＧＦ１Ｒ発現度が低いと確認された卵巣ガン細胞株であるＯＶＣＡＲ３細胞にＮ−末端にはｅＧＦＰ  ｔａｇが融合されＣ−末端ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎは除去されたＩＧＦ１Ｒライブラリーを発現させた。ＩＧＦ１Ｒライブラリーは、ＩＧＦ１Ｒ表面の残基がａｌａｎｉｎｅで置換された突然変異を含む。準備されたライブラリーをＯＶＣＡＲ３細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。ＩＧＦ１Ｒの発現が確認された細胞に対して１５６４抗体を処理し、その後、ＤｙＬｉｇｈｔ６５０が標識された二次抗体を処理して蛍光標識した。標識された細胞をＩＧＦ１Ｒ発現有無とＩＧＦ１Ｒの発現と１５６４結合有無によって分類した後、これらに対してイルミナＨｉＳｅｑ技法でＲＮＡ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行って、当該細胞群での各ａｌａｎｉｎｅ突然変異の頻度を分析した。当該頻度数はｗｉｌｄｅ  ｔｙｐｅ  ＩＧＦ１Ｒを発現した細胞に対する結果として正規化した後、相対頻度を計算して、１５６４が標識された細胞群でその数字が減少した突然変異を選別した。このような観察に基づいて、１５６４のエピトープはＦＮ２ドメインに位置することが分かり、これに属する残基はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８であることが分かった。当該結果および１５６４クローンが認識するシークエンスは、図９に示した。この残基は先行文献によればＩＧＦ１の結合に関与しないので、当該結果は実施例２３−１で１５６４が示す性質を忠実に説明している。
【０３６５】
実施例２４．単独抗体および二重抗体の抗原結合力比較など
２４−１：ａ−ｓｙｎ抗原に対する単独抗体および二重抗体の結合力
ＩＧＦ１Ｒ抗体がｓｃＦｖ形態でＩｇＧ形態のａ−ｓｙｎ抗体と連結させた時、ａ−ｓｙｎ抗体の結合力に対する影響を分析した。
【０３６６】
１ｕｇ／ｍｌ濃度で９６ウェルプレートに１８時間ａ−ｓｙｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅをｃｏａｔｉｎｇし、洗浄後、各抗体は４００ｎＭから５倍ずつ希釈して結合させた。結合された抗体は抗−ヒトＦｃ−ＨＲＰを結合させた後、ＴＭＢ溶液を添加して発色させて抗体の結合程度を確認した。
【０３６７】
図１０ａのように、ａ−ｓｙｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅに対する結合力は、単独抗体や二重抗体で同一であるのを確認した。
【０３６８】
２４−２：ＩＧＦ１Ｒ抗原に対する単独抗体および二重抗体の結合力
ＩＧＦ１Ｒ抗原に対するａ−ｓｙｎ単独抗体と二重抗体の結合程度を比較するために実施例２２と同様な方法で実験を行った。
【０３６９】
図１０ｂの結果のように、ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖ抗体を有している二重抗体は濃度依存的によく結合したが、ＩＧＦ１Ｒ抗体部位がない単独抗体は結合しないのを確認した。
【０３７０】
２４−３：ａ−ｓｙｎヒト化抗体の結合力分析
実施例２４−１と同様な方法で実験を行って、キメラ二重抗体とヒト化二重抗体間の結合力差を分析した。
【０３７１】
図１０ｃの結果のように、ヒト化二重抗体はキメラ二重抗体と類似した水準でａ−ｓｙｎ凝集体との結合力を保有しており、ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖが一つであるｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体もキメラ抗体と類似した結合力を示すのを確認した。
【０３７２】
実施例２４−２と同様な方法で実験を行って、キメラ二重抗体とヒト化二重抗間のＩＧＦ１Ｒ結合力を分析した結果、図１０ｄのように、全ての二重抗体が同一な結合力を示し、ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖがない単独抗体は結合しないのを確認した。
【０３７３】
このような結果は、人体内で免疫原として作用できるマウス抗体部位を交替するためにヒト化した時、ａ−ｓｙｎ凝集体およびＩＧＦ１Ｒに対する結合力に変化がなかったのを示唆するものであって、同一な活性を保有しているのを意味するものである。
【０３７４】
２４−４：単独抗体と二重抗体の食細胞作用比較
食細胞作用は、大食細胞の多様な受容体が関与して細胞外不必要な物質を除去する作用を意味する。多様なタンパク質凝集体は免疫反応や炎症反応を誘導して人体に悪影響を与えるようになり、特に、ａ−ｓｙｎ凝集体の除去のために抗体を投与した時、抗体のＦｃ部位と細胞表面のＦｃｒＲとの相互作用によって促進されると知られている。このような理由で、単独抗体とＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖが連結された二重抗体の食細胞作用に対する活性を比較した。
【０３７５】
単独抗体と二重抗体の食細胞作用を比較するために、マウスに由来したＢＶ−２小膠細胞を用いた。ＢＶ−２細胞はＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、２×１０Ｅ６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで準備してＵ−ｂｏｔｔｏｍ  ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００ｕＬずつ分注した。１０ｕｇ／ｍｌのａ−ｓｙｎ凝集体と２５ｕｇ／ｍｌ抗体はＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して混合した後、常温で２０分間放置した。ａ−ｓｙｎ凝集体と抗体混合物をＢＶ−２細胞に処理した後、１５分間放置した。１２００ｒｐｍで遠心分離して上層液のａ−ｓｙｎ凝集体を除去し、細胞表面に結合された凝集体または抗体を除去するために、ＰＢＳ、ｐＨ２．５バッファーで３回洗浄した。細胞は４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定させた後、ＰＢＳバッファーで洗浄した。細胞内にｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓされた凝集体と抗体を確認するために、０．５％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して細胞膜を緩くし、ＰＢＳバッファーで洗浄後、ｐａｎ−ａ−ｓｙｎ抗体を１時間処理した。結合されたｐａｎ−ａ−ｓｙｎ抗体はａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ａｌｅｘａ−４８８抗体を１時間処理した後、ＦＡＣＳ分析によって大食作用によって細胞内に入った凝集体を確認した。
【０３７６】
図１０ｄの結果のように、ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧは大食作用に影響を与えなく、ａ−ｓｙｎ抗体を処理した時、ａ−ｓｙｎ凝集体の大食作用が増加するのを確認することができた。単独抗体と二重抗体を比較した時、類似の水準に大食作用が起こるのを確認して、ＩｇＧ  Ｃ−末端部位に結合されたｓｃＦｖ形態のＩＧＦ１Ｒ抗体がａ−ｓｙｎ抗体の作用に影響を与えないのを確認した。
【０３７７】
実施例２５．二重特異抗体の効能評価
実施例ＸＸによってキメラ１１Ｆ１１抗体と１５６４クローンｓｃＦｖのｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体を製作し、ヒトアルファ−シヌクレインを過発現する形質転換マウス（ｍＴｈｙ−１  ｈｕｍａｎ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＵＣ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）で二重特異抗体とアルファ−シヌクレイン抗体のインビボで効果を比較、分析した。２．５ｍｇ／ｋｇの単独抗体またはヒトＩｇＧまたは同一モル数のｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体を３ヶ月間毎週腹腔投与した。グループ当り５匹のマウスを使用し、非形質転換マウス（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）を対照群として使用した。その次に、灌流を次のように行った。
【０３７８】
最後の投与が完了した後、脳内の病理分析のために、人道的規定によって当該動物はｃｈｌｏｒａｌ  ｈｙｄｒａｔｅで麻酔がかかった後、０．９％の生理食塩水で心臓灌流された。その次に、灌流された脳の半分（ｓａｇｇｉｔａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）はリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４、４℃）に分析時点まで保管し、他の半分は直ちに冷凍状態で保管した（−７０℃）。
【０３７９】
病理学的分析は、次のように行われた。パラホルムアルデヒドに固定された脳半分は、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを用いてｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ方式で４０μｍ厚さの連続切片に切り出した。各投与群の脳内アルファ−シヌクレインの発現程度を確認するために、ｃｏｒｔｅｘ、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ、ｓｔｒｉａｔｕｍを含む切片をアルファ−シヌクレイン抗体（凝集体のマーカであるｐ１２９  α−ｓｙｎ抗体、ａｂｃａｍ、ａｂ５９２６４または総アルファ−シヌクレイン抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２６４２）と４℃で一晩培養した。または、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の活性程度を分析するために、前記切片をＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＢ５８０４、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あるいは脳炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）程度を確認するために、ＩＬ−１βに対する抗体（ａｂ９７２２、ａｂｃａｍ）をそれぞれ処理した。または、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓの神経細胞死滅程度を分析するために、ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、＃ＭＡＢ３７７）に対する抗体を処理した。１次抗体との培養後に、ビオチンが結合されたｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＡｖｉｄｉｎ  Ｄ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（１：２００、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を処理し、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で検出した。免疫染色された各切片は、明視野顕微鏡で観察して光学密度を測定した。結果は、図１１ａ〜図１１ｅに開示されている。
【０３８０】
２５−１．キメラ抗体と二重特異抗体のアルファ−シヌクレイン減少能分析
図１１ａは、キメラ１１Ｆ１１抗体および当該キメラ抗体と１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体がヒトα−Ｓｙｎを過発現するマウス動物モデル（ＴＧ）でアルファ−シヌクレイン凝集体を除去することができるかを、マウスに抗体投与後、ｐ−１２９  α−Ｓｙｎ抗体を用いてマウス脳組織中のｃｏｒｔｅｘ、ｈｉｐｐｏｍｃａｐｕｓを染色して測定した結果である。ｐ−１２９  α−ｓｙｎは１２９番目残基がリン酸化された形態の凝集体のマーカであって、染色された組織で濃い茶色点あるいは凝集体形態に示される。
【０３８１】
図１１ａによれば、ＩｇＧ処理群はｎｏｎ−ｔｇ対照群に比べて高いｐ−１２９の染色程度を示した（＃：ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。これとは反対に、単独抗体あるいは二重特異抗体を処理したグループでは、ｐ−１２９  α−ｓｙｎあるいは凝集体の染色程度が顕著に減少した。特に、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでは二重特異抗体処理群の減少程度がキメラ１１Ｆ１１抗体に比べて優れていた（＊：ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。図１１ｂは図１１ａと同一な実験であるが、マーカとして、総アルファ−シヌクレイン抗体で染色した結果である。総アルファ−シヌクレイン検出は、本願による抗体がアルファ−シヌクレイン自体の除去能（ｃｌｅａｒｉｎｇ）および抗体の細胞間伝達（ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）抑制能があるのを示すことである。また、他の側面から、単量体の凝集体への形成の抑制、または単量体を全て除去することができると解釈できる。ＴＧ  ｍｏｕｓｅで増加したヒトアルファ−シヌクレインは単独抗体および二重特異抗体投与によってＩｇＧ投与群に比べて減少し、特に、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでは二重特異抗体の単独抗体に比べて効能がさらに優れた。
【０３８２】
当該結果は、キメラ１１Ｆ１１抗体および二重特異抗体が２．５ｍｇ／ｋｇの低い容量でもパーキンソン疾患動物モデルで効果的にアルファ−シヌクレインおよびその凝集体レベルを減少させるのを示す。特に、二重特異抗体が単独抗体に比べて効能が優れており、これは二重特異抗体が向上したＢＢＢ通過能を基にして単独抗体に比べて脳にさらに多く到達して疾患を効果的に治療することができるのを示唆する。
【０３８３】
２５−２．キメラ抗体と二重特異抗体のａｓｔｒｏｇｌｏｓｉｓおよびｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅレベル減少能分析
グリオーシス（ｇｌｉｏｓｉｓ）は、ＢＢＢの損傷、ＴＧＦ−ベータまたはインターロイキンのような物質によって触発される、中枢神経系に損傷がある場合、これに対する反応として膠細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）で起こる非特異的反応である。代表的なものとして、Ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを含み、ＧＦＡＰタンパク質がマーカーとして使用される。よって、キメラ１１Ｆ１１抗体およびキメラ抗体と１５６４クローンの二重特異抗体をマウスに投与してＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ減少およびこれを触発する炎症性サイトカイン放出減少に及ぼす影響を分析した。分析結果は、図１１ｃおよび１１ｄに開示されている。
【０３８４】
図１１ｃは本発明の一例で製造されたキメラ１１Ｆ１１抗体あるいは当該抗体と１５６４クローンの二重特異抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカとしてＧＦＡＰ（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。単独抗体および二重特異抗体はＩｇＧ対照群に比べてａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを抑制し、特に、ｓｔｒｉａｔｕｍでは二重特異抗体の効能が単独抗体に比べて優れるのを確認することができた。
【０３８５】
図１１ｄは、本発明の一例で製造されたキメラ１１Ｆ１１抗体あるいは当該抗体と１５６４クローンの二重特異抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで炎症性サイトカインを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカとしてＩＬ−１ベータ抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。ＩＬ−１ベータは炎症を誘発して多様な神経細胞の死滅および炎症反応を誘導するようになる。本願による抗体を投与したマウスのｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでＩｇＧ対照群に比べて単独抗体および二重特異抗体投与群でＩＬ−１ベータが減少し、特に、二重特異抗体の減少能が単独抗体に比べて有意に優れた（＃＃：Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００５；＊：ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。
【０３８６】
前記図面に示されているように、本願による抗体は対照群と比較して、Ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させ、これを触発する炎症性サイトカインＩＬ−１ｂｅｔａの放出を減少させることが明らかになった。
【０３８７】
２５−３．キメラ抗体と二重特異抗体のｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ減少能分析
アルファシヌクレインの神経毒性および炎症反応によって脳細胞の死滅が発生するのを先行文献で確認されてきた。本願の単独抗体および二重特異抗体がアルファ−シヌクレインによるｉｎ  ｖｉｖｏでの脳細胞死滅を抑制できるか分析した。
【０３８８】
ｃｏｒｔｅｘおよびｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでニューロンのマーカであるＮｅｕＮで染色した結果、単独抗体および二重特異抗体全てＩｇＧ対照群に比べて脳細胞死滅程度が減少することが明らかになった。特に、ｃｏｒｔｅｘでは二重特異抗体の脳細胞死滅抑制能が単独抗体に比べて優れたことが確認された。当該結果は、図１１ｅに示した。
【０３８９】
実施例２６．Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇによる半減期増大およびこれによるＢＢＢ通過能向上
ＦｃＲｎは、血管内で抗体が循環する時、溶解されないように細胞内に抗体を引き込んで循環させることによって半減期を増加させる細胞膜の重要な受容体である。ＢＢＢ通過能はトランスサイトーシス抗体の活性も重要であるが、血管内での濃度に依存してＢＢＢを通過するということはよく知られた事実である。このような理由で、二重抗体の半減期を増加させるためにＦｃ部位の４２８番目アミノ酸をメチオニン（Ｍｅｔ）をロイシン（Ｌｅｕ）に変化させてＦｃＲｎとの結合力を増大させた二重抗体を製作した。Ｈｕｍａｎ  ＦｃＲｎを発現するｔｇ  ｍｏｕｓｅに１０ｍｇ／ｋｇ濃度でＷＴ二重抗体とＭ４２８Ｌ二重抗体を投与して比較した結果、図１２のように、約５０％程度の半減期増大効果を確認した。半減期増加を再確認するために、サルにＷＴ二重抗体、Ｂｉｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体を投与してＰＫ  ｐｒｏｆｉｌｅを分析した。図２２ａのように、ＷＴ二重抗体の場合、１６８時間以後から急激に血液内濃度が低まる反面、ＦｃＲｎとの結合力が高いＭ４２８Ｌ二重抗体はＷＴに比べて向上した血液内濃度を維持した。半減期は、ＷＴ二重抗体に比べてＭ４２８Ｌ二重抗体で１．５日程度増加する結果を確認した。特に、ｃｌｅａｒａｎｃｅ側面からは、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体が最も優れており、ＷＴ二重抗体が最も速いｃｌｅａｒａｎｃｅを示した（図２２ｂ）。
【０３９０】
半減期増加効果によるＢＢＢ通過向上を検証するために、抗体投与２４時間後にＣＳＦを抽出して、ＣＳＦ内の抗体量を分析した。１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１Ｒを１８時間冷蔵状態でｃｏａｔｉｎｇした後、ＣＳＦを添加してＩＧＦ１Ｒと結合した抗体をｄｅｔｅｃｔｉｏｎした。図２２ｃで確認されるように、血液内抗体量が多かったＭ４２８Ｌ二重抗体のＢＢＢ通過量が多いのを確認し、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体は優れたＢＢＢ通過能と結合されてｂｉｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体より向上した通過能を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ−１】
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【図１５ｃ−２】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ−１】
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【図１７ｄ−２】
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【図１７ｅ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２０ｄ】
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【図２０ｅ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２１ｅ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月26日(2019.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファ−シヌクレインおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体、前記二重特異抗体を含むシヌクレイン病（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の予防および／または治療用薬学的組成物、および前記二重特異抗体を含むアルファ−シヌクレイン凝集体検出またはシヌクレイン病診断のための情報を提供する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルファ−シヌクレイン（α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、α−ｓｙｎ）は、ニューロンの前シナプス末端で主に発現し、正常状態では自然に折り畳まれていない状態の単量体として存在する。アルファ−シヌクレインは、随意および不随意運動の開始と停止を制御する重要な一種の神経伝達物質であるドーパミンの放出を規制することを助ける。特に、アルファ−シヌクレインの機能はシナプス活動の増加および年を取るにつれて重要であり、神経退化の重要な因子である。
【０００３】
しかし、病的な状態でアルファ−シヌクレインは、液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）、リン脂質二重膜または脂質膜などとの結合および相互作用により構造的変化を起こして折りたたまれた、またはフォールディングされたα−ヘリカル形態の２次構造を形成して、二量体（ｄｉｍｅｒ）、オリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）および／または線維状形態の分子を含む凝集体を形成するようになる。
【０００４】
このようなアルファ−シヌクレイン凝集体は、細胞に毒性を誘発することが知られており、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、その他多様な疾患の神経細胞内で発見される異常なタンパク質凝集体であるレビー小体の主成分である。また、アルファ−シヌクレインのリン酸化、またはユビキチン化のような翻訳後修飾も、アルファ−シヌクレインの凝集および神経毒性と関連があることが知られている。アルファ−シヌクレインは、動物実験および細胞実験でもドーパミン神経細胞を死滅させて炎症反応を誘発し、実験動物でパーキンソン病症と類似の運動症状を誘発することが知られている。また、アルファ−シヌクレイン凝集は、パーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、多系統萎縮症およびその他多数の神経軸索疾患を含むシヌクレイン病（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）と呼ばれる一群の神経退行性疾患の病因と関連があることが知られている。
【０００５】
アルファ−シヌクレインに対する抗体またはそのような抗体を誘導するためのアルファ−シヌクレインの切片は、シヌクレイン病に対する免疫療法の方法として提案されてきた。しかし、抗体の脳浸透は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって制限されることがある。
【０００６】
また、高度−特異性のＢＢＢ輸送体の欠乏は、脳腫瘍および神経変性疾患を含む脳から起こる疾患のための新たな治療剤および診断剤の開発を遅延させている。ＢＢＢの生理学および恒常性を崩壊させないながら、脳に薬学的に効能のある投与量で治療剤および診断剤分子を伝達するための方法に対する必要性が明らかに存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一例は、アルファ−シヌクレイン（ａ−Ｓｙｎ）に対する抗原結合部位およびＩＧＦ１Ｒに対する抗原結合部位を含むタンパク質複合体または前記タンパク質複合体の製造方法を提供する。
【０００８】
他の例は、前記タンパク質複合体をコーディングするポリヌクレオチド、これを含む組換えベクター、およびこれを含む組換え細胞を提供する。
【０００９】
また他の例は、前記タンパク質複合体から得られるａ−ＳｙｎおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその製造方法を提供する。
【００１０】
また他の例は、前記ａ−ＳｙｎおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤を含む、アルファ−シヌクレイン病（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の予防および／または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１１】
本発明による抗体または抗原結合断片を用いたアルファ−シヌクレイン病の診断、治療または予防に使用される薬物を脳に伝達する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の一例は、アルファ−シヌクレイン（ａ−Ｓｙｎ）に対する抗原結合部位およびＩＧＦ１Ｒに対する抗原結合部位を含むタンパク質複合体および前記タンパク質複合体から得られるアルファ−シヌクレイン（ａ−Ｓｙｎ）およびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体（以下、抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体）に関するものである。よって、本発明による二重特異抗体は、アルファ−シヌクレインとＩＧＦ１Ｒを全て抗原として認識および結合することができる。
【００１３】
本発明による抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片を含み、アルファ−シヌクレインを特異的に認識して結合することができ、特にアルファ−シヌクレインのＣ−末端部位に結合でき、アルファ−シヌクレインまたはその凝集体に関連する疾病であるシヌクレイン病の予防、治療および／または診断用途として使用できる。
【００１４】
本発明によれば、用語“シヌクレイン病”は、病理学的シヌクレイン凝集体を特徴とする全ての神経退行性障害を含む。パーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、レビー小体病、レビー小体を伴う認知症、認知症を伴うパーキンソン症候群、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、多発性神経系萎縮および脳鉄沈着を伴う神経変性Ｉ型（ＮＢＩＡ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）を含むいくつかの神経退行性障害は、シヌクレイン病として集合的にグループ化される。また、アルファ−シヌクレイン凝集は、二次的にアルツハイマー疾患でも発見される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４、６：７３）。
【００１５】
シヌクレイン病は、共通的な病理学的特性を共有する神経退行性障害の多様なグループである：神経病理的実験で、特有の病変は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）および希小突起神経膠（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）の選択された集団内でアルファ−シヌクレインタンパク質の異常な凝集を含んで感知されることがある。アルファ−シヌクレイン（最初にＰＡＲＫｌおよびＰＡＲＫ４と判明する）は、新皮質、海馬、歯状回、嗅球、線条体、視床および小脳で広範囲に発現する１４０個アミノ酸のタンパク質である。アルファ−シヌクレインはまた、Ｂ−、Ｔ−、およびＮＫ細胞をはじめとして蛋白球および血小板を含む造血細胞で高く発現する。このような細胞内での正確な役割は知られていないが、巨核球（血小板前駆体）の分化と関連があった。
【００１６】
本願において、“アルファ−シヌクレイン凝集体に関連する疾患”は、シヌクレイン病と呼ばれる一群の神経退行性疾患であって、ニューロンおよび膠細胞（ｇｌｉａ）集団を含む病巣でアルファ−シヌクレイン凝集体が発見され、ドーパミン性システムの退化、運動能力変化、認知障害およびレビー小体および／またはレビーニューライトの形成のような特徴を有する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４、６：７３；ＭｃＫｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４）。このような疾患には、パーキンソン疾患、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、アルツハイマーレビー小体疾患、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病、多系統萎縮症およびその他の多数の神経軸索疾患を含むが、これに制限されるのではない。一実施形態において、本願による抗体は、パーキンソン病の治療に効果的に使用される。
【００１７】
また、本発明による抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を含み、抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片を血液脳関門を通過するようにして脳でその作用を発揮することができるようにし、半減期を延長して薬効を長期間維持することができるようにする。
【００１８】
さらに、本発明による抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに結合するが、リガンドの結合に影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達経路には影響を与えない特性を有し、よって、ＩＧＦ１Ｒとそのリガンド結合およびＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制しないので、血液脳関門を通過するシャトル手段として使用できる。
【００１９】
特に本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識し、ＩＧＦ１Ｒ、特にヒトＩＧＦ１Ｒ、マウスＩＧＦ１Ｒ、ラットＩＧＦ１Ｒ、およびサルＩＧＦ１Ｒに認識および結合し、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を阻害せず、トランスサイトーシスに使用できて血液脳関門通過能を有し、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有しないため、動物に反復投与した場合にも脳のＩＧＦ１Ｒ水準を減少させなくて、毒性を有しない。
【００２０】
特に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＢＢＢを構成する脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の表面に存在するＩＧＦ１Ｒに結合して細胞内部にＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが行われる。例えば、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株（例えば、ＭＣＦ−７など）を用いて本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされるかを確認することができる。本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体、例えば１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１、そして１５６４のａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔであるＣ０４、Ｆ０６、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２、ＶＨ３５は陰性対照群に比べて高いｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示した。当該結果は、試験した抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ程度は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに特異的でるのを示唆する。また、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体はｓｃＦｖ形態であって、多様な方式で治療用抗体に結合して製作できる。例えば、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖは治療用抗体、例えばα−ｓｙｎ抗体のＣ−末端に二つが結合した二重特異抗体、即ち、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態二重抗体あるいは当該抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｓｃＦｖ形態）が治療用抗体のＣ−末端に一つが結合した二重特異抗体、即ち、１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態二重特異抗体として製作でき、当該二重特異抗体は全てＩＧＦ１Ｒを発現する細胞中にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされる。ＩＧＦ１Ｒ抗体は細胞表面の抗原に対する高い結合力がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ効果を高め、これはＢＢＢ通過能につながる。但し、当該抗体がＢＢＢ通過能を有しながらＩＧＦ１Ｒのシグナリングに干渉を与える場合、副作用を引き起こすことがあるので、ＢＢＢ  ｓｈｕｔｔｌｅとしての機能を果たすことができる結合力を有しながら、同時にＩＧＦ１Ｒシグナルに対するｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体であることが特徴である。
【００２１】
前記抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、優れた開発容易性を有する。これに関連して、前記抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＣＤＲ領域に発生して抗体の安定性と効能を減少させるｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、例えば、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎを除去しようとした。ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生するアミノ酸の置換で、抗原であるＩＧＦ１ＲのＥＣＤに対する結合力に変化がないながら、抗体の安定性と効能がｐａｒｅｎｔａｌに比べて増大される。抗体のｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生する部位は、Ａｓｎを一つずつＱ、Ｈ、Ｋを含む他のｒｅｓｉｄｕｅへの突然変異体に対して、ＩＧＦ１Ｒに対する結合力をＥＬＩＳＡで分析した時、当該突然変異の結合力はｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と類似しているのを確認した。
【００２２】
追加的に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、脳で作用する生理活性物質と連結された時、前記生理活性物質単独に比べて向上したＢＢＢ通過能および効能を誘導することができる。
【００２３】
本発明の一例による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、多様な治療用第２抗体を含む二重特異抗体として活用でき、ヒトＩＰＳＣ由来ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムの通過実験で、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べて１５倍高いＢＢＢ通過能を示した（図１６ａ）。前記二重特異抗体において、前記第２抗体に結合された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）あるいは２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態に結合されたものであってもよい。例えば、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価または２価である二重特異抗体を正常ラットに単回投与後、血中抗体量およびＣＳＦでの抗体量を分析した時、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価または２価である二重特異抗体は、ｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（１５６４クローン）に比べて最大５倍増加された血中抗体量と最大５倍増加されたＣＳＦ抗体量を示した。Ｐａｒｅｎｔａｌ抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（１５６４クローン）に比べて約３倍増加されたＣＳＦおよび約４．５倍増加されたｂｒａｉｎ通過量を示す（図１６ｃ）。したがって、前記の方法で改善された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の二重特異抗体は、治療用第２抗体のみから構成される単独抗体に比べて最大約１５倍のＣＳＦおよび約２３倍のＢｒａｉｎ通過能を示すことが期待される。
【００２４】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＩＧＦ１Ｒ、特に、ヒト、サル、ラット、およびマウスを含む哺乳動物のＩＧＦ１Ｒに結合することが確認され、薬物開発のためのスクリーニング、臨床試験などに有用に使用できる。
【００２５】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片である。
【００２６】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）が≦１０−６Ｍの親和度で結合する時、抗原のようなその標的に“特異的に結合する”と言われる。抗体は、ＫＤが≦１ｘ１０−８Ｍである時、あるいはＥＣ５０（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０）が２ｎＭ以下である時、高い親和性で標的に特異的に結合する。一実施形態で、抗体またはその抗原結合断片はＫＤ≦１×１０−８であって、ＩＧＦ１ＲまたはヒトＩＧＦ１Ｒに結合することができる。本発明に開示された抗体は、ＩＧＦ１Ｒ、特に、ヒトＩＧＦ１Ｒ、マウスＩＧＦ１Ｒ、ラットＩＧＦ１Ｒ、およびサルＩＧＦ１Ｒに結合することが確認された。
【００２７】
本明細書において、用語“エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）”は抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体によって認知される抗原の一部分を意味すると解釈される。一具体例によれば、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の結合部位は、ＩＧＦ１Ｒタンパク質、例えば、ヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質（配列番号９９）の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）であってもよい。さらに具体的に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体、例えば１５６４クローン抗体のヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合部位は、配列番号９９のアミノ酸配列からなるタンパク質で、結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８  ａｎｄ  Ｇｌｕ７７９を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、ａｎｄ  Ｌ８１３を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０、ａｎｄＣ４８８を含む。よって、本発明によるＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープはｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅであって、前記の３個結合部位を全てあるいは一部を含むものであってもよい。
【００２８】
本発明において、“抗体”とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、生体内で生成されたもの、組換え的に生成されたもの、または人工的に合成されたものであってもよく、その種類は特に制限されない。本発明において、抗体は、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を全て含む。また、本発明において、抗体とは、抗原結合能を保有した抗体の抗原結合断片も含む。
【００２９】
前記抗体はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も含み、前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体であってもよい。前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体である。
【００３０】
本発明による抗体は、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されない。多様な抗体の構造が以下本発明で追加的に開示される。
【００３１】
本明細書に記載された“抗原結合断片”は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはこれを含むポリペプチドを意味する。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および／または親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部またはこれを含むポリペプチドであってもよい。このような抗原結合断片は、典型的に、一つ以上の“相補性決定部位”（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ、ｏｒ  ＣＤＲ）を含むことができ、ここに加えて、一つ以上の“フレームワーク”領域を含むことができる。ＣＤＲは抗体の抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列であり、フレームワーク領域はこれらＣＤＲの適切な形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持するのに寄与するアミノ酸配列部位であって、抗原結合領域と抗原の間に結合を促進することができる。
【００３２】
本発明において、“相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）”とは、抗体の可変領域中の抗原との結合特異性を付与する部位を意味する。
【００３３】
前記抗体は、全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、など）より選択されたものであってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプ形態であってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は二つの重鎖と二つの軽鎖を含み、それぞれの重鎖および軽鎖はジスルフィド結合を通じて結合されて二つの重鎖−軽鎖構造体（ｄｉｍｅｒ）を形成し、前記形成された二つの重鎖−軽鎖は重鎖のＦｃ部位でジスルフィド結合を通じて連結された形態を有する。前記ＩｇＧ形態の抗体は、両側重鎖−軽鎖構造体に同一な抗原に対する抗原結合部位を含んで一つの抗原を標的とする単一標的抗体、または両側重鎖−軽鎖構造体に互いに異なる抗原に対する抗原結合部位を含んで二つの抗原を標的とする二重特異抗体であってもよい。
【００３４】
本願に使用された、抗体または免疫グロブリンの鎖（重鎖または軽鎖）の“抗原結合断片”は全長鎖と比較して一部のアミノ酸が欠如したが、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含むものである。このような抗原結合断片は、標的抗原に特異的に結合でき、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的に活性があるといえる。具体的に、前記抗原結合断片は前記相補性決定領域を一つ以上含む抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよいが、これに限定しない。このような生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または、例えば、完全な抗体を酵素的または化学的切断して生産できる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、これで制限するのではない。
【００３５】
本発明において、例えば、抗原結合断片、タンパク質、または抗体のようなポリペプチドの“変異体”は、他のポリペプチド配列と比較して一つ以上のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加および／または置換が発生したポリペプチドであり、融合ポリペプチドを含む。例えば、抗体の一部は、前記重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲ配列の一つ以上の残基で保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を含む。
【００３６】
本発明において、ポリペプチドの“誘導体”は、挿入、欠失、付加または置換変異体とは異なる、他の化学的モイエティとのコンジュゲーションを通じて化学的に変形されたポリペプチドを意味する。
【００３７】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害しない。具体的に、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞でＩＧＦ１Ｒのリガンドが細胞膜に位置する前記ＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制せず、また細胞表面のＩＧＦ１Ｒ発現にも影響を与えない長所がある。よって、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、トランスサイトーシスを通じて血液脳関門を通過するのに効果的に使用できる。
【００３８】
ヒトＩＧＦ１Ｒは、インスリン類似成長因子、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２およびインスリン（ＩＮＳ）によって活性化できる。ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達は、ＰＩ３  Ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ経路の活性化に依存的なＩＲＳアダプタータンパク質を通じて細胞の成長と生存を促進する。ＩＧＦ１Ｒは、その主要サブストレートであるＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＩＲＳ−３およびＩＲＳ−４とＳｈｃタンパク質に信号を伝達する。その結果、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼおよびＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ信号伝達経路の活性化がもたらされる。ＩＧＦ１Ｒは、現在まで主に使用されるＢＢＢ通過能向上のための、脳の内皮細胞でその発現すると知られた他のトランスサイトーシス標的と比較して、ＩＧＦ１Ｒの発現は脳に相対的に高い発現量を示すことが明らかになった。
【００３９】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた前述のような信号伝達経路を妨害しない。また、本発明による一実施形態で、ＩＧＦ１Ｒは、治療抗体のＢＢＢ通過能向上用途として現在開発されている他の標的、例えば、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒなどと比較した時、正常脳およびｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅ、例えば肝、肺、大腸などに相対的に低い発現量を示すことが明らかになった。
【００４０】
ＩＧＦ１Ｒは、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過して有用な物質を脳の内部に伝達できるＲＭＴ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）の標的になっている。しかし、血液脳関門通過のための薬物伝達標的として使用されるためには、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに結合するが、リガンドの結合に影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達経路には影響を与えない特性を有してこそ好ましい。したがって、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒとそのリガンド結合およびＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制しないので、血液脳関門を通過するシャトル手段として使用できる。
【００４１】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、トランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）が可能であり、脳の内皮細胞を通過することができる。また、本発明による抗体は、マウスに血管注射した場合、マウスの脳血管と同一の位置に位置する。このような結果は、本発明による抗体または抗原結合断片が血液脳関門を通過する薬物伝達体として効果的に使用できるのを示すものである。
【００４２】
したがって、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、脳で作用する生理活性物質が血液脳関門を通過できるようにする。本発明において、生物学的障壁は、細胞、組織、膜または生物学的分子の効果的な通過、拡散または伝達を遮断する細胞、膜、または構造をいう。このような生物学的障壁は、神経細胞／組織、結合組織、筋肉、膜または上皮（例えば、粘膜または血管）細胞を含む。代表的な例として血液脳関門が挙げられる。
【００４３】
本発明において、“血液脳関門”またはＢＢＢは、脳および脊椎とその周辺循環系との間に存在する脳の毛細血管内皮細胞膜内にタイト結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）によって形成された障壁である。このような障壁は非常に堅固で、約６０Ｄａ分子量の低分子物質が脳に通過することも制限する。脳の血液脳関門、脊椎の血管脊髄障壁、そして網膜の血管網膜障壁は、中枢神経系内の連続的な毛細血管障壁であって、通常ＢＢＢと称する。
【００４４】
本発明において、“血液脳関門伝達体”はこのような血液脳関門を通過して、前記脳作動因子物質を伝達することができ、前記脳作動因子物質は例えば、化合物、ペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体、または低分子化合物を含む。
【００４５】
本発明による抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、目的とする特異性を有する抗原−特異的ヒトｍＡｂが遺伝子導入マウス、例えば、先に記述されたものから生成され選択され得る。このような抗体は適切なベクターおよび宿主細胞を使用してクローニングされて発現するか、または前記抗体は培養されたハイブリドーマ細胞から収穫できる。また、前記抗体は、ファージ−ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。ファージディスプレイ技術は、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）バクテリオファージの表面上で抗体レパートリーをディスプレイして、これから目的とする抗原に結合するファージを選別する一種の免疫選択（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を模倣した方法である。このようなファージ技術は本発明の実施例またはＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／１０４９４号を参照することができる。一実施形態で、本発明のヒト化ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ファージディスプレイ方法によって選別される。
【００４６】
本発明はＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片に関するものであって、前記抗体または抗原結合断片は重鎖の相補性決定部位と軽鎖の相補性決定部位を含んで、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するポリペプチド、タンパク質または抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
【００４７】
具体的に、以下、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する抗体に関する記載である。
【００４８】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識し、ＩＧＦ１Ｒ、特に、ヒトＩＧＦ１Ｒ、マウスＩＧＦ１Ｒ、ラットＩＧＦ１Ｒ、およびサルＩＧＦ１Ｒに認識および結合し、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を阻害せず、トランスサイトーシスに使用できて、血液脳関門通過能を有し、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有しないので、動物に反復投与した場合にも脳のＩＧＦ１Ｒ水準を減少させなくて、毒性を有しない。
【００４９】
特に、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＢＢＢを構成する脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の表面に存在するＩＧＦ１Ｒに結合して細胞内部にＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが行われる。例えば、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株（例えば、ＭＣＦ−７など）を用いて本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされるかを確認することができる。本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体、例えば、１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１、そして１５６４のａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔであるＣ０４、Ｆ０６、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２、ＶＨ３５は陰性対照群に比べて高いｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示した。当該結果は、試験した抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ程度は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに特異的であるのを示唆する。また、本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体はｓｃＦｖ形態であって、多様な方式で治療用抗体に結合して製作できる。例えば、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖは治療用抗体、例えば、α−ｓｙｎ抗体のＣ−末端に二つが結合した二重特異抗体、即ち、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態二重抗体あるいは当該抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｓｃＦｖ形態）が治療用抗体のＣ−末端に一つが結合した二重特異抗体、即ち、１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態二重特異抗体として製作でき、当該二重特異抗体は全てＩＧＦ１Ｒを発現する細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされる。ＩＧＦ１Ｒ抗体は細胞表面の抗原に対する高い結合力がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ効果を高め、これはＢＢＢ通過能につながる。但し、当該抗体がＢＢＢ通過能を有しながらＩＧＦ１Ｒのシグナリングに干渉を与える場合、副作用を引き起こすことがあるため、ＢＢＢ  ｓｈｕｔｔｌｅとして機能を果たすことができる結合力を有しながら同時にＩＧＦ１Ｒシグナルに対するｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体であることが特徴である。
【００５０】
本発明はＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片に関するものであって、前記抗体または抗原結合断片は重鎖の相補性決定部位と軽鎖の相補性決定部位を含んで、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するポリペプチド、タンパク質または抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
【００５１】
具体的な一例は、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、
（ｉ）表１に開示されたＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）表２に開示されたＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域；
前記一つ以上の重鎖相補性決定領域および前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域の組み合わせ；または
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組み合わせ
を含むものであってもよい。
【００５２】
追加的に、前記重鎖可変領域、前記軽鎖可変領域、または前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組み合わせにおいて、前記重鎖可変領域はＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の重鎖フレームワークを含むことができ、前記軽鎖可変領域はＬ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の軽鎖フレームワークを含むことができる。
【００５３】
本発明による（ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２またはＨ−ＣＤＲ３の重鎖相補性決定部位は、下記表１に記載されたアミノ酸配列から選択されるか、前記選択されたアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含む。また、（ｉｉ）Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２またはＬ−ＣＤＲ３の軽鎖相補性決定部位は、下記表２に記載されたアミノ酸配列から選択されるか、前記選択されたアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含む。
【００５４】
前記実質的同一性とは、本発明は配列変異が存在する本発明に開示された効果を維持することを意味する。一実施形態で開示された重鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。他の実施形態で開示された軽鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。例えば、本発明に開示された抗体または抗原結合断片の配列と９０％、９５％、または９９％同一性を示す変異体の場合、任意の変異はＣＤＲよりは可変領域の骨格で発生する。
【００５５】
［表１］本発明の抗体クローンと重鎖可変領域のＣＤＲ配列
2021506770.tif 000190
2021506770.tif 000191
2021506770.tif 000192
2021506770.tif 000193
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【００５６】
［表２］本発明の抗体クローンと軽鎖可変領域のＣＤＲ配列
2021506770.tif 000195
2021506770.tif 000196
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2021506770.tif 000198
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【００５７】
本発明によるＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の重鎖フレームワークは下記表３に記載されたアミノ酸配列から選択でき、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の軽鎖フレームワークは下記表４に記載されたアミノ酸配列から選択できる。
【００５８】
具体的に、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の重鎖可変領域は、上記表１に記載されたＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含むか、追加的に表３のＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４の重鎖フレームワークを含むことができる。本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の軽鎖可変領域は、下記表３に示すＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含むか、追加的に表４に示すＬ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４の軽鎖フレームワークを含むことができる。一例で、前記抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、表１に記載されたＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列からなる群より選択された各クローンのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域および表２に記載されたＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列からなる群より選択された各クローンのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むものであってもよい。
【００５９】
本発明の一例で、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＦｃ領域にアミノ酸変異、例えば、アミノ酸のＤｅａｍｉｎｄａｔｉｏｎ除去で、抗原であるＩＧＦ１ＲのＥＣＤに対する結合力に変化がないながら血中ｃｌｅａｒａｎｃｅ減少で抗体のｐＫが増加され、よって抗体の半減期を延長する。一例で、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体でｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが除去されたアミノ酸位置は、クローン１５６４で軽鎖ＬＣＤＲ２のＮ５１Ｄ、ＬＣＤＲ３のＮ９５ａＫ、Ｎ９５ａＨ、Ｎ９５ａＲ、Ｎ９５ａＤ、または重鎖のＨＣＤＲ２でＮ５４ＤまたはＮ５４Ｑであってもよい。
【００６０】
［表３］本発明の抗体クローンと重鎖可変領域のフレームワーク配列
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【００６１】
［表４］本発明の抗体クローンと軽鎖可変領域のフレームワーク配列
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【００６２】
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗体であってもよく、本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は表５および表６に開示され、各クローンのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３およびフレームワーク１〜４のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯをそれぞれ記載する。
【００６３】
下記表５および表６に記載された前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、多様な形態の抗体の製造のために自由に組み合わせることができる。前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各組み合わせ例を表５及び表６に示す。
【００６４】
［表５］本発明による抗体の重鎖可変領域
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【００６５】
［表６］本発明による抗体の軽鎖可変領域
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【００６６】
本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は表５および表６に開示される。このようなそれぞれの可変領域は、完全な抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を形成するために前記重鎖および軽鎖不変領域に結合できる。本発明の一例による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を構成する重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせ例は、前記表５および表６に記載された同一クローン名によって重鎖可変領域と軽鎖可変領域を組み合わせたものであってもよい。
【００６７】
本発明の具体的な一例で、配列番号１〜配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、
配列番号１０〜配列番号４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、
配列番号５０〜配列番号８０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）；
配列番号９６〜配列番号１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、
配列番号１１４〜配列番号１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および
配列番号１３３〜配列番号１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）からなる群より選択された少なくとも一つを含む、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片に関するものである。
【００６８】
具体的に、本発明による抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１０〜配列番号４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５０〜配列番号８０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域と、
配列番号９６〜配列番号１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１４〜配列番号１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１３３〜配列番号１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【００６９】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１０のアミノ酸配列を含むタンパク質でＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、Ｇｌｕ７７９、Ｌ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、Ｌ８１３、Ｖ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸を特異的に認識して結合するものである、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片であってもよい。具体的に、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１０のアミノ酸配列を含むタンパク質で結合部位１〜結合部位３からなる群より選択された少なくとも一つ以上の結合部位に結合するものであり、前記結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８およびＧｌｕ７７９からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９およびＬ８１３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含むものであってもよい。本発明による抗体またはその抗原結合断片重鎖可変領域は、
配列番号８１〜８４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号８５〜８６のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号８７〜９１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号９２〜９５のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものであってもよい。
【００７０】
本発明による抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、
配列番号１６２〜１６４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号１６５のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号１６６〜１６８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号１６９〜１７１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものであってもよい。
【００７１】
前記表５および表６に開示された重鎖可変領域および軽鎖各可変領域はそれぞれ別途のドメイン抗体として使用されるか、互いに自由に組み合わせられて多様な抗体を形成することができ、単一鎖形態に連結されてｓｃＦｖのような単鎖抗体を形成することもできる。
【００７２】
本発明において、“ドメイン抗体”は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。一実施形態では、２個以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによる共有結合で連結されて、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）のドメイン抗体を形成する。このような２価ドメイン抗体の２個のＶＨ領域は同一または異なる抗原を標的とすることができる。
【００７３】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、相補性決定領域を一つ以上含む抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディおよびジアボディからなる群より選択できる。
【００７４】
前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、Ｆａｂで重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、２個のＦａｂ’がＦａｂ’ヒンジ領域のシステイン残基がジスルファイド結合をなしながら生成される。
【００７５】
Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体断片であって、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）および二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む。二重鎖Ｆｖは、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結され得る。単鎖Ｆｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が直接またはペプチドリンカーを通じて共有結合で連結されるか、またはＣ−末端で直ちに連結されていて、二重鎖ＦｖのようにｓｃＦｖダイマーと同じ構造（ｄｉ−ｓｃＦｖ）を成すことができる。本発明において、単鎖Ｆｖは重鎖および軽鎖可変領域が直接またはリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ、ｓｃＦｖダイマーと同じ構造（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、および重鎖可変領域、軽鎖可変領域、およびＦｃが単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ−Ｆｃなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００７６】
前記ペプチドリンカーは前述の通りであってもよく、例えば、１〜１００個、例えば、２〜５０個または５〜２５個アミノ酸長さのものであってもよく、前記ペプチドリンカーは抗体の機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。前記ペプチドリンカーに含まれているアミノ酸種類は例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＬｅｕからなる群より選択された１種以上のアミノ酸から構成でき、具体的な例として、ＧｌｙとＳｅｒ残基から構成されるか、ロイシン（Ｌｅｕ）とセリン（Ｓｅｒ）から構成できる。具体的一例で、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであってもよく、前記ｎは（Ｇ４Ｓ）の反復数であって、１〜１０の整数、例えば２〜５、特に３または４の整数で表されるものであってもよい。前記ペプチドリンカーの一例は、配列番号１７２または１７３のアミノ酸からなるペプチドであってもよい。
配列番号４１１：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号４１２：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【００７７】
このような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２個の可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコーディングするＤＮＡの間にペプチドリンカーをコーディングするＤＮＡを融合することによって製造できる。製造されたポリペプチドは、折りたたみによって抗原−結合単量体を形成するか、または２個の可変ドメインの間に柔軟性リンカーの長さによって、多量体（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成することができる。異なるＶＬとＶＨを含むポリペプチドを組み合せることによって、異なるエピトープに結合する多量体性ｓｃＦｖを形成することができる。
【００７８】
前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペブシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術によって製作することができる。
【００７９】
本発明に開示された単鎖抗体は、重鎖および軽鎖可変領域のドメイン組み合わせを含むｓｃＦｖ、またはＣＤＲを含む軽鎖および重鎖可変ドメインの組み合わせが含まれるが、これで制限されるわけではない。
【００８０】
また、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、前記重鎖可変領域を含む重鎖および前記軽鎖可変領域を含む軽鎖を含むことができる。具体的に、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は重鎖不変領域および軽鎖不変領域に結合でき、前記重鎖および軽鎖配列はまた、完全な抗体構造を形成するために組み合わせられ得る。
【００８１】
本発明による可変領域と組み合わせられるこのような不変領域配列は例示的であり、前記不変領域は免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）の重鎖不変領域および軽鎖不変領域から適切に選択できる。例えば、重鎖不変領域はＩｇＧ１重鎖不変領域、ＩｇＧ３重鎖不変領域、またはＩｇＧ４重鎖不変領域であってもよく、軽鎖不変領域はカッパ不変領域またはラムダ軽鎖不変領域であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００８２】
一例として、本発明による前記可変領域は不変領域に結合されて、下記記載された重鎖および軽鎖配列を形成することができる。前記重鎖および軽鎖の組み合わせ例を表７に示す。また、例示的な完全な抗体を表１６に記載した。前記不変領域は、免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）の重鎖不変領域および軽鎖不変領域から適切に選択できる。
【００８３】
［表７］例示的な抗体
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【００８４】
本発明に記載された抗体はまた、前記のような一つ以上のＣＤＲまたは一つ以上の可変領域を含む二重特異的抗体および二重機能性抗体を含む。二重特異的または二重機能性抗体は互いに関連性があるかまたはない二種類の異なる標的を認識する人工ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結のような多様な方法を用いて製造できる。
【００８５】
本発明において、“多重特異抗原結合タンパク質”または“多重特異抗体”は、二つ以上の抗原またはエピトープを標的とするものであって、二つ以上の抗原結合部位を含む。本発明において、“二重特異”または“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二重特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知された多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生産できる。
【００８６】
前記多重特異抗体、例えば、二重特異抗体を製造することができる、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、前述の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片を全て含むことができ、例えば、完全な抗体であってもよく、前記抗原結合断片はドメイン抗体、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよい。
【００８７】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを媒介とするかまたはせずに連結できる。また、抗原結合断片内の重鎖部分と軽鎖部分、例えば、ｓｃＦｖ断片内の重鎖可変領域と軽鎖可変領域もペプチドリンカーを媒介とするかまたはせずに連結できる。前記ペプチドリンカーは、先に説明した通りであってもよい。
【００８８】
前記二重特異抗体で、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、結合された異なる抗原またはエピトープを標的とする第２抗体またはその抗原結合断片を血液脳関門を通過させて脳に伝達させる機能を遂行することができる。前記第２抗体は、脳で効能を発揮する抗体であってもよいが、特に限定されるのではない。
【００８９】
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、異なる第２抗体と特定の領域または配列を共有することができる。例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、第２抗体の抗体または抗原結合断片の不変領域を共有するか、Ｆｃ領域を共有することができる。
【００９０】
また、本発明において、二重特異的抗体の構造は、完全な免疫グロブリンの２個重鎖のＦｃ領域、例えば、重鎖の末端に直接またはリンカーを媒介として各Ｆｃに抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖが連結された形態であるｂｉｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍ二重抗体と、完全な免疫グロブリンの２個重鎖のうちの１個重鎖の末端にのみ直接またはリンカーを媒介として抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖが連結された形態であるｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体を全て含むが、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体が好ましい。
【００９１】
具体的に、本発明の一例で、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍのクローンがｂｉｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍのクローンより半減期が向上する場合があり、この時、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍクローンの構造は完全な免疫グロブリンの形態で１個の重鎖末端にのみリンカーでＩＧＦ１Ｒに結合するドメイン抗体（ｓｃＦｖ）が連結された形態である。完全な免疫グロブリン形態で１個の重鎖にはＣ末端にリンカーが含まれているＩＧＦ１Ｒ抗原に結合するドメイン抗体が連結されており、残り１個の重鎖には不変領域Ｃ末端の後にいずれのものも連結されていない二つの互いに異なる重鎖を含むＫｎｏｂ−Ｉｎ−ｈｏｌｅ技法が適用された異種二量体の形態である。
【００９２】
前記二重特異抗体において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片に結合する前記第２抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体であってもよい。前記第２抗体は、完全な抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されない。
【００９３】
以下、本発明による抗−ｓｙｎ抗体およびその抗原結合断片に関するものである。
本明細書で提供される抗体が抗原として認識するアルファ−シヌクレインは、ヒトアルファ−シヌクレイン、サルアルファ−シヌクレイン（例えば、Ｒｈｅｓｕｓアルファ−シヌクレイン）、マウスアルファ−シヌクレイン、ラットアルファ−シヌクレインなどの哺乳動物アルファ−シヌクレインから選択されたものであってもよく、例えば、ヒトアルファ−シヌクレインはアルファ−シヌクレイン（ＮＣＢＩ  ＩＤ：ＮＰ＿０００３３６）であってもよいが、これに制限されるわけではない。本明細書に異なって言及されない限り、アルファ−シヌクレインはヒトアルファ−シヌクレインを指して称するものであり、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片はヒトアルファ−シヌクレインだけでなく、サル（例えば、Ｒｈｅｓｕｓ）、ラット、および／またはマウスアルファ−シヌクレインにも特異的な結合能を有するものであってもよい。
【００９４】
前記抗体またはその抗原結合断片が結合するアルファ−シヌクレインのＣ−末端部位に結合し、具体的に、ヒトアルファ−シヌクレインタンパク質は、配列番号５５９のアミノ酸配列で、Ｃ−末端領域、例えば、１１０番残基〜１２０番残基または１１１番残基〜１２２番残基を含む連続する少なくとも１１個または１２個のアミノ酸から構成されたペプチドを含むＣ−末端領域であってもよい。本発明による抗体またはその抗原結合断片は、前記抗原認識部位を認識してアルファ−シヌクレイン凝集体に対する高い親和度で結合することが確認された。
【００９５】
本明細書において、“親和性または親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、抗体またはその抗原結合断片と抗原の間の相互作用の強度であり、抗体または抗原結合断片のＣＤＲ配列、および／または抗体または抗原結合断片の物理化学的特性（親水性／疎水性、静電気的特性など）、抗原の大きさ、形状、および／または電荷のような抗原の特徴などによって決定できる。このような親和度を決定する方法は、当業界に公知されており、通常解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）で示すことができるが、これに制限されるわけではない。
【００９６】
本明細書において、“アルファ−シヌクレインタンパク質またはアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的結合する”とは、アルファ−シヌクレインタンパク質またはアルファ−シヌクレイン凝集体に対する親和度が他の抗原と比較して相対的に高いことを意味するものであって、例えば、アルファ−シヌクレイン凝集体、具体的に、アミロイドフィブリル（ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ）、プロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ）およびオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ）、特にアミロイドフィブリルに対して親和度がＯｃｔｅｔおよびＳＰＲ分析でそれぞれ解離定数（ＫＤ）０．１×１０−１０Ｍ〜２×１０−１０Ｍ、または０．０５×１０−１０Ｍ〜０．３×１０−９Ｍであるが、これに制限されるわけではない。
【００９７】
本発明の一例による軽鎖および重鎖を含むヒト化アルファ−シヌクレイン抗体、例えば、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、およびＨｕ１１Ｆ１１＿ＡＢＬ２−４の場合、キメラアルファ−シヌクレイン抗体に比べて高い食細胞作用促進活性を示す。Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、ＡＢＬ２−４の場合、キメラアルファ−シヌクレイン抗体に比べてフィブリルの神経細胞膜結合に対する高い抑制能を示し、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、ＡＢＬ２−４の場合、キメラアルファ−シヌクレイン抗体と比較して、アルファ−シヌクレイン過発現細胞から分泌されたアルファ−シヌクレインの他の神経細胞への伝播に対する高い抑制能を示す。アルファ−シヌクレイン凝集体に対する結合力、例えば、ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙでは測定した結合力は、キメラアルファ−シヌクレイン抗体と類似するか優れた活性を有する。
【００９８】
本発明によるアルファ−シヌクレイン抗体は、適用対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の神経系で神経細胞の外に分泌されたアルファ−シヌクレイン凝集体が細胞外空間（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅ）で他の正常細胞に移動して当該神経細胞を一種の感染させる作用を抑制し（ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）、また、小膠細胞が細胞外空間に位置するアルファ−シヌクレイン凝集体に対する食細胞作用促進能を有する。アルファ−シヌクレイン凝集体は、プリオンのように、一つの細胞から他の細胞に伝播しながら当該正常細胞内にもアルファ−シヌクレイン、特にアルファ−シヌクレイン凝集体が脳全般に広がりながらシヌクレイン病を招く。したがって、アルファ−シヌクレイン凝集体は、脳神経細胞に対して毒性があり、脳神経細胞死滅（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、脳炎症反応（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を起こすことがよく知らされている。したがって、アルファ−シヌクレイン凝集体が脳の様々な部位に広がるにつれて脳細胞死滅と脳炎症反応が増加し、これによってシヌクレイン病、例えば、パーキンソン病が進行しながら確認される脳細胞死滅およびこれによる行動、認知機能の障害が現れる。
【００９９】
よって、本発明のアルファ−シヌクレイン抗体は、アルファ−シヌクレインまたはアルファ−シヌクレイン凝集体の神経細胞間移動を抑制して、アルファ−シヌクレイン凝集体が脳の多様な領域に広がる現象を防止することができ、また、小膠細胞の食細胞作用を促進して、対象神経系で神経細胞の外部に存在するアルファ−シヌクレイン凝集体自体の減少または除去によってシヌクレイン病の重要な原因であるアルファ−シヌクレイン凝集体の水準を減少させて、脳神経細胞死滅および脳炎症反応を減らし、さらに、シヌクレイン病、例えばパーキンソン病の症状および病の進行を改善、軽減または予防する効果を期待することができる。
【０１００】
また、本発明によるアルファ−シヌクレイン抗体は、（ｉ）アルファ−シヌクレインまたはアルファ−シヌクレイン凝集体の神経細胞間移動を抑制、および（ｉｉ）小膠細胞の食細胞作用の促進による脳神経系のアルファ−シヌクレイン凝集体の水準減少と関連して二つの機能を全て遂行できる点から優れた活性を有する（本願ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ結果参考）。特に、現在まで臨床試験が進行中であるか論文に公開されたアルファ−シヌクレイン抗体は、前記（ｉ）および（ｉｉ）活性のうちの一つの活性を有するので、これは、本願のアルファ−シヌクレイン抗体は知られたアルファ−シヌクレイン抗体に比べて優れたシヌクレイン病の予防または治療に長所があるのを示す。したがって、本願発明によるアルファ−シヌクレイン抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集体の除去および減少と、病因としての作用を抑制する効能がさらに優れており、したがって、シヌクレイン病またはこれに関連した症状的疾病（例えば、認知障害など）にさらに効果的である。
【０１０１】
アルファ−シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、アルファ−シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、脳の凝集体の濃度を低めることができる。また、アルファ−シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外でのアルファ−シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、結局、血液脳関門を境界にしたアルファ−シヌクレイン形態間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低める効果をもたらすことができる。
【０１０２】
これは、抗体を、例えばこれに制限されるのではないが、より簡便な皮下注射のような方式で投与しても十分な効能を得ることができるため、臨床で大きな長所がある。また、本理論で限定するのではないが、本願による抗体または抗原結合断片は、単量体の除去による凝集体形成抑制、または単量体と凝集体を全て除去することができる。
【０１０３】
本明細書で提供されるアルファ−シヌクレインタンパク質またはアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、自然に生産されたものでなくてもよい（ｎｏｎ−ｎａｔｙｕｒａｌｌｙ  ｏｃｕｒｒｉｎｇ；例えば、化学的合成または組み換え的に生産されたものであってもよい）。前記のような組換技術は、当該技術分野に広く公知されている。
【０１０４】
本明細書において、“抗体”は、任意のアイソタイプの完全な免疫グロブリン、または標的抗原への結合のために完全な抗体と競争できる抗原結合断片を意味する。例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒトまたは二重特異的抗体またはこれらの抗原結合断片を含む。抗体は、それ自体で抗原結合タンパク質の一種でもある。完全な抗体は、一般に少なくとも２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖を含むが、一部の場合に抗体が単に重鎖のみを含んでもよい。
【０１０５】
抗体またはその抗原結合断片は、ただの単一源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来するか、またはキメラであってもよい、キメラ抗体は、２種類の異なる抗体に由来する部分を含み、以下、より詳細に記述される。抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、組換えＤＮＡ技術または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって生産できる。他の言及がなければ、本願において、用語、抗体は、２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖を含む抗体はもちろん、これらの誘導体、変異体、断片、および突然変異体を含み、これらの例は以下の記述の通りである。
【０１０６】
一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されず、本願に開示された多様な形態の抗体を含む。一実施形態において、本願に開示された抗体の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単一体である断片（ｓｃＦｖ）、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）または重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）を通じて連結された単一鎖の単鎖抗体分子であってもよい。
【０１０７】
本願において、“軽鎖”は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長の軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、および不変領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在する。軽鎖の種類には、カッパおよびラムダ鎖が含まれる。
【０１０８】
本願において、“重鎖”は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨドメインはカルボキシ末端に存在し、ＣＨ３がカルボキシ−末端に最も近く位置する。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプを含む。
【０１０９】
本明細書に記載された“抗原結合断片”は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはこれを含むポリペプチドを意味する。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および／または親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部またはこれを含むポリペプチドであってもよい。このような抗原結合断片は典型的に、一つ以上の“相補性決定部位”（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ、ｏｒ  ＣＤＲ）を含むことができ、ここに加えて、一つ以上の“フレームワーク”領域を含むことができる。ＣＤＲは抗体の抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列であり、フレームワーク領域はこれらＣＤＲの適切な形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持するのに寄与するアミノ酸配列部位であって、抗原結合領域と抗原の間に結合を促進することができる。
【０１１０】
本願に使用された、抗体または免疫グロブリンの鎖（重鎖または軽鎖）の“抗原結合断片”は全長鎖と比較して一部のアミノ酸が欠如したが、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含むものである。このような断片は、標的抗原に特異的に結合でき、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的に活性があるといえる。一態様において、このような断片は全長軽鎖または重鎖内に存在する少なくとも一つのＣＤＲを含み、一部の実施形態において、単鎖、重鎖および／または軽鎖、またはその一部を含む。このような生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または、例えば、完全な抗体を酵素的または化学的切断して生産できる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、これに制限されるのではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃなど）を含む。また、これに制限されるのではないが、ヒト、マウス、ラット、カメリドまたはウサギを含む任意の哺乳動物に由来し得る。本明細書に開示された一つ以上のＣＤＲのような抗体の機能的な部分は、第２のタンパク質または低分子化合物と共有結合で連結され、特定の標的に対する標的治療剤として使用できる。
【０１１１】
本願において、“Ｆａｂ断片”は、１個の軽鎖と、ＣＨ１および可変領域のみを含む１個の重鎖から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【０１１２】
本願において、“Ｆｃ”領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖断片を二分子含む。これら２個の重鎖断片は、２個以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって互いに結合されている。
【０１１３】
本願において、“Ｆａｂ’断片”は、Ｆａｂ断片に重鎖のＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に存在する領域を追加的に含んで、二分子のＦａｂ’断片の二つの重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
【０１１４】
本願において、“Ｆ（ａｂ’）２断片”は、先に記述したように、２個の軽鎖、および可変領域、ＣＨ１とＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に不変領域の一部を含む重鎖２分子を含んで、２分子の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は２個のＦａｂ’断片から構成され、前記二つのＦａｂ’断片はこれら間のジスルフィド結合によって互いに会合されている。
【０１１５】
本願において、“Ｆｖ領域”は、重鎖および軽鎖の可変領域を含むが、不変領域は含まない抗体である。
【０１１６】
本願において、“単鎖抗体”は、重鎖および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖である。例えば、前記単鎖抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、およびＦｃが単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ−Ｆｃなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。単鎖抗体は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができる。
【０１１７】
本願において、“２価の抗原結合タンパク質”または“２価抗体”は、２個の抗原結合部位を含む。このような２価抗体に含まれている２個の抗原結合部位は、同一の抗原特異性を有するか、またはそれぞれ異なる抗原に結合する二重特異的抗体であってもよい。本願において、“多重特異的抗原結合タンパク質”または“多重特異的抗体”は、二つ以上の抗原またはエピトープを標的とするものである。
【０１１８】
本願において、“二特異的”、“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知の多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生産できる。
【０１１９】
本願において、“二特異的”、“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知の多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片あるいはｓｃＦｖ断片の連結によって生産できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０、７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２、１４８：１５４７−１５５３などを参照することができる。二特異的抗原結合タンパク質または抗体の２個の抗原結合部位が結合する２個の互いに異なるエピトープは、同一または異なるタンパク質標的に配置できる。本願による一実施形態において、本願による抗体は、血液脳関門を通過して伝達されるために伝達体に対する結合を追加的に含む二重特異的抗体の形態を取ることができる。血液脳関門を通じて薬物を伝達するための一つ方法は、細胞に内在したグルコースおよびアミノ酸伝達体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介トランスサイトーシスのような伝達システムの使用を含む。
【０１２０】
本願において、“コンジュゲート”は、本願に開示された抗体またはその抗原結合断片と他の分子、特に後述する血液脳関門伝達体または治療剤とのキメラ分子をいうものである。コンジュゲートで、本願による抗体またはその抗原結合断片は、他の分子と、例えば、共有結合またはファンデルワールスまたは疎水性相互作用による物理的力、カプセル化、包埋化（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）または前記組み合わせを含む方法によって物理的に結合される。一実施形態によるコンジュゲートで、本願による抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドリンカーを通じて連結できる。
【０１２１】
本願はまた、本願に開示された一つ以上のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含む。実質的同一性とは、本願は、配列変異が存在する本願に開示された効果を維持することを意味する。一実施形態で開示された重鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。他の実施形態で開示された軽鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。例えば、本願に開示された抗体または抗原結合断片の配列と９０％、９５％、または９９％同一性を示す変異体の場合、任意の変異はＣＤＲよりは可変領域の骨格から発生する。
【０１２２】
本発明によるアルファ−シヌクレインまたはその凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の相補性決定部位を含む重鎖可変領域；およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１２３】
一具体例で、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、下記のＣＤＲ配列を含むことができる：
配列番号４３４および配列番号４３９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、
配列番号４３５〜４３７および配列番号４４０〜４４１のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、
配列番号４３８および配列番号４４２のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）、
配列番号４４３および配列番号４４６のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、
配列番号４４４および配列番号４４７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および
配列番号４４５および配列番号４４８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）。
【０１２４】
前記重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列と軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表８および表９に整理した：
【０１２５】
［表８］重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列
2021506770.tif 000229
2021506770.tif 000230
【０１２６】
［表９］軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列
2021506770.tif 000231
【０１２７】
一具体例において、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４３５〜４３７のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号４３８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号４４３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１２８】
また、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４４０〜４４１のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号４４６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４４７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１２９】
他の具体例において、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、
Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ１）であって、配列番号４４９〜４５０および配列番号４６８〜４７３のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含む。
【０１３０】
Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）であって、配列番号４５１〜４５２および配列番号４７４〜４７７のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）であって、配列番号４５３〜４６４および配列番号４７８〜４８３のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｈ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）であって、配列番号４６５〜４６７および配列番号４８４〜４８５のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）であって、配列番号４８６〜４９１および配列番号５０４〜５１０のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）であって、配列番号４９２〜４９４および配列番号５１１〜５１４のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）であって、配列番号４９５〜５００および配列番号５１５〜５２１のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、および／または
Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）であって、配列番号５０１〜５０３および配列番号５２２のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含むものであってもよい。
【０１３１】
本明細書でフレームワークに使用可能なアミノ酸配列として、重鎖可変領域フレームワーク配列を表３および表４に、軽鎖可変領域フレームワーク配列を表１０および表１１に例示した。
【０１３２】
［表１０］重鎖フレームワーク１〜２のアミノ酸配列
2021506770.tif 000232
2021506770.tif 000233
【０１３３】
［表１１］重鎖フレームワーク３〜４のアミノ酸配列
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2021506770.tif 000235
【０１３４】
［表１２］軽鎖フレームワーク１〜２のアミノ酸配列
2021506770.tif 000236
【０１３５】
［表１３］軽鎖フレームワーク３〜４のアミノ酸配列
2021506770.tif 000237
【０１３６】
他の具体例において、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３４および配列番号４３９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４３５〜４３７および配列番号４４０〜４４１のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、配列番号４３８および配列番号４４２のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号４４９〜４５０および配列番号４６８〜４７３のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ１）、配列番号４５１〜４５２および配列番号４７４〜４７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、配列番号４５３〜４６４および配列番号４７８〜４８３のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および配列番号４６５〜４６７および配列番号４８４〜４８５のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むことができる。さらに詳しくは、前記重鎖可変領域は、配列番号４５０のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ１、配列番号４５１のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ２、配列番号４６２〜４６４のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ−ＦＲ３、および配列番号４６７のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ４を含むことができる。
【０１３７】
また、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４４３および配列番号４４６のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４４４および配列番号４４７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４５および配列番号４４８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記軽鎖可変領域は、追加的に、配列番号４８６〜４９１および配列番号５０４〜５１０のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号４９２〜４９４および配列番号５１１〜５１４のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、配列番号４９５〜５００および配列番号５１５〜５２１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および配列番号５０１〜５０３および配列番号５２２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むことができる。さらに詳しくは、前記軽鎖可変領域は、配列番号４９１のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ１、配列番号４９２のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ２、配列番号５００のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ３、および配列番号５０１のアミノ酸を含むＬ−ＦＲ４を含むことができる。
【０１３８】
本発明の具体的な一例による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４３５〜４３７のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号４３８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号４４３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号４４９〜４５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ１）、配列番号４５１〜４５２のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、配列番号４５３〜４６４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および配列番号４６５〜４６７のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号４８６〜４９１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号４９２〜４９４のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、配列番号４９５〜５００のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および配列番号５０１〜５０３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むことができる。
【０１３９】
好ましくは、本発明の具体的な一例による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３４、配列番号４３５および配列番号４３８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４４３、配列番号４４４および配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号４５０のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ１、配列番号４５１のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ２、配列番号４６２〜４６４のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ−ＦＲ３、および配列番号４６７のアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ４を含むことができ、前記軽鎖可変領域は、配列番号４９１のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ１、配列番号４９２のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ２、配列番号５００のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ３、および配列番号５０１のアミノ酸配列を含むＬ−ＦＲ４を含むことができる。
【０１４０】
本発明の具体的な一例による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４４０〜４４１のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号４４６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４４７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号４６８〜４７３のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ１）、配列番号４７４〜４７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、配列番号４７８〜４８３のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および配列番号４８４〜４８５のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号５０４〜５１０のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号５１１〜５１４のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、配列番号５１５〜５２１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および配列番号５２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むことができる。
【０１４１】
全長の軽鎖および重鎖で、可変領域および不変領域は約１２個以上のアミノ酸長さの“Ｊ”領域によって結合され、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の“Ｄ”領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ、Ｗ．、ｅｄ．）１９８９、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓを参照することができる。典型的に、抗体の軽鎖／重鎖対の可変領域が抗原結合部位を形成する。
【０１４２】
免疫グロブリン鎖の可変領域は一般に全体的構造が同一であり、“相補的決定部位または領域またはドメイン”またはＣＤＲと称される３個の超可変領域によってつながる比較的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。重鎖／軽鎖対を構成する各鎖由来の可変領域のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域によって整列されて標的タンパク質（アルファ−シヌクレイン）の特定エピトープと特異的に結合する構造を形成する。自然発生軽鎖および重鎖可変領域のこのような要素は、Ｎ−末端からＣ−末端まで典型的に次の順序で含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。可変領域で、これらそれぞれに該当するアミノ酸配列の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３に記載されたものに従う。
【０１４３】
本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は、表１４および表１５に開示される。このようなそれぞれの可変領域は、完全な抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を形成するために、前記重鎖および軽鎖不変領域に結合できる。また、このように生成されたそれぞれの重鎖および軽鎖配列はまた完全な抗体構造を形成するために組合わせられ得る。例えば、本発明による抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５２３〜５３４または配列番号５３５〜５４１のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と、配列番号５４２〜５４８または配列番号５４９〜５５６のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含み、さらに詳しくは、配列番号５２３〜５３４のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号５４２〜５４８のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むか、配列番号５３５〜５４１のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号５４９〜５５６のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１４４】
本発明の具体的な一例で、抗−アルファ−シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５３１〜５３４のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と、配列番号５４８のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含むことができるか（例、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．３）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．４）、など）、または配列番号５２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５４６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる（例、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ＡＢＬ２−４）抗体）。
【０１４５】
一実施形態による抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表１４および表１５に例示した。
【０１４６】
［表１４］重鎖可変領域
2021506770.tif 000238
2021506770.tif 000239
【０１４７】
［表１５］軽鎖可変領域
2021506770.tif 000240
2021506770.tif 000241
【０１４８】
また、一実施形態による抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせと不変領域を含む、例示的な抗体を表９に記載した。
【０１４９】
［表１６］本発明の例示的な抗ａ−ｓｙｎ抗体
2021506770.tif 000242
2021506770.tif 000243
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【０１５０】
本明細書に開示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、完全な抗体の重鎖および軽鎖を形成するために、それぞれ重鎖不変領域および軽鎖不変領域に結合できる。このように生成されたそれぞれの重鎖および軽鎖は適切に組み合わせられて重鎖−軽鎖組み合わせを成すことができ、前記重鎖−軽鎖組み合わせは多量体を形成（例えば、ＩｇＧタイプ抗体の場合、二量体を形成）して完全な抗体構造を成すことができる。
【０１５１】
前記不変領域は、免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）重鎖不変領域および軽鎖不変領域から適切に選択できる。例えば、重鎖不変領域はＩｇＧ１重鎖不変領域、ＩｇＧ３重鎖不変領域、またはＩｇＧ４重鎖不変領域であってもよく、軽鎖不変領域はカッパ不変領域またはラムダ軽鎖不変領域であってもよいが、これに制限されるわけではなく、抗体安定性、製造可能性、抗原親和性、および／またはその他目的とする特徴などのために、他の類型の不変領域または変形された不変領域を適切に選択して使用することができ、これは当業者が明確に分かる事項である。
【０１５２】
他の実施形態において、前記表１４および表１５に開示された重鎖可変領域および軽鎖各可変領域は互いに自由に組み合わせられて多様な抗体を形成することができ、単一鎖形態に連結されてｓｃＦｖのような単鎖抗体を形成することもできる。
【０１５３】
本明細書に開示された抗体は、本明細書に開示された他の抗体と特定領域または配列を共有する。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の不変領域を共有することができる。他の実施形態では、Ｆｃ領域を共有することができる。
【０１５４】
一例で、本明細書で提供される抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。他の例で、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または動物由来抗体であってもよい。他の例で、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、組み換え的または化学的に合成されたものであってもよい。
【０１５５】
一実施形態において、本明細書に開示された抗体の抗原結合断片または抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ジアボディ、およびｓｃＦｖなどの単鎖抗体分子からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【０１５６】
他の実施形態で、本願に提供された抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、多様なイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、またはＩｇＤ）であってもよく、特に、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−またはＩｇＧ４−類型、例えば、ＩｇＧ１−またはＩｇＧ２−類型であってもよい。
【０１５７】
また他の実施形態において、抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、前記記載された軽鎖または重鎖のみからなるものであってもよい。他の実施形態において、抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のみからなるものであってもよい。
【０１５８】
当業者であれば、抗体が本明細書に開示された一つ以上のＣＤＲを含む場合、開示された各ＣＤＲは互いに独立的に選択されて組み合わせられ得るのを理解するはずである。したがって、１、２、３、４、５、または６個の独立的に選択されたＣＤＲを有する抗体が生成できる。また、組み合わせのためにＣＤＲが選択される時、同じ種類のＣＤＲが反復的に使用されず、例えば、抗体は一般に二つのＣＤＲＨ２領域を含んで製造されないということを当業者であれば分かるはずである。
【０１５９】
一実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体または多クローン抗体であってもよい。本明細書に開示された抗体は、アルファ−シヌクレインに結合するモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、当該技術分野に公知された任意の技術を使用して製造できる。例えば、免疫化された形質転換動物から収穫された脾臓細胞を不滅化させることによって生産できる。ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該技術分野に公知された技術を使用して精製することができる。
【０１６０】
他の具体例において、前記抗体は、動物由来抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体（例えば、マウス−ヒトキメラ抗体）、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。抗体はまた、多様な目的のために多様な方式で変形できる。キメラおよびヒト化抗体がさらに提供される。キメラ抗体は、異なる抗体に由来するポリペプチド断片が共有結合で連結されて、免疫学的に機能的な軽鎖、重鎖またはその断片を形成する抗体である。
【０１６１】
このようなモノクローナル抗体で、典型的に抗体の非−抗原認識部分を構成する特定のアミノ酸残基がヒト抗体の相応するアイソタイプの相応する残基と相同性になるように変形する。ヒト化は、例えば、公知された多様な方法を用いて、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の相応する領域で置換することによって行われる（米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）。
【０１６２】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリンの生成が欠乏してヒト抗体を生成することができる形質転換動物（通常、マウス）を免疫化させることによって生成できる。完全ヒト抗体はまた、ファージ−ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。完全ヒト抗体を使用すれば、マウスまたはマウス−由来のｍＡｂをヒトに投与することによって誘発することがある免疫原性反応およびアレルギー反応を最少化することができる。
【０１６３】
一実施形態において、本願のヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、ファージディスプレイ方法によって選別される。ファージスクリーニングによって選別したアルファ−シヌクレイン特異的な単一クローンファージ抗体を全体ＩｇＧ（ｆｕｌｌ  ＩｇＧ）形態に変換するために組換え方法を用いた。抗−アルファ−シヌクレイン抗体の組換え製造のために各単一クローンファージ抗体の配列を確保する。確保した配列において、重鎖可変領域配列は重鎖不変領域配列に、軽鎖可変領域配列は軽鎖不変領域配列に移植した後、コドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）方法によってアミノ酸配列を核酸配列に変更する。確保した核酸配列を動物細胞培養用ベクターにクローニングした後、ＣＨＯ細胞などのタンパク質生産用宿主細胞に前記ベクターを用いて形質転換して、培養する。前記培養液に含まれている抗体を精製するために親和度クロマトグラフィーなどの精製技術を用いて組換え抗体を分離精製する。
【０１６４】
他の具体例において、前記抗体は、自然から発見される抗体の典型的な構造を有するか、変形された構造を有する抗体であってもよい。
【０１６５】
前記典型的な構造を有する抗体は、互いに異なる二つのポリペプチド鎖（即ち、重鎖および軽鎖）を含む構造的単位体を含む多量体構造を有することができる。前記互いに異なる二つのポリペプチド鎖は、全長軽鎖（約２５ｋＤａ）および全長重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を含むことができる。各鎖は、特徴的な折りたたみパターンを示し、約９０〜１１０個アミノ酸からなる、数個の免疫グロブリンドメインから構成されている。このようなドメインは、抗体ポリペプチドを構成している基本単位体である。各鎖のアミノ−末端部分は、典型的に抗原を認識する部分である可変領域またはＶ領域と称される部分を含む。カルボキシ−末端部分は、アミノ−末端より進化的により保存され、不変領域またはＣ領域と称される部分を含む。ヒト軽鎖は、一般にカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類され、これらそれぞれは、一つの可変領域および一つの不変領域を含む。重鎖は、一般にミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはエプシロン（ε）鎖として分類され、これらはそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥイソタイプと定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これに制限されない複数のサブタイプを有する。重鎖不変領域は、典型的に効果器機能を示す一つ以上のドメインを含む。重鎖不変領域ドメインの数はイソタイプによって変わる。ＩｇＧ重鎖は、例えば、それぞれＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と公知された３個のＣ領域ドメインを含む。本明細書に開示された抗体は、このようなイソタイプおよびサブタイプのうちの任意の一つであってもよい。一実施形態において、前記抗−アルファ−シヌクレイン抗体は、ＩｇＧイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブタイプであってもよい。
【０１６６】
本願によるアルファ−シヌクレイン凝集体を高い親和度で特異的に認識し、アルファ−シヌクレイン抗体がこのような疾患の診断、または検出に有用に使用できるのを示す。さらに、本願によるアルファ−シヌクレイン凝集体を特異的に認識するアルファ−シヌクレイン抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集体の形成を抑制するか、または凝集体を分解し、細胞間凝集体の伝達を抑制して、シヌクレイン病、特にパーキンソン病の治療に効果的に使用することができるのを示す。
【０１６７】
本発明による二重特異抗体の一例は、下記の表１７の通りである。
［表１７］
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【発明の効果】
【０１６８】
本発明の一例で製造された抗体は、ＩＧＦ１Ｒにｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌのｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓに最適化された結合力でＩＧＦ１Ｒ特異的に結合し、低い血液脳関門通過能で治療効能が制約的であった退行性脳疾患および脳ガン治療抗体の伝達に有用に使用できる。特に本発明に開示された単一クローン抗体は、リガンドであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２およびそのｈｏｍｏｌｏｇであるｉｎｓｕｌｉｎがＩＧＦ１Ｒに結合することには影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒ受容体を通じた信号伝達を抑制しないなどの効果を示すので、血液脳関門通過と関連して有用性を有する。
【０１６９】
本願に開示された抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集体を効果的に除去するか、分解を促進することができ、アルファ−シヌクレインの細胞間伝達を抑制することができて、アルファ−シヌクレインの凝集体の蓄積に関連する疾患の治療に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】本発明の一例で製造された抗ａ−ｓｙｎ抗体が凝集された形態のｎａｔｉｖｅアルファ−シヌクレインを特異的に認識するか否かを測定したドットブロット結果を示す。
【図２】本発明の一例で製造された抗ａ−ｓｙｎ抗体の親和度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３ａ】本発明の一例で製造された抗ａ−ｓｙｎ抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。
【図３ｂ】図３ａの結果を表で示したことである。
【図４ａ】本発明の一例で製造された抗ａ−ｓｙｎ抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性をＯｃｔｅｔで分析した結果である。
【図４ｂ】図４ａの結果を表で示したものである。
【図５ａ】それぞれ、本発明の一例による抗ａ−ｓｙｎ抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。
【図５ｂ】それぞれ、本発明の一例による抗ａ−ｓｙｎ抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。
【図６】本発明の一例による抗ａ−ｓｙｎ抗体のエピトープマッピング結果を図式的に示したものであって、本願による抗体は大部分Ｃ−末端部位に結合することが明らかになった。
【図７】本発明の一例で製造された抗ａ−ｓｙｎキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体の親和度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図８】本発明の一例で製造された抗ａ−ｓｙｎキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。
【図９ａ】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎキメラ抗体がベータ−シヌクレイン、ガンマ−シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ１−４２）、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ−シヌクレイン、特にアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。
【図９ｂ】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎキメラ抗体がベータ−シヌクレイン、ガンマ−シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ１−４２）、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ−シヌクレイン、特にアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。
【図１０】本発明の一例で製造されたａ−ｓｙｎキメラ抗体がベータ−シヌクレイン、ガンマ−シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ１−４２）、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ−シヌクレイン、特にアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。
【図１１ａ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合データである。
【図１１ｂ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合データである。
【図１２ａ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。
【図１２ｂ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。
【図１２ｃ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。
【図１３ａ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株へのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎおよびｃｅｌｌ内でのｆａｔｅ関連データである。
【図１３ｂ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株へのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎおよびｃｅｌｌ内でのｆａｔｅ関連データである。
【図１３ｃ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株へのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎおよびｃｅｌｌ内でのｆａｔｅ関連データである。
【図１４ａ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはｉｎｓｕｌｉｎによるＩＧＦ１Ｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。
【図１４ｂ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはｉｎｓｕｌｉｎによるＩＧＦ１Ｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。
【図１４ｃ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはｉｎｓｕｌｉｎによるＩＧＦ１Ｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。
【図１５ａ】本願の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＡＤＣＣがないというデータである。
【図１５ｂ】本発明の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が反復投与された後も脳内のＩＧＦ１Ｒレベルに影響を及ぼさないことを示すデータである。
【図１５ｃ−１】本発明の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が脳内の正常ニューロンに結合せず、ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに特異的に結合することを示す顕微鏡である。
【図１５ｃ−２】本発明の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が脳内の正常ニューロンに結合せず、ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに特異的に結合することを示す顕微鏡である。
【図１６ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体が治療抗体のみから構成された単独抗体よりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムをさらによく通過するというデータである。
【図１６ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体が治療抗体のみから構成された単独抗体よりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムをさらによく通過するというデータである。
【図１６ｃ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体が治療抗体のみから構成された単独抗体よりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢシステムをさらによく通過するというデータである。
【図１７ａ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がラット単回投与時、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてＢｒａｉｎとＣＳＦにさらに多く分布することを示すデータである。
【図１７ｂ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がラット単回投与時、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてＢｒａｉｎとＣＳＦにさらに多く分布することを示すデータである。
【図１７ｃ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がラット単回投与時、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてＢｒａｉｎとＣＳＦにさらに多く分布することを示すデータである。
【図１７ｄ−１】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がラット単回投与時、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてＢｒａｉｎとＣＳＦにさらに多く分布することを示すデータである。
【図１７ｄ−２】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がラット単回投与時、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてＢｒａｉｎとＣＳＦにさらに多く分布することを示すデータである。
【図１７ｅ】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がラット単回投与時、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてＢｒａｉｎとＣＳＦにさらに多く分布することを示すデータである。
【図１８ａ】本発明の一例で製造された抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体でｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生した部位を確認した結果である。
【図１８ｂ】ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎを防止するために特定のアミノ酸を置換して製造した変異体である。
【図１９】抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング結果である。
【図２０ａ】本願の一例で製造された二重特異抗体の各抗原に対する結合力を測定するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図２０ｂ】本願の一例で製造された二重特異抗体の各抗原に対する結合力を測定するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図２０ｃ】キメラ抗体とヒト化した抗体の各抗原に対する結合力を比較するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図２０ｄ】キメラ抗体とヒト化した抗体の各抗原に対する結合力を比較するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図２０ｅ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対してｍｉｃｒｏｇｌｉａの食細胞作用に対する活性を評価した結果である。
【図２１ａ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２１ｂ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２１ｃ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２１ｄ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２１ｅ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。
【図２２ａ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過能向上を確認した結果である。
【図２２ｂ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過能向上を確認した結果である。
【図２２ｃ】本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過能向上を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１７１】
実施例１．マウスアルファ−シヌクレイン抗体の製造
１−１：免疫化およびハイブリドーマ生産
抗原としては全長（１４０残基）またはＣ−末端２１個の残基が切断されたアルファ−シヌクレイン単量体を３７度のｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｃに入れて、１４日間１０５０ｒｐｍで振って凝集化させ、ソニケーションして使用した。前記製造された１ｍｇ／ｍｌ濃度の１４０個および１１９個残基のアルファ−シヌクレインフィブリルそれぞれをアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）と１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合してよく混合した。
【０１７２】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎのＡｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５９）
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
その次に、前記準備した混合物２００μＬを５〜７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの皮下に注射し、２週後に、同様な方法で製造した混合物２００μＬを追加的に皮下注射してブースティングさせた。ブースティング１週後に血液を採取して、投与抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を使用して免疫化滴定（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｔｅｒａｔｉｏｎ）を行った。その次に、３次ブースティングは、抗原のみを皮下注射した。
【０１７３】
その次に、前記のように免疫が完了したマウスの脾臓を除去して、これから細胞を確保した。その次に、脾臓細胞を１０％ＦＢＳが添加されたＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に懸濁させた。ハイブリドーマを製造するために、マウス骨髄腫細胞であるＳＰ２／０−Ａｇ１４と脾臓細胞を血清が含まれていないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地で混合した後、遠心分離を行って培地を除去した。その次に、細胞ペレットにＰＥＧを添加した後、３７℃で１分間培養して細胞融合を誘導した。
【０１７４】
１−２：単細胞クローニングおよび抗体精製
融合２週後に、細胞培養培地を用いてマウスに投与した抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を使用して抗体を生産するマウスＢ細胞との融合を確認した。その次に、ハイブリドーマを用いて単細胞クローニングを行って単クローン抗体を生産するハイブリドーマを総１６個選別した。全長（１４０残基）アルファ−シヌクレイン凝集体を抗原として用いて９Ｂ１１（それぞれ、ＩｇＧ１  ｋａｐｐａ）クローンを得て、Ｃ−末端２１個残基が切断されたアルファ−シヌクレイン凝集体を抗原として用いて３Ａ９および１１Ｆ１１（それぞれ、ＩｇＧ２ｂ  ｋａｐｐａ、ＩｇＧ２ｂ  ｋａｐｐａ）のクローンを得た。
【０１７５】
前記抗体の精製のために、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ１６４０培地で各ハイブリドーマを培養し、抗体生産のためにｓｅｒｕｍのないＳＦＭ培地に培養培地を交替した後、４日程度培養する。細胞培養上層液を分離して遠心分離した後、０．２２μｍフィルターでろ過した後、ＩｇＧ１タイプはｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｃｏｌｕｍｎで、残りの抗体はｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎで精製した。
【０１７６】
１−３：可変領域配列決定
可変領域およびＣＤＲ配列は、Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ２００４、１８（２）：２３７−２４１論文を参照して決定した。ハイブリドーマを培養した後、遠心分離して細胞のみを分離した。分離されたハイブリドーマにトリゾールを入れてＲＮＡを分離し、これを鋳型にしてｃＤＮＡを合成した後、塩基配列分析によって可変領域およびＣＤＲ配列を確認した。したがって、抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１を得た。
【０１７７】
実施例２．抗アルファ−シヌクレイン（キメラ）抗体の製造
２−１：抗体クローニングおよび発現
ヒト化を進行後に確保した重鎖可変領域および軽鎖可変領域の抗体ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を用いて、短い断片のｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅであるｇｂｌｏｃｋ（ｍ．ｂｉｏｔｅｃｈ）を合成し、これを用いて動物細胞培養用ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）にクローニングした。可変領域前後に重畳したｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを約２０ｂｐ程度含んでｇｂｌｏｃｋを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ｖｅｃｔｏｒの可変領域を除外した部分をＰＣＲで増幅後に準備して、Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ方法でクローニングした。
【０１７８】
前記クローニングされた抗体をＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎおよび発現するために、前記製造されたベクターをｍａｘｉ−ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）して、多量のｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを確保後、次のように細胞に導入した。形質注入前日、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣＨＯＴＭ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１００−０１）培地に３×１０Ｅ６〜４×１０Ｅ６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度を合わせた後、８％  ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日、７×１０Ｅ６〜１０×１０Ｅ６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上に育った細胞を新鮮な培地を用いて６×１０６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬで希釈して準備した。
【０１７９】
準備された母細胞への形質注入のために、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ＆  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ複合体を準備した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯＴＭＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注して、滴定濃度で準備したＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、ｍｉｘして常温で５分間定置し、母細胞に接種して形質注入後、培養を始めた。形質注入翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔに含まれているｅｎｈａｎｃｅｒおよびｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％  ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して生産を完了した。
【０１８０】
生産が完了した培養液の収得のために遠心分離用瓶に培養液を移して４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、０．２μｍの大きさのフィルターでフィルタリングを行って、浮遊物を除いた培養液を確保して、その後、精製過程を行った。
【０１８１】
２−２：抗体の精製および配列確認
ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１１−００３４−９４）を使用して培養液を精製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を使用して平衡化させた後、回収された培養液をカラムにローディングした。ローディングが完了すれば、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐＨ５．０で中間洗浄後、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐＨ３．４を用いて溶出を行った。溶出液に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０を添加してｐＨ６．０になるように中和した。その後、溶出液をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）でバッファー交換および濃縮して、使用時まで４℃に保管した。
【０１８２】
追加精製が必要な場合、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムに１Ｘ  ＰＢＳをバッファーにして１次精製分を通過させて、溶出試料の大きさに基づいて２次精製を行った。前記精製された抗体のアミノ酸配列を質量分析方法で分析し、ｍｏｕｓｅ由来単クローン抗体の可変領域と一致するのを確認した。
【０１８３】
前記方法で確認された３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１アイソタイプのｂａｃｋｂｏｎｅ可変領域部分に置換してキメラ形態のヒトＩｇＧ１抗体を製作した。前記得られたキメラ抗体のうち、特にＣｈ１１Ｆ１１抗体はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９０の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＨ）と配列番号１０９の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＬ）の組み合わせを含み、Ｃｈ  ３Ａ９抗体はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号１０２の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＨ）と配列番号１１６の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１−ＶＬ）の組み合わせを含む。
【０１８４】
実施例３：ヒト化抗体の製造
３−１：ライブラリーファージ（Ｌｉｂｒａｒｙｐｈａｇｅ）準備
キメラ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３  ｒｅｓｉｄｕｅにｈｕｍａｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋを結合させながら各ＣＤＲ  ｒｅｓｉｄｕｅにｍｏｕｓｅあるいはヒト由来ｓｅｑｕｅｎｃｅが導入されたｍｉｎｉライブラリーを製作した。当該ライブラリーのｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌをクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍｌ、２％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５４００）および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２３９３）が含まれている２Ｘ  ＹＴ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ、１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ、１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）５ｇ］培地に接種後、３７℃で３時間程度培養してＯＤ６００値が０．５から０．７になるようにした後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を感染させた後、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）を添加した２Ｘ  ＹＴ培地で３０℃、１６時間培養してファージパッキングを誘導した。その次に、培養液を４５００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離した後、上澄み液に４％  ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、８１２５３）と３％  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。これを再び４℃条件で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで懸濁した後、再び４℃条件で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してライブラリーファージを含む上澄み液を得て、新しいチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。
【０１８５】
３−２：ファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
具体的に、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ  ４４４２０２）に１０μｇ／ｍｌ濃度の組換えアルファ−シヌクレイン凝集体をＰＢＳに添加して４℃で一晩試験管表面にタンパク質を吸着させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）３％溶液を試験管に添加して、アルファ−シヌクレイン凝集体が吸着していない表面を保護した。試験管を空けた後、ＢＳＡ  ３％溶液に分散した１０１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリーをアルファ−シヌクレイン単量体タンパク質の吸着している免疫試験管に入れて、常温で１時間反応させた（ネガティブ選別）。アルファ−シヌクレイン単量体に非結合したファージを回収してアルファ−シヌクレイン凝集体が付着された免疫試験管に常温で２時間結合させた。その次に、非特異的に結合したファージをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で５回〜３０回洗い落とした後、残っている抗原特異的ファージ抗体を１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いて回収した。回収されたファージを１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．４）で中和させた後、ＥＲ２５３７大腸菌に３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌をカルベニシリンを含有する２Ｘ  ＹＴ寒天培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌を４ｍｌの２Ｘ  ＹＴカルベニシリン培養液に懸濁し、１５％グリセロールを添加して、一部は−８０℃に保管し、残りは次のラウンドのパニングのためにファージを製造した。このような過程を総３ラウンド繰り返して抗原特異的な抗体を増幅させた。パニングラウンドが進行するほど、ＰＢＳ−Ｔを用いた洗浄回数を増加させて抗原特異的ファージを増幅および濃縮した。
【０１８６】
３−３：単一クローンファージ抗体選別（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
前記パニングによって得られたファージプール（ｐｈａｇｅ  ｐｏｏｌ）からアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合する単クローン抗体を選別するために、次のような実験を行った。
【０１８７】
濃縮されたプールから単一クローンを分離するために、ＬＢ−テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に前記ファージプールを塗抹した後、培養して単一コロニーを確保した。その次に、単一クローンをウェル当り４００μｌの２Ｘ  ＹＴ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地が入った９６ディープウェルプレートに接種して一晩育てた後、培養液１０μｌを新たな３９０μｌの２Ｘ  ＹＴ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地が含まれている９６ディープウェルプレートに入れて、３７℃で４時間培養した。前記培養液に１ｍＭ  ＩＰＴＧとなるように入れて、３０℃で一晩培養した。一晩培養した培養液を遠心分離して上澄み液を取った。
【０１８８】
その次に、次のようにＥＬＩＳＡ方法を使用してアルファ−シヌクレイン凝集体と結合する単一クローン可溶性ｓｃＦｖを発現するクローンを選択した（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ．Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ．２０００．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＮＹ．ＵＳＡ．ｐｐ．１１．９−１１．１２）。具体的に、９６ウェルプレートに実施例１−１で選別された７Ｂ７抗体を入れ、４℃で一晩コーティングした。３％  ＢＳＡを各ウェル当り２００μＬずつ入れて３７℃で２時間ブロッキングした。その次に、アルファ−シヌクレイン凝集体と単量体を１００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれローディングした後、３７℃で２時間反応させた。その次に、ＰＢＳ−Ｔ  ３００μＬで５回洗浄した。前記準備された単一クローン上澄み液は３％  ＢＳＡと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した後、上記混合液を前記凝集体および単量体と結合させたプレートに１００μＬずつローディングした後、３７℃で２時間反応させた。その次に、ＰＢＳ−Ｔ  ３００μＬで５回洗浄した後、抗−ＨＡ  ＨＲＰ結合抗体を入れて３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００μＬを入れて発色した後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μＬを入れて反応を停止した後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度が０．５以上であるクローンを結合による陽性反応と見なし、ＢＳＡ非特異的に結合するクローンは排除させた。
【０１８９】
ライブラリーで発見されたクローンのＣＤＲ  ｒｅｓｉｄｕｅは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ方式で分析を併行して、ｆｒａｍｅｗｏｒｋとの結合に深刻な問題が生じるか、ＣＤＲを除いたｆｒａｍｅｗｏｒｋ部分にＴ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅおよびＭＨＣＩＩ  ｅｐｉｔｏｐｅが存在しないクローンを選別した。
【０１９０】
その後、次のような重鎖、軽鎖の可変領域の組み合わせで形成された５個抗体に対して、ヒト化抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１アイソタイプのｂａｃｋｂｏｎｅ可変領域部分に置換して５個のＩｇＧ１  ｂａｃｋｂｏｎｅのヒト化抗体を製作した。具体的に、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ＡＢＬ２−４）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９２の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ２）と配列番号１１３の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬ４）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９８の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ１）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．２）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９９の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ２）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．３）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号１００の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ３）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）の組み合わせを含む。
【０１９１】
Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）は、配列番号１０１の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ４）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）の組み合わせであるのを確認した。
【０１９２】
実施例４．アルファ−シヌクレイン抗体の抗原結合特異性および結合力分析
４−１：抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いたドットブロット分析
本願による抗体がネイティブ状態での単量体または凝集体に結合するかを分析するために、ドットブロット実験を行った。このために、抗原として５０ｎｇあるいは１００ｎｇのアルファ−シヌクレインモノマーまたはフィブリルタンパク質（ソウル大学校のイ・スンジェ教授ｌａｂで製造する；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３２：１３４５４、２０１２）をＤｏｔ  ｂｌｏｔ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてニトロセルロースメンブレンにスポットローディングした。２倍ずつ希釈したモノマーまたはフィブリルタンパク質は、メンブレンの右から左へ順次にローディングした（１２．５、２５、５０、１００ｎｇ）。メンブレンをＴＢＳＴ組成の５％ｎｏｎ−ｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋで１時間常温でブロッキングした後、実施例１で製造したアルファ−シヌクレイン抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で１％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ含有ＴＢＳＴに入れて、メンブレンと当該抗体を１時間常温でインキュベーションした。その次に、ＴＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体および基質としてｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＮＥＮ）を製造者の方法通りに使用して信号を分析した。結果は、ＬＡＳ−３０００  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてイメージングした。結果は、図１に記載されている。
【０１９３】
図１に示されているように、本願によるアルファ−シヌクレイン抗体は、アルファ−シヌクレインモノマーと比較して、凝集体にのみ選好的に結合することが明らかになった。特に、９Ｂ１１、３Ａ９および１１Ｆ１１は、凝集体に結合することが明らかになった。２７４抗体（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２  Ｓｅｐ  ２６；３２（３９）：１３４５４−１３４６９）は、単量体および凝集体に全て結合する比較抗体である。
【０１９４】
４−２：抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析
本願による抗体の抗原に対する結合力を定量的に分析するために、ＥＬＩＳＡを行った。このために、実施例１で得られたマウス抗−アルファ−シヌクレイン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにコーティングした後、ここに１０、１００、１０００、１０，０００ｎｇ／ｍｌ濃度のアルファ−シヌクレインフィブリル凝集体を処理した後、ＰＢＳで洗浄し、その次に、ビオチンが結合された２次抗体およびＨＲＰが結合されたストレプトアビジンを処理した後、基質としてＴＭＢと反応した後に吸光度を測定し、その測定結果を図２に示した。
【０１９５】
図２に示されているように、本願による抗体は、凝集体に高い結合力で選好的に結合することが明らかになった。ＥＬＩＳＡ結果を通じて抗体を分析してみれば、凝集体選好的に結合する抗体は０．１×１０−９Ｍ〜２×１０−９Ｍ程度の親和力を示し、単量体および凝集体に全て結合する抗体はこれより高い〜１×１０−１０Ｍ値を示した。本発明による抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集体に高い親和度で選好的に結合し、単一体に対しては凝集体より低いかまたは結合しないため、親和度を導出できなかった。このような結果は、パーキンソン病のようなアルファシヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去することができるか、活動を抑制することができるのを示すものである。
【０１９６】
４−３：抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ分析
実施例１で製造されたアルファ−シヌクレイン抗体の単量体および凝集体抗原結合に対する定量的分析をＢＩＡｃｏｒｅを使用して行った。
【０１９７】
機器は、Ｔ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓ／Ｎ：１５６５８８８）を使用した。ＣｈｉｐはＰｒｏｔｅｉｎ  Ａを使用し（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．２９−１２７５−５６）、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒは１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ１．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ−１００３−５４）、Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとａｎａｌｙｔｅ希釈、サンプル希釈緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰを使用した。実施例１で製造されたα−ｓｙｎ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）は１Ｘ  ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ−１００６−６９）で希釈し、α−ｓｙｎ単量体（１ｍｇ／ｍｌ）またはフィブリルタンパク質（３ｍｇ／ｍｌ）（ａｎａｌｙｔｅ）は２倍ずつ順次に希釈して、０ｎＭ含む総６個濃度（０、０．３９、１．５６、６．２５、２５、１００ｎＭ）で分析した。キャプチャの場合、単量体は標的ＲＵを８００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、フィブリルは標的ＲＵを１００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、キャプチャｐｈａｓｅをｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅを６０秒とし、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｅｒｉｏｄを１８０秒として行った。ａｓｓｏｃａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅではａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを１２０秒とし、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅではｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを３６０秒とし、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとした。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅでは、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとして、ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを２４０秒（１次）、６０秒（２次）、二回にわたって行った。１：１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌを使用してｆｉｔｔｉｎｇし、ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅはＢＩＡＣｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。結果は、図３ａおよび図３ｂに記載されている。
【０１９８】
図３ａは、本発明の一例で製造された単クローン抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。本願による抗体が高い親和度で凝集体に結合することを示す。このような結果は、パーキンソン病のようなアルファ−シヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去することができるか、活動を抑制することができるのを示すものである。図３ｂは、図３ａの結果を表で示したものである。
【０１９９】
図３ａおよび図３ｂの結果に示したように、分析した４個のアルファ−シヌクレイン抗体のうちの前述した他の方法で凝集体に選好的に結合する抗体である、３Ａ９、９Ｂ１１、および１１Ｆ１１がＢＩＡｃｏｒｅでも凝集体にのみ結合することが明らかになり、約１〜３×１０−９Ｍの高い親和度を有することが明らかになった。
【０２００】
４−４．抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いたＯｃｔｅｔ分析
実施例１で製造されたマウスアルファ−シヌクレイン抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）の単量体および凝集体抗原結合に対する定量的分析をＯｃｔｅｔを使用して行った。
【０２０１】
具体的に、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒは１Ｘ  ＫＢ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．１８−１０９２）あるいは１Ｘ  ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを１０００ｒｐｍで使用し、ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒはｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５（１０ｍＭ、Ｃａｔ．１８−１０６８）を使用した。α−ｓｙｎモノマーはα−ｓｙｎ抗原をｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせ、フィブリルの場合、テスト抗体をｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせた。ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは、モノマーの場合、２０μｇ／ｍｌ、フィブリルの場合、０．４μｇ／ｍｌとし、ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは、モノマーの場合５０ｎＭから、フィブリルの場合１００ｎＭから２倍ずつ順次に希釈して総７個のポイントを設定した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ時間は、モノマーの場合５分／２０分、フィブリルは５分／２５分であり、ＢｉｏｓｅｎｓｏｒはＡＲＧ２を、ｆｉｔｔｉｎｇは１：１  ｆｉｔｔｉｎｇを使用した。結果は、図４に記載されている。図４は、本発明の一例で製造された単クローン抗体のα−Ｓｙｎ凝集体に対する選好的結合特異性をＯｃｔｅｔで分析した結果である。
【０２０２】
図４ａに示されているように、３Ａ９、９Ｂ１１および１１Ｆ１１の場合、単量体にはほとんど結合せず（赤い点線ボックス）、凝集体にはよく結合することが明らかになった（赤い点線ボックス内のグラフが上がる）。このような結果はＤｏｔ  ｂｌｏｔ、Ｏｃｔｅｔ、ＥＬＩＳＡでの結果と類似あるいは一致する結果であって、テストした４個のα−ｓｙｎ抗体のうちの前記他の方法で凝集体に選好的に結合する抗体である、３Ａ９、９Ｂ１１および１１Ｆ１１がＯｃｔｅｔでも凝集体にのみ結合することが明らかになった。図４ｂは、図４ａの結果を表で示したものである。図４ａおよび図４ｂの結果は、アルファ−シヌクレイン凝集体に選好的に結合することを示し、図１の結果と一致するものである。比較群として使用された＃２７４抗体の場合、単量体および凝集体に全てよく結合することが明らかになった。
【０２０３】
実施例５．抗−アルファ−シヌクレイン抗体のヒト脳組織でのレビー小体検出分析
１０マイクロメートルの厚さのパラフィン包埋されたパーキンソン疾患で死亡した患者の脳組織切片を実施例２で得られたキメラ抗−アルファ−シヌクレイン抗体を用いて組織切片内レビー小体とレビー神経突起（ｎｅｕｒｉｔｅ）を次のように染色した。９０％ギ酸で組織切片を３分間処理してａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌを進行させた後、１％  Ｈ２Ｏ２（５０％  ｅｔｈａｎｏｌ  ｂａｓｅ）を用いて組織自体のｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ活性を抑制した。組織のｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇを防止するために、１０％  ｎｏｒｍａｌ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍを処理した。その次に、リン酸緩衝液で洗浄した後、本願による３Ａ９、１１Ｆ１１および１１Ｆ１１抗体をａｄｊａｃｅｎｔ  ｓｅｃｔｉｏｎに４℃で一晩処理した。リン酸緩衝液で洗浄後、ビオチンが結合されたａｎｔｉ−ヒトＩｇＧ抗体を３７℃で３０分間処理した後、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘを常温で３０分間反応させた（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【０２０４】
その次に、０．００５％  Ｈ２Ｏ２を含むＤＡＢで発色し、当該ｓｅｃｔｉｏｎを０．５％ｃｒｅｓｙｌ  ｖｉｏｌｅｔでカウンター染色して各細胞を区分した。結果は、図５ａおよび図５ｂに開示されている。
【０２０５】
図５ａおよび図５ｂは、それぞれ本発明の一例による単クローン抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。
【０２０６】
図５ａおよび図５ｂに示されているように、本願による抗体はレビー小体およびレビー神経突起に効果的に結合（矢印で表示）することが明らかになった。このような結果は、ヒト脳組織にあるレビー小体の構成成分であるアルファ−シヌクレイン凝集体に効果的に結合できるのを意味するものである。ヒト脳に伝達された抗体が効果的にアルファ−シヌクレイン凝集体に特異的に結合できるのを示すものである。このような結果は、本願の抗体が実際のヒト脳組織に存在するアルファ−シヌクレイン凝集体と特異的に結合できるのを示すものであって、アルファ−シヌクレイン病因に関連する疾患の予防および／または治療に効果的に使用できるのを示す。
【０２０７】
実施例６．抗−アルファ−シヌクレイン抗体のエピトープ分析
実施例２で得られたキメラ抗−アルファ−シヌクレイン抗体である３Ａ９および１１Ｆ１１抗体に対するエピトープマッピングは、ＰＥＰＳＣＡＮ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にペプチドアレイ分析を依頼して行われた。結果は、図６に開示されている。図６は、本発明の一例による抗体のエピトープマッピング結果を図式的に示したものである。
【０２０８】
図６に示されているように、本願による抗体はＣ−末端を認識することが明らかになった。本願による抗体は、大部分Ｃ−末端部位に結合することが明らかになった。Ｎ−末端を認識するアルファ−シヌクレイン抗体はアルファ−シヌクレイン関連疾患を通称するシヌクレイン病に属する多系統萎縮症のような他の疾病の凝集体は認識しないのに対し、Ｃ−末端部位を認識するアルファ−シヌクレイン抗体はパーキンソン病だけでなく、その他の多様なシヌクレイン病の凝集体も認識するという長所を有する。特に、先に説明したように、１１０番目残基〜１２２番目残基からなるペプチドを認識する場合、凝集体選好的な結合を示した。
【０２０９】
実施例７．抗−アルファ−シヌクレイン抗体のＥＬＩＳＡ分析試験
実施例４−２と実質的に同様な方法で、実施例２で得られたキメラ抗体（Ｃｈ１１Ｆ１１）および実施例３で得られたヒト化抗体（Ｈｕ１１Ｆ１１）の結合力を定量的に分析するためにｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを行った。
【０２１０】
具体的に、それぞれ抗体を０．０４〜４００ｎＭの濃度で１／１０ずつ希釈して９６ウェルプレートにコーティングした後、ここに２０００ｎｇ／ｍｌの凝集体を各ウェルに処理した。１ＸＰＢＳで洗浄後、その次にビオチンが結合されたｃａｐｔｕｒｅ抗体およびＨＲＰが結合されたストレプトアビジンを処理した後、基質としてＴＭＢと反応させた後、その吸光度を測定した。結果は、図７に記載されている。
【０２１１】
図７に示したように、本発明によるヒト化された抗体、特にキメラ１１Ｆ１１に由来するヒト化抗体（ヒト化１１Ｆ１１抗体）は、キメラ１１Ｆ１１クローンと同等な結合力を示すことが確認された。ヒト化抗体、特に１１Ｆ１１由来ｖａｒｉａｎｔである、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ１とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃはキメラ１１Ｆ１１クローンと類似の結合力を示すことが確認され、そのＥＣ５０は１１．５〜１５．１ｎＭであって、キメラ１１Ｆ１１抗体のＥＣ５０である１２．５ｎＭと類似の値を示した。
【０２１２】
実施例８：抗アルファ−シヌクレイン抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ分析
実施例４−３と実質的に同様な方法で、実施例２で得られたキメラ抗体および実施例３で得られたヒト化抗体の結合力をＢＩＡｃｏｒｅを使用して定量的に分析した。前記分析結果を図８および下記表に示す。
【０２１３】
［表１８］
2021506770.tif 000258
【０２１４】
その結果、本願に記載されたヒト化抗体、特に１１Ｆ１１のｖａｒｉａｎｔ、即ち、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）（Ｈｕ１１Ｆ１１−ＶＨ−ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１−ＶＬｖ３  ４ｃ）はキメラ１１Ｆ１１クローンと類似なＫＤ値を示すことが確認され、その結合程度としてはヒト化クローンが０．０２〜０．０６×１０−９ＭのＫＤ、キメラ１１Ｆ１１クローンが０．０２×１０−９Ｍの低いＫＤ値、即ち、凝集体に対する高い結合力を示した。
【０２１５】
実施例９．キメラ抗体のアルファ−シヌクレイン特異的結合評価
９−１：ベータ−シヌクレインおよびガンマ−シヌクレインとのＥＬＩＳＡ分析
実施例２によるキメラ抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１の３種を生産後、当該抗体のアルファ−シヌクレインの結合特異性をそのホモログであるベータ−シヌクレインおよびガンマ−シヌクレインとのＥＬＩＳＡと比較した。
【０２１６】
このために、ヒトベータ−シヌクレイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ１６１４３）タンパク質（ＣＵＳＡＢＩＯ、Ｃａｔ：ＣＳＢ−ＥＰ６２４０９０ＨＵ）、あるいはヒトガンマ−シヌクレイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ７６０７０）タンパク質（ＣＵＳＡＢＩＯ、Ｃａｔ：ＣＳＢ−ＥＰ０２１９１５ＨＵ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにコーティングした後、ｗａｓｈした後に５％  ＢＳＡで２時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。この時、アルファ、ベータ、ガンマ−シヌクレインに全て結合するｐａｎ−Ｓｙｎ抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、Ｃａｔ：ＦＬ−１４０、ｓｃ−１０７１７、ｒａｂｂｉｔ）を陽性対照群として使用した。Ｗａｓｈ後、ここに４００ｎＭから０．０４ｎＭまで１／１０ずつ希釈されたキメラ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）を２時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、その次に、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈＦｃ抗体にＨＲＰが結合されたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を処理した後、基質としてＴＭＢと反応した後、４５０ｎｍ、６５０ｎｍで吸光度を測定し、陽性対照群の場合、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体としてｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ抗体にＨＲＰが結合された抗体を使用した。
【０２１７】
実験結果を図９ａおよび図９ｂに示し、これは本発明の一例によるキメラ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）のヒトベータ−シヌクレインおよびヒトガンマ−シヌクレインに対する非常に低い結合力をＥＬＩＳＡで分析した結果を示したものである。これとは反対に、陽性対照群であるｐａｎ−Ｓｙｎ抗体は、ベータ−およびガンマ−シヌクレインに対して高い結合力を示した。図９ａは、ヒトベータ−シヌクレインに関するものであり、図９ｂはヒトガンマ−シヌクレインに関するものである。
【０２１８】
９−２：アミロイドベータおよびタウ凝集体に対するドットブロット分析
実施例２によるキメラ抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１の３種をアミロイドベータ１−４２（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０５０６７；ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ：１０７７６１−４２−２）およびタウ（Ｕｎｉｐｏｒｔ：Ｐ１０６３６−８）タンパク質から形成された凝集体とドットブロットで反応させて、当該抗体のアルファ−シヌクレイン凝集体に対する特異的結合力を分析した。その理由は次の通りである。
【０２１９】
アミロイドベータ１−４２およびタウは凝集体を形成して退行性神経疾患、特にアルツハイマー病の重要な病因と思われ、当該凝集体はアルファ−シヌクレインの凝集体と同様にオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルなどの構造を有すると知られている。したがって、当該ドットブロットは、キメラ抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１がアルファ−シヌクレインの特異的なシークエンスを認識し、アルファ−シヌクレイン、アミロイドベータ、タウ由来凝集体が凝集体として有する共通的な構造を認識しないことを確認するためのものである。
【０２２０】
本実施例のドットブロット方法は前記実施例４−３と実質的に同様な方法で行われ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔアミロイドベータ１−４２およびタウタンパク質およびこれに対する凝集体はソウル大学校のイ・スンジェ教授ｌａｂで製造された。Ｓｙｎ−１、６Ｅ１０、Ｔａｕ５は、それぞれアルファ−シヌクレイン、アミロイドベータ１−４２、タウタンパク質に結合すると知られた抗体である。分析結果は、図１０に記載された。
【０２２１】
実験結果を図１０に示し、これは、本願のキメラ抗体である３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１がアルファ−シヌクレイン由来凝集体にのみ特異的に結合し、アミロイドベータ１−４２およびタウ由来凝集体には結合しないのを示した結果である。これとは異なり、アミロイドベータ１−４２およびタウにそれぞれ結合すると知られた６Ｅ１０およびＴａｕ５抗体は、ドットブロット上で当該凝集体に結合するのを示した。
【０２２２】
前記の結果により、当該キメラ抗体がアルファ−シヌクレインのホモログおよび異なるタンパク質由来凝集体に結合しないのは、当該抗体がターゲットタンパク質にのみ効率的に結合してホモログおよび異なるタンパク質由来凝集体に結合する抗体あるいは薬物と比較してその効能が優れるのを示唆する。
【０２２３】
実施例１０：二重特異抗体の製造
１０−１：Ｂｉｖａｌｅｎｔ二重抗体クローニング
Ｂｉｖａｌｅｎｔ二重抗体発現ベクターを製作するために、ｐｃＤＮＡ３．４（ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターのＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）内にｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを含む抗体ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を挿入した。二重抗体発現ベクターはモノシストロン性ベクターであって、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターをそれぞれ製作した。
【０２２４】
重鎖発現ベクターに挿入された重鎖配列の場合、抗ａ−Ｓｙｎ抗体をコーディングする重鎖可変領域およびヒト重鎖不変領域が連結された免疫グロブリンＣ末端に抗ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖがリンカーで連結された形態である。軽鎖発現ベクターに挿入された軽鎖配列の場合、抗ａ−Ｓｙｎ抗体をコーディングする軽鎖可変領域およびヒト軽鎖不変領域が連結された形態である。
【０２２５】
１０−２：Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体クローニング
Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体は、抗ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖがＣ  ｔｅｒｍｉｎａｌにリンカーで接合されている抗ａ−Ｓｙｎ免疫グロブリン重鎖（ｈｏｌｅ）とｓｃＦｖが連結されていない抗ａ−Ｓｙｎ免疫グロブリン重鎖（ｋｎｏｂ）が結合した異種二量体に抗体軽鎖が接合された形態である。
【０２２６】
重鎖異種二量体の接合効率を高めるために、Ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ技法が用いられた。即ち、Ｈｏｌｅ  ｔｙｐｅ重鎖ｃｏｄｉｎｇ配列はＣＨ３部分でＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０６Ｖで置換し、ｋｎｏｂ  ｔｙｐｅ重鎖ｃｏｄｉｎｇ配列はＣＨ３部分でＴ３６６Ｗでａｍｉｎｏ  ａｃｉｄで置換した。
【０２２７】
１０−３：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
前記製造されたベクターをｍａｘｉ−ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）して、多量のｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを確保後、次のように細胞に導入した。ＢｓＡｂを生産するために、重鎖発現ベクターＤＮＡおよび軽鎖発現ベクターＤＮＡを１：１の比率で形質導入した。ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＢｓＡｂを生産するためには、ｈｏｌｅ  ｔｙｐｅ重鎖発現ベクターＤＮＡ、ｋｎｏｂ  ｔｙｐｅ重鎖発現ベクターＤＮＡおよび軽鎖発現ベクターＤＮＡを０．５：０．５：１の比率で形質導入した。
【０２２８】
形質注入前日、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣＨＯＴＭ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１００−０１）培地に３×１０Ｅ６〜４×１０Ｅ６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度を合わせた後、８％  ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日、７×１０Ｅ６〜１０×１０Ｅ６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上に育った細胞を新鮮な培地を用いて６×１０６  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬで希釈して準備した。
【０２２９】
準備された母細胞への形質注入のために、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ＆  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ複合体を準備した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯＴＭＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注して、滴定濃度で準備したＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、ｍｉｘして常温で５分間定置し、母細胞に接種して形質注入後、培養を始めた。形質注入翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔに含まれているｅｎｈａｎｃｅｒおよびｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％  ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して生産を完了した。
【０２３０】
１０−４：Ｍｅｄｉｕｍ  ｈａｒｖｅｓｔ
生産が完了した培養液の収得のために遠心分離用瓶に培養液を移して４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、０．２μｍの大きさのフィルターでフィルタリングを行って、浮遊物を除いた培養液を確保して、その後、精製過程を行った。
【０２３１】
実施例１１．ＩＧＦ１Ｒ抗体製造（ｓｃＦＶ）
１１−１：ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｓｃＦＶ）の製造
ファージディスプレイ／パニング技術を用いて単一クローン抗体を製造した。
【０２３２】
具体的に、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体製造のためのファージディスプレイパニング遂行およびその他の分析に使用される抗原を次のようなタンパク質を使用した。ヒトＩＧＦ１Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）で信号配列が除去された配列番号９９アミノ酸残基の３１番から９３２番のアミノ酸配列のＣ−末端にヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ  ｔａｇ）が結合されたものを使用した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ、３９１−ＧＲ）。また、種間交差反応性を確認するために、Ｃ末端にＨｉｓ  ｔａｇが融合されたサルＩＧＦ１Ｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）、マウスＩＧＦ１Ｒ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、６６３０−ＧＲ／ＣＦ）、およびラットＩＧＦ１Ｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）のタンパク質を抗原として使用した。
【０２３３】
多様性を有するヒト由来ＳｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリー細胞（ＯＰＡＬ  ｌｉｂｒａｒｙ、梨花女子大学校のシム・ヒョンボ教授製作）１×１０１０個をクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍｌ、２％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５４００）および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２３９３）が含まれている２Ｘ  ＹＴ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ、１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ、１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）５ｇ］培地に接種後、３７℃で３時間程度培養してＯＤ６００値が０．５から０．７になるようにした後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を感染させた後、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）を添加した２Ｘ  ＹＴ培地で３０℃、１６時間培養してファージパッキングを誘導した。その次に、培養液を４５００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離した後、上澄み液に４％  ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、８１２５３）と３％  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。これを再び４℃条件で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで懸濁した後、再び４℃条件で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してライブラリーファージを含む上澄み液を得て、新しいチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。
【０２３４】
１１−２：ファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
ヒトＩＧＦ１Ｒ抗体をスクリーニングするために、次のような方法で総３回パニングを行った。本発明に使用されたファージライブラリーは合成ヒトｓｃＦｖライブラリーであり、ファージディスプレイパニング過程および結果は次の表１９の通りである。
【０２３５】
［表１９］
2021506770.tif 000259
【０２３６】
具体的に、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ  ４４４２０２）に５ｕｇ／ｍｌ濃度の組換えヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ、３９１−ＧＲあるいはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ、１０１６４−Ｈ０８Ｈ−５０Ｒ）を１ｍｌ添加して４℃で１６時間試験管表面にコーティングした後、上澄み液を除去し、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）３％が含まれているＰＢＳ溶液を４ｍｌ添加して３７℃で１時間反応させてＩＧＦ１Ｒが吸着していない表面にＢＳＡを結合させることによって非特異的な結合を遮断した。その次に、上澄み液を除去した後、実施例１１−１で準備したファージライブラリーをＢＳＡ  １．５％溶液と混合して前記免疫試験管に３７℃で１時間反応させて、ＩＧＦ１Ｒ特異的なファージが抗原に結合するようにした。その次に、ＰＢＳ−Ｔ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）溶液で１回洗い落として、非特異的に結合されたファージを除去した後、１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いてＩＧＦ１Ｒに結合したファージを回収した。
【０２３７】
回収されたファージを１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で中和させた後、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＥＲ２７３８大腸菌に３７℃で１時間感染させた後、前記大腸菌をテトラサイクリンとカルベニシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌をテトラサイクリンとカルベニシリンを含有した５ｍｌのＳＢ（ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）培地に懸濁し同一体積の５０％グリセロールを添加して、一部は８０℃に保管し、残りの中の５０ｕｌを４０ｍｌのＳＢ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地に懸濁した後、１０１２ＰＦＵのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を入れて徐々に攪拌しながら３７℃で１時間培養した。その後、培養液にカナマイシンを添加後、３０℃で約１６時間培養してヘルパーファージが感染された大腸菌のみが培養されるようにした。
【０２３８】
翌日、培養液を遠心分離した後、上澄み液を取って４％  ＰＥＧ８０００、３％  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むバッファーを添加して４℃で約１時間反応させファージを沈殿させて遠心分離した。その次に、上澄み液を除去し沈殿したファージを１％  ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーで再懸濁して、これを次のラウンドのパニングに使用した。上記のような過程を４回繰り返し、パニングラウンドが進行するほど、ＰＢＳ−Ｔを用いた洗浄回数を増加させて抗原特異的ファージを増幅および濃縮した。
【０２３９】
１１−３：単一クローンファージ抗体選別（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
ヒトＩＧＦ１ＲのＥＣＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）に対する結合力（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）だけでなく、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞株であるＭＣＦ−７に対する結合力を示す（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）クローンを選別した。
【０２４０】
具体的に、実施例１１−２によって得られたファージプール（Ｐｈａｇｅ  ｐｏｏｌ）からＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する単一クローン抗体を選別するために次のような実験を行った。
【０２４１】
濃縮されたプールから単一クローンを分離するために、ＬＢ−テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に得られたファージプールを塗抹、培養して単一コロニーを確保した。このコロニーを９６ディープウェルプレートに接種して一晩培養した後、培養液１０ｕｌを同じ方法で９６ディープウェルプレートに再接種し３７℃で約４時間培養して滴定ＯＤ（０．５〜０．７）になるようにした。前記培養液に２０  ＭＯＩ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅを入れた後、３７℃で１時間反応させた。その後、培養液にカナマイシンを入れ、３０℃で一晩培養した。翌日、培養液を遠心分離して上澄み液を取って、ＩＧＦ１Ｒ特異的ファージを選別するためのＥＬＩＳＡを行った（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ．Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ．２０００．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＮＹ．ＵＳＡ．ｐｐ．１１．９−１１．１２）。
【０２４２】
ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅに組換えＩＧＦ１Ｒを各ウェル当り１００ｎｇ入れ、４℃で約１５時間反応させて、抗原をｐｌａｔｅ上にコーティングした。非特異的結合を防止するために３％  ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーをウェル当り２００ｕｌずつ添加した後、３７℃で約１時間反応させた。上澄み液を捨てた。
【０２４３】
前記準備した単一クローンファージが含まれている１００ｕｌの溶液を各ウェルに入れて３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ  ３００ｕｌで３回洗浄した。ＩＧＦ１Ｒ抗原に結合されたｐｈａｇｅを検出するために、３％  ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーに抗−ＨＡ  ＨＲＰを１：５０００で希釈した後、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ  ３００ｕｌを用いた洗浄過程を３回行った後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００ｕｌを入れて発色させた後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０ｕｌを入れて反応を終了した。これを４５０ｎｍで吸光度を測定して、対照群であるＢＳＡに比べて吸光度が高いクローンを抗原特異的抗体クローンとして選別した。
【０２４４】
２回のスクリーニングにわたって総７種の１５６４、４８Ｇ５、４９Ｇ１１、５４Ｈ４、６０Ａ１１、６０Ｈ６、Ｂ１１クローンを選別した。
【０２４５】
実施例１２．ＩＧＦ１Ｒ抗体の変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔ）の製造
リガンド結合力およびＢＢＢ通過能を評価して選別されたクローンに対してａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎを行って抗体を最適化した。１次試みでは１５６４  ｓｃＦｖを基にしてｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎのＣＤＲ２とｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎのＣＤＲ３をｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎするためのＮＮＳ  ｈａｎｄ−ｍｉｘ  ｐｒｉｍｅｒを製作し、ＰＣＲ技法を用いてｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ配列が含まれている１５６４  ｓｃＦｖ遺伝子を増幅させた。増幅された遺伝子はｐＣｏｍｂ３ｘ  ｖｅｃｔｏｒに挿入することによってｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙに適したライブラリー形態に作り、ｌｉｂｒａｒｙ  ｐａｎｎｉｎｇおよびＥＬＩＳＡ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇによってＩＧＦ１Ｒに結合する複数のｓｃＦｖクローンを選別することができた。選別されたクローンは遺伝子シークエンシングによって可変部位のアミノ酸配列を確認した。
【０２４６】
２番目の試みではＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３にそれぞれｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎを導入したｈｅａｖｙ、ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎに対する２個のｍｉｎｉ  ｌｉｂｒａｒｙを製作した。９６個のコロニーを分析して、そのうちの３１個のＶＬクローンと３９個のＶＨクローンが独特（ｕｎｉｑｕｅ）のシークエンスを有するのを確認した。当該クローンの生産性および抗原結合力を基にして変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔ）を選別して、最終的にクローンを確保した
【０２４７】
実施例１３．Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｕｅ変異抗体製造
１３−１：Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｕｅ確認
ＣＤＲにｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生すれば、抗体が分解されながら抗原への結合が弱くなって効能低下およびｓａｍｐｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｔｙが誘発されることがあり、Ｓａｍｐｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙは向後の臨床承認などでそのｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎのため複雑性を誘発する。したがって、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析およびｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇによってｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生する位置を確認しようとした。
【０２４８】
図８ａに示したように、ｐａｒｅｎｔａｌである１５６４クローンのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析とｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇで実際ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが起こることを確認した。この時、試料を４℃あるいは４０℃に１週間保管した後に分析を行い、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２でｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生するのを確認した。実施例１２に開示されたａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔに対しても分析を行ってｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ発生位置を確認した。
【０２４９】
１３−２：変異抗体製造
Ｐａｒｅｎｔａｌ  ｃｌｏｎｅである１５６４クローンは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析でｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅが−０．７である。通常、ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅが＜０あるいは＞５．５である場合、体内でｆａｓｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅにぜい弱であると考えられる。したがって、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｕｅをｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅであるＨ、Ｒ、Ｋなどで置換すれば、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎもなくし全体ｃｈａｒｇｅを上げてｆａｓｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅを防止することができると考えた。したがって、ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎが発生する位置を図１８ｂのように置換したｍｕｔａｎｔを生産した。
【０２５０】
Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｕｅを除去するために下記のようにｒｅｓｉｄｕｅを置換したｍｕｔａｎｔを生産した。
【０２５１】
１）アミノ酸配列で、ＡｓｎをＡｓｎと類似したＤあるいはＱに変えた。結合力に変化がないことが確認されれば、当該ｒｅｓｉｄｕｅは全てＱで置換する。
【０２５２】
２）使用されたｐａｒｅｎｔａｌクローンのｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅは−０．７。ｆａｓｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅが誘発されるｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅは＜０あるいは＞５．５であるので、Ｃｈａｒｇｅがｐｏｓｉｔｉｖｅに変わるほど有利である。したがって、ＬＣＤＲ３のｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ発生ｒｅｓｉｄｕｅであるＮ９５ａはｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅを帯びるＨ、Ｒ、Ｋで置換した。
【０２５３】
実施例１４．多様な形態の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の製造
１４−１：抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ形態の抗体製造
実施例１１〜１３で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のｓｃＦｖ全体をＦｃのＣ−末端に連結してミニボディを製造した。このために、本願に開示されたｓｃＦＶのアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を製造し、この配列を制限酵素で切断して、Ｆｃをコーディングする核酸を含むｐｃＤＮＡ基盤の発現ベクターにクローニングした。
【０２５４】
１４−２：抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｂｉｖａｌｅｎｔ形態の抗体製造
実施例１１〜１３で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のｓｃＦｖ全体を、治療抗体ＩｇＧ形態のＣ−末端それぞれに二つを連結したｂｉｖａｌｅｎｔ形態を製作した。このために、本願に開示されたｓｃＦＶのアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を製造し、この配列を制限酵素で切断して、治療抗体をコーディングする核酸を含むｐｃＤＮＡ基盤の発現ベクターにクローニングした。
【０２５５】
１４−３：抗−ＩＧＦ１Ｒ  ＩｇＧ（Ｆｕｌｌ−ＩｇＧ）形態の抗体製造
実施例１１および１２で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のうち、５６４抗体およびＦ０６抗体の配列を全体ＩｇＧ１（Ｆｕｌｌ  ＩｇＧ）形態に変換するために、重鎖と軽鎖領域の遺伝子配列を合成した（ゼノテック（ｇｅｎｏｔｅｃｈ））。合成した重鎖および軽鎖遺伝子は、発現ベクターにクローニングした。
【０２５６】
１４−４：抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態の抗体製造
実施例１４−１が重鎖二つのＦｃのＣ−末端それぞれに抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｓｃＦｖ形態に結合したｍｉｎｉｂｏｄｙ形態であれば、本実施例では重鎖中の一箇所のＦｃ  Ｃ−末端にのみｓｃＦｖ一つが結合したｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態で抗体を製造した。このために実施例１１〜１３で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のうちの１５６４、Ｆ０６、Ｃ０４、ＶＨ５、ＶＨ１６、ＶＨ３５、ＶＨ９、ＶＨ２、ＶＨ７、ＶＨ３２をＦｃ  Ｃ−末端中一箇所にのみ結合させたベクター、Ｃ−末端に抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合されていないベクターを製作した。当該Ｆｃ内にはｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎを導入して、細胞で抗体生産時、ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ形態が製作されるようにした。抗体生産のためにＣＨＯ−Ｓ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ時には、治療抗体のＦｃ  Ｃ−末端に抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合された重鎖に対するベクター、治療抗体のＣ−末端に抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合されていない重鎖に対するベクター、治療抗体の軽鎖に対するベクター、総３個のベクターを注入した。
【０２５７】
１４−５：多様な抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の発現および精製
実施例１４−１〜１４−４で製造されたベクターを次のように細胞に導入した。
【０２５８】
具体的に、ＣＨＯ−Ｓ細胞をＣＤ−ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ、１０７４３）培地に１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで濃度を合わせた後、８％  ＣＯ２、３７℃で１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日、２．５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに育った細胞を１％  ＤＭＳＯが含まれているＣＤ−ＣＨＯ培地を用いて２．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で準備した後、８％  ＣＯ２、３７℃で３ｈｒ培養した。３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離後、上澄み液を除去した後、２．５％  ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。
【０２５９】
その次に、ベクターの組み合わせを培地ｍｌ当り１μｇずつＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に希釈し、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６、ｓｔｏｃｋ濃度：１ｍｇ／ｍｌ）は培養培地ｍｌ当り８μｇ希釈した。ＤＮＡおよびＰＥＩ混合物を混合して、常温で１０ｍｉｎ間静置した後、細胞が含まれているフラスコに入れた後、５％  ＣＯ２、３７℃、１００ｒｐｍで４ｈｒ培養した後、培養ボリュームの同一なボリュームのＣＤ−ＣＨＯ培地を入れた後、８％  ＣＯ２、３７℃、１１０ｒｐｍで４日間培養した。
【０２６０】
前記得られた培養液を、平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を通過させて平衡化したＭａｂ  ｓｅｌｅｃｔｓｕｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍＬ）に通過させて発現された抗体がカラムに結合するようにした。その後、５０ｍＭ  Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で溶出させた後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて中和させて、最終ｐＨが７．２になるようにした。その後、緩衝液をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）に交換して、純度が高い場合、製形後−２０℃に冷凍保管し、追加精製が必要な場合、追加精製時まで４℃に保管した。
【０２６１】
追加精製が必要な場合、Ｈｉｌｏａｄ  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−９８９３−３６）を使用して精製し、多様な他のｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを使用して精製することができる。平衡化バッファー（１ｘ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００１０−０２３）を使用して平衡化させた後、１次精製が完了した試料をカラムにローディングした。精製完了した試料は、製形後−２０℃に冷凍保管した。
【０２６２】
１４−６：抗ａ−Ｓｙｎ（アルファ−シヌクレイン）との二重抗体製造
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体をリンカー（配列番号１７２）を使用して重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結してｓｃＦＶに製造し、下記表に記載された抗ａ−Ｓｙｎ抗体の完全な形態のＩＧＧ抗体の重鎖不変領域のＣ末端にリンカー（配列番号１７３）によって連結して二重抗体を製造した。本実施例では、抗ａ−Ｓｙｎ抗体の完全な形態のＩＧＧ抗体１分子当り、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖ形態一つ分子を連結して製造したｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ抗体と、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖ形態二つ分子を連結して製造したｂｉｖａｌｅｎｔ抗体をそれぞれ製造した。本実施例で二重抗体製造のために使用した抗ａ−Ｓｙｎ抗体の配列及び本件発明によって製造した二重抗体の配列は表１７に記載された通りである。その後、実施例で表１７に例示された二重抗体に対する実験を行った。
【０２６３】
実施例１５．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ特異的結合力分析
１５−１：Ｍｉｎｉｂｏｄｙ形態抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒに対する結合力分析（ＥＬＩＳＡ）
実施例１４−１で製作した９９６、１２２６、１５６４、ＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ形態が組換えＩＧＦ１Ｒに対する結合力および濃度依存的に結合するか否かを確認するためにＥＬＩＳＡ分析を行った。
【０２６４】
具体的に、抗体結合対象であるヒト組換えＩＧＦ１Ｒはｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ（ＥＣＤ）であって、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した（６６３０−ＧＲ／ＣＦ）。９６−ウェルＥＬＩＳＡｐｌａｔｅに（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）ヒトＩＧＦ１ＲをＰＢＳバッファーに１ｕｇ／ｍｌで希釈してウェル当り１００ｕｌ入れた後、４℃で１６時間反応してコーティング後、上澄み液を除去した。３％  ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれているＰＢＳバッファーをウェル当り２００ｕｌ入れ２時間反応させて非特異的結合を遮断させた。
【０２６５】
実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４、ＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体を最高濃度２０ｎＭを基準にして３倍ずつ希釈して１２ポイントを作った後、各ウェルに１００μｌずつ移した後、常温で１時間処理後に、Ｔｗｅｅｎ２０が０．０５％含有されたＰＢＳバッファーを用いて４回洗浄し、ｍｉｎｉｂｏｄｙに存在するｈｕｍａｎ  Ｆｃを認知する抗−ｈｕｍａｎ  ＨＲＰをブロッキングｂｕｆｆｅｒに１：５０００で希釈し各ウェルに１００ｕｌずつ移して１．５時間常温で反応させた。再びＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％）３００ｕｌを用いて４回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）を使用して発色させた。酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸によって中止させ、マイクロプレートリーダー機（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を記録および分析した。前記実験結果を図１ａに示した。
【０２６６】
ｍｉｎｉｂｏｄｙ４種クローンがヒトＩＧＦ１Ｒ組換えタンパク質に濃度依存的に結合し、具体的に、ＭＫＪＰ２が最も優れた結合力を、その次に９９６と１５６４が類似した結合力を示すのを確認し、１２２６はそれより若干落ちる結合力を示すのを確認した。
【０２６７】
１５−２：：ＩＧＦ１Ｒ抗体の種間交差反応性のＥＬＩＳＡ分析
実施例１４−２の方法によって製作した１５６４抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と、実施例１１−３で確保した抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の種間交差結合有無をＥＬＩＳＡ技法によって分析した。このために、まず、ヒト、サル、マウスおよびラットＩＧＦ１Ｒ抗原を１ｕｇ／ｍｌで希釈して各ウェルに１００ｕｌずつ入れ、４℃で１５時間反応してプレートの底にコーティングされるようにした。上澄み液を除去した後、３％  ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファー２００ｕｌを各ウェルに処理して非特異的な結合を遮断した。抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を最高濃度４００ｎＭにして、ＰＢＳＢ（ＢＳＡ３％  ｉｎ  ＰＢＳ）に５倍ずつ希釈して前記各ウェルに処理した後、３７℃で１時間反応した。その次に、ＰＢＳバッファーを用いて５回洗浄した後、結合された抗体のＦａｂ部分を認知する抗−ヒトＦａｂ  ＨＲＰを１：２００００で希釈して各ウェルに１００ｕｌ処理した後、３７℃で１時間反応させた、その次にＰＢＳバッファーで５回洗浄し、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）を使用して製造者の方法通りに発色させた。酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸によって中止させ、マイクロプレートリーダー機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ遂行時、サンプルが多い場合はプレートを２つに分けて行い、実験結果は次の表１２に示した。
【０２６８】
具体的に、表１２でヒトＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、１５６４ＩｇＧと二重特異抗体のヒトＩＧＦ１Ｒに対するＥＬＩＳＡ結果、マウスＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、ラットＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、サルＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果を下記表１２に整理した。
【０２６９】
下記の実験結果は多様な種の動物モデルを用いて効能を評価することができる長所を示すものであって、本願発明による抗体を用いて多様な種の疾患モデルを通じた治療剤の効能評価が可能であるのが分かる。
【０２７０】
［表２０］多様な種のＩＧＦ１Ｒに対する抗体結合力のＥＬＩＳＡ分析結果
2021506770.tif 000260
＊：ｎｏｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ
＊＊２０１：ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ
【０２７１】
１５−３：Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔのＩＧＦ１Ｒに対する結合力分析（ＦＡＣＳ）
実施例１２で製作されたａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔの結合力をＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対するＥＬＩＳＡ遂行およびＭＣＦ−７に対する結合力をＦＡＣＳで分析した。
【０２７２】
１次クローンに対する分析で、表２１は１次選別された当該クローンの二重特異抗体形態でのＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡ分析結果であり、表２２はＭＣＦ−７細胞株への結合をＦＡＣＳで分析した結果である。
【０２７３】
［表２１］１次選別された当該クローンの二重特異抗体形態でのＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡ
2021506770.tif 000261
【０２７４】
［表２２］ＭＣＦ−７細胞株への結合をＦＡＣＳで分析した結果
2021506770.tif 000262
【０２７５】
その結果、Ｆ０６が最もｐａｒｅｎｔａｌクローン（１５６４クローン）と比較して細胞結合において最も高い結合力を有するクローンに選定され（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ）、Ｃ０４はｐａｒｅｎｔａｌ（１５６４クローン）より細胞結合力が最も落ちるクローンに選定された（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ）。
【０２７６】
２次クローンに対する分析で、表２３は２次製作方法で製作されたクローンの二重特異抗体形態でのＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡである。
【０２７７】
［表２３］２次選別クローンのＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結果
2021506770.tif 000263
【０２７８】
２次製作されたクローンのうちの生産性および物性が顕著に落ちるクローンを除いた後、ＦＡＣＳ分析を行うクローンを表２４のように選定した。
【０２７９】
［表２４］ＦＡＣＳ分析を行うクローン
2021506770.tif 000264
【０２８０】
図１２ｃは当該クローンのＭＣＦ−７細胞株への結合をＦＡＣＳで分析した結果であり、分析クローン全てがｐａｒｅｎｔａｌクローンである１５６４に比べてＭＣＦ−７に対する結合力が落ちた。当該結果は、ＥＬＩＳＡで結合力低下を示したクローンがＦＡＣＳでも結合力低下を示すのを示す。
【０２８１】
選別された抗体クローンはＦ０６、Ｃ０４、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２＿であり、これら抗体に対する重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列は前記表５および表６に示した。
【０２８２】
１５−４：Ｈｕｍａｎ  ＩＧＦ１Ｒに対するＢＩＡｃｏｒｅ分析
本発明による抗体とヒトＩＧＦ１Ｒ間の結合力を分析しようとした。
【０２８３】
１５６４クローンのＩｇＧ形態に対してＳＰＲ分析でヒトＩＧＦ１Ｒに対する結合程度を分析した。抗原であるヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤに結合されたＨｉｓ  ｔａｇに対する抗−ｈｉｓ抗体をａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ４．０  ｂｕｆｆｅｒに２０μｇ／ｍｌで希釈した後、ＣＭ４  ｃｈｉｐにａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ方法でｒｅｆｅｒｅｎｃｅ／ａｎａｌｙｔｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌにｔａｒｇｅｔ  ＲＵを１０，０００ＲＵにｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅした。Ｃａｐｔｕｒｅの間、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとしてはＰＢＳを使用した。Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは３０μＬ／ｍｉｎを維持した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの間、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは４０μＬ／ｍｉｎ、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとしてはＰＢＳを使用した。ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｄｉｓｓｓｏｃｉａｔｉｏｎはそれぞれ５分、２０分であった。分析は、ｂａｓｅｌｉｎｅ  １、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＥＤＣ＋ＮＨＳ）、ヒトＩＧＦ１Ｒ  ｌｏａｄｉｎｇ、ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ（１Ｍ  Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ｂａｓｅｌｉｎｅ  ２、ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ順に行われた。Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎはｂｉｖａｌｅｎｔモデルを使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０、Ｓ／Ｎ：０４Ｙ１５Ｘ１１−０１４９）を使用して分析した。
【０２８４】
分析結果、１５６４ＩｇＧ抗体のＫＤは２．５３０５×１０−９ｎＭに、Ｆ０６  ＩｇＧ抗体は４．７８０２×１０−７ｎＭに確認されて、全てヒトＩＧＦ１Ｒに高い結合力を示すのを確認した。分析の結果は図１１ｂである。特に、１５６４クローンをＩｇＧ形態に製作した時、ヒトＩＧＦ１Ｒに２．５３０５×１０−９ｎＭの解離定数を示すのを確認して、１５６４はその形態によって結合力に大きな変わりがないのを確認した
【０２８５】
実施例１６．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のヒトＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株および脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）に対する結合力分析
１６−１：ＭＣＦ−７に対するＦＡＣＳ分析
実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、および１５６４クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ形態が、細胞表面のｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＧＦ１Ｒに結合するか確認するために、ヒトＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株および脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）に対する結合力分析をＦＡＣＳで行った。Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔとＩＧＦ１Ｒが過発現すると知られたＭＣＦ−７、乳癌細胞株との結合程度をＦＡＣＳで確認した。
【０２８６】
具体的に、サンプル当り０．４３×１０Ｅ６のＭＣＦ−７細胞株に、前記３種のｍｉｎｉｂｏｄｙをそれぞれ２０ｕｇ／ｍｌで希釈後、処理して４℃で１時間反応させた。ＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄後、抗−ｈｕｍａｎ  ＦＩＴＣを１：５００で希釈して処理、４℃で１時間反応させた。再びＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を用いて抗−ＩＧＦ１Ｒ  ｍｉｎｉｂｏｄｙが結合された程度を測定した。対照群としてｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙのみ処理したＭＣＦ−７細胞を使用した。前記実験結果を図１２ａに示した。
【０２８７】
実施例１２および実施例１４−２で製作されたＡ０２、Ａ０６、Ａ０７、Ｂ０１、Ｂ０２、Ｂ０９、Ｂ１０、Ｃ０４、Ｄ０３、Ｅ０６、Ｆ０６、Ｈ０４（Ｇｌｙ）、Ｈ０４（Ｖａｌ）、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２、ＶＨ３５を前記と同様な方法でＭＣＦ−７に対する結合力を分析した。１５６４クローンを実施例１４−２方法で製作してｐａｒｅｎｔａｌクローンとして比較し、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙのみ処理したＭＣＦ−７細胞を対照群として使用した。分析結果は表２１および図１２ｃに示した。
【０２８８】
前記実験結果によって、当該サンプルのＭＦＩ（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で示し、テストした３種のｍｉｎｉｂｏｄｙ内のｓｃＦｖおよび二重特異抗体形態のａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔおよびｐａｒｅｎｔａｌクローン（１５６４クローン）が細胞表面に発現されるｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。当該結果は、前記例で確保されたクローンが体内に実際に存在する形態のＩＧＦ１Ｒに結合して意図した目的で使用できるのを示す結果である。
【０２８９】
１６−２：ＪＩＭＴ−１およびＢＴ４７４に対するＦＡＣＳ分析
実施例１６−１で使用したＭＣＦ−７細胞株の代わりに、ＪＩＭＴ−１およびＢＴ４７４乳癌細胞株を使用したことを除いては実質的に同様な方法で実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、および１５６４クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ形態が、細胞表面のｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓのＩＧＦ１Ｒに結合するか確認した。前記実験結果を図１２ａに示した。
【０２９０】
前記実験結果によって、当該サンプルのＭＦＩ（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で示し、テストした３種のｍｉｎｉｂｏｄｙ内のｓｃＦｖがＩＧＦ１Ｒ発現多様な細胞株表面のｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。
【０２９１】
１６−３：マウス脳内皮細胞に対するＦＡＣＳ分析
実施例１４−２方法で製作した１５６４クローンの二重特異抗体形態と実施例１４−３方法で製作した１５６４クローンのＩｇＧ形態がマウスの脳内皮細胞であるｂＥＮＤ．３に結合するかを分析した。この時、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ抗体のみ処理グループおよび治療抗体単独ＩｇＧ（ＣＨ１１Ｆ１１）処理グループを陰性対照群として使用した。ＦＡＣＳ分析法は実施例１６−１および１６−２と同様に行った。分析結果は図１２ｂに示した。
【０２９２】
試験したテストクローン全て陰性対照群を除いてｂＥＮＤ．３に対して結合力を示した。当該結果を通じて多様な形態の１５６４クローンが脳内皮細胞表面に発現するＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。
【０２９３】
実施例１７．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ分析
１７−１：ＭＣＦ−７  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ−１５６４、９９６、１２２６、ＭＫＪＰ２（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）
実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ形態が、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株でｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされ、細胞内に導入された抗体は分解されずＲＭＴ  Ｐａｔｈｗａｙを経るかを確認しようとした。抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＢＢＢ通過能を向上させるシャトルとして使用されるためには、当該抗体がＢＢＢを構成するｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされることが先行されなければならない。
【０２９４】
ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ−７細胞株を用いて発明による抗体が細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされるかを分析した。具体的に、８−ｗｅｌｌ  ｓｌｉｄｅ  ｃｈａｍｂｅｒ内に３０，０００個のＭＣＦ−７細胞株をｐｌａｔｉｎｇした後、１日間培養した。実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体をそれぞれ５μｇ／ｍｌずつ４℃で各ｗｅｌｌに２時間処理し、冷たいＤＭＥＭ培養液で３回洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体をまた４℃で１時間処理した。
【０２９５】
抗体ｃｏｍｐｌｅｘのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎをテストするために、当該ｐｌａｔｅをＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒに移して３７℃で３０分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。１００％メタノールを入れてｃｕｌｔｕｒｅを固定すると同時に反応を終了した。固定後にはＰＢＳで３回洗浄した。蛍光顕微鏡上で抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ程度をｇｒｅｅｎ  ｆｉｌｔｅｒ領域（Ａｌｅｘａ４８８）でイメージングした。イメージング時に、ＤＡＰＩを用いて細胞内核を染色して各細胞の位置を確認した。前記実験結果を図１３ａに示した。
【０２９６】
前記実験結果から、ＭＣＦ−７細胞株を用いた実験でもテストした４種抗体全てｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎがよく起こるのを確認することができ、特に、ＭＫＪＰ２と１５６４のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが他のクローンに比べて多く起こることが分かった。
【０２９７】
１７−２：ＭＣＦ−７  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ−Ｃ０４、Ｆ０６、ＶＨ５、ＶＨ１６、ＶＨ３５、ＶＨ９、ＶＨ２、ＶＨ７、ＶＨ３２
ＩＧＦ１Ｒに対する結合力を変化させた１５６４  ｖａｒｉａｎｔの細胞表面ＩＧＦ１Ｒ結合を分析するために、ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ−７細胞株を用いてＦＡＣＳ分析を行った。ｓｃＦｖ形態の二重抗体から製作されたＩＧＦ１Ｒ抗体を１０ｕｇ／ｍＬ濃度で２×１０Ｅ５のＭＣＦ７細胞に３０分間処理した。１％  ＢＳＡが添加されたＰＢＳバッファーで洗浄した後、ヒト抗体をｄｅｔｅｃｔｉｏｎするＦＩＴＣが結合された２次抗体を１時間処理した。ＰＢＳバッファーで洗浄した後、ＦＡＣＳ分析によって結合力が変化多様なｖａｒｉａｎｔの細胞外結合およびｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを確認した。
【０２９８】
表２５の結果のように、１５６４  ＩＧＦ１Ｒ抗体が含まれている二重抗体は冷蔵条件より３７℃条件でｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが増加してｉｎｔｅｎｓｉｔｙが増加するのを確認し、細胞結合程度が高かったＦ０６クローンも、ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが増加するのを確認した。このような結果は、１５６４  ｖａｒｉａｎｔが細胞によく結合して結合依存的に細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎされるのを示唆するものである。
【０２９９】
［表２５］
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【０３００】
１７−３：ヒトｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに対するｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ分析
実施例１４−２および１４−４で製作した１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔおよびｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態がヒト由来ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ（ＨＭＢＥＣ））にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされるか分析した。治療抗体ＩｇＧ（１１Ｆ１１）を陰性対照群として使用した。
【０３０１】
ＨＭＢＥＣ（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃：ＡＣＢＲＩ３７６）を１２ウェルプレートに９０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙでプレーティングした後、テスト抗体を投与した。その翌日、４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳリンス後に、３％  ＢＳＡとＴｒｉｔｏｎＸが含まれているｓｏｌｕｔｉｏｎを５０分間使用してｂｌｏｃｋｉｎｇおよびｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅした。ＰＢＳでリンス後、ヒトＦｃに対する抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ抗体）を２時間３０分間投与し、ＰＢＳリンス後、当該ｐｒｉｍａｒｙ抗体に対するｓｅｃｏｎｄａｒｙ抗体を１時間投与した。ＰＢＳリンス後、核染色のために１：１０００で希釈された濃度でＨｏｅｃｈｓｔを１０分間ｓｔａｉｎｉｎｇした。結果物は、ＬＳＭ  ７８０  ＮＬＯ  ＥＣ  Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ１００Ｘ／１．３  Ｏｉｌ条件で共焦点顕微鏡で分析した。前記実験結果を図１３ｂに示した。
【０３０２】
１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔおよびｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態は、陰性対照群である治療抗体（１１Ｆ１１）に比べて増加されたｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示した。この結果は、前述の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が治療抗体と連結された多様な形態の二重特異抗体であって、ＢＢＢを構成するｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ内に当該治療抗体を効果的にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅさせることができるのを、したがって窮極的に当該治療抗体のＢＢＢ通過能を増大させるのを示唆する。
【０３０３】
１７−４：ヒトｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ内でのｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｅの分析
万一、当該抗体がｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされた後、細胞内のリソソーム関連マーカとｃｏｌｏｃａｌｉｚｅすれば、当該抗体はｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ内で分解されてしまうためＢＢＢを通過できない。これとは反対に、ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓに関連するｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅあるいはＢＢＢ通過に関連すると知られたマーカとｃｏｌｏｃａｌｉｚｅすれば、当該抗体はｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌにｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされた後、脳側に抜け出るｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓによってＢＢＢを通過すると予想される。
【０３０４】
実施例１７−２でテストされた抗体のうちの１５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔ形態を同様な方式でＨＭＢＥＣに処理した後、細胞内で当該抗体がいずれのｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔとｃｏｌｏｃａｌｉｚｅするか分析した。但し、ｂｌｏｃｋｉｎｇおよびｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ後、投与抗体をｄｅｔｅｃｔｉｏｎするＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ抗体と共に、次の抗体をそれぞれ同時に投与した。
【０３０５】
−Ａｎｔｉ−Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ：リソソームマーカ
−Ａｎｔｉ−Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１：ｃａｖｅｏｌｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓマーカ（ＢＢＢ通過の主要メカニズムと思われる）
−Ａｎｔｉ−ＥＥＡ１：ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅマーカ
残り方法は実施例１７−２と同様であるが、前記のマーカに対するｓｅｃｏｎｄａｒｙ抗体をそれぞれ処理した。
【０３０６】
分析結果は図１３ｃに示した。１５６４クローンは二重特異抗体形態で全てＣａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄとｃｏｌｏｃａｌｉｚｅせず、その代わりにｃａｖｅｏｌｉｎ−１およびＥＥＡ１と細胞膜および細胞内部でｃｏｌｏｃａｌｉｚｅした。この結果は、１５６４クローンがｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅされた後、細胞内の分解メカニズムを経ずにＲＭＴを通じてＢＢＢを通過することができるのを示す。
【０３０７】
実施例１８．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ信号伝達に及ぼす影響分析
１８−１：ＭＣＦ−７細胞株のＩＧＦ１Ｒによるｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１Ｒ（ＩＧＦ１受容体）とそのリガンドであるＩＧＦ１間の結合を妨害するか否かを、ＩＧＦ１による細胞増殖効能を用いて確認した。
【０３０８】
実施例１４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体をそれぞれ４００ｎＭから５倍ずつ希釈して希釈サンプルを製作後、２０ｎｇ／ｍｌ濃度の２５μｌ  ＩＧＦ１に各２５μｌずつ処理した。ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ−７細胞株を培養し、実験当日培地を除去して継代し、ＩＧＦ１とテスト抗体が分注されている９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ当り２０，０００個ずつ（５０μｌに該当）処理した。
【０３０９】
３日間適切な温度および湿度で培養してから、細胞生長程度を測定するためにＣＣＫ−８  ｒｅａｇｅｎｔを１０μｌずつ処理し、ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで４−５時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。その後、取り出してｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒの４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【０３１０】
前記実験結果を図１４ａに示した。
前記実験結果から、本発明による抗体は、ＩＧＦ１のＩＧＦ１Ｒに対するｓｉｇｎａｌｉｎｇによるＭＣＦ−７の細胞増殖を阻害しないことが確認された。対照群として使用したＩｍｃｌｏｎｅ社の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＩＧＦ１によるＭＣＦ−７の細胞増殖を処理濃度に比例して阻害した。したがって、本発明の抗体はＢＢＢを構成するｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに発現するＩＧＦ１Ｒに結合してＢＢＢ通過能を有するが、同時に体内ＩＧＦ１によるｓｉｇｎａｌｉｎｇを阻害しない抗体であるので、本発明による抗体はＢＢＢシャトルとして使用できるのを確認した。
【０３１１】
１８−２：ＭＣＦ−７細胞株のＩＧＦ１Ｒによるｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔの阻害分析
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞と結合するＩＧＦ１がｓｉｇｎａｌｉｎｇを細胞内に伝達する時、そのｓｉｇｎａｌｉｎｇのｒｅｃｅｐｔｏｒおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔに関与するかどうかを確認するために実験した。即ち、ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ−７細胞株に抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を投与し、これによる細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量を分析した。
【０３１２】
ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌを培養してから、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を処理２０時間前にその培養液をｓｅｒｕｍが含まれていない培養液に変更した。実施例４−１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体をそれぞれ１００ｎＭを前記ＭＣＦ−７細胞株に処理後、１時間後に２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１を処理した。２０分後、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ｐｒｏｔｅａｓｅとｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌが添加されたＭ−ＰＥＲで細胞を溶解した。ＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用してタンパク質濃度を測定した後、１２．５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌにローディングしてｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓさせた後、ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅにｔｒａｎｓｆｅｒした。ブロッキングは５％のＢＳＡが含まれているＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）と共に１時間ｇｅｎｔｌｅ  ｓｈａｋｉｎｇで常温で行い、その後にＩＧＦ１ＲあるいはＡｋｔに対するｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを４℃で軽く揺すりながら一晩処理した。ｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙはｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌとして使用された。洗浄した後にｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを１時間常温で軽く揺すりながら処理した後に洗浄し、ＥＣＬ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｌａｓ４０００を用いてシグナルを確認した。前記実験結果を図１４ｂに示した。
【０３１３】
前記実験結果から、本発明による抗体は、細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量に影響を与えないことを確認した。
【０３１４】
１８−３：マウス脳内皮細胞のＩＧＦ１Ｒによるｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔの阻害分析
本発明による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が、マウス由来ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ細胞にＩＧＦ１がｓｉｇｎａｌｉｎｇを細胞内に伝達する時、そのｓｉｇｎａｌｉｎｇのｒｅｃｅｐｔｏｒおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔに関与するかどうかを確認するために実験した。即ち、ＩＧＦ１Ｒを発現することが確認されたｂＥＮＤ３細胞株に実施例１４−２の方法で製作された１１Ｆ１１−１５６４、３Ａ９−１５６４（ＣＨ１１Ｆ１１とｃｈ３Ａ９、抗ａ−ｓｙｎ単独抗体として大韓民国公開特許２０１８−００８１４６５に記載されたもの）および実施例１４−３の方法で製作された１５６４クローンのＩｇＧ形態を投与し、これによる細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量を分析した。
【０３１５】
ｂＥＮＤ３  ｃｅｌｌを培養してから、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体を処理２０時間前にその培養液をｓｅｒｕｍが含まれていない培養液に変更した。実施例１４−２の１５６４およびＭＫＪＰ２クローンの二重特異抗体をそれぞれ１００ｎＭを前記ｂＥＮＤ細胞株に処理後、１時間後に２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１を処理した。２０分後、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ｐｒｏｔｅａｓｅとｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌが添加されたＭ−ＰＥＲで細胞を溶解した。ＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用してタンパク質濃度を測定した後、１２．５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌにローディングしてｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓさせた後、ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅにｔｒａｎｓｆｅｒした。ブロッキングは５％のＢＳＡが含まれているＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）と共に１時間ｇｅｎｔｌｅ  ｓｈａｋｉｎｇで常温で行い、その後にＩＧＦ１ＲあるいはＡｋｔに対するｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを４℃で軽く揺すりながら一晩処理した。ｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙはｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌとして使用された。洗浄した後にｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを１時間常温で軽く揺すりながら処理した後に洗浄し、ＥＣＬ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｌａｓ  ４０００を用いてシグナルを確認した。
【０３１６】
前記実験結果を図１４ｃに示した。
前記実験結果から、本発明による抗体は、細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量に影響を与えないことを確認した。
【０３１７】
実施例１９．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の無毒性分析
１９−１：ＩｇＧ形態ＩＧＦ１Ｒ抗体のＡＤＣＣ分析
実施例１４−３による抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩｇＧ形態として、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞の表面に結合してＩＧＦ１Ｒ依存的な結合によって細胞死滅に影響を与えるか確認するために実験した。即ち、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体である１５６４クローンが結合した時、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ、ＮＫ  ｃｅｌｌ）を活性化させてＩＧＦ１Ｒ発現細胞に悪影響を与えるかをＡＤＣＣ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用して分析した。
【０３１８】
ＩＧＦ１Ｒを過発現するＭＣＦ−７細胞と低い水準で発現するＳＫＢＲ３細胞を培養した後、抗体処理２０時間前に９６ウェルプレートにｗｅｌｌ当り５０００個の細胞を分注した。培養した細胞は４％  ｌｏｗ  ＩｇＧ  ｓｅｒｕｍが含まれているＲＰＭＩ／１６４０培地に交換した後、１５６４クローンのＩｇＧ形態を１３３．３ｎＭから８倍ずつ希釈して各ｗｅｌｌに添加した。安定化させたＡＤＣＣ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞を各ｗｅｌｌに添加した後、６時間培養した後、常温で約１０分間放置する。予め準備したＢｉｏ−Ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔを各ｗｅｌｌに添加した後、ＰＨＥＲＡｓｔｅｒ  ＦＳ  ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ装備でｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ程度を測定してＡＤＣＣ誘導程度を分析した。前記実験結果を図１５ａに示した。
【０３１９】
前記実験結果から、本発明による抗体、特に１５６４クローンはＩＧＦ１Ｒ過発現細胞株であるＭＣＦ−７細胞と低い水準で発現するＳＫＢＲ３細胞に結合するが、ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞によるＡＤＣＣを誘導しないのを確認した。
【０３２０】
１９−２：抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の反復投与後の脳内ＩＧＦ１Ｒレベル分析
ＢＢＢシャトルとして使用される抗体はｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌのターゲットｒｅｃｅｐｔｏｒに結合して治療抗体の通過能を高める役割を果たすが、当該ｒｅｃｅｐｔｏｒレベルに変化を与えてはいけない。ターゲットｒｅｃｅｐｔｏｒのｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎは当該ターゲットの脳での役割に影響を与えて副作用を引き起こすことがある。
【０３２１】
本願の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が反復投与後にも脳内のＩＧＦ１Ｒレベルに影響を与えるかを分析した。実施例１４−６によって製造されたパーキンソン病治療抗体と１５６４クローンが連結されたｂｉｖａｌｅｎｔ形態の二重特異抗体とパーキンソン病治療抗体単独、そして陰性対照群としてＩｇＧをパーキンソンモデルマウスに３ヶ月間毎週反復投与した後、その脳組織でのＩＧＦ１Ｒレベルをｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで分析した。
【０３２２】
各グループ当り３匹のマウスの脳組織をＰＢＳでｐｅｒｆｕｓｉｏｎ後、ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅした後、１０ｕｇのｌｙｓａｔｅを４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌにローディングしｒｕｎｎｉｎｇした後、ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅにｔｒａｎｓｆｅｒした。残り方法は実施例１９−１と同様に行った。
【０３２３】
実験結果は図１５ｂに示した。１５６４クローンから構成された二重特異抗体は、パーキンソン病治療抗体単独およびＩｇＧ投与群と類似したレベルのＩＧＦ１Ｒを示した。この結果は、１５６４クローンが反復投与後にも脳内ＩＧＦ１Ｒレベルに深刻な変化を引き起こさず、したがって、当該抗体はＢＢＢシャトルとして使用される場合、副作用が低いことと予想される。
【０３２４】
１９−３：抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の投与後脳内分布分析
ＢＢＢシャトルはｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ表面のｒｅｃｅｐｔｏｒに結合して治療抗体を脳内に伝達するが、脳内の正常細胞表面のｒｅｃｅｐｔｏｒへの結合は少なくなければならない。万一、ＢＢＢシャトルが脳内で抗原を発現する正常細胞に多量結合すれば、それだけ当該シャトルに結合された治療抗体は疾患ターゲットに少なく到達するようになる。
【０３２５】
本願の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の脳内分布を分析するために実施例２１−２で行ったｉｎ  ｖｉｖｏ実験動物の脳で抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の分布を免疫染色法で分析した。１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ形態が投与されたＳＤ  ｒａｔをｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ方式で生理食塩水を用いてｐｅｒｆｕｓｉｏｎした。左半球を１０％ｎｅｕｔｒａｌ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎに２４時間入れて固定した。脳を１ＸＰＢＳでリンスし、３０％  ｓｕｃｒｏｓｅが含まれている溶液に２４時間冷凍させた。脳をＯＣＴに入れた後に凍らせてｓｅｃｔｉｏｎまで−８０℃で保管した。Ｓｅｃｔｉｏｎはｃｏｒｏｎａｌ方向に２５μｍ厚さで行い、２４ウェルペトリ皿に０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅを含む１Ｘ  ＰＢＳに集めた。当該組織をｆｒｅｅ  ｆｌｏａｔｉｎｇ方式で０．３％  Ｔｗｅｅｎ−２０が含まれているＤａｋｏ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋ（Ｘ０９０９、ＤＡＫＯ）と１時間常温でｉｎｃｕｂａｔｉｏｎしてｂｌｏｃｋｉｎｇおよびｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅした。Ｐｒｉｍａｒｙ抗体では１：５０比率のｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄヒトＦｃ抗体（ＢＡ３０８０、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を処理後、４℃でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。ＴＢＳで３回ｗａｓｈ後、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに対する抗体であるＲＥＣＡ−１（ａｂ９７７４、ＡｂＣａｍ）を１：２０００比率、あるいはニューロンに対する抗体であるＮｅｕＮ（ＭＡＢ３７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１：２５０の比率で、２時間処理した。Ｗａｓｈ後、Ａｌｅｘａ４８８が結合され各抗体に対するｓｅｃｏｎｄａｒｙ抗体を４５分間処理した。ｗａｓｈ以後、ｓｅｃｔｉｏｎをガラスｓｌｉｄｅに載せた後、Ｄａｐｉが含まれているＰｒｏＬｏｎｇ  ＧｏｌｄあるいはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８が含まれているＤａｋｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａを添加して核を染色した。共焦点顕微鏡で大脳皮質および海馬を適切な蛍光波長を用いて分析した。分析結果は、図１５ｃに示した。
【０３２６】
当該結果は、１５６４クローンが結合された二重特異抗体は正常ニューロンに結合せず、その代わりにｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに特異的に結合するのを示した。従って、本源の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は脳内の正常細胞に結合せず、治療抗体のＢＢＢ通過能のみを増大させて副作用が殆どなく、治療抗体の治療効能の向上をもたらすと予想される。
【０３２７】
実施例２０．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能分析
２０−１．ｓｖ−ＡＲＢＥＣ由来ＢＢＢモデルでｂｉｖａｌｅｎｔ抗体のＢＢＢ通過能分析
実施例１１および１２由来抗体を実施例１４−２で製作した二重特異抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能をＳｖ−ＡＲＢＥＣから構成されたＢＢＢモデルで評価した。Ｓｖ−ＡＲＢＥＣをｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅの上に単一層でプレーティングし、当該ＢＢＢシステムの抵抗値（ＴＥＥＲ）およびｓｕｃｒｏｓｅ通過程度を基にして当該システムのｉｎｔｅｇｒｉｔｙを予め評価した。この時、ｓｖ−ＡＲＢＥＣは当該システムのｉｎｔｅｇｒｉｔｙに役立つことが確認されたラットａｓｔｒｏｃｙｔｅ培養ｍｅｄｉｕｍ（ＲＡＳ−ＣＭ）を処理した。テスト抗体である１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１のｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体をｍｅｍｂｒａｎｅの上に処理した後、９０分後にｂｏｔｔｏｍ  ｃｈａｍｂｅｒでの抗体量を質量分析で分析した。質量分析のために、各抗体ＦｃおよびｓｃＦｖでのｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅが分析された後、使用された。この時、パーキンソン病治療抗体単独（１１Ｆ１１）および当該抗体にＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭのバイオシミラーのｓｃＦｖ形態を結合させた二重特異抗体を陰性対照群として使用した。当該システムにはＢＢＢを通過しないと知られたＡ２０．１抗体（ｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｕｎｃｉｌ製作）を通過させて当該システムの検量限界線を決めた。質量分析で導出された結果値を先行文献で知られた公式に代入してＰａｐｐ値を決定し、この値はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＢＢ通過能程度を示す。
【０３２８】
分析結果は、図１６ａに示した。Ｂ１１を除いたテスト抗体は陰性対照群に比べて高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能を示した。特に、１５６４クローンは他のクローンに比べて高いＢＢＢ通過能を示した。これは、１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６クローンおよびクローンを連結した二重特異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能が単独抗体に比べて高いことが可能であるのを示す。
【０３２９】
２０−２．ｓｖ−ＡＲＢＥＣ由来ＢＢＢモデルでｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ抗体のＢＢＢ通過能分析
２０−１と同一のモデルで、実施例１４−４を基にして製作したｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ抗体と実施例１４−２を基にして制作したｂｉｖａｌｅｎｔ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能を分析した。１５６４クローンから製作したｂｉｖａｌｅｎｔ、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ抗体および陰性対照群であるパーキンソン病治療抗体（３Ａ９）をｓｖ−ＡＲＢＥＣ  ＢＢＢシステムに通過させた後、通過量を分析した。分析結果は、図１６ｂに示した。
【０３３０】
１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態は単独抗体である３Ａ９に比べて全て高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能を示し、特に、ｂｉｖａｌｅｎｔ形態の通過能がｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態より高かった。これは、１５６４クローンは多様な形態にそれに連結された治療抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過能を向上させることができるのを示す。
【０３３１】
２０−３．ヒトＩＰＳＣ由来ＢＢＢモデルで抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のＢＢＢ通過能分析
ヒトｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ由来ＢＢＢモデルは、ラットあるいはマウス細胞由来ＢＢＢシステムに比べて高い抵抗値（ＴＥＥＲ）を示し、ＢＢＢで確認された多様なマーカを全て発現する。したがって、ヒトｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ由来モデルのＢＢＢ  ｔｉｇｈｔｎｅｓｓは動物細胞由来ＢＢＢに比べて高く、当該モデルはヒトＢＢＢをよく再現している。
【０３３２】
ヒトの羊水に由来した細胞（ＡＦ−ｉＰＳＣ）にｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１  ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ  ａｎｄ  ＬＩＮ２８などのベクターを導入してｉＰＳＣにｒｅｐｒｏｇｒａｍした。生成されたコロニーにＫＯ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫＯＳＲ、ｇｌｕｔａｍａｘ、ＮＥＡＡ、ｂｅｔａ  ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを処理してｐｒｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ状態のｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌを製作した後、ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍおよび１％ＰＤＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを処理してｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌに分化させた。羊水細胞の獲得および当該細胞を用いたＢＢＢシステムの確立は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌで行われた。抵抗値およびｓｕｃｒｏｓｅ通過値でシステムのｉｎｔｅｇｒｉｔｙを確認した後、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がパーキンソン病治療抗体とｓｃＦｖ形態に結合された二重特異抗体形態で通過能を分析した。テスト抗体は、１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ形態、１５６４クローンのｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態、Ｆ０６クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ形態、Ｃ０４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ形態であった。パーキンソン病治療抗体である１１Ｆ１１は、陰性対照群として使用された。ＢＢＢシステムを通過した抗体は、実施例２０−１と同様な方法で分析した。
【０３３３】
分析結果は、図１６ｃに示した。テストクローンは陰性対照群に比べて全て高いＢＢＢ通過能を示し、特に、Ｆ０６  ｂｉｖａｌｅｎｔおよびＣ０４  ｂｉｖａｌｅｎｔは単独抗体に比べて最大１５倍の高いＢＢＢ通過能を示した。当該結果は、本願の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がヒト由来ＢＢＢシステムを単独抗体に比べて効率的に通過するのを示す。
【０３３４】
実施例２１．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能分析（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
２１−１．ｍｉｎｉｂｏｄｙのｂｒａｉｎ  ｖｅｓｓｅｌとのｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
本発明の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでｂｒａｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅに沿って分布するかどうかを確認するために次のような実験を行った。
【０３３５】
具体的に、６−８週齢ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ雄の尾静脈にＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒあるいは１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ ｃｏｎｔｒｏｌおよび実施例１４−１で製造した９９６、１２２６および１５６４クローンのｍｉｎｉｂｏｄｙ抗体をそれぞれ単回投与した。４時間後、ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎを十分な量の０．９％  ＮａＣｌ溶液および４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅでｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｌｌｙｐｅｒｆｕｓｅした。固定されたｂｒａｉｎは摘出して２０μｍにｓｅｃｔｉｏｎ後、脳血管とＩＧＦ１Ｒテストのｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを確認するために血管マーカであるａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ３１およびａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙでｃｏ−ｓｔａｉｎｉｎｇした。ＣＤ３１はＡｌｅｘａ４８８がｃｏｎｊｕｇａｔｅされたｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙで、ｈｕｍａｎ  ＦｃはＡｌｅｘａ  ５９４がｃｏｎｊｕｇａｔｅされたｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを用いて、蛍光顕微鏡下でイメージングした。
【０３３６】
前記実験結果は、図１７ａに示した。
前記実験結果から、本発明によるリガンド結合非阻害クローン（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は優れたＢＢＢ通過能を有するのを確認し、抗体が脳血管とｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎする程度を免疫染色で分析する方法（Ｎｅｕｒｏｎ（２０１６）Ｙｕ−Ｚｕｃｈｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）によって、脳組織を血管マーカ（ａｎｔｉ−ＣＤ３１、緑色）とヒト抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ、赤色）で染色した結果、本願の一例によるリガンド結合非阻害クローンはＩｇＧ対照群に比べて高いｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ程度を示した。
【０３３７】
２１−２．二重特異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能分析
本願抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能をｎｏｒｍａｌ  ｒａｔで確認しようとした。ＳＤ  ｒａｔに１０ｍｇ／ｋｇあるいは３０ｍｇ／ｋｇのパーキンソン病治療単独抗体（１１Ｆ１１）あるいは１５６４クローンがｂｉｖａｌｅｎｔ形態に結合された二重特異抗体（１１Ｆ１１−１５６４）を尾静脈に単回投与後、２４時間目にそのＣＳＦおよびｂｒａｉｎでの抗体量を質量分析で分析した。質量分析方法は実施例２０−１での方法と同一であった。
【０３３８】
１５６４クローンが結合された二重特異抗体は、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合していない治療抗体に比べて高いＣＳＦ、ｂｒａｉｎ通過能を示し、当該効能を１０、３０ｍｇ／ｋｇ  ｄｏｓｅ全てで確認された。二重特異抗体は、３０ｍｇ／ｋｇ  ｄｏｓｅで単独抗体に比べて最大約４．５倍以上のｂｒａｉｎへの通過能を示した。
【０３３９】
１５６４クローンを実施例１４−２および１４−４によってｂｉｖａｌｅｎｔおよびｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態に製作した後、前記と同様な方式で３０ｍｇ／ｋｇあるいは６０ｍｇ／ｋｇで投与後、２４時間目にＣＳＦとｂｒａｉｎでの抗体量を分析した。１５６４クローンが結合された２つ形態の二重特異抗体は、単独抗体に比べて高いＣＳＦ、ｂｒａｉｎ通過能を示した。特に、ｂｉｖａｌｅｎｔ形態はｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態に比べて高いＢＢＢ通過能を示し、これは最大約５倍のｂｒａｉｎ通過能増大であった。
【０３４０】
図１７ｂの結果は、１５６４クローンが多様な形態に治療抗体に結合された時にも当該治療抗体の体内ＢＢＢ通過能を向上させるのを示す。
【０３４１】
実施例２によって製作された１５６４クローンのａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔは、ｐａｒｅｎｔａｌクローンに比べてｓｅｒｕｍ  ＰＫの増大が予想された。したがって、ｓｅｒｕｍ内に長期間残存し、継続してＢＢＢ流入量を維持することによって、そのＢＢＢ通過能が向上されることと期待された。実施例１４−２によってｂｉｖａｌｅｎｔ形態あるいは４−４によってｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態に製作されたａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔをＳＤ  ｒａｔに３０ｍｇ／ｋｇで尾静脈投与した後、０、２４、４８時間目に血液を眼窩静脈叢から採取した。テスト抗体は治療抗体のｂａｃｋｂｏｎｅによって２つ実験に分けられ、実験に使用された当該ｖａｒｉａｎｔの二重特異抗体は下記表２６の通りである。
【０３４２】
［表２６］ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ通過能分析に使用された二重特異抗体
2021506770.tif 000266
【０３４３】
血液内抗体量は、ＥＬＩＳＡで分析した。９６ウェルプレートにｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体をコーティングした後、適当量希釈された試料を処理後、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗体でｄｅｔｅｃｔｉｏｎした。
【０３４４】
分析結果は、図１７ｄに示した。
その結果、１次試験群では、１５６４のｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ、Ｆ０６のｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ、Ｃ０４のｍｏｎｏｖａｌｅｎｔがｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔに比べて長くなったｓｅｒｕｍ  ＰＫを示した。２次試験群では、ＶＨ３５  ｂｉｖａｌｅｎｔ群を除いてＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２のｂｉｖａｌｅｎｔ形態がｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて増大されたｓｅｒｕｍ  ＰＫを示した。
【０３４５】
当該グループのＢＢＢ通過能を分析するために、４８時間目に当該ラットからＣＳＦを抽出して同一なＥＬＩＳＡで分析した。分析結果は、図１７ｅに示した。
【０３４６】
１次試験群では増大されたｓｅｒｕｍ  ＰＫを示した１５６４  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ、Ｆ０６  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ、Ｃ０４  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態がｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて増大されたＣＳＦ抗体量を示した。２次試験群でもまた増大されたｓｅｒｕｍ  ＰＫを示したＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２のｂｉｖａｌｅｎｔがｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて増大されたＣＳＦ抗体量を示した。ＶＨ３５は、ｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて短くなったｓｅｒｕｍ  ＰＫおよびＣＳＦ抗体量を示した。
【０３４７】
図１７ｄおよび図１７ｅの結果は、ｓｅｒｕｍでのＰＫが持続的な抗体のＢＢＢ流入によって抗体のＢＢＢ通過能において重要な要素であり、ＢＢＢシャトルを有しｓｅｒｕｍ  ＰＫが増大された二重特異抗体のＢＢＢ通過能が増加するのを示す。特に、ＣＳＦ抗体量が最も高いＦ０６  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態の場合、ｐａｒｅｎｔａｌ  １５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔに比べて約５倍程度高いＣＳＦ通過能を示した。実施例１８−２および１８−３で１５６４  ｂｉｖａｌｅｎｔ抗体がＣＳＦで単独抗体に比べて約３倍増加されたＣＳＦ通過能を示すので、Ｆ０６  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ形態は単独抗体に比べて最大約１５倍増加されたＢＢＢ通過能を示すことが予想される。
【０３４８】
実施例２２．ＩＧＦ１Ｒ抗体の脱アミド化
脱アミド化反応は例えば、アスパラギンの側鎖ペプチド結合を攻撃して対称構造のスクシンイミド中間産物を作ることを意味し、この中間産物は加水分解によってアスパラギン酸あるいはイソアスパラギン酸のうちの一つに変わるようになる。このような脱アミン化反応はタンパク質の持続的な活性に影響を与えることがあるため、軽鎖および重鎖アミノ酸を他のアミノ酸で置換して脱アミン化を防止すると同時に、長期間の安定性を確保しようとした。
【０３４９】
Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏによって確認した脱アミン化部位を確認するために、４０℃で１５６４  ＩＧＦ１Ｒ抗体を放置した後、Ｍａｓｓ分析によって脱アミン化程度を確認した結果、図１８ａのように、軽鎖ＣＤＲ２とＣＤＲ３、そして重鎖ＣＤＲ２部位で４．６〜４７．３％の脱アミン化反応が起こるのを確認した。脱アミン化を防止するために、図１８ｂのように、各部位別にアミノ酸を置換し、各アミノ酸置換によるＩＧＦ１Ｒタンパク質との結合力変化を確認した。ＷＴ  １５６４と同一の結合力を示す突然変異体を選別し、３個または４個の突然変異を適用した突然変異体がＩＧＦ１Ｒ結合力においてＷＴ  １５６４と同一であるのを確認した。このような突然変異体の導入は、製形バッファー保存条件で結合力を維持し、長期的に安定した形態を維持することができるのを意味することである。分析結果は、表２７に示した。
【０３５０】
［表２７］
2021506770.tif 000267
【０３５１】
実施例２３．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング
２３−１．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体とｂｏｉｌｅｄ、ｎａｔｉｖｅ  ＩＧＦ１Ｒタンパク質のＥＬＩＳＡ
抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が線状あるいはｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅを認識するか確認しようとした。１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１のｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体とｎａｔｉｖｅ  ヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤタンパク質あるいは当該タンパク質に熱を加えたタンパク質（ｂｏｉｌｅｄ  ＩＧＦ１Ｒ）に対するＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡ方法は、実施例１５に示された方法と同一であった。分析結果は表２８に示した。
【０３５２】
［表２８］
2021506770.tif 000268
＊Ｎ／Ａ：Ｎｏｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ
【０３５３】
前記クローンはｎａｔｉｖｅ  ヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤに実施例１５での結果と類似した結合力を示した反面、熱を加えて３次構造を破壊したｂｏｉｌｅｄ  ヒトＩＧＦ１Ｒ  ＥＣＤには全て結合しなかった。これは、本願の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体が線状でないｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅに結合するのを意味する。
【０３５４】
２３−２．抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング
１５６４クローンのＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅを分析するために、次のようにａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇを行った。ＩＧＦ１Ｒ発現度が低いと確認された卵巣ガン細胞株であるＯＶＣＡＲ３細胞にＮ−末端にはｅＧＦＰ  ｔａｇが融合されＣ−末端ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎは除去されたＩＧＦ１Ｒライブラリーを発現させた。ＩＧＦ１Ｒライブラリーは、ＩＧＦ１Ｒ表面の残基がａｌａｎｉｎｅで置換された突然変異を含む。準備されたライブラリーをＯＶＣＡＲ３細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。ＩＧＦ１Ｒの発現が確認された細胞に対して１５６４抗体を処理し、その後、ＤｙＬｉｇｈｔ６５０が標識された二次抗体を処理して蛍光標識した。標識された細胞をＩＧＦ１Ｒ発現有無とＩＧＦ１Ｒの発現と１５６４結合有無によって分類した後、これらに対してイルミナＨｉＳｅｑ技法でＲＮＡ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行って、当該細胞群での各ａｌａｎｉｎｅ突然変異の頻度を分析した。当該頻度数はｗｉｌｄｅ  ｔｙｐｅ  ＩＧＦ１Ｒを発現した細胞に対する結果として正規化した後、相対頻度を計算して、１５６４が標識された細胞群でその数字が減少した突然変異を選別した。このような観察に基づいて、１５６４のエピトープはＦＮ２ドメインに位置することが分かり、これに属する残基はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８であることが分かった。当該結果および１５６４クローンが認識するシークエンスは、図１９に示した。この残基は先行文献によればＩＧＦ１の結合に関与しないので、当該結果は実施例２３−１で１５６４が示す性質を忠実に説明している。
【０３５５】
実施例２４．単独抗体および二重抗体の抗原結合力比較など
２４−１：ａ−ｓｙｎ抗原に対する単独抗体および二重抗体の結合力
ＩＧＦ１Ｒ抗体がｓｃＦｖ形態でＩｇＧ形態のａ−ｓｙｎ抗体と連結させた時、ａ−ｓｙｎ抗体の結合力に対する影響を分析した。
【０３５６】
１ｕｇ／ｍｌ濃度で９６ウェルプレートに１８時間ａ−ｓｙｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅをｃｏａｔｉｎｇし、洗浄後、各抗体は４００ｎＭから５倍ずつ希釈して結合させた。結合された抗体は抗−ヒトＦｃ−ＨＲＰを結合させた後、ＴＭＢ溶液を添加して発色させて抗体の結合程度を確認した。
【０３５７】
図２０ａの結果のように、ａ−ｓｙｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅに対する結合力は、単独抗体や二重抗体で同一であるのを確認した。
【０３５８】
２４−２：ＩＧＦ１Ｒ抗原に対する単独抗体および二重抗体の結合力
ＩＧＦ１Ｒ抗原に対するａ−ｓｙｎ単独抗体と二重抗体の結合程度を比較するために実施例２２と同様な方法で実験を行った。
【０３５９】
図２０ｂの結果のように、ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖ抗体を有している二重抗体は濃度依存的によく結合したが、ＩＧＦ１Ｒ抗体部位がない単独抗体は結合しないのを確認した。
【０３６０】
２４−３：ａ−ｓｙｎヒト化抗体の結合力分析
実施例２４−１と同様な方法で実験を行って、キメラ二重抗体とヒト化二重抗体間の結合力差を分析した。
【０３６１】
図２０ｃの結果のように、ヒト化二重抗体はキメラ二重抗体と類似した水準でａ−ｓｙｎ凝集体との結合力を保有しており、ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖが一つであるｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重抗体もキメラ抗体と類似した結合力を示すのを確認した。
【０３６２】
実施例２４−２と同様な方法で実験を行って、キメラ二重抗体とヒト化二重抗体間のＩＧＦ１Ｒ結合力を分析した結果、図２０ｄのように、全ての二重抗体が同一な結合力を示し、ＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖがない単独抗体は結合しないのを確認した。
【０３６３】
このような結果は、人体内で免疫原として作用できるマウス抗体部位を交替するためにヒト化した時、ａ−ｓｙｎ凝集体およびＩＧＦ１Ｒに対する結合力に変化がなかったのを示唆するものであって、同一な活性を保有しているのを意味するものである。
【０３６４】
２４−４：単独抗体と二重抗体の食細胞作用比較
食細胞作用は、大食細胞の多様な受容体が関与して細胞外不必要な物質を除去する作用を意味する。多様なタンパク質凝集体は免疫反応や炎症反応を誘導して人体に悪影響を与えるようになり、特に、ａ−ｓｙｎ凝集体の除去のために抗体を投与した時、抗体のＦｃ部位と細胞表面のＦｃｒＲとの相互作用によって促進されると知られている。このような理由で、単独抗体とＩＧＦ１Ｒ  ｓｃＦｖが連結された二重抗体の食細胞作用に対する活性を比較した。
【０３６５】
単独抗体と二重抗体の食細胞作用を比較するために、マウスに由来したＢＶ−２小膠細胞を用いた。ＢＶ−２細胞はＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、２×１０Ｅ６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで準備してＵ−ｂｏｔｔｏｍ  ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００ｕＬずつ分注した。１０ｕｇ／ｍｌのａ−ｓｙｎ凝集体と２５ｕｇ／ｍｌ抗体はＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して混合した後、常温で２０分間放置した。ａ−ｓｙｎ凝集体と抗体混合物をＢＶ−２細胞に処理した後、１５分間放置した。１２００ｒｐｍで遠心分離して上層液のａ−ｓｙｎ凝集体を除去し、細胞表面に結合された凝集体または抗体を除去するために、ＰＢＳ、ｐＨ２．５バッファーで３回洗浄した。細胞は４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定させた後、ＰＢＳバッファーで洗浄した。細胞内にｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓされた凝集体と抗体を確認するために、０．５％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して細胞膜を緩くし、ＰＢＳバッファーで洗浄後、ｐａｎ−ａ−ｓｙｎ抗体を１時間処理した。結合されたｐａｎ−ａ−ｓｙｎ抗体はａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ａｌｅｘａ−４８８抗体を１時間処理した後、ＦＡＣＳ分析によって大食作用によって細胞内に入った凝集体を確認した。
【０３６６】
図２０ｅの結果のように、ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧは大食作用に影響を与えなく、ａ−ｓｙｎ抗体を処理した時、ａ−ｓｙｎ凝集体の大食作用が増加するのを確認することができた。単独抗体と二重抗体を比較した時、類似の水準に大食作用が起こるのを確認して、ＩｇＧ  Ｃ−末端部位に結合されたｓｃＦｖ形態のＩＧＦ１Ｒ抗体がａ−ｓｙｎ抗体の作用に影響を与えないのを確認した。
【０３６７】
実施例２５．二重特異抗体の効能評価
実施例１４−６によってキメラ１１Ｆ１１抗体と１５６４クローンｓｃＦｖのｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体を製作し、ヒトアルファ−シヌクレインを過発現する形質転換マウス（ｍＴｈｙ−１  ｈｕｍａｎ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＵＣ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）で二重特異抗体とアルファ−シヌクレイン抗体のインビボで効果を比較、分析した。２．５ｍｇ／ｋｇの単独抗体またはヒトＩｇＧまたは同一モル数のｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体を３ヶ月間毎週腹腔投与した。グループ当り５匹のマウスを使用し、非形質転換マウス（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）を対照群として使用した。その次に、灌流を次のように行った。
【０３６８】
最後の投与が完了した後、脳内の病理分析のために、人道的規定によって当該動物はｃｈｌｏｒａｌ  ｈｙｄｒａｔｅで麻酔がかかった後、０．９％の生理食塩水で心臓灌流された。その次に、灌流された脳の半分（ｓａｇｇｉｔａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）はリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４、４℃）に分析時点まで保管し、他の半分は直ちに冷凍状態で保管した（−７０℃）。
【０３６９】
病理学的分析は、次のように行われた。パラホルムアルデヒドに固定された脳半分は、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを用いてｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ方式で４０μｍ厚さの連続切片に切り出した。各投与群の脳内アルファ−シヌクレインの発現程度を確認するために、ｃｏｒｔｅｘ、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ、ｓｔｒｉａｔｕｍを含む切片をアルファ−シヌクレイン抗体（凝集体のマーカであるｐ１２９  α−ｓｙｎ抗体、ａｂｃａｍ、ａｂ５９２６４または総アルファ−シヌクレイン抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２６４２）と４℃で一晩培養した。または、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の活性程度を分析するために、前記切片をＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＢ５８０４、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あるいは脳炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）程度を確認するために、ＩＬ−１βに対する抗体（ａｂ９７２２、ａｂｃａｍ）をそれぞれ処理した。または、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓの神経細胞死滅程度を分析するために、ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、＃ＭＡＢ３７７）に対する抗体を処理した。１次抗体との培養後に、ビオチンが結合されたｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＡｖｉｄｉｎ  Ｄ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（１：２００、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を処理し、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で検出した。免疫染色された各切片は、明視野顕微鏡で観察して光学密度を測定した。結果は、図２１ａ〜図２１ｅに開示されている。
【０３７０】
２５−１．キメラ抗体と二重特異抗体のアルファ−シヌクレイン減少能分析
図２１ａは、キメラ１１Ｆ１１抗体および当該キメラ抗体と１５６４クローンのｂｉｖａｌｅｎｔ二重特異抗体がヒトα−Ｓｙｎを過発現するマウス動物モデル（ＴＧ）でアルファ−シヌクレイン凝集体を除去することができるかを、マウスに抗体投与後、ｐ−１２９  α−Ｓｙｎ抗体を用いてマウス脳組織中のｃｏｒｔｅｘ、ｈｉｐｐｏｍｃａｐｕｓを染色して測定した結果である。ｐ−１２９  α−ｓｙｎは１２９番目残基がリン酸化された形態の凝集体のマーカであって、染色された組織で濃い茶色点あるいは凝集体形態に示される。
【０３７１】
図２１ａによれば、ＩｇＧ処理群はｎｏｎ−ｔｇ対照群に比べて高いｐ−１２９の染色程度を示した（＃：ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。これとは反対に、単独抗体あるいは二重特異抗体を処理したグループでは、ｐ−１２９  α−ｓｙｎあるいは凝集体の染色程度が顕著に減少した。特に、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでは二重特異抗体処理群の減少程度がキメラ１１Ｆ１１抗体に比べて優れていた（＊：ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。図２１ｂは図２１ａと同一な実験であるが、マーカとして、総アルファ−シヌクレイン抗体で染色した結果である。総アルファ−シヌクレイン検出は、本願による抗体がアルファ−シヌクレイン自体の除去能（ｃｌｅａｒｉｎｇ）および抗体の細胞間伝達（ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）抑制能があるのを示すことである。また、他の側面から、単量体の凝集体への形成の抑制、または単量体を全て除去することができると解釈できる。ＴＧ  ｍｏｕｓｅで増加したヒトアルファ−シヌクレインは単独抗体および二重特異抗体投与によってＩｇＧ投与群に比べて減少し、特に、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでは二重特異抗体の単独抗体に比べて効能がさらに優れた。
【０３７２】
当該結果は、キメラ１１Ｆ１１抗体および二重特異抗体が２．５ｍｇ／ｋｇの低い容量でもパーキンソン疾患動物モデルで効果的にアルファ−シヌクレインおよびその凝集体レベルを減少させるのを示す。特に、二重特異抗体が単独抗体に比べて効能が優れており、これは二重特異抗体が向上したＢＢＢ通過能を基にして単独抗体に比べて脳にさらに多く到達して疾患を効果的に治療することができるのを示唆する。
【０３７３】
２５−２．キメラ抗体と二重特異抗体のａｓｔｒｏｇｌｏｓｉｓおよびｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅレベル減少能分析
グリオーシス（ｇｌｉｏｓｉｓ）は、ＢＢＢの損傷、ＴＧＦ−ベータまたはインターロイキンのような物質によって触発される、中枢神経系に損傷がある場合、これに対する反応として膠細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）で起こる非特異的反応である。代表的なものとして、Ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを含み、ＧＦＡＰタンパク質がマーカーとして使用される。よって、キメラ１１Ｆ１１抗体およびキメラ抗体と１５６４クローンの二重特異抗体をマウスに投与してＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ減少およびこれを触発する炎症性サイトカイン放出減少に及ぼす影響を分析した。分析結果は、図２１ｃおよび２１ｄに開示されている。
【０３７４】
図２１ｃは本発明の一例で製造されたキメラ１１Ｆ１１抗体あるいは当該抗体と１５６４クローンの二重特異抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカとしてＧＦＡＰ（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。単独抗体および二重特異抗体はＩｇＧ対照群に比べてａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを抑制し、特に、ｓｔｒｉａｔｕｍでは二重特異抗体の効能が単独抗体に比べて優れるのを確認することができた。
【０３７５】
図２１ｄは、本発明の一例で製造されたキメラ１１Ｆ１１抗体あるいは当該抗体と１５６４クローンの二重特異抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで炎症性サイトカインを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカとしてＩＬ−１ベータ抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。ＩＬ−１ベータは炎症を誘発して多様な神経細胞の死滅および炎症反応を誘導するようになる。本願による抗体を投与したマウスのｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでＩｇＧ対照群に比べて単独抗体および二重特異抗体投与群でＩＬ−１ベータが減少し、特に、二重特異抗体の減少能が単独抗体に比べて有意に優れた（＃＃：Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００５；＊：ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。
【０３７６】
前記図面に示されているように、本願による抗体は対照群と比較して、Ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させ、これを触発する炎症性サイトカインＩＬ−１ｂｅｔａの放出を減少させることが明らかになった。
【０３７７】
２５−３．キメラ抗体と二重特異抗体のｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ減少能分析
アルファシヌクレインの神経毒性および炎症反応によって脳細胞の死滅が発生するのを先行文献で確認されてきた。本願の単独抗体および二重特異抗体がアルファ−シヌクレインによるｉｎ  ｖｉｖｏでの脳細胞死滅を抑制できるか分析した。
【０３７８】
ｃｏｒｔｅｘおよびｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでニューロンのマーカであるＮｅｕＮで染色した結果、単独抗体および二重特異抗体全てＩｇＧ対照群に比べて脳細胞死滅程度が減少することが明らかになった。特に、ｃｏｒｔｅｘでは二重特異抗体の脳細胞死滅抑制能が単独抗体に比べて優れたことが確認された。当該結果は、図２１ｅに示した。
【０３７９】
実施例２６．Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇによる半減期増大およびこれによるＢＢＢ通過能向上
ＦｃＲｎは、血管内で抗体が循環する時、溶解されないように細胞内に抗体を引き込んで循環させることによって半減期を増加させる細胞膜の重要な受容体である。ＢＢＢ通過能はトランスサイトーシス抗体の活性も重要であるが、血管内での濃度に依存してＢＢＢを通過するということはよく知られた事実である。このような理由で、二重抗体の半減期を増加させるためにＦｃ部位の４２８番目アミノ酸をメチオニン（Ｍｅｔ）をロイシン（Ｌｅｕ）に変化させてＦｃＲｎとの結合力を増大させた二重抗体を製作した。Ｈｕｍａｎ  ＦｃＲｎを発現するｔｇ  ｍｏｕｓｅに１０ｍｇ／ｋｇ濃度でＷＴ二重抗体とＭ４２８Ｌ二重抗体を投与して比較した結果、図２２のように、約５０％程度の半減期増大効果を確認した。半減期増加を再確認するために、サルにＷＴ二重抗体、Ｂｉｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体を投与してＰＫ  ｐｒｏｆｉｌｅを分析した。図２２ａのように、ＷＴ二重抗体の場合、１６８時間以後から急激に血液内濃度が低まる反面、ＦｃＲｎとの結合力が高いＭ４２８Ｌ二重抗体はＷＴに比べて向上した血液内濃度を維持した。半減期は、ＷＴ二重抗体に比べてＭ４２８Ｌ二重抗体で１．５日程度増加する結果を確認した。特に、ｃｌｅａｒａｎｃｅ側面からは、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体が最も優れており、ＷＴ二重抗体が最も速いｃｌｅａｒａｎｃｅを示した（図２２ｂ）。
【０３８０】
半減期増加効果によるＢＢＢ通過向上を検証するために、抗体投与２４時間後にＣＳＦを抽出して、ＣＳＦ内の抗体量を分析した。１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１Ｒを１８時間冷蔵状態でｃｏａｔｉｎｇした後、ＣＳＦを添加してＩＧＦ１Ｒと結合した抗体をｄｅｔｅｃｔｉｏｎした。図２２ｃで確認されるように、血液内抗体量が多かったＭ４２８Ｌ二重抗体のＢＢＢ通過量が多いのを確認し、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体は優れたＢＢＢ通過能と結合されてｂｉｖａｌｅｎｔ  Ｍ４２８Ｌ二重抗体より向上した通過能を示した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片；および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を含む、抗ａ−Ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒの二重特異抗体であって、
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号１〜配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１０〜配列番号４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５０〜配列番号８０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号９６〜配列番号１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１４〜配列番号１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１３３〜配列番号１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含むものである、二重特異抗体。
【請求項２】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、ヒト、サル、ラット、およびマウスアルファ−シヌクレインタンパク質のＣ−末端領域に特異的に結合するものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項３】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５５９のアミノ酸配列で、Ｎ−末端から１１０番残基〜１２０番残基を含む連続する少なくとも１１個のアミノ酸を含むペプチド、または１１１番残基〜１２２番残基を含む連続する少なくとも１２個のアミノ酸を含むペプチドに特異的に結合するものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項４】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号４３４および配列番号４３９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４３５〜４３７および配列番号４４０〜４４１のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、配列番号４３８および配列番号４４２のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）、配列番号４４３および配列番号４４６のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４４４および配列番号４４７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および
配列番号４４５および配列番号４４８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含むものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項５】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号４３４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４３５〜４３７のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号４３８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および
配列番号４４３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項６】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号４３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４４０〜４４１のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および
配列番号４４６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４４７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号４４８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項７】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の重鎖可変領域は、
配列番号４４９〜４５０および配列番号４６８〜４７３のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号４５１〜４５２および配列番号４７４〜４７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号４５３〜４６４および配列番号４７８〜４８３のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号４６５〜４６７および配列番号４８４〜４８５のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項８】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号４８６〜４９１および配列番号５０４〜５１０のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号４９２〜４９４および配列番号５１１〜５１４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号４９５〜５００および配列番号５１５〜５２１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号５０１〜５０３および配列番号５２２のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の重鎖可変領域は、
配列番号５２３〜５４１から選択されるアミノ酸配列；
配列番号５２３〜５４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する配列；または
配列番号５２３〜５４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１２】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号５４２〜５５６から選択されるアミノ酸配列；
配列番号５４２〜５５６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上；または
配列番号５４２〜５５６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１３】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５２３〜５３４のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号５４２〜５４８のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１４】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５３５〜５４１のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号５４９〜５５６のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１５】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号５６０重鎖可変領域と配列番号５６６の軽鎖可変領域を含み、配列番号５６１の重鎖可変領域と配列番号５６６の軽鎖可変領域を含み、配列番号５６２の重鎖可変領域と配列番号５６６の軽鎖可変領域を含み、配列番号５６３の重鎖可変領域と配列番号５６６の軽鎖可変領域を含み、配列番号５６４の重鎖可変領域と配列番号５６７の軽鎖可変領域を含み、または配列番号５６５の重鎖可変領域と配列番号５６８の軽鎖可変領域を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１０のアミノ酸配列を含むタンパク質でＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、Ｇｌｕ７７９、Ｌ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、Ｌ８１３、Ｖ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０、およびＣ４８８からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸を特異的に認識して結合するものである、請求項１６に記載の二重特異抗体
【請求項１８】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１０のアミノ酸配列を含むタンパク質で結合部位１〜結合部位３からなる群より選択された少なくとも一つ以上の結合部位に結合するものであり、前記結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、およびＧｌｕ７７９からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、およびＬ８１３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０、およびＣ４８８からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含むものである、請求項１７に記載の二重特異抗体。
【請求項１９】
前記重鎖可変領域は、
配列番号８１〜８４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号８５〜８６のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号８７〜９１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号９２〜９５のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものである、請求項１７に記載の二重特異抗体。
【請求項２０】
前記軽鎖可変領域は、
配列番号１６２〜１６４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号１６５のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号１６６〜１６８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号１６９〜１７１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものである、請求項１７に記載の二重特異抗体。
【請求項２１】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１６に記載の二重特異抗体。
【請求項２２】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体は完全な抗体であり、抗ＩＧＦＲ抗体は抗体のＦｖ−断片である、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項２３】
前記抗ａ−Ｓｙｎ抗体は、完全な抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４形態である、請求項１に記載の二重特異抗体
【請求項２４】
抗ＩＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
【請求項２５】
請求項１〜２４のうちのいずれか一項による二重特異抗体を含む、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの予防または治療用薬学組成物。
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
（削除）
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、ヒト、サル、ラット、およびマウスを含む哺乳動物のＩＧＦ１Ｒタンパク質に特異的に結合する抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片であって、
前記抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号１〜配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１０〜配列番号４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５０〜配列番号８０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号９６〜配列番号１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１４〜配列番号１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号１３３〜配列番号１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含むものである、 抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３１】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
配列番号８１〜８４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ−ＦＲ１）、
配列番号８５〜８６のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ１とＨ−ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ２）、
配列番号８７〜９１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ３）、および
配列番号９２〜９５のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ−ＦＲ４）を含むものである、請求項２６に記載の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、
配列番号１６２〜１６４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ−ＦＲ１）、
配列番号１６５のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、
配列番号１６６〜１６８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ−ＣＤＲ２とＬ−ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および
配列番号１６９〜１７１のアミノ酸配列のうちの一つを含むＬ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）を含むものである、請求項２６に記載の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月17日(2020.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号１〜９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ-ＣＤＲ１）、配列番号１０〜４９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ-ＣＤＲ２）、および配列番号５０〜８０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ-ＣＤＲ３）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号９６〜１１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ-ＣＤＲ１）、配列番号１１４〜１３２のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ-ＣＤＲ２）、および配列番号１３３〜１６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ-ＣＤＲ３）を含むものである、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗ａ-Ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、ヒト、サル、ラット、およびマウスアルファ−シヌクレインタンパク質のＣ-末端領域に特異的に結合するものである、請求項１に記載の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
配列番号８１〜８４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ-ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ-ＦＲ１）、
配列番号８５〜８６のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ-ＣＤＲ１とＨ-ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ-ＦＲ２）、
配列番号８７〜９１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ-ＣＤＲ２とＨ-ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ-ＦＲ３）および
配列番号９２〜９５のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ-ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ-ＦＲ４）を含むものである、請求項１に記載の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、
配列番号１６２〜１６４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ-ＣＤＲ１のＮ−末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ-ＦＲ１）、
配列番号１６５のアミノ酸配列を含む、Ｌ-ＣＤＲ１とＬ-ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ-ＦＲ２）、
配列番号１６６〜１６８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ-ＣＤＲ２とＬ-ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ-ＦＲ３）および
配列番号１６９〜１７１のアミノ酸配列のうちの一つを含むＬ−ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ-ＦＲ４）を含むものである、請求項１に記載の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１０のアミノ酸配列を含むタンパク質でＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、Ｇｌｕ７７９、Ｌ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、Ｌ８１３、Ｖ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸を特異的に認識して結合するものである、請求項１に記載のＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１０のアミノ酸配列を含むタンパク質で結合部位１〜結合部位３からなる群より選択された少なくと一つ以上の結合部位に結合するものであり、前記結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８およびＧｌｕ７７９からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９およびＬ８１３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含むものである、請求項５に記載の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ-Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を含む生理活性物質の血液脳関門伝達体。
【請求項９】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片に、生理活性物質、および生理活性物質をカップリングさせるリンカーを含む、請求項８に記載の血液脳関門伝達体。
【請求項１０】
前記生理活性物質は脳で作用する化合物、タンパク質、抗体、ポリペプチドおよびペプチドからなる群より選択される、請求項９に記載の血液脳関門伝達体。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片、および治療抗体を含む二重特異抗体。
【国際調査報告】
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