(57)【要約】  本発明は、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、がんの治療における、Ｔ細胞二重特異性分子との組み合わせでのその使用、アゴニストＩＣＯＳ結合分子自体、それら分子を含む薬学的組成物、及びそれらを使用する方法に関する。【選択図】図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子とＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体とが、単一の組成物中で一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中で別々に投与される、請求項１に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む少なくとも一つのＩＣＯＳ−Ｌを含む、請求項１又は２に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項４】
配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトＩＣＯＳにアゴニスト結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、請求項１又は２に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項５】
抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項６】
（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、
ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項７】
アゴニストＩＣＯＳ結合分子が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＦＡＰに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項８】
がん胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項９】
（ａ）（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むか、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む
ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、請求項１から４又は８のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１０】
アゴニストＩＣＯＳ結合分子が、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＣＥＡに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインが、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１から４、８又は９のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、請求項１、２又は４から１０のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１２】
配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ））と配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、請求項１、２又は４から１１のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１３】
Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１４】
配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び、配列番号３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むか、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む一つの軽鎖を含む、請求項１、２、４から７又は１１から１３のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１５】
配列番号１５５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項１、２、又は８から１３のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１６】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１７】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１８】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項１９】
疾患、特にがんの、併用治療、連続治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、薬学的に許容される添加物とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と、薬学的に許容される添加物とを含む第２の組成物を含む薬学的製品。
【請求項２０】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群より選択される、アゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２１】
（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、
ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、請求項２０に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２２】
アゴニストＩＣＯＳ結合分子が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＦＡＰに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項２０又は２１に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２３】
（ａ）（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むか、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、
ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、請求項２０に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２４】
アゴニストＩＣＯＳ結合分子が、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＣＥＡに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインが、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項２０又は２３に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２５】
（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、請求項２０又は２１に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２６】
腫瘍関連標的に対する一価の結合と、ＩＣＯＳに対する一価の結合とを含む、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２７】
腫瘍関連標的に対する一価の結合と、ＩＣＯＳに対する二価の結合とを含む、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項２８】
請求項２０から２７のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項２９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
請求項２０から２７のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を製造するための方法であって、（ｉ）ＩＣＯＳ結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）ＩＣＯＳ結合分子を回収する工程を含む方法。
【請求項３２】
請求項２０から２７のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、少なくとも一つの薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物。
【請求項３３】
がんの治療における使用のための、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、又は請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
がん免疫療法における使用のための化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤との組み合わせ投与のためのものである、がんの治療における使用のための、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項３５】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤との組み合わせ投与のためのものである、請求項３４に記載のがんの治療における使用のための腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【請求項３６】
がんの治療のための医薬の製造のための、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子の使用。
【請求項３７】
がんを有する個体において疾患を治療する方法であって、前記個体に対し、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、又は請求項２３に記載の薬学的組成物の、治療的有効量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍標的化アゴニストＩＣＯＳ結合分子、及びがんの治療におけるＴ細胞二重特異性分子と組み合わせた免疫調節物質としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抑制経路の調節は、がん治療における最近の主要な躍進である。細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＹＥＲＶＯＹ／イピリムマブ）及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１、ＯＰＤＩＶＯ／ニボルマブ又はＫＥＹＴＲＵＤＡ／ペンブロリズマブ）、それぞれのＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）を標的とするチェックポイント阻害抗体は、許容可能な毒性を示しており、種々の腫瘍徴候を有する患者における臨床応答、耐久性のある疾患制御、及び生存率の改善を約束するものである。しかしながら、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）療法に対する持続的応答を示す患者は少数に過ぎず、残りの患者は一次又は二次抵抗性を示し、より多くの患者に延命効果を提供するためにさらなる経路を調節する必要があることが明らかである。したがって、治療効果を向上させるために併用戦略が必要である。
【０００３】
ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）は、誘導性Ｔ細胞共刺激分子であり、Ｂ７／ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４免疫グロブリンスーパーファミリーに属する（Hutloff, et al., Nature 1999, 397）。その発現は、主にＴ細胞に限定されているように思われ、ＮＫ細胞上の発現はごく弱い（Ogasawara et al., J Immunol. 2002, 169 and unpublished own data using human NK cells）。恒常的にＴ細胞に発現されるＣＤ２８と異なり、ＩＣＯＳは、ナイーブＴＨ１及びＴＨ２エフェクターＴ細胞集団にほとんど発現されず（Paulos CM et al., Sci Transl Med 2010, 2）、休止ＴＨ１７、Ｔ濾胞性ヘルパー（ＴＦＨ）及び調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞に発現される。しかしながら、ＩＣＯＳは、以前の抗原プライミング、それぞれのＴＣＲ／ＣＤ３係合時に、すべてのＴ細胞サブセットに強力に誘導される（Wakamatsu et al., Proc Natal Acad Sci USA, 2013, 110）。
【０００４】
ＩＣＯＳ経路を通したシグナル伝達は、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及びＴＮＦ−αで処理された非免疫細胞に発現する、そのリガンドであるいわゆるＩＣＯＳ−Ｌ（Ｂ７ｈ、Ｂ７ＲＰ−１、ＣＤ２７５）の結合時に発生する（Simpson et al., Current Opinion in Immunology 2010, 22）。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４のリガンドであるＢ７−１及びＢ７−２のいずれもが、ＩＣＯＳに結合することも、ＩＣＯＳを活性化することもできない。それでも、ＩＣＯＳ−ＬはＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の両方に弱く結合することが示された（Yao et al., Immunity 2011, 34）。活性化すると、ジスルフィド結合したホモダイマーであるＩＣＯＳは、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴ経路にシグナルを誘導する。ＣＤ２８とは対照的に、ＩＣＯＳは、固有のＹＭＦＭ  ＳＨ２結合モチーフを有し、それは、ＣＤ２８によって補充されたアイソフォームと比較して脂質キナーゼ活性が上昇したＰＩ３Ｋ変異体を補充する。結果として、ＡＫＴシグナル伝達にホスファチジルイノシトール（３、４、５）−トリホスフェートの生成増加及び随従性の上昇を観察することができ、このことは、Ｔ細胞生存におけるＩＣＯＳの重要な役割を示唆するものである（Simpson et al., Current Opinion in Immunology 2010, 22）。
【０００５】
Ｓｈａｒｐｅによる概説に見られるように（Immunol Rev., 2009, 229）、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳリガンド経路は、エフェクターＴ細胞の応答、Ｔ依存性Ｂ細胞の応答の刺激、ＩＬ−１０生成Ｔｒｅｇを制御することによるＴ細胞寛容の調節において、必須の役割を有している。さらに、ＩＣＯＳは、胚中心反応及び液性免疫を調節する固有のＴ細胞サブセットであるケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＸＣＲ５）＋濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）の生成に重要である。ＩＣＯＳ欠損マウスにおける最近の研究により、ＩＣＯＳが、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）の生成を調節し、次いでＴヘルパー（Ｔｈ）型１７（ＴＨ１７）細胞及びＴＦＨの拡大を調節することが示された。この文脈において、ＩＣＯＳは、黒色腫、早期卵巣がん他を含む複数のがんの徴候において患者の生存期間の延長と相関することが示された、ＴＨ１様ＴＨ１７表現型に向かってＣＤ４Ｔ細胞を二極化すると記載されている（Rita Young, J Clin Cell Immunol. 2016, 7）。
【０００６】
ＩＣＯＳ欠損マウスは、胚中心形成の不全を示し、減少したＩＬ−１０及びＩＬ−１７の生成を有し、これは、糖尿病（ＴＨ１）、気道炎症（ＴＨ２）及びＥＡＥ神経炎症性モデル（ＴＨ１７）といった様々な疾患モデルの自己免疫表現型の発達不全において明白になる（Warnatz et al, Blood 2006）。これと合致して、突然変異を起こしたＩＣＯＳを有するヒト分類不能型免疫不全症患者は、重度の低ガンマグロブリン血症及び不安定なＢ細胞ホメオスタシスを示す（Sharpe, Immunol Rev., 2009, 229）。重要なのは、ＩＣＯＳ受容体を介した効率的な共刺激シグナル伝達が、同時的なＴＣＲ活性化シグナルを受け取るＴ細胞でのみ起こることである（Wakamatsu et al., Proc Natal Acad Sci USA, 2013, 110）。
【０００７】
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子は、対応するＴ細胞受容体によってＭＨＣＩ−ペプチドが認識される必要性を回避しながらも、細胞表面腫瘍関連抗原に対するポリクローナルＴ細胞応答を可能にするため、魅力的な免疫細胞誘導である（Yuraszeck et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics 2017, 101）。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体であるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、治験用の、がんに対する免疫系を誘導する免疫グロブリン  Ｇ１（ＩｇＧ１）Ｔ細胞二重特異性抗体である。それはＣＲＣ（結腸直腸がん）、ＧＣ（胃がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）及びＢＣ（乳がん）を含む種々のがん細胞により発現される、Ｔ細胞上のヒトＣＤ３εとがん胎児性抗原（ＣＥＡ）とに対する同時結合により、Ｔ細胞を腫瘍細胞に再方向付けするように設計される。Ｔ細胞と腫瘍細胞の架橋は、ＣＤ３／ＴＣＲの下流でのシグナル伝達と、免疫学的シナプスの形成、Ｔ細胞活性化、細胞傷害性顆粒及びその他のサイトカインの分泌を導き、最終的には腫瘍細胞の用量及び時間依存性の溶解をもたらす。さらに、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢがＴ細胞浸潤を増大させ且つ高度に炎症を起こした腫瘍微小環境を生じさせることが提示されており、このため、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、免疫チェックポイント阻害療法（ＩＣＢ）にとって、特に十分な内因性の適応的及び機能的免疫浸潤の不足に起因するＩＣＢに対する一次抵抗性を示す腫瘍にとって、理想的な組み合わせのパートナーである。しかしながら、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の機能障害性のＴ細胞上における、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ及びＯＸ４０といった複数の共刺激受容体の奇異な発現を考慮すると、Ｔ細胞上の単一又は複数の阻害経路を遮断することによる抑制をオフにすることは十分でないと思われる。
【０００８】
ＩＣＯＳに関し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞上のＣＤ２７８との係合が抗腫瘍能を有するという着想を実際にサポートする文献が増加している。ＩＣＯＳ−ＩＣＯＳ−Ｌシグナル伝達の活性化は、複数の同系マウスモデルにおいて共に単剤療法として、並びにＩＣＯＳの下流でのシグナル伝達の活性化が抗ＣＴＬＡ４療法の有効性を有意に上昇させた抗ＣＬＴＡ４治療の状況において、有効な抗腫瘍応答を誘導した（Fu T et al., Cancer Res, 2011, 71 and Allison et al.、国際公開第２０１１／０４１６１３号、２００９）。抗ＣＴＬＡ４抗体を用いて治療した患者から得られるデータも、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞上のＩＣＯＳ発現の持続的なレベルの上昇と、例えば転移性の黒色腫、尿路上皮性の、乳房又は前立腺がんを有する腫瘍患者の全生存の改善との相関を指している（Giacomo et al., Cancer Immunol Immunother. 2013, 62; Carthon et al., Clin Cancer Res. 2010, 16; Vonderheide et al., Clin Cancer Res. 2010, 16; Liakou et al, Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105 and Vonderheide et al., Clin Cancer Res. 2010, 16）。したがって、ＩＣＯＳ陽性Ｔエフェクター細胞は、イピリムマブ応答の陽性予測バイオマーカーとみられる。
【０００９】
抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、即ちＣＥＡ  ＴＣＢを腫瘍標的化アゴニストＩＣＯＳ結合分子と組み合わせたとき、よりよい抗腫瘍効果が達成されることが分かった。ＩＣＯＳが種々の腫瘍徴候において既にベースラインで発現されていることと（Allison et al., 2009、国際公開第２０１１／０４１６１３号）ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴを介したＩＣＯＳの下流でのシグナル伝達の活性化が完全な活性のために同時的なＣＤ３トリガーに依存していることとを考慮すると、ＴＣＢ分子と腫瘍標的化ＩＣＯＳ分子との組み合わせは相乗的に働き、強力で持続する抗腫瘍応答を誘導する。Ｔ細胞二重特異性抗体は、Ｔ細胞に最初のＴＣＲ活性化シグナル伝達を与え、次いで腫瘍標的化アゴニストＩＣＯＳ結合分子との組み合わせは、抗腫瘍Ｔ細胞免疫をさらにブーストする。したがって、本発明者らは、ここに、がんの治療のための、特にＣＥＡを発現する腫瘍（ＣＥＡ陽性がん）に対する新規の併用療法を記載する。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、及び抗ＣＤ３二重特異性抗体の組み合わせでのその使用、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法におけるその使用に関する。ここに記載される併用療法が、早期Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖の誘導、Ｔメモリー細胞の誘導、及びその結果としての、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍細胞の排除において、抗ＣＤ３二重特異性抗体のみを用いた治療と比較してより効果的であることが分かった。特に、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【００１１】
一態様において、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される。一態様において、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
【００１２】
一態様において、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、ｉ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む少なくとも一つのＩＣＯＳ−Ｌ；又はｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトＩＣＯＳにアゴニスト結合することのできる一つの抗原結合ドメインとを含み、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される。一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子と同じ腫瘍関連抗原に結合する。別の態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子とは異なる腫瘍関連抗原に結合する。一態様において、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。さらなる態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子とＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、単一の組成物中で一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中で別々に投与される。一態様においては、それらは二つの異なる組成物中で別々に投与される。特定の一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と相乗的に作用する。
【００１３】
一態様において、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は少なくとも一つのＩＣＯＳ−Ｌ又はその断片を含む。一態様において、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、二つのＩＣＯＳ−Ｌ又はその断片を含む。特定の一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む少なくとも一つのＩＣＯＳ−Ｌを含む。
【００１４】
さらなる態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩＣＯＳにアゴニスト結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。特に、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトＩＣＯＳにアゴニスト結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、抗繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子である。一態様において、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。特定の一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１６】
一態様において、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＦＡＰに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む。特に、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子である。一態様において、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ａ）（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。特定の一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１８】
一態様において、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＣＥＡに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインは、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む。特に、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。別の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１９】
別の態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。特定の一態様では、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００２０】
さらなる態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。特定の一態様では、ＩｇＧ  ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。また別の特定の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００２１】
一態様において、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。別の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む一つの軽鎖を含む。別の態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連標的に対する一価の結合、及びＩＣＯＳに対する二価の結合を含む。一態様において、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。さらなる態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。別の態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連標的に対する一価の結合、及びＩＣＯＳに対する二価の結合を含む。一態様において、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む。別の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１３１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。特に、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）と、（ｉｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）とを含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
【００２４】
さらなる態様では、上記に定義されたＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、第２の抗原結合ドメインを含む。一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメイン、又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体であり、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体はＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、第３の抗原結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む。さらに詳細には、第３の抗原結合ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００２６】
さらなる態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここで腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。特定の一態様では、ＩｇＧ  ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。また別の特定の態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００２７】
特定の一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ａ）配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む。さらに詳細には、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせで、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤との組み合わせで使用される。一態様において、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブである。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、疾患、特にがんの、併用治療、連続治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、薬学的に許容される添加物とを含む第１の組成物；並びに（Ｂ）腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される添加物とを含む第２の組成物を含む薬学的製品を提供する。特に、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、上記に定義された分子である。別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、上記に定義された抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
【００３０】
また別の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物に関する。特定の一態様では、がんの治療における使用のための、さらに詳細には固形腫瘍の治療のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物が提供される。
【００３１】
別の態様では、二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合腫瘍標的化分子をＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与することによりがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法が提供され、ここで二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと；ｉ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む少なくとも一つのＩＣＯＳ−Ｌ；又はｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトＩＣＯＳにアゴニスト結合することのできる一つの抗原結合ドメインとを含み；Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は腫瘍関連抗原に結合する。一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子と同じ腫瘍関連抗原に結合する。別の態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子とは異なる腫瘍関連抗原に結合する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここで腫瘍関連抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群より選択される。
【００３３】
一態様において、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここで腫瘍関連抗原はＦＡＰである。特に、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。一態様において、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメイン、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。特定の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００３４】
さらなる一態様において、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここで腫瘍関連抗原はＣＥＡである。特に、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ａ）（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。一態様において、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＣＥＡに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインは、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。さらなる一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。別の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。特定の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００３５】
一態様において、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。さらなる態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む一つの軽鎖を含む。別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連標的に対する一価の結合及びＩＣＯＳに対する二価の結合を含む。一態様において、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む。
【００３６】
さらなる一態様において提供されるのは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子であり、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。さらなる態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連標的に対する一価の結合及びＩＣＯＳに対する二価の結合を含む。一態様において、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む。さらなる一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１３１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、上記に記載された、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、ベクター、特に本発明の単離されたポリヌクレオチド含む発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
【００３８】
別の態様では、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を生成するための方法が提供され、この方法は、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程を含む。本発明はまた、本発明の方法により生成された、ここに記載される腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を包含する。
【００３９】
本発明は、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、少なくとも一つの薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００４０】
本発明によりさらに包含されるのは、医薬としての使用のための、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、又は腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を含む薬学的組成物である。
【００４１】
一態様において提供されるのは、
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激すること，
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存をサポートすること，
（ｉｉｉ）感染症の治療，
（ｉｖ）がんの治療，
（ｖ）がんの進行を遅らせること、又は
（ｖｉ）がんに罹患した患者の生存期間を延長すること
における使用のための、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、又は腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を含む薬学的組成物である。
【００４２】
特定の態様では、がんの治療における使用のための、上記に記載された腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、又は上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を含む薬学的組成物である。
【００４３】
別の特定の態様では、本発明は、がんの治療における使用のための、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供し、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法における使用のためのその他薬剤との組み合わせ投与のためのものである。
【００４４】
さらなる態様において提供されるのは、がんの治療における使用のための、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子であり、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて投与される。一態様において、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブである。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために、個体に対し、上記に記載された腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、又は上記に記載された腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を含む薬学的組成物の治療的有効量を投与することを含む。
【００４６】
さらに提供されるのは、疾患の治療を必要とする個体におけるそのような治療のための医薬の製造のための、特にがんの治療のための医薬の製造のための、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子の使用、ならびに、個体における疾患を治療する方法であって、前記個体に対し、上記に記載された腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を含む組成物の治療的有効量を、薬学的に許容される形態で投与することを含む方法である。特定の一態様では、疾患はがんである。上記態様のいずれにおいても、個体は哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ−Ｄ】ＦＡＰ又はＣＥＡ標的化ＩＣＯＳ分子及びそれらの非標的化（ＤＰ４７）参照分子の模式図である。Ａ及びＢでは、異なる種類の標的化ＩＣＯＳ二重特異性抗体が１＋１のフォーマットで示されている。Ａは、腫瘍関連標的化部分としてＦＡＰ又はＣＥＡを含んでいる。Ｃは、２＋１フォーマット（腫瘍関連標的に対して一価）のＦＡＰ−又はＣＥＡ−ＩＣＯＳ抗体を示し、Ｄには、１＋１のフォーマットの非標的化（ＤＰ４７）−ＩＣＯＳ二重特異性抗体が示されている。
【図１Ｅ−Ｆ】Ｅは、非標的化（ＤＰ４７）参照分子の模式図である。Ｅには、２＋１フォーマットの非標的化（ＤＰ４７）−ＩＣＯＳ二重特異性抗体が示されている。Ｆは、腫瘍関連抗原に特異的なヒトＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ  ＴＣＢ）の模式図である。
【図２】Ａ及びＢは、ＦＡＰ標的化ｍＩＣＯＳ−Ｌ分子（Ａ）及び非標的化（ＤＰ４７）−ｍＩＣＯＳ−Ｌ参照分子（Ｂ）の模式図である。    Ｃは、腫瘍関連抗原に特異的なマウスＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ  ＴＣＢ）の模式図である。
【図３Ａ−Ｄ】健常なドナー由来のＴ細胞、ＴＩＬ、又は同じ患者の正常組織から単離されたＴ細胞上のＩＣＯＳ発現である。
【図３Ｅ−Ｈ】ＣＥＡ陽性Ｌｏｖｏ標的細胞の存在下においてＴＣＢ治療を行った場合と行わなかった場合の、ベースラインとコントロールにおける、ＴＩＬとヒトＰＢＭＣのＩＣＯＳ発現の対比である。フローサイトメトリーによって決定された蛍光強度の中央値及びＩＣＯＳ陽性Ｔ細胞のパーセントを示している。ＳＤと共に技術的３回分が示されている。アイソタイプは差し引いた。
【図４】フローサイトメトリーによって決定された、ヒトＴ細胞のＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性活性化時のヒトＩＣＯＳ発現の増大を示している。Ａ及びＢは、ＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢと共に４８時間インキュベートした時の、ＩＣＯＳ＋  ＣＤ４（Ａ）及びＣＤ８＋（Ｂ）Ｔ細胞の用量依存性の増大を示している。グラフは、技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示す。Ｃ及びＤは、５名の異なる健常なヒトＰＢＭＣドナーにＣＥＡ  ＴＣＢ（１００ｎＭ）又はＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢ（２０ｎＭ）治療を４８時間行った時の、ＩＣＯＳ＋  ＣＤ４＋（Ｃ）及びＣＤ８＋（Ｄ）Ｔ細胞のパーセンテージの増加を示している。
【図５Ａ−Ｃ】マウスＴ細胞のＴＣＢ媒介性活性化時の、マウスＣＤ４＋、Ｔｒｅｇ又はＣＤ８＋  Ｔ細胞上のマウスＩＣＯＳ発現の増大を示している。ＭＣ３８−ｈＣＥＡ腫瘍標的細胞、ｈＣＥＡ（ＨＯ）Ｔｇマウス由来のマウス脾細胞、及び漸増濃度のｍＣＥＡ−ＴＣＢの４８時間の共インキュベーション後の、マウスＣＤ４（Ａ）、Ｔｒｅｇ（Ｂ）又はＣＤ８Ｔ細胞（Ｃ）のＩＣＯＳ陽性細胞のパーセンテージ  を示している。グラフは技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示し、アイソタイプ値は差し引かれている。
【図５Ｄ−Ｆ】マウスＴ細胞のＴＣＢ媒介性活性化時の、マウスＣＤ４＋、Ｔｒｅｇ又はＣＤ８＋  Ｔ細胞上のマウスＩＣＯＳ発現の増大を示している。ＭＣ３８−ｈＣＥＡ腫瘍標的細胞、ｈＣＥＡ（ＨＯ）Ｔｇマウス由来のマウス脾細胞、及び漸増濃度のｍＣＥＡ−ＴＣＢの４８時間の共インキュベーション後の、マウスＣＤ４（Ｄ）、Ｔｒｅｇ（Ｅ）又はＣＤ８Ｔ細胞（Ｆ）のＩＣＯＳ陽性細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示している。グラフは技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示し、アイソタイプ値は差し引かれている。
【図６】フローサイトメトリーによって決定された、細胞上のヒトＩＣＯＳ（Ａ及びＢ）と、ヒトＦＡＰ（Ｃ）に対する異なるＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子の結合を示している。フローサイトメトリーによって測定された、活性化ＰＢＭＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１１６１Ｄ、４８時間、１：２のビーズ対細胞比を用いた）に対する異なるＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子又はＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子の結合の蛍光強度の中央値を、ヒトＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈＦＡＰ細胞に対する同結合と対比させて示している。図示されているのは、技術的３回分とＳＤである。
【図７】フローサイトメトリーによって決定された、マウスＩＣＯＳ（Ａ）発現細胞及びマウスＦＡＰ（Ｂ）発現細胞に対するＦＡＰ−ｍＩＣＯＳ−Ｌの結合を示している。フローサイトメトリーによって測定された、マウスＩＣＯＳを過剰発現している安定なＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクタントに対するＦＡＰ−ｍＩＣＯＳ−Ｌの結合の蛍光強度の中央値（Ａ）を、３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞（マウスＦＡＰを安定に過剰発現するように修飾された親細胞株ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−９２）（Ｂ）と対比させて示している。ＳＤと共に技術的３回分が示されている。
【図８Ａ】異なるＦＡＰ対非標的化ＩＣＯＳ分子の評価。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイを用いて潜在的なスーパーアゴニズムに対処した。グラフは、発光シグナル強度、即ち同時にコートされたａＣＤ３の存在下又は非存在下において異なるプレート結合ａＩＣＯＳコンストラクトを用いた事前活性化Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ２Ｐ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＣＳ１７６５０１）の蛍光強度を示す。図示されているのは、技術的３回分とＳＥＭである。
【図８Ｂ−Ｅ】フローサイトメトリーによりＴ細胞活性化アッセイにおいて評価された、ＦＡＰを介したＩＣＯＳ分子の架橋の影響を示している。図示されているのは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（Ｂ及びＣ）又はＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｄ及びＥ）上での早期Ｔ細胞活性化ＣＤ６９及び後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベルである。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）は、漸増濃度のＦＡＰ標的化ＦＡＰ−ＩＣＯＳコンストラクト又は非標的化ＤＰ４７−ＩＣＯＳコンストラクトの存在下での８０ｐＭ  ＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢの存在下において、５：１：１のＥ：ＴでヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ４５腫瘍細胞及び３Ｔ３−ｈＦＡＰ線維芽細胞を４８時間共インキュベーションした後に測定された。グラフは、技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示す。
【図８Ｆ−Ｉ】図示されているのは、曲線下面積ＡＵＣとしての、ＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＣＤ８＋  Ｔ細胞上での早期Ｔ細胞活性化ＣＤ６９及び後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベルである。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）は、漸増濃度のＦＡＰ標的化ＦＡＰ−ＩＣＯＳコンストラクト又は非標的化ＤＰ４７−ＩＣＯＳコンストラクトの存在下での８０ｐＭ  ＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢの存在下において、５：１：１のＥ：ＴでヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ４５腫瘍細胞及び３Ｔ３−ｈＦＡＰ線維芽細胞を４８時間共インキュベーションした後に測定された。グラフは、技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示す。
【図９Ａ−Ｄ】フローサイトメトリーによって決定された、３Ｔ３−ｈＦＡＰ細胞に対する結合により架橋したＦＡＰ−ＩＣＯＳ  二重特異性分子によるＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化の増大を示している。図示されているのは、漸増濃度のＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿２＋１分子の存在下における、ＭＦＩ又は陽性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセントとしての、ＣＤ６９の発現レベルである。ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋  Ｔ細胞（Ａ及びＢ）又はＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｃ及びＤ）の蛍光強度中央値（ＭＦＩ、Ａ及びＣ）とパーセンテージ（Ｂ及びＤ）は、漸増濃度のＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿２＋１の存在下での８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢにおいて５：１：１のＥ：ＴでヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ４５腫瘍細胞及び３Ｔ３−ｈＦＡＰ線維芽細胞を４８時間共インキュベーションした後のものが示されている。グラフは、技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示す。
【図９Ｅ−Ｈ】フローサイトメトリーによって決定された、３Ｔ３−ｈＦＡＰ細胞に対する結合により架橋したＦＡＰ−ＩＣＯＳ  二重特異性分子によるＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化の増大を示している。図示されているのは、最大５名の異なる健常なヒトＰＢＭＣドナーに関する、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子とＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢの共インキュベーションにより誘導されたＴ細胞活性化の最大の倍数増加としてのＣＤ６９の発現レベルである。グラフは、技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示す。Ｅ−Ｈは、最大５名の異なる健常なヒトＰＢＭＣドナーに関する、図示のＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子と８０ｐＭのＴＣＢとの共インキュベーションによって誘導された、Ｔ細胞活性化の最大の倍数増加を示している。
【図１０Ａ−Ｂ】ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞増殖及びＴ細胞分化の増大を、複数のＦＡＰ−ＩＣＯＳフォーマットが存在しない場合と存在する場合を対比させて示している。グラフは、フローサイトメトリーによって決定された、ＴＣＢの濃度を漸増させた場合（ＣからＪ）又は固定濃度２．９ｐＭでの（Ｋ及びＬ）での、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の絶対数（Ａ及びＢ）と、ナイーブ、中心メモリー（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）及びＣＤ４５ＲＡ陽性エフェクターメモリー（Ｔｅｍｒａ）細胞の相対数を示す。１ｎＭのＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿２＋１、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１  ＨＴの存在下でのＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ（漸増濃度）の存在下における、５：１：１のＥ：ＴでのヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ４５腫瘍細胞及び３Ｔ３−ｈＦＡＰ線維芽細胞の９６時間の共インキュベーション後の、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の絶対細胞数（Ａ及びＢ）、又はＣＤ４若しくはＣＤ８＋  Ｔｅｍ、Ｔｃｍ、Ｔｎａｉｖｅ及びＴｅｍｒａメモリーＴ細胞サブセット（１０Ｃから１０Ｊ）。グラフは、技術的な３回の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。
【図１０Ｃ−Ｆ】ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞増殖及びＴ細胞分化の増大を、複数のＦＡＰ−ＩＣＯＳフォーマットが存在しない場合と存在する場合を対比させて示している。グラフは、フローサイトメトリーによって決定された、ＴＣＢの濃度を漸増させた場合（ＣからＪ）又は固定濃度２．９ｐＭでの（Ｋ及びＬ）での、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の絶対数（Ａ及びＢ）と、ナイーブ、中心メモリー（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）及びＣＤ４５ＲＡ陽性エフェクターメモリー（Ｔｅｍｒａ）細胞の相対数を示す。１ｎＭのＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿２＋１、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１  ＨＴの存在下でのＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ（漸増濃度）の存在下における、５：１：１のＥ：ＴでのヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ４５腫瘍細胞及び３Ｔ３−ｈＦＡＰ線維芽細胞の９６時間の共インキュベーション後の、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の絶対細胞数（Ａ及びＢ）、又はＣＤ４若しくはＣＤ８＋  Ｔｅｍ、Ｔｃｍ、Ｔｎａｉｖｅ及びＴｅｍｒａメモリーＴ細胞サブセット（１０Ｃから１０Ｊ）。グラフは、技術的な３回の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。
【図１０Ｇ−Ｊ】ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞増殖及びＴ細胞分化の増大を、複数のＦＡＰ−ＩＣＯＳフォーマットが存在しない場合と存在する場合を対比させて示している。グラフは、フローサイトメトリーによって決定された、ＴＣＢの濃度を漸増させた場合（ＣからＪ）又は固定濃度２．９ｐＭでの（Ｋ及びＬ）での、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の絶対数（Ａ及びＢ）と、ナイーブ、中心メモリー（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）及びＣＤ４５ＲＡ陽性エフェクターメモリー（Ｔｅｍｒａ）細胞の相対数を示す。１ｎＭのＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿２＋１、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１  ＨＴの存在下でのＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ（漸増濃度）の存在下における、５：１：１のＥ：ＴでのヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ４５腫瘍細胞及び３Ｔ３−ｈＦＡＰ線維芽細胞の９６時間の共インキュベーション後の、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の絶対細胞数（Ａ及びＢ）、又はＣＤ４若しくはＣＤ８＋  Ｔｅｍ、Ｔｃｍ、Ｔｎａｉｖｅ及びＴｅｍｒａメモリーＴ細胞サブセット（１０Ｃから１０Ｊ）。グラフは、技術的な３回の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。
【図１０Ｋ−Ｌ】図１０ＣからＪに示されたデータセットに関し、１ｎＭの図示のＩＣＯＳ分子が存在しない場合と存在する場合とを対比させて、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢの固定濃度２．９ｐＭにおける、ナイーブ、中心メモリー、エフェクターメモリー又はＴｅｍｒａ細胞の絶対数を強調している。ゲーティングは以下のように行った：Ｔｅｍ＝ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−、Ｔｃｍ＝ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋、Ｔｅｍｒａ＝ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−、Ｔｎａｉｖｅ＝ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋
【図１１】ＦＡＰ−ｍＩＣＯＳ−Ｌの存在下におけるｍＣＥＡ−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化の増大を示している。グラフは、フローサイトメトリーによって評価された、ＣＤ２５及びＣＤ６９陽性ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセントを示している。５０ｎＭのＦＡＰ標的化又は非標的化参照ｍＩＣＯＳ−Ｌ分子の存在下又は非存在下での、１．５ｎＭのｍＣＥＡ−ＴＣＢの存在下において、５０：１のＥ：ＴでＭＣ３８−ｈＣＥＡ腫瘍細胞、３Ｔ３−ｍＦＡＰ  線維芽細胞及びマウス脾細胞エフェクター細胞（Ｃ５７  Ｂｌ／６匹）を４８時間共インキュベーションした後の、ＣＤ２５及びＣＤ６９陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ａ）又はＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ）の割合である。グラフは３回分を示し、エラーバーはＳＤを示し、アイソタイプ値は差し引かれている。
【図１２】ＮＳＧマウスの、単回注射後のＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１の薬物動態プロファイルである。
【図１３】ヒト化マウスにおいてＭＫＮ４５異種移植片と組み合わせてＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１及びＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢを用いた有効性試験を示す。図示されているのは、試験デザインと治療群である。
【図１４Ａ】ヒト化マウスにおいてＭＫＮ４５異種移植片と組み合わせてＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１及びＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢを用いた有効性試験を示す。示されているのは、平均腫瘍容積である。ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１の存在下においてＴＣＢ媒介性腫瘍縮小が進んでいることが分かる。
【図１４Ｂ−Ｅ】ヒト化マウスにおいてＭＫＮ４５異種移植片と組み合わせてＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１及びＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢを用いた有効性試験を示す。ｙ軸上に個々のマウスにおける腫瘍の増殖が示されている（ＢからＤ）。個々のマウスの４４日目の腫瘍重量がＥにまとめられている。ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１の存在下においてＴＣＢ媒介性腫瘍縮小が進んでいることが分かる。
【図１５】ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＫＮ４５及び３Ｔ３−ｈＦＡＰ細胞の共グラフトモデルでの、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１抗体とＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢの併用療法時のＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇｓの腫瘍特異性枯渇。脾臓（Ｃ及びＤ）及び腫瘍（Ａ及びＢ）における、ＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＴｒｅｇの出現頻度及びＣＤ８とＴｒｅｇ細胞との比が示されている。各形状は個々のマウスを示す。
【図１６】サイトカイン分析。ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＫＮ４５と３Ｔ３−ｈＦＡＰ細胞との共グラフトモデルでの、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１抗体とＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとの併用療法時の選択されたケモカイン及びサイトカイン発現における腫瘍内変化。各形状は個々のマウスを示す。図示されているのは、ＣＣＬ３（Ａ）、ＴＮＦ−α（Ｂ）及びＣＸＣＬ１３（Ｃ）に関するデータである。
【図１７】ＩＣＯＳ被調節遺伝子を同定するための、ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＫＮ４５と３Ｔ３−ｈＦＡＰとの共グラフトモデルでの、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１とＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとの組み合わせ試験の残りの腫瘍の遺伝子発現分析。図示されているのは、有意に上方制御された遺伝子ＴＮＦＡＩＰ６（ｐ値は０．１である）及びＣＸＣＬ１３（ｐ値０．０５）の倍数増加であり、閾値は、ＴＣＢ単剤療法効果と比較して少なくとも２の倍率変化を有するように設定された。ＴＮＦＡＩＰ６のデータはＡに、ＣＸＣＬ１３のデータはＢに示されている。
【図１８】すべてのＦＡＰ又はＣＥＡ標的化抗マウスＩＣＯＳ分子の模式図である。２＋１フォーマットの腫瘍標的化マウスＩＣＯＳ抗体（腫瘍関連標的に対して一価）がＡに、１＋１フォーマットの同抗体がＢに示されている。
【図１９】フローサイトメトリーによって測定された、ＩＣＯＳ陽性活性化ヒトＣＤ４＋（上部パネル、Ａ）又はヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞（下部パネル、Ｂ）に対するＣＥＡ標的化ＩＣＯＳ分子の結合を、ＣＥＡ陽性ＭＫＮ４５細胞（Ｃ及び１９Ｄ）と対比させて示している。グラフは、技術的３回分の蛍光中央値（ＭＦＩ）を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示している。
【図２０Ａ】８０ｐＭのＴＣＢの存在下において、５：１：１の細胞比及び漸増濃度の異なるＩＣＯＳ分子でヒトＰＢＭＣ、ＭＫＮ４５及びＮＩＨ−３Ｔ３−ｈＦＡＰを４８時間共インキュベーションした後の、ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ（％）として示されたＴ細胞の活性化。グラフは、技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示す。
【図２０Ｂ】２００ｐＭ又は１ｎＭのＩＣＯＳ分子と８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとの組み合わせにより誘導された、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ単剤療法を上回る、ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージ（％）の倍数増加が示されている。
【図２１】フローサイトメトリーによって測定された、マウスＩＣＯＳを過剰発現するＩＣＯＳ陽性ＣＨＯ細胞（Ａ）又はマウスＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞（Ｂ）に対する抗マウスＩＣＯＳ分子の結合を、ＣＥＡ陽性ＭＫＮ４５細胞（Ｃ）と対比させて示している。グラフは、技術的３回分の蛍光中央値（ＭＦＩ）を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示している。
【図２２】１．５ｎＭのマウスＣＥＡ−ＴＣＢの存在下において、３：１：１の細胞比及び漸増濃度の異なるＩＣＯＳ分子でＣ５７Ｂｌ／６マウス、ＭＣ３８−ｈＣＥＡ及びＮＩＨ−３Ｔ３−ｈＦＡＰのマウス脾細胞を４８時間共インキュベーションした後の、ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋（Ａ及びＣ）のパーセンテージ（％）として示されたマウスＴ細胞の活性化を、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ及びＤ）と対比させて示している。グラフは、技術的３回分を示し、エラーバーはＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
特に断らない限り、ここで使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般的に使用されるものと同じ意味を有する。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、単数形で用いられる用語は、適切な場合はいつでも複数形も含み、その逆も同じである。
【００４９】
ここにおいて使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
【００５０】
ここで使用される用語「腫瘍関連抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる抗原結合ドメイン」又は「腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様において、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。特定の一態様では、抗原結合ドメインは、それが結合している実態（例えばＩＣＯＳアゴニスト）を、標的部位へ、例えば抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞又は腫瘍間質へと方向付けることができる。標的細胞抗原に特異的に結合することのできる抗原結合ドメインは、ここでさらに記載される抗体及びその断片を含む。加えて、標的細胞抗原に特異的に結合することのできる抗原結合ドメインは、ここでさらに記載される足場抗原結合タンパク質、例えば設計反復タンパク質又は設計反復ドメインに基づく結合ドメインを含む（例えば国際公開第２００２／０２０５６５号参照）。
【００５１】
抗体又はその断片に関して、用語「標的細胞抗原に特異的に結合することのできる抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し且つ相補的であるエリアを含む分子の部分を指す。特異的抗原結合能を有する抗原結合ドメインは、例えば、一つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により、提供されうる。特に、特異的抗原結合能を有する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様では、「標的細胞抗原に特異的に結合することのできる抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片としてもよい。
【００５２】
ここでの用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、並びに、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００５３】
ここで使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、 即ち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００５４】
ここで使用される用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する一つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００５５】
本出願において使用される用語「価」は、一つの個別の抗原決定基に特異的な、抗原結合分子中の一つの個別の抗原決定基に特異的な特定数の結合部位の存在を意味する。このように、用語「一価」、「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗原結合分子中、特定の抗原決定基に特異的な、それぞれ一つの結合部位、二つの結合部位、四つの結合部位、及び六つの結合部位の存在を示す。本発明の特定の態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であり、即ち前記抗原決定基に対して結合部位を一つだけ有しても、又は特定の抗原決定基に対して二価又は四価であり、即ち前記抗原決定基に対してそれぞれ二つの結合部位又は四つの結合部位を有してもよい。
【００５６】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、ここでは互換可能に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が続いている。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五つのタイプのうちの一つに割り当てられ、それらのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる二つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００５７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 （2003）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer-Verlag, New York）, pp. 269-315 （1994）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 （2003）; oyobiHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 （1993）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 （2003）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号参照）。抗体断片は、ここに記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解及び組み換え宿主細胞（例えば大腸菌又はファージ）による生成を含むがこれらに限定されない様々な技術により作製することができる。
【００５８】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメインと、さらには軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗原結合断片を生成する。したがって、ここで使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインと、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む軽鎖断片を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位（二つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２  断片を生成する。
【００５９】
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」はＦａｂ断片を指し、重鎖と軽鎖の可変領域又は定常領域は交換可能である。クロスオーバーＦａｂ分子の二つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。対して、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変領域は交換されており、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含んでいる。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。対して、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含んでいる。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００６０】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し；前記リンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されている。加えて、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化する可能性もある。
【００６１】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し、ＶＨとＶＬは一緒に、特に抗原に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化されることがある。
【００６２】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより接続した、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに、並びに溶解度のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することができるか、又はその逆が可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., houhou in Enzymol. 203 （1991）46-96に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する、つまり機能性抗原結合部位へとＶＬドメインと一緒に集合することのできる、又はＶＬドメインの特性を有する、つまり機能性抗原結合部位へとＶＨドメインと一緒に集合することのできる単鎖ポリペプチドを含み、それにより完全長抗体の抗原結合特性を提供する。
【００６３】
「足場抗原結合タンパク質」は当技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されている。例えば、Gebauer and Skerra, Engineered protain scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 （2009） and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 （2008）を参照されたい。本発明の一態様において、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、プロテインＡに由来する分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ），Ａドメイン（Ａｖｉｍｅｒ／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランス体）；設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）；新規抗原受容体ベータ−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ−クリスタリン又はユビキチン（Ａｆｆｉｌｉｎ分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクーニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えばノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）からなる群より選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を持つように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディとしても知られている（例：米国特許第７１６６６９７号）。エビボディは、抗体の分離された可変領域（例：ドメイン抗体）とほほ同じ大きさである。さらなる詳細は、Journal of Immunological Method 248 （1-2）, 31-45 （2001）を参照のこと。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質といった疎水性の小分子を運搬する細胞外タンパク質のファミリーである。これは、異なる標的抗原に結合するように操作することのできる螺旋構造の開放端に多数のループを有する剛性のベータ−シート二次構造を有する。アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）は１６０〜１８０のアミノ酸の大きさであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 （2000）、米国特許第７２５０２９７号及び同第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ由来の足場であり、抗原に結合するように操作できる。このドメインは、約５８のアミノ酸で構成される３ヘリックスバンドルからなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって生成されている。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及びＥＰ第１６４１８１８号を参照のこと。アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）は、Ａドメイン足場ファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５のアミノ酸の天然ドメインは、明確���ジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、Ａドメインのファミリーが呈する天然変異のシャッフルによって生じる。さらなる詳細については、Nature Biotechnology 23（12）, 1556 - 1561 （2005）及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16（6）, 909-917 （June 2007）を参照されたい。トランスフェリンは、単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、ペプチド配列を許容表面ループに挿入することにより、様々な標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例には、トランスボディが含まれる。さらなる詳細は、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 （1999）を参照のこと。設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格に対する内在性膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は、二つのアルファヘリックスと一つのベータターンからなる３３残基のモチーフである。これらは、各反復の第１のアルファヘリックスとベータターンの残基をランダム化することにより、様々な標的抗原に結合するように操作することができる。これらの結合面は、モジュールの数を増加せることにより増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 （2003）, PNAS 100（4）, 1700-1705 （2003）及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 （2007）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科の抗体重鎖の可変ドメインに由来するものであった（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５の反復単位のうちの１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の主鎖からなる。アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識できるように、ベータサンドイッチの一端にある三つのループを操作することができる。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 （2005）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 （2005）を参照されたい。ミクロボディは、３〜４個のシステインブリッジを含有する、長さ２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質に由来する。微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その全体的な折り畳みに影響を与えることなく、最大２５個のアミノ酸を含むように操作できるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
【００６４】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照分子の結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は競合アッセイにおいてその抗原に対する抗原結合分子の結合を５０％以上遮断する。
【００６５】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定部分にのみ結合しうる。抗原結合ドメインは、例えば、一つ又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６６】
ここで使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、ここで抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然タンパク質を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。ここで特定のタンパク質が言及される場合、その用語は、「完全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じるあらゆる形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、タンパク質の天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異型を包含する。
【００６７】
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 （2000））、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 （2002））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００６８】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。ここで使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する本質的な結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は通常、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができるが、これは、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｏｆｆ、ｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含みうる。親和性は、ここに記載したものを含め、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００６９】
ここで使用される「腫瘍関連抗原」即ちＴＡＡは、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍中の細胞の表面上に存在する抗原決定基（ＩＣＯＳとは異なる）を指す。一部の実施態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施態様において、ＴＡＡは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群より選択される。特に、腫瘍関連抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はがん胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
【００７０】
特に断らない限り、「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」（プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１としても知られている）という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のいずれかの天然ＦＡＰを指す。用語は、「完全長」の、未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じたあらゆる形態のＦＡＰを包含する。この用語は、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の登録番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号７９）又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２．に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで延びる。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を配列番号８０に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔの登録番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号８１）又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで延びる。配列番号８２は、Ｈｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号８３は、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子は、ＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
【００７１】
特に断らない限り、用語「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）」（がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られる）は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号８４）に示されている。ＣＥＡは、腫瘍関連抗原として同定されてから久しい（Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。元々は、胎児組織においてのみ発現されるタンパク質として分類されていたが、ＣＥＡは、現在では複数の正常成人組織においても同定される。これら組織は一次的には元は上皮系であり、胃腸、呼吸器、及び泌尿器系の細胞と、結腸、子宮頸部、汗腺、及び前立腺の細胞を含む（Nap et al., Tumour Biol., 9（2-3）:145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52（8）:2329-23339, 1992）．上皮由来の腫瘍、並びにそれらの転移は、ＣＥＡを腫瘍関連抗原として含んでいる。ＣＥＡの存在自体ががん性細胞への形質転換を示すものではないが、ＣＥＡの分布が示唆されている。正常組織において、ＣＥＡは通常、細胞の先頂面に発現され（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9（2）:67-81 （1999））、よって血流中の抗体にアクセス不能である。正常組織とは対照的に、ＣＥＡはがん性細胞の表面全体に発現される傾向がある（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9（2）:67-81 （1999））。発現パターンのこのような変化により、ＣＥＡは、がん性細胞に結合する抗体にアクセス可能となる。加えて、ＣＥＡの発現はがん性細胞において増加する。さらに、増加したＣＥＡの発現は、細胞間接着の増大を促進し、これが転移に繋がりうる（Marshall J., Semin Oncol., 30（a Suppl. 8）:30-6, 2003）。種々の腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の出現率は、通常極めて高い。公開済みのデータと一致して、組織試料において実施された固有の分析により、その高い出現率が確認され、出現率はそれぞれ、結腸直腸癌（ＣＲＣ）においては約９５％、膵臓がんにおいては９０％、胃がんにおいて８０％、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、ＨＥＲ３と共発現される場合）において６０％、乳がんにおいて４０％であった。小細胞肺がんと膠芽細胞腫において低い出現率が見られた。
【００７２】
ＣＥＡは、細胞表面から容易に切断され、直接又はリンパを介して腫瘍から血流中に流れる。この特性により、血清ＣＥＡのレベルは、がんの診断及びがん、特に結腸直腸がんの再発のスクリーニングのための臨床マーカーとして使用されている（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12（23）:6985-6988, 2006）。
【００７３】
用語「ＦｏｌＲ１」は、葉酸受容体アルファを指し、複数のがんの予後及び治療標的の候補として同定された。特に断らない限り、それは、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＦｏｌＲ１を指す。ヒトＦｏｌＲ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１５３２８（配列番号８５）に示されており、マウスＦｏｌＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ３５８４６（配列番号８６）のアミノ酸配列を有し、カニクイザルＦｏｌＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｇ７ＰＲ１４（配列番号８７）に示されるアミノ酸配列を有する。ＦｏｌＲ１は、細胞の原形質膜上に発現されるＮ−グリコシル化タンパク質である。ＦｏｌＲ１は、葉酸及び複数の還元葉酸誘導体に対して高い親和性を有し、生理的葉酸、５−メチルテトラヒドロ葉酸の、細胞の内部への送達を媒介する。ＦＯＬＲ１は、卵巣がんの大多数、並びに多くの子宮、子宮内膜、膵臓、腎臓、肺、及び乳がんにおいて過剰発現される一方で、正常組織におけるＦＯＬＲ１の発現は、腎臓近位尿細管、肺の肺胞肺細胞、膀胱、精巣、脈絡叢、及び甲状腺の上皮細胞の頂端膜に限定されるため、ＦＯＬＲ１指向性のがん療法にとって望ましい標的である。最近の研究により、ＦｏｌＲ１の発現が三種陰性乳がんにおいて特に高いことが同定された（Necela et al. PloS One 2015, 10（3）, e0127133）。
【００７４】
特に断らない限り、コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られる用語「黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号８８）に示されている。ＭＣＳＰは、細胞膜上に発現されるＮ−結合型２８０ｋＤａ糖タンパク質成分及び４５０−ｋＤａコンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン成分からなる高度にグリコシル化された内在性膜コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカンである（Ross et al., Arch. Biochem. Biophys. 1983, 225:370-38）。ＭＣＳＰは、多数の正常細胞及び形質転換細胞にさらに広く分布している。特に、ＭＣＳＰは、表皮のほとんどすべての基底細胞に見られる。ＭＣＳＰは、黒色腫細胞では差次的に見られ、分析した良性母斑及び黒色腫病変の９０％超に発現していることが分かった。ＭＣＳＰは、基底細胞癌、神経堤由来の種々の腫瘍、及び乳房癌腫を含む、非メラニン細胞由来の腫瘍にも発現されることが分かった。
【００７５】
がん原遺伝子ｃ−ＥｒｂＢ−１又は受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１とも呼ばれる「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」という用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むいずれかの脊椎動物源由来のあらゆる天然ＥＧＦＲを指す。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号８９）に示されている。がん原遺伝子「ＨＥＲ２」（ヒト上皮増殖因子受容体２）は、ヒト上皮増殖因子受容体に関連し、且つヒト上皮増殖因子受容体とある程度の相同性を有するタンパク質チロシンキナーゼ（ｐ１８５ＨＥＲ２）をコードする。ＨＥＲ２は、本分野ではｃ−ｅｒｂＢ−２としても知られており、時にラットのホモログ、ｎｅｕの名称でも知られる。ＨＥＲ２の増幅及び／又は過剰発現は、複数のヒト悪性腫瘍に関連付けられ、ヒト乳がん及び卵巣がんのうち２５−３０％の進行に内的に関与していると思われる。さらに、増幅の範囲は、観察された患者の生存時間の中央値に逆相関する（Slamon, D. J. et al., Science 244:707-712 （1989））。ヒトＨＥＲ２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０４６２６（バージョン２３０、配列番号９０）に示されている。ここで使用される用語「ｐ９５ＨＥＲ２」は、「６１１−ＣＴＦ」又は「１００−１１５  ｋＤａ  ｐ９５ＨＥＲ２」としても知られるＨＥＲ２受容体タンパク質のカルボキシ末端断片（ＣＴＦ）を指す。ｐ９５ＨＥＲ２断片は、完全長ＨＥＲ２分子のコドン位置６１１でのＨＥＲ２  ｍＲＮＡの翻訳開始により細胞内に生成される（Anido et al, EMBO J 25; 3234-44 （2006））。この断片は１００から１１５ｋＤａの分子量を有し、細胞膜に発現され、そこで分子間ジスルフィド結合により維持されるホモダイマーを形成することができる（Pedersen et al., Mol Cell Biol 29, 3319-31 （2009））。ヒトｐ９５ＨＥＲ２の例示的配列は、配列番号９１に与えられている。
【００７６】
特に断らない限り、用語「ＩＣＯＳ」（誘導性Ｔ細胞共刺激分子）は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のいずれかの誘導性Ｔ細胞共刺激タンパク質を指す。ＩＣＯＳは、ＡＩＬＩＭ又はＣＤ２７８とも呼ばれ、ＣＤ２８スーパーファミリー（ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４細胞表面受容体ファミリー）のメンバーであり、最初のＴ細胞活性化の後でＴ細胞上に特異的に発現される。ＩＣＯＳは、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７を含む、他のＴ細胞サブセットの発達及び機能にも役割を果たしている。特に、ＩＣＯＳは、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞療法に関連付けられるサイトカインの分泌とＴ細胞の増殖とを共刺激する。したがって、ＩＣＯＳ  ＫＯマウスは、糖尿病（Ｔｈ１）、気道炎症（Ｔｈ２）及びＥＡＥ神経炎症性モデル（Ｔｈ１７）を含む様々な疾患モデルにおいて自己免疫表現型の発達障害を示す。Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞機能の調節におけるその役割に加えて、ＩＣＯＳは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）も調節する。ＩＣＯＳは、Ｔｒｅｇｓ上に高レベルで発現され、Ｔｒｅｇのホメオスタシス及び機能に関与している。活性化すると、ＩＣＯＳは、ジスルフィド結合したホモダイマーであり、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴ経路にシグナルを誘導する。その後のシグナル伝達事象により、系列特異的転写因子（例えば、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３）が発現され、次にＴ細胞増殖及び生存期間に効果がもたらされる。この用語は、天然に存在するＩＣＯＳの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。ヒトＩＣＯＳのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）登録番号Ｑ９Ｙ６Ｗ８（配列番号３）に示されている。
【００７７】
上記に記載された、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ；Ｂ７−Ｈ２；Ｂ７ＲＰ−１；ＣＤ２７５；ＧＬ５０）は、Ｂ７スーパーファミリーのメンバーでもあり、ＩＣＯＳの膜結合天然リガンドであり、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞の細胞表面上に発現される。ＩＣＯＳ−Ｌは、ＩＣＯＳとの相互作用において、細胞表面上に非共有結合的に結合したホモダイマーとして機能する。ヒトＩＣＯＳ−Ｌはまた、ヒトＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４に結合することが報告された（Yao Et Al., 2011, Immunity, 34: 729-740）。ｈｕＩＣＯＳ−Ｌのエクトドメインの例示的アミノ酸配列が配列番号１に、マウスＩＣＯＳ−Ｌ（ｍｕＩＣＯＳ−Ｌ）の例示的アミノ酸配列が配列番号２に、それぞれ示されている。
【００７８】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は一般に、各ドメインが四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む、類似の構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., p 91 （2007）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。
【００７９】
ここで使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列において超可変であり、且つ抗原結合特異性、例えば「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）を決定する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。
【００８０】
通常、抗体は、六つのＣＤＲ；ＶＨに三つ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）、及びＶＬに三つ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）を含む。ここでの例示的ＣＤＲには：
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk、J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））；及び
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732/-745 （1996）
が含まれる。
【００８１】
特に断らない限り、ＣＤＲはKabat et al., supraに従って決定される。当業者であれば、ＣＤＲの指定は、Chothia, supra, McCallum, supra又は他の任意の科学的に受け入れられている命名法も使用することができることを理解するだろう。
【００８２】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。「Ｋａｂａｔ番号付け」は、ここで使用される場合、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of proteins of Immunological Interest」 （1983）によって定められた番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００８３】
ここで抗原結合分子（例えば抗体）の文脈で使用される用語「親和性成熟」は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子より高い親和性を有す抗原結合分子を指す。親和性成熟は通常、抗原結合分子の一つ又は複数のＣＤＲにおいて一つ又は複数のアミノ酸残基の修飾を伴う。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００８４】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の次の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００８５】
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００８６】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００８７】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００８８】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を産むように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
【００８９】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により生成されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００９０】
用語「ＣＨ１ドメイン」は、概ねＥＵ位置１１８からＥＵ位置２１５（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム）に延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一態様において、ＣＨ１ドメインは、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶのアミノ酸配列（配列番号（１７０）を有する。通常、ＥＰＫＳＣのアミノ酸配列（配列番号１７１）を有するセグメントが続いて、ＣＨ１ドメインをヒンジ領域に結合する。
【００９１】
用語「ヒンジ領域」は、野生型抗体の重鎖のＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、例えばＫａｂａｔのＥＵ番号システムによる約２１６位から約２３０位、又はＫａｂａｔのＥＵ番号システムによる約２２６位から約２３０位に結合する抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。他のＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることにより決定することができる。ヒンジ領域は通常、同一のアミノ酸配列を有する二つのポリペプチドからなる二量体型分子である。ヒンジ領域は一般に、最大２５のアミノ酸残基を含み、柔軟であるため、関連付けられた標的結合部位が独立して動くことができる。ヒンジ領域は、三つのドメイン：上側、中央、及び下側ヒンジドメインへとさらに分割することができる（例えばRoux, et al., J. Immunol. 161 （1998）4083参照）。
【００９２】
一態様において、ヒンジ領域は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１７２）を有し、ここでＸはＳ又はＰである。一態様において、ヒンジ領域は、アミノ酸配列ＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１７３）を有し、ここでＸはＳ又はＰである。一態様において、ヒンジ領域は、アミノ酸配列  ＣＰＸＣＰ（配列番号１７４）を有し、ここでＸはＳ又はＰである。
【００９３】
ここでの用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、又はＡｌａ２３１から、重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって生成された抗体は、重鎖のＣ末端から一つ又は複数、特に一つ又は二つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特異的核酸分子の発現により宿主細胞によって生成された抗体は、完全長重鎖を含みうるか、又は完全長重鎖の切断された変異体を含みうる。これは、重鎖の最後の二つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在することもしないこともありうる。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、ここでは、特に断らない限り、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチドを有さないものとして示されている。一態様において、本発明による抗体に含まれる、ここで特定されるＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。一態様において、本発明による抗体に含まれる、ここで特定されるＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。
【００９４】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は通常、アミノ酸残基の概ねＥＵ位置２３１からアミノ酸残基の概ねＥＵ位置３４０（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム）まで延びる。一態様において、ＣＨ２ドメインは、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ  ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＥＳＴＹＲＷ  ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ  ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ  ＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥ  ＫＴＩＳＫＡＫのアミノ酸配列（配列番号１７５）を有する。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接な対にならないという点で独特である。むしろ、二つのＮ結合型分枝状糖鎖（炭水化物）がインタクトな天然Ｆｃ領域の二つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。炭水化物がドメイン−ドメインペアリングを置換してＣＨ２ドメインの安定化を助けると推測された。Burton、Mol. Immunol. 22(1985)161-206。一態様では、ＣＨ２ドメインに糖鎖が結合している。ここでのＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメインでも変異体ＣＨ２ドメインでもよい。
【００９５】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｃ末端からＦｃ領域内のＣＨ２ドメインまでの残基の区間を意味し、概ねＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４６（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム）に延びる抗体重鎖ポリペプチドの一部を含む。一態様において、ＣＨ３ドメインは、ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ  ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＰＧのアミノ酸配列（配列番号１７６）を有する。ここでのＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメインでも変異体ＣＨ３ドメイン（例えばその一方の鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）と、その他方の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）とを有するＣＨ３ドメイン；米国特許第５８２１３３３号（出典明示によりここで明示的に援用される）参照）でもよい。このような変異体ＣＨ３ドメインは、ここに記載の二つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用することができる。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。ここで特に断らない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
【００９６】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996）and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロダイマー形成を促進し、且つホモダイマー形成を妨害することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがってダイマーをさらに安定させる（Carter, J Immunol houhou248, 7-15 （2001））。
【００９７】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」には、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体と、置換、付加又は欠失を生じるが免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害）を媒介する能力を実質的に低下させない変更を有する変異体とが含まれることが意図される。例えば、一つ又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。このような変異体は、活性に対する影響が最小となるように、当技術分野で知られている一般的な規則に従って選択することができる（例えばBowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 （1990）参照）。
【００９８】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって左右される、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００９９】
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞の特定の細胞表面上の受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介されうる。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介した、免疫複合体の食作用による抗体で抗体でコートされた病原体の除去と、対応する抗体でコートされた赤血球及び種々の他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解との両方を媒介することが示されている（例えば、Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 （1991） 511-524を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに関するそれらの特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に関するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと表される。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 （1991） 457-492, Capel, P.J., et al., Immunomethod 4 （1994） 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 （1995） 330-341；及びGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 （1998） 231-248に記載されている。
【０１００】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域（ＦｃγＲ）に関する受容体の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害性、及び炎症メディエーターの放出、並びに免疫複合体除去及び抗体生成の制御を含む広範なエフェクター機能を引き起こす。ヒトにおいては、以下の、ＦｃγＲの三つのクラスの特徴が明らかにされている。
−ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高いアフィニティーで単量体ＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球に発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従い番号付け）の少なくとも一つのＦｃ領域ＩｇＧにおける修飾は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された２３３〜２３６の位置のＩｇＧ２残基が、ＦｃγＲＩへの結合を１０3分の１に減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 （1999） 2613-2624）。
−ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中程度から低い親和性で複合体化したＩｇＧに結合し、広く発現される。この受容体は、二つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見られ、殺傷プロセスを活性化することができるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びにマスト細胞及び好酸球に見られる。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、さらなる免疫グロブリン生成及びアイソタイプスイッチ（例えばＩｇＥクラスへの）を抑制するように機能するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球及びマスト細胞上では、Ｂフォームが、ＩｇＥの分離した受容体へのＩｇＥ結合を通じたこれらの細胞の活性化を抑制するのに資する。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２及びＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）のうちの少なくとも一つに変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体に関して見られる。
−ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中程度から低い親和性でＩｇＧに結合し、二種類で存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で見られ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球に多く発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡへの減少した結合は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８及びＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う番号付け）のうちの少なくとも一つに変異を有するＩｇＧＦｃ領域を含む抗体で見られる。
【０１０１】
Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上の結合部位、すなわち上述の変異部位のマッピング、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 （2001） 6591-6604に記載されている。
【０１０２】
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害性」は、Ｆｃ受容体結合により媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下での、ここに報告される抗体による標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力は、Ｆｃγ受容体発現細胞（ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ、又はＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）を組換え発現する細胞など）への結合を測定することによって調べられる。特に、ＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合が測定される。
【０１０３】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体はヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【０１０４】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（即ち標的細胞外の空間）中に延びる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは通常、表面との接触を開始するタンパク質の部分であり、シグナル伝達をもたらす。
【０１０５】
用語「ペプチドリンカー」は、一つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であるか、又はここに記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の数字、特に２であり、すなわちＧＧＧＧＳ（配列番号９２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９４）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９５）からなる群より選択されるペプチドだけでなく、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号９６）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号９７）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９８）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号９９）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１００）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１０１）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１０２）、ＧＧＳＧ（配列番号１０３）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１０４）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１０５）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１０６）も含む。特に対象となるペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号９２）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号９７）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９８）である。
【０１０６】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【０１０７】
「融合した」又は「接続した」とは、成分（例えば前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン及びポリペプチド）が、ペプチド結合により、直接又は一つ又は複数のペプチドリンカーを介して結合していることを意味する。
【０１０８】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、ユーザー文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、ここで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされていなければならない。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの（又はこれに対する）アミノ酸配列同一性％（或いは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと（又はこれに対して）特定のアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａ、ということもできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、ここで使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【０１０９】
特定の実施態様では、ここに提供されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、アゴニストＩＣＯＳ結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。アゴニストＩＣＯＳ結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製されうる。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの削除、及び／又は同残基への挿入、及び／又は同残基の置換を含む。削除、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って、最終コンストラクトに到達することができるが、但し、これは最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有する場合に限る。置換突然変異の対象となる部位には、ＨＶＲとフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。表Ｂの「好ましい置換」という項目で保存的置換が示されており、その後にアミノ酸側鎖に基づいた分類（１）から（６）がさらに記載されている。アミノ酸置換を目的の分子に導入することができ、その生成物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
表Ａ
2021506293.tif 000003
2021506293.tif 000004
【０１１０】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１１１】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１１２】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子の一つ又は複数の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的変異体を含む（例えばヒト化又はヒト抗体）。一般的には、結果として得られ、さらなる研究のために選択された変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性に修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の向上、免疫原性の低下）を有する、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、ここに記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、一つ又は複数のＣＤＲ残基が変異し、変異型抗原結合分子は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は削除は、 これらの変更が抗原結合分子の抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、一つ又は複数のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えばここで提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells （1989）Science, 244:1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置き換えられる。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されうる。代替的に又は追加的に、抗体と抗原の接点を同定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうか判定することができる。
【０１１３】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００又はそれ以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、 並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入の例には、アゴニストＩＣＯＳ結合分子の血清半減期を延ばす、ポリペプチドに対するＮ又はＣ末端への融合を有するアゴニストＩＣＯＳ結合分子が含まれる。
【０１１４】
特定の実施態様では、ここに提供されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、簡便には、一つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより得られる。アゴニストＩＣＯＳ結合分子がＦｃドメインを含む場合、それに結合する炭水化物は改変されうる。哺乳動物細胞によって生成された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により通常結合する分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 （1997）を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」におけるＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含みうる。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する変異体を作製するために、アゴニストＩＣＯＳ結合分子中のオリゴ糖の修飾が行われうる。一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合するフコースを欠く糖鎖構造を有するアゴニストＩＣＯＳ結合分子の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）又は同第２００４／００９３６２１号（協和発酵株式会社）を参照のこと。本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子のさらなる変異体は、二分されたオリゴ糖を含むもの、例えば、Ｆｃ領域に結合する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているものを含む。このような変変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能有しうる。例えば国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet et al.）；米国特許第６６０２６８４号（Umana et al.）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも一つのガラクトース残基を持つ変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel et al.）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４（Raju, S.）に記載されている。
【０１１５】
特定の実施態様では、本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子のシステイン操作変異体、例えば、分子の一つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているチオＭａｂＴＭ抗体技術プラットフォームを作成することが望ましい。特定の実施態様において、置換される残基が分子の到達可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の到達可能な部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、免疫コンジュゲートを作るために使用することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちのいずれかの一つ又は複数がシステイン：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）で置換される。システイン操作抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成されうる。
【０１１６】
特定の態様では、ここに提供されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分には、限定されないが、水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するするポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が限定条件下での治療に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露により選択的に加熱することのできる抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 （2005） 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定しないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含む。別の態様では、ここで提供されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子のイムノコンジュゲートが得られる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一つ又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【０１１７】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミド  ＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１１８】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
【０１１９】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり五つまでの点突然変異を含みうること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除されるか又は別のヌクレオチドで置換されてよく、或いは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に一つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【０１２０】
用語「発現カセット」は、組み換えにより又は合成により、標的細胞内の特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１２１】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１２２】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。ここには、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する突然変異子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞といった哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
【０１２３】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１２４】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１２５】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象は、ヒト又はヒト患者である。
【０１２６】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【０１２７】
「薬学的に許容される添加物」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される添加物には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１２８】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１２９】
ここで使用される「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」といったその文法的変形）は、治療されている個体の自然な過程を変化させようとする試みでの臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理学の過程の間に実施することができる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発生又は再発の防止、症状の緩和、疾患のいずれかの直接的又は間接的病理学的帰結の縮減、転移の防止、疾患進行速度の低下、病状の改善又は緩和及び寛解又は予後の改善が含まれる。好ましくは、治療は疾患の治癒又は完全寛解を意味する。いくつかの態様において、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１３０】
ここで使用される用語「がん」は、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫（任意の上記がんの難治性型、又は一つ以上の上記がんの組合せを含む）を指す。
【０１３１】
本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子
本発明は、生産可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、毒性の低下、患者に与えることのできる用量範囲の拡大及びそれにより可能となる有効性の増強といった特に有利な特性を有する新規の二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３２】
腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む例示的なアゴニストＩＣＯＳ結合分子
一態様において、本発明は、
（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメイン、及び
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）Ｆｃドメイン
を含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供する。
【０１３３】
特定の一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、エフェクター機能を低減する又は消失させる変異を含むＦｃドメインを含む。エフェクター機能を低減する又は消失させる変異を含むＦｃドメインの使用は、Ｆｃ受容体を介した架橋により非特異的アゴニズムを防ぎ、ＩＣＯＳ＋細胞のＡＤＣＣを防ぐであろう。
【０１３４】
ここに記載されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、典型的にはがん細胞又は腫瘍間質である標的細胞に免疫応答を選択的に誘導するという点で、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる従来の抗体を上回る利点を保持する。一態様において、腫瘍関連抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群より選択される。特に、腫瘍関連抗原は、ＦＡＰ又はＣＥＡである。特定の一態様では、腫瘍関連抗原はＦＡＰである。
【０１３５】
特に、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３６】
さらに詳細には、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３７】
特定の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又は配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに特定の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメイン、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３８】
別の特定の態様では、腫瘍関連抗原はＣＥＡである。特に、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ａ）（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むか、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３９】
さらに詳細には、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。別の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１４０】
特定の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又は配列番号１６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに特定の態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメイン、又は配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１４１】
さらなる一態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１４２】
さらに詳細には、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１４３】
一態様において提供されるのは、
（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含むＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと
を含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【０１４４】
別の態様において提供されるのは、
（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳＳ）を含むＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと
を含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【０１４５】
一態様において、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる一つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる一つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃドメインとを含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供する。したがって、この場合、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩＣＯＳへの結合について一価であり、腫瘍関連抗原への結合について一価である（１＋１のフォーマット）。
【０１４６】
特定の一態様において提供されるのはアゴニストＩＣＯＳ結合分子であり、ここで前記分子は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）互いと安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含む。
【０１４７】
さらに詳細には、提供されるのは二重特異性抗原結合分子であり、ここで前記分子は、  （ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含むＩＣＯＳに特異的に結合することのできる第１のＦａｂ断片と、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することのできる第２のＦａｂ断片と
を含む。
【０１４８】
別の特定の態様において提供されるのは、二重特異性抗原結合分子であり、ここで前記分子は、
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含むＩＣＯＳに特異的に結合することのできる第１のＦａｂ断片と、
（ｉｉ）配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる第２のＦａｂ断片と
を含む。
【０１４９】
特定の一態様において提供されるのは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む二重特異性抗原結合分子である。
【０１５０】
さらなる特定の態様において提供されるのは、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む二重特異性抗原結合分子である。
【０１５１】
一態様において提供されるのは、アゴニストＩＣＯＳ結合分子であり、ここで前記分子は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）ＶＨ及びＶＬドメインを含む腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）互いと安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる抗原結合ドメインのＶＨドメイン及びＶＬドメインのうちの一方は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合し、ＶＨ及びＶＬのうちの他方はＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合する。このような分子は、１＋１ヘッドトゥーテールと呼ばれる。
【０１５２】
特定の一態様において提供されるのは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【０１５３】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる二つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる一つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃドメインとを含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供する。したがって、この場合、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩＣＯＳへの結合について二価であり、腫瘍関連抗原への結合について一価である（２＋１のフォーマット）。
【０１５４】
一態様において提供されるのは、アゴニストＩＣＯＳ結合分子であり、ここで前記分子は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる二つのＦａｂ断片と、（ｂ）ＶＨ及びＶＬドメインを含む腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）互いと安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる抗原結合ドメインのＶＨドメイン及びＶＬドメインのうちの一方は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合し、ＶＨ及びＶＬのうちの他方はＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合する。このような分子は２＋１と呼ばれる。
【０１５５】
特定の一態様において提供されるのは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【０１５６】
特定の一態様において提供されるのは、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【０１５７】
本発明はまた、（ａ）マウスＩＣＯＳリガンドの少なくとも一つのエクトドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することのできる一つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を提供する。特に、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、マウスＩＣＯＳリガンドの二つのエクトドメインを含む。
【０１５８】
さらに詳細には、提供されるのは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）を含む二重特異性アゴニストマウスＩＣＯＳ結合分子である。
【０１５９】
さらなる一態様では、二重特異性アゴニストマウスＩＣＯＳ結合分子が提供され、ここでアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、（ｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、マウスＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１６０】
さらに詳細には、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１６１】
特定の一態様において提供されるのは、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号１３１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【０１６２】
別の特定の態様において提供されるのは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む二重特異性アゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【０１６３】
Ｆｃ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの修飾
本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン  Ｇ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。
【０１６４】
したがって、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【０１６５】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する、本発明の二重特性抗体の望ましくない標的化の原因となることがある。したがって、特定の態様では、本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の一態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、さらに詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、さらに詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一つ又は複数を含むことができる。
【０１６６】
特定の態様において、一つ又は複数のアミノ酸修飾を、ここで提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１６７】
特定の一態様では、本発明は、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低減する一つ又は複数のアミノ酸置換を含む抗体を提供する。
【０１６８】
一態様において、本発明の抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一つ又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。さらに詳細には、本発明により、ＩｇＧ重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載があり、同文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定するための方法も記載されている。
【０１６９】
Ｆｃ受容体の結合が低減した及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一つ又は複数の置換を伴うものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二つ以上に置換を有するＦｃ変異を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１７０】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低下を呈する。さらに詳細な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。さらに詳細な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
【０１７１】
半減期が延長され、且つ、母体ＩｇＧの胎児への輸送を担う新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 （1976） 587-593, and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 （1994） 2429-2434）に対する結合が改善された抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つ又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの一つ又は複数に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を含むものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関するDuncan、A.R. and Winter、G.、Nature 322(1988)738-740；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１７２】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組み換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイはここに記載される。代替的に、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、ここに記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 （1986） and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 （1985）; 米国特許第５８２１３３７号; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 （1987）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的又は追加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al.,  Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 （1998）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１７３】
以下のセクションでは、Ｆｃ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃ領域の修飾を含む本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子の好ましい態様を記載する。一態様において、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットとを含む二重特異性抗原結合分子に関し、ここでＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する、特にＦｃγ受容体に対する抗体の結合親和性を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含む。別の態様では、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットから構成されているＦｃドメインとを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子に関し、ここでＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含む。特定の態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【０１７４】
本発明の一態様では、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメインにアミノ酸置換Ｄ２６５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「ＤＡＰＧ」）を含む。このような一実施態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、特にマウスＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。ＤＡＰＧ変異は、例えば国際公開第２０１６／０３０３５０号に記載されており、マウスのＦｃガンマ受容体に対する抗原結合分子の結合を抑止するために、重鎖のＣＨ２領域に導入することができる。
【０１７５】
ヘテロダイマー化を促すＦｃドメインの修飾
本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部位を含み、したがってＦｃドメインの二つのサブユニットは、二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれていることがある。これらポリペプチドの組み換え共発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成において本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促す修飾を含めることが有利であろう。
【０１７６】
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、（ｃ）互いと安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットから構成されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子に関し、ここでＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
【０１７７】
特定の一態様では、前記修飾はいわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。したがって、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインと、（ｃ）互いと安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットとを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子に関し、ここで、ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはホールを含む。特定の一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７８】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996）oyobi Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロダイマー形成を促進し、且つホモダイマー形成を妨害することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１７９】
このように、一態様では、本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作製することができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６の位置のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７の位置のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６の位置のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８の位置のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）。
【０１８０】
またさらなる態様ではＦｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４の位置のセリン残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９の位置のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらにダイマーを安定させる（Carter （2001）, J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１８１】
一態様において、Ｆｃ領域の第１のサブユニットは、３９２及び４０９の位置にアスパラギン酸残基（Ｄ）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットは、３５６及び３９９の位置にリジン残基（Ｋ）を含む。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットにおいて、３９２及び４０９の位置のリジン残基がアスパラギン酸残基（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）で置き換えられ、Ｆｃ領域の第２のサブユニットにおいて、３５６の位置のグルタメート残基及び３９９の位置のアスパラギン酸残基がリジン残基で置き換えられる（Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ）。「ＤＤＫＫ」ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば国際公開第２０１４／１３１６９４号に記載されており、相補的アミノ酸残基を提供するサブユニットを担持する重鎖の集合に有利である。
【０１８２】
代替的な一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモダイマー形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのＦｃドメインサブユニットの接触面における一つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。
【０１８３】
ここに報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終端する完全なＣ末端でありうる。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端のアミノ酸残基のうちの一つ又は二つが除去されている、短縮されたＣ末端でありうる。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終端する短縮されたＣ末端である。ここに報告されるすべての態様のうちの一態様において、ここに規定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。ここに報告されるすべての態様のうちの一態様において、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、ここに規定されるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１８４】
本発明における使用のための例示的抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及びアゴニストＩＣＯＳ抗原結合分子と組み合わせたその使用、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるため、さらに詳細には固体腫瘍を治療するため又は固体腫瘍の進行を遅らせるための方法におけるその使用に関する。ここで使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＥＡに結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体である。
【０１８５】
したがって、ここで使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。
【０１８６】
特定の一態様では、組み合わせにおける使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
【０１８７】
一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は完全長抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒトＩｇＧクラスの抗体、特にヒトＩｇＧ１クラスの抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、抗体断片、特にＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子、さらに詳細にはＦａｂ分子である。特定の一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（即ち互いによって置き換えられている）クロスオーバーＦａｂ分子である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒト化抗体である。
【０１８８】
別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む
第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１８９】
さらに詳細には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１９０】
別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む
第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１９１】
さらに詳細には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１９２】
さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である二重特異性抗体である。
【０１９３】
別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している二重特異性抗体である。
【０１９４】
Ｆａｂ分子は、Ｆｃドメインに対して、又は互いに、直接又はペプチドリンカーを介して融合していてよく、一つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又は４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５のアミノ酸長を、一実施態様では５から１００、さらなる実施態様では１０から５０のアミノ酸長を有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）］であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を接続するために適した例示的ペプチドリンカーは配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２を含む。別の適切なこのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に、Ｆａｂ分子は、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
【０１９５】
さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【０１９６】
特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号６１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号６３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号６４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号６１のポリペプチド配列、配列番号６２のポリペプチド配列、配列番号６３のポリペプチド配列、及び配列番号６４のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）。
【０１９７】
さらなる特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号６０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号５７のポリペプチド配列、配列番号５８のポリペプチド配列、配列番号５９のポリペプチド配列、及び配列番号６０のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ）。
【０１９８】
特定の二重特異性抗体は、国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載されている。
【０１９９】
さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））も含む。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２００７／０７１４２６号又は同２０１４／１３１７１２号に記載されている二重特異性抗体である。別の態様では、二重特異性抗体はＭＥＤＩ５６５である。
【０２００】
別の態様では、本発明は、重鎖可変領域（ＶＨｍｕＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬｍｕＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨｍｕＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬｍｕＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨｍｕＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬｍｕＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインとを含むマウス抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関する。
【０２０１】
特定の態様では、マウス抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号７５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号７６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号７７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号７８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の態様では、マウス抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号７５のポリペプチド配列、配列番号７６のポリペプチド配列、配列番号７７のポリペプチド配列、及び配列番号７８のポリペプチド配列を含む（ｍｕ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）。
【０２０２】
本発明における使用のためのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤
本発明の一態様において、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のためのものであり、ここで腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、さらにそれらはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて使用される。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、標的化４−１ＢＢ  アゴニストのみと組み合わせて使用される。これらすべての態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ−１結合アンタゴニストである。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体である。
【０２０３】
ＣＤ２７４又はＢ７−Ｈ１としても知られる「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＰＤ−Ｌ１、特に「ヒトＰＤ−Ｌ１」を指す。完全ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）登録番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号１０７）において示される。用語「ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１、Ｂ７−１といったその結合パートナーのいずれか一つ又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を、低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の一態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１及び／又はＢ７−１に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド及びＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１、Ｂ７−１といったその結合パートナーのうちの一つ又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を、低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１を介したＴリンパ球媒介性シグナル伝達に発現される細胞表面タンパク質により又は同タンパク質を介して媒介される陰性の共刺激シグナルを低減し、機能障害性のＴ細胞の機能障害性を低下させる（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）。特に、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体」又は「アゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１」は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な結合アッセイにより決定される。
【０２０４】
特定の一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。特定の一態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びＭＤＸ−１１０５からなる群より選択される。特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ここに記載されるＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ここに記載されるＭＤＸ−１１０５である。また別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。さらなる態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１０９の重鎖可変ドメイン  ＶＨ（ＰＤＬ−１）及び配列番号１１０の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ−１）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１１１の重鎖可変ドメイン  ＶＨ（ＰＤＬ−１）及び配列番号１１２の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ−１）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０２０５】
ＣＤ２７９、ＰＤ１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる「ＰＤ−１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＰＤ−Ｌ１、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）登録番号Ｑ１５１１６（配列番号１０８）に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＤ−１を指す。用語「ＰＤ−１結合アンタゴニスト」は、そのリガンド結合パートナーに対するＰＤ−１の結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２両方に対する結合を阻害する。特に、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ−１抗体」又は「ヒトＰＤ−１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ−１に特異的に結合する抗体」又は「アンタゴニスト抗ＰＤ−１」は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性でヒトＰＤ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な結合アッセイにより決定される。
【０２０６】
一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は抗ＰＤ−１抗体である。特定の一態様では、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＤＸ  １１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ピディリズマブ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ−１０８からなる群より選択され、特にペンブロリズマブ及びニボルマブから選択される。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１１３の重鎖可変ドメイン  ＶＨ（ＰＤ−１）及び配列番号１１４の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ−１）を含む抗ＰＤ−１抗体である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１１５の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ−１）及び配列番号１１６の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ−１）を含む抗ＰＤ−１抗体である。
【０２０７】
ポリヌクレオチド
本発明は、ここに記載されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子若しくはＴ細胞二重特異性抗体又はそれらの断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。
【０２０８】
本発明の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば、二つ以上の）ポリヌクレオチとして発現されうる。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能的抗原結合分子を形成することができる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされる。共発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
【０２０９】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、ここに記載される本発明による抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、ここに記載される本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２１０】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０２１１】
組み換え法
本発明の二重特異性抗体は、例えば、固体相ペプチド合成（例えばメリフィールド固体相合成）又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする一つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために一つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドの一つ又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これら方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. （1989）; and Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. （1989）に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であっても、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片（即ち、コード化領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと動作可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。ここで使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいても、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一つ又は複数のポリペプチドをコードしうる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一つ又は複数の調節配列と結合するときである。（ポリペプチドコード化領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２１２】
適切なプロモーター及び他の転写調節領域がここに開示される。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、最初期プロモーターとイントロンＡ）、シミアンウイルス４０（例えば最初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素といった他の特徴も含みうる。
【０２１３】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２１４】
後の精製を容易にするため（例えばヒスチジンタグ）又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用されうる短タンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は末端に含まれうる。
【０２１５】
本発明のさらなる態様では、本発明の一つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連してここに記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。ここで使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう操作できるいずれかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は、特定の発現ベクターを適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、臨床応用に十分な量の抗原結合分子を得るために大規模発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成を結果として生じる菌類及び酵母菌株を含む、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 （2004）,oyobiLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 （2006）を参照。
【０２１６】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。特にヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用することができる、多数のバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977）に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 （1980）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 （1９８２）に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 （１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Method in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, p. 255-268 （2003）を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞だけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作することができる。
【０２１７】
一態様では、本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子又はそのポリペプチド断片を生成する方法が提供され、この方法は、ここに提供されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む。
【０２１８】
一部の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる抗原結合ドメイン又はＩＣＯＳに特異的に結合することのできる抗原結合ドメイン（例えばＦａｂ断片又はＶＨ及びＶＬ）は、抗原に結合することのできる免疫グロブリン可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から得られる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野でよく知られている（例えばHarlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照）。天然に存在しない抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に生成することも、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０２１９】
あらゆる動物種の免疫グロブリンを本発明に使用することができる。本発明において有用な非限定的免疫グロブリンは、マウス、霊長類又はヒト起源のものでありうる。融合タンパク質がヒトでの使用を目的とする場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ型の免疫グロブリンを使用することができる。ヒト化又は完全ヒト型の免疫グロブリンも、当分野でよく知られている方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わない、ヒト（例えばレシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体及びその製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 （2008）に総説があり、さらに、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 （1988）; Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 （1989）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Jones et al., Nature 321, 522-525 （1986）; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 （1984）; Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 （1988）; Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 （1988）; Padlan, Molec Immun 31（3）, 169-217 （1994）; Kashmiri et al., Method 36, 25-34 （2005）（SDR （a-CDR）移植について記載）；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 （1991）（「リサーフェイシング」について記載）； Dall’Acqua et al., 方法 36, 43-60 （2005）（「ＦＲシャフリング」について記載）；Osbourn et al., Method 36, 61-68 （2005）及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 （2000）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」アプローチについて記載）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 （2001）及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 （2008）に概要が記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から得ることができる（例えば、Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 （Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 （2005）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖ��ローン可変領域配列を単離することによっても生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. Method in Molecular Biology 178, 1-37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001）;及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 （1991）参照）。ファージは通常、抗体断片を、単鎖Fv（scFv）断片又はFab断片として表示する。
【０２２０】
一部の態様では、抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関連する実施例参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示される方法に従って増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329（2000））及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229（2002））によって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用されうる。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細が、Morris （1996）“Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 （Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。例示的競合アッセイでは、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中において、固定化された抗原がインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在しうる。コントロールとして、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane （1988）Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【０２２１】
ここに記載されるように調製された本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用されうる。連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように、抗原結合分子を単離するために使用されうる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む任意の様々な周知の分析方法によって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現された二重特異性抗原結合分子は、還元型及び非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるようにインタクトであり、且つ適切に集合することが示された。
【０２２２】
アッセイ
ここで提供される抗原結合分子は、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
【０２２３】
１．アフィニティアッセイ
ＩＣＯＳ又は腫瘍関連抗原体に対する、ここに提供される抗体の親和性は、実施例に規定される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。また、標的細胞抗原に対する二重特異性抗原結合分子の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的且つ例示的な実施態様は、実施例９に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、２５ ℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２２４】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、ここに報告される抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリーなどの周知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０２２５】
３．活性のアッセイ
腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子の活性を評価するために、複数の細胞ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが実施された。このアッセイは、Ｔ細胞のＴ細胞二重特異性−（ＴＣＢ）媒介性の活性化の存在下において抗ＩＣＯＳ二重特異性分子のさらなるアゴニスト／共刺激性の活性を示すために設計された。例えば、ＣＤ３／ＴＣＲとＩＣＯＳの結合時に誘導される、ルシフェラーゼのＮＦＡＴ調節発現を有するレポーター細胞株を用いたＪｕｒｋａｔアッセイでは、ＩＣＯＳ  ＩｇＧ分子が、プレート結合と溶液中との対比、コートされたＣＤ３  ＩｇＧ刺激の非存在下と存在下との対比で測定された。これは実施例１１でさらに詳細に記載される。
【０２２６】
さらに、一次ヒトＰＢＭＣ共培養アッセイでは、Ｔ細胞上のヒトＩＣＯＳとヒトＦＡＰへの同時結合により架橋され、３Ｔ３−ｈＦＡＰ細胞（親細胞株ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−９２、ヒトＦＡＰを安定に過剰発現するように修飾）上に発現されるＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ分子が、Ｔ細胞上のＣＤ３と腫瘍細胞上のヒトＣＥＡへの同時結合により架橋されているＴＣＢ分子の存在下において試験された。これは実施例１２に記載される。一次マウス脾細胞共培養アッセイは、実施例１３に記載される。
【０２２７】
特定の態様では、ここに報告される抗体は、そのような生物活性について試験される。
【０２２８】
薬学的組成物、製剤及び投与経路
さらなる一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物を提供する。特定の一態様では、がんの治療における使用のための、さらに詳細には固形腫瘍の治療のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と、薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物が提供される。さらなる一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む薬学的組成物が提供され、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、単一の組成物中で一緒に投与するため、又は二つ以上の異なる組成物中で別々に投与されるためのものである。別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と同時に、同抗体に先立ち、又は同抗体の後で投与される。
【０２２９】
別の態様では、薬学的組成物は、ここに提供されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、少なくとも一つの薬学的に許容される添加物とを含む。別の態様では、薬学的組成物は、ここに提供されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、例えば後述される、少なくとも一つの追加的治療剤とを含む。
【０２３０】
また別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を含む薬学的組成物を提供し、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでの使用のためのものであるか、又はＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせるためのものである。別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせ、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤との組み合わせでの使用のためのものである。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブである。別の特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、ペンブロリズマブ又はニボルマブである。
【０２３１】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加物中に溶解又は分散された一つ又は複数の抗体の治療的有効量を含む。「薬学的又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー又は他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも一つの抗体と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990（参照によりここに包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。ここで使用される場合、「薬学的に許容される添加物」には、当業者に既知であるように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【０２３２】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明のＴＮＴファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化されうる。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。代替的に、融合タンパク質は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全量（例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満）で、最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な添加物には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等の懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はエチルクリート（ｅｔｈｙｌ  ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２３３】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル、ポリ−（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（18th Ed. Mack Printing Company, 1990）に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組み合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
【０２３４】
ここで例示的な薬学的に許容される添加物には、間質性薬物分散剤（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一つ又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２３５】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２３６】
前述の組成物に加えて、ここに記載されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、持効性製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、移植（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、アゴニストＩＣＯＳ結合分子は、適切なポリマー性又は疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２３７】
本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、一つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、添加物、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適した製剤は、選択される投与経路に応じて決まる。
【０２３８】
本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、中性又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２３９】
ここでの組成物は、治療される特定の徴候に必要な一を超える活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するのも含有しうる。そのような活性成分は、意図する目的に有効な量の組み合わせで適切に存在する。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０２４０】
治療方法及び組成物
一態様において提供されるのは、対象においてがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であり、この方法は、対象に対して腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子及びＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効量を投与することを含む。
【０２４１】
このような一態様では、方法は、有効量の少なくとも一つの追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。さらなる実施態様においてここに提供されるのは、腫瘍縮小のための方法であり、この方法は、対象に対して腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子及びＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効量を投与することを含む。上記のいずれの態様に記載の「個体」又は「対象」も、好ましくはヒトである。
【０２４２】
さらなる態様では、がん免疫療法における使用のための組成物が提供され、この組成物は、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む。一部の実施態様では、がん免疫療法の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む組成物が提供される。
【０２４３】
さらなる態様では、医薬の製造又は調製における、腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む組成物の使用がここに提供される。一実施態様において、医薬は、がんの治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、固形腫瘍を有する個体に対して医薬の有効量を投与することを含む腫瘍縮小の方法における使用のためのものである。このような一態様では、方法は、少なくとも一つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、固形腫瘍を治療するためのものである。いくつかの態様では、個体はＣＥＡ陽性がんを有する。いくつかの態様では、ＣＥＡ陽性がんは、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、又は前立腺がんである。いくつかの態様では、乳がんは、乳癌、又は乳腺癌である。いくつかの態様では、乳癌は浸潤性乳管癌である。いくつかの態様では、肺がんは肺腺癌である。いくつかの実施態様では、結腸がんは結腸直腸腺癌である。上記実施態様のいずれかによるに「対象」又は「個体」は、ヒトであってよい。
【０２４４】
別の態様において提供されるのは、対象においてがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であり、この方法は、対象に対して腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子及びＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効量を投与することを含み、ここで対象は、アゴニストＩＣＯＳ結合分子を用いた治療の前には、Ｔ細胞上に低ＩＣＯＳベースライン発現を有している。
【０２４５】
上記の併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が同一又は別々の製剤に含まれている）と、ここに報告される抗体の投与が、一つ又は複数の追加の治療剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に行われうる個別投与とを包含する。一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与、及び腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子の投与、及び任意選択的に追加的治療剤の投与は、互いの約一カ月以内、又は一、二、若しくは三週間以内、又は約一、二、三、四、五、若しくは六日以内に行われる。
【０２４６】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及びここに報告される腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子の両方（及び任意の追加的治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、局所的治療が望ましい場合は病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回の投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投薬スケジュールがここで考慮される。
【０２４７】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及びここに報告される腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子の両方は、医学行動規範と一致した様式で製剤化、用量決定、及び投与されるであろう。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。この抗体は、必ずしも必須ではないが任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために目下使用されている一つ又は複数の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記他の因子によって決まる。そのような他の薬剤は、一般的にはここに記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載の用量の約１から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路で使用される。
【０２４８】
別の態様において提供されるのは、対象においてがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であり、この方法は、対象に対して腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子の有効量を投与することを含む。
【０２４９】
その他の薬剤及び治療
本発明の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、治療法において、一つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明のアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、少なくとも一つの追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。一態様において、追加の治療剤は、化学療法剤、放射線及びがん免疫療法における使用のための他の薬剤からなる群より選択される。さらなる態様において提供されるのは、がんの治療における使用のための、ここに記載される、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子であり、ここで腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、別の免疫調節剤と組み合わせて投与される。
【０２５０】
用語「免疫調節剤」は、免疫系に影響を及ぼすモノクローナル抗体を含むいずれかの物質を指す。本発明の分子は、免疫調節剤と考慮される。免疫調節剤は、がんの治療のための抗腫瘍性薬剤として使用することができる。一態様において、免疫調節剤には、限定されないが、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えばイピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体（例えばニボルマブ又はペンブロリズマブ）、ＰＤ−Ｌ１抗体（例えばアテゾリズマブ、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）又はデュルバルマブ）、ＯＸ−４０抗体、ＬＡＧ３抗体、ＴＩＭ−３抗体、４−１ＢＢ抗体及びＧＩＴＲ抗体が含まれる。
【０２５１】
さらなる態様において提供されるのは、がんの治療における使用のための、ここに記載される、上記に記載された腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子であり、ここで腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて投与される。一態様において、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブである。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤は、ペンブロリズマブ又はニボルマブである。このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるアゴニストＩＣＯＳ結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上述した他の要因によって決まる。腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むＩＣＯＳ抗原結合分子は、一般的に、ここに記載されるものと同じ投与量及び投与経路において、又はここに記載された投与量の１から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び任意の経路により使用される。
【０２５２】
上記のこのような併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が同じ又は別個の組成物に含まれている）と、分離投与とを包含し、分離投与の場合、本発明の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子の投与は、追加的治療剤及び／又はアジュバントの投与に先立ち、同投与と同時に、及び／又は同投与に続いて行うことができる。
【０２５３】
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は、本発明の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子である。
【０２５４】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の腫瘍関連抗原に特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子を含む組成物を中に収容する第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性治療剤又はそれ以外の治療剤を含む組成物を中に収容する第２の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。
【０２５５】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器をさらに備えてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
表Ｂ（配列）：
2021506293.tif 000005
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【０２５６】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。抗体鎖のアミノ酸は、上記に定義されるように、Kabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））による番号付けシステムに従って番号付け及び参照される。
【０２５７】
以下の番号付き項目は、本発明の態様を説明するものである。
項目１．がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２．腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、項目１の方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目３．腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子とＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体とが、単一の組成物中で一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中で別々に投与される、項目１又は２の方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目４．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と相乗的に作用する、項目１から３の方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目５．少なくとも一つのＩＣＯＳ−Ｌ又はその断片を含む、項目１から４のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目６．配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む少なくとも一つのＩＣＯＳ−Ｌを含む、項目１から５のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目７．ＩＣＯＳにアゴニスト結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、項目１から４のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目８．配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトＩＣＯＳにアゴニスト結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、項目１から４のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目９．抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子である、項目１から８のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１０．（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、
ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、
項目１から９のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１１．配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＦＡＰに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、項目１から１０のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１２．（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、項目１から４又は７から１１のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１３．配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、項目１から４又は７から１２のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１４．ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、項目１から１３のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１５．Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、項目１から１４のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１６．配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び、配列番号３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むか、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む一つの軽鎖を含む、項目１から４又は７から１５のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１７．腫瘍関連標的に対する一価の結合及びＩＣＯＳに対する二価の結合を含む、項目１から４又は７から１５のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１８．配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む、項目１から４又は７から１５又は１７のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目１９．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、項目１から１８のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２０．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、項目１から１９のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２１．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、（ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）と、（ｉｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）とを含む第１の抗原結合ドメインを含む、項目１から２０のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２２．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む、項目１から２１のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２３．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、  （ａ）（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むか、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む
第２の抗原結合ドメインを含む、項目１から２２のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２４．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含むか、又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む、項目１から２３のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２５．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む、項目１から２４のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２６．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、項目１から２５のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２７．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、（ａ）配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４配列番号６５のアミノ酸配列を含む、項目１から２５のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２８．腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて使用される、項目１から２７のいずれか一つの方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目２９．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である、項目２８の方法における使用のための腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目３０．疾患、特にがんの、併用治療、連続治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子と、薬学的に許容される添加物とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と、薬学的に許容される添加物とを含む第２の組成物を含む薬学的製品。
項目３１．腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物。
項目３２．固形腫瘍の治療における使用のための項目３１の薬学的組成物。
項目３３．腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群より選択される、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目３４．腫瘍関連抗原がＦＡＰである、項目３３の腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目３５．（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、
ＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、
項目３３又は３４の腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目３６．アゴニストＩＣＯＳ結合分子が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むか、又はＦＡＰに特異的に結合することのできる抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、項目３３から３５のいずれか一つの腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目３７．（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳに特異的に結合することのできる少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、項目３３から３６のいずれか一つの腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目３８．配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、項目３３から３７のいずれか一つの腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目３９．ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、項目３３から３８のいずれか一つの腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目４０．Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、項目３３から３９のいずれか一つの腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目４１．配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、項目３３から４０のいずれか一つの腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目４２．腫瘍関連標的に対する一価の結合及びＩＣＯＳに対する二価の結合を含む、項目３３から４０のいずれか一つの腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
項目４３．配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖を含む、項目３３から４０又は４２のいずれか一つの腫瘍関連抗原に結合する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子。
【実施例】
【０２５８】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることを理解されたい。
【０２５９】
組み換えＤＮＡ技術
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., （1991） Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242.
【０２６０】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２６１】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／配列決定ベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２６２】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology （2000）, Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. （eds.）, John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０２６３】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ＰＢＳ中又は２０ｍＭのヒスチジン（１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中の単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要な場合）、−２０℃又は−８０℃で冷凍し、保存した。試料の一部が、その後のタンパク質分析、及び例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析による分析的特徴付けのために提供された。
【０２６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示書に従って使用した。特に、１０％若しくは４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２６５】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−システムで２倍のＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に塗布した。ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分により、溶出したタンパク質を定量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１-１９０１が標準として機能した。
【０２６６】
質量分析
このセクションでは、正確な集合に重きを置いて、ＶＨ／ＶＬ交換を含む多重特異性抗体（ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）の特徴を説明する。予測される一次抗体を、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂの、及び脱グリコシル化／プラスミン消化された又は別の方法で脱グリコシル化／限定されたＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂの、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析した。
【０２６７】
ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂを、３７℃で最大１７時間、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、リン酸又はＴｒｉｓバッファー中Ｎ−ＧグリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂで、それぞれ室温で１２０時間、及び３７℃で４０分間、行った。質量分析の前に、セファデックス  Ｇ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨＰＬＣを介して、試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上のＥＳＩ−ＭＳを介して、総質量を決定した。
【０２６８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いた、対応抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定
生成された抗体の、対応抗原に対する結合が、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる表面プラズモン共鳴により調査される。簡潔には、親和性の測定のために、Ｇｏａｔ−抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ  １０９−００５−０９８抗体を、対応抗原に対する抗体の提示のためのアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合は、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐｈ  ７．４）中において、２５℃（又は代替的に３７℃）で測定される。抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製）は、溶液中様々な濃度で加えた。８０秒から３分の抗原注入により会合を測定し；３〜１０分間にわたりＨＢＳバッファーでチップ表面を洗浄することにより解離を測定し、ラングミュア１：１結合モデルを用いてＫＤ値を測定した。システム固有のベースラインドリフトを補正するため及びノイズシグナル低減のために、ネガティブコントロールデータ（例えば緩衝曲線）が試料曲線から差し引かれる。センサーグラムの分析のため及び親和性データの計算のために、それぞれのＢｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアが使用される。
【０２６９】
実施例１
ＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及びＦＡＰに対する一価の結合を有する二重特異性抗体の生成
ＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及びＦＡＰに対する一価の結合を有する、以下の二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体を、それぞれ図１Ａ−１Ｃに示すように調製した。
Ａ）ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１、ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、一価のＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）、一価のＦＡＰ（４Ｂ９）（図１Ａ、配列番号２８−３１）
Ｂ）ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１＿ＨＴ、ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、一価のＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）、一価のＦＡＰ（４Ｂ９）（重鎖Ｃ領域のｃ末端融合）（図１Ｂ、配列番号２９、３２、６６）
Ｃ）ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿２＋１、ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、二価のＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）、一価のＦＡＰ（４Ｂ９）（図１Ｃ、配列番号２９、２９、３２）
【０２７０】
実施例１Ａにおいて、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１コンストラクトのＨＣ１は、以下の成分：抗ＩＣＯＳのＶＨＣＨ１（ＪＭＡｂ１３６）と、それに続くＦｃホールから構成されていた。ＨＣ２は、抗ＦＡＰ（４Ｂ９）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃノブから構成されていた。
【０２７１】
実施例１Ｂでは、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１＿ＨＴコンストラクトのＨＣ１は、以下の成分：Ｆｃホールから構成されており、そのＣ末端には抗ＦＡＰバインダー（４Ｂ９）のＶＨが融合していた。ＨＣ２は、抗ＩＣＯＳのＶＨＣＨ１（ＪＭＡｂ１３６）と、それに続くＦｃノブから構成されており、そのＣ末端には抗ＦＡＰバインダー（４Ｂ９）のＶＬが融合していた。
【０２７２】
実施例１Ｃでは、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿２＋１コンストラクト（実施例１Ｃ）のＨＣ１は、以下の成分：抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃホールから構成されており、そのＣ末端には抗ＦＡＰバインダー（４Ｂ９）のＶＨが融合していた。ＨＣ２は、抗ＩＣＯＳのＶＨＣＨ１（ＪＭＡｂ１３６）と、それに続くＦｃノブから構成されており、そのＣ末端には抗ＦＡＰバインダー（４Ｂ９）のＶＬが融合していた。
【０２７３】
ＩＣＯＳバインダーについて、クローンＪＭＡｂ１３６のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許公開第２００８／０１９９４６６号に記載されているものと同一であった。
【０２７４】
ＦｃノブとＦｃホール鎖との組み合わせは、ヘテロダイマーの生成を可能にする。国際公開ＷＯ２０１２／号に記載の方法に従って、Ｆｃγ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。
【０２７５】
二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列は、表１、２及び３にそれぞれ見ることができる。
【０２７６】
標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ分子コード化配列を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターからの挿入物の発現を促進し且つＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡ配列を含むプラスミドベクター中にクローニングした。加えて、ベクターには、プラスミドのエピソーム維持のためのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ｏｒｉＰ配列が含まれていた。
【０２７７】
二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、１：１：１：１の比で（Ａ：「ＶＨＣＨ１（ＪＭＡｂ１３６）−  Ｆｃノブ鎖」：「ＶＬＣＬ（ＪＭＡｂ１３６）軽鎖」：「ＶＨＣＨ１（４Ｂ９）−  Ｆｃホール鎖」：「ＶＬＣＬ（４Ｂ９）軽鎖」）、又は１：１：１の比で（Ｂ：「ＶＨＣＨ１（ＪＭＡｂ１３６）−Ｆｃノブ鎖−ＶＨ（４Ｂ９）」：「Ｆｃホール鎖−ＶＬ（４Ｂ９）」：「ＶＬＣＬ（ＪＭＡｂ１３６）軽鎖」）又は１：１：２の比で（Ｃ：「ＶＨＣＨ１（ＪＭＡｂ１３６）−Ｆｃノブ鎖−ＶＨ（４Ｂ９）」：「ＶＨＣＨ１（ＪＭＡｂ１３６）−Ｆｃホール鎖−ＶＬ（４Ｂ９）」：「ＶＬＣＬ（ＪＭＡｂ１３６）軽鎖」）、対応する発現ベクターを用いてトランスフェクトした。
【０２７８】
５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成の場合、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、これらの細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。ＤＮＡの最終量が２００μｇになるように、発現ベクターを２０ｍＬ  ＣＤ−ＣＨＯ培地で混合した。５４０μｌのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。
【０２７９】
その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１６０ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ  ２９３（Ｓｉｇｍａ）培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの翌日、１ｍＭのバルプロ酸と、サプリメントを含む７％のＦｅｅｄとを添加した。７日間の培養後、上清を、２１０×ｇでの１５分間の遠心分離により収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルタ）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に保った。
【０２８０】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、バッファーを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、１５カラム容積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．０）でつくられた塩化ナトリウムの直線ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を用いて溶出した。次いでカラムを、１０カラム容積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．０）で洗浄した。収集された画分のｐＨは、１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることにより調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ５０／６００Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【０２８１】
精製された二重特異性コンストラクトのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。この二重特異性コンストラクトの純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（ノギス）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の有無に関わらずＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。二重特異性コンストラクトの凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７）の２５℃のランニングバッファー中で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
表１−二重特異性１＋１  ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡのアミノ酸配列（図１Ａ）
2021506293.tif 000027
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表２−二重特異性１＋１ヘッドトゥーテールＦＡＰ（４Ｂ９）標的化抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡのアミノ酸配列（図１Ｂ）
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表３−二重特異性２＋１  ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡのアミノ酸配列（図１Ｃ）
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【０２８２】
実施例２
ＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及び非標的化部分を有する二重特異性抗体（コントロール分子）の生成
ＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合を有し、非標的化部分を含む以下の二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体を、標的化フォーマットと同様に、それぞれ図１Ｄ及び１Ｅに示すように調製した。
Ａ）ＤＰ４７−ＩＣＯＳ＿１＋１、ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、一価のＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）、一価のＤＰ４７（図１Ｄ、配列番号２８，２９、６７及び６８）
Ｂ）ＤＰ４７−ＩＣＯＳ＿２＋１、ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、二価のＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）、一価のＤＰ４７（図１Ｅ、配列番号２９、６９及び７０）
【０２８３】
この実施例では、ＤＰ４７−ＩＣＯＳ＿１＋１コンストラクトのＨＣ１は、以下の成分、抗ＩＣＯＳ抗体としてのＪＭＡｂ１３６のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃホールから構成されていた。ＨＣ２は、非結合抗体としてＤＰ４７のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃノブから構成されていた。
【０２８４】
ＤＰ４７−ＩＣＯＳ＿２＋１コンストラクトのＨＣ１は、以下の成分：抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃホールから構成されており、そのＣ末端には非結合クローン（ＤＰ４７）のＶＨが融合していた。ＨＣ２は、抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃノブから構成されており、そのＣ末端には非結合クローン（ＤＰ４７）のＶＬが融合していた。
【０２８５】
非標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ分子は、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体に関して実施例１に記載されているように調製された。
表４−二重特異性１＋１非標的化ＤＰ４７抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡのアミノ酸配列
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表５：二重特異性２＋１非標的化ＤＰ４７抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡのアミノ酸配列（図１Ｅ）
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【０２８６】
ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）に対する一価若しくは二価の結合及びＦＡＰ（４Ｂ９）又は実施例１及び２に記載されるように生成されたＤＰ４７に対する一価の結合を有する二重特異性分子の生化学的分析の結果を表６にまとめる。
表６：二重特異性ＦＡＰ−ＩＣＯＳ又はＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子の生化学的分析
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【０２８７】
実施例３
ＦＡＰ標的化又は非標的化（コントロール）二価マウスＩＣＯＳリガンドコンストラクトの生成
ＦＡＰに対する一価の結合又は非標的化部分を含む以下の二重特異性マウスＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）コンストラクトを、図２Ａ及び２Ｂに示すように調製した。
２Ａ）ＦＡＰ標的化ｍＩＣＯＳＬ、ｍＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、二価のマウスＩＣＯＳＬ（Ｇｌｙ４７−Ｌｙｓ２７９）一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）（重鎖Ｃ領域のＣ末端融合）（図２Ａ、配列番号１８−１９）
２Ｂ）非標的化ｍＩＣＯＳＬ、ｍＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、二価のマウスＩＣＯＳＬ（Ｇｌｙ４７−Ｌｙｓ２７９）、一価の非標的化部分（重鎖Ｃ領域のＣ末端融合）（図２Ｂ、配列番号２０−２１）
【０２８８】
この実施例では、ＦＡＰ標的化ｍＩＣＯＳＬコンストラクトＨＣ１は、マウスＩＣＯＳＬ、マウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＫＫから構成されており、そのＣ末端には抗ＦＡＰバインダー（２８Ｈ１）のＶＨが融合していた。ＨＣ２は、マウスＩＣＯＳＬと、それに続くマウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＤＤから構成されており、そのＣ末端には抗ＦＡＰバインダー（２８Ｈ１）のＶＬが融合していた。
【０２８９】
ＩＣＯＳＬアミノ酸配列をＵｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＪＨＪ８から得て、そのＧｌｙ４７からＳｅｒ２７９までをクローニングに使用した。マウスＩＣＯＳリガンド（Ｇｌｙ４７−Ｓｅｒ２７９）のアミノ酸配列は、それぞれ表７に見ることができる。
【０２９０】
Ｆｃ  ＤＤとＦｃ  ＫＫ鎖との組み合わせは、ヘテロダイマーの生成を可能にする。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃγ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＤＡＰＧ変異を導入した。
【０２９１】
対応するｃＤＮＡｓを、従来の（非ＰＣＲベース）クローニング技術を使用してｅｖｉｔｒｉａのベクター中にクローニングした。ｅｖｉｔｒｉａベクタープラスミド遺伝子が合成された。プラスミドＤＮＡを、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づき、低エンドトキシン条件下で調製した。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍの波長での吸収を測定することにより決定された。配列の正確性を、サンガー配列決定（ｃＤＮＡのサイズに応じてプラスミド一つ当たり最大二つの配列決定反応を用いる）により検証した。
【０２９２】
懸濁に適応させたＣＨＯ  Ｋ１細胞（ＡＴＣＣから入手し、ｅｖｉｔｒｉａでの懸濁培養における無血清増殖に適応させた）を生成に使用した。種は、ｅｖｉＧｒｏｗ培地（既知組成の、動物性成分を含まない無血清培地）中で増殖させた。細胞に、ｅｖｉＦｅｃｔ（ｅｖｉｔｒｉａのカスタムメイドの特製トランスフェクション試薬）をトランスフェクトし、トランスフェクション後ｅｖｉＭａｋｅ２（動物性成分を含まない無血清培地）中で細胞を増殖させた。上清を、遠心分離後濾過（０．２μｍのフィルタ）することにより回収した。
【０２９３】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、バッファーを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、１５カラム容積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．０）でつくられた塩化ナトリウムの直線ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を用いて溶出した。次いでカラムを、１０カラム容積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．０）で洗浄した。収集された画分のｐＨは、１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ  トリス（ｐＨ８．０）を加えることにより調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ５０／６００Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【０２９４】
精製された二重特異性コンストラクトのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。この二重特異性コンストラクトの純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（ノギス）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の有無に関わらずＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。二重特異性コンストラクトの凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７）の２５℃のランニングバッファー中で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
表７−ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化ｍＩＣＯＳＬ、ｍＩｇＧ１  ＤＡＰＧのアミノ酸配列
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表８−ＤＰ４７−非標的化ｍＩＣＯＳＬ、ｍＩｇＧ１  ＤＡＰＧのアミノ酸配列
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【０２９５】
この実施例に記載されるように生成されたｍＩＣＯＳＬを含む二重特異性分子の生化学的分析の結果を表９にまとめる。
表９：二重特異性ＦＡＰ−ｍＩＣＯＳ−Ｌ又はＤＰ４７−ｍＩＣＯＳ−Ｌ分子の生化学的分析
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【０２９６】
実施例４
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製、精製及び特徴づけ
４．１  ヒト又はヒト化バインダーを用いたＴＣＢ抗体の調製
ＴＣＢ分子が、国際公開第２０１４／１３１７１２号又は同第２０１６／０７９０７６号に記載されている方法に従って調製された。
【０２９７】
実験に使用された抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡ  ＴＣＢ）の調製は、国際公開第２０１４／１３１７１２号の実施例３に記載されている。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」抗体であり、二つの異なる重鎖と二つの異なる軽鎖から構成される。ＣＨ３ドメインにおける点突然変異（「ノブ・イントゥ・ホール」）を、二つの異なる重鎖の集合を促すために導入した。ＣＤ３結合ＦａｂにおけるＶＨドメインとＶＬドメインの交換を、二つの異なる軽鎖の正確な集合を促すために行った。２＋１とは、分子が、ＣＥＡに特異的な二つの抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な一つの抗原結合ドメインとを有することを意味する。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢは、同じフォーマットを有しているが、別のＣＥＡバインダーを含み、軽鎖の正確なペアリングを支持するために、ＣＤ３バインダーのＣＨ及びＣＬドメインに点突然変異を含む。
【０２９８】
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ  ＴＣＢは、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む。２＋１フォーマットの二重特異性抗体の図式的スキームを図１Ｆに示す。
【０２９９】
４．２  ２＋１フォーマット（マウスＣＥＡに対して二価及びマウスＣＤ３に対して一価）での抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性抗体の調製
一つのＣＤ３−Ｆａｂ、及び二つのＣＥＡ−Ｆａｂ及びＦｃドメインからなる抗ＣＥＡ（ＣＨ１Ａ１Ａ  ９８／９９  ２Ｆ１）／抗ＣＤ３（２Ｃ１１）Ｔ細胞二重特異性２＋１サロゲート分子を調製した。ここで二つのＣＥＡ−ＦａｂはそれらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に結合しており、ＣＤ３−ＦａｂはそのＣ末端で一つのＣＥＡ−ＦａｂのＮ末端に結合している。ＣＤ３結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。
【０３００】
マウスサロゲート分子のＦｃドメインは、ｍｕ  ＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、ここに、特にGunasekaran et al.、J. Biol. Chem. 2010,19637-19646によって記載されているように、抗体のＦｃヘテロダイマー形成を強化するためにＤＤＫＫ変異が導入された。第１の重鎖のＦｃ部分は、変異Ｌｙｓ３９２Ａｓｐ及びＬｙｓ４０９Ａｓｐ（Ｆｃ−ＤＤと呼ばれる）を含み、第２の重鎖のＦｃ部分は、変異Ｇｌｕ３５６Ｌｙｓ及びＡｓｐ３９９Ｌｙｓ（Ｆｃ−ＫＫと呼ばれる）を含む。番号付けは、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従う。さらに、マウスＦｃガンマ受容体に対する結合を無効にするために、例えばBaudino et al. J. Immunol.(2008)、181、6664-6669、又は国際公開第２０１６／０３０３５０号に記載される方法に従って、ＤＡＰＧ変異を重鎖の定常領域に導入した。簡潔には、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｆｃ−ＤＤ及びＦｃ−ＫＫ重鎖の定常領域にＡｓｐ２６５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙ変異を導入した（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；即ちＤ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）。
表１０−マウス抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性抗体のアミノ酸配列
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【０３０１】
実施例５
５．１  ＰＢＭＣの単離
ＰＢＭＣを、健常なドナーの新鮮な血液から単離した。簡潔には、血液をＰＢＳで２：１に希釈した。約３０ｍｌの血液／ＰＢＳ混合物を、１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅの上に重層し、３０分間４５０ｇでブレーキをかけることなく遠心分離した。１０ｍｌのピペットを用いて、ＰＢＳを含む５０ｍｌの管にリンパ球を収集した。管を５０ｍｌまでＰＢＳで満たし、１０分間３５０ｇで遠心分離した。上清を棄て、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１０分間３００ｇで遠心分離した。洗浄工程を一度繰り返した。細胞を、１０％のＦＢＳと１％のＧｌｕｔａＭａｘを含むＲＰＭＩに再懸濁し、インキュベーター内で３７℃、５％  ＣＯ２で、アッセイの開始まで（２４時間以下）保存した。
【０３０２】
５．２  脾細胞の単離
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス又はｈＣＥＡ（ＨＯ）Ｔｇマウスの脾臓を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中に移し、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を各管に加えた。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて脾臓を解離し、すぐに管をスピンダウンし、細胞を１００μｍのナイロン製セルストレーナーに通した。その後、管を３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｒ７３８８）ですすぎ、８分間３５０×ｇで遠心分離した。上清を棄て、細胞懸濁液を７０μｍのナイロン製セルストレーナーに通し、培地で洗浄した。もう一度遠心分離（３５０×ｇ、８分）した後、上清を棄て、５ｍｌのＡＣＫ溶解バッファーを加えた。ＲＴでの５分のインキュベーション後、細胞をＲＰＭＩ培地で洗浄した。
【０３０３】
その後、細胞計数のために、細胞を再懸濁し、ペレットをアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ）にプールした（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ−Ｓｅｔｔｉｎｇｓ白血球、１：１０に希釈）。
【０３０４】
実施例６
健常なヒトＴ細胞部分母集団又は種々の腫瘍徴候の腫瘍浸潤リンパ球上のＩＣＯＳ発現
異なる腫瘍徴候のＴＩＬに対する、健常なＰＢＭＣ上の異なるＴ細胞集団に発現されるＩＣＯＳの相対強度を比較するために、マルチカラーフローサイトメトリーを使用してＩＣＯＳ発現を評価した。加えて、一部の患者について、ＰＢＭＣを腫瘍組織に隣接する正常組織から単離し、ＩＣＯＳ発現を同様に評価した（図５Ａから５Ｄ）。腫瘍試料を、以下の徴候から取得した：膵臓がん（ＰａｎｃＣａ）、リンパ節転移（膣部）、陰茎腺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、黒色腫、中皮腫、肉腫様軟組織新生物、傍心臓腫瘍リンパ節、卵巣がんの結腸転移、精上皮腫、頭頚部がん、胸腺腫（Ｔｈｙｍｏｍ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、腺様嚢胞癌の肺転移、腎臓がん、肝腺癌の直腸転移、小腸がん、脂肪性軟組織腫瘍、及び肺がん（ＬＣ）。
【０３０５】
６．１  ヒト腫瘍組織又は隣接する正常組織試料の分解消化
腫瘍組織又は正常組織由来のＴ細胞上でのＩＣＯＳ発現の分析のために、試料を分解消化し、単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。
【０３０６】
簡潔には、４．４ｍｌの組織保存溶液（＃１３０−１００−００８、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、５ｍｌのＡｃｃｕｔａｓｅ（＃Ａ６９６４、Ｓｉｇｍａ）、３３３μｌの１％ＢＳＡ（＃Ａ９５７６、Ｓｉｇｍａ）及び２６０μｌの酵素混合物（２７５Ｕ／ｍｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ、＃ＬＳ００４１８９、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、１０Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  Ｔｙｐｅ  ４、＃１０Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  Ｔｙｐｅ  ４、Ｓｉｇｍａ及び４７１Ｕ／ｍｌ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ＃Ｈ６２５４、Ｓｉｇｍａ）を用いて分解消化混合物を調製した。
【０３０７】
腫瘍、それぞれの隣接正常組織片を室温で小片に切断し、回転デバイスを使用して分解消化混合物中で４０分間３７℃でインキュベートした。７０μｍのセルストレーナー（＃３５２３５０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、細胞をさらに分離した。セルストレーナーを、１０ｍｌの冷ＰＢＳ（＃３５２３５０、ＧＩＢＣＯ）で洗浄し、細胞懸濁液を１０分間２５０×ｇで４℃で遠心分離した。冷ＰＢＳでのさらなる洗浄工程の後、続いて上述のような遠心分離を行い、細胞ペレットを５から１５分間１×のＰｈａｒｍＬｙｓｅバッファー（＃５５５８９９、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中において室温でインキュベートすることにより赤血球を溶解した。冷ＰＢＳの付加及び１０分間２５０×ｇ及び４℃での遠心分離により溶解を停止させた。細胞を、冷ＰＢＳを用いて２回目の洗浄を行い、トリパンブルー染色を使用して生存細胞の数を決定した。
【０３０８】
６．２  ヒト腫瘍組織又は隣接する正常組織試料の分解消化
健常なドナー由来のヒトＴ−細胞、ＴＩＬ又はがん患者の正常組織から単離されたＴ細胞上でのＩＣＯＳの発現レベルを以下のように決定した：５−３０万個の細胞を、ＰＢＳ及び５分間３５０×ｇでの遠心分離を用いて洗浄した。生存細胞と死細胞を区別するため、ＰＢＭＣをＺｏｍｂｉｅ  ＵＶ（＃４２３１０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて２０分間室温でインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ及びＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．２５％ナトリウムアシド（ａｃｉｄｅ）含有）を用いて洗浄し、ＣＤ４（＃３１７４３８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（＃３０１０４４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＩＣＯＳ（＃３１３５２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）について２０分間室温で染色した。ＦＡＣＳバッファーでの二回の洗浄工程の後、２％  ＰＦＡ含有ＰＢＳ中で１５分間室温で細胞をインキュベーションすることにより、染色を固定した。細胞をＦＡＣＳバッファーで一回洗浄し、フローサイトメトリー（Ｄｉｖａソフトウェアを備えるＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ機器）により分析した。
【０３０９】
実施例７
腫瘍患者の末梢Ｔ細胞及びＴＩＬ上におけるＩＣＯＳのＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性上方制御（ＦＡＣＳ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＴ−細胞のＴＣＢ媒介性活性化時のヒトＩＣＯＳの発現増強を、フローサイトメトリーにより評価した（図３Ｅ−３Ｈ）。簡潔には、２０万個のＰＢＭＣ又は結腸転移を有する卵巣がん患者から単離したＴＩＬ（６．６．１及び６．４）を、１０％ＦＣＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１×ＮＥＡＡ＋Ｐｅｎ／連鎖球菌を含むＤＭＥＭに再懸濁し、平底９６ウェルプレートを使用して４万個のＣＥＡ発現Ｌｏｖｏ腫瘍細胞（＃ＣＣＬ−２２９、ＡＴＣＣ）及び１０ｎＭのＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢと共にインキュベートした。
【０３１０】
別の実施例（図４Ａ及び４Ｂ）では、健常なドナーの２５万個のＰＢＭＣを、２万５千個のＣＥＡ陽性ＭＫＮ４５及び様々な濃度のＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ（０．１ｐＭから２０ｎＭ）と共に４８時間平底９６ウェルプレートにおいてインキュベートした。表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８及びＩＣＯＳの染色後、ＩＣＯＳの上方制御を、３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーション後に評価した。これについて後述する。
【０３１１】
ＰＢＭＣを、アッセイプレートから回収し、その後の４℃での染色のために新しい丸底９６ウェルプレートに移した。細胞をＦＡＣＳバッファーで一回洗浄し、次いで製造者の指示に従って抗ヒトＣＤ４（＃３００５０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ８（＃３４４７２２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ２５（＃３５６１２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ６９（＃３１０９３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及び抗ヒトＩＣＯＳ（＃３１０９３１  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して３０分間４℃で染色した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーを使用して二回洗浄し、２％  ＰＦＡを含むＦＡＣＳバッファー中で１５分間室温で固定した。ＦＡＣＳバッファーを用いた一回の洗浄工程後、細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａマシンを使用して分析した。
【０３１２】
実施例８
マウス脾細胞上でのマウスＩＣＯＳのマウスＣＥＡ−ＴＣＢ媒介性上方制御（ＦＡＣＳ）
ｅｘ  ｖｉｖｏでのマウスＴ細胞のＴＣＢ媒介性活性化時のマウスＩＣＯＳの発現増強を、フローサイトメトリーにより評価した（図５Ａ−５Ｆ）。このために、実施例１４に記載されるように、古典的な腫瘍細胞溶解実験を実施した。４８時間後、脾細胞を回収し、その後の染色のために新しい丸底９６ウェルプレートに移した。
【０３１３】
細胞を、ＰＢＳで一回洗浄し、ＵＶ  Ｚｏｍｂｉｅ染料（＃４２３１０８  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して染色し、ＰＢＳ中で  ３０分間４℃で１：１０００に希釈した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーで二回洗浄し、表面染色を、製造者の指示に従って抗マウスＴＣＲ（＃１０９２２８  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＩＣＯＳ（＃１３５２２０  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＣＤ４（＃１００４２２  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＣＤ８（＃１００７４７  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、３０分間４℃で実施した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーで二回洗浄し、３０−４５分間室温での光から保護したＰｅｒｍ／Ｆｉｘバッファー（＃４２１４０３  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の付加により、細胞内染色を開始させた。細胞を、Ｐｅｒｍバッファー（＃４２１４０２  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で三回洗浄し、抗マウスＦｏｘＰ３を含有するＰｅｒｍバッファー（＃３２００１４  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中で染色した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーを使用して二回洗浄し、２％ＰＦＡを含むＦＡＣＳバッファー中で１５分間室温で固定した。ＦＡＣＳバッファーを用いた一回の洗浄工程後、細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａマシンを使用して分析した。
【０３１４】
実施例９
ＦＡＰ及びＩＣＯＳ発現細胞に対するＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳ−Ｌと、それぞれの非標的化参照分子の結合
実施例１及び２において調製された複数のＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子の結合を、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９を発現するヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を使用して試験した。この細胞株は、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択下においてｈｕＦＡＰを発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９２１を用いたマウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）のトランスフェクションにより生成された。ヒトＩＣＯＳに対する結合を、活性化ヒトＴ細胞を用いて試験した。
【０３１５】
さらに、実施例３で調製されたｍＩＣＯＳ−Ｌ標的化二重特異性分子を、３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞（親細胞株ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−９２、マウスＦＡＰを安定に過剰発現するよう修飾）を使用して、マウスＦＡＰ（ｍＦＡＰ）に対するそれらの結合について試験し、マウスＩＣＯＳ発現細胞に対する結合を、ＣＨＯ  ｍＩＣＯＳ（親細胞株ＣＨＯ−ｋ１  ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１、マウスＩＣＯＳを安定に過剰発現するように修飾）を使用して試験した。簡潔には、細胞を回収し、カウントし、生存率をチェックして、ＦＡＣＳバッファー（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中１ｍｌあたり１００万個の細胞に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（１０万個の細胞を含む）を、漸増濃度のＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ又はｍＩＣＯＳ−Ｌコンストラクト（Ｔ細胞／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞に対するＦＡＰ−ＩＣＯＳコンストラクトの結合については７ｐＭ−１２０ ｎＭ、ｍＩＣＯＳ−Ｌコンストラクトの結合についてはそれぞれ４ｐＭ−３００ｎＭ）と共に丸底９６ウェルプレートで３０分間４℃でインキュベートし、細胞を、冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで二回洗浄し、ＰＥにコンジュゲートした、ロバ抗ヒトＨ＋Ｌ  ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ＃７０９−１１６−１４９）と共にさらに３０分間４℃で再インキュベートし、冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで二回洗浄した。染色を、１ウェルあたりＦＡＣＳバッファー中７５μｌの１％ＰＦＡを使用して暗所で２０分間４℃で固定した。蛍光を、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ソフトウェアＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を使用してＦＡＣＳにより分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して結合曲線を取得した。それらを図６Ａ−６Ｃ及び７Ａ−７Ｂにそれぞれ示す。
【０３１６】
ヒトＩＣＯＳ及びヒトＦＡＰ発現細胞に対する異なるＦＡＰ−又はＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子の結合により決定したＥＣ５０値を表１１に示し、マウスＩＣＯＳ発現ＣＨＯトランスフェクタント及びマウスＦＡＰ発現３Ｔ３細胞に対するＦＡＰ−ｍＩＣＯＳ−Ｌの結合について決定したＥＣ５０値を下の表１２に示す。
表１１：ヒトＩＣＯＳ及びヒトＦＡＰ発現細胞に対する異なるＦＡＰ−又はＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０値
2021506293.tif 000045
表１２：ＥＣ５０値、マウスＩＣＯＳ発現ＣＨＯトランスフェクタント及びマウスＦＡＰ発現３Ｔ３細胞に対するＦＡＰ−ｍＩＣＯＳ−Ｌの結合
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【０３１７】
実施例１０
ＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ、それぞれのｍＩＣＯＳ−Ｌ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能的特徴づけ
複数の細胞ベースｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、ＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ又はｍＩＣＯＳ−Ｌ分子の活性を、それらの対応する非標的化（ＤＰ４７）参照分子との対比で評価した。
【０３１８】
このアッセイは、Ｔ細胞のＴ細胞二重特異性−（ＴＣＢ）媒介性の活性化の存在下においてさらなるアゴニスト／共刺激分子性の活性抗ＩＣＯＳ二重特異性分子を示すために設計された。
１．Ｊｕｒｋａｔアッセイ（ＣＤ３／ＴＣＲとＩＣＯＳの結合時に誘導される、ルシフェラーゼのＮＦＡＴ調節発現を有するレポーター細胞株）。ＩＣＯＳ  ＩｇＧ分子が、プレート結合と溶液中との対比で及びコートされたＣＤ３  ＩｇＧ刺激の非存在下と存在下との対比で測定される。
２．一次ヒトＰＢＭＣ共培養アッセイ。Ｔ細胞上のヒトＩＣＯＳとヒトＦＡＰへの同時結合により架橋され、３Ｔ３−ｈＦＡＰ細胞（親細胞株ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−９２、ヒトＦＡＰを安定に過剰発現するように修飾）上に発現されるＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ分子が、Ｔ細胞上のＣＤ３と腫瘍細胞上のヒトＣＥＡへの同時結合により架橋されているＴＣＢ分子の存在下において試験された。ＦＡＰ標的化架橋ＩＣＯＳ分子と非標的化ＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子とを、ＴＣＢ分子及びＣＥＡ陽性腫瘍細胞の非存在下と存在下とにおいて、溶液中で測定した。フローサイトメトリーによって決定したＴ細胞活性化，Ｔ細胞分化又はＴ細胞増殖を、読み出し情報として取得した。
３．一次マウス脾細胞共培養アッセイ。Ｔ細胞上のマウスＩＣＯＳとマウスＦＡＰへの同時結合により架橋され、３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞（親細胞株ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−９２、マウスＦＡＰを安定に過剰発現するように修飾）上に発現されるＦＡＰ標的化ｍＩＣＯＳ分子が、マウスＴ細胞上のｍＣＤ３とＭＣ３８−ｈＣＥＡ腫瘍細胞上のヒトＣＥＡへの同時結合により架橋されているＴＣＢ分子の存在下において測定された。
【０３１９】
実施例１１
Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株アッセイ
同時ＴＣＲ係合への依存性を、ＮＦＡＴ核転座に応答してルシフェラーゼを発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞株を使用して評価した。
【０３２０】
ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＣＳ１７６５０１）レポーター細胞株を事前活性化し、ＪｕｒｋａｔＮＦＡＴ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＧｌｕＭａｘ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１×ＮＥＡＡ、１％Ｓｏ−Ｐｙｒｕｖａｔｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地；選択：２００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシン  Ｂ）において、１．５μｇ／ｍｌのａＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１７３０４）及び２μｇ／ｍｌのａＣＤ２８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２９１４）でコートした細胞培養フラスコを使用してＩＣＯＳ発現を誘導した。
【０３２１】
アッセイの前に、細胞を一晩飢餓状態にした（ＪｕｒｋａｔＮＦＡＴ培地、刺激なし）。アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、９６ウェル、白色壁、透明底；＃６５５０９８）を、０．５μｇ／ｍｌのａＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１７３０４）＋ＦＡＰ−ＩＣＯＳ／ＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子又はＦＡＰ−ＩＣＯＳ／ＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子のみと同時に、示された濃度で（３回で４ｐＭ−６５０００ｐＭの範囲）コートした。翌日、プレートを、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４１９０１３６）で一回洗浄し、１０万個の刺激して飢餓状態にしたＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２Ｐを加えた。ＮＦＡＴ媒介性シグナル伝達を、３７℃、５％ＣＯ２での５時間のインキュベーションの後、製造者の指示に従ってＰｒｏｍｅｇａ  ＯｎｅＧｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６１２０）を使用し、発光読み取りにより評価した。プレートは、Ｔｅｃａｎ  Ｓｐａｒｋ１０Ｍ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（発光読み取り、１０００ｍｓ積分時間刻み、自動減衰設定）で読み取った。
【０３２２】
実施例１２
一次ヒトＰＢＭＣ共培養アッセイ
ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子とを組み合わせることにより媒介された、Ｔ細胞活性化，Ｔ細胞増殖又はＴ細胞分化の増強を、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ  ＃ＡＣＣ  ４０９）細胞及びｈｕＦＡＰ発現線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９）上で評価した。
【０３２３】
ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。Ｔ細胞活性化を４８時間後に、Ｔ細胞の増殖及び分化をＦＡＰ−ＩＣＯＳ及びＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢを用いた９６時間のインキュベーションの後に、検出した。簡潔には、実験の一日前に、付着した標的細胞及び線維芽細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して１００００個の細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バフィーコート（「Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｚｕｒｉｃｈ」）から取得したヘパリン添加血液の富化したリンパ球調製物のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１０７７１−５００ＭＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７）密度遠心分離により調製した。この血液を滅菌ＤＰＢＳで１：２に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含有する界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて二度洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。結果として得られたＰＢＭＣ集団を自動的にカウントし（Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓ）、アッセイを開始するまで加湿したインキュベーター内で、１０％ＦＣＳ及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ３５０５００６１）に３７℃で貯蔵した。Ｔ細胞活性化（図９Ａ−９Ｈ）を測定するために、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子を示された濃度（３回で０．１１ｐＭ−５０００ｐＭの範囲）で加え、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢを固定濃度（８０ｐＭ）で加えた。コントロールとして、ＴＣＢ分子のみ又はＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子のみを含むウェルを含めた。Ｔ細胞の増殖及び分化のために（図１０Ａ及び１０Ｂ）、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢを漸増濃度（３回で１．２８ｐＭ−２００００ｐＭの範囲）で加え、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子を固定濃度（１０００ｐＭ）で加えた。
【０３２４】
ＰＢＭＣを標的細胞及び繊維芽細胞に、最終的なＥ：Ｔ比が５：１：１となるように加えた。Ｔ細胞活性化を、３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーションの後に、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（早期活性化マーカー）及びＣＤ２５（後期活性化マーカー）を認識する抗体を使用してフローサイトメトリー分析によって評価した。Ｔ細胞増殖を、３７℃、５％ＣＯ２での９６時間のインキュベーションの後に、Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓに正規化したＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の絶対数を使用して、フローサイトメトリー分析により評価した。Ｔ細胞分化を、３７℃、５％ＣＯ２での９６時間のインキュベーションの後に、メモリーサブセットを区別するためのＣＤ４５Ｒ０及びＣＣＲ７に対する抗体を使用して、フローサイトメトリー分析により評価した。
【０３２５】
簡潔には、ＰＢＭＣを、４００×ｇで４分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡ（ＦＡＣＳバッファー）を含むＰＢＳで二回洗浄した。ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ８ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３０１０３２）、ＣＤ４（ＡＰＣ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３００５１８）、ＣＤ６９（ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１０９３０）、ＣＤ２５（ＰＥ抗ヒトＣＤ２５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３５６１０４）、ＣＤ４５Ｒ０（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４５ＲＯ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３０４２１０）及びＣＣＲ７（ＦＩＴＣ  抗ヒトＣＣＲ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３５３２１６）の表面染色を、供給者の指示に従って実施した。Ｔ細胞の絶対数を、製造者の指示に従ってＣｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔ  Ｂｅａｄｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃４２４９０２）を使用して取得した。次いで細胞を、０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで二回洗浄し、１％ＰＦＡを含む７５μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーを使用して１５−３０分間４℃で固定した。遠心分離後、試料を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。
【０３２６】
実施例１３
一次マウス脾細胞共培養アッセイ
ｍＩＣＯＳ−Ｌ分子の存在下又は非存在下で、マウス脾細胞エフェクター細胞及びヒトＣＥＡ発現ＭＣ３８−ｈＣＥＡ標的細胞（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９７５、３５：２４３４−２４４０に記載の親細胞株、ヒトＣＥＡを安定に過剰発現するように社内で修飾した３Ｔ３）の共インキュベーション時にｍＣＥＡ−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化を、以下のように評価した（図１１Ａ及び１１Ｂ）：
【０３２７】
ｈＣＥＡ（ＨＯ）トランスジェニックＣ５７／ＢＬ６マウス又はＣ５７／ＢＬ６野生型マウス（６．５）の脾臓から単離された１２５万個の脾細胞を、平底９６ウェルプレートの１ウェルあたり２５０００個の事前に播種したＭＣ３８−ｈＣＥＡ腫瘍標的細胞に加えた。固定濃度１．５ｎＭのｍＣＥＡ−ＴＣＢ及び５０ ｎＭのＦＡＰ標的化又は非標的化ＤＰ４７−ｍＩＣＯＳ−Ｌ分子を加え、アッセイプレートを、加湿したインキュベーター内のＴ細胞培地（１０％ＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ  ＃３５０５００６１）、５０ｍＭ×β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、＃Ｍ３１４８−１００）、２００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、１×抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５２４００６２）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１３６００７０）を含むＲＰＭＩ１６４０）において４８時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０３２８】
実施例１４
ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとの組み合わせでのＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能的特徴づけ
１４．１  ＮＳＧマウスにおける単回注射後のＦＡＰ−ＩＣＯＳ（１＋１）の薬物動態プロファイル
ＦＡＰ−ＩＣＯＳ（１＋１）の２．５ｍｇ／ｋｇの単回用量をＮＳＧマウスに注射した。すべてのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液（表１２、ＦＡＰ−ＩＣＯＳ）をヒスチジンバッファーで希釈した。１０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、６日、８日、１０日及び１２日目に、一つの時点につき三匹のマウスから採血した。注射した化合物を、血清試料中においてＥＬＩＳＡにより分析した。分子の検出を、ｈｕＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより実行した（ヒトＦｃ抗体部分を介した検出）。各工程後にプレートを三回洗浄して未結合の物質を除去した。最後に、ペルオキシダーゼに結合した複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えることにより可視化して、有色反応生成物を形成した。４０５ｎｍ（参照波長４９０ｎｍ）で測光法により決定された反応生成物の強度は、血清試料中の被分析物濃度に比例していた。結果（図１２）は、安定なＰＫ挙動（Ｔ１／２：９．５２日）を示し、その後の有効性試験に週一回のスケジュールが示唆された。
表１３：試験組成物の説明
2021506293.tif 000047
【０３２９】
１４．２  完全ヒト化ＮＯＧマウス３Ｔ３−ｈｕＦＡＰを共移植したＭＫＮ４５におけるＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとの組み合わせでのＦＡＰ−ＩＣＯＳ（１＋１）のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
ＦＡＰ−ＩＣＯＳとＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとの組み合わせに関する最初の概念実証研究は、完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍縮小及びＩｍｍｕｎｏ−ＰＤの観点からの可能性を理解することを目的としていた。
【０３３０】
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、最初ＡＴＣＣから取得し、拡大後にＧｌｙｃａｒｔ社内細胞銀行に寄託した。細胞を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中において、３７℃で１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。生存率９７％で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代１２を皮下注射に使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は、最初ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−９２）から取得し、Ｒｏｃｈｅ  ＮｕｔｌｅｙにおいてヒトＦＡＰを発現するように操作し、１０％ウシ血清、１ｘピルビン酸ナトリウム及び１．５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。クローン３９を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代番号１８で、生存率９８．２％で使用した。
【０３３１】
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１ｘ１０６のＭＫＮ４５細胞＋１ｘ１０６の３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を、２２Ｇから３０Ｇの針を用いて麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
【０３３２】
実験開始時に週齢４−５の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定病原体感液防止条件下に維持した。実験研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された（Ｐ２０１１１２８）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３３３】
雌ＮＯＧマウスに１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、続いて翌日臍帯血から単離された１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈内注射した。幹細胞注射の１４−１６週後、マウスの舌下から採血し、血液を、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーにより分析した。効率的に移植されたマウスを、それらのヒトＴ細胞頻度に従って異なる治療群に無作為化した。この時、記載されるように（図１３）マウスに腫瘍細胞及び線維芽細胞を皮下注射し、化合物又はヒスチジンバッファー（ビヒクル）で週一回治療したところ、腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に到達した（２３日目）。すべてのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液（表１３）を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ＦＡＰ−ＩＣＯＳ及びＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとの併用療法の場合（Ｃ群、図１３）、それぞれの組成物を同時に注射した。腫瘍増殖をノギスを使用して週に二回測定し（図２）、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
【０３３４】
終了時（４４日目）、マウスを屠し、腫瘍及び脾臓を除去し、重量を測定し、その後のＦＡＣＳ分析のためにコラーゲナーゼＶ、ディスパーゼＩＩ及びＤＮａｓｅを用いた酵素消化を通して単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞をヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３（細胞内）について染色し、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。
【０３３５】
腫瘍組織の小片（３０ｍｇ）を急速冷凍し、全タンパク質を単離した。タンパク質懸濁液を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ分析によりサイトカイン含有量について分析した。
【０３３６】
図１４Ａ−１４Ｅは、すべての治療群における腫瘍増殖の動態（平均値）と、試験終了時点での腫瘍重量とを示している。単剤としてのＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢは、いくらかの腫瘍増殖阻害を誘導した。しかしながら、ＦＡＰ−ＩＣＯＳとの組み合わせは、有意に改善された腫瘍増殖の阻害を示し、それは試験終了時の腫瘍重量にも反映されていた。興味深いことに、試験終了時に屠殺した動物由来の腫瘍のＩｍｍｕｎｏ−ＰＤデータ（図１５Ａ−１５Ｄ）により、腫瘍組織に特異的に、ヒトＴｒｅｇ細胞の減少が明らかになった。治療した動物の脾臓に減少は検出されなかった（図１５Ｃ及び１５Ｄ、フローサイトメトリー）。Ｔｒｅｇの減少は、併用治療においてＣＤ８／ＴｒｅｇをＣＤ８細胞の方にシフトさせた。
【０３３７】
さらに、サイトカイン分析は、併用群における腫瘍組織内部のＣＸＣＬ１３、ＴＮＦ−α及びＣＣＬ３の評価レベルを示した（図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃ）。
表１４：試験組成物の説明
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【０３３８】
実施例１５
遺伝子発現分析
ＩＣＯＳ調節遺伝子を同定するため、ヒト化ＮＳＧマウスにおける上記有効性試験の腫瘍組織（実施例１４）を、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｎｅｌ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
【０３３９】
簡潔には、新規の冷凍ヒト化マウス腫瘍組織（３０−７０ｍｇ）を破裂させ、ＲＮＡ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で均質化し、続いてＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。遺伝子発現を、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを使用して定量化した。
【０３４０】
２００ｎｇの全ＲＮＡを、５９４の異なる免疫学関連ヒト遺伝子にマッチするバーコードプローブのパネルを備えたｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｎｅｌ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）を用いて分析した。コードセットを一晩６５℃でＲＮＡとハイブリダイズした。ＲＮＡ転写物を固定化し、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してバーコードプローブをカウントした。コードセット−内部ネガティブコントロールプローブの幾何平均を上回る２の標準偏差に達したとき、正規化した生発現データ（ｎＳｏｌｖｅｒ分析ソフトウェア）を分析した。遺伝子の発現の９０％が背景閾値を下回っている場合、それら遺伝子をさらなる分析から除外した。背景フィルタリング後に残った遺伝子を、内部ポジティブコントロールの幾何平均、並びに５のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＡＬＡＳ１、ＧＵＳＢ及びＴＵＢＢ）に合わせて正規化し、次いでｌｏｇ２−形質転換した。
【０３４１】
データは、Ｑｌｕｃｏｒｅ  Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＱＯＥ）ソフトウェア（Ｑｌｕｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて分析した。ＰＣＡ及び階層クラスタリングを実施して、治療群間の遺伝子発現の差異を決定した。遺伝子は、転写レベルに２倍の差異を示すとき差次的に発現されると考えた。
【０３４２】
図１７Ａ及び１７Ｂは、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化と組み合わせた、二つの最も強いＩＣＯＳ上方制御遺伝子であるＴＮＦＡＩＰ６及びＣＸＣＬ１３を示している。
【０３４３】
結果
１．ＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子のＩｎ−ｖｉｔｒｏでの特徴づけ
がんの免疫療法の標的としてのＩＣＯＳの潜在的な臨床的関連性を理解するため、様々な腫瘍徴候のＴＩＬ上でのＩＣＯＳの発現を評価した。
【０３４４】
図３Ａ−３Ｄに示されるように、両方のサブタイプの腫瘍浸潤リンパ球、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞は、平均で、正常組織から単離された同じ腫瘍患者由来のＴ細胞、又は健常なドナー由来の（末梢）Ｔ細胞より高いＩＣＯＳ発現を示す。発現レベル、並びにＩＣＯＳ発現Ｔ細胞の割合には、ドナーによる大きなばらつきが観察された。患者由来の腫瘍片の、ＴＩＬ、Ｌｏｖｏ腫瘍細胞及びＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとのｅｘ  ｖｉｖｏでの共インキュベーション時には、大部分のＴ細胞はベースラインにおいて既にＩＣＯＳ陽性であったため、ＴＩＬ上のＩＣＯＳレベルの上昇はわずかなものに過ぎなかった（図３Ｅ−３Ｈ）。
【０３４５】
しかしながら、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ及び健常なドナーの新たに単離したＰＢＭＣとの、Ｌｏｖｏ腫瘍細胞の共インキュベーションにより、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上にそれよりもはるかに低いベースラインレベルのＩＣＯＳが示され、Ｔ細胞のＴＣＢ媒介性活性化時にはＩＣＯＳの大きな上昇が示されている。
【０３４６】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞両方におけるＩＣＯＳの上方制御は、Ｔ細胞活性化に使用されたＴＣＢ濃度と直接相関しており、異なるＴＣＢ分子にも一貫して見られる（図４Ａから４Ｄ）。
【０３４７】
同様に、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞及びＣＤ３陽性Ｔ細胞との、ｍＣＥＡ−ＴＣＢ又はｍＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢの共インキュベーションは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＴｒｅｇ細胞上のマウスＩＣＯＳの発現を、濃度依存性に上方制御することができる（図５Ａ−５Ｆ）。
【０３４８】
これは、ＩＣＯＳを、多くの腫瘍徴候についてベースラインにおいて既に上方制御されている治療標的として、並びにＴ細胞上での低ＩＣＯＳベースライン発現を有する設定において、ＴＣＢの有力な併用パートナーとして確認するものである。
【０３４９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合アッセイは、ＩＣＯＳ−ＦＡＰ分子が、細胞上のヒトＦＡＰ及びヒトＩＣＯＳの両方に、濃度依存性に結合できることを検証する（図６Ａ及び６Ｂ：ヒトＴ−細胞上のｈＩＣＯＳに対する結合；図６Ｃ：３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞上のｈｕＦＡＰに対する結合）。予想されたように、非標的化ＩＣＯＳ−ＤＰ４７コントロール分子は、ｈｕＦＡＰに対する結合を示さない（図８Ｂ）。Ｃ末端融合を有するＦＡＰを標的とする分子（ＩＣＯＳ−ＦＡＰ  ２＋１／ＩＣＯＳ−ＦＡＰ  １＋１  ＨＴ）は、ヒトＦＡＰに対する結合について、やや高いＥＣ５０値を示す（表１０）。ヒトＩＣＯＳに対する結合について、フォーマット間に有意な差異は見られない。
【０３５０】
図７Ａ及び７Ｂに示されるように、両分子、非標的化ＤＰ４７−ｍＦＡＰ−ＬとＦＡＰ−ｍＩＣＯＳＬは、マウスＩＣＯＳに濃度依存性に結合する。加えて、ＦＡＰ−ｍＩＣＯＳ−Ｌは、予想されたように、マウスＦＡＰに対して濃度依存性の結合を示す。
【０３５１】
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞又は一次細胞を使用したＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子の特徴づけは、同時ＣＤ３／ＴＣＲ結合に対するＩＣＯＳシグナル伝達の依存性を実証した（図８Ａ）。すべてのＩＣＯＳ分子は、プレートに対する直接的結合によって架橋されており、したがって、ＤＰ４７−ＩＣＯＳ及びＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子は、同時ＣＤ３トリガーの存在下で類似の活性を示した。しかしながら、同時ＣＤ３トリガーの非存在下では、下流のシグナル伝達を観察することはできなかった。
【０３５２】
第２の手法では、標的化の効果、ＩＣＯＳシグナル伝達の誘導に対するそれぞれの架橋を評価した：抗ＩＣＯＳ抗体の、それらのＦＡＰ部分を介したヒトＦＡＰ発現細胞への架橋は、非標的化ＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子と比較して、ＩＣＯＳの下流にはるかに効果的なシグナル伝達をもたらした。これらは溶液中で評価された（図８Ｂ−８Ｅ及び８Ｆ−８Ｉ）。このモデル系、及び非標的化分子は、一定レベルの活性を示すものの、その活性は、それぞれの標的化バージョンよりはるかに低い程度であることに注目されたい。これは、ＩＣＯＳシグナル伝達の完全な力を活用するための架橋の重要性を明瞭に示すものである。
【０３５３】
ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ治療（図３Ａ−３Ｈ及び図４Ａ−４Ｄ）時にＩＣＯＳが上方制御されると考えたうえで、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化を増強するＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子の有効性が評価された（図９Ａ−９Ｈ）。図９Ａから９Ｄは、ＣＤ４＋（９Ａ及び９Ｂ）及びＣＤ８＋（９Ｃ及び９Ｄ）Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ６９発現の増強の例示的グラフを示し、これにより、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ治療のみを上回る、ＣＤ２５及びＣＤ６９発現の用量依存性の増大が明らかである。図９Ｅ−９Ｈは、最大５名の異なる健常なヒトＰＢＭＣドナーと、５名すべてのＦＡＰ−ＩＣＯＳ又はＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子をまとめたものである。ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ治療に起因するＦＡＰ−ＩＣＯＳ、並びにベースライン活性化レベルの増強効果には、異なるドナー間で極めて強い変動があり、一部のドナー（例えばドナー４）はＦＡＰ−ＩＣＯＳの増強効果をまったく示していないことに注目されたい。
【０３５４】
上記観察結果と一致して、ｍＣＥＡ−ＴＣＢ分子と組み合わせたＦＡＰ標的化ｍＩＣＯＳ−Ｌ分子の共インキュベーションは、ＴＣＢ効果のみと比較して、増強されたＴ細胞活性化をもたらし、これは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ６９の用量依存性の上方制御に見ることができた（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
【０３５５】
ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢを標的化ＩＣＯＳ療法と組み合わせることの効果をさらに特徴づけるために、本発明者らは、９６時間後の一次細胞の応答をＴ細胞増殖及びＴ細胞分化の観点から特徴づけた（図１０）。図示のように、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとＦＡＰ−ＩＣＯＳの組み合わせは、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ治療のみと比較して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞両方の増殖を誘導した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。三つすべてのフォーマットは比較的うまく働いた。図１２Ｃ−１２Ｆ及び１２Ｇ−１２Ｊは、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ及びＦＡＰ−ＩＣＯＳとの併用治療時、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ単剤療法と比較して、ＴＣＢの漸増濃度でのエフェクターメモリー及び中央記憶Ｔ細胞の増加が観察されることを示しており、（それに対してＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢはそれぞれ固定濃度２．９ｐＭ）（図１０Ｋ）、ここでも三つすべてのフォーマットは等しく良好に機能した。これは、早期Ｔ細胞活性化（図９）に対するブースティング効果が、Ｔ細胞の総数の増加及び所望のメモリーＴ細胞サブセットの形成の増加に伝播するという所見を支持するものであり、患者における長期にわたる効率的な抗腫瘍応答を可能にすると考えられる。
【０３５６】
２．ＦＡＰ−ＩＣＯＳ分子のＩｎ−ｖｉｖｏでの特徴づけ
上記スクリーニングアッセイのＦＡＰ−ＩＣＯＳ＿１＋１分子を、ヒトＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞及び３Ｔ３−ｈＦＡＰ発現線維芽細胞を共グラフトしたヒト化ＮＳＧマウスを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。予想されたように、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢの単剤療法は、腫瘍増殖を遅延させた。しかしながら、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢとＦＡＰ−ＩＣＯＳの組み合わせははるかに強い抗腫瘍応答をもたらし、これは、腫瘍特異性のＴｒｅｇ枯渇、Ｔエフェクター細胞の活性化、及びその結果としての対Ｔｒｅｇ細胞ＣＤ８エフェクター比の上昇に起因していた。
【０３５７】
さらに、残りの腫瘍試料のサイトカイン分析により、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢを用いた単剤療法と比較して、組み合わせ群のＣＸＣＬ１３、ＴＮＦ−アルファ及びＣＣＬ３のレベルが有意に上方制御されることが明らかとなった（図１６Ａから１６Ｃ）。
【０３５８】
ＣＣＬ３は、ＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインであり、ＣＣＬ４と相互作用することが示された。それはＭＩＰ１アルファとしても知られ、マクロファージ、単球及び好中球を引き付けることが記載されている。腫瘍微小環境において、ＣＣＬ３は、ワクチンの状況で抗腫瘍免疫応答を増大させる（Ａｌｌｅｎ、２０１６）。
【０３５９】
上記サイトカイン分析と一致して、ＣＸＣＬ１３及びＴＮＦＡＩＰ６は、二つの最も強いＩＣＯＳ特異性調節遺伝子として同定された（図１７Ａ及び１７Ｂ）。
【０３６０】
腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質は、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質又はＴＳＧ−６としても知られている。このタンパク質は、炎症性腸疾患における疾患活性の有効なバイオマーカーとして記載されている。これは、細胞外マトリックスの安定性及び細胞遊走に関与することが知られているヒアルロナン結合ドメインを呈する。
【０３６１】
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）は、Ｂリンパ球ケモアトラクタント（ＢＬＣ）又はＢ細胞誘引ケモカイン１（ＢＣＡ−１）としても知られている。ＣＸＣＲ５（ｈｉ）ＩＣＯＳ（ｈｉ）ＣＤ４Ｔ細胞は、ＩｇＧ生成の最も有効な誘導因子であり、大量のＢ細胞誘引ケモカイン  ＣＸＣＬ１３も分泌する。したがって、ＣＸＣＬ１３及びその受容体ＣＸＣＲ５は、リンパ組織の濾胞内部のＢ細胞の構成を制御し、複数の腫瘍徴候における三次リンパ性構造の形成に重要な役割を果たしている可能性がある。
【０３６２】
Ｂ細胞ケモアトラクタントＣＸＣＬ１３は、近年ＴＦＨ細胞浸潤に関連付けられ、ＣＸＣＬ１３生成（ＣＸＣＲ５）濾胞性ヘルパーＴ細胞により誘導される局所的なメモリーＢ細胞の分化により、ヒトがんにおいて生存率を改善した（Ｇｕ−Ｔｒａｎｔｉｅｎ  ２０１７）。これはまた、様々な二次的機序を介して有効な抗腫瘍応答を媒介するうえでの、ＩＣＯＳの潜在的な重要な役割を強調するものである。
【０３６３】
まとめると、ＩＣＯＳは、腫瘍応答性Ｔ細胞有意なＩＣＯＳベースライン発現を有する複数の炎症性腫瘍徴候において単剤療法として有効な抗腫瘍分子として機能しうる。ＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ分子を使用することで、ＩＣＯＳ発現活性化Ｔエフェクター細胞の腫瘍特異性の活性化が可能となり、したがって、非標的化ＩＣＯＳ分子と比較して優先的な安全性及び力価プロファイルを有すると考えられる。
【０３６４】
Ｔ細胞二重特異性は、有効な免疫エンゲージャーであり、Ｔ細胞活性化を誘導するとともに、腫瘍中へのＴ細胞浸潤を強化することができる。ＴＣＢ療法時のＩＣＯＳ発現の増大は、有効なＴＣＢを腫瘍特異性ＩＣＯＳ分子と組み合わせることにより、ＩＣＯＳ単剤療法アプローチと比較して、はるかに広範な患者集団の標的化を可能にすると思われ、ＴＣＢ又はＩＣＯＳ単剤療法と比較して、抗腫瘍応答の増強及び延長をもたらすことが期待される。
【０３６５】
実施例１６
ＩＣＯＳ抗体の生成
１６．１  抗原の調製、精製及び特徴付けと、ファージディスプレイによる新規抗体の生成のためのスクリーニングツール
１６．１．１  二量体型マウスＩＣＯＳ抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の調製、精製及び特徴づけ
【０３６６】
マウスＩＣＯＳのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（表１５）を、二量体型ＩＣＯＳ抗原Ｆｃ融合分子のホール及びノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。抗原−Ｆｃノブ鎖のＣ末端に、定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ビオチン化用のＡｖｉタグが導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせにより、鎖を含むエクトドメインの２つのコピーを含むＩＣＯＳヘテロダイマーの生成が可能になり、それによってＦｃ結合抗原のダイマー形態が作製される。表１６は、抗原Ｆｃ融合コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
表１５：抗原エクトドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸番号付け及び起源
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表１６：二量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列
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【０３６７】
ＩＣＯＳ  Ｆｃ−融合体をコードする配列は、キメラＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を促進し且つＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクター中にクローニングされた。さらに、ベクターには、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列が含まれていた。ビオチン化抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁液ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、融合タンパク質の二つの構成要素（ノブ鎖とホール鎖）をコードする三つのベクターと、ビオチン化反応に必要な酵素ＢｉｒＡとをコトランスフェクトした。対応するベクターは、１：１：０．０５の比率（「Ｆｃノブ」：「Ｆｃ（ホール）」：「ＢｉｒＡ」）で使用された。
【０３６８】
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質生成のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地で上清を置き換えた。発現ベクターは、２００μｇのベクターＤＮＡを含む２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの翌日、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培養液に加えた。７日間の培養後、細胞上清を、２１０ｇで１５分間スピンダウンすることにより収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルタ）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に保った。
【０３６９】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する少なくとも１０カラム体積のバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより、結合していないタンパク質を除去した。結合したタンパク質は、２０カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）で作成された塩化ナトリウムの直線ｐＨ勾配（０〜５００ｍＭ）を使用して溶出した。その後、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）を含有する、１０カラム体積の溶液でカラムを洗浄した。収集された画分のｐＨは、１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ  トリス（ｐＨ８．０）を加えることにより調整した。このタンパク質を濃縮し、濾過した後、２ｍＭ  ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【０３７０】
１６．１．２  組み換えマウスＩＣＯＳを発現する安定な細胞株の生成及び特徴づけ
マウスＩＣＯＳをコードする完全長ｃＤＮＡを、哺乳動物の発現ベクター中にサブクローニングした。製造者のプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５３３８１００）を使用して、プラスミドをＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）細胞中にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたＩＣＯＳ陽性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１６１４００６３）及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ；＃３１３３１−０２８）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ、＃１１３２００３３）中に維持した。トランスフェクションの二日後、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；＃ａｎｔ−ｐｒ−１）を加えて６μｇ／ｍＬとした。最初の選択後、最も高いＩＣＯＳの細胞表面発現を有する細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してソートし、培養して安定な細胞クローンを確立した。発現レベル及び安定性は、ＰＥ  抗ヒト／マウス／ラットＣＤ２７８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；＃３１３５０８）を使用した４週間の期間にわたるＦＡＣＳ解析により確認した。
【０３７１】
１６．２  ファージディスプレイによるＩＣＯＳ特異性１６Ｅ０９抗体（サロゲート分子）の生成
１６．２．１  ジェネリックＦａｂライブラリーからのＩＣＯＳ特異性抗体の選択
マウスＩＣＯＳ組み換え抗原に結合するクローンの選択のために、ファージディスプレイによる選択手法を実施した。選択ラウンドに先立ち、望ましくないバインダー、例えばタグに対するものを除去するために、事前洗浄工程を含めた。この目的のために、４ウェルのニュートラアビジンプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１２８）を、ＰＢＳ中において３０分間３７℃でビオチン化抗原の１００ｎＭ溶液２００μｌ（枯渇因子）によりコートし、ＰＢＳで簡単に洗浄した。
【０３７２】
６００μｌのライブラリーファージ（社内生成）を、オービタルシェーカー上で、室温で、２００μｌの５％ＢＳＡと共にＰＢＳ中において１０分間インキュベートした。事前に遮断したライブラリー混合物を、ビオチン化枯渇因子でコートした４つのウェルに移し、１時間室温でインキュベートした。上清を注意深くウェルから除去し、選択のために使用した。
【０３７３】
ビオチン化  ＩＣＯＳ−Ｆｃ融合タンパク質上で選択を三ラウンド実行した。すべての選択ラウンドについて、３０個のファージディスプレイライブラリーを使用した（すべてのライブラリーは社内生成）。
【０３７４】
パニングラウンドは、以下のパターンに従って溶液中で実施された：（１）〜１０ｅ１２の事前にクリアにしたファージミド粒子を、１００ｎＭのビオチン化ＩＣＯＳ−Ｆｃタンパク質に、総容積１ｍｌ中において０．５時間結合させ、（２）ビオチン化ＩＣＯＳ−Ｆｃタンパク質及び特異的に結合したファージ粒子を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズを１０分間付加することにより捕捉し、（３）ビーズを、５×１ｍｌのＰＢＳ／０．１％−Ｔｗｅｅｎ−２０及び５×１ｍｌ  ＰＢＳを使用して洗浄し、（４）ファージ粒子を、１ｍｌの１００ｍＭ  ＴＥＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．９０３３５）の付加により１０分間溶出し、５００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の付加により中和させ、（５）指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌を再感染させ、（６）ヘルパーファージ  ＶＣＳＭ１３で感染させ、次にファージミド粒子を２０％  ＰＥＧ−２．５Ｍ  ＮａＣｌ沈殿させて、次の選択ラウンドで使用する。２ラウンド目では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。ニュートラアビジンプレートを、５×ＰＢＳ／０．１％−Ｔｗｅｅｎ−２０及び５×ＰＢＳで洗浄した。三度目の選択ラウンドを、抗原濃度を２０ｎＭに低下させて実行した。
【０３７５】
１６．２．２  選択ラウンド後の特異性ＩＣＯＳクローンのスクリーニング
ＩＣＯＳ特異性クローンを、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌによる二つの異なる方法で同定した。３８４ウェルプレートでの組み換えＩＣＯＳ抗原上のＩＣＯＳ特異性クローンのスクリーニングのために、５０μｌのストレプトアビジン被覆Ｓｏｌ−ＲＴＭビーズ（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４１５０−０９１２５）を、８０ｎＭのビオチン化抗原でコートし、１時間室温でインキュベートした。結合した抗原を有するビーズを、１ｘＰＢＳで洗浄した。抗原−ビーズ複合体を２３ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異性抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−６０５−００６）を、最終濃度が８００ｎｇ／ｍｌとなるように、混合物に加えた。混合物を、３５μｌの容積で各ウェル中に等しく分配した。上清中５μｌのＦａｂを各ウェルに加えた。読み取りに先立ち、試料を２時間室温でインキュベートした。
【０３７６】
３８４ウェルプレートにおけるＩＣＯＳ抗原を発現する組み換え細胞上でのＩＣＯＳ特異性クローンのスクリーニングのために、細胞を遠心分離により回収して上清を棄てた。細胞を、予熱したＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ７０２５）希釈標準溶液に１．２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、続いて増殖条件下で細胞をインキュベートした。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ希釈標準溶液を、新鮮な予熱培地で置き換えた。細胞を、さらに３０分間増殖条件下でインキュベートし、続いてＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、総容積８ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−６０５−００６）を、最終濃度が８００ｎｇ／ｍｌとなるように加えた。混合物を、２０μｌの容積で各ウェル中に等しく分配した。上清中５μｌのＦａｂを、１５μｌのＰＢＳと共に各ウェルに加えた。読み取りに先立ち、試料を２時間室温でインキュベートした。
【０３７７】
１６．２．３  選択されたクローンの配列決定
Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ陽性であったクローン（組み換えタンパク質上で及びＩＣＯＳ抗原を発現する組み換え細胞上で）を、固有のクローンを明らかにする配列決定のために選択した。
【０３７８】
選択されたクローン１６Ｅ０９の配列を以下の表１７に示す。
表１７：ファージ由来抗マウスＩＣＯＳ抗体１６Ｅ０９のための可変領域アミノ酸配列（下線部は相補性決定領域（ＣＤＲ）である。）
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【０３７９】
１６．２．４  固有のクローンのＦａｂ発現及び精製
ＴＧ１細胞におけるモノクローナル抗体Ｆａｂ断片の発現を、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ０８３９．０１００）を付加したＤｉｆｃｏ  ２ｘＹＴ培地（ＢＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２４４０２０）中において一晩３０℃で、１ｍＭのイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導した。Ｆａｂの精製を、製造者のプロトコールに従って、Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐアフィニティーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１（−００３３−９９）で実施した。バッファー交換を、製造者のプロトコールに従ってＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０８５１−０１）で実施した。
【０３８０】
１６．２．５  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）での精製クローンの結合の特徴づけ
モノクローナル抗体Ｆａｂ断片の親和性（ＫＤ）を、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してＳＰＲにより測定した。動力学測定のために、１５μｇ／ｍｌのマウスＩＣＯＳタンパク質と、Ｆｃ枯渇因子を注射した。ワンショットの動力学測定のために、精製されたモノクローナル抗体Ｆａｂ断片の希釈系列を、別個のチャネル１−５に沿って同時に注射した。参照用の「インライン」ブランク（“ｉｎ−ｌｉｎｅ”  ｂｌａｎｋ）を提供するために、バッファー（ＰＢＳＴ）を６番目のチャネルに沿って注入した。結合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアで単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して、結合センサーグラムと解離センサーグラムを同時にフィットさせることにより計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した（表１８）。
表１８：Ｆａｂ断片としての１６Ｅ０９抗ＩＣＯＳ抗体の動力学的平衡定数（ＫＤ）
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【０３８１】
１６．２．６  マウスＩＣＯＳを発現する組み換え細胞上での精製Ｆａｂ断片１６Ｅ０９の結合の特徴づけ
精製Ｆａｂ断片１６Ｅ０９の結合を、マウスＩＣＯＳ組み換え抗原を発現する安定なＣＨＯ  Ｋ１細胞上で確認した。
【０３８２】
１６．３  抗ＩＣＯＳ  １６Ｅ０９  ＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体の調製及び精製
選択された抗ＩＣＯＳクローンの重及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。
【０３８３】
抗ＩＣＯＳクローンのアミノ酸配列を表１９に示す。抗ＩＣＯＳ−Ｆｃ−融合体コード化配列は、ＣＭＶプロモーターから挿入物の発現を促進し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクター中でクローニングされた。
表１９：Ｐ３２９ＧＬＡＬＡヒトＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＩＣＯＳクローン１６Ｅ０９のアミノ酸配列
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【０３８４】
抗ＩＣＯＳ抗体は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成された。細胞には、対応する発現ベクターが１：１（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）の比でトランスフェクトされた。
【０３８５】
３０ｍｌの振盪フラスコ内での生成の場合、トランスフェクションの前に６千万個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、これらの細胞を２１０×ｇで１０分間遠心分離し、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地で上清を置き換えた。発現ベクター（３０μｇの全ＤＮＡ）を３ｍＬ  ＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。８１μｌのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５０ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰＥＰＳＯＹ培地及び１ｍＭのバルプロ酸を補った２４ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの翌日、１２％のＦｅｅｄ７及びグルコース（最終濃度３ｇ／Ｌ）を加えた。７日間の培養後、上清を、４００×ｇでの３０分間の遠心分離により収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルタ）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に保った。
【０３８６】
細胞培養上清からの抗体分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体の生成の場合に上に記載したプロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーで行った。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【０３８７】
精製された抗体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗体の純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（ノギス）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の有無に関わらずＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。抗体試料の凝集体含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。表２０は、抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１抗体の収率及び最終含有量をまとめたものである。
表２０：抗ＩＣＯＳ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１抗体の生化学的分析
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【０３８８】
１６．４  抗ＩＣＯＳ  １６Ｅ０９  ＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体の特徴づけ
１６．４．１  表面プラズモン共鳴により測定したマウスＩＣＯＳに対する結合（結合力＋親和性）
ファージ由来ＩＣＯＳ特異性抗体の、組み換え単量体ＩＣＯＳ  Ｆｃ（ｋｉｈ）に対する結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。すべてのＳＰＲ実験は、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）をランニングバッファーとして用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃で実施された。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して導出し、数値積分法により、１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、結合力を定量的に推定するために使用した。
【０３８９】
同じ実験において、ファージ由来ＩＣＯＳ特異性抗体１６Ｅ０９と組み換えマウスＩＣＯＳとの相互作用の親和性を決定した。この目的のために、マウスＩＣＯＳのエクトドメインをａｖｉ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）タグ（配列については表２１を参照）とインフレームでサブクローニングした。
表２１：マウスＩＣＯＳ  Ｆｃ（ｋｉｈ）Ａｖｉタグのアミノ酸配列
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【０３９０】
タンパク質生成を、実施例１６．１でＦｃ−融合タンパク質について記載したように実施した。分泌タンパク質を、キレート化クロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製した。第１のクロマトグラフィー工程は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｎＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化したＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）で実施した。１２カラム容積に５％から４５％の溶出バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｎＭの塩化ナトリウム、５００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４））のグラジエントを適用して溶出を実施した。このタンパク質を濃縮し、濾過した後、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【０３９１】
組み換えマウスＩＣＯＳ  Ｆｃ（ｋｉｈ）に対するＩＣＯＳ特異性抗体１６Ｅ０９の結合を、ヒトＩＣＯＳ  Ｆｃ（ｋｉｈ）について上述したように（実施例１６．２．５参照）、表面プラズモン共鳴により評価した。表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃））を用いて２５℃で実施した。
【０３９２】
親和性決定のために、標準の製造者の手順を使用してマウスＩＣＯＳ  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジンチップに直接結合させた（ＳＡ  ｃｈｉｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。固定化のレベルは約６００  ＲＵであった。組み換えＩＣＯＳ特異性抗体の親和性を、３０μｌ／分で２４０秒間にわたり六通りの濃度（１０００ｎＭ−３１．２５ｎＭ、１：２に希釈）を注射することによりマルチサイクル動力学を用いて決定し、会合相を記録した。解離相を、５００秒間監視し、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰに切り換えることによりトリガーした。チップ表面は、毎サイクル後に、１０ ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）を６０秒間で一回の注射を使用して再生された。バルク屈折率の差異は、参照フローセルに得られた応答を差し引くことにより修正され、抗ＩＣＯＳ抗体抗原は、ＩＣＯＳ受容体が固定化されていない表面上に流された。
【０３９３】
親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合を当てはめることにより、動力学的速度定数から導出した。抗体１６Ｅ０９が高い親和性でマウスＩＣＯＳに結合することが示された（表２２）。
表２２：マウスＩＣＯＳに対する抗ＩＣＯＳ抗体１６Ｅ０９の結合
2021506293.tif 000059
【０３９４】
実施例１７
マウスＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及びＦＡＰに対する一価の結合を有する二重特異性抗体の生成
ＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及びＦＡＰに対する一価の結合を有する、以下の二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体を、それぞれ図１８Ａ及び１８Ｂに示すように調製した。
Ａ）ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１、ＦＡＰ標的化抗マウスＩＣＯＳ＿２＋１、ｍＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、二価のマウスＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）、一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）（図１８Ａ、配列番号：１３５、１３６及び１３１）。
Ｂ）ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＦＡＰ（２８Ｈ１）１＋１、ＦＡＰ標的化抗マウスＩＣＯＳ＿１＋１、ｍＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、一価のマウスＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）、一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）（図１８Ｂ、配列番号：１３７、１３８、１３１及び１３９）。
【０３９５】
ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１の場合、ＦＡＰ標的化抗マウスＩＣＯＳ＿２＋１コンストラクトの第１の重鎖（Ｈｃ１）は、以下の成分：マウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＤＤ領域上の抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＶＨＣＨ１から構成されており、そのＣ末端には抗ＦＡＰバインダー（２８Ｈ１）のＶＨが融合していた。第２の重鎖（ＨＣ２）は、マウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＫＫ領域上の抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＶＨＣＨ１から構成されており、そのＣ末端には抗ＦＡＰバインダー（２８Ｈ１）のＶＬが融合していた。
【０３９６】
「ＤＤＫＫ」ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば国際公開第２０１４／１３１６９４号に記載されており、Ｆｃ  ＤＤとＦｃ  ＫＫ鎖との組み合わせはヘテロダイマーの生成を可能にする。簡潔には、アスパラギン酸残基（Ｄ）が、重鎖の一方（ＨＣ１）のＦｃ領域サブユニットの、位置３９２及び４０９に対応する位置に提供され（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；即ちＫ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ）、リジン（Ｋ）残基が、重鎖の他方（ＨＣ２）のＦｃ領域サブユニットの、位置３５６及び３９９に対応する位置に提供される（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；即ちＥ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ）。マウスＦｃガンマ受容体に対する結合を無効にするために、例えばBaudino et al. J. Immunol.(2008), 181, 6664-6669、又は国際公開第２０１６／０３０３５０号に記載される方法に従って、ＤＡＰＧ変異が重鎖の定常領域導入される。簡潔には、アラニン（Ａ）がＦｃ領域の位置２６５に対応する位置に提供され、グリシン（Ｇ）がＦｃ領域の位置３２９に対応する位置に提供される（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；即ちＤ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）。
【０３９７】
ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＦＡＰ（２８Ｈ１）１＋１において、ＨＣ１は、マウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＤＤ上の抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＶＨＣＨ１から構成されていた。ＨＣ２は、抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃ  ＤＡＰＧ  ＫＫから構成されていた。マウスＩＣＯＳバインダーの場合、ＶＨ及びＶＬ配列は、実施例１６．２に記載されるファージディスプレイキャンペーンから得られた。ＦＡＰバインダー（２８Ｈ１）の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号に記載されており、これは参照によりここに包含される。
【０３９８】
二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列は、以下の表２３及び２４に見ることができる。
表２３：二重特異性ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧのアミノ酸配列
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表２４：二重特異性ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＦＡＰ（２８Ｈ１）１＋１マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧのアミノ酸配列
2021506293.tif 000062
2021506293.tif 000063
【０３９９】
対応するｃＤＮＡｓを、従来の（非ＰＣＲベース）クローニング技術を使用してｅｖｉｔｒｉａのベクター中にクローニングした。ｅｖｉｔｒｉａベクタープラスミドが遺伝子合成された。プラスミドＤＮＡを、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づき、低エンドトキシン条件下で調製した。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍの波長での吸収を測定することにより決定された。配列の正確性を、サンガー配列決定（ｃＤＮＡにサイズに応じてプラスミド一つ当たり最大二つの配列決定反応を用いる）により検証した。
【０４００】
懸濁に適応させたＣＨＯ  Ｋ１細胞（ＡＴＣＣから入手し、ｅｖｉｔｒｉａでの懸濁培養における無血清増殖に適応させた）を生成に使用した。種は、ｅｖｉＧｒｏｗ培地（既知組成の、動物性成分を含まない無血清培地）中で増殖させた。細胞に、ｅｖｉＦｅｃｔ（ｅｖｉｔｒｉａのカスタムメイドの特製トランスフェクション試薬）をトランスフェクトし、トランスフェクション後ｅｖｉＭａｋｅ２（動物性成分を含まない無血清培地）中で細胞を増殖させた。上清を、遠心分離後濾過（０．２μｍのフィルタ）することにより回収した。
【０４０１】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したタンパク質Ａ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、バッファーを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、１５カラム容積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）でつくられた塩化ナトリウムの直線ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を使用して溶出した。次いでカラムを、１０カラム容積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）で洗浄した。収集された画分のｐＨは、１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ  トリス（ｐＨ８．０）を加えることにより調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ５０／６００Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【０４０２】
精製された二重特異性コンストラクトのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。この二重特異性コンストラクトの純度及び分子量をＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（ノギス）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の有無に関わらずＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。二重特異性コンストラクトの凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７）の２５℃のランニングバッファー中で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０４０３】
マウスＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及び非標的化部分を有する二重特異性抗体の生成（コントロール分子）
マウスＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合を有する以下の二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体を、図１８Ａ及び１８Ｂのそれぞれに示される標的化フォーマットと同様に調製したが、抗ＦＡＰの代わりにそれらは標的化部分を含む。
Ｃ）ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＤＰ４７  ２＋１、非標的化抗マウスＩＣＯＳ  ２＋１、ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、二価のマウスＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）、一価の非標的化部分（ＤＰ４７）（配列番号：１４０、１４１及び１３１）。
Ｄ）ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＤＰ４７  １＋１、非標的化抗マウスＩＣＯＳ  １＋１、ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、一価のマウスＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）、一価の非標的化部分  ＤＰ４７（配列番号：１４２、１４３、１３１及び１４４）。
【０４０４】
実施例Ｃでは、非標的化抗マウスＩＣＯＳ  ２＋１コンストラクトは、以下の成分：第１の重鎖（ＨＣ１）：抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＶＨＣＨ１と、それに続くマウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＤＤから構成されており、そのＣ末端には非結合  クローン（ＤＰ４７）のＶＨが融合していた。第２の重鎖（ＨＣ２）は、抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＶＨＣＨ１と、それに続くマウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＫＫから構成されており、そのＣ末端には非結合クローン（ＤＰ４７）のＶＬが融合していた。
【０４０５】
非標的化抗マウスＩＣＯＳ１＋１コンストラクトは、以下の成分から構成されていた：ＨＣ１は、抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＶＨＣＨ１と、それに続くマウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＤＤから構成されていた。ＨＣ２は、非結合抗体としてのＤＰ４７のＶＨＣＨ１と、それに続くマウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＫＫから構成されていた。
【０４０６】
非標的化アゴニストＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列は、表２５及び２６にそれぞれ見ることができる。
表２５：二重特異性２＋１非標的化ＤＰ４７抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧのアミノ酸配列
2021506293.tif 000064
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表２６：二重特異性１＋１非標的化ＤＰ４７抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧのアミノ酸配列
2021506293.tif 000066
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【０４０７】
非標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ分子は、ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体に関してここに前述したように調製された。
【０４０８】
マウスＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）に対する一価若しくは二価の結合及びＦＡＰ（２８Ｈ１）又はここに記載されるように生成されたＤＰ４７に対する一価の結合を有する二重特異性分子の生化学的分析の結果を表２７にまとめる。
表２７：二重特異性ＦＡＰ−ＩＣＯＳ又はＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子の生化学的分析
2021506293.tif 000068
【０４０９】
実施例１８
ＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及びＣＥＡに対する一価の結合を有する二重特異性抗体の生成
ＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及びＣＥＡに対する一価の結合を有する、以下の二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体を、それぞれ図１８Ａ及び１８Ｂに示すように調製した。
Ａ）ＩＣＯＳ（ＪＭａｂ１３６）−ＣＥＡ（ＭＥＤＩ−５６５）２＋１、ＣＥＡ−ＩＣＯＳ＿２＋１  ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、二価のＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）、一価のＣＥＡ（ＭＥＤＩ−５６５）（図１８Ａ、配列番号：１５３、１５４及び２９）．
Ｂ）ＩＣＯＳ（ＪＭａｂ１３６）−ＣＥＡ（ＭＥＤＩ−５６５）１＋１、ＣＥＡ−ＩＣＯＳ＿１＋１、ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、一価のＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）、一価のＣＥＡ（ＭＥＤＩ−５６５）（図１８Ｂ、配列番号：１５５、２９、１５６及び１５７）．
【０４１０】
ＣＥＡ−ＩＣＯＳ＿２＋１コンストラクトは、以下の成分：抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃホールから構成されており、そのＣ末端には抗ＣＥＡバインダー（ＭＥＤＩ−５６５）のＶＨが融合していた。ＨＣ２は、抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃノブから構成されており、そのＣ末端には抗ＣＥＡバインダー（ＭＥＤＩ−５６５）のＶＬが融合していた。
【０４１１】
ＣＥＡ−ＩＣＯＳ＿１＋１コンストラクトでは、Ｈｃ１は、以下の成分、抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃホールから構成されていた。ＨＣ２は、抗ＣＥＡ（ＭＥＤＩ−５６５）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃノブから構成されていた。
【０４１２】
ＩＣＯＳバインダーの場合、クローンＪＭＡｂ１３６のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許出願公開第２００８／０１９９４６６号から得られた。ＣＥＡバインダーの場合、クローンＭＥＤＩ−５６５のＶＨ及びＶＬ配列は国際公開第２０１４／０７９８８６号から得られた。
【０４１３】
ＦｃノブとＦｃホール鎖との組み合わせは、ヘテロダイマーの生成を可能にする。国際公開ＷＯ２０１２／号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。
【０４１４】
二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列は、表２８及び２９にそれぞれ見ることができる。
表２８：二重特異性２＋１ＣＥＡ（ＭＥＤＩ−５６５）標的化抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡのアミノ酸配列
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2021506293.tif 000070
表２９：二重特異性１＋１ＣＥＡ（ＭＥＤＩ−５６５）標的化抗ＩＣＯＳ（ＪＭＡｂ１３６）ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡのアミノ酸配列
2021506293.tif 000071
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【０４１５】
ＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合と、ＣＥＡに対する一価の結合とを有する二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体を、ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体について実施例１７で記載したように調製した。二重特異性分子の生化学的分析の結果が以下の表３０にまとめられている。
表３０：二重特異性ＣＥＡ−ＩＣＯＳ又はＤＰ４７−ＩＣＯＳ分子の生化学的分析
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【０４１６】
マウスＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及びＣＥＡに対する一価の結合を有する二重特異性抗体の生成
マウスＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合及びＣＥＡに対する一価の結合を有する以下の二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体を、それぞれ図１８Ａ及び１８Ｂに示すように調製した。
Ｃ）ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１  ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、ＣＥＡ標的化抗マウスＩＣＯＳ＿２＋１、ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、二価のマウスＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）、一価のＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）（配列番号：１６６、１６７及び１３１）。
Ｄ）ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）１＋１  ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、ＣＥＡ標的化抗マウスＩＣＯＳ＿１＋１、ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧ、一価のマウスＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）、一価のＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）（配列番号：１３７、１３１、１６８及び１６９）。
【０４１７】
実施例Ｃでは、ＣＥＡ標的化抗マウスＩＣＯＳ＿２＋１コンストラクトのＨＣ１は、以下の成分：マウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＤＤ上の抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＶＨＣＨ１から構成されており、そのＣ末端には抗ＣＥＡバインダー（Ａ５Ｂ７）のＶＬが融合していた。ＨＣ２は、マウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＫＫ上の抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＶＨＣＨ１から構成されており、そのＣ末端には抗ＣＥＡバインダー（Ａ５Ｂ７）のＶＨが融合していた。
【０４１８】
ＣＥＡ−ＩＣＯＳ＿１＋１＿コンストラクト（実施例Ｄ）は、マウスＦｃ  ＤＡＰＧ  ＤＤ上の抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）のＨＣ１、ＶＨＣＨ１から構成されていた。ＨＣ２は、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）のＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃ  ＤＡＰＧ  ＫＫから構成されていた。
【０４１９】
Ｆｃ  ＤＤとＦｃ  ＫＫ鎖との組み合わせは、ヘテロダイマーの生成を可能にする。マウスＦｃガンマ受容体に対する結合を無効にするために、例えばＢａｕｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）、１８１、６６６４−６６６９、又は国際公開第２０１６／０３０３５０号に記載される方法に従って、ＤＡＰＧ変異が重鎖の定常領域に導入される。
【０４２０】
マウスＩＣＯＳバインダーの場合、ＶＨ及びＶＬ配列は、ファージディスプレイキャンペーンから得られた（実施例１６．２）。ＣＥＡバインダー（Ａ５Ｂ７）の生成及び調製は、国際公開第９２／０１０５９号に記載されており、これは参照によりここに包含される。
【０４２１】
二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列は、表３１及び３２にそれぞれ見ることができる。
表３１：二重特異性２＋１ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）標的化抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧのアミノ酸配列
2021506293.tif 000074
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表３２：二重特異性１＋１ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）標的化抗ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧのアミノ酸配列
2021506293.tif 000076
【０４２２】
マウスＩＣＯＳに対する一価又は二価の結合と、ＣＥＡに対する一価の結合とを有する二重特異性アゴニストマウスのＩＣＯＳ抗体を、ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体についてここに先述したように調製した。二重特異性分子の生化学的分析の結果が表３３にまとめられている。
表３３：二重特異性ＣＥＡ−ＩＣＯＳ分子の生化学的分析
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【０４２３】
実施例１９
ヒトＩＣＯＳ又はヒトＣＥＡを発現する細胞に対する二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体の結合（フローサイトメトリー分析）
実施例１８で調製した複数の二重特異性アゴニストＩＣＯＳ抗体の結合を、ＩＣＯＳ陽性事前活性化ＰＢＭＣ又はＣＥＡ陽性ＭＫＮ４５細胞（ヒト胃腺癌細胞株、ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９）を使用して試験した。簡潔には、健常なヒトドナー由来のバフィーコート又は新鮮な血液から単離したヒトＰＢＭＣを（実施例５．１に記載）、加湿したインキュベーター内において、２μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌ（Ｒｏｃｈｅ、＃１１２４９７３８００１）及び１００単位／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２（“Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ”、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含む１００万個の細胞／ｍｌの細胞密度のＲＰＭＩ１６４０培地中において、３７℃で４８時間インキュベートした。
【０４２４】
アッセイ当日、事前活性化ＰＢＭＣ細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（０．１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ）中２０万個の細胞を、９６ウェル丸底プレートの各ウェルに播種した。同様に、付着したＭＫＮ４５腫瘍細胞を、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、２５３００−０５４）を使用して分離させ、洗浄し、１５万個の細胞を９６ウェル丸底プレートに移した。続く染色は、３０分間４℃で漸増濃度の抗ＩＣＯＳ（７ｐＭ−１２０ｎＭ）を用いて実施した。その後、細胞を、冷ＰＢＳ ０．１％  ＢＳＡで二回洗浄し、標識化二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＬａｂのＦｃγ断片特異性（１９０−６０６−００８）、ＦＡＣＳバッファー中で１：１００に希釈）を用いてさらに３０分間４℃でさらにインキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、染色を、１ウェルあたりＦＡＣＳバッファー中７５μｌの１％  ＰＦＡを使用して、暗所で２０分間４℃で固定した。細胞を再びＦＡＣＳバッファーで二回洗浄し、分析のためにＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。
【０４２５】
蛍光を、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ソフトウェアＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を使用してＦＡＣＳにより分析した。結合曲線及びＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して取得した。
【０４２６】
結果は、ＣＥＡ−ＩＣＯＳ分子が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上のヒトＩＣＯＳ（それぞれ図１９Ａ及び１９Ｂ）、及びヒトＣＥＡに、濃度依存性に結合できることを示している（図１９Ｃ及び１９Ｄ）。ＥＣ５０値を表３４に示す。両分子は、ヒトＩＣＯＳに対して同様の結合プロファイルを呈している。しかしながら、ＩＣＯＳ（ＪＭａｂ１３６）−ＣＥＡ（ＭＥＤＩ５６５）１＋１分子は、ＩＣＯＳ（ＪＭａｂ１３６）−ＣＥＡ（ＭＥＤＩ５６５）２＋１分子と比較して、ヒトＣＥＡへのより良好な結合を示した。この場合、ＣＥＡはＶＨ−ＶＬとしてＦｃ領域のＣ末端に融合している。異なる機能活性に変換可能であるかどうかを見るために、ＰＢＭＣエフェクターと、ＣＥＡ−及びＦＡＰ陽性標的細胞を用いた共培養アッセイを実施した（実施例２０）。
表３４：ＩＣＯＳ＋  ＰＢＭＣ又はＣＥＡ陽性ＭＫＮ−４５細胞に対する異なるＣＥＡ−ＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０値
2021506293.tif 000078
【０４２７】
実施例２０
ＴＣＢ誘導Ｔ細胞活性化のＩＣＯＳ媒介性ブースティング（フローサイトメトリー分析）
ＦＡＰ又はＣＥＡ標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ分子の、Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ媒介性活性化をさらにブーストする能力を、ＣＥＡ陽性ＭＫＮ−４５及びＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ  ｃｌ．１９細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−９２、ヒトＦＡＰを安定に過剰発現するようにトランスフェクトされた）、並びにヒトＰＢＭＣの共培養アッセイにおいて評価した。
【０４２８】
簡潔には、付着した標的細胞を細胞解離バッファーを用いて回収し、実験の前日に平底９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルの密度で播種した（Ｇｉｂｃｏ、１３１５１０１４）。これにより、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、Ｘ−Ｒａｙ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ  ＲＳ  ２０００（ラド源）を５０００ラド（フィルタなしでの照射、レベル５）で使用して、播種の前に追加照射した。標的細胞を一晩放置して付着させた。実施例５．１に記載のように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バフィーコート（「Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｚｕｒｉｃｈ」）由来の富化したリンパ球調製物のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１０７７１−５００ＭＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７）密度遠心分離により調製した。
【０４２９】
４８時間後のＴ細胞活性化を、固定濃度８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ及び漸増濃度のＦＡＰ又はＣＥＡ標的化ＩＣＯＳ分子（３回分、０．１１ｐＭ−５０００ｐＭ）の存在下における、ＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ４５、及びＮＩＨ３Ｔ３−ｈＦＡＰ標的細胞の、５：１：１の比での共インキュベーションにより決定した。実施例１２参照。標的化ＩＣＯＳ及びＴＣＢ分子を用いた同時療法時のＴ細胞活性化は、ＴＣＢ単剤療法を参照した。
【０４３０】
図２０Ａ及び２０Ｂに示すように、ＣＥＡ−ＩＣＯＳ及びＦＡＰ−ＩＣＯＳ二重特異性分子の両方は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の上方制御により決定したとき、ＣＥＡＣＡＭ５−ＴＣＢ治療による単剤療法と比較して、ＴＣＢ媒介性活性化をさらに増大させることができる。図２０Ａに強調したように、その効果は濃度依存性であり、ＩＣＯＳ分子の高濃度で低減する。ＴＣＢ単剤療法に対する倍数増加を表３５に示す。
【０４３１】
ＣＥＡ−ＩＣＯＳ分子は、ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化のさらなるブースティングにおいて、ＦＡＰ標的化分子と比較して明らかに優れている。両フォーマットは、等しく有効で、標的部分とは無関係である。ＣＥＡ又はＦＡＰ標的化１＋１又は２＋１フォーマット（二名の代表的ドナー）の示された濃度でのＴＣＢ単剤療法に対する併用療法の倍数増加を図２０Ｂに示す。
表３５：ＴＣＢ単剤療法と比較した、標的化ＩＣＯＳ分子及びＴＣＢを用いた併用療法時のＣＤ４＋  Ｔ細胞上でのＣＤ６９の誘導の倍数増加
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【０４３２】
実施例２１
マウスＩＣＯＳ又はヒトＣＥＡを発現する細胞に対するマウスＩＣＯＳ分子の結合（フローサイトメトリー分析）
実施例１７又は１８に記載したように調製された複数のＩＣＯＳ分子の結合を、マウスＩＣＯＳ陽性ＣＨＯ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１、マウスＩＣＯＳを安定に過剰発現するようにトランスフェクトされた）、ＦＡＰ陽性ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍｏＦＡＰ  ｃｌ．３４細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−９２、マウスＦＡＰを安定に過剰発現するようにトランスフェクトされた）、又はＣＥＡ陽性ＭＫＮ４５細胞を使用して試験した。
【０４３３】
簡潔には、付着したＭＫＮ４５、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍｏＦＡＰ又はＣＨＯ−ｍＩＣＯＳ細胞を、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、２５３００−０５４）を使用して分離させ、洗浄し、１０万個の細胞を９６ウェル丸底プレートに移した。続く染色は、３０分間４℃で漸増濃度のＣＥＡ−ＩＣＯＳ／ＦＡＰ−ＩＣＯＳ（３ｐＭ−２００ｎＭ）を用いて実施した。その後、細胞を、冷ＰＢＳ  ０．１％  ＢＳＡで二回洗浄し、標識化二次抗体（ＰＥコンジュゲート、＃７１５−１１６−１５０）、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ、ＦＡＣＳバッファー中で１：５０に希釈）を用いてさらに３０分間４℃でさらにインキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、染色を、１ウェルあたりＦＡＣＳバッファー中７５μｌの１％  ＰＦＡを使用して暗所で２０分間４℃で固定した。細胞をＦＡＣＳバッファーで二回洗浄し、分析のためにＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。
【０４３４】
蛍光を、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ソフトウェアＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。結合曲線及びＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して取得した。
【０４３５】
図２１Ａから２１Ｃに示すように、ＣＥＡ及びＦＡＰ標的化抗マウスＩＣＯＳ分子は、それぞれマウスＩＣＯＳ及びヒトＣＥＡ又はマウスＦＡＰに、濃度依存性に結合することができる。ＥＣ５０値を表３６に示す。予想されたように、マウスＩＣＯＳに対する二価の標的化を有する２＋１二重特異性フォーマットは、マウスＩＣＯＳに対する一価の結合を有する１＋１のフォーマットより良好な結合を呈している。ＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１とＩＣＯＳ（１６Ｅ０９）−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１の、それらそれぞれの標的マウスＦＡＰ又はヒトＣＥＡに対する結合は、対応する１＋１のフォーマットと比較して弱い。これは、ヒト分子について観察された結合力価と一貫するもので、Ｆａｂアームとして含まれる場合、１＋１のフォーマットと比較して、ＶＨ−ＶＬとして融合するときの標的化部分のより弱い親和性により説明することができる。
表３６：細胞上に発現されたマウスＦＡＰ又はヒトＣＥＡを標的とする異なるマウスＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０（ＦＡＣＳ）
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【０４３６】
実施例２２
ＴＣＢ誘導Ｔ細胞活性化のＩＣＯＳ媒介性ブースティング（フローサイトメトリー分析）
ＦＡＰ又はＣＥＡ標的化二重特異性アゴニストＩＣＯＳ分子の、マウスＴ細胞のマウスＣＥＡ−ＴＣＢ媒介性活性化をさらにブーストする能力を、ＣＥＡ陽性ＭＣ３８−ｈＣＥＡ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９７５、３５：２４３４−２４４０）及びマウス（及びヒト）ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−９２、ヒトＦＡＰを安定に過剰発現するようにトランスフェクトされた）、並びにＣ５７Ｂｌ／６マウス由来のマウス脾細胞の共培養アッセイにおいて評価した。ネガティブコントロールとして、アッセイに含まれる細胞のいずれにも結合しないＤＰ４７標的化バージョンを含めた。Ｔ細胞活性化を、４８時間後におけるマウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上でのＣＤ６９の上方制御として評価した。
【０４３７】
簡潔には、付着した標的細胞を細胞解離バッファーを用いて回収し、実験の前日に平底９６ウェルプレートを使用して１００００細胞／ウェルの密度で播種した（Ｇｉｂｃｏ、１３１５１０１４）。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、Ｘ−Ｒａｙ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ  ＲＳ  ２０００（ラド源）を５０００ラド（フィルタなしでの照射、レベル５）で使用して、播種の前に追加照射し、洗浄した。細胞を一晩放置して付着させた。Ｃ５７Ｂｌ／６脾細胞を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓から、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を満たしたＭＡＣＳ  Ｃ−チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中へ移す形で単離した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて脾臓を解離し、すぐに管をスピンダウンし、細胞を１００μｍのナイロン製セルストレーナーに通した。その後、管を３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｒ７３８８）ですすぎ、８分間３５０×ｇで遠心分離した。上清を棄て、細胞懸濁液を７０μｍのナイロン製セルストレーナーに通し、培地で洗浄した。もう一度遠心分離（３５０×ｇ、８分）した後、上清を棄て、５ｍｌのＡＣＫ溶解バッファーを加えた。ＲＴでの５分のインキュベーション後、細胞をＲＰＭＩ培地で洗浄した。
【０４３８】
その後、細胞をアッセイ培地（１０％  ＦＣＳ、１％  ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ  ＃３５０５００６１）、１μＭ  Ｓｏｄｉｕｍｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１３６００７０）、１μＭ  β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、＃Ｍ３１４８−１００）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｍ７１４５）、１×抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５２４００６２）、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、細胞をカウントした（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ−Ｓｅｔｔｉｎｇｓ白血球、１：１０に希釈）。
【０４３９】
Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用し、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２で、脾細胞、ＣＥＡ陽性腫瘍及びマウスＦＡＰ陽性線維芽細胞を３：１：１の最終比で用いた共インキュベーション時のマウスＴ細胞活性化を、フローサイトメトリー分析により決定した。マウスＦＡＰ−ＩＣＯＳ又はＣＥＡ−ＩＣＯＳ分子を、示された濃度（３回で５ｐＭ−７５０００ｐＭの範囲）で加え、マウスＣＥＡ−ＴＣＢを固定濃度（１．５ｎＭ）で加えた。標的化ＩＣＯＳ及びＴＣＢ分子を用いた同時療法時のＴ細胞活性化は、ＴＣＢ単剤療法を参照した。
【０４４０】
簡潔には、脾細胞を、４００×ｇで４分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡ（ＦＡＣＳバッファー）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で二回洗浄した。ＣＤ４５（ＡｌＦｌ７００抗マウスＣＤ４５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１０３１３２）、ＣＤ８（Ｂｖ７１１  抗マウスＣＤ８ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃１００７４７）、ＣＤ４（Ｂｖ４２１抗マウスＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃１００４３８）、ＣＤ６９（Ｐｅ／Ｃｙ７抗マウスＣＤ６９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃１０４５１２）に対する表面染色を、供給者の指示に従って実施した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで二回洗浄し、１％ＰＦＡを含む７５μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーを使用して１５−３０分間４℃で固定した。遠心分離後、試料を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。
【０４４１】
図２２Ａから２２Ｄに示すように、ＣＥＡ及びＦＡＰ標的化抗マウスＩＣＯＳ分子の両方は、マウスＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の上方制御により決定したとき、ｍｕＣＥＡ−ＴＣＢ治療による単剤療法と比較して、ＴＣＢ媒介性活性化をさらに増大させることができる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞に対するＣＥＡ標的化１＋１の効果は、用量依存性であり、ＣＥＡ標的化１＋１  ＩＣＯＳ分子の高濃度において減少する（上記それぞれのヒト分子について観察されたものと同様）。ＤＰ４７標的化参照バージョンはＴＣＢ活性化Ｔ細胞のさらなる活性化を有意にブーストしなかったため、活性化は、ＩＣＯＳとＣＥＡ又はＦＡＰへの同時結合により架橋されている分子に依存していた。ＴＣＢ単剤療法に対する倍数増加を表３７に示す。
表３７：ＴＣＢ単剤療法と比較した、標的化ＩＣＯＳ分子及びＴＣＢを用いた併用療法時の、マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上でのＣＤ６９の誘導の倍数増加（ＦＡＣＳ分析）
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【０４４２】
ＣＥＡ−ＩＣＯＳ二重特異性分子は、ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化のさらなるブースティングにおいて、ＦＡＰ標的化分子と比較して優れている。ヒトＩＣＯＳを標的とする分子に関し、両フォーマットは等しく有効で、標的部分とは無関係である。
【０４４３】
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【図１Ａ−Ｄ】
2021506293.tif 000082
【図１Ｅ−Ｆ】
2021506293.tif 000083
【図２】
2021506293.tif 000084
【図３Ａ−Ｄ】
2021506293.tif 000085
【図３Ｅ−Ｈ】
2021506293.tif 000086
【図４】
2021506293.tif 000087
【図５Ａ−Ｃ】
2021506293.tif 000088
【図５Ｄ−Ｆ】
2021506293.tif 000089
【図６】
2021506293.tif 000090
【図７】
2021506293.tif 000091
【図８Ａ】
2021506293.tif 000092
【図８Ｂ−Ｅ】
2021506293.tif 000093
【図８Ｆ−Ｉ】
2021506293.tif 000094
【図９Ａ−Ｄ】
2021506293.tif 000095
【図９Ｅ−Ｈ】
2021506293.tif 000096
【図１０Ａ−Ｂ】
2021506293.tif 000097
【図１０Ｃ−Ｆ】
2021506293.tif 000098
【図１０Ｇ−Ｊ】
2021506293.tif 000099
【図１０Ｋ−Ｌ】
2021506293.tif 000100
【図１１】
2021506293.tif 000101
【図１２】
2021506293.tif 000102
【図１３】
2021506293.tif 000103
【図１４Ａ】
2021506293.tif 000104
【図１４Ｂ−Ｅ】
2021506293.tif 000105
【図１５】
2021506293.tif 000106
【図１６】
2021506293.tif 000107
【図１７】
2021506293.tif 000108
【図１８】
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【図１９】
2021506293.tif 000110
【図２０Ａ】
2021506293.tif 000111
【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021506293.tif 000116
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