(57)【要約】血液脳関門（ＢＢＢ）を越えた治療剤または診断剤の送達を促進するための、ＢＢＢ輸送活性を有する活性剤にカップリングされたｐ９７断片を含む、治療用ペイロードが、そのバリアントおよび組合せを含め、開示される。治療用ペイロードは、被験体における脳内に存在する疾患以外の疾患、例えば、身体の固形腫瘍の処置を可能にし得る、二重官能性を有する。様々な疾患を処置する方法および医薬組成物もまた、開示される。本発明は、血液脳関門を透過する化合物を含む、疾患を処置するための化合物に関する。本発明はまた、本発明の化合物を含む医薬組成物、および前記組成物を様々な障害の処置に使用する方法も提供する。
2021518392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の脳内における第１の疾患を、前記被験体の血液脳関門を越えて治療用ペイロードを送達することによって処置する方法であって、前記被験体に、前記治療用ペイロードを投与するステップを含み、前記治療用ペイロードが、（ｉ）ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含み、（ｉｉ）カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７６％を上回るＡＵＣｌａｓｔをもたらす、方法。
【請求項２】
前記治療用ペイロードが、カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７７％〜１５０％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療用ペイロードが、カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約８０％〜１２５％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体の前記脳内以外の第２の疾患を処置するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療用ペイロードが、頭蓋内以外で前記被験体に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用ペイロードが、経口、静脈内、筋肉内、皮下、注射、または注入によって投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の疾患および前記第２の疾患が、同じである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の疾患および前記第２の疾患が、異なる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の疾患が、前記被験体の前記脳内における腫瘍または異常の形態を呈する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の疾患が、前記被験体の、前記脳内以外の身体または血液における腫瘍または異常の形態を呈する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、書面の代わりにテキスト形式で提出され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、２００５６ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約７ＫＢであり、２０１９年３月２１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出されている。
【０００２】
本発明は、血液脳関門を透過する化合物を含む、疾患を処置するための化合物に関する。本発明はまた、本発明の化合物を含む医薬組成物、および前記組成物を様々な障害の処置に使用する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
治療剤を脳の特定の領域に送達することに関する課題を克服することは、脳のものを含め、多くの中枢神経系（ＣＮＳ）障害の処置または診断に対する主要な課題を表す。その神経保護的役割において、血液脳関門（ＢＢＢ）は、可能性として重要な多くの治療剤の脳への送達を妨害するように機能する。
【０００４】
そうでなければ診断および治療において有効であるかもしれない治療剤は、適切な量でＢＢＢを越えられない。すべての治療用分子のうちの９５％を上回るものが、血液脳関門を越えられないことが報告されている。したがって、疾患を処置するためにＢＢＢを越えて治療剤を送達することが所望されている。
【０００５】
加えて、脳内における疾患を処置するのに有効であり得る治療剤はまた、脳内以外における疾患を処置するのにも有用であり得る。したがって、被験体の脳内および脳外の両方における疾患、例えば、固形腫瘍または血液悪性疾患などを処置する方法を提供することが所望される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、被験体の脳内における疾患の処置を、活性剤がＢＢＢを越えることを可能にするある特定のｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含む治療用ペイロードを投与することによって行う方法が、提供される。本発明によると、治療用ペイロードは、ｐ９７断片にカップリングされていない形態の活性剤に類似の薬物動態特性を有する。
【０００７】
本発明により、被験体の脳内における疾患を処置し、さらに被験体の身体（脳内以外）または血液における疾患も処置することが可能となる。
【０００８】
本発明の一態様では、被験体の血液脳関門を越えて治療用ペイロードを送達する方法であって、被験体に、前記治療用ペイロードを投与するステップを含み、前記治療用ペイロードが、（ｉ）ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含み、（ｉｉ）カップリングされていない形態の活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７６％より大きいＡＵＣｌａｓｔをもたらす、方法が、提供される。
【０００９】
一態様では、治療用ペイロードは、カップリングされていない形態の活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７７％〜１５０％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす。一態様では、治療用ペイロードは、カップリングされていない形態の活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約８０％〜１２５％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす。
【００１０】
一態様では、ｐ９７断片は、１つまたは複数の末端システインおよび／またはチロシンを有する。
【００１１】
一態様では、ｐ９７断片は、Ｃ末端チロシンを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）から本質的になり、ここで、ｐ９７断片および活性剤は、長さが約１〜１０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている。
【００１２】
一態様では、ｐ９７断片は、Ｃ末端システインを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）から本質的になり、ここで、ｐ９７断片および活性剤は、長さが約１〜１０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている。
【００１３】
一態様では、ｐ９７断片は、Ｎ末端チロシンを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）から本質的になり、ここで、ｐ９７断片および活性剤は、長さが約１〜１０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている。
【００１４】
一態様では、ｐ９７断片は、Ｎ末端システインを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）から本質的になり、ここで、ｐ９７断片および活性剤は、長さが約１〜１０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている。
【００１５】
一態様では、活性剤は、小分子、ポリペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、アプタマー、または検出可能な実体である。
【００１６】
一態様では、小分子は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、白金、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、およびタキサンのうちの１つまたは複数から選択される、細胞傷害性剤または化学療法剤または抗血管新生剤である。
【００１７】
一態様では、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片である。
【００１８】
一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、がん関連抗原に特異的に結合する。
【００１９】
本発明の一態様では、被験体の血液脳関門を越えて治療用ペイロードを送達する方法であって、被験体に、前記治療用ペイロードを投与するステップを含み、前記治療用ペイロードが、（ｉ）ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含み、（ｉｉ）カップリングされていない形態の活性剤のＶｚ（ｍｌ／ｋｇ）の約１７３％未満のＶｚをもたらす、方法が、提供される。
【００２０】
一態様では、治療用ペイロードは、カップリングされていない形態の活性剤のＶｚ（ｍｌ／ｋｇ）の約５０％〜１５０％のＶｚをもたらす。
【００２１】
一態様では、治療用ペイロードは、カップリングされていない形態の活性剤のＶｚ（ｍｌ／ｋｇ）の約８０％〜１２５％のＶｚをもたらす。
【００２２】
本発明の一態様では、被験体の血液脳関門を越えて治療用ペイロードを送達する方法であって、被験体に、前記治療用ペイロードを投与するステップを含み、前記治療用ペイロードが、（ｉ）ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含み、（ｉｉ）カップリングされていない形態の活性剤のＣＬ（ｍｌ／日／ｋｇ）の１７８％未満のＣＬをもたらす、方法が、提供される。
【００２３】
一態様では、治療用ペイロードは、カップリングされていない形態の活性剤のＣＬ（ｍｌ／日／ｋｇ）の約５０％〜１７６％のＣＬをもたらす。
【００２４】
一態様では、治療用ペイロードは、カップリングされていない形態の活性剤のＣＬ（ｍｌ／日／ｋｇ）の約８０％〜１２５％のＣｌをもたらす。
【００２５】
本発明の一態様では、治療用ペイロードを被験体におけるＬＲＰ１受容体に結合させる方法であって、ＬＲＰ１受容体を、前記治療用ペイロードと接触させるステップを含み、前記治療用ペイロードが、（ｉ）ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）から本質的になるｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含み、（ｉｉ）カップリングされていない形態の活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７６％より大きいＡＵＣｌａｓｔをもたらす、方法が、提供される。
【００２６】
本発明の一態様では、被験体の脳内における第１の疾患を、被験体の血液脳関門を越えて治療用ペイロードを送達することによって処置する方法であって、被験体に、前記治療用ペイロードを投与するステップを含み、前記治療用ペイロードが、（ｉ）ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含み、（ｉｉ）カップリングされていない形態の活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７６％より大きいＡＵＣｌａｓｔをもたらす、方法が、提供される。
【００２７】
一態様では、治療用ペイロードは、カップリングされていない形態の活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７７％〜１５０％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす。
【００２８】
一態様では、治療用ペイロードは、カップリングされていない形態の活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約８０％〜１２５％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす。
【００２９】
一態様では、本発明は、被験体の脳内以外の第２の疾患を処置するステップをさらに含む。
【００３０】
一態様では、治療用ペイロードは、頭蓋内以外で被験体に投与される。
【００３１】
一態様では、治療用ペイロードは、経口、静脈内、筋肉内、皮下、注射、または注入によって投与される。
【００３２】
一態様では、第１の疾患および第２の疾患は、同じである。
【００３３】
一態様では、第１の疾患および第２の疾患は、異なる。
【００３４】
一態様では、第１の疾患は、被験体の脳内における腫瘍または異常の形態を呈する。
【００３５】
一態様では、第２の疾患は、被験体の、脳内以外の身体または血液における腫瘍または異常の形態を呈する。
【００３６】
一態様では、ｐ９７断片は、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む。
【００３７】
一態様では、ｐ９７断片は、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む。
【００３８】
一態様では、ｐ９７断片は、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。
【００３９】
一態様では、ｐ９７断片は、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
【００４０】
一態様では、ｐ９７断片は、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
一態様では、ｐ９７断片は、１つのアミノ酸残基が配列ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）とは異なるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
一態様では、ｐ９７断片は、２つのアミノ酸残基が配列ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）とは異なるアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、研究した異なる分子の概略図を示す。図１Ａは、単独の、ならびにフレキシブルリンカーまたは化学的コンジュゲーションを伴う遺伝子融合としてＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐが組み込まれた、ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１ＴＭを含む構築物を示す。図１Ｂは、鎮痛効果がある治療用分子ＩＬ−１ＲＡ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）を含有する、および遺伝子融合後にＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐがフレキシブルリンカーとともに組み込まれた、ＮＩＰ２２８ｈＩｇＧＴＭ抗体または抗体のＦｃ断片を含む構築物を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ＣＤ−１雌マウスにおけるＩＶ投与の２時間後のｍＡｂ  ＮＩＰ２２８  ａｎ  ｈＩｇＧ１ＴＭに基づく異なる構築物の脳内分布の代表的３Ｄ共焦点画像を示す。図２Ａは、Ａｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＮＩＰ２２８（赤色）の分布を示す。図２Ｂは、Ａｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＮＩＰ２２８に化学的にコンジュゲートされたＭＴｆ（赤色）の分布を示す。図２Ｃは、Ａｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＮＩＰ２２８に化学的にコンジュゲートされたＭＴｆｐｅｐ（赤色）の分布を示す。図２Ｄは、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識毛細血管（緑色）、およびＡｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＮＩＰ２２８に化学的にコンジュゲートされたＭＴｆｐｅｐ（赤色）が、表面拡大によりレンダリングされた（定量化された）ことを示す。
【図３】図３は、脳実質内の異なる分子の分布についての共焦点蛍光顕微鏡分析および半定量化を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、マウスＰＫアッセイにおけるＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ標的化ＩｇＧの血漿および脳曝露を示す。図４Ａは、ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ標的化ｈＩｇＧ１ＴＭの血漿中ＰＫを非標的化アイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）と比較して２週間にわたって示す。図４Ｂは、脳曝露を脳１グラム当たりの注射用量の％の尺度として示す。図４Ｃは、脳：血漿比の比較を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、マウスＰＫアッセイにおけるＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ標的化ＩｇＧの血漿および脳曝露を示す。図４Ａは、ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ標的化ｈＩｇＧ１ＴＭの血漿中ＰＫを非標的化アイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）と比較して２週間にわたって示す。図４Ｂは、脳曝露を脳１グラム当たりの注射用量の％の尺度として示す。図４Ｃは、脳：血漿比の比較を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、マウスＰＫアッセイにおけるＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ標的化ＩｇＧの血漿および脳曝露を示す。図４Ａは、ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ標的化ｈＩｇＧ１ＴＭの血漿中ＰＫを非標的化アイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）と比較して２週間にわたって示す。図４Ｂは、脳曝露を脳１グラム当たりの注射用量の％の尺度として示す。図４Ｃは、脳：血漿比の比較を示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、マウスＰＫアッセイにおけるＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ標的化ＩｇＧ−ＩＬ−１ＲＡ融合分子の血漿および脳曝露を示す。図５Ａは、ＩＬ−１ＲＡに融合したＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ標的化ｈＩｇＧの血漿中ＰＫを非標的化アイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）と比較して２週間にわたって示す。図５Ｂは、脳曝露を脳１グラム当たりの注射用量の％の尺度として示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、マウスＰＫアッセイにおけるＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ標的化ＩｇＧ−ＩＬ−１ＲＡ融合分子の血漿および脳曝露を示す。図５Ａは、ＩＬ−１ＲＡに融合したＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ標的化ｈＩｇＧの血漿中ＰＫを非標的化アイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）と比較して２週間にわたって示す。図５Ｂは、脳曝露を脳１グラム当たりの注射用量の％の尺度として示す。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、マウス部分的神経結紮モデルに対するＭＴｆ−ＩＬ−１ＲＡ融合体の鎮痛効果を示す。図６Ａは、ＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐを含有するＩＬ−１ＲＡ融合構築物とアイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）、ビヒクル対照および非結紮（偽手術施行）対照群との鎮痛効果の比較を示す。図６Ｂは、部分的神経結紮誘発機械的痛覚過敏の逆転に対するＭＴｆｐｅｐ標的化ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１ＴＭ−ＩＬ−１ＲＡ融合体の用量応答を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、マウス部分的神経結紮モデルに対するＭＴｆ−ＩＬ−１ＲＡ融合体の鎮痛効果を示す。図６Ａは、ＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐを含有するＩＬ−１ＲＡ融合構築物とアイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）、ビヒクル対照および非結紮（偽手術施行）対照群との鎮痛効果の比較を示す。図６Ｂは、部分的神経結紮誘発機械的痛覚過敏の逆転に対するＭＴｆｐｅｐ標的化ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１ＴＭ−ＩＬ−１ＲＡ融合体の用量応答を示す。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、配列番号２のペプチド（「ｘＢ３」と呼ばれる）のアミノ酸配列の配列差、およびＢＢＢを越えるペプチドの輸送を示す。図７Ａは、配列番号２のペプチドのアミノ酸配列の配列差を示す。図７Ｂは、ＢＢＢを越えるペプチドの輸送の比較を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、配列番号２のペプチド（「ｘＢ３」と呼ばれる）のアミノ酸配列の配列差、およびＢＢＢを越えるペプチドの輸送を示す。図７Ａは、配列番号２のペプチドのアミノ酸配列の配列差を示す。図７Ｂは、ＢＢＢを越えるペプチドの輸送の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下の詳細な説明は、当業者が本発明を実施するのを補助するために提供される。当業者であれば、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される実施形態に修正および変更を行うことができる。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。説明に使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、制限することを意図するものではない。
【００４５】
本出願に使用される場合、別途本明細書に明示的に提供される場合を除き、以下の用語のそれぞれは、以下に記載される意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願全体を通じて記載されている。用語が、本明細書に具体的に定義されていない場合、その用語には、その用語を本発明の説明においてその使用の文脈に適用する当業者により当該技術分野において認識されている意味が与えられる。
【００４６】
冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、文脈により別途明確に示されない限り、１つまたは１つより多くの（すなわち、少なくとも１つの）その冠詞の文法上の目的物を指す。例として、「１つの要素」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【００４７】
「約」という用語は、当業者によって決定される、特定の値または組成に対する許容可能な誤差の範囲内である値または組成を意味し、これは、部分的に、その値または組成が、どのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に依存することになる。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従い、１または１より大きい標準偏差の範囲内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、最大１０％または２０％の範囲（すなわち、±１０％または±２０％）を意味し得る。例えば、約３ｍｇは、２．７ｍｇ〜３．３ｍｇ（１０％の場合）または２．４ｍｇ〜３．６ｍｇ（２０％の場合）の任意の数を含み得る。さらに、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、最大１桁または最大５倍の値を意味し得る。特定の値または組成が、本出願および特許請求の範囲において提供される場合、別途示されない限り、「約」の意味は、その特定の値または組成の許容可能な誤差の範囲内であると想定するものとする。
【００４８】
「投与すること」は、当業者に公知の様々な方法および送達システムのいずれかを使用した、治療剤を含む組成物の被験体への物理的導入を指す。例えば、投与の経路としては、頬内、鼻内、眼、経口、浸透（osmotic）、非経口、直腸、舌下、局所、経皮、膣、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入によるものを挙げることができる。本明細書で使用される場合、「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与様式、通常、注射によるものを意味し、これには、限定することなく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔が含まれる。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１回もしくは複数回の長期間にわたって、実施されてもよく、治療有効用量または治療量以下の用量であり得る。
【００４９】
「ＡＵＣ」（曲線下面積）という用語は、被験体に吸収または曝露される薬物の総量を指す。一般に、ＡＵＣは、濃度が無視できるようになるまでの被験体における経時的な薬物濃度のプロットで、数学的方法により得ることができる。「ＡＵＣ」（曲線下面積）という用語はまた、指定の時間間隔における部分的なＡＵＣ（早期の時間間隔においてＡＵＣが増加するであろう舌下吸収の場合に該当し得るような）も指し得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の両方、ならびにアミノ酸アナログおよび模倣体を意味することが意図される。天然に存在するアミノ酸としては、タンパク質生合成中に用いられる２０個の（Ｌ）−アミノ酸、ならびに例えば４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリン、およびオルニチンなどのその他のものが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸としては、例えば、（Ｄ）−アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどが挙げられ、これらは、当業者に公知である。アミノ酸アナログには、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸の改変形態が含まれる。そのような改変としては、例えば、アミノ酸上の化学基および部分の置換もしくは置換え、またはアミノ酸の誘導体化によるものを挙げることができる。アミノ酸模倣体は、例えば、参照アミノ酸に特徴的な電荷および電荷間隔など、機能的に類似する特性を呈する有機構造体を含む。例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）を模倣する有機構造体は、天然に存在するＡｒｇアミノ酸に類似の分子空間に位置し、その側鎖のアミノ基と同じ程度の可撓性を有する、正電荷部分を有するであろう。模倣体には、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適な間隔および電荷の相互作用を維持するように拘束された構造体も含まれる。当業者であれば、どの構造体が、機能的に同等なアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を構成するのかを認識しているかまたは決定することができる。
【００５１】
「がん」という用語は、身体における異常な細胞の無制御な成長に特徴付けられる様々な疾患の広範な群を指す。制御されない細胞の分裂および成長は、隣接する組織に侵入し、またリンパ系または血流を通じて身体の遠位部分に転移し得る、悪性腫瘍の形成をもたらす。「がん」には、原発性がん、転移性がんおよび再発性がん、ならびに前がん状態、すなわち、がんの危険性の増加と関連する障害を受けた細胞形態の状態が含まれる。「がん」という用語は、これらに限定されないが、以下の増殖性疾患：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌（Adrenocortical Carcinoms）、小児がん、ＡＩＤＳ関連がん、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブロイド腫瘍、基底細胞癌、皮膚がん（非黒色腫）、胆管がん、膀胱がん、骨がん、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、骨肉腫および悪性線維性組織球症、脳幹神経膠腫、非定型奇形腫／ラブロイド腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、消化管癌、心（心臓）腫瘍、原発性リンパ腫、子宮頸がん、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫およびセザリー症候群、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、胚芽腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、感覚神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨の線維性組織球症、悪性および骨肉腫、胆嚢がん、胃（gastric）（胃（stomach））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣、精巣、妊娠性の絨毛性疾患、神経膠腫、有毛細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、膵臓内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓、腎細胞、ランゲルハンス細胞の組織球症、喉頭がん、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、有毛細胞性の白血病、口唇および口腔のがん、肝臓がん（原発性）、非小細胞、小細胞の肺がん、ホジキン型、非ホジキン型のリンパ腫、ワルデンシュトレーム型のマクログロブリン血症、男性の乳がん、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、潜在性原発性転移性扁平上皮性頸部がん、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線上の癌（MidlineTract Carcinoma）、口のがん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成性／骨髄増殖性新生物、慢性（ＣＭＬ）骨髄性白血病、骨髄性白血病、急性（ＡＭＬ）骨髄腫、多発性、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん（OralCancer）、口腔のがん（Oral Cavity Cancer）、口唇および中咽頭のがん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球症、卵巣がん、低悪性度潜在性腫瘍、膵臓がん、膵臓内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔のがん、副甲状腺がん、陰茎が��、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠および乳がん、原発性ＣＮＳリンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓細胞（腎臓）がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、横紋筋肉腫、子宮、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸部がん、胃（stomach）（胃（gastric））がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、不明な原発性尿管および腎盂の移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにウイルムス腫瘍が挙げられる。
【００５２】
「Ｃｍａｘ」という用語は、最初の用量の投与と第２の用量の投与との間の被験体の血液、血清、指定コンパートメント、または試験領域における薬物の最大濃度を指す。Ｃｍａｘという用語は、指定される場合、用量正規化比も指し得る。
【００５３】
本明細書全体を通じて、文脈によりそうでないことが求められない限り、「含む（comprise）、「含む（comprises）」、および「含むこと（comprising）」という言葉は、示されたステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を意味するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。「からなる」とは、「からなる」という語句が続くものがすべて含まれ、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が、必要とされるかまたは必須であること、および存在し得る他の要素がないことを示す。「から本質的になる」とは、この語句の前に列挙されるすべての要素を含み、列挙された要素に対し、本開示で指定された活性または作用に干渉も妨害もしない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が、必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は、必要に応じたものであり、それらが列挙された要素の活性または作用に物質的に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在し得る場合も存在し得ない場合もあることを示す。
【００５４】
「コンジュゲート」という用語は、薬剤または他の分子、例えば、生物学的に活性な分子の、ｐ９７ポリペプチドへの共有結合的または非共有結合的な結合または連結の結果として形成される実体を指すことが意図される。コンジュゲートポリペプチドの１つの例は、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」であり、これは、もともとは別個のポリペプチドをコードしていた２つまたはそれより多くのコード配列の接続によって作られるポリペプチドであり、結合されたコード配列の翻訳により、典型的に別個のポリペプチドのそれぞれに由来する機能的特性を有する単一の融合ポリペプチドが生じる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「機能」および「機能的」などの用語は、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
【００５６】
「相同性」は、同一であるか、または保存的置換を構成する、アミノ酸のパーセンテージ数を指す。相同性は、配列比較プログラム、例えば、ＧＡＰ（Deveraux et al., Nucleic Acids Research. 12, 387-395, 1984）を使用して決定することができ、これは、参照により本明細書に組み込まれる。このようにして、本明細書に記載されるものに類似または実質的に異なる長さの配列を、アライメントへのギャップの挿入によって比較することができ、そのようなギャップは、例えば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【００５７】
「単離された」とは、通常はその天然の状態で付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、ペプチドまたはポリペプチド分子のその天然の細胞環境から、および細胞の他の成分との関係からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単離および／または精製を含み、すなわち、それは、ｉｎ  ｖｉｖｏの物質とは有意に関係していない。
【００５８】
「連結」、「リンカー」、「リンカー部分」、または「Ｌ」という用語は、ｐ９７ポリペプチド断片を、目的の薬剤から分離するため、または例えば、ここで、２つもしくはそれより多くの薬剤が連結されてｐ９７コンジュゲートを形成している場合に、第１の薬剤を別の薬剤から分離するために使用することができる、リンカーを指す。リンカーは、生理学的に安定であり得るか、または放出可能なリンカー、例えば、酵素的に分解可能なリンカー（例えば、タンパク質分解により切断可能なリンカー）を含み得る。ある特定の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーであり得、例えば、ｐ９７融合タンパク質の一部であり得る。一部の態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーまたは非タンパク質性リンカーであり得る。一部の態様では、リンカーは、粒子、例えば、ナノ粒子であり得る。
【００５９】
「モジュレートする」および「変更する」という用語は、典型的に、対照と比べて統計学的に有意または生理学的に有意な量または程度で、「増加させる」、「増強する」、または「刺激する」、ならびに「減少させる」または「低減させる」ことを含む。「増加した」、「刺激される」、または「増強される」量は、典型的に、「統計学的に有意な」量であり、これには、組成物なしで（例えば、本発明のコンジュゲートのポリペプチドの不在）または対照組成物、試料、もしくは試験被験体によって産生される量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれより大きい（例えば、５００倍、１０００倍）（それらの間にあるすべての整数および１を上回るすべての小数値、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）増加が含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に、「統計学的に有意な」量であり、これには、組成物なしでまたは対照組成物によって産生される量の、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少が、それらの間のすべての整数を含めて、含まれ得る。１つの非限定的な例として、対照は、活性、例えば、薬剤単独と比べた、ｐ９７−薬剤コンジュゲートの血液脳関門を越える輸送／送達の量または速度、中枢神経系組織への分布の速度および／またはレベル、ならびに／あるいは血漿、中枢神経系組織、または任意の他の全身もしくは末梢非中枢神経系組織のＣｍａｘを比較することができる。比較および「統計学的に有意な」量の他の例は、本明細書に記載される。
【００６０】
ある特定の実施形態では、組成物中の任意の所与の薬剤（例えば、ｐ９７コンジュゲート、例えば、融合タンパク質）の「純度」は、具体的に定義され得る。例えば、ある特定の組成物は、例えば、決して限定することなく、化合物を分離、特定、および定量するために生物化学および分析化学において頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの周知の形態である高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した場合に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（間にあるすべての小数値を含む）純粋である薬剤を含み得る。
【００６１】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマー、ならびにそのバリアントおよび合成アナログを指して互換可能に使用される。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、天然に存在しない合成のアミノ酸、例えば、天然に存在する対応するアミノ酸の化学的アナログである、アミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書に記載されるポリペプチドは、具体的な長さの産物に限定されず、したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれ、そのような用語は、別途具体的に示されない限り、本明細書において互換可能に使用され得る。本明細書に記載されるポリペプチドはまた、発現後の改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該技術分野において公知の他の改変、天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方を、含み得る。ポリペプチドは、タンパク質全体、またはその部分配列、断片、バリアント、もしくは誘導体であり得る。
【００６２】
「生理学的に切断可能」または「加水分解可能」または「分解可能」な結合は、生理学的条件下において、水と反応する（すなわち、加水分解される）結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子を接続している連結の一般的な種類だけでなく、これらの中心原子に結合している置換基にも依存するであろう。適切な加水分解的に不安定または弱い連結としては、これらに限定されないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、カーボネート、およびヒドラゾン、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６３】
「放出可能なリンカー」としては、これらに限定されないが、生理学的に切断可能なリンカーおよび酵素的に分解可能なリンカーが挙げられる。したがって、「放出可能なリンカー」は、生理学的条件下において、自発的加水分解または何らかの他の機序による切断（例えば、酵素に触媒される、酸に触媒される、塩基に触媒されるなど）のいずれかを受け得るリンカーである。例えば、「放出可能なリンカー」は、駆動力として、プロトン（例えば、イオン化可能な水素原子、Ｈａ）の塩基の引き抜き（base abstraction）を有する脱離反応を含み得る。本明細書の目的で、「放出可能なリンカー」は、「分解可能なリンカー」と同義である。「酵素的に分解可能な連結」は、連結、例えば、１つまたは複数の酵素、例えば、ペプチダーゼまたはプロテアーゼによる分解の対象となるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、放出可能なリンカーは、ｐＨ７．４、２５℃、例えば、生理学的ｐＨ、ヒトの体温（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、または約９６時間、またはそれよりも短い半減期を有する。
【００６４】
「参照配列」という用語は、一般に、核酸コード配列、またはアミノ酸配列を指し、それに対して、別の配列が比較される。本明細書に記載されるすべてのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、名称で記載されるものならびに表および配列表に記載されるものを含め、参照配列として含まれる。
【００６５】
「配列同一性」または例えば「５０％同一な配列」を含む用語は、本明細書で使用される場合、配列が、比較ウインドウにわたって、ヌクレオチドごとの基準またはアミノ酸ごとの基準で、同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアライメントされた配列を、比較ウインドウにわたって比較し、同一な核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一なアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列に生じる位置の数を決定して、一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除し、この結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算することができる。
【００６６】
本明細書に記載される参照配列（例えば、配列表を参照されたい）のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する。
【００６７】
２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関係を説明するために使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さが、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含め、少なくとも１２個であるが、高頻度で１５〜１８個であり、多くの場合に少なくとも２５個のモノマー単位である。
【００６８】
２つのポリヌクレオチドは、それぞれが、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似である配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含むため、２つ（またはそれより多くの）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、２つのポリヌクレオチドの配列を、「比較ウインドウ」にわたって比較して、局所的な配列類似性領域を特定し、比較することによって行われる。「比較ウインドウ」は、少なくとも６つ、通例的には約５０〜約１００個、より通例的には約１００〜約１５０個の連続した位置の概念的セグメントを指し、このセグメントにおいて、ある配列が、同じ連続する位置数の参照配列に対して、２つの配列を最適にアライメントした後に比較される。比較ウインドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウをアライメントするのに最適な配列アライメントは、例えば、コンピューターによるアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージリリース７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または選択された様々な方法のいずれかによって生成される探索および最良のアライメント（すなわち、比較ウインドウにわたってもっとも高いパーセンテージの相同性をもたらすもの）によって行うことができる。例えば、Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389, 1997によって開示されるように、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムへの参照もなされ得る。配列分析の詳細な考察は、Ausubelet al., "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley &Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15のユニット１９．３に見出すことができる。
【００６９】
「統計学的に有意な」とは、結果が、偶然によって生じる可能性が低かったことを意味する。統計学的有意性は、当該技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。一般的に使用される有意性の尺度としては、ｐ値が挙げられ、これは、帰無仮説が正しい場合に観察された事象が生じる頻度または確率である。得られたｐ値が、有意性レベルよりも小さい場合、帰無仮説は拒絶される。単純な事例では、有意性レベルは、０．０５またはそれ未満のｐ値で定義される。
【００７０】
「溶解度」という用語は、ｐ９７ポリペプチド断片またはコンジュゲートが、液体溶媒中に溶解され、均質な溶液を形成する特性を指す。溶解度は、典型的に、濃度として、溶媒の単位体積当たりの溶質の質量（溶媒１ｋｇ当たりの溶質のｇ数、１ｄＬ（１００ｍｌ）当たりのｇ数、ｍｇ／ｍｌなど）、容積モル濃度、重量モル濃度、モル分率、または他の類似の濃度に関する記述のいずれかによって、表される。溶媒の量当たりの溶解し得る溶質の最大平衡量は、溶媒の温度、圧力、ｐＨ、および性質を含む、指定された条件下における、その溶媒中へのその溶質の溶解度である。ある特定の実施形態では、溶解度は、生理学的ｐＨにおいて、または他のｐＨ、例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、もしくはｐＨ７．４において測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、水中または生理学的緩衝液、例えば、ＰＢＳまたはＮａＣｌ（ＮａＰありまたはなし）において測定される。具体的な実施形態では、溶解度は、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および比較的高い塩（例えば、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＮａＰ）において測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、生物学的流体（溶媒）、例えば、血液または血清において測定される。ある特定の実施形態では、温度は、およそ室温（例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５℃）またはおよそ体温（約３７℃）であり得る。ある特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドまたはコンジュゲートは、室温または約３７℃において、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。
【００７１】
「被験体」には、本明細書で使用される場合、本発明のｐ９７コンジュゲートで処置または診断することができる症状を呈するか、または症状を呈する危険性にある、動物が含まれる。好適な被験体（患者）には、研究室動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、もしくはモルモット）、家畜動物、および飼育動物または愛玩動物（例えば、ネコもしくはイヌ）が含まれる。非ヒト霊長類および、好ましくはヒト患者が、含まれる。
【００７２】
「実質的に」または「本質的に」とは、ほぼ全体的または完全にを意味し、例えば、なんらかの所与の数量の９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも上を意味する。
【００７３】
「実質的に含まない」とは、所与の数量のほぼ完全な不在または完全な不在を指し、例えば、なんらかの所与の数量の約１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、またはそれを下回ることを指す。例えば、ある特定の組成物は、細胞タンパク質、膜、核酸、内毒素、または他の夾雑物を「実質的に含まない」場合がある。
【００７４】
「処置」または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、疾患または状態の症状または病理に対する任意の望ましい効果を含み、処置されている疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最小限の変化または改善すらも含み得る。「処置」または「処置すること」は、必ずしも、疾患もしくは状態またはその関連症状の完全な根絶または治癒を示すわけではない。この処置を受けている被験体は、それを必要とする任意の被験体である。臨床上の改善の例示的なマーカーは、当業者には明らかであろう。
【００７５】
「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団においてもっとも高頻度に観察されるものであり、したがって、遺伝子の「通常」または「野生型」形態と任意に設計される。
【００７６】
ｐ９７ポリペプチド配列およびそのコンジュゲート
本発明の実施形態は、概して、ヒトｐ９７（メラノトランスフェリン、ＭＴｆ）のポリペプチド断片、そのような断片を含む組成物、およびそのコンジュゲートに関する。ある特定の事例では、本明細書に記載されるｐ９７ポリペプチド断片は、輸送活性を有する、すなわち、それらは、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送することができる。特定の実施形態では、ｐ９７断片は、目的の薬剤、例えば、治療剤、診断剤、または検出可能な薬剤に共有結合的に、非共有結合的に、または作動可能にカップリングされて、ｐ９７−薬剤コンジュゲートを形成する。薬剤の具体的な例としては、本明細書に記載され当該技術分野において公知である他の薬剤の中でもとりわけ、小分子およびポリペプチド、例えば、抗体が挙げられる。例示的なｐ９７ポリペプチド配列および薬剤は、以下に記載されている。また、ｐ９７ポリペプチドを目的の薬剤にカップリングさせるための例示的な方法および成分、例えば、リンカー基も記載されている。
【００７７】
ｐ９７配列。一部の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドは、配列番号２（ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ）において特定されるヒトｐ９７断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００７８】
以下により詳細に記載される他の具体的な実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、その長さにわたって、配列番号２に記載されるヒトｐ９７配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性または相同性を有する配列を含む。典型的には、ｐ９７ポリペプチドは、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％、より典型的には少なくとも８５％、さらにより典型的には少なくとも９０％、さらにより典型的には少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。多くの場合、ｐ９７ポリペプチドは、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。典型的には、ｐ９７ポリペプチドは、０、１、または２個のアミノ酸がＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）とは異なるアミノ酸配列、例えば、ＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号３）を含む。
【００７９】
特定の実施形態では、ｐ９７断片またはそのバリアントは、ＢＢＢを越え、必要に応じて、ＢＢＢを越えて中枢神経系へ目的の薬剤を輸送する能力を有する。ある特定の実施形態では、ｐ９７断片またはそのバリアントは、ｐ９７受容体、ＬＲＰＩ受容体、および／またはＬＲＰＩＢ受容体に特異的に結合することができる。
【００８０】
一部の実施形態では、ｐ９７断片は、１つまたは複数の末端（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端）システインおよび／またはチロシンを有し、これらは、それぞれ、コンジュゲーションおよびヨウ素化のために付加され得る。
【００８１】
参照ｐ９７ポリペプチドおよび他の参照ポリペプチドのバリアントおよび断片は、以下により詳細に説明されている。
【００８２】
ｐ９７カップリング。上述のように、ある特定の実施形態は、融合またはコンジュゲーションによって、目的の薬剤、例えば、小分子、ポリペプチド（例えば、ペプチド、抗体）、ペプチド模倣体、ペプトイド、アプタマー、検出可能な実体、またはこれらの任意の組合せにカップリングされたｐ９７ポリペプチドを含む。また、１つより多くの目的の薬剤を含むコンジュゲート、例えば、抗体および小分子にコンジュゲートされたｐ９７断片も含まれる。
【００８３】
共有結合的連結が好ましいが、しかしながら、比較的強力な非共有結合的タンパク質−リガンド相互作用、例えば、ビオチンとアビジンとの間の相互作用を用いるものを含め、非共有結合的連結もまた、利用することができる。ｐ９７断片の薬剤との融合が、特に好ましい。必ずしもｐ９７断片と目的の薬剤との間の直接的な共有結合的または非共有結合的相互作用を必要としない、作動可能な連結も含まれ、そのような連結の例としては、ｐ９７ポリペプチドおよび目的の薬剤を含むリポソーム混合物が挙げられる。タンパク質コンジュゲートを生成する例示的な方法は、本明細書に記載されており、他の方法は、当該技術分野において周知である。
【００８４】
小分子。特定の実施形態では、ｐ９７断片は、小分子にコンジュゲートされる。「小分子」は、合成起源または生物学的起源（生体分子）であるが、典型的にはポリマーでない、有機化合物を指す。有機化合物は、分子が炭素を含む、大きなクラスの化学的化合物を指し、典型的に、カーボネートのみを含むもの、炭素の単純な酸化物、またはシアン化物は除外される。「生体分子」は、一般に、生きた生物によって産生される有機分子を指し、大きなポリマー分子（バイオポリマー）、例えば、ペプチド、多糖類、および核酸、ならびに小分子、例えば、一次二次代謝産物、脂質、リン脂質、糖脂質、ステロール、グリセロ脂質、ビタミン、およびホルモンが含まれる。「ポリマー」は、一般に、典型的には共有結合的化学結合によって接続される反復的構造単位から構成される大きな分子または高分子を指す。
【００８５】
ある特定の実施形態では、小分子は、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、５００、６５０、６００、７５０、７００、８５０、８００、９５０、１０００、または２０００ダルトンを含め、約１０００〜２０００ダルトン未満の、典型的には、約３００〜７００ダルトンの分子量を有する。
【００８６】
ある特定の小分子は、抗体に関して記載される（後述）「特異的結合」の特徴を有し得る。例えば、小分子は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で、本明細書に記載される標的に特異的に結合し得る。ある特定の実施形態では、小分子は、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、本明細書に記載される少なくとも１つのがん関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、小分子は、本明細書に記載される少なくとも１つの神経系関連抗原、疼痛関連抗原、および／または自己免疫関連抗原に特異的に結合する。
【００８７】
例示的な小分子としては、細胞傷害剤、化学療法剤、および抗血管新生剤、例えば、中枢神経系のがんおよび中枢神経系に転移したがんを含む、様々ながんの処置において有用であると考えられているものが挙げられる。
【００８８】
小分子の特定のクラスとしては、限定することなく、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、白金、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、およびタキサンが挙げられる。
【００８９】
小分子の具体的な例としては、クロラムブシル、シクロホスファミド、シレンジタイド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、エンザスタウリン、ブスルファン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ゲフィチニブ、エルロチニブ  イダルビシン、テモゾロミド、エピルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、テムシロリムス、エベロリムス、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ＣＴ５２９２３、およびパクリタキセル、ならびに上述のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【００９０】
小分子のさらなる例としては、神経系（例えば、ＣＮＳ）障害の処置のためにタンパク質キナーゼを標的とするものが挙げられ、これには、イマチニブ、ダサチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、スニチニブ、バタラニブ、ゲフチニブ（geftinib）、エルロチニブ、ＡＥＥ−７８８、ジコロ酢酸（dichoroacetate）、タモキシフェン、ファスジル、ＳＢ−６８１３２３、およびセマキサニブ（ＳＵ５４１６）が含まれる（Chicoet al., Nat Rev Drug Discov. 8:829-909, 2009を参照されたい）。小分子の例としては、ドネピジル（donepizil）、ガランタミン、メマンチン、リバスチグミン、タクリン、ラシギリン（rasigiline）、ナルトレキソン、ルビプロストン、サフィナミド、イストラデフィリン、ピマバンセリン、ピトリサント（pitolisant）、イスラジピン、プリドピジン（ＡＣＲ１６）、テトラベナジン、およびベキサロテン（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病を処置するため）、ならびに酢酸グラチリマー（glatirimeracetate）、フィンゴリモド、ミトキサントロン（例えば、ＭＳを処置するため）も挙げられる。上述のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体もまた含まれる。
【００９１】
小分子のさらなる例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））、スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン、アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスファオラミド（triethylenethiophosphaoramide）、およびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン、ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（mechlorethamineoxide hydrochloride）、メルファラン、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、ニトロソ尿素（nitrosureas）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、抗生物質、例えば、アクラノマイシン（aclacinomysins）、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン（olivomycin）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート、プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ、アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、抗副腎薬（anti-adrenal）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、葉酸補液（folicacid replenisher）、例えば、フロリン酸（frolinic acid）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド（aldophosphamideglycoside）、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル（bestrabucil）、ビスアントレン、エダトレキセート（edatraxate）、デフォファミン（defofamine）、デメコルチン、ジアジクオン、エルフォルミチン（elformithine）、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸（podophyllinicacid）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン（gacytosine）、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）、クロラムブシル、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキセート、白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、ＣＰＴ−１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００、ジフルオロメチロミチン（difluoromethylomithine）（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸誘導体、例えば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）、ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）、エスペラミシン、カペシタビン、ならびに上述のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【００９２】
腫瘍に対してホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、例として、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む、抗エストロゲン剤、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤、ならびに上述のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体もまた、含まれる。
【００９３】
上述のように、ある特定の態様では、小分子は、そうでなければ心臓毒性剤である。
【００９４】
心臓毒性小分子の特定の例としては、限定することなく、アントラサイクリン／アントラキノロン、シクロホスファミド、代謝拮抗物質、微小管阻害剤、およびチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。心臓毒性剤の具体的な例としては、本明細書に記載され当該技術分野において公知の他の小分子の中でもとりわけ、シクロペンテニルシトシン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、パクリタキセル、ドカタキセル（docataxel）、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エメチン、イソタミド（isotamide）、マイトマイシンＣ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、シスプラチン、サリドマイド、ブスルファン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、三酸化ヒ素、メトトレキセート、ロシグリタゾン、およびミトキサントロンが挙げられる。
【００９５】
ポリペプチド薬剤。特定の実施形態では、目的の薬剤は、ペプチドまたはポリペプチドである。「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用されるが、しかしながら、ある特定の事例では、「ペプチド」という用語は、より短いポリペプチド、例えば、間のすべての整数および範囲（例えば、５〜１０個、８〜１２個、１０〜１５個）を含め、約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個のアミノ酸からなるポリペプチドを指し得る。ポリペプチドおよびペプチドは、本明細書に記載されるように、天然に存在するアミノ酸および／または天然に存在しないアミノ酸から構成され得る。抗体もまた、ポリペプチドとして含まれる。
【００９６】
例示的なポリペプチド薬剤としては、リソソーム貯蔵障害と関連するポリペプチドが挙げられる。そのようなポリペプチドの例としては、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイン輸送体、Ｌａｍｐ−２、ａ−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、ａ−Ｌ−フコシダーゼ、−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−ガングリオシド活性化因子（ＧＭ２Ａ）、ａ−Ｄ−マンノシダーゼ、−Ｄ−マンノシダーゼ、アリルスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、ａ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼｙ−サブユニット、Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、ａ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、スルファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、カテプシンＡ、カテプシンＫ、ａ−ガラクトシダーゼＢ、ＮＰＣｌ、ＮＰＣ２、シアリン、およびシアル酸輸送体が、それらの断片、バリアント、および誘導体を含め、挙げられる。
【００９７】
ある特定の実施形態は、ポリペプチド、例えば、インターフェロン−ポリペプチド、例えば、インターフェロン−Ｉａ（例えば、ＡＶＯＮＥＸ、ＲＥＢＩＦ）、およびインターフェロン−Ｉｂ（例えば、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）を含み、これらは、多発性硬化症（ＭＳ）の処置に使用されることが多い。
【００９８】
一部の実施形態では、上述のように、ポリペプチド薬剤は、抗体またはその抗原結合性断片である。本発明のコンジュゲートまたは組成物において使用される抗体または抗原結合性断片は、本質的に任意の種類のものであり得る。特定の例としては、治療用抗体および診断用抗体が挙げられる。当該技術分野において周知のように、抗体は、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を通じて特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’ｈ、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その合成バリアント、天然に存在するバリアント、必要とされる特異性の抗原結合性断片を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性の抗原結合性部位または断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリンの任意の他の改変された構成も包含する。
【０１００】
「抗原結合性断片」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の抗原に結合する免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有する、ポリペプチド断片を指す。この点に関して、本明細書に記載される抗体の抗原結合性断片は、治療標的または診断標的に結合する抗体に由来するＶＨおよびＶＬ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つすべてのＣＤＲを含み得る。
【０１０１】
「抗原」という用語は、選択的結合剤、例えば、抗体が結合することができ、さらに、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生させるために動物において使用することができる、分子または分子の一部分を指す。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有し得る。
【０１０２】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど、分子の化学的に活性な表面基（surface grouping）を含み、ある特定の実施形態では、特異的な３次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗原の一次構造に関して連続的であっても非連続的であってもよい。
【０１０３】
抗体などの分子は、それが、特定の細胞または物質と、別の細胞または物質よりも、より頻繁に、より急速に、より長い期間、および／またはより高い親和性で、反応または会合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。抗体は、それが他の物質に結合するよりも、高い親和性で、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間、結合する場合、標的に「特異的に結合する」か、または「優先的に結合する」。例えば、特異的なエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、その特異的なエピトープに、それが他のエピトープに結合するよりも、高い親和性で、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間結合する、抗体である。この定義を読むことにより、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的または優先的に結合する場合も結合しない場合もあることも理解される。そのため、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも、排他的結合を必要とするものではない（が、それを含んでもよい）。一般には、結合への言及は、優先的結合を意味するが、必ずしもそうとは限らない。
【０１０４】
免疫学的結合は、一般に、例えば、例示であり限定ではなく、静電的、イオン、親水性、および／もしくは疎水性の引力もしくは斥力、立体力、水素結合、ファンデルワールス力、ならびに他の相互作用の結果として、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンの特異的な抗原との間に生じる、非共有結合的な種類の相互作用を指す。免疫学的結合の相互作用の強さまたは親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表すことができ、ここで、Ｋｄが小さいほど、親和性が高い。
【０１０５】
選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野において周知の方法を使用して、定量することができる。１つのそのような方法は、抗原結合性部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを必要とし、ここで、その速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および速度に両方向で同等に影響を及ぼす幾何パラメーターに依存する。したがって、「オンレート定数」（Ｋｏｎ）および「オフレート定数」（Ｋｏｆｆ）の両方を、濃度ならびに結合および解離の実際の速度の計算によって決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しないすべてのパラメーターを取り消すことを可能にし、したがって、解離定数Ｋｄと同等である。
【０１０６】
選択された抗体およびポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野において周知の方法を使用して、定量することができる（Davies et al., Annual Rev. Biochem. 59:439-473, 1990を参照されたい）。一部の実施形態では、抗体または他のポリペプチドは、平衡解離定数が約１０−７または１０−８Ｍ以下の場合に、抗原またはそのエピトープに特異的に結合すると言われる。一部の実施形態では、抗体の平衡解離定数は、約１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下である。ある特定の例示的な実施形態では、抗体または他のポリペプチドは、（抗体が特異的に結合する）抗原または本明細書に記載される標的に対して、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの親和性（Ｋｄ）を有する。
【０１０７】
一部の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質のリガンドに特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、細胞内タンパク質に特異的に結合する。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合性断片または他のポリペプチドは、がん関連抗原またはがん抗原に特異的に結合する。例示的ながん抗原としては、細胞表面タンパク質、例えば、細胞表面受容体が挙げられる。そのような細胞表面タンパク質または受容体に結合するリガンドもまた、がん関連抗原として含まれる。具体的な実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、細胞内がん抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、がん抗原が付随するがんは、乳がん、転移性脳がん、前立腺がん、消化管がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、扁平上皮癌、ＣＮＳもしくは脳がん、黒色腫、非黒色腫がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、上皮腫瘍、骨がん、または造血系がんのうちの１つまたは複数である。
【０１０９】
特定の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、少なくとも１つのがん関連抗原またはがん抗原、例えば、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒｌ／ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、Ｂ７Ｈ３、ＣＤＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、Ｃ２４２抗原、ＳＴ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）  ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤＳｌ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−ｌＣ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、アルファ−フェトタンパク質、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インテグリンａｖ３、インテグリンａ５  １、葉酸受容体１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ１６（もしくはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−ＲＩ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦｌＯＢもしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原（pancarcinoma antigen）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来増殖因子受容体、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−ｌＡ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＯＩ）、再生肝のホスファターゼ（Phosphataseof Regenerating Liver）３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、ルイス−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現されるジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ならびに／またはメソテリンに特異的に結合する。
【０１１０】
具体的な実施形態では、抗体もしくはその抗原結合性断片または他のポリペプチドは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する。本質的に、任意の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗原結合性断片、または他のＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的結合剤を、本発明のｐ９７−抗体コンジュゲートの産生に使用することができる。例示的な抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、例えば、米国特許第５，６７７，１７１号、同第５，７２０，９３７号、同第５，７２０，９５４号、同第５，７２５，８５６号、同第５，７７０，１９５号、同第５，７７２，９９７号、同第６，１６５，４６４号、同第６，３８７，３７１号、および同第６，３９９，０６３号に記載されており、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
一部の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合性断片または他のポリペプチドは、ヒトＨｅｒｌ／ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に特異的に結合する。本質的に、任意の抗Ｈｅｒｌ／ＥＧＦＲ抗体、抗原結合性断片、または他のＨｅｒｌ／ＥＧＦＲ特異的結合剤を、本発明のｐ９７−抗体コンジュゲートの産生に使用することができる。例示的な抗Ｈｅｒｌ／ＥＧＦＲ抗体は、例えば米国特許第５，８４４，０９３号、同第７，１３２，５１１号、同第７，２４７，３０１号、同第７，５９５，３７８号、同第７，７２３，４８４号、同第７，９３９，０７２号、および同第７，９６０，５１６号に記載されており、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、抗体は、治療用抗体、例えば、抗がん治療用抗体であり、これには、３Ｆ８、８Ｈ９、アバゴボマブ、アデカツムマブ（adecatumumab）、アフツズマブ、アレムツズマブ、アラシズマブ（alacizumab）（ペゴール）、アマツキシマブ、アポリズマブ、バビツキシマブ（bavituximab）、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ（メルタンシン）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブ（メルタンシン）、カンツズマブ（ラブタンシン）、カプロマブ（ペンデチド）、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ボガトクス）、シクスツムマブ（cixutumumab）、クリバツズマブ（テトラキセタン）、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エナバツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ＦＢＴＡ０５、フィジツムマブ、フランボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ（オゾガマイシン）、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ（ベドチン）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ（igovomab）、インダツキシマブラブタンシン、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１）、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（メルタンシン）、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モキセツモマブ（パスドトクス）、ナコロマブ（タフェナトクス）、ナプツモマブ（エスタフェナトクス）、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、Ｎｅｕｒａｄｉａｂ（登録商標）（放射性ヨウ素ありまたはなし）、ＮＲ−ＬＵ−１０、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ（モナトクス）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サマリズマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、タバルマブ、タプリツモマブ（パプトクス）、テナツモマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、トレメリムマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ、ＴＲＢＳ０７、トラスツズマブ、ツコツズマブ（セルモロイキン）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、およびザルツムマブなどの抗体が含まれる。これらの抗体の断片、バリアント、および誘導体もまた、含まれる。
【０１１３】
特定の実施形態では、抗体は、心臓毒性抗体、すなわち、コンジュゲートされていない形態で投与されると心臓毒性を呈する抗体である。心臓毒性を呈する抗体の具体的な例としては、トラスツズマブおよびベバシズマブが挙げられる。
【０１１４】
具体的な実施形態では、ｐ９７コンジュゲートにおいて使用される抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体である。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、ヒト乳がんの処置に承認されているＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合する抗原結合性断片は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体のＣＤＲのうちの１つまたは複数を含む。この点に関して、一部の事例では、抗体のＶＨＣＤＲ３のみの輸送が行われ得、残りは、所望される特異的結合を保持することが、示されている（Barbas et al., PNAS. 92:2529-2533, 1995）。Mclane et al., PNAS USA.92:5214-5218, 1995およびBarbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162, 1994もまた参照されたい。
【０１１５】
他の具体的な実施形態では、本発明のコンジュゲートにおいて使用される抗Ｈｅｒｌ／ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、またはその断片もしくは誘導体である。ある特定の実施形態では、抗Ｈｅｒｌ／ＥＧＦＲ結合性断片は、Ｈｅｒｌ／ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブのＣＤＲのうちの１つまたは複数を含む。セツキシマブは、頭頸部がんおよび結腸直腸がんの処置に承認されている。セツキシマブは、ヒトＩｇＧｌ重鎖およびカッパ軽鎖定常（フレームワーク）領域を有するヒトＥＧＦＲのＮ末端部分に特異的な２２５マウスＥＧＦＲモノクローナル抗体のＦｖ（可変、抗原結合性）領域から構成される。
【０１１６】
一部の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、末梢神経系および／または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の障害を含む、少なくとも１つの神経系障害（例えば、その処置）と関連する抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、急性疼痛、慢性疼痛、および神経障害性疼痛を含む、疼痛（例えば、その処置）と関連する抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、神経系またはＣＮＳの自己免疫障害を含む、自己免疫障害（例えば、その処置）と関連する抗原に特異的に結合する。
【０１１７】
神経系、疼痛、および／または自己免疫に関連する抗原の例としては、限定することなく、アルファ−４（ａ４）インテグリン、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ならびに軸索再成長および再ミエリン化阻害剤Ｎｏｇａ−ＡおよびＬＩＮＧＯ、ＩＬ−２３、アミロイド−β（例えば、Ａβ（１−４２））、ハンチンチン、ＣＤ２５（すなわち、ＩＬ−２受容体のアルファ鎖）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体１型（ＴｒｋＡ、ＮＧＦの高親和性触媒受容体）、ならびにａ−シヌクレインが挙げられる。これらおよび他の標的は、様々な神経系、疼痛、および／または自己免疫障害、例えば、多発性硬化症（ａ４インテグリン、ＩＬ−２３、ＣＤ２５、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ならびに軸索再成長および再ミエリン化阻害剤Ｎｏｇａ−ＡおよびＬＩＮＧＯ）、アルツハイマー病（Ａ）、ハンチントン病（ハンチンチン）、パーキンソン病（ａ−シヌクレイン）、ならびに疼痛（ＮＧＦおよびＴｒｋＡ）の処置に有用であると考えられている。
【０１１８】
具体的な実施形態では、ｐ９７コンジュゲートにおいて使用される抗ＣＤ２５抗体は、ダクリズマブ（すなわち、Ｚｅｎａｐａｘ（商標））、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体である。ダクリズマブは、ＩＬ−２受容体のアルファサブユニットであるＣＤ２５に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体は、リツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、またはＣＤ２０に特異的に結合するそのバリアントもしくは断片である。特定の実施形態では、抗体は、アレムツズマブ、またはＣＤ５２に特異的に結合するそのバリアントもしくは断片である。ある特定の実施形態では、抗体は、ウステキヌマブ（ＣＮＴＯ  １２７５）、またはＩＬ−１２およびＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに特異的に結合するそのバリアントもしくは断片である。
【０１１９】
具体的な実施形態では、コンジュゲートにおいて使用される抗ＮＧＦ抗体は、タネズマブ、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体である。タネズマブは、ＮＧＦに特異的に結合し、ＮＧＦが、交感神経ニューロンおよび感覚ニューロンに存在するその高親和性膜結合型触媒受容体であるトロポミオシン関連キナーゼＡ（ＴｒｋＡ）に結合するのを防止し、ＮＧＦによるＴｒｋＡの刺激が低減されることにより、そのようなニューロンの疼痛伝達活性が阻害されると考えられる。
【０１２０】
一部の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合性断片または他のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン様分子、可溶性受容体、リガンド）は、炎症促進性分子、例えば、炎症促進性サイトカインまたはケモカインに特異的に結合する。これらおよび関連する実施形態では、ｐ９７コンジュゲートは、本明細書に記載される様々な炎症性状態を処置するために使用することができる。
【０１２１】
炎症促進性分子の例としては、とりわけ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えば、ＴＮＦ−ａおよびＴＮＦ−、ＴＮＦスーパーファミリー分子、例えば、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、Ｏｘ４０Ｌ、４−ＩＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、およびＡｐｏ３Ｌ、ＩＬ−ｌａおよびＩＬ−１を含むインターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＦＮ−ａ／、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＬＩＦ、ＣＣＬ５、ＧＲＯａ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＸＣＬ２、ＣＣＬ２が挙げられる。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、前述の炎症促進性分子のうちの１つまたは複数の受容体、例えば、とりわけ、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）、ＩＬ−１受容体（ＩＬ−ｌＲ）、またはＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に特異的に結合する。
【０１２２】
具体的な実施形態では、上述のように、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、ＴＮＦ−ａまたはＴＮＦ−に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗ＴＮＦ抗体または他のＴＮＦ結合性ポリペプチドは、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、セルトリズマブペゴール（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、ゴリムマブ（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、またはインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ｄ２Ｅ７、ＣＤＰ５７１、もしくはＣＤＰ８７０、またはその抗原結合性断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、ＴＮＦ結合性ポリペプチドは、可溶性受容体またはリガンド、例えば、ＴＮＲＦＳＦｌ０Ｂ、ＴＲＡＩＬ（すなわち、ＣＤ２５３）、ＴＮＦＳＦｌＯ、ＴＲＡＤＤ（腫瘍壊死因子受容体１型関連ＤＥＡＴＨドメインタンパク質）、ＴＲＡＦ（ＴＮＦ受容体関連因子、ＴＲＡＦＳ１〜７を含む）、またはＲＩＰ（リボソーム不活性化タンパク質）である。抗ＴＮＦ抗体またはＴＮＦ結合性ポリペプチドを含むコンジュゲートは、例えば、本明細書に記載されるように、様々な炎症性状態の処置において使用することができる。そのようなｐ９７コンジュゲートはまた、様々な神経学的状態または障害、例えば、アルツハイマー病、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脊柱管狭窄、急性脊髄損傷、および脊髄圧迫の処置において使用することもできる（米国特許第６，０１５，５５７号、同第６，１７７，０７７号、同第６，４１９，９３４号、同第６，４１９，９４４号、同第６，５３７，５４９号、同第６，９８２，０８９号、および同第７，２１４，６５８号を参照されたい）。
【０１２３】
具体的な実施形態では、上述のように、抗体または抗原結合性断片は、ＩＬ−ｌａまたはＩＬ−１に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗ｌＬ−１抗体は、カナキヌマブまたはゲボキズマブ、またはＩＬ−１に特異的に結合するそのバリアントもしくは断片である。本明細書に記載される他の炎症性状態の中でもとりわけ、抗ｌＬ−１抗体を含むｐ９７コンジュゲートは、家族性低温自己炎症性症候群、マックルウェルズ症候群、および新生児期発症多臓器性炎症性疾患を含む、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）を処置するために使用することができる。
【０１２４】
抗体は、当業者に公知の様々な技法のうちのいずれかによって調製することができる。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, 1988を参照されたい。目的のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Eur.J. lmmunol. 6:511-519, 1976の技法、およびそれに対する改良形を使用して、調製することができる。トランスジェニック動物、例えば、マウスを用いて、ヒト抗体を発現させる方法もまた、含まれる。例えば、Neubergeret al., Nature Biotechnology 14:826, 1996、Lonberg et al., Handbook ofExperimental Pharmacology 113:49-101, 1994、およびLonberg et al., Internal Reviewof Immunology 13:65-93, 1995を参照されたい。
【０１２５】
特定の例としては、ＲＥＧＥＮＥＲＥＸ（登録商標）によるＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）プラットフォームが挙げられる（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号を参照されたい）。
【０１２６】
抗体はまた、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイライブラリーの使用によって生成または特定することもできる（例えば、米国特許第７，２４４，５９２号、Chao et al., Nature Protocols. 1:755-768, 2006を参照されたい）。利用可能なライブラリーの非限定的な例としては、クローニングまたは合成ライブラリー、例えば、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ）が挙げられ、ここでは、ヒト抗体レパートリーの構造的な多様性が、７つの重鎖可変領域遺伝子および７つの軽鎖可変領域遺伝子によって表される。これらの遺伝子の組合せにより、マスターライブラリーに４９個のフレームワークが生じる。高度に可変性の遺伝子カセット（ＣＤＲ＝相補性決定領域）を、これらのフレームワークに重ねることにより、巨大なヒト抗体レパートリーが再生され得る。軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲ−３、重鎖ＣＤＲ−１における多様性をコードする合成ＤＮＡ、および重鎖ＣＤＲ−２における多様性をコードする合成ＤＮＡをコードするヒトドナーを起源とする断片を用いて設計されたヒトライブラリーもまた、含まれる。
【０１２７】
使用に好適な他のライブラリーは、当業者には明らかであろう。本明細書に記載され当該技術分野において公知であるｐ９７ポリペプチドは、精製プロセス、例えば、親和性クロマトグラフィーステップにおいて使用することができる。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合性断片は、ＣＤＲに支持を提供し、ＣＤＲの互いに対する空間的関係を定義する重鎖および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）セットの間にそれぞれ挿入された、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含む。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」として表される。抗原結合性部位は、したがって、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれのＣＤＲセットを構成する６つのＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書において「分子認識単位」と称される。いくつかの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基が、結合される抗原との拡張的な接触を形成することが示されており、ここで、もっとも拡張的な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３によるものである。したがって、分子認識単位は、主として、抗原結合性部位の特異性を担う。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲのフレームとなる４つの隣接するアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合した抗原と接触し得るが、しかしながら、ＦＲは、主として、特に、ＣＤＲに直接隣接しているＦＲ残基は、Ｖ領域を折りたたんで抗原結合性部位にすることを担う。ＦＲ内では、ある特定のアミノ残基およびある特定の構造的特性は、非常に高度に保存されている。この点に関して、すべてのＶ領域配列は、およそ９０個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が折りたたまれて結合性部位となると、ＣＤＲは、抗原結合性表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。一般に、正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なくある特定の「カノニカル」構造に折りたたまれたＣＤＲループの形状に影響を及ぼす、ＦＲの保存された構造領域が存在することが、認識されている。さらに、ある特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定させる非共有結合的ドメイン間接触に関与することが公知である。
【０１３０】
免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Kabat, E. A. etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. USDepartment of Health and Human Services. 1987およびそのアップデートへの参照によって決定され得る。
【０１３１】
「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を指し、ここで、モノクローナル抗体は、エピトープの選択的な結合に関与するアミノ酸（天然に存在するまたは存在しない）から構成される。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一のエピトープに指向されている。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’ｈ、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、そのバリアント、抗原結合性部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性の抗原結合性断片（エピトープ認識部位）およびエピトープに結合する能力を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成も包含する。これは、抗体の供給源またはそれが作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物により）に制限されることを意図するものではない。この用語は、免疫グロブリン全体、および「抗体」の定義のもとに上述された断片などを含む。
【０１３２】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、複数の断片をもたらし、それらのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、それぞれが、インタクトな抗原結合性部位を含む共有結合的ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合性部位を含むＦ（ａｂ’ｈ断片を含む、複数の断片をもたらすことができる。本発明のある特定の実施形態による使用のためのＦｖ断片は、ＩｇＭの優先的タンパク質分解切断によって産生され得、ＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の切断によるものは稀である。Ｆｖ断片は、しかしながら、より一般的に、当該技術分野において公知の組換え技法を使用して誘導される。Ｆｖ断片は、天然の抗体分子の抗原の認識および結合の能力の多くを保持する、抗原結合性部位を含む、非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Inbar et al., PNAS USA. 69:2659-2662, 1972、Hochman et al., Biochem.15:2706-2710, 1976、およびEhrlich et al., Biochem.19:4091-4096, 1980を参照されたい。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体が、企図される。例えば、カッパボディ（Ill et al., Prat. Eng. 10:949-57, 1997）、ミニボディ（Martin et al., EMBO J13:5305-9, 1994）、ダイアボディ（Holliger et al., PNAS 90:6444-8, 1993）、またはジャヌシン（Janusin）（Trauneckeret al., EMBO J 10:3655-59, 1991およびTraunecker et al., Int. J. Cancer Suppl.7:51-52, 1992）は、所望される特異性を有する抗体の選択に関する本出願の教示に従って、標準的な分子生物学技法を使用して調製され得る。
【０１３４】
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶｗおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Huston et al. (PNAS USA. 85(16):5879-5883, 1988）。抗体Ｖ領域に由来する天然には凝集されているが化学的に分離されている軽鎖および重鎖ポリペプチド鎖を、抗原結合性部位の構造に実質的に類似の三次元構造体に折りたたまれるｓＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するためのいくつかの方法が、説明されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらへの米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号、ならびにＬａｄｎｅｒらへの同第４，９４６，７７８号を参照されたい。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、「ダイアボディ」の形態である。
【０１３６】
ダイアボディは、ポリペプチドの多量体であり、それぞれのポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインおよび免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインを含み、この２つのドメインが、連結されているが（例えば、ペプチドリンカーによって）、互いに会合して抗原結合性部位を結合することはできず、抗原結合性部位は、多量体内の１つのポリペプチドの第１のドメインと、多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される（第ＷＯ９４／１３８０４号）。抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）。ダイアボディおよび他の多価または多重特異性断片は、例えば、遺伝子融合によって構築される（第ＷＯ９４／１３８０４号、およびHolligeret al., PNAS USA. 90:6444-6448, 1993)を参照されたい）。
【０１３７】
ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディもまた、含まれる（Hu etal., Cancer Res. 56:3055-3061, 1996を参照されたい）。Ward et al., Nature. 341:544-546,1989、Bird et al., Science. 242:423-426, 1988、Huston et al., PNAS USA.85:5879-5883, 1988)、第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号、国際公開第ＷＯ９４／１３８０４号、およびReiter et al., NatureBiotech. 14:1239-1245, 1996もまた、参照されたい。
【０１３８】
二特異性抗体を使用しようとする場合、これらは、様々な手法（Holliger andWinter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, 1993）で製造され得る、例えば、化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製され得る、従来的な二特異性抗体であってもよく、または上述の二特異性抗体断片のうちのいずれかであってもよい。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用してＦｅ領域なしで構築することができ、可能性として抗イディオタイプ反応の効果を低減する。
【０１３９】
二特異性ダイアボディはまた、二特異性全長抗体とは対照的に、ｆ．ｃｏｌｉにおいて容易に構築および発現させることができるため、特に有用であり得る。適切な結合特異性のダイアボディ（および多数の他のポリペプチド、例えば、抗体断片）は、ファージディスプレイ（第ＷＯ９４／１３８０４号）を使用して、ライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームを、例えば、抗原Ｘに対する特異性を有するように一定に保とうとする場合、他方のアームを変動させたライブラリーを作製し、適切な特異性の抗体を選択することができる。二特異性全長抗体は、取っ手と穴（knobs-into-holes）の操作によって作製することができる（Ridgeway et al., Protein Eng.,9:616-621, 1996）。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供され得る。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（GenMab Utrecht, The Netherlandsを参照されたく、また、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００９０２２６４２１号も参照されたい）。この抗体技術により、現在の小型抗体形式よりも長い治療域を想定した安定でより小型の抗体形式が作られる。ＩｇＧ４抗体は、不活性であると考えられ、したがって、免疫系と相互作用しない。全長ヒトＩｇＧ４抗体は、対応するインタクトなＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）とは異なる安定性特性を有する半分子断片を得るように抗体のヒンジ領域を排除することによって改変することができる。ＩｇＧ４分子を有することにより、同種抗原（例えば、疾患標的）に結合することができる１つの領域のみがＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上に残り、したがって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上の１つのみの部位に一価で結合し得る。ある特定のがん細胞表面抗原については、この一価結合は、同じ抗原特異性を有する二価抗体を使用した場合に見ることができるように、がん細胞が成長するよう刺激することができず、したがって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）技術は、従来的な抗体での処置に対して不応答性であり得る一部の種類のがんの処置選択肢を提供し得る。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の小さなサイズは、一部の形態のがんを処置する場合に大きな利点であり得、大きな固形腫瘍よりも良好な分子分布を可能にし、有効性を増加させる可能性がある。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ナノボディの形態をとり得る。ミニボディは、単一の遺伝子によってコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（米国特許第６，７６５，０８７号を参照されたい）、カビ（例えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＰｉｃｈｉａ（米国特許第６，８３８，２５４号を参照されたい）において効率的に産生される。産生プロセスは、拡張可能であり、複数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは、長期保管寿命を有するすぐに使用可能な溶液として製剤化することができる。ナノクローン方法（第ＷＯ０６／０７９３７２号を参照されたい）は、Ｂ細胞の自動化高スループット選択に基づく、所望される標的に対するナノボディを生成するための特許方法である。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト化されている。これらの実施形態は、一般に組換え技法を使用して調製される、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来する抗原結合性部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく、キメラ分子を指す。抗原結合性部位は、完全な可変ドメインが定常ドメインに融合されたもの、またはＣＤＲのみが可変ドメインの適切なフレームワーク領域にグラフトされたもののいずれかを含み得る。エピトープ結合性部位は、野生型であってもよく、または１つもしくは複数のアミノ酸置換によって改変されていてもよい。これにより、ヒト個体における免疫原としての定常領域が排除されるが、外来可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（LoBuglio et al., PNAS USA 86:4220-4224, 1989、Queen et al., PNAS USA.86:10029-10033, 1988、Riechmann et al., Nature. 332:323-327, 1988）。
【０１４３】
抗体のヒト化のための例示的な方法としては、米国特許第７，４６２，６９７号に記載される方法が挙げられる。
【０１４４】
別のアプローチは、ヒト由来の定常領域を提供することだけでなく、可変領域を、ヒト形態に可能な限り近似するように再形成するように改変することにも焦点を当てる。重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、所与の種において比較的保存されており推定上ＣＤＲに足場を提供する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接している、問題のエピトープに応答して変動し結合能力を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有することが公知である。特定のエピトープに対する非ヒト抗体を調製する場合、可変領域は、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、改変しようとするヒト抗体に存在するＦＲにグラフトすることによって、「再形成」または「ヒト化」することができる。このアプローチを様々な抗体に適用することは、Sato et al., Cancer Res. 53:851-856, 1993、Riechmann et al., Nature332:323-327, 1988、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988、Kettleboroughet al., Protein Engineering. 4:773-3783, 1991、Maeda et al., Human AntibodiesHybridoma 2:124-134, 1991、Gorman et al., PNAS USA. 88:4181-4185, 1991、Tempestet al., Bio/Technology 9:266-271, 1991、Co et al., PNAS USA. 88:2869-2873, 1991、Carteret al., PNAS USA. 89:4285-4289, 1992、およびCo et al., J lmmunol. 148:1149-1154,1992によって報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体に由来する６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、もともとの抗体に対して変更されている１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）を有し、これは、１つまたは複数のＣＤＲが、もともとの抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲに「由来する」とも称される。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、キメラ抗体であり得る。この点に関して、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｅ部分に作動可能に連結されたかまたはそれ以外では融合された、抗体の抗原結合性断片から構成される。ある特定の実施形態では、異種Ｆｅドメインは、ヒト起源のものである。他の実施形態では、異種Ｆｅドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ならびにＩｇＭを含む、親抗体とは異なるＩｇクラスに由来し得る。さらなる実施形態では、異種Ｆｅドメインは、異なるＩｇクラスの１つまたは複数に由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインから構成され得る。ヒト化抗体に関して上述のように、キメラ抗体の抗原結合性断片は、本明細書に記載される抗体のＣＤＲのうちの１つのみもしくは複数（例えば、本明細書に記載される抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲ）を含み得るか、または可変ドメイン全体（ＶＬ、ＶＨ、もしくは両方）を含み得る。
【０１４６】
ペプチド模倣体。ある特定の実施形態は、「ペプチド模倣体」を利用する。ペプチドアナログは、鋳型ペプチドのものに類似の特性を有する非ペプチド薬として、医薬品業界において広く使用されている。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（peptide mimetics）」または「ペプチド模倣体（peptidemimetics）」と称される（Luthman et al.,A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2nd Ed., HarwoodAcademic Publishers, 1996、Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,33:1699-1720, 1994、Fauchere, Adv. Drug Res., 15:29, 1986、Veber and FreidingerTINS, p.392 (1985)、およびEvans et al., J. Med. Chem. 30:229, 1987）。ペプチド模倣体は、ペプチドの生物活性を模倣するが、化学的な性質はもはやペプチド的ではない、分子である。ペプチド模倣体化合物は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第６，２４５，８８６号に記載されている。
【０１４７】
ペプチド模倣体は、抗体に関して記載されている（上記）「特異的結合」の特徴を有し得る。例えば、ペプチド模倣体は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で、本明細書に記載される標的に特異的に結合し得る。一部の実施形態では、ペプチド模倣体は、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、ペプチド模倣体は、本明細書に記載される少なくとも１つのがん関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、ペプチド模倣体は、本明細書に記載される少なくとも１つの神経系関連抗原、疼痛関連抗原、および／または自己免疫関連抗原に特異的に結合する。
【０１４８】
ペプトイド。本発明のコンジュゲートには、「ペプトイド」も含まれる。ペプチドのペプトイド誘導体は、生物活性の重要な構造上の決定基を保持するが、ペプチド結合を排除し、それによって、タンパク質分解に対する耐性を付与する、改変されたペプチドの別の形態を表す（Simon, et al., PNAS USA. 89:9367-9371, 1992）。ペプトイドは、Ｎ−置換型グリシンのオリゴマーである。それぞれが天然のアミノ酸の側鎖に対応する、いくつかのＮ−アルキル基が、説明されている。本発明のペプチド模倣体は、少なくとも１つのアミノ酸、少数のアミノ酸、またはすべてのアミノ酸残基が、対応するＮ−置換型グリシンによって置換えられた化合物を含む。ペプトイドライブラリーは、例えば、米国特許第５，８１１，３８７号に記載されている。
【０１４９】
ペプトイドは、抗体に関して記載されている（上記）「特異的結合」の特徴を有し得る。例えば、ペプトイドは、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で、本明細書に記載される標的に特異的に結合し得る。ある特定の実施形態では、ペプトイドは、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、ペプトイドは、本明細書に記載される少なくとも１つのがん関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、ペプトイドは、本明細書に記載される少なくとも１つの神経系関連抗原、疼痛関連抗原、および／または自己免疫関連抗原に特異的に結合する。
【０１５０】
アプタマー。本発明のｐ９７コンジュゲートは、アプタマーも含む（例えば、Ellingtonet al., Nature. 346, 818-22, 1990およびTuerk et al., Science. 249, 505-10, 1990を参照されたい）。アプタマーの例としては、核酸アプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー）、およびペプチドアプタマーが挙げられる。核酸アプタマーは、概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択または同等の方法、例えば、ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの体系的進化、systematicevolution of ligands by exponential enrichment）を複数回反復することによって、様々な分子標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸、ならびにさらには細胞、組織、および生物に結合するように操作されている、核酸種を指す。例えば、米国特許第６，３７６，１９０号および同第６，３８７，６２０号を参照されたい。
【０１５１】
典型的に、ペプチドアプタマーは、両方の末端で、典型的にペプチドアプタマーの結合親和性を抗体のものに匹敵するレベルまで（例えば、ナノモル濃度範囲で）増加させる二重構造制限であるタンパク質足場に結合された、可変ペプチドループを含む。ある特定の実施形態では、可変ループの長さは、約１０〜２０個のアミノ酸（間のすべての整数を含む）から構成され得、足場は、良好な溶解度および小型化（compacity）特性を有する任意のタンパク質を含み得る。ある特定の例示的な実施形態は、細菌タンパク質チオレドキシン−Ａを足場タンパク質として利用し得、可変ループが、低減活性部位（野生型タンパク質における−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループ）内に挿入されており、２つのシステイン側鎖がジスルフィド架橋を形成することができる。ペプチドアプタマーを特定する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０８５３２号に記載されている。
【０１５２】
アプタマーは、抗体に関して記載されている（上記）「特異的結合」の特徴を有し得る。例えば、アプタマーは、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で、本明細書に記載される標的に特異的に結合し得る。特定の実施形態では、アプタマーは、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、アプタマーは、本明細書に記載される少なくとも１つのがん関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、アプタマーは、本明細書に記載される少なくとも１つの神経系関連抗原、疼痛関連抗原、および／または自己免疫関連抗原に特異的に結合する。
【０１５３】
検出可能な実体。一部の実施形態では、ｐ９７断片は、「検出可能な実体」にコンジュゲートされる。例示的な検出可能な実体としては、限定することなく、ヨウ素に基づく標識、放射性同位体、フルオロフォア／蛍光色素、およびナノ粒子が挙げられる。
【０１５４】
例示的なヨウ素に基づく標識としては、ジアトリゾ酸（Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびそのアニオン形態、ジアトリゾエートが挙げられる。ジアトリゾ酸は、高度Ｘ線技法、例えば、ＣＴスキャンにおいて使用される造影剤である。以下に記載されるヨウ素放射性同位体もまた、含まれる。
【０１５５】
検出可能な実体として使用することができる例示的な放射性同位体としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１１１Ｎ、１６９Ｙｂ、９９ｍＴＣ、５５Ｆｅ、およびヨウ素の同位体、例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが挙げられる。これらの放射性同位体は、異なる半減期、減衰の種類、およびエネルギーのレベルを有し、これらを、特定のプロトコールの必要性に一致するように適合することができる。これらの放射性同位体のうちのある特定のものは、ｐ９７ポリペプチドへのコンジュゲーションによって、ＣＮＳ組織に選択的に標的化するかまたはより良好に標的化して、例えば、ＣＮＳ組織の医療イメージングを改善することができる。
【０１５６】
直接的に検出可能な実体として使用することができるフルオロフォアまたは蛍光色素の例としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、およびその他多数が挙げられる（例えば、Haugland, Handbook of Fluorescent Probes - 9th Ed., 2002, Malec.Probes, Inc., Eugene OR、Haugland, The Handbook: A Guide to Fluorescent Probesand Labeling Technologies-10th Ed., 2005, lnvitrogen, Carlsbad, CA）。発光またはその他の方法で検出可能な色素もまた、含まれる。色素によって放出される光は、可視光または非可視光、例えば、紫外線光もしくは赤外線光であってもよい。例示的な実施形態では、色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素、キサンテン色素、例えば、フルオレセインおよびローダミン、アルファ位もしくはベータ位にアミノ基を有する色素（例えば、ナフチルアミン色素、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンデスルホネート（naphthalendesulfonate）、および２−ｐ−トウイジニル（touidinyl）−６−ナフタレンスルホネート）、３−フェニル−７−イソシアナトクマリンを有する色素、アクリジン、例えば、９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ、ピレン、ベンソキサジアゾール（bensoxadiazole）、およびスチルベン、３−（ｓ−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）を有する色素、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５＆６−カルボキシローダミン−１１０（Ｒ１１０）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）、Ｃｙ２、テキサスレッドおよびローダミンレッド、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）、ＮＡＮ、ＮＥＤ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびＣｙ７．５、ＩＲ８００ＣＷ、ＩＣＧ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０であり得る。ある特定の実施形態は、検出可能な実体、例えば、フルオロフォア（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）で標識した化学療法剤（例えば、パクリタキセル、アドリアマイシン）へのコンジュゲーションを含む。
【０１５７】
ナノ粒子は、通常、サイズが約１〜１０００ｎｍの範囲に及び、多様な化学構造体、例えば、金および銀粒子、ならびに量子ドットを含む。角度のついた入射白色光で照射されると、約４０〜１２０ｎｍの範囲の銀または金ナノ粒子は、高い強度で単色光を散乱する。散乱される光の波長は、粒子のサイズに依存する。近接している４〜５つの異なる粒子は、それぞれ、単色光を散乱し、これが重なると、特定の固有の色が得られる。誘導体化されたナノ粒子、例えば、銀または金粒子は、タンパク質、抗体、小分子、受容体リガンド、および核酸を含む、広範なアレイの分子に結合し得る。ナノ粒子の具体的な例としては、金属ナノ粒子および金属ナノシェル、例えば、金粒子、銀粒子、銅粒子、白金粒子、カドミウム粒子、複合粒子、金中空球、金コーティングシリカナノシェル、およびシリカコーティング金シェルが挙げられる。シリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ＰＶＤＦナノ粒子、およびこれらの材料のうちのいずれかの着色された粒子もまた、含まれる。
【０１５８】
量子ドットは、広範な波長にわたる光により励起可能な直径が約１〜５ｎｍの蛍光を発する結晶である。適切な波長を有する光によって励起されると、これらの結晶は、それらの化学組成およびサイズに応じた波長で、光、例えば、単色光を放出する。量子ドット、例えば、ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ｌｎＰ、またはｌｎＡｓは、固有の光学特性を有し、これらおよび類似の量子ドットは、いくつかの市販供給源から入手可能である（例えば、ＮＮ−Ｌａｂｓ、Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ、ＡＲ；Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ、Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ、ＡＲ；Ｎａｎｏｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１５９】
ポリペプチドバリアントおよび断片。ある特定の実施形態は、名称で記載されるかまたは配列識別子を参照して記載されるかにかかわらず、ｐ９７ポリペプチドおよびポリペプチドに基づく薬剤、例えば、抗体を含む、本明細書に記載される参照ポリペプチドのバリアントおよび／または断片を含む。これらのポリペプチドの野生型またはもっとも一般的な配列は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されるバリアントおよび断片の比較物として使用することができる。
【０１６０】
ポリペプチド「バリアント」は、この用語が本明細書に使用される場合、典型的に１つまたは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入が、本明細書に具体的に開示されるポリペプチドとは異なる、ポリペプチドである。バリアントポリペプチドは、生物学的に活性である、すなわち、それらは、参照ポリペプチドの酵素活性または結合活性を有し続ける。そのようなバリアントは、例えば、遺伝子多型および／またはヒト操作により、生じ得る。
【０１６１】
多数の事例では、生物学的に活性なバリアントは、１つまたは複数の保存的置換を含むことになる。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸の代わりに使用されるものであり、ペプチド化学の当業者であれば、実質的に変更されないであろうポリペプチドの二次構造および疎水親水性質（hydropathic nature）を予測するであろう。上述のように、改変が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に行われてもよく、依然として、望ましい特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。本発明のポリペプチドの同等またはさらには改善されたバリアントまたは部分を作るようにポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者であれば、典型的に、以下の表Ａに従ってコードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変更するであろう。
【表１−１】
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【０１６２】
例えば、ある特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合性領域または基質分子上の結合部位などの構造体と相互作用する結合能力の明らかな消失を伴わずに、タンパク質構造体における他のアミノ酸の代わりに使用され得る。タンパク質の生物学的な機能的活性を定義するのは、タンパク質の相互作用能力および性質であるため、ある特定のアミノ酸配列置換を、タンパク質配列、および当然ながらその根底にあるＤＮＡコード配列に行うことができ、いずれにせよ、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、様々な変更が、開示される組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に、それらの有用性の明らかな消失を伴わずに、行われ得ることが企図される。
【０１６３】
そのような変更を行う場合、アミノ酸の疎水親水性インデックスが、考慮され得る。タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与することにおける疎水親水性アミノ酸インデックスの重要性は、一般に、当該技術分野において理解されている（Kyte & Doolittle, 1982、参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸の相対的な疎水親水性特徴は、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとのタンパク質の相互作用を定義することが、許容されている。それぞれのアミノ酸には、その疎水性および荷電特徴に基づいて、疎水親水性インデックスが割り当てられている（Kyte& Doolittle, 1982）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プラリン（praline）（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。ある特定のアミノ酸は、類似の疎水親水性インデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、依然として、類似の生物活性を有するタンパク質が得られること、すなわち、依然として生物学的機能が同等のタンパク質が得られることが、当該技術分野において公知である。そのような変更を行う場合、疎水親水性インデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが、特に好ましく、±０．５以内のものが、さらにより特に好ましい。
【０１６４】
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることもまた、当該技術分野において理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる）は、タンパク質のもっとも高い局所平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって左右され、タンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プラリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のものの代わりに使用することができ、依然として、生物学的に同等な、特に、免疫学的に同等なタンパク質を得ることができることが、理解されている。そのような変更の場合、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが、特に好ましく、±０．５以内のものが、さらにより特に好ましい。
【０１６５】
上記に概説されるように、アミノ酸置換は、したがって、概して、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮した例示的な置換は、当業者に周知であり、これには、アルギニンおよびリシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびスレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが挙げられる。
【０１６６】
アミノ酸置換は、さらに、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性質に基づいて行われてもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ、類似の親水性値を有する荷電していない極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、およびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。保存的変更を表し得る他のアミノ酸群としては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｉｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。
【０１６７】
バリアントは、さらに、または代替として、非保存的変更を含有し得る。好ましい実施形態では、バリアントポリペプチドは、約１０個よりも少ない、９個よりも少ない、８個よりも少ない、７個よりも少ない、６個よりも少ない、５個よりも少ない、４個よりも少ない、３個よりも少ない、２個よりも少ないアミノ酸、またはさらには１個のアミノ酸の置換、欠失、または付加が、天然の配列とは異なる。バリアントは、さらに（または代替として）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、酵素活性、および／または疎水親水性質に対して最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）のバリアントは、２０１６年６月１４日に発行された米国特許第９３６４５６７号の表Ｂに示されるように、他の生物に由来するｐ９７配列の配列に基づき得、このような特許の全内容は、その全体が提示されるかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
一般に、バリアントは、参照ポリペプチド配列に対して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性または配列同一性もしくは配列相同性を呈する。さらに、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、またはそれより多くのアミノ酸の付加（例えば、（−末端付加、Ｎ末端付加、それらの両方）、欠失、短縮、挿入、または置換が、天然または親配列とは異なるが、親または参照ポリペプチド配列の特性または活性を保持する、配列が、企図される。
【０１７０】
一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１個であるが、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１５個未満、１０個未満、８個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸残基が、参照配列とは異なる。他の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１％であるが、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の残基が、参照配列とは異なる。（この比較が、アライメントを必要とする場合、配列は、最大の類似性に関してアライメントされるものとする。欠失もしくは挿入、またはミスマッチからの「ループ」アウト配列は、差異と考える。）
【０１７１】
配列間の配列類似性または配列同一性（これらの用語は、本明細書において互換可能に使用される）の計算は、以下のように行われる。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適な比較の目的でアライメントする（例えば、最適なアライメントのために、ギャップが、第１および第２のアミノ酸または核酸配列のうちの一方または両方に導入されてもよく、非相同配列は、比較目的で、無視してもよい）。ある特定の実施形態では、比較目的でアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次いで、比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されている場合、分子は、その位置において同一である。
【０１７２】
２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有している同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮する。
【０１７３】
２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970）のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、決定される。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、決定される。特に好ましいパラメーターセット（および別途示されない限り使用すべきもの）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスで、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５である。
【０１７４】
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Cabios. 4:11-17, 1989）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して、決定することができる。
【０１７５】
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を特定するために公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。本発明の核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るために、Altschulet al., (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。
【０１７６】
一実施形態では、上述のように、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、ＢＬＡＳＴアライメントツールを使用して、評価することができる。局所アライメントは、単純に、配列セグメントの対からなり、それぞれの配列から１つずつが比較される。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎまたはＳｅｌｌｅｒｓのアルゴリズムの改変形は、スコアを伸長またはトリミングによって改善することができない、高スコアセグメント対（ＨＳＰ）と称されるすべてのセグメント対を見出すであろう。ＢＬＡＳＴアライメントの結果には、ＢＬＡＳＴスコアが偶然のみにより予測され得る尤度を示す、統計学的尺度が含まれる。
【０１７７】
生のスコアＳは、それぞれのアライメントした配列と関連するギャップおよび置換の数から計算され、ここで、類似性スコアが高いことは、より有意なアライメントを示す。置換スコアは、参照テーブルによって得られる（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭを参照されたい）。
【０１７８】
ギャップスコアは、典型的に、ギャップ開始ペナルティＧおよびギャップ伸長ペナルティＬの合計として計算される。長さｎのギャップについては、ギャップコストは、Ｇ＋Ｌｎとなるであろう。ギャップコストＧおよびＬの選択は、経験によるものであるが、Ｇには高い値（１０〜１５）、例えば、１１、Ｌには低い値（１〜２）、例えば、１を選択することが慣例的である。
【０１７９】
ビットスコアＳ’は、使用されるスコア付けシステムの統計学的特性が考慮されている、生のアライメントスコアＳから得られる。ビットスコアは、スコア付けシステムに対して正規化され、したがって、それらは、異なる検索から得られたアライメントスコアを比較するために使用することができる。「ビットスコア」および「類似性スコア」という用語は、互換可能に使用される。ビットスコアは、アライメントがどれほど良好であるかの指標を提供し、スコアが高いほど、アライメントが良好である。
【０１８０】
Ｅ値または期待値は、類似のスコアを有する配列が、データベース内に偶然生じる尤度を示す。これは、データベース検索に偶然生じると予測される、Ｓと同等またはＳよりも良好なスコアを有する異なるアライメントの数の予測である。Ｅ値が小さいほど、アライメントの有意性が高い。例えば、ｅ−１１７のＥ値を有するアライメントは、類似のスコアを有する配列が、単純に偶然に生じる可能性が非常に低いことを意味する。加えて、ランダムなアミノ酸対のアライメントの予測スコアは、負となることが必要とされるが、そうでなければ、長いアライメントは、アライメントされるセグメントが関連していたかどうかとは独立して高いスコアを有する傾向となるであろう。加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換マトリクス、ヌクレオチド、またはアミノ酸を使用し、ギャップ付きアライメントについては、ギャップ作りおよび伸長ペナルティを使用する。例えば、ポリペプチド配列のＢＬＡＳＴアライメントおよび比較は、典型的に、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して、行われる。
【０１８１】
一実施形態では、配列類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して行われるＢＬＡＳＴ分析から報告される。
【０１８２】
特定の実施形態では、本明細書に提供される配列同一性／類似性スコアは、ＧＡＰバージョン１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を以下のパラメーターで使用して得られた値を指す：ＧＡＰ重み５０および長さ重み３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア付けマトリクスを使用したヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；ＧＡＰ重み８および長さ重み２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（Henikoff and Henikoff, PNAS USA. 89:10915-10919, 1992）を使用したアミノ酸配列の同一性％および類似性％。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（JMol Biol. 48:443- 453, 1970）のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にし、ギャップの数を最小限に抑える、２つの完全な配列のアライメントを見出す。
【０１８３】
上述のように、参照ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮、付加、および挿入を含む、様々な手段で変更され得る。そのような操作のための方法は、概して、当該技術分野において公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Kunkel (PNAS USA. 82: 488-492, 1985)、Kunkel et al., (Methods inEnzymol. 154:367-382, 1987)、米国特許第４，８７３，１９２号、Watson, J. D. et al.,("Molecular Biology of the Gene," Fourth Edition, Benjamin/Cummings,Menlo Park, Calif., 1987)、ならびにそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Dayhoffet al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res.Found., Washington, D.C.)のモデルにおいて見出すことができる。
【０１８４】
そのような改変によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための方法は、当該技術分野において公知である。そのような方法は、参照ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適応可能である。一例として、ライブラリー内の機能性変異体の頻度を増強する技法である回帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）は、ポリペプチドバリアントを特定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Arkin and Yourvan, PNAS USA 89:7811-7815, 1992、Delgrave et al.,Protein Engineering. 6:327-331, 1993）。
【０１８５】
コンジュゲーションの例示的な方法。目的の薬剤へのｐ９７ポリペプチド配列のコンジュゲーションまたはカップリングは、標準的な化学的技法、生物化学的技法、および／または分子技法を使用して、行うことができる。実際に、本開示を踏まえて、利用可能な当該技術分野において認識されている手法を使用して、ｐ９７コンジュゲートを作製する方法は、明らかであろう。当然ながら、一般に、本発明のｐ９７コンジュゲートの主要な成分をカップリングさせる場合に、用いられる技法および結果として生じる架橋化学反応は、コンジュゲートの個々の成分の所望される機能性または活性を実質的に妨害するものではないことが、好ましい。
【０１８６】
用いられる特定のカップリング化学反応は、生物学的に活性な薬剤（例えば、小分子、ポリペプチド）の構造、生物学的に活性な薬剤内の複数の官能基の潜在的な存在、保護／脱保護ステップの必要性、薬剤の化学的安定性などに依存することになり、当業者によって容易に決定されるであろう。本発明のｐ９７コンジュゲートを調製するのに有用な例示的なカップリング化学反応は、例えば、Wong (1991), "Chemistry of Protein Conjugation andCrosslinking", CRC Press, Boca Raton, FlaおよびBrinkley "A Brief Surveyof Methods for Preparing Protein Conjugates with Dyes, Haptens, andCrosslinking Reagents," in Bioconjug. Chem., 3:2013, 1992において見出すことができる。好ましくは、コンジュゲートの結合能力および／または活性は、用いられるコンジュゲーション技法の結果として、例えば、コンジュゲートされていない薬剤またはコンジュゲートされていないｐ９７ポリペプチドと比べて、実質的に低減されるものではない。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、直接的または間接的のいずれかで、目的の薬剤にカップリングされ得る。ｐ９７ポリペプチド配列と目的の薬剤との間の直接的な反応は、それぞれが、互いに反応することができる置換基を有する場合に、可能である。例えば、一方における求核基、例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基は、他方におけるカルボニル含有基、例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することが可能であり得る。
【０１８８】
あるいは、ｐ９７ポリペプチド配列および目的の薬剤を、非ペプチドリンカーおよびペプチドリンカーを含むリンカー基を介して間接的にカップリングさせることが、望ましい場合がある。リンカー基は、結合能力、標的化能力、または他の機能性の妨害を回避するために、目的の薬剤をｐ９７ポリペプチド配列から分離するためのスペーサーとしても機能し得る。リンカー基はまた、薬剤における置換基の化学的反応性を増加させ、したがって、カップリング効率を増加させるようにも機能し得る。化学的反応性の増加はまた、そうでなければ可能ではないであろう薬剤または薬剤における官能基の使用を促進することもできる。放出可能なリンカーまたは安定なリンカーの選択はまた、ｐ９７コンジュゲートおよび結合される目的の薬剤の薬物動態を変更するためにも用いることができる。例示的な連結基としては、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、およびエステラーゼ不安定性基が挙げられる。他の例示的な実施形態では、コンジュゲートは、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０  ４２５  ２３５号Ｂ１、およびChari et al., Cancer Research. 52:127-131, 1992に開示されるものなどの連結基を含む。さらなる例示的なリンカーは、以下に記載されている。
【０１８９】
一部の実施形態では、１つより多くのｐ９７ポリペプチド配列を、薬剤にカップリングさせること、またはその逆が、望ましい場合がある。例えば、ある特定の実施形態では、複数のｐ９７ポリペプチド配列が、１つの薬剤にカップリングされるか、または代替として、１つもしくは複数のｐ９７ポリペプチドが、複数の薬剤にコンジュゲートされる。ｐ９７ポリペプチド配列は、同じであっても異なってもよい。特定の実施形態にかかわらず、複数のｐ９７ポリペプチド配列を含むコンジュゲートは、様々な手段で調製することができる。例えば、１つより多くのポリペプチドは、薬剤に直接的にカップリングされてもよく、または結合のための複数の部位を提供するリンカーを使用してもよい。様々な公知のヘテロ二官能性架橋戦略のうちのいずれかを、本発明のコンジュゲートを作製するために利用することができる。これらの実施形態の多くは、コンジュゲーション／架橋手順中に使用される材料の化学量論を制御することによって達成することができる。
【０１９０】
ある特定の例示的な実施形態では、スクシンイミジルエステル官能基を含む薬剤とアミノ基を含むｐ９７ポリペプチドとの間の反応により、アミド結合が形成され、オキシカルボニルイミジザオール（oxycarbonylimidizaole）官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、カルバメート結合が形成され、ｐ−ニトロフェニルカーボネート官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、カルバメート結合が形成され、トリクロロフェニルカーボネート官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、カルバメート結合が形成され、チオエステル官能基を含む薬剤とｎ末端アミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、アミド結合が形成され、プロプリオンアルデヒド（proprionaldehyde）官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成される。
【０１９１】
一部の例示的な実施形態では、ブチルアルデヒド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、アセタール官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、ピペリドン官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、メチルケトン官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、トレシレート（tresylate）官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、マレイミド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、アルデヒド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、ヒドラジン官能基を含む薬剤とカルボン酸基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成される。
【０１９２】
特定の例示的な実施形態では、マレイミド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、チオエーテル結合が形成され、ビニルスルホン官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、チオエーテル結合が形成され、チオール官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、ジスルフィド結合が形成され、オルトピリジルジスルフィド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、ジスルフィド結合が形成され、ヨードアセトアミド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、チオエーテル結合が形成される。
【０１９３】
具体的な実施形態では、アミンとスルフヒドリルとの架橋剤が、コンジュゲートを調製するのに使用される。
【０１９４】
１つの好ましい実施形態では、例えば、架橋剤は、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、これは、中等度の長さのシクロヘキサン安定化スペーサーアーム（８．３オングストローム）の両端に、ＮＨＳ−エステルおよびマレイミド反応基を含有する、スルフヒドリル架橋剤である。ＳＭＣＣは、後続のｐ９７ポリペプチド配列との反応のためのスルフヒドリル反応性、マレイミドによって活性化された薬剤（例えば、ポリペプチド、抗体）を作るために使用することができる、切断不能な膜透過性架橋剤である。ＮＨＳエステルは、ｐＨ７〜９で第１級アミンと反応して、安定なアミド結合を形成する。マレイミドは、ｐＨ６．５〜７．５でスルフヒドリル基と反応して、安定なチオエーテル結合を形成する。したがって、ＳＭＣＣのアミン反応性ＮＨＳエステルは、薬剤の第１級アミンと急速に架橋し、結果として得られるスルフヒドリル反応性マレイミド基は、ｐ９７のシステイン残基との反応に利用可能であり、目的の特定のコンジュゲートが得られる。
【０１９５】
ある特定の具体的な実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、架橋を促進するため、例えば、マレイミドによって活性化された薬剤への架橋を促進するために、露出したスルフヒドリル基を含有するように改変される。より具体的な実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、保護チオールスルフヒドリル基を付加するように、第１級アミンを改変する試薬により、改変される。さらにより具体的な実施形態では、試薬Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、チオール化ｐ９７ポリペプチドを得る。
【０１９６】
他の具体的な実施形態では、マレイミドによって活性化された薬剤は、好適な条件下において、チオール化ｐ９７ポリペプチドと反応して、本発明のコンジュゲートを産生する。この反応におけるＳＭＣＣ、ＳＡＴＡ、薬剤、およびｐ９７ポリペプチドの比を操作することによって、異なる化学量論、分子量、および特性を有するコンジュゲートを産生することが可能であることが、理解される。
【０１９７】
なおも他の例示的な実施形態では、コンジュゲートは、二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルデヒド（glutareldehyde））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製される。特定のカップリング剤としては、ジスルフィド結合を提供するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Carlssonet al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
【０１９８】
本明細書に考察される具体的な架橋戦略は、本発明のコンジュゲートを産生する場合に用いることができる好適なコンジュゲーション戦略の多くの例のうちの数例でしかない。ホモ官能性およびヘテロ官能性を含む、様々な他の二官能性または多官能性試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカタログに記載のもの）を、リンカー基として用いることができることは、当業者には明らかであろう。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化炭水化物残基を通じて実行することができる。そのような手法について記載している多数の参考文献、例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号がある。
【０１９９】
特定の実施形態は、ｐ９７ポリペプチドと薬剤との間のコンジュゲーションを促進するために、１つまたは複数のアルデヒドタグを利用し得る（参照により組み込まれる米国特許第８，０９７，７０１号および同第７，９８５，７８３号を参照されたい）。ここで、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用によるアルデヒドタグのスルファターゼモチーフにおける酵素改変により、ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基が生じる。ＦＧｌｙ残基のアルデヒド部分は、次いで、目的の部分のポリペプチドへの部位特異的結合のための化学的ハンドルとして利用することができる。一部の態様では、目的の部分は、小分子、ペプトイド、アプタマー、またはペプチド模倣体である。一部の態様では、目的の部分は、別のポリペプチド、例えば、抗体である。
【０２００】
上述のモチーフを有するポリペプチドは、ＦＧｌｙ残基を有するモチーフを生成するようにＦＧＥ酵素によって改変され得、この残基は、上述のように、薬剤、例えば、第２のポリペプチドの、例えば、リンカー部分を介した部位特異的結合に使用され得る。そのような改変は、例えば、ＦＧＥ酵素を発現する哺乳動物、酵母、もしくは細菌細胞において、スルファターゼモチーフを含有するポリペプチド（例えば、ｐ９７、抗体）を発現させること、または単離されたＦＧＥ酵素による単離されたポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ改変によって、行うことができる（Wu et al., PNAS. 106:3000-3005, 2009、Rush and Bertozzi, J. Am ChemSoc. 130:12240-1, 2008、およびCarlson et al., J Biol Chem. 283:20117-25, 2008を参照されたい）。
【０２０１】
薬剤または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド（例えば、抗体、ｐ９７ポリペプチド）は、１つまたは複数のアルデヒド反応基、例えば、アミノオキシ、ヒドラジド、およびチオセミカルバジドで官能化され、次いで、少なくとも１つのＦＧｌｙ残基を介してアルデヒドタグ含有ポリペプチドに共有結合で連結されて、アルデヒド反応性結合が形成され得る。アミノオキシで官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の結合により、ＦＧｌｙ残基と官能化された薬剤（例えば、非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にオキシム結合が作られ、ヒドラジドで官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の結合により、ＦＧｌｙ残基と官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にヒドラジン結合が作られ、チオセミカルバジドで官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の結合により、ＦＧｌｙ残基と官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にヒドラジンカルボチアミド結合が作られる。したがって、これらおよび関連する実施形態では、Ｒ１は、シッフ塩基を含む結合、例えば、オキシム結合、ヒドラジン結合、またはヒドラジンカルボチアミド結合であり得る。
【０２０２】
ある特定の実施形態は、（ｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ｐ９７ポリペプチド、および（ｉｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ポリペプチド薬剤（Ａ）のコンジュゲートを含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、それぞれのＦＧｌｙ残基を介して、必要に応じて二官能化リンカー部分または基を介して、共有結合的に連結される。
【０２０３】
一部の実施形態では、アルデヒドタグ含有ｐ９７ポリペプチドおよびアルデヒドタグ含有薬剤は、多官能化リンカー（例えば、二官能化リンカー）を介して連結され（例えば、共有結合的に連結され）、後者は、同じかまたは異なるアルデヒド反応基で官能化されている。これらおよび関連する実施形態では、アルデヒド反応基は、リンカーが、ｐ９７ポリペプチドと薬剤との間でそれらのそれぞれのＦＧｌｙ残基を介して共有結合的架橋を形成することを可能にする。リンカー部分としては、１つまたは複数のアルデヒド反応性基で官能化することができ、好ましくは、二官能化または多官能化することができる、任意の部分または化学物質が挙げられる。特定の例としては、ペプチド、水溶性ポリマー、検出可能な実体、他の治療用化合物（例えば、細胞傷害性化合物）、ビオチン／ストレプトアビジン部分、およびグリカンが挙げられる（Hudak et al., J Am Chem Soc. 133:16127-35, 2011を参照されたい）。
【０２０４】
グリカン（またはグリコシド）の具体的な例としては、アミノオキシグリカン、例えば、グリコシルＮ−ペンテノイルヒドロキサメート中間体から構成される高次グリカンが挙げられる（上記）。例示的なリンカーは、本明細書に記載されており、当該技術分野において日常的な技法により、アルデヒド反応性基で官能化することができる（例えば、Carrico et al., Nat Chem Biol. 3:321-322, 2007、ならびに米国特許第８，０９７，７０１号および同第７，９８５，７８３号を参照されたい）。
【０２０５】
ｐ９７コンジュゲートはまた、様々な「クリック化学反応」技法によって調製することができ、これには、モジュール式であり、範囲が広く、非常に高い収率が得られ、非クロマトグラフィー方法によって除去することができる主として害にならない副産物を生成し、立体特異的であり得るが必ずしもエナンチオ選択的でない、反応が挙げられる（Kolb et al., Angew Chem Int Ed Engl. 40:2004-2021, 2001を参照されたい）。特定の例としては、「アジド−アルキン付加環化」反応とも称されるアジドおよびアルキンのヒュスゲン１，３−双極性付加環化を用いるコンジュゲーション技法が挙げられる（Heinet al., Pharm Res. 25:2216-2230, 2008を参照されたい）。アジド−アルキン付加環化反応の非限定的な例はとしては、銅触媒アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応およびルテニウム触媒アジド−アルキン付加環化（ＲｕＡＡＣ）反応が挙げられる。
【０２０６】
ＣｕＡＡＣは、広い温度範囲にわたって機能し、水性条件および４〜１２にわたるｐＨ範囲で非感受性であり、広範な官能基を許容する（Himo et al, J Am Chem Soc. 127:210-216, 2005を参照されたい）。活性なＣｕ（Ｉ）触媒は、例えば、還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを使用して、Ｃｕ（Ｉ）塩またはＣｕ（ＩＩ）塩から生成することができる。この反応は、１，４置換産物を形成するため、領域特異的となっている（Heinet al.（上記）を参照されたい）。
【０２０７】
ＲｕＡＡＣは、アジドの末端アルキンへの付加環化を触媒することができるペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウム塩化物［Ｃｐ＊ＲｕＣｌ］錯体を用い、位置選択的に、１，５−二置換１，２，３−トリアゾールをもたらす（Rasmussen et al., Org. Lett. 9:5337-5339, 2007を参照されたい）。さらに、ＣｕＡＡＣとは対照的に、ＲｕＡＡＣはまた、内部アルキンとともに使用して、完全置換１，２，３−トリアゾールをもたらすこともできる。
【０２０８】
ある特定の実施形態は、したがって、内部および末端の非天然のアミノ酸（例えば、Ｎ末端、（末端）を含め、アジド側鎖またはアルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。これらのｐ９７ポリペプチドのうちのある特定のものは、アジド側鎖またはアルキン側鎖を含有する非天然のアミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、無細胞系）での組込みによって形成することができる。例示的なｉｎ  ｖｉｖｏ技法としては、細胞培養技法、例えば、改変されたＥ．ｃｏｌｉを使用するものが挙げられ（Travis and Schultz, The Journal of Biological Chemistry.285:11039-44, 2010およびDeiters and Schultz, Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters. 15:1521-1524, 2005を参照されたい）、例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ技法としては、無細胞系が挙げられる（Bundy,Bioconjug Chem. 21:255-63, 2010を参照されたい）。
【０２０９】
一部の実施形態では、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドは、アジド−アルキン付加環化によって、少なくとも１つのアルキン基を含む薬剤（またはリンカー）、例えば、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤に、コンジュゲートされる。他の実施形態では、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドは、アジド−アルキン付加環化によって、少なくとも１つのアジド基を含む薬剤（またはリンカー）、例えば、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤に、コンジュゲートされる。したがって、ある特定の実施形態は、１，２，３−トリアゾール結合を介して薬剤に共有結合的に連結されたｐ９７ポリペプチドを含むコンジュゲートを含む。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、アジド側鎖を有する非天然のアミノ酸および／またはアルキン側鎖を有する非天然のアミノ酸は、末端アミノ酸（Ｎ末端、（−末端）である。ある特定の実施形態では、非天然のアミノ酸のうちの１つまたは複数は、内部である。
【０２１１】
例えば、ある特定の実施形態は、アルキン基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。一部の実施形態は、アルキン基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。特定の実施形態は、アジド側鎖基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。一部の実施形態は、アルキン基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有する少なくとも１つの内部の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの内部の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
【０２１２】
特定の実施形態は、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。他の実施形態は、アルキン側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおも他の実施形態は、アルキン側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
【０２１３】
他の実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおもさらなる実施形態は、アジド側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおもさらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有する（−末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
【０２１４】
ｐ９７コンジュゲートを産生する方法であって、（ａ）（ｉ）アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと少なくとも１つのアルキン基（例えば、アルキン側鎖を有する非天然のアミノ酸）を含む薬剤との間、または（ｉｉ）アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと少なくとも１つのアジド基（例えば、アジド側鎖を有する非天然のアミノ酸）を含む薬剤との間で、アジド−アルキン付加環化反応を行うステップと、（ｂ）反応物からｐ９７コンジュゲートを単離し、それによって、ｐ９７コンジュゲートを産生するステップとを含む、方法もまた、含まれる。
【０２１５】
ｐ９７コンジュゲートが融合ポリペプチドである場合には、融合ポリペプチドは、概して、標準的な技法を使用して調製することができる。しかしながら、好ましくは、融合ポリペプチドは、本明細書に記載され当該技術分野において公知である発現系において、組換えポリペプチドとして発現される。本発明の融合ポリペプチドは、ｐ９７ポリペプチド配列の１つまたは複数のコピーを含有し得、所望される配置で存在する、目的のポリペプチドに基づく薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）の１つまたは複数のコピーを含有し得る。
【０２１６】
融合タンパク質に関して、ｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド薬剤（例えば、抗体）、および必要に応じてペプチドリンカー成分をコードするＤＮＡ配列を、別個に組み立て、次いで、適切な発現ベクターにライゲーションし得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、配列のリーディングフレームが同相となるように、ペプチドリンカーありまたはなしで、他のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端にライゲーションされる。ライゲーションされたＤＮＡ配列は、好適な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’にのみ位置する。同様に、翻訳を停止させるために必要とされる停止コドンおよび転写終結シグナルは、もっとも（−末端側のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’にのみ存在する。これにより、両方のポリペプチド成分の生物活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳が可能となる。
【０２１７】
同様の技法、主として、調節エレメント、例えば、プロモーター、停止コドン、および転写終結シグナルの配置が、非融合コンジュゲートの産生のための非融合タンパク質、例えば、ｐ９７ポリペプチドおよびポリペプチド薬剤（例えば、抗体剤）の組換え産生に適用され得る。
【０２１８】
本発明のポリヌクレオチドおよび融合ポリヌクレオチドは、ｐ９７ポリペプチド配列をコードする核酸の１つもしくは複数のコピーを含有し得、および／またはポリペプチド薬剤をコードする核酸の１つもしくは複数のコピーを含有し得る。
【０２１９】
一部の実施形態では、対象となるｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド薬剤、および／またはｐ９７−ポリペプチド融合体をコードする核酸が、宿主細胞に直接的に導入され、細胞が、コードされるポリペプチドの発現を誘導するのに十分な条件下においてインキュベートされる。本開示のポリペプチド配列は、本明細書に提供されるポリペプチドおよび核酸配列と組み合わせて、当業者に周知の標準的な技法を使用して調製され得る。
【０２２０】
したがって、ある特定の関連する実施形態によると、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは融合ポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞が提供される。宿主細胞におけるｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド薬剤、またはｐ９７−ポリペプチド薬剤融合体の発現は、便宜的に、適切な条件下において、ポリヌクレオチドを含有する組換え宿主細胞を培養することによって達成することができる。発現による産生に続いて、ポリペプチドは、任意の好適な技法を使用して単離および／または精製された後、所望されるように使用され得る。
【０２２１】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムが、周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、およびバキュロウイルス系が挙げられる。
【０２２２】
異種ポリペプチドの発現のための当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、およびその他多数が挙げられる。一般に好ましい細菌宿主は、ｆ．ｃｏｌｉである。原核細胞、例えば、ｆ．ｃｏｌｉにおけるポリペプチドの発現は、当該技術分野において十分に確立されている。考察については、例えば、Pluckthun, A. Bio/Technology. 9:545-551 (1991)を参照されたい。培養物中での真核細胞における発現もまた、ポリペプチドの組換え産生のための選択肢として、当業者に利用可能である（Ref,Curr. Opinion Biotech. 4:573-576, 1993およびTrill et al., Curr. Opinion Biotech.6:553-560, 1995を参照されたい。
【０２２３】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を適宜含む、適切な調節配列を含有する、好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook etal., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析のための核酸の操作のための多数の公知の技法およびプロトコールは、CurrentProtocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley& Sons, 1992、またはそれに対する後続のアップデートに詳細に記載されている。
【０２２４】
「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載されるポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードする核酸配列が導入されているか、またはそれを導入することができ、さらに、選択された目的の遺伝子、例えば、本明細書に記載される任意のポリペプチドをコードする遺伝子を発現するか、またはそれを発現することができる、細胞を指して使用される。この用語は、親細胞の子孫を含み、選択された遺伝子が存在する限り、子孫がもともとの親と形質または遺伝子構造が同一であるかどうかは関係ない。宿主細胞は、ある特定の特徴、例えば、スルファターゼモチーフ内のシステインもしくはセリン残基をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換するためのホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の発現、またはコンジュゲーションを促進するためにアジド側鎖、アルキン側鎖、もしくは他の所望される側鎖を有する非天然のアミノ酸を含め、非天然のアミノ酸をポリペプチドに組み込むことができる、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼの発現について、選択することができる。
【０２２５】
したがって、そのような核酸を宿主細胞に導入するステップを含む方法もまた、企図される。核酸の導入は、任意の利用可能な技法を用い得る。真核細胞については、好適な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニア、もしくは昆虫細胞についてはバキュロウイルスを使用した形質転換を挙げることができる。細菌細胞については、好適な技法は、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを使用したトランスフェクションを挙げることができる。導入には、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能にすること、例えば、遺伝子の発現のための条件下において宿主細胞を培養することが続き得る。一実施形態では、核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に統合される。統合は、標準的な技法に従って、ゲノムでの組換えを促進する配列の包含により促進され得る。
【０２２６】
本発明はまた、ある特定の実施形態では、特定のポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド薬剤、またはｐ９７−ポリペプチド薬剤融合タンパク質を発現させるために、本明細書に記載される核酸構築物を発現系において使用するステップを含む、方法も提供する。
【０２２７】
上述のように、ある特定のｐ９７コンジュゲート、例えば、融合タンパク質は、非ペプチドリンカー（例えば、非タンパク質性リンカー）およびペプチドリンカーを含む、１つまたは複数のリンカー基を利用し得る。そのようなリンカーは、安定なリンカーまたは放出可能なリンカーであり得る。
【０２２８】
例示的な非ペプチドの安定な連結としては、スクシンイミド、プロピオン酸、カルボキシメチレート結合、エーテル、カルバメート、アミド、アミン、カルバミド、イミド、脂肪族Ｃ−Ｃ結合、チオエーテル結合、チオカルバメート、チオカルバミドなどが挙げられる。一般に、加水分解的に安定な連結は、生理学的条件下において、１日当たり約１〜２％未満から５％の加水分解速度を呈する。
【０２２９】
例示的な非ペプチドの放出可能なリンカーとしては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、カーボネート、およびヒドラジン結合が挙げられる。他の例示的な放出可能なリンカーの例は、ベンジル脱離に基づくリンカー、トリアルキルロックに基づくリンカー（またはトリアルキルロックラクトン化に基づく）、ビシンに基づくリンカー、および酸不安定性リンカーであり得る。酸不安定性リンカーの中でもとりわけ、ジスルフィド結合、ヒドラゾン含有リンカー、およびチオプロピオネート含有リンカーであり得る。細胞への内部移行中またはその後に放出可能または切断可能であるリンカーもまた、含まれる。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出の機序には、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、光不安定性結合の照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体に媒介される加水分解による切断（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸に触媒される加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）が含まれる。一実施形態では、酸不安定性リンカーが、使用され得る（Cancer Research 52:127-131, 1992および米国特許第５，２０８，０２０号）。さらなる詳細は、当業者に公知である。例えば、米国特許第９３６４５６７号を参照されたい。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、「水溶性ポリマー」が、ｐ９７ポリペプチド配列を目的の薬剤にカップリングするためのリンカーにおいて使用される。「水溶性ポリマー」とは、水に可溶性であり、通常、実質的に非免疫原性であり、通常、約１，０００ダルトンより大きい原子分子量（atomic molecular weight）を有する、ポリマーを指す。水溶性ポリマーを介した２つのポリペプチドの結合は、そのような改変が、血清半減期を増加させることによって、例えば、タンパク質分解安定性を増加させることおよび／または腎臓クリアランスを減少させることによって、治療インデックスを増加させ得るため、望ましい場合がある。加えて、１つまたは複数のポリマーを介した結合により、タンパク質医薬品の免疫原性が低減され得る。
【０２３１】
水溶性ポリマーの特定の例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。
【０２３２】
一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、約１０，０００Ｄａより大きい、約２０，０００Ｄａより大きく、５００，０００Ｄａまで、約４０，０００Ｄａより大きく３００，０００Ｄａまで、約５０，０００Ｄａより大きく７０，０００Ｄａまで、通常は約６０，０００Ｄａより大きい、有効流体力学分子量を有する。「有効流体力学分子量」とは、水溶液に基づくサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される、ポリマー鎖の水に溶媒和される有効サイズを指す。水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド反復単位、例えば、酸化エチレン反復単位を有するポリマー鎖を含有する場合、それぞれの鎖は、約２００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａ、または約１，５００Ｄａ〜約４２，０００Ｄａの原子分子量を有し得、２，０００〜約２０，０００Ｄａが、特に目的とされる。直鎖状、分岐状、および末端荷電した水溶性ポリマーもまた、含まれる。
【０２３３】
アルデヒドタグ付きポリペプチド間のリンカーとして有用なポリマーは、広範な分子量およびポリマーサブユニットを有し得る。これらのサブユニットは、生物学的ポリマー、合成ポリマー、またはこれらの組合せを含み得る。そのような水溶性ポリマーの例としては、硫酸デキストラン、Ｐ−アミノ架橋型デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンを含む、デキストランおよびデキストラン誘導体、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデキストリン、ならびにデンプンの誘導体およびヒドロイルアクト（hydroylacte）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールのプロピレングリコールとのコポリマーを含む、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体が挙げられ、ここで、前記ホモポリマーおよびコポリマーは、一方の末端において、アルキル基、ヘパリンおよびヘパリンの断片、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルトアミド、ならびにポリオキシエチル化ポリオール、デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体で置換されているか、または非置換である。具体的に記載される水溶性ポリマーの様々な誘導体もまた含まれることが理解される。
【０２３４】
水溶性ポリマー、特に、ポリアルキレンオキシドに基づくポリマー、例えば、ポリエチレングリコール「ＰＥＧ」が、当該技術分野において公知である（Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and BiomedicalApplications, J. M. Harris, Ed., Plenum Press, New York, N.Y. (1992)およびPoly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, J. M. Harris and S. Zalipsky,Eds., ACS (1997)、ならびに国際特許出願第ＷＯ９０／１３５４０号、同第ＷＯ９２／００７４８号、同第ＷＯ９２／１６５５５号、同第ＷＯ９４／０４１９３号、同第ＷＯ９４／１４７５８号、同第ＷＯ９４／１７０３９号、同第ＷＯ９４／１８２４７号、同第ＷＯ９４／２８９３７号、同第ＷＯ９５／１１９２４号、同第ＷＯ９６／０００８０号、同第ＷＯ９６／２３７９４号、同第ＷＯ９８／０７７１３号、同第ＷＯ９８／４１５６２号、同第ＷＯ９８／４８８３７号、同第ＷＯ９９／３０７２７号、同第ＷＯ９９／３２１３４号、同第ＷＯ９９／３３４８３号、同第ＷＯ９９／５３９５１号、同第ＷＯ０１／２６６９２号、同第ＷＯ９５／１３３１２号、同第ＷＯ９６／２１４６９号、同第ＷＯ９７／０３１０６号、同第ＷＯ９９／４５９６４号、および米国特許第４，１７９，３３７号、同第５，０７５，０４６号、同第５，０８９，２６１号、同第５，１００，９９２号、同第５，１３４，１９２号、同第５，１６６，３０９号、同第５，１７１，２６４号、同第５，２１３，８９１号、同第５，２１９，５６４号、同第５，２７５，８３８号、同第５，２８１，６９８号、同第５，２９８，６４３号、同第５，３１２，８０８号、同第５，３２１，０９５号、同第５，３２４，８４４号、同第５，３４９，００１号、同第５，３５２，７５６号、同第５，４０５，８７７号、同第５，４５５，０２７号、同第５，４４６，０９０号、同第５，４７０，８２９号、同第５，４７８，８０５号、同第５，５６７，４２２号、同第５，６０５，９７６号、同第５，６１２，４６０号、同第５，６１４，５４９号、同第５，６１８，５２８号、同第５，６７２，６６２号、同第５，６３７，７４９号、同第５，６４３，５７５号、同第５，６５０，３８８号、同第５，６８１，５６７号、同第５，６８６，１１０号、同第５，７３０，９９０号、同第５，７３９，２０８号、同第５，７５６，５９３号、同第５，８０８，０９６号、同第５，８２４，７７８号、同第５，８２４，７８４号、同第５，８４０，９００号、同第５，８７４，５００号、同第５，８８０，１３１号、同第５，９００，４６１号、同第５，９０２，５８８号、同第５，９１９，４４２号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、同第５，９６５，１１９号、同第５，９６５，５６６号、同第５，９８５，２６３号、同第５，９９０，２３７号、同第６，０１１，０４２号、同第６，０１３，２８３号、同第６，０７７，９３９号、同第６，１１３，９０６号、同第６，１２７，３５５号、同第６，１７７，０８７号、同第６，１８０，０９５号、同第６，１９４，５８０号、同第６，２１４，９６６号を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２３５】
例示的な目的のポリマーとしては、エチレンオキシド反復単位を含むポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドを含む、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはこれらの誘導体を含むものが挙げられる。さらなる例示的な目的のポリマーとしては、約１，０００ダルトンより大きい分子量を有するポリアミドが挙げられる。さらなる例示的な水溶性反復単位は、エチレンオキシドを含む。そのような水溶性反復単位の数は、有意に変動してもよく、そのような単位の通例的な数は、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、およびもっとも通例的には２〜５０である。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカー配列は、ｐ９７コンジュゲートの成分を分離するかまたはカップリングさせるために用いることができる。例えば、ポリペプチド−ポリペプチドコンジュゲートに関して、ペプチドリンカーは、それぞれのポリペプチドが、その二次構造および三次構造に折りたたまれるのを確実にするのに十分な距離で、成分を分離することができる。そのようなペプチドリンカー配列は、本明細書に記載され当該技術分野において周知である標準的な技法を使用して、コンジュゲート（例えば、融合タンパク質）に組み込まれ得る。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）可撓性の伸長されたコンフォメーションを採用することができること、（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用することができないこと、ならびに（３）ポリペプチドの機能性エピトープと反応し得る疎水性残基も荷電残基もないこと。リンカーとして有益に用いることができるアミノ酸配列としては、Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985、Murphy et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 83:8258-8262, 1986、米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものが挙げられる。
【０２３７】
ある特定の例示的な実施形態では、ペプチドリンカーは、約１〜５個のアミノ酸、５〜１０個のアミノ酸、５〜２５個のアミノ酸、５〜５０個のアミノ酸、１０〜２５個のアミノ酸、１０〜５０個のアミノ酸、１０〜１００個のアミノ酸、または任意の介在範囲のアミノ酸である。他の例示的な実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが約１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはそれより多くのアミノ酸を含む。特定のリンカーは、約１〜２００個のアミノ酸、１〜１５０個のアミノ酸、１〜１００個のアミノ酸、１〜９０個のアミノ酸、１〜８０個のアミノ酸、１〜７０個のアミノ酸、１〜６０個のアミノ酸、１〜５０個のアミノ酸、１〜４０個のアミノ酸、１〜３０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜５個のアミノ酸、１〜４個のアミノ酸、１〜３個のアミノ酸、または約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、またはそれより多くのアミノ酸の全アミノ酸長を有し得る。
【０２３８】
ペプチドリンカーは、本明細書の他の箇所に記載され当該技術分野において公知である、任意の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログ、および／またはアミノ酸模倣体を利用し得る。リンカーとして有益に用いることができるある特定のアミノ酸配列としては、Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985、Murphy et al., PNAS USA.83:8258-8262, 1986、米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものが挙げられる。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ残基を含有する。他のほぼ中性のアミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａもまた、所望される場合、ペプチドリンカー配列において用いることができる。これらおよび関連するアミノ酸の他の組合せは、当業者には明らかであろう。
【０２３９】
具体的な実施形態では、リンカー配列は、３つのグリシン残基を含む、Ｇｌｙ３リンカー配列を含む。特定の実施形態では、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合性部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータープログラムを使用して（Desjarlais & Berg, PNAS. 90:2256-2260, 1993およびPNAS.91:11099-11103, 1994）、またはファージディスプレイ法によって、合理的に設計することができる。
【０２４０】
ペプチドリンカーは、生理学的に安定であり得るか、または放出可能なリンカー、例えば、生理学的に分解可能もしくは酵素的に分解可能なリンカー（例えば、タンパク質分解により切断可能なリンカー）を含み得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の放出可能なリンカーは、コンジュゲートのより短い半減期およびより急速なクリアランスをもたらし得る。これらおよび関連する実施形態を使用して、例えば、血流中におけるｐ９７コンジュゲートの溶解度および血液循環寿命を強化し、同時に、血流中に（またはＢＢＢを越えて）薬剤を送達することができるが、リンカーの分解の後に、ｐ９７配列が実質的に含まれないようにすることができる。これらの態様は、ポリペプチドまたは他の薬剤が、ｐ９７配列に恒久的にコンジュゲートされた場合に、低減された活性を呈する事例において、特に有用である。本明細書に提供されるリンカーを使用することにより、そのような抗体は、コンジュゲートされた形態にある場合に、治療活性を維持することができる。これらおよび他の手段において、ｐ９７コンジュゲートの特性は、時間をわたり抗体の生体活性および循環半減期のバランスを取るように、より効果的に適合させることができる。
【０２４１】
本発明の特定の実施形態での使用に好適な酵素的に分解可能な連結としては、これらに限定されないが、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、またはサブスチリジン（substilisin）など、セリンプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２４２】
本発明の特定の実施形態での使用に好適な酵素的に分解可能な連結としてはまた、コラゲナーゼ、ストロメリシン、およびゼラチナーゼなど、マトリクスメタロプロテイナーゼによって切断することができるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２４３】
本発明の特定の実施形態での使用に好適な酵素的に分解可能な連結はまた、アンジオテンシン変換酵素によって切断することができるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２４４】
本発明の特定の実施形態での使用に好適な酵素的に分解可能な連結はまた、カテプシンＢによって分解することができるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、しかしながら、非ペプチドまたはペプチドリンカーのうちのいずれか１つまたは複数は、必要に応じたものである。例えば、リンカー配列は、第１および第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、立体障害を防止するために使用することができる非必須Ｎ末端および／または（−末端のアミノ酸領域を有する場合、融合タンパク質において必要とされない場合がある。
【０２４６】
本明細書に記載されるｐ９７ポリペプチドおよびｐ９７ポリペプチドコンジュゲートの機能的特性は、例えば、親和性／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合的阻害アッセイ）、細胞傷害アッセイ、細胞生存性アッセイ、細胞増殖もしくは分化アッセイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用したがん細胞および／もしくは腫瘍成長阻害を含む、当業者に公知の様々な方法を使用して、評価することができる。例えば、本明細書に記載されるコンジュゲートは、血液脳関門を越えた輸送速度を含め、受容体内部移行、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性などに対する効果に関して試験され得る。そのようなアッセイは、当業者に公知の十分に確立されたプロトコール（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc.& John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)、Current Protocols in Immunology(Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M.Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NYを参照されたい）、または市販入手可能なキットを使用して、行うことができる。
【０２４７】
使用方法および医薬組成物
本発明のある特定の実施形態は、本明細書に記載のｐ９７ポリペプチドおよびｐ９７コンジュゲートの組成物を使用する方法に関する。そのような方法の例としては、例えば、神経系のものなどの、ある特定の臓器／組織の医用イメージングのためのｐ９７コンジュゲートの使用を含む、処置の方法および診断の方法が挙げられる。特定の実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）の障害もしくは状態、またはＣＮＳ要素を有する障害もしくは状態を、診断および／または処置する方法を含む。
【０２４８】
したがって、ある特定の実施形態は、本明細書に記載のｐ９７コンジュゲートを含む組成物を投与するステップを含む、それを必要とする被験体を処置する方法を含む。本明細書に記載のｐ９７コンジュゲートを含む組成物を投与するステップを含む、被験体の神経系（例えば、中枢神経系組織）に薬剤を送達する方法も含まれる。これらのおよび関連実施形態の幾つかでは、方法は、中枢神経系組織に薬剤を送達する速度を、例えば、薬剤単独を含む組成物による送達と比べて、上昇させる。
【０２４９】
一部の事例では、被験体は、ＣＮＳの疾患、障害または状態に罹患しており、末梢組織と比べてＣＮＳ組織への、治療剤の脳血液関門を越える送達の増加は、例えば、末梢組織への薬剤の曝露に関連する副作用を低減させることにより、処置を向上させることができる。ＣＮＳの例示的な疾患、障害および状態には、原発性および転移性ＣＮＳがんを含む様々ながん、リソソーム蓄積症、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、ならびに自己免疫疾患、例えば多発性硬化症が含まれる。
【０２５０】
したがって、ある特定の実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）、必要に応じて脳、のがんを処置するための方法であって、それを必要とする被験体が、そのようながんに罹患している、またはそのような状態を発症するリスクがある、方法に関する。一部の実施形態では、がんは、原発性ＣＮＳがん、例えば、原発性脳がんである。例えば、方法は、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、または未分化神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）を処置するためであり得る。一部の実施形態では、神経膠腫は、星細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、または脈絡叢乳頭腫である。ある特定の実施形態では、原発性ＣＮＳまたは脳がんは、多形神経膠芽腫、例えば、巨細胞神経膠芽腫（gliobastoma）または神経膠肉腫である。
【０２５１】
特定の実施形態では、がんは、転移性ＣＮＳがん、例えば、脳に転移したがんである。そのようながんの例としては、限定ではないが、乳がん、肺がん、泌尿生殖器がん、消化管がん（例えば、結腸直腸がん、膵癌）、骨肉腫、黒色腫、頭頸部がん、前立腺がん（例えば、前立腺腺癌）、およびリンパ腫が挙げられる。したがって、ある特定の実施形態は、本明細書で開示されるコンジュゲートの治療有効量を（例えば、統計学的に有意な方法で、すなわち、当業者に公知であろうような適切な対照と比較して、投与後にがんの転移を阻害する、予防するまたは遅延させる量で）患者に投与することにより、がんの転移を処置、阻害または予防するための方法を含む。特定の実施形態では、被験体は、当技術分野で公知の数あるものの中でも特に、上記のがんのうちの１つまたは複数を含む、中枢神経系にまだ転移していないがんに罹患している。
【０２５２】
特定の実施形態では、がん（細胞）は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２０、Ｈｅｒｌ／ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＣＤ３０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＴＬＡ−４、またはテネイシンのうちの１つまたは複数を発現または過剰発現する。
【０２５３】
乳がん、前立腺がん、消化器がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、扁平上皮癌、黒色腫、非黒色腫がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、上皮腫瘍、骨がん、または造血器がんを含む、他のがんの処置も含まれる。したがって、ある特定の実施形態では、ｐ９７コンジュゲートにより処置されるがん細胞は、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒｌ／ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、Ｂ７Ｈ３、ＣＤＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、Ｃ２４２抗原、ＳＴ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンａｖ  ３、インテグリンａ５  １、葉酸受容体１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（もしくはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢもしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来増殖因子受容体、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＯＩ）、肝再生ホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現されるジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）および／またはメソテリンなどの、がん抗原を過剰発現する、またはがん抗原に関連する。
【０２５４】
ＣＮＳのがんをはじめとするがんを処置するためのｐ９７コンジュゲートの使用を、他の治療モダリティと組み合わせることができる。例えば、ｐ９７コンジュゲートを含む組成物を、症状に対するケア、放射線療法、外科手術、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法、抗生物質療法またはこれらの任意の組合せを含む、他の治療介入の前、最中または後に、被験体に投与することができる。症状に対するケアは、脳浮腫、頭痛、認知機能障害および嘔吐を軽減するための副腎皮質ステロイドの投与、ならびにけいれんを軽減するための抗けいれん薬の投与を含む。放射線療法は、全脳照射、分割放射線療法、および放射線手術、例えば定位手術的照射を含み、これらを旧来の外科手術とさらに組み合わせることができる。
【０２５５】
特定の併用療法では、ｐ９７−抗体コンジュゲートの抗体部分は、セツキシマブを含み、ｐ９７−セツキシマブコンジュゲートは、頭頸部の局所または領域進行扁平上皮癌に罹患している被験体を処置するために放射線療法と組み合わせて使用される。他の態様では、ｐ９７−セツキシマブコンジュゲートは、頭頸部の再発性局所領域疾患または転移性扁平上皮癌に罹患している被験体を処置するために、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を用いる白金に基づく治療と組み合わせて使用される。一部の態様では、ｐ９７−セツキシマブコンジュゲートは、ＥＧＦＲ発現結腸直腸がんに罹患している被験体であって、イリノテカンに基づく化学療法に反応しない被験体を処置するために、イリノテカンと組み合わせて使用される。
【０２５６】
一部の事例では、被験体は、リソソーム蓄積症に罹患しているか、または罹患するリスクがある。したがって、ある特定の方法は、それを必要とする被験体におけるリソソーム蓄積症、必要に応じて、中枢神経系に関連するそれらのリソソーム蓄積症、の処置に関する。例示的なリソソーム蓄積症としては、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス１／１１型、ゴーシェ病１／１１／１１１型、ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、クラッベ病、糖原病ＩＩ、ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシス１／１１／１１１型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、ａ−マンノシドーシス１／１１型、−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシス１／１１型、ムコリピドーシス１１／１１１１型−細胞疾患、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽性ハーラー・ポリジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症１１１Ｄ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型モルキオ症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症ＩＸ型、多発性スルファターゼ欠損、神経セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマン・ピック病ＮＢ型、ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病１／１１型、シンドラー病、およびシアル酸蓄積症が挙げられる。これらのおよび関連実施形態では、ｐ９７ポリペプチドを、本明細書に記載されるようなリソソーム蓄積症に関連する１つまたは複数のポリペプチドにコンジュゲートさせることができる。
【０２５７】
ある特定の事例では、被験体は、自己免疫障害および／または神経変性障害、必要に応じてＣＮＳの自己免疫障害および／または神経変性障害、に罹患しているか、または罹患するリスクがある。したがって、それを必要とする被験体における中枢神経系（ＣＮＳ）の変性障害または自己免疫障害を処置する方法も含まれる。例えば、特定の実施形態では、ＣＮＳの変性障害または自己免疫障害は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、または多発性硬化症（ＭＳ）である。したがって、ある特定の実施形態は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病またはＭＳに罹患している被験体にｐ９７コンジュゲートを投与することを含む。特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドは、アルツハイマー病のためにアミロイド、ハンチントン病のためにハンチンチン、パーキンソン病のためにａ−シヌクレイン、またはＭＳのためにａ４インテグリン、ＣＤ２５もしくはＩＬ−２３に特異的に結合する、抗体または他の薬剤にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドは、ＭＳの処置のために、インターフェロン−ポリペプチドにコンジュゲートされる。特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドは、ＭＳの処置のために、ダクリズマブにコンジュゲートされる。
【０２５８】
それを必要とする被験体における疼痛を処置する方法も含まれる。例としては、急性疼痛、慢性疼痛、および神経障害性疼痛が、これらの組合せを含めて、挙げられる。一部の態様では、疼痛は、疼痛が、脳、脳幹および／または脊髄をはじめとするＣＮＳの損傷または機能不全に関連する、中枢性疼痛症候群（ＣＰＳ）などの、中枢作用性要素を有する。特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドは、ＮＧＦまたはＴｒｋＡに特異的に結合する、抗体または他の薬剤に、コンジュゲートされる。特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドは、疼痛の処置のために、必要に応じて、膝もしくは股関節の変形性関節症、慢性腰痛症、骨がん疼痛、または間質性膀胱炎の処置のために、タネズマブにコンジュゲートされる。
【０２５９】
それを必要とする被験体における炎症または炎症性状態を処置する方法も含まれる。「炎症」は、病原体、損傷した細胞（例えば、創傷）、および刺激物などの、有害な刺激に対する組織の生物学的反応を一般に指す。用語「炎症反応」は、炎症が獲得され、調節される特異的機構を指し、単に実例として、本明細書に記載のおよび当技術分野で公知の数あるものの中でも特に、免疫細胞活性化または遊走、サイトカイン産生、キニン放出を含む血管拡張、フィブリン溶解、および凝固を含む。理想的には、炎症は、傷害性刺激を除去することと罹患組織（単数または複数）の治癒過程を開始させることの両方のための、身体による防御的試みである。炎症の非存在下では、創傷および感染症は、決して治癒せず、進行性組織破壊が生存を脅かすことになる状況を生じさせることになる。その一方で、過度のまたは慢性的な炎症は、本明細書に記載のおよび当技術分野で公知の数あるものの中でも特に、枯草熱、アテローム動脈硬化症および関節リウマチなどの、様々な疾患に関連し得る。
【０２６０】
本発明のｐ９７コンジュゲートは、急性炎症、慢性炎症、または両方をモジュレートし得る。被験体の必要に応じて、ある特定の実施形態は、急性炎症または炎症反応を軽減することに関し、ある特定の実施形態は、慢性炎症または慢性炎症反応を軽減することに関する。
【０２６１】
急性炎症は、有害と推定される刺激に対する身体の初期反応に関係し、血液から傷害組織への血漿および白血球の移動の増加を引き起こす。これは、短期の過程であり、通常は、数分または数時間以内に始まり、傷害性刺激を除去すると終わる。急性炎症は、発赤、熱感増加（increased heat）、腫脹、疼痛、および機能喪失のいずれか１つまたは複数によって特徴付けられ得る。発赤および熱感は、中核体温での炎症部位への血流増加に主として起因し、腫脹は、体液の蓄積により引き起こされ、疼痛は、神経終末を刺激する化学物質の放出に通常は起因し、機能喪失には複数の原因がある。
【０２６２】
急性炎症反応は、常在性マクロファージ、樹状細胞、組織球、クッパー細胞およびマスト細胞などの、局所免疫細胞によって主として開始される。感染症、熱傷または他の傷害の開始時に、これらの細胞は、活性化され、炎症の臨床徴候の原因となる炎症性メディエーター、例えば、血管作用性アミンおよびエイコサノイドを放出する。血管拡張およびその結果として生じる血流増加は、発赤および熱感増加を引き起こす。血管透過性の増大は、組織への血漿タンパク質および体液の滲出または漏出をもたらし、これにより腫脹が生じる。ブラジキニンなどの、ある特定の放出されたメディエーターは、疼痛に対する感受性を増大させ、血管を、局所免疫細胞によって作られる走化性勾配に沿って通常は遊走する好中球などの白血球の遊走または血管外遊出を可能にするように、変化させる。
【０２６３】
急性炎症反応は、炎症反応を開始して伝播するように並行して作用する、予め形成された血漿タンパク質モジュレートからなる、１つまたは複数の無細胞性生化学的カスケード系も含む。これらの系は、細菌により主として活性化される補体系と、ある特定の感染症、熱傷または他の外傷によって引き起こされるタイプの組織損傷などの、壊死により主として活性化される凝固・フィブリン溶解系とを含む。したがって、ｐ９７コンジュゲートを使用して、急性炎症、または個々の急性炎症反応のいずれか１つもしくは複数をモジュレートすることができる。
【０２６４】
慢性炎症、または長期の遅延型炎症反応は、炎症部位に存在する細胞のタイプの漸進的シフトによって特徴付けられ、多くの場合、炎症過程からの組織の同時またはほぼ同時の破壊と治癒をもたらす。細胞レベルでは、慢性炎症反応には、単球、マクロファージ、リンパ球、形質細胞および線維芽細胞などの、様々な免疫細胞が関与するが、顆粒球により主として媒介される急性炎症とは対照的に、慢性炎症は、単球およびリンパ球などの単核細胞により主として媒介される。慢性炎症には、ＩＦＮ−ｙおよび他のサイトカイン、増殖因子、活性酸素種、ならびに加水分解酵素などの、様々な炎症性メディエーターも関与する。慢性炎症は、何カ月もまたは何年も続くことがあり、望ましくない組織破壊および線維形成をもたらすこともある。
【０２６５】
慢性炎症の臨床徴候は、罹患期間、炎症の病変、原因および解剖学的患部に依存する。（例えば、Kumar et al., Robbins Basic Pathology-8th Ed., 2009 Elsevier, London；Miller,LM, Pathology Lecture Notes, Atlantic Veterinary College, Charlottetown, PEI,Canadaを参照されたい）。慢性炎症は、例えば、本明細書に記載のおよび当技術分野で公知の数あるものの中でも特に、アレルギー、アルツハイマー病、貧血、大動脈弁狭窄、関節炎、例えば関節リウマチおよび変形性関節症、がん、うっ血性心不全、線維筋痛症、線維症、心臓発作、腎不全、狼瘡、膵炎、脳卒中、手術合併症、炎症性肺疾患、炎症性腸疾患、アテローム動脈硬化症、ならびに乾癬を含む、様々な病態または疾患に関連する。したがって、ｐ９７コンジュゲートを使用して、慢性炎症を処置もしくは管理すること、個々の慢性炎症反応のいずれか１つもしくは複数をモジュレートすること、または慢性炎症に関連するいずれか１つもしくは複数の疾患もしくは状態を処置することができる。
【０２６６】
ある特定の実施形態では、ｐ９７コンジュゲートは、炎症に関与する様々な細胞の活性化、炎症性分子分泌（例えば、サイトカインもしくはキニン分泌）、増殖、活性、遊走または接着をモジュレートすることなどにより、細胞レベルで炎症反応をモジュレートすることができる。
【０２６７】
そのような細胞の例としては、免疫細胞および血管細胞が挙げられる。免疫細胞としては、例えば、顆粒球、例えば好中球、好酸球および好塩基球、マクロファージ／単球、リンパ球、例えばＢ細胞、キラーＴ細胞（すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ヘルパーＴ細胞（すなわち、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、ｙｏ  Ｔ細胞、樹状細胞、ならびにマスト細胞が挙げられる。血管細胞の例としては、平滑筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞が挙げられる。好中球媒介、マクロファージ媒介、およびリンパ球媒介炎症状態を含む、１つまたは複数の免疫細胞または血管細胞に関連する炎症状態をモジュレートする方法も含まれる。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、ｐ９７コンジュゲートは、血漿由来炎症性分子および細胞由来炎症性分子を含む、炎症性分子のレベルまたは活性をモジュレートすることができる。炎症誘発性分子および抗炎症性分子が含まれる。血漿由来炎症性分子の例としては、限定ではないが、補体系、キニン系、凝固系およびフィブリン溶解系のいずれか１つまたは複数のタンパク質または分子が挙げられる。補体系のメンバーの例としては、約６個のＣ１ｑ分子と２個のＣ１ｒ分子と２個のＣ１ｓ分子とを含有する分子複合体として血清中に存在するＣ１；Ｃ２（ａおよびｂ）；Ｃ３（ａおよびＢ）；Ｃ４（ａおよびｂ）；ＣＳ；ならびにＣＳａ、ＣＳｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９の膜攻撃複合体が挙げられる。キニン系の例としては、ブラジキニン、カリジン、カリクレイン（kallidreins）、カルボキシペプチダーゼ、アンジオテンシン変換酵素、および中性エンドペプチダーゼが挙げられる。
【０２６９】
細胞由来炎症性分子の例としては、限定ではないが、リソソーム顆粒内に含有される酵素、血管作用性アミン、エイコサノイド、サイトカイン、急性期タンパク質、および可溶性ガス、例えば酸化窒素が挙げられる。血管作用性アミンは、少なくとも１つのアミノ基を含有し、血管を標的として、それらの透過性を変化させるかまたは血管拡張を引き起こす。血管作用性アミンの例としては、ヒスタミンおよびセロトニンが挙げられる。エイコサノイドは、２０炭素必須脂肪酸の酸化により作製されるシグナル伝達分子を指し、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、およびロイコトリエンを含む。
【０２７０】
ｐ９７コンジュゲートは、急性期タンパク質のレベルまたは活性をモジュレートすることもできる。急性期タンパク質の例としては、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、血清アミロイドＰ、およびバソプレッシンが挙げられる。ある特定の事例では、急性期タンパク質の発現は、アミロイドーシス、発熱、血圧上昇、発汗減少、倦怠感、食欲減退、および傾眠を含む、様々な望ましくない全身性作用を引き起こし得る。したがって、ｐ９７コンジュゲートは、急性期タンパク質のレベルもしくは活性、それらの全身性作用、または両方をモジュレートすることができる。
【０２７１】
ある特定の実施形態では、ｐ９７コンジュゲートは、局所炎症、全身性炎症、または両方を軽減することができる。ある特定の実施形態では、ｐ９７コンジュゲートは、局所炎症または局所炎症反応を軽減するまたは維持する（すなわち、さらなる悪化を防止する）ことができる。ある特定の実施形態では、ｐ９７コンジュゲートは、全身性炎症または全身性炎症反応を軽減するまたは維持する（すなわち、さらなる悪化を防止する）ことができる。
【０２７２】
ある特定の実施形態では、炎症または炎症反応のモジュレーションは、１つまたは複数の組織または臓器に関連し得る。そのような組織または臓器の非限定的な例としては、皮膚（例えば、真皮、表皮、皮下層）、毛包、神経系（例えば、脳、脊髄、末梢神経、髄膜、例えば硬膜、くも膜および軟膜）、聴覚系または平衡器官（例えば、内耳、中耳、外耳）、呼吸器系（例えば、鼻、気管、肺）、胃食道組織、消化器系（例えば、口、食道、胃、小腸、大腸、直腸）、血管系（例えば、心臓、血管および動脈）、肝臓、胆嚢、リンパ／免疫系（例えば、リンパ節、リンパ濾胞、脾臓、胸腺、骨髄）、泌尿生殖器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道、子宮頸部（cervix）、卵管、卵巣、子宮、外陰部、前立腺、尿道球腺、精巣上体、前立腺、精嚢、精巣）、筋骨格系（例えば、骨格筋、平滑筋、骨、軟骨、腱、靱帯）、脂肪組織、乳房、ならびに内分泌系（例えば、視床下部、下垂体、甲状腺、膵臓、副腎）が挙げられる。したがって、ｐ９７コンジュゲートを使用して、これらの組織または臓器のいずれかに関連する炎症をモジュレートすること、例えば、これらの組織または臓器の炎症に関連する状態または疾患を処置することができる。
【０２７３】
特定の実施形態では、炎症性状態は、脳、脊髄および／または髄膜の炎症を含む、神経系または中枢神経系要素を有する。特定の実施形態では、髄膜炎（例えば、細菌、ウイルス）、脳炎（例えば、感染症または自己免疫性炎症、例えば急性播種性脳脊髄炎（Enchephalomyelitis）により引き起こされる）、サルコイドーシス、新生物に関連する非転移性疾患における、ＣＮＳの炎症性状態。神経系またはＣＮＳ関連炎症状態の特定の例としては、限定ではないが、髄膜炎（すなわち、脳および脊髄を覆っている保護膜の炎症）、脊髄炎、脳脊髄炎（encaphaloymyelitis）（例えば、筋痛性脳脊髄炎、急性播種性脳脊髄炎、散在性脳脊髄炎または多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎）、くも膜炎（すなわち、中枢神経系の神経を包囲して保護する膜の１つであるくも膜の炎症）、肉芽腫、薬物性炎症または髄膜炎、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、脳卒中、ＨＩＶ認知症、脳炎、例えばウイルス性脳炎および細菌性脳炎、寄生生物感染症、炎症性脱髄障害、ならびに自己免疫障害、例えば、ＣＮＳのＣＤ８＋Ｔ細胞媒介自己免疫疾患が挙げられる。さらなる例としては、パーキンソン病、重症筋無力症、運動ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、自己免疫性ニューロパチー、ランバート・イートン筋無力症候群、傍腫瘍性神経疾患、傍腫瘍性小脳萎縮、非傍腫瘍性スティフ・マン症候群、進行性小脳萎縮、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム（Sydeham）舞踏病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、自己免疫性多腺性内分泌障害、免疫異常性ニューロパチー、後天性神経性筋強直症、多発性関節拘縮症、視神経炎、スティフ・マン症候群、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脊柱管狭窄症、急性脊髄傷害、および脊髄圧迫が挙げられる。
【０２７４】
上述のように、神経系またはＣＮＳの感染症に関連する炎症も含まれる。神経系の炎症に関連する細菌性感染症の具体的な例としては、限定ではないが、連鎖球菌感染症、例えば、Ｂ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えば、サブタイプＩＩＩ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、血清型６、９、１４、１８および２３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（例えば、Ｋ１抗原を有するもの）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（例えば、血清型ＩＶｂ）、ナイセリア感染症、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）、ブドウ球菌感染症、ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ感染症、例えば、Ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ならびにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが挙げられる。主として、鼻腔内の細菌が髄膜腔に侵入できるようにする頭蓋骨の外傷に関する、または脳シャントもしくは関連デバイス（例えば、脳室外ドレイン、オンマヤリザーバー）を有する人物における、ブドウ球菌およびシュードモナスならびに他のグラム陰性桿菌による感染症も含まれる。神経系の炎症に関連するウイルス感染症の具体的な例としては、限定ではないが、エンテロウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２型、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（水痘および帯状疱疹）、ムンプスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ならびにリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）が挙げられる。髄膜炎は、スピロヘータ、例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）およびＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ライム病）、寄生生物、例えば、マラリア（例えば、脳性マラリア）、真菌、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、ならびにアメーバ、例えば、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉによる感染症の結果であることもある。
【０２７５】
髄膜炎または他の型の神経系炎症は、髄膜へのがんの拡大（悪性髄膜炎）、ある特定の薬物、例えば、非ステロイド性抗炎症薬、抗生物質および静注用免疫グロブリン、サルコイドーシス（または神経サルコイドーシス）、結合組織障害、例えば、全身性エリテマトーデス、ならびにある特定の型の血管炎（血管壁の炎症性状態）、例えばベーチェット病に関連することもある。類表皮嚢胞および類皮嚢胞は、刺激物をくも膜下腔に放出することにより髄膜炎を引き起こし得る。したがって、ｐ９７コンジュゲートを使用して、これらの状態のいずれか１つまたは複数を処置または管理することができる。
【０２７６】
上述のように、ある特定の被験体は、そうしないと心毒性の薬剤、すなわち、その非コンジュゲート形態（ｐ９７にコンジュゲートされていない薬剤）では心毒性を示す薬剤での治療を、まさに受けようとしている、受けている、または受けたことがある。そのような被験体は、一つには、そうしないと心毒性の薬剤に対して、ｐ９７がそのＢＢＢ輸送特性とは異なると考えられる機構により心保護効果を発揮することができるので、単独での薬剤の投与と比べてｐ９７−薬剤コンジュゲートの投与による恩恵を受けることができる。したがって、そのような被験体を、本明細書に記載のＣＮＳの疾患、および末梢の非ＣＮＳ組織に関する疾患を含む、様々な疾患状態についてｐ９７と心毒性の薬剤のコンジュゲートで処置することができる。
【０２７７】
例示的な心毒性の薬剤は、本明細書の他の箇所に記載されており、周知のｉｎ  ｖｉｖｏ診断およびｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング技術に従って同定され得る。Bovelli et al., 2010、上掲；Inoue et al., AATEX 14, Special Issue,457-462, 2007；およびDorr et al., Cancer Research. 48:5222-5227, 1988を参照されたい。
【０２７８】
例えば、心毒性の疑いがある薬剤での治療を受けている被験体を、イメージング技術によりモニターして、ＬＶ収縮および拡張機能障害、心臓弁膜症、心膜炎および心膜液貯留（pericardiaI effusion）、ならびに頸動脈病変を評価することができる。ＬＶ短縮率およびＬＶＥＦは、例えば化学療法中の、心機能評価のためのＬＶ収縮機能の最も一般的な指標である。また、ドプラ法による拡張期指標は、治療を受けている患者においてＬＶ機能不全の初期徴候を表し、したがって、僧帽弁拡張期血流パターン、初期ピーク血流速度対心房ピーク血流速度（Ｅ／Ａ）比、Ｅ波への減速時間および等容弛緩時間を評価することは、収縮機能障害が起こる前にＬＶ機能の拡張変化を検出するのに有用であり得る。パルス組織ドプラは、標準的なドプラ心エコー検査中に行うことができ、これは、心筋拡張期弛緩および収縮期機能（Ｅ’波、Ａ’波およびＳ波速度）に関する定量的情報を提供する点で信頼性があり得る。ＬＶ外側僧帽弁輪の組織ドプラは、予後的役割が認知されており、僧帽弁流入のＰＷドプラと組み合わせて、ＬＶ充満圧の程度に関する正確な情報を提供する。ＬＶ心筋機能の初期変化は、複数のＬＶ部位のパルス組織ドプラにより同定されており、心毒性の適切な決定因子であり得る。
【０２７９】
特定の実施形態では、心毒性の薬剤は、化学療法薬であり、被験体は、がんに罹患している。がんの具体的な例としては、限定ではないが、乳がん、前立腺がん、消化器がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、扁平上皮癌、ＣＮＳまたは脳がん（本明細書に記載されている）、黒色腫、非黒色腫がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、上皮腫瘍、骨がん、および造血器がんが挙げられる。
【０２８０】
特定の実施形態では、被験体は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現がん、例えば乳がん、卵巣がん、胃がん、侵襲性子宮がん、または転移性がん、例えば転移性ＣＮＳがんに罹患しており、ｐ９７ポリペプチドは、トラスツズマブにコンジュゲートされる。そのような患者は、特にＣＮＳがんについては、ｐ９７とトラスツズマブの組合せの結果として生じる治療相乗作用による恩恵を受けることができるばかりでなく、ｐ９７の潜在的心保護効果の結果として生じる、トラスツズマブの心毒性低減による恩恵も受けることができる。
【０２８１】
本明細書に記載の疾患または状態のうちの１つまたは複数に罹患している被験体を同定するための方法は、当技術分野で公知である。
【０２８２】
被験体の臓器または組織成分をイメージングするための方法であって、（ａ）ｐ９７ポリペプチドが検出可能な実体にコンジュゲートされている、ヒトｐ９７（メラノトランスフェリン）ポリペプチドまたはそのバリアントを含む組成物を、被験体に投与するステップと、（ｂ）被験体、臓器または組織中の検出可能な実体を可視化するステップとを含む方法も含まれる。
【０２８３】
特定の実施形態では、臓器または組織コンパートメントは、中枢神経系（例えば、脳、脳幹、脊髄）を含む。特定の実施形態では、臓器または組織コンパートメントは、脳またはその一部分、例えば、脳の実質を含む。
【０２８４】
様々な方法を利用して、被験体、臓器または組織中の検出可能な実体を可視化することができる。例示的な非侵襲的方法としては、Ｘ線撮影、例えば、透視および投影X線写真；Ｘ線ＣＴスキャンを利用するのか、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を利用するのか、または単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を利用するのかを問わず、ＣＴスキャンまたはＣＡＴスキャン（コンピューター断層撮影（ＣＴ）またはコンピューター体軸断層撮影（ＣＡＴ））；ならびにある特定のタイプの磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、特に、造影剤を利用するものが、これらの組合せを含めて、挙げられる。単に例として、ＰＥＴは、陽電子放出造影剤または放射性同位体、例えば１８Ｆを用いて行うことができ、ＳＰＥＣＴは、ガンマ線放射造影剤または放射性同位体を用いて行うことができ、ＭＲＩは、造影剤または放射性同位体を用いて行うことができる。これらの例示的な造影剤または放射性同位体のいずれか１つまたは複数を、ｐ９７ポリペプチドにコンジュゲートし、または別様に組み込み、イメージングのために被験体に投与することができる。
【０２８５】
例えば、ｐ９７ポリペプチドを、これらの放射性同位体のうちの１つまたは複数で直接標識することができ、あるいはこれらの放射性同位体造影剤のうちの１つもしくは複数を含む分子（例えば、小分子）、または本明細書に記載の任意の他のものに、コンジュゲートすることができる。
【０２８６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のために、例えば、ヒト疾患の処置、医用イメージング、または試験のために、本明細書に記載のコンジュゲートは、一般に、投与前に医薬組成物に組み込まれる。医薬組成物は、本明細書に記載のｐ９７ポリペプチドまたはコンジュゲートのうちの１つまたは複数を、生理的に許容される担体または賦形剤と組み合わせて含む。
【０２８７】
医薬組成物を調製するために、ｐ９７ポリペプチドまたはコンジュゲートのうちの１つまたは複数の有効量または所望される量が、特定の投与様式に好適になるように当業者に公知の任意の薬学的担体または賦形剤と混合される。薬学的担体は、液体、半液体または固体であることがある。非経口、皮内、皮下または局所的適用に使用される溶液または懸濁物は、例えば、滅菌希釈剤（例えば、水）、食塩溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水；ＰＢＳ）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗微生物剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム）およびキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩）を含み得る。静脈内投与される場合、好適な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびこれらの混合物などの増粘および可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。
【０２８８】
純粋な形態でのまたは適切な医薬組成物での、本明細書に記載のポリペプチドおよびコンジュゲートの投与は、同様の有用性に役立つ薬剤についての受け入れられている投与様式のいずれかによって行うことができる。医薬組成物を、ポリペプチドまたはコンジュゲートまたはコンジュゲート含有組成物を適切な生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と合わせることにより調製することができ、固体、半固体、液体または気体形態の調製物、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射剤、吸入剤、ゲル、マイクロスフェアおよびエアロゾルに製剤化することができる。加えて、他の薬学的に活性な成分（本明細書の他の箇所に記載の他の抗がん剤を含む）ならびに／または適切な賦形剤、例えば、塩、緩衝液および安定剤が、組成物中に存在することもあるが、存在しなくてもよい。
【０２８９】
投与は、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮内、皮下または局所的経路を含む、様々な異なる経路により果たすことができる。好ましい投与様式は、処置または予防される状態の性質に依存する。
【０２９０】
担体は、例えば、利用される投薬量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物にとって非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含み得る。多くの場合、生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理的に許容される担体の例としては、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポロクサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））などが挙げられる。
【０２９１】
ある特定の態様では、ｐ９７ポリペプチド配列および薬剤は、各々、個別にまたは既存コンジュゲートとして、粒子、例えば、ナノ粒子、ビーズ、脂質製剤、脂質粒子、もしくはリポソーム、例えばイムノリポソームに結合されるか、またはこれらの中に封入される。例えば、特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、粒子の表面に結合され、目的の薬剤は、粒子の表面に結合される、および／または粒子内に封入される。これらのおよび関連実施形態のうちの一部では、ｐ９７ポリペプチドおよび薬剤は、専ら粒子（例えば、ナノ粒子、リポソーム）自体を介して互いに共有結合で連結または動作可能に連結され、いずれの他の方法でも互いに共有結合で連結されない；すなわち、それらは、同じ粒子に個別に結合される。他の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドおよび薬剤は、先ず、本明細書に記載されるように（例えば、リンカー分子を介して）互いに共有結合でまたは非共有結合でコンジュゲートされ、次いで、粒子（例えば、イムノリポソーム、ナノ粒子）に結合される、またはそのような粒子内に封入される。特定の実施形態では、粒子は、リポソームであり、組成物は、１つまたは複数のｐ９７ポリペプチドと、目的の１つまたは複数の薬剤と、リポソームを形成するための脂質の混合物（例えば、リン脂質、界面活性剤特性を有する混合脂質鎖）とを含む。一部の態様では、ｐ９７ポリペプチドおよび薬剤は、脂質／リポソーム混合物と個別に混合され、したがって、リポソーム構造の形成により、共有結合性コンジュゲーションを必要とせずにｐ９７ポリペプチドおよび薬剤が動作可能に連結される。他の態様では、ｐ９７ポリペプチドおよび薬剤は、先ず、本明細書に記載されるように互いに共有結合でまたは非共有結合でコンジュゲートされ、次いで、リポソームを形成するための脂質と混合される。ｐ９７ポリペプチド、薬剤、またはｐ９７−薬剤コンジュゲートを、例えば、コアセルベーション技術によりもしくは界面重合により、調製されたマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、それぞれ）内に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン内に捕捉することができる。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)において開示されている。粒子またはリポソームは、他の治療または診断剤、例えば細胞傷害剤をさらに含み得る。
【０２９２】
正確な投薬量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、正確な投薬量および処置期間を、公知の試験プロトコールを使用して実験により決定することができ、または当技術分野で公知のモデル系で組成物を試験し、そこから外挿することにより決定することができる。対照臨床試験を行うこともできる。投薬量は、緩和される状態の重症度によっても変わり得る。医薬組成物は、一般に、望ましくない副作用を最小限に抑えて治療有用効果を発揮するように、製剤化され、投与される。組成物は、１回で投与されることもあり、または多数のより小さい用量に分割されて時間の間隔を空けて投与されることもある。いずれの特定の被験体についても、具体的な投薬量レジメンは、個々の必要に応じて時間をわたり調整され得る。
【０２９３】
したがって、これらのおよび関連医薬組成物を投与する典型的な経路は、限定ではないが、経口、局所的、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸、膣および鼻腔内経路を含む。本明細書で使用される場合の非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術を含む。本発明のある特定の実施形態による医薬組成物は、それらの中に含有される活性成分が患者への組成物の投与時に体内に吸収されて利用され得ることを可能にするように製剤化される。被験体または患者に投与されることになる組成物は、１つまたは複数の投薬単位の形態をとることができ、例えば、錠剤が単一投薬単位であることもあり、エアロゾル形態での本明細書に記載のコンジュゲートの容器が複数の投薬単位を保持することもある。そのような剤形の実際の調製方法は、当業者には公知である、または分かるであろう；例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)を参照されたい。いずれにせよ、投与される組成物は、目的の疾患または状態の処置のための、本明細書に記載のｐ９７ポリペプチド、薬剤またコンジュゲートの治療有効量を含有することになる。
【０２９４】
医薬組成物は、固体の形態であることもあり、または液体の形態であることもある。一実施形態では、組成物が例えば錠剤または粉末形態であるために、担体は粒状である。組成物が、例えば、経口油、注射可能な液体、または例えば吸入投与に有用であるエアロゾルであると、担体は液体であり得る。経口投与が意図される場合、医薬組成物は、好ましくは、固体形態または液体形態のどちらかであり、半固体、半液体、懸濁物およびゲル形態は、本明細書で固体または液体のどちらかと見なされる形態の中に含まれる。
【０２９５】
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物を、粉末、顆粒、圧縮錠剤、丸剤、カプセル、チューインガム、オブラートなどに製剤化することができる。そのような固体組成物は、１つまたは複数の不活性希釈剤または可食担体を通常は含有することになる。加えて、次のうちの１つまたは複数が、存在することもある：結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン、ラクトースまたはデキストリン；崩壊剤、例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、トウモロコシデンプンなど；滑沢剤、例えば、ステアリン鎖マグネシウムまたはステロテックス；流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリン；矯味矯臭剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料；および着色剤。医薬組成物が、カプセル、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、その医薬組成物は、上記のタイプの材料に加えて、液体担体、例えば、ポリエチレングリコールまたは油を含有し得る。
【０２９６】
医薬組成物は、液体形態、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁物であり得る。液体は、２つの例として、経口投与用または注射による送達用であり得る。経口投与が意図される場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、保存薬、色素／着色剤および風味増強剤（ｆｌａｖｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）のうちの１つまたは複数を含有する。注射により投与することが意図される組成物の場合、界面活性剤、保存薬、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤および等張剤のうちの１つまたは複数を含み得る。
【０２９７】
液体医薬組成物は、それらが溶液であるか、懸濁物であるか、他の同様の形態であるかを問わず、次のアジュバントのうちの１つまたは複数を含み得る：滅菌希釈剤、例えば、注射用蒸留水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、固定油、例えば、溶媒または懸濁媒体として役立ち得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；および張度の調整用の薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入することができる。生理食塩水は、好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
【０２９８】
非経口投与または経口投与のどちらかが意図される液体医薬組成物は、好適な投薬量が得られることになるように、本明細書で開示されるようなｐ９７ポリペプチドまたはコンジュゲートの量を含有するべきである。通常は、この量は、組成物中に少なくとも０．０１％の目的の薬剤である。経口投与が意図される場合、この量を、組成物の重量の０．１％〜約７０％の間になるように変動させることができる。ある特定の経口医薬組成物は、約４％〜約７５％の間の目的の薬剤を含有する。ある特定の実施形態では、本発明による医薬組成物および調製物は、非経口投薬単位が希釈前に０．０１〜１０重量％の間の目的の薬剤を含有するように調製される。
【０２９９】
医薬組成物は、局所的投与が意図されることもあり、その場合、担体は、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲル基剤を適切に含み得る。基剤は、例えば、次のうちの１つまたは複数を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤、例えば水およびアルコール、ならびに乳化剤および安定剤。増粘剤が、局所的投与用の医薬組成物中に存在することもある。経皮投与が意図される場合、組成物は、経皮パッチまたはイオン導入デバイスを含み得る。
【０３００】
医薬組成物は、直腸内で融解されて薬物を放出することになる形態、例えば座薬の形態での、直腸投与が意図されることもある。直腸投与用の組成物は、好適な無刺激賦形剤として脂肪性基剤を含有し得る。そのような基剤としては、限定ではないが、ラノリン、カカオ脂、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３０１】
医薬組成物は、固体または液体投薬単位の物理的形態を改良するための様々な材料を含み得る。例えば、組成物は、活性成分の周囲にコーティングシェルを形成する材料を含み得る。コーティングシェルを形成する材料は、通常は不活性であり、例えば、糖、セラック、および他の腸溶コーティング剤から選択され得る。あるいは、活性成分は、ゼラチンカプセルに封入されることもある。固体または液体形態の医薬組成物は、コンジュゲートまたは薬剤に結合し、それによって化合物の送達を補助する薬剤を含み得る。この能力で作用し得る好適な薬剤は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、１つもしくは複数のタンパク質、またはリポソームを含む。
【０３０２】
医薬組成物は、エアロゾルとして投与することができる投薬単位から本質的になることもある。エアロゾルという用語は、コロイド的性質のものから、加圧パッケージからなる系までの幅がある、様々な系を示すために使用される。送達は、液化もしくは圧縮ガスによることもあり、または活性成分を計量供給する好適なポンプシステムによることもある。エアロゾルは、活性成分を送達するために単相、二相または三相系で送達されることがある。
【０３０３】
エアロゾルの送達は、必要な容器、活性化剤、弁、サブコンテナなどを含むことがあり、これらが一緒にキットを形成し得る。当業者は、過度の実験をしなくても、好ましいエアロゾルを決定することができる。
【０３０４】
本明細書に記載されるようなコンジュゲートを含む組成物を、時限放出製剤またはコーティングなどの、コンジュゲートを身体から急速に排出されないように保護する担体を用いて調製することができる。そのような担体は、放出制御製剤、例えば、これらに限定されないが、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系、ならびに生体内分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他のものを含む。
【０３０５】
医薬組成物を、製薬技術分野で周知の方法論により調製することができる。例えば、注射により投与されることが意図される医薬組成物は、本明細書に記載されるようなコンジュゲートと必要に応じて塩、緩衝液および／または安定剤のうちの１つまたは複数とを含む組成物を、溶液を形成するための滅菌蒸留水と合わせることにより、調製することができる。界面活性剤が、均一な溶液または懸濁物の形成を助長するために添加されることもある。界面活性剤は、コンジュゲートと非共有結合的に相互作用して水性送達系へのコンジュゲートの溶解または均一な懸濁を助長する化合物である。
【０３０６】
組成物を治療有効量で投与することができ、この治療有効量は、利用される具体的な化合物（例えば、コンジュゲート）の活性；化合物の代謝安定性および作用長；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；投与の様式およびタイミング；排泄率；薬物の組合せ；特定の障害または状態の重症度；ならびに治療を受けている被験体を含む、様々な因子に依存して変わることになる。
【０３０７】
一般に、治療有効一日用量は、（７０ｋｇの哺乳動物について）約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約７．０ｇ）であり；好ましくは、治療有効用量は、（７０ｋｇの哺乳動物について）約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約３．５ｇ）であり；より好ましくは、治療有効用量は、（７０ｋｇの哺乳動物について）約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約１．７５ｇ）である。
【０３０８】
本明細書に記載のコンジュゲートを含む組成物を、本明細書に記載されるような１つまたは複数の他の治療剤の投与と同時に、投与の前に、または投与の後に、投与することもできる。例えば、一実施形態では、コンジュゲートは、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤または抗炎症薬としては、ステロイドおよびグルココルチコイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、例えば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０９】
そのような併用療法は、本発明の化合物と１つまたは複数の追加の活性薬剤とを含有する単一の医薬投与製剤の投与はもちろん、本発明のコンジュゲートと、それ自体の別個の医薬投与製剤での各活性薬剤とを含む組成物の投与も含み得る。例えば、本明細書に記載されるようなコンジュゲートと他の活性薬剤とを、患者に、錠剤もしくはカプセルなどの単一経口投与組成物で一緒に投与することができ、または各薬剤を別個の経口投与製剤で投与することができる。同様に、本明細書に記載されるようなコンジュゲートと他の活性薬剤とを、患者に、食塩溶液もしくは他の生理的に許容される溶液中のものなどの単一非経口投与組成物で一緒に投与することができ、または各薬剤を別個の非経口投与製剤で投与することができる。別個の投与製剤が使用される場合、コンジュゲートを含む組成物と、１つまたは複数の追加の活性薬剤を含む組成物とを、本質的に同時に、すなわち並行して、投与することができ、または別々にずらした時間で、すなわち、逐次的におよび任意の順序で投与することができ、併用療法は、これらのレジメン全てを含むと理解される。
【実施例】
【０３１０】
本発明を例証するために以下の実施例を提供するが、以下の実施例は、後続の特許請求の範囲に記載の範囲を限定することを意図したものではない。
【０３１１】
材料および方法
ＭＴｆペプチド
成熟タンパク質のアミノ酸４４１〜４５２（ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ）に対応するＭＴｆ（ＭＴｆｐｅｐ）のトリプシン消化からのペプチド断片は、ＢＢＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを通過するものとして以前に同定されており、これを本研究に利用する。ＭＴｆペプチドの同定の詳細は、他の場所２１に記載されている。手短に述べると、Yang et al.１３；Karkan et al.19；およびHegedus etal.２２により以前に記載されたように発現させ、精製した組換えヒトＭＴｆを、３７℃で２０時間、トリプトファン消化に付して、凍結乾燥させた。初代ラットグリア細胞により支持されたコンフルエントな単層を形成する、コラーゲンで被覆されたポリカーボネート製のトランスウェルインサート（孔径０．４μｍ、直径２４ｍｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で成長させたウシ脳毛細血管内皮細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデル（Ｃｅｌｌｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｅｎｓ  Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、トランスサイトーシスアッセイでトリプシンペプチドをスクリーニングした。２０μＭのＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ（ＬＹ）を傍細胞マーカーとして使用して、細胞障壁の完全性を評価した。ＭＴｆのトリプシン消化物とＬＹとを含有するリンゲル−ＨＥＰＥＳ緩衝液を、トランスウェルの上方チャンバー内（管腔側）に配置した。トランスウェルを揺動プラットフォーム上で、３７℃で１２０分間インキュベートした。実験終了時に、アリコートを、トランスウェルの反管腔側および管腔側コンパートメントから採取し、凍結乾燥させ、質量分析まで−８０℃で保管した。トランスウェル実験からの試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラムを使用して液体クロマトグラフィーにより分解した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４９０  ＱｑＱ質量分析計をポジティブモードで用いて、ＡｇｉｌｅｎｔのＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｗｏｒｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（バージョンＢ．０４．０１）で制御し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎソフトウェア（バージョンＢ．０４．０１）で処理して、溶出物を分析した。
【０３１２】
ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１対照抗体
ＮＩＰ２２８  ｈＩｇ１は、４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸に対するマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体であり、これを、ＢＢＢを横断するタンパク質融合体の陰性対照として使用する。これは、ＩＬ−１ＲＡに結合すると、ＢＢＢを横断することができないので、神経障害性疼痛のマウスモデルにおいて痛覚脱失がないことが以前に示された２３。
【０３１３】
共焦点蛍光顕微鏡観察のためのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を伴う蛍光マーカーでのＮＩＰ２２８抗体およびＭＴｆペプチドの標識
ＭＴｆｐｅｐをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ６４７）Ｃ２−マレイミド（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ２０３４７）と反応させ、反応後に半分取逆相Ｃ１８クロマトグラフィーを使用して精製した。ＮＩＰ２２８マウスＩｇＧ１抗体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ＮＨＳエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応させ、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを使用して脱塩した。
【０３１４】
共焦点蛍光顕微鏡観察のためのＮＩＰ２２８  ｍＡｂへのＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐの化学的コンジュゲーション
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識およびコンジュゲーションは、ＣｅｌｌＭｏｓａｉｃ，Ｉｎｃ．が行った。手短に述べると、脱塩されたＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１をＮ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）と反応させた。別の反応で、ＭＴｆを２−ピリジルジチオール−テトラオキサテトラデカン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＰＥＧ４−ＳＰＤＰ）と反応させ、次いで脱塩した。回収した画分をジチオトレイトール（ＤＴＴ）還元に付して、遊離スルフヒドリル基を含有するＭＴｆを生成した。スルフヒドリル含有ＭＴｆを、ｍＡｂ（ＡＦ６４７）ｎとＢＭＰＳの反応から生成された、マレイミド基を含有するＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１（ＡＦ６４７）と、さらに反応させた。反応をシステインによりクエンチし、粗反応混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。１：１のＭＴｆとＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１のコンジュゲートを主として含有する画分を合わせ、濃縮し、滅菌済みウルトラフリーＭＣ  ０．２２μｍ  ＧＶ  Ｄｕｒａｐｏｒｅスピンフィルターを使用して滅菌した。得られたコンジュゲートは、ＮＩＰ２２８抗体１個につきおよそ２個のＭＴｆを含有した。
【０３１５】
ＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１コンジュゲートを同様に調製し、この場合は、マレイミド含有ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１をチオール含有ＭＴｆｐｅｐと反応させた。反応をシステインによりクエンチし、脱塩した。得られたコンジュゲートは、ＮＩＰ２２８抗体１個につきおよそ４個のＭＴｆｐｅｐを含有した。
【０３１６】
コンジュゲーション生成物を、逆相ＨＰＬＣまたはサイズ排除ＨＰＬＣのどちらかにより分析して純度および濃度を決定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して純度および分子量を決定した。
【０３１７】
ＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８融合構築物のクローニング、発現および精製
抗体、ＮＩＰ２２８のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長により組み立て、適切な軽鎖および重鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした２４。全ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐアミノ酸配列（ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ）および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２〜４フレキシブルリンカーをコードするＤＮＡを、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長、およびアクセプターＩｇＧ重鎖のＮまたはＣ末端のどちらかへの指向性クローニングによって、同様に組み立てた。全てのＩｇＧを、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ三重変異（ＩｇＧ１  ＴＭ）を有するキメラヒトＩｇＧ１分子として発現させた２５。抗体を、以前に記載された２６ように、無血清培地中の一過的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させた。プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用し、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、抗体を細胞培養培地から精製した。ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を使用してＡ２８０によりＩｇＧの濃度を決定した２７。
【０３１８】
（Ｇ４Ｓ）３フレキシブルリンカーを介してＩｇＧ１  ＴＭ重鎖のＣ末端に融合されたＩＬ−１ＲＡの発現を可能にするプラスミドを、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手したｃＤＮＡからのＩＬ−１ＲＡ遺伝子のＰＣＲ増幅、ならびにＩＬ−１ＲＡ遺伝子およびＩｇＧ１  ＴＭ  ＣＨ３ドメインとオーバーラップしているオリゴヌクレオチドプライマーでのその後のＰＣＲ増幅によって組み立て、上記のリンカーを組み込んだ。ＩｇＧ１  ＴＭ−ＩＬ−１ＲＡ融合体の発現および精製を、前に説明したように行った。
【０３１９】
ＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８  ｍＡｂ構築物の化学的コンジュゲーション
Thompson et al.２８に記載されているように、Ｃ末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４リンカーを用い、続いて、ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１ＴＭのＦｃ領域の操作されたシステイン残基のチオール基に連結させるためのマレイミド基を含有するリシン残基を用いて、ＭＴｆｐｅｐを化学合成した。手短に述べると、部位特異的ペプチドコンジュゲーションを生じさせるために、システインが操作されたＮＩＰ２２８を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）中の４０モル等量過剰のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｏｎｄ−ｂｒｅａｋｅｒ  ＴＣＥＰ溶液）を使用して、３時間、室温で、還元した。ＴＣＥＰを除去するための緩衝液交換の後、２０モル等量のデヒドロアスコルビン酸を４時間にわたって室温で添加した。得られた溶液を０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過し、１０モル等量のＭＴｆペプチドを添加し、その後、室温で１時間インキュベートした。４等量（ＭＴｆペプチドに対して）のＮ−アセチルシステインの添加により、反応をクエンチした。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＭＴｆペプチド標識ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１ＴＭを精製した。Thompsonet al.２８に記載されているように、ペプチド対抗体比を推定した。Ｆａｂアームは分子量および流体力学的半径を増加させて腎臓によるクリアランスを低減させるので、腎クリアランスの差を回避するために、ＦｃドメインのみではなくＩｇＧを用いてＭＴｆｐｅｐを含有する分子を構築した。図１は、ＮＩＰ２２８に基づく、異なる分子の設計および組成を示し、図１Ａは、末梢薬物動態（ＰＫ）におよび脳曝露に使用した分子を示し、図１Ｂは、神経障害性疼痛のマウス薬力学（ＰＤ）モデルに使用した、ヒトＦｃのＣ末端にＩＬ−１ＲＡが組み込まれた分子を示す。
【０３２０】
共焦点蛍光顕微鏡観察によるＭＴｆｐｅｐ、ｍＡｂおよびＭＴｆｐｅｐ／ＭＴｆ−ｍＡｂ化学的コンジュゲートの脳内分布
生存相および共焦点顕微鏡調査をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ）ｏｆ  Ｃａｎａｄａ（Ｏｔｔａｗａ、ＯＮ）との契約のもとで行った。この研究における動物の管理および使用を含むプロトコールおよび手順は、Ｏｔｔａｗａ−ＮＲＣ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより審査され、承認された。動物の管理および使用は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）のガイドラインに従った。ＡＲＲＩＶＥガイドライン（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）を遵守して、この研究の実験を報告した。
【０３２１】
６〜８週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（ｎ＝３）に、ｍＡｂＡＦ６４７（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＭＴｆ−ｍＡｂＡＦ６４７（１５ｍｇ／ｋｇ）、およびＭＴｆｐｅｐ−ｍＡｂＡＦ６４７（１０．２ｍｇ／ｋｇ）を注射（ｉ．ｖ．）した。これらの用量は、これら３つの分子の分子量が異なるため、等価のモル／ｋｇ用量を表す。対照群には、ビヒクル対照、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または遊離ＡＦ６４７（０．１ｍｇ／ｋｇ）を施した。注射の２時間後、毛細血管を標識するためのトマトレクチンＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１００μｇ／マウス）を安楽死の（１０分）前に注射（ｉ．ｖ．）した。動物を麻酔施行により安楽死させ、２．７％ＢＳＡ、１００Ｕ／ｍＬのヘパリンを補充した、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で灌流した。脳を除去し、凍結させ、凍結切片作製および免疫組織化学的検査に付した。組織切片を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩブルー）で染色して細胞核を標識した。
【０３２２】
３Ｄ共焦点イメージングは、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｈｅｒｓｈｅｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂで行った。高分解能Ｌｅｉｃａ  ６３Ｘ／１．４または４０Ｘ／１．３  Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ油浸対物レンズを使用して、Ｌｅｉｃａ  ＡＯＢＳ  ＳＰ８レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、蛍光標識細胞の共焦点画像を取得した。励起に使用したレーザー線は、ＤＡＰＩについては連続波４０５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄについては８０ＭＨｚでパルスされる５９５ｎｍ、ＡＦ６４７については８０ＭＨｚでパルスされる６５３ｎｍであった。全ての画像およびスペクトルデータ（ＤＡＰＩを除く）は、スキャンヘッドの内側に位置する高感度Ｌｅｉｃａ  ＨｙＤハイブリッド検出器（時間ゲートオプション付き）を使用して生成した。組織体積からおよそ０．３μｍの光学切片厚（ｚ軸）で３Ｄスタック画像を取り込んだ。Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使用して、３Ｄ画像復元を行った。脳組織試料の５つまたはそれより多くの異なるエリアから記録した３Ｄ画像データを用いて、体積推定を行った。ガウス雑音除去フィルターを適用してフォアグラウンドとバックグラウンドとの境界を画定し、全ての可能なバックグラウンドボクセル値を除外するように下限閾値レベルを設定した。この閾値レベルより上の全てのボクセルの和を体積であると決定する。同様のイメージング条件を使用して、組織の３Ｄ画像体積を系統的に比較した。脳の毛細血管および実質における被験物質の分布を体積分率として定量化し、この体積分率は、被験物質の体積（毛細血管または実質のどちらかと共局在するＡＦ６４７のボクセル）を総組織体積で割って決定する。
【０３２３】
脳実質および毛細血管におけるＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１に関連するＡＦ６４７蛍光の体積分率とＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１またはＭＴｆ−ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１に関連するＡＦ６４７蛍光の体積分率との比較に使用したＡＮＯＶＡ多重比較。ｐ＜０．０５での全ての差を統計的に有意と見なした。データを平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。
【０３２４】
末梢動態および脳曝露
末梢および脳における抗体曝露を測定するための全ての研究は、Ｑｕｏｔｉｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、ＵＫ）で行った。雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、週齢１０〜１２週に、対照ＩｇＧ（ＮＩＰ２２８）のＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ遺伝子的または化学的にコンジュゲート化バリアントを、２０ｍｇ／ｋｇまたはモル等量で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。静脈内用量を１０ｍｌ／ｋｇの一定投与体積で尾静脈に投与した。抗体をＤ−ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）に供給した。投薬後、時点（０．０８、２、４、６、８、２４、４８、９６、１２０、１６８、２４０および３３６時間）毎に１用量群当たり６匹の動物の各々からの２つの血漿試料を個別のＬｉ−ヘパリン容器に採取した。各動物からの第１の試料は、Ｌｉ−Ｈｅｐ  Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に外側尾静脈から採取し（約２００μＬ）、その一方で、第２の試料（約６００μＬ）は、イソフルラン麻酔下での心穿孔によりＬｉ−ｈｅｐ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に採取した。採取後、血液試料を３０分間放置して凝固させ、１０，０００×ｇで２分間、４℃で遠心分離し、得られた血漿を取り出した。血漿試料を後続の分析のためにドライアイスで急速凍結させた。最後の採血後、１０分間、体肢が白く見えるまで、２ｍｌ／分の速度でＤ−ＰＢＳを用いてマウスを灌流した。脳を摘出し、一方の半球を直ちに処理し、他方を液体窒素中で瞬間凍結させた。
【０３２５】
０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０とＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とを含有する５体積の氷冷ＰＢＳ中で、脳半球を均質化した。均質化は、１０ｍｌ  Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ乳鉢型ガラス製ホモジナイザーにおいて、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製乳棒で、５秒の静止時間を伴う２×１０回の時計回りのストロークを使用して行った。ホモジネートをＬｏＢｉｎｄ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、４℃で１時間回転させた後、冷却したベンチトップ遠心分離機において１３，０００ｇで２０分間、遠心分離した。上清を脳抗体測定のために単離した。０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤とを含有する５体積の氷冷ＰＢＳを残存細胞ペレットに添加し、上で説明したようにペレットを処理した。上清を再び除去し、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）による測定のために第１の上清と合わせた。ＭＳＤマルチアレイ技術は、電気化学発光検出を使用して単一および多重形式でのバイオマーカーの検出を可能にする。
【０３２６】
使用した動物飼育管理および手順は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従い、Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６を遵守した。Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ＡＲＲＩＶＥ）ガイドラインを遵守して、全ての動物実験を報告した。
【０３２７】
マウス脳および血漿中の抗体濃度の測定
マウス血漿および脳試料中の抗体濃度をＭＳＤアッセイプラットフォームによって測定した。ＭＳＤアッセイは、抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体が標準物質または試料に結合し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧで標識された特異的検出抗体が電気化学的刺激によって発光する、プレートベースのサンドイッチイムノアッセイ形式を利用する。血漿および脳試料中のＭＴｆ−ＮＩＰ２２８、ＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８および対照抗体単独＋／−ＩＬ−１ＲＡ融合体のレベルを、４パラメーター非線形回帰モデルで標準物質試料を使用して生成した標準曲線への参照により定量化した。
【０３２８】
Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ［バージョン６．３；Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（Ｃｅｒｔａｒａ）、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ］を使用して、ノンコンパートメント薬物動態（ＰＫ）解析（ＮＣＡ）を行った。名目収集時間をＰＫデータ解析に使用し、名目時点での濃度平均値の算出のために定量レベル未満（ＢＬＱ）の値を「欠測」に設定した。ＮＣＡ解析のために、投薬前のＢＬＱ値を「ゼロ」、ピーク濃度後のＢＬＱ値を「欠測」と設定した。
【０３２９】
最後の測定可能時点までの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｈｏｅｎｉｘに実装されているような線形台形方法を使用して血漿および脳について算出した。加えて、全身クリアランス（ＣＬ）、終末相分布体積（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）（Ｖｚ）および終末相半減期（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）（ｔ１／２）を血漿について決定した。言及するＣｍａｘおよびＴｍａｘは、各時点での平均濃度データに基づく実測値である。
【０３３０】
部分的神経結紮
部分的神経結紮は、マウスにおいてChessell et al.２９およびWebsteret al.２３に記載されているように行った。手短に述べると、雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＵＫ）において大腿中央レベルに切開を入れることによって鈍的解離により左坐骨神経を露出させた。次いで、縫合糸（９／０  Ｖｉｒｇｉｎ  Ｓｉｌｋ：Ｅｔｈｉｃｏｎ）を神経の背側３分の１に通し、固く結んだ。マウスを、試験の開始前に少なくとも７日間放置して回復させた。偽手術施行マウスに同じプロトコールを施したが、神経の露出後にマウスを放置して回復させた。外科手術後７日目および１０日目に、マウスをベースライン応答について試験した。８０％より高い同側／対側比を示した手術施行マウスを、非応答マウスとして分類し、研究から除去した。次いで、残りのマウスを、１群当たりマウス８〜１０匹のほぼ等しい同側／対側比を有する処置群に無作為に割り振り、その後、マウスを被験化合物で処置した。別個の動物を各研究に使用した。全ての手順は、Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６に従って行い、地元の倫理委員会により承認された。ベースライン読み取りデータの確立後、以前に記載されたSeltzeret al.の方法３０に基づいて、マウスを、坐骨神経を部分的に結紮する外科手術受けた、または偽手術施行対照としての役割を果たした、ほぼ等しい同側／対側比を有する２つの群に分けた。ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ融合体の効果を調査するために、ＰＢＳビヒクル（１０ｍｌ／ｋｇ体重  ｓ．ｃ．）またはＭＴｆ−ｈＦｃ−ＩＬ−１ＲＡ（１３５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）、ＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ融合タンパク質（２５〜１００ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）もしくはＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ（１００ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ）のうちの１つを動物に施した。偽手術施行マウスには、ＰＢＳビヒクル（１０ｍｌ／ｋｇ体重  ｓ．ｃ．）を施した。上記のような投薬の４時間後に、機械的痛覚過敏の変化についてマウスを再試験した。投薬後１、２および４日の時点でもマウスを再試験した。
【０３３１】
データ解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで行った。研究を完了した動物のみを解析に含めた。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して結果を解析した。必要に応じて、テューキー検定を使用してペアワイズ比較を行った。
【０３３２】
図１：
研究した異なる分子の略図。
Ａでは、単独の、ならびにフレキシブルリンカーまたは化学的コンジュゲーションを伴う遺伝子融合としてＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐが組み込まれた、ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１ＴＭを含む構築物。
【０３３３】
Ｂでは、鎮痛効果がある治療用分子ＩＬ−１ＲＡ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）を含有する、および遺伝子融合後にＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐがフレキシブルリンカーとともに組み込まれた、ＮＩＰ２２８ｈＩｇＧＴＭ抗体または抗体のＦｃ断片を含む構築物。
【０３３４】
図２：
ＣＤ−１雌マウスにおけるＩＶ投与の２時間後のｍＡｂ  ＮＩＰ２２８  ａｎ  ｈＩｇＧ１ＴＭに基づく異なる構築物の脳内分布の代表的３Ｄ共焦点画像。
細胞核は、青色（ＤＡＰＩ）であり、毛細血管は、緑色（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）である。（Ａ）は、Ａｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＮＩＰ２２８（赤色）の分布を表し；（Ｂ）は、Ａｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＮＩＰ２２８に化学的にコンジュゲートされたＭＴｆ（赤色）の分布を表し；（Ｃ）は、Ａｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＮＩＰ２２８に化学的にコンジュゲートされたＭＴｆｐｅｐ（赤色）の分布を表し；（Ｄ）は、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識毛細血管（緑色）、およびＡｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＮＩＰ２２８に化学的にコンジュゲートされたＭＴｆｐｅｐ（赤色）が、表面拡大によりレンダリングされた（定量化された）ことを示す。これらの３Ｄ画像は、ＮＩＰ２２８単独と比較して、完全長ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐが組み込まれた標識されたＮＩＰ２２８のほうが、脳実質内分布がはるかに高度であることを実証する。定量的手順の詳細については方法セクションを参照されたい。スケールバーは、２０μｍを表す。
【０３３５】
図３：
脳実質内の異なる分子の分布についての共焦点蛍光顕微鏡分析および半定量化。
ＩＶ注射後２時間の時点で、脳内のＭＴｆ−ｍＡｂまたはＭＴｆｐｅｐ−ｍＡｂの９５％より多くが、毛細血管ではなく実質に見られる。データは、ＭＴｆ完全長タンパク質またはＭＴｆｐｅｐを含有する分子が、Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスにおいて脳毛細血管内皮を越えて脳実質に非常に効率的に輸送されることを明確に示す。データを平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。
【０３３６】
図４：
マウスＰＫアッセイにおけるＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ標的化ＩｇＧの血漿および脳曝露。
（Ａ）非標的化アイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）と２週間にわたって比較した、ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ標的化ｈＩｇＧ１ＴＭの血漿中ＰＫ。（Ｂ）脳１グラム当たりの注射用量の％の尺度としての脳曝露。（Ｃ）脳：血漿比の比較。全ての分子を同じモル濃度で投薬した。１群当たりＮ＝６。ＰＫ、薬物動態。示されている各測定時点についてＳ．Ｅ．Ｍを得た。
【０３３７】
図５：
マウスＰＫアッセイにおけるＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ標的化ＩｇＧ−ＩＬ−１ＲＡ融合分子の血漿および脳曝露。
（Ａ）非標的化アイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）と２週間にわたって比較した、ＩＬ−１ＲＡに融合したＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ標的化ｈＩｇＧの血漿中ＰＫ。（Ｂ）脳１グラム当たりの注射用量の％の尺度としての脳曝露。全ての分子を同じモル濃度で投薬した。１群当たりＮ＝６。ＰＫ、薬物動態；ＩＬ−１ＲＡ、インターロイキン１受容体アンタゴニスト。
【０３３８】
図６：
マウス部分的神経結紮モデルに対するＭＴｆ−ＩＬ−１ＲＡ融合体の鎮痛効果：
（Ａ）ＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐを含有するＩＬ−１ＲＡ融合構築物とアイソタイプ対照（ＮＩＰ２２８）、ビヒクル対照および非結紮（偽手術施行）対照群との鎮痛効果の比較。１群当たりＮ＝８。時間および処置を従属因子として用いて二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを解析した。その後、テューキー事後検定を使用して統計的有意性を得た。＋＋  Ｐ＜０．０１；＋＋＋  Ｐ＜０．００１  −  Ｏｐ＋ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ対Ｏｐ＋ＭＴｆ−Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡ  １３５ｍｇ／ｋｇ；＊＊＊  Ｐ＜０．００１  −  Ｏｐ＋ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ対Ｏｐ＋ＭＴｆｐｅｐ−ＮＨ−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ  １００ｍｇ／ｋｇ；＠＠＠Ｐ＜０．００１  −  Ｏｐ＋ＮＩＰ２２８対Ｏｐ＋ＭＴｆｐｅｐ−ＡＤＣ−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ  １００ｍｇ／ｋｇ。（Ｂ）部分的神経結紮誘発機械的痛覚過敏の逆転に対するＭＴｆｐｅｐ標的化ＮＩＰ２２８  ｈＩｇＧ１ＴＭ−ＩＬ−１ＲＡ融合体の用量応答。１群当たりＮ＝７〜１０。時間および処置を従属因子として用いて二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを解析した。その後、テューキー事後検定を使用して統計的有意性を得た。＊  Ｐ＜０．０５；＊＊  Ｐ＜０．０１  −  ＮＩＰ２２８対ＭＴｆｐｅｐ  ５０ｍｇ／ｋｇ；＋＋＋  Ｐ＜０．００１  −  ＮＩＰ２２８対ＭＴｆｐｅｐ  １００ｍｇ／ｋｇ
【０３３９】
図７
配列番号２のペプチドのアミノ酸配列の配列差、およびＢＢＢを越えるペプチドの輸送。
図７Ａは、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）およびＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号３）のペプチドのアミノ酸配列の配列差を示す。図７Ｂは、ＢＢＢを越えるペプチドの輸送の比較を示す。実に驚くべきことに、２つのアミノ酸、ＨＡ→ＹＳの置換は、本発明のペプチド断片、ｘＢ３のＢＢＢを横断する能力に観察可能な影響を与えなかった。
【０３４０】
結果
ＭＴｆ  ＢＢＢ輸送ペプチド
最も効率的にトランスサイトーシスされたペプチド、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（ＭＴｆｐｅｐまたはｘＢ３）を、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＢＢ輸送を調査するための候補として以前に選択した。ＭＴｆｐｅｐは、完全長ＭＴｆのアミノ酸４６０〜４７１の間に位置する１２アミノ酸ペプチドである。このペプチドは、ＭＴｆに特有であり、Ｔｆ、ラクトトランスフェリンおよびオボトランスフェリンなどの、他のＴｆファミリーメンバーには存在しない。ＭＴｆｐｅｐ配列は、齧歯動物種とヒトとの間でアミノ酸が２個異なり、４位および５位のヒスチジンおよびアラニンが齧歯動物種ではそれぞれチロシンおよびセリンに置換されている。齧歯動物とヒト種との間のこのアミノ酸２個の差異は、脳毛細血管内皮を横断するＭＴｆｐｅｐの能力に対しても、脳にペイロードを輸送する能力およびその後の有効性にも、影響を与えない（データ図示せず）。
【０３４１】
蛍光標識ＮＩＰ２２８に化学的にコンジュゲートされたＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐのｉｎ  ｖｉｖｏ脳内分布研究
ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでＢＢＢを越える抗体の送達を実証するために、野生型マウスに静脈内注射によって対照ｍＡｂ  ＮＩＰ２２８−ＡＦ６４７（図２Ａ）、ＭＴｆ−ＮＩＰ２２８−ＡＦ６４７（図２Ｂ）またはＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８−ＡＦ６４７（図２Ｃ）のコンジュゲートを注射した。注射後２時間後に、マウスを屠殺し、ＰＢＳ灌流し、３Ｄ共焦点蛍光顕微鏡観察を使用して脳への浸透を評価し、半定量化した。ＭＴｆ−ＮＩＰ２２８−ＡＦ６４７コンジュゲートとＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８−ＡＦ６４７コンジュゲートの両方について、ＮＩＰ２２８−ＡＦ６４７単独と比較しておよそ２倍大きい分率の蛍光が、脳実質において測定された（図３）。ＭＴｆ−ｍＡｂコンジュゲートとＭＴｆｐｅｐ−ｍＡｂコンジュゲートの両方について、全ＡＦ６４７蛍光シグナルの９５％より多くが脳実質に局在し、残りは、脳毛細血管に局在した。解析および実験のこの第１ステップは、ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐの組み込みが、脳毛細血管内皮を経由する脳実質へのｍＡｂの輸送を増加させることを実証した。
【０３４２】
ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐの組み込み後の融合体およびコンジュゲート化抗体の薬物動態（ＰＫ）特性
保有されるＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐが脳標的化を向上させることを確認するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて血漿中ＰＫおよび脳曝露研究を行った。これらの研究を、２週間、その２週間を通して定期的に血漿試料（０．０８、２、４、６、８、２４、４８、９６、１２０、１６８、２４０および３３６時間）および毛細血管除去脳ホモジネート試料（２、６、２４、９６、１６８および３３６時間）を採取して行った。この研究における逐次サンプリング手順によって、試験した分子の各々についての単回静脈内投薬後に血漿曝露についての複合プロファイルを得た。全ての分子を同じモル等量で投薬した（ＮＩＰ２２８、ＭＴｆｐｅｐ−ＮＨ−ＮＩＰ２２８、ＭＴｆｐｅｐ−ＡＤＣ−ＮＩＰ２２８を２０ｍｇ／ｋｇで投薬したが、ＮＩＰ２２８−ＭＴｆは、ＭＴｆのより高い分子量を補償するために４０ｍｇ／ｋｇで投薬した）。全てのパラメーターは、各データ点の平均値を使用して導出した。図４Ａは、静脈内投薬後の最初の時点（１０分）でＴｍａｘに到達した、平均血漿曝露プロファイル（ｎＭ＋／−平均偏差）を示す。アイソタイプ対照およびＭＴｆｐｅｐ構築物の血漿中ＰＫプロファイルには殆ど差がなく、ＭＴｆｐｅｐ−ＡＤＣ−ＮＩＰ２２８は、８および５（ｍｌ／日／ｋｇ）のクリアランス値をそれぞれ有する、アイソタイプ対照、およびＮＩＰ２２８に遺伝子融合したＭＴｆｐｅｐと比較して、１４．１（ｍｌ／日／ｋｇ）という若干速いクリアランス値を有する。しかし、ＮＩＰ２２８−ＭＴｆは、血漿中ＰＫプロファイルの有意な変化を有し、７４（ｍｌ／日／ｋｇ）というよりいっそう速いクリアランス速度を有し、その結果、ＮＩＰ２２８単独対照（１３．８日）と比較すると、５．５日という有意に短い半減期および３分の１の曲線下面積（ＡＵＣ）になる（補足資料の表１）。
【０３４３】
ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐの組み込み後の遺伝子融合したおよび化学的にコンジュゲートされた抗体についての脳曝露
脳ホモジネート中の被験分子の各々についての測定を行って、中枢曝露を決定した。静脈内投与後２、６、２４、９６、１６８および３３６時間の時点でＰＢＳ灌流動物から脳試料を採取し、ＭＳＤアッセイによる分析のために処理して均質化した（図４Ｂ）。ＮＩＰ２８８  ｍＡｂとコンジュゲート化ＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８  ｍＡｂの両方について、Ｔｍａｘは、投与後２４時間の時点に存在したが、ＮＩＰ２２８−ＭＴｆコンジュゲート化ｍＡｂは、投与の２時間後にＴｍａｘに到達した。しかし、ＮＩＰ２２８−ＭＴｆについてのこの時点での試料間には大きな差異があった。ＮＩＰ２２８−ＭＴｆは、１６８時間後にアッセイの定量レベル未満であった。ＮＩＰ２２８は、投与の４日後にＴｍａｘに達した（図４Ｂ）。ＮＩＰ２２８にコンジュゲートされたＭＴｆｐｅｐは、ＮＩＰ２２８−ＭＴｆおよびＮＩＰ２２８単独と比較すると、有意に延長された脳曝露を有し（図４Ｂ）、２４時間時点で注射用量の約４％のピーク曝露となった。ＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８コンジュゲート化ｍＡｂとＮＩＰ２２８−ＭＴｆコンジュゲート化ｍＡｂの両方について、投与後１６８時間の時点でＮＩＰ２２８  ｍＡｂ単独についての０．５％のピークと比較して１．５〜３％の間のピークに達する、有意に高い脳−血漿比も存在した（図４Ｃ）。
【０３４４】
ＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ  ＩＬ−１ＲＡ融合タンパク質についての薬物動態（ＰＫ）特性
Ｃ末端ＩＬ−１ＲＡ融合を含むＭＴｆｐｅｐおよびＭＴｆタンパク質を用いて２週間にわたって末梢ＰＫ解析を行った。ＭＴｆｐｅｐをフレキシブルリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）×２でＮＩＰ２２８の重鎖のＮ末端に遺伝子的にコンジュゲートさせ、ＩＬ−１ＲＡをＮＩＰ２２８の重鎖のＣ末端に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）×３リンカーでコンジュゲートさせた。しかし、ＭＴｆタンパク質は、ＦｃドメインのＮ末端に遺伝子的にコンジュゲートさせ、上記の通りにＣ末端ＩＬ−１ＲＡ融合を行った（図１Ｂ）。
【０３４５】
血漿試料を２週間を通して定期的に採取し、上記の通りに処理した。ＮＩＰ２２８およびＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ融合体は、ＩＬ−１ＲＡが存在しないｍＡｂの血漿曝露と比較したとき５〜１０倍増加した分布相（Ｖｚ）およびクリアランス（ＣＬ）の９〜１５倍増加（図４Ａおよび表１補足資料）に起因して、ＡＵＣ（ｌａｓｔ）により測定して血漿曝露のそれぞれ４．５分の１および７．２分の１への低減を実証した（表５Ａおよび表２補足資料）。ＭＴｆ−Ｆｃ−ＩＬ−１ＲＡ  ＡＵＣ（ｌａｓｔ）は、ＮＩＰ２２８−ＭＴｆについて観察された低減と比較して２．３分の１に低減された；（図５Ａならびに表１および２補足資料）、これは、全てのＩＬ−１ＲＡコンジュゲート化ｍＡｂについてのより高いクリアランス速度（ＣＬ）に起因すると思われる（表２補足資料）。全ての構築物についてのＣｍａｘは、投与の１０分後である最初の測定時点に存在した。
【０３４６】
ＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐ  ＩＬ−１ＲＡ融合タンパク質についての脳曝露
ＩＬ−１ＲＡ融合体の脳曝露を上記の通りに測定し、複合曝露プロファイルを生成した（図５Ｂ）。試験した各分子についてのＴｍａｘは（２時間）での最初の測定時点であり、これは、それぞれ２４時間および９６時間であった、ＩＬ−１ＲＡのないＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８およびＮＩＰ２２８構築物について観察されたものより、多少早い（図４Ｂ）。ＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡおよびＭＴｆ−ｈＦｃ−ＩＬ−１ＲＡの脳曝露は、最初の時点では脳１グラム当たり注射用量の２．２％という最大曝露と非常に類似していた。ＭＴｆ−ｈＦｃ−ＩＬ−１ＲＡが脳内で検出可能であったのは研究の最初の１週間のみであり、その後はアッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）未満であった（図５Ｂ）。ＭＴｆｐｅｐおよびＭＴｆ  ＩＬ−１ＲＡ融合タンパク質のより少ない中枢曝露は、ＩＬ−１ＲＡを欠いているＭＴｆ融合体と比較してＩＬ−１ＲＡ融合体についてのより速い末梢クリアランス速度（ＣＬ）に起因すると思われた。
【０３４７】
ＢＢＢ遊出ＭＴｆ−ＩＬ−１ＲＡ融合体による機械的痛覚過敏の逆転
Seltzer et al.３０によって最初に記載され、Chessellet al.２９によってマウスに適応されたような、実験動物での坐骨神経の部分的結紮により、神経障害性疼痛を誘発することができる。このモデルで発症する機械的痛覚過敏は、ＩＬ−１ＲＡの中枢投与に対して感受性であることが示されている２３。
【０３４８】
ｍＡｂ−ＩＬ−１ＲＡ融合体が機械的痛覚過敏を逆転することができるかどうかを試験するためにＭＴｆ−ｈＦｃ−ＩＬ−１ＲＡまたはＭＴｆｐｅｐ（ＮＨもしくはＡＤＣ）−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡをそれぞれ１３５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇでｓ．ｃ．投与（等モル投薬）し、投薬後４日間、マウスをモニターした。ビヒクル、ＰＢＳおよび対照ｍＡｂ−ＩＬ−１ＲＡ（ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ）処置マウスの間で効果の差が認められなかった。これは、ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡが中枢コンパートメントにおいてＩＬ−１受容体に近づくことができなかったことを示す（図６Ａ）。ＭＴｆ−ｈＦｃ−ＩＬ−１ＲＡおよびＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡ融合体の投与は、投薬後４時間〜２日の時点で機械的痛覚過敏の逆転をもたらした。ＭＴｆｐｅｐ（ＡＤＣ）−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡだけは、投薬後４日の時点で逆転を達成した。応答の大きさは、試験したＭＴｆ−ｈＦｃ−ＩＬ−１ＲＡ融合体とＭＴｆｐｅｐ−ＩＬ−１ＲＡ融合体の両方について非常に類似していた（図６Ａ）。
【０３４９】
用量と機械的痛覚過敏の逆転との関係を調査するために、本発明者らは、ＭＴｆｐｅｐ−ＮＨ−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡを用量２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇで投与した。異なる用量レベルは、継続期間ではなく応答の大きさの差を実証した。ＭＴｆｐｅｐ−ＮＨ−ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡの５０および１００ｍｇ／ｋｇ投薬は、テューキー事後検定を使用して解析したときＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡと比較して統計的に有意な鎮痛効果を生じさせた（図６Ｂ）。
【表１−２】
2021518392.tif 000004
【表２】
2021518392.tif 000005
【０３５０】
終末相消失半減期（ｔ１／２）は、全ての投薬コホートについての濃度が測定可能であった最後の３つのサンプリング時点を少なくとも含む濃度データの回帰を使用して算出した：
ｔ１／２＝ｌｎ（２）／λｚ
（式中、λｚは、終末対数線形減衰相の線形回帰によって推定した一次終末速度定数（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）であった）。
【０３５１】
ＩＶ投与後の血漿クリアランス（ＣＬ）を、
ＣＬ＝用量／ＡＵＣｉｎｆ
として推定し、式中の無限大に外挿されたＡＵＣ（ＡＵＣｉｎｆ）は、台形方法により算出した。ＩＶ投与後の分布体積（Ｖｚ）を、
Ｖｚ＝用量／λｚ  ＡＵＣｉｎｆ  ＩＶ
として推定した。
【０３５２】
投与後の定常状態分布体積（Ｖｓｓ）を、
Ｖｓｓ＝ＭＲＴ×ＣＬ
として推定した。
【０３５３】
考察
これらの実施例は、メラノトランスフェリン（ＭＴｆ）とＭＴｆに由来する１２アミノ酸ペプチド（ＭＴｆｐｅｐ）の両方が、化学的コンジュゲーションまたは遺伝子融合により対照抗体（ＮＩＰ２２８）の配列に組み込まれたとき、脳毛細血管内皮を越える抗体の輸送を誘導して、脳実質中で治療濃度に達することができることを実証する。複数の技術を使用して、ＭＴｆまたはＭＴｆペプチドで改変された抗体の脳への浸透を確認した。共焦点蛍光顕微鏡観察を使用して、脳実質中の、蛍光マーカー、Ａｌｅｘａ  Ｆ６４７で標識されたＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐにコンジュゲートされた抗体を可視化することが可能であった。マウスにおけるｉ．ｖ．投与後、ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐ融合体は、コンジュゲート化されていない抗体と比較して有意に増加した脳内分布を示し、全蛍光の９５％が脳実質に局在した（図２および３）。この観察を、ｉ．ｖ．投薬した動物からの脳ホモジネート中のＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐが組み込まれた抗体の濃度を解析することにより確認した（図４Ｂおよび４Ｃ）。この研究では、ＭＴｆを抗体重鎖のＣ末端に遺伝子融合させ、ＭＴｆｐｅｐを、抗体に、抗体重鎖のＮ末端への遺伝子融合により、または抗体のＦｃドメインに導入された不対システインのチオール基への化学的コンジュゲーションにより、結合させた。分析した異なる分子の設計を図１に示す。ｉ．ｖ．投与後の異なる分子の脳曝露を、動物の広範なＰＢＳ灌流、続いての脳均質化の後、決定した。ホモジネートを毛細血管から取り切って、脳実質に存在する分子の量をより正確に決定した。ＭＴｆｐｅｐを含有する分子は、ＭＴｆ含有分子または抗体単独のどちらかと比較したとき有意に延長された脳曝露を有する（図４Ｂ）。２４時間の時点で注射用量の約４％および２週間にわたって注射用量の３〜４％の間というピーク曝露が観察された。これは、ＮＩＰ２２８対照抗体単独と比較してＭＴｆｐｅｐ−またはＭＴｆ−ＮＩＰ２２８コンジュゲート化または融合タンパク質両方の脳−血漿比にも反映された（図４Ｃ）。脳−血漿比は、投与後１６８時間の時点でＮＩＰ２２８  ｍＡｂについての０．５％ピーク比と比較して、ＭＴｆｐｅｐまたはＭＴｆ含有タンパク質については約１．５〜３％でピークに達する（図４Ｃ）。この研究は、これらの抗体の血漿中ＰＫプロファイルも調査した（図４Ａ）。抗体の重鎖上のＭＴｆｐｅｐの存在は、３分の１の末梢半減期を示す、ＭＴｆタンパク質を含有するｍＡｂとは対照的に、その血漿中ＰＫに影響を与えない（表１補足資料）。これは、ＭＴｆタンパク質に起因するこの構築物のより高度な組織内分布に起因する可能性が最も高い。
【０３５４】
ＣＮＳに分子を送達するＭＴｆおよびＭＴｆｐｅｐの見かけの能力をさらに検証するために、神経障害性疼痛のマウスモデルで薬力学研究を行った。ＩＬ−１ＲＡへの融合は、部分的坐骨神経結紮後の機械的過敏症の軽減による痛覚脱失の測定を可能にした２３。ＩＬ−１ＲＡの付加は、これらの分子のＰＫを有意に変化させ、その結果、ＩＬ−１ＲＡを欠いている同等の分子と比較して血漿曝露が低減された（図５Ａおよび表２補足資料）。これは、はるかに増加された分布相（Ｖｚ）と、ＩＬ−１受容体媒介クリアランスに恐らく起因するクリアランス（ＣＬ）の増加とに起因した（図４Ａおよび表１補足資料）。ＩＬ−１ＲＡ融合体の脳曝露も変化した（図５Ｂ）。曝露のピークが２時間の時点で見られ、これは、ＩＬ−１ＲＡのないＭＴｆｐｅｐ−ＮＩＰ２２８およびＮＩＰ２２８構築物について観察されたものよりはるかに早い（図４Ｂ）。脳曝露は、類似しており、最初の時点では脳抽出物１ｇ当たり２．２％注射用量であった。ＭＴｆｐｅｐおよびＭＴｆ  ＩＬ−１ＲＡタンパク質のより低い中枢曝露は、より速い末梢クリアランスに起因する可能性が高かった。神経障害性疼痛モデルでは、ＩＬ−１ＲＡ、ＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐのいずれかを欠いている対照抗体（ＮＩＰ２８８）は、痛覚脱失を誘導しなかった（図６Ａ）。ＩＬ−１ＲＡおよびＭＴｆまたはＭＴｆｐｅｐのどちらかを両方含有する融合体は、投薬後４時間〜２日の時点で機械的痛覚過敏の逆転をもたらした。ＮＩＰ２２８−ＩＬ−１ＲＡに化学的にコンジュゲートされたＭＴｆｐｅｐだけは、投薬後４日の時点で逆転があった。応答の大きさは、試験した全てのＭＴｆ−ＩＬ−１ＲＡ融合体について非常に類似していた（図６Ａ）。痛覚過敏の逆転が、効果が１日続いたＩＬ−１ＲＡを直接髄腔内注射した場合より１日長い、２〜４日の長さであったことに、注目することが重要である２３。この効果は、用量依存性であることも判明した（図６Ｂ）。加えて、本発明者らは、ＭＴｆに由来する１２アミノ酸の本発明者らのペプチドが、ＣＮＳ内に鎮痛化合物（ＩＬ−１ＲＡ）を送達することになり、抗体によりトランスフェリン受容体を標的化する構築物２３より良好な血漿中および脳内薬物動態特性を示すことを、本明細書で示す。痛覚脱失を達成するために必要な用量は高いが、より強い鎮痛薬の非存在下で、ＩＬ−１ＲＡは、この研究によるＢＢＢ透過および薬理学的効果の実証を可能にした。より効果的な分子にＢＢＢ技術を適用する、これらの発見を足場とするさらなる研究は、神経障害性疼痛に対する処置を見出すための探求を助けることになる。
【０３５５】
上記実施例で述べた参考文献の引用情報は、以下の通りである：
【化１】
2021518392.tif 000006
【０３５６】
本願を通して、様々な公表文献に、著者名および日付により、または特許番号もしくは特許公開番号により言及している。これらの公表文献の開示は、本明細書において説明され、特許請求の範囲に記載される本発明の日付の時点で当業者に公知であるような従来技術をより十分に説明するために、これによりそれら全体が参照により本願に組み込まれる。しかし、本明細書における参考文献の引用を、そのような参考文献が本発明の先行技術であるということの承認と見なすべきではない。
【０３５７】
当業者は、通例と同程度の実験を使用して、本明細書に記載の特定の手順の非常に多くの均等物を認識することまたは突き止めることができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であると見なされ、以下の特許請求の範囲に包含される。例えば、グルタメートモジュレート剤と免疫治療剤とを使用する併用療法を利用して、本明細書および本明細書中の実施例で開示した特定のがん以外のがんを処置することができることが、本発明に従って意図される。さらに、本明細書および本明細書中の実施例で開示したもの以外の、グルタメートモジュレート剤および免疫治療剤を利用することができる。さらに、項目のリスト中の特定の項目、または項目のより大きい群の中の項目のサブセット群を、他の特定の項目、項目のサブセット群、または項目のより大きい群と、そのような組合せを特定する具体的な開示が本明細書中にあるか否かを問わず、組み合わせることができることが、意図される。例えば、がん処置の分野では、本発明のＣＤ３結合部分は、本明細書に記載のタイプのリンカーを用いてまたは用いずに、他のタイプの抗体、例えばポリクローナル抗体、抗体断片、ペプチド、タンパク質、小分子、アジュバント、サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、二重特異性分子および細胞治療剤を含む、免疫標的化抗がん剤に結合し得る。
【図１】
2021518392.tif 000007
【図２】
2021518392.tif 000008
【図３】
2021518392.tif 000009
【図４Ａ】
2021518392.tif 000010
【図４Ｂ】
2021518392.tif 000011
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2021518392.tif 000013
【図５Ｂ】
2021518392.tif 000014
【図６Ａ】
2021518392.tif 000015
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2021518392.tif 000017
【図７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月19日(2020.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の脳内における第１の疾患を、前記被験体の血液脳関門を越えて治療用ペイロードを送達することによって処置するための、前記治療用ペイロードを含む組成物であって、前記治療用ペイロードが、（ｉ）ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含み、（ｉｉ）カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７６％を上回るＡＵＣｌａｓｔをもたらす、組成物。
【請求項２】
前記治療用ペイロードが、カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７７％〜１５０％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記治療用ペイロードが、カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約８０％〜１２５％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記被験体の前記脳内以外の第２の疾患を処置するためにさらに使用される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
頭蓋内以外で前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
経口、静脈内、筋肉内、皮下、注射、または注入によって投与されることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１の疾患および前記第２の疾患が、同じである、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１の疾患および前記第２の疾患が、異なる、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の疾患が、がん、リソソーム蓄積症、自己免疫障害、神経変性障害、疼痛、炎症および炎症性状態からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第２の疾患が、がん、リソソーム蓄積症、自己免疫障害、神経変性障害、疼痛、炎症および炎症性状態からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の疾患および前記第２の疾患が、がん、リソソーム蓄積症、自己免疫障害、神経変性障害、疼痛、炎症および炎症性状態からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１の疾患が、前記被験体の前記脳内における腫瘍または異常の形態を呈する、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２の疾患が、前記被験体の、前記脳内以外の身体または血液における腫瘍または異常の形態を呈する、請求項４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５７】
当業者は、通例と同程度の実験を使用して、本明細書に記載の特定の手順の非常に多くの均等物を認識することまたは突き止めることができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であると見なされ、以下の特許請求の範囲に包含される。例えば、グルタメートモジュレート剤と免疫治療剤とを使用する併用療法を利用して、本明細書および本明細書中の実施例で開示した特定のがん以外のがんを処置することができることが、本発明に従って意図される。さらに、本明細書および本明細書中の実施例で開示したもの以外の、グルタメートモジュレート剤および免疫治療剤を利用することができる。さらに、項目のリスト中の特定の項目、または項目のより大きい群の中の項目のサブセット群を、他の特定の項目、項目のサブセット群、または項目のより大きい群と、そのような組合せを特定する具体的な開示が本明細書中にあるか否かを問わず、組み合わせることができることが、意図される。例えば、がん処置の分野では、本発明のＣＤ３結合部分は、本明細書に記載のタイプのリンカーを用いてまたは用いずに、他のタイプの抗体、例えばポリクローナル抗体、抗体断片、ペプチド、タンパク質、小分子、アジュバント、サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、二重特異性分子および細胞治療剤を含む、免疫標的化抗がん剤に結合し得る。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
被験体の脳内における第１の疾患を、前記被験体の血液脳関門を越えて治療用ペイロードを送達することによって処置する方法であって、前記被験体に、前記治療用ペイロードを投与するステップを含み、前記治療用ペイロードが、（ｉ）ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むｐ９７断片にカップリングされた活性剤を含み、（ｉｉ）カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７６％を上回るＡＵＣｌａｓｔをもたらす、方法。
（項目２）
前記治療用ペイロードが、カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約７７％〜１５０％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記治療用ペイロードが、カップリングされていない形態の前記活性剤のＡＵＣｌａｓｔ（日．μｇ／ｍＬ）の約８０％〜１２５％のＡＵＣｌａｓｔをもたらす、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記被験体の前記脳内以外の第２の疾患を処置するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記治療用ペイロードが、頭蓋内以外で前記被験体に投与される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記治療用ペイロードが、経口、静脈内、筋肉内、皮下、注射、または注入によって投与される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第１の疾患および前記第２の疾患が、同じである、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記第１の疾患および前記第２の疾患が、異なる、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記第１の疾患が、前記被験体の前記脳内における腫瘍または異常の形態を呈する、項目４に記載の方法。
（項目１０）
前記第２の疾患が、前記被験体の、前記脳内以外の身体または血液における腫瘍または異常の形態を呈する、項目４に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021518392000001.app
【国際調査報告】
2021518392.tif 000019
2021518392.tif 000020