(57)【要約】フソソーム組成物および方法が、本明細書に記載される。本開示は、膜タンパク質を標的細胞に送達するためのフソソームおよびそれらの使用に関する技術を提供する。一部の実施形態では、フソソームは、脂質二重層と、脂質二重層によって包まれている内腔と、フソゲンと、膜タンパク質ペイロード剤を含むカーゴとを含む。一部の実施形態では、そのようなカーゴは、膜タンパク質自体であり得るか、またはそれを含み得、一部の実施形態では、そのようなカーゴは、膜タンパク質をコードする（またはそれをコードする核酸に相補的である）核酸であり得るか、またはそれを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）前記脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）前記供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、前記脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤（例えば、前記供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている）であって、
ｉ）キメラ抗原受容体、
ｉｉ）例えば、表５から選択される、インテグリン膜タンパク質ペイロード、
ｉｉｉ）表６から選択される、イオンチャネルタンパク質、
ｉｖ）例えば、表７および８から選択される、細孔形成タンパク質、
ｖ）例えば、表９から選択される、Ｔｏｌｌ様受容体、
ｖｉ）例えば、表１０から選択される、インターロイキン受容体ペイロード、
ｖｉｉ）表１１〜１２から選択される、細胞接着性タンパク質、
ｖｉｉｉ）表１５から選択される、輸送タンパク質、
ｉｘ）天然に存在する膜タンパク質に対して異種である、シグナル配列、または
ｘ）表４に列挙されている、シグナル配列
のうちの１つまたは複数を含むかまたはそれをコードする、膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、ヌクレオキャプシドタンパク質もウイルスマトリックスタンパク質も含まない、フソソーム。
【請求項２】
前記供給源細胞が、初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞系（例えば、骨髄芽球細胞系、例えば、Ｃ２Ｃ１２）である、請求項１に記載のフソソーム。
【請求項３】
前記供給源細胞が、内皮細胞、線維芽細胞、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、例えば、対象の細胞に由来する人工多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児皮膚、青年皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織に由来する幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆体細胞（例えば、網膜前駆体細胞、骨髄芽球、骨髄系前駆体細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆体細胞、正赤芽球、もしくは血液芽細胞）、始原細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射神経膠細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ−１、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＩＭＲ  ９０、ＩＭＲ  ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ−１０８０、もしくはＢＪ細胞）である、請求項１または２に記載のフソソーム。
【請求項４】
前記供給源細胞が、同種であり、例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られる、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項５】
前記供給源細胞が、自家であり、例えば、前記標的細胞と同じ生物から得られる、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項６】
前記供給源細胞が、白血球または幹細胞から選択される、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項７】
前記供給源細胞が、好中球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、マクロファージ、顆粒球、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項８】
前記フソソームが、改変されたゲノムを有する、例えば、低減された免疫原性を有する（例えば、ＭＨＣ複合体を除去するようにゲノム編集することによって）供給源細胞に由来する、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項９】
前記フソソームが、例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合に、前記供給源細胞の径の約０．０１％または１％よりも小さい径を有する、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１０】
前記フソゲンが、哺乳動物フソゲンまたはウイルスフソゲンである、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１１】
前記フソゲンが、６〜８のｐＨにおいて活性である、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１２】
前記フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、少なくとも１，０００コピーのコピー数で、膜タンパク質ペイロード剤を含む、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１３】
ｉ）前記フソソームが、医薬品もしくは適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｉｉ）前記フソソームが、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｉｉｉ）前記フソソームが、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、または
ｉｖ）前記フソソームが、所定の参照値を下回る混入物質レベルを有し、例えば、混入物質を実質的に含まない、
先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１４】
前記膜タンパク質ペイロード剤が、前記フソソーム脂質二重層内に配置された膜タンパク質である、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１５】
前記膜タンパク質ペイロード剤が、前記フソソーム内腔に配置された膜タンパク質をコードする核酸である、請求項１から１３のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１６】
前記膜タンパク質ペイロード剤が、抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であるかまたはそれを含む、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１７】
前記標的細胞が、生物内にある、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１８】
前記標的細胞が、生物から単離された初代細胞である、請求項１から１６のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１９】
前記標的細胞が、内皮細胞、線維芽細胞、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、例えば、対象の細胞に由来する人工多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児皮膚、青年皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織に由来する幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆体細胞（例えば、網膜前駆体細胞、骨髄芽球、骨髄系前駆体細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆体細胞、正赤芽球、もしくは血液芽細胞）、始原細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射神経膠細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ−１、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＩＭＲ  ９０、ＩＭＲ  ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ−１０８０、もしくはＢＪ細胞）から選択される、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項２０】
前記標的細胞が、好中球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、マクロファージ、顆粒球、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項２１】
前記フソソームが、前記フソソームを標的細胞に局在化させる標的化ドメインを含む、先行する請求項のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項２２】
前記標的化ドメインが、前記標的細胞上の標的細胞部分と相互作用する、請求項２１に記載のフソソーム。
【請求項２３】
フソソーム組成物を製造する方法であって、
ｉ）請求項１から２２のいずれかに記載の複数のフソソームを得るステップと、
ｉｉ）前記複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を、例えば、対象への投与に好適なフソソーム薬物製品として、製剤化するステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
前記フソソームが、改変されたゲノムを有する、例えば、低減された免疫原性を有する（例えば、ＭＨＣ複合体を除去するようにゲノム編集することによって）哺乳動物細胞に由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
フソソーム薬物製品組成物を製造する方法であって、
ａ）請求項１から２２のいずれかに記載の複数のフソソームを得る、例えば、産生するステップと、
ｂ）前記複数のフソソームからの１つまたは複数のフソソームをアッセイして、以下の因子：
ｉ）免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるもの、
ｉｉ）病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
ｉｉｉ）混入物質
のうちの１つまたは複数の存在またはレベルを判定するステップと、
ｃ）（必要に応じて）前記因子のうちの１つまたは複数が参照値を下回る場合に、前記複数のフソソームまたはフソソーム組成物の出荷を承認するステップと
を含み、それによって、フソソーム薬物製品組成物を製造する、方法。
【請求項２６】
フソソーム組成物を、対象、例えば、ヒト対象に投与する方法であって、前記対象に、請求項１から２２のいずれかに記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物を投与するステップを含み、それによって、前記フソソーム組成物を前記対象に投与する、方法。
【請求項２７】
タンパク質膜ペイロードを、対象に送達する方法であって、前記対象に、請求項１から２２のいずれかに記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物を投与するステップを含み、前記フソソーム組成物が、前記タンパク質膜ペイロードが送達されるような量および／または時間で投与される、方法。
【請求項２８】
患者における疾患または障害を処置する方法であって、前記対象に、請求項１から２２のいずれかに記載の複数のフソソームを投与するステップを含み、前記フソソーム組成物が、前記疾患または障害が処置されるような量および／または時間で投与される、方法。
【請求項２９】
前記疾患または障害が、がん、自己免疫障害、または感染性疾患から選択される、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年２月１７日に出願された米国第６２／６３１，７４７号の優先権を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年２月１２日に作成されたそのＡＳＣＩＩのコピーは、Ｖ２０５０−７０１３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが１４，９１１バイトである。
【背景技術】
【０００３】
細胞間の融合は、受精、発達、免疫応答、および腫瘍発生ほどの多様な生物学的プロセスにおいて必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、膜タンパク質を標的細胞に送達するためのフソソームおよびそれらの使用に関する技術を提供する。一部の実施形態では、フソソームは、脂質二重層と、脂質二重層によって包まれている内腔と、フソゲンと、膜タンパク質ペイロード剤を含むカーゴとを含む。一部の実施形態では、そのようなカーゴは、膜タンパク質自体であり得るか、またはそれを含み得、一部の実施形態では、そのようなカーゴは、膜タンパク質をコードする（またはそれをコードする核酸に相補的である）核酸であり得るか、またはそれを含み得る。
【０００５】
一部の態様では、本開示は、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤（例えば、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている）であって、
ｉ）キメラ抗原受容体、
ｉｉ）例えば、表５から選択される、インテグリン膜タンパク質ペイロード、
ｉｉｉ）表６から選択される、イオンチャネルタンパク質、
ｉｖ）例えば、表７および８から選択される、細孔形成タンパク質、
ｖ）例えば、表９から選択される、Ｔｏｌｌ様受容体、
ｖｉ）例えば、表１０から選択される、インターロイキン受容体ペイロード、
ｖｉｉ）表１１〜１２から選択される、細胞接着性タンパク質、
ｖｉｉｉ）表１５から選択される、輸送タンパク質、
ｉｘ）天然に存在する膜タンパク質に対して異種である、シグナル配列、または
ｘ）表４に列挙されている、シグナル配列
のうちの１つまたは複数を含むかまたはそれをコードする、膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、必要に応じて、ヌクレオキャプシドタンパク質もウイルスマトリックスタンパク質も含まない、フソソームを提供する。
【０００６】
一部の態様では、本開示は、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）Ｔ細胞受容体を含むかまたはそれをコードする、膜タンパク質ペイロード剤（例えば、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている）と
を含むフソソームであって、必要に応じて、フソソームが、ヌクレオキャプシドタンパク質もウイルスマトリックスタンパク質も含まない、フソソームを提供する。
【０００７】
一部の態様では、本開示は、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、以下：
ｉ）フソソームが、細胞生物製剤（ｃｙｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃ）を含むか、もしくはそれに含まれる、
ｉｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、少なくとも１，０００コピーのコピー数で、治療剤を含む、
ｉｖ）フソソームが、脂質を含み、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つもしくは複数が、供給源細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、供給源細胞のものに類似のプロテオーム組成を含む、
ｖｉ）フソソームが、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの伝達、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、もしくはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）の取込みを、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも少なくとも１０％多く、行うことができる、
ｖｉｉ）フソソームが、対象、例えば、マウスに投与されると、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、もしくは眼を標的とし、例えば、投与されたフソソーム集団中のフソソームの少なくとも０．１％、もしくは１０％が、例えば、実施例８７もしくは１００のアッセイによって、２４時間後に、標的組織に存在する、または
ｖｉｉｉ）供給源細胞が、好中球、顆粒球、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、もしくはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される
のうちの１つまたは複数である、フソソームを提供する。
【０００８】
一部の態様では、本開示は、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤であって、
ｉ）膜タンパク質をコードするＤＮＡを含むか、または
ｉｉ）供給源細胞に対して外因性であるかもしくはそれと比べて過剰発現されている膜タンパク質をコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む、膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、必要に応じて、フソソームが、ヌクレオキャプシドタンパク質もウイルスマトリックスタンパク質も含まない、フソソームを提供する。
【０００９】
一部の態様では、本開示は、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている非ウイルス性、例えば、哺乳動物フソゲンであって、哺乳動物フソゲンが、アルツハイマー病のベータアミロイドペプチドでもファーティリンでもない、フソゲンと、
（ｄ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、必要に応じて、フソソームが、ヌクレオキャプシドタンパク質もウイルスマトリックスタンパク質も含まない、フソソームを提供する。
【００１０】
一部の態様では、本開示は、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、除核細胞を含み、
必要に応じて、ヌクレオキャプシドタンパク質もウイルスマトリックスタンパク質も含まない、フソソームを提供する。
【００１１】
一部の態様では、本開示は、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、以下：
ｉ）フソソームが、細胞生物製剤を含むか、もしくはそれに含まれる、
ｉｉ）フソソームが、除核細胞を含む、
ｉｉｉ）フソソームが、不活性化された核を含む、
ｉｖ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で、標的細胞と融合する、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的フソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％高い割合で、標的細胞と融合する、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の膜タンパク質ペイロード剤が２４、４８、もしくは７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合する、
ｖｉｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らないコピー数で、存在する、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らないコピー数で、膜タンパク質ペイロード剤を含む、
ｉｘ）フソゲンのコピー数の、膜タンパク質ペイロード剤のコピー数に対する比が、１，０００，０００：１〜１００，０００：１、１００，０００：１〜１０，０００：１、１０，０００：１〜１，０００：１、１，０００：１〜１００：１、１００：１〜５０：１、５０：１〜２０：１、２０：１〜１０：１、１０：１〜５：１、５：１〜２：１、２：１〜１：１、１：１〜１：２、１：２〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：２０、１：２０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１，０００、１：１，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：１００，０００、もしくは１：１００，０００〜１：１，０００，０００である、
ｘ）フソソームが、供給源細胞のものに実質的に類似の脂質組成を含み、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つもしくは複数が、供給源細胞における対応する脂質レベルの１０％以内、１５％以内、２０％以内、２５％以内、３０％以内、３５％以内、４０％以内、４５％以内、５０％以内、５５％以内、６０％以内、６５％以内、７０％以内、もしくは７５％以内である、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、供給源細胞のものに類似のプロテオーム組成を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、脂質のタンパク質に対する比を含む、
ｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、タンパク質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を含む、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、脂質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を含む、
ｘｖ）フソソームが、例えば、実施例７５のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞の半減期の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、１００％以内である、対象、例えば、マウスにおける半減期を有する、
ｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合に、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、膜を越えてグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）を輸送する、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のものの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における代謝活性（例えば、クエン酸シンターゼ活性）の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、代謝活性（例えば、クエン酸シンターゼ活性）レベルを含む、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を含む、
ｘｘ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、多くとも１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したその他は同様のフソソームのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したマクロファージのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含む、
ｘｘｉ）フソソームが、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のものよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高いｍｉＲＮＡ含量レベルを有する、
ｘｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞のものの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくはそれを上回る、例えば、供給源細胞のものの１％〜２％以内、２％〜３％以内、３％〜４％以内、４％〜５％以内、５％〜１０％以内、１０％〜２０％以内、２０％〜３０％以内、３０％〜４０％以内、４０％〜５０％以内、５０％〜６０％以内、６０％〜７０％以内、７０％〜８０％以内、もしくは８０％〜９０％以内である、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を有する、
ｘｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４８に記載される質量分析によって測定した場合に、供給源細胞のＬＰＳ含量の５％を下回る、１％を下回る、０．５％を下回る、０．０１％を下回る、０．００５％を下回る、０．０００１％を下回る、０．００００１％を下回る、もしくはそれを下回る、ＬＰＳレベルを有する、
ｘｘｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの伝達、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、もしくはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）の取込みを、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、行うことができる、
ｘｘｖ）フソソームが、対象、例えば、哺乳動物、例えば、実験用哺乳動物（例えば、マウス）、飼育動物（例えば、ペットもしくは家畜動物）、もしくはヒトに投与されると、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、もしくは眼を標的とし、投与されたフソソーム集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％が、例えば、実施例８７もしくは１００のアッセイによって、２４、４８、もしくは７２時間後に、標的組織に存在する、
ｘｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくは骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高いジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％高いパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内のレベルで、アクチンを重合する、
ｘｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、１００％以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約−２０〜−１５０ｍＶ、−２０〜−５０ｍＶ、−５０〜−１００ｍＶ、もしくは−１００〜−１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｘ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５７のアッセイを使用して、例えば、供給源細胞と同じ種類の細胞の溢出割合の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％の割合で、血管から溢出することができ、例えば、供給源細胞が、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、もしくはＮＫ細胞である、
ｘｘｘｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、供給源細胞と同じ種類の細胞のものの少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％の割合で、細胞膜、例えば、内皮細胞膜もしくは血液脳関門を越えることができる、
ｘｘｘｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚線維芽細胞もしくは供給源細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高い割合で、タンパク質を分泌することができる、
ｘｘｘｉｉｉ）フソソームが、医薬品もしくは適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｘｘｘｉｖ）フソソームが、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｘｘｘｖ）本明細書に記載される複数のフソソームを含む医薬調製物が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
ｘｘｘｖｉ）本明細書に記載される複数のフソソームを含む医薬調製物が、所定の参照値を下回る混入物質レベルを有し、例えば、混入物質を実質的に含まない、
ｘｘｘｖｉｉ）本明細書に記載される複数のフソソームを含む医薬調製物が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｘｘｘｖｉｉｉ）供給源細胞が、好中球、顆粒球、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、もしくはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、あるいは
ｘｘｘｉｘ）供給源細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、もしくはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、もしくは幹細胞以外である
のうちの１つまたは複数である、フソソームを提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、内在性膜タンパク質であり、一部の実施形態では、膜タンパク質は、表在性膜タンパク質である。他の実施形態では、膜タンパク質は、膜と一時的に会合している。一部の実施形態では、膜タンパク質は、標的細胞の膜と会合している、および／またはそれに全体的もしくは部分的にまたがっている（例えば、膜貫通タンパク質）、タンパク質である。一部の実施形態では、膜タンパク質は、内在性単地性タンパク質である（すなわち、膜の一方の側面のみと会合している）。一部の実施形態では、膜タンパク質は、標的細胞の膜の外部表面と会合しているかまたは会合するようになる（例えば、部分的もしくは完全にそこに存在する）。一部の実施形態では、膜タンパク質は、標的細胞の膜の内部表面と会合しているかまたは会合するようになる（例えば、部分的もしくは完全にそこに存在する）。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、治療用膜タンパク質である。一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、受容体（例えば、細胞表面受容体および／もしくは膜貫通受容体）、細胞表面リガンド、膜輸送タンパク質（例えば、能動的もしくは受動的輸送タンパク質、例えば、例として、イオンチャネルタンパク質、細孔形成タンパク質［例えば、毒素タンパク質］など）、膜酵素、ならびに／または細胞接着性タンパク質）であるかまたはそれを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、天然に存在する膜タンパク質の配列を含む。一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、天然に存在する膜タンパク質のバリアントまたは改変バージョンであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、操作された膜タンパク質であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、融合タンパク質であるかまたはそれを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、膜タンパク質ペイロード剤が部分的または完全にフソソーム内腔に配置された、フソソーム調製物を提供し、かつ／またはそれを利用する。一部の実施形態では、本開示は、膜タンパク質ペイロード剤が、フソソームの脂質二重層と会合した（例えば、部分的または完全にその中に位置する）、フソソーム調製物を提供する。一部の実施形態では、関連する膜タンパク質は、フソソームの外部表面と会合している、かつ／または部分的もしくは完全にそこに提示される。
【００１６】
本開示は、一部の態様では、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤、例えば、供給源細胞に対して外因性である膜タンパク質と
を含むフソソームであって、供給源細胞に由来し、
部分的または完全な核不活性化を有する（例えば、供給源細胞において見出されるインタクトな核が欠如している、核除去／脱核、非機能性核など）、フソソームを提供する。
【００１７】
本開示は、一部の態様では、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）標的細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている（例えば、供給源細胞に内因性または外因性である）、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤（例えば、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている）であって、
ｘｉ）キメラ抗原受容体を含むかまたはそれをコードする、
ｘｉｉ）例えば、表５から選択される、インテグリン膜タンパク質ペイロードを含むか、またはそれをコードする、
ｘｉｉｉ）表６から選択される、イオンチャネルタンパク質を含むかまたはそれをコードする、
ｘｉｖ）例えば、表７および８から選択される、細孔形成タンパク質を含むかまたはそれをコードする、
ｘｖ）例えば、表９から選択される、Ｔｏｌｌ様受容体を含むかまたはそれをコードする、
ｘｖｉ）例えば、表１０から選択される、インターロイキン受容体ペイロードを含むかまたはそれをコードする、
ｘｖｉｉ）表１１〜１２から選択される、細胞接着性タンパク質を含むかまたはそれをコードする、
ｘｖｉｉｉ）表１５から選択される、輸送タンパク質を含むかまたはそれをコードする、
ｘｉｘ）天然に存在する膜タンパク質に対して異種であるシグナル配列を含むかまたはそれをコードする、
ｘｘ）表４に列挙されている、シグナル配列を含むかまたはそれをコードする
膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、ウイルスキャプシドタンパク質もウイルスエンベロープタンパク質も含まない、フソソームを提供する。
【００１８】
本開示は、一部の態様では、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤（例えば、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている）であって、
ｉ）脂質アンカータンパク質、
ｉｉ）膜貫通タンパク質に結合する、細胞外タンパク質、
ｉｉｉ）膜貫通ドメインが欠如した、細胞外タンパク質、
ｉｖ）部分的に膜（例えば、標的細胞またはフソソームの膜）にまたがり、完全には膜にまたがらない、タンパク質（例えば、タンパク質は、平面膜ヘリックスを含むか、もしくはタンパク質は、膜に完全にはまたがらない疎水性ループを含む）、または
ｖ）膜貫通ドメインを含まず、膜表面と、例えば、静電相互作用もしくはイオン相互作用を通じて相互作用するタンパク質
のうちの１つまたは複数を含むかまたはそれをコードする膜タンパク質ペイロード剤と
を含むフソソームであって、ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスキャプシドタンパク質もウイルスエンベロープタンパク質も含まない、フソソームを提供する。
【００１９】
一部の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、存在する：
ｘｌ）フソソームが、細胞生物製剤を含むか、もしくはそれに含まれること、
ｘｌｉ）フソソームが、除核細胞を含む、
ｘｌｉｉ）フソソームが、不活性化された核を含む、
ｘｌｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で、標的細胞と融合する、
ｘｌｉｖ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的フソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％高い割合で、標的細胞と融合する、
ｘｌｖ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の膜タンパク質ペイロード剤が２４、４８、もしくは７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合する、
ｘｌｖｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らないコピー数で、存在する、
ｘｌｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らないコピー数で、膜タンパク質ペイロード剤を含む、
ｘｌｖｉｉｉ）フソゲンのコピー数の、膜タンパク質ペイロード剤のコピー数に対する比が、１，０００，０００：１〜１００，０００：１、１００，０００：１〜１０，０００：１、１０，０００：１〜１，０００：１、１，０００：１〜１００：１、１００：１〜５０：１、５０：１〜２０：１、２０：１〜１０：１、１０：１〜５：１、５：１〜２：１、２：１〜１：１、１：１〜１：２、１：２〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：２０、１：２０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１，０００、１：１，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：１００，０００、もしくは１：１００，０００〜１：１，０００，０００である、
ｘｌｉｘ）フソソームが、供給源細胞のものに実質的に類似の脂質組成を含み、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つもしくは複数が、供給源細胞における対応する脂質レベルの１０％以内、１５％以内、２０％以内、２５％以内、３０％以内、３５％以内、４０％以内、４５％以内、５０％以内、５５％以内、６０％以内、６５％以内、７０％以内、もしくは７５％以内である、
ｌ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、供給源細胞のものに類似のプロテオーム組成を含む、
ｌｉ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、脂質のタンパク質に対する比を含む、
ｌｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、タンパク質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を含む、
ｌｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、脂質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を含む、
ｌｉｖ）フソソームが、例えば、実施例７５のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞の半減期の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、１００％以内である、対象、例えば、マウスにおける半減期を有する、
ｌｖ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合に、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、膜を越えてグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）を輸送する、
ｌｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のものの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
ｌｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における代謝活性（例えば、クエン酸シンターゼ活性）の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、代謝活性（例えば、クエン酸シンターゼ活性）レベルを含む、
ｌｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を含む、
ｌｉｘ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、多くとも１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したその他は同様のフソソームのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したマクロファージのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含む、
ｌｘ）フソソームが、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のものよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高いｍｉＲＮＡ含量レベルを有する、
ｌｘｉ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞のものの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくはそれを上回る、例えば、供給源細胞のものの１％〜２％以内、２％〜３％以内、３％〜４％以内、４％〜５％以内、５％〜１０％以内、１０％〜２０％以内、２０％〜３０％以内、３０％〜４０％以内、４０％〜５０％以内、５０％〜６０％以内、６０％〜７０％以内、７０％〜８０％以内、もしくは８０％〜９０％以内である、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を有する、
ｌｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４８に記載される質量分析によって測定した場合に、供給源細胞のＬＰＳ含量の５％を下回る、１％を下回る、０．５％を下回る、０．０１％を下回る、０．００５％を下回る、０．０００１％を下回る、０．００００１％を下回る、もしくはそれを下回る、ＬＰＳレベルを有する、
ｌｘｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの伝達、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、もしくはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）の取込みを、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、行うことができる、
ｌｘｉｖ）フソソームが、対象、例えば、哺乳動物、例えば、実験用哺乳動物（例えば、マウス）、飼育動物（例えば、ペットもしくは家畜動物）、もしくはヒトに投与されると、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、もしくは眼を標的とし、投与されたフソソーム集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％が、例えば、実施例８７もしくは１００のアッセイによって、２４、４８、もしくは７２時間後に、標的組織に存在する、
ｌｘｖ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくは骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高いジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｌｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％高いパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｌｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内のレベルで、アクチンを重合する、
ｌｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、１００％以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約−２０〜−１５０ｍＶ、−２０〜−５０ｍＶ、−５０〜−１００ｍＶ、もしくは−１００〜−１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｌｘｉｘ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５７のアッセイを使用して、例えば、供給源細胞の溢出割合の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％の割合で、血管から溢出することができ、例えば、供給源細胞が、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、もしくはＮＫ細胞であること、
ｌｘｘ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、細胞膜、例えば、内皮細胞膜もしくは血液脳関門を越えることができること、
ｌｘｘｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚線維芽細胞もしくは供給源細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高い割合で、タンパク質を分泌することができること、
ｌｘｘｉｉ）フソソームが、医薬品もしくは適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｌｘｘｉｉｉ）フソソームが、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｌｘｘｉｖ）本明細書に記載される複数のフソソームを含む医薬調製物が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
ｌｘｘｖ）本明細書に記載される複数のフソソームを含む医薬調製物が、所定の参照値を下回る混入物質レベルを有し、例えば、混入物質を実質的に含まない、
ｌｘｘｖｉ）本明細書に記載される複数のフソソームを含む医薬調製物が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｌｘｘｖｉｉ）供給源細胞が、好中球、顆粒球、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、もしくはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、あるいは
ｌｘｘｖｉｉｉ）供給源細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、もしくはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、もしくは幹細胞以外であること。
【００２０】
一部の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、存在する：
ｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合に、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％多く、膜を越えてグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）を輸送すること、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のものの９０％以内である、内腔におけるエステラーゼ活性を含むこと、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における代謝活性（例えば、クエン酸シンターゼ活性）の９０％以内である、代謝活性レベルを含むこと、
ｉｖ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における呼吸レベルの９０％以内である、呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を含むこと、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、多くとも１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したその他は同様のフソソームのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したマクロファージのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むこと、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合に、フソソームの脂質含量の５％を下回る、ＬＰＳレベルを有すること、
ｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくは骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％高いジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有すること、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％高いパラクリンシグナル伝達レベルを有すること、
ｉｘ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、５％以内のレベルで、アクチンを重合すること、または
ｘ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚線維芽細胞よりも少なくとも５％高い割合で、タンパク質を分泌することができること。
【００２１】
一部の実施形態では、提供されるフソソームは、内腔に配置された、オルガネラ、例えば、治療上有効な数のオルガネラをさらに含む。
【００２２】
代替または追加として、一部の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、存在する：
ｉ）供給源細胞が、内皮細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞）、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、もしくはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択されること、
ｉｉ）フソソームが、ゴルジ体、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、およびこれらの組合せから選択されるオルガネラを含むこと、
ｉｉｉ）フソソームが、５μｍを上回る、１０μｍを上回る、２０μｍを上回る、５０μｍを上回る、もしくは１００μｍを上回る径を有すること、
ｉｖ）複数のフソソームを含む調製物が、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合に、１．０８ｇ／ｍＬ〜１．１２ｇ／ｍＬ以外の密度を有し、例えば、調製物が、１．１２ｇ／ｍＬを上回る、例えば、１．２５ｇ／ｍＬ±０．１、１．２５ｇ／ｍＬ±０．０５の密度を有すること、
ｖ）フソソームが、実験用哺乳動物もしくはヒトにおいて、循環中のスカベンジャー系もしくは肝臓洞のクッパー細胞によって実質的に捕捉されないこと、
ｖｉ）供給源細胞が、２９３細胞以外であること、
ｖｉｉ）供給源細胞が、形質転換も不死化もされていないこと、
ｖｉｉｉ）供給源細胞が、アデノウイルス媒介不死化以外の方法を使用して、形質転換もしくは不死化されている、例えば、自発的突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化されていること、
ｉｘ）フソゲンが、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、または分泌性顆粒タンパク質以外であること、
ｘ）フソソームが、Ｃｒｅも、ＧＦＰ、例えば、ＥＧＦＰも含まないこと、
ｘｉ）フソソームが、供給源細胞に対して外因性である、ＣｒｅもしくはＧＦＰ、例えば、ＥＧＦＰ以外のタンパク質をさらに含むこと、
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、内腔に、供給源細胞に対して外因性である核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）、もしくは供給源細胞に対して外因性であるタンパク質（例えば、抗体）をさらに含むこと、
ｘｉｉｉ）フソソームが、ミトコンドリアを含まないか、もしくはミトコンドリアを実質的に含まないこと、または
ｘｉｖ）フソソームが、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）、もしくはタンパク質（例えば、抗体）をさらに含み、核酸もしくはタンパク質が、供給源細胞に対して外因性であること。
【００２３】
代替または追加として、一部の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、真である：
ｉ）膜タンパク質ペイロード剤が、膜タンパク質、または膜タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするかもしくはそれをコードするものに相補的である核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）であること、
ｉｉ）膜タンパク質が、受容体、例えば、抗原受容体であるかまたはそれを含み、それが、一部の実施形態では、天然の受容体であり得るかまたは操作された受容体、例えば、ＣＡＲであり得ること、
ｉｉｉ）膜タンパク質が、インテグリンであるかまたはそれを含むこと、
ｉｖ）膜タンパク質が、Ｔ細胞受容体であるかまたはそれを含むこと、
ｖ）膜タンパク質が、膜輸送タンパク質、例えば、イオンチャネルタンパク質または細孔形成タンパク質（例えば、ヘモリジンもしくはコリシン）であるかまたはそれを含むこと、
ｖｉ）膜タンパク質が、ｔｏｌｌ様受容体であるかまたはそれを含むこと、
ｖｉｉ）膜タンパク質が、インターロイキン受容体であるかまたはそれを含むこと、
ｖｉｉｉ）膜タンパク質が、膜酵素であるかまたはそれを含むこと、
ｉｘ）膜タンパク質が、細胞接着性タンパク質（例えば、カドヘリンタンパク質、セレクチンタンパク質、ムチンタンパク質など）であるかまたはそれを含むこと。
【００２４】
本開示は、一部の態様では、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるフソゲン、または過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤と、
（ｅ）機能性核と
を含むフソソームであって、供給源細胞に由来する、フソソームを提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、存在する：
ｉ）供給源細胞が、樹状細胞もしくは腫瘍細胞以外であり、例えば、供給源細胞が、内皮細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞）、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、もしくはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択されること、
ｉｉ）フソゲンが、膜融合性タンパク質以外であること、
ｉｉｉ）フソゲンが、ファーティリン−ベータ以外の哺乳動物タンパク質であること、
ｉｖ）フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有すること、
ｖ）フソソームが、医薬品もしくは適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしていること、
ｖｉ）複数のフソソームを含む医薬調製物が、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製されたこと、
ｖｉｉ）複数のフソソームを含む医薬調製物が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まないこと、または
ｖｉｉｉ）複数のフソソームを含む医薬調製物が、所定の参照値を下回る混入物質レベルを有し、例えば、混入物質を実質的に含まないこと。
【００２６】
本開示は、一部の態様では、本明細書に記載される膜タンパク質ペイロード剤を含む複数のフソソームを含む、凍結された精製されたフソソーム調製物であって、４℃もしくはそれを下回る、０℃もしくはそれを下回る、−４℃もしくはそれを下回る、−１０℃もしくはそれを下回る、−１２℃もしくはそれを下回る、−１６℃もしくはそれを下回る、−２０℃もしくはそれを下回る、−８０℃もしくはそれを下回る、または−１６０℃もしくはそれを下回る温度で凍結されている、フソソーム調製物を提供する。
【００２７】
本開示は、一部の態様では、本明細書に記載される複数のフソソームを含む、フソソーム調製物（例えば、医薬調製物）を提供する。
【００２８】
本開示はまた、一部の態様では、複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、少なくとも１つのフソソームが、
（ａ）供給源細胞に由来する複数の脂質を含む、脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって包まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）例えば、本明細書に記載される、膜タンパク質ペイロード剤と
を含む、フソソーム組成物を提供する。
【００２９】
本開示は、一部の態様では、本明細書に記載されるフソソーム組成物または調製物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００３０】
本開示は、ある特定の態様では、本明細書に記載される膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソーム組成物または調製物を、ヒト対象、標的組織、または細胞に送達する方法であって、本明細書に記載される複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載されるフソソーム組成物、または本明細書に記載される医薬組成物を、ヒト対象に投与するステップ、または標的組織もしくは細胞をそれらと接触させるステップを含み、それによって、フソソーム組成物を対象に投与する、方法を提供する。
【００３１】
本開示は、ある特定の態様では、膜タンパク質ペイロード剤を、対象、標的組織、または細胞に送達する方法であって、本明細書に記載されるフソソーム組成物または調製物（例えば、本明細書に記載される医薬組成物）を、対象に投与するステップ、または標的組織もしくは細胞をそれらと接触させるステップを含み、フソソーム組成物または調製物が、膜タンパク質ペイロード剤が送達されるような量および／または時間で投与される、方法を提供する。
【００３２】
本開示は、ある特定の態様では、対象、標的組織、または細胞における生物学的機能をモジュレート、例えば、増強する方法であって、本明細書に記載される膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソーム組成物または調製物、例えば、本明細書に記載される医薬組成物を、対象に投与するステップ、または標的組織もしくは細胞をそれらと接触させるステップを含み、それによって、対象における生物学的機能をモジュレートする、方法を提供する。
【００３３】
本開示は、ある特定の態様では、膜タンパク質機能を対象に送達するかまたはそれを対象に標的化する方法であって、対象に、膜タンパク質ペイロード剤を含む本明細書に記載されるフソソーム組成物または調製物を投与するステップを含み、フソソーム組成物または調製物が、膜タンパク質機能が対象に送達されるかまたはそれが対象に標的化されるような量および／または時間で投与される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、がん、炎症性障害、自己免疫疾患、慢性疾患、炎症、臓器機能の損傷、感染性疾患、変性障害、遺伝性疾患、または傷害を有する。
【００３４】
本開示は、一部の態様では、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）フソゲンを含む、例えば、それを発現する、供給源細胞を得るステップと、
ｂ）供給源細胞からフソソームを産生させ、それによってフソソームを作製するステップであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含む、ステップと、
ｃ）フソソームを、例えば、対象への投与に好適な医薬組成物として、製剤化するステップと
を含む、方法を提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、存在する：
ｉ）供給源細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外であること、
ｉｉ）フソゲンが、ウイルスタンパク質以外であること、
ｉｉｉ）複数のフソソームを含む調製物が、１．０８ｇ／ｍＬ〜１．１２ｇ／ｍＬ以外の密度を有すること、
ｉｖ）複数のフソソームを含む調製物が、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合に、１．２５ｇ／ｍＬ±０．０５の密度を有すること、
ｖ）フソソームが、循環中のスカベンジャー系もしくは肝臓洞のクッパー細胞によって実質的に捕捉されないこと、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７６のアッセイによって、対象における細網内皮系（ＲＥＳ）によって実質的に捕捉されないこと、
ｖｉｉ）複数のフソソームが、対象に投与されると、複数のフソソームのうちの１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回るものが、例えば、実施例７６のアッセイによって、２４、４８、または７２時間後に、ＲＥＳによって捕捉されること、
ｖｉｉｉ）フソソームが、５μｍを上回る、６μｍを上回る、７μｍを上回る、８μｍを上回る、１０μｍを上回る、２０μｍを上回る、５０μｍを上回る、１００μｍを上回る、１５０μｍを上回る、もしくは２００μｍを上回る径を有すること、
ｉｘ）フソソームが、細胞生物製剤を含むこと、
ｘ）フソソームが、除核細胞を含むこと、または
ｘｉ）フソソームが、不活性化された核を含むこと。
【００３６】
一部の態様では、本開示は、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載される複数のフソソームまたは本明細書に記載されるフソソーム組成物を得るステップと、
ｂ）フソソームを、例えば、対象への投与に好適な医薬組成物として、製剤化するステップと
を含む、方法を提供する。
【００３７】
一部の態様では、本開示は、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載される複数のフソソームまたはフソソーム調製物を得る、例えば、産生するステップと、
ｂ）複数のフソソームの（例えば、調製物の）試料をアッセイして、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、もしくはそれを上回る）基準を満たすかどうかを判定するステップであって、いくつかの実施形態では、基準が、以下：
ｉ）試料中のフソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉ）試料中のフソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉｉ）試料中のフソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の膜タンパク質ペイロード剤が２４、４８、もしくは７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らないコピー数で（例えば、試料中の平均で）、存在すること、
ｖ）膜タンパク質ペイロード剤が、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、試料のフソソームにおいて、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らないコピー数で（例えば、試料中の平均で）、検出可能であること、
ｖｉ）フソゲンのコピー数の膜タンパク質ペイロード剤のコピー数に対する比が、１，０００，０００：１〜１００，０００：１、１００，０００：１〜１０，０００：１、１０，０００：１〜１，０００：１、１，０００：１〜１００：１、１００：１〜５０：１、５０：１〜２０：１、２０：１〜１０：１、１０：１〜５：１、５：１〜２：１、２：１〜１：１、１：１〜１：２、１：２〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：２０、１：２０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１，０００、１：１，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：１００，０００、もしくは１：１００，０００〜１：１，０００，０００であること、
ｖｉｉ）試料のフソソームが、供給源細胞のものに実質的に類似の脂質組成を特徴とするか、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つもしくは複数が、供給源細胞における対応する脂質レベルの１０％以内、１５％以内、２０％以内、２５％以内、３０％以内、３５％以内、４０％以内、４５％以内、５０％以内、もしくは７５％以内であること、
ｖｉｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、供給源細胞のものに類似のプロテオーム組成を特徴とすること、
ｉｘ）試料のフソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、脂質のタンパク質に対する比を特徴とすること、
ｘ）試料のフソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、タンパク質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を特徴とすること、
ｘｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、脂質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を特徴とすること、
ｘｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例７５のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞の半減期の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、１００％以内である、対象、例えば、実験用動物、例えば、マウスにおける半減期を特徴とすること、
ｘｉｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合に、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下におけるその他は同様の試料のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、膜を越えてグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）を輸送することを特徴とすること、
ｘｉｖ）試料のフソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のものの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、内腔におけるエステラーゼ活性を特徴とすること、
ｘｖ）試料のフソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における代謝活性、例えば、クエン酸シンターゼ活性の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、代謝活性（例えば、クエン酸シンターゼ活性）レベルを特徴とすること、
ｘｖｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における呼吸レベルの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内である、呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を特徴とすること、
ｘｖｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、多くとも１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシン−Ｖ染色レベルを特徴とするか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したその他は同様のフソソームのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したマクロファージのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むこと、
ｘｖｉｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のものよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高いｍｉＲＮＡ含量レベルを特徴とすること、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞のものの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくはそれを上回る、例えば、供給源細胞のものの１％〜２％以内、２％〜３％以内、３％〜４％以内、４％〜５％以内、５％〜１０％以内、１０％〜２０％以内、２０％〜３０％以内、３０％〜４０％以内、４０％〜５０％以内、５０％〜６０％以内、６０％〜７０％以内、７０％〜８０％以内、もしくは８０％〜９０％以内である、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を有すること、
ｘｘ）試料のフソソームが、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合に、供給源細胞もしくは参照細胞のＬＰＳ含量の５％を下回る、１％を下回る、０．５％を下回る、０．０１％を下回る、０．００５％を下回る、０．０００１％を下回る、０．００００１％を下回る、もしくはそれを下回る、ＬＰＳレベルを特徴とすること、
ｘｘｉ）試料のフソソームが、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの伝達、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、もしくはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）の取込みを、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、行うことができること、
ｘｘｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくは骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高いジャクスタクリンシグナル伝達レベルを特徴とすること、
ｘｘｉｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％高いパラクリンシグナル伝達レベルを特徴とすること、
ｘｘｉｖ）試料のフソソームが、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくは１００％以内のレベルで、アクチンを重合することを特徴とすること、
ｘｘｖ）試料のフソソームが、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、１００％以内の膜電位を特徴とするか、またはフソソームが、約−２０〜−１５０ｍＶ、−２０〜−５０ｍＶ、−５０〜−１００ｍＶ、もしくは−１００〜−１５０ｍＶの膜電位を有すること、
ｘｘｖｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚線維芽細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高い割合で、タンパク質を分泌することができること、または
ｘｘｖｉｉ）試料のフソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を特徴とすること
から選択される、ステップと、
ｃ）（必要に応じて）基準のうちの１つもしくは複数を満たす場合に、複数のフソソームもしくはフソソーム組成物の出荷を承認するか、または（必要に応じて）１つもしくは複数の基準を満たす場合に、複数のフソソームもしくはフソソーム調製物を薬物製品として製剤化するステップと
を含む、方法を提供する。
【００３８】
本開示はまた、一部の態様では、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載される複数のフソソームまたは本明細書に記載されるフソソーム組成物もしくは調製物を得る、例えば、産生するステップと、
ｂ）複数のフソソームまたは調製物の試料をアッセイして、以下の因子：
ｉ）免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるもの、
ｉｉ）病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
ｉｉｉ）混入物質（例えば、核構造体もしくは成分、例えば、核ＤＮＡ）
のうちの１つまたは複数の存在またはレベルを判定するステップと、
ｃ）（必要に応じて）因子のうちの１つもしくは複数が、参照値から有意に（例えば、指定された量を上回って）逸脱する場合に、複数のフソソームもしくはフソソーム調製物の出荷を承認するか、または（必要に応じて）１つもしくは複数の因子が、参照値から有意に逸脱しない（例えば、指定された量を上回って逸脱しない）場合に、複数のフソソームもしくはフソソーム調製物を薬物製品として製剤化するステップと
を含む、方法を提供する。
【００３９】
本開示はまた、一部の態様では、膜タンパク質ペイロード剤を対象に送達する方法であって、例えば、
ａ）対象に、第１のフソゲンを、対象の１つまたは複数の標的細胞への第１のフソゲンの配置を許容する条件下において投与するステップであって、以下：
ｉ）第１のフソゲンを投与するステップが、第１のフソゲンをコードする核酸を、１つもしくは複数の標的細胞における第１のフソゲンの発現を許容する条件下において投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない
のうちの１つまたは複数である、ステップと、
ｂ）ヒト対象に、第２のフソゲンおよび膜タンパク質ペイロード剤を含む複数のフソソームを含む、本明細書に記載されるフソソーム組成物または調製物を投与するステップであって、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤（例えば、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている）をさらに含む、ステップと
を含み、それによって、膜タンパク質ペイロード剤を対象に送達する、方法を提供する。
【００４０】
本開示はまた、一部の態様では、対象における生物学的機能をモジュレート、例えば、増強する方法であって、
ａ）対象に、第１のフソゲンを、対象の１つまたは複数の標的細胞への第１のフソゲンの配置を許容する条件下において投与するステップであって、以下：
ｉ）第１のフソゲンを投与するステップが、第１のフソゲンをコードする核酸を、１つもしくは複数の標的細胞における第１のフソゲンの発現を許容する条件下において投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない
のうちの１つまたは複数である、ステップと、
ｂ）ヒト対象に、第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、本明細書に記載されるフソソーム組成物または調製物を投与するステップであって、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤（例えば、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている）をさらに含む、ステップと
を含み、それによって、対象における生物学的機能をモジュレートする、方法を提供する。
【００４１】
一部の態様では、フソソームは、コンドリソーム（ｃｈｏｎｄｒｉｓｏｍｅ）およびフソゲンを含む。
【００４２】
一部の態様では、組成物は、複数のフソソームを含み、ここで、少なくとも１つのフソソームは、コンドリソームおよびフソゲンを含む。
【００４３】
一部の態様では、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）フソゲンを含む、例えば、それを発現する、供給源細胞を得るステップと、
ｂ）供給源細胞からフソソームを産生させ、それによってフソソームを作製するステップであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含む、ステップと、
ｃ）フソソームを、例えば、対象への投与に好適な医薬組成物として、製剤化するステップであって、以下：
ｉ）供給源細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外である、
ｉｉ）フソゲンが、ウイルスタンパク質以外である、
ｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、１．０８ｇ／ｍＬ〜１．１２ｇ／ｍＬ以外の密度を有する、
ｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合に、１．２５ｇ／ｍＬ±０．０５の密度を有する、
ｖ）フソソームが、循環中のスカベンジャー系もしくは肝臓洞のクッパー細胞によって捕捉されない、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７６のアッセイによって、対象における細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない、
ｖｉｉ）複数のフソソームが、対象に投与されると、複数のフソソームのうちの１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、９０％を下回るものが、例えば、実施例７６のアッセイによって、２４時間後に、ＲＥＳによって捕捉されない、
ｖｉｉｉ）フソソームが、５μｍを上回る、６μｍを上回る、７μｍを上回る、８μｍを上回る、１０μｍを上回る、２０μｍを上回る、５０μｍを上回る、１００μｍを上回る、１５０μｍを上回る、もしくは２００μｍを上回る径を有する、
ｉｘ）フソソームが、細胞生物製剤を含む、
ｘ）フソソームが、除核細胞を含む、または
ｘｉ）フソソームが、不活性化された核を含む
のうちの１つまたは複数である、ステップと
を含む、方法が、本明細書に提供される。
【００４４】
一部の態様では、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ｉ）本明細書に記載される複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を得るステップと、
ｉｉ）複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を、例えば、対象への投与に好適なフソソーム薬物製品として、製剤化するステップと
を含む、方法が、本明細書に提供される。
【００４５】
一部の態様では、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ｉ）本明細書に記載される複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を得るステップと、
ｂ）複数のフソソームから１つまたは複数のフソソームをアッセイして、以下の基準：
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも、少なくとも５０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の薬剤が２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在すること、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、少なくとも１，０００コピーのコピー数で、タンパク質膜ペイロードを含むこと、
ｖｉ）フソゲンのコピー数のタンパク質膜ペイロードのコピー数に対する比が、１，０００，０００：１〜１００，０００：１、１００，０００：１〜１０，０００：１、１０，０００：１〜１，０００：１、１，０００：１〜１００：１、１００：１〜５０：１、５０：１〜２０：１、２０：１〜１０：１、１０：１〜５：１、５：１〜２：１、２：１〜１：１、１：１〜１：２、１：２〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：２０、１：２０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１，０００、１：１，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：１００，０００、もしくは１：１００，０００〜１：１，０００，０００であること、
ｖｉｉ）フソソームが、脂質組成を含み、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つもしくは複数が、供給源細胞における対応する脂質レベルの７５％以内であること、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、供給源細胞のものに類似のプロテオーム組成を含むこと、
ｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、脂質のタンパク質に対する比を含むこと、
ｘ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、タンパク質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を含むこと、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内である、脂質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を含むこと、
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７５のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞の半減期の９０％以内である、対象、例えば、マウスにおける半減期を有すること、
ｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合に、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％多く、膜を越えてグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）を輸送すること、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のものの９０％以内である、内腔におけるエステラーゼ活性を含むこと、
ｘｖ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における代謝活性（例えば、クエン酸シンターゼ活性）の９０％以内である、代謝活性レベルを含むこと、
ｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における呼吸レベルの９０％以内である、呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を含むこと、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、多くとも１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したその他は同様のフソソームのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したマクロファージのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むこと、
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のものの少なくとも１％のｍｉＲＮＡ含量レベルを有すること、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞のものの９０％以内である、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を有すること、
ｘｘ）フソソームが、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合に、フソソームの脂質含量の５％を下回る、ＬＰＳレベルを有すること、
ｘｘｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの伝達、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、もしくはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）の取込みを、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも少なくとも１０％多く、行うことができること、
ｘｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくは骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％高いジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有すること、
ｘｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％高いパラクリンシグナル伝達レベルを有すること、
ｘｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、５％以内のレベルで、アクチンを重合すること、
ｘｘｖ）フソソームが、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約５％以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約−２０〜−１５０ｍＶ、−２０〜−５０ｍＶ、−５０〜−１００ｍＶ、もしくは−１００〜−１５０ｍＶの膜電位を有すること、
ｘｘｖｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚線維芽細胞よりも少なくとも５％高い割合で、タンパク質を分泌することができること、または
ｘｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有すること
のうちの１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、もしくはすべて）を満たすかどうかを判定するステップと、
ｃ）（必要に応じて）基準のうちの１つまたは複数を満たす場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の出荷を承認するステップと
を含み、それによって、フソソーム薬物製品組成物を製造する、方法が、本明細書に提供される。
【００４６】
一部の態様では、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載される複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を得るステップと、
ｂ）複数のフソソームから１つまたは複数のフソソームをアッセイして、以下の因子：
ｉ）免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるもの、
ｉｉ）病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
ｉｉｉ）混入物質
のうちの１つまたは複数の存在またはレベルを判定するステップと、
ｃ）（必要に応じて）因子のうちの１つまたは複数が参照値を下回る場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の出荷を承認するステップと
を含み、それによって、フソソーム薬物製品組成物を製造する、方法が、本明細書に提供される。
【００４７】
一部の態様では、フソソーム組成物を、対象、例えば、ヒト対象に投与する方法であって、対象に、本明細書に記載される複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を含むフソソーム組成物を投与するステップを含み、それによって、フソソーム組成物を対象に投与する、方法が、本明細書に提供される。
【００４８】
一部の態様では、タンパク質膜ペイロードを対象に送達する方法であって、対象に、本明細書に記載される複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を含むフソソーム組成物を投与するステップを含み、フソソーム組成物が、タンパク質膜ペイロードが送達されるような量および／または時間で投与される、方法が、本明細書に提供される。
【００４９】
一部の態様では、対象における生物学的機能をモジュレート、例えば、増強する方法であって、対象に、本明細書に記載される複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を含むフソソーム組成物を投与するステップを含み、それによって、対象における生物学的機能をモジュレートする、方法が、本明細書に提供される。
【００５０】
一部の態様では、機能を対象に送達するかまたはそれを対象に標的化する方法であって、対象に、本明細書に記載される複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を含むフソソーム組成物を投与するステップを含み、フソソーム組成物が、対象において機能が送達または標的化されるような量および／または時間で投与される、方法が、本明細書に提供される。
【００５１】
一部の態様では、患者における疾患または障害を処置する方法であって、対象に、本明細書に記載される複数のフソソーム、フソソーム組成物、または医薬組成物を含むフソソーム組成物を投与するステップを含み、フソソーム組成物が、疾患または障害が処置されるような量および／または時間で投与される、方法が、本明細書に提供される。
【００５２】
一部の態様では、フソソーム組成物を、ヒト対象に投与する方法であって、
ａ）対象に、第１のフソゲンを、対象の１つまたは複数の標的細胞への第１のフソゲンの配置を許容する条件下において投与するステップであって、以下：
ｉ）第１のフソゲンを投与するステップが、第１のフソゲンをコードする核酸を、１つもしくは複数の標的細胞における第１のフソゲンの発現を許容する条件下において投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない
のうちの１つまたは複数である、ステップと、
ｂ）ヒト対象に、第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含むフソソーム組成物を投与するステップであって、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤（例えば、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている）をさらに含む、ステップと
を含み、それによって、フソソーム組成物を対象に投与する、方法が、本明細書に提供される。
【００５３】
一部の態様では、膜タンパク質ペイロード剤を、対象に送達する方法であって、
ａ）対象に、第１のフソゲンを、対象の１つまたは複数の標的細胞への第１のフソゲンの配置を許容する条件下において投与するステップであって、以下：
ｉ）第１のフソゲンを投与するステップが、第１のフソゲンをコードする核酸を、１つもしくは複数の標的細胞における第１のフソゲンの発現を許容する条件下において投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない
のうちの１つまたは複数である、ステップと、
ｂ）ヒト対象に、第２のフソゲンおよび治療剤を含む複数のフソソームを含むフソソーム組成物を投与するステップであって、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤をさらに含む、ステップと
を含み、それによって、膜タンパク質ペイロード剤を対象に送達する、方法が、本明細書に提供される。
【００５４】
一部の態様では、対象における生物学的機能をモジュレート、例えば、増強する方法であって、
ａ）対象に、第１のフソゲンを、対象の１つまたは複数の標的細胞への第１のフソゲンの配置を許容する条件下において投与するステップであって、以下：
ｉ）第１のフソゲンを投与するステップが、第１のフソゲンをコードする核酸を、１つもしくは複数の標的細胞における第１のフソゲンの発現を許容する条件下において投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない
のうちの１つまたは複数である、ステップと、
ｂ）ヒト対象に、第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含むフソソーム組成物を投与するステップであって、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤をさらに含む、ステップと
を含み、それによって、対象における生物学的機能をモジュレートする、方法が、本明細書に提供される。
【００５５】
本明細書における態様、例えば、上述のフソソーム、フソソーム組成物、調製物、および方法のいずれも、本明細書における実施形態のうちの１つまたは複数、例えば、本明細書に記載される実施形態のうちの１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００５６】
一部の実施形態では、生物学的機能は、
ａ）２つの細胞間の相互作用をモジュレート、例えば、増加もしくは減少させること、
ｂ）免疫応答をモジュレート、例えば、増加もしくは減少させること、
ｃ）標的組織への細胞の動員をモジュレート、例えば、増加もしくは減少させること、
ｄ）がんの成長速度を減少させること、または
ｅ）対象におけるがん性細胞の数を低減させること
から選択される。
【００５７】
一部の実施形態では、複数のフソソームは、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下において標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処置されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団における細胞数の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％に、カーゴを送達する。
【００５８】
一部の実施形態では、複数のフソソームが、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触した場合、カーゴは、非標的細胞よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍多くの標的細胞に、存在する。一部の実施形態では、複数のフソソームは、非標的細胞とよりも、少なくとも少なくとも５０％高い割合で、標的細胞と融合する。
【００５９】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、コネキシン、ＣＦＴＲ、サイロトロピン受容体、ミエリンタンパク質ゼロ、メラコルチン（ｍｅｌａｃｏｒｔｉｎ）４、ミエリンプロテオリピドタンパク質、低密度リポタンパク質受容体、ＡＢＣ輸送体、ＣＤ８１、ｍＣＡＴ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４、ＣＣＲ５、シアル酸リッチタンパク質、クローディン、ＣＤ２１、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、ＴＮＦＲ１、ＣＤ６３、ＧＬＵＴ４、ＶＥＧＦ、またはＩＣＡＭ以外であるか、これらを含まないか、これらをコードしないか、またはこれらをコードする配列に相補的でない。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、標的細胞の細胞表面マーカーにも標的細胞部分にも結合せず、蛍光タンパク質を含まないキメラタンパク質を含むかまたはコードする。
【００６０】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載される治療用タンパク質を含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、ゴルジ体タンパク質、分泌タンパク質、または小胞体タンパク質、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、二量体（例えば、供給源細胞に対して外因性である二量体）、ヘテロ二量体（例えば、供給源細胞に対して外因性であるヘテロ二量体）、または二量体化ドメイン（例えば、供給源細胞に対して外因性であるポリペプチドにおける二量体化ドメイン）のうちの１つまたは複数を含まない。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、膜タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、フソゲンは、非ウイルス性フソゲン、例えば、哺乳動物フソゲンである。一部の実施形態では、フソゲン（例えば、外因性または過剰発現されているフソゲン）は、供給源細胞からの小胞形成を促進しない。一部の実施形態では、フソソームは、除核細胞を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、膜貫通ドメインを含む膜タンパク質を含むかまたはそれをコードする。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、脂質アンカータンパク質を含むかまたはそれをコードする。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、膜貫通タンパク質に結合するタンパク質を含むかまたはそれをコードする。例えば、タンパク質は、膜貫通タンパク質の細胞外部分に結合する細胞外タンパク質であってもよく、またはタンパク質は、膜貫通タンパク質の細胞内部分に結合する細胞内タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、膜貫通ドメインが欠如したタンパク質を含むかまたはそれをコードする。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、部分的に膜（例えば、標的細胞またはフソソームの膜）にまたがり、完全には膜にまたがらない、タンパク質を含むかまたはそれをコードする。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、平面膜ヘリックスを含むか、またはタンパク質は、膜に完全にはまたがらない疎水性ループを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、膜貫通ドメインを含まないタンパク質を含むかまたはそれをコードし、ここで、タンパク質は、膜表面と、例えば、静電相互作用またはイオン相互作用を通じて相互作用する）。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される、膜タンパク質ペイロード剤を標的細胞の膜に送達するフソソームは、さらに、１つまたは複数の薬剤、例えば、タンパク質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）、オルガネラ、またはおよび／または代謝産物を、標的細胞のサイトゾルに送達することができる（例えば、送達する）。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、薬剤を、標的細胞のサイトゾルに送達するステップを含み、一部のそのような実施形態では、サイトゾルに送達される薬剤は、タンパク質（またはタンパク質をコードするかまたはそれをコードするものに相補的な核酸、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）である。
【００６３】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１の配列であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１の配列の断片、バリアント、またはホモログであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１の配列を含むタンパク質をコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１の配列の断片、バリアント、またはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるかまたはそれを含む。
【００６４】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表５〜１５から選択されるタンパク質であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表５〜１５から選択されるタンパク質の断片、バリアント、またはホモログであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表５〜１５から選択されるタンパク質であるかまたはそれを含むタンパク質をコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表５〜１５から選択されるタンパク質の断片、バリアント、またはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるかまたはそれを含む。
【００６５】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメイン（例えば、１つ、２つ、または３つのシグナル伝達ドメイン）を含む、第１世代のＣＡＲであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および２つのシグナル伝達ドメインを含む、第２世代のＣＡＲであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む、第３世代のＣＡＲを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、およびＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む、第４世代のＣＡＲ。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖまたはＦａｂであるかまたはそれを含む。
【００６６】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、新生物細胞に特徴的な抗原を標的とする。一部の実施形態では、新生物細胞に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合型受容体、酵素結合型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、複数回膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞アルファ鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１  ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒａ、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、カノニカルＴｒｅｇ  ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、ＴＲＥＧ、ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、ルイス−γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ  １／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ−１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ��ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ−１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、もしくはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｔｎ  Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン−１１受容体ａ（ＩＬ−１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体−ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレイクポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰＩＢ  Ｉ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ネオ抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）  ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１  ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、もしくはｔｒｋＣ、またはこれらの抗原性断片もしくは抗原性部分から選択される。
【００６７】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞に特徴的な抗原を標的とする。一部の実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｔ細胞に特徴的な細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、能動的もしくは受動的輸送タンパク質、例えば、例として、イオンチャネルタンパク質、細孔形成タンパク質など）、膜貫通受容体、膜酵素、および／または細胞接着性タンパク質から選択される。一部の実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＡＫＴ３；ＡＴＦ２；ＢＣＬ１０；ＣＡＬＭ１；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）；ＣＤ４；ＣＤ８；ＣＤ２８；ＣＤ４５；ＣＤ８０（Ｂ７−１）；ＣＤ８６（Ｂ７−２）；ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）；ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）；ＥＬＫ１；ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）；ＥＲＫ２；ＦＯＳ；ＦＹＮ；ＧＲＡＰ２（ＧＡＤＳ）；ＧＲＢ２；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＬＡ−ＤＲＢ１；ＨＬＡ−ＤＲＢ３；ＨＬＡ−ＤＲＢ４；ＨＬＡ−ＤＲＢ５；ＨＲＡＳ；ＩＫＢＫＡ（ＣＨＵＫ）；ＩＫＢＫＢ；ＩＫＢＫＥ；ＩＫＢＫＧ（ＮＥＭＯ）；ＩＬ２；ＩＴＰＲ１；ＩＴＫ；ＪＵＮ；ＫＲＡＳ２；ＬＡＴ；ＬＣＫ；ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）；ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）；ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）；ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）；ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）；ＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）；ＭＡＰ３Ｋ１（ＭＥＫＫ１）；ＭＡＰ３Ｋ３；ＭＡＰ３Ｋ４；ＭＡＰ３Ｋ５；ＭＡＰ３Ｋ８；ＭＡＰ３Ｋ１４（ＮＩＫ）；ＭＡＰＫ８（ＪＮＫ１）；ＭＡＰＫ９（ＪＮＫ２）；ＭＡＰＫ１０（ＪＮＫ３）；ＭＡＰＫ１１（ｐ３８β）；ＭＡＰＫ１２（ｐ３８γ）；ＭＡＰＫ１３（ｐ３８δ）；ＭＡＰＫ１４（ｐ３８α）；ＮＣＫ；ＮＦＡＴ１；ＮＦＡＴ２；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＦＫＢＩＡ；ＮＲＡＳ；ＰＡＫ１；ＰＡＫ２；ＰＡＫ３；ＰＡＫ４；ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ；ＰＩＫ３Ｃ３（ＶＰＳ３４）；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３ＣＤ；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＫＣＡ；ＰＫＣＢ；ＰＫＣＭ；ＰＫＣＱ；ＰＬＣＹ１；ＰＲＦ１（パーフォリン）、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＥＬＡ、ＳＤＦ１、ＳＨＰ２、ＳＬＰ７６、ＳＯＳ、ＳＲＣ、ＴＢＫ１、ＴＣＲＡ、ＴＥＣ、ＴＲＡＦ６、ＶＡＶ１、ＶＡＶ２、またはＺＡＰ７０であり得る。
【００６８】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、自己免疫障害または炎症性障害に特徴的な抗原を標的とする。一部の実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害は、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症もしくは強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素病、尋常性天疱瘡、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、血友病Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、エヴァンス症候群、ＩｇＭ媒介性ニューロパチー、クリオグロブリン血症（ｃｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱、後天性血管浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発ニューロパチー、および自己免疫性血小板減少症もしくは好中球減少症、または純赤芽球癆から選択されるが、同種免疫疾患の例示的な非限定的な例としては、造血器移植もしくは固形臓器移植、輸血、胎児同種感作を伴う妊娠による同種感作（例えば、Ｂｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  １５（４）：９３１−４１を参照されたい）または異種感作、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児の溶血性疾患、外来抗原への感作、例えば、酵素もしくはタンパク質置き換え療法、血液製剤、および遺伝子療法により処置される先天性もしくは後天性の欠損障害の置換えにより生じ得るものが挙げられる。一部の実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合型受容体、酵素結合型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、Ｂ細胞、形質細胞、形質芽細胞に発現されているリガンド、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＺＡＰ−７０、ＬＦＡ−１、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ５、またはＣＤ２に結合する。
【００６９】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、感染性疾患に特徴的な抗原を標的とする。一部の実施形態では、感染性疾患は、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタインバーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択される。一部の実施形態では、感染性疾患に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合型受容体、酵素結合型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ結合型受容体、ＨＩＶ  Ｅｎｖ、ｇｐｌ２０、またはＨＩＶ−１  Ｅｎｖ上のＣＤ４誘導型エピトープから選択される。
【００７０】
一部の実施形態では、ＣＡＲ膜貫通ドメインは、少なくとも、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはこれらの機能性バリアントの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、少なくとも、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂ、またはこれらの機能性バリアントの膜貫通領域を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１  （ＬＦＡ−１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ゼータドメイン、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはこれらの機能性断片のうちの１つまたは複数から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。
【００７２】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能性バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能性バリアント、および（ｉｉｉ）４−１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能性バリアントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータドメインもしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能性バリアントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能性バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４−１ＢＢドメイン、またはその機能性バリアント、および／または（ｉｉｉ）４−１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能性バリアントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能性バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能性バリアント、（ｉｉｉ）４−１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能性バリアント、および（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激性リガンド導入遺伝子を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数のスペーサーをさらに含み、例えば、ここで、スペーサーは、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間の第１のスペーサーである。一部の実施形態では、第１のスペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは改変バージョンの少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、スペーサーは、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第２のスペーサーである。一部の実施形態では、第２のスペーサーは、オリゴペプチドであり、例えば、ここで、オリゴペプチドは、グリシン−セリンのダブレットを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞の表面において、標的細胞に融合する。一部の実施形態では、フソソームは、リソソーム非依存的様式で、標的細胞への融合を促進する。一部の実施形態では、フソソームおよび／またはフソソーム内容物は、エンドサイトーシスによって、または非エンドサイトーシス経路を介して、標的細胞に進入する。一部の実施形態では、フソソームは、エンドサイトーシスによって標的細胞に進入し、例えば、ここで、所与のフソソームについて、エンドサイトーシス経路を介して送達される膜タンパク質ペイロード剤のレベルは、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、０．０１〜０．６、０．０１〜０．１、０．１〜０．３、もしくは０．３〜０．６であるか、またはクロロキン処置参照細胞よりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。一部の実施形態では、フソソームは、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に進入し、例えば、ここで、所与のフソソームについて、非エンドサイトーシス経路を介して送達される膜タンパク質ペイロード剤のレベルは、例えば、実施例９０のアッセイを使用して、０．１〜０．９５、０．１〜０．２、０．２〜０．３、０．３〜０．４、０．４〜０．５、０．５〜０．６、０．６〜０．７、０．７〜０．８、０．８〜０．９、０．９〜０．９５であるか、またはクロロキン処置参照細胞よりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。
【００７５】
一部の実施形態では、標的細胞は、凝集またはミスフォールディングされた膜タンパク質を含む。一部の実施形態では、フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、標的細胞における凝集もしくはミスフォールディングされたタンパク質のレベルを低減することができる（例えば、そのレベルを低減する）か、または本明細書における方法は、標的細胞における凝集もしくはミスフォールディングされたタンパク質のレベルを低減するステップを含む。
【００７６】
本明細書に記載されるように、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、膜タンパク質を、標的細胞の細胞膜に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、一部の実施形態では、本明細書における方法は、膜タンパク質を、標的細胞の細胞膜に送達するステップを含む。一部の実施形態では、タンパク質を送達するステップは、標的細胞がタンパク質を産生し、それを膜に局在化させるように、タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）を標的細胞に送達することを含む。一部の実施形態では、フソソームは、タンパク質を含むか、または方法が、それを送達するステップをさらに含み、フソソームと標的細胞との融合により、タンパク質が、標的細胞の細胞膜に輸送される。一部の実施形態では、薬剤は、細胞表面リガンド、または細胞表面受容体に結合する抗体を含む。一部の実施形態では、フソソームは、第２の細胞表面リガンドまたは細胞表面受容体に結合する抗体を含むかまたはそれをコードし、必要に応じて、さらに、１つまたは複数の追加の細胞表面リガンドまたは細胞表面受容体に結合する抗体（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、５０個、もしくはそれを上回る）を含むかまたはそれをコードする、第２の薬剤をさらに含むか、または方法が、それを送達するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第１の薬剤および第２の薬剤は、複合体を形成し、ここで、必要に応じて、複合体は、１つまたは複数の追加の細胞表面リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、薬剤は、細胞表面受容体、例えば、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されている、細胞表面を含むかまたはそれをコードする。一部の実施形態では、提供されるフソソームは、第２の細胞表面受容体を含むかまたはそれをコードし、必要に応じて、さらに、１つまたは複数の追加の細胞表面受容体（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、５０個、もしくはそれを上回る細胞表面受容体）を含むかまたはそれをコードする、第２の薬剤をさらに含むか、または方法が、それを送達するステップをさらに含む。
【００７７】
一部の実施形態では、第２の薬剤、例えば、治療剤は、タンパク質、タンパク質複合体（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、もしくは５０個のタンパク質、例えば、少なくとも少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、もしくは５０個の異なるタンパク質）ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体、もしくはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ）、または小分子から選択される。
【００７８】
一部の実施形態では、第１の薬剤および第２の薬剤は、複合体を形成し、ここで、必要に応じて、複合体は、１つまたは複数の追加の細胞表面受容体をさらに含む。一部の実施形態では、薬剤は、抗原または抗原提示タンパク質を含むかまたはそれをコードする。
【００７９】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、標的細胞がタンパク質を産生しそれを分泌することを可能にする条件下において、タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）を標的細胞に送達することによって、分泌された薬剤、例えば、分泌タンパク質を、標的部位（例えば、細胞外領域）に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、一部の実施形態では、本明細書における方法は、本明細書に記載される分泌された薬剤を送達するステップを含む。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、供給源細胞に対して内因性または外因性であり、一部の実施形態では、分泌タンパク質は、標的細胞に対して内因性または外因性である。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、タンパク質治療薬、例えば、抗体分子、サイトカイン、または酵素を含む。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、オートクリンシグナル伝達分子またはパラクリンシグナル伝達分子を含む。いくつかの実施形態では、分泌された薬剤は、分泌性顆粒を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、抗原であるかまたはそれを含む膜タンパク質または分泌タンパク質を送達することができる（例えば、送達する）。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、抗原抗原提示タンパク質であるかまたはそれを含む膜タンパク質または分泌タンパク質を、必要に応じて抗原と一緒に（例えば、複合体として）送達することができる（例えば、送達する）。
【００８１】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、１つまたは複数の細胞表面受容体を、標的細胞（例えば、免疫細胞）に供与することができる（例えば、供与する）。同様に、一部の実施形態では、本明細書における方法は、１つまたは複数の細胞表面受容体を供与するステップを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、免疫刺激性リガンド、抗原提示タンパク質、腫瘍サプレッサータンパク質、アポトーシス促進性タンパク質、または前述のもののうちのいずれかの受容体もしくは結合パートナーであるかまたはそれを含む膜タンパク質または分泌タンパク質を、送達することができる（例えば、送達する）。一部の実施形態では、フソソームは、免疫調節性、例えば、免疫刺激性である薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または少なくとも１つの第２の薬剤）を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、標的細胞に抗原を提示させることができる（例えば、提示させる）。同様に、一部の実施形態では、本明細書における方法は、標的細胞上に抗原を提示するステップを含む。
【００８４】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、本明細書に記載される膜タンパク質（もしくは分泌タンパク質）の発現を引き起こすように、例えば、標的細胞における遺伝子発現を一時的に改変するか、または例えば、標的細胞のゲノムへの組込みによりそのゲノムを改変するために、核酸を標的細胞に送達することができる（例えば、送達する）。
【００８５】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、標的細胞のタンパク質欠損が、少なくとも一時的に救助されるように、タンパク質（例えば、膜タンパク質、例えば、輸送体タンパク質または分泌タンパク質、例えば、免疫抑制性タンパク質）を、標的細胞に送達することができる（例えば、送達する）。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される膜タンパク質ペイロード剤によってかまたは膜タンパク質ペイロード剤として提供される膜タンパク質は、免疫グロブリン部分または実体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦａｂ、ｓｄＡｂ、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ（ｚｙｂｏｄｙ）、ラクダ抗体、ＢｉＴＥ、クアドローマ、ｂｓＤｂなど）であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質は、１つまたは複数の共有結合により会合した非ペプチド部分、例えば、例として、１つまたは複数の炭水化物部分、脂質部分、ポリエチレングリコール部分、小分子など、およびこれらの組合せを含み得る。
【００８７】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、標的細胞に、タンパク質、例えば、治療用タンパク質を分泌させることができる（例えば、分泌させる）。同様に、一部の実施形態では、本明細書における方法は、標的細胞に、タンパク質を分泌させるステップを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される膜タンパク質ペイロード剤によってかまたは膜タンパク質ペイロード剤として提供される膜タンパク質は、１つまたは複数の細胞表面リガンド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、５０個、またはそれを上回る細胞表面リガンド）であるかまたはそれを含む。同様に、一部の実施形態では、本明細書における方法は、１つまたは複数の細胞表面リガンドを標的細胞に提示するステップを含む。一部の実施形態では、細胞表面リガンドを有するフソソームは、好中球（例えば、さらに標的細胞が腫瘍浸潤リンパ球である）、樹状細胞（例えば、さらに標的細胞がナイーブＴ細胞である）、または好中球（例えば、さらに標的が腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞である）から選択される供給源細胞に由来する。一部の実施形態では、そのようなフソソームは、膜複合体、例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つのタンパク質を含む複合体、例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含む。一部の実施形態では、そのようなフソソームは、抗体、例えば、毒性抗体を含み、例えば、フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、抗体を、例えば、標的部位へのホーミングによって、標的部位に送達することができる（例えば、送達する）。一部の実施形態では、供給源細胞は、ＮＫ細胞または好中球である。
【００８９】
一部の実施形態では、膜タンパク質は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合型受容体、酵素結合型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、複数回膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞アルファ鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１  ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒａ、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、カノニカルＴｒｅｇ  ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、ＴＲＥＧ、ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、ルイス−γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ  １／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ−１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ−１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、もしくはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｔｎ  Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン−１１受容体ａ（ＩＬ−１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体−ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレイクポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰＩＢ  Ｉ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ネオ抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）  ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１  ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、またはｔｒｋＣから選択される。
【００９０】
一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞または標的細胞の表面特徴部と会合する、および／またはそれに結合する。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書における方法は、標的細胞からのタンパク質の分泌または標的細胞の表面上のリガンドの提示を引き起こすステップを含む。一部の実施形態では、フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、標的細胞の細胞死を引き起こすことができる。一部の実施形態では、フソソームは、ＮＫ供給源細胞に由来する。
【００９２】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、１つまたは複数の局所環境特徴部、例えば、例として、代謝産物、インターロイキン、抗原など、またはこれらの組合せを感知する、および／またはそれに応答する。
【００９３】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、走化性、溢出、および／または１つもしくは複数の代謝活性が可能である。いくつかの実施形態では、代謝活性は、キヌリニン（ｋｙｎｅｕｒｉｎｉｎｅ）、糖新生、プロスタグランジン脂肪酸酸化、アデノシン代謝、尿素サイクル、および発熱性呼吸から選択される。一部の実施形態では、供給源細胞は、好中球であり、フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、傷害の部位にホーミングすることができる。一部の実施形態では、供給源細胞は、マクロファージであり、フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、ファゴサイトーシスが可能である。一部の実施形態では、供給源細胞は、褐色脂肪組織細胞であり、フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、脂肪分解が可能である。
【００９４】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、複数の薬剤（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、または５０個の薬剤）を含み（例えば、それを標的細胞に送達することができ）、ここで、少なくとも１つの薬剤は、膜タンパク質ペイロードであるかまたはそれを含み、一部のそのような実施形態では、薬剤のうちの１つまたは複数は、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）および／またはｍＲＮＡであるかまたはそれを含む。
【００９５】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤を含む（例えば、それを標的細胞に送達することができる）、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、標的細胞を再プログラミングまたは分化転換することができ、例えば、フソソーム（および／またはその組成物）は、標的細胞の再プログラミングまたは分化転換を誘導する１つまたは複数の薬剤を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で、標的細胞と融合する。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、少なくとも少なくとも１０％高い割合で、標的細胞と融合する。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い割合で、標的細胞と融合する。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも、少なくとも５０％高い割合で、標的細胞と融合する。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の薬剤が２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合する。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の薬剤が２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合する。
【００９７】
一部の実施形態では、フソゲンは、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピー、またはそれを上回らないコピー数で、存在する。一部の実施形態では、フソゲンは、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する。一部の実施形態では、フソソームに含まれるフソゲンのうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、細胞膜に配置される。いくつかの実施形態では、フソソームはまた、内部に、例えば、細胞質またはオルガネラに、フソゲンを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピー、またはそれを上回らないコピー数で、治療剤（例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤）を含む。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数で、タンパク質治療剤を含む。一部の実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数で、核酸治療剤を含む。一部の実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数で、ＤＮＡ治療剤を含む。一部の実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数で、ＲＮＡ治療剤を含む。一部の実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数で、供給源細胞に対して外因性である治療剤を含む。一部の実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数で、供給源細胞に対して外因性であるタンパク質治療剤を含む。一部の実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数で、供給源細胞に対して外因性である核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）治療剤を含む。一部の実施形態では、フソゲンのコピー数の治療剤のコピー数に対する比は、１，０００，０００：１〜１００，０００：１、１００，０００：１〜１０，０００：１、１０，０００：１〜１，０００：１、１，０００：１〜１００：１、１００：１〜５０：１、５０：１〜２０：１、２０：１〜１０：１、１０：１〜５：１、５：１〜２：１、２：１〜１：１、１：１〜１：２、１：２〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：２０、１：２０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１，０００、１：１，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：１００，０００、または１：１００，０００〜１：１，０００，０００である。一部の実施形態では、フソゲンのコピー数の膜タンパク質ペイロード剤のコピー数に対する比は、１，０００，０００：１〜１００，０００：１、１００，０００：１〜１０，０００：１、１０，０００：１〜１，０００：１、１，０００：１〜１００：１、１００：１〜５０：１、５０：１〜２０：１、２０：１〜１０：１、１０：１〜５：１、５：１〜２：１、２：１〜１：１、１：１〜１：２、１：２〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：２０、１：２０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１，０００、１：１，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：１００，０００、または１：１００，０００〜１：１，０００，０００である。
【００９９】
一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞に、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーの治療剤（例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤）を送達する。一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞に、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのタンパク質治療剤を送達する。一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞に、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーの核酸治療剤を送達する。一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞に、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのＲＮＡ治療剤を送達する。一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞に、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのＤＮＡ治療剤を送達する。
【０１００】
一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞に、フソソームに含まれる膜タンパク質ペイロード剤（例えば、治療剤、例えば、供給源細胞に対して内因性または外因性である治療剤）のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を送達する。一部の実施形態では、標的細胞と融合するフソソームは、標的細胞に、平均で、標的細胞と融合するフソソームに含まれる膜タンパク質ペイロード剤（例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、内因性治療用膜タンパク質ペイロード剤または供給源細胞に対して外因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤）のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を送達する。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、標的組織に、フソソーム組成物に含まれる膜タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤薬剤、例えば、供給源細胞に対して外因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤）のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を送達する。
【０１０１】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、フソソーム中の総タンパク質１ｍｇ当たり、０．０００００００１ｍｇのフソゲン〜１ｍｇのフソゲン、例えば、フソソーム中の総タンパク質１ｍｇ当たり、０．０００００００１〜０．００００００１ｍｇ、０．００００００１〜０．０００００１ｍｇ、０．０００００１〜０．００００１ｍｇ、０．００００１〜０．０００１ｍｇ、０．０００１〜０．００１ｍｇ、０．００１〜０．０１ｍｇ、０．０１〜０．１ｍｇ、または０．１〜１ｍｇのフソゲンを含む。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、フソソーム中の脂質１ｍｇ当たり、０．０００００００１ｍｇのフソゲン〜５ｍｇのフソゲン、例えば、フソソーム中の脂質１ｍｇ当たり、０．０００００００１〜０．００００００１ｍｇ、０．００００００１〜０．０００００１ｍｇ、０．０００００１〜０．００００１ｍｇ、０．００００１〜０．０００１ｍｇ、０．０００１〜０．００１ｍｇ、０．００１〜０．０１ｍｇ、０．０１〜０．１ｍｇ、０．１〜１ｍｇ、または１〜５ｍｇのフソゲンを含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、供給源細胞のものに実質的に類似の脂質組成を特徴とするか、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つもしくは複数が、供給源細胞における対応する脂質レベルの１０％以内、１５％以内、２０％以内、２５％以内、３０％以内、３５％以内、４０％以内、４５％以内、もしくは５０％以内、例えば、７５％以内である。
【０１０３】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、供給源細胞におけるカルジオリピン：セラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：セラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ジアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ジアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ヘキソシルセラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ヘキソシルセラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：リゾホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：リゾホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルコリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルコリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：リゾ−ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ホスファチジルコリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルコリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルエタノールアミンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：コレステロールエステルの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：コレステロールエステルの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：スフィンゴミエリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：スフィンゴミエリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：セラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：セラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：ヘキソシルセラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：リゾホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルコリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルコリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾ−ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるカルジオリピン：ホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：ホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：コレステロールエステルの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：コレステロールエステルの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：セラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：セラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：ヘキソシルセラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ヘキソシルセラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルコリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルコリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾ−ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以
内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：セラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：セラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：リゾホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルコリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルコリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾ−ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：ホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：ホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：コレステロールエステルの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：コレステロールエステルの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるホスファチジルセリン：トリアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるホスファチジルセリン：トリアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：セラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：セラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：ジアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：ジアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：ヘキソシルセラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：リゾホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルコリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルコリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾ−ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：ホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：ホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：コレステロールエステルの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：コレステロールエステルの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるスフィンゴミエリン：トリアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるスフィンゴミエリン：トリアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：セラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：セラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：ジアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：ジアシルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：ヘキソシルセラミドの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：ヘキソシルセラミドの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：リゾホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：リゾホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルコリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルコリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルエタノールアミンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルセリンの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：リゾ−ホスファチジルセリンの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：ホスファチデートの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：ホスファチデートの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：ホスファチジルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：ホスファチジルグリセロールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：ホスファチジルイノシトールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：ホスファチジルイノシトールの比を特徴とするか、または供給源細胞におけるコレステロールエステル：トリアシルグリセロールの比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、もしくは５０％以内であるコレステロールエステル：トリアシルグリセロールの比を特徴とする。
【０１０４】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、供給源細胞のものに類似のプロテオーム組成を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内である、脂質のタンパク質に対する比を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内である、タンパク質の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に対する比を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比よりも高い、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い、タンパク質のＤＮＡに対する比を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内である、脂質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞における対応する比よりも高い、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い、脂質の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する比を特徴とする。
【０１０５】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７５のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞の半減期の１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、１００％以内である、対象、例えば、マウスにおける半減期を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７５のアッセイによって、例えば、ヒト対象またはマウスにおいて、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、または２４時間である、対象、例えば、マウスにおける半減期を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、フソソームの半減期よりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、２倍、５倍、または１０倍長い、対象における半減期を特徴とする、膜タンパク質ペイロード剤（例えば、治療剤）を送達することができる（例えば、送達する）。例えば、フソソームは、治療剤を標的細胞に送達することができ、この薬剤は、フソソームがもはや存在していないかまたは検出可能でなくなった後に、存在していてもよい。
【０１０６】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合に、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、膜を越えてグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）を輸送する。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のものの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、または１００％以内である、内腔におけるエステラーゼ活性を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における代謝活性レベルの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、または１００％以内である、代謝活性レベル（例えば、クエン酸シンターゼ活性）を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における代謝活性レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、代謝活性レベル（例えば、クエン酸シンターゼ活性）を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における呼吸レベルの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、または１００％以内である、呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞における呼吸レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、多くとも１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシン−Ｖ染色レベルを特徴とするか、またはフソソームは、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したその他は同様のフソソームまたはその組成物もしくは調製物のアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームは、実施例７０のアッセイにおいて、メナジオンで処置したマクロファージのアネキシン−Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは９０％低いアネキシン−Ｖ染色レベルを含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のものよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも高いｍｉＲＮＡ含量レベルを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のｍｉＲＮＡ含量レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも高い（例えば、最大で供給源細胞のｍｉＲＮＡ含量レベルの１００％の）ｍｉＲＮＡ含量レベルを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例１０８のアッセイによって測定した場合に、供給源細胞の総ＲＮＡ含量レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも高い（例えば、最大で供給源細胞の総ＲＮＡ含量レベルの１００％の）総ＲＮＡ含量レベルを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞のものの１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、もしくはそれを上回る、例えば、供給源細胞のものの１％〜２％以内、２％〜３％以内、３％〜４％以内、４％〜５％以内、５％〜１０％以内、１０％〜２０％以内、２０％〜３０％以内、３０％〜４０％以内、４０％〜５０％以内、５０％〜６０％以内、６０％〜７０％以内、７０％〜８０％以内、もしくは８０％〜９０％以内である、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を特徴とする。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞のものの９０％以内の可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を有する。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合に、フソソームの脂質含量の５％を下回る、１％を下回る、０．５％を下回る、０．０１％を下回る、０．００５％を下回る、０．０００１％を下回る、０．００００１％を下回る、またはそれを下回るＬＰＳレベルを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの伝達、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識化グルコース、例えば、２−ＮＢＤＧ）の取込みを、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下におけるその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、行うことができる。一部の実施形態では、フソソームは、対象、例えば、マウスに投与されると、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、投与されたフソソーム集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、例えば、実施例８７もしくは１００のアッセイによって、２４、４８、または７２時間後に、標的組織に存在する。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％高いジャクスタクリンシグナル伝達レベルを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大で１００％）のジャクスタクリンシグナル伝達レベルを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％高いパラクリンシグナル伝達レベルを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大で１００％）のパラクリンシグナル伝達レベルを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、または１００％以内のレベルで、アクチンを重合することを特徴とする。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、１００％以内の膜電位を特徴とするか、または提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、約−２０〜−１５０ｍＶ、−２０〜−５０ｍＶ、−５０〜−１００ｍＶ、もしくは−１００〜−１５０ｍＶの膜電位を特徴とするか、またはフソソームは、−１ｍｖを下回る、−５ｍｖを下回る、−１０ｍｖを下回る、−２０ｍｖを下回る、−３０ｍｖを下回る、−４０ｍｖを下回る、−５０ｍｖを下回る、−６０ｍｖを下回る、−７０ｍｖを下回る、−８０ｍｖを下回る、−９０ｍｖを下回る、−１００ｍｖを下回る膜電位を有する。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例５７のアッセイを使用して、例えば、供給源細胞の溢出割合の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の割合で、血管から溢出することができ、例えば、供給源細胞は、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例５８のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マクロファージと比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大で１００％）の走化性が可能である。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６０のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マクロファージと比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大で１００％）のファゴサイトーシスが可能である。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を越えることができる。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚線維芽細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％高い割合で、タンパク質を分泌することができる。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚線維芽細胞と比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大で１００％）の割合で、タンパク質を分泌することができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例１９のアッセイを使用して、転写が可能でないか、または参照細胞、例えば、供給源細胞の転写活性のものの１％を下回る、２．５％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回る転写活性を有する。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例２０のアッセイを使用して、核ＤＮＡ複製が可能でないか、または参照細胞、例えば、供給源細胞の核ＤＮＡ複製の１％を下回る、２．５％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回る核ＤＮＡ複製を有する。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例３７のアッセイを使用して、クロマチンが欠如しているか、または参照細胞、例えば、供給源細胞のクロマチン含量の１％を下回る、２．５％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回るクロマチン含量を有する。
【０１０９】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物の特徴は、参照細胞との比較によって説明される。いくつかの実施形態では、参照細胞は、供給源細胞である。いくつかの実施形態では、参照細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ−１、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＩＭＲ  ９０、ＩＭＲ  ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ−１０８０、またはＢＪ細胞である。一部の実施形態では、フソソーム集団および／またはその組成物もしくは調製物の特徴は、参照細胞集団、例えば、供給源細胞集団、またはＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ−１、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＩＭＲ  ９０、ＩＭＲ  ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ−１０８０、もしくはＢＪ細胞の集団との比較によって説明される。
【０１１０】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、所定の参照値を下回る病原体レベルを特徴とし、例えば、病原体を実質的に含まない。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、所定の参照値を下回る混入物質（例えば、核成分、例えば、核ＤＮＡ）レベルを有し、例えば、１つまたは複数の指定される混入物質を実質的に含まない。一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を特徴とする。
【０１１１】
一部の実施形態では、供給源細胞または標的細胞は、内皮細胞、線維芽細胞、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、例えば、対象の細胞に由来する人工多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児皮膚、青年皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織に由来する幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆体細胞（例えば、網膜前駆体細胞、骨髄芽球、骨髄系前駆体細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆体細胞、正赤芽球、もしくは血液芽細胞）、始原細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射神経膠細胞（ｒａｄｉａｌ  ｇｉａｌ  ｃｅｌｌ）、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ−１、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＩＭＲ  ９０、ＩＭＲ  ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ−１０８０、もしくはＢＪ細胞）である。一部の実施形態では、供給源細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、もしくはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外である。一部の実施形態では、供給源細胞または標的細胞は、白血球または幹細胞である。一部の実施形態では、供給源細胞または標的細胞は、好中球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、マクロファージ、顆粒球、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される。
【０１１２】
一部の実施形態では、供給源細胞は、付着または懸濁液条件下において成長させた細胞である。一部の実施形態では、供給源細胞は、初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞系（例えば、骨髄芽球（ｍｙｅｌｏｂａｓｔ）細胞系、例えば、Ｃ２Ｃ１２）である。一部の実施形態では、供給源細胞は、同種であり、例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られる。一部の実施形態では、供給源細胞は、自家であり、例えば、標的細胞と同じ生物から得られる。一部の実施形態では、供給源細胞は、異種であり、例えば、標的細胞とは異なる種の生物から得られる。
【０１１３】
一部の実施形態では、供給源細胞は、供給源細胞に対して外因性である第２の薬剤、例えば、治療剤、例えば、タンパク質または核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らずにフソソームに含まれて存在するか、またはフソソーム１つ当たり、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らない平均レベルで、存在する。
【０１１４】
一部の実施形態では、フソソームは、例えば、ｓｉＲＮＡまたは遺伝子編集酵素による供給源細胞、例えば、哺乳動物供給源細胞の処置に起因して、供給源細胞と比較して、１つまたは複数の内因性分子、例えば、タンパク質または核酸のレベルの変更、例えば、増加または減少を有する。一部の実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らない内因性分子を含むか、またはフソソーム１つ当たり、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らない内因性分子の平均レベルで、存在する。一部の実施形態では、内因性分子（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）は、供給源細胞におけるその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８高い濃度で、フソソーム中に存在する。一部の実施形態では、内因性分子（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）は、供給源細胞におけるその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８低い濃度で、フソソーム中に存在する。
【０１１５】
一部の実施形態では、フソソームは、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、供給源細胞に対して外因性または内因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤を含む。一部の実施形態では、治療用膜タンパク質ペイロード剤は、タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質、細部表面タンパク質、分泌タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡのうちの１つまたは複数から選択される。
【０１１６】
一部の実施形態では、標的細胞は、生物内にある。一部の実施形態では、標的細胞は、生物から単離された初代細胞である。一部の実施形態では、標的化ドメインは、標的細胞の標的細胞部分、例えば、細胞表面特徴部と相互作用する。一部の実施形態では、フソソームは、前記標的細胞部分を含まない。一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞上のフソゲン結合性パートナーと相互作用し、それによってフソソームが標的細胞に結合または融合することを可能にする、フソゲンを含む。一部の実施形態では、フソソームは、前記フソゲン結合性パートナーを含まない。一部の実施形態では、標的化ドメインは、フソゲンの一部ではない。一部の実施形態では、フソゲンは、標的化ドメインを含む。一部の実施形態では、フソゲン結合性パートナーは、標的細胞部分とは異なる実体であるか、またはその一部分である。一部の実施形態では、フソゲン結合性パートナーは、標的細胞部分であるか、またはその一部分である。
【０１１７】
一部の実施形態では、フソソームは、エンドサイトーシスによって標的細胞に進入し、例えば、ここで、エンドサイトーシス経路を介して送達される薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または第２の薬剤）のレベルは、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、０．０１〜０．６、０．０１〜０．１、０．１〜０．３、もしくは０．３〜０．６であるか、または同様のフソソームと接触させたクロロキン処置参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。一部の実施形態では、標的細胞に進入するフソソーム組成物または調製物中のフソソームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％は、非エンドサイトーシス経路を介して進入し、例えば、フソソームは、細胞表面との融合を介して標的細胞に進入する。一部の実施形態では、標的細胞に進入するフソソーム組成物または調製物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％は、細胞質に進入する（例えば、エンドソームにもリソソームにも進入しない）。一部の実施形態では、標的細胞に進入するフソソーム組成物または調製物中のフソソームの９０％を下回る、８０％を下回る、７０％を下回る、６０％を下回る、５０％を下回る、４０％を下回る、３０％を下回る、２０％を下回る、１０％を下回る、５％を下回る、４％を下回る、３％を下回る、２％を下回る、１％を下回るものは、エンドソームまたはリソソームに進入する。一部の実施形態では、フソソームは、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に進入し、例えば、ここで、送達される薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または第２の薬剤）のレベルは、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、クロロキン処置参照細胞の少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％である。一部の実施形態では、フソソームは、ダイナミン媒介経路を介して、薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または第２の薬剤）を標的細胞に送達する。一部の実施形態では、ダイナミン媒介経路を介して送達される薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または第２の薬剤）のレベルは、例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合に、０．０１〜０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触させたＤｙｎａｓｏｒｅ処置標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。一部の実施形態では、フソソームは、マクロピノサイトーシスを介して、薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または第２の薬剤）を標的細胞に送達する。一部の実施形態では、マクロピノサイトーシスを介して送達される薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または第２の薬剤）のレベルは、例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合に、０．０１〜０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触させたＥＩＰＡ処置標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。一部の実施形態では、フソソームは、アクチン媒介経路を介して、薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または第２の薬剤）を標的細胞に送達する。一部の実施形態では、アクチン媒介経路を介して送達される薬剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／または第２の薬剤）のレベルは、例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合に、０．０１〜０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触させたラトランクリンＢ処置標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。
【０１１８】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例３３のアッセイによって、１ｇ／ｍＬを下回る、１〜１．１ｇ／ｍＬ、１．０５〜１．１５ｇ／ｍＬ、１．１〜１．２ｇ／ｍＬ、１．１５〜１．２５ｇ／ｍＬ、１．２〜１．３ｇ／ｍＬ、１．２５〜１．３５ｇ／ｍＬ、または１．３５ｇ／ｍＬを上回る密度を有する。
【０１１９】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、タンパク質質量を基準として０．０１％を下回る、０．０５％を下回る、０．１％を下回る、０．５％を下回る、１％を下回る、１．５％を下回る、２％を下回る、２．５％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、もしくは１０％を下回る供給源細胞を含むか、または細胞のうちの０．０１％を下回る、０．０５％を下回る、０．１％を下回る、０．５％を下回る、１％を下回る、１．５％を下回る、２％を下回る、２．５％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、もしくは１０％を下回るものが、機能性核を有する。一部の実施形態では、フソソーム組成物または調製物中のフソソームのうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、オルガネラ、例えば、ミトコンドリアを含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、少なくとも０．０１％〜０．０５％、０．０５％〜０．１％、０．１％〜０．５％、０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、または８０％〜９０％のフソソームを含み、ここで、ｉ）フソゲンは、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在するか、ｉｉ）フソソーム１つ当たりのフソゲンのコピー数の膜タンパク質ペイロード剤のコピー数に対する比は、１，０００，０００：１〜１００，０００：１、１００，０００：１〜１０，０００：１、１０，０００：１〜１，０００：１、１，０００：１〜１００：１、１００：１〜５０：１、５０：１〜２０：１、２０：１〜１０：１、１０：１〜５：１、５：１〜２：１、２：１〜１：１、１：１〜１：２、１：２〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：２０、１：２０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１，０００、１：１，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：１００，０００、もしくは１：１００，０００〜１：１，０００，０００であるか、またはｉｉｉ）膜タンパク質ペイロード剤は、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合に、フソソーム１つ当たり少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する。
【０１２１】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、供給源細胞に対して外因性である治療剤を含む。一部の実施形態では、治療剤は、標的細胞に対して外因性である。一部の実施形態では、外因性治療剤は、タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質、細部表面タンパク質、分泌タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または小分子のうちの１つまたは複数から選択される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、提供されるフソソームは、エンドサイトーシスまたは非エンドサイトーシス経路によって、細胞に進入する。
【０１２３】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、核を含まない。一部の実施形態では、フソソームは、核ＤＮＡを実質的に含まない。
【０１２４】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、冷却または凍結される。いくつかの実施形態では、提供されるフソソームは、機能性核を含まず、かつ／または提供されるフソソーム組成物もしくは調製物は、機能性核を有さない１つもしくは複数のフソソームを含む。一部の実施形態では、提供されるフソソーム組成物または調製物は、タンパク質質量を基準として０．０１％を下回る、０．０５％を下回る、０．１％を下回る、０．５％を下回る、１％を下回る、１．５％を下回る、２％を下回る、２．５％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、もしくは１０％を下回る供給源細胞を含むか、または細胞のうちの０．０１％を下回る、０．０５％を下回る、０．１％を下回る、０．５％を下回る、１％を下回る、１．５％を下回る、２％を下回る、２．５％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、もしくは１０％を下回るものが、機能性核を有する。いくつかの実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、前記温度で、少なくとも１時間、２時間、３時間、６時間、もしくは１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、もしくは６日間、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、もしくは６ヶ月間、または１年間、２年間、３年間、４年間、もしくは５年間、維持されている。いくつかの実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、前記温度での維持の前の集団の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を特徴とし、例えば、以下：
ｉ）例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉ）例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉｉ）例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の薬剤が２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合すること、または
ｉｖ）例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、もしくはそれを上回らないコピー数のフソゲンのレベル
のうちの１つまたは複数を特徴とする。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、提供されるフソソーム組成物または調製物は、４℃を下回る温度において、少なくとも１時間、２時間、３時間、６時間、もしくは１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、もしくは６日間、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、もしくは６ヶ月間、または１年間、２年間、３年間、４年間、もしくは５年間、安定である。いくつかの実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、−２０℃を下回る温度において、少なくとも１時間、２時間、３時間、６時間、もしくは１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、もしくは６日間、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、もしくは６ヶ月間、または１年間、２年間、３年間、４年間、もしくは５年間、安定である。いくつかの実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、−８０℃を下回る温度において、少なくとも１時間、２時間、３時間、６時間、もしくは１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、もしくは６日間、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、もしくは６ヶ月間、または１年間、２年間、３年間、４年間、もしくは５年間、安定である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物に当てはまる：
ｉ）供給源細胞が、２９３細胞以外であること、
ｉｉ）供給源細胞が、形質転換も不死化もされていないこと、
ｉｉｉ）供給源細胞が、アデノウイルス媒介不死化以外の方法を使用して、形質転換もしくは不死化されている、例えば、自発的突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化されていること、
ｉｖ）フソゲンが、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、または分泌性顆粒タンパク質以外であること、
ｖ）治療剤が、ＣｒｅまたはＧＦＰ、例えば、ＥＧＦＰ以外であること、
ｖｉ）治療剤が、例えば、内腔内の核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）もしくは供給源細胞に対して外因性のタンパク質（例えば、抗体、例えば、抗体）であること、または
ｖｉｉ）フソソームが、ミトコンドリアを含まないこと。
【０１２７】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物に当てはまる：
ｉ）供給源細胞が、２９３細胞もしくはＨＥＫ細胞以外であること、
ｉｉ）供給源細胞が、形質転換も不死化もされていないこと、
ｉｉｉ）供給源細胞が、アデノウイルス媒介不死化以外の方法を使用して、形質転換もしくは不死化されている、例えば、自発的突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化されていること、
ｉｖ）フソゲンが、ウイルスフソゲンではないこと、
ｖ）フソソームが、４０〜１５０ｎｍ以外、例えば、１５０ｎｍを上回る、２００ｎｍを上回る、３００ｎを上回る、４００ｎｍを上回る、もしくは５００ｎｍを上回る径を有すること、または
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合に、少なくとも約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、もしくは２００ｎｍの径を有すること。
【０１２８】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物に当てはまる：
ｉ）膜タンパク質が、供給源細胞によって発現されること、
ｉｉ）フソゲンが、ＴＡＴ、ＴＡＴ−ＨＡ２、ＨＡ−２、ｇｐ４１、アルツハイマー病ベータアミロイドペプチド、センダイウイルスタンパク質、もしくは両親媒性ｎｅｔ陰性ペプチド（ＷＡＥ  １１）以外であること、
ｉｉｉ）フソゲンが、哺乳動物フソゲンであること、
ｉｖ）フソソームが、酵素、抗体、もしくは抗ウイルスポリペプチドから選択されるポリペプチドを、その内腔に含むこと、
ｖ）フソソームが、治療用膜貫通タンパク質、例えば、供給源細胞に対して外因性である治療用膜貫通タンパク質を含まないこと、または
ｖｉ）フソソームが、ＣＤ６３もＧＬＵＴ４も含まないこと。
【０１２９】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物に当てはまる：
ｉ）フソゲンが、ウイルスタンパク質以外であること、
ｉｉ）フソゲンが、膜融合性タンパク質以外であること、
ｉｉｉ）フソゲンが、ファーティリン−ベータ以外の哺乳動物タンパク質であること、
ｉｖ）フソゲンが、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、もしくは分泌性顆粒タンパク質以外であること、または
ｖ）フソゲンが、ＴＡＴ、ＴＡＴ−ＨＡ２、ＨＡ−２、ｇｐ４１、アルツハイマー病ベータアミロイドペプチド、センダイウイルスタンパク質、もしくは両親媒性ｎｅｔ陰性ペプチド（ＷＡＥ  １１）以外であること。
【０１３０】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物に当てはまる：
ｉ）ウイルスを含まないか、感染性でないか、もしくは宿主細胞において繁殖しないこと、
ｉｉ）ＶＬＰ（ウイルス様粒子）ではないこと、
ｉｉｉ）ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスキャプシドタンパク質、例えば、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質を含まないか、もしくはウイルスキャプシドタンパク質の量が、例えば、実施例５３のアッセイによって、総タンパク質の１０％を下回る、５％を下回る、４％を下回る、３％を下回る、２％を下回る、１％を下回る、０．５％を下回る、０．２％を下回る、もしくは０．１％を下回ること、
ｉｖ）ウイルスマトリックスタンパク質を含まないこと、
ｖ）ウイルス非構造タンパク質を含まないこと、
ｖｉ）小胞１つ当たり、１０を下回る、５０を下回る、１００を下回る、５００を下回る、１，０００を下回る、２，０００を下回る、５，０００を下回る、１０，０００を下回る、２０，０００を下回る、５０，０００を下回る、１００，０００を下回る、２００，０００を下回る、５００，０００を下回る、１，０００，０００を下回る、５，０００，０００を下回る、１０，０００，０００を下回る、５０，０００，０００を下回る、１００，０００，０００を下回る、５００，０００，０００を下回る、１，０００，０００，０００を下回るコピーのウイルス構造タンパク質を含むこと、または
ｖｉｉ）フソソームがウイロソームではないこと。
【０１３１】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、フソソームにおけるフソゲンのコピー数のウイルス構造タンパク質のコピー数に対する比は、少なくとも１，０００，０００：１、１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１  １、２０：１、１０：１、５：１、または１：１である。いくつかの実施形態では、フソソームにおけるフソゲンのコピー数のウイルスマトリックスタンパク質のコピー数に対する比は、少なくとも１，０００，０００：１、１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、または１：１である。
【０１３２】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物に当てはまる：
ｉ）フソソームが、水不混和性液滴を含まないこと、
ｉｉ）フソソームが、水溶性内腔および親水性外部を含むこと、
ｉｉｉ）フソゲンが、タンパク質フソゲンであること。
【０１３３】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物に当てはまる：
ｉ）フソゲンが、哺乳動物フソゲンもしくはウイルスフソゲンであること、
ｉｉ）フソソームが、フソソームに治療用もしくは診断用物質をローディングすることによって作製されたものではないこと、
ｉｉｉ）供給源細胞に、治療用もしくは診断用物質がローディングされていないこと、
ｉｖ）フソソームが、ドキソルビシン、デキサメタゾン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ１２５、ＶＥＧＦ受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、酸化鉄、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰもしくはＲＦＰ、ナノ粒子、もしくはＲＮａｓｅを含まないか、または供給源細胞に対して外因性である前述のもののいずれかの外因性形態を含まないこと、または
ｖ）フソソームが、１つもしくは複数の翻訳後改変、例えば、グリコシル化を有する、供給源細胞に対して外因性である治療剤をさらに含むこと。
【０１３４】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、フソソームは、単層または多層である。
【０１３５】
代替または追加として、いくつかの実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合に、供給源細胞のものの約０．０１％以内、０．０５％以内、０．１％以内、０．５％以内、１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、５％以内、１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内の径を特徴とする。いくつかの実施形態では、例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合に、供給源細胞のものの約０．０１％を下回る、０．０５％を下回る、０．１％を下回る、０．５％を下回る、１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、９０％を下回る、径。いくつかの実施形態では、例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合に、供給源細胞の径の約０．０１％〜０．０５％以内、０．０５％〜０．１％以内、０．１％〜０．５％以内、０．５％〜１％以内、１％〜２％以内、２％〜３％以内、３％〜４％以内、４％〜５％以内、５％〜１０％以内、１０％〜２０％以内、２０％〜３０％以内、３０％〜４０％以内、４０％〜５０％以内、５０％〜６０％以内、６０％〜７０％以内、７０％〜８０％以内、または８０％〜９０％以内の径。いくつかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合に、供給源細胞の径の約０．０１％〜０．０５％を下回る、０．０５％〜０．１％を下回る、０．１％〜０．５％を下回る、０．５％〜１％を下回る、１％〜２％を下回る、２％〜３％を下回る、３％〜４％を下回る、４％〜５％を下回る、５％〜１０％を下回る、１０％〜２０％を下回る、２０％〜３０％を下回る、３０％〜４０％を下回る、４０％〜５０％を下回る、５０％〜６０％を下回る、６０％〜７０％を下回る、７０％〜８０％を下回る、または８０％〜９０％を下回る径を有する。いくつかの実施形態では、径は、例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合に、少なくとも約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、または２５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、径は、例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合に、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、または２５０ｎｍ（例えば、±２０％）である。いくつかの実施形態では、径は、例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合に、少なくとも約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、または２０，０００ｎｍである。いくつかの実施形態では、径は、例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合に、約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５���０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、または２０，０００ｎｍ（例えば、±２０％）である。いくつかの実施形態では、径は、５μｍを上回る、６μｍを上回る、７μｍを上回る、８μｍを上回る、１０μｍを上回る、２０μｍを上回る、５０μｍを上回る、１００μｍを上回る、１５０μｍを上回る、または２００μｍを上回る。
【０１３６】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、供給源細胞の体積の約０．０１％〜０．０５％を下回る、０．０５％〜０．１％を下回る、０．１％〜０．５％を下回る、０．５％〜１％を下回る、１％〜２％を下回る、２％〜３％を下回る、３％〜４％を下回る、４％〜５％を下回る、５％〜１０％を下回る、１０％〜２０％を下回る、２０％〜３０％を下回る、３０％〜４０％を下回る、４０％〜５０％を下回る、５０％〜６０％を下回る、６０％〜７０％を下回る、７０％〜８０％を下回る、または８０％〜９０％を下回る体積を有する。
【０１３７】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、１．０８ｇ／ｍＬ〜１．１２ｇ／ｍＬ以外の密度を有する。一部の実施形態では、密度は、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合に、１．２５ｇ／ｍＬ±０．０５である。一部の実施形態では、密度は、例えば、実施例３３のアッセイによって、１ｇ／ｍＬを下回る、１〜１．１ｇ／ｍＬ、１．０５〜１．１５ｇ／ｍＬ、１．１〜１．２ｇ／ｍＬ、１．１５〜１．２５ｇ／ｍＬ、１．２〜１．３ｇ／ｍＬ、１．２５〜１．３５ｇ／ｍＬ、または１．３５ｇ／ｍＬを上回る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物に当てはまる：
ｉ）フソソームが、エクソソームではないこと、
ｉｉ）フソソームが、マイクロベシクルであること、
ｉｉｉ）フソソームが、非哺乳動物フソゲンを含むこと、
ｉｖ）フソソームが、フソゲンを含むかもしくはそれを組み込むように操作されていること、
ｖ）フソソームが、供給源細胞に対して外因性であるフソゲンもしくは過剰発現されているフソゲンを含むこと、
ｖｉ）フソソームが、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、もしくは１５００ｎｍの径を有するか、またはフソソーム集団もしくは複数のフソソームが、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、もしくは１５００ｎｍの平均径を有すること、
ｖｉｉ）フソソームが、１つもしくは複数のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒を含むこと、
ｖｉｉｉ）フソソームが、細胞骨格もしくはその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、ホルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、もしくはチューブリンを含むこと、
ｉｘ）複数のフソソームを含む調製物が、例えば、Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ．”  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００６  Ａｐｒ；  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｕｎｉｔ  ３．２２に記載されるように、例えば、スクロース勾配遠心分離アッセイにおいて、１．０８〜１．２２ｇ／ｍＬの浮遊密度を有さないか、または少なくとも１．１８〜１．２５ｇ／ｍＬ、もしくは１．０５〜１．１２ｇ／ｍＬの密度を有すること、
ｘ）脂質二重層が、供給源細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリンまたはこれらの組合せが濃縮されている、または脂質二重層が、供給源細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはこれらの組合せが濃縮されていない（例えば、それが枯渇されている）こと、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例５２のアッセイにおいて測定した場合に、ホスファチジルセリン（ＰＳ）もしくはＣＤ４０リガンド、またはＰＳおよびＣＤ４０リガンドの両方を含むこと、
ｘｉｉ）フソソームが、供給源細胞と比較して、ＰＳが濃縮されている、例えば、フソソーム集団において、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％が、Ｋａｎａｄａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆａｔｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２：Ｅ１４３３−Ｅ１４４２のアッセイによって、ＰＳに関して陽性であること、
ｘｉｉｉ）フソソームが、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を実質的に含まないか、または例えば、実施例６７のアッセイによって、タンパク質１μｇ当たり、０．００１を下回る、０．００２を下回る、０．００５を下回る、０．０１を下回る、０．０２を下回る、０．０５を下回る、０．１を下回る、０．２を下回る、０．５を下回る、１を下回る、２を下回る、５を下回る、１０を下回る、２０を下回る、５０を下回る、１００を下回る、２００を下回る、５００を下回る、もしくは１０００を下回るＡＣｈＥ活性単位を含むこと、
ｘｉｖ）フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、もしくはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ−Ｂ、もしくはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン−４、ミトフィリン、シンテニン−１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン−１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン−１、熱ショック７０ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、もしくはこれらの任意の組合せを実質的に含まないか、または例えば、実施例４４のアッセイによって、０．０５％を下回る、０．１％を下回る、０．５％を下回る、１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、５％を下回る、もしくは１０％を下回る任意の個々のエクソソームマーカータンパク質、および／または０．０５％を下回る、０．１％を下回る、０．５％を下回る、１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、１５％を下回る、２０％を下回る、もしくは２５％を下回る、前記タンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質を含むか、または供給源細胞と比較してこれらのタンパク質のうちのいずれか１つもしくは複数が脱濃縮されているか、またはこれらのタンパク質のうちのいずれか１つもしくは複数が濃縮されていないこと、
ｘｖ）フソソームが、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、総タンパク質１μｇ当たり５００ｎｇを下回る、２５０ｎｇを下回る、１００ｎｇを下回る、５０ｎｇを下回る、２０ｎｇを下回る、１０ｎｇを下回る、５ｎｇを下回る、もしくは１ｎｇを下回るグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）であるか、または供給源細胞におけるＧＡＰＤＨのレベルを下回る、例えば、供給源細胞におけるｎｇ／μｇ単位での総タンパク質当たりのＧＡＰＤＨのレベルよりも、１％を下回って、２．５％を下回って、５％を下回って、１０％を下回って、１５％を下回って、２０％を下回って、３０％を下回って、４０％を下回って、５０％を下回って、６０％を下回って、７０％を下回って、８０％を下回って、もしくは９０％を下回って低い、ＧＡＰＤＨのレベルを含むこと、
ｘｖｉ）フソソームが、１つもしくは複数の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つもしくは複数のプロテアソームタンパク質、または１つもしくは複数のミトコンドリアタンパク質、またはこれらの任意の組合せが濃縮されており、例えば、カルネキシンの量が、総タンパク質１μｇ当たり５００ｎｇを下回る、２５０ｎｇを下回る、１００ｎｇを下回る、５０ｎｇを下回る、２０ｎｇを下回る、１０ｎｇを下回る、５ｎｇを下回る、もしくは１ｎｇを下回るカルネキシンであるか、またはフソソームが、例えば、実施例４６のアッセイを使用して、供給源細胞と比較して、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％少ない、ｎｇ／μｇ単位での総タンパク質当たりのカルネキシンを含むこと、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例３９もしくは４０のアッセイを使用して測定した場合に、供給源細胞に対して外因性である薬剤（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）を含むこと、または
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、Ｋａｎａｄａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆａｔｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２：Ｅ１４３３−Ｅ１４４２のアッセイによって、少なくとも３０分間、原子間力顕微鏡法によりマイカ表面上に固定化することができること。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、以下：
ｉ）フソソームが、エクソソームである、
ｉｉ）フソソームが、マイクロベシクルではない、
ｉｉｉ）フソソームが、８０ｎｍを下回る、１００ｎｍを下回る、２００ｎｍを下回る、５００ｎｍを下回る、１０００ｎｍを下回る、１２００ｎｍを下回る、１４００ｎｍを下回る、もしくは１５００ｎｍを下回る径を有するか、またはフソソーム集団が、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、もしくは１５００ｎｍの平均径を有する、
ｉｖ）フソソームが、オルガネラを含まない、
ｖ）フソソームが、細胞骨格もしくはその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、ホルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、もしくはチューブリンを含まない、
ｖｉ）複数のフソソームを含む調製物が、例えば、Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ．”  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００６  Ａｐｒ；  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｕｎｉｔ  ３．２２に記載されるように、例えば、スクロース勾配遠心分離アッセイにおいて、１．０８〜１．２２ｇ／ｍＬの浮遊密度を有する、
ｖｉｉ）脂質二重層が、供給源細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリンまたはこれらの組合せが濃縮されていない（例えば、それが枯渇されている）か、または脂質二重層が、供給源細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはこれらの組合せが濃縮されている、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５２のアッセイにおいて測定した場合に、供給源細胞と比べて、ホスファチジルセリン（ＰＳ）もしくはＣＤ４０リガンド、またはＰＳおよびＣＤ４０リガンドの両方を含まないか、またはそれが枯渇されている、
ｉｘ）フソソームが、供給源細胞と比較して、ＰＳが濃縮されていない（例えば、それが枯渇されている）、例えば、フソソーム集団において、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回るものが、Ｋａｎａｄａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆａｔｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２：Ｅ１４３３−Ｅ１４４２のアッセイによって、ＰＳに関して陽性である、
ｘ）フソソームが、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を、例えば、実施例６７のアッセイによって、例えば、タンパク質１μｇ当たり、少なくとも０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００ＡＣｈＥ活性単位で含む、
ｘｉ）フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、もしくはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ−Ｂ、もしくはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン−４、ミトフィリン、シンテニン−１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン−１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン−１、熱ショック７０ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、もしくはこれらの任意の組合せを含み、例を上げると、例えば実施例４４のアッセイによって、０．０５％を上回る、０．１％を上回る、０．５％を上回る、１％を上回る、２％を上回る、３％を上回る、４％を上回る、５％を上回る、５％を上回る、もしくは１０％を上回る任意の個々のエクソソームマーカータンパク質、および／または０．０５％を下回る、０．１％を下回る、０．５％を下回る、１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、１５％を下回る、２０％を下回る、もしくは２５％を下回る、前記タンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質を含むか、または供給源細胞と比較してこれらのタンパク質のうちのいずれか１つもしくは複数が濃縮されている、
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、総タンパク質１μｇ当たり５００ｎｇを上回る、２５０ｎｇを上回る、１００ｎｇを上回る、５０ｎｇを上回る、２０ｎｇを上回る、１０ｎｇを上回る、５ｎｇを上回る、もしくは１ｎｇを上回るグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）であるか、または供給源細胞におけるＧＡＰＤＨのレベルを下回る、例えば、供給源細胞におけるｎｇ／μｇ単位での総タンパク質当たりのＧＡＰＤＨのレベルよりも、少なくとも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％高い、ＧＡＰＤＨのレベルを含む、
ｘｉｉｉ）フソソームが、１つもしくは複数の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つもしくは複数のプロテアソームタンパク質、または１つもしくは複数のミトコンドリアタンパク質、またはこれらの任意の組合せが濃縮されておらず（例えば、それが枯渇されており）、例えば、カルネキシンの量が、総タンパク質１μｇ当たり５００ｎｇを下回る、２５０ｎｇを下回る、１００ｎｇを下回る、５０ｎｇを下回る、２０ｎｇを下回る、１０ｎｇを下回る、５ｎｇを下回る、もしくは１ｎｇを下回るカルネキシンであるか、またはフソソームが、例えば、実施例４６のアッセイを使用して、供給源細胞と比較して、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％少ない、ｎｇ／μｇ単位での総タンパク質当たりのカルネキシンを含む、または
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、Ｋａｎａｄａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆａｔｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２：Ｅ１４３３−Ｅ１４４２のアッセイによって、少なくとも３０分間、原子間力顕微鏡法によりマイカ表面上に固定化することができない
のうちの１つまたは複数である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、以下：
ｉ）フソソームが、ＶＬＰを含まない、
ｉｉ）フソソームが、ウイルスを含まない、
ｉｉｉ）フソソームが、複製能力のあるウイルスを含まない、
ｉｖ）フソソームが、ウイルスタンパク質、例えば、ウイルス構造タンパク質、例えば、キャプシドタンパク質もしくはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
ｖ）フソソームが、エンベロープウイルス由来のキャプシドタンパク質を含まない、
ｖｉ）フソソームが、ヌクレオキャプシドタンパク質を含まない、または
ｖｉｉ）フソゲンが、ウイルスフソゲンではない
のうちの１つまたは複数である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、フソソームは、サイトゾルを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、フソソームは、細胞生物製剤を含むかまたはそれに含まれる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、フソソームは、除核細胞を含むかまたはそれに含まれる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、フソソームは、コンドリソームであるかまたはそれを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、以下：
ｉ）フソソームもしくは供給源細胞が、例えば、実施例１０２のアッセイによって、対象に埋め込まれた場合に、奇形腫を形成しない、
ｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５８のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マクロファージと比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の速度で、走化性が可能である、
ｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、傷害の部位に、ホーミングすることができ、細胞生物製剤が、例えば、実施例５９のアッセイを使用して、ヒト細胞に由来し、例えば、供給源細胞が、好中球である、または
ｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、ファゴサイトーシスが可能であり、例えば、フソソームによるファゴサイトーシスが、実施例６０のアッセイを使用して、０．５時間以内、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、もしくは６時間以内に検出可能であり、例えば、供給源細胞が、マクロファージである
のうちの１つまたは複数である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、対象、例えば、ヒト対象に投与した後、特徴のうちのいずれかのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれよりも多くを、５日間またはそれよりも短い間、例えば、４日間またはそれよりも短い間、３日間またはそれよりも短い間、２日間またはそれよりも短い間、１日間またはそれよりも短い間、例えば、約１２〜７２時間、保持する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、フソソームは、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：
ａ）供給源細胞に由来する１つもしくは複数の内因性タンパク質、例えば、膜タンパク質もしくは細胞質タンパク質を含むこと、
ｂ）少なくとも１０個、２０個、５０個、１００個、２００個、５００個、１０００個、２０００個、もしくは５０００個の異なるタンパク質を含むこと、
ｃ）少なくとも１つ、２つ、５つ、１０個、２０個、５０個、もしくは１００個の異なる糖タンパク質を含むこと、
ｄ）フソソーム中、少なくとも１０質量％、２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、８０質量％、もしくは９０質量％のタンパク質が、天然に存在するタンパク質であること、
ｅ）少なくとも１０個、２０個、５０個、１００個、２００個、５００個、１０００個、２０００個、もしくは５０００個の異なるＲＮＡを含むこと、または
ｆ）例えば、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧから選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、もしくは２０個の異なる脂質を含むこと。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、フソソームは、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれよりも多くを有するように操作されているか、またはフソソームは天然に存在する細胞ではなく、かつ以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれよりも多くを有するか、または核は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれよりも多くを天然に有さない：
ａ）部分的な核不活性化により、核機能に、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれを上回る低減、例えば、転写もしくはＤＮＡ複製またはその両方の低減がもたらされ、例えば、転写は、実施例１９のアッセイによって測定され、ＤＮＡ複製は、実施例２０のアッセイによって測定されること、
ｂ）フソソームが、転写が可能ではないか、または例えば、実施例１９のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞の転写活性のものの１％を下回る、２．５％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回る転写活性を有すること、
ｃ）フソソームが、核ＤＮＡ複製が可能ではないか、または例えば、実施例２０のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞の核ＤＮＡ複製の１％を下回る、２．５％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回る核ＤＮＡ複製を有すること、
ｄ）フソソームが、クロマチンが欠如しているか、または例えば、実施例３７のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞のクロマチン含量の１％を下回る、２．５％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回るクロマチン含量を有すること、
ｅ）フソソームが、核膜が欠如しているか、または例えば、実施例３６のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞もしくはＪｕｒｋａｔ細胞の５０％を下回る、４０％を下回る、３０％を下回る、２０％を下回る、１０％を下回る、５％を下回る、４％を下回る、３％を下回る、２％を下回る、もしくは１％を下回る量の核膜を有すること、
ｆ）フソソームが、機能性核膜孔複合体が欠如しているか、または実施例３６のアッセイによって、例えば、少なくとも５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％低減された、核内外輸送活性を有するか、またはフソソームが、核膜孔タンパク質のうちの１つもしくは複数、例えば、ＮＵＰ９８もしくはインポーチン７が欠如していること、
ｇ）フソソームが、ヒストンを含まないか、または例えば、実施例３７のアッセイによって、供給源細胞のヒストンレベル（例えば、Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、もしくはＨ４）の１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、もしくは９０％を下回るヒストンレベルを有すること、
ｈ）フソソームが、２０個を下回る、１０個を下回る、５つを下回る、４つを下回る、３つを下回る、２つを下回る、もしくは１つを下回る染色体を含むこと、
ｉ）核機能が、排除されていること、
ｊ）フソソームが、除核哺乳動物細胞であること、
ｋ）核が、除去もしくは不活性化されており、例えば、機械力、放射線、もしくは化学的アブレーションによって押し出されていること、または
ｌ）フソソームが、例えば、中間期もしくは有糸分裂中に、完全にもしくは部分的に除去されるＤＮＡを有する哺乳動物細胞に由来すること。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、フソソームは、ｍｔＤＮＡまたはベクターＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、フソソームは、ＤＮＡを含まないか、またはＤＮＡを実質的に含まない。一部の実施形態では、フソソームは、機能性核を含まない。一部の実施形態では、フソソームは、核を含まない。一部の実施形態では、フソソームは、核ＤＮＡを実質的に含まない。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、フソソームは、以下のオルガネラのうちの１つもしくは複数を実質的に含まない：ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒。いくつかの実施形態では、フソソームは、供給源細胞と比較して、少ない数のオルガネラを有し、ここで、オルガネラは、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒から選択される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、供給源細胞は、初代細胞、不死化細胞、または細胞系（例えば、骨髄芽球細胞系、例えば、Ｃ２Ｃ１２）である。いくつかの実施形態では、フソソームは、改変されたゲノムを有する、例えば、低減された免疫原性を有する（例えば、例として、ＭＨＣタンパク質、例えば、ＭＨＣ複合体を除去するようにゲノム編集することによって）供給源細胞に由来する。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、免疫抑制剤で処置した細胞培養物に由来する。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、例えば、本明細書に記載されるアッセイを使用して、実質的に非免疫原性である。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、外因性薬剤、例えば、治療剤を含む。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、組換え細胞である。
【０１５２】
一部の実施形態では、供給源細胞は、抗炎症性シグナルで処置した細胞培養物に由来する。一部の実施形態では、本明細書に記載される作製方法は、例えば、核を不活性化する前または後、例えば、細胞を除核する前または後に、供給源細胞を、抗炎症性シグナルと接触させるステップをさらに含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、フソソームは、供給源細胞に対して外因性である薬剤、例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性薬剤は、少なくとも、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピー、またはそれを上回らずに存在する。いくつかの実施形態では、フソソームは、例えば、ｓｉＲＮＡまたは遺伝子編集酵素による供給源細胞、例えば、哺乳動物供給源細胞の処置に起因して、１つまたは複数の内因性分子、例えば、タンパク質または核酸（例えば、一部の実施形態では、供給源細胞に対して内因性であり、一部の実施形態では、標的細胞に対して内因性である）のレベルの変更、例えば、増加または減少を有する。いくつかの実施形態では、内因性分子は、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピー、またはそれを上回らずに存在する。いくつかの実施形態では、内因性分子（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）は、供給源細胞におけるその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８高い濃度で存在する。いくつかの実施形態では、内因性分子（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）は、供給源細胞におけるその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８低い濃度で存在する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、フソゲンは、ウイルスフソゲン、例えば、ＨＡ、ＨＩＶ−１  ＥＮＶ、ｇｐ１２０、またはＶＳＶ−Ｇである。いくつかの実施形態では、フソゲンは、哺乳動物フソゲン、例えば、ＳＮＡＲＥ、シンシチン（Ｓｙｎｃｙｔｉｎ）、ミオメーカー（ｍｙｏｍａｋｅｒ）、ミオミキサー（ｍｙｏｍｉｘｅｒ）、ミオマージャー（ｍｙｏｍｅｒｇｅｒ）、またはＦＧＦＲＬ１である。いくつかの実施形態では、フソゲンは、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０のｐＨにおいて活性である。いくつかの実施形態では、フソゲンは、６〜８のｐＨにおいて活性である。いくつかの実施形態では、フソゲンは、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０のｐＨにおいて活性ではない。いくつかの実施形態では、フソソームは、標的細胞の表面において、標的細胞に融合する。いくつかの実施形態では、フソゲンは、リソソーム非依存的様式で、融合を促進する。いくつかの実施形態では、フソゲンは、タンパク質フソゲンである。いくつかの実施形態では、フソゲンは、脂質フソゲン、例えば、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、または改変された不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、フソゲンは、化学物質フソゲン、例えば、ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、フソゲンは、小分子フソゲン、例えば、ハロタン、ＮＳＡＩＤ、例えば、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンである。いくつかの実施形態では、フソゲンは、組換えである。いくつかの実施形態では、フソゲンは、生物化学的に組み込まれ、例えば、フソゲンは、精製されたタンパク質として提供され、フソゲンと脂質二重層との会合を可能にする条件下において、脂質二重層と接触される。いくつかの実施形態では、フソゲンは、フソゲンが脂質二重層と会合するのを可能にする条件下において、供給源細胞に生物合成的に組み込まれ、例えば、発現される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、フソソームは、標的細胞に結合する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ＨｅＬａ細胞以外であるか、または標的細胞は、形質転換も不死化もされていない。例えば、一部の実施形態では、形質転換されていない細胞は、接触の阻害を呈し、かつ／またはその成長は、同じ種類の正常な細胞と同じ生存因子もしくは増殖因子に依存する。一部の実施形態では、標的細胞は、形質転換または不死化されている。
【０１５６】
フソソーム組成物または調製物が関与する一部の実施形態では、複数のフソソームは、同じである。一部の実施形態では、複数のフソソームは、異なる。一部の実施形態では、複数のフソソームは、１つ、２つ、またはそれを上回る種類の供給源細胞に由来する。一部の実施形態では、複数のフソソームは、フソソーム組成物中のフソソームのうちの少なくとも０．０１％〜０．０５％、０．０５％〜０．１％、０．１％〜０．５％、０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、または８０％〜９０％が、以下から選択される少なくとも１つの特性を共有する場合、同じである：同じフソゲンを含むこと、同じ種類の供給源細胞を使用して産生されたこと、または同じ膜タンパク質ペイロード剤を含むこと。一部の実施形態では、複数のフソソーム中のフソソームのうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、フソソーム組成物または調製物中のフソソームの平均径の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内の径を有する。一部の実施形態では、複数のフソソーム中のフソソームのうちの少なくとも５０％は、フソソーム組成物中のフソソームの平均径の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内の径を有する。一部の実施形態では、複数のフソソームは、少なくとも約５０ｎｍ、約８０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１４００ｎｍ、または約１５００ｎｍの平均径を有する。一部の実施形態では、複数のフソソームは、約１０ｎｍ〜約１００μｍの範囲内の径を有するフソソームを含む。一部の実施形態では、複数のフソソームは、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲内のサイズを有するフソソームを含む。一部の実施形態では、複数のフソソーム中のフソソームのうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、フソソーム組成物または調製物中のフソソームの平均体積の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内の体積を有する。一部の実施形態では、複数のフソソーム中のフソソームのうちの少なくとも５０％は、フソソーム組成物中のフソソームの平均体積の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内の体積を有する。一部の実施形態では、複数のフソソームは、約５００ｎｍ３〜約０．０００６ｍｍ３、または約４，０００ｎｍ３〜約０．００５μｍ３、約６５，０００ｎｍ３〜約０．００５μｍ３、約６５，０００ｎｍ３〜約０．０００６μｍ３、約６５，０００ｎｍ３〜約０．００２μｍ３、もしくは約０．０００６μｍ３〜約０．００２μｍ３の範囲内の体積を有するフソソームを含む。一部の実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、例えば、実施例３１に基づいて、約９０％を下回る、８０％を下回る、７０％を下回る、６０％を下回る、５０％を下回る���４０％を下回る、３０％を下回る、２０％を下回る、１０％を下回る、５％を下回る、供給源細胞集団の径分布変動性の１０％以内、５０％以内、または９０％以内の径分布変動性を有する。一部の実施形態では、複数のフソソーム中のフソソームのうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、フソソーム組成物または調製物中のフソソームにおける平均フソゲンコピー数の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、または９０％以内のフソゲンのコピー数を有する。一部の実施形態では、複数のフソソーム中のフソソームのうちの少なくとも５０％は、フソソーム組成物中のフソソームにおける平均フソゲンコピー数の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内のフソゲンのコピー数を有する。一部の実施形態では、複数のフソソーム中のフソソームのうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、フソソーム組成物または調製物中のフソソームにおける平均治療剤コピー数の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、または９０％以内の治療剤のコピー数を有する。一部の実施形態では、複数のフソソーム中のフソソームうちの少なくとも５０％は、フソソーム組成物中のフソソームにおける平均タンパク質膜ペイロードコピー数の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、または５０％以内の膜タンパク質ペイロードのコピー数を有する。一部の実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、少なくとも１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、または１０１０個、またはフソソームを含む。一部の実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、少なくとも１μＬ、２μＬ、５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、または１０ｍＬの体積中にある。
【０１５７】
一部の実施形態では、複数のフソソームは、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する、少なくとも０．０１％〜０．０５％、０．０５％〜０．１％、０．１％〜０．５％、０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、または８０％〜９０％のフソソームを含む：
（ｉ）核もしくは機能性核を含まないこと、
（ｉｉ）核ＤＮＡを実質的に含まないこと、または
（ｉｉｉ）ミトコンドリアもしくは機能性ミトコンドリアを含まないこと。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：
ａ）医薬組成物が、医薬品もしくは適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしていること、
ｂ）医薬組成物が、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製されたこと、
ｃ）医薬組成物が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まないこと、
ｄ）医薬組成物が、所定の参照値を下回る混入物質レベル（例えば、核ＤＮＡ）を有し、例えば、混入物質を実質的に含まないこと、または
ｅ）医薬組成物が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有すること。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、生物学的機能は、
ａ）酵素をモジュレート、例えば、阻害もしくは刺激すること、
ｂ）例えば、因子の合成を阻害もしくは刺激することまたはその分解を阻害もしくは刺激することによって、対象における分子（例えば、タンパク質、核酸、もしくは代謝産物、薬物、もしくは毒素）のレベルをモジュレート、例えば、増加もしくは減少させること、
ｃ）標的細胞もしくは組織の生存性をモジュレート、例えば、増加もしくは減少させること、または
ｄ）タンパク質の状態をモジュレート、例えば、タンパク質のリン酸化を増加もしくは減少させること、またはタンパク質の立体構造をモジュレートすること、
ｅ）傷害の治癒を促進すること、
ｆ）２つの細胞間の相互作用をモジュレート、例えば、増加もしくは減少させること、
ｇ）細胞分化をモジュレート、例えば、促進もしくは阻害すること、
ｈ）対象における因子（例えば、タンパク質、核酸、代謝産物、薬物、もしくは毒素）の分布を変更すること、
ｉ）免疫応答をモジュレート、例えば、増加もしくは減少させること、または
ｊ）標的組織への細胞の動員をモジュレート、例えば、増加もしくは減少させること
から選択される。
【０１６０】
本明細書における治療方法の一部の実施形態では、複数のフソソームは、局所作用を有する。一部の実施形態では、複数のフソソームは、遠位作用を有する。一部の実施形態では、複数のフソソームは、全身作用を有する。
【０１６１】
一部の実施形態では、対象は、がん、炎症性障害、自己免疫疾患、慢性疾患、炎症、臓器機能の損傷、感染性疾患、代謝疾患、変性障害、遺伝性疾患（例えば、遺伝子欠損もしくは優性遺伝子障害）、または傷害を有する。一部の実施形態では、対象は、感染性疾患を有し、フソソームは、感染性疾患の抗原を含む。一部の実施形態では、対象は、遺伝子欠損を有し、フソソームは、対象が欠損しているタンパク質、またはそのタンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）、またはそのタンパク質をコードするＤＮＡ、またはそのタンパク質をコードする染色体、またはそのタンパク質をコードする核酸を含む核を含む。一部の実施形態では、対象は、優性遺伝子障害を有し、フソソームは、優性変異型アレルの核酸阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、対象は、優性遺伝子障害を有し、フソソームは、優性変異型アレルの核酸阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含み、フソソームはまた、核酸阻害剤によって標的とされない変異型遺伝子の非変異型アレルをコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、対象は、ワクチン接種を必要とする。一部の実施形態では、対象は、例えば、傷害を受けた部位の再生を必要とする。
【０１６２】
一部の実施形態では、フソソームは、１つまたは複数のシグナル配列をコードする１つまたは複数の配列をさらに含む核酸を含み、例えば、ここで、標的細胞は、シグナル配列を含むタンパク質を、標的細胞の細胞膜へと転位させる。
【０１６３】
一部の実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、少なくとも１回、２回、３回、４回、または５回、対象に投与される。
【０１６４】
一部の実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内）、または局所的に、対象に投与される。一部の実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、フソソーム組成物または調製物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼から選択される標的組織に到達するように、対象に投与される。一部の実施形態（例えば、対象が自己免疫疾患を有する）では、フソソーム組成物または調製物は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、またはイムノフィリンモジュレーターと共投与される。一部の実施形態（例えば、対象ががんまたは感染性疾患を有する）では、フソソーム組成物または調製物は、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと共投与される。一部の実施形態では、フソソーム組成物または調製物の投与は、対象の標的細胞における遺伝子の上方調節または下方調節をもたらし、例えば、ここで、フソソームは、転写活性化因子もしくは転写抑制因子、翻訳活性化因子もしくは翻訳抑制因子、またはエピジェネティック活性化因子もしくはエピジェネティック抑制因子を含む。
【０１６５】
本明細書における作製方法の一部の実施形態では、フソゲンを発現する供給源細胞を得るステップは、供給源細胞において外因性フソゲンを発現させるステップ、または供給源細胞において内因性フソゲンの発現を上方調節するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、供給源細胞の核を不活性化するステップを含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、複数のフソソームのうちの少なくとも１つのフソソームは、供給源細胞に由来する。
【０１６７】
一部の実施形態では、フソソームは、４℃を下回る、０℃を下回る、−４℃を下回る、−１０℃を下回る、−１２℃を下回る、−１６℃を下回る、−２０℃を下回る、−８０℃を下回る、または−１６０℃を下回る温度にある。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、フソソーム調製物は、少なくとも約１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個、または１０１５個のフソソームを含む。いくつかの実施形態では、フソソーム調製物は、少なくとも１０ｍＬ、２０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、または５０Ｌの体積を含む。いくつかの実施形態では、方法は、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞を、例えば、化学的除核、機械力の使用、例えば、フィルターもしくは遠心分離の使用、細胞骨格の少なくとも部分的な破壊、またはこれらの組合せによって、除核するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、供給源細胞においてフソゲンまたは他の膜タンパク質を発現させるステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、小胞形成、低浸透圧処置、押出、または遠心分離のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、方法は、供給源細胞において外因性薬剤を遺伝子的に発現させるステップまたは供給源細胞もしくはフソソームに外因性薬剤をローディングするステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、核を不活性化する前、例えば、細胞を除核する前に、供給源細胞を、ポリペプチド剤をコードするＤＮＡと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、核を不活性化する前または後、例えば、細胞を除核する前または後に、供給源細胞を、ポリペプチド剤をコードするＲＮＡと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療剤（例えば、核酸またはタンパク質、例えば、膜タンパク質ペイロード剤）を、例えば、エレクトロポレーションによって、フソソームに導入するステップを含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、フソソームは、例えば、免疫原性を低減するように改変されたゲノムを有する（例えば、例として、ＭＨＣタンパク質を除去するようにゲノム編集することによって）哺乳動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、核を不活性化する前または後、例えば、細胞を除核する前または後に、ステップａ）の供給源細胞を、免疫抑制剤と接触させるステップをさらに含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、検出可能なレベル、例えば、参照値を上回る値が判定された場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物もしくは調製物を含有する試料は、破棄される。
【０１７１】
一部の実施形態では、第１のフソゲンは、リポペプチドではない。
【０１７２】
一部の実施形態では、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物は、部分的または完全な核不活性化（例えば、核の除去）を有する。
【０１７３】
一部の実施形態では、供給源細胞は、付着または懸濁液条件下において成長させた細胞である。一部の実施形態では、供給源細胞は、初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞系（例えば、骨髄芽球細胞系、例えば、Ｃ２Ｃ１２）である。一部の実施形態では、供給源細胞は、同種であり、例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られる。一部の実施形態では、供給源細胞は、自家であり、例えば、標的細胞と同じ生物から得られる。一部の実施形態では、供給源細胞は、異種であり、例えば、標的細胞とは異なる種の生物から得られる。
【０１７４】
一部の実施形態では、フソソームは、循環中のスカベンジャー系もしくは肝臓洞のクッパー細胞によって捕捉されない。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７６のアッセイによって、対象における細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない。一部の実施形態では、複数のフソソームは、対象に投与されると、複数のフソソームのうちの１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、９０％を下回るものが、例えば、実施例７６のアッセイによって、２４時間後に、ＲＥＳによって捕捉されない。一部の実施形態では、複数のフソソームは、対象に投与されると、複数のフソソームのうちの１％を下回る、２％を下回る、３％を下回る、４％を下回る、５％を下回る、１０％を下回る、２０％を下回る、３０％を下回る、４０％を下回る、５０％を下回る、６０％を下回る、７０％を下回る、８０％を下回る、９０％を下回るものが、例えば、実施例７６のアッセイによって、２４時間後に、ＲＥＳによって捕捉されない。
【０１７５】
一部の実施形態では、フソソームは、ウイルス構造タンパク質および／またはウイルスマトリックスタンパク質を含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、フソソームは、以下のオルガネラのうちの１つまたは複数を実質的に含まないか、または例えば、供給源細胞と比較して、少ない数のそれらを有する：ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒。
【０１７７】
一部の実施形態では、フソソームは、Ｃｒｅも、ＧＦＰ、例えば、ＥＧＦＰも含まない。
【０１７８】
一部の実施形態では、フソソーム組成物または医薬組成物は、所定の温度で、少なくとも１時間、２時間、３時間、６時間、もしくは１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、もしくは６日間、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、もしくは６ヶ月間、または１年間、２年間、３年間、４年間、もしくは５年間、維持されている。一部の実施形態では、所定の温度は、約４℃、０℃、−４℃、−１０℃、−１２℃、−１６℃、−２０℃、−８０℃、または−１６０℃から選択される。
【０１７９】
一部の実施形態では、フソソーム組成物または医薬組成物は、例えば、以下のうちの１つまたは複数により、前記温度での維持の前の複数のフソソームの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を有する：
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも、少なくとも５０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の薬剤が２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合すること、または
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、前記温度での維持の前に、複数のフソソームのフソゲンコピー数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％のコピー数で存在すること。
【０１８０】
一部の実施形態では、フソソーム組成物または医薬組成物は、例えば、以下のうちの１つまたは複数により、前記温度で前記期間にわたる保管の前の複数のフソソームの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を有する場合、安定と考えられる：
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも、例えば、少なくとも５０％高い割合で、標的細胞と融合すること、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の薬剤が２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合すること、または
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合に、前記温度での維持の前に、複数のフソソームのフソゲンコピー数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％のコピー数で存在すること。
【０１８１】
一部の実施形態では、疾患または障害は、がん、自己免疫障害、または感染性疾患から選択される。一部の実施形態では、対象は、がんを有する。一部の実施形態では、フソソームは、ネオ抗原を含む。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、少なくとも１回、２回、３回、４回、または５回、対象に投与される。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内）、または局所的に、対象に投与される。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、フソソーム組成物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼から選択される標的組織に到達するように、対象に投与される。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、またはイムノフィリンモジュレーターと共投与される。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと共投与される。
【０１８２】
一部の実施形態では、複数のフソソームは、局所、遠位、または全身作用を有する。
【０１８３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、がんの進行、腫瘍退縮、腫瘍体積、新生物細胞数の減少、融合細胞の数、膜タンパク質ペイロード剤を含む融合細胞の数、核酸タンパク質ペイロードを発現する融合細胞の数、および融合細胞の膜に配置された膜タンパク質の数のうちの１つまたは複数をモニタリングするステップをさらに含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、生物における有害事象をモニタリングするステップをさらに含む。一部の実施形態では、有害事象としては、サイトカイン放出症候群、発熱、頻脈、悪寒、食欲不振、吐き気、嘔吐、筋痛、頭痛、毛細血管漏出症候群、低血圧、肺水腫、凝血異常、腎機能障害、腎臓傷害、マクロファージ活性化症候群、血球貪食性リンパ組織球症、臓器不全、脳浮腫、Ｔ細胞活性化によるバイスタンダー炎症、神経症状、脳症、混乱、幻覚、せん妄、鈍麻、失語症、痙攣、Ｂ細胞形成不全、腫瘍溶解症候群、および移植片対宿主病のうちの１つまたは複数が挙げられる。
【０１８５】
一部の実施形態では、生物は、ヒトである。一部の実施形態では、ヒトは、疾患、障害、または状態を有する。一部の実施形態では、標的細胞の細胞膜脂質二重層における膜タンパク質ペイロード剤の存在は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状を改善する。
【０１８６】
本発明の他の特性、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１８７】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。例えば、本明細書、例えば、本明細書における任意の表において参照される、すべてのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、およびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。別途指定されない限り、本明細書における任意の表におけるものを含め、本明細書において示される配列受託番号は、２０１８年２月１７日時点のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子またはタンパク質が、複数の配列受託番号を参照する場合、配列バリアントのすべてが包含される。加えて、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【０１８８】
本発明の下記の詳細な説明は、添付の図面と併せて読まれるとよりよく理解されるであろう。本発明を説明するために、今般例示される、本明細書に記載のある特定の実施形態は、図面で示される。しかし、本発明が、図面で示される実施形態のまさにその配置および手段に限定されないことは、理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１は、色素でのフソソームの小胞体についての染色を定量する。
【０１９０】
【図２】図２は、色素でのフソソームのミトコンドリアについての染色を定量する。
【０１９１】
【図３】図３は、色素でのフソソームのリソソームについての染色を定量する。
【０１９２】
【図４】図４は、色素でのフソソームのＦ−アクチンについての染色を定量する。
【０１９３】
【図５】図５は、ＣｒｅおよびＧＦＰを発現するフソゲンと接触した細胞の光退色後のＧＦＰ蛍光の回復を示すグラフである。
【０１９４】
【図６】図６は、フソソームまたは陰性対照との接触後のＲＦＰを発現する標的細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【０１９５】
【図７】図７は、ドナー細胞とレシピエントＨｅＬａ細胞との融合による明確なオルガネラ送達の画像である。白色で示されている細胞内エリアは、ドナーミトコンドリアとレシピエントミトコンドリアとのオーバーラップを示す。灰色の細胞内領域は、ドナーオルガネラとレシピエントオルガネラがオーバーラップしない場所を示す。
【０１９６】
【図８】図８は、ドナー細胞とレシピエントＨｅＬａ細胞との融合による明確なオルガネラ送達の画像である。白色で示されている細胞内エリアは、ドナーミトコンドリアとレシピエントミトコンドリアとのオーバーラップを示す。灰色の細胞内領域は、ドナーオルガネラとレシピエントオルガネラがオーバーラップしない場所を示す。
【０１９７】
【図９】図９は、フソソームを注射したマウスからの示されている組織の顕微鏡画像を示す。白色は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのタンパク質カーゴの送達を示す、代表的なＲＦＰ蛍光細胞を示す。
【０１９８】
【図１０】図１０は、標的とされた細胞によりルシフェラーゼが発現される結果となる、示されている投与経路によるｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス組織へのフソソームの送達成功を示す一連の画像である。
【０１９９】
【図１１】図１１は、細胞生物製剤による筋肉細胞へのタンパク質カーゴの送達を示す、マウス筋肉組織におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の顕微鏡画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２００】
本発明は、膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソーム、および関連する方法について記載する。
定義
【０２０１】
薬剤：一般に、「薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、糖類もしくは多糖類、脂質、小分子、またはこれらの組合せもしくは複合体を含む、化合物または実体を指して使用され得る。この用語は、オルガネラであるかもしくはそれを含む実体、またはその画分、抽出物、もしくは成分を指し得る。
【０２０２】
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原への特異的結合を付与するのに十分なカノニカル免疫グロブリン配列エレメントを含むポリペプチドを指す。本発明の目的で、ある特定の実施形態では、抗原への特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが天然に産生された（例えば、抗原に反応する生物によって生成された）か、または組換え操作、化学合成、もしくは他の人工的なシステムもしくは手法によって産生されたかに関係なく、「抗体」と称することができ、かつ／または「抗体」として使用することができる。一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナルであり、一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルである。一部の実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。一部の実施形態では、抗体配列エレメントは、ヒト化、霊長類化、キメラなどである。いくつかの実施形態では、本発明により用いられる抗体は、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離されたＣＤＲもしくはそのセット、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド−Ｆｃ融合体、単一ドメイン抗体（例えば、サメ単一ドメイン抗体、例えば、ＩｇＮＡＲもしくはその断片）、ラクダ抗体、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰ（商標）」）、一本鎖もしくはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質もしくはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、マイクロタンパク質、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、ならびにＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるがこれらに限定されない、形式である。一部の実施形態では、抗体は、天然に産生された場合には有するであろう共有結合的な改変（例えば、グリカンの結合）が欠如していてもよい。一部の実施形態では、抗体は、共有結合的な改変（例えば、グリカン、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリ−エチレングリコールなど］の結合を含んでもよい。一部の実施形態では、上述の形式のうちのいずれかの抗体は、１つまたは複数の相補性決定領域、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤ２、および／またはＣＤＲ３を含む。
【０２０３】
抗原結合性ドメイン：本明細書に使用される「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原に結合する抗体またはキメラ抗原受容体の部分を指す。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、細胞の細胞表面抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、がんに特徴的な抗原、例えば、新生物細胞における腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、感染性疾患に特徴的な抗原、例えば、ウイルス感染細胞におけるウイルス関連抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、自己免疫疾患において対象の免疫系によって標的とされる細胞に特徴的な抗原、例えば、自己抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性部分であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖまたはＦａｂであるかまたはそれを含む。
【０２０４】
会合する：一部の実施形態では、２つまたはそれを上回る実体が、直接的または間接的に相互作用する場合、それらは、互いに物理的に「会合」しており、結果として、それらは、互いに物理的に近接している、および／または物理的近接性が保たれる。一部の実施形態では、互いに物理的に会合した２つまたはそれを上回る実体は、互いに共有結合で連結されており、一部の実施形態では、互いに物理的に会合した２つまたはそれを上回る実体は、互いに共有結合で連結されていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気作用、およびこれらの組合せによって、非共有結合的に会合している。
【０２０５】
がん：「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」、および「癌腫」という用語は、相対的に異常な無制御のおよび／または自律的な成長を呈し、結果として、細胞増殖の制御の有意な消失を特徴とする異常な成長表現型を呈する、細胞を指して、本明細書に使用される。一部の実施形態では、腫瘍は、前がん性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、および／または非転移性である細胞であり得るかまたはそれを含み得る。本開示は、その教示が具体的に関連し得るある特定のがんを特異的に特定する。一部の実施形態では、関連するがんは、固形腫瘍を特徴とし得る。一部の実施形態では、腫瘍は、分散腫瘍または液性腫瘍であってもよい。一部の実施形態では、関連するがんは、血液腫瘍を特徴とし得る。一般に、当該技術分野において公知の異なる種類のがんの例としては、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫および骨髄増殖性障害、肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織の癌腫、口腔、咽喉、喉頭、および肺の扁平上皮細胞癌、肝臓がん、尿生殖器がん、例えば、前立腺、子宮頸、膀胱、子宮、および子宮内膜のがん、ならびに腎細胞癌、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚もしくは眼内の黒色腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、頭頸部がん、乳がん、消化器がんおよび神経系のがん、良性病変、例えば、乳頭腫などが挙げられる。
【０２０６】
カーゴ：本明細書で使用される場合、「カーゴ」または「ペイロード」は、フソソームによって標的細胞に送達することができる薬剤を含む。一部の実施形態では、カーゴは、治療剤、例えば、供給源細胞に対して内因性または外因性である治療剤のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、治療剤は、タンパク質、例えば、酵素、膜貫通タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または小分子のうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、カーゴは、膜タンパク質ペイロード剤であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、カーゴは、オルガネラであるかまたはそれを含む。
【０２０７】
ＣＤＲ：本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、例えば、抗体可変領域内に位置し得る、相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに、３つのＣＤＲが存在し、これらは、可変領域のそれぞれについて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と表記される。「ＣＤＲのセット」または「ＣＤＲセット」は、抗原に結合することができる単一の可変領域または抗原に結合することができる同種重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲのいずれかに生じる、３つまたは６つのＣＤＲの群を指す。ＣＤＲ境界部を定義するためのある特定のシステムが、当該技術分野において確立されており（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａなど）、当業者であれば、これらのシステム間の違いを認識し、特許請求される発明を理解し、実施するために必要とされる程度に、ＣＤＲ境界部を理解することができる。
【０２０８】
細胞膜：本明細書で使用される場合、「細胞膜」は、細胞、例えば、供給源細胞または標的細胞に由来する膜を指す。
【０２０９】
細胞生物製剤：本明細書で使用される場合、「細胞生物製剤」は、内腔および細胞膜を含む細胞の一部分、または部分的もしくは完全な核不活性化を有する細胞を指す。一部の実施形態では、細胞生物製剤は、細胞骨格成分、オルガネラ、およびリボソームのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、細胞生物製剤は、除核細胞、マイクロベシクル、または細胞ゴーストである。
【０２１０】
サイトゾル：本明細書で使用される場合、「サイトゾル」は、細胞の細胞質の水溶性成分を指す。サイトゾルは、タンパク質、ＲＮＡ、代謝産物、およびイオンを含み得る。
【０２１１】
内因性：本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、関連する系（例えば、細胞、組織、生物、供給源細胞、または標的細胞など）において天然に見出される、薬剤、例えば、タンパク質または脂質を指す。例えば、一部の実施形態では、フソソームまたは膜封入調製物は、関連する脂質および／またはタンパク質が、フソソームまたは膜封入調製物が得られたかまたは由来する供給源細胞（例えば、フソソームまたは膜封入調製物の供給源細胞）において天然に見出される場合、１つまたは複数の「内因性」脂質および／またはタンパク質を含むと称され得る。一部の実施形態では、内因性薬剤は、供給源細胞において過剰発現されている。
【０２１２】
外因性：本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、関連する系（例えば、細胞、組織、生物、供給源細胞、または標的細胞など）において天然に見出されない、薬剤（例えば、タンパク質または脂質）を指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、関連する系に操作および／または導入され、例えば、一部の実施形態では、フソソームまたは膜封入調製物は、関連する脂質および／またはタンパク質が、フソソームまたは膜封入調製物が得られたかまたは由来する供給源細胞（例えば、フソソームまたは膜封入物の供給源細胞）において天然に見出されない場合、１つまたは複数の「外因性」脂質および／またはタンパク質を含むと称され得る。一部の実施形態では、外因性薬剤は、内因性薬剤のバリアント、例えば、例として、１つまたは複数の構造的態様、例えば、アミノ酸配列、翻訳後改変などが参照内因性タンパク質などとは異なる、タンパク質バリアント）である。
【０２１３】
機能性バリアント：「機能性バリアント」という用語は、参照アミノ酸配列に実質的に同一なアミノ酸配列を有するか、実質的に同一なヌクレオチド配列によってコードされ、参照アミノ酸配列の１つまたは複数の活性を有することができる、ポリペプチドを指す。
【０２１４】
融合細胞：本明細書で使用される場合、「融合細胞」は、１つまたは複数のフソソームを標的細胞と接触させることによって産生される、細胞を指す。融合細胞の一部の実施形態では、１つまたは複数のフソソームの脂質二重層の少なくとも一部分は、標的細胞の膜と会合している。
【０２１５】
フソゲン：本明細書で使用される場合、「フソゲン」は、２つの膜封入内腔の間の相互作用をもたらす、薬剤または分子を指す。いくつかの実施形態では、フソゲンは、膜の融合を促進する。他の実施形態では、フソゲンは、２つの内腔（例えば、フソソームの内腔および標的細胞の細胞質）の間に、接続、例えば、細孔をもたらす。一部の実施形態では、フソゲンは、２つまたはそれを上回るタンパク質の複合体を含み、例えば、ここで、いずれのタンパク質も、単独では膜融合活性を有さない。
【０２１６】
フソゲン結合性パートナー：本明細書で使用される場合、「フソゲン結合性パートナー」は、フソゲンと相互作用して、２つの膜の間の融合を促進する、薬剤または分子を指す。一部の実施形態では、フソゲン結合性パートナーは、細胞の表面特徴部であり得るかまたはそれを含み得る。
【０２１７】
フソソーム組成物：本明細書で使用される場合、「フソソーム組成物」は、１つまたは複数のフソソームを含む、組成物を指す。
【０２１８】
膜タンパク質ペイロード剤：本明細書で使用される場合、「膜タンパク質ペイロード剤」は、膜タンパク質および／または膜タンパク質をコードする核酸であるかまたはそれを含む、カーゴを指し、このカーゴは、本明細書に記載されるフソソームまたは膜封入調製物に含まれ得る（例えば、標的細胞への送達のために）。膜タンパク質は、細胞膜と会合する（例えば、その中および／もしくはその上に局在化する）かまたはそれと会合することができる、タンパク質である。一部の実施形態では、膜タンパク質は、膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、膜タンパク質は、少なくとも部分的に（例えば、完全に）膜、例えば、細胞膜をまたぐドメインを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質は、膜脂質二重層の内側（例えば、細胞質）部分と会合している。一部の実施形態では、膜タンパク質は、膜脂質二重層の外側部分（例えば、細胞表面または本明細書に記載されるフソソームもしくは膜封入調製物の表面）と会合している。一部の実施形態では、膜タンパク質は、膜脂質二重層の外側部分と会合しており、細胞表面タンパク質である。一部の実施形態では、膜タンパク質は、膜脂質二重層を通過し、分泌される。一部の実施形態では、膜タンパク質は、天然に存在するタンパク質である。一部の実施形態では、膜タンパク質は、操作および／または合成タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体）である。一部の実施形態では、膜タンパク質は、治療剤である。
【０２１９】
医薬組成物：本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された活性剤を指す。一部の実施形態では、活性剤は、治療レジメンでの関連する対象への投与に適切な単位投薬量で存在する。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液、または持続放出製剤として、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射による非経口投与のために特別に製剤化され得る。
【０２２０】
薬学的に許容される担体：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、または賦形剤を意味する。
【０２２１】
精製された：本明細書で使用される場合、「精製された」とは、天然の状態から変更されているか、または取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する細胞または細胞断片は、「精製」されていないが、同じ細胞または細胞断片が、その天然の状態の共存する材料から部分的または完全に分離されている場合は、「精製」されている。精製されたフソソーム組成物は、実質的に純粋な形態で存在してもよく、または非天然の環境、例えば、例として、培養培地、例えば、細胞を含む培養培地に存在してもよい。
【０２２２】
供給源細胞：本明細書で使用される場合、「供給源細胞」は、フソソームが由来する、例えば、得られた、細胞を指す。一部の実施形態では、由来するとは、供給源細胞から膜封入調製物を得、フソゲンに追加することを含む。
【０２２３】
実質的に同一である：ヌクレオチド配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、第１および第２のヌクレオチド配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第１の核酸配列が、第２の核酸配列におけるアライメントしたヌクレオチドに同一である十分な数または最小限の数のヌクレオチド、例えば、参照配列、例えば、本明細書に提供される配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを指して、本明細書に使用される。本明細書における組成物および方法は、指定される配列またはそれに実質的に同一もしくは類似である配列、例えば、指定される配列に少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一であるか、またはそれを上回って同一である配列を有する、ポリペプチドおよび核酸を包含する。アミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有し得るように、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列におけるアライメントしたアミノ酸残基と、ｉ）同一であるか、またはｉｉ）その保存的置換である、十分な数または最小限の数のアミノ酸残基、例えば、参照配列、例えば、本明細書に提供される配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列を含むことを指して、本明細書に使用される。
【０２２４】
標的細胞部分：本明細書で使用される場合、「標的細胞部分」という用語は、フソソームを細胞に特異的に（関連する系における少なくとも１つの他の細胞と比べて）標的化するために使用することができる、細胞（例えば、標的細胞）の特徴部を指して使用される。一部の実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の表面特徴部である。一部の実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の細胞膜と会合したタンパク質であるかまたはその一部分である。一部の実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の膜と会合したペプチドまたはタンパク質であるかまたはその一部分である。一部の実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の膜と会合した脂質であるかまたはその一部分である。一部の実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の膜と会合した糖類であるかまたはその一部分である。
【０２２５】
標的化ドメイン：本明細書で使用される場合、「標的化ドメイン」という用語は、標的細胞部分と会合または相互作用する、フソソームの特徴部である。一部の実施形態では、標的化ドメインは、標的細胞部分と特異的に（曝露条件下において）会合または相互作用する。一部の実施形態では、標的化ドメインは、標的細胞上に存在する標的細胞部分に特異的に結合する。一部の実施形態では、標的化ドメインは、フソゲンのドメインであるかまたはそれを含み、例えば、フソゲンに共有結合しており、例えば、フソゲンポリペプチドの一部である。一部の実施形態では、標的化ドメインは、任意のフソゲンとは別個の実体であり、例えば、フソゲンに共有結合で連結しておらず、例えば、フソゲンポリペプチドの一部ではない。
【０２２６】
安定：本明細書における組成物に適用される場合、「安定」という用語は、組成物が、指定される条件セット下において、ある期間にわたり、その物理的構造および／または活性の１つまたは複数の態様を維持することを意味する。一部の実施形態では、指定される条件は、低温保管である（例えば、約４℃もしくはそれよりも低い、−２０℃もしくはそれよりも低い、または−８０℃もしくはそれよりも低い）。
【０２２７】
標的細胞：本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、フソソームが融合する細胞を指す。
【０２２８】
ＴＣＲドメイン：本明細書で使用される場合、「ＴＣＲドメイン」は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様について、ＴＣＲ複合体を活性化させることができる、Ｔ細胞受容体ポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントの一部分を指す。一部の実施形態では、ＴＣＲ複合体の活性化は、Ｔ細胞の増殖、活性化、分化、サイトカイン分泌、または細胞溶解活性のうちの１つまたは複数を引き起こす。
【０２２９】
バリアント：「バリアント」という用語は、参照アミノ酸配列に実質的に同一なアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一なヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、バリアントは、機能性バリアントである。
フソソーム
【０２３０】
本明細書に記載されるフソソーム組成物および方法は、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）脂質二重層によって囲まれている、内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、（ｃ）供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤とを含む。いくつかの実施形態では、フソソームは、非植物細胞、例えば、哺乳動物細胞、またはその誘導体（例えば、ミトコンドリア、コンドリソーム、オルガネラ、小胞、もしくは除核細胞）に由来し、フソゲン、例えば、タンパク質フソゲン、脂質フソゲン、または化学物質フソゲンを含む。
封入
【０２３１】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、フソソーム、例えば、フソゲンを有する両親媒性脂質の天然由来の二重層を含む。フソソームは、複数の異なる種類の脂質、例えば、両親媒性脂質、例えば、リン脂質を含み得る。フソソームは、最も外側の表面として、脂質二重層を含み得る。そのような組成物は、驚くべきことに、本発明の方法において使用することができる。一部の事例では、膜は、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４  Ｍｉｒｏ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ＆  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｃｕｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ．  ３３（９）：９９４−１０１０に記載されるような、自家、同種、ゼノジェニック、または操作された細胞の形態をとり得る。一部の実施形態では、組成物は、例えば、Ｏｒｉｖｅ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５．  Ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｄｖａｎｃｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；  ３６  （８）：５３７−４６およびＭｉｓｈｒａ．  ２０１６．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓに記載されるような、操作された膜を含む。一部の実施形態では、組成物は、天然に存在する膜を含む（ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２．  Ａ  Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｈｕｔｔｌｅｓ  Ｃａｒｇｏ  ｆｒｏｍ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｔｏ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２：１３５−１４１）。
【０２３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、天然由来の膜、例えば、細胞または組織から調製された膜小胞を含む。一部の実施形態では、フソソームは、ＭＳＣまたは星状細胞に由来する小胞である。
【０２３３】
一部の実施形態では、フソソームは、エクソソームである。
【０２３４】
例示的なエクソソームおよび他の膜封入体は、例えば、ＵＳ２０１６１３７７１６に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、細胞から得ることができる小胞、例えば、マイクロベシクル、エクソソーム、アポトーシス体（アポトーシス細胞に由来する）、微粒子（例えば、血小板に由来し得る）、エクトソーム（例えば、血清中の好中球および単球に由来する）、プロスタトソーム（前立腺がん細胞から得ることができる）、カルディオソーム（心細胞に由来し得る）などを含む。
【０２３５】
例示的なエクソソームおよび他の膜封入体はまた、ＷＯ／２０１７／１６１０１０、ＷＯ／２０１６／０７７６３９、ＵＳ２０１６０１６８５７２、ＵＳ２０１５０２９０３４３、およびＵＳ２００７０２９８１１８に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、フソソームは、細胞外小胞、ナノ小胞、またはエクソソームを含む。一部の実施形態では、フソソームは、細胞外小胞、例えば、内部空間を封入する膜を含み、それが由来する細胞よりも小さい径を有する、細胞由来の小胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、２０ｎｍ〜１０００ｎｍの径を有する。いくつかの実施形態では、フソソームは、アポトーシス体、細胞の断片、直接的または間接的な操作による細胞に由来する小胞、小胞化オルガネラ、および生細胞によって産生された小胞（例えば、直接的な形質膜出芽または後期エンドソームと形質膜との融合による）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、生きているかもしくは死亡した生物、外植組織もしくは臓器、または培養細胞に由来する。いくつかの実施形態では、フソソームは、ナノ小胞、例えば、内部空間を封入する膜を含む、細胞に由来する小さな（例えば、２０〜２５０ｎｍの径、または３０〜１５０ｎｍの径の）小胞を含み、これは、直接的または間接的な操作によって前記細胞から生成される。ナノ小胞の産生は、一部の事例では、供給源細胞の破壊をもたらす。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸、およびポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、フソソームは、エクソソームを含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、内部空間を封入する膜を含む、細胞に由来する小さな（例えば、２０〜３００ｎｍの径、または４０〜２００ｎｍの径の）小胞であり、これは、直接的な形質膜出芽または後期エンドソームと形質膜との融合によって前記細胞から生成される。いくつかの実施形態では、エクソソームの産生は、供給源細胞の破壊をもたらさない。いくつかの実施形態では、エクソソームは、脂質または脂肪酸、およびポリペプチドを含む。
【０２３６】
例示的なエクソソームおよび他の膜封入体はまた、ＵＳ  ２０１６０３５４３１３に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、フソソームは、生体適合性送達分子、エクソソーム（例えば、約３０ｎｍ〜約２００ｎｍの径）、マイクロベシクル（例えば、約１００ｎｍ〜約２０００ｎｍの径）、アポトーシス体（例えば、約３００ｎｍ〜約２０００ｎｍの径）、膜粒子、膜小胞、エクソソーム様小胞、エクトソーム様小胞、エクトソーム、または外小胞を含む。
【０２３７】
一部の実施形態では、フソソームは、マイクロベシクルである。一部の実施形態では、フソソームは、細胞ゴーストである。一部の実施形態では、小胞は、形質膜小胞、例えば、巨大形質膜小胞である。
【０２３８】
フソソームは、複数の異なる種類の脂質、例えば、両親媒性脂質、例えば、リン脂質から作製され得る。フソソームは、最も外側の表面として、脂質二重層を含み得る。この二重層は、同じかまたは異なる種類の１つまたは複数の脂質から構成され得る。例としては、限定されないが、リン脂質、例えば、ホスホコリンおよびホスホイノシトールが挙げられる。具体的な例としては、限定することなく、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、およびＤＳＰＣが挙げられる。
フソゲン
【０２３９】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソソーム（例えば、小胞または細胞の一部分を含む）は、例えば、フソソームの、膜、例えば、細胞膜への融合を促進するために、１つまたは複数のフソゲンを含む。また、これらの組成物は、１つまたは複数のフソゲンを含むように合成中またはその後になされる表面改変を含み得る。表面改変は、膜に対する改変、例えば、膜への脂質またはタンパク質の挿入を含み得る。
【０２４０】
一部の実施形態では、フソソームは、特定の細胞または組織種（例えば、心筋細胞）を標的とするために、その外表面上に（例えば、細胞膜に組み込まれた）１つまたは複数のフソゲンを含む。フソソームは、標的化ドメインを含み得る。フソゲンは、限定されないが、タンパク質に基づくフソゲン、脂質に基づくフソゲン、および化学物質に基づくフソゲンを含む。フソゲンは、標的細胞の表面上のパートナー、例えば、特徴部に結合し得る。一部の実施形態では、標的細胞の表面上のパートナーは、標的細胞部分である。一部の実施形態では、フソゲンを含むフソソームは、膜を標的細胞の脂質二重層へと組み込む。
【０２４１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソゲンのうちの１つまたは複数は、フソソームに含まれ得る。
タンパク質フソゲン
【０２４２】
一部の実施形態では、フソゲンは、タンパク質フソゲン、例えば、哺乳動物タンパク質または哺乳動物タンパク質のホモログ（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれを上回る同一性を有する）、非哺乳動物タンパク質、例えば、ウイルスタンパク質またはウイルスタンパク質のホモログ（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれを上回る同一性を有する）、天然のタンパク質または天然のタンパク質の誘導体、合成タンパク質、その断片、そのバリアント、フソゲンまたは断片のうちの１つまたは複数を含むタンパク質融合体、ならびにこれらの任意の組合せである。
【０２４３】
一部の実施形態では、フソゲンは、フソソームにおける脂質と標的細胞における脂質との間の混合をもたらす。一部の実施形態では、フソゲンは、フソソームの内腔と標的細胞のサイトゾルとの間で１つまたは複数の細孔の形成をもたらし、例えば、フソソームは、本明細書に記載されるコネキシンであるかまたはそれを含む。
（ｉ）哺乳動物タンパク質
【０２４４】
一部の実施形態では、フソゲンは、哺乳動物タンパク質を含み得、表１を参照されたい。哺乳動物フソゲンの例としては、ＳＮＡＲＥファミリータンパク質、例えば、ｖＳＮＡＲＥおよびｔＳＮＡＲＥ、シンシチンタンパク質、例えば、シンシチン−１（ＤＯＩ：  １０．１１２８／ＪＶＩ．７６．１３．６４４２−６４５２．２００２）、およびシンシチン−２、ミオメーカー（ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１７／０４／０２／１２３１５８、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２３１５８、ｄｏｉ：  １０．１０９６／ｆｊ．２０１６００９４５Ｒ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）、ミオミキサー（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ４９９／ｎ７４５８／ｆｕｌｌ／ｎａｔｕｒｅ１２３４３．ｈｔｍｌ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）、ミオマージャー（ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１７／０４／０５／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３６１、ＤＯＩ：  １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３６１）、ＦＧＦＲＬ１（線維芽細胞成長因子受容体様１）、Ｍｉｎｉｏｎ（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２２６９７）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のアイソフォーム（例えば、ＵＳ  ６，０９９，８５７Ａに開示される）、ギャップ結合タンパク質、例えば、コネキシン４３、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン３２、またはコネキシン３７（例えば、ＵＳ  ２００７／０２２４１７６に開示される、Ｈａｐ２、異種細胞間での合胞体形成を誘導することができる任意のタンパク質（表２を参照されたい）、フソゲン特性を有する任意のタンパク質（表３を参照されたい）、そのホモログ、その断片、そのバリアント、ならびに１つまたは複数のタンパク質またはその断片を含むタンパク質融合体を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、フソゲンは、ヒトゲノムにおいて見出されるヒト内因性レトロウイルスエレメント（ｈＥＲＶ）によってコードされる。さらなる例示的なフソゲンは、ＵＳ  ６，０９９，８５７ＡおよびＵＳ  ２００７／０２２４１７６に開示されており、これらの全内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【表１】
2021513849.tif 000002
【表２−１】
2021513849.tif 000003
【表２−２】
2021513849.tif 000004
【表３−１】
2021513849.tif 000005
【表３−２】
2021513849.tif 000006
【表３−３】
2021513849.tif 000007
【表３−４】
2021513849.tif 000008
【０２４５】
一部の実施形態では、フソソームは、曲率生成タンパク質、例えば、エプシン１、ダイナミン、またはＢＡＲドメインを含むタンパク質を含む。例えば、Ｋｏｚｌｏｖｅｔ  ａｌ，  ＣｕｒｒＯｐ  ＳｔｒｕｃＢｉｏ  ２０１５，  Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  ２００６，  Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０１１を参照されたい。
（ｉｉ）非哺乳動物タンパク質
ウイルスタンパク質
【０２４６】
一部の実施形態では、フソゲンは、非哺乳動物タンパク質、例えば、ウイルスタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、ウイルスフソゲンは、クラスＩウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質、ウイルス膜糖タンパク質、もしくは他のウイルス融合タンパク質、またはそのホモログ、その断片、そのバリアント、または１つもしくは複数のタンパク質もしくはその断片を含むタンパク質融合体である。
【０２４７】
一部の実施形態では、クラスＩウイルス膜融合タンパク質としては、バキュロウイルスＦタンパク質、例えば、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ  ＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）Ｆタンパク質、およびＬｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ  ＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）、ならびにパラミクソウイルスＦタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４８】
一部の実施形態では、クラスＩＩウイルス膜タンパク質としては、ダニ媒介脳炎（ｔｉｃｋ  ｂｏｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）Ｅ（ＴＢＥＶ  Ｅ）、セムリキ森林ウイルスＥ１／Ｅ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４９】
一部の実施形態では、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質としては、ラブドウイルスＧ（例えば、水疱性口内炎ウイルスの膜融合性タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ））、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ（例えば、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ｇＢ））、エプシタインバーウイルス糖タンパク質Ｂ（ＥＢＶ  ｇＢ）、ソゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ多重ＮＰＶ（ＡｃＭＮＰＶ）ｇｐ６４）、およびボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶ  Ｇ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５０】
他のウイルスフソゲン、例えば、膜糖タンパク質およびウイルス融合タンパク質の例としては、ウイルス合胞体タンパク質、例えば、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）もしくは変異体、またはその融合タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス１型エンベロープタンパク質（ＨＩＶ−１  ＥＮＶ）、ＬＦＡ−１に結合してリンパ球合胞体を形成するＨＩＶ由来のｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＩＶ  ｇｐ１６０、もしくはＨＩＶ転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）、ウイルス糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇ、ラブドウイルスファミリーの水疱性口内炎ウイルスに由来するウイルス糖タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タンパク質ｇＢおよびｇＨ−ｇＬ、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）−１０Ａ１、テナガザル白血病ウイルス糖タンパク質（ＧａＬＶ）、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、水疱性口内炎ウイルス、およびトガウイルスにおけるＧ型糖タンパク質、マウス肝炎ウイルスＪＨＭ表面突出タンパク質、ブタ呼吸器コロナウイルススパイクおよび膜糖タンパク質、トリ感染性気管支炎スパイク糖タンパク質およびその前駆体、ウシ腸コロナウイルススパイクタンパク質、麻疹ウイルスのＦおよびＨ、ＨＮ、もしくはＧ遺伝子、イヌジステンパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス３、シミアンウイルス４１、センダイウイルスおよびヒト呼吸器合胞体ウイルス、シャペロンタンパク質ｇＬを伴うヒトヘルペス１およびサル水痘ウイルスのｇＨ、ヒト、ウシ、およびオナガザルヘルペスウイルスｇＢ、フレンドマウス白血病ウイルスおよびマソンファイザーサルウイルスのエンベロープ糖タンパク質、ムンプスウイルスヘマグルチニンノイラミニダーゼならびに糖タンパク質（ｇｌｙｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｆ１およびＦ２、ベネズエラウマ脳炎に由来する膜糖タンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ＳＩＶ  ｇｐ１６０タンパク質、エボラウイルスＧタンパク質、またはセンダイウイルス融合タンパク質、またはそのホモログ、その断片、そのバリアント、ならびに１つもしくは複数のタンパク質もしくはその断片を含むタンパク質融合体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５１】
非哺乳動物フソゲンとしては、ウイルスフソゲン、そのホモログ、その断片、ならびに１つまたは複数のタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質が挙げられる。ウイルスフソゲンには、クラスＩフソゲン、クラスＩＩフソゲン、クラスＩＩＩフソゲン、およびクラスＩＶフソゲンが含まれる。いくつかの実施形態では、クラスＩフソゲン、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ４１は、シグネチャーである中心部のコイルドコイル構造を伴うα−ヘリックスヘアピンの三量体を有する特徴的な融合後立体構造を有する。クラスＩウイルス融合タンパク質としては、中心部の融合後の６ヘリックスのバンドルを有するタンパク質が挙げられる。クラスＩウイルス融合タンパク質としては、インフルエンザＨＡ、パラインフルエンザＦ、ＨＩＶ  Ｅｎｖ、エボラＧＰ、オルソミクソウイルスに由来するヘマグルチニン、パラミクソウイルスに由来するＦタンパク質（例えば、麻疹（Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１０，  １０：３７））、レトロウイルスに由来するＥＮＶタンパク質、ならびにフィロウイルスおよびコロナウイルスのフソゲンが挙げられる。いくつかの実施形態では、クラスＩＩウイルスフソゲン、例えば、デング熱Ｅ糖タンパク質は、再フォールディングによりヘアピンの三量体をもたらす伸長された外部ドメインを形成するβ−シートの構造的シグネチャーを有する。いくつかの実施形態では、クラスＩＩウイルスフソゲンは、中心部のコイルドコイルが欠如している。クラスＩＩウイルスフソゲンは、アルファウイルス（例えば、Ｅ１タンパク質）およびフラビウイルス（例えば、Ｅ糖タンパク質）において見出され得る。クラスＩＩウイルスフソゲンには、セムリキ森林ウイルス、Ｓｉｎｂｉｓ、風疹ウイルス、およびデング熱ウイルスに由来するフソゲンが含まれる。いくつかの実施形態では、クラスＩＩＩウイルスフソゲン、例えば、水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質は、クラスＩおよびＩＩにおいて見出される構造的シグネチャーを組み合わせる。いくつかの実施形態では、クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、αヘリックス（例えば、６ヘリックスのバンドルを形成して、タンパク質をクラスＩウイルスフソゲンのようにフォールドバックさせる）と、クラスＩＩウイルスフソゲンを想起させる端部に両親媒性融合ペプチドを有するβシートとを含む。クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスにおいて見出すことができる。いくつかの実施形態では、クラスＩＶウイルスフソゲンは、融合関連の小さな膜貫通（ＦＡＳＴ）タンパク質であり（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００７６７，  Ｎｅｓｂｉｔｔ，  Ｒａｅ  Ｌ．，  ”Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＦＡＳＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  （２０１２）．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．  Ｐａｐｅｒ  ３８８）、これは、非エンベロープ型レオウイルスによってコードされる。いくつかの実施形態では、クラスＩＶウイルスフソゲンは、十分に小さいため、ヘアピンを形成しない（ｄｏｉ：  １０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｃｅｌｌｂｉｏ−１０１５１２−１２２４２２、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２００７．１２．００８）。
【０２５２】
一部の実施形態では、フソゲンは、パラミクソウイルスフソゲンである。一部の実施形態では、フソゲンは、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ｔｕｐａｉａパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、またはアブラウイルスＦタンパク質である。
【０２５３】
さらなる例示的なフソゲンは、米国特許第ＵＳ  ９，６９５，４４６号、米国公開第ＵＳ  ２００４／００２８６８７号、米国特許第ＵＳ  ６，４１６，９９７号、同第ＵＳ  ７，３２９，８０７号、米国公開第ＵＳ  ２０１７／０１１２７７３号、同第ＵＳ  ２００９／０２０２６２２号、国際公開第ＷＯ  ２００６／０２７２０２号、および米国公開第ＵＳ  ２００４／０００９６０４号に開示されており、これらのすべての全内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
（ｉｉｉ）他のタンパク質
【０２５４】
一部の実施形態では、フソゲンは、ｐＨ依存性（例えば、虚血傷害の場合のような）タンパク質、そのホモログ、その断片、ならびに１つまたは複数のタンパク質またはその断片を含むタンパク質融合体を含み得る。フソゲンは、細胞表面、またはエンドソーム、または別の細胞−膜結合空間において、膜融合を媒介し得る。
【０２５５】
一部の実施形態では、フソゲンは、ＥＦＦ−１、ＡＦＦ−１、ギャップ結合タンパク質、例えば、コネキシン（例えば、Ｃｎ４３、ＧＡＰ４３、ＣＸ４３）（ＤＯＩ：  １０．１０２１／ｊａｃｓ．６ｂ０５１９１）、他の腫瘍接続タンパク質、そのホモログ、その断片、そのバリアント、および１つまたは複数のタンパク質またはその断片を含むタンパク質融合体を含む。
タンパク質フソゲンに対する改変
【０２５６】
一部の実施形態では、タンパク質フソゲンは、免疫反応性を低減するように変更することができる。例えば、タンパク質フソゲンは、免疫相互作用を低減させる分子、例えば、ＰＥＧで修飾することができる（ＤＯＩ：  １０．１１２８／ＪＶＩ．７８．２．９１２−９２１．２００４）。したがって、一部の実施形態では、フソゲンは、ＰＥＧを含み、例えば、ＰＥＧ化ポリペプチドである。免疫系によって標的とされるフソゲンにおけるアミノ酸残基を、免疫系によって認識されないように変更してもよい（ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１４．０１．０２７、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４６６６７）。一部の実施形態では、フソゲンのタンパク質配列は、ヒトにおいて見出されるアミノ酸配列に近似するように変更される（ヒト化）。一部の実施形態では、フソゲンのタンパク質配列は、ＭＨＣ複合体に低い強度で結合するタンパク質配列に変更される。一部の実施形態では、タンパク質フソゲンは、ヒトに感染しないウイルスまたは生物（ヒトが、それに対してワクチン接種されていない）に由来し、患者の免疫系がタンパク質フソゲンに対してナイーブである可能性が高い（例えば、フソゲンに対して無視できる程度の体液性または細胞媒介性適応免疫応答が存在する）（ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｔｈｅ．２００２．０５５０、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００５６４１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１１．２０９、ＤＯＩ  １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０２−５５８１６３）。一部の実施形態では、フソゲンのグリコシル化は、免疫相互作用を変更するか、または免疫反応性を低減させるように変更され得る。理論によって束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、ヒトに感染しないウイルスまたは生物に由来するタンパク質フソゲンは、患者において天然の融合標的を有さず、したがって、高い特異性を有する。
脂質フソゲン
【０２５７】
一部の実施形態では、フソソームは、膜融合性脂質、例えば、飽和脂肪酸で処置され得る。一部の実施形態では、飽和脂肪酸は、１０〜１４個の炭素を有する。一部の実施形態では、飽和脂肪酸は、より長鎖のカルボン酸を有する。一部の実施形態では、飽和脂肪酸は、モノエステルである。
【０２５８】
一部の実施形態では、フソソームは、不飽和脂肪酸で処置され得る。一部の実施形態では、不飽和脂肪酸は、Ｃ１６〜Ｃ１８の不飽和脂肪酸を有する。一部の実施形態では、不飽和脂肪酸としては、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、改変された不飽和脂肪酸、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０２５９】
理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、負曲率脂質は、膜融合を促進する。一部の実施形態では、フソソームは、膜において、１つまたは複数の負曲率脂質、例えば、供給源細胞に対して外因性である負曲率脂質を含む。いくつかの実施形態では、負曲率脂質またはその前駆体は、供給源細胞またはフソソームを含む培地に添加される。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、１つまたは複数の脂質合成遺伝子を発現または過剰発現するように操作されている。負曲率脂質は、例えば、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、コレステロール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、または脂肪酸（ＦＡ）であり得る。
【０２６０】
理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、正曲率脂質は、膜融合を阻害する。一部の実施形態では、フソソームは、膜において、低減されたレベルの１つまたは複数の正曲率脂質、例えば、外因性の正曲率脂質を含む。いくつかの実施形態では、レベルは、供給源細胞において、脂質の合成を阻害することによって、例えば、脂質合成遺伝子のノックアウトまたはノックダウンによって、低減される。正曲率脂質は、例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、またはモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）であり得る。
化学物質フソゲン
【０２６１】
一部の実施形態では、フソソームは、膜融合性化学物質で処置され得る。一部の実施形態では、膜融合性化学物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である。
【０２６２】
一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、２つの膜の間での局所的脱水を誘導し、これにより、二重層の望ましくない分子充填が引き起こされる。一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、脂質二重層の近傍の領域の脱水を誘導し、細胞間から水溶性分子を押しのけ、２つの膜同士の相互作用を可能にする。
【０２６３】
一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、正のカチオンである。正のカチオンの一部の非限定的な例としては、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｌａ３＋、Ｓｒ３＋、およびＨ＋が挙げられる。
【０２６４】
一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、表面極性を改変することによって標的膜に結合し、表面極性の改変により、水和依存性の膜間斥力が変更される。
【０２６５】
一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、可溶性脂質可溶性である。一部の非限定的な例としては、オレオイルグリセロール、ジオレオイルグリセロール、トリオレオイルグリセロール、ならびにこれらのバリアントおよび誘導体が挙げられる。
【０２６６】
一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、水溶性化学物質である。一部の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ならびにこれらのバリアントおよび誘導体が挙げられる。
【０２６７】
一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、有機小分子である。非限定的な例としては、ｎ−ヘキシルブロミドが挙げられる。
【０２６８】
一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、フソゲンまたは標的膜の構成、細胞生存性、またはイオン輸送特性を変更させない。
【０２６９】
一部の実施形態では、化学物質フソゲンは、ホルモンまたはビタミンである。一部の非限定的な例としては、アブシジン酸、レチノール（ビタミンＡ１）、トコフェロール（ビタミンＥ）、ならびにこれらのバリアントおよび誘導体が挙げられる。
【０２７０】
一部の実施形態では、フソソームは、アクチン、および重合アクチンを安定させる薬剤を含む。理論に束縛されることを望むものではないが、フソソーム中の安定化されたアクチンは、標的細胞との融合を促進し得る。いくつかの実施形態では、重合アクチンを安定させる薬剤は、アクチン、ミオシン、ビオチン−ストレプトアビジン、ＡＴＰ、神経細胞ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（Ｎ−ＷＡＳＰ）、またはホルミンから選択される。例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．  ２０１１  Ａｕｇ  １６；２７（１６）：１００６１−７１およびＷｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１６  Ａｕｇ  ３１；７を参照されたい。いくつかの実施形態では、フソソームは、供給源細胞に対して外因性であるかまたはそれと比べて過剰発現されているアクチン、例えば、野生型アクチンまたは重合を促進する変異を含むアクチンを含む。いくつかの実施形態では、フソソームは、ＡＴＰまたはホスホクレアチン、例えば、外因性ＡＴＰまたはホスホクレアチンを含む。
小分子フソゲン
【０２７１】
一部の実施形態では、フソソームは、膜融合性小分子で処置され得る。一部の非限定的な例としては、ハロタン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンが挙げられる。
【０２７２】
一部の実施形態では、小分子フソゲンは、ミセル様凝集体で存在してもよく、または凝集体を含まなくてもよい。
フソゲン改変
【０２７３】
一部の実施形態では、フソゲンは、切断可能なタンパク質に連結されている。一部の事例では、切断可能なタンパク質は、プロテアーゼへの曝露によって切断され得る。操作された融合タンパク質は、膜貫通タンパク質の任意のドメインに結合し得る。操作された融合タンパク質は、切断性ペプチドによって、膜間腔内に位置するタンパク質ドメインに連結され得る。切断性ペプチドは、膜間プロテアーゼ（例えば、ＨＴＲＡ２／ＯＭＩであり、これは、非極性脂肪族アミノ酸、好ましくはバリン、イソロイシン、またはメチオニンを、Ｐ１位に必要とし、親水性残基、好ましくはアルギニンを、Ｐ２位およびＰ３位に必要とする）のうちの１つまたは組合せによって、切断され得る。
【０２７４】
一部の実施形態では、フソゲンは、親和性タグに連結されている。一部の実施形態では、親和性タグは、フソソームの分離および単離を補助する。一部の実施形態では、親和性タグは、切断可能である。一部の実施形態では、親和性タグは、フソゲンに非共有結合的に連結されている。一部の実施形態では、親和性タグは、フソソームに存在し、フソゲンとは別個である。
【０２７５】
一部の実施形態では、フソゲンタンパク質は、当該技術分野において公知の任意の方法または本明細書に記載される任意の方法によって、タンパク質分解配列、例えば、ミトコンドリアまたはサイトゾル分解配列を含むように操作されている。フソゲンタンパク質は、限定されないが、タンパク質分解配列、例えば、カスパーゼ２タンパク質配列（例えば、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−｜−（配列番号１））もしくは他のタンパク質分解配列（例えば、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ；  ２００５：  ５７１−６０７を参照されたい）、野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれを上回る同一性を有する改変されたタンパク質分解配列、サイトゾルタンパク質分解配列、例えば、ユビキチン、または野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれを上回る同一性を有する改変されたサイトゾルタンパク質分解配列を含むように操作されていてもよい。一部の実施形態では、組成物は、タンパク質分解配列で改変されたタンパク質、例えば、野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれを上回る同一性のもの、サイトゾルタンパク質分解配列、例えば、ユビキチン、または野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれを上回る同一性を有する改変されたサイトゾルタンパク質分解配列を含む、供給源細胞のミトコンドリアまたはコンドリソームを含む。
【０２７６】
一部の実施形態では、フソゲンは、特定のタンパク質、例えば、プロテアーゼの過剰発現、例えば、プロテアーゼ活性を有する操作された融合タンパク質を認識する、プロテアーゼドメインで改変され得る。例えば、プロテアーゼまたはプロテアーゼに由来するプロテアーゼドメイン、例えば、ＭＭＰ、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、内部膜ペプチダーゼなどである。
【０２７７】
Ａｌｆｏｎｚｏ，  Ｊ．Ｄ．  ＆  Ｓｏｌｌ，  Ｄ．  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔＲＮＡ  ｉｍｐｏｒｔ  −  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ  ｈａｓ  ｊｕｓｔ  ｂｅｇｕｎ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９０：  ７１７−７２２．  ２００９、Ｌａｎｇｅｒ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．  ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．  Ｖｏｌ．  ２８０，  Ｎｏ．  ４．  ２６９１−２６９９，  ２００５；  Ｖｌｉｅｇｈ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｔ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ．  １５（１／２）．  ２０１０、Ｑｕｉｒｏｓ  Ｐ．Ｍ．ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ，  ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｖ１６，  ２０１５、Ｗｅｂｅｒ−Ｌｏｔｆｉ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  ＤＮＡ  ｉｍｐｏｒｔ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．  Ｖｏｌ．  ３０．  Ｎ  １．  ７１−７３，  ２０１４を参照されたい。
標的細胞への非エンドサイトーシス進入
【０２７８】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソソームまたはフソソーム組成物は、非エンドサイトーシス経路を介して、カーゴを標的細胞に送達する。理論に束縛されることを望むものではないが、非エンドサイトーシス送達経路により、細胞、例えば、細胞の所望されるコンパートメントに送達されるカーゴの量またはパーセンテージを改善することができる。
【０２７９】
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される複数のフソソームは、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下において標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処置されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団における細胞数の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％に、カーゴを送達する。
【０２８０】
一部の実施形態では、カーゴのうちの１０％を下回るものが、エンドサイトーシスによって細胞に進入する。
【０２８１】
一部の実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤は、リソソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１である。
【０２８２】
一部の実施形態では、カーゴの送達は、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、国際出願第ＷＯ２０１８／２０８７２８号の実施例１３５のアッセイを使用して判定され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８３】
一部の実施形態では、カーゴは、ダイナミン非依存性経路またはリソソーム酸性化非依存性経路、マクロピノサイトーシス非依存性経路、またはアクチン非依存性経路を通じて細胞に進入する。
【０２８４】
一部の実施形態（例えば、カーゴの非エンドサイトーシス送達をアッセイするための実施形態）では、カーゴの送達は、以下のステップのうちの１つまたは複数（例えば、すべて）を使用してアッセイされる：（ａ）３０，０００個のＨＥＫ−２９３Ｔ標的細胞を、１００ｎＭバフィロマイシンＡ１を含む９６ウェルプレートの第１のウェルに入れ、類似の数の類似の細胞を、バフィロマイシンＡ１を含まない９６ウェルプレートの第２のウェルに入れるステップ、（ｂ）標的細胞を、ＤＭＥＭ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で４時間培養するステップ、（ｃ）標的細胞を、カーゴを含む１０ｕｇのフソソームと接触させるステップ、（ｄ）標的細胞およびフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートするステップ、ならびに（ｅ）第１のウェルおよび第２のウェルにおいてカーゴを含む細胞のパーセンテージを判定するステップ。ステップ（ｅ）は、顕微鏡法を使用して、例えば、免疫蛍光を使用して、カーゴを検出することを含み得る。ステップ（ｅ）は、間接的にカーゴを検出すること、例えば、カーゴの下流作用、例えば、レポータータンパク質の存在を検出することを含み得る。一部の実施形態では、上記のステップ（ａ）〜（ｅ）のうちの１つまたは複数は、国際出願第ＷＯ２０１８／２０８７２８号の実施例１３５に記載されるように行われる。
【０２８５】
一部の実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤（例えば、クロロキンまたはバフィロマイシンＡ１）は、エンドソーム酸性化を阻害する。一部の実施形態では、カーゴの送達は、リソソーム酸性化から独立している。一部の実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤（例えば、Ｄｙｎａｓｏｒｅ）は、ダイナミンを阻害する。一部の実施形態では、カーゴの送達は、ダイナミン活性から独立している。
【０２８６】
一部の実施形態では、フソソームは、エンドサイトーシスによって標的細胞に進入し、例えば、ここで、エンドサイトーシス経路を介して送達される治療剤のレベルは、例えば、本明細書における実施例９１のアッセイを使用して、０．０１〜０．６、０．０１〜０．１、０．１〜０．３、もしくは０．３〜０．６であるか、または同様のフソソームと接触させたクロロキン処置参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。一部の実施形態では、標的細胞に進入するフソソーム組成物中のフソソームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％は、非エンドサイトーシス経路を介して進入し、例えば、フソソームは、細胞表面との融合を介して標的細胞に進入する。一部の実施形態では、所与のフソソームについて、非エンドサイトーシス経路を介して送達される治療剤のレベルは、例えば、本明細書における実施例９０のアッセイを使用して、０．１〜０．９５、０．１〜０．２、０．２〜０．３、０．３〜０．４、０．４〜０．５、０．５〜０．６、０．６〜０．７、０．７〜０．８、０．８〜０．９、０．９〜０．９５であるか、またはクロロキン処置参照細胞よりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。一部の実施形態では、標的細胞に進入するフソソーム組成物中のフソソームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％は、細胞質に進入する（例えば、エンドソームにもリソソームにも進入しない）。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤が細胞質に進入した後、膜タンパク質ペイロード剤またはそこでコードされるポリペプチドは、細胞膜に局在化するかまたは分泌される。一部の実施形態では、標的細胞に進入するフソソーム組成物中のフソソームのうちの９０％を下回る、８０％を下回る、７０％を下回る、６０％を下回る、５０％を下回る、４０％を下回る、３０％を下回る、２０％を下回る、１０％を下回る、５％を下回る、４％を下回る、３％を下回る、２％を下回る、１％を下回るものは、エンドソームまたはリソソームに進入する。一部の実施形態では、フソソームは、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に進入し、例えば、ここで、送達される治療剤のレベルは、例えば、本明細書における実施例９１のアッセイを使用して、クロロキン処置参照細胞の少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％である。ある実施形態では、フソソームは、ダイナミン媒介経路を介して、薬剤を標的細胞に送達する。ある実施形態では、ダイナミン媒介経路を介して送達される薬剤のレベルは、例えば、本明細書における実施例９２のアッセイにおいて測定した場合に、０．０１〜０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触させたＤｙｎａｓｏｒｅ処置標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。ある実施形態では、フソソームは、マクロピノサイトーシスを介して、薬剤を標的細胞に送達する。ある実施形態では、マクロピノサイトーシスを介して送達される薬剤のレベルは、例えば、本明細書における実施例９２のアッセイにおいて測定した場合に、０．０１〜０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触させたＥＩＰＡ処置標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。ある実施形態では、フソソームは、アクチン媒介経路を介して、薬剤を標的細胞に送達する。ある実施形態では、アクチン媒介経路を介して送達される薬剤のレベルは、例えば、本明細書における実施例９２のアッセイにおいて測定した場合に、０．０１〜０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触させたラトランクリンＢ処置標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い。
【０２８７】
一部の実施形態では、標的細胞に送達されるカーゴは、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、本明細書における実施例５５、９０、または９２のアッセイを使用して判定される。
【０２８８】
一部の実施形態では、カーゴは、ダイナミン非依存性経路もしくはリソソーム酸性化非依存性経路、マクロピノサイトーシス非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤が、マクロピノサイトーシスの阻害剤、例えば、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロリド（ＥＩＰＡ）、例えば、２５μＭの濃度である）、またはアクチン非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤が、アクチン重合の阻害剤であり、例えば、ラトランクリンＢ、例えば、６μＭの濃度である）を通じて、標的細胞に進入する。
【０２８９】
一部の実施形態では、フソソームは、標的細胞集団と接触されると、エンドソームまたはリソソーム以外の標的細胞の場所、例えば、サイトゾルまたは細胞膜に、カーゴを送達する。いくつかの実施形態では、カーゴのうちの５０％を下回る、４０％を下回る、３０％を下回る、２０％を下回る、または１０％を下回るものが、エンドソームまたはリソソームに送達される。
標的細胞への特異的送達
【０２９０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソソーム組成物は、非標的細胞と比較して、標的細胞に優先的にカーゴを送達する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるフソソームは、以下の特性のうちの一方または両方を有する：（ｉ）複数のフソソームを、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触させた場合、カーゴは、非標的細胞よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、もしくは１００倍多くの標的細胞に存在すること、または（ｉｉ）複数のフソソームが、非標的細胞とよりも少なくとも少なくとも５０％高い割合で、標的細胞と融合すること。
【０２９１】
一部の実施形態では、カーゴの存在は、顕微鏡法によって、例えば、国際出願第ＷＯ２０１８／２０８７２８号の実施例１２４のアッセイを使用して、測定され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、融合は、顕微鏡法によって、例えば、本明細書における実施例５４のアッセイを使用して、測定される。一部の実施形態では、標的化部分は、標的細胞上の細胞表面マーカーに特異的である。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、皮膚細胞、心筋細胞、肝細胞、腸細胞（例えば、小腸の細胞）、膵臓細胞、脳細胞、前立腺細胞、肺細胞、結腸細胞、または骨髄細胞の細胞表面マーカーである。
【０２９２】
一部の実施形態（例えば、非標的細胞と対比して標的細胞へのカーゴの特異的送達の実施形態）では、カーゴの送達は、以下のステップのうちの１つまたは複数（例えば、すべて）を使用してアッセイされる：（ａ）ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂを過剰発現する３０，０００個のＨＥＫ−２９３Ｔ標的細胞を、９６ウェルプレートの第１のウェルに入れ、ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂを過剰発現しない３０，０００個のＨＥＫ−２９３Ｔ非標的細胞を、９６ウェルプレートの第２のウェルに入れるステップ、（ｂ）細胞を、ＤＭＥＭ培地において、３７℃および５％  ＣＯ２で４時間培養するステップ、（ｃ）標的細胞を、カーゴを含む１０ｕｇのフソソームと接触させるステップ、（ｄ）標的細胞およびフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートするステップ、ならびに（ｅ）第１のウェルおよび第２のウェルにおいてカーゴを含む細胞のパーセンテージを判定するステップ。ステップ（ｅ）は、顕微鏡法を使用して、例えば、免疫蛍光を使用して、カーゴを検出することを含み得る。ステップ（ｅ）は、間接的にカーゴを検出すること、例えば、カーゴの下流作用、例えば、レポータータンパク質の存在を検出することを含み得る。一部の実施形態では、上記のステップ（ａ）〜（ｅ）のうちの１つまたは複数は、国際出願第ＷＯ２０１８／２０８７２８号の実施例１２４に記載されるように行われる。
【０２９３】
一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で、標的細胞と融合する。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い割合で、標的細胞と融合する。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム内の薬剤が２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で、標的細胞と融合する。いくつかの実施形態では、標的化された融合の量は、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、約３０％〜７０％、３５％〜６５％、４０％〜６０％、４５％〜５５％、または４５％〜５０％、例えば、約４８．８％である。いくつかの実施形態では、標的化された融合の量は、例えば、実施例５５のアッセイにおいて、約２０％〜４０％、２５％〜３５％、または３０％〜３５％、例えば、約３２．２％である。
【０２９４】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団または非標的細胞集団と比較して、カーゴのうちの少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を、標的細胞集団に送達する。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団または非標的細胞集団と比較して、カーゴのうちの少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％多くを、標的細胞集団に送達する。
フソソーム生成
細胞から生成されるフソソーム
【０２９５】
フソソームの組成物は、培養中の細胞、例えば、培養哺乳動物細胞、例えば、培養ヒト細胞から生成され得る。細胞は、始原細胞または非始原（例えば、分化）細胞であり得る。細胞は、初代細胞または細胞系（例えば、本明細書に記載される哺乳動物細胞系、例えば、ヒト細胞系）であり得る。いくつかの実施形態では、培養細胞は、始原細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来の成体始原細胞（ＭＡＰＣ）、内皮始原細胞（ＥＰＣ）、芽細胞、脳室下帯において形成される中間始原細胞、神経幹細胞、筋幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚性幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、前駆体細胞、筋前駆体細胞、筋芽細胞、心筋芽細胞、神経前駆体細胞、膠前駆体細胞、ニューロン前駆体細胞、肝芽細胞である。
【０２９６】
一部の実施形態では、供給源細胞は、内皮細胞、線維芽細胞、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、例えば、対象の細胞に由来する人工多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児皮膚、青年皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織に由来する幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆体細胞（例えば、網膜前駆体細胞、骨髄芽球、骨髄系前駆体細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆体細胞、正赤芽球、もしくは血液芽細胞）、始原細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射神経膠細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ−１、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＩＭＲ  ９０、ＩＭＲ  ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ−１０８０、もしくはＢＪ細胞）である。
【０２９７】
培養細胞は、上皮、結合、筋肉、または神経の組織または細胞、およびそれらの組合せに由来し得る。フソソームは、任意の真核生物（例えば、哺乳動物）臓器系、例えば、心血管系（心臓、血管）、消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、および肛門）、内分泌系（視床下部、脳下垂体、松果体もしくは松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）、排出系（腎臓、尿管、膀胱）、リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃、咽頭扁桃、胸腺、脾臓）、外皮系（皮膚、毛髪、爪）、筋肉系（例えば、骨格筋）、神経系（脳、脊髄、神経）、生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）、呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）、骨格系（骨、軟骨）、ならびにこれらの組合せに由来する培養細胞から生成することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、有糸分裂性の高い組織（例えば、有糸分裂性の高い健常な組織、例えば、上皮、胚組織、骨髄、腸陰窩）に由来する。いくつかの実施形態では、組織試料は、代謝性の高い組織（例えば、骨格組織、神経系組織、心筋細胞）である。
【０２９８】
一部の実施形態では、細胞は、懸濁細胞である。一部の実施形態では、細胞は、付着細胞である。
【０２９９】
一部の実施形態では、細胞は、若齢のドナー、例えば、年齢が２５歳、２０歳、１８歳、１６歳、１２歳、１０歳、８歳、年齢が５歳、年齢が１歳、またはそれより若いドナーに由来する。一部の実施形態では、細胞は、胎児組織に由来する。
【０３００】
一部の実施形態では、細胞は、対象に由来し、同じ対象または類似の遺伝子シグネチャーを有する（例えば、ＭＨＣが一致する）対象に投与される。
【０３０１】
ある特定の実施形態では、細胞は、長さが３０００ヌクレオチドを上回る、４０００ヌクレオチドを上回る、５０００ヌクレオチドを上回る、６０００ヌクレオチドを上回る、７０００ヌクレオチドを上回る、８０００ヌクレオチドを上回る、９０００ヌクレオチドを上回る、または１００００ヌクレオチドを上回る（例えば、長さが４，０００〜１０，０００ヌクレオチド、長さが６，０００〜１０，０００ヌクレオチド）の平均サイズのテロメアを有する。
【０３０２】
フソソームは、概して当該技術分野において公知の方法により培養された細胞から生成することができる。一部の実施形態では、細胞は、２つまたはそれを上回る「期」、例えば、細胞が、増殖し、培養物の生物量（ｂｉｏｍａｓｓ）を増加させる条件下において培養される増殖期、および細胞が、細胞の表現型を変更する（例えば、ミトコンドリア表現型を最大にし、ミトコンドリアの数もしくは径を増加させ、酸化的リン酸化状態を増加させる）条件下において培養される「産生」期において、培養され得る。細胞が、細胞膜における供給源細胞に対して外因性であるタンパク質フソゲンまたは薬剤の発現を最大にし、他の期における望ましくない融合を制限する条件下において培養される、「発現」期も存在し得る。
【０３０３】
一部の実施形態では、フソソームは、例えば、増殖期または産生期の間に、同期される細胞から生成される。例えば、細胞は、培養培地から血清を排除することにより（例えば、約１２〜２４時間）または培養培地におけるＤＮＡ合成阻害剤、例えば、チミジン、アミノプテリン、ヒドロキシ尿素、およびシトシンアラビノシドの使用によって、Ｇ１期において、同期され得る。哺乳動物細胞周期の同期のためのさらなる方法は、公知であり、例えば、Ｒｏｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８：６０２−６２６（特にＲｏｓｎｅｒの表１）に開示されている。
【０３０４】
一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるフソソーム組成物の供給源として使用するのに望ましい表現型または遺伝子型に関して評価され、必要に応じて濃縮され得る。例えば、細胞は、例えば、培養前、培養中（例えば、増殖期もしくは産生期の間）、または培養後であるがフソソーム産生の前に、例えば、膜電位（例えば、−５〜−２００ｍＶの膜電位、カルジオリピン含量（例えば、総脂質の１〜２０％）、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジグリセリド（ＤＡＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、または脂肪酸（ＦＡ）含量、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る遺伝子品質、フソゲン発現もしくは含量、カーゴ発現もしくは含量のうちの１つまたは複数に関して評価され、必要に応じて濃縮され得る。
【０３０５】
一部の実施形態では、フソソームは、本明細書に記載されるフソソーム組成物の供給源として使用するのに望ましい表現型または遺伝子型に基づいて特定、選別、または選択された細胞クローンから生成される。例えば、細胞クローンは、低いミトコンドリア変異負荷、長いテロメア長、分化状態、または特定の遺伝子シグネチャー（例えば、レシピエントと一致する遺伝子シグネチャー）に基づいて、特定、選別、または選択される。
【０３０６】
本明細書に記載されるフソソーム組成物は、１つの細胞もしくは組織供給源、または供給源の組合せに由来するフソソームから構成され得る。例えば、フソソーム組成物は、ゼノジェニック供給源（例えば、動物、前述の種の細胞の組織培養物）に由来する、同種、自家、異なるタンパク質濃度および分布をもたらす特定の組織に由来する（肝臓、骨格、神経、脂肪など）、異なる代謝状態（例えば、糖分解、呼吸）の細胞に由来するフソソームを含み得る。組成物はまた、異なる代謝状態、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、結合型または非結合型のフソソームも含み得る。
【０３０７】
一部の実施形態では、フソソームは、フソゲン、例えば、本明細書に記載されるフソゲンを発現する供給源細胞から生成される。一部の実施形態では、フソゲンは、供給源細胞の膜、例えば、脂質二重層膜、例えば、細胞表面膜、または細胞内膜（例えば、リソソーム膜）に配置されている。一部の実施形態では、フソソームは、フソゲンが細胞表面膜に配置されている供給源細胞から生成される。
【０３０８】
一部の実施形態では、フソソームは、エクソソーム、マイクロベシクル、膜小胞、細胞外膜小胞、形質膜小胞、巨大形質膜小胞、アポトーシス体、ミト粒子（ｍｉｔｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、ピレノサイト（ｐｙｒｅｎｏｃｙｔｅ）、リソソーム、または他の膜封入小胞の出芽を誘導することによって、生成される。
【０３０９】
一部の実施形態では、フソソームは、細胞除核を誘導することによって生成される。除核は、アッセイ、例えば、遺伝子方法、化学的方法（例えば、アクチノマイシンＤを使用、Ｂａｙｏｎａ−Ｂａｆａｌｕｙｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｔｏ  ρ○  ｃｅｌｌｓ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００３  Ａｕｇ  １５；  ３１（１６）：  ｅ９８を参照されたい）、機械的方法（例えば、圧搾もしくは吸引、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｐｉｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ．”  Ａｎｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８；１９（２）：７１−９を参照されたい）、またはこれらの組合せを使用して、行うことができる。除核は、核の完全な除去だけでなく、細胞が核を含むが非機能的となるような核の典型的な位置からの変位も指す。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、フソソームの作製は、細胞ゴースト、巨大形質膜小胞、またはアポトーシス体を産生することを含む。いくつかの実施形態では、フソソーム組成物は、細胞ゴースト、巨大形質膜小胞、およびアポトーシス体のうちの１つまたは複数を含む。
【０３１１】
一部の実施形態では、フソソームは、細胞断片化を誘導することによって生成される。一部の実施形態では、細胞断片化は、化学的方法、機械的方法（例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離もしくは密度遠心分離）、凍結解凍、または超音波処理）、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない方法を使用して、行うことができる。
【０３１２】
一部の実施形態では、フソソームは、以下の方法：
ｉ）ミト粒子、エクソソーム、もしくは他の膜封入小胞の出芽を誘導すること、
ｉｉ）核不活性化、例えば、除核を、以下の方法：
ａ）遺伝子方法、
ｂ）化学的方法、例えば、アクチノマイシンＤを使用すること、または
ｃ）機械的方法、例えば、圧搾もしくは吸引
のうちのいずれかまたはその組合せによって、誘導すること、または
ｉｉｉ）細胞断片化を、例えば、以下の方法：
ａ）化学的方法、
ｂ）機械的方法、例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離もしくは密度遠心分離）、凍結解凍、もしくは超音波処理
のうちのいずれかまたはその組合せによって、誘導すること、
のうちのいずれか１つ、すべて、または組合せによって、例えば、本明細書に記載されるように、フソゲンを発現する供給源細胞から生成され得る。
【０３１３】
疑いを回避するために、多くの事例では、実際にフソソームを作製するために使用される供給源細胞は、フソソームが作製された後に試験に利用可能ではないことを理解されよう。したがって、供給源細胞とフソソームとの間の比較は、フソソームを作製するために実際に改変された（例えば、除核した）供給源細胞をアッセイする必要はない。むしろ、その他は供給源細胞と同様である細胞、例えば、同じ培養物に由来する細胞、同じ遺伝子型、同じ組織型の細胞、またはこれらの任意の組合せの細胞を、代わりにアッセイすることができる。
フソソーム生成前の細胞の改変
【０３１４】
一部の態様では、改変、例えば、対象、組織、または細胞の改変が、フソソーム生成前に、細胞に行われる。そのような改変は、例えば、融合、フソゲンの発現もしくは活性、カーゴの構造もしくは機能、または標的細胞の構造もしくは機能を改善するために、有効であり得る。
（ｉ）物理的改変
【０３１５】
一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、物理的に改変される。例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、フソゲンは、細胞の表面に結合していてもよい。
【０３１６】
一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、化学剤で処置される。例えば、細胞は、化学物質フソゲンまたは脂質フソゲンが、細胞の表面と非共有結合的もしくは共有結合的に相互作用するか、または細胞の表面内に包埋されるように、化学物質フソゲンまたは脂質フソゲンで処置されてもよい。一部の実施形態では、細胞は、細胞膜における脂質の膜融合特性を増強するための薬剤で処置される。
【０３１７】
一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、臓器、組織、または細胞型へのフソソームの標的化を増強する、細胞表面上の合成または内因性小分子または脂質に対する１つまたは複数の供給結合的または非共有結合的な結合部位を有するように、物理的に改変される。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、フソソームは、増加または減少したレベルの内因性分子を含む。例えば、フソソームは、天然に存在する供給源細胞にも天然に存在するが、フソソームにおけるものよりも高いかまたは低いレベルで存在する、内因性分子を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、供給源細胞またはフソソーム中の外因性核酸から発現される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、供給源から単離され、供給源細胞またはフソソームにローディングまたはコンジュゲートされる。
【０３１９】
一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、細胞における内因性フソゲン（例えば、一部の実施形態では、供給源細胞に対して内因性であり、一部の実施形態では、標的細胞に対して内因性である）の発現または活性を増加させるように、化学剤、例えば、小分子で処置される。一部の実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。一部の実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を減少させ得る。一部の実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの発現を増加させるエピジェネティック改変因子である。
【０３２０】
一部の実施形態では、フソソームは、融合停止化合物、例えば、リゾホスファチジルコリンで処置された細胞から生成される。一部の実施形態では、フソソームは、フソゲンを切断しない解離試薬、例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅで処置された細胞から生成される。
【０３２１】
一部の実施形態では、供給源細胞は、フソソームを生成してフソゲンを添加するかまたはその濃度を増加させる前に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化因子で物理的に改変される。
【０３２２】
一部の実施形態では、細胞は、オルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、細胞内小胞（例えば、リソソーム、オートファゴソーム）の数を増加もしくは減少させるか、その構造もしくは機能を増強するように、物理的に改変される。
（ｉｉ）遺伝子改変
【０３２３】
一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、細胞における内因性フソゲン（例えば、一部の実施形態では、供給源細胞に対して内因性であり、一部の実施形態では、標的細胞に対して内因性である）の発現を増加させるように、遺伝子改変される。一部の実施形態では、遺伝子改変は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。一部の実施形態では、遺伝子改変は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を減少させ得る。一部の実施形態では、活性化因子または抑制因子は、ガイドＲＮＡによって内因性フソゲンへと標的化される転写活性化因子または転写抑制因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、遺伝子改変は、内因性フソゲン遺伝子を、その発現を増加させるようにエピジェネティックに改変する。一部の実施形態では、エピジェネティック活性化因子は、ガイドＲＮＡによって内因性フソゲンへと標的化されるエピジェネティック改変因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。
【０３２４】
一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、細胞における外因性フソゲンの発現、例えば、導入遺伝子の送達を増加させるように、遺伝子改変される。一部の実施形態では、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡは、フソソームを生成する前に、例えば、臓器、組織、または細胞の標的化に使用される細胞表面分子（タンパク質、グリカン、脂質、または低分子量の分子）の発現を増加または減少させるために、細胞に移入される。一部の実施形態では、核酸は、フソゲンの抑制因子、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ構築物を標的とする。一部の実施形態では、核酸は、フソゲン抑制因子の阻害剤をコードする。
【０３２５】
一部の実施形態では、本方法は、供給源細胞に対して外因性であり、フソゲンをコードする核酸を、供給源細胞に導入するステップを含む。外因性核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、外因性核酸は、例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどであり得る。一部の実施形態では、外因性ＤＮＡは、線形ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、または人工染色体であり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡは、エピソームで維持される。一部の実施形態では、ＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。外因性ＲＮＡは、化学的に改変されたＲＮＡであってもよく、例えば、１つまたは複数の骨格改変、糖改変、非カノニカル塩基、またはキャップを含み得る。骨格改変としては、例えば、ホスホロチオエート、Ｎ３’ホスホラミダイト、ボラノホスフェート、ホスホノアセテート、チオ−ＰＡＣＥ、モルホリノホスホラミダイト、またはＰＮＡが挙げられる。糖改変としては、例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’Ｆ、２’Ｆ−ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＵＮＡ、および２’−Ｏ−ＭＯＥが挙げられる。非カノニカル塩基としては、例えば、５−ブロモ−Ｕ、および５−ヨード−Ｕ、２，６−ジアミノプリン、Ｃ−５プロピニルピリミジン、ジフルオロトルエン、ジフルオロベンゼン、ジクロロベンゼン、２−チオウリジン、シュードウリジン、およびジヒドロウリジンが挙げられる。キャップとしては、例えば、ＡＲＣＡが挙げられる。さらなる改変は、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １９，  Ｉｓｓｕｅ  ８，  ２４  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１２，  Ｐａｇｅｓ  ９３７−９５４において考察されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２６】
一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、細胞において、供給源細胞に対して外因性であるフソゲンの発現または活性を増加させるように、化学剤、例えば、小分子で処置される。一部の実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。一部の実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を減少させ得る。一部の実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの発現を増加させるエピジェネティック改変因子である。
【０３２７】
一部の実施形態では、核酸は、改変されたフソゲンをコードする。例えば、制御可能な膜融合活性、例えば、特異的細胞型、組織型、または局所微小環境活性を有するフソゲンなどである。そのような制御可能な膜融合活性には、低ｐＨ、高ｐＨ、熱、赤外光、細胞外酵素活性（真核生物もしくは原核生物）、または小分子、タンパク質、もしくは脂質の曝露による、膜融合活性の活性化および／または開始が含まれ得る。一部の実施形態では、小分子、タンパク質、または脂質は、標的細胞上に提示される。
【０３２８】
一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、シグナル伝達経路（例えば、Ｗｎｔ／ベータ−カテニン経路）の発現を変更（すなわち、上方制御または下方制御）するように、遺伝子改変される。一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、目的の遺伝子の発現を変更（例えば、上方制御または下方制御）するように、遺伝子改変される。一部の実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に、目的の核酸（例えば、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の発現を変更（例えば、上方制御または下方制御）するように、遺伝子改変される。一部の実施形態では、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡは、フソソームを生成する前に、例えば、シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸の発現を増加または減少させるために、細胞に移入される。一部の実施形態では、核酸は、シグナル伝達経路、遺伝子、もしくは核酸の抑制因子を標的とするか、またはシグナル伝達経路、遺伝子、もしくは核酸を抑制する。一部の実施形態では、核酸は、シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を上方制御または下方制御する、転写因子をコードする。一部の実施形態では、活性化因子または抑制因子は、ガイドＲＮＡによってシグナル伝達経路、遺伝子、または核酸へと標的化される転写活性化因子または転写抑制因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、遺伝子改変は、内因性シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を、その発現へとエピジェネティックに改変する。一部の実施形態では、エピジェネティック活性化因子は、ガイドＲＮＡによってシグナル伝達経路、遺伝子、または核酸へと標的化されるエピジェネティック改変因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、細胞のＤＮＡは、フソソームを生成する前に、シグナル伝達経路（例えば、Ｗｎｔ／ベータ−カテニン経路）、遺伝子、または核酸の発現を変更（例えば、上方制御または下方制御）するように、編集される。一部の実施形態では、ＤＮＡは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１または他の遺伝子編集技術を使用して、編集される。
【０３２９】
細胞は、組換え方法を使用して、遺伝子改変され得る。所望される遺伝子をコードする核酸配列は、組換え方法を使用して、例えば、例として、標準的な方法を使用し、遺伝子を発現する細胞から得られたライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むことが判明しているベクターから遺伝子を誘導することによって、またはそれを含む細胞および組織から直接的に単離することによって、得ることができる。代替として、目的の遺伝子は、クローニングするのではなく、合成により産生することができる。
【０３３０】
天然または合成の核酸の発現は、典型的に、目的の遺伝子をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結させ、構築物を発現ベクターに組み込むことによって、達成される。ベクターは、真核生物における複製および組込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望される核酸配列の発現に有用な、転写終結因子および翻訳終結因子、開始配列、ならびにプロモーターを含む。
【０３３１】
一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の発現領域、例えば、遺伝子により遺伝子改変され得る。一部の実施形態では、細胞は、外因性遺伝子（例えば、外因性遺伝子産物、例えば、ＲＮＡもしくはポリペプチド産物を発現することができる）および／または外因性制御性核酸で遺伝子改変され得る。一部の実施形態では、細胞は、標的細胞に対して内因性である遺伝子産物をコードする外因性配列および／または内因性遺伝子の発現をモジュレートすることができる外因性制御性核酸で遺伝子改変され得る。一部の実施形態では、細胞は、外因性遺伝子、および／または外因性遺伝子の発現をモジュレートする制御性核酸で遺伝子改変され得る。一部の実施形態では、細胞は、外因性遺伝子、および／または内因性遺伝子の発現をモジュレートする制御性核酸で遺伝子改変され得る。当業者であれば、本明細書に記載される細胞が、タンパク質または制御性分子をコードし、例えば、標的細胞の内因性ゲノムまたは外因性ゲノムの遺伝子産物に対して作用し得る、様々な外因性遺伝子を発現するように、遺伝子改変され得ることを理解するであろう。一部の実施形態では、そのような遺伝子は、フソソームに特徴を付与し、例えば、標的細胞との融合をモジュレートする。一部の実施形態では、細胞は、内因性遺伝子および／または制御性核酸を発現するように、遺伝子改変され得る。一部の実施形態では、内因性遺伝子または制御性核酸は、他の内因性遺伝子の発現をモジュレートする。一部の実施形態では、細胞は、他の染色体における内因性遺伝子および／または制御性核酸のバージョンとは異なって（例えば、誘導的に、組織特異的に、構成的に、またはより高いかもしくは低いレベルで）発現される、内因性遺伝子および／または制御性核酸を発現するように、遺伝子改変され得る。
【０３３２】
プロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的に、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、近年、開始部位の下流にも同様に機能的エレメントを含むことが示されている。多くの場合、プロモーターエレメント間の間隔には、柔軟性があり、そのため、プロモーター機能は、エレメントが互いに逆転した場合または移動した場合にも、保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの場合、プロモーターエレメント間の間隔は、５０ｂｐ間隔に増加した後に、活性が低下し始める。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協働してまたは独立してのいずれかで機能し得るとみられる。
【０３３３】
好適なプロモーターの１つの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、そこに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を作動させることができる、強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）のプロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターが含まれるがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用することができる。
【０３３４】
さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるものではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、それが作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が所望されるときには有効にし、発現が所望されないときには発現を無効にすることができる、分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、組織特異的プロモーター、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、フソゲンの発現は、フソソームが生成される前、例えば、フソソームが生成される３、６、９、１２、２４、２６、４８、６０、または７２時間前に、上方制御される。
【０３３５】
供給源に導入しようとする発現ベクターはまた、ウイルスベクターを通じてトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の特定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、または両方を含み得る。他の態様では、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片に保持させ、コトランスフェクション手順において使用してもよい。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現を可能にする適切な制御配列に隣接し得る。有用な選択的マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ｎｅｏなどが挙げられる。
【０３３６】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされている可能性のある細胞を特定するため、および制御配列の機能性を評価するために使用され得る。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント供給源には存在しないか、または発現されない遺伝子であり、かつ発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：  ７９−８２）。好適な発現系は、周知であり、公知の技法を使用して調製することができるか、市販で入手することができる。一般に、最も高いレベルのレポーター遺伝子発現を示す、最小限の５’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結させることができ、プロモーターにより作動される転写をモジュレートする能力に関して薬剤を評価するために使用することができる。
【０３３７】
一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のタンパク質の発現を変更するように、遺伝子改変され得る。１つまたは複数のタンパク質の発現は、特定の期間、例えば、供給源の発生または分化状態に関して、改変され得る。一部の実施形態では、フソソームは、１つまたは複数のタンパク質、例えば、融合活性、構造、または機能に影響を及ぼすフソゲンタンパク質または非フソゲンタンパク質の発現を変更するように遺伝子改変された細胞供給源から生成される。１つまたは複数のタンパク質の発現は、特定の位置に制限され得るか、または供給源全体に拡がっていてもよい。
【０３３８】
一部の実施形態では、フソゲンタンパク質の発現は、改変される。一部の実施形態では、フソソームは、フソゲンタンパク質発現の改変、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、またはそれを上回るフソゲンの発現の増加または減少を有する細胞から生成される。
【０３３９】
一部の実施形態では、細胞は、フソゲンタンパク質を標的とするサイトゾル酵素（例えば、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、デメチラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ）を発現するように操作され得る。一部の実施形態では、サイトゾル酵素は、翻訳後改変を変更することによって、１つまたは複数のフソゲンに影響を及ぼす。タンパク質の翻訳後タンパク質改変は、栄養素の利用可能性および酸化還元条件に対する応答、ならびにタンパク質−タンパク質相互作用に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、フソソームは、翻訳後改変の変更、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、またはそれを上回る翻訳後改変の増加または減少を有するフソゲンを含む。
【０３４０】
改変を細胞に導入する方法としては、物理的方法、生物学的方法、および化学的方法が挙げられる。例えば、Ｇｅｎｇ．  ＆  Ｌｕ，  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ．  １３（１９）：３８０３−２１．  ２０１３、Ｓｈａｒｅｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｖｅｃｔｏｒ−ｆｒｅｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  ＰＮＡＳ  ｖｏｌ．  １１０  ｎｏ．  ６．  ２０１３、Ｙｉｎ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  １５：  ５４１−５５５．  ２０１４を参照されたい。本明細書に記載されるフソソームの生成において使用するための細胞を改変するのに好適な方法としては、例えば、拡散、浸透、浸透圧パルス、浸透圧ショック、低浸透圧溶解、低浸透圧透析、イオン泳動、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、カルシウム沈降、膜インターカレーション、脂質媒介トランスフェクション、界面活性剤処置、ウイルス感染、受容体媒介エンドサイトーシス、タンパク質形質導入ドメインの使用、粒子発射（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｉｒｉｎｇ）、膜融合、凍結解凍、機械的破壊、および濾過が挙げられる。
【０３４１】
遺伝子改変の存在の確認には、様々なアッセイが含まれる。そのようなアッセイとしては、例えば、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ、生物化学的アッセイ、例えば、特定のペプチドの存在または非存在を、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）または本明細書に記載されるアッセイによって検出することが挙げられる。
フソソーム改変
【０３４２】
一部の態様では、改変が、フソソームに行われる。そのような改変は、例えば、標的化、機能、または構造を改善するために有効であり得る。
【０３４３】
一部の実施形態では、フソソームは、膜の表面に非共有結合的または共有結合的に連結し得るフソゲン、例えば、本明細書に記載される化学物質フソゲンで処置される。一部の実施形態では、フソソームは、膜に非共有結合的もしくは共有結合的に連結し得るか、またはそれ自体が膜に埋め込まれ得る、フソゲン、例えば、タンパク質フソゲンまたは脂質フソゲンで処置される。
【０３４４】
一部の実施形態では、リガンドは、フソソームの表面上に存在する官能性化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリル、およびヒドロキシル）を介して、フソソームの表面にコンジュゲートされる。
【０３４５】
そのような反応性基としては、限定されないが、マレイミド基が挙げられる。一例として、フソソームは、限定することなく、ＤＳＰＥ−ＭａＬ−ＰＥＧ２０００など、マレイミドがコンジュゲートされたリン脂質を含むように合成され得る。
【０３４６】
一部の実施形態では、小分子または脂質は、合成でも天然でも、フソソームの表面に共有結合的または非共有結合的に連結され得る。一部の実施形態では、フソソームにおける膜脂質は、膜融合特性を促進、誘導、または増強するように改変され得る。
【０３４７】
一部の実施形態では、フソソームは、改変されたタンパク質をローディングすることによって、改変される（例えば、新規な機能性を可能にするか、翻訳後改変を変更するか、ミトコンドリア膜および／もしくはミトコンドリア膜タンパク質に結合するか、異種機能を有する切断可能なタンパク質を形成するか、タンパク質分解が運命付けられたタンパク質を形成するか、薬剤の位置およびレベルをアッセイするか、または薬剤を担体として送達する）。一部の実施形態では、フソソームには、１つまたは複数の改変されたタンパク質がローディングされる。
【０３４８】
一部の実施形態では、供給源細胞に対して外因性であるタンパク質は、フソソームに非共有結合的に結合される。タンパク質は、放出のための切断可能なドメインを含み得る。一部の実施形態では、本発明は、切断可能なドメインを有する外因性タンパク質を含むフソソームを含む。
【０３４９】
一部の実施形態では、フソソームは、タンパク質分解が運命付けられたタンパク質で改変される。様々なプロテアーゼは、特定のタンパク質アミノ酸配列を認識し、そのタンパク質を分解の標的とする。これらのタンパク質分解酵素を使用して、タンパク質分解配列を有するタンパク質を特異的に分解することができる。一部の実施形態では、フソソームは、１つまたは複数のタンパク質分解酵素のレベルのモジュレート、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、またはそれを上回るタンパク質分解酵素の増加または減少を含む。
【０３５０】
本明細書に記載されるように、非フソゲン添加剤が、フソソームの構造および／または特性を改変するために、フソソームに添加されてもよい。例えば、構造の安定化を補助し、内部カーゴの漏出を防止するために、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかが、膜に添加され得る。さらに、膜は、水素化卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、およびジセチルホスフェートから調製されてもよい。（例えば、考察については、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ｖｏｌ．  ２０１１，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，  １２  ｐａｇｅｓ，  ２０１１．  ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
【０３５１】
一部の実施形態では、フソソームは、特定の細胞または組織型（例えば、心筋細胞）を標的とするために、外表面上に１つまたは複数の標的化基（例えば、標的化タンパク質）を含む。これらの標的化基としては、限定することなく、受容体、リガンド、抗体などが挙げられる。これらの標的化基は、標的細胞の表面上でそのパートナーと結合する。いくつかの実施形態では、標的化タンパク質は、本明細書に記載される標的細胞、例えば、皮膚細胞、心筋細胞、肝細胞、腸細胞（例えば、小腸の細胞）、膵臓細胞、脳細胞、前立腺細胞、肺細胞、結腸細胞、または骨髄細胞上の細胞表面マーカーに特異的である。
【０３５２】
一部の実施形態では、標的化タンパク質は、標的細胞上の細胞表面マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、タンパク質、糖タンパク質、受容体、細胞表面リガンド、クラスＩ膜貫通タンパク質、クラスＩＩ膜貫通タンパク質、またはクラスＩＩＩ膜貫通タンパク質を含む。
【０３５３】
一部の実施形態では、標的化部分は、フソゲンとは別個のポリペプチドであるポリペプチドに含まれる。一部の実施形態では、標的化部分を含むポリペプチドは、膜貫通ドメインおよび細胞外標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外標的化ドメインは、ｓｃＦｖ、ＤＡＲＰｉｎ、ナノボディ、受容体リガンド、または抗原を含む。一部の実施形態では、細胞外標的化ドメインは、抗体もしくはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合型Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線形抗体、単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ（ＶＬもしくはＶＨのいずれか）、もしくはラクダＶＨＨドメイン）、抗原結合性フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンポリペプチドミニボディ、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。
【０３５４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソソームは、診断剤で官能化される。診断剤の例としては、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ補助断層撮影法（ＣＡＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、ｘ線、蛍光透視法、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）において使用される市販入手可能なイメージング剤、ならびに造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＲＩにおける造影剤として使用するのに好適な材料の例としては、ガドリニウムキレート剤、ならびに鉄、マグネシウム、マンガン、銅、およびクロムが挙げられる。
【０３５５】
フソソームに官能基を導入する別の例は、調製後の間に、フソソームおよびリガンドを、ホモまたはヘテロ二官能性架橋剤と直接的に架橋することによるものである。この手順は、好適な化学反応および架橋剤のクラス（本明細書に考察されるように、ＣＤＩ、ＥＤＡＣ、グルタルアルデヒドなど）、または調製後のフソソーム表面の化学的改変によってリガンドをフソソーム表面に連結させる任意の他の架橋剤を使用し得る。これには、両親媒性分子、例えば、脂肪酸、脂質、または官能性安定化剤が、フソソーム表面に受動的に吸着および接着され、それによって、リガンドへの接続のための官能末端基が導入され得る、プロセスも含まれる。
カーゴ
【０３５６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソソームは、膜タンパク質ペイロード剤であるかまたはそれを含むカーゴを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、治療用タンパク質であり得るかまたはそれをコードし得る。フソソームは、さらに、他のカーゴを含んでもよく、例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソソームは、治療剤であるかまたはそれを含むカーゴを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソソームは、複数の膜ペイロード剤を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるフソソームは、複数の治療剤であるかまたはそれを含むカーゴを含む。一部の実施形態では、フソソームは、１つまたは複数の膜タンパク質ペイロード剤および１つまたは複数の治療剤を含むカーゴを含む。一部の実施形態では、カーゴは、供給源細胞に対して外因性または内因性である治療剤であり得る。
【０３５７】
一部の実施形態では、フソソームは、フソソーム脂質二重層と会合したカーゴを含む。一部の実施形態では、フソソームは、フソソームの内腔内に配置されたカーゴを含む。一部の実施形態では、フソソームは、フソソーム脂質二重層と会合したカーゴおよびフソソームの内腔内に配置されたカーゴを含む。
【０３５８】
一部の実施形態では、カーゴは、フソソーム（ｆｕｏｓｏｓｍｅ）が由来する細胞において天然に発現されない。一部の実施形態では、カーゴは、フソソームが由来する細胞において天然に発現される。一部の実施形態では、カーゴは、フソソームが由来する細胞において天然に発現される野生型核酸もしくはタンパク質の変異体であるか、またはフソソームが由来する細胞において天然に発現される変異体の野生型である。
【０３５９】
一部の実施形態では、カーゴは、フソソームが由来する細胞における発現（例えば、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入されたＤＮＡからの発現）を介して、フソソームにローディングされる。一部の実施形態では、カーゴは、フソソームが由来する細胞のゲノムに組み込まれているかまたはフソソームが由来する細胞においてエピソームで維持されているＤＮＡから発現される。一部の実施形態では、カーゴの発現は、フソソームが由来する細胞において構成的である。一部の実施形態では、フソソームが由来する細胞におけるカーゴの発現は、誘導される。一部の実施形態では、カーゴの発現は、フソソームを生成する直前に、フソソームが由来する細胞において誘導される。一部の実施形態では、フソソームが由来する細胞におけるカーゴの発現は、フソソームが由来する細胞におけるフソゲンの発現と同時に誘導される。
【０３６０】
一部の実施形態では、カーゴは、フソソーム自体またはフソソームが由来する細胞へのエレクトロポレーションを介して、フソソームにローディングされる。一部の実施形態では、カーゴは、フソソーム自体またはフソソームが由来する細胞へのトランスフェクションを介して、フソソームにローディングされる。
【０３６１】
一部の態様では、本開示は、（ｉ）コンドリソーム（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１号に記載される）、ミトコンドリア、オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、リソソーム、核、細胞膜、細胞質、小胞体、リボソーム、液胞、エンドソーム、スプライソソーム、ポリメラーゼ、キャプシド、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、筋原線維、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、およびオルガネラのネットワーク）、除核細胞、例えば、前述のもののうちのいずれかを含む除核細胞のうちの１つまたは複数、ならびに（ｉｉ）フソゲン、例えば、ミオメーカータンパク質を含む、フソソーム組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、フソゲンは、ミトコンドリアまたはコンドリソームに対して外部である脂質二重層に存在する。いくつかの実施形態では、コンドリソームは、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１号に記載される特性のうちの１つまたは複数を有し、これは、参照によりその全体が、本発明の実施例および概要を含め、本明細書に組み込まれる。
【０３６３】
一部の実施形態では、カーゴは、１つまたは複数の核酸配列、１つまたは複数のポリペプチド、核酸配列および／またはポリペプチドの組合せ、１つまたは複数のオルガネラ、ならびにこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、カーゴは、１つまたは複数の細胞成分を含み得る。一部の実施形態では、カーゴは、１つまたは複数のサイトゾルおよび／または核成分を含む。
【０３６４】
一部の実施形態では、カーゴは、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、タンパク質コーディングＤＮＡ、遺伝子、オペロン、染色体、ゲノム、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ウイルスゲノム、イントロン、エクソン、改変されたＤＮＡ、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、改変されたＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｔｍＲＮＡ（トランスファーメッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ  ＲＮＡ（ｍＲＮＡトランススプライシングＲＮＡ）、ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、ＴＥＲＣ（テロメラーゼＲＮＡ成分）、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）、シス−ＮＡＴ（シス−天然アンチセンス転写産物）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（長い非コーディングＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）、ｔａｓｉＲＮＡ（トランス作用ｓｉＲＮＡ）、ｅＲＮＡ（エンハンサーＲＮＡ）、衛星ＲＮＡ、ｐｃＲＮＡ（タンパク質コーディングＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ（環状ＲＮＡ）、再プログラミングＲＮＡ、アプタマー、ならびにこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、核酸は、野生型核酸である。一部の実施形態では、タンパク質は、突然変異型核酸である。一部の実施形態では、核酸は、複数の核酸配列の融合体またはキメラである。
【０３６５】
一部の実施形態では、フソソーム中のＤＮＡまたはフソソームが由来する細胞中のＤＮＡは、遺伝子編集技術、例えば、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１を使用して、または異なる標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））を使用して、遺伝的突然変異を補正するように編集される。一部の実施形態では、遺伝的突然変異は、対象における疾患と関連している。ＤＮＡに対する編集の例としては、小さな挿入／欠失、大きな欠失、鋳型ＤＮＡによる遺伝子補正、または大きなＤＮＡ挿入が挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性組換え修復（ＨＤＲ）を用いて達成される。一部の実施形態では、編集は、ノックアウトである。一部の実施形態では、編集は、ノックインである。一部の実施形態では、ＤＮＡの両方の対立遺伝子が、編集される。一部の実施形態では、単一の対立遺伝子が、編集される。一部の実施形態では、複数の編集が行われる。一部の実施形態では、フソソームまたは細胞は、対象に由来するか、または対象に遺伝子が一致するか、または対象と免疫学的に適合性がある（例えば、類似のＭＨＣを有する）。
【０３６６】
一部の実施形態では、カーゴは、核酸を含み得る。例えば、カーゴは、内因性タンパク質（例えば、一部の実施形態では、供給源細胞に対して内因性であり、一部の実施形態では、標的細胞に対して内因性である）の発現を増強するためのＲＮＡ、または内因性タンパク質のタンパク質発現を阻害するｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを含み得る。例えば、内因性タンパク質は、標的細胞における構造または機能をモジュレートし得る。一部の実施形態では、カーゴは、標的細胞における構造または機能をモジュレートする操作されたタンパク質をコードする核酸を含み得る。一部の実施形態では、カーゴは、標的細胞における構造または機能をモジュレートする転写活性化因子を標的とする核酸である。
【０３６７】
一部の実施形態では、カーゴは、例えば、本明細書に記載される自己複製ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡおよび／または線形ＲＮＡである。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、１つまたは複数のタンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質、例えば、膜タンパク質または分泌タンパク質をコードする。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、アルテリウイルスまたはアルファウイルス、またはそのバリアントに由来する部分的または完全なゲノムを含む。
【０３６８】
一部の実施形態では、カーゴは、標的細胞に送達することができるＲＮＡを含み得、ＲＮＡは、標的細胞の内部で複製される。自己複製ＲＮＡの複製は、宿主細胞に対して外因性であるＲＮＡ複製機序、および／または宿主細胞に対して内因性であるＲＮＡ複製機序を含み得る。
【０３６９】
一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルスゲノム、またはその自己複製部分もしくは類似体を含む。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、正センス一本鎖ＲＮＡウイルスに由来する。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、部分的または完全なアルテリウイルスゲノムまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、アルテリウイルスは、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）を含む。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、部分的または完全なアルファウイルスゲノムまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、アルファウイルスは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、ＳＦ群、またはＳＩＮ群に属する。
【０３７０】
一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡを含むフソソームは、例えば、自己複製ＲＮＡの一部としてまたは別個の核酸分子に、（ｉ）ＲＮＡの複製を促進する１つもしくは複数のタンパク質、または（ｉｉ）ＲＮＡの複製を促進する１つもしくは複数のタンパク質をコードする核酸をさらに含む。
【０３７１】
一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、対応する野生型ゲノムと比べて、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも１つの機能性遺伝子が欠如している。例えば、一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質の１つもしくは複数の遺伝子が完全に欠如しているか、またはウイルス構造タンパク質の非機能性変異体遺伝子を含む。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質の任意の遺伝子を含まない。
【０３７２】
一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、例えば、国際出願第ＷＯ２０１８／１０６６１５号に記載されるように、ウイルスキャプシドエンハンサーを含み、これは、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、例えば、コーディング配列のｅＩＦ２ａｌｐｈａ非依存性翻訳を可能にすることによって、シスでのコーディング配列の翻訳を増加させるＲＮＡ構造体である。一部の実施形態では、宿主細胞は、例えば、ＰＫＲ媒介ｅＩＦ２ａｌｐｈａのリン酸化に起因して、損傷した翻訳を有する。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、ウイルスキャプシドタンパク質由来の下流ループ（ＤＬＰ）またはＤＬＰのバリアントを含む。一部の実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、トガウイルス科、例えば、トガウイルス科のアルファウイルス属に属するウイルスに由来する。一部の実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、ＷＯ２０１８／１０６６１５の配列番号１の配列（この配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、配列は、ＷＯ２０１８／１０６６１５の図１に示される同じ二次構造を有する。
【０３７３】
一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、例えば、国際出願第ＷＯ２０１７／１８０７７０号に記載されるように、１つまたは複数のアルテリウイルス配列を含み、これは、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ＯＲＦ７（またはその機能性断片もしくはバリアント）を含み、かつ／または自己複製ＲＮＡは、アルテリウイルスの機能性ＯＲＦ２ａが欠如している（例えば、ＯＲＦ２ａが完全に欠如しているか、もしくはＯＲＦ２ａの非機能性変異体を含む）。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、機能性ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５ａ、ＯＲＦ５、もしくはＯＲＦ６、またはこれらの任意の組合せが欠如している（例えば、配列が完全に欠如しているか、または配列の非機能性変異体を含む）。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５ａ、ＯＲＦ５、またはＯＲＦ６のうちの１つまたは複数の一部分が欠如している。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、例えば、非天然部位に位置する１つまたは複数のサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ｓｇプロモーター１、ｓｇプロモーター２、ｓｇプロモーター３、ｓｇプロモーター４、ｓｇプロモーター５、ｓｇプロモーター６、ｓｇプロモーター７、またはその機能性断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、１つまたは複数の転写終結シグナル、例えば、Ｔ７転写終結シグナル、例えば、変異型Ｔ７転写終結シグナル、例えば、Ｔ９００１Ｇ、Ｔ３１８５Ａ、またはＧ３１８８Ａのうちの１つまたは複数（例えば、いずれか２つもしくはすべて）を含む変異型Ｔ７転写終結シグナルを含む。
【０３７４】
一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、例えば、国際出願第ＷＯ２０１８／０７５２３５号に記載されるように、５’ＵＴＲ、例えば、変異型アルファウイルス５’ＵＴＲを含み、これは、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、変異型アルファウイルス５’ＵＴＲは、１位、２位、４位、またはこれらの組合せに、１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、変異体アルファウイルス５’ＵＴＲは、２位におけるＵからＧへの置換を含む。
【０３７５】
一部の実施形態では、カーゴは、ポリペプチド、例えば、酵素、構造ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、制御性ポリペプチド、輸送ポリペプチド、感覚性ポリペプチド、運動ポリペプチド、防御ポリペプチド、保管ポリペプチド、転写因子、抗体、サイトカイン、ホルモン、異化ポリペプチド、同化ポリペプチド、タンパク質分解ポリペプチド、代謝ポリペプチド、キナーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、酵素モジュレーターポリペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、脂質結合ポリペプチド、膜融合ポリペプチド、細胞分化ポリペプチド、エピジェネティックポリペプチド、細胞死ポリペプチド、核輸送ポリペプチド、核酸結合ポリペプチド、再プログラミングポリペプチド、ＤＮＡ編集ポリペプチド、ＤＮＡ修復ポリペプチド、ＤＮＡ組換えポリペプチド、トランスポサーゼポリペプチド、ＤＮＡ組込みポリペプチド、標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｃａｓ９、およびその相同体）、リコンビナーゼ、ならびにこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、細胞内のタンパク質を分解の標的とする。一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質をプロテアソームに局在化させることにより、細胞内のタンパク質を分解の標的とする。一部の実施形態では、タンパク質は、野生型タンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、変異型タンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、融合タンパク質またはキメラタンパク質である。
【０３７６】
一部の実施形態では、カーゴは、小分子、例えば、イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｃｌ−、Ｆｅ２＋）、炭水化物、脂質、反応性酸素種、反応性窒素種、イソプレノイド、シグナル伝達分子、ヘム、ポリペプチド補因子、電子受容化合物、電子供与化合物、代謝産物、リガンド、およびこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、小分子は、細胞内の標的と相互作用する医薬である。一部の実施形態では、小分子は、細胞内のタンパク質を分解の標的とする。一部の実施形態では、小分子は、タンパク質をプロテアソームに局在化させることにより、細胞内のタンパク質を分解の標的とする。一部の実施形態では、その小分子は、タンパク質分解標的化キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）である。
【０３７７】
一部の実施形態では、カーゴは、タンパク質、核酸、または代謝産物、例えば、複数のポリペプチド、複数の核酸、複数の小分子の混合物、核酸、ポリペプチド、および小分子の組合せ、リボヌクレオタンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体）、複数の転写因子、複数のエピジェネティック因子、再プログラミング因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４）、複数の制御性ＲＮＡ、ならびにこれらの任意の組合せを含む。
【０３７８】
一部の実施形態では、カーゴは、１つまたは複数のオルガネラ、例えば、コンドリソーム、ミトコンドリア、リソソーム、核、細胞膜、細胞質、小胞体、リボソーム、液胞、エンドソーム、スプライソソーム、ポリメラーゼ、キャプシド、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、筋原線維、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、オルガネラのネットワーク、およびこれらの任意の組合せを含む。
【０３７９】
一部の実施形態では、カーゴは、フソソームまたは細胞膜に濃縮されている。一部の実施形態では、カーゴは、ペプチドシグナル配列を介して膜へと標的化することによって、濃縮される。一部の実施形態では、カーゴは、膜会合型タンパク質、脂質、または小分子との結合によって濃縮される。一部の実施形態では、カーゴは、膜会合型タンパク質、脂質、または小分子との二量体化によって濃縮される。一部の実施形態では、カーゴは、キメラ（例えば、キメラタンパク質または核酸）であり、膜会合型タンパク質、脂質、または小分子との結合または二量体化を媒介するドメインを含む。目的の膜会合型タンパク質としては、細胞膜と安定に会合する、例えば、それに結合する、それに組み込まれるなどのドメイン（すなわち、膜会合ドメイン）を有する任意のタンパク質が挙げられるがこれに限定されず、ここで、そのようなドメインとしては、ミリストイル化ドメイン、ファルネシル化ドメイン、膜貫通ドメインなどを挙げることができる。具体的な目的の膜会合型タンパク質としては、ミリストイル化タンパク質、例えば、ｐ  ６０  ｖ−ｓｒｃなど、ファルネシル化タンパク質、例えば、Ｒａｓ、Ｒｈｅｂ、およびＣＥＮＰ−Ｅ，Ｆ、細胞膜二重層の脂質成分であるホスファチジル−セリンなどへの結合によって、特定の脂質二重層成分に結合するタンパク質、例えば、アネキシンＶ、膜アンカータンパク質、膜貫通タンパク質、例えば、トランスフェリン受容体およびその部分、ならびに膜融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、膜会合型タンパク質は、第１の二量体化ドメインを含む。第１の二量体化ドメインは、例えば、カーゴの第２の二量体化ドメインに直接的に結合するか、または二量体化媒介因子を介して第２の二量体化ドメインに結合する、ドメインであり得る。一部の実施形態では、カーゴは、第２の二量体化ドメインを含む。第２の二量体化ドメインは、例えば、直接的にかまたは二量体化媒介因子を通じてのいずれかで、膜会合型タンパク質の第１の二量体化ドメインと二量体化する（例えば、直接的にかまたは媒介因子を通じてのいずれかで、非共有結合的結合相互作用などによって安定に会合する）、ドメインであり得る。二量体化ドメインに関して、これらのドメインは、直接的にかまたは二量体化媒介因子を介してのいずれかで、結合事象に関与するドメインであり、ここで、結合事象は、膜会合型タンパク質および標的タンパク質の所望される多量体、例えば、二量体の複合体の産生をもたらす。第１および第２の二量体化ドメインは、ホモ二量体性であり得、その場合にはそれらは同じアミノ酸配列から作製されているか、またはヘテロ二量体性であり得、その場合にはそれらは異なるアミノ酸配列から作製されている。二量体化ドメインは、変動し得、ここで、目的のドメインとしては、標的生体分子のリガンド、例えば、目的の特定のタンパク質に特異的に結合するリガンド（例えば、タンパク質：タンパク質相互作用ドメイン）、例えば、ＳＨ２ドメイン、Ｐａｚドメイン、ＲＩＮＧドメイン、転写活性化因子ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、酵素触媒ドメイン、酵素制御性ドメイン、酵素サブユニット、定義される細胞位置への局在化��ためのドメイン、局在化ドメインの認識ドメイン、ＵＲＬ：  ｐａｗｓｏｎｌａｂ．ｍｓｈｒｉ．ｏｎ．ｃａ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｏｐｔｉｏｎ＝ｃｏｍ＿ｃｏｎｔｅｎｔ＆ｔａｓｋ＝ｖｉｅｗ＆ｉｄ＝３０＆Ｉｔｅｍｉｄ＝６３／に列挙されているドメインなどが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、第１の二量体化ドメインは、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合し、第２の二量体化ドメインは、カーゴに存在する核酸配列である（例えば、第１の二量体化ドメインは、ＭＳ２であり、第２の二量体化ドメインは、ＭＳ２  ＲＮＡの高親和性結合ループである）。二量体化媒介因子として機能する任意の便宜的な化合物を用いることができる。天然および合成の両方の物質を含む、広範な化合物を、二量体化媒介因子として使用することができる。二量体化媒介因子の選択に適用可能であり、その容易に観察可能もしくは測定可能な基準としては、（Ａ）リガンドが生理学的に許容されること（すなわち、使用しようとする細胞または動物に対して不適切な毒性が欠如していること）、（Ｂ）それが、妥当な治療投薬量範囲を有すること、（Ｃ）それが、必要に応じて細胞膜および他の膜を越えることができること（一部の事例では、細胞の外部から二量体化を媒介することができること）、ならびに（Ｄ）所望される用途に妥当な親和性で、それが設計されたキメラタンパク質の標的ドメインに結合することが挙げられる。第１の望ましい基準は、化合物が、その二量体化媒介因子活性を除き、相対的に生理学的に不活性であることである。一部の事例では、リガンドは、非ペプチドであり、非核酸である。さらなる二量体化ドメインは、例えば、ＵＳ２０１７００８７０８７およびＵＳ２０１７０１３０１９７に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ペイロード剤
【０３８０】
本明細書に記載される方法および組成物を使用して、ペイロード剤を標的化することができる。例えば、ペイロード剤は、例えば、同時翻訳小胞体（ＥＲ）シグナルの使用を通じて、細胞膜へと標的化することができる。細胞膜は、例えば、ＥＲ膜、形質膜、分泌小胞および／もしくは分泌性小胞の膜、またはリソソーム膜であり得る。一部の実施形態では、ペイロード剤は、分泌の標的とされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、ペイロードを、ＥＲにおける翻訳後に、オルガネラ（例えば、ゴルジ体、分泌性小胞、またはリソソーム）の内腔へと標的化することができる。
【０３８１】
タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤または分泌タンパク質ペイロード剤）は、例えば、膜貫通タンパク質、細胞表面タンパク質、膜のサイトゾル側と会合したタンパク質、小胞体タンパク質、リソソームタンパク質、ゴルジ体タンパク質、分泌タンパク質、分泌性小胞タンパク質、もしくはエンドソームタンパク質、またはこれらの組合せから選択される、タンパク質、またはタンパク質をコードする核酸であり得るかまたはそれを含み得る。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、標的膜内に天然に存在するかまたは標的膜へと標的化される、タンパク質の外因性バージョンである。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、標的膜に天然に存在しないかまたは標的化されない。一部の実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤または分泌タンパク質ペイロード剤）は、例えば、細胞表面受容体タンパク質、輸送体、イオンチャネル、膜会合型酵素、細胞接着性タンパク質、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、小胞体タンパク質、リソソームタンパク質、ゴルジ体タンパク質、分泌タンパク質、分泌性小胞タンパク質、エンドソームタンパク質から選択される、タンパク質、またはタンパク質をコードする核酸であり得るかまたはそれを含み得る。膜タンパク質ペイロード剤は、例えば、天然に存在する膜タンパク質の組換えバージョン、または合成タンパク質、例えば、天然に見出されない配列もしくは天然には一緒に見出されないドメインを有するタンパク質、例えば、キメラ膜タンパク質、例えば、第１の天然に存在するタンパク質に由来する細胞外ドメインならびに第２の天然に存在するタンパク質に由来する膜貫通ドメインおよび／もしくは細胞内ドメインを有する膜貫通タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体であり得る。
【０３８２】
一部の実施形態では、フソソームは、タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤または分泌タンパク質ペイロード剤）を含む。一部の実施形態では、タンパク質ペイロード剤は、タンパク質および／またはそれをコードする核酸である。一部の実施形態では、タンパク質は、細胞系において発現され、次いで、フソソームに組み込まれる。当業者であれば、任意のそのようなタンパク質が細胞系によって発現される程度まで、細胞系が、タンパク質を作製するのに必要とされる任意の翻訳後プロセシングが可能であることを理解するであろう。一部の実施形態では、翻訳後プロセシングは、タンパク質スプライシング、タンパク質切断、タンパク質フォールディング、タンパク質グリコシル化、二量体化などのうちの１つまたは複数を含む。
【０３８３】
一部の実施形態では、タンパク質（例えば、膜タンパク質または分泌タンパク質）は、フソソームが由来する供給源細胞によって発現される。当業者であれば、任意のそのようなタンパク質が供給源細胞によって発現される程度まで、供給源細胞が、タンパク質を作製するのに必要とされる任意の翻訳後プロセシングが可能であることを理解するであろう。一部の実施形態では、翻訳後プロセシングは、タンパク質スプライシング、タンパク質切断、タンパク質フォールディング、タンパク質グリコシル化、二量体化などのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、タンパク質ペイロード剤は、核酸である。一部の実施形態では、核酸は、細胞表面タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸は、小胞体タンパク質、リソソームタンパク質、ゴルジ体タンパク質、分泌タンパク質、分泌性小胞タンパク質、またはエンドソームタンパク質をコードする。一部の実施形態では、タンパク質ペイロード剤、例えば、膜タンパク質ペイロード剤は、本明細書に記載される細胞表面抗原から選択されるタンパク質またはタンパク質をコードする核酸である。一部の実施形態では、核酸は、操作された細胞表面タンパク質をコードする。一部の実施形態では、操作された細胞表面タンパク質は、キメラ抗原受容体である。
【０３８４】
一部の実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤または分泌タンパク質ペイロード剤）は、融合された標的細胞によって発現される核酸を含む。当業者であれば、核酸タンパク質膜ペイロード剤の発現によって産生される任意のタンパク質が翻訳後プロセシングを必要とする程度まで、そのような翻訳後プロセシングが融合された標的細胞において行われることを理解するであろう。一部の実施形態では、翻訳後は、タンパク質スプライシング、タンパク質切断、タンパク質フォールディング、タンパク質グリコシル化、二量体化などのうちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、翻訳後改変は、脂質、例えば、脂肪酸、イソプレノイド、ステロール、リン脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、コレステロール、ファルネシル、ゲラニルゲラニル、ミリストイル、パルミトイルの共有結合的付加であり、これは、一部の実施形態では、タンパク質を形質膜へと標的化する。
【０３８５】
一部の実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤または分泌タンパク質ペイロード剤）は、核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の天然の核酸残基であるか、それを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の核酸類似体であるか、それを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、核酸は、機能性遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然の源からの単離、相補的鋳型に基づく重合による酵素合成（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、組換え細胞または系における再生、および化学合成のうちの１つまたは複数によって調製される。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１  １０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれを上回る残基長である。一部の実施形態では、核酸は、部分的または完全に一本鎖であり、一部の実施形態では、核酸は、部分的または完全に二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするかまたはポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つのエレメントを含む、ヌクレオチド配列を有する。核酸は、例えば、参照核酸との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体的な配列同一性を有するバリアントを含み得る。一部の実施形態では、バリアント核酸は、少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを、参照核酸と共有しない。一部の実施形態では、バリアント核酸は、参照核酸の生物学的活性のうちの１つまたは複数を共有する。一部の実施形態では、核酸バリアントは、特定の位置における少数の配列変更を除き、参照物のものに同一である核酸配列を有する。一部の実施形態では、バリアントにおける残基のうちの約２０％を下回る、約１５％を下回る、約１０％を下回る、約９％を下回る、約８％を下回る、約７％を下回る、約６％を下回る、約５％を下回る、約４％を下回る、約３％を下回る、または約２％を下回るものが、参照物と比較して、置換、挿入、または欠失されている。一部の実施形態では、バリアント核酸は、参照物と比較して、約１０個、約９つ、約８つ、約７つ、約６つ、約５つ、約４つ、約３つ、約２つ、または約１つの置換された残基を含む。一部の実施形態では、バリアント核酸は、参照物と比較して、特定の生物学的活性に関与する、非常に少ない数（例えば、約５つを下回る、約４つを下回る、約３つを下回る、約２つを下回る、または約１つを下回る）の置換、挿入、または欠失された機能性残基を含む。一部の実施形態では、バリアント核酸は、参照物と比較して、約１５個を上回らない、約１２個を上回らない、約９つを上回らない、約３つを上回らない、または約１つを上回らない付加または欠失を含み、一部の実施形態では、付加も欠失も含まない。一部の実施形態では、バリアント核酸は、参照物と比較して、約２７個を下回る、約２４個を下回る、約２１個を下回る、約１８個を下回る、約１５個を下回る、約１２個を下回る、約９つを下回る、約６つを下回る、約３つを下回る、または約９つを下回る、約６つを下回る、約３つを下回る、または約２つを下回る付加または欠失を含む。
【０３８６】
一部の実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤または分泌タンパク質ペイロード剤）は、タンパク質を含む。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含んでもよく（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであってもよく）、および／またはそれ以外にプロセシングもしくは改変されていてもよい。タンパク質は、例えば、１つもしくは複数のジスルフィド結合によって連結されているかまたは他の手段によって会合されている、１つを上回るポリペプチド鎖を含むことがあってもよい。タンパク質は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または両方を含んでもよく、様々なアミノ酸改変もしくは類似体のいずれかを含んでもよい。一部の実施形態では、タンパク質は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、合成のアミノ酸、およびこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分、および／またはその特徴的な部分である。ポリペプチドは、例えば、参照ポリペプチドとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体的な配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを、参照ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性のうちの１つまたは複数を共有する。一部の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、特定の位置における少数の配列変更を除き、参照物のものに同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、バリアントにおける残基のうちの約２０％を下回る、約１５％を下回る、約１０％を下回る、約９％を下回る、約８％を下回る、約７％を下回る、約６％を下回る、約５％を下回る、約４％を下回る、約３％を下回る、または約２％を下回るものが、参照物と比較して、置換、挿入、または欠失されている。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照物と比較して、約１０個、約９つ、約８つ、約７つ、約６つ、約５つ、約４つ、約３つ、約２つ、または約１つの置換された残基を含む。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照物と比較して、特定の生物学的活性に関与する、非常に少ない数（例えば、約５つを下回る、約４つを下回る、約３つを下回る、約２つを下回る、または約１つを下回る）の置換、挿入、または欠失された機能性を含む。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照物と比較して、約５つを上回らない、約４つを上回らない、約３つを上回らない、約２つを上回らない、または約１つを上回らない付加または欠失を含み、一部の実施形態では、付加も欠失も含まない。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照物と比較して、約２５個を下回る、約２０個を下回る、約１９個を下回る、約１８個を下回る、約１７個を下回る、約１６個を下回る、約１５個を下回る、約１４個を下回る、約１３個を下回る、約１０個を下回る、約９つを下回る、約８つを下回る、約７つを下回る、約６つを下回る、一般的には約５つを下回る、約４つを下回る、約３つを下回る、または約２つを下回る付加または欠失を含む。
シグナル配列
【０３８７】
一部の実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤または分泌タンパク質ペイロード剤）は、タンパク質を特定の部位または位置（例えば、細胞表面）に方向付けるシグナル配列を含むかまたはそれが含まれるタンパク質（またはそれをコードする核酸）である。当業者であれば、ある特定の事例において、細胞は、少なくとも一時的にタンパク質の一部である（例えば、最初に産生されたときに）アミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用して、タンパク質を、特定の細胞内位置（例えば、標的細胞の特定のオルガネラまたは表面膜）へと標的化することを理解するであろう。一部の実施形態では、選別シグナルは、シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列であり、これは、タンパク質を、小胞体（ＥＲ）と称されるオルガネラへと方向付け、一部のそのような実施形態では、タンパク質は、次いで、形質膜へと送達される。ＵＳ２０１６０２８９６７４Ａ１を参照されたい。一部のそのような実施形態では、タンパク質は、次いで、分泌される。一部のそのような実施形態では、タンパク質は、次いで、リソソームへと輸送される。一部のそのような実施形態では、タンパク質は、次いで、ゴルジ体へと輸送される。一部のそのような実施形態では、タンパク質は、次いで、分泌性小胞へと輸送され、次いで、細胞から分泌され得る。一部のそのような実施形態では、タンパク質は、次いで、エンドソームへと輸送される。
【０３８８】
一部の実施形態では、ＥＲを標的とするタンパク質は、同時翻訳性である。一部の実施形態では、タンパク質の転位および膜挿入は、タンパク質合成と関連している。一部の実施形態では、シグナル配列は、疎水性であり得る。一部の実施形態では、シグナル配列は、部分的に疎水性であり得る。一部の実施形態では、シグナル配列は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）によって認識される。一部の実施形態では、シグナル配列がリボソームから生じるときにそれを認識するＳＲＰ。一部の実施形態では、発生期のペプチド鎖−リボソーム複合体は、ＳＲＰ受容体に結合することによって、ＥＲへと標的化される。一部の実施形態では、シグナル配列は、トランスロコンのＳｅｃ６１αサブユニットと相互作用し、膜タンパク質または前記膜タンパク質の部分鎖の転位を開始する。
【０３８９】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、目的のタンパク質と膜貫通タンパク質のコーディング配列とのインフレーム融合体、または目的のタンパク質とタンパク質の膜貫通ドメインもしくは膜アンカードメインとのインフレーム融合体（例えば、トランスフェリン受容体膜アンカードメインとの融合体）を含む。例えば、Ｗｉｎｎｄａｒｄ，  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ．  １２：１８８９−１８９９  （２００７）を参照されたい。
【０３９０】
一部の実施形態では、選別シグナルまたはシグナルペプチドは、タンパク質（例えば、膜タンパク質または分泌タンパク質）のＮ末端またはＣ末端に結合される。Ｇｏｄｅｒ，  Ｖ．  ＆  Ｓｐｉｅｓｓ，  Ｍ．，  Ｔｏｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．  ５０４（３）：  ８７−９３  （２００１）を参照されたい。一部の実施形態では、タンパク質は、天然のタンパク質である。一部の実施形態では、膜タンパク質は、合成タンパク質である。
【０３９１】
一部の実施形態では、シグナルは、転写産物の翻訳が終止コドンに到達した後にのみ、リボソームから生じる。一部の実施形態では、膜タンパク質の挿入は、翻訳後である。
【０３９２】
一部の実施形態では、シグナル配列は、表４から選択される。一部の実施形態では、シグナル配列は、表４から選択される配列を含む。一部の実施形態では、表４のシグナル配列は、タンパク質、例えば、膜タンパク質または分泌タンパク質のＮ末端に付加され得る。一部の実施形態では、表４のシグナル配列は、タンパク質、例えば、膜タンパク質または分泌タンパク質のＣ末端に付加され得る。当業者であれば、以下のシグナル配列が、そのそれぞれの天然に会合するタンパク質での使用に制限されないことを理解するであろう。一部の実施形態では、核酸は、標的細胞による膜タンパク質をコードする配列の発現を方向付ける１つまたは複数の制御性エレメントを含む。
【表４−１】
2021513849.tif 000009
【表４−２】
2021513849.tif 000010
【表４−３】
2021513849.tif 000011
【表４−４】
2021513849.tif 000012
膜タンパク質ペイロード剤
【０３９３】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、細胞の膜表面上（例えば、形質膜の表面上）に天然に見出されるタンパク質（またはそれをコードする核酸）である。
【０３９４】
例示的な膜タンパク質（および／またはそれをコードする核酸）は、例えば、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号において見出すことができ、その内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤（および／またはそれをコードする核酸）は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１のうちのいずれか１つに記載される配列、またはその機能性断片を有する。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１のうちのいずれか１つに記載される形質膜タンパク質（それをコードする核酸）、または形質膜タンパク質の断片、バリアント、またはホモログ（もしくはそれをコードする核酸）である。
【０３９５】
一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、治療用膜タンパク質である。一部の実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、能動的もしくは受動的輸送タンパク質、例えば、例として、イオンチャネルタンパク質、細孔形成タンパク質［例えば、毒素タンパク質］など）、膜酵素、ならびに／または細胞接着性タンパク質）であるかまたはそれを含む。
【０３９６】
一部の実施形態では、膜タンパク質は、一回膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、一回膜貫通タンパク質は、細胞質Ｎ末端および細胞質外Ｃ末端（Ｎｃｙｔ／Ｃｅｘｏ）またはその逆の配向（Ｎｅｘｏ／Ｃｃｙｔ）を有する最終的な位相を想定し得る。
【０３９７】
一部の実施形態では、膜タンパク質は、Ｎ末端切断可能シグナル配列および輸送停止（ｓｔｏｐ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）配列（Ｎｅｘｏ／Ｃｃｙｔ）を含むＩ型膜タンパク質である。一部の実施形態では、シグナルは、Ｃ末端にある。一部の実施形態では、Ｎ末端切断可能シグナル配列は、発生期のペプチドをＥＲへと標的化する。一部の実施形態では、Ｎ末端切断可能シグナル配列は、典型的な７〜１５個の主として無極性の残基からできた疎水性ストレッチを含む。一部の実施形態では、Ｉ型膜タンパク質は、ポリペプチドのさらなる転位を停止させ、膜貫通アンカーとして作用する、輸送停止配列を含む。一部の実施形態では、輸送停止配列は、約２０個の疎水性残基のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型膜タンパク質のＮ末端は、細胞外にあり、Ｃ末端は、細胞質にある。一部の実施形態では、Ｉ型膜タンパク質は、グリコホリンまたはＬＤＬ受容体であり得る。
【０３９８】
一部の実施形態では、膜タンパク質は、シグナルアンカー配列（Ｎｃｙｔ／Ｃｅｘｏ）を含むＩＩ型膜タンパク質である。一部の実施形態では、シグナルは、Ｃ末端にある。一部の実施形態では、シグナルアンカー配列は、ＩＩ型膜タンパク質の挿入およびアンカーの両方を担う。一部の実施形態では、シグナルアンカー配列は、約１８〜２５個の主として無極性の残基を含む。一部の実施形態では、シグナルアンカー配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位が欠如している。一部の実施形態では、シグナルアンカー配列は、ポリペプチド鎖の内部に配置され得る。一部の実施形態では、シグナルアンカー配列は、タンパク質のＣ末端の細胞膜を越える転位を誘導する。一部の実施形態では、ＩＩ型膜タンパク質のＣ末端は、細胞外にあり、Ｎ末端は、細胞質にある。一部の実施形態では、ＩＩ型膜タンパク質は、トランスフェリン受容体またはガラクトシルトランスフェラーゼ受容体であり得る。
【０３９９】
一部の実施形態では、膜タンパク質は、逆シグナルアンカー配列（Ｎｅｘｏ／Ｃｃｙｔ）を含むＩＩＩ型膜タンパク質である。一部の実施形態では、シグナルは、Ｎ末端にある。一部の実施形態では、逆シグナルアンカー配列は、ＩＩＩ型膜タンパク質の挿入およびアンカーの両方を担う。一部の実施形態では、逆シグナルアンカー配列は、約１８〜２５個の主として無極性の残基を含む。一部の実施形態では、シグナルアンカー配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位が欠如している。一部の実施形態では、シグナルアンカー配列は、ポリペプチド鎖の内部に配置され得る。一部の実施形態では、シグナルアンカー配列は、タンパク質のＮ末端の細胞膜を越える転位を誘導する。一部の実施形態では、ＩＩＩ型膜タンパク質のＮ末端は、細胞外にあり、Ｃ末端は、細胞質にある。一部の実施形態では、Ｉ型膜タンパク質は、シナプトガミン、ニューレグリン、またはシトクロムＰ−４５０であり得る。
【０４００】
一部の実施形態では、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の膜タンパク質は、ＳＲＰ、ＳＲＰ受容体、およびＳｅｃ６１トランスロコンを含む細胞経路を介して、細胞膜へと挿入される。
【０４０１】
一部の実施形態では、膜タンパク質は、主として、サイトゾルに曝露されており、Ｃ末端シグナル配列によって膜にアンカーされているが、これは、ＳＲＰと相互作用しない。一部の実施形態では、タンパク質は、シトクロムｂ５、またはＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、シナプトブレビン）である。
【０４０２】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、ペイロード膜タンパク質を細胞膜へと局在化させるシグナル配列を含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、核酸であり、ここで、核酸は、核酸によってコードされるペイロード膜タンパク質を細胞膜へと局在化させるシグナル配列をコードする。
（ｉ）インテグリン膜タンパク質ペイロード
【０４０３】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、インテグリン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表５から選択されるインテグリン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表５のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表５の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【表５】
2021513849.tif 000013
（ｉｉ）イオンチャネルタンパク質
【０４０４】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、イオンチャネルタンパク質、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表６から選択されるイオンチャネルタンパク質、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表６のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表６の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【表６−１】
2021513849.tif 000014
【表６−２】
2021513849.tif 000015
【表６−３】
2021513849.tif 000016
【表６−４】
2021513849.tif 000017
【表６−５】
2021513849.tif 000018
【表６−６】
2021513849.tif 000019
【表６−７】
2021513849.tif 000020
【表６−８】
2021513849.tif 000021
【表６−９】
2021513849.tif 000022
（ｉｉｉ）細孔形成タンパク質
【０４０５】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、細孔形成タンパク質、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、細孔形成タンパク質は、ヘモリジン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であり得る。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表７から選択されるヘモリジン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、細孔形成タンパク質は、コリシン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であり得る。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表８から選択されるコリシン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表７のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表７の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【０４０７】
いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表８のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表８の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【表７】
2021513849.tif 000023
【表８】
2021513849.tif 000024
（ｉｖ）Ｔｏｌｌ様受容体
【０４０８】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表９から選択されるｔｏｌｌ様受容体、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表９のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表９の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【表９】
2021513849.tif 000025
【０４０９】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、インターロイキン受容体、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１０から選択されるインターロイキン受容体、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１０のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１０の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
（ｖ）インターロイキン受容体ペイロード
【表１０−１】
2021513849.tif 000026
【表１０−２】
2021513849.tif 000027
【表１０−３】
2021513849.tif 000028
【表１０−４】
2021513849.tif 000029
（ｖｉ）細胞接着性タンパク質ペイロード
【０４１０】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、細胞接着性タンパク質、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１１から選択される細胞接着性タンパク質、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、細胞接着性タンパク質は、カドヘリン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であり得る。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１２から選択されるカドヘリン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、細胞接着性タンパク質は、セレクチン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であり得る。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１３から選択されるセレクチン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、細胞接着性タンパク質は、ムチン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であり得る。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１４から選択されるムチン、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１１のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１１の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１２のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１２の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【０４１３】
いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１３のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１３の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【０４１４】
いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１４のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１４の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【表１１】
2021513849.tif 000030
【表１２−１】
2021513849.tif 000031
【表１２−２】
2021513849.tif 000032
【表１２−３】
2021513849.tif 000033
【表１３】
2021513849.tif 000034
【表１４−１】
2021513849.tif 000035
【表１４−２】
2021513849.tif 000036
（ｖｉｉ）輸送タンパク質ペイロード
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、輸送タンパク質、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１５から選択される輸送タンパク質、またはその機能性断片、バリアント、もしくはホモログ、またはそれをコードする核酸であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１５のタンパク質のポリペプチド配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１５の遺伝子の核酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一である配列を有する核酸を含む。
【表１５−１】
2021513849.tif 000037
【表１５−２】
2021513849.tif 000038
【表１５−３】
2021513849.tif 000039
【表１５−４】
2021513849.tif 000040
【表１５−５】
2021513849.tif 000041
【表１５−６】
2021513849.tif 000042
【表１５−７】
2021513849.tif 000043
【表１５−８】
2021513849.tif 000044
【表１５−９】
2021513849.tif 000045
【表１５−１０】
2021513849.tif 000046
【表１５−１１】
2021513849.tif 000047
（ｖｉｉｉ）キメラ抗原受容体ペイロード
【０４１５】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、ＣＡＲ、例えば、第１世代のＣＡＲ、または第１世代のＣＡＲをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、第１世代のＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化の間の下流シグナル伝達を媒介する。
【０４１６】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、第２世代のＣＡＲ、または第２世代のＣＡＲをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、第２世代のＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および２つのシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化の間の下流シグナル伝達を媒介する。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化の間のサイトカイン産生、ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖、およびまたはＣＡＲ  Ｔ細胞持続を増強する。
【０４１７】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、第３世代のＣＡＲ、または第３世代のＣＡＲをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、第３世代のＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化の間の下流シグナル伝達を媒介する。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化の間のサイトカイン産生、ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖、およびまたはＣＡＲ  Ｔ細胞持続を増強する。一部の実施形態では、第３世代のＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも２つの共刺激ドメインは、同じではない。
【０４１８】
一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、第４世代のＣＡＲ、または第４世代のＣＡＲをコードする核酸であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、第４世代のＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも２つ、３つ、または４つのシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化の間の下流シグナル伝達を媒介する。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化の間のサイトカイン産生、ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖、およびまたはＣＡＲ  Ｔ細胞持続を増強する。
【０４１９】
一部の実施形態では、第１世代、第２世代、第３世代、または第４世代のＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインをさらに含む。一部の実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含むＣＡＲを含む標的細胞に対して内因性または外因性である。一部の実施形態では、サイトカイン遺伝子は、炎症促進性サイトカインをコードする。一部の実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、またはＩＦＮ−ガンマ、またはこれらの機能性断片をコードする。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能的ドメインもしくは断片であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能的ドメインもしくは断片であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、転写因子またはその機能的ドメインもしくは断片は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ−ｋＢ、またはその機能的ドメインもしくは断片であるかまたはそれを含む。例えば、Ｚｈａｎｇ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ５：２２  （２０１７）、ＷＯ  ２０１６１２６６０８、Ｓｈａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｊａｎ  ２７，  ２０１７，  ３７  （１）を参照されたい。
（ａ）ＣＡＲ抗原結合性ドメイン
【０４２０】
一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性部分であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖまたはＦａｂであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞アルファ鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１  ＢＢ）抗体、ＣＤ１６３抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒａ抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体、またはトランスフェリン受容体抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片を含む。
【０４２１】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、細胞の細胞表面抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞表面抗原は、１つの種類の細胞に特徴的である。一部の実施形態では、細胞表面抗原は、１つを上回る種類の細胞に特徴的である。
【０４２２】
一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞に特徴的な細胞表面抗原に結合する。一部の実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｔ細胞に特徴的な細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、能動的もしくは受動的輸送タンパク質、例えば、例として、イオンチャネルタンパク質、細孔形成タンパク質など）、膜貫通受容体、膜酵素、および／または細胞接着性タンパク質であり得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体であり得る。
【０４２３】
一部の実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｔ細胞受容体であり得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＡＫＴ３；ＡＴＦ２；ＢＣＬ１０；ＣＡＬＭ１；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）；ＣＤ４；ＣＤ８；ＣＤ２８；ＣＤ４５；ＣＤ８０（Ｂ７−１）；ＣＤ８６（Ｂ７−２）；ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）；ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）；ＥＬＫ１；ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）；ＥＲＫ２；ＦＯＳ；ＦＹＮ；ＧＲＡＰ２（ＧＡＤＳ）；ＧＲＢ２；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＬＡ−ＤＲＢ１；ＨＬＡ−ＤＲＢ３；ＨＬＡ−ＤＲＢ４；ＨＬＡ−ＤＲＢ５；ＨＲＡＳ；ＩＫＢＫＡ（ＣＨＵＫ）；ＩＫＢＫＢ；ＩＫＢＫＥ；ＩＫＢＫＧ（ＮＥＭＯ）；ＩＬ２；ＩＴＰＲ１；ＩＴＫ；ＪＵＮ；ＫＲＡＳ２；ＬＡＴ；ＬＣＫ；ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）；ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）；ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）；ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）；ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）；ＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）；ＭＡＰ３Ｋ１（ＭＥＫＫ１）；ＭＡＰ３Ｋ３；ＭＡＰ３Ｋ４；ＭＡＰ３Ｋ５；ＭＡＰ３Ｋ８；ＭＡＰ３Ｋ１４（ＮＩＫ）；ＭＡＰＫ８（ＪＮＫ１）；ＭＡＰＫ９（ＪＮＫ２）；ＭＡＰＫ１０（ＪＮＫ３）；ＭＡＰＫ１１（ｐ３８β）；ＭＡＰＫ１２（ｐ３８γ）；ＭＡＰＫ１３（ｐ３８δ）；ＭＡＰＫ１４（ｐ３８α）；ＮＣＫ；ＮＦＡＴ１；ＮＦＡＴ２；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＦＫＢＩＡ；ＮＲＡＳ；ＰＡＫ１；ＰＡＫ２；ＰＡＫ３；ＰＡＫ４；ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ；ＰＩＫ３Ｃ３（ＶＰＳ３４）；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３ＣＤ；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＫＣＡ；ＰＫＣＢ；ＰＫＣＭ；ＰＫＣＱ；ＰＬＣＹ１；ＰＲＦ１（パーフォリン）、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＥＬＡ、ＳＤＦ１、ＳＨＰ２、ＳＬＰ７６、ＳＯＳ、ＳＲＣ、ＴＢＫ１、ＴＣＲＡ、ＴＥＣ、ＴＲＡＦ６、ＶＡＶ１、ＶＡＶ２、またはＺＡＰ７０であり得る。
【０４２４】
一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、がんに特徴的な抗原に結合する。一部の実施形態では、がんに特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合型受容体、酵素結合型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、複数回膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞アルファ鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１  ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒａ、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、カノニカルＴｒｅｇ  ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、ＴＲＥＧ、ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、ルイス−γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ  １／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ−１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ��、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ−１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、もしくはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｔｎ  Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン−１１受容体ａ（ＩＬ−１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体−ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレイクポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰＩＢ  Ｉ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ネオ抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）  ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１  ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、もしくはｔｒｋＣ、またはその抗原性断片もしくは抗原性部分から選択される。
【０４２５】
一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、感染性疾患（例えば、ウイルス感染または細菌感染）に特徴的な抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原は、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタインバーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択される感染性疾患に特徴的である。一部の実施形態では、感染性疾患に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合型受容体、酵素結合型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、感染性疾患に特徴的な抗原に結合し、ここで、抗原は、ＨＩＶ  Ｅｎｖ、ｇｐｌ２０、またはＨＩＶ−１  Ｅｎｖ上のＣＤ４に誘導されるエピトープから選択される。例えば、ＷＯ２０１５／０７７７８９を参照されたく、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、ＣＤ４またはそのＨＩＶ結合性断片を含む。
【０４２６】
一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、自己免疫障害または炎症性障害に特徴的な抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原は、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症もしくは強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素病、尋常性天疱瘡、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、血友病Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、エヴァンス症候群、ＩｇＭ媒介性ニューロパチー、クリオグロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱、後天性血管浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発ニューロパチー、および自己免疫性血小板減少症もしくは好中球減少症、または純赤芽球癆から選択される自己免疫障害または炎症性障害に特徴的であり、一方で同種免疫疾患の例示的な非限定的な例としては、造血器移植もしくは固形臓器移植、輸血、胎児同種感作を伴う妊娠による同種感作（例えば、Ｂｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  １５（４）：９３１−４１を参照されたい）または異種感作、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児の溶血性疾患、外来抗原への感作、例えば、酵素もしくはタンパク質置換え療法、血液製剤、および遺伝子療法により処置される先天性もしくは後天性の欠損障害の置換えにより生じ得るものが挙げられる。一部の実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合型受容体、酵素結合型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、Ｂ細胞、形質細胞、または形質芽細胞に発現されるリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、自己免疫障害または炎症性障害に特徴的な抗原に結合し、ここで、抗原は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＺＡＰ−７０、ＬＦＡ−１、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ５、またはＣＤ２から選択される。ＵＳ  ２００３／００７７２４９、ＷＯ  ２０１７／０５８７５３、ＷＯ  ２０１７／０５８８５０を参照されたく、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
（ｂ）ＣＡＲ膜貫通ドメイン
【０４２７】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはこれらの機能性バリアントの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂ、またはこれらの機能性バリアントの膜貫通領域を含む。
（ｃ）ＣＡＲシグナル伝達ドメイン
【０４２８】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ゼータドメイン、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはこれらの機能性バリアントのうちの１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む。
【０４２９】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインであるシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、第２の共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つの共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドのうちの１つまたは複数から選択される共刺激ドメインを含む。
【０４３０】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータドメインもしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能性バリアントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能性バリアント、および（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４−１ＢＢドメイン、またはその機能性バリアントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能性バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能性バリアント、および（ｉｉｉ）４−１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能性バリアントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能性バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能性バリアント、（ｉｉｉ）４−１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能性バリアント、および（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激性リガンド導入遺伝子を含む。
（ｄ）ＣＡＲスペーサー
【０４３１】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数のスペーサーを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサーを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間のスペーサーを含む。
（ｅ）ＣＡＲ膜タンパク質ペイロード剤
【０４３２】
本明細書に記載されるＣＡＲに加えて、様々なキメラ抗原受容体およびそれをコードするヌクレオチド配列が、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されるようにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるフソソーム送達および標的細胞の再プログラミングに好適であろう。例えば、ＷＯ２０１３０４０５５７、ＷＯ２０１２０７９０００、ＷＯ２０１６０３０４１４、Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２０１７．  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４３３】
一部の実施形態では、ＣＡＲまたはＣＡＲをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ＭＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）であるかまたはそれを含む膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソームは、標的細胞に送達される。一部の実施形態では、標的細胞は、エフェクター細胞、例えば、１つまたは複数のＦｃ受容体を発現し、１つまたは複数のエフェクター機能を媒介する、免疫系の細胞である。一部の実施形態では、標的細胞としては、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球（例えば、Ｔ細胞）、ガンマデルタＴ細胞、Ｂリンパ球（例えば、Ｂ細胞）のうちの１つまたは複数を挙げることができるが、これらに限定されなくてもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むがこれらに限定されない任意の生物に由来し得る。
（ｉｘ）Ｔ細胞受容体ペイロード
【０４３４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される膜タンパク質ペイロード剤は、Ｔ細胞受容体、例えば、Ｔ細胞受容体融合タンパク質（ＴＦＰ）を含むポリペプチドを含むかまたはそれをコードする。一部の実施形態では、ＴＦＰは、概して、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合すること、およびｉｉ）典型的にはＴ細胞内またはその表面上に共在している場合に、インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することが可能である、ＴＣＲを含む様々なポリペプチドに由来する組換えポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＴＦＰは、Ｔ細胞において発現されると、ＴＣＲに組み込まれる。一部の実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、（ｉｉ）ＴＣＲドメインに作動可能に連結された（ｉ）抗原結合性ドメインを含むかまたはそれをコードする。
【０４３５】
抗原結合性ドメインは、例えば、ｓｃＦｖ、例えば、がん細胞に含まれる抗原、例えば、がん細胞の表面における抗原に結合するｓｃＦｖを含み得る。抗原結合性ドメインは、ヒトまたはヒト化であり得る。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、本明細書において、例えば、「ＣＡＲ抗原結合性ドメイン」と題される節に記載される抗原結合性ドメインである。
【０４３６】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗体のＦｃドメインに結合する。一部の実施形態では、ＩｇＧｌ抗体に選択的に結合する抗原結合性ドメイン。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、細胞表面抗原、例えば、腫瘍細胞の表面上の細胞表面抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗原もその断片も含まない。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１６ポリペプチドまたはその断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１６結合性ポリペプチドを含む。
【０４３７】
一部の実施形態では、ＴＦＰは、Ｔ細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３ガンマ、またはその機能性断片もしくはバリアントからなる群から選択される、タンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲドメインは、膜貫通ドメイン、例えば、少なくとも、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、またはＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、またはそれらの機能性断片もしくはバリアントの膜貫通ドメインの膜貫通領域を含む。
【０４３８】
さらなる実施形態では、ＴＣＲドメインは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタ、またはそれらのバリアントの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメインを含む、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。
【０４３９】
さらなる実施形態では、ＴＣＲドメインは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、ここで、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つまたは３つすべてが、同じＴＣＲサブユニットに由来する。
【０４４０】
一部の実施形態では、ＴＣＲドメインは、ＣＤ３εまたはその機能性断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲドメイン（例えば、ＣＤ３εに基づくＴＣＲドメイン）は、内因性ＣＤ３ζに結合する。一部の実施形態では、ＴＣＲドメイン（例えば、ＣＤ３εに基づくＴＣＲドメイン）は、内因性ＣＤ３γおよび／または内因性ＣＤ３δに結合する。一部の実施形態では、ＴＣＲドメインは、ＣＤ３αまたはその機能性断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲドメインは、ＣＤ３βまたはその機能性断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲドメイン（例えば、ＣＤ３αに基づくかまたはＣＤ３βに基づくＴＣＲドメイン）は、内因性ＣＤ３ζに結合する。一部の実施形態では、ＴＣＲドメイン（例えば、ＣＤ３αに基づくＴＣＲドメイン）は、内因性ＣＤ３βに結合する。一部の実施形態では、ＴＣＲドメイン（例えば、ＣＤ３βに基づくＴＣＲドメイン）は、内因性ＣＤ３αに結合する。一部の実施形態では、ＴＣＲドメイン（例えば、ＣＤ３αに基づくかまたはＣＤ３βに基づくＴＣＲドメイン）は、内因性ＣＤ３δに結合する。
【０４４１】
一部の実施形態では、ＴＦＰは、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分、およびＣＤ３（例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、もしくはＴＣＲベータ）の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびにヒトまたはヒト化抗原結合性ドメインを含み、ここで、ＴＣＲサブユニットおよび抗原結合性ドメインは、作動可能に連結されており、ＴＦＰは、Ｔ細胞において発現されると、ＴＣＲに組み込まれる。一部の実施形態では、ＴＦＰは、ＴＣＲサブユニット、および抗ＣＤ１９結合性ドメインまたは抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合性ドメインである抗原結合性ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む。
【０４４２】
例示的なＴＦＰは、例えば、ＷＯ２０１６１８７３４９、ＷＯ２０１８０２６９５３、ＷＯ２０１８０６７９９３、ＷＯ２０１８０９８３６５、ＷＯ２０１８１１９２９８、およびＷＯ２０１８２３２０２０に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
分泌ペイロード剤、例えば、分泌タンパク質ペイロード剤
【０４４３】
ペイロード剤、例えば、タンパク質ペイロード剤はまた、分泌の標的とされ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、ペイロードを、ＥＲにおける翻訳後に、オルガネラ（例えば、ゴルジ体、分泌性小胞）の内腔へと標的化することができる。一部の実施形態では、分泌タンパク質ペイロード剤は、分泌タンパク質またはそれをコードする核酸を含む。
コンドリソーム
【０４４４】
一部の実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、コンドリオソームまたはコンドリソーム調製物をさらに含む。一部の実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、ミトコンドリアの細胞供給源に由来する改変されたコンドリソーム調製物を含む。一部の実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、外因性タンパク質を発現するコンドリソーム調製物を含む。一部の実施形態では、外因性タンパク質は、前記ミトコンドリアに対して外因性である。一部の実施形態では、外因性タンパク質は、ミトコンドリアの前記細胞供給源に対して外因性である。コンドリソーム、コンドリソーム調製物、方法、および使用を含む、さらなる特性および実施形態が、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１号に記載されるように、本発明によって企図される。
免疫原性
【０４４５】
本明細書に記載の態様のいずれかについての一部の実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性である。免疫原性は、例えば本明細書に記載されるように、定量することができる。
【０４４６】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性である細胞または実質的に非免疫原性であることが公知である細胞、例えば、幹細胞、間葉幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞の、膜対称性を有する。一部の実施形態では、フソソームは、本明細書に記載のアッセイによって測定した場合に、幹細胞、間葉幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞の免疫原性を５％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％より大きく上回らない免疫原性を有する。
【０４４７】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、上昇したレベルの免疫抑制剤を含む。一部の実施形態では、上昇したレベルは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍である。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞には非存在である免疫抑制剤を含む。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、低下したレベルの免疫活性化剤を含む。一部の実施形態では、低下したレベルは、参照細胞と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。一部の実施形態では、免疫活性化剤は、フソソームには実質的に非存在である。
【０４４８】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、例えばプロテオミクスによって測定した場合に、供給源細胞、例えば実質的非免疫原性の供給源細胞のものと実質的に同様の組成を有する膜を含む。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、供給源細胞の膜タンパク質の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％を含む膜を含む。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、供給源細胞の膜上での膜タンパク質の発現レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％で発現される膜タンパク質を含む膜を含む。
【０４４９】
一部の実施形態では、フソソーム組成物、またはフソソーム組成物が由来する供給源細胞は、次の特徴のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、またはそれより多くを有する：
ａ．ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩについての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｂ．ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７−Ｈ３、またはＢ７−Ｈ４を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の共刺激性タンパク質についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、または本明細書に記載の参照細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｃ．マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７についての発現、例えば、本明細書に記載の方法により検出可能な発現、例えば、マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して１．５倍を上回る、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍の、またはそれより多い発現；
ｄ．可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ−１０についての発現、例えば、本明細書に記載の方法により検出可能な発現、例えば、可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ−１０についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して１．５倍を上回る、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍の、またはそれより多い発現；
ｅ．可溶性免疫抑制性タンパク質、例えばＰＤ−Ｌ１についての発現、例えば、本明細書に記載の方法により検出可能な発現、例えば、可溶性免疫抑制性タンパク質、例えばＰＤ−Ｌ１についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して１．５倍を上回る、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍の、またはそれより多い発現；
ｆ．可溶性免疫刺激サイトカイン、例えばＩＦＮ−ガンマまたはＴＮＦ−ａについての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＵ−２６６細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｇ．内因性免疫刺激性抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＡ５４９細胞もしくはＳＫ−ＢＲ−３細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｈ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、例えば本明細書に記載の方法により検出可能な、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇについての発現；
ｉ．例えばＮＫ細胞活性化を抑制するように作用する、例えばシアル酸を含有する、表面グリコシル化プロファイル；
ｊ．ＴＣＲα／βについての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｋ．ＡＢＯ血液型についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｌ．マイナー組織適合抗原（ＭＨＡ）についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；あるいは
ｍ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、もしくはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して１０％未満、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％の、もしくはそれより少ないミトコンドリアＭＨＡを有する、または検出可能なミトコンドリアＭＨＡを有さない。
【０４５０】
一部の実施形態では、共刺激性タンパク質は、４−１ＢＢ、Ｂ７、ＳＬＡＭ、ＬＡＧ３、ＨＶＥＭ、またはＬＩＧＨＴであり、ｒｅｆ細胞は、ＨＤＬＭ−２である。一部の実施形態では、共刺激性タンパク質は、ＢＹ−Ｈ３であり、参照細胞は、ＨｅＬａである。一部の実施形態では、共刺激性タンパク質は、ＩＣＯＳＬまたはＢ７−Ｈ４であり、参照細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３である。一部の実施形態では、共刺激性タンパク質は、ＩＣＯＳまたはＯＸ４０であり、参照細胞は、ＭＯＬＴ−４である。一部の実施形態では、共刺激性タンパク質は、ＣＤ２８であり、参照細胞は、Ｕ−２６６である。一部の実施形態では、共刺激性タンパク質は、ＣＤ３０ＬまたはＣＤ２７であり、参照細胞は、Ｄａｕｄｉである。
【０４５１】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、免疫系、例えば自然免疫系による免疫原性応答を実質的に惹起しない。実施形態では、免疫原性応答を、例えば本明細書に記載されるように、定量することができる。一部の実施形態では、自然免疫系による免疫原性応答は、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、マスト細胞、またはガンマ／デルタＴ細胞を含むがこれらに限定されない、自然免疫細胞による応答を含む。一部の実施形態では、自然免疫系による免疫原性応答は、可溶性血液成分と膜結合成分とを含む補体系による応答を含む。
【０４５２】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、免疫系、例えば適応免疫系による免疫原性応答を実質的に惹起しない。実施形態では、免疫原性応答を、例えば本明細書に記載されるように、定量することができる。一部の実施形態では、適応免疫系による免疫原性応答は、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、およびもしくはガンマ−デルタＴ細胞）またはＢリンパ球の数または活性の変化、例えば増加を含むがこれらに限定されない、適応免疫細胞による免疫原性応答を含む。一部の実施形態では、適応免疫系による免疫原性応答は、サイトカインまたは抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ）の数または活性の変化、例えば増加を含むがこれらに限定されない、可溶性血液成分レベルの増加を含む。
【０４５３】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、低下した免疫原性を有するように改変される。免疫原性は、例えば本明細書に記載されるように、定量することができる。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞の免疫原性を５％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％未満下回る免疫原性を有する。
【０４５４】
本明細書に記載の態様のいずれかについての一部の実施形態では、フソソーム組成物は、例えば、本明細書に記載の方法を使用して免疫原性を低下させるように、例えば下げるように改変された、改変ゲノムを有する供給源細胞、例えば哺乳動物細胞に由来する。免疫原性は、例えば本明細書に記載されるように、定量することができる。
【０４５５】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれより多くが枯渇している、例えば、それらがノックアウトしている、哺乳動物細胞に由来する：
ａ．ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩもしくＭＨＡ；
ｂ．ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７−Ｈ３、もしくはＢ７−Ｈ４を含むがこれらに限定されない、１つもしくは複数の共刺激性タンパク質；
ｃ．可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−ガンマもしくはＴＮＦ−ａ；
ｄ．内因性免疫刺激性抗原、例えば、Ｚｇ１６もしくはＨｏｒｍａｄ１；
ｅ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；
ｆ．ＡＢＯ血液型をコードする遺伝子、例えば、ＡＢＯ遺伝子；
ｇ．免疫活性化を駆動する転写因子、例えば、ＮＦｋＢ；
ｈ．ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ  ５の調節因子（ＲＦＸ５）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、もしくはＲＦＸアンキリンリピート（ＲＦＸＡＮＫ；ＲＦＸＢとしても公知）；または
ｉ．ＭＨＣクラスＩ発現を低減させるＴＡＰタンパク質、例えば、ＴＡＰ２、ＴＡＰ１、もしくはＴＡＰＢＰ。
【０４５６】
一部の実施形態では、フソソームは、免疫抑制剤、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つまたはそれより多くの発現増加をもたらす遺伝子改変を有する供給源細胞（例えば、遺伝子改変前にはその因子を発現しない細胞）に由来する：
ａ．マクロファージ貪食を抑制する細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４７；例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＣＤ４７の発現増加；
ｂ．可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０；例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＩＬ−１０の発現増加；
ｃ．可溶性免疫抑制性タンパク質、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはＢＴＬＡ；例えば、参照細胞、例えば、細胞源と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、免疫抑制性タンパク質の発現増加；あるいは
ｄ．寛容原性タンパク質、例えば、ＩＬＴ−２またはＩＬＴ−４アゴニスト、例えば、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇまたは任意の他の内因性ＩＬＴ−２もしくはＩＬＴ−４アゴニスト；例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＬＴ−２またはＩＬＴ−４の発現増加。
一部の実施形態では、発現レベル増加は、参照細胞と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い。
一部の実施形態では、フソソームは、免疫活性化剤、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれより多くについての発現減少を有するように改変された供給源細胞に由来する：
ａ．ＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩについての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｂ．ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７−Ｈ３、またはＢ７−Ｈ４を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の共刺激性タンパク質についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、または本明細書に記載の参照細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｃ．可溶性免疫刺激サイトカイン、例えばＩＦＮ−ガンマまたはＴＮＦ−ａについての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＵ−２６６細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｄ．内因性免疫刺激性抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＡ５４９細胞もしくはＳＫ−ＢＲ−３細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｅ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｆ．ＡＢＯ血液型についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｇ．免疫活性化を駆動する転写因子、例えばＮＦｋＢについての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；
ｈ．ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ  ５の調節因子（ＲＦＸ５）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）またはＲＦＸアンキリンリピート（ＲＦＸＡＮＫ；ＲＦＸＢとしても公知）についての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現；あるいは
ｉ．ＭＨＣクラスＩ発現を低減させるＴＡＰタンパク質、例えば、ＴＡＰ２、ＴＡＰ１またはＴＡＰＢＰについての、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％の、もしくはそれより少ない発現。
【０４５７】
一部の実施形態では、ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスを使用してＭＨＣクラスＩ発現を減少させるように改変された哺乳動物細胞、例えば間葉幹細胞に由来するフソソーム組成物は、未改変細胞、例えば、改変されていない間葉幹細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩのより少ない発現を有する。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｇを発現するレンチウイルスを使用してＨＬＡ−Ｇの発現を増加させるように改変された哺乳動物細胞、例えば間葉幹細胞に由来するフソソーム組成物は、未改変細胞、例えば、改変されていない間葉幹細胞と比較して、ＨＬＡ−Ｇの発現増加を有する。
【０４５８】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に免疫原性でない供給源細胞、例えば哺乳動物細胞に由来し、供給源細胞は、例えば、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイして、０ｐｇ／ｍＬ〜＞０ｐｇ／ｍＬのレベルで、Ｔ細胞ＩＦＮ−ガンマ分泌を刺激する、例えば、誘導する。
【０４５９】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ−ＣＤ３）、またはイムノフィリンモジュレーター（例えば、シクロスポリンもしくはラパマイシン）で処置された細胞培養物からのものである。
【０４６０】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、外因性薬剤、例えば治療剤を含む。
【０４６１】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、組換え細胞である。
【０４６２】
一部の実施形態では、フソソームは、ウイルスイムノエバシン、例えば、ｈＣＭＶ  ＵＳ２、またはＵＳ１１を発現するように遺伝子改変された哺乳動物細胞に由来する。
【０４６３】
一部の実施形態では、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、ポリマー、例えば、免疫原性および免疫介在性クリアランスを低下させる生体適合性ポリマー、例えばＰＥＧで、共有結合的にまたは非共有結合的に改変される。
【０４６４】
一部の実施形態では、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、シアル酸、例えば、ＮＫ抑制性グリカンエピトープを含有する糖重合体を構成するシアル酸で、共有結合的にまたは非共有結合的に改変される。
【０４６５】
一部の実施形態では、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、ＡＢＯ血液型を除去するために、例えば、グリコシダーゼ酵素、例えばα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで、酵素的に処置される。
【０４６６】
一部の実施形態では、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、例えば、レシピエントの血液タイプとマッチするＡＢＯ血液型を生じさせるために、例えば、そのようなＡＢＯ血液型の発現を誘導するために、酵素的に処置される。
免疫原性を評定するためのパラメーター
【０４６７】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に免疫原性でない、または免疫原性の低下を有するように改変された、例えば、本明細書に記載の方法を使用して改変された、供給源細胞、例えば哺乳動物細胞に由来する。供給源細胞およびフソソーム組成物の免疫原性は、本明細書に記載のアッセイのいずれかにより判定することができる。
【０４６８】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植片生着の増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える増加を有する。一部の実施形態では、移植片生着は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｖｏ移植片生存率を測定するアッセイにより判定される。
【０４６９】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、奇形腫形成の増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える増加を有する。一部の実施形態では、奇形腫形成は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載される奇形腫形成を測定するアッセイにより判定される。
【０４７０】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、奇形腫生存期間の増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える増加を有する。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、奇形腫生存期間のアッセイで１日または複数日、生存する。一部の実施形態では、奇形腫生存期間は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載される奇形腫生存期間を測定するアッセイにより判定される。ある実施形態では、奇形腫形成は、実施例で説明されるような、例えば凍結またはホルマリン固定された、固定組織の画像解析、例えば、ＩＨＣ染色、蛍光染色またはＨ＆Ｅにより測定される。一部の実施形態では、固定組織を、次の抗体のいずれか１つまたはすべてで染色することができる：抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ４、または抗ヒトＣＤ８。
【０４７１】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、移植片または奇形腫へのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低減、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有する。一部の実施形態では、ＣＤ８  Ｔ細胞浸潤は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載されるＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば組織学的分析により判定される。一部の実施形態では、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学組織切片の５０倍画像視野の０％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％にＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を有する。
【０４７２】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、移植片または奇形腫へのＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤の低減、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有する。一部の実施形態では、ＣＤ４  Ｔ細胞浸潤は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載されるＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば組織学的分析により判定される。一部の実施形態では、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学組織切片の５０倍画像視野の０％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％にＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を有する。
【０４７３】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、移植片または奇形腫へのＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤の低減、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有する。一部の実施形態では、ＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載されるＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば組織学的分析により判定される。一部の実施形態では、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学組織切片の５０倍画像視野の０％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％にＣＤ３＋ＮＫ  Ｔ細胞浸潤を有する。
【０４７４】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルへの、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞の、１回または複数回の埋込後の液性応答と比較して、適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルへの、得られたフソソームの１回または複数回の埋込後の液性応答の低減によって測定された場合、免疫原性の低下を有する。一部の実施形態では、液性応答の低減は、血清試料において、抗細胞抗体価、例えば抗フソソーム抗体価により、例えばＥＬＩＳＡによって測定される。一部の実施形態では、フソソーム組成物を投与された動物からの血清試料は、未改変細胞を投与された動物からの血清試料と比較して、抗細胞抗体価の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有する。一部の実施形態では、フソソーム組成物を投与された動物からの血清試料は、抗細胞抗体価の増加、例えば、ベースラインからの１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、または４０％増加を有し、例えば、ベースラインは、フソソーム組成物の投与前の同じ動物からの血清試料を指す。
【０４７５】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、マクロファージファゴサイトーシスの低減、例えば、マクロファージファゴサイトーシスの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有し、マクロファージファゴサイトーシスの低減は、例えば実施例８２で説明されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでファゴサイトーシス指数をアッセイすることにより判定される。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、マクロファージファゴサイトーシスのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでマクロファージとともにインキュベートされたとき、例えば、実施例８２のアッセイによって測定された場合に、０、１、１０、１００、またはそれより大きいファゴサイトーシス指数を有する。
【０４７６】
一部の実施形態では、供給源細胞は、例えば、実施例８３のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、または間葉幹細胞と比較して、ＰＢＭＣによる細胞傷害性媒介細胞溶解の低減、例えば、細胞溶解の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有する。実施形態では、供給源細胞は、外因性ＨＬＡ−Ｇを発現する。
【０４７７】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、ＮＫ媒介細胞溶解の低減、例えば、ＮＫ媒介細胞溶解の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有し、ＮＫ媒介細胞溶解は、クロム放出アッセイまたはユーロピウム放出アッセイによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
【０４７８】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞溶解の低減、例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞媒介細胞溶解の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有し、ＣＤ８  Ｔ細胞媒介細胞溶解は、クロム放出アッセイまたはユーロピウム放出アッセイによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。実施形態では、活性化および／または増殖は、実施例８５で説明されるように測定される。
【０４７９】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖および／または活性化の低減、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有し、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖は、例えば実施例８６で説明されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる（例えば、改変または未改変哺乳動物供給源細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズでの共培養アッセイ）。
【０４８０】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、Ｔ細胞ＩＦＮ−ガンマ分泌の低減、例えば、Ｔ細胞ＩＦＮ−ガンマ分泌の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有し、Ｔ細胞ＩＦＮ−ガンマ分泌は、例えばＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
【０４８１】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、免疫原性サイトカインの分泌の低減、例えば、免疫原性サイトカインの分泌の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える低減を有し、免疫原性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
【０４８２】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、免疫抑制性サイトカインの分泌の増加、例えば、免疫抑制性サイトカインの分泌の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える増加をもたらし、免疫抑制性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
【０４８３】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現の増加、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える発現の増加を有し、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、例えば未改変細胞と比較して、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現の増加、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える発現の増加を有するように改変されている、供給源細胞に由来し、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｇ発現の増加を有する改変細胞に由来するフソソーム組成物は、奇形種形成アッセイ、例えば、本明細書に記載される奇形種形成アッセイにおいて、例えば免疫細胞浸潤の低減によって測定された場合、免疫原性の低下を実証する。
【０４８４】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、Ｔ細胞阻害剤リガンド（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１）の発現の増加、例えば、Ｔ細胞阻害剤リガンドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える発現の増加を有し、Ｔ細胞阻害剤リガンドの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
【０４８５】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞と比較して、共刺激性リガンドの発現の減少、例えば、共刺激性リガンドの発現の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える減少を有し、共刺激性リガンドの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
【０４８６】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の点では同様の未改変細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現の減少、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える発現の減少を有し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
【０４８７】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性である、細胞源、例えば、哺乳動物細胞源に由来する。一部の実施形態では、免疫原性を、例えば本明細書に記載されるように、定量することができる。一部の実施形態では、哺乳動物細胞源は、以下の特徴のいずれか１つ、すべてまたは組合せを含む：
ａ．供給源細胞が、自家細胞源から得られる；例えば、フソソーム組成物を受けることになる、例えば投与されることになる、レシピエントから得られる細胞；
ｂ．供給源細胞が、レシピエント、例えば、フソソーム組成物を受けることになる、例えば投与されることになる、レシピエントとマッチした性別、例えば同様の性別のものである同種細胞源から得られる；フソソーム組成物；
ｃ．供給源細胞が、レシピエントのＨＬＡと例えば１つまたは複数の対立遺伝子がマッチしたＨＬＡである同種細胞源から得られる；
ｄ．供給源細胞が、ＨＬＡホモ接合体である同種細胞源から得られる；
ｅ．供給源細胞が、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを欠いている（もしくは参照細胞と比較してレベル低下を有する）同種細胞源から得られる；または
ｆ．供給源細胞が、幹細胞、間葉幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、もしくは網膜色素上皮細胞を含むがこれらに限定されない、実質的に非免疫原性であることが公知である細胞源から得られる。
【０４８８】
一部の実施形態では、フソソーム組成物を投与されることになる対象は、フソソームと反応する既存抗体（例えば、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）を有するか、そのような既存抗体を有することが既知であるか、またはそのような既存抗体について試験される。一部の実施形態では、フソソーム組成物を投与されることになる対象は、フソソームと反応する、検出可能なレベルの既存抗体を有さない。抗体の試験は、例えば実施例７８で、説明される。
【０４８９】
一部の実施形態では、フソソーム組成物を受けたことがある対象は、フソソームと反応する抗体（例えば、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）を有するか、そのような抗体を有することが既知であるか、またはそのような抗体について試験される。一部の実施形態では、フソソーム組成物を（例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、またはそれより多い回数）受けた対象は、フソソームと反応する、検出可能なレベルの抗体を有さない。実施形態では、抗体のレベルは、第１の時点がフソソームの初回投与の前であり、第２の時点がフソソームの１回または複数回の投与後である、２時点間で、１％、２％、５％、１０％、２０％または５０％より大きく上昇しない。抗体の試験は、例えば実施例７９で、説明される。
追加の治療剤
【０４９０】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、対象、例えば、レシピエント、例えば本明細書に記載のレシピエントに、追加の薬剤、例えば治療剤と、併用投与される。一部の実施形態では、併用投与される治療剤は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ−ＣＤ３）、またはイムノフィリンモジュレーター（例えば、シクロスポリンもしくはラパマイシン）である。実施形態では、免疫抑制剤は、フソソームの免疫介在性クリアランスを減少させる。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、免疫刺激剤、例えばアジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと、併用投与される。
【０４９１】
一部の実施形態では、フソソーム組成物および免疫抑制剤は、同時に投与される、例えば、同期間内に投与される。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、免疫抑制剤の投与の前に投与される。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、免疫抑制剤の投与の後に投与される。
【０４９２】
一部の実施形態では、免疫抑制剤は、小分子、例えば、イブプロフェン、アセトアミノフェン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸塩、シクロホスファミド、グルココルチコイド、シロリムス、アザチオプリン、またはメトトレキサートである。
【０４９３】
一部の実施形態では、免疫抑制剤は、ムロモナブ（ｍｕｒｏｎｏｍａｂ）（抗ＣＤ３）、ダクリズマブ（抗ＩＬ１２）、バシリキシマブ、インフリキシマブ（抗ＴＮＦａ）、またはリツキシマブ（抗ＣＤ２０）を含むがこれらに限定されない、抗体分子である。
【０４９４】
一部の実施形態では、フソソーム組成物と免疫抑制剤の併用投与は、単独でのフソソーム組成物の投与と比較して対象におけるフソソーム組成物の持続性を向上させる結果となる。一部の実施形態では、併用投与で向上されるフソソーム組成物の持続性は、単独で投与されたときのフソソーム組成物の持続性と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより長い。一部の実施形態では、併用投与で向上されるフソソーム組成物の持続性は、単独で投与されたときのフソソーム組成物の残存と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５もしくは３０日、またはそれより長い。
送達
【０４９５】
一部の実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質もしくは化学的フソゲン）またはフソゲン結合パートナーは、フソソームの送達前に、送達と同時に、または送達後に、標的細胞または組織に送達される。
【０４９６】
一部の実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質もしくは化学的フソゲン）またはフソゲン結合パートナーは、フソソームの送達前に、送達と同時に、または送達後に、非標的細胞または組織に送達される。
【０４９７】
一部の実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質もしくは脂質フソゲン）またはフソゲン結合パートナーをコードする核酸は、フソソームの送達前に、送達と同時に、または送達後に、標的細胞または組織に送達される。
【０４９８】
一部の実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質もしくは化学的フソゲン）またはフソゲン結合パートナーの発現を上方調節または下方調節する、ポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質または小分子は、フソソームの送達前に、送達と同時に、または送達後に、標的細胞または組織に送達される。
【０４９９】
一部の実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質もしくは化学的フソゲン）またはフソゲン結合パートナーの発現を上方調節または下方調節する、ポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質または小分子は、フソソームの送達前に、送達と同時に、または送達後に、非標的細胞または組織に送達される。
【０５００】
一部の実施形態では、標的細胞または組織は、フソソームの送達前に、送達と同時に、または送達後に、融合の速度を上昇させるように（例えば、ストレスまたは細胞分裂を誘導することにより）改変される。一部の非限定的な例としては、虚血を誘導すること、化学療法、抗生物質、照射、毒素、炎症、炎症性分子、抗炎症性分子、酸傷害、塩基傷害、熱傷、ポリエチレングリコール、神経伝達物質、骨髄毒性の薬物、増殖因子、もしくはホルモンでの処置、組織切除、飢餓、および／または運動が挙げられる。
【０５０１】
一部の実施形態では、標的細胞または組織は、標的組織へのフソソーム輸送の速度を上昇させるために血管拡張薬（例えば、一酸化窒素（ＮＯ）、一酸化炭素、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、ニトログリセリン、フェントラミン）または血管収縮薬（例えば、アンジオテンシン（ＡＧＴ）、エンドセリン（ＥＤＮ）、ノルエピネフリン）で処置される。
【０５０２】
一部の実施形態では、標的細胞または組織は、化学剤、例えば、化学療法薬で処置される。そのような実施形態では、化学療法薬は、標的細胞または組織の膜融合活性を増強する、標的細胞または組織への損傷を誘導する。
【０５０３】
一部の実施形態では、標的細胞または組織は、物理的ストレス、例えば、電気融合を用いて処置される。そのような実施形態では、物理的ストレスは、標的細胞または組織の膜を不安定化して、標的細胞または組織の膜融合活性を増強する。
【０５０４】
一部の実施形態では、標的細胞または組織を、フソソームとの融合を増進させるための薬剤で処置することができる。例えば、特定のニューロン受容体を抗うつ薬で刺激して、膜融合特性を増強することができる。
【０５０５】
本明細書に記載のフソソームを含む組成物を、循環系、肝臓系、腎臓系、心肺系、中枢神経系、末梢神経系、筋骨格系、リンパ系、免疫系、感覚神経系（視覚、聴覚、嗅覚、触覚、味覚）、消化器系、内分泌系（脂肪組織代謝調節を含む）、および生殖器系に投与または標的化することができる。
【０５０６】
実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、ｅｘ−ｖｉｖｏで細胞または組織、例えば、ヒト細胞または組織に送達される。一部の実施形態では、組成物は、傷害状態（例えば、外傷、疾患、低酸素、虚血または他の損傷のために）であるｅｘ  ｖｉｖｏ組織に送達される。
【０５０７】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、ｅｘ−ｖｉｖｏ移植物（例えば、組織外植片もしくは移植用組織、例えば、ヒト静脈、筋骨格移植片、例えば骨もしくは腱、角膜、皮膚、心臓弁、神経；または単離もしくは培養された臓器、例えば、ヒトに移植される臓器、例えば、ヒト心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、胸腺、眼）に送達される。組成物は、移植物の生存能、呼吸または他の機能を改善する。組成物を組織または臓器に、移植前、移植中および／または移植後に送達することができる。
【０５０８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、対象に由来する細胞または組織にｅｘ−ｖｉｖｏで送達される。一部の実施形態では、細胞または組織は、対象に再投与される（すなわち、細胞または組織は自家である）。
【０５０９】
フソソームは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）組織からの、例えば、上皮、結合、筋肉または神経組織または細胞、およびこれらの組合せからの、細胞と融合することができる。フソソームは、例えば、心血管系（心臓、血管系）；消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸および肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排泄系（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃、咽頭扁桃、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、毛髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）’；生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）、ならびにこれらの組合せからの、任意の真核生物（例えば、哺乳動物）臓器系に送達することができる。
【０５１０】
実施形態では、フソソームは、対象に投与されると、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、脂肪組織（例えば、褐色脂肪組織もしくは白色脂肪組織）または眼を標的とし、例えば、投与されたフソソーム集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、例えば実施例８７または１００のアッセイにより、２４、４８または７２時間後に標的組織に存在する。
【０５１１】
実施形態では、フソソームは、幹細胞または始原細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成体始原細胞（ＭＡＰＣ）、内皮始原細胞（ＥＰＣ）、芽細胞、脳室下帯において形成される中間始原細胞、神経幹細胞、筋幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚性幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、前駆体細胞、筋前駆体細胞、筋芽細胞、心筋芽細胞、神経前駆体細胞、膠前駆体細胞、ニューロン前駆体細胞、肝芽細胞の供給源からの細胞と融合することができる。
例えばランディングパッド実施形態のための、フソゲン結合パートナー
【０５１２】
ある特定の態様では、本開示は、対象における標的細胞にフソソームを送達する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、フソゲン、例えばミオメーカータンパク質をコードする核酸を含むフソソームを対象に投与するステップを含み、核酸は、細胞内に存在しないか、または細胞内に、対象におけるフソソームの表面でのフソゲンの発現を可能にする条件下で、発現されない（例えば、存在するが、転写も翻訳もされない）。一部の実施形態では、方法は、薬剤、例えば治療剤と、フソゲン結合パートナーと、必要に応じて担体、例えば膜とを含む組成物を、フソソーム上のフソゲンとフソゲン結合パートナーとの融合を可能にする条件下で、対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、担体は、膜、例えば脂質二重層を含み、例えば、薬剤は、脂質二重層内に配置される。一部の実施形態では、脂質二重層は、標的細胞と融合し、それによって薬剤を対象における標的細胞に送達する。
【０５１３】
一部の実施形態では、フソゲン結合パートナーは、標的細胞、例えば本明細書で開示される標的細胞の膜（例えば、脂質二重層）内に配置された部分、例えばタンパク質分子である。一部の実施形態では、膜は、細胞表面膜であることもあり、またはオルガネラ、例えばミトコンドリア、リソソームもしくはゴルジ体の細胞内膜であることもある。一部の実施形態では、フソゲン結合パートナーを、内因性発現、過剰発現、または外因性発現させることができる（例えば、本明細書に記載の方法により）。一部の実施形態では、フソゲン結合パートナーは、膜において他のフソゲン結合パートナーとクラスターを形成することができる。
【０５１４】
一部の実施形態では、標的細胞の膜におけるフソゲン結合パートナーまたは複数のフソゲン結合パートナーの存在は、標的細胞（例えば、本明細書に記載の細胞）上のフソゲン結合パートナーとフソソーム（例えば、本明細書に記載のフソソーム）上のフソゲンとの相互作用、例えば結合を容易にし得る界面を生じさせる。一部の実施形態では、フソソーム上のフソゲンは、標的細胞上の、例えば、標的細胞の膜（例えば、脂質二重層）上の、フソゲン結合パートナーと相互作用して、例えば結合して、フソソームと標的膜の融合を誘導する。一部の実施形態では、フソゲンは、ミトコンドリアをはじめとする細胞内オルガネラ上のランディングパッド上のフソゲン結合パートナーと相互作用して、例えば結合して、フソソームと細胞内オルガネラの融合を誘導する。
【０５１５】
フソゲン結合パートナーを標的細胞、例えば、本明細書で開示される標的細胞内に、下で論じる方法のいずれかにより導入することができる。
【０５１６】
一部の実施形態では、フソゲン結合パートナーを標的細胞に導入する方法は、対象（例えば、本明細書に記載の対象）からの標的細胞の（例えば、アフェレーシスまたは生検による）除去、例えば抽出、および標的細胞の膜上でのフソゲン結合パートナーの発現を可能にする条件下でのフソゲン結合パートナーの投与、例えば、フソゲン結合パートナーへの曝露を含む。一部の実施形態では、方法は、フソソームと標的細胞膜の融合を誘導するために、ｅｘ  ｖｉｖｏでフソゲン結合パートナーを発現する標的細胞とフソゲンを含むフソソームとを接触させるステップを含む。一部の実施形態では、フソソームに融合した標的細胞は、対象に、例えば静脈内に、再導入される。
【０５１７】
一部の実施形態では、フソソーム結合パートナーを発現する標的細胞は、対象に、例えば静脈内に、再導入される。一部の実施形態では、方法は、フソソーム上のフソゲンと標的細胞上のフソゲン結合パートナーの相互作用、例えば結合、およびフソソームと標的細胞膜の融合を可能にするために、フソゲンを含むフソソームを対象に投与するステップを含む。
【０５１８】
一部の実施形態では、標的細胞は、内因性細胞表面分子（例えば、一部の実施形態では、標的細胞に対して内因性）、例えば、フソゲン結合パートナー、例えば、臓器、組織または細胞標的化分子の発現を増加または減少させるようにエピジェネティック改変因子、例えば小分子エピジェネティック改変因子で処置され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質または低分子量分子である。一部の実施形態では、標的細胞は、内因性細胞表面分子、例えば、フソゲン結合パートナー、例えば、臓器、組織または細胞標的化分子の発現を増加させるように遺伝子改変され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質または低分子量分子である。一部の実施形態では、遺伝子改変は、内因性細胞表面分子、例えばフソゲン結合パートナーの転写活性化因子の発現を減少させることができる。
【０５１９】
一部の実施形態では、標的細胞は、外因性細胞表面分子、例えばフソゲン結合パートナーを発現するように、例えば、過剰発現するように、遺伝子改変され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質または低分子量分子である。
【０５２０】
一部の実施形態では、標的細胞は、細胞における外因性フソゲンの発現を増加させるように、例えば導入遺伝子の送達を増加させるように、遺伝子改変される。一部の実施形態では、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、標的細胞に、例えば、細胞表面分子（タンパク質、グリカン、脂質または低分子量分子）の発現を増加または減少させるために移入される。一部の実施形態では、核酸は、フソゲン結合パートナー、例えばｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ構築物のリプレッサーを標的とする。一部の実施形態では、核酸は、フソゲン結合パートナーリプレッサーの阻害剤をコードする。
使用方法
【０５２１】
本明細書に記載の医薬組成物の投与は、経口投与、吸入投与、経皮投与または非経口投与（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、腔内および皮下投与を含む）による投与であり得る。フソソームを単独で投与することができ、または医薬組成物として製剤化することができる。
【０５２２】
フソソームを、単位用量経口、非経口、経皮または吸入組成物などの、単位用量組成物の形態で投与することができる。そのような組成物は、混合により調製され、経口、吸入、経皮または非経口投与に適切に適応され、したがって、錠剤、カプセル、経口液体調製物、粉末、顆粒、トローチ剤、再構成可能な粉末、注射用および注入用溶液もしくは懸濁液または座剤またはエアロゾルの形態であり得る。
【０５２３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物による膜タンパク質ペイロード剤の送達は、細胞分化、脱分化または分化転換を誘導することもあり、または阻止することもある。標的哺乳動物細胞は、前駆体細胞であり得る。あるいは、標的哺乳動物細胞は、分化細胞であり得、細胞運命変更は、多能性前駆体細胞への脱分化の推進、またはそのような脱分化の阻止を含む。細胞運命の変化が所望される状況では、細胞運命誘導分子またはシグナルをコードする本明細書に記載のフソソームの有効量が、標的細胞に、細胞運命の変更が誘導されるような条件下で導入される。一部の実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、細胞の部分集団の第１の表現型から第２の表現型への再プログラミングに有用である。そのような再プログラミングは、一時的であることもあり、または永続的であることもある。必要に応じて、再プログラミングは、中間表現型をとるように標的細胞を誘導する。
【０５２４】
標的細胞集団において細胞分化を低減させる方法も提供される。例えば、１つまたは複数の前駆体細胞型を含有する標的細胞集団と本明細書に記載のフソソーム組成物とを、組成物が前駆体細胞の分化を低減させるような条件下で接触させる。ある特定の実施形態では、標的細胞集団は、哺乳動物対象の傷害組織または外科手技による影響を受けた組織を含有する。前駆体細胞は、例えば、間質前駆体細胞、神経前駆体細胞、または間葉前駆体細胞である。
【０５２５】
膜タンパク質ペイロード剤を含む、本明細書に記載のフソソーム組成物を使用して、そのような薬剤を細胞組織または対象に送達することができる。本明細書に記載のフソソーム組成物の投与による膜タンパク質ペイロード剤の送達は、細胞タンパク質発現レベルを改変することができる。ある特定の実施形態では、投与は、膜タンパク質ペイロード剤が送達される細胞に実質的に非存在であるまたはそのような細胞において低減されている機能活性を供給する１つまたは複数の膜タンパク質ペイロード剤（例えば、ポリペプチドまたは核酸）の（細胞における発現、細胞における送達、または細胞内における誘導による）上方調節を導く。例えば、欠けている機能活性は、実際は、酵素活性、構造活性、シグナル伝達活性または調節活性であり得る。関連実施形態では、投与された組成物は、膜タンパク質ペイロード剤が上方調節される細胞に存在するが実質的に不十分である機能活性を（例えば相乗的に）増大させる１つまたは複数の膜タンパク質ペイロード剤の上方調節を導く。関連実施形態では、投与された組成物は、ポリペプチドが下方調節される細胞に存在するまたはそのような細胞において上方調節されている機能活性を（例えば相乗的に）低下させる１つまたは複数のポリペプチドの下方調節を導く。ある特定の実施形態では、投与された組成物は、ある特定の機能活性の上方調節、および他の機能活性の下方調節を導く。
【０５２６】
実施形態では、フソソーム組成物は、標的細胞に対する効果を媒介し、効果は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７日間、２、３もしくは４週間、または１、２、３、６もしくは１２ヶ月間続く。一部の実施形態（例えば、フソソーム組成物が外因性タンパク質を含む）では、効果は、１、２、３、４、５、６もしくは７日、２、３もしくは４週、または１、２、３、６もしくは１２ヶ月未満の間、続く。
ｅｘ−ｖｉｖｏ利用
【０５２７】
実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、ｅｘ−ｖｉｖｏで細胞または組織、例えば、ヒト細胞または組織に送達される。実施形態では、組成物は、ｅｘ−ｖｉｖｏで細胞または組織の機能を改善し、例えば、細胞生存率、シグナル伝達、呼吸、または他の機能（例えば、本明細書に記載の別の機能）を改善する。
【０５２８】
一部の実施形態では、組成物は、傷害状態（例えば、外傷、疾患、低酸素、虚血または他の損傷のために）であるｅｘ  ｖｉｖｏ組織に送達される。
【０５２９】
一部の実施形態では、組成物は、ｅｘ−ｖｉｖｏ移植物（例えば、組織外植片もしくは移植用組織、例えば、ヒト静脈、筋骨格移植片、例えば骨もしくは腱、角膜、皮膚、心臓弁、神経；または単離もしくは培養された臓器、例えば、ヒトに移植される臓器、例えば、ヒト心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、胸腺、眼）に送達される。組成物を組織または臓器に、移植前、移植中および／または移植後に送達することができる。
【０５３０】
一部の実施形態では、組成物は、細胞、例えば細胞調製物とともに送達される、投与される、または細胞、例えば細胞調製物と接触させられる。細胞調製物は、細胞治療用調製物（ヒト対象への投与を目的とする細胞調製物）であり得る。実施形態では、細胞調製物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞、例えば、組換えＣＡＲを発現する細胞を含む。ＣＡＲを発現する細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞であり得る。実施形態では、細胞調製物は、神経幹細胞調製物である。実施形態では、細胞調製物は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）調製物である。実施形態では、細胞調製物は、造血幹細胞（ＨＳＣ）調製物である。実施形態では、細胞調製物は、島細胞調製物である。
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用
【０５３１】
本明細書に記載のフソソーム組成物を対象、例えば、哺乳動物、例えばヒトに投与することができる。そのような実施形態では、対象は、特定の疾患もしくは状態（例えば、本明細書に記載の疾患もしくは状態）のリスクがあることもあり、そのような疾患もしくは状態の症状を有することもあり、またはそのような疾患もしくは状態であると診断される、またはそのような疾患もしくは状態に罹患していると特定されることもある。一実施形態では、対象は、がんに罹患している。一実施形態では、対象は、感染性疾患に罹患している。
【０５３２】
一部の実施形態では、フソソームの供給源は、フソソーム組成物を投与される同じ対象からのものである。他の実施形態では、それらは異なる。例えば、フソソームの供給源およびレシピエント組織は、自家（同じ対象からのもの）であることもあり、または異種（異なる対象からのもの）であることもある。いずれにせよ、本明細書に記載のフソソーム組成物のドナー組織は、レシピエント組織とは異なる組織型であり得る。例えば、ドナー組織は、筋肉組織であり得、レシピエント組織は、結合組織（例えば、脂肪組織）であり得る。他の実施形態では、ドナー組織およびレシピエント組織は、同じまたは異なる型の、しかし異なる臓器系からのものであり得る。
【０５３３】
本明細書に記載のフソソーム組成物を、がん、自己免疫疾患、感染性疾患、代謝疾患、神経変性疾患、または遺伝性疾患（例えば、酵素欠損症）に罹患している対象に投与することができる。一部の実施形態では、対象の組織は、再生を必要としている。
【０５３４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物の治療有効量が対象に投与される。一部の実施形態では、物質の治療有効量は、疾患、障害および／もしくは状態に罹患している対象、または疾患、障害および／もしくは状態に罹患しやすい対象に投与されたとき、疾患、障害および／もしくは状態を処置するのにならびに／または疾患、障害および／もしくは状態の開始を遅らせるのに十分である量である。例えば、実施形態では、疾患、障害および／または状態を処置するための製剤中のフソソームの有効量は、疾患、障害および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは特徴を、軽減する、改善する、緩和する、抑制する、そのような症状もしくは特徴の、開始を遅らせる、重症度を低下させる、ならびに／または発生率を低下させる量である。
【０５３５】
一部の実施形態では、対象は、フソソーム組成物で処置される。一部の実施形態では、処置は、特定の疾患、障害および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状、特徴および／もしくは原因を、部分的にもしくは完全に軽減する、部分的にもしくは完全に改善する、部分的にもしくは完全に緩和する、部分的にもしくは完全に抑制する、そのような症状、特徴および／もしくは原因の、開始を部分的にもしくは完全に遅らせる、重症度を部分的にもしくは完全に低下させる、ならびに／または発生率を部分的にもしくは完全に低下させる。一部の実施形態では、処置は、関連疾患、障害および／または状態を患っていると診断された対象の処置であり得る。一部の実施形態では、処置は、関連疾患、障害および／または状態を発症するリスク増加と統計的に相関する１つまたは複数の易罹患性因子を有することが分かっている対象の処置であり得る。一部の実施形態では、処置は、関連疾患、障害および／または状態の根本的原因を部分的にまたは完全に改善する。
【０５３６】
一部の実施形態では、フソソーム組成物は、疾患、例えばがんを処置するのに有効である。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、対象におけるがん細胞の数を、投与前の対象におけるがん細胞の数と比較して低減させるのに有効である。一部の実施形態では、フソソーム組成物は、処置なしで予想される疾患経過と比較して対象におけるがん細胞の数を低減させるのに有効である。一部の実施形態では、対象は、フソソーム組成物の投与後に、完全奏効または部分奏効を経験する。
【０５３７】
一部の実施形態では、フソソームは、膜融合を阻害するタンパク質の阻害剤と併用投与される。例えば、サプレシンは、細胞間融合を阻害するヒトタンパク質である（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ”  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：１４６２  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｓｒｅｐ０１４６２）。したがって、一部の実施形態では、フソソームは、サプレシン（ｓｙｐｒｅｓｓｙｎ）の阻害剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたは阻害性抗体と併用投与される。
非ヒトでの利用
【０５３８】
本明細書に記載の組成物を使用して、家畜もしくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）、ペットまたは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、トリ、ライオン、トラおよびクマなど）、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）、植物種（木、作物、観葉植物、花など）、発酵種（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなど）を含むがこれらに限定されない、様々な他の生物の細胞もしくは組織機能または生理機能を同様にモジュレ−とすることもできる。本明細書に記載のフソソーム組成物をそのような非ヒト供給源から作製し、非ヒト標的細胞または組織または対象に投与することができる。
【０５３９】
フソソーム組成物は、標的にとって自家であることもあり、同種であることもあり、またはゼノジェニックであることもある。
【０５４０】
本明細書に引用されるすべての参考文献および公表文献は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【０５４１】
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない；それらが例示的な性質のものであることから、当業者には公知である他の手順、方法論または技法を代わりに使用することができることは、理解されるであろう。
【実施例】
【０５４２】
（実施例１）
化学的処置（ＰＥＧ）による除核膜融合性細胞の生成
Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄ（ミトコンドリア特異的な標的化された色素）発現ドナーＨｅＬａ細胞を０．２５％トリプシンでトリプシン処理し、収集し、５分間５００×ｇで回転させ、ＰＢＳで１回洗浄し、計数した。その後、１０×１０６個の細胞を、１０ｕｇ／ｍＬのサイトカラシン−Ｂを補充した完全ＭＥＭ−アルファ（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）中の１２．５％フィコール３ｍｌに、１５分間、再懸濁させた。細胞を除核するために、それらの細胞を、（最高から最低へ）２ｍＬの１２．５％フィコール画分、０．５ｍＬの１５％フィコール画分、０．５ｍＬの１６％フィコール画分、２ｍＬの１７％フィコール勾配画分、２ｍＬの２５％フィコール画分からなる、不連続フィコール勾配液に移した。すべてのフィコール勾配画分を、１０ｕｇ／ｍＬのサイトカラシン−Ｂを補充した完全ＤＭＥＭ中で作製した。勾配液を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ−４０超遠心分離機、Ｔｉ−７０ローターを用いて１０７９７１×ｇで１時間、３７℃で回転させた。遠心分離後、除核ＨｅＬａ細胞を１２．５％フィコール画分と、１５％フィコール画分と、１６％フィコール画分と、１７％フィコール画分の１／２とから収集し、完全ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）に再懸濁させ、５００×ｇで５分間回転させてペレット化した。除核Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄドナー細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。同時に、Ｍｉｔｏ−ＧＦＰ（ミトコンドリア特異的な標的化された色素）発現レシピエントＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、計数し、融合用に調製した。
【０５４３】
融合のために、５０％ポリエチレングリコール溶液（１０％ＤＭＳＯを含有する完全なＤＭＥＭで調製したｗ／ｖで５０％のＰＥＧ）中で１分間、３７℃で、除核Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄドナーＨｅＬａ細胞とＭｉｔｏ−ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞を１：１比（各々２００，０００個）で合わせた。その後、細胞を１０ｍＬの完全ＤＭＥＭで３回洗浄し、３５ｍｍガラス底四分円形イメージングディッシュに５０ｋ細胞／四分円の密度で播種し、各四分円は、１．９ｃｍ２の面積を有した。
（実施例２）
化学的処置（ＰＥＧ）による有核膜融合性細胞の生成
【０５４４】
Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄ（ミトコンドリア特異的な標的化された色素）発現ドナーＨｅＬａ細胞を０．２５％トリプシンでトリプシン処理し、収集し、５分間５００×ｇで回転させ、ＰＢＳで１回洗浄し、計数した。その後、２×１０６個の細胞を完全ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）に再懸濁させ、計数し、融合用に調製した。
【０５４５】
Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄドナー細胞をＤＭＥＭで３回洗浄した。同時に、Ｍｉｔｏ−ＧＦＰ（ミトコンドリア特異的な標的化された色素）発現レシピエントＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、計数し、融合用に調製した。
【０５４６】
融合のために、５０％ポリエチレングリコール溶液（１０％ＤＭＳＯを含有する完全ＤＭＥＭで調製したｗ／ｖで５０％のＰＥＧ）中で１分間、３７℃で、Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄドナーＨｅＬａ細胞とＭｉｔｏ−ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞を１：１比（各々２００，０００個）で合わせた。その後、細胞を１０ｍｌの完全ＤＭＥＭで３回洗浄し、３５ｍｍガラス底四分円形イメージングディッシュに５０ｋ細胞／四分円の密度で播種し、各四分円は、１．９ｃｍ２の面積を有した。
（実施例３）
外因性フソゲンを発現するＨｅＬａ細胞の作出
【０５４７】
この実施例は、外因性フソゲンを発現する組織培養細胞の作出を説明する。以下の実施例は、タンパク質に基づく任意のフソゲンに同等に適用可能であり、初代細胞（懸濁状態のまたは接着性の）および組織における産生に同等に適用可能である。ある特定の場合には、融合を誘導するために（フソゲンおよびフソゲン結合パートナーとして詳しく説明する）フソゲンペアを使用することができる。
【０５４８】
フソゲン遺伝子、融合不全１（ＥＦＦ−１）をｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、次いで、この構築物を、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ−２（商標）、ＡＴＣＣ）にトランスフェクトする。フソゲン結合パートナー遺伝子、アンカー−細胞融合不全１（ＡＦＦ−１）をｐＩＲＥＳ２  ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、次いで、この構築物を、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ−２（商標）、ＡＴＣＣ）にトランスフェクトする。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）と１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）と５００ｍｇ／ｍＬのゼオシンとを補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２で保持する。ＥＦＦ−１発現細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）での選別により単離して、ＥＦＦ−１フソゲンを発現するＧＦＰ＋Ｈｅｌａ細胞の純粋な集団を得る。ＡＦＦ−１発現細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）での選別により単離して、ＡＦＦ−１フソゲン結合パートナーを発現するＤＳＲＥＤ＋Ｈｅｌａ細胞の純粋な集団を得る。
（実施例４）
化学的に増強された膜融合性除核細胞によるオルガネラ送達
【０５４９】
実施例１で説明したように産生し、融合させた、膜融合性細胞（Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄドナー除核細胞およびＭｉｔｏ−ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞）を、イメージングディッシュに堆積させてから２４時間後に、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０倒立共焦点顕微鏡を用いて倍率６３倍でイメージングした。単独でのＭｉｔｏ−ＤｓＲｅｄおよび単独でのＭｉｔｏ−ＧＦＰを専ら発現する細胞を別途イメージングして、Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄとＭｉｔｏ−ＧＦＰ両方が同時に両方とも存在し、それら両方を同時に両方とも取得する条件で２つのチャネル間にシグナルオーバーラップがないことを確実にするように取得設定を構成した。最低１００個の細胞が下流の解析に利用可能であるために最低１０個の細胞が各ＲＯＩ内に含まれることを唯一の基準として、完全に偏りのないよう１０の関心領域を選択した。これらの画像内の所与の画素は、どちらかのチャネル（ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ−ＧＦＰ）についてのその強度が、３つのＲＯＩすべてにわたってそれぞれのチャネル各々について最大強度値の１０％より大きかった場合、ミトコンドリアについて陽性であると判定した。
【０５５０】
細胞内のミトコンドリアの（ｍｉｔｏ−ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ−Ｄｓ−Ｒｅｄ＋のどちらかであるすべての画素により同定して）＞５０％が、上に示した閾値に基づきｍｉｔｏＤｓ−Ｒｅｄとｍｉｔｏ−ＧＦＰの両方について陽性であるという、これらのタンパク質を含有するオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が送達され、融合し、それらの内容物が混ざり合ったことを示す基準に基づいて、オルガネラ送達に伴う融合イベントを同定した。２４時間の時点で、複数の細胞は、図７に示されているように融合による明確なオルガネラ送達を示した。これは、ドナー細胞とレシピエントＨｅＬａ細胞との融合による明確なオルガネラ送達の画像である。白色で示されている細胞内エリアは、ドナーミトコンドリアとレシピエントミトコンドリアとのオーバーラップを示す。灰色の細胞内領域は、ドナーオルガネラとレシピエントオルガネラがオーバーラップしない場所を示す。
（実施例５）
化学的に増強された膜融合性有核細胞によるオルガネラ送達
【０５５１】
実施例２で説明したように産生し、組み合わせた、膜融合性細胞（Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄドナー細胞およびＭｉｔｏ−ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞）を、イメージングディッシュに堆積させてから２４時間後に、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０倒立共焦点顕微鏡を用いて倍率６３倍でイメージングした。単独でのＭｉｔｏ−ＤｓＲｅｄおよび単独でのＭｉｔｏ−ＧＦＰを専ら発現する細胞を別途イメージングして、Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄとＭｉｔｏ−ＧＦＰ両方が同時に両方とも存在し、それら両方を同時に両方とも取得する条件で２つのチャネル間にシグナルオーバーラップがないことを確実にするように取得設定を構成した。最低１００個の細胞が下流の解析に利用可能であるために最低１０個の細胞が各ＲＯＩ内に含まれることを唯一の基準として、完全に偏りのないように１０の関心領域を選択した。これらの画像内の所与の画素は、どちらかのチャネル（ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ−ＧＦＰ）についてのその強度が、３つのＲＯＩすべてにわたってそれぞれのチャネル各々について最大強度値の２０％より大きかった場合、ミトコンドリアについて陽性であると判定した。
【０５５２】
細胞内のミトコンドリアの（ｍｉｔｏ−ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ−Ｄｓ−Ｒｅｄ＋のどちらかであるすべての画素により同定して）＞５０％が、上に示した閾値に基づきｍｉｔｏＤｓ−Ｒｅｄとｍｉｔｏ−ＧＦＰの両方について陽性であるという、これらのタンパク質を含有するオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が送達され、融合し、それらの内容物が混ざり合ったことを示す基準に基づいて、オルガネラ送達に伴う融合イベントを同定した。２４時間の時点で、複数の細胞は、図８に示されているように融合による明確なオルガネラ送達を示した。これは、ドナー細胞とレシピエントＨｅＬａ細胞との融合による明確なオルガネラ送達の画像である。白色で示されている細胞内エリアは、ドナーミトコンドリアとレシピエントミトコンドリアとのオーバーラップを示す。灰色の細胞内領域は、ドナーオルガネラとレシピエントオルガネラがオーバーラップしない場所を示す。
（実施例６）
タンパク質増強膜融合性除核細胞によるミトコンドリアの送達
【０５５３】
実施例３で説明したように産生し、組み合わせた膜融合性細胞を、イメージングディッシュに堆積させてから２４時間後に、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０倒立共焦点顕微鏡を用いて倍率６３倍でイメージングする。単独でのＭｉｔｏ−ＤｓＲｅｄおよび単独でのＭｉｔｏ−ＧＦＰを専ら発現する細胞を別途イメージングして、Ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄとＭｉｔｏ−ＧＦＰ両方が同時に両方とも存在し、それら両方を同時に両方とも取得する条件で２つのチャネル間にシグナルオーバーラップがないことを確実にするように取得設定を構成する。最低限の数の細胞が下流の解析に利用可能であるために最低１０個の細胞が各ＲＯＩ内に含まれることを唯一の基準として、完全に偏りのないように１０の関心領域を選択する。これらの画像内の所与の画素は、どちらかのチャネル（ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ−ＧＦＰ）についてのその強度が、３つのＲＯＩすべてにわたってそれぞれのチャネル各々について最大強度値の１０％より大きかった場合、ミトコンドリアについて陽性であると判定する。
【０５５４】
細胞内のミトコンドリアの（ｍｉｔｏ−ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ−Ｄｓ−Ｒｅｄ＋のどちらかであるすべての画素により同定して）＞５０％が、上に示した閾値に基づきｍｉｔｏＤｓ−Ｒｅｄとｍｉｔｏ−ＧＦＰの両方について陽性であるという、これらのタンパク質を含有するオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が送達され、融合し、それらの内容物が混ざり合ったことを示すことになる基準に基づいて、オルガネラ送達に伴う融合イベントを同定することになる。２４時間の時点で、複数の細胞は、融合による明確なオルガネラ送達を示すと予想される。
（実施例７）
核酸電気穿孔によるフソソームの生成
【０５５５】
この実施例は、フソゲンをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）での細胞または小胞の電気穿孔によるフソソーム生成を説明する。
【０５５６】
クローニングされた断片（例えば、水疱性口内炎ウイルスからの糖タンパク質［ＶＳＶ−Ｇ］、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＃  ＯＧ５９２）のオープンリーディングフレームとともにピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含むトランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞系特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して２９３Ｔに電気穿孔する。
【０５５７】
２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ中で３〜５日間、１μｇ／μＬのピューロマイシンで選択した後に、次いで細胞を１×ＰＢＳ、氷冷溶解緩衝剤（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１１１７））で洗浄し、３回、毎回１０〜１５秒で超音波処理し、１６，０００×ｇで２０分間、遠心分離する。回収した上清画分を用いてＶＳＶ−Ｇに特異的なプローブでウエスタンブロットを行って、安定的にトランスフェクトされた細胞または対照細胞から調製したフソソームからのＶＳＶ−Ｇの非膜特異的濃度を決定し、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の標準と比較する。
【０５５８】
実施形態では、安定的にトランスフェクトされた細胞からのフソソームは、安定的にトランスフェクトされなかった細胞から生成されたフソソームより多いＶＳＶ−Ｇを有することになる。
（実施例８）
タンパク質電気穿孔によるフソソームの生成
【０５５９】
この実施例は、フソソームを生成するためのフソゲンの電気穿孔を説明する。
【０５６０】
おおよそ５×１０６個の細胞または小胞を、電気穿孔トランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する電気穿孔に使用する。マスターミックスを用意するために、２４μｇの精製タンパク質フソゲンを再懸濁緩衝剤（キットに備えられている）に添加する。混合物を室温で１０分間、インキュベートする。その間に、細胞または小胞を滅菌試験管に移し、５００×ｇで５分間、遠心分離する。上清を吸引し、ペレットをＣａ２＋およびＭｇ２＋不含の１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させる。次いで、フソゲンを含有する緩衝剤を使用して、細胞または小胞のペレットを再懸濁させる。細胞または小胞懸濁液を、パルス電圧、パルス幅およびパルス数が異なる最適化条件にも使用する。電気穿孔後、フソゲンを含有する電気穿孔された細胞または小胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、氷上で保持する。
【０５６１】
例えば、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０８：  ４４−５３，  ２０１５を参照されたい。
（実施例９）
小胞形成および遠心分離によるフソソームの生成および単離
【０５６２】
この実施例は、小胞形成および遠心分離によるフソソーム生成および単離を説明する。これは、フソソームを単離することができる方法の１つである。
【０５６３】
フソソームは、次のように調製する。おおよそ４×１０６個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍディッシュの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に播種する。播種の１日後、１５μｇのフソゲン発現プラスミドまたはウイルスを細胞に送達する。フソゲン発現に十分な時間の後、培地を、１００μＭ  ＡＴＰを補充した新鮮培地に注意深く置換する。フソゲン発現の４８〜７２時間後に上清を回収し、０．４５μｍフィルターによる濾過により清澄化し、１５０，０００×ｇで１時間、超遠心分離する。ペレット化された材料を終夜、氷冷ＰＢＳに再懸濁させる。フソソームを実験のために望ましい緩衝剤に再懸濁させる。
【０５６４】
例えば、Ｍａｎｇｅｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｖｏｌ．  １９  ｎｏ．  ９，  １６５６−１６６６，  Ｓｅｐｔ．  ２０１１を参照されたい。
（実施例１０）
巨大原形質膜フソソームの生成および単離
【０５６５】
この実施例は、小胞形成および遠心分離によるフソソーム生成および単離を説明する。これは、フソソームを単離することができる方法の１つである。フソソームは、次のように調製する。
【０５６６】
手短に述べると、フソゲンを発現するＨｅＬａ細胞を緩衝剤（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、溶液（ＧＰＭＶ緩衝剤中の１ｍＭ  ＤＴＴ、１２．５ｍＭパラホルムアルデヒド、および１ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド）に再懸濁させ、３７℃で１時間インキュベートする。先ず、１００×ｇで１０分間の遠心分離により細胞を除去し、次いで、２０，０００×ｇで１時間、４℃でフソソームを回収することにより、細胞からフソソームを清澄化する。フソソームを実験のために望ましい緩衝剤に再懸濁させる。
【０５６７】
例えば、Ｓｅｚｇｉｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｇｉａｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｌａｓｍａ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  ７（６）：１０４２−５１  ２０１２を参照されたい。
（実施例１１）
フソソームゴーストの生成および単離
【０５６８】
この実施例は、低浸透圧処置および遠心分離によるフソソーム生成および単離を説明する。これは、フソソームを産生することができる方法の１つである。
【０５６９】
先ず、フソソームを、フソゲンを発現する間葉幹細胞（１０９個の細胞）から、主として、細胞が破裂してフソソームを形成するような低浸透圧処置を使用することにより単離する。Ｔｒｉｓ−マグネシウム緩衝剤（ＴＭ、例えば、４℃でｐＨ７．４またはｐＨ８．６、ｐＨ調整をＨＣｌで行う）である低浸透圧溶液に、細胞を再懸濁させる。細胞膨潤を位相差顕微鏡観察によりモニターする。細胞が膨潤し、フソソームが形成されたら、懸濁液をホモジナイザー内に配置する。典型的には、細胞計数および標準ＡＯＰＩ染色によって測定して、約９５％細胞破裂で十分である。次いで、膜／フソソームを保存のためにスクロース（０．２５Ｍまたはそれより高濃度）に入れる。あるいは、細胞を溶解するための当技術分野において公知の他の手法、例えば、穏やかな超音波処理（Ａｒｋｈｉｖ  ａｎａｔｏｍｉｉ，  ｇｉｓｔｏｌｏｇｉｉ  ｉ  ｅｍｂｒｉｏｌｏｇｉｉ；  １９７９，  Ａｕｇ，  ７７（８）  ５−１３；  ＰＭＩＤ：  ４９６６５７）、凍結・解凍（Ｎａｔｕｒｅ．  １９９９，  Ｄｅｃ  ２；４０２（６７６１）：５５１−５；  ＰＭＩＤ：  １０５９１２１８）、フレンチプレス（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５４１，  ２０１４，  Ｐａｇｅｓ  １６９−１７６；  ＰＭＩＤ：  ２４４２３２６５）、ニードル・パッセージング（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｎｕｃｌｅａｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）または界面活性剤含有溶液への可溶化（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／８９９００）により、フソソームを形成することができる。
【０５７０】
接着を回避するために、フソソームをプラスチック管に入れ、遠心分離する。最上部のより薄い灰色の薄層が主にフソソームを含む積層ペレットが生成される。しかし、収量を増加させるためにペレット全体を処理する。遠心分離（例えば、４℃で１５分間、３，０００ｒｐｍ）および洗浄（例えば、２０体積のＴｒｉｓ・マグネシウム／ＴＭ−スクロース  ｐＨ７．４）を繰り返してもよい。
【０５７１】
次のステップでは、フソソーム画分を不連続スクロース密度勾配での浮遊選別によって分離する。小過剰の上清を、洗浄されたペレットが残存するままとし、このとき、このペレットはフソソーム、核、および不完全に破裂した全細胞を含む。ＴＭ、ｐＨ８．６中の追加の６０％ｗ／ｗスクロースを、屈折計で４５％スクロースの表示数値が得られるように、懸濁液に添加する。このステップの後、すべての溶液は、ＴＭ  ｐＨ８．６である。１５ｍＬの懸濁液をＳＷ−２５．２硝酸セルロース管に入れ、４０％ｗ／ｗスクロースの１５ｍＬ層および３５％ｗ／ｗスクロースの１５ｍＬ層それぞれの添加、次いで５ｍＬのＴＭ−スクロース（０．２５Ｍ）の添加により、懸濁液の上に不連続勾配を形成する。次いで、試料を、１０分間、４℃、２０，０００ｒｐｍで遠心分離する。核沈降物がペレットを形成し、不完全に破裂した全細胞を４０％〜４５％界面で収集し、フソソームを３５％〜４０％界面で収集する。複数の管からフソソームを収集し、プールする。例えば、国際特許公報、ＷＯ２０１１０２４１７２Ａ２を参照されたい。
（実施例１２）
押出しによるフソソームの生成
【０５７２】
この実施例は、膜を通して押し出すことによるフソソームの製造を説明する。
【０５７３】
手短に述べると、フソゲンを発現する造血幹細胞が、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｅｔ  Ｖ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ５３９１３７−１ＭＬ）を含有する無血清培地中、１×１０６細胞／ｍＬの密度で、３７℃懸濁液中に存在する。細胞をルアーロックシリンジで吸引し、使い捨て５ｍｍシリンジフィルターに１回通して清浄な管に移す。膜が汚れ、詰まった場合、それを取り外し、新しいフィルターを付ける。細胞懸濁液すべてがフィルターを通過した後、プロセスに使用したすべてのフィルターに５ｍＬの無血清培地を通して、フィルターの至るところの一切の残存材料を洗浄する。次いで、溶液を濾液中の抽出フソソームと合わせる。
【０５７４】
５ｍｍから０．２ｍｍに至るまでの徐々に小さいフィルター孔径を用いて同じ方法に従う連続押出しによりフソソームの径をさらに低減させることができる。最終押出しが完了したら、懸濁液を遠心分離（必要とする時間および速度はサイズによって変わる）によりペレット化し、培地に再懸濁させる。
【０５７５】
加えて、このプロセスにアクチン細胞骨格阻害剤の使用を補って、押出しに対する既存細胞骨格構造の影響を低下させることができる。手短に述べると、１×１０６細胞／ｍＬの懸濁液を、５００ｎＭラトランクリンＢ（ａｂ１４４２９１、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含有する無血清培地中でインキュベートし、５％ＣＯ２の存在下、３０分間、３７℃でインキュベートする。インキュベーション後、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、細胞をルアーロックシリンジに吸引し、前に説明したように押出しを行う。
【０５７６】
フソソームをペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄して細胞骨格阻害剤を除去した後、培地に再懸濁させる。
（実施例１３）
タンパク質での化学的処置によるフソソームの生成
【０５７７】
この実施例は、フソソームを生成するためのフソゲンの化学物質媒介送達を説明する。おおよそ５×１０６個の細胞または小胞を、フソゲンの化学物質媒介送達に使用する。細胞または小胞を、５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に懸濁させる。マスターミックスを用意するために、２４μｇの精製タンパク質フソゲンを２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合し、その後、２μＬの脂質トランスフェクション試薬３０００を含有する２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加する。プレートを穏やかに旋回させることにより細胞または小胞とフソゲン溶液を混合し、フソゲンが細胞または小胞膜に組み込まれるように３７Ｃで６時間インキュベートする。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、氷上で保持する。
【０５７８】
Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０８：  ４４−５３，  ２０１５も参照されたい。
（実施例１４）
フソゲン含有リポソームでの処置によるフソソームの生成
【０５７９】
この実施例は、フソソームを生成するための供給源細胞へのフソゲンのリポソーム媒介送達を説明する。おおよそ５×１０６個の細胞または小胞を、フソゲンのリポソーム媒介送達に使用する。細胞または小胞を、５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に懸濁させる。フソゲンタンパク質を、ｎ−オクチルｂ−Ｄ−グルコピラノシドの存在下で細胞から精製する。ｎ−オクチルｂ−Ｄ−グルコピラノシドは、膜内在性タンパク質を可溶化するために使用される穏やかな界面活性剤である。次いで、Ｔｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  ２４：  ２９８０−２９８８，  ２００５に記載されているように、ｎ−オクチルｂ−Ｄ−グルコピラノシド懸濁タンパク質と、ｎ−オクチルｂ−Ｄ−グルコピラノシドで事前に飽和させたＬＵＶとを混合し、その後、ｎ−オクチルｂ−Ｄ−グルコピラノシドを除去することによって、フソゲンタンパク質を大型（４００ｎｍ径）単層小胞（ＬＵＶ）に再構成する。マスターミックスを用意するために、２４μｇの全フソゲンタンパク質を含有するリポソームの塊を５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合する。次いで、リポソームの溶液と供給源細胞または小胞を合わせ、溶液全体を、プレートを穏やかに旋回させることにより混合し、フソゲンタンパク質が供給源細胞または小胞膜に組み込まれることになるような、フソゲン含有リポソームと供給源細胞または小胞との融合を可能にする条件下で、６時間、３７Ｃでインキュベートする。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、氷上で保持する。Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０８：  ４４−５３，  ２０１５も参照されたい。
（実施例１５）
細胞から遊離放出される膜融合性微小胞の単離
【０５８０】
この実施例は、遠心分離によるフソソームの単離を説明する。これは、フソソームを単離することができる方法の１つである。
【０５８１】
フソゲンを発現する細胞から分画遠心分離によりフソソームを単離する。培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清）を、先ず、＞１００，０００×ｇで１時間の超遠心分離により小粒子について清澄化する。次いで、清澄化した培養培地を使用して、フソゲンを発現するマウス胚性線維芽細胞を成長させる。細胞を２００×ｇで１０分間の遠心分離により培養培地から分離する。上清を収集し、５００×ｇで１０分間、２回、２，０００×ｇで１５分間、１回、１０，０００×ｇで３０分間、１回、そして７０，０００×ｇで６０分間、１回、逐次的に遠心分離する。遊離放出されるフソソームは最終遠心分離ステップ中にペレット化され、それらをＰＢＳに再懸濁させ、７０，０００×ｇで再ペレット化する。最終ペレットをＰＢＳに再懸濁させる。
【０５８２】
Ｗｕｂｂｏｌｔｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  Ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：１０９６３−１０９７２  ２００３も参照されたい。
（実施例１６）
フソソームの物理的除核
【０５８３】
この実施例は、細胞骨格不活性化および遠心分離によるフソソームの除核を説明する。これは、フソソームを改変することができる方法の１つである。
【０５８４】
フソゲンを発現する哺乳動物初代または不死化細胞系からフソソームを単離する。アクチン骨格阻害剤での処置および超遠心分離により細胞を除核する。手短に述べると、Ｃ２Ｃ１２細胞を収集し、ペレット化し、１２．５％フィコール４００（Ｆ２６３７、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と５００ｎＭラトランクリンＢ（ａｂ１４４２９１、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）とを含有するＤＭＥＭに再懸濁させ、３０分間、３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートする。５％ＣＯ２の存在下で終夜３７℃で平衡させた、ＤＭＥＭに溶解した漸増濃度のフィコール４００（１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、１層当たり３ｍＬ）を含有する超遠心分離管に、懸濁液を注意深く積層させる。フィコール勾配液をＴｉ−７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）において３２，３００ＲＰＭで６０分間、３７Ｃで回転させる。超遠心分離後、１６〜１８％の間フィコールが見られるフソソームを除去し、ＤＭＥＭで洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁させる。
【０５８５】
実施例３５で説明するようなＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２での核含有量の染色、その後、フローサイトメトリーおよび／またはイメージングの使用を実行して、核の放出を確認することになる。
（実施例１７）
照射によるフソソームの改変
【０５８６】
以下の実施例は、ガンマ線照射でのフソソームの改変を説明する。理論により拘束されるものではないが、ガンマ線照射は、ＤＮＡの二本鎖切断を引き起こし、細胞にアポトーシスを遂げさせることができる。
【０５８７】
先ず、フソゲンを発現する細胞を、組織培養フラスコまたはプレート上で、単層で、コンフルエントな密度未満で（例えば、細胞を培養または播種することにより）培養する。次いで、コンフルエントなフラスコから培地を除去し、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含のＨＢＳＳですすぎ、トリプリン処理して細胞を培養マトリックスから除去する。次いで、細胞ペレットを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有しない１０ｍｌの組織培養培地に再懸濁させ、１００ｍｍペトリ皿に移す。ペレット中の細胞数は、１５０ｃｍ２フラスコでの１０〜１５のコンフルエントＭＥＦ培養物から得られるものと同等であるはずである。次いで、細胞をγ線源からの４０００ラドに曝露してフソソームを生成する。次いで、フソソームを洗浄し、使用する最終緩衝剤または培地に再懸濁させる。
（実施例１８）
化学的処置によるフソソームの改変
【０５８８】
以下の実施例は、マイトマイシンＣ処置でのフソソームの改変を説明する。いずれかの特定の理論により拘束されるものではないが、マイトマイシンＣ処置は、細胞周期を不活性化することによりフソソームを改変する。
【０５８９】
先ず、フソゲンを発現する細胞を、組織培養フラスコまたはプレートにおいて単層でコンフルエントな密度で（例えば、細胞を培養または播種することにより）培養する。１ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ原液を培地に添加して、１０μｇ／ｍＬの最終濃度にする。次いで、プレートを２〜３時間、インキュベーターに戻す。次いで、培地をコンフルエントなフラスコから除去し、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含のＨＢＳＳですすぎ、トリプリン処理して細胞を培養マトリックスから除去する。次いで、細胞を洗浄し、使用する最終緩衝剤または培地に再懸濁させる。
【０５９０】
例えば、Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  （ＭＥＦ）  Ｆｅｅｄｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｄａｖｉｄ  Ａ．  Ｃｏｎｎｅｒ  ２００１を参照されたい。
（実施例１９）
フソソームにおける転写活性の欠如
【０５９１】
この実施例は、フソソームにおける転写活性を、フソソーム生成に使用する親細胞、例えば供給源細胞と比較して定量する。一部の実施形態では、転写活性は、親細胞、例えば供給源細胞と比較してフソソームでのほうが低いかまたはフソソームには非存在である。
【０５９２】
フソソームは、治療剤の送達のためのシャーシである。細胞または局所組織環境に高効率で送達することができる治療剤、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質および／またはオルガネラを使用して、通常は活性でない、またはレシピエントの組織における病原性の低いもしくは高いレベルで活性でない経路をモジュレートすることができるだろう。一部の実施形態では、フソソームに転写能力がないまたはフソソームがそれらの親細胞より低い転写活性を有するという観察は、核物質の除去が十分に行われたことを実証することになる。
【０５９３】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。次いで、十分な数のフソソーム、およびフソソームを生成するために使用する十分な数の親細胞を、６ウェル低接着性マルチウェルプレートの、２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンと蛍光タグ付け可能なアルキン−ヌクレオシドＥＵとを含有するＤＭＥＭに、３７℃および５％ＣＯ２で１時間、播種する。陰性対照のために、十分な数のフソソームおよび親細胞を、マルチウェルプレートの、２０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するがアルキン−ヌクレオシドＥＵを含有しないＤＭＥＭにも、播種する。
【０５９４】
１時間のインキュベーション後、試料を、イメージングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の製造業者の使用説明書に従って処理する。陰性対照を含む、細胞およびフソソーム試料を、１×ＰＢＳ緩衝剤で３回洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝剤に再懸濁させ、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、励起のための４８８ｎｍアルゴンレーザー、および５３０＋／−３０ｎｍ発光を使用して解析する。ＤＢ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを取得および解析に使用した。光散乱チャネルをリニアゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールに設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を解析する。
【０５９５】
一部の実施形態では、陰性対照において５３０＋／−３０ｎｍ発光によって測定した場合の転写活性は、アルキン−ヌクレオシドＥＵを含めないことに起因してゼロとなる。一部の実施形態では、フソソームは、親細胞と比べて約７０％未満、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれを下回る転写活性を有することになる。
【０５９６】
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００８，  Ｏｃｔ  １４；１０５（４１）：１５７７９−８４．  ｄｏｉ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０８４８０１０５．  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｏｃｔ  ７も参照されたい。
（実施例２０）
ＤＮＡ複製または複製活性の欠如
【０５９７】
この実施例は、フソソームにおけるＤＮＡ複製を定量する。一部の実施形態では、フソソームは、細胞と比較して低い率でＤＮＡを複製することになる。
【０５９８】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。フソソームおよび親細胞ＤＮＡ複製活性を、蛍光タグ付け可能なヌクレオチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃  Ｃ１０６３２）の組込みにより評定する。ジメチルスルホキシドでのＥｄＵ原液の調製後、フソソームおよび同等の数の細胞を１０μＭの最終濃度でＥｄＵとともに２時間インキュベートする。次いで、３．７％ＰＦＡを使用して試料を１５分間固定し、１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４で洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４中の０．５％界面活性剤溶液で１５分間、透過処理する。
【０５９９】
透過処理後、０．５％界面活性剤を含有するＰＢＳ緩衝剤中の懸濁状態のフソソームおよび細胞を１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４で洗浄し、反応カクテル、１×ＰＢＳ緩衝剤、ＣｕＳＯ４（成分Ｆ）、ａｚｉｄｅ−ｆｌｕｏｒ  ４８８、１×反応緩衝剤添加剤中で３０分間、２１℃でインキュベートする。
【０６００】
フソソームおよび細胞ＤＮＡ複製活性の陰性対照は、１×反応カクテル中にａｚｉｄｅ−ｆｌｕｏｒ  ４８８がないこと以外は上記と同じように試料を処置して作製する。
【０６０１】
次いで、細胞およびフソソーム試料を洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝剤に再懸濁させ、フローサイトメトリーにより解析する。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で４８８ｎｍアルゴンレーザー励起を用いて行い、５３０＋／−３０ｎｍ発光スペクトルを収集する。ＦＡＣＳ解析ソフトウェアを取得および解析に使用する。光散乱チャネルをリニアゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールに設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を解析する。相対ＤＮＡ複製活性を、各試料におけるａｚｉｄｅ−ｆｌｕｏｒ  ４８８の強度中央値に基づいて算出する。すべてのイベントを前方および側方散乱チャネルで取得する（あるいは、ゲートをかけてフソソーム集団のみを選択することができる）。フソソームについての正規化蛍光強度値を、フソソームの蛍光強度中央値からそれぞれの陰性対照試料の蛍光強度中央値を減算することにより決定する。次いで、フソソーム試料についての正規化相対ＤＮＡ複製活性をそれぞれの有核細胞試料に正規化して、ＤＮＡ複製活性の定量的測定値を生じさせる。
【０６０２】
一部の実施形態では、フソソームは、親細胞より低いＤＮＡ複製活性を有する。
【０６０３】
Ｓａｌｉｃ，  ２４１５−２４２０，  ｄｏｉ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．０７１２１６８１０５も参照されたい。
（実施例２１）
フソソームを改変するための核酸カーゴによる電気穿孔
この実施例は、核酸カーゴによるフソソームへの電気穿孔を説明する。
【０６０４】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。おおよそ１０９個のフソソームと１μｇの核酸、例えばＲＮＡを、電気穿孔用緩衝剤（１．１５ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ７．２、２５ｍＭ塩化カリウム、水中の６０％イオジキサノールｗ／ｖ）中で混合する。単一４ｍｍキュベットを使用し、電気穿孔システム（ＢｉｏＲａｄ、１６５−２０８１）を使用して、フソソームに電気穿孔する。フソソームおよび核酸の電気穿孔を４００Ｖ、１２５μＦおよび∞オームで行い、キュベットを直ちに氷に移す。電気穿孔後、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、氷上で保持する。
【０６０５】
例えば、Ｋａｍｅｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＫＲＡＳ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２０１７を参照されたい。
【０６０６】
【０６０７】
（実施例２２）
フソソームを改変するためのタンパク質カーゴによる電気穿孔
【０６０８】
この実施例は、タンパク質カーゴによるフソソームへの電気穿孔を説明する。
【０６０９】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。おおよそ５×１０６個のフソソームを、電気穿孔トランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する電気穿孔に使用する。マスターミックスを用意するために、２４μｇの精製タンパク質カーゴを再懸濁緩衝剤（キットに備えられている）に添加する。混合物を室温で１０分間、インキュベートする。その間に、フソソームを滅菌試験管に移し、５００×ｇで５分間、遠心分離する。上清を吸引し、ペレットをＣａ２＋およびＭｇ２＋不含の１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させる。次いで、タンパク質カーゴを含有する緩衝剤を使用して、フソソームのペレットを再懸濁させる。次いで、フソソーム懸濁液を、パルス電圧、パルス幅およびパルス数が異なる最適化条件に使用する。電気穿孔後、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、氷上で保持する。
【０６１０】
例えば、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０８：  ４４−５３，  ２０１５を参照されたい。
（実施例２３）
核酸カーゴで改変するためのフソソームの化学的処置
【０６１１】
この実施例は、化学的処置によるフソソームへの核酸カーゴのローディングを説明する。
【０６１２】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。おおよそ１０６個のフソソームを、１０，０００ｇで５分間、４℃での遠心分離によりペレット化する。次いで、ペレット化したフソソームを、２０μｇのＤＮＡとともにＴＥ緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させる。フソソーム：ＤＮＡ溶液を、フソソーム膜へのＤＮＡ透過性を増大させるための穏やかな界面活性剤（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ−ＧＮ−００１−ＥＸ）で処置する。溶液を再び遠心分離し、ＤＮＡがローディングされたフソソームと標的レシピエント細胞との親和性を増大させるための、硫酸プロタミンなどの、正荷電ペプチドを含有する緩衝剤（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃ、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ−ＧＮ−００１−ＥＸ）にペレットを再懸濁させる。ＤＮＡをローディングした後、ローディングされたフソソームを使用するまで氷上で保持する。
Ｋａｎｅｄａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ２００３も参照されたい。
（実施例２４）
タンパク質カーゴで改変するためのフソソームの化学的処置
【０６１３】
この実施例は、化学的処置によるフソソームへのタンパク質カーゴのローディングを説明する。
【０６１４】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。おおよそ１０６個のフソソームを、１０，０００ｇで５分間、４℃での遠心分離によりペレット化する。次いで、ペレット化したフソソームを、フソソームとカーゴタンパク質との親和性を増大させるための、硫酸プロタミンなどの、正荷電ペプチドを含有する緩衝剤（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ−ＧＮ−００１−ＥＸ）に再懸濁させる。次に、１０μｇのカーゴタンパク質をフソソーム溶液に添加し、その後、フソソーム膜へのタンパク質透過性を増大させるための穏やかな界面活性剤（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ−ＧＮ−００１−ＥＸ）を添加する。溶液を再び遠心分離し、タンパク質がローディングされたフソソームと標的レシピエント細胞との親和性を増大させるための、硫酸プロタミンなどの、正荷電ペプチドを含有する緩衝剤（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃ、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ−ＧＮ−００１−ＥＸ）にペレットを再懸濁させる。タンパク質をローディングした後、ローディングされたフソソームを使用するまで氷上で保持する。
【０６１５】
Ｙａｓｏｕｋａ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＶＪ−Ｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ２００７も参照されたい。
（実施例２５）
核酸カーゴで改変するためのフソソームのトランスフェクション
【０６１６】
この実施例は、核酸カーゴのフソソームへのトランスフェクションを説明する。フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。
【０６１７】
５×１０６個のフソソームをＯｐｔｉ−Ｍｅｍ中で維持する。０．５μｇの核酸を２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合し、その後、２μＬの脂質トランスフェクション試薬２０００を含有する２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加する。核酸とＯｐｔｉ−ＭＥＭと脂質トランスフェクション試薬との混合物を室温で１５分間維持し、次いでフソソームに添加する。プレートを穏やかに旋回させることにより溶液全体を混合し、３７Ｃで６時間インキュベートする。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、氷上で保持する。
【０６１８】
Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０８：  ４４−５３，  ２０１５も参照されたい。
（実施例２６）
タンパク質カーゴで改変するためのフソソームのトランスフェクション
【０６１９】
この実施例は、タンパク質カーゴのフソソームへのトランスフェクションを説明する。
【０６２０】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。５×１０６個のフソソームをＯｐｔｉ−Ｍｅｍ中で維持する。０．５μｇの精製タンパク質を２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合し、その後、２μＬの脂質トランスフェクション試薬３０００を含有する２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加する。タンパク質とＯｐｔｉ−ＭＥＭと脂質トランスフェクション試薬との混合物を室温で１５分間維持し、次いでフソソームに添加する。プレートを穏やかに旋回させることにより溶液全体を混合し、３７Ｃで６時間インキュベートする。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、氷上で保持する。
【０６２１】
Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０８：  ４４−５３，  ２０１５も参照されたい。
（実施例２７）
脂質二重層構造を有するフソソーム
【０６２２】
この実施例は、フソソームの組成を説明する。一部の実施形態では、フソソーム組成は、中央に内腔がある脂質二重層構造を含むことになる。
【０６２３】
理論により拘束されることを望まないが、フソソームの脂質二重層構造は、標的細胞との融合を促進し、フソソームによる種々の治療薬のローディングを可能にする。
【０６２４】
フソソームを、前の実施例で説明した方法を使用して新たに調製する。陽性対照は、ネイティブ細胞系（ＨＥＫ２９３）であり、陰性対照は、冷ＤＰＢＳ、および３６ゲージ針に５０回通された膜破壊ＨＥＫ２９３細胞調製物である。
【０６２５】
エッペンドルフ管の中の試料を遠心沈降させ、上清を注意深く除去する。次いで、予温した固定溶液（０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍカコジル酸緩衝剤中の２．５％グルタルアルデヒド、ｐＨ７．５；使用前、３０分間、３７℃で保持する）を試料ペレットに添加し、２０分間、室温で保持する。固定後、試料をＰＢＳで２回洗浄する。四酸化オスミウムを試料ペレットに添加し、３０分インキュベートする。ＰＢＳで１回すすいだ後、３０％、５０％、７０％および９０％ヘキシレングリコールを添加し、各々１５分、旋回させて洗浄する。次いで、１００％ヘキシレングリコールを３回、各々１０分、旋回させながら添加する。
【０６２６】
樹脂をヘキシレングリコールと１：２比で合わせ、次いで、試料に添加し、室温で２時間インキュベートする。インキュベーション後、溶液を１００％樹脂に置換し、４〜６時間インキュベートする。このステップを新鮮１００％樹脂でもう１回繰り返す。次いで、それを１００％新鮮樹脂に置換し、レベルを深さ約１〜２ｍｍに調整し、８〜１２時間焼成する。エッペンドルフ管を切断し、試料を含有するエポキシキャスト片をさらに１６〜２４時間焼成する。次いで、細胞を有する側に注意してエポキシキャストを小片に切断する。市販の５分硬化型エポキシ系接着剤を使用して、小片を切片作製用のブロックに接着する。透過型電子顕微鏡（ＪＯＥＬ、ＵＳＡ）を使用して、８０ｋＶの電圧で試料をイメージングする。
【０６２７】
一部の実施形態では、フソソームは、陽性対照（ＨＥＫ２９３細胞）と同様の脂質二重層構造を示すことになり、ＤＰＢＳ対照では明瞭な構造が観察されない。一部の実施形態では、破壊された細胞調製物では内腔構造が観察されない。
（実施例２８）
フソゲン発現の検出
【０６２８】
この実施例は、フソソームにおけるフソゲン発現を定量する。
【０６２９】
クローニングされた断片（例えば、水疱性口内炎ウイルスからの糖タンパク質［ＶＳＶ−Ｇ］、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＃  ＯＧ５９２）のオープンリーディングフレームとともにピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含むトランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞系特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して２９３Ｔに電気穿孔する。
【０６３０】
２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ中の１μｇ／μＬのピューロマイシンで３〜５日間選択した後、安定的に発現する細胞系からまたは対照細胞からフソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。
【０６３１】
次いで、フソソームを、１×ＰＢＳ、氷冷溶解緩衝剤（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１１１７））で洗浄し、各回１０〜１５秒で３回、超音波処理し、１６，０００×ｇで２０分間、遠心分離する。回収した上清画分を用いてＶＳＶ−Ｇに特異的なプローブでウエスタンブロットを行って、安定的にトランスフェクトされた細胞または対照細胞から調製したフソソームからのＶＳＶ−Ｇの非膜特異的濃度を決定し、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の標準と比較する。
【０６３２】
一部の実施形態では、安定的にトランスフェクトされた細胞からのフソソームは、安定的にトランスフェクトされなかった細胞から生成されたフソソームより多いＶＳＶ−Ｇを有することになる。
（実施例２９）
フソゲンの定量
【０６３３】
この実施例は、１フソソーム当たりのフソゲンの絶対数の定量を説明する。
【０６３４】
フソソーム組成物を前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生するが、ただし、ＧＦＰでダグ付けしたフソゲン（ＶＳＶ−Ｇ）を発現するように、前の実施例で説明したようにフソソームを操作する。加えて、陰性対照フソソームを、フソゲン（ＶＳＶ−Ｇ）もＧＦＰも存在しないように操作する。
【０６３５】
次いで、ＧＦＰタグ付きフソゲンを含有するフソソームおよび陰性対照を、フソゲンの絶対数について、次のようにアッセイする。購入した組換えＧＦＰを段階希釈して、タンパク質濃度の較正曲線を作成する。次いで、較正曲線およびフソソーム量が分かっている試料のＧＦＰ蛍光を、蛍光光度計でＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して測定して、フソソーム調製物中のＧＦＰ分子の平均モル濃度を算出する。次いで、モル濃度をＧＦＰ分子の数に変換し、１試料当たりのフソソームの数で割って１フソソーム当たりのＧＦＰタグ付きフソゲン分子の平均数を獲得し、この結果として１フソソーム当たりのフソゲンの数の相対推定値を得る。
【０６３６】
一部の実施形態では、ＧＦＰ蛍光は、フソゲンもＧＦＰも存在しない陰性対照と比較してＧＦＰタグを有するフソソームでのほうが高くなる。一部の実施形態では、ＧＦＰ蛍光は、存在するフソゲン分子の数に比例する。
【０６３７】
あるいは、単一細胞調製システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を製造業者の使用説明書に従って使用して個々のフソソームを単離し、市販のプローブセット（Ｔａｑｍａｎ）と、Ｃｔ値に基づいてフソゲンまたはＧＦＰ  ｃＤＮＡレベルを定量するために設計されたマスターミックスとを使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲを行う。フソゲン遺伝子またはＧＦＰ遺伝子のクローニングされた断片と同じ配列のＲＮＡ標準を、合成（Ａｍｓｂｉｏ）により生成し、次いで、単一細胞調製システムｑＲＴ−ＰＣＲ実験反応物に段階希釈物で添加して、フソゲンまたはＧＦＰ  ＲＮＡの濃度に対するＣｔの標準曲線を確立する。
【０６３８】
フソソームからのＣｔ値を標準曲線と比較して、１フソソーム当たりのフソゲンまたはＧＦＰ  ＲＮＡの量を決定する。
【０６３９】
一部の実施形態では、フソゲンおよびＧＦＰ  ＲＮＡは、フソゲンもＧＦＰも存在しない陰性対照と比較して、フソゲンを発現するように操作したフソソームでのほうが高くなる。
【０６４０】
以前に記載されたような脂質二重層構造の解析、および本明細書の他の実施例で説明するようなＬＣ−ＭＳによる脂質二重層中のフソゲンの定量により、脂質二重層中のフソゲンをさらに定量することができる。
（実施例３０）
フソソームの平均径の測定
【０６４１】
この実施例は、フソソームの平均径の測定を説明する。
【０６４２】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。市販のシステム（ｉＺＯＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、フソソームを測定して平均径を決定する。ソフトウェアを製造業者の使用説明書に従って用い、径の範囲４０ｎｍ〜１０μｍ以内の粒子を解析するために設計されたナノポアを用いて、システムを使用する。フソソームおよび親細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させて、０．０１〜０．１μｇタンパク質／ｍＬの最終濃度範囲にする。他の計器設定は、次の表に示すように調整する：
【表１６】
2021513849.tif 000048
【０６４３】
すべてのフソソームを単離から２時間以内に解析する。一部の実施形態では、フソソームは、親供給源細胞より約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内またはそれを超えて大きい径を有することになる。
（実施例３１）
フソソームの平均径分布の測定
【０６４４】
この実施例は、フソソームの径の分布の測定を説明する。
【０６４５】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより生成し、前の実施例に記載のものなどの市販のシステムを使用して試験して粒子の平均径を決定する。一部の実施形態では、中央値を中心としてフソソームの１０％、５０％および９０％についての径閾値を、親細胞と比較して、フソソーム径の分布を評定する。
【０６４６】
一部の実施形態では、フソソームは、試料の１０％、５０％または９０％以内で親細胞の径分布変動の約９０％未満、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％またはそれより低い径分布変動を有することになる。
（実施例３２）
フソソームの平均体積
【０６４７】
この実施例は、フソソームの平均体積の測定を説明する。理論により拘束されることを望まないが、フソソームのサイズ（例えば、径、体積、表面積など）を変化させることで、明確に異なるカーゴローディング、治療設計または応用へのフソソームの汎用性を高くすることができる。
【０６４８】
フソソームを前の実施例で説明したように調製する。陽性対照は、ＨＥＫ２９３細胞、またはサイズが分かっているポリスチレンビースである。陰性対照は、３６ゲージ針におおよそ５０回通されたＨＥＫ２９３細胞である。
【０６４９】
前の実施例で説明したような透過型電子顕微鏡での解析を使用して、フソソームのサイズを決定する。フソソームの径を測定し、次いで体積を算出する。
【０６５０】
一部の実施形態では、フソソームは、おおよそ５０ｎｍまたはそれより大きい径の平均サイズを有することになる。
（実施例３３）
フソソームの平均密度
【０６５１】
フソソーム密度は、Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００６  Ａｐｒ；  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｕｎｉｔ  ３．２２に記載されているような連続スクロース勾配遠心分離アッセイによって測定する。フソソームを前の実施例で説明したように得る。
【０６５２】
先ず、スクロース勾配を調製する。４ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロース原液と１ｍＬのＨＥＰＥＳ原液、または０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロース原液と４．５ｍＬのＨＥＰＥＳ原液を、それぞれ混合することにより、２Ｍおよび０．２５スクロース溶液を生成する。これら２つの画分を、すべてのシャッターを閉じた勾配作製装置に、２Ｍスクロース溶液を磁気撹拌棒とともに近位区画に、０．２５Ｍスクロース溶液を遠位区画に、ローディングする。勾配作製装置を磁気撹拌プレート上に配置し、近位区画と遠位区画の間のシャッターを開け、磁気撹拌プレートをオンにする。ＨＥＰＥＳ原液は、次のように作製する：２．４ｇのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；最終２０ｍＭ）、３００  Ｈ２Ｏ、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで７．４に調整し、最終的に体積をＨ２Ｏで５００ｍＬに調整する。ＨＥＰＥＳ／スクロース原液は、次のように作製する：２．４ｇのヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；最終２０ｍＭ）、４２８ｇのプロテアーゼ不含スクロース（ＩＣＮ；最終２．５Ｍ）、１５０ｍＬのＨ２Ｏ、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで７．４に調整し、最終的に体積をＨ２Ｏで５００ｍＬに調整する。
【０６５３】
フソソームを２ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロース原液に再懸濁させ、ＳＷ  ４１遠心分離管の底部に注入する。外部チューブを、ＳＷ  ４１管内の２ｍＬのフソソームのすぐ上に配置する。外側のシャッターを開け、連続２Ｍ（最低）〜０．２５Ｍ（最高）スクロース勾配液をフソソームの最上部にゆっくりと注入する。チューブが常に液体の最上部の少し上にあるように、勾配液を注入するにつれてＳＷ  ４１管を下げる。
【０６５４】
勾配液が入っているすべての管について、互いにバランスをとるか、または同じ重量のスクロース溶液を有する他の管とのバランスをとる。勾配液を、終夜（≧１４時間）、２１０，０００×ｇ、４℃で、ＳＷ  ４１スイングバケットローターにおいてブレーキを低に設定して遠心分離する。
【０６５５】
マイクロピペッターを用いて、最高から最低まで１１の１ｍＬ画分を収集し、ＴＬＡ−１００．３ローターの３ｍＬ管に入れる。試料を取り出し、９６ウェルプレートの別々のウェルで、５０μｌの各画分を使用して屈折率を測定する。蒸発を防止するためにプレートを接着ホイルで覆い、１時間以下、室温で保管する。屈折計を使用して、９６ウェルプレートに取っておいた材料からの１０〜２０μｌの各画分の屈折率（したがって、スクロース濃度、および密度）を測定する。
【０６５６】
屈折率をｇ／ｍＬに変換するための表は、Ｂｅｃｋｍａｎウェブサイトからダウンロードできる超遠心分離カタログで入手できる。
【０６５７】
次いで、各画分をタンパク質含有量解析のために調製する。２ミリリットルの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を１ｍＬ勾配画分各々に添加し、２〜３回、ピペットで吸い上げ、吐き出すことによって混合する。各管の一側面に油性マーカーでマークを付け、マークを付けた側を上にして管をＴＬＡ−１００．３ローター内に配置する。
【０６５８】
希釈された画分が入っている３ｍＬ管を１時間、１１０，０００×ｇ、４℃で遠心分離する。ＴＬＡ−１００．３ローターは、６本の管を把持するため、勾配ごとに２回の遠心分離を行い、他の管は、それらを遠心分離することができるまで４℃で保持する。
【０６５９】
３ｍＬ管の各々から上清を、ペレットの上に１滴残して、吸引する。ペレットは、ほぼ確実に目には見えないが、その位置を管上のマークから推測することができる。目に見えないペレットを再懸濁させ、微小遠心分離管に移す。各再懸濁画分の半分を、別の実施例で説明するビシンコニン酸アッセイによるタンパク質含有量解析に使用する。これにより、フソソーム調製物の様々な勾配画分にわたっての分布が得られる。この分布を使用して、フソソームの平均密度を決定する。もう一方の半分の体積の画分を−８０℃で保管し、タンパク質解析によって画分にわたってのフソソーム分布が明らかになったら他の目的（例えば、機能解析、または免疫隔離によるさらなる精製）に使用する。
【０６６０】
一部の実施形態では、このアッセイまたは同等のアッセイを使用して、複数のフソソームを含む調製物の平均密度は、１．２５ｇ／ｍＬ＋／−０．０５標準偏差となる。一部の実施形態では、調製物の平均密度は、１〜１．１、１．０５〜１．１５、１．１〜１．２、１．１５〜１．２５、１．２〜１．３、または１．２５〜１．３５ｇ／ｍＬの範囲内となる。一部の実施形態では、調製物の平均密度は、１未満になるか、または１．３５より高くなる。
（実施例３４）
フソソーム中のオルガネラ含有量の測定
【０６６１】
この実施例は、フソソーム中のオルガネラの検出を説明する。
【０６６２】
フソソームを本明細書に記載するように調製した。小胞体（ＥＲ）およびミトコンドリアの検出のために、フソソームまたはＣ２Ｃ１２細胞を１μＭ  ＥＲ染色剤（Ｅ３４２５１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）および１μＭミトコンドリア染色剤（Ｍ２２４２６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。リソソームの検出のために、フソソームまたは細胞を５０ｎＭリソソーム染色剤（Ｌ７５２６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。
【０６６３】
染色されたフソソームをフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にかけ、下の表に記載の色素ごとに蛍光強度を測定した。染色されたフソソームの蛍光強度と未染色のフソソーム（陰性対照）および染色された細胞（陽性対照）の蛍光強度とを比較することにより、オルガネラの存在の検証を行った。
【０６６４】
フソソームは、除核５時間後に小胞体（図１）、ミトコンドリア（図２）およびリソソーム（図３）に対して陽性の染色を示した。
【表１７】
2021513849.tif 000049
（実施例３５）
フソソーム中の核含有量の測定
【０６６５】
この実施例は、フソソーム中の核含有量の測定を説明する。フソソームが核を含有しないことを検証するために、フソソームを１μｇ・ｍＬ−１のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２および１μＭカルセインＡＭ（Ｃ３１００ＭＰ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色し、染色されたフソソームをＡｔｔｕｎｅ  ＮＸＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にかけて、下の表に記載の色素ごとに蛍光強度を決定する。一部の実施形態では、サイトゾルの存在についての検証（カルセインＡＭ）および核の非存在についての検証（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を、染色されたフソソームの平均蛍光強度を未染色のフソソームおよび染色された細胞の平均蛍光強度と比較することにより、行うことになる。
【表１８】
2021513849.tif 000050
（実施例３６）
核エンベロープ含有量の測定
【０６６６】
この実施例は、有核フソソーム中の核エンベロープ含有量の測定を説明する。核エンベロープは、細胞のＤＮＡを細胞質から単離する。
【０６６７】
一部の実施形態では、精製フソソーム組成物は、本明細書で説明するように除核した哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ（２９３［ＨＥＫ−２９３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標））を含む。この実施例は、フソソーム生成後に残存する無傷核膜の量を測定するためのプロキシとしての種々の核膜タンパク質の定量を説明する。
【０６６８】
この実施例では、１０×１０６個のＨＥＫ−２９３Ｔ、および１０×１０６個のＨＥＫ−２９３Ｔから調製した同量のフソソームを、３．７％ＰＦＡを使用して１５分間固定し、１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４で洗浄し、同時に透過処理し、次いで、１％ウシ血清アルブミンと０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００とを含有する１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４を使用して１５分間ブロックする。透過処理後、フソソームおよび細胞を、１％ウシ血清アルブミンと０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００とを含有する１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４で希釈した製造業者推奨濃度の種々の一次抗体、例えば抗ＲａｎＧＡＰ１抗体［ＥＰＲ３２９５］（Ａｂｃａｍ−ａｂ９２３６０）、抗ＮＵＰ９８抗体［ＥＰＲ６６７８］−核膜孔マーカー（Ａｂｃａｍ−ａｂ１２４９８０）、抗核膜孔複合体タンパク質抗体［Ｍａｂ４１４］−（Ａｂｃａｍ−ａｂ２４６０９）、抗インポーチン７抗体（Ａｂｃａｍ−ａｂ２１３６７０）とともに、１２時間、４℃でインキュベートする。次いで、フソソームおよび細胞を１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４で洗浄し、１％ウシ血清アルブミンと０．５％界面活性剤とを含有する１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４で希釈した製造業者推奨濃度の、前に明記した一次抗体を検出する適切な蛍光二次抗体とともに、２時間、２１℃でインキュベートする。次いで、フソソームおよび細胞を１×ＰＢＳ緩衝剤で洗浄し、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を含有する３００μＬの１×ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４に再懸濁させ、２０μｍ  ＦＡＣＳ管に通して濾過し、フローサイトメトリーにより解析する。
【０６６９】
陰性対照は、一次抗体を添加しないこと以外は同じ染色手順を使用して生成する。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で４８８ｎｍアルゴンレーザー励起を用いて行い、５３０＋／−３０ｎｍ発光スペクトルを収集する。ＦＡＣＳ取得ソフトウェアを、取得および解析に使用する。光散乱チャネルをリニアゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールに設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を解析する。無傷核膜の相対含有量を、各試料における蛍光強度中央値に基づいて算出する。すべてのイベントを前方および側方散乱チャネルで取得する。
【０６７０】
フソソームについての正規化蛍光強度値を、フソソームの蛍光強度中央値からそれぞれの陰性対照試料の蛍光強度中央値を減算することにより決定する。次いで、フソソーム試料についての正規化蛍光をそれぞれの有核細胞試料に正規化して、無傷核膜含有量の定量的測定値を生じさせる。
【０６７１】
一部の実施形態では、除核フソソームは、有核親細胞と比較して１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満の蛍光強度または核エンベロープ含有量を含むことになる。
（実施例３７）
クロマチンレベルの測定
【０６７２】
この実施例は、除核フソソーム中のクロマチンの測定を説明する。
【０６７３】
ＤＮＡを、核内に収まらせるために、クロマチンに凝縮することができる。一部の実施形態では、精製フソソーム組成物は、本明細書に記載の方法のいずれか１つにより産生した場合、低レベルのクロマチンを含むことになる。
【０６７４】
前述の方法のいずれかにより調製した除核フソソーム、および陽性対照細胞（例えば、親細胞）を、ヒストンタンパク質Ｈ３またはヒストンタンパク質Ｈ４に特異的である抗体でのＥＬＩＳＡを使用して、クロマチン含有量についてアッセイする。ヒストンはクロマチンの主タンパク質成分であり、Ｈ３およびＨ４は主要ヒストンタンパク質である。
【０６７５】
市販のキット（例えば、Ａｂｃａｍ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｂ１１３４７６））または当技術分野において公知の他の方法を使用して、ヒストンをフソソーム調製物および細胞調製物から抽出する。これらの分割量を使用するまで−８０℃で保管する。精製ヒストンタンパク質（Ｈ３またはＨ４のどちらか）をアッセイ緩衝剤の溶液中１〜５０ｎｇ／μＬから希釈することにより、標準物質の段階希釈物を調製する。アッセイ緩衝剤は、製造業者により供給されるキット（例えば、Ａｂｃａｍ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ４  Ｔｏｔａｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｂ１５６９０９）またはＡｂｃａｍ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｔｏｔａｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｂ１１５０９１））から得ることができる。抗ヒストンＨ３または抗Ｈ４抗体でコーティングされている４８または９６ウェルプレートの各ウェルにアッセイ緩衝剤を添加し、試料または標準対照をウェルに添加して、各ウェルの総体積を５０μＬにする。次いで、プレートを覆い、３７度で９０〜１２０分間インキュベートする。
【０６７６】
インキュベーション後、プレートに接着した抗ヒストン抗体に結合した任意のヒストンを検出用に調製する。上清を吸引し、プレートを１５０μＬの洗浄緩衝剤で洗浄する。次いで、抗ヒストンＨ３または抗Ｈ４捕捉抗体を含む捕捉緩衝剤をプレートに５０μＬの体積および１μｇ／ｍＬの濃度で添加する。次いで、オービタルシェーカーを用いて室温で６０分間、プレートをインキュベートする。
【０６７７】
次に、プレートを吸引し、洗浄緩衝剤を使用して６回洗浄する。次いで、捕捉抗体により活性化可能なシグナルレポーター分子を各ウェルに添加する。プレートを覆い、室温で３０分間インキュベートする。次いで、プレートを吸引し、洗浄緩衝剤を使用して４回洗浄する。停止溶液を添加することにより、反応を停止させる。プレートの各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取り、各試料中のヒストンの濃度を、標準試料中のヒストンの濃度に対する４５０ｎｍでの吸光度の標準曲線に従って算出する。
【０６７８】
一部の実施形態では、フソソーム試料は、有核親細胞の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のヒストン濃度を含むことになる。
（実施例３８）
フソソーム中のＤＮＡ含有量の測定
【０６７９】
この実施例は、有核対応物と比較してフソソーム中のＤＮＡの量の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、有核対応物より少ないＤＮＡを有することになる。全ＤＮＡ、または特定のハウスキーピング遺伝子のレベルを測定することにより、核酸レベルを決定する。一部の実施形態では、低減したＤＮＡ含有量を有するまたはＤＮＡを実質的に欠いているフソソームは、遺伝子を複製、分化または転写することができず、これにより、それらの用量および機能は対象に投与されたとき変更されないことが保証されることになる。
【０６８０】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。フソソームおよび供給源細胞のタンパク質によって測定した場合に同じ質量の調製物を使用して、全ＤＮＡを（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙカタログ番号６９５０４などのキットを使用して）単離し、その後、ＤＮＡによる吸光度を評定するための標準的な分光方法を使用して（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＮａｎｏＤｒｏｐで）ＤＮＡ濃度を決定する。
【０６８１】
一部の実施形態では、除核フソソーム中のＤＮＡの濃度は、親細胞中のその濃度と比べて約５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満低くなる。
【０６８２】
あるいは、半定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＧＡＰＤＨなどの特定のハウスキーピング遺伝子の濃度を有核細胞とフソソーム間で比較することができる。全ＤＮＡを親細胞およびフソソームから単離し、ＤＮＡ濃度を本明細書で説明するように測定する。ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３０９１５５）で以下の反応鋳型を使用して行う：
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス：１０μＬ
０．４５μＭフォワードプライマー：    １μＬ
０．４５μＭリバースプライマー：      １μＬ
ＤＮＡ鋳型：                          １０ｎｇ
ＰＣＲグレード水：                    可変的
【０６８３】
フォワードおよびリバースプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手する。下記の表は、プライマーペアおよびそれらの関連配列を列挙するものである。
【表１９】
2021513849.tif 000051
【０６８４】
リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、以下のプロトコールで増幅および検出を行う：
変性、９４℃                  ２分
４０サイクルの下記シーケンス：
変性、９４℃                  １５秒
アニーリング、伸長、６０℃    １分
【０６８５】
ＤＮＡ濃度に対するＣｔの標準曲線をＧＡＰＤＨ  ＤＮＡの段階希釈物で作成し、それを使用してフソソームＰＣＲ結果からの核Ｃｔ値をＤＮＡの特定の量（ｎｇ）に正規化する。
【０６８６】
一部の実施形態では、除核フソソーム中のＧＡＰＤＨ  ＤＮＡの濃度は、親細胞中のその濃度と比べて約５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満低くなる。
（実施例３９）
フソソーム中のｍｉＲＮＡ含有量の測定
【０６８７】
この実施例は、フソソーム中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、ｍｉＲＮＡを含む。
【０６８８】
ｍｉＲＮＡは、数ある活性の中でも特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をタンパク質に翻訳する速度を制御する、調節エレメントである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡを担持するフソソームを使用して、ｍｉＲＮＡを標的部位に送達することができる。
【０６８９】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。ＲＮＡを、フソソームまたは親細胞から、前に説明したように調製する。ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｒｎａ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌのＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙから、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ遺伝子を選択する。ｍｉＲＮＡを、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３３（２０），  ２００５に記載されているように調製する。すべてのＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡアッセイは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ａ２５５７６、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を通して入手できる。
【０６９０】
ｍｉＲＮＡ  ｃＤＮＡを用いて製造業者の仕様書に従ってｑＰＣＲを行い、本明細書に記載するようなリアルタイムＰＣＲシステムを使用して、ＣＴ値を生成し、解析する。
【０６９１】
一部の実施形態では、フソソームのｍｉＲＮＡ含有量は、それらの親細胞のものよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えて多くなる。
（実施例４０）
フソソームにおける内因性ＲＮＡまたは合成ＲＮＡの発現の定量
【０６９２】
この実施例は、発現が変更された内因性ＲＮＡのレベルまたはフソソームに発現される合成ＲＮＡのレベルの定量を説明する。
【０６９３】
フソソームまたは親細胞を、フソソームに対する細胞機能を媒介する内因性または合成ＲＮＡの発現を変更するように操作する。
【０６９４】
トランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、タンパク物質のクローニングされた断片のオープンリーディングフレームとともに、ピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含む。エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞系特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ベクターを２９３Ｔに電気穿孔する。
【０６９５】
２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ中で３〜５日間、ピューロマイシンで選択した後、安定的に発現する細胞系から、前の実施例で説明した方法のいずれか１つによりフソソームを調製する。
【０６９６】
個々のフソソームを単離し、１フソソーム当たりのタンパク物質またはＲＮＡを前の実施例で説明したように定量する。
【０６９７】
一部の実施形態では、フソソームは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、またはそれより多くのＲＮＡを有することになる。
（実施例４１）
フソソーム中の脂質組成の測定
【０６９８】
この実施例は、フソソームの脂質組成の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞と同様である。脂質組成は、フソソームおよび細胞の重要な生物物理学的パラメーター、例えば、サイズ、静電相互作用、およびコロイド挙動に影響を与える。
【０６９９】
脂質測定は、質量分析に基づく。フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。
【０７００】
質量分析に基づく脂質解析は、脂質解析サービス（Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、記載されているように（Ｓａｍｐａｉｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ２０１１，  Ｆｅｂ  １；１０８（５）：１９０３−７）行う。２ステップクロロホルム／メタノール手順（Ｅｊｓｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ２００９，  Ｍａｒ  １７；１０６（７）：２１３６−４１）を使用して脂質を抽出する。カルジオリピン  １６：１／１５：０／１５：０／１５：０（ＣＬ）、セラミド  １８：１；２／１７：０（Ｃｅｒ）、ジアシルグリセロール  １７：０／１７：０（ＤＡＧ）、ヘキソシルセラミド  １８：１；２／１２：０（ＨｅｘＣｅｒ）、リゾホスファチデート  １７：０（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルコリン  １２：０（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン  １７：１（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルグリセロール  １７：１（ＬＰＧ）、リゾホスファチジルイノシトール  １７：１（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルセリン  １７：１（ＬＰＳ）、ホスファチデート  １７：０／１７：０（ＰＡ）、ホスファチジルコリン  １７：０／１７：０（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン  １７：０／１７：０（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール  １７：０／１７：０（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール  １６：０／１６：０（ＰＩ）、ホスファチジルセリン  １７：０／１７：０（ＰＳ）、コレステロールエステル  ２０：０（ＣＥ）、スフィンゴミエリン  １８：１；２／１２：０；０（ＳＭ）およびトリアシルグリセロール  １７：０／１７：０／１７：０（ＴＡＧ）の内部脂質標準混合物を、試料にスパイクする。
【０７０１】
抽出後、有機相を注入プレートに移し、スピード真空濃縮器で乾燥させる。第１ステップ乾燥抽出物をクロロホルム／メタノール／プロパノール（１：２：４、Ｖ：Ｖ：Ｖ）中の７．５ｍＭ酢酸アンモニウムに再懸濁させ、第２ステップ乾燥抽出物をクロロホルム／メタノール中のメチルアミン（０．００３：５：１、Ｖ：Ｖ：Ｖ）の３３％エタノール溶液に再懸濁させる。液体を取り扱うすべてのステップは、液垂れ防止制御特徴を有する有機溶媒用のロボットプラットフォーム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ）をピペッティングに使用して行う。
【０７０２】
イオン源（Ａｄｖｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を装備した質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に対する直接注入により、試料を解析する。１回の取得操作で、正のイオンモードと負のイオンモードの両方で、ＭＳについてはＲｍ／ｚ＝２００＝２８００００およびタンデムＭＳ／ＭＳ実験についてはＲｍ／ｚ＝２００＝１７５００の分解能で、試料を解析する。１Ｄａ刻みでスキャンされる対応するＭＳ質量範囲を包含するインクルージョンリストにより、ＭＳ／ＭＳを始動させる（Ｓｕｒｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０１５，  Ｏｃｔ；１１７（１０）：１５４０−９）。ＭＳデータとＭＳ／ＭＳデータの両方を組み合わせて、アンモニウム付加物としてＣＥ、ＤＡＧおよびＴＡＧイオンを、酢酸付加物としてＰＣ、ＰＣ  Ｏ−を、ならびに脱プロトン化アニオンとしてＣＬ、ＰＡ、ＰＥ、ＰＥ  Ｏ−、ＰＧ、ＰＩおよびＰＳをモニターする。ＭＳのみを使用して、脱プロトン化アニオンとしてＬＰＡ、ＬＰＥ、ＬＰＥ  Ｏ−、ＬＰＩおよびＬＰＳを、酢酸としてＣｅｒ、ＨｅｘＣｅｒ、ＳＭ、ＬＰＣおよびＬＰＣ  Ｏ−をモニターする。
【０７０３】
データを、次の参考文献（Ｈｅｒｚｏｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，  ２０１１，  Ｊａｎ  １９；１２（１）：Ｒ８；Ｈｅｒｚｏｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ２０１２，  Ｊａｎ；７（１）：ｅ２９８５１）に記載されているような社内開発脂質同定ソフトウェアで解析する。シグナル対ノイズ比＞５を有し、かつ対応するブランク試料のシグナル強度より５倍大きいシグナル強度を有する脂質同定のみを、さらなるデータ解析の考慮の対象にする。
【０７０４】
フソソーム脂質組成を親細胞の脂質組成と比較する。一部の実施形態では、フソソームおよび親細胞は、親細胞中の同定脂質の＞５０％がフソソーム中に存在し、それらの同定された脂質のうち、フソソーム中のレベルが、親細胞中の対応する脂質レベルの＞２５％となる場合、同様の脂質組成を有することになる。
（実施例４２）
フソソーム中のプロテオーム組成の測定
【０７０５】
この実施例は、フソソームのタンパク質組成の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームのタンパク質組成は、それらが由来する細胞と同様になる。
【０７０６】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。フソソームを溶解緩衝剤（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中の４％（ｗ／ｖ）Ｃｈａｐ）に再懸濁させ、１５分間、室温で、時々ボルテックスしながらインキュベートする。次いで、混合物を氷浴中での５分間の超音波処理により溶解し、５分間、１３，０００ＲＰＭで遠心沈降させる。タンパク質含有量を比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定し、各試料のタンパク質を新しい管に移し、体積を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で等しくする。
【０７０７】
タンパク質を摂氏６５で１５分間、１０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、暗所において室温で３０分間、１５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化する。６体積の冷（摂氏−２０°）アセトンを徐々に添加してタンパク質を沈殿させ、−８０℃で終夜インキュベートする。タンパク質ペレットを３回、冷（摂氏−２０°）メタノールで洗浄する。タンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３に再懸濁させる。
【０７０８】
次に、消化の最初の４時間、摂氏３７で、撹拌しながらタンパク質にトリプシン／ｌｙｓＣを添加する。試料を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で希釈し、０．１％デオキシコール酸ナトリウムを消化のための追加のトリプシン／ｌｙｓＣとともに、終夜、摂氏３７で撹拌しながら添加する。消化を停止させ、２％ｖ／ｖギ酸の添加によりデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１分間の１３，０００ＲＰＭでの遠心分離により透明にする。ペプチドを逆相固相抽出（ＳＰＥ）により精製し、凍結乾燥させる。試料を、水中の３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸２０μｌで再構成し、ＬＣ−ＭＳにより解析する。
【０７０９】
定量的測定値を有するために、タンパク質標準も計器にかける。標準ペプチド（Ｐｉｅｒｃｅ、等モル濃度、ＬＣ−ＭＳグレード、＃８８３４２）を４、８、２０、４０および１００ｆｍｏｌ／μＬに希釈し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析する。タンパク質ごとに５つの最良ペプチド（３回のＭＳ／ＭＳ遷移／ペプチド）の平均ＡＵＣ（曲線下面積）を各濃度について算出して、標準曲線を作成する。
【０７１０】
取得は、エレクトロスプレーインターフェースと２５μｍのｉＤのキャピラリーを装備し、マイクロ超高速液体クロマトグラフィー（μＵＨＰＬＣ）（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）に結合されている高分解能質量分析計（ＡＢＳｃｉｅｘ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行う。計器を制御するために、ならびにデータ処理および取得のために、解析ソフトウェアを使用する。電源電圧を５．２ｋＶに設定し、２２５℃で維持し、カーテンガスを２７ｐｓｉに、ガス１を１２ｐｓｉに、ガス２を１０ｐｓｉに設定する。取得は、タンパク質データベースについては情報依存型取得（ＩＤＡ）モードで、試料についてはＳＷＡＴＨ取得モードで行う。ｉ．ｄ．が０．３μｍであり、粒子が２．７μｍであり、長さが１５０ｍｍである逆相カラム（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて、このカラムを６０℃で維持して、分離を行う。試料を５μＬループへのループ過充填により注入する。１２０分（試料）ＬＣ勾配のための３μＬ／分の流速での移動相は、次のものを含む：溶媒Ａ（水中の０．２％ｖ／ｖギ酸および３％ＤＭＳＯｖ／ｖ）および溶媒Ｂ（ＥｔＯＨ中の０．２％ｖ／ｖギ酸および３％ＤＭＳＯ）。
【０７１１】
タンパク質の絶対定量のために、タンパク質ごとに５つの最良ペプチド（ペプチドごとに３回のＭＳ／ＭＳイオン）のＡＵＣの合計を使用して標準曲線（５点、Ｒ２＞０．９９）を生成する。試料を解析するためのデータベースを生成するために、ＤＩＡＵｍｐｉｒｅアルゴリズムを１２試料の各々に関して実行し、出力ＭＧＦファイルと組み合わせて１つのデータベースにする。このデータベースをソフトウェア（ＡＢＳｃｉｅｘ）で使用して、５遷移／ペプチドおよび５ペプチド／タンパク質最大値を使用して各々の試料中のタンパク質を定量する。ペプチドは、計算されたスコアが１．５を上回ったまたはＦＤＲ＜１％を有した場合、適切に測定されたと考えられる。適切に測定されたペプチドの各々についてのＡＵＣの合計が標準曲線にマッピングされ、ｆｍｏｌとして報告される。
【０７１２】
次いで、得られたタンパク質定量データを解析して、タンパク質レベル、および次のようなタンパク質の既知クラスについての割合を決定する：酵素が、酵素（ＥＣ）番号のアノテーションが付与されているタンパク質として同定される、クラス；ＥＲ関連タンパク質が、ミトコンドリアではなくＥＲの遺伝子オントロジー（ＧＯ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）細胞内コンパートメント分類を有したタンパク質として同定される、クラス；エクソソーム関連タンパク質が、ミトコンドリアではなくエクソソームの遺伝子オントロジー細胞内コンパートメント分類を有するタンパク質として同定される、クラス；およびミトコンドリアタンパク質が、ＭｉｔｏＣａｒｔａデータベース（Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ  ２０１５ｌ  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ１００３）でミトコンドリアのものとして同定されているタンパク質として同定される、クラス。これらのカテゴリーの各々についてのモル比を、各クラス内のすべてのタンパク質のモル量の合計を各試料中のすべての同定タンパク質のモル量の合計で割って決定する。
【０７１３】
フソソームプロテオーム組成を親細胞プロテオーム組成と比較する。一部の実施形態では、同定タンパク質の＞５０％がフソソームに存在し、それらの同定タンパク質のうち、レベルが、親細胞中の対応するタンパク質レベルの＞２５％であった場合、フソソームと親細胞間で同様のプロテオーム組成が観察されることになる。
（実施例４３）
１フソソーム当たりの内因性または合成タンパク質レベルの定量
【０７１４】
この実施例は、フソソーム中の内因性または合成タンパク質カーゴの定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、内因性または合成タンパク質カーゴを含む。
【０７１５】
フソソームまたは親細胞を、内因性タンパク質の発現を変更するように、または治療用もしくは新規の細胞機能を媒介する合成カーゴを発現するように、操作する。
【０７１６】
タンパク物質のクローニングされた断片のオープンリーディングフレームとともに、ピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含み、必要に応じて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のオープンリーディングフレームに翻訳により融合されている、トランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）。エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞系特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、これらのベクターを２９３Ｔに電気穿孔する。
【０７１７】
２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ中で３〜５日間、ピューロマイシンで選択した後、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより、安定的に発現する細胞系からフソソームを調製する。
【０７１８】
内因性タンパク質の変更された発現レベル、またはＧＦＰに融合されていない合成タンパク質の発現レベルを、上で説明したような質量分析により定量する。一部の実施形態では、フソソームは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、またはそれより多くのタンパク物質分子を有することになる。
【０７１９】
あるいは、精製ＧＦＰを、２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭで段階希釈して、タンパク質濃度の標準曲線を作成する。標準曲線およびフソソーム試料のＧＦＰ蛍光を、蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）でＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して測定して、フソソーム中のＧＦＰ分子の平均モル濃度を算出する。次いで、モル濃度をＧＦＰ分子の数に変換し、１試料当たりのフソソームの数で割って１フソソーム当たりのタンパク物質分子の平均数を獲得する。
【０７２０】
一部の実施形態では、フソソームは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、またはそれより多くのタンパク物質分子を有することになる。
（実施例４４）
フソソーム中のエクソソームタンパク質のマーカーの測定
【０７２１】
このアッセイは、試料調製のプロテオーム構成の定量を記述し、エクソソームの特異的マーカーであることが公知であるタンパク質の割合を定量する。
【０７２２】
標準生体試料取り扱い手順に従って、フソソームをペレット化し、凍結状態でプロテオミクス解析センターに発送する。
【０７２３】
フソソームをタンパク質抽出および解析のために解凍する。先ず、それらを溶解緩衝剤（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中の４％（ｗ／ｖ）ｃｈａｐ）に再懸濁させ、１５分間、室温で、時々ボルテックスしながらインキュベートする。次いで、混合物を氷浴中での５分間の超音波処理により溶解し、５分間、１３，０００ＲＰＭで遠心沈降させる。全タンパク質含有量を比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により判定し、各試料の１００μｇのタンパク質を新しい管に移し、体積を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で調整する。
【０７２４】
タンパク質を摂氏６５°で１５分間、１０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、暗所で、室温で３０分間、１５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化する。次いで、６体積の冷（摂氏−２０°）アセトンを徐々に添加してタンパク質を沈殿させ、摂氏−８０°で終夜インキュベートする。
【０７２５】
タンパク質をペレット化し、冷（摂氏−２０°）メタノールで３回洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８に再懸濁させる。３．３３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣを、消化の最初の４時間、摂氏３７°で、撹拌しながらタンパク質に添加する。試料を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で希釈し、終夜、摂氏３７°で撹拌しながら０．１％デオキシコール酸ナトリウムを消化のための別の３．３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣとともに添加する。消化を停止させ、２％ｖ／ｖギ酸の添加によりデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１分間の１３，０００ＲＰＭでの遠心分離により透明にする。
【０７２６】
タンパク質を逆相固相抽出（ＳＰＥ）により精製し、凍結乾燥させる。試料を、水中の３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸で再構成し、前に説明したようにＬＣ−ＭＳにより解析する。
【０７２７】
得られたタンパク質定量データを解析して、タンパク質レベル、および公知エクソソームマーカータンパク質の割合を決定する。具体的には、テトラスパニンファミリータンパク質（ＣＤ６３、ＣＤ９、またはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ−Ｂ、またはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン−４、ミトフィリン、シンテニン−１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン−１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン−１、熱ショック７０ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）。これらのエクソソームマーカータンパク質の、測定したすべてのタンパク質に対するモル比を、上に列挙した各々の特定のエクソソームマーカータンパク質のモル量を各試料中のすべての同定タンパク質のモル量の合計で割って決定し、パーセントとして表す。
【０７２８】
同様に、すべてのエクソソームマーカータンパク質の、測定したすべてのタンパク質に対するモル比を、上に列挙したすべての特定のエクソソームマーカータンパク質のモル量の合計を各試料中のすべての同定タンパク質のモル量の合計で割って決定し、総量のパーセントとして表す。
【０７２９】
一部の実施形態では、試料は、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の５％未満、および総エクソソームマーカータンパク質の１５％未満を含むことになる。
【０７３０】
一部の実施形態では、個々のエクソソームマーカータンパク質は、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、または１０％未満で存在することになる。
【０７３１】
一部の実施形態では、すべてのエクソソームマーカータンパク質の合計は、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％未満となる。
（実施例４５）
フソソーム中のＧＡＰＤＨの測定
【０７３２】
このアッセイは、フソソーム中のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベルの定量、および親細胞と比較したフソソーム中のＧＡＰＤＨの相対レベルを記述する。
【０７３３】
ＧＡＰＤＨを、親細胞およびフソソームにおいて、ＧＡＰＤＨ用の標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ａｂ１７６６４２、Ａｂｃａｍ）を製造業者の指示書に従って使用して測定する。
【０７３４】
総タンパク質レベルを、ＧＡＰＤＨを測定するために使用した同じ体積の試料において、前述のビシンコニン酸アッセイによって同様に測定する。実施形態では、このアッセイを使用して、フソソーム中のＧＡＰＤＨの総タンパク質当たりのレベルは、＜１００ｎｇ  ＧＡＰＤＨ／（μｇ総タンパク質）となる。同様に、実施形態では、親細胞からフソソームへの総タンパク質に対するＧＡＰＤＨレベルの減少は、１０％より大きい減少となる。
【０７３５】
一部の実施形態では、（ｎｇ  ＧＡＰＤＨ）／（μｇ総タンパク質）での調製物中のＧＡＰＤＨ含有量は、５００未満、２５０未満、１００未満、５０未満、２０未満、１０未満、５未満、または１未満となる。
【０７３６】
一部の実施形態では、ＧＡＰＤＨについての総タンパク質当たりの、ｎｇ／μｇでの、親細胞から調製物への減少は、１％より大きく、２．５％より大きく、５％より大きく、１０％より大きく、１５％より大きく、２０％より大きく、３０％より大きく、４０％より大きく、５０％より大きく、６０％より大きく、７０％より大きく、８０％より大きく、または９０％より大きくなる。
【０７３７】
（実施例４６）
フソソーム中のカルネキシンの測定
【０７３８】
このアッセイは、フソソーム中のカルネキシン（ＣＮＸ）のレベルの定量、および親細胞と比較したフソソーム中のＣＮＸの相対レベルを記述する。
【０７３９】
カルネキシンを、出発細胞および調製物において、カルネキシン用の標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ＭＢＳ７２１６６８、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を製造業者の指示書に従って使用して測定する。
【０７４０】
総タンパク質レベルを、カルネキシンを測定するために使用した同じ体積の試料において、前述のビシンコニン酸アッセイによって同様に測定する。実施形態では、このアッセイを使用して、フソソーム中のカルネキシンの総タンパク質当たりのレベルは、＜１００ｎｇカルネキシン／（μｇ総タンパク質）となる。同様に、実施形態では、親細胞からフソソームへの総タンパク質に対するカルネキシンレベルの増加は、１０％より大きい増加となる。
【０７４１】
一部の実施形態では、（ｎｇカルネキシン）／（μｇ総タンパク質）での調製物中のカルネキシン含有量は、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、または１未満となる。
【０７４２】
一部の実施形態では、カルネキシンについての総タンパク質当たりの、ｎｇ／μｇでの、親細胞から調製物への減少は、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％より大きくなる。
（実施例４７）
可溶性タンパク質質量と不溶性タンパク質質量の比較
【０７４３】
この実施例は、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性：不溶性比の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性：不溶性比は、有核細胞と同様になる。
【０７４４】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。フソソーム調製物を、標準的なビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を使用して（例えば、市販のＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  製品番号２３２２５を使用して）試験して、可溶性：不溶性タンパク質比を決定する。調製したフソソームまたは親細胞を、ＰＢＳに、１×１０７細胞またはフソソーム／ｍＬの濃度で懸濁させ、１６００ｇで遠心分離してフソソームまたは細胞をペレット化することにより、可溶性タンパク質試料を調製する。上清を可溶性タンパク質画分として収集する。
【０７４５】
ペレット中のフソソームまたは細胞を、激しいピペッティングおよび２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中でのボルテックスによって溶解する。溶解した画分が、不溶性タンパク質画分に相当する。
【０７４６】
供給ＢＳＡ、１ウェル当たり０〜２０μｇのＢＳＡ、を（三重反復で）使用して、標準曲線を作成する。フソソームまたは細胞調製物を、測定量が標準の範囲内になるように希釈する。フソソーム調製物を三重反復で解析し、平均値を使用する。可溶性タンパク質濃度を不溶性タンパク質濃度で割って、可溶性：不溶性タンパク質比を得る。
【０７４７】
一部の実施形態では、フソソーム可溶性：不溶性タンパク質比は、親細胞と比較して１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内、またはそれを超えて上回る範囲内になる。
（実施例４８）
フソソーム中のＬＰＳの測定
【０７４８】
この実施例は、親細胞と比較してフソソーム中のリポ多糖（ＬＰＳ）のレベルの定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して低いＬＰＳレベルを有することになる。
【０７４９】
ＬＰＳは、細菌膜の成分であり、自然免疫応答の強力な誘導因子である。
【０７５０】
ＬＰＳ測定は、前の実施例で説明したような質量分析に基づく。
【０７５１】
一部の実施形態では、フソソームの脂質含有量の５％未満、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％またはそれ未満がＬＰＳとなる。
（実施例４９）
フソソーム中の脂質のタンパク質に対する比
【０７５２】
この実施例は、フソソーム中の脂質質量のタンパク質質量に対する比の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、有核細胞と同様である脂質質量のタンパク質質量に対する比を有することになる。
【０７５３】
総脂質含有量を、前の実施例で概要を示したリピドミクスデータセットで確認されるすべての脂質のモル含有量の合計として計算する。フソソームの総タンパク質含有量を、本明細書に記載するようなビシンコニン酸アッセイによって測定する。
【０７５４】
あるいは、脂質のタンパク質に対する比を、特定の脂質種の特定タンパク質に対する比として述べることができる。特定の脂質種を、前の実施例で生成したリピドミクスデータから選択する。特定のタンパク質を、前の実施例で生成したプロテオミクスデータから選択する。選択した脂質種およびタンパク質の種々の組合せを使用して、特定の脂質：タンパク質比を定義する。
（実施例５０）
フソソーム中のタンパク質のＤＮＡに対する比
【０７５５】
この実施例は、フソソーム中のタンパク質質量のＤＮＡ質量に対する比の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、細胞よりはるかに大きい、タンパク質質量のＤＮＡ質量に対する比を有することになる。
【０７５６】
フソソームおよび細胞の総タンパク質含有量を、前の実施例で説明したように測定する。フソソームおよび細胞のＤＮＡ質量を、前の実施例で説明したように測定する。次いで、典型的なフソソーム調製物について総タンパク質含有量を総ＤＮＡ含有量で割って所与の範囲内の比を得ることにより、タンパク質の総核酸に対する比を決定する。
【０７５７】
あるいは、半定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＧＡＰＤＨなどの特定のハウスキーピング遺伝子のレベルに応じて核酸レベルを定義することにより、タンパク質の核酸に対する比を決定する。
【０７５８】
次いで、典型的なフソソーム調製物について総タンパク質含有量を総ＧＡＰＤＨ  ＤＮＡ含有量で割ってタンパク質：核酸比の特定の範囲を定義することにより、タンパク質のＧＡＰＤＨ核酸に対する比を決定する。
（実施例５１）
フソソーム中の脂質のＤＮＡに対する比
【０７５９】
この実施例は、親細胞と比較してフソソーム中の脂質のＤＮＡに対する比の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して大きい、脂質のＤＮＡに対する比を有することになる。
【０７６０】
この比を、総脂質含有量（上の実施例で概要を示した）または特定の脂質種に応じて定義する。特定の脂質種の場合、範囲は、選択される特定の脂質種に依存する。特定の脂質種を、前述の実施例で生成したリピドミクスデータから選択する。核酸含有量を、前述の実施例で説明したように決定する。
【０７６１】
核酸含有量に正規化した選択脂質種の種々の組合せを使用して、特定のフソソーム調製物に特徴的な特異的脂質：核酸比を定義する。
（実施例５２）
フソソーム上の表面マーカーの解析
【０７６２】
このアッセイは、フソソーム上の表面マーカーの同定を記述する。
【０７６３】
標準生体試料取り扱い手順に従って、フソソームをペレット化し、凍結状態でプロテオミクス解析センターに発送する。
【０７６４】
フソソーム上の表面マーカーの存在または非存在を同定するために、それらをホスファチジルセリンおよびＣＤ４０リガンドに対するマーカーで染色し、ＦＡＣＳシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリーにより解析する。表面ホスファチジルセリンの検出のために、アネキシンＶアッセイ（５５６５４７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて製造業者により説明されたとおりに生成物を解析する。
【０７６５】
手短に述べると、フソソームを冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１×結合緩衝剤に１×１０６フソソーム／ｍＬの濃度で再懸濁させる。再懸濁液の１０％を５ｍＬ培養管に移し、５μｌのＦＩＴＣアネキシンＶを添加する。細胞を穏やかにボルテックスし、１５分間、室温（２５℃）で、暗所でインキュベートする。
【０７６６】
並行して、再懸濁液の別の１０％を異なる管に移し、これは、未染色対照としての役割を果たす。１×結合緩衝剤を各管に添加する。試料を１時間以内にフローサイトメトリーにより解析する。
【０７６７】
一部の実施形態では、このアッセイを使用して、染色されたフソソームの集団の平均値は、未染色細胞の平均値より上であると判定されることになり、これは、フソソームがホスファチジルセリンを含むことを示す。
【０７６８】
同様に、ＣＤ４０リガンドについては、洗浄したフソソームの別の１０％に、次のモノクローナル抗体：ＰＥ−ＣＦ５９４マウス抗ヒトＣＤ１５４クローンＴＲＡＰ１（５６３５８９、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って添加する。手短に述べると、飽和量の抗体を使用する。並行して、フソソームの別の１０％を異なる管に移し、これは、未染色対照としての役割を果たす。これらの管を５分間、４００×ｇで、室温で遠心分離する。上清をデカントし、ペレットをフローサイトメトリー洗浄溶液で２回洗浄する。０．５ｍＬの１％パラホルムアルデヒド固定剤を各管に添加する。各々を短時間ボルテックスし、フローサイトメーターでの解析まで４℃で保管する。
【０７６９】
一部の実施形態では、このアッセイまたは同等のアッセイを使用して、染色されたフソソームの集団の平均値は、未染色細胞の平均値より上であることになり、これは、フソソームがＣＤ４０リガンドを含むことを示す。
（実施例５３）
フソソーム中のウイルスキャプシドタンパク質の解析
【０７７０】
このアッセイは、試料調製物の構成の解析を記述し、ウイルスキャプシド源に由来するタンパク質の割合を評定する。
【０７７１】
標準生体試料取り扱い手順に従って、フソソームをペレット化し、凍結状態でプロテオミクス解析センターに発送する。
【０７７２】
フソソームをタンパク質抽出および解析のために解凍する。先ず、それらを溶解緩衝剤（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中の４％（ｗ／ｖ）ｃｈａｐ）に再懸濁させ、１５分間、室温で、時々ボルテックスしながらインキュベートする。次いで、混合物を氷浴内での５分間の超音波処理により溶解し、５分間、１３，０００ＲＰＭで遠心沈降させる。全タンパク質含有量を比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により判定し、各試料の１００μｇのタンパク質を新しい管に移し、体積を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で調整する。
【０７７３】
タンパク質を摂氏６５°で１５分間、１０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、暗所で、室温で３０分間、１５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化する。次いで、６体積の冷（摂氏−２０°）アセトンを徐々に添加してタンパク質を沈殿させ、摂氏−８０°で終夜インキュベートする。
【０７７４】
タンパク質をペレット化し、冷（摂氏−２０°）メタノールで３回洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８に再懸濁させる。３．３３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣを、消化の最初の４時間、摂氏３７°で、撹拌しながらタンパク質に添加する。試料を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で希釈し、終夜、摂氏３７°で撹拌しながら０．１％デオキシコール酸ナトリウムを消化のための別の３．３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣとともに添加する。消化を停止させ、２％ｖ／ｖギ酸の添加によりデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１分間の１３，０００ＲＰＭでの遠心分離により透明にする。
【０７７５】
タンパク質を逆相固相抽出（ＳＰＥ）により精製し、凍結乾燥させる。試料を、前に説明したように、水中の３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸で再構成してＬＣ−ＭＳにより解析する。
【０７７６】
ウイルスキャプシドタンパク質の、測定したすべてのタンパク質に対するモル比を、すべてのウイルスキャプシドタンパク質のモル量を各試料中のすべての同定タンパク質のモル量の合計で割って決定し、パーセントとして表す。
【０７７７】
一部の実施形態では、この手法または同等の手法を使用して、試料は、１０％未満のウイルスキャプシドタンパク質を含むことになる。一部の実施形態では、試料は、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満のウイルスキャプシドタンパク質を含むことになる。
（実施例５４）
標的細胞との融合の測定
【０７７８】
この実施例は、非標的細胞と比較して標的細胞とのフソソーム融合の定量を説明する。
【０７７９】
一部の実施形態では、標的細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞のサイトゾルへの、フソソームの内腔内に担持されたカーゴの、細胞特異的送達を可能にする。本明細書に記載の方法により産生したフソソームを、標的細胞との融合速度について下記のとおりアッセイする。
【０７８０】
この実施例では、フソソームは、その原形質膜上にミオメーカーを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。加えて、フソソームは、ｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ミオメーカーとミオミキサーの両方を発現する筋芽細胞であり、非標的細胞は、ミオメーカーもミオミキサーも発現しない線維芽細胞である。ミオメーカー発現フソソームは、非標的細胞ではなく、ミオメーカーとミオミキサーの両方を発現する標的細胞と融合すると予測される（Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ８，  １５６６５．  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５６６５）（Ｍｉｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４９９（７４５８），  ３０１−３０５．  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）。標的細胞型と非標的細胞型の両方をマウスから単離し、これらの細胞型は、Ｃｒｅによる組換え時にｔｄＴｏｍａｔｏ発現をオンにする（これは、融合を示す）ＣＭＶプロモーターのもとで「ＬｏｘＰ−ｓｔｏｐ−Ｌｏｘｐ−ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを安定的に発現する。
【０７８１】
標的または非標的レシピエント細胞を、黒色の透明底９６ウェルプレートに播種する。標的細胞と非標的細胞の両方を種々の融合群のために播種する。次に、レシピエント細胞の播種の２４時間後に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質およびミオメーカーを発現するフソソームを、ＤＭＥＭ培地中の標的または非標的レシピエント細胞に適用する。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関する。フソソームの適用後、細胞プレートを４００ｇで５分間、遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞間の接触の開始を助長する。
【０７８２】
フソソーム適用後４時間の時点で開始して、細胞ウェルをイメージングして、視野またはウェル内のＲＦＰ陽性細胞をＧＦＰ陽性細胞と対比して陽性同定する。
【０７８３】
この実施例では、自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−ａｕｔｏｍａｔｅｄ−ｃｅｌｌ−ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ−ｆｘ−ａｕｔｏｍａｔｅｄ−ｌｉｖｅ−ｃｅｌｌ−ｉｍａｇｅｒ／）を使用して細胞プレートをイメージングする。先ず、ＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で細胞を１０分間染色することにより、所与のウェル内の全細胞集団を判定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、ＤＮＡへのインターカレーションにより細胞核を染色するので、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を使用して個々の細胞を同定する。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に置換する。
【０７８４】
４０５ｎｍ  ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して、Ｈｏｅｃｈｓｔをイメージングする。４６５ｎｍ  ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用してＧＦＰをイメージングし、その一方で、５２３ｎｍ  ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用してＲＦＰをイメージングする。先ず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームではなくＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処置したレシピエント細胞を用いてＬＥＤ強度および積分時間を確立することにより、標的および非標的細胞ウェルの画像を取得する。
【０７８５】
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰ強度が飽和値ではなく最大画素強度値での強度になるように設定する。次いで、確立した設定を使用して、目的のウェルをイメージングする。ウェルを４時間ごとにイメージングして、融合活性の速度についての経時的データを取得する。
【０７８６】
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの解析は、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアまたは他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，  Ｗ．Ｓ．，  ＩｍａｇｅＪ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ，  ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，  １９９７−２００７）を用いて行う。
【０７８７】
６０μｍ幅でローリングボールバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して画像を前処理する。全細胞マスクをＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定する。バックグラウンド強度より有意に高いＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞を閾値化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞であるには小さ過ぎるまたは大き過ぎるエリアを除外する。
【０７８８】
全細胞マスクの中で、バックグラウンドより有意に高い細胞について再び閾値化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞蛍光全体を含むように細胞エリア全体に拡大することにより、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞を同定する。標的または非標的レシピエント細胞を含有する対照ウェルにおいて同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含有するウェルにおけるＲＦＰ陽性細胞の数から減算する（非特異的Ｌｏｘｐ組換えについて減算する）。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（融合したレシピエント細胞）の数を、各時点でのＧＦＰ陽性細胞（融合していないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団内のフソソーム融合速度を定量する。速度を、レシピエント細胞に適用したフソソームの所与の用量に正規化する。標的化された融合（標的とされた細胞へのフソソーム融合）速度については、非標的細胞への融合速度を標的細胞への融合速度から減算して、標的化された融合の速度を定量する。
一部の実施形態では、フソソームと標的細胞の平均融合速度は、標的細胞融合について毎時０．０１〜４．０のＲＦＰ／ＧＦＰ細胞の範囲内となるか、またはフソソームと非標的レシピエント細胞より少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれより高くなる。一部の実施形態では、フソソームを適用しない群は、毎時＜０．０１のＲＦＰ／ＧＦＰ細胞というバックグラウンド速度を示すことになる。
（実施例５５）
膜タンパク質を送達するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ融合
【０７８９】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞への活性膜タンパク質の送達をもたらす。
【０７９０】
この実施例では、センダイウイルスＨＶＪ−Ｅタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４），  １−８．  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２）からフソソームを生成する。一部の実施形態では、主として筋肉および脂肪組織に見られ、細胞へのグルコースのインスリン調節輸送に関与する膜タンパク質であるＧＬＵＴ４を発現するように、フソソームを生成する。ＧＬＵＴ４を有するおよび有さないフソソームを、記載したようなＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、前の実施例で説明した方法のいずれかによって調製する。
【０７９１】
次いで、ＧＬＵＴ４を発現するフソソーム、ＧＬＵＴ４を発現しないフソソーム、ＰＢＳ（陰性対照）、またはインスリン（陽性対照）で、Ｃ２Ｃ１２細胞などの筋肉細胞を処置する。Ｃ２Ｃ１２細胞上のＧＬＵＴ４の活性を、蛍光２−デオキシグルコースアナログである２−［Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ｄｉａｘｏｌ）−４−イル）アミノ］−２−デオキシグルコース（２−ＮＢＤＧ）の取込みにより測定する。Ｃ２Ｃ１２細胞の蛍光を、前の実施例で説明した方法を使用して顕微鏡観察によって評定する。
【０７９２】
一部の実施形態では、ＧＬＵＴ４およびインスリンを発現するフソソームで処置したＣ２Ｃ１２細胞は、ＰＢＳでまたはＧＬＵＴ４を発現しないフソソームで処置されるＣ２Ｃ１２細胞と比較して蛍光の増加を明示すると予想される。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９，  １６０５６０４，  ２０１７も参照されたい。
（実施例５６）
膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ送達
【０７９３】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞とのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞への活性膜タンパク質の送達をもたらす。
【０７９４】
この実施例では、センダイウイルスＨＶＪ−Ｅタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、前の実施例におけるようにフソソームを生成する。一部の実施形態では、膜タンパク質であるＧＬＵＴ４を発現するように、フソソームを生成する。ＧＬＵＴ４を有するおよび有さないフソソームを、記載したようなＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、前の実施例で説明した方法のいずれかによって調製する。
【０７９５】
ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウスに、ＧＬＵＴ４を発現するフソソーム、ＧＬＵＴ４を発現しないフソソーム、またはＰＢＳ（陰性対照）を投与する。マウスの前脛骨筋にフソソームまたはＰＢＳを筋肉内注射する。フソソーム投与の直前に、マウスを１２時間絶食させ、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴイメージング）を可能にするグルコースのアナログである［１８Ｆ］２−フルオロ−２−デオキシ−ｄ−グルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）を注射する。麻酔（２％イソフルラン）下のマウスに尾静脈経由で１８Ｆ−ＦＤＧを注射する。ＰＥＴイメージングは、ナノスケールイメージングシステム（１Ｔ、Ｍｅｄｉｓｏ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して行う。フソソームの投与の４時間後にイメージングを行う。イメージングの直後に、マウスを屠殺し、前脛骨筋を計量する。すべての補正オン、高度な正則化、および８回の反復での、フルの検出器モードで３Ｄイメージングシステムを使用して、ＰＥＴ画像を再構成する。イメージングソフトウェアパッケージ（Ｍｅｄｉｓｏ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用し、標準取込値（ＳＵＶ）解析を適用して、再構成画像の三次元関心体積（ＶＯＩ）解析を行う。２ｍｍ径の球体で固定したＶＯＩを、前脛骨筋部位について描く。各ＶＯＩ部位のＳＵＶを、次の式を使用して算出する：ＳＵＶ＝（Ｂｑ／ｃｃ×体重として測定される、関心体積の放射能）／注射した放射能。
【０７９６】
一部の実施形態では、ＧＬＵＴ４を発現するフソソームを投与したマウスは、ＰＢＳを投与したまたはＧＬＵＴ４を発現しないフソソームを投与したマウスと比較して、ＶＯＩにおける放射能シグナルの増加を明示すると予想される。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９，  １６０５６０４，  ２０１７も参照されたい。
（実施例５７）
血管からの溢出の測定
【０７９７】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏマイクロ流体システム（Ｊ．Ｓ  Ｊｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３，  ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５６９１０）で試験した場合の、内皮単層を介したフソソーム溢出の定量を説明する。
【０７９８】
細胞は、血管系から周囲組織に溢出する。理論により拘束されることを望まないが、溢出は、フソソームが血管外組織に到達する１つの方法である。
【０７９９】
システムは、ＥＣＭ模倣ゲルを注入することができるチャンバーによって隔てられている、独立して対応可能な３つの媒体チャネルを含む。手短に述べると、マイクロ流体システムは、マイクロ流体チャネルを形成するために、取り出し口が開けられ、カバーガラスに接着されている、成形ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン；Ｓｉｌｇａｒｄ  １８４；Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＭＩ）を有する。チャネル断面寸法は、１ｍｍ（幅）×１２０μｍ（高さ）である。マトリックス接着を増強するために、ＰＤＭＳチャネルは、ＰＤＬ（ポリ−Ｄ−リシン臭化水素酸塩；１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液でコーティングされている。
【０８００】
次に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）とＮａＯＨとを含有するＩ型コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）を、４つの別個の充填口経由でデバイスのゲル領域に注入し、３０分間インキュベートしてヒドロゲルを形成する。ゲルが重合されたら、直ちに内皮細胞培地（ＬｏｎｚａまたはＳｉｇｍａなどの供給業者から入手したもの）をピペットでチャネルに移して、ゲルの脱水を防止する。培地を吸引し次第、希釈ヒドロゲル（ＢＤ  ｓｃｉｅｎｃｅ）溶液（３．０ｍｇ／ｍＬ）を細胞チャネルに導入し、冷培地を使用して過剰なヒドロゲル溶液を洗浄除去する。
【０８０１】
内皮細胞を中央のチャネルに導入し、放置して沈降させて内皮を形成する。内皮細胞播種の２日後、フソソームまたはマクロファージ細胞（陽性対照）を、内皮細胞が完全単層を形成した同じチャネルに導入する。フソソームを導入し、そうするとフソソームは単層に接着し、単層を越えてゲル領域に遊出する。培養物を３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内に保持する。フソソームのＧＦＰ発現バージョンを使用して、蛍光顕微鏡観察による生細胞イメージングを可能にする。翌日、チャンバー内で、細胞を固定し、ＤＡＰＩ染色を使用して核を染色し、共焦点顕微鏡を使用して複数の関心領域をイメージングして、内皮単層を通過したフソソームの数を判定する。
【０８０２】
一部の実施形態では、ＤＡＰＩ染色は、フソソームおよび陽性対照細胞が播種後に内皮バリアを通過することができることを示すことになる。
（実施例５８）
走化性細胞可動性の測定
【０８０３】
この実施例は、フソソーム走化性の定量を説明する。細胞は、走化性によって化学勾配に近づくことまたは化学勾配から離れることができる。一部の実施形態では、走化性は、フソソームが傷害部位にホーミングすることまたは病原体を追跡することを可能にする。前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生したような精製フソソーム組成物を、その走化性能力について以下のようにアッセイする。
【０８０４】
フソソームまたはマクロファージ細胞（陽性対照）の十分な数を、製造業者提供のプロトコールに従ってマイクロスライドウェル内のＤＭＥＭ培地にローディングする（ｉｂｉｄｉ．ｃｏｍ／ｉｍｇ／ｃｍｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌａｂｗａｒｅ／ｃｈａｎｎｅｌ＿ｓｌｉｄｅｓ／Ｓ＿８０３２×＿Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ／ＩＮ＿８０３２×＿Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．ｐｄｆ）。フソソームを３７℃および５％ＣＯ２で１時間放置して接着させる。細胞接着後、ＤＭＥＭ（陰性対照）、またはＭＣＰ１走化性因子を含有するＤＭＥＭを、中央チャネルの隣接リザーバーにローディングし、Ｚｅｉｓｓ倒立広視野顕微鏡を使用してフソソームを２時間、連続的にイメージングする。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，  Ｗ．Ｓ．，  ＩｍａｇｅＪ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ，  ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，  １９９７−２００７）を使用して画像を解析する。観察されたフソソームまたは細胞各々についての移動座標データを手動追跡プラグイン（Ｆａｂｒｉｃｅ  Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ、Ｏｒｓａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）で取得する。走化性プロットおよび遊走速度をＣｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ（ｉｂｉｄｉ）で決定する。
【０８０５】
一部の実施形態では、フソソームの平均累積距離および遊走速度は、ケモカインに対する陽性対照細胞の応答を、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内またはそれを超えて上回ることになる。ケモカインに対する細胞の応答は、例えば、Ｈｏｗａｒｄ  Ｅ．  Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ４（１）：  ４７−５９，  ２００９に記載されている。
（実施例５９）
ホーミングする可能性の測定
【０８０６】
この実施例は、傷害部位へのフソソームのホーミングを説明する。細胞は、遠位部位から遊走することおよび／または特定の部位に蓄積することができ、例えば、ある部位にホーミングすることができる。典型的に、部位は、傷害部位である。一部の実施形態では、フソソームは、傷害部位にホーミングする、例えば、傷害部位に遊走するまたは傷害部位に蓄積することになる。
【０８０７】
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、滅菌食塩水中の、筋毒素であるノテキシン（ＮＴＸ）（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ）を、２μｇ／ｍＬの濃度で、３０Ｇ針を使用する右前脛骨（ＴＡ）筋への筋肉内（ＩＭ）注射によって投与する。前脛骨（ＴＡ）筋の上にある皮膚を、化学的除毛剤を４５秒間使用してそのエリアを脱毛すること、その後、水で３回すすぐことによって準備する。この濃度は、筋線維の最大の変性ならびにそれらの衛星細胞、運動軸索および血管への最小の損傷を確実にするために選択する。
【０８０８】
ＮＴＸ注射後１日目に、マウスに、ホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは細胞のＩＶ注射を施す。ホタルルシフェラーゼを安定的に発現する細胞から前の実施例で説明した方法のいずれか１つによりフソソームを産生する。注射後０、１、３、７、２１および２８の時点で生物発光イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して動物全体の生物発光画像を得る。
【０８０９】
ルシフェラーゼを可視化するために、イメージングの５分前に１５０ｍｇ／ｋｇの用量の生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の腹腔内注射をマウスに施す。イメージングシステムを較正してすべてのデバイス設定を補正する。生物発光シグナルを、Ｒａｄｉａｎｃｅ  Ｐｈｏｔｏｎｓを使用して測定し、全光束を測定値として使用する。関心領域（ＲＯＩ）を、ＲＯＩのシグナルを囲むことにより生成して、光子数／秒で値を得る。ＲＯＩを、ＮＴＸで処置したＴＡ筋と対側ＴＡ筋の両方に関して評定し、ＮＴＸ処置ＴＡ筋とＮＴＸ未処置ＴＡ筋の間の光子数／秒の比を、ＮＴＸ処置筋へのホーミングの尺度として算出する。
【０８１０】
一部の実施形態では、フソソームおよび細胞におけるＮＴＸ処置ＴＡ筋とＮＴＸ未処置ＴＡ筋の間の光子数／秒の比は１より大きくなり、これは、傷害位置でのルシフェラーゼ発現フソソームの部位特異的蓄積を示す。
【０８１１】
例えば、Ｐｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ３４（５）Ｌ  ５７７−８５，  ２００６を参照されたい。
（実施例６０）
食作用活性の測定
【０８１２】
この実施例は、フソソームの食作用活性を実証する。一部の実施形態では、フソソームは、食作用活性を有し、例えば、ファゴサイトーシスすることができる。細胞は、粒子を貪食するファゴサイトーシスを行い、かくて細菌のような外来侵入物または死細胞の隔離および破壊を可能にする。
【０８１３】
部分的にまたは完全に核不活性化された哺乳動物マクロファージからのフソソームを含む、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生した精製フソソーム組成物には、病原体生体粒子によってアッセイして、ファゴサイトーシスすることができた。この評価は、下記のプロトコールによる蛍光ファゴサイトーシスアッセイを使用することにより行った。
【０８１４】
マクロファージ（陽性対照）およびフソソームを回収後直ちに別個の共焦点ガラス底ディッシュに播種した。マクロファージおよびフソソームをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ中で１時間インキュベートして接着させた。フルオレセイン標識Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２および非フルオレセイン標識Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２（陰性対照）を製造業者のプロトコールに示されているとおりにマクロファージ／フソソームに添加し、２時間インキュベートした、ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆ。２時間後、トリパンブルーを添加することにより遊離蛍光粒子をクエンチした。貪食された粒子により発光された細胞内蛍光を４８８励起で共焦点顕微鏡観察によりイメージングした。イメージＪソフトウェアを使用して、ファゴサイトーシス陽性フソソームの数を定量した。
【０８１５】
ファゴサイトーシス性フソソームの平均数は、生体粒子導入の２時間後に少なくとも３０％であり、陽性対照マクロファージでは３０％より多かった。
（実施例６１）
血液脳関門の細胞膜を横断する能力の測定
【０８１６】
この実施例は、血液脳関門を横断するフソソームの定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、例えば中枢神経系への送達のために、血液脳関門を横断することになる、例えば、血液脳関門に侵入し、血液脳関門から退出することになる。
【０８１７】
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは白血球（陽性対照）を静脈内注射する。ホタルルシフェラーゼを安定的に発現する細胞またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより、フソソームを産生する。生物発光イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、フソソームまたは細胞注射後１、２、３、４、５、６、８、１２および２４時間の時点で動物全体の生物発光画像を得る。
【０８１８】
ルシフェラーゼを可視化するために、イメージングの５分前に１５０ｍｇ／ｋｇの用量の生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の腹腔内注射をマウスに施す。イメージングシステムを較正してすべてのデバイス設定を補正する。生物発光シグナルを測定し、全光束を測定値として使用する。関心領域（ＲＯＩ）を、ＲＯＩのシグナルを囲むことにより生成して、光子数／秒で値を得る。選択するＲＯＩは、脳を含むエリア周辺のマウス頭部である。
【０８１９】
一部の実施形態では、ＲＯＩの光子数／秒は、ルシフェラーゼを発現しない陰性対照フソソームよりルシフェラーゼを発現する細胞またはフソソームを注射した動物におけるほうが高くなり、これは、脳内または脳周辺でのルシフェラーゼ発現フソソームの蓄積を示す。
（実施例６２）
タンパク質分泌の可能性の測定
【０８２０】
この実施例は、フソソームによる分泌の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームには、分泌能力、例えばタンパク質分泌能力があるだろう。細胞は、分泌によって物質を処分または排出することができる。一部の実施形態では、フソソームは、それらの環境内で分泌によって化学的に相互作用し、通信することになる。
【０８２１】
所与の速度でタンパク質を分泌するフソソームの能力を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイ（カタログ番号１６１５８）を使用して判定する。マウス胚性線維芽細胞（陽性対照）または前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生されるフソソームを増殖培地中でインキュベートし、先ず１６００ｇで５分間のフソソームのペレット化、次いで上清の収集により、培地の試料を１５分ごとに収集する。収集した試料をピペットで透明底９６ウェルプレートに移す。次いで、アッセイ緩衝剤の作業溶液を、製造業者の使用説明書に従って調製する。
【０８２２】
手短に述べると、セレンテラジン（ｃｏｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）、ルシフェリンまたは発光分子をフラッシュアッセイ緩衝剤と混合し、混合物を、試料が入っている９６ウェルプレートの各ウェルにピペットで移す。細胞またはフソソームを欠く陰性対照ウェルは、バックグラウンドガウシアルシフェラーゼシグナルを判定するために、増殖培地またはアッセイ緩衝剤を含む。加えて、精製ガウシアルシフェラーゼ（Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０３０８）の標準曲線を作成して、発光シグナルを１時間当たりのガウシアルシフェラーゼ分泌分子数に変換する。
【０８２３】
５００ミリ秒積分を使用して、プレートを発光についてアッセイする。バックグラウンドガウシアルシフェラーゼシグナルをすべての試料から減算し、次いで、線形最良適合曲線をガウシアルシフェラーゼ標準曲線について算出する。試料の表示数値が標準曲線内に収まらなかった場合、それらを適切に希釈し、再アッセイする。このアッセイを使用して、所与の範囲内の速度（分子数／時）でガウシアルシフェラーゼを分泌するフソソームの能力を判定する。
【０８２４】
一部の実施形態では、フソソームは、陽性対照細胞より１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれを超えて高い速度でタンパク質を分泌することができるだろう。
（実施例６３）
シグナル伝達の可能性の測定
【０８２５】
この実施例は、フソソームにおけるシグナル伝達の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、シグナル伝達することができる。細胞は、シグナル伝達として公知のプロセスでリン酸化などのシグナル伝達カスケードによって、分子シグナルを送信することおよび細胞外環境から分子シグナルを受信することができる。部分的にまたは完全に核不活性化された哺乳動物細胞からのフソソームを含む、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される精製フソソーム組成物は、インスリンにより誘導されてシグナル伝達することができる。インスリンにより誘導されるシグナル伝達は、ＡＫＴリン酸化レベル、インスリン受容体シグナル伝達カスケードの肝要な経路、およびインスリンに応答してのグルコース取込みを測定することにより評定される。
【０８２６】
ＡＫＴリン酸化を測定するために、細胞、例えばマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（陽性対照）、およびフソソームを、４８ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内に２時間放置する。細胞接着後、インスリン（例えば、１０ｎＭで）、またはインスリンを含有しない陰性対照溶液を、細胞またはフソソームを含有するウェルに添加し３０分間おく。３０分後、タンパク質溶解物がフソソームまたは細胞から生成されるので、インスリン刺激試料および対照非刺激試料におけるリン酸化ＡＫＴレベルをウエスタンブロット法により測定する。
【０８２７】
インスリンまたは陰性対照溶液に応答してのグルコース取込みを、標識グルコース（２−ＮＢＤＧ）を使用することにより、グルコース取込みセクションで説明されているように測定する。（Ｓ．  Ｇａｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５（２）：  ８１９−８２９，  ２００５）。
【０８２８】
一部の実施形態では、フソソームは、インスリンに応答してＡＫＴリン酸化およびグルコース取込みを、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれより大きく陰性対照を上回って、増進することになる。
（実施例６４）
細胞膜を越えてグルコースを輸送する能力の測定
【０８２９】
この実施例は、生細胞におけるグルコース取込みをモニターし、したがって脂質二重層を介した能動輸送を測定するために使用することができる蛍光グルコースアナログである２−ＮＢＤＧ（２−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース）のレベルの定量を説明する。一部の実施形態では、このアッセイまたは同等のアッセイを使用して、フソソームの脂質二重層を介したグルコース取込みおよび能動輸送レベルを測定することができる。
【０８３０】
フソソーム組成物を、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生する。次いで、十分な数のフソソームを、グルコースを含有せず、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で、２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。２時間のグルコース飢餓期間の後、培地を、グルコースを含有せず、２０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２０μＭ  ２−ＮＢＤＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＤＭＥＭを含むように交換し、もう２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。
【０８３１】
陰性対照フソソームには、２−ＮＢＤＧの代わりに同量のＤＭＳＯを添加することを除いて同じ処置を施す。
【０８３２】
次いで、フソソームを１×ＰＢＳで３回洗浄し、適切な緩衝剤に再懸濁させ、９６ウェルイメージングプレートに移す。次いで、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光光度計で２−ＮＢＤＧ蛍光を測定して、１時間のローディング期間中にフソソーム膜を越えて輸送されてフソソーム内に蓄積された２−ＮＢＤＧの量を定量する。
【０８３３】
一部の実施形態では、２−ＮＢＤＧ蛍光は、陰性（ＤＭＳＯ）対照と比較して２−ＮＢＤＧで処置したフソソームにおけるほうが高くなる。５２５／３９発光フィルターでの蛍光測定量は、存在する２−ＮＢＤＧ分子の数と相関することになる。
（実施例６５）
フソソームの内腔は水溶液と混和性である
【０８３４】
この実施例は、フソソーム内腔と水などの水溶液の混和性を評定する。
【０８３５】
フソソームを前の実施例で説明したように調製する。対照は、低浸透圧溶液、高浸透圧溶液または正常浸透圧溶液のいずれかを伴う透析膜である。
【０８３６】
フソソーム、陽性対照（正常浸透圧溶液）および陰性対照（低浸透圧溶液）を低浸透圧溶液（１５０ｍＯｓｍｏｌ）とともにインキュベートする。各試料を水溶液に曝露した後、細胞サイズを顕微鏡下で測定する。一部の実施形態では、低浸透圧溶液中のフソソームおよび陽性対照サイズは、陰性対照と比較して増加する。
【０８３７】
フソソーム、陽性対照（正常浸透圧溶液）および陰性対照（高浸透圧溶液）を高浸透圧溶液（４００ｍＯｓｍｏｌ）とともにインキュベートする。各試料を水溶液に曝露した後、細胞サイズを顕微鏡下で測定する。一部の実施形態では、高浸透圧溶液中のフソソームおよび陽性対照サイズは、陰性対照と比較して減少する。
【０８３８】
フソソーム、陽性対照（低浸透圧または高浸透圧溶液）および陰性対照（正常浸透圧）を正常浸透圧溶液（２９０ｍＯｓｍｏｌ）とともにインキュベートする。各試料を水溶液に曝露した後、細胞サイズを顕微鏡下で測定する。一部の実施形態では、正常浸透圧溶液中のフソソームおよび陽性対照サイズは、陰性対照と比較して実質的に同じままとなる。
（実施例６６）
サイトゾルにおけるエステラーゼ活性の測定
【０８３９】
この実施例は、フソソームにおける、代謝活性の代わりとしての、エステラーゼ活性の定量を説明する。フソソームにおけるサイトゾルエステラーゼ活性を、カルセインＡＭ染色の定量的評定（Ｂｒａｔｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ６６（１）：  ７８−８４，  ２００５）により判定する。
【０８４０】
膜透過性色素であるカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を、ジメチルスルホキシド中１０ｍＭの原液として、およびＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４中１００ｍＭの作業溶液として調製する。前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生されるフソソーム、または陽性対照親マウス胚性線維芽細胞を、ＰＢＳ緩衝剤に懸濁させ、３０分間、カルセインＡＭ作業溶液（カルセインＡＭの最終濃度：５ｍＭ）とともに３７℃で、暗所でインキュベートし、次いで、カルセイン蛍光保持の即時フローサイトメトリー解析のためにＰＢＳ緩衝剤で希釈する。
【０８４１】
フソソームおよび対照親マウス胚性線維芽細胞を、ゼロエステラーゼ活性についての陰性対照として、（Ｊａｃｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １２（６）：  ５５０−５５８，  １９９１）に記載されているようにサポニンで実験的に透過処理する。フソソームおよび細胞を、０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．４中１％のサポニン溶液中で１５分間インキュベートする。原形質膜透過処理の可逆的性質のため、さらなる染色および洗浄ステップに使用するすべての緩衝剤にサポニンを含める。サポニン透過処理後、フソソームおよび細胞を、０．１％サポニンと０．０５％アジ化ナトリウムとを含有するＰＢＳ緩衝剤に懸濁させ、カルセインＡＭとともにインキュベート（暗所で４５分間３７℃）して５ｍＭの最終濃度にし、０．１％サポニンと０．０５％アジ化ナトリウムとを含有する同じＰＢＳ緩衝剤で３回洗浄し、フローサイトメトリーにより解析する。フローサイトメトリー解析を、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で４８８ｎｍアルゴンレーザー励起を用いて行い、発光を５３０＋／−３０ｎｍで収集する。ＦＡＣＳソフトウェアを、取得および解析に使用する。光散乱チャネルをリニアゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールに設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を解析する。相対エステラーゼ活性を、各試料におけるカルセインＡＭの強度に基づいて算出する。すべてのイベントを前方および側方散乱チャネルで取得する（あるいは、ゲートをかけてフソソーム集団のみを選択することができる）。フソソームについての蛍光強度（ＦＩ）値は、それぞれの陰性対照サポニン処置試料のＦＩ値を減算することにより決定する。フソソーム試料についての正規化エステラーゼ活性をそれぞれの陽性対照細胞試料に正規化して、サイトゾルエステラーゼ活性の定量的測定値を生じさせる。
【０８４２】
一部の実施形態では、フソソーム調製物は、陽性対照細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内またはそれより大きいエステラーゼ活性を有することになる。
【０８４３】
Ｂｒａｔｏｓｉｎ  Ｄ，  Ｍｉｔｒｏｆａｎ  Ｌ，  Ｐａｌｉｉ  Ｃ，  Ｅｓｔａｑｕｉｅｒ  Ｊ，  Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ  Ｊ．  Ｎｏｖｅｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ．  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．  ２００５  Ｊｕｌ；６６（１）：７８−８４；およびＪａｃｏｂ  ＢＣ，  Ｆａｖｒｅ  Ｍ，  Ｂｅｎｓａ  ＪＣ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓａｐｏｎｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １９９１；１２：５５０−５５８も参照されたい。
（実施例６７）
フソソームにおけるアセチルコリンエステラーゼ活性の測定
【０８４４】
キット（ＭＡＫ１１９、ＳＩＧＭＡ）を以前に記載された手順（Ｅｌｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７，  ８８，  １９６１）に従って使用して、および製造業者の推奨手順に従って、アセチルコリンエステラーゼ活性を測定する。
【０８４５】
手短に述べると、フソソームをＰＢＳ、ｐＨ８中の１．２５ｍＭアセチルチオコリンに懸濁させ、ＰＢＳ、ｐＨ７中の０．１ｍＭ  ５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）と混合する。インキュベーションを室温で行うが、光学密度読取りを開始する前に１０分間、フソソームおよび基質溶液を３７℃で予温する。
【０８４６】
吸収の変化を、プレートリーダー分光光度計（ＥＬＸ８０８、ＢＩＯ−ＴＥＫ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）で１０分間、４５０ｎｍでモニターする。別途、試料を、正規化のためのビシンコニン酸アッセイによるフソソームのタンパク質含有量の判定に使用する。このアッセイを使用して、＜１００のＡＣｈＥ活性単位／（μｇタンパク質）を有するフソソームを判定する。
【０８４７】
一部の実施形態では、ＡＣｈＥ活性単位／（μｇタンパク質）値は、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、または１０００未満となる。
（実施例６８）
代謝活性レベルの測定
【０８４８】
この実施例は、フソソームにおけるクエン酸シンターゼ活性の測定の定量を説明する。
【０８４９】
クエン酸シンターゼは、クエン酸を生成するためのオキサロ酢酸（ＯＡＡ）とアセチル−ＣｏＡ間の反応を触媒する、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路内の酵素である。アセチル−ＣｏＡが加水分解されると、チオール基を有するＣｏＡ（ＣｏＡ−ＳＨ）が放出される。チオール基は、化学試薬である５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応して、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を形成し、このＴＮＢは、４１２ｎｍで分光光度法により測定することができる黄色生成物である（Ｇｒｅｅｎ  ２００８）。Ａｂｃａｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（製品番号ａｂ１１９６９２）などの市販のキットは、この測定を行うためのすべての必要試薬を備えている。
【０８５０】
アッセイを製造業者の推奨手順どおりに行う。前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生されるフソソームを収集し、それらを氷上で抽出緩衝剤（Ａｂｃａｍ）に２０分間可溶化することにより、フソソーム試料溶解物を調製する。遠心分離後に上清を収集し、タンパク質含有量をビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により評定し、調製物は、下記の定量プロトコールを開始するまで氷上に留まる。
【０８５１】
手短に述べると、フソソーム溶解物試料を、付属のマイクロプレートウェルにおいて１×インキュベーション緩衝剤（Ａｂｃａｍ）で希釈し、１セットのウェルには１×インキュベーション緩衝剤のみを入れておく。プレートを密封し、３００ｒｐｍで振盪しながら４時間、室温でインキュベートする。次いで、緩衝剤をウェルから吸引し、１×洗浄緩衝剤を添加する。この洗浄ステップをもう１度繰り返す。次いで、１×活性溶液を各ウェルに添加し、読取りと読取りの間に振盪してマイクロプレートリーダーで３０分間、２０秒ごとに４１２ｎｍで吸光度を測定することにより、プレートを解析する。
【０８５２】
バックグラウンド値（１×インキュベーション緩衝剤のみを有するウェル）をすべてのウェルから減算し、クエン酸シンターゼ活性を、ローディングしたフソソーム溶解物試料１μｇ当たりの毎分の吸光度の変化［（４１２ｎｍでのΔｍＯＤ）／分／（μｇタンパク質）］として表す。１００〜４００秒の動力学的測定からの線形部分のみを使用して活性を算出する。
【０８５３】
一部の実施形態では、フソソーム調製物は、対照細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内またはそれより大きいシンターゼ活性を有することになる。
【０８５４】
例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ，  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ  ｄａｙｓ  ｏｆ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５：  Ｒ１２３８−Ｒ１２５０，  ２００８を参照されたい。
（実施例６９）
呼吸レベルの測定
【０８５５】
この実施例は、フソソームにおける呼吸レベルの測定の定量を説明する。細胞における呼吸レベルは、代謝を推進する酸素消費の尺度であり得る。フソソーム呼吸を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）により酸素消費速度について測定する（Ｚｈａｎｇ  ２０１２）。
【０８５６】
前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生されるフソソーム、または細胞を、９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅマイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）に播種する。マイクロプレートを短時間遠心分離してウェルの底部にフソソームおよび細胞をペレット化する。増殖培地を除去し、２５ｍＭグルコースと２ｍＭグルタミンとを含有する低緩衝ＤＭＥＭ最小培地（Ａｇｉｌｅｎｔ）に置換し、マイクロプレートを３７℃で６０分間インキュベートして温度およびｐＨを平衡させることにより、酸素消費アッセイを開始する。
【０８５７】
次いで、接着フソソームおよび細胞を直接包囲している培地の細胞外酸素およびｐＨの変化を測定する細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）でマイクロプレートをアッセイする。定常状態酸素消費（基礎呼吸速度）および細胞外酸性化速度を得た後、ＡＴＰシンターゼを阻害するオリゴマイシン（５μＭ）と、ミトコンドリアを脱共役させるプロトンイオノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン；２μＭ）とをマイクロプレートの各ウェルに添加して、最大酸素消費速度の値を得る。
【０８５８】
最後に、呼吸変化がミトコンドリア呼吸に主として起因することを確認するために５μＭアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤）を添加する。アンチマイシンＡ添加後の最低酸素消費速度をすべての酸素消費測定値から減算して、非ミトコンドリア呼吸成分を除去する。オリゴマイシンに適切に応答しない（基礎値からの酸素消費速度の少なくとも２５％低下）またはＦＣＣＰに適切に応答しない（オリゴマイシン後の酸素消費速度の少なくとも５０％上昇）細胞試料を解析から除外する。次いで、フソソーム呼吸レベルを、ｐｍｏｌ  Ｏ２／分／１ｅ４フソソームとして測定する。
【０８５９】
次いで、この呼吸レベルをそれぞれの細胞呼吸レベルに正規化する。一部の実施形態では、フソソームは、それぞれの細胞試料と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれより大きい呼吸レベルを有することになる。
【０８６０】
例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｎｕｅｂｅｌ  Ｅ，  Ｗｉｓｉｄａｇａｍａ  ＤＲＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  ２０１２；７（６）：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０４８．  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０４８を参照されたい。
（実施例７０）
フソソームのホスファチジルセリンレベルの測定
【０８６１】
この実施例は、フソソームの表面へのアネキシン−Ｖ結合レベルの定量を説明する。
【０８６２】
瀕死の細胞は、プログラム細胞死経路のアポトーシスのマーカーであるホスファチジルセリンを細胞表面に提示し得る。アネキシン−Ｖは、ホスファチジルセリンに結合するので、アネキシン−Ｖ結合は、細胞の生存のプロキシである。
【０８６３】
フソソームを本明細書に記載するように産生した。アポトーシスシグナルの検出のために、フソソームまたは陽性対照細胞を５％アネキシンＶ  ｆｌｕｏｒ  ５９４（Ａ１３２０３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。各群（下記の表に列挙する）は、アポトーシス誘導因子であるメナジオンで処置した実験アームを含んだ。メナジオンを１００μＭメナジオンで４時間、添加した。すべての試料をフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にかけ、５６１ｎｍの波長のＹＬ１レーザーおよび５８５／１６ｎｍの発光フィルターを用いて蛍光強度を測定した。すべての群におけるアネキシンＶの蛍光強度を比較することにより、細胞外ホスファチジルセリンの存在を定量した。
【０８６４】
陰性対照未染色フソソームは、アネキシンＶ染色に対して陽性でなかった。
【０８６５】
一部の実施形態では、フソソームは、メナジオンに応答して細胞表面でのホスファチジルセリン提示を上方調節することができ、これは、非メナジオン刺激フソソームがアポトーシスを遂げないことを示す。一部の実施形態では、メナジオンで刺激した陽性対照細胞は、メナジオンで刺激していないフソソームより高レベルのアネキシンＶ染色を明示した。
【表２０】
2021513849.tif 000052
（実施例７１）
ジャクスタクリンシグナル伝達レベルの測定
【０８６６】
この実施例は、フソソームにおけるジャクスタクリンシグナル伝達の定量を説明する。
【０８６７】
細胞は、ジャクスタクリンシグナル伝達によって細胞接触依存性シグナル伝達を成すことができる。一部の実施形態では、フソソームにおけるジャクスタクリンシグナル伝達の存在は、フソソームがそれらのすぐ近くの細胞を刺激することができ、抑制することができ、および一般にそのような細胞と通信することができることを実証することになる。
【０８６８】
部分的にまたは完全に核不活性化された哺乳動物骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）から、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生したフソソームは、マクロファージにおいてジャクスタクリンシグナル伝達によってＩＬ−６分泌を誘発する。初代マクロファージおよびＢＭＳＣを共培養する。先ず、骨髄由来マクロファージを６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートし、次いで、初代マウスＢＭＳＣ由来フソソームまたはＢＭＳＣ細胞（陽性対照親細胞）を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中のマクロファージ上に配置する。上清を異なる時点（２、４、６、２４時間）で収集し、ＥＬＩＳＡアッセイによりＩＬ−６分泌について解析する。（Ｃｈａｎｇ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。
【０８６９】
一部の実施形態では、ＢＭＳＣフソソームにより誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達レベルを、培地中のマクロファージ分泌ＩＬ−６レベルの増加により測定する。一部の実施形態では、ジャクスタクリンシグナル伝達レベルは、陽性対照骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）により誘導されるレベルより少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれを超えて高くなる。
（実施例７２）
パラクリンシグナル伝達レベルの測定
【０８７０】
この実施例は、フソソームにおけるパラクリンシグナル伝達の定量を説明する。
【０８７１】
細胞は、局所微小環境において他の細胞とパラクリンシグナル伝達によって通信することができる。一部の実施形態では、フソソームは、例えば、それらの局所環境における細胞と通信するために、パラクリンシグナル伝達することができるだろう。一部の実施形態では、フソソームが内皮細胞において下記のプロトコールでパラクリン誘導分泌によるＣａ２＋シグナル伝達を誘発することができることにより、Ｃａ２＋シグナル伝達がカルシウム指示薬であるｆｌｕｏ−４  ＡＭによって測定されることになる。
【０８７２】
実験プレートを用意するために、マウス肺微小血管内皮細胞（ＭＰＭＶＥＣ）を、０．２％ゼラチンをコーティングした２５ｍｍガラス底共焦点ディッシュに播種する（８０％コンフルエンス）。ｆｌｕｏ−４  ＡＭのローディングを可能にするために、ＭＰＭＶＥＣを、２％ＢＳＡと０．００３％プルロニック（登録商標）酸とを含有するＥＣＭ中、最終濃度５μＭのｆｌｕｏ−４  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに３０分間、室温でインキュベートする。ローディング後、ＭＰＭＶＥＣを、色素損失を最小限に抑えるためにスルフィンピラゾンを含有する実験用イメージング溶液（０．２５％ＢＳＡを含有するＥＣＭ）で洗浄する。ｆｌｕｏ−４をローディングした後、５００μｌの予温した実験用イメージング溶液をプレートに添加し、プレートをＺｅｉｓｓ共焦点イメージングシステムによりイメージングする。
【０８７３】
別の管で、単離したてのマウスマクロファージを、培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中の１μｇ／ｍＬのＬＰＳで処置するか、またはＬＰＳで処置しない（陰性対照）。刺激後、フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つによりマクロファージから生成する。
【０８７４】
次いで、フソソームまたは親マクロファージ（陽性対照）を、２％ＢＳＡと０．００３％プルロニック（登録商標）酸とを含有するＥＣＭ中のセルトラッカーレッド、ＣＭＴＰＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識する。次いで、フソソームおよびマクロファージを洗浄し、実験用イメージング溶液に再懸濁させる。標識されたフソソームおよびマクロファージを、共焦点プレート内のｆｌｕｏ−４  ＡＭがローディングされたＭＰＭＶＥＣに添加する。
【０８７５】
アルゴンイオンレーザー源を有するＺｅｉｓｓ共焦点イメージングシステムを使用して、ｆｌｕｏ−４  ＡＭおよびセルトラッカーレッド蛍光についてそれぞれ４８８および５６１ｎｍで励起して、１０〜２０分間、３秒ごとに、緑色および赤色蛍光シグナルを記録する。ｆｌｕｏ−４蛍光強度変化を、イメージングソフトウェア（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．  （５８）：  ３５１１，  ２０１１）を使用して解析する。陰性対照フソソームおよび細胞群で測定されたＦｌｕｏ−４強度レベルを、ＬＰＳ刺激フソソームおよび細胞群から減算する。
【０８７６】
一部の実施形態では、フソソーム、例えば活性化フソソームは、陽性対照細胞群より少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれを超えて大きいＦｌｕｏ−４蛍光強度の増加を誘導することになる。
（実施例７３）
可動性のためにアクチンを重合する能力の測定
【０８７７】
この実施例は、フソソーム中のアクチンなどの細胞骨格成分の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、アクチンなどの細胞骨格成分を含み、アクチンを重合することができる。
【０８７８】
細胞は、細胞骨格成分であるアクチンを、運動性および他の細胞質内プロセスのために使用する。細胞骨格は、運動性駆動力を生じさせるために、および移動プロセスを協調させるために不可欠である。
【０８７９】
Ｃ２Ｃ１２細胞を本明細書に記載するように除核した。１２．５％および１５％フィコール層から得たフソソームをプールして「Ｌｉｇｈｔ」ラベルを付け、その一方で、１６〜１７％層からのフソソームをプールして「Ｍｅｄｉｕｍ」ラベルを付けた。フソソームまたは細胞（親Ｃ２Ｃ１２細胞、陽性対照）をＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に再懸濁させ、２４ウェル超低接着プレート（＃３４７３、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に播種し、３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。試料を定期的に採取し（５．２５時間、８．７５時間、２６．５時間）、１６５μＭローダミンファロイジンで染色し（陰性対照を染色せず）、フローサイトメーター（＃Ａ２４８５８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）でＦＣレーザーＹＬ１（５８５／１６フィルターを伴う５６１ｎｍ）を用いて測定してＦ−アクチン細胞骨格含有量を測定した。未染色のフソソームおよび染色した親Ｃ２Ｃ１２細胞とともに、フソソームにおけるローダミンファロイジンの蛍光強度を測定した。
【０８８０】
フソソーム蛍光強度は、すべての時点で陰性対照より大きく（図４）、フソソームは、親Ｃ２Ｃ１２細胞と同様の速度でアクチンを重合することができた。
【０８８１】
下記の表に収載するものなどの追加の細胞骨格成分を、市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）によって製造業者の使用説明書に従って測定する。
【表２１】
2021513849.tif 000053
【０８８２】
次いで、１００μＬの適切に希釈した溶解物をマイクロウェルストリップから適切なウェルに添加する。マイクロウェルをテープで密封し、２時間、３７℃でインキュベートする。インキュベーション後、密封テープを除去し、内容物を廃棄する。各マイクロウェルを２００μＬの１×洗浄緩衝剤で４回洗浄する。個々の洗浄各々の後、残留洗浄溶液を各ウェルから除去するためにプレートを吸収性の布の上に打ち当てる。しかし、ウェルは、実験中のどの時点でも完全に乾いてはいない。
【０８８３】
次に、１００μＬの再構成検出抗体（緑色）を、陰性対照ウェルを除いて個々のウェル各々に添加する。次いで、ウェルを密封し、１時間、３７℃でインキュベートする。インキュベーションが完了した後、洗浄手順を繰り返す。１００μＬの再構成ＨＲＰ結合二次抗体（赤色）を各々のウェルに添加する。ウェルをテープで密封し、３０分間、３７℃でインキュベートする。次いで、密封テープを除去し、洗浄手順を繰り返す。次いで、１００μＬのＴＭＢ基質を各ウェルに添加する。ウェルをテープで密封して、次いで、１０分間、３７℃でインキュベートする。この最終インキュベーションが完了したら、１００μＬのＳＴＯＰ溶液をウェルの各々に添加し、プレートを数秒間、穏やかに振盪する。
【０８８４】
アッセイの分光光度解析を、ＳＴＯＰ溶液の添加から３０分以内に行う。ウェルの下側を、糸くずの出ないティッシュで拭き、次いで吸光度を４５０ｎｍで読み取る。一部の実施形態では、検出抗体で染色されたフソソーム試料は、４５０ｎｍで陰性対照フソソーム試料より多い光を吸収することになり、検出抗体で染色された細胞試料より少ない光を吸収することになる。
（実施例７４）
平均膜電位の測定
【０８８５】
この実施例は、フソソームのミトコンドリア膜電位の定量を説明する。一部の実施形態では、ミトコンドリア膜を含むフソソームは、ミトコンドリア膜電位を維持することになる。
【０８８６】
ミトコンドリア代謝活性は、ミトコンドリア膜電位によって測定することができる。ミトコンドリア膜電位を評定するための市販の色素であるＴＭＲＥ（ＴＭＲＥ：テトラメチルローダミン，エチルエステル，過塩素酸塩、Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ｔ６６９）を使用して、フソソーム調製物の膜電位を定量する。
【０８８７】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより生成する。６分割量（未処置のおよびＦＣＣＰ処置した三重反復物）のフソソームまたは親細胞を、増殖培地（１０％ウシ胎仔血清を含有する、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ）で希釈する。試料の１つの分割量を、ミトコンドリア膜電位を除去してＴＭＲＥ染色を防止する脱共役剤であるＦＣＣＰとともに、インキュベートする。ＦＣＣＰ処置試料については、２μＭ  ＦＣＣＰを試料に添加し、解析の前に５分間インキュベートする。次いで、フソソームおよび親細胞を３０ｎＭ  ＴＭＲＥで染色する。各試料について、未染色（ＴＭＲＥなし）試料も並行して調製する。試料を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、フローサイトメーターで４８８ｎｍアルゴンレーザーを用いて試料を解析し、励起および発光を５３０＋／−３０ｎｍで収集する。
【０８８８】
膜電位値（ミリボルト、ｍＶで）をＴＭＲＥの強度に基づいて算出する。すべてのイベントを前方および側方散乱チャネルで取得する（あるいは、ゲートをかけて小さい残屑を排除することができる）。未処置試料とＦＣＣＰ処置試料の両方についての蛍光強度（ＦＩ）値を、未処置試料とＦＣＣＰ処置試料の幾何平均から未染色試料の蛍光強度の幾何平均を減算することにより正規化する。ＴＭＲＥ蛍光（ＴＭＲＥは、ネルンスト方式でミトコンドリアに蓄積するので）に基づいてフソソームまたは細胞のミトコンドリア膜電位を決定するために使用することができる修正されたネルンストの式（下記参照）で、正規化蛍光強度値を使用して、各調製物の膜電位状態を算出する。
【０８８９】
フソソームまたは細胞膜電位を、次の式を用いて算出する：（ｍＶ）＝−６１．５＊ｌｏｇ（ＦＩ未処置−正規化／ＦＩＦＣＣＰ−処置−正規化）。一部の実施形態では、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞からのフソソーム調製物に対してこのアッセイまたは同等のアッセイを使用して、フソソーム調製物の膜電位状態は、親細胞より、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内またはそれを超えて高くなる。一部の実施形態では、膜電位の範囲は、約−２０〜−１５０ｍＶである。
（実施例７５）
対象における持続半減期の測定
【０８９０】
この実施例は、フソソーム半減期の測定を説明する。
【０８９１】
フソソームは、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生した、ガウシア−ルシフェラーゼを発現する細胞に由来し、純粋なもの、ならびに緩衝溶液中の１：２、１：５および１：１０希釈物を作製する。フソソームを欠く緩衝溶液を陰性対照として使用する。
【０８９２】
各用量を３匹の８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内投与する。フソソームの静脈内投与後１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８および７２時間の時点で後眼窩静脈から血液を採取する。実験終了時にＣＯ２吸入により動物を屠殺する。
【０８９３】
血液を２０分間、室温で遠心分離する。直ちに、血清試料を−８０℃で、生物分析まで凍結する。次いで、試料をガウシア−ルシフェラーゼ基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ、Ｐｉｎｅｔｏｐ、ＡＺ）と混合した後、各血液試料を使用してガウシア−ルシフェラーゼ活性アッセイを行う。手短に述べると、セレンテラジン、ルシフェリンまたは発光分子をフラッシュアッセイ緩衝剤と混合し、混合物を、９６ウェルプレートの血液試料を含有するウェルにピペットで移す。血液を欠く陰性対照ウェルは、バックグラウンドガウシアルシフェラーゼシグナルを判定するためにアッセイ緩衝剤を含有する。
【０８９４】
加えて、陽性対照精製ガウシアルシフェラーゼ（Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０３０８）の標準曲線を作成して、発光シグナルを１時間当たりのガウシアルシフェラーゼ分泌分子数に変換する。５００ミリ秒積分を使用して、プレートを発光についてアッセイする。バックグラウンドガウシアルシフェラーゼシグナルをすべての試料から減算し、次いで、線形最良適合曲線をガウシアルシフェラーゼ標準曲線について算出する。試料の表示数値が標準曲線内に収まらなかった場合、それらを適切に希釈し、再アッセイする。１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８および７２時間の時点で採取した試料からのルシフェラーゼシグナルを標準曲線に内挿する。消失速度定数ｋｅ（ｈ−１）を、１コンパートメントモデルについての次の式を使用して算出する：Ｃ（ｔ）＝Ｃ０×ｅ−ｋｅｘｔ（式中、Ｃ（ｔ）（ｎｇ／ｍＬ）は、時間ｔ（ｈ）でのフソソームの濃度であり、Ｃ０は、時間＝０でのフソソームの濃度（ｎｇ／ｍＬ）である）。消失半減期ｔ１／２，ｅ（ｈ）は、ｌｎ（２）／ｋｅとして算出する。
【０８９５】
一部の実施形態では、フソソームは、陰性対照細胞より、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれを超えて大きい半減期を有することになる。
（実施例７６）
循環におけるフソソームの保持の測定
【０８９６】
この実施例は、循環へのフソソームの送達および臓器での保持の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、循環に送達されるが、臓器部位で捕捉されず、保持されない。
【０８９７】
一部の実施形態では、末梢循環に送達されたフソソームは、細網内皮系（ＲＥＳ）による捕捉および保持を回避して標的部位に高効率で到達する。ＲＥＳは、脾臓、リンパ節および肝臓などの固形臓器に存在する細胞、主としてマクロファージの系を含む。これらの細胞は、赤血球などの「旧」細胞を除去する役割を通常は担う。
【０８９８】
フソソームは、ＣＲＥリコンビナーゼを発現する細胞（薬剤）、またはＣＲＥを発現しない細胞（陰性対照）に由来する。これらのフソソームを、実施例６２におけるようにｉｎ  ｖｉｖｏ注射用に調製する。
【０８９９】
レシピエントマウスは、フソソームにより送達されるｍＲＮＡから作製されるＣＲＥタンパク質によってルシフェラーゼの発現の遮断を解除するように改変されているｌｏｘｐ−ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を保有する（ＪＡＸ＃００５１２５）。ルシフェラーゼを生存動物において生物発光イメージングにより検出することができる。この実施例の陽性対照は、同じタンパク質をそれ自体のゲノムからマクロファージおよび単球細胞において排他的に発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫（Ｃｘ３ｃｒ１−ＣＲＥ  ＪＡＸ＃０２５５２４）である。この交配からの子孫は、各対立遺伝子（ｌｏｘｐ−ルシフェラーゼ、Ｃｘ３ｃｒ１−ＣＲＥ）の一方を保有する。
【０９００】
ＣＲＥタンパク質による作用を受けたときにルシフェラーゼの発現をもたらす遺伝子座を保有するマウスの末梢循環に、尾静脈注射（ＩＶ、実施例番号４８）によってフソソームを注射する。ＲＥＳの非特異的捕捉メカニズムは、ある割合のＣＲＥタンパク質をフソソームからマクロファージへ放出してゲノム組換えをもたらす性質の点から食細胞性である。ＩＶＩＳ測定（実施例６２で説明したような）によって、非フソゲン対照が蓄積し、融合する場所が特定される。脾臓、リンパ節および肝臓における蓄積は、フソソームの非特異的ＲＥＳ媒介捕捉を示すことになる。フソソーム注射後２４、４８および９６時間の時点でＩＶＩＳを行う。
【０９０１】
マウスを安楽死させ、脾臓、肝臓、および腸内の主要リンパ節群を採取する。
【０９０２】
ゲノムＤＮＡをこれらの臓器から単離し、組換えゲノムＤＮＡ遺残物に対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応に付す。代替ゲノム遺伝子座（ＣＲＥにより標的とされない）も定量して試料中の細胞の数の測定量を得る。
【０９０３】
実施形態では、低い生物発光シグナルが、動物全体にわたってならびに特異的に肝臓および脾臓部位で、薬剤と陰性対照の両方について観察されることになる。実施形態では、陽性対照は、肝臓で（陰性対照および薬剤と比較して）シグナル増加を、脾臓で高シグナルを、およびリンパ節と一致する分布を示すことになる。
【０９０４】
一部の実施形態では、これらの組織のゲノムＰＣＲ定量は、陽性対照では検査したすべての組織において代替遺伝子座と比較して組換えシグナルの高い割合を示すことになり、その一方で、薬剤および陰性対照については、組換えレベルは、すべての組織において無視できるレベルとなる。
【０９０５】
一部の実施形態では、この実施例の結果は、非フソゲン対照が、ＲＥＳにより保持されず、広い分布を達成することおよび高いバイオアベイラビリティを示すことができるであろうということを、示すことになる。
（実施例７７）
フソソーム寿命と免疫抑制
【０９０６】
この実施例は、フソソーム組成物を免疫抑制薬と併用投与したときのフソソーム組成物の免疫原性の定量を説明する。
【０９０７】
免疫応答を刺激する治療は、治療有効性を低下させ得ることもあり、またはレシピエントに対する毒性の原因となり得ることもある。一部の実施形態では、フソソームは、実質的に非免疫原性である。
【０９０８】
前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生されるフソソームの精製組成物を免疫抑制薬と併用投与し、免疫原性の特性をｉｎ  ｖｉｖｏでのフソソームの寿命によりアッセイする。ルシフェラーゼで標識した十分な数のフソソームを、タクロリムス（ＴＡＣ、４ｍｇ／ｋｇ／日；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、またはビヒクルとともに（陰性対照）、またはいかなる追加の薬剤もなしで（陽性対照）、正常マウスの腓腹筋に局所注射する。次いで、マウスを、注射後１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８および７２時間の時点でｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに付す。
【０９０９】
手短に述べると、マウスにイソフルランで麻酔し、Ｄ−ルシフェリンを体重１キログラム当たり３７５ｍｇの用量で腹腔内投与する。イメージング時に、動物を遮光チャンバーに入れ、動物に移植したルシフェラーゼ発現フソソームから放出される光子を、生物発光の発光強度に依存して５秒〜５分の積分時間で収集する。同じマウスを上記の様々な時点で繰り返しスキャンする。ＢＬＩシグナルを毎秒光子数（全光束）の単位で定量し、ｌｏｇ［毎秒光子数］として表す。強度をＴＡＣを伴うおよび伴わないフソソーム注射と比較することにより、データを解析する。
【０９１０】
実施形態では、アッセイは、最終時点で単独でのフソソーム群およびビヒクル群に対してＴＡＣ併用投与群においてフソソーム寿命の延長を示すことになる。フソソーム寿命の延長に加えて、一部の実施形態では、各々の時点でのフソソーム＋ビヒクルまたは単独でのフソソームに対してフソソーム＋ＴＡＣアームからＢＬＩシグナルの増加を観察することになる。
（実施例７８）
フソソームに対して反応性の既存ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の測定
【０９１１】
この実施例は、フローサイトメトリーを使用して測定した既存抗フソソーム抗体価の定量を説明する。
【０９１２】
フソソームの免疫原性の尺度は、抗体応答である。フソソームを認識する抗体は、フソソーム活性または寿命を制限することができる方法で結合することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のフソソームの一部のレシピエントは、フソソームに結合するおよびフソソームを認識する既存の抗体を有するだろう。
【０９１３】
この実施例では、ゼノジェニック供給源細胞を使用して前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生したフソソームを使用して、抗フソソーム抗体価を試験する。この実施例では、フソソームを未投与のマウスを、抗フソソーム抗体の存在について評定する。注目すべきこととして、本明細書に記載の方法は、ヒト、ラット、サルに、プロトコールに最適化を施して、同等に適用可能であり得る。
【０９１４】
陰性対照は、ＩｇＭおよびＩｇＧを枯渇させたマウス血清であり、陽性対照は、ゼノジェニック供給源細胞から生成したフソソームの複数回の注射を受けたマウスに由来する血清である。
【０９１５】
フソソームに結合する既存抗体の存在を評定するために、フソソームを未投与のマウスからの血清を、先ず、３０分間、５６℃に加熱することにより補体消耗させ、その後、３％ＦＣＳと０．１％ＮａＮ３とを含有するＰＢＳで３３％希釈する。同量の血清とフソソーム（１ｍＬ当たり１×１０２〜１×１０８フソソーム）の懸濁液を３０分間４℃でインキュベートし、仔ウシ血清クッションに通してＰＢＳで洗浄する。
【０９１６】
ＩｇＭ異種反応性抗体を、細胞とマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥコンジュゲートヤギ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）との４℃で４５分間のインキュベーションにより染色する。注目すべきこととして、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体も使用することができる。すべての群からの細胞を、２％ＦＣＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析する。蛍光データを対数増幅の使用により収集し、平均蛍光強度として表す。一部の実施形態では、陰性対照血清は、無血清対照または二次単独の対照と同等の無視できるほどの蛍光しか示さないことになる。ある実施形態では、陽性対照は、陰性対照より強い蛍光、および無血清対照または二次単独の対照より強い蛍光を示すことになる。ある実施形態では、免疫原性が存在する場合、フソソームを未投与のマウスからの血清は、陰性対照より強い蛍光を示すことになる。ある実施形態では、免疫原性が存在しない場合、フソソームを未投与のマウスからの血清は、陰性対照と比較して同様の蛍光を示すことになる。
（実施例７９）
フソソームの複数回投与後のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答の測定
【０９１７】
この実施例は、改変フソソームの複数回投与後の改変フソソームの液性応答の定量を説明する。一部の実施形態では、例えば本明細書に記載の方法により改変された、改変フソソームは、改変フソソームの複数回（例えば、１回より多い、例えば、２回またはそれより多い）投与後に低減した（例えば、未改変フソソームの投与と比較して低減した）液性応答を有することになる。
【０９１８】
フソソームの免疫原性の尺度は、抗体応答である。一部の実施形態では、フソソームの反復注射は、抗フソソーム抗体、例えば、フソソームを認識する抗体の発生につながり得る。一部の実施形態では、フソソームを認識する抗体は、フソソーム活性または寿命を制限することができる方法で結合することができる。
【０９１９】
この実施例では、抗フソソーム抗体価を、１回または複数回のフソソーム投与後に検査する。フソソームを、前の実施例のいずれか１つにより産生する。未改変間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ）、ＨＬＡ−Ｇのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空のベクターのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−空ベクター）から、フソソームを生成する。異なるコホート：ビヒクルの１、２、３、５、１０回の注射での全身および／もしくは局所注射を受けたマウス（フソソームを未投与の群）、ＭＳＣフソソームの１、２、３、５、１０回の注射での全身および／もしくは局所注射を受けたマウス、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇフソソームの１、２、３、５、１０回の注射での全身および／もしくは局所注射を受けたマウス、またはＭＳＣ−空ベクターフソソームの１、２、３、５、１０回の注射での全身および／もしくは局所注射を受けたマウスから、血清を採取する。
【０９２０】
抗フソソーム抗体の存在および存在量を評定するために、マウスからの血清を、先ず、３０分間、５６℃に加熱することにより補体消耗させ、その後、３％ＦＣＳと０．１％ＮａＮ３とを含有するＰＢＳで３３％希釈する。同量の血清とフソソーム（１ｍＬ当たり１×１０２〜１×１０８フソソーム）を３０分間４℃でインキュベートし、仔ウシ血清クッションに通してＰＢＳで洗浄する。
【０９２１】
フソソーム反応性ＩｇＭ抗体を、細胞とマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥコンジュゲートヤギ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）との４℃で４５分間のインキュベーションにより染色する。注目すべきこととして、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体も使用することができる。すべての群からの細胞を、２％ＦＣＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析する。蛍光データを対数増幅の使用により収集し、平均蛍光強度として表す。
【０９２２】
一部の実施形態では、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇフソソームは、ＭＳＣフソソームまたはＭＳＣ−空ベクターフソソームと比較して、注射後に（ＦＡＣＳで蛍光強度により測定した場合）減少した抗フソソームＩｇＭ（またはＩｇＧ１／２）抗体価を有することになる。
（実施例８０）
免疫原性を低下させるために寛容原性タンパク質を発現させるためのフソソーム供給源細胞の改変
【０９２３】
この実施例は、改変細胞源に由来するフソソームの免疫原性の定量を説明する。一部の実施形態では、改変細胞源に由来するフソソームは、未改変細胞源に由来するフソソームと比較して低下した免疫原性を有する。
【０９２４】
免疫応答を刺激する治療は、治療有効性を低下させ得ることもあり、またはレシピエントに対する毒性の原因となり得ることもある。一部の実施形態では、実質的に非免疫原性のフソソームを対象に投与する。一部の実施形態では、細胞源の免疫原性をフソソーム免疫原性のプロキシとしてアッセイすることができる。
【０９２５】
ＨＬＡ−Ｇのレンチウイルス媒介発現を使用して改変されたｉＰＳ細胞、または空のベクターを発現するｉＰＳ細胞（陰性対照）を、免疫原性の特性について次のようにアッセイする。可能性のあるフソソーム細胞源として、十分な数のｉＰＳ細胞を、Ｃ５７／Ｂ６マウスの後側腹部に皮下注射し、奇形腫の形成を可能にするために適切な時間を取る。
【０９２６】
奇形腫が形成されたら、組織を採取する。蛍光染色用に調製した組織をＯＣＴ中で凍結し、免疫組織化学的検査およびＨ＆Ｅ染色用に調製したものを１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する。組織切片を、一般的な免疫組織化学プロトコールに従って、抗体、ポリクローナルウサギ抗ヒトＣＤ３抗体（ＤＡＫＯ）、マウス抗ヒトＣＤ４  ｍＡｂ（ＲＰＡ−Ｔ４、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、マウス抗ヒトＣＤ８  ｍＡＢ（ＲＰＡ−Ｔ８、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で、染色する。これらを、適切な検出試薬、すなわち、抗マウス二次ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、または抗ウサギ二次ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用することにより、検出する。
【０９２７】
ペルオキシダーゼに基づく可視化システム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して検出を果たす。光学顕微鏡を使用して２０倍視野で検査した２５、５０または１００の組織切片中に存在する浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＮＫ細胞の平均数を使うことにより、データを解析する。実施形態では、改変されていないｉＰＳＣ、または空のベクターを発現するｉＰＳＣには、ＨＬＡ−Ｇを発現するｉＰＳＣと比較して、より多数の浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＮＫ細胞が検査した視野に存在することになる。
【０９２８】
一部の実施形態では、フソソームの免疫原性の特性は、供給源細胞のものと実質的に同等となる。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｇで改変されたｉＰＳ細胞に由来するフソソームは、それらの未改変対応物に対して低減した免疫細胞浸潤を有することになる。
（実施例８１）
免疫原性を低下させるために免疫原性タンパク質をノックダウンさせるためのフソソーム供給源細胞の改変
【０９２９】
この実施例は、免疫原性である分子の発現を低減させるように改変された細胞源に由来するフソソーム組成物の生成の定量を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、免疫原性である分子の発現を低減させるように改変された細胞源に由来し得る。
【０９３０】
免疫応答を刺激する治療は、治療有効性を低下させることもあり、またはレシピエントに対する毒性の原因となることもある。したがって、免疫原性は、安全で有効な治療用フソソームにとって重要な特性である。ある特定の免疫活性化剤の発現は、免疫応答を生じさせ得る。ＭＨＣクラスＩは、免疫活性化剤の一例に相当する。
【０９３１】
この実施例では、フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより生成する。未改変間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ、陽性対照）、ＭＨＣクラスＩを標的とするｓｈＲＮＡのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−ｓｈＭＨＣクラスＩ）、および非標的化スクランブル型ｓｈＲＮＡのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−スクランブル型、陰性対照）から、フソソームを生成する。
【０９３２】
フローサイトメトリーを使用して、ＭＨＣクラスＩの発現についてフソソームをアッセイする。適切な数のフソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、ＭＨＣクラスＩに対する蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｅｒａ−Ｌａｂ、Ｂｅｌｔｏｎ、ＵＫ）の１：１０〜１：４０００希釈物とともに、３０分間、氷上で保持する。フソソームをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させる。同等の希釈度で＿＿および適切な蛍光コンジュゲートアイソタイプ対照抗体とともにインキュベートしたフソソームの調製物の等しい分割量を使用して、非特異的蛍光を判定する。フソソームをフローサイトメーター（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でアッセイし、データをフロー解析ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析する。
【０９３３】
ＭＳＣ、ＭＳＣ−ｓｈＭＨＣクラスＩ、ＭＳＣ−スクランブル型に由来するフソソームの平均蛍光データを比較する。一部の実施形態では、ＭＳＣ−ｓｈＭＨＣクラスＩに由来するフソソームは、ＭＳＣおよびＭＳＣ−スクランブル型と比較してより低いＭＨＣクラスＩ発現を有することになる。
（実施例８２）
マクロファージファゴサイトーシスを回避するためのフソソーム供給源細胞の改変
【０９３４】
この実施例は、改変フソソームによるファゴサイトーシスの回避の定量を説明する。一部の実施形態では、改変フソソームは、マクロファージによるファゴサイトーシスを回避することになる。
【０９３５】
細胞は、粒子を貪食するファゴサイトーシスを行い、かくて細菌のような外来侵入物または死細胞の隔離および破壊を可能にする。一部の実施形態では、マクロファージによるフソソームのファゴサイトーシスは、それらの活性を低下させることになる。
【０９３６】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより生成する。ＣＤ４７を欠くＣＳＦＥ標識哺乳動物細胞（以降、ＮＭＣ、陽性対照）、ＣＤ４７  ｃＤＮＡのレンチウイルス媒介発現を使用してＣＤ４７を発現するように操作されているＣＳＦＥ標識細胞（以降、ＮＭＣ−ＣＤ４７）、および空ベクター対照のレンチウイルス媒介発現を使用して操作されたＣＳＦＥ標識細胞（以降、ＮＭＣ−空ベクター、陰性対照）から、フソソームを作出する。
【０９３７】
マクロファージ媒介免疫リアランスの低減を、次のプロトコールによるファゴサイトーシスアッセイで判定する。マクロファージを、採取直後に共焦点ガラス底ディッシュに播種する。マクロファージをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ中で１時間インキュベートして接着させる。ＮＭＣ、ＮＭＣ−ＣＤ４７、ＮＭＣ−空ベクターに由来する適切な数のフソソームを、プロトコールに示されているようにマクロファージに添加し、２時間インキュベートする、ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆ。
【０９３８】
２時間後、ディッシュを穏やかに洗浄し、細胞内蛍光を検査する。貪食された粒子により発光された細胞内蛍光を４８８励起で共焦点顕微鏡観察によりイメージングする。イメージングソフトウェアを使用して、ファゴサイトーシス陽性マクロファージの数を定量する。データを、食作用指数＝（貪食された細胞の総数／計数されたマクロファージの総数）×（貪食された細胞を含有するマクロファージの数／計数されたマクロファージの総数）×１００として表す。
【０９３９】
一部の実施形態では、食作用指数は、ＮＭＣ、またはＮＭＣ−空ベクター由来のフソソームに対して、ＮＭＣ−ＣＤ４７由来のフソソームとともにマクロファージをインキュベートすると、低減されることになる。
（実施例８３）
ＰＢＭＣ細胞溶解により媒介される細胞傷害性低下のためのフソソーム供給源細胞の改変
【０９４０】
この実施例は、ＰＢＭＣによる細胞溶解に起因して細胞傷害性低下を有するように改変された細胞に由来するフソソームの生成を説明する。
【０９４１】
一部の実施形態では、ＰＢＭＣによる供給源細胞またはフソソームの細胞傷害性媒介細胞溶解は、溶解がフソソームの活性を低下させることになる、例えば阻害するまたは停止させることになるので、フソソームの免疫原性の尺度である。
【０９４２】
この実施例では、フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより生成する。未改変間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ−Ｇのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空のベクターのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−空ベクター、陰性対照）から、フソソームを作出する。
【０９４３】
フソソームのＰＭＢＣ媒介溶解は、Ｂｏｕｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５（２）：８５−９２；  １９９２およびｖａｎ  Ｂｅｓｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７０（１）：１３６−１４３；  ２０００に記載されているようなユーロピウム放出アッセイによって判定する。ＰＢＭＣ（以降、エフェクター細胞）を適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレートにおいて７日間、３７℃で、ガンマ線照射同種ＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ  ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で刺激する。フソソームをユーロピウム−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で標識する。
【０９４４】
７日目に、エフェクター細胞とともに６３Ｅｕ標識フソソームを、１０００：１〜１：１および１：１．２５〜１：１０００の範囲のエフェクター／標的比での播種後１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、９６ウェルプレートにおいてインキュベートすることにより、細胞傷害性媒介溶解アッセイを行う。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、上清の試料を、バックグラウンド蛍光が低い９６ウェルプレート（フルオロイムノプレート、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に移す。
【０９４５】
その後、増強溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各ウェルに添加する。放出されたユーロピウムを、時間分解蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定する。蛍光をカウント毎秒（ＣＰＳ）で表す。適切な数（１×１０２〜１×１０８）のフソソームを１％トリトン（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）とともに適切な時間にわたってインキュベートすることにより、標的フソソームによるユーロピウムの最大放出パーセントを決定する。エフェクター細胞なしでの標識標的フソソームのインキュベーションにより、標的フソソームによるユーロピウムの自然放出を測定する。次いで、漏洩パーセンテージを、（自然放出／最大放出）×１００％として算出する。最後に、細胞傷害性媒介溶解のパーセンテージを、溶解％＝［（実測溶解−自然溶解−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×１００％として算出する。データを、溶解のパーセンテージを異なるエフェクター標的比の関数と見ることにより、解析する。
【０９４６】
一部の実施形態では、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇ細胞から生成したフソソームは、特定の時点で、ＭＳＣ生成フソソームまたはＭＳＣ−スクランブル型生成フソソームと比較して、標的細胞による溶解のパーセンテージ低下を有することになる。
（実施例８４）
ＮＫ溶解活性低下のためのフソソーム供給源細胞の改変
【０９４７】
この実施例は、ＮＫ細胞による細胞傷害性媒介細胞溶解を減少させるように改変された、細胞源に由来するフソソーム組成物の生成を説明する。一部の実施形態では、ＮＫ細胞による供給源細胞またはフソソームの細胞傷害性媒介細胞溶解は、フソソームの免疫原性の尺度である。
【０９４８】
この実施例では、フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより生成する。未改変間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ−Ｇのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空のベクターのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−空ベクター、陰性対照）から、フソソームを作出する。
【０９４９】
フソソームのＮＫ細胞媒介溶解は、Ｂｏｕｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５（２）：８５−９２；  １９９２およびｖａｎ  Ｂｅｓｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７０（１）：１３６−１４３；  ２０００に記載されているようなユーロピウム放出アッセイによって判定する。ＮＫ細胞（以降、エフェクター細胞）を、Ｃｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  （２０）：１５４７−１５５９；  ２０１１における方法に従って適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレートにおいて７日間、３７℃で、ガンマ線照射同種ＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ  ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で刺激する。フソソームをユーロピウム−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で標識する。
【０９５０】
７日目に、エフェクター細胞とともに６３Ｅｕ標識フソソームを、１０００：１〜１：１および１：１．２５〜１：１０００の範囲のエフェクター／標的比での播種後１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、９６ウェルプレートにおいてインキュベートすることにより、細胞傷害性媒介溶解アッセイを行う。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、上清の試料を、バックグラウンド蛍光が低い９６ウェルプレート（フルオロイムノプレート、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に移す。
【０９５１】
その後、増強溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各ウェルに添加する。放出されたユーロピウムを、時間分解蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定する。蛍光をカウント毎秒（ＣＰＳ）で表す。適切な数（１×１０２〜１×１０８）のフソソームを１％トリトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに適切な時間にわたってインキュベートすることにより、標的フソソームによるユーロピウムの最大放出パーセントを決定する。エフェクター細胞なしでの標識標的フソソームのインキュベーションにより、標的フソソームによるユーロピウムの自然放出を測定する。次いで、漏洩パーセンテージを、（自然放出／最大放出）×１００％として算出する。最後に、細胞傷害性媒介溶解のパーセンテージを、溶解％＝［（実測溶解−自然溶解−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×１００％として算出する。データを、溶解のパーセンテージを異なるエフェクター標的比の関数と見ることにより、解析する。
【０９５２】
一部の実施形態では、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇ細胞から生成したフソソームは、適切な時点で、ＭＳＣ生成フソソームまたはＭＳＣ−スクランブル型生成フソソームと比較して溶解のパーセンテージ低下を有することになる。
（実施例８５）
ＣＤ８キラーＴ細胞溶解減少のためのフソソーム供給源細胞の改変
【０９５３】
この実施例は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞傷害性媒介細胞溶解を減少させるように改変された細胞源に由来するフソソーム組成物の生成を説明する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞による供給源細胞またはフソソームの細胞傷害性媒介細胞溶解は、フソソームの免疫原性の尺度である。
【０９５４】
この実施例では、フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより生成する。未改変間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ−Ｇのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空のベクターのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−空ベクター、陰性対照）から、フソソームを作出する。
【０９５５】
フソソームのＣＤ８＋Ｔ細胞媒介溶解は、Ｂｏｕｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５（２）：８５−９２；  １９９２およびｖａｎ  Ｂｅｓｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７０（１）：１３６−１４３；  ２０００に記載されているようなユーロピウム放出アッセイによって判定する。ＣＤ８＋Ｔ細胞（以降、エフェクター細胞）を、Ｃｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  （２０）：１５４７−１５５９；  ２０１１における方法に従って適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレートにおいて７日間、３７℃で、ガンマ線照射同種ＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ  ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で刺激する。フソソームをユーロピウム−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で標識する。
【０９５６】
７日目に、エフェクター細胞とともに６３Ｅｕ標識フソソームを、１０００：１〜１：１および１：１．２５〜１：１０００の範囲のエフェクター／標的比での播種後１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、９６ウェルプレートにおいてインキュベートすることにより、細胞傷害性媒介溶解アッセイを行う。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、２０μＬの上清を、バックグラウンド蛍光が低い９６ウェルプレート（フルオロイムノプレート、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に移す。
【０９５７】
その後、増強溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各ウェルに添加する。放出されたユーロピウムを、時間分解蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定する。蛍光をカウント毎秒（ＣＰＳ）で表す。適切な数（１×１０２〜１×１０８）のフソソームを１％トリトン（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）とともに適切な時間にわたってインキュベートすることにより、標的フソソームによるユーロピウムの最大放出パーセントを決定する。エフェクター細胞なしでの標識標的フソソームのインキュベーションにより、標的フソソームによるユーロピウムの自然放出を測定する。次いで、漏洩パーセンテージを、（自然放出／最大放出）×１００％として算出する。最後に、細胞傷害性媒介溶解のパーセンテージを、溶解％＝［（実測溶解−自然溶解−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×１００％として算出する。データを、溶解のパーセンテージを異なるエフェクター標的比の関数と見ることにより、解析する。
【０９５８】
一部の実施形態では、ＭＳＣ−ＨＬＡ−Ｇ細胞から生成したフソソームは、適切な時点で、ＭＳＣ生成フソソームまたはＭＳＣ−スクランブル型生成フソソームと比較して溶解のパーセンテージ低下を有することになる。
（実施例８６）
Ｔ細胞活性化減少のためのフソソーム供給源細胞の改変
この実施例は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により評定した場合にＴ細胞活性化および増殖の低減を有することになる改変フソソームの生成を説明する。
【０９５９】
Ｔ細胞増殖および活性化は、フソソームの免疫原性の尺度である。フソソーム組成物によるＭＬＲ反応におけるＴ細胞増殖の刺激は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖の刺激を示唆し得る。
【０９６０】
一部の実施形態では、改変供給源細胞から生成したフソソームは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により評定した場合にＴ細胞活性化および増殖の低減を有する。一部の実施形態では、改変供給源細胞から生成したフソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫応答を生じさせず、したがって、フソソーム組成物の有効性を維持する。
【０９６１】
この実施例では、フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより生成する。未改変間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ、陽性対照）、ＩＬ−１０のレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−ＩＬ−１０）、および空のベクターのレンチウイルス媒介発現で改変された間葉幹細胞（以降、ＭＳＣ−空ベクター、陰性対照）から、フソソームを生成する。
【０９６２】
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６脾細胞を、刺激細胞またはレスポンダー細胞のどちらかとして使用する。注目すべきこととして、これらの細胞の源を、一般に使用されているヒト由来刺激／レスポンダー細胞と交換することができる。加えて、任意の哺乳動物精製同種ＣＤ４＋Ｔ細胞集団、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団、またはＣＤ４−／ＣＤ８−を、レスポンダー集団として使用することができる。
【０９６３】
マウス脾細胞を、完全フロスト加工スライドガラスを使用する機械的解離によって単離し、その後、溶解緩衝剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で赤血球溶解を行う。実験の前に、刺激細胞に２０Ｇｙのγ線を照射して、それらがレスポンダー細胞に対して反応しないようにする。次いで、同数（または１：１比を維持するが代替濃度）の刺激細胞およびレスポンダー細胞を、丸底９６ウェルプレートの完全ＤＭＥＭ−１０培地に添加することによって共培養を行う。適切な数のフソソームを（１×１０１〜１×１０８の範囲からのいくつかの濃度で）異なる時間間隔、ｔ＝０、６、１２、２４、３６、４８時間で、共培養に加える。
【０９６４】
１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を添加して組込みを可能にすることにより、増殖を評定する。［３Ｈ］−チミジンを、ｔ＝２、６、１２、２４、３６、４８、７２時間の時点でＭＬＲに添加し、２、６、１２、１８、２４、３６および４８時間の拡大培養後、９６ウェルセルハーベスター（Ｉｎｏｔｅｃｋ、ベルトールドジャパン株式会社、日本）を使用してガラス繊維フィルターで細胞を採取する。Ｔ細胞増殖実験のすべてを三重反復で行う。［３Ｈ］−チミジン組込みを、マイクロベータｌＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を使用して測定する。結果をカウント毎分（ｃｐｍ）で表すことができる。
【０９６５】
一部の実施形態では、ＭＳＣ−ＩＬ１０フソソームは、ＭＳＣ−空ベクターまたはＭＳＣ未改変フソソーム対照と比較してＴ細胞増殖の減少を示すことになる。
（実施例８７）
対象における標的化可能性の測定
【０９６６】
この実施例は、特定の身体部位を標的とするフソソームの能力を評定する。一部の実施形態では、フソソームは、特定の身体部位を標的とすることができる。標的化は、治療薬の活性を１つまたは複数の適切な治療部位に制限する方法である。
【０９６７】
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは細胞を静脈内注射する。ホタルルシフェラーゼを安定的に発現する細胞またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から、前の実施例で説明した方法のいずれか１つによりフソソームを産生する。マウスの群をフソソームまたは細胞注射後１、２、３、４、５、６、８、１２および２４時間の時点で安楽死させる。
【０９６８】
ルシフェラーゼを可視化するために、安楽死の５分前に１５０ｍｇ／ｋｇの用量の生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のＩＰ注射をマウスに施す。生物発光イメージングシステムを較正してすべてのデバイス設定を補正する。次いで、マウスを安楽死させ、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、ＧＩ、および腎臓を採取する。イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、これらのｅｘ  ｖｉｖｏ臓器の生物発光の画像を得る。生物発光シグナルは、Ｒａｄｉａｎｃｅ  Ｐｈｏｔｏｎｓを使用して測定し、全光束を測定値として使用する。関心領域（ＲＯＩ）を、ｅｘ  ｖｉｖｏ臓器を囲むことにより生成して、光子数／秒で値を得る。標的臓器（例えば、肝臓）と非標的臓器（例えば、肺、心臓、脾臓、膵臓、ＧＩおよび腎臓からの光子数／秒の合計）の間の光子数／秒の比を、肝臓への標的化の尺度として算出する。
【０９６９】
一部の実施形態では、フソソームと細胞の両方において、肝臓と他の臓器の間の光子数／秒の比は、１より大きくなり、これは、フソソームが肝臓を標的とすることを示すことになる。一部の実施形態では、陰性対照動物は、すべての臓器において、はるかに低い光子数／秒を提示することになる。
（実施例８８）
対象における外因性薬剤の送達の測定
【０９７０】
この実施例は、対象における外因性薬剤を含むフソソームの送達の定量を説明する。ガウシア−ルシフェラーゼを発現する細胞またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から、前の実施例で説明した方法のいずれか１つによりフソソームを調製する。
【０９７１】
陽性対照細胞またはフソソームをマウスに静脈内注射する。２６ゲージインスリン注射針を使用して５〜８秒以内にフソソームまたは細胞を送達する。注射の１、２または３日後に、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用してｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングを行う。
【０９７２】
使用直前に、セレンテラジン、ルシフェリンまたは発光分子（５ｍｇ／ｍＬ）を酸性メタノール中で調製し、マウスの尾静脈に直ちに注射する。マウスは、加熱された台の上で、ＸＧＩ−８ガス麻酔システムを使用して持続麻酔されている。
【０９７３】
セレンテラジン［４μｇ／（ｇ体重）］の尾静脈静脈内注射直後に５分にわたって光子カウントを取得することにより、生体発光イメージングを達成する。取得データを、ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用してライト・ビュー画像を重ね合わせて解析する。自動シグナル強度カウンターツールを使用して関心領域（ＲＯＩ）を作成し、同じ動物のバックグラウンド減算で正規化する。５８０、６００および６２０ｎｍの波長の３つのフィルターを３〜１０分の露光時間で使用して順次データ取得を行って、マウス体内の生物発光の光源の位置を突き止める。
【０９７４】
さらに、各時点で、腹部触診により尿試料を収集する。
【０９７５】
血液試料（５０μＬ）を各マウスの尾静脈から、ヘパリン処理された管またはＥＤＴＡ管に採取する。血漿単離のために、血液試料を２５分間、１．３×ｇで、４℃で遠心分離する。
【０９７６】
次いで、試料を５０μＭガウシア−ルシフェラーゼ基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ、Ｐｉｎｅｔｏｐ、ＡＺ）と混合した後、５μＬの血液、血漿または尿試料を使用してガウシア−ルシフェラーゼ活性アッセイを行う。
【０９７７】
一部の実施形態では、陰性対照試料は、ルシフェラーゼに対して陰性となり、陽性対照試料は、細胞を投与した動物からの試料となる。一部の実施形態では、ガウシア−ルシフェラーゼを発現するフソソームを投与した動物からの試料は、各試料においてルシフェラーゼに対して陽性となる。
【０９７８】
例えば、Ｅｌ−Ａｍｏｕｒｉ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５３（１）：  ６３−７３，  ２０１３を参照されたい。
（実施例８９）
フソソームの脂質二重層を介した能動輸送
【０９７９】
この実施例は、生細胞におけるグルコース取込みをモニターし、したがって脂質二重層を介した能動輸送をモニターするために使用することができる蛍光グルコースアナログである２−ＮＢＤＧ（２−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース）のレベルの定量を説明する。一部の実施形態では、このアッセイまたは同等のアッセイを使用して、フソソームの脂質二重層を介したグルコース取込みおよび能動輸送レベルを測定することができる。
【０９８０】
前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生されるフソソーム組成物。次いで、十分な数のフソソームを、グルコースを含有せず、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で、２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。２時間のグルコース飢餓期間の後、培地を、グルコースを含有せず、２０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２０μＭ  ２−ＮＢＤＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＤＭＥＭを含むように交換し、２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。陰性対照フソソームには、２−ＮＢＤＧのビヒクルである同量のＤＭＳＯを２−ＮＢＤＧの代わりに添加することを除いて、同じ処置を施す。
【０９８１】
次いで、フソソームを１×ＰＢＳで３回洗浄し、適切な緩衝剤に再懸濁させ、９６ウェルイメージングプレートに移す。次いで、蛍光光度計でＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して２−ＮＢＤＧ蛍光を測定して、１時間のローディング期間中にフソソーム膜を越えて輸送されてフソソーム内に蓄積された２−ＮＢＤＧの量を定量する。
【０９８２】
一部の実施形態では、２−ＮＢＤＧ蛍光は、陰性（ＤＭＳＯ）対照と比較して２−ＮＢＤＧ処置を行ったフソソームにおけるほうが高くなる。５２５／３９発光フィルターでの蛍光測定量は、存在する２−ＮＢＤＧ分子の数に比例することになる。
（実施例９０）
非エンドサイトーシス経路によるフソソームの送達
【０９８３】
この実施例は、非エンドサイトーシス経路によるレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達の定量を説明する。
【０９８４】
一部の実施形態では、フソソームは、薬剤を、フソソーム媒介、非エンドサイトーシス経路によって送達することになる。理論により拘束されることを望まないが、フソソームのエンドサイトーシス媒介取込みを一切必要としない、直接レシピエント細胞のサイトゾルへの、フソソームの内腔内に担持される薬剤、例えばＣｒｅの送達が、フソソーム媒介、非エンドサイトーシス経路送達によって起こることになる。
【０９８５】
この実施例では、フソソームは、センダイウイルスＨおよびＦタンパク質をその原形質膜上に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４），  １−８．  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２３）を含む。加えて、フソソームは、ｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、Ｃｒｅによる組換え時にＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替える（これは、融合および、マーカーとしてのＣｒｅ送達を示す）ＣＭＶプロモーターのもとで「ＬｏｘＰ−ＧＦＰ−ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ＲＦＰ」カセットを安定的に発現する、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。
【０９８６】
本明細書に記載の方法により産生したフソソームを、非エンドサイトーシス経路によるＣｒｅの送達について次のようにアッセイする。レシピエント細胞を、黒色の透明底９６ウェルプレートに播種する。次に、レシピエント細胞の播種の２４時間後、ＤＭＥＭ培地中のレシピエント細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、適用する。非エンドサイトーシス経路によるＣｒｅ送達レベルを判定するために、フソソームを受けるレシピエント細胞の並行群を、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキン（３０μｇ／ｍＬ）で処置する。フソソームの用量は、ウェルに播種するレシピエント細胞の数と相関する。フソソームの適用後、細胞プレートを４００ｇで５分間、遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞間の接触の開始を助長する。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、薬剤送達、Ｃｒｅをイメージングによって評定する。
【０９８７】
細胞をイメージングして、視野またはウェル内のＲＦＰ陽性細胞をＧＦＰ陽性細胞と対比して陽性同定する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡を使用して細胞プレートをイメージングする。先ず、ＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で細胞を１０分間染色することにより、所与のウェル内の全細胞集団を判定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、ＤＮＡへのインターカレーションにより細胞核を染色するので、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を使用して個々の細胞を同定する。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に置換する。
【０９８８】
４０５ｎｍ  ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して、Ｈｏｅｃｈｓｔをイメージングする。４６５ｎｍ  ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用してＧＦＰをイメージングし、その一方で、５２３ｎｍ  ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用してＲＦＰをイメージングする。先ず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームではなくＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処置したレシピエント細胞を用いてＬＥＤ強度および積分時間を確立することにより、異なる細胞群の画像を取得する。
【０９８９】
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰ強度が飽和値ではなく最大画素強度値での強度になるように設定する。次いで、確立した設定を使用して、目的のウェルをイメージングする。
【０９９０】
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの解析は、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアまたは他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，  Ｗ．Ｓ．，  ＩｍａｇｅＪ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ，  １９９７−２００７）を用いて行う。６０μｍ幅でローリングボールバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して画像を前処理する。全細胞マスクをＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定する。バックグラウンド強度より有意に高いＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞を使用して閾値を設定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞であるには小さ過ぎるまたは大き過ぎるエリアを除外する。
【０９９１】
全細胞マスクの中で、バックグラウンドより有意に高い細胞について再び閾値を設定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞蛍光全体を含むように細胞エリア全体に拡大することにより、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞を同定する。
【０９９２】
レシピエント細胞を含有する対照ウェルにおいて同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含有するウェルにおけるＲＦＰ陽性細胞の数から減算する（非特異的Ｌｏｘｐ組換えについて減算する）。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受けたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受けていないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団に送達されたフソソームＣｒｅの分率を定量する。レベルを、レシピエント細胞に適用したフソソームの所与の用量に正規化する。非エンドサイトーシス経路によって送達されるフソソームＣｒｅの値を算出するために、クロロキンの存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）のレベルを決定し、クロロキンの非存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ−ＣＱ）のレベルも決定する。非エンドサイトーシス経路によって送達されるフソソームＣｒｅの正規化値を決定するために、次の式を使用する：［（ＦｕｓＬ−ＣＱ）−（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）］／（ＦｕｓＬ−ＣＱ）。
【０９９３】
一部の実施形態では、所与のフソソームについての非エンドサイトーシス経路によって送達されるフソソームＣｒｅの平均レベルは、０．１〜０．９５の範囲内、またはクロロキン処置レシピエント細胞より少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれを超えて高くなる。
（実施例９１）
エンドサイトーシス経路によるフソソームの送達
【０９９４】
この実施例は、エンドサイトーシス経路によるレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達を説明する。
【０９９５】
一部の実施形態では、フソソームは、薬剤を、フソソーム媒介、エンドサイトーシス経路によって送達することになる。理論により拘束されることを望まないが、エンドサイトーシス依存性である取込み経路での、レシピエント細胞への、フソソームの内腔内に担持されている薬剤、例えばカーゴの送達が、フソソーム媒介、エンドサイトーシス経路送達によって起こることになる。
【０９９６】
この実施例では、フソソームは、その原形質膜上にフソゲンタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２μｍフィルターに通して押し出すことにより産生した微小胞（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，  １８（３）．  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０５４４−０１６−００６６−ｙ）（Ｒｉｅｄｅｌ，  Ｋｏｎｄｏｒ−Ｋｏｃｈ，  ＆  Ｇａｒｏｆｆ，  １９８４，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３（７），  １４７７−８３；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／６０８６３２６から検索）を含む。加えて、フソソームは、ｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、Ｃｒｅによる組換え時にＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替える（これは、融合および、マーカーとしてのＣｒｅ送達を示す）ＣＭＶプロモーターのもとで「ＬｏｘＰ−ＧＦＰ−ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ＲＦＰ」カセットを安定的に発現する、ＰＣ３細胞である。
【０９９７】
本明細書に記載の方法により産生したフソソームを、エンドサイトーシス経路によるＣｒｅの送達について次のようにアッセイする。レシピエント細胞を、使用するイメージングシステムに適合する細胞培養マルチウェルプレートに播種する（この実施例では、細胞を黒色の透明底９６ウェルプレートに播種する）。次に、レシピエント細胞の播種の２４時間後、ＤＭＥＭ培地中のレシピエント細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、適用する。エンドサイトーシス経路によるＣｒｅ送達レベルを判定するために、フソソームを受けるレシピエント細胞の並行群を、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキン（３０μｇ／ｍＬ）で処置する。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関する。フソソームの適用後、細胞プレートを４００ｇで５分間、遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞間の接触の開始を助長する。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、薬剤送達、Ｃｒｅをイメージングによって評定する。
【０９９８】
細胞をイメージングして、視野またはウェル内のＲＦＰ陽性細胞をＧＦＰ陽性細胞と対比して陽性同定する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡を使用して細胞プレートをイメージングする。先ず、ＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で細胞を１０分間染色することにより、所与のウェル内の全細胞集団を判定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、ＤＮＡへのインターカレーションにより細胞核を染色するので、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を使用して個々の細胞を同定する。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に置換する。
【０９９９】
４０５ｎｍ  ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して、Ｈｏｅｃｈｓｔをイメージングする。４６５ｎｍ  ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用してＧＦＰをイメージングし、その一方で、５２３ｎｍ  ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用してＲＦＰをイメージングする。先ず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームではなくＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処置したレシピエント細胞を用いてＬＥＤ強度および積分時間を確立することにより、異なる細胞群の画像を取得する。
【１０００】
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰ強度が飽和値ではなく最大画素強度値での強度になるように設定する。次いで、確立した設定を使用して、目的のウェルをイメージングする。
【１００１】
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの解析は、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアまたは他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，  Ｗ．Ｓ．，  ＩｍａｇｅＪ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ，  １９９７−２００７）を用いて行う。６０μｍ幅でローリングボールバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して画像を前処理する。全細胞マスクをＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定する。バックグラウンド強度より有意に高いＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞を閾値化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞であるには小さ過ぎるまたは大き過ぎるエリアを除外する。
【１００２】
全細胞マスクの中で、バックグラウンドより有意に高い細胞について再び閾値化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞蛍光全体を含むように細胞エリア全体に拡大することにより、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞を同定する。
【１００３】
レシピエント細胞を含有する対照ウェルにおいて同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含有するウェルにおけるＲＦＰ陽性細胞の数から減算する（非特異的Ｌｏｘｐ組換えについて減算する）。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受けたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受けていないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団に送達されたフソソームＣｒｅの分率を定量する。レベルを、レシピエント細胞に適用したフソソームの所与の用量に正規化する。エンドサイトーシス経路によって送達されるフソソームＣｒｅの値を算出するために、クロロキンの存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）のレベルを決定し、クロロキンの非存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ−ＣＱ）のレベルも決定する。エンドサイトーシス経路によって送達されるフソソームＣｒｅの正規化値を決定するために、次の式を使用する：（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）／（ＦｕｓＬ−ＣＱ）。
【１００４】
一部の実施形態では、所与のフソソームについてのエンドサイトーシス経路によって送達されるフソソームＣｒｅの平均レベルは、０．０１〜０．６の範囲内、またはクロロキン処置レシピエント細胞より少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれを超えて高くなる。
（実施例９２）
ダイナミン媒介経路、マクロピノサイトーシス経路、またはアクチン媒介経路によるフソソームの送達
【１００５】
この実施例は、ダイナミン媒介経路によるレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達を説明する。微小胞を含むフソソームは、前記実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をダイナミンの阻害剤であるダイナソア（１２０μＭ）で処置することを除いて、前記実施例に従ってフソソームをダイナミン媒介経路によるＣｒｅの送達についてアッセイする。ダイナミン媒介経路によって送達されるフソソームＣｒｅの値を算出するために、ダイナソアの存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ＋ＤＳ）のレベルを決定し、ダイナソアの非存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ−ＤＳ）のレベルも決定する。送達されるフソソームＣｒｅの正規化値は、前記実施例で説明したように算出することができる。
【１００６】
この実施例は、マクロピノサイトーシスによるレシピエント細胞へのＣｒｅの送達も説明する。微小胞を含むフソソームは、前記実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をマクロピノサイトーシスの阻害剤である５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）（２５μＭ）で処置することを除いて、前記実施例に従ってフソソームをマクロピノサイトーシスによるＣｒｅの送達についてアッセイする。マクロピノサイトーシスによって送達されるフソソームＣｒｅの値を算出するために、ＥＩＰＡの存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ＋ＥＰＩＡ）のレベルを決定し、ＥＰＩＡの非存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ−ＥＩＰＡ）のレベルも決定する。送達されるフソソームＣｒｅの正規化値は、前記実施例で説明したように算出することができる。
【１００７】
この実施例は、アクチン媒介経路によるレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達も説明する。微小胞を含むフソソームは、前記実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をアクチン重合の阻害剤であるラトランクリンＢ（６μＭ）で処置することを除いて、前記実施例に従ってフソソームをマクロピノサイトーシスによるＣｒｅの送達についてアッセイする。アクチン媒介経路によって送達されるフソソームＣｒｅの値を算出するために、ラトランクリンＢの存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ＋ＬａｔＢ）のレベルを決定し、ラトランクリンＢの非存在下でのフソソームＣｒｅ送達（ＦｕｓＬ−ＬａｔＢ）のレベルも決定する。送達されるフソソームＣｒｅの正規化値は、前記実施例で説明したように算出することができる。
（実施例９３）
オルガネラの送達
【１００８】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞へのフソソームミトコンドリアカーゴの送達をもたらすことができる。
【１００９】
本明細書に記載の方法により説明される方法により産生したフソソームを、そのミトコンドリアをレシピエント細胞に送達するその能力について以下のようにアッセイした。
【１０１０】
この特定の実施例では、フソソームは、その膜上にフソゲンタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞であって、ミトコンドリアを標識するためのミトコンドリアに標的化されたＤｓＲＥＤ（ｍｉｔｏ−ＤｓＲＥＤ）も発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞であった。レシピエント細胞を、使用するイメージングシステムに適合する細胞培養マルチウェルプレートに播種した（この実施例では、細胞をガラス底イメージングディッシュに播種した）。レシピエント細胞は、サイトゾルＧＦＰを安定的に発現した。
【１０１１】
次に、レシピエント細胞の播種の２４時間後、ＤＭＥＭ培地中のレシピエント細胞に、ｍｉｔｏ−ＤｓＲＥＤを発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、適用した。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関した。フソソームの適用後、細胞プレートを４００ｇで５分間、遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞間の接触の開始を助長した。次いで、細胞を４時間インキュベートし、ＶＳＶＧ媒介融合を、ｐＨ６．０リン酸緩衝食塩水への１分の曝露により誘導した（または対照細胞をｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水に曝露する）。融合の誘導後、細胞をさらに１６時間インキュベートし、ミトコンドリア送達をイメージングによって評定した。
【１０１２】
この実施例では、３７℃および５％ＣＯ２で維持しながら、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０共焦点顕微鏡で６３倍油浸対物レンズを用いて、細胞をイメージングした。ＧＦＰを４８８ｎｍレーザーで励起させ、発光を４９５〜５３０ｎｍバンドパスフィルターによって記録した。ＤｓＲＥＤを５４３ｎｍレーザーで励起させ、発光を５６０〜６１０ｎｍバンドパスフィルターによって記録した。細胞をスキャンして、サイトゾルＧＦＰ蛍光およびｍｉｔｏ−ＤｓＲＥＤ蛍光に対して陽性の細胞を陽性同定した。
【１０１３】
サイトゾルＧＦＰミトコンドリアとｍｉｔｏ−ＤｓＲＥＤミトコンドリア両方の存在が同じ細胞で認められ、これは、細胞がＶＳＶＧ媒介融合を受けたこと、したがって、ミトコンドリアがフソソームからレシピエント細胞に送達されたことを示す。
（実施例９４）
ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達
【１０１４】
この実施例は、フソソームを使用するＤＮＡの細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの送達を説明する。この実施例は、外因性遺伝子、ＧＦＰ、代替治療用カーゴをコードするプラスミドを使用してＤＮＡを送達するフソソームの能力を定量する。
【１０１５】
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームになるようにフソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。フソソームの産生後、ＧＦＰをコードする配列を有するプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）をそのフソソームにさらにヌクレオフェクトする。
【１０１６】
例えば、Ｃｈｅｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｉｓ．  ２０１５  Ｍａｒ；２（１）：９６−１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
【１０１７】
陰性対照として、ベータ−アクチンをコードする配列を有するプラスミドをフソソームにヌクレオフェクトする。
【１０１８】
次いで、十分な数のフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞系とともに、４８時間、２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ中でインキュベートする。４８時間のインキュベーション後、次いで、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して５６１ｎｍレーザー励起でＦＡＣＳによってｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を単離し、発光を５９０＋／−２０ｎｍで収集する。次いで、ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して全ＤＮＡを単離し、６００ｂｐ断片を増幅するＧＦＰに特異的なプライマー（表２２２を参照されたい）を使用してＰＣＲを行う。次いで、ゲル電気泳動後にゲル上に存在する６００ｂｐ断片は、レシピエント細胞へのＤＮＡ送達の存在を実証することになる。
【表２２】
2021513849.tif 000054
【１０１９】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフソソームでの核酸カーゴの送達は、陰性対照と比較して、ＧＦＰプラスミドを有するフソソームでのほうが多い。陰性対照では無視できるほどのＧＦＰ蛍光しか検出されない。
（実施例９５）
ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達
【１０２０】
この実施例は、フソソームによるｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのＤＮＡの送達を説明する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのＤＮＡの送達は、レシピエント細胞内でのタンパク質の発現をもたらす。
【１０２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのフソソームＤＮＡ送達は、生物（マウス）体内のレシピエント細胞内へのＤＮＡの送達およびそのレシピエント細胞内でのタンパク質発現を実証することになる。
【１０２２】
肝臓指向性フソゲンを発現するフソソームを、本明細書に記載するように調製する。フソソームの産生後、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする配列を有するプラスミドをそのフソソームにさらにヌクレオフェクトする。
【１０２３】
フソソームをｉｎ  ｖｉｖｏ送達用に調製する。フソソーム懸濁液を遠心分離に付す。フソソームのペレットを注射用の滅菌リン酸緩衝食塩水に再懸濁させる。
【１０２４】
核酸検出方法、例えばＰＣＲを使用して、フソソームがＤＮＡを含有することを検証する。
【１０２５】
レシピエントマウスは、フソソームにより送達されるＤＮＡから作製されるＣＲＥタンパク質によってルシフェラーゼの発現の遮断を解除するように改変されているｌｏｘｐ−ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を保有する（ＪＡＸ＃００５１２５）。この実施例の陽性対照は、同じタンパク質をそれ自体のゲノムから肝臓において排他的に発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫（アルブミン−ＣＲＥ  ＪＡＸ＃００３５７４）である。この交配からの子孫は、各対立遺伝子（ｌｏｘｐ−ルシフェラーゼ、アルブミン−ＣＲＥ）の一方を保有する。陰性対照は、フソゲンを発現しないフソソーム、またはフソゲンを有するがＣｒｅ  ＤＮＡを含有しないフソソームをレシピエントマウスに注射することによって行う。
【１０２６】
フソソームを尾静脈静脈内（ＩＶ）投与によりマウスに送達する。マウスを市販のマウス拘束器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に入れる。拘束する前に、動物のケージを循環水浴上に置くことにより動物を温める。拘束器内に入れたら、動物を放置して順化させる。３０Ｇ針先端と、３”長のＰＥ−１０チューブと、２８Ｇ針とからなるＩＶカテーテルを用意し、ヘパリン添加食塩水でフラッシュする。尾を７０％アルコールプレップパッドで消毒する。次いで、カテーテル針を鉗子で把持し、チューブ内に血液が見えてくるまで外側尾静脈にゆっくりと導入する。フソソーム溶液（約５００Ｋ〜５Ｍフソソーム）を１ｃｃツベルクリン注射器に吸引し、輸液ポンプに接続する。フソソーム溶液を、用量に依存して３０秒〜５分間、毎分２０μＬの速度で送達する。輸注が完了した時点で、カテーテルを取り外し、一切の出血が止まるまで注射部位に圧力をかける。マウスをそれらのケージに戻し、放置して回復させる。
【１０２７】
融合後、ＤＮＡは、ＣＲＥタンパク質に転写され、翻訳されることになり、するとそのＣＲＥタンパク質が核に移行して組換えを実行し、その結果、ルシフェラーゼが構成的に発現されることになる。Ｄ−ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により、生物発光が生じることよってルシフェラーゼ発現の検出が可能になる。動物が動かないようにするためのコーン付き麻酔器（イソフルラン）を内蔵しているｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に動物を入れる。光子収集を注射後８〜２０分の間行って、Ｄ−ルシフェリン薬物動態学的クリアランスに起因する生物発光の最大値を観測する。肝臓の特定の領域をソフトウェアで作成し、計数率が（この領域で）６００より上になるように収集露光時間を設定して、解釈可能な放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）測定値を得る。生物発光放射輝度の最大値を生物発光分布の画像として記録する。肝臓組織を、特に、バックグラウンド（未処置動物）および陰性対照のものより上の放射輝度測定値についてモニターする。注射後２４時間の時点で測定を行ってルシフェラーゼ活性を観察する。次いで、マウスを安楽死させ、肝臓を採取する。
【１０２８】
採取したての組織を、４℃で１〜３時間の４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．４への浸漬による固定および包埋に付す。次いで、組織を４℃の滅菌１５％スクロース／１×ＰＢＳに浸漬する（３時間〜終夜）。次いで、組織をＯ．Ｃ．Ｔ．（Ｂａｘｔｅｒ番号Ｍ７１４８−４）に包埋する。切片作製のためにブロック内の組織（断面）の向きを適切に合わせる。次いで、次の方法を使用して組織を液体窒素で凍結させる：ブロックの下３分の１を液体窒素に入れ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．の中心部を除いてすべてが凍結されるまで放置して凍結させ、ドライアイスで凍結を完結させる。ブロックをクリオスタットにより切片作製して５〜７マイクロメートル切片にし、スライドガラスに載せ、染色のために再凍結させる。
【１０２９】
抗ジゴキシゲニン蛍光抗体により標識したジゴキシゲニン標識核酸プローブを（ＣＲＥ  ＤＮＡおよびルシフェラーゼｍＲＮＡ検出に）使用して組織切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを（標準的な方法を使用して）行い、共焦点顕微鏡観察により観察する。
【１０３０】
一部の実施形態では、陽性対照動物（フソソーム注射を伴わない育種による組換え）は、未処置動物（ＣＲＥなしおよびフソソームなし）および陰性対照と比較して肝臓において生物発光強度を示すことになり、その一方で、薬剤注射動物は、陰性対照（フソゲンを有さないフソソーム）および未処置動物と比較して肝臓において生物発光を示すことになる。
【１０３１】
実施形態では、薬剤注射動物の組織切片における核酸の検出は、組織内の細胞において、陰性対照および未処置動物と比較してＣＲＥリコンビナーゼおよびルシフェラーゼｍＲＮＡの検出を明示することになり、その一方で、陽性対照は、組織全体にわたって、ルシフェラーゼｍＲＮＡとＣＲＥリコンビナーゼＤＮＡの両方のレベルを示すことになる。
【１０３２】
フソソームによるＤＮＡ送達の証拠を、動物のレシピエント組織におけるＤＮＡおよびその共局在についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに基づく検出によって検出することになる。ＤＮＡから発現されるタンパク質の活性を、生物発光イメージングによって検出することになる。実施形態では、フソソームは、タンパク質産生および活性をもたらすＤＮＡを送達することになる。
（実施例９６）
ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達
【１０３３】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞への特定ｍＲＮＡの送達をもたらす。
【１０３４】
本明細書に記載の方法により産生したフソソームを、特定ｍＲＮＡをレシピエント細胞に送達するその能力について次のようにアッセイした。この特定の実施例では、フソソームは、ＣｒｅおよびＧＦＰを発現する３Ｔ３マウス線維芽細胞から生成された細胞生物製剤（核を欠いている）であった。したがって、細胞生物製剤をＨＶＪ−Ｅフソゲンタンパク質で処置してフソソームを産生した。
【１０３５】
レシピエントマウスマクロファージ細胞を、使用するイメージングシステムに適合する細胞培養マルチウェルプレートに播種した（この実施例では、細胞をガラス底イメージングディッシュに播種する）。レシピエント細胞は、Ｃｒｅによる組換え時にｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導する（これは、レシピエント細胞へのＣｒｅタンパク質の送達を示す）ＣＭＶプロモーターのもとで「ＬｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを安定的に発現した。
【１０３６】
次に、レシピエント細胞の播種の２４時間後、ＤＭＥＭ培地中のレシピエント細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、適用した。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関した。フソソームの適用後、細胞プレートを４００ｇで５分間、遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞間の接触の開始を助長した。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、ｍＲＮＡ送達をイメージングによって評定した。
【１０３７】
細胞を、イメージング前に１０分間、ＤＭＥＭ培地中の１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した。この実施例では、３７℃および５％ＣＯ２で維持しながら、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０共焦点顕微鏡で６３倍油浸対物レンズを用いて、細胞をイメージングした。Ｈｏｅｃｈｓｔを４０５ｎｍレーザーで励起させ、発光を４３０〜４６０ｎｍバンドパスフィルターによって記録した。ＧＦＰを４８８ｎｍレーザーで励起させ、発光を４９５〜５３０ｎｍバンドパスフィルターによって記録した。ｔｄＴｏｍａｔｏを５４３ｎｍレーザーで励起させ、発光を５６０〜６１０ｎｍバンドパスフィルターによって記録した。
【１０３８】
先ず、細胞をスキャンして、単核のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を陽性同定した。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の存在は、融合された細胞を示し、単一の核は、融合が細胞生物製剤フソソームドナーによるものであることを示した。これらの同定細胞を先ずイメージングして、次いでその後、４８８ｎｍレーザーを使用して光退色させてＧＦＰ蛍光を部分的にクエンチした。次いで、細胞を経時的にイメージングしてＧＦＰ蛍光の回復を評定し、この回復は、新しいＧＦＰタンパク質の翻訳、したがって、ドナーフソソームにより送達されたＧＦＰ  ｍＲＮＡの存在を実証することになる。
【１０３９】
目的の細胞におけるＨｏｅｃｈｓｔ、ＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の解析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，  Ｗ．Ｓ．，  ＩｍａｇｅＪ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ，  ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，  １９９７−２００７）を使用して行った。先ず、６０μｍ幅でローリングボールバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して画像を前処理した。光退色細胞内のＧＦＰ蛍光を閾値化してバックグラウンドを除去した。次いで、光退色細胞のＧＦＰ平均蛍光強度を、光退色前および後の異なる時点で解析した。
【１０４０】
この特定の実施例の中で、ＣｒｅおよびＧＦＰを発現し、どちらかが適用されたフソゲンＨＶＪ−Ｅ（＋フソゲン）を保有する、３Ｔ３マウス線維芽細胞の細胞生物製剤を、「ＬｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを発現するレシピエントマウスマクロファージ細胞に適用した。代表的な画像およびデータを図５に示す。この特定の実施例の場合、ＧＦＰ蛍光強度は、光退色の１０時間後に元の強度の最大２５％を回復し、これは、レシピエント細胞において活発に翻訳されるｍＲＮＡの送達を示す。
（実施例９７）
ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達
【１０４１】
この実施例は、フソソームによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞への低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達を説明する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞へのｓｉＲＮＡの送達は、レシピエント細胞内でのタンパク質の発現の抑制をもたらす。このことを使用して、その発現が細胞にとって有害であるタンパク質の活性を阻害することができ、したがって、細胞を正常に挙動することを可能にする。
【１０４２】
本明細書に記載の方法により産生したフソソームを、特定ｓｉＲＮＡをレシピエント細胞に送達するその能力について次のようにアッセイする。フソソームを本明細書に記載するように調製する。フソソームの産生後、ＧＦＰを特異的に阻害する配列を有するｓｉＲＮＡをそのフソソームにさらに電気穿孔する。ＧＦＰに対して標的化された二本鎖ｓｉＲＮＡの配列は、５’ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＵＣ  ３’（配列番号４３）およびその相補配列３’ＣＧＣＵＧＣＡＵＵＵＧＣＣＧＧＵＧＵＵＣＡ  ５’（配列番号４４）である（ｓｉＲＮＡ配列の３’末端に２塩基対長のオーバーハングがあることに留意されたい）。陰性対照としてルシフェラーゼを特異的に阻害する配列を有するｓｉＲＮＡをフソソームに電気穿孔する。ルシフェラーゼに対して標的化された二本鎖ｓｉＲＮＡの配列は、５’ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ  ３’（配列番号４５）およびその相補配列３’ＴＴＧＡＡＵＧＣＧＡＣＵＣＡＵＧＡＡＧＣＵ  ５’（配列番号４６）である（ｓｉＲＮＡ配列の３’末端に２塩基対長のオーバーハングがあることに留意されたい）。
【１０４３】
次いで、ＧＦＰを構成的に発現するレシピエント細胞にフソソームを適用する。レシピエント細胞を、黒色の透明底９６ウェルプレートに播種する。次に、レシピエント細胞の播種の２４時間後、発現するフソソームをＤＭＥＭ培地中のレシピエント細胞に適用する。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関する。フソソームの適用後、細胞プレートを４００ｇで５分間、遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞間の接触の開始を助長する。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、薬剤送達、ｓｉＲＮＡをイメージングによって評定する。
【１０４４】
細胞をイメージングして、視野またはウェル内のＧＦＰ陽性細胞を陽性同定する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−ａｕｔｏｍａｔｅｄ−ｃｅｌｌ−ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ−ｆｘ−ａｕｔｏｍａｔｅｄ−ｌｉｖｅ−ｃｅｌｌ−ｉｍａｇｅｒ／）を使用して細胞プレートをイメージングする。先ず、ＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で細胞を１０分間染色することにより、所与のウェル内の全細胞集団を判定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、ＤＮＡへのインターカレーションにより細胞核を染色するので、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を使用して個々の細胞を同定する。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に置換する。
【１０４５】
４０５ｎｍ  ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して、Ｈｏｅｃｈｓｔをイメージングする。４６５ｎｍ  ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して、ＧＦＰをイメージングする。先ず、未処置ウェル、すなわち、いかなるフソソームでも処置しなかったレシピエント細胞を用いてＬＥＤ強度および積分時間を確立することにより、異なる細胞群の画像を取得する。
【１０４６】
取得設定は、ＧＦＰ強度が飽和値ではなく最大画素強度値での強度になるように設定する。次いで、確立した設定を使用して、目的のウェルをイメージングする。
【１０４７】
ＧＦＰ陽性ウェルの解析は、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアまたは他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，  Ｗ．Ｓ．，  ＩｍａｇｅＪ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ，  ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，  １９９７−２００７）を用いて行う。６０μｍ幅でローリングボールバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して画像を前処理する。全細胞マスクをＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定する。バックグラウンド強度より有意に高いＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞を閾値化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞であるには小さ過ぎるまたは大き過ぎるエリアを除外する。
【１０４８】
全細胞マスクの中で、バックグラウンドより有意に高い細胞について再び閾値化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを、ＧＦＰ細胞蛍光全体を含むように細胞エリア全体に拡大することにより、ＧＦＰ陽性細胞を同定する。全細胞のうちのＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを算出する。
【１０４９】
実施形態では、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを含有するフソソームで処置したウェルにおけるＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを含有するフソソームで処置したウェルにおけるＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージより少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％低くなる。
（実施例９８）
ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達
【１０５０】
この実施例は、フソソームによるｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達を説明する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのｍＲＮＡの送達は、レシピエント細胞内でのタンパク質の発現をもたらす。一部の実施形態では、この送達方法を使用して、遺伝的突然変異に起因して存在しないタンパク質を補充することができ、したがって、細胞が正常に挙動することを可能にする、または機能、例えば治療機能を行うように細胞の活性の方向を変えることを可能にする。
【１０５１】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでのフソソームｍＲＮＡ送達は、生物（例えば、マウス）体内のレシピエント細胞内へのメッセンジャーＲＮＡの送達およびそのレシピエント細胞内でのタンパク質発現を実証する。
【１０５２】
一部の実施形態では、肝臓指向性フソゲンを発現するフソソームであって、Ｃｒｅを発現するｍＲＮＡを産生するフソソームを、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達用に調製する。
【１０５３】
フソソームを本明細書に記載するように調製する。フソソーム懸濁液を遠心分離に付す。フソソームのペレットを注射用の滅菌リン酸緩衝食塩水に再懸濁させる。
【１０５４】
核酸検出方法、例えばＰＣＲを使用して、フソソームがｍＲＮＡを発現することを検証する。
【１０５５】
レシピエントマウスは、フソソームにより送達されるｍＲＮＡから作製されるＣＲＥタンパク質によってルシフェラーゼの発現の遮断を解除するように改変されているｌｏｘｐ−ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を保有する（ＪＡＸ＃００５１２５）。この実施例の陽性対照は、同じタンパク質をそれ自体のゲノムから肝臓において排他的に発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫（アルブミン−ＣＲＥ  ＪＡＸ＃００３５７４）である。この交配からの子孫は、各対立遺伝子（ｌｏｘｐ−ルシフェラーゼ、アルブミン−ＣＲＥ）の一方を保有する。陰性対照は、フソゲンを発現しないフソソーム、またはフソゲンを有するがＣｒｅ  ｍＲＮＡを発現しないフソソームを、レシピエントマウスに注射することによって行う。
【１０５６】
フソソームを尾静脈静脈内（ＩＶ）投与によりマウスに送達する。マウスを市販のマウス拘束器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に入れる。拘束する前に、動物のケージを循環水浴上に置くことにより動物を温める。拘束器内に入れたら、動物を放置して順化させる。３０Ｇ針先端と、３”長のＰＥ−１０チューブと、２８Ｇ針とからなるＩＶカテーテルを用意し、ヘパリン添加食塩水でフラッシュする。尾を７０％アルコールプレップパッドで消毒する。次いで、カテーテル針を鉗子で把持し、チューブ内に血液が見えてくるまで外側尾静脈にゆっくりと導入する。フソソーム溶液（約５００Ｋ〜５Ｍフソソーム）を１ｃｃツベルクリン注射器に吸引し、輸液ポンプに接続する。フソソーム溶液を、用量に依存して３０秒〜５分間、毎分２０μＬの速度で送達する。輸注が完了した時点で、カテーテルを取り外し、一切の出血が止まるまで注射部位に圧力をかける。マウスをそれらのケージに戻し、放置して回復させる。
【１０５７】
融合後、ｍＲＮＡは、レシピエント細胞質においてＣＲＥタンパク質に翻訳され、するとそのＣＲＥタンパク質が核に移行して組換えを実行し、その結果、ルシフェラーゼが構成的に発現されることになる。Ｄ−ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により、生物発光が生じることよってルシフェラーゼ発現の検出が可能になる。動物が動かないようにするためのコーン付き麻酔器（イソフルラン）を内蔵しているｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に動物を入れる。光子収集を注射後８〜２０分の間行って、Ｄ−ルシフェリン薬物動態学的クリアランスに起因する生物発光の最大値を観測する。肝臓の特定の領域をソフトウェアで作成し、計数率が（この領域で）６００より上になるように収集露光時間を設定して、解釈可能な放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）測定値を得る。生物発光放射輝度の最大値を生物発光分布の画像として記録する。肝臓組織を、特に、バックグラウンド（未処置動物）および陰性対照のものより上の放射輝度測定値についてモニターする。注射後２４時間の時点で測定を行ってルシフェラーゼ活性を観察する。次いで、マウスを安楽死させ、肝臓を採取する。
【１０５８】
採取したての組織を、４℃で１〜３時間の４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．４への浸漬による固定および包埋に付す。次いで、組織を４℃の滅菌１５％スクロース／１×ＰＢＳに浸漬する（３時間〜終夜）。次いで、組織をＯ．Ｃ．Ｔ．（Ｂａｘｔｅｒ番号Ｍ７１４８−４）に包埋する。切片作製のためにブロック内の組織（断面）の向きを適切に合わせる。次いで、次の方法を使用して組織を液体窒素で凍結させる：ブロックの下３分の１を液体窒素に入れ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．の中心部を除いてすべてが凍結されるまで放置して凍結させ、ドライアイスで凍結を完結させる。ブロックをクリオスタットにより切片作製して５〜７マイクロメートル切片にし、スライドガラスに載せ、染色のために再凍結させる。
【１０５９】
抗ジゴキシゲニン蛍光抗体により標識したジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを（ＣＲＥ  ｍＲＮＡおよびルシフェラーゼｍＲＮＡ検出に）使用して組織切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い（標準的な方法を使用する）、共焦点顕微鏡観察により観察する。
【１０６０】
一部の実施形態では、陽性対照動物（例えば、フソソーム注射を伴わない育種による組換え）は、未処置動物（例えば、ＣＲＥもフソソームもなし）および陰性対照と比較して、肝臓において生物発光強度を示すことになる。一部の実施形態では、フソソーム注射動物は、陰性対照（フソゲンを有さないフソソーム）および未処置動物と比較して、肝臓において生物発光を示すことになる。
【１０６１】
一部の実施形態では、フソソームを投与した動物の組織切片におけるｍＲＮＡの検出は、組織内の細胞において、陰性対照および未処置動物と比較してＣＲＥリコンビナーゼおよびルシフェラーゼｍＲＮＡの検出を明示することになる。一部の実施形態では、陽性対照は、組織全体にわたって、ルシフェラーゼｍＲＮＡとＣＲＥリコンビナーゼｍＲＮＡの両方のレベルを示すことになる。
【１０６２】
一部の実施形態では、フソソームによるｍＲＮＡ送達の証拠を、動物のレシピエント組織におけるｍＲＮＡおよびその共局在についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに基づく検出によって検出することになる。一部の実施形態では、フソソームにより送達されたｍＲＮＡから発現されたタンパク質の活性を、生物発光イメージングにより検出する。一部の実施形態では、フソソームは、タンパク質産生および活性をもたらすｍＲＮＡを送達する。
（実施例９９）
タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達
【１０６３】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合を実証する。この実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞へのＣｒｅタンパク質の送達をもたらす。
【１０６４】
この実施例では、センダイウイルスＨＶＪ−Ｅタンパク質を保有する３Ｔ３マウス線維芽細胞（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４），  １−８．  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２）からフソソームを生成した。加えて、フソソームは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現した。標的細胞は、Ｃｒｅによる組換え時にＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替える（これは、融合および、マーカーとしてのＣｒｅ送達を示す）ＣＭＶプロモーターのもとで「ＬｏｘＰ−ＧＦＰ−ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ＲＦＰ」カセットを安定的に発現する、初代ＨＥＫ２９３Ｔ細胞であった。
【１０６５】
本明細書に記載の方法により産生したフソソームを、Ｃｒｅタンパク質をレシピエント細胞に送達する能力について次のようにアッセイした。レシピエント細胞を、使用するイメージングシステムに適合する細胞培養マルチウェルプレートに播種した（この実施例では、細胞を黒色の透明底９６ウェルプレートに播種した）。次に、レシピエント細胞の播種の２４時間後、ＤＭＥＭ培地中のレシピエント細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、適用した。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関した。フソソームの適用後、細胞プレートを４００ｇで５分間、遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞間の接触の開始を助長した。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、タンパク質送達をイメージングによって評定した。
【１０６６】
細胞をイメージングして、視野またはウェル内のＲＦＰ陽性細胞をＧＦＰ陽性細胞と対比して陽性同定した。この実施例では、自動顕微鏡を使用して細胞プレートをイメージングした。先ず、ＤＭＥＭ培地中の１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で細胞を１０分間染色することにより、所与のウェル内の全細胞集団を判定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、ＤＮＡへのインターカレーションにより細胞核を染色するので、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を使用して個々の細胞を同定する。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に置換した。４０５ｎｍ  ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して、Ｈｏｅｃｈｓｔをイメージングした。４６５ｎｍ  ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用してＧＦＰをイメージングし、その一方で、５２３ｎｍ  ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用してＲＦＰをイメージングした。先ず、陽性対照ウェル、すなわち、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処置した細胞を用いてＬＥＤ強度および積分時間を確立することにより、異なる細胞群の画像を取得した。取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰ強度が飽和値ではなく最大画素強度値での強度になるように設定した。次いで、確立した設定を使用して、目的のウェルをイメージングした。
【１０６７】
Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＧＦＰ、およびＲＦＰ陽性ウェルの解析は、ＬｉｏｎＨｅａｒｔ  ＦＸに付属のＧｅｎ５ソフトウェアで、またはＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，  Ｗ．Ｓ．，  ＩｍａｇｅＪ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ，  ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，  １９９７−２００７）によって、行った。先ず、６０μｍ幅でローリングボールバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して画像を前処理した。次に、全細胞マスクをＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定した。バックグラウンド強度より有意に高いＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞を閾値化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞であるには小さ過ぎるまたは大き過ぎるエリアを除外した。全細胞マスクの中で、バックグラウンドより有意に高い細胞について再び閾値化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞蛍光全体を含むように細胞エリア全体に拡大することにより、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞を同定した。
【１０６８】
レシピエント細胞のみを含有する対照ウェルにおいて同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含有するウェルにおけるＲＦＰ陽性細胞の数から減算した（非特異的Ｌｏｘｐ組換えについて減算した）。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（薬剤を受けたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（薬剤を受けていないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団内のフソソーム剤送達の分率を定量した。
【１０６９】
この特定の実施例の中で、Ｃｒｅを発現し、適用されたフソゲンＨＶＪ−Ｅ（＋フソゲン）を保有するかまたは保有しない（−ｆｕｓｏｇｅｎ）、３Ｔ３マウス線維芽細胞を、「ＬｏｘＰ−ＧＦＰ−ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ＲＦＰ」カセットを発現するレシピエント２９３Ｔ細胞に適用した。Ｃｒｅタンパク質の送達を、レシピエント細胞におけるＲＦＰ発現の誘導によって評定する。図６のグラフは、Ｈｏｅｃｈｓｔに対して陽性の染色を示した全細胞（各ペアの最も左側のバー）のうちのＲＦＰ陽性細胞（各ペアの最も右側のバー）の定量を示す。この特定の実施例の場合、レシピエント細胞へのフソソーム送達の分率は、ＨＶＪ−Ｅフソゲンを保有する３Ｔ３  Ｃｒｅ細胞について０．４４である。
（実施例１００）
タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ送達
【１０７０】
この実施例は、フソソームによる眼への治療剤の送達を説明する。
【１０７１】
フソソームは、前の実施例において説明した方法のいずれかを使用して造血幹細胞および始原細胞から得られ、ノックアウトされたマウスに欠損しているタンパク質をフソソームにローディングする。
【１０７２】
タンパク質が欠損しているマウスの右眼にフソソームを網膜下注射し、マウスの左眼にビヒクル対照を注射する。マウスのサブセットを、それらが２ヶ月齢に達したら、安楽死させる。
【１０７３】
採取した網膜組織の組織学的検査およびＨ＆Ｅ染色を行って、マウスの各網膜においてレスキューされた細胞の数を計数する（Ｓａｎｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  １２６（８）：  ３１０４−３１１６，  ２０１６に記載されている）。
【１０７４】
注射タンパク質のレベルを、２ヶ月齢で安楽死させたマウスから採取した網膜において、ＰＤＥ６Ｂタンパク質に特異的な抗体でのウエスタンブロットによって測定する。
【１０７５】
一部の実施形態では、フソソームを投与されるマウスの左眼は、ビヒクルで処置されるマウスの右眼と比較して、網膜の外顆粒層（ｏｕｔｅｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｖｅｌ）に存在する核の数の増加を有することになる。タンパク質の増加は、突然変異したＰＢＥ６Ｂタンパク質の補完を示唆する。
（実施例１０１）
レシピエントＤＮＡを編集するための送達
【１０７６】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞へのゲノムＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集機構の送達のためのフソソームを説明する。一部の実施形態では、フソソームによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞へのゲノムＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集機構の送達は、レシピエント細胞内の特定のタンパク質の機能の喪失をもたらす。この実施例で言及するゲノム編集機構は、ＧＦＰに特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成しているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質である。
【１０７７】
一部の実施形態では、フソソームは、治療剤の送達のためのシャーシである。一部の実施形態では、高い特異性および効率で細胞に送達され得るゲノム編集機構などの治療剤を使用して、高レベルでまたは不適切な細胞型において発現されると病原性になる遺伝子を、したがって後の遺伝子産物を不活性化することができるだろう。
【１０７８】
フソソームが、Ａ．Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＥＧＦＰの配列に特異的であるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列と複合体を形成しているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質も含むように、フソソームを操作することを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生されるフソソーム組成物。これを、Ｐ２Ａ切断配列により隔てられている、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９のオープンリーディングフレームとのインフレーム融合体である、ネオマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを有するＰｉｇｇｙＢａｃベクターをコヌクレオフェクトすることによって、実現する。コヌクレオフェクトされるさらなるＰｉｇｇｙＢａｃベクターとして、Ｕ６プロモーターにより駆動されるｇＲＮＡ配列（ＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣ（配列番号４７））も挙げられる。陰性対照として、フソソームが、マウスゲノム内の任意の標的に非特異的であるスクランブル型ｇＲＮＡ（ＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡ（配列番号４８））配列と複合体を形成しているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質を含むように、フソソームを操作する。
【１０７９】
十分な数のフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で、ＮＩＨ／３Ｔ３  ＧＦＰ＋細胞とともに、４８時間、２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ中でインキュベートする。４８時間のインキュベーション後、ゲノムＤＮＡを調製し、ＧＦＰ遺伝子内の予測ｇＲＮＡ切断部位の５００ｂｐ以内の領域に特異的なプライマー（表２３を参照されたい）とともに、鋳型として使用する。
【表２３】
2021513849.tif 000055
【１０８０】
次いで、ＰＣＲアンプリコンを精製し、キャピラリーシーケンシングによりシーケンシングし、次いで、ガイドＲＮＡにより決定される標的遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集を迅速に評定するウェブツールであるＴｉｄｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒにアップロードする。２つの標準的キャピラリーシーケンシング反応からの定量的配列トレースデータに基づいて、ソフトウェアは、編集有効性を定量する。ＧＦＰ遺伝子座を有する予測ｇＲＮＡ切断部位でのインデル（挿入または欠失）は、細胞におけるＧＦＰ発現の喪失をもたらすので、インデルを、ＦＡＣＳ解析（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用する４８８ｎｍアルゴンレーザー励起でのＦＡＣＳよって定量し、発光を５３０＋／−３０ｎｍで収集する。ＦＡＣＳソフトウェアを、取得および解析に使用する。光散乱チャネルをリニアゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールに設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を解析する。インデルおよびその後のＧＦＰ機能喪失を、各試料におけるＧＦＰシグナルの強度に基づいて算出する。
【１０８１】
一部の実施形態では、ＧＦＰ遺伝子座を有する予測ｇＲＮＡ切断部位でのインデル（挿入または欠失）、および細胞におけるＧＦＰ蛍光の喪失は、陰性対照と比較して、フソソームが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡを編集することができること、および結果としてタンパク質機能を喪失させることができることを示す。一部の実施形態では、スクランブル型ｇＲＮＡ配列を有するフソソームは、インデルも、その後のタンパク質機能喪失も明示しないことになる。
（実施例１０２）
フソソームの投与後の奇形種形成の評定
【１０８２】
この実施例は、フソソームでの奇形種形成の非存在を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、対象に投与されたとき、奇形種形成をもたらさないことになる。
【１０８３】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生する。ＰＢＳ中の、フソソーム、腫瘍細胞（陽性対照）またはビヒクル（陰性対照）を、マウス（１２〜２０週齢）の左側腹部に皮下注射する。奇形腫、例えば腫瘍、成長を、フソソーム、腫瘍細胞またはビヒクル注射後８週間、週に２〜３回、ノギスでの測定による腫瘍体積の判定によって分析する。
【１０８４】
一部の実施形態では、フソソームまたはビヒクルを投与したマウスは、ノギスでの測定によって測定可能な腫瘍形成、例えば奇形腫を有さないことになる。一部の実施形態では、腫瘍細胞で処置した陽性対照動物は、８週間の観察期間にわたってノギスにより測定して認識できる腫瘍、例えば奇形腫、サイズを明示することになる。
（実施例１０３）
フソソームはｉｎ  ｖｉｖｏで対象のレシピエント細胞に活性タンパク質を送達する
【１０８５】
この実施例は、フソソームがｉｎ  ｖｉｖｏで対象にタンパク質を送達することができることを実証する。このことは、核編集タンパク質Ｃｒｅの送達により例示される。細胞の内部に入ると、Ｃｒｅは核に移行し、そこでＣｒｅは、２つのＬｏｘＰ部位を組換え、２つのＬｏｘＰ部位の間のＤＮＡを切断する。２つのＬｏｘＰ部位間のＤＮＡが停止コドンであり、赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏなどの遠位蛍光タンパク質の上流にある場合、Ｃｒｅ媒介組換えを顕微鏡で測定することができる。
【１０８６】
タカラバイオ株式会社から購入した、ＣＲＥとフソゲンＶＳＶ−Ｇとを含有するフソソーム（Ｃｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｇｅｓｉｃｌｅｓ、タカラバイオ株式会社製品６３１４４９）を、Ｂ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ００７９０９系統）に注射した。動物の、表２４に記載するような解剖学的部位、注射体積および注射部位に、注射した。ｔｄＴｏｍａｔｏを有さないマウス（ＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）−ＧＴ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ００５１２５系統）であって、フソソームを注射したマウスと、フソソームを注射しなかったＢ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウスとを、陰性対照として使用した。
【表２４】
2021513849.tif 000056
【１０８７】
注射の２日後に、動物を屠殺し、試料を収集した。試料を８時間、２％ＰＦＡで固定し、終夜３０％スクロースで固定し、ＯＣＴへの即時包埋およびスライドにするための切片作製のために発送した。スライドをＤＡＰＩで核染色した。ＤＡＰＩおよびｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を顕微鏡でイメージングした。
【１０８８】
表２４に収載したすべての解剖学的部位は、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を明示した（図９）。加えて、筋肉組織への送達を、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光顕微鏡観察を使用して確認した（図１１）。陰性対照マウスは、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を有するいかなる組織も有さなかった。この結果は、フソソームが、マウスの様々な解剖学的部位の細胞においてｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光をオンにすることができること、およびこれが、マウスをフソソームで処置しなかった場合にも、マウスがそれらのゲノムにｔｄＴｏｍａｔｏを有さなかった場合にも、起こらないことを実証する。したがって、フソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏでマウス細胞の核に活性Ｃｒｅリコンビナーゼを送達する。
【１０８９】
異なる投与経路によってｉｎ  ｖｉｖｏでフソソームを組織に送達することができることも明らかになった。タカラバイオ株式会社から購入した、ＣＲＥとフソゲンＶＳＶ−Ｇとを含有するフソソーム（Ｃｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｇｅｓｉｃｌｅｓ、タカラバイオ株式会社製品６３１４４９）を、ＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）−ＧＴ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ００５１２５系統）に、筋肉内注射（５０μＬで右前脛骨筋に）、腹腔内注射（５０μＬで腹腔に）、および皮下注射（５０μＬで背面皮膚下に）した。
【１０９０】
下肢、腹側、および背面皮膚を、化学的除毛剤を４５秒間使用してそのエリアを脱毛し、その後、水で３回すすぐことによって、筋肉内、腹腔内および皮下注射のためにそれぞれ準備した。
【１０９１】
注射後３日目に、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して動物全体の生物発光画像を得た。ルシフェラーゼを可視化するために、イメージングの５分前に、１５０ｍｇ／ｋｇの用量の生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の腹腔内注射をマウスに施した。イメージングシステムを較正してすべてのデバイス設定を補正した。
【１０９２】
３つの経路すべてによる投与が発光をもたらし（図１０）、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス細胞への活性Ｃｒｅリコンビナーゼの送達成功を示す。
【１０９３】
結論として、フソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象の細胞に活性タンパク質を送達することができる。
（実施例１０４）
フソソーム内への核酸の超音波処理媒介ローディング
【１０９４】
この実施例は、超音波処理によるフソソームへの核酸ペイロードのローディングを説明する。超音波処理方法は、例えば、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，  ＴＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｖｉａ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  （２０１６）において開示されており、この参考文献の全内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【１０９５】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。おおよそ１０６個のフソソームを５〜２０μｇの核酸と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、４０ｋＨｚで作動する水浴超音波処理装置（Ｂｒａｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ−ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間、フソソーム／核酸混合物を超音波処理する。次いで、混合物を１分間、氷上に置き、その後、４０ｋＨｚで３０秒間の第２の超音波処理ラウンドを行う。次いで、混合物を１６，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離して、核酸を含有するフソソームをペレット化する。組み込まれなかった核酸を含有する上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝食塩水に再懸濁させる。ＤＮＡのローディング後、フソソームを使用するまで氷上で保持する。
（実施例１０５）
フソソーム内へのタンパク質の超音波処理媒介ローディング
【１０９６】
この実施例は、超音波処理によるフソソームへのタンパク質ペイロードのローディングを説明する。超音波処理方法は、例えば、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，  ＴＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｖｉａ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  （２０１６）において開示されており、この参考文献の全内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【１０９７】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。おおよそ１０６個のフソソームを５〜２０μｇタンパク質と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、４０ｋＨｚで作動する水浴超音波処理装置（Ｂｒａｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ−ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間、フソソーム／タンパク質混合物を超音波処理する。次いで、混合物を１分間、氷上に置き、その後、４０ｋＨｚで３０秒間の第２の超音波処理ラウンドを行う。次いで、混合物を１６，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離して、タンパク質を含有するフソソームをペレット化する。組み込まれなかったタンパク質を含有する上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝食塩水に再懸濁させる。タンパク質のローディング後、フソソームを使用するまで氷上で保持する。
（実施例１０６）
フソソーム内への核酸の疎水性担体媒介ローディング
【１０９８】
この実施例は、疎水性担体によるフソソームへの核酸ペイロードのローディングを説明する。例示的な疎水性ローディング方法は、例えば、Ｄｉｄｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｍＲＮＡ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２４（１０）：  １８３６−１８４７，  （２０１６）において開示されており、この参考文献の全内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【１０９９】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。ＲＮＡ分子の３’末端を生物活性疎水性コンジュゲート（トリエチレングリコール−コレステロール）にコンジュゲートする。１ｍＬでのおおよそ１０６個のフソソームとＰＢＳ中の１０μｍｏｌ／ｌのｓｉＲＮＡとを、３７℃で９０分間、５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートすることによって混合する。疎水性担体は、ＲＮＡとフソソームの膜との会合を媒介する。一部の実施形態では、フソソームの内腔に組み込まれるＲＮＡ分子もあり、フソソームの表面に存在するＲＮＡ分子もある。ローディングされていないフソソームを、ＲＮＡがローディングされたフソソームから、ＴＬＡ−１１０ローターを使用する卓上超遠心分離機での１時間、１００，０００ｇ、４℃での超遠心分離によって分離する。ローディングされていないフソソームは上清に残存し、ＲＮＡがローディングされたフソソームはペレットを形成する。ＲＮＡがローディングされたフソソームを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、使用するまで氷上で保持する。
（実施例１０７）
フソソームの処理
【１１００】
この実施例は、フソソームの処理を説明した。前の実施例において説明した方法のいずれかによって産生したフソソームをさらに処理することができる。
【１１０１】
一部の実施形態では、フソソームを、先ず、例えば超音波処理により、均質化する。例えば、超音波処理プロトコールは、８の振幅設定でマイクロプローブを有するＭＳＥ超音波処理装置（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｎ．Ｙ．）を使用する５秒の超音波処理を含む。一部の実施形態では、均質なサイズのフソソームへのフソソームの原形質膜の分解を引き起こすのに、この短い超音波処理時間で十分である。これらの条件下で、オルガネラ膜は破壊されず、これらを遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５分４℃）により除去する。次いで、実施例１６で説明したように分画遠心分離によりフソソームを精製する。
【１１０２】
市販のポリカーボネート膜（例えば、Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎからのもの）またはＰａｌｌ  Ｅｘｅｃｉａ、Ｆｒａｎｃｅから市販されている非対称セラミック膜（例えば、Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ）に通すフソソームの押出しは、比較的よく定義されているサイズ分布にフソソームサイズを低減させるのに有効な方法である。通常は、膜を通して１回または複数回、所望のフソソームサイズ分布が達成されるまで、懸濁液を循環させる。フソソームを、順々により小さい孔の膜（例えば、孔径４００ｎｍ、１００ｎｍおよび／または５０ｎｍ）に通して押し出して、サイズの漸減および均一な分布を達成することができる。
【１１０３】
一部の実施形態では、通常は均質化、超音波処理および／または押出しステップの前だが、フソソーム産生の任意のステップで、医薬剤（例えば、治療薬）を反応混合物に添加することができ、その結果、得られるフソソームに医薬剤が封入される。
（実施例１０８）
フソソームおよび供給源細胞中の全ＲＮＡの測定
【１１０４】
この実施例は、供給源細胞と比較してフソソーム中のＲＮＡの量を定量する方法を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、供給源細胞と同様のＲＮＡレベルを有することになる。このアッセイでは、全ＲＮＡを測定することによりＲＮＡレベルを決定する。
【１１０５】
フソソームを、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより調製する。フソソームおよび供給源細胞のタンパク質によって測定したときに同じ質量の調製物を使用して、全ＲＮＡを（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカタログ番号７４１０４などのキットを使用して）単離し、その後、ＲＮＡによる吸光度を評定するための標準的な分光方法を使用して（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＮａｎｏＤｒｏｐで）ＲＮＡ濃度を決定する。
【１１０６】
一部の実施形態では、フソソーム中のＲＮＡの濃度は、タンパク質の質量当たりで供給源細胞のものの５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％となる。
（実施例１０９）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞とのフソソーム融合
ａ．ＤＮＡペイロード
【１１０７】
この実施例は、フソソームを使用するＤＮＡのＣＤ３＋Ｔ細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの送達を説明する。この実施例は、治療用カーゴである、ＣＤ１９に対して指向されたキメラ抗原受容体である、外因性遺伝子をコードするプラスミドを使用してＤＮＡを送達するフソソームの能力を定量する。
【１１０８】
フソゲンが、Ｃｒｅのオープンリーディングフレームと、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により隔てられているが、インフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。フソソームの産生後、ＣＡＲをコードする配列を有するプラスミドをそのフソソームにさらにヌクレオフェクトする。
【１１０９】
例えば、Ｃｈｅｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｉｓ．  ２０１５  Ｍａｒ；２（１）：９６−１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
【１１１０】
陰性対照として、ＧＦＰをコードするプラスミドを、フソソームにヌクレオフェクトする。
【１１１１】
次いで、十分な数のフソソームを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬＡＸ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、１００Ｕ  ｍＬ−１のペニシリンと、１００μｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシンと、１．２５μｇ  ｍＬ−１のアンホテリシンＢと、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）と、１００Ｕ  ｍＬ−１のｈＩＬ−２（ＰｅｒｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＣＴ、ＵＳＡ）とを補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、ＣＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＴ細胞培地中で、４８時間、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＣＤ３＋Ｔ細胞とともに、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を遮断する停止コドンをＤＮＡから切除するＣｒｅリコンビナーゼに起因して、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後に、次いで、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して５６１ｎｍレーザー励起でＦＡＣＳによってｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を単離し、発光を５９０＋／−２０ｎｍで収集する。次いで、ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して全ＤＮＡを単離する。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｎｇのＤＮＡ鋳型、抗ＣＤ１９  ＣＡＲの可変領域に特異的であるプライマーとプローブのセット（Ｔａｑｍａｎオンラインプライマーおよびプローブ設計プログラムを使用して設計した）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行う。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ導入遺伝子ＤＮＡコピーの絶対定量のために、ＣＡＲをコードするプラスミドの段階希釈を行うことによってｃＡ標準曲線を作成する。ベータ−ラクタマーゼ（ＡＭＰｒ遺伝子）に特異的なプライマーとプローブのセットを使用して、ＤＮＡ量について正規化した。Ｃｔ値を使用して、ＣＡＲプラスミドを有するまたは陰性対照を有するフソソームで処置したＣＤ３＋Ｔ細胞においてＣＡＲ  ＤＮＡの量を比較する。
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフソソームでのＤＮＡカーゴの送達は、陰性対照と比較して、ＣＡＲプラスミドを有するフソソームでのほうが多い。
ｂ．ｍＲＮＡペイロード
【１１１２】
この実施例は、フソソームを使用するｍＲＮＡのＣＤ３＋Ｔ細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの送達を説明する。この実施例は、治療用カーゴである、ＣＤ１９に対して指向されたキメラ抗原受容体である、外因性遺伝子をコードするｍＲＮＡを送達するフソソームの能力を定量する。
【１１１３】
フソゲンが、Ｃｒｅのオープンリーディングフレームと、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により隔てられているが、インフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。フソソームの産生後、ＣＡＲをコードする配列を有するｍＲＮＡをそのフソソームにさらにヌクレオフェクトする。例えば、Ｃｈｅｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｉｓ．  ２０１５  Ｍａｒ；２（１）：９６−１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
【１１１４】
陰性対照として、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡをフソソームにヌクレオフェクトする。
【１１１５】
次いで、十分な数のフソソームを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬＡＸ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、１００Ｕ  ｍＬ−１のペニシリンと、１００μｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシンと、１．２５μｇ  ｍＬ−１のアンホテリシンＢと、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）と、１００Ｕ  ｍＬ−１のｈＩＬ−２（ＰｅｒｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＣＴ、ＵＳＡ）とを補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、ＣＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＴ細胞培地中で、４８時間、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＣＤ３＋Ｔ細胞とともに、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を遮断する停止コドンをＤＮＡから切除するＣｒｅリコンビナーゼに起因して、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後に、次いで、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して５６１ｎｍレーザー励起でＦＡＣＳによってｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を単離し、発光を５９０＋／−２０ｎｍで収集する。
【１１１６】
全ＲＮＡを（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカタログ番号７４１０４などのキットを使用して）単離し、その後、ＲＮＡによる吸光度を評定するための標準的な分光方法を使用して（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＮａｎｏＤｒｏｐで）ＲＮＡ濃度を決定する。ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写を行い、ＲＮＡ（１００ｎｇ）をｃＤＮＡに逆転写する。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、１００ｎｇのｃＤＮＡ鋳型と、抗ＣＤ１９  ＣＡＲの可変領域に特異的であるプライマーとプローブのセット（Ｔａｑｍａｎオンラインプライマーおよびプローブ設計プログラムを使用して設計した）と、内因性ローディング対照としてのβ−アクチンを増幅するために設計したプライマープローブセットとを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行う。Ｃｔ値を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲ反応におけるＣＡＲ  ｃＤＮＡの量を、ＣＡＲ  ｍＲＮＡを含有するフソソームで処置したＣＤ３＋Ｔ細胞と、陰性対照を含有するフソソームで処置したＣＤ３＋Ｔ細胞との間で比較する。ΔΔＣｔ方法を使用して相対発現を算出する。ＣＡＲのより高い相対発現レベルは、選別ＣＤ３＋Ｔ細胞から精製される、より高いＣＡＲ  ｍＲＮＡレベルに起因する。
【１１１７】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフソソームでのｍＲＮＡカーゴの送達は、陰性対照フソソームと比較して、ＣＡＲ  ｍＲＮＡを含有するフソソームでのほうが多い。
ｃ．タンパク質／ｍＲＮＡペイロード（ペイロードは、ドナー細胞により発現される）
【１１１８】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の膜へのキメラ抗原受容体タンパク質の送達をもたらす。
【１１１９】
フソゲンが、Ｐ２ＡおよびＴ２Ａ自己切断ペプチド配列によりそれぞれ隔てられて、ＣｒｅのオープンリーディングフレームとおよびＣＤ１９を標的とするＣＡＲのオープンリーディングフレームとインフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。陰性対照フソソームは、フソゲンが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により各々隔てられて、Ｃｒｅのオープンリーディングフレームとおよび青色蛍光タンパク質ｍＴａｇＢＦＰ２のオープンリーディングフレームとインフレームになるように、操作する。例えば、Ｃｈｅｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｉｓ．  ２０１５  Ｍａｒ；２（１）：９６−１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
【１１２０】
次いで、十分な数のフソソームを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬＡＸ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、１００Ｕ  ｍＬ−１のペニシリンと、１００μｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシンと、１．２５μｇ  ｍＬ−１のアンホテリシンＢと、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）と、１００Ｕ  ｍＬ−１のｈＩＬ−２（ＰｅｒｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＣＴ、ＵＳＡ）とを補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、ＣＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＴ細胞培地中で、４８時間、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＣＤ３＋Ｔ細胞とともに、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を遮断する停止コドンをＤＮＡから切除するＣｒｅリコンビナーゼに起因して、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後に、次いで、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して５６１ｎｍレーザー励起でＦＡＣＳによってｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を単離し、発光を５９０＋／−２０ｎｍで収集する。
【１１２１】
選別Ｔ細胞へのｍＲＮＡ送達をアッセイする。全ＲＮＡを（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカタログ番号７４１０４などのキットを使用して）単離し、その後、ＲＮＡによる吸光度を評定するための標準的な分光方法を使用して（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＮａｎｏＤｒｏｐで）ＲＮＡ濃度を決定する。ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写を行い、ＲＮＡ（１００ｎｇ）をｃＤＮＡに逆転写する。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、１００ｎｇのｃＤＮＡ鋳型と、抗ＣＤ１９  ＣＡＲの可変領域に特異的であるプライマーとプローブのセット（Ｔａｑｍａｎオンラインプライマーおよびプローブ設計プログラムを使用して設計した）と、内因性ローディング対照としてのβ−アクチンを増幅するために設計したプライマープローブセットとを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行う。Ｃｔ値を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲ反応におけるＣＡＲ  ｃＤＮＡの量を、ＣＡＲ  ｍＲＮＡを含有するフソソームで処置したＣＤ３＋Ｔ細胞と、陰性対照を含有するフソソームで処置したＣＤ３＋Ｔ細胞との間で比較する。ΔΔＣｔ方法を使用して相対発現を算出する。ＣＡＲのより高い相対発現レベルは、選別ＣＤ３＋Ｔ細胞から精製される、より高いＣＡＲ  ｍＲＮＡレベルに起因する。
【１１２２】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフソソームでのＣＡＲ  ｍＲＮＡカーゴの送達は、ＣＦＰを発現する細胞に由来する陰性対照フソソームと比較して、ＣＡＲを発現する細胞に由来するフソソームでのほうが高い。
【１１２３】
選別細胞の表面でのＣＡＲ発現をアッセイする。選別ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＣＤ３＋細胞を、Ｄｅ  Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：２３，  ２０１３に記載されているような、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲートしたＣＤ１９ｓＩｇ１−４（ＣＤ１９ｓＩｇ１−４：ＡＦ４８８）とともにインキュベートする。ＣＤ１９ｓＩｇ１−４：ＡＦ４８８は、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を標識する。２×１０５個の細胞を、ＡＢ血漿からのヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって１０分間ブロックした後、４℃で３０分間、暗所で４５０ｎｇのＣＤ１９ｓＩｇ１−４：ＡＦ４８８とともにインキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）マシンでＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）を実行して解析する。陰性対照フソゲンとともにインキュベートしたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＣＤ３＋細胞を使用して、ＣＤ１９ｓＩｇ１−４：ＡＦ４８８シグナルに対する陰性ゲートを設ける。ゲートは、ＣＤ１９ｓＩｇ１−４：ＡＦ４８８に対する陽性イベントの％が０．０％に等しくなるように選択する。ＣＤ１９ｓＩｇ１−４：ＡＦ４８８に対して陽性であるイベントのパーセントを、ＣＡＲを発現する細胞に由来するフソソームで処置した選別細胞において測定する。
【１１２４】
一部の実施形態では、表面ＣＡＲ発現を有する選別細胞のパーセントは、ｍＴａｇＢＦＰ２を発現する細胞に由来する陰性対照フソソームと比較して、ＣＡＲを発現する細胞に由来するフソソームで処置した細胞におけるほうが高い。
（実施例１１０）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞と融合するＴ細胞特異的フソソーム
【１１２５】
この実施例は、ＣＤ３＋Ｔ細胞に優先的であるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、そのペイロードをＣＤ３＋Ｔ細胞に代替細胞型より高い効率で送達する。
【１１２６】
フソゲンが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により隔てられているがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。
【１１２７】
次いで、十分な数のフソソームを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬＡＸ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、１００Ｕ  ｍＬ−１のペニシリンと、１００μｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシンと、１．２５μｇ  ｍＬ−１のアンホテリシンＢと、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）と、１００Ｕ  ｍＬ−１のｈＩＬ−２（ＰｅｒｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＣＴ、ＵＳＡ）とを補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、ＣＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＴ細胞培地中で、４８時間、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＣＤ３＋Ｔ細胞とともに、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を遮断する停止コドンをＤＮＡから切除するＣｒｅリコンビナーゼに起因して、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。
【１１２８】
別の実験では、同数のフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞系とともに、４８時間、２０％ウシ胎仔血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ中でインキュベートする。ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を遮断する停止コドンをＤＮＡから切除するＣｒｅリコンビナーゼに起因して、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。
【１１２９】
４８時間のインキュベーション後、細胞をＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）にかけ、５６１ｎｍレーザーで励起させ、発光を５９０＋／−２０ｎｍで収集する。陽性ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を測定するためにゲートを設ける。ゲートは、フソソームと接触していないＣＤ３＋Ｔ細胞およびＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞がすべて陰性になるように選択する。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現に対して陽性である細胞のパーセントを、フソソームによる接触を受けていないＣＤ３＋Ｔ細胞およびＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞において測定する。
【１１３０】
一部の実施形態では、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現に対して陽性である細胞のパーセントは、フソソームと接触したＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞でよりフソソームと接触したＣＤ３＋細胞でのほうが高く、これは、フソソームが標的ＣＤ３＋細胞と優先的に融合することを実証する。
（実施例１１１）
ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞と融合するＴ細胞特異的フソソーム
【１１３１】
この実施例は、ＣＤ３＋Ｔ細胞に優先的であるｉｎ  ｖｉｖｏでのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、フソソームは、そのペイロードをＣＤ３＋Ｔ細胞にいずれの代替細胞型よりも高い効率で送達する。
【１１３２】
フソゲンが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により隔てられているがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。
【１１３３】
次いで、３×１０１１個のフソソームまたはＰＢＳを、Ｂ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ００７９０９系統）に、プログラム可能なＢＳ−３００輸注ポンプを使用して齧歯動物尾静脈カテーテルによって（両方ともＢｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、５日間、毎日、２０分かけてゆっくりと投与する。最終処置の３日後、フソソーム処置マウスおよびＰＢＳ処置を受けたマウスから末梢血を採取する。凝固を防止するために、５μＭ  ＥＤＴＡを含有する１ｍｌのＰＢＳに血液を採取して直ちに混合する。管を氷上に保持し、緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して赤血球を除去する。ウシ（ｂｏｖｓｉｎｅ）血清アルブミンで１０分間ブロックした後、細胞を４℃で３０分間、暗所で、マウスＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：１１−００３２−８２）で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、４８８ｎｍレーザーで励起させ、５３０＋／−３０ｎｍで発光を収集する、ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）で、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）を実行して、細胞を解析する。ＰＢＳ処置を受けたマウスからの未染色細胞を使用して、陰性ＦＩＴＣおよび陰性ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光のゲートを設定する。
【１１３４】
一部の実施形態では、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光に対して陽性である細胞のパーセントは、ＰＢＳで処置したマウスでよりフソソームで処置したマウスでのほうが高い。一部の実施形態では、ＦＩＴＣに対して陽性の染色を示すｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセントは、フソソームで処置したマウスにおいて、ＦＩＴＣに対して陰性の染色を示すものより高い。このことは、ＣＤ３＋細胞を標的とするフソソームがｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ３＋細胞と特異的に融合することを実証する。
（実施例１１２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作されたＴ細胞は標的抗原と会合している細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解する
【１１３５】
この実施例は、前の実施例における方法のいずれか１つで説明したようにフソソームによる接触を受けた後、ＣＡＲを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞が、標的抗原、例えばＣＤ１９と会合している細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解することができることを実証する。
【１１３６】
ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋Ｅμ−ＡＬＬ０１白血病細胞（標的）またはＣＤ１９−Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞（対照）とともにインキュベートする。インキュベーションの前に、ビーズ３個／細胞でＣＤ３特異的およびＣＤ２８特異的磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化し、Ｅμ−ＡＬＬ０１白血病細胞およびＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞を膜色素ＰＫＨ−２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩで洗浄し、同培地に１ｍＬ当たり１×１０５個の腫瘍細胞の濃度で再懸濁させる。次いで、Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの懸濁液に、０個のＴ細胞：１個の腫瘍細胞〜１００個のＴ細胞：１個の腫瘍細胞の範囲の、Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する様々な比で添加し（最終体積、２００μｌ）、３時間、３７℃でインキュベートする。次いで、細胞をＶ字底９６ウェルプレートに移し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色する。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）マシンでＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）を実行してフローサイトメトリーにより解析する。０個のＴ細胞：１個の腫瘍細胞のインキュベーションからの細胞、およびＴ細胞の別のバッチを、先ず、フローサイトメーターにかける。先ず、ＰＫＨ−２６蛍光に基づいてＴ細胞と腫瘍細胞を区別するためのゲートを設定する。ゲートは、Ｔ細胞が陰性であり、ＰＫＨ−２６とともにインキュベートした腫瘍細胞が陽性であるように設定する。次に、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１染色を測定するためのゲートを設定する。ゲートは、０個のＴ細胞：１個の腫瘍細胞のインキュベーションからの細胞がすべてＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｔｎ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１に対して陰性であるように設定する。これら２つのゲートを使用して、Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する様々な比のインキュベーション各々からの細胞をフローサイトメーターにかける。
【１１３７】
一部の実施形態では、ＰＫＨ−２６およびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１に対して陽性である細胞のパーセントは、Ｅμ−ＡＬＬ０１白血病細胞についてはＴ細胞の腫瘍細胞に対する比の上昇に伴って上昇するが、ＰＫＨ−２６およびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１に対して陽性である細胞のパーセントは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞についてはＴ細胞の腫瘍細胞に対する比の上昇に伴って上昇しない。このことは、フソソームによる接触を受けた後、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞が、ＣＤ１９陽性である細胞を特異的に溶解することができることを実証する。
【１１３８】
例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２０１７．  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい。
（実施例１１３）
ｉｎ  ｖｉｖｏで操作されたＴ細胞は標的抗原と会合している細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解する
【１１３９】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏでフソソームによる接触を受けた後、ＣＡＲを発現するように操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞が、標的抗原と会合している細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解することができることを実証する。
【１１４０】
フソゲンが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により隔てられているがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。加えて、前の実施例で説明したように、ＣＤ−１９を標的とするＣＡＲを標的細胞に送達するように、フソソームを操作する。
【１１４１】
次いで、３×１０１１個のフソソームまたはＰＢＳを、Ｂ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ００７９０９系統）に、プログラム可能なＢＳ−３００輸注ポンプを使用して齧歯動物尾静脈カテーテルによって（両方ともＢｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、５日間、毎日、２０分かけてゆっくりと投与する。最終処置の３日後、フソソーム処置マウスおよびＰＢＳ処置を施したマウスから末梢血を採取する。凝固を防止するために、５μＭ  ＥＤＴＡを含有する１ｍｌのＰＢＳに血液を採取して直ちに混合する。管を氷上に保持し、緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して赤血球を除去する。ウシ血清アルブミンで１０分間ブロックした後、細胞を４℃で３０分間、暗所で、マウスＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：１１−００３２−８２）で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、４８８ｎｍレーザーで励起させ、５３０＋／−３０ｎｍで発光を収集する、ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）で、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）を実行して解析する。次いで、フソソームまたはＰＢＳで処置したマウスからの選別細胞を、ＣＤ１９＋Ｅμ−ＡＬＬ０１白血病細胞とともにインキュベートする。インキュベーションの前に、Ｅμ−ＡＬＬ０１白血病細胞を膜色素ＰＫＨ−２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩで洗浄し、同培地に１ｍＬ当たり１×１０５個の腫瘍細胞の濃度で再懸濁させる。次いで、Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの懸濁液に、０個のＴ細胞：１個の腫瘍細胞〜１００個のＴ細胞：１個の腫瘍細胞の範囲の、Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する様々な比で添加し（最終体積、２００μｌ）、３時間、３７℃でインキュベートする。次いで、細胞をＶ字底９６ウェルプレートに移し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色する。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）マシンでＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）を実行してフローサイトメトリーにより解析する。０個のＴ細胞：１個の腫瘍細胞のインキュベーションからの細胞、および選別Ｔ細胞の別のバッチを、先ず、フローサイトメーターにかける。先ず、ＰＫＨ−２６蛍光に基づいてＴ細胞と腫瘍細胞を区別するための第一のゲートを設定する。ゲートは、Ｔ細胞が陰性であり、ＰＫＨ−２６とともにインキュベートした腫瘍細胞が陽性であるように設定する。次に、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１染色を測定するためのゲートを設定する。ゲートは、０個のＴ細胞：１個の腫瘍細胞のインキュベーションからの細胞がすべてＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１に対して陰性であるように設定する。これら２つのゲートを使用して、Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する様々な比のインキュベー���ョン各々からの細胞をフローサイトメーターにかける。
【１１４２】
一部の実施形態では、ＰＫＨ−２６およびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１に対して陽性である細胞のパーセントは、フソソームで処置したマウスからのＴ細胞のＥμ−ＡＬＬ０１白血病細胞に対する比の上昇に伴って上昇するが、ＰＫＨ−２６およびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１に対して陽性である細胞のパーセントは、ＰＢＳで処置したマウスからのＴ細胞のＥμ−ＡＬＬ０１白血病細胞に対する比の上昇に伴って上昇しない。このことは、フソソームでの処置後、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞が、ＣＤ１９と会合している細胞を溶解することができることを実証する。例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２０１７．  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい。
（実施例１１４）
ｉｎ  ｖｉｖｏで操作されたＴ細胞は標的抗原と会合している細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解する
【１１４３】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏでフソソームによる接触を受けた後、ＣＡＲを発現するように操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を処置することができることを実証する。
【１１４４】
フソゲンが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により隔てられているがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。加えて、前の実施例で説明したように、ＣＤ−１９を標的とするＣＡＲを送達するように、フソソームを操作する。
【１１４５】
４〜６週齢雌アルビノＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒ＜ｃ−２Ｊ＞）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にルシフェラーゼ発現Ｅμ−ＡＬＬ０１白血病細胞を全身注射し、これらのマウスを１週間放置して発症させることにより、白血病のモデルを確立する。次いで、マウスを実験コホートに無作為に割り当てる。次いで、３×１０１１個のフソソームまたはＰＢＳを、プログラム可能なＢＳ−３００輸注ポンプを使用して齧歯動物尾静脈カテーテルによって（両方ともＢｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、５日間、毎日、２０分かけてゆっくりと投与する。
【１１４６】
次いで、肝臓白血病細胞の数のプロキシとして蛍光を毎日測定する。ＰＢＳ中のＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）（１５ｍｇ  ｍＬ−１）を、白血病細胞により発現されるＦ−ｌｕｃの基質として使用する。生物発光画像をＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で収集する。１５０ｍｇ  ｋｇ−１の２％イソフルラン（Ｆｏｒａｎｅ、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で麻酔した動物へのＤ−ルシフェリンの腹腔内注射後１０〜３５分の範囲にわたって得られるデータを、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアバージョン４．３．１（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して取得（および後に定量）する。取得時間は、１０秒〜５分の範囲である。バックグラウンド生物発光について補正するために、腫瘍のないマウス（Ｄ−ルシフェリンを注射した）から取得したシグナルを関心領域（ＲＯＩ）測定値から減算する。
【１１４７】
実施形態では、ＰＢＳで処置したマウスではルシフェラーゼシグナルが２１日にわたって増加し、フソソームで処置したマウスではルシフェラーゼシグナルが２１日にわたって減少する。
【１１４８】
ＰＢＳまたはフソソームを受けたマウスの生存期間も追跡する。実施形態では、ＰＢＳを受けたマウスは、フソソームで処置したマウスより小さい生存期間中央値を有する。
【１１４９】
このことは、フソソームが、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を標的とするようにＴ細胞を操作することができることを実証する。例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２０１７．  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい。
（実施例１１５）
フソソームは膜貫通タンパク質をレシピエント細胞に送達する
【１１５０】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、フソソーム融合は、レシピエント細胞への膜貫通タンパク質の送達をもたらす。
【１１５１】
フソゲンが、Ｐ２ＡおよびＴ２Ａ自己切断ペプチド配列によりそれぞれ隔てられて、Ｃｒｅのオープンリーディングフレームとおよびヒトインスリン受容体のオープンリーディングフレームとインフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。陰性対照フソソームは、フソゲンが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により各々が隔てられて、Ｃｒｅのオープンリーディングフレームとおよび青色蛍光タンパク質ｍＴａｇＢＦＰ２のオープンリーディングフレームとインフレームになるように、操作する。例えば、Ｃｈｅｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｉｓ．  ２０１５  Ｍａｒ；２（１）：９６−１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
【１１５２】
次いで、十分な数のフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＨＥＫ２９３細胞とともに、４８時間、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中でインキュベートする。ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＨＥＫ２９３細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を遮断する停止コドンをＤＮＡから切除するＣｒｅリコンビナーゼに起因して、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後に、次いで、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して５６１ｎｍレーザー励起でＦＡＣＳによってｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を単離し、発光を５９０＋／−２０ｎｍで収集する。
【１１５３】
選別ＨＥＫ２９３細胞へのｍＲＮＡ送達をアッセイする。全ＲＮＡを（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカタログ番号７４１０４などのキットを使用して）単離し、その後、ＲＮＡによる吸光度を評定するための標準的な分光方法を使用して（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＮａｎｏＤｒｏｐで）ＲＮＡ濃度を決定する。ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写を行い、ＲＮＡ（１００ｎｇ）をｃＤＮＡに逆転写する。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、１００ｎｇのｃＤＮＡ鋳型と、ヒトインスリン受容体の可変領域に特異的であるプライマーとプローブのセット（Ｔａｑｍａｎオンラインプライマーおよびプローブ設計プログラムを使用して設計した）と、内因性ローディング対照としてのβ−アクチンを増幅するために設計したプライマープローブセットとを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行う。Ｃｔ値を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲ反応におけるインスリン受容体ｃＤＮＡの量を、インスリン受容体ｍＲＮＡを含有するフソソームで処置したＨＥＫ２９３細胞と、陰性対照を含有するフソソームで処置したＨＥＫ２９３細胞との間で比較する。ΔΔＣｔ方法を使用して相対発現を算出する。インスリン受容体のより高い相対発現レベルは、選別ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞から精製される、より高いインスリン受容体ｍＲＮＡレベルに起因する。
【１１５４】
一部の実施形態では、フソソームでのインスリン受容体ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの送達は、ＣＦＰを発現する細胞に由来する陰性対照フソソームと比較して、インスリン受容体を発現する細胞に由来するフソソームでのほうが高い。
【１１５５】
選別細胞の表面でのインスリン受容体発現をアッセイする。選別ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＥＫ２９３細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲートしたインスリン受容体アルファ抗体（Ｂｉｏｓｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、カタログ番号ｂｓ−０２６０Ｒ−Ａ４８８）とともにインキュベートする。抗体は、インスリン受容体発現の量に比例してインスリン受容体を発現する細胞を標識する。２×１０５個の細胞を、ＡＢ血漿からのヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって１０分間ブロックした後、４℃で３０分間、暗所で、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲートしたインスリン受容体アルファ抗体４５０ｎｇとともにインキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）マシンでＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）を実行して解析する。陰性対照フソゲンとともにインキュベートしたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＥＫ２９３細胞を使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲートしたインスリン受容体アルファ抗体のシグナルに対する陰性ゲートを設ける。ゲートは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲートしたインスリン受容体アルファ抗体に対する陽性イベントのパーセントが、０．０％に等しくなるように選択する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲートしたインスリン受容体アルファ抗体に対して陽性であるイベントのパーセントを、インスリン受容体を発現する細胞に由来するフソソームで処置した選別細胞において測定する。
【１１５６】
一部の実施形態では、表面インスリン受容体発現を有する選別細胞のパーセントは、ｍＴａｇＢＦＰ２を発現する細胞に由来する陰性対照フソソームと比較して、インスリン受容体を発現する細胞に由来するフソソームで処置した細胞におけるほうが高い。
（実施例１１６）
フソソームは、異種、シグナルペプチドにより標的化された膜貫通タンパク質を、レシピエント細胞に送達する
【１１５７】
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合を説明する。一部の実施形態では、レシピエント細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞の原形質膜への異種膜タンパク質ペイロードの送達をもたらす。
【１１５８】
フソゲンが、Ｐ２ＡおよびＴ２Ａ自己切断ペプチド配列によりそれぞれ隔てられて、Ｃｒｅのオープンリーディングフレームとおよび膜に標的化されたＧＦＰのオープンリーディングフレームとインフレームになるように、フソソームを操作したことを除いて、前の実施例で説明した方法のいずれか１つにより産生される、細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物製剤から得られる、フソソーム組成物。膜に標的化されたＧＦＰは、２つのパルミトイル化ドメインと単一のミリストイル化ドメインとを含有するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼであるＬＣＫの最初の２６アミノ酸に、ＧＦＰのコード配列のＮ末端を融合させることによって、生成する。陰性対照フソソームは、フソゲンが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列により各々が隔てられて、ＣｒｅのオープンリーディングフレームとおよびサイトゾルＧＦＰのオープンリーディングフレーム（追加の標的化ペプチド配列を一切有さないＧＦＰのコード配列）とインフレームになるように、操作する。例えば、Ｃｈｅｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｉｓ．  ２０１５  Ｍａｒ；２（１）：９６  １０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１、およびＢｅｎｅｄｉｋｔｓｓｏｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５  １４１，  ４１−５３を参照されたい。
【１１５９】
次いで、十分な数のフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＨＥＫ２９３細胞とともに、４８時間、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中でインキュベートする。ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＨＥＫ２９３細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を遮断する停止コドンをＤＮＡから切除するＣｒｅリコンビナーゼに起因して、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後に、次いで、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して５６１ｎｍレーザー励起でＦＡＣＳによってｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を単離し、発光を５９０＋／−２０ｎｍで収集する。
【１１６０】
選別ＨＥＫ２９３細胞の原形質膜におけるＧＦＰの膜局在を共焦点顕微鏡観察によってアッセイする。共焦点顕微鏡観察の前に、選別ＨＥＫ２９３細胞を、原形質膜を標識する試薬（例えば、ＣｅｌｌＭａｓｋ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ１００４６）で染色する。イメージング実験は、６３倍、開口数１．４の油浸対物レンズＰｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔを使用してＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０倒立顕微鏡で行う。４８８ｎｍアルゴンレーザーを使用してＧＦＰ／ＥＧＦＰを励起させ、６３２ｎｍヘリウム−ネオンレーザーを使用して原形質膜染色剤を励起する。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを書いて、各細胞についての原形質膜およびサイトゾルの平均ＧＦＰ強度を決定する。このスクリプトで、原形質膜（原形質膜染色剤により規定される場合、原形質膜の両側の６画素により規定される）およびサイトゾル（原形質膜領域内の領域）の平均強度を算出する。次いで、各細胞についての原形質膜およびサイトゾル強度の値を使用して、原形質膜局在％を算出する。原形質膜局在％を次の式で算出する：原形質膜強度／全（原形質膜＋サイトゾル）強度×１００％。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６：  １９１２５  （２０１５）を参照されたい。
【１１６１】
一部の実施形態では、原形質膜局在ＧＦＰを含有するフソソームで処置した選別細胞は、サイトゾルＧＦＰを含有するフソソームで処置した選別細胞より高い、ＧＦＰの原形質膜局在％を有する。
【図１】
2021513849.tif 000057
【図２】
2021513849.tif 000058
【図３】
2021513849.tif 000059
【図４】
2021513849.tif 000060
【図５】
2021513849.tif 000061
【図６】
2021513849.tif 000062
【図７】
2021513849.tif 000063
【図８】
2021513849.tif 000064
【図９】
2021513849.tif 000065
【図１０】
2021513849.tif 000066
【図１１】
2021513849.tif 000067
【配列表】
2021513849000001.app
【国際調査報告】
2021513849.tif 000068
2021513849.tif 000069
2021513849.tif 000070
2021513849.tif 000071
2021513849.tif 000072
2021513849.tif 000073
2021513849.tif 000074