(57)【要約】  本発明は、脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAH-OUT)の阻害剤の使用によって疼痛を低減するための鎮痛処置に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛を低減するための鎮痛処置の方法であって、疼痛に苦しむ個体に、有効量の脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAH-OUT)の阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記阻害剤が、FAAH-OUT遺伝子発現を抑制する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害剤が、FAAH-OUT転写を抑制し、又はFAAH-OUTの効果を低減して、鎮痛作用を達成する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害剤の投与が、個体におけるN-アシルエタノールアミンのレベルの増大につながり、任意選択で、N-アシルエタノールアミンが、アナンダミド(AEA)、パルミトイルエタノールアミド(PEA)及びオレオイルエタノールアミン(OEA)のうち少なくとも1種から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤が、FAAH-OUTをコードするDNA配列を修飾する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記修飾が、遺伝子編集によって行われる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害剤が、FAAH-OUTの部位とハイブリダイズし、FAAH-OUTをCRISPR-Cas酵素の標的とするガイド配列を含むガイドRNAである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ガイド配列が、FAAH-OUTの調節領域をCRISPR-Cas酵素の標的とする、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記ガイド配列が、FAAH-OUTのプロモーターをCRISPR-Cas酵素の標的とする、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害剤が、FAAH-OUTに対して向けられた一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA分子である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害剤が、配列番号5を有するFAAH-OUT遺伝子をコードする配列又は前記FAAH-OUT遺伝子の発現産物を標的とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤が、くも膜下腔内に投与される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害剤が、アデノ随伴ベクター(AAV)を使用して送達される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
疼痛を処置する方法における使用のためのFAAH-OUTの阻害剤であって、前記方法が、有効量の前記阻害剤を対象に投与することを含む、阻害剤。
【請求項１５】
前記阻害剤が、FAAH-OUT遺伝子発現を抑制する、請求項14に記載の使用のためのFAAH-OUTの阻害剤。
【請求項１６】
前記阻害剤が、FAAH-OUT転写を抑制し、又はFAAH-OUTの効果を低減して、鎮痛作用を達成する、請求項14又は15に記載の使用のためのFAAH-OUTの阻害剤。
【請求項１７】
前記阻害剤が、FAAH-OUTの部位とハイブリダイズし、FAAH-OUTのプロモーターをCRISPR-Cas酵素の標的とするガイド配列を含むガイドRNAである、請求項14から16のいずれか一項に記載の使用のためのFAAH-OUTの阻害剤。
【請求項１８】
前記ガイド配列が、FAAH-OUTの調節領域をCRISPR-Cas酵素の標的とする、請求項17に記載の使用のためのFAAH-OUTの阻害剤。
【請求項１９】
前記ガイド配列が、FAAH-OUTのプロモーターをCRISPR-Cas酵素の標的とする、請求項17に記載の使用のためのFAAH-OUTの阻害剤。
【請求項２０】
前記阻害剤が、FAAH-OUTに対して向けられた一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA分子である、請求項14から16のいずれか一項に記載の使用のためのFAAH-OUTの阻害剤。
【請求項２１】
前記阻害剤が、くも膜下腔内に投与される、請求項14から20のいずれか一項に記載の使用のためのFAAH-OUTの阻害剤。
【請求項２２】
前記阻害剤が、AAVベクターを使用して送達される、請求項14から21のいずれか一項に記載の使用のためのFAAH-OUTの阻害剤。
【請求項２３】
疼痛を低減するための鎮痛処置の方法であって、疼痛に苦しむ個体に、有効量の脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAH-OUT)の阻害剤を投与することを含み、前記阻害剤が、FAAHに対して向けられた一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA分子である、方法。
【請求項２４】
前記阻害剤が、FAAH転写を抑制し、又はFAAHの効果を低減して、鎮痛作用を達成する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記阻害剤が、FAAHをコードするDNA配列を修飾する、請求項23又は請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記阻害剤が、配列番号1によってコードされるFAAHタンパク質をコードする配列を標的とする、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記阻害剤が、配列番号39を有するFAAH遺伝子をコードする配列を標的とする、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記修飾が、遺伝子編集によって行われる、請求項23から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記阻害剤が、FAAHの部位とハイブリダイズし、FAAHをCRISPR-Cas酵素の標的とするガイド配列を含むガイドRNAである、請求項23から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記阻害剤が、配列番号40を有する野生型FAAHタンパク質のアミノ酸配列を標的とする、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項３１】
疼痛を処置する方法における使用のためのFAAHの阻害剤であって、前記方法が、有効量の前記阻害剤を対象に投与することを含み、前記阻害剤が、FAAHに対して向けられた一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA分子である、阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛を低減するための鎮痛処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸アミド加水分解酵素(FAAH)は、N-アシルエタノールアミン(例えば、アナンダミド(AEA)、パルミトイルエタノールアミド(PEA)及びオレオイルエタノールアミン(OEA))及びN-アシルタウリンを含むさまざまな生理活性脂質の主要な異化酵素である1,2。カンナビノイド受容体の内因性リガンドであるアナンダミド(すなわち、エンドカンナビノイド（endocannabinoid）)は、侵害受容、恐怖消去（fear extinction）記憶、不安神経症及び鬱病において役割を有すると示されている3,4。Faahノックアウトマウスは、アナンダミドの著しく上昇した脳組織レベルを有し、急性熱刺激に応じて鎮痛表現型を示し、ホルマリン及びカラゲナン（carrageenan）炎症モデルにおいて疼痛の低減を示す5,6。
【０００３】
ヒトFAAH遺伝子は、FAAH酵素の活性を著しく低減する一般的に保有されるハイポモルフ(hypomorphic)SNP(C385A;rs324420)を含有する7。遺伝子関連解析により、これと、他のFAAH SNP及び疼痛感度間の関連が調査された8〜10。注目すべきことに、乳癌手術を受けている女性のコホート中のハイポモルフSNPのホモ接合保有者は、著しくより低い冷疼痛感度を有し、術後鎮痛の必要性が少ないことが示された8。さらに、ヒトSNPのマウスノックインモデルは、マウス及びヒトSNP保有者の両方が、恐怖消去学習の増強及び不安神経症関連挙動の減少を示すことを示した11。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、FAAHは、疼痛並びに不安神経症及び鬱病を処置するための魅力的な薬物標的であるが、FAAH阻害剤を用いた最近の臨床治験は、不成功であるとわかった12,13。本発明は、小分子FAAHアンタゴニストの副作用問題を有さないと予測される遺伝子療法を使用する、FAAH機能を阻害するための経路を記載する。
【０００５】
本発明者らは、脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAH-OUT)における微小欠失と、疼痛を感じる個々人の能力の間に関連を見出した。特に、本発明者らは、疼痛軽減(hypoalgesic)表現型を有する個体(PFS)を研究することによって、その個体において、正常な疼痛表現型を有する個体にはないFAAH-OUTにおける微小欠失を同定した。微小欠失は、全長FAAH-OUT転写物の正常な発現を破壊し(例えば、低又は高FAAH-OUT発現の結果)、結果として、FAAH機能の減少及び内因性鎮痛分子、例えば、アナンダミドのレベルの増大を伴う。遺伝子療法を使用してFAAH遺伝子を直接破壊することも可能である。
【０００６】
本発明は、疼痛を低減するための鎮痛処置の方法であって、疼痛に苦しむ個体に、有効量の脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAH-OUT)の阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、疼痛を処置する方法における使用のためのFAAH-OUTの阻害剤も提供し、その方法は、有効量の前記阻害剤を対象に投与することを含む。
【０００８】
本発明はさらに、疼痛を低減するための鎮痛処置の方法であって、疼痛に苦しむ個体に、有効量の脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAH-OUT)の阻害剤を投与することを含み、その阻害剤が、FAAHに対して向けられた一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA分子である、方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、疼痛を処置する方法における使用のためのFAAHの阻害剤も提供し、その方法は、有効量の前記阻害剤を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】(A)は、PFSにおけるFAAH、FAAH-OUT及び微小欠失を示すゲノムマップである。FAAH及びFAAH-OUTの遺伝子フットプリントを示すヒト1番染色体。エキソンは、黒色四角によって表わされ、転写の方向は矢印によって示されている。FAAH SNP rs324420は、エキソン3(アスタリスクによって示される)にマッピングされる。PFSにおいて検出された8,131bpの微小欠失が示され、Alu反復配列(灰色四角)が両側に位置する。FAAH-OUTのプロモーター領域並びにエキソン1及び2は、欠失された配列にマッピングされる。(B)ヒト組織におけるFAAH-OUTの発現プロファイルを示すリアルタイムRT-qPCR。FAAH-OUTは、広範囲のヒト組織において、注目すべきことに、後根神経節(DRG)及びいくつかの脳領域において発現される。発現は、ベータアクチンに対して示されている。
【図２Ａ−Ｂ】図2は、FAAH及びFAAH-OUT RNAが、ヒトDRG切片において異なって局在することを示す図である。RNAの蛍光in situハイブリダイゼーション(RNAscope(登録商標)Technology)によって検出されるようなFAAH及びFAAH-OUT RNA発現。FAAH及びFAAH-OUTに対するプローブを用いて5μm厚FFPE固定ヒトDRG切片を解析した。細胞核の対照としてDAPI染色を使用した。FAAH-OUT(単一尾部矢印)及びFAAH発現(二重尾部矢印)の例が示されている。(A)ヒトDRGノード（node）の全体的な像は、FAAH RNAは、ニューロンの細胞質において容易に検出されるが、FAAH-OUT RNAは核に局在していることを示す。(B)及び(C)はそれぞれ、FAAH及びFAAH-OUT発現ニューロンに関してより綿密な像を提供するために、主像(A)において外形が描かれた範囲B及びCを示す。
【図２Ｃ】図2は、FAAH及びFAAH-OUT RNAが、ヒトDRG切片において異なって局在することを示す図である。(B)及び(C)はそれぞれ、FAAH及びFAAH-OUT発現ニューロンに関してより綿密な像を提供するために、主像(A)において外形が描かれた範囲B及びCを示す。
【図３】図3は、PFSにおいて循環AEA、PEA及びOEAレベルが著しく増大されることを示す図である。AEA、PEA、OEA及び2-AGのレベルは、PFS及び4個体の無関係な正常対照から採取された血液サンプルから質量分析によって測定された。AEA、PEA及びOEAは、FAAHの基質であり、2-AGは、そうではない。対照A及びBは、ハイポモルフSNPについてホモ接合WTであり、対照C及びDは、ヘテロ接合保有者である。4個体の対照の平均値は、AEA(1.15pmol/ml)、PEA(43.4pmol/ml)、OEA(5.06pmol/ml)及び2-AG(42.2pmol/ml)であり、これらは、同様の測定プロトコールを使用するこれまでのデータと一致する14。PFS(2回読取り)の平均値は、AEA(1.99pmol/ml)、PEA(113.07pmol/ml)、OEA(17.26pmol/ml)及び2-AG(45pmol/ml)であった。
【図４】図4は、患者PFSにおける定量的感覚試験を示す図である。定量的感覚試験(QST)は、神経因性疼痛に関するドイツ研究ネットワーク（German Research Network on Neuropathic Pain）のプロトコールに従って実施した。QSTは、所与の刺激に対する感覚的知覚の測定である。この試験は、感覚機能の異常を示し得るが、神経系の特定の構造に異常を限局化しない。評価部位の比較は、評価部位の各々についてコーカサス人対照集団に対して行われる。感覚機能の獲得は、zスコア>2として示され、感覚機能の喪失は、<2として示される。対照部位:手、試験部位:足。試験は、手及び足両方の温知覚閾値(warm detection threshold)及び温感覚閾値(thermal sensory limen)における病理学的感度低下並びに温疼痛閾値(thermal pain threshold)について足における幾分かの感度低下を示した。機械的知覚閾値(mechanical detection threshold)は、足において異常であった。矛盾熱感覚(paradoxical heat sensation)及び/又は動的機械異痛(dynamic mechanical allodynia)の証拠はなかった。CDT、冷知覚閾値(cold detection threshold)；WDT、温知覚閾値；TSL、温感覚閾値；CPT、冷疼痛閾値(cold pain threshold)；HPT、温疼痛閾値(heat pain threshold)；PPT、圧痛閾値(pressure pain threshold)；MPT、機械的疼痛閾値(mechanical pain threshold)；MPS、機械的疼痛感度(mechanical pain sensitivity)；WUR、ワインドアップレシオ(wind up ratio)；MDT、機械的触覚閾値；VDT、振動知覚閾値(vibration detection threshold)；DMA、動的機械異痛；PHS、矛盾熱感覚。
【図５】図5は、Cytoscan HDアレイを使用する微小欠失の同定を示す図である。PFSにおいて1番染色体で同定されたヘテロ接合の8kb微小欠失を示すChromosome Analysis Suite(Affymetrix)スクリーンショット。8種の連続プローブ(-1点線に沿ったスポットによって表される)は、-1対立遺伝子コピー数を示し、1番染色体p33:46,882,936〜46,890,857にまたがる(hg19を構築する)。解析の時点で、この微小欠失(塗りつぶされた四角形)は、ゲノムバリアントのデータベース（Database of Genomic Variants）においてアノテートされなかった(図中のゲノムバリアントのデータベース(DGV)中の空のトラックを参照のこと)。同様の欠失は、1000 Genomes Projectのフェーズ3において5008種の対立遺伝子中1種でその後報告されている(この個体、HG10353は、FAAH SNP rs324420についてホモ接合WTである)。微小欠失は、FAAH 3'UTRの約4.7kb下流に位置する。アノテートされていないエキソンは、図の下部にFAAH遺伝子の横に示されている。本発明者らは、その後、5'RACEを使用してこの新規遺伝子フットプリントを微小欠失領域中に拡大した。
【図６】図6は、PFSにおける微小欠失の確認を示す図である。(A)白色矢印によって示されるように、微小欠失領域の外側に位置するPCRプライマーは、PFSとその息子(すなわち、微小欠失を含有する対立遺伝子)から2,259bp領域を増幅した。同一の反応から得られた野生型対立遺伝子産物は、10,390bpである(DNAポリメラーゼの能力を超えて)。1kbラダーは、レーン1にある。(B)突然変異型対立遺伝子のSangerシーケンシングは、微小欠失ブレークポイントを同定した(野生型対立遺伝子上の8,131bpの欠失された配列は、通常、強調された塩基の間のアスタリスクに位置する)。(C)AluSp配列(ヒトゲノムは、38/ヒト;chr1:46418719〜46419015及びchr1:46426839〜46427143を構築する)は、微小欠失領域の両側に位置する。これらの配列のアラインメントは、298bpにわたって89%の同一性を示し、ゲノム再配列の領域の素因となる可能性が高い。
【図７Ａ】図7は、FAAHとFAAH-OUT cDNA配列の比較を示す図である。(A)FAAH及びFAAH-OUTエキソン配列間のアラインメントは、約70%のヌクレオチド同一性を有する800bp領域を同定する。高い配列相同性は、遺伝子が、マイクロRNAシード部位を共有する可能性が高いことを意味し、miRcodeによって予測されるように、2例が太字及び下線が引かれた本文に示される(miR-125a-5p/125b-5p/351/670/4319;CAGGGG及びmiR-128/128ab; CTGTGC)。
【図７Ｂ−Ｃ】図7は、FAAHとFAAH-OUT cDNA配列の比較を示す図である。(B)ATGprによって予測されるような、FAAH-OUT cDNAから作製される最も可能性が高いペプチド。(C)推定FAAH-OUTタンパク質は、FAAH酵素の139のアミノ酸セグメントにわたって69%の相同性(50%の同一性)を共有する。
【図８】図8は、患者PFS線維芽細胞株及び4種の無関係な女性の線維芽細胞対照におけるリアルタイムRT-qPCRを示す図である。(A)β-アクチンに対する相対FAAH発現。FAAH発現は、4種の対照細胞株と比較してPFS線維芽細胞において著しく低減した。データは、対照線維芽細胞(n=4、対照線維芽細胞)の平均FAAHレベルを100%ととらえて正規化された。(B)β-アクチンに対する相対BDNF発現。BDNF発現は、4種の対照細胞株と比較してPFS線維芽細胞において著しく増大した。4種の対照線維芽細胞株におけるBDNFの平均発現レベルは、PFS線維芽細胞サンプルのBDNF発現レベルを100%ととらえて正規化された(n=4、対照線維芽細胞)。P値は、t検定によって作成した。**p<0.01、***p<0.001。エラーバー=SEM。
【図９】図9は、HEK293細胞における遺伝子編集を示す図である。(A)患者PFSにおいて同定された微小欠失の両側に存在する2つのガイド配列をそれぞれ有するSaCas9プラスミド(HMa及びHMb)を一時的にトランスフェクトすることによって誘導されたFAAH-OUTにおける微小欠失を示す図である。ゲノムDNAを、HMaをトランスフェクトされた細胞から(約463bp)及びHMbをトランスフェクトされた細胞から(約598bp)得た編集されたDNAをPCR増幅するための鋳型として使用した。ガイド配列を含有しないベクターをトランスフェクトされた細胞からは、対応する編集された断片は増幅されなかった。(B)HMa又はHMbを用いた一時的トランスフェクション後のFAAH mRNAレベルのRT-qPCR解析。FAAH-OUTにおける微小欠失は、FAAH発現の著しい低減をもたらす。P値は、t検定によって作成した。**p<0.01、***p<0.001。エラーバー=SEM。
【図１０】図10は、HEK293細胞におけるCRISPRiを示す図である。ガイド「FOP1」によってFAAH-OUTのプロモーターに向けられたdSaCas9-KRABは、FAAH発現の著しい低減をもたらす。P値は、t検定によって作成した。**p<0.01。エラーバー=SEM。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
配列の簡単な説明
配列番号1は、ハイポモルフrs324420 SNPを含有しない野生型ヒトFAAHのcDNA配列である。
配列番号2は、ハイポモルフSNP rs324420(C385A)を含有するヒトFAAHのcDNA配列である。
配列番号3は、野生型ヒトFAAH-OUTのcDNA配列である。
配列番号4は、微小欠失を含むヒトFAAH-OUTのcDNA配列である。
配列番号5は、野生型ヒトFAAH-OUTのゲノムDNA配列である。
配列番号6は、微小欠失を含むFAAH-OUTのゲノムDNA配列である。
配列番号7は、微小欠失に対応するゲノムDNA配列である。
配列番号8〜23は、プライマー配列である。
配列番号24〜28は、ガイド配列である。
配列番号29〜38は、図6及び7の配列に対応する。
配列番号39は、FAAHの両側の5kbを含む、野生型ヒトFAAHのゲノムDNA配列である。
配列番号40は、ハイポモルフrs324420 SNPを含有しない野生型ヒトFAAHのアミノ酸配列である。
配列番号41は、ハイポモルフSNP rs324420を含有するヒトFAAHのアミノ酸配列である。
【００１２】
発明の詳細な説明
開示された製品及び方法の種々の適用が、当技術分野における特定の必要性に合わせられてもよいということは理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであって、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、上記又は下記にかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、内容が明確に別のものを示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「1つのペプチド（a peptide）」は、「ペプチド(peptides)」を含む、など。
【００１４】
脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAH-OUT)
脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAH-OUT)は、本明細書において、FAAHP1又はFAAHPと呼ばれることもある。FAAH-OUTは、胎児及び成体脳において並びに後根神経節組織において発現される。FAAH-OUTはまた、神経系のその他の部分、例えば、脊髄において発現され得る。野生型FAAH-OUTは、配列番号5のゲノムDNA配列を有する。配列アラインメントは、FAAH及びFAAH-OUT間で800bp領域内で約70%のヌクレオチド同一性があることを示す。ゲノムDNA中のFAAH-OUT遺伝子のフットプリントは、26960bpである。FAAH-OUT転写物(cDNA)は、2845ヌクレオチドである。FAAH-OUTタンパク質は、約166個のアミノ酸の長さであり得る。FAAH-OUTは、長い非コーディングRNA（long non-coding RNA）として機能し得る。FAAH-OUTは、微小欠失を含み得る。通常、微小欠失は、およそ8kbの長さである。例えば、Sangerシーケンシングを使用して、ゲノムDNA中の微小欠失は、およそ8,131bpの長さであり得る。微小欠失は、FAAH 3' UTRのおよそ4.7kb下流に位置する。微小欠失は、プロモーター及びFAAH-OUTの最初の2つのエキソンを除去する。いくつかの例では、FAAHの調節エレメント又はエンハンサーエレメントは、微小欠失内に位置する。したがって、微小欠失によるFAAH-OUTの破壊は、FAAHの発現に影響を及ぼす。
【００１５】
いくつかの例では、FAAH-OUTは、本明細書において記載される処置において標的とされ得る。
【００１６】
脂肪酸アミド加水分解酵素(FAAH)及びFAAH遺伝子内に位置するSNP
脂肪酸アミド加水分解酵素(FAAH)は、酵素のセリン加水分解酵素の酵素ファミリーのメンバーであり、N-アシルエタノールアミン(例えば、アナンダミド(AEA)、パルミトイルエタノールアミド(PEA)及びオレオイルエタノールアミン(OEA))及びN-アシルタウリンを含むさまざまな生理活性脂質の主要な異化酵素である。FAAHノックアウトマウスは、アナンダミドの著しく上昇した脳組織レベルを有し、鎮痛表現型を示す。ヒトFAAH遺伝子は、FAAH酵素の活性を著しく低減する一般的に保有されるハイポモルフSNP(C385A;rs324420)を含有する。
【００１７】
処置/医学的使用の方法
鎮痛処置
本発明は、遺伝子療法を使用する疼痛を低減するための鎮痛処置の方法に関する。その方法は、疼痛に苦しむ個体に、有効量のFAAH-OUT発現の阻害剤を投与することを含む。本発明はまた、疼痛を処置する方法における使用のためのFAAH-OUTの阻害剤に関し、方法は、有効量の前記阻害剤を対象に投与することを含む。本発明はまた、疼痛を処置するための医薬の製造におけるFAAH-OUT発現の阻害剤の使用に関する。方法はまた、疼痛に苦しむ個体に、有効量のFAAH発現の阻害剤を投与することを含み、その阻害剤は、FAAHに対して向けられた一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA分子である。本発明はまた、疼痛を処置する方法における使用のためのFAAHの阻害剤に関し、その方法は、有効量の前記阻害剤を対象に投与することを含み、その阻害剤は、FAAHに対して向けられた一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA分子である。本発明はまた、疼痛を処置するための医薬の製造におけるFAAH発現の阻害剤の使用に関する。
【００１８】
方法は、疼痛を処置するためであり得る。処置の場合には、患者は、通常、疼痛を感じているか、又は有痛性であると知られる手順を受けている。本明細書において、用語「処置」は、以下のうち任意のものを含む：疼痛の予防、疼痛の発生又は進行の低減又は予防、及び既存の疼痛の低減又は排除。
【００１９】
療法及び予防として、これだけには限らないが、疼痛に起因する、又はそれと関連する症状及び/若しくは合併症を予防、軽減、低減、治癒すること又は少なくとも部分的に停止することが挙げられる。治療的に提供される場合、療法は、通常、疼痛の発生時、又はその短時間の後に提供される。このような治療的投与は、通常、疼痛進行を予防若しくは改善するため、又は疼痛の重症度を低減するためである。予防的に提供される場合には、処置は、通常、疼痛の発生の前に提供される。このような予防的投与は、通常、疼痛の発生を予防する又は遅延させるためである。
【００２０】
疼痛は、多数の異なる供給源に起因し得るので、多数の異なる種類の疼痛が処置又は予防され得る。疼痛は、急性(例えば、術後疼痛)である場合も、慢性(例えば、有痛性状態（例えば、関節リウマチ、末梢神経障害、特発性疼痛、癌）)である場合もある。疼痛は、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛又は炎症性疼痛であり得る。侵害受容性疼痛は、組織、例えば、皮膚、筋肉、内臓器官、関節、腱又は骨の侵害性（noxious）侵襲又は傷害に対する正常な応答である。例えば、侵害受容性疼痛は、体細胞性(例えば、筋骨格性、皮膚性)又は内臓性であり得る。神経因性疼痛は、体性感覚神経系に影響を及ぼす損傷又は疾患によって引き起こされる。神経因性疼痛は、末梢性感作又は中枢性感作を含み得る。それは、感覚異常、例えば、しびれ又は過敏症(痛覚過敏又は異痛)につながり得る。神経因性疼痛の例として、これだけには限らないが、手根管症候群、中枢痛症候群、変性椎間板症、糖尿病性ニューロパチー、幻肢痛、帯状疱疹後神経痛(帯状疱疹)、陰部神経痛、坐骨神経痛及び三叉神経神経痛が挙げられる。神経因性疼痛はまた、ギランバレー症候群、癌、多発性硬化症、腎臓障害、アルコール依存症、HIV、脊髄傷害からの神経損傷、乳房切除後疼痛(PMPS)、術後ヘルニア修復疼痛、幻肢痛(肢切断後)及びその他の種類の術後疼痛によって引き起こされることもある。炎症性疼痛は、影響を受けた感覚繊維内のイオンチャンネルの活性を変更する、組織炎症の部位で放出されたメディエーターによる侵害受容性経路の活性化及び感作によって引き起こされる。炎症性疼痛は、通常、変形性関節症、関節リウマチ、クローン病又は線維筋痛症によって引き起こされる。
【００２１】
疼痛の処置又は予防は、疼痛が、低減又は排除される場合に有効であると理解される。疼痛の低減又は排除は、当技術分野で公知の任意の適した技術によって、例えば、McGill疼痛質問票（McGill pain questionnaire）又はMcGill疼痛指数（McGill pain index）として知られる技術によって測定され得る。McGill質問票は、主に、患者によって疼痛経験を特定するために使用される3つの主要なクラス、つまり感覚的（sensory）、感情的（affective）及び評価的(evaluative)世界的記述子からなる。その3つの主要な尺度とは、疼痛評点指数、選択された単語の数及び1〜5強度スケールに基づく現在の疼痛強度である。
【００２２】
一般
物質(すなわち、阻害剤)の投与によって処置されるべき個体は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。ヒトへの投与が好ましい。
【００２３】
本明細書において記載される治療薬の投与の具体的な経路、適用量及び方法は、医師によって日常的に決定され得る。これらは、以下でより詳細に論じられる。
【００２４】
侵害受容において役割を有する化学物質のレベルの測定は、血液サンプル又は組織サンプルを解析することによって実施され得る。このような化学物質として、これだけには限らないが、N-アシルエタノールアミン(例えば、アナンダミド(AEA)、パルミトイルエタノールアミド(PEA)及びオレオイルエタノールアミン(OEA))及びN-アシルタウリンが挙げられ得る。一例として、AEAの血液組織レベルにおける著しい増大が、鎮痛表現型を有する対象において観察される。
【００２５】
疼痛関連化学物質を測定するための例示的アッセイはまた、実施例において記載される。
【００２６】
その他の処置
本発明の方法はまた、不安神経症、鬱病又は外傷後ストレス障害(PTSD)を処置するために、恐怖レベルを低減するために、及び迅速な創傷治癒のために使用され得る。
【００２７】
FAAH-OUT阻害剤
FAAH-OUT阻害剤は、FAAH-OUTの効果を低減し得る、又はFAAH-OUT発現を抑制し得る任意の化合物、薬剤又は物質である。抑制は、好ましくは、FAAHを上回ってFAAH-OUTに対して選択的である。このような阻害剤として、これだけには限らないが、オリゴヌクレオチド、抗体、小分子が挙げられる。特に好ましい薬剤として、オリゴヌクレオチドがある。例えば、FAAH-OUTの効果を低減するために、又はFAAH-OUTを抑制するために、siRNA若しくはshRNAノックダウンが使用される場合があり、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド及びCrispr/Cas9系が使用される場合がある。例えば、任意選択で、エフェクター(例えば、レプレッサー)ドメイン、例えば、KRABドメインを介して、触媒的に死滅した/不活性のCas9(例えば、dCas9)を使用したCRISPR干渉(CRISPRi)も使用されてもよい。いくつかの実施形態では、阻害剤は、FAAH-OUTをコードするDNA配列を修飾する。いくつかの例では、修飾は、遺伝子編集によって行われる。いくつかの例では、阻害剤は、FAAH-OUTを標的とするが、FAAHの発現に影響を及ぼす。例えば、阻害剤は、FAAH-OUT中に位置するFAAHの調節エレメント若しくはエンハンサーエレメントを破壊し得る、又はそれらの除去につながり得る。
【００２８】
FAAH-OUT阻害剤は、配列番号5を有するFAAH-OUT遺伝子又はFAAH-OUT遺伝子の発現産物をコードする配列を標的とし得る。FAAH-OUT遺伝子の発現産物は、RNA又はタンパク質であり得る。FAAH-OUT遺伝子をコードする配列は、配列番号5の配列に対して、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%の同一性を有する配列であり得る。同一性レベルは、好ましくは、少なくとも85%又はそれより高い。配列番号5の配列に対する同一性は、配列番号5に示される配列における少なくとも1000bp、少なくとも2000bp、少なくとも3000bp、少なくとも4000bp、少なくとも5000bp、少なくとも6000bp、少なくとも7000bp、少なくとも8000bp、少なくとも9000bp、少なくとも10000bp、少なくとも11000bp若しくはそれより多くの連続ヌクレオチドの領域にわたって、又はより好ましくは、配列番号5の全長にわたって測定され得る。
【００２９】
オリゴヌクレオチド
本発明は、FAAH-OUTの効果を抑制又は低減することが可能であるオリゴヌクレオチドを提供する。FAAH-OUTに対して向けられたこのようなオリゴヌクレオチドは、本発明によるFAAH-OUTの阻害剤である。上記で記載したように、FAAH又はFAAHを抑制するためにオリゴヌクレオチドが代わりに使用されてもよい。
【００３０】
用語「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか、又はその類似体の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する塩基、糖及び糖間(骨格)連結からなるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのオリゴマーを指す。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、同様に機能する、天然に存在しないモノマー又はその一部を含むオリゴマーを含む。このような修飾又は置換されたオリゴヌクレオチドは、特性、例えば、細胞取り込みの増強、免疫原性の低減及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などのために、天然形態を上回って好ましいことが多い。
【００３１】
本明細書において記載されるオリゴヌクレオチドは、一本鎖DNA若しくはRNA、二本鎖DNA若しくはRNA、DNA-RNAハイブリッド又はキメラDNA-RNA構造であり得る。二本鎖RNAの例として、例えば、siRNA、ショートヘアピンRNA(shRNA)及びその他のRNAi物質、例えば、pre-miRNAが挙げられる。一本鎖オリゴヌクレオチドとして、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、成熟miRNA及び三本鎖形成性オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
公知の技術を使用し、FAAH-OUT又はFAAHの配列の知識に基づいて、二本鎖RNA(dsRNA)分子は、そのRNA転写物の配列相同性をベースとする標的化によって、FAAH-OUT又はFAAH発現を抑制するように設計され得る。このようなdsRNAは、通常、普通はステム-ループ(「ヘアピン」)立体配置のsiRNA又はマイクロ-RNA(miRNA)であろう。このようなdsRNAの配列は、FAAH-OUT又はFAAHのmRNA転写物の部分のものと対応する部分を含む。この部分は、普通、ドミナント突然変異を含む対立遺伝子内の標的部分と100%相補的だろうが、より低レベルの相補性(例えば、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上又は95%以上)も使用され得る。
【００３３】
いくつかの例では、オリゴヌクレオチドの全長は、最大100、90、80、70、60、50、40、30又は20ヌクレオチドであり得る。その他では、全長は、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10ヌクレオチドであり得る。
【００３４】
公知の技術を使用し、FAAH-OUT(例えば、配列番号5のヌクレオチド配列に基づいて)又はFAAH(配列番号1、2又は39によってコードされる)の配列の知識に基づいて、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)は、そのRNA転写物の配列相同性をベースとする標的化によって、FAAH-OUT又はFAAHを抑制するように設計され得る。このようなAONの配列は、mRNA転写物又はFAAH-OUT又はFAAHの部分のものと対応する部分を含む。この部分は、普通、対立遺伝子内の標的部分と100%相補的だろうが、より低レベルの相補性(例えば、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上又は95%以上)も使用され得る。AONは、Watson-Crick塩基対形成によるpre-mRNA又はmRNAとの結合によって作用し、異なる機序、例えば、RNアーゼH媒介性mRNA分解によって遺伝子抑制を誘導し得る。AONは、FAAH-OUT又はFAAHのmRNAと相補的である塩基配列を有し得る。それらは、細胞内エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによる迅速分解の傾向がある。
【００３５】
AONは、ギャップマー又はアルティマー(altimer)であり得る。ギャップマーは、DNA分子の中心ブロックを含有し、内部ブロックをヌクレアーゼ分解から保護する2'-O修飾リボオリゴヌクレオチド又はその他の人工修飾リボオリゴヌクレオチドモノマーのブロックが両側に位置するキメラAONである。オリゴヌクレオチドは、DNA塩基を含有し、DNA塩基のうち一部又はすべては、ホスホロチオエート化骨格を有する。例えば、DNA塩基のうち0、5以上、10以上、15以上、20以上、25以上又はすべてが、ホスホロチオエート化骨格を有する。ホスホロチオエート化骨格を含有するDNAは、未修飾DNAと比較して、ヌクレアーゼに対する耐性の増大を提供する。
【００３６】
一実施形態では、本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドは、その特性を増強するのに役立つ修飾を含む。したがって、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのヌクレオチドの、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドとの置換によって修飾されてもよく、理想的には、その結果、オリゴヌクレオチドのin vivo及びin vitro安定性が、対応する未修飾オリゴヌクレオチドと比較して増強される。修飾ヌクレオチドは、例えば、糖修飾ヌクレオチド又は核酸塩基修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの例では、2、3、4、5、6又は7つ、又は少なくともその数の修飾ヌクレオチドが含まれてもよく、その他では、8、9、10、11若しくは12又は少なくともその数のこのような修飾が含まれてもよく、その他の場合には、15、20、21、22、23、24、25又は少なくともこのような数が修飾されてもよい。さらにその他では、ヌクレオチドのすべて、又は1、2、3、4若しくは5つのヌクレオチドを除くすべてが修飾されてもよい。
【００３７】
いくつかの例では、修飾ヌクレオチドは、2'-デオキシリボヌクレオチドである。特定の場合には、2'-デオキシリボヌクレオチドは、2'-デオキシグアノシン又は2'-デオキシアデノシンである。その他の場合には、修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチル(例えば、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルシュードウリジン、2'-O-メチルウリジン、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチル)リボヌクレオチドである。いくつかの場合には、修飾ヌクレオチドは、2'-アミノ、2'-チオ及び2'-フルオロ修飾リボヌクレオチドから選択される。さらなる場合には、修飾ヌクレオチドは、2'-フルオロ-シチジン、2'-フルオロ-ウリジン、2'-フルオロ-グアノシン、2'-フルオロ-アデノシン、2'-アミノ-シチジン、2'-アミノ-ウリジン、2'-アミノ-アデノシン、2'-アミノ-グアノシン、2'-アミノ-ブチリル-ピレン-ウリジン及び2'-アミノ-アデノシンからなる群から選択される。さらなる場合には、修飾ヌクレオチドは、5-ヨード-ウリジン、リボ-チミジン、5-ブロモ-ウリジン、2-アミノプリン、5-メチル-シチジン、5-フルオロ-シチジン及び5-フルオロ-ウリジン、2,6-ジアミノプリン、4-チオ-ウリジン及び5-アミノ-アリル-ウリジンから選択される。
【００３８】
いくつかの例では、修飾ヌクレオチドとして、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン、5-プロピンウリジン、5-プロペニルウリジンから選択される5位の誘導体化、例えば、6-(2-アミノ)プロピルウリジンの6位の誘導体化、アデノシン及び/又はグアノシン、例えば、8-ブロモグアノシン、8-クロログアノシン又は8-フルオログアノシン、デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザ-アデノシンを含む使用され得るヌクレオチド類似体の8位の誘導体化、O-及びN-修飾(例えば、アルキル化、例えば、N6-メチルアデノシン)ヌクレオチド並びにその他の複素環式修飾ヌクレオチド類似体が挙げられる。使用され得るヌクレオチドの糖部分への修飾の例として、H、OR、R、F、Cl、Br、I、SH、SR、NH2、NHR、NR2、COOR又はORから選択される基によって置換されている2'OH基が挙げられる(式中、Rは、置換又は非置換C1〜C6アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである)。ヌクレオチドのリン酸基も、例えば、リン酸基の酸素のうち1個以上を、硫黄と置換することによって(例えば、ホスホロチオエートを使用することによって)修飾され得る。修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害することによって、修飾塩基を含むポリヌクレオチドの加水分解の速度を減少させ得る。1つの好ましい場合には、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼに対して耐性である。使用され得るオリゴヌクレオチドとして、このような耐性を促進するための修飾を有するものが挙げられ、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、2'-O-メチル基(例えば、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルシュードウリジン、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルウリジン、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチル)を用いて修飾されていてもよく、さらにホスホロチオエート骨格を含んでもよい。
【００３９】
いくつかの例では、本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート及び2'-O-メチル(例えば、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルシュードウリジン、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルウリジン、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチル)修飾を含有するオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチド修飾のその他の形態、例えば、ロックド核酸(少なくとも1つの2'-C,4'-C-オキシ-メチレン連結二環式リボヌクレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチド)が使用されてもよい。いくつかの例では、使用される修飾ヌクレオチドは、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン(galactosylqueosine)、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン(mannosylqueosine)、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル、キューオシン(queosine)、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキソ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキソ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w及び2,6-ジアミノプリンであり得る。
【００４０】
いくつかの例では、修飾オリゴヌクレオチドとして、リン酸骨格の修飾、例えば、メチルホスホネート、メチルホスホンチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート（phosphoropiperazidate）及びホスホロアミダイトを挙げることができる。一例では、ヌクレオチド間架橋形成リン酸残基が、1個おきに、記載されたように修飾され得る。別の限定されない例では、このようなオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのうち少なくとも1つ又はすべてが、2'低級アルキル部分(例えば、C1〜C4、直鎖又は分岐、飽和又は不飽和アルキル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、1-プロペニル、2-プロペニル及びイソプロピル)を含有するオリゴヌクレオチドである。
【００４１】
一実施形態では、本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNA(siRNA)である。siRNAは、RNAi誘導抑制複合体(RISC複合体としても知られる)を活性化することによって作用する。siRNA分子は、未修飾である場合も、修飾されている場合もあり、FAAH-OUT(例えば、配列番号36を有する)又はFAAHタンパク質(例えば、配列番号40又は41を有する)の発現を抑制(すなわち、部分的又は完全に防止)することができる。siRNAは、FAAH-OUT又はFAAHの発現を防止し得る。siRNAは、FAAH-OUT又はFAAHタンパク質をコードするmRNAの発現を防止し得る。siRNAは、FAAH-OUT又はFAAHタンパク質をコードするmRNAの翻訳を防止し得る。siRNAは、FAAH-OUT又はFAAHタンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼすことによってFAAH-OUT又はFAAHタンパク質発現を低減又は防止し得る。siRNAは、通常、約5〜60ヌクレオチドの長さ、約5〜55ヌクレオチドの長さ、約5〜50ヌクレオチドの長さ、約5〜45ヌクレオチドの長さ、約5〜40ヌクレオチドの長さ、約5〜35ヌクレオチドの長さ、約5〜30ヌクレオチドの長さ、約5〜25ヌクレオチドの長さ、約5〜20ヌクレオチドの長さ、約5〜15ヌクレオチドの長さ又は約5〜10ヌクレオチドの長さである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、修飾siRNAは、少なくとも1つの2'O-Meプリン又はピリミジンヌクレオチド、例えば、2'O-Me-グアノシン、2'O-Me-ウリジン、2'O-Me-アデノシン及び/又は2'O-Me-シトシンヌクレオチドを含有する。修飾ヌクレオチドは、siRNAの1つの鎖(すなわち、センス又はアンチセンス)中に存在する場合も、両鎖中に存在する場合もある。siRNA配列は、オーバーハング又は平滑末端を有し得る。
【００４３】
修飾siRNAは、siRNA二本鎖の二本鎖領域中に約1%〜約100%(例えば、約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)の修飾ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、siRNAの二本鎖領域中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多いのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む。
【００４４】
適したsiRNA配列は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して同定され得る。通常、Elbashirら、Nature、411巻:494〜498頁(2001年)及びElbashirら、EMBO J.、20巻:6877〜6888頁(2001年)に記載される方法が、Reynoldsら、Nature Biotech.、22巻(3号):326〜330頁(2004年)に示される合理的な設計ルールと組み合わされる。
【００４５】
好ましくは、siRNAは、化学合成される。本発明のsiRNA分子を含むオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の種々の技術のいずれか、例えば、Usmanら、J. Am. Chem. Soc.、109巻:7845頁(1987年);Scaringeら、Nucl. Acids Res.、18巻:5433頁(1990年);Wincottら、Nucl. Acids Res.、23巻:2677〜2684頁(1995年)及びWincottら、Methods Mol. Bio.、74巻:59頁(1997年)に記載されるものを使用して合成され得る。オリゴヌクレオチドの合成は、一般的な核酸保護及びカップリング基、例えば、5'末端にジメトキシトリチル及び3'末端にホスホロアミダイトを使用する。或いは、siRNA分子は、2つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てられてもよく、ここで、一方のオリゴヌクレオチドは、siRNAのセンス鎖を含み、もう一方は、siRNAのアンチセンス鎖を含む。例えば、各鎖は、別個に合成され、合成及び/又は脱保護後にハイブリダイゼーション又はライゲーションによって一緒に接続されてもよい。特定のその他の場合には、siRNA分子は、単一の連続オリゴヌクレオチド断片として合成されてもよく、ここでは、自己相補性センス及びアンチセンス領域がハイブリダイズして、ヘアピン二次構造を有するsiRNA二本鎖を形成する。
【００４６】
一実施形態では、本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドは、ガイドRNA配列及びtracrRNAを含むガイドRNAである。ガイドRNA配列は、対立遺伝子のDNA中の標的配列とハイブリダイズ可能である。tracrRNAは、ガイドRNA配列にカップリングされる。ガイドRNAは、ドミナント突然変異を保有する対立遺伝子の部位とハイブリダイズし、前記部位をCRISPR-Cas酵素の標的とする。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、10〜30の間又は15〜25の間又は15〜20の間のヌクレオチドの長さである。好ましくは、CRISPR-Cas酵素は、II型CRISPR酵素、例えば、Cas-9である。酵素は、ガイドRNAと複合体形成する。一実施形態では、複合体は、FAAH-OUT又はFAAHのDNA配列を標的とし、ハイブリダイゼーションによって結合する。別の実施形態では、複合体は、FAAH-OUT又はFAAHの調節領域、例えば、プロモーターのDNA配列を標的とする。別の実施形態では、複合体は、FAAH-OUT又はFAAHの最初の2つのエキソンのDNA配列を標的とする。いくつかの実施形態では、FAAH-OUT又はFAAHの任意の領域が標的とされてもよく、これによりFAAH-OUT若しくはFAAHの欠失及び/又はその機能の破壊につながる。一実施形態では、酵素は活性を持ち、エンドヌクレアーゼとして作用して、非相同末端結合又は相同DNA修復経路いずれかの活性化によってDNAを切断して、平滑末端切断又はニックをもたらす。修復鋳型配列が供給され、そして相同組換えによって対立遺伝子中に導入され、それによって、それが標的とする配列、例えば、対立遺伝子のDNAにおける突然変異を置換し得る。別の実施形態では、酵素は、FAAH-OUT又はFAAHのDNAを標的とするが、酵素は、FAAH-OUT又はFAAHを編集せずにその転写を防止又は低減するように、そのエンドヌクレアーゼ活性を低減又は排除する1以上の突然変異を含む。別の実施形態では、酵素は、転写レプレッサーに融合されて、そのエンドヌクレアーゼ機能が低減される又は失われるように遺伝子操作され得る。酵素は、ガイドRNAと結合し、DNA配列を標的とすることが可能だが、DNAの切断は起こらない。FAAH-OUT又はFAAHは、例えば、プロモーターをシャットダウンすること又はRNAポリメラーゼの遮断によって抑制され得る。別の実施形態では、転写レプレッサーは、tracr配列に結合され得る。機能ドメインは、Konermannら(Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex、Nature、517巻、583〜588頁、2015年)に記載されるように、タンパク質結合RNAアプタマー配列を組み込むことによってtracr配列に付加され得る。転写レプレッサー-tracr配列複合体は、所望の正確な遺伝子位置を、その他の部分の標的とするために使用され得る。
【００４７】
当技術分野で周知のその他の遺伝子編集法が、本発明において使用され得る。このような方法として、これだけには限らないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子編集法、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ゲノム編集法、遺伝子編集のためにCpf1を使用する非Cas9 CRISPR系及びトランスポゾンを使用する方法が挙げられる。これらの方法において使用される例示的ヌクレアーゼとして、これだけには限らないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、メガヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALEN)が挙げられる。
【００４８】
本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドは、ペプチド又は受容体とコンジュゲートされ得る。オリゴヌクレオチドの送達を補助するために、ペプチドは、例えば、細胞浸透性ペプチドであり得る。この技術は、例えば、WO2009/147368、WO2013/030569、WO2012/150960及びWO2004/097017に記載されている。オリゴヌクレオチドはまた、担体にコンジュゲートされてもよく、リポソーム内にカプセル化されてもよい。
【００４９】
本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドは、FAAH-OUT又はFAAH由来のRNA転写物の領域と相補的であり得る。一例では、オリゴヌクレオチドは、その配列の10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチドと相補的となり、好ましくは、その配列の13〜25又は16〜21ヌクレオチドと相補的となる。
【００５０】
一例では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26又は27ヌクレオチドの長さ、好ましくは、少なくとも19、20、21、22、23、24、25又は26ヌクレオチドの長さ、例えば、13〜25又は16〜21ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、10から35の間のヌクレオチドの長さ、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、18から30の間のヌクレオチドの長さ、例えば、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 30ヌクレオチドの長さである。ハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチドの領域がその長さ又は少なくともその長さであるが、オリゴヌクレオチドの5'及び/若しくは3'末端にさらなるヌクレオチドもあるということはあり得、ただ、その他の場合には、オリゴヌクレオチドの全長が、その数のヌクレオチドである。
【００５１】
一般に、標的RNAの部分と完全に相補的であるオリゴヌクレオチド配列が、好ましくは使用され得る。ただ、いくつかの例では、遺伝子突然変異、系統多型(strain polymorphism)又は進化的多様性のために予測され得る配列のバリエーションが存在し得る。例えば、標的配列に対して挿入、欠失及び単一点突然変異を有するオリゴヌクレオチド配列はまた、阻害のために有効であり得る。オリゴヌクレオチド配列と標的RNA、例えば、標的pre-mRNAとの間の、70%を超える配列同一性(又は相補性)、例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はさらに100%の配列同一性が好ましい。
【００５２】
核酸配列の配列相補性の決定を含む配列同一性は、当技術分野で公知の配列比較及びアラインメントアルゴリズムによって決定され得る。2種の核酸配列の(又は2種のアミノ酸配列の)同一性パーセントを決定するために、配列は、最適比較を目的として（for optimal comparison purposes）アラインされる(例えば、ギャップが、最適アラインメントのために第1の配列又は第2の配列中に導入され得る)。次いで、対応するヌクレオチド(又はアミノ酸)位置のヌクレオチド(又はアミノ酸残基)が比較される。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同一の残基によって占められる場合には、その位置の分子は同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、相同性%=同一位置の数/位置の総数×100)、任意選択で、導入されたギャップの数及び/又は導入されたギャップの長さのスコアにペナルティーを科す。
【００５３】
2つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。一実施形態では、アラインメントは、十分な同一性を有するアラインされた配列の特定の部分にわたって作成されたが、低い同一性の程度を有する部分にわたっては作成されなかった(すなわち、ローカルアラインメント)。配列の比較のために利用されたローカルアラインメントアルゴリズムの好ましい限定されない例として、Karlin及びAltschul (1993年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90巻:5873〜77頁において改変された、Karlin及びAltschul (1990年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87巻:2264〜68頁のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、Altschulら(1990年) J. Mol. Biol. 215巻:403〜10頁のBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。
【００５４】
別の実施形態では、アラインメントは、適当なギャップを導入することによって最適化され、同一性パーセントは、アラインされた配列の長さにわたって決定される(すなわち、ギャップ付きアラインメント)。比較を目的としてギャップ付きアラインメントを得るためには、Altschulら、(1997年)Nucleic Acids Res. 25巻(17号):3389〜3402頁に記載されるようにギャップ付きBLAST（Gapped BLAST）が利用され得る。別の実施形態では、アラインメントは、適当なギャップを導入することによって最適化され、同一性パーセントがアラインされた配列の全長にわたって決定される(すなわち、グローバルアラインメント)。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい限定されない例として、Myers及びMiller、CABIOS (1989年)のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合には、PAM120加重残基テーブル、12のギャップ長ペナルティー及び4のギャップペナルティーが利用され得る。
【００５５】
本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドはまた、多型、例えば、単一ヌクレオチド多型(SNP)、マイクロサテライト多型、挿入多型及び欠失多型を有する部位であり得るFAAH-OUT又はFAAH内の部位とハイブリダイズし得る。好ましくは、多型は、SNPである。このような多型は、対象を遺伝子型同定し、そのゲノム中に存在する突然変異型対立遺伝子をシーケンシングすることによって同定され得る、又はそれらは事前に存在すると知られている又は疑われている場合もある。オリゴヌクレオチドを、対立遺伝子中のこのような突然変異に標的化することは、標的とされる突然変異が、疾患の原因とならない場合であっても、対立遺伝子を抑制し、疼痛の処置を達成する（effect）であろう。さらに、原因となる突然変異及び1種以上の原因とならないものは両方とも、異なるオリゴヌクレオチドを用いて標的とされ得る。
【００５６】
対立遺伝子の発現の抑制は、当技術分野で公知の任意の適した技術によって測定され得る。例えば、逆転写、Sangerシーケンシング及び定量的リアルタイムPCRは、頻繁に使用される技術である。本発明のオリゴヌクレオチドは、対立遺伝子の発現を任意の量、好ましくは、最大95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、30%、20%又は10%まで抑制し得る。
【００５７】
オリゴヌクレオチド送達
本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドは、任意の適した方法を使用して細胞に導入され得る。例えば、オリゴヌクレオチド配列を細胞に送達するために、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、細胞外小胞(例えば、エキソソーム又は微小胞)、コロイド状ポリマー粒子、デンドリマー並びにウイルス性及び非ウイルス性ベクター並びに当技術分野で公知のその他の手段が使用され得る。
【００５８】
いくつかの例では、オリゴヌクレオチドは、リポソーム媒介性取り込みを含む方法を使用して送達される。リポフェクチン及びサイトフェクチン（cytofectin）は、負電荷を有する核酸と結合して、細胞膜を越えて核酸を運ぶことができる複合体を形成する脂質ベースの陽イオンであり、使用され得る。一例では、リポフェクチンは、オリゴヌクレオチドの送達において使用され、特に、Lipofectamine 2000が使用される。一例では、オリゴヌクレオチドは、jetPRIME(登録商標)試薬を使用して送達され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、in vitroでjetPRIME(登録商標)試薬を含む方法を使用して細胞に送達され得る。いくつかの例では、トランスフェクション試薬が必要とされない場合もあり、オリゴヌクレオチドは、ジムノシス(gymnosis)によって標的細胞によって直接取り込まれることもある。
【００５９】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、デンドリマーを含む組成物を使用して送達され得る。デンドリマーは、十分に規定された均一な単分散構造を有するナノサイズの放射対称性分子であり、通常、対称性コア、内部シェル及び外部シェルを有する(Madaanら(2014年) J Pharm Bioallied Sci. 2014年7月〜9月;6巻(3号):139〜150頁)。任意のデンドリマーは、オリゴヌクレオチドの送達に適したものであり得る。オリゴヌクレオチドと共に使用するためのデンドリマーは、ポリアミドアミン(PAMAM)、ポリ(プロピレンイミン)(PPI、ポリ-L-リシン、メラミン、ポリ(エーテルヒドロキシルアミン)(PEHAM)、ポリ(エステラミン)(PEA)及び/又はポリグリセロールから構成され得る、からなり得る。送達は、対象へ、又は例えば、細胞若しくは組織へ直接であってもよく、例えば、細胞又は組織は、その後、再導入される。オリゴヌクレオチドは、標的細胞中に直接導入されてもよく、又は腔（cavity）、間質空間中に、対象の循環中に細胞外導入されてもよく、経口的に導入されてもよく、又は核酸を細胞中にin vivoで導入するための方法を使用する、RNAを含有する溶液であってもよい。
【００６０】
オリゴヌクレオチドは、任意の適した投与経路によって送達され得る。いくつかの例では、投与は、全身であってもよく、その他では、局在化されてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、組織部位での直接注射又は体液への注入によって投与され得る。血管又は血管外循環、血液又はリンパ系及び脳脊髄液が、RNAが導入され得る位置の例である。
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、例えば、対象の神経系に任意の適した方法によって送達され得る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド試薬の注射、特に、静脈内注射は、拡散性及び/又は能動的手段を介して末梢ニューロンへの送達のために使用され得る。或いは、オリゴヌクレオチドは、血液脳関門(BBB)の通過を促進し、前記試薬の、中枢神経系(CNS)のニューロン細胞への送達を達成するように修飾され得る。特定の場合には、オリゴヌクレオチドは、経皮的方法によって送達され得る。オリゴヌクレオチドはまた、埋め込み可能なデバイスを介して送達され得る。
【００６２】
オリゴヌクレオチドを導入する物理的方法として、オリゴヌクレオチドを含有する溶液の注射、オリゴヌクレオチドによって覆われた粒子による衝撃（bombardment）、オリゴヌクレオチドの溶液中に細胞若しくは生物を浸漬すること又はオリゴヌクレオチドの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションが挙げられる。オリゴヌクレオチドの細胞への効率的な導入及び発現構築物によってコードされるオリゴヌクレオチドの転写を達成するためにウイルス粒子中にパッケージングされたウイルスベクターが使用されてもよい。核酸を細胞に導入するための、当技術分野で公知のその他の方法、例えば、脂質媒介性担体輸送、化学物質媒介性輸送、例えば、リン酸カルシウムなどが使用されてもよい。オリゴヌクレオチドは、以下の活動のうち1つ以上を発揮する成分と共に導入されてもよい:細胞による本発明のオリゴヌクレオチドの取り込みを増強する、本発明のオリゴヌクレオチドの単鎖のアニーリングを阻害する、オリゴヌクレオチドの単鎖を安定化する、オリゴヌクレオチドの分解を防ぐ、又はそうでなければ標的遺伝子の阻害を増大する。
【００６３】
オリゴヌクレオチドは、例えば、特定の細胞種上に見られる受容体との結合によって、それらが特定の細胞を標的とするように修飾されてもよい。オリゴヌクレオチドは、ベクターを使用して細胞に送達されてもよい。
【００６４】
これはまた、以下の「投与経路、製剤化及び適用量」の節においてさらに記載される。
【００６５】
ベクター
本発明において使用され得るベクターは、任意の種類のものであってよく、例えば、プラスミドベクター又は小環状DNAであり得る。
【００６６】
通常、本発明において使用され得るベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、例えば、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス又はレンチウイルスに基づいたものであり得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター又はその誘導体であり得る。ウイルスベクター誘導体は、キメラ、シャッフル又はカプシド修飾誘導体であり得る。ウイルスベクターは、天然に由来するAAVの血清型、単離物又はクレードに由来するAAVゲノムを含み得る。血清型は、例えば、AAV2、AAV5、AAV8又はAAV9であり得る。好ましくは、血清型は、AAV9であり得る。
【００６７】
遺伝子療法の有効性は、一般に、提供されるDNAの適切な、効率的な送達に依存している。このプロセスは、普通、ウイルスベクターによって媒介される。パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス(AAV)は、遺伝子療法においてよく使用される。ウイルス遺伝子を含有する野生型AAVは、そのゲノム材料を、宿主細胞の染色体中に挿入する。AAV一本鎖DNAゲノムは、2つの逆方向末端反復配列(inverted terminal repeat；ITR)並びに構造(cap)遺伝子及びパッケージング(rep)遺伝子を含有する2つのオープンリーディングフレームを含む。
【００６８】
治療を目的として、治療遺伝子に加えてシスで必要とされる唯一の配列は、ITRである。したがって、AAVウイルスは、修飾される:ウイルス遺伝子は、ゲノムから除去され、組換えAAV(rAAV)が生成する。これは、治療遺伝子、2つのITRのみを含有する。ウイルス遺伝子の除去は、rAAVを、そのゲノムを宿主細胞DNA中に活発に挿入できないようにする。代わりに、rAAVゲノムは、ITRを介して融合し、環状エピソーム構造を形成する、又は既存の染色体切断に挿入する。ウイルス産生のためには、ここではrAAVから除去されている構造遺伝子及びパッケージング遺伝子は、ヘルパープラスミドの形態でトランスで供給される。AAVは、概して非病原性であるので特に魅力的なベクターである；大部分の人は、その生涯の間にこのウイルスに感染しており、副作用はない。
【００６９】
rAAVは、血清型特異的受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に形質導入する。rAAV導入遺伝子発現の動態に影響を及ぼす主要な因子は、エンドソーム内でのウイルス粒子脱コートの速度である。次いで、これは、遺伝物質を封入しているカプシドの種類に左右される(同書)。脱コート後、直鎖一本鎖rAAVゲノムは、相補鎖のde novo合成を介して二本鎖分子を形成することによって安定化される。自己相補的DNAの使用は、二本鎖導入遺伝子DNAを産生することによってこの段階を迂回し得る。Natkunarajahら(2008年)は、自己相補性AAV2/8遺伝子発現は、一本鎖AAV2/8と比較して、より早い開始及びより高い振幅（amplitude）のものであることを見い出した。したがって、第2鎖合成と関連する時間差を回避することによって、標準一本鎖構築物からの導入遺伝子発現と比較した場合に遺伝子発現レベルが増大される。その他のAAV偽型(例えば、AAV2/5)における自己相補的DNAの効果を調べるその後の研究は、同様の結果をもたらした。この技術への1つの警告として、AAVは、およそ4.8kbのパッケージング能を有するので、自己相補性組換えゲノムは、適切な大きさでなくてはならない(すなわち、2.3kb以下)ということがある。
【００７０】
AAVゲノムは、AAVウイルス粒子の産生に必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列である。これらの機能は、AAVゲノムのAAVウイルス粒子へのカプセル化を含む、宿主細胞におけるAAVの複製及びパッケージングサイクルにおいて働くものを含む。天然に存在するAAVウイルスは、複製欠損であり、複製及びパッケージングサイクルの完了のためにトランスでのヘルパー機能の提供に頼る。したがって、AAV rep及びcap遺伝子のさらなる除去によって、本発明のベクターのAAVゲノムは、複製欠損である。
【００７１】
AAVゲノムは、プラス若しくはマイナス鎖いずれかの一本鎖形態で、又は或いは二本鎖形態であり得る。二本鎖形態の使用は、標的細胞におけるDNA複製ステップの迂回を可能にし、その結果、導入遺伝子発現を加速し得る。
【００７２】
AAVゲノムは、任意の天然に由来するAAVの血清型又は単離物若しくはクレードに由来し得る。当業者には公知であるように、天然に生じるAAVウイルスは、種々の生物学的系に従って分類され得る。
【００７３】
一般に、AAVウイルスは、その血清型によって言及される。血清型は、そのカプシド表面抗原の発現のプロファイルのために、それぞれの反応性を有するAAVのバリアント亜種に対応し、これを使用して、その他のバリアント亜種から区別することができる。通常、特定のAAV血清型を有するウイルスは、任意のその他のAAV血清型に対して特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。AAV血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及びAAV11を含み、組換え血清型、例えば、霊長類脳から最近同定されたRec2及びRec3も含む。本発明において使用されるベクターでは、ゲノムは、任意のAAV血清型に由来し得る。カプシドはまた、任意のAAV血清型に由来し得る。ゲノム及びカプシドは、同一の血清型又は異なる血清型に由来し得る。AAV血清型の概説は、Choiら(Curr Gene Ther. 2005年;5巻(3号);299〜310頁)及びWuら(Molecular Therapy. 2006年;14巻(3号)、316〜327頁)に見い出すことができる。
【００７４】
AAV血清型は、AAVウイルスの感染の組織特異性(又はトロピズム)を決定する。したがって、本発明に従って患者に投与されるAAVウイルスにおける使用のための好ましいAAV血清型は、脳組織若しくは後根神経節組織への天然トロピズム又は高感染効率を有するものである。
【００７５】
阻害剤投与の効果
阻害剤の投与は、個体におけるN-アシルエタノールアミン及びN-アシルタウリンのレベルの増大につながり得る。例えば、阻害剤の投与は、アナンダミド(AEA)、パルミトイルエタノールアミド(PEA)及び/又はオレオイルエタノールアミン(OEA)のレベルの増大につながる。阻害剤の投与はまた、N-アシル-タウリン、例えば、N-テトラコサノイル（tetracosanoyl）-タウリン[NAT(24:0)]及びN-エイコサノイル（eicosanoyl）-タウリン[NAT(20:0)]の増大につながり得る。
【００７６】
併用療法
阻害剤は、同一個体において疼痛を処置又は改善するように意図される1種以上のその他の療法又は薬剤と組み合わせて使用され得る。療法又は薬剤は、組み合わされた形態又は別個の形態で、同時に個体に投与され得る。療法又は薬剤は、同一治療計画の一部として、別個に又は逐次、個体に投与され得る。
【００７７】
例示的薬剤として、これだけには限らないが、非ステロイド系抗炎症薬(NSAIDS)、例えば、イブプロフェン、アスピリン、ナプロキセン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、オキサプロジン、ジクロフェナクナトリウム、エトドラック、インドメタシン、ケトロラク、スリンダック、トルメチン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ナブメトン、ピロキシカム、COX-2阻害剤、例えば、セレコキシブ、オピオイド、例えば、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ジヒドロモルヒネ、ペチジン、フェンタニル、オキシモルフォン、メサドン、カンナビノイドが挙げられる。例えば、麻酔薬、抗痙攣薬、抗鬱薬、神経調節物質、疼痛軽減注射及び心理学的療法、及び任意のその他の療法又は疼痛管理も使用され得る。
【００７８】
投与経路、製剤及び適用量
本発明における使用のための物質(FAAH-OUT又はFAAH発現の阻害剤を含む)の投与の特定の経路、適用量及び方法は、医師によって日常的に決定され得る。通常、物質の治療上有効な量が、患者に投与される。物質の治療上有効な量は、鎮痛処置に関連して疼痛を低減するのに有効な量である。物質の治療上有効な量が投与される。用量は、種々のパラメータに従って、特に、使用される化合物、処置されるべき患者の年齢、体重及び状態、投与の経路並びに必要なレジメンに従って決定され得る。やはり、医師ならば、任意の特定の患者について必要な投与経路及び適用量を決定できるであろう。
【００７９】
物質は、任意の適した手段によって患者に投与され得る。物質は、経腸若しくは腸管外経路によって、例えば、経口(例えば、吸入)、頬側、肛門、肺、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、脊髄内、頭蓋内、腹腔内、皮内、皮下、くも膜下腔内、関節内、局所によって、又はその他の適当な投与経路によって投与され得る。くも膜下腔内投与は特に好ましい。
【００８０】
物質は、種々の剤形で投与され得る。物質は、経口的に(例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性又は油性懸濁液、分散性散剤又は顆粒剤として)、腸管外に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、骨内に、胸骨内に（intrasternally）、脊髄内に、頭蓋内に、経皮的に又は注入技術（infusion）によって投与され得る。物質はまた、坐剤として投与され得る。医師ならば、それぞれ特定の患者にとって必要な投与経路を決定できるであろう。
【００８１】
阻害剤、例えば、オリゴヌクレオチド、siRNA、ベクター又は単離細胞は、医薬上許容される担体又は希釈剤と共に、使用のために製剤化されてもよく、これは、医薬の技術分野における日常的な方法を使用して実施され得る。医薬担体又は希釈剤は、例えば、等張性溶液であり得る。好ましい医薬上許容される担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物において使用され得る、適した水性担体の例として、水、緩衝水及び生理食塩水が挙げられる。その他の担体の例として、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)及びそれらの適した混合物、植物油、例えば、オリーブ油及び注射用（injectable）有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材、例えば、レシチンの使用によって、分散物（dispersion）の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合には、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
【００８２】
固体経口形態は、例えば、活性化合物と一緒に、希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモデンプン；滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム及び/又はポリエチレングリコール；結合剤、例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン；脱凝集剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギネート又はデンプングリコール酸ナトリウム；発泡性混合物；色素；甘味料；湿潤剤、例えば、レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸；並びに一般に、医薬製剤において使用される非毒性の薬理学的に不活性な物質を含有し得る。このような医薬調製物は、公知の方法で、例えば、混合、顆粒化、打錠、糖衣又はフィルムコーティングプロセスの手段によって製造され得る。
【００８３】
経口投与用液体分散物は、シロップ、エマルジョン及び懸濁液であり得る。シロップは、担体として、例えば、サッカロース、又はグリセリン及び/若しくはマンニトール及び/若しくはソルビトールを伴ったサッカロースを含有し得る。
【００８４】
懸濁液及びエマルジョンは、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを含有し得る。筋肉内注射のための懸濁液又は溶液は、活性化合物と一緒に、医薬上許容される担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えば、プロピレングリコール、及び必要な場合には、適した量の塩酸リドカインを含有し得る。
【００８５】
静脈内又は注入用溶液は、担体として、例えば、滅菌水を含有し得る、又は好ましくは、それらは、滅菌、水性、等張性生理食塩水溶液の形態であり得る。坐剤用には、伝統的な結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含んでもよく、このような坐剤は、0.5%〜10%、好ましくは、1%〜2%の範囲の有効成分を含有する混合物から形成され得る。
【００８６】
経口製剤は、このような通常使用される賦形剤、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤又は散剤の形態をとり、10%〜95%の有効成分、好ましくは、25%〜70%を含有する。医薬組成物が凍結乾燥される場合には、凍結乾燥材料は、投与に先立って復元（reconstitution）、例えば、懸濁され得る。復元は、好ましくは、バッファー中で達成される。
【００８７】
患者への経口投与のために、例えば、Eudragit「S」、Eudragit「L」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶コーティングを有するカプセル剤、錠剤及び丸剤が提供され得る。
【００８８】
無針注射による、例えば、経皮的送達に適した医薬組成物も使用され得る。
【００８９】
投与は、単回又は複数回用量であり得る。複数回用量は、同一又は異なる経路によって、同一又は異なる位置に投与され得る。或いは、用量は、持続性放出製剤によってであってもよく、この場合には、より少ない頻度の投与が必要である。適用量及び頻度は、患者における物質の半減期及び所望の処置の期間に応じて異なり得る。
【００９０】
当業者及び特に、適切な医師は、例えば、処置されるべき患者の年齢、性別、体重、状態、疾患の重症度並びに投与の頻度及び経路などを考慮して適切な適用量を同定することができるであろう。
【００９１】
物質は、オリゴヌクレオチドであり得る。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、処置されるべき患者の細胞において発現され得る発現ベクターの形態で提供される。これはまた、上記の節「オリゴヌクレオチド送達」及び以下の節において記載される。オリゴヌクレオチドは、裸のヌクレオチド配列であってもよく、カチオン性脂質、ポリマー又は標的化系との組合せであってもよい。オリゴヌクレオチドは、任意の利用可能な技術、例えば、上記のものによって送達され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、ニードル注射（needle injection）によって、好ましくは、皮内に、皮下に又は筋肉内に導入され得る。或いは、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド送達デバイス、例えば、粒子媒介性遺伝子送達を使用して皮膚を越えて直接的に送達され得る。オリゴヌクレオチドは、皮膚に、又は粘膜表面に、例えば、鼻腔内、経口、膣内又は直腸内投与によって局所的に投与され得る。好ましい送達方法は、AAVベクターのくも膜下腔内投与である。
【００９２】
オリゴヌクレオチド構築物の取り込みは、いくつかの公知のトランスフェクション技術、例えば、トランスフェクション剤の使用を含むものによって増強され得る。これらの薬剤の例として、カチオン性薬剤、例えば、リン酸カルシウム及びDEAE-デキストラン及びリポフェクタント、例えば、リポフェクタム及びトランスフェクタムが挙げられる。
【００９３】
医薬組成物は、記載されるような、1種以上の阻害剤、オリゴヌクレオチド、siRNA、ベクター又は単離細胞を含み得る。医薬組成物は、さらなる有効成分、及び記載される1種以上の阻害剤、オリゴヌクレオチド、siRNA、ベクター又は単離細胞を含み得る。それらはまた、さらなる治療薬又は予防薬を含み得る。さらなる治療薬又は予防薬は、疼痛を処置又は予防するのに有用であり得る。
【００９４】
投与は、例えば、吸入によってであり得る。全身投与は、例えば、経粘膜又は経皮手段によってであり得る。経粘膜投与は、鼻腔スプレー又は坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のために、オリゴヌクレオチドは、例えば、経皮パッチ又はプラスター、軟膏、膏薬、ゲル又はクリームに製剤化され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、坐剤又は保留浣腸の形態に調製され得る。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドは、化合物を身体からの迅速な排出から保護する担体、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む徐放性製剤を用いて製剤化され得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸酸が使用され得る。
【００９５】
一実施形態では、医薬組成物は、単位剤形に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、アンプルに製剤化され得る。医薬組成物は、投与のための使用説明書と一緒にコンテナ、パック又はディスペンサーに含まれ得る。
【００９６】
投与されるオリゴヌクレオチドの適用量は、実施されている特定の方法、並びに対象に投与されている場合、疾患の性質、対象の状態、特定の製剤化及び投与経路に応じて変わる。オリゴヌクレオチドの細胞内濃度の例は、約0.005〜50μM、又はより好ましくは、0.02〜5μMの範囲のものを含む。対象、例えば、ヒトへの投与用には、約0.001〜50mg/kg、好ましくは、0.01〜10mg/kg、及びより好ましくは、0.1〜5mg/kgの範囲の1日適用量が使用され得る。当業者及び特に、適切な医師ならば、例えば、因子、例えば、年齢、性別、体重などを考慮して適切な適用量を同定できるであろう。
【００９７】
投与計画は、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するように調整され得る。例えば、単回用量が投与されてもよく、いくつかの分割用量が経時的に投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急性によって必要とされる（indicated）ように、比例的に低減若しくは増大されてもよい。本明細書において使用される適用量単位形は、処置されるべき対象の単位適用量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように算出された所定量の活性化合物を含有する。
【００９８】
本発明は、以下の実施例によって例示される。
【００９９】
[実施例1]
方法
定量的感覚試験(QST)のためのドイツのDFNSプロトコール
QSTを、DFNSの訓練を受けた実験者15によって、ドイツ神経因性疼痛ネットワーク(DFNS)プロトコールに従って、足及び手の背側においてインフォームドコンセント後に実施した。このプロトコールは、機能の獲得及び喪失の両方を検出するように設計された13のパラメータを含み、以下にまとめられている。
【０１００】
熱刺激:温度試験を、接触範囲9cm2のサーモードを備えたTSA-2001-II(Medoc、イスラエル)を使用して実施した。閾値を、32℃(中性範囲の中心)から対象管理又は自動カットオフ温度によって終結されるまで、傾斜刺激(1℃/s)を使用して得、それによって温度はベースライン温度に戻った。サーモード温度は、10秒の刺激間間隔の間、32℃で維持された。続いて、冷知覚閾値及び温知覚閾値(CDT、WDT)を評価した。矛盾熱感覚(PHS)の存在は、温感覚閾値(TSL)を決定するためにも使用された交互の加温及び冷却によって調べた。次いで、冷疼痛閾値及び温疼痛閾値(CPT、HPT)も測定した。試験は、3連で実施し、比較のために平均データが使用された。すべての対象は、温度増大の開始のタイミング及び刺激間間隔に気付いていなかった。
【０１０１】
機械的刺激:機械的知覚閾値(MDT)は、範囲0.25〜512mN内の2倍増加性屈曲力の、先端が同一の形状で丸くなっているフォンフライ毛(Optihair2-Set、Marstock、Nervtest、Germany)の標準セットを使用して評価した。MDTは、「限界の方法」によって毛の連続上昇及び下降適用を使用して確認された5つの閾値の幾何平均として算出した。振動感覚(VS)の評価は、ライデルセイファー段階的音叉(64Hz、8/8スケール)を用いて実施し、これを尺骨茎状突起又は内くるぶし上に置き、対象がそれ以上振動を感じることができなくなるまで残し、3回実施した。機械的疼痛閾値(MPT)は、0.2mm径のとがっていない接触範囲を有する8、16、32、64、128、256、512mNの固定強度を発揮する7個の機械的プローブのセットを使用して確認した。刺激は、刺激が鋭いと知覚されるまで2秒オン、2秒オフの速度で昇順で適用し、その後、もはやそのように報告されなくなるまで下降させた。閾値は、これらのシリーズを5回繰り返した幾何平均として算出した。ワインドアップレシオ(WUR)は、256mNピンプリックの単回適用からの痛みの、1cm2範囲内で1回/秒の速度で適用された同一刺激の10回反復からの痛みとの比較での、知覚された強度から生じた一時的な脊髄ワインドアップの知覚モデルである。疼痛強度は、数値評価尺度(NRS)を使用して報告され、ここで、0は疼痛なしを表し、100は最大の想像できる疼痛を表す。プロセスを5回反復し、10回適用後の平均疼痛報告を、単回刺激から報告された平均強度によって除すことによってWURを算出した。機械的疼痛感度(MPS)は、7種の加重ピンプリック刺激の同一セットを使用して評価して、ピンプリック誘発疼痛の刺激-応答関数を得た(最も強いピンプリック力は、平均機械的疼痛閾値の約8倍であった)。対象に「0~100」数値評価尺度で各刺激の疼痛評点を示すように求めた(「0」は、「疼痛なし」を示し、「100」は、「想像できる最も強烈な疼痛」を示す)。この試験は、ピンプリック痛覚過敏を検出するように設計した。動的機械異痛(DMA)は、綿のウィスプ（wisp）、綿棒及び200〜400mNの力を発揮する標準ブラシ(Somedic Sweden)を使用してこの試験の一部として評価した。圧痛閾値(PPT)は、1cm2のプローブ範囲を有する圧力計デバイス(FDN 200、Wagner instruments、USA)を使用して母指球及び足の甲で評価した。圧痛閾値は、50KPa/sの漸増勾配で3シリーズの上昇刺激強度を使用して決定した。
【０１０２】
各パラメータの知見は、Z-スコアによって対照コーカサス人集団と比較される。Z-スコアは、生スコアから集団の平均を引いた結果を表し、これを集団の標準偏差によってさらに除する。±2標準偏差上回る又は下回るZスコアは、過感度/感度低下及び痛覚過敏/痛覚鈍麻を表す。疼痛試験の倫理委員会によって許可された上限が到達された場合には、現れたカットオフ値は、何らかの組織損傷を引き起こす前の最大刺激と等価である(温度について0℃〜52℃、機械的疼痛について512mN、圧痛について10Kg)。
【０１０３】
皮膚生検
発端者の脚の外側くるぶしの10cm上からパンチ皮膚生検を採取し、2%過ヨウ素酸-リシン-パラホルムアルデヒドを用いて一晩固定し、スクロース中で保存し、その後、ブロッキングし、50μM切片に処理した。神経線維を、ウサギ抗PGP(タンパク質遺伝子産物)9.5Ab(1:2000;Ultraclone Ltd、Yarmouth、Isle of Wight、UK)及びCy3抗ウサギ(1:500;Jackson Immunoresearch、West Grove、PA、USA)を使用して染色した。Zeiss LSM 710共焦点顕微鏡、z-スタック(2μm間隔)によって、20×倍率のPlan-Apochromat対物レンズ(Carl Zeiss MicroImaging GmbH、Jena、Germany)を用いて最大強度投影を作製した。解析は、公開されたガイドラインのとおりに実施した16。真皮-表皮接合部を横切るPGP9.5陽性神経線維をカウントし、IENFDカウントは、皮膚の1ミリメートルあたりの線維数で与えられる。
【０１０４】
全エキソームシーケンシング
エキソン及び両端に位置するイントロン配列の濃縮のために、本発明者らは、Agilent Human SureSelect V5キットをUTRと共に使用した。本発明らは、Genome Analyzer HiSeq 2000システム(Illumina)で100bpペアエンドランを実施し、5.2(PFS)、5.3(息子)、5.4(母)及び5.6(娘)Gbの配列を作製した。この量のデータにより、以下の標的のパーセンテージが、10×以上でカバーされることとなった:95.7(PFS)、96(息子)、96(母)及び96.2(娘)。Burrows-Wheeler Aligner17及びGenome Analysis Toolkit18,19を使用することによって、参照ヒトゲノムアセンブリ(hg19)に対して配列アラインメント及びバリアントコールを実施した。Picardソフトウェアを用いてフォーマット変換及びインデックス作成を実施した。単一ヌクレオチドバリアント及び小さい挿入及び欠失を、確立されたデータベースに対してチェックした(1000 Genomes Project及びdbSNP v.142)。バリアントを、ExACブラウザ、dbSNP v.150及び本発明者らのその他の疾患のシーケンシングデータの社内データベース(n>2000)を使用してさらにチェックした。SIFT、Polyphen2及びM-CAPを使用してバリアントのタンパク質コーディング効果を予測した。NNSPLICE Splice Site Predictorを使用してスプライシング変化を解析した。新規バリアントをSangerシーケンシングによって検証し、チェックして、それらがファミリー内でどのように分離したかを確かめた(依頼に応じて、プライマーが利用可能である)。
【０１０５】
ゲノムコピー数解析
PFSから得た末梢血サンプルから単離されたゲノムDNAを、Cytoscan HD Copy Array(Affymetrix)に使用し、製造業者の条件に従ってAROSに掛けた。データは、Chromosome Analysis Suite(Affymetrix)ソフトウェア及びゲノムバリアントのデータベース(DGV)との比較によって同定された新規ゲノムバリアントを使用して解析した。
【０１０６】
欠失ブレークポイントクローニング
Cytoscan HD Copy Arrayにおいて同定された微小欠失の両側に位置すると予測されたさまざまなプライマーを設計した。LA Taq DNAポリメラーゼ(Clontech)及びプライマー5'CCACCAGTGTGCTGGTGGCTAC(配列番号8)及び5'AGCCTCTGGGGCACTTTGACTC(配列番号9)を使用して、PFS及び息子から2,259bpの産物を増幅した(図6A)。次いで、KAPA HiFi DNAポリメラーゼ及びプライマー5'TTAATGTCTGGAGTGATAACATGAC(配列番号10)及び5'ACAACTTCTAATTAGTGTTAATGAC(配列番号11)を使用して、欠失ブレークポイントにより近いプライマーを設計し、使用して、1349bp産物を増幅した。プライマー5'TTAATGTCTGGAGTGATAACATGAC(配列番号10)及び5'AAGGCCGGGCGCGGTGACTTAC(配列番号12)を使用する、ゲル精製されたPCR産物(Qiagen)のSangerシーケンシングによって、微小欠失ブレークポイントの同定が可能となった(図6B)。
【０１０７】
SNP rs324420のPCR増幅及びSangerシーケンシング 
ゲノムDNAを鋳型として使用し、プライマー5'CTCTGGGCCATGTTGCTGGTTAC(配列番号13)及び5'CAACTGTCACACAGGCCAAAACAG(配列番号14)を使用して、SNP rs324420を含有する領域から424bpの産物を増幅した。精製されたPCR産物を標準法によってSangerシーケンシングした。
【０１０８】
FAAH-OUTのクローニング
部分発現された配列タグ(EST)を、微小欠失の下流で同定し、Refseqにおいて、1267bp配列(NR_045483)にアセンブルされ、「脂肪酸アミド加水分解酵素偽遺伝子(FAAHP1)非コーディングRNA」とアノテートされた。さらなる5'エキソンを同定するために、UCSCゲノムブラウザを使用してさまざまな種に由来するFAAHP1遺伝子座を検索した。これは、ウシゲノムにおけるEST CN788775の同定につながった。このESTのヌクレオチド配列を、Blatツール並びにヒトゲノムDNA配列内で同定されたコンセンサススプライスドナー及びアクセプター部位を使用してヒトゲノムと比較した。ヒト成体脳全RNAを、オリゴd(T)及びスーパースクリプトIII first-strand synthesis system(Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写した。最も5'の予測されたエキソンにマッピングされるフォワードプライマー(5'CCAGAAGTGGAGGGAGGTAGCAC(配列番号15)及び下流の予測されたエキソンにおけるリバースプライマー(5'GCTGTCATAGGTGTCCTTGAGGCTC(配列番号16)を設計及び使用して、ヒト成体脳cDNAから産物を増幅した。Sangerシーケンシングによって、アンプリコンが5'からFAAHP1にマッピングされる新規ヒトエキソンであると確認された。次いで、5'RACEを、全ヒト脳Marathon-Ready cDNA(Clontech)を使用し、リバースプライマー(5'CAAAGTGAGACTCCGTCTGCTGC(配列番号17)を製造業者の条件に従って使用して実施した。生成したアンプリコンをpCR-Blunt II-TOPO(Thermofisher)にクローニングし、M13フォワード及びリバースプライマーを使用してシーケンシングした。次いで、フォワードプライマー(5’GGCAAAGGCGCCATTCTCCTGGGTACA(配列番号18)を、新規に同定された転写物の最も5'末端で設計し、リバースプライマー(5'GCCAGTCAGAAAATGTTTATTGAGCTC(配列番号19)を、NR_045483の最も3'エキソンにおいて設計した。ヒト大脳皮質cDNAを鋳型として使用して、2845bp産物を増幅し、これをその後、pCR-Blunt II-TOPOにクローニングし、完全シーケンシングした。シーケンシングされたクローン(CC2)の挿入部分を、受託番号KU950306の下でGenBankに提供した。本発明者らは、この遺伝子をFAAH-OUTと称する。
【０１０９】
ヒト組織におけるリアルタイムqPCR解析 
さまざまなヒト組織に由来する1μgの全RNA(Clontech)を、オリゴd(T)及びスーパースクリプトIII first-strand synthesis system(Invitrogen)を、製造業者の条件に従って使用して逆転写した。リアルタイムPCRをUniversal SYBR Green Supermixプロトコール(Bio-Rad)及び以下のプライマー:FAAH-OUT、214bp(5'ACTGACACAGGTGACAGCATCTG(配列番号20)及び5'GTCCAGTCGGTACATGTCTTCAC(配列番号21)並びにアクチン(ACTB)、144bp(5'CCTGGCACCCAGCACAAT(配列番号22)及び5'GGGCCGGACTCGTCATACT(配列番号23)を使用して実施した。これらのアッセイは、BioRad CXF Connect(商標)リアルタイムサーマルサイクラーで実施した。FAAH-OUT発現は、同一プレート上で並行して同一サンプルで測定されたアクチンのものと比較し、ACTBから試験遺伝子を引いた、CT差(ΔCT)を得た。ΔCTデータで平均及び標準誤差の算出を行い、相対発現レベル(2＾ΔCT)に変換した。
【０１１０】
成体ヒト後根神経節組織におけるRNAscope
RNAscope蛍光in situハイブリダイゼーションを、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルのためのRNAscope(登録商標)Multiplex Fluorescent V2 Kitを製造業者の実験プロトコールに従って用いて実施した。標的RNA分子を検出するために使用される蛍光色素は、1:1000希釈のPerkinElmerによるOpal520(緑色)及びOpal650(赤色)であった。FAAH(534291-C2番)及びFAAH-OUT(534301-C3番)RNAの特異的RNAscope(登録商標)プローブが設計され、ACD company (BioTechne)によって合成された。DAPI染色を使用して、核を染色した。画像を、4×アベレージングを用いてAirscanを備えたZeiss LSM-880顕微鏡を使用して集め、未圧縮TIFファイルとしてエクスポートし、Adobe Lightroom 7 photoshopを使用してファイナライズした。
【０１１１】
血漿エンドカンナビノイド(EC)の評価
AEA、PEA、OEA及び2-AGのレベルを、PFS及び4人の無関係な正常対照から採取した血液サンプルからの質量分析によって測定した。研究参加者は、PFS(指標患者、女性、閉経後(69歳)、FAAH-OUT微小欠失及びrs324420についてA/C)、対照A(女性、閉経後(50歳)、rs324420についてCC)、対照B(男性、57歳、rs324420についてCC)、対照C(女性、閉経後(50歳)、rs324420についてAC)及び対照D(男性、49歳、rs324420についてAC)であった。研究参加者は、少なくとも4週間、いかなる医薬も用いなかった。前腕静脈の静脈穿刺によって、一晩絶食した後の午前8〜9時の間にEDTAを用いて抗凝固剤処置された全血を得た。ex vivo血液を氷上で20分より短い時間静置し、4℃で遠心分離し、血漿をアッセイされるまで-80℃で保存した。エンドカンナビノイドN-アラキドノイルエタノールアミド(AEA)及び2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)の血漿レベルのアッセイを、これまでに公開された方法を使用して実施した20。簡潔には、500ulの血漿を、2mlのアセトニトリル中に直接ピペットで入れ、それには、内部標準[2H8]-AEA(5pmol)及び[2H8]-2-AG(5nmol)(Cayman Chemicals、Ann Arbor、MI)はすでに添加されていた。すべてのサンプルを超音波処理し、-20℃で一晩保存して、タンパク質を沈殿させた。翌朝、すべてのサンプルを1500×gで4分間遠心分離し、その後、上清を新しいバイアルに移し、再度、同一パラメータ下で遠心分離した。次いで、この2回目の遠心分離から得た上清を未使用のホウケイ酸ガラス管に移し、窒素ガス下で乾燥させた。次いで、すべてのサンプルを200ulのアセトニトリルに再懸濁し、解析まで-80℃で保存した。AEA及び2-AGを、これまでに記載したように液体クロマトグラフィー及びタンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用して定量化し20、すべての値は、血漿中1mlあたりの濃度に正規化した。
【０１１２】
線維芽細胞株及びマイクロアレイ解析
患者PFS及び4人の無関係な女性対照(A、D、E及びF)から得た皮膚生検から一次線維芽細胞を抽出し、20%胎児ウシ血清を含有するDMEMで継代した。TRIzol試薬(Life Technologies)及びPurelink RNAマイクロキット(Thermo Fisher)を製造業者の使用説明書に従って使用してRNAを単離した。マイクロアレイ解析を、Clariom Dヒトトランスクリプトームアレイ(Applied Biosystems)及びWTプラスキットを使用して実施した。トランスクリプトームアレイデータの異なる遺伝子発現解析を、トランスクリプトームAnalysis Console(TAC Ver 4.0、Thermo Fisher)を使用して実施した。
【０１１３】
CRISPR/Cas9プラスミド
プラスミド6159121及び10621922(Addgene)を、遺伝子編集(SaCas9)及び転写抑制(dSaCas9-KRAB)CRISPR実験のために修飾した。遺伝子編集プラスミド61591について、CMVプロモーターを、ハウスキーピングEef1a1遺伝子に由来するより短いプロモーター配列と置き換え、bGHポリアデニル化配列を、より短い合成ポリアデニル化配列と置き換えた。gBlocks遺伝子断片(IDT)を、In-Fusionクローニング(Takara)によって2つのガイドカセットが1つのプラスミドに挿入されることを可能にする設計を用いて、U6プロモーター、ガイド配列及び修飾ガイドスキャホールド23を含有するように設計した。ガイド配列を、患者PFSにおいて観察された微小欠失の両側に位置するように設計した。プラスミドHMaは、ガイドCCCAGTGAGTACGATGGCCAG(配列番号24)及びTTAGTGATATTGTTCCGTGGG(配列番号25)を含有した。プラスミドHMbは、ガイドTCATGGCCTTTCCCCTTCTCA(配列番号26)及びGTCACTTGCAGTCTGATTAAG(配列番号27)を含有した。「空のベクター」対照は、Eef1a1プロモーターによって駆動されるSaCas9を含有するが、ガイド配列を含有しなかった。転写抑制CRISPRi実験のために、dSaCas9-KRAB配列を含有するプラスミド106219に由来するAgeI-EcoRI断片を使用して、プラスミド61591由来のSaCas9配列を置換して、CMVによって駆動されるdSaCas9-KRABを得た。次いで、gBlocks遺伝子断片(IDT)を、合成ポリ(A)配列、U6プロモーター、ガイド配列及び修飾ガイドスキャホールド23を含有するように設計した。この配列を、In-Fusionクローニング(Takara)を使用して、修飾プラスミド61591のEcoRI-NotI部位にクローニングした。ガイド配列「FOP1」(AAAAGGTGAGGTCACGAGGCC(配列番号28))を、FAAH-OUT転写開始部位のおよそ323bp上流のDNアーゼ過敏性部位内に位置させた。「空のベクター」対照は、CMVによって駆動されるdSaCas9-KRABを含有したが、ガイド配列を含有していなかった。
【０１１４】
CRISPR/Cas9プラスミドのHEK293細胞へのトランスフェクション
ヒト胚性腎293細胞(ECACC)へのトランスフェクションのために、DNA担体としてLipofectamine 3000(Invitrogen)を製造業者の手順に従って使用した。HEK293細胞を、10%ウシ胎児血清(Hyclone)を有するダルベッコ改変イーグル培地(Life Technologies、Inc.)で培養した。Lipofectamine 3000を、Opti-MEM I還元血清培地(Life Technologies、Inc.)に希釈した。5μgのプラスミドDNAを、Opti-MEMにまず希釈し、混合物に10μlのP3000試薬を添加した。希釈DNAを、希釈したLipofectamineに添加すること(比1:1)及び混合物を室温で30分間インキュベートすることによって、DNAリポソーム複合体を調製した。DNA-リポソーム混合物を、70%コンフルエントHEK293細胞に添加した。37℃で24時間インキュベートした後、培地を除去し、トランスフェクションステップを反復した。細胞を、92〜95%の湿度を有する5%CO2インキュベーター中、37℃でさらに24時間インキュベートした。培養細胞から全RNAを抽出するために、培地をまず吸引除去し、細胞を氷冷PBSを用いてすすいだ。1mlのTrizol(登録商標)を、細胞に直接添加し、それを室温で5分間インキュベートした。細胞溶解物をピペットに上下に数回通過させた。RNAを、PureLink(商標)RNA Micro Scaleキット(Invitrogen)を製造業者の手順に従って使用して抽出した。ゲノムDNAを、DNeasy Blood and Tissueキット(Qiagen)を使用して単離し、鋳型として使用して、遺伝子編集を確認した。プライマー5'TTAATGTCTGGAGTGATAACATGAC(配列番号10)及び5'ACAACTTCTAATTAGTGTTAATGAC(配列番号11)を使用して、HMaをトランスフェクトされた細胞からの約463bpのバンド及びHMbをトランスフェクトされた細胞からの約598bpのバンドを増幅した。プラスミドHMa及びHMbによって誘導された微小欠失の大きさは、それぞれ、約9017bp及び約8882bpであった。
【０１１５】
TaqmanリアルタイムPCR
一次線維芽細胞及びHEK細胞RNA(5μg)(CRISPR/Cas9実験から)を、オリゴd(T)及びスーパースクリプトIII first-strand synthesis system(Invitrogen)を製造業者の条件に従って使用して逆転写した。TaqmanリアルタイムPCRを、以下のプローブ:FAAH(Hs01038660_m1)、BDNF(Hs03805848_m1)及びアクチン(Hs01060665_g1)を使用して実施した。FAAH又はBDNF発現は、同一プレート上で並行して同一サンプルで測定されたアクチンのものと比較し、ACTBから試験遺伝子を引いた、CT差(ΔCT)を得た。ΔCTデータで平均及び標準誤差の算出を行い、相対発現レベル(2＾ΔCT)に変換した。
【０１１６】
結果
症例報告
66歳コーカサス人女性(本明細書においてPFSと呼ばれる)は、整形外科、具体的には、両側性汎大菱形骨変形性関節症（bilateral pantrapezial osteoarthritis）の診断後のLRTI及びEPL再調整を伴う大多角骨摘出術（trapeziectomy）のためにスコットランド、インヴァネスのRaigmore Hospitalに訪れた。PFSは、右親指の使用において著しい悪化及び変形を有していたが、彼女は無痛と報告した。前評価メモから彼女はASA I(アメリカ麻酔科学会類別)として分類されたが、モルヒネ摂取後の嘔吐歴を有していたということが強調された。手術のために、彼女は、超音波によってガイドされる腋窩神経遮断と共に全身性麻酔を与えられた。手術中に[1530〜1630時（hours）の間]、彼女は、腋窩神経遮断において、フェンタニル50mcg iv、Propofol 200mg iv、オンダンセトロン4mg iv及び20mlの0.25% l-ブピバカインを投与された。術後、彼女の疼痛強度スコアは、翌日まで一貫して看護早期警告チャート(NEWS)で0/10として記録され、その時点で彼女は術後に自宅に退院した。彼女の入院の間に彼女が投与された唯一の術後鎮痛薬は、彼女の手術当日、麻酔後ケアユニットにおける静脈内パラセタモール1gm iv [1705時]であった。彼女はまた、シクリジン50mg iv[1655時]及び1705時にシクリジン50mg ivを投与された。PFSは、異常なことに、この公知の有痛性手術(大多角骨摘出術)のための術後鎮痛剤を必要とせず、ベッドサイドで、つまむこと又は末梢ivカニューレ操作から疼痛がないと示すことが観察され、これはさらなる調査につながった。
【０１１７】
PFSは、股関節の変形性関節症とこれまでに診断されており、彼女は無痛と報告しており、これは関節変性の重症度と一致しなかった。65歳で、彼女は、股関節置換手術を受け、術後1日目と2日目にパラセタモール1グラムの2錠のみ経口投与された。PFSは、パラセタモールを摂取するよう勧められたが、鎮痛剤を全く要求しなかったと報告している。彼女はまた、術後の夜にモルヒネ(MST硫酸モルヒネ10mg)の単回用量を投与された。これは、重度の吐き気及び嘔吐を2日間引き起こした。術後、彼女の疼痛強度スコアは、術後の夜の2200時の1/10の1スコアを除いてずっと0/10として記録された。彼女の過去の術歴は、複数の静脈瘤及び歯科処置に関して注目に値する。PFSは、これらの介入のいずれの後にも決して鎮痛を必要としたことはなかったと述べている。
【０１１８】
PFSは、彼女が鎮痛薬を使用しなかった痛みのない損傷の長い歴史を報告している(例えば、耳の切り傷の縫合、左手首の骨折)。彼女の人生を通じて、彼女は、疼痛が全く誘発されずに火傷及び切り傷を負った多数のエピソードを有していた。彼女は、肉の焼ける匂いがして初めて、何らかの火傷損傷が生じていることに気付くことが多く、それが、損傷に対する唯一の注意喚起状況である。彼女は、これらの創傷は、極めて迅速に治癒し、残存する瘢痕がほとんど又はまったく残らないことが多いと述べている。蚊に刺されることは、彼女の炎症(発赤と腫れ)を引き起こし、イラクサの刺傷は心地よく痛みを伴わないと記録されている。
【０１１９】
月経は11歳で始まり、気持ちの悪い期間があり、彼女の腹部膨満感と一般的な不快感な感情を引き起こした。彼女は29歳及び42歳での2回の出産中の疼痛について苦痛を訴えなかった(ただし、ガス鎮痛を受けたことを覚えている)。彼女は分娩を、圧迫の感覚を彼女に引き起こしたものとして思い出し、不快に感じたが痛みはなかった。彼女は裂傷のためにステッチを必要としたが、鎮痛剤は必要なかった。
【０１２０】
PFSは、彼女の夫と暮らし、引退前は教師であった。彼女には以前の結婚からの娘と息子がいる。彼女の家族歴は、神経障害又は有痛性状態について目立つものはない。彼女の母及び娘は、疼痛を正常に知覚するようである。彼女の父(現在は死亡している)は、鎮痛剤をほとんど必要としなかった。彼女の息子も、いくらかの程度の疼痛無感覚を有すると報告しているが、彼の母と同程度ではない。彼は、献血による、又は切り傷若しくは打撲傷による疼痛を感じず、頻繁に、熱い飲み物や食べ物で口を火傷し、皮膚が剥がれ落ち始めるまで気付かない。彼は、鎮痛剤を服用する必要があったことは決してないと報告している。
【０１２１】
PFSは、現在、投薬を全く服用しておらず、健康で活動的である。彼女は、もう一方の手の大多角骨摘出術を待っている。彼女は、関節炎以外の他の医学的状態を有していない。PFSは、極めておしゃべりで幸せで不安を感じず、常に楽観的な気質を有する。彼女は長年の記憶の喪失（long-standing memory lapse）について報告している(例えば、頻繁に文章の途中で単語を、キーの配置を忘れること)。彼女は、危険な状況において、例えば、最近の交通事故においてでさえ、パニックにならないと報告している。
【０１２２】
無痛の大多角骨摘出術後、67歳で、PFSは、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンとオックスフォード大学の疼痛遺伝学チームに照会され、さらに調査された。両方の機関から倫理的な承認が得られ、書面による同意が得られた。臨床検査では、腕の周りと手の甲に複数の傷跡があった。血圧は、横臥で105/75mmHgであり、体位性低下（postural drop）はなかった。脳神経の検査は正常であり、四肢の筋力低下又は重大な運動異常はなかった。すべての深部腱反射は保たれていた。上肢の軽いタッチでは、関節の位置の感覚と振動は遠位で保たれていたが、温度感覚は手首の両側で失われ、ピンプリック感覚は肩へと損なわれた(すなわち、それはタッチとして感じられたが、鋭い刺すような痛みを伴う感覚を誘発しなかった)。下肢タッチでは、関節の位置の感覚及び振動は、同様に遠位で保たれていた。温度感覚はつま先の基部まで失われ、ピンプリック感覚は膝まで失われていた。定量的感覚試験(図4)は、手と足の両方において侵害性熱に対する感度低下を実証した。皮膚生検は、正常な表皮内神経線維密度を示した。
【０１２３】
さらなる臨床情報
PFSは、1947年に生まれ、歩行又は発話について問題は報告されておらず、その他の発達の診査事項は問題なく達成された。教育は目立ったものではなく、小学校教師のトレーニングを完了し、特別支援教育の卒業証書を有している。彼女は臭いをかぐことに問題がなく、コーヒー、オレンジ、香水、ミントの間の違いを告げることができ、スパイス及びさまざまなフレーバーを楽しんでいる。PFSは、タバコを吸ったことがなく、極めてまれにアルコールを消費する。彼女は38年間ベジタリアンであり、11年間ビーガンであり、ビタミン欠乏症の病歴はない。注目すべきことに、彼女の歯科医は、最も珍しいことに、彼女の唾液がほんの90分後に暫間義歯の固定液を溶解することを観察した。
【０１２４】
67歳での診察時、彼女の身長は170cm、体重は63kgであった。遠位脚からの表皮内神経線維密度(外側くるぶしの10cm上)は、5.8f/mmであり、年齢及び性別の正常範囲内であった24。神経伝導試験によって、正常な運動及び感覚伝導パラメータが実証された。彼女は、ピリピリ感を伴う外反母趾による、並びにピン及び針による彼女のつま先の灼熱感に言及し、これを、彼女は「心地よい」と述べている。加温状態における発汗は正常であった。
【０１２５】
遺伝子検査
PFS、彼女の2人の子供及び彼女の母から提供された末梢血サンプルから、ゲノムDNAを単離した。4人のメンバーすべてについてエキソームシーケンシングを実施して、この新規障害の病原突然変異を同定した。息子における部分的表現型を考慮して、本発明者らは、表現度の差異（variable expressivity）を有する優性遺伝パターンを予測した。本発明者らはまた、PFSが機能対立遺伝子のさらなる喪失の遺伝のために完全表現型を提示している可能性があることを考慮した。これまでに記載されていない表現型を考慮して、本発明者らは、PFSのエキソーム中で、彼女の影響を受けていない母及び娘には存在しないが、息子によって受け継がれた新規バリアントについて検索した。バリアントのフィルタリング後、本発明者らは、PFS及び彼女の息子において4つの候補突然変異を同定した:MACF1 (NM_012090:c.C14416T:p.L4806F)、USP24(NM_015306:c.G6490A:p.V2164M)、KIAA1107(NM_015237:c.A3359G:p.N1120S)及びNSD1(NM_022455:c.C6703T:p.H2235Y)。USP24、KIAA1107及びNSD1におけるバリアントは、Polyphen2(HumVar)ツールによって良性（benign）としてアノテートされている。MACF1バリアントは、「おそらく有害（probably damaging）」とアノテートされており、神経遺伝子である。しかし、本発明者らは、この微小管-アクチン架橋因子は、疼痛との関連で既知の遺伝子機能の解析後に、優先度の低い候補であると考えた25。代わりに、本発明者らは、遺伝子解析を広げ、Cytoscan HD Array(Affymetrix)を使用して細胞遺伝学的コピー数変化について検索した。この解析によって、1番染色体でPFSにおいて約8kbのヘテロ接合微小欠失が同定され(図5)、これは、FAAHの3'末端から約4.7kb下流で始まっていた(図1A)。1000ゲノムプロジェクトにおいてスクリーニングされた5008種の対立遺伝子のうち1人のコロンビア人男性(HG01353)も、同様の大きさの微小欠失を保有しているが、FAAH SNP rs324420についてホモ接合野生型である。
【０１２６】
微小欠失の検証及びFAAH-OUTのクローニング
微小欠失の存在を確認するために、予測欠失領域の両端に位置するPCRプライマーを設計し、使用して、突然変異型PFS対立遺伝子(図6A)を増幅した。Sangerシーケンシングによって欠失ブレークポイントが同定され(図6B)、これは、8,131bpである微小欠失の大きさを示した。AluSp反復配列(図1及び6C)は微小欠失の両側に位置し、この領域を、ゲノム再編成を起こしやすくさせる可能性が高い。PCR解析(図6A)は、部分的に影響を受けた息子が、微小欠失を受け継いでいることを示したが、影響を受けていない母及び娘のゲノム中には微小欠失は存在しない。さらに、Sangerシーケンシングによって、PFSは、FAAHハイポモルフSNP(rs324420)についてヘテロ接合であると示された(表1)。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
PFSにおける異常な表現型及び微小欠失がFAAHに近いことを考慮して、本発明者らは、微小欠失がいかにして病原性となり得るかを調べた。興味深いことに、部分的ヒト発現配列タグ(EST)が、微小欠失の下流に同定され、FAAH偽遺伝子、FAAHP1(本明細書において、FAAH-OUTと呼ばれる)とアノテートされ、ウシゲノムを使用するさらなる解析によって、可能性のあるさらなる保存された5'エキソンが同定された。RT-PCR及び5'RACEを使用して、本発明者らは、成体脳において頑強に発現する全長転写物をクローニングした。FAAHと同様に、この2.845kbのFAAH-OUT配列は、胎児及び成体脳において、並びに後根神経節組織において発現される(図1B)。成体ヒト後根神経節切片におけるRNAscope解析は、FAAH-OUT転写物は、主に核に局在することを示し、これは、このRNAがFAAHの発現を調節する役割を担う可能性と一致する(図2)。配列アラインメントは、FAAHとFAAH-OUTの間で800bp領域内で約70%のヌクレオチド同一性を示す(図7A)。オープンリーディングフレーム及びKozakコンセンサス解析(ATGpr)は、最も可能性が高い予測FAAH-OUTペプチドが、166個のアミノ酸を含有することを示し(図7B)、FAAHの領域に対して69%の類似性を共有するが(図7C)、FAAH-OUTは、潜在的に、長い非コーディングRNA（long non-coding RNA）として機能する可能性がより高い26,37。
【０１２９】
FAAH-OUTにおける微小欠失及びハイポモルフFAAH SNPの両方を保有することによる効果を決定するために、本発明者らは、PFSから得た血液サンプルから循環脂肪酸アミドレベルを測定し、それらを4人の対照個体に対して比較し、それらのうち2人は、SNPのヘテロ接合保有者であった。際立ったことに、対照と比較して、AEAレベルは、70%増大され、OEA及びPEAの循環レベルは、およそ3倍であった(図3)。2-AG（FAAHの基質ではない別のエンドカンナビノイド）のレベルは大きく変更されなかった。これらの結果は、患者において著しい機能の喪失を示すFAAHと一致する。
【０１３０】
BDNFは、患者線維芽細胞において上方制御される
FAAH-OUT微小欠失及びハイポモルフFAAH SNPを保有することによる下流の効果をさらに調べるために、本発明者らは、患者PFS及び4人の無関係の女性の正常対照から得た皮膚生検から線維芽細胞を単離した。リアルタイムqPCRは、対照と比較して、患者線維芽細胞株においてFAAH転写物の約64%の低減を示した(図8A)。さらに、マイクロアレイ解析は、脳由来神経栄養因子(BDNF)が、対照と比較して、患者線維芽細胞において著しく上方制御されたことを示し、これは、リアルタイムqPCRによって検証された(図8B)。BDNFの上方制御は、FAAHの阻害が、アナンダミド及びBDNFレベルの上昇をもたらし、亜慢性軽度ストレスのラットモデルにおける抗うつ剤様効果と関連していたことを示すこれまでのデータと一致する27。
【０１３１】
HEK293細胞における遺伝子編集
次いで、本発明者らは、CRISPR/Cas9を用いる遺伝子編集を使用して、HEK293細胞に、患者PFSにおいて同定されたものと同様の大きさの微小欠失を導入した。SaCas9プラスミド「HMa」及び「HMb」(微小欠失の両側に位置する異なるガイド対を有する)のトランスフェクションは、HEK293細胞における遺伝子編集及び微小欠失の生成をもたらした(図9A)。リアルタイムqPCRは、一時的トランスフェクション後、FAAH転写物のレベルが、対照ベクターを用いるトランスフェクションと比較して、プラスミドHMa及びHMbの両方について著しく低減されたことを示し、これは、微小欠失がFAAH発現に直接的に影響を及ぼすことを示す(図9B)。本発明者らは、次いで、FAAH-OUT遺伝子の上流のDNアーゼ過敏性部位について検索し、FAAH-OUTのプロモーター領域内にガイド配列「FOP1」を設計した。dSaCas9-KRAB及びガイドFOP1を有するこのCRISPRiプラスミドの一時的トランスフェクションは、FAAH発現の約25%の低減をもたらした(図10)。総合すると、このデータは、シスでの全長FAAH-OUT転写物の発現は、FAAHの正常な発現のために必要とされ、正常なFAAH機能を阻害するための可能性のある遺伝子療法経路であることを示す。
【０１３２】
考察
エンドカンナビノイド系は、多様なホメオスタシス機能を実施する重要な生理学的系であり、疼痛知覚にとって重要である28。FAAHは、多様な生理学的役割を有するさまざまな生理活性脂質(エンドカンナビノイドAEA及び関連脂肪酸アミド及びN-アシル-タウリンを含む)の分解にとって重要な酵素である。FAAH機能喪失突然変異のマウスモデル化及び薬理学的阻害研究は、痛覚鈍麻、皮膚創傷治癒の加速、恐怖消去記憶の増強、不安神経症の低減及び短期間記憶欠損を含むさまざまな表現型を示した6,11,29〜32。さらに、ヒトハイポモルフFAAH SNPは、術後鎮痛の必要性の低減、オピオイドによって誘導される術後吐き気及び嘔吐の増大並びに不安神経症関連挙動の低減と関連している8,11,14,33〜35。
【０１３３】
ここで、本発明者らは、痛覚鈍麻、変更された恐怖及び記憶の症状及び不安を感じない気質を有する患者における新規ヒト遺伝子障害を報告する。この障害は、新規偽遺伝子における微小欠失及び既知のFAAHハイポモルフSNPを同時に受け継ぐことによる。微小欠失は、その他のゲノム障害において見られるように、この領域をゲノム再編成を起こしやすくさせる可能性が高い反復配列が両側に位置する36。結果として、一般集団においてさらなる類似の個体がある可能性がある。この障害が過少報告されてきた可能性は、PFSが、無痛損傷の再発歴にもかかわらず66歳で診断されたという事実によって強調される。末梢血サンプルにおける脂質プロファイリングは、PFSにおけるAEA、OEA及びPEAの著しい増大を示し、これは、脳及びDRGではさらに悪化されるであろう。どの脂肪酸アミドが、患者表現型の主要な貢献要素であるかを理解するためには、さらなる研究が必要である。 
【０１３４】
微小欠失は、FAAH-OUTのプロモーター及び最初の2つのエキソンを除去するが、これが、FAAHの機能をいかにして破壊するかは、依然として、正確には解明されていない。1つの仮説は、FAAH-OUT転写物が、高い配列相同性のためにマイクロRNAのデコイとして正常に機能し、FAAH mRNAを分解から保護するということである(図6A)26。あるいは、FAAH-OUTは、FAAH転写の調節においてエピジェネティックな役割を有する可能性があり、又は欠失は、重大な転写調節エレメントを除去する36,37。成体ヒト後根神経節におけるRNAscope実験は、FAAH-OUTの核機能を示唆する。HEK293細胞における遺伝子編集及びCRISPRi実験は、シスでの全長FAAH-OUTの転写が、正常なFAAH 発現にとって必要であることを示す。
【０１３５】
この患者は、鎮痛におけるエンドカンナビノイド系の役割に、より詳しくは、FAAHゲノム遺伝子座に関して新規洞察を提供し、疼痛感覚への、隣接する、これまでに特性決定されていないFAAH-OUT遺伝子の重要性を強調する。FAAH阻害剤鎮痛薬試験のこれまでの失敗を考慮して、これらの結果は、FAAH-OUTを標的とすることによるFAAH関連鎮痛の開発への新たな経路を提供し得るので重要性を有する。
【０１３６】
参考文献
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【０１３７】
配列
配列番号１−野生型ヒトFAAHのcDNA配列（ハイポモルフrs324420 SNPを有しない）
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2021512929.tif 000007
【０１３８】
配列番号２−ハイポモルフSNP rs324420(C385A:太字及び下線)を有するヒトFAAHのcDNA配列
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【０１３９】
配列番号３−野生型ヒトFAAH-OUTのcDNA配列
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【０１４０】
配列番号４−微小欠失を含むヒトFAAH-OUTのcDNA配列
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【０１４１】
配列番号５−野生型ヒトFAAH-OUTのゲノムDNA配列
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【０１４２】
配列番号６−微小欠失を含むFAAH-OUTのゲノムDNA配列
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【０１４３】
配列番号７−微小欠失に対応するゲノムDNA配列
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【０１４４】
配列番号８−プライマー
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配列番号９−プライマー
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配列番号１０−プライマー
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配列番号１１−プライマー
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配列番号１２−プライマー
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配列番号１３−プライマー
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配列番号１４−プライマー
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配列番号１５−フォワードプライマー
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配列番号１６−リバースプライマー
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配列番号１７−リバースプライマー
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配列番号１８−フォワードプライマー
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配列番号１９−リバースプライマー
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配列番号２０−プライマー
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配列番号２１−プライマー
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配列番号２２−プライマー
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配列番号２３−プライマー
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配列番号２４−ガイド
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配列番号２５−ガイド
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配列番号２６−ガイド
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配列番号２７−ガイド
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配列番号２８−ガイド「FOP1」
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【０１４５】
配列番号３９−FAAHの両側の5kbを含む（FAAHエキソンは太字）、野生型ヒトFAAHのゲノムDNA配列（ハイポモルフrs324420 SNPを有しない）
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【０１４６】
配列番号４０−野生型ヒトFAAHのアミノ酸配列（ハイポモルフrs324420 SNPを有しない）
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配列番号４１−ハイポモルフSNP rs324420（太字）を含有するヒトFAAHのアミノ酸配列
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【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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