(57)【要約】  本発明は、放射標識４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イル）誘導体および放射性トレーサーとしてのそれらの使用、特にイメージング剤としてのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射標識されている、式（Ｉ）の化合物
【化１】
2021504426.tif 000015
、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
水素の少なくとも１つのが３Ｈであるか、または炭素の少なくとも１つが１１Ｃであるか、またはフッ素原子が１８Ｆである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
式（Ｉａ）によって表される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【化２】
2021504426.tif 000016
（式中、炭素の１つは１１Ｃである。）
【請求項４】
式（Ｉｂ）によって表される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【化３】
2021504426.tif 000017
（式中、フッ素は１８Ｆである。）
【請求項５】
式（Ｉｃ）によって表される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【化４】
2021504426.tif 000018
（式中、水素の１つまたは複数は３Ｈである。）
【請求項６】
アトロプ異性体（−）から本質的になる、請求項１から５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
検出可能な量の請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項８】
放射性トレーサーとして使用するための、請求項１から６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
Ｄ１様受容体の密度を定量化する方法に使用するための、請求項８に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１０】
インビボＰＥＴイメージングの方法に使用するための、請求項３に記載の式（Ｉａ）の化合物、または請求項４に記載の式（Ｉｂ）の化合物、または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ｄ１様受容体のオルソステリックアゴニストモジュレーターの標的結合のインビボＰＥＴイメージングおよび測定の方法に使用するための、請求項３に記載の式（Ｉａ）の化合物、または請求項４に記載の式（Ｉｂ）の化合物。
【請求項１２】
Ｄ１受容体に対するＤ１アロステリックモジュレーターの効果のインビボ定量化に使用するための、請求項３に記載の式（Ｉａ）の化合物または請求項４に記載の式（Ｉｂ）の化合物。
【請求項１３】
Ｄ１様受容体のオルソステリックアゴニストモジュレーターの標的結合をインビトロまたはエキソビボで測定するための、請求項５に記載の式（Ｉｃ）の化合物の使用。
【請求項１４】
Ｄ１受容体に対するＤ１アロステリックモジュレーターの効果をインビトロまたはエキソビボで定量化するための、請求項５に記載の式（Ｉｃ）の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射標識４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イル）誘導体および放射性トレーサーとしての、特にイメージング剤としてのそれらの使用に関する。
【０００２】
特に、本発明は、放射標識６−［２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル］−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン化合物、および放射性トレーサーとしての、特にイメージング剤としてのそれらの使用に関する。
【０００３】
さらに特に、本発明は、ＰＥＴイメージング剤としての放射標識６−［２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル］−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト脳のドーパミン作動性ニューロンは、脳の健康および機能において中心的な役割を果たす。ドーパミン作動性神経伝達は、運動、認知および報酬行動にとって重要である。５つのシナプス後ドーパミン作動性神経受容体が特定されている（Ｄ１〜Ｄ５）。
【０００５】
モノアミンドーパミンは、ＧＰＣＲの２つのファミリーを介して作用して、運動機能、報酬メカニズム、認知プロセスおよび他の生理学的機能を調節する。具体的には、ドーパミンは、主にＧｓ  Ｇタンパク質に結合し、それによってｃＡＭＰ産生を刺激するＤ１様（ドーパミンＤ１およびＤ５を含む）受容体、およびＧｉ／ｑ  Ｇタンパク質に結合し、ｃＡＭＰ産生を減衰させるＤ２様（Ｄ２、Ｄ３およびＤ４を含む）受容体を介してニューロンに作用する。これらの受容体は、様々な脳の領域で広く発現されている。
【０００６】
Ｓｔｏｃｃｈｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ２０１６，１７（１４），１８８９−１９０２；Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｐ．Ｆ．Ｂｒｏａｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２００１，５０（１１），９１２−９２４；ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍ．Ａ．ＡＤＨＤ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｊ  Ａｔｔｅｎ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２００８，１１（６），６２８−６４１に報告されるように、パーキンソン病、統合失調症、レストレスレッグス症候群およびＡＤＨＤのために、ドーパミン作動性受容体でのアンタゴニストおよびアゴニスト作用様式に基づく医薬品が開発されている。
【０００７】
しかしながら、一部のＧＰＣＲでは、サブタイプ間、例えばドーパミンＤ１とＤ５（Ｄ１様）またはＤ２とＤ３のリガンド結合部位の相同性が高いため、小分子を開発する、または十分な選択性を達成することが難しいことが判明しており、したがって既存の医薬品は副作用が完全にないわけではない。
【０００８】
過去１５年間にわたる、薬物開発における開発中止（ａｔｔｒｉｔｉｏｎ）を減少させるための多くの努力にもかかわらず、臨床試験に入る薬物が市場に届く可能性は依然として１０％未満である。開発中止は、腫瘍学およびＣＮＳ薬物開発、特に生物学についての理解が限られている新規な標的で最も高い。Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，Ｊ．ａｎｄ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＦＤＡ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｐａｔｈ  ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ２００８，５９，１−１２に示されるように、より迅速でより良い決定を可能にする信頼性の高いトランスレーショナルな評価ツールを開発することが明確に必要とされている。
【０００９】
生きているヒトの脳組織にアクセスすることは不可能であるため、ＣＮＳ創薬をサポートするこのようなトランスレーショナルなツールの開発は、とりわけインビボイメージングなどの非侵襲的技術に依存しなければならない。ここ数年、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングの使用が、ＣＮＳ創薬をサポートするために広く開発されてきた。
【００１０】
ＰＥＴは、サイクロトロンで生成される同位体に依存する正確で高度な技術である。陽電子放出放射性核種が、例えば注射によって導入され、標的組織に蓄積する。これが崩壊すると陽電子を放出し、陽電子が近くの電子と即座に結合して、２つの識別可能なガンマ線が反対方向に同時に放出される。これらがＰＥＴカメラによって検出され、その起源を正確に示す。ＰＥＴは非常に敏感な技術であるので、ＰＥＴトレーサーまたはＰＥＴイメージング剤またはＰＥＴリガンドと呼ばれる少量の放射標識化合物を要する。
【００１１】
ＰＥＴイメージングは、ほとんどの小分子薬物候補に存在する原子の放射性同位元素の取り込みに依存しているため、特に適している。これは、前臨床および臨床薬物開発の様々な段階での意思決定プロセスをサポートするための定量的情報を提供することができる。
【００１２】
例えば、ＰＥＴイメージングは、生きている対象の脳内薬物動態情報を提供することができる。薬物候補の直接放射標識を通して、健康な対象と罹患した対象の両方での血液脳関門（ＢＢＢ）浸透に関する情報を入手することができる。
【００１３】
薬物開発プログラムの標的となるタンパク質／受容体用の検証されたＰＥＴイメージング剤の開発は、ブロッキング試験を通して、薬物候補の標的占有率または結合を評価する機会も提供する。これらの試験は、標的占有率と投与用量の関係、ならびに標的占有率の動態などの重要な情報を提供し得る。臨床開発の第Ｉ相で得られた場合、このような情報は、第ＩＩ相ＰＯＣ試験に最も適切な用量範囲およびレジメンを選択するための意思決定となり得る。
【００１４】
ＰＥＴイメージング試験はまた、候補薬物の作用機序に関する洞察を提供し、患者の層別化、疾患進行の監視を可能にする、または薬理学の証拠として、もしくは第ＩＩ相ＰＯＣ試験の客観的エンドポイントとして使用することができる。
【００１５】
ＰＥＴイメージング剤の設計には、必ずしも薬物候補の特性と足並みのそろわない特定の特性を有する化合物が必要である。
【００１６】
化合物がＰＥＴイメージング剤として適切であるために必要とされる理想的な特性は、Ｚｈａｎｇ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ＣＮＳ  ＰＥＴ  ｌｉｇａｎｄｓ．ＥＪＮＭＭＩ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１６，１（１３），１−１２；Ｎｅｅｄ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｒａｉｎ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ２０１７，５（３），２６５−２７４；Ｐｉｋｅ，Ｖ．Ｗ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ＰＥＴ  ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｂｒａｉｎ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６，２３（１８），１８１８−１８６９；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｔｏ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ＰＥＴ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２Ａ  ＰＥＴ  ｌｉｇａｎｄ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１３，５６（１１），４５６８−４５７９に報告されている。しかしながら、これらの特性の適切な組み合わせは、多くの場合、達成が複雑である。
【００１７】
さらに、インビボイメージングを超えて、インビトロまたはエキソビボで、例えば動物組織のオートラジオグラフィーで使用することができる放射性トレーサーも、薬物開発の意思決定において同様に重要である。これらの試験は、１つまたは複数の疾患に関連する特定の受容体を調節する化合物の作用機序を理解する、または化合物薬理作用から得られる標的密度の変化を理解するのに役立つ。
【００１８】
Ｄ１様受容体は、多数の生理学的機能および行動プロセスに関与している。例えば、これらはシナプス可塑性、認知機能および目標指向運動機能だけでなく、報酬プロセスにも関与している。いくつかの生理学的／神経学的プロセスにおける役割のため、Ｄ１様受容体は、統合失調症の認知症状および陰性症状、古典的抗精神病療法に関連する認知障害、衝動性、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、パーキンソン病および関連する運動障害、ジストニア、ハンチントン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、加齢に伴う認知低下、軽度認知障害（ＭＣＩ）、薬物中毒睡眠障害およびアパシーを含む種々の障害に関与している。
Ｐｒａｎｔｅ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  ２０１３，５６（３−４），１３０−１４８に報告されているように、ドーパミン作動性神経受容体サブタイプのためにいくつかのＰＥＴイメージング剤が開発されている。
【００１９】
しかしながら、これらのＰＥＴイメージング剤は、特に脳の新皮質におけるＤ１様受容体の選択性の欠如、不適切な薬物動態特性、または血液脳関門を通過して定量的測定を損ない得る放射性代謝産物の生成などの一定の欠点を呈する。
【００２０】
これらのＰＥＴイメージング剤のほとんどはまた、アゴニストではなくアンタゴニストに基づいている。
【００２１】
したがって、オルソステリックＤ１モジュレーター、ならびに内因性Ｄ１リガンドであるドーパミンのレベルに感受性であるため、Ｄ１様受容体のオルソステリックアゴニストイメージング剤、特にＰＥＴイメージング剤を開発することが望ましい。これにより、その受容体部位を標的とする薬物の効果に関するより正確な試験が可能になり、疾患状態における受容体刺激の変化を決定することが可能になる。
【００２２】
近年、ドーパミン受容体、特にＤ１受容体の活性を調節し、Ｄ１媒介障害の治療に使用することができる非カテコール選択的Ｄ１様オルソステリックアゴニストまたはアロステリックモジュレーターを開発する新たな関心がある。
【００２３】
Ｄ１非カテコールオルソステリックリガンドは、例えば、番号、国際公開第２０１４／０７２８８１号パンフレットで公開された国際特許出願に記載されている。
【００２４】
Ｄ１様アロステリックモジュレーターは、例えば、番号、国際公開第２０１４／１９３７８１号パンフレットおよび番号、国際公開第２０１６／０５５４７９号パンフレットで公開された国際特許出願に記載されている。
【００２５】
この新たな関心を考えると、薬剤候補の開発をサポートする、または目的の病理学におけるＤ１受容体の役割を描写するために、選択的Ｄ１様イメージング剤、特にインビトロ、エキソビボまたはインビボ試験およびヒト臨床試験で使用され得るＤ１様ＰＥＴイメージング剤が必要である。
【発明の概要】
【００２６】
したがって、本発明の１つの目的は、Ｄ１様受容体の選択的アゴニストであり、放射性トレーサーとして、特にＰＥＴイメージング剤として有用である化合物を提供することである。
【００２７】
本発明による化合物を使用して、Ｄ１受容体の発現を画像化および定量化する方法を提供することも、本発明の目的である。
【００２８】
本発明の別の目的は、内因性または外因性リガンドの有無にかかわらず、脳組織内の利用可能なＤ１様受容体の密度のインビトロまたはエキソビボ検出および定量化のための方法であって、組織を本発明による放射標識化合物で処理することと、前記放射標識化合物の結合レベルを測定することとを含む方法を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、内因性または外因性リガンドの有無にかかわらず、脳内の利用可能なＤ１様受容体の密度のインビボ検出および定量化のための方法であって、有効量の本発明による放射標識化合物を対象に投与することと、関連関心領域中の前記放射標識化合物の脳取り込みレベルを測定することとを含む方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、脳組織内のＤ１受容体の利用可能性に対するＤ１  ＰＡＭの効果のインビトロまたはエキソビボ検出および定量化のための方法であって、組織をＤ１  ＰＡＭと組み合わせた本発明による放射標識化合物で処理することと、ＰＡＭの存在下での前記放射標識化合物の結合増加を検出することとを含む方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらに別の目的は、対象の脳内のＤ１受容体の利用可能性に対するＤ１  ＰＡＭの効果のインビボ検出および定量化のための方法であって、Ｄ１  ＰＡＭを投与することと組み合わせて、有効量の本発明による放射標識化合物を対象に投与することと、ベースライン条件と比較した、関連関心領域中の前記放射標識化合物の脳取り込みレベルの増加を検出することとを含む方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ここで以下に記載される式（Ｉ）の化合物を使用した細胞ベースのＤ１受容体機能アッセイの結果を示す図である。
【図２】ここで以下に記載される式（Ｉ）の放射標識化合物を使用したサルの脳インビボＰＥＴイメージングを示す図である。
【図３】Ｄ１  ＰＡＭの非存在下または存在下でのヒト組換えＤ１受容体に対する、ここで以下に記載される式（Ｉ）の放射標識化合物、および放射標識Ｄ１アンタゴニストによるインビトロ結合実験を示す図である。
【図４】Ｄ１  ＰＡＭの非存在下または存在下での、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）脳組織における式（Ｉ）の放射標識化合物を用いたオートラジオグラフィーエキソビボ結合実験を示す図である。
【図５】Ｄ１  ＰＡＭの有無にかかわらず式（Ｉ）の放射標識化合物の存在下、サルで実施されたインビボ脳ＰＥＴイメージング、および関連する標準化取り込み値（ＳＵＶ）時間放射能曲線を示す図である。
【図６】Ｄ１  ＰＡＭのインビボ投与後の脳の様々な領域における式（Ｉ）の放射標識化合物の増加した分布容積（ＶＴ）を示す増強プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、放射標識されている式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、
【化１】
2021504426.tif 000002
に関する。
【００３５】
特に、本発明は、水素の少なくとも１つが３Ｈである；または炭素の少なくとも１つが１１Ｃである；またはフッ素原子が１８Ｆである、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００３６】
一態様では、本発明は、以下で式（Ｉａ）の化合物と呼ばれる、炭素の１つが１１Ｃである、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩
【化２】
2021504426.tif 000003
に関する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、以下で式（Ｉｂ）の化合物と呼ばれる、フッ素が１８Ｆである、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩
【化３】
2021504426.tif 000004
に関する。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は、以下で式（Ｉｃ）の化合物と呼ばれる、水素の１つまたは複数が３Ｈである、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩
【化４】
2021504426.tif 000005
に関する。
【００３９】
特定の化合物に関して本明細書で使用される「放射標識」という用語は、放射性同位元素で標識されたことを意味する。
【００４０】
放射性同位元素とは、核が不安定で、α線、β線およびγ線の形態で放射線を自然放出することによって過剰なエネルギーを散逸する、質量の異なる化学元素のいくつかの種のいずれかである。本発明による放射性同位元素の具体例は、３Ｈ、１８Ｆおよび１１Ｃである。
【００４１】
本発明は、その範囲内に、上記の式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩を含む。医薬における使用のために、式（Ｉ）の化合物の塩は、薬学的に許容される塩である。しかしながら、他の塩は、本発明に使用する化合物またはその薬学的に許容される塩の調製において有用となり得る。薬学的に許容される塩の選択および調製の基礎となる標準的な原理は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，ｅｄ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ＆Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２に記載されている。
【００４２】
本発明に関して、１つまたは複数の化合物への言及は、特定の異性体形態が具体的に言及されない限り、その可能な異性体形態の各々の化合物およびその混合物を包含することを意図している。
【００４３】
特に、１つまたは複数の化合物への言及は、その可能なアトロプ異性体のそれぞれのその化合物を包含することを意図している。
【００４４】
アトロプ異性体は、単結合の周りの回転が妨げられているために生じる立体異性体であり、立体ひずみまたは他の原因によるエネルギー差が、個々の配座異性体の単離を可能にするのに十分に高い回転の障壁を作り出す（例えば、Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａｔｒｏｐｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｘｉａｌｌｙ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｂｉａｒｙｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（２００５）４４（３４）：５３８４−５４２７参照）。
【００４５】
アトロプ異性体は、一般的に異性体（＋）および（−）として特定され、それらの配置は、当業者に周知の方法に従って旋光計で化合物の旋光度［α］Ｄを測定することによって決定される。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、アトロプ異性体（＋）と（−）の５０：５０混合物である式（Ｉ）の放射標識化合物に関する。特定の実施形態では、本発明は、アトロプ異性体（−）から本質的になる式（Ｉ）の放射標識化合物に関する。
【００４７】
アトロプ異性体への言及による「から本質的になる」という用語は、アトロプ異性体が他のアトロプ異性体に対して少なくとも９５：５の比で存在することを意味する。
【００４８】
本発明による式（Ｉ）の放射標識化合物は、Ｄ１のオルソステリックアゴニストである。これらは、セロトニン５−ＨＴ２Ａ受容体にも結合する既存の放射標識Ｄ１トレーサーと比較して、Ｄ１様受容体に選択的であるため、特に有利である。
【００４９】
したがって、一実施形態では、本発明は、Ｄ１様受容体の選択的オルソステリックアゴニストである、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物に関する。
【００５０】
典型的には、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、少なくとも約８、好ましくは少なくとも約９のｐＫｉ値の形態で表されるＤ１様受容体に対する親和性を有する。これは、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物が、これらの受容体に対して低ナノモル濃度の範囲の親和性を有することを意味する。具体的な値は実験節で提供する。
【００５１】
式（Ｉ）の非放射標識化合物で得られるｐＫｉの値は、対応する放射標識化合物に転置可能であることが、当業者に理解されるだろう。
【００５２】
競合的放射性リガンド結合アッセイを実施して、Ｄ１受容体に対する式（Ｉ）の化合物の親和性を測定し、８０種の関連および非関連生物学的標的の大きなパネルに関する選択性を評価した。式（Ｉ）の化合物が、ナノモル濃度以下の範囲の親和性でＤ１およびＤ５受容体（以下、「Ｄ１様受容体」と呼ぶ）に結合し、他の試験した標的のいずれにも有意に結合しないことが示された。
【００５３】
さらに、図１に示されるように、実験節でさらに詳述されるように、Ｄ１細胞ベースの機能アッセイにおける式（Ｉ）の化合物の活性および効力を実施し、Ｄ１受容体の内因性アゴニストリガンドであるドーパミンと比較した。このアッセイでは、ドーパミンによるように、式（Ｉ）の化合物によりインビトロでＤ１受容体が活性化されることが示された。さらに、本発明による化合物は、内因性リガンドのドーパミンと比較して、優れた効力（少なくとも８のｐＥＣ５０値）を示す。具体的な値および条件については、実験節でさらに詳述する。
【００５４】
上記および実験節で述べた証拠は、式（Ｉ）の放射標識化合物がＤ１様受容体の選択的アゴニストリガンドであるという事実を支持している。
【００５５】
これにより、本明細書に記載される式（Ｉ）の放射標識化合物が、単独で、またはＤ１媒介疾患を治療するために開発されたＤ１オルソステリックもしくはアロステリックモジュレーターと組み合わせて、ＰＥＴイメージング試験における使用に特に適したものとなる。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、インビトロまたはエキソビボ試験について本明細書に記載される式（Ｉ）の放射標識化合物の使用に関する。
【００５７】
この実施形態による特定の態様では、本発明は、インビトロまたはエキソビボ試験における式（Ｉｃ）の化合物の使用に関する。
【００５８】
本発明はまた、脳内のＤ１受容体の発現を検出する方法であって、検出可能な量の本明細書に記載される式（Ｉ）の放射標識化合物をインビトロまたはエキソビボインキュベーションすることと、前記放射標識化合物を検出することとを含む方法に関する。
【００５９】
このような方法は、Ｄ１受容体が役割を果たす疾患における利用可能なＤ１受容体の密度の定量化を可能にする。
【００６０】
図４のグラフは、式（Ｉｃ）の化合物が、脳組織の線条体領域に見られる高レベルのＤ１受容体発現と一致して尾状核被殻に有意に結合することを示している。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、インビボＰＥＴイメージング試験に使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。この実施形態の一態様では、本発明は、インビボＰＥＴイメージング試験に使用するための式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物に関する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、インビボＰＥＴイメージングに使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。
【００６３】
図２は、カニクイザルで式（Ｉａ）の化合物を使用して実施されたＰＥＴイメージングを示しており、報告される脳内のＤ１様受容体の分布と一致した取り込みパターンを実証している。
【００６４】
この実施形態の特定の態様では、本発明は、Ｄ１媒介障害のインビボ診断方法に使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。
【００６５】
この実施形態の別の特定の態様では、本発明は、Ｄ１受容体が役割を果たす疾患における利用可能なＤ１受容体の密度のインビボ定量化の方法に使用するための、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物に関する。
【００６６】
本発明はまた、その範囲内に、Ｄ１受容体によって媒介される神経障害のインビボイメージングおよび検出の方法であって、検出可能な量の本明細書に記載される式（Ｉ）の放射標識化合物またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することと、Ｄ１受容体と結合した放射標識化合物を検出することとを含む方法を包含する。
【００６７】
いくつかのインビボ試験が、式（Ｉ）の放射標識化合物、特に式（Ｉａ）の化合物を使用して実施され、血液脳関門を通過し、したがってインビボＰＥＴイメージング試験におけるＤ１受容体の密度の定量化に影響を及ぼし得る関連する親油性代謝産物がないことを示している。
【００６８】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｄ１オルソステリックリガンドの標的結合をインビトロまたはエキソビボで定量化するための式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００６９】
本発明はさらに、Ｄ１受容体の内因性または外因性オルソステリックリガンドの標的結合を測定するインビトロまたはエキソビボ方法に関する。
【００７０】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｄ１様受容体のオルソステリックアゴニストの標的結合をインビボで画像化および測定する方法に使用するための、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物に関する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、Ｄ１様受容体のオルソステリックアゴニストの標的結合をインビボで画像化および測定する方法に使用するための式（ＩａまたはＩｂ）の化合物に関する。
【００７１】
本明細書で使用される「標的結合」という用語は、オルソステリックまたはアロステリックでその意図されたタンパク質標的（Ｄ１様受容体）と相互作用し、下流生物学的イベントを誘発する内因性または外因性分子を意味する。
【００７２】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載される式（Ｉ）のいくつかの放射標識化合物が、インビトロ、エキソビボおよびインビボでＤ１受容体の正のアロステリックモジュレーターである化合物の効果を定量化するのに適していることを発見した。
【００７３】
「アロステリックモジュレーター」という用語は、オルソステリック天然アゴニストとは異なる標的部位に結合するが、ＧＰＣＲのコンフォメーション変化を誘導し、それによって受容体機能をアロステリックに調節する化合物を意味する。
【００７４】
正のアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）は、内因性リガンドの活性または外因性オルソステリックアゴニストの活性を増強する。
【００７５】
Ｄ１  ＰＡＭは、内因性／外因性リガンドのオルソステリック部位とは異なる結合部位からＤ１受容体に作用するので、例えば、Ｄ１媒介性疾患に対する望ましい治療効果を得るために必要となるＤ１  ＰＡＭ化合物の有効用量を最適化することができるようにするために、Ｄ１受容体に対するこれらの化合物の実際の効果を定量化する方法を有することが望ましい。
【００７６】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、Ｄ１受容体に対するＤ１  ＰＡＭの効果のインビトロまたはエキソビボ定量化のための、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００７７】
この実施形態の一態様では、本発明は、Ｄ１受容体に対するＤ１  ＰＡＭの効果のインビトロ定量化における式（Ｉｃ）の化合物の使用に関する。図３に示されるように、Ｄ１  ＰＡＭ化合物は式（Ｉｃ）の化合物の結合特性を有意に改善した。
【００７８】
この実施形態の一態様では、本発明は、Ｄ１受容体に対するＤ１  ＰＡＭの効果のエキソビボ定量化における式（Ｉｃ）の化合物の使用に関する。特に、本発明は、Ｄ１受容体に対するＤ１  ＰＡＭの効果のオートラジオグラフィー定量化における式（Ｉｃ）の化合物の使用に関する。
【００７９】
図４は、オートラジオグラフィーにより、Ｄ１  ＰＡＭ化合物の存在下で、ＮＨＰ脳切片で測定された化合物（−）−Ｉｃの特異的結合が有意に増加することを示している。
【００８０】
したがって、本発明はまた、その範囲内に、Ｄ１様受容体発現およびＤ１受容体を発現する細胞株または脳組織におけるＤ１アロステリックモジュレーターの効果のインビトロまたはオートラジオグラフィー検出および定量化のための方法を包含する。
【００８１】
インビトロ放射性リガンド結合またはオートラジオグラフィー法は、生体試料をＤ１様もしくはＤ１オルソステリックまたはアロステリックリガンドの存在下または非存在下で本発明による放射標識化合物で処理することと、得られた結合した本発明の放射標識化合物を測定することによって、Ｄ１様受容体発現またはアロステリックモジュレーター効果を定量化することとを含む。
【００８２】
別の特定の実施形態では、本発明は、Ｄ１受容体に対するＤ１  ＰＡＭの効果のインビボ定量化に使用するための式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物に関する。
【００８３】
したがって、本発明はまた、その範囲内に、Ｄ１様受容体発現およびＤ１アロステリックモジュレーターの効果のインビボ検出および定量化に使用するための式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物を包含する。
【００８４】
特定の実施形態では、本発明は、Ｄ１様受容体発現およびＤ１アロステリックモジュレーターの効果のインビボ検出および定量化に使用するための式（Ｉｂ）の化合物に関する。
【００８５】
図５に示されるように、Ｄ１  ＰＡＭ化合物は、式（Ｉｂ）の化合物、特に式（−）−（Ｉｂ）の化合物の結合特性を有意に改善した。このようなＤ１  ＰＡＭの増強効果を図６に示す。
【００８６】
本明細書で「対象」について言及する場合、それは、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヒトまたは非ヒト霊長類、鳥類または両生類を指すことを意図している。好ましくは、マウス、ヒトまたは非ヒト霊長類、またはヒトが言及される。
【００８７】
イメージング試験、特にインビボＰＥＴイメージング試験のために、式（Ｉ）の放射標識化合物またはそれらの薬学的に許容される塩は、医薬組成物の形態で投与され得る。
【００８８】
したがって、本発明の別の実施形態は、検出可能な量の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物に関する。
【００８９】
本明細書で使用される「検出可能な量」という用語は、選択された検出方法によって検出するのに必要な化合物の量を意味する。一般に、このような検出可能な量は、使用される化合物および検出方法に基づいて当業者によって決定されるだろう。
【００９０】
したがって、本発明はまた、その範囲内に、Ｄ１媒介障害のインビボ診断に使用するための、式（Ｉ）の化合物およびそれらの医薬組成物を包含する。
【００９１】
本明細書に記載される式（Ｉ）の放射標識化合物は、実験節でさらに詳述される方法に従って調製した。
【００９２】
式（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物は、以下で中間体ａ１３と呼ばれる、化合物２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタート
【化５】
2021504426.tif 000006
からの多段階合成を通して調製した。反応条件については、実験節でさらに詳述する。
【００９３】
式（Ｉｃ）の化合物は、当業者に知られており、実験節において以下でさらに詳述される方法に従って、Ｋｅｒｒの触媒の存在下で、化合物６−［２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル］−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ）をトリチウム標識することによって調製される。
【００９４】
実験節
Ｉ．式（Ｉ）の化合物の合成
ａ．略語／再現試薬
Ａｃ：アセチル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ブライン：飽和塩化ナトリウム水溶液
Ｂｚ：ベンゾイル
ｃＡＭＰ：環状アデノシン一リン酸
ＤＡＳＴ：ジエチルアミノ硫黄トリフルオリド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＥＡ：ジエチルアミン
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ｄｐｐｆ：１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン
ｐＥＣ５０：最大応答の５０％を生成する濃度
Ｅｒｅｌ：相対的有効性
ＥＳ＋：エレクトロスプレー陽イオン化
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化
Ｅｔ：エチル
ＥｔＯＨ：エタノール
Ｅｔ２Ｏ：ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ｈ：時間
（ｈ）Ｄ１Ｒ：ヒトドーパミンＤ１受容体
（ｈ）Ｄ５Ｒ：（ヒト）ドーパミンＤ５受容体
ＨＥＫ：ヒト胎児腎細胞
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィー
ＨＴＲＦ：均一時間分解蛍光
ＬＣ：液体クロマトグラフィー
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析
ＬＤＡ：リチウムジイソプロピルアミド
ＭｅＯＨ：メタノール
ｍｉｎ．：分
ＮＨＰ：非ヒト霊長類
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＰＡＭ：正のアロステリックモジュレーター
ｉＰｒＯＨ：イソプロパノール
ｒｔ：室温
ＲＶ：反応容器
ＳＥＭ：２−（トリメチルシリル）エトキシメチル
ＳＦＣ：超臨界流体クロマトグラフィー
ＳＰＥ：固相抽出
ＳＵＶ：標準化取り込み値
ＴＡＣ：時間放射能曲線
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＷＦＩ：注射用水
【００９５】
ｂ．分析方法
空気または水分に敏感な試薬を含む全ての反応は、乾燥溶媒およびガラス器具を使用して、窒素またはアルゴン雰囲気下で実施した。マイクロ波照射を必要とする実験は、オペレーティングソフトウェアのバージョン２．０でアップグレードされたＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  Ｓｉｘｔｙ電子レンジで実施する。実験は可能な限り速く必要な温度に到達するよう実行する（最大照射電力：４００Ｗ、外部冷却なし）。市販の溶媒および試薬は一般に、さらに精製することなく使用し、適切な場合は無水溶媒（一般的にはＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ製のＳｕｒｅ−Ｓｅａｌ（商標）製品またはＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ製のＡｃｒｏＳｅａｌ（商標））を含む。一般に、反応を薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたは質量分析によって監視した。
【００９６】
ｉ）ＨＰＬＣ分析は以下の通り実施する：
方法Ａ：酸性
ＨＰＬＣ分析は、ＬＣ−２０１０  ＣＨＴモジュール、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａフォトダイオードアレイ検出器（２１０〜４００ｎｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムで、カラムＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ−１８（１５０×４．６）ｍｍ  ３μを使用して実施する。勾配溶出は、５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液＋０．１％ギ酸（Ａ相）、およびアセトニトリル＋５％溶媒Ａ＋０．１％ギ酸（Ｂ相）で行い、勾配８．０分で５〜９５％Ｂを１３．０分まで保持し、１５．０分で５％Ｂを１８．０分まで保持する。ＨＰＬＣ流量：１．０ｍＬ／分、注入量：１０μＬ。
【００９７】
方法Ｂ：塩基性
ＨＰＬＣ分析は、ＬＣ−２０１０  ＣＨＴモジュール、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａフォトダイオードアレイ検出器（２１０〜４００ｎｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムで、カラムＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ−１８（１５０×４．６）ｍｍ  ３μを使用して実施する。勾配溶出は、５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液＋０．１％アンモニア（Ａ相）、およびアセトニトリル＋５％溶媒Ａ＋０．１％アンモニア（Ｂ相）で行い、勾配８．０分で５〜９５％を１３．０分まで保持し、１５．０分で５％Ｂを１８．０分まで保持する。ＨＰＬＣ流量。
【００９８】
異なる分析条件を使用する場合、ＬＣデータについて異なる保持時間（ＲＴ）が得られる可能性があることは、当業者に明らかであるだろう。
【００９９】
ｉｉ）ＬＣＭＳモードでの質量分析測定は以下の通り実施する：
方法Ａ：酸性
Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ２０１０ＥＶシングル四重極質量分析計を、ＬＣ−ＭＳ分析に使用する。この分光計は、ＥＳＩ源およびＬＣ−２０ＡＤバイナリグラジエントポンプ、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａフォトダイオードアレイ検出器（２１０〜４００ｎｍ）を備えている。データを、ポジティブモードおよびネガティブモードでｍ／ｚ  ７０〜１２００のフルＭＳスキャンで取得する。逆相分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ  １８（３０×２．１）ｍｍ  ２．５μカラムを使用して行う。勾配溶出は、５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液＋０．１％ギ酸（Ａ相）、およびアセトニトリル＋５％溶媒Ａ＋０．１％ギ酸（Ｂ相）で行い、勾配４．０分で５〜９５％Ｂを５．０分まで保持し、５．１分で５％Ｂを６．５分まで保持する。ＨＰＬＣ流量：１．０ｍＬ／分、注入量：５μＬ。
【０１００】
ＭＳパラメータ：検出器電圧１．５ｋＶ。ソースブロック温度２００℃。脱溶媒温度２４０℃。噴霧ガス流量１．２Ｌ／分（窒素）。データを、ポジティブモードおよびネガティブモードでｍ／ｚ  ７０〜１２００のフルＭＳスキャンで取得する。
【０１０１】
方法Ｂ：塩基性
Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ２０１０ＥＶシングル四重極質量分析計を、ＬＣ−ＭＳ分析に使用する。この分光計は、ＥＳＩ源およびＬＣ−２０ＡＤバイナリグラジエントポンプ、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａフォトダイオードアレイ検出器（２１０〜４００ｎｍ）を備えている。データを、ポジティブモードおよびネガティブモードでｍ／ｚ  ７０〜１２００のフルＭＳスキャンで取得する。逆相分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（３０×２．１）ｍｍ  ２．５μカラムを使用して行う。勾配溶出は、５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液＋０．１％アンモニア（溶媒Ａ）、またはアセトニトリル＋５％溶媒Ａ＋０．１％アンモニア（溶媒Ｂ）で行い、勾配４．０分で５〜９５％Ｂを５．０分まで保持し、５．１分で５％Ｂを６．５分まで保持する。ＨＰＬＣ流量：１．０ｍＬ／分、注入量：５μＬ。
【０１０２】
ＭＳパラメータ：検出器電圧１．５ｋＶ。ソースブロック温度２００℃。脱溶媒温度２４０℃。噴霧ガス流量１．２Ｌ／分（窒素）。データを、ポジティブモードおよびネガティブモードでｍ／ｚ  ７０〜１２００のフルＭＳスキャンで取得する。
【０１０３】
ＮＭＲスペクトルは、オペレーティングシステムＲｅｄｈａｔ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｌｉｎｕｘ（Ｌｉｎｕｘは登録商標）  ５．１．および５ｍｍ逆１Ｈ／１３Ｃプローブヘッドを備えたＬｉｎｕｘ（Ｌｉｎｕｘは登録商標）  ３．２ソフトウェアを搭載したＶａｒｉａｎ  ＭＲ  ４００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計、またはオペレーティングシステムＲｅｄｈａｔ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｌｉｎｕｘ（Ｌｉｎｕｘは登録商標）  ６．３および５ｍｍ逆１Ｈ／１３Ｃ／１９Ｆトリプルプローブヘッドを備えたＬｉｎｕｘ（Ｌｉｎｕｘは登録商標）  ３．２ソフトウェアを搭載したＶａｒｉａｎ  ＶＮＭＲ  ４００ＭＨｚ  ＮＭＲで記録する。化合物を、ＤＭＳＯ−ｄ６、ＣＤＣｌ３、ＭｅＯＤおよびＤ２Ｏなどの重水素化溶媒中で、プローブ温度３００Ｋおよび濃度約４〜５ｍｇ／ｍＬで試験する。機器を使用した重水素化溶媒の重水素シグナルでロックする。化学シフトを、内部標準として使用されるＴＭＳ（テトラメチルシラン）からのｐｐｍ低磁場で示す。
【０１０４】
旋光度（［α］Ｄ）は、キュベット（ｌ＝１ｄｍ）内でＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ偏光計３４１で、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、具体例に記載される温度で、５８９ｎｍ（ナトリウムランプ）で測定した。
【０１０５】
ｉｉｉ）分取精製は、酸性、塩基性および中性条件で以下のシステムを使用して実施する：
システムＡ．Ｗａｔｅｒｓ分取ＨＰＬＣシステム：
２９９８  ＰＤＡ検出器を備えたバイナリポンプ２５４５モジュールを備え、２７６７サンプルマネージャーで構成されるＷａｔｅｒｓ分取ＨＰＬＣ。Ｗａｔｅｒｓ  ３１００シングル４重極検出器が、検出および収集トリガーに使用される。
【０１０６】
Ｓｈｉｍａｄｚｕ分取ＨＰＬＣは、手動注入および手動画分収集を備えたバイナリＬＣ８ＡポンプおよびＳＰＤ  Ｍ２０Ａ  ＰＤＡ検出器からなる。
【０１０７】
上記の２つのシステムでは、以下のカラムを使用して精製が行われる：
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃ１８、（１００×３０）ｍｍ、４μ
ＹＭＣ  ＯＤＳ（５００×３０）ｍｍ  １０μ。
ＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ（２５０×３０）ｍｍ  １０μ。
【０１０８】
システムＢ．ＳＦＣでの精製
２５４５共溶媒ポンプおよびＣｏ２ポンプ、カラムオーブン、２７６７オートサンプラーおよびフラクションコレクター、システムの圧力を維持するためのＡＢＰＲ、２９９８  ＰＤＡ検出器で構成されるＴｈａｒ  ＳＦＣ  １００分取システム。システムはＭａｓｓｌｙｎｘ  Ｖ４．１ソフトウェアによって制御される。ＳＦＣのカラムは、以下に列挙されるものから選択される：
Ｖｉｒｄｉｓ、２−エチルピリジン（２５０×３０）ｍｍ、５μ
Ｖｉｒｄｉｓ、ＣＳＨ  Ｆｌｕｒｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（２５０×３０）ｍｍ、５μ
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｈｉｌｉｃ（２５０×３０）ｍｍ、５μ
ＹＭＣ、シアノ（２５０×１９）ｍｍ、５μ
ＹＭＣ、ジオール（２５０×３０）ｍｍ、１０μ
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ（２５０×３０）ｍｍ、５μ
【０１０９】
Ｃ．  中間体の合成
Ｃ．１．  ６−ブロモ−１，５−ジメチル−３−（２−トリメチルシリルエトキシメチル）ピリミジン−２，４−ジオンａ１の合成
【化６】
2021504426.tif 000007
【０１１０】
ａ１は、番号、国際公開第２０１４／０７２８８１号パンフレットで公開された国際特許出願に開示されており、ここに記載されている方法に従って調製される。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．２１（ｓ，２Ｈ），３．５６（ｔ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，２Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，２Ｈ），−０．０４（ｓ，９Ｈ）。
【０１１１】
Ｃ．２．６−ヨード−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ６の合成
【化７】
2021504426.tif 000008
【０１１２】
Ｃ．２．１．  ５−メチルピリミジン−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−トリオンａ３の合成
ＭｅＯＨ（５００ｍＬ）中のＮａ（３．１８ｇ、１３７ｍｍｏｌ）の溶液に、尿素（８．２８ｇ、１３７ｍｍｏｌ）を添加し、引き続いてジエチル２−メチルプロパンジオアートａ２（２０．０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１６時間加熱還流した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をＨＣｌの２Ｎ水溶液でｐＨ３に酸性化し、次いで、−１０℃で冷却し、同じ温度で３時間撹拌した。反応混合物を濾過し、冷水（５０ｍＬ）、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）およびヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄した。得られた粗生成物を真空下で乾燥させて、５−メチルピリミジン−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−トリオンａ３を１５ｇ、白色固体として得た。
収率（粗）：９２％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：１４３（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．０７（ｓ，２Ｈ），３．６３（ｑ，Ｊ＝６．８０Ｈｚ，１Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．８０Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１１３】
Ｃ．２．２．  ２，４，６−トリクロロ−５−メチルピリミジンａ４の合成
ＰＯＣｌ３（１５８ｇ、１０３５ｍｍｏｌ）中の５−メチルピリミジン−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−トリオンａ３（１５．０ｇ、１０５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ３ＰＯ４（２ｍＬ）を添加し、反応混合物１００℃で４５分間加熱した。反応の進行をＴＬＣで監視した。完了後、反応混合物を氷に注ぎ入れ、濾過し、真空下で乾燥させて、粗２，４，６−トリクロロ−５−メチルピリミジンａ４を８ｇ、白色固体として得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
【０１１４】
Ｃ．２．３．  ６−クロロ−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ５の合成
粗２，４，６−トリクロロ−５−メチルピリミジンａ４（８．００ｇ、４０．８ｍｍｏｌ）のＮａＯＨの１０％水溶液（７５ｍＬ）中撹拌溶液を１．５時間加熱還流した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物をＨＣｌの２Ｎ水溶液でｐＨ２に酸性化し、濾過し、真空下で乾燥させて、６−クロロ−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ５を４．８ｇ、白色固体として得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
収率（粗）：２１％
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．７８（ｓ，１Ｈ），１１．２９（ｓ，１Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ）。
【０１１５】
Ｃ．２．４．  ６−ヨード−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ６の合成
６−クロロ−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ５（４．８０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびＮａＩ（２３．４ｇ、１５０ｍｍｏｌ）のＨＩ（６０ｍＬ）中撹拌溶液を、密封管内、室温で６６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を濾過し、冷水（５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、６−ヨード−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ６を２．１ｇ得て、これを褐色固体として単離し、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：２５３（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．２１（ｓ，１Ｈ），１．９０（ｓ，３Ｈ）。
【０１１６】
Ｃ．３．  ５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジルアセタートａ１２の合成
ａ１２を、国際特許出願、国際公開第２０１４／０７２８８１号パンフレットに記載されている手順と同様の手順に従って、以下に具体的に示されるように、多段階合成を介して化合物ａ７から調製した。
【化８】
2021504426.tif 000009
【０１１７】
Ｃ．３．１．  ４−（４−ブロモ−３−メチルフェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ８の合成
ＤＭＳＯ（３００ｍＬ）中の４−クロロフロ［３，２−ｃ］ピリジンａ７（１２ｇ、７８．１ｍｍｏｌ）および４−ブロモ−３−メチルフェノール（１７．５ｇ、９３．７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（６３．４ｇ、１９５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１２５℃で１６時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を氷上に注ぎ、濾過した。残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解し、ブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。得られた粗生成物を、ペンタン中１％Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）による研和によって精製して、４−（４−ブロモ−３−メチルフェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ８を１２．６ｇ、ベージュ色固体として得た。
収率：５３％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：３０４（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１４（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝１．２０Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），７．０４−６．９８（ｍ，１Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ）。
【０１１８】
Ｃ．３．２．  ４−（４−ブロモ−３−（ブロモメチル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ９の合成
ＣＣｌ４（２５０ｍＬ）中の４−（４−ブロモ−３−メチルフェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ８（１２．５ｇ、４１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮＢＳ（８．０５ｇ、４５．２ｍｍｏｌ）およびＢｚ２Ｏ２（１．９９ｇ、８．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を８０℃で１２時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）で希釈した。有機層をＮａＯＨの１Ｎ水溶液（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮して、４−（４−ブロモ−３−（ブロモメチル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ９  ２２ｇを褐色半固体として得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：２８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１９】
Ｃ．３．３．  （２−ブロモ−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）メタノールａ１０の合成
ＤＭＦ（８０ｍＬ）中の４−（４−ブロモ−３−（ブロモメチル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ９（２２．０ｇ、５７．４ｍｍｏｌ）溶液に、ＮａＯＡｃ（２３．０ｇ、２８７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃で３時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で希釈した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解し、引き続いてＮａＯＨの１Ｎ水溶液（２０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣を水（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、（２−ブロモ−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）メタノールａ１０を３．５ｇ、白色固体として得た。
収率：１９％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：３２０（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１４（ｄ，Ｊ＝２．４０Ｈｚ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝２．８０Ｈｚ，１Ｈ），７．１２−７．０８（ｍ，２Ｈ），５．５１（ｔ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１２０】
Ｃ．３．４．  ２−ブロモ−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１１の合成
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の（２−ブロモ−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）メタノールａ１０（３．５０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（２．６０ｇ、３３．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、反応混合物を同じ温度で１０分間撹拌した。塩化アセチル（１．７３ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）を０℃で滴加し、反応混合物を１００℃で１６時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液で中和し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で連続的に洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中２〜５％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、２−ブロモ−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１１を４ｇ、無色液体として得た。
収率：９８％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：３６２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１４（ｄ，Ｊ＝２．００Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，１Ｈ），７．４９−７．４５（ｍ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝２．８０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−７．１７（ｍ，１Ｈ），７．１４−７．１１（ｍ，１Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ）。
【０１２１】
Ｃ．３．５．  ５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジルアセタートａ１２の合成
ジオキサン（５０ｍＬ）中の２−ブロモ−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１１（４ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）および４，４，５，５−テトラメチル−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，３，２−ジオキサボロラン（３．６６ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＫＯＡｃ（３．２６ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴンで３０分間パージし、次いで、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）．ＤＣＭ（２．７０ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を再びアルゴンで５分間パージした。反応混合物を１１０℃で１６時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液を真空下で濃縮した。残渣を、ヘキサン中１０〜１２％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジルアセタートａ１２を４．１ｇ得て、これを灰白色固体として単離した。
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：４１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２２】
Ｃ．４．  ２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１３、ａ１３＿アトロプ異性体＿１およびａ１３＿アトロプ異性体＿２の合成
【化９】
2021504426.tif 000010
ジオキサン（９ｍＬ）および水（１ｍＬ）中の５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジルアセタートａ１２（２００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）および６−ブロモ−１，５−ジメチル−３−（２−トリメチルシリルエトキシメチル）ピリミジン−２，４−ジオンａ１（１３０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１６０ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴンで３０分間パージした。ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）．ＤＣＭ（９０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を再びアルゴンで５分間パージした。反応混合物をマイクロ波照射下、１２０℃で２時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。１３×０．２０ｇで反応を繰り返し、１４の反応の粗混合物を合わせた。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過し、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中２０〜４０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１３を８２７ｍｇ、アトロプ異性体（＋）と（−）のラセミ混合物である白色固体として得た。
収率：３１％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：４９４（Ｍ＋Ｈ−ＳｉＭｅ３）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１８（ｄ，Ｊ＝１．９６Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄｄ，Ｊ＝５．８７，０．９８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｓ，１Ｈ），７．４４（ｓ，２Ｈ），７．１４−７．１２（ｍ，１Ｈ），５．７６（ｓ，２Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），３．６８−３．５９（ｍ，２Ｈ），２．９７（ｓ，３Ｈ），１．９５（ｓ，３Ｈ），１．５５（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．０９Ｈｚ，２Ｈ），−０．０１（ｓ，９Ｈ）。
【０１２３】
ラセミ体２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１３  ５００ｍｇのキラル分離（ＬＣ、ＹＭＣ  Ｃｈｉｒａｌａｒｔ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ＳＣ、２５０＊４．６ｍｍ、１ｍＬ／分、２５２ｎｍ、２５℃、溶離液：５０％ｎ−ヘキサン（＋０．１％ＤＥＡ）、５０％ｉＰｒＯＨ）によって、
−  白色固体としての２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタート（ａ１３＿アトロプ異性体１）１５１ｍｇ。
収率：３０％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：４９４（Ｍ＋Ｈ−ＳｉＭｅ３）＋。
キラル分析（ＬＣ、ＹＭＣ  Ｃｈｉｒａｌａｒｔ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ＳＣ、２５０＊４．６ｍｍ、１ｍＬ／分、２５２ｎｍ、溶離液：５０％ｎ−ヘキサン（＋０．１％ＤＥＡ）、５０％ｉＰｒＯＨ）ＲＴ  ２８．９３分、９８．５％ｅｅ。
−  白色固体としての２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタート（ａ１３＿アトロプ異性体２）１５２ｍｇ。
収率：３０％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：４９４（Ｍ＋Ｈ−ＳｉＭｅ３）＋。
キラル分析（ＬＣ、ＹＭＣ  Ｃｈｉｒａｌａｒｔ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ＳＣ、２５０＊４．６ｍｍ、１ｍＬ／分、２５２ｎｍ、溶離液：５０％ｎ−ヘキサン（＋０．１％ＤＥＡ）、５０％ｉＰｒＯＨ）ＲＴ  ３１．２８分、９２．５％ｅｅ。
【０１２４】
それぞれのアトロプ異性体の特定の配置（＋）または（−）を、この段階では割り当てなかった。
【０１２５】
Ｄ．  式（Ｉ）の化合物の合成
Ｄ．１．  ６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（＋）−（Ｉ）および（−）−（Ｉ）の合成。
【化１０】
2021504426.tif 000011
Ｄ．１．１．  ６−（４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル））エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１４＿アトロプ異性体１およびａ１４＿アトロプ異性体２の合成
ＴＨＦ（７．７１ｍＬ）および水（８６０μＬ）中の２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１３＿アトロプ異性体１（１５１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＨ（５０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を真空下で濃縮した。残渣を水（１５ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮して、６−（４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１４＿アトロプ異性体１を１２４ｍｇ、淡褐色液体として得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
収率（粗）：９０％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：５１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２６】
６−（４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１４＿アトロプ異性体２
化合物ａ１４＿アトロプ異性体２は、２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１３＿アトロプ異性体１を出発物質として使用して同じ方法により合成することができる。
収率（粗）：９３％。
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：５１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２７】
それぞれのアトロプ異性体の特定の配置（＋）または（−）を、この段階では割り当てなかった。
【０１２８】
Ｄ．１．２．  ６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１５＿アトロプ異性体１およびａ１５＿アトロプ異性体２の合成
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の６−（４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１４＿アトロプ異性体１（０．１３ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＤＡＳＴ（０．２０ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（２ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を水（１０ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）で連続的に洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中２０〜３０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１５＿アトロプ異性体１を７４ｍｇ、灰白色固体として得た。
収率：５９％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：５１２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１８（ｄ，Ｊ＝２．４５Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５８−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｓ，２Ｈ），７．１６−７．１２（ｍ，１Ｈ），５．３９（ｄ，Ｊ＝２．４５Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），５．２７（ｓ，１Ｈ），３．６９−３．６２（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ），１．５４（ｓ，３Ｈ），０．９２−０．８４（ｍ，２Ｈ），０．０３（ｓ，９Ｈ）。
【０１２９】
６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１５＿アトロプ異性体２
化合物ａ１５＿アトロプ異性体２は、６−（４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１４＿アトロプ異性体２を出発物質として使用して同じ方法により合成することができる。
収率：５８％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：５１２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１８（ｄ，Ｊ＝２．４５Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５８−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｓ，２Ｈ），７．１６−７．１２（ｍ，１Ｈ），５．３９（ｄ，Ｊ＝２．４５Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），５．２７（ｓ，１Ｈ），３．６９−３．６２（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ），１．５４（ｓ，３Ｈ），０．９２−０．８４（ｍ，２Ｈ），０．０３（ｓ，９Ｈ）。
【０１３０】
それぞれのアトロプ異性体の特定の配置（＋）または（−）を、この段階では割り当てなかった。
【０１３１】
Ｄ．１．３．  ６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（＋）−（Ｉ）および（−）−（Ｉ）の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１５＿アトロプ異性体１（０．０７ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）および２５％アンモニア水溶液（１ｍＬ）に溶解した。反応混合物を３０分間撹拌し、次いで、濾過し、冷水（２ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させた。残渣をＤＣＭ：ペンタン（１：４、２．５ｍＬ）による研和によって精製し、真空下で乾燥させて、６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンのアトロプ異性体（＋）（＋）−（Ｉ）２０ｍｇを灰白色固体として得た。
収率：３６％
ＨＰＬＣ純度：９７．５％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：３８２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４８（ｓ，１Ｈ），８．１６−８．１９（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５６−７．５２（ｍ，２Ｈ），７．４９−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１．４７Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｄ，Ｊ＝３．４２Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｄ，Ｊ＝２．９３Ｈｚ，１Ｈ），２．８６（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，３Ｈ）。
［α］Ｄ（ＭｅＯＨ，３０°Ｃ）＝＋１４．７
【０１３２】
６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ）アトロプ異性体（−）、（（−）−Ｉ）
化合物（−）−Ｉは、６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１５＿アトロプ異性体２を出発物質として使用して同じ方法により合成することができる。
ＨＰＬＣ純度：９９．８％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：３８２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４８（ｓ，１Ｈ），８．１９−８．１６（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５６−７．５２（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｂｒｓ，２Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１．４７Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｄ，Ｊ＝３．４２Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｄ，Ｊ＝２．９３Ｈｚ，１Ｈ），２．８６（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，３Ｈ）。
［α］Ｄ（ＭｅＯＨ，３０°Ｃ）＝−８．３
【０１３３】
Ｄ．２．  ［１１Ｃ］−６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉａ）のアトロプ異性体（−）、（−）−（Ｉａ）の合成
【化１１】
2021504426.tif 000012
Ｄ．２．１．  ４−（４−ブロモ−３−（フルオロメチル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ１６の合成
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の（２−ブロモ−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）メタノールａ１０（５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＤＡＳＴ（１０ｇ、６２．８ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（２０ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中１０〜１５％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、４−（４−ブロモ−３−（フルオロメチル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ１６を２．１ｇ、灰白色固体として得た。
収率：４１％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：３２２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９９（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ），７．６８−７．６４（ｍ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，１Ｈ），７．３８−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ，１Ｈ），７．１４−７．１０（ｍ，１Ｈ），６．９１（ｓ，１Ｈ），５．４６（ｄ，Ｊ＝４６．８Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１３４】
Ｄ．２．２．  ４−（３−（フルオロメチル）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ１７の合成
ジオキサン（５０ｍＬ）中の４−（４−ブロモ−３−（フルオロメチル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ１６（２ｇ、６．２３ｍｍｏｌ）および４，４，５，５−テトラメチル−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，３，２−ジオキサボロラン（２．０５ｇ、８．０９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＫＯＡｃ（１．８３ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、反応物をアルゴンで３０分間パージした。ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（１．５２ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を再びアルゴンで５分間パージした。反応混合物を１００℃で１２時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、４−（３−（フルオロメチル）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ１７を２．１ｇ、灰白色固体として得た。
収率：９１％
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１６−８．１４（ｍ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ），７．３２−７．２８（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．２０（ｍ，１Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ），５．６５（ｄ，Ｊ＝４７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．３１（ｓ，１２Ｈ）。
【０１３５】
Ｄ．２．３．  ６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１８の合成
ジオキサン（１０ｍＬ）および水（１ｍＬ）中の４−（３−（フルオロメチル）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）フロ［３，２−ｃ］ピリジンａ１７（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および６−ヨード−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ６（１３０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１１０ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴンで３０分間パージした。ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（６０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を再びアルゴンで５分間パージした。反応混合物を８０℃で１時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液を真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中５０〜６０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンａ１８を２０ｍｇ、灰白色固体として得た。
収率：２１％
ＨＰＬＣ純度：９８．４％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：３６８（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．１８（ｓ，１Ｈ），１０．８５（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝２．００Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ），７．４５−７．３７（ｍ，３Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝１．６０Ｈｚ，１Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝４６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．５１（ｓ，３Ｈ）。
【０１３６】
Ｄ．２．４．  ［１１Ｃ］−６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉａ）のアトロプ異性体（−）、（−）−（Ｉａ）の合成
２つのアトロプ異性体の混合物としての［１１Ｃ］−（６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン）を、ａ１８前駆体および［１１Ｃ］メタンから出発して調製した。［１１Ｃ］メタンは、ＧＥ  ＰＥＴｔｒａｃｅサイクロトロンで、窒素ガス中水素１０％の混合物を含有するガス標的に１６．５ＭｅＶの陽子ビームを照射し、１４Ｎ（ｐ，α）１１Ｃ核反応およびその後のメタンを形成するための炭素−１１と窒素の標的内反応により［１１Ｃ］メタンを生成することによって生成した。
【０１３７】
次いで、生成された［１１Ｃ］メタンを、約−１８０℃でＨａｙｅＳｅｐトラップに捕捉し、その後、これにヘリウムを流して、微量の水素および窒素を除去した。次いで、捕捉された［１１Ｃ］メタンを、加熱下で再循環システムに放出し、約７２０℃でヨウ素蒸気と反応させて、［１１Ｃ］ヨウ化メチルを生成した。再循環後、［１１Ｃ］ヨウ化メチルをヘリウム流中、不活性担体上に加熱銀トリフラートを含有するカラムに通過させて、標識剤、［１１Ｃ］メチルトリフラートを生成した。今度は、これを非標識前駆体ａ１８、０．２〜０．４ｍｇ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ水溶液４〜５μｌおよびアセトン６００〜７００μｌを含有する溶液に捕捉させた。
【０１３８】
約１２０秒後、反応混合物を水で希釈し、半分取ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（２００×１０ｍｍ、５μｍ）に移し、流量７ｍＬ／分で、アセトニトリルとＮＨ４ＯＨ水溶液（０．１５％）２９：７１の混合物で溶出した。溶出液を、連続的に接続された放射能およびＵＶ検出器で監視し、ＵＶ検出器は２５４ｎｍに設定した。放射標識生成物を含有するピークを収集し、滅菌水約５０ｍｌに希釈し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ  ３ｃｃ  ＳＰＥカートリッジに通過させて、生成物を捕捉した。次いで、カートリッジを滅菌水８ｍＬで洗浄し、生成物を、生理食塩水１２ｍｌを含有するバイアルに、９６％エタノール約１．１ｍｌで溶出した。次いで、生成物を、０．２２μｍ滅菌フィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ）を通して濾過した。品質管理用の試料を、濾過後に生成物バイアルから採取した。放射化学的純度を、２５４ｎｍに設定したＵＶ検出器で、移動相としてアセトニトリル／ＮＨ４ＯＨ水溶液（０．１５％）２５：７５を用いて、分析用ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を使用して、直列に接続された放射能およびＵＶ検出器と、標準的ＨＰＬＣシステムを使用して決定した。
【０１３９】
２つのアトロプ異性体は通常のＣ１８  ＨＰＬＣカラムでは分離できないため、分離のためにキラル分離法を開発した。
【０１４０】
（Ｉａ）のアトロプ異性体（−）を単離するために、流量５ｍＬ／分で、２５４ｎｍに設定されたＵＶ検出器を使用して、アセトニトリル／エタノール７：９３混合物を移動相として使用するＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡカラム（２５０×１０ｍｍ、５μｍ）を使用して、半分取ＨＰＬＣを実施した。反応自体および生成物の配合は、上記のように実施した。
【０１４１】
放射化学的純度およびアトロプ異性体純度を、流量１ｍｌ／分で、２５４ｎｍに設定されたＵＶ検出器を使用して、ＭｅＣＮ／ＥｔＯＨ  ７：９３移動相で溶出するＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ−３分析カラムを備えた標準的なＨＰＬＣシステムを使用して決定した（（−）−Ｉａの保持時間＝７．２分、ｅｅ＞９９％）。
【０１４２】
Ｄ．３．  ［１８Ｆ］−６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉｂ）のアトロプ異性体（−）、（−）−（Ｉｂ）の合成
【化１２】
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Ｄ．３．１．  ２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１９の合成
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１３（２．６０ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＴＦＡ（２６．０ｍＬ、３５０ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をアセトニトリル：アンモニア混合物（１：１、１０ｍＬ）に溶解し、３０分間撹拌した。反応混合物を濾過し、冷水（２０ｍＬ）およびペンタン（２０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１９を１．６ｇ、灰白色固体として得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
収率（粗）：８１％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：４２２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４７（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝１．９６Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄｄ，Ｊ＝５．８７，０．９８Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｓ，１Ｈ），７．４５−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｓ，１Ｈ），５．０２−４．９７（ｍ，１Ｈ），４．９７−４．９１（ｍ，１Ｈ），２．９０（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，３Ｈ）。
【０１４３】
Ｄ．３．２．  ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（アセトキシメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−カルボキシラートａ２０の合成
２−（３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−１，２，３，６−テトラヒドロピリミジン−４−イル）−５−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）ベンジルアセタートａ１９（１．６０ｇ、３．８０ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（１．５７ｍＬ、６．８３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．６４ｍＬ、４．５６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０５ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３３．３ｍＬ）に溶解し、反応混合物を７０℃で１６時間加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中７０〜８０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（アセトキシメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−カルボキシラートａ２０を１．１ｇ、灰白色固体として得た。
収率：５６％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：５２２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１７（ｄ，Ｊ＝１．９６Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．３１Ｈｚ，２Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝１．４７Ｈｚ，１Ｈ），４．３３−４．３８（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｓ，３Ｈ），１．９５（ｓ，３Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．５２（ｓ，３Ｈ）。
【０１４４】
Ｄ．３．３．  ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）フェニル）−３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−カルボキシラートａ２１の合成
ＴＨＦ（１５ｍＬ）および水（２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（アセトキシメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−カルボキシラートａ２０（１．１ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＨ（９０ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）フェニル）−３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−カルボキシラートａ２１を３００ｍｇ、白色固体として得た。
収率：３０％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：４８０（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１４（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．４０−７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．２７（ｍ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），５．３７（ｔ，Ｊ＝５．６２Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．２９（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｓ，３Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ），１．４９（ｓ，３Ｈ）。
【０１４５】
Ｄ．３．４．  ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（クロロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−カルボキシラートａ２２の合成
ＤＣＭ（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）フェニル）−３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−カルボキシラートａ２１（３００ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＳＯＣｌ２（０．０９ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液を添加し、次いで、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳで監視した。完了後、反応混合物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（５ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣を、溶離液としてヘキサン中５０〜５５％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（クロロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−３，５−ジメチル−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−カルボキシラートａ２２を１５０ｍ、白色固体として得た。
収率：４８％
ＨＰＬＣ純度：９８．４％
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：４９８（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１８（ｄ，Ｊ＝１．９６Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝１．９６Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝５．３８Ｈｚ，１Ｈ），７．５１−７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４６−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１．４７Ｈｚ，１Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ），１．５５（ｂｒｓ，３Ｈ）。
【０１４６】
Ｄ．３．５．  ［１８Ｆ］−６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉｂ）のアトロプ異性体（−）、（−）−（Ｉｂ）の合成
典型的な手順で、輸送用バイアル（サイクロトロン施設から得られた標的水）中の［１８Ｆ］フッ化物をイオン交換カートリッジに移し、捕捉する。次いで、これを炭酸カリウムおよびＫｒｙｐｔｏｆｉｘ  ２２２の溶液でＴＲＡＣＥＲｌａｂ（登録商標）モジュールの反応容器（ＲＶ１）に溶出する。真空およびヘリウム流下、９５℃で４分間加熱することによって、溶液を最初に蒸発させる。アセトニトリル（１ｍＬ）をＲＶ１に添加し、同じ条件下、真空下で２分間蒸発を続ける。アセトニトリル（１ｍＬ）の２回目の添加後、真空およびヘリウム流下、９５℃で２分間、最終的な蒸発を行う。次いで、反応器を５０℃に冷却する。
【０１４７】
無水アセトニトリル中の前駆体ａ２２（０．７ｍｇ）の溶液を反応容器に添加し、反応混合物を８０℃で５分間加熱する。５分後、反応器を７０℃に冷却し、塩酸（１Ｍ）を添加し、７０℃で４分間加熱した後、４０℃に冷却し、ＷＦＩで希釈する。混合物をＲＶ１から中間固相抽出カートリッジ（ＳＰＥ、Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ  ｌｉｇｈｔ）に移す。ＲＶ１をメタノールですすぎ、ＳＰＥを通して移して、生成物を、ＷＦＩを事前充填したＲＶ２に生溶出する。ＲＶ２の全内容物を、精製のためにＨＰＬＣインジェクターループに移す。
【０１４８】
（−）−Ｉｂの単離を、半分取Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈカラム（５μｍ、２５０×１０ｍｍ）およびＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）（１０μｍ、２５０×１０ｍｍ）を使用してＨＰＬＣによって実施し、４ｍＬ／分の流量で、アセトニトリル／酢酸アンモニウム溶液（５ｍＭ）（４０／６０、ｖ／ｖ）の混合物で溶出する。生成物画分を、ＷＦＩ中アスコルビン酸２５ｍＬを含有するフラスコ１に収集する。希釈した生成物混合物をｔＣ１８固相抽出カートリッジに通過させ、カートリッジをＷＦＩ中アスコルビン酸１０ｍＬですすぐ。放射標識生成物を、２００プルーフＵＳＰグレードエタノール１ｍＬを含むＳＰＥカートリッジから、配合ベース１０ｍＬが事前充填された配合フラスコに溶出する。カートリッジを配合ベース４ｍＬですすぎ、洗液を配合フラスコの内容物と混合する。得られた溶液を、滅菌０．２μｍメンブレンフィルタに通過させ、滅菌フィルタベントバイアル（最終生成物バイアル、ＦＰＶ）に送る。
【０１４９】
放射化学的純度を、ＵＶ検出器を２５４ｎｍに設定して、移動相として、１５分で８０／２０まで増加するＭｅＯＨ／５  ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ  ５０／５０を用いて、分析Ｋｉｎｅｔｅｘ  ＥＶＯ  Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を使用して、直列に接続された放射能およびＵＶ検出器と、標準的ＨＰＬＣシステムを使用して決定した（（−）−１ｂの保持時間＝９．７分、放射化学的純度９９％超）。
【０１５０】
アトロプ異性体の純度を、ＵＶ検出器を２５４ｎｍに設定して、流量１ｍｌ／分で、ＭｅＣＮ／５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ  ４０／６０移動相で溶出する、分析ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＯＪ−Ｈカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μＭ）を使用して、直列に接続された放射能およびＵＶ検出器と、標準的ＨＰＬＣシステムを使用して決定した（（−）−１ａの保持時間＝１０．１分、ｅｅ＞９９％）。
【０１５１】
Ｄ．４．  ［３Ｈ］−６−（２−（フルオロメチル）−４−（フロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−イルオキシ）フェニル）−１，５−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉｃ）のアトロプ異性体（−）、（−）−（Ｉｃ）の合成
式（−）−（Ｉ）の化合物（２ｍｇ）、Ｋｅｒｒの触媒（２ｍｇ）およびジクロロメタン（１ｍＬ）をトリチウム標識フラスコで合わせ、５Ｃｉのトリチウムガス下で２．５時間撹拌した。不安定なトリチウムをエタノールから繰り返し蒸発乾固させて除去した。残渣をエタノール（２０ｍＬ）に溶解した。粗（−）−（Ｉｃ）を、流量３ｍＬ／分で、勾配として６０分間にわたって２０％Ｂ〜１００％Ｂで、溶離液Ａとしての水＋ＴＦＡ（０．１％）、溶離液Ｂとしてのアセトニトリル＋ＴＦＡ（０．１％）を用いて、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８  ５μ  ２５０×１０ｍｍカラムを使用してＨＰＬＣによって精製した。（−）−（Ｉｃ）を収集し、回転蒸発乾固し、エタノール（２０ｍＬ）に溶解した。
【０１５２】
高速液体クロマトグラフィーによって決定される（−）−（Ｉｃ）の放射化学的純度を、放射能検出器を用いて、流量１ｍＬ／分（勾配ｔ＝０で２０％Ｂ〜ｔ＝２０分で１００％に及ぶ）で、溶離液Ａとしての水／ＴＦＡおよび溶離液Ｂ相としてＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡで溶出されるｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ３分析カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μＭ）を使用して測定した（（−）−（Ｉｃ）の保持時間＝１２．９分、放射化学的純度＝９９．４％）。
【０１５３】
ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）：３８４（Ｍ＋Ｈ）＋の主イオンは、ほぼ１トリチウムの取り込みおよび１８Ｃｉ／ｍｍｏｌで測定された比放射能と一致している。
【０１５４】
Ｅ．  生物学
Ｄ１受容体に対する化合物（Ｉ）活性を評価するために、機能アッセイでこれを試験した。機能アッセイは、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイで環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の生成の刺激を測定し、内因性アゴニストであるドーパミンの濃度を増加させることによるｃＡＭＰの最大増加を１００％のＤ１受容体活性化として定義する。試験すると、化合物（±）−（Ｉ）は、有意な直接的アゴニスト様効果を示す。
【０１５５】
化合物（Ｉ）のＤ１に対する親和性および選択性を評価するために、これを競合的放射性リガンド結合アッセイで試験した。次いで、競合的放射性リガンド結合アッセイを使用して、Ｄ１受容体に対する（±）−Ｉの親和性を測定し、８０種の関連および非関連標的の大きなパネルに関するその選択性を評価した。化合物（±）−（Ｉ）は、ナノモル濃度以下の範囲の親和性でＤ１およびＤ５受容体に結合し、他の試験した標的のいずれにも有意には結合しない。
【０１５６】
次いで、化合物（−）−（Ｉ）をトリチウム標識して、
１）既知のＤ１アンタゴニスト［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０および式（−）−（Ｉｃ）のＤ１アゴニスト化合物の放射性リガンド結合特性、および
２）Ｄ１正のアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）がＤ１受容体（Ｄ１Ｒ）へのアゴニストまたはアンタゴニストの結合を増強する能力
を測定および比較した。オートラジオグラフィーによって、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）脳切片上でヒトＤ１Ｒを発現する細胞膜上での放射性リガンド結合の増加としてＤ１  ＰＡＭ誘導増強を測定した。
【０１５７】
化合物を試験した特定のアッセイ条件を以下に記載する。
【０１５８】
Ｅ．１．  材料および方法
ヒトドーパミンＤ１Ｒの一過的トランスフェクションを、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ  ｈＤ１Ｒ）でｐｃＤＮＡ３．１ベクターを使用して実施した。
【０１５９】
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の脳切片は、Ｍｏｔａｃ（Ｂｏｒｄｅａｕｘ、フランス）から提供され、全ての動物実験は欧州の動物使用に関する倫理ガイダンスおよび法律に従って実施した。
【０１６０】
Ｄ１アンタゴニスト化合物は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｚａｖｅｎｔｅｍ、ベルギー）から入手した［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０（比放射能７３  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）である。
【０１６１】
ＨＴＲＦ  ｃＡＭＰダイナミックアッセイキット、ヒト神経上皮腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞、および他の全ての試薬は分析グレードのものであり、従来の商業的供給元から入手し、製造業者の推奨に従って使用した。
【０１６２】
データはＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して分析した。ＫＤ、Ｂｍａｘ、ｐＩＣ５０およびｐＥＣ５０およびＥｒｅｌは、様々な競合的およびアロステリックな結合および機能的活動モデルを表す方程式に従って、コンピューター化された曲線当てはめによって測定した。
【０１６３】
Ｅ．２．  ｃＡＭＰ  ＨＴＲＦ  Ｄ１機能アッセイ
ドーパミンＤ１ＲはＧｓ型Ｇタンパク質に結合しており、その活性化により細胞内ｃＡＭＰ濃度（［ｃＡＭＰ］ｉ）が増加する。［ｃＡＭＰ］ｉの変化を、Ｄ１Ｒを内因的に発現するヒト神経上皮腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞でＨＴＲＦ技術を使用して測定した。３８４ウェルプレートで、１ウェル当たり２００００個細胞を、０．１ｍＭイソブチルメチルキサンチンおよび１０の増加する濃度のドーパミンまたは式（Ｉ）の化合物（１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍ）を含有する最終体積２０μＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで緩衝化したハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４）中、室温で１時間インキュベートした。反応を、共に溶解緩衝液に希釈した１０μＬのｄ２検出試薬とクリプタート試薬を連続して添加することによって終結した。室温で６０分の期間の後、標準曲線を使用してＨＴＲＦ放出比の変化を決定し、［ｃＡＭＰ］ｉに変換した。全てのインキュベーションを２連で実施し、結果をドーパミンの濃度−効果曲線と比較した。化合物の効力ｐＥＣ５０は、ｃＡＭＰレベルの活性化の５０％を生成する化合物の濃度の−ｌｏｇ１０であり、Ｅｒｅｌは、ドーパミンの濃度を増加させることによって生成される最大応答と比較した化合物によって生成される最大％増強として定義される相対有効性である（Ｅｒｅｌ１＝ドーパミン最大応答）。
【０１６４】
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で試験した場合、化合物（−）−Ｉは、ドーパミンと比較して、ｐＥＣ５０が８．３、Ｅｒｅｌが５３％のＤ１部分アゴニスト様効果を示した。化合物（−）−１とドーパミンについての比較機能結果を表１に要約し、図１にさらに示す。
【表１】
2021504426.tif 000014
【０１６５】
Ｅ．３．  化合物（±）−ＩのヒトＤ１Ｒに対する親和性および選択性プロファイル
組換えヒトＤ１Ｒに対する式（±）−（Ｉ）の化合物の親和性（ｐＫｉ）を、［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０放射性リガンド競合結合実験によってＣＥＲＥＰ（Ｃｅｌｌｅ  ｌ’Ｅｖｅｓｃａｕｌｔ、フランス）で測定した。化合物（±）−Ｉは、ヒトＤ１ＲについてｐＫｉ９．２を示した。
【０１６６】
ヒトＤ１Ｒについての化合物選択性を、受容体、トランスポーター、酵素およびイオンチャネルを含む８０種の標的（２連のデータでｎ＝１）のパネルに対してＣＥＲＥＰで、１０μＭで評価した。潜在的に関連する親和性を、ドーパミンＤ５受容体（Ｄ５Ｒ）、タキキニンＮＫ１受容体およびアデノシン輸送体（ＡＤＥＴ）の３つの標的のみで特定したところ、１０μＭの化合物（±）−（Ｉ）で６０％超の阻害を示した。次いで、ヒトＤ５Ｒ、ＮＫ１受容体およびＡＤＥＴに対する式（±）−Ｉの化合物の親和性（ｐＫｉ）を測定した。式（±）−Ｉの化合物は、他の７９種の試験した標的（ｐＫｉ  ６．０以下）に対して１０００倍超選択的であるので、Ｄ１様（Ｄ１ＲおよびＤ５Ｒ）選択的リガンドである（ヒトＤ５ＲのｐＫｉは９．４）。
【０１６７】
Ｅ．４．  放射性リガンド結合アッセイ
ＨＥＫ  ｈＤ１Ｒ細胞の膜を使用して、放射性リガンド結合を測定した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を１５００ｇおよび４℃で１０分間の遠心分離によってペレット化した。ペレットを氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、上記のように遠心分離した。ペレットを、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．３ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭエチレングリコール四酢酸、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５）を含有し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した緩衝液でホモジネートした。ホモジネートを２回凍結融解し、２５℃で平衡化し、引き続いて、１０分間ＤＮＡｓｅ（１０Ｕ／ｍｌ）処理した。その後、溶液を４００００ｇおよび４℃で３０分間遠心分離した。最後に、ペレットを、２５０ｍＭスクロースを含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁し、Ｄ１放射性リガンド結合アッセイまで−８０℃で貯蔵した。ＨＥＫ  ｈＤ１Ｒの膜調製物（１アッセイ当たり５μｇのタンパク質）を、２５℃で１２０分間、１％ＤＭＳＯを含有する０．２ｍｌ結合緩衝液中（−）−（Ｉｃ）または［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０とインキュベートした。インキュベーション期間の最後に、タンパク質結合放射性リガンドを、事前浸漬ＧＦ／Ｂガラスファイバーフィルタを通して濾過することによって回収した。フィルタをアッセイ体積の少なくとも４倍の氷冷５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。濾過ステップ全体は１０秒を超えなかった。フィルタを乾燥させ、液体シンチレーションによって放射能を測定した。飽和結合アッセイを、１０μＭ  Ｄ１  ＰＡＭ、化合物ａ（ＣＡＳ１９００７０６−５１−５）および化合物ｂ（ＣＡＳ１９０４６６１−５３−５）（段落Ｅ．７ならびに図５および図６では化合物Ｂとも呼ばれる）の非存在下および存在下で、増加する濃度の（−）−（Ｉｃ）または［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０（０．５〜５０ｎＭ）を使用して行った。
【０１６８】
競合／増強結合実験を、一定の（−）−（Ｉｃ）濃度（１〜４ｎＭ）および１０の増加する濃度の（−）−（Ｉｃ）または化合物ｂ（１０−１０Ｍ〜１０−５Ｍ）で行った。全ての実験で、非特異的結合（ＮＳＢ）を、１０μＭの標識されていないそれぞれの化合物の存在下で観察された残留放射性リガンド結合として定義した。
【０１６９】
Ｄ１  ＰＡＭ化合物はＤ１アンタゴニスト放射性リガンド［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０結合に影響を与えませなかった（図３Ａ）が、Ｂｍａｘを４５％増加させ、ＫＤを２０％減少させることにより、Ｄ１アゴニスト放射性リガンド（−）−（Ｉｃ）の結合特性を有意に改善した（図３Ｂ）。
【０１７０】
Ｄ１  ＰＡＭ化合物が、Ｄ１Ｒへの低ナノモル濃度（ＰＥＴトレーサーに関連）のアゴニスト放射性リガンド（−）−（Ｉｃ）結合を増強する能力が、図３Ｃで実証された（（−）−（Ｉｃ）結合の５０％超の増強）。
【０１７１】
得られた曲線を図３に示す。
【０１７２】
Ｅ．５．  オートラジオグラフィー
１２μｍの脳切片を新鮮な凍結ＮＨＰ脳半球から調製し、ガラス製顕微鏡スライドに配置した。オートラジオグラフィー実験は、ＨＢＳＳ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、室温で実施した。ＮＨＰ脳切片を最初に３０分間平衡化した後、１％ＤＭＳＯ中［３Ｈ］化合物と１時間インキュベートした。次いで、スライドを氷冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で５分間洗浄し、引き続いて氷冷蒸留水で２回洗浄した。切片を大気圧下、室温で乾燥させた。切片上の放射能を、直接カウンターを使用して、蛍光面へのスライドの曝露後に間接的に測定した。全てのオートラジオグラフィー実験で、［３Ｈ］標準を定量化に含め、ＮＳＢを１０μＭ非標識化合物の存在下で観察される［３Ｈ］化合物の残留結合として定義した。
【０１７３】
ＮＨＰ脳切片に対するオートラジオグラフィーで試験すると、既知のＤ１様トレーサーと同様に（Ｃａｄｅｔ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｄ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ，ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．（２０１０）９（５）：５２６−５３８）、（−）−Ｉｃは、これらの構造（Ｃａｄｅｔら）で見られる高レベルのＤ１受容体発現と一致した尾状核被殻における有意な結合（総結合）を実証した。この結合は置換可能であり、２０％は非特異的結合として評価された（１０μＭの化合物（Ｉ）の存在下で測定）。
【０１７４】
１０μＭ  Ｄ１  ＰＡＭ化合物ｂの存在下では、（−）−Ｉｃ特異的結合が有意に増加し（１５０％超）、有意な増強があることを示している。
【０１７５】
図４は、オートラジオグラフィーアッセイで得られた結果を示している。挿入は、データ定量化のために選択された領域を示す。データを、重複の平均±標準偏差として表す。
【０１７６】
Ｅ．６．  カニクイザルにおけるインビボＰＥＴイメージング試験
カニクイザル（雌、体重６．０２ｋｇ）で実験を実施した。サルを、ケタミンの筋肉内注射を使用して鎮静し、実験の期間中、セボフルラン、酸素および医療用空気の混合物を使用して麻酔をかけ続けた。７９５ＧＢｑ／μｍｏｌの比放射能で１４１ＭＢｑの（−）−（Ｉａ）を静脈内投与した後、ベースラインスキャンを実施し、Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＨＲＲＴ  ＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を使用して脳のＰＥＴ画像を取得した。
【０１７７】
データを１２３分間取得し、以下のフレームタイミングでサイノグラムにビニングした：９×２０秒；３×１分；５×３分；および１７×６分。この試験で使用した関心領域は、尾状核、被殻、小脳、前頭皮質、後頭皮質、淡蒼球、中脳、腹側線条体、視床および側頭皮質であった。関心領域をＰＥＴスキャンに適用するための登録パラメータを取得し、領域の時間放射能曲線（ＴＡＣ）を作成した。代謝産物分析のため、（−）−（Ｉａ）投与の４、１５、３０、６０、９０、１２０分後に静脈血試料を採取した。
【０１７８】
（−）−Ｉａの標準化取り込み値（ＳＵＶ）時間放射能曲線
（−）−Ｉａの標準化取り込み値（ＳＵＶ）時間放射能曲線を、複数の関心領域で取得した。（−）−Ｉａのピーク取り込みは、種々の脳領域にわたって投与後５〜１０分で約３．５〜４のＳＵＶに達し、引き続いて、Ｄ１受容体のない参照領域から予想されるように、小脳から急速に洗い流されて、６０分で約１のＳＵＶに達する。
【０１７９】
尾状核および被殻関心領域からの洗い流しは有意に遅く、６０分で約２のＳＵＶに達し、これは報告されたこれらの領域でのＤ１の分布から予想されるだろう。小脳を参照領域およびローガン参照組織モデルとして使用すると、結合電位（ＢＰＮＤ）は、尾状核および被殻でそれぞれ０．９４および０．８７と計算され、これは、式（−）−（Ｉａ）の化合物がＰＥＴイメージングによって確実に定量化できる特定の結合を有することを意味する。
【０１８０】
３３〜６３分の間に得られた合計ＳＵＶ画像は、脳組織のオートラジオグラフィーおよび報告される線条体構造での取り込みが高いＤ１の分布と一致することを実証している。
【０１８１】
式（Ｉ）の化合物の代謝産物プロファイル
（−）−Ｉａの代謝産物のプロファイルを、いくつかの時点で投与後に収集した静脈血試料のラジオＨＰＬＣ分析によって決定した。血漿中の親画分は、１５分で８５％、３０分で６０％、６０分でまだ約４５％である。以前に報告されたＤ１アゴニストトレーサーとは対照的に、血液脳関門を通過する可能性が低い親水性代謝産物のみが検出されている。
【０１８２】
Ｅ．７．  カニクイザルにおけるインビボ増強ＰＥＴイメージング試験
ＭＰＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｔａｗａｎ、ＭＩ）に収容されている２匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、インビボ増強ＰＥＴ試験の研究対象として使用した。
【０１８３】
Ｅ．７．１．  化合物の投与および画像取得
各動物をプロポフォールｉｖボーラス（２．５〜５．０ｍｋ／ｋｇ）で麻酔し、化合物Ｂのｉ．ｖ用量投与の開始前に少なくとも３０分間、プロポフォールｉｖ持続速度注入（ＣＲＩ、０．１〜０．６ｍｇ／ｋｇ／分）で維持した。いくつかの用量レベルを投与した。２０ｍｇ／ｋｇ（総用量）の用量レベルでは、化合物Ｂを負荷注入用量８．５４ｍｇ／ｋｇとして投与し；ＣＲＩ  ３４．２ｍｇ／ｋｇ／時間で約１５分間にわたって投与し、引き続いて、注入維持量１１．４５ｍｇ／ｋｇで投与し；およそ４０分間にわたって１７．２ｍｇ／ｋｇ／時間の速度でＣＲＩを介して投与した。およそ５５分の総注入時間後、化合物Ｂの投与を中止した。化合物（−）−Ｉｂをボーラス注射によってｉｖ投与し、化合物Ｂ注入開始の１０分後に投与を開始した。脳イメージングデータを、ｍｉｃｒｏＰＥＴ  Ｆｏｃｕｓ  ２２０スキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）での放射性トレーサーの投与開始直後に取得した。動的放出データを、化合物（−）−Ｉｂ注射直後に１２０分間にわたってリストモードで収集し、次いで、マルチフレームの動的画像（６×０．５分、３×１分、２×２分および２２×５分フレーム）に再構築した。ＰＥＴ画像を、ＰＥＴカメラ製造業者によって提供されるソフトウェアおよび方法論を使用して、検出器の正規化、デッドタイム、不均一なラディアルサンプリング、減衰、散乱および放射性崩壊について補正した。
【０１８４】
Ｅ．７．２．  動脈血サンプリング
化合物（−）−Ｉｂ投与後、化合物（−）−Ｉｂを投与する前、および化合物（−）−Ｉｂの注射後最大１２０分までの１３時点で、動脈血試料を中央腸骨動脈から採取した。全ての血液試料を抗凝固剤チューブに収集し、ガンマカウンターによる放射能の定量化、ＨＰＬＣによる経時的な血漿中の化合物（−）−Ｉｂ親画分および血中の化合物（−）−Ｉｂエキソビボ安定性の測定まで、氷上で貯蔵した。
【０１８５】
Ｅ．７．３．  画像処理および分析
再構成された動的脳ＰＥＴ画像を転送し、画像処理ＰＭＯＤソフトウェアパッケージ（ＰＭＯＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）を使用して分析した。ベースラインで取得されたＰＥＴ画像を、以前に取得された動物の脳の構造的磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に合わせた。動物の脳のＭＲＩを、一般的なＭＲカニクイザル脳テンプレートに空間的に正規化し、得られた正規化変換をＰＥＴ画像に適用した。薬物試験中に取得されたその後のＰＥＴ画像を、最初にベースライン画像に合わせ、次いで、ベースライン画像から既に計算された変換を使用して、共通のＭＲテンプレート空間に変換した。
【０１８６】
テンプレート空間で定義される関心領域（ＲＯＩ）をＰＥＴ画像に適用して、時間放射能曲線（ＴＡＣ）を計算した。各ＲＯＩ内の平均放射能濃度（ｋＢｑ／ｃｃ）を決定し、経時的な局所脳放射能濃度を表すＴＡＣを作成した。脳のＴＡＣおよび画像を、動物の体重および注射用量で正規化することによって、ＳＵＶ単位（ｇ／ｍＬ）で提示した。
【０１８７】
血漿ベース方法ローガングラフ解析（ＬＧＡ）を局所ＴＡＣに適用して、各脳領域の分布（ＶＴ）の総体積を決定した。モデリングに使用した動脈入力関数は、測定された親画分を使用して代謝産物についての血漿放射能を補正することによって作成した。
【０１８８】
ＶＴ処理−ＶＴベースラインがｙ軸上にあり、ＶＴ処理がｘ軸上にある、全体的占有率ラッセンプロットと概念が類似の増強プロットを使用した。次いで、特定のシグナルの増加として定義される増強、増強＝Ｖｓ処理／ＶＴベースライン（式中、ＶＳは特定の分布体積である）を、グラフの勾配／（１−勾配）としての増強プロットから導出することができ、変位不可能な分布体積（ＶＮＤ）は、グラフのｘ切片によって与えられる。
【０１８９】
Ｅ．７．４．  結果
ベースラインおよび２０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂの投与後に取得された４０〜９０分間にわたる平均（時間加重）のＳＵＶ  ＰＥＴ画像と関連する時間放射能曲線を図５に示す。両画像は、化合物Ｂの取り込みに対する化合物Ｂの効果を示しており、Ｄ１アロステリック部位への化合物Ｂの結合による化合物（−）−Ｉｂの増強により、取り込みの増加が観察される。
【０１９０】
増強効果を定量化するために、ベースライン時およびＬＧＡを使用した化合物Ｂの投与後の時間放射能曲線から分布量（ＶＴ）を推定した。２０ｍｇ／ｋｇでは、カニクイザルの尾状核および被殻で平均で約１００％の増加が観察された。
【０１９１】
尾状核、被殻、腹側線条体、淡蒼球、黒質、島、帯状回および小脳についての増強プロットを図６に示す。
【０１９２】
プロットから、５５分間にわたって注入された２０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂの総用量について、増強がおよそ１３６％と推定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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