(57)【要約】  本発明は、チャイニーズハムスター卵巣伸長因子１−α（ＣＨＥＦ１）転写調節ＤＮＡ要素、対象となる遺伝子（ＧＯＩ）、最小限サイトメガロウイルス（ｍｉｎＣＭＶ）、および選択マーカー（ＳＭ）、ならびに／またはヒトアデノウイルス三区分リーダー（ＡｄＴＰＬ）配列を含む、双方向発現ベクターを提供する。本発明はまた、宿主細胞双方向発現ベクター（複数可）を培養することを含む、宿主細胞における異種タンパク質発現を増加させるための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
双方向発現ベクターであって、チャイニーズハムスター伸長因子−１α（ＣＨＥＦ１）転写調節ＤＮＡ、対象となる遺伝子（ＧＯＩ）、最小限サイトメガロウイルスプロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）、および選択マーカー（ＳＭ）を含む、双方向発現ベクター。
【請求項２】
前記ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよび前記ＧＯＩの配向が、５’：３’である、請求項１に記載の双方向発現ベクター。
【請求項３】
前記５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡが、配列番号３または配列番号３と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の双方向発現ベクター。
【請求項４】
前記５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡが、配列番号４または配列番号４と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の双方向発現ベクター。
【請求項５】
３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含み、前記３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡが、前記５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよび前記ＧＯＩと同じ配向にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の双方向発現ベクター。
【請求項６】
前記３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡが、配列番号５または配列番号５と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の双方向発現ベクター。
【請求項７】
前記ｍｉｎＣＭＶおよび前記ＳＭの配向が、３’：５’である、請求項１に記載の双方向発現ベクター。
【請求項８】
前記ＳＭが、コドン脱最適化されている、請求項１に記載の双方向発現ベクター。
【請求項９】
ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、ＧＯＩ、およびＳＭを含む、双方向発現ベクター。
【請求項１０】
前記ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよび前記ＧＯＩの配向が、５’：３’である、請求項９に記載の双方向発現ベクター。
【請求項１１】
前記５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡが、配列番号３または配列番号３と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載の双方向発現ベクター。
【請求項１２】
３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の双方向発現ベクター。
【請求項１３】
前記３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡが、配列番号５または配列番号５と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の双方向発現ベクター。
【請求項１４】
前記ＳＭの配向が、３’：５’である、請求項９に記載の双方向発現ベクター。
【請求項１５】
前記ＳＭが、前記ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡの上流にある、請求項９に記載の双方向発現ベクター。
【請求項１６】
前記ＳＭが、コドン脱最適化されている、請求項９に記載の双方向発現ベクター。
【請求項１７】
ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＣＭＶプロモーターおよび／またはヒトアデノウイルス三区分リーダー（ＡｄＴＰＬ）配列、ＧＯＩ、ｍｉｎＣＭＶ、ならびにＳＭを含む、双方向発現ベクター。
【請求項１８】
ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＣＭＶプロモーター、ＧＯＩ、ならびにＳＭを含む、双方向発現ベクター。
【請求項１９】
前記ＳＭが、コドン脱最適化されている、請求項１７に記載の双方向発現ベクター。
【請求項２０】
前記ＳＭが、コドン脱最適化されている、請求項１８に記載の双方向発現ベクター。
【請求項２１】
前記ＳＭが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ  ＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）、ゼオシン、フレオマイシン、ブレオマイシン耐性遺伝子ｂｌｅ（酵素不明）、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、変異型のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）、ブロモキシニルニトリラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）、エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸（ＥＰＳＰ）シンターゼ（ａｒｏ  Ａ）、筋肉特異的チロシンキナーゼ受容体分子（ＭｕＳＫ−Ｒ）、銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄ１）、メタロチオネイン（ｃｕｐ１、ＭＴ１）、ベータ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）、ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ（ｐａｃ）、ブラスチシジンアセチルトランスフェラーゼ（ｂｌｓ）、ブラスチシジンデアミナーゼ（ｂｓｒ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）、Ｎ−スクシニル−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンテターゼ（ａｄｅ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇ４）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕ２）、インベルターゼ（ｓｕｃ２）、およびオロチジン−５’−リン酸（ＯＭＰ）デカルボキシラーゼ（ｕｒａ３）からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれかに記載の双方向発現ベクター。
【請求項２２】
宿主細胞における異種タンパク質発現を増加させるための方法であって、請求項１〜２１のいずれかに記載の双方向発現ベクターを含む前記宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、昆虫細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、植物細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記宿主細胞が、原生動物細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター細胞のものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が、無血清懸濁液適応ＣＨＯ細胞株（ＳＦＳＡ  ＤＧ４４）である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５２５３０＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１２９，１３８バイト、２０１９年１月８日作成）を含み、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、異種タンパク質発現を増加させ、組換えタンパク質産生の分野において実際的な用途を有する、新規のプロモーター−エンハンサーの組み合わせを含む双方向発現ベクターを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
転写、翻訳、タンパク質の折り畳み、および／または分泌の改善を通した組換えタンパク質の発現の増加は、細胞株開発中の収率を最適化するための基本的な優先事項である。チャイニーズハムスター卵巣伸長因子１−α（ＣＨＥＦ１）発現システムは、組換えタンパク質を産生するための臨床細胞株を作成するために広く使用されている。伸長因子１−α（ＥＦ−１α）遺伝子は、ほとんどの組織型で高度に発現されており、ＥＦ−１は、ヒト細胞における最も豊富なタンパク質のうちの１つである（Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５４９；２０１１）。ＣＨＥＦ１発現ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびに非ハムスター細胞において高レベルの組換えタンパク質発現を達成する。
【０００４】
ＣＨＥＦ１の発現は、力価の増加が体積生産性の増加によって促進されるように、成長と連動している。典型的には、タンパク質発現は、成長の指数関数期の初期に始まり、定常期および減少の間に低下する。タンパク質発現と細胞成長との間の関連は、リボソームタンパク質複合体において機能するように構成的に発現される天然のＥＦ−１α遺伝子の調節と一致している。ＥＦ−１αの発現は、形質転換細胞（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：５９０７；１９９２）およびマイトジェン刺激細胞（Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０３：２１３７；１９８６）において増加すると報告されており、これは、活発に成長している細胞におけるＥＦ−１αの構成的発現と一致している。成長細胞における転写制御に加えて、成長因子インスリンは、ｍＲＮＡ  ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を通してＥＦ−１αの翻訳を調節する（Ｈａｍｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｂｏｗｍａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：１７７８５；１９８８、Ｐｒｏｕｄ  ａｎｄ  Ｄｅｎｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２８：３２９；１９９７）。この翻訳制御は、５’ＵＴＲに見られるポリピリミジントラクト（ＴＯＰ）配列を通して達成される（Ｍａｒｉｏｔｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ａｍａｌｄｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：８１６；１９９０）。
【０００５】
ＣＨＥＦ１発現システムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＥＦ−１α、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどの他の一般に使用されるプロモーターを用いるベクターよりも高いレベルのタンパク質発現を達成することができることが示されている（Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２０：８８０；２００４）。ＣＭＶプロモーターは、組換えタンパク質発現のために最も広く使用されているプロモーターのうちの１つである。例えば、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）システムは、マウスまたはヒトＣＭＶプロモーターを使用する（Ｋａｌｗｙ，Ｓ．，“Ｔｏｗａｒｄｓ  ｓｔｒｏｎｇｅｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ’ｓ  ｔａｌｅ，”１９ｔｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＥＳＡＣＴ）ｍｅｅｔｉｎｇ，２００５）。市販の発現プラスミドｐｃＤＮＡ（商標）３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、以前に記載されている主要な前初期（ＩＥ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｋ０３１０４．１）に由来するＣＭＶプロモーターを保有している（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８５；４：５２１）。別の一般的に使用されるＣＭＶプロモーターは、ヒトヘルペスウイルス５としても知られているヒトＣＭＶ株ＡＤ１６９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｘ１７４０３．１）に由来する。
【０００６】
ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡを含有するベクターは、ＣＭＶ制御プラスミドよりも最大２８０倍高い組換えタンパク質の発現の改善をもたらす（Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，２００４）。分泌タンパク質および膜結合タンパク質を含む、対象となる様々なタンパク質の発現の増加は、ＣＨＥＦ１駆動ベクターを使用して、非ハムスター細胞を含む異なる真核細胞株において達成されている。ＣＨＥＦ１とＣＭＶベクターとの間のトランスフェクション効率は同等であるが、ＣＨＥＦ１ベクターでトランスフェクトされたクローンにおける発現レベルは、ほぼ均一に高くなっている。
組換えタンパク質の高レベル発現の促進におけるＣＨＥＦ１ベクターの成功が実証されているにもかかわらず、改善された発現系を開発する継続的な必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５４９；２０１１
【非特許文献２】Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：５９０７；１９９２
【非特許文献３】Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０３：２１３７；１９８６
【非特許文献４】Ｈａｍｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｂｏｗｍａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：１７７８５；１９８８
【非特許文献５】Ｐｒｏｕｄ  ａｎｄ  Ｄｅｎｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２８：３２９；１９９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、１つ以上の組換えタンパク質および／または選択マーカー（ＳＭ）の高レベル発現のための双方向発現ベクターを提供する。様々な態様では、双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ要素、対象となる遺伝子（ＧＯＩ）、および選択マーカー（ＳＭ）を含む。いくつかの態様では、双方向発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターおよび／またはヒトアデノウイルス三区分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＡｄＴＰＬ）配列をさらに含む。関連する態様では、双方向発現ベクターは、最小限サイトメガロウイルスプロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）を含む。
【０００９】
様々な実施形態では、本開示は、双方向発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、宿主細胞における異種タンパク質発現を増加させるための方法を提供する。
【００１０】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩを含む。様々な実施形態では、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩの配向は、５’：３’である（すなわち、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩは、同じ配向にある）。様々な態様では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号３または配列番号３と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号４または配列番号４と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む。
【００１１】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含み、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡと同じ配向にある。様々な実施形態では、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号５または配列番号５と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む。
【００１２】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、最小限ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）および選択マーカー（ＳＭ）を含む。様々な実施形態では、ｍｉｎＣＭＶおよびＳＭの配向は、３’：５’である（すなわち、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩは、ｍｉｎＣＭＶおよびＳＭに対して逆配向にある）。様々な実施形態では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。
【００１３】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、ＧＯＩ、およびＳＭを含む。関連する態様では、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩの配向は、５’：３’である（すなわち、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩは、同じ配向にある）。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号３または配列番号３と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む。関連する実施形態では、双方向発現ベクターは、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含み、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩと同じ配向にある。関連する実施形態では、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号３または配列番号３と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む。関連する実施形態では、ＳＭの配向は、３’：５’である（すなわち、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、およびＧＯＩに対して逆配向にある）。関連する実施形態では、ＳＭは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡの上流にある。関連する実施形態では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。
【００１４】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡと、ＣＭＶプロモーターおよび／またはヒトアデノウイルス三区分リーダー（ＡｄＴＰＬ）配列と、ＧＯＩと、ｍｉｎＣＭＶと、ＳＭと、を含む。
【００１５】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＣＭＶプロモーター、ＧＯＩ、ならびにＳＭを含む。
【００１６】
様々な実施形態では、本開示による双方向発現ベクターは、選択マーカー遺伝子をさらに含む。様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。様々な態様では、ＳＭは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ  ＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）、ゼオシン、フレオマイシン、ブレオマイシン耐性遺伝子ｂｌｅ（酵素不明）、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、変異型のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）、ブロモキシニルニトリラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）、エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸（ＥＰＳＰ）シンターゼ（ａｒｏ  Ａ）、筋肉特異的チロシンキナーゼ受容体分子（ＭｕＳＫ−Ｒ）、銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄ１）、メタロチオネイン（ｃｕｐ１、ＭＴ１）、ベータ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）、ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ（ｐａｃ）、ブラスチシジンアセチルトランスフェラーゼ（ｂｌｓ）、ブラスチシジンデアミナーゼ（ｂｓｒ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）、Ｎ−スクシニル−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンテターゼ（ａｄｅ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇ４）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕ２）、インベルターゼ（ｓｕｃ２）、およびオロチジン−５’−リン酸（ＯＭＰ）デカルボキシラーゼ（ｕｒａ３）からなる群から選択される。
【００１７】
様々な実施形態では、本開示は、宿主細胞における異種タンパク質発現を増加させるための方法であって、本開示による双方向発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、方法を提供する。様々な態様では、宿主細胞は、真核細胞または原核細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。様々な態様では、宿主細胞は、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。様々な態様では、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）である。様々な態様では、宿主細胞は、植物細胞である。様々な態様では、宿主細胞は、原生動物細胞である。様々な態様では、宿主細胞は、である。様々な態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。様々な態様では、宿主細胞は、ヒト細胞である。様々な態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター細胞である。様々な態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。様々な態様では、宿主細胞は、無血清懸濁液適応ＣＨＯ細胞株（ＳＦＳＡ  ＤＧ４４）である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】双方向発現ベクターｐＤＥＦ９０（図１Ａ）、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶ（図１Ｂ）、およびｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦ（図１Ｃ）のマップを示す。図１Ａは、５’および３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよび最小限ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーターを含むｐＤＥＦ９０を示す。ｍｉｎＣＭＶプロモーターは、ＣＨＥＦプロモーターの上流に逆配向で存在する。ＤＨＦＲ遺伝子は、ＣＨＥＦプロモーターに関して逆配向で最小限ＣＭＶ要素の下流に存在する。図１Ｂは、５’および３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを含むｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶを示す。ｍｉｎＣＭＶプロモーターは、ｐＤＥＦ９０ベクターから削除されている。ＤＨＦＲ遺伝子は、ＣＨＥＦプロモーターの上流に逆配向で存在する。図１Ｃは、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦを示し、４ｋｂの５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡが削除されており、ｐＤＥＦ９０は、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを含み、ＤＨＦＲ遺伝子は、最小限ＣＭＶプロモーターの下流に存在する。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図２Ａ−２Ｄ】ｐＤＥＦ９０ベクターのトランスフェクション、ならびに２１日にわたる回復および選択中のトランスフェクションプールの細胞成長、生存率、倍加時間、および世代に対するそれらの影響を示す。生存細胞密度（図２Ａ）、生存率（図２Ｂ）、細胞倍加時間（図２Ｃ）、ｐＤＥＦ３８、ｐＤＥＦ９０、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦ、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶについての世代数（図２Ｄ）、および模擬対照。
【図３Ａ】ｐＤＥＦ９０が、無血清懸濁液適応（ＳＦＳＡ）細胞において異種タンパク質の発現を促進することを示す。ＳＦＳＡ細胞の、ｐＤＥＦ９０−ＧＦＰ−１およびｐＤＥＦ９０−ＧＦＰ−２によるトランスフェクション（線状化プラスミドによるＳＦＳＡ細胞におけるトランスフェクションの重複）の０〜２１日後の生存細胞密度（図３Ａ）および生存率（図３Ｂ）を示す。ＣＤＣＩＭ１培地においてトランスフェクタントを回復し、Ｇｕａｖａフローサイトメーターを使用してＧＦＰを測定した。図３Ｃは、緑色蛍光（ＧＲＮ−ＨＬｏｇ）、ｐＤＥＦ９０−ＧＦＰプール、およびｐＤＥＦ９０（ＧＦＰなし）によりトランスフェクトされたプールの測定による、２つのｐＤＥＦ９０−ＧＦＰトランスフェクションプールの計数を示す。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図４】ｐＥＦ９０−ＧＦＰクローンのＧＦＰ発現を示す。フローサイトメトリーによって、ＧＦＰ発現について１２個のクローンを分析した。左のピーク：トランスフェクトされていない細胞、右のピーク：ｐＤＥＦ９０−ＧＦＰクローン。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、様々な態様では、チャイニーズハムスター伸長因子−１α（ＣＨＥＦ１）転写調節ＤＮＡ、対象となる遺伝子（ＧＯＩ）、および選択マーカー（ＳＭ）を含む様々な双方向発現ベクターを提供する。関連する態様では、双方向発現ベクターはまた、最小限サイトメガロウイルス（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、および／またはヒトアデノウイルス三区分リーダー（ＡｄＴＰＬ）配列を含み得る。
【００２０】
組換えタンパク質の高レベルの発現を達成するための発現ベクター（一方向発現ベクター）におけるＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ要素の使用は、以前に記載されている（米国特許第５，８８８，８０９号、同第９，２１２，３６７号、同第９，２９７，０２４号（それらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，２００４）。ＣＨＥＦ１駆動ベクターからのタンパク質発現は、いくつかの異なるタンパク質および宿主細胞型について、ＣＭＶプロモーター制御ベクターからのタンパク質発現よりも有意に高いことが示されており、その増加は、２５０倍を超える可能性がある（Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，２００４）。ＡｄＴＰＬ配列は、それらの翻訳を促進する後期ウイルスｍＲＮＡ上に見られる２００ヌクレオチド５’非コード配列である（Ｌｏｇａｎ，ＰＮＡＳ  ８１：３６５５；１９８４）。
【００２１】
定義
本明細書で使用される場合、以下の定義は、当業者が本開示を理解するのを助けるのに有用であり得る。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「双方向」という用語は、５’〜３’（転写方向）および３’〜５’（それぞれの反対の転写方向）の両方における対象となる遺伝子または選択マーカーの発現を指す。「双方向発現ベクター」という用語は、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットが反対方向に配列されるように発現カセットが組織化されている、すなわち、対象となる遺伝子（ＧＯＩ）についての発現カセットが、１つの転写方向にあり、選択マーカー（ＳＭ）についての発現カセットが、それぞれの反対の転写方向にある、発現ベクターを指す。
【００２３】
「発現ベクター」または「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子を指す。様々な態様では、発現ベクターは、核酸、プラスミド、コスミド、ウイルス、または人工染色体である。本開示による「発現プラスミド」または「プラスミド」は、実施例にさらに記載されている。
【００２４】
ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される場合、「脱最適化された」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質の翻訳が、ポリヌクレオチドが導入された宿主細胞にとって最適ではないようにポリヌクレオチドが改変されていることを意味する。ポリヌクレオチドは、多くの方法で脱最適化されており、本発明は、本明細書で例示される方法によって限定されない。
【００２５】
「宿主細胞」という用語は、次に細胞によって発現されるＧＯＩを保有する双方向発現ベクターによって形質転換、トランスフェクト、または形質導入された細胞を指す。宿主細胞は、様々な態様では、原核細胞または真核細胞である。様々な態様では、宿主細胞は、細菌細胞、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞である。この用語はまた、対象となる遺伝子が存在する限り、子孫が遺伝子型または表現型において親と同一であるかどうかに関係なく、親宿主細胞の子孫を指す。
【００２６】
「サイトメガロウイルスプロモーター」または「ＣＭＶプロモーター」という用語は、当該技術分野で知られているＣＭＶプロモーター配列を指す。様々な態様では、ＣＭＶプロモーターは、マウス（ｍＣＭＶ）またはヒト（ｈＣＭＶ）を含む任意の起源のものである。様々な態様では、ｈＣＭＶは、任意のＣＭＶ株に由来する。様々な態様では、ＣＭＶ株は、ＡＤ１６９、Ｄａｖｉｓ、Ｔｏｌｅｄｏ、またはＴｏｗｎｅである。本開示の様々な実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、配列番号１に記載のポリヌクレオチドを含有する。
【００２７】
「最小限ＣＭＶ」または「ｍｉｎＣＭＶ」プロモーターという用語は、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位を含むＣＭＶプロモーターの最小限要素を指し、これは、プロモーター活性を増強する調節要素がない上流に配置されない限り、不活性である（または基本活性が非常に低い）。本開示で使用するためのｍｉｎＣＭＶプロモーターの例には、配列番号６に記載のポリヌクレオチドが含まれる。
【００２８】
「ＡｄＴＰＬ配列」という用語は、当該技術分野で知られているヒトアデノウイルス後期ウイルスｍＲＮＡに存在する約２００ヌクレオチドの５’非コード配列を指す。様々な実施形態では、ＡｄＴＰＬ配列は、配列番号２に記載のポリヌクレオチドを含有する。
【００２９】
「転写調節ＤＮＡ」という用語は、プロモーター領域ならびにエンハンサー、絶縁体、および足場／マトリックス付着領域などの要素などの遺伝子の転写を制御することができるシス作用調節要素を含む非コード配列を指す。
【００３０】
「ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ」という用語は、プロモーター領域ならびにエンハンサー、絶縁体、および足場／マトリックス付着領域などの要素などのＣＨＥＦ１遺伝子の転写を制御することができるシス作用調節要素を含む非コード配列を指す。
【００３１】
「５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ」という用語は、天然の場合、チャイニーズハムスターゲノムにおけるＣＨＥＦ１遺伝子の開始コドンの５’、すなわち、上流に位置するＤＮＡを指す。
【００３２】
「３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ」という用語は、天然の場合、チャイニーズハムスターゲノムにおけるＣＨＥＦ１遺伝子の終止コドンの３’、すなわち、下流に位置するＤＮＡを指す。
【００３３】
「およそ」および「約」という用語は、参照量の近い範囲内にある量を指す。ポリヌクレオチドに関して、およそ／約特定された長さである配列は、列挙された長さの５％以内である。
双方向発現ベクター
【００３４】
双方向発現ベクターは、対象となる１つ以上の遺伝子と、任意選択的に選択マーカーと、を構成的に発現するように設計されている。様々な態様では、双方向ベクターは、１つ以上のプロモーターをコードし得る。様々な態様では、発現ベクターは、１、２、３、または４つの対象となる遺伝子を含む。関連する態様では、１、２、３、または４つの対象となる遺伝子は、１つまたは任意選択的に２つのプロモーターの制御下にある。
【００３５】
本発明の双方向発現ベクターは、選択マーカー（ＤＨＦＲ）およびＧＯＩが同じＣＨＥＦ１プロモーターから発現されるので、対象となる遺伝子（ＧＯＩ）の安定性の向上を可能にする。
ｐＤＥＦ９０
【００３６】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、ｍｉｎＣＭＶ、ＧＯＩ、およびＳＭを含む。
【００３７】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、５’：３’の配向でＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩを含む（すなわち、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩは、同じ配向にある）。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号３を含む。本開示はまた、配列番号３に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号４に記載のポリヌクレオチドを含む。本開示はまた、配列番号４に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’：５’の配向でｍｉｎＣＭＶおよびＳＭを含む（すなわち、ｍｉｎＣＭＶおよびＳＭは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩに対して逆配向にある）。様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。本開示の様々な実施形態では、ｍｉｎＣＭＶプロモーターは、配列番号６に記載のポリヌクレオチドを含有する。
【００３８】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含む。様々な実施形態では、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号５を含む。本開示はまた、配列番号５に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００３９】
ｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶ
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、ＧＯＩ、およびＳＭを含む。様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、５’：３’の配向でＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩを含む（すなわち、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩは、同じ配向にある）。関連する実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号３を含む。本開示はまた、配列番号３に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号４に記載のポリヌクレオチドを含む。本開示はまた、配列番号４に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００４０】
関連する態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含む。様々な実施形態では、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号５を含む、本開示は、配列番号５に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００４１】
関連する態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’：５’の配向でＳＭを含む（すなわち、ＳＭは、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、およびＧＯＩに対して逆配向にある）。様々な態様では、ＳＭは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡの上流にある。様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。関連する態様では、前述のＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ配列は、ＳＭおよびＧＯＩの両方の発現を促進する。
ｐＤＥＦ９０  ＣＨＥＦ  ＣＭＶ  ＡｄＴＰＬハイブリッド
【００４２】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡと、ＣＭＶプロモーターおよび／またはヒトアデノウイルス三区分リーダー（ＡｄＴＰＬ）配列と、ＧＯＩと、ｍｉｎＣＭＶと、ＳＭと、を含む。様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。本開示の様々な実施形態では、ＡｄＴＰＬは、配列番号２に記載のポリヌクレオチドを含有する。
【００４３】
関連する態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含む。関連する実施形態では、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号５を含む。本開示はまた、配列番号５に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００４４】
ＣＨＥＦおよびＣＭＶを有するｐＤＥＦ９０
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＣＭＶプロモーター、ＧＯＩ、ならびにＳＭを含む。様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。本開示の様々な態様では、ＣＭＶプロモーターは、配列番号１に記載のポリヌクレオチドを含有する。
【００４５】
様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号３を含む。本開示はまた、配列番号３に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号４に記載のポリヌクレオチドを含む。本開示はまた、配列番号４に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００４６】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含む。様々な実施形態では、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号５を含む。本開示はまた、配列番号５に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００４７】
ｐＤＥＦ９３ＣＭＶ
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、効率的なｍＲＮＡプロセシングのためにＳＭの３’末端に５’ＵＴＲおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を有する、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、ｍｉｎＣＭＶ、ＧＯＩ、およびＳＭを含む。
【００４８】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、５’：３’の配向でＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩを含む（すなわち、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩは、同じ配向にある）。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号３を含む。本開示はまた、配列番号３に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号４に記載のポリヌクレオチドを含む。本開示はまた、配列番号４に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００４９】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ｍｉｎＣＭＶおよびＳＭを３’：５’の配向で含む（すなわち、ｍｉｎＣＭＶおよびＳＭは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩに対して逆配向にある）。様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。本開示の様々な実施形態では、ｍｉｎＣＭＶプロモーターは、配列番号６に記載のポリヌクレオチドを含有する。
【００５０】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含む。様々な実施形態では、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号５を含む。本開示はまた、配列番号５に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００５１】
ｐＤＥＦ９４ＣＭＶ
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、効率的なｍＲＮＡプロセシングのためにＳＭの３’末端にＳＶ４０ポリアデニル化配列を有する、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡ、ｍｉｎＣＭＶ、ＧＯＩ、およびＳＭを含む。
【００５２】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、５’：３’の配向でＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩを含む（すなわち、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩは、同じ配向にある）。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号３を含む。本開示はまた、配列番号３に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。様々な実施形態では、５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号４に記載のポリヌクレオチドを含む。本開示はまた、配列番号４に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である５’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００５３】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、ｍｉｎＣＭＶおよびＳＭを３’：５’の配向で含む（すなわち、ｍｉｎＣＭＶおよびＳＭは、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＧＯＩに対して逆配向にある）。様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。本開示の様々な実施形態では、ｍｉｎＣＭＶプロモーターは、配列番号６に記載のポリヌクレオチドを含有する。
【００５４】
様々な態様では、本開示による双方向発現ベクターは、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡをさらに含む。様々な実施形態では、３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡは、配列番号５を含む。本開示はまた、配列番号５に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、または少なくとも７０％同一である３’ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡを提供する。
【００５５】
選択マーカー
選択マーカーは、トランスフェクション実験において使用され、宿主細胞のタンパク質欠損を補完するか、または別様に毒性の薬剤に対する耐性を与え、それにより対象となる同時形質転換遺伝子の存在（発現）を選択する。
【００５６】
様々な態様では、双方向発現ベクターは、形質転換細胞の同定のための選択マーカー（ＳＭ）遺伝子をさらに含む。好適なＳＭ遺伝子の例には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ  ＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）、ゼオシン、フレオマイシン、ブレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、変異型のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）、ブロモキシニルニトリラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）、エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸（ＥＰＳＰ）シンターゼ（ａｒｏ  Ａ）、筋肉特異的チロシンキナーゼ受容体分子（ＭｕＳＫ−Ｒ）、銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄ１）、メタロチオネイン（ｃｕｐ１、ＭＴ１）、ベータ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）、ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ（ｐａｃ）、ブラスチシジンアセチルトランスフェラーゼ（ｂｌｓ）、ブラスチシジンデアミナーゼ（ｂｓｒ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）、Ｎ−スクシニル−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンテターゼ（ａｄｅ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇ４）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕ２）、インベルターゼ（ｓｕｃ２）、およびオロチジン−５’−リン酸（ＯＭＰ）デカルボキシラーゼ（ｕｒａ３）、ならびに上述のうちのいずれかのオルソログが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
本開示はまた、ＣＨＥＦ１転写調節ＤＮＡおよびＣＭＶプロモーターおよび／またはＡｄＴＰＬ配列を含む双方向発現ベクターにより形質転換、形質導入、またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。様々な態様では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。様々な態様では、宿主細胞は、ハムスター細胞である。様々な態様では、ハムスター細胞は、ＣＨＯ細胞である。様々な実施形態では、宿主細胞は、非ハムスター哺乳動物細胞であり、様々な態様では、細胞は、ヒト細胞である。
コドン脱最適化
【００５８】
様々な態様では、ＳＭは、コドン脱最適化されている。コドン脱最適化のための方法は、他の人々によって記載されている（Ｉｔａｋｕｒａ  １９８７，Ｋｏｔｕｌａ  １９９１，Ｈｏｌｌｅｒ  １９９３，Ｓｅｅｄ  １９９８）。しかしながら、コドン脱最適化の効用の例は限定されている。１つのそのような例は、ウイルス遺伝子を脱最適化して、最も優先度の低いコドンまたはランダム化されていないコドン対を組み込むことによって複製の適応度を低下させることである（Ｂｕｒｎｓ２００６，Ｍｕｅｌｌｅｒ  ２００６，Ｃｏｌｅｍａｎ２００８，Ｋｅｗ  ２００８）。コドン脱最適化の方法は、米国特許第９，２１２，３６７号にさらに記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられ、特に実施例を参照して、コドン脱最適化ＤＨＦＲコードポリヌクレオチド配列がＣＨＥＦ１発現ベクターｐＤＥＦ３８に導入されたことが記載されている（縦列１４〜１６）。提示されている例は、一般に、それらの種特異的宿主についての任意の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドにおけるコドンを脱最適化するために適用可能である。
対象となる遺伝子
【００５９】
様々な態様では、双方向発現ベクターは、１つ以上の対象となる遺伝子（ＧＯＩ）をさらに含む。好適なＧＯＩの例には、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体および他の糖タンパク質、バイオシミラー、Ｆｃ融合遺伝子、酵素、ワクチン、ペプチドホルモン、または成長因子が含まれるが、これらに限定されない。関連する態様では、抗体の場合、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）は、単一のプロモーターから単一のベクターで発現され得る。
ベクターおよび宿主細胞
【００６０】
選択される宿主細胞に有用な哺乳動物、酵母、真菌、昆虫、植物、またはウイルスベクターを含む、任意の真核生物および原核生物ベクターが、本方法における使用を企図される。「ベクター」という用語は、当該技術分野で認識されているように使用され、コード情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指す。「宿主細胞」という用語は、次に細胞によって発現される、選択される対象となる遺伝子を保有するベクターによって形質転換されているか、または形質転換され得る細胞を指すために使用される。この用語には、選択される遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構成において元の親と同一であるかどうかに関係なく、哺乳動物、酵母、真菌、昆虫、植物、原生動物の細胞、および親細胞の子孫が含まれる。概して、任意のベクターを本発明の方法において使用することができ、適切なベクターの選択は、一態様では、ＧＯＩの発現のために選択される宿主細胞に基づく。
【００６１】
例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞、ＣＭＣ  ＩＣＯＳ（ＳＦＳＡ  ＤＧ４４細胞）で作成された無血清懸濁液適応ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞株、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３もしくは２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）などの哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）細胞株、ならびにＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。さらに他の好適な哺乳動物細胞株には、Ｓｐ２／０、ＮＳ１およびＮＳ０マウスハイブリドーマ細胞、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ、またはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３株、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株（ＡＴＣＣからも入手可能である）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞には、形質転換細胞株を含む霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が含まれる。正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、ならびに一次外植片も好適である。
【００６３】
宿主細胞として同様に有用なものには、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの様々な株（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ番号３３６９４）ＤＨ５ｙ、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどの様々な株が含まれる。
【００６４】
当業者に知られている酵母細胞の多くの株も、ＧＯＩの発現のための宿主細胞として利用可能であり、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｒａｉｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが含まれる。
【００６５】
追加的に、必要に応じて、昆虫細胞系を本発明の方法で利用することができる。そのようなシステムには、例えば、限定されないが、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。
【００６６】
例示的な真菌細胞には、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを含むが限定されない、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（糸状菌）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、およびＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅを含むが限定されない、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（糸状菌）が含まれる。
【００６７】
例示的な原生動物細胞には、テトラヒメナ株およびトリパノソーマ株が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
本開示による発現プラスミドは、以下の実施例にさらに記載される。実施例は、本発明を例示するためだけに役立ち、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００６９】
遺伝子配列および発現ベクター−最小限ＣＭＶ要素（配列番号６）のＤＮＡ断片（６１ｂｐ）を、ＣＨＥＦプロモーターの上流のマイナス鎖にクローン化し（ＳＶ４０プロモーターの下流のＤＨＦＲ遺伝子カセットをｍｉｎＣＭＶ要素の下流のマイナス鎖に再クローン化し）、化学的に合成し、米国特許第９，２９７，０２４号のＣＨＥＦ１発現ベクターの以前に記載された配列であるｐＤＥＦ３８にクローン化し、本出願で配列番号７として提供し、ｐＤＥＦ９０と指定される双方向ＣＨＥＦ１−ｍｉｎＣＭＶ−プロモーターベクターを作成した（図１Ａ）。ｐＤＥＦ９０ベクターの２つのさらなる変形も生成された。双方向ＣＨＥＦ１プロモーターベクター（最小限ＣＭＶ要素が削除され、ＤＨＦＲ遺伝子がＣＨＥＦプロモーターの上流に逆配向で存在する）は、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶ（図１Ｂ）およびｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦ（４ｋｂの５’ＣＨＥＦ領域が除去され、ＤＨＦＲ遺伝子が最小限ＣＭＶ要素の下流に存在する）（図１Ｃ）を指定した。
【００７０】
すべてのプラスミドを、標準的な分子生物学技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．５４５，１９８２）を使用して調製した。それぞれのプラスミドのＤＮＡ配列を、配列表に提供する。ｐＤＥＦ９０（配列番号８）、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶ（配列番号９）、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦ（配列番号１０）、ｐＤＥＦ９３ＣＭＶ（配列番号１１）、ｐＤＥＦ９４ＣＭＶ（配列番号１２）。
【００７１】
ＣＨＯ細胞培養および培地−このプロジェクトのために使用される細胞株は、ＳＦＳＡと指定される無血清懸濁液適応ＣＨＯ細胞株であった。ＳＦＳＡ細胞株は、ｄｈｆｒ変異体ＣＨＯ細胞株であるＤＧ４４細胞株に由来した。ＤＧ４４細胞の起源は、Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｇａｍｍａ  Ｒａｙｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｌｏｃｕｓ：Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：５５５−５６６，１９８６）によって記載されている。
【００７２】
細胞株の開発全体を通じて、ＣＤ−ＣＩＭ１およびＢＭ１８培地を使用した。ＳＦＳＡ細胞を、トランスフェクション前に、２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の１／１００体積およびＨＴサプリメント（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の１／１００体積を加えたＣＤ−ＣＩＭ１：ＢＭ１８（７５：２５）混成培地に継代した。その後、トランスフェクトされたプールまたはクローンを、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠くＣＤ−ＣＩＭ１選択培地で完全に継代した。
【００７３】
特に明記されない限り、ＳＦＳＡ細胞培養を、３７℃、５％のＣＯ２で１２５ｒｐｍで振とうし、３日間のスケジュールで継代した。成長培養を、典型的には、０．３または０．４×１０６ｃ／ｍｌで播種した。培養液のスプリットが１：３より大きい場合は、希釈によって継代を行ったが、スプリットが１：３未満の場合は、遠心分離およびその後の新鮮な培地への細胞の懸濁によって継代を行った。エレクトロポレーションの１日前に、細胞を１×１０６ｃ／ｍｌで播種した。
【００７４】
実施例１：様々なベクター骨格プラスミドによる細胞のトランスフェクション
ＳＦＳＡ  ＤＧ４４細胞を、Ａ  Ｂｉｏｒａｄエレクトロポレーターを使用して、様々なプラスミド（ｐＤＥＦ３８、ｐＤＥＦ９０、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶ、およびｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦ）でトランスフェクトした。簡単に言うと、対数的に増殖する細胞を、ＤＮＡ／ＨＥＢＳバッファーミックスに再懸濁し、４ｃｍのギャップキュベットに移した。２０００万個の細胞を、１００μｇのプラスミドでトランスフェクトした。標準的なＣＨＯ設定を使用して、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を非選択培地で３日間回復させた後、完全な培地交換によってヒポキサンチンおよびチミジンを欠く選択培地に移した。細胞を、選択培地で定期的に（２〜４日）選択培地で継代した。トランスフェクトされた細胞は、培養生存率が９０％超に到達したときに、選択から完全に「回復」したと見なされた。
【００７５】
トランスフェクション後、選択培地での最初の継代の間に、予想されるように、培養生存率は低下し、細胞成長は減速した。選択から約２週間後、ｐＤＥＦ３８（ｐＤＥＦ３８−１）、ｐＤＥＦ９０（ｐＤＥＦ９０−１）、およびｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶ（ｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶ−１）でトランスフェクトされた細胞の培養細胞成長、生存率、倍加時間、および世代は、図２Ａ〜２Ｄに示されるように、９０％超まで回復し、ｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦ（ｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦ−１）でトランスフェクトされた細胞および模擬トランスフェクト細胞は、選択培地で回復しなかった。
【００７６】
これらの結果は、ｐＤＥＦ９０プラスミドによる模擬制御と比較した場合、ｐＤＥＦ９０プラスミドが、細胞が選択培地で成長するのに十分なＤＨＦＲを産生することができることを実証した。選択培地中の細胞についての回復時間は、ｐＤＥＦ３８プラスミドに匹敵した。ＣＨＥＦプロモーターを欠くプラスミドは選択培地（ｐＤＥＦ９０マイナスＣＨＥＦ）での成長を支援することができなかったため、ｐＤＥＦ９０プラスミドのＣＨＥＦ領域は、ｐＤＥＦ９０骨格からのＤＨＦＲ発現のために必要であった。回復期間はｐＤＥＦ９０およびｐＤＥＦ３８プラスミドよりもわずかに長かったが、ＣＨＥＦプロモーター単独で、選択培地（ｐＤＥＦ９０マイナスＣＭＶ）での成長を支援するために、逆配向で上流にクローン化されたＤＨＦＲカセットからの遺伝子発現を促進することができた。
【００７７】
実施例２：ｐＤＥＦ９０  ＧＦＰプラスミドによる細胞のトランスフェクション
ＳＦＳＡ  ＤＧ４４細胞を、ｐＤＥＦ９０−ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（トランスフェクションの重複）。エレクトロポレーションの前に、ｐＤＥＦ９０プラスミドを、Ｐｖｕ１酵素を使用して線状化した。ＤＮＡをエタノール沈殿によって精製し、オートクレーブ注入用水（ＷＦＩ）に再懸濁した。対数的に増殖する細胞を、ＤＮＡ／ＨＥＢＳバッファーミックスに再懸濁し、４ｃｍのギャップキュベットに移した。２０００万個の細胞を、１００μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。続いて、標準的なＣＨＯ設定を使用して、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を非選択培地で３日間回復させた後、完全な培地交換によってヒポキサンチンおよびチミジンを欠く選択培地に移した。細胞を選択培地で定期的に（２〜４日）継代した。トランスフェクトされ細胞は、培養生存率が９０％超に到達したときに選択から完全に「回復」したと見なされた（図３Ａおよび３Ｂ）。回復されたプールからの細胞を使用して、Ｇｕａｖａフローサイトメーターおよび関連するＥｘｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏソフトウェアを使用してＧＦＰ発現を分析した。空のベクターｐＤＥＦ９０でトランスフェクトされた細胞は、ＧＦＰ発現の陰性対照として機能した（図３Ｃ）。
【００７８】
これらの結果は、ｐＤＥＦ９０プラスミド骨格が選択培地でＣＨＯ細胞の成長を維持し、異種タンパク質の発現を促進することを示している。
【００７９】
実施例３：細胞株のクローン化およびクローンの拡大
１つのｐＤＥＦ９０−ＧＦＰトランスフェクションプールからの細胞を、限界希釈クローン化法によってクローン化した。激しくピペッティングすることによってプールからの細胞をクローン化培地に再懸濁し、任意の複数細胞集塊を分離し、理論的な０．５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。合計５枚のプレートに播種した。クローン化培地は、３日間の成長後にプールから単離された６．２％のＢＭ１８、３４．４％のＤＭＥＭ／Ｆ１２、３４．４％のＣＤ−ＣＩＭ１、および２５％の条件培地の混成からなる。条件培地を収集するために、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を０．２ミクロンのＰＥＳフィルターを通して濾過した。モノクローナル細胞株は、ＳｏｌｅｎｔｉｍからのＣｅｌｌ  Ｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｅｒを使用した１４日間の連続イメージングによって、単一の細胞に由来することが確認された。単一のコロニーを含有するウェルを同定し、各クローンのモノクローナル性を、０日目の画像におけるコロニーの起点で単一の細胞を同定することによって証明または反証した。
【００８０】
９６ウェルプレートからのコロニーは、ＣＭＣ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓクローン化プラットフォームを通して実行された過去の抗体および組換えタンパク質プロジェクトと一致する形態および成長率を示した。選択される１２個のモノクローナルコロニーを６ウェルプレートに拡大した。これらのプレートを、５％のＣＯ２中、３７℃で１２５ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。十分な細胞密度が達成されたら、Ｇｕａｖａフローサイトメーターおよび関連するＥｘｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して、ＧＦＰ発現について各クローンを分析した。トランスフェクトされていない細胞は、ＧＦＰ発現の陰性対照として機能した。
【００８１】
６ウェルプレートにスケーリングされた１２個のクローンのうち１１個のクローンは、様々なレベルの蛍光でＧＦＰ発現について陽性であった（図４）。
【００８２】
本明細書に開示され、特許請求される組成物のうちのすべてを、本開示の観点から過度の実験なしで作製および実施することができる。本開示の組成物は、特定の実施形態に関して記載されているが、本開示の概念および範囲から逸脱することなく、組成物の変形を行うことができることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生物学的の両方に関連する特定のポリヌクレオチドを、本明細書に記載のポリヌクレオチドの代わりに使用して、同じまたは類似の結果を達成することができることは明らかであろう。当業者に明らかなすべてのそのような類似の置換および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲および概念の範囲内であると見なされる。
【００８３】
本明細書全体を通して引用される参考文献は、それらが本明細書に記載されるものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、すべてが参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【図１Ａ】
2021510304.tif 000002
【図１Ｂ】
2021510304.tif 000003
【図１Ｃ】
2021510304.tif 000004
【図２Ａ−２Ｄ】
2021510304.tif 000005
【図３Ａ】
2021510304.tif 000006
【図３Ｂ】
2021510304.tif 000007
【図３Ｃ】
2021510304.tif 000008
【図４】
2021510304.tif 000009
【配列表】
2021510304000001.app
【国際調査報告】
2021510304.tif 000010
2021510304.tif 000011
2021510304.tif 000012