(57)【要約】  本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化するための、二重特異性抗原結合性分子を含む、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明は、抗体を産生するための方法、およびそれらを疾患の治療に使用するための方法にさらに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体であって、抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１のＷＴ１ペプチド、特にＷＴ１ＲＭＦペプチドの少なくとも３つのアミノ酸残基を含む、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦのエピトープに結合する抗体。
【請求項２】
少なくとも３つのアミノ酸残基が、ＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｍ２、Ｐ４、Ｎ５、Ａ６、およびＹ８に対応するアミノ酸残基から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体であって、抗体は、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、および配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、および配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、および配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、および配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、および配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、および配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２、および配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む抗体。
【請求項４】
抗体が、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、完全長抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、およびＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、多重特異性抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原はＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１であり、第１の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、および配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、および配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、および配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、および配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、および配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、および配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２、および配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む第１の抗原結合性部分、ならびに
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合性部分
を含む、二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１０】
第１の抗原結合性部分が、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項９に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１１】
第２の抗原が、ＣＤ３、特にＣＤ３εである、請求項９または１０に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１２】
第２の抗原結合性部分が、
（ｉ）配列番号１１５のＨＣＤＲ１、配列番号１１６のＨＣＤＲ２、および配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２、および配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉ）配列番号１３０のＨＣＤＲ１、配列番号１３１のＨＣＤＲ２、および配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１３３のＬＣＤＲ１、配列番号１３４のＬＣＤＲ２、および配列番号１３５のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む、請求項１１に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１３】
第２の抗原結合性部分が、
（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項１２に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１４】
第１および／または第２の抗原結合性部分が、Ｆａｂ分子である、請求項９から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１５】
第２の抗原結合性部分が、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１、特に可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１６】
第１の抗原結合性部分が、定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である、請求項９から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１７】
第１および第２の抗原結合性部分が、互いに、任意選択でペプチドリンカーを介して融合されている、請求項９から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１８】
第１および第２の抗原結合性部分が、各々がＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているかのいずれかである、請求項９から１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項１９】
第３の抗原結合性部分を含む、請求項９から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項２０】
第３の抗原部分が、第１の抗原結合性部分と同一である、請求項１９に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項２１】
第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、請求項９から２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項２２】
第１、第２、および存在する場合は第３の抗原結合性部分が、各々Ｆａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているかのいずれかであり；ならびに第３の抗原結合性部分は、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項２１に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項２３】
Ｆｃドメインが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項２１または２２に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項２４】
Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項２５】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置決め可能である第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起を位置決め可能である第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞が生成される、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項２６】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体との結合および／またはエフェクター機能を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子をコードする１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、１つまたは複数のベクター、特に発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体を産生するための方法であって、ａ）抗体の発現に好適な条件下で請求項２９に記載の宿主細胞を培養する工程、およびｂ）任意選択で抗体を回収する工程を含む方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法により産生される、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体。
【請求項３２】
請求項１から２６または３１のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
医薬として使用するための、請求項１から２６もしくは３１のいずれか一項に記載の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子、または請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
疾患の治療に使用するための、請求項１から２６もしくは３１のいずれか一項に記載の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子、または請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
疾患が、がんである、請求項３４に記載の抗体、二重特異性抗原結合性分子、または薬学的組成物。
【請求項３６】
疾患の治療に使用するための医薬の製造における、請求項１から２６または３１のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子の使用。
【請求項３７】
個体の疾患を治療するための方法であって、請求項１から２６または３１のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む、薬学的に許容される形態の治療的有効量の組成物を、個体に投与することを含む方法。
【請求項３８】
疾患が、がんである、請求項３６に記載の使用または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化するための、二重特異性抗原結合性分子を含む、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明は、抗体を産生するための方法、およびそれらを疾患の治療に使用するための方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＴ１（ウィルムス腫瘍１、ウィルムス腫瘍タンパク質）は、細胞増殖、分化、ならびにアポトーシスおよび臓器発生に関与するがん遺伝子転写因子であり、正常成体組織でのその発現は希である（ＨｉｎｒｉｃｈｓおよびＲｅｓｔｉｆｏ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３年）３１巻、９９９〜１００８頁）。しかしながら、ＷＴ１は、幾つかのタイプの血液学的悪性腫瘍（ｍａｌｉｇａｎｃｉｅｓ）および幅広い範囲の固形腫瘍で過剰発現されることが報告されている（Ｖａｎ  Ｄｒｉｅｓｓｃｈｅら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ（２０１２年）１７巻、２５０〜２５９頁）。ＷＴ１は、核タンパクであり、細胞内に局在化される。細胞内タンパク質は、プロテアソームで分解され、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ＩによりＴ細胞エピトープとして細胞表面にプロセシングおよび提示され、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により認識され得る。そのため、ＷＴ１ＲＭＦ（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）およびＷＴ１ＶＬＤ（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ）などのＷＴ１由来ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２と結合した状態で細胞表面に提示され、Ｔ細胞認識を誘発することができる。
【０００３】
ＷＴ１由来ペプチドおよび養子Ｔ細胞移入またはＷＴ１特異的Ｔ細胞に基づくがんワクチンの開発を含む、がん（免疫）療法の標的としてＷＴ１を活用する幾つかの手法が採用されている。また、それらの二重特異性誘導体を含む、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体に対するＴＣＲ様抗体が生成されている（Ｄａｏら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１３年）５巻、１７６ｒａ３３；国際公開第２０１２／１３５８５４号パンフレット；Ｄａｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１５年）３３巻、１０７９〜１０８６頁；国際公開第２０１５／０７００６１号パンフレット；国際公開第２０１７／０６０２０１号パンフレット）。
【０００４】
標的細胞の表面抗原およびＴ細胞のＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗体（本明細書ではＴ細胞二重特異性抗体または「ＴＣＢ」とも呼ばれる）は、種々のがんの治療に非常に有望である。そのような抗体がその標的の両方と同時に結合すると、標的細胞とＴ細胞との相互作用が一時的に強制され、Ｔ細胞受容体の架橋、および任意の細胞傷害性Ｔ細胞のその後の活性化、および標的細胞のその後の溶解が引き起こされることになる。標的細胞死滅におけるそれらの力価を考慮すると、Ｔ細胞二重特異性抗体にとって、オンおよびオフターゲット毒性を回避するには、標的の選択および標的指向性抗体の特異性が最も重要である。ＷＴ１などの細胞内タンパク質は、魅力的な標的であるが、細胞内タンパク質に由来するペプチド抗原を細胞表面に提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体に接近可能であるに過ぎない。ＴＣＲ様抗体につきまとう問題は、ＭＨＣ分子それ自体との、または所望のものではないペプチドを提示するＭＨＣ分子との交差反応性の可能性であり、それにより臓器または組織選択性が損なわれる場合がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合し、治療目的に特に有利な特性を有する、二重特異性抗体を含む新規抗体を提供する。
【０００６】
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する、予期しない向上された特性を有する新規抗体を開発した。特に、これら抗体は、良好な親和性および顕著な特異性でＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する。さらに、本発明者らは、新規のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体が組み込まれており、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１および活性化Ｔ細胞抗原に結合し、良好な有効性および生産可能性と低毒性および有利な薬物動態学的特性とを併せ持つ二重特異性抗原結合性分子を開発した。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、および配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、および配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、および配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、および配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、および配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、および配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２、および配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む抗体を提供する。
【０００８】
一実施態様では、抗体は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【０００９】
一実施態様では、抗体は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様では、抗体は完全長抗体である。別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、およびＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。一実施態様では、抗体は多重特異性抗体である。
【００１０】
また、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原はＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１であり、第１の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、および配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、および配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、および配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、および配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、および配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、および配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２、および配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む第１の抗原結合性部分；ならびに
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合性部分
を含む二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【００１１】
一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【００１２】
一実施態様では、第２の抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３εである。一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１１５のＨＣＤＲ１、配列番号１１６のＨＣＤＲ２、および配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２、および配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。一実施態様では、第２の抗原結合性部分のＶＨは、配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合性部分のＶＬは、配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、第１および／または第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ分子である。一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１、特に可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である。一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、定常ドメインでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である。一実施態様では、第１および第２の抗原結合性部分は、互いに、任意選択でペプチドリンカーを介して融合されている。一実施態様では、第１および第２の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているかのいずれかである。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３の抗原結合性部分を含む。一実施態様では、第３の抗原部分は、第１の抗原結合性部分と同一である。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。一実施態様では、第１、第２、および存在する場合は第３の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端がＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端がＦｃドメインの第１のサブユニットの���末端に融合されているかのいずれかであり；ならびに第３の抗原結合性部分は、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端がＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置決め可能である第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起をその内に位置決め可能である第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞が生成される。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体との結合および／またはエフェクター機能を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【００１３】
本発明の別の態様によると、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子をコードする１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の発現ベクター、および本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。一部の実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００１４】
別の態様では、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体を産生するための方法であって、ａ）抗体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、およびｂ）抗体を回収する工程を含む方法が提供される。また、本発明は、本発明の方法により産生された、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体を包含する。
【００１５】
本発明は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００１６】
本発明の抗体、二重特異性抗原結合性分子、および薬学的組成物を使用するための方法も、本発明により包含される。一態様では、本発明は、医薬として使用するための、本発明による抗体、二重特異性抗原結合性分子、または薬学的組成物を提供する。一態様では、疾患の治療に使用するための、本発明による抗体、二重特異性抗原結合性分子、または薬学的組成物が提供される。具体的な実施態様では、疾患はがんである。
【００１７】
疾患を治療するための医薬の製造における、本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子の使用；ならびに個体の疾患を治療するための方法であって、本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む、薬学的に許容される形態の治療的有効量の組成物を個体に投与することを含む方法も提供される。具体的な実施態様では、疾患はがんである。上記の実施態様のいずれかでは、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ−Ｆ】本発明の二重特異性抗原結合性分子の例示的な構成を示す図である。（Ａ、Ｄ）「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図示。（Ｂ、Ｅ）代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｃ、Ｆ）「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｇ、Ｋ）代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｈ、Ｌ）「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓｆａｂおよび代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」分子の図示。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子の図示。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図示。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子の図示。黒色ドット：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋、−−：任意選択でＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入される電荷が反対のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の交換を含むものとして図示されているが、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、その代わりにＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの交換を含んでいてもよい。
【図１Ｇ−Ｎ】本発明の二重特異性抗原結合性分子の例示的な構成を示す図である。（Ａ、Ｄ）「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図示。（Ｂ、Ｅ）代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｃ、Ｆ）「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｇ、Ｋ）代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｈ、Ｌ）「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓｆａｂおよび代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」分子の図示。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子の図示。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図示。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子の図示。黒色ドット：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋、−−：任意選択でＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入される電荷が反対のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の交換を含むものとして図示されているが、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、その代わりにＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの交換を含んでいてもよい。
【図１Ｏ−Ｖ】本発明の二重特異性抗原結合性分子の例示的な構成を示す図である。（Ａ、Ｄ）「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図示。（Ｂ、Ｅ）代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｃ、Ｆ）「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｇ、Ｋ）代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｈ、Ｌ）「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓｆａｂおよび代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」分子の図示。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子の図示。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図示。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子の図示。黒色ドット：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋、−−：任意選択でＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入される電荷が反対のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の交換を含むものとして図示されているが、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、その代わりにＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの交換を含んでいてもよい。
【図１Ｗ−Ｚ】本発明の二重特異性抗原結合性分子の例示的な構成を示す図である。（Ａ、Ｄ）「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図示。（Ｂ、Ｅ）代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｃ、Ｆ）「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｇ、Ｋ）代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｈ、Ｌ）「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓｆａｂおよび代替順序の（「逆位の」）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分およびＦａｂ成分を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」分子の図示。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図示。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子の図示。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図示。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子の図示。黒色ドット：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋、−−：任意選択でＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入される電荷が反対のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の交換を含むものとして図示されているが、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、その代わりにＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの交換を含んでいてもよい。
【図２】実施例で調製されたＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体分子の図示である。試験したＴＣＢ抗体分子はすべて、電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位」として産生された（ＣＤ３結合体におけるＶＨ／ＶＬ交換、ＷＴ１結合体における電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）。
【図３Ａ−Ｄ】ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対するＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１  ＩｇＧ抗体の結合を示す図である。（Ａ）１１Ｄ０６  ＩｇＧ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＩｇＧ、（Ｃ）１１Ｂ０９−ＩｇＧ、（Ｄ）１３Ｂ０４−ＩｇＧ、（Ｅ）５Ｅ１１−ＩｇＧ、（Ｆ）５Ｃ０１−ＩｇＧ、（Ｇ）１１Ｇ０６−ＩｇＧ。
【図３Ｅ−Ｇ】ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対するＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１  ＩｇＧ抗体の結合を示す図である。（Ａ）１１Ｄ０６  ＩｇＧ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＩｇＧ、（Ｃ）１１Ｂ０９−ＩｇＧ、（Ｄ）１３Ｂ０４−ＩｇＧ、（Ｅ）５Ｅ１１−ＩｇＧ、（Ｆ）５Ｃ０１−ＩｇＧ、（Ｇ）１１Ｇ０６−ＩｇＧ。
【図４Ａ−Ｄ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）が、ペプチドでパルスされたＴ２細胞に結合すると、Ｔ細胞が活性化されることを示す図である（ＮＦＡＴレポーターアッセイ）。（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｃ）１１Ｂ０９−ＴＣＢ、（Ｄ）１３Ｂ０４−ＴＣＢ、（Ｅ）ＥＳＫ１−ＴＣＢ、（Ｆ）５Ｅ１１−ＴＣＢ。（Ｇ）５Ｃ０１−ＴＣＢ、（Ｈ）ＤＰ４７ＧＳ−ＴＣＢ。
【図４Ｅ−Ｈ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）が、ペプチドでパルスされたＴ２細胞に結合すると、Ｔ細胞が活性化されることを示す図である（ＮＦＡＴレポーターアッセイ）。（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｃ）１１Ｂ０９−ＴＣＢ、（Ｄ）１３Ｂ０４−ＴＣＢ、（Ｅ）ＥＳＫ１−ＴＣＢ、（Ｆ）５Ｅ１１−ＴＣＢ。（Ｇ）５Ｃ０１−ＴＣＢ、（Ｈ）ＤＰ４７ＧＳ−ＴＣＢ。
【図５Ａ−Ｄ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）により媒介された、ペプチドでパルスされたＴ２細胞の死滅を示す図である。（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｃ）１３Ｂ０４−ＴＣＢ、（Ｄ）１１Ｂ０９−ＴＣＢ、（Ｅ）３３Ｆ０５−ＴＣＢ、（Ｆ）５Ｃ０１−ＴＣＢ。
【図５Ｅ−Ｆ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）により媒介された、ペプチドでパルスされたＴ２細胞の死滅を示す図である。（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｃ）１３Ｂ０４−ＴＣＢ、（Ｄ）１１Ｂ０９−ＴＣＢ、（Ｅ）３３Ｆ０５−ＴＣＢ、（Ｆ）５Ｃ０１−ＴＣＢ。
【図６Ａ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）により媒介された、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋腫瘍細胞株の死滅を示す図である。（Ａ）細胞株の概要。（Ｂ〜Ｅ）（Ｂ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｃ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｄ）１１Ｂ０９−ＴＣＢ、（Ｅ）１３Ｂ０４−ＴＣＢによる細胞株の死滅。（Ｆ）異なるＴＣＢによるＳＫＭ−１細胞の死滅。（Ｇ）異なるＴＣＢによるＢＪＡＢ細胞の死滅。
【図６Ｂ−Ｅ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）により媒介された、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋腫瘍細胞株の死滅を示す図である。（Ａ）細胞株の概要。（Ｂ〜Ｅ）（Ｂ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｃ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｄ）１１Ｂ０９−ＴＣＢ、（Ｅ）１３Ｂ０４−ＴＣＢによる細胞株の死滅。（Ｆ）異なるＴＣＢによるＳＫＭ−１細胞の死滅。（Ｇ）異なるＴＣＢによるＢＪＡＢ細胞の死滅。
【図６Ｆ−Ｇ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）により媒介された、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋腫瘍細胞株の死滅を示す図である。（Ａ）細胞株の概要。（Ｂ〜Ｅ）（Ｂ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｃ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｄ）１１Ｂ０９−ＴＣＢ、（Ｅ）１３Ｂ０４−ＴＣＢによる細胞株の死滅。（Ｆ）異なるＴＣＢによるＳＫＭ−１細胞の死滅。（Ｇ）異なるＴＣＢによるＢＪＡＢ細胞の死滅。
【図７Ａ−Ｂ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）が、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋腫瘍細胞株に結合すると、Ｔ細胞が活性化されることを示す図である。（Ａ）ＳＫＭ−１細胞、（Ｂ）ＢＪＡＢ細胞。
【図８Ａ−Ｃ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）は、オフターゲットペプチドに結合しないことを示す図である。（Ａ〜Ｃ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対する（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｃ）ＥＳＫ１−ＴＣＢによる結合。（Ｄ〜Ｅ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して（Ｄ）１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび（Ｅ）３３Ｈ０９−ＴＣＢが結合するとＴ細胞が活性化される。（Ｆ）ペプチドの概要。
【図８Ｄ−Ｆ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）は、オフターゲットペプチドに結合しないことを示す図である。（Ａ〜Ｃ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対する（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、（Ｃ）ＥＳＫ１−ＴＣＢによる結合。（Ｄ〜Ｅ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して（Ｄ）１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび（Ｅ）３３Ｈ０９−ＴＣＢが結合するとＴ細胞が活性化される。（Ｆ）ペプチドの概要。
【図９Ａ−Ｂ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）は、追加のオフターゲットペプチドに結合しないことを示す図である。（Ａ〜Ｂ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢが結合するとＴ細胞が活性化される。ＲＭＦペプチドと共に、６つの示されているオフターゲットペプチドを試験した。（Ｃ〜Ｇ）（Ｃ、Ｅ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｄ、Ｆ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、および（Ｇ）ＥＳＫ１−ＴＣＢによる、ペプチドでパルスされたＴ２細胞の死滅。ＲＭＦペプチドおよびＶＬＤペプチドと共に、１９個の示されているオフターゲットペプチドを試験した。
【図９Ｃ−Ｄ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）は、追加のオフターゲットペプチドに結合しないことを示す図である。（Ａ〜Ｂ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢが結合するとＴ細胞が活性化される。ＲＭＦペプチドと共に、６つの示されているオフターゲットペプチドを試験した。（Ｃ〜Ｇ）（Ｃ、Ｅ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｄ、Ｆ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、および（Ｇ）ＥＳＫ１−ＴＣＢによる、ペプチドでパルスされたＴ２細胞の死滅。ＲＭＦペプチドおよびＶＬＤペプチドと共に、１９個の示されているオフターゲットペプチドを試験した。
【図９Ｅ−Ｇ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）は、追加のオフターゲットペプチドに結合しないことを示す図である。（Ａ〜Ｂ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢが結合するとＴ細胞が活性化される。ＲＭＦペプチドと共に、６つの示されているオフターゲットペプチドを試験した。（Ｃ〜Ｇ）（Ｃ、Ｅ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｄ、Ｆ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ、および（Ｇ）ＥＳＫ１−ＴＣＢによる、ペプチドでパルスされたＴ２細胞の死滅。ＲＭＦペプチドおよびＶＬＤペプチドと共に、１９個の示されているオフターゲットペプチドを試験した。
【図１０Ａ−Ｂ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）が、正常骨髄由来ＣＤ３４＋幹細胞の死滅を媒介しないことを示す図である。（Ａ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ、（Ｂ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ。
【図１１Ａ−Ｄ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）に対するＲＭＦペプチドの結合残基をアラニン走査により特定したことを示す図である。（Ａ）ＲＭＦ天然ペプチド、（Ｂ）ＲＭＦ  Ｒ１Ｙペプチド、（Ｃ）ＲＭＦ  Ｒ１Ａペプチド、（Ｄ）ＲＭＦ  Ｍ２Ａペプチド、（Ｅ）ＲＭＦ  Ｆ３Ａペプチド、（Ｆ）ＲＭＦ  Ｐ４Ａペプチド、（Ｇ）ＲＭＦ  Ｎ５Ａペプチド、（Ｈ）ＲＭＦ  Ａ６Ｇペプチド、（Ｉ）ＲＭＦ  Ｐ７Ａペプチド、（Ｊ）ＲＭＦ  Ｙ８Ａペプチド、（Ｋ）ＲＭＦ  Ｌ９Ａペプチド。（Ｌ）ペプチドの概要。（Ｍ）ＲＭＦ天然ペプチドのＥＣ５０に対するＥＣ５０の倍率変化。（Ｎ）重要な接触残基。
【図１１Ｅ−Ｈ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）に対するＲＭＦペプチドの結合残基をアラニン走査により特定したことを示す図である。（Ａ）ＲＭＦ天然ペプチド、（Ｂ）ＲＭＦ  Ｒ１Ｙペプチド、（Ｃ）ＲＭＦ  Ｒ１Ａペプチド、（Ｄ）ＲＭＦ  Ｍ２Ａペプチド、（Ｅ）ＲＭＦ  Ｆ３Ａペプチド、（Ｆ）ＲＭＦ  Ｐ４Ａペプチド、（Ｇ）ＲＭＦ  Ｎ５Ａペプチド、（Ｈ）ＲＭＦ  Ａ６Ｇペプチド、（Ｉ）ＲＭＦ  Ｐ７Ａペプチド、（Ｊ）ＲＭＦ  Ｙ８Ａペプチド、（Ｋ）ＲＭＦ  Ｌ９Ａペプチド。（Ｌ）ペプチドの概要。（Ｍ）ＲＭＦ天然ペプチドのＥＣ５０に対するＥＣ５０の倍率変化。（Ｎ）重要な接触残基。
【図１１Ｉ−Ｌ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）に対するＲＭＦペプチドの結合残基をアラニン走査により特定したことを示す図である。（Ａ）ＲＭＦ天然ペプチド、（Ｂ）ＲＭＦ  Ｒ１Ｙペプチド、（Ｃ）ＲＭＦ  Ｒ１Ａペプチド、（Ｄ）ＲＭＦ  Ｍ２Ａペプチド、（Ｅ）ＲＭＦ  Ｆ３Ａペプチド、（Ｆ）ＲＭＦ  Ｐ４Ａペプチド、（Ｇ）ＲＭＦ  Ｎ５Ａペプチド、（Ｈ）ＲＭＦ  Ａ６Ｇペプチド、（Ｉ）ＲＭＦ  Ｐ７Ａペプチド、（Ｊ）ＲＭＦ  Ｙ８Ａペプチド、（Ｋ）ＲＭＦ  Ｌ９Ａペプチド。（Ｌ）ペプチドの概要。（Ｍ）ＲＭＦ天然ペプチドのＥＣ５０に対するＥＣ５０の倍率変化。（Ｎ）重要な接触残基。
【図１１Ｍ−Ｎ】選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）に対するＲＭＦペプチドの結合残基をアラニン走査により特定したことを示す図である。（Ａ）ＲＭＦ天然ペプチド、（Ｂ）ＲＭＦ  Ｒ１Ｙペプチド、（Ｃ）ＲＭＦ  Ｒ１Ａペプチド、（Ｄ）ＲＭＦ  Ｍ２Ａペプチド、（Ｅ）ＲＭＦ  Ｆ３Ａペプチド、（Ｆ）ＲＭＦ  Ｐ４Ａペプチド、（Ｇ）ＲＭＦ  Ｎ５Ａペプチド、（Ｈ）ＲＭＦ  Ａ６Ｇペプチド、（Ｉ）ＲＭＦ  Ｐ７Ａペプチド、（Ｊ）ＲＭＦ  Ｙ８Ａペプチド、（Ｋ）ＲＭＦ  Ｌ９Ａペプチド。（Ｌ）ペプチドの概要。（Ｍ）ＲＭＦ天然ペプチドのＥＣ５０に対するＥＣ５０の倍率変化。（Ｎ）重要な接触残基。
【図１２】ＮＳＧマウスへの単回注射後のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢ）の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図１３Ａ−Ｂ】ヒト化マウスのＳＫＭ−１異種移植片におけるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）の有効性研究を示す図である。（Ａ）研究設計。（Ｂ）治療群。（Ｃ）全治療群での腫瘍増殖動力学（平均）。（Ｄ）ビヒクル群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｅ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｆ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｇ）統計。計算は、３８日目に基づく（コントロール群としてのビヒクル）。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）：ＴＧＩ＞１００−＞腫瘍縮小（ＴＧＩ＝１００−＞腫瘍停滞）。治療対コントロール比（ＴＣＲ）：ＴＣＲ＝１−＞効果はない、ＴＣＲ＝０−＞完全後退。
【図１３Ｃ】ヒト化マウスのＳＫＭ−１異種移植片におけるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）の有効性研究を示す図である。（Ａ）研究設計。（Ｂ）治療群。（Ｃ）全治療群での腫瘍増殖動力学（平均）。（Ｄ）ビヒクル群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｅ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｆ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｇ）統計。計算は、３８日目に基づく（コントロール群としてのビヒクル）。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）：ＴＧＩ＞１００−＞腫瘍縮小（ＴＧＩ＝１００−＞腫瘍停滞）。治療対コントロール比（ＴＣＲ）：ＴＣＲ＝１−＞効果はない、ＴＣＲ＝０−＞完全後退。
【図１３Ｄ−Ｇ】ヒト化マウスのＳＫＭ−１異種移植片におけるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）の有効性研究を示す図である。（Ａ）研究設計。（Ｂ）治療群。（Ｃ）全治療群での腫瘍増殖動力学（平均）。（Ｄ）ビヒクル群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｅ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｆ）３３Ｈ０９−ＴＣＢ群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｇ）統計。計算は、３８日目に基づく（コントロール群としてのビヒクル）。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）：ＴＧＩ＞１００−＞腫瘍縮小（ＴＧＩ＝１００−＞腫瘍停滞）。治療対コントロール比（ＴＣＲ）：ＴＣＲ＝１−＞効果はない、ＴＣＲ＝０−＞完全後退。
【図１４Ａ−Ｃ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体−ｐＭＨＣ複合体の結晶構造の概要を示す図である。抗体（Ｆａｂ断片）は最上部に示されており、重鎖は暗灰色に色付けされており、軽鎖は明灰色に色付けされている。結晶化溶媒原子は示されていない。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ０２／ＶＬＤ  ｐＭＨＣと複合体化した５Ｃ０１  Ｆａｂの１．９８Å分解能結晶構造。Ｆａｂ−ｐＭＨＣ接触面積：約４７６Å２、ペプチド寄与分：約６８Å２。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ０２／ＲＭＦ  ｐＭＨＣと複合体化した１１Ｄ０６  Ｆａｂの２．６０Å分解能結晶構造。Ｆａｂ−ｐＭＨＣ接触面積：約３９７Å２、ペプチド寄与分：約１０７Å２。（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ０２／ＲＭＦ  ｐＭＨＣと複合体化したＥＳＫ１  Ｆａｂの３．０５Å分解能結晶構造（公開済み、ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＷＵＵ）。Ｆａｂ−ｐＭＨＣ接触面積：約５０５Å２、ペプチド寄与分：約６０Å２。
【図１５】５Ｃ０１  Ｆａｂ−ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ  ｐＭＨＣ結合接触面の拡大図を示す。ＢＩＯＶＩＡ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５により特定された、ＦａｂとｐＭＨＣとの間の必須な化学的相互作用が強調されている。溶媒原子は示されていない。
【図１６】５Ｃ０１  Ｆａｂ残基（行）とＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ  ｐＭＨＣ残基（列）との接触面および相互作用マトリックスを示す図である。Ｎ＝付近／近隣、Ｈ＝Ｈ結合、Ｐｉ＝Ｐｉ相互作用、ＳＢ＝塩橋。接触面残基は、相互作用パートナーの非存在下／存在下において溶媒接近可能表面積が変化を起こす残基であると定義した。
【図１７】１１Ｄ０６  Ｆａｂ−ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ結合接触面の拡大図を示す。ＢＩＯＶＩＡ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５により特定された、ＦａｂとｐＭＨＣとの間の必須な化学的相互作用が強調されている。溶媒原子は示されていない。
【図１８】１１Ｄ０６  Ｆａｂ残基（行）とＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ残基（列）との接触面および相互作用マトリックスを示す図である。Ｎ＝付近／近隣、Ｈ＝Ｈ結合、Ｐｉ＝Ｐｉ相互作用、ＳＢ＝塩橋。接触面残基は、相互作用パートナーの非存在下／存在下において溶媒接近可能表面積が変化を起こす残基であると定義した。
【図１９】ＥＳＫ１  Ｆａｂ−ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ結合接触面の拡大図を示す（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＷＵＵ）。ＢＩＯＶＩＡ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５により特定された、ＦａｂとｐＭＨＣとの間の必須な化学的相互作用が強調されている。溶媒原子は示されていない。
【図２０】ＥＳＫ１  Ｆａｂ残基（行）とＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ残基（列）との接触面および相互作用マトリックスを示す図である。Ｎ＝付近／近隣、Ｈ＝Ｈ結合、Ｐｉ＝Ｐｉ相互作用、ＳＢ＝塩橋。接触面残基は、相互作用パートナーの非存在下／存在下において溶媒接近可能表面積が変化を起こす残基であると定義した。
【図２１】異なるＣＤ３結合体を有するＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体により媒介された、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１＋  ＳＫＭ−１細胞の死滅を示す図である。
【図２２】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）により媒介された、ＲＭＦペプチドでパルスされたＴ２細胞の死滅を示す図である。
【図２３Ａ−Ｄ】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）Ａａｌｉ−ＴＣＢ（Ａ）、Ｄａｎｉｅｌ−ＴＣＢ（Ｂ）、およびＥＳＫ１−ＴＣＢ（Ｃ）、および１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｄ）によるオフターゲットペプチドとの結合の評価を示す図である。
【図２４】ＮＳＧマウスへの単回注射後のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図２５Ａ】ヒト化マウスのＳＫＭ−１異種移植片におけるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）の有効性研究を示す図である。（Ａ）全治療群での腫瘍増殖動力学（平均）。（Ｂ）ビヒクル群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｃ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ群（Ｖ９）における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｄ）統計。計算は、４８日目に基づく（コントロール群としてのビヒクル）。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）：ＴＧＩ＞１００−＞腫瘍縮小、ＴＧＩ＝１００−＞腫瘍停滞。治療対コントロール比（ＴＣＲ）：ＴＣＲ＝１−＞効果はない、ＴＣＲ＝０−＞完全後退。
【図２５Ｂ−Ｄ】ヒト化マウスのＳＫＭ−１異種移植片におけるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）の有効性研究を示す図である。（Ａ）全治療群での腫瘍増殖動力学（平均）。（Ｂ）ビヒクル群における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｃ）１１Ｄ０６−ＴＣＢ群（Ｖ９）における単一の腫瘍増殖動力学。（Ｄ）統計。計算は、４８日目に基づく（コントロール群としてのビヒクル）。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）：ＴＧＩ＞１００−＞腫瘍縮小、ＴＧＩ＝１００−＞腫瘍停滞。治療対コントロール比（ＴＣＲ）：ＴＣＲ＝１−＞効果はない、ＴＣＲ＝０−＞完全後退。
【図２６】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）が、ＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ複合体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合すると、Ｔ細胞が活性化されることを示す図である（ＮＦＡＴレポーターアッセイ）。実線：１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）（「２＋１」形式）。点線：「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」形式の類似分子（１１Ｄ０６およびＶ９結合体）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
用語は、本明細書では、下記で別様に定義されていない限り当該技術分野で一般に用いられている通りに使用される。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合性分子」は、その最も幅広い意味では、抗原決定基と特異的に結合する分子を指す。抗原結合性分子の例は、免疫グロブリンおよびそれらの誘導体、例えば断片である。
【００２１】
用語「二重特異性」は、抗原結合性分子が、少なくとも２つの異なる抗原決定基と特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合性分子は、各々が異なる抗原決定基に対して特異的である２つの抗原結合部位を含む。ある特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、２つの抗原決定基、特に、２つの異なる細胞上に発現される２つの抗原決定基と同時に結合することが可能である。
【００２２】
用語「価」は、本明細書で使用される場合、特定数の抗原結合部位が抗原結合性分子に存在することを示す。したがって、用語「抗原に対する一価の結合」は、抗原に対して特異的な１つの（および多くとも１つの）抗原結合部位が、抗原結合性分子に存在することを示す。
【００２３】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合性分子の部位、つまり１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来するアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合性部分」は、抗原決定基と特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合性部分は、それに付着されている実体（例えば、第２の抗原結合性部分）を、標的部位へと、例えば抗原決定基を担持する特定タイプの腫瘍細胞へと向かわせることができる。別の実施態様では、抗原結合性部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合体抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合性部分としては、本明細書でさらに定義されているような抗体およびそれらの断片が挙げられる。特定の抗原結合性部分としては、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合性ドメインが挙げられる。ある特定の実施態様では、抗原結合性部分は、本明細書でさらに定義されているような、および当該技術分野で公知である抗体定常領域を含んでいてもよい。有用な重鎖定常領域としては、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、またはμのいずれかが挙げられる。有用な軽鎖定常領域としては、２つのアイソタイプ：κおよびλのいずれかが挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「抗原決定基」または「抗原」は、抗原結合性部分が結合して、抗原結合性部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子の部位を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離状態で、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見出すことができる。
【００２６】
用語「エピトープ」は、抗原結合性部分が結合する、タンパク質性または非タンパク質性のいずれでもよい抗原の部位を示す。エピトープは、連続アミノ酸伸長（線形エピトープ）で形成されていても、または例えば抗原のフォールディングにより、つまりタンパク質性抗原の三次構造フォールディングにより空間的近傍に配置される非連続アミノ酸（立体構造エピトープ）を含んでいてもいずれでもよい。線形エピトープは、典型的には、タンパク質性抗原を変性剤と接触させた後でも依然として抗原結合性部分と結合するが、立体構造エピトープは、典型的には、変性剤で処理されると破壊される。エピトープは、固有な空間的立体構造を取っている少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００２７】
「ＣＤ３」は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源に由来する任意の天然ＣＤ３を指す。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＤ３、ならびに細胞中でのプロセシングから生じるあらゆる形態のＣＤ３を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在する変異体、例えばスプライスバリアントまたは対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０７７６６（バージョン１８９）またはＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号１０７も参照されたい。カニクイザル［マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号１０８も参照されたい。
【００２８】
「ＷＴ１」は、「ウィルムス腫瘍１」または「ウィルムス腫瘍タンパク質」としても知られており、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源に由来する任意の天然ＷＴ１を指す。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないＷＴ１、ならびに細胞中でのプロセシングから生じるあらゆる形態のＷＴ１を包含する。この用語は、ＷＴ１の天然に存在する変異体、例えばスプライスバリアントまたは対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、ＷＴ１は、ヒトＷＴ１、特に配列番号１０６のタンパク質である。ヒトＷＴ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ１９５４４（エントリーバージョン２１５）に記載されており、ヒトＷＴ１のアミノ酸配列は、配列番号１０６にも示されている。
【００２９】
「ＶＬＤ」、「ＶＬＤペプチド」、または「ＷＴ１ＶＬＤ」は、アミノ酸配列ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号７７；配列番号１０６のＷＴ１タンパク質の３７〜４５位）を有するＷＴ１由来ペプチドを意味する。
【００３０】
「ＲＭＦ」、「ＲＭＦペプチド」、または「ＷＴ１ＲＭＦ」は、アミノ酸配列ＲＭＦＲＮＡＰＹＬ（配列番号７８；配列番号１０６のＷＴ１タンパク質の１２６〜１３４位）を有するＷＴ１由来ペプチドを意味する。
【００３１】
「ＨＬＡ−Ａ２」、「ＨＬＡ−Ａ＊０２」、「ＨＬＡ−Ａ０２」、または「ＨＬＡ−Ａ＊２」（同義的に使用される）は、ＨＬＡ−Ａ血清型群のヒト白血球抗原血清型を指す。ＨＬＡ−Ａ２タンパク質（対応するＨＬＡ遺伝子によりコードされる）は、β２ミクログロブリンサブユニットをさらに含む対応するクラスＩ  ＭＨＣ（主要組織適合複合体）タンパク質のα鎖を構成する。具体的なＨＬＡ−Ａ２タンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２０１である（ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０２．０１、またはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１とも呼ばれる）。具体的な実施態様では、本明細書に記載のＨＬＡ−Ａ２タンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２０１である。
【００３２】
「ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１」は、ＨＬＡ−Ａ２分子と、ＷＴ１由来ペプチド（本明細書では「ＷＴ１ペプチド」とも呼ばれる）、具体的にはＲＭＦまたはＶＬＤペプチドとの複合体（それぞれ「ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ」および「ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ」）を指す。本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ複合体のいずれかと特異的に結合する。
【００３３】
「特異的結合」は、結合が、抗原に対して選択的であり、望ましくないかまたは非特異的な相互作用から区別ことができることを意味する。抗原結合性部分が具体的な抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７巻、３２３〜３２９頁（２０００年））、および伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８巻、２１７〜２２９頁（２００２年））のいずれかにより測定することができる。本発明の抗体および二重特異性抗原結合性分子の特異性の決定に好適なアッセイは、本明細書に、例えば、下記の実施例４、９、および１０に記載されている。一実施態様では、抗原結合性部分が無関連タンパク質に結合する程度は、例えばＳＰＲにより測定して、抗原に対する抗原結合性部分の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合性部分、またはその抗原結合性部分を含む抗原結合性分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍまたはそれ未満、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍまで、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍまで）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００３４】
「親和性」は、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。別様の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合性部分および抗原または受容体およびそのリガンド）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）により表わすことができ、解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数および結合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含む場合がある。親和性は、本明細書に記載されているものを含む、当該技術分野で公知の十分に確立されている方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）である。
【００３５】
「結合の低減」、例えばＦｃ受容体に対する結合の低減は、例えばＳＰＲにより測定して、対応する相互作用の親和性の減少を指す。明瞭性のため、この用語は、親和性がゼロに（または分析方法の検出限界よりも下方に）低減すること、つまり相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合の増加」は、対応する相互作用の結合親和性の増加を指す。
【００３６】
「活性化Ｔ細胞抗原」は、本明細書で使用される場合、抗原結合性分子と相互作用するとＴ細胞活性化を誘導することが可能である、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に発現される抗原決定基を指す。具体的には、抗原結合性分子と活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のエプシロンサブユニットである（ヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１０７を参照；またはカニクイザル［マカカ・ファシキュラリス］配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、および配列番号１０８を参照）。
【００３７】
「Ｔ細胞活性化」は、本明細書で使用される場合、：増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つまたは複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するための好適なアッセイは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
【００３８】
「標的細胞抗原」は、本明細書で使用される場合、標的細胞、例えばがん細胞または腫瘍間質の細胞などの腫瘍中の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ、最も特にはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦである。
【００３９】
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ分子などに関する用語「第１の」、「第２の」、「第３の」は、各タイプの部分が１つよりも多く存在する場合、区別の便宜をはかるために使用される。こうした用語の使用は、明示的にそうであると記載されていない限り、二重特異性抗原結合性分子の特定の順序または向きを付与することは意図されていない。
【００４０】
「融合されている」は、成分（例えば、Ｆａｂ分子およびＦｃドメインサブユニット）が、直接的にまたは１つもしくは複数のペプチドリンカーを介してのいずれかで、ペプチド結合により連結されていることを意味する。
【００４１】
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）ならびに軽鎖のＶＬおよびＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）からなるタンパク質を指す。
【００４２】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称される）は、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインまたは定常ドメインが交換されている（つまり、互いに置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し、つまりクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１で構成されるペプチド鎖（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＬ−ＣＨ１）および重鎖可変ドメインＶＨおよび軽鎖定常ドメインＣＬで構成されるペプチド鎖（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＨ−ＣＬ）を含む。明瞭性のため、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子では、重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１を含むペプチド鎖が、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子では、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖が、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
【００４３】
それとは対照的に、「従来型」Ｆａｂ分子は、つまり重鎖可変ドメインおよび定常ドメインで構成される重鎖（Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ−ＣＨ１）ならびに軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインで構成される軽鎖（Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＬ−ＣＬ）を含む、その天然形式のＦａｂ分子を意味する。
【００４４】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合されている２つの軽鎖および２つの重鎖で構成されている、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へと、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へと、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに帰属させることができ、それらの一部は、サブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）、およびα２（ＩｇＡ２）にさらに分割することができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの１つに帰属させることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結されている２つのＦａｂ分子および１つのＦｃドメインから本質的になる。
【００４５】
用語「抗体」は、本明細書ではその最も幅広い意味で使用され、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
【００４６】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。つまり、例えば天然に存在する突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる考え得る変異体抗体であって、そのような変異体は一般には少量で存在する考え得る変異体を除いて、集団に含まれる個々の抗体は、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原にある単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈されないものとする。例えば、本発明に従って使用されることになるモノクローナル抗体は、これらに限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部分を含むトランスジェニック動物を使用する方法を含む様々な技法により製作することができる。モノクローナル抗体を製作するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００４７】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されているものであり、つまりその自然境遇には存在しないものである。特定レベルの精製は必要とされない。例えば、単離された抗体は、その天然または自然環境から取り出されてもよい。宿主細胞で発現される組換え的に産生される抗体は、任意の好適な技法により分離、分画、または部分的にもしくは実質的に精製されている天然または組換え抗体であるため、本発明の目的では単離されているとみなされる。そのため、本発明の抗体および二重特異性抗原結合性分子は単離されている。一部の実施態様では、抗体は、例えば電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）、クロマトグラフィー法（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定して、９５％または９９％よりも高い純度に精製される。抗体純度を評価するための方法の総説は、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８巻：７９〜８７頁（２００７年）を参照されたい。
【００４８】
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」、および、「全抗体」は、本明細書では同義的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似する構造を有する抗体を指す。
【００４９】
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体が挙げられる。ある抗体断片の総説は、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９巻、１２９〜１３４頁（２００３年）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい。また国際公開第９３／１６１８５号パンフレット；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号明細書および第５，５８７，４５８号明細書を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の考察は、米国特許第５，８６９，０４６号明細書を参照されたい。ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／０１１６１号パンフレット；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９巻、１２９〜１３４頁（２００３年）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁（１９９３年）を参照されたい。Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９巻、１２９〜１３４頁（２００３年）には、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）も記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは部分または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは部分を含む抗体断片である。ある特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、ウォルサム、マサチューセッツ州；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１明細書を参照）。抗体断片は、これらに限定されないが、インタクト抗体のタンパク質分解消化ならびに本明細書に記載されているような組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含む、種々の技法により製作することができる。
【００５０】
用語「抗原結合性ドメイン」は、抗原の一部分またはすべてに特異的に結合し、およびそれに相補的である区域を含む抗体の一部分を指す。抗原結合性ドメインは、例えば、１つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供されてもよい。特に、抗原結合性ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００５１】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７年）を参照されたい。抗原結合特異性の付与には、単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインで十分であり得る。可変領域配列に関して本明細書で使用される場合、「カバット番号付け」は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１年）に示されている番号付け方式を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１年）に示されており、本明細書では「カバットによる番号付け」または「カバット番号付け」と呼ばれるカバット番号付け方式に従って番号付けされている。具体的には、カッパおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬには、カバット番号付け系（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１年）の６４７〜６６０頁を参照）が使用され、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３）には、カバットＥＵインデックス番号付け方式（６６１〜７２３頁を参照）が使用され、この場合、本明細書では「カバットＥＵインデックスによる番号付け」と呼ぶことによりさらに明確化されている。
【００５３】
用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、本明細書で使用される場合、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、および／または構造的に画定されているループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。例示的なＨＶＲとしては、本明細書では、以下のものが挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１年））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、および９３〜１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２巻：７３２〜７４５（１９９６年））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、および９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組合せ。
【００５４】
別途指示がない限り、可変ドメインのＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書ではＫａｂａｔら、上記に従って番号付けされている。
【００５５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列およびＦＲ配列は、一般に、以下の順序でＶＨ（またはＶＬ）に出現する：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００５６】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基およびヒトＦＲに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つの、および典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むだろう。そのような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも部分を含んでいてもよい。一部の実施態様では、ヒト化抗体の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または向上させるために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生成するように元の抗体の定常領域からさらに修飾または変更されているものである。
【００５７】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列が使用されている非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ある特定の実施態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック／遺伝子組換え哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはウサギに由来する。ある特定の実施態様では、ヒト抗体はハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片も、本明細書では、ヒト抗体またはヒト抗体断片であるとみなされる。
【００５８】
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。５つの主要クラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００５９】
用語、「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、本明細書では、定常領域の少なくとも部分を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を画定するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変わる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、重鎖のＣｙｓ２２６からまたはＰｒｏ２３０からカルボキシル末端まで伸長すると画定される。しかしながら、宿主細胞により産生される抗体は、重鎖のＣ末端からの１つまたは複数の、特に１つまたは２つのアミノ酸の翻訳後切断を受ける場合がある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により宿主細胞によって産生される抗体は、全長重鎖を含んでいてもよく、または完全長重鎖の切断型変異体（本明細書中では「切断型変異体重鎖」とも呼ばれる）を含んでいてもよい。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）およびリジン（Ｋ４４７、カバットＥＵインデックスによる番号付け）である場合、該当する可能性がある。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）またはＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）およびリジン（Ｋ４４７）は、存在してもよく、または存在しなくともよい。Ｆｃドメイン（または本明細書で定義されるようなＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、別様の記載がない場合、本明細書ではＣ末端グリシン−リジンジペプチドなしで示される。本発明の一実施態様では、本明細書で指定されているようなＦｃドメインのサブユニットを含み、本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子に含まれる重鎖は、追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、カバットのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様では、本明細書で指定されているようなＦｃドメインのサブユニットを含み、本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子に含まれる重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、カバットのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載されている薬学的組成物などの、本発明の組成物は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子の集団を含む。抗体または二重特異性抗原結合性分子の集団は、完全長重鎖を有する分子および切断型変異体重鎖を有する分子を含んでいてもよい。抗体または二重特異性抗原結合性分子の集団は、完全長重鎖を有する分子および切断型変異体重鎖を有する分子の混合物であって、抗体または二重特異性抗原結合性分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、切断型変異体重鎖を有する分子の混合物からなっていてもよい。本発明の一実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子の集団を含む組成物は、追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、カバットのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書で指定されているようなＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む。本発明の一実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子の集団を含む組成物は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、カバットのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書で指定されているようなＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む。本発明の一実施態様では、そのような組成物は、本明細書で指定されているようなＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子で構成される抗体または二重特異性抗原結合性分子；追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、カバットのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書で指定されているようなＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；および追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、カバットのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書で指定されているようなＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子の集団を含む。別様の指示がない限り、本明細書では、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１年）に記載されているような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付け方式によるものである（上記も参照）。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、ダイマーＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ、つまり、安定した自己付随が可能である、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００６０】
「Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの付随を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドが同一のポリペプチドと付随してホモダイマーを形成することを低減または防止するペプチド骨格の操作またはＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。付随を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、特に、付随させることが所望である２つのＦｃドメインサブユニット（つまり、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニット）の各々になされる別々の修飾を含み、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの付随を促進するように互いに相補的である。例えば、付随を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方または両方の構造または電荷を、それらの付随がそれぞれ立体的にまたは静電気的に有利となるように変更することができる。したがって、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間に（ヘテロ）二量体化が生じ、ポリペプチドは、サブユニットの各々に融合されているさらなる成分（例えば、抗原結合性部分）が同じでないという意味で非同一であってもよい。一部の実施態様では、付随を促進する修飾は、Ｆｃドメインのアミノ酸突然変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、付随を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に、別々のアミノ酸突然変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【００６１】
用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因するそれらの生物活性を指し、抗体アイソタイプに応じて様々である。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子操作する、遺伝子操作された、遺伝子操作」は、ペプチド骨格の任意の操作、または天然に存在するもしくは組換えポリペプチドもしくはその断片の翻訳後修飾を含むとみなされる。遺伝子操作は、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、ならびにそうした手法の組合せを含む。
【００６３】
用語「アミノ酸突然変異」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸置換、欠失、挿入、および修飾を包含することが意図されている。置換、欠失、挿入、および修飾の任意の組合せを行って最終コンストラクトに到着することができ、ただし最終コンストラクトは、所望の特性、例えばＦｃ受容体に対する結合の低減または別のペプチドとの付随の増加を有する。アミノ酸配列欠失および挿入としては、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ端子欠失ならびにアミノ酸の挿入が挙げられる。特定のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的では、非保存的アミノ酸置換、つまり１つのアミノ酸を、異なる構造および／または化学的性質を有する別のアミノ酸に置き替えることが特に好ましい。アミノ酸置換としては、天然に存在しないアミノ酸による、または２０種の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）による置き換えが挙げられる。アミノ酸突然変異は、当該技術分野で周知である遺伝学的または化学的手法を使用して生成することができる。遺伝学的方法としは、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、および遺伝子合成などを挙げることができる。化学修飾などの遺伝子工学以外の方法によりアミノ酸の側鎖基を変更する方法も有用であり得ることが企図される。本明細書では、同じアミノ酸突然変異を示すために、種々の表記方式が使用される場合がある。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、またはＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示すことができる。
【００６４】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後で、いかなる保存的置換も配列同一性の一部分とは見なさずに、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージであると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、およびＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＦＡＳＴＡプログラムパッケージなど、公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術内にある種々の方法で達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的では、アミノ酸配列同一性％値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて、バージョン３６．３．８ｃまたはそれ以降のＦＡＳＴＡパッケージのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ＰＮＡＳ  ８５巻：２４４４〜２４４８頁；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６年）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６巻：２２７〜２５８頁；およびＰｅａｒｓｏｎら、（１９９７年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６巻：２４〜３６頁により著作されたものであり、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌから公的に入手可能である。あるいは、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的サーバーを使用し、ローカルではなくグローバルなアラインメントが実施されることを保証するために、ｇｇｓｅａｒｃｈ（グローバルタンパク質：タンパク質）プログラムおよび初期設定オプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：−１０；ｅｘｔ：−２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して配列を比較してもよい。アミノ酸同一性パーセントは、出力アラインメントヘッダーに示される。
【００６５】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合または非従来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などに見出されるアミド結合）を含んでいてもよい。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を指す。
【００６６】
「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡが意図されている。例えば、ベクターに含まれているポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されているとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常通りに含む細胞に含まれているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外にまたはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物、ならびにプラス鎖形態、およびマイナス鎖形態、および二本鎖形態が挙げられる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としては、合成的に生産されたそのような分子がさらに挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの制御エレメントであってもよくまたは含んでいてもよい。
【００６７】
「［例えば、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子」をコードする単離されたポリヌクレオチド（または核酸）」は、単一のベクターまたは個別のベクター中のそのようなポリヌクレオチド分子、および宿主細胞中の１つまたは複数の位置に存在するそのような核酸分子を含む、抗体重鎖および軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド分子を指す。
【００６８】
用語「発現カセット」は、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸エレメントを有する、組換え的にまたは合成的に生成されるポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、または核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写しようとする核酸配列およびプロモーターを含む。ある特定の実施態様では、発現カセットは、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、それに作動可能に付随されている特定の遺伝子を細胞に導入し発現を指図するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定ｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが細胞内部に存在すると、遺伝子によりコードされているリボ核酸分子またはタンパク質が、細胞転写および／または翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【００７０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、同義的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫が含まれる。宿主細胞としては、一次形質転換細胞および継代数に関わらずそれに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が挙げられる。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一ではなく、突然変異を含んでいてもよい。本明細書では、元の形質転換細胞でスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を生成するために使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞などの哺乳動物培養細胞だけでなく、ほんの少数を挙げれば、トランスジェニック動物、トランスジェニック／遺伝子組換え植物または培養植物または動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。
【００７１】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインと係合した後、受容体担持細胞を刺激してエフェクター機能を実施するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
【００７２】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による、抗体でコートされた標的細胞の溶解に結び付く免疫機序である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体またはそれらの誘導体が、一般に、Ｆｃ領域のＮ末端側にあるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、用語「ＡＤＣＣの低減」は、標的細胞を取り囲む培地中の所与の抗体濃度にて所与の時間内に、上記で定義されているＡＤＣＣ機序により溶解される標的細胞の数の低減、および／またはＡＤＣＣの機序により所与の時間内で所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準的な産生方法、精製方法、製剤化方法、および保管方法（当業者に公知である）を使用するが、遺伝子操作されていない同じタイプの宿主細胞により産生される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと比べたものである。例えば、ＡＤＣＣを低減するアミノ酸置換をそのＦｃドメインに含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低減は、Ｆｃドメインにこのアミノ酸置換を有していない同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと比べたものである。ＡＤＣＣを測定するための好適なアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号パンフレットまたは国際公開第２０１２／１３０８３１号パンフレットを参照）。
【００７３】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞または組織に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【００７４】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」、必要とされる用量および期間において所望の治療的または予防的結果を達成するために有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、例えば、疾患の有害作用を排除するか、減少させるか、遅延させるか、最小限に抑えるか、または予防する。
【００７５】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。特に、個体または対象は、ヒトである。
【００７６】
用語「薬学的組成物」は、それに含まれる活性成分の生物活性が効果的であることを可能にするような形態であり、組成物が投与されることになる対象に許容し難い毒性を示す追加成分を含まない調製物を指す。
【００７７】
「薬学的に許容される担体」は、対象に無毒性である、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられる。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」または「治療すること」などのその文法的変化形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変更する試みである臨床介入を指し、予防のためにまたは臨床病理の経過中のいずれかで実施することができる。望ましい治療効果としては、これらに限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症候の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の衰退、転移の予防、疾患進行速度の低下、病態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、疾患の発症を遅延させるかまたは疾患の進行を遅延させるために使用される。
【００７９】
用語「添付文書」は、治療用製品の市販パッケージに慣例的に含まれており、適応症、使用法、投薬量、投与法、併用療法、そのような治療用製品の使用に関する禁忌および／または警告に関する情報を含む使用説明書を指すために使用される。
【００８０】
実施態様の詳細な説明
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ、最も特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦに結合し、治療目的に必要とされる良好な親和性および特異性を有する抗体および二重特異性抗原結合性分子を提供する。加えて、上記分子は、治療応用のための他の有利な特性、例えば有効性および／または安全性ならびに生産可能性も有する。
【００８１】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体
本発明者らは、特に良好な親和性および特異性を有する、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する新規抗体を開発した。例えば、実施例に示されるように、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２と他の構造的に類似するペプチドとの複合体よりも、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ）に対して顕著に選択的である抗体を開発した。
【００８２】
したがって、ある特定の態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合し、以下の特徴のいずれかを有する抗体を提供する。
【００８３】
一実施態様では、抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対する一価親和性を有し、解離定数（ＫＤ）が、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満である。一実施態様では、抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対する二価親和性（アビディティー）を有し、見かけのＫＤは、約１．５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．７５ｎＭ未満である。一実施態様では、抗体の二価親和性（アビディティー）は、（見かけの）ＫＤに換算して、抗体の一価親和性よりも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍高い。
【００８４】
一実施態様では、親和性は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により２５℃で決定される。一実施態様では、一価親和性は、抗体のＦａｂ分子形式で決定される。一実施態様では、二価親和性（アビディティー）は、抗体のＩｇＧ分子形式で決定される。
【００８５】
具体的な実施態様では、抗体の親和性は、以下のように決定される：
ＰＢＳＴをランニングバッファー（１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０））として使用して、２５℃で実験を実施する。ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）のＧＬＣおよびＧＬＭセンサチップを備えたＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーおよびカップリング試薬（１０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ４．５、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド［スルホ−ＮＨＳ］、１−エチル−３−（３−ジメチルアミンプロピル）−カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣ］、およびエタノールアミン）を使用する。固定化をＧＬＭチップ上にて３０μｌ／分で実施する。ｐＡｂ（ヤギ）抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、標準的アミンカップリング手順を使用して垂直方向にカップリングする：６つのリガンドチャネルをすべて、ＥＤＣ（２００ｍＭ）およびスルホ−ＮＨＳ（５０ｍＭ）の混合物で５分間活性化する。表面を活性化した直後に、ｐＡｂ（ヤギ）抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２特異的抗体（５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５）を、６つすべてのチャネルにわたって５分間注入する。最後に、１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を５分間注入することによりチャネルをブロックする。別々の水平チャネルの５つに沿って同時に５分間注入する（３０μｌ／分）ことにより大腸菌上清からＦａｂ変異体を捕捉する。順化培地を６番目のチャネルに沿って注入して、二重参照目的の「インライン」ブランクを提供する。ワンショット動力学測定（ｏｎｅ−ｓｈｏｔ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を、ＨＬＡ−ＷＴ１（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）の希釈系列物（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、０ｎＭ、５０μｌ／分）を垂直チャネルに沿って２分間注入することにより実施する。解離を３分間モニターする。動力学データは、ＰｒｏｔｅＯｎマネージャー  ｖ．２．１で分析する。反応スポットデータの処理は、インラインバッファーブランクを使用したスポット間参照工程および二重参照工程を適用すること含む（Ｍｙｓｚｋａ、Ｊ  ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ（１９９９年）１２巻、２７９〜２８４頁）。反復ワンショット注入の処理データを、物質移行のない単純な１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングする（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９３年）２１２巻、４５７〜４６８頁）。
【００８６】
本発明の抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（つまり、ＨＬＡ−Ａ２分子およびＷＴ１由来ペプチドの複合体）と特異的に結合する。一部の実施態様では、本発明の抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ（つまり、ＨＬＡ−Ａ２分子およびＷＴ１ＲＭＦペプチドの複合体）と特異的に結合する。より具体的な実施態様では、抗体は、ＨＬＡ−Ａ２０１／ＷＴ１ＲＭＦ（つまり、ＨＬＡ−Ａ２０１分子およびＷＴ１ＲＭＦペプチドの複合体）と特異的に結合する。ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦに結合する本発明の抗体としては、本明細書に記載されている抗体１１Ｄ０６、３３Ｈ０９、および５Ｅ１１が挙げられる。他の実施態様では、本発明の抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ（つまり、ＨＬＡ−Ａ２分子およびＷＴ１ＶＬＤペプチドの複合体）と特異的に結合する。より具体的な実施態様では、抗体は、ＨＬＡ−Ａ２０１／ＷＴ１ＶＬＤ（つまり、ＨＬＡ−Ａ２０１分子およびＷＴ１ＶＬＤペプチドの複合体）と特異的に結合する。ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤに結合する本発明の抗体としては、本明細書に記載されている抗体１１Ｂ０９、１３Ｂ０４、および５Ｃ０１が挙げられる。
【００８７】
一実施態様では、抗体の特異的結合は、ＨＬＡ−Ａ２／ペプチド（例えば、ＷＴ１ＲＭＦペプチドまたはＷＴ１ＶＬＤペプチド）発現細胞、特にペプチドでパルスされたＴ２細胞を使用して、フローサイトメトリーにより決定される。
【００８８】
具体的な実施態様では、抗体の特異的結合は、以下のように決定される：
Ｔ２細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）で補完されたＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９８０−０４８）（完全培地）中１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物として調製する。総容積が１０ｍｌの細胞をチューブで維持し、１０μｌの１０−２Ｍ（ペプチドの最終濃度：１０−５Ｍ）ペプチド（例えば、ＷＴ１  ＶＬＤペプチド（配列番号７７）またはＲＭＦペプチド（配列番号７８））と共に、５％ＣＯ２で２時間３７℃にてインキュベートする。洗浄した後、細胞を冷却ＰＢＳに懸濁し、滴定された濃度のＩｇＧ形式の抗体（例えば、１０μｇ／ｍｌ〜０．０００６４μｇ／ｍｌ）と共に４℃で１時間インキュベートし、続いて二次抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）と共に３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ）で細胞を取得する。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰｒｉｓｍにおいてＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示される。
【００８９】
一実施態様では、本発明の抗体は、ＨＬＡ−Ａ２のみ（つまり、ペプチドを有していない）にも、ＷＴ１ＲＭＦまたはＷＴ１ＶＬＤなどのＷＴ１由来ペプチド以外のペプチドを有するＨＬＡ−Ａ２にも著しくは結合しない。
【００９０】
一実施態様では、抗体は、ＷＴ１由来ペプチド、特にＷＴ１ＲＭＦまたはＷＴ１ＶＬＤの非存在下ではＨＬＡ−Ａ２と著しくは結合しない。一実施態様では、抗体は、ＷＴ１由来ペプチド（具体的には、ＷＴ１ＲＭＦまたはＷＴ１ＶＬＤ）の非存在下におけるＨＬＡ−Ａ２に対する結合のＥＣ５０よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、または少なくとも１００倍低いＥＣ５０で、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）に結合する。
【００９１】
一実施態様では、抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）とは結合するが、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）から選択されるペプチドを有するＨＬＡ−Ａ２とは著しくは結合しない。一実施態様では、抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）とは結合するが、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５ペプチド）のいずれかを有するＨＬＡ−Ａ２とは著しくは結合しない。
【００９２】
一実施態様では、抗体は、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）から選択されるペプチドを有するＨＬＡ−Ａ２に対する結合のＥＣ５０よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、または少なくとも１００倍低いＥＣ５０でＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）に結合する。一実施態様では、抗体は、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）のいずれかを有するＨＬＡ−Ａ２に対する結合のＥＣ５０よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、または少なくとも１００倍低いＥＣ５０でＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）に結合する。
【００９３】
一実施態様では、ＥＣ５０は、ＨＬＡ−Ａ２／ペプチド（例えば、ＷＴ１ＲＭＦまたはＷＴ１ＶＬＤペプチド）発現細胞、特にペプチドでパルスされたＴ２細胞を使用して、フローサイトメトリーにより決定される。
【００９４】
具体的な実施態様では、ＥＣ５０は、以下のように決定される：
Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１９９２）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）で補完されたＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９８０−０４８）（完全培地）中１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物として調製する。総容積が１０ｍｌの細胞をチューブで維持し、１０μｌの１０−２Ｍ（ペプチドの最終濃度：１０−５Ｍ）ペプチド（例えば、ＷＴ１  ＶＬＤペプチド（配列番号７７）またはＲＭＦペプチド（配列番号７８））と共に、５％ＣＯ２で２時間３７℃にてインキュベートする。洗浄した後、細胞を冷却ＰＢＳに懸濁し、滴定された濃度のＩｇＧ形式の抗体（例えば、１０μｇ／ｍｌ〜０．０００６４μｇ／ｍｌ）と共に４℃で１時間インキュベートし、続いて二次抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）と共に３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ）で細胞を取得する。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰｒｉｓｍにおいてＰＥの平均蛍光発光強度（ＭＦＩ）として示される。ＥＣ５０値は、ＸＬｆｉｔ（登録商標）アドオン（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ギルフォード、英国）を使用してＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌで算出される。
【００９５】
一態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２０１／ＷＴ１ＲＭＦに対する結合を、配列番号７の重鎖可変領域（ＶＨ）配列および配列番号８の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む抗体と競合する抗体を提供する。
【００９６】
競合アッセイを使用して、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対する結合を、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含む抗体（参照抗体）と競合する抗体を特定することができる。ある特定の実施態様では、そのような競合抗体は、参照抗体が結合するものと同じエピトープ（例えば、線形エピトープまたは立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６年）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー州）に提供されており、本明細書の実施例にも記載されている。例示的な競合アッセイでは、固定化されているＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１を、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（例えば、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含む抗体）に結合する第１の標識化抗体、およびＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対する結合を第１の抗体と競合するその能力に関して試験されている第２の未標識化抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清に存在してもよい。コントロールとして、固定化されているＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１を、第１の標識化抗体を含むが第２の未標識化抗体を含まない溶液中でインキュベートする。ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対する第１の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰の未結合抗体を除去し、固定化されているＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に付随している標識の量を測定する。固定化されているＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に付随している標識の量が、コントロール試料と比べて試験試料で実質的に低減されている場合、それは、第２の抗体が、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対する結合を第１の抗体と競合していることを示す。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）を参照されたい。
【００９７】
一態様では、本発明は、配列番号７の重鎖可変領域（ＶＨ）配列および配列番号８の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む抗体と同じ、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦのエピトープに結合する抗体を提供する。
【００９８】
特定のエピトープに結合する抗体（つまり、同じエピトープに結合するもの）についてスクリーニングは、例えば、限定ではないが、アラニン走査、ペプチドブロット（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４８巻（２００４年）４４３〜４６３頁を参照）、ペプチド切断分析、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９巻（２０００年）４８７〜４９６頁を参照）、およびクロスブロックキング（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照）などの、当該技術分野で常套的な方法を使用して行うことができる。
【００９９】
抗原構造に基づく抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）は、修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）としても知られており、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１と特異的に結合する、多数のモノクローナル抗体を、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する、上記多数のものに由来する抗体の各々の結合プロファイルに基づいてビン分けすることを可能にする（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号明細書を参照）。各ビンの抗体は、別のビンにより表されるエピトープと明確に異なるかまたは部分的にオーバーラップするかのいずれかである固有のエピトープであってもよい同じエピトープに結合する。
【０１００】
また、競合的結合を使用すると、抗体が、参照抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体と同じＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１のエピトープに結合するか否かまたは参照抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体と結合を競合するか否かを容易に決定することができる。例えば、参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照抗体の結合を５０％またはそれよりも大きくブロックする抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原に対する抗体の結合を５０％またはそれよりも大きくブロックする。また、例えば、抗体が参照抗体と同じＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１のエピトープに結合するか否かを決定するために、参照抗体が、飽和条件下でＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１と結合することを可能にする。過剰な参照抗体を除去した後、調査中の抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体がＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する能力を評価する。抗体が、参照抗体の飽和結合後にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合することができる場合、その調査中の抗体は、参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。しかし、調査中の抗体が、参照抗体の飽和結合後にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１と結合することができない場合、調査中の抗体は、参照抗体が結合したエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。調査中の抗体が同じエピトープに結合するかまたは立体構造的理由により結合が妨げられているに過ぎないのかを確認するために、常套的実験作業を使用することができる（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴法、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用したペプチド突然変異および結合分析）。このアッセイは、２つの設定で、つまり抗体を両方とも飽和抗体とする設定で実施されるべきである。両設定において、第１の（飽和）抗体のみがＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合可能である場合、調査中の抗−ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体および参照抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対する結合を競争すると結論付けることができる。
【０１０１】
一部の実施態様では、２つの抗体は、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰の一方の抗体が、競合結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０巻（１９９０年）１４９５〜１５０２頁を参照）で測定して、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または９９％も、またはそれよりも大きく他方の結合を阻害する場合、同じまたはオーバーラップするエピトープに結合するとみなされる。
【０１０２】
一部の実施態様では、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減または排除する本質的にすべての抗原中のアミノ酸突然変異が、他方の結合も低減または排除する場合、同じエピトープに結合するとみなされる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減または排除するアミノ酸突然変異のサブセットのみが、他方の結合を低減または排除する場合、「オーバーラップエピトープ」を有するとみなされる。
【０１０３】
一態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体であって、以下の実施態様のいずれかによる、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦのエピトープに結合する抗体を提供する。エピトープは、特に、結晶構造解析により決定することができる。
【０１０４】
一実施態様では、エピトープは、ＷＴ１ペプチド、特に配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドの少なくとも３つのアミノ酸残基を含む。
【０１０５】
一実施態様では、エピトープは、ＷＴ１ペプチド、特に配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドの少なくとも４つのアミノ酸残基を含む。
【０１０６】
一実施態様では、エピトープは、ＷＴ１ペプチド、特に配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドの少なくとも５つのアミノ酸残基を含む。
【０１０７】
一実施態様では、エピトープは、ＷＴ１ペプチド、特に配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドの少なくとも６つのアミノ酸残基を含む。
【０１０８】
一実施態様では、エピトープは、ＷＴ１ペプチドの少なくとも３つのアミノ酸残基を含み、少なくとも３つのアミノ酸残基は、配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｍ２、Ｐ４、Ｎ５、Ａ６、およびＹ８に対応するアミノ酸残基から選択される。
【０１０９】
一実施態様では、エピトープは、ＷＴ１ペプチドの少なくとも４つのアミノ酸残基を含み、少なくとも４つのアミノ酸残基は、配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｍ２、Ｐ４、Ｎ５、Ａ６、およびＹ８に対応するアミノ酸残基から選択される。
【０１１０】
一実施態様では、エピトープは、ＷＴ１ペプチドの少なくとも５つのアミノ酸残基を含み、少なくとも５つのアミノ酸残基は、配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｍ２、Ｐ４、Ｎ５、Ａ６、およびＹ８に対応するアミノ酸残基から選択される。
【０１１１】
一実施態様では、エピトープは、ＷＴ１ペプチドの少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、少なくとも６つのアミノ酸残基は、配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｍ２、Ｐ４、Ｎ５、Ａ６、およびＹ８に対応するアミノ酸残基から選択される。
【０１１２】
一実施態様では、エピトープは、配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｎ５、およびＡ６に対応するアミノ酸残基を含む。
【０１１３】
一実施態様では、エピトープは、配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｍ２、Ｐ４、Ｎ５、Ａ６、およびＹ８に対応するアミノ酸残基を含む。
【０１１４】
一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｒ６５、Ｋ６６、およびＱ１５５に対応するアミノ酸残基を含む。
【０１１５】
一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｒ６５、Ｋ６６、およびＱ１５５に対応するアミノ酸残基、ならびに配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｎ５、およびＡ６に対応するアミノ酸残基を含む。
【０１１６】
一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｒ６５、Ｋ６６、Ｑ１５５、およびＤ６１に対応するアミノ酸残基を含む。一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｒ６５、Ｋ６６、Ｑ１５５、およびＡ６９に対応するアミノ酸残基を含む。一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｒ６５、Ｋ６６、Ｑ１５５、およびＡ１５０に対応するアミノ酸残基を含む。
【０１１７】
一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｒ６５、Ｋ６６、Ｑ１５５、ならびにＤ６１、Ａ６９、およびＡ１５０の１つまたは複数に対応するアミノ酸残基、ならびに配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｍ２、Ｐ４、Ｎ５、Ａ６、および／またはＹ８に対応するアミノ酸残基を含む。
【０１１８】
一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｄ６１、Ｇ６２、Ｒ６５、Ｋ６６、Ａ６９、Ａ１５０、Ｑ１５５、Ａ１５８、Ｔ１６３、Ｅ１６６、Ｗ１６７、およびＲ１７０に対応するアミノ酸残基を含む。
【０１１９】
一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｄ６１、Ｇ６２、Ｒ６５、Ｋ６６、Ａ６９、Ａ１５０、Ｑ１５５、Ａ１５８、Ｔ１６３、Ｅ１６６、Ｗ１６７、およびＲ１７０に対応するアミノ酸残基、ならびに配列番号７８に示されているＷＴ１ＲＭＦペプチドのアミノ酸残基Ｒ１、Ｍ２、Ｐ４、Ｎ５、Ａ６、および／またはＹ８に対応するアミノ酸残基を含む。
【０１２０】
一実施態様では、エピトープは、配列番号１３８に示されているＨＬＡ−Ａ２配列のアミノ酸残基Ｇ５６、Ｄ１０６、Ｗ１０７、Ｒ１０８、Ｅ１６１、Ｇ１６２、および／またはＲ１６９に対応するアミノ酸残基を含まない。
【０１２１】
さらなる態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、および配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、および配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、および配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、および配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、および配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、および配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２、および配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む抗体を提供する。
【０１２２】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０１２３】
別の実施態様では、抗体は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０１２４】
さらなる実施態様では、抗体は、配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０１２５】
またさらなる実施態様では、抗体は、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０１２６】
一部の実施態様では、抗体はヒト抗体である。一実施態様では、ＶＨはヒトＶＨであり、および／またはＶＬはヒトＶＬである。一実施態様では、抗体は、上記の実施態様のいずれかの通りのＣＤＲを含み、ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークをさらに含む。
【０１２７】
一実施態様では、抗体は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【０１２８】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１２９】
別の実施態様では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１３０】
さらなる実施態様では、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１３１】
またさらなる実施態様では、抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１３２】
一実施態様では、抗体は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列
を含む。
【０１３３】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０１３４】
別の実施態様では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０１３５】
さらなる実施態様では、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０１３６】
またさらなる実施態様では、抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０１３７】
ある特定の実施態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するＶＨ配列またはＶＬ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する能力を維持する。ある特定の実施態様では、ＶＨ（配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、または７１）において、合計で１〜１０個のアミノ酸が、置換、挿入、および／もしくは欠失されており、ならびに／またはＶＬ（配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、または７２）において、合計で１〜１０個のアミノ酸が、置換、挿入、および／もしくは欠失されている。ある特定の実施態様では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外部の領域に（つまりＦＲに）生じる。任意選択で、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、上記に示されているＶＨ配列および／またはＶＬ配列を含む。
【０１３８】
一実施態様では、抗体は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【０１３９】
一実施態様では、抗体は、
（ｉ）配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列；
（ｉｉ）配列番号１５のＶＨ配列および配列番号１６のＶＬ配列；
（ｉｉｉ）配列番号２３のＶＨ配列および配列番号２４のＶＬ配列；
（ｉｖ）配列番号３１のＶＨ配列および配列番号３２のＶＬ配列；
（ｖ）配列番号３９のＶＨ配列および配列番号４０のＶＬ配列；
（ｖｉ）配列番号４７のＶＨ配列および配列番号４８のＶＬ配列；
（ｖｉｉ）配列番号５５のＶＨ配列および配列番号５６のＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のＶＨ配列および配列番号６４のＶＬ配列；または
（ｉｘ）配列番号７１のＶＨ配列および配列番号７２のＶＬ配列
を含む。
【０１４０】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１４１】
別の実施態様では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１４２】
さらなる実施態様では、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１４３】
またさらなる実施態様では、抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１４４】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含む。
【０１４５】
別の実施態様では、抗体は、配列番号１５のＶＨ配列および配列番号１６のＶＬ配列を含む。
【０１４６】
さらなる実施態様では、抗体は、配列番号２３のＶＨ配列および配列番号２４のＶＬ配列を含む。
【０１４７】
またさらなる実施態様では、抗体は、配列番号３１のＶＨ配列および配列番号３２のＶＬ配列を含む。
【０１４８】
一実施態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号１１２および１１３（それぞれ、ヒトカッパおよびラムダＣＬドメイン）ならびに配列番号１１４（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示されている。一部の実施態様では、抗体は、配列番号１１２または配列番号１１３のアミノ酸配列、特に配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一部の実施態様では、抗体は、配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、Ｆｃドメインに本明細書に記載のようなアミノ酸突然変異を含んでいてもよい。
【０１４９】
一実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１５０】
一実施態様では、抗体は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様では、抗体は完全長抗体である。
【０１５１】
一実施態様では、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ  Ｆｃドメイン、より特にはＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。一実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。抗体のＦｃドメインには、本発明の二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインに関して本明細書に記載されている特徴のいずれかが単独でまたは組合せで組み込まれていてもよい。
【０１５２】
別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、およびＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片であり、特にＦａｂ分子である。別の実施態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディである。
【０１５３】
さらなる態様では、上記の実施態様のいずれかによる抗体には、下記のセクションに記載されているような特徴のいずれかが単独でまたは組合せで組み込まれていてもよい。
【０１５４】
グリコシル化変異体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更されている。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つまたは複数のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより簡便に達成することができる。
【０１５５】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着しているオリゴ糖を変更することができる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、一般にＮ結合によりＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に付着している分岐の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、ＴＩＢＴＥＣＨ  １５巻：２６〜３２頁（１９９７年）を参照されたい。オリゴ糖は、種々の糖、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」にあるＧｌｃＮＡｃに付着しているフコースを含んでいてもよい。一部の実施態様では、本発明の抗体のオリゴ糖の修飾は、ある特定の特性が向上された抗体変異体を創出するためになされてもよい。
【０１５６】
一実施態様では、非フコシル化オリゴ糖、つまりＦｃ領域に付着した（直接的または間接的に）フコースを欠如するオリゴ糖構造を有する抗体変異体が提供される。そのような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化された」オリゴ糖とも呼ばれる）は、特に、二分岐オリゴ糖構造のステムにある最初のＧｌｃＮＡｃに付着したフコース残基を欠如するＮ結合型オリゴ糖である。一実施態様では、天然抗体または親抗体と比較してＦｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加された抗体変異体が提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、または約１００％（つまり、フコシル化オリゴ糖は存在しない）でさえあってもよい。例えば、非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号パンフレットに記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定して、Ａｓｎ２９７に付着しているすべてのオリゴ糖（例えば、複合型構造、ハイブリッド型構造、および高マンノース型構造）の合計に対する、フコース残基を欠如するオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）付近に位置するアスパラギン残基を指す。しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体の軽微な配列差異により、２９７位の上流または下流の±３個アミノ酸に、つまり２９４位と３００位との間に位置する場合もある。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したそのような抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合の向上および／またはエフェクター機能の向上、特にＡＤＣＣ機能の向上を示すことができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号明細書を参照されたい。
【０１５７】
フコシル化が低減された抗体を産生することが可能な細胞株の例として、以下のものが挙げられる：タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９巻：５３３〜５４５頁（１９８６年）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；および国際公開第２００４／０５６３１２号パンフレット、特に実施例１１）、およびアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７巻：６１４〜６２２頁（２００４年）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９４巻（４頁）：６８０〜６８８頁（２００６年）；および国際公開第２００３／０８５１０７号パンフレットを参照）、またはＧＤＰフコース合成または輸送タンパク質の活性が低減または消失した細胞（例えば、米国特許出願第２００４２５９１５０号明細書、米国特許出願第２００５０３１６１３号明細書、米国特許出願公開第２００４１３２１４０号明細書、米国特許出願第２００４１１０２８２号明細書を参照）。
【０１５８】
さらなる実施態様では、抗体変異体には、例えば、抗体のＦｃ領域に付着している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている、二分されたオリゴ糖が提供される。そのような抗体変異体は、上記に記載されているようなフコシル化の低減および／またはＡＤＣＣ機能の向上を示すことができる。そのような抗体変異体の例は、例えば、Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７巻、１７６〜１８０頁（１９９９年）；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９３巻、８５１〜８６１頁（２００６年）；国際公開第９９／５４３４２号パンフレット；国際公開第２００４／０６５５４０号パンフレット、国際公開第第２００３／０１１８７８号パンフレットに記載されている。
【０１５９】
Ｆｃ領域に付着しているオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、ＣＤＣ機能の向上を示すことができる。そのような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号パンフレット；国際公開第１９９８／５８９６４号パンフレット；および国際公開第１９９９／２２７６４号パンフレットに記載されている。
【０１６０】
システイン操作抗体変異体
ある特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を創出することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体の接近可能な部位に生じる。そうした残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基がそれにより抗体の接近可能な部位に配置され、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートして、本明細書でさらに記載されていようなイムノコンジュゲートを創出するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号明細書、第８、３０，９３０号明細書、第７，８５５，２７５号明細書、第９，０００，１３０号明細書、または国際公開第２０１６０４０８５６号パンフレットに記載されているように生成することができる。
【０１６１】
抗体誘導体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で公知であり容易に利用可能である追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾されていてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分としては、これに限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造に有利であり得る。ポリマーは、分子量が任意であってもよく、分岐していてもよく、または非分岐であってもよい。抗体に付着されるポリマーの数は様々であってもよく、１つよりも多くのポリマーが付着されている場合、それらは同じ分子であってもよくまたは異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、これらに限定されないが、向上させようとする抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が画定された条件下での治療に使用されることになるか否かなどを含む考察に基づいて決定することができる。
【０１６２】
別の実施態様では、抗体と、放射線への曝露により選択的に加熱することができる非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２巻：１１６００〜１１６０５頁（２００５年））。放射線は、波長が任意であってもよく、これらに限定されないが、正常細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に近接する細胞が死滅する温度に非タンパク質性部分を加熱する波長が挙げられる。
【０１６３】
イムノコンジュゲート
また、本発明は、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌由来、真菌由来、植物由来、もしくは動物由来の酵素的活性毒素、またはそれらの断片）または放射性同位体などの１つまたは複数の治療剤にコンジュゲートされた（化学的結合された）本明細書に記載されているような抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１６４】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、上記で言及された治療剤の１つまたは複数が抗体にコンジュゲートされている、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は、典型的には、リンカーを使用して治療剤の１つまたは複数に接続されている。治療剤および薬物およびリンカーの例を含むＡＤＣ技術の概要は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ６８巻：３〜１９頁（２０１６年）に示されている。
【０１６５】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、これらに限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテシン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含む、酵素的活性毒素またはその断片のコンジュゲートされている本明細書に記載されているような抗体を含む。
【０１６６】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされた、本明細書に記載されているような抗体を含む。様々な放射性同位体が、放射性コンジュゲートの産生に利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、またはこの場合もヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄などの、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られている）用のスピン標識を含む。
【０１６７】
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジピミダートＨＣｌなど）、活性エステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して製作することができる。例えば、リシンイムノトキシンを、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８巻：１０９８頁（１９８７年）に記載されているように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号パンフレットを参照されたい。リンカーは、細胞中での細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２巻：１２７〜１３１頁（１９９２年）；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）を使用することができる。
【０１６８】
イムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、本明細書では、これらに限定されないが、架橋試薬で調製されるそのようなコンジュゲートを明示的に企図しており、架橋試薬としては、これらに限定されないが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含が挙げられ、それらは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、ロックフォード、イリノイ州、米国から）。
【０１６９】
多重特異性抗体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して、つまり異なる抗原の異なるエピトープまたは同じ抗原の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、多重特異性抗体は、３つまたはそれよりも多くの結合特異性を有する。ある特定の実施態様では、結合特異性の１つはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対するものであり、他の（２つまたはそれよりも多い）特異性は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１の２つの（またはそれよりも多くの）異なるエピトープに結合することができる。また、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を使用すると、細胞傷害性剤または細胞傷害性細胞を、またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１を発現する細胞に局在化することができる。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０１７０】
多重特異性抗体を製作するための技法としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５巻：５３７頁（１９８３年）を参照）および「ノブインホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」遺伝子操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、およびＡｔｗｅｌｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７０巻：２６頁（１９９７年）を参照）。また、多重特異性抗体は、抗体Ｆｃ−ヘテロダイマー分子を製作するための静電気操向効果（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）を遺伝子操作することにより（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照）；２つまたはそれよりも多くの抗体または断片を架橋することにより（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書、およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生させることにより（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁（１９９２年）および国際公開第２０１１／０３４６０５号パンフレットを参照）；軽鎖ミスペアリング問題を回避するための共通軽鎖技術を使用することにより（例えば、国際公開第９８／５０４３１号パンフレットを参照）；二重特異性抗体断片を製作するための「ダイアボディ」技術を使用することにより（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）を参照）；および単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用することにより（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻：５３６８頁（１９９４年）を参照）；および例えばＴｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０頁（１９９１年）に記載されているような三重特異性抗体を調製することにより製作することができる。
【０１７１】
例えば、「オクトパス抗体」またはＤＶＤ−Ｉｇを含む、３つまたはそれよりも多くの抗原結合部位を有する遺伝子操作抗体も、本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号パンフレットおよび国際公開第２００８／０２４７１５号パンフレットを参照）。３つまたはそれよりも多くの抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号パンフレット、国際公開第２０１０／１１２１９３号パンフレット、国際公開第２０１０／１３６１７２号パンフレット、国際公開第２０１０／１４５７９２号パンフレット、および国際公開第２０１３／０２６８３１号パンフレットに見出すことができる。また、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ならびに別の異なる抗原またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号明細書および国際公開第２０１５／０９５５３９号パンフレットを参照）。
【０１７２】
また、同じ抗原特異性の１つまたは複数の結合性アームにドメインクロスオーバーを有する、つまりＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１５０４４７号パンフレットを参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号パンフレットを参照）、または完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号パンフレット、国際公開第２０１６／０１６２９９号パンフレットを参照。Ｓｃｈａｅｆｅｒら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）１１８７〜１１９１頁、およびＫｌｅｉｎら、ＭＡｂｓ  ８巻（２０１６年）１０１０〜２０頁も参照）を交換することによる、非対称形態の多重特異性抗体を提供することができる。また、非対称性Ｆａｂアームは、荷電または非荷電アミノ酸突然変異をドメイン接触面に導入して正確なＦａｂペアリングを指図することにより遺伝子操作することができる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号パンフレットを参照されたい。
【０１７３】
多重特異性抗体の種々さらなる分子形式は、当該技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６７巻（２０１５年）９５〜１０６頁を参照）。
【０１７４】
また、本明細書に含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞の表面抗原に同時に結合し、Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を死滅させるために、ＣＤ３などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の不変成分を活性化するように設計された二重特異性抗体である。したがって、ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、特に結合特異性の一方がＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対してであり、他方がＣＤ３に対してである二重特異性抗体である。
【０１７５】
この目的に有用であり得る二重特異性抗体形式の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：２つのｓｃＦｖ分子が可撓性リンカーより融合されているいわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞誘導（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ））分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号パンフレット、国際公開第２００５／０６１５４７号パンフレット、国際公開第２００７／０４２２６１号パンフレット、および国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット、ＮａｇｏｒｓｅｎおよびＢａｕｅｒｌｅ、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、３１７巻、１２５５〜１２６０頁（２０１１）を参照）；タンデムダイアボディ（「ｔａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｊ  ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３巻、４１〜５６頁（１９９９年））などの、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ、９巻、２９９〜３０５頁（１９９６年））およびそれらの誘導体；ダイアボディ形式に基づくが、追加の安定化のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ  ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９９巻、４３６〜４４９頁（２０１０年））、および全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Ｓｅｉｍｅｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ３６巻、４５８〜４６７頁（２０１０年）に概説がある）。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体形式は、国際公開第２０１３／０２６８３３号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３９号パンフレット、国際公開第２０１６／０２０３０９号パンフレット；Ｂａｃａｃら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５巻（８号）（２０１６年）ｅ１２０３４９８に記載されている。
【０１７６】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１および第２の抗原に結合する二重特異性抗原結合性分子
また、本発明は、二重特異性抗原結合性分子、つまり２つの異なる抗原決定基（第１および第２の抗原）に対して特異的に結合することが可能な少なくとも２の抗原結合性部分を含む抗原結合性分子を提供する。
【０１７７】
本発明者らは、本発明者らが開発したＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体に基づいて、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１およびさらなる抗原、特にＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合性分子を開発した。
【０１７８】
実施例に示されているように、こうした二重特異性抗原結合性分子は、良好な有効性および低い毒性を含む少なからぬ顕著な特性を有する。
【０１７９】
したがって、ある特定の態様では、本発明は、（ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１である第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分および（ｂ）第２の抗原と特異的に結合する第２の抗原結合性部分を含む二重特異性抗原結合性分子であって、以下の特徴のいずれかを有する二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０１８０】
本発明の二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（つまり、ＨＬＡ−Ａ２分子およびＷＴ１由来ペプチドの複合体）を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を特異的に誘導する。一部の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ（つまり、ＨＬＡ−Ａ２分子およびＷＴ１ＲＭＦペプチドの複合体）を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を特異的に誘導する。より具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２．０１／ＷＴ１ＲＭＦ（つまり、ＨＬＡ−Ａ２０１分子およびＷＴ１ＲＭＦペプチドの複合体）を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を特異的に誘導する。
【０１８１】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子によるＴ細胞媒介性死滅の誘導は、ＨＬＡ−Ａ２／ペプチド（例えば、ＷＴ１ＲＭＦペプチドまたはＷＴ１ＶＬＤペプチド）発現細胞、特にペプチドでパルスされたＴ２細胞を使用し、Ｔ細胞が存在下で二重特異性抗原結合性分子と共にインキュベートした後で上記細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を測定することにより決定される。
【０１８２】
具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子によるＴ細胞媒介性死滅の誘導は、以下の通りに決定される：
Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−１９９２）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）で補完されたＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９８０−０４８）（完全培地）中１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物として調製する。総容積が１０ｍｌの細胞をチューブで維持し、１０μｌの１０−２Ｍ（ペプチドの最終濃度：１０−５Ｍ）ペプチド（例えば、ＷＴ１  ＶＬＤペプチド（配列番号７７）またはＲＭＦペプチド（配列番号７８））と共に、５％ＣＯ２で２時間３７℃にてインキュベートする。フィコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１４４０−０３）勾配遠心分離によりバフィーコートから単離したＰＢＭＣから汎ＣＤ３＋細胞を精製する。ヒト汎Ｔ細胞抗原細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０−０９６−５３５）を使用して、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）により、全ＣＤ３＋  Ｔ細胞を精製する。細胞傷害性アッセイを以下の通りに実施する：ペプチドでパルスした細胞（１００μｌ）を９６ウェルマイクロタイター丸底プレートに播種し（３×１０５細胞／ｍｌ）、完全培地中で、５０μｌのＴ細胞（６×１０６細胞／ｍｌ）および５０μｌの滴定された二重特異性抗原結合性分子（ｍｏｅｌｃｕｌｅ）（例えば、４０μｇ／ｍｌ〜０．００００４μｇ／ｍｌ）と共に、５％ＣＯ２で１８時間３７℃にて共培養する。その後、５０μｌの上清を新しい白色プレートに移し、１ウェル当たり２５μｌのＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ９２９１）を添加して、１５分間室温（ＲＴ）にてインキュベートする。発光シグナル（細胞死を示すものとしてのＬＤＨ放出を測定するため）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（パーキンエルマー）で読み取る。データは相対発光ユニット（ＲＬＵ）として示されている。
【０１８３】
本発明の二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（つまり、ＨＬＡ−Ａ２分子およびＷＴ１由来ペプチドの複合体）を発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。一部の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ（つまり、ＨＬＡ−Ａ２分子およびＷＴ１ＲＭＦペプチドの複合体）を発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。より具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２０１／ＷＴ１ＲＭＦ（つまり、ＨＬＡ−Ａ２０１分子およびＷＴ１ＲＭＦペプチドの複合体）を発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。
【０１８４】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子によるＴ細胞の活性化は、ＨＬＡ−Ａ２／ペプチド（例えば、ＷＴ１ＲＭＦペプチドまたはＷＴ１ＶＬＤペプチド）発現細胞、特にペプチドでパルスされたＴ２細胞に存在下で二重特異性抗原結合性分子と共にインキュベートした後のＴ細胞によるＣＤ２５および／またはＣＤ６９の発現を、特にフローサイトメトリーにより測定することにより決定される。
【０１８５】
具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子によるＴ細胞の活性化は、以下の通りに決定される：
Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−１９９２）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）で補完されたＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９８０−０４８）（完全培地）中１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物として調製する。総容積が１０ｍｌの細胞をチューブで維持し、１０μｌの１０−２Ｍ（ペプチドの最終濃度：１０−５Ｍ）ペプチド（例えば、ＷＴ１  ＶＬＤペプチド（配列番号７７）またはＲＭＦペプチド（配列番号７８））と共に、５％ＣＯ２で２時間３７℃にてインキュベートする。フィコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１４４０−０３）勾配遠心分離によりバフィーコートから単離したＰＢＭＣから汎ＣＤ３＋細胞を精製する。ヒト汎Ｔ細胞抗原細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０−０９６−５３５）を使用して、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）により、全ＣＤ３＋  Ｔ細胞を精製する。細胞傷害性アッセイを以下の通りに実施する：ペプチドでパルスした細胞（１００μｌ）を９６ウェルマイクロタイター丸底プレートに播種し（３×１０５細胞／ｍｌ）、完全培地中で、５０μｌのＴ細胞（６×１０６細胞／ｍｌ）および５０μｌの滴定された二重特異性抗原結合性分子（ｍｏｅｌｃｕｌｅ）（例えば、４０μｇ／ｍｌ〜０．００００４μｇ／ｍｌの）と共に、５％ＣＯ２で１８時間３７℃にて共培養する。１８時間の共インキュベーション後に細胞を回収し、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３００３２１）、ＣＤ２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０２６０６）、およびＣＤ６９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３１０９１４）に対する抗体で染色して、フローサイトメトリーによりＴ細胞活性化を測定する。
【０１８６】
別の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子によるＴ細胞の活性化は、ＨＬＡ−Ａ２／ペプチド（例えば、ＷＴ１ＲＭＦペプチドまたはＷＴ１ＶＬＤペプチド）発現細胞、特にペプチドでパルスされたＴ２細胞、およびレポーターＴ細胞株、特にＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するジャーカットＴ細胞株を使用して決定される。
【０１８７】
具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子によるＴ細胞の活性化は、以下の通りに決定される：
Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−１９９２）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）で補完されたＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９８０−０４８）（完全培地）中１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物として調製する。総容積が１０ｍｌの細胞をチューブで維持し、１０μｌの１０−２Ｍ（ペプチドの最終濃度：１０−５Ｍ）ペプチド（例えば、ＷＴ１  ＶＬＤペプチド（配列番号７７）またはＲＭＦペプチド（配列番号７８））と共に、５％ＣＯ２で２時間３７℃にてインキュベートする。洗浄した後、２．２×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁物中のペプチドでパルスされた細胞の９０μｌを、９６ウェルマイクロタイター丸底プレート（２０，０００細胞／ウェル、ＴＰＰ、Ｃａｔ．Ｎｏ．９２０９７）に播種し、ＮＦＡＴのプロモーター下でルシフェラーゼを発現する５０μｌのジャーカット細胞（ジャーカット−ＮＦＡＴ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＳ１７６５０１）（２×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物）および１０μｌの滴定された二重特異性抗原結合性分子（例えば、ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ〜０．００６４μｇ／ｍｌ）と共に、５％ＣＯ２で１６時間３７℃にて共培養する。その後、５０μｌの上清を除去し、１ウェル当たり１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２６２０）と取り替え、室温（ＲＴ）でインキュベートする。５分後、１８０μｌの上清を新しい白色プレートに移して、発光シグナルをＥｎＶｉｓｉｏｎ（パーキンエルマー）で測定する。データは相対発光ユニット（ＲＬＵ）として示されている。
【０１８８】
一実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２のみ（つまりペプチドを有しない）またはＷＴ１ＲＭＦもしくはＷＴ１ＶＬＤなどのＷＴ１由来ペプチド以外のペプチドを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を著しく誘導することもなく、その存在下においてＴ細胞を著しく活性化することもない。
【０１８９】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＷＴ１由来ペプチド、特にＷＴ１ＲＭＦまたはＷＴ１ＶＬＤの非存在下でＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を著しく誘導することもなく、ＷＴ１由来ペプチド、特にＷＴ１ＲＭＦまたはＷＴ１ＶＬＤの非存在下でＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞の存在下でＴ細胞を著しく活性化することもない。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＷＴ１由来ペプチド（具体的には、ＷＴ１ＲＭＦまたはＷＴ１ＶＬＤ）の非存在下でＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅の誘導またはＷＴ１由来ペプチド（具体的には、ＷＴ１ＲＭＦまたはＷＴ１ＶＬＤ）の非存在下でＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞の存在下でのＴ細胞の活性化のＥＣ５０よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、または少なくとも１００倍低いＥＣ５０で、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導し、および／またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞の存在下でＴ細胞を活性化する。
【０１９０】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導し、および／またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞の存在下でＴ細胞を活性化するが、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）から選択されるペプチドを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を著しく誘導することもなく、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）から選択されるペプチドを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞の存在下でＴ細胞を著しく活性化することもない。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導し、および／またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞の存在下でＴ細胞を活性化するが、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）のいずれかを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を著しく誘導することもなく、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）のいずれかを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞の存在下でＴ細胞を著しく活性化することもない。
【０１９１】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）から選択されるペプチドを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅の誘導および／または表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）から選択されるペプチドを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞の存在下でのＴ細胞の活性化のＥＣ５０よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、または少なくとも１００倍低いＥＣ５０で、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導し、および／またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞の存在下でＴ細胞を活性化する。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）のいずれかを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅の誘導および／または表５のペプチド（配列番号７９〜１０５のペプチド）のいずれかを有するＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞の存在下でのＴ細胞の活性化のＥＣ５０よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、または少なくとも１００倍低いＥＣ５０で、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導し、および／またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ）を発現する細胞の存在下でＴ細胞を活性化する。
【０１９２】
一実施態様では、Ｔ細胞媒介性死滅の誘導および／またはＴ細胞の活性化は、上記に記載されているように決定され、ＥＣ５０は、ＸＬｆｉｔ（登録商標）アドオン（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ギルフォード、英国）を使用してＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌで算出される。
【０１９３】
本発明の特定の実施態様によると、二重特異性抗原結合性分子に含まれている抗原結合性部分は、Ｆａｂ分子（つまり、各々が可変ドメインおよび定常ドメインを含む重鎖および軽鎖で構成される抗原結合性ドメイン）である。一実施態様では、第１および／または第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ分子である。一実施態様では、Ｆａｂ分子はヒトである。特定の実施態様では、Ｆａｂ分子はヒト化されている。さらに別の実施態様では、Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインを含む。
【０１９４】
好ましくは、抗原結合性部分の少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。そのような修飾は、異なるＦａｂ分子に由来する重鎖および軽鎖のミスペアリングを低減し、それにより組換え体産生時の本発明の二重特異性抗原結合性分子の収率および純度を向上させる。本発明の二重特異性抗原結合性分子に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬおよびＶＨ）が交換されている。しかしながら、このドメイン交換でさえ、二重特異性抗原結合性分子の調製物は、ミスペアリングした重鎖および軽鎖間のいわゆるベンスジョーンズ型相互作用によるある副産物を含む場合がある（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）１１１８７〜１１１９１頁を参照）。異なるＦａｂ分子に由来する重鎖および軽鎖のミスペアリングをさらに低減し、したがって所望の二重特異性抗原結合性分子の純度および収率を増加させるために、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、本明細書でさらに記載されているように、第１の抗原（ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１）に結合するＦａｂ分子または第２の抗原（例えば、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原）に結合するＦａｂ分子のいずれかのＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に導入してもよい。電荷修飾は、二重特異性抗原結合性分子に含まれる従来型Ｆａｂ分子（例えば、図１Ａ〜１Ｃ、１Ｇ〜１Ｊに示されているものなど）または二重特異性抗原結合性分子に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｄ〜１Ｆ、１Ｋ〜１Ｎに示されているものなど）のいずれかになされる（しかし両方ではない）。特定の実施態様では、電荷修飾は、二重特異性抗原結合性分子に含まれる従来型Ｆａｂ分子（特定の実施態様では、第１の抗原、つまりＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する）になされる。
【０１９５】
本発明による特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１の抗原（つまり、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１）および第２の抗原（例えば、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３）に同時に結合することが可能である。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１および活性化Ｔ細胞抗原に同時に結合することより、Ｔ細胞と標的細胞とを架橋することが可能である。さらにより特定の実施態様では、そのような同時結合は、標的細胞、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１発現腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施態様では、そのような同時結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。他の実施態様では、そのような同時結合は、分化、増殖、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３と結合しても、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１との同時結合がなければ、Ｔ細胞活性化をもたらさない。
【０１９６】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に再指向させることが可能である。特定の実施態様では、この再指向化は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示および／またはＴ細胞の特異性に依存しない。
【０１９７】
特に、本発明の実施態様のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。一部の実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞、特にＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０１９８】
第１の抗原結合性部分
本発明の二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（第１の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合性部分、特にＦａｂ分子を含む。ある特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する２つの抗原結合性部分、特にＦａｂ分子を含む。特定のそのような実施態様では、こうした抗原結合性部分の各々は、同じ抗原決定基に結合する。さらにより特定の実施態様では、こうした抗原結合性部分はすべて同一であり、つまり、本明細書に記載されているように、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに同じアミノ酸置換（もしあれば）を含む同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する２つ以下の抗原結合性部分、特にＦａｂ分子を含む。
【０１９９】
特定の実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗原結合性部分は、従来型Ｆａｂ分子である。そのような実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合性部分は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまり、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＨ１およびＣＬが互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。
【０２００】
代替的な実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗原結合性部分は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまり、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＨ１およびＣＬが互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。そのような実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子である。
【０２０１】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１結合性部分は、二重特異性抗原結合性分子を、標的部位に、例えばＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１を発現する特定のタイプの腫瘍細胞に指向させることができる。
【０２０２】
二重特異性抗原結合性分子の第１の抗原結合性部分には、科学的に明白に不合理であるかまたは不可能でない限り、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体に関して本明細書に記載されている特徴のいずれかが単独でまたは組合せで組み込まれていてもよい。
【０２０３】
したがって、一態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原はＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１であり、第１の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、および配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、および配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、および配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、および配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、および配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、および配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２、および配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む第１の抗原結合性部分；ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分
を含む二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０２０４】
特定の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２０５】
別の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２０６】
さらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２０７】
またさらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２０８】
一部の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、ヒト抗体である（に由来する）。一実施態様では、ＶＨはヒトＶＨであり、および／またはＶＬはヒトＶＬである。一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、上記の実施態様のいずれかの通りのＣＤＲを含み、ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークをさらに含む。
【０２０９】
一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【０２１０】
特定の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２１１】
別の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２１２】
さらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２１３】
またさらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列
を含む。
【０２１４】
特定の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２１５】
別の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２１６】
さらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２１７】
またさらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２１８】
一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【０２１９】
一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列；
（ｉｉ）配列番号１５のＶＨ配列および配列番号１６のＶＬ配列；
（ｉｉｉ）配列番号２３のＶＨ配列および配列番号２４のＶＬ配列；
（ｉｖ）配列番号３１のＶＨ配列および配列番号３２のＶＬ配列；
（ｖ）配列番号３９のＶＨ配列および配列番号４０のＶＬ配列；
（ｖｉ）配列番号４７のＶＨ配列および配列番号４８のＶＬ配列；
（ｖｉｉ）配列番号５５のＶＨ配列および配列番号５６のＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のＶＨ配列および配列番号６４のＶＬ配列；または
（ｉｘ）配列番号７１のＶＨ配列および配列番号７２配列のＶＬ
を含む。
【０２２０】
特定の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２２１】
別の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２２２】
さらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２２３】
またさらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２２４】
特定の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含む。
【０２２５】
別の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号１５のＶＨ配列および配列番号１６のＶＬ配列を含む。
【０２２６】
さらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号２３のＶＨ配列および配列番号２４のＶＬ配列を含む。
【０２２７】
またさらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号３１のＶＨ配列および配列番号３２のＶＬ配列を含む。
【０２２８】
一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、第１の抗原結合性部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１および／またはＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号１１２および１１３（それぞれ、ヒトカッパおよびラムダＣＬドメイン）ならびに配列番号１１４（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示されている。一部の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号１１２または配列番号１１３のアミノ酸配列、特に配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、クロスオーバーＦａｂ分子の場合、本明細書の「電荷修飾」に記載されているようなアミノ酸突然変異を含んでいてもよく、および／または１つもしくは複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失もしくは置換を含んでいてもよい。一部の実施態様では、第１の抗原結合性部分は、配列番号１１４のアミノ酸配列に含まれているＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的には、ＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」に記載されているようなアミノ酸突然変異を含んでいてもよい。
【０２２９】
第２の抗原結合性部分
本発明の二重特異性抗原結合性分子は、第２の抗原（ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１とは異なる）と結合する少なくとも１つの抗原結合性部分、特にＦａｂ分子を含む。
【０２３０】
特定の実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合性部分は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまり、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＨ１およびＣＬが互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。そのような実施態様では、第１の抗原（つまり、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１）に結合する抗原結合性部分は、好ましくは従来型Ｆａｂ分子である。ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する１つよりも多くの抗原結合性部分、特にＦａｂ分子が二重特異性抗原結合性分子に含まれている実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合性部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗原結合性部分は、従来型Ｆａｂ分子である。
【０２３１】
代替的な実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合性部分は、従来型Ｆａｂ分子である。そのような実施態様では、第１の抗原（つまり、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１）に結合する抗原結合性部分は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまり、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＨ１およびＣＬが互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。第２の抗原に結合する１つよりも多くの抗原結合性部分、特にＦａｂ分子が二重特異性抗原結合性分子に含まれている実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗原結合性部分は、好ましくは、クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原に結合する抗原結合性部分は、従来型Ｆａｂ分子である。
【０２３２】
一部の実施態様では、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原（本明細書では「活性化Ｔ細胞抗原結合性部分または活性化Ｔ細胞抗原結合性Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、活性化Ｔ細胞抗原と特異的に結合することが可能な１つ以下の抗原結合性部分を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、活性化Ｔ細胞抗原との一価結合を提供する。
【０２３３】
特定の実施態様では、第２の抗原は、ＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号１０７）またはカニクイザルＣＤ３（配列番号１０８）、最も特にヒトＣＤ３である。一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、ヒトＣＤ３およびカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（つまり、特異的に結合する）。一部の実施態様では、第２の抗原は、ＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３エプシロン）である。
【０２３４】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１１５のＨＣＤＲ１、配列番号１１６のＨＣＤＲ２、配列番号１１７のＨＣＤＲ３、配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２、および配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含む。
【０２３５】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１１５のＨＣＤＲ１、配列番号１１６のＨＣＤＲ２、および配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１１８のＬＣＤＲ１、配列番号１１９のＬＣＤＲ２、および配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２３６】
一部の実施態様では、第２の抗原結合性部分は、ヒト化抗体である（に由来する）。一実施態様では、ＶＨはヒト化ＶＨであり、および／またはＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、上記の実施態様のいずれかの通りのＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【０２３７】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２３８】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２３９】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分のＶＨは、配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合性部分のＶＬは、配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２４０】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２４１】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１２１のＶＨ配列および配列番号１２２のＶＬ配列を含む。
【０２４２】
特定の実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１３０のＨＣＤＲ１、配列番号１３１のＨＣＤＲ２、配列番号１３２のＨＣＤＲ３、配列番号１３３のＬＣＤＲ１、配列番号１３４のＬＣＤＲ２、および配列番号１３５のＬＣＤＲ３を含む。
【０２４３】
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１３０のＨＣＤＲ１、配列番号１３１のＨＣＤＲ２、および配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１３３のＬＣＤＲ１、配列番号１３４のＬＣＤＲ２、および配列番号１３５のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２４４】
一部の実施態様では、第２の抗原結合性部分は、ヒト化抗体である（に由来する）。一実施態様では、ＶＨはヒト化ＶＨであり、および／またはＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、上記の実施態様のいずれかの通りのＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【０２４５】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２４６】
特定の実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２４７】
別の特定の実施態様では、第２の抗原結合性部分のＶＨは、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合性部分のＶＬは、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２４８】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２４９】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１３６のＶＨ配列および配列番号１３７のＶＬ配列を含む。
【０２５０】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、第２の抗原結合性部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１および／またはＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号１１２および１１３（それぞれ、ヒトカッパおよびラムダＣＬドメイン）ならびに配列番号１１４（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示されている。一部の実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１１２または配列番号１１３のアミノ酸配列、特に配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、クロスオーバーＦａｂ分子の場合、本明細書の「電荷修飾」に記載されているようなアミノ酸突然変異を含んでいてもよく、および／または１つもしくは複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失もしくは置換を含んでいてもよい。一部の実施態様では、第２の抗原結合性部分は、配列番号１１４のアミノ酸配列に含まれているＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特に、ＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」に記載されているようなアミノ酸突然変異を含んでいてもよい。
【０２５１】
一部の実施態様では、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１、特に可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である（つまり、そのような実施態様によると、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインまたは定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。１つのそのような実施態様では、第１の（および該当する場合は第３の）抗原結合性部分は、従来型Ｆａｂ分子である。
【０２５２】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子には、第２の抗原（例えば、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原）に結合する１つ以下の抗原結合性部分が存在する（つまり、二重特異性抗原結合性分子は、第２の抗原との一価結合を提供する）。
【０２５３】
電荷修飾
本発明の二重特異性抗原結合性分子は、それらの結合性アームの１つ（または複数、２つよりも多くの抗原結合性Ｆａｂ分子を含む分子の場合）にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂに基づく二重特異性／多重特異性抗原結合性分子を産生する際に生じる場合がある、軽鎖と不一致重鎖とのミスペアリング（ベンスジョーンス型副産物）の低減に特に効果的であるアミノ酸置換を、それらに含まれているＦａｂ分子に含んでいてもよい（また、国際公開第２０１５／１５０４４７号パンフレット、特にその中の例を参照。この文献は、その全内容が本明細書に参照により援用される）。望ましくない副産物、特にそれらの結合性アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗原結合性分子に生じるベンスジョーンズ型副産物と比較した、所望の二重特異性抗原結合性分子の比率は、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することにより向上させることができる（本明細書では「電荷修飾」と呼ばれることもある）。
【０２５４】
したがって、二重特異性抗原結合性分子の第１および第２の抗原結合性部分が両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合性部分（特に第２の抗原結合性部分）の１つでは、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられている一部の実施態様では、
ｉ）第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、正荷電アミノ酸により置換されており（カバットによる番号付け）、その場合、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸が、負荷電アミノ酸により置換されているか（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；または
ｉｉ）第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、正荷電アミノ酸により置換されており（カバットによる番号付け）、その場合、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸が、負荷電アミノ酸により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２５５】
二重特異性抗原結合性分子は、ｉ）およびｉｉ）で言及されている修飾を両方ともは含まない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合性部分の定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられていない（つまり、未交換のままである）。
【０２５６】
より具体的な実施態様では、
ｉ）第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されているか（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；または
ｉｉ）第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２５７】
１つのそのような実施態様では、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２５８】
さらなる実施態様では、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２５９】
特定の実施態様では、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２６０】
より特定の実施態様では、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２６１】
さらにより特定の実施態様では、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２６２】
特定の実施態様では、上記の実施態様によるアミノ酸置換が、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１になされている場合、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
【０２６３】
あるいは、上記の実施態様によるアミノ酸置換は、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１ではなく、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１になされていてもよい。特定のそのような実施態様では、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
【０２６４】
したがって、一実施態様では、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２６５】
さらなる実施態様では、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２６６】
さらに別の実施態様では、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）に置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２６７】
一実施態様では、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２６８】
別の実施態様では、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）により置換されており（カバットによる番号付け）、第２の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２６９】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、具体的にはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分を含み、
第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により（特定の実施態様では、独立してリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により（特定の実施態様では、独立してリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２７０】
別の特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、具体的にはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分を含み、
第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により（特定の実施態様では、独立してリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により（特定の実施態様では、独立してリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）に置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２７１】
二重特異性抗原結合性分子形式
本発明による二重特異性抗原結合性分子の成分は、様々な構成で互いに融合させることができる。例示的な構成は図１に示されている。
【０２７２】
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子に含まれている抗原結合性部分は、Ｆａｂ分子である。そのような実施態様では、第１、第２、第３などの抗原結合性部分は、本明細書では、それぞれ第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ばれる場合がある。
【０２７３】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子の第１および第２の抗原結合性部分は、互いに、任意選択でペプチドリンカーを介して融合されている。特定の実施態様では、第１および第２の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子である。１つのそのような実施態様では、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。別のそのような実施態様では、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。（ｉ）第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているかのいずれかである実施態様では、加えて、第１の抗原結合性部分のＦａｂ軽鎖および第２の抗原結合性部分のＦａｂ軽鎖は、互いに、任意選択でペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。
【０２７４】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１などの標的細胞抗原と特異的に結合することが可能な単一の抗原結合性部分（Ｆａｂ分子など）を有する二重特異性抗原結合性分子（例えば、図１Ａ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｋ、１Ｌに示されているような）は、高親和性抗原結合性部分の結合後に標的細胞抗原の内部移行が予想される場合、特に有用である。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な１つよりも多くの抗原結合性部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を増強し、それによりその利用能が低減される。
【０２７５】
しかしながら、他の場合では、例えば、標的部位への標的指向性を最適化するために、または標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な２つまたはそれよりも多くの抗原結合性部分（Ｆａｂ分子など）を含む二重特異性抗原結合性分子（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍ、または１Ｎに示されている例を参照）を有することが有利だろう。
【０２７６】
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第３の抗原結合性部分を含む。
【０２７７】
一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、第１の抗原、つまりＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する。一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、Ｆａｂ分子である。
【０２７８】
特定の実施態様では、第３の抗原部分は、第１の抗原結合性部分と同一である。
【０２７９】
二重特異性抗原結合性分子の第３の抗原結合性部分には、科学的に明白に不合理であるかまたは不可能でない限り、第１の抗原結合性部分に関しておよび／またはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する抗体に関して本明細書に記載されている特徴のいずれかが単独でまたは組合せで組み込まれていてもよい。
【０２８０】
一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、および配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、および配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、および配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、および配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、および配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、および配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２、および配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む。
【０２８１】
特定の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２８２】
別の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２８３】
さらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２８４】
またさらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、および配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、および配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０２８５】
一部の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、ヒト抗体である（に由来する）。一実施態様では、ＶＨはヒトＶＨであり、および／またはＶＬはヒトＶＬである。一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、上記の実施態様のいずれかの通りのＣＤＲを含み、ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークをさらに含む。
【０２８６】
一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【０２８７】
特定の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２８８】
別の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２８９】
さらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２９０】
またさらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２９１】
一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列
を含む。
【０２９２】
特定の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２９３】
別の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２９４】
さらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２９５】
またさらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ配列、および配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０２９６】
一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｘ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【０２９７】
一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列；
（ｉｉ）配列番号１５のＶＨ配列および配列番号１６のＶＬ配列；
（ｉｉｉ）配列番号２３のＶＨ配列および配列番号２４のＶＬ配列；
（ｉｖ）配列番号３１のＶＨ配列および配列番号３２のＶＬ配列；
（ｖ）配列番号３９のＶＨ配列および配列番号４０のＶＬ配列；
（ｖｉ）配列番号４７のＶＨ配列および配列番号４８のＶＬ配列；
（ｖｉｉ）配列番号５５のＶＨ配列および配列番号５６のＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号６３のＶＨ配列および配列番号６４のＶＬ配列；または
（ｉｘ）配列番号７１のＶＨ配列および配列番号７２配列のＶＬ
を含む。
【０２９８】
特定の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０２９９】
別の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０３００】
さらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０３０１】
またさらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０３０２】
特定の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含む。
【０３０３】
別の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号１５のＶＨ配列および配列番号１６のＶＬ配列を含む。
【０３０４】
さらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号２３のＶＨ配列および配列番号２４のＶＬ配列を含む。
【０３０５】
またさらなる実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号３１のＶＨ配列および配列番号３２のＶＬ配列を含む。
【０３０６】
一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、第３の抗原結合性部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１および／またはＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号１１２および１１３（それぞれ、ヒトカッパおよびラムダＣＬドメイン）ならびに配列番号１１４（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示されている。一部の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号１１２または配列番号１１３のアミノ酸配列、特に配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、クロスオーバーＦａｂ分子の場合、本明細書の「電荷修飾」に記載されているようなアミノ酸突然変異を含んでいてもよく、および／または１つもしくは複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失もしくは置換を含んでいてもよい。一部の実施態様では、第３の抗原結合性部分は、配列番号１１４のアミノ酸配列に含まれているＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的には、ＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」に記載されているようなアミノ酸突然変異を含んでいてもよい。
【０３０７】
特定の実施態様では、第３および第１の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子であり、第３の抗原結合性部分は、第１の抗原結合性部分と同一である。したがって、こうした実施態様では、第１および第３の抗原結合性部分は、同じ重鎖配列および軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン配置（つまり、従来型またはクロスオーバー）を有する。さらに、こうした実施態様では、第３の抗原結合性部分は、該当する場合、第１の抗原結合性部分と同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書に「電荷修飾」として記載されているアミノ酸置換は、第１の抗原結合性部分および第３の抗原結合性部分の各々の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１になされることになる。あるいは、アミノ酸置換は、第１の抗原結合性部分および第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１ではなく、第２の抗原結合性部分（特定の実施態様では、これもＦａｂ分子である）の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１になされていてもよい。
【０３０８】
第１の抗原結合性部分のように、第３の抗原結合性部分は、特に従来型Ｆａｂ分子である。しかしながら、第１および第３の抗原結合性部分がクロスオーバーＦａｂ分子である（および第２の抗原結合性部分が従来型Ｆａｂ分子である）実施態様も企図される。したがって、特定の実施態様では、第１および第３の抗原結合性部分は各々従来型Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合性部分は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまり、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。他の実施態様では、第１および第３の抗原結合性部分は各々クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子である。
【０３０９】
第３の抗原結合性部分が存在する場合、特定の実施態様では、第１および第３の抗原部分はＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合し、第２の抗原結合性部分は第２の抗原、特に活性化Ｔ細胞抗原、より特にＣＤ３、最も特にＣＤ３エプシロンに結合する。
【０３１０】
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットは、安定的な付随が可能である。
【０３１１】
本発明による二重特異性抗原結合性分子は、異なる構成を有してもよく、つまり、第１の、第２の（および任意選択で第３の）抗原結合性部分は、互いにおよびＦｃドメインに異なる様式で融合されていてもよい。成分は、互いに直接的に融合されていてもよく、または好ましくは１つもしくは複数の好適なペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。Ｆａｂ分子の融合がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に対してある場合、融合は、典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介してである。
【０３１２】
一部の実施態様では、第１および第２の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような実施態様では、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、またはＦｃドメインのサブユニットの他方のサブユニットのＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、第１の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合性部分は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまり、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来型Ｆａｂ分子である。
【０３１３】
一実施態様では、第１および第２の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１および第２のＦａｂ分子、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ｇおよび１Ｋに概略的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意選択で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、加えて互いに融合されていてもよい。
【０３１４】
別の実施態様では、第１および第２の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子であり、第１および第２の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている。具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１および第２のＦａｂ分子、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１および第２のＦａｂ分子は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ａおよび１Ｄに概略的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子である）。第１および第２のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインと直接的に融合されていてもよく、またはペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。特定の実施態様では、第１および第２のＦａｂ分子は各々、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合されている。具体的な実施態様では、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメインである場合、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【０３１５】
一部の実施態様では、第１および第２の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子であり、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような実施態様では、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、または（上記に記載されているように）Ｆｃドメインのサブユニットの他方のサブユニットのＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、第１の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合性部分は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまり、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来型Ｆａｂ分子である。
【０３１６】
一実施態様では、第１および第２の抗原結合性部分は各々Ｆａｂ分子であり、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１および第２のＦａｂ分子、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ｈおよび１Ｌに概略的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子である）。任意選択で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、加えて互いに融合されていてもよい。
【０３１７】
一部の実施態様では、第３の抗原結合性部分、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、第１および第３のＦａｂ分子は各々従来型Ｆａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまりＦａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、第１および第３のＦａｂ分子は各々クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来型Ｆａｂ分子である。
【０３１８】
特定のそのような実施態様では、第２および第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１、第２、および第３のＦａｂ分子、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ｂおよび１Ｅ（これらの例では、第２の抗原結合性部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子である）ならびに図１Ｊおよび１Ｎ（これらの例では、第２の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合性部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に示されている。第２および第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に融合されていてもよく、またはペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。特定の実施態様では、第２および第３のＦａｂ分子は各々、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合されている。具体的な実施態様では、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメインである場合、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、加えて互いに融合されていてもよい。
【０３１９】
別のそのような実施態様では、第１および第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１、第２、および第３のＦａｂ分子、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ｃおよび１Ｆ（これらの例では、第２の抗原結合性部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子である）ならびに図１Ｉおよび１Ｍ（これらの例では、第２の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合性部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に示されている。第１および第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に融合されていてもよく、またはペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。特定の実施態様では、第１および第３のＦａｂ分子は各々、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合されている。具体的な実施態様では、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメインである場合、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、加えて互いに融合されていてもよい。
【０３２０】
Ｆａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端が免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインのサブユニットの各々のＮ末端に融合されている二重特異性抗原結合性分子の構成では、本質的に、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域、およびＦｃドメインが、免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。さらにより特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。さらなる特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである。一実施態様では、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
【０３２１】
本発明の二重特異性抗原結合性分子の一部では、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、互いに任意選択でペプチドリンカーを介して融合されている。第１および第２のＦａｂ分子の構成に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合されていてもよく、または第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合されていてもよい。第１および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、不一致のＦａｂ重鎖および軽鎖のミスペアリングをさらに低減し、また本発明の二重特異性抗原結合性分子の一部の発現に必要なプラスミドの数を低減させる。
【０３２２】
抗原結合性部分は、直接的に、または１つもしくは複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介してＦｃドメインにまたは互いに融合されていてもよい。ペプチドリンカーは、当該技術分野にて公知であり、本明細書に記載されている。好適な非免疫原性ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、またはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、一般には１から１０まで、典型的には２から４までの整数である。一実施態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも５個アミノ酸の長さを有し、一実施態様では、５〜１００の長さを有し、さらなる実施態様では、１０〜５０個アミノ酸の長さを有する。一実施態様では、ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎまたは（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、および（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５、または６、およびｍ＝０、１、２、または３）または（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４、または５、およびｍ＝０、１、２、または３）であり、一実施態様では、ｘ＝４およびｎ＝２または３であり、さらなる実施態様では、Ｘ＝４およびｍ＝２である。一実施態様では、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特に好適なペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１および第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を接続するために好適な例示的ペプチドリンカーは、配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１１０および１１１）を含む。別の好適なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の部分）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されている場合、Ｆａｂ分子は、追加のペプチドリンカーを有するまたは有していない免疫グロブリンヒンジ領域またはその部分を介して融合されていてもよい。
【０３２３】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれがＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。ある特定の実施態様では、ポリペプチドは、共有結合的に、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【０３２４】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれがＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとのカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。ある特定の実施態様では、ポリペプチドは、共有結合的に、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【０３２５】
一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれがＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれがＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【０３２６】
こうした実施態様の一部では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。こうした実施態様の他のものでは、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、または第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））を、必要に応じてさらに含む。
【０３２７】
こうした実施態様による二重特異性抗原結合性分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））または（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））および第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含んでいてもよい。ある特定の実施態様では、ポリペプチドは、共有結合的に、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【０３２８】
一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれがＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれがＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【０３２９】
こうした実施態様に一部では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。こうした実施態様の他のものでは、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、または第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））を、必要に応じてさらに含む。
【０３３０】
こうした実施態様による二重特異性抗原結合性分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））または（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））および第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含んでいてもよい。ある特定の実施態様では、ポリペプチドは、共有結合的に、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【０３３１】
ある特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、Ｆｃドメインを含まない。特定のそのような実施態様では、第１のおよび存在する場合は第３のＦａｂ分子は各々従来型Ｆａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、本明細書に記載されているようなクロスオーバーＦａｂ分子、つまりＦａｂ重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに交換／置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、第１のおよび存在する場合は第３のＦａｂ分子は各々クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来型Ｆａｂ分子である。
【０３３２】
１つのそのような実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１および第２の抗原結合性部分ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１および第２の抗原結合性部分は両方ともＦａｂ分子であり、第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ｏおよび１Ｓに概略的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子である）。
【０３３３】
別のそのような実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１および第２の抗原結合性部分ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１および第２の抗原結合性部分は両方ともＦａｂ分子であり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ｐおよび１Ｔに概略的に示されている（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合性部分は従来型Ｆａｂ分子である）。
【０３３４】
一部の実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、二重特異性抗原結合性分子は、第３の抗原結合性部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。ある特定のそのような実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１、第２、および第３のＦａｂ分子ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ｑおよび１Ｕ（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１および抗原結合性部分は各々従来型Ｆａｂ分子である）または図１Ｘおよび１Ｚ（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインは従来型Ｆａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合性部分は各々ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に示されている。
【０３３５】
一部の実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、二重特異性抗原結合性分子は、第３の抗原結合性部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合されている。ある特定のそのような実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１、第２、および第３のＦａｂ分子ならびに任意選択で１つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合されている。そのような構成は、図１Ｒおよび１Ｖ（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１および抗原結合性部分は各々従来型Ｆａｂ分子である）または図１Ｗおよび１Ｙ（これらの例では、第２の抗原結合性ドメインは従来型Ｆａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合性部分は各々ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に示されている。
【０３３６】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。
【０３３７】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。
【０３３８】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。
【０３３９】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。
【０３４０】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０３４１】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０３４２】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０３４３】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、および第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０３４４】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（つまり、第３のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１））、および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））をさらに含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０３４５】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（つまり、第３のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（３）−ＣＬ（３））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））、および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））をさらに含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））をさらに含む。
【０３４６】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第３のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１））、および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））をさらに含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０３４７】
ある特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第３のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いでそれが第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（つまり、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、次いでそれが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３）−ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２））を含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））、および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））をさらに含む。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））をさらに含む。
【０３４８】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ａ）の第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３４９】
特定の実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合性部分と同一である第３の抗原結合性部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ａ）の第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３５０】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分およびｂ）の第２の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端の融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３５１】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ａ）の第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３５２】
特定の実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合性部分と同一である第３の抗原結合性部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ａ）の第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３５３】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分およびｂ）の第２の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端の融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３５４】
本発明による二重特異性抗原結合性分子の様々な構成のすべてにおいて、本明細書に記載されているアミノ酸置換は、存在する場合、第１のおよび（存在する場合は）第３の抗原結合性部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン、または第２の抗原結合性部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインのいずれに存在してもよい。好ましくは、アミノ酸置換は、第１のおよび（存在する場合は）第３の抗原結合性部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに存在する。本発明の概念によると、本明細書に記載されているようなアミノ酸置換が、第１の（および存在する場合は第３の）抗原結合性部分／Ｆａｂ分子になされている場合、そのようなアミノ酸置換は、第２の抗原結合性部分／Ｆａｂ分子にはなされていない。逆に、本明細書に記載されているようなアミノ酸置換が、第２の抗原結合性部分／Ｆａｂ分子になされている場合、そのようなアミノ置換は、第１の（および存在する場合は第３の）抗原結合性部分／Ｆａｂ分子にはなされていない。アミノ酸置換は、特に、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子を含む二重特異性抗原結合性分子になされる。
【０３５５】
本発明による二重特異性抗原結合性分子の特定の実施態様では、特に、本明細書に記載されているようなアミノ酸置換が、第１の（および存在する場合は第３の）抗原結合性部分／Ｆａｂ分子になされている場合、第１の（および存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。本発明による二重特異性抗原結合性分子の他の実施態様では、特に、本明細書に記載されているようなアミノ酸置換が、第２の抗原結合性部分／Ｆａｂ分子になされている場合、第２の抗原結合性部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。一部の実施態様では、第１の（および存在する場合は第３の）抗原結合性部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ、および第２の抗原結合性部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
【０３５６】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
ａ）の第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により（最も特にはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；ならびに
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ａ）の第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３５７】
特定の実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合性部分と同一である第３の抗原結合性部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
ａ）の第１の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により（最も特にはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；ならびに
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ａ）の第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３５８】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、
ａ）の第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により（最も特にはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；ならびに
ａ）の第１の抗原結合性部分およびｂ）の第２の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端の融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３５９】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み；
ａ）の第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により（最も特にはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；ならびに
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ａ）の第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３６０】
特定の実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合性部分と同一である第３の抗原結合性部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み；
ａ）の第１の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により（最も特にはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；ならびに
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ａ）の第１の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１の抗原結合性部分およびｃ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３６１】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合性部分であって、第１の抗原は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１の抗原結合性部分は、配列番号９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、および配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、および配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である第１の抗原結合性部分；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、より特にＣＤ３エプシロンであり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み；
ａ）の第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により（最も特にはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；ならびに
ａ）の第１の抗原結合性部分およびｂ）の第２の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端の融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３６２】
上記の実施態様のいずれかによると、二重特異性抗原結合性分子の成分（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接的に、または種々のリンカー、特に、本明細書に記載されているかもしくは当該技術分野で公知である、１つもしくは複数のアミノ酸、典型的には２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。好適な非免疫原性ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、またはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられ、式中、ｎは一般には１から１０まで、典型的には２から４までの整数である。
【０３６３】
特定の態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１および第３の抗原結合性部分であって、第１の抗原はＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１および第２の抗原結合性部分は各々、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む（従来型）Ｆａｂ分子である第１および第３の抗原結合性部分；
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原はＣＤ３であり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、（ｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（特に、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域）を含むＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み；
ａ）の第１および第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により（最も特にはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１および第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；ならびに
さらに
ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分およびａ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３６４】
さらなる態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１および第３の抗原結合性部分であって、第１の抗原はＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１、特にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦであり、第１および第２の抗原結合性部分は各々、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む（従来型）Ｆａｂ分子である第１および第３の抗原結合性部分；
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合性部分であって、第２の抗原はＣＤ３であり、第２の抗原結合性部分は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、（ｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（特に、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域）を含むＦａｂ分子である第２の抗原結合性部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み；
ａ）の第１および第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）により置換されており（カバットによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により（最も特にはアルギニン（Ｒ）により）置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１および第３の抗原結合性部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；ならびに
さらに
ａ）の第１の抗原結合性部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｂ）の第２の抗原結合性部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２の抗原結合性部分およびａ）の第３の抗原結合性部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端が、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
【０３６５】
本発明のこうした態様による一実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットでは、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基に置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでは、４０７位のチロシン残基がバリン残基に置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択で３６６位のスレオニン残基がセリン残基に置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基に置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３６６】
本発明のこうした態様によるさらなる実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットでは、加えて、３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられているか（Ｓ３５４Ｃ）、または３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基に置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでは、加えて、３４９位のチロシン残基がシステイン残基に置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３６７】
本発明のこうした態様によるまたさらなる実施態様において、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの各々では、２３４位のロイシン残基がアラニン残基に置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基に置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基に置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３６８】
本発明のこうした態様によるまたさらなる実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０３６９】
特定の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、配列番号１２３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号１４０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる特定の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号１４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０３７０】
別の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、配列番号１２３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる特定の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０３７１】
別の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、配列番号１２６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０３７２】
Ｆｃドメイン
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。二重特異性抗原結合性分子に関して本明細書に記載されているＦｃドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるＦｃドメインに等しく適用することができることが理解される。
【０３７３】
二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、各々のサブユニットがＣＨ２およびＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含むダイマーである。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定的な付随が可能である。一実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、１つ以下のＦｃドメインを含む。
【０３７４】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバットＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３８巻、８４〜９１頁（２０１０年）を参照）。さらなる特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。さらにより特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号１０９に示されている。
【０３７５】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による二重特異性抗原結合性分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方または他方に融合されていてもよい異なる抗原結合性部分を含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖で構成される。こうしたポリペプチドの組換え共発現およびその後の二量体化は、２つのポリペプチドの幾つかの考え得る組合せに結び付く。したがって、組換え産生における二重特異性抗原結合性分子の収率および純度を向上させるために、二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの付随を促進する修飾を導入することが有利だろう。
【０３７６】
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの付随を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質間相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一実施態様では、修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０３７７】
ヘテロ二量体化を強化するためにＦｃドメインのＣＨ３ドメインに修飾をなすための手法は幾つか存在し、それらは国際公開第９６／２７０１１号パンフレット、国際公開第９８／０５０４３１号パンフレット、欧州特許第１８７０４５９号明細書、国際公開第２００７／１１０２０５号パンフレット、国際公開第２００７／１４７９０１号パンフレット、国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット、国際公開第２０１０／１２９３０４号パンフレット、国際公開第２０１１／９０７５４号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３５４５号パンフレット、国際公開第２０１２０５８７６８号パンフレット、国際公開第２０１３１５７９５４号パンフレット、国際公開第２０１３０９６２９１号パンフレットに十分に記載されている。典型的には、すべてのそのような手法では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは両方とも、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）が、もはやそれ自体とホモ二量体化することはできないが、相補的に遺伝子操作された他方のＣＨ３ドメインとのヘテロ二量体化が強いられるように（第１および第２のＣＨ３ドメインはヘテロ二量体化し、２つの第１のＣＨ３ドメイン間のまたは２つの第２のＣＨ３ドメイン間のホモダイマーは形成されないように）相補的な様式で遺伝子操作されている。向上された重鎖ヘテロ二量体化のためのこうした様々な手法は、重鎖／軽鎖ミスペアリングおよびベンスジョーンズ型副産物を低減させる、二重特異性抗原結合性分子の重鎖−軽鎖修飾（例えば、１つの結合性アームにおけるＶＨおよびＶＬ交換／置換、ならびにＣＨ１／ＣＬ接触面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた様々な代替法として企図される。
【０３７８】
具体的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニット付随を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾、およびＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含むいわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。
【０３７９】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書；米国特許第７，６９５，９３６号明細書；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９巻、６１７〜６２１頁（１９９６年）およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８巻、７〜１５頁（２００１年）に記載されている。一般に、この方法は、ヘテロダイマー形成を促進し、ホモダイマー形成を妨害するように突起が空洞に位置決めされ得るように、突起（「ノブ」）を第１のポリペプチドの接触面に導入し、および対応する空洞（「ホール」）を第２のポリペプチドの接触面に導入することを含む。突起は、第１のポリペプチドの接触面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置き換えることにより構築される。突起とサイズが同一または同様の代償的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）に置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に創出される。
【０３８０】
したがって、特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置決め可能である突起が第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起をその内に位置決め可能である空洞が第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成される。
【０３８１】
好ましくは、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
【０３８２】
好ましくは、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、およびバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
【０３８３】
突起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変更することにより、例えば、部位特異的突然変異誘発によりまたはペプチド合成により製作することができる。
【０３８４】
具体的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）においては、３６６位のスレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）においては、４０７位のチロシン残基がバリン残基と置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいては、加えて、３６６位のスレオニン残基がセリン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３８５】
またさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいては、加えて、３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられているか（Ｓ３５４Ｃ）、または３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基に置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいては、加えて、３４９位のチロシン残基がシステイン残基により置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。こうした２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、ダイマーをさらに安定化させる（Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８巻、７〜１５頁（２００１年））。
【０３８６】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３８７】
特定の実施態様では、第２の抗原（例えば、活性化Ｔ細胞抗原）に結合する抗原結合性部分は、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に（任意選択で、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に結合する第１の抗原結合性部分および／またはペプチドリンカーを介して）融合されている。理論により束縛されることは望まないが、活性化Ｔ細胞抗原などの第２の抗原に結合する抗原結合性部分をＦｃドメインのノブ含有サブユニットと融合させると、活性化Ｔ細胞抗原に結合する２つの抗原結合性部分を含む抗原結合性分子の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）が（さらに）最小限に抑えられるだろう。
【０３８８】
ヘテロ二量体化を強化するためのＣＨ３修飾の他の技法が、本発明による代替法として企図され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号パンフレット、国際公開第９８／０５０４３１号パンフレット、欧州特許第１８７０４５９号明細書、国際公開第２００７／１１０２０５号パンフレット、国際公開第２００７／１４７９０１号パンフレット、国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット、国際公開第２０１０／１２９３０４号パンフレット、国際公開第２０１１／９０７５４号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３５４５号パンフレット、国際公開第２０１２／０５８７６８号パンフレット、国際公開第２０１３／１５７９５４号パンフレット、国際公開第２０１３／０９６２９１に記載されている。
【０３８９】
一実施態様では、それらの代わりに、欧州特許第１８７０４５９号明細書に記載のヘテロ二量体化手法が使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン接触面の特定のアミノ酸位置に、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに基づく。本発明の二重特異性抗原結合性分子の１つの好ましい実施態様は、２つのＣＨ３ドメイン（Ｆｃドメインの）の一方におけるアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、およびＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３９０】
別の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｗ、およびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、ならびに加えてＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、およびＦｃドメインの第２サブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３９１】
別の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、または二重特異性抗原結合性分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＦｃドメインの第２サブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、ならびに加えてＦｃドメインの第１サブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、およびＦｃドメインの第２サブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（すべてカバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３９２】
一実施態様では、その代わりに、国際公開第２０１３／１５７９５３号パンフレットに記載されているヘテロ二量体化手法が使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｄを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、およびＬ３６８Ｅから選択されるアミノ酸突然変異（好ましくはＬ３６８Ｅ）をさらに含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３９３】
一実施態様では、その代わりに国際公開第２０１２／０５８７６８号パンフレットに記載のヘテロ二量体化手法が使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、またはＫ３９２位に、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、またはＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、またはＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、またはＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、またはＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、またはＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、またはＫ３９２Ｅから選択されるさらなるアミノ酸突然変異を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、およびＳ４００Ｒをさらに含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３９４】
一実施態様では、その代わりに、国際公開第２０１１／１４３５４５号パンフレットに記載されているヘテロ二量体化手法が使用され、アミノ酸修飾は、３６８および４０９（カバットＥＵインデックスによる番号付け）からなる群から選択される位置になされる。
【０３９５】
一実施態様では、その代わりに、国際公開第２０１１／０９０７６２号パンフレットに記載されているヘテロ二量体化手法が使用され、この技術でも上記に記載されているノブ・イントゥー・ホール技術が使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ｔを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３９６】
一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子またはそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号パンフレットに記載のヘテロ二量体化手法がその代わりに使用される。
【０３９７】
代替的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの付随を促進する修飾は、例えば国際公開第２００９／０８９００４号パンフレットに記載されているような静電気操向効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面の１つまたは複数のアミノ酸残基を、ホモダイマー形成は静電気的に不利になるが、ヘテロ二量体化が静電気的に有利となるように、荷電アミノ酸残基により置き換えることを含む。１つのそのような実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２ＤまたはＮ３９２Ｄ）によるＫ３９２またはＮ３９２のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正荷電アミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、またはＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ）によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、またはＥ３５７のアミノ酸置換を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９ＤまたはＲ４０９Ｄ）によるＫ４０９またはＲ４０９のアミノ酸置換をさらに含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９および／またはＫ３７０のアミノ酸置換をさらにまたはその代わりに含む（すべてカバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３９８】
またさらなる実施態様では、その代わりに国際公開第２００７／１４７９０１号パンフレットに記載されているヘテロ二量体化手法が使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、およびＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、およびＫ２９２Ｄを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３９９】
さらに別の実施態様では、その代わりに国際公開第２００７／１１０２０５号パンフレットに記載されているヘテロ二量体化手法を使用することができる。
【０４００】
一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０４０１】
Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合性分子（または抗体）に、標的組織における良好な蓄積および有利な組織−血液分布比に寄与する長期血清半減期を含む有利な薬物動態特性を付与する。しかしながら、Ｆｃドメインは、同時に、好ましい抗原担持細胞に対してではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対しての二重特異性抗原結合性分子（または抗体）の望ましくない標的化に結び付く場合がある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、二重特異性抗原結合性分子のＴ細胞活性化特性（例えば、第２の抗原結合性部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合性分子の実施態様において）および長期半減期と組み合わさると、全身投与時にサイトカイン受容体の過剰活性化および重度の副作用をもたらすサイトカイン放出に結び付く場合がある。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体担持）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によりＴ細胞が破壊される可能性があるため、二重特異性抗原結合性分子（特に、第２の抗原結合性部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合性分子）の有効性を低減する場合さえある。
【０４０２】
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減および／またはエフェクター機能の低減を示す。１つのそのような実施態様では、Ｆｃドメイン（またはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）は、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（または天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、および最も好ましくは５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性、ならびに／または天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメイン（または天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、および最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施態様では、Ｆｃドメインドメイン（またはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）は、実質的にＦｃ受容体と結合せず、および／またはエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、またはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびサイトカイン分泌の群から選択される１つまたは複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（またはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）が、ＦｃＲｎに対する天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（または天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）の結合親和性の約７０％よりも大きな、特に約８０％よりも大きな、より特に約９０％よりも大きな結合親和性を示す場合に達成される。
【０４０３】
ある特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、非遺伝子操作Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減および／またはエフェクター機能の低減を示すように遺伝子操作されている。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性および／またはエフェクター機能を低減させる１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的には、同じ１つまたは複数のアミノ酸突然変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低減させる。一実施態様では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍低減させる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低減させる１つよりも多くのアミノ酸突然変異が存在する実施態様では、そうしたアミノ酸突然変異の組合せは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍低減させることさえできる。一実施態様では、遺伝子操作Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子は、非遺伝子操作Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より特に５％未満を示す。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一部の実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一部の実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、またはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、こうした受容体の各々に対する結合が低減される。一部の実施態様では、補体成分に対する結合親和性、Ｃ１ｑに対する特異的な結合親和性も低減される。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減されない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、つまり受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（またはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）が、ＦｃＲｎに対する非遺伝子操作形態のＦｃドメイン（または非遺伝子操作形態のＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）の結合親和性の約７０％より大きな結合親和性を示す場合に達成される。ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合性分子は、そのような親和性の約８０％よりも大きな、および約９０％よりも大きな親和性をさえ示すことができる。ある特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインは、非遺伝子操作Ｆｃドメインと比較してエフェクター機能の低減を示すように遺伝子操作されている。エフェクター機能の低減としては、これらに限定されないが、以下の１つまたは複数を挙げることができる：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、直接シグナル伝達誘導性アポトーシスの低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、またはＴ細胞プライミングの低減。一実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、およびサイトカイン分泌の低減の群から選択される１つまたは複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低減はＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低減は、非遺伝子操作Ｆｃドメイン（または非遺伝子操作Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０４０４】
一実施態様では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性および／またはエフェクター機能を低減させるアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１、およびＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。一部の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。１つのそのような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、およびＰ３３１の群から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４、およびＬ２３５位にアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」、または「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、特定の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（カバットＥＵインデックス番号付け）を含み、つまり、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの各々では、２３４位のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）に置き換えられており、２３５位のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３５Ａ）に置き換えられており、３２９位のプロリン残基がグリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）に置き換えられている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０４０５】
１つのそのような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組合せは、国際公開第２０１２／１３０８３号パンフレットに記載されているように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体（ならびに補体）結合をほとんど完全に消失させる。この文献は、その全内容が本明細書に参照により援用される。また、国際公開第２０１２／１３０８３１号パンフレットには、そのような突然変異体Ｆｃドメインを調製するための方法、およびＦｃ受容体結合またはエフェクター機能などのその特性を決定するための方法が記載されている。
【０４０６】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減およびエフェクター機能の低減を示す。したがって、一部の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性および／またはそのエフェクター機能をさらに低減させるため、一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５、およびＰ３２９位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３２９Ｇを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン突然変異体およびそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号パンフレットに記載されている。この文献は、その全内容が本明細書に参照により援用される。
【０４０７】
特定の実施態様では、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減および／またはエフェクター機能の低減を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および任意選択でＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインであるか、またはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、および任意選択でＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０４０８】
ある特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮ−グリコシル化は除去されている。１つのそのような実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位にアミノ酸突然変異、特にアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）またはアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）に置き換えるアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０４０９】
上記および国際公開第２０１２／１３０８３１号パンフレットに記載されているＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能が低減されたＦｃドメインとしては、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）の１つまたは複数の置換を有するものも挙げられる。そのようなＦｃ突然変異体としては、残基２６５および２９７がアラニンに置換されているいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７，３３２，５８１号明細書）を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７の２つまたはそれよりも多くに置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられる。
【０４１０】
突然変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的または化学的方法を使用してアミノ酸を欠失、置換、挿入、または修飾することにより調製することができる。遺伝的方法としては、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、および遺伝子合成などを挙げることができる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０４１１】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡにより、またはＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的機器を使用した表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、Ｆｃ受容体は、例えば、組換え発現により得ることができる。その代わりに、ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞など、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株を使用して評価することができる。
【０４１２】
ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号明細書；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３巻、７０５９〜７０６３頁（１９８６年）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２巻、１４９９〜１５０２頁（１９８５年）；米国特許第５，８２１，３３７号明細書；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６巻、１３５１〜１３６１頁（１９８７年）に記載されている。その代わりに、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性フローサイトメトリーアッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、マウンテンビュー、カリフォルニア州）；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。その代わりにまたはそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えばＣｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５巻、６５２〜６５６頁（１９９８年）に開示されているものなどの動物モデルで評価することができる。
【０４１３】
一部の実施態様では、Ｃ１ｑに特異的な補体成分に対するＦｃドメインの結合が低減される。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能の低減を示すように遺伝子操作されている一部の実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合性分子がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣの活性を有するか否かを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号パンフレットおよび国際公開第２００５／１００４０２号パンフレットのＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２巻、１６３頁（１９９６年）；Ｃｒａｇｇら、Ｂｌｏｏｄ  １０１巻、１０４５〜１０５２頁（２００３年）；ならびにＣｒａｇｇおよびＧｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ  １０３巻、２７３８〜２７４３頁（２００４年）を参照）。
【０４１４】
また、当該技術分野で公知の方法を使用して、ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期決定を実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８巻（１２号）：１７５９〜１７６９頁（２００６年）；国際公開第２０１３／１２０９２９号パンフレットを参照）。
【０４１５】
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載されているような抗体または二重特異性抗原結合性分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。一部の実施態様では、断片は、抗原結合性断片である。
【０４１６】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子をコードするポリヌクレオチドは、抗体または二重特異性抗原結合性分子の全体をコードする単一ポリヌクレオチドとして発現されてもよく、または同時発現される複数の（例えば、２つまたはそれよりも多くの）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合または他の手段を介して付随して、機能的な抗体または二重特異性抗原結合性分子を形成することができる。例えば、抗体または二重特異性抗原結合性分子の軽鎖部分は、抗体または二重特異性抗原結合性分子の重鎖を含む抗体または二重特異性抗原結合性分子の部分とは別のポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。同時発現されると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと付随して、抗体または二重特異性抗原結合性分子を形成することになる。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットの一方および任意選択で１つまたは複数のＦａｂ分子（の一部分）を含む抗体または二重特異性抗原結合性分子の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方および任意選択でＦａｂ分子（の一部分）を含む抗体または二重特異性抗原結合性分子の部分とは別のポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。同時発現されると、Ｆｃドメインサブユニットは付随して、Ｆｃドメインを形成することになる。
【０４１７】
一部の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているような本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子の全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているような本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０４１８】
ある特定の実施態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよい。
【０４１９】
組換え法
本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、例えば、固体状態ペプチド合成（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（例えば、メリフィールド固相合成）または組換え産生により得ることができる。組換え産生の場合、例えば上記に記載されているような抗体または二重特異性抗原結合性分子（断片）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドが単離され、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞での発現のために１つまたは複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来手順を使用して容易に単離および配列決定することができる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に抗体または二重特異性抗原結合性分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。そうした方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９８９年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８９年）に記載の技法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部分であってもよく、または核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体または二重特異性抗原結合性分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（つまり、コード化領域）が、プロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントと作動可能に付随してクローニングされている発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード化領域の一部分とみなされる場合がある。しかしながら、任意のフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、ならびに５’および３’非翻訳領域などは、存在する場合でもコード化領域の一部分ではない。２つまたはそれよりも多くのコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば単一のベクターに存在してもよく、または別々のポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば別々の（異なる）ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよく、または２つもしくはそれよりも多くのコード化領域を含んでいてもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解性切断により翻訳後にまたは翻訳と同時に最終タンパク質へと分離される１つまたは複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子（断片）またはその変異体も��くは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合されているかまたは融合されていないかのいずれでもよい異種コード化領域をコードしてもよい。異種コード化領域としては、限定ではないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが挙げられる。作動可能な付随は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード化領域が、遺伝子産物の発現が調節配列の影響下または制御下に配置されるように、１つまたは複数の調節配列に付随されている場合である。２つのＤＮＡ断片（それらに付随するポリペプチドコード化領域およびプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指図する発現調節配列の能力に干渉しないか、または転写しようとするＤＮＡ鋳型の能力に干渉しない場合、「作動可能に付随されている」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を達成することが可能だった場合、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に付随されていることになる。プロモーターは、所定の細胞でのみＤＮＡの実質的な転写を指図する細胞特異的プロモーターであってもよい。細胞特異的転写を指図するために、プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルが、ポリヌクレオチドに作動可能に付随されていてもよい。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示されている。様々な転写制御領域が当業者に公知である。そうした転写制御領域としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（例えば、イントロン−Ａを伴う最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）に由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどの、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域。他の転写制御領域としては、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御可能な他の配列が挙げられる。追加の好適な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに誘導可能なプロモーター（例えば、プロモーター誘導可能なテトラサイクリン）が挙げられる。同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。翻訳制御エレメントとしては、これらに限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメントが挙げられる（特に、内部リボソーム侵入部位すなわちＩＲＥＳは、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）。また、発現カセットは、複製開始点などの他の特徴、および／またはレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）もしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復（ＩＴＲ）などの染色体組込みエレメントを含んでいてもよい。
【０４２０】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドの分泌を指図する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード化領域に付随されていてもよい。例えば、抗体または二重特異性抗原結合性分子の分泌が所望である場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸の上流に配置してもよい。シグナル仮説によると、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、成長中タンパク質鎖の粗面小胞体からの搬出が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドは、一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合されているシグナルペプチドを有し、シグナルペプチドは、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌または「成熟」形態が産生されることを承知している。ある特定の実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、またはそれに作動可能に付随されているポリペプチドの分泌を指図する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。その代わりに、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されていてもよい。
【０４２１】
後の精製を容易にするために（例えば、ヒスチジンタグ）、または抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子の標識を支援するために使用することができる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡが、抗体または二重特異性抗原結合性分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの内部または末端に含まれていてもよい。
【０４２２】
さらなる実施態様では、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある特定の実施態様では、本発明の１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチドおよびベクターには、それぞれポリヌクレオチドおよびベクターに関して本明細書に記載されている特徴のいずれかを単独でまたは組合せで組み込むことができる。１つのそのような実施態様では、宿主細胞は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子（の一部分）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のベクターを含む（例えば、それで形質転換またはトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子またはその断片を生成するように遺伝子操作することができる任意の種類の細胞系を指す。抗体または二重特異性抗原結合性分子の複製におよび発現支援に好適な宿主細胞は、当該技術分野で周知である。そのような細胞は、特定の発現ベクターで適切にトランスフェクトまたは形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を大規模発酵槽に播種して、臨床応用のために十分な量の抗体または二重特異性抗原結合性分子を得るために増殖させることができる。好適な宿主細胞としては、大腸菌などの原核微生物、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくは昆虫細胞などの種々の真核細胞が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌内で産生することができる。発現させた後、ポリペプチドを、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす真菌株および酵母株を含む、ポリペプチドコードベクターの好適なクローニング宿主または発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２巻、１４０９〜１４１４頁（２００４年），およびＬｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４巻、２１０〜２１５頁（２００６年）を参照されたい。また、（グリコシル化）ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と共に、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために使用することができる多数のバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号明細書、第６，０４０，４９８号明細書、第６，４２０，５４８号明細書、第７，１２５，９７８号明細書、および第６，４１７，４２９号明細書を参照されたい（トランスジェニック／遺伝子組換え植物中で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術が記載されている）。脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁中で増殖するように構成された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ��０（ＣＯＳ−７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；
ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３６巻、５９頁（１９７７年）に記載されているような２９３細胞または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２３巻、２４３〜２５１頁（１９８０年）に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ３８３巻、４４〜６８頁（１９８２年）に記載されているような）、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、７７巻、４２１６頁（１９８０年））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。タンパク質産生に好適なある哺乳動物宿主細胞株の総説は、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー州）、２５５〜２６８頁（２００３年）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、ほんの少数を挙げれば、例えば、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、および植物細胞だけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック／遺伝子組換え植物、または培養植物または動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球細胞（例えば、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。
【０４２３】
こうした系で外来遺伝子を発現するための標準的技術は、当該技術分野で公知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖または軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現される産物が重鎖および軽鎖を両方とも有する抗体となるように、抗体鎖の他方も発現するように遺伝子操作することができる。
【０４２４】
一実施態様では、本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子を産生するための方法であって、本明細書で提供されるような抗体または二重特異性抗原結合性分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、抗体または二重特異性抗原結合性分子の発現に好適な条件下で培養すること、および任意選択で抗体または二重特異性抗原結合性分子を宿主細胞（または宿主細胞培地）から回収することを含む方法が提供される。
【０４２５】
本発明の二重特異性抗原結合性分子（または抗体）の成分は、遺伝子的に互いに融合されていてもよい。二重特異性抗原結合性分子は、その成分が互いに直接的にまたはリンカー配列介して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成および長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性を試験することができる。二重特異性抗原結合性分子の異なる成分の間のリンカー配列の例は、本明細書に提供されている。また、所望の場合、融合体の個々の成分を分離するための切断部位を組み込むための追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列が含まれていてもよい。
【０４２６】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、概して、少なくとも、抗原決定基に結合することが可能な抗体可変領域を含む。可変領域は、天然に存在するまたは天然に存在しない抗体およびそれらの断片の一部分を形成してもよく、およびそれらに由来してもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、組換え的に産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されているように）、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号を参照）。
【０４２７】
任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合性ドメイン、または可変領域を、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子に使用することができる。本発明に有用な非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合性ドメイン、または可変領域は、マウス由来、霊長類由来、またはヒト由来であってもよい。抗体または二重特異性抗原結合性分子がヒト使用のためである場合、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体を使用してもよい。また、ヒト化形態または完全ヒト形態の抗体は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照）。ヒト化は、それらに限定されないが、以下のものを含む種々の方法により達成することができる：（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性または抗体機能の維持に重要なもの）が維持されているかまたは維持されていないヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワークおよび定常領域にグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲまたはＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワークおよび定常領域にグラフトすること、または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基を置き換えることによりそれらをヒト様区画で「覆い隠す」こと。ヒト化抗体およびそれらを製作するための方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３巻：１６１９〜１６３３頁（２００８年）に総説されており、以下の文献にさらに記載されている：例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６巻：１００２９〜１００３３頁（１９８９年）；米国特許第５，８２１，３３７号明細書、第７，５２７，７９１号明細書、第６，９８２，３２１号明細書、および第７，０８７，４０９号明細書；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６巻：２５〜３４頁（２００５年）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフト法が記載されている）；Ｐａｄｌａｎ、ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻：４８９〜４９８頁（１９９１年）（「リサーフェイシング」が記載されている）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６巻：４３〜６０頁（２００５年）（「ＦＲシャッフリング（ＦＲ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」が記載されている）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６巻：６１〜６８頁（２００５年）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３巻：２５２〜２６０頁（２０００年）（ＦＲシャッフリングの「ガイドされた選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」手法が記載されている）。ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：「ベスト−フィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法（例えば、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁（１９９３年）を参照）を使用して選択されるフレームワーク領域；軽鎖または重鎖可変領域の特定の部分群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒ��ｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁（１９９３年）を参照）；ヒト成熟（体細胞性的に突然変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９〜１６３３頁（２００８年）を参照）；ならびにＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻：１０６７８〜１０６８４頁（１９９７年）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻：２２６１１〜２２６１８頁（１９９６年）を参照）。
【０４２８】
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の種々の技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５巻、３６８〜７４頁（２００１）、およびＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０巻、４５０〜４５９頁（２００８年）に記載されている。ヒト抗体は、抗原負荷に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製することができる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えているか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは部分を含む。。そのようなトランスジェニック／遺伝子組換えマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説は、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻：１１１７〜１１２５頁（２００５年）を参照されたい。また、例えば、以下の文献を参照されたい：ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術が記載されている米国特許第６，０７５，１８１号明細書および第６，１５０，５８４号明細書；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術が記載されている米国特許第５，７７０，４２９号明細書；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術が記載されている米国特許第７，０４１，８７０号明細書、および
ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術が記載されている米国特許出願公開第２００７／００６１９００号明細書）。そのような動物により生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾することができる。
【０４２９】
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法により製作することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁（１９９１年）を参照。）また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体が、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３巻：３５５７〜３５６２頁（２００６年）に記載されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号明細書（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生が記載されている）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６巻（４号）：２６５〜２６８頁（２００６年）（ヒト−ヒトハイブリドーマが記載されている）に記載されているものが挙げられる。また、ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）が、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０巻（３号）：９２７〜９３７頁（２００５年）、ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７巻（３号）：１８５〜９１頁（２００５年）に記載されている。
【０４３０】
また、ヒト抗体は、本明細書に記載されているように、ヒト抗体ライブラリーから単離することにより生成することができる。
【０４３１】
本発明に有用な抗体は、１つまたは複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６巻：４９８〜５０８頁（２０１６年）で総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当該技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌら、ｍＡｂｓ  ８巻：１１７７巻、１１９４頁（２０１６年）；Ｂａｚａｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８巻：１８１７〜１８２８頁（２０１２年）、およびＺｈａｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３６巻：２７６〜２８９頁（２０１６年）、ならびにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８巻：１〜３７頁（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー州、２００１年）ならびにＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８巻：１６１〜１７５頁（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー州、２００３年）で総説されている。
【０４３２】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングし、ファージライブラリーにてランダムに組み換え、その後それを、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２巻：４３３〜４５５（１９９４年）に記載されているように、抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とせずに、免疫原に対して高度親和性の抗体を提供する。その代わりに、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）により記載されているように、未感作レパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、いかなる免疫化も行わずに、広範囲の非自己抗原およびさらに自己抗原に対する抗体の単一供給源が提供される。最後に、未感作ライブラリーは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）により記載されているように、幹細胞に由来する未編成Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再編成を達成することにより合成的に製作することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーが記載されている特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号明細書；第７，９８５，８４０号明細書；第７，７８５，９０３号明細書、および第８，６７９，４９０号明細書；ならびに米国特許出願第２００５／００７９５７４号明細書、第２００７／０１１７１２６号明細書、第２００７／０２３７７６４号明細書、および第２００７／０２９２９３６号明細書が挙げられる。１つまたは複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当該技術分野で公知の方法のさらなる例としては、リボソームおよびｍＲＮＡディスプレイ、ならびに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または酵母細胞での抗体ディスプレイおよび選択法が挙げられる。酵母表面ディスプレイ法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０３巻：１３５〜５６頁（２０１２年）およびＣｈｅｒｆら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３１９巻：１５５〜１７５頁（２０１５年）、ならびにＺｈａｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８８９巻：７３〜８４頁（２０１２年）で総説されている。リボソームディスプレイ法は、例えば、Ｈｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５巻：５１３２〜５１３４頁（１９９７年）およびＨａｎｅｓら、ＰＮＡＳ  ９４巻：４９３７〜４９４２頁（１９９７年）に記載されている。
【０４３３】
本明細書に記載されているように調製された抗体または二重特異性抗原結合性分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの当該技術分野で公知の技法により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、部分的には、実効電荷、疎水性、親水性などの要因に依存することになり、当業者であれば明白であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合、抗体または二重特異性抗原結合性分子が結合する抗体、リガンド、受容体、または抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子のアフィニティークロマトグラフィー精製の場合、プロテインＡまたはプロテインＧを有するマトリックスを使用することができる。プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを連続して使用して、本質的に実施例に記載されているように抗体または二重特異性抗原結合性分子を単離することができる。抗体または二重特異性抗原結合性分子の純度は、ゲル電気泳動および高圧液体クロマトグラフィーなどを含む、様々な周知の分析法のいずれかにより決定することができる。
【０４３４】
組成物、製剤、および投与経路
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合性分子のいずれかを含む、例えば下記の治療方法のいずれかで使用するための薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合性分子のいずれか、および薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合性分子のいずれか、および例えば下記に記載されているような少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
【０４３５】
インビボでの投与に好適な形態の本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を生産するための方法であって、（ａ）本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子を得ること、および（ｂ）抗体または二重特異性抗原結合性分子を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体で製剤化し、それにより抗体または二重特異性抗原結合性分子の調製物を、インビボで投与するために製剤化することを含む方法がさらに提供される。
【０４３６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散されている治療的有効量の抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む。語句「薬学的にまたは薬理的に許容される」は、一般に、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに無毒である、つまり、例えばヒトなどの動物に適切に投与された場合、有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。抗体または二重特異性抗原結合性分子および任意選択で追加の活性成分を含む薬学的組成物の調製物は、本開示に照らして当業者に公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年により例示されている通りである。この文献は、本明細書に参照により援用される。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、調製物は、ＦＤＡオフィスの生物学的基準（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）または他国の対応する規制当局により求められる無菌状態、発熱性、一般的安全性、および純度基準を満たさなければならないことが理解されるだろう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」としては、ありとあらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、それらの類似材料および組合せが挙げられ、当業者であれば公知であろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年、１２８９〜１３２９頁を参照。この文献は、本明細書に参照により援用される）。従来担体はいずれも、活性成分と適合性でない場合を除いて、治療剤または薬学的組成物におけるその使用が企図される。
【０４３７】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子（ｍｏｅｌｃｕｌｅ）（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、および鼻腔内、ならびに局所治療が所望の場合は病巣内投与を含む、任意の好適な手段により投与することができる。非経口点滴としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短期であるか長期であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路により、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射により行うことができる。
【０４３８】
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内  筋肉内、髄腔内、または腹腔内注射による投与のために設計されているものが挙げられる。注射の場合、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、水溶液で、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水バッファーなどの生理学的に適合するバッファーで製剤化することができる。溶液は、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの調合剤を含んでいてもよい。その代わりに、抗体または二重特異性抗原結合性分子は、使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水で構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、必要とされる量の本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を、必要に応じて下記に列挙されている種々の他の成分と共に適切な溶媒に組み込むことにより調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜による濾過により、容易に達成することができる。一般に、分散体は、基本分散媒および／または他の成分を含む滅菌ビヒクルに種々の殺菌活性成分を組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁物、またはエマルジョンを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、以前に滅菌濾過されたその液体媒体から活性成分＋任意の追加の所望成分の粉末が産出される減圧乾燥技法または凍結乾燥技法である。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、注射前に、まず十分な生理食塩水またはグルコースで等張化されるべきである。組成物は、製造条件下および保管条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。エンドトキシン汚染は、安全レベルで最小限に、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持されるべきであることが認識されるだろう。好適な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の糖（炭水化物）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。水性注射懸濁物は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁物���粘性を増加させる化合物を含んでいてもよい。また、任意選択で、懸濁物は、好適な安定剤、または高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増加させる薬剤を含んでいてもよい。加えて、活性化合物の懸濁物は、適切な油性注射懸濁物として調製されていてもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ごま油などの脂肪油、またはエチルクリート（ｅｔｈｙｌ  ｃｌｅａｔ）もしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。
【０４３９】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によりまたは界面重合により調製されるマイクロカプセルに、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに封入されていてもよい。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例としては、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは、有形物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射用組成物の持続性吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはそれらの組合せなど、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に使用することによりもたらすことができる。
【０４４０】
以前に記載されている組成物に加えて、抗体または二重特異性抗原結合性分子は、持効性製剤として製剤化することもできる。そのような長期作用型製剤は、移植（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、抗体または二重特異性抗原結合性分子は、好適なポリマー性材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体、例えば難溶性塩として製剤化することができる。
【０４４１】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、封入、捕捉、または凍結乾燥処理により製造することができる。薬学的組成物は、タンパク質を処理して、薬学的に使用することができる調製物にすることを容易にする１つまたは複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を使用して、従来様式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０４４２】
抗体または二重特異性抗原結合性分子は、遊離酸もしくは塩基の形態、中性形態、または塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸または塩基の生物活性を実質的に維持する塩である。それらとしては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、あるいは塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基に由来してもよい。薬学的な塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性溶媒および他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向がある。
【０４４３】
治療方法および組成物
本明細書に提供される抗体または二重特異性抗原結合性分子のいずれかを、治療方法に使用することができる。本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、例えば、がんの治療における免疫療法剤として使用することができる。
【０４４４】
治療方法に使用する場合、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、医学行動規範に準拠する様式で、製剤化され、投薬され、および投与されることになる。この状況で考慮すべき要因としては、治療しようとする特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医学施術者に公知の他の要因が挙げられる。
【０４４５】
一態様では、医薬として使用するための本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療に使用するための本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子が提供される。ある特定の実施態様では、治療の方法に使用するための本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子が提供される。一実施態様では、本発明は、その必要性のある個体の疾患の治療に使用するための、本明細書に記載されているような抗体または二重特異性抗原結合性分子を提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、疾患を有する個体を治療するための方法であって、治療的有効量の抗体または二重特異性抗原結合性分子を個体に投与することを含む方法に使用するための抗体または二重特異性抗原結合性分子を提供する。ある特定の実施態様では、治療しようとする疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。ある特定の実施態様では、方法は、治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療しようとする疾患ががんである場合は、抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用するための、本明細書に記載されているような抗体または二重特異性抗原結合性分子を提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法であって、有効量の抗体または二重特異性抗原結合性分子を個体に投与して、標的細胞の溶解を誘導することを含む方法に使用するための抗体または二重特異性抗原結合性分子を提供する。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０４４６】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造または調製における、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、その必要性のある個体の疾患を治療するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、疾患を治療する方法であって、疾患を有する個体に治療的有効量の医薬を投与することを含む方法に使用するためのものである。ある特定の実施態様では、治療しようとする疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、方法は、治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療しようとする疾患ががんである場合は、抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる実施態様、医薬は、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法であって、有効量の医薬を個体に投与して、標的細胞の溶解を誘導する方法に使用するためのものである。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０４４７】
さらなる態様では、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、そのような疾患を有する個体に、治療的有効量の本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を投与することを含む。一実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む、薬学的に許容される形態の組成物が、個体（ｉｎｖｉｄｉｄｕａｌ）に投与される。ある特定の実施態様では、治療しようとする疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。ある特定の実施態様では、方法は、治療的有効量の少なくとも１の追加の治療剤、例えば、治療しようとする疾患ががんである場合は、抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０４４８】
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、標的細胞を、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子と接触させることを含む。さらなる態様では、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。１つのそのような実施態様では、方法は、有効量の抗体または二重特異性抗原結合性分子を個体に投与して、標的細胞の溶解を誘導することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
【０４４９】
ある特定の実施態様では、治療しようとする疾患は、増殖性疾患であり、特にがんである。がんの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：白血病などの血液学的がん、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、胆道がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、大腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、扁平上皮癌、肉腫、骨がん、および腎臓がん。本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を使用して治療することができる他の細胞増殖障害としては、これらに限定されないが、腹部、骨、胸部、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、目、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭領域、および泌尿生殖器系に位置する腫瘍が挙げられる。また、前がん性状態または病変およびがん転移が含まれる。ある特定の実施態様では、がんは、血液学的がん（白血病など）、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、および前立腺がんからなる群から選択される。一実施態様では、がんは、血液学的がん、特に白血病、最も特には急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。当業者であれば、多くの場合、抗体または二重特異性抗原結合性分子は治癒を提供しない場合があり、部分的な利益を提供するに過ぎない場合があることを容易に認識する。一部の実施態様では、ある程度の利益を有する生理的変化も治療上有益であるとみなされる。したがって、一部の実施態様では、生理的変化を提供する抗体または二重特異性抗原結合性分子の量は、「有効量」または「治療的有効量」とみなされる。治療を必要とする対象、患者、または個体は、典型的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【０４５０】
一部の実施態様では、有効量の本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、細胞に投与される。他の実施態様では、治療的有効量の本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、疾患を治療するための個体に投与される。
【０４５１】
疾患の予防または治療の場合、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子の適切な投薬量は（単独でまたは１つもしくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）、治療しようとする疾患のタイプ、投与の経路、患者の体重、抗体または二重特異性抗原結合性分子のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体または二重特異性抗原結合性分子が予防目的で投与されるのかまたは治療目的で投与されるのか、以前のまたは現在の治療介入、患者の病歴、抗体または二重特異性抗原結合性分子に対する応答、および主治医の裁量に依存することになる。いずれの場合でも、投与に責任のある施術者が、個々の対象について、組成物中の活性成分の濃度および適切な用量を決定することになる。本明細書では、これらに限定されないが、単回投与または種々の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス点滴を含む、種々の投薬スケジュールが企図される。
【０４５２】
抗体または二重特異性抗原結合性分子は、単回でまたは一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。例えば１つまたは複数の別々の投与によるかまたは連続的注入によるかに関わりなく、患者に投与するための初期候補投薬量は、疾患のタイプおよび重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体または二重特異性抗原結合性分子であってもよい。１つの典型的な１日投薬量は、上記で言及されている要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であるかまたはそれよりも多い。数日またはより長期にわたる反復投与の場合、治療は、一般に状態に応じて病徴の所望の抑制が生じるまで持続されるだろう。抗体または二重特異性抗原結合性分子の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲だろう。また、他の非限定的な例では、用量は、１投与当たり、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重までを含んでいてもよく、またはそれよりも多くを含んでいてもよく、それら内で推論可能な任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書に列挙されている数の推論可能な範囲の非限定的な例では、上記に記載されている数に基づき、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約５マイクログラム／ｋｇ体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ体重の範囲などを投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組合せ）の１つまたは複数の用量を、患者に投与することができる。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週毎に投与することができる（例えば、患者が、約２から約２０用量までの、または例えば６用量の抗体または二重特異性抗原結合性分子を受け取るように）。初期により高い負荷用量を、続いて１つまたは複数のより低い用量を投与してもよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。本療法の進行は、従来の技法およびアッセイにより容易にモニターされる。
【０４５３】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、一般に、意図されている目的を達成するのに有効な量で使用されることになる。疾患状態を治療または予防するために使用する場合、本発明の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子またはその薬学的組成物は、治療的有効量で投与または適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書で提供されている詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力内にある。
【０４５４】
全身投与の場合、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイでまず評価することができる。その後、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルで製剤化することができる。そのような情報を使用すると、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【０４５５】
また、初期投薬量は、当該技術分野で周知である技法を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから評価することができる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトに対する投与を容易に最適化することができる。
【０４５６】
投薬量および投薬間隔は、治療効果を維持するために十分な抗体または二重特異性抗原結合性分子の血漿レベルを提供するように個々に調整することができる。注射により投与するための通常の患者投薬量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日までの、典型的には約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲である。治療上有効な血漿レベルは、１日に複数の用量を投与することにより達成してもよい。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０４５７】
局所投与または選択的取り込みの場合、抗体または二重特異性抗原結合性分子の有効局所濃度は、血漿濃度と関連しない場合がある。当業者であれば、過度の実験作業をせずに、治療上有効な局所投薬量を最適化することができるだろう。
【０４５８】
本明細書に記載されている抗体または二重特異性抗原結合性分子の治療上有効用量は、一般に、毒性を実質的に引き起こさずに、治療利益を提供するだろう。抗体または二重特異性抗原結合性分子の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物での標準的薬学手順により決定することができる。細胞培養アッセイおよび動物研究を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％に対しての致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％での治療上有効用量）を決定することができる。毒性と治療効果との用量比は、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる治療指数である。大きな治療指数を示す抗体または二重特異性抗原結合性分子が好ましい。一実施態様では、本発明による抗体または二重特異性抗原結合性分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトでの使用に好適な一連の投薬量での製剤化に使用することができる。投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有しないＥＤ５０を含む一連の循環濃度内にある。投薬量は、様々な要因、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、および対象の状態などに応じて、この範囲内で様々であってもよい。正確な製剤、投与経路、および投薬量は、患者の状態に照らして個々の医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５年：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁を参照。この文献は、その全内容が本明細書に参照により援用される）。
【０４５９】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子で治療される患者の主治医であれば、毒性および臓器機能障害などがあった場合に、投与をどのようにおよびいつ中止、中断、または調整したらよいかを知っているだろう。逆に、主治医であれば、臨床応答が適切でない場合（毒性は除外）、治療をより高いレベルへと調整することを知っているだろう。目的の障害を管理するために投与される用量の大きさは、治療しようとする状態の重症度および投与経路などに応じて様々であろう。例えば、状態の重症度は、部分的には標準的予後評価法により評価することができる。さらに、用量および恐らくは用量頻度は、個々の患者の年齢、体重、および応答によっても様々であろう。
【０４６０】
他の薬剤および治療
本発明の抗体および二重特異性抗原結合性分子は、治療において１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、少なくとも１つの追加の治療剤と共に共投与することができる。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症候または疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に好適な任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含む。ある特定の実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、またはアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管撹乱物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法剤、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、または抗血管新生剤である。
【０４６１】
そのような他の薬剤は、意図されている目的に有効な量での組合せで適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される抗体または二重特異性抗原結合性分子の量、障害または治療のタイプ、および上記で考察されている他の要因に依存する。抗体または二重特異性抗原結合性分子は、一般に、本明細書に記載されているものと同じ投薬量および投与経路で使用されるか、または本明細書に記載されている投薬量の約１〜９９％で、または経験的に／臨床的に適切であると決定されている任意の投薬量および任意の経路で使用される。
【０４６２】
上記で述べられているそのような併用療法は、組合せ投与（２つまたはそれよりも多くの治療剤が、同じまたは別々の組成物に含まれている）および個別投与を包含する。個別投与の場合、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子の投与は、追加の治療剤および／またはアジュバントを投与する前に、投与と同時に、および／または投与後に生じてもよい。また、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、放射線療法と組み合わせて使用してもよい。
【０４６３】
製造品
本発明に別の態様では、上記に記載されている障害の治療、予防、および／または診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器および容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料で形成されてもよい。容器は、組成物それ自体であるか、または状態を治療、予防、および／もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わされている組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静注溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む組成物がそこに含まれている第１の容器；および（ｂ）さらなる細胞傷害性治療剤または別様の治療剤を含む組成物がそこに含まれている第２の容器を含んでいてもよい。本発明のこの実施態様の製造品は、組成物が、特定の状態を治療するために使用することができることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。その代わりにまたはそれに加えて、製造品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストローズ溶液などの、薬学的に許容されるバッファーを含む第２の（または第３の）容器をさらに含んでいてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的な視点およびユーザの視点で望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０４６４】
診断および検出のための方法および組成物
ある特定の実施態様では、本明細書中で提供される抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体のいずれかは、生物学的試料中のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１の存在の検出に有用である。用語「検出する」は、本明細書で使用される場合、定量的検出または定性的検出を包含する。ある特定の実施態様では、生物学的試料は、前立腺組織などの細胞または組織を含む。
【０４６５】
一実施態様では、診断法または検出法に使用するための抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１の存在を検出するための方法が提供される。ある特定の実施態様では、方法は、本明細書に記載されているような抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体を、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対する抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体の結合を許容する条件下で、生物学的試料と接触させること、および抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体とＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１との間で複合体が形成される否かを検出することを含む。そのような方法はインビトロ法であってもよく、またはインビボ法であってもよい。一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体は、抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体による治療に適格な対象を選択するために使用され、その場合は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１は、患者を選択するためのバイオマーカーである。
【０４６６】
本発明の抗体を使用して診断することができる例示的な障害としては、がん、特に前立腺がんが挙げられる。
【０４６７】
ある特定の実施態様では、標識抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体が提供される。標識としては、これらに限定されないが、直接的に検出される標識または部分（蛍光性の、発色性の、高電子密度の、化学発光性の、および放射性の標識）ならびに例えば酵素反応または分子相互作用により間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が挙げられる。例示的な標識としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ、希土類キレート剤またはフルオレセインおよびその誘導体などのフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号明細書）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼなどの、過酸化水素を使用して色素前駆体を酸化する酵素とカップリングされている、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、ならびに安定なフリーラジカルなど。
【実施例】
【０４６８】
下記は、本発明の方法および組成物の例である。上記で提供されている基本的な説明を考慮すれば、種々の他の実施態様を実施することができることが理解される。
【０４６９】
実施例１
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１のＦａｂ結合体の生成
抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１  Ｆａｂの選択およびスクリーニング
ＶＬドメイン（３つの異なる長さ）およびＶＨドメイン（６つの異なる長さ）のＣＤＲ３に配列多様性を有する完全ヒトフレームワークに基づく合成Ｆａｂライブラリーからファージディスプレイにより、抗ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１  Ｆａｂを選択した。
【０４７０】
選択ラウンド（バイオパニング）を、溶液中で以下のプロトコールに従って実施した：１．  ５００ｎＭの無関連ビオチン化ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ複合体でコーティングされたニュートラアビジン被覆９６ウェルプレートに、１ライブラリープール当たり約１０１２個のファージミド粒子をプレクリアリングする；２．  非ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤ結合ファージミド粒子を１００ｎＭのビオチン化ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体と共に８００μｌの総容積中で０．５時間インキュベートする；３．  ８０μｌのストレプトアビジン被覆磁気粒子を２０分間振盪器で添加することによりビオチン化ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦおよび特異的結合ファージを捕捉する；４．  磁気粒子分離器を使用して、それぞれの磁気粒子を、１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で５〜１０回、１ｍｌのＰＢＳで５〜１０回洗浄する；５．  ｌｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を５〜１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、１／２容積の１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４を添加することにより中和する；６．  溶出したファージ粒子を対数増殖期の大腸菌ＴＧ１細胞に再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を感染させ、振盪器で一晩３０℃にてインキュベートし、次いでファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿して、次の選択ラウンドで使用する。
【０４７１】
選択は、１００ｎＭの一定抗原濃度を使用して、３〜４ラウンドにわたって実施した。
【０４７２】
一定抗原濃度での選択作業に加えて、より低い親和性を有する抗体を選択するために、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、および５ｎＭの漸減抗原濃度でさらなる選択作業を実施した。
【０４７３】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１結合アッセイ：ファージディスプレイにより得られたＦａｂを特徴付けするためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
個々のクローンを、９６ウェル形式の１ｍｌ培養物として細菌で発現させ、上清をＥＬＩＳＡによるスクリーニングに供した。特異的結合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦに対しては５×バックグラウンドよりも高いシグナルを有し、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤに対しては３×バックグラウンド未満のシグナルを有すると定義した。より正確には、ニュートラアビジン９６ウェルストリッププレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、１０ｎＭ  ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたは５０ｎＭ  ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤで３０分間３７℃にてコーティングし、続いて２％（ｗ／ｖ）ミルク−リン酸緩衝生理食塩水（ＭＰＢＳ）（２００μｌ／ウェル）で１時間室温にてプレートをブロックした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、その後Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、プレートを１時間室温にてインキュベートした。ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ８５９２（（１：４０００）を添加し、プレートを室温で１時間振盪器でインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）を添加することにより発色させた。５０μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより酵素反応を停止させた。ＯＤ４５０−６５０の最終読み取りには、４５０ｎｍのＯＤを読み取った（参照は６５０ｎｍ）。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、下記に記載されている動力学スクリーニング実験に供した。
【０４７４】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１結合アッセイ：ファージディスプレイにより得られたＦａｂを動力学的に特徴付けるための表面プラズモン共鳴法
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、Ｆａｂ含有細菌培養上清を表面プラズモン共鳴法でスクリーニングすることにより、特異的結合体を特定した。手短に述べると、溶出したファージ粒子を対数増殖期の大腸菌ＴＧ１細胞に感染させた後、単一コロニー形成単位（ｃｆｕ）をプレーティングし、９６ディープウェルプレートの１ｍｌ発現培養に接種するため採取した。
【０４７５】
実験はすべて、ＰＢＳＴをランニングバッファー（１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）として使用して、２５℃で実施した。ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）のＧＬＣおよびＧＬＭセンサチップを備えたＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーおよびカップリング試薬（１０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ４．５、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド［スルホ−ＮＨＳ］、１−エチル−３−（３−ジメチルアミンプロピル）−カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣ］、およびエタノールアミン）を使用した。
【０４７６】
固定化は、ＧＬＭチップ上にて３０μｌ／分で実施した。ｐＡｂ（ヤギ）抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、標準的アミンカップリング手順を使用して垂直方向にカップリングした。６つすべてのリガンドチャネルを、ＥＤＣ（２００ｍＭ）およびスルホ−ＮＨＳ（５０ｍＭ）の混合物で５分間活性化した。表面を活性化した直後に、ｐＡｂ（ヤギ）抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２特異的抗体（５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５）を、６つすべてのチャネルにわたって５分間注入した。最後に、チャネルを、１Ｍ  エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の５分間注入によりブロックした。最終固定化レベルは、すべてのチャネルで同様であり、１１０００から１１５００ＲＵまでの範囲だった。別々の水平チャネルの５つに沿って５分間同時に注入する（３０μｌ／分）ことにより大腸菌上清からＦａｂ変異体を捕捉した。上清中のＦａｂ濃度に応じて、２００から９００ＲＵまでの範囲のレベルがもたらされた。順化培地を６番目のチャネルに注入して、二重参照目的の「インライン」ブランクを提供した。ワンショット動力学測定を、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤの希釈系列物（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、０ｎＭ、５０μｌ／分）を垂直チャネルに沿って２分間注入することにより実施した。解離を３分間モニターした。動力学データは、ＰｒｏｔｅＯｎマネージャー  ｖ．２．１で分析した。反応スポットデータの処理は、インラインバッファーブランクを使用したスポット間参照および二重参照工程の適用を含んでいた（Ｍｙｓｚｋａ、Ｊ  ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ（１９９９年）１２巻、２７９〜２８４頁）。反復ワンショット注入の処理データを、物質移行のない単純な１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９３年）２１２巻、４５７〜４６８頁）。
【０４７７】
６ウェル形式でのＨＥＫ産生の上清に由来するＩｇＧを測定するために、別々の水平チャネルの５つに沿って５分間同時に注入する（３０μｌ／分）ことによりＩｇＧ変異体をＨＥＫ２９３上清から捕捉した。２００から４００ＲＵまでの範囲のレベルがもたらされた。順化培地を６番目のチャネルに注入して、二重参照目的の「インライン」ブランクを提供した。ワンショット動力学測定を、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤの希釈系列物（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、０ｎＭ、５０μｌ／分）を垂直チャネルに沿って３分間注入することにより実施した。解離を５分間モニターした。動力学データを上記に記載されている通りに分析した。
【０４７８】
結合プロファイルおよび抗原に結合する特異性の測定に基づいて、少数の結合体を選択し、細胞結合アッセイで測定した。
【０４７９】
選択された結合体（１１Ｄ０６、３３Ｈ０９、１３Ｂ０４、１１Ｂ０９、３３Ｆ０５、５Ｅ１１、１３Ｅ０８、５Ｃ０１、１１Ｇ０６）の配列はすべて、本明細書に含まれている配列表に提供されており、下記の表１に要約されている。
表1.選択されたHLA-A2/WT1結合体のアミノ酸配列。
2021507698.tif 000002
【０４８０】
実施例２
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１  ＩｇＧおよびＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体の調製
クローニング
タンパク質をコードするｃＤＮＡを、従来の（非ＰＣＲに基づく）クローニング技法を使用して、ベクター系（Ｅｖｉｔｒｉａ）にクローニングした。ベクタープラスミドは、合成された遺伝子だった。陰イオン交換クロマトグラフィーに基づき低エンドトキシン条件下でプラスミドＤＮＡを調製した。２６０ｎｍの波長の吸光度を測定することによりＤＮＡ濃度を決定した。サンガー配列決定法で配列の正確性を検証した（ｃＤＮＡのサイズに応じて、１プラスミド当たり最大２つの配列決定反応を用いた）。
【０４８１】
産生
ＩｇＧ抗体および二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞（無血清のＥｘｃｅｌｌ培地で懸濁培養した）の一過性のトランスフェクションにより生成した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めておいたＣＤ  ＣＨＯ培地に取り替えた。発現ベクターをＣＤ  ＣＨＯ培地で混合した、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加し、溶液をボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中で３時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、補完剤を有するＥｘｃｅｌｌ培地を添加した。１日後に、トランスフェクション補完剤を添加した。細胞上清を７日後に回収し、標準的な方法により精製した。
【０４８２】
その代わりに、懸濁に適したＣＨＯ  Ｋ１細胞（元々はＡＴＣＣに由来し、懸濁培養での無血清増殖に適している）を産生に使用した。種を、化学的に画定されている動物成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＧｒｏｗ培地で増殖させた。細胞をｅｖｉＦｅｃｔトランスフェクション試薬でトランスフェクトし、トランスフェクション後に細胞を、動物成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＭａｋｅ２で増殖させた。遠心分離により上清を回収し、その後の濾過した（０．２μｍフィルター）。
【０４８３】
精製
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。手短に述べると、プロテインＡ（ＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清からＦｃ含有タンパク質を精製した。ｐＨ３．０で溶出を達成し、続いて試料を直ちに中和した。タンパク質を濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、凝集したタンパク質をモノマータンパク質から分離した。
【０４８４】
分析論
精製タンパク質の濃度を、ペースら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、４巻、２４１１〜１４２３頁）に従ってアミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。タンパク質の純度および分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ装置（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、還元剤の存在下および非存在下でＣＥ−ＳＤＳを行うことにより分析した。凝集体含有量の決定は、２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニンモノヒドロクロリド（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｌｏｒｉｄｅ）ｐＨ６．７ランニングバッファーで２５℃にて平衡化された分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ、Ｔｏｓｏｈ）を使用してＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。
【０４８５】
ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書では「Ｔ細胞二重特異性抗体」または「ＴＣＢ」とも呼ばれる。この例で調製した二重特異性抗体の概略図は、図２に示されている。
【０４８６】
ＴＣＢの例示的な配列は、配列番号１２３、１２４、１２５、および１２９（１１Ｄ０６  ＴＣＢ）、ならびに配列番号１２６、１２７、１２８、および１２９（３３Ｈ０９−ＴＣＢ）に示されている。対応するＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１結合体のＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、他のＴＣＢを同様の様式で構築した。
【０４８７】
コントロールとして、抗体ＥＳＫ１（Ｄａｏら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１３年）５巻、１７６ｒａ３３；国際公開第２０１２／１３５８５４号パンフレット）に類似した結合体に基づく、本明細書では「ＥＳＫ１−ＴＣＢ」と呼ばれるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）（可変領域配列は、配列番号７３および７４を参照）、ならびに非標的ＴＣＢ（可変領域配列は、配列番号７５および７６を参照）を調製した。
【０４８８】
分子はすべて、同じ方法に従って産生および精製した。最終的な品質は、すべての分子で非常に良好であり、ＣＥ−ＳＤＳでは、モノマー含有量がほとんど１００％であり、純度がほとんど１００％だった。
【０４８９】
実施例３
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性およびアビディティーの生化学的分析
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦに対するＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性を決定するために、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））をランニングバッファーとして用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃にて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を実施した。抗ヒトＦｃ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１００８−３９）を、アミンカップリングによりＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接固定化した。二重特異性コンストラクトを、５ｎＭにて３０秒間捕捉した。ＨＢＳ−ＥＰによるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体の３倍希釈系列物（１．０３〜２５０ｎＭ）を、３０μｌ／分で１２０秒間リガンドに流して結合段階を記録した。解離段階を１２０秒間モニターした。解離段階は、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰに切り替えることにより誘発させた。各サイクル後に３Ｍ  ＭｇＣｌ２を１０μｌ／分で３０秒間注入して、チップ表面を再生した。抗ヒトＦｃ抗体を含むが、それに二重特異性コンストラクトが捕捉されていない参照フローセルで得られた応答を減算することにより、バルク屈折率差を補正した。ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合にフィッティングすることによる動力学的速度定数から、親和性定数を導き出した。
【０４９０】
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦに対するＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体のアビディティーおよび特異性を決定するために、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））をランニングバッファーとして用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃にて、ＳＰＲ実験を再び実施した。抗Ｈｉｓ抗体（ペンタＨｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３４６６０）を、アミンカップリングによりＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接固定化した。ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦまたはＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤを、５または１ｎＭ（それぞれ二重特異性抗体またはＩｇＧを測定するため）において３０秒間１０μｌ／分で捕捉した。ＨＢＳ−ＥＰによる二重特異性コンストラクトの３倍希釈系列物（１．２３〜１００ｎＭ）を、３０μｌ／分で１２０秒間にわたってリガンドに流して結合段階を記録した。解離段階を２４０秒間モニターした。解離段階は、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰに切り替えることにより誘発させた。各サイクル後に１０ｍＭグリシン  ｐＨ２を６０秒間注入して、チップ表面を再生した。参照フローセル（抗Ｈｉｓ抗体を含むが、それにＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦが捕捉されていない）で得られた応答を減算することにより、バルク屈折率差を補正した。この場合は２：１相互作用であるが（被分析物は二価であるが）、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合にフィッティングすることによる動力学的速度定数から親和性定数を導き出した。これにより、相互作用のアビディティーを表わす見かけのＫＤがもたらされる。
【０４９１】
こうした実験の結果は、下記の表２に要約されている。試験したＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体は両方とも、二桁のナノモル（一価）親和性／３桁のピコモル（二価）親和性（アビディティー）でＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦに結合し、ＩｇＧから二重特異性形式に変換されても同じ親和性／アビディティーを維持する。２つの試験した抗体の親和性は約２倍異なるが、両分子のアビディティーは同じ範囲にある。
【０４９２】
試験したＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤに対する結合は検出されなかった（データ非表示）。
表2. HLA-A2/WT1RMFに対する選択されたHLA-A2/WT1 IgGおよびHLA-A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)のSPRにより決定された親和性およびアビディティーデータの要約。
2021507698.tif 000003
【０４９３】
ＣＤ３に対するＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性を決定するために、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））をランニングバッファーとして用いてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃にて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を実施した。抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−９５８３−２５）を、アミンカップリングによりＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接固定化した。二重特異性コンストラクトを、５ｎＭにて４０秒間捕捉した。ＨＢＳ−ＥＰによるＣＤ３εδ−Ｆｃ融合分子の３倍希釈系列物（１２．３５〜３０００ｎＭ）を、３０μｌ／分で２４０秒間にわたって二重特異性抗体に流して結合段階を記録した。解離段階を２４０秒間モニターした。解離段階は、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰに切り替えることにより誘発させた。各サイクル後に１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．１を３０μｌ／分で６０秒間２回注入して、チップ表面を再生した。参照フローセル（抗ヒトＦａｂ抗体を含むが、それに二重特異性コンストラクトが捕捉されていない）で得られた応答を減算することにより、バルク屈折率差を補正した。ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合にフィッティングすることによる動力学的速度定数から、親和性定数を導き出した。
【０４９４】
結果は表３に要約されている。ＣＤ３結合体は、試験した二重特異性分子の両方で同一であるため、ＣＤ３に対するそれらの親和性は、予想通り本質的に同じである。
表3. CD3に対する選択されたHLA-A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)のSPRにより決定された親和性データの要約。
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【０４９５】
実施例４
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ペプチドＲＭＦまたはＶＬＤに対する特異性によるＩｇＧ結合体の選択。
本発明者らは、まず、ファージディスプレイから生成されたＩｇＧ結合体による、ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対する結合特異性をフローサイトメトリーにより測定した。手短に言えば、Ｔ２細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）で補完されたＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９８０−０４８）（完全培地）中１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物として調製した。総容積が１０ｍｌの細胞をチューブで維持し、１０μｌの１０−２Ｍ（ペプチドの最終濃度：１０−５Ｍ）ペプチド（ＷＴ１  ｐ３７−４５  ＶＬＤペプチド（配列番号７７）またはｐ１２６−１３４  ＲＭＦペプチド（配列番号７８））と共に、５％ＣＯ２で２時間３７℃にてインキュベートした。洗浄した後、細胞を冷却ＰＢＳに懸濁し、滴定濃度のＩｇＧ結合体（１０μｇ／ｍｌ〜０．０００６４μｇ／ｍｌ）と共に１時間４℃にてインキュベートし、続いて二次抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）と共に３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ）で細胞を取得した。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰｒｉｓｍにおいてＰＥの平均蛍光発光強度（ＭＦＩ）として示される。
【０４９６】
図３に示されているように、１１Ｄ０６−ＩｇＧ、３３Ｈ０９−ＩｇＧ、および５Ｅ１１−ＩｇＧはすべて、ＲＭＦペプチドでパルスされたＴ２細胞に結合するが、パルスされていないかまたはＶＬＤペプチドでパルスされたＴ２細胞には結合しない。対照的に、１１Ｂ０９−ＩｇＧ、１３Ｂ０４−ＩｇＧ、および５Ｃ０１−ＩｇＧはすべて（１１Ｇ０６−ＩｇＧを除く）、ＶＬＤ−ペプチドと特異的に結合するが、ＲＭＦ−ペプチドには結合しない。こうしたデータに基づき、ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＣＢ）に変換するための結合体を選択した。
【０４９７】
実施例５
ＮＦＡＴ−ジャーカットレポーターアッセイでは、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）が、ペプチドでパルスされたＴ２細胞に結合するとＴ細胞が活性化される
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）の特異性を調べるため、ＮＦＡＴのプロモーター下でルシフェラーゼを発現するジャーカット細胞（ジャーカット−ＮＦＡＴ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＳ１７６５０１）であるレポーター細胞株を使用して、ＴＣＢが、ペプチドでパルスされたＴ２細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−１９９２）に結合する際のＴ細胞活性化を測定した。手短に言えば、Ｔ２細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）で補完されたＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９８０−０４８）（完全培地）中１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物として調製した。総容積が１０ｍｌの細胞をチューブで維持し、１０μｌの１０−２Ｍ（ペプチドの最終濃度：１０−５Ｍ）ペプチド（ＷＴ１  ｐ３７−４５ＶＬＤペプチドまたはｐ１２６−１３４ＲＭＦペプチド）と共に、５％ＣＯ２で２時間３７℃にてインキュベートした。洗浄した後、２．２×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁物中９０μｌのペプチドでパルスされた細胞を、９６ウェルマイクロタイター丸底プレート（２０，０００細胞／ウェル、ＴＰＰ、Ｃａｔ．Ｎｏ．９２０９７）に播種し、５０μｌのジャーカット−ＮＦＡＴ（２×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物）および１０μｌの滴定されたＴＣＢ（ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ〜０．００６４μｇ／ｍｌの）と共に、５％ＣＯ２で１６時間３７℃にて共培養した。その後、５０μｌの上清を除去し、１ウェル当たり１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２６２０）と取り替え、室温（ＲＴ）でインキュベートした。５分後、１８０μｌの上清を新しい白色プレートに移して、発光シグナルをＥｎＶｉｓｉｏｎ（パーキンエルマー）で測定した。データは相対発光ユニット（ＲＬＵ）として示されている。
【０４９８】
図４に示されているように、１１Ｄ０６結合体および３３Ｈ０９結合体に基づくＴＣＢ（それぞれ１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢ）は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体を特異的に認識し、ＲＭＦペプチドでパルスされたＴ２細胞の存在下でのみレポータージャーカット細胞のＮＦＡＴを活性化する。これらとは対照的に、ＥＳＫ１様結合体に基づくコントロールＴＣＢ（ＥＳＫ１−ＴＣＢ）は、ＲＭＦペプチドに対して特異性を示さなかった。また、５Ｅ１１結合体に基づくＴＣＢ（５Ｅ１１−ＴＣＢ）は、ＲＭＦペプチドおよびＶＬＤペプチドでパルスされたＴ２細胞の両方の存在下でＮＦＡＴレポーターＴ細胞の活性化を示した。したがって、次のラウンドのスクリーニングでは、このＴＣＢを除外した。また、１１Ｂ０９結合体および１３Ｂ０４結合体に基づくもの（それぞれ１１Ｂ０９−ＴＣＢおよび１３Ｂ０４−ＴＣＢ）など、幾つかのＶＬＤペプチド特異的ＴＣＢが特定された。陰性コントロールとして、ＲＭＦペプチドまたはＶＬＤペプチドでパルスされたＴ２細胞の存在下でレポータージャーカット細胞のＮＦＡＴを活性化しなかった非標的ＴＣＢ（ＤＰ４７ＧＳ−ＴＣＢ）をアッセイに使用した。５Ｃ０１−ＴＣＢは、ＶＬＤペプチドの認識を示したが、より高い濃度ではＲＭＦペプチドと交差反応した。
【０４９９】
実施例６
ペプチドでパルスされたＴ２細胞との結合時にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）により媒介されるＴ細胞細胞傷害性
次に、本発明者らは、ＴＣＢの細胞傷害性を測定した。標的細胞は、実施例５に記載されているようなペプチドでパルスされたＴ２細胞だった。エフェクター細胞は、フィコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１４４０−０３）勾配遠心分離によりバフィーコートから単離されたＰＢＭＣから精製された汎ＣＤ３＋細胞だった。ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０−０９６−５３５）を使用して、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）により、全ＣＤ３＋  Ｔ細胞を精製した。細胞傷害性アッセイを以下の通りに実施した：ペプチドでパルスした細胞（１００μｌ）を９６ウェルマイクロタイター丸底プレートに播種し（３×１０５細胞／ｍｌ）、５０μｌのＴ細胞（６×１０６細胞／ｍｌ）および５０μｌの滴定されたＴＣＢ（４０μｇ／ｍｌ〜０．００００４μｇ／ｍｌの）と共に、５％ＣＯ２で１８時間３７℃にて完全培地中で共培養した。その後、５０μｌの上清を新しい白色プレートに移し、１ウェル当たり２５μｌのＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ９２９１）を添加して、１５分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。発光シグナル（細胞死を示すものとしてのＬＤＨ放出を測定するため）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（パーキンエルマー）で読み取った。データは相対発光ユニット（ＲＬＵ）として示されている。
【０５００】
図５は、ＲＭＦまたはＶＬＤ発現標的細胞のＴＣＢ媒介性特異的Ｔ細胞死滅を示す。本発明者らは、１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢが両方とも、ＲＭＦペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して特異的な死滅を示したことを見出した。３３Ｆ０５−ＴＣＢは、ＲＭＦペプチドまたはＶＬＤペプチドでパルスされた細胞の特異的死滅を媒介しなかった。加えて、１３Ｂ０４−ＴＣＢおよび１１Ｂ０９−ＴＣＢは、ＶＬＤペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して強力な死滅を媒介した。５Ｃ０１−ＴＣＢは、ＶＬＤでパルスされたＴ２細胞の死滅を示したが、より高い濃度ではＲＭＦでパルスされた細胞の死滅も示した。これは、ＮＦＡＴレポーターアッセイでの観察と一致する（図４）。
【０５０１】
実施例７
ＷＴ１＋細胞株との結合時にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）により媒介されるＴ細胞細胞傷害性
ＴＣＢによる特異的な死滅を確認するために、本発明者らは、ＷＴ１＋腫瘍細胞株で細胞傷害性アッセイを実施した。ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋細胞株は、ＳＫＭ−１細胞（ＤＺＭＺ  Ｎｏ．ＡＣＣ５４７）およびＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＷＴ１）（自家製）だった。陰性コントロールは、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１−細胞：ＢＪＡＢ（ＤＺＭＺ  Ｎｏ．ＡＣＣ７５７）、ＡＲＨ−７７（ＤＺＭＺ  Ｎｏ．ＡＣＣ５１２）、およびＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４複合体でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＭＡＧＥＡ４）（自家製）、ならびにＨＬＡ−Ａ２−ＷＴ１＋細胞株：Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＬＬ−２４３）だった（図６Ａ）。細胞傷害性アッセイを、実施例６に記載されているように実施した。１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢは両方とも、ＳＫＭ−１細胞およびＣＨＯ−ＷＴ１細胞に対して強力な死滅を示したが、いかなるＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１−細胞およびＨＬＡ−Ａ２−ＷＴ１＋細胞に対しては死滅を示さず、これら２つのＴＣＢが、ＷＴ１ペプチドＲＭＦに対して特異性を有することが示された（図６Ｂ、６Ｃ）。それとは対照的に、ＶＬＤペプチド特異的なＴＣＢはいずれも、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋細胞株に対する死滅を示さなかった。それらが高濃度（１０μｇ／ｍｌ）においてＷＴ１＋細胞株に対して低力価の死滅を示した場合、ＷＴ１−細胞株に対しても同様に同じ程度の死滅が見られた（図６Ｄ、６Ｅ）。こうした機能性データに基づき、本発明者らは、さらなる評価のために１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢを選択した。
【０５０２】
また、本発明者らは、本発明者らの選択されたＴＣＢを、腫瘍標的細胞の死滅活性についてＥＳＫ１−ＴＣＢと比較した。興味深いことに、ＥＳＫ１−ＴＣＢは、１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢと比較して、ＳＫＭ−１細胞死滅の媒介には同様の力価を達成したが、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ−１−  ＢＪＡＢ細胞に対する死滅も誘導する。これは、ＥＳＫ１−ＴＣＢ結合がＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体に限定されないことを示す（図６Ｆ、６Ｇ）。
【０５０３】
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋である複数の腫瘍細胞株の死滅を試験した。死滅のＥＣ５０値に基づき、細胞株を、ＥＣ５０＜１μＭで死滅されたもの（表４では「＋＋」と標記されている）、ＥＣ５０＞１μＭおよび＜５μＭで死滅されたもの（表４では「＋」と標記されている）、および本質的に死滅されなかったもの（表４では「無し」と標記されている）に分類した。
【０５０４】
まとめると、選択されたＴＣＢである１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢは、１３個のＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋細胞株のうちの６個に対してＴ細胞細胞傷害性を媒介した。他の細胞株に対する死滅の欠如は、ＭＨＣ  Ｉにより細胞表面に提示されるＷＴ１の発現が低いためである可能性が高かった。表４は、１１Ｄ０６−ＴＣＢの結果を示す。３３Ｈ０９−ＴＣＢの結果は同様だった（ＥＣ５０値は、１１Ｄ０６−ＴＣＢよりもわずかに高かった）。
表4.選択されたTCBによるWT1+細胞株の死滅。
2021507698.tif 000005
【０５０５】
実施例８
ＷＴ１＋細胞株との結合時にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）により媒介されるＴ細胞活性化
ＷＴ１＋標的細胞に対するＴＣＢ媒介細胞傷害性の要件は、Ｔ細胞が活性化されてエフェクター機能を獲得することである。本発明者らは、実施例７に記載されているようなインビトロ死滅アッセイ中に、２つの選択されたＴＣＢ、３３Ｈ０９−ＴＣＢおよび１１Ｄ０６−ＴＣＢの存在下でのＴ細胞およびＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１−細胞ＳＫＭ−１またはＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１−細胞ＢＪＡＢの共培養のフローサイトメトリーによりＴ細胞の活性化状態を測定した。１８時間の共インキュベーション後に細胞を回収し、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３００３２１）、ＣＤ２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０２６０６）、およびＣＤ６９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３１０９１４）に対する抗体で染色して、フローサイトメトリーによりＴ細胞活性化を測定した。
【０５０６】
図７に示されているように、両ＴＣＢは、ＳＫＭ−１細胞に結合するとＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＤ６９およびＣＤ２５の上方制御を誘導したが、ＢＪＡＢ細胞では誘導しなかった。これは、ＴＣＢが、ＳＫＭ−１細胞により提示されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体を特異的に認識することにより、ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化が誘発され、最終的には標的細胞の特異的溶解が導かれることを示す。
【０５０７】
実施例９
選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）は、報告されているオフターゲットペプチドに結合しない
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体の開発における主要な潜在的リスクは、正常組織により発現されるタンパク質に由来する提示されたペプチドホモログと抗体との交差反応性である。ＥＳＫ１抗体はタンパク質ＭＥＤ１３ＬおよびＰＩＧＱに由来する配列類似ペプチドに結合することが、Ａｔａｉｅら（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２０１６年）４２８巻：１９４〜２０５頁）により報告されているため、本発明者らは、これら２つのペプチドに対する交差反応性に関して本発明者らのＴＣＢを試験した。これらのペプチドの配列は、図８Ｆおよび配列番号７９および８０に示されている。実施例４に記載されているようなフローサイトメトリーに基づく結合アッセイでは、本発明者らは、１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢが両方ともＰＩＧＱペプチドに結合しないことを見出した。両ＴＣＢによるＭＥＤ１３Ｌペプチドとの結合は、天然ＷＴ１  ＲＭＦペプチドと比較して、ほぼ１００倍だけより低い（図８Ａ、８Ｂ）。ＥＳＫ１−ＴＣＢは、ＲＭＦペプチドと低親和性で結合するが、ＰＩＧＱペプチドとは同様の様式で結合し、ＭＥＤ１３Ｌとはさらにより強力に結合する（図８Ｃ）。これは、ＥＳＫ１  ＩｇＧの報告されている結合活性と一致する（Ａｔａｉｅら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２０１６年）４２８巻：１９４〜２０５頁）。
【０５０８】
また、本発明者らは、実施例５に記載されているようなＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、交差反応性を試験した。結合データと一致して、ＭＥＤ１３ＬおよびＰＩＧＱとの結合時のジャーカット細胞でのＮＦＡＴ活性化の強度は、１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢによるＷＴ１  ＲＭＦペプチドとの結合時の活性化よりも少なくとも１００倍弱い（図８Ｄ、８Ｅ）
【０５０９】
実施例１０
選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）は、未同定のオフターゲットペプチドに結合しない
正常組織に由来する相同ペプチド（重要な認識残基を共有する）に対する交差反応性は、ＴＣＲ様抗体またはＴＣＲに基づくＴ細胞療法による、重度の容易に予測可能でない毒性を引き起こす場合がある（例えば、Ｌｉｎｅｔｔｅら、Ｂｌｏｏｄ（２０１３年）１２２巻：８６３〜７１を参照；心臓組織により発現されるタンパク質に対するオフターゲット反応性による、ＭＡＧＥ  Ａ３−ＴＣＲ療法の致死毒性が報告されている）。したがって、こうした薬剤の特異性は重要である。１１Ｄ０６（実施例１５を参照）の結合に関与するＲＭＦペプチドの位置を確認する結晶構造データに基づいて本発明者らの抗体の特異性を詳しく画定するために、本発明者らは、ペプチドームデータベース（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔおよびＴｒＥＭＢＬ）において、ＲｘｘＰＮｘｘＹｘをマスキングすることにより、ＷＴ１  ＲＭＦペプチド（配列番号７８）と類似したアミノ酸配列を有する潜在的オフターゲットペプチドの探索を拡張した。本発明者らは、すべてがＨＬＡ−Ａ２に対する高い予測親和性を有する様々なタンパク質に由来する追加の２５個のペプチドを見出した（表５）。その後、本発明者らは、上記に記載されているように、ＮＦＡＴレポーターアッセイ（ペプチド１〜６）またはＴ細胞細胞傷害性アッセイ（ペプチド７〜２５）を使用して、ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対する本発明者らの選択されたＴＣＢの交差反応性を試験した。
【０５１０】
試験した最初の６個のペプチドの場合、１１Ｄ０６−ＴＣＢは、この６個のペプチドのいずれに対しても交差反応性を示さなかった。３３Ｈ０９−ＴＣＢは、ＡＲＨＧＥＦ１１に対してある程度の認識を示したが、ＮＦＡＴ活性化の度合いは、天然ＲＭＦペプチドと比較して＞１００倍低かった（図９Ａ、９Ｂ）。同様に、他の１９個のオフターゲットペプチドの交差反応性は、ペプチドでパルスされたＴ２細胞のＴ細胞死滅を指図することにより測定して、天然ＲＭＦペプチドによりも少なくとも１００倍低かった（図９Ｃ、９Ｄ）。この結果を第２の実験で確認した。第２の実験ではＥＳＫ１−ＴＣＢも試験した（図９Ｅ〜９Ｇ）。
【０５１１】
まとめると、本発明者らは、１１Ｄ０６および３３Ｈ０９（ＥＳＫ１様結合体を除く）がＷＴ１  ＲＭＦペプチドに対して特異性を示し、ペプチドームで検出された潜在的オフターゲットペプチドに対しては特異性を示さないことを確認した。
表5.追加の新しく特定されたオフターゲットペプチド。
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【０５１２】
実施例１１
選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）は、ＣＤ３４＋幹細胞に対する細胞傷害性を媒介しない
ＣＤ３４＋造血幹細胞はＷＴ１陽性であることが報告されており（ＲａｍａｎｉおよびＣｏｗｅｌｌ、Ｊ．Ｐａｔｈ（１９９６年）１７９巻：１６２〜８頁）、したがって、ＴＣＢがそれらに結合した場合、潜在的に有害であり得る。ＣＤ３４＋細胞がＲＭＦペプチドを内因的に提示するか否かを研究するため、本発明者らは、３人のドナーに由来するＨＬＡ−Ａ２＋骨髄由来ＣＤ３４＋細胞をＬｏｎｚａから得、本発明者らの選択されたＴＣＢを、上記の実施例７に記載されているような死滅アッセイで試験した。１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢは、ＳＫＭ−１細胞に対して強力な死滅を媒介するが、ＣＤ３４＋幹細胞に対しては死滅活性を示さなかった。これは、これらの幹細胞がＨＬＡ−Ａ２の状況ではＲＭＦペプチドを提示しない可能性があることを示す（図１０）。
【０５１３】
実施例１２
アラニン走査アッセイによる、選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）の結合残基の画定
本発明者らのＴＣＢは、ＥＳＫ１−ＴＣＢと比較して、ＲＭＦペプチドに対する結合および機能活性が異なることは明らかである。ＴＣＢによるＲＭＦペプチドの潜在的結合モチーフの特徴を明らかにするため、本発明者らは、天然配列に由来するペプチドアレイを使用して各アミノ酸をアラニンに個々に置き換えることによるアラニン走査アッセイを設定し、そうしたペプチドでパルスされたＴ２細胞によるＮＦＡＴレポーターシグナルを測定した（図１１Ａ〜１１Ｌ）。データは、漸増濃度のＴＣＢにわたってＲＬＵとして示されている。本発明者らは、天然ペプチドのＥＣ５０に対するＥＣ５０の倍率変化をプロットし、１０≧の倍率変化を有意であるとみなした。これは、ＲＭＦペプチドの対応するアミノ酸残基が、１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢによる認識に重要であり得ることを意味する（図１１Ｍ）。本発明者らは、１１Ｄ０６−ＴＣＢおよび３３Ｈ０９−ＴＣＢは両方とも、残基Ｒ１、Ｆ３、Ｎ５、およびＡ６と重要な接触を有するが（図１１Ｎ）、ＥＳＫ１は、ＲＭＦペプチドＲ１、Ｐ４、およびＮ５と緊密な接触を有することが示された（Ａｔａｉｅら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２０１６年）４２８巻：１９４〜２０５頁）と結論付けた。
【０５１４】
実施例１３
ＮＳＧマウスへの単回注射後のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）の薬物動態プロファイル
０．５ｍｇ／ｋｇの３３Ｈ０９−ＴＣＢまたは１１Ｄ０６−ＴＣＢの単一用量を、ＮＳＧマウスに注射した。マウスにはすべて、２００μｌの適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。適正量の２００μｌ当たりの化合物を得るために、ストック溶液をヒスチジンバッファーで希釈した。１時点当たり３匹のマウスを、１０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、６日、８日、１０日、および１２日目に出血させた。血清試料中の注射した化合物をＥＬＩＳＡにより分析した。ビオチン化抗ｈｕＣＤ３−ＣＤＲ抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ペンツベルク、ドイツ）、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＦｃ抗体、および抗ジゴキシゲニン検出抗体（ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））を、９６ウェルストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに段階的に添加し、各段階後に室温で１時間インキュベートした。各段階後にプレートを３回洗浄して、未結合物質を除去した。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）基質溶液を添加して、有色反応生成物を形成することにより視覚化する。４０５ｎｍ（参照波長は４９０ｎｍ）で光度測定的に決定した反応生成物強度は、血清中の被分析物濃度に比例する。結果（図１２）は、試験した両クローンのＰＫ挙動は安定であることを示した。これは、その後の有効性研究では週１回のスケジュールでよいことを示唆した。
【０５１５】
実施例１４
ヒト化マウスのＳＫＭ−１異種移植片におけるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）の有効性研究
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体の最初の有効性研究は、完全ヒト化ＮＳＧマウスにおけるヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）異種移植片（ＳＫＭ−１；ＨＬＡ−Ａ２＋、ＷＴ−１＋）での有効性の点で、２つの異なるＷＴ１結合体（１１Ｄ０６および３３Ｈ０９）を比較することが目的だった。
【０５１６】
ＳＫＭ−１細胞（ヒトＡＭＬ）は、元々はＡＴＣＣから得られたものであり、Ｒｏｃｈｅ  Ｇｌｙｃａｒｔ組織内細胞バンクに寄託されていた。細胞を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気にてＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋１％グルタミンで培養した。マトリゲルでの生存率（１：１比）が９８％であるインビトロ継代１５を、皮下注射に使用した。
【０５１７】
実験開始時に４〜５週齢であった雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、準拠ガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って毎日１２時間明期／１２時間暗期のサイクルで特定の病原体がない条件下にて維持した。実験研究プロトコールは、地方自治体により審査および承認された。動物は、到着後、新しい環境に馴らすため１週間維持し、観察した。連続健康モニタリングを定期的に実施した。
【０５１８】
雌ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンをｉ．ｐ．注射し、続いて臍帯血から単離された１×１０５個のヒト造血幹細胞を１日後にｉ．ｖ．注射した。幹細胞注射の１４〜１６週間後、マウスを舌下出血させ、血液を、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーにより分析した。効率的に移植されたマウスを、ヒトＴ細胞頻度に従って異なる治療群に無作為化した。その際、図１３Ａに示されているようにＳＫＭ−１腫瘍細胞をマウスにｓ．ｃ．注射し、腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３に達したら（１０日目）、化合物またはヒスチジンバッファー（ビヒクル）で週１回処置した。マウスにはすべて、２００μｌの適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。適正量の２００μｌ当たりの化合物を得るために、ストック溶液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ノギスを使用して腫瘍増殖を週３回測定し、腫瘍容積を以下のように算出した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ      （Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
【０５１９】
腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）ならびに腫瘍対コントロール比（ＴＣＲ）を、以下のように算出した：
2021507698.tif 000007
【０５２０】
図１３は、すべての治療群の腫瘍増殖動力学（平均）（図１３Ｃ）ならびに各群の単一の腫瘍増殖動力学（図１３Ｄ〜１３Ｆ）を示す。図示されているように、ＴＣＢは両方とも腫瘍増殖阻害を示し、クローン１１Ｄ０６が最も強い腫瘍増殖阻害を示し、ＴＧＩは１０１．３だった（図１３Ｇ）。
【０５２１】
実施例１５
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１抗体／ｐＭＨＣ複合体の結晶構造
Ｆａｂ断片を、１ｍｇ当たり１．０５Ｕのプラスミン（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６０２３６１）を有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で抗体を７２時間２５℃にてインキュベートすることにより調製した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化された４．５ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＣＨ１−アフィニティーカラム（ＢＡＣ  ＢＶ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１９１．３１２０）を使用して、切断されたＦｃをＦａｂ断片から分離した。Ｆａｂ断片を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．０でカラムから溶出し、０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０で中和してから、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化されたサイズ排除カラムＳ７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。品質管理は、非還元条件および還元条件下で分析用サイズ排除（カラムはＴｏｓｏｈ、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬで、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ１２００装置を使用）およびＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を行うことにより実施した。精製Ｆａｂ断片を、液体窒素で凍結し、−８０℃で保管した。
【０５２２】
５Ｃ０１抗体／ｐＭＨＣ複合体の結晶化、データ収集、および構造決定
結晶化。５Ｃ０１結合体に基づく１．２倍過剰モルのＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１  Ｆａｂ断片（Ｆａｂ  ５Ｃ０１）を、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＶＬＤペプチド複合体（ＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＶＬＤ  ｐＭＨＣ）と混合することにより、抗体／ｐＭＨＣ複合体（Ｆａｂ  ５Ｃ０１  ＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＶＬＤ  ｐＭＨＣ）を調製した。４℃で１時間インキュベートした後、混合物を１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。初期結晶化試行は、シッティングドロップ蒸気拡散設定で２１℃にて実施した。結晶品質を向上させるために１０％２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）が結晶化液滴に添加された０．２Ｍ酒石酸ナトリウム、２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３５０から１日以内に結晶が出現した。結晶を、一切のさらなる最適化工程を行わずにスクリーニングプレートから直接回収した。
【０５２３】
データ収集および構造決定。データ収集のために、結晶を、１５％グリセロールを含む析出剤溶液中で１００Ｋにて瞬間凍結した。回折データは、Ｓｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｖｉｌｌｉｇｅｎ、スイス）のビームラインＸ１０ＳＡでＰＩＬＡＴＵＳ  ６Ｍ検出器を使用して１．００００Åの波長で収集した。データを、ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．、Ｄ６６巻、１３３〜１４４頁（２０１０年））で処理し、ＳＡＤＡＢＳ（ＢＲＵＫＥＲ）でスケーリングした。複合体の結晶は、空間群Ｐ２１２１２に属し、セル軸は、ａ＝１５８．９４Å、ｂ＝４９．１２Å、ｃ＝１２８．６３Åであり、１．９８Åの分解能で回折する。構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）エントリー４ＮＯ５の結晶構造および自家製Ｆａｂ構造の座標を検索モデルとして使用して、ＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．、Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．、Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｌ．Ｃ．、およびＲｅａｄ，Ｒ．Ｊ．、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．、４０巻、６５８〜６７４頁（２００７年））で分子置換することにより決定した。差電子密度を使用してペプチドを配置し、配列差異に従って実空間精密化（ｒｅａｌ  ｓｐａｃｅ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）によりアミノ酸を変更した。構造は、ＣＣＰ４スイート（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｕｍｂｅｒ  ４  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．、Ｄ５０巻、７６０〜７６３頁（１９９４年））およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，Ｇ．、Ｂｌａｎｃ，Ｅ．、Ｂｒａｎｄｌ，Ｍ．、Ｆｌｅｎｓｂｕｒｇ，Ｃ．、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｐ．、Ｐａｃｉｏｒｅｋ，Ｗ．、Ｒｏｖｅｒｓｉ，Ｐ．、Ｓｈａｒｆｆ，Ａ．、Ｓｍａｒｔ，Ｏ．Ｓ．、Ｖｏｎｒｈｅｉｎ，Ｃ．、Ｗｏｍａｃｋ，Ｔ．Ｏ．（２０１１年）。Ｂｕｓｔｅｒバージョン２．９．５  ケンブリッジ、英国：Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ）のプログラムを用いて精密化した。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ、Ｐ．、Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．、Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ６６巻、４８６〜５０１頁（２０１０年））でマニュアルリビルディング（ｍａｎｕａｌ  ｒｅｂｕｉｌｄｉｎｇ）を行った。
【０５２４】
データ収集および精密化統計は、表６に要約されている。
表6. Fab 5C01 HLA-A02/WT1VLD pMHCのデータ収集および精密化統計学
2021507698.tif 000008
*括弧中の値は、最も高い分解能シェルのものである。
【０５２５】
ＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＶＬＤとの複合体中のＦａｂ  ５Ｃ０１の構造
ＶＬＤペプチドとＦａｂ  ５Ｃ０１との相互作用の詳細、５Ｃ０１とＨＬＡ−Ａ０２との結合エピトープおよびパラトープの特徴を明らかにするために、本発明者らは、５Ｃ０１とＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＶＬＤ  ｐＭＨＣとの複合体の結晶構造を、１．９８Åの分解能で決定した（図１４Ａ）。この構造は、Ｆａｂ  ５Ｃ０１が、軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３の主な寄与により、および重鎖のすべてのＣＤＲにより、ｐＭＨＣに結合することを明らかにする。ＶＬＤペプチド（配列番号７７）からは、残基Ｖａｌ１、Ｐｈｅ４、およびＰｒｏ７の側鎖がＦａｂと直接接触する。ペプチドの他のすべての側鎖は、ＨＬＡ−Ａ０２分子の方を向いている。接触表面積に対するペプチドの寄与は約６８Å２であるが、総Ｆａｂ−ｐＭＨＣ接触面積は約４７６Å２であることが観察される。Ｆａｂ  ５Ｃ０１−ｐＭＨＣ接触面の拡大図は図１５に示されている。
【０５２６】
プログラムＰＩＳＡ（Ｅ．ＫｒｉｓｓｉｎｅｌおよびＫ．Ｈｅｎｒｉｃｋ（２００７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２巻、７７４〜７９７頁）による結合接触面の分析は、８つの水素結合、Ｐｉ−Ｐｉ相互作用、およびファンデルワールス接触による、Ｆａｂ  ５Ｃ０１とＨＬＡ−Ａ０２との相互作用パターンを明らかにする。重鎖ＣＤＲ３（Ｔｒｐ９７）およびＣＤＲ２（Ｓｅｒ５２、Ｓｅｒ５３）の残基とＨＬＡ−Ａ０２のＧｌｕ６３およびＧｌｕ１６６との間に側鎖水素結合が形成されている。さらなる水素結合が、Ｔｙｒ９１およびＩｌｅ９３の軽鎖骨格原子とＧｌｎ１５５とにより確立されている。複合体は、軽鎖残基Ｔｒｐ３２およびＴｒｐ９４とＧｌｎ１５５およびＨｉｓ１５１のＨＬＡ−Ａ０２側鎖とのＰｉ−Ｐｉ相互作用の形成により、さらに安定化されている。ＶＬＤペプチドのＮ末端バリンは、ＨＬＡ−Ａ０２のＴｙｒ１７１との水素結合を骨格窒素を介して受け入れている。その側鎖は、ＨＬＡ−Ａ０２のＧｌｕ６３およびＴｒｐ１６７ならびにＦａｂ  ５Ｃ０１の重鎖のＴｒｐ９７により形成されているポケットに向かって配向されている。加えて、ペプチドのＰｈｅ４は、重鎖のＴｙｒ１００とエッジトゥーフェイス（ｅｄｇｅ  ｔｏ  ｆａｃｅ）で相互作用する。接触が要約されている概略的Ｆａｂ  ５Ｃ０１−ｐＭＨＣ相互作用マトリックスが、図１６に示されている。
【０５２７】
１１Ｄ０６抗体／ｐＭＨＣ複合体の結晶化、データ収集、および構造決定
結晶化。１１Ｄ０６結合体（Ｆａｂ  １１Ｄ０６）に基づく１：１モル量のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１  Ｆａｂ断片を、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦペプチド複合体（ＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ）と混合することにより、抗体／ｐＭＨＣ複合体（Ｆａｂ  １１Ｄ０６  ＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ）を調製した。２１℃で４時間インキュベートした後、混合物を２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。初期結晶化試行は、シッティングドロップ蒸気拡散設定で２１℃にて実施した。結晶は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２０％ＰＥＧ  ４０００から４日以内に出現した。結晶を、一切のさらなる最適化工程を行わずにスクリーニングプレートから直接回収した。
【０５２８】
データ収集および構造決定。データを、上記に記載されているように収集、処理、およびスケーリングした。複合体の結晶は、空間群Ｐ２１に属し、セル軸は、ａ＝５４．１１Å、ｂ＝６７．００Å、ｃ＝１３９．３６Åであり、β＝９０．５７°であり、２．６４Åの分解能で回折する。構造は、自家製ＦａｂおよびＭＨＣ複合体構造の座標を検索モデルとして使用して、ＰＨＡＳＥＲで分子置換することにより決定した。差電子密度を使用してペプチドを配置し、配列差異に従って実空間精密化によりアミノ酸を変更した。構造精密化およびマニュアルリビルディングを、上記に記載のように実行した。
【０５２９】
データ収集および精密化統計は、表７に要約されている。
表7. 11D06 HLA-A02/WT1RMF pMHCのデータ収集および精密化統計学
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*括弧中の値は、最も高い分解能シェルのものである。
【０５３０】
ＨＬＡ−Ａ０２／ＲＭＦ  ｐＭＨＣとの複合体中のＦａｂ  １１Ｄ０６の構造
本発明者らは、Ｆａｂ  １１Ｄ０６とＨＬＡ−Ａ０２／ＲＭＦ  ｐＭＨＣとの複合体の結晶構造を、２．６４Åの分解能で決定した（図１４Ｂ）。構造は、Ｆａｂ  １１Ｄ０６が、ＣＤＲすべての寄与によりｐＭＨＣと結合することを示す。残基Ａｒｇ１、Ｍｅｔ２、Ｐｒｏ４、Ａｓｎ５、Ａｌａ６、およびＴｙｒ８のＲＭＦペプチド（配列番号７８）側鎖は、Ｆａｂの軽鎖および重鎖と直接接触している。ペプチドの残りの側鎖は、ＨＬＡ−Ａ０２分子の方を向いている。接触表面積に対するペプチドの寄与は約１０７Å２である。総Ｆａｂ−ｐＭＨＣ接触面積は約３９７Å２に相当する。Ｆａｂ  １１Ｄ０６−ｐＭＨＣ接触面の拡大図は図１７に示されている。
【０５３１】
プログラムＰＩＳＡによる結合接触面の分析は、４つの水素結合、数多くのＰｉ−Ｐｉ相互作用、およびファンデルワールス接触による、Ｆａｂ  １１Ｄ０６とＨＬＡ−Ａ０２との相互作用パターンを明らかにする。重鎖ＣＤＲ１（Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１）およびＣＤＲ３（Ｇｌｙ１００Ａ）の残基とＨＬＡ−Ａ０２のＧｌｕ５８およびＡｒｇ６５との間に水素結合が観察される。さらなる水素結合が、軽鎖残基Ａｓｐ５０とＨＬＡ−Ａ０２  Ａｒｇ６５とにより確立されている。その他に、重鎖のＴｒｐ１００は、ＨＬＡ−Ａ０２のＡｒｇ６５およびＬｙｓ６６との、ならびにＲＭＦペプチドのＰｒｏ４とのファンデルワールス接触およびＰｉ−Ｐｉ接触を提供する。ＲＭＦペプチドのＮ末端アルギニンは、その側鎖が、１１Ｄ０６の重鎖のＳｅｒ３１、Ｇｌｕ９７、およびＩｌｅ９６の骨格カルボニルにより形成されている極性ポケットに向けられている。１１Ｄ０６およびＨＬＡ−Ａ０２に対する追加の極性接触は、ＨＬＡ−Ａ０２のＧｌｎ１５５と共に、軽鎖ＣＤＲ１のＴｒｐ３２、軽鎖ＣＤＲ３のＧｌｕ９２との水素結合ネットワークの一部分であるＲＭＦペプチド残基Ａｓｎ５により受け入れられている。接触が要約されている概略的Ｆａｂ  １１Ｄ０６−ｐＭＨＣ相互作用マトリックスが、図１８に示されている。
【０５３２】
公的データベースで検索されたＥＳＫ１の３Ｄ構造：
比較のために、ＨＬＡ−Ａ０２／ＲＭＦ  ｐＭＨＣに結合する抗体（Ｆａｂ）ＥＳＫ１の公的に入手可能な結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＷＵＵ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｅｘｐｌｏｒｅ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｄｏ？ｓｔｒｕｃｔｕｒｅＩｄ＝４ＷＵＵ）を、そのＦａｂ−ｐＭＨＣ接触に関して同様に分析した。図１４Ｃは、ＨＬＡ−Ａ０２／ＶＬＤ  ｐＭＨＣとのＦａｂ  ５Ｃ０１およびＨＬＡ−Ａ０２／ＲＭＦ  ｐＭＨＣとのＦａｂ  １１Ｄ０６の結晶構造（図１４Ａおよび１４Ｂ）と同じ角度（ＨＬＡ−Ａ０２部分に対してアラインされている）からのＨＬＡ−Ａ０２／ＲＭＦ  ｐＭＨＣとのＦａｂ  ＥＳＫ１結晶構造を示す。Ｆａｂ  ＥＳＫ１−ｐＭＨＣ接触面の拡大図は図１９に示されており、接触が要約されている概要的Ｆａｂ  ＥＳＫ１−ｐＭＨＣ相互作用マトリックスは、図２０に示されている。
【０５３３】
構造比較は、５Ｃ０１および特に１１Ｄ０６が、ＲＭＦペプチドのＮ末端Ａｒｇと排他的に特異的接触を形成し結合接触面の残りがＨＬＡ−Ａ０２により提供されるＥＳＫ１よりも、それぞれのＷＴ１ペプチドをより大きな割合で覆って結合することを明らかにする。こうした観察に基づくと、５Ｃ０１および１１Ｄ０６は、露出位置に非ＶＬＤまたは非ＲＭＦ様側鎖を有するペプチドに対して著しくより大きな立体障害を創出するため、ＥＳＫ１よりもオフターゲットペプチドを許容する可能性がより低いはずであると結論付けることができる。
【０５３４】
結晶構造の図式表示はすべて、ＢＩＯＶＩＡ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５、Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ  ＢＩＯＶＩＡで作成した。
【０５３５】
エピトープおよびパラトープ残基（５Å半径）
結合体５Ｃ０１、１１Ｄ０６、およびＥＳＫ１のエピトープおよびパラトープの要約は、下記に示されている。エピトープおよびパラトープ（５Å近隣半径に基づき画定した）残基は、太字斜体文字で強調されている。ＣＤＲ残基は灰色背景で強調されている。
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【０５３６】
化学的相互作用に関与する残基
結合体５Ｃ０１、１１Ｄ０６、およびＥＳＫ１の化学的相互作用に関与する残基の要約は、下記に示されている。特異的な化学的相互作用に関与する残基（図１６、１８、および２０を比較）は、太字斜体文字で強調されている。ＣＤＲ残基は灰色背景で強調されている。
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【０５３７】
実施例１６
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）と様々なＣＤ３結合体との比較
本発明者らは、上記に記載されているようなアッセイ（実施例７）にてＳＫＭ−１細胞を使用して、１１Ｄ０６−ＴＣＢの死滅活性の力価を様々なＣＤ３結合体と比較した。ＣＨ２５２７は、以前の実験で使用したＴＣＢのＣＤ３結合体である（ＶＨ配列およびＶＬ配列は、配列番号１２１および１２２を参照）。Ｖ９は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ（１９９２年）７巻、４５〜５０頁および国際公開第１９９２／２２６５３号パンフレットに記載されているＣＤ３結合剤であり（ＶＨ配列およびＶＬ配列は、配列番号１３６および１３７を参照）、４０Ｇ５Ｃは、国際公開第２０１５／０９５３９２号パンフレットに記載されている（ＶＨ配列およびＶＬ配列は、国際公開第２０１５／０９５３９２号パンフレットの配列番号１８４および１８５（「ｈｕ４０Ｇ５ｃ」）を参照）。
【０５３８】
ＣＤ３結合体ＣＨ２５２７、４０Ｇ５Ｃ、およびＶ９の親和性は、表８に示されている。
【０５３９】
図２１に示されているように、本発明者らは、１１Ｄ０６−ＴＣＢ（ＣＨ２５２７）が、ＨＬＡ−Ａ２＋ＷＴ１＋  ＳＫＭ−１細胞株に対して１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）と同じ力価のＴ細胞媒介性死滅を示したが、１１Ｄ０６−ＴＣＢ（４０Ｇ５Ｃ）は、強力に低減された死滅力価を示したことを観察した。
表8.この実験で比較されたCD3結合体の親和性。
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【０５４０】
実施例１７
ＲＭＦペプチドでパルスされたＴ２細胞との結合時にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）により媒介されるＴ細胞細胞傷害性
１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）（完全な配列は、配列番号１２３、１２５、１３９、１４０を参照）の死滅活性を、異なるＨＬＡ／ＷＴ１結合体を有する類似ＴＣＢと比較した（「Ａａｌｉ」および「Ｄａｎｉｅｌ」、国際公開第２０１７／０６０２０１号パンフレット、それぞれ配列番号５（ＶＨ）および６（ＶＬ）ならびに配列番号３５（ＶＨ）および３６（ＶＬ）を参照）。また、ＥＳＫ１−ＴＣＢおよび非標的ＤＰ４７−ＴＣＢが、コントロールとして含まれていた。実験は、実施例６に記載されているように実施した。ＲＭＦペプチドでパルスされた細胞（１００μｌ、２×１０５細胞／ｍｌ）を、５０μｌのＴ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）と共におよびＴＣＢ（５０μｌ）の段階希釈物と共に、５％ＣＯ２で２４時間３７℃にて共培養した。
【０５４１】
図２２は、ＲＭＦ発現標的細胞のＴＣＢ媒介性特異的Ｔ細胞死滅を示す。本発明者らは、１１Ｄ０６−ＴＣＢおよびＥＳＫ１−ＴＣＢが、ＲＭＦペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して強力な死滅を媒介したが、ＨＬＡ／ＷＴ１結合体「Ａａｌｉ」および「Ｄａｎｉｅｌ」に基づくＴＣＢ（Ａａｌｉ−ＴＣＢおよびＤａｎｉｅｌ−ＴＣＢ）は、最も高い濃度でのみ、ＲＭＦでパルスされた細胞のわずかな死滅を示したことを見出した。
【０５４２】
実施例１８
選択されたＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）はオフターゲットペプチドに結合しない
また、本発明者らは、実施例９および１０に記載されているオフターゲットペプチドとの、１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）、Ａａｌｉ−ＴＣＢ、Ｄａｎｉｅｌ−ＴＣＢ、およびＥＳＫ１−ＴＣＢの交差反応性を比較した。
【０５４３】
この実験では、抗ＰＧＬＡＬＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するジャーカットＮＦＡＴレポーター細胞を使用した（ＣＡＲ  Ｊアッセイ、その全内容が本明細書に参照により援用される欧州特許出願第ＥＰ１７２０９２０１．７号明細書の優先権を主張するＰＣＴ出願を参照）。抗ＰＧＬＡＬＡ  ＣＡＲは、ＴＣＢのＦｃ領域のＰ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）突然変異を認識する。上記に記載されているような、ペプチドでパルスされたＴ２細胞を、標的細胞として使用した。アッセイの原理は、ジャーカット−ＮＦＡＴ遺伝子操作エフェクター細胞を標的細胞と共に共培養することである。ＴＣＢが、ＣＡＲ（ＰＧＬＡＬＡ突然変異を介して）および標的抗原と同時に結合する場合のみ、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、ジャーカットエフェクター細胞でのルシフェラーゼ発現増加に結び付く。適切な基質を添加すると、活性ホタルルシフェラーゼは、ＣＡＲ媒介性活性化のシグナルとして測定することができる発光の放出に結び付く。
【０５４４】
手短に言えば、標的細胞を回収し、生存率を決定した。２０  ０００標的細胞／ウェルを、丸底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、＃６５０１８０）の１００μｌ培地にプレーティングした。非パルスＴ２細胞を、陰性コントロールとして使用した。５０μｌ／ウェルの希釈ＴＣＢを標的細胞に添加した。続いて、ジャーカット−ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、生存率を評価し、細胞培地に再懸濁し、１００  ０００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）で腫瘍細胞に添加して、５：１の最終エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比および１ウェル当たり２００μｌの最終容積を得た。細胞を、加湿インキュベーターで２０時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、プレートを室温に適応させた（約１５分間）。１２５ｕｌの培地／ウェルを最上部から除去し、２５μｌ／ウェルのＯｎｅ−Ｇｌｏルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ６１２０）を添加および混合した。その後、１００ｕｌ／ウェルの混合物を、９６ウェル平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、＃６５５０９８）に移し、プレートを暗所で１５分間インキュベートしてから、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒを使用して発光を検出した。
【０５４５】
図２３に示されているように、Ａａｌｉ−ＴＣＢ（Ａ）、Ｄａｎｉｅｌ−ＴＣＢ（Ｂ）、およびＥＳＫ１−ＴＣＢ（Ｃ）は、ジャーカットＮＦＡＴレポーター細胞株のより弱い活性化（図２２に示されているより弱い死滅に対応する）、およびさらに１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）（Ｄ）と比較して、ＲＭＦペプチドの認識と他のオフターゲットペプチドの認識との間のより小さなウインドウをもたらした。
【０５４６】
実施例１９
ＮＳＧマウスへの単回注射後のＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９））の薬物動態プロファイル
１ｍｇ／ｋｇの１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）の単一用量を、ヒト化および腫瘍保有ＮＳＧマウスに注射した。マウスに、ヒスチジンバッファーで希釈した２００μｌのＴＣＢをｉ．ｖ．注射した。１時点当たり３匹のマウスを、１０分、６時間、２４時間、７２時間、７日目に出血させた。血清試料中の注射した化合物を、実施例１３に記載されているようにＥＬＩＳＡにより分析した。
【０５４７】
結果（図２４）は、試験したＴＣＢのＰＫ挙動は安定であることを示した。これは、その後の有効性研究では週１回のスケジュールでよいことを示唆した。
【０５４８】
実施例２０
ヒト化マウスのＳＫＭ−１異種移植片におけるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９））の有効性研究
この有効性研究は、完全ヒト化ＮＳＧマウスのヒトＡＭＬ異種移植片（ＳＫＭ−１）における１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）の有効性を評価することが目的だった。実験は、実施例１４に記載されているように実施した。
【０５４９】
図２５は、腫瘍増殖動力学（平均、図２５Ａ）ならびに各群の単一の腫瘍増殖動力学（図２５Ｂ、２５Ｃ）を示す。図示されているように、ＴＣＢは、研究４８日目にＴＧＩが７８の腫瘍増殖阻害を示した（図２５Ｄ）。
【０５５０】
実施例２１
様々な分子形式を有するＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１×ＣＤ３二重特異性抗体（「ＴＣＢ」）の比較
本発明者らは、１１Ｄ０６−ＴＣＢ（Ｖ９）の活性を、「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」形式の類似分子（図１Ａに図示されているような）と比較した。活性を、標的細胞の存在下にて用量依存的な様式でレポーター細胞株（ジャーカットＮＦＡＴ）のＴＣＢ媒介性活性化を検出する、細胞に基づく機能アッセイを使用してモニターした。アッセイは、ＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ複合体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を標的細胞として使用して、本質的に上記の実施例５に記載されているように実施した。ＴＣＢが、標的細胞のＨＬＡ−Ａ０２／ＷＴ１ＲＭＦ  ｐＭＨＣ複合体およびレポーター細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤ３εユニットに同時に結合すると、レポーター細胞活性化が生じ、それによりＣＤ３のハイパークラスタリングがもたらされ、それによりＴＣＲ活性化がもたらされる。対応する細胞内シグナル伝達経路のその後の開始は、転写因子ＮＦＡＴの活性化をもたらし、それによりＮＦＡＴ駆動性ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が誘導される。ルシフェラーゼレポーターの活性を、基質の添加時に発光を読み取ることにより測定する。
【０５５１】
この実験の結果は図２６に示されている。標的依存性レポーター細胞活性化を反映する相対光ユニット（ＲＬＵ、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）が、抗体濃度に対してプロットされている。図２６から理解することができるように、このアッセイでは、「１＋１」形式の分子は、「２＋１」形式よりも低い活性を示した。
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＊  ＊  ＊
【０５５２】
上述の発明は、明瞭な理解のために図示および例を用いてある程度詳細に説明されているが、説明および例は、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。本明細書で引用されているすべての特許および科学的文献の開示は、明示的にその全内容が本明細書に参照により援用される。
【図１Ａ−Ｆ】
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【図１Ｇ−Ｎ】
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【図１Ｏ−Ｖ】
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【図１Ｗ−Ｚ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｇ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｈ】
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【図５Ａ−Ｄ】
2021507698.tif 000032
【図５Ｅ−Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｅ】
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【図６Ｆ−Ｇ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図８Ｄ−Ｆ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図９Ｅ−Ｇ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１Ａ−Ｄ】
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【図１１Ｅ−Ｈ】
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【図１１Ｉ−Ｌ】
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【図１１Ｍ−Ｎ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ−Ｇ】
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【図１４Ａ−Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ−Ｄ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ−Ｄ】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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