(57)【要約】  共有ＨＥＲＶ−Ｋ由来抗原からなるか又はそれらを含む少なくとも１つのペプチド又は前記少なくとも１つのペプチドの発現をインビボで誘導する発現ベクター、及び薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤を含む組成物又はワクチン。そのようなペプチドで治療された患者の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む、又はそのようなペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞を含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
―９〜１００個のアミノ酸残基を有する、２、３、４、５、６、又は７個のペプチドであって、各ペプチドは配列番号１〜７の配列のエピトープの少なくとも１つを含み、そして各ペプチドは他のペプチドに対して少なくとも１つの異なるエピトープを含む前記ペプチド、又は前記２、３、４、５、６、又は７個のペプチドの発現をインビボで誘導する１又は複数の発現ベクター、又は
―９〜１００個のアミノ酸残基を有し、そして配列番号１〜７の配列のエピトープを２、３、４、５、６、又は７個含む少なくとも１つのペプチド、又は前記少なくとも１つのペプチドの発現をインビボで誘導する発現ベクター、及び
薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤
を含む、組成物。
【請求項２】
配列番号１及び／又は６の配列のエピトープを含む１又は複数のペプチドを含むか又は発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
配列番号１〜７の配列のエピトープを含む３、４、５、６、又は７個のペプチドを含むか又は発現する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、９〜１００、７０、５０、４０、３０、２５、又は２０個のアミノ酸残基及び前記配列番号１〜７の配列のエピトープの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
９〜１００、７０、５０、４０、３０、２５、又は２０個のアミノ酸残基の各ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、又は７のうち１つの特定のエピトープを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、前記配列番号１〜７の配列のエピトープの少なくとも１つを含む、ＨＥＲＶ  ｇａｇ又はｐｏｌの９〜１００、７０、５０、４０、３０、２５、又は２０個の連続したアミノ酸残基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドが、前記配列番号１〜７の配列のエピトープの少なくとも１つを含む、ＨＥＲＶ  ｇａｇ又はｐｏｌの１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個の連続したアミノ酸残基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列番号８〜１４からなる群から選択され、そして前記組成物が、それらの２、３、４、５、６、又は７個を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが、９アミノ酸長エピトープを含む、配列番号８〜１４の配列の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８個の連続するアミノ酸残基からなり、そして前記組成物がそれらペプチドの２、３、４、５、６、又は７個を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤、及び好ましくはアジュバントとを含む、ワクチン又は免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドで治療された患者の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、又は請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞、及び薬学的ビヒクルを含む、組成物。
【請求項１２】
癌、特に、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、奇形癌、膀胱癌、肺癌（非小細胞肺癌及び小細胞肺癌）、頭頸部癌、結腸直腸癌、神経膠芽細胞腫、及び白血病の治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
配列番号２〜１４の配列のペプチドからなる群から選択される単離ペプチドであって、前記ペプチドは、１０〜１００、７０、５０、４０、３０、２５、又は２０個のアミノ酸を有し、そして前記配列番号２〜７のペプチドの少なくとも１つを含む、前記単離ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一部の腫瘍サブタイプで共有され、診断、予後予測、及び免疫モニタリング、並びに抗原性組成物、免疫原性組成物、抗癌ワクチン又はＴ細胞に基づく免疫療法に使用できるＨＥＲＶ−Ｋ抗原に由来するエピトープ又はネオエピトープの同定に関する。よって、本発明は、癌及び免疫療法の分野、一又は複数、好ましくはいくつかのこれらのエピトープを含み、診断、予後予測、及び免疫モニタリング、及び癌の治療及び予防において有用なペプチドに基づく抗原性免疫原性組成物の開発、並びに癌の治療及び予防のための１又は複数、好ましくはいくつかのこれらのエピトープを含む免疫原性組成物及びワクチンの開発に関する。あるいは、本発明の組成物は、インビボで前記ペプチドの発現を実行する又はその発現をもたらす１又は複数のベクターを含み、例えば、ベクターは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡベクター、又は細菌若しくはウイルスベクターであり得る。
【背景技術】
【０００２】
ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）は、ヒトゲノムの８％を占めている。それらはおそらく、外因性レトロウイルスの古代の生殖細胞系列感染の残遺物に対応する。ほとんどのＨＥＲＶ遺伝子は、ＤＮＡ組換え、変異、及び欠失のために機能しないが、群特異性抗原（Ｇａｇ）、逆転写酵素を伴うポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、エンベロープ（Ｅｎｖ）表面ユニットなどの機能性タンパク質を生成するものもいる。ＨＥＲＶの発現は、エピジェネティックなメカニズムによって正常細胞で抑制される。
【０００３】
ＨＥＲＶは、「ウイルス模倣」に関連する強力な免疫原性特性を有しており、脱メチル化により一部の固形腫瘍でその発現が増加される。ＨＥＲＶは、挿入変異誘発又は染色体異常への関与によって作用する可能性のある発癌における可能性のある病原体を表すと考えられている。ＨＥＲＶ−Ｋ  ＲｅｃやＮｐ９などの一部のＨＥＲＶタンパク質も、推定癌遺伝子である。
【０００４】
癌におけるＨＥＲＶの発現は、免疫系に対する以下の様々な影響と関連している：
―Ｅｎｖユニットの免疫抑制ドメインを介した免疫調節、
―ＨＥＲＶ  ｄｓＲＮＡによる自然免疫の活性化（先天性Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の誘導）、
―ＨＥＲＶ抗原に対する適応免疫応答の誘導。
【発明の概要】
【０００５】
よって、本発明によれば、単離又は精製ペプチドであって、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、及び／又はＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）からなる群から選択される配列からなるエピトープからなる又はそのようなエピトープを含む前記ペプチド、並びに少なくとも１つのそのようなペプチドを含む組成物、又はインビボで前記少なくとも１つのそのようなペプチドの発現を誘導する発現ベクターを提供する。前記組成物は、適切な液体、バッファー、又はビヒクルをさらに含み得る。ヒトの治療に使用するための前記組成物において、前記組成物は、薬学的に許容されるビヒクル、担体、又は賦形剤をさらに含む。
【０００６】
特に、少なくとも１つのペプチドであって、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、及び／又はＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）からなる群から選択される配列からなるエピトープからなる又はそのようなエピトープを含む前記ペプチド、又はインビボで前記少なくとも１つのペプチドの発現を誘導する発現ベクター、及び薬学的に許容されるビヒクル、担体、又は賦形剤を含む免疫原性組成物を提供する。
【０００７】
少なくとも１つのペプチドであって、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、及び／又はＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）からなる群から選択される配列からなるエピトープからなる又はそのようなエピトープを含む前記ペプチド、又はインビボで前記少なくとも１つのペプチドの発現を誘導する発現ベクター、及び薬学的に許容されるビヒクル、担体、又は賦形剤を含むワクチン又は抗癌ワクチンを提供する。
【０００８】
本発明に係る組成物は、特に以下を含み得る：
９〜１００個のアミノ酸残基を有する、２、３、４、５、６、又は７個のペプチドであって、各ペプチドは配列番号１〜７の配列のエピトープの少なくとも１つ、特に１つを含み、及び各ペプチドは他のペプチドに対して少なくとも１つの異なるエピトープを含む前記ペプチド、又は前記２、３、４、５、６、又は７個のペプチドの発現をインビボで誘導する１又は複数の発現ベクター、又は
９〜１００個のアミノ酸残基を有し、配列番号１〜７の配列のエピトープを２、３、４、５、６、又は７個含む少なくとも１つのペプチド、又は前記少なくとも１つのペプチドの発現をインビボで誘導する発現ベクター。
【０００９】
一実施形態では、本発明に係る組成物は、特に以下を含み得る：
９〜１００個のアミノ酸残基を有する、２、３、４、５、６、又は７個のペプチドであって、１つのペプチドは配列番号１又は６の配列のエピトープを含み、少なくとも１つの別のペプチドは配列番号１〜７の配列の他のエピトープの少なくとも１つを含む少なくとも１つを含み、及び各ペプチドは他のペプチドに対して少なくとも１つの異なるエピトープを含む前記ペプチド、又は
９〜１００個のアミノ酸残基を有し、配列番号１又は６（特に両方）の配列のエピトープを含む配列番号１〜７の配列のエピトープを２、３、４、５、６、又は７個含む、少なくとも１つのペプチド、又は前記少なくとも１つのペプチドの発現をインビボで誘導する発現ベクター。
【００１０】
本明細書で後述されるように、本発明による組成物は、以下の実施形態を含み得る（しかしながら、他の実施形態もまた、他の説明部分から明らかである）：
―前記組成物は、配列番号１〜７の配列の２、３、４、５、６、又は７個のペプチドを含み、又は前記組成物は、これらのペプチドのインビボ発現を含む１又は複数の発現ベクターを含み、一実施形態では、配列番号１又は６の配列のペプチド又はこれら両方ペプチドが存在する又は発現される、
―前記組成物は、９〜１００アミノ酸残基及び少なくとも配列番号１〜７の配列のペプチドを含み、前記ペプチドは、２、３、４、５、６、又は７個の開示されたペプチドを含み得、一実施形態では、前記組成物は、本明細書に開示されるように、ｇａｇ（ギャグ）エピトープ及び／又はｐｏｌ（ポル）エピトープ、又はこれらのｇａｇ及び／又はｐｏｌエピトープの少なくとも２つ又は３つを含み得、又は前記組成物は、この又はこれらのペプチドのインビボ発現を含む一又は複数の発現ベクターを含み、一実施形態では、含まれる又は発現されるペプチドは、配列番号１又は６の配列のペプチド又はこれら両方のペプチドを含む、
―前記組成物は、９〜１００個のアミノ酸残基を有する２、３、４、５、６、又は７個のペプチドを含み、各ペプチドは、配列番号１〜７の配列のエピトープを少なくとも１つ、好ましくは１つ含み、及び各ペプチドは他のペプチドに対して少なくとも１つの異なるエピトープを含む、又は前記組成物は、これらのペプチドのインビボ発現を含む１又は複数の発現ベクターを含み、一実施形態では、配列番号１又は６の配列のペプチド又はこれら両方のペプチドが存在する又は発現される、
―含まれる又は発現される９〜１００個のアミノ酸残基のペプチドは、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６、又は７の１つの特定の（前記組成物において他のペプチドと異なる）エピトープを含む、
―前記含まれる又は発現されるペプチド（１又は複数）は、配列番号１〜７の配列の前記ペプチドの少なくとも１つを含むＨＥＲＶ  ｇａｇ又はｐｏｌの９〜５０個のアミノ酸残基を含む、
―前記組成物は、配列番号８〜１４のペプチドからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、又は７個のペプチドを含む、又は―前記組成物は、この又はこれらのペプチドのインビボ発現を含む１又は複数の発現ベクターを含み、一実施形態では、配列番号８又は１３の配列のペプチド又はこれら両方ペプチドが存在する又は発現される。
【００１１】
配列番号４、２、及び１の配列のエピトープは、ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇに由来する。配列番号５、３、６、及び７の配列のエピトープは、ＨＥＲＶ−Ｋ  ｐｏｌに由来する。これらはＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ａ２エピトープである。一実施形態では、前記組成物は、１つ、２つ、又は３つのＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇエピトープを含む又は発現する。一実施形態では、前記組成物は、１、２、３、又は４つのＨＥＲＶ−Ｋ  ｐｏｌエピトープを含む又は発現する。
【００１２】
前記組成物である本発明に係る免疫原性組成物又はワクチンという観点から、前記含まれる又は発現されるペプチドは、９〜１００、特に９〜７０、又は９〜５０、４０、３０、２５、２０の連続する残基を含み得、好ましくはこれらの残基は、前記エピトープの少なくとも１つを含む、ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇ及び／又はｐｏｌ、より好ましくはネイティブのコンセンサスＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇ及び／又はｐｏｌ配列由来である。前記ペプチドは、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５残基など５０残基未満であり得る。
【００１３】
前記組成物である本発明に係る免疫原性組成物又はワクチン（以下、特に断りのない限り「組成物」とする）は、特にｇａｇ及び／又はｐｏｌ由来のＨＥＲＶ−Ｋのペプチドの２以上、又は特にｇａｇ及び／又はｐｏｌ由来のＨＥＲＶ−Ｋのこれらのペプチドの２以上のインビボ発現を誘導する発現ベクター、若しくは特にｇａｇ及び／又はｐｏｌ由来のＨＥＲＶ−Ｋの（これらのペプチドのうち）異なるペプチドのインビボ発現を誘導するいくつか（２以上）の発現ベクターのそれぞれを含み得る。
【００１４】
一実施形態では、前記ペプチド（９残基以上を有する）は、９アミノ酸長（９−ｍｅｒ）エピトープと、所定の長さのペプチドを形成するＮ末端及び／又はＣ末端に隣接するアミノ酸とを含むネイティブのＨＥＲＶ−Ｋ断片である。一実施形態では、前記ペプチドは、２以上のＨＥＲＶ−Ｋエピトープ（例えば、開示されたエピトープの２、３、４、５、６、又は７個）を含む。
【００１５】
一実施形態では、前記ペプチド（９残基以上を有する）は、９アミノ酸長エピトープと、Ｎ末端及び／又はＣ末端に隣接するアミノ酸と、所定の長さのペプチドを形成する追加の外来アミノ酸とを含むネイティブのＨＥＲＶ−Ｋ断片である。一実施形態では、前記ペプチドは、２以上のＨＥＲＶ−Ｋエピトープ（例えば、開示されたエピトープの２、３、４、５、６、又は７個）を含む。
【００１６】
別の実施形態では、前記組成物に含まれる又は発現されるペプチドのペプチド配列の全部又は一部は、ＨＥＲＶ−Ｋに対して外来性である。本実施形態では、ペプチドは、２個より多いＨＥＲＶ−Ｋエピトープ、例えば、開示されたエピトープの２、３、４、５、６、又は７個を容易に含み得る。前記ペプチドの長さは、エピトープの数、及び可能な追加のアミノ酸を含むのに適している。したがって、前記ペプチドは、９又は１０〜６９ペプチド長又はそれ以上であり得る。
【００１７】
好ましくは、前記組成物は２、３、４、５、６、又は７個の異なるペプチドを含み、又は前記ベクターはそれらペプチドの発現を誘導し、各ペプチドは、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、ＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）からなる群から選択される配列からなる異なるエピトープを含む又はからなる。
【００１８】
一実施形態では、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、ＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）からなる群から選択される配列からなる少なくとも２つの異なるエピトープを含む又はからなる少なくとも１つのペプチドを、前記組成物は含む又は前記ベクターはその発現を誘導する。一実施形態では、前記ペプチドは２、３、４、５、６、又は７個の前記エピトープを含み、前記発現ベクターは、２、３、４、５、６、又は７個の前記エピトープを含むペプチドの発現を誘導する。
【００１９】
同じ患者のインビボでの組成物又は発現産物に異なるエピトープを表すためのいくつかの解決策が存在する。ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、ＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）の前記エピトープの２、３、４、５、６、又は７個が組成物中に存在するか発現するように、前記群の異なるエピトープの１又は複数を含む１又は複数のペプチドを、前記組成物は含み得る又は前記ベクターはその発現を誘導する。
【００２０】
本発明に従って複数のペプチドの発現を誘導する発現ベクターについて述べる場合、いくつかのペプチドの発現を誘導するベクターを含む組成物（ペプチドは、前記群のエピトープを1又は複数、例えば、前記エピトープの２、３、４、５、６、７個を含み得る）、又は少なくとも２つの発現ベクターであって、いくつかのベクターはそれぞれ、少なくとも１つのペプチドの発現を誘導する。一実施形態では、前記組成物は、１個のベクター又はいくつかのベクターを含み、前記ベクターは、１又は複数のペプチド及び２、３、４、５、６、又は７個の前記エピトープの発現を誘導する。
【００２１】
本発明に係るエピトープ及び他のｇａｇ又はｐｏｌアミノ酸残基を含む単離又は精製２９アミノ酸長（２９−ｍｅｒ）ペプチドの例は以下である：
ＫＳＫＩＫＳＫＹＡＳＹＬＳＦＩＫＩＬＬＫＲＧＧＶＫＶＳＴＫ（配列番号８）、
ＴＬＬＤＳＩＡＨＧＨＲＬＩＰＹＤＷＥＩＬＡＫＳＳＬＳＰＳＱ（配列番号９）、
ＬＡＫＳＳＬＳＰＳＱＦＬＱＦＫＴＷＷＩＤＧＶＱＥＱＶＲＲＮ（配列番号１０）、
ＧＰＬＱＰＧＬＰＳＰＡＭＩＰＫＤＷＰＬＬＩＩＩＤＬＫＤＣＦ（配列番号１１）、
ＫＬＩＤＣＹＴＦＬＱＡＥＶＡＮＡＧＬＡＩＡＳＤＫＩＱＴＳＴ（配列番号１２）、
ＷＩＲＰＴＬＧＩＰＴＹＡＭＳＮＬＦＳＩＬＲＧＤＳＤＬＮＳＫ（配列番号１３）、及び
ＲＤＶＥＴＡＬＩＫＹＳＭＤＤＱＬＮＱＬＦＮＬＬＱＱＴＶＲＫ（配列番号１４）。
これらの単離又は精製２９アミノ酸長ペプチド又は断片、又は２８〜１０個のアミノ酸残基は、９アミノ酸長エピトープを含み、単離又は精製形態であり、それぞれ本発明の目的である。前記ペプチドの長さは、９アミノ酸長エピトープを含む、配列番号８〜１４の配列の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８残基など、２９残基未満であり得る。興味深いことに、前記エピトープに付加されたアミノ酸配列は、配列番号８〜１４のペプチドの場合のように、他の潜在的なＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔエピトープを含み得る。本発明は、本明細書に開示されるようなエピトープ及びＣ末端及び／又はＮ末端に「さらなるアミノ酸」を含むペプチドを提供する。これらのさらなるアミノ酸は、配列番号１〜１６の配列と共に本明細書に開示されるようなｇａｇ又はｐｏｌ配列であり得る。しかしながら、本発明は、これらのｇａｇ／ｐｏｌ配列内のこれらの「さらなるアミノ酸」のレベルでのアミノ酸のバリエーションを包含する。よって、本発明は、配列番号１〜１６の配列を含むそれらの配列を包含し、さらなるアミノ酸配列は、それらのｇａｇ／ｐｏｌ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性（％）を有する。
【００２２】
一実施形態では、本発明の組成物は、配列番号８、配列番号１３のペプチド、又は配列番号８及び１３の両方のペプチド、及び配列番号８〜１４の他のペプチドの１、２、３、４、又は５つを含む又は発現する。
【００２３】
一実施形態では、前記組成物はさらにアジュバントを含む。
【００２４】
単離又は精製形態のペプチドＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）は、本発明の目的である。
【００２５】
単離又は精製形態のペプチドＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）は、本発明の目的である。
【００２６】
単離又は精製形態のペプチドＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）は、本発明の目的である。
【００２７】
単離又は精製形態のペプチドＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）は、本発明の目的である。
【００２８】
単離又は精製形態のペプチドＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）は、本発明の目的である。
【００２９】
単離又は精製形態のペプチドＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）は、本発明の目的である。
【００３０】
単離又は精製形態の配列番号１〜７の前記ペプチドの少なくとも１つを含む１０〜１００個のアミノ酸のペプチドは、本発明の目的である。
【００３１】
ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、及びＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）のエピトープのうち２、３、４、５、６、又は７個を含む、単離又は精製形態のペプチドは、本発明の目的である。前記ペプチドは、好ましくはＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）及び／又はＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）からなる。
【００３２】
一実施形態では、このペプチドは、上記エピトープの少なくとも１つを含む、好ましくはＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇ及び／又はｐｏｌ、より好ましくはネイティブのコンセンサスＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇ及び／又はｐｏｌ配列の、９〜１００、特に９〜７０、又は９〜５０、４０、３０、２５、２０、さらには１０〜３０、１２〜２５、好ましくは１４〜１８、例えば１４、１５、１６、１７、又は１８個の連続する残基を含み得、配列番号１〜７の配列の対応するエピトープ以外のアミノ酸は、本明細書に開示されるＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇ又はｐｏｌに存在するネイティブのアミノ酸であり、前記エピトープの５’、３’、又は５’及び３’に延びる。前記ペプチドは、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５残基、典型的には１４、１５、１６、１７、又は１８残基など５０残基未満であり得る。本発明の別の目的は、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、ＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号）、及びそれらの配列の少なくとも２つ（特にそれらの２、３、４、５、６、又は７個）からなる群から選択されるアミノ酸をコードする核酸、及び患者において核酸（ポリヌクレオチド）のインビボ発現に至るために必要な要素を含む発現ベクターである。
【００３３】
３個のｇａｇエピトープを含むＨＥＲＶＫ−ｇａｇポリペプチドの例：
ＭＧＱＴＫＳＫＩＫＳＫＹＡＳＹＬＳＦＩＫＩＬＬＫＲＧＧＶＫＶＳＴＫＮＬＩＫＬＦＱＩＩＥＱＦＣＰＷＦＰＥＱＧＴＬＤＬＫＤＷＳＱＫＥＴＥＧＬＨＣＥＹＶＡＥＰＶＭＡＱＳＴＱＮＶＤＹＮＱＬＱＥＶＩＹＰＥＴＬＫＬＥＥＳＫＰＲＧＴＳＰＬＰＡＧＱＶＰＶＴＬＱＰＱＫＱＶＫＥＮＫＴＱＰＰＶＡＹＱＹＷＰＰＡＥＬＱＹＲＰＰＰＥＳＱＹＧＹＰＧＭＰＰＡＰＱＧＲＡＰＹＰＱＰＰＴＲＲＬＮＰＴＡＰＰＳＲＱＧＳＫＬＨＥＩＡＱＥＧＥＰＰＴＶＥＡＲＹＫＳＦＳＩＫＫＬＫＤＭＫＥＧＶＫＱＹＧＰＮＳＰＹＭＲＴＬＬＤＳＩＡＨＧＨＲＬＩＰＹＤＷＥＩＬＡＫＳＳＬＳＰＳＱＦＬＱＦＫＴＷＷＩＤＧＶＱＥＱＶＲＲＮＲＡＡＮＰＰＶＮＩＤＡＤＱＬＬＧＩＧＱＮＷＳＴＩＳＱＱＡＬＭＱＮＥＡＩＥＱＶＲＡＩＣＬＲＡＷＥＫＩＱＤＰＳＫＥＰＹＰＤＦＶＡＲＬＱＤＶＡＱＫＳＩＡＤＥＫＡＲＫＶＩＶＥＬＭＡＹＥＮＡＮＰＥＣＱＳＡＩＫＰＬＫＧＫＶＰＡＧＳＤＶＩＳＥＹＶＫＡＣＤＧＩＧＧＡＭＨＫＡＭＬＭＡＱＡＩＴＧＶＶＬＧＧＱＶＲＴＦＧＲＫＣＹＮＣＧＱＩＧＨＬＫＫＮＣＰＶＬＮＫＱＮＩＴＩＱＡＴＴＴＧＲＥＰＰＤＬＣＮＥＱＲＧＱＰＱＡＰＱＱＴＧＡＦＰＩＱＰＦＶＰＱＧＦＱＧＱＱＰＰＬＳＱＶＦＱＧＩＳＱＬＰＱＹＮＮＣＰＰＰ（配列番号１５）。
【００３４】
４個のｐｏｌエピトープを含むＨＥＲＶＫ−ｐｏｌポリペプチドの例：
ＮＫＳＲＫＲＲＮＲＥＳＬＬＧＡＡＴＶＥＰＰＫＰＩＰＬＴＷＫＴＥＫＰＶＷＶＮＱＷＰＬＰＫＱＫＬＥＡＬＨＬＬＡＮＥＱＬＥＫＧＨＩＥＰＳＦＳＰＷＮＳＰＶＦＶＩＱＫＫＳＧＫＷＲＭＬＴＤＬＲＡＶＮＡＶＩＱＰＭＧＰＬＱＰＧＬＰＳＰＡＭＩＰＫＤＷＰＬＩＩＩＤＬＫＤＣＦＦＴＩＰＬＡＥＱＤＣＥＫＦＡＦＴＩＰＡＩＮＮＫＥＰＡＴＲＦＱＷＫＶＬＰＱＧＭＬＮＳＰＴＩＣＱＴＦＶＧＲＡＬＱＰＶＲＥＫＦＳＤＣＹＩＩＨＣＩＤＤＩＬＣＡＡＥＴＫＤＫＬＩＤＣＹＴＦＬＱＡＥＶＡＮＡＧＬＡＩＡＳＤＫＩＱＴＳＴＰＦＨＹＬＧＭＱＩＥＮＲＫＩＫＰＱＫＩＥＩＲＫＤＴＬＫＴＬＮＤＦＱＫＬＬＧＤＩＮＷＩＲＰＴＬＧＩＰＴＹＡＭＳＮＬＦＳＩＬＲＧＤＳＤＬＮＳＫＲＭＬＴＰＥＡＴＫＥＩＫＬＶＥＥＫＩＱＳＡＱＩＮＲＩＤＰＬＡＰＬＱＬＬＩＦＡＴＡＨＳＰＴＧＩＩＩＱＮＴＤＬＶＥＷＳＦＬＰＨＳＴＶＫＴＦＴＬＹＬＤＱＩＡＴＬＩＧＱＴＲＬＲＩＩＫＬＣＧＮＤＰＤＫＩＶＶＬＴＫＥＱＶＲＱＡＦＩＮＳＧＡＷＫＩＧＬＡＮＦＶＧＩＩＤＮＨＹＰＫＴＫＩＦＱＦＬＫＬＴＴＷＩＬＰＫＩＴＲＲＥＰＬＥＮＡＬＴＶＦＴＤＧＳＳＮＧＫＡＡＹＴＧＰＫＥＲＶＩＫＴＰＹＱＳＡＱＲＡＥＬＶＡＶＩＴＶＬＱＤＦＤＱＰＩＮＩＩＳＤＳＡＹＶＶＱＡＴＲＤＶＥＴＡＬＩＫＹＳＭＤＤＱＬＮＱＬＦＮＬＬＱＱＴＶＲＫＲＮＦＰＦＹＩＴＨＩＲＡＨＴＮＬＰＧＰＬＴＫＡＮＥＱＡＤＬＬＶＳＳＡＬＩＫＡＱＥＬＨＡＬＴＨＶＮＡＡＧＬＫＮＫＦＤＶＴＷＫＱＡＫＤＩＶＱＨＣＴＱＣＱＶＬＨＬＰＴＱＥＡＧＶＮＰＲＧＬＣＰＮＡＬＷＱＭＤＶＴＨＶＰＳＦＧＲＬＳＹＶＨＶＴＶＤＴＹＳＨＦＩＷＡＴＣＱＳＴＳＨＶＫＫＨＬＬＳＣＦＡＶＭＧＶＰＥＫＩＫＴＤＮＧＰＧＹＣＳＫＡＦＱＫＦＬＳＱＷＫＩＳＨＴＴＧＩＰＹＮＳＱＧＱＡＩＶＥＲＴＮＲＴＬＫＴＱＬＶＫＱＫＥＧＧＤＳＫＣＴＴＰＱＭＱＬＮＬＡＬＹＴＬＮＦＬＮＩＹＲＮＱＴＴＴＳＡＥＱＨＬＴＧＫＫＳＰＧＥＮＱＬＰＶＷＩＰＴＲＨＬＫＦＹＮＥＰＩＲＤＡＫＫＳＴＳＡ（配列番号１６）。
【００３５】
配列番号１５及び１６の単離又は精製ポリペプチドは、本明細書で定義され、配列番号１５及び／又は配列番号１６のポリペプチドを含む又は発現する組成物、免疫原性組成物、及び抗癌ワクチンと同様に、本発明の目的である。
【００３６】
一実施形態では、前記発現ベクターは、９〜１００、特に９〜７０、又は９〜５０、４０、３０、２５、２０個のアミノ酸ペプチドをコードする核酸（前記コードされたペプチドは、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５残基など５０残基未満であり得る）を含み、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、ＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）の群から選択されるエピトープ、及び患者における核酸（ポリヌクレオチド）のインビボ発現に必要な要素を含む。上記のように、前記ベクターが、２、３、４、５、６、又は７個のエピトープ含有ペプチドの発現を誘導する又は２、３、４、５、６、又は７個の前記エピトープを含むペプチドの発現を誘導するように、前記ベクターは、核酸配列を含み得る。また上記のように、前記ベクターは、これらのエピトープの１つ又はいくつかを含むペプチドをコードする核酸、及び関連するエピトープに加えてアミノ酸残基を含み得、追加の残基は、ｐｏｌ又はｇａｇに由来するか、ｇａｇ又はｐｏｌに対して外来性であり得る。
【００３７】
前記発現コンストラクト又はベクターは、細菌発現コンストラクト、ＤＮＡ又はＲＮＡ発現コンストラクト、又はウイルス発現コンストラクトなどの非ウイルス発現コンストラクトであり得る。前記発現コンストラクトは、抗原提示細胞に位置し得る。前記コンストラクトは、発現コンストラクトの細胞のゲノムへの統合をもたらす可能性がある。
【００３８】
本発明はまた、癌の治療に使用するためのこれらの組成物に関する。この使用に関係する癌が、特に（限定されないが）以下の癌から選択され得る：トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、奇形癌、膀胱癌、肺癌（非小細胞肺癌及び小細胞肺癌）、頭頸部癌、結腸直腸癌、神経膠芽細胞腫、及び白血病であり、例えば、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、奇形癌、膀胱癌、及び白血病。
【００３９】
前記使用は、患者、例えば乳癌患者において、Ｔ細胞応答、Ｂ細胞応答、又はその両方を活性化することを目的とし得る。
【００４０】
本発明はまた、本明細書に開示されるような癌を治療するための免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、本明細書に開示されるような１つの９アミノ酸長エピトープ又はいくつかの９アミノ酸長エピトープ、本明細書に開示される１つ又はいくつかのペプチド、本明細書に開示される１つの発現ベクター又はいくつかの発現ベクター、又は本明細書に開示される組成物の使用に関する。
【００４１】
本発明の別の目的は、癌を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されるような治療有効量の免疫原性組成物又はワクチンを投与することを含む、前記方法である。上述のように、前記組成物は、１又は複数のペプチド、又は１又は複数の発現ベクター若しくはコンストラクトを含み得る。前記方法は、前記ワクチンを２回以上投与することを含み得る。投与されるペプチドの１日治療有効量（本発明によるペプチドの総量）は、０．０１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲内、０．０２５ｍｇ〜５．０ｍｇの範囲内、又は０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇの範囲内であり得る。
【００４２】
本発明の別の目的は、患者の癌を治療するための方法であって、（ａ）癌治療を必要とする患者の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を本発明による組成物又は免疫原性組成物と接触させること、及び（ｂ）工程（ａ）の治療有効量のＣＴＬを患者に投与すること、を含む前記方法である。前記方法は、投与前にエクスビボ又はインビボの方法によって前記ＣＴＬを増殖させることをさらに含み得る。接触させることは、本発明のペプチドをロードした抗原提示細胞を提供すること、又は発現コンストラクトら前記ペプチド又はポリペプチドを発現させることを含み得る。治療効果を提供するために必要な治療有効量のＣＴＬ細胞は前記対象の体重１キログラムあたり約０．１×１０4〜約５×１０9個の細胞であり得る。前記方法は、工程（ｂ）を２回以上行うことを含み得る。
【００４３】
本発明はまた、癌治療を必要とする患者の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を本発明に係る組成物又は免疫原性組成物と接触させること、及び場合によっては前記ＣＴＬをエクスビボで増殖させることを含む、ＣＴＬを調製する方法に関する。接触させることは、本発明のペプチドをロードした抗原提示細胞を提供すること、又は発現コンストラクトら前記ペプチド又はポリペプチドを発現させることを含み得る。
【００４４】
上記のように調製された、薬学的ビヒクル中にそのようなＣＴＬを含む組成物もまた、本発明の目的である。
【００４５】
本発明の別の目的は、本発明からのエピトープペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞及び薬学的ビヒクル中にそのようなＴ細胞を含む組成物である。これらのＴ細胞を調製するプロセスは、当業者に公知である。それは以下のようになり得る（そしてそのプロセスも本発明の目的である）：（ｉ）ＴＣＲα及びβ鎖は、本発明のエピトープペプチドを認識するＴ細胞から単離され、ベクター（レンチウイルス又はレトロウイルスなど）に挿入される、（ｉｉ）患者又はドナーの末梢血から分離されたＴ細胞は、このようなベクター（レンチウイルスやレトロウイルスなど）で修飾され、目的のＴＣＲαβ配列をコードする、（ｉｉｉ）次に、これらの修飾Ｔ細胞をインビトロで増殖させて、治療に充分な数を取得し、患者に投与する。注目すべきことに、ＴＣＲ配列は、ＴＣＲ親和性を最適化するために変更してもよい。これらのＴ細胞の使用方法、例えば癌の治療は、本発明の別の目的であり、それを必要とする対象に効率的な量のそれらのＴ細胞を投与することを含む。治療効果を提供するために必要な治療有効量のＴ細胞は、前記対象の体重１キログラムあたり約０．１×１０4〜約５×１０9個の細胞であり得る。
【００４６】
一実施形態では、前記癌は、トリプルネガティブ乳癌、その他の乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、奇形癌、膀胱癌、肺癌（非小細胞肺癌及び小細胞肺癌）、頭頸部癌、結腸直腸癌、神経膠芽細胞腫、及び白血病であり、例えば、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、奇形癌、膀胱癌、及び白血病である。
【００４７】
本明細書に開示されるように作製又は前記エピトープを含む抗原はまた、抗ＨＥＲＶ−Ｋ抗体を生成し、ＨＥＲＶ−Ｋ+癌患者における抗ＨＥＲＶ−Ｋ抗体の存在を検出するために使用され得る。
【００４８】
本発明によるエピトープ及び少なくとも１つの抗原ペプチドを含む組成物は、診断、予後予測、又は免疫モニタリング法において使用され得る。特に、本発明はまた、患者における免疫応答の免疫モニタリングのための方法に関する。免疫療法（前記エピトープ又は本発明の組成物を使用するワクチン、又は適応抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導する任意の他の免疫療法）後の抗腫瘍適応応答の誘導は、本発明のＨＥＲＶエピトープに対する特定のＴ細胞応答の測定によって評価される。測定は、例えば、本発明に記載のエピトープを含むマルチマーを使用することにより、直接又は本発明に記載のペプチドによるエクスビボ刺激の後に実施され得る。Ｔ細胞応答の測定はまた、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）、又は他の方法を使用して特定のＴ細胞活性化を検出することにより、本発明のペプチドによるエクスビボ刺激後に実施され得る。
【００４９】
一実施形態では、生体試料は、血液、腫瘍からの循環細胞又はリンパ球を含む血液誘導体である。好ましくは、前記方法は、血液中の一部かのリンパ球が、インビトロ刺激時に目的のペプチドを特異的に認識し、及び／又は特異的に再活性化できることを決定することを含む。
【００５０】
当業者は、腫瘍関連ペプチドに対する免疫応答が生成されたかどうかを決定するための様々なアッセイを知っているであろう。「免疫応答」という語句には、細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の両方が含まれる。ＥＬＩＳＡ、クロム放出アッセイなどの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用した増殖アッセイ、テトラマーアッセイ、サイトカイン産生アッセイなど、様々なＢリンパ球及びＴリンパ球アッセイが周知である。参照により本明細書に援用されるＢｅｎｊａｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）を参照。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明者らは、ＨＥＲＶ配列をヒトゲノムに局在化し、ＨＥＲＶのＲＮＡｓｅｑ分析を開発した。公開データベースの８４個の乳癌（４２個のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）及び４２個のＥＲ+サブタイプ）のＲＮＡｓｅｑデータを使用して、この発現を正常な乳房組織試料（５１個は腫瘍周囲領域から、５個は乳房縮小術試料から）のＲＮＡｓｅｑと比較した。１９個のＨＥＲＶはＴＮＢＣで特異的に過剰発現しており、その大部分はＨＥＲＶ−Ｋファミリーに属している。
【００５２】
多重成分分析は、ＨＥＲＶを使用してトリプルネガティブサブタイプを特徴付けることができることを示した。ＨＥＲＶの発現は、ＴＮＢＣのＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）の上昇及びＴＲＩＭ２８のレベルの低下に関連しており、これらはＨＥＲＶの転写をそれぞれ正と負に調節する２つの因子である。ＥＭＴシグネチャーとの関係も観察された。これは、ＴＮＢＣの幹細胞性機能に関連している可能性がある。興味深いことに、ＨＥＲＶの発現は、Ｔ細胞及び細胞傷害性リンパ球のトランスクリプトームシグネチャーと有意に相関した。これは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答及び抗原提示細胞シグネチャーの存在によって説明され得る。エフェクターＴ細胞シグネチャーは、免疫調節シグネチャー（負の免疫チェックポイント及びＩＤＯ１／２を含む）とサプレッサー細胞（制御性Ｔ細胞及びＭＤＳＣを含む）とによって相殺された。
【００５３】
ＨＥＲＶの多型は、特定のＨＥＲＶ抗原に対するＴ細胞応答を特徴付ける、又は癌ワクチン接種の戦略でそれらを使用するための主な障害と見なされることがよくある。ＴＮＢＣを特徴付ける限られた数のＨＥＲＶの特異的発現に基づいて、ＴＮＢＣで発現する異なるＨＥＲＶ間で共有されるＧａｇ（ギャグ）タンパク質及びＰｏｌ（ポル）タンパク質内の共通領域を同定し、これらのドメインに存在するＴ細胞エピトープを決定できる可能性があるという仮説が立てた。ＴＮＢＣで過剰発現し、各タンパク質のインタクトなＯＲＦを含むいくつかのＨＥＲＶ−ＫのＧａｇ及びＰｏｌの共通領域が効果的に見つかった。興味深いことに、これらの共有ドメインには、様々なエピトープ予測ツール（ＮｅｔＭＨＣ  Ｉ及びＩＩを含む）を使用して、最も高頻度なＭＨＣクラスＩ及びＩＩ対立遺伝子の潜在的な強力なエピトープバインダーが豊富ないくつかの領域が含まれる。
【００５４】
予測されたＨＬＡ−Ａ２エピトープに対応する９アミノ酸長ペプチドを合成し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激して目的のペプチドに対して特異的応答を誘導することからなる、インビトロプロトコルに使用した。特定のＣＤ８+Ｔ細胞の存在はマルチマー染色によって評価し、機能的応答（ＩＦＮ−γ産生及び脱顆粒）は同族ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対してさらに評価したところ、本発明に従って作製されたＨＥＲＶペプチドに対するＣＤ８+Ｔ細胞の特異的活性化が見られた。さらに、ＨＥＲＶ発現腫瘍細胞株に対するＨＥＲＶ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞傷害性は、ペプチド配列番号１に特異的なＣＤ８+Ｔ細胞を使用して実証され、これらのペプチドによって生成されたＴ細胞の機能的抗腫瘍特性を確認した。
【００５５】
腫瘍細胞におけるＨＥＲＶ発現の増強と得られた結果を考慮すると、以下の結論となり得る。
―ＨＥＲＶは腫瘍で優先的に発現し、１９のＨＥＲＶサブタイプがトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を特徴付け、そのほとんどがＨＥＲＶ−Ｋファミリーに属している。
―Ｔ細胞エピトープを含む一般的な配列は、これらの１９のＨＥＲＶサブタイプ間に見られる。
―以下の７つの９アミノ酸長ペプチドが強力なＨＬＡ−Ａ２バインダーとして同定され、同族ペプチドでパルスされたＴ２細胞又はＨＥＲＶ発現腫瘍細胞株に対して特異的な細胞傷害性応答を伴う特定のＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘発することができた：ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、ＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）。
―ＨＥＲＶ産物は、機能的なＴ細胞応答を誘導可能なこのように共有される腫瘍抗原を表している。ＨＥＲＶ由来の腫瘍抗原は、癌ワクチンの開発や適応免疫応答のモニタリングに使用され得る。
【００５６】
定義
「単離（した／された）」、「精製（した／された）」、又は「生物学的に純粋な」という語句は、ネイティブ状態で見られるように通常材料に付随する成分を実質的又は本質的に含まない材料を指す。したがって、本発明による単離ペプチドは、好ましくは、それらのインサイチュ環境においてペプチドに通常関連する材料を含まない。
【００５７】
「主要組織適合遺伝子複合体」又は「ＭＨＣ」は、生理学的免疫応答に関与する細胞相互作用の制御に役割を果たす遺伝子のクラスターである。ヒトでは、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ複合体としても知られている。ＭＨＣ複合体及びＨＬＡ複合体の詳細な説明について。
【００５８】
「ヒト白血球抗原」又は「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩ又はクラスＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質である。
【００５９】
「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という語句は、ヒトに投与された場合にアレルギー又は同様の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。有効成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当技術分野でよく理解されている。典型的には、そのような組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、薬学的に許容される通常のビヒクル、賦形剤、又は担体を注射可能に調製され、注射前の液体への溶解または液体への懸濁に適した固体形態にも調製され得る。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ビヒクル、賦形剤、担体」には、任意の全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。
【００６１】
「免疫原性ペプチド」は、ペプチドが患者の免疫系に提示されると、体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発する可能性があり、この応答は免疫原性であるが、必ずしも保護的（防御的）ではないことを意味する。これは「免疫原性組成物」に適用される。
【００６２】
「免疫原性応答」は、感染性病原体又は腫瘍抗原に由来する抗原に対するＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を指す。免疫応答には、ヘルパーＴ細胞の刺激によって促進された抗体応答も含まれる場合がある。
【００６３】
特に、免疫原性組成物は、組成物中に存在するＨＥＲＶペプチドに対して、及び／又は腫瘍細胞で発現される同様のエピトープを含むＨＥＲＶペプチド又はポリペプチドに対して、ＣＤ８+Ｔ細胞のインビボ活性化を誘導し得る。
【００６４】
「ワクチン組成物」又は「ワクチンペプチド」は、患者に投与され、それぞれ患者の免疫系に提示されると、組成物又はペプチドが、体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘導し得、この免疫応答が保護的（防御的）であることを意味する。
【００６５】
「保護（protective）免疫応答」は、感染性病原体又は腫瘍抗原に由来する抗原に対するＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を指し、これは、疾患の症状又は進行を予防するか、又は少なくとも部分的に阻止する。免疫応答には、ヘルパーＴ細胞の刺激によって促進された抗体応答も含まれる場合がある。
【００６６】
「免疫原性」とは、ペプチド又はエピトープが患者、特に患者の血液、組織、又は臓器に存在すると、体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発できることを意味する。
【００６７】
組成物又はベクターが「発現を誘導する」とは、ペプチドをコードする、核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む１又は複数の発現ベクターを含むことを意味する。前記ベクターは、特に、ＲＮＡベクター、ＤＮＡベクター若しくはプラスミド、ウイルスベクター、又は細菌ベクターであり得る。ベクターの性質に応じて、そして当業者に周知のように、発現カセットの宿主細胞ゲノムへの組み込みがあり得るか、または組み込みがあり得ない。発現ベクター又は発現カセットは、患者における核酸（ポリヌクレオチド）のインビボ発現に必要な要素をさらに含み得る。最低限として、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン、及びプロモーター、並びにプラスミドやポックスウイルス以外のウイルスベクターなどの特定のベクターのポリアデニル化配列からなる。ＡＴＧはリーディングフレームの５’に配置され、終止コドンは３’に配置される。周知のように、発現を制御することを可能にする他の要素、例えば、エンハンサー配列、安定化配列、及びペプチドの分泌を可能にするシグナル配列が存在し得る。
【００６８】
タンパク質又はペプチドは、標準的な分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現、天然源からのタンパク質又はペプチドの単離、又はタンパク質又はペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技術によって作製され得る。合成ペプチドは通常約３５残基の長さであり、これはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）から入手可能な自動ペプチド合成装置のおおよその長さの上限である。より長いペプチドもまた、例えば、組換え手段によって調製され得る。
【００６９】
「ペプチドエピトープ」又は「エピトープ」は、ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を誘導するような対立遺伝子特異的モチーフ又はスーパーモチーフを含むペプチドである。したがって、少なくとも１つの「ペプチドエピトープ」を含む本発明の免疫原性又はワクチン用ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し、その後、免疫原性又はワクチン用ペプチドが由来する抗原に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答又はヘルパーＴ細胞応答を誘導することができる。
【００７０】
本発明のペプチドは、置換、挿入、又は欠失バリアントなどのアミノ酸配列バリアントをさらに使用し得ることが企図される。欠失バリアントは、ネイティブのタンパク質の１又は複数の残基を欠失している。挿入バリアントは、通常、ポリペプチドの非末端点での物質の付加を伴う。置換は、既存のアミノ酸への変更である。これらの配列バリアントは、トランケーション（短縮化）、点突然変異、及びフレームシフト突然変異を生成する可能性がある。当業者に公知のように、合成ペプチドは、これらの突然変異によって生成され得る。
【００７１】
アミノ酸配列バリアントは、追加のＮ末端又はＣ末端アミノ酸などの追加の残基を含み得るが、それでも、配列が生物学的活性の維持を含む上記の基準を満たしている限り、本質的に本明細書に開示される配列の１つに記載されている通りであることが理解されよう。
【００７２】
以下は、本発明のペプチド又はタンパク質などのタンパク質のアミノ酸を変更して、変異、短縮、又は修飾されたタンパク質を作製することに基づく検討である。例えば、特定のアミノ酸は、腫瘍関連ペプチド又はタンパク質の他のアミノ酸と置換され、より大きなＣＴＬ免疫応答をもたらし得る。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力及び性質であるため、特定のアミノ酸置換をタンパク質配列及びその基礎となる核酸コード配列で行うことができ、それによって変異、短縮、又は修飾タンパク質を産生する。
【００７３】
このような変化を作製する際に、アミノ酸の親水性・疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の親水性・疎水性指標の重要性は、当技術分野で通常理解されている。アミノ酸の相対的な親水性・疎水性特性が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、それが次に、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが認められている。
【００７４】
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることも当技術分野で理解されている。本明細書に参照として援用される米国特許第４，５５４，１０１号には、隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大の局所平均親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関することが記載されている。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：塩基性アミノ酸：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、及びヒスチジン（−０．５）；酸性アミノ酸：アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、アスパラギン（＋０．２）、及びグルタミン（＋０．２）；親水性非イオン性アミノ酸：セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、及びスレオニン（−０．４）；硫黄含有アミノ酸：システイン（−１．０）及びメチオニン（−１．３）；疎水性非芳香族アミノ酸：バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、及びグリシン（０）；疎水性芳香族アミノ酸：トリプトファン（−３．４）、フェニルアラニン（−２．５）、及びチロシン（−２．３）。
【００７５】
アミノ酸は、同様の親水性を有する別のものと置換することができ、生物学的又は免疫学的に修飾されたタンパク質を産生できることが理解される。そのような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【００７６】
上で概説したように、アミノ酸置換は、通常、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の様々な特性を考慮に入れる例示的な置換は、当業者に周知であり、以下を含む：アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン、及びイソロイシン。
【００７７】
その他の構成要素
本発明の他の実施形態では、前記組成物は、追加の免疫刺激剤又はそのような薬剤をコードする核酸を含み得る。免疫刺激剤には、追加の抗原、免疫調節剤、抗原提示細胞、又はアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、１又は複数の追加の薬剤がペプチドに共有結合している。キトサンを含む多糖類などの他の免疫増強化合物もまた、本発明の組成物と共に使用することが企図されている。複数の（２以上の）エピトープ又はペプチドは、互いに架橋され得る（例えば、重合され得る）。
【００７８】
免疫化又はワクチン接種のための小さなペプチドの使用はまた、典型的には、最終産物又は標的ペプチド若しくはエピトープに免疫原性又は最強の免疫原性を与える担体ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質へのペプチドの結合を必要とし得る。よって、本発明の一実施形態では、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、及びＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）から選択される各ペプチドは、本発明の結合産物又はペプチドに免疫原性又は最強の免疫原性を付与するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質（追加のアミノ酸残基）に結合又はペプチド結合を介して結合される。
【００７９】
一実施形態では、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、及び／又はＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）のペプチド又はエピトープは、より長いペプチド又はポリペプチド、特にＨＥＲＶ−Ｋペプチド又はポリペプチドに存在し、好ましくは、エピトープが由来するＨＥＲＶ−Ｋにおけるエピトープを含む天然のより長いペプチド又はポリペプチドである。したがって、より長い配列は、例として、配列番号８〜１４の配列で提示される。バリアントでは、いくつかのエピトープが同じ長いペプチドの一部である。それらのより長いペプチドを、結合した最終産物に免疫原性又は最強の免疫原性を付与するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に結合させることも本発明に包含される。
【００８０】
本発明に係る免疫原性組成物又はワクチンにおいて、それに含まれる、又はベクターによって発現されるペプチドは、免疫原性であるか、又は保護（防御）免疫応答を誘導することができる。
【００８１】
前記組成物又はペプチド若しくはエピトープが、免疫モニタリングなどの診断またはアッセイの目的で使用される場合、前記ペプチド若しくはエピトープは抗原性であり得る。よって、前記組成物の一実施形態では、ＦＬＱＦＫＴＷＷＩ（配列番号１）、ＲＬＩＰＹＤＷＥＩ（配列番号２）、ＫＬＩＤＣＹＴＦＬ（配列番号３）、ＹＬＳＦＩＫＩＬＬ（配列番号４）、ＡＭＩＰＫＤＷＰＬ（配列番号５）、ＹＡＭＳＮＬＦＳＩ（配列番号６）、及び／又はＳＭＤＤＱＬＮＱＬ（配列番号７）のペプチド若しくはエピトープ、又はそのようなエピトープを含むペプチド若しくはエピトープは、抗原性である。抗原性ペプチド又はエピトープは、本明細書に開示されるように、非結合形態（エピトープ配列配列番号１〜７からなる）であり得るか、又はペプチド若しくはポリペプチド部分に結合され得る。
【００８２】
当業者は、腫瘍関連ペプチドに対する免疫応答が生成されたかどうかを決定するための様々なアッセイを知っているであろう。「免疫応答」という語句には、細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の両方が含まれる。ＥＬＩＳＡ、クロム放出アッセイなどの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用した増殖アッセイ、テトラマーアッセイ、サイトカイン産生アッセイなど、様々なＢリンパ球及びＴリンパ球アッセイが周知である。参照により本明細書に援用されるＢｅｎｊａｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）を参照。
【００８３】
アジュバント
当技術分野でも周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって増強されてもよい。一部のアジュバントは、抗原の提示方法に影響を与える。例えば、タンパク質抗原がミョウバンによって沈殿すると、免疫応答が増加する。抗原の乳化はまた、抗原提示の期間を延長する。適切な分子アジュバントには、サイトカイン、毒素、又は合成組成物などの全ての許容可能な免疫刺激化合物が含まれる。
【００８４】
例示的な、しばしば好ましいアジュバントには、完全フロイントアジュバント（死滅結核菌を含む免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロイントアジュバント、及び水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。使用され得る他のアジュバントには、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ−ＭＤＰ及びｎｏｒ−ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、及びモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が挙げられる。細菌から抽出された３つの成分、ＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョンに含むＲＩＢＩも検討される。ＭＨＣ抗原を使用することも可能である。
【００８５】
一態様では、アジュバント効果は、リン酸緩衝生理食塩水中の約０．０５〜約０．１％の溶液で使用されるミョウバンなどの薬剤の使用によって達成される。あるいは、前記抗原は、約０．２５％の溶液として使用される糖の合成ポリマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物として作製される。アジュバント効果はまた、それぞれ約７０℃〜約１０１℃の範囲内の温度で３０秒〜２分間の熱処理によって、ワクチン中の抗原の凝集をもたらし得る。アルブミンに対するペプシン処理（Ｆａｂ）抗体、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）などの細菌細胞との混合物、グラム陰性菌のエンドトキシン又はリポ多糖成分、モノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）などの生理学的に許容される油性ビヒクル中のエマルジョン、ブロック代替品として使用されるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ（登録商標））の２０％溶液を含むエマルジョンで再活性化することによる凝集もまた採用され得る。
【００８６】
いくつかのアジュバント、例えば、細菌から得られる特定の有機分子は、抗原ではなく宿主に作用する。例として、細菌性ペプチドグリカンであるムラミルジペプチド（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン［ＭＤＰ］）が挙げられる。ＭＤＰはマクロファージを刺激するが、Ｂ細胞を直接刺激するようにも見える。
【００８７】
特定の実施形態において、ヘモシアニン及びヘモエリスリンもまた、本発明において使用され得る。特定の実施形態では、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ、ＫＬＨ）からのヘモシアニンの使用が好ましいが、他の軟体動物及び節足動物のヘモシアニン及びヘモエリスリンを使用してもよい。
【００８８】
様々な多糖アジュバントも使用され得る。例えば、マウスの抗体応答に対する様々な肺炎球菌多糖体アジュバントの使用が記述されている。脱アセチル化キチンを含む、キチン及びキトサンなどの多糖類のポリアミン種が特に好ましい。
【００８９】
アジュバントの別の群は、細菌ペプチドグリカンのムラミルジペプチド（ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）群である。アミノ酸誘導体スレオニル−ＭＤＰ、及び脂肪酸誘導体ＭＴＰＰＥなどのムラミルジペプチドの誘導体もまた企図される。米国特許第４，９５０，６４５号には、ムラミルジペプチドの親油性二糖−トリペプチド誘導体が記載され、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールから形成された人工リポソームでの使用を目的として記載されている。
【００９０】
ＢＣＧ（マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の弱毒化株であるカルメット・ゲラン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）桿菌）及びＢＣＧ細胞壁骨格（ＣＷＳ）もまた、トレハロースジミコレートの有無にかかわらず、アジュバントとして使用され得る。トレハロースジミコレート自体を使用してもよい。ＢＣＧは、その免疫刺激特性のために重要な臨床ツールである。
【００９１】
両親媒性界面活性剤、例えば、サポニン及びＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）などの誘導体は、本発明の免疫原と共に使用するためのさらに別の群のアジュバントを形成する。非イオン性ブロック共重合体界面活性剤も使用され得る。オリゴヌクレオチドは、アジュバントの別の有用な群である。Ｑｕｉｌ−Ａ（登録商標）及びレンチナンは、本発明の特定の実施形態において使用され得る他のアジュバントである。
【００９２】
アジュバントの別の群は、米国特許第４，８６６，０３４号の精製無毒化エンドトキシンなどの無毒化エンドトキシンである。
【００９３】
当業者は、本発明に従って細胞ワクチンにコンジュゲート可能な様々な種類のアジュバントを知っており、これらには、中でもアルキルリゾリン脂質（ＡＬＰ）、ＢＣＧ、及びビオチン（ビオチン化誘導体を含む）が含まれる。使用が特に企図されている特定のアジュバントは、グラム細胞からのテイコ酸である。これらには、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、リビトールテイコ酸（ＲＴＡ）、及びグリセロールテイコ酸（ＧＴＡ）が含まれる。それらの合成対応物の活性形態もまた、本発明に関連して使用され得る。
【００９４】
アジュバントは、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）によってコードされ得る。そのようなアジュバントはまた、抗原をコードする核酸（例えば、発現ベクター）、又は別個のベクター若しくは他のコンストラクトにコードされ得ることが企図される。アジュバントをコードする核酸は、例えば脂質又はリポソームとともに、直接送達されてもよい。そのようなアジュバントの例は、ポリ−ＩＣＬＣである。
【００９５】
発現ベクター
本発明によるペプチドは、患者の身体においてインビボで産生され得る。
【００９６】
免疫原性組成物又はワクチンは、ペプチドがインサイチュで生成されるように、上記のようにペプチドの１又は複数をコードするＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。ＲＮＡ又はＤＮＡは、核酸発現システム（ヌードＤＮＡ又はプラスミド、ＲＮＡベクター）、細菌又はウイルス発現システムを含む、当技術分野の当業者に公知の様々な送達システムのいずれかに存在し得る。適切な核酸発現システムには、患者での発現に必要なＲＮＡ又はＤＮＡ配列（適切なプロモーターや終結シグナルなど）が含まれている。細菌送達システムは、その細胞表面上のポリペプチドの免疫原性部分の発現を誘導する細菌（カルメット・ゲラン桿菌など）の投与を伴う。好ましい実施形態において、ＲＮＡ又はＤＮＡは、非病原性（欠陥）の複製能力のあるウイルスの使用を含み得るウイルス発現システム（例えば、ワクシニア若しくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、又はアデノウイルス）を使用して導入され得る。そのような発現系にＲＮＡ又はＤＮＡを組み込むための技術は、当業者に周知である。ＤＮＡは、例えばＵｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９  （１９９３）に記載され、Ｃｏｈｅｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１−１６９２  （１９９３）において再検討されるように「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）」であってもよい。ネイキッドＤＮＡの取り込みは、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズにＤＮＡをコーティングすることによって増加させることができる。
【００９７】
好ましいベクターには、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス及び弱毒化ポックスウイルス（改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣなど）などのポックスウイルスなどのウイルスベクター、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスなどの他のウイルスベクター、並びに細菌ベクターが挙げられる。
【００９８】
「発現」という用語は、その最も一般的な意味で本発明に従って使用され、例えば転写及び／又は翻訳によるＲＮＡ及び／又はペプチド若しくはポリペプチドの産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、特にペプチド又はポリペプチドの産生に関連している。また、核酸の部分的な発現も含まれる。さらに、発現は一過性又は安定的であり得る。
【００９９】
発現ベクターを細胞に導入可能な方法はいくつかある。本発明の特定の実施形態において、発現ベクターは、ウイルス又はウイルスゲノムに由来する改変ベクターを含む。特定のウイルスが受容体を介したエンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力により、外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入するための有望な候補となっている。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイルスは、パポーバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス、及びポリオーマ）及びアデノウイルスを含むＤＮＡウイルスであった。
【０１００】
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡに組み込む能力が低いことが知られているが、この機能は、これらのベクターによってもたらされる遺伝子導入の高効率によって埋め合わせられる。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）コンストラクトのパッケージングをサポートし、（ｂ）その中にクローン化された組織又は細胞特異的コンストラクトを最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含むコンストラクトを含むことを意味する。遺伝子構成又はアデノウイルス、３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡウイルスの知識により、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片を最大７ｋｂの外来配列で置換可能である。
【０１０１】
核酸は、アデノウイルス支援トランスフェクションを使用して細胞に導入され得る。アデノウイルス結合システムを使用した細胞システムでは、トランスフェクション効率の向上が報告されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｓ，  １９９４；Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，  １９９４）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明のワクチンで使用するための有望なベクターシステムである。ＡＡＶは感染性の広い宿主範囲を有する。ｒＡＡＶベクターの生成と使用に関する詳細については、それぞれ参照により本明細書に援用される米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されている。
【０１０２】
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに統合し、大量の外来遺伝物質を伝達し、広範囲の種や細胞型に感染し、特別な細胞株にパッケージングされるため、ワクチンの遺伝子送達ベクターとして有望である。レトロウイルスベクターを構築するために、特定のウイルス配列の代わりに核酸（例えば、目的の抗原をコードするもの）をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損ウイルスを産生する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列とともにｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが特別な細胞株に導入されると（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列により、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることができ、ウイルス粒子は培地に分泌される。次に、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、所望により濃縮し、遺伝子導入に使用する。
【０１０３】
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子が含まれている。レンチウイルスベクターは当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，０１３，５１６号及び第５，９９４，１３６号を参照）。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成され、例えば、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆ遺伝子が欠失され、ベクターが生物学的に安全になっている。
【０１０４】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボ及びエクスビボの両方の遺伝子導入及び核酸配列の発現に使用可能である。例えば、適切な宿主細胞が、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ、並びにｒｅｖ及びｔａｔを運ぶ２以上のベクターでトランスフェクトされる非分裂細胞に感染可能な組換えレンチウイルスが、参照により本明細書に援用される米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。特定の細胞型の受容体を標的とするために、エンベロープタンパク質を抗体又は特定のリガンドと結合させることによって組換えウイルスを標的にすることができる。目的の配列（調節領域を含む）を、特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクターに挿入することにより、例えば、当該ベクターは標的特異的である。
【０１０５】
免疫原性組成物又はワクチン投与
本発明の方法及び組成物を使用して、細胞を死滅させ、細胞増殖を阻害し、転移を阻害し、腫瘍又は組織のサイズを減少させ、そうでなければ腫瘍細胞の悪性表現型を逆転又は減少させるためには、当業者は通常本発明のペプチドを投与して（又は発現させて）、標的の癌細胞を認識して死滅させることが可能なＴ細胞を誘導するであろう。投与経路は、当然、病変の位置及び性質によって異なり、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接注射、及び経口投与が含まれる。
【０１０６】
腫瘍内注射、又は腫瘍血管系への注射は、個別の、固形の、アクセス可能な腫瘍のために特に企図されている。局在的、局所的、又は全身的な管理も適切であり得る。４ｃｍを超える腫瘍の場合、投与容量は約４〜１０ｍＬ（好ましくは１０ｍＬ）であり、一方、４ｃｍ未満の腫瘍の場合、約１〜３ｍＬ容量が使用される（好ましくは３ｍＬ）。単回投与として送達される複数回の注射は、約０．１〜約０．５ｍＬの容量を含む。ウイルス粒子は、約１ｃｍ間隔でスペースを空けて腫瘍に複数回注射することによって有利に接触させることができる。
【０１０７】
外科的介入の場合、本発明を術前に使用して、手術不能な腫瘍を切除の対象にしてもよい。あるいは、本発明は、手術時、及び／又はその後、残存又は転移性疾患を治療するために使用され得る。例えば、切除された腫瘍床は、腫瘍関連ペプチド、ポリペプチド、又はそれらをコードするコンストラクトを含む製剤で注射又は灌流され得る。灌流は、例えば、手術部位にカテーテルを移植したままにすることによって、切除後も継続することができる。定期的な術後治療も想定される。
【０１０８】
継続的な投与はまた、適切な場合、例えば、腫瘍が切除され、腫瘍床が残存する顕微鏡的疾患を排除するために治療される場合に適用され得る。
【０１０９】
シリンジ又はカテーテルによる送達が好ましい。そのような連続灌流は、治療開始後約１〜２時間、約２〜６時間、約６〜１２時間、約１２〜２４時間、約１〜２日、約１〜２週間以上の期間にわたって起こり得る。通常、連続灌流による治療用組成物の用量は、灌流が発生する期間にわたって調整された、単回又は複数回の注射によって与えられる用量と同等であろう。特に黒色腫及び肉腫の治療において、四肢灌流を使用して、本発明の治療用組成物を投与することができることがさらに企図される。
【０１１０】
治療計画も様々であり、多くの場合、腫瘍の種類、腫瘍の位置、疾患の進行、及び患者の健康や年齢によって異なり得る。明らかに、特定の種類の腫瘍はより積極的な治療を必要とするであろうが、同時に、特定の患者はより困難なプロトコルに耐えられない場合がある。臨床医は、治療用製剤の既知の有効性及び毒性（もしあれば）に基づいてそのような決定を下すのに最も適しているであろう。
【０１１１】
医薬免疫原性又はワクチン組成物の有効量は、通常、疾患若しくは状態又はその症状の程度を検出可能かつ反復的に改善、低減、最小化、又は制限するのに十分な量として定義される。疾患の除去、根絶、又は治癒を含む、より厳密な定義がワクチン組成物に適用され得る。
【０１１２】
特定の実施形態では、治療される腫瘍は、少なくとも最初は切除可能ではない場合がある。治療用ウイルスコンストラクトによる治療は、腫瘍縁での縮小により、又は特定の特に浸潤部分の除去によって、腫瘍の切除可能性を高め得る。治療後、切除が可能となり得る。切除後の追加治療は、腫瘍部位の顕微鏡的残存病変を排除するのに役立つであろう。
【０１１３】
原発腫瘍又は切除後の腫瘍床の典型的な治療方針には、複数回の投与が含まれるだろう。投与されるペプチドの１日治療有効量（本発明によるペプチドの総量）は、０．０１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲内、特に０．０２５ｍｇ〜５．０ｍｇの範囲内、又は０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇの範囲であり得る。
【０１１４】
治療には、様々な「単位用量」が含まれ得る。単位用量は、所定量の治療用組成物を含むものとして定義される。投与される量及び特定の経路や製剤は、臨床分野の当業者の技能の範囲内であり、ペプチド組成物又は発現ベクター組成物のいずれかとしての組成物の性質に応じて変化し得る。単位用量は、単回注射として投与する必要はなく、設定された期間にわたる持続注入を含み得る。本発明の単位用量は、ウイルスコンストラクトのプラーク形成単位（ｐｆｕ）に関して簡便に説明され得る。単位用量は、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、又は１０13ｐｆｕ以上の範囲内である。あるいは、ベクターの種類と達成可能な力価に応じて、単位用量は１〜１００、１０〜５０、１００−１０００、又は最大約１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9、１×１０10、１×１０11、１×１０12、１×１０13、１×１０14、又は１×１０15以上の感染性ウイルス粒子（ｖｐ）を患者又は患者の細胞へ送達するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１Ａは、ＴＮＢＣで過剰発現している１９のＨＥＲＶサブタイプの発現と免疫シグネチャーとの相関を示す図であり、抗原提示、細胞毒性、及び免疫調節経路との相関を表しており、正の相関は、各ドット（明るい灰色又は暗い灰色）で示される。図１Ｂは、一例としてＨＥＲＶ−Ｋ１０発現とＴ細胞シグネチャーとの相関を示す図である。
【図２】図２Ａは、ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドによる刺激の有り無し（それぞれ上象限）及びＨＥＲＶペプチドＰ５（配列番号５）による刺激の有り無し（それぞれ下象限）でのＣＤ８+Ｔ細胞のデキストラマー染色の代表的なプロットを示す図である。図２Ｂは、数人のドナーのＰＢＭＣに対する特定のＨＥＲＶペプチド（Ｐ１〜Ｐ７：配列番号１〜７）又はコントロールによる刺激の有り無しでの１２日目のデキストラマー陽性ＣＤ８+Ｔ細胞の割合（％）を示す図である。
【図３】図３Ａは、陰性対照及び陽性対照（上象限）及びＨＥＲＶペプチドＰ１、Ｐ２、及びＰ３（配列番号１、２、及び３）（下象限）でパルスしたＴ２細胞との接触後のＣＤ８+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の代表的なプロットを示す図である。図３Ｂは、数人のドナーのＰＢＭＣに対する特定のＨＥＲＶペプチド（Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３：配列番号１、２、及び３）又はコントロールによる刺激の有り無しでの１２日目のＩＦＮ−γ陽性ＣＤ８+Ｔ細胞の割合（％）を示す図である。
【図４】図４Ａは、ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドによる刺激の有り無し（それぞれ上象限）及びＨＥＲＶペプチドＰ１（配列番号１）による刺激の有り無し（それぞれ下象限）でのＣＤ８+Ｔ細胞のデキストラマー染色の代表的なプロットを示す図である。  図４Ｂは、数人のドナーのＰＢＭＣに対するペプチド刺激状態対非刺激状態（Ｐ１〜Ｐ７：配列番号１〜７）の１２日目のデキストラマー陽性特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の割合（％）の倍率変化比を示す図である。  図４Ｃは、１２日間の刺激後及び同族ペプチドでパルスしたＴ２細胞との２４時間の接触後のＩＦＮ−γ+スポット及びグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）−β+スポットの数の代表的なヒストグラムを示す図である。
【図５】図５Ａは、ドナーａにおける陰性対照及び陽性対照（上象限）及びＨＥＲＶペプチドＰ１、Ｐ２、及びＰ３（配列番号１〜３）（下象限）でパルスしたＴ２細胞との接触後のＣＤ８+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の代表的なプロットを示す図である。  図５Ａ（続き）は、ドナーｂにおける陰性対照及び陽性対照（上象限）及びＨＥＲＶペプチドＰ４、Ｐ５、Ｐ６、及びＰ７（配列番号４〜７）（下象限）でパルスしたＴ２細胞との接触後のＣＤ８+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の代表的なプロットを示す図である。  図５Ｂは、数人のドナーのＰＢＭＣに対する特定のＨＥＲＶペプチド（Ｐ１〜Ｐ７：配列番号１〜７）又はコントロールによる刺激の有り無しでの１２日目のＩＦＮ−γ陽性ＣＤ８+Ｔ細胞の割合（％）を示す図である。
【図６】図６Ａは、特定のＰ１のＣＤ８+Ｔ細胞（右象限）及びそれらの陰性対応物（左象限）の選別及び増殖後のＰ１（配列番号１）のデキストラマー染色の代表的なプロットを示す図である。  図６Ｂは、Ｐ１（配列番号１）特異的ＣＤ８+Ｔ細胞とＰ１又は陰性対照（ペプチド負荷なし）でパルスしたＴ２細胞の培養２４時間後のＩＦＮ−γ＋スポット及びグランザイム−β+スポットの数の代表的なヒストグラムを示す図である。  図６Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（目的のペプチドとパルスを実施又は未実施）をＰ１（配列番号１）特異的ＣＤ８+Ｔ細胞又はそれらの陰性対応物と共培養した際のリアルタイム細胞死定量化の代表的な曲線を示す図である。  図６Ｄは、目的のペプチドとパルスを実施又は非実施のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株との６時間の共培養後、Ｐ１（配列番号１）特異的ＣＤ８+Ｔ細胞（黒）対それらの陰性対応物（非特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、白）のＩＦＮ−γ（ＰＥ）の細胞内染色の割合（％）の代表的なヒストグラムを示す図である。ＨＬＡ−Ａ２遮断抗体の添加を対照として使用した。
【図７】図７Ａは、ＴＮＢＣの小片から増殖したＣＤ８+細胞に見られるデキストラマー陽性腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（黒色象限）の代表的なスキーマを示す図である。Ｐ１〜Ｐ７（配列番号１〜７）はペプチド１〜７のデキストラマーを表し、ＴＮＢＣ１〜ＴＮＢＣ４は４人の異なる患者を表す。図７Ｂは、卵巣腫瘍の小片から増殖したＣＤ８+細胞に見られるデキストラマー陽性ＴＩＬ（黒色象限）の代表的なスキーマを示す図である。Ｐ１〜Ｐ７（配列番号１〜７）はペプチド１〜７のデキストラマーを表し、卵巣１〜卵巣３は３人の異なる患者を表す。
【０１１６】
以下に、本発明について図面を参照して非限定的な実施例を使用して説明する。
【実施例】
【０１１７】
ＨＥＲＶ配列の同定
異なるファミリー（ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−Ｅ、及びＥＲＶ３を含む）からのＨＥＲＶのＤＮＡ配列をＧｅｎｂａｎｋデータベースから抽出した。ＢＬＡＳＴを使用して、これらの配列をヒトゲノム（ＧＲＣＨ３７）上に局在化し、問い合わせ配列の少なくとも８５％で少なくとも９８％の類似性を有し、ギャップのない位置を維持した。したがって、６６の機能的ＨＥＲＶ配列を同定した。
【０１１８】
ＴＮＢＣにおけるＨＥＲＶ配列の分析
ＨＥＲＶの発現を、４２のＴＮＢＣを含む８４の乳癌試料の既存のデータベースで分析した。５６の正常な乳房試料（５１の腫瘍周囲試料及び５つの乳房縮小術試料）との比較を行った。ＤＮＡｓｅ処理及びポリＡ選択を行う新鮮な腫瘍生検組織からＲＮＡを抽出した。充分な品質（ＲＮＡ完全性番号＞６．５）を示している場合、機能的ＨＥＲＶ配列はＲＮＡｓｅｑデータと一致している。
【０１１９】
６６のヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）サブタイプの多重成分分析を実施した。４２のＨＥＲＶが発現している。１９のＨＥＲＶは、正常組織及びＥＲ+サブタイプ（ＨＥＲＶＫ＿１０、１７、２２、７、６、２１、２５、１１、２０、１６、２３、１、及び５、ＨＥＲＶＨ＿４及び７、並びにＨＥＲＶ３＿１）におけるトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を特異的に特徴付ける。
【０１２０】
ペプチドの選択及び合成
１９の過剰発現ＨＥＲＶ間で共有されるＧａｇとＰｏｌとの共通領域は、参照ゲノム上のリードのアラインメント後に同定した。様々なエピトープ予測ツール（ＮｅｔＭＨＣ  Ｉ及びＩＩ）を使用して、最も高頻度のＭＨＣＩ及びＩＩ対立遺伝子の潜在的な強力なエピトープバインダーを同定した。それらの中で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の以下の７つの予測される９アミノ酸長の強力なバインダーを選択し、合成した：４つのＧａｇペプチド及び３つのＰｏｌペプチド（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ベルリン、ドイツ）。ペプチドの同一性は、販売業者による質量分析によって確認した。９５％を超える純度が予想され、高速液体クロマトグラフィーによって決定した。凍結乾燥ペプチドを５％未満ＤＭＳＯの脱イオン水に溶解し、等分して使用するまで−２０℃で保存した。
【０１２１】
クラスＩＭＨＣ（配列番号１〜７）の９アミノ酸長ペプチドの強力なバインダーを含む２９アミノ酸長のＧＭＸペプチド（配列番号８〜１４）、及びクラスＩＩモチーフの側方配列（lateral sequences）（各側に１０アミノ酸長（１０−ｍｅｒ）、配列番号１２のペプチドを除き、配列番号５の配列はＣ末端にある）を同定し、合成のために分析した。
【０１２２】
ＨＥＲＶ発現とＴ細胞シグネチャーとの相関関係のバイオインフォマティクス分析
腫瘍の免疫特性を評価するために、以下の様々シグネチャーを使用した：対照分析のためのＴ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性リンパ球、並びに線維芽細胞、好中球、及び内皮細胞のＭＣＰカウンターシグネチャー（ｈｔｔｐ：／／ｃｉｔ．ｌｉｇｕｅ−ｃａｎｃｅｒ．ｎｅｔ／？ｐ＝１３３８＆ｌａｎｇ＝ｅｎを参照）；ＩｍｍｕｎｅＳｃｏｒｅ及びＳｔｒｏｍａｌＳｃｏｒｅのためのＥＳＴＩＭＡＴＥパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｅｓｔｉｍａｔｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）；エフェクター細胞、免疫調節剤（免疫チェックポイント）、サプレッサー細胞（制御性Ｔ細胞及びＭＤＳＣ）のイムノフェノグラム（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｇｒａｍ１５）。ＥＭＴシグネチャー（ＳＳＧＳＥＡ及びＪｅａｎ−Ｐａｕｌ  Ｔｈｉｅｒｒｙシグネチャー）及び腫瘍サブタイプに特に関連するシグネチャーと同様に、特定の遺伝子（ＯＣＴ４、ＴＲＩＭ２８、ＳＥＴＤＢ１など）も評価される。これらのシグネチャーとＨＥＲＶとの間の相関関係は、従来の統計手法を使用して分析される。図１Ａは、１９個のＨＥＲＶと、抗原提示関連、細胞毒性、又は免疫調節シグネチャーとしての特定の免疫シグネチャーとの間の有意な相関関係を示す図である。一例として、ＨＥＲＶ−Ｋ  １０の発現は、乳癌のＴ細胞シグネチャーと強く相関している（図１Ｂ）。
【０１２３】
特異的ＣＤ８+ＨＥＲＶ+刺激のためのＰＢＭＣ培養
ＨＬＡ−Ａ２ドナーからのＰＢＭＣを、５％ＡＢヒト血清（ＥＦＳ  Ｌｙｏｎ病院からの５ドナーのプール、ろ過済）、及び５μｇ／ｍＬのＲ８４８  （ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、米国サンディエゴ）及び１０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ−ＩＣ  （ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）並びに目的のペプチド（１０μＭ）で濃縮した２０ＵＩ／ｍＬのＩＬ−２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）  ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ社、ヴヴェイ、スイス）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で１２日間培養した。培養は、Ｕ底９６ウェルプレートで、ウェルあたり１．５×１０5細胞で、各ペプチド条件で２０ウェルに対して行った。１００μＬの培地を交換し、Ｒ８４８、Ｐｏｌｙ−ＩＣ、ＩＬ−２、及び目的のペプチド（配列番号１〜７の配列のペプチド）で濃縮して、３日目に同じ最終濃度を達成した。ＩＬ−２及び目的のペプチドは６日目に添加し、１０日目にＩＬ−２のみを添加した。陽性対照は、デキストラマー（Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ（登録商標））実験で０．１μｇ／ｍＬのＰＰ６５（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と共に培養した。ＰＰ６５は、ＭＨＣクラスＩによって提示され、ＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に刺激するＣＭＶペプチドである。ＩＦＮ−γ実験では、０．４μｇ／ｍＬのＣＥＦペプチド（Ｍａｂｔｅｃｈ社）を使用した。これは、ＣＤ８+Ｔ細胞を刺激してＩＦＮ−γを優先的に合成する、ヒトＣＭＶ、ＥＢＶ、及びインフルエンザウイルス由来の２３のＭＨＣクラスＩ制限ウイルスペプチドのプールで構成されている。
【０１２４】
デキストラマーアッセイ及び選別
１２日目に、同じ条件の細胞をポリプロピレンチューブに一緒にプールし、２ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。条件を、１０μＬの対応するデキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ社、コペンハーゲン、デンマーク）で、室温、暗所で１５分間染色とした。Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ（商標）（近赤外線）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（固定可能な生存率）キット（Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ（商標）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、パリ、フランス）を１／４００で使用して、生存率を評価した。次に、抗ＣＤ３（ＢＶ４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）抗体及び抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国カリフォルニア州ブレア）抗体を各条件に加え（図２のアッセイでは１／１０、図４では１／２５）、４℃で暗所に２０分間放置した後、細胞を２ｍＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、分析まで３５０μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。分析は、マルチマー特異的ＨＥＲＶ  ＣＤ８+Ｔ細胞を識別するためにＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）（ＢＤ社）で実施した。
【０１２５】
図２Ａの結果は、非特異的（左パネル）及び特異的（右パネル）ペプチドパルスＰＢＭＣでデキストラマーによって染色された集団を示している。上のパネルでは、ＣＤ８+Ｔ細胞の最大７２％が、ＣＭＶからの陽性対照ｐｐ６５ペプチドによる刺激後に陽性を示したのに対し、非刺激ＰＢＭＣでは２．０２％であった（以前の感染によるＣＭＶに対するメモリーＴ細胞の存在の可能性を示している）。興味深いことに、ＨＥＲＶペプチド（例えば、下のパネルの配列番号５）で刺激したＰＢＭＣは、非刺激状態では０．０４％であるのに対し、デキストラマー陽性ＣＤ８+Ｔ細胞では３４．２％となった。４人の異なるドナーで得られた結果を図２Ｂに要約する。
【０１２６】
図４Ａの結果は、非特異的（左パネル）及び特異的（右パネル）ペプチドパルスＰＢＭＣでデキストラマーによって染色された集団を示している。上のパネルでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最大２３．４０％が、ＣＭＶからの陽性対照ｐｐ６５ペプチドによる刺激後に陽性を示したのに対し、非刺激ＰＢＭＣでは３．６３％であった（以前の感染によるＣＭＶに対するメモリーＴ細胞の存在の可能性を示している）。興味深いことに、ＨＥＲＶペプチド（例えば、下のパネルの配列番号１）で刺激したＰＢＭＣは、非刺激状態では０．０９１％であるのに対し、デキストラマー陽性ＣＤ８+Ｔ細胞では０．６３％となった。１２人の異なるドナーで得られた結果を図４Ｂに要約すると、Ｐ１、Ｐ４、及びＰ６（例えば、配列番号１、４、及び６）ではデキストラマー陽性ＣＤ８+Ｔ細胞が顕著に増加し、Ｐ２及びＰ３（例えば、配列番号２及び３）ではわずかに増加した。
【０１２７】
１２日間の培養後のペプチド刺激ＰＢＭＣを使用して、ＩＦＮ−γ及びグランザイム−βのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した（図２Ｃ）。ウェルあたり２．１０5個の細胞を、目的のペプチドに特異的なＴ２細胞と１０：１の比率で共培養した。ＥＬＩＳＰＯＴは２４時間後に明らかになり、Ｐ１及びＰ６に特異的なＩＦＮ−γ及びグランザイム−βスポットが示された（例えば、配列番号１及び６）。
【０１２８】
Ｔ２細胞接触による細胞毒性アッセイ
ＰＢＭＣ培養の１２日目に、Ｔ２細胞をＲＰＭＩで洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に再懸濁した。Ｔ２（ＳＤ細胞株）は、抗原処理（ＴＡＰ）タンパク質に関連するトランスポーターが欠損しているリンパ芽球細胞株であるため、クラスＩのＭＨＣに内因性ペプチドを提示することはできないが、非競合環境で目的の外因性抗原に対するＣＴＬ応答をモニタリングするために使用できる。Ｔ２細胞を、最初に１０μｇ／ｍＬの対応するペプチドを２ＭのＴ２細胞に３７℃で２時間添加することにより、ＨＥＲＶペプチドでパルスした。ＰＢＭＣをプールしてカウントし、対応するＴ２細胞とそれぞれ１：５の濃度で共培養して新しいＵ底９６ウェルプレートに加えた。
【０１２９】
３７℃で４時間インキュベートした後、共培養した細胞を洗浄し、ＦＡＣＳバッファーでの染色条件に従ってＶ底ウェルプレートにプールした。Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ（商標）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）は、生存率を評価するために１／４００で使用した。抗ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）抗体及び抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）抗体を条件ごとに１／１０で添加し、４℃で２５分間放置した。細胞を再度洗浄した後、固定／透過処理溶液キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用して、製造業者の指示に従って室温で１５分間固定した。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、４℃に維持した。
【０１３０】
１３日目に、細胞を透過処理溶液キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で室温で５分間透過処理し、抗ＩＦＮ−γ（ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）抗体を溶液に１／２０で４℃でさらに２５分間添加した。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析の前に３５０μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。分析は、ＨＥＲＶ配列を発現するＴ２細胞に対する特定の細胞毒性及び脱顆粒を調べるためにＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）（ＢＤ社）で実施した。
【０１３１】
図３Ａの結果は、非パルスＴ２細胞（Ｐ０：左上パネル）、異なるペプチドで（Ｐ（−）：中央上パネル）、又は各同族ペプチド（陽性対照Ｐ（＋）：上／右パネル、下パネルの配列番号１、２、及び３のＨＥＲＶペプチド）でパルスしたＴ２細胞に対する刺激ＣＤ８+Ｔ細胞のＩＦＮ−ｙ産生を示している。結果は、ＨＥＲＶペプチドを発現するＴ２細胞に対する特異的なＩＦＮ−γ産生を示している。５人の異なるドナーの結果を図３Ｂに要約すると、Ｐ１（配列番号１）で刺激したＣＤ８+Ｔ細胞の約１０％（中央値）及びＰ２又はＰ３（配列番号２及び３）で刺激したＣＤ８+Ｔ細胞の約５％（中央値）でのＩＦＮ−γ産生を示している。
【０１３２】
図５Ａの結果は、非パルスＴ２細胞（Ｐ０：左上パネル、ドナーａ及びドナーｂの両方の象限）、異なるペプチドで（陰性対照Ｐ（−）：中央上パネル、ドナーａとドナーｂの両方の象限）、又は各同族ペプチド（陽性対照Ｐ（＋）：上／右パネル、トナーａの下パネルの配列番号１〜３のＨＥＲＶペプチド及びトナーｂの下パネルの配列番号４〜７のＨＥＲＶペプチド）でパルスしたＴ２細胞に対する刺激ＣＤ８+Ｔ細胞のＩＦＮ−ｙ産生を示している。結果は、ＨＥＲＶペプチドを発現するＴ２細胞に対する特異的なＩＦＮ−γ産生を示している。１２人の異なるドナーの結果を図５Ｂに要約すると、かなりの数のＰ１（配列番号１）で刺激したＣＤ８+Ｔ細胞及びＰ２及びＰ３（配列番号２及び３）で刺激したＣＤ８+Ｔ細胞、及び中程度の数のＰ６（配列番号６）で刺激したＣＤ８+Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を示している。
【０１３３】
Ｐ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞傷害性
デキストラマー染色細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ社）で選別し、ペプチド特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を非特異的な対応物から分離した。両方の画分を収集し、丸底９６ウェルプレートのフィーダーセルで１４日間別々に増殖させた。特異的画分対非特異的画分の純度を１４日目に評価したところ（図６Ａ）、陽性画分では９０％超のデキストラマー陽性ＣＤ８+Ｔ細胞であり、陰性画分では５％未満であった。これらの細胞は細胞毒性実験に使用した。
【０１３４】
選別及び増殖したＣＤ８+Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （ＣＴＬ）社）によって細胞傷害性の可能性について評価した。４．１０4個のＰ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を、ペプチドＰ１で事前にパルスしたＴ２細胞と共培養した。カウントしたスポット数は、陰性対照と比較して、同族ペプチドでパルスした標的細胞に対するＰ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ及びグランザイム−βの産生（両方のサイトカインで約８００スポット）を示している（図６Ｂ）。これらの実験は、それらの細胞が特異的かつ機能的であることを示している。
【０１３５】
ＨＭＥＣ細胞株（ＨＬＡ−Ａ２ヒト乳腺上皮細胞）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（ＨＬＡ−Ａ２トリプルネガティブ乳癌細胞株）で実施したＨＥＲＶ発現のインシリコ分析は、ＨＭＥＣと比較したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株におけるＨＥＲＶの過剰発現を示した。
【０１３６】
ＨＬＡ−Ａ２  ＴＮＢＣ細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、Ｐ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞によって誘導される細胞死のリアルタイム分析の標的として使用した。５．１０3個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にペプチドＰ１にパルスを実施し又は実施せずに、９６ウェルプレートに接着させた。接着後、Ｐ１のＣＤ８+Ｔ細胞又はそれらの陰性対応物（対照）をウェルに加えた。共培養は、細胞膜の完全性が低下する際に細胞に入り、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に結合すると蛍光が１００〜１０００倍増加するＣｙｔｏｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅ（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）の存在下で行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＰ１特異的Ｔ細胞と共培養すると、細胞死における動態が陰性対応物と比較して顕著に増加することを示している。予想通り、標的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にＰ１をパルスし、Ｐ１特異的Ｔ細胞と共培養すると、細胞死のさらなる増加が観察された（おそらく標的細胞上のＨＬＡ−ペプチド１複合体の数の増加によるものである）（図６Ｃ）。
【０１３７】
さらに、Ｐ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞又はそれらの陰性対応物とＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＨＬＡ−Ａ２  ＴＮＢＣ細胞株との間の６時間の共培養後、ＩＦＮ−γの細胞内染色をＦＡＣＳによって実施した（図６Ｄ）。結果は、Ｐ１特異的細胞が共培養されている場合、陰性対応物との共培養と比較して、ＩＦＮ−γ産生細胞の割合（％）が増加していることを示している。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を事前にＰ１でパルスした場合、この割合（％）はわずかに増加する。抗ＨＬＡ−Ａ２特異的遮断抗体を使用すると、この効果を逆転させることができ、その特異性が実証される。
【０１３８】
まとめると、これらの実験は、Ｐ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞が同族ペプチドを提示する標的細胞（この実験ではＴ２細胞）を特異的に認識して機能し、内因的にＨＥＲＶ由来の抗原（この実験ではＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ細胞株））を発現する腫瘍細胞を特異的に認識して死滅させることを示している。
【０１３９】
ＴＮＢＣ及び卵巣癌からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のデキストラマー染色
腫瘍を小片に分割し、コラゲナーゼＩＶ及びＤＮＡｓｅで４５分間消化した。得られた細胞を５％ヒト血清ＲＰＭＩに再懸濁し、９６ウェルに分注した（ウェルあたり５．１０4細胞）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を、ＩＬ−２（終濃度１００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で細胞と１：４の比率でウェルに添加した。５、７、９、及び１２日目に培地を交換してＴＩＬを１４日間培養し、細胞数を０．５×１０6  細胞／ｍＬに調整した。
【０１４０】
１４日目に、目的の７つのペプチド（Ｐ１〜Ｐ７：配列番号１〜７）に対してデキストラマー染色を行い（デキストラマーアッセイの段落を参照）、デキストラマー特異的ＣＤ８+Ｔ細胞をＴＮＢＣ（図７Ａ）及び卵巣癌（図７Ｂ）でのＦＡＣＳ分析によって同定した。結果は、目的の全てのペプチドに特異的なＣＤ８+Ｔ細胞が腫瘍に見られることを示しているが、試料によって多少の違いがある。これにより、ペプチドのインビボ免疫原性が確認され、これらのペプチドが自然に処理され得、腫瘍発生中に検出可能な免疫応答を誘導し得ることを示している。Ｐ１及びＰ６に特異的なＣＤ８+Ｔ細胞は、腫瘍でより高頻度に提示され、ワクチン又は免疫原性組成物の基礎として選択されるペプチドである。これらの結果はまた、この反応性に関して状態が不明の患者に使用可能であり、好ましくはＰ１及び／又はＰ６を含むワクチン又は免疫原性組成物を提供するために、いくつかのペプチドの組み合わせを支持する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021536479.tif 000020
2021536479.tif 000021