(57)【要約】  本発明は、血清型Ａｄ５の改変腫瘍溶解性アデノウイルス；同アデノウイルスを含む医薬組成物；および同アデノウイルスを使用してがんを治療する方法に関し、ここで、前記改変アデノウイルスは、凝固第１０因子（ＦＸ）とのウイルス結合を妨げるヘキソン超可変領域７の少なくとも１つの点突然変異（ＨＶＲ７突然変異）；コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とのウイルス結合を妨げるファイバーノブ領域ＡＢループの少なくとも１つの点突然変異（ＫＯ１突然変異）；およびανβ３／ανβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げるペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）の少なくとも１つの点突然変異を含む。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）凝固第１０因子（ＦＸ）とのウイルス結合を妨げる、ヘキソン超可変領域７のＩ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４Ｓ、Ｅ４５０ＱまたはＬ４２６Ｙ点突然変異（ＨＶＲ７突然変異）のうちの少なくとも１つ；
ｂ）コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とのウイルス結合を妨げる、ファイバーノブ領域ＡＢループのＳ４０８ＥまたはＰ４０９Ａ点突然変異（ＫＯ１突然変異）のうちの少なくとも１つ；および
ｃ）αＶβ３／αＶβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げる、ペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）のＤ３４２ＥまたはＤ３４２Ａ点突然変異のうちの少なくとも１つ
を含む改変Ａｄ５血清型アデノウイルス。
【請求項２】
前記ＨＶＲ７突然変異が、以下の点突然変異：Ｉ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４ＳおよびＬ４２６Ｙのうちの少なくとも１つを含むまたはからなる、請求項１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項３】
前記ＫＯ１突然変異が、Ｓ４０８ＥおよびＰ４０９Ａ点突然変異を含むまたはからなる、請求項１または２に記載の改変アデノウイルス。
【請求項４】
前記ＲＧＤ突然変異が、Ｄ３４２Ｅであり、ＲＧＥをもたらす、請求項１から３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項５】
前記アデノウイルスが、腫瘍細胞を選択的に標的化する少なくとも１つのがん標的化改変または配列を含むようにさらに改変されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項６】
前記アデノウイルスが、アミノペプチダーゼＮに結合する少なくとも１つのＮＧＲ（含有）ペプチドモチーフを含み、ここで、前記ＮＧＲが、アデノウイルスファイバータンパク質のＨＩループ中にあるか；または汎がんマーカーＥｐｈＡ２に結合する少なくとも１つのＹＳＡ（含有）ペプチドモチーフにあり、ここで、前記ＹＳＡが、キメラファイバー中にあるか、または少なくとも１つのがん標的化抗体、または少なくとも１つの成長因子抗体、または少なくとも１つのマトリックス分解酵素中にある、請求項５に記載の改変アデノウイルス。
【請求項７】
前記がん標的化改変が、αｖβ６インテグリン結合ペプチドまたはＡ２０ペプチド配列ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）のウイルスへのまたはウイルスによる挿入または発現を含む、請求項５に記載の改変アデノウイルス。
【請求項８】
前記Ａ２０ペプチド配列が、ウイルスファイバーノブＨＩループに挿入される、または前記ウイルスファイバーノブＨＩループで発現される、請求項７に記載の改変アデノウイルス。
【請求項９】
前記アデノウイルス（Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０）が、
ａ）凝固第１０因子（ＦＸ）とのウイルス結合を妨げる、ヘキソン超可変領域７のＩ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４Ｓ、Ｅ４５０ＱまたはＬ４２６Ｙ点突然変異（ＨＶＲ７突然変異）のうちの少なくとも１つ；
ｂ）コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とのウイルス結合を妨げる、ファイバーノブ領域ＡＢループのＳ４０８ＥまたはＰ４０９Ａ点突然変異（ＫＯ１突然変異）のうちの少なくとも１つ；
ｃ）αＶβ３／αＶβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げる、ペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）のＤ３４２ＥまたはＤ３４２Ａ点突然変異のうちの少なくとも１つ；および
ｄ）ウイルスファイバーノブＨＩループ中にＡ２０ペプチド配列ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）の挿入または発現
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１０】
改変アデノウイルス（Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０）が、
ａ）凝固第１０因子（ＦＸ）とのウイルス結合を妨げる、ヘキソン超可変領域７のＩ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４ＳおよびＬ４２６Ｙ点突然変異（ＨＶＲ７突然変異）；
ｂ）コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とのウイルス結合を妨げる、ファイバーノブ領域ＡＢループのＳ４０８ＥおよびＰ４０９Ａ点突然変異（ＫＯ１突然変異）；
ｃ）αＶβ３／αＶβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げる、ＲＧＥ突然変異をもたらすペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）のＤ３４２Ｅ点突然変異；および
ｄ）ウイルスファイバーノブＨＩループ中にＡ２０ペプチド配列ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）の挿入または発現
を含む、請求項８に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１１】
アデノウイルスが、治療用分子または薬剤をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含むようにさらに改変されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１２】
前記アデノウイルスが、ウイルス複製をｐＲＢ欠損細胞に制限するために、２４塩基対の欠失ｄｌ９２２〜９４７（Δ２４突然変異）をＥ１Ａ遺伝子に含めるようにさらに改変されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１３】
前記アデノウイルスが、腫瘍溶解能を高めるために、Ｅ３／１９Ｋの小胞体（ＥＲ）保持ドメイン内の４４５位に単一のアデニン塩基付加（Ｔ１突然変異）を含むようにさらに改変されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１４】
医薬として使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１５】
がんの治療に使用するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１６】
がんを治療するための医薬の製造に使用するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１７】
前記がんが、上咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎がん、結合組織のがん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、咽喉がん、口腔がん、肝臓がん、骨がん、膵臓がん、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、尿管がん、脳がん、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨がん、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発不明がん、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳がん、パジェット病、子宮頸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、胆嚢がん、頭部がん、眼がん、頸部がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝臓がん、カポジ肉腫、前立腺がん、肺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟部肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛がん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉がん、心臓がん、口唇がん、髄膜がん、口腔がん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がんおよび扁桃がんを含む群から選択される、請求項１５または１６に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１８】
前記がんが、卵巣がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、皮膚がん、乳がん、腎臓がんおよび結腸直腸がんを含む群から選択される、請求項１７に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１９】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス、および、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
医薬組成物を調製する方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルスを、薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルと併せるまたは会合させることを含む方法。
【請求項２１】
がんを治療する方法であって、有効量の請求項１から１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルスまたは請求項１９に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清型Ａｄ５の改変腫瘍溶解性アデノウイルス；同アデノウイルスを含む医薬組成物；および同アデノウイルスを使用してがんを治療する方法に関し、ここで、前記改変アデノウイルスは、凝固第１０因子（ＦＸ）とのウイルス結合を妨げるヘキソン超可変領域７の少なくとも１つの点突然変異（ＨＶＲ７突然変異）；コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とのウイルス結合を妨げるファイバーノブ領域ＡＢループの少なくとも１つの点突然変異（ＫＯ１突然変異）；およびαＶβ３／αＶβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げるペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）の少なくとも１つの点突然変異を含む。
【背景技術】
【０００２】
がんウイルス療法は、進行期黒色腫の最初の腫瘍溶解性免疫療法としての１型単純ヘルペスベースのタリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）による新興分野である。腫瘍溶解性アデノウイルスは、感染性疾患に対する種々のワクチンアプローチでしばしば使用される高度免疫原性ウイルスである。重要なことに、これらは免疫応答を刺激すると同時に増強する並はずれた能力を有する。さらに、腫瘍内の腫瘍溶解性アデノウイルスの存在およびそれが引き起こす免疫原性細胞死は、ＩＦＮｇのようなＴＨ１型免疫モジュレーターの発現を引き起こすことによって、臨床的に関連する抗腫瘍免疫が発生するより感受性のある状態に向けて敵の腫瘍微小環境を形作る可能性がある。しかしながら、腫瘍溶解性アデノウイルスの免疫原性は両刃の剣である；抗ウイルス免疫はしばしばあまりに圧倒的であるので、腫瘍によって発現される自己抗原に対して引き起こされるはるかに弱い免疫応答を無効にする。
【０００３】
アデノウイルス５（Ａｄ５）は、遺伝子操作が可能であり大きな導入遺伝子を許容できるため、がんおよび遺伝子治療の多数の臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、２０１６）で展開されている一般的なベクターである。しかしながら、この血清型は、その広範な臨床使用を妨げるいくつかの次善の特徴を有する。Ａｄ５は一般的な呼吸器ウイルスであり、一定の集団では血清有病率が１００％に近く、中和抗体（ｎＡｂ）が全身送達された治療用ベクターを急速に不活性化する。他の次善の特徴には、ウイルスヘキソンタンパク質とヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）の架橋を介した脾臓および肝臓への広範なオフターゲット隔離、ヒト凝固第１０因子（ＦＸ）によって媒介される向性指示相互作用が含まれる。インビトロでは、Ａｄ５は、ウイルスファイバータンパク質と分極上皮細胞上の密着結合内で遍在的に発現されるが、進行性がんで下方制御されるコクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）との間の相互作用を介して宿主細胞に侵入する。その後、Ａｄ５は、ウイルスペントンベースタンパク質によって媒介されるクラスリン媒介エンドサイトーシスによって、αｖβ３／５インテグリンを介して宿主細胞に内部移行する。
【０００４】
免疫療法および患者自身の免疫系の刺激によりがんを標的化および攻撃することが人気を得てきているため、がん治療における腫瘍溶解性ウイルスの役割の認識は過去１０年間で劇的に変化した。世紀の初めには、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解を介して腫瘍細胞を溶解するそれらの固有の能力を通してのみ作用する、がん治療の活性薬剤として認識された。近年、がんワクチンとしてのそれらの使用が関心を集めており、免疫系を活性化するために腫瘍溶解時にがん細胞から腫瘍抗原を放出するそれらの能力が、がんに対する究極の免疫療法を設計する上で重要な特徴として認識されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ウイルスベクターが臨床設定でますます魅力的になっているが、一般的な血清型−Ａｄ５−の臨床的有効性は、乏しい腫瘍特異性、広範なオフターゲット送達、および自然免疫による不活化によって妨げられ、革新的な操作戦略を必要としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、上記の欠点を克服するように設計された改変アデノウイルスベクターを開示する。
【０００７】
本発明の第１の態様によると、
ａ）凝固第１０因子（ＦＸ）とのウイルス結合を妨げる、ヘキソン超可変領域７のＩ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４Ｓ、Ｅ４５０ＱまたはＬ４２６Ｙ点突然変異（ＨＶＲ７突然変異）のうちの少なくとも１つ；
ｂ）コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とのウイルス結合を妨げる、ファイバーノブ領域ＡＢループのＳ４０８ＥまたはＰ４０９Ａ点突然変異（ＫＯ１突然変異）のうちの少なくとも１つ；および
ｃ）αＶβ３／αＶβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げる、ペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）のＤ３４２ＥまたはＤ３４２Ａ点突然変異のうちの少なくとも１つ
を含む改変Ａｄ５血清型アデノウイルスが提供される。
【０００８】
本発明による改変Ａｄ５血清型アデノウイルスは、オフターゲット組織に感染するその能力がひどく損なわれ、実際、肝臓および脾臓に感染することが防止／阻害され、また体の細胞に広範囲に感染する能力も折り合っているので、有利である。したがって、改変アデノウイルスは、感染することができる組織の点で折り合っている。
【０００９】
アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する正二十面体ヌクレオカプシドを有する、中型サイズ（９０〜１００ｎｍ）のノンエンベロープ（外側の脂質二重層を有さない）ウイルスである。ヒトでは、７つの種（ヒトアデノウイルスＡ〜Ｇ）に分類される５７の一般に認められたヒトアデノウイルス血清型（Ａｄ−１〜５７）がある：Ａ−１２、１８、３１；Ｂ−３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０、５５；Ｃ−１、２、５、６、５７；Ｄ−８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３６、３７、３８、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５４、５６；Ｅ−４；Ｆ−４０、４１；およびＧ−５２。したがって、本明細書におけるＡｄ５への言及は、アデノウイルスのＣサブクラスに属するアデノウイルス血清型５を指す。
【００１０】
当業者に知られているように、アデノウイルスビリオンは、ウイルスＤＮＡ−タンパク質コア複合体を取り囲むノンエンベロープ正二十面体形カプシドからなる。ヘキソンが最も豊富な構造タンパク質であり、カプシド１個当たり２４０コピーの三量体分子を有する。１２コピーのヘキソン三量体が、カプシドの２０個の三角形切子面の各々を形成する。ペントンベースとファイバータンパク質の複合体がカプシドの頂点をシールし、そして、ウイルスの付着（ファイバー）および内部移行（ペントンベース）を促進する。
【００１１】
ヘキソンタンパク質は、９つの超可変領域（ＨＶＲ）を除いて、さまざまなアデノウイルス血清型間で高度に保存されている。これらのＨＶＲはヘキソンタンパク質の露出面を形成する２つの異なるループに存在し、ＨＶＲ１〜６はＤＥ１ループ内にあり、ＨＶＲ７〜９はＦＧ１ループ内に位置する。
【００１２】
したがって、本明細書におけるＨＶＲ７の少なくとも１つの突然変異への言及は、超可変領域７の突然変異を指す。具体的には、前記の少なくとも１つのＨＶＲ７突然変異は、凝固第Ｘ因子との相互作用を妨げ、それによって改変アデノウイルスの肝臓へのオフターゲット隔離を制限し、そして、標的がん細胞への標的化を改善する。
【００１３】
好ましい実施形態では、前記少なくとも１つのＨＶＲ７突然変異は、Ｉ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４Ｓ、Ｅ４５０ＱまたはＬ４２６Ｙを含む群のうちの１以上から選択されるＦＸ相互作用を妨げる少なくとも１つのアミノ置換突然変異を含む。最も好ましくは、前記少なくとも１つのＨＶＲ７突然変異は、追加的または代替的に、Ｉ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４ＳおよびＬ４２６Ｙ点突然変異のうちの少なくとも１つを含む。
【００１４】
当業者に知られているように、アデノウイルスベクターは、ベクターの広範な分布をもたらす天然の向性を有する。Ａｄ５のようなグループＣアデノウイルスの細胞への侵入は、ウイルスファイバータンパク質とコクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の相互作用を通したウイルスの細胞への高親和性結合を伴うと考えられている。したがって、抗がん療法の目的のために、アデノウイルスベクターを特定の組織または細胞型に標的化することは、特異性を改善するためにベクターの正常な向性の改変を必要とする。
【００１５】
アデノウイルス感染は、ウイルス表面上の特殊なタンパク質、すなわちアデノウイルスファイバータンパク質、特に、カルボキシ末端ノブドメインと呼ばれるアデノウイルスファイバータンパク質の球状カルボキシ末端ドメインによる宿主細胞受容体の認識で始まる。したがって、本明細書におけるアデノウイルスファイバータンパク質のノブへの言及は、アデノウイルスファイバータンパク質の球状カルボキシ末端ドメインへの言及である。
【００１６】
したがって、少なくとも１つのＫＯ１突然変異への言及は、ファイバーノブ領域ＡＢループの少なくとも１つの突然変異を指す。具体的には、前記の少なくとも１つのＫＯ１突然変異は、ＣＡＲへのウイルス結合を妨げる。好ましい実施形態では、前記の少なくとも１つのＫＯ１突然変異は、Ｓ４０８ＥまたはＰ４０９Ａを含む群のうちの１以上から選択されるＣＡＲ結合を妨げる少なくとも１つの点突然変異を含む。最も好ましくは、前記点突然変異は、Ｓ４０８ＥおよびＰ４０９Ａ点突然変異を含む。
【００１７】
アデノウイルスペントンベースは５つのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含み、インテグリンアルファｖベータ３およびアルファｖベータ５（αＶβ３／αＶβ５）に結合して、ウイルス内部移行を可能にすることによってウイルス感染を促進する。この相互作用を妨げることにより、脾臓へのオフサイト標的化が減少し、それによって腫瘍特異的標的化が促進され、さらに、抗がん療法の状況で使用した場合に、そうでなければ有害な免疫宿主応答をもたらす炎症性サイトカインの放出が弱められることが分かった。
【００１８】
したがって、少なくとも１つのＲＧＤ突然変異への言及は、αＶβ３／αＶβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げる、ペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの少なくとも少なくとも１つの突然変異（ＲＧＤ突然変異）を指す。好ましい実施形態では、前記少なくとも１つのＲＧＤ突然変異は、それぞれＲＧＥまたはＲＧＡをもたらすＤ３４２ＥまたはＤ３４２Ａを含む群のうちの１以上から選択される少なくとも１つの点突然変異を含む。最も好ましくは、前記点突然変異が、ＲＧＥをもたらすＤ３４２Ｅである。
【００１９】
なおさらに好ましい実施形態では、前記アデノウイルスは、腫瘍細胞、特に特定の型の腫瘍細胞を選択的に標的化する少なくとも１つのがん標的化改変を含むようにさらに改変されている。当業者によって理解されるように、アデノウイルスの天然の向性を改変するための本明細書に記載される突然変異の組み込み、およびまた少なくとも１つの標的化改変／配列の導入を通して、前記改変ウイルスは改善した腫瘍特異性および減少したオフサイト標的化を有し、それによって不要な副作用が減少する。がん標的化改変／配列の例は、当業者に知られており、例えば、それだけに限らないが、アミノペプチダーゼＮに結合するＮＧＲ（含有）ペプチド、特にアデノウイルスファイバータンパク質のＨＩループにＮＧＲを有するアデノウイルス（Ａｄ）；汎がんマーカーＥｐｈＡ２に結合するＹＳＡ（含有）ペプチド、特にＥｐｈＡ２陽性がん細胞の強力な形質導入をもたらすが、ＥｐｈＡ２陰性がん細胞の形質導入はもたらさないキメラファイバーにＹＳＡを有するアデノウイルス；成長因子抗体、特にこれらの標的化部分の化学結合、例えばｂＦＧＦ、ＥＧＦＲ、例えばアビジン／ビオチン結合を使用したアデノウイルスに対する抗体（例えば、セツキシマブ、ハーセプチン、アバスチンなど）；およびいったんウイルスの外側に付着すると（典型的には、化学的に結合、例えばヒアルロニダーゼを介した結合）、細胞外膜を分解し、ウイルスが腫瘍微小環境にさらに効率的に浸透できるようにするマトリックス分解酵素がある。
【００２０】
好ましい実施形態では、前記がん標的化改変は、Ａ２０ペプチド配列ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）などのαｖβ６インテグリン結合ペプチド（配列結合および相同性技術のような従来の技術を使用して同定される）の、それぞれウイルスへのまたはウイルスによる、理想的にはウイルスファイバーノブＨＩループへのまたはここでの挿入または発現を含む（この改変ウイルスは以下でＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０と呼ばれる）。Ａ２０は元々、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１に由来し、αｖβ６インテグリンに対して高い親和性を有する。αｖβ６インテグリンは、卵巣がんの３分の１および種々の他の上皮がんで発現され、健康な成人組織では検出できない。したがって、当業者に理解されるように、改変ウイルスにおけるこの配列の発現および組み込みを通して、改変ウイルスが、それだけに限らないが、卵巣がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、皮膚がん、乳がん、腎臓がんおよび結腸直腸がんのようなαｖβ６インテグリン過剰発現がんを選択的に標的化することができる。
【００２１】
当業者であれば、列挙される突然変異のホモログ、オルソログまたは機能的誘導体もまた、本発明の状況において用途を見出すことを理解するだろう。よって、例えば、１以上の付加、欠失、置換などを含む突然変異は、本発明に包含される。加えて、あるアミノ酸を類似の「型」の別のアミノ酸で置き換えることが可能となり得る。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置き換えることは、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを使用してアミノ酸配列を比較することによって達成することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、必要に応じていずれかの配列にスペースを挿入することによって、最適なアライメントを見出す。最適なアライメントのために、アミノ酸の同一性または類似性（同一性とは、アミノ酸型の保存を意味する）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘなどのプログラムは、最長の類似の配列をアラインメントし、値をフィットに割り当てる。したがって、それぞれが異なるスコアを有するいくつかの類似性の領域が見出される比較を得ることが可能である。本発明では、両方の型の分析が意図される。
【００２２】
なおさらに好ましい実施形態では、前記改変アデノウイルスベクター（Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０）は、
ａ）凝固第１０因子（ＦＸ）とのウイルス結合を妨げる、ヘキソン超可変領域７のＩ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４Ｓ、Ｅ４５０ＱまたはＬ４２６Ｙ点突然変異（ＨＶＲ７突然変異）のうちの少なくとも１つ；
ｂ）コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とのウイルス結合を妨げる、ファイバーノブ領域ＡＢループのＳ４０８ＥまたはＰ４０９Ａ点突然変異（ＫＯ１突然変異）のうちの少なくとも１つ；
ｃ）αＶβ３／αＶβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げる、ペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）のＤ３４２ＥまたはＤ３４２Ａ点突然変異のうちの少なくとも１つ；および
ｄ）ウイルスファイバーノブＨＩループ中にＡ２０ペプチド配列ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）の挿入または発現
を含む。
【００２３】
より好ましくは、前記改変アデノウイルスベクター（Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０）は、
ａ）凝固第１０因子（ＦＸ）とのウイルス結合を妨げる、ヘキソン超可変領域７のＩ４２１Ｇ、Ｔ４２３Ｎ、Ｅ４２４ＳおよびＬ４２６Ｙ点突然変異（ＨＶＲ７突然変異）；
ｂ）コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とのウイルス結合を妨げる、ファイバーノブ領域ＡＢループのＳ４０８ＥおよびＰ４０９Ａ点突然変異（ＫＯ１突然変異）；
ｃ）αＶβ３／αＶβ５インテグリンとのウイルス結合を妨げる、（ＲＧＥ突然変異をもたらす）ペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−ＡｓｐのＤ３４２Ｅ点突然変異；および
ｄ）ウイルスファイバーノブＨＩループ中にＡ２０ペプチド配列ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）の挿入または発現
を含む。
【００２４】
本発明の上記ウイルスベクターにおいて、本発明者らは、主要なカプシドタンパク質：ヘキソン、ファイバーおよびペントンを突然変異させることにより、Ａｄ５の天然の向性をうまく切除した。凝固第１０因子（ＦＸ）、コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）、およびαｖβ３／５インテグリンとの結合をそれぞれ担うアミノ酸残基の置換突然変異を含む、ヘキソン超可変領域７（ＨＶＲ７突然変異）、ファイバーノブＡＢループ（ＫＯ１突然変異）およびペントンインテグリン結合モチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの改変（ＲＧＤ突然変異）により、トリプル脱標的化（ｄｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）Ａｄ５系ベクター骨格を作製した（Ａｄ５．３Ｄ）。
【００２５】
Ａｄ５．３Ｄベクターは相同組換え技術を使用して作製し、損なわれたアデノウイルスを救済するように設計された相補的細胞株を使用して高ウイルス力価で提供した。３つの向性切除突然変異の組み合わせにより、インビトロでのαｖβ３／５インテグリン、ＣＡＲおよびＦＸを介した細胞侵入が完全に遮断された。さらに、原理の証明として、本発明者らは、異種αｖβ６インテグリン結合ペプチド（Ａ２０、ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ；配列番号１）のウイルスファイバーノブのＨＩループ内への遺伝子組み込みにより、特定のがん腫瘍細胞、すなわちαｖβ６を優先的に標的化し、これに感染するための追加の標的化配列の組み込みによって、アデノウイルスをさらに改変した（Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０）。β６を過剰発現するように設計された２９６−β６細胞を使用して、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０アデノウイルスを増殖した。
【００２６】
αｖβ６インテグリンは、卵巣がんの３分の１および種々の他の上皮がんで発現され、健康な成人組織では検出できない。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０は、高度中和腹水の存在下においてさえ、αｖβ６＋卵巣がん細胞株および初代臨床腹水由来ＥＯＣエキソビボ培養物を効率的に形質導入した。非腫瘍保有マウスでの全身送達後のＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０のインビボ生体内分布プロファイルは、Ａｄ５と比較して著しく変化し、全てのオフターゲット臓器でルシフェラーゼ発現が減少し、肝臓でウイルスゲノム負荷が７ｌｏｇ減少した。さらに、腹腔内送達後の腫瘍溶解性Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０（ＯＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０）の抗腫瘍有効性を、腹腔内ＳＫＯＶ３（−β６）ＥＯＣ異種移植片を保有する免疫不全マウスで評価した。ＯＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０による腫瘍溶解性処置は、Ａｄ５処置と比較して全生存率を改善した。
【００２７】
したがって、Ａｄ５．３Ｄ改変アデノウイルスは、さらなるがん特異的標的化突然変異の組み込みを通して、がん治療およびアデノウイルス療法のための刺激的な標的化プラットフォームを提供するウイルスベクターである。
【００２８】
なおさらに好ましい実施形態では、前記アデノウイルスは、限定されないが、治療薬剤のような分子または薬剤をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含むようにさらに改変されている。したがって、この実施形態は、標的化がん細胞に対して治療作用を発揮するための、細胞内での薬剤の送達に関する。薬剤の例には、免疫応答を直接刺激する薬剤、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２；免疫系を間接的に刺激する薬剤、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ１またはＬａｇ３のようなコリプレッサーを阻害する免疫チェックポイント阻害剤をコードする抗体（または抗体のフラグメント）；二重特異性Ｔ細胞結合（ＢｉＴＥ）抗体構築物；二重特異性ナチュラルキラー細胞結合（ＢｉＫＥ）抗体構築物；例えばＣＤ１９をコードする、腫瘍を細胞ベースの免疫療法に感作する薬剤；抗ＣＤ２５抗体をコードする、腫瘍微小環境内の制御性Ｔ細胞を枯渇させる薬剤；例えばナトリウム／ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）またはソマトスタチン受容体２型（ＳＳＴＲ２）をコードすることによって、腫瘍を放射線療法に対してまたは画像化のために感作する薬剤が含まれ得る。あるいは、導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ（ＲＥＩＣ／ＤＫＫ３）をコードし、または非毒性プロドラッグから毒性薬物への変換を介してがん細胞を感作する酵素、例えばシトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼをコードすることによって、腫瘍細胞に対して直接毒性である治療剤をコードすることができる。当技術分野で知られておりがんの治療に有用な他の導入遺伝子を、本発明の実施に使用することができる。
【００２９】
なおさらに好ましい実施形態では、前記アデノウイルスは、ウイルス複製をｐＲＢ欠損細胞に制限するために、２４塩基対の欠失ｄｌ９２２〜９４７（Δ２４突然変異）をＥ１Ａ遺伝子に含めるようにさらに改変されている。
【００３０】
さらにより好ましくは、前記アデノウイルスは、腫瘍溶解能を高めるために、Ｅ３／１９Ｋの小胞体（ＥＲ）保持ドメイン内の４４５位に単一のアデニン塩基付加（Ｔ１突然変異）を含むようにさらに改変されている。
【００３１】
本発明の第２の態様によると、医薬として使用するための、本明細書に定義される改変アデノウイルスが提供される。
【００３２】
本発明の第３の態様によると、がんの治療に使用するための、本明細書に定義される改変アデノウイルスが提供される。
【００３３】
本発明の第４の態様によると、がんを治療するための医薬の製造において使用するための、本明細書に定義される改変アデノウイルスが提供される。
【００３４】
最も好ましくは、本明細書で言及されるがんが、以下のがんのうちのいずれか１以上を含む：上咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎がん、結合組織のがん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、咽喉がん、口腔がん、肝臓がん、骨がん、膵臓がん、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、尿管がん、脳がん、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨がん、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発不明がん、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳がん、パジェット病、子宮頸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、胆嚢がん、頭部がん、眼がん、頸部がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝臓がん、カポジ肉腫、前立腺がん、肺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟部肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛がん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉がん、心臓がん、口唇がん、髄膜がん、口腔がん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がんおよび扁桃がん。
【００３５】
医薬に使用するための化合物は、一般に、医薬または獣医用組成物で提供され、したがって、本発明のさらに第５の態様によると、本明細書に定義されるアデノウイルス、および薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００３６】
適切な医薬賦形剤は、当業者に周知である。医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口、頬側、経鼻または気管支（吸入）、経皮または非経口による投与用に製剤化することができ、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。
【００３７】
組成物は、上に定義されるアデノウイルスを担体と会合させることによって調製することができる。一般に、製剤は、アデノウイルスを液体担体または微粉固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって調製される。本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、上に定義されるアデノウイルスを、薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルと組み合わせるまたは会合させるステップを含む方法に及ぶ。
【００３８】
本発明のなおさらなる態様によると、がんを治療する方法であって、有効量の本明細書に定義される改変アデノウイルスまたは医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００３９】
本明細書における「有効量」のアデノウイルスまたは同アデノウイルスを含む組成物への言及は、がん細胞死のような所望の生物学的効果を達成するのに十分な量である。有効投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存することが理解される。典型的には、有効量は治療を投与する者によって決定される。
【００４０】
以下の特許請求の範囲および前記の本発明の説明では、明示的な言語または必要な含意のために文脈が他に必要とする場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、包括的意味で、すなわち、述べられた特徴の存在を指定するが、本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在も追加も排除しないために使用される。
【００４１】
本明細書に引用される、あらゆる特許または特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。参考文献が先行技術を構成することは認められない。さらに、先行技術のいずれかが当技術分野における一般的知識の一部を構成することは認められない。
【００４２】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して説明される通りであり得る。
【００４３】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるだろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示される特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または実施例と併せて説明される特徴、整数、特性、化合物または化学部分は、矛盾しない限り、本明細書に記載される他の任意の態様、実施形態または実施例に適用できると理解されるべきである。
【００４４】
さらに、特に明記しない限り、本明細書に開示される特徴は、同じまたは類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。
【００４５】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、明細書は、文脈上別段の要求がない限り、複数性ならびに単数性を企図するものとして理解されるべきである。
【００４６】
ここで、本発明の実施形態を、以下を参照して、単なる例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】作製したベクター。（Ａ）Ａｄ５およびトリプル脱標的化ａｖβ６インテグリン再標的化ベクター、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０のウイルス力価および予想される向性を示す図である。（Ｂ）腫瘍溶解性Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０のベクターマップを示す図である。（Ｃ）アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ファイバーノブおよびＨＩループ（緑色）におけるＡ２０ペプチド（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ；配列番号１）挿入を有する改変Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ファイバーノブの比較予測３Ｄモデリングを示す図である。ＣＡＲ、コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体；ＦＸ、凝固第１０因子；ＨＶＲ７、ヘキソン超可変領域７のＦＸ結合突然変異；ＫＯ１、ファイバーノブＡＢループのＣＡＲ結合突然変異；Ｌｕｃ、ルシフェラーゼ導入遺伝子；ｖｐ、ウイルス粒子。
【図２】天然受容体向性の切除。（Ａ）コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）への複製欠損Ａｄ５およびＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターの結合を示す図である。Ａｄ５と比較したＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０からのウイルス導入遺伝子発現の比をバーの上に示す。（Ｂ）凝固第１０因子への複製欠損Ａｄ５およびＨＶＲ７突然変異Ａｄ５バリアントの結合を示す図である（抗凝固薬Ｘ−ｂｐを含む（＋）または含まない（−）ヒトＦＸの存在下、３７℃で３時間、細胞を感染させることによって、ルシフェラーゼアッセイでＦＸ０を評価した）。ＨＶＲ７、ＦＸ結合突然変異。統計的有意性：ｎｓ、ｐ？０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図３】αｖβ６インテグリン標的化のインビトロ評価。（Ａ）αｖβ６＋ＢＴ−２０乳がん細胞における複製欠損野生型（Ａｄ５）およびトリプル脱標的化、インテグリン再標的化（Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０）ベクターの形質導入効率を示す図である。（Ｂ）患者００４のαｖβ６＋原発性上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）細胞における複製欠損野生型（Ａｄ５）ベクターおよびトリプル脱標的化、インテグリン再標的化（Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０）ベクターの形質導入効率を示す図である。（Ｃ）感染したａｖβ６−ｌｏｗ／ＣＡＲ＋ＳＫＯＶ３およびａｖβ６−ｈｉｇｈ／ＣＡＲ＋ＳＫＯＶ３−β６細胞（ａｖβ６のレトロウイルス発現を伴う自社製ＳＫＯＶ３細胞）における腫瘍溶解性ベクター（Ｔ１／Δ２４）によるルシフェラーゼ発現を示す図である。（Ｄ）αｖβ６インテグリン媒介細胞侵入の競合阻害を示す図である。最高の１０％αｖβ６発現ＳＫＯＶ３−β６細胞をＦＡＣＳで選別し、継代培養し、感染させた。ＩｇＧ、正常なマウスＩｇＧ対照；１０Ｄ５、抗αｖβ６機能遮断抗体。ウイルス導入遺伝子発現の比をバーの上に示す。統計的有意性ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図４】エキソビボでのベクター形質導入に対する悪性卵巣腹水の効果。（Ａ）ＥＬＩＳＡによる２０の臨床卵巣腹水（ＯＡＳ）試料および健康な男性ボランティアからの対照血清（黒色実線）における抗Ａｄ５抗体の定量化を示す図である。水平線は、対照血清における抗Ａｄ５  ａｂの５０％結合および１００％結合を示す。（Ｂ）ウエスタンブロットによる腹水および血清中の抗Ａｄ５抗体の抗原特異性を示す図である。（Ｃ）ＢＴ−２０細胞における卵巣がん患者００４からの腹水のさまざまな希釈の非存在下および存在下での複製欠損（Ａｄ５）ベクターおよびＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターのベクター形質導入効率を示す図である。（Ｄ）患者００４からの上皮性卵巣がん細胞の初代エキソビボ培養物における卵巣がん患者００４からの腹水のさまざまな希釈の非存在下および存在下での複製欠損（Ａｄ５）ベクターおよびＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターのベクター形質導入効率を示す図である。細胞を、上昇する濃度の腹水と共にプレインキュベートし、感染させた。
【図５】全身送達後７２時間での複製欠損ベクターの生体内分布。（Ａ）生体内分布試験スケジュールを示す図である。（Ｂ）静脈内注射３日後の、複製欠損（Ａｄ５）ウイルスおよびトリプル脱標的化Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ウイルスの生体内分布のインビボ画像化を示す図である。（Ｃ）全身におけるパネルＢからの総発光シグナルの定量化を示す図である。（Ｄ）肝臓、３３５におけるパネルＢからの総発光シグナルの定量化を示す図である。（Ｅ）脾臓におけるパネルＢからの総発光シグナルの定量化を示す図である。（Ｆ）肺におけるパネルＢからの総発光シグナルの定量化を示す図である。（Ｇ）卵巣におけるパネルＢからの総発光シグナルの定量化を示す図である。（Ｈ）心臓におけるパネルＢからの総発光シグナルの定量化を示す図である。ｉ．ｐ．、腹腔内；ＩＶＩＳ、インビボ画像化システム；ｐ．ｉ．、感染後；ｖｐ、ウイルス粒子。エラーバーは平均の標準誤差を表す；ｎ＝５／群；ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図６】全身送達後のオフターゲット臓器におけるウイルスゲノムコピー数。（Ａ）全身ベクター送達後のヘキソン遺伝子についてのｑＰＣＲによる、図５で切除された組織：肝臓からのアデノウイルスゲノムコピー数を示す図である。（Ｂ）全身ベクター送達後のヘキソン遺伝子についてのｑＰＣＲによる、図５で切除された組織：脾臓からのアデノウイルスゲノムコピー数を示す図である。（Ｃ）全身ベクター送達後のヘキソン遺伝子についてのｑＰＣＲによる、図５で切除された組織：肺からのアデノウイルスゲノムコピー数を示す図である。（Ｄ）全身ベクター送達後のヘキソン遺伝子についてのｑＰＣＲによる、図５で切除された組織：卵巣からのアデノウイルスゲノムコピー数を示す図である。（Ｅ）全身ベクター送達後のヘキソン遺伝子についてのｑＰＣＲによる、図５で切除された組織：心臓からのアデノウイルスゲノムコピー数を示す図である。データを正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでの一元配置ＡＮＯＶＡおよびＳｉｄａｋの多重比較事後検定によって分析した。エラーバーは平均の標準誤差を表す；ｎ＝５／群；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｐ＜０．０００１；ｎｓ、統計的有意差なし。グラフの下の数値は、Ａｄ５群と比較したＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０群の減少倍率を示す。
【図７】腫瘍溶解性有効性試験：卵巣がん異種移植片モデルにおける腫瘍溶解性ベクターの腹腔内送達。（Ａ）試験スケジュールを示す図である。ヒト卵巣がん細胞の腹腔内異種移植片（ＳＫＯＶ３およびＳＫＯＶ３−６）を免疫不全マウス（ｎ＝５／群）に移植し、次いで、１４日目、１６日目および１８日目に、３回用量の静脈内腫瘍溶解性Ａｄ５またはトリプル脱標的化、インテグリン再標的化Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０で処置した。（Ｂ）最初の処置の４８時間後（１６日目）に３４９で測定された発光ヒートマップ画像を示す図である。（Ｃ）最初の処置の４８時間後（１６日目）に３４９で測定された全身発光の定量化を示す図である。（Ｄ）最初の処置の７日後（２１日目）に３４９で測定された発光ヒートマップ画像を示す図である。（Ｅ）最初の処置の７日後（２１日目）に３４９で測定された全身発光の定量化を示す図である。（Ｆ）１０１日間の最終試験エンドポイントまで、カプラン・マイヤー生存曲線として示される上記のようにＳＫＯＶ３（αｖβ６−ｌｏｗ／ＣＡＲ＋）細胞を接種し、次いで、ウイルスで処置した動物の全生存率を示す図である。（Ｇ）１０１日間の最終試験エンドポイントまで、カプラン・マイヤー生存曲線として示される、上記のようにＳＫＯＶ３−β６（αｖβ６−ｈｉｇｈ／ＣＡＲ＋）細胞を接種し、次いで、ウイルスで処置した動物の全生存率を示す図である。ｉ．ｐ．、腹腔内；ＩＶＩＳ、インビボ画像化システム；ｖｐ、ウイルス粒子＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。ＩＶＩＳ、インビボ画像化システム。
【図８】生体内分布試験：エキソビボでの発光強度のヒートマップ画像。（Ａ）ＰＢＳ（対照）を静脈内接種された動物から死後直ちに収集された肝臓、脾臓、肺、卵巣および心臓を示す図である。（Ｂ）Ａｄ５．Ｌｕｃベクターを静脈内接種された動物から死後直ちに収集された肝臓、脾臓、肺、卵巣および心臓を示す図である。（Ｃ）Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターを静脈内接種された動物から死後直ちに収集された肝臓、脾臓、肺、卵巣および心臓を示す図である。臓器をＤ−ルシフェリンに浸し、ＩＶＩＳイメージャーで画像化した。組織の色は、ルシフェラーゼ導入遺伝子によって放出される相対的発光強度を示す；スケールを正規化して、バックグラウンド発光を除外した。（Ｄ）Ａｄ５．Ｌｕｃと比較した総発光（光子／秒）の減少倍率を示す図である。Ａｄ５．Ｌｕｃ群の平均発光強度を、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０群の各臓器の平均発光で割った。ＰＢＳ対照群の平均値を全ての値から差し引いた。
【図９】生体分布試験：ホルマリン固定、パラフィン包埋肝臓切片の免疫組織化学。（Ａ）細胞構造の可視化のためのヘマトキシリン−エオシン染色、ならびにウサギＩｇＧアイソタイプ対照抗体（１μｇ／ｍＬ）、一次ウサギ抗ＣＡＲ抗体（１：１００）および一次ウサギ抗ＩＴＧＢ６（αｖβ６）抗体（１：１０）を使用したマウス肝臓染色を示す図である。（Ｂ）一次ウサギ抗Ａｄ５抗体（１μｇ／ｍＬ）を使用した、Ａｄ５ベクターまたはＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターに感染した動物のＡｄ５感染肝細胞の染色を示す図である。ＤＡＢを基質として使用し、切片をヘマトキシリンで対比染色し、カバーガラスに取り付け、光学顕微鏡で観察した。
【図１０】パイロット試験：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の局在化および取り込み率を示す図である。１×１０７個のＳＫＯＶ３−β６細胞／動物を０日目にｉ．ｐ．移植し、７、１４、２１および４８／４９日目（最終エンドポイント）の各時点で２匹のマウスを屠殺した。おおよその腫瘍サイズを測定し、腹水の体積を定量化した。
【図１１】腫瘍溶解性有効性試験：エンドポイント腫瘍の特徴付け。（Ａ）ｑＰＣＲによるＳＫＯＶ３およびＳＫＯＶ３−β６コホートからのＯＡｄ５およびＯＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０の死後腫瘍におけるウイルスゲノムコピー数（４０ｎｇのＤＮＡ当たり）を示す図である。（Ｂ）ｑＰＣＲによるＳＫＯＶ３およびＳＫＯＶ３−β６コホートからのＯＡｄ５およびＯＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０の死後腫瘍におけるαｖβ６インテグリン（ＩＴＧＢ６）遺伝子発現を示す図である。αｖβ６発現のレベルを、内因性対照としてヒトＡＣＴＢ（β−アクチン）を使用することにより、ＳＫＯＶ３コホートにおける陰性対照ＰＢＳ群からのマウス番号１と比較して示す。
【図１２】膵臓がん細胞株におけるＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０およびＡｄ５発現ルシフェラーゼの形質導入活性。（Ａ）ＡＳＰＣ−１膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｂ）ＢｘＰｃ膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｃ）ＣＦＰＡＣ膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｄ）ＰＡＮＣ１０−０５膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｅ）ＳＷ１９９０膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｆ）ＰＡＮＣ０４０３膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｇ）ＳＵＩＴ−２膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｈ）ＭｉＰａＣａ２膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｉ）ＰＴ４５膵臓がん細胞株で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。細胞を５，０００ｖｐ／細胞のウイルス発現ルシフェラーゼで感染させ、感染後４８時間で導入遺伝子発現を定量化し、総細胞タンパク質について補正した。
【図１３】食道がん細胞株におけるＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０およびＡｄ５発現ルシフェラーゼの形質導入活性を示す図である。αｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを、Ｋｙｓｅ−３０食道がん細胞で決定した。細胞を５，０００ｖｐ／細胞のウイルス発現ルシフェラーゼで感染させ、感染後４８時間で導入遺伝子発現を定量化し、総細胞タンパク質について補正した。
【図１４】乳がん細胞株におけるＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０およびＡｄ５発現ルシフェラーゼの形質導入活性。（Ａ）ＢＴ−２０乳がん細胞で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｂ）ＢＴ−４７４乳がん細胞で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳がん細胞で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。細胞を５，０００ｖｐ／細胞のウイルス発現ルシフェラーゼで感染させ、感染後４８時間で導入遺伝子発現を定量化し、総細胞タンパク質について補正した。
【図１５】肺がん細胞株におけるＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０およびＡｄ５発現ルシフェラーゼの形質導入活性。（Ａ）Ａ４２７肺がん細胞で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｂ）Ａ５４９肺がん細胞で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。（Ｃ）ＮＣＩ−Ｈ４６０肺がん細胞で決定したαｖβ６およびｈＣＡＲの発現レベルを示す図である。細胞を５，０００ｖｐ／細胞のウイルス発現ルシフェラーゼで感染させ、感染後４８時間で、導入遺伝子発現を定量化し、総細胞タンパク質について補正した。
【図１６】膵臓がん細胞株および乳がん細胞株における複製欠損および腫瘍溶解性（Ｏ）Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ならびにＡｄ５の腫瘍溶解活性を示す図である。膵臓がん細胞株Ｓｕｉｔ  ２（αｖβ６ｈｉｇｈ／ｈＣＡＲｈｉｇｈ）、ＭｉＣａＰａ２（αｖβ６ｌｏｗ／ｈＣＡＲｈｉｇｈ）、ＰＡＮＣ０４０３（αｖβ６ｖｖｈｉｇｈ／ｈＣＡＲｈｉｇｈ）およびＰＴ４５（αｖβ６ｎｅｇ／ｈＣＡＲｈｉｇｈ）ならびに乳がん細胞株ＢＴ−２０（αｖβ６ｈｉｇｈ／ｈＣＡＲｎｅｇ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（αｖβ６ｎｅｇ／ｈＣＡＲｈｉｇｈ）を、２０，０００個細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔いた。細胞を５，０００ｖｐ／細胞で感染させ、標準的なＭＴＳ細胞生存率アッセイを使用して２４時間毎に細胞生存率を定量化した。予想通り、複製欠損ベクターは細胞生存率に対する有害効果を示さなかったが、ＯＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０およびＯＡｄ５の細胞殺傷（腫瘍溶解）活性は細胞αｖβ６およびｈＣＡＲの有／無に直接関連していた。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
材料および方法
アデノウイルスベクター、細胞株および臨床腹水
全ての作製したベクターはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現し、細菌人工染色体（ＢＡＣ）で捕捉された野生型Ａｄ５ゲノムに基づいていた。以前に記載されたように（Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１６）、全ての遺伝子改変は、ＡｄＺ相同組換え法（Ｓｔａｎｔｏｎら、２００８）によってＢＡＣに導入された。ウイルスを、Ｔ−Ｒｅｘ  ２９３またはＨＥＫ２９３−β６細胞（Ａ２０改変ウイルス）で産生させた。複製欠損ベクターは、Ｅ１／Ｅ３遺伝子欠失を有する一方、腫瘍溶解性ベクターは、ウイルス複製をｐＲＢ欠損細胞に制限するための（Ｓｈｅｒｒ，１９９６）、Ｅ１Ａ遺伝子における２４塩基対の欠失ｄｌ９２２−９４７（Δ２４）（Ｆｕｅｙｏら、２０００）、および、腫瘍溶解性の増強のための（Ｇｒｏｓら、２００８）、Ｅ３／１９Ｋの小胞体（ＥＲ）保持ドメイン内の４４５位のＴ１突然変異である、単一アデニン塩基付加を有する。ＦＭＤＶからの異種Ａ２０ペプチド配列（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ；配列番号１）を、ファイバーノブＨＩループに遺伝的に挿入した。高力価ウイルスを、本質的に以前に記載されたように（Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１５，Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１６）、Ｔ−ＲＥｘ−２９３細胞またはＨＥＫ２９３−β６細胞で産生させた。
【００４９】
ＳＫＯＶ３−β６細胞株は自作した。β６遺伝子挿入を有するピューロマイシン選択的ｐＢＡＢＥ−β６プラスミド（番号１３５９６；Ａｄｄｇｅｎｅ）を、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅを使用して２９３Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞株にトランスフェクトした。４８時間後、レトロウイルスを採取し、濾過し、ＳＫＯＶ３細胞を感染させるために使用した；αｖβ６インテグリン発現細胞を、５μｇ／ｍＬピューロマイシンの存在下で選択した。腹水からの初代ＥＯＣ細胞の収集および培養の許可は、生体材料についてのウェールズがんバンク申請を通して付与された（参照ＷＣＢ  １４／００４）。全ての患者が収集前に書面によるインフォームドコンセントを与えた。腹水臨床試料は、カーディフのＶｅｌｉｎｄｒｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅで進行性卵巣がんの治療を受けている患者から収集し、匿名化した。以前に記載されたように（Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１５、Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１６）、細胞を処理し、継代培養した。
【００５０】
インビトロアッセイ
細胞表面受容体発現を、抗αｖβ６クローン１０Ｄ５および抗ＣＡＲ抗体クローンＲｍｃＢ、引き続いて二次Ｆ（ａｂ’）２ヤギα−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＩｇＧ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を使用して、以前に説明されたように（Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１６）、フローサイトメトリーによって評価した。卵巣腹水および血清中の抗Ａｄ５抗体の存在を、本質的に以前に報告されたＥＬＩＳＡ法（Ｓｔａｌｌｗｏｏｄら、２０００）に従って決定した。抗体の抗原特異性をウエスタンブロットによって評価した。
【００５１】
インビトロでの細胞形質導入効率を、マルチモードプレートリーダーで、本質的に以前に記載されたように（Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１５、Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１６）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで評価し、相対光単位（ＲＬＵ）を、各ウェルの総タンパク質濃度（ＲＬＵ／ｍｇ）に正規化した。形質導入効率に対するＦＸの効果を評価するために、形質導入培地に１０μｇ／ｍＬのヒトＦＸを補充した。細胞受容体のベクター向性を、抗αｖβ６抗体（１０μｇ／ｍＬ；クローン１０Ｄ５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または通常の抗マウス対照ＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用して、以前に記載されたように（Ｕｕｓｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａら、２０１６）、競合阻害アッセイで評価した。中和アッセイは、無細胞ＯＡＳの２倍連続希釈（１：４０〜１：２．５、最終濃度２．５〜４０％に対応）でのプレインキュベーションステップを含んでいた。
【００５２】
インビボ試験
全ての動物実験は、米国、ロチェスターのＭａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃで実施した。結果の一貫性を保つため、全ての動物は７週齢とし、性別を一致させた；飼育のしやすさから雌マウスを選択した。全ての動物の取り扱いおよび注射は、現地の規制に従って、経験豊富な獣医技術者のＪｉｌｌ  Ｍ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ夫人によって実施された。
【００５３】
ルシフェラーゼ追跡についての白色毛皮の実行可能性により、野生型Ｂ６アルビノマウス（Ｂ６Ｎ−Ｔｙｒｃ−Ｂｒｄ／ＢｒｄＣｒＣｒｌ）（ｎ＝５／群）で、複製欠損ベクターの生体内分布試験を実施した。ウイルスを１×１０１１  ｖｐで側方尾静脈に注射した。全てのマウスを、ＣＯ２の吸入により、感染後７２時間のＩＶＩＳ画像化後に屠殺し、分析のために臓器を摘出した。有効性試験を免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝５／群）で実施した。処置スケジュールを、最初にパイロット試験（ｎ＝８）で最適化した。１×１０７個のＳＫＯＶ３−β６細胞を０日目にｉ．ｐ．移植し、そして、７、１４、２１および４８／４９日目（最終エンドポイント）に２匹のマウスを屠殺した。各時点での腫瘍におけるＣＡＲおよびαｖβ６の発現を、フローサイトメトリーによって評価した。腫瘍溶解性有効性試験では、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、０日目に１×１０７個のＳＫＯＶ３細胞またはＳＫＯＶ３−β６細胞をｉ．ｐ．異種移植した。次いで、マウス（ｎ＝５／群）を、１４、１６および１８日目に、１×１０１０  ｖｐのＯＡｄ（ＰＢＳ、ＯＡｄ５およびＯＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０）のｉ．ｐ．注射で処置した。主要エンドポイントは全生存率（％）とした。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００イメージャー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でルシフェラーゼ導入遺伝子によって放出される発光シグナルを定量化することによって、ベクターの取り込みを監視した。主要なオフターゲット臓器およびエンドポイント腫瘍におけるウイルスゲノムコピー数を、ｑＰＣＲによって定量化した。エンドポイント腫瘍におけるαｖβ６遺伝子発現のレベルを、ｑＰＣＲによって定量化した。
【００５４】
細胞生存率アッセイの簡潔なプロトコル
細胞生存率アッセイでは、製造元の推奨プロトコルに従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。２０，０００個または３０，０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩インキュベートした。細胞を、無血清培地中、細胞１個当たり５，０００個のウイルス粒子（ｖｐ／細胞）で３時間感染させた。感染後２４、４８、７２、９６および１４４時間に、１ウェル当たり２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬を添加することによって、生細胞を決定した。加湿した５％ＣＯ２雰囲気で２時間インキュベートした後、４９０ｎｍで吸光度を測定した。未処置細胞に対して生細胞の％を計算した。結果は平均、ｎ＝３であり、エラーバーは標準偏差を表す。
【００５５】
統計分析
全ての数値および統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０３で行った。インビトロおよびエキソビボアッセイを、両側の対応のないｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡとＤｕｎｎｅｔｔの多重比較事後検定によって分析した。インビボデータを正規化し、一元配置ＡＮＯＶＡとＳｉｄａｋの多重比較事後検定によって分析した。腫瘍溶解性処置後の全生存率（％）を、カプラン・マイヤー生存曲線として示す；生存率をゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定によって分析した。全ての試験：ｎｓ、ｐ＞０，０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００５６】
結果
３つの脱標的化突然変異およびベクターをαｖβ６インテグリン発現細胞に再標的化するＡ２０ペプチド挿入を有する新規なＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターの高ウイルス力価の複製欠損および腫瘍溶解性バリアントを、作製および産生した（図１）。複数の遺伝子操作は、力価に有意な影響を与えなかった。ＳＷＩＳＳ１４７  ＭＯＤＥＬプラットフォームでの予測モデリングは、免疫優勢ＨＩループ内のＡ２０ペプチドの突出を示した（図１Ｃ）。
【００５７】
複製欠損ベクターの形質導入効率を、可変量のＣＡＲおよびαｖβ６インテグリンを発現する細胞株で評価した。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０の脱標的化突然変異は、ＣＨＯ−ＣＡＲ細胞（ＣＡＲ＋）におけるＣＡＲを介した侵入を完全に廃止したが、Ａｄ５はこれらの細胞を効率的に形質導入した（図２Ａ）。ＨＶＲ７突然変異により、ＦＸを介したベクター形質導入が廃止された（図２Ｂ）。予想通り、ＦＸは、ＦＸを含まない培養条件と比較して、これらの細胞へのＡｄ５の形質導入を有意に増加させた（図２Ｂ；右パネル）。逆に、培養培地へのヒトＦＸの添加は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＦＸ結合切除Ａｄ５．ＨＶＲ７対照ベクターの形質導入効率に効果がなかった（図２Ｂ；左パネル）。さらに、Ａｄ５について見られる形質導入増強は、培地中で、３：１モル過剰のＦＸに結合してこれを不活性化するＧｌａドメイン相互作用タンパク質である抗凝固薬Ｘ−ｂｐの添加によって逆転した（図２Ｂ、右パネル）。対照的に、ＦＸ枯渇は、Ａｄ５．ＨＶＲ７ベクターの形質導入に影響を及ぼさなかった（図２Ｂ、左パネル）。
【００５８】
αｖβ６インテグリンは、トリプル脱標的化、インテグリン再標的化Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０の主要な侵入受容体として確認された（図３）。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０は、Ａｄ５と比較して、αｖβ６＋／ＣＡＲ−ＢＴ−２０乳がん細胞を、３０５倍高い効率で形質導入し（図３Ａ；ｐ＝０．０２７０）、初代ＥＯＣ００４細胞（αｖβ６＋／ＣＡＲ−）を６９倍増加した効率で形質導入した（図３Ｂ；ｐ＝０．００９０）。加えて、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターの腫瘍溶解性バリアントは、低レベルのαｖβ６を発現するＳＫＯＶ３細胞（αｖβ６−ｌｏｗ／ＣＡＲ＋、図３Ｃ；ｐ＜０．０００１）と比較して、約５倍増加した効率でＳＫＯＶ３−β６細胞（αｖβ６−ｈｉｇｈ／ＣＡＲ＋）を形質導入し、腫瘍溶解性改変がＡ２０ペプチド：αｖβ６相互作用を損なわなかったことが確認された。抗αｖβ６抗体（１０Ｄ５）を使用した競合アッセイは、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターによる形質導入を有意に阻害し（１６９  図３Ｄ；ｐ＝０．００１０）、αｖβ６の選択性が確認された。
【００５９】
２０人の患者からの臨床卵巣腹水（ＯＡＳ）試料を、ＥＬＩＳＡによって抗Ａｄ５抗体の存在についてスクリーニングした。悪性卵巣腹水における抗Ａｄ５  ａｂの力価を、健康な成人男性ボランティアの血清抗Ａｄ５抗体力価に対して精査した（図４Ａ）。同等の割合の患者が、対照血清よりも低い抗体力価および高い抗体力価を有することが分かった（図４Ａ、黒色点線）。患者００１の腹水（ＯＡＳ００１）を、対照血清と抗体力価が類似しているため、その後の中和アッセイに選択した。ＯＡＳ００１および対照血清の抗体は、ファイバータンパク質に特異的であるように見えたが、最も豊富なカプシドタンパク質ヘキソンは、変性ウイルス粒子を使用したウエスタンブロットで、非常に低レベルでのみ認識された（図４Ｂ）。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０の形質導入効率に対するＯＡＳ００１の中和効果を、αｖβ６＋／ＣＡＲ−ＥＯＣ００４初代細胞で評価した。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０は、２．５、５および１０％のＯＡＳ濃度で、Ａｄ５と比較して優れた形質導入効率（最大９０２倍高い）を示したが、Ａｄ５はこれらの細胞を検出可能なレベルで形質導入しなかった（図４Ｃ）。
【００６０】
非腫瘍保有マウスに静脈内接種して、インビボでのベクターの向性、特にベクター生体内分布に対する３つの脱標的化突然変異の効果を評価した（図５Ａ）。Ａｄ５は肝臓および脾臓の領域に強い局在化を示したが、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターによる発光は７２時間で検出できなかった（図５Ｂ）。Ａｄ５を接種された動物は、ＰＢＳ（ｐ＜０．０００１）またはＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０（ｐ＜０．０００１）で処置された対照動物よりも全身発光が有意に高かった（図５Ｃ）。肝臓、脾臓、肺、卵巣および心臓を摘出し、エキソビボ発光について定量化した（発光ヒートマップについては、図８Ａ〜図８Ｃ参照）。Ａｄ５負荷動物の肝臓は、ＰＢＳ対照またはＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０群よりも有意に強く発光した（共にｐ＜０．０００１）（図５Ｄ）。同様に、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０は、Ａｄ５と比較して、脾臓、肺、卵巣および心臓における導入遺伝子発現を有意に減少させた（図５Ｅ〜図５Ｈ；全てでｐ＜０．０００１）。各臓器における発光強度の変化倍率については、図８Ｄを参照されたい。
【００６１】
Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０の改変により複数の正常な組織におけるウイルスの隔離が１９６減少したことの確認を、ｑＰＣＲによるオフターゲット臓器のウイルス負荷の定量化を介して確認した。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０のゲノムコピー数は、Ａｄ５と比較して肝臓で１０００万倍低かった（図６Ａ；ｐ＜０．０００１）。同様に、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ゲノムコピー数は、Ａｄ５と比較して脾臓で７００倍超低かった（図６Ｂ；ｐ＜０．０００１）。加えて、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターは、Ａｄ５と比較して全ての臓器でオフターゲットプロファイルの改善を示し、ウイルス負荷が肺、心臓および卵巣でそれぞれ１０５、１０４、１０３低かった（図６Ｃ〜図６Ｅ）。肝臓の脱標的化成功がＡｄ５の遺伝子改変によるものであることは、αｖβ６は検出できなかった一方で、ＣＡＲの高い発現レベルを示した肝臓切片の免疫組織化学的染色によって裏付けられている（図９Ａ）。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０での遺伝子改変の脱標的化効果の確認は、マウスの肝臓切片が、Ａｄ５群ではＡｄカプシドタンパク質について陽性染色を示したが、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターで負荷されたマウスの肝臓では示さなかったことの観察によって提供される（図９Ｂ）。
【００６２】
インビボがんモデルでαｖβ６再標的化の有効性を評価するために、αｖβ６−ｈｉｇｈ／ＣＡＲ−ＳＫＯＶ３−β６ヒト卵巣がん異種移植片を免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで確立した。動物は、ＳＫＯＶ３−β６細胞の腹腔内移植後１４日以内に細胞注射部位および腹腔内のさまざまな部位で大きな固形腫瘍を発症し、４９日目までに、腫瘍は大量の腹水を蓄積して腹腔全体に広がった。腫瘍は高いαｖβ６発現を保持していた（フローサイトメトリーについては、図１０参照）。これらの観察に基づいて、αｖβ６−ｌｏｗ／ＣＡＲ−ＳＫＯＶ３およびαｖβ６−ｈｉｇｈ／ＣＡＲ−ＳＫＯＶ３−β６の移植後１４、１６、および１８日目に、３回静脈内投与のＡｄ５およびＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０の腫瘍溶解性バリアントを送達することによって、ウイルス療法有効性試験を実施した。
【００６３】
最初のウイルス療法処置投与（１６日目）の４８時間後のＩＶＩＳ画像化は、腫瘍溶解性Ａｄ５ベクターで処置された動物の腹部領域全体に広範囲の発光を示し、ＳＫＯＶ３とＳＫＯＶ３−β６異種移植モデルの両方で、肝臓／脾臓領域で最高の強度であった（図７Ｂ）。この分布は維持されたが、５日後の２１日目に、強度は低下した（図７Ｄ）。対照的に、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０  ２２３ベクターは非常に選択的な局在化を示し、非腫瘍組織の脱標的化成功と一致して、Ａｄ５と比較して全体的発光が有意に減少した。ＳＫＯＶ３モデルとＳＫＯＶ３−β６モデルの両方で、全身発光の定量により、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターの取り込みが１６日目（図７Ｃ；それぞれｐ＜０．０５および＜０．０１）と２１日目（図７Ｅ；ｐ＜０．０００１）の両方でＡｄ５よりも有意に低いことが示された。
【００６４】
抗腫瘍活性は、ＳＫＯＶ３異種移植片モデルにおいて腫瘍溶解性Ａｄ５と腫瘍溶解性Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０の両方について見られた（図７Ｆ）。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０の増強した腫瘍選択的効果と一致して、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０で処置された５匹のマウスは全て１０１日間の最終時点でまだ生きていたが、Ａｄ５で処置された動物は最大７０日間しか生存しなかった。
【００６５】
膵臓（図１２）、食道（図１３）、乳房（図１４）および肺（図１５）起源の一連のがん細胞株で、追加の形質導入アッセイを実施した。全ての細胞型を、最初にαｖβ６およびｈＣＡＲ発現について分析した（各図のヒストグラム）。７／９膵臓細胞株（ＡＳＰＣ−１、ＢｘＰｃ、ＣＦＰＡＣ、ＰＡＮＣ  １０．０５、ＳＷ１９９０、ＰＡＮＣ  ０４０３およびＳｕｉｔ２）が、αｖβ６をさまざまなレベルで発現し、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０で効率的に形質導入することができた（図１２Ａ〜図１２Ｇ）。逆に、予測されるように、ＭｉＰａＣａ２（図１２Ｈ）およびＰＴ４５（図１２Ｉ）細胞は、αｖβ６を非常に低く発現したまたは全く発現せず、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０媒介形質導入に対してあまり許容的でなかった。食道細胞株Ｋｙｓｅ−３０は高レベルのαｖβ６を発現し、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０媒介形質導入に非常に許容的であった（図１３）。試験した乳がん細胞株では、試験した４つの細胞株のうち３つ（ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４およびＭＤＡ−ＭＢ３６１）がさまざまな程度でαｖβ６を発現し、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０による形質導入に許容的であった（図１４Ａ〜図１４Ｃ）が、逆に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、αｖβ６の発現の欠如により、細胞がＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０に対して非感染性になった（図１４Ｄ）。試験した３つの肺がん細胞株全てで（Ａ４２７、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４６０、図１５Ａ〜図１５Ｃ）、αｖβ６が存在せず、細胞はＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０媒介形質導入に対して屈折性であった。
【００６６】
Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０の腫瘍溶解性バージョンの細胞殺傷活性を評価するために、αｖβ６ｈｉｇｈ（Ｓｕｉｔ２、Ｐａｎｃ０４０３）およびαｖβ６ｌｏｗ（ＭｉＰａＣａ２）またはαｖβ６ｎｅｇ（ＰＴ４５）膵臓がん細胞株で、細胞生存率アッセイを実施した（図１６）。細胞を、５，０００ｖｐ／細胞の、複製欠損Ａｄ５もしくはＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０、または、腫瘍溶解性（Ｏ）Ａｄ５もしくはＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０のいずれかで感染させた。予想通り、複製欠損ベクターは細胞生存率に対する有意な効果を媒介しなかったが、一方、腫瘍溶解性ベクターの細胞殺傷活性はαｖβ６発現とよく相関することが示された。同様に、αｖβ６ｈｉｇｈ／ｈＣＡＲｎｅｇトリプルネガティブ乳がん細胞株ＢＴ−２０では、高レベルのαｖβ６の存在とｈＣＡＲの欠如が組み合わさって、ＯＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０のみが細胞殺傷を効率的に媒介することができた。逆に、αｖβ６ｎｅｇ／ｈＣＡＲｈｉｇｈ乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、ｈＣＡＲの存在およびαｖβ６の非存在により、ＯＡｄ５のみが細胞を効率的に殺傷することができた。
【００６７】
考察
全ての既知の向性が切除され、過剰発現した予後診断がんマーカーであるαｖβ６インテグリンに再標的化された、新規な腫瘍選択的腫瘍溶解性アデノウイルスベクター、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０について記載する。インテグリンαｖβ６は、侵攻性形質転換がんで発現するため、治療的がん用途の有望な標的である。
【００６８】
本試験では、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターの複製欠損型が、天然のウイルス取り込み経路を介して細胞によるウイルス取り込みを脱標的化し（図２）、代わりにインビトロおよびエキソビボでαｖβ６＋細胞を選択的に再標的化することに成功した（図３）。アデノウイルスベクターの全身送達で発生する有効性を制限する相互作用は、理論的にはｉ．ｐ．投与を介したベクターの腔内投与によって迂回することができるが、実際には野生型Ａｄ５が腹水中の抗Ａｄ５  ｎＡｂによって隔離されるので、このアプローチは課題を呈する。したがって、高い既存のレベルの抗Ａｄ５  ｎＡｂを含むＯＡＳの存在下で、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０の形質導入効率を評価した（図４Ａ）。Ａｄ５とは異なり、Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０は、比較的高いＯＡＳ濃度でさえも、αｖβ６＋細胞を形質導入する能力を保持していた（図４Ｃ）。
【００６９】
非改変カプシドを有するＡｄ５ベクターの臨床的有効性はまた、特に肝臓におけるオフターゲット組織隔離によっても有意に制限される。Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０がインビボでＡｄ５ベクターの生体内分布を変化させることに成功したことを実証する。腫瘍のないマウスでは、複製欠損Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０は、親Ａｄ５と比較して改善した生体内分布を示し、肝臓、脾臓および肺のウイルス導入遺伝子発現が有意に減少し（図５）、Ａｄ５と比較して全てのオフターゲット臓器２７４でウイルスゲノムコピー数が減少している（図６）。
【００７０】
脱標的化／再標的化Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０ベクターの腫瘍溶解型の有効性を試験するために、免疫不全マウスでヒト卵巣がんの同所性ｉ．ｐ．異種移植片モデルを確立した。腹腔内投与後の腫瘍溶解性Ａｄ５．３Ｄ．Ａ２０のウイルスコード導入遺伝子発現のより局所的化した生体内分布は、オフターゲット隔離および／または腫瘍選択的ウイルス取り込みの減少と一致していた（図７Ｂ〜図７Ｅ）。これは、ＳＫＯＶ３異種移植片モデルで、Ａｄ５と比較して優れたＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０で処置された動物の生存率によって裏付けられた（図７Ｆ）。
【００７１】
Ａｄ５．３ＤまたはＡｄ５．３Ｄ．Ａ２０の投与は、それぞれ、進行性化学療法抵抗性がんまたはαｖβ６＋がん、特に排他的ではないが卵巣がん、膵臓がん、食道がんおよび乳がんの有望な治療選択肢を提供する。このベクターは、最終的に高精度のウイルス療法用途のために改変することができる重要なプラットフォームを提供する。
【００７２】
参考文献
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ＳＴＡＮＴＯＮ，Ｒ．Ｊ．，ＭＣＳＨＡＲＲＹ，Ｂ．Ｐ．，ＡＲＭＳＴＲＯＮＧ，Ｍ．，ＴＯＭＡＳＥＣ，Ｐ．＆ＷＩＬＫＩＮＳＯＮ，Ｇ．Ｗ．Ｇ．２００８．Ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４５，６５９−６６８．
ＵＵＳＩ−ＫＥＲＴＴＵＬＡ，Ｈ．，ＤＡＶＩＥＳ，Ｊ．，ＣＯＵＧＨＬＡＮ，Ｌ．，ＨＵＬＩＮ−ＣＵＲＴＩＳ，Ｓ．，ＪＯＮＥＳ，Ｒ．，ＨＡＮＮＡ，Ｌ．，ＣＨＥＳＴＥＲ，Ｊ．Ｄ．＆ＰＡＲＫＥＲ，Ａ．Ｌ．２０１６．Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ６  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．
ＵＵＳＩ−ＫＥＲＴＴＵＬＡ，Ｈ．，ＬＥＧＵＴ，Ｍ．，ＤＡＶＩＥＳ，Ｊ．，ＪＯＮＥＳ，Ｒ．，ＨＵＤＳＯＮ，Ｅ．，ＨＡＮＮＡ，Ｌ．，ＳＴＡＮＴＯＮ，Ｒ．Ｊ．，ＣＨＥＳＴＥＲ，Ｊ．Ｄ．＆ＰＡＲＫＥＲ，Ａ．Ｌ．２０１５．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＥＧＦＲ  ａｎｄ  ＦＧＦＲ１  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｆｉｂｅｒ  Ｋｎｏｂ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｓ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２６，３２０−９．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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