(57)【要約】  本発明は、凝固診断薬の分野に関係し、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールの群からの鉄キレート剤の添加により安定化することができる、組換えまたは天然の組織因子タンパク質およびリン脂質に基づくプロトロンビン時間試薬に関する。
2021504705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織因子タンパク質およびリン脂質を含むプロトロンビン時間試薬であって、該試薬は、少なくとも１つの鉄キレート剤をさらに含み、該少なくとも１つの鉄キレート剤は、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択されることを特徴とする前記プロトロンビン時間試薬。
【請求項２】
シデロフォアは、デフェロキサミン、ピオベルジンおよびフェリクロームを含む群から選択される、請求項１に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項３】
３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールは、デフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートおよび３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを含む群から選択される、請求項１に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項４】
少なくとも１つの鉄キレート剤を、０．００７〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項５】
Ｃａ２＋も含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項６】
塩化カルシウム  ５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌを含む、請求項５に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項７】
組織因子タンパク質は、ヒトまたは動物の組換え組織因子タンパク質および組織抽出物由来の天然のヒトまたは動物の組織因子タンパク質の群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項８】
組織因子タンパク質およびリン脂質ならびに場合によりＣａ２＋イオンを含む液体のプロトロンビン時間試薬を調製するための方法であって、組織因子タンパク質、リン脂質ならびにシデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択される少なくとも１つの鉄キレート剤を含む液体を準備し、該液体を、この液体を凍結乾燥することなく試薬バイアル中に充填することを特徴とする前記方法。
【請求項９】
組織因子タンパク質およびリン脂質ならびに場合によりＣａ２＋イオンを含むプロトロンビン時間試薬を安定化するための方法であって、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択される少なくとも１つの鉄キレート剤を該試薬に添加することを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの鉄キレート剤を、試薬が少なくとも１つの鉄キレート剤を０．００７〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含むような量で添加する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
シデロフォアは、デフェロキサミン、ピオベルジンおよびフェリクロームを含む群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールは、デフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートおよび３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを含む群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
血漿サンプル中の凝固パラメーターを決定するための方法における、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬の使用。
【請求項１４】
血漿サンプル中の凝固パラメーターを決定するための方法であって、該血漿サンプルを請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬と混合して、反応混合物を得、該反応混合物中の該凝固パラメーターを決定することを特徴とする前記方法。
【請求項１５】
プロトロンビン時間、誘導フィブリノーゲンおよび内因性トロンビン活性の群から凝固パラメーターを決定するための、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
反応混合物の吸光度の変化を、測光法で測定し、プロトロンビン時間試薬と血漿サンプルの混合の時点から閾値に達するまでの時間を決定する、プロトロンビン時間を決定するための、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
組織因子タンパク質およびリン脂質を含むプロトロンビン時間試薬を調製するための、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群からの鉄キレート剤の使用。
【請求項１８】
シデロフォアは、デフェロキサミン、ピオベルジンおよびフェリクロームを含む群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールは、デフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートおよび３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを含む群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固診断の分野であり、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択される鉄キレート剤の添加により安定化することができる、組換えまたは天然の組織因子タンパク質およびリン脂質をベースとするプロトロンビン時間試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織因子タンパク質（組織因子またはトロンボプラスチンと略される）は、血液凝固にとって不可欠な重要性を有する膜貫通タンパク質である。組織因子タンパク質は、例えば内皮下層（平滑筋）中の細胞および血管を囲む細胞（例えば線維芽細胞）のような、通常は血流と接触していない細胞により発現される。しかし、血管への損傷の場合には、組織因子タンパク質発現細胞が、血中を循環する凝固促進性血液凝固因子（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）である第ＶＩＩ因子と接触する。カルシウムの存在下では、組織因子タンパク質と第ＶＩＩ因子とが複合体を形成し、第ＶＩＩ因子の活性は千倍である（Ｆ  ＶＩＩ＞Ｆ  ＶＩＩａ）。リン脂質およびカルシウムの存在下では、組織因子タンパク質と第ＶＩＩａ因子との複合体は、不活性な血液凝固因子である第Ｘ因子の、活性型の第Ｘａ因子への変換を触媒し、したがって、凝固プロセスを促進する。第ＶＩＩ因子と一緒になって、組織因子は、いわゆる血液凝固の外因性経路を形成し、外因性経路を介して、血管への損傷は血液凝固により可能な限り早急に阻止されることとなる。
【０００３】
凝固診断では、様々なインビトロの試験方法が開発されており、これらの手段により、患者の血液もしくは血漿が問題なく凝固することができるかどうか、または凝固障害が存在するかどうかを決定することができる。凝固障害の事例では、最適な治療方策を選択できるようにするために、存在する障害の原因についてのより正確な情報の入手が必要であることが多い。組織因子タンパク質は、様々な血液凝固の部分的機能を調査するため、特に外因性の血液凝固系を調査するための活性化剤として使用される。凝固活性化剤としての組織因子タンパク質の最も広く知られている用途は、プロトロンビン時間（ＰＴ）（類義語：トロンボプラスチン時間）を決定するための、いわゆるＱｕｉｃｋ試験である。Ｑｕｉｃｋ試験およびその変形形態では、血漿サンプルを通常、組織因子タンパク質、リン脂質およびカルシウムイオンの混合物と混合し、混合の時点からフィブリン形成が検出可能となるまでの秒単位の期間を測定する。代わりに、発色基質を使用する凝固試験では、混合の時点から特定の吸光度の変化が達成されるまでの期間を測定する。組織因子タンパク質は、凝固時間を決定するのではなく、例えば内因性トロンビン活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＥＴＰ）のような凝固系の個々の構成要素を決定するのに役立つ他の試験方法においても使用される（特許文献１）。原則として、組織因子タンパク質は、内因性凝固の構成要素に関与するすべての試験において使用することができる。
【０００４】
プロトロンビン時間試薬（組織因子試薬、ＰＴ試薬）は、各試験において中心的な重要性を有する。通常、プロトロンビン時間試薬は、凝固活性リン脂質とともに組織因子を含む。組織因子タンパク質は、様々な種（例えば、ウサギ、ヒト、ウシ）の様々な器官（例えば、脳、胎盤、肺）由来の組織抽出物として入手するか、または組換えにより製造するかのいずれかである。組織因子タンパク質を入手する、およびプロトロンビン時間試薬を製造するための無数の方法が先行技術から公知であり、無数のプロトロンビン時間試薬が市販されている。
【０００５】
現在、大半の市販のプロトロンビン時間試薬は凍結乾燥形態で販売されており、したがって、使用前に、再構成媒体、例えば蒸留水または緩衝溶液に溶解させなければならない。この理由は、液体状態の試薬の安定性が不良であるためである。凍結乾燥形態で提供される試薬の欠点は、製造者および使用者がさらなる時間および費用集約的な方法工程（凍結乾燥および再構成）を実行しなければならないことだけでなく、これらのさらなる工程により、試薬の質を損なうことのあるエラーのリスクが上昇するということもある。したがって、液体の、使用準備が整った試薬製剤が望ましい。しかし、液体のプロトロンビン時間試薬の提供における問題は、これらの安定性が不良であることである。プロトロンビン時間試薬の安定性は、例えば、保存期間にわたる、特定の血漿、例えば正常な血漿のプロトロンビン時間の維持として理解される。理想的には、プロトロンビン時間試薬は、その保存もしくは使用の期間を通してその規格を維持すべきであり、または最も好ましい事例では、プロトロンビン時間試薬がその製造時点で有した特性および特徴を維持すべきである。
【０００６】
液体のプロトロンビン時間試薬を安定化するための様々な戦略が先行技術に記載されている。特許文献２には、アスコルビン酸および血清アルブミンの組合せ添加により安定化される組換え組織因子をベースとした液体のプロトロンビン時間試薬が記載されている。特許文献３には、特定のナトリウムまたはカルシウム塩の添加により安定化される、組織から抽出した（天然の）液体のプロトロンビン時間試薬が記載されている。特許文献４には、アルブミンまたはポリエチレングリコールのような様々な安定化剤およびアジ化ナトリウムまたは抗生物質のような様々な抗微生物活性物質の添加により安定化される、天然の組織因子タンパク質をベースとした別の液体のプロトロンビン時間試薬が記載されている。特許文献５には、金属イオンキレート剤、特にＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを組織因子の抽出に使用し、完成した試薬に含有することができる、プロトロンビン時間試薬を調製するための方法が記載されている。金属イオンキレート剤が結合したカルシウムイオンの量は、さらなるカルシウム塩を添加することにより代替される。
【０００７】
特許文献６には、第１の容器に組織因子タンパク質およびリン脂質を含む第１の溶液を含み、第２の容器に塩化カルシウム溶液を含む、使用準備の整った液体のプロトロンビン時間試薬を調製するための２成分系のキットが記載されている。第１の溶液は、安定化目的のためのカルシウムキレート剤を含む。使用の直前に、先ず、使用者により２つの溶液が互いに混合される。製造者は凍結乾燥を省くことができ、使用者は凍結乾燥された試薬の再構成を省くことができるが、使用者はなお、使用準備の整ったプロトロンビン時間試薬を入手するために２つの液体を互いに混合しなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ−Ａ２−４２０３３２
【特許文献２】ＥＰ−Ａ２−９４２２８４
【特許文献３】米国特許第３，５２２，１４８号
【特許文献４】ＥＰ−Ａ１−５８５９８７
【特許文献５】ＥＰ−Ａ２−５２４８０３
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１７／０２３４８９５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、少なくとも組織因子タンパク質およびリン脂質を含むことができ、場合によりカルシウムイオンを含むこともできる、液体状態で長期間の安定性を示し、使用準備の整ったプロトロンビン時間試薬を提供することである。
【００１０】
鉄キレート剤、特にシデロフォアを含む群からの鉄キレート剤の添加、およびそれらの中でも特にデフェロキサミン、ピオベルジンもしくはフェリクロームの添加、または３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群からの鉄キレート剤の添加、およびそれらの中でも特にデフェラシロクスの添加が、組織因子およびリン脂質ならびに場合によりカルシウムイオンを含む水性溶液の安定性を増大させることが分かった。本発明による液体状態で安定化され保存されたプロトロンビン時間試薬では、＋３７℃での１０週間の保存後になお、実行時間の最初のＰＴ測定結果からの逸脱が２０％未満であるプロトロンビン時間（ＰＴ）測定結果を得た。１２ヶ月以上の期間にわたる＋２℃〜＋８℃での保存安定性が予期できるかどうかを早急に評価するために、＋３７℃で１０週間の強制保存を実行した。＋３７℃で１０週間の期間にわたり保存された安定化されたプロトロンビン時間試薬で、実行時間の最初のＰＴ測定結果からの逸脱が２０％未満であるプロトロンビン時間（ＰＴ）測定結果が得られた場合、試薬は、＋２℃〜＋８℃の保存温度で１２ヶ月以上の期間にわたり安定であると予期することができる。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、組織因子タンパク質およびリン脂質を含み、少なくとも１つの鉄キレート剤をさらに含むプロトロンビン時間試薬であって、少なくとも１つの鉄キレート剤がシデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択される、プロトロンビン時間試薬である。
【００１２】
シデロフォアは、細菌および菌類のような微生物ならびに植物から形成され、鉄ＩＩＩイオン（Ｆｅ３＋イオン）と高い親和性を示す、鉄結合キレート剤の一種である。好ましいシデロフォアは、例えばデフェロキサミン、フェリクロームおよびフェリクロシンのような６座ヒドロオキサメートの群からのシデロフォアである。
【００１３】
好ましくは、シデロフォアの群からの鉄キレート剤は、デフェロキサミン、ピオベルジンおよびフェリクロームを含む群から選択される。
【００１４】
一実施形態では、本発明によるプロトロンビン時間試薬は、例えば、細菌ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ）から形成される、六座ヒドロオキサメートの群からの鉄キレート剤デフェロキサミン（類義語：デフェロキサミン；商標名：デスフェラール）を含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明によるプロトロンビン時間試薬は、例えば細菌シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）から形成され、六座混合ヒドロオキサメート（ｈｅｘａｄｅｎｔａｔｅ  ｍｉｘｅｄ  ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）およびカテコレート型のシデロフォアの群に分類される非リボソームペプチドである、鉄キレート剤ピオベルジンを含む。６座混合ヒドロオキサメートおよびカテコレート型のシデロフォアの群からの他の適切な鉄キレート剤は、例えばヘテロバクチンおよびエルシニアバクチンである。
【００１６】
さらに別の実施形態では、本発明によるプロトロンビン時間試薬は、例えば、真菌ウスティラゴ・セファロジェナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｈａｅｒｏｇｅｎａ）から形成され、六座ヒドロオキサメートの群にも分類される、３つのグリシンならびにヒドロキシル化およびアセチル化オルニチンラジカルから構成される環状ヘキサペプチドである鉄キレート剤フェリクローム（類義語：デフェリフェリクローム）を含む。
【００１７】
３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールは、他の適用の中で、治療目的のために開発された鉄結合キレート剤の一種である（ＥＰ−Ｂ１−０９１４１１８）。好ましい３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールは、デフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートおよび３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールである。
【００１８】
対応する一実施形態では、本発明によるプロトロンビン時間試薬は、３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール、それらの中でも特にデフェラシロクス（ＩＵＰＡＣ名：４−［（３Ｚ，５Ｅ）−３，５−ビス（６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）−１，２，４−トリアゾリジン−１−イル］安息香酸）、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートまたは３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール）の群からの鉄キレート剤を含む。
【００１９】
本発明によるプロトロンビン時間試薬は、上記の適切な鉄キレート剤の１つを、好ましくは０．００７〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む。
【００２０】
本発明によるプロトロンビン時間試薬は、１つの、または２つ、３つ、４つもしくはそれ以上の組合せの、上記の適切な鉄キレート剤を含むことができる。
【００２１】
特に好ましい一実施形態では、本発明によるプロトロンビン時間試薬は、カルシウムイオンをさらに含む。この目的のために、プロトロンビン時間試薬は、塩化カルシウムを、好ましくは５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含むことができる。
【００２２】
プロトロンビン時間試薬中に含有される組織因子タンパク質は、好ましくは、ヒトまたは動物（例えば、ウサギ、ウシ等）の組換え組織因子タンパク質および組織抽出物由来（例えば、脳、胎盤、肺等由来）の天然のヒトまたは動物の組織因子タンパク質を含む群から選択される。
【００２３】
リン脂質は、天然のおよび／または合成の供給源に由来することができる。
【００２４】
本発明の特定の利点は、本発明によるプロトロンビン時間試薬を使用準備の整った液体の試薬として保存することができるということにあるが、試薬を水または緩衝液中で再構成することが可能である凍結乾燥物として提供することも当然可能である。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、液体のプロトロンビン時間試薬を調製するための方法であって、組織因子タンパク質、リン脂質、ならびにシデロフォアを含む群から選択される少なくとも１つの鉄キレート剤、それらの中でも、好ましくはデフェロキサミン、ピオベルジンまたはフェリクローム、および３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール、それらの中でも、好ましくはデフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートまたは３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを含む液体を準備し、この液体を凍結乾燥することなく試薬バイアル中に充填する方法である。
【００２６】
本発明のなおさらなる目的は、組織因子タンパク質およびリン脂質ならびに場合によりＣａ２＋イオンを含むプロトロンビン時間試薬を安定化するための方法であって、シデロフォアを含む群から選択される少なくとも１つの鉄キレート剤、それらの中でも好ましくはデフェロキサミン、ピオベルジンまたはフェリクローム、および３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール、好ましくはデフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートまたは３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを試薬に添加する方法である。
【００２７】
本発明による安定化方法では、鉄キレート剤を、好ましくは、試薬が最終的に鉄キレート剤を０．００７〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含むような量で添加する。
【００２８】
本発明の別の目的は、患者サンプル中の凝固パラメーターを決定する、特に、プロトロンビン時間（ＰＴ、また、Ｑｕｉｃｋ試験）およびこれらの変形形態、プロトロンビン時間誘導フィブリノーゲン（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）ならびに内因性トロンビン活性（ＥＴＰ）の群から凝固パラメーターを決定するためのインビトロの方法における本発明によるプロトロンビン時間試薬の使用である。本発明による試薬は、例えば、フィブリンクロットの検出に基づく試験方法における、およびまた、発色性または蛍光性の試験方法における、凝固カスケードの活性化剤としての使用に適切である。
【００２９】
本発明は、血漿サンプル中の凝固パラメーターを決定するための方法であって、血漿サンプルを本発明によるプロトロンビン時間試薬と混合して、反応混合物を得、反応混合物中の凝固パラメーターを決定する方法にさらに関する。凝固パラメーターは、例えば、サンプル、例えばヒト全血または血漿サンプルのプロトロンビン時間または内因性トロンビン活性とすることができる。
【００３０】
プロトロンビン時間を決定するために、反応混合物の吸光度の変化を、好ましくは測光法で測定し、本発明によるプロトロンビン時間試薬と血漿サンプルの混合の時点から閾値に達するまでの期間を決定する。
【００３１】
プロトロンビン時間の決定からフィブリノーゲン濃度を誘導するため（「誘導フィブリノーゲン」）、反応混合物の吸光度の増大を測光法で測定する；これはフィブリノーゲン濃度と相関している。
【００３２】
本発明は、組織因子タンパク質およびリン脂質を含むプロトロンビン時間試薬を調製するための鉄キレート剤の使用であって、鉄キレート剤が、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択される、使用にさらに関する。好ましく使用される、シデロフォアの群からの鉄キレート剤は、デフェロキサミン、ピオベルジンおよびフェリクロームを含む群から選択される。好ましく使用される、３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールの群からの鉄キレート剤は、デフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートおよび３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】デフェロキサミンを含まない安定化していないＰＴ試薬（０＝０ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０ｍＭ）、および凍結乾燥して保存し、その後、溶解させたばかりの参照試薬（Ｒ）と比較した、デフェロキサミンで安定化したＰＴ試薬（９＝９ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．０１３７ｍＭ；１２＝１２ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．０１８３ｍＭ；１５＝１５ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．０２２８ｍＭ）による、正常な対照血漿Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １の秒単位のプロトロンビン時間（ＰＴ  ［ｓ］）の週単位の経時的な（ｔ）変化を示す図である。試薬は３７℃の温度で保存した。
【図２】デフェロキサミンを含まない安定化していないＰＴ試薬（０＝０ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０ｍＭ）、および凍結乾燥して保存し、その後溶解させたばかりの参照試薬（Ｒ）と比較した、デフェロキサミンで安定化したＰＴ試薬（９＝９ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．０１３７ｍＭ；１２＝１２ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．０１８３ｍＭ；１５＝１５ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．０２２８ｍＭ）による、異常な対照血漿Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  ２の秒単位のプロトロンビン時間（ＰＴ  ［ｓ］）の週単位の経時的な（ｔ）変化を示す図である。試薬は３７℃の温度で保存した。
【図３】デフェロキサミンを含まない安定化していないＰＴ試薬（０＝０ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０ｍＭ）と比較した、デフェロキサミンで安定化したＰＴ試薬（１５＝１５ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．０２２８ｍＭ；７５＝７５ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．１１４ｍＭ；１５０＝１５０ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．２２８ｍＭ）による、正常な対照血漿Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １の秒単位のプロトロンビン時間（ＰＴ  ［ｓ］）の週単位の経時的な（ｔ）変化を示す図である。試薬は３７℃の温度で保存した。
【図４】デフェロキサミンを含まない安定化していないＰＴ試薬（０＝０ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０ｍＭ）と比較した、デフェロキサミンで安定化したＰＴ試薬（１５＝１５ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．０２２８ｍＭ；７５＝７５ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．１１４ｍＭ；１５０＝１５０ｍｇ／Ｌ＝デフェロキサミン  ０．２２８ｍＭ）による、異常な対照血漿Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  ２の秒単位のプロトロンビン時間（ＰＴ  ［ｓ］）の週単位の経時的な（ｔ）な変化を示す図である。試薬は３７℃の温度で保存した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下の例示的な実施形態は、本発明を明らかにする目的にかなうものであり、限定的なものとして理解されるべきでない。
【実施例１】
【００３５】
液体の、デフェロキサミンで安定化したプロトロンビン時間試薬の安定性の決定
ｔ０時点で、組換えヒト組織因子タンパク質、合成リン脂質およびカルシウムイオンを含む液体のプロトロンビン時間試薬に下記の最終濃度でデフェロキサミン（デフェロキサミンメシル酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、様々なバッチで、添加した：
１．デフェロキサミン  ０ｍＭ、
２．デフェロキサミン  ０．０１３７ｍＭ（９ｍｇ／Ｌ）、
３．デフェロキサミン  ０．０１８３ｍＭ（１２ｍｇ／Ｌ）、
４．デフェロキサミン  ０．０２２８ｍＭ（１５ｍｇ／Ｌ）、
５．デフェロキサミン  ０．１１４ｍＭ（７５ｍｇ／Ｌ）、
６．デフェロキサミン  ０．２２８ｍＭ（１５０ｍｇ／Ｌ）。
【００３６】
様々な試薬を、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）ＣＡ−１５００分析装置（シスメックス株式会社、日本、神戸）における、自動プロトロンビン時間試験（ＰＴ試験）に使用した。以下の定義された対照血漿を、サンプルとして使用した：
・Ｄａｄｅ（登録商標）Ｃｉ−Ｔｒｏｌ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｅｖｅｌ  １（Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １）対照血漿；プロトロンビン時間の決定のための正常対照；結果は、新鮮な正常のクエン酸血漿に相当する；
・Ｄａｄｅ（登録商標）Ｃｉ−Ｔｒｏｌ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｅｖｅｌ  ２（Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  ２）対照血漿；凝固障害において観察されるようなプロトロンビン時間の決定のための異常対照；凝固時間は、新鮮な正常のクエン酸血漿の凝血時間と比較して延長される。
【００３７】
サンプルおよび試薬を、それぞれ、３７℃に予熱し、その後混合した。試薬の添加により凝固プロセスを引き起こし、フィブリンクロットの形成までの時間を測定した（秒単位のプロトロンビン時間）。
【００３８】
様々な試薬の長期の安定性を決定するために、試薬を、＋３７℃で１６〜１８週間の期間にわたり、栓付きガラスバイアル（ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｖｉａｌ）に液体状態で保存した。約２週間毎に、試薬のサンプルを採取し、同一の参照血漿のプロトロンビン時間を決定した。各時点で、参照試薬として、凍結乾燥させたプロトロンビン時間試薬（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）試薬、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、蒸留水を用いて新たに再構成して測定した。
【００３９】
図１（サンプルとして、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １）および図２（サンプルとして、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  ２）では、１６週間の期間にわたる、＋３７℃での、様々なプロトロンビン時間試薬（デフェロキサミン  ０、１２、１５ｍｇ／Ｌ）のプロトロンビン時間を示す。ｔ０時点での最初の値と比較して逸脱が２０％未満である、少なくとも１０週間の期間にわたる安定なプロトロンビン時間は、凍結乾燥し各事例において溶解したばかりの参照試薬（Ｒ）、および本発明によるデフェロキサミンで安定化したプロトロンビン時間試薬でのみ、達成された。デフェロキサミンを含まず液体状態で保存された試薬では、遅くとも４週間後に、はっきりと逸脱したプロトロンビン時間のみが得られた。
【００４０】
図３（サンプルとして、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １）および図４（サンプルとして、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  ２）では、１８週間の期間にわたる、＋３７℃での、様々なプロトロンビン時間試薬（デフェロキサミン  １５、７５、１５０ｍｇ／Ｌ）のプロトロンビン時間を示す。ｔ０時点でのベースラインと比較して逸脱が２０％未満である、少なくとも１０週間の期間にわたる安定なプロトロンビン時間は、本発明によるデフェロキサミンで安定化したプロトロンビン時間試薬でのみ達成された。デフェロキサミンを含まず液体状態で保存された試薬では、遅くとも４週間後に、はっきりと逸脱したプロトロンビン時間のみが得られた。
【実施例２】
【００４１】
様々な鉄キレート剤で安定化した液体のプロトロンビン時間試薬の安定性の決定
ｔ０時点で、以下の金属イオンキレート剤  ０．０２２８ｍｍｏｌ／Ｌの各々を、様々なバッチで、組換えヒト組織因子タンパク質、合成リン脂質およびカルシウムイオンを含む液体のプロトロンビン時間試薬に添加した：
ｉ．ピオベルジン（ピオベルジン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；
ｉｉ．フェリクローム（ウスティラゴ・セファロジェナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｈａｅｒｏｇｅｎａ）由来の鉄不含フェリクローム、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；
ｉｉｉ．デフェロキサミン（デフェロキサミンメシル酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）デフェロキサミン（デフェロキサミンメシル酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；
ｉｖ．デフェラシロクス（Ｃｏｍｂｉ−Ｂｌｏｃｋｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）；
ｖ．ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）；
ｖｉ．ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；
ｖｉｉ．ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）。
【００４２】
様々な試薬を、実施例１において記載されているように、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）ＣＡ−１５００分析装置（シスメックス株式会社、日本、神戸）での、自動プロトロンビン時間試験（ＰＴ試験）に使用した。実施例１においてさらなる詳細が記載されている対照血漿Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １およびＣｉ−Ｔｒｏｌ  ２をサンプルとして使用した。
【００４３】
様々な試薬の長期の安定性を決定するために、試薬を、＋３７℃で１６〜１８週間の期間にわたり、栓付きガラスバイアルに液体状態で保存した。試薬のサンプルをおよそ１ヶ月毎に採取し、同一の参照血漿のプロトロンビン時間を決定した。
【００４４】
ｔ０時点、２および４ヶ月の保存後（２Ｍ、４Ｍ）の様々な測定結果（秒単位のプロトロンビン時間、ＰＴ［ｓ］）、ならびに対応するｔ０時点でのプロトロンビン時間測定からの逸脱の％を表１（サンプルとして、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １対照血漿）および表２（サンプルとして、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  ２対照血漿）に示す。
【００４５】
【表１】
2021504705.tif 000003
【００４６】
【表２】
2021504705.tif 000004
【００４７】
ｔ０時点でのベースラインと比較して逸脱が２０％未満である、４ヶ月（すなわち、少なくとも１６週間）の期間にわたる安定なプロトロンビン時間は、本発明による鉄キレート剤、すなわちピオベルジン、フェリクローム、デフェロキサミンまたはデフェラシロクスで安定化したプロトロンビン時間試薬でのみ達成された。キレート剤を含まない液体形態で保存された試薬、および先行技術（ＵＳ  ２０１７／０２３４８９５  Ａ１）から公知である金属イオンキレート剤ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡまたはＢＡＰＴＡを添加し液体形態で保存された試薬の両方では、遅くとも４ヶ月後に、激しく逸脱したプロトロンビン時間のみが示された。
【実施例３】
【００４８】
上昇したＦｅ３＋イオン濃度の存在下での、様々な鉄キレート剤で安定化した液体のプロトロンビン時間試薬の安定性の決定
ｔ０時点で、ＦｅＣｌ３  ０．００３０８ｍＭ（０．５ｍｇ／Ｌ）を、組換えヒト組織因子タンパク質、合成リン脂質およびカルシウムイオンを含む液体のプロトロンビン時間試薬に添加し、その後、実施例２において言及されている金属イオンキレート剤  ０．０２２８ｍＭの各々を、様々なバッチで添加した。
【００４９】
様々な試薬を、実施例１において記載されているように、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）ＣＡ−１５００分析装置（シスメックス株式会社、日本、神戸）での、自動プロトロンビン時間試験（ＰＴ試験）に使用した。実施例１においてさらなる詳細が記載されている対照血漿Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １およびＣｉ−Ｔｒｏｌ  ２をサンプルとして使用した。
【００５０】
上昇したＦｅ３＋イオン濃度の存在下での様々な試薬の長期の安定性を決定するために、試薬を、＋３７℃で６週間の期間にわたり、栓付きガラスバイアルに液体状態で保存した。試薬のサンプルを毎週採取し、同一の参照血漿のプロトロンビン時間を決定した。
【００５１】
ｔ０時点、１、２、４および６週間の保存後（１Ｗ、２Ｗ、４Ｗ、６Ｗ）の様々な測定結果（秒単位のプロトロンビン時間、ＰＴ［ｓ］）、ならびに対応するｔ０時点でのプロトロンビン時間測定からの逸脱の％を表３（サンプルとして、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  １対照血漿）および表４（サンプルとして、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ  ２対照血漿）に示す。
【００５２】
【表３】
2021504705.tif 000005
【００５３】
【表４】
2021504705.tif 000006
【００５４】
ｔ０時点でのベースラインと比較して逸脱が２０％未満である、６週間の期間にわたる安定なプロトロンビン時間は、上昇したＦｅ３＋イオン濃度の存在下で、本発明による鉄キレート剤、すなわちピオベルジン、フェリクローム、デフェロキサミンまたはデフェラシロクスで安定化したプロトロンビン時間試薬でのみ達成された。キレート剤を含まず液体形態で保存された試薬、および先行技術（ＵＳ  ２０１７／０２３４８９５  Ａ１）から公知である金属イオンキレート剤ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡまたはＢＡＰＴＡを添加し液体形態で保存された試薬の両方では、遅くとも２週間後に、激しく逸脱したプロトロンビン時間のみが示された。
【図１】
2021504705.tif 000007
【図２】
2021504705.tif 000008
【図３】
2021504705.tif 000009
【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月13日(2020.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織因子タンパク質およびリン脂質を含むプロトロンビン時間試薬であって、該試薬は、少なくとも１つの鉄キレート剤をさらに含み、該少なくとも１つの鉄キレート剤は、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択されることを特徴とする前記プロトロンビン時間試薬。
【請求項２】
シデロフォアは、デフェロキサミン、ピオベルジンおよびフェリクロームを含む群から選択される、請求項１に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項３】
３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールは、デフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートおよび３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを含む群から選択される、請求項１に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項４】
少なくとも１つの鉄キレート剤を、０．００７〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項５】
少なくとも１つの鉄キレート剤を、０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む、請求項４に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項６】
Ｃａ2+イオンも含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項７】
塩化カルシウム  ５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌを含む、請求項６に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項８】
組織因子タンパク質は、ヒトまたは動物の組換え組織因子タンパク質および組織抽出物由来の天然のヒトまたは動物の組織因子タンパク質の群から選択される、請求項１〜７の
いずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬。
【請求項９】
組織因子タンパク質およびリン脂質を含む液体のプロトロンビン時間試薬を調製するための方法であって、組織因子タンパク質、リン脂質ならびにシデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択される少なくとも１つの鉄キレート剤を含む液体を準備し、該液体を、この液体を凍結乾燥することなく試薬バイアル中に充填することを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
プロトロンビン時間試薬がＣａ2+イオンも含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組織因子タンパク質およびリン脂質を含むプロトロンビン時間試薬を安定化するための方法であって、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群から選択される少なくとも１つの鉄キレート剤を該試薬に添加することを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
プロトロンビン時間試薬がＣａ2+イオンも含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの鉄キレート剤を、試薬が少なくとも１つの鉄キレート剤を０．００７〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含むような量で添加する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの鉄キレート剤を０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
シデロフォアは、デフェロキサミン、ピオベルジンおよびフェリクロームを含む群から選択される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールは、デフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートおよび３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを含む群から選択される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
血漿サンプル中の凝固パラメーターを決定するための方法における、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬の使用。
【請求項１８】
血漿サンプル中の凝固パラメーターを決定するための方法であって、該血漿サンプルを請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間試薬と混合して、反応混合物を得、該反応混合物中の該凝固パラメーターを決定することを特徴とする前記方法。
【請求項１９】
プロトロンビン時間、誘導フィブリノーゲンおよび内因性トロンビン活性の群から凝固パラメーターを決定するための、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
反応混合物の吸光度の変化を、測光法で測定し、プロトロンビン時間試薬と血漿サンプルの混合の時点から閾値に達するまでの時間を決定する、プロトロンビン時間を決定するための、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
組織因子タンパク質およびリン脂質を含むプロトロンビン時間試薬を調製するための、シデロフォアおよび３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールを含む群からの鉄キレート剤の使用。
【請求項２２】
シデロフォアは、デフェロキサミン、ピオベルジンおよびフェリクロームを含む群から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールは、デフェラシロクス、エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］アセテートおよび３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾールを含む群から選択される、請求項２１に記載の使用。
【国際調査報告】
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