(57)【要約】  本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆａｂ断片（ａ）及び（ｂ）が互いに融合している、新規の二重特異性抗原結合分子、並びに、これらの分子の作製方法及びこの使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、
（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、及び
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、を含み、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて、第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に縮合し、転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、
標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、（ｉ）可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、又は（ｉｉ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている、
二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
前記二重特異性抗原結合分子が、４−１ＢＢに対する二価結合、及び前記標的細胞抗原に対する一価結合を提供する、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成される前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
ノブ・ホール法に従って、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットがノブを含み、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットがホールを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能への、前記抗原結合分子の結合親和性を低減する１つ以上のアミノ酸置換、特に、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
４−１ＢＢに特異的に結合可能な前記第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに、（ｉｖ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
４−１ＢＢに特異的に結合可能な前記第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、段落１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
４−１ＢＢに特異的に結合可能な前記第１及び第３のＦａｂ断片の前記定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）におけるアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており、位置１２３（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）におけるアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）によって置換されており、４−１ＢＢに特異的に結合可能な前記第１及び第３のＦａｂ断片の前記定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、位置２１３（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
標的細胞抗原に特異的に結合可能な前記第２のＦａｂ断片が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、及びＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
標的細胞抗原に特異的に結合可能な前記第２のＦａｂ断片が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片で、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のｔｋｌｏｓｔｅｒｄｈｅアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
標的細胞抗原に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｅ）（ｉ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｆ）（ｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１２７又は配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２９又は配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、請求項１〜９、又は１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号３２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号４０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号４８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号５６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｅ）配列番号１２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｆ）配列番号５５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号５６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｇ）配列番号１３３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１４３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｈ）配列番号１３７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１４３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、請求項１〜９、又は１３又は１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、又は配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、又は配列番号１４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１〜９、又は１３又は１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
標的細胞抗原に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
ＣＤ１９に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに、（ｉｖ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、請求項１〜９、又は１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
ＣＤ１９に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、配列番号６３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び、配列番号６４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、段落１〜９、又は１７又は１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
標的細胞抗原に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ−Ｌ１）、並びに、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ−Ｌ１）
を含む、請求項１〜９、又は２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能な前記Ｆａｂ断片が、配列番号１５２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ−Ｌ１）、及び、配列番号１５３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ−Ｌ１）を含む、請求項１〜９、又は２０又は２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子の作製方法であって、前記二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下にて、請求項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２８】
薬剤として使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
癌の治療に使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線治療、及び／又は癌免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、癌の治療に使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
癌又は感染症の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３２】
個体における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、前記個体に有効量の、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２７に記載の医薬組成物を投与し、前記腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
【請求項３３】
個体に、治療に有効な量の、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２７に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌又は感染症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆａｂ断片（ａ）及び（ｂ）が互いに融合している、新規の二重特異性抗原結合分子に関する。本発明は更に、これらの分子を製造する方法、及びこれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、発現がＴ細胞の活性化により誘発される分子として最初に識別されている（Ｋｗｏｎ  Ｙ．Ｈ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ  Ｓ．Ｍ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１９６３−１９６７）。その後の研究では、Ｔ及びＢリンパ球（Ｓｎｅｌｌ  Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２４４，１９７−２１７  ｏｒ  Ｚｈａｎｇ  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４，７８７−７９５）、ＮＫ細胞（Ｌｉｎ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｂｌｏｏｄ  １１２，６９９−７０７，ＮＫＴ−ｃｅｌｌｓ（Ｋｉｍ  Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０，２０６２−２０６８）、単核細胞（Ｋｉｅｎｚｌｅ  Ｇ．ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｋｅｍｐｉｓ  Ｊ．（２０００），Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，７３−８２，ｏｒ  Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｂｌｏｏｄ  ８５，１０４３−１０５２）、好中球（Ｈｅｉｎｉｓｃｈ  Ｉ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，３４４１−３４４６）、肥満（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｂｌｏｏｄ  １０６，４２４１−４２４８）、並びに、樹状細胞、及び、内皮及び平滑筋細胞などの非造血性由来の細胞（Ｂｒｏｌｌ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１１５，５４３−５４９  ｏｒ  Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１７，１２９２−１３０１）における、４−１ＢＢの発現が示された。異なる細胞型における４−１ＢＢの発現は大部分にて誘発性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体のトリガリング、及び、プロ炎症性サイトカインの同時刺激分子又は受容体を通して誘発されるシグナル伝達などの、様々な刺激性シグナルによる駆動される（Ｄｉｅｈｌ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，３７５５−３７６２；ｖｏｎ  Ｋｅｍｐｉｓ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ５，３９４−４０６；Ｚｈａｎｇ  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４，７８７−７９５）。
【０００３】
ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌及び増殖を刺激し（Ｂｕｅｃｈｅｌｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２，７３７−７４８；Ｌｉｎ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｂｌｏｏｄ  １１２，６９９−７０７；Ｍｅｌｅｒｏ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０，１６７−１７２）、その生残の増加、及び、サイトカインを分泌して同時刺激分子を上方制御する能力により示されるように、ＤＣ活性化を促進する（Ｃｈｏｉ  Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，４１０７−４１１５；Ｆｕｔａｇａｗａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，２７５−２８６；Ｗｉｌｃｏｘ  Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，４２６２−４２６７）ことが知られている。しかし、ＣＤ１３７はＴ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方で、ＴＣＲにより誘発される活性化を制御する共刺激分子として、最も特性決定されている。ＴＣＲトリガリングと組み合わせて、アゴニスト４−１ＢＢ特異性抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化により誘発される細胞死の感度を低下させる（Ｓｎｅｌｌ  Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２４４，１９７−２１７）。インビトロでの、Ｔ細胞上での４−１ＢＢ抗体のこれらの同時刺激効果と共に、これらを、腫瘍を有するマウスに投与することにより、多くの実験腫瘍モデルにおける、強力な抗腫瘍効果がもたらされる（Ｍｅｌｅｒｏ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３，６８２−６８５；Ｎａｒａｚａｋｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｂｌｏｏｄ  １１５，１９４１−１９４８）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、４−１ＢＢ特異性抗体の抗腫瘍効果において、最も重要な役割を果たすことをインビボ枯渇実験は示した。しかし、抗４−１ＢＢを含む、腫瘍モデル又は併用療法に応じて、ＤＣ、ＮＫ細胞、又はＣＤ４＋Ｔ細胞などの、他の種類の細胞の寄与が報告されている（Ｍｕｒｉｌｌｏ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９，２４２４−２４３６；Ｓｔａｇｇ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０８，７１４２−７１４７）。
【０００４】
インビボでの４−１ＢＢアゴニスト抗体の免疫賦活特性には、抗体分子上での野生型Ｆｃ部分が存在している必要があり、これにより、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のアポトーシス誘発性又は免疫賦活メンバーに対して特異的なアゴニスト抗体に関して既に記載されているとおり、このような試薬の薬理活性に必要な、重要事象としてのＦｃ受容体結合を示唆しているようである（Ｌｉ  Ｆ．ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ  Ｊ．Ｖ．（２０１１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，１０３０−１０３４；Ｔｅｎｇ  Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３，１９１１−１９２０）。しかし、機能的に活性のＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体を全身投与することによってもまた、マウスでの、機能性Ｆｃ受容体の不存在下にて、低下した、又は著しく回復した、肝臓毒性（Ｄｕｂｒｏｔ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５９，１２２３−１２３３）と関連する、ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張が誘発される。
【０００５】
ウレルマブ（ＢＭＳ−６６６５１３、クローン１０Ｃ７）は、４−１ＢＢ細胞外ドメインに結合する、完全にヒトの、アゴニスト非リガンド遮断モノクローナルＩｇＧ４抗体である。これは、米国特許第７，２８８，６３８号に２０Ｈ４．９−ＩｇＧ４として開示されている。ヒト臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ＮＣＴ００３０９０２３及びＮＣＴ００６１２６６４）において、１２週間、３週に１回投与されるウレルマブは、黒色腫、卵巣癌、又は腎細胞癌を有する患者における病気の安定化を誘発した。しかし、抗体が、２つの肝毒性関連死の発生をもたらすグレード４の肝炎を引き起こしたことによって、治験は終了した（Ｓｉｍｅｏｎｅ  Ｅ．ａｎｄ  Ａｓｃｉｅｒｔｏ  Ｐ．Ａ．（２０１２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ９，２４１−２４７）。後で行った、臨床安全性データの詳細分析によって、与えられたウレルマブの投与により、深刻な高トランスアミナーゼ血症の進行が主に引き起こされたことが示された。グレード２＋の好中球減少症、白血球減少症、及び血小板減少もまた観察された。後で行った、臨床安全性データの詳細分析によって、与えられたウレルマブの投与により、深刻な高トランスアミナーゼ血症の進行が主に引き起こされたことが示された。２０１２年には、ウレルマブは再度臨床開発が行われたが、３週間に１回、１ｍｇ／ｋｇ未満の用量という条件下、というものを使用した。現在推奨されている用量は、３週間に１回与えられる０．１ｍｇ／ｋｇである（Ｎ．Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６），Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｕｒｅｌｕｍａｂ，ａｎ  Ａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ１３７  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １，２０１６）。用量が制限される毒性の観点から、制御不可能な副作用を避けるために、腫瘍特異的部位にてのみ作用すべき、４−１ＢＢに特異的な、改善された抗原結合分子が必要とされている。本発明の二重特異性抗原結合分子は、腫瘍特異性又は腫瘍関連抗原（標的細胞抗原）に好ましく結合可能なＦａｂ断片を、４−１ＢＢにアゴニスト結合可能な２つのＦａｂ断片と組み合わせる。特異性フォーマットにおける、本発明の二重特異性抗原結合分子は、効果的にだけでなく、所望の部位にても非常に選択的に４−１ＢＢをトリガできるため、ウレルマブなどの、従来の単一特異性抗体を用いて観察されている望ましくない副作用を低減することができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆａｂ断片（ａ）及び（ｂ）が互いに融合している、新規の二重特異性抗原結合分子、並びに、これらの分子の作製方法及びこの使用方法に関する。標的細胞抗原に対する結合能力によって、標的細胞抗原が発現する箇所において４−１ＢＢを好ましく活性化し、体内の他の部位にて活性化を低減し、４−１ＢＢのみに特異的な抗体の副作用を回避するため、これらの二重特異性抗原結合分子は有利である。これらは更に、それぞれ、４−１ＢＢに二価結合する、及び、標的細胞抗原に一価結合する、４−１ＢＢ及び標的細胞抗原に特異的結合が可能な２つのＦａｂ断片が近接しているといった、特異的な構造的特徴を特徴とし、これにより、これらの二重特異性抗原結合分子が非常に強力になる。
【０００７】
一態様では、本発明は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、
（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、及び
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、を含み、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて、第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に縮合し、転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、
標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、（ｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているか、又は、（ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域ＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０００８】
特定の態様において、４−１ＢＢに対する二価結合、及び標的細胞抗原に対する一価結合を提供する、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０００９】
更なる態様において、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、もっと大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、もっと小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。したがって、ノブ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００１０】
別の態様では、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合、及び／又はエフェクター機能を低減する１つ以上のアミノ酸置換を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様では、上記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）の群から選択される１つ以上の位置にある。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能への、抗原結合分子の結合親和性を低減する１つ以上のアミノ酸置換、特に、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）を含む。特に、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である、かつ／又は、エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
【００１１】
一態様では、４−１ＢＢ（ａ）及び（ｃ）に対して特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が同一である、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様において、本発明は、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１２】
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、それぞれ配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片を含む。より具体的には、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片はそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【００１３】
一態様では、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて、第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に縮合し、転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片において、（ｉ）可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、又は（ｉｉ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４におけるアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、位置１２３におけるアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、位置２１３におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１４】
特定の態様において、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１５】
更なる態様において、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、及びＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。特定の態様において、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、及びＣＤ１９から選択される。より具体的には、標的細胞抗原はＦＡＰ及びＣＥＡから選択される。別の態様では、標的細胞抗原はＰＤ−Ｌ１である。
【００１６】
一態様では、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片である。したがって、第２のＦａｂ断片がＦＡＰに特異的に結合可能であり、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のｔｋｌｏｓｔｅｒｄｈｅアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１７】
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【００１８】
特に、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【００１９】
更に、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、
本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２１】
したがって、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｅ）（ｉ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｆ）（ｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１２７又は配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２９又は配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２２】
一態様では、第２のＦａｂ断片がＣＥＡに特異的に結合可能であり、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２３】
別の態様では、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号３２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号４０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号４８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号５６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、
（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号５６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｅ）配列番号１２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｆ）配列番号１３３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１４３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｇ）配列番号１３７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１４３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む。
【００２４】
より具体的には、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。更に、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２５】
一態様では、第２のＦａｂ断片がＣＥＡに特異的に結合可能であり、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、又は配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、又は配列番号１４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２６】
特に、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００２７】
更に、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含み、かつ
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、
本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２８】
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含み、（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子もまた、提供する。
【００２９】
更なる態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含み、かつ
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、
本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３０】
特定の態様において、（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。より具体的には、ＣＥＡに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【００３１】
更に特定の態様において、（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の特定の態様において、（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片が、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３３】
具体的には、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片が
（ａ）（ｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに、（ｉｖ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３４】
具体的には、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号６３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び、配列番号６４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。より具体的には、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【００３５】
特定の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＣＤ１９に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３６】
更に別の態様では、本発明は、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３７】
具体的には、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ−Ｌ１）、並びに、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ−Ｌ１）を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３８】
具体的には、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１５２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ−Ｌ１）、及び、配列番号１５３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ−Ｌ１）を含む。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１５２アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ−Ｌ１）、及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ−Ｌ１）を含む。
【００３９】
特定の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４０】
本発明の別の態様に従うと、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。本発明は更に、ベクター、特に、本発明の単離ポリヌクレオチドと、単離ポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む宿主細胞と、を含む発現ベクターを提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００４１】
別の態様では、（ｉ）抗原結合分子の発現に好適な条件下にて、本発明の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程と、を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子の作製方法を提供する。本発明は、本発明の方法により作製した二重特異性抗原結合分子もまた包含する。
【００４２】
本発明は更に、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、癌の治療に用いるためのものである。
【００４３】
薬剤として使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は、二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物もまた、本発明に包含されている。
【００４４】
一態様では、
（ｉ）Ｔ細胞応答の刺激、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生残の支持、
（ｉｉｉ）癌の治療、
（ｉｖ）癌の進行の遅延、又は
（ｖ）癌を患う患者の生残の延長
で使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物を提供する。
【００４５】
一態様では、癌の治療で使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物を提供する。別の態様においては、本発明は、化学療法剤、放射線治療、及び／又は、癌免疫治療法で使用する他の剤と組み合わせて投与される、癌の治療で使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４６】
更なる態様において、本発明は、個体における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、当該個体に有効量の、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物を投与して、当該腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法を提供する。
【００４７】
病気の治療を必要とする個体での、病気の治療のための薬剤を作製するための、特に、癌又は感染症の治療ための薬剤の製造のための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子の使用、及び、個体における病気の治療方法であって、当該個体に、治療に有効な量の、本発明の二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物を投与することを含む、方法もまた提供する。特定の態様において、病気は癌である。上記態様のいずれかにおいて、個体は哺乳類、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の二重特異性抗原結合分子の一例を示す。二重特異性抗原結合分子は、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢに二価で結合）、及び、その重鎖のＣ末端にて、４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片の１つの重鎖のＮ末端に融合した、１つの抗ＦＡＰ交差Ｆａｂ断片（ＶＨ領域とＶＬ領域が交換されているＦａｂ断片）を含むｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットとなっている。このフォーマットは本明細書では、頭部から頭部（Ｈ２Ｈ）２＋１フォーマットと呼ばれる。大きな黒点は、ノブからホールへの変異を表す一方で、ＣＨ１／ＣＬドメイン内の小さな黒点は、重鎖の、抗４−１ＢＢ軽鎖との正しい対形成を改善するアミノ酸変異を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢに二価で結合）、並びに、それぞれ、重鎖のＣ末端にて融合したＦＡＰに特異的に結合可能なＶＨ及びＶＬドメインを含むｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット内の、別の二重特異性抗原結合分子を示す。このフォーマットは本明細書では、２＋１ＶＨ／ＶＬフォーマットと呼ばれ、対照分子として本明細書では用いられる。
【図１Ｃ】図１Ｃでは、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢに二価で結合）、並びに、生殖細胞系対照ＤＰ４７（非標的化対照）のＶＨ及びＶＬドメインを含むｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット内の、二重特異性抗原結合分子を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢに二価で結合）を含む、ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット内の標準抗体を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明の二重特異性抗原結合分子の別の例を示す。二重特異性抗原結合分子は、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢに二価で結合）、及び、その重鎖のＣ末端にて、４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片のうち１つの重鎖のＮ末端に融合した、１つの抗ヒトＰＤ−Ｌ１（抗ＰＤ−Ｌ１と呼ばれる）交差Ｆａｂ断片（ＶＨ領域とＶＬ領域が交換されているＦａｂ断片）を含むｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットとなっている。このフォーマットは本明細書では、頭部から頭部（Ｈ２Ｈ）２＋１フォーマットと呼ばれる。大きな黒点は、ノブからホールへの変異を表す一方で、ＣＨ１／ＣＬドメイン内の小さな黒点は、重鎖の、抗４−１ＢＢ軽鎖との正しい対形成を改善するアミノ酸変異を表す。図１Ｆは、１つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢに一価で結合）、及び、１つの抗ヒトＰＤ−Ｌ１（抗ＰＤ−Ｌ１と呼ばれる）交差Ｆａｂ断片（ＶＨ領域とＶＬ領域が交換されているＦａｂ断片）を含むｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット内の、二重特異性抗原結合分子を示す。このフォーマットは本明細書では、１＋１フォーマットと呼ばれる。大きな黒点は、ノブからホールへの変異を表す一方で、ＣＨ１／ＣＬドメイン内の小さな黒点は、重鎖の、抗４−１ＢＢ軽鎖との正しい対形成を改善するアミノ酸変異を表す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、二重特異性２＋１  Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ×抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の、４−１ＢＢ及びＦＡＰへの同時結合に関する。図２Ａは、アッセイのセットアップの図像である。図２Ｂは、二重特異性Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ×抗ＦＡＰ抗原結合分子（分析物１）の、不動化したヒト４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰ（分析物２）への同時結合を示す。
【図３】図３は、２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子の二価結合を評価するための、ＦＲＥＴベースの競合アッセイを示す。トランスフェクションしたＨｅｋ細胞上で発現するｈｕ４−１ＢＢ−スナップ  Ｔｂ標識と、ｄ２標識４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）ＩｇＧとの相互作用を、未標識の２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ構築物（遊離Ｎ末端を有しない４−１ＢＢに対するＦａｂの１つ、黒の正方形）を添加することにより、又は、未標識の２＋１ＶＨ／ＶＬ（Ｃ末端）４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＦＡＰ（４Ｂ９）二重特異性構築物（４−１ＢＢに対する２つの「遊離Ｆａｂ」、白の正方形）により競合させた。競合により、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの低下がもたらされた。
【図４】図４では、ヒトＦＡＰを発現するＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞への結合が示される。２＋１Ｈ２Ｈ抗−４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子（黒円と黒線）、又はその対照分子の濃度を、ＰＥ抱合体化二次検出抗体の蛍光強度（ｇＭＦＩ）の幾何平均に対してブロットする。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗−ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１Ｈ２Ｈ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（黒円及び線）、並びに、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗−ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１ＶＨ／ＶＬ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（灰色の正方形及び線）などの、ＦＡＰ抗原結合ドメイン含有構築物のみが、ＦＡＰ発現細胞に効率的に結合する。抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１Ｈ２Ｈ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（黒円及び線）の、Ｎ末端が融合した抗ＦＡＰ交差Ｆａｂ断片が、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ＶＨ／ＶＬ２＋１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（灰色の正方形及び線）の、Ｃ末端が融合したＶＨ／ＶＬ抗ＦＡＰ抗原結合ドメインよりも高いｇＭＦＩ、及び低いＥＣ５０を示したことが確認できる。
【図５】図５は、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２を発現するヒト４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の結合を示す。２＋１Ｈ２Ｈ抗−４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子（黒円と黒線）、又はその対照の濃度を、ＰＥ抱合体化二次検出抗体の蛍光強度（ｇＭＦＩ）の幾何平均に対してブロットする。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗−ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１Ｈ２Ｈ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（黒円及び線）は、その対照抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（灰色の星及び線）と同様に４−１ＢＢに結合する。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２を発現する４−１ＢＢにおける、ＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現の活性を示す。２＋１Ｈ２Ｈ抗−４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子（黒円と黒線）と、２＋１ＶＨ／ＶＬ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子（灰色の正方形及び線）と、対照の機能性を試験するために、分子を、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２で、ヒトＦＡＰを発現する細胞株の不存在下、又は存在下にて、１：５の比率で５時間インキュベートした。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子又はその対照の濃度を、５時間の、ルシフェラーゼ検出溶液のインキュベーション及び添加後に測定した放出光（ＲＬＵ）の単位に対してブロットする。ブランク対照（例えば、抗体非添加）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。図６Ａにおいては、ＦＡＰ標的とは独立した４−１ＢＢ活性化を示す。これにより、４−１ＢＢ結合が、あらゆるＦＡＰ媒介架橋無しに、レポーター細胞株内でＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現を誘発する。図６Ｂにおいて、ＦＡＰを発現するヒト黒色腫細胞株である、ＷＭ−２６６−４ヒト黒色腫細胞株（中間体ＦＡＰ表面発現）を添加した。ＦＡＰを発現するＷＭ−２６６−４細胞は、二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子の架橋をもたらす。二重特異性のＦＡＰ標的化２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子（黒円と黒線）は、わずかに良好な活性化（低いＥＣ５０値）を示し、これはＦＡＰに対するより高い親和性を反映し得る。これは、非常にＦＡＰを発現する細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（ヒトＦＡＰトランスジェニックマウス線維芽細胞細胞株）の存在下における、ＮＦκＢにより誘発されるルシフェラーゼ活性化を示す図６Ｃにおいて確認されるように、更に良好であることができる。
【図７】図７は、親マウスＡ５Ｂ７抗体の結合と比較した、ヒト化Ａ５Ｂ７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ多様体のＭＫＮ−４５への結合を示す。抗体は、蛍光標識した二次抗体で検出し、フローサイトメトリーにより蛍光を測定した。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、ヒト化ＭＦＥ２３抗体多様体のＶＨアミノ酸配列（図８Ａ）、及びＶＬアミノ酸配列（図８Ｂ）のアラインメントを示す。
【図９】図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃは、親マウスＭＦＥ２３抗体の結合と比較した、ヒト化ＭＦＥ２３  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ多様体のＭＫＮ−４５への結合を示す。抗体は、蛍光標識した二次抗体で検出し、フローサイトメトリーにより蛍光を測定した。グラフを、親ＭＦＥ２３クローンに対する低い結合、中間の結合、及び同様の結合を示す３つのグラフに分けた。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＣＥＡ標的化三量体スプリット４−１ＢＢＬ分子の、ｈｕ４−１ＢＢ及びｈｕＮ（Ａ２−Ｂ２）Ａ又はｈｕ（ＮＡ１）ＢＡへの同時結合に関する。図１０Ａは、アッセイのセットアップを示す。図１０Ｂは、２＋１Ｈ２Ｈ抗ヒト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（分析物１）の、不動化したヒトＮ（Ａ２−Ｂ２）Ａ及びヒト４−１ＢＢ（分析物２）への同時結合を示す。図１０Ｃは、２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（分析物１）の、不動化したヒトＮ（Ａ２−Ｂ２）Ａ及びヒト４−１ＢＢ（分析物２）への同時結合を示す。図１０Ｄは、２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（分析物１）の、不動化したヒト（ＮＡ１）ＢＡ及びヒト４−１ＢＢ（分析物２）への同時結合を示す。２重反復試験を示す。
【図１１】図１１は、結合アッセイのために使用する異なるＣＥＡＣＡＭ５を発現するクローンの、細胞表面ＣＥＡＣＡＭ５発現量を示す。ＣＨＯ−ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６１８）と呼ばれるチャイニーズハムスター卵巣細胞株に、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５（ＣＨＯ−ｋ１−ｃｙｎｏＣＥＡＣＡＭ５クローン８）、又はヒトＣＥＡＣＡＭ５（ＣＨＯ−ｋ１−ｈｕＣＥＡＣＡＭ５クローン１１、クローン１２、及びクローン１３）をトランスフェクションした。フローサイトメトリーにより、滴定した（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ６６特異的検出抗体（クローンＣＤ６６ＡＢ．１．１）を使用して、発現量を測定した。蛍光強度の中央値と検出抗体の濃度を示し、蛍光強度の中央値は、結合した検出抗体の量と正に相関するため、細胞表面上でのＣＥＡＣＡＭ５分子の発現量とも正に相関する。ＣＨＯ−ｋ１−ｃｙｎｏＣＥＡＣＡＭ５クローン８及びＣＨＯ−ｋ１−ｈｕＣＥＡＣＡＭ５クローン１１は、同様の細胞表面ＣＥＡＣＡＭ５発現を示す一方で、ＣＨＯ−ｋ１−ｈｕＣＥＡＣＡＭ５クローン１２及び１３は、高い細胞表面ＣＥＡＣＡＭ５発現量を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄにおいて、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５又はヒトＣＥＡＣＡＭ５発現ＣＨＯ−ｋ１細胞への結合を示す。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗−ＣＥＡ（４Ｂ９）抗原結合分子、又は対照分子の濃度を、ＰＥ抱合体化二次検出抗体の蛍光強度の中央値に対してブロットする。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。ＣＥＡＣＡＭ５抗原結合ドメイン含有構築物、例えば、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒円、点線）、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒の菱形、黒線）、及び４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（灰色の逆三角形、灰色線）のみが、ヒトＣＥＡＣＡＭ５発現細胞に効率的に結合する（図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄ）。対照的に、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×Ａ５Ｈ１ＥＬ１ＤｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（灰色の逆三角形、灰色線）に検出可能に結合した４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒の菱形、黒線）のみが、非常に低いカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５のみを示し、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒円、点線）は、ＭＦＥ２３がヒト／カニクイザル交差反応性ではないため、結合を示さない（図１２Ａ）。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２を発現する４−１ＢＢにおける、ＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現の活性を示す。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＣＥＡ抗原結合分子と、対照の機能性を試験するために、分子を、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２で、カニクイザル又はヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現するＣＨＯ−ｋ１細胞株の不存在下、又は存在下にて、１：５の比率で５時間インキュベートした。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＣＥＡ抗原結合分子又はその対照の濃度を、５時間の、ルシフェラーゼ検出溶液のインキュベーション及び添加後に測定した放出光（ＲＬＵ）の単位に対してブロットする。ブランク対照（例えば、抗体非添加）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。ＣＥＡＣＡＭ５を発現するＣＨＯ−ｋ１細胞に対する結合アッセイと相関して、全てのＣＥＡＣＡＭ５抗原結合ドメイン含有構築物、例えば、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒円、点線）、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒の菱形、黒線）、及び抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（灰色の逆三角形、灰色線）が、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現するＣＨＯ−ｋ１細胞株の存在下にて、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株の活性化の増加を誘発した（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）。一方で、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の存在下において、ＭＦＥ２３がヒト／カニクイザル交差反応性ではないため、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒円、点線）ではなく、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒の菱形、黒線）、及び抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（灰色の逆三角形、灰色線）のみが、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株の活性化を誘発した（図１３Ｂ）。ＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞の不存在下において、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ  ２＋１Ｈ２Ｈの架橋は発生せず、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株は活性化されなかった。
【図１４】図１４Ａは、ＰＤ−Ｌ１標的化４−１ＢＢアゴニスト構築物の、ｈｕ４−１ＢＢ及びｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｆｃへの同時結合を評価するためのセットアップを示す。図１４Ｂは、２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡの、ｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ及びｈｕ４−１ＢＢ−Ｆｃ（ｋｉｈ）への同時結合を示す。図１４Ｃは、１＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡの、ｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ及びｈｕ４−１ＢＢ−Ｆｃ（ｋｉｈ）への同時結合を示す。３重反復試験を示す。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂにおいて、ＭＫＮ４５及びＰＤ−Ｌ１トランスフェクションＭＫＮ４５（ＭＫＮ４５−ｈｕＰＤ−Ｌ１）への結合を示す。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗原結合分子、１＋１抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗原結合分子、又は対照分子の濃度を、ＰＥ抱合体化二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均に対してブロットする。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメイン含有構築物、例えば４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋１Ｈ２Ｈ（黒の正三角形、及び線）並びに抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  １＋１（灰色の逆三角形、及び線）のみが、親細胞株ＭＫＮ４５ではなく（図１５Ａ）、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＭＫＮ４５−ｈｕＰＤ−Ｌ１細胞に効率的に結合する（図１５Ｂ）。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２を発現する４−１ＢＢにおける、ＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現の活性を示す。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＰＤ−Ｌ１、及び１＋１抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＰＤ−Ｌ１抗原結合分子と、対照の機能性を試験するために、分子を、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２で、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＭＫＮ４５細胞株の不存在下、又は存在下にて、１：５の比率で５時間インキュベートした。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）とＰＤ−Ｌ１、及び１＋１抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）とＰＤ−Ｌ１抗原結合分子、又はその対照の濃度を、５時間の、ルシフェラーゼ検出溶液のインキュベーション及び添加後に測定した放出光（ＲＬＵ）の単位に対してブロットする。ブランク対照（例えば、抗体非添加）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。１＋１抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）とＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡにより表示される、４−１ＢＢへの一価の結合は、わずかに低いＥＣ５０値をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」との用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及びスキャフォールド抗原結合タンパク質である。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」、又は「標的細胞抗原に特異的に結合可能な部分」とは、抗原に特異的に結合するポリペプチド分子を意味する。一態様では、抗原結合領域は、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様において、抗原結合ドメインは、標的部位、例えば、特定の種類の腫瘍細胞、又は抗原決定基を有する腫瘍間質に結合する構成要素（例えば４−１ＢＢアゴニスト）を指令することができる。標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。更に、標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）を含む。
【００５２】
抗体又はその断片に関連して、用語「標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む分子の一部を意味する。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により、提供されることができる。具体的には、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００５３】
特定の態様において、「標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂ断片又は交差Ｆａｂ断片である。
【００５４】
本明細書の「抗体」との用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、並びに抗体断片を含む。
【００５５】
「モノクローナル抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能な多様体抗体は除く。そのような多様体は、一般的に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製と比べて、モノクローナル抗体の調製における各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。
【００５６】
「単一特異性」抗体との用語は、本明細書で使用される場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」との用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。
【００５７】
本出願の中で用いられる用語「−価」とは、１つの異なる抗原決定基に対して特異的である抗原結合分子内で、１つの異なる抗原決定基に対して特異的な結合部位が特定の数、存在することを意味する。そのため、用語「二価」、「四価」、及び「六価」とは、抗原結合分子においてそれぞれ、特定の抗原決定基に対して特異的な、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを意味する。本発明の特定の態様において、本発明に従った二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができ、このことは、これらが、上記抗原決定基に対して１つのみの結合部位を有することを意味する。又は、これらは特定の抗原決定基に対して二価若しくは四価であることができ、このことは、これらが、上記抗原決定基に対してそれぞれ、２つの結合部位、若しくは４つの結合部位を有することを意味する。
【００５８】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」との用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」とは、様々な構造を有する、天然に発生する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、ネイティブＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖とから構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプにさらに分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
【００５９】
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、交差Ｆａｂ断片；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、また、国際公開第９３／１６１８５号並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合ドメインを含む抗体断片であり、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）に説明されている。「単一ドメイン抗体」とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ。例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
【００６０】
インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」との用語は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを含む、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。本発明に従うと、用語「Ｆａｂ断片」は、以下で定義する「交差Ｆａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」もまた含む。
【００６１】
「交差Ｆａｂ断片」又は「交差Ｆａｂ分子」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」との用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。交差Ｆａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００６２】
「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する：（ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、（ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ。ここで、上記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。上記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。さらに、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるだろう。
【００６３】
「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する。（ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ。ここで、ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、上記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるだろう。
【００６４】
「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、又はその逆で接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６）に記載されている。さらに、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を与えることができる。
【００６５】
「スキャフォールド抗原結合タンパク質」は、当技術分野において既知である。例えば、フィブロネクチン及びデザインされたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が、抗原結合ドメイン用の代替スキャフォールドとして使用されている（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３：２４５−２５５（２００９）ａｎｄ  Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：６９５−７０１（２００８）を参照のこと）。本発明の一態様では、スキャフォールド抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ−ドメイン（アフィボディ）、Ａ−ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７Ｂ１号）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）、３１−４５（２００１）を参照。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０〜１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８２：３３７−３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａ���ｒｅｕｓのプロテインＡに由来するスキャフォールドである。ドメインは、約５８アミノ酸の３つのラセン形の束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５−４６２号、及び欧州特許出願公開第１６４１８１８Ａ１号を参照のこと。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸のネイティブドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ−ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１２）、１５５６−１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １６（６）、９０９−９１７（２００７年６月）を参照。トランスフェリンは、モノマー血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリンスキャフォールドの例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４、２４０６６−２４０７３（１９９９）を参照。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαらせんとβターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のαらせん及びβターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９−５０３（２００３）、ＰＮＡＳ  １００（４）、１７００−１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５−１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８Ａ１号を参照。一本鎖ドメイン抗体は、一本のモノマー性可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。更に、単一ドメイン抗体との用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来ＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能なスキャフォールドである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。βサンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５−４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号、及び米国特許第６８１８４１８Ｂ��号を参照のこと。ペプチドアプタマーは、定常スキャフォールドタンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３−７９７（２００５）を参照。ミクロボディは、３〜４のシステイン架橋を含む、２５〜５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照。
【００６６】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競争アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競争アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
【００６７】
用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」とは、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む抗原結合分子の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」との用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分−抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患した細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。本発明の抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブ形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「完全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在する多様体、例えば、スプライス多様体又は対立遺伝子多様体も包含する。
【００６９】
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７，３２３−３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８，２１７−２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。
【００７０】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合パートナー（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００７１】
「親和性成熟した」抗体は、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の変更を有する抗体を指し、これに対して、親抗体は、そのような変更を有しておらず、そのような変更によって、抗原に対する抗体の親和性が向上する。
【００７２】
「標的細胞抗原」とは、本明細書で使用する場合、標的細胞、例えば癌細胞又は腫瘍間質細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。特定の実施形態において、標的細胞抗原は腫瘍特異的、又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。一実施形態では、ＴＡＡは腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施形態では、ＴＡＡは腫瘍間質の細胞上にある。別の態様では、標的細胞抗原はＴ細胞又はＢ細胞上の腫瘍関連抗原である。一実施形態では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、及びＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される。特定の態様において、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、又はＣＤ１９である。より具体的には、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＥＡである。別の態様では、標的細胞抗原はＰＤ−Ｌ１である。
【００７３】
プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている、用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＦＡＰを意味する。この用語は、「完全長」の、未処理ＦＡＰ、及び、細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在する多様体、例えば、スプライス多様体又は対立遺伝子多様体も包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合可能である。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号８６）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２にて示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで伸びている。Ｈｉｓタグ化したヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号８７に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号８８）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで伸びている。配列番号８９は、Ｈｉｓタグ化されたマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号９０は、Ｈｉｓタグ化されたカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、抗本発明のＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
【００７４】
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている、用語「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＥＡを意味する。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号９１）に示されている。ＣＥＡは長らく、腫瘍関連抗原として識別されている（Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１２１：４３９−４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  Ｎ．Ｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７−２２０７，２００２）。元は、胎児組織のみで発現するタンパク質として分類されていたＣＥＡは現在、いくつかの健常な成人組織にて同定されている。これらの組織は主に、胃腸、呼吸、及び泌尿器管の細胞、並びに、結腸、子宮頸、汗腺、及び前立腺の細胞を含む、元々上皮に存在する（Ｎａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，９（２−３）：１４５−５３，１９８８；Ｎａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２（８）：２３２９−２３３３９，１９９２）。上皮由来の腫瘍、及びこれらの転移物は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含有する。ＣＥＡ自身が存在することは、癌性細胞への形質転換を意味するものではないものの、ＣＥＡが分布していることを示している。健常な組織において、ＣＥＡは一般的に、細胞の先端面にて発現し（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ  Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．９（２）：６７−８１（１９９９））、血流にて抗体に接近できなくなる。健常な組織とは対照的に、ＣＥＡは、癌性細胞の全面にわたって発現する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ  Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．９（２）：６７−８１（１９９９））。発現パターンのこの変化により、ＣＥＡが、癌性細胞内で抗体結合をしやすくなる。更に、ＣＥＡの発現は、癌性細胞にて増加する。更に、ＣＥＡの発現が増加することにより、細胞間の接着性が増加し、転移につながり得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｊ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３０（ａ  Ｓｕｐｐｌ．８）：３０−６，２００３）。様々な腫瘍構成要素におけるＣＥＡ発現の有症率は一般的に、非常に高い。公開されたデータに一致して、組織サンプルにて実施した自身の分析により、その高い有症率が確認され、結腸癌（ＣＲＣ）において約９５％、膵癌において９０％、胃癌において８０％、非小細胞肺癌（ＨＥＲ３と同時発現するＮＳＣＬＣ）において６０％、及び、乳癌において４０％であり、小細胞肺癌及びグリア芽腫においては低い発現が確認された。
【００７５】
ＣＥＡは速やかに細胞表面から切断され、腫瘍から直接、又は、リンパ系を介してのいずれかにより、血流に入る。この性質から、血清ＣＥＡの濃度は、癌診断のための臨床マーカー、及び、癌、特に結腸直腸癌の再発のためのスクリーニングとして使用されてきた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  Ｄ  Ｍ．，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ，７：１８３−１８８，１９９２；Ｃｈａｕ  Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２２：１４２０−１４２９，２００４；Ｆｌａｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；１２（２３）：６９８５−６９８８，２００６）。
【００７６】
コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている、用語「黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＭＣＳＰを意味する。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号９２）に示されている。原型癌遺伝子ｃ−ＥｒｂＢ−１又は受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒｂＢ−１という名も付いている、用語「上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＥＧＦＲを意味する。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号９３）に示されている。用語「ＣＤ１９」とは、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られている、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９を意味し、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号９４）に示されている。「ＣＤ２０」とは、膜貫通４ドメインサブファミリーＡメンバー１（ＭＳ４Ａ１）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られている、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０を意味し、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号９５）に示されている。「ＣＤ３３」とは、ＳＩＧＬＥＣ３又はｇｐ６７としても知られている、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を意味し、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＤ３３を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ２０１３８（バージョン１５７、配列番号９６）に示されている。
【００７７】
ＣＤ２７４又はＢ７−Ｈ１としても知られている用語「ＰＤ−Ｌ１」とは、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＰＤ−Ｌ１（特に、「ヒトＰＤ−Ｌ１」）を意味する。完全ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号１０６）に示されている。用語「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」、又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体」、又は「アゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１」とは、１．０×１０−８ｍｏｌ／Ｌ以下のＫＤ値、一態様においては、１．０×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイを用いて測定される。
【００７８】
「可変領域」又は「可変ドメイン」との用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分な場合がある。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。
【００８０】
一般的に、抗体は、６個のＣＤＲを含み、ＶＨに３個（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）、ＶＬに３個（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；並びに
【００８１】
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））が挙げられる。
【００８２】
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．は、任意の抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」又は「Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス」とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）により説明されている番号付けシステムを意味する。特に明記されない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けに関する言及は、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付けシステムに従う。
【００８３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは通常、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、概して、ＶＨ（又はＶＬ）における次の配列において現れる。ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８４】
用語「キメラ」抗体とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の源又は種に由来する一方で、重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる源又は種に由来する抗体を意味する。
【００８５】
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、σ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００８６】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域からさらに修飾されるか、又は変更されているものである。
【００８７】
「ヒト」抗体とは、ヒト若しくはヒト細胞により作製した、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用した、非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、詳細には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００８８】
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」との用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、天然配列Ｆｃ領域と可変Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインとを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、おおよそのアミノ酸位置２３１のアミノ酸残基から、おおよそのアミノ酸位置３４０のアミノ酸残基まで延びている。一実施形態では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本発明のＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメイン又は多様体ＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基の伸長部を含む（すなわち、ＩｇＧのおおよその３４１位のアミノ酸残基から、おおよその４４７位のアミノ酸残基まで）。本発明のＣＨ３領域は、ネイティブ配列ＣＨ３ドメイン又は多様体ＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「突起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。そのような多様体ＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、完全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂した多様体を含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｋ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇ４４６）、及びリジン（Ｋ４４７）は、存在していてもよいし、存在していなくてもよい。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は本明細書において、別様に示されない場合、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチドを含まずに表される。一態様では、本発明に従った抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）を含む。一態様では、本発明に従った抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）を含む。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，��Ｄ，１９９１において説明されるような、ＥＵインデックスとも呼ばれる「ＥＵ番号付け」システムによる。
【００８９】
「ノブ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、米国特許第７，６９５，９３６号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８，７−１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらに具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、さらに、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、さらに、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、ダイマーをさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８，７−１５（２００１））。
【００９０】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子多様体及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有する多様体を含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失されていてもよい。そのような多様体は、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１０（１９９０）を参照）。
【００９１】
「エフェクター機能」との用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる。すなわち、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の低下調節、及びＢ細胞活性化である。
【００９２】
Ｆｃ受容体結合に依存したエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞における専用の細胞表面受容体である、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介されることができる。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で覆われた病原体の除去、並びに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による、赤血球、及び対応する抗体で覆われた他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１−５２４を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７−４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４（１９９４）２５−３４；ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０−３４１；ａｎｄ  Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１−２４８に記載されている。
【００９３】
ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃ領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエータの放出、並びに、免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の制御を含む、多種多様のエフェクター機能を引き起こす。ヒトにおいて、３クラスのＦｃγＲが特性決定されており、これらは以下のとおりである。
【００９４】
−ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、単量体ＩｇＧに高い親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球にて発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の少なくとも１つにおける、Ｆｃ領域内での修飾によって、ＦｃγＲＩへの結合が低下する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された、位置２３３〜２３６におけるＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍低下させ、抗体により感作される赤血球に対するヒト単核細胞応答を取り除いた（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３−２６２４）。
【００９５】
−ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧに中程度から低度の親和性で結合し、幅広く発現する。受容体は、２つのサブグループ：ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは主に、殺傷に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）にて発見され、殺傷プロセスを活性化可能であるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスで役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球で発見されている。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫グロブリン産生、及び、例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを更に抑制する機能を有するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介されるように、ファゴサイトーシスを阻害する役割を果たす。好酸球及び肥満細胞上において、Ｂ形態は、ＩｇＥの、その個別の受容体への結合による、これらの細胞の活性化を抑制を補助し得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の１つにおいて変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
【００９６】
−ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）はＩｇＧに、中程度〜低度の親和性で結合し、２つの種類として存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡはＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で発見されており、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上で非常に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の１つにおいて変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
【００９７】
Ｆｃ受容体に対する、ヒトＩｇＧ１上での結合部位のマッピング、上述した変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１−６６０４に記載されている。
【００９８】
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」とは、Ｆｃ受容体結合により媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下における、本明細書で報告される抗体による、標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ又は（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞を組み換えにより発現する細胞といった、Ｆｃγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。特に、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
【００９９】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による係合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体として、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７，バージョン１４１を参照）。
【０１００】
「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」、又は「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」は現在、２７種類の受容体で構成されている。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーは、細胞外のシステインリッチなドメイン（ＣＲＤ）を介して、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体の群である。これらの擬似反復は、受容体鎖内で高度に保存されたシステイン残基により生成される、鎖内ジスルフィドにより定義される。神経成長因子（ＮＧＦ）の例外はあれど、全てのＴＮＦは、典型的なＴＮＦ−αに対して相同である。これらの活性形態において、ＴＮＦ受容体の大多数は、血漿膜内で三量体の複合体を形成する。したがって、大部分の受容体は膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含有している。これらの受容体のいくつかは、リガンド結合の後にカスパーゼ相互作用タンパク質を動員して、カスパーゼ活性化の外因性経路を開始する細胞内死ドメイン（ＤＤ）もまた含有している。死ドメインを欠く、他のＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＴＮＦ受容体関連因子に結合し、増殖又は分化をもたらすことが可能な細胞内シグナル伝達経路を活性化する。これらの受容体は、アポトーシスを開始することもできるが、アポトーシスは間接的な機構を介して行う。アポトーシスの制御に加えて、いくつかのＴＮＦスーパーファミリー受容体は、Ｂ細胞のホメオスタシス及び活性化、ナチュラルキラー細胞の活性化、並びにＴ細胞の同時刺激といった、免疫細胞の機能の制御に関与している。いくつかの他のものは、毛嚢の成長及び破骨細胞の成長といった、細胞種に特異的な応答を制御する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーとしては、以下が挙げられる：腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ）、リンフォトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ、ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、ＣＤ４０（Ｂｐ５０）、Ｆａｓ受容体（Ａｐｏ−１、ＣＤ９５、ＦＡＳ）、デコイ受容体３（ＴＲ６、Ｍ６８、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔｐ５５）、ＣＤ３０（Ｋｉ−１、ＴＮＦＲＳＦ８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１、Ａｐｏ−２、ＣＤ２６１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ２６２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３、ＣＤ２６３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、デコイ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４、ＣＤ２６４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、オステオプロテゲリン（ＯＣＩＦ、ＴＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４、ＣＤ２６６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ、ＴＲ２、ＣＤ２７０、ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経増殖因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ２７１、ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７、糖質コルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＤＲ６（ＣＤ３５８��ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＤＲ３（Ａｐｏ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳ−１、ＴＮＦＲＳＦ２５）、及びエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２Ｒ）。
【０１０１】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのいくつかのメンバーは、最初のＴ細胞の活性化の後で機能し、Ｔ細胞応答を維持する。用語「同時刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」、又は「同時刺激性ＴＮＦファミリー受容体」とは、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのサブグループを意味し、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン産生を同時に刺激することができる。この用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳類を含む、任意の脊椎動物源からの任意の天然ＴＮＦファミリー受容体を意味する。本発明の特定の実施形態において、同時刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＣＤ３０、及びＧＩＴＲからなる群から選択され、これらは全て、Ｔ細胞上で同時刺激効果を有することができる。より具体的には、同時刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、４−１ＢＢである。
【０１０２】
用語「４−１ＢＢ」は本発明で使用する場合、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳類を含む、任意の脊椎動物源の任意の天然４−１ＢＢを意味する。この用語は、「完全長」の、未処理４−１ＢＢ、及び、細胞内での処理によりもたらされる任意の形態の４−１ＢＢを包含する。この用語は、４−１ＢＢの天然に存在する多様体、例えば、スプライス多様体又は対立遺伝子多様体も包含する。例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号９７（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｑ０７０１１）に示され、例示的なマウス４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号９８（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ２０３３４）に示され、例示的な（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａからの）カニクイザル４−１ＢＢのアミノ酸配列は、配列番号９９（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示されている。
【０１０３】
用語「抗４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ」、「４−１ＢＢ抗体」、及び「４−１ＢＢに特異的に結合する抗体」とは、抗体が４−１ＢＢの標的化において、診断及び／又は治療薬として有用であるような十分な親和性を有して、４−１ＢＢに結合可能である抗体を意味する。一実施形態では、抗４−１ＢＢ抗体が無関係の、非４−１ＢＢタンパク質に結合する程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定すると、４−１ＢＢに対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、４−１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８〜１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特に、抗４−１ＢＢ抗体は、米国特許第７，２８８，６３８号に開示されているように、クローン２０Ｈ４．９である。
【０１０４】
「ペプチドリンカー」との用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２〜２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。好適な、非免疫原性リンカーペプチドは例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に、１〜１０、典型的には２〜４、特に２の数字である。即ち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１００）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０１）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０２）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０３）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１０４）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０５）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１０６）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０７）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１０８）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１０９）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１１０）、ＧＧＳＧ（配列番号１１１）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１１２）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１１３）、及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１１４）もまた含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号１００）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０１）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０５）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１０６）、より具体的には（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０１）である。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」とは、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を表す。
【０１０６】
「融合した」、又は「接続した」とは、構成成分（例えば、抗体の重鎖及びＦａｂ断片）が直接、又は１つ以上のペプチドリンカーを介してのいずれかで、ペプチド結合により結合されていることを意味する。
【０１０７】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性率（％）」は、アラインメントの目的で、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるのに適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性率の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、かつ、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
【０１０８】
特定の実施形態において、本明細書において提供する、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列多様体が想到される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性、及び／又は他の生物学的性質を改善するのが望ましい場合がある。適切な改変を、分子をコードするヌクレオチド配列に導入することにより、又はペプチド合成により、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列多様体を調製することができる。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含む。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。置換による突然変異生成のための目的部位として、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、見出し「好ましい置換」の下の表Ａに提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）を参照して、以下で更に説明される。アミノ酸置換は、目的の分子及び所望の活性（例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの向上）についてスクリーニングされた産物に導入されていてもよい。
表Ａ
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【０１０９】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けされてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１１０】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。
【０１１１】
「アミノ酸配列多様体」との用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的な多様体を含む。一般的に、更なる試験のために選択され、得られた多様体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改良）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換多様体は、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用い、簡便に生成されてもよい。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされた多様体抗原結合分子である。特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中に作られてもよい。変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。多様体は、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
【０１１２】
アミノ酸配列挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子が挙げられる。分子の他の挿入多様体としては、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させる、Ｎ又はＣ末端の、ポリペプチドへの融合が挙げられる。
【０１１３】
特定の実施形態において、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。１つ以上のグリコシル化部位が作製される、又は取り除かれるように、アミノ酸配列を改変することにより、分子のグリコシル化多様体を便利に入手することができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合において、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＴＩＢＴＥＣＨ」、第１５巻、第２６〜３２頁（１９９７年）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、特定の改善された性質を有する多様体を作製するために、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子内でオリゴ糖の修飾を行うことができる。一態様では、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の多様体が提供される。このようなフコシル化多様体は、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照。別の態様において、バイセクトオリゴ糖を含む、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分割されている、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の多様体が提供される。このような多様体は、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ）を参照のこと。Ｆｃ領域に接続したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する多様体も提供される。このような抗体多様体は、改良されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。
【０１１４】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン操作された多様体、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の態様において、置換された残基は、分子の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基は、抗体の接近可能な部位に位置しており、これを使用し、抗体を他の部分（例えば、薬物部分又はリンカー−薬物部分）に対して抱合させ、免疫抱合体を作成してもよい。特定の態様において、任意の１つ以上の以下の残基をシステインで置換してよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作成されてもよい。
【０１１５】
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びホスフェート基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基配列によって記述され、ここで、上記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書中、核酸分子との用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子との用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、改変されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び／又はインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、インビボで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｒｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１７、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２１０１８２３Ｂ１号明細書を参照）。
【０１１６】
「単離された」ポリヌクレオチドは、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
【０１１７】
「二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチド」とは、単一ベクター又は個別のベクター内の核酸分子を含む、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を意味し、そのような核酸分子は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【０１１８】
「発現カセット」との用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１１９】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は「発現構築物」と同義であり、標的細胞中で作用可能に会合した特異的遺伝子の発現を導入及び誘導するのに使用されるＤＮＡ分子を意味する。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。いったん発現ベクターが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子又は遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞の転写機構及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１２０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」は同じ意味で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を意味し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。後代は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、突然変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、又は選択されるのと同じ機能若しくは生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗体を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。
【０１２１】
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
【０１２２】
ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。作用剤の治療有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
【０１２３】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、個体又は対象は、ヒトである。
【０１２４】
「医薬組成物」との用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、製剤が投与される対象に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での製剤を指す。
【０１２５】
「薬学的に許容される賦形剤」は、医薬組成物中の成分であって、有効成分以外であり、対象にとって毒性ではない成分を指す。薬学的に許容される賦形剤として、限定されないが、緩衝液、安定化剤又は防腐剤が挙げられる。
【０１２６】
「パッケージ添付文書」との用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「治療」（及びその文法的な変形語、例えば、「治療する」又は「治療すること」）は、治療される個体において本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、病気の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、病気の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、病気進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用して、病気の発生を遅らせるか、又は病気の進行を遅らせる。
【０１２８】
「癌」との用語は、本明細書で使用される場合、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、肺胞細胞性肺癌、骨腫瘍、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、消化器癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、陰門の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫尿道の癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫及びユーイング肉腫（上述のいずれかの癌の難治性態様を含む）、又は上述の癌の１つ以上の組合せを指す。
【０１２９】
本発明の二重特異性抗原結合分子
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、及び低下した毒性といった、特に有利な性質を備える、新規の二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体に関する。これらは更に、それぞれ、４−１ＢＢに二価結合する、及び、安全性を損なわず、二重特異性抗原結合分子を非常に強力にする標的細胞抗原に一価結合する、４−１ＢＢ及び標的細胞抗原に特異的結合が可能な２つのＦａｂ断片が近接しているといった、特異的な構造的特徴を特徴とする。
【０１３０】
例示的な二重特異性抗原結合分子
一態様では、本発明は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、
（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、及び
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、を含み、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて、第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に縮合し、転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、
標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、（ｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているか、又は、（ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域ＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３１】
一態様では、本発明は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、
（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、及び
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、を含み、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて、第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に縮合し、転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、
標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３２】
特に、４−１ＢＢに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）
を含む。
【０１３３】
特定の態様において、４−１ＢＢに対する二価結合、及び標的細胞抗原に対する一価結合を提供する、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子を提供する。より具体的には、二重特異性抗原結合分子は、４−１ＢＢへの二価結合、及び、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）への一価結合を提供する。
【０１３４】
複数のＦａｂ断片はＦｃドメインに、又は互いに、直接、又は、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含む、１個以上のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーを介して、融合することができる。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であり、本明細書に説明される。好適な非免疫原性ペプチドリンカーとしては例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１〜１０、典型的には２〜４の整数である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖に接続するのに好適な、例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２を含む。別の好適なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子が、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介し、更なるペプチドリンカーを伴い、又は伴わずに融合してもよい。
【０１３５】
一態様では、４−１ＢＢ（ａ）及び（ｃ）に対して特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が同一である、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様において、本発明は、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３６】
したがって、一態様において、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、
（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、及び
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、を含み、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて、第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に縮合し、転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、
標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、（ｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているか、又は、（ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域ＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３７】
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、それぞれ配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片を含む。より具体的には、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片はそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０１３８】
一態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（Ｆｃホール重鎖）、及び、配列番号６７のアミノ酸配列を含む２つのポリペプチド（軽鎖）を含む。
【０１３９】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片を含むことを更に特徴とする。それ故、二重特異性抗原結合分子は、４−１ＢＢに特異的に結合可能な従来の抗体に対して、典型的には癌細胞である標的細胞にて、同時刺激性Ｔ細胞応答を選択的に誘発するという利点を有する。一態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、及びＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される。一態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。特に、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、及びＣＤ１９から選択される。ある特定の態様において、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）から選択される。より具体的には、標的細胞抗原はＦＡＰである。あるいは、標的細胞抗原はＣＥＡである。別の特定の態様において、標的細胞抗原はＣＤ１９である。更なる態様において、標的細胞抗原はＰＤ−Ｌ１である。
【０１４０】
標的細胞抗原がＦＡＰである二重特異性抗原結合分子
特定の態様において、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ＦＡＰ結合部分は、その全体が参照により含まれている、国際公開第２０１２／０２００６号に記載されている。特に興味深いＦＡＰ結合部分を以下に記載する。
【０１４１】
一態様において、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４２】
特に、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片が（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４３】
別の態様において、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１４４】
特に、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４５】
特に、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１４６】
別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４７】
更なる態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４８】
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６６の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号６８の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号６６の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号６８の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１４９】
標的細胞抗原がＣＥＡである二重特異性抗原結合分子
特定の態様において、標的細胞抗原は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。ＣＥＡ結合部分は例えば、その全体が参照により含まれている、国際公開第９２／０１０５９号、同第２００７／０７１４２２号、同第２０１６／０７５２７８Ａ２号、又は同第２００７／０７１４２６号に記載されている。特に興味深いＣＥＡ結合部分を以下に記載する。
【０１５０】
一態様において、本発明は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｅ）（ｉ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｆ）（ｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１２７又は配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２９又は配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５１】
特に、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片が（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５２】
特に、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号３２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様では、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む（抗体Ａ５Ｂ７）。
【０１５３】
一態様では、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１５３のアミノ酸配列を含むヒトアクセプターフレームワークＩＧＨＶ３−２３−０２に基づくヒト化重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１６５のアミノ酸配列を含むヒトアクセプターフレームワークＩＧＫＶ３−１１に基づくヒト化軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５４】
ある特定の態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５５】
一態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。特に、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む（抗体Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）。別の態様において、Ｆａｂ断片は、同一のフレームワーク領域を含むが、ＣＤＲ領域に変異があるＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄと比較して、ＣＥＡに対して高い親和性を有する抗体を含むことができる。したがって、配列番号１２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片もまた提供する。
【０１５６】
別の態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５７】
一態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号４０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。一態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む（抗体ＭＦＥ２３）。
【０１５８】
特に、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、ヒト化重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様において、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、又は配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、又は配列番号１４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５９】
一態様において、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、
（ａ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｅ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｆ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｇ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む。
【０１６０】
更なる態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１６１】
一態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号４７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号４８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。特に、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む（抗体Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）。
【０１６２】
更なる態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１６３】
一態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号５５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号５６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。特に、ＣＥＡに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む（抗体ＣＨ１Ａ１Ａ  ９８／９９／２Ｆ１）。
【０１６４】
一態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６５】
更なる態様において、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６６】
別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６７】
更なる態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６８】
更なる態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６９】
別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７０】
別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７１】
更なる態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７２】
別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７３】
別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７４】
更に別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７５】
別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７６】
別の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７７】
また更なる態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７８】
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号７６の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号７７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号７６の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号７７の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１７９】
別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号７８の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号７９の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号７８の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号７９の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８０】
更に特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号８０の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号８１の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号８０の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号８１の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８１】
更に別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号８２の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号８３の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号８２の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号８３の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８２】
更に特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１７３の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１７４の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１７３の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１７４の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８３】
別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１７９の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１８０の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１７９の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１８０の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８４】
別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１８１の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１８２の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１８１の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１８２の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８５】
別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１８３の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１８４の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１８３の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１８４の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８６】
別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１８５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１８６の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１８５の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１８６の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８７】
別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１８７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１８８の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１８７の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１８８の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８８】
別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１８９の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１９０の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１８９の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１９０の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１８９】
別の特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１９１の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１９２の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１９１の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１９２の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１９０】
標的細胞抗原がＣＤ１９である二重特異性抗原結合分子
特定の態様において、標的細胞抗原はＣＤ１９である。ＣＤ１９結合部分は例えば、その全体が参照により含まれている、国際公開第２０１６／０７５２７８Ａ１号に記載されている。特に興味深いＣＤ１９結合部分を以下に記載する。
【０１９１】
一態様において、本発明は、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片が
（ａ）（ｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに、（ｉｖ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９２】
具体的には、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号６３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び、配列番号６４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。より具体的には、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【０１９３】
特定の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＣＤ１９に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９４】
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号８４の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号８５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号８４の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号８５の１つのポリペプチド配列を含む。
【０１９５】
標的細胞抗原がＰＤ−Ｌ１である二重特異性抗原結合分子
特定の態様において、標的細胞抗原はＰＤ−Ｌ１である。ＣＤ１９結合部分は例えば、その全体が参照により含まれている、国際公開第２０１０／０７７６３４号に記載されている。特に興味深いＰＤ−Ｌ１結合部分を以下に記載する。
【０１９６】
一態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ断片が
（ｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ−Ｌ１）、並びに、（ｉｖ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ−Ｌ１）
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９７】
具体的には、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１５２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ−Ｌ１）、及び、配列番号１５３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ−Ｌ１）を含む。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号１５２アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ−Ｌ１）、及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ−Ｌ１）を含む。
【０１９８】
特定の態様において、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｉｉ）ＣＤ１９に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９９】
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１９３の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である２つのポリペプチド、及び、配列番号１９４の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１９３の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の２つのポリペプチド配列、及び配列番号１９４の１つのポリペプチド配列を含む。
【０２００】
４−１ＢＢに一価で結合する抗原結合分子（１＋１フォーマット）もまた、開示する。したがって、配列番号６５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号１９５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチド、及び、配列番号１９４の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である１つのポリペプチドを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５の１つのポリペプチド配列、配列番号１９５の１つのポリペプチド配列、配列番号６７の１つのポリペプチド配列、及び配列番号１９４の１つのポリペプチド配列を含む。
【０２０１】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を下げるＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを更に含む。
【０２０２】
特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域多様体を作成する。Ｆｃ領域多様体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２０３】
Ｆｃドメインは、本発明の二重特異性抗体に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織−血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかし、同時に、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。したがって、特定的な実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特に、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  ドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。より具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０２０４】
１つのこのような態様では、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の結合親和性を示し、及び／又はネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘発しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌のうち１つ以上である。特定の態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインのドメインは、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、ＦｃＲｎに対して約７０％より大きく、特に約８０％より大きく、より特定的には約９０％より大きい結合親和性を示す場合に達成される。
【０２０５】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、及び／又はエフェクター機能が低下するように操作される。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる。別の態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に下げる。一態様では、操作されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、操作されていないＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より特定的には５％未満を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。別の態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらそれぞれの受容体に対する結合が低下する。いくつかの態様では、相補性構成要素に対する結合親和性（特定的にはＣ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合（すなわち、上記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保護）は、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの操作されていない形態（又はＦｃのこの操作されていない形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％を超える結合親和性を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％より大きく、更に約９０％より大きい親和性を示してもよい。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられ得る：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞に対する結合の低下、マクロファージに対する結合の低下、単球に対する結合の低下、多形核細胞に対する結合の低下、直接的なシグナル伝達誘発性アポトーシスの低下、樹状細胞成熟の低下、又��Ｔ細胞プライミングの低下。
【０２０６】
エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。ＦｃＲへの結合が向上又は低下した特定の抗体多様体について記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号及びＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１−６６０４。）
【０２０７】
本発明の一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択される更なるアミノ酸置換を含む。より特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１３０８３１  Ａ１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体の結合をほとんど完全になくす。上記文書は、このような変異Ｆｃドメインを調製するための方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などの特性を決定するための方法も記載する。このような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか、又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌのＥＵインデックスによる番号付け、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）。
【０２０８】
一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含む、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を減らす（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３８，８４−９１（２０１０）を参照）。
【０２０９】
半減期が長くなり、新生児Ｆｃ受容体に対する結合が向上した抗体は、胎児に対する成熟ＩｇＧの移動を担い（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７−５９３及びＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９−２４３４）、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上する１つ以上の置換基を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ多様体としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうち１つ以上における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を伴うものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域多様体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８８）７３８−７４０；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照。
【０２１０】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。適切なこのような結合アッセイを本明細書に記載する。あるいは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野において既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３，７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，１４９９−１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６，１３５１−１３６１（１９８７）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
【０２１１】
以下の章は、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン改変を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様において、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する抗体の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、エフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、天然ＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する、低下した結合親和性、及び／又は、低下したエフェクター機能、特に、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す二重特異性抗原結合分子に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能への結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、特に、上記１つ以上のアミノ酸置換がＬ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）からなる群から選択される１つ以上の位置に存在する二重特異性抗原結合分子に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能への結合を低下させる３つのアミノ酸置換基を含み、上記アミノ酸置換基がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）である二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ��メインである。
【０２１２】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
【０２１３】
したがって、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、前記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
【０２１４】
具体的な態様では、前記改変は、いわゆる「ホールにノブを入れる」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」改変と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」改変とを含む。したがって、本発明は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、もっと大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、もっと小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である二重特異性抗原結合分子に関する。したがって、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、ノブ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、ホールを含む二重特異性抗原分子を提供する。特に、より大きな側鎖体積を有する上記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、より小さな側鎖体積を有する上記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。一態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換されており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基で置換されており（Ｙ４０７Ｖ）、かつ任意に、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、位置３６６のスレオニン残基がセリン残基で置換されており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基で置換されている（Ｌ３６８Ａ）（全ての番号付けはＫａｂａｔ  ＥＵインデックスに従う）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２１５】
ホールにノブを入れる技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８，７−１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
【０２１６】
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。
【０２１７】
なお更なる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、ダイマーをさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ（２００１），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８，７−１５）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２１８】
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する改変を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
【０２１９】
本明細書に報告されるような二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短くなったＣ末端である。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２２０】
ＣＨ１／ＣＬドメイン内での修飾
正しい対形成を更に改善するために、二重特異性抗原結合分子は、異なる荷電を有するアミノ酸置換（「荷電残基」と呼ばれる）を含有することができる。これらの修飾は、交差しているか、又は交差していないＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。特定の態様において、本発明は、ＣＬドメインの少なくとも１つにおいて、位置１２３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換されており、位置１２４（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、ＣＨ１ドメインの少なくとも１つにおいて、位置１４７（ＥＵ番号付け）、及び位置２１３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。二重特異性抗原結合分子に関する。より詳細には、本発明は、４−１ＢＢに結合するＦａｂドメインのＣＬドメインにおいて、位置１２３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換されており、位置１２４（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、４−１ＢＢに結合するＦａｂドメインのＣＨ１ドメインにおいて、位置１４７（ＥＵ番号付け）、及び位置２１３（ＥＵ番号付け）におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２２１】
一態様では、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて、第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に縮合し、転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片において、（ｉ）可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、又は（ｉｉ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４におけるアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、位置１２３におけるアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、位置２１３におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２２２】
Ｆａｂドメイン内の修飾
本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、（ｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているか、又は、（ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域ＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体はＣｒｏｓｓｍａｂ技術に従い調製される。
【０２２３】
１つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂ  ＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７−１１９１に記載されている。これらの多重特異性抗体は、明確に、第１の抗原に対する軽鎖と、第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす（このようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合）。
【０２２４】
一態様において、本発明は、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、（ｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているか、又は、（ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域ＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、第２のＦａｂ断片において、定常ドメインが互いに置き換えられていることで、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となっており、ＣＬドメインが重鎖の一部となっている（ＣＨ−ＣＬクロスマブ）、二重特異性抗原結合分子に関する。別の態様において、第２のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられていることで、ＶＨドメインが軽鎖の一部となっており、ＶＬドメインが重鎖の一部となっている（ＶＨ−ＶＬクロスマブ）。より具体的には、標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨは互いに置き換えられていることで、ＶＨドメインが軽鎖の一部となっており、ＶＬドメインが重鎖の一部となっている。
【０２２５】
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０２２６】
本発明の二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。
【０２２７】
いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２２８】
一態様において、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、並びに、（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【０２２９】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【０２３０】
組み換え方法
本発明の二重特異性抗原結合分子は例えば、組み換え産生により入手することができる。組み換え産生のために、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。二重特異性抗原結合分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを単離して、宿主細胞で更にクローニング及び／又は発現するために、１つ以上のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上を含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルに従い、二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照のこと。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（即ちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び／又は他の転写若しくは翻訳調節要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチド構築物中に例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はその多様体若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグ���ルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。
【０２３１】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン−Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ−グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。更なる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴も含んでいてもよい。
【０２３２】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質からは開裂する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。特定の実施形態では、ネイティブシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分裂を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。又は、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２３３】
後での精製（例えばヒスチジンタグ）を容易にする、又は、融合タンパク質の標識を補助するために使用可能な、短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの中に、又はその末端に含めることができる。
【０２３４】
本発明の更なる態様において、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の態様において、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様において、宿主細胞は、本発明の本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、これにより形質転換されている、又はこれがトランスフェクションされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」との用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２，１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４，２１０−２１５（２００６）を参照。
【０２３５】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３６、５９（１９７７）に記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２３、２４３−２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ３８３，４４−６８（１９８２）に記載）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞で他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発��する細胞を組み換えて、他方の免疫グロブリン鎖を発現して、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンとなるようにすることができる。
【０２３６】
一態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片の作製方法であって、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片を発現するのに好適な条件下にて、本明細書において提供するように、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片を、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することと、を含む、方法を提供する。
【０２３７】
本明細書に記載のとおりに調製される本発明の二重特異的分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィー精製のために、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧの親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗原結合分子を単離することができる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例にて記載のとおりに発現する二重特異性抗原結合分子は、還元型、及び非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるように、インタクトであり、適切にアセンブルしたことが示された。
【０２３８】
アッセイ
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の物理的／化学的性質、及び／又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。
【０２３９】
１．親和性アッセイ
４−１ＢＢ及び標的細胞抗原に対する、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子、抗体及び抗体断片の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装、及び、例えば組み換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、実施例において説明する方法に従い測定することができる。標的細胞抗原に対する二重特異性抗原結合分子の親和性もまた、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装、及び、例えば組み換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態は、実施例１．２に記載される。一態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
【０２４０】
２．結合アッセイ及び他のアッセイ
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の、対応する受容体を発現する細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様において、４−１ＢＢを発現するレポーター細胞株のＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２を、結合アッセイにて使用する。更なる態様において、標的細胞抗原を発現する癌細胞株、例えばＦＡＰ又はＣＥＡを使用して、抗原結合分子の、標的細胞抗原への結合を実証した。
【０２４１】
別の態様において、競合アッセイを使用して、それぞれ、標的又は４−１ＢＢへの結合に対して、特異性抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を識別することができる。特定の実施形態において、このよう競合抗原結合分子は、特異性抗標的抗体、又は特異性抗４−１ＢＢ抗体により結合される、同一のエピトープ（例えば、直鎖又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
【０２４２】
３．活性アッセイ
一態様において、特異性標的細胞抗原及び生物活性を有する４−１ＢＢに結合する二重特異性抗原結合分子を識別するためのアッセイを提供する。生物活性としては例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上での、４−１ＢＢを通したアゴニストシグナル伝達を挙げることができる。アッセイにより、このようなインビトロ生物活性を有すると識別される二重特異性抗原結合分子もまた、提供される。
【０２４３】
特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のこのような生物活性を試験する。更に、（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）細胞溶解、（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）誘発されたアポトーシス動態、又は（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いた）アポトーシスを検出するアッセイが、当該技術分野において周知である。更に、このような複合体の生物活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、若しくはγσＴ細胞などの、様々なリンパ球サブセットの生残、増殖、及びリンホカイン分泌におけるこれらの効果を評価することにより、又は、表現型を制御する能力、及び、樹状細胞、単球／マクロファージ、若しくはＢ細胞などの抗原提示細胞の機能を評価することにより評価することができる。
【０２４４】
医薬組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の１つ以上を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び、例えば後述する少なくとも１種の追加の治療薬を含む。
【０２４５】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤に溶解又は分散した、治療に有効な量の１種以上の二重特異性抗原結合分子を含む。「医薬的又は薬理学的に許容される」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。本発明に従った少なくとも１種の二重特異性抗原結合分子、及び任意に追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示の見地から当業者に既知であろう。具体的には、組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者に既知であろうあらゆる全ての溶媒、緩衝剤、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗カビ剤）、等張剤、塩類、安定剤、及びこれらの組み合わせを含む。
【０２４６】
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射により投与されるように設計されているものが挙げられる。注射のために、本発明の二重特異性抗原結合分子は水溶液中で、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの、生理学的に適合性の緩衝剤中で製剤化することができる。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。あるいは、二重特異性抗原結合分子は使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱性物質除去水と共に構成するための、粉末形態であることができる。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の抗原結合分子を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇのタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な薬学的に許容される賦形剤としては、限定されないが、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなど）を含んでいてもよい。場合により、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。更に、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ  ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
【０２４７】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成型物品の形態である。特定的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
【０２４８】
本発明の例示的な薬学的に許容される賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と合わせる。
【０２４９】
例示的な凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。
【０２５０】
前述した組成物に加えて、抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。このような長く作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下若しくは筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。それゆえに、例えば融合タンパク質は、好適なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容されるオイルの乳剤エマルションとして）又はイオン交換樹脂と共に、又は例えば、低溶解性の塩等の難溶性誘導体として製剤化してよい。
【０２５１】
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
【０２５２】
二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。医薬的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩類である。医薬的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸若しくはリン酸などの無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
【０２５３】
本発明の組成物は、治療される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
【０２５４】
インビボ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。
【０２５５】
治療方法及び組成物
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれかを、治療方法にて使用することができる。治療方法で使用するために、本発明の二重特異性抗原結合分子を、良好な医事に一致する様式で製剤化、用量化、及び投与することができる。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。
【０２５６】
一態様において、薬剤として使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２５７】
更なる態様において、（ｉ）Ｔ細胞応答の刺激若しくは増強で使用するための、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生残の支持で使用するための、（ｉｉｉ）癌の治療で使用するための、（ｉｖ）癌の進行の遅延で使用するための、又は、（ｖ）癌を患う患者の生残を伸ばすのに使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様において、病気の治療で使用するための、特に、癌の治療で使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２５８】
特定の態様では、治療方法で使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様において、本発明は、病気の治療を必要とする個体における、病気の治療で使用するための、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様において、本発明は、病気を有する個体の治療方法であって、治療に有効な量の二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む方法で使用するための二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様において、治療される病気は癌である。治療が必要な対象、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より特定的には、ヒトである。
【０２５９】
一態様において、（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激若しくは増強させる、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生残を支持する、（ｉｉｉ）癌を治療する、（ｉｖ）癌の進行を遅延させる、又は癌を患う患者の生残を伸ばす方法であって、治療に有効な量の、本発明の二重特異性抗原結合分子を、これらを必要とする個体に投与することを含む、方法を提供する。
【０２６０】
更なる態様において、本発明は、病気の治療を必要とする個体における、病気の治療のための薬剤の製造又は調製における、本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一態様において、薬剤は、病気を有する個体に、治療に有効な量の薬剤を投与することを含む病気の治療方法で使用するためのものである。特定の態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特に癌である。癌の例としては、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、胃癌、前立腺癌、血液がん、皮膚癌、扁平細胞癌腫、骨がん及び腎臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。癌の他の例としては、癌、リンパ腫（例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を使用して治療可能な、その他の細胞増殖性疾患としては、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。前癌状態又は病変及び癌転移も含まれる。特定の実施形態では、癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌からなる群から選択される。多くの場合において、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は治癒をもたらし得ないが、効果をもたらし得ることを当業者は速やかに理解する。いくつかの態様では、いくらかの効果を有する生理学的変化もまた、治療上有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化をもたらす本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体量を、「有効量」、又は「治療に有効な量」とみなす。
【０２６１】
病気の予防又は治療のために、（単独で、又は、１種以上の他の追加の治療薬と組み合わせて使用する場合の）本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な用量は、治療される病気の種類、投与経路、患者の体重、特異性分子、病気の重症度及び経過、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が、予防又は治療目的で投与されるか田舎、以前又は現在の治療的介入、融合タンパク質に対する患者の病歴及び応答、並びに、主治医の自由裁量に応じて変化する。投与に責任を持つ施術者はいずれにせよ、組成物中の活性成分の濃度、及び個々の対象での適切な用量を決定する。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
【０２６２】
本発明の二重特異性抗原結合分子は患者に１回、又は連続治療にわたって好適に投与される。病気の種類及び重症度に応じ、例えば、一度以上の個別投与、又は連続点滴に関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となることができる。１つの典型的な日用量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の、１つの例示的な用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の例では、用量はまた、投与あたり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、又はもっと多く、又はその間の誘導可能な任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の例では、約０．１ｍｇ／ｋｇ／体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１ｍｇ／ｋｇ／体重などが、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１回以上の投薬を患者に投与してもよい。このような用量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者は、約２〜約２０回、又は例えば約６回の融合タンパク質の投薬を受ける）。特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は３週間に１回投与される。最初の多めの投与量、それに続く一回以上の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬計画が有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
【０２６３】
本発明の二重特異性抗原結合分子は一般に、意図する目的を達成するのに有効な量で使用される。病状を治療又は予防するのに使用するため、本発明の二重特異性抗原結合分子若しくは抗体、又はその医薬組成物は、治療に有効な量で投与される、又は適用される。治療に有効な量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示の観点で、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２６４】
全身投与の場合、治療に有効な用量は、インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
【０２６５】
初期用量も、インビボデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者は、動物のデータに基づきヒトへの投与を速やかに最適化することができる。
【０２６６】
投与量及び感覚を個別に調節して、治療効果を維持するのに十分な、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の血漿濃度を提供することができる。注射による投与に有用な通常の患者用量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回の用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中の量は、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。
【０２６７】
局所投与又は選択的な取り込みの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の効果的な局所濃度は、血漿濃度のとは関係し得ない。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所用量を最適化することができる。
【０２６８】
本明細書で記載される、本発明の二重特異性抗原結合分子の治療に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果を提供する。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の投薬比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を配合する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される投薬量、利用される投与経路、対象の状態などの種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。正確な配合物、投与経路及び用量は、患者の状態に鑑みて個々の医師により選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ，１９７５：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１内を参照のこと：その全体が本明細書に参照として組み込まれる）。
【０２６９】
本発明の二重特異性抗体で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を生じずに）、治療をもっと高レベルにするように調整することも知っている。目的の疾患の管理において投与される投薬量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与経路などに伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な診断評価方法によって評価されてもよい。更に、用量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。
【０２７０】
他の薬剤及び治療
本発明の二重特異性抗原結合分子は単独、又は療法における１種以上の他の薬剤との組み合わせ、のいずれかで投与することができる。例えば、本発明の本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、少なくとも１種の追加の治療薬と同時に投与することができる。「治療薬剤」との用語は、このような治療が必要な個体において、症状又は病気を治療するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような更なる治療薬剤は、治療される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態において、追加の治療薬は、別の抗癌剤又は化学療法剤、例えば、微細管撹乱物質、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、アントラサイクリン、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。特定の態様では、更なる治療薬剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤若しくは細胞増殖抑制、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。
【０２７１】
一態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、化学療法剤、放射線治療、及び／又は癌免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される。化学療法剤は、上述した抗癌剤である。あるいは、化学療法剤は、ヌクレオチド類似体（例えばアザシチジン、カペシタビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、又は）、白金製剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン、又はオキサリプラチン）、タキサン（例えばパクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、又はタキソテール）、アルキル化剤（例えばシクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン、又はテモゾロミド）、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン又はイダルビシン）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えばイリノテカン又はトポテカン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えばエトポシド又はテニポシド）、キナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、又はビスモデギブ）、レチノイド、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及びビンカアルカロイドからなる群から選択される。癌免疫治療法で使用するための他の薬剤としては、例えば、ＰＤ１抗体（例えばペムブロリズマブ若しくはニボルマブ）、又はＰＤ−Ｌ１抗体（例えばアテゾリズマブ）などの、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤が挙げられる。本発明の二重特異性抗原結合分子は、放射線治療と組み合わせても使用することができる。
【０２７２】
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、若しくは本明細書で記載される１〜９９％の用量、又は実験的／臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。
【０２７３】
上述したこのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が同一又は個別の組成物に含まれる）、及び個別投与を包含し、個別投与において、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、これと同時、及び／又はこの後に生じることができる。一態様では、二重特異性抗原結合分子の投与、及び追加の治療薬の投与は互いに、約１ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。
【０２７４】
製造物品
本発明の別の態様では、上述の疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル若しくはパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から作られてもよい。容器は、組成物をそれ自身で、又は状態を治療し、予防し、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子である。
【０２７５】
ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される病態を治療するために使用されることを示す。更に、製造物品は、（ａ）製造物品中に含有され、本発明の二重特異性抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器、及び、（ｂ）製造物品中に含有され、更なる細胞毒性又は別の治療薬を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。製造物品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を治療するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。
【０２７６】
これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、医薬的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。製造物品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
表Ｂ（配列）：
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【０２７７】
全てのヌクレオチド配列は、対応する終止コドン配列なしで表される。
【０２７８】
発明の態様
以下の番号付けした段落は、本発明の態様を記載する：
【０２７９】
１．
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片、
（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片、及び
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、を含み、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて、第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に縮合し、転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に縮合し、
標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、（ｉ）可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、又は（ｉｉ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている、を含む
二重特異性抗原結合分子。
【０２８０】
２．二重特異性抗原結合分子が、４−１ＢＢに対する二価結合、及び標的細胞抗原に対する一価結合を提供する、段落１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８１】
３．安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、段落１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８２】
４．Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、ノブ・ホール法に従ったホールを含む、段落１〜３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８３】
５．Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能への、抗原結合分子の結合親和性を低減する１つ以上のアミノ酸置換、特に、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）を含む、段落１〜４のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８４】
６．４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片が同一である、段落１〜５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８５】
７．４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）
を含む、段落１〜６のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８６】
８．４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片がそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、段落１〜７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８７】
９．４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４におけるアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、位置１２３におけるアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、４−１ＢＢに特異的に結合可能な第１及び第３のＦａｂ断片の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、位置２１３におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスの番号付け）、段落１〜８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８８】
１０．標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、段落１〜９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２８９】
１１．標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される、段落１〜１０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９０】
１２．標的細胞抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、段落１〜１１のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９１】
１３．線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のｔｋｌｏｓｔｅｒｄｈｅアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、段落１〜１２のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９２】
１４．線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び、配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、段落１〜１３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９３】
１５．標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、段落１〜１１のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９４】
１６．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、段落１〜１１、又は１５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９５】
１７．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号３２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号４０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号４８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び、配列番号５６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、段落１〜１１、又は１５若しくは１６のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９６】
１８．標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、段落１〜１１のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９７】
１９．ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに、（ｉｖ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、段落１〜１１、又は１８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９８】
２０．ＣＤ１９に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、配列番号６３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び、配列番号６４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、段落１〜１１、又は１８若しくは１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９９】
２１．段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【０３００】
２２．段落２１に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【０３０１】
２３．段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子の作製方法であって、二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下にて、段落２２に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【０３０２】
２４．段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０３０３】
２５．癌の治療で使用するための、段落２４に記載の医薬組成物。
【０３０４】
２６．薬剤として使用するための、段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、又は、段落２４に記載の医薬組成物。
【０３０５】
２７．
（ｉ）Ｔ細胞応答の刺激、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生残の支持、
（ｉｉｉ）癌の治療、
（ｉｖ）癌の進行の遅延、又は
（ｖ）癌を患う患者の生残の延長
で使用するための、段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０６】
２８．癌の治療に使用するための、段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、又は段落２４に記載の医薬組成物。
【０３０７】
２９．二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線治療、及び／又は癌免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、癌の治療に使用するための、段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０８】
３０．癌又は感染症の治療のための薬剤の製造における、段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、又は段落２４に記載の医薬組成物の使用。
【０３０９】
３１．個体における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、当該個体に有効量の、段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、又は段落２４に記載の医薬組成物を投与し、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
【０３１０】
３２．個体に、治療に有効な量の、段落１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、又は段落２４に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌又は感染症の治療方法。
【実施例】
【０３１１】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
【０３１２】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載のとおりにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ  ９１−３２４２。
【０３１３】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
【０３１４】
遺伝子の合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生じたか、又はＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。正確な遺伝子配列が利用できない場合においては、最も近い相同物の配列に基づきオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全ての構築物は、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
【０３１５】
タンパク質の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶離は、ｐＨ２．８で達成され、その後、試料を即時中和した。凝集したタンパク質は、ＰＢＳ中での、又は２０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体の抗体画分をプールし、（必要であれば）例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を使用して濃縮し、−２０℃〜−８０℃で冷凍して保存した。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、又は質量分析による、後続のタンパク質分析及び分析による特性決定のために、サンプルの一部を提供した。
【０３１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％又は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニング緩衝液助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニング緩衝液を使用した。
【０３１７】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムの３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１を標準物質として供した。
【０３１８】
質量分析
この章は、その正しいアセンブリに重点をおいて、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ／ＣＬ交換（ＣｒｏｓｓＭａｂ）を有する多重特異性抗体の特性決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂ及び脱グリコシル化した／消化したプラスミン、又は脱グリコシル化した／制限されたＬｙｓＣ消化したＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した。
【０３１９】
ＣｒｏｓｓＭａｂを、リン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ−グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。プラスミン又は制限されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、１００μｇの脱グリコシル化したＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂを用い、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中、それぞれ、室温で１２０時間、また、３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、サンプルを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ  ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ−ＭＳによって測定された。
【０３２０】
実施例１
４−１ＢＢに対する二価結合、及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製、及び特性決定
１．１  ４−１ＢＢに対する二価結合、及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対する二価結合、及びＦＡＰに対する一価結合を有する、二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢを、図１に示すように調製した。この構築物は、頭部から頭部（Ｈ２Ｈ）２＋１フォーマット、又は２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１、又は４−１ＢＢ（２０Ｈ．９）×ＦＡＰ  ２＋１Ｈ２Ｈとも呼ばれる。
【０３２１】
構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の構成要素から構成された。抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、続いてＦｃホール。第２の重鎖ＨＣ２は、抗ＦＡＰバインダー（交差Ｆａｂフォーマット内のクローン４Ｂ９）のＶＬＣＨ１、続いて、抗４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、そしてＦｃノブで構成された。ＦＡＰバインダー４Ｂ９の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれている。４−１ＢＢバインダーに関して、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列を米国特許第７，２８８，６３８Ｂ２号、又は同第７，６５９，３８４Ｂ２号に従い入手した。２つの重鎖を組み合わせることでヘテロ二量体の生成が可能となり、このヘテロ二量体は、１つのＦＡＰ結合交差Ｆａｂ、及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含む（図１）。
【０３２２】
正しい対形成を改善するために、以下の変異を、抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ分子のＣＨ−ＣＬに導入した。ＣＬにＥ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、並びにＣＨ１にＫ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。抗ＦＡＰバインダー（クローン４Ｂ９）の第２の軽鎖ＬＣ２は、ＶＨＣＬ（交差Ｆａｂ）で構成されていた。
【０３２３】
第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを導入することにより、ノブ・ホール技術を適用し、ヘテロ二量体の生成を可能にした。
【０３２４】
国際特許出願公開番号第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。
【０３２５】
二重特異性抗体４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）に対するアミノ酸配列は、表１に見いだすことができる。
【０３２６】
表１：二重特異性の二価抗４−１ＢＢ／一価の抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000013
【０３２７】
１．２  ４−１ＢＢに対する二価結合、及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性抗体の産生
ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ又はＣＨＯ  ＥＢＮＡ細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の産生
ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞、又はＣＨＯ  ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。ＣＤ  ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６−１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％  ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、補充液（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｗ．Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８−３−６４２−５４０５０−９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充液（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後に、遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
【０３２８】
ＣＨＯ  Ｋ１細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の産生
あるいは、従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、（元は、ＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した）懸濁適応性ＣＨＯ  Ｋ１細胞を用い、Ｅｖｉｔｒｉａにより、本明細書で記載される抗体及び二重特異性抗体を調製した。産生のために、Ｅｖｉｔｒｉａは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）、並びに、専有のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
【０３２９】
ＩｇＧ様タンパク質の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡単に言うと、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（平衡緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）により、細胞培養上清からＦｃ含有タンパク質を精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いてサンプルをすぐにｐＨ中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ−１５，カタログ番号：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
【０３３０】
ＩｇＧ様タンパク質の分析
Ｐａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１−１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下、及び不存在下にて、ＣＥ−ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，２００ｍＭ  Ｌアルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ６．７、又は２００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ  ＫＣｌ，ｐＨ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ又はＵＰ−ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。
【０３３１】
表２−２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の生化学的分析
2021528988.tif 000014
【０３３２】
抗原の調製、及びスクリーニングツールのヒト４−１ＢＢＦｃ（ｋｉｈ）：
ヒト４−１ＢＢ（Ｑ０７０１１に従い合成）のエクトドメインをコードするＤＮＡ配列を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するフレーム内でサブクローニングした。抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に、ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を導入した。抗原−ＦｃノブのＣ末端に、指示したビオチン化のためのＡｖｉタグを導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含有する抗原Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含有するＦｃホール鎖とを組み合わせることにより、４−１ＢＢエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成が可能となり、Ｆｃ結合抗原の単量体形態が作製される。表３は、抗原Ｆｃ融合構築物のアミノ酸配列を示す。
【０３３３】
表３：（１つのＦｃホール鎖と、１つの抗原Ｆｃノブ鎖との組み合わせにより生成した）単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のアミノ酸配列
2021528988.tif 000015
【０３３４】
１．３  ４−１ＢＢに対する二価結合、及びＦＡＰに対する一価結合を有し、ＦＡＰのＶＨ及びＶＬが重鎖のＣ末端にて融合している、二重特異性抗体の調製（対照）
４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１ＶＨ／ＶＬとも呼ばれる、４−１ＢＢに対する二価結合、及びＦＡＰに対する一価結合を有する、二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ
それぞれ、重鎖のそれぞれのＣ末端にてＦＡＰ（４Ｂ９）バインダーのＶＨ及びＶＬが融合している（Ｃ末端）を調製した。第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することにより、ノブ・ホール技術を適用し、ヘテロ二量体の生成を可能にした。
【０３３５】
本実施例において、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の構成要素から構成された。抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、続いてＦｃノブ（このＣ末端にて、抗ＦＡＰバインダーのＶＬが融合した）。第２の重鎖ＨＣ２は抗４−１ＢＢのＶＨＣＨ１、続いてＦｃホールで構成され、このＣ末端にて、抗ＦＡＰバインダー（クローン４Ｂ９）が融合した。２つの重鎖を組み合わせることでヘテロ二量体の生成が可能となり、このヘテロ二量体は、１つのＦＡＰ結合部分、及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含む。
【０３３６】
国際特許出願公開番号第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。
【０３３７】
ＦＡＰ  ＶＨがＦｃノブ重鎖に融合し、ＶＬがＦｃホール重鎖に融合した、２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物のアミノ酸配列は、表４に見いだすことができる。
【０３３８】
表４：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（ＦＡＰ  ＶＨがＦｃホール鎖に融合し、ＶＬがＦｃノブ鎖に融合した構築物、２＋１ＶＨ／ＶＬと呼ばれる）
2021528988.tif 000016
【０３３９】
表５：４−１ＢＢに対する二価結合、及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性抗原結合分子（２＋１ＶＨ／ＶＬ  ４−１ＢＢ／ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）の生化学的分析
2021528988.tif 000017
【０３４０】
１．４  ４−１ＢＢに対する二価結合、並びに、非標的ＶＨ及びＶＬ部分（ＤＰ４７生殖細胞系対照）を有し、ＤＰ４７のＶＨ及びＶＬが重鎖のＣ末端にて融合している二重特異性抗体（対照）の調製
４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／非標的（ＤＰ４７）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１ＶＨ／ＶＬ（Ｃ末端）とも呼ばれる、４−１ＢＢに対する二価結合、及び一価の非標的ＤＰ４７生殖細胞系対照を有する、二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ抗体を調製した（非結合クローン（ＤＰ４７）のＶＨ及びＶＬはそれぞれ、重鎖のそれぞれのＣ末端にて融合している）。第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することにより、ノブ・ホール技術を適用し、ヘテロ二量体の生成を可能にした。
【０３４１】
本実施例において、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の構成要素から構成された。抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、続いてＦｃノブ（このＣ末端にて、ＤＰ４７のＶＬが融合した）。第２の重鎖ＨＣ２は抗４−１ＢＢのＶＨＣＨ１、続いてＦｃホールで構成され、このＣ末端にて、ＤＰ４７のＶＨが融合した。２つの重鎖を組み合わせることでヘテロ二量体の生成が可能となり、このヘテロ二量体は、１つの、ＦＡＰ結合部分の代わりのＤＰ４７、及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含む。
【０３４２】
国際特許出願公開番号第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。
【０３４３】
ＤＰ４７ＶＨがＦｃノブ重鎖に融合し、ＶＬがＦｃホール重鎖に融合した、２＋１抗４−１ＢＢ、非標的（ＤＰ４７）構築物のアミノ酸配列は、表６に見いだすことができる。
【０３４４】
表６：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／非標的（ＤＰ４７）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（ＤＰ４７  ＶＨがＦｃホール鎖に融合し、ＤＰ４７  ＶＬがＦｃノブ鎖に融合した構築物、Ｃ末端と呼ばれる）
2021528988.tif 000018
【０３４５】
実施例２
４−１ＢＢに対する二価結合、及びＣＥＡに対する一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製、及び特性決定
２．１  ４−１ＢＢに対する二価結合、及びＣＥＡに対する一価結合を有する二重特異性抗体の生成及び産生
抗ＦＡＰ交差Ｆａｂを抗ＣＥＡ交差Ｆａｂで置き換えることにより、４−１ＢＢに対する二価結合、及びＣＥＡに対する一価結合を有する、二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ抗体もまた、調製することができる。この構築物は、頭部から頭部（Ｈ２Ｈ）２＋１フォーマットとも呼ばれる。
【０３４６】
構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の構成要素から構成される。抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、続いてＦｃホール。第２の重鎖ＨＣ２は、交差Ｆａｂフォーマット内の抗ＣＥＡバインダーのＶＬＣＨ１、続いて、抗４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、そしてＦｃノブで構成された。親ＣＥＡバインダーのＡ５Ｂ７は、国際公開第９２／０１０５９号に記載されている。ＣＥＡバインダーであるＭＦＥ２３の配列は、国際公開第２００７／０７１４２２号に記載されている。４−１ＢＢバインダーに関して、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列を米国特許第７，２８８，６３８Ｂ２号、又は同第７，６５９，３８４Ｂ２号に従い入手した。２つの重鎖を組み合わせることでヘテロ二量体の生成が可能となり、このヘテロ二量体は、１つのＣＥＡ結合交差Ｆａｂ、及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含む（図１）。
【０３４７】
正しい対形成を改善するために、以下の変異を、抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ分子のＣＨ−ＣＬに導入した。ＣＬにＥ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、並びにＣＨ１にＫ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。抗ＣＥＡバインダーの第２の軽鎖ＬＣ２は、ＶＨＣＬ（交差Ｆａｂ）で構成されている。
【０３４８】
第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを導入することにより、ノブ・ホール技術を適用し、ヘテロ二量体の生成を可能にする。
【０３４９】
国際特許出願公開番号第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。
【０３５０】
二重特異性２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、２＋１抗４−１ＢＢ抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体に関して実施例１．２に記載されているように、作製する。
【０３５１】
二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体のアミノ酸配列は表７に見いだすことができる一方、二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体のアミノ酸配列は表８に見いだすことができる。
【０３５２】
実施例１．２に記載のとおりにタンパク質を作製し精製した。
【０３５３】
表７：二重特異性の二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000019
【０３５４】
表８：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000020
【０３５５】
４−１ＢＢに対する二価結合、及びＣＥＡに対する一価結合を有する、更なる二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢを、抗ＣＥＡバインダークローン抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）、又はクローン抗ＣＥＡ（ＣＨ１Ａ１Ａ  ９８／９９  ＳＦ１）により調製することができる。二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）とＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体のアミノ酸配列は表９に見いだすことができる一方で、二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）とＣＥＡ（ＣＨ１Ａ１Ａ  ９８／９９  ＳＦ１）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体のアミノ酸配列は表１０に見いだすことができる。
【０３５６】
表９：二重特異性の二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000021
【０３５７】
表１０：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ＣＨ１Ａ１Ａ  ９８／９９  ２Ｆ１）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000022
【０３５８】
２．２  抗ＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化多様体の生成
２．２．１  方法論
抗ＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７は例えば、Ｍ．Ｊ．Ｂａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９７，２９（２），１６１−１７１により開示されており、その構造は、タンパク質構造データベースＰＤＢ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ，Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，２８，２３５−２４２）中で、ＰＤＢ  ＩＤ：１ＣＬＯとして見いだすことができる。このエントリーは、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。抗ＣＥＡバインダーＡ５Ｂ７のヒト化の間に、好適なヒトアクセプターフレームワークを識別するために、高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを検索し、このフレームワークのＣＤＲをグラフトし、復帰突然変異が予想可能なものを評価することによる、古典的なアプローチを利用した。より明示的には、親抗体に対する、識別したフレームワークの各アミノ酸の違いの、バインダーに対する構造的完全性の影響を判断し、適切な場合はいつでも、親配列に対する復帰突然変異を導入した。構造評価は、親抗体、及び、Ｂｉｏｖｉａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，バージョン４．５を使用して実装した、インハウス抗体構造相同性モデリングツールにより作製したそのヒト化版の両方のＦｖ領域相同性モデルに基いた。
【０３５９】
２．２．２  アクセプターフレームワークの選択及びその適合
アクセプターフレームワークを、下表１１に記載のとおりに選択した。
【０３６０】
表１１：アクセプターフレームワーク
2021528988.tif 000023
【０３６１】
重鎖に関してはヒトＪエレメント生殖細胞系ＩＧＪＨ６、及び、軽鎖に関しては、κＪエレメントＩＧＫＪ２に類似した配列から、ポストＣＤＲ３フレームワーク領域を適合させた。
【０３６２】
構造の考察に基づき、親バインダーにおける、ヒトアクセプターフレームワークからアミノ酸への復帰突然変異を、重鎖の位置９３及び９４に導入した。
【０３６３】
２．２．３  得られるヒト化ＣＥＡ抗体のＶＨ及びＶＬ領域
ヒト化ＣＥＡ抗体の得られたＶＨドメインは、下表１２に見いだすことができ、ヒト化ＣＥＡ抗体の得られたＶＬドメインは、下表１３に列挙されている。
【０３６４】
表１２：ヒトアクセプターフレームワークＩＧＨＶ３−２３又はＩＧＨＶ３−１５に基づく、ヒト化ＣＥＡ抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列
2021528988.tif 000024
【０３６５】
重鎖に関して、最初の多様体３−２３Ａ５−１は、結合アッセイにおいて好適であることが発見され（しかし、親マウス抗体よりわずかに低い結合を示した）、更なる修飾のための起点として選択した。ＩＧＨＶ３−１５に基づく多様体は、ヒト化多様体３−２３Ａ５−１と比較して、低い結合活性を示した。
【０３６６】
親キメラ抗体の完全な結合活性を復元するために、多様体３−２３Ａ５−１Ａ、３−２３Ａ５−１Ｃ、及び３−２３Ａ５−１Ｄを作製した。ＣＤＲ−Ｈ２の長さがヒトアクセプター配列に適合可能であるか否か、多様体３−２３Ａ５−１を試験したが、この構築物は完全に結合活性を失っていた。推定では、アミド分解ホットスポットはＣＤＲ−Ｈ２（Ａｓｎ５３−Ｇｌｙ５４）に存在したため、このモチーフをＡｓｎ５３−Ａｌａ５４に変更した。可能性のある別のホットスポットＡｓｎ７３−Ｓｅｒ７４を、Ｌｙｓ７３−Ｓｅｒ７４に復帰突然変異させた。このように、多様体３−２３Ａ５−１Ｅを作製した。
【０３６７】
表１３：ヒトアクセプターフレームワークＩＧＫＶ３−１１に基づく、ヒト化ＣＥＡ抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列。
2021528988.tif 000025
【０３６８】
ヒトＩＧＫＶ３−１１アクセプターフレームワークに基づき、軽鎖をヒト化した。連続したＡ５−Ｌ１からＡ５−Ｌ４において、多様体Ａ５−Ｌ１は良好な結合活性を示す（しかし、親抗体をわずかに下回る）ことが分かった。ＣＤＲ−Ｌ１（多様体Ａ５−Ｌ２；Ｋａｂａｔ位置３０及び３１）の部分的なヒト化により、結合が完全に失われる。同様に、ＣＤＲ−Ｈ２（多様体Ａ５−Ｌ３；Ｋａｂａｔ位置５０〜５６）のヒト化によってもまた、結合が完全に失われる。位置９０（多様体Ａ５−Ｌ４）は、結合特性に対する著しい寄与を示す。この位置におけるヒスチジンは、結合に重要である。したがって、多様体Ａ５−Ｌ１を更なる修飾のために選択した。
【０３６９】
連続したＡ５−Ｌ１Ａ〜Ａ５−Ｌ１Ｄは、親キメラ抗体の完全な結合能力を復元するために、どの復帰突然変異が必要であるかの問いを解決した。Ｋａｂａｔ位置１、２、全体フレームワーク２、並びにＫａｂａｔ位置７１における復帰突然変異は、どのような更なる結合活性も添加しないことを、多様体Ａ５−Ｌ１Ａは示した。多様体Ａ５−Ｌ１Ｂ、及びＡ５−Ｌ１Ｃは、これらの位置のサブセットを解決し、そのサブセットは結合特性を変化させないことを確認する。Ｋａｂａｔ位置４６及び４７において復帰突然変異を有する多様体Ａ５−Ｌ１Ｄは、最良の結合活性を示した。
【０３７０】
２．２．４  ヒト化Ａ５Ｂ７抗体の選択
ＶＨ及びＶＬの新規のヒト化多様体に基づき、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載の方法に従い、新規のＣＥＡ抗体を、エフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を有するｈｕＩｇＧ１抗体として発現させてＦｃγ受容体への結合をなくし、ＭＫＮ４５細胞上で発現したＣＥＡへの結合を試験し、それぞれの親マウスＡ５Ｂ７抗体と比較した。
表１４：ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧ抗体として発現したＶＨ／ＶＬの組み合わせ
2021528988.tif 000026
【０３７１】
ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９）は、ＣＥＡを発現するヒトの胃腺癌細胞株である。細胞を、高度ＲＰＭＩ＋２％  ＦＣＳ＋１％  Ｇｌｕｔａｍａｘで培養した。ＭＫＮ−４５細胞の生存能を確認し、細胞を再懸濁し、１Ｍｉｏ細胞／ｍＬの密度に調節した。１００μＬのこの細胞懸濁液（０．１Ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次に、４０μＬの希釈抗体又はＦＡＣＳ緩衝液を細胞に添加し、３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μＬの希釈した二次ＰＥ抗ヒトＦｃ特異性二次抗体（１０９−１１６−１７０，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に加えた。細胞を更に３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％  ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
【０３７２】
図７に、ヒト化Ａ５Ｂ７多様体の結合曲線を示す。試験したバインダーは全て、ＭＫＮ４５細胞に結合することができたが、結合能力は、親Ａ５Ｂ７抗体と比較してわずかに低下した。クローンＰ１ＡＥ２１６７は、試験した全ての多様体に最良の結合を有したので、更なる開発のために選択した。
【０３７３】
２．２．５  表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用した、マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化多様体のＦａｂ断片の、ヒトＣＥＡに対する親和性の測定
マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化多様体のＦａｂ断片の、ヒトＣＥＡに対する親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ２００機器を用いる表面プラズモン共鳴により評価した。ＣＭ５チップ上で、ヒトＣＥＡ（ｈｕ  Ｎ（Ａ２−Ｂ２）Ａ−ａｖｉ−Ｈｉｓ  Ｂ）を、フローセル２上での３０秒間の、約１００ＲＵに対する標準的なアミンカップリングにより、４０ｎＭの濃度で不動態化した。マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化多様体のＦａｂ断片を、１２０秒の接触時間、２５０又は１０００秒の解離時間、及び３０μＬ／分の流速に対して、５００〜０．６５６ｎＭの範囲の３倍希釈で、分析物としてその後注入した。ヒトＣＥＡ（ｈｕ  Ｎ（Ａ２−Ｂ２）Ａ−ａｖｉ−Ｈｉｓ  Ｂ）の濃度における再生は、２パルスの、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．０（６０秒間）により達成された。不動態化フローセル１、及び分析物のゼロ濃度に対して、データを二重参照した。分析物の前記を、単純な１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。ヒトＣＥＡ（Ａ２ドメイン）に対する親和性定数［ＫＤ］を、下表１５にまとめている。
【０３７４】
表１５：マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７の異なるヒト化多様体を表すＦａｂ断片の、ヒトＣＥＡ（Ａ２ドメイン）への親和性定数。
2021528988.tif 000027
【０３７５】
マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化多様体は、親マウス抗体よりも低い親和性を有する。Ｐ１ＡＥ２１６７（ＶＨ多様体３−２３Ａ５−１Ａを有する重鎖、及びＶＬ多様体Ａ５−Ｌ１Ｄを有するＣκ軽鎖）に由来するｆａｂ断片Ｐ１ＡＥ４１３８を、最終のヒト化多様体として選択した。更に、アミド分解部位を取り除くために、Ｋａｂａｔ位置５４における、グリシンからアラニンへの変異（Ｇ５４Ａ）をＶＨドメインに導入し、ＶＬ多様体３−２３Ａ５−１Ｅをもたらした。最終のヒト化抗体（ＶＨ多様体３−２３Ａ５−１Ｅを有する重鎖、及びＶＬ多様体Ａ５−Ｌ１Ｄを有するＣκ軽鎖）の名前を、Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ又はｈｕＡ５Ｂ７とした。
【０３７６】
２．２．６  ４−１ＢＢに対する二価結合、及びＣＥＡに対する一価結合を有する二重特異性抗体の生成及び産生（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）
二重特異性２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、２＋１抗４−１ＢＢ抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体に関して実施例２．１に記載されているように、作製する。
【０３７７】
二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体のアミノ酸配列は表１６に見いだすことができる。実施例１．２に記載のとおりにタンパク質を作製し精製する。
【０３７８】
表１６：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000028
【０３７９】
２．３  抗ＣＥＡ抗体ＭＦＥ２３のヒト化多様体の生成
２．３．１  方法論
抗ＣＥＡ抗体ＭＦＥ２３は例えば、Ｍ．Ｋ．Ｂｏｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００，３４６，５１９−５２８により開示されており、その構造は、タンパク質構造データベースＰＤＢ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ，Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，２８，２３５−２４２）中で、ＰＤＢ  ＩＤ：１１ＱＯＫとして見いだすことができる。このエントリーは、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。抗ＣＥＡバインダーＭＦＥ２３のヒト化の間に、好適なヒトアクセプターフレームワークを識別するために、高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを検索し、このフレームワークのＣＤＲをグラフトし、復帰突然変異が予想可能なものを評価することによる、古典的なアプローチを利用した。より明示的には、親抗体に対する、識別したフレームワークの各アミノ酸の違いの、バインダーに対する構造的完全性の影響を判断し、適切な場合はいつでも、親配列に対する復帰突然変異を導入した。構造評価は、親抗体、及び、Ｂｉｏｖｉａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，バージョン４．５を使用して実装した、インハウス抗体構造相同性モデリングツールにより作製したそのヒト化版の両方のＦｖ領域相同性モデルに基いた。
【０３８０】
復帰突然変異の選択の確証を高めるために、この抗体が由来し得る最も近いマウス相同配列を識別した。その配列において、マウスＢ細胞内でのこの抗体の変異の間に、全体的な体節の超突然変異を受けた位置を探した。これらの変異は、ヒト化構築物に組み込まれる可能性がある、潜在的に重要なものである。
【０３８１】
２．３．２  アクセプターフレームワークの選択及びその適合
アクセプターフレームワークを、下表１７に記載のとおりに選択した。
表１７：アクセプターフレームワーク
2021528988.tif 000029
【０３８２】
重鎖に関してはヒトＪエレメント生殖細胞系ＩＧＨＪ４−０１、及び、軽鎖に関しては、κＪエレメントＩＧＫＪ４−０１に類似した配列から、ポストＣＤＲ３フレームワーク領域を適合させた。構造の考察に基づき、親バインダーにおける、ヒトアクセプターフレームワークからアミノ酸への復帰突然変異を、重鎖のＫａｂａｔ位置７１及び９３に導入した。最終の成熟ＭＦＥ２３配列をもたらす、マウス生殖細胞系でのフレームワーク変異が重要であるという考察に基づき、ＶＨのＫａｂａｔ位置９４の残基を変更して、マウス配列に戻した。
【０３８３】
ＭＦＥ２３配列での更なる親和性、及び／又は安定性の改善を評価するために、以下の変異を軽鎖配列に組み込んだ。Ｃ．Ｐ．Ｇｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２００４，１７（４），２９３−３０４により記載されている、Ｐｈｅ２６Ｌｅｕ、Ｓｅｒ３０Ｐｒｏ、又はＴｙｒ、Ｌｅｕ７８Ｖａｌ。
【０３８４】
２．３．３  得られるヒト化ＣＥＡ抗体のＶＨ及びＶＬドメイン
ヒト化ＣＥＡ抗体の得られたＶＨドメインは、下表１８に見いだすことができ、ヒト化ＣＥＡ抗体の得られたＶＬドメインは、下表１９に列挙されている。
【０３８５】
表１８：ヒトアクセプターフレームワークＩＧＨＶ１−２−０２に基づく、ヒト化ＣＥＡ抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列
2021528988.tif 000030
【０３８６】
表１９：ヒトアクセプターフレームワークＩＧＫＶ１−３９−０１に基づく、ヒト化ＣＥＡ抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列。
2021528988.tif 000031
【０３８７】
図８はそれぞれ、表１８及び１９に列挙する配列のアラインメントを示す。
【０３８８】
ヒト化ＣＥＡバインダーをコードする、６つの重鎖及び６つの軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、Ｐ２３９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ変異を含有するヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかを有するフレーム内でサブクローニングし、Ｆｃγ受容体への結合をなくした（国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号）。抗体を後述のように作製した。得られた３６個の多様体（表２０）の、ＭＫＮ４５細胞上での結合を試験し、７つの多様体を更なる開発のために選択した。
【０３８９】
表２０：ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧ抗体として発現したＶＨ／ＶＬの組み合わせに関する命名法
2021528988.tif 000032
【０３９０】
２．３．４  ヒト化ＭＦＥ２３抗体の選択
３６個のヒト化ＭＦＥ２３  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ多様体の、ＭＫＮ４５細胞上で発現したＣＥＡへの結合を、それぞれの親マウスＭＦＥ２３  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体と比較した。１７個のクローンは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現するＭＫＮ４５細胞への結合能力を喪失した（図９Ａ）。８個のクローンは、親クローンＭＦＥ２３と比較した場合に低下した結合を示した（図９Ｂ）。１１個のクローンは、親クローンＭＦＥ２３と比較した場合に、同様の結合を示した（図９Ｃ）。適合するＥＣ５０値、及びこれらの結合曲線の、曲線下面積（ＡＵＣ）を表２１に示す。
【０３９１】
表２１：図８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃに示す、異なるヒト化ＭＦＥ２３  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体の結合曲線の、ＥＣ５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）
2021528988.tif 000033
【０３９２】
２．３．５  ４−１ＢＢに対する二価結合、及びヒト化ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）に対する一価結合を有する二重特異性抗体の生成及び産生
二重特異性２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、２＋１抗４−１ＢＢ抗ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体に関して実施例２．１に記載されているように、作製する。
【０３９３】
二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２８−Ｈ２４）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体のアミノ酸配列  を表２２に、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２８−Ｈ２８）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体のアミノ酸配列を表２３に示す。実施例１．２に記載のとおりにタンパク質を作製し精製する。更なる二重特異性構築物を、表２４〜２８に示す。
【０３９４】
表２２：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２８−Ｈ２４）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000034
【０３９５】
表２３：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２８−Ｈ２８）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000035
【０３９６】
表２４：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２８−Ｈ２５）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000036
【０３９７】
表２５：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２７−Ｈ２９）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000037
【０３９８】
表２６：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２７−Ｈ２８）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000038
【０３９９】
表２７：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２７−Ｈ２６）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000039
【０４００】
表２８：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（ｈｕＭＦＥ２３−Ｌ２７−Ｈ２４）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000040
【０４０１】
二重特異性抗体の産生を、実施例１．２に記載のとおりに実施した。入手した生成物の例示的な分析を下表２９に示す。
【０４０２】
表２９−２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ二重特異性抗体の生化学的分析
2021528988.tif 000041
【０４０３】
実施例３
４−１ＢＢに対する二価結合、及びＣＤ１９に対する一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製、及び特性決定
２．１  ４−１ＢＢに対する二価結合、及びＣＤ１９に対する一価結合を有する二重特異性抗体の生成及び産生
抗ＦＡＰ交差Ｆａｂを抗ＣＤ１９交差Ｆａｂで置き換えることにより、４−１ＢＢに対する二価結合、及びＣＥＡに対する一価結合を有する、二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ抗体もまた、調製することができる。この構築物は、頭部から頭部（Ｈ２Ｈ）２＋１フォーマットとも呼ばれる。
【０４０４】
ＣＤ１９バインダークローン２Ｂ１１の生成及び調製は、国際公開第２０１７／０５５３２８Ａ１号に記載されている。２＋１Ｈ２Ｈ二価二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＤ１９（２Ｂ１１）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡのアミノ酸配列は、下表３０に見いだすことができる。
【０４０５】
表３０：二重特異性の、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９（２Ｂ１１）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000042
【０４０６】
実施例４
ＦＡＰに対する一価結合を有する、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異的性のアゴニスト４−１ＢＢ抗原結合分子の、機能性質決定
４．１  表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰへの同時結合能を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。全てのＳＰＲ実験は、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃にて実施した。ヒト４−１ＢＢＦｃ（ｋｉｈ）を、アミンカップリング（ＣＭ５センサーチップ）により、フローセルに直接結合した。７１０共鳴単位（ＲＵ）の不動化レベルを用いた。
【０４０７】
２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ／抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ構築物を、３０μＬ／分の速度で２００ｎＭの濃度範囲で、９０秒にわたりフローセルを通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを第２分析物として、３０μＬ／分の速度で９０秒にわたり、５００ｎＭの濃度でフローセルを通過させた（図２Ａでの、アッセイのセットアップを参照）。解離を１２０秒間監視した。タンパク質が不動化しなかった参照フローセルで入手した応答を差し引くことで、バルク屈折率の差を補正した。
【０４０８】
図２Ｂのグラフで確認できるように、２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１抗体構築物は、ヒト４−１ＢＢとヒトＦＡＰに同時に結合することができる。
【０４０９】
４．２  ｈｕ４−１ＢＢへの二価結合を確認するための、ＴａｇＬｉｔｅによる競合アッセイ
二重特異性２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体の、ｈｕ４−１ＢＢへの二価結合を確認するために、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）（ＴａｇＬｉｔｅと呼ぶ）を用いる競合アッセイを実施した。
【０４１０】
ｄ２標識４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）ＩｇＧ１の、トランスフェクションＨｅｋ細胞上でのＴｂ標識したｈｕ４−１ＢＢ−ＳＮＡＰへの結合は、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルをもたらした。競合アッセイのために、結合したｄ２標識４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）ＩｇＧ１を、非標識２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１抗体（４−１ＢＢに対するＦａｂの１つは、遊離Ｎ末端を有しない）により、又は、非標識２＋１ＶＨ／ＶＬ（Ｃ末端）４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１抗体（４−１ＢＢに対する２つの「遊離Ｆａｂ」）により置き換えると、ＦＲＥＴシグナルの低下がもたらされた（表３１）。
【０４１１】
表３１：競合アッセイで用いられるサンプル
2021528988.tif 000043
【０４１２】
簡潔に述べると、予め標識したＴｂ  ｈｕ４−１ＢＢ−ＳＮＡＰ発現細胞を解凍して洗浄し、１０μＬ中、ウェル当たり５０００細胞を、３８４ウェルプレート中で、５μＬのアクセプター（ｄ２）標識４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）ＩｇＧ１（０．６ｎＭ）、及び、５μＬの非標識競合構築物と、０．００６〜１０００ｎＭの範囲の１：３濃縮希釈；終体積２０μＬで混合した。０時間、２時間、及び４時間後に室温で、蛍光性ドナー（Ｔｂ）に関して６２０ｎｍ、及び、蛍光性アクセプター（ｄ２）染料に関して６６５ｎｍで、蛍光シグナルを測定した（Ｍ１０００  Ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ）。６６５／６２０＊１００００（Ｒ）の比率を計算し、参照（細胞のみ）の比率を差し引いて、プロットしたΔＲ値を得た。ＩＣ５０測定のために、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で、一カ所適合対数ＩＣ５０を用いて結果を分析した（表３２）。アッセイは２通りで行った。
【０４１３】
表３２：９５％信頼区間を含む、４時間後のＫｉ値
2021528988.tif 000044
【０４１４】
両方の４−１ＢＢ  ＦＡＰ二重特異性構築物が、ｈｕ４−１ＢＢへの結合に関して、４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）と同様に競合することができる（同様のＩＣ５０）ことを、結果は示す。二重特異性２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体の４−１ＢＢに対する両方のＦａｂアームが、４−１ＢＢに結合可能であることを、このことは示唆する。したがって、２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体は、４−１ＢＢに二価結合することができる（図３）。
【０４１５】
４．３  ヒトＦＡＰ発現細胞株への結合
細胞表面に発現したヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の試験のために、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を使用した。マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）に、ＣＭＶプロモーターの元でヒトＦＡＰをコードする発現ｐＥＴＲ４９２１プラスミドをトランスフェクションすることにより、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９を生成した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の（ＧＩＢＣＯ）、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、γ線照射マイコプラズマ非含有、熱不活化）、２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド（Ｇｌｕｔａ−ＭＡＸ−Ｉ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の（ＧＩＢＣＯ）、カタログ番号３５０５０−０３８）、及び、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ａｎｔ−ｐｒ−５）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号：４２３４０−０２５）中で細胞を維持した。結合アッセイのために、２×１０５のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号６５  ０８６３  １８）を含有する、１００μＬ／ウェル４℃の冷却ＤＰＢＳ緩衝液で再懸濁した。プレートを３０分間４℃でインキュベートし、２００μＬの、４℃に冷却したＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後細胞を、異なる滴定濃度の、ＦＡＰ（抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１Ｈ２Ｈとも呼ばれる）又は対照分子に対する一価結合を有する、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＦＡＰ（４Ｂ９）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡを含有する、５０μＬ／ウェルの、４℃に冷却したＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、その後、暗所にて１時間、４℃でインキュベートした。２００μＬのＤＰＢＳ／ウェルで４回洗浄した後、２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９−１１６−０９８）を含有する、５０μＬ／ウェルの、４℃に冷却したＦＡＣＳ緩衝液で、３０分間４℃で細胞を染色した。細胞を、２００μＬの、４℃のＤＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、固定のために、１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日、又は翌日に、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して入手した。
【０４１６】
図４に示すように、非ＦＡＰ標的ｈｕＩｇＧ１  Ｐ２９３Ｇ  ＬＡＬＡフォーマットではなく、ＦＡＰ標的分子が、ヒトＦＡＰを発現するＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞に効率的に結合した。これにより、Ｎ末端が融合した抗ＦＡＰ交差Ｆａｂ（黒円及び線）は、Ｃ末端が融合した抗ＦＡＰ  ＶＨ／ＶＬ結合ドメイン（灰色の正方形及び点線）よりも、高い親和性でＦＡＰに結合する。これは、２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体に対する低いＥＣ５０値により反映されているが、より大きな曲線下面積（ＡＵＣ）値をもたらす、飽和時点での高いｇＭＦＩでも反映されている。適合するＥＣ５０値、及び曲線下面積の値を表３３に列挙し、適合するＡＵＣ値を表３４に列挙する。
【０４１７】
表３３：ＦＡＰ発現細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９に対する結合のＥＣ５０値
2021528988.tif 000045
【０４１８】
表３４：ＦＡＰを発現する細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９に対する結合の曲線下面積（ＡＵＣ）値
2021528988.tif 000046
【０４１９】
４．４  ヒト４−１ＢＢを発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２への結合
細胞表面に発現するヒト４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）への結合を測定するために、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。１０％（体積／体積）のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の（ＧＩＢＣＯ）、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、γ線照射マイコプラズマ非含有、熱不活化）、２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド（Ｇｌｕｔａ−ＭＡＸ−Ｉ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の（ＧＩＢＣＯ）、カタログ番号３５０５０−０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（体積／体積）のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１００ｘ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）、６００μｇ／ｍＬのＧ−４１８（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４７２７８９４００１）、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：１０８４３５５５００１）、及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｉｅｎｃｅ、カタログ番号：Ｈ０８８７−１００ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１−０４２）中で細胞を、懸濁細胞として維持した。結合アッセイのために、２×１０５のＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号６５  ０８６３  １８）を含有する、１００μＬ／ウェル４℃の冷却ＤＰＢＳ緩衝液で再懸濁した。プレートを３０分間４℃でインキュベートし、２００μＬの、４℃に冷却したＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後細胞を、異なる滴定濃度の、２＋１Ｈ２Ｈアゴニスト抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体、又は対照分子を含有する、５０μＬ／ウェルの、４℃に冷却したＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、その後、暗所にて１時間、４℃でインキュベートした。２００μＬのＤＰＢＳ／ウェルで４回洗浄した後、２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９−１１６−０９８）を含有する、５０μＬ／ウェルの、４℃に冷却したＦＡＣＳ緩衝液で、３０分間４℃で細胞を染色した。細胞を、２００μＬの、４℃のＤＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、固定のために、１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日、又は翌日に、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して入手した。
【０４２０】
図５に示すように、２＋１Ｈ２Ｈアゴニスト抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体は、その対照の抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡと同様に４−１ＢＢに結合する。したがって、Ｎ末端の、抗ＦＡＰ交差Ｆａｂの頭部から頭部への融合は、４−１ＢＢへの結合に影響を及ぼさなかった。結合曲線のＥＣ５０の値及びＡＵＣを、表３５及び表３６に列挙する。
【０４２１】
表３５：図５に示す、細胞で発現したヒト４−１ＢＢに対する結合曲線のＥＣ５０値の一覧
2021528988.tif 000047
【０４２２】
表３６：図５に示す、細胞で発現したヒト４−１ＢＢに対する結合曲線のＡＵＣ値の一覧
2021528988.tif 000048
【０４２３】
４．５  ヒト４−１ＢＢ及びＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２における、ＮＦ−κＢの活性化
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）受容体の、そのリガンド（４−１ＢＢＬ）へのアゴニスト結合は、核因子κＢ（ＮＦｋＢ）の活性化を介する４−１ＢＢ下流シグナル伝達を誘発し、ＣＤ８  Ｔ細胞の生残及び活性を促進する（Ｌｅｅ  ＨＷ，Ｐａｒｋ  ＳＪ，Ｃｈｏｉ  ＢＫ，Ｋｉｍ  ＨＨ，Ｎａｍ  ＫＯ，Ｋｗｏｎ  ＢＳ．４−１ＢＢ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）ａｎｄ  Ｂｆｌ−１．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２；１６９：４８８２−４８８８）。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ二重特異性抗体により媒介されるこのＮＦκＢ−活性化を監視するため、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。細胞を上記のとおりに培養した（ヒト４−１ＢＢを発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２への結合）。アッセイのために、細胞を回収し、１０％（体積／体積）ＦＢＳ及び１％（体積／体積）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを補充したアッセイ培地である、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。２×１０３のＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞を含有する１０μＬを、蓋付きの滅菌白色３８４ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３８２６）の各ウェルに移した。滴定濃度の、ＦＡＰに対する一価結合を有する、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１Ｈ２Ｈとも呼ばれる）、又は対照分子を含有する１０μＬのアッセイ培地を添加した。最後に、１０μＬの、アッセイ培地のみ、又は、１×１０４の細胞ＦＡＰ発現細胞、ヒト黒色腫細胞株ＷＭ−２６６−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）、若しくはＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（前述の通り）を含有する培地を供給し、プレートを６時間、３７℃及び５％  ＣＯ２で、細胞インキュベーター内でインキュベートした。６μＬも、新たに解凍したＯｎｅ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ検出溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｅ６１１０）を各ウェルに添加し、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（５００ｍｓの積分時間、全波長にてフィルタ収集なし）を用いて速やかに、ルミネセンス発光を測定した。
【０４２４】
図６に示すように、ＦＡＰ発現細胞の不存在下においては、いずれの分子も、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株内で強力なヒト４−１ＢＢ受容体の活性化を誘発することはできず、ＮＦｋＢの活性化、及びそれ故、ルシフェラーゼ発現をもたらした。二重特異性２＋１抗４−１ＢＢの架橋である、ＷＭ−２６６−４（ヒト黒色腫細胞株、中程度のＦＡＰ発現）、又はＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（ヒトＦＡＰトランスジェニックマウス線維芽細胞細胞株）などのＦＡＰ発現細胞の存在下において、抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ抗体（２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗体：黒円及び線、又は２＋１ＶＨ／ＶＬ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗体：灰色の正方形及び点線）は、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株における、ＮＦｋＢにより活性化されたルシフェラーゼ活性の強力な増加をもたらし、これは、非標的化対照抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と非標的化（ＤＰ４７）２＋１ＶＨ／ＶＬ（灰色抜きの正方形及び小型の点線）により媒介される活性化を上回っていた。これにより、二重特異性２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢと抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１Ｈ２Ｈ、黒円及び線）は、わずかに良好な活性化（低いＥＣ５０値）を示し、これはＦＡＰに対するより高い親和性を反映し得る。活性化曲線のＥＣ５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）を、表３７及び表３８に列挙する。
【０４２５】
表３７：図６に示す活性化曲線のＥＣ５０値
2021528988.tif 000049
【０４２６】
表３８：図６に示す活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）の値
2021528988.tif 000050
【０４２７】
実施例５
ＣＥＡに対する一価結合を有する、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異的性のアゴニスト４−１ＢＢ抗原結合分子の、機能性質決定
５．１  表面プラズモン共鳴（同時結合）
ＮＡＢＡ構築物の形態での、ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＣＥＡへの同時結合能を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。全てのＳＰＲ実験は、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃にて実施した。ヒトＮ（Ａ２Ｂ２）Ａ又は（ＮＡ１）ＢＡは、アミンカップリングによりＣＭ５チップのフローセルに直接結合した。約６００ＲＵの不動化レベルを使用した。
【０４２８】
ＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニスト構築物を、３０μＬ／分で２００ｎＭの濃度範囲で、９０秒にわたりフローセルを通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を第２の分析物として、３０μＬ／分の速度で、５００ｎＭの濃度で９０秒にわたりフローセルを通して注入した（図１０Ａ）。解離を１２０秒間監視した。タンパク質が不動化しなかった参照フローセルで入手した応答を差し引くことで、バルク屈折率の差を補正した。
【０４２９】
図１０Ｂ及び１０Ｃに確認できるように、２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１、及び２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡは、ヒトＣＥＡ（Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ構築物の形態）、及びヒト４−１ＢＢに同時に結合することができた。図１０Ｄは、ヒトＣＥＡ（（ＮＡ１）ＢＡ構築物の形態）及びヒト４−１ＢＢに同時に結合する、２＋１Ｈ２Ｈ  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡを示す。
【０４３０】
５．２  カニクイザル及びヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞株への結合
まず、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５又はヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞株を生成した。ヒト及びカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５をコードする完全長ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングした。メーカーのプロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５３３８１００）を使用してプラスミドをＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６１８）細胞にトランスフェクションした。安定してトランスフェクションしたＣＥＡＣＡＭ５陽性ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、γ線照射マイコプラズマ非含有、熱不活化）、及び、２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド（Ｇｌｕｔａ−ＭＡＸ−Ｉ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０−０３８）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ，＃１１３２００３３）で維持した。トランスフェクションの２日後、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；＃ａｎｔ−ｐｒ−１）を６μｇ／ｍＬ添加し、細胞を複数継代のために培養した。最初の選択の後、ヒト及びカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の、細胞表面での高い発現を有するセル（検出抗体：抗ＣＤ６６クローンＣＤ６６ＡＢ．１．１）を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりソートし、培養して安定した細胞クローンを確立した。発現量及び安定性は、４週間にわたるフローサイトメトリー分析で確認した。結合アッセイのために、ＣＨＯ−ｋ１−ｃｙｎｏＣＥＡＣＡＭ５クローン８、ＣＨＯ−ｋ１−ｈｕＣＥＡＣＡＭ５クローン１１、ＣＨＯ−ｋ１−ｈｕＣＥＡＣＡＭ５クローン１２、又はＣＨＯ−ｋ１−ｈｕＣＥＡＣＡＭ５クローン１３を回収し、ＤＰＢＳ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ，＃１４１９０−１３６）で洗浄し、固定可能な生存能染料ｅＦ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃６５−０８６３−１８）を含有するＤＰＢＳ内で、３０分間４℃で染色した。細胞を洗浄し、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３８３０）に、３×１０４細胞／ウェルで播種した。細胞を遠心分離にかけ（３５０ｘｇ、５分）、上清を取り除き、滴定濃度の、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）とＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体、又は対照（開始濃度３００ｎＭ）を含有する１０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳ、５ｎＭのＥＤＴＡ、７．５ｍＭのアジ化ナトリウムを補充したＤＰＢＳ）中に再懸濁した。細胞を３０分間４℃でインキュベートした後、８０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した。２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９−１１６−０９８）を含有する１０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で、３０分間４℃で細胞を再懸濁した。細胞を８０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した後、少なくとも１５分間、１％ホルムアルデヒドを含有する３��μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で固定した。同日、又は翌日に、細胞を５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して入手した。
【０４３１】
図１２Ａ〜１２Ｄに示すように、非ＣＥＡ標的化ｈｕＩｇＧ１  Ｐ２９３Ｇ  ＬＡＬＡフォーマットではなく、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体が、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現するＣＨＯ−ｋ１クローン１２及びクローン１３細胞に効率的に結合した。対照的に、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体のみが、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５を発現するＣＨＯ−ｋ１−ｃｙｎｏＣＥＡＣＡＭ５細胞株に良好に結合した。２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体の、カニクイザルＣＥＣＡＭ５を発現するＣＨＯ−ｋ１−ｃｙｎｏＣＥＡＣＡＭ５への結合は非常に弱い一方で、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体は、ＭＦＥ２３クローンがヒト／カニクイザル交差反応性ではないため、ＣＨＯ−ｋ１−ｃｙｎｏＣＥＡＣＡＭ５に結合しない。適合するＥＣ５０値、及び曲線下面積の値を表３９に列挙し、適合するＡＵＣ値を表４０に列挙する。
【０４３２】
表３９：図９に示すＣＥＡＣＡＭ５発現細胞株への結合のＥＣ５０値
2021528988.tif 000051
【０４３３】
表４０：図９に示すＣＥＡＣＡＭ５発現細胞株への結合の曲線下面積（ＡＵＣ）
2021528988.tif 000052
【０４３４】
５．３  ヒト４−１ＢＢ及びＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２における、ＮＦκＢの活性化
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）受容体の、そのリガンド（４−１ＢＢＬ）へのアゴニスト結合は、核因子κＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介する４−１ＢＢ下流シグナル伝達を誘発し、ＣＤ８  Ｔ細胞の生残及び活性を促進する（Ｌｅｅ  ＨＷ，Ｐａｒｋ  ＳＪ，Ｃｈｏｉ  ＢＫ，Ｋｉｍ  ＨＨ，Ｎａｍ  ＫＯ，Ｋｗｏｎ  ＢＳ．４−１ＢＢ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）ａｎｄ  Ｂｆｌ−１．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２；１６９：４８８２−４８８８）。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ二重特異性抗体により媒介されるこのＮＦκＢ−活性化を監視するため、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。細胞を前述のとおりに培養した。アッセイのために、細胞を回収し、１０％（体積／体積）ＦＢＳ及び１％（体積／体積）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを補充したアッセイ培地である、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。２×１０３のＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞を含有する１０μＬを、蓋付きの滅菌白色３８４ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３８２６）の各ウェルに移した。滴定濃度の、ＣＥＡ（異なるクローン、例えばＡ５Ｂ７、Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ、若しくはＭＦＥ２３）に対する一価結合を有する、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体、又は対照分子を含有する１０μＬのアッセイ培地を添加した。最後に、１０μＬの、アッセイ培地のみ、又は、１×１０４の細胞の、カニクイザル若しくはヒトＣＥＡＣＡＭ５をトランスフェクションした異なるＣＨＯ−ｋ１細胞を含有する培地を供給し、プレートを６時間、３７℃及び５％  ＣＯ２で、細胞インキュベーター内でインキュベートした。６μＬも、新たに解凍したＯｎｅ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ検出溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｅ６１１０）を各ウェルに添加し、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（５００ｍｓの積分時間、全波長にてフィルタ収集なし）を用いて速やかに、ルミネセンス発光を測定した。
【０４３５】
図１３Ａ〜１３Ｄに示すように、ＣＥＡＣＡＭ５発現細胞の不存在下においては、いずれの分子も、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株内で強力なヒト４−１ＢＢ受容体の活性化を誘発することはできず、ＮＦｋＢの活性化、及びそれ故、ルシフェラーゼ発現をもたらした。二重特異性２＋１抗４−１ＢＢの架橋である、ＣＨＯ−ｋ１−ｈｕｍａｎＣＥＡＣＡＭ５クローン１１及びＣＨＯ−ｋ１−ｈｕｍａｎＣＥＡＣＡＭ５クローン１２などのｈｕｍａｎＣＥＡＣＡＭ５発現細胞の存在下において、抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ抗体（２＋１Ｈ２Ｈ  抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）抗体：黒円及び点線、又は、２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）抗体：黒色の菱形及び線、又は２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）抗体：灰色の逆三角形）は、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株における、ＮＦｋＢにより活性化されたルシフェラーゼ活性の強力な増加をもたらし、これは、非標的化対照抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（灰色抜きの正方形及び点線）により媒介される活性化を上回った。ＣＨＯ−ｋ１−ｃｙｎｏＣＥＡＣＡＭ５クローン８の存在下において、ＭＦＥ２３バインダーはヒト／カニクイザル交差反応性ではないため、２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＣＥＡ（ＭＦＥ２３）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（黒円及び点線）ではなく、２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（黒色の菱形及び線）、並びに２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（灰色の逆三角形）のみが、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株での、ＮＦｋＢにより活性化されたルシフェラーゼ活性の強力な増加を誘発した。
【０４３６】
活性化曲線のＥＣ５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）を、表４１及び表４２に列挙する。
【０４３７】
表４１：図１０に示す活性化曲線のＥＣ｛１＞５０＜１｝値
2021528988.tif 000053
【０４３８】
表４２：図１０に示す活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）の値
2021528988.tif 000054
【０４３９】
実施例６
４−１ＢＢに対する二価結合、及びＰＤ−Ｌ１に対する一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製、及び特性決定
２．１  ４−１ＢＢに対する二価結合、及びＰＤ−Ｌ１に対する一価結合を有する二重特異性抗体の生成及び産生
抗ＦＡＰ交差Ｆａｂを抗ＰＤ−Ｌ１交差Ｆａｂで置き換えることにより、４−１ＢＢに対する二価結合、及びＰＤ−Ｌ１に対する一価結合を有する、二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ抗体もまた、調製することができる。この構築物は、頭部から頭部（Ｈ２Ｈ）２＋１フォーマットとも呼ばれる。
【０４４０】
構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の構成要素から構成される。抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、続いてＦｃホール。第２の重鎖ＨＣ２は、抗ＰＤ−Ｌ１バインダー（交差Ｆａｂフォーマット内のクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）のＶＬＣＨ１、続いて、抗４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、そしてＦｃノブで構成された。ＰＤ−Ｌ１バインダーのＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、国際公開第２０１０／０７７６３４号に記載されている。４−１ＢＢバインダーに関して、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列を米国特許第７，２８８，６３８Ｂ２号、又は同第７，６５９，３８４Ｂ２号に従い入手した。２つの重鎖を組み合わせることでヘテロ二量体の生成が可能となり、このヘテロ二量体は、１つのＰＤ−Ｌ１結合交差Ｆａｂ、及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含む（図１Ｅ）。４−１ＢＢに対する一価結合を有する別のヘテロ二量体を、抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、続いてＦｃホールを含む第１の重鎖ＨＣ１、及び、抗ＰＤ−Ｌ１バインダー（交差Ｆａｂフォーマット内のクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）のＶＬＣＨ１、続いてＦｃノブを含む第２の重鎖ＨＣ２から構築した（図１Ｆ）。
【０４４１】
正しい対形成を改善するために、以下の変異を、抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ分子のＣＨ−ＣＬに導入した。ＣＬにＥ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、並びにＣＨ１にＫ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。抗ＰＤ−Ｌ１バインダーの第２の軽鎖ＬＣ２は、ＶＨＣＬ（交差Ｆａｂ）で構成されている。第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを導入することにより、ノブ・ホール技術を適用し、ヘテロ二量体の生成を可能にした。
【０４４２】
更に、国際特許出願公開番号第２０１２／１３０８３１Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。
【０４４３】
二重特異性２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ抗ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、２＋１抗４−１ＢＢ抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体に関して実施例１．２に記載されているように、作製する。
【０４４４】
二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＰＤ−Ｌ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ２＋１（Ｈ２Ｈ）抗体のアミノ酸配列は表４３に見いだすことができ、一方で、二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＰＤ−Ｌ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  １＋１抗体のアミノ酸配列は表４４に見いだすことができる。
【０４４５】
実施例１．２に記載のとおりにタンパク質を作製し精製した。
【０４４６】
表４３：二重特異性の二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（２＋１Ｈ２Ｈ）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000055
【０４４７】
表４４：二重特異性の一価抗４−１ＢＢ／抗ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子（１＋１）のアミノ酸配列
2021528988.tif 000056
【０４４８】
ＡＬＡ抗原結合分子（１＋１）のアミノ酸配列
二重特異性抗体の産生を、実施例１．２に記載のとおりに実施した。入手した生成物の例示的な分析を下表４５に示す。
【０４４９】
表４５−抗４−１ＢＢ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡの生化学的分析
2021528988.tif 000057
【０４５０】
実施例７
ＰＤ−Ｌ１に対する一価結合を有する、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異的性のアゴニスト４−１ＢＢ抗原結合分子の、機能性質決定
７．１  表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＰＤ−Ｌ１への同時結合能を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。全てのＳＰＲ実験は、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃にて実施した。ヒト４−１ＢＢ−Ｆｃ（ｋｉｈ）タンパク質は、アミンカップリングによりＣＭ５チップのフローセルに直接結合した。約９００ＲＵの不動化レベルを使用した。
【０４５１】
ＰＤ−Ｌ１標的化４−１ＢＢアゴニスト構築物を、１０μＬ／分で１５０ｎＭの濃度範囲で、９０秒にわたりフローセルを通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（組み換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１  Ｆｃキメラタンパク質、１５６−Ｂ７−１００：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を第２の分析物として、３０μＬ／分の速度で、２００ｎＭの濃度にて９０秒にわたりフローセルを通して注入した（図１４Ａ）。解離を２４０秒間監視した。タンパク質が不動化しなかった参照フローセルで入手した応答を差し引くことで、バルク屈折率の差を補正した。
【０４５２】
図１４Ｂ及び１４Ｃに確認できるように、２＋１Ｈ２Ｈ及び１＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ抗体は両方、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒト４−１ＢＢに同時に結合することができる。
【０４５３】
７．２  ヒトＰＤ−Ｌ１発現細胞株への結合
まず、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現する細胞株を生成した。ヒトＰＤ−Ｌ１をコードする完全長ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。メーカーのプロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５３３８１００）を使用してプラスミドをＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ  ４０９）細胞にトランスフェクションした。安定してトランスフェクションしたＰＤ−Ｌ１陽性ＰＤ−Ｌ１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、γ線照射マイコプラズマ非含有、熱不活化）、及び、２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド（Ｇｌｕｔａ−ＭＡＸ−Ｉ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０−０３８）並びに、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１０８４３５５５００１）及び１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧｉｂｃｏ，カタログ番号Ａ１１１３８−０２）のいずれかで補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１−０４２）中で維持した。結合アッセイのために、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５−ｈｕＰＤ−Ｌ１を回収し、ＤＰＢＳ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ，＃１４１９０−１３６）で洗浄し、固定可能な生存能染料ｅＦ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃６５−０８６３−１８）を含有するＤＰＢＳ内で、３０分間４℃で染色した。細胞を洗浄し、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３８３０）に、３×１０４細胞／ウェルで播種した。細胞を遠心分離にかけ（３５０ｘｇ、５分）、上清を取り除き、滴定濃度の、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ、１＋１二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体、又は対照（開始濃度：３００ｎＭ）を含有する１０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳ、５ｎＭのＥＤＴＡ、７．５ｍＭのアジ化ナトリウムを補充したＤＰＢＳ）中に再懸濁した。細胞を３０分間４℃でインキュベートした後、８０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した。２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９−１１６−０９８）を含有する１０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で、３０分間４℃で細胞を再懸濁した。細胞を８０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した後、少なくとも１５分間、１％ホルムアルデヒドを含有する３０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で固定した。同日、又は翌日に、細胞を５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して入手した。
【０４５４】
図１５Ｂに示すように、非ＰＤ−Ｌ１標的化ｈｕＩｇＧ１  Ｐ２９３ＧＬＡＬＡフォーマットではなく、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）とＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（黒の三角形及び線）、並びに１＋１二重特異性のアゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）とＰＤ−Ｌ１（灰色の三角形及び線）が、親細胞株ＭＫＮ４５ではなく、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＭＫＮ４５−ｈｕＰＤ−Ｌ１細胞に効率的に結合する。適合するＥＣ５０値、及び曲線下面積の値を表４６に列挙し、適合するＡＵＣ値を表４７に列挙する。
【０４５５】
表４６：図１５Ｂに示すＰＤ−Ｌ１発現細胞株への結合のＥＣ５０値
2021528988.tif 000058
【０４５６】
表４７：図１５Ｂに示すＰＤ−Ｌ１発現細胞株への結合の曲線下面積（ＡＵＣ）値
2021528988.tif 000059
【０４５７】
７．３  ヒト４−１ＢＢ及びＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２における、ＮＦ−κＢの活性化
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）受容体の、そのリガンド（４−１ＢＢＬ）へのアゴニスト結合は、核因子κＢ（ＮＦｋＢ）の活性化を介する４−１ＢＢ下流シグナル伝達を誘発し、ＣＤ８  Ｔ細胞の生残及び活性を促進する（Ｌｅｅ  ＨＷ，Ｐａｒｋ  ＳＪ，Ｃｈｏｉ  ＢＫ，Ｋｉｍ  ＨＨ，Ｎａｍ  ＫＯ，Ｋｗｏｎ  ＢＳ．４−１ＢＢ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）ａｎｄ  Ｂｆｌ−１．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２；１６９：４８８２−４８８８）。２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢと抗ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ二重特異性抗体により媒介されるこのＮＦκＢ−活性化を監視するため、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。細胞を前述のとおりに培養した。アッセイのために、細胞を回収し、１０％（体積／体積）ＦＢＳ及び１％（体積／体積）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを補充したアッセイ培地である、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。２×１０３のＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞を含有する１０μＬを、蓋付きの滅菌白色３８４ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３８２６）の各ウェルに移した。滴定濃度の、２＋１Ｈ２Ｈ二重特異性のアゴニスト抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体、１＋１二重特異性のアゴニスト抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）と抗ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体、又は対照分子を含有する１０μＬのアッセイ培地を添加した。最後に、１０μＬの、アッセイ培地のみ、又は１×１０４の細胞の、ヒトＰＤ−Ｌ１をトランスフェクションした親ＭＫＮ４５又はＭＫＮ４５細胞を含有するアッセイ培地を供給し、プレートを６時間、３７℃及び５％  ＣＯ２で、細胞インキュベーター内でインキュベートした。６μＬも、新たに解凍したＯｎｅ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ検出溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｅ６１１０）を各ウェルに添加し、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（５００ｍｓの積分時間、全波長にてフィルタ収集なし）を用いて速やかに、ルミネセンス発光を測定した。
【０４５８】
図１６Ａ〜１６Ｃに示すように、ＰＤ−Ｌ１発現細胞の不存在下においては、いずれの分子も、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株内で強力なヒト４−１ＢＢ受容体の活性化を誘発することはできず、ＮＦｋＢの活性化、及びそれ故、ルシフェラーゼ発現をもたらした。ヒトＰＤ−Ｌ１発現ＭＫＮ４５細胞の存在下で、二重特異性２＋１Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ抗体（黒の三角形及び線）、又は二重特異性１＋１抗４−１ＢＢ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ抗体（灰色の三角形及び線）の架橋は、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株における、ＮＦｋＢにより活性化されたルシフェラーゼ活性の強力な増加をもたらし、これは、非標的化対照抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（灰色の円及び線）により媒介される活性化を上回った。活性化曲線のＥＣ５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）を、表４８及び表４９に列挙する。
【０４５９】
表４８：図１６Ｂに示す活性化曲線のＥＣ５０値
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【０４６０】
表４９：図１６Ｂに示す活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）の値
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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