(57)【要約】本明細書記載の技術は、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とすることによって血管疾患を防止または処置するための方法および組成物に関する。2021513993.tif 000052
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における胸部大動脈瘤を防止または処置するための方法であって、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
細胞骨格タンパク質が、TAGLN遺伝子によってコードされるSM22aである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
エピジェネティック制御標的が、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
クロマチンまたは染色体タンパク質が、H3である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
高メチル化の原因となる酵素が、多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）、およびその触媒ドメイン、メチルトランスフェラーゼEZH2である、請求項3または請求項4記載の方法。
【請求項６】
化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）が、PRC2複合体のメチルトランスフェラーゼ触媒活性を阻害する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
メチルトランスフェラーゼEZH2を阻害する化合物または薬物が、GSK343である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
化合物または薬物の組合せが、GSK343およびロサルタンである、請求項6または請求項7記載の方法。
【請求項９】
血管疾患を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象に、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
血管疾患が、心血管疾患（CVD）である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
CVDが、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1つの作用物質が、ポリコーム抑制複合体2（PRC2）の活性を阻害する、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも1つの作用物質が、ヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）複合体を阻害する、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも1つの作用物質が、EZH2の阻害剤である、請求項9〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1つの作用物質が、EC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素の阻害剤である、請求項19〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも1つの作用物質が、HDAC9の阻害剤である、請求項9〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも1つの作用物質が、MALAT1の阻害剤である、請求項9〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
酵素が、EC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の酵素である、請求項9記載の方法。
【請求項１９】
阻害剤が、阻害性核酸または低分子阻害剤である、請求項9〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を患者に投与する工程を含む、患者における胸部大動脈瘤の防止または処置のための組成物。
【請求項２１】
細胞骨格タンパク質が、TAGLN遺伝子によってコードされるSM22aである、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
エピジェネティック制御標的が、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である、請求項20記載の組成物。
【請求項２３】
クロマチンまたは染色体タンパク質が、H3である、請求項20記載の組成物。
【請求項２４】
高メチル化の原因となる酵素が、多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）、およびその触媒ドメイン、メチルトランスフェラーゼEZH2である、請求項20または請求項22記載の組成物。
【請求項２５】
化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）が、PRC2複合体のメチルトランスフェラーゼ触媒活性を阻害する、請求項20〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
メチルトランスフェラーゼEZH2を阻害する化合物または薬物が、GSK343である、請求項25記載の組成物。
【請求項２７】
化合物または薬物の組合せが、GSK343およびロサルタンである、請求項20または請求項22記載の組成物。
【請求項２８】
血管疾患を防止または処置する組成物であって、それを必要とする対象に、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与する工程を含む、組成物。
【請求項２９】
血管疾患が、心血管疾患（CVD）である、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
CVDが、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤からなる群より選択される、請求項28記載の組成物。
【請求項３１】
少なくとも1つの作用物質が、ポリコーム抑制複合体2（PRC2）の活性を阻害する、請求項28〜30のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３２】
少なくとも1つの作用物質が、ヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）複合体を阻害する、請求項28〜31のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３３】
少なくとも1つの作用物質が、EZH2の阻害剤である、請求項28〜32のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも1つの作用物質が、EC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素の阻害剤である、請求項28〜33のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３５】
少なくとも1つの作用物質が、HDAC9の阻害剤である、請求項28〜34のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３６】
少なくとも1つの作用物質が、MALAT1の阻害剤である、請求項28〜35のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３７】
酵素が、EC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の酵素である、請求項28〜36のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３８】
阻害剤が、阻害性核酸または低分子阻害剤である、請求項28〜37のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３９】
血管疾患を防止または処置するための組成物であって、それを必要とする対象に、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の転写サイレンシングを標的とする少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与し、それによって血管疾患を防止または処置する工程を含む、組成物。
【請求項４０】
血管疾患が、心血管疾患（CVD）から選択される、請求項39記載の組成物。
【請求項４１】
CVDが、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤から選択される、請求項39記載の組成物。
【請求項４２】
転写サイレンシングが、多タンパク質複合体を含む、請求項39〜41のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４３】
多タンパク質複合体が、ポリコーム抑制複合体を含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】
多タンパク質複合体が、ポリコーム抑制複合体2（PRC2）を含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４５】
多タンパク質複合体が、ヒストンデアセチラーゼを含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４６】
多タンパク質複合体が、ヒストンデアセチラーゼ複合体9（HDAC9）を含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４７】
多タンパク質複合体が、血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する触媒サブユニットを含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４８】
触媒サブユニットが、高メチル化によって遺伝子サイレンシングを誘導する、請求項42記載の組成物。
【請求項４９】
触媒サブユニットが、酵素である、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５０】
酵素が、メチルトランスフェラーゼEZH2である、請求項39記載の組成物。
【請求項５１】
酵素が、EC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素である、請求項39記載の組成物。
【請求項５２】
酵素が、血管平滑筋遺伝子座におけるクロマチンの高メチル化による転写サイレンシングを誘導する、請求項39記載の組成物。
【請求項５３】
酵素が、ヒストンデアセチラーゼである、請求項39記載の組成物。
【請求項５４】
酵素が、ヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）である、請求項39記載の組成物。
【請求項５５】
酵素が、EC（Enzyme Comission）3.5.1.98の酵素である、請求項39記載の組成物。
【請求項５６】
酵素が、血管平滑筋遺伝子座におけるクロマチンの高アセチル化による転写サイレンシングを誘導する、請求項39記載の組成物。
【請求項５７】
血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する酵素が、EZH2、HDAC9からなる群より選択される、請求項39〜56のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５８】
血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する作用物質が、EZH2阻害剤である、請求項39記載の組成物。
【請求項５９】
EZH2阻害剤が、GSK343およびロサルタンからなる群より選択される、請求項39記載の組成物。
【請求項６０】
細胞骨格タンパク質が、SM22a、MMP-9、ACTA2、TAGLN、MYH11、SMTNからなる群より選択される、請求項39記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2018年2月19日に出願された米国仮出願第62/632,105号および2019年1月17日に出願された同第62/793,614号の、米国特許法第119条（e）項に基づく恩典を主張し、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付された助成金番号HL130113およびHL142809の下に、政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本願はASCIIフォーマットで電子提出された配列表を含み、この配列表は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。2019年2月15日に作成されたこのASCIIコピーの名称は030258-091670WOPT＿SL.txtであり、サイズは81,924バイトである。
【０００４】
技術分野
本明細書記載の技術は、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とすることによって血管疾患を防止または処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
血管系は身体の血管ネットワークである。これは、心臓の内外に血液を運ぶ動脈、静脈および毛細血管を含む。心血管疾患（CVD）は心臓および血管の一群の血管疾患である。心血管疾患は世界的に死因の第一位であり、毎年、他のどの死因よりも多くの人々がCVDで死亡している。世界保健機関の推定によれば、2016年には1790万人がCVDで死亡しており、これは全世界の死亡数の31％を占める。これらの死亡例のうち、85％は心臓発作および脳卒中による。
【０００６】
心臓発作および脳卒中は通常は急性イベントであり、主に心臓または脳への血流を妨げる閉塞によって引き起こされる。最も一般的なその理由は、心臓または脳に血液を供給する血管の内壁への脂肪沈着物の蓄積である。脳卒中は脳内の血管または凝血塊からの出血によって引き起こされる場合もある。心臓発作および脳卒中の原因は、通常、喫煙、不健康な食事および肥満、運動不足および有害な飲酒、高血圧、糖尿病および高脂血症などといったリスク因子の組合せの存在である。他のCVDとして、アテローム性動脈硬化、冠動脈心疾患;脳血管疾患;末梢動脈疾患;リウマチ性心臓疾患;先天性心臓疾患;深部静脈血栓症および肺塞栓症が挙げられる。現行の処置は、症状を寛解させることと、疾患の自然進行を遅くすることに限定されており、CVDの原因に対処することはできていない。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本明細書で述べるように、本発明者らは、さまざまな血管疾患において、血管系の平滑筋細胞の収縮性を与える原因となるいくつかの遺伝子の発現を、2つのタンパク質複合体（すなわちPRC2複合体およびHDAC9複合体）が不適切にダウンレギュレートしていることを、発見した。これは血管系の硬化および瘢痕化をもたらす。したがって、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質のエピジェネティック制御を標的とすることによって防止および/または処置することができる血管疾患、例えば限定するわけではないがアテローム性動脈硬化、虚血/再灌流、高血圧、再狭窄および動脈炎などを防止および/または処置するための組成物および方法が、本明細書において提供される。本組成物および本方法は、PRC2複合体およびHDAC9複合体の阻害に関係し、収縮性に寄与する血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質（例えば限定するわけではないがSM22a、a-SMAおよび/またはsMHC）の回復をもたらす。
【０００８】
したがっていくつかの局面では、患者における胸部大動脈瘤を防止または処置するための方法であって、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を該患者に投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０００９】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、細胞骨格タンパク質はTAGLN遺伝子によってコードされるSM22aである。
【００１０】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、エピジェネティック制御標的は、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である。
【００１１】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、クロマチンまたは染色体タンパク質はH3である。
【００１２】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、高メチル化の原因となる酵素は多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）、およびその触媒ドメイン、メチルトランスフェラーゼEZH2である。
【００１３】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）はPRC2複合体のメチルトランスフェラーゼ触媒活性を阻害する。
【００１４】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼEZH2を阻害する化合物または薬物はGSK343である。
【００１５】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、化合物または薬物の組合せはGSK343およびロサルタンである。
【００１６】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、本方法は、それを必要とする対象に、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与する工程を含む。
【００１７】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、血管疾患は心血管疾患（CVD）である。
【００１８】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、CVDは、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤からなる群より選択される。
【００１９】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質は、ポリコーム抑制複合体2（PRC2）の活性を阻害する。
【００２０】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）複合体を阻害する。
【００２１】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はEZH2の阻害剤である。
【００２２】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素の阻害剤である。
【００２３】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はHDAC9の阻害剤である。
【００２４】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はMALAT1の阻害剤である。
【００２５】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、酵素はEC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の酵素である。
【００２６】
これらの方法および本明細書記載の同様の方法すべてのいくつかの態様において、阻害剤は阻害性核酸または低分子阻害剤である。
【００２７】
いくつかの局面において、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を患者に投与する工程を含む患者における胸部大動脈瘤の防止または処置のための組成物も、本明細書において提供される。
【００２８】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、細胞骨格タンパク質はTAGLN遺伝子によってコードされるSM22aである。
【００２９】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、エピジェネティック制御標的は、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である。
【００３０】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、クロマチンまたは染色体タンパク質はH3である。
【００３１】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、高メチル化の原因となる酵素は多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）、およびその触媒ドメイン、メチルトランスフェラーゼEZH2である。
【００３２】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）はPRC2複合体のメチルトランスフェラーゼ触媒活性を阻害する。
【００３３】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼEZH2を阻害する化合物または薬物はGSK343である。
【００３４】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、化合物または薬物の組合せはGSK343およびロサルタンである。
【００３５】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、それを必要とする対象に、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与する工程を含む。
【００３６】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、血管疾患は心血管疾患（CVD）である。
【００３７】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、CVDは、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤からなる群より選択される。
【００３８】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質は、ポリコーム抑制複合体2（PRC2）の活性を阻害する。
【００３９】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）複合体を阻害する。
【００４０】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はEZH2の阻害剤である。
【００４１】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素の阻害剤である。
【００４２】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はHDAC9の阻害剤である。
【００４３】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、前記少なくとも1つの作用物質はMALAT1の阻害剤である。
【００４４】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、酵素はEC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の酵素である。
【００４５】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、阻害剤は阻害性核酸または低分子阻害剤である。
【００４６】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、それを必要とする対象に、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の転写サイレンシングを標的とする少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与し、それによって血管疾患を防止または処置する工程を含む組成物。
【００４７】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、血管疾患は心血管疾患（CVD）から選択される。
【００４８】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、CVDは、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤から選択される。
【００４９】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、転写サイレンシングは多タンパク質複合体を含む。
【００５０】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、多タンパク質複合体はポリコーム抑制複合体を含む。
【００５１】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、多タンパク質複合体はポリコーム抑制複合体2（PRC2）を含む。
【００５２】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、多タンパク質複合体はヒストンデアセチラーゼを含む。
【００５３】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、多タンパク質複合体はヒストンデアセチラーゼ複合体9（HDAC9）を含む。
【００５４】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、多タンパク質複合体は、血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する触媒サブユニットを含む。
【００５５】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、触媒サブユニットは高メチル化によって遺伝子サイレンシングを誘導する。
【００５６】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、触媒サブユニットは酵素である。
【００５７】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、酵素はメチルトランスフェラーゼEZH2である。
【００５８】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、酵素はEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素である。
【００５９】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、酵素は血管平滑筋遺伝子座におけるクロマチンの高メチル化によって転写サイレンシングを誘導する。
【００６０】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、酵素はヒストンデアセチラーゼである。
【００６１】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、酵素はヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）である。
【００６２】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、酵素はEC（Enzyme Comission）3.5.1.98の酵素である。
【００６３】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、酵素は血管平滑筋遺伝子座におけるクロマチンの高アセチル化による転写サイレンシングを誘導する。
【００６４】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する酵素は、EZH2、HDAC9からなる群より選択される。
【００６５】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する作用物質はEZH2阻害剤である。
【００６６】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、EZH2阻害剤はGSK343およびロサルタンからなる群より選択される。
【００６７】
これらの組成物および本明細書記載の同様の組成物すべてのいくつかの態様において、細胞骨格タンパク質は、SM22a、MMP-9、ACTA2、TAGLN、MYH11、SMTNからなる群より選択される。
【００６８】
定義:
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および語句の意味を、以下に記載する。別段の言明がある場合または文脈上言うまでもない場合を除き、以下の用語および獄は以下に記載する意味を包含する。これらの定義は、特定態様の説明を助けるために記載するのであって、請求項に係る技術を限定しようとするものではない。この技術の範囲は請求項によってのみ限定されるからである。別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本技術が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。当技術分野におけるある用語の使用法と、本明細書に記載されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合は、本明細書に記載される定義が優先されるものとする。
【００６９】
微生物学、分子生物学および医学における一般的用語の定義は、例えば「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」第19版、Merck Sharp＆Dohme Corp.刊、2011（ISBN 978-0-911910-19-3）;Robert S.Porterら編、「Black,Jacquelyn G.Microbiology:Principles and Explorations」第9版、Wiley;第9版、2014、Moore,Veranus A.「Principles of Microbiology:A Treatise on Bacteria,Fungi and Protozoa」Forgotten Books、2012、「The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine」Blackwell Science Ltd.刊、1999-2012（ISBN 9783527600908）;およびRobert A.Meyers編「Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference」VCH Publishers,Inc.刊、1995（ISBN 1-56081-569-8）;「Lewin’s Genes XI」Jones＆Bartlett Publishers刊、2014（ISBN-1449659055）;Michael Richard Green and Joseph Sambrook「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（2012）（ISBN 1936113414）;Davisら「Basic Methods in Molecular Biology」Elsevier Science Publishing,Inc.、米国ニューヨーク（2012）（ISBN 044460149X）;「Laboratory Methods in Enzymology:DNA」Jon Lorsch編、Elsevier,2013（ISBN 0124199542）;「Current Protocols in Molecular Biology」（CPMB）、Frederick M.Ausubel編、John Wiley and Sons,2014（ISBN 047150338X,9780471503385）、「Current Protocols in Protein Science」（CPPS）、John E.Coligan編、John Wiley and Sons,Inc.、2005;および「Current Protocols in Immunology」（CPI）（John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe編、John Wiley and Sons,Inc.,2003（ISBN 0471142735,9780471142737）に見出すことができ、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００７０】
本明細書にいう「作用物質」とは、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現を阻害し、または標的ポリペプチドもしくはそれをコードするポリヌクレオチドに結合し、その刺激を部分的もしくは完全に遮断し、その活性化を減少させ、防止し、遅延させ、不活化し、脱感作し、またはその活性をダウンレギュレートする、例えば分子、タンパク質、ペプチド、抗体、または核酸を指す。「作用物質」は任意の化学的実体または化学的部分であることができ、合成された、および天然の、タンパク質性および非タンパク質性実体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。任意の局面のいくつかの態様において、作用物質は、核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸または糖質、例えば限定するわけではないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAzyme、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質および/またはそれらの修飾物もしくは組合せなどである。一定の態様において、作用物質は低分子化学部分である。例えば化学部分は、無置換の、または置換された、アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分、例えばマクロライド、レプトマイシンおよび関連天然物またはその類似体を含む。化合物は、所望の活性および/または特性を有することが公知であるか、多様な化合物ライブラリーから選択することができる。
【００７１】
「減少する」、「低減する」、「低減」、「低下する」もしくは「低下」、または「阻害する」という用語は、いずれも本明細書では、統計的に有意な量の減少を表すために広く使用される。例えば「減少する」、「低減する」、「低減」または「阻害する」は、基準レベルと比較して少なくとも10％の減少を意味する。例えば少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％の減少、または100％を含む100％までの減少（例えば基準レベルと比較して消失または検出不能なレベル）、または基準レベルと比較して10〜100％の間の任意の減少を意味する。マーカーまたは症状との関連では、これらの用語は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。減少は、例えば少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％またはそれ以上であることができ、好ましくは所与の疾患がない個体について正常範囲内として許容されるレベルまで下がる。
【００７２】
「疾患」、「障害」または「状態」という用語は、本明細書では相互可換的に使用され、機能の遂行を妨げもしくは乱し、かつ/または不快、機能障害、苦痛などの症状、さらには死を、罹患した人または人と接触する人々に引き起こす、身体の状況もしくは器官の一部の何らかの変化を指す。疾患または障害は、不調（distemper）、慢性的病状（ailing）、慢性的病気（ailment）、疾病（malady）、障害（disorder）、病気（sickness）、病（illness）、愁訴（complaint）または虚飾（affectation）にも関係しうる。
【００７３】
本明細書において使用される用語「血管疾患」は、血管の一群の疾患を指す。これは心血管疾患の下位群である。血管疾患は、大型および中型の筋性動脈の病理学的状態であり、内皮細胞の機能障害によってトリガーされる。生理的条件下で、動脈内皮は、血管のホメオスタシスを維持するために、強力な保護作用を発揮する。しかし血管疾患の発生時にはこれらの保護活性が失われ、実際には、機能障害を起こした内皮細胞が疾患の病理発生を促進する。正常な内皮機能は血管および生体の健康にとって極めて重要である。内皮細胞は血管収縮、血栓形成性、炎症、透過性および血管リモデリングの重要な制御因子である。正常な状態では、内皮は、これらのプロセスを阻害し、血管の安定性およびホメオスタシスを維持するように、保護作用を発揮する。しかし血管疾患の発生時には、表現型が変化した内皮細胞、すなわち「機能障害を起こした」内皮が、それら同じプロセスを促進し、血管の構造および反応性の病理学的変化の一因となる。例示的な血管疾患として、紅通症、末梢動脈疾患、バージャー病、レイノー病、および脳血管疾患が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００７４】
本明細書において使用される用語「心血管疾患」、「CVD」は、心臓または血管が関わる一群の疾患を指す。CVDには、アンギナおよび心筋梗塞などの冠動脈疾患（CAD）、脳卒中、心不全、高血圧性心臓疾患、リウマチ性心臓疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心臓疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、ならびに静脈血栓症が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７５】
治療的処置または予防的処置に関連して使用される場合、「それを必要とする」という用語は、疾患を有すること、疾患と診断されること、または例えば疾患を発症するリスクがある人について疾患を防止する必要があることを意味する。したがって、それを必要とする対象とは、疾患の処置または防止を必要としている対象であることができる。
【００７６】
本明細書において使用される「処置する」、「処置」、「処置すること」または「寛解」（amelioration）という用語は、血管の疾患または症候群、例えばエピジェネティック誤制御または平滑筋細胞変化の進行または重症度を反転し、緩和し、寛解し、阻害し、減速しまたは停止させることを目的とする治療的処置を指す。「処置すること」という用語は、血管疾患の少なくとも1つの有害作用または症状を低減しまたは緩和することを包含する。処置は一般に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減するのであれば、「有効」である。本明細書記載の処置は、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間、少なくとも11週間、少なくとも12週間、少なくとも13週間、少なくとも14週間、少なくとも15週間、少なくとも16週間、少なくとも17週間、少なくとも18週間またはそれ以上、例えば少なくとも20週間（または5ヶ月）、6ヶ月またはそれ以上にわたって、血管疾患症状を低減することができる。上記に代えて、または上記に加えて、処置は、疾患の進行が低減しまたは停止されるのであれば、「有効」である。すなわち「処置」は、症状またはマーカーの改善を包含するだけでなく、処置がない場合に予想されるものとの比較で、症状の進行または悪化の停止または少なくとも減速も包含する。有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、1つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しないこと）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の寛解または緩和、緩解（remission）（部分的であるか完全であるかを問わない）、および/または死亡率の減少が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。例えば処置は、状態が安定化すれば、有効とみなされる。疾患の「処置」という用語は、疾患の症状または副作用の軽減（待期的処置を含む）も包含する。
【００７７】
本明細書において使用される「対象」、「患者」、「個体」などの用語は、相互可換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、ヒト、霊長類、齧歯類、野生動物または家畜、例えば野生化した動物、農用動物、スポーツ動物およびペットが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。霊長類としては、例えばチンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。齧歯類としては、例えばマウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが挙げられる。家畜および狩猟獣としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ科動物、例えばイエネコ、およびイヌ科動物、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、例えばマス、ナマズおよびサケが挙げられる。「個体」、「患者」および「対象」という用語は、本明細書では相互可換的に使用される。対象は雄性または雌性であることができる。
【００７８】
好ましくは対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであることができるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、血管疾患に関連する状態または障害の動物モデルに相当する対象として、有利に使用することができる。非限定的な例として、Fbn1cl°39Gi＋マウスモデル、アポBまたはアポR欠損ブタ（Rapacz,et al.,1986,Science 234:1573-1577）およびワタナベ遺伝性高脂質血症（WHHL）ウサギ（Kita et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.84:5928-5931）が挙げられる。加えて、本明細書記載の組成物および方法は、家畜および/またはペットを処置するために使用することもできる。
【００７９】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、隣接残基のアルファ-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いにつながれた一連のアミノ酸残基を指定するために相互可換的に使用される。「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、修飾アミノ酸（例えばリン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸アナログを含むアミノ酸のポリマーを指し、そのサイズまたは機能は問わない。「タンパク質」および「ポリペプチド」が比較的大きなポリペプチドに関連して使用されることが多いのに対して、「ペプチド」という用語は小さなポリペプチドに関連して使用されることが多いが、これらの用語の使用法は当技術分野では部分的に重なっているところがある。「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物およびそのフラグメントを指す場合に、本明細書では相互可換的に使用される。
【００８０】
本明細書において使用される用語「平滑筋細胞」（SMC）は不随意非横紋筋を指す。多様な形態の血管疾患において、平滑筋細胞（SMC）は、SMC限定的収縮遺伝子（SMC-restricted contractile gene）のダウンレギュレーションに代表される細胞表現型を調節することが知られており、細胞外マトリックスの分泌、増殖および遊走に関与する遺伝子群をアップレギュレートする。この細胞の挙動は、限定するわけではないがアテローム性動脈硬化、肺高血圧、大動脈瘤および末梢動脈瘤、ならびに経皮動脈インターベンション後の再狭窄などといった血管疾患において重要である。
【００８１】
本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット/リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物および/または剤形を指す。
【００８２】
本明細書において使用する用語「薬学的に許容される担体」は、活性成分または活性作用物質を対象への送達用に製剤化する際に必要な、または使用される、薬学的に許容される材料、組成物または媒体、例えば液状または固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤または溶媒封入材料（solvent encapsulating material）を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者にとって有害でないという意味で、「許容される」ものでなければならない。
【００８３】
本明細書において使用される用語「治療有効量」は、処置した時に有益な臨床結果または望ましい臨床結果を達成するのに十分な量を指す。具体的には、「治療有効量」という用語は、血管疾患の動物モデルにおいて測定可能な改善を引き起こすのに十分な量を意味する。改善には、例えば有病率ならびに脂肪線条および/または心血管疾患プラークのサイズの減少を含めることができる。
【００８４】
本明細書記載の用語「単位用量」は、所望の治療効果を生じるように計算された所定の活性物質量を、必要な希釈剤、すなわち担体または媒体と共に含有する単位と定義される。例えば、投与される阻害性酵素の単位用量は、主活性成分、例えば酵素またはその組合せを、250μg〜5μgの範囲の量で含有する。単位用量は、さらに、心血管疾患症状を寛解、防止および/または処置する能力に関する試験に供しうる、主活性成分、例えばEZH2ならびに/またはEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43および/もしくはEC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の生物学的活性を持つ任意の酵素を阻害する作用物質を含有する用量と、定義される。
【００８５】
本明細書において使用される用語「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成に使用されるプロセスを指す。本明細書にいう「差次的発現」とは、遺伝子の時間的発現パターンおよび/または組織発現パターンの量的差異と質的差異の両方を指す。差次的発現遺伝子は「フィンガープリント遺伝子」および/または「標的遺伝子」に相当しうる。本明細書にいう「フィンガープリント遺伝子」とは、その発現パターンを予後的または診断的心血管疾患評価の一部として利用しうるか、あるいは血管疾患および/または心血管疾患の処置に有用な化合物を同定するための方法において使用しうる、差次的発現遺伝子を指す。本明細書にいう「標的遺伝子」とは、標的遺伝子発現のレベルまたは標的遺伝子産物活性のレベルの調節が心血管疾患状態を寛解するように作用しうる形で心血管疾患に関与する差次的発現遺伝子を指す。標的遺伝子発現または標的遺伝子産物の活性を調節する化合物は、血管疾患および/または心血管疾患の防止および/または処置において使用することができる。本明細書にいう「差次的発現」とは、遺伝子の時間的発現パターンおよび/または組織発現パターンの量的差異と質的差異の両方を指す。したがって、差次的発現遺伝子は、正常な状態では血管疾患状態との対比で、または対照条件下では実験条件下との対非で、その発現が活性化されていること、または完全に不活化されていることがありうる。定性的に制御されるそのような遺伝子は、所与の組織内または細胞タイプ内で、対照または心血管疾患対象のどちらか一方では検出可能であるが、両方において検出可能であることはない発現パターンを呈するだろう。あるいは、定性的に制御されるそのような遺伝子は、所与の組織内または細胞タイプ内で、対照または実験対象のどちらか一方では検出可能であるが、両方において検出可能であることはない発現パターンを呈するだろう。本明細書にいう「検出可能」とは、当業者に周知であるディファレンシャルディスプレイ、逆転写酵素-（RT-）PCRおよび/またはノーザン解析の標準的技法によって検出可能なRNA発現パターンを指す。
【００８６】
本明細書にいう「標的遺伝子」とは、標的遺伝子発現のレベルまたは標的遺伝子産物活性のレベルの調節が心血管疾患の症状を寛解するように作用しうる形で血管疾患および/または心血管疾患に関与する差次的発現遺伝子を指す。
【００８７】
実施例を除き、または別段の表示がある場合を除き、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す数字はすべて、いずれの場合も、「約」という用語で修飾されていると理解すべきである。パーセンテージとの関連で使用される場合、「約」という用語は、言及されている値の±1％を意味する。例えば約100とは99〜101を意味する。
【００８８】
本開示の実施または試験では、本明細書に記載するものと類似するか等価な方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料を以下に説明する。「e.g.」という略号はexempli gratiaというラテン語に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって「e.g.」という略号は「例えば（for example）」と同義である。
【００８９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つ（an）」および「その（the）」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。したがって例えば、「本方法（the method）」とは、本明細書に記載するタイプの、および/またはこの開示を読んだ当業者には明らかになるであろうタイプの、1つまたは複数の方法および/または工程を包含するなどである。
【００９０】
本願および特許請求の範囲において、単数形の使用は、別段の具体的言明がある場合を除き、複数形を包含する。加えて、「または」の使用は、別段の言明がある場合を除き、「および/または」を意味する。さらにまた、「含む（including）」ならび他の形態、例えば「含む（includes）」および「含む（included）」という用語の使用は、限定ではない。また、「要素」または「構成要素」などの用語は、別段の具体的言明がある場合を除き、1つの単位を含む要素および構成要素も、2つ以上の単位を含む要素および構成要素も、どちらも包含する。
【００９１】
本明細書において使用される「組み合わせて」という用語は、2つ以上の予防剤および/または治療剤を、同時にまたは逐次的に、それぞれの効果が相加的または相乗的になるような形で使用することを指す。
【００９２】
「統計的に有意」または「有意」という用語は、統計的有意性を指し、一般に、2標準偏差（2SD）以上の差を意味する。
【００９３】
本明細書において使用される用語「含む（comprising）」または「含む（comprises）」は、ある態様にとって有用な組成物、方法およびそれらの各構成要素に関連して使用されるが、有用であるか否かを問わず、指定されていない要素の包含も許容される。
【００９４】
本明細書において使用される「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語は、所与の態様にとって必要な要素を指す。この用語は、本発明の当該態様の基本的かつ新規なまたは機能的特徴に実質的な影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
【００９５】
本明細書において使用される「からなる（consisting of）」という用語は、本明細書記載の組成物、方法およびそれらの各構成要素を指し、その態様の当該説明において列挙されていない要素はいずれも除外される。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１Ａ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1A.対照ドナー（n＝13）およびTAA（D）ドナー（n＝30）からのヒト大動脈組織におけるVSMC表現型マーカーの発現パターン。TAGLN（SM22a）転写産物の喪失が、解離を起こした患者では、より有意であった（TAA-FC＝0.55対TAAD-FC＝0.12）。
【図１Ｂ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1B.対照ドナー（n＝7）およびTAA（D）ドナー（n＝9）からのヒト大動脈組織におけるSM22aタンパク質のイムノブロッティング解析。
【図１Ｃ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1C.対照試料、TAA試料およびTAAD試料からのヒト大動脈の、患者像の解剖学的再構成および収縮タンパク質の免疫蛍光染色（最上段）。患者からの大動脈試料のVVG染色はエラスチンの断片化を示す。バー＝150um（2段目）。SM22a、CNN、DAPIまたはビンキュリン、スムーセリンおよびDAPIを示す大動脈試料からの免疫蛍光。バー＝50urn、挿入拡大図倍率3倍。
【図１Ｄ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1D.ラテックスを注入した野生型マウスおよびFbnic1°39w＋マウスの心臓および上行大動脈の代表的顕微鏡写真。矢印は大動脈の上行部分を示す。大動脈エラスチン線維をVerhoeff-Van Gieson染色（VVG）、ならびにDAPI F-アクチンおよびSm22aの免疫蛍光で染色した。バー＝50um。
【図１Ｅ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1E.野生型（n＝7）およびFbn1C1°39Gl＋（n＝7）6ヶ月齢マウスからの大動脈組織および血漿におけるTag/n（Sm22a）転写産物のqPCR解析。
【図１Ｆ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1F.Fbnlci°39G/±大動脈（n＝7）におけるTagin（Sm22a）組織発現の大動脈寸法との相関関係（曲線の当てはめには最小二乗法を使用）。
【図１Ｇ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1G.siCtrlまたはsiSM22aで処理した大動脈VMSCにおける収縮タンパク質の免疫蛍光染色。バー＝10um、拡大図倍率3倍。
【図１Ｈ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1H.大動脈VMSCにおけるSM22a阻害およびその結合パートナー・カルポニン（CNN）の喪失のイムノブロッティング解析。（-アクチンに対する定量を下に示す。
【図１Ｉ】図1A〜1IはTAA患者におけるVSMC収縮機構のメンバーの減少量を示す。図1I.健常VSMCのsiSM22a処理は、インビトロゼラチンザイモグラフィーによって評価されるMMP活性を誘導する（＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、’p＜0.001、スチューデントのt検定、両側）。FC、倍率変化;TAA、胸部大動脈瘤;TAAD、胸部大動脈瘤および大動脈解離;Ctrl、対照;VVG、Verhoeff-Van Gieson染色;SMTN、スムーセリン;CNN、カルポニン;VCL、ビンキュリン。
【図２Ａ】図2A〜2GはSM22aの喪失が動脈瘤の進行および解離の直接的エフェクターであることを示す。図2A.4ヶ月齢における野生型マウスおよびFbnic’’39G1＋マウスの心エコー大動脈基部および上行大動脈の定量化。
【図２Ｂ】図2A〜2GはSM22aの喪失が動脈瘤の進行および解離の直接的エフェクターであることを示す。図2B.4ヶ月齢におけるSm22＋/＋（n＝8）、Sm22-/-（n＝10）、Fbnicl°39G1＋:Sm22＋/＋（n＝10）およびFbn1ci°39Gl＋:Sm22/-（n＝5）の大動脈寸法の定量化（一元配置Anova、事後チューキー検定）。
【図２Ｃ】図2A〜2GはSM22aの喪失が動脈瘤の進行および解離の直接的エフェクターであることを示す。図2C.組織学的解析は4ヶ月齢Sm22欠損マウスにおける異常な大動脈アーキテクチャおよびコラーゲン沈着の増加を示す。H＆E、バー＝250pm;マッソントリクローム、バー＝250psn、拡大図5×;VVG、バー＝50pm。
【図２Ｄ】図2A〜2GはSM22aの喪失が動脈瘤の進行および解離の直接的エフェクターであることを示す。図2D.4ヶ月齢Sm22a欠損マウスにおけるMMP活性の増加。
【図２Ｅ】図2A〜2GはSM22aの喪失が動脈瘤の進行および解離の直接的エフェクターであることを示す。図2E.妊娠マウスの剖検は血胸を示す。
【図２Ｆ】図2A〜2GはSM22aの喪失が動脈瘤の進行および解離の直接的エフェクターであることを示す。図2F.妊娠中のSm22a生存率のカプラン-マイヤープロット（Sm22＋/＋、n＝10およびSm22/-、n＝5、ログ・ランク検定）。
【図２Ｇ】図2A〜2GはSM22aの喪失が動脈瘤の進行および解離の直接的エフェクターであることを示す。図2G.妊娠Sm22＋/＋マウスおよび妊娠Sm224-マウスからの大動脈のトリクローム染色およびVVG染色、バー＝50pm、VVG、Verhoeff-Van Gieson染色。
【図３Ａ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3A.ヒト大動脈組織におけるChIP-qPCRアッセイは、TAGLN遺伝子座において、対照大動脈（n＝7）と比較した場合の、TAA組織（n＝8）におけるEZH2タンパク質とH3K27me3修飾の相互作用の増加を示す。下側の図は、H3K27me3修飾のマップを表す（＊p＜0.05、’’p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、野生型に対するスチューデントのt検定、両側）。
【図３Ｂ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3B.Genomatixを使ったイントロン1内の高メチル化領域における転写因子結合サイドの同定。
【図３Ｃ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3C.siSMAD3で処理したVSMCは基礎SM22a発現およびTGF-3誘導SM22a発現の阻害を示す。
【図３Ｄ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3D.TAA（n＝8）から培養しTGF-31（10ng/mL）で処理したVSMCにおけるSMAD3 ChIP-qPCRアッセイは、対照VSMC培養物（n＝4）と比較した場合に、TAGLN座におけるSMAD3結合の減少を示す（＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、野生型に対するスチューデントのt検定、両側）。
【図３Ｅ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3E.組換えTGF-31（10ng/mL）で処理した対照（n＝4）またはTAA（n＝8）単離VSMC培養物におけるSM22a転写産物のqPCR解析（’’p＜0.01、’p＜0.001、一元配置Anova）。
【図３Ｆ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3F.対照大動脈およびTAA大動脈からのヒト組織におけるH3K27me3修飾の免疫蛍光染色。バー＝20μm。
【図３Ｇ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3G.EZH2阻害剤（GSK343 10pM）および/またはTGF-31（10ng/mL）で処理された対照およびTAA VSMC培養物からの単離VSMCにおけるSM22aのイムノブロッティング解析。
【図３Ｈ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3H.6ヶ月齢のFbnlcl°39G1＋マウスおよび野生型マウスの大動脈におけるEzh2（黄色）およびH3K27me3（赤色）の免疫蛍光染色。バー＝40p.m。
【図３Ｉ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3C.野生型、Ezh2-、FbniC1039G/＋およびFbn1C1°39Gi＋:EZh2-細胞から単離されたマウスVSMCにおけるEzh2およびTagIn（Sm22a）転写産物のqPCR解析。（＊＊p＜0.01、’p＜0.001、一元配置Anova）。
【図３Ｊ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3J.TGF-31（10ng/mL）で処理したまたは処理していない野生型、EzhZA、Fbnicl°39G/＋およびFbnicl°39G/＋:Ezh2-/-細胞から単離されたマウスVSMCにおけるSm22aのイムノブロッティング解析。
【図３Ｋ】図3A〜3Kは、メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害がSM22a発現を回復させることを示す。図3K.EZH2阻害剤（GSK343 10pM）およびTGF-31（10ng/mL）で処理されたFbn1cl°39w＋マウスおよび野生型マウスVSMCにおけるSm22a（マゼンタ）およびF-アクチン（グレー）の免疫蛍光染色。バー＝10。TAA、胸部大動脈瘤;Ctrl、対照;H3K27me3、ヒストン3リジン27トリメチル化;H3K27ac、ヒストン3アセチル化リジン27。
【図４Ａ】図4A〜4Cは、EZH2活性のインビボ阻害が実験的大動脈瘤を緩和することを示す。図4A.2ヶ月齢から6ヶ月齢まで処置されたマウスの心エコー大動脈基部および上行大動脈の定量化（6ヶ月齢時点）。野生型マウス（PBS、n＝8;ロサルタン、n＝6;GSK343、n＝6）およびFbn1C1°39G/＋マウス（PBS、n＝8;ロサルタン、n＝6;GSK343、n＝6）を処置した（一元配置Anova、事後チューキー検定）。
【図４Ｂ】図4A〜4Cは、EZH2活性のインビボ阻害が実験的大動脈瘤を緩和することを示す。図4B.2〜6ヶ月齢の、ロサルタンまたはGSK343で処置された野生型マウスまたはFbnicl°39Gi＋マウス（PBS、n＝8;ロサルタン、n＝6;GSK343、n＝6）およびFbn1C1039G/＋（PBS,n＝8;ロサルタン、n＝6;GSK343,n＝6）からの大動脈におけるVSMC表現型マーカーの発現パターン。RNAレベルをPBSで処置された野生型マウスに標準化した。
【図４Ｃ−１】図4A〜4Cは、EZH2活性のインビボ阻害が実験的大動脈瘤を緩和することを示す。図4C.上:PBS、ロサルタンまたはGSK343のいずれかで処置された野生型マウスまたはFbnicl°39G/＋マウス大動脈のCTスキャンおよび組織学的解析。低倍率大動脈VVG、バー＝250□m、高倍率VVG、H＆E、マッソントリクロームおよび免疫蛍光、バー＝50um。下:組織学的パラメータの定量化（一元配置Anova、事後チューキー検定）。FC、倍率変化;VVG,Verhoeff-Van Gieson染色。
【図４Ｃ−２】図4C-1の説明を参照のこと。
【図４Ｃ−３】図4C-1の説明を参照のこと。
【図４Ｃ−４】図4C-1の説明を参照のこと。
【図５Ａ−１】図5A〜5Cは、確立した大動脈肥大において併用処置が大動脈寸法を改善することを示す。処置前および処置後のマウス大動脈の、（図5A）大動脈測定値および（図5B）代表的心エコー像は、無処置マウス（n＝8）、ロサルタン処置マウス（n＝6）およびGSK343処置マウス（n＝5）と比較した場合に、4ヶ月齢から6ヶ月齢までロサルタン/GSK343の組合せで処置されたFbnici°39G/＋マウス（n＝5）における大動脈寸法の復帰を示す（一元配置Anova、事後チューキー検定）。
【図５Ａ−２】図5A-1の説明を参照のこと。
【図５Ｂ】図5A-1の説明を参照のこと。
【図５Ｃ−１】図5A〜5Cは、確立した大動脈肥大において併用処置が大動脈寸法を改善することを示す。図5C.FbnIci°39G/÷大動脈組織におけるSm22a、Myh11およびCnnの免疫組織化学染色および免疫蛍光染色。バー＝50Rm。（一元配置Anova、事後チューキー検定）。VVG、Verhoeff-Van Gieson染色。
【図５Ｃ−２】図5C-1の説明を参照のこと。
【図５Ｃ−３】図5C-1の説明を参照のこと。
【図５Ｃ−４】図5C-1の説明を参照のこと。
【図６】図6A〜6CはTAAにおけるエピジェネティック抑制の模式図である。図6A.大動脈ホメオスタシスを担う収縮遺伝子（例えばTAGLN、MYH11、SMTN）は、VSMCでは、とりわけSMAD3などの転写因子の作用によって活発に転写される。図6B.胸部大動脈瘤では、EZH2を含有するポリコーム抑制複合体2（PRC2）が、大動脈遺伝子のプロモーターおよび遺伝子内部へのヒストン3リジン27トリメチル化マークの付加を媒介して、クロマチンへの転写因子のアクセスを妨げる。図6C.EZH2阻害剤GSK343による処置は、クロマチンへの転写因子（SMAD3など）のアクセスを可能にすることによって、収縮タンパク質発現を脱抑制する。
【図７Ａ】図7A〜7Dは、ACTA2R179H変異が、HDAC9-BRGI-MALATI複合体の、VSMC収縮性と関連する遺伝子座との相互作用を誘導することを示す。図7A.ACTA2R179H（Ao＿562）変異を持つ患者における左側頭蓋内動脈系の側面像。末端における急激な先細りおよび閉塞性病変（赤い矢印）を伴う海綿静脈洞内頸動脈拡張（cavernous internal carotid dilatation）（白い矢印）。
【図７Ｂ】図7A〜7Dは、ACTA2R179H変異が、HDAC9-BRGI-MALATI複合体の、VSMC収縮性と関連する遺伝子座との相互作用を誘導することを示す。図7B.ACTA2R179H発現条件下でのヒトVSMCにおけるChIP-Seq実験を記述するベン図により、野生型細胞と比較して1141の遺伝子座におけるHDAC9、BRGIおよびH3K27me3修飾の重複した濃縮が示される。パスウェイ解析により、収縮に関わる複数の細胞機能が示される。
【図７Ｃ】図7A〜7Dは、ACTA2R179H変異が、HDAC9-BRGI-MALATI複合体の、VSMC収縮性と関連する遺伝子座との相互作用を誘導することを示す。図7C.箱ひげ図によって、野生型細胞と比較したACTA2R179H変異体におけるSMC収縮要素の座におけるHDAC9、BRGIおよびH3K27me3の濃縮倍率変化が示されている。座内の個々のゲノム部位の名目P値が色分けして示されている。macs2からのピークのP値アノテーションはR中のChipSeekerパッケージを使って行った。
【図７Ｄ】図7A〜7Dは、ACTA2R179H変異が、HDAC9-BRGI-MALATI複合体の、VSMC収縮性と関連する遺伝子座との相互作用を誘導することを示す。図7Dは、ACTA2R179’’変異体細胞におけるMALATIの阻害が、ACTA2プロモーターにおける抑制マークH3K27me3のレベルを減少させたことを示している。統計的有意性は、一元配置ANOVAとチューキー事後検定によって決定した（対野生型細胞）。（＊＊P＜0.001、＊＊＊P＜0.0001）。
【図８Ａ】図8A〜8Eは動脈狭窄の実験モデルがHdac9-Brgl-Malatl複合体形成を誘導することを示す。図8A.結紮頸動脈および非結紮頸動脈の組織学的解析および免疫蛍光解析は新生内膜形成および内腔閉塞を示す（雄、n＝2および雌、n＝2）。結紮頸動脈はActa2（a-Sma）、Sm22aの有意な低減およびMmp9発現の増加を示す。有意性は対応のないt検定（両側、対非結紮頸動脈）を使って計算した。赤いアスタリスクは対側非結紮頸動脈と比較した場合に結紮頸動脈試料にいて最もダウンレギュレートされた遺伝子を示す。
【図８Ｂ】図8A〜8Eは動脈狭窄の実験モデルがHdac9-Brgl-Malatl複合体形成を誘導することを示す。図8B.野生型マウスの非結紮頸動脈（雄、n＝3および雌、n＝3）に対する結紮頸動脈（雄、n＝3および雌、n＝3）からの収縮SMCマーカーおよび合成SMCマーカーのヒートマップ。
【図８Ｃ】図8A〜8Eは動脈狭窄の実験モデルがHdac9-Brgl-Malatl複合体形成を誘導することを示す。図8C.RT-QPCR解析は、野生型マウスの結紮頸動脈におけるHdac9 mRNAおよびMalatl mRNAのアップレギュレーションを示す。有意性は対応のないt検定（両側、対非結紮頸動脈）を使って計算した。
【図８Ｄ】図8A〜8Eは動脈狭窄の実験モデルがHdac9-Brgl-Malatl複合体形成を誘導することを示す。図8D.結紮頸動脈の免疫蛍光染色（Hdac9およびBrgl）およびインサイチューハイブリダイゼーション染色（Malatl）では、ロバストな発現が、新たに形成された新生内膜に局在している。
【図８Ｅ】図8A〜8Eは動脈狭窄の実験モデルがHdac9-Brgl-Malatl複合体形成を誘導することを示す。図8E.結紮頸動脈の3Dシーケンシャル免疫蛍光およびインサイチューハイブリダイゼーション顕微鏡観察は、新生内膜細胞におけるHdac9、BrglおよびMalatlの共局在を示す。Malatl-Hdac9とMalatl-Brglの空間的オーバーラップのグローバルピアソン共局在（Global Pearson’s colocalization）（GPC）を示す。スケールバー:50pm。
【図９Ａ】図9A〜9DはHdac9またはMaladの遺伝子破壊が新生内膜形成を阻害することを示す。図9A.野生型マウス（雄、n＝6および雌、n＝6）、Malatfl-マウス（雄、n＝6および雌、n＝6）およびHdac9fin:Tagln-creマウス（雄、n＝6および雌、n＝6）からの結紮頸動脈における新生内膜肥厚の組織学的定量化。頸動脈あたり15枚の水平断面スライド（10pm）を解析した。
【図９Ｂ】図9A〜9DはHdac9またはMaladの遺伝子破壊が新生内膜形成を阻害することを示す。図9B.結紮頸動脈の組織学的解析および免疫蛍光解析は、Malatfl-マウスおよびHdac9fIni:Tagln-creマウスの水平断面および垂直断面に新生内膜肥厚の強い阻害が観察されることを示す。Hdac9またはMalat1の遺伝子除去は、頸動脈中膜におけるActa2、Cnn1およびSm22aのタンパク質レベルを回復させた。
【図９Ｃ−１】図9A〜9DはHdac9またはMaladの遺伝子破壊が新生内膜形成を阻害することを示す。図9C.結紮頸動脈の免疫蛍光解析は、Ma’atoll-マウスおよびHdac9f1111:Tagln-creマウスの結紮頸動脈における内皮層の保存を示す。内皮層はCD31染色によって示され、動脈中膜はActa2染色およびMmp9によって示される。有意性は一元配置ANOVAをチューキー検定と共に使用することで計算した。
【図９Ｃ−２】図9C-1の説明を参照のこと。
【図９Ｄ】図9A〜9DはHdac9またはMaladの遺伝子破壊が新生内膜形成を阻害することを示す。図9D.野生型マウスの結紮頸動脈（n＝7）と比較した、Malat14-マウス（n＝7）およびHdac9finl:Tagin-cre（n＝7）マウスの結紮頸動脈からの収縮SMCマーカーおよび合成SMCマーカーのヒートマップ。有意性は対応のないt検定（両側、対野生型結紮頸動脈）を使って計算した。スケールバー:50pm。
【図１０Ａ】図10A〜10Bは、Hdac9またはMalatlの遺伝子破壊がSMC増殖マーカーの活性化を阻害することを示す。図10A.野生型マウス（n＝4）、Malatfi-マウス（n＝4）およびHdac9fini:Tagln-creマウス（n＝4）の結紮頸動脈におけるp-PDGFRp）、F-アクチンおよび核の免疫蛍光解析。
【図１０Ｂ】図10A〜10Bは、Hdac9またはMalatlの遺伝子破壊がSMC増殖マーカーの活性化を阻害することを示す。図10B.野生型マウス（n＝4）、Malat14-マウス（n＝4）およびHdac9fini:Tagln-creマウス（n＝4）の結紮頸動脈におけるp-FAK、F-アクチンおよび核の免疫蛍光解析。有意性は一元配置ANOVAをチューキー検定と共に使用することで計算した。破線は動脈中膜を示し、M＝中膜、L＝内腔。スケールバー:50pm。
【図１１Ａ】図11A〜11Eは、Hdac9-Brgl-Malatl複合体の薬理学的阻害が新生内膜形成を阻害することを示す。図11A.上図、GapmeR-MalatlまたはGSK343による実験的頸動脈狭窄の処置戦略。下図、媒体処置マウス（n＝5）およびGapmeR-Malat1処置マウス（n＝4）からの大動脈および肝臓組織におけるMalat1 mRNAレベルを示すqPCR解析。
【図１１Ｂ】図11A〜11Eは、Hdac9-Brgl-Malatl複合体の薬理学的阻害が新生内膜形成を阻害することを示す。図11B.媒体処置マウス、GapmeR-Malat1処置マウスおよびGSK343処置マウスの結紮頸動脈の組織学的解析および免疫蛍光解析。
【図１１Ｃ】図11A〜11Eは、Hdac9-Brgl-Malatl複合体の薬理学的阻害が新生内膜形成を阻害することを示す。図11C.媒体処置群（雄、n＝6および雌、n＝6）、GapmeR-Malat1処置群（雄、n＝3および雌、n＝3）およびGSK343処置群（雄、n＝6および雌、n＝6）の定量化プロットは新生内膜形成の有意な阻害を示す。
【図１１Ｄ】図11A〜11Eは、Hdac9-Brgl-Malatl複合体の薬理学的阻害が新生内膜形成を阻害することを示す。図11D.GapmeR-Malat1処置マウスの結紮頸動脈では3’-FAM-フルオロフォアとコンジュゲートされたGapmeR-Malat1分子が検出されるが、媒体処置マウスおよびGSK343処置マウスでは検出されない。
【図１１Ｅ】図11A〜11Eは、Hdac9-Brgl-Malatl複合体の薬理学的阻害が新生内膜形成を阻害することを示す。図11E.GapmeR-Malat1処置マウスおよびGSK343処置マウスの結紮大動脈におけるMmp活性の阻害。屠殺、切離およびイメージングの24時間前に、MMP2活性およびMMP9活性に関する近赤外蛍光センサーであるMMPSense 750 FASTを、マウスに尾静脈注射した。有意性は一元配置ANOVAをチューキー多重比較検定と共に使用することで計算した。
【図１２Ａ−１】図12A〜12Cは、Hdac9-Brgl-Malatl複合体の薬理学的阻害がSMC増殖を阻害し、Hdac9発現をダウンレギュレートすることを示す。図12A.媒体（n＝4）、GapmeR-Malat1（n＝4）またはGSK343（n＝4）の結紮頸動脈におけるp-PDGFRI3、F-アクチンおよび核の免疫蛍光解析。
【図１２Ａ−２】図12A-1の説明を参照のこと。
【図１２Ｂ−１】図12A〜12Cは、Hdac9-Brgl-Malatl複合体の薬理学的阻害がSMC増殖を阻害し、Hdac9発現をダウンレギュレートすることを示す。図12B.媒体（n＝4）、GapmeR-Malatl（n＝4）またはGSK343（n＝4）の結紮頸動脈におけるp-FAK、F-アクチンおよび核の免疫蛍光解析。
【図１２Ｂ−２】図12B-1の説明を参照のこと。
【図１２Ｃ−１】図12A〜12Cは、Hdac9-Brgl-Malatl複合体の薬理学的阻害がSMC増殖を阻害し、Hdac9発現をダウンレギュレートすることを示す。図12C.）媒体（n＝4）、GapmeR-Malatl（n＝4）、またはGSK343（n＝4）の結紮頸動脈におけるCD31、Hdac9およびMmp9の免疫蛍光解析。有意性は一元配置ANOVAをチューキー多重比較検定と共に使用することで計算した。破線は動脈中膜を示し、M＝中膜、L＝内腔。スケールバー:50pm。
【図１２Ｃ−２】図12C-1の説明を参照のこと。
【図１３Ａ】図13A〜13Cは、TGFR2G357w変異が、HDAC9-BRGI-MALATI複合体の、VSMC収縮性と関連する遺伝子座との相互作用を誘導することを示す。図13A.TGFR2G357wが発現する条件下でのヒトVSMCにおけるChIP-Seq実験を記述するベン図により、野生型細胞と比較して663の遺伝子座におけるHDAC9、BRGIおよびH3K27me3修飾の重複した濃縮が示される。パスウェイ解析により、平滑筋細胞収縮に関わる複数の細胞機能が示される。
【図１３Ｂ】図13A〜13Cは、TGFR2G357w変異が、HDAC9-BRGI-MALATI複合体の、VSMC収縮性と関連する遺伝子座との相互作用を誘導することを示す。図13B.箱ひげ図によって、野生型細胞と比較したTGFR2G357w変異体におけるSMC収縮要素の座におけるHDAC9、BRGIおよびH3K27me3の濃縮倍率変化が示されている。座内の個々のゲノム部位の色分けされた名目p値。macs2からのピークのP値アノテーションはR中のChipSeeker（商標）パッケージを使って行った。
【図１３Ｃ】図13A〜13Cは、TGFR2G357w変異が、HDAC9-BRGI-MALATI複合体の、VSMC収縮性と関連する遺伝子座との相互作用を誘導することを示す。図13C.ACTA2R179’’発現細胞を使った多重検定に関するBenjamini-Hochberg補正後の、列挙された遺伝子のプロモーター中の選択されたゲノム部位のp値。
【図１４Ａ】図14A〜14Eは、頸動脈結紮における血管平滑筋コンパートメント中のEzh2の欠失を示す。図14A.肺組織および大動脈組織におけるMyh11-cre-GFP陽性の検出。
【図１４Ｂ】図14A〜14Eは、頸動脈結紮における血管平滑筋コンパートメント中のEzh2の欠失を示す。図14B.PCRジェノタイピングのゲル像。
【図１４Ｃ】図14A〜14Eは、頸動脈結紮における血管平滑筋コンパートメント中のEzh2の欠失を示す。図14C.not creマウスとの比較で雄および雌Myh11-creマウスにおけるEzh2のタンパク質レベルを示すイムノブロットアッセイ。
【図１４Ｄ】図14A〜14Eは、頸動脈結紮における血管平滑筋コンパートメント中のEzh2の欠失を示す。図14D.GapmeR-Malatl-3’FAM（n＝3）およびEzh2fl/fl:Myh11-cre-GFP（n＝6）の結紮頸動脈の組織学的解析および免疫蛍光解析。Acta2、Mmp9、Sm22aおよび核。
【図１４Ｅ】図14A〜14Eは、頸動脈結紮における血管平滑筋コンパートメント中のEzh2の欠失を示す。図14E.野生型マウス（n＝6）およびEzh2fl/fl/Myh11-cre-GFPマウス（n＝6）の結紮頸動脈の新生内膜対中膜の比。有意性は一元配置ANOVAをチューキー多重比較検定と共に使用することで計算した。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
詳細な説明
心血管疾患、例えば限定するわけではないがアテローム性動脈硬化、虚血/再灌流、高血圧、再狭窄、および動脈炎を診断および処置するための方法および組成物が、本明細書に記載される。本明細書記載の組成物および方法は、一つには、HDCA9複合体および/またはPRC2複合体を阻害することによって血管疾患を防止および/または処置することができるという驚くべき発見に基づく。
【００９８】
血管疾患は、血管、身体の循環系の動脈および静脈の一群の疾患である。これは心血管疾患の下位群である。この広大な血管網における障害は、重篤であったり致命的になったりする場合もある一連の健康問題を引き起こしうる。
【００９９】
血管疾患は、大型および中型の筋性動脈の病理学的状態であり、内皮細胞の機能障害によってトリガーされる。生理的条件下で、動脈内皮は、血管のホメオスタシスを維持するために、強力な保護作用を発揮する。しかし血管疾患の発生時にはこれらの保護活性が失われ、実際には、機能障害を起こした内皮細胞が疾患の病理発生を促進する。正常な内皮機能は血管および生体の健康にとって極めて重要である。内皮細胞は血管収縮、血栓形成性、炎症、透過性および血管リモデリングの重要な制御因子である。正常な状態では、内皮は、これらのプロセスを阻害し、血管の安定性およびホメオスタシスを維持するように、保護作用を発揮する。しかし血管疾患の発生時には、表現型が変化した内皮細胞、すなわち「機能障害を起こした」内皮が、それら同じプロセスを促進し、血管の構造および反応性の病理学的変化の一因となる。
【０１００】
病原体、酸化LDL粒子および他の炎症性刺激のような因子により、内皮細胞は活性状態になる。このプロセスは、血管壁の肥厚を引き起こして、増殖性平滑筋細胞、マクロファージおよびリンパ球からなるプラークを形成する。プラークは血流の制限をもたらし、それが一定の器官に到達する酸素および栄養の量を減少させる。プラークは破裂して血餅の形成を引き起こすかもしれない。
【０１０１】
血管疾患にはいくつかのタイプがあり、徴候および症状はそのタイプに依存する。なかでも、紅通症は希少な末梢血管疾患であり、症候群には灼熱痛、体温上昇、紅斑および腫脹が含まれ、主に手足が冒される。末梢動脈疾患は大動脈から腎臓に血液を運ぶ腎動脈の狭小化である。バージャー病は、小血管が炎症を起こし腫脹した後、血管が狭小化したり、凝血塊によって遮断されたりすることによる。レイノー病は、冷えると手足の指において末梢血管が収縮する、希少な末梢血管障害である。播種性血管内血液凝固は、より小さな血管における凝血の広範な活性化である。脳血管疾患は脳機能を冒す一群の血管疾患である。
【０１０２】
動物に基づく心血管疾患のモデル系には、非組換え動物および操作されたトランスジェニック動物があるが、それらに限定されるわけではない。心血管疾患の非組換え動物モデルとしては、例えば遺伝的モデルを挙げることができる。そのような遺伝的心血管疾患モデルの例としては、例えばアポBまたはアポR欠損ブタ（Rapacz,et al.,1986,Science 234:1573-1577）およびワタナベ遺伝性高脂質血症（WHHL）ウサギ（Kita et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.84:5928-5931）を挙げることができる。
【０１０３】
平滑筋は不随意非横紋筋である。これは2つのサブグループ、すなわち単一ユニット（単体）平滑筋と多ユニット平滑筋とに分割される。単一ユニット細胞内では、束全体またはシート全体がシンシチウムとして収縮する。平滑筋細胞は胃、腸、膀胱および子宮を含む中空器官の壁、そして循環系の動脈および静脈などの通路の壁ならびに呼吸器系、泌尿器系および生殖器系などの管の壁に見出される。これらの細胞は眼にも存在し、虹彩のサイズを変化させ、水晶体の形状を変えることができる。皮膚では、平滑筋細胞が低温または恐怖に反応して毛髪を直立させる。
【０１０４】
大半の平滑筋は単一ユニット種、すなわち全筋収縮または全筋弛緩のどちらか一方であるが、気管、大きな弾性動脈および眼の虹彩には多ユニット平滑筋がある。しかし、単一ユニット平滑筋が最も一般的であり、これが血管（大きな弾性動脈を除く）、尿路および消化管を裏打ちしている。
【０１０５】
平滑筋は、構造、機能、収縮の制御、および興奮収縮連関に関して、骨格筋および心筋とは根本的に異なる。筋細胞として知られる平滑筋細胞は紡錘形であり、横紋筋のように緊張したり弛緩したりすることができる。しかし平滑筋組織は、横紋筋と比べると、より大きな弾性を示し、より大きな長さ-張力曲線内で機能する傾向がある。伸展してもなお収縮性を維持するこの能力は、腸や膀胱のような器官では重要である。弛緩した状態では、各細胞は長さ20〜500マイクロメートルの紡錘状である。
【０１０６】
VDまたはCVDではSMCの表現型が調節されうる。調節されたこれらの表現型は、SMC限定的収縮遺伝子のダウンレギュレーションならびに細胞外マトリックスの分泌、増殖および遊走に関与する遺伝子群のアップレギュレーションを特徴とする。そのようなSMC限定的収縮遺伝子のダウンレギュレーションならびに細胞外マトリックスの分泌、増殖および遊走に関与する遺伝子群のアップレギュレーションは、アテローム性動脈硬化、肺高血圧、大動脈瘤および末梢動脈瘤、ならびに経皮動脈インターベンション後の再狭窄などの血管疾患において重要である。
【０１０７】
任意の局面のいくつかの態様において、本明細書には、それら同じSMC限定的収縮遺伝子をコードする遺伝子におけるヒト変異が記載される。例えば、アルファ-平滑筋アクチン（a-SMA）をコードする遺伝子であるACTA2中の変異は非症候性胸部大動脈瘤の主因である。同様に、このアクチンアイソフォームの結合パートナーである平滑筋ミオシン重鎖（smMHC）をコードする遺伝子MYH/1中の変異は、胸部大動脈瘤（TAA）と動脈管開存症（patent ductus arteriosis）の合併症状を引き起こす。SMC収縮の破壊はTAA病理発生の基礎を成す機序であることができる。
【０１０８】
動脈狭窄はよく見られるヒトの状態であり、健康への影響は極めて大きい。動脈狭窄の大部分はアテローム性動脈硬化に関連するが、狭窄は経皮インターベンション後の再狭窄または大動脈閉塞または肺閉塞などの先天性狭窄との関連においても起こりうる。
【０１０９】
肺閉塞は、SMCの過剰な中膜拡大および内膜拡大によって引き起こされると考えられている。動脈SMCは、これらの疾患プロセス中に深刻な表現型変化を起こし、軟骨細胞、骨細胞およびマクロファージの特徴を獲得する能力を有する。しかし最もよく見られる形態の一つは、増殖性表現型として知られる分化度の低下した細胞型である。この表現型は、細胞増殖、平滑筋細胞表現型の決定的マーカー（例えばcc-SMA）の喪失およびマトリックス分解酵素の活性化の増大を特徴とする。
【０１１０】
ほとんどの動脈狭窄はアテローム性動脈硬化に関連して起こるが、メンデル型血管平滑筋機能障害のいくつかの希少な形態も、表現型として動脈狭窄を包含する。そのような状態の一つはACTA2中の変異が引き起こす血管疾患である。ACTA2中に（そしてそれより程度は低いがMYHI I中に）特定のミスセンス変異を持つ患者は、過剰な中膜肥厚が引き起こすと考えられる頭蓋内動脈狭窄および冠動脈狭窄を示す。
【０１１１】
任意の局面のいくつかの態様において、患者における胸部大動脈瘤を防止または処置するための方法であって、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を該患者に投与する工程を含む方法が、本明細書において記載される。
【０１１２】
任意の局面のいくつかの態様において、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする工程は、PRC2複合体および/またはHDAC9複合体を阻害する工程を含むことができる。
【０１１３】
任意の局面のいくつかの態様において、エピジェネティック制御標的は、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である。
【０１１４】
ポリコーム抑制複合体（PRC2）は、本明細書記載のSMC細胞骨格遺伝子の重要なエピジェネティック制御因子である。したがって、任意の局面のいくつかの態様において、本明細書記載の方法および組成物は、ポリコーム抑制複合体（PRC2）の1つまたは複数の構成要素、例えばEZH2（Enhancer of zeste homolog 2）を調節することができる。
【０１１５】
PRC2（ポリコーム抑制複合体2）は、2種類のポリコーム群タンパク質、すなわち（PcG）のうちの一つである。PRC2は進化的に保存されており、哺乳動物、昆虫、および植物に見出されている。このタンパク質群の他方の構成要素はPRC1（ポリコーム抑制複合体1）である。この複合体はヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有し、主としてヒストンH3のリジン27をトリメチル化する（すなわちH3K27me3）。これは転写的にサイレントなクロマチンのマークである。PRC2は、サイレンシングされるゲノム領域（PRC応答エレメント、すなわちPRE）の初期ターゲティングに必要であり、一方、PRC1はこのサイレンシングを安定化するために必要であって、細胞分化後にサイレンシングされた領域の細胞記憶の基礎を成す。PRC2はすべての多細胞生物に存在する。
【０１１６】
PRC2は、少なくとも4つの構成要素EZH2、Suz12、EeedおよびRbAp46/48を含む多タンパク質酵素複合体である。EZH2（Enhancer of zeste homolog 2）は、PRC2のメチル化活性を担っている。任意の局面のいくつかの態様において、PRC2複合体の阻害剤は、Ezh1/2、Suz12、EeedおよびRbAp46/48の阻害剤である。
【０１１７】
任意の局面のいくつかの態様において、PRC2複合体の阻害剤は、SUZ12の阻害剤である。本明細書にいう「SUZ12」または「SUZ12ポリコーム抑制複合体2サブユニット」は、反復性染色体転座のブレークポイントに同定されたタンパク質であり、SUZ12遺伝子によってコードされている。この遺伝子がコードするタンパク質は、コード領域のC末端にジンクフィンガードメインを含有する。
【０１１８】
SUZ12の配列はいくつかの種について公知である。例えばヒトSUZ12（SUZ12 NCBI Gene IDは23512である）mRNA配列（例えばNM＿001321207.1およびポリペプチド配列（例えばNP＿001308136.1）。
【０１１９】
これらは、同じ反応を触媒するその任意の天然アレル変種、スプライス変種およびプロセシングされた形態と共に、本明細書記載の方法および組成物における使用が考えられる。
【０１２０】
任意の局面のいくつかの態様において、SUZ12核酸は、以下の核酸配列CCDS82101.1（SEQ ID NO:3）を有するヒトSUZ12を含むか、またはそれに由来する。
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【０１２１】
任意の局面のいくつかの態様において、SUZ12ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列NP＿001308136.1（SEQ ID NO:4）を有するヒトSUZ12を含むか、またはそれに由来する。
2021513993.tif 000006
【０１２２】
任意の局面のいくつかの態様において、PRC2複合体の阻害剤はEEDの阻害剤である。
【０１２３】
本明細書にいう「EED」または「Embryonic ectoderm development（胚性外胚葉発生）」はポリコームタンパク質であり、ポリコーム群（PcG）ファミリーのメンバーの1つはEED遺伝子によってコードされている。
【０１２４】
EEDの配列はいくつかの種について公知である。例えばヒトEED（EED NCBI Gene IDは8726である）mRNA配列（例えばNM＿001308007.1およびポリペプチド配列（例えばNP＿001294936.1）。
【０１２５】
これらは、同じ反応を触媒するその任意の天然アレル変種、スプライス変種およびプロセシングされた形態と共に、本明細書記載の方法および組成物における使用が考えられる。
【０１２６】
任意の局面のいくつかの態様において、EED核酸は、以下の核酸配列CCDS76463.1（SEQ ID NO:5）を有するヒトEEDを含むか、またはそれに由来する。
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【０１２７】
任意の局面のいくつかの態様において、EEDポリペプチドは以下のアミノ酸配列NP＿001294936.1（SEQ ID NO:6）を有するヒトEEDを含むか、またはそれに由来する。
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【０１２８】
任意の局面のいくつかの態様において、PRC2複合体の阻害剤はRbAp46/48の阻害剤である。
【０１２９】
本明細書にいう「RbAp46/48」または「ヒストン結合タンパク質RBBP4」は、RbAp46/48遺伝子によってコードされるヒストン結合タンパク質である。
【０１３０】
RbAp46/48の配列はいくつかの種について公知である。例えばヒトRbAp46/48（RbAp46/48 NCBI Gene IDは5928である）およびポリペプチド配列（例えばNP＿001128727.1）。
【０１３１】
RbAp46/48にはEC（Enzyme Comission）2.1.1.43が割り当てられている。このEC番号の酵素は本明細書記載の方法および組成物において同様に機能すると予期される。
【０１３２】
これらは、同じ反応を触媒するその任意の天然アレル変種、スプライス変種およびプロセシングされた形態と共に、本明細書記載の方法および組成物における使用が考えられる。
【０１３３】
任意の局面のいくつかの態様において、RbAp46/48核酸は、以下の核酸配列CCDS44105.1（SEQ ID NO:7）を有するヒトRbAp46/48を含むか、またはそれに由来する。
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【０１３４】
任意の局面のいくつかの態様において、RbAp46/48ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列NP＿001128727.1（SEQ ID NO:8）を有するヒトRbAp46/48を含むか、またはそれに由来する 。
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【０１３５】
任意の局面のいくつかの態様において、PRC2は、PRC2の触媒サブユニットであるEZH2の阻害によって阻害することができる。本明細書にいう「EZH2」または「Enhancer of zeste homolog 2」とは、EZH2遺伝子によってコードされるヒストン-リジンN-メチルトランスフェラーゼ酵素の酵素を指す。EZH2は、補因子S-アデノシル-L-メチオニンを利用してヒストンH3のリジン27へのメチル基の付加を触媒する。EZH2のメチル化活性は、ヘテロクロマチン形成を助長し、それによって遺伝子機能をサイレンシングする。
【０１３６】
EZH2阻害は、限定するわけではないがSM22a、a-SMA、smMHCを含む収縮タンパク質発現の、より効率的な発現を可能にする。このような収縮タンパク質の発現の増加は、限定するわけではないが大動脈瘤などの血管疾患の防止および/または処置をもたらすことができる。
【０１３７】
EZH2にはEC（Enzyme Comission）2.1.1.43が割り当てられている。このEC番号の酵素は本明細書記載の方法および組成物において同様に機能すると予期される。
【０１３８】
EZH2の配列はいくつかの種について公知である。例えばヒトEZH2（EZH2 NCBI Gene IDは2146である）mRNA配列（例えばNM＿001203247.1およびポリペプチド配列（例えばNP＿001190176.1）。
【０１３９】
これらは、同じ反応を触媒するその任意の天然アレル変種、スプライス変種およびプロセシングされた形態と共に、本明細書記載の方法および組成物における使用が考えられる。
【０１４０】
任意の局面のいくつかの態様において、EZH2核酸は、以下の核酸配列CCDS56516.1（SEQ ID NO:9）を有するヒトEZH2を含むか、またはそれに由来する。
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【０１４１】
任意の局面のいくつかの態様において、EZH2ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列NP＿001190176.1（SEQ ID NO:10）を有するヒトEZH2を含むか、またはそれに由来する。
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【０１４２】
EZH2阻害剤として、阻害性核酸および低分子、例えばGSK343、ロサルタン、タゼメトスタット、CPI-1205および/またはPF-06821497を挙げることができる。
【０１４３】
HDAC9は、少なくとも2つの構成要素BRG1およびMALAT1を含む多タンパク質酵素複合体の構成要素である。任意の局面のいくつかの態様において、HDAC9-BRG1-MALAT1複合体の阻害剤は、BRG1および/またはMALAT1の阻害剤である。
【０１４４】
HDAC9-BRG1-MALAT1クロマチン修飾複合体は、胸部大動脈瘤（TAA）関連変異で修飾された遺伝子産物の存在下で、血管平滑筋細胞（VSMC）特異的遺伝子のプロモーターに動員される。数ある機能の中でも、HDAC9複合体はPRC2（ポリコーム抑制複合体2）を動員することで、その酵素サブユニットであるEZH2によるヒストン3のリジン27（H3K27）でのトリメチル化を触媒する。
【０１４５】
本明細書にいう「HDAC9」または「ヒストンデアセチラーゼ9」は、HDAC9遺伝子によってコードされるヒストンデアセチラーゼファミリーの酵素を指す。HDAC9は、コアヒストン（H2A、H2B、H3およびH4）のN末端部分にあるリジン残基の脱アセチル化を触媒する。この遺伝子については、異なるアイソフォームをコードする複数の転写産物変種が見出されている。
【０１４６】
本明細書記載のとおり、HDAC9複合体は、狭窄性病変においてダウンレギュレーションを起こす収縮関連遺伝子産物の転写サイレンシングに関与している。したがってHDAC9複合体の阻害は、狭窄性疾患などの血管疾患を防止または処置し、動脈閉塞を寛解させることができる。
【０１４７】
任意の局面のいくつかの態様において、平滑筋依存的狭窄性血管疾患を改善するためのHDAC9複合体阻害に関係する方法および組成物が本明細書に記載される。
【０１４８】
任意の局面のいくつかの態様において、HDAC9複合体の阻害剤はMALAT1、BRG1、HDAC9、および/またはEZH2の阻害剤であることができる。
【０１４９】
HDAC9にはEC（Enzyme Comission）3.5.1.98が割り当てられている。このEC番号の酵素は本明細書記載の方法および組成物において同様に機能すると予期される。
【０１５０】
HDAC9の配列はいくつかの種について公知である。例えばヒトHDAC9（HDAC9 NCBI Gene IDは9734である）mRNA配列（例えばNM＿001204144.2およびポリペプチド配列（例えばNP＿001191073.1）。
【０１５１】
これらは、同じ反応を触媒するその任意の天然アレル変種、スプライス変種およびプロセシングされた形態と共に、本明細書記載の方法および組成物における使用が考えられる。
【０１５２】
任意の局面のいくつかの態様において、HDAC9核酸は、以下の核酸配列CCDS56465.1（SEQ ID NO:11）を有するヒトHDAC9を含むか、またはそれに由来する。
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【０１５３】
任意の局面のいくつかの態様において、HDAC9ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列NP＿001191073.1（SEQ ID NO:12）を有するヒトHDAC9を含むか、またはそれに由来する 。
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【０１５４】
本明細書にいう「BRG1」または「Brahma関連遺伝子1タンパク質」は、BRG1遺伝子によってコードされるSWI/SNFタンパク質ファミリーのメンバーを指す。上述のように、BRG11はエピジェネティックリモデリング複合体HDAC9-BRG1-MALAT1の構成要素であり、任意の局面のいくつかの態様において、HDAC9複合体の阻害剤はBRG1の阻害剤であることができる。任意の局面のいくつかの態様において、BRG1阻害剤は阻害性核酸であることができる。
【０１５５】
BRG1の配列はいくつかの種について公知である。例えばヒトBRG1（BRG1 NCBI Gene IDは6597である）、RNA配列（例えばNM＿001128844.1およびポリペプチド配列（例えばNP＿001122316.1）。
【０１５６】
これらは、同じ反応を触媒するその任意の天然アレル変種、スプライス変種およびプロセシングされた形態と共に、本明細書記載の方法および組成物における使用が考えられる。
【０１５７】
任意の局面のいくつかの態様において、BRG1核酸は、以下の核酸配列CCDS12253.1（SEQ ID NO:13）を有するヒトBRG1を含むか、またはそれに由来する 。
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【０１５８】
任意の局面のいくつかの態様において、BRG1ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列NP＿001122316.1（SEQ ID NO:14）を有するヒトBRG1を含むか、またはそれに由来する。
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【０１５９】
本明細書において使用される「MALAT1」または「metastasis associated lung adenocarcinoma transcript（転移関連肺腺癌転写産物）1」は、tRNA様低分子ncRNAのRNase P切断によってその3’末端から生じる長鎖ノンコーディングRNAである。結果として生じる成熟転写産物はカノニカルポリ（A）テールを欠くが、その代わりに3’三重らせん構造によって安定化されている。この転写産物は核内に保持され、そこでリボヌクレオタンパク質複合体の分子スキャフォールドを形成する。
【０１６０】
上述のように、MALAT1はエピジェネティックリモデリング複合体HDAC9-BRG1-MALAT1の構成要素であり、任意の局面のいくつかの態様において、HDAC9複合体の阻害剤はMALAT1の阻害剤であることができる。任意の局面のいくつかの態様において、MALAT1阻害剤は阻害性核酸であることができる。
【０１６１】
MALAT1の配列はいくつかの種について公知である。例えばヒトMALAT1（MALAT1 NCBI Gene IDは378938である）およびRNA配列（例えばNR＿002819.4）。
【０１６２】
任意の局面のいくつかの態様において、MALAT1 RNAは以下のアミノ酸配列NR＿002819.4（SEQ ID NO:15）を有するヒトRNAを含むか、またはそれに由来する。
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【０１６３】
任意の態様の一局面において、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を患者に投与する工程を含む患者における血管疾患の防止または処置のための組成物も、本明細書において提供される。
【０１６４】
任意の態様の一局面において、細胞骨格タンパク質はTAGLN遺伝子によってコードされるSM22aである。本明細書記載のとおり、大動脈ホメオスタシスを担う収縮遺伝子、例えば限定するわけではないがTAGLN、MYH11および/またはSMTNは、VSMCでは、とりわけSMAD3などの転写因子の作用によって活発に転写される。
【０１６５】
任意の態様の一局面において、エピジェネティック制御標的は、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である。
【０１６６】
任意の態様の一局面において、高メチル化の原因となる酵素は、多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）、およびその触媒ドメイン、メチルトランスフェラーゼEZH2である。
【０１６７】
任意の態様の一局面において、クロマチンまたは染色体タンパク質はH3である。
【０１６８】
本明細書記載のとおり、胸部大動脈瘤を含む血管疾患では、EZH2を含有するポリコーム抑制複合体2（PRC2）が、大動脈遺伝子のプロモーターおよび遺伝子内部へのヒストン3リジン27トリメチル化マークの付加を媒介し、それによってクロマチンへの転写因子のアクセスを妨げる。本明細書記載のとおり、EZH2阻害剤GSK343による処置は、クロマチンへの転写因子（SMAD3など）のアクセスを可能にすることによって、収縮タンパク質発現を脱抑制する。
【０１６９】
任意の態様の一局面において、化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）は、PRC2複合体のメチルトランスフェラーゼ触媒活性を阻害する。
【０１７０】
任意の態様の一局面において、メチルトランスフェラーゼEZH2を阻害する化合物または薬物はGSK343である。
【０１７１】
任意の態様の一局面において、化合物または薬物の組合せはGSK343およびロサルタンである。
【０１７２】
血管疾患を防止または処置するための組成物であって、それを必要とする対象に、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の転写サイレンシングを標的とする少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与し、それによって血管疾患を防止または処置する工程を含む組成物。
【０１７３】
任意の態様の一局面において、血管疾患は、限定するわけではないがアテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤を含む心血管疾患（CVD）から選択される。
【０１７４】
任意の態様の一局面において、血管疾患を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象に、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１７５】
任意の態様の一局面において、血管疾患は、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤からなる群より選択される心血管疾患（CVD）である。
【０１７６】
任意の態様の一局面では、少なくとも1つの作用物質がポリコーム抑制複合体2（PRC2）の活性を阻害する。
【０１７７】
任意の態様の一局面では、少なくとも1つの作用物質がヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）複合体を阻害する。
【０１７８】
任意の態様の一局面において、少なくとも1つの作用物質はEZH2の阻害剤である。
【０１７９】
任意の態様の一局面において、少なくとも1つの作用物質はEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素の阻害剤である。
【０１８０】
任意の態様の一局面において、少なくとも1つの作用物質はHDAC9の阻害剤である。
【０１８１】
任意の態様の一局面において、少なくとも1つの作用物質はMALAT1の阻害剤である。
【０１８２】
任意の態様の一局面において、酵素はEC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の酵素である。
【０１８３】
任意の態様の一局面において、阻害剤は阻害性核酸または低分子阻害剤である。
【０１８４】
本明細書にいう「阻害剤」とは、標的の発現および/または活性を、例えば少なくとも10％以上、例えば10％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、または98％以上減少させることができる作用物質を指す。1つまたは複数の標的の阻害剤の効力、例えば標的のレベルおよび/または活性を減少させるその能力は、例えば標的の発現産物のレベルおよび/または標的の活性のレベルを測定することによって決定することができる。所与のmRNAおよび/またはポリペプチドのレベルを測定するための方法は、当業者には公知であり、例えばプライマーによるRT-PCRを使ってRNAのレベルを決定し、後退によるウェスタンブロッティングを使ってポリペプチドのレベルを決定することができる。例えばHDAC9複合体またはPRC2複合体の活性は、当技術分野において公知の方法を使って決定することができる。任意の局面のいくつかの態様において、阻害剤は、阻害性核酸、アプタマー、抗体試剤、抗体、または低分子であることができる。本明細書記載の標的の阻害剤は、標的ポリペプチドの活性、発現または蓄積を阻害することができる。
【０１８５】
例えばPRC2複合体の阻害剤は、標的そのものに直接作用する（例えばPRC2複合体の構成要素のうちの1つに結合する、例えばEZH2タンパク質またはEZH2転写産物に結合する）阻害剤（例えば直接阻害剤）または標的に間接的に作用する阻害剤、例えばPRC2複合体の1つまたは複数の制御因子に直接作用する阻害剤を含むことができる。
【０１８６】
例えばHDAC9複合体の阻害剤は、標的そのものに直接作用する（例えばHDAC9複合体の構成要素のうちの1つに結合する、例えばMALAT1タンパク質またはMALAT1転写産物に結合する）阻害剤（例えば直接阻害剤）または標的に間接的に作用する阻害剤、例えばPRC2複合体の1つまたは複数の制御因子に直接作用する阻害剤を含むことができる。
【０１８７】
任意の態様の一局面において、血管疾患の処置を必要とする対象における血管疾患を処置する方法であって、EZH2の阻害剤を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１８８】
任意の態様の一局面において、血管疾患の処置を必要とする対象における血管疾患を処置する方法であって、HDAC9の阻害剤を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１８９】
任意の局面のいくつかの態様では、エピジェネティック制御因子タンパク質の阻害剤の2つ以上の個々の試剤、例えばEZH2の阻害剤および/もしくはEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の生物学的活性を持つ酵素の阻害剤ならびに/またはHDAC9および/もしくはEC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の生物学的活性を持つ酵素の阻害剤、例えばエピジェネティック制御因子タンパク質の1つまたは2つの異なる阻害剤を、投与することができる。
【０１９０】
任意の態様の一局面において、血管疾患の処置を必要とする対象における血管疾患を処置する方法であって、EZH2の阻害剤を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０１９１】
任意の局面のいくつかの態様において、阻害剤は、阻害性核酸、アプタマー、ゲノム編集システム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNA、およびsiRNA、阻害抗体試剤、抗体、ペプチド、または低分子である。
【０１９２】
本明細書において使用される「RNAi」または「siRNA」または「shRNA」という用語は、干渉RNAまたはRNA干渉を指す。RNAiとは、mRNAに結合しそのプロセシングを阻害する分子、例えばmRNAの翻訳を阻害する分子またはmRNAの分解をもたらす分子による特異的mRNAの破壊による、選択的な転写後遺伝子サイレンシングの手段を指す。本明細書において使用される用語「RNAi」は、例えば限定するわけではないがsiRNA、shRNA、内在性マイクロRNAおよび人工的マイクロRNAを含む、任意のタイプの干渉RNAを指す。例えばこれには、RNAの下流プロセシングの機序を問わず、以前にsiRNAであると同定された配列が含まれる。ヒトEZH2（例えばSEQ ID NO:9）を標的とする例示的RNAi配列として、例えば以下のRNAi配列が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
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【０１９３】
任意の局面のいくつかの態様において、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する作用物質はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書にいう「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、DNA配列またはmRNA配列に相補的な、例えばマイクロRNAのそれに相補的な、合成された核酸配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、標的に結合して発現を転写、翻訳またはスプライシングのレベルで停止させることによって、DNA標的またはRNA標的の発現を遮断するように設計される。本明細書記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞条件下で遺伝子にハイブリダイズするように設計された相補的核酸配列である。したがって、標的に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチド、すなわち細胞環境下で十分によくかつ十分な特異性でハイブリダイズして所望の効果を与えるオリゴヌクレオチドが選ばれる。例えば、HDAC9複合体および/またはPRC2複合体の活性および/またはレベルを直接的または間接的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれヒトEZH2、Suz12、Eeed、RbAp46/48、MALAT1、BRG1遺伝子のコード配列（例えばSEQ ID NO:3〜15）の一部分に相補的な塩基を、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個以上を含みうる。
【０１９４】
任意の局面のいくつかの態様において、HDAC9複合体の阻害はMALAT1に対する阻害性核酸で達成される。
【０１９５】
任意の局面のいくつかの態様において、MALAT1に対する阻害性核酸はSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2の配列を有する。任意の局面のいくつかの態様において、MALAT1に対する阻害性核酸は、クロマチンにPRC2を動員する複合体を解離させるために長鎖非コーディングRNA（IncRNA）MALAT1を標的とするGapmeRである。
【０１９６】
本明細書において使用される用語「GapmeR」は、標的転写産物分解のためにRNAse Hを動員する修飾された末端ヌクレオチドを持つ低分子アンチセンスDNAを指す。任意の局面のいくつかの態様では、動脈組織におけるMALAT1の抑制をアッセイするために、末梢に注射されたGapmeRを使用することができる。
【０１９７】
任意の局面のいくつかの態様において、MALAT1に対する阻害性核酸で達成されるHDAC9複合体の阻害は、例えば限定するわけではないが動脈狭窄を含む血管疾患を制御するのに、有効である。
【０１９８】
本明細書において使用される用語「低分子」とは、例えば限定するわけではないがペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含みうる、天然の（すなわち自然界に見出される）または非天然の（すなわち自然界には見出されない）有機分子または無機分子、約10,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物（例えばヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約5,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約1,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約500グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステルおよび薬学的に許容される他の形態を指す。自然界に見出される「低分子」の例には、タキソール、ダイネミシンおよびラパマイシンがあるが、それらに限定されるわけではない。研究室で合成される「低分子」の例としては、Tanら（「Stereoselective Synthesis of over Two Million Compounds Having Structural Features Both Reminiscent of Natural Products and Compatible with Miniaturized Cell-Based Assays」J.Am.Chem.Soc.120:8565,1998;参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている化合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。他の一定の好ましい態様では、天然物様の低分子が利用される。
【０１９９】
本明細書にいう「化合物」とは、任意の化学物質、試験化学物質、薬物、新規化学物質（NCE（new chemical entity））または他の部分を指す。例えば化合物は、ヒトを含む哺乳動物などの対象中に通常は存在しない任意の外来化学物質であることができる。化合物は、ヒトを含む哺乳動物などの生物系において通常存在し合成される内在性化学物質であることもできる。例えば、試験化合物、薬物などの化合物は、本明細書で述べるように、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害することができる。
【０２００】
本明細書において使用される用語「誘導体」は、ある作用物質の任意の化学修飾、保存的置換または構造修飾を意味する。誘導体は、薬力学、薬物動態、吸収、分布、送達、特異的受容体へのターゲティングまたは効力などといった作用物質または低分子の特徴を改良することができる。例えば低分子の場合、誘導体は、本質的に少なくとも1個〜約10個の化学修飾からなる。誘導体は作用物質の対応する塩であることもできる。誘導体は、本明細書で述べる低分子のプロドラッグであることもできる。
【０２０１】
任意の態様の一局面において、EZH2阻害剤は、GSK-343、ロサルタン、タゼメトスタット、CPI-1205およびPF-06821497からなる群より選択される。
【０２０２】
任意の態様の一局面において、血管疾患を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の低分子GSK-343を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０２０３】
任意の態様の一局面において、低分子GSK-343はHDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する。
【０２０４】
任意の態様の一局面において、低分子GSK-343は、PRC2が媒介する転写抑制を防止する。
【０２０５】
任意の態様の一局面において、血管疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、参照のみによって本明細書に組み入れられるUS20170105997A1に見出すことができる低分子GSK-343を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０２０６】
本明細書において使用される用語「低分子GSK-343」は、ヒストンH3-リジン27（H3K27）メチルトランスフェラーゼEZH2の強力で特異的な阻害剤である。GSK-343はEZH2の酵素活性を4nMのIC50で阻害する。この化合物は、EZH2に対してEZH1との比較で60倍の選択性を呈し、また他のヒストンメチルトランスフェラーゼに対して1000倍以上の選択性を呈する。H3K27メチル化の阻害に関するIC50はHCC1806細胞において＜200nMである。
【０２０７】
低分子EZH2阻害剤GSK-343の構造は次のとおりである。
2021513993.tif 000032
【０２０８】
任意の態様の一局面において、血管疾患を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の低分子ロサルタンを投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０２０９】
任意の態様の一局面において、低分子ロサルタンはHDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する。
【０２１０】
任意の態様の一局面において、低分子ロサルタンは、PRC2が媒介する転写抑制を防止する。
【０２１１】
本明細書において使用される用語「ロサルタン」とは、高血圧および糖尿病性腎症の治療に使用されるアンジオテンシンII受容体遮断薬を指す。ロサルタンは低率の一過性血清アミノトランスフェラーゼ上昇と関連し、稀な急性肝損傷例と関連付けられている。
【０２１２】
低分子EZH2阻害剤ロサルタンの構造は次のとおりである。
2021513993.tif 000033
【０２１３】
任意の態様の一局面において、血管疾患を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の低分子タゼメトスタットを投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０２１４】
任意の態様の一局面において、低分子タゼメトスタットはHDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する。
【０２１５】
任意の態様の一局面において、低分子タゼメトスタットは、PRC2が媒介する転写抑制を防止する。
【０２１６】
本明細書において使用される用語「タゼメトスタット」は、強力な選択的EZH2阻害剤として作用する実験的抗がん薬を指す。
【０２１７】
低分子EZH2阻害剤タゼメトスタットの構造は次のとおりである。
2021513993.tif 000034
【０２１８】
任意の態様の一局面において、血管疾患を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の低分子CPI-1205を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０２１９】
任意の態様の一局面において、血管疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、参照のみによって本明細書に組み入れられるWO2018081530A1に見出すことができる低分子CPI-1205を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０２２０】
任意の態様の一局面において、低分子CPI-1205はHDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する。
【０２２１】
任意の態様の一局面において、低分子CPI-1205は、PRC2が媒介する転写抑制を防止する。
【０２２２】
本明細書において使用される用語「タゼメトスタット」は、強力な選択的EZH2阻害剤として作用する実験的抗がん薬を指す。
【０２２３】
低分子EZH2阻害剤CPI-1205の構造は次のとおりである。
2021513993.tif 000035
【０２２４】
任意の態様の一局面において、血管疾患を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の低分子PF-06821497を投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。
【０２２５】
任意の態様の一局面において、低分子PF-06821497はHDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する。
【０２２６】
任意の態様の一局面において、低分子PF-06821497は、PRC2が媒介する転写抑制を防止する。
【０２２７】
本明細書において使用される用語「PF-06821497」は、強力な選択的EZH2阻害剤として作用する実験的抗がん薬を指す。
【０２２８】
低分子EZH2阻害剤PF-06821497の構造は次のとおりである。
2021513993.tif 000036
【０２２９】
血管疾患の処置のために血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする作用物質の単位投薬量を投与することによる対象における血管疾患の処置のための組成物が、本明細書において開示される。
【０２３０】
任意の局面のいくつかの態様において、組成物はEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の生物学的活性を持つ酵素の阻害剤を含む。
【０２３１】
別の一態様において、組成物はEC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の生物学的活性を持つ酵素の阻害剤を含む。
【０２３２】
限定するわけではないがタゼメトスタット、CPI-1205、PF-06821497、ロサルタンおよびGSK343を含む、EZH2および/またはEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の生物学的活性を持つ酵素を阻害する化合物のいずれかを、心血管疾患症状を寛解させる能力について試験することができる。そのような心血管疾患症状を寛解させる能力を呈する化合物を同定するための細胞ベースのアッセイおよび動物モデルベースのアッセイは以下に説明する。
【０２３３】
限定するわけではないがTMP269、キシノスタット、CUDC-101、プラシノスタット（Pracinostat）（SB939）、CUDC-907を含む、HDAC9および/またはEC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の生物学的活性を持つ酵素を阻害する化合物のいずれかを、心血管疾患症状を寛解させる能力について試験することができる。そのような心血管疾患症状を寛解させる能力を呈する化合物を同定するための細胞ベースのアッセイおよび動物モデルベースのアッセイは以下に説明する。
【０２３４】
本明細書記載の組成物および方法は、本明細書記載の状態のうちの1つを有する対象または本明細書記載の状態のうちの1つを有すると診断された対象に投与/施行することができる。任意の局面のいくつかの態様において、本明細書記載の方法は、本明細書記載の状態の症状を緩和するために、有効量の本発明記載の組成物、例えば操作された細胞の組成物を、対象に投与する工程を含む。任意の局面のいくつかの態様では、治療有効用量の組成物が投与される。本明細書にいう「症状を緩和する」とは、疾患に関連する任意の状態または症状を寛解させることをいう。等価な無処置対照と比較して、そのような低減は、任意の標準的技法による測定で、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％以上の低減である。本明細書記載の組成物を対象に投与するためのさまざまな手段は、当業者に公知である。そのような方法としては、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、注射、または腫瘍内投与を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。投与は局所的または全身性であることができる。
【０２３５】
本明細書において使用する用語「有効量」は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を緩和するのに必要な組成物の量を指し、所望の効果を与えるのに十分な、薬理学的組成物の量に関する。それゆえに「治療有効量」という用語は、典型的対象に投与された時に特定の治療効果を与えるのに十分な組成物の量を指す。本明細書においてさまざまな文脈で使用される有効量には、疾患の症状の発生を遅延させ、疾患症状の経過を変化させ（例えば疾患症状の進行を減速し）、または疾患の症状を反転させるのに十分な量も含まれるであろう。したがって、一般的には、正確な「有効量」の指定は実行不可能である。しかし、任意の所与のケースについて、当業者は、日常的な実験だけを使って、適当な「有効量」を決定することができる。
【０２３６】
有効量、毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物において、例えばLD50（集団の50％にとって致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を決定するための標準的な薬学的手順で決定することができる。投薬量は使用する剤形および利用する投与経路に応じて変動しうる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療係数であり、これは比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療係数を呈する組成物および方法が好ましい。治療有効用量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。また、細胞培養または適当な動物モデルにおいて決定されたIC50（すなわち症状の50％最大阻害を達成する活性成分の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を得るために、動物モデルにおいて用量を策定することもできる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定投薬量の効果は、例えば、とりわけ、腫瘍サイズおよび/または炎症マーカーに関する適切なバイオアッセイによってモニターすることができる。医師は投薬量を決定し、必要に応じて、観察された処置の効果に合わせて調整することができる。
【０２３７】
任意の局面のいくつかの態様において、本明細書記載の組成物は薬学的組成物であることができる。任意の局面のいくつかの態様において、本明細書記載の技術は、本明細書記載の操作された細胞の組成物と任意で薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的組成物の活性成分は、本明細書記載の操作された細胞の組成物を含む。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的組成物の活性成分は、本質的に本明細書記載の操作された細胞の組成物からなる。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的組成物の活性成分は、本明細書記載の操作された細胞の組成物からなる。薬学的に許容される担体および希釈剤としては、食塩水、水性緩衝液、溶媒および/または分散媒が挙げられる。そのような担体および希釈剤の使用は当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料の非限定的な例を以下にいくつか挙げる:（1）糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース;（2）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン;（3）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース;（4）トラガント粉末;（5）麦芽;（6）ゼラチン;（7）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク;（8）賦形剤、例えばカカオ脂および坐剤用ワックス;（9）油、例えばラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油;（10）グリコール、例えばプロピレングリコール;（11）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）;（12）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;（13）寒天;（14）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;（15）アルギン酸;（16）パイロジェンフリー水;（17）等張食塩水;（18）リンゲル液;（19）エチルアルコール;（20）pH緩衝溶液;（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物;（22）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸、（23）血清構成要素、例えば血清アルブミン、HDLおよびLDL;（22）C2-C12アルコール、例えばエタノール;および（23）薬学的製剤に使用される他の非毒性適合物質。湿潤剤、着色剤、放出剤、被覆剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および酸化防止剤も製剤中に存在しうる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等の用語は、本明細書では相互可換的に使用される。任意の局面のいくつかの態様において、担体は、本明細書記載の活性作用物質の分解を阻害する。
【０２３８】
任意の局面のいくつかの態様において、本明細書記載の操作された細胞の組成物を含む薬学的組成物は、非経口剤形でありうる。非経口剤形の投与は通例、汚染物質に対する患者の自然防御を迂回するので、非経口剤形は好ましくは滅菌状態にあるか、患者への投与に先だって滅菌することが可能である。非経口剤形の例としては、そのまま注射できる溶液剤、注射用に薬学的に許容される媒体にそのまま溶解または懸濁することができる乾燥製品または凍結乾燥製品、そのまま注射できる懸濁剤、および乳剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。加えて、患者への投与のために、限定するわけではないがDUROS（登録商標）型剤形および用量ダンピング（dose-dumping）を含む、制御放出非経口剤形を調製することができる。
【０２３９】
本明細書記載の操作された細胞の組成物の非経口剤形を提供するために使用することができる適切な媒体は、当業者には周知である。例として、滅菌水;米国薬局方注射用水;食塩溶液;グルコース溶液;限定するわけではないが塩化ナトリウム注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸加リンゲル注射液などの水性媒体;限定するわけではないがエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールなどの水混和性媒体;ならびに限定するわけではないがトウモロコシ油、綿実油、ラッカセイ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、イソプロピルミリステートおよび安息香酸ベンジルなどの非水性媒体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０２４０】
任意の局面のいくつかの態様において、本明細書記載の操作された細胞の組成物は単独治療として投与され、例えば当該状態に対する他の処置は対象には施行されない。
【０２４１】
任意の局面のいくつかの態様において、本明細書記載の方法は、対象への第2の作用物質および/または処置の投与/施行を、例えば併用治療の一部として、さらに含むことができる。第2の作用物質および/または処置の非限定的な例としては、ベータ遮断薬、例えばメトプロロール（Lopressor、Toprol-XL）、アテノロール（Tenormin）および/もしくはビソプロロール（Zebeta）;ならびに/またはアンジオテンシンII受容体遮断薬、例えばロサルタン（Cozaar）、バルサルタン（Diovan）およびオルメサルタン（Benicar）;ならびに/またはスタチン、例えばアトルバスタチン（Lipitor）、ロバスタチン（Altoprev）および/またはシンバスタチン（Zocor）、上記の任意の誘導体を挙げることができる。
【０２４２】
加えて、処置の方法は、放射線照射または放射線治療の使用を、さらに含むことができる。さらに、処置の方法は、外科的処置の使用を、さらに含むことができる。
【０２４３】
非限定的な例として、対象が本明細書記載の方法に従って炎症について処置される場合、対象には、痛みまたは炎症を患っている対象にとって有益であることが公知の第2の作用物質および/または処置を投与/施行することができる。そのような作用物質および/または処置の例としては、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID-例えばアスピリン、イブプロフェン、またはナプロキセン）;コルチコステロイド、例えばグルココルチコイド（例えばコルチゾール、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロンおよびベクロメタゾン）;メトトレキサート;スルファサラジン;レフルノミド;抗TNF薬物治療;シクロホスファミド;消炎薬（pro-resolving drug）;ミコフェノラート;またはオピエート（例えばエンドルフィン、エンケファリンおよびダイノルフィン）、ステロイド、鎮痛薬、バルビツレート類、オキシコドン、モルヒネ、リドカインなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０２４４】
一定の態様では、本明細書記載の操作された細胞の組成物を含む組成物の有効量を、患者に一度に投与することができる。一定の態様では、組成物の有効量を患者に繰り返し投与することができる。任意の局面のいくつかの態様では、初回処置レジメン後に、頻度を減らして処置を施行することができる。例えば、3ヶ月にわたる2週間に1回の処置後に、6ヶ月または1年以上にわたって、月1回の処置を繰り返すことができる。本明細書記載の方法による処置は、状態のマーカーまたは症状のレベルを、例えば少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％もしくは少なくとも90％またはそれ以上、低減させることができる。
【０２４５】
医師は本明細書記載の組成物の投薬量を決定し、必要に応じて、観察された処置の効果に合わせて調整することができる。処置の継続期間および頻度に関して、熟練した臨床家は、通例、対象をモニターして、処置がいつ治療的利益を提供しているかを決定し、投薬量を増加または減少させるべきか、投与頻度を増加または減少させるべきか、処置を中断すべきか、処置を再開すべきか、または処置レジメンに他の変更を加えるべきかを決定する。投与スケジュールは、組成物に対する対象の感受性などといったいくつかの臨床因子に応じて、週に1回から毎日までさまざまであることができる。望ましい用量または活性化のための量を一度に投与するか、または部分用量に分割して、例えば2〜4回分の部分用量に分割して、一定期間にわたって、例えば適当な間隔で1日かけて、または他の適当なスケジュールで投与することができる。任意の局面のいくつかの態様において、投与は、慢性的、例えば数週間または数ヶ月の期間にわたって、1回または複数回の投与および/または毎日の処置であることができる。投与および/または処置スケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、または6ヶ月以上にわたって、1日1回、1日2回、1日3回または1日4回以上の投与である。本明細書に記載の操作された細胞の組成物を含む組成物は、ある時間をかけて、例えば5分、10分、15分、20分または25分かけて、投与することができる。
【０２４６】
本明細書記載の方法による本明細書記載の組成物の投与に関する投薬量は、例えば細胞の力価、および本明細書記載の状態の症状、マーカーまたは指標をどの程度低減させたいか、例えば所望する腫瘍成長の低減百分率、または例えば創傷治癒をどの程度誘導したいかに依存する。投薬量は、過剰な炎症または免疫抑制などの有害な副作用を引き起こすほど多くてはいけない。一般的に、投薬量は患者の年齢、状態および性別によって変動し、当業者はそれを決定することができる。何らかの合併症がある場合は、個々の医師が投薬量を調整することもできる。
【０２４７】
熟練した臨床家は、操作された細胞の組成物の、例えば本明細書記載の状態の処置における効力または本明細書記載の応答を誘導する効力を決定することができる。ただし処置は、本明細書記載の方法による処置後に、本明細書記載の状態の徴候または症状の1つまたは複数が有益な形で変化し、他の臨床的に許容される症状が改善し、もしくはさらには寛解し、または所望の応答が例えば少なくとも10％誘導されるのであれば、本明細書にいう意味で「有効な処置」とみなされる。効力は、例えば、本明細書記載の方法に従って処置される状態のマーカー、指標、症状および/または発生を測定するか、他の適当な任意の測定可能なパラメータを測定することによって評価することができる。効力は、入院または医学的インターベンションの必要によって評価される個体の悪化がない（すなわち疾患進行が停止する）ことによっても測定することができる。これらの指標を測定する方法は当業者には公知であり、かつ/または本明細書に記載する。処置には、個体または動物（いくつかの非限定的な例としてヒトまたは動物が挙げられる）における疾患の任意の処置が含まれ、（1）疾患を阻害すること、例えば症状（例えば痛みまたは炎症）の悪化を防止すること、または（2）疾患の重症度を軽減すること、例えば症状の後退を引き起こすことが含まれる。疾患処置のための有効量とは、それを必要とする対象に投与した場合に、当該疾患について本明細書に定義する意味での有効な処置をもたらすのに十分な量を意味する。作用物質の効力は、状態の、または所望する応答の、物理的指標を評価することによって決定することができる。そのようなパラメータのいずれか1つまたはパラメータの任意の組合せを測定することによって投与および/または処置の効力をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。効力は、本明細書記載の状態の動物モデル、例えばがん処置の動物モデルにおいて、評価することができる。実験動物モデルを使用する場合、処置の効力は、統計的に有意な変化が例えば腫瘍成長、腫瘍サイズ、炎症、創傷サイズなどのマーカーに観察された場合に証明される。
【０２４８】
本明細書記載のさまざまな態様では、記載の特定ポリペプチドのいずれかの変種（天然であるかそうでないかを問わない）、アレル、ホモログ、保存的に改変された変種、および/または保存的に置換された変種が包含されると、さらに考えられる。アミノ酸配列に関して、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列における個々の置換、欠失または付加であって、コードされている配列中の単一のアミノ酸またはごく一部のアミノ酸を変化させるものは、その変化が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保っている場合に、「保存的に改変された変種」であることは、当業者にはわかるであろう。そのような保存的に改変された変種は、本開示に合致する多型変種、種間ホモログおよびアレルに加えられ、それらを除外するものではない。
【０２４９】
一定の態様において、心血管疾患症状の防止および処置の測定には、細胞アッセイを使用することができる。心血管疾患症状を寛解し、防止しまたは処置する能力を呈すると推測される化合物に、曝露された細胞において心血管疾患症状のそのような寛解を引き出すのに十分な濃度で、十分な時間にわたって細胞系を曝露しうる。
【０２５０】
別の一態様では、EZH2および/またはEC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の生物学的活性を持つ任意の酵素を阻害する化合物、例えば限定するわけではないが心血管疾患症状を寛解させる能力を呈すると推測されるタゼメトスタット、CPI-1205、PF-06821497、ロサルタンおよびGSK343に、曝露された細胞において心血管疾患症状のそのような寛解を引き出すのに十分な濃度で、十分な時間にわたって細胞系を曝露しうる。
【０２５１】
別の一態様では、HDAC9および/またはEC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の生物学的活性を持つ任意の酵素を阻害する化合物、例えば限定するわけではないが心血管疾患症状を寛解させる能力を呈すると推測されるTMP269、キシノスタット、CUDC-101、プラシノスタット（SB939）、CUDC-907に、曝露された細胞において心血管疾患症状のそのような寛解を引き出すのに十分な濃度で、十分な時間にわたって細胞系を曝露しうる。
【０２５２】
曝露後に、細胞を調べて、心血管疾患細胞表現型の1つまたは複数が、正常寄りの、または野生型寄りの、非心血管疾患表現型と類似するように変化したかどうかを決定する。例えば限定するわけではないが、単球の場合、そのような、正常寄りの表現型としては、LDL取込み率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫細胞形成、脂肪線条形成、および泡沫細胞によるbFGF、IGF-I、VEGF、IL-1、M-CSF、TGFβ、TGFα、TNFα、HB-EGF、PDGF、IFN-γおよびGM-CSFなどの成長因子の産生の減少を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。
【０２５３】
ある細胞系は平滑筋細胞を含む（Navab et al.,1988,J.Clin.Invest.,82:1853）。この系では、未変性コラーゲンのゲル層で覆われたミクロポアフィルタ上で、ヒト大動脈平滑筋細胞の多層を成長させ、コラーゲン層の上にヒト大動脈内皮細胞の単層を成長させた。この共培養物を走化性因子rFMLPの存在下でヒト単球に曝露すると、内皮細胞への単球の付着が起こり、続いて、内皮単層を横切って、内皮下空間のコラーゲン層への遊走が起こる。このタイプの培養物は、泡沫細胞を生成させるためにLDLで処理することもできる。次に泡沫細胞を回収し、それらの遺伝子発現パターンを無処理細胞のそれと、当業者に公知の方法を使って比較することができる。実験条件と対照条件との間で遺伝子発現パターンを比較することにより、差次的発現遺伝子を検出することができる。
【０２５４】
加えて、遺伝子発現パターンは、心血管疾患症状を寛解させる化合物の能力を評価するためにも利用しうる。例えば1つまたは複数のフィンガープリント遺伝子の発現パターンは「フィンガープリントプロファイル」の一部を形成することができ、そしてそれは前述のような評価に使用しうる。本明細書にいう「フィンガープリントプロファイル」とは、所与の条件セット下で所与の組織または細胞タイプについて得られるmRNA発現のパターンを指す。そのような条件として、アテローム性動脈硬化、虚血/再灌流、高血圧、再狭窄、および動脈炎を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。
【０２５５】
本発明に従って使用するための薬学的組成物は、1つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使って、従来の方法で製剤化しうる。
【０２５６】
したがって、化合物ならびにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入または吹送（口または鼻を経由するもの）による投与、経口投与、口腔粘膜投与、非経口投与または直腸投与用に、製剤化しうる。
【０２５７】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）;充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）;潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）;崩壊剤（例えばバレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）;または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を使って従来の手段によって調製された、錠剤またはカプセル剤の形態をとりうる。錠剤は当技術分野において周知の方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液状調製物は、例えば溶液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとりうるか、または使用前に水または他の適切な媒体で構成するための乾燥製品として提示しうる。そのような液状調製物は、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）;乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアガム）;非水性媒体（例えばアーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）;および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を使って従来の手段で調製しうる。調製物は適宜、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有しうる。
【０２５８】
経口投与用の調製物は活性化合物の制御放出を与えるように適切に製剤化しうる。
【０２５９】
口腔粘膜投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤または口中錠の形態をとりうる。
【０２６０】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使って、加圧パックまたはネブライザーから、エアロゾルスプレー提示の形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量済みの量を送達するためのバルブを設けることによって決定しうる。化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または吹送器に使用するための、例えばゼラチン製の、カプセルおよびカートリッジを製剤化しうる。
【０２６１】
化合物は注射による、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与用に製剤化しうる。注射用の製剤は、単位剤形で、例えばアンプルに入れて、または保存剤が添加された多用量型容器に入れて、提示することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁剤、溶液剤または乳剤などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定剤および/または分散剤などの製剤用薬剤を含有しうる。あるいは、活性成分は、使用前に適切な媒体、例えば滅菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末状であってもよい。
【０２６２】
化合物は、例えばカカオ脂または他のグリセライドなどの従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸剤などの直腸組成物にも製剤化しうる。
【０２６３】
上記の製剤に加えて、化合物はデポー調製物としても製剤化しうる。そのような長時間作用性製剤は、植込み（例えば皮下または筋肉内への植込み）によって、または筋肉内注射によって投与しうる。したがって例えば、化合物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を使って製剤化するか、やや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として、製剤化することができる。
【０２６４】
所望であれば組成物は、活性成分を含有する1つまたは複数の単位剤形を含有しうる、パックまたはディスペンサーデバイスに入れて提示することができる。パックは、例えば、ブリスター包装など、金属箔またはプラスチック箔を含みうる。パックまたはディスペンサーデバイスには投与に関する説明書を添付することができる。
【０２６５】
本明細書において開示する本発明の代替的要素または態様のグループ分けは、制約とみなしてはならない。各グループの構成要素は、個別に、またはそのグループの他の構成要素もしくは本明細書に見出される他の要素との任意の組合せで、言及し、クレームすることができる。あるグループの1つまたは複数の構成要素は、利便性および/または特許可能性を理由として、あるグループに含めること、またはあるグループから除外することができる。何らかのそのような包含または除外が行われる場合、本明細書は、変更が加えられたグループを包含し、よって本願特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュグループの書面による説明を満たすとみなされる。
【０２６６】
本明細書において別段の定義がある場合を除き、本願との関連で使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野の通常の技能を有する者に一般に理解されている意味を有するものとする。本発明は本明細書記載の特定の方法、プロトコールおよび試剤に限定されず、したがってさまざまでありうると理解すべきである。本明細書において使用される術語には、特定の態様を説明する目的しかなく、本願の請求項によってのみ規定される本発明の範囲を限定する意図はない。免疫学および分子生物学における一般的用語の定義は、「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」第20版、Merck Sharp＆Dohme Corp.刊、2018（ISBN 0911910190、978-0911910421）;Robert S.Porterら編「The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine」Blackwell Science Ltd.刊、1999-2012（ISBN 9783527600908）;およびRobert A.Meyers編「Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference」VCH Publishers,Inc.刊、1995（ISBN 1-56081-569-8）;Werner Luttmann著「Immunology」Elsevier刊、2006;「Janeway’s Immunobiology」Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver編、W.W.Norton＆Company、2016（ISBN 0815345054,978-0815345053）;「Lewin’s Genes XI」Jones＆Bartlett Publishers刊、2014（ISBN-1449659055）;Michael Richard Green and Joseph Sambrook著「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（2012）（ISBN 1936113414）;Davisら著「Basic Methods in Molecular Biology」Elsevier Science Publishing,Inc.、米国ニューヨーク（2012）（ISBN 044460149X）;「Laboratory Methods in Enzymology:DNA」Jon Lorsch編、Elsevier,2013（ISBN 0124199542）;「Current Protocols in Molecular Biology」（CPMB）、Frederick M.Ausubel編、John Wiley and Sons、2014（ISBN 047150338X,9780471503385）、「Current Protocols in Protein Science」（CPPS）、John E.Coligan編、John Wiley and Sons,Inc.、2005;および「Current Protocols in Immunology」（CPI）（John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe編、John Wiley and Sons,Inc.、2003（ISBN 0471142735、9780471142737）に見出すことができ、これらの文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０２６７】
他の用語は、本明細書において、本発明のさまざまな局面の説明内で定義する。
【０２６８】
本願において言及する特許および他の刊行物は、参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含めてすべて、例えば本明細書記載の技術に関連して使用されるかもしれないそのような刊行物に記載の方法論を記載し開示するために、参照により、特に本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、それらの開示が本願の出願日より前になされたという理由で提供されるにすぎない。この点について、本発明者らが先行発明を理由に、または他の何らかの理由で、そのような開示に先行する資格がないことの自白であるとみなすべきものは何もない。これらの文書の日付に関する陳述またはこれらの文書の内容に関する表現はいずれも出願人が入手できる情報に基づくが、これらの文書の日付または内容の正しさに関する承認を構成するものではない。
【０２６９】
本開示の態様の説明は網羅的であることを意図しておらず、本開示を開示した形態そのものに限定しようとするものでもない。本明細書には本開示の具体的態様または実施例が例示を目的として記載されているが、関連分野の当業者にはわかるであろうとおり、さまざまな等価な変更が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の工程または機能は所与の順序で提示されているが、代替的態様では、機能を異なる順序で履行してもよく、実質的に同時に履行してもよい。本明細書において提供される開示の教示は、適宜、他の手順または方法にも応用することができる。本明細書記載のさまざまな態様を組み合わせてさらなる態様を提供することができる。必要であれば、上記参考文献および出願の組成物、機能および概念を利用するように本開示の局面を改変することで、本開示のさらなる態様を提供することもできる。さらにまた、生物学的機能の等価性を考慮することにより、生物学的作用または化学的作用の種類または量に影響を及ぼすことなく、いくつかの変更をタンパク質構造に加えることができる。これらの変更および他の変更は、詳細な説明に照らして、本開示に加えることができる。そのような変更はすべて添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【０２７０】
前述の態様のいずれかの具体的要素を、他の態様の要素と組み合わせ、または置き換えることができる。さらにまた、本開示の一定の態様に関連する利点をこれらの態様との関連において説明したが、他の態様もそのような利点を呈しうるし、本開示の範囲内に包含されるために、すべての態様がそのような利点を必ずしも呈するわけではない。
【０２７１】
以下に実施例を挙げて本明細書記載の技術をさらに例示する。ただし決して以下の実施例をさらなる限定と解釈してはならない。
【０２７２】
本明細書記載の技術のいくつかの態様は、以下の番号付きパラグラフに従って規定することができる。
1.
患者における胸部大動脈瘤を防止または処置するための方法であって、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を該患者に投与する工程を含む、方法。
2.
細胞骨格タンパク質が、TAGLN遺伝子によってコードされるSM22aである、パラグラフ1の方法。
3.
エピジェネティック制御標的が、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である、パラグラフ1の方法。
4.
クロマチンまたは染色体タンパク質が、H3である、パラグラフ3の方法。
5.
高メチル化の原因となる酵素が、多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）、およびその触媒ドメイン、メチルトランスフェラーゼEZH2である、パラグラフ3またはパラグラフ4の方法。
6.
化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）が、PRC2複合体のメチルトランスフェラーゼ触媒活性を阻害する、パラグラフ1〜5のいずれかの方法。
7.
メチルトランスフェラーゼEZH2を阻害する化合物または薬物が、GSK343である、パラグラフ6の方法。
8.
化合物または薬物の組合せが、GSK343およびロサルタンである、パラグラフ6またはパラグラフ7の方法。
9.
血管疾患を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象に、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与する工程を含む、方法。
10.
血管疾患が、心血管疾患（CVD）である、パラグラフ9の方法。
11.
CVDが、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤からなる群より選択される、パラグラフ10の方法。
12.
少なくとも1つの作用物質が、ポリコーム抑制複合体2（PRC2）の活性を阻害する、パラグラフ9〜11のいずれかの方法。
13.
少なくとも1つの作用物質が、ヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）複合体を阻害する、パラグラフ9〜11のいずれかの方法。
14.
少なくとも1つの作用物質が、EZH2の阻害剤である、パラグラフ9〜13のいずれかの方法。
15.
少なくとも1つの作用物質が、EC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素の阻害剤である、パラグラフ19〜14のいずれかの方法。
16.
少なくとも1つの作用物質が、HDAC9の阻害剤である、パラグラフ9〜15のいずれかの方法。
17.
少なくとも1つの作用物質が、MALAT1の阻害剤である、パラグラフ9〜16のいずれかの方法。
18.
酵素が、EC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の酵素である、パラグラフ9の方法。
19.
阻害剤が、阻害性核酸または低分子阻害剤である、パラグラフ9〜18のいずれかの方法。
20.
血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を患者に投与する工程を含む、患者における胸部大動脈瘤の防止または処置のための組成物。
21.
細胞骨格タンパク質が、TAGLN遺伝子によってコードされるSM22aである、パラグラフ20の組成物。
22.
エピジェネティック制御標的が、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である、パラグラフ20の組成物。
23.
クロマチンまたは染色体タンパク質が、H3である、パラグラフ20の組成物。
24.
高メチル化の原因となる酵素が、多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）、およびその触媒ドメイン、メチルトランスフェラーゼEZH2である、パラグラフ20またはパラグラフ22の組成物。
25.
化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）が、PRC2複合体のメチルトランスフェラーゼ触媒活性を阻害する、パラグラフ20〜24のいずれかの組成物。
26.
メチルトランスフェラーゼEZH2を阻害する化合物または薬物が、GSK343である、パラグラフ25の組成物。
27.
化合物または薬物の組合せが、GSK343およびロサルタンである、パラグラフ20またはパラグラフ22の組成物。
28.
血管疾患を防止または処置する組成物であって、それを必要とする対象に、HDAC9複合体またはPRC2複合体の活性を阻害する少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与する工程を含む、組成物。
29.
血管疾患が、心血管疾患（CVD）である、パラグラフ28の組成物。
30.
CVDが、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤からなる群より選択される、パラグラフ28の組成物。
31.
少なくとも1つの作用物質が、ポリコーム抑制複合体2（PRC2）の活性を阻害する、パラグラフ28〜30のいずれかの組成物。
32.
少なくとも1つの作用物質が、ヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）複合体を阻害する、パラグラフ28〜31のいずれかの組成物。
33.
少なくとも1つの作用物質が、EZH2の阻害剤である、パラグラフ28〜32のいずれかの組成物。
34.
少なくとも1つの作用物質が、EC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素の阻害剤である、パラグラフ28〜33のいずれかの組成物。
35.
少なくとも1つの作用物質が、HDAC9の阻害剤である、パラグラフ28〜34のいずれかの組成物。
36.
少なくとも1つの作用物質が、MALAT1の阻害剤である、パラグラフ28〜35のいずれかの組成物。
37.
酵素が、EC（Enzyme Comission）番号3.5.1.98の酵素である、パラグラフ28〜36のいずれかの組成物。
38.
阻害剤が、阻害性核酸または低分子阻害剤である、パラグラフ28〜37のいずれかの組成物。
39.
血管疾患を防止または処置するための組成物であって、それを必要とする対象に、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の転写サイレンシングを標的とする少なくとも1つの作用物質の治療有効量を投与し、それによって血管疾患を防止または処置する工程を含む、組成物。
40.
血管疾患が、心血管疾患（CVD）から選択される、パラグラフ39の組成物。
41.
CVDが、アテローム性動脈硬化、血管石灰化、カルシフィラキシー、新生内膜狭窄および動脈瘤から選択される、パラグラフ39の組成物。
42.
転写サイレンシングが、多タンパク質複合体を含む、パラグラフ39〜41のいずれかの組成物。
43.
多タンパク質複合体が、ポリコーム抑制複合体を含む、パラグラフ42の組成物。
44.
多タンパク質複合体が、ポリコーム抑制複合体2（PRC2）を含む、パラグラフ42の組成物。
45.
多タンパク質複合体が、ヒストンデアセチラーゼを含む、パラグラフ42の組成物。
46.
多タンパク質複合体が、ヒストンデアセチラーゼ複合体9（HDAC9）を含む、パラグラフ42の組成物。
47.
多タンパク質複合体が、血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する触媒サブユニットを含む、パラグラフ42の組成物。
48.
触媒サブユニットが、高メチル化によって遺伝子サイレンシングを誘導する、パラグラフ42の組成物。
49.
触媒サブユニットが、酵素である、パラグラフ42〜48のいずれかの組成物。
50.
酵素が、メチルトランスフェラーゼEZH2である、パラグラフ39の組成物。
51.
酵素が、EC（Enzyme Comission）番号2.1.1.43の酵素である、パラグラフ39の組成物。
52.
酵素が、血管平滑筋遺伝子座におけるクロマチンの高メチル化による転写サイレンシングを誘導する、パラグラフ39の組成物。
53.
酵素が、ヒストンデアセチラーゼである、パラグラフ39の組成物。
54.
酵素が、ヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）である、パラグラフ39の組成物。
55.
酵素が、EC（Enzyme Comission）3.5.1.98の酵素である、パラグラフ39の組成物。
56.
酵素が、血管平滑筋遺伝子座におけるクロマチンの高アセチル化による転写サイレンシングを誘導する、パラグラフ39の組成物。
57.
血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する酵素が、EZH2、HDAC9からなる群より選択される、パラグラフ39〜56のいずれかの組成物。
58.
血管平滑筋遺伝子座における転写サイレンシングを誘導する作用物質が、EZH2阻害剤である、パラグラフ39の組成物。
59.
EZH2阻害剤が、GSK343およびロサルタンからなる群より選択される、パラグラフ39の組成物。
60.
細胞骨格タンパク質が、SM22a、MMP-9、ACTA2、TAGLN、MYH11、SMTNからなる群より選択される、パラグラフ39の組成物。
【０２７３】
本明細書記載の技術のいくつかの態様は、以下の番号付きパラグラフに従って規定することができる。
1.
患者における胸部大動脈瘤を防止または処置するための方法であって、血管平滑筋細胞細胞骨格タンパク質の遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）の治療有効用量を該患者に投与する工程を含む方法。
2.
細胞骨格タンパク質がTAGLN遺伝子によってコードされるSM22aである、請求項1記載の方法。
3.
エピジェネティック制御標的が、血管平滑筋遺伝子座におけるその触媒活性またはクロマチンの高メチル化による遺伝子サイレンシングの原因となる多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）である、請求項1記載の方法。
4.
クロマチンまたは染色体タンパク質がH3である、請求項3記載の方法。
5.
高メチル化の原因となる酵素が、多タンパク質複合体（PRC2、ポリコーム抑制複合体2）、およびその触媒ドメイン、メチルトランスフェラーゼEZH2である、請求項3または請求項4記載の方法。
6.
化合物または薬物（または該化合物もしくは薬物の組合せ）がPRC2複合体のメチルトランスフェラーゼ触媒活性を阻害する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
7.
メチルトランスフェラーゼEZH2を阻害する化合物または薬物がGSK343である、請求項6記載の方法。
8.
化合物または薬物の組合せがGSK343およびロサルタンである、請求項6または請求項7記載の方法。
【実施例】
【０２７４】
実施例1:HDAC9複合体阻害は平滑筋依存的狭窄性血管疾患を改善する
ACTA2遺伝子またはMYH11遺伝子にヘテロ接合性ミスセンス変異を持つ患者が、胸部大動脈瘤（TAA）および早期発症性大動脈解離のリスクを呈することは公知である。しかし、それほど一般的ではないが、冠血管および脳血管の狭窄性疾患など、動脈閉塞を伴う表現型も観察される。本明細書において本発明者らは、狭窄性病変においてダウンレギュレーションを起こすことが知られている収縮関連遺伝子産物の転写サイレンシングには、HDAC9複合体が関与していることを示す。さらにまた、収縮タンパク質発現が維持されたHDAC9欠損マウスまたはMALAT1欠損マウスでは、新生内膜形成が阻害された。MALAT1アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはメチルトランスフェラーゼEZH2の阻害（HDAC9複合体によって動員される触媒的メディエーター）のどちらかによるHDAC9複合体の薬理学的ターゲティングは、新生内膜形成を低減した。結論として、本発明者らは狭窄性疾患へのHDAC9複合体の関与を報告し、エピジェネティック複合体を標的とする薬理学的治療が実験系における動脈閉塞を寛解させうることを実証する。
【０２７５】
多様な形態の血管疾患において、平滑筋細胞（SMC）は、SMC限定的収縮遺伝子のダウンレギュレーションに代表される細胞表現型を調節することが知られており、細胞外マトリックスの分泌、増殖および遊走に関与する遺伝子群をアップレギュレートする。この細胞の挙動は、アテローム性動脈硬化、肺高血圧、大動脈瘤および末梢動脈瘤、ならびに経皮動脈インターベンション後の再狭窄などといった重要なヒト疾患において認められている（1、2）。興味深いことに、胸部大動脈瘤（TAA）の表現型は、これらと同じSMC限定的収縮遺伝子をコードする遺伝子中のヒト変異と関連付けられている。例えば、アルファ-平滑筋アクチン（a-SMA）をコードする遺伝子であるACTA2中の変異は非症候性胸部大動脈瘤の主因である（3）。同様に、このアクチンアイソフォームの結合パートナーである平滑筋ミオシン重鎖（smMHC）をコードする遺伝子MYH/1中の変異は、TAAと動脈管開存症の合併症状を引き起こす（4）。SMC収縮の破壊はTAA病理発生の基礎を成す機序であると提案されている（5）。しかし、動脈瘤疾患への平滑筋収縮機能障害の広範にわたる関与に加えて、SMCは狭窄性/虚血性血管疾患にも広範に関連付けられている。事実、ACTA2変異を持つ個体は、冠動脈狭窄、肺動脈狭窄または頭蓋内動脈狭窄などの病態を示す（6、7）。MYH1/変異はモヤモヤ病様の血管病態を引き起こすことが同様に示されていることから、この遺伝子ファミリーはヒトの狭窄性障害および動脈瘤障害に結びつけられている（8）。血管疾患において観察されるSMC表現型調節の中心には、a-SMAおよびsmMHCなどの収縮要素の抑制と合成機能および増殖機能のアップレギュレーションとを協調させる転写パスウェイの複雑なネットワークがある（2、9）。
【０２７６】
最近、本発明者らは、ヒストンデアセチラーゼHDAC9、クロマチンリモデリングタンパク質brahma関連遺伝子（brahma-related gene）1（BRG1）、および長鎖ノンコーディングRNA（IncRNA）MALAT1からなる、TAAの病理発生において活性な、そのようなパスウェイの一つを記載した（10）。このHDAC9クロマチン修飾複合体は、TAA関連変異で修飾された遺伝子産物の存在下で、VSMC特異的遺伝子のプロモーターに動員される。数ある機能の中でも、HDAC9複合体はPRC2（ポリコーム抑制複合体2）を動員することで、その酵素サブユニットであるEZH2によるヒストン3のリジン27（H3K27）でのトリメチル化を触媒する。
【０２７７】
この研究において、本発明者らは、マウス頸動脈結紮モデルを使って、狭窄性血管疾患の調節におけるHDAC9複合体の役割を調べた。本発明者らは、結紮後の中膜および新生内膜のSMCにおけるHDAC9活性化の証拠を見出し、SMC収縮プロモーターへのHDAC9含有複合体の結合は収縮要素の転写ダウンレギュレーションと相関した。偏りのない（non-biased）クロマチン免疫沈降シーケンシングアッセイにより、cGMP、アンジオテンシン、アドレナリン作動性およびオキシトシンシグナリングパスウェイを含むHDAC9複合体の複数の標的が示される。これらのデータを利用して、本発明者らは、このパスウェイの阻害を治療モダリティーとして調べた。実験動物では、MALAT1発現またはHDAC9発現の阻害が新生内膜肥厚を停止させ、動脈の転写シグネチャを部分的に正常化した。MALAT1に対するGapmeRアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子阻害剤GSK343によるHDAC9複合体の薬理学的ターゲティングは、動脈狭窄の制御に有効であった。これらのデータにより、狭窄性動脈疾患の過程でHDAC9が媒介する転写サイレンシングにおける決定的役割が明らかになり、狭窄性動脈疾患の標的としてのこのパスウェイの妥当性が確認される。
【０２７８】
結果:
ACTA2のR179H変異体アレルに曝露された細胞におけるHDAC9標的の同定
以前に、本発明者らは、大動脈瘤を引き起こす遺伝子変異の影響下にある血管平滑筋細胞において活性化されるエピジェネティックリモデリング複合体（HDAC9-BRG1-MALATI）を同定した（10）。しかし、遺伝子によってトリガーされる大動脈疾患（GTAD）のうち、ACTA2またはMYI-1/’I遺伝子中の変異によって引き起こされるものなど、いくつかの形態は、狭窄性疾患も引き起こす（6、8）。特に、アルギニン179のコドンにおける反復ミスセンス変異は、血管動脈瘤と血管狭窄の両方を伴う重篤な形態の平滑筋ジストロフィーを引き起こす（図7a）（7）。これらの表現型分岐の説明となりうる遺伝子標的に関する洞察を得るために、本発明者らは、ACTA2R179’’アレルが形質導入されたVSMC内で、HDAC9、BRG1およびヒストンマーク・ヒストン3トリメチル化リジン27（H3K27me3）の全ゲノムクロマチン免疫沈降と、それに続く次世代シーケンシング解析（ChIP-Seq）を行った。ACTA2R179’’を発現する細胞において濃縮される遺伝子の解析を、ベースライン条件下で同定された遺伝子を差し引くことによって捜した。その結果、これら3つの個別相互作用のそれぞれによって1141の遺伝子が同定された（図7bおよび図7cならびにinsight.jci.org/articles/view/124706/sd/2のワールドワイドウェブで入手できるSupplemental Table 1）。コア遺伝子のインシリコ解析により、VSMC収縮機構を構成する遺伝子に加えて、cGMP-PKG1、レニンおよびアドレナリン作動性シグナリングを含むVSMC力発生の調節に関与するいくつかのパスウェイが関連付けられる（図7cおよび表1）。興味深いことに、ACTA2座そのものがH3K27me3の有意な濃縮ならびにHDAC9およびBRG1との会合を示した（図7b）。動脈瘤性疾患を誘導するが狭窄性疾患は誘導しないことが知られている他のアレル、例えばTGFBR2G357WはACTA2座を抑制することができないので、ACTA2座のこの制御は特異的であると思われる（図7）。本発明者らのChIP-seqデータに多重比較補正を適用すると、ACTA2がゲノムワイドに有意な唯一の遺伝子座であることがわかる（図7）。このサイレンシングがHDAC9複合体によって媒介されているかどうかを決定するために、本発明者らは、ACTA2プロモーターにおける標的ChIP-qPCRによってH3K27me3修飾をアッセイし、それらがMALATI依存的であることを発見した（図7d）。
【０２７９】
（表１）ACTA2R179H細胞においてHDAC9、BRG1およびH3k27me3によって濃縮される遺伝子座のKEGGパスウェイ解析
2021513993.tif 000037
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2021513993.tif 000040
【０２８０】
マウスの実験的新生内膜肥厚および動脈狭窄におけるHDAC9複合体
血管狭窄における遺伝子産物（例えばa-SMA）のエピジェネティックサイレンシングの役割に関する洞察を得るために、本発明者らはマウスの頸動脈結紮を行った。マウスにおける頸動脈の片側結紮は、動脈中膜における有意な転写変化を誘導し、広範な新生内膜の形成を刺激する（図8a）。肉眼的には、MMPなどのマトリックス分解酵素の分泌、平滑筋細胞の増殖および表現型変化ならびに炎症を含む反応性（reactionary）新生内膜変化が見られる。a-SMAおよびSm22aなどの収縮タンパク質は結紮動脈では強くダウンレギュレートされると共に、MMP9などのマトリックス分解酵素は発現の増加を示した（図8b）。以前に、本発明者らは、大動脈瘤の細胞モデルにおける収縮タンパク質のプロモーターへのHDAC9複合体のターゲティングを記載した。そこで本発明者らは、この複合体が頸動脈結紮モデル内での新生内膜形成中に観察されるサイレンシングを媒介しうるかどうかを調べた。まず本発明者らは、結紮動脈におけるこの複合体の構成要素HDAC9、BRG1およびMALATIの発現レベルを調べた。HDAC9 mRNAとMALATI mRNAはどちらも有意にアップレギュレートされ（図8c）、複合体の構成要素は結紮動脈では内膜の核内に共局在した（図8dおよび図8e）。
【０２８１】
HDAC9複合体の阻害は新生内膜肥厚を改善する
ACTA2プロモーターへのH3K27me3クロマチンマークの蓄積を防止するMALATI阻害の能力（図7d）は、ダウンレギュレーションが新生内膜肥厚形成に必要な表現型変化を助長しうることを示唆する。HDAC9複合体の阻害が新生内膜形成を阻害するかどうかを決定するために、本発明者らはMALATIまたはHDAC9が欠損しているマウスの頸動脈を結紮した。頸動脈結紮は、Malat1欠損動物（Malatln）（14）およびVSMC標的HDAC9欠損動物（Hdac9filfl:Tagln-cre）（10）で行った。新生内膜増殖の形成における重要な役割を裏付けて、Hdac9欠損マウスおよびMalat欠損マウスは、結紮の21日後に有意に低減した新生内膜肥厚および狭窄を示した（図9aおよび図9b）。さらに、新生内膜形成中に典型的にダウンレギュレートされるVSMCの収縮要素（SM22、a-SMAおよびカルポニンタンパク質）の免疫染色は、Malatl÷動物およびHdac9filfl:Tagln-cre動物からの結紮頸動脈では保存されたままだった（図9b）。同様に、結紮動脈のCD31染色によって評価したところ、MalatT÷およびHdac9f1117:Tagln-creでは、内皮の完全性が維持されていた（図9c）。標的マウスの頸動脈における転写制御不全の程度を決定するために、収縮mRNAおよび合成mRNAのパネルをアッセイした。収縮遺伝子産物の中でも、HDAC9複合体の遺伝子阻害はACTA2遺伝子に対して最も劇的な効果を有した（図9d）。狭窄性表現型の改善とACTA2発現の回復との両方と合致して、Malati÷マウスおよびHdac9’’’:Tagln-creマウスでは、マトリックスメタロプロテイナーゼ9（MMP9）タンパク質の発現が抑制される（図9cおよび図9d）。
【０２８２】
次に本発明者らは、新生内膜形成中に活性化されることが知られている増殖パスウェイおよびリモデリングパスウェイを検討した（15、16）。そこで本発明者らは、リン酸基特異的抗体染色により、血小板由来成長因子受容体（PDGFR）パスウェイおよび接着斑キナーゼ（FAK）パスウェイの活性化をアッセイした。観察された新生内膜発生の緩和と合致して、Malati÷マウスおよびHdac9M1:Tagln-creマウスの中膜および内膜では、PDGFRおよびFAKのリン酸化の劇的な低減が認められた（図10aおよび図10b）。
【０２８３】
HDAC9複合体の薬理学的阻害は狭窄性病態を改善する
Malatfl-マウスおよびHdacel:Tagln-creマウスにおける狭窄性血管表現型の改善により、この複合体の薬理学的ターゲティングは血管の性能を改善することが示唆された。以前の研究で本発明者らは、HDAC9複合体がPRC2を動員することで、収縮タンパク質プロモーターにおけるヒストンH3のサイレンシング修飾を可能にすることを実証した。PRC2の触媒ユニットであって、EZH2と呼ばれる酵素の阻害は、マウスにおける大動脈瘤の成長を阻害した（11）。そこで本発明者らは、HDAC9複合体の下流にある転写イベントを阻害するために、2つの別個の処置の使用を調査した。まず本発明者らは、PRC2をクロマチンに動員する複合体を解離させるために、IncRNA MALAT1を標的とするGapmeRを使用した。GapmeRは、標的転写産物分解のためにRNAse Hを動員する修飾された末端ヌクレオチドを持つ低分子アンチセンスDNAである。末梢に注射されたこのGapmeRを使って、本発明者らはまず動脈組織におけるMalat1の抑制をアッセイした（図11a）。第2段階では、本発明者らは、PRC2が媒介する転写抑制を防止するために、EZH2酵素の薬理学的阻害剤GSK343を使用した。
【０２８４】
頸動脈結紮前に開始して頸動脈結紮中も継続された、GapmeR-MalatlまたはGSK343のどちらか一方による動物の処置は、狭窄性応答の程度を劇的に改善した（図11bおよび図11c）。肉眼的表現型の改善と合致して、GapmeR-Malat1処置およびGSK343処置はどちらも、新生内膜肥厚において典型的にダウンレギュレートされるa-SMAおよびSM22aなどの収縮タンパク質の発現を改善した（図11b）。EZH2が動脈応答における一次的治療標的であるという概念を裏付けて、新生内膜の形成は、EZH2座がSMC特異的に不活化されたマウス（Ezh2’’1:Myh11-cre）でも阻害された（図8A〜8E）。本発明者らは、脈管構造への送達をアッセイするために、蛍光標識されたGapmerR（3’-FAM-GapmeR-Malatl）を使用した。3’-FAM陽性頸動脈VSMCと、GSK343で処置した動物からのVSMCは、野生型動物における頸動脈VSMCとは対照的に、□□-SMAのロバストな発現を示した（図11d）。同様に、GapmeR-Malatl処置およびGSK343処置は、新生内膜形成のマトリックスリモデリングに関与することが知られているMMPの活性を阻害した（図11e）。
【０２８５】
Malati÷マウスおよびHdac9filfl:Tagln-creマウスにおける知見と同様に、GapmeR-Malat1またはGSK343で処置されたマウスは、頸動脈の中膜でも内膜でも、PDGFRおよびFAKのリン酸化の劇的な低減を示した（図12aおよび図12b）。重要なことに、GapmeR-MalatlまたはGSK343で処置されたマウスからの頸動脈は、動脈の中膜および内膜におけるHdac9およびMmp9の蓄積の減少も示した（図12c）。
【０２８６】
考察:
平滑筋収縮機構のメンバーに変異を持つ個体には狭窄性病変および動脈瘤病変が認められている。この研究において、本発明者らは、ACTA2R179’’アレルを発現する細胞におけるHDAC9複合体の標的を同定するために、クロマチン免疫沈降を使用した。興味深いことに、MEF2A、MEF2CおよびMYOCDなどの血管平滑筋転写因子を含めて、複数の座がこの複合体と相互作用すると同定された（図7）。興味深いことに、主な標的の一つはACTA2遺伝子そのものであり、動脈瘤病変でも狭窄性病変でも低いa-SMAレベルが観察された以前の結果と合致した。MYOCDおよびACTA2のどちらか一方の欠損は血管損傷後の新生内膜狭窄を悪化させることが知られており（17、18）、新生内膜狭窄における病理発生段階としてのこれらの遺伝子産物の抑制的制御が暗示される。そこで、血管損傷におけるHDAC9複合体活性をさらに調査するために、本発明者らはマウス頸動脈結紮モデルを使用した。
【０２８７】
病理の進行におけるHDAC9複合体の役割と合致して、HDAC9発現またはMALATI発現に欠陥があるマウスは血管損傷後に新生内膜肥厚を発生しにくく、収縮タンパク質発現を維持した。そこで本発明者らはこの複合体の薬理学的ターゲティングを調査した。まず、頸動脈結紮前と頸動脈結紮の一週間後に、MALAT1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを野生型マウスに注射した。GapmeR MALATIで処置した動物は、MALATIノックアウトマウスと同様に、頸動脈結紮後の新生内膜発生に抵抗性であった。次に本発明者らは、マウスを頸動脈結紮中にEZH2阻害剤GSK343で処置した。EZH2は、ヒストン3のトリメチル化（H3K27me3）を触媒するためにHDAC9複合体によって動員されることが知られているPRC2の触媒ユニットである（19）。MALATIの阻害と事実上同様に、EZH2活性の遮断は血管の新生内膜形成および狭窄を効果的に阻害し、MMP生産および収縮タンパク質発現に対する有益な効果を伴った。これらのデータは、新生内膜発生に必要なエピジェネティック複合体を標的にすることの実効可能性を実証している。
【０２８８】
動脈狭窄はよく見られるヒトの状態であり、健康への影響は極めて大きい。動脈狭窄の大部分はアテローム性動脈硬化に関連するが、狭窄は経皮インターベンション後の再狭窄または大動脈閉塞または肺閉塞などの先天性狭窄との関連においても起こりうる。後者の場合、閉塞は、SMCの過剰な中膜または内膜の拡大によって引き起こされると考えられる。動脈SMCは、これらの疾患プロセス中に深刻な表現型変化を起こし、軟骨細胞、骨細胞およびマクロファージの特徴を獲得する能力を有する（20）。しかし最もよく見られる形態の一つは、増殖性表現型として知られる分化度の低下した細胞型である。この表現型は、細胞増殖、平滑筋細胞表現型の決定的マーカー（例えばcc-SMA）の喪失およびマトリックス分解酵素の活性化の増大を特徴とする（2、20）。ほとんどの動脈狭窄はアテローム性動脈硬化に関連して起こるが、メンデル型血管平滑筋機能障害のいくつかの希少な形態も、表現型として動脈狭窄を包含する。そのような状態の一つはACTA2中の変異が引き起こす血管疾患である。ACTA2中に（そしてそれより程度は低いがMYHI I中に）特定のミスセンス変異を持つ患者は、過剰な中膜肥厚が引き起こすと考えられる頭蓋内動脈狭窄および冠動脈狭窄を示す（6、21）。これらのデータは、これらの希少疾患に見られる特異的病態を特徴づけるのに役立ちうる。
【０２８９】
実験的中膜肥厚において起こる転写変化は詳しく記載されている。本研究において、本発明者らは、HDAC9-MALAT1-BRG1複合体が、平滑筋分化の制御因子をコードするMEF2A、MEF2CおよびMYOCDなどの重要な遺伝子を標的とすることを観察した（図7）。特に、平滑筋分化のマスター制御因子であるミオカルディンは、新生内膜狭窄における保護因子として関係づけられている（18）。VSMCのアイデンティティの維持を担うこの因子が欠損しているマウスは、動脈損傷に対する内膜反応の増悪を呈する。同様に、ACTA2が欠損しているマウスは、同じく狭窄および内膜反応の増悪を呈する（17）。したがってHDAC9複合体の阻害によってACTA2遺伝子のサイレンシングを防止することにより、新生内膜増殖に必要な表現型スイッチングが防止されうる。同様にSM22aをコードするTAGLNはMMP発現の転写制御およびこの遺伝子の発現の維持に関連し、Malatl÷マウスおよびHdac91147:Tagln-creマウスにおける表現型に認められるMMP発現の抑制の部分的説明になりうる。
【０２９０】
血管損傷後の新生内膜肥厚は、動脈閉塞を軽減するためのステント設置との関連において起こりうる。ステントの存在は中膜平滑筋細胞の増殖および拡大を誘導し、それが二次的狭窄を引き起こし、血流を再閉塞しうる。ラパマイシンなどの抗増殖剤を含浸させたステントは新生内膜増殖を防止する。残念なことに、この作用機序は、適正な内皮化も妨げて、出血リスクを増加させる抗血小板剤による処置を余儀なくする（22）。内皮化を妨げずに血管平滑筋細胞を妨害する能力を有する作用物質は、この状況を改善することができる。本明細書において提示するデータによれば、HDAC9複合体の作用を阻害する作用物質は、そのような狭窄性血管疾患の処置において比較優位性を有する。
【０２９１】
方法
頸動脈狭窄のマウスモデル
この研究において使用したマウスはすべて、米国公衆衛生局（USPHS）の規制を受けるパートナーの施設内動物実験委員会（IACUC）に厳密に従って取り扱われた。頸動脈結紮は10週齢のマウスで行った。簡単に述べると、腹腔内ケタミン/キシラジン（それぞれ80および12mg/kg）を使って動物を麻酔した後、頸動脈を露出させるために頸部に小切開を施した。次に、8-0絹縫合糸を使って、左頸動脈を分岐レベルにおいて結紮した。21日時点で、マウスを屠殺し、組織学的解析のために頸動脈を収集した。野生型マウスのおよそ98％が狭窄性病変を発生させた。結紮頸動脈の血栓症を発生させたマウスは研究から除外した（約1〜2％）。MalatlノックアウトマウスはDavid Spector博士（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）のご厚意により提供された。Hdac9 flox/flox/Talgn-creマウスは以前に報告したように生成させた（10）。Ezh2 fl/fl/（STOCK Ezh2tm2Sho/J）とMyh11-cre-GFP（B6.Cg-Tg（Myh11-cre,-EGFP）2Mik/J）とを交配して、平滑筋細胞Ezh2欠損マウスを生成させた。上記のマウスおよび野生型マウス（C57BL/6J）はいずれもJackson laboratoryから購入した。組織解析のために、吸入イソフルラン（Sigma、ミズーリ州セントルイス）によって動物を安楽死させてから、組織を収集した。頸動脈結紮（左頸動脈）術はすべて10週齢で行った。実験はすべて雄と雌の比を1:1にして行った。
【０２９２】
組織学
左頸動脈および右頸動脈をOCT標準プロトコールおよび薄切法を使って凍結切片化した。右頸動脈は結紮せず、内部対照とした。新生内膜解析は、最適切断温度（Optimal Cutting Temperature）（OCT）コンパウンドに包埋されたヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色水平断切片から行った。簡単に述べると、結紮縫合糸部位から遠位0.2mmの頸動脈を捨てた後、20のスライドを生成させた（10pM）。スライド1、5、10および15を新生内膜の定量化のためにH＆E染色した。新生内膜の定量化のために、米国国立衛生研究所（NIH）のImage Jソフトウェアを使って4つの4分の1区（4 quadrants）から内弾性板周長および外弾性板周長ならびに中膜厚を測定し、平均した。スライド2〜4、6〜9および11〜14は免疫蛍光染色に使用した。すべての抗体を表2に列挙する。
【０２９３】
（表２）抗体、カタログ番号、試料および応用の一覧表
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【０２９４】
RNAの単離およびRT-qPCR解析
切離した頸動脈を700pLのTrizolが入っている1.5mLチューブに収集し、RNeasyキット（Qiagen）を製造者のプロトコールに従って使用することで、全RNAを調製した。逆転写によってcDNAを調製し、SYBR greenシステム（Applied Biosystems）でのqPCRによって遺伝子発現を解析した。発現結果を＆OCT法によって解析し、GAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする）をハウスキーピング遺伝子として使用した。すべての対照頸動脈の平均をベースラインとして、FCを算出した。すべてのプライマーを表3に列挙する。
【０２９５】
（表３）プライマーの一覧表。表3は、SEQ NO:19〜42としての「F＿プライマー」配列およびSEQ ID NO:43〜63、63および64〜65としての「R＿プライマー」をそれぞれ、出現順に開示している。
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【０２９６】
インビボMMP活性
MMP2活性およびMMP9活性に関する近赤外蛍光センサーであるMMPSense 750 FAST（米国PerkinElmer）600uLを、マウスに尾静脈注射した。注射の24時間後にマウスを屠殺し、大動脈を切離し、巨視的蛍光反射分子イメージング（macroscopic fluorescence reflectance molecular imaging）のためにKodakイメージステーション4000MM Proを使って解析した。
【０２９７】
シーケンシャルFISHおよび免疫蛍光顕微鏡法
マウスMalat1を認識するStellaris（登録商標）FISHプローブであってQuasar（登録商標）570標識オリゴ（Biosearch Technologies,Inc.、カリフォルニア州ペタルーマ）で標識されたもの（SMF-3008-1:Quasar（登録商標）570色素を持つStellaris（登録商標）FISHプローブ、マウスMalat1）を、www.biosearchtech.com/stellarisprotocolsでオンライン入手できる製造者の説明書に従って、組織試料にハイブリダイズさせた後、一次抗体および二次抗体と共にインキュベートした。イメージングと解析はVolocity 5.2ソフトウェアを使って行った。三次元定量蛍光共局在解析は既述のように行った（10）。二次元白色光イメージはImageJソフトウェアを使って解析した。
【０２９８】
ChIP-seqおよびChIP-qPCR
ヒト野生型平滑筋細胞またはヒト動脈瘤（ACTA2R179’’またはTGFR2G357w）（10）平滑筋細胞（1000万個）を、1％のホルムアルデヒドを使って37Cで20分間固定し、125mMグリシンで5分間（RT）クエンチし、EpiTect ChIPキットを製造者の説明書（米国Qiagen）に従って使用することでタンパク質溶解物を調製した。次に、全タンパク質溶解物を超音波処理することでクロマチンを平均長500〜1,000bpに剪断した後、最大速度で10分間遠心分離した。上清を、HDAC9（ab59718）、BGR1（ab110641）、H3K27me3（Abcam、ab4729）に対するモノクローナル抗体またはIgGアイソタイプ対照（ab171870）6pgと、1×プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche Diagnostics）を補足した溶解緩衝液1mlとが入っている2mLチューブに収集した後、4℃で一晩（14時間）インキュベートした。EpiTect ChIPキットを製造者の説明書（Qiagen）に従って使用することにより、免疫沈降物を解析した。次に、ChIPしたDNA（ChIP-ed DNA）を定量し、DNA末端修復（3’-dA）とそれに続くPCR増幅およびサイズ選択（アダプター配列を含めて通常100〜400bp）に使用した。条件を満たすライブラリーをHi seqシーケンシング（Illumina HiSeq 50 SEシーケンシング）に使用した。次に、bowtie2アライナー（23）を使って、fastqファイルをヒトゲノム（hg19、ENSEMBLバージョン75）にアラインメントし、50個までのアラインメントを報告させた。多重マッピングされた（multimapped）リード、重複した（duplicated）リードまたは3つ以上のミスマッチを含有するものは、samtools v1.3.1（24）を使ってフィルターアウトした。bamファイル形式のフィルタリングされたアラインメントファイルを、Integrative Genome Viewer（25）で、それらを視覚化できるようにインデキシングした。動脈瘤（ACTA2R179’’またはTGFR2G357w）平滑筋細胞とそれぞれの対応する対照試料との間で、0.05のp値しきいで、macs2 v.コーラーを使ってピークコーリングを行った。macs2からのアノテーションはR中のChipSeekerパッケージ（26）を使って行った。簡単に述べると、帰属する染色体が決まらないスキャフォールド（unplaced scaffold）にマッピングされるリードを解析から除いた。UCSCのhg19 knownGeneデータベースでピークをアノテーションする前に、ゲノム座標をまずENSEMBLからUCSCに変換し、遺伝子位置の5キロベースに規定された転写開始部位領域を持つすべてのピークをアノテーションする。パスウェイ解析は、DAVID（27）を使って、ACTA2R179’’細胞またはTGFR2G357w細胞と野生型細胞との比較の両群で見られたp値＜10-4の差次的に発現するピークを含有するすべての遺伝子で行った。ChIP-qPCRのために、T-75フラスコ中で60％コンフルエントのヒト野生型平滑筋細胞または動脈瘤（ACTA2R17911）平滑筋細胞に、MALATIを標的とするsiRNA（30pM）またはsiRNA陰性対照（30pM）を、OPTIMUM培地中で48時間トランスフェクトした後、完全成長培地で24時間培養した。次に、1％のホルムアルデヒドを使って細胞を37℃で10分間固定し、125mMグリシンを使ってRTで5分間クエンチした後、EpiTect ChIPキットを製造者の説明書（米国Qiagen）に従って使用することにより、全タンパク質溶解物を調製した。次に、剪断されたDNAを、H3K27me3に対するモノクローナル抗体（Abcam、ab4729）またはIgGアイソタイプ対照（ab171870）6pgと共にインキュベートした。qPCRを使って、インプットおよび免疫沈降物のシグナルを解析した。免疫沈降物シグナルのパーセン���ージをインプットシグナルに対して算出した。実験は独立した試料で三重に行った。すべてのプライマーおよび抗体を表2および表3に列挙する。関連データはすべて著者から入手できる。ChiP-seq実験からのゲノムデータはGEOにアクセス番号GSE120394として登録された。
【０２９９】
インビボでのGSK343処置およびMalat1アンチセンスLNA処置
10週齢の野生型マウスのコホートを、左頸動脈結紮の24時間前および処置後3週間にわたって、飲料水に入れたGSK343の経口投与で処置した。GSK343阻害剤（25mg）を1mLのDMSOに溶解することで、46mMの原液を得た。次に、250mlの飲料水に250plのGSK343原液を補足した。対照群には等体積の滅菌水を与えた。GSK343を含有するボトルは、3日ごとに、薬物を添加した新鮮な水と交換した。MalatlアンチセンスLNA処置の場合は、10週齢野生型マウスのコホートに、左頸動脈結紮の24時間前に食塩水中の15nmolを注射し、結紮の7日後に2回目の注射を行った。
【０３００】
（表４）MALAT1に対するGapmeRアンチセンスオリゴヌクレオチド
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【０３０１】
統計
結果を平均±SDとして記載する。対照群と処置群の間の相違の統計的有意性を決定するためにスチューデントのt検定（両側）を適用した（＊P＜0.05、＊＊P＜0.01および＊＊＊P＜0.001）。すべての実験について、少なくとも3つの実験レプリケートを行った。散布図は平均±SDを示す。一元配置分散分析（ANOVA）を使って、複数のマウス遺伝子型が関わる組織学データを解析した（95％信頼区間をプロットした）。P値は一元配置ANOVAとそれに続くチューキーの事後HSD（honestly significant difference）検定を表す。グラフはすべてGraphPad Prism 7.0を使って作成した。
【０３０２】
参考文献:
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【０３０３】
実施例2:メチルトランスフェラーゼEZH2の阻害は実験的胸部大動脈瘤（TAA）における大動脈の性能を改善する
胸部大動脈瘤（TAA）では収縮タンパク質をコードする遺伝子中に機能喪失型変異が観察されている。TAAの病理発生における収縮タンパク質欠損の寄与に関する洞察を得るために、本発明者らはヒト動脈瘤試料を調べた。本発明者らは、TAA試料において欠損している複数の収縮遺伝子産物を見出し、特にSM22aの発現は動脈瘤サイズと逆相関していた。SM22a欠損マウスは妊娠誘発性大動脈解離を示し、SM22a欠損症はFbn/cl°39G/＋（マルファン）マウスにおける大動脈瘤を悪化させたことから、この遺伝子産物のTAAエフェクターとしての妥当性が確認された。本発明者らは、メチルトランスフェラーゼEZH2の活性の増加によって、SM22aの抑制が強いられることを見出した。SMAD3などのTGF-βエフェクターは、TAA試料では、SM22aをコードするクロマチン（TAGLN）への結合から排除されたが、EZH2阻害剤GSK343による処置は細胞骨格アーキテクチャを改善し、SM22a発現を回復させた。最後に、EZH2の阻害は収縮タンパク質発現（SM22aを含む）の回復と関連してFbn1c1°39G/＋マウスにおける大動脈の性能を改善した。総合するとこれらのデータは、TAAにおける収縮タンパク質欠損の本発明者らの理解を特徴づけ、大動脈疾患における治療標的としてのクロマチン修飾因子の探究を支持する。
【０３０４】
収縮タンパク質は血管平滑筋細胞（VSMC）細胞骨格の不可欠な構成要素であり、健康と疾患のどちらにおいても、動的および静的な制御機能を果たす。収縮タンパク質発現の喪失は、動脈瘤（1〜3）、アテローム性動脈硬化（4〜6）および血管狭窄（7、8）を含むさまざまな形態の血管疾患で観察されている。VSMC収縮機構に関与する複数の遺伝子が家族型の胸部大動脈瘤（TAA）に関係づけられていることから、このような知見は相関以上のものでありうる。例えば、平滑筋アクチン-ミオシン機構の相補的構成要素であるアルファ-平滑筋アクチン（□-SMA）および平滑筋ミオシン重鎖（smMHC）をコードする遺伝子ACTA2およびMYH11中の病原性変異は、どちらもヒトにおいてTAAを引き起こすことが示されている（9、10）。さらに、この相互作用の制御因子は、ミオシン軽鎖キナーゼをコードするMYLK中の機能喪失型変異や、ミオシン軽鎖ホスファターゼの負の制御因子であるPRKG1中の反復性機能獲得型変異など、TAAに関係づけられている（11、12）。これらの遺伝子データは血管平滑筋細胞収縮に関与する遺伝子産物をTAAの病理発生に直接関係づけるものである。マトリックス非依存的遺伝子産物の第2のグループにおける破壊がTAAに関係づけられている。とりわけTGFBR1、TGFBR2、TGFB2、TGFB3およびSMAD3を含むTGF-βシグナリングカスケードのさまざまなメンバーをコードする遺伝子中の機能喪失型変異を伴う症候性表現（syndromic presentation）（すなわちロイス・ディーツ（Loeys-Dietz）症候群、動脈瘤-変形性関節症症候群、またはマルファン症候群）が記載されている（13〜17）。これらの遺伝子はTGF-βリガンド（TGFB2/3）、TGF-β受容体（TGFR1/2）およびカノニカルTGF-βシグナリングの下流メディエーター（SMAD3など）をコードする。TAAの症候性表現および非症候性表現（nonsyndromic presentation）はどちらも、大動脈の類似する解剖学的部分に影響を及ぼし、組織アーキテクチャの類似する破壊を示すことから、共通の病理発生が示唆される（18）。
【０３０５】
a-SMA、SM22aおよびスムーセリンなどの収縮タンパク質要素の発現は、外から適用されたTGF-βによって実験的に誘導されうることから（19〜22）、カノニカルTGF-βシグナリングカスケードにおける機能喪失型の遺伝的変異が収縮要素の欠損に直接つながりうるというモデルがもたらされる。しかし、Smadタンパク質のリン酸化（p-Smad2/3）のレベルの増加によって評価されるTGF-βシグナリングのレベルの増加は、遺伝的に誘発された大動脈試料でも、散発性大動脈試料でも、日常的に観察されている（18、23）。TGF-13シグナリングが増加しているにもかかわらず、TAAからの大動脈標本では収縮タンパク質要素がしばしば欠乏しており、非炎症性実験的TAAではTGF-βシグナリングの拮抗作用は治療上有効であることが示されている（24）。これらの知見は、健康な状態でVSMCにおいて稼働している転写回路とTAAにおけるそれとの間の矛盾を示唆している。
【０３０６】
この研究において本発明者らは、ヒト動脈瘤試料を解析することで、TAAにおける収縮機構のタンパク質を調べた。ヒトおよびマウスのTAA試料では複数の遺伝子産物が欠乏しており、特にタンパク質SM22aの発現が欠乏している。本発明者らはまず、SM22aの喪失がインビボでの動脈瘤の進行および大動脈解離の直接的エフェクターであることを示した。SM22a転写制御を調べたところ、ヒストン3リジン27トリメチル化（H3K27me3）修飾に関連して、ヒト動脈瘤組織では、TAGLN（SM22aをコードする）遺伝子の座にあるSMAD転写因子結合部位（TFBS）含有コンセンサス配列の高メチル化が明らかになった。低分子阻害剤GSK343でメチルトランスフェラーゼEZH2（H3K27me3修飾を触媒する）をターゲティングすると、収縮タンパク質発現の回復を伴って、Fbn1cl°39w＋マウスにおける大動脈の性能が改善された。GSK343阻害剤の治療的利益はロサルタンに匹敵したが、これらの化合物は異なる分子機序を呈した。これらのデータは、大動脈ホメオスタシスにおける血管平滑筋細胞収縮タンパク質の決定的な役割に光を当て、胸部大動脈疾患における新規エピジェネティック修飾を記載し、胸部大動脈瘤のための治療選択肢を拡大する。
【０３０７】
結果:
収縮タンパク質発現はTAA病態と関連する
収縮タンパク質のダウンレギュレーションはさまざまな形態の血管疾患において観察されている。この減少がTAAにおける疾患の進行とどのように関係しうるかを研究するために、本発明者らは、外科手術時に採取された大動脈組織におけるVSMC表現型状態の既述のマーカー（25）の転写産物発現を評価した。VSMCの「合成状態」を示すいくつかの遺伝子が対照大動脈と比較してアップレギュレートされていた。逆に、収縮タンパク質をコードする転写産物は、TAA修復術からの組織および大動脈解離を起こした患者からの組織では、有意に欠乏していた（図1Aおよびワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5922285/bin/jciinsight-3-97493-s002.xlsxで入手可能なSupplemental Table 1）。特に、SM22aをコードするTAGLN遺伝子は大動脈解離患者ではダウンレギュレートされると報告されているので（倍率変化＝0.12）（26、27）、本発明者らはこの因子をさらに調べることにした。心臓外科手術時にTAA患者から収集した動脈瘤試料におけるSM22aタンパク質の発現は、症候性および/または非症候性大動脈疾患の患者からは、有意な抑制を示す（図1B）。ヒトTAA試料を免疫組織化学で調べると、収縮タンパク質の減少が大動脈中膜に局在することが、同様に示される（図1C）。よりコントロールされた系でSM22a制御を調べるために、本発明者らは、マルファン症候群のFbn1cl°39G1＋マウスモデルにおける発現を調べ、mRNAレベルでもタンパク質レベルでも同様の抑制を見出した（図1Dおよび図1E）。興味深いことに、SM22aの発現は、動脈瘤サイズと密接に逆相関することがわかった（図1F）。これらの知見から、本発明者らは、SM22aの欠乏がVSMCの挙動に及ぼす効果を調べることにした。siRNAが媒介するサイレンシングでSM22a発現をターゲティングすると、細胞骨格の不安定化および空胞形成が誘発された（図1Gおよび図1H）。これら2つの表現型はヒト患者からのTAA組織の古典的電子顕微鏡検査で直接視覚化されるものである（28）。さらにまた、SM22a siRNAで処理されたVSMCでは大動脈瘤と関連することが知られているマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）活性が活性化され（図11）、SM22aをMMP発現の負の制御因子であるとする以前の報告（29）と合致した。
【０３０８】
SM22aは大動脈ホメオスタシスにとって必要である
これらのデータはSM22a発現の喪失がTAAにおける動脈瘤進行の一因になりうることを示唆している。この概念を検討するために、本発明者らはSM22a欠損マウス（TagleまたはSm22）をFbn/cl°39Gl＋マウスと交配することで、SM22a欠損Fbnicl°39G1＋動物を生成させ、大動脈瘤の進行を調べた。大動脈ホメオスタシスの重要な決定因子としてのSM22aの役割と合致して、Fbnicl°3961＋:Sm224-マウスは、同齢のFbn/cl°39G/＋:Sm22＋/＋マウスと比べて、より大きな大動脈およびより迅速な大動脈成長を呈した（図2Aおよび図2B）。Sm22大動脈の組織化学的検査により、野生型マウスと比較して、外膜におけるコラーゲン沈着のレベルが増加していることが明らかになった（図2C）。Fbnicl°39°/＋:Sm22-/-マウスではコラーゲン沈着がさらに目立ち、大動脈壁アーキテクチャは同齢のFbnici°39G/＋:Sm22＋/＋マウスよりも破壊されていた（図2C）。これらの変化には、Fbnicl°39G1＋:Sm2241＋マウスと比較した場合に、Fbnicl°39Gif:Sm22-/-マウスにおけるMMP活性の増加が付随した（図2D）。
【０３０９】
Sm22-/-からの大動脈の検査では、Sm22＋/＋マウスとの比較で、軽度の、有意でない大動脈肥大しか示されなかった（図2B）。しかし繁殖中に本発明者らはSm22雌親に早逝を認めた。妊娠マウスの剖検により、大動脈破裂を原因とする血胸の証拠が示されたことから、妊娠誘発性大動脈疾患へのSm22大動脈の感受性が示唆された（図2E）。致死は、ヒトにおける妊娠誘発性大動脈解離と同様に、主として妊娠末期に起こった（図2F）。剖検により、大動脈中膜全体にわたるコラーゲン沈着の増加が示された（図2G）。
【０３１０】
EZH2活性の阻害は細胞モデルにおけるSM22a発現を改善する。
これらのデータは、SM22a欠損がTAA病理発生の決定的メディエーターに相当するという概念を裏付けている。SM22a（TAGLN遺伝子）の転写制御を調べるために、本発明者らは、クロマチンの状態をヒト大動脈瘤試料から直接調べることにした。クロマチン免疫沈降（ChIP-qPCR）アッセイを使用することにより、本発明者らは、SM22aの喪失が、TAGLN遺伝子のプロモーターおよび遺伝子内部における、PRC2複合体の触媒サブユニットであるメチルトランスフェラーゼEZH2の活性の増加によって引き起こされることを実証する。本発明者らは、イントロン1の2つの領域（ln1.3およびIn1.6）にも、EZH2の触媒生成物であるH3K27me3のロバストな濃縮を見出した（図3A）。そこで本発明者らは、これら2つの領域の一次配列を、可能性のある転写因子結合部位について、Genomatixを使って解析した（図3B）。本発明者らは、バイオインフォマティクスプロファイリングにより、SMAD3、ミオカルディン、KLF因子およびMEF2の推定結合部位を同定した。TAAとTGF-13シグナリングとの関連は周知であるから、本発明者らは、SM22a発現に関してSMAD3活性を調べることにした。VSMCにおけるSMAD3のサイレンシングにより、基礎SM22a発現とTGF-βによって誘導されるSM22a発現はどちらも、部分的に、SMAD3発現によって媒介されることが明らかになった（図3C）。そこで本発明者らは、外から加えたTGF-βの存在下で、In1.3イントロン領域およびIn1.6イントロン領域へのSMAD3結合を調べた。興味深いことに、SMAD3結合は、対照VSMC培養物には検出されたが、TAA試料から培養されたVSMCからは検出されなかった（図3D）。SMAD3がこれらのプロモーター領域にアクセスできないことは、TGF-13がTAGLN転写産物発現を誘導できないことと相関する（図3E）。TAA大動脈における免疫蛍光染色はH3K27me3マークのレベルの増加を示した（図3F）。そこで本発明者らは、EZH2の強力な阻害剤であるGSK343の、SMAD3が媒介するSM22a転写制御に影響を及ぼす能力を調べた。実際、GSK343阻害剤で処理された単離TAA VSMCは、組換えTGF-f31による刺激後にSM22a発現を誘導する能力を回復した（図3G）。
【０３１１】
マウス大動脈での免疫染色は、野生型マウスとの対比でFbnici°39G/’マウスにおけるH3K27me3のレベルの増加およびEzh2とH3K27me3との共局在の増加を示した（図3Hおよび図1A）。Ezh2が大動脈ホメオスタシスに関係するSM22aなどの遺伝子をサイレンシングしているかどうかを決定するために、本発明者らは、Fbnici°39Gi＋マウスと交配されたEzh2欠失能を持つマウス系統から単離されるVSMCを研究した。驚くべきことに、TGF-βはFbn1ci°39Gif細胞ではSM22a発現を誘導する能力を失っていたのに、Ezh2を欠失させたFbn/cl°39G/＋マウスからの細胞ではその能力が回復した（図3Iおよび図3J、ならびにワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5922285/bin/jciinsight-3-97493-s001.pdfで入手可能なSupplemental Figure 1B）。この所見と合致して、VSMCにおけるEzh2の過剰発現はSM22a発現を抑制した（ワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5922285/bin/jciinsight-3-97493-s001.pdfで入手可能なSupplemental Figure 1Cおよび1D）。Ezh2の阻害は、SM22a発現の回復に加えて、TGF-βが誘導するストレスファイバー形成を強化した（図3Kおよびワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5922285/bin/jciinsight-3-97493-s001.pdfで入手可能なSupplemental Figure 1E）。
【０３１２】
PRC2活性の阻害は実験的TAAの進行を寛解させる
TAA組織では、smadタンパク質のリン酸化およびリガンド発現の増加によってアッセイされるTGF-β活性の増加が、繰り返し報告されている10。本発明者らは、健康時にTGF-β活性によって誘導されうる大動脈ホメオスタシスにとって重要な収縮遺伝子（例えばTAGLN）は、Fbn1Ci°39G/＋マウスの大動脈ではエピジェネティック修飾によって抑制されると判断した。TGF-βが媒介するSM22a発現を細胞培養において回復させる能力をGSK343が持つことから、本発明者らは、EZH2阻害を、治療戦略として、実験的動脈瘤において調べることにした。この概念に取り組むために、本発明者らは、Fbnicl°39w＋マウスを2ヶ月齢から6ヶ月齢までアンジオテンシンII1型受容体遮断薬ロサルタンまたはGSK343で処置した。GSK343化合物の活性はH3K27me3の組織レベルを調べることによって確認された（ワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5922285/bin/jciinsight-3-97493-s001.pdfで入手可能なSupplemental Figure 2）。ロサルタンとGSK343はどちらもFbn1c1°39Gi＋マウスにおける大動脈の寸法を改善する能力を示した（図4A）。VSMC表現型マーカーを調べたところ、作用物質ごとに異なる作用機序が示された。Col1a1、Col3a1、Gja1、Mmp2（合成マーカー）を含む周知の病理マーカーを減少させ（図4B）、全体としてエラスチンの完全性を改善する（図4C）能力は、ロサルタン処置の方が優れていた。収縮要素の回復についてはGSK343阻害剤の方が優れていたが、エラスチンファイバーの完全性については有意な改善が見られなかった。これはおそらくGSK343阻害剤には合成マーカーを抑制する能力がないからであろう（図4Bおよび図4C）。ロサルタンまたはGSK343はどちらも大動脈アーキテクチャおよび線維状アクチン含量の改善を示した（図4C）。組織学的染色は、対照マウスまたはロサルタン処置Fbn/c/°3°G/4マウスのどちらかと比較した場合に、GSK343処置動物からのFbn1cl°39G/＋大動脈におけるH3K27me3染色の有意な抑制を示した。興味深いことに、大動脈瘤形成の効果的な制御にもかかわらず、GSK343化合物は、Smad2タンパク質またはErk1タンパク質のリン酸化によって評価されるTGF-13活性を抑制しなかった（図4C）。大動脈の免疫染色は、対照Fbnicl°39G/1-マウスと比較した場合に、どちらの処置でもSM22aタンパク質発現の回復を示した（図4C）。
【０３１３】
実施例3:EZH2はポリコーム抑制複合体2（PRC2）の触媒サブユニットであって、ヒストンサブユニット3のリジン27のメチル化（H3K27me3）を媒介し、それゆえに特異的遺伝子座をサイレンシングする
EZH2はポリコーム抑制複合体2（PRC2）の触媒サブユニットであって、ヒストンサブユニット3のリジン27のメチル化（H3K27me3）を媒介し、それゆえに特異的遺伝子座をサイレンシングする。EZH2は、発生中に、細胞運命に関連する遺伝子を抑制するために動員される（33、34）。例えばがん幹細胞の場合など、いくつかのシナリオでは、EZH2は、系譜決定（lineage specification）に関連する遺伝子へとターゲティングされ、それゆえに分化を抑制するように作用する（35）。しかしこの一般論には例外があり、いくつかの細胞タイプでは、細胞系譜の維持にEZH2が必要とされる（36）。本発明者らは主として収縮タンパク質制御を研究したが、この機序はVSMCのアイデンティティの維持に必要な転写因子も標的としうる。本発明者らの系では、観察されたクロマチン変化が、プロモーター配列に結合するSMAD3などの転写メディエーターの能力の欠如と相関した。SMADタンパク質のリン酸化によってアッセイされるTGF-βシグナリングの増加は、ヒトTAA組織とマウスTAA組織とで重複する知見であり、TGF-βシグナリングの抑制は、Fbnicl°39G1＋マウスモデルでの実験的動脈瘤において治療的応答を示した（24、37）。しかし、抗TGF-β中和抗体によるTGF-βシグナリングの同様の抑制は、アンジオテンシン2注入マウスにおける大動脈疾患を悪化させた（38）。さらにまた、TGFB2およびSMAD3などのカノニカルTGF-F3メディエーターにおける機能喪失型変異は症候性大動脈疾患の基礎を成しているが、これらの変異を持つ患者からの大動脈組織は、一貫して、TGF-βシグナリングのアップレギュレーションを示す（14、16、17）。大動脈瘤の病因および進行におけるTGF-βの役割のこれらの見かけ上の矛盾は、論争の的になりつづけている（39）。この研究において記述するようなエピジェネティックサイレンシングが引き起こす差次的転写応答性は、これらの逆説的知見の、全部ではないが一部を説明するのに役立ちうる。これらのデータは、TAA試料において日常的に観察されるTGF-β活性が増加している状況下で本来であれば大動脈ホメオスタシスを改善するであろう決定的遺伝子における正常な転写応答性を、TAAにおけるエピジェネティック修飾が妨げるというパラダイムを提供する。不十分なカノニカルTGF-βシグナリングは、VMSCのエピジェネティックリモデリングを誘導すると共に、TGF-βシグナリングの代償的アップレギュレーションのお膳立てもしうる。TGF-βシグナリングの下流にあるいくつかの効果は、線維形成カスケード（動脈の硬化を媒介する）やMMPアップレギュレーション（細胞外マトリックス破壊を媒介する）を含めて、大動脈ホメオスタシスにとって有害であり、そのような産物の拮抗作用は性能を改善しうる。これがTGF-β拮抗作用の論理的根拠である。しかし、このカノニカルシグナリングカスケードのメンバーを遺伝子的に阻害するモデル（例えばTgfbr2欠損マウスにおける実験）（40〜42）や、TGF-βメディエーター中の機能喪失型変異によって媒介されるヒトの状態（13、14、16、17）において実証されたように、VSMCはTGF-βシグナリングの内因性阻害に影響をうけやすい。それゆえに、TAAにおけるVSMCでの内因性TGF-βシグナリング活性の回復も有益でありうる。単純に有害か無害かというTGF-βシグナリングの簡単なモデルでは、VSMC生物学における代償的シグナリ��グイベントの複雑さを取り入れることができない。収縮座のエピジェネティックサイレンシングは、大動脈瘤における収縮タンパク質発現（とりわけ、SM22a、a-SMA、smMHC）の改善においては有効でないというTGF-13シグナリングの性質の説明になりうる。このタイプの機序は、下行大動脈VSMCと比較すると、メンデル型の関連（Mendelian association）がない場合でさえユニークな臨床プロファイルを有する上行大動脈瘤の方が関連が深い（43）-モデル系での内因性VSMC TGF-13阻害に対する感受性の差異において認められている機序的相関（42）。
【０３１４】
EZH2阻害が適正な大動脈ホメオスタシスに必要なタンパク質であるSM22aのより効率的な発現を可能にするという知見（図2A〜2G）により、この作用物質を大動脈瘤を処置するための治療剤として使用できる可能性が示唆された。この目的のために、本発明者らはFbn1cl°39Gi＋マウスにおける実験的大動脈瘤を処置し、ロサルタンによる治療と匹敵する治療的応答を見出した。これらの効果は、異なる分子機序によって働くと思われる。smad2リン酸化の抑制によって評価されるTGF-βシグナリングは、ロサルタン処置大動脈組織では低減されたが、GSK343処置動物では低減されなかった。逆に、GSK343は大動脈中膜のH3K27me3修飾を有意に減少させたが、ロサルタンはそうではなかった。これらの知見から、本発明者らは、付加的利益を与える複合治療を調べることにした（図5A〜5C）。慢性疾患に対して複合治療を使用することの臨床的利益は、他の心血管疾患、例えば心不全、高脂質血症および糖尿病などでは明白であり、それはTAAにも当てはまりうる。この見込みにも関わらず、EZH2阻害剤は、動脈瘤などの慢性状態に対するそれらの使用が想定される場合はとりわけ、大きなオフターゲット生物効果を有すると予想されるだろう。そのため、病原性エピジェネティックイベントを利用しようとする治療戦略は、より高い標的特異性を持つ作用物質またはより正確な組織ターゲティング性を持つ作用物質を必要とするだろう。
【０３１５】
一般に、TAAに対する内科的治療は、さまざまな降圧剤クラスに限られており、ARBまたはACE阻害剤など、抗TGF-β活性を持つものもある。クロマチン修飾剤の治療効果を実証するこの概念実証実験により、TAAの将来の内科的処置において意外な薬物クラスが役割を果たしうることが示唆される。
【０３１６】
方法
大動脈試料
大動脈試料は、Massachusetts General Hospital（MGH）において心臓外科手術を受ける患者から収集した。組織を収集したら、中膜層を切離し、RNA発現およびタンパク質発現の解析のために-80Cで保存した。対照大動脈組織は同所性心臓移植を受ける患者から得た。IRB許諾は、廃棄される組織からの人口統計学的情報を収集または保存することを許可していない。
【０３１７】
初代大動脈平滑筋細胞株
健常ドナーからの初代ヒト大動脈平滑筋細胞（HAoSMC）は米国カリフォルニア州のCell Applications Inc.から購入した（カタログ番号354K-05a）。初代動脈瘤大動脈SMCは、外科手術時に新鮮TAA組織から、動脈中膜の標準的外植によって単離された。マウス大動脈SMCは、野生型マウスまたはFbnlci°39G1＋マウスから大動脈の上行セクションの標準的外植によって単離された。平滑筋細胞のアイデンティティは、SM22a、カルポニン、スムーセリンおよびビンキュリンを含む収縮マーカーの免疫蛍光染色によって評価した。細胞のアイデンティティを保つために、実験はすべて第1継代〜第5継代時点で実行した（Timraz et al.,2016）。ヒトSMCおよびマウスSMCはCell Applications Inc.の平滑筋細胞成長培地（カタログ番号311-500）で成長させた。
【０３１８】
RNA抽出およびリアルタイムqPCR解析
RNeasyキット（Qiagen）を使用し、製造者のプロトコールに従って、組織または初代細胞から全RNAを調製した。逆転写によってcDNAを調製し、SYBR greenシステム（Applied Biosystem、カリフォルニア州フォスターシティ）でのqRT-PCRによってSMC収縮遺伝子の発現を解析した。野生型マウスまたはFbn1cl°39G1＋マウスからの血漿50pLを使って、上述のように全RNAを調製した。発現結果をddCT法によって解析し、GAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする）をハウスキーピング遺伝子として使用した。全対照試料の平均をベースラインとして利用することによって倍率変化を算出した。滅菌PBS 2mL中の血漿100pLを使用し、次に100,000Gで2時間超遠心分離することによって、マウスTagin（SM22a）転写産物の血漿中レベルを測定した。上清を除去し、小胞画分を750pLのTRizol試薬に再懸濁し、次にRNeasyキット（Qiagen）を製造者のプロトコールに従って使用することにより、RNAを抽出した。
【０３１９】
発現結果は□□CT法によって解析し、上述のようにGAPDHをハウスキーピングとして使用した。本発明者らは、本発明者らの実験条件下で直接試験することにより、健常SMCでも、本発明者らの血漿試料でも、GAPDHを最も安定なハウスキーピング遺伝子とした。この知見を得るために、本発明者らは、QiagenのRTプロファイラーPCRアレイ（RT profiler PCR array）（ヒトカタログ番号330231/PAHS-055Zおよびマウスカタログ番号330231/PAMM-055Z）を使ってqPCRアッセイを行った。このアレイは、ACTB（ベータ-アクチン）、B2M（ベータ-2-VSMCなどのよく使用される5つのハウスキーピング遺伝子を含有しており、本発明者らの実験条件下で直接試験することにより、本発明者らの血漿試料で。この知見を得るために、本発明者らは、QiagenのRTプロファイラーPCRアレイ（RT profiler PCR array）（ヒトカタログ番号330231/PAHS-055Zおよびマウスカタログ番号330231/PAMM-055Z）を使ってqPCRアッセイを行った。このアレイは、ACTB（ベータ-アクチン）、B2M（ベータ-2-ミクログロブリン、GAPDH（グリセルアルデヒド-3-ホスホデヒドロゲナーゼ）、HPRT1ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1、RPLP0（リボソームタンパク質、ラージ、P0）などの、よく使用される5つのハウスキーピング遺伝子を含有している。さらに、このアレイは、1つのヒトゲノムDNAコンタミネーション対照と、3つの逆転写対照と、3つの陽性PCR対照とを含有している。PCRプライマーおよびsiRNAは、ワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5922285/＃で入手可能なSupplemental Table 2に列挙されている。
【０３２０】
ChIP-qPCR
ヒト大動脈組織からのChIP-qPCRのために、対照またはTAAドナーからの凍結大動脈中膜切片200mgを、1％のホルムアルデヒドを使って37Cで20分間固定し、125mMグリシンを使ってRTで5分間クエンチし、1×プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）を補足した後、全タンパク質溶解物を調製した。次に、50ugの全タンパク質溶解物を超音波処理することでクロマチンを平均長500〜1500bpに剪断した後、最大速度で10分間遠心分離した。EZH2（クローンAC22、米国active motif）またはH3K27me3（米国Abcam）に対するモノクローナル抗体6pgおよび1×プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）を補足した溶解緩衝液1mLが入っている2mLチューブに上清を収集し、次に4Cで一晩（14時間）インキュベートした。EpiTect ChIPキットを製造者の説明書（米国Qiagen）に従って使用することにより、免疫沈降物を解析した。TAGLN遺伝子のプロモーターおよび遺伝子内部をスキャンするために使用したプライマーは表1に列挙する。細胞からのChIP-qPCRのために、健常VSMCまたは単離された大動脈瘤VSMCからの500万個の細胞をまず、成長培地中、0.1％のDMS0または10ng/mLのヒト組換えTGFf31（米国Abcam）で、24時間処理した。次に、1％のホルムアルデヒドを使って細胞を37Cで10分間固定し、125mMグリシンを使ってRTで5分間クエンチした後、全タンパク質溶解物を調製した。次に、SMAD3に対するモノクローナル抗体を20pgの溶解物と共にインキュベートし、上述のように解析した。PCRプライマー、siRNAおよび抗体は、ワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5922285/＃で入手可能なSupplemental Table 2に列挙されている。
【０３２１】
siRNA阻害
健常VSMCに5pL/mLのlipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）を使って30nMのsiCtrl、siSMAD3またはsiSM22aを48時間トランスフェクトした後、通常の成長培地で24時間インキュベートした。次に、イムノブロッティングまたは核酸解析によって標的転写産物のサイレンシングを解析するために、30pgの全タンパク質をsiRNA処理細胞から調製した。siRNAはワールドワイドウェブのncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5922285/＃で入手可能なSupplemental Table 2に列挙されている。
【０３２２】
MMP活性
インビトロMMP活性のために、健常VSMCに30nMのsiCtrlまたはsiSM22aを上述のようにトランスフェクトした。ゼラチンザイモグラフィーによってMMP活性を測定するために、非トランスフェクト細胞、siCtrl処理細胞およびsiSM22a処理細胞から30ugの全タンパク質を調製し、Image Jソフトウェア（NIH）によって解析した。インビボMMP活性アッセイのために、MMP2活性およびMMP9活性に関する近赤外蛍光センサーであるMMPSense 680 FAST（米国PerkinElmer）300pLを、マウスに尾静脈注射した。注射の24時間後にマウスを屠殺し、大動脈を切離し、巨視的蛍光反射分子イメージングのためにKodakイメージステーション4000MM Proを使って解析した（44）。
【０３２３】
Ezh24-1/SMCの生成
VSMC標的Ezh2（VSMC-targeted Ezh2）の遺伝的枯渇は胚性致死を呈したので、本発明者らはFbn1c1°93Gi＋マウスをEzh2fvflマウスと交配した。次にFbn1c1°93G/＋:Ezh2fvflまたはEzh2futlマウスの上行大動脈を4ヶ月齢時点で上述のように単離した。第1継代時に、単離されたVSMC細胞に、Ezh2遺伝子発現を枯渇させるためにCMV-creを過剰発現するレンチウイルス（pFUGW-H1空ベクター、Addgeneプラスミド番号25870）を形質導入した。感染の72時間後に、細胞を通常の成長培地と共に24時間インキュベートしてから、上述のようにTGFβ刺激を行った。
【０３２４】
高クロマチンアフィニティーEZH2アイソフォームの過剰発現
EZH2タンパク質中のセリン21をアラニンで置き換えると（EZH2S21A）、野生型対応物よりも2〜4倍高いアフィニティーでヒストン3と結合するようになる（45）。pcDNA3-3myc-6His-EZH2 21AコンストラクトはAddgene（プラスミド番号42663）から得た。lipofectamine TLX（Thermo Fisher Scientific）およびopti-MEM培地（Thermo Fisher Scientific）を使って、1〜2pgのプラスミドを48時間、ヒト平滑筋細胞に一過性にトランスフェクトした。
【０３２５】
次に、組換えTGF131（10ng/mL）を含有する新鮮な成長培地を細胞に一晩（14時間）供給した。
【０３２６】
心エコーおよびマイクロCTスキャン
各動物からの寸法は、遺伝子型に関して盲検化された心臓病専門医が大動脈弁輪、大動脈洞、洞上行大動脈移行部または上行大動脈の最大内径を収縮期に静止画像で測定した値の平均を表す。大動脈は標準的な傍胸骨左室長軸像を使って撮像した。ヒストリカル対照によれば、4ヶ月齢時の野生型大動脈基部の平均直径は1.73±0.2mmであるが、本発明者らの疾患モデル（Fbn1ci°39G/＋）では、平均直径は2.15±0.3mmである。これは治療的改善を観測するための0.42mmのウインドウを与える。6ヶ月齢時の野生型大動脈基部の平均直径は1.76±0.2mmであり、Fbn1c1°39Gi＋では、平均直径は2.22±0.25mmである。これは治療的改善を観測するための0.46mmのウインドウを与える。心エコーの前日にすべてのマウスにNair除毛クリームを使用した。心エコーはVisualsonics Vevoイメージングシステムおよび30MHzトランスデューサーを使って、覚醒した非鎮静下のマウスで行った。CT画像はすべてInveon小動物マイクロCT（Siemens Medical Solutions Inc.、ペンシルバニア州マルヴァーン）を使って得た。スキャン中はすべてのマウスに20pL/分の静脈内ヨード系造影剤（Isovue-370、Bracco Diagnostic Inc.）を投与した。CT像は0.11mmの同寸ボクセル（isometric voxel）を有した。画像はOsiriXソフトウェアで視覚化され解析された。
【０３２７】
組織学
ラテックスを、それが大腿動脈に見えるまで、低圧下で左心尖部心室に注入した。次に動物をホルマリン（10％）中で24時間固定してから、切離と貯蔵のために70％エタノールに移した。次に、写真撮影のために、大動脈を動物から取り出すか、インサイチューで切離してから、パラフィン処理と薄切を行った（10pM）。スライドを組織染色用に作成するか、定量解析のために、H＆E染色、コラーゲン沈着（トリクローム染色（マッソン）キット、米国Sigma）、エラスチン（Verhoeff-Van Gieson、Thermo Scientific、米国ミシガン州）またはF-アクチン（ActinGreen（商標）488 ReadyProbes、米国ThermoFisher Scientific）を含む標準的染料で染色した。エラスチン完全性スコア（Elastin integrity score）は盲検化した観察者によって評価され、5（高品質の弾性線維を示す）から1（激しいエラスチンの断片化を示す）までの任意尺度で類別された。核染色用に、ヒトおよびマウスからの大動脈を、既述のOCT標準プロトコール（Fischerら,2008）を使って凍結切片化した。
【０３２８】
インビトロGSK343処理
濃度10pMのGSK343を含有する完全成長培地による4日間の処理の24時間前に、60〜70％コンフルエントのVSMCにopti-MEMを補足した。GSK343を含有する新鮮培地を毎日供給した。GSK343/TGF81（10ng/mL）併用処理のために、細胞をまず、最初の2日間、濃度10nMのGSK343を含有する完全培地で処理した後、次の2日間、GSK343/TGFβ併用処置を行った。細胞収集に先だって細胞を滅菌PBSで洗浄し、RNA抽出またはタンパク質抽出を上述のように行った。
【０３２９】
インビボ薬物処置
8週齢の野生型マウスまたはFbn1cw3gGi＋マウスのコホートを、飲料水に入れたロサルタンまたはGSK343の経口投与で20週にわたって処置した（図5）。ロサルタンを飲料水に溶解し、濾過して、濃度を0.6g/Lとした。これにより、既述のように、60mg/Kg/日の推定値になる（41）。25mgのGSK343阻害剤を1mLのDMSOに溶解することで、46mMの原液を得た。次に200mLの飲料水に250pLのGSK343原液を補足した。どちらかの薬物処置に関する対照群には等体積の滅菌水を与えた。ロサルタンまたはGSKS343を含有するボトルは、3日ごとに、薬物を添加した新鮮な水と交換した。図5A〜5Cに記載する実験のために、16週齢の野生型マウスまたはFbnicw3gGi＋マウスを8週間にわたって上述のように処置した。加えて、1つのマウス群には、他の単剤処置の場合と同じ濃度のロサルタンとGSK343の両方の組合せを与えた。大動脈寸法を上述のように心エコーによって毎月モニターした。
【０３３０】
統計
結果を平均±S.D.として記載する。対照群と処置群の間の相違の統計的有意性を決定するためにスチューデントの検定（両側）を適用した（＊＝P＜0.05、＊＊＝P＜0.01および＊＊＊＝P＜0.001）。すべての実験について、少なくとも3つの実験レプリケートを行った。図1Fでは線の当てはめに最小二乗法を使用した。散布図は平均±SDを示す。Prism 6.0（GraphPad Software）を使ってデータを解析し、グラフを調製した。複数のグループ（心エコーおよび組織学的解析）間の相違は、一元配置ANOVAとそれに続くチューキーの事後HSD（honestly significance difference）検定によって評価し、p値を生成させた（95％CIをプロットする）。0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。
【０３３１】
参考文献:
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
2021513993.tif 000076
【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021513993.tif 000081
【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｃ−３】
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【図４Ｃ−４】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図５Ｃ−３】
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【図５Ｃ−４】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ−１】
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【図９Ｃ−２】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ−１】
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【図１２Ａ−２】
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【図１２Ｂ−１】
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【図１２Ｂ−２】
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【図１２Ｃ−１】
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【図１２Ｃ−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2021513993.tif 000125
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【配列表】
2021513993000001.app
【国際調査報告】
2021513993.tif 000129
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