(57)【要約】グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）を発現する多能性細胞またはＧＢＡ及び１つもしくは複数のＭ２促進物質を発現する多能性細胞を対象に投与することにより、パーキンソン病を有する、または発症するリスクのある対象を処置する方法が、本明細書には記載されている。ＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現する多能性細胞などの、ＧＢＡを発現する多能性細胞を含む組成物も開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるパーキンソン病を処置する方法であって、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）をコードする導入遺伝子を発現する多能性細胞の集団を含む組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＧＢＡが全長ＧＢＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＧＢＡがＧＢＡの触媒ドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＧＢＡが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＢＡが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＢＡが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＢＡが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＢＡが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＢＡが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＢＡが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＢＡが配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が配列番号６の核酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が配列番号７の核酸配列を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が配列番号１１の核酸配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＧＢＡがシグナルペプチドを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記シグナルペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記シグナルペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記シグナルペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記シグナルペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記シグナルペプチドが、配列番号２０の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記シグナルペプチドが、配列番号２０の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記シグナルペプチドが、配列番号２０の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記シグナルペプチドが、配列番号２０の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が非分泌型ＧＢＡをコードする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
非分泌型ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子がシグナルペプチドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シグナルペプチドがＧＢＡシグナルペプチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が分泌型ＧＢＡをコードする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
分泌型ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が分泌シグナルペプチドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記分泌シグナルペプチドがアルファ−１アンチトリプシン分泌シグナルペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記分泌シグナルペプチドがインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）分泌シグナルペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子がＧＢＡ融合タンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号８の核酸配列を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号９の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号９の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が配列番号９の核酸配列を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が配列番号１０の核酸配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＧＢＡ融合タンパク質がＧＢＡ及びグリコシル化非依存性リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）タグを含む、請求項４０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＧＩＬＴタグが、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列（配列番号１２）と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、かつインスリン受容体についての天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比較して、インスリン受容体についての結合親和性が低下しているヒトＩＧＦ−ＩＩムテインを含み、その際、前記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、フーリン切断に抵抗性があり、かつマンノース−６−リン酸非依存的な様式で前記ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１２のアミノ酸３０〜４０に対応する領域内に変異を含み、前記変異が少なくとも１つのフーリンプロテアーゼ切断部位を無効にする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記変異がアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記変異が、配列番号１２のＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に対応する位置でのＬｙｓまたはＡｌａアミノ酸置換である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記変異が、配列番号１２の３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３３〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に対応するアミノ酸残基の欠失または置換である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＧＩＬＴタグが配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１７の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項６５〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１７の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１７の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１７の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１８の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項６５〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１８の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１９の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項６５〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１９の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１９の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１９の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の受容体結合（Ｒｂ）ドメインを含む、請求項４０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｒｂドメインが、配列番号２１の残基２５〜１８５、５０〜１８０、７５〜１７５、１００〜１７０、１２５〜１６０、または１３０〜１５０のアミノ酸配列を有するＡｐｏＥの一部を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｒｂドメインが、配列番号２１の残基１５９〜１６７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する領域を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が、３’−ＵＴＲにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ターゲティング配列をさらに含む、請求項１〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ｍｉＲＮＡターゲティング配列がｍｉＲ−１２６ターゲティング配列である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記分泌型ＧＢＡが、前記対象において血液脳関門（ＢＢＢ）を透過する、請求項３６〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記パーキンソン病がＧＢＡ関連パーキンソン病である、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記多能性細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＣＤ３４＋細胞が胚性幹細胞である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＣＤ３４＋細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＣＤ３４＋細胞が造血幹細胞である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＣＤ３４＋細胞が骨髄系前駆細胞である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象の内因性ミクログリアの集団を、前記組成物の投与前に除去しておく、請求項１〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記組成物を前記対象に投与する前に、前記対象の内因性ミクログリアの集団を除去することを含む、請求項１〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ミクログリアを、ブスルファン、ＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ６４７、ＰＬＸ５６２２、トレオスルファン、及びクロドロネートリポソームからなる群から選択される薬剤を使用して、放射線療法、またはそれらの組み合わせにより除去する、請求項１０７または１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組成物を前記対象に全身投与する、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記組成物を前記対象に静脈内注射により投与する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記組成物を前記対象の中枢神経系に直接投与する、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記組成物を、脳室内注射、定位注射、またはそれらの組み合わせにより前記対象に投与する、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記組成物を前記対象の骨髄に直接投与する、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記組成物を骨内注射により前記対象に投与する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記組成物を、前記組成物を含む骨髄移植により前記対象に投与する、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記組成物を脳室内注射により前記対象に投与する、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記組成物を静脈内注射により前記対象に投与する、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記組成物を前記対象に、前記対象の中枢神経系への直接投与及び全身投与により投与する、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記組成物を前記対象に、脳室内注射及び静脈内注射により投与する、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ＣＤ３４＋細胞の集団を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記組成物の投与前に、前記ＣＤ３４＋細胞の集団を前記対象に投与する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記組成物の投与後に、前記ＣＤ３４＋細胞の集団を前記対象に投与する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＣＤ３４＋細胞を、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、及び骨髄性前駆細胞からなる群から選択する、請求項１２１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ＣＤ３４＋細胞を、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現するように改変していない、請求項１２１〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ＣＤ３４＋細胞を前記対象に全身投与する、請求項１２１〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＣＤ３４＋細胞を前記対象に、静脈内注射により投与する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記対象への前記組成物の投与前に、内因性ＧＢＡを前記多能性細胞において破壊する、請求項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記対象への前記組成物の投与前に、内因性ＧＢＡを前記対象において破壊する、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記対象への前記組成物の投与の前に、内因性ＧＢＡを前記対象においてニューロンの集団において破壊する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記内因性ＧＢＡを、前記多能性細胞を、前記多能性細胞中の内因性ＧＢＡ核酸の切断を触媒するヌクレアーゼと接触させることにより破壊する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ヌクレアーゼが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質がＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ヌクレアーゼが転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記内因性ＧＢＡを、阻害性ＲＮＡ分子を前記多能性細胞、前記対象、または前記ニューロンの集団に投与することにより破壊する、請求項１２８〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記阻害性ＲＮＡ分子が短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記多能性細胞が、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子をさらに発現する、請求項１〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記多能性細胞が、それぞれがＭ２促進物質をコードする２つの導入遺伝子を発現する、請求項１〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
それぞれがＭ２促進物質をコードする前記１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つが、インターロイキン−２５（ＩＬ−２５）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）からなる群から選択されるサイトカインをコードする、請求項１３７または１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
それぞれがＭ２促進物質をコードする前記１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つがＩＬ−２５をコードする、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
それぞれがＭ２促進物質をコードする前記１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つが、グルココルチコイド受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲβ／δ、エストロゲン受容体、核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー２（ＮＲ４Ａ２）、リジンデメチラーゼ６Ｂ（ＫＤＭ６Ｂ）、ＭＳＨホメオボックス３（ＭＳＸ３）、配列類似性１９を持つファミリー（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）様）、メンバーＡ３（ＦＡＭ１９Ａ３）、核因子ＮＦ−カッパＢ  Ｐ５０サブユニット（ＮＦ−κＢ  Ｐ５０）、マイクロＲＮＡ１２４（ｍｉＲ１２４）、マイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）、及びマイクロＲＮＡ１８１ｃ（ｍｉＲ１８１ｃ）、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸ３ＣＬ１）、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、ＣＤ２００分子（ＣＤ２００）、ＣＤ２００受容体１（ＣＤ２００Ｒ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、白血球表面抗原ＣＤ４７（ＣＤ４７）、補体崩壊促進因子（ＣＤ５５）、栄養膜白血球共通抗原（ＣＤ４６）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ５（ＡＤＧＲＥ５）、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰＡ）、及びシグレックからなる群から選択される作用物質をコードする、請求項１３７または１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記多能性細胞が自家細胞である、請求項１〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記多能性細胞が同種異系細胞である、請求項１〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記多能性細胞を、前記ＧＢＡを発現するようにエクスビボで形質導入する、請求項１〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記多能性細胞を、前記ＧＢＡ及び前記１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボで形質導入する、請求項１３７〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記多能性細胞を、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、及びＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターで形質導入する、請求項１４４または１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ウイルスベクターがＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクターである、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクターがアルファレトロウイルスベクターである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクターがガンマレトロウイルスベクターである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５１】
前記Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクターが、中央ポリプリン路、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、５’−ＬＴＲ、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶ  Ｐｓｉシグナル５’−スプライス部位、デルタＧＡＧエレメント、３’−スプライス部位、及び３’−自己不活性化ＬＴＲを含む、請求項１４７〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択されるＡＡＶである、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ウイルスベクターが偽型ウイルスベクターである、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１５４】
前記偽型ウイルスベクターが、偽型ＡＡＶ、偽型アデノウイルス、偽型パルボウイルス、偽型コロナウイルス、偽型ラブドウイルス、偽型パラミクソウイルス、偽型ピコルナウイルス、偽型アルファウイルス、偽型ヘルペスウイルス、偽型ポックスウイルス、及び偽型Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスからなる群から選択される、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記多能性細胞を、別個のモノシストロニック発現カセットから前記ＧＢＡ及び前記１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するように形質導入する、請求項１４４〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記多能性細胞を、ポリシストロニック発現カセットから前記ＧＢＡ及び前記１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するように形質導入する、請求項１４４〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記多能性細胞が単一のＭ２促進物質を発現し、かつ前記多能性細胞を、ビシストロニック発現カセットから前記ＧＢＡ及び前記Ｍ２促進物質を発現するように形質導入する、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ポリシストロニック発現カセットが、前記ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと前記１つまたは複数のＭ２促進物質のうちの１つをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ポリシストロニック発現カセットが、前記ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと前記１つまたは複数のＭ２促進物質のうちの１つをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する口蹄疫ウイルス２Ａ（ＦＭＤＶ２Ａ）ポリヌクレオチドを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６０】
前記多能性細胞が、単一のポリシストロニック発現カセットからＧＢＡ、第１のＭ２促進物質、及び第２のＭ２促進物質を発現し、かつ前記ポリシストロニック発現カセットが、前記ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと前記第１のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する第１のＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドを含み、前記ポリシストロニック発現カセットが、前記第１のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドと前記第２のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する第２のＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６１】
前記多能性細胞を、前記ＧＢＡを発現するようにエクスビボでトランスフェクトする、請求項１〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記多能性細胞を、前記ＧＢＡ及び前記１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトする、請求項１３７〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記多能性細胞を、
ａ）カチオン性ポリマー、ジエチルアミノエチル−デキストラン、ポリエチレンイミン、カチオン性脂質、リポソーム、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、及び磁性ビーズからなる群から選択される作用物質；または
ｂ）エレクトロポレーション、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、スクイーズ−ポレーション、ソノポレーション、光学トランスフェクション、Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ、及びインペールフェクションからなる群から選択される技術を使用してトランスフェクトする、請求項１６１または１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記多能性細胞を、別個のモノシストロニック発現カセットから前記ＧＢＡ及び前記１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトする、請求項１６２または１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記モノシストロニック発現カセットを２つ以上の別個のプラスミド内に配置する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記モノシストロニック発現カセットを単一のプラスミド上に配置する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
前記多能性細胞を、ポリシストロニック発現カセットから前記ＧＢＡ及び前記１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトする、請求項１６２または１６３に記載の方法。
【請求項１６８】
前記多能性細胞が単一のＭ２促進物質を発現し、かつ前記多能性細胞を、ビシストロニック発現カセットから前記ＧＢＡ及び前記Ｍ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトする、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ポリシストロニック発現カセットが、前記ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと前記１つまたは複数のＭ２促進物質のうちの１つをコードするポリヌクレオチドとの間に位置するＩＲＥＳを含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７０】
前記ポリシストロニック発現カセットが、前記ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと前記１つまたは複数のＭ２促進物質のうちの１つをコードするポリヌクレオチドとの間に位置するＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドを含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７１】
前記多能性細胞が、単一のポリシストロニック発現カセットからＧＢＡ、第１のＭ２促進物質、及び第２のＭ２促進物質を発現し、かつ前記ポリシストロニック発現カセットが、前記ＧＢＡコードするポリヌクレオチドと前記第１のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する第１のＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドを含み、かつ前記ポリシストロニック発現カセットが、前記第１のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドと前記第２のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する第２のＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７２】
前記多能性細胞における前記ＧＢＡの発現及び／または前記１つまたは複数のＭ２促進物質の発現を、ユビキタスプロモーターを使用して駆動する、請求項１３７〜１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記ユビキタスプロモーターを、伸長因子１−アルファ及びホスホグリセリン酸キナーゼ１からなる群から選択する、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記多能性細胞における前記ＧＢＡ及び／または前記の１つまたは複数のＭ２促進物質の発現を、組織特異的プロモーターを使用して駆動する、請求項１３７〜１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記組織特異的プロモーターを、ＣＤ６８分子、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカイン受容体１、インテグリンサブユニットアルファＭ、同種移植炎症因子１、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１２、膜貫通タンパク質１１９、及びコロニー刺激因子１受容体からなる群から選択する、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子を、タンパク質不安定化ドメインをコードする核酸に作動可能に連結させる、請求項１〜１７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記不安定化ドメインがＦＫ５０６結合タンパク質１Ａ（ＦＫＢＰ１２）不安定化ドメインである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記ＦＰＢＰ１２不安定化ドメインが、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ、Ｌ１０６Ｐ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、及びＫ１０５Ｉからなる群から選択されるＦＫＢＰ１２変異体である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
機能的ＧＢＡの発現を誘導するために十分な量でＳｈｉｅｌｄ−１を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１７７または１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記不安定化ドメインが大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）不安定化ドメインである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８１】
機能的ＧＢＡの発現を誘導するために十分な量でトリメトプリムを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記不安定化ドメインがヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ）不安定化ドメインである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８３】
機能的ＧＢＡの発現を誘導するために十分な量でＣＭＰ８または４−ヒドロキシタモキシフェンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記多能性細胞において前記１つまたは複数のＭ２促進物質のそれぞれをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドをタンパク質不安定化ドメインに作動可能に連結させる、請求項１３７〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８５】
前記不安定化ドメインがＦＫＢＰ１２不安定化ドメインである、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ＦＰＢＰ１２不安定化ドメインが、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ、Ｌ１０６Ｐ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、及びＫ１０５Ｉからなる群から選択されるＦＫＢＰ１２変異体である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
機能的Ｍ２促進物質の発現を誘導するために十分な量でＳｈｉｅｌｄ−１を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１８５または１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記不安定化ドメインがｅｃＤＨＦＲ不安定化ドメインである、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８９】
機能的Ｍ２促進物質の発現を誘導するために十分な量でトリメトプリムを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記不安定化ドメインがヒトＥＲＬＢＤ不安定化ドメインである、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９１】
機能的Ｍ２促進物質の発現を誘導するために十分な量でＣＭＰ８または４−ヒドロキシタモキシフェンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記組成物を、
ａ）前記対象の脳内のＭ１ミクログリアの量と比較して、前記対象の脳内のＭ２ミクログリアの量を増加させる；
ｂ）前記対象の脳における１つまたは複数の炎症誘発性サイトカインのレベルを低下させる；
ｃ）前記対象の脳内の１つまたは複数の抗炎症性サイトカインのレベルを上昇させる；
ｄ）前記対象の認知能力を向上させる；
ｅ）前記対象の運動機能を改善する；
ｆ）前記対象のドーパミン作動性ニューロンの喪失を減少させる；及び／または
ｇ）前記対象におけるα−シヌクレインレベルまたはその凝集を減少させるために十分な量で前記対象に投与する、請求項１〜１９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記対象がヒトである、請求項１〜１９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９４】
（ｉ）非分泌型ＧＢＡをコードする第１の導入遺伝子；及び（ｉｉ）それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を発現する多能性細胞の集団を含む組成物。
【請求項１９５】
（ｉ）分泌型ＧＢＡをコードする第１の導入遺伝子；及び（ｉｉ）それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を発現する多能性細胞の集団を含む組成物。
【請求項１９６】
前記ＧＢＡが全長ＧＢＡである、請求項１９４または１９５に記載の組成物。
【請求項１９７】
前記ＧＢＡがＧＢＡの触媒ドメインである、請求項１９４または１９５に記載の組成物。
【請求項１９８】
前記ＧＢＡが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１９４〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９９】
前記ＧＢＡが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１９８に記載の組成物。
【請求項２００】
前記ＧＢＡが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１９９に記載の組成物。
【請求項２０１】
前記ＧＢＡが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２００に記載の組成物。
【請求項２０２】
前記ＧＢＡが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１９５〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０３】
前記ＧＢＡが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２０２に記載の組成物。
【請求項２０４】
前記ＧＢＡが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２０３に記載の組成物。
【請求項２０５】
前記ＧＢＡが配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項２０４に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記導入遺伝子が、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項１９４〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０７】
前記導入遺伝子が、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２０６に記載の組成物。
【請求項２０８】
前記導入遺伝子が、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２０７に記載の組成物。
【請求項２０９】
前記導入遺伝子が、配列番号６の核酸配列を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２０８に記載の組成物。
【請求項２１０】
前記導入遺伝子が、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項１９４〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１１】
前記導入遺伝子が、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２１０に記載の組成物。
【請求項２１２】
前記導入遺伝子が、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２１１に記載の組成物。
【請求項２１３】
前記導入遺伝子が、配列番号７の核酸配列を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１４】
前記導入遺伝子が、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項１９５〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１５】
前記導入遺伝子が、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２１４に記載の組成物。
【請求項２１６】
前記導入遺伝子が、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２１５に記載の組成物。
【請求項２１７】
前記導入遺伝子が配列番号１１の核酸配列を有するポリヌクレオチドをコードする、請求項２１６に記載の組成物。
【請求項２１８】
前記ＧＢＡがシグナルペプチドを含む、請求項１９５〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１９】
前記シグナルペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２１８に記載の組成物。
【請求項２２０】
前記シグナルペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２１９に記載の組成物。
【請求項２２１】
前記シグナルペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２２０に記載の組成物。
【請求項２２２】
前記シグナルペプチドが配列番号１６のアミノ酸を有する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２３】
前記シグナルペプチドが、配列番号２０の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１９５〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２４】
前記シグナルペプチドが、配列番号２０の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２２３に記載の組成物。
【請求項２２５】
前記シグナルペプチドが、配列番号２０の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２２４に記載の組成物。
【請求項２２６】
前記シグナルペプチドが、配列番号２０の核酸を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２２５に記載の組成物。
【請求項２２７】
分泌型ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が分泌シグナルペプチドを含む、請求項１９５に記載の組成物。
【請求項２２８】
前記シグナルペプチドがＧＢＡシグナルペプチドである、請求項２２７に記載の組成物。
【請求項２２９】
前記分泌シグナルペプチドがアルファ−１アンチトリプシン分泌シグナルペプチドである、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３０】
前記分泌シグナルペプチドがインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）分泌シグナルペプチドである、請求項２２７に記載の組成物。
【請求項２３１】
前記導入遺伝子がＧＢＡ融合タンパク質をコードする、請求項１９５〜２３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３２】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３１に記載の組成物。
【請求項２３３】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３２に記載の組成物。
【請求項２３４】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３３に記載の組成物。
【請求項２３５】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２３４に記載の組成物。
【請求項２３６】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３１に記載の組成物。
【請求項２３７】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３６に記載の組成物。
【請求項２３８】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３７に記載の組成物。
【請求項２３９】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項２３８に記載の組成物。
【請求項２４０】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３１に記載の組成物。
【請求項２４１】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２４０に記載の組成物。
【請求項２４２】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２４１に記載の組成物。
【請求項２４３】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項２４２に記載の組成物。
【請求項２４４】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項２３１に記載の組成物。
【請求項２４５】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項２４４に記載の組成物。
【請求項２４６】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項２４５に記載の組成物。
【請求項２４７】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が配列番号８の核酸配列を有する、請求項２４６に記載の組成物。
【請求項２４８】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号９の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項２３１に記載の組成物。
【請求項２４９】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項２４８に記載の組成物。
【請求項２５０】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号９の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項２４９に記載の組成物。
【請求項２５１】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が配列番号９の核酸配列を有する、請求項２５０に記載の組成物。
【請求項２５２】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項２３１に記載の組成物。
【請求項２５３】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項２５２に記載の組成物。
【請求項２５４】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項２５３に記載の組成物。
【請求項２５５】
前記ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子が配列番号１０の核酸配列を有する、請求項２５４に記載の組成物。
【請求項２５６】
前記ＧＢＡ融合タンパク質がＧＢＡ及びグリコシル化非依存性リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）タグを含む、請求項２３１〜２５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５７】
前記ＧＩＬＴタグが、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列（配列番号１２）と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、かつインスリン受容体についての天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比較して、インスリン受容体についての結合親和性が低下しているヒトＩＧＦ−ＩＩムテインを含み、その際、前記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、フーリン切断に抵抗性があり、かつマンノース−６−リン酸非依存的な様式で前記ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する、請求項２５６に記載の組成物。
【請求項２５８】
前記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１２のアミノ酸３０〜４０に対応する領域内に変異を含み、この際、前記変異が少なくとも１つのフーリンプロテアーゼ切断部位を無効にする、請求項２５７に記載の組成物。
【請求項２５９】
前記変異がアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入である、請求項２５８に記載の組成物。
【請求項２６０】
前記変異が、配列番号１２のＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に対応する位置でのＬｙｓまたはＡｌａアミノ酸置換である、請求項２５９に記載の組成物。
【請求項２６１】
前記変異が、配列番号１２の３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３３〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に対応するアミノ酸残基の欠失または置換である、請求項２６０に記載の組成物。
【請求項２６２】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２５６〜２６１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６３】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６２に記載の組成物。
【請求項２６４】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６３に記載の組成物。
【請求項２６５】
前記ＧＩＬＴタグが配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項２６４に記載の組成物。
【請求項２６６】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２５６〜２６１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６７】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６６に記載の組成物。
【請求項２６８】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６７に記載の組成物。
【請求項２６９】
前記ＧＩＬＴタグが配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項２６８に記載の組成物。
【請求項２７０】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２５６〜２６１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７１】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２７０に記載の組成物。
【請求項２７２】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２７１に記載の組成物。
【請求項２７３】
前記ＧＩＬＴタグが配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項２７２に記載の組成物。
【請求項２７４】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１７の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２５６〜２７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７５】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１７の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２７４に記載の組成物。
【請求項２７６】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１７の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２７７】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１７の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２７６に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１８の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２５６〜２７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７９】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２７８に記載の組成物。
【請求項２８０】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２７９に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１８の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２８０に記載の組成物。
【請求項２８２】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１９の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２５６〜２７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８３】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１９の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２８２に記載の組成物。
【請求項２８４】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１９の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２８３に記載の組成物。
【請求項２８５】
前記ＧＩＬＴタグが、配列番号１９の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２８４に記載の組成物。
【請求項２８６】
前記ＧＢＡ融合タンパク質が、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の受容体結合（Ｒｂ）ドメインを含む、請求項１９４〜２８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８７】
前記Ｒｂドメインが、配列番号２１の残基２５〜１８５、５０〜１８０、７５〜１７５、１００〜１７０、１２５〜１６０、または１３０〜１５０のアミノ酸配列を有するＡｐｏＥの一部を含む、請求項２８６記載の組成物。
【請求項２８８】
前記Ｒｂドメインが、配列番号２１の残基１５９〜１６７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する領域を含む、請求項２８６に記載の組成物。
【請求項２８９】
ＧＢＡをコードする前記導入遺伝子が３’−ＵＴＲにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ターゲティング配列をさらに含む、請求項１９４〜２８８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９０】
前記ｍｉＲＮＡターゲティング配列がｍｉＲ−１２６ターゲティング配列である、請求項２８９に記載の組成物。
【請求項２９１】
前記多能性細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１９４または１９５に記載の組成物。
【請求項２９２】
前記ＣＤ３４＋細胞が胚性幹細胞である、請求項２９１に記載の組成物。
【請求項２９３】
前記ＣＤ３４＋細胞が人工多能性幹細胞である、請求項２９１に記載の組成物。
【請求項２９４】
前記ＣＤ３４＋細胞が造血幹細胞である、請求項２９１に記載の組成物。
【請求項２９５】
前記ＣＤ３４＋細胞が骨髄性前駆細胞である、請求項２９１に記載の組成物。
【請求項２９６】
それぞれがＭ２促進物質をコードする前記１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＬ−２５、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及びＴＧＦ−βからなる群から選択されるサイトカインをコードする、請求項１９４〜２９５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９７】
それぞれがＭ２促進物質をコードする前記１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つがＩＬ−２５をコードする、請求項２９６に記載の組成物。
【請求項２９８】
それぞれがＭ２促進物質をコードする前記１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つが、グルココルチコイド受容体、ＰＰＡＲ、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲβ／δ、エストロゲン受容体、ＮＲ４Ａ２、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＳＸ３、ＦＡＭ１９Ａ３、ＮＦ−κＢｐ５０、ｍｉＲ１２４、ｍｉＲ２１、及びｍｉＲ１８１ｃ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＦＨ、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ４６、ＡＤＧＲＥ５、ＳＩＲＰα、及びシグレックからなる群から選択される作用物質をコードする、請求項１９４〜２９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９９】
前記多能性細胞が、前記ＧＢＡ及び前記１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボで形質導入されている、請求項１９４〜２９８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３００】
前記多能性細胞が、前記ＧＢＡ及び前記１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトされている、請求項１９４〜２９８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０１】
内因性ＧＢＡが前記多能性細胞において破壊されている、請求項１９４〜３００のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０２】
請求項１９４〜３０１のいずれか１項に記載の組成物及び添付文書を含むキット。
【請求項３０３】
前記添付文書が、前記キットのユーザーに請求項１〜１９３のいずれか１項に記載の方法を実行するように指示する、請求項３０２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年３月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は５１１８２−００７ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿３．８．１９＿ＳＴ２５であり、サイズは４９，９６２バイトである。
【０００２】
本発明は、パーキンソン病を処置するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、運動に影響を及ぼし、安静時振戦、硬直、運動緩慢などの症状をもたらす神経系の進行性障害である。パーキンソン病に罹患している患者は、うつ病、便秘、疼痛、睡眠障害、認知機能低下、及び嗅覚機能障害を含む非運動症状も経験し得る。ＰＤ患者の脳の死後分析では多くの場合に、罹患した脳領域におけるα−シヌクレインを含むレビー小体と、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失とが明らかになる。ＰＤの現在の処置は主に、ドーパミンレベルの上昇に焦点を当てている。ＰＤを処置するための改善された治療モダリティーが必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）を発現する、とりわけＣＤ３４＋細胞及び造血幹細胞などの多能性細胞を使用してパーキンソン病を処置するための方法を提供する。前記細胞を、とりわけ患者の中枢神経系に直接的（例えば、脳室内投与により）、または全身的（例えば、静脈内投与により）を含めて、様々な経路の１つまたは複数によりパーキンソン病を有する患者に投与することができる。前記細胞は、Ｍ２促進物質をコードする導入遺伝子などの１つまたは複数の追加の導入遺伝子をさらに発現してもよい。本発明はまた、そのような多能性細胞を含む組成物、さらにはパーキンソン病を処置するための、これらの細胞を含むキットを特徴とする。
【０００５】
第１の態様では、本発明は、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現する多能性細胞の集団を含む組成物を対象に投与することにより、対象においてパーキンソン病を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＧＢＡは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＢＡなどの全長ＧＢＡまたはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、配列番号１に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性）を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、ＧＢＡは成熟ＧＢＡタンパク質である。一部の実施形態では、ＧＢＡは、配列番号１の触媒ドメインなどのＧＢＡの触媒ドメイン（例えば、配列番号１の残基７６〜３８１及び４１６〜４３０を含む触媒ドメイン）である。
【０００６】
一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、野生型ヒトＧＢＡ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較して、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換などの１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の保存的アミノ酸置換など、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のアミノ酸置換）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するコドン最適化ポリヌクレオチドを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、非分泌型ＧＢＡをコードする。一部の実施形態では、非分泌型ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、ＧＢＡシグナルペプチド（例えば、３９アミノ酸のＧＢＡシグナルペプチド）などのシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、改変シグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、改変シグナルペプチドを含むＧＢＡは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、改変シグナルペプチドを含む分泌型ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態では、改変シグナルペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、改変シグナルペプチドは、配列番号２０の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０００８】
一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、分泌型ＧＢＡをコードする。一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、分泌シグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＧＢＡ分泌シグナルペプチドである。一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、アルファ−１アンチトリプシン分泌シグナルペプチドである。一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）分泌シグナルペプチドである。
【０００９】
一部の実施形態では、ＧＢＡは、ＧＢＡ融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、ＧＢＡ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態において、ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号１０の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質は、ＧＢＡ及びグリコシル化非依存性リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）タグを含む。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグを、ＧＢＡのＮ末端に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグを、ＧＢＡのＣ末端に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列（配列番号１２）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ−ＩＩムテインを含む。ムテインは、インスリン受容体についての天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比較して、インスリン受容体についての結合親和性が低下していてもよく、及び／またはフーリン切断に対して抵抗性があってもよい。ムテインは、マンノース−６−リン酸非依存的な様式で、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合してよい。一部の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１２のアミノ酸３０〜４０に対応する領域内に変異を含み、その際、その変異は少なくとも１つのフーリンプロテアーゼ切断部位を無効にする。一部の実施形態では、変異は、アミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入である。一部の実施形態では、変異は、配列番号１２のＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に対応する位置でのＬｙｓまたはＡｌａアミノ酸置換である。一部の実施形態では、変異は、配列番号１２の３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３３〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に対応するアミノ酸残基の欠失または置換である。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、配列番号１７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、配列番号１８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、配列番号１９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を有する。
【００１０】
一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の低密度リポタンパク質受容体ファミリー（ＬＤＬＲｆ）結合（Ｒｂ）ドメイン、またはその断片、バリアント、もしくはオリゴマーを含む。一部の実施形態では、ＡｐｏＥのＲｂドメイン、またはその断片、バリアント、もしくはオリゴマーを、ＧＢＡのＮ末端に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、ＡｐｏＥのＲｂドメイン、またはその断片、バリアント、もしくはオリゴマーを、ＧＢＡのＣ末端に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡ融合タンパク質は、ＡｐｏＥのＲｂドメインの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のオリゴマーを含む。一部の実施形態では、Ｒｂドメインは、配列番号２１の残基２５〜１８５に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＡｐｏＥの領域を含む。一部の実施形態では、Ｒｂドメインは、配列番号２１の残基５０〜１８０に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＡｐｏＥの領域を含む。一部の実施形態では、Ｒｂドメインは、配列番号２１の残基７５〜１７５に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＡｐｏＥの領域を含む。一部の実施形態では、Ｒｂドメインは、配列番号２１の残基１００〜１７０に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＡｐｏＥの領域を含む。一部の実施形態では、Ｒｂドメインは、配列番号２１の残基１２５〜１６０に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＡｐｏＥの領域を含む。一部の実施形態では、Ｒｂドメインは、配列番号２１の残基１３０〜１５０に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＡｐｏＥの領域を含む。一部の実施形態では、Ｒｂドメインは、配列番号２１の残基１４８〜１７３もしくは残基１５９〜１６７を含むその一部に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＡｐｏＥの領域、または配列番号２１の残基１５９〜１６７に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｒｂドメインは、配列番号２１の残基１５９〜１６７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する領域を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ターゲティング配列（例えば、ｍｉＲ−１２６ターゲティング配列）をさらに含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡターゲティング配列（例えば、ｍｉＲ−１２６ターゲティング配列）は、導入遺伝子の３’−ＵＴＲ内に配置される。
【００１２】
一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡは、対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を透過する。
【００１３】
一部の実施形態では、パーキンソン病はＧＢＡ関連パーキンソン病である。
【００１４】
一部の実施形態では、多能性細胞はＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は胚性幹細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は人工多能性幹細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は造血幹細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は骨髄系前駆細胞である。
【００１５】
一部の実施形態では、対象への組成物の投与前に、対象の内因性ミクログリアの集団を除去する。一部の実施形態では、前記方法は、組成物を対象に投与する前に、対象の内因性ミクログリアの集団を除去することを含む。一部の実施形態では、ミクログリアを、ブスルファン、ＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ６４７、ＰＬＸ５６２２、トレオスルファン、及びクロドロネートリポソームからなる群から選択される薬剤を使用して、放射線療法またはそれらの組み合わせにより除去する。
【００１６】
一部の実施形態では、前記組成物を対象に全身投与する。一部の実施形態では、前記組成物を、静脈内注射により対象に投与する。一部の実施形態では、前記組成物を、対象の中枢神経系に直接投与する。一部の実施形態では、脳室内注射、定位注射、またはそれらの組み合わせにより対象に投与する。
【００１７】
一部の実施形態では、前記組成物を、対象の骨髄に直接投与する。一部の実施形態では、前記組成物を、骨内注射により投与する。
【００１８】
一部の実施形態では、前記組成物を、骨髄移植により対象に投与する。一部の実施形態では、組成物を、脳室内注射により対象に投与する。一部の実施形態では、前記組成物を、静脈内注射により対象に投与する。
【００１９】
一部の実施形態では、前記組成物を、対象の中枢神経系への直接投与及び全身投与により対象に投与する。一部の実施形態では、前記組成物を、脳室内注射及び静脈内注射により対象に投与する。
【００２０】
一部の実施形態では、前記方法は、ＣＤ３４＋細胞の集団を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞の集団を、前記組成物の投与前に対象に投与する。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞の集団を、前記組成物の投与後に対象に投与する。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、及び骨髄性前駆細胞からなる群から選択する。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現するように改変しない。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、対象に全身投与する。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、静脈内注射により対象に投与する。
【００２１】
一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、対象への前記組成物の投与前に多能性細胞で破壊する。
【００２２】
一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、多能性細胞を、多能性細胞における内因性ＧＢＡ核酸の切断を触媒するヌクレアーゼと接触させることにより破壊する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。
【００２３】
一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、例えば、内因性ＧＢＡの発現を破壊するために十分な時間及び量で、多能性細胞を阻害性ＲＮＡ分子と接触させることにより破壊する。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
【００２４】
一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、対象への前記組成物の投与前に、対象において破壊する。一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、阻害性ＲＮＡ分子を対象に投与することにより破壊する。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。
【００２５】
一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、対象への前記組成物の投与前に、対象のニューロンの集団において破壊する。一部の実施形態において、内因性ＧＢＡは、例えば、内因性ＧＢＡの発現を破壊するために十分な時間及び量で、ニューロンの集団を阻害性ＲＮＡ分子と接触させることにより、ニューロンの集団において破壊される。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。
【００２６】
一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現する多能性細胞は、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子をさらに発現する。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現する多能性細胞は、それぞれがＭ２促進物質をコードする２つの導入遺伝子を発現する。
【００２７】
一部の実施形態では、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子は、インターロイキン−２５（ＩＬ−２５）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）を含む群から選択されるサイトカインをコードする。一部の実施形態では、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＬ−２５をコードする。一部の実施形態では、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子は、グルココルチコイド受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲβ／δ、エストロゲン受容体、核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー２（ＮＲ４Ａ２）、リジンデメチラーゼ６Ｂ（ＫＤＭ６Ｂ）、ＭＳＨホメオボックス３（ＭＳＸ３）、配列類似性１９を持つファミリー（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）様）、メンバーＡ３（ＦＡＭ１９Ａ３）、核因子ＮＦ−カッパＢ  Ｐ５０サブユニット（ＮＦ−κＢ  Ｐ５０）、マイクロＲＮＡ１２４（ｍｉＲ１２４）、マイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）、及びマイクロＲＮＡ１８１Ｃ（ｍｉＲ１８１ｃ）、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸ３ＣＬ１）、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、ＣＤ２００分子（ＣＤ２００）、ＣＤ２００受容体１（ＣＤ２００Ｒ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、白血球表面抗原ＣＤ４７（ＣＤ４７）、補体崩壊促進因子（ＣＤ５５）、栄養膜白血球共通抗原（ＣＤ４６）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ５（ＡＤＧＲＥ５）、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰＡ）、及びシグレックを含む群から選択される作用物質をコードする。
【００２８】
一部の実施形態では、多能性細胞は自家細胞である。一部の実施形態では、多能性細胞は同種異系細胞である。
【００２９】
一部の実施形態では、多能性細胞を、ＧＢＡを発現するようにエクスビボで形質導入する。一部の実施形態では、多能性細胞を、ＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボで形質導入する。
【００３０】
一部の実施形態では、多能性細胞を、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、及びレトロウイルス科ウイルスを含む群から選択されるウイルスベクターで形質導入する。
【００３１】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス科ウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルス科ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルス科ウイルスベクターは、アルファレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルス科ウイルスベクターは、ガンマレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルス科ウイルスベクターは、中央ポリプリン路、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、５’−ＬＴＲ、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶ  Ｐｓｉシグナル５’−スプライス部位、デルタ−ＧＡＧエレメント、３’−スプライス部位、及び３’−自己不活化ＬＴＲを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶｒｈ７４を含む群から選択されるＡＡＶである。
【００３３】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、偽型ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、偽型ＡＡＶ、偽型アデノウイルス、偽型パルボウイルス、偽型コロナウイルス、偽型ラブドウイルス、偽型パラミクソウイルス、偽型ピコルナウイルス、偽型アルファウイルス、偽型ヘルペスウイルス、偽型ポックスウイルス、及び偽型レトロウイルス科ウイルスである。
【００３４】
一部の実施形態では、多能性細胞を、別々のモノシストロニック発現カセットからＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するように形質導入する。
【００３５】
一部の実施形態では、多能性細胞を、ポリシストロニック発現カセットからＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するように形質導入する。一部の実施形態では、多能性細胞は単一のＭ２促進物質を発現し、その多能性細胞を、ビシストロニック発現カセットからＧＢＡ及びＭ２促進物質を発現するように形質導入する。一部の実施形態では、ポリシストロニック発現カセットは、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと１つまたは複数のＭ２促進物質の１つをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態では、ポリシストロニック発現カセットは、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと１つまたは複数のＭ２促進物質の１つをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する口蹄疫ウイルス２Ａ（ＦＭＤＶ２Ａ）ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、多能性細胞は、単一のポリシストロニック発現カセットから、ＧＢＡ、第１のＭ２促進物質、及び第２のＭ２促進物質を発現し、その際、そのポリシストロニック発現カセットは、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと第１のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する第１のＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドを含み、かつそのポリシストロニック発現カセットは、第１のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドと第２のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する第２のＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドをさらに含む。
【００３６】
一部の実施形態では、多能性細胞を、ＧＢＡを発現するようにエクスビボでトランスフェクトする。一部の実施形態では、多能性細胞を、ＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトする。
【００３７】
一部の実施形態では、多能性細胞を、カチオン性ポリマー、ジエチルアミノエチル−デキストラン、ポリエチレンイミン、カチオン性脂質、リポソーム、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、及び磁気ビーズを含む群から選択される薬剤；またはエレクトロポレーション、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、スクイーズ−ポレーション、ソノポレーション、光学トランスフェクション、Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ、及びインペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）を含む群から選択される技術を使用してトランスフェクトする。
【００３８】
一部の実施形態では、多能性細胞を、別々のモノシストロニック発現カセットからＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトする。一部の実施形態では、モノシストロニック発現カセットを２つ以上の別個のプラスミド内に配置する。一部の実施形態では、モノシストロニック発現カセットを単一のプラスミド上に配置する。
【００３９】
一部の実施形態では、多能性細胞を、ポリシストロニック発現カセットからＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現させるようにエクスビボでトランスフェクトする。一部の実施形態では、多能性細胞は単一のＭ２促進物質を発現し、その多能性細胞を、ビシストロニック発現カセットからＧＢＡ及びＭ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトする。一部の実施形態では、ポリシストロニック発現カセットは、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと１つまたは複数のＭ２促進物質の１つをコードするポリヌクレオチドとの間に位置するＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、ポリシストロニック発現カセットは、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと１つまたは複数のＭ２促進物質の１つをコードするポリヌクレオチドとの間に位置するＦＭＤＶ  ２Ａポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、多能性細胞は、単一のポリシストロニック発現カセットから、ＧＢＡ、第１のＭ２促進物質、及び第２のＭ２促進物質を発現し、その際、そのポリシストロニック発現カセットは、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドと第１のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する第１のＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドを含み、かつそのポリシストロニック発現カセットは、第１のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドと第２のＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する第２のＦＭＤＶ２Ａポリヌクレオチドをさらに含む。
【００４０】
一部の実施形態では、多能性細胞におけるＧＢＡ及び／または１つまたは複数のＭ２促進物質の発現を、ユビキタスプロモーターを使用して駆動する。ユビキタスプロモーターには、伸長因子１−αプロモーター及びホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーターが含まれる。一部の実施形態では、多能性細胞におけるＧＢＡ及び／または１つまたは複数のＭ２促進物質の発現を、組織特異的プロモーターを使用して駆動する。組織特異的プロモーターには、ＣＤ６８分子、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカイン受容体１、インテグリンサブユニットアルファＭ、同種移植炎症因子１、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１２、膜貫通タンパク質１１９、及びコロニー刺激因子１受容体が含まれる。
【００４１】
一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を、タンパク質不安定化ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結させる。
【００４２】
一部の実施形態では、不安定化ドメインは、ＦＫ５０６結合タンパク質１Ａ（ＦＫＢＰ１２）不安定化ドメインである。一部の実施形態では、ＦＰＢＰ１２不安定化ドメインは、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ、Ｌ１０６Ｐ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、及びＫ１０５Ｉを含む群から選択されるＦＫＢＰ１２変異体である。一部の実施形態では、前記方法は、機能的ＧＢＡの発現を誘導するために十分な量でＳｈｉｅｌｄ−１を対象に投与することを含む。
【００４３】
一部の実施形態では、不安定化ドメインは、大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）不安定化ドメインである。一部の実施形態では、前記方法は、機能的ＧＢＡの発現を誘導するために十分な量でトリメトプリムを対象に投与することを含む。
【００４４】
一部の実施形態では、不安定化ドメインは、ヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ）不安定化ドメインである。一部の実施形態では、前記方法は、機能的ＧＢＡの発現を誘導するために十分な量でＣＭＰ８または４−ヒドロキシタモキシフェンを対象に投与することを含む。
【００４５】
一部の実施形態では、多能性細胞において１つまたは複数のＭ２促進物質のそれぞれをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、タンパク質不安定化ドメインに作動可能に連結させる。
【００４６】
一部の実施形態では、不安定化ドメインは、ＦＫＢＰ１２不安定化ドメインである。一部の実施形態では、ＦＰＢＰ１２不安定化ドメインは、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ、Ｌ１０６Ｐ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、及びＫ１０５Ｉを含む群から選択されるＦＫＢＰ１２変異体である。一部の実施形態では、前記方法は、機能的Ｍ２促進物質の発現を誘導するために十分な量でＳｈｉｅｌｄ−１を対象に投与することを含む。
【００４７】
一部の実施形態では、不安定化ドメインは、ｅｃＤＨＦＲ不安定化ドメインである。一部の実施形態では、前記方法は、機能的Ｍ２促進物質の発現を誘導するために十分な量でトリメトプリムを対象に投与することを含む。
【００４８】
一部の実施形態では、不安定化ドメインは、ヒトＥＲＬＢＤ不安定化ドメインである。一部の実施形態では、前記方法は、機能的Ｍ２促進物質の発現を誘導するために十分な量でＣＭＰ８または４−ヒドロキシタモキシフェンを対象に投与することを含む。
【００４９】
一部の実施形態では、前記組成物を、対象の脳内のＭ１ミクログリアの量と比較して、対象の脳内のＭ２ミクログリアの量を増加させる、対象の脳内の１つまたは複数の炎症誘発性サイトカインのレベルを低下させる、対象の脳内の１つまたは複数の抗炎症性サイトカインのレベルを上昇させる、対象の認知能力を改善する、対象の運動機能を改善する、対象におけるドーパミン作動性ニューロン喪失を減少させる、及び／または対象におけるα−シヌクレインレベルまたはその凝集を減少させるために十分な量で対象に投与する。
【００５０】
一部の実施形態では、対象はヒトである。
【００５１】
別の態様では、本発明は、（ｉ）非分泌型ＧＢＡをコードする第１の導入遺伝子；及び（ｉｉ）それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を発現する多能性細胞の集団を含む組成物を提供する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、（ｉ）分泌型ＧＢＡをコードする第１の導入遺伝子；及び（ｉｉ）それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を発現する多能性細胞の集団を含む組成物を提供する。
【００５３】
先行する２つの態様のいずれかの一部の実施形態では、多能性細胞はＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は胚性幹細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は人工多能性幹細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は造血幹細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は骨髄系前駆細胞である。一部の実施形態では、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＬ−２５、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及びＴＧＦ−βからなる群から選択されるサイトカインをコードする。一部の実施形態では、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＬ−２５をコードする。一部の実施形態では、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、グルココルチコイド受容体、ＰＰＡＲ、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲβ／δ、エストロゲン受容体、ＮＲ４Ａ２、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＳＸ３、ＦＡＭ１９Ａ３、ＮＦ−κＢｐ５０、ｍｉＲ１２４、ｍｉＲ２１、及びｍｉＲ１８１ｃ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＦＨ、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ４６、ＡＤＧＲＥ５、ＳＩＲＰα、及びシグレックからなる群から選択される作用物質をコードする。一部の実施形態では、多能性細胞を、ＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボで形質導入する。一部の実施形態では、多能性細胞を、ＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現するようにエクスビボでトランスフェクトする。一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、多能性細胞において破壊する。
【００５４】
追加の態様では、本発明は、上記の態様及び実施形態のいずれかによる組成物ならびに添付文書を含むキットを提供する。一部の実施形態では、添付文書は、キットのユーザーに上記の態様及び実施形態のいずれかによる方法を実行するように指示する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＧＢＡシグナルペプチド（ＳＰ）と、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されたＧＢＡ触媒ドメイン（ＧＢＡ−ｃｏ  ＣＤ）とをコードするポリペプチド配列を含む、例示的なＧＢＡ導入遺伝子構築物の図である。
【図１Ｂ】Ｎ末端からＣ末端方向に、ＧＢＡ  ＳＰと、ＡｐｏＥのＲｂドメイン（Ｒｂ−ＡｐｏＥ）と、コドン最適化ＧＢＡ（ＧＢＡ−ｃｏ）とをコードするポリペプチド配列を含む、例示的なＧＢＡ導入遺伝子構築物の図である。
【図１Ｃ】Ｎ末端からＣ末端の方向に、コドン最適化ヒトインスリン様成長因子ＩＩ分泌シグナルペプチド（ＩＧＦ−ＩＩ−ｃｏ  ＳＳＰ）と、Ｒ３７Ａ変異を含むＧＩＬＴタグ（ＧＩＬＴ）と、リンカー（Ｌ）と、ＧＢＡ−ｃｏとをコードするポリペプチド配列を含む、例示的なＧＢＡ導入遺伝子構築物の図である。
【図１Ｄ】Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＩＧＦ−ＩＩ−ｃｏ  ＳＳＰと、第１のリンカー（Ｌ）と、Ｒｂ−ＡｐｏＥと、第２のリンカーと、Ｒ３７Ａ変異を含むＧＩＬＴと、第３のリンカーと、ＧＢＡ−ｃｏとをコードするポリペプチド配列を含む、例示的なＧＢＡ導入遺伝子構築物の図である。
【図１Ｅ】Ｎ末端からＣ末端方向に、ＩＧＦ−ＩＩ−ｃｏ  ＳＳＰと、Ｒ３７Ａ変異を含むＧＩＬＴと、リンカーと、Ｒｂ−ＡｐｏＥと、リンカーと、３つの主要な非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）にマイクロＲＮＡターゲティング配列（ｍｉＲＴ）を含むＧＢＡ−ｃｏとをコードするポリペプチド配列を含む、例示的なＧＢＡ導入遺伝子構築物の図である。
【図１Ｆ】Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＩＧＦ−ＩＩ−ｃｏ  ＳＳＰと、第１のリンカー（Ｌ）と、ＧＢＡ−ｃｏと、第２のリンカーと、Ｒ３７Ａ変異を含むＧＩＬＴとをコードするポリペプチド配列を含む、例示的なＧＢＡ導入遺伝子構築物の図である。
【図１Ｇ】Ｎ末端からＣ末端方向に、ＩＧＦ−ＩＩ−ｃｏ  ＳＳＰと、第１のリンカー（Ｌ）と、ＧＢＡ−ｃｏと、第２のリンカーと、Ｒｂ−ＡｐｏＥとをコードするポリペプチド配列を含む、例示的なＧＢＡ導入遺伝子構築物の図である。
【図２Ａ】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＧＢＡ構築物で形質導入された哺乳動物細胞株におけるＧＢＡ酵素活性及びタンパク質レベルを実証する一連の棒グラフである。図２Ａは、ＧＦＰ（黒色のバー）またはコドン最適化ＧＢＡ（ＧＢＡｃｏ）構築物（灰色のバー）でのレンチウイルス形質導入後のヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞細胞の細胞溶解物から測定されたＧＢＡ酵素活性を示している。ＧＢＡにより酵素的に変換されて蛍光生成物である４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）を生成する４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵＧ）基質を使用して、ＧＢＡ酵素活性を測定した。試験したＧＢＡｃｏ構築物には次が含まれる：１）ＧＢＡｃｏのみ；２）ＧＢＡｃｏ、Ｃ末端グリコシル化非依存的リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）タグ、及びペプチドリンカー；３）ＧＢＡｃｏ及び改変シグナルペプチド配列；４）ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及び剛性ペプチドリンカー；または５）ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及びＸＴＥＮリンカー。レンチウイルスでコードされたＧＢＡｃｏ構築物はすべて、試験した細胞株の両方でＧＢＡ酵素活性の上昇をもたらした。データは平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３の独立した形質導入として表されている。アステリスクは、統計学的有意性に一元ＡＮＯＶＡ検定を使用して決定した場合に、０．０５未満のｐ値を示す。
【図２Ｂ】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＧＢＡ構築物で形質導入された哺乳動物細胞株におけるＧＢＡ酵素活性及びタンパク質レベルを実証する一連の棒グラフである。図２Ｂは、ＧＦＰ（黒色のバー）またはコドン最適化ＧＢＡ（ＧＢＡｃｏ）構築物（灰色のバー）でのレンチウイルス形質導入後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物のウエスタンブロット分析によりアッセイした場合のＧＢＡタンパク質レベルを示している。レンチウイルスでコードされたＧＢＡｃｏ構築物はすべて、試験した細胞株の両方でＧＢＡタンパク質レベルの上昇をもたらした。データは平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３の独立した形質導入として表されている。アステリスクは、統計学的有意性に一元ＡＮＯＶＡ検定を使用して決定した場合に、０．０５未満のｐ値を示す。
【図２Ｃ】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＧＢＡ構築物で形質導入された哺乳動物細胞株におけるＧＢＡ酵素活性及びタンパク質レベルを実証する一連の棒グラフである。図２Ｃは、ＧＦＰ（黒色のバー）またはコドン最適化ＧＢＡ（ＧＢＡｃｏ）構築物（灰色のバー）でのレンチウイルス形質導入後のマウスＲＡＷ２６４．７細胞の細胞溶解物から測定されたＧＢＡ酵素活性を示している。ＧＢＡにより酵素的に変換されて蛍光生成物である４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）を生成する４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵＧ）基質を使用して、ＧＢＡ酵素活性を測定した。試験したＧＢＡｃｏ構築物には次が含まれる：１）ＧＢＡｃｏのみ；２）ＧＢＡｃｏ、Ｃ末端グリコシル化非依存的リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）タグ、及びペプチドリンカー；３）ＧＢＡｃｏ及び改変シグナルペプチド配列；４）ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及び剛性ペプチドリンカー；または５）ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及びＸＴＥＮリンカー。レンチウイルスでコードされたＧＢＡｃｏ構築物はすべて、試験した細胞株の両方でＧＢＡ酵素活性の上昇をもたらした。データは平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３の独立した形質導入として表されている。アステリスクは、統計学的有意性に一元ＡＮＯＶＡ検定を使用して決定した場合に、０．０５未満のｐ値を示す。
【図２Ｄ】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＧＢＡ構築物で形質導入された哺乳動物細胞株におけるＧＢＡ酵素活性及びタンパク質レベルを実証する一連の棒グラフである。２Ｄは、ＧＦＰ（黒色のバー）またはコドン最適化ＧＢＡ（ＧＢＡｃｏ）構築物（灰色のバー）でのレンチウイルス形質導入後のＲＡＷ２６４．７細胞からの細胞溶解物のウエスタンブロット分析によりアッセイした場合のＧＢＡタンパク質レベルを示している。レンチウイルスでコードされたＧＢＡｃｏ構築物はすべて、試験した細胞株の両方でＧＢＡタンパク質レベルの上昇をもたらした。データは平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３の独立した形質導入として表されている。アステリスクは、統計学的有意性に一元ＡＮＯＶＡ検定を使用して決定した場合に、０．０５未満のｐ値を示す。
【図３】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解液から採取したグリコシル化導入遺伝子由来ＧＢＡのウエスタンブロット分析である。細胞を、１）ＧＢＡｃｏのみ；２）ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及び剛性ペプチドリンカー；または３）ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及びＸＴＥＮリンカーを含む群から選択される３つのレンチウイルスでコードされたＧＢＡｃｏ構築物のうちの１つで形質導入した。細胞溶解物をＥｎｄｏＨまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆグリコシダーゼで処理して、電気泳動移動度の上昇によりＮ結合型グリコシル化の変化を評価した。ウエスタンブロット分析は、予測された分子量で操作ＧＢＡｃｏタンパク質を検出し、これは、ＧＩＬＴ及びリンカーペプチドが安定発現されることを示唆している。さらに、操作ＧＢＡタンパク質の電気泳動移動度が酵素的脱グリコシル化後に増加し、これは、これらのタンパク質が生理学的グリコシル化を受けること実証している。
【図４Ａ】野生型及びＧＢＡ変異型マウス由来のマウス系統陰性（Ｌｉｎ−）細胞におけるＧＢＡ酵素活性を実証する一連の棒グラフである。Ｌｉｎ−細胞を骨髄から単離し、ＧＦＰまたはＧＢＡｃｏをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。Ａは、ＧＦＰ（黒色のバー）またはＧＢＡｃｏ（灰色のバー）をコードするベクターで形質導入された野生型マウス及びＧＢＡ欠失遺伝子導入マウス（ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋、ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋；Ｔｈｙ１−ＳＮＣＡ及びＧｂａＤ４０９Ｖ／Ｄ４０９Ｖ）からのＬｉｎ−細胞溶解産物におけるＧＢＡ酵素活性の棒グラフを示している。Ｌｉｎ−細胞の酵素活性は、ヘテロ接合及びホモ接合Ｇｂａ変異がＧＢＡ導入遺伝子の非存在下でそれぞれＧＢＡ活性を４３％及び９２％低下させたことを実証した（ＷＴ：１３．０４±０．６４４ｎｍｏｌ  ｈｒ−１ｍｇ−１；ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋：７．４９±０．２９３ｎｍｏｌ  ｈｒ−１ｍｇ−１；Ｔｈｙ１−ＳＮＣＡ；ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋：７．１４±０．２５２ｎｍｏｌ  ｈｒ−１ｍｇ−１；Ｔｈｙ１−ＳＮＣＡ；ＧｂａＤ４０９Ｖ／Ｄ４０９Ｖ：１．２０±０．１１４ｎｍｏｌ  ｈｒ−１ｍｇ−１；ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後分析を伴うＡＮＯＶＡ、Ａ）。ＧＢＡｃｏ構築物でのＬｉｎ−細胞のレンチウイルス形質導入は、試験したマウス株すべてにわたってＧＢＡ活性をかなり上昇させた（ＧＦＰ対照と比較；Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後分析を伴うＡＮＯＶＡ）。Ｂは、ＧＦＰ（黒色のバー）またはＧＢＡｃｏ（灰色のバー）でのレンチウイルス形質導入後のＧｂａＤ４０９Ｖ／＋、ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋；Ｔｈｙ１−ＳＮＣＡ及びＧｂａＤ４０９Ｖ／Ｄ４０９Ｖマウス（合計ｎ＝８動物）からのＬｉｎ−細胞馴化培地におけるＧＢＡ活性の棒グラフを示しており、これは、ＧＢＡ活性の検出の増加を実証している。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝１つの独立した形質導入）として表されている。まとめると、これらの所見は、レンチウイルスＧＢＡｃｏ構築物が造血幹細胞（例えば、マウスＬｉｎ−細胞において）において機能的ＧＢＡ酵素を産生し、ＧＢＡ欠乏のマウスモデルにおいてＧＢＡの活性及び発現レベルを奪回することができることを実証している。
【図４Ｂ】図４Ａの続きである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
定義
本明細書で使用する場合、「投与」は、任意の有効な経路により、治療薬（例えば、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現するＣＤ３４＋細胞などの多能性細胞、またはＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現する多能性細胞。例えば、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現する多能性細胞は、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を追加的に発現してもよい）を対象に提供または与えることを指す。例示的な投与経路を、本明細書において以下に記載する（例えば、脳室内（ＩＣＶ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、及び定位注射）。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「同種異系」とは、同じ種の異なる対象から採取された、または由来する細胞、組織、ＤＮＡ、または因子を意味する。例えば、同種形質導入多能性細胞がパーキンソン病の対象に投与される状況では、対象ではない患者から得られた細胞に由来する多能性細胞が、ＧＢＡ及び、任意選択で、１つまたは複数のＭ２促進物質の発現を指示するベクターで形質導入またはトランスフェクトされ、その形質導入された細胞が対象に投与される。「発現を指示する」という語句は、発現される分子をコードする配列を含むポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、目的の分子の発現を増強する追加の配列を含み得る。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「自家」とは、個体自身の組織、細胞、またはＤＮＡから採取された、または由来する細胞、組織、ＤＮＡ、または因子に関する。例えば、形質導入された自家の多能性細胞がパーキンソン病の対象に投与される状況では、対象から得られた細胞に由来する多能性細胞が、ＧＢＡ、及び任意選択で１つまたは複数のＭ２促進物質の発現を指示するベクターで形質導入またはトランスフェクトされ、その形質導入された細胞が対象に投与される。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「ＡｐｏＥ」という用語は、脂質輸送に関与するタンパク質のクラスのメンバーであるアポリポタンパク質Ｅを指す。アポリポタンパク質Ｅは、キロミクロン及び中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）の一部である脂肪結合タンパク質（アポリポタンパク質）である。これらは、トリグリセリドに富むリポタンパク質の正常なプロセシング（異化作用）に必須である。ＡｐｏＥはＡＰＯＥ遺伝子によりコードされる。「ＡｐｏＥ」という用語はまた、野生型ＡｐｏＥタンパク質のバリアント、例えば、配列番号２１で示される野生型ＡｐｏＥのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、８６％、例えば８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性、またはそれ以上）を有するタンパク質を指す。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「細胞型」という用語は、遺伝子発現データに基づいて統計的に区別可能な表現型を共有する細胞のグループを指す。例えば、細胞型が共通する細胞は、類似した遺伝子活性化パターン及び抗原提示プロファイルなどの類似した構造及び／または機能的特徴を共有し得る。細胞型が共通する細胞には、共通の組織（例えば、上皮組織、神経組織、結合組織、または筋肉組織）から単離されるもの、及び／または共通の臓器、組織系、血管、または生体の他の構造及び／または領域から単離されるものが含まれ得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「コドン最適化」は、コーディングＤＮＡにおける同義コドン（例えば、同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種では偏っているという原則に従って、核酸配列を改変するプロセスを指す。そのようなコドン縮重は、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によりコードされることを可能にする。このようにして改変された配列は、本明細書では「コドン最適化」と称される。このプロセスは、発現または安定性を増強するために、本明細書に記載の配列のいずれで行われてもよい。コドン最適化は、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５６１，９７２号、第７，５６１，９７３号、及び第７，８８８，１１２号に記載されているような様式で行うことができる。翻訳開始部位を取り巻く配列は、既知の方法に従ってコンセンサスコザック配列に変換することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｚａｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５  （２０）：  ８１２５−８１４８を参照されたい。複数の停止コドンを組み込むことができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「前処置」及び「前処置すること」という用語は、多能性幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を含む移植片を受け取るために対象が準備されるプロセスを指す。そのような手順は、例えば、内因性ミクログリアまたは造血幹細胞を選択的に枯渇させ、それにより外因性多能性幹細胞移植片により満たされる空孔を作ることにより、多能性幹細胞移植片の生着を促進する。本明細書に記載の方法によれば、対象を、多能性幹細胞移植療法のために、内因性ミクログリア及び／または造血幹細胞または前駆細胞を除去することができる１つまたは複数の薬剤（例えば、ブスルファン、トレオスルファン、ＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ６４７、ＰＬＸ５６２２、及びクロドロネートリポソーム）、放射線療法、またはそれらの組み合わせを対象に投与することにより、前処置することができる。前処置は、骨髄破壊的または非骨髄破壊的であってよい。当技術分野で周知の他の細胞除去薬及び方法（例えば、抗体−薬物コンジュゲート）を使用することもできる。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「保存的変異」、「保存的置換」、及び「保存的アミノ酸置換」という用語は、極性、静電荷、及び立体体積などの類似の物理化学的特性を示す１つまたは複数の異なるアミノ酸で１つまたは複数のアミノ酸を置換することを指す。これらの特性を、２０種の天然に存在するアミノ酸のそれぞれについて、下の表１にまとめる。
[表１]
表１．天然に存在するアミノ酸の代表的な物理化学的特性
2021517168.tif 000002
2021517168.tif 000003
【００６４】
この表から、保存的アミノ酸ファミリーには（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ；（ｉｉ）Ｄ及びＥ；（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ及びＴ；（ｉｖ）Ｈ、Ｋ及びＲ；（ｖ）Ｎ及びＱ；（ｖｉ）Ｆ、Ｙ、及びＷが含まれることが分かるであろう。したがって、保存的変異または置換は、同じアミノ酸ファミリーのメンバーを１つのアミノ酸で置換するものである（例えば、ＴｈｒをＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに置換）。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「不安定化ドメイン（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）」及び「不安定化ドメイン（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）」という用語は、それらが作動可能に連結されるタンパク質を不安定化することができる調節エレメントを指す。これらのドメインは、小分子などの特異的外因性リガンドにより安定化され得る。例示的な不安定化ドメインには、これらの不安定化ドメインに融合した他のタンパク質に不安定性を与える、ヒトＦＫ５０６及びラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）の変異体が含まれる。その開示がＦＫＢＰ１２不安定化ドメインに関係するため、参照により本明細書に組み込まれるＢａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １２６：９９５  （２００６）において特徴付けられているとおり、ＦＫＢＰ１２変異体には、Ｎ末端変異体Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ、及びＬ１０６Ｐ、ならびにＣ末端変異体Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、及びＫ１０５Ｉが含まれる。ＦＫＢＰ１２不安定化ドメインはタンパク質分解を促進する。小分子リガンドＳｈｉｅｌｄ−１（Ｓｈｌｄ１）を使用して、ＦＫＢＰ１２変異体含有タンパク質を分解から保護して安定化させることができる。それぞれの開示が不安定化ドメインシステムに関係するため、参照により本明細書に組み込まれるＩｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  １７：９８１  （２０１０）  ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，  １３４：３９４２  （２０１２）に記載のとおり、ＧＢＡまたはＭ２促進物質の発現を調節するために使用することができる他の不安定化ドメインには、目的のタンパク質と融合すると不安定性を与えて分解をもたらし、かつそれぞれ小分子リガンドトリメトプリム（ＴＭＰ）により、またはＣＭＰ８もしくは４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）により安定化され得る大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）の変異体及びヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ）の変異体が含まれる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、遺伝子に関して「破壊する」という用語は、機能的遺伝子産物の形成を阻止することを指す。遺伝子産物は、その正常な（野生型）機能を満たしていれば機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止し、遺伝子によりコードされる配列及び／または動物における遺伝子の発現に必要なプロモーター及び／またはオペレーターにおける１つまたは複数の塩基の挿入、削除、または置換を含む。破壊される遺伝子は、例えば、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するような遺伝子の改変、干渉ＲＮＡ、または外因性遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現により破壊されてもよい。１つまたは複数の遺伝子の発現を破壊するための、多能性幹／前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を遺伝子改変するための材料及び方法は、それぞれの開示がその全体で参照により本明細書に組み込まれる（矛盾する場合、本明細書が優先される）ＵＳ８，５１８，７０１；ＵＳ２０１０／０２５１３９５；及びＵＳ２０１２／０２２２１４３に詳述されている。
【００６７】
本明細書で使用する場合、本明細書に記載の組成物、ベクター構築物、ウイルスベクター、または細胞の「有効量」、「治療有効量」、及び「十分量」という用語は、哺乳動物、例えばヒトを含む対象に投与したときに、臨床結果を含む有益または所望の結果をもたらすために十分な量を指し、したがって、「有効量」またはその同義語は、それが適用される状況に依存する。例えば、パーキンソン病の処置の文脈では、それは、組成物、ベクター構築物、ウイルスベクター、または細胞を投与しなかった場合に得られる応答と比較して、処置応答を達成するために十分な組成物、ベクター構築物、ウイルスベクター、または細胞の量である。そのような量に対応する本明細書に記載の所与の組成物の量は、所与の薬剤、医薬製剤、投与経路、疾患もしくは障害の種類、対象のアイデンティティ（例えば、年齢、性別、体重）または処置される受容者などの様々な因子に応じて変化するが、それにもかかわらず、当業者はルーチン的に決定することができる。また、本明細書で使用する場合、本開示の組成物、ベクター構築物、ウイルスベクター、または細胞の「治療有効量」は、対照と比較して、対象において有益または所望の結果をもたらす量である。本明細書で定義されるとおり、本開示の組成物、ベクター構築物、ウイルスベクター、または細胞の治療有効量は、当業者により、当技術分野で公知のルーチン的な方法により容易に決定され得る。投薬計画を、最適な治療応答が得られるように調節することができる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」及び「ＥＳ細胞」という用語は、適切な条件下でインビトロ培養で維持することができる胚盤胞の内部細胞塊に由来する、胚由来の全能性または多能性幹細胞を指す。ＥＳ細胞は３つの脊椎動物の胚葉、例えば、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉のいずれの細胞にも分化することができる。ＥＳ細胞は、適切なインビトロ培養条件下で無期限に増殖するその能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５  （１９９８）を参照されたい。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「内因性」という用語は、特定の生物（例えば、ヒト）または生物内の特定の場所（例えば、臓器、組織、またはヒト細胞などの細胞）において天然に見い出される分子（例えば、ポリペプチド、核酸、または補因子）を説明している。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「発現する」という用語は、次の事象のうちの１つまたは複数を指す：（１）（例えば転写による）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生；（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’エンドプロセシングによる）ＲＮＡ転写物のプロセシング；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。対象における目的の遺伝子の発現は、例えば、対象から得られたサンプルにおける、対応するタンパク質をコードするｍＲＮＡの量または濃度の増加（例えば、本明細書に記載か、または定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）及びＲＮＡ  ｓｅｑ技術などの当技術分野で公知のＲＮＡ検出手順を使用して評価される）、対応するタンパク質の量または濃度の増加（例えば、本明細書に記載か、またはとりわけ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの当技術分野で公知のタンパク質検出方法を使用して評価される）、及び／または対応するタンパク質の活性の上昇（例えば、酵素の場合、本明細書に記載か、または当技術分野で公知の酵素活性アッセイを使用して評価される）を検出することにより明らかにすることができる。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「外因性」という用語は、特定の生物（例えば、ヒト）または生物内の特定の場所（例えば、臓器、組織、またはヒト細胞などの細胞）において天然には見い出されない分子（例えば、ポリペプチド、核酸、または補因子）を説明する。外因性物質には、外部供給源から生物または生物から抽出された培養物に提供されるものが含まれる。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「ＦＭＤＶ２Ａ」という用語は、口蹄疫ウイルスの２Ａ核酸配列を指す。一般に、ＦＭＤＶ２Ａ配列は、単一のオープンリーディングフレームから等モル量で複数のタンパク質を協調的に発現させることを可能にする機能である。ＦＭＤＶ２Ａは、２Ａ配列により連結されたタンパク質を分離する共翻訳切断事象を媒介する。複数の２Ａ配列を１つのベクターで用いることができ、切断活性は真核生物のリボソームに依存するため、２Ａにより連結されたタンパク質の共発現はほとんどの真核細胞で機能する。複数のタンパク質を発現させるためのＦＭＤＶ２Ａの使用例については、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＲｙａｎ  ａｎｄ  Ｄｒｅｗ，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：９２８  （１９９４）を参照されたい。
【００７３】
本明細書で使用する場合、造血幹細胞などの幹細胞に関連する「機能的可能性」という用語は、１）多能性（限定されないが、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、及びリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞）を含む複数の異なる血液細胞系に分化する能力を指す）、２）自己再生（母細胞と同等の能力を有し、さらにこの能力が消耗することなく個人の生涯を通じて繰り返し発生し得る娘細胞を生じさせる幹細胞の能力を指す）、及び３）幹細胞またはその後代が移植レシピエントに再導入されると、幹細胞ニッチェに帰着し、生産的で持続的な細胞の成長と分化を再確立する能力を含む幹細胞の機能的特性を指す。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「フーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテイン」という用語は、野生型ヒトＩＧＦ−ＩＩペプチドと比較して、フーリン切断が阻止、阻害、低減、または減速されるように、少なくとも１つの天然フーリンプロテアーゼ切断部位を無効にするか、または天然フーリンプロテアーゼ切断部位に近いか、または隣接する配列を変更する、野生型ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１２）と比較して変化したアミノ酸配列を含むインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）ベースのペプチドを指す。本明細書で使用する場合、フーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、フーリンに対して抵抗性であるＩＧＦ−ＩＩムテインとも称される。例示的なフーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１２のＡｒｇ３７及び／またはＡｒｇ４０に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「フーリンプロテアーゼ切断部位」（「フーリン切断部位」または「フーリン切断配列」とも称される）という用語は、フーリンまたはフーリン様プロテアーゼによる酵素的プロテアーゼ切断の認識配列として機能するペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を指す。典型的には、フーリンプロテアーゼ切断部位は、コンセンサス配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇを有し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。切断部位は、配列中のカルボキシ末端アルギニン（Ａｒｇ）残基の後に位置する。一部の実施形態では、フーリン切断部位はコンセンサス配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇを有し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。切断部位は、配列中のカルボキシ末端アルギニン（Ａｒｇ）残基の後に位置する。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「フーリン」という用語は、フーリンまたはフーリン様プロテアーゼを含む、本明細書で定義するとおりのフーリンプロテアーゼ切断部位を認識及び切断することができる任意のプロテアーゼを指す。フーリンはまた、対塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ）としても知られている。フーリンはサブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属する。フーリンをコードする遺伝子は、ＦＵＲ（ＦＥＳ  Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ｒｅｇｉｏｎ）として知られている。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「グリコシル化非依存性リソソームターゲティング」または「ＧＩＬＴ」という用語は、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）非依存性であるリソソームターゲティングを指す。ＧＩＬＴタグは、ＧＩＬＴタグ付き融合タンパク質（例えば、ＩＧＦ−ＩＩムテインに結合されたＧＢＡ融合タンパク質）として発現されるタンパク質（例えば、ＧＢＡ）をリソソームにターゲティングするために使用することができる。
【００７８】
本明細書で互換的に使用する場合、「カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ−ＩＩ受容体」もしくは「ＩＧＦ２受容体」という用語、またはそれらの略語は、Ｍ６Ｐ及びＩＧＦ−ＩＩの両方に結合する細胞受容体を指す。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「ＧＢＡ関連パーキンソン病」または「ＧＢＡ関連ＰＤ」に罹患している患者は、パーキンソン病を有すると診断されており、かつＧＢＡ遺伝子に有害な変異も含む患者である。重度の病原性変異にはｃ．８４ＧＧＩｎｓ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｖ３９４Ｌ、ｐ．Ｄ４０９Ｈ、ｐ．Ｌ４４４Ｐ、及びＲｅｃＴＬが含まれ、これらは、ＰＤ発症のオッズ比９．９２〜２１．２９につながっている。軽度のＧＢＡ変異ｐ．Ｎ３７０Ｓ及びｐ．Ｒ４９６Ｈは、ＰＤ発症のオッズ比２．８４〜４．９４につながっている。変異ｐ．Ｅ３２６ＫもＰＤリスク因子として同定されている。ＧＢＡ変異は、それらの開示がヒトＧＢＡ変異に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる  Ｂａｒｋｈｕｉｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ９３：６  （２０１６）及びＳｉｄｒａｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．  １１：９８６  （２０１２）において論述されている。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「グルコセレブロシダーゼ」及び「ＧＢＡ」という用語は、グルコセレブロシド（グルコシルセラミドとしても公知）のグルコース及びセラミドへの代謝を担うリソソーム酵素を指す。この遺伝子は染色体１ｑ２１に配置されており、ＧＢＡ１としても公知である。「グルコセレブロシダーゼ」及び「ＧＢＡ」という用語は、野生型グルコセレブロシダーゼ酵素のバリアント及びそれをコードする核酸、例えば、野生型ＧＢＡ酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号１）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％の同一性、またはそれ以上）を有するバリアントタンパク質、または野生型ＧＢＡ遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号６）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％の同一性、またはそれ以上）を有するポリヌクレオチドを指すが、ただし、コードされたＧＢＡ類似体が野生型ＧＢＡの治療機能を保持することを条件とする。「ＧＢＡ」はまた、天然シグナルペプチドが存在するＧＢＡタンパク質を指すこともある。「グルコセレブロシダーゼ」及び「ＧＢＡ」という用語は、ＧＢＡをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド、例えば、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％の同一性、またはそれ以上）を有するコドン最適化ポリヌクレオチドも指し得る。別法では、「ＧＢＡ」は、天然シグナルペプチドが除去されたＧＢＡタンパク質（例えば、成熟タンパク質）も指し得る。ＧＢＡは、配列番号１の残基７６〜３８１及び４１６〜４３０を含むドメインなどのＧＢＡの触媒ドメイン、またはそのようなドメインに対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するバリアントを指すこともある。本明細書で使用する場合、ＧＢＡは、当業者には理解されるとおり、文脈に応じて、リソソーム酵素またはこのタンパク質をコードする遺伝子を指すこともある。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「造血幹細胞」及び「ＨＳＣ」という用語は、限定されないが、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、及びリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞）を含む、自己複製し、かつ多様な細胞系の成熟血液細胞に分化する能力を有する未熟血液細胞を指す。そのような細胞はＣＤ３４＋細胞を含んでも、または含まなくてもよいことが当技術分野で知られている。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する未熟細胞である。ヒトでは、ＣＤ３４＋細胞には、上記で定義した幹細胞特性を持つ細胞の亜集団が含まれると考えられるが、マウスでは、ＨＳＣはＣＤ３４−である。加えて、ＨＳＣは、長期再増殖ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）及び短期再増殖ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）も指す。ＬＴ−ＨＳＣ及びＳＴ−ＨＳＣは、機能的可能性及び細胞表面マーカーの発現に基づき区別される。例えば、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９Ｆ＋、及びｌｉｎ−（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２３５Ａを含む成熟細胞系マーカーについて陰性）である。マウスでは、骨髄ＬＴ−ＨＳＣは、ＣＤ３４−、ＳＣＡ−１＋、Ｃ−ｋｉｔ＋、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−及びｌｉｎ−（Ｔｅｒ１１９、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＩＬ−７ｒａなどの成熟細胞系マーカーについて陰性）であるが、ＳＴ−ＨＳ  Ｃａｒｅは、ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｃ−ｋｉｔ＋、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋、及びｌｉｎ−（Ｔｅｒ１１９、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＩＬ−７ｒａを含む成熟細胞系マーカーについて陰性）である。加えて、ＳＴ−ＨＳＣは、恒常性条件下でＬＴ−ＨＳＣよりも静止しておらず（すなわち、よりアクティブであり）、より増殖性である。しかしながら、ＬＴ−ＨＳＣは、より高い自己再生能力（すなわち、成人期を通じて存続し、継代レシピエントを通じて連続して移植することができる）を有するが、ＳＴ−ＨＳＣは、限られた自己再生能力を有する（すなわち、限られた期間しか生存せず、かつ連続移植能力を持たない）。これらのＨＳＣのいずれも、本明細書に記載の方法のいずれかで使用することができる。任意選択で、ＳＴ−ＨＳＣは、非常に増殖性が高く、したがって分化した後代をより迅速に生じさせることができるため、有用である。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「ＨＬＡマッチの」という用語は、造血幹細胞移植療法を必要とするレシピエントに造血幹細胞移植片を提供するドナーなど、ドナーとレシピエントとの間でＨＬＡ抗原のいずれもミスマッチしないドナー−レシピエントのペアを指す。ＨＬＡマッチの（すなわち、６つの対立遺伝子すべてがマッチする）ドナー−レシピエントのペアは、内因性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が外来移植片を異物として認識する可能性が低く、したがって移植片に対する免疫応答を開始する可能性が低いため、移植片拒絶のリスクが低い。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ＨＬＡミスマッチの」という用語は、造血幹細胞移植療法を必要とするレシピエントに造血幹細胞移植片を提供するドナーなど、ドナーとレシピエントとの間で特にＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲに関して、少なくとも１つのＨＬＡ抗原がミスマッチしているドナー−レシピエントのペアを指す。一部の実施形態では、一方のハプロタイプは一致し、他方はミスマッチする。ＨＬＡミスマッチのドナー−レシピエントのペアの場合には内因性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が、外来移植片を異物として認識する可能性が高く、したがってそのようなＴ細胞及びＮＫ細胞が移植片に対する免疫応答を開始する可能性がより高いので、ＨＬＡミスマッチのドナー−レシピエントのペアは、ＨＬＡマッチのドナー−レシピエントのペアと比較して、移植片拒絶のリスクが高くなり得る。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「人工多能性幹細胞」、「ｉＰＳ細胞」、及び「ｉＰＳＣ」という用語は、分化した体細胞に直接由来し得る多能性幹細胞を指す。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリー転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリー転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、クルッペル様ファミリー（ＫＬＦ）転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、及び／またはＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８などの関連転写因子及び／またはＧｌｉｓ１が含まれ得る、特異的なセットの再プログラミング因子を非多能性細胞に導入することにより生成することができる。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、ｍｉＲＮＡ、転写因子の作用を模倣する小分子、または細胞系指定子の使用により生成することもできる。ヒトｉＰＳ細胞は、３つの脊椎動物の胚葉、例えば内胚葉、外胚葉、または中胚葉の任意の細胞に分化するそれらの能力により特徴づけられる。ヒトｉＰＳ細胞は、適切なインビトロ培養条件下で無期限に増殖するそれらの能力によっても特徴づけられる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｃｅｌｌ  １２６：６６３  （２００６）を参照されたい。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「ＩＲＥＳ」という用語は、内部リボソーム進入部位を指す。一般に、ＩＲＥＳ配列は、真核生物のリボソームがｍＲＮＡ転写物に結合し、５’キャップ末端に結合せずに翻訳を開始することを可能にする機能である。ＩＲＥＳ配列を含むｍＲＮＡは２つの翻訳産物を生成し、１つはｍＲＮＡの５’末端から開始し、もう１つはＩＲＥＳにより媒介される内部翻訳機構から開始する。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「Ｍ２促進物質」という用語は、さらなる抗炎症状態へと細胞をシフトさせることによりマクロファージまたはミクログリアの分極に影響を及ぼす作用物質を指す。Ｍ２促進物質には、マクロファージまたはミクログリアによる古典的活性化／Ｍ１に関連する炎症誘発性サイトカイン及び遺伝子、例えば、ＩＬ−１β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｉＮＯＳ、またはＩＬ−１２の分泌及び／または発現を減少させることができるものが含まれる。例えば、Ｍ２促進物質は、活性化マクロファージまたはミクログリアの集団をその物質の存在下で、例えば、約２時間〜２４時間（例えば、約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、または２４時間）にわたって培養した場合に、炎症誘発性サイトカイン及びＩＬ−１β、ＴＮＦ、ｉＮＯＳ、またはＩＬ−１２などの古典的Ｍ１活性化に関連する遺伝子の分泌または発現を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、５００％、またはそれ以上減少させることができる物質である。加えてＭ２促進物質には、抗炎症性サイトカイン及びマクロファージまたはミクログリアによる代替の活性化／Ｍ２に関連する遺伝子、例えばＩＬ−２５、ＩＬ−１０、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、ＣＤ１６３、もしくはＴＲＥＭ２の分泌及び／または発現を増加させる、または細胞の形態または形状を変化させる、例えば、分岐を増加させることができるものが含まれる。例えば、Ｍ２促進物質は、活性化マクロファージまたはミクログリアの集団をその物質の存在下で、例えば、約２時間〜２４時間（例えば、約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、または２４時間）の期間にわたって培養した場合に、抗炎症性サイトカイン及び代替Ｍ２活性化に関連する遺伝子、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＣＤ１６３、またはＴＲＥＭ２の分泌または発現を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、５００％、またはそれ以上増加させることができる物質である。細胞培養培地中の分泌されたサイトカインの濃度を決定するために適切な技術は、例えば、当技術分野で公知の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である。加えて、目的の遺伝子の発現を定量化するために使用することができる技術には、限定されないが、当技術分野で公知の定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが含まれる。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「モノシストロニック」という用語は、単一のタンパク質またはポリペプチド産物のコーディング配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡ構築物を指す。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「骨髄破壊的」または「骨髄破壊」という用語は、典型的には細胞毒性薬（例えば、ブスルファン）または放射線への曝露により、造血系を実質的に損傷または破壊する前処置レジメンを指す。骨髄破壊は、造血系を破壊する高用量の細胞毒性剤または全身照射によりもたらされる完全な骨髄破壊を含む。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「非骨髄破壊性」または「骨髄抑制性」という用語は、宿主起源の実質的にすべての造血細胞を排除しない前処置レジメンを指す。
【００９０】
本明細書で使用する場合、「ポリシストロニック」という用語は、１種よりも多いタンパク質またはポリペプチド産物のコーディング配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡ構築物を指す。例示的なポリシストロニックベクターには、ＷＯ１９９３／００３１４３、Ｒｙａｎ  ａｎｄ  Ｄｒｅｗ，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：９２８  （１９９４）、Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ａｎｄ  Ｖｉｇｎａｌｉ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ５：６２７  （２００５）、Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：５８９  （２００４）、及びＯｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：５６９  （２００５）に記載のものが含まれる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「多能性細胞」という用語は、造血細胞系（例えば、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、及びリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞）の細胞型などの１種よりも多い分化細胞型に成長する能力を有する細胞を指す。多能性細胞の例は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）である。例示的な多能性細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」という用語は、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る染色体外環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。プラスミドはベクターの１種であり、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ある特定のプラスミドは、それらが導入された宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌起源の複製を有する細菌プラスミド及びエピソーム性哺乳動物プラスミド）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）が、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。ある特定のプラスミドは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ上の認識部位を指す。ポリメラーゼは導入遺伝子の転写を駆動する。本明細書に記載の組成物及び方法で使用するために適した例示的なプロモーターは、例えば、その開示が核酸調節エレメントに関係するため、参照により本明細書に組み込まれるＳａｎｄｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：４２４  （２００７）に記載されている。
【００９４】
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインさせ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後に、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における核酸またはアミノ酸と同一である候補配列における核酸またはアミノ酸のパーセンテージと定義される。核酸及びアミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、当業者の能力の範囲内である様々な方式で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアなどの公共利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするために適切なパラメータを決定することができる。例えば、配列同一性パーセント値を、配列比較コンピュータープログラムＢＬＡＳＴを使用して生成することができる。一例示として、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比した、所与の核酸またはアミノ酸配列Ａの配列同一性パーセント（代替的に、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比したある特定の配列同一性パーセントを有する所与の核酸またはアミノ酸配列Ａとも表現され得る）は、次のように算出される：
１００掛ける（分数Ｘ／Ｙ）
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムのアラインメントで、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）により同一のマッチとしてスコア付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂの核酸の総数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性パーセントは、Ａに対するＢの配列同一性パーセントに等しくないことは分かるであろう。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題となる合併症を伴うことなく哺乳動物（例えば、ヒト）などの対象の組織と接触させるために適した、妥当なベネフィット／リスク比に見合う化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す。
【００９６】
本明細書で使用する場合、強力な「ＡｐｏＥ由来の受容体結合ペプチド（Ｒｂ）」は、融合タンパク質として操作された場合、タンパク質をＢＢＢを超えて脳に移動させる能力を有する。したがって、この方法は、融合タンパク質として操作された場合、治療薬（例えば、可溶性ＧＢＡ）のためにＢＢＢを選択的に開けるように機能し得る。このペプチドは、ＡｐｏＥタンパク質全体ではなく、ＡｐｏＥのＲｂドメインを利用するため、生物学的機能を危険にさらしたり、またはＡｐｏＥの重要な生物学的機能を妨害したりすることなく、診断薬または治療薬に容易に結合させることができる。この経路はまた、脳実質におけるＬＤＬＲｆメンバーの広範な発現により、薬剤がＣＮＳに到達した後のさらなる／二次的脳内分布を促進することができる代替の取り込み経路である。例示的なＲｂドメインは、ＡｐｏＥのＮ末端において見い出され得る。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なＲｂドメインは、配列番号２１の残基１〜１９１のアミノ酸配列、配列番号２１の残基２５〜１８５、配列番号２１の残基５０〜１８０、配列番号２１の残基７５〜１７５、配列番号２１の残基１００〜１７０、または配列番号２１の残基１２５〜１６５を有するポリペプチド、さらにはこれらの配列のいずれかに関して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するポリペプチドなどのそのバリアントである。例示的なＲｂドメインは、配列番号２１の残基１５９〜１６７のアミノ酸配列を有するＡｐｏＥの領域である。
【００９７】
本明細書で使用する場合、「調節配列」という用語には、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。そのような調節配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｅｄｄｅｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  （１９９０））に記載されている。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「サンプル」という用語は、対象から単離された検体（例えば、血液、血液成分（例えば、血清または血漿））、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織（例えば、胎盤または皮膚）、膵液、絨毛膜絨毛サンプル、及び細胞）を指す。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「分泌シグナルペプチド」という用語は、前駆体タンパク質の分泌物を宿主の細胞質から細胞周辺腔または細胞外腔へと向ける、前駆体タンパク質内の短い（通常は１６〜６０アミノ酸）ペプチド領域を指す。そのような分泌シグナルペプチドは一般に、前駆体タンパク質のアミノ末端に配置される。一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、アミノ末端に連結されており、それが連結されているタンパク質に対して異種であってもよい。典型的には、分泌シグナルペプチドは、細胞分泌経路を通過する間に切断される。分泌されたタンパク質がその望ましい活性を保持している限り、切断は必須ではない。例示的な分泌シグナルペプチドには、ＩＧＦ−ＩＩ、アルファ−１アンチトリプシン、及びＧＢＡからのものが含まれる。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「シグナルペプチド」という用語は、成熟タンパク質には典型的には存在しない、前駆体タンパク質に（典型的にはＮ末端に）存在する短い（通常は１６〜６０アミノ酸）ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは、細胞膜を介しての翻訳されたタンパク質の輸送を指示する。シグナルペプチドは、ターゲティングシグナル、トランジットペプチド、ローカリゼーションシグナル、またはシグナル配列とも呼ばれる。例えば、シグナル配列は、同時翻訳または翻訳後シグナルペプチドであってもよい。例示的なシグナルペプチドには、ＧＢＡシグナルペプチドが含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４１：１０１６−１０２４  （１９８７）に記載されているとおりの３９アミノ酸ＧＢＡシグナルペプチド）。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「幹細胞」及び「未分化細胞」という用語は、複数の細胞型に分化する発生能を有する未分化または部分的に分化した状態の細胞を指す。幹細胞は、その機能的可能性を維持しながら増殖して、より多くのそのような幹細胞を生じさせることができる。幹細胞は非対称的に分裂することができ、これは義務的非対称分化として知られ、一方の娘細胞は親幹細胞の機能的能力を保持し、他方の娘細胞は、親細胞とは多少異なる他の特異的な機能、表現型及び／または発生能を発現する。親の発生能を有する１つまたは複数の細胞も保持しながら増殖し、かつ１つまたは複数の成熟した細胞タイプに後で分化する後代を生じるように、娘細胞そのものを誘導することができる。分化細胞は、それ自体が多能性細胞に由来する多能性細胞などに由来してもよい。別法では、集団中の幹細胞の一部は２つの幹細胞に対称的に分裂することができる。したがって、「幹細胞」という用語は、特定の状況下では、より特殊化または分化した表現型に分化する発生能を有し、ある特定の状況下では、実質的に分化することなく増殖する能力を保持している細胞の任意のサブセットを指す。一部の実施形態では、幹細胞という用語は一般的に、その子孫（子孫細胞）が、分化によって、例えば、胚細胞及び組織の徐々に進行する多様化において起こるように、完全にそれぞれ異なる特徴を獲得することによって特殊化する、多くの場合に種々の方向に特殊化する、天然に存在する親細胞を指す。一部の分化細胞は、より優れた発生能の細胞を生じる能力も持つ。このような能力は天然でもよいし、または様々な因子で処理することで人為的に誘導されてもよい。幹細胞として始まった細胞は、分化表現型に進み得るが、「逆戻り」させ、次いで、幹細胞表現型を再発現するように誘導することができ、この用語は、当業者によって「脱分化」または「リプログラミング」または「逆分化」と呼ばれることが多い。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「トランスフェクション」という用語は、外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞に導入するために一般に使用される多種多様な技術のいずれか、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、スクイーズ−ポレーション、ソノポレーション、光学トランスフェクション、Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ、インペールフェクションなどを指す。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」という用語は、遺伝子産物（例えば、ＧＢＡ）をコードする組換え核酸（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を指す。遺伝子産物は、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質であり得る。遺伝子産物のコード領域に加えて、導入遺伝子は、プロモーター、エンハンサー（複数可）、不安定化ドメイン（複数可）、応答エレメント（複数可）、レポーターエレメント（複数可）、インスレーターエレメント（複数可）、ポリアデニル化シグナル（複数可）及び／または他の機能エレメントなどの発現を促進または増強する１つまたは複数のエレメントを含むか、またはそれらに作動可能に連結していてもよい。本発明の実施形態は、任意の公知の適切なプロモーター、エンハンサー（複数可）、不安定化ドメイン（複数可）、応答エレメント（複数可）、レポーターエレメント（複数可）、インスレーターエレメント（複数可）、ポリアデニル化シグナル（複数可）、及び／または他の機能的エレメントを利用してもよい。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「対象」または「患者」という用語は、動物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）を指す。本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、パーキンソン病もしくはＧＢＡ関連パーキンソン病と診断されている対象、またはこれらの状態を発症するリスクのある対象であり得る。診断は、当技術分野で公知の任意の方法または技法により行うことができる。当業者は、本開示に従って処置される対象が、標準検査を受けていてもよいし、または検査なしに、病気や状態に関連する１つまたは複数のリスク因子の存在によってリスクのあるものとして同定されていてもよいことを理解するであろう。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「形質導入」及び「形質導入する」という用語は、ベクター構築物またはその一部を細胞に導入する方法を指す。ベクター構築物が、例えばレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターに含まれる場合、形質導入は、細胞のウイルス感染、及びその後のベクター構築物またはその一部の細胞ゲノムへの移入及び組み込みを指す。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、疾患または状態に関連する「処置」または「処置する」は、有益または所望の結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを指す。有益または所望の結果には、限定されないが、検出可能または検出不可能にかかわらず、１つまたは複数の症状または状態の緩和または改善；疾患または状態の程度の縮小；疾患、障害、または状態の状況の安定化（すなわち、悪化しない）；疾患または状態の進展の予防；疾患または状態の進行の遅延または減速；疾患または状態の改善または緩和；及び寛解（部分的か、または完全かにかかわらず）が含まれる。疾患または状態を「改善すること」または「緩和すること」は、処置がない場合の程度または時間経過と比較して、疾患、障害、または状態の程度及び／または望ましくない臨床兆候が減少し、及び／または進行の時間経過が減速または延長されることを意味する。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。処置を必要とする者には、状態もしくは障害を既に有する者、さらには状態もしくは障害を有し易い者、または病態もしくは障害を予防する必要がある者が含まれる。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語には、核酸ベクター、例えば、プラスミドなどのＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルス、または他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）が含まれる。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に送達するための様々なベクターが開発されている。そのような発現ベクターの例は、例えば、目的の遺伝子の発現に適したベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９９４／０１１０２６に開示されている。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、さらには例えば、タンパク質の発現及び／またはこれらのポリヌクレオチド配列の哺乳動物細胞のゲノムへの組み込みに使用される追加の配列エレメントを含む。本明細書に記載のＧＢＡ及びＭ２促進物質の発現に使用することができる、ある特定のベクターには、プロモーター及びエンハンサー領域など、遺伝子転写を指示する調節配列を含むプラスミドが含まれる。ＧＢＡ及びＭ２促進物質の発現のための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を高める、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性もしくは核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、例えば、発現ベクターで運ばれる遺伝子の効率的な転写を指示するために、５’及び３’非翻訳領域、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用するために適した発現ベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。適切なマーカーの例は、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ヌーセオトリシン、またはゼオシンなどの抗生物質に対する抵抗性をコードする遺伝子である。
【０１０８】
詳細な説明
対象（哺乳動物対象、例えば、ヒトなど）におけるパーキンソン病（ＰＤ）を処置するための組成物及び方法を本明細書では記載する。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）をコードする導入遺伝子を発現するＣＤ３４＋細胞などの多能性細胞を投与することにより、対象（例えば、ヒト対象）におけるパーキンソン病（例えば、ＧＢＡ関連パーキンソン病）を処置することができる。例えば、ＧＢＡを発現するようにエクスビボで改変された多能性細胞を含む組成物を本明細書では記載する。以下のセクションでは、パーキンソン病を処置するために有用な組成物及び方法をさらに詳細に記載する。
【０１０９】
パーキンソン病
ＰＤは運動に影響を及ぼす進行性の障害であり、アルツハイマー病に次いで２番目に多い神経変性疾患として認識されている。ＰＤに共通する症状には、安静時振戦、硬直、及び運動緩慢が含まれ、うつ病、便秘、疼痛、睡眠障害、泌尿生殖器系の問題、認知機能の低下、及び嗅覚障害などの非運動症状もますます、ＰＤに関連づけられている。ＰＤの重要な特徴は、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロンの死滅であり、そのため、ＰＤの最新の処置はドーパミンの増加に焦点を当てている。ＰＤの別の周知の神経病理学的特徴は、ＰＤによる影響を受けた脳領域にα−シヌクレインを含むレビー小体が存在することであり、これが、この疾患に寄与していると考えられている。
【０１１０】
ＰＤは、遺伝的及び環境的リスク因子の組み合わせから生じると考えられている。パーキンソン病のすべての症例の原因となる単一の遺伝子はなく、ＰＤ症例の大部分は散発性であり、直接的に遺伝しないようである。パーキン、ＰＴＥＮ誘発推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、及びパーキンソニズム関連デグリカーゼ（ＤＪ−１）をコードする遺伝子の変異が、ＰＤに関連していることが見い出されているが、それらはＰＤ症例の総数のうちの小さなサブセットを表しているに過ぎない。一部の農薬及び除草剤への職業上の暴露も、ＰＤのリスク因子として提案されている。合成神経毒ＭＰＴＰはパーキンソン症候群を引き起こし得るが、その使用は非常にまれである。
【０１１１】
ＧＢＡ関連パーキンソン病
最近の研究では、ＧＢＡ遺伝子の変異とＰＤのリスクの増加との関連が示されており、その際、より重度の変異がより高レベルのリスクをもたらす。グルコセレブロシダーゼは、グルコセレブロシド（グルコシルセラミドとしても公知）のグルコースとセラミドへの代謝を担うリソソーム酵素である。これは、特にマクロファージ／単球細胞系統においてスフィンゴ脂質の分解に重要な役割を果たす。ＰＤ患者の黒質、小脳、及び尾状核において、ＧＢＡ活性の低下が報告されているが、ＧＢＡ活性が年齢とともに低下することも示されている（ＰＤにおけるＧＢＡ活性に関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＡｌｃａｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  １３８：２６４８  （２０１５）を参照されたい）。重度の病原性変異にはｃ．８４ＧＧＩｎｓ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｖ３９４Ｌ、ｐ．Ｄ４０９Ｈ、ｐ．Ｌ４４４Ｐ、及びＲｅｃＴＬが含まれ、これらは、ＰＤ発症のオッズ比９．９２〜２１．２９につながっている。軽度のＧＢＡ変異ｐ．Ｎ３７０Ｓ及びｐ．Ｒ４９６Ｈは、ＰＤ発症のオッズ比２．８４〜４．９４につながっている。変異ｐ．Ｅ３２６ＫもＰＤリスク因子として同定されている。ＧＢＡ変異は、それらの開示がヒトＧＢＡ変異に関与するため、参照により本明細書に組み込まれるＢａｒｋｈｕｉｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ９３：６  （２０１６）及びＳｉｄｒａｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．  １１：９８６  （２０１２）において論述されている。これらの変異はまた、変異タンパク質がＥＲにトラップされるときに、小胞体（ＥＲ）ストレスを活性化することによる毒性機能の獲得も誘発し得る。ＧＢＡ変異を伴うＰＤ脳ではＥＲストレスのマーカーが上昇し、ＥＲカルシウム貯蔵の調節不全が、ＰＤに関連するＧＢＡ変異を含む細胞モデルで報告されている。加えて、これらの変異体は、神経細胞における分解されるべきミスフォールディングされたポリペプチドの総負担を増加させ、細胞資源の転用により細胞機能の変化をもたらし得る。毒性機能の獲得及び／または細胞資源の転換による細胞機能の変化をもたらすＧＢＡ変異は、それらの開示がヒトＧＢＡ変異に関係するため、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ７２：４５５−４６３  （２０１２）、Ｓｃｈｏｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ５：４０２８  （２０１４）、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｕｉｍ．  ５９：１２−２０  （２０１６）、及びＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．６９：９４０−９５３  （２０１１）において論述されている。それらの開示がＧＢＡとα−シヌクレインとの間の関係に関連するため、参照により本明細書に開示されるＲｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ＆  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２３：  ５５０  （２０１５）及びＲｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ８２：４９５  （２０１５）に記載されてるとおり、ＰＤのげっ歯類モデルにおける研究では、ＧＢＡ活性とα−シヌクレイン蓄積との関連���示唆されている。
【０１１２】
パーキンソン病の処置は、長い間ドーパミンの補充に焦点を当てていた。疾患の症状を処置しているだけのこれらの処置とは異なり、本明細書に記載の組成物及び方法は、パーキンソン病の発症の根底にあり得る別の生化学的現象を処置するという利点を提供する。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の生理学的原因をターゲティングし、治癒的治療の可能性を表す。本明細書に記載の組成物及び方法は、ＧＢＡを発現する多能性細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を投与することにより、ＰＤを処置するために使用することができる。これらの組成物及び方法を使用すると、いずれの病因、例えば、遺伝子変異、環境毒素、または散発性によるパーキンソン病も処置することができる。これらの組成物及び方法はまた、ＧＢＡ関連ＰＤ、例えばＧＢＡ遺伝子の変異に関連するＰＤを有する患者を処置するために使用することもできる。本明細書に記載の組成物及び方法は、正常なＧＢＡ活性、低下したＧＢＡ活性を有する患者、及びそのＧＢＡ変異状態及び／またはＧＢＡ活動レベルが不明な患者を処置するために使用することができる。本明細書に記載の組成物及び方法は、パーキンソン病を発症するリスクのある患者、例えばＧＢＡ変異を有する患者、ＧＢＡ活性が低下した患者、またはパーキン、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、またはＤＪ−１をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数に変異を有する患者に予防的処置として投与することもできる。ＰＤに罹患している患者に投与される細胞は、ＧＢＡに加えて、１つまたは複数のＭ２促進物質を発現してもよい。
【０１１３】
本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて使用することができるＧＢＡをコードする構築物は、野生型ＧＢＡをコードするポリヌクレオチド（そのアミノ酸配列は配列番号１として下に示されている）またはそのバリアント、例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする構築物は、配列番号１の残基７６〜３８１及び４１６〜４３０を含むドメインなど、ＧＢＡの触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする構築物は、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする構築物は、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するコドン最適化ポリヌクレオチドであってもよく、それにより、内因性ＧＢＡに向けられたヌクレアーゼ及び阻害性ＲＮＡによる分解に対する抵抗性を付与する。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、ＧＢＡ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態において、ＧＢＡ融合タンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号１０の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸配列を有する。
【０１１４】
野生型ヒトＧＢＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＣ６３０５６．１）は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＥＦＳＳＰＳＲＥＥＣＰＫＰＬＳＲＶＳＩＭＡＧＳＬＴＧＬＬＬＬＱＡＶＳＷＡＳＧＡＲＰＣＩＰＫＳＦＧＹＳＳＶＶＣＶＣＮＡＴＹＣＤＳＦＤＰＰＴＦＰＡＬＧＴＦＳＲＹＥＳＴＲＳＧＲＲＭＥＬＳＭＧＰＩＱＡＮＨＴＧＴＧＬＬＬＴＬＱＰＥＱＫＦＱＫＶＫＧＦＧＧＡＭＴＤＡＡＡＬＮＩＬＡＬＳＰＰＡＱＮＬＬＬＫＳＹＦＳＥＥＧＩＧＹＮＩＩＲＶＰＭＡＳＣＤＦＳＩＲＴＹＴＹＡＤＴＰＤＤＦＱＬＨＮＦＳＬＰＥＥＤＴＫＬＫＩＰＬＩＨＲＡＬＱＬＡＱＲＰＶＳＬＬＡＳＰＷＴＳＰＴＷＬＫＴＮＧＡＶＮＧＫＧＳＬＫＧＱＰＧＤＩＹＨＱＴＷＡＲＹＦＶＫＦＬＤＡＹＡＥＨＫＬＱＦＷＡＶＴＡＥＮＥＰＳＡＧＬＬＳＧＹＰＦＱＣＬＧＦＴＰＥＨＱＲＤＦＩＡＲＤＬＧＰＴＬＡＮＳＴＨＨＮＶＲＬＬＭＬＤＤＱＲＬＬＬＰＨＷＡＫＶＶＬＴＤＰＥＡＡＫＹＶＨＧＩＡＶＨＷＹＬＤＦＬＡＰＡＫＡＴＬＧＥＴＨＲＬＦＰＮＴＭＬＦＡＳＥＡＣＶＧＳＫＦＷＥＱＳＶＲＬＧＳＷＤＲＧＭＱＹＳＨＳＩＩＴＮＬＬＹＨＶＶＧＷＴＤＷＮＬＡＬＮＰＥＧＧＰＮＷＶＲＮＦＶＤＳＰＩＩＶＤＩＴＫＤＴＦＹＫＱＰＭＦＹＨＬＧＨＦＳＫＦＩＰＥＧＳＱＲＶＧＬＶＡＳＱＫＮＤＬＤＡＶＡＬＭＨＰＤＧＳＡＶＶＶＶＬＮＲＳＳＫＤＶＰＬＴＩＫＤＰＡＶＧＦＬＥＴＩＳＰＧＹＳＩＨＴＹＬＷＲＲＱ（配列番号１）
【０１１５】
ＧＢＡ融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＥＦＳＳＰＳＲＥＥＣＰＫＰＬＳＲＶＳＩＭＡＧＳＬＴＧＬＬＬＬＱＡＶＳＷＡＳＧＡＲＰＣＩＰＫＳＦＧＹＳＳＶＶＣＶＣＮＡＴＹＣＤＳＦＤＰＰＴＦＰＡＬＧＴＦＳＲＹＥＳＴＲＳＧＲＲＭＥＬＳＭＧＰＩＱＡＮＨＴＧＴＧＬＬＬＴＬＱＰＥＱＫＦＱＫＶＫＧＦＧＧＡＭＴＤＡＡＡＬＮＩＬＡＬＳＰＰＡＱＮＬＬＬＫＳＹＦＳＥＥＧＩＧＹＮＩＩＲＶＰＭＡＳＣＤＦＳＩＲＴＹＴＹＡＤＴＰＤＤＦＱＬＨＮＦＳＬＰＥＥＤＴＫＬＫＩＰＬＩＨＲＡＬＱＬＡＱＲＰＶＳＬＬＡＳＰＷＴＳＰＴＷＬＫＴＮＧＡＶＮＧＫＧＳＬＫＧＱＰＧＤＩＹＨＱＴＷＡＲＹＦＶＫＦＬＤＡＹＡＥＨＫＬＱＦＷＡＶＴＡＥＮＥＰＳＡＧＬＬＳＧＹＰＦＱＣＬＧＦＴＰＥＨＱＲＤＦＩＡＲＤＬＧＰＴＬＡＮＳＴＨＨＮＶＲＬＬＭＬＤＤＱＲＬＬＬＰＨＷＡＫＶＶＬＴＤＰＥＡＡＫＹＶＨＧＩＡＶＨＷＹＬＤＦＬＡＰＡＫＡＴＬＧＥＴＨＲＬＦＰＮＴＭＬＦＡＳＥＡＣＶＧＳＫＦＷＥＱＳＶＲＬＧＳＷＤＲＧＭＱＹＳＨＳＩＩＴＮＬＬＹＨＶＶＧＷＴＤＷＮＬＡＬＮＰＥＧＧＰＮＷＶＲＮＦＶＤＳＰＩＩＶＤＩＴＫＤＴＦＹＫＱＰＭＦＹＨＬＧＨＦＳＫＦＩＰＥＧＳＱＲＶＧＬＶＡＳＱＫＮＤＬＤＡＶＡＬＭＨＰＤＧＳＡＶＶＶＶＬＮＲＳＳＫＤＶＰＬＴＩＫＤＰＡＶＧＦＬＥＴＩＳＰＧＹＳＩＨＴＹＬＷＲＲＱＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＡＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号２）
【０１１６】
別法では、ＧＢＡ融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＥＦＳＳＰＳＲＥＥＣＰＫＰＬＳＲＶＳＩＭＡＧＳＬＴＧＬＬＬＬＱＡＶＳＷＡＳＧＡＲＰＣＩＰＫＳＦＧＹＳＳＶＶＣＶＣＮＡＴＹＣＤＳＦＤＰＰＴＦＰＡＬＧＴＦＳＲＹＥＳＴＲＳＧＲＲＭＥＬＳＭＧＰＩＱＡＮＨＴＧＴＧＬＬＬＴＬＱＰＥＱＫＦＱＫＶＫＧＦＧＧＡＭＴＤＡＡＡＬＮＩＬＡＬＳＰＰＡＱＮＬＬＬＫＳＹＦＳＥＥＧＩＧＹＮＩＩＲＶＰＭＡＳＣＤＦＳＩＲＴＹＴＹＡＤＴＰＤＤＦＱＬＨＮＦＳＬＰＥＥＤＴＫＬＫＩＰＬＩＨＲＡＬＱＬＡＱＲＰＶＳＬＬＡＳＰＷＴＳＰＴＷＬＫＴＮＧＡＶＮＧＫＧＳＬＫＧＱＰＧＤＩＹＨＱＴＷＡＲＹＦＶＫＦＬＤＡＹＡＥＨＫＬＱＦＷＡＶＴＡＥＮＥＰＳＡＧＬＬＳＧＹＰＦＱＣＬＧＦＴＰＥＨＱＲＤＦＩＡＲＤＬＧＰＴＬＡＮＳＴＨＨＮＶＲＬＬＭＬＤＤＱＲＬＬＬＰＨＷＡＫＶＶＬＴＤＰＥＡＡＫＹＶＨＧＩＡＶＨＷＹＬＤＦＬＡＰＡＫＡＴＬＧＥＴＨＲＬＦＰＮＴＭＬＦＡＳＥＡＣＶＧＳＫＦＷＥＱＳＶＲＬＧＳＷＤＲＧＭＱＹＳＨＳＩＩＴＮＬＬＹＨＶＶＧＷＴＤＷＮＬＡＬＮＰＥＧＧＰＮＷＶＲＮＦＶＤＳＰＩＩＶＤＩＴＫＤＴＦＹＫＱＰＭＦＹＨＬＧＨＦＳＫＦＩＰＥＧＳＱＲＶＧＬＶＡＳＱＫＮＤＬＤＡＶＡＬＭＨＰＤＧＳＡＶＶＶＶＬＮＲＳＳＫＤＶＰＬＴＩＫＤＰＡＶＧＦＬＥＴＩＳＰＧＹＳＩＨＴＹＬＷＲＲＱＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＡＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号３）
【０１１７】
別法では、ＧＢＡ融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＥＦＳＳＰＳＲＥＥＣＰＫＰＬＳＲＶＳＩＭＡＧＳＬＴＧＬＬＬＬＱＡＶＳＷＡＳＧＡＲＰＣＩＰＫＳＦＧＹＳＳＶＶＣＶＣＮＡＴＹＣＤＳＦＤＰＰＴＦＰＡＬＧＴＦＳＲＹＥＳＴＲＳＧＲＲＭＥＬＳＭＧＰＩＱＡＮＨＴＧＴＧＬＬＬＴＬＱＰＥＱＫＦＱＫＶＫＧＦＧＧＡＭＴＤＡＡＡＬＮＩＬＡＬＳＰＰＡＱＮＬＬＬＫＳＹＦＳＥＥＧＩＧＹＮＩＩＲＶＰＭＡＳＣＤＦＳＩＲＴＹＴＹＡＤＴＰＤＤＦＱＬＨＮＦＳＬＰＥＥＤＴＫＬＫＩＰＬＩＨＲＡＬＱＬＡＱＲＰＶＳＬＬＡＳＰＷＴＳＰＴＷＬＫＴＮＧＡＶＮＧＫＧＳＬＫＧＱＰＧＤＩＹＨＱＴＷＡＲＹＦＶＫＦＬＤＡＹＡＥＨＫＬＱＦＷＡＶＴＡＥＮＥＰＳＡＧＬＬＳＧＹＰＦＱＣＬＧＦＴＰＥＨＱＲＤＦＩＡＲＤＬＧＰＴＬＡＮＳＴＨＨＮＶＲＬＬＭＬＤＤＱＲＬＬＬＰＨＷＡＫＶＶＬＴＤＰＥＡＡＫＹＶＨＧＩＡＶＨＷＹＬＤＦＬＡＰＡＫＡＴＬＧＥＴＨＲＬＦＰＮＴＭＬＦＡＳＥＡＣＶＧＳＫＦＷＥＱＳＶＲＬＧＳＷＤＲＧＭＱＹＳＨＳＩＩＴＮＬＬＹＨＶＶＧＷＴＤＷＮＬＡＬＮＰＥＧＧＰＮＷＶＲＮＦＶＤＳＰＩＩＶＤＩＴＫＤＴＦＹＫＱＰＭＦＹＨＬＧＨＦＳＫＦＩＰＥＧＳＱＲＶＧＬＶＡＳＱＫＮＤＬＤＡＶＡＬＭＨＰＤＧＳＡＶＶＶＶＬＮＲＳＳＫＤＶＰＬＴＩＫＤＰＡＶＧＦＬＥＴＩＳＰＧＹＳＩＨＴＹＬＷＲＲＱＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＡＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号４）
【０１１８】
改変シグナルペプチド配列を有するＧＢＡタンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＧＩＰＭＧＫＳＭＬＶＬＬＴＦＬＡＦＡＳＣＣＩＡＡＲＰＣＩＰＫＳＦＧＹＳＳＶＶＣＶＣＮＡＴＹＣＤＳＦＤＰＰＴＦＰＡＬＧＴＦＳＲＹＥＳＴＲＳＧＲＲＭＥＬＳＭＧＰＩＱＡＮＨＴＧＴＧＬＬＬＴＬＱＰＥＱＫＦＱＫＶＫＧＦＧＧＡＭＴＤＡＡＡＬＮＩＬＡＬＳＰＰＡＱＮＬＬＬＫＳＹＦＳＥＥＧＩＧＹＮＩＩＲＶＰＭＡＳＣＤＦＳＩＲＴＹＴＹＡＤＴＰＤＤＦＱＬＨＮＦＳＬＰＥＥＤＴＫＬＫＩＰＬＩＨＲＡＬＱＬＡＱＲＰＶＳＬＬＡＳＰＷＴＳＰＴＷＬＫＴＮＧＡＶＮＧＫＧＳＬＫＧＱＰＧＤＩＹＨＱＴＷＡＲＹＦＶＫＦＬＤＡＹＡＥＨＫＬＱＦＷＡＶＴＡＥＮＥＰＳＡＧＬＬＳＧＹＰＦＱＣＬＧＦＴＰＥＨＱＲＤＦＩＡＲＤＬＧＰＴＬＡＮＳＴＨＨＮＶＲＬＬＭＬＤＤＱＲＬＬＬＰＨＷＡＫＶＶＬＴＤＰＥＡＡＫＹＶＨＧＩＡＶＨＷＹＬＤＦＬＡＰＡＫＡＴＬＧＥＴＨＲＬＦＰＮＴＭＬＦＡＳＥＡＣＶＧＳＫＦＷＥＱＳＶＲＬＧＳＷＤＲＧＭＱＹＳＨＳＩＩＴＮＬＬＹＨＶＶＧＷＴＤＷＮＬＡＬＮＰＥＧＧＰＮＷＶＲＮＦＶＤＳＰＩＩＶＤＩＴＫＤＴＦＹＫＱＰＭＦＹＨＬＧＨＦＳＫＦＩＰＥＧＳＱＲＶＧＬＶＡＳＱＫＮＤＬＤＡＶＡＬＭＨＰＤＧＳＡＶＶＶＶＬＮＲＳＳＫＤＶＰＬＴＩＫＤＰＡＶＧＦＬＥＴＩＳＰＧＹＳＩＨＴＹＬＷＲＲＱ（配列番号５）
【０１１９】
野生型ヒトＧＢＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１９２８５．１）は、以下の核酸配列を有する：
ＧＣＴＡＡＣＣＴＡＧＴＧＣＣＴＡＴＡＧＣＴＡＡＧＧＣＡＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＴＡＧＧＧＴＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＡＴＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＧＡＧＴＡＣＡＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＡＡＴＣＡＣＡＣＧＧＧＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＣＴＡＣＴＴＡＡＡＴＣＧＴＡＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＣＧＣＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧＴＣＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＣＴＣＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＴＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＴＡＣＣＣＴＣＧＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＡＣＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＡＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＡＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＧＣＧＧＣＴＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＧＣＧＴＡＡＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＧＴＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＧＧＴＣＧＴＧＣＴＡＡＡＣＣＧＣＴＣＣＴＣＴＡＡＧＧＡＴＧＴＧＣＣＴＣＴＴＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＴＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＮＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＴＡＧＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＣＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＧＡＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＡＧＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＣＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＣＴＧＧＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＴＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡ（配列番号６）
【０１２０】
コドン最適化ＧＢＡ構築物は、以下の核酸配列を有する：
ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＴＡＧＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＧＡＴＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号７）
【０１２１】
コドン最適化ＧＢＡ融合タンパク質構築物は、以下の核酸配列を有する：
ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＴＡＧＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＧＡＴＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＧＴＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡ（配列番号８）
【０１２２】
別法では、コドン最適化ヒトＧＢＡ融合タンパク質は、以下の核酸配列を有する：
ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＴＡＧＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＧＡＴＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＧＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡ（配列番号９）
【０１２３】
別法では、コドン最適化ヒトＧＢＡ融合タンパク質は、次の核酸配列を有する：
ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＴＡＧＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＧＡＴＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＧＣＧＡＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＧＣＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡ
（配列番号１０）
【０１２４】
改変シグナルペプチド配列を有するコドン最適化ヒトＧＢＡは、以下の核酸配列を有する：
ＡＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＡＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＴＡＧＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＧＡＴＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡ
（配列番号１１）
【０１２５】
一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする構築物は、野生型ＧＢＡを天然シグナルペプチド（Ｓｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４１：１０１６−１０２４  （１９８７）に記載のとおりの３９アミノ酸ＧＢＡシグナルペプチド）と共にコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＧＢＡをコードする構築物は、天然のシグナルペプチドを伴わずに野生型ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、改変シグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、改変シグナルペプチドを含むＧＢＡは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、改変シグナルペプチドを含む分泌型ＧＢＡをコードする導入遺伝子は、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸配列を有する。一部の実施形態では、改変シグナルペプチドは、下に示すとおりの配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。
ＭＧＩＰＭＧＫＳＭＬＶＬＬＴＦＬＡＦＡＳＣＣＩＡ（配列番号１６）
【０１２６】
一部の実施形態では、改変シグナルペプチドは、下に示すとおりの配列番号２０の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
ＡＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＡＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴ（配列番号２０）
【０１２７】
本明細書に記載の方法によると、患者に、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号１と比較して１つまたは複数の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の保存的アミノ酸置換）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する多能性細胞（例えば、ＨＳＣ、ｉＰＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、ＥＳ細胞、または骨髄前駆細胞）を投与することができるが、ただし、コードされるＧＢＡ類似体が野生型ＧＢＡの治療機能を保持していることを条件とする。野生型ＧＢＡの酵素活性は糖脂質の代謝に重要である。ＧＢＡはリソソームで作用して、スフィンゴ脂質グルコセレブロシドをグルコースとセラミドに代謝する。ＧＢＡ機能の喪失は、マクロファージにおけるグルコセレブロシドの蓄積につながる。
【０１２８】
宿主細胞
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用することができる細胞には、さらなる分化を受けることができる細胞が含まれる。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて使用することができる細胞の１つの型は、多能性細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）である。多能性細胞は、１種よりも多い分化した細胞型に成長する能力を有する細胞である。多能性細胞の例は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）である。ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、皮膚及び神経系を生じさせる外胚葉、消化管及び気道、内分泌腺、肝臓、及び膵臓を形成する内胚葉、ならびに骨、軟骨、筋肉、結合組織、及びほとんどの循環器系を形成する中胚葉の細胞に分化する能力を有する。
【０１２９】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用することができる細胞には、造血幹細胞及び骨髄系前駆細胞が含まれる。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、自己再生し、かつ限定されないが、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、及びリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞）を含む多様な細胞系を含む成熟血液細胞に分化する能力を有する未熟血液細胞である。ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋である。加えて、ＨＳＣはまた、長期再増殖ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）及び短期再増殖ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）も指す。これらのＨＳＣのいずれも、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用することができる。
【０１３０】
ＨＳＣは、ＣＤ３４＋でもある骨髄性前駆細胞に分化することができる。骨髄系前駆細胞はさらに、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、及び血小板）、単球（例えば、単球及びマクロファージ）、樹状細胞、及びミクログリアに分化することができる。一般的な骨髄系前駆細胞は、細胞表面分子により特徴付けることができ、ｌｉｎ−、ＳＣＡ１−、ｃ−ｋｉｔ＋、ＣＤ３４＋、及びＣＤ１６／３２ｍｉｄであることが公知である。
【０１３１】
ＨＳＣ及び骨髄前駆細胞は血液製剤から得ることができる。血液製剤は、造血起源の細胞を含む身体または身体の臓器から得られる製品である。そのような供給源には、分画されていない骨髄、臍帯、胎盤、末梢血、または動員末梢血が含まれる。前述の粗製または未分画の血液製剤はすべて、いくつかの方法で、ＨＳＣまたは骨髄系前駆細胞の特徴を有する細胞について富化することができる。例えば、それらが発現する細胞表面分子に基づき、より成熟した分化細胞を選択することができる。血液製剤は、ＣＤ３４＋細胞を正で選択することにより分画することができ、これには、自己再生、多分化能が可能で、移植レシピエントに再導入されると造血幹細胞ニッチェに帰着し得て、生産的かつ持続的な造血を再確立することができる造血幹細胞の亜集団が含まれる。このような選択は、例えば、市販の磁性抗ＣＤ３４ビーズ（Ｄｙｎａｌ，  Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，  ＮＹ）を使用して達成される。骨髄系前駆細胞は、それらが発現するマーカーに基づいて単離することもできる。未分画の血液製剤は、ドナーから直接入手するか、凍結保存保管庫から回収することができる。ＨＳＣ及び骨髄前駆細胞を、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、または他の再プログラムされた成熟細胞型の分化により取得することもできる。
【０１３２】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用することができる細胞には、同種細胞または自家細胞が含まれる。前述の細胞型はすべて、ミクログリアに分化し得る。細胞は、ミクログリア前駆細胞またはミクログリア幹細胞に分化することもある。分化は、エクスビボまたはインビボで起こってよい。ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞のエクスビボ分化のための方法は当業者に知られており、その開示が多能性細胞をミクログリアに分化させる方法に関するため、参照により本明細書に組み込まれるＭｕｆｆａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２：１３５８−１３６７  （２０１６）及びＰａｎｄｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１７）（印刷前にｅｐｕｂ）に記載されている。
【０１３３】
ミクログリア
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用することができる細胞には、ミクログリア細胞に分化することができるものが含まれる。ミクログリアは、中枢神経系の免疫細胞または常在マクロファージとして機能する骨髄由来細胞である。ミクログリアは、遺伝的にも機能的にもマクロファージに非常に類似しており、炎症誘発性状態と抗炎症性状態との間を動的にシフトする能力を共有している。炎症誘発性状態は古典的活性化、またはＭ１として公知であり、抗炎症状態は代替活性化、またはＭ２と呼ばれる。ミクログリアは、細胞外シグナル、例えばとりわけ、隣接するニューロンまたは星状細胞、細胞片、毒素、感染症、虚血、及び外傷などからのシグナルにより、２つの状態の間でシフトされ得る。Ｍ１ミクログリアは多くの場合に、罹患した脳において、特にＰＤなどの神経炎症を伴う疾患において観察される。古典的活性化Ｍ１表現型は、パーキンヌルマウス及びＤＪ−１ヌルマウスなどのＰＤのマウスモデルにおいても観察される。Ｍ１ミクログリアが神経炎症の原因または結果であるかどうかは不明であるが、ミクログリアが古典的に活性化されると、炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６、ケモカイン、一酸化窒素を分泌し得て、これらが、持続的な炎症、ニューロンの損傷、及びＭ１ミクログリアのさらなる活性化につながり得る。この正のフィードバックループは、脳組織に有害であり得るので、したがって、Ｍ１活性化を低下させる、及び／またはＭ２活性化を上昇させる方法は、神経炎症を特徴とする疾患、例えば、パーキンソン病の患者の助けとなり得る。
【０１３４】
Ｍ２促進物質
本明細書に記載の組成物及び方法は追加的に、ＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現する細胞を提供する。Ｍ２促進物質は、細胞をより抗炎症状態へと移行させることにより、マクロファージまたはミクログリアの分極に影響を及ぼす作用物質である。Ｍ２促進物質は、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、及び古典的活性化／Ｍ１に関連する遺伝子、例えば、ＩＬ−１β、腫瘍壊死因子、ｉＮＯＳ、ＩＬ−６、またはＩＬ−１２の分泌または発現を減少させることにより、Ｍ１ミクログリア数またはＭ１ミクログリア表現型を減少させることができる。Ｍ２促進物質はまた、Ｍ１細胞のマーカー、例えば、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ６８、ＣＤ１１Ｂ、及びＦｃγ受容体を減少させ得る。Ｍ２促進物質は、抗炎症性サイトカイン及び代替の活性化／Ｍ２に関連する遺伝子、例えば、ＩＬ−２５、ＩＬ−１０、トランスフォーミング増殖因子ベータ、ＣＤ１６３、ＴＲＥＭ２、Ａｒｇ１、またはＣＤ２０６の分泌及び発現を増加させることにより、Ｍ２ミクログリアまたはＭ２表現型の数を増加させ得る。Ｍ２促進物質はまた、細胞の形態または形状を変化させることがあり、例えば、アメーバ様ミクログリアを減少させるか、またはミクログリア分岐を増加させる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるＭ２作用物質は、投与された細胞にＭ２表現型をディスプレイさせることができ、脳のミクログリアをＭ１表現型から、またはＭ２表現型へとシフトさせることができるか、または投与された細胞及び内因性ミクログリアの両方の表現型に影響を及ぼすことができる。ミクログリアは、厳密にＭ１またはＭ２状態で観察されることはほとんどなく、Ｍ１マーカー及びＭ２マーカーの両方のサブセットとして発現されることが多い。Ｍ２表現型へのシフトは、１種もしくは複数のＭ１関連サイトカインもしくは遺伝子の減少、１種もしくは複数のＭ２関連サイトカイン及び遺伝子の増加、またはＭ１及びＭ２関連サイトカインと遺伝子の両方の変化として現れ得る。
【０１３５】
Ｍ２促進物質は多くの広範なカテゴリーに分類される。Ｍ２表現型を促進する、またはＭ１表現型を減少させる作用物質には、抗炎症性サイトカイン、例えば、インターロイキン−２５（ＩＬ−２５）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）が含まれる。ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１０Ｒ、ＴＧＦβＲ１、及びＴＧＦβＲ２などのサイトカイン受容体の発現はまた、細胞が抗炎症性サイトカインを検出できるようにすることにより、Ｍ２表現型を促進し得る。ＩＬ−２５は、神経炎症を阻害することが示されている抗炎症性サイトカインである。その開示がＭ２促進物質としてのＩＬ−２５に関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＭａｉｏｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：４８７  （２０１３）に記載されているとおり、ＩＬ−２５は、２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞、マスト細胞、上皮細胞、好酸球、好塩基球及び肺胞マクロファージなどのいくつかの細胞により産生され、ミクログリアをより抗炎症性のＭ２状態にシフトさせることが示されている。
【０１３６】
Ｍ２促進物質の別のカテゴリーには、炎症誘発性メディエーター、例えば、サイトカイン、亜硝酸塩、及びＮＦ−κＢ活性の発現、合成、及び分泌を減少させる作用物質が含まれる。このカテゴリーの作用物質には、グルココルチコイド受容体、例えば、ＧＲ、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、例えば、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲβ／δ、エストロゲン受容体、例えば、ＥＲα、ＥＲβ、及び核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー２（ＮＲ４Ａ２）が含まれる。Ｍ２促進物質は、エピジェネティックな変化を引き起こすことによりＭ２表現型を誘発することができ、このクラスの作用物質には、リジンデメチラーゼ６Ｂ（ＫＤＭ６Ｂ）、ＭＳＨホメオボックス３（ＭＳＸ３）、配列類似性１９を持つファミリー（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）様）、メンバーＡ３（ＦＡＭ１９Ａ３）、核因子ＮＦ−カッパＢ  Ｐ５０サブユニット（ＮＦ−κＢ  Ｐ５０）が含まれる。ｍｉＲ１２４、ｍｉＲ２１、及びｍｉＲ１８１ｃを含むマイクロＲＮＡも、Ｍ２促進物質として機能し得る。Ｍ２表現型を促進するか、またはＭ１表現型を減少させることができる作用物質の別のカテゴリーは、免疫系から食細胞が自己物質を非自己物質から区別するのを助けることで知られている自己関連分子パターン（ＳＡＭＰ）として公知の作用物質である。このクラスの作用物質には、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸ３ＣＬ１）、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、ＣＤ２００分子（ＣＤ２００）、ＣＤ２００受容体１（ＣＤ２００Ｒ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、白血球表面抗原ＣＤ４７（ＣＤ４７）、補体崩壊促進因子（ＣＤ５５）、栄養膜白血球共通抗原（ＣＤ４６）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ５（ＡＤＧＲＥ５）、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰＡ）、及びシグレック、例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１、Ｓｉｇｌｅｃ−２、Ｓｉｇｌｅｃ−３、Ｓｉｇｌｅｃ−４、ＣＤ３３関連シグレックが含まれる。ミクログリアの保護調節シグナルの論述については、その開示がミクログリアの古典的活性化を低下させるシグナルに関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＬｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９  （２０１６）  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎを参照されたい。
【０１３７】
哺乳動物細胞におけるＧＢＡ及びＭ２促進物質の発現
パーキンソン病の患者では、グルコセレブロシダーゼ活性が低下しており、ＰＤ脳は、古典的活性化Ｍ１ミクログリアを含む。本明細書に記載の組成物及び方法は、ＧＢＡをコードする導入遺伝子（例えば、非分泌型ＧＢＡまたは分泌型ＧＢＡ）、及び任意選択で、それぞれがＭ２促進物質をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を発現する細胞を投与することにより、これらの機能障害をターゲティングする。パーキンソン病の処置における治療用途でこれらの作用物質を利用するために、これらの作用物質は、細胞の内部に、特定の例では、特定のオルガネラに向けられ得る。そのようなタンパク質を哺乳動物細胞に送達するために、かつ哺乳動物細胞においてそのようなタンパク質をコードする遺伝子を安定発現させるために、幅広い方法が確立されている。
【０１３８】
ＧＢＡ及びＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチド
哺乳動物細胞でＧＢＡ及びＭ２促進物質の治療上有効な細胞内濃度を達成するために使用することができるプラットフォームの１つは、これらの作用物質をコードする遺伝子の安定発現によるものである（例えば、哺乳動物細胞の核またはミトコンドリアゲノムへの統合により）。これらの遺伝子は、対応するタンパク質の一次アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。そのような外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入するために、これらの遺伝子をベクターに組み込むことができる。ベクターは、形質転換、トランスフェクション、直接取り込み、プロジェクタイル衝撃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を含む様々な方法により、及びリポソーム中でのベクターの封入により、細胞に導入することができる。細胞をトランスフェクトまたは形質転換する適切な方法の例は、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、リポフェクション、及び直接取り込みである。そのような方法は、例えば、それぞれの開示が参照により本明細書に組み込まれる  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２０１４））；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２０１５））にさらに詳細に記載されている。
【０１３９】
ＧＢＡ及びＭ２促進物質は、そのような作用物質をコードする遺伝子を含むベクターを細胞膜リン脂質にターゲティングすることにより、哺乳動物細胞に導入することもできる。例えば、ベクター分子を、すべての細胞膜リン脂質に親和性を持つウイルスタンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に連結させることにより、ベクターを細胞膜の細胞外表面上のリン脂質にターゲティングすることができる。そのような構築物は、当業者に周知の方法を使用して生成することができる。
【０１４０】
哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼによるＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドの認識及び結合が、遺伝子発現には重要である。したがって、これは、ＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子について高い親和性を示し、転写開始部位での転写複合体のアセンブリを促進する配列エレメントをポリヌクレオチド内に含むことができる。そのような配列エレメントには、例えば、その配列が特異的な転写開始因子及び最終的にはＲＮＡポリメラーゼにより認識及び結合され得る哺乳動物プロモーターが含まれる。哺乳動物プロモーターの例は、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｓｙｓ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：７３  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎに記載されている。
【０１４１】
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するために適したポリヌクレオチドには、哺乳動物プロモーターの下流でＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードするものが含まれる。哺乳動物細胞におけるＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質の発現に有用なプロモーターには、例えば、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、ＣＤ６８分子（ＣＤ６８）プロモーター（ＧＢＡを発現するためのＰＧＫ及びＣＤ６８プロモーターの使用に関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＤａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３：８３５  （２０１５）を参照されたい）、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）プロモーター、インテグリンサブユニットアルファＭ（ＩＴＧＡＭ）プロモーター、同種移植炎症因子１（ＡＩＦ１）プロモーター、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１２（Ｐ２Ｙ１２）プロモーター、膜貫通タンパク質１１９（ＴＭＥＭ１１９）プロモーター、及びコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）プロモーターが含まれる。別法では、ウイルスゲノムに由来するプロモーターも、哺乳動物細胞におけるこれらの作用物質の安定発現のために使用することができる。これらの作用物質の哺乳動物発現を促進するために使用することができる機能的ウイルスプロモーターの例は、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。
【０１４２】
ＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドが哺乳動物細胞の核ＤＮＡに組み込まれたら、このポリヌクレオチドの転写を、当技術分野で公知の方法により誘導することができる。例えば、哺乳動物細胞を、転写因子、及び／またはＲＮＡポリメラーゼの哺乳動物プロモーターへの結合を調節して、遺伝子発現を調節する薬剤などの外部化学試薬に曝露することにより、発現を誘導することができる。化学試薬は、例えばプロモーターに結合したリプレッサータンパク質を除去することにより、ＲＮＡポリメラーゼ及び／または転写因子の哺乳動物プロモーターへの結合を促進するために役立つ。別法では、化学試薬は、ＲＮＡポリメラーゼ及び／または転写因子についての哺乳動物プロモーターの親和性を上昇させて、プロモーターの下流に配置された遺伝子の転写率が化学試薬の存在下で上昇するようにするために役立ち得る。上記の機構によりポリヌクレオチド転写を増強する化学試薬の例は、テトラサイクリン及びドキシサイクリンである。これらの試薬は市販されており（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、確立されたプロトコルに従って遺伝子発現を促進するように哺乳動物細胞に投与することができる。
【０１４３】
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのポリヌクレオチドに含めることができる他のＤＮＡ配列エレメントは、エンハンサー配列である。エンハンサーは、ＤＮＡが転写開始部位で転写因子及びＲＮＡポリメラーゼの結合に好都合な３次元配向を採用するように、目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドのコンフォメーション変化を誘導する調節エレメントの別のクラスを表す。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのポリヌクレオチドには、ＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードし、追加的に哺乳動物エンハンサー配列を含むものが含まれる。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から現在公知であり、例は、哺乳動物グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリンをコードする遺伝子に由来するエンハンサーである。本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのエンハンサーには、真核細胞に感染することができるウイルスの遺伝物質に由来するものも含まれる。例は、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。真核生物の遺伝子転写の活性化を誘導する追加のエンハンサー配列は、Ｙａｎｉｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７  （１９８２）に開示されている。エンハンサーは、例えば、この遺伝子の５’または３’位で、水形成ＮＡＤＨオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにスプライシングされ得る。好ましい配向では、エンハンサーはプロモーターの５’側に位置し、次いでこれは、ＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドに対して５’側に配置される。
【０１４４】
ＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子発現をオンまたはオフにすることができる調節エレメントを含み得る。これらの調節エレメントには、スイッチまたは不安定化ドメインが含まれ得る。例示的な不安定化ドメインは、ヒトＦＫ５０６及びラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）の変異体であり、これらは、これらの不安定化ドメインに融合した他のタンパク質に不安定性を与える。ＦＫＢＰ１２変異体には、その開示がＦＫＢＰ１２不安定化ドメインに関係するので、参照により本明細書に組み込まれるＢａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １２６：９９５  （２００６）において特徴付けられているとおり、Ｎ末端変異体Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ、及びＬ１０６Ｐ、ならびにＣ末端変異体Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、及びＫ１０５Ｉが含まれる。ＦＫＢＰ１２不安定化ドメインはタンパク質分解を促進する。小分子リガンドＳｈｉｅｌｄ−１（Ｓｈｌｄ１）は、ＦＫＢＰ１２変異体含有タンパク質を分解から保護して安定化させるために使用することができる。それぞれの開示が不安定化ドメインシステムに関係するため、参照により本明細書に組み込まれるＩｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  １７：９８１  （２０１０）及びＭｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，  １３４：３９４２  （２０１２）に記載されているとおり、ＧＢＡまたはＭ２促進物質の発現を調節するために使用することができる他の不安定化ドメインには、目的のタンパク質に融合すると不安定性を与えて分解をもたらし、かつそれぞれ小分子リガンドトリメトプリム（ＴＭＰ）により、またはＣＭＰ８もしくは４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）により安定化され得る大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）の変異体及びヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ）の変異体が含まれる。ＧＢＡをコードする遺伝子及びＭ２促進物質（例えばＩＬ−２５）をコードする遺伝子などの１つまたは複数の遺伝子の発現を独立に調節するために、本明細書に記載の組成物及び方法で併せて使用することができる追加の不安定化ペプチド／安定化リガンド系は、それらの開示が不安定化ドメイン及びそれらの対応するリガンドの使用に関係するので、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１６４８２８、ＵＳ２００５／０２１４７３８、ＵＳ８，１７３，７９２、ＵＳ２０１２／０１７８１６８、ＵＳ２０１４／０２５５３６１、ＷＯ２０１４／１６４８２８、ＷＯ２０１５／１５２８１３、ＷＯ２０１４／０４３１８９、ＷＯ２０１４／０８９１５８、ＵＳ８，１０６，１９１、ＵＳ２０１５／０３０７８５０、及びＵＳ２０１４／０２２００６２でさらに説明されている。
【０１４５】
細胞特異的遺伝子発現
干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞に送達して相補的ｍＲＮＡの分解を引き起こすことにより内在性遺伝子の発現をノックダウンするために広く使用されている。追加の適用は、人工ｍｉＲＮＡターゲット配列でタグ付けされた外因的に導入された導入遺伝子の発現を負に調節するために、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の多様性を利用することである。これらのｍｉＲＮＡターゲットタグ付き導入遺伝子は、組織、細胞系、活性化、または分化段階に特異的であり得る所与のｍｉＲＮＡの活性に応じて、負に調節され得る。これらの人工ｍｉＲＮＡターゲット配列（ｍｉＲＴ）は、特異的ｍｉＲＮＡによりターゲットとして認識されて、転写後遺伝子サイレンシングを誘導し得る。ターゲティングされた細胞での強力な導入遺伝子発現は有益な治療結果をもたらし得るが、ＨＳＰＣまたは他の前駆細胞での異所性または無秩序な導入遺伝子発現などのオフターゲット発現は、細胞毒性効果を有し得、細胞挙動の変化及び治療効果の低下につながる導入遺伝子含有細胞の対抗選択をもたらし得る。ＨＳＰＣ及び前駆細胞では広く発現しているが、骨髄細胞系の細胞には存在しないｍｉＲＮＡのためのｍｉＲＮＡターゲット配列（ｍｉＲＴ）の組み込みにより、ＨＳＰＣ及び他の前駆細胞での導入遺伝子発現の抑制が可能になり、導入遺伝子含有造血後代のサイレントで長期の貯留が可能になる一方で、成熟分化ターゲット細胞での強力な導入遺伝子発現が可能になる。ｍｉＲ−１２６は、ＨＳＰＣ、他の前駆細胞、及び赤血球細胞系の細胞で高度に発現するが、骨髄細胞系の細胞（例えば、マクロファージ及びミクログリア）には存在しない（Ｇｅｎｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２：５８ｒａ３４  （２０１０））。例えば、導入遺伝子内に組み込まれたｍｉＲ−１２６ターゲティング配列は、骨髄細胞系の細胞における導入遺伝子のターゲティングされた発現及びＨＳＰＣ及び他の前駆細胞における発現の抑制を可能にし、したがって、オフターゲットの細胞毒性効果を最小限にする。一部の実施形態では、ＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードする導入遺伝子はｍｉＲ−１２６ターゲティング配列を含んでもよい。
【０１４６】
シグナルペプチド
ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含んでもよい。シグナルペプチドは、５〜３０残基長のアミノ酸配列を有してよく、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドの上流（例えば、５’側）に配置されていてよい。これらのシグナルペプチドは、シグナル認識粒子による合成中の新生ＧＢＡポリペプチドの認識を可能にし、粗面小胞体の膜を超えての輸送、さらにはリソソームに輸送するためのグリコシル化をもたらす。ＧＢＡをリソソーム輸送するための例示的なシグナルペプチドは、ＧＢＡに由来するものである。
【０１４７】
分泌シグナルペプチド
ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドは、分泌シグナルペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含んでもよい。分泌シグナルペプチドは、５〜３０残基長のアミノ酸配列を有してよく、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドの上流（すなわち、５’側）に配置されていてよい。これらの分泌シグナルペプチドは、シグナル認識粒子による合成中の新生ポリペプチドの認識を可能にし、ＥＲへの移行、輸送小胞へのパッケージング、そして最後に分泌をもたらす。タンパク質分泌のための例示的な分泌シグナルペプチドは、ＧＢＡ、ＩＧＦ−ＩＩ、アルファ−１アンチトリプシン、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＣＤ５、免疫グロブリン、トリプシノーゲン、血清アルブミン、プロラクチン、エラスチン、組織プラスミノーゲン活性化シグナルペプチド（ｔＰＡ−ＳＰ）、及びインスリンに由来するものである。一部の実施形態では、分泌型のＧＢＡを発現する多能性細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を、失った酵素を血流に注入することにより酵素欠損（例えば、ＧＢＡ）を補正するための治療戦略として利用することができる。血液が患者の組織を灌流すると、ＧＢＡが細胞により取り込まれ、リソソームに輸送され、そこで酵素が、酵素欠乏症に起因してリソソーム内に蓄積したグルコセレブロシドを排除するように作用する。リソソーム酵素補充療法が有効であるためには、治療用酵素（例えば、ＧＢＡ）は、貯蔵不全が明らかになっている組織の適切な細胞内のリソソームに送達されなければならない。従来のリソソーム酵素補充療法は、ターゲット細胞の表面上の特異的な受容体に係合するために、そのタンパク質に天然に結合する炭水化物を使用して送達される。カチオン非依存性マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）という１種の受容体が、補充リソソーム酵素をターゲティングするために特に有用であり、それというのも、ＣＩ−ＭＰＲはほとんどの細胞型の表面に存在するためである。
【０１４８】
グリコシル化非依存性リソソームターゲティング
グリコシル化非依存性リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）技術を利用して、治療用酵素（ＧＢＡなど）をリソソームにターゲティングすることができる。具体的には、ＧＩＬＴ技術は、リソソームターゲティングでＣＩ−ＭＰＲに係合するために、Ｍ６Ｐの代わりにペプチドタグを使用する。典型的には、ＧＩＬＴタグは、マンノース−６−リン酸非依存的な様式でＣＩ−ＭＰＲに結合するタンパク質、ペプチド、または他の部分である。有利なことに、この技術は、リソソーム酵素を取り込むための通常の生物学的機構を模倣するが、マンノース−６−リン酸に非依存的な様式で模倣する。一部の実施形態では、ＧＢＡは、ＧＢＡ及びＧＩＬＴタグを含有するＧＢＡ融合タンパク質として分泌される。一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）に由来する。ヒトＩＧＦ−ＩＩはＣＩ−ＭＰＲの高親和性リガンドであり、ＩＧＦ−ＩＩ受容体とも称される。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体へのＧＩＬＴタグ付き治療用酵素の結合は、エンドサイトーシス経路を介してタンパク質をリソソームにターゲティングする。ＧＩＬＴ技術及びＧＩＬＴタグの詳細な説明は、それらすべての教示が、その全体で参照により本明細書に組み込まれる米国公開番号２００３００８２１７６、２００４０００６００８、２００４０００５３０９、２００５０２８１８０５、及び２００９０４３２０７において見い出すことができる。
【０１４９】
フーリン抵抗性ＧＩＬＴタグ
ＩＧＦ−ＩＩ由来のＧＩＬＴタグは、哺乳動物細胞における産生中にフーリンによるタンパク質分解切断を受けることがある。フーリンプロテアーゼは典型的に、コンセンサス配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇを有する切断部位を認識及び切断し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。切断部位は、配列のカルボキシ末端アルギニン（Ａｒｇ）残基の後に位置する。一部の実施形態では、フーリン切断部位は、コンセンサス配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇを有し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。切断部位は、配列のカルボキシ末端アルギニン（Ａｒｇ）残基の後に位置する。成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩペプチド配列を下に示す。
2021517168.tif 000004
（配列番号１２）
【０１５０】
成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩは、残基３４〜４０（太字）の間に２つの潜在的な重複するフーリン切断部位を含む。フーリンによる切断に抵抗性のある改変ＧＩＬＴタグは、マンノース−６−リン酸非依存的な様式でＣＩ−ＭＰＲに結合する能力をまだ保持している。具体的には、フーリン抵抗性ＧＩＬＴタグは、その変異が少なくとも１つのフーリン切断部位を無効にするように、１つまたは複数のフーリン切断部位でアミノ酸配列を変異させることにより設計することができる。したがって、一部の実施形態では、フーリン抵抗性ＧＩＬＴタグは、フーリン切断が野生型ＩＧＦ−ＩＩペプチド（例えば、野生型ヒト成熟ＩＧＦ−ＩＩ）と比較して阻止される、阻害される、低減される、または減速されるように、少なくとも１つのフーリンプロテアーゼ切断部位を無効にするか、またはフーリンプロテアーゼ切断部位に隣接する配列を変更する変異を含むフーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインである。適切な変異は、フーリン抵抗性ＧＩＬＴタグがヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する能力に影響を与えない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用するために適したフーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、マンノース−６−リン酸非依存的な様式で、ｐＨ７．４で１０−７以下（例えば、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、またはそれ以下）の解離定数で、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する。一部の実施形態では、フーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１２のアミノ酸３０〜４０（例えば、３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３２〜３９、３３〜３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０）に対応する領域内に変異を含む。一部の実施形態では、適切な変異は、少なくとも１つのフーリンプロテアーゼ切断部位を無効にする。変異は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であってよい。例えば、配列番号１２の残基３０〜４０（例えば、３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３２〜３９、３３〜３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０）に対応する領域内の任意の１つのアミノ酸を、他の任意のアミノ酸で置換するか、または欠失させることができる。例えば、３４位での置換は、最初の切断部位のフーリン認識に影響を及ぼし得る。各認識部位内に１つまたは複数の追加のアミノ酸を挿入すると、一方または両方のフーリン切断部位を無効にすることができる。縮重位置の残基のうちの１個または複数の残基を欠失させて、両方のフーリン切断部位を無効にすることもできる。
【０１５１】
一部の実施形態では、フーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１２のＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に対応する位置にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、フーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、Ａｒｇ３７またはＡｒｇ４０位にＬｙｓまたはＡｌａ置換を含む。３７位と４０位の両方でのＬｙｓ及び／またはＡｌａ変異の組み合わせ、またはＬｙｓもしくはＡｌａ以外のアミノ酸の置換を含む、他の置換が可能である。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用するために適したフーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、追加の変異を含んでもよい。例えば、配列番号１２の残基のうちの最大３０％またはそれ以上が変更されていてもよい（例えば、最大１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％またはそれ以上の残基が変更されていてもよい）。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用するために適したフーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１２と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％を含めて少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有してよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用するために適したフーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインを、特異的にＣＩ−ＭＰＲにターゲティングする。ＣＩ−ＭＰＲには高い親和性で（例えば、ｐＨ７．４で１０−７Ｍ以下の解離定数で）結合するが、ＩＧＦ−ＩＩが結合することが公知の他の受容体には天然ＩＧＦ−ＩＩと比較して低い親和性で結合するタンパク質をもたらすＩＧＦ−ＩＩポリペプチドの変異は、特に有用である。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用するために適したフーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインを、ＩＧＦ−Ｉ受容体についての天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比較して、ＩＧＦ−Ｉ受容体についての結合親和性が低いように改変することができる。追加の変異戦略が利用されており、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０４３２０７号において詳細に論述されている。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ残基Ｔｙｒ２７をＬｅｕで、Ｌｅｕ４３をＶａｌで、またはＳｅｒ２６をＰｈｅで置換すると、ＩＧＦ−Ｉ受容体についてのＩＧＦ−ＩＩの親和性がそれぞれ９４倍、５６倍、及び４倍低下する（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４８（２）：３８５−４０１  （１９９５））。ヒトＩＧＦ−ＩＩの残基１〜７を欠失させると、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体についての親和性が３０倍低下し、それに伴ってラットＩＧＦ−ＩＩ受容体についての親和性が１２倍上昇した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０（３０）：１８０１３−８  （１９９５））。ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、Ｔｈｒ７が残基４８Ｐｈｅ及び５０Ｓｅｒの近く、さらには９Ｃｙｓ−４７Ｃ��ｓジスルフィド橋の近くに配置されていることを示している。Ｔｈｒ７とこれらの残基との相互作用が、ＩＧＦ−Ｉ受容体結合に必要な柔軟なＮ末端ヘキサペプチドを安定化させ得ると考えられる（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３（２３）５５９０−７  （１９９４））。同時に、この相互作用はＩＧＦ−ＩＩ受容体への結合を調節することができる。ＩＧＦ−ＩＩのＣ末端の短縮化（残基６２〜６７）も、ＩＧＦ−Ｉ受容体についてのＩＧＦ−ＩＩの親和性を５倍低下させるようである（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １８１（２）：９０７−１４  （１９９１））。ＩＧＦ−Ｉ及びカチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体の結合面は、ＩＧＦ−ＩＩの別々の面にある。構造及び変異データに基づき、ヒトＩＧＦ−ＩＩよりも大幅に小さい機能的カチオン非依存性Ｍ６Ｐ結合ドメインを構築することができる。例えば、アミノ末端アミノ酸（例えば、１〜７または２〜７）及び／またはカルボキシ末端残基６２〜６７を欠失させる、または置換することができる。加えて、ポリペプチドの残りのフォールディングを変更したり、またはカチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体に結合したりすることなく、アミノ酸２９〜４０をおそらく削除または置き換えることができる。したがって、アミノ酸８〜２８及び４１〜６１を含むターゲティング部分を構築することができる。アミノ酸のこれらのストレッチはおそらく、直接結合され得るか、またはリンカーにより分離され得るであろう。別法では、アミノ酸８〜２８及び４１〜６１を別々のポリペプチド鎖上に提供することができる。ＩＧＦ−ＩＩと相同であり、ＩＧＦ−ＩＩの構造と密接に関連する三次構造を持つインスリンの比較可能なドメインは、別々のポリペプチド鎖に存在する場合でも適切な三次構造への適正なリフォールディングを許容する十分な構造情報を有する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １６（８）：２７９−２８１  （１９９１））。したがって、例えば、アミノ酸８〜２８、またはその保存的置換バリアントをリソソーム酵素に融合させることができる；得られた融合タンパク質を、アミノ酸４１〜６１、またはその保存的置換バリアントと混合し、患者に投与することができるであろう。ＩＧＦ−ＩＩ／ＧＩＬＴ構築物の隔離を回避するために、ＩＧＦ−ＩＩを、血清ＩＧＦ結合タンパク質への結合を最小限にするように改変することもできる（Ｂａｘｔｅｒ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２７８（６）：９６７−７６（２０００））。多くの研究が、ＩＧＦ結合タンパク質への結合に必要なＩＧＦ−ＩＩ中の残基を位置特定している。これらの残基に変異を有する構築物を、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合する高い親和性の維持、及びＩＧＦ結合タンパク質についての低い親和性についてスクリーニングすることができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩのＰｈｅ  ２６をＳｅｒに置き換えると、ＩＧＦＢＰ−１及び−６についてのＩＧＦ−ＩＩの親和性は低下するが、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体への結合については作用がないと報告されている。（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ���  ２６８（１３）：９２４６−５４  （１９９３））。Ｇｌｕ９ではＬｙｓなどの他の置換も有利であり得る。ＩＧＦ−ＩＩと高度に保存されているＩＧＦ−Ｉの領域での類似の変異は、別々に、または組み合わせで、ＩＧＦ−ＢＰ結合の大幅な減少をもたらす（Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０  （１９９９））。
【０１５２】
代替のアプローチは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に高い親和性で結合し得るＩＧＦ−ＩＩの最小領域を同定することである。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体へのＩＧＦ−ＩＩの結合に関係している残基はほとんど、ＩＧＦ−ＩＩの片面に集まっている（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３（２３）：５５９０−７  （１９９４））。ＩＧＦ−ＩＩ三次構造は通常３つの分子内ジスルフィド結合により維持されるが、ＩＧＦ−ＩＩのＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体結合表面上のアミノ酸配列を組み込んだペプチドを、適正にフォールドし、結合活性を有するように設計することができる。そのような最小の結合ペプチドは、非常に好ましいリソソームターゲティングドメインである。例えば、好ましいリソソームターゲティングドメインは、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜６７である。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合する、アミノ酸４８〜５５の周りの領域に基づいて設計されたペプチドも、望ましいリソソームターゲティングドメインである。別法では、ペプチドのランダムライブラリーを、酵母ツーハイブリッドアッセイまたはファージディスプレイタイプアッセイのいずれかにより、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合する能力についてスクリーニングすることができる。
【０１５３】
本明細書に記載の多くのフーリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、インスリン受容体についての結合親和性が低下または減少している。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用するために適したペプチドタグは、インスリン受容体についての天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比較して、インスリン受容体についての結合親和性が低下または減少している。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用するために適した、インスリン受容体についての結合親和性が低下または減少しているペプチドタグには、野生型成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの結合親和性よりも、インスリン受容体についての結合親和性が１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、５０倍、１００倍超低いペプチドタグが含まれる。インスリン受容体についての結合親和性は、当技術分野で公知の様々なインビトロ及びインビボアッセイを使用して測定することができる。
【０１５４】
一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、下に示すとおりの配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＡＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号１３）
【０１５５】
一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、下に示すとおりの配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。
ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＡＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号１４）
【０１５６】
一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、下に示すとおりの配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。
ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＡＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号１５）
【０１５７】
一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、下に示すとおりの配列番号１７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列によりコードされる。
ＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＧＴＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧ
（配列番号１７）
【０１５８】
一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、下に示すとおりの配列番号１８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列によりコードされる。
ＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＧＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡ（配列番号１８）
【０１５９】
一部の実施形態では、ＧＩＬＴタグは、下に示すとおりの配列番号１９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列によりコードされる。
ＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＧＣＧＡＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＧＣＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡ（配列番号１９）
【０１６０】
分泌型ＧＢＡのＢＢＢ透過のためのＡｐｏＥタグ
一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡ（例えば、分泌型ＧＢＡ融合タンパク質）を、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過するように改変する。ＢＢＢ透過を媒介するための改変は、当技術分野で周知である。例示的な改変は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の受容体結合（Ｒｂ）ドメイン（配列番号２１のアミノ酸残基１４８〜１７３）を含むタグの使用である。完全なＡｐｏＥペプチド配列を下に示す。
ＭＫＶＬＷＡＡＬＬＶＴＦＬＡＧＣＱＡＫＶＥＱＡＶＥＴＥＰＥＰＥＬＲＱＱＴＥＷＱＳＧＱＲＷＥＬＡＬＧＲＦＷＤＹＬＲＷＶＱＴＬＳＥＱＶＱＥＥＬＬＳＳＱＶＴＱＥＬＲＡＬＭＤＥＴＭＫＥＬＫＡＹＫＳＥＬＥＥＱＬＴＰＶＡＥＥＴＲＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤＶＣＧＲＬＶＱＹＲＧＥＶＱＡＭＬＧＱＳＴＥＥＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡＶＹＱＡＧＡＲＥＧＡＥＲＧＬＳＡＩＲＥＲＬＧＰＬＶＥＱＧＲＶＲＡＡＴＶＧＳＬＡＧＱＰＬＱＥＲＡＱＡＷＧＥＲＬＲＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ（配列番号２１）
【０１６１】
ＡｐｏＥは脂質輸送に関与する重要なタンパク質であり、その細胞内在化は、ＬＤＬ受容体、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）、及びＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ１、ＬＲＰ２、及びＬＲＰ８を含むＬＲＰ）を含む、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーにより媒介される。ＬＤＬ受容体は、脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）で高度に発現されることが見い出されており、末梢血管では発現の下方制御が観察されている。ＢＣＥＣ、ニューロン、グリア細胞で検出した場合、肝臓及び脳でも、ＬＲＰとＶＬＤＬＲの発現の制限が顕著に示されている。ＬＤＬＲを除いて、ＬＲＰ１及びＶＬＤＬＲを含む低密度リポタンパク質受容体ファミリー（ＬＤＬＲｆ）タンパク質のいくつかのメンバーは、ＢＢＢを形成するＢＣＥＣで高度に発現される。これらのタンパク質はＡｐｏＥに結合して、ＢＢＢの反管腔側へのそれらのトランスサイトーシスを促進し得る。
【０１６２】
加えて、ＬＲＰ１及びＶＬＤＬＲの両方のアンタゴニスト及びリガンドである受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）は、インビボ及びインビトロでトランスフェリンよりもＢＢＢを超えての透過性が高いことが示されており（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１７：５０７１−８  （２００４））、これは、これらのリポタンパク質受容体（ＬＤＬＲｆ）が、トランスフェリン受容体よりも発現が低いにもかかわらず、効率的なＢＢＢ送達ターゲットであり得ることを示している。本明細書に記載のとおり、ＡｐｏＥに由来する強力な受容体結合ペプチド（Ｒｂ）は、融合タンパク質として操作された場合、タンパク質をＢＢＢを超えて脳に移動させる能力を有する。したがって、この方法は、融合タンパク質として操作された場合、治療薬（例えば、可溶性ＧＢＡ）のためにＢＢＢを選択的に開くように機能し得る。このペプチドは、ＡｐｏＥタンパク質全体ではなく、ＡｐｏＥのＲｂドメインを利用するため、それらの生物学的機能を危険にさらしたり、またはＡｐｏＥの重要な生物学的機能を妨害したりすることなく、診断薬または治療薬に容易に結合させることができる。この経路はまた、脳実質におけるＬＤＬＲｆメンバーの広範な発現により、薬剤がＣＮＳに到達した後のさらなる／二次的脳内分布を促進することができる代替の取り込み経路である。施与戦略、例えば酵素補充療法または細胞ベース遺伝子ベースの治療にかかわらず、脳実質内の治療薬の量と分布の両方が、疾患処置の臨床成果に大きな影響を有するはずである。ＢＢＢを超えるタンパク質のターゲティング化送達におけるＡｐｏＥのＲｂドメインの開発及び使用の詳細な説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４０２１９９７４号において見出すことができる。
【０１６３】
一部の実施形態では、分泌型ＧＢＡ融合タンパク質は、配列番号２１のＬＤＬＲｆ受容体結合ドメイン（Ｒｂ）を含むペプチド配列、またはその断片、バリアント、もしくはオリゴマーを有する。例示的な受容体結合ドメインは、ＡｐｏＥのＮ末端、例えば、配列番号２１のアミノ酸残基１〜１９１の間、配列番号２１のアミノ酸残基２５〜１８５の間、配列番号２１のアミノ酸残基５０〜１８０の間、配列番号２１のアミノ酸残基７５〜１７５の間、配列番号２１のアミノ酸残基１００〜１７０の間、または配列番号２１のアミノ酸残基１２５〜１６５の間で見出すことができる。例示的な受容体結合ドメインは、配列番号２１の残基１５９〜１６７のアミノ酸配列を有する。
【０１６４】
一部の実施形態では、ＡｐｏＥの受容体結合ドメインを含むペプチド配列は、少なくとも１つのアミノ酸変異、欠失、付加、または置換を含んでよい。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、２つ以上の変異、欠失、付加、または置換の組み合わせであってよい。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換は保存的置換である。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸付加は、ＡｐｏＥのＲｂドメインに既に見出される選択された配列の付加を含む。当業者は、ＢＢＢを超えての輸送のために、ある程度の生化学的活性を保持しながら配列に対して行うことができる適切な改変を認識するであろう。
【０１６５】
ＧＢＡ及びＭ２促進物質の発現用ベクター
高い転写及び翻訳率を達成することに加えて、哺乳動物細胞における外因性遺伝子の安定発現を、遺伝子を含むポリヌクレオチドを哺乳動物細胞の核ゲノムに組み込むことにより達成することができる。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを哺乳動物細胞の核ＤＮＡに送達及び組み込むための様々なベクターが開発されている。発現ベクターの例は、例えば、ＷＯ１９９４／０１１０２６に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用するための発現ベクターは、ＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチド配列、さらには例えば、これらの作用物質の発現及び／またはこれらのポリヌクレオチド配列の哺乳動物細胞のゲノムへの組み込みに使用される追加の配列エレメントを含む。ＧＢＡ及びＭ２促進物質の発現に使用することができるある特定のベクターには、プロモーター及びエンハンサー領域などの遺伝子転写を指示する調節配列を含むプラスミドが含まれる。ＧＢＡ及びＭ２促進物質の発現に有用な他のベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を高める、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性または核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、例えば、発現ベクター上で運ばれる遺伝子の効率的な転写を指示するために、５’及び３’非翻訳領域、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用するために適した発現ベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。適切なマーカーの例は、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ヌーセオトリシンなどの抗生物質に対する抵抗性をコードする遺伝子である。
【０１６６】
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するための発現ベクターは、モノシストロニックまたはポリシストロニック発現カセットからＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現することができる。モノシストロニック発現カセットは、単一の遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載の多能性細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を、例えば、それぞれがモノシストロニック発現カセットを含む複数のプラスミド、または１つよりも多いモノシストロニック発現カセットを含む単一のプラスミドでトランスフェクトすることができる。ポリシストロニック発現カセットを使用して、単一の転写物から２つ以上のタンパク質を同時に発現させることができる。ポリシストロニック発現カセットは、単一の転写物から２つのタンパク質を生成するために使用することができ、かつリボソームを動員して５’キャップ以外のｍＲＮＡの領域から翻訳を開始するＩＲＥＳ配列を含んでもよいビシストロニック発現カセットを含む。
【０１６７】
口蹄疫ウイルス２Ａ（ＦＭＤＶ２Ａ）ポリヌクレオチドを、２つ以上の遺伝子（例えば、２つの遺伝子、３つの遺伝子、４つの遺伝子、５つの遺伝子またはそれ以上）を発現させるために利用することができ、ビシストロニックまたはポリシストロニック発現カセットを使用して、同じ転写物から等モルレベルの複数の遺伝子を生成することができる。ＦＭＤＶ２Ａは、２Ａ配列により連結されたタンパク質を分離する同時翻訳切断イベントを媒介し、複数の２Ａ配列を１つのベクターで使用することができる。複数のタンパク質を発現させるためのＦＭＤＶ２Ａの使用例については、その開示がＦＭＤＶ２Ａ配列の使用に関係するため、参照により本明細書に組み込まれるＲｙａｎ  ａｎｄ  Ｄｒｅｗ，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：９２８  （１９９４）を参照されたい。他のウイルス由来の２Ａ様配列も、本明細書に記載の組成物及び方法で使用することができ、それらの開示が遺伝子発現における２Ａ様配列の使用に関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＳｚｙｍｃｚａｋ  ａｎｄ  Ｖｉｇｎａｌｉ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ５：６２７  （２００５），  Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：５８９  （２００４）、及びＯｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：５６９  （２００５）に記載のとおり、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、ブタテスコウイルス−１（Ｐ２Ａ）、及びＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）由来の２Ａ様配列が含まれる。
【０１６８】
ＧＢＡ及びＭ２促進物質を発現させるためのウイルスベクター
ウイルスゲノムは、哺乳動物細胞への外因性遺伝子の効率的な送達に使用することができるベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、そのようなゲノム内に含まれるポリヌクレオチドが典型的に、一般化または特殊化された形質導入により哺乳動物細胞の核ゲノムに組み込まれるため、遺伝子送達に特に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として生じ、遺伝子統合を誘導するために追加のタンパク質または試薬を必要としない。ウイルスベクターの例は、レトロウイルス（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクター）、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルスなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘、カナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスである。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト泡沫状ウイルス、及び肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、トリＣ型ウイルス、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶグループ、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプマウイルスである（Ｃｏｆｆｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  （１９９６）））。他の例は、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、ギボンサル白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスである。ベクターの他の例は、例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれるＭｃＶｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （ＵＳ  ５，８０１，０３０）に記載されている。
【０１６９】
核酸送達のためのＡＡＶベクター
本明細書に記載の組成物及び方法の核酸を、細胞へのそれらの導入を容易にするために、ｒＡＡＶベクター及び／またはビリオンに組み込むことができる。ＡＡＶベクターは中枢神経系で使用することができ、適切なプロモーター及び血清型は、その開示がＣＮＳ遺伝子治療において有用なプロモーター及びＡＡＶ血清型に関するため参照により本明細書に組み込まれるＰｉｇｎａｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  （２０１７）（印刷前にｅｐｕｂ）において論述されている。本明細書に記載の組成物及び方法において有用なｒＡＡＶベクターは、（１）発現されるべき異種配列（例えば、ＧＢＡ及び／またはＭ２促進物質をコードするポリヌクレオチド）及び（２）異種遺伝子の統合及び発現を促進するウイルス配列を含む組換え核酸構築物である。ウイルス配列は、ビリオンへのＤＮＡの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされるＡＡＶの配列を含んでよい。そのようなｒＡＡＶベクターはまた、マーカーまたはレポーター遺伝子を含んでもよい。有用なｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ＷＴ遺伝子の１つまたは複数を全体的または部分的に欠失しているが、機能的隣接ＩＴＲ配列は保持する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、特定の用途に適した任意の血清型のものであってよい。ｒＡＡＶベクターを使用する方法は、例えば、それぞれの開示が遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関係するため、参照により本明細書に組み込まれる  Ｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ７：２７９  （２０００），及びＭｏｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ７：２４  （２０００）に記載されている。
【０１７０】
本明細書に記載の核酸及びベクターを、細胞への核酸またはベクターの導入を容易にするために、ｒＡＡＶビリオンに組み込むことができる。ＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ビリオンの外側の非核酸部分を構成し、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子によりコードされる。ｃａｐ遺伝子は、ビリオンのアセンブリに必要な３つのウイルスコートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶビリオンの構築は、例えば、それぞれの開示が遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ５，１７３，４１４；ＵＳ５，１３９，９４１；ＵＳ５，８６３，５４１；ＵＳ５，８６９，３０５；ＵＳ６，０５７，１５２；及びＵＳ６，３７６，２３７さらにはＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：７９１  （２００２）及びＢｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：４２３  （２００３）に記載されている。
【０１７１】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なｒＡＡＶビリオンには、ＡＡＶ  １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及びｒｈ７４を含む様々なＡＡＶ血清型に由来するものが含まれる。中枢神経系に配置されている、または中枢神経系に送達される細胞をターゲティングするためには、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０が特に有用であり得る。種々の血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、例えば、それぞれの開示が遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２：６１９  （２０００）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：３４２８  （２０００）；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：２２２４  （１９９８）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：１５２４  （２０００）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：６６１５  （２００１）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０：３０７５  （２００１）に記載されている。
【０１７２】
偽型ｒＡＡＶベクターも、本明細書に記載される組成物及び方法と併せて有用である。偽型ベクターには、所与の血清型以外の血清型に由来するキャプシド遺伝子で偽型化された所与の血清型のＡＡＶベクターが含まれる（例えば、とりわけＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０）。偽型ｒＡＡＶビリオンの構築及び使用をに関する技術は当技術分野で知られており、例えば、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：７６６２  （２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：１５２４  （２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２８：１５８  （２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０：３０７５  （２００１）に記載されている。
【０１７３】
ビリオンキャプシド内に変異を有するＡＡＶビリオンを使用して、非変異型キャプシドビリオンよりも効果的に特定の細胞型を感染させることができる。例えば、適切なＡＡＶ変異体は、特異的な細胞型へのＡＡＶのターゲティングを容易にするためのリガンド挿入変異を有してもよい。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、及びエピトープタグ変異体を含むＡＡＶキャプシド変異体の構築及び特徴付けは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：８６３５  （２０００）に記載されている。本明細書に記載の方法で使用することができる他のｒＡＡＶビリオンには、ウイルスの分子育種により、さらにはエクソンシャッフリングにより生成されるキャプシドハイブリッドが含まれる。例えば、Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２５：４３６  （２０００）及びＫｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：４２３  （２００１）を参照されたい。
【０１７４】
レトロウイルスベクター
本明細書に記載の方法及び組成物で使用される送達ベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。本明細書に記載の方法及び組成物で使用することができるレトロウイルスベクターの１つの型は、レンチウイルスベクターである。レトロウイルスのサブセットであるレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、広範囲の分裂細胞型及び非分裂細胞型を高効率で形質導入し、導入遺伝子の安定した長期発現をもたらす。レンチウイルスベクターの最適化戦略の概要は、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＤｅｌｅｎｄａ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：  Ｓ１２５  （２００４）に提示されている。
【０１７５】
レンチウイルスベースの遺伝子導入技術の使用は、目的の導入遺伝子が収容されている高度に欠失したウイルスゲノムを運ぶ組換えレンチウイルス粒子のインビトロ生成に依存している。特に、組換えレンチウイルスは、（１）パッケージング構築物、すなわち、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体をＲｅｖと共に発現するベクター（代替では、トランスで発現）；（２）一般に異種の性質のエンベロープ受容体を発現するベクター；及び（３）すべてのオープンリーディングフレームが除去されているが、複製、キャプシド形成、及び発現に必要な配列を維持し、発現されるべき配列が挿入されているウイルスｃＤＮＡであるトランスファーベクターの許容細胞株でのイントランス共発現により回収される。
【０１７６】
本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるレンチウイルスベクターは、５’−長末端反復（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶ  Ｐｓｉシグナル５’−スプライス部位（ＳＤ）、デルタ−ＧＡＧエレメント、Ｒｅｖレスポンシブエレメント（ＲＲＥ）、３’−スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１−アルファプロモーター及び３’−自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ−ＬＴＲ）のうちの１つまたは複数を含んでもよい。レンチウイルスベクターは、その開示がＷＰＲＥに関連するため参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，１３６，５９７に記載されているとおり、中央ポリプリン路（ｃＰＰＴ）及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を任意選択で含む。レンチウイルスベクターは、例えば下に示すとおりのものを含み得るｐＨＲ’主鎖をさらに含んでもよい。
【０１７７】
Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：９６３  （２００４）に記載のレンチゲンレンチウイルスベクターを使用して、ＤＮＡ分子を発現させる、及び／または細胞を形質導入することもできる。
【０１７８】
本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるレンチウイルスベクターは、５’−長末端反復（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶ  Ｐｓｉシグナル５’−スプライス部位（ＳＤ）、デルタ−ＧＡＧエレメント、Ｒｅｖレスポンシブエレメント（ＲＲＥ）、３’−スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１−アルファプロモーター及び３’−自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ−ＬＴＲ）を含んでもよい。任意選択で、これらの領域の１つまたは複数が、同様の機能を実行する別の領域で置換されることは、当業者には容易に明らかであろう。
【０１７９】
ＧＢＡまたはＭ２促進物質は、十分に高いレベルで発現する必要がある。導入遺伝子の発現は、プロモーター配列により駆動される。任意選択で、レンチウイルスベクターはＣＭＶプロモーターを含む。前記プロモーターは、ＥＦ１αまたはＰＧＫプロモーターであってもよい。別の実施形態では、前記プロモーターは、ミクログリア特異的プロモーター、例えば、ＣＤ６８プロモーター、ＣＸ３ＣＲ１プロモーター、ＩＴＧＡＭプロモーター、ＡＩＦ１プロモーター、Ｐ２Ｙ１２プロモーター、ＴＭＥＭ１１９プロモーター、またはＣＳＦ１Ｒプロモーターである。当業者は、本明細書に記載のベクター構築物において適切である多くのプロモーターに精通しているであろう。
【０１８０】
改変ＤＮＡ分子の発現を増加させる、またはレンチウイルスの組み込み効率を高めるために、エンハンサーエレメントを使用することができる。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるレンチウイルスベクターは、ｎｅｆ配列を含んでもよい。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるレンチウイルスベクターは、ベクター統合を増強するｃＰＰＴ配列を含んでもよい。ｃＰＰＴは、（＋）−鎖ＤＮＡ合成の第２の起点として機能し、その天然ＨＩＶゲノムの中央に部分的なストランドオーバーラップを導入する。トランスファーベクター主鎖にｃＰＰＴ配列を導入すると、核輸送及びターゲット細胞のＤＮＡに組み込まれるゲノムの総量が大幅に増加した。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるレンチウイルスベクターは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含んでもよい。ＷＰＲＥは、転写物の核輸出を促進することにより、及び／または新生転写物のポリアデニル化の効率を高めることにより、転写レベルで機能し、したがって、細胞内のｍＲＮＡの総量を増加させる。レンチウイルスベクターにＷＰＲＥを付加すると、インビトロ及びインビボの両方で、いくつかの異なるプロモーターからの導入遺伝子発現レベルが大幅に改善される。本明細書に記載される方法及び組成物において使用されるレンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴ配列及びＷＰＲＥ配列の両方を含んでもよい。ベクターはまた、単一のプロモーターからの複数のポリペプチドの発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含んでもよい。
【０１８１】
ＩＲＥＳ配列に加えて、複数のポリペプチドの発現を可能にする他のエレメントが有用である。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるベクターは、１種よりも多いポリペプチドの発現を可能にする複数のプロモーターを含んでもよい。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるベクターは、１種よりも多いポリペプチドの発現を可能にするタンパク質切断部位を含んでもよい。１種よりも多いポリペプチドの発現を可能にするタンパク質切断部位の例は、それらの開示が１種よりも多いポリペプチドの発現を可能にするタンパク質切断部位に関するため、参照により本明細書に組み込まれるＫｌｕｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．；８：８１１  （２００１），  Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：５６９  （２００５），  Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ａｎｄ，  Ｖｉｇｎａｌｉ，．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ５：６２７  （２００５）、及びＳｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：５８９  （２００４）に記載されている。当業者には、将来同定される複数のポリペプチドの発現を可能にする他のエレメントが有用であり、本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適したベクターで利用することができることは容易に明らかであろう。
【０１８２】
本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるベクターは、臨床グレードのベクターであってもよい。
【０１８３】
ウイルス調節エレメント
ウイルス調節エレメントは、核酸分子を宿主細胞に導入するために使用される送達担体の成分である。ウイルス調節エレメントは任意選択で、レトロウイルス調節エレメントである。例えば、ウイルス調節エレメントは、ＨＳＣ１またはＭＳＣＶからのＬＴＲ及びｇａｇ配列であってもよい。レトロウイルス調節エレメントはレンチウイルスに由来してもよいし、または他のゲノム領域から同定される異種配列であってもよい。
【０１８４】
当業者は、他のウイルス調節エレメントが同定されたとき、それらを本明細書に記載の核酸分子と共に使用することができることも理解するであろう。
【０１８５】
ターゲット細胞に外因性核酸を送達するための方法
コドン最適化ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、化学改変ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するために使用することができる技術は、当技術分野で周知である。例えば、エレクトロポレーションを使用して、目的の細胞に静電位を印加することにより、哺乳動物細胞（例えば、ヒトターゲット細胞）を透過性にすることができる。この様式で外部電場にかけられたヒト細胞などの哺乳動物細胞はその後、外因性核酸を取り込みやすくなる。哺乳動物細胞のエレクトロポレーションは、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１３１１  （１９８７）に詳細に記載されている。同様の技術であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）は、真核細胞の核への外因性ポリヌクレオチドの取り込みを刺激するために、印加電場を利用する。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）及びこの技術を実行するために有用なプロトコルは、例えば、それぞれの開示が参照により本明細書に組み込まれるＤｉｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １４：３１５  （２００５）、さらにはＵＳ２０１０／０３１７１１４に詳細に記載されている。
【０１８６】
ターゲット細胞のトランスフェクションに有用な追加の技術は、スクイーズ−ポレーション法である。この技術は、加えられたストレスに応答して形成される膜孔を通して外因性ＤＮＡの取り込みを刺激するために、細胞の急速な機械的変形を誘導する。この技術は、ヒトターゲット細胞などの細胞への核酸の送達にベクターが必要とされないということにおいて有利である。スクイーズ−ポレーションは、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＳｈａｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ８１：ｅ５０９８０  （２０１３）に詳細に記載されている。
【０１８７】
リポフェクションは、ターゲット細胞のトランスフェクションに有用な別の技術である。この方法は、多くの場合に第４級またはプロトン化アミンなどのカチオン性官能基をリポソーム外部に向かって提示するリポソームに、核酸を負荷することを伴う。これは、細胞膜のアニオン性の性質により、リポソームと細胞との間の静電相互作用を促進し、最終的に、例えば、リポソームと細胞膜の直接融合により、または複合体のエンドサイトーシスにより、外因性核酸の取り込みにつながる。リポフェクションは、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４４２，３８６号に詳細に記載されている。細胞膜とのイオン相互作用を利用して外来核酸の取り込みを誘発する同様の技術は、細胞をカチオン性ポリマー−核酸複合体と接触させることである。ポリヌクレオチドと会合して細胞膜との相互作用に好ましい正電荷を付与する例示的なカチオン性分子は、活性化デンドリマー（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＤｅｎｎｉｇ，  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２８：２２７  （２００３）に記載）ポリエチレンイミン、及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランであり、トランスフェクション剤としてのその使用は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＧｕｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：Ｉ：９．２：９．２．１  （１９９７）に詳細に記載されている。磁気ビーズは、穏やかで効率的な様式でターゲット細胞をトランスフェクトするために使用することができる別のツールである。それというのも、この方法は、核酸の取り込みを指示するため印加された磁場を利用するためである。この技術は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０２２７４０６で詳細に説明されている。
【０１８８】
ターゲット細胞による外因性核酸の取り込みを誘導するための別の有用なツールは、光トランスフェクションとも呼ばれるレーザーフェクションであり、これは細胞を穏やかに透過性にし、ポリヌクレオチドを細胞膜に透過させるために、細胞を特定の波長の電磁放射線に曝露することを含む技術である。この技術の生物活性は、エレクトロポレーションと同様であり、場合によっては、エレクトロポレーションより優れているとみられる。
【０１８９】
インペールフェクションは、遺伝物質をターゲット細胞に送達するために使用することができる別の技術である。これは、カーボンナノファイバー、カーボンナノチューブ、ナノワイヤーなどのナノ材料の使用に依存している。針状のナノ構造を、基質の表面に対して垂直に合成する。細胞内送達が意図されている遺伝子を含むＤＮＡを、ナノ構造表面に付着させる。次いで、これらの針のアレイを備えたチップを細胞または組織に押し付ける。ナノ構造を突き刺された細胞は、送達された遺伝子（複数可）を発現することができる。この技術の例は、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＳｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １０７：  １８７０  （２０１０）に記載されている。
【０１９０】
マグネトフェクションも、核酸をターゲット細胞に送達するために使用することができる。マグネトフェクションの原理は、核酸をカチオン性磁性ナノ粒子と会合させることである。磁性ナノ粒子は、完全に生分解性である酸化鉄から作製され、用途に応じて変化する特異的なカチオン性独自の分子（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）でコーティングされる。遺伝子ベクター（ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスベクターなど）とのそれらの会合は、塩誘導性コロイド凝集及び静電相互作用により達成される。次いで、磁石により生じる外部磁場の影響により、磁性粒子がターゲット細胞で濃縮される。この技術は、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＳｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１０２  （２００２）に詳細に説明されている。
【０１９１】
ターゲット細胞による外因性核酸の取り込みを誘導するための別の有用なツールは、ソノポレーションであり、これは、細胞原形質膜の透過性を変更するために音（典型的には超音波周波数）を使用して細胞を透過性にし、ポリヌクレオチドが細胞膜を透過することを可能にする技術である。この技術は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＲｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８２：３０９  （２００７）に詳細に説明されている。
【０１９２】
微小胞は、本明細書に記載の方法に従ってターゲット細胞のゲノムを改変するために使用され得る別の潜在的な担体を表す。例えば、糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇと、例えばヌクレアーゼなどのゲノム改変タンパク質との同時過剰発現により誘導される微小胞を使用して、後で内因性ポリヌクレオチド配列の部位特異的切断を触媒するタンパク質を細胞に効率的に送達して、遺伝子または調節配列などの目的のポリヌクレオチドの共有結合的組み込みのために細胞のゲノムを準備することができる。真核細胞の遺伝子改変ではジェシクルとも称されるそのような小胞の使用は、例えば、Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ［ａｂｓｔｒａｃｔ］：  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ［ａｂｓｔｒａｃｔ］  ：  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ；２０１５  Ｍａｙ  １３，  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  １２２に詳細に記載されている。
【０１９３】
遺伝子編集技術を使用した遺伝子発現の調節
内因性ＧＢＡの破壊
一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを破壊する（例えば、処置中の対象のニューロンの集団においてなど、処置を受けている対象において、または対象に投与される多能性細胞において）。内因性ＧＢＡ発現を破壊するための例示的な方法は、阻害性ＲＮＡ分子を対象に投与するか、または対象のニューロンの集団または対象に投与される多能性細胞の集団と接触させる方法である。阻害性ＲＮＡ分子は、内因性ＧＢＡ発現を破壊するように機能し得る、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して作用し得る。阻害性ＲＮＡ分子は、内因性ＧＢＡの発現レベル（例えば、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベル）を低下させ得る。例えば、阻害性ＲＮＡ分子には、全長の内因性ＧＢＡをターゲティングする短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、及び／またはマイクロＲＮＡが含まれる。ｓｉＲＮＡは、典型的には約１９〜２５塩基対の長さを持つ二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを介してターゲット遺伝子の発現を減少させるヘアピンターンを含むＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、プラスミド、例えば、ウイルスまたは細菌ベクターなどの形態で、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質導入により細胞に送達することができる。マイクロＲＮＡは、典型的には約２２ヌクレオチドの長さを有する非コーディングＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子上のターゲット部位に結合し、例えば、ｍＲＮＡの切断、ｍＲＮＡの不安定化、またはｍＲＮＡの翻訳の阻害を引き起こすことにより、ｍＲＮＡをサイレンシングする。阻害性ＲＮＡ分子は、改変ヌクレオチド、例えば、２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−デオキシ、アンロックド核酸、２’−ヒドロキシ、ホスホロチオエート、２’−チオウリジン、４’−チオウリジン、２’−デオキシウリジンを含むように改変することができる。理論に束縛されることはないが、ある特定の改変はヌクレアーゼ抵抗性及び／または血清安定性を上昇させることができるか、または免疫原性を低下させることができると考えられる。
【０１９４】
一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、内因性ＧＢＡのレベル及び／または活性もしくは機能を低下させる。実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、内因性ＧＢＡの発現を阻害する。他の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、内因性ＧＢＡの分解を増加させる、及び／または内因性ＧＢＡの安定性を低下させる。阻害性ＲＮＡ分子を、化学的に合成するか、またはインビトロで転写することができる。
【０１９５】
一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、例えば、本明細書に記載の遺伝子編集技術を使用して、ＧＢＡ導入遺伝子を含む多能性幹細胞において破壊する。一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、例えば、本明細書に記載の遺伝子編集技術を使用して、対象において全体的に破壊する。一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、例えば、本明細書に記載の遺伝子編集技術を使用して、対象のニューロンの集団で破壊する。一部の実施形態では、対象、ニューロン、及び／またはＧＢＡ導入遺伝子を含む多能性細胞における内因性ＧＢＡの破壊を、多能性幹細胞を対象に投与する前に行う。
【０１９６】
リボザイム、ＲＮＡｓｅ  Ｐ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの非コーディングＲＮＡに基づく阻害性治療薬の作製及び使用も、例えば、Ｓｉｏｕｄ，  ＲＮＡ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｄｅｓｉｇｎ，  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１０に記載のとおり、当技術分野で公知である。
【０１９７】
ヌクレアーゼ媒介遺伝子導入
多能性幹細胞のゲノムへのターゲット遺伝子の破壊及び統合のための別の有用なツールは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムであり、これは、元々はウイルス感染に対する細菌と古細菌における適応防御機構として進化したシステムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、プラスミドＤＮＡ及び関連Ｃａｓ９ヌクレアーゼ内の回文リピート配列を含む。このＤＮＡ及びタンパク質の集合体は、最初に外来ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むことにより、ターゲット配列の部位特異的ＤＮＡ切断を指示する。次いで、これらの外来配列及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピート−スペーサーエレメントを含むポリヌクレオチドを宿主細胞に転写してガイドＲＮＡを作製し、その後これを、ターゲット配列にアニーリングし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをこの部位に局在化させることができる。このように、Ｃａｓ９をターゲットＤＮＡ分子に近接させる相互作用はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに支配されるので、高度に部位特異的なＣａｓ９媒介ＤＮＡ切断を外来ポリヌクレオチドにおいて操作することができる。結果として、理論的にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、目的の任意のターゲットＤＮＡ分子（例えば、内因性ＧＢＡ）を切断するために設計することができる。この技術は、真核生物のゲノムを編集するために利用されており（その開示が参照により本明細書に組み込まれるＨｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：２２７  （２０１３））、多能性幹細胞ゲノムを部位特異的に編集して、ターゲット遺伝子をコードする遺伝子の取り込み前にＤＮＡ切断をするための効率的な手段として使用することができる。遺伝子発現を調節するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，６９７，３５９に記載されている。多能性幹細胞に目的の遺伝子を組み込む前に、ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断することによりターゲットＤＮＳを破壊するための代替方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは異なり、これらの酵素は、特異的なターゲット配列に局在化するための誘導ポリヌクレオチドを含まない。代わりに、ターゲット特異性は、これらの酵素内のＤＮＡ結合ドメインにより制御される。ゲノム編集用途でのＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの使用は、例えば、その両方の開示が参照により本明細書に組み込まれるＵｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：６３６  （２０１０）；及びＪｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：４９  （２０１３）に記載されている。一部の実施形態では、内因性ＧＢＡを、本明細書に記載のこれらの遺伝子編集技術を使用して、ＧＢＡ導入遺伝子及び／またはＭ２促進物質を含む多能性幹細胞において破壊することができる。
【０１９８】
トランスポゾン媒介遺伝子導入
ウイルスベクターに加えて、外因性遺伝子を多能性幹細胞（ＣＤ３４＋細胞など）に組み込むために使用することができる様々な追加のツールが開発されている。ターゲット遺伝子をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に組み込むために使用することができるそのような方法の１つは、トランスポゾンの使用を含む。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドであり、目的のポリヌクレオチド配列または遺伝子を５’及び３’切除部位に隣接して含む。トランスポゾンが細胞に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が始まり、トランスポゾンから目的の遺伝子を切断する活性酵素が生じる。この活性は、トランスポザーゼによるトランスポゾン切除部位の部位特異的認識により媒介される。ある特定の場合には、これらの切除部位は、末端リピートまたは逆位末端リピートであってもよい。トランスポゾンから切除されると、目的の遺伝子は、細胞の核ゲノム内に存在する同様の切除部位のトランスポザーゼ触媒切断により、哺乳動物細胞のゲノムに統合され得る。これにより、目的の遺伝子が相補的切除部位で切断された核ＤＮＡに挿入されることが可能になり、その後、目的の遺伝子を哺乳動物細胞ゲノムのＤＮＡに結合するホスホジエステル結合の共有ライゲーションで、組み込みプロセスは完了する。ある特定の場合には、トランスポゾンはレトロトランスポゾンであってもよく、その結果、ターゲット遺伝子をコードする遺伝子は、最初にＲＮＡ産物に転写され、次いで、哺乳動物細胞ゲノムへの組み込み前にＤＮＡに逆転写される。トランスポゾンシステムには、ピギーバックトランスポゾン（例えば、ＷＯ２０１０／０８５６９９に詳細に記載）及びスリーピングビューティートランスポゾン（例えば、ＵＳ２００５／０１１２７６４に詳細に記載）が含まれ、それぞれの開示が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
処置の方法
対象の選択
本明細書に記載のとおりに処置され得る対象は、パーキンソン病を有するか、または発症するリスクのある対象である。ＰＤのタイプは、ＧＢＡ関連ＰＤ、散発性ＰＤ、環境毒素、例えば除草剤や農薬により引き起こされるＰＤ、または非ＧＢＡ変異、例えばパーキン、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、もしくはＤＪ−１をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数の変異に関連するＰＤであってよい。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、正常なＧＢＡ活性を有する患者、ＧＢＡ活性が低下している患者、及びそのＧＢＡ変異状態及び／またはＧＢＡ活動レベルが不明な患者を処置することができる。本明細書に記載の組成物及び方法を、パーキンソン病を発症するリスクのある患者、例えばＧＢＡ変異を有する患者、ＧＢＡ活性が低下している患者、パーキン、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、またはＤＪ−１をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数に変異を有する患者、またはＰＤに関連する環境毒素に曝露された患者に予防的処置として投与することもできる。ＰＤのリスクのある患者は、処置を投与するときにＰＤの初期症状を示していてもよいし、またはまだ症状がなくてもよい。
【０２００】
投与経路
本明細書に記載の細胞及び組成物は、脳室内、定位的、静脈内、骨内などの様々な経路により、または骨髄移植により、パーキンソン病を有する対象に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及び組成物を、全身的に（例えば、静脈内）、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接（例えば、脳室内または定位的）、または骨髄に直接（例えば、骨内）投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及び組成物を大脳側脳室へと脳室内で、対象に投与する（この方法の説明は、マウスモデルの大脳側脳室への造血幹細胞及び前駆細胞の脳室内注入に関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＣａｐｏｔｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ３：ｅ１７０１２１１  （２０１７）において見い出すことができる）。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及び組成物を、黒質への定位的注射により対象に投与する（この方法の説明は、ＰＤマウスモデルの黒質への造血幹細胞及び前駆細胞の定位注入に関連するため、参照により本明細書に組み込まれるＡｌｔａｒｃｈｅ−Ｘｉｆｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：８３  （２０１６）において見い出すことができる）。任意の所与の症例における最適な投与経路は、投与される特定の細胞または組成物、患者、医薬製剤方法、投与方法（例えば、投与時間及び投与経路）、患者の年齢、体重、性別、処置される疾患の重症度、患者の食事、及び患者の排泄速度に依存する。複数の投与経路を使用して、例えば、脳室内もしくは定位注射と静脈内注射、脳室内もしくは定位注射と骨内注射、または脳室内もしくは定位注射と骨髄移植で、単一の対象を処置することができる。複数の投与経路を使用して、単一の対象を一度に処置することもできるし、または対象は、最初に１つの投与経路を介して処置を受け、２回目の受診時に、例えば１週間後、２週間後、１ヶ月後、６ヶ月後、または１年後に、別の投与経路を介して処置を受けてもよい。パーキンソン病の処置のために、細胞を対象に１回投与してもよいし、または細胞を対象に週、月、または年に１回または複数回（例えば２〜１０回）投与してもよい。
【０２０１】
前処置
細胞または組成物の投与前に、内因性ミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞を枯渇または除去することが有利であり得る。ミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞は、化学薬剤（例えば、ブスルファン、トレオスルファン、ＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ６４７、ＰＬＸ５６２２、またはクロドロネートリポソーム）、照射、またはそれらの組み合わせを使用することで除去することができる。細胞除去に使用される薬剤は、ＢＢＢ透過性であってもよいし（例えば、ブスルファン）、またはＢＢＢを超える能力を欠いていてもよい（例えば、トレオスルファン）。例示的なミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞除去薬はブスルファン（その開示がミクログリアを除去するためのブスルファンの使用に関連するため、参照により組み込まれるＣａｐｏｔｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １０９：１５０１８  （２０１２））、トレオスルファン、ＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ６４７、ＰＬＸ５６２２、またはクロドロネートリポソームである。内因性ミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞を枯渇させるための他の薬剤には、造血幹細胞により発現される抗原に結合することができる抗体またはその抗原結合断片に共有結合して抗体薬物複合体を形成することができる細胞毒素が含まれる。抗体薬物コンジュゲートに適した細胞毒素には、当技術分野で既知の中でも、ＤＮＡ挿入薬（例えば、アントラサイクリン）、有糸分裂紡錘体を破壊することができる薬剤（例えば、ビンカアルカロイド、メイタンシン、メイタンシノイド、及びそれらの誘導体）、ＲＮＡポリメラーゼ阻害薬（例えば、α−アマニチン及びその誘導体などのアマトキシン）、タンパク質生合成を妨害することができる薬剤（例えば、サポリン及びリシンＡ鎖などのｒＲＮＡ  Ｎ−グリコシダーゼ活性を示す薬剤）が含まれる。除去はすべてのミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞を排除してもよいし、またはミクログリア及び／または造血幹細胞と前駆細胞の数を少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上）減少させてもよい。ミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞を除去する１種または複数の薬剤を、本明細書に記載の細胞または組成物の投与の少なくとも１週間（例えば、１、２、３、４、５、または６週間以上）前に投与することができる。本明細書に記載の方法で投与された細胞は、除去されたミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞に取って代わることができ、脳室内、定位的、静脈内、または骨内注射後に、または骨髄移植後に、脳で再増殖し得る。静脈内、骨内、または骨髄移植により投与された細胞は、血液脳関門を通過して脳に入り、ミクログリアに分化し得る。脳に投与された細胞、例えば、脳室内または定位的に投与された細胞は、インビボでミクログリアに分化し得るか、エクスビボでミクログリアに分化し得る。
【０２０２】
幹細胞の奪回
本明細書に記載の方法は、ＣＤ３４＋細胞の集団（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、及び骨髄性前駆細胞）を対象に投与することを含み得る。これらの細胞は、ＧＢＡをコードする導入遺伝子を発現するように改変されていないＣＤ３４＋細胞であってもよい。これらの細胞が内因性ＧＢＡを破壊していてもよい。本明細書に記載のとおりの前処置後に、ＣＤ３４＋細胞を全身的に（例えば、静脈内）、または骨髄移植により投与して、骨髄区画を再構成することができる。例えば、これらのＣＤ３４＋細胞は幹細胞ニッチェに移動し、そのような部位で造血細胞系の細胞の量を例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれ以上増加させることができる。投与を、本明細書に記載の組成物の投与前または後に行うことができる。
【０２０３】
ドナー細胞の選択
一部の実施形態では、対象はドナーである。そのような場合、取り出された造血幹細胞または前駆細胞を（改変（例えば、ＧＢＡ及び／または１つ以上のＭ２促進物質をコードする導入遺伝子の組み込み、及び／または内因性ＧＢＡの破壊）後に）対象に再注入することができ、その後、細胞は、造血組織に帰着し、生産的造血を確立することとなり、それにより、対象において欠陥または欠損している細胞株（例えば、ミクログリアの集団）を増殖または再増殖することができる。このシナリオでは、注入される細胞が患者に由来し、患者が発現するのと同じＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ抗原を発現するので、移植された造血幹細胞または前駆細胞は移植片拒絶を受ける可能性が最も低くなる。
【０２０４】
別法では、対象及びドナーは異なってもよい。一部の実施形態では、対象及びドナーは血縁があり、例えば、ＨＬＡマッチであってよい。本明細書に記載されているとおり、ＨＬＡマッチのドナー−レシピエントのペアは、移植レシピエント内の内因性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が外来造血幹細胞または前駆細胞を異物として認識する可能性が低く、したがって移植に対する免疫応答を開始する可能性が低いので、移植片拒絶のリスクが低い。例示的なＨＬＡマッチのドナー−レシピエントのペアは、家族内ドナー−レシピエントペア（例えば、兄弟ドナー−レシピエントペア）などの遺伝的に関連するドナー及びレシピエントである。
【０２０５】
一部の実施形態では、対象及びドナーはＨＬＡミスマッチであり、これは、特にＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに関して、少なくとも１つのＨＬＡ抗原がドナーとレシピエントとの間でミスマッチである場合に起こる。例えば、移植片拒絶の可能性を低下させるために、一方のハプロタイプがドナーとレシピエントとの間でマッチしてもよく、かつ他方はミスマッチであってもよい。
【０２０６】
薬学的組成物及び用量
本明細書に記載のとおりにパーキンソン病（例えば、ＧＢＡ関連パーキンソン病）を処置するために対象に投与される細胞の数は、例えば、ＧＢＡの発現レベル、及び任意選択で、細胞におけるＭ２促進物質の発現レベル、患者、医薬製剤方法、投与方法（例えば、投与時間及び投与経路）、患者の年齢、体重、性別、処置を受ける疾患の重症度、及び患者が内因性ミクログリアを除去する薬剤で処置を受けたことがあるかどうかに依存し得る。投与される細胞の数は、例えば、１×１０６細胞／ｋｇ〜１×１０１２細胞／ｋｇ、またはそれ以上（例えば、１×１０７細胞／ｋｇ、１×１０８細胞／ｋｇ、１×１０９細胞／ｋｇ、１×１０１０細胞／ｋｇ、１×１０１１細胞／ｋｇ、１×１０１２細胞／ｋｇ、またはそれ以上）であってよい。細胞を未分化状態で、またはミクログリアへの部分的もしくは完全な分化後に投与することができる。ＣＤ３４＋細胞の数を、前処置後に任意の適切な用量で投与することができる。用量の非限定的な例は、約１×１０５ＣＤ３４＋細胞／レシピエントｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ（例えば、約２×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約９×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約３×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約８×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約４×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約７×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約５×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約６×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約５×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約６×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約７×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約８×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約９×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、及び約１×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ））である。追加の例示的な投与量は、とりわけ約１×１０１０ＣＤ３４＋細胞／レシピエントｋｇ〜約１×１０１２ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ（例えば、約２×１０１０ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約９×１０１１ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約３×１０１０ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約８×１０１１ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約４×１０１０ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約７×１０１１ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約５×１０１０ＣＤ３４
＋細胞／ｋｇ〜約６×１０１１ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約５×１０１０ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０１２ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約６×１０１０ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０１２ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約７×１０１０ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０１２ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約８×１０１０ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０１２ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約９×１０１０ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０１２ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、及び約１×１０１１ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０１２ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ）である。
【０２０７】
本明細書に記載の細胞及び組成物は、ＰＤにおける１つまたは複数の病理学的特徴を改善するために十分な量で投与することができる。本明細書に記載の細胞または組成物の投与は、対象の脳におけるＭ１ミクログリアの量と比較して、対象の脳におけるＭ２ミクログリアの量を増加させる、対象の脳における炎症誘発性サイトカインのレベルを低下させる、対象の脳における抗炎症性サイトカインのレベルを上昇させる、対象の認知能力を改善する、対象の運動機能を改善する、対象におけるα−シヌクレインレベルまたはその凝集を低減する、及び／または対象におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失を減少させることができる。Ｍ１及びＭ２ミクログリアの数を、処置前後の対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるサイトカイン、ケモカイン、ならびに他の炎症誘発性及び抗炎症性メディエーターのレベルを比較するためにＥＬＩＳＡを使用して、処置の前後に古典的活性化Ｍ１ミクログリアで高度に発現されるタンパク質であるトランスロケータータンパク質（ＴＳＰＯ）を、例えばＴＳＰＯ放射性リガンド１１Ｃ−（Ｒ）−ＰＫ１１１９５を使用して観察するためにＰＥＴイメージングを使用することにより、または標準的な技術、例えばウエスタンブロット分析、免疫組織化学分析、もしくは定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して組織サンプル中のＭ１及びＭ２関連遺伝子及びタンパク質のレベルを分析することにより評価することができる。認知と運動機能は、処置の前後に標準的な神経学的検査を使用して評価することができ、単量体及びオリゴマーのα−シヌクレインはＥＬＩＳＡを使用して血漿とＣＳＦで検出することができる。ドーパミン作動性ニューロンの損失は、Ｆ１８−ドーパＰＥＴスキャンまたはドーパミントランスポーターイメージングスキャン（１２３Ｉ−ＦＰ−ＣＩＴ  ＤａＴＳＣＡＮ）を使用して評価することができる。Ｍ２促進物質は、１つまたは複数の炎症誘発性サイトカイン、例えばＩＬ−１β、腫瘍壊死因子、ｉＮＯＳ、ＩＬ−６、またはＩＬ−１２、ケモカイン、Ｍ１関連遺伝子及び／またはタンパク質レベル、例えば、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ６８、ＣＤ１１Ｂ、またはＦｃγ受容体、オリゴマーα−シヌクレインレベル、及び／またはＴＳＰＯシグナルを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、５００％、またはそれ以上減少させ得る。Ｍ２促進物質は、１つまたは複数の抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−２５、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−β、ケモカイン、Ｍ２関連遺伝子及び／またはタンパク質レベル、例えば、ＣＤ１６３、ＴＲＥＭ２、Ａｒｇ１、またはＣＤ２０６、認知機能、運動機能、及び／またはＦ１８−ドーパシグナルを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、５００％、またはそれ以上増加させ得る。Ｍ２促進物質は、認知機能、運動機能及び／またはＦ１８−ドーパシグナルの低下を減速させる、または予防することができる。これらの作用は、例えば、１つまたは複数のＭ��促進物質を発現する多能性細胞の投与後１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、またはそれ以上の内に生じ得る。患者を、処置に使用された投与経路に応じて、多能性細胞の集団の投与から１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれ以上後に評価することができる。評価の結果に応じて、患者は追加の処置を受けることができる。
【０２０８】
キット
本明細書に記載の組成物を、パーキンソン病の処置において使用するためのキットで提供することができる。組成物は、ＧＢＡ及び１つまたは複数のＭ２促進物質を発現し、かつ任意選択で、内因性ＧＢＡを破壊していてもよい本明細書に記載の宿主細胞（例えば、ＨＳＣ、ｉＰＳＣ、ＥＳ細胞、ＣＤ３４＋細胞、骨髄前駆細胞）を含んでよい。細胞を、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、または別の凍結保護剤中で凍結保存することができる。前記キットは、医師などのキットのユーザーに本明細書に記載の方法を実施するように指示する添付文書を含むことができる。前記キットは任意選択で、組成物を投与するためのシリンジまたは他のデバイスを含んでもよい。
【実施例】
【０２０９】
以下の実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法をどのように使用し、作製し、評価することができるかについての説明を当業者に提供するために記載するものであって、本発明を単に例示することを意図しており、本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図したものではない。
【０２１０】
実施例１．非分泌型グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）及び任意選択でＭ２促進物質を発現するＣＤ３４＋造血幹細胞の生成
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するための、非分泌型ＧＢＡ及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を作製するための例示的な方法は、形質導入である。ＣＤ６８プロモーターなどのミクログリア特異的プロモーター、ＧＢＡシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、及びＧＢＡをコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アルファレトロウイルスベクター、またはガンマレトロウイルスベクター）を、当技術分野で公知の標準技術を使用して操作することができる。ＧＢＡ及びＩＬ−２５などのＭ２促進物質を発現する多能性細胞を作製すべき場合、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドとＩＬ−２５をコードするポリヌクレオチドとの間にＩＲＥＳ配列が配置されたビシストロニック発現カセットを使用することができる。レトロウイルスベクターを操作した後、そのレトロウイルスを使用して多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＣＤ３４＋ＨＳＣ）を形質導入すると、非分泌型ＧＢＡ及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を生成することができる。
【０２１１】
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するための、非分泌型ＧＢＡ、及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞を作製するための追加の例示的な方法は、トランスフェクションである。当技術分野で公知の分子生物学技術を使用して、ミクログリア特異的プロモーター（例えば、ＣＤ６８プロモーター）などのプロモーター、ＧＢＡシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、及びＧＢＡをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを生成することができる。例えば、ＧＢＡ遺伝子を、当技術分野で公知のＰＣＲベースの技術を使用してヒト細胞株から増幅することができるか、または遺伝子を、例えば、固相ポリヌクレオチド合成手順を使用して合成することができる。次いで、ＧＢＡ遺伝子、プロモーター、及びＭ２促進物質をコードする核酸を、例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼ媒介切断及びライゲーションプロトコルを使用して、目的のプラスミドにライゲートすることができる。非分泌型ＧＢＡ及びＩＬ−２５などのＭ２促進物質を発現する多能性細胞を作製すべき場合、ＩＲＥＳ配列がＧＢＡをコードするポリヌクレオチドとＩＬ−２５をコードするポリヌクレオチドとの間に位置するビシストロニック発現カセットを使用することができる。プラスミドＤＮＡを操作した後、そのプラスミドを使用して、例えばエレクトロポレーションまたは本明細書に記載の別のトランスフェクション技術を使用して多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＣＤ３４＋ＨＳＣ）をトランスフェクトし、非分泌型ＧＢＡ及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を生成することができる。本明細書に記載の両方の例示的な方法で、非分泌型ＧＢＡを、ＧＢＡ融合タンパク質として発現させることができる。融合タンパク質は、非分泌型ＧＢＡ及びグリコシル化非依存型リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）タグを含んでもよい。例示的なＧＩＬＴタグは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に由来するムテインである。これらのＩＧＦ−ＩＩムテインは、インスリン受容体についての天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比較して、インスリン受容体についての結合活性が低下しており、フーリン切断に抵抗性があり、マンノース−６−リン酸非依存的な様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する。ＧＩＬＴタグは、分泌型ＧＢＡ融合タンパク質のリソソームへの送達を容易にする。
【０２１２】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用するためのＧＢＡをコードする例示的な構築物は、図１Ａ〜１Ｇに示されている。
【０２１３】
実施例２．分泌型グルコセレブロシダーゼ、及び任意選択でＭ２促進物質を発現するＣＤ３４＋造血幹細胞の生成
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するための、分泌型ＧＢＡ、及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を作製するための例示的な方法は形質導入である。ＣＤ６８プロモーターなどのミクログリア特異的プロモーター、ＩＧＦ−ＩＩ、α−１アンチトリプシン、またはＧＢＡ分泌シグナルペプチドなどの分泌シグナルペプチド、及びＧＢＡをコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アルファレトロウイルスベクター、またはガンマレトロウイルスベクター）を、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して操作することができる。分泌型ＧＢＡ及びＩＬ−２５などのＭ２促進物質を発現する多能性細胞を作製すべき場合、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドとＩＬ−２５をコードするポリヌクレオチドとの間にＩＲＥＳ配列が位置するビシストロニック発現カセットを使用することができる。レトロウイルスベクターを操作した後、そのレトロウイルスを使用して多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＣＤ３４＋ＨＳＣ）を形質導入し、非分泌型ＧＢＡ及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を生成することができる。
【０２１４】
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するための、分泌型ＧＢＡ、及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞を作製するための追加の例示的な方法は、トランスフェクションである。当技術分野で公知の分子生物学技術を使用して、ミクログリア特異的プロモーター（例えば、ＣＤ６８プロモーター）などのプロモーター、ＩＧＦ−ＩＩ、アルファ−１アンチトリプシン、またはＧＢＡ分泌シグナルペプチドなどの分泌シグナルペプチド、及びＧＢＡをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを生成することができる。例えば、ＧＢＡ遺伝子を、当技術分野で公知のＰＣＲベースの技術を使用してヒト細胞株から増幅することができるか、または遺伝子を、例えば、固相ポリヌクレオチド合成手順を使用して合成することができる。次いで、ＧＢＡ遺伝子、プロモーター、及びＭ２促進物質をコードする核酸を、例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼ媒介切断及びライゲーションプロトコルを使用して、目的のプラスミドにライゲートすることができる。分泌型ＧＢＡ及びＩＬ−２５などのＭ２促進物質を発現する多能性細胞を作製すべき場合、ＧＢＡをコードするポリヌクレオチドとＩＬ−２５をコードするポリヌクレオチドとの間にＩＲＥＳ配列が位置するビシストロニック発現カセットを使用することができる。プラスミドＤＮＡを操作した後、そのプラスミドを使用して、例えばエレクトロポレーションまたは本明細書に記載の別のトランスフェクション技術を使用して多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＣＤ３４＋ＨＳＣ）をトランスフェクトし、非分泌型ＧＢＡ及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を生成することができる。
【０２１５】
本明細書に記載の例示的な方法の両方で、分泌型ＧＢＡを、ＧＢＡ融合タンパク質として発現させることができる。融合タンパク質は、分泌型ＧＢＡ及びグリコシル化非依存型リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）タグを含んでもよい。例示的なＧＩＬＴタグは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に由来するムテインである。これらのＩＧＦ−ＩＩムテインは、インスリン受容体についての天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比較して、インスリン受容体についての結合活性が低下しており、マンノース−６−リン酸非依存的な様式でフーリン切断に抵抗性があり、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する。ＧＩＬＴタグは、分泌型ＧＢＡ融合タンパク質のリソソームへの送達を容易にする。分泌型ＧＢＡ融合タンパク質は追加的に、血液脳関門（ＢＢＢ）を超えてのＧＢＡ融合タンパク質の透過を可能にするＬＤＬＲｆ受容体結合（Ｒｂ）ドメインアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を含むペプチド配列を含む。
【０２１６】
実施例３．パーキンソン病に罹患している患者への、ＧＢＡを発現する多能性細胞の集団の投与
本明細書に開示の方法によれば、当業医師は、パーキンソン病の症状を軽減または緩和するように、ヒト患者などの患者を処置することができる。この目的のために、当業医師は、ＧＢＡを発現する多能性細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＨＳＣ、または骨髄前駆細胞など））の集団をヒト患者に投与することができる。細胞は、ＩＬ−２５、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＴＧＦ−βなどのＭ２促進物質を発現してもよい。本明細書に記載されているか、または当技術分野で公知の技術を使用して、細胞を、ＧＢＡ及び、任意選択でＭ２促進物質を発現するようにエクスビボで形質導入またはトランスフェクトすることができる。ＧＢＡ、及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を、例えば、全身的に（例えば、静脈内）、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接的に（例えば、脳室内または定位的）、骨髄に直接的に（例えば、骨内）患者に投与して、パーキンソン病を処置することができる。細胞を、複数の投与経路により、例えば静脈内及び脳室内で患者に投与することもできる。細胞を、１×１０６細胞／ｋｇ〜１×１０１２細胞／ｋｇまたはそれ以上（例えば１×１０７細胞／ｋｇ、１×１０８細胞／ｋｇ、１×１０９細胞／ｋｇ、１×１０１０細胞／ｋｇ、１×１０１１細胞／ｋｇ、１×１０１２細胞／ｋｇ、またはそれ以上）などの治療有効量で投与する。
【０２１７】
ＧＢＡ、及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を患者に投与する前に、１つまたは複数の薬剤、例えば、ブスルファン、トレオスルファン、ＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ６４７、ＰＬＸ５６２２、及び／またはクロドロネートリポソームを患者に投与して、患者の内因性ミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞を除去することもできる。照射など、当技術分野で周知の他の細胞除去方法を、単独で、または前述の薬剤の１つまたは複数と組み合わせて使用して、患者のミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞を除去することができる。これらの薬剤及び／または処置は、当技術分野で公知のＰＥＴ画像化技術により評価した場合に、内因性ミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞を少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、それ以上）除去し得る。ミクログリア除去後に、ＧＢＡ及び、任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を患者に投与すると、多能性細胞が脳で再増殖し、ミクログリアに分化する。ＧＢＡび、任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を、例えば、ミクログリア除去から１週間から１ヶ月（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間）またはそれ以上後に患者に投与することができる。
【０２１８】
患者の内因性ミクログリア及び／または造血幹細胞及び前駆細胞の除去後に、ＣＤ３４＋細胞の集団を、患者に全身的に（例えば、静脈内）、または骨髄移植により投与して、骨髄区画を再構成することができる。ＣＤ３４＋細胞の数を、前処置後に任意の適切な用量で投与することができる。用量の非限定的な例は、約１×１０５ＣＤ３４＋細胞／レシピエントｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ（例えば、とりわけ約２×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約９×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約３×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約８×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約４×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約７×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約５×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約６×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約５×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約６×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約７×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約８×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、約９×１０５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ、または約１×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ）である。投与は、ＧＢＡ、及び任意選択で１つまたは複数のＭ２促進物質を発現する多能性細胞の投与の前、または後に行うことができる。
【０２１９】
ＧＢＡ及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を、パーキンソン病の病理学的特徴の１つまたは複数を処置するために十分な量で患者に投与することができる。例えば、ＧＢＡ及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団を、患者の脳のＭ１ミクログリアの量と比較して、患者の脳のＭ２ミクログリアの量を増加させるために十分な量で投与することができる。相対的な増加は、当技術分野で公知の従来の技術を使用して、例えば処置の前後に患者のＣＳＦでＥＬＩＳＡを実行して、両方の時点でＭ１及びＭ２ミクログリアにより分泌される炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインのレベルを評価することにより測定することができる。認知能力と運動機能の変化を評価するために、医師が標準的な神経学的検査を処置前後に行うこともできる。患者を、処置に使用される投与経路に応じて、多能性細胞の集団の投与から例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれ以上後に評価することもできる。ＧＢＡ及び任意選択でＭ２促進物質を発現する多能性細胞の集団の投与後の炎症誘発性サイトカインの減少、抗炎症性サイトカインの増加、及び／または認知機能または運動機能の改善の所見は、処置がパーキンソン病を成功裏に処置していることを示す。
【０２２０】
実施例４．パーキンソン病に罹患している患者への投与前の多能性細胞における内因性ＧＢＡの破壊。
本明細書に開示の方法のいずれかにおいて、ＣＤ３４＋細胞などの多能性幹細胞（例えば、ＧＢＡ及び任意選択で１つまたは複数のＭ２促進物質をコードする導入遺伝子を発現するもの、または導入遺伝子非含有ＣＤ３４＋細胞）を、患者への投与前に内因性ＧＢＡを破壊するように処理することができる。多能性細胞の内因性ＧＢＡを破壊する例示的な方法は、ＧＢＡ特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を使用して、１つまたは複数の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することである。ＤＳＢを修復するための非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に続いて、新しく形成されたインデル変異の存在により、内因性ＧＢＡの破壊が生じる。多能性幹細胞にＧＢＡ導入遺伝子を組み込む前にゲノムＤＮＡを部位特異的に切断することにより内因性ＧＢＡを破壊するための代替方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは異なり、これらの酵素は、特異的なターゲット配列に局在化するガイドポリヌクレオチドは含まないが、代わりに酵素内の内部ＤＮＡ結合ドメインに依存してターゲット特異性を媒介する。例示的な実施形態において、多能性細胞は、内因性ＧＢＡの発現を１０％またはそれ以上低下または減少させるために、ヌクレアーゼによりエクスビボで操作される（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上）。
【０２２１】
実施例５．コドン最適化ＧＢＡを発現する哺乳動物細胞株の生成。
レンチウイルスでコードされるコドン最適化ＧＢＡ（ＧＢＡｃｏ）導入遺伝子（例えば、配列番号７〜１０のいずれか１つのコドン最適化核酸配列を持つＧＢＡｃｏ導入遺伝子）の、哺乳動物細胞株で安定発現する能力を評価するために、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びマウスＲＡＷ２６４．７細胞をインビトロで形質導入した。細胞を、１）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；２）ＧＢＡｃｏのみ；３）ＧＢＡｃｏ、グリコシル化非依存性リソソームターゲティング（ＧＩＬＴ）タグ、及びペプチドリンカー；４）ＧＢＡｃｏ及び改変シグナルペプチド配列；５）ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及び剛性ペプチドリンカー；または６）ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及びＸＴＥＮリンカーを含む群から選択される６つの操作構築物の１つで形質導入した。形質導入後にタンパク質サンプルを採取して、ＧＢＡ酵素活性を測定し、タンパク質レベルを定量化した。ＧＢＡにより酵素的に変換されて蛍光生成物である４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）を生成する４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵＧ）基質を使用して、ＧＢＡ酵素活性を測定した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ベクターコピー数（ＶＣＮ）＝１．２１）またはＲＡＷ２６４．７（ＶＣＮ＝０．９３）細胞でのＧＢＡｃｏ構築物のレンチウイルス発現は、対照ＧＦＰ構築物と比較して、ＧＢＡ酵素活性（図２Ａ、２Ｃ）及びタンパク質レベル（図２Ｂ、２Ｄ）を増加させた（ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙ事後分析を伴うＡＮＯＶＡ、ｎ＝３の独立した形質導入）。さらに、操作ＧＢＡタンパク質は予測された分子量で検出され、これは、ＧＩＬＴ及びリンカーペプチドが安定生成されたことを示唆している（図３）。
【０２２２】
ＧＢＡタンパク質のＮ末端での翻訳後グリコシル化（例えば、Ｎ結合型グリコシル化）は、ＧＢＡ機能にとって重要である。したがって、操作ＧＢＡタンパク質を、インビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＮ結合型グリコシル化について試験した。本発明者らは、糖タンパク質からＮ結合型糖を除去するＥｎｄｏＨまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆグリコシダーゼで酵素消化した後、操作ＧＢＡタンパク質の電気泳動移動度シフトをアッセイした。細胞溶解産物のウエスタンブロット分析により、試験した構築物のすべて（例えば、ＧＢＡｃｏ、ＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及び剛性リンカー、またはＧＢＡｃｏ、ＧＩＬＴタグ、及びＸＴＥＮリンカー；図３）において脱グリコシル化後の電気泳動移動度の上昇が明らかになり、これは、操作ＧＢＡタンパク質が哺乳動物細胞株でグリコシル化されることを示している。
【０２２３】
操作ＧＢＡ構築物が安定して造血幹細胞で発現し得るかを決定するために、レンチウイルスでコードされる構築物を、ＧＢＡ欠乏のマウスモデルの骨髄から単離したマウス系統陰性（Ｌｉｎ−）造血幹細胞に形質導入した（ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋ｎ＝３；Ｔｈｙ１−ＳＮＣＡ；ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋ｎ＝１；Ｔｈｙ１−ＳＮＣＡ；ＧｂａＤ４０９Ｖ／Ｄ４０９Ｖｎ＝２；野生型（ＷＴ）ｎ＝２）。ＧＦＰまたはＧＢＡｃｏをコードするレンチウイルス構築物での形質導入の５日後（感染の多重度＝８０）に、Ｌｉｎ−細胞は＞８３％生存していて（トリパンブルー色素排除によりアッセイ）、かつ多能性のままであった（＞５０コロニー形成単位）。Ｌｉｎ−細胞の酵素アッセイは、ヘテロ接合及びホモ接合Ｇｂａ変異がＧＢＡ導入遺伝子の非存在下でそれぞれＧＢＡ活性を４３％及び９２％低下させたことを実証した（ＷＴ：１３．０４±０．６４４ｎｍｏｌ  ｈｒ−１ｍｇ−１；ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋：７．４９±０．２９３ｎｍｏｌ  ｈｒ−１ｍｇ−１；Ｔｈｙ１−ＳＮＣＡ；ＧｂａＤ４０９Ｖ／＋：７．１４±０．２５２ｎｍｏｌ  ｈｒ−１ｍｇ−１；Ｔｈｙ１−ＳＮＣＡ；ＧｂａＤ４０９Ｖ／Ｄ４０９Ｖ：１．２０±０．１１４ｎｍｏｌ  ｈｒ−１ｍｇ−１；ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後分析を伴うＡＮＯＶＡ、図４Ａ）。重要なことに、Ｌｉｎ−細胞のＧＢＡｃｏ形質導入は、ＧＦＰ対照と比較して、すべての試験したＧＢＡｃｏ構築物で同様のレベルにまでＧＢＡ酵素活性を有意に上昇させた（Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後分析を伴うＡＮＯＶＡ。図４Ａ）。さらに、ＧＢＡｃｏ発現は、ウエスタンブロットによるＬｉｎ−細胞からの馴化培地におけるＧＢＡ活性の検出につながった（図４Ｂ）。まとめると、これらの所見は、レンチウイルスＧＢＡｃｏ構築物が造血幹細胞（例えば、マウスＬｉｎ−細胞において）において機能的ＧＢＡ酵素を産生し、ＧＢＡ欠乏のマウスモデルにおいてＧＢＡの活性及び発現レベルを奪回することができることを実証している。
【０２２４】
他の実施形態
本発明の様々な改変及び変形が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を、具体的な実施形態との関係において説明してきたが、特許請求の範囲に記載のとおりの本発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際に、当業者に明らかである、本発明を実施するための記載の様式の様々な改変が本発明の範囲内であることが意図されている。
【０２２５】
他の実施形態は、特許請求の範囲に見出される。
【図１Ａ】
2021517168.tif 000005
【図１Ｂ】
2021517168.tif 000006
【図１Ｃ】
2021517168.tif 000007
【図１Ｄ】
2021517168.tif 000008
【図１Ｅ】
2021517168.tif 000009
【図１Ｆ】
2021517168.tif 000010
【図１Ｇ】
2021517168.tif 000011
【図２Ａ】
2021517168.tif 000012
【図２Ｂ】
2021517168.tif 000013
【図２Ｃ】
2021517168.tif 000014
【図２Ｄ】
2021517168.tif 000015
【図３】
2021517168.tif 000016
【図４Ａ】
2021517168.tif 000017
【図４Ｂ】
2021517168.tif 000018
【配列表】
2021517168000001.app
【国際調査報告】
2021517168.tif 000019
2021517168.tif 000020
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