(57)【要約】  本発明は式１、式２または式３の化合物、その薬学的に許容可能な塩、または溶媒和物に関し、式中、Ｘ１、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は本明細書に定義された通りである。前記化合物は、様々な細菌感染と原虫感染およびそうした感染症に関連する障害を処置するために使用され得る抗菌剤である。本発明は、さらに、前記化合物を含む医薬組成物、および、式１、式２または式３の化合物の投与により、細菌感染および原虫感染を処置する方法に関する。【化１】2021510143.tif 000046【選択図】なし
2021510143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の化合物、その薬学的に許容可能な塩、または溶媒和物であって、
【化１】
2021510143.tif 000033
式中：
（１）  Ｘ１が、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、および、−Ｃ（＝Ｏ）、から成る群から選択され；および、
（２）  Ｒ１−Ｒ５の各々が、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾから成る群から独立して選択されることを特徴とし、または、前記化合物が：
【化２】
2021510143.tif 000034
からなる群から選択されることを特徴とする、化合物。
【請求項２】
前記化合物が：
【化３−１】
2021510143.tif 000035
【化３−２】
2021510143.tif 000036
【化３−３】
2021510143.tif 000037
【化３−４】
2021510143.tif 000038
【化３−５】
2021510143.tif 000039
【化３−６】
2021510143.tif 000040
【化３−７】
2021510143.tif 000041
から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１の化合物を含む、細菌感染症または原虫感染症の処置または予防のための医薬組成物。
【請求項４】
前記医薬組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハードキャンディー、粉末、分無罪、クリーム、軟膏、坐剤、ゼリー、ゲル、ペースト、ローション、膏薬、水性懸濁液、注射溶液、エリキシル剤、またはシロップ剤の形態をとることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が前記化合物の５重量％から７０重量％含むことを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記細菌感染症または原虫感染症が、エンテロコッカス・フェカーリス、黄色ブドウ球菌、肺炎杆菌、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、汚物腸内菌、大腸菌および肺炎連鎖球菌から成る群から選択される微生物によって引き起こされることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
微生物におけるＮｕｓＢ−ＮｕｓＥ相互作用を阻害する方法であって、前記微生物に請求項１の化合物を接触させる工程を含む、方法。
【請求項８】
前記ＮｕｓＢはＮｕｓＢ  Ｅ８１、ＮｕｓＢ  Ｙ１８、およびＮｕｓＢ  Ｅ７５から選択され、および、前記ＮｕｓＥはＮｕｓＥ  Ｈ１５、ＮｕｓＥ  Ｄ１９、およびＮｕｓＥ  Ｒ１６から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物は、エンテロコッカス・フェカーリス、黄色ブドウ球菌、肺炎杆菌、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、汚物腸内菌、大腸菌および肺炎連鎖球菌から成る群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
被験体における細菌感染または原虫感染を処置または予防する方法であって、該方法は前記被験体に治療上効果的な量の請求項１の化合物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記化合物は、経口、非経口、局所的、または直腸の経路を通じて投与されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物がエンテロコッカス・フェカーリス、黄色ブドウ球菌、肺炎杆菌、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、汚物腸内菌、大腸菌および肺炎連鎖球菌から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮｕｓＢはＮｕｓＢ  Ｅ８１、ＮｕｓＢ  Ｙ１８およびＮｕｓＢ  Ｅ７５から選択され、および前記ＮｕｓＥはＮｕｓＥ  Ｈ１５、ＮｕｓＥ  Ｄ１９およびＮｕｓＥ  Ｒ１６から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
式２の化合物、その薬学的に許容可能な塩、またはその溶媒和物であって、
【化４】
2021510143.tif 000042
式中：
（１）  Ｘ１が、  −Ｎ＝ＣＨ−、  −ＣＨ＝Ｎ−、  −ＣＨ＝ＣＨ−、  −ＮＨ−ＣＨ２−、  −ＣＨ２−ＮＨ−、  −ＣＨ２−ＣＨ２−、  −ＣＨ２−Ｏ−、  −Ｏ−ＣＨ２−、  −ＣＨ２−Ｓ−、  −Ｓ−ＣＨ２−、  −Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、  −Ｓ（＝Ｏ）−ＮＨ−、  −ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−、  −ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）−、  −Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ２−、  −Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ−、  −ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）２−、  −ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）２−、  −Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、  −ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、  および  −Ｃ（＝Ｏ）−、からなる群から選択され；および、
（２）  Ｒ１−Ｒ５の各々が、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾ、から成る群から独立して選択されることを特徴とする、式２の化合物。
【請求項１５】
前記化合物が：
【化５】
2021510143.tif 000043
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
式３の化合物、その薬学的に許容可能な塩、またはその溶媒和物であって、
【化６】
2021510143.tif 000044
式中：
（１）Ｘ１およびＹの各々は、−ＮＨ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−および−Ｓ−から成る群から独立して選択され；および、
（２）  Ｒ１−Ｒ５の各々が、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾから成る群から独立して選択される、ことを特徴とする、式３の化合物。
【請求項１７】
前記化合物がＭＣ４−４５であることを特徴とする、請求項１６に記載の化合物。
【化７】
2021510143.tif 000045
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１月９日に出願された米国仮出願６２／６１５，４１８号の利益を主張する。先の出願の全内容および開示は参照によってこの出願に組み入れられる。
【０００２】
本出願の全体にわたって、様々な刊行物が引用される。これらの刊行物の全体における開示は、本発明が関係する最先端技術をより十分に記載するために本出願への引用によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
この発明は抗菌活性を有する化合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
グラム陽性の病原体メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）によって引き起こされた感染は、最も深刻な公衆衛生の懸念の１つになった１。ＭＲＳＡを抑制するのに利用可能な薬学的対抗手段は、バンコマイシン、ダプトマイシン及びリネゾリドに限られるため２、それらに対する抵抗性が既に増している３。従って、ＭＲＳＡに関連する感染症と戦うための強力且つ特異的な活性を備えた新しい抗菌剤を開発するために、新しい抗生物質の標的を検証する緊急の必要性がある。
【０００５】
細菌細胞では、ｒＲＮＡは、ＲＮＡ全体の最大８０％を含み、及び、ｒＲＮＡの転写は、タンパク質合成に対する需要を満たすために、細菌増殖速度に正の相関を持つと示されてきた４。ｒＲＮＡ合成は生細胞にとって最も基礎的な必要条件の１つであるが、この過程において顕著な不一致がある。真核細胞では、リボソームの遺伝子は、異なるタイプのＲＮＡポリメラーゼ、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよび、ＩＩＩ５によって転写される。他方、細菌においては、１つだけＲＮＡポリメラーゼがあり、これは、いわゆる「ｒＲＮＡ抗終結複合体」の形成のための多くの伸長因子に関係しており、ｒＲＮＡ遺伝子の効率的な転写を保証する６。
【０００６】
ＮｕｓＢおよびＮｕｓＥ（３０Ｓリボソームサブユニットのリボソームタンパク質Ｓ１０としても知られている）は、ｒＲＮＡ抗終結複合体の形成に関わる、高度に保存された必須の小さな転写因子である７。ＮｕｓＢとＮｕｓＥの間のタンパク質−タンパク質相互作用は、ｒＲＮＡ転写抗終結複合体の集合における最初の調節工程をあらわす８。一旦、ＮｕｓＢ−ＮｕｓＥヘテロダイマーが形成されると、それはｂｏｘＡと呼ばれるｒＲＮＡリーダー配列の領域と相互作用する９。ＮｕｓＢ−ＮｕｓＥ−ｂｏｘＡ複合体のＲＮＡポリメラーゼへの結合の後、他の因子（例えばＮｕｓＡ、ＮｕｓＧなど）が動員され、その中でＮｕｓＧだけには真核生物ホモログがある１０。
【０００７】
ＮｕｓＢおよびＮｕｓＥが細菌細胞の生存にとって不可欠であるため１１、本発明は、ｒＲＮＡ合成および細菌細胞増殖の速度を低下させるために、ＮｕｓＢ−ＮｕｓＥヘテロダイマー形成の阻害のための化合物を供給する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は抗菌活性を備えた化合物を供給する。一実施形態において、本発明は、式１の化合物または薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、またはその溶媒和物を提供し：
【０００９】
【化１】
2021510143.tif 000003
式中：
（１）  Ｘ１は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨ、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２、−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、および、−Ｃ（＝Ｏ）−、から成る群から選択され；および、
（２）  Ｒ１−Ｒ５の各々は、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾから成る群から独立して選択される。
【００１０】
一実施形態において、この発明は、式２の化合物または薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、またはその溶媒和物を提供し：
【００１１】
【化２】
2021510143.tif 000004
式中：
（１）  Ｘ１は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、および、−Ｃ（＝Ｏ）−、から成る群から選択され；および、
（２）  Ｒ１−Ｒ５の各々は、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾから成る群から独立して選択される。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、式３の化合物または薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、またはその溶媒和物を提供し、
【００１３】
【化３】
2021510143.tif 000005
式中：
（１）  Ｘ１またはＹは、−ＮＨ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−、および、−Ｓ−、から成る群から選択され；および、
（２）  Ｒ１  −  Ｒ５の各々は、また、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾから成る群から独立して選択される。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物、魚類または鳥類における細菌感染または原虫感染の処置のために医薬組成物を提供し、該医学組成物は薬学的に許容可能な担体を備えた、治療上有効な量の式１、式２または式３の化合物を含む。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物、魚類または鳥類における細菌感染または原虫感染を処置する方法を提供し、該方法は前記哺乳動物、魚類または鳥類に治療上有効な量の式１、式２または式３の化合物を投与する工程を含む。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、式１、式２、または式３の化合物を調製する方法を提供する。
【００１７】
定義および略語
以下の用語は、本発明を説明するために使用される。本明細書に述べられる具体的な定義がない限り、本発明を説明することに使用される用語は、当業者によって理解されるようなそれらの共通の意味を与えられる。
【００１８】
本明細書で使用されるように、他に示されない限り、用語「処置すること」は、前記用語が適用される障害又は疾病、或いは、そのような障害又は疾病の１つ以上の症状を逆転し、軽減し、それらの進行を阻害し、或いは予防することを意味する。本明細書で使用されるように、用語「処置」は、「処置すること」が直前に定義されるような、処置の作用を指す。
【００１９】
本明細書において使用される際は、他に指示がない限り、「細菌感染」、「原虫感染」、および「細菌感染または原虫感染に関連する障害」という用語または句は、以下を含む：肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、モラクセラ・カタラーリス、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス、Ｅ．フェシウム（Ｅ．  ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．  ｃａｓｓｅｌｆｌａｖｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．ヘモリチカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、またはペプトストレプトコッカス属菌による感染に関連する肺炎、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、扁桃腺炎、および、乳様突起炎；化膿連鎖球菌、Ｃ群およびＧ群の連鎖球菌、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、またはアクチノバチルス・ヘモリティクム（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）による感染に関連する咽頭炎、リウマチ熱、および糸球体腎炎；マイコプラズマ肺炎、レジオネラニューモフィラ菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、またはクラミジア・ニューモニエによる感染に関連する呼吸器感染症；ベータ・ラクタム、バンコマイシン、アミノグリコシド、キノロン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンおよびマクロライドなどの、しかしこれらに限定されない既知の抗菌性物質に耐性のある菌種を含む、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｅ．フェシウム、Ｅ．デュランス（ｅ．ｄｕｒａｎｓ）によって引き起こされる、心内膜炎と骨髄炎を含む血液と組織の感染症；黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（つまり、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、など）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｃ群−Ｆ群の連鎖球菌（ｍｉｎｕｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、緑色連鎖球菌（  ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、コリネバクテリウム−ミヌティシムーム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ）、クロストリジウム属菌、またはバルトネラ・ヘンゼレ（  Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）による感染に関連する、無併発性の皮膚と軟組織の感染症および膿瘍、および産褥熱；黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌属菌、またはエンテロコッカス属菌による感染に関連する、無併発性の急性の尿路感染症；尿道炎および子宮頚管炎；クラミジア・トラコマーティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、軟性下疳菌、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、または、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）による感染に関連する性感染症；黄色ブドウ球菌（食中毒および毒素性ショック症候群）、または、Ａ群、Ｂ群、およびＣ群の連鎖球菌による感染に関連する中毒性疾患；ヘリコバクターピロリによる感染に関連する潰瘍；回帰熱ボレリアによる感染に関連する全身性の発熱症候群；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）による感染に関連するライム病；クラミジア・トラコマーティス、淋菌、黄色ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、インフルエンザ菌、またはリステリア属菌による感染に関連する、結膜炎、角膜炎、および涙嚢炎；鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）またはマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）による感染に関連する播種性の鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）疾患；ヒト型結核菌、癩菌、Ｍ．パラ結核症、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）またはＭ．ケロナエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ）によって引き起こされた感染症；キャンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）による感染と関連する胃腸炎；クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属菌による感染に関連する腸内原生動物性疾患；緑色連鎖球菌による感染に関連する歯の感染症；百日咳菌による感染と関連する執拗な咳；ウェルシュ菌またはバクテロイド属菌による感染に関連するガス壊疽；および、はヘリコバクターピロリまたはクラミジア・ニューモニエによる感染に関連する状動脈硬化症または心疾患。細菌感染および原虫感染、およびそのような感染に関連する障害は、動物において処置または予防され得るものであり、下記を含む：パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）あるいはボルデテラ属菌による感染に関連するウシの呼吸器疾患；大腸菌あるいは原生動物（つまりコクシジウム、ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ、ｅｔｃ．）による感染に関連するウシの腸管疾患；黄色ブドウ球菌、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ．  ｕｂｅｒｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス−ディスガラクティエ、クレブシェラ属菌、コリネ細菌またはエンテロコッカス属菌による感染に関連する乳牛の乳腺炎。アクチノバチルス・プルロ（Ａ．ｐｌｅｕｒｏ）、パスツレラ・ムルトシダ、あるいはマイコプラズマ属菌による感染に関連するブタ呼吸器疾患。；大腸菌、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、サルモネラ菌またはセルプリナ・ハイオディセンテリア（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｏｄｙｓｉｎｔｅｒｉａｅ）による感染に関連するブタの腸疾患；フソバクテリウム属菌による感染に関連するウシの腐蹄症；大腸菌による感染に関連するウシの子宮炎；壊死杆菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）またはバクテロイデス・ノドサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｄｏｓｕｓ）による感染に関連するウシの趾皮膚炎（ｃｏｗ  ｈａｉｒｙ  ｗａｒｔｓ）；ウシモラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｉｓ）による感染に関連するウシの感染性角結膜炎；原生動物（つまりｎｅｏｓｐｏｒｉｕｍ）による感染性病源体に関連するウシの早流産；大腸菌による感染に関連するイヌおよびネ���における尿路感染症；表皮ブドウ球菌、Ｓ．  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ  ｎｅｇ．  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはパスツレラ・ムルトシダによる感染に関連するイヌおよびネコにおける皮膚軟組織感染症；および、アルカリゲネス属菌、バクテロイデス属菌、クロストリジウム属菌、エンテロバクター属菌、ユーバクテリウム、ペプトストレプトコッカス、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）あるいはプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）による感染に関連するイヌおよびネコにおける歯或いは口腔の感染症。本発明の方法と調和して処置或いは予防され得る他の細菌感染および原虫感染、そしてそのような感染に関連する障害は、Ｊ．Ｐ．Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、“  ２６  ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、  Ｉｎｃ．，  １９９６）において参照される。
【００２０】
用語「ハロ（ｈａｌｏ）」は、本明細書に使用される際は、他に指示がない限り、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを含む。好ましいハロ基はフルオロ、クロロ、および、ブロモである。
【００２１】
用語「アルキル」は、本明細書において使用される際、他に指示がない限り、環式、直鎖および／または分岐部分を有する飽和した１価の炭化水素基を含む。アルキル基が、環式部分を含むために、少なくとも３つの炭素原子を含まなければならないことは、理解されるべきである。
【００２２】
用語「アルケニル」は、本明細書において使用される際、他に指示がない限り、アルキル鎖中のある点において少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、上に定義されるようなアルキル基を含む。
【００２３】
用語「アルキニル」は、本明細書において使用される際、他に指示がない限り、アルキル鎖の中のある点において少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、上に定義されるようなアルキル基を含む。
【００２４】
用語「アリール」は、本明細書において使用される際、他に指示がない限り、フェニルまたはナフチルなどの、１つの水素を除去することにより芳香族炭化水素から誘導した有機ラジカルを含む。
【００２５】
用語「４員から１０員の複素環式」は、本明細書において使用される際、他に指示がない限り、Ｏ、Ｓ、およびＮから各々選択された１つ以上の異種原子を含んでいる芳香族および非芳香族複素環基を含み、そこにおいて複素環基はそれぞれその環構造において４から１０の原子を持っている。非芳香族複素環基は、その環系内に４個の原子しか備えていない基を含むが、芳香族複素環基は、その環系内に少なくとも５個の原子を備えなければならない。複素環基はベンゾ縮合環系、および１つ以上のオキソ部分と置換された環構造を含む。４員複素環基の例は、アゼチジニル（アゼチジンに由来）である。５員複素環基の例は、チアゾリルであり、１０員複素環基の例は、キノリニルである。非芳香族複素環基の例は、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオクサニル、ピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアセピニル、１、２、３、６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１、３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、３Ｈ−インドリル、及びキノリジニルである。芳香族複素環基の例としては、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルである。上記の化合物に由来するような前述の基は、可能な場合に、Ｃ付加又はＮ付加であり得る。例えば、ピロールに由来する基は、ピロール−１−イル（Ｎ付加）又はピロール−３−イル（Ｃ付加）であり得る。
【００２６】
本明細書において使用される際、他に指示がない限り、句「薬学的に許容可能な塩」は、式１、式２または式３の化合物に存在しうる、酸性基か塩基性基の塩を含む。本来塩基性である式１、式２または式３の化合物は、様々な無機酸および有機酸により様々な塩を形成することができる。式１、式２または式３のそのような塩基性化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するために使用され得る酸は、無毒な酸付加塩、即ち、酢酸塩、ベンゼンスルホナート（ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、ブロミド、エデト酸カルシウム、カンシル酸（ｃａｍｓｙｌａｔｅ）塩、炭酸塩、塩酸塩、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸（ｅｄｉｓｌｙａｔｅ）塩、エストレート（ｅｓｔｏｌａｔｅ）塩、エシレート、こはく酸ジエチル（ｅｔｈｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（ｇｌｙｃｏｌｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘキシルレゾルシン酸塩（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎａｔｅ）、ヒドラバミン、ヒドロブロミド、塩酸塩、ヨウ化物、イソチオネート（ｉｓｏｔｈｉｏｎａｔｅ）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩（ｍａｎｄｅｌａｔｅ）、メシル酸塩、硫酸メチル、ムケート（ｍｕｃａｔｅ）、ナプシレート（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボネート（ｅｍｂｏｎａｔｅ））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロ酸塩（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｔｅ）、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシレート、トリエチオドード（ｔｒｉｅｔｈｉｏｄｏｄｅ）、および吉草酸塩の塩などの、薬理学的に許容可能なアニオンを含有している塩を形成する酸である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】細菌のｒＲＮＡ転写複合体のモデル。
【図１Ｂ】ＮｕｓＢ−ＮｕｓＥインターフェース。
【図２Ａ】ＭＣ４がドッキングされたファーマコフォア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）モデル。
【図２Ｂ】（Ｅ）−２−｛［（３−エチニルフェニル）イミノ］メチル｝−４−ニトロフェノール（ＭＣ４）の化学構造。
【図３】選択された病原性菌に対するＭＣ４の抗菌活性。略語：ＭＩＣ、最小阻止濃度；ＭＢＣ、最小殺菌濃度；ＮＤ、測定されず。
【図４】黄色ブドウ球菌２５９２３細胞におけるＤＮＡ、ｒＲＮＡ（１６Ｓ  ＋  ２３Ｓ）およびタンパク質産生に対する、４分の１最小阻止濃度（ＭＩＣ）のＭＣ４、リファンピシン（Ｒｉｆ）およびオキサシリン（Ｏｘａ）の効果。
【図５】ＮｕｓＢおよびＮｕｓＥの部分配列アラインメント。Ａａｅｏ：アクイフェックス・アエロリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）；Ｂｓｕｂ：枯草菌；Ｅｃｏｌ：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）；Ｈｉｎｆ：インフルエンザ菌；Ｈｐｙｌ：ヘリコバクターピロリ；Ｐａｅｒ：緑膿菌；Ｍｔｕｂ：ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；Ｓａｕｒ：黄色ブドウ球菌；Ｓｐｎｅ：肺炎連鎖球菌；矢印は、ＮｕｓＢーＥ相互作用に関与している残基を示す。
【図６】インシリコスクリーニングから最終選考に残った７つの化合物。ＭＣ１，Ｎ−｛４−［２−（２−ニトロベンゾイル）カルボヒドラゾノイル］フェニル｝アセトアミド（ＣＡＳ  ｎｏ．  ６７９４２３−０５−３）；ＭＣ２，３−（｛４−［（１、５−ジメチル−３−オキソ−２−フェニル−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）スルファモイル］フェニル｝カルバモイル）プロパン酸（ＣＡＳ  ｎｏ．  ２５３６０５−５３−７）；ＭＣ３，３−［３−（３−ヒドロキシ−４Ｈ−ピラゾル−４−イル）プロピル］−１−（４−メトキシフェニル）チオ尿素（ＣＡＳ  ｎｏ．  ６５６２２２−９８−９）；ＭＣ４，（Ｅ）−２−［［（３−エチニルフェニル）イミノ］メチル］−４−ニトロフェノール（ＣＡＳ  ｎｏ．  ２１９１４０−３１−５）；ＭＣ５，（Ｅ）−｛アミノ［３−（｛［４−メチル−５−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１、２、４−ｔｒｉａｚｏｌ−３−イル］スルファニル｝メチル）フェニル］メチリデン｝アミノ  Ｎ−（４−クロロフェニル）カルバマート  （ＣＡＳ  ｎｏ．  ８８２２５６−３９−５））；ＭＣ６，Ｎ−（４−｛［２−（２、４−ジクロロフェノキシ）フェニル］スルファモイル｝フェニル）−３、４−ジメトキシベンゼン−１−スルホンアミド（ＣＡＳ  ｎｏ．  ３１２３２４−３５−９）；ＭＣ７，メチル４−［（１Ｅ）−［（Ｅ）−２−｛［４−（メトキシカルボニル）−２、５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル］メチリデン｝ヒドラジン−１−イリデン］メチル］−２、５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシラート（ＣＡＳ  ｎｏ．  ８８３０３７−１１−４））。
【図７】ＭＣ４の１０のアナログ。ＭＣ４−１，２−ニトロ−６−［（Ｅ）−（フェニルイミノ）メチル］フェノール（ＣＡＳ  ｎｏ．  ２４３９８１−８７−５）；ＭＣ４−２，２−｛［（１Ｅ）−（２−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）メチレン］アミノ｝−４−メチルフェノール（ＣＡＳ  ｎｏ．  ３２１７２６−９０−３）；ＭＣ４−３，１−（３−｛［（１Ｅ）−（２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル）メチレン］アミノ｝フェニル）エタノン（ＣＡＳ  ｎｏ．  ３１６１３３−４９−０）；ＭＣ４−４，４−ニトロ−２−［（フェニルイミノ）メチル］フェノール（ＣＡＳ  ｎｏ．  １５６６７−９９−９）；ＭＣ４−５，２−｛（Ｅ）−［（３−メチルフェニル）イミノ］メチル｝−４−ニトロフェノール（ＣＡＳ  ｎｏ．  ３０３０５８−７３−３）；ＭＣ４−６，２−｛（Ｅ）−［（４−ヒドロキシフェニル）イミノ］メチル｝−４−ニトロフェノール（ＣＡＳ  ｎｏ．  １０８１７８０−２２−４）；ＭＣ４−７，２−｛（Ｅ）−［（４−クロロフェニル）イミノ］メチル｝−４−ニトロフェノール（ＣＡＳ  ｎｏ．  ３０３２１５−４９−８）；ＭＣ４−８、  ２−｛（Ｅ）−［（３−ヒドロキシフェニル）イミノ］メチル｝−４−ニトロフェノール（ＣＡＳ  ｎｏ．  ３０３２１５−１９−２）。
【図８Ａ】ＭＣ４および枯草菌ＮｕｓＢ野性型タンパク質（図８Ａ）および変異体Ｙ１８Ａ、Ｄ７６Ａ、Ｄ８１Ａ（それぞれ図８Ｂ−８Ｄ）、を使用する等温滴定熱量測定分析のグラフであり、Ｎ  ＝  ０．９８８±０．０７６、Ｋｄ  ＝  １．４５±０．５５μＭ、ΔＨ  ＝  −７１４１±９３９．８ｃａｌ／ｍｏｌ、およびΔＳ  ＝  −１．８１ｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇである。
【図８Ｂ】ＭＣ４および枯草菌ＮｕｓＢ野性型タンパク質（図８Ａ）および変異体Ｙ１８Ａ、Ｄ７６Ａ、Ｄ８１Ａ（それぞれ図８Ｂ−８Ｄ）、を使用する等温滴定熱量測定分析のグラフであり、Ｎ  ＝  ０．９８８±０．０７６、Ｋｄ  ＝  １．４５±０．５５μＭ、ΔＨ  ＝  −７１４１±９３９．８ｃａｌ／ｍｏｌ、およびΔＳ  ＝  −１．８１ｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇである。
【図８Ｃ】ＭＣ４および枯草菌ＮｕｓＢ野性型タンパク質（図８Ａ）および変異体Ｙ１８Ａ、Ｄ７６Ａ、Ｄ８１Ａ（それぞれ図８Ｂ−８Ｄ）、を使用する等温滴定熱量測定分析のグラフであり、Ｎ  ＝  ０．９８８±０．０７６、Ｋｄ  ＝  １．４５±０．５５μＭ、ΔＨ  ＝  −７１４１±９３９．８ｃａｌ／ｍｏｌ、およびΔＳ  ＝  −１．８１ｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇである。
【図８Ｄ】ＭＣ４および枯草菌ＮｕｓＢ野性型タンパク質（図８Ａ）および変異体Ｙ１８Ａ、Ｄ７６Ａ、Ｄ８１Ａ（それぞれ図８Ｂ−８Ｄ）、を使用する等温滴定熱量測定分析のグラフであり、Ｎ  ＝  ０．９８８±０．０７６、Ｋｄ  ＝  １．４５±０．５５μＭ、ΔＨ  ＝  −７１４１±９３９．８ｃａｌ／ｍｏｌ、およびΔＳ  ＝  −１．８１ｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇである。
【図９−１】様々な微生物上のＭＣ４アナログの最小阻止濃度を示す。
【図９−２】様々な微生物上のＭＣ４アナログの最小阻止濃度を示す。
【図９−３】様々な微生物上のＭＣ４アナログの最小阻止濃度を示す。
【図９−４】様々な微生物上のＭＣ４アナログの最小阻止濃度を示す。
【図９−５】様々な微生物上のＭＣ４アナログの最小阻止濃度を示す。
【図９−６】様々な微生物上のＭＣ４アナログの最小阻止濃度を示す。
【図９−７】様々な微生物上のＭＣ４アナログの最小阻止濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
特定の実施形態に係る以下の説明は、本質において単に典型的であり、且つ、本発明の範囲、その適用、または用途を制限する意図は全くない。
【００２９】
本発明は、抗菌活性を有する、式１、式２または式３の化合物に関する。一実施形態において、本来酸性である、式１、式２または式３の化合物は、様々な薬理学的に許容可能なカチオンを備えた塩基性塩を形成することができる。そのような塩の例はアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、具体的にはナトリウムおよびカリウム塩を含む。
【００３０】
一実施形態において、式１、式２または式３の特定の化合物は不斉中心を持ち、従って、異なるエナンチオマー型で存在し得る。本発明は、式１、式２または式３の化合物およびそれらの混合物のすべての光学異性体および立体異性体の使用に関する。特に、本発明は、化合物のＥとＺの両方の異性体を含む。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、式１、式２または式３の化合物の互変異性体を含む。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、さらに、アイソトープ標識化合物、及びそれらの薬学的に許容可能な塩を含み、それらは式１、式２または式３の中に記されたものと同一であるが、但し実際は、１つ以上の原子が、自然界で通常見つかる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を持っている原子と置き替えられる。本発明の化合物に組み込まれ得る同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッソ、及び塩素の同位体であり、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌなどである。前記同位体及び／又は他の原子の他の同位体を含む、本発明の化合物、そのプロドラッグ、及びそれらの薬学的に許容可能な塩は、本発明の範囲内である。本発明の特定の同位体的に標識された化合物、例えば、３Ｈ及び１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれるものは、薬物及び／又は基質組織分布アッセイにおいて役立つ。トリチウム化した、即ち、３Ｈ、及び炭素１４、即ち１４Ｃの同位体は、調製の容易さ及び検出能のために特に好ましい。更に、重水素、即ち２Ｈなどの、より重い同位体での置換は、より大きな代謝安定性から結果として生じる特定の治療上の利点、例えば、インビボの半減期の増加又は必要用量の減少をもたらすことができ、従って、幾つかの状況に好ましい場合がある。本発明の式１、式２、または式３の同位体的に標識された化合物およびそのプロドラッグは、一般に、容易に入手可能な同位体的に標識された試薬を、非同位体的に標識された試薬に置換することによって、下記の模式図及び／又は実施例及び調製に開示される手順を実行することによって調製され得る。
【００３３】
一実施形態において、この発明は、式１、式２または式３の化合物のプロドラッグを含む医薬組成物、および前記プロドラッグの投薬を介して細菌性感染症を処置する方法もまた包含する。遊離アミノ、アミド、ヒドロキシ、または、カルボキシル基を有する式１、式２または式３の化合物は、プロドラッグへと変換され得る。プロドラッグは、アミノ酸残基、または、２以上（例えば、２、３または４）のアミノ酸残基のポリペプチド鎖が、アミドまたはエステル結合を介して、式１、式２または式３の化合物の遊離アミノ、ヒドロキシ又はカルボン酸基に共有結合される化合物を含む。アミノ酸残基は、限定されないが、一般に３文字の記号で指定される２０の天然に存在するアミノ酸を含み、さらに、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デモシン（ｄｅｍｏｓｉｎｅ）、イソデモシン（ｉｓｏｄｅｍｏｓｉｎｅ）、３−メチルヒスチジン、ノルバリン（ｎｏｒｖａｌｉｎ）、β−アラニン、ガンマアミノ酪酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチン、および、メチオニンスルホンを含んでいる。追加のタイプのプロドラッグも包含される。例えば、遊離カルボキシル基は、アミドまたはアルキルエステルとして誘導体化され得る。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、  １９９６、  １９、  １１５において概説されるように、遊離したヒドロキシ基は、ヘミスクシナート（ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅｓ）、リン酸エステル、ジメチルアミノアセテート（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｃｅｔａｔｅｓ）およびホスホリルオキシメチルオキシカルボニル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｓ）を含むが、これらに限定されない基を使用して誘導体化され得る。炭酸塩プロドラッグ、硫酸エステル、およびヒドロキシ基の硫酸エステルと同様に、ヒドロキシ基とアミノ基のカルバマート・プロドラッグも含まれる。（アシルオキシ）メチルと（アシルオキシ）エチルエーテルとしてのヒドロキシ基の誘導体化もまた包含され、ここでアシル基がアミンおよびカルボン酸官能基を含むが、それらに限定されない基と任意に置換される、エーテル、又は、アシル基が上に記載されるようなアミノ酸エステルであり、アルキルエステルであり得る。このタイプのプロドラッグはＪ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  １９９６、  ３９、  １０．の中に記載されている。遊離したアミンもアミド、スルホンアミド、またはホスホンアミドとして誘導体化され得る。これらのプロドラッグ部分はすべて、限定されないが、エーテル、アミンおよびカルボン酸官能基を含む基を取り込む。
【００３４】
一実施形態において、本発明の化合物は不斉炭素原子を有し得る。ジアステレオマー混合物は、当業者に既知の方法、例えば、クロマトグラフィーまたは分別再結晶によって、その物理化学的な違いに基づいてその個々のジアステレオマーへと分離可能である。エナンチオマーは、適切な光学活性化合物（例えばアルコール）との反応によってエナンチオマー混合物をジアステレオマー混合物に転化させることにより、ジアステレオマーを分離することにより、および、個々のジアステレオマーを対応する純粋なエナンチオマーに転化（例えば加水分解）させることにより、分離可能である。ジアステレオマー混合物および、純粋なエナンチオマーを含むそのような異性体はすべて、本発明の一部と見なされる。
【００３５】
本来塩基性である、式１、式２または式３のあらゆる化合物は、様々な無機酸および有機酸を伴う幅広く多様な塩類を形成することができる。
【００３６】
本来酸性である、式１、式２または式３のあらゆる化合物は、様々な薬学的に許容可能なカチオンを伴って塩基塩類を形成することができる。そのような塩類の例は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、および特にナトリウム塩およびカリウム塩を含む。これらの塩類は従来の技術によって調製され得る。本発明の、薬学的に許容可能な塩基塩類を調製するために試薬として使用される化学的塩基は、式１、式２または式３のあらゆる酸性化合物を伴って、無毒な塩基塩類を形成するものである。そのような無毒な塩基塩類は、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムなどの薬学的に許容可能なカチオンから誘導したものを含む。これらの塩類は、対応する酸性化合物を望ましい薬学的に許容可能なカチオンを含有する水溶液で処置し、および次に、結果として生じる溶液を好適な減圧下で乾燥するまで蒸発させることより調製することができる。あるいは、それらも、酸性化合物のアルカノール溶液と望ましいアルコキシドを共に混合し、および次に、結果として生じる溶液を好適な減圧下で乾燥するまで蒸発させることにより調製され得る。いずれの場合も、試薬の化学量論的量が、反応の完全性および最終生成物の最大収率を確実なものにするために使用される。
【００３７】
一実施形態において、細菌感染および原生動物感染の処置または予防において、式１、式２または式３の化合物およびそれらの薬学的に許容可能な塩類と溶媒和物（以下、「活性化合物」）は、経口で、非経口で、局所的または直腸経由で投与され得る。いずれにしろ、処置されている哺乳動物、魚類または鳥類の種、および、上述の薬物に対する個体の反応、さらには、選択された医薬製剤のタイプ及びそうした投与の期間や間隔に依存して、変化は起こり得る。
【００３８】
一実施形態において、活性化合物は、単独で、または、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせて、先に示された経路によって投与される場合があり、および、そうした投与は一回量か複数回量において実施され得る。より詳しくは、該活性化合物は、広く多様な形態で投与され得るのであり、つまり、それらは、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハードキャンディー、粉末、噴霧剤、クリーム、軟膏、坐剤、ゼリー、ゲル、ペースト、ローション、膏薬、水性懸濁液、注射溶液、エリキシル剤、シロップ剤などの形態をとる、薬学的に許容可能な不活性の担体と混合される。そのような担体は、固体の希釈剤または充填剤、無菌の水性溶媒および様々な無毒の有機溶媒などを含む。さらに、経口医薬組成物は適切に甘味及び／又は香味を持たせることができる。一般に、活性化合物は、約５．０重量％から約７０重量％に及ぶ濃度レベルのそのような剤形の中に存在する。
【００３９】
一実施形態において、経口投与のために、微結晶性セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムおよびグリシンなどの様々な賦形剤を含んでいる錠剤が、デンプン（および好ましくはトウモロコシ、じゃがいもまたはタピオカデンプン）、アルギン酸および特定の複雑なケイ酸塩などの様々な崩壊剤を伴って、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチンおよびアラビアゴムなどの顆粒結合剤と共に使用され得る。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの平滑剤は、成形の目的にしばしば非常に有用である。同様のタイプの固形組成物がゼラチン・カプセル剤における充填剤として使用されてもよい；この関係における好ましい材料には、ラクトースまたは乳糖も、高分子量ポリエチレングリコールと同様に含まれる。水性懸濁液および／またはエリキシル剤が経口投与に所望されるとき、活性化合物は様々な甘味剤または香味剤、着色料または色素と混合され、および所望されるならば、乳化剤および／または懸濁化剤も、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、またはそれらの組み合わせなどの希釈剤と共に使用されてもよい。
【００４０】
一実施形態において、非経口投与のために、ゴマ油かピーナッツ油のいずれか、または水性のプロピレングリコールに入った活性化合物の溶液が使用され得る。必要に応じて、および最初に希釈剤が等張で与えられた場合、水溶液は適切に（好ましくは８を超えるｐＨに）バッファーされなければならない。これらの水溶液は静脈内注射の目的に適している。油性溶液は関節内、筋肉内、および皮下への注射の目的に適している。無菌条件下における、これらのすべての溶液の調製は、当業者に知られている標準の製薬技術によって容易に遂行される。
【００４１】
他の実施形態において、本発明の活性化合物を局所的に投与することもまた可能であり、これは標準の製薬技術によるとクリーム、ゲル、ペースト、膏薬などによってなされ得る。
【００４２】
一実施形態において、活性化合物は、ウシまたは家庭動物などの人間以外の動物への投与のために、動物の飼料に入れて、または水薬組成物として経口で投与され得る。
【００４３】
一実施形態において、活性化合物は、小型単層小胞、大型単層小胞、および多層小胞などのリポソーム送達システムのかたちでも投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成することができる。
【００４４】
一実施形態において、活性化合物も目標が定められる薬物担体として可溶性ポリマーと結合され得る。そのようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェニル、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミド−フェノール、またはパルミトイル残基（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｒｅｓｉｄｕｅｓ）で置換されたポリエチレンオキシドポリリンを含むことができる。更に、活性化合物は、薬剤の制御放出を達成することにおいて有用なある種の生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸のコポリマー、ポリエプシロンカプロラクトン（ｐｏｌｙｅｐｓｉｌｏｎ  ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒｓ）、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン（ｐｏｌｙｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｓ）、ポリシアノアクリレート（ｐｏｌｙｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅｓ）、およびヒドロゲルの、架橋性または両親媒性のブロックコポリマー  に結合され得る。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、式１の化合物、その薬学的に許容可能な塩、または溶媒和物を提供し、
【００４６】
【化４】
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式中：
（１）  Ｘ１は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および、−Ｃ（＝Ｏ）−から成る群から選択され；および、
（２）  Ｒ１−Ｒ５の各々は、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾから成る群から独立して選択される。
【００４７】
一実施形態において、本発明は、限定されないが、以下を含む化合物を提供する：
【００４８】
【化５】
2021510143.tif 000007
【００４９】
一実施形態では、本発明は、次のものを含み、これらに限定されない化合物を提供する：
【００５０】
【化６−１】
2021510143.tif 000008
【００５１】
【化６−２】
2021510143.tif 000009
【００５２】
【化６−３】
2021510143.tif 000010
【００５３】
【化６−４】
2021510143.tif 000011
【００５４】
【化６−５】
2021510143.tif 000012
【００５５】
【化６−６】
2021510143.tif 000013
【００５６】
【化６−７】
2021510143.tif 000014
【００５７】
一実施形態において、本発明は、細菌性か原虫性の感染症の処置または予防のための、化合物を含む、医薬組成物を供給する。
【００５８】
一実施形態において、組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハードキャンディー、粉末、分無罪、クリーム、軟膏、坐剤、ゼリー、ゲル、ペースト、ローション、膏薬、水性懸濁液、注射溶液、エリキシル剤、シロップ剤などの形態をとる。
【００５９】
一実施形態において、医薬組成物は、化合物の５重量％から７０重量％を含む。
【００６０】
一実施形態において、細菌感染症または原虫感染症は、エンテロコッカス・フェカーリス、黄色ブドウ球菌、肺炎杆菌、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌、汚物腸内菌、大腸菌および肺炎連鎖球菌から成る群から選択される微生物によって引き起こされる。
【００６１】
一実施形態において、本発明は、化合物を上記微生物と接触させる工程を含む、微生物におけるＮｕｓＢ−ＮｕｓＥの相互作用を阻害する方法を提供する。
【００６２】
一実施形態において、ＮｕｓＢは、ＮｕｓＢ  Ｅ８１、ＮｕｓＢ  Ｙ１８およびＮｕｓＢ  Ｅ７５から選択され、および、ＮｕｓＥはＮｕｓＥ  Ｈ１５、ＮｕｓＥ  Ｄ１９およびＮｕｓＥ  Ｒ１６から選択される。
【００６３】
一実施形態において、微生物は、エンテロコッカス・フェカーリス、黄色ブドウ球菌、肺炎杆菌、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌、汚物腸内菌、大腸菌および肺炎連鎖球菌から成る群から選択される。
【００６４】
一実施形態において、本発明は、被検体における細菌感染症または原虫感染症を処置または予防する方法を提供し、該方法は、上記被検体に治療上有効な量の化合物を投与する工程を含む。
【００６５】
一実施形態において、化合物は経口か、非経口か、局所的か、直腸の経路を通って投与される。
【００６６】
一実施形態において、微生物は、エンテロコッカス・フェカーリス、黄色ブドウ球菌、肺炎杆菌、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、汚物腸内菌、大腸菌および肺炎連鎖球菌から成る群から選択される。
【００６７】
一実施形態において、ＮｕｓＢはＮｕｓＢ  Ｅ８１、ＮｕｓＢ  Ｙ１８およびＮｕｓＢ  Ｅ７５から選択され、および、ＮｕｓＥはＮｕｓＥ  Ｈ１５、ＮｕｓＥ  Ｄ１９およびＮｕｓＥ  Ｒ１６から選択される。
【００６８】
一実施形態において、本発明は、式２の化合物、その薬学的に許容可能な塩、または溶媒和物を提供し、
【００６９】
【化７】
2021510143.tif 000015
式中：
（１）  Ｘ１は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、および、−Ｃ（＝Ｏ）、から成る群から選択され；および、
（２）  Ｒ１−Ｒ５の各々は、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾから成る群から独立して選択される。
【００７０】
一実施形態において、化合物は、以下からなる群から選択される：
【００７１】
【化８】
2021510143.tif 000016
【００７２】
一実施形態において、本発明は、式３の化合物、その薬学的に許容可能な塩、または溶媒和物を提供し、
【００７３】
【化９】
2021510143.tif 000017
式中：
（１）Ｘ１およびＹの各々は、−ＮＨ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−および−Ｓ−から成る群から独立して選択され；および、
（２）  Ｒ１−Ｒ５の各々は、水素、ヒドロキシ、ニトロ、アセチル、メチル、エチニル、カルボキシ、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、メトキシ、メトキシカルボニル、アミノスルホニル、アミノカルボニル、シアノ、テトラゾリル、ジメチルアミノスルホニルアミノカルボニル、シアノメチル、アセチルアミノスルホニル、メトキシアミノカルボニル、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、フェニル、トリフルオロメチル、および、ベンゾから成る群から独立して選択される。
【００７４】
一実施形態において、化合物は、
【００７５】
【化１０】
2021510143.tif 000018
である。
【実施例１】
【００７６】
従来、抗菌活性を備えた小さな化学分子の阻害剤は、細菌性のＲＮＡポリメラーゼと必須ハウスキーピング転写開始因子σとの相互作用を標的とする、合理的な設計およびファーマコフォアに基づく仮想スクリーニングにより特定された１２。同様のアプローチを使用して、ＭＲＳＡを含む黄色ブドウ球菌株に対する抗菌活性を有する、細菌のｒＲＮＡ合成への阻害剤は特定された。
【００７７】
細菌性のｒＲＮＡ転写複合体は、Ｎｕｓ転写因子の一式、ＮｕｓＡ、ＮｕｓＢ、ＮｕｓＥ、およびＮｕｓＧを備えたＲＮＡポリメラーゼ伸長複合体１３の結晶構造に基づいてモデル化された（図１Ａ）。ＮｕｓＧは、そのＮ末端ドメインを介してＲＮＡポリメラーゼの中央の裂け目に結合し１４、そのＣ末端ドメインはＮｕｓＥと相互作用し１５、そのことがＮｕｓＢ−ＮｕｓＥ−ｂｏｘＡ部分複体をＲＮＡポリメラーゼの下流面につなぎ留める（図１Ａ）。ＮｕｓＡは、ＢｏｘＡシーケンスのすぐ下流のＲＮＡへの結合と一貫して１７、ＲＮＡ出口チャネル付近のＲＮＡポリメラーゼに結合する（図１Ａ）１６。ＲＮＡポリメラーゼ・Ｎｕｓ因子とｒＲＮＡの間の相互作用は、新たに生じた転写の急速かつ適切な折りたたみを促進して、拘束ループを生じさせるのであり、そのことは、ＲＮＡポリメラーゼ・Ｎｕｓ因子複合体がｒＲＮＡ合成においてシャペロンの役割を果たし得るという従来の生化学の観察とも一致している１８。このアセンブリは、終結因子ＲｈｏがｒＲＮＡ転写にアクセスするのを阻害し、急速な細菌細胞増殖の間に比較的大きなｒＲＮＡオペロンの完全な転写を保証する役割を持つ可能性もある１９。最近報告された、ファージ・タンパク質λＮ依存転写抗転写終結複合体の構造情報もまた、本発明において使用されるｒＲＮＡ転写複合体モデルの構造情報に類似している２０。
【００７８】
公表された大腸菌ＮｕｓＢ−ＮｕｓＥヘテロダイマーの結晶構造の調査（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （ＰＤＢ）  ｅｎｔｒｙ  ３Ｄ３Ｂ）（図１Ｂ）２１は、ＮｕｓＥがα−ヘリックスを１８％だけ含み、主にヘリックス２との相互作用を介してＮｕｓＢに結合することを明らかにしている（図１Ｂ）２２。水素結合相互作用が、ＮｕｓＢ  Ｅ８１とＮｕｓＥ  Ｈ１５、ＮｕｓＢ  Ｙ１８とＮｕｓＥ  Ｄ１９、およびＮｕｓＢ  Ｅ７５とＮｕｓＥ  Ｒ１６の間に生じ（図１Ｂ、拡大図；大腸菌アミノ酸残基ナンバリング）、それらは、原核細胞にわたって高度に保存されている（図５（矢印））。加えて、アクイフェックス・アエロリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）のＮｕｓＢ−ＮｕｓＥ相互作用に関する核磁気共鳴調査は、さらに同様の相互作用を溶液において確認した２３。
【００７９】
ＮｕｓＢ−ＮｕｓＥヘテロダイマー共結晶（ＰＤＢエントリー３Ｄ３Ｂ）２２についての構造情報はファーマコフォア・モデル（図２Ａ）を作成するために使用された。ファーマコフォア・モデルは、上に述べたように、ＮｕｓＢとＮｕｓＥの間の主な水素結合を模倣するために、２つの水素供与体（ピンク）、１つの受容体（緑）、および大腸菌残基ＮｕｓＢ  Ｌ２２とＮｕｓＥ  Ｖ２６の間の１つの保存された疎水的相互作用（シアン、図２Ａ）を含んでいた。相互作用に加えて、一連の除外領域（グレー）は、ＮｕｓＢの上で結合部位を形成する浅いポケット内での位置的な不一致を最小限にするために付け加えられた。その後、最終的なファーマコフォア・モデルが、すべての要求される形質をマッピングするためにＢｉｏｖｉａ  ＤＳ４．５を使用して作成された２４。ファーマコフォア・モデルが、ＮｕｓＢに結合することの原因である、ＮｕｓＥタンパク質における重要なアミノ酸残基の特性に基づいて設計されたとき、理論上、このファーマコフォア・モデルにドッキング可能である理想的な小分子は、ＮｕｓＢに結合でき且つＮｕｓＢ−ＮｕｓＥ相互作用に対して阻害する活性を実証できるに違いない。
【００８０】
ファーマコフォア・モデルに基づいて、ｍｉｎｉ−Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ライブラリとＥｎａｍｉｎｅ  抗菌ライブラリを組み合わせることにより構築された仮想の化合物ライブラリを使用したインシリコのスクリーニングが行われた２５。最初の仮想スクリーニングからの上位５０のヒットは、ファーマコフォア・モデルおよび視覚的に調査された化合物のエネルギーが最小限に抑えられた配座に対して再マッピングされた。ファーマコフォアに対する適合の乏しい化合物は取り除かれた。その結果、７つの化合物（図６）が、最初にウェットラボ試験の対象として絞り込まれた。
【００８１】
市中感染したＭＲＳＡの株ＵＳＡ３００に対する７つの化合物の抗菌活性が最初にスクリーニングされた。評価されたアナログのうち、ＭＣ４（図２Ｂ）は、６４μｇ／ｍＬの最小阻止濃度（ＭＩＣ）で生育阻害効果を実証することが分かった（図３）。２６６．３の分子量で、ＭＣ４が光学データ記録のための光学層における金属錯体染料を形成するためにのみ役に立つことが報告された２６。その後、病原体の代表的な菌株のパネルに対するＭＣ４の抗菌活性がテストされた。ＭＣ４は、他の試験された病原体よりも、ＭＲＳＡを含む黄色ブドウ球菌株に対して好ましい抗菌活性を実証し、ＭＩＣは黄色ブドウ球菌の対照菌株２５９２３に対しては８μｇ／ｍＬと低く、および医療施設で得られたＭＲＳＡ・ＳＴ２３９に対しては１６μｇ／ｍＬと低かった（図３）。加えて、ＭＣ４は、５−フルオロウラシル（表１）に比較して、哺乳動物細胞株に対する著しい細胞毒性を示さなかった。
【００８２】
ＭＣ４処理による指数的生長の間に黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２５９２３細胞における高分子のレベルが分析された。ＭＣ４、リファンピシンおよびオキサシリンは４分の１  ＭＩＣレベルで加えられたが、それらは黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２５９２３細胞の成長率に干渉しなかった。図４に示されるように、どの処置も、作用機序によってプレビューされたように、ＤＮＡレベルに影響しなかった。対照細胞では、主なｒＲＮＡ（１６Ｓ  ＋  ２３Ｓ）のレベルはＲＮＡの全体の約７８％だった（図４）４。リファンピシンは、先の観察（図４）と一致して、ｒＲＮＡレベルの減少を生じさせた２７。ＭＣ４はｒＲＮＡレベルの著しい減少を示し、それはリファンピシンで試験した細胞（図４）より低くなった。更に、ＭＣ４の処置はタンパク質レベルの著しい減少につながったが、一方、リファンピシンは、恐らくリボソーム生産の減少したレベルの結果として、タンパク質合成能力に影響するこの効果を示さなかった。オキサシリンで処置された細胞は、対照細胞のものよりわずかに高いｒＲＮＡとタンパク質産生のレベルを示した。
【００８３】
最後に、分子レベルにおいてＭＣ４の作用機序を確立するために、酵素結合免疫吸着定量法に基づいたインビトロの阻害アッセイが、ＭＣ４によるＮｕｓＢ−ＮｕｓＥヘテロダイマーの形成の阻害を評価するために遂行された２４。精製されたＮｕｓＢは９６ウェルプレートをコーティングするために使用され、および、ＧＳＴタグ付けされたＮｕｓＥは、プローブとして使用された。ＭＣ４は、〜３４．７±０．１３μＭのＩＣ５０でＮｕｓＢ−ＮｕｓＥ相互作用の陽性の阻害を示した。一連のＭＣ４アナログをさらにテストすることにより（図７）、Ｂｉｏｖｉａ  ＤＳ４．５のＦｉｔＳｃｏｒｅにより予想されたように、ＮｕｓＢ  Ｅ８１とＮｕｓＥ  Ｈ１５、ＮｕｓＢ  Ｙ１８とＮｕｓＥ  Ｄ１９、および、ＮｕｓＢ  Ｅ７５とＮｕｓＥ  Ｒ１６の間の相互作用をターゲットとする分子における３つの官能基が、ＮｕｓＢ−ＮｕｓＥ結合の阻害には必須だったことが分かった（表３）。フェニル・アセチレン基のフェノールへの変化で、対応するＭＣ４アナログのＩＣ５０値は増加し、その一方、この終端の三重結合の欠失またはメチルもしくはクロリドによる置換は、ＩＣ５０の減少を引き起こした。ｐ−ニトロフェノールがｏ−ニトロフェノールに変えられた時、ＩＣ５０値は、恐らくＮｕｓＢ  Ｙ８１との結合相互作用へのフェノール基の関与が原因で増加した（表３）。これらの結果は、本発明において使用されるファーマコフォア・モデルを確証し、イミンおよびｐ−ニトロフェノールの反応性がＭＣ４の活性の一因とならないことを実証した。
【００８４】
ＭＣ４とＮｕｓＢの間の相互作用も生物物理学的に定量化された。先の報告は、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により測定されたように、ＮｕｓＢが、１μＭ以下のＫｄでＮｕｓＥに１：１の比率で結合することを実証した２１。同様の実験では、ＭＣ４が、一部位結合モードで１．４５±０．５５μＭのＫｄで、ＮｕｓＢに特異的に結合することが見出された（図８Ａ）。ＭＣ４のＮｕｓＥへの結合（図示せず）、または、ＭＣ４と、ＮｕｓＥの結合の原因である３つのアミノ酸残基（Ｙ１８Ａ、Ｄ７６ＡおよびＤ８１Ａ）がアラニンに変化したＮｕｓＢの変異体の間の結合は、ＩＴＣによって検出することができなかった（図８Ｂ−Ｄ）。これらの結果はともに、ＮｕｓＢ−ＮｕｓＥヘテロダイマー形成の阻害が、設計されたように、ＭＣ４とＮｕｓＢの間の特定の相互作用を通じて達成されることを示唆する。標的評価として、また構造に基づくリード最適化として、さらなる実験が、ＭＣ４と複合したＮｕｓＢの構造を解決するために遂行されるだろう。
【００８５】
処置不可能な抗生物質抵抗性の感染症の社会に対する潜在的な影響は深遠であり、および、新薬の標的を特定することに緊急のニーズがある２８。従来、細菌のリボソームそれ自体（３０Ｓおよび５０Ｓサブユニットの両方）は、タンパク質合成を阻害する抗生物質のために最も一般に利用される標的の１つだった２９。最近の創薬研究は、ｍＲＮＡの末端に停止したリボソームをレスキューすることの阻害が抗菌活性を生じるという発見を検証した３０。リボソームが急速な成長／増殖と正の相関を持つこと、および、真核生物と原核生物の間のｒＲＮＡ転写機構の大きな違いに鑑みれば、ｒＲＮＡ合成の阻害が細胞増殖および／または生存性に対して主要な影響を及ぼすことが期待できると仮定するのは魅力的である。この仮説は、多くの抗癌薬がｒＲＮＡの合成または成熟を阻害することを示す最近の発見により強化される３１。
【００８６】
この研究では、生物学的な証明が後に続くファーマコフォアに基づいたインシリコスクリーニングが、潜在的な新しい抗生物質のリードの特定に対して使用された。細菌細胞内のｒＲＮＡの合成のために使用される高度に発展的な複合体の形成のために要求される転写因子ＮｕｓＢとＮｕｓＥの間の不可欠の相互作用が標的とされた。絞り込まれた候補の化合物の１つ（ＭＣ４）は、哺乳動物細胞株に対する著しい毒性を伴わずに、ＭＲＳＡを含む黄色ブドウ球菌株に対する特異的な活性を示した。この化合物は、細菌性のｒＲＮＡ合成を標的とすることを目指した、抗菌活性を有する最初のものに似ている。ｒＲＮＡ転写／処理、リボソーム生物発生、および黄色ブドウ球菌の毒性に対するＭＣ４の詳細な影響は、現在調査中である。ＭＣ４は分子レベルにおいてＮｕｓＢ−ＮｕｓＥ相互作用を特異的に阻害すると示されたが、細菌細胞に対するあらゆる可能な標的外の影響もこれから解明される。ＮｕｓＢとＮｕｓＥが細菌において高度に保存されるため、ＭＣ４が他の病原体よりも黄色ブドウ球菌に対して好ましい抗菌活性を有する理由をさらに調査する必要がある。
【００８７】
抗菌の新しい標的として、細菌のｒＲＮＡ合成機構における転写因子間の必須のタンパク質−タンパク質相互作用が検証された。例えばＮｕｓＥ−ＮｕｓＧ間の、細菌のｒＲＮＡ転写に関与する他の重要なタンパク質−タンパク質相互作用、ＮｕｓＥ−ＲＮＡポリメラーゼ複合体間もまた、抗菌の新しい標的としての可能性を持つかもしれない３２。この研究は、ＭＣ４が、および、可能性としてはより包括的なスクリーニングによって他の化合物が、細菌性のｒＲＮＡ合成を標的とする、将来の新しい抗菌のリード分子として発展するための、構造最適化の方法を補強する。
【００８８】
材料と方法
菌株および化学薬品。次の細菌菌株がこの研究において微量希釈（ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）アッセイのために使用された：エンテロコッカス・フェカーリスＡＴＣＣ  ２９２１２、クレブシェラ肺炎杆菌ＡＴＣＣ  ７００６０３、アシネトバクター・バウマニＡＴＣＣ  １９６０６、緑膿菌ＰＡ０１、汚物腸内菌ＡＴＣＣ  １３０４７、大腸菌ＡＴＣＣ  ２５９２２、尋常変形菌ＡＴＣＣ  ６３８０、および黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００、ＡＴＣＣ２５９２３、ＡＴＣＣ２９２１３、ＳＴ２２、ＳＴ３０、ＳＴ４５、ＳＴ５９、ＳＴ２３９、ＪＥ−２、ＢＡＡ４４。大腸菌株ＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）はこの研究においてクローニングのために使用され、および、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ３３はタンパク質の過剰生産のために使用された。微量希釈アッセイにおいて使用される５−フルオロウラシル、リファンピシンおよび他の抗生物質は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから購入された。化合物ＭＣ１−７はＭｏｌＰｏｒｔから購入された。
【００８９】
分子モデリング。抗転写終結複合体のモデルが、サーマス・サーモフィルス転写伸長複合体（ＰＤＢ：２Ｏ５Ｉ）３４、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ−ＮｕｓＧ複合体（ＰＤＢ：５ｔｂｚ）３５、ｂｏｘＡ  ＲＮＡと複合したアクイフェックス・アエロリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）ＮｕｓＢ−Ｅ（ＰＤＢ：  ３Ｒ２Ｃ）３６、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＮｕｓＡ  Ｃ−末端ドメインＲＮＡ複合体（ＰＤＢ：  ２ＡＳＢ）３７；を含む多くの公開された結晶構造を、大腸菌ＮｕｓＥ：ＮｕｓＧ−ＣＴＤ複合体（ＰＤＢ：  ２ＫＶＱ）３８、および、枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮｕｓＡ  Ｎ−末端ドメイン（ＰＤＢ：  ２ＭＴ４）３９の溶液ＮＭＲ構造も同様に、統合することにより構築された。構造の照合はＵＣＳＦ  ＣｈｉｍｅｒａイメージのＭａｔｃｈＭａｋｅｒ機能を使用して、遂行された４０。画像はＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａで生成された。
【００９０】
従来記載されたように、ファーマコフォア設計および仮想スクリーニングは遂行された４１。
【００９１】
抗菌活性試験。微量希釈アッセイは、ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの推奨に従って遂行された４２。試験された化合物および対照の抗生物質の２倍段階希釈（ｓｅｒｉａｌ  ２−ｆｏｌｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）は、２５６μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌまで作られた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、陰性対照として含まれた。
【００９２】
この研究において、細胞毒性アッセイは、Ａ５４９肺癌およびヒト表皮角化細胞株（ＨａＣａＴ）を除き、従来詳述されたように遂行された４３。
【００９３】
ＤＮＡ、タンパク質およびｒＲＮＡの定量化。１／４  ＭＩＣレベルのＭＣ４、オキサシリン、およびリファンピシンは、ＬＢ培地における、初期の対数増殖期（ＯＤ５９５  ＝  ０．２）にある黄色ブドウ球菌株ＡＴＣＣ  ２５９２３に加えられ、その後、それは中期の対数増殖期（ＯＤ５９５  ＝  ０．５）まで育成された。ＤＮＡおよびタンパク質の定量化のために、１ｍｌの細胞が収穫され、および、１３０００ｇ／ｍｉｎの３分間の遠心分離の前に、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム＋  ０．５ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンを用いて室温で１時間処置された。上澄み液は廃棄され、および、細胞は６００μｌのＮｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ／  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）に5分間溶解し、その後、弱い超音波処理を行った。ＤＮＡの量は、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  （広帯域／ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ）を用いて定量化し、および、タンパク質はＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量化された。ｒＲＮＡ定量化のために、１ｍｌの培養物が集められ、および、ＲＮＡ全体がＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出される前に、ＲＮＡＰｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて処置された。デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）処置は、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  Ｋｉｔ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて遂行された。抽出されたＲＮＡはＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００の分析、および、ＲＮＡ全体のパーセンテージとしての主要なｒＲＮＡ（１６Ｓ  ＋  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの合計）のレベルにさらした。値は各処置群で横断的に比較された。全ての実験を繰り返し行った。
【００９４】
プラスミド構築。クローニング・工程はすべて大腸菌ＤＨ５αにおいて行なわれた。この研究において使用され且つ構築されたプラスミドは、ＤＮＡ塩基配列決定により確認され、表２に挙げられる。枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）  ＮｕｓＢはプライマー５’−ＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および精製された枯草菌染色体ＤＮＡからの５’ＴＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＧＡＴＴＣＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して、増幅された。ｎｕｓＢ突然変異体は、突然変異体プライマー５’−ＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＡｇｃＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５’ＧＡＣＡＴＣＡＡＴＴＴＧＡｇｃＴＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧ−３’（Ｆ１５Ａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、５’−ＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧＣＴＣＧＡＴｇｃＧＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および５’−ＣＡＴＴＧＧＣＡＡＴＣｇｃＡＴＣＧＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＴＣ−３’（Ｒ７０Ａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、および、５’ＧＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＴＴＧｃＣＣＧＴＧＣＧＡＴＴＴＴＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）および５’−ＧＣＡＡＡＡＴＣＧＣＡＣＧＧｇＣＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＴＣ−３’（Ｄ７５Ａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を使用するＰＣＲ  スプライシング４４によって作られた。アンプリコンはＸｂａＩとＡｃｃ６５Ｉを用いてカットされ、および、ｐＮＧ１３０、ｐＮＧ１１７８、ｐＮＧ１１７９、およびｐＮＧ１１８０（表２）をそれぞれ生産するために、同様にカットされたｐＥＴＭＣＳＩＩＩ（表２）に挿入された。枯葉菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）  ｎｕｓＥは、枯草菌染色体ＤＮＡからのプライマー５’−ＡＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）および５’ＣＴＡＴＡＴＴＴＴＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を使用して増幅され、およびｐＮＧ８９６をもたらすためにｐＮＧ６５１のＮｄｅＩとＡｃｃ６５Ｉの部位へ連結された（表２）。
【００９５】
タンパク質の過剰生産および精製。枯葉菌ＮｕｓＢ（野性型と突然変異体）およびＮｕｓＥ−ＧＳＴはプラスミド（表２）から過剰生産され、および、前述されたものと同様のアプローチを使用して精製された４５。精製されたタンパク質は、２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０％のグリセロール、ｐＨ  ７．８へと透析され、および８０℃において保存された。
【００９６】
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ。これらのアッセイは、ＮｕｓＢがＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６−ウェルのプレートをコーティングするために使用され、および、ＧＳＴタグを付けられたＮｕｓＥがプローブとして使用された以外は、前述のように遂行された４１。
【００９７】
等温熱量滴定（ＩＴＣ）。前述のように、ＩＴＣ実験が遂行された４１。化合物試験のために、ＤＭＳＯの中で構築された５０ｍＭのストックは、ＩＴＣ緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）の中で５００μＭに希釈された。タンパク質はすべてＩＴＣ緩衝液へ透析され、および、緩衝液ミス・マッチを最小限にするために同じ濃度のＤＭＳＯ（１％ｖ／ｖ）が補われた。ＭＣ４は、その後、陰性対照として、ＩＴＣ緩衝液において１％のＤＭＳＯを使用して、前述のように、５０μＭ  のＮｕｓＢ野性型および突然変異体に対して滴定された４１。
【００９８】
表１．ヒト細胞株に対するＭＣ４の細胞毒性（ＣＣ５０）
【００９９】
【表１】
2021510143.tif 000019
【０１００】
表２．この研究において使用された、および作成された株とプラスミド。
【０１０１】
【表２】
2021510143.tif 000020
【０１０２】
表３．ＭＣ４および予想された特性におけるアナログとＩＣ５０の比較。
【０１０３】
【表３】
2021510143.tif 000021
【実施例２】
【０１０４】
ＭＣ４アナログ
さらなるＭＣ４アナログの構造が以下に提示され、共に図９において９つの微生物に対するそれらの最小阻止濃度が示される（ＥＦＡＥ  １９４３３：エンテロコッカス・フェカーリス  ＡＴＣＣ  １９４３３；ＳＡＵＲ  ２５９２３：黄色ブドウ球菌  ＡＴＣＣ  ２５９２３；ＳＡＵＲ  ２９２１３：黄色ブドウ球菌  ＡＴＣＣ  ２９２１３；ＫＰＮＥ  ７００６０３：肺炎杆菌  ＡＴＣＣ  ７００６０３；ＡＢＡＵ  １９６０６：アシネトバクター・バウマニ  ＡＴＣＣ  １９６０６；ＰＡＥＲ  ２７８５３：緑膿菌  ＡＴＣＣ  ２７８５３；ＥＣＬＯ  １３０４７：汚物腸内菌  ＡＴＣＣ  １３０４７；ＥＣＯＬ  ２５９２２：大腸菌  ＡＴＣＣ  ２５９２２；ＳＰＮＥ  ４９６１９：肺炎連鎖球菌ＡＴＣＣ  ４９６１９）。
【０１０５】
化合物の抗菌活性はＣＬＳＩガイドライン（１）に従い培養液微量希釈により測定された。試験培地はカチオンを調整されたＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨ）であった。２倍段階希釈は、２５６μｇ／ｍｌから始まり０．０６２５μｇ／ｍｌまでの試験済みの化学薬品に対して遂行され、および、細菌細胞接種材料は１ｍｌ当たりおよそ５×１０５  ＣＦＵに調節された。結果は３７℃での２０時間のインキュベーションの後に取得された。ＭＩＣは視認できる成長がない抗生物質の最低の濃度として定義された。実験は二通り遂行された。
【０１０６】
【表４−１】
2021510143.tif 000022
【０１０７】
【表４−２】
2021510143.tif 000023
【０１０８】
【表４−３】
2021510143.tif 000024
【０１０９】
【表４−４】
2021510143.tif 000025
【０１１０】
【表４−５】
2021510143.tif 000026
【０１１１】
【表４−６】
2021510143.tif 000027
【０１１２】
【表４−７】
2021510143.tif 000028
【０１１３】
【表４−８】
2021510143.tif 000029
【０１１４】
【表４−９】
2021510143.tif 000030
【０１１５】
【表４−１０】
2021510143.tif 000031
【０１１６】
【表４−１１】
2021510143.tif 000032
【０１１７】
参考文献
（１）（ａ）  Ｊｅａｎ，  Ｓ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｈｓｕｅｈ，  Ｐ．  Ｒ．  （２０１１）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ３７，  ２９１−２９５．  （ｂ）  Ｆｒｉｅｄｅｎ，  Ｔ．  Ｒ．  （２０１３）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６８，  １８５７−１８５９．
（２）Ｃｈａｍｂｅｒｓ，  Ｈ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｄｅｌｅｏ，  Ｆ．  Ｒ．  （２００９）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７，  ６２９−６４１．
（３）（ａ）  Ｇａｒｄｅｔｅ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｔｏｍａｓｚ，  Ａ．  （２０１４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２４，  ２８３６−２８４０．  （ｂ）  Ｎａｎｎｉｎｉ，  Ｅ．，  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｂ．  Ｅ．，  ａｎｄ  Ａｒｉａｓ，  Ｃ．  Ａ．  （２０１０）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １０，  ５１６−５２１．
（４）Ｊｉｎ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｃａｇｌｉｅｒｏ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｚｈｏｕ，  Ｙ．  Ｎ．  （２０１２）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．  ３６，  ２６９−２８７．
（５）Ｖｉｋｔｏｒｏｖｓｋａｙａ，  Ｏ．  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｄ．  Ａ．  （２０１５）  Ｇｅｎｅ  ５５６，  １９−２６．
（６）Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ，  Ｔ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ａｒｔｓｉｍｏｖｉｔｃｈ，  Ｉ．  （２０１１）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９，  ３１９−３２９．
（７）Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｊ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ，  Ｊ．  （１９９６）  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ｐｐ  ８２２−８４８，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ．
（８）Ｇｒｅｉｖｅ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｌｉｎｓ，  Ａ．  Ｆ．，  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ，  Ｐ．  Ｈ．  （２００５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  ３６３９７−３６４０８．
（９）（ａ）  Ｎｏｄｗｅｌｌ，  Ｊ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ，  Ｊ．  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７２，  ２６１−２６８．  （ｂ）  Ｂｕｒｍａｎｎ，  Ｂ．  Ｍ．，  Ｌｕｏ，  Ｘ．，  Ｒｏｓｃｈ，  Ｐ．，  Ｗａｈｌ，  Ｍ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｍ．  Ｅ．  （２０１０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３８，  ３１４−３２６．
（１０）  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｇｒｏｈｍａｎｎ，  Ｄ．  （２０１１）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９，  ８５−９８．
（１１）  （ａ）  Ｋａｔｏ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  （２００７）  Ｍｏｌ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３，  １３２．  （ｂ）  Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ，  Ｍ．，  Ｂａｋｅｒ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｃｏｕｒｔ，  Ｄ．  Ｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８９，  ２８４４−２８５３．
（１２）  （ａ）  Ｍａ，  Ｃ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  Ｋａｎｄｅｍｉｒ，  Ｈ．，  Ｍｉｅｌｃｚａｒｅｋ，  Ｍ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｅ．  Ｂ．，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｒ．，  Ｋｕｍａｒ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２０１３）  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ８，  １９７２−１９８０．  （ｂ）  Ｍａ，  Ｃ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２０１６）  ＡＣＳ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２，  ３９−４６．
（１３）  Ｖａｓｓｙｌｙｅｖ，  Ｄ．  Ｇ．，  Ｖａｓｓｙｌｙｅｖａ，  Ｍ．  Ｎ．，  Ｐｅｒｅｄｅｒｉｎａ，  Ａ．，  Ｔａｈｉｒｏｖ，  Ｔ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ａｒｔｓｉｍｏｖｉｔｃｈ，  Ｉ．  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，  １５７−１６２．
（１４）  Ｌｉｕ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｔｚ，  Ｔ．  Ａ．  （２０１７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４５，  ９６８−９７４．
（１５）  Ｂｕｒｍａｎｎ，  Ｂ．  Ｍ．，  Ｓｃｈｗｅｉｍｅｒ，  Ｋ．，  Ｌｕｏ，  Ｘ．，  Ｗａｈｌ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｓｔｉｔｔ，  Ｂ．  Ｌ．，  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｍ．  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｒｏｓｃｈ，  Ｐ．  （２０１０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８，  ５０１−５０４．
（１６）  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  Ｍｏｌｉｍａｕ，  Ｓ．，  Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｇ．  Ｐ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｅ．  Ｂ．，  Ｍａｒｌｅｓ−Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｊ．，  Ｒｏｔｈｎａｇｅｌ，  Ｒ．，  Ｈａｎｋａｍｅｒ，  Ｂ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｒ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２００９）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  １０，  ９９７−１００２．
（１７）  （ａ）  Ｂｅｕｔｈ，  Ｂ．，  Ｐｅｎｎｅｌｌ，  Ｓ．，  Ａｒｎｖｉｇ，  Ｋ．  Ｂ．，  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｓ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｉ．  Ａ．  （２００５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２４，  ３５７６−３５８７．  （ｂ）  Ｐｒａｓｃｈ，  Ｓ．，  Ｊｕｒｋ，  Ｍ．，  Ｗａｓｈｂｕｒｎ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｍ．  Ｅ．，  Ｗｏｅｈｒｌ，  Ｂ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｒｏｅｓｃｈ，  Ｐ．  （２００９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３７，  ４７３６−４７４２．
（１８）  （ａ）  Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ，  Ｍ．，  Ｃｏｕｒｔ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ａｌ  Ｒｅｆａｉｉ，  Ａ．，  Ｓａｘｅｎａ，  Ｓ．，  Ｋｏｒｅｐａｎｏｖ，  Ａ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｄ．  Ｉ．，  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｍ．  Ｅ．，  ａｎｄ  Ａｌｉｘ，  Ｊ．  Ｈ．  （２０１３）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８７，  ３８２−３９３．  （ｂ）  Ｗｏｎｇ，  Ｔ．，  Ｓｏｓｎｉｃｋ，  Ｔ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｐａｎ，  Ｔ．  （２００５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，  ７５３５−７５４２．
（１９）  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａ．  Ｃ．  （２００３）  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １０，  ７８７−７９７．
（２０）  Ｓａｉｄ，  Ｎ．，  Ｋｒｕｐｐ，  Ｆ．，  Ａｎｅｄｃｈｅｎｋｏ，  Ｅ．，  Ｓａｎｔｏｓ，  Ｋ．  Ｆ．，  Ｄｙｂｋｏｖ，  Ｏ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．  Ｈ．，  Ｌｅｅ，  Ｃ．  Ｔ．，  Ｌｏｌｌ，  Ｂ．，  Ｂｅｈｒｍａｎｎ，  Ｅ．，  Ｂｕｅｒｇｅｒ，  Ｊ．，  Ｍｉｅｌｋｅ，  Ｔ．，  Ｌｏｅｒｋｅ，  Ｊ．，  Ｕｒｌａｕｂ，  Ｈ．，  Ｓｐａｈｎ，  Ｃ．  Ｍ．  Ｔ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，  Ｍ．  Ｃ．  （２０１７）  Ｎａｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２，  １７０６２．
（２１）  Ｄａｓ，  Ｒ．，  Ｌｏｓｓ，  Ｓ．，  Ｌｉ，  Ｊ．，  Ｗａｕｇｈ，  Ｄ．  Ｓ．，  Ｔａｒａｓｏｖ，  Ｓ．，  Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，  Ｐ．  Ｔ．，  Ｂｙｒｄ，  Ｒ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ，  Ａ．  Ｓ．  （２００８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７６，  ７０５−７２０．
（２２）  Ｌｕｏ，  Ｘ．，  Ｈｓｉａｏ，  Ｈ．  Ｈ．，  Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ，  Ｍ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｇ．，  Ｃｏｕｒｔ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｍ．  Ｅ．，  Ｕｒｌａｕｂ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，  Ｍ．  Ｃ．  （２００８）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ３２，  ７９１−８０２．
（２３）  Ｓｔａｇｎｏ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ａｌｔｉｅｒｉ，  Ａ．  Ｓ．，  Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ，  Ｍ．，  Ｔａｒａｓｏｖ，  Ｓ．  Ｇ．，  Ｌｉ，  Ｊ．，  Ｃｏｕｒｔ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｂｙｒｄ，  Ｒ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｊｉ，  Ｘ．  （２０１１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３９，  ７８０３−７８１５．
（２４）  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  Ｍａ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２０１５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８６，  ４５−５０．
（２５）  Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｌｏｍｂａｒｄｏ，  Ｆ．，  Ｄｏｍｉｎｙ，  Ｂ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，  Ｐ．  Ｊ．  （２００１）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ４６，  ３−２６．
（２６）  （ａ）  Ｌｕｅｃｋｅ，  Ｌ．，  Ｗｅｉｓｓ，  Ａ．，  Ｇｒａｃｉｅｔ，  Ｊ．−Ｃ．，  Ｓｔｅｆｆａｎｕｔ，  Ｐ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｍ．  Ａ．  （２００８）  Ｅｕｒ．  Ｐａｔ．  Ａｐｐｌ．  ＥＰ  １９３０３７８．  （ｂ）  Ｌｕｅｃｋｅ，  Ｌ．，  Ｗｅｉｓｓ，  Ａ．，  Ｇｒａｃｉｅｔ，  Ｊ．−Ｃ．，  Ｓｔｅｆｆａｎｕｔ，  Ｐ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｍ．  Ａ．  （２００８）  Ｅｕｒ．  Ｐａｔ．  Ａｐｐｌ．  ＥＰ  １９２５６４３．
（２７）  （ａ）  Ｃａｎｇｅｌｏｓｉ，  Ｇ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂｒａｂａｎｔ，  Ｗ．  Ｈ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９，  ４４５７−４４６３．  （ｂ）  Ｈａｌｆｏｒｄ，  Ｃ．，  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｒ．，  Ｃａｍｐｕｚａｎｏ，  Ｓ．，  Ｈｕ，  Ｂ．，  Ｂａｂｂｉｔｔ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．，  Ｗａｎｇ，  Ｊ．，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，  Ｂ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈａａｋｅ，  Ｄ．  Ａ．  （２０１３）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５７，  ９３６−９４３．
（２８）  Ｏ’Ｎｅｉｌ，  Ｊ．  （２０１４）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  Ｔａｃｋｌｉｎｇ  ａ  ｃｒｉｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｗｅａｌｔｈ  ｏｆ  ｎａｔｉｏｎｓ，  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  ａｎｄ  ＨＭ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ，  Ｌｏｎｄｏｎ．
（２９）  Ｃｈｅｌｌａｔ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｒａｇｕｚ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｒｉｅｄｌ，  Ｒ．  （２０１６）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ５５，  ６６００−６６２６．
（３０）  Ｇｏｒａｌｓｋｉ，  Ｔ．  Ｄ．，  Ｄｅｗａｎ，  Ｋ．  Ｋ．，  Ａｌｕｍａｓａ，  Ｊ．  Ｎ．，  Ａｖａｎｚａｔｏ，  Ｖ．，  Ｐｌａｃｅ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｍａｒｋｌｅｙ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｋａｔｋｅｒｅ，  Ｂ．，  Ｒａｂａｄｉ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｂａｋｓｈｉ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｋｅｉｌｅｒ，  Ｋ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｋｉｒｉｍａｎｊｅｓｗａｒａ，  Ｇ．  Ｓ．  （２０１６）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ６０，  ３２７６−３２８２．
（３１）  Ｂｒｉｇｈｅｎｔｉ，  Ｅ．，  Ｔｒｅｒｅ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｄｅｒｅｎｚｉｎｉ，  Ｍ．  （２０１５）  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ６，  ３８６１７−３８６２７．
（３２）  Ｍａ，  Ｃ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２０１６）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８０，  １３９−１６０．
（３３）  Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｆ．  Ｗ．；  Ｍｏｆｆａｔｔ，  Ｂ．  Ａ．  （１９８６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８９，  １１３−１３０．
（３４）  Ｖａｓｓｙｌｙｅｖ，  Ｄ．  Ｇ．；  Ｖａｓｓｙｌｙｅｖａ，  Ｍ．  Ｎ．；  Ｐｅｒｅｄｅｒｉｎａ，  Ａ．；  Ｔａｈｉｒｏｖ，  Ｔ．  Ｈ．；  Ａｒｔｓｉｍｏｖｉｔｃｈ，  Ｉ．  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，  １５７−１６２．
（３５）  Ｌｉｕ，  Ｂ．；  Ｓｔｅｉｔｚ，  Ｔ．  Ａ．  （２０１７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４５，  ９６８−９７４．
（３６）  Ｓｔａｇｎｏ，  Ｊ．  Ｒ．；  Ａｌｔｉｅｒｉ，  Ａ．  Ｓ．；  Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ，  Ｍ．；  Ｔａｒａｓｏｖ，  Ｓ．  Ｇ．；  Ｌｉ，  Ｊ．；  Ｃｏｕｒｔ，  Ｄ．  Ｌ．；  Ｂｙｒｄ  Ｒ．  Ａ．；  Ｊｉ，  Ｘ．  （２０１１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３９，  ７８０３−７８１５．
（３７）  Ｂｅｕｔｈ，  Ｂ．；  Ｐｅｎｎｅｌｌ，  Ｓ．；  Ａｒｎｖｉｇ，  Ｋ．  Ｂ．；  Ｍａｒｔｉｎ  Ｓ．  Ｒ．；  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｉ．  Ａ．  （２００５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２４，  ３５７６−３５８７．
（３８）  Ｂｕｒｍａｎｎ，  Ｂ．  Ｍ．；  Ｓｃｈｗｅｉｍｅｒ，  Ｋ．；  Ｌｕｏ，  Ｘ．；  Ｗａｈｌ，  Ｍ．  Ｃ．；  Ｓｔｉｔｔ，  Ｂ．  Ｌ．；  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｍ．  Ｅ．；  Ｒｏｓｃｈ，  Ｐ．  （２０１０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８，  ５０１−５０４．
（３９）  Ｍａ，  Ｃ．；  Ｍｏｂｌｉ，  Ｍ．；  Ｙａｎｇ，  Ｘ．；  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｎ．；  Ｋｉｎｇ  Ｇ．  Ｆ．；  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２０１５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４３，  ２８２９−２８４０．
（４０）  Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，  Ｅ．  Ｆ．；  Ｇｏｄｄａｒｄ，  Ｔ．  Ｄ．；  Ｈｕａｎｇ，  Ｃ．  Ｃ．；  Ｃｏｕｃｈ，  Ｇ．  Ｓ．；  Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ，  Ｄ．  Ｍ．；  Ｍｅｎｇ，  Ｅ．  Ｃ．；  Ｆｅｒｒｉｎ，  Ｔ．  Ｅ．  （２００４）  Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．  ２５，  １６０５−１６１２．
（４１）  Ｙａｎｇ，  Ｘ．；  Ｍａ  Ｃ．；  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２０１５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８６，  ４５−５０．
（４２）  ＣＬＳＩ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．  （２０１５）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，  Ｔｗｅｎｔｙ−Ｆｉｆｔｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  （Ｍ１００Ｓ２５）．
（４３）  Ｂｉ，  Ｙ．；  Ｙａｎｇ，  Ｘ．；  Ｚｈａｎｇ，  Ｔ．；  Ｌｉｕ，  Ｚ．；  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．；  Ｌｕ，  Ｊ．；  Ｃｈｅｎｇ，  Ｋ．；  Ｘｕ，  Ｊ．；  Ｗａｎｇ，  Ｈ．；  Ｌｖ，  Ｇ．；  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．；  Ｍｅｎｇ  Ｑ．；  Ｍａ，  Ｃ．  （２０１５）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １０１，  ７１−８０．
（４４）  Ｈｅｃｋｍａｎ  Ｋ．  Ｌ．；  Ｐｅａｓｅ，  Ｌ．  Ｒ．  （２００７）  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２，  ９２４−９３２．
（４５）  Ｍａ，  Ｃ．；  Ｙａｎｇ，  Ｘ．；  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２０１６）  ＡＣＳ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２，  ３９−４６．
（４６）  Ｎｅｙｌｏｎ，  Ｃ．；  Ｂｒｏｗｎ，  Ｓ．  Ｅ．；  Ｋｒａｌｉｃｅｋ，  Ａ．  Ｖ．；  Ｍｉｌｅｓ，  Ｃ．  Ｓ．；  Ｌｏｖｅ，  Ｃ．  Ａ．；  Ｄｉｘｏｎ，  Ｎ．  Ｅ．  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，  １１９８９−１１９９９．
（４７）  Ｍａ，  Ｃ．；  Ｙａｎｇ，  Ｘ．；  Ｋａｎｄｅｍｉｒ，  Ｈ．；  Ｍｉｅｌｃｚａｒｅｋ，  Ｍ．；  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｅ．  Ｂ．；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｒ．；  Ｋｕｍａｒ，  Ｎ．；  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．  （２０１３）  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ８，  １９７２−１９８０．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021510143.tif 000048
【図２Ａ】
2021510143.tif 000049
【図２Ｂ】
2021510143.tif 000050
【図３】
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【図４】
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【図５】
2021510143.tif 000053
【図６】
2021510143.tif 000054
【図７】
2021510143.tif 000055
【図８Ａ】
2021510143.tif 000056
【図８Ｂ】
2021510143.tif 000057
【図８Ｃ】
2021510143.tif 000058
【図８Ｄ】
2021510143.tif 000059
【図９−１】
2021510143.tif 000060
【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021510143.tif 000068
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