(57)【要約】  【解決手段】  内皮機能不全を特徴とする疾患の治療に使用するためのポリペプチドを含むポリペプチドまたは製剤であって、前記ポリペプチドまたはその断片が、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸を含むことが本明細書に提供される。また、それに関連する方法および使用が提供される。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮機能不全を特徴とする疾患の治療に使用するためのポリペプチドを含むポリペプチドまたは製剤であって、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、ポリペプチドまたは製剤。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドまたは製剤において、内皮機能不全を特徴とする前記疾患は、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満症および肺動脈高血圧症から選択される、ポリペプチドまたは製剤。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載のポリペプチドまたは製剤において、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号：１、２、３、または４に記載の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する、ポリペプチドまたは製剤。
【請求項４】
請求項１または請求項２記載のポリペプチドまたは製剤において、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載の前記アミノ酸配列を含む、ポリペプチドまたは製剤。
【請求項５】
請求項１または請求項２記載のポリペプチドまたは製剤において、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載の前記アミノ酸配列からなる、ポリペプチドまたは製剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の製剤において、前記製剤は、経口医薬製剤である、製剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の製剤において、前記製剤は、非経口医薬製剤である、製剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の製剤において、前記製剤は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体および／または１つまたはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤および／または１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、製剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の製剤において、前記製剤は、水性医薬製剤である、製剤。
【請求項１０】
請求項９記載の製剤において、前記ポリペプチドは、０．０５〜５μｇ／Ｌの濃度で存在する、製剤。
【請求項１１】
請求項９記載の製剤において、前記ポリペプチドは、０．１〜１μｇ／Ｌの濃度で存在する、製剤。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の製剤において、前記水性医薬製剤は、緩衝液、選択的に生理的ｐＨを有する緩衝液を含む、製剤。
【請求項１３】
請求項１２記載の製剤において、前記緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水である、製剤。
【請求項１４】
内皮細胞の増殖を調節する方法であって、前記方法は、内皮細胞をポリペプチドまたはポリペプチドを含む製剤と接触させることを含み、
前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記接触させる工程は、水溶液中で行われる、方法。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５記載の方法において、前記ポリペプチドまたは製剤は、請求項３〜１３のいずれかにさらに定義されるとおりである、方法。
【請求項１７】
内皮細胞の増殖を調節するためのポリペプチドまたはポリペプチドを含む製剤の使用であって、
前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、使用。
【請求項１８】
請求項１７記載の使用において、前記ポリペプチドまたは製剤は、請求項３〜１３のいずれかにさらに定義されるとおりである、使用。
【請求項１９】
内皮機能不全を特徴とする疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、配列ＩＤ番号１、２、３、４に記載のアミノ酸配列セットと少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物、または活性断片またはその類似体の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法において、前記内皮機能不全を特徴とする前記疾患は、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満症および肺動脈高血圧症から選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１９または請求項２０記載の方法において、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する、方法。
【請求項２２】
請求項１９または請求項２０記載の方法において、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２３】
請求項１９または請求項２０記載の方法において、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項２４】
内皮機能不全を特徴とする疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１、３、４または５のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチドの使用であって、任意で、前記疾患は心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満症および肺動脈高血圧症から選択される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年１月９日に提出された米国仮特許出願番号６２／６１５，２２３の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
内皮細胞および脈管構造の変化は、広範囲のヒト疾患の病因において中心的な役割を果たす。（より包括的なレビューについては、「血管内皮と人間の病気」Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１３；９（１０）：１０５７−１０６９参照）内皮細胞の層で構成される内皮は、血管の内面であり、バリア機能、血液凝固、炎症、新しい血管の形成、血管収縮および血管拡張などの血管系の重要な側面に関与する。内皮は、末梢血管疾患、脳卒中、心臓病、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓症、および重度のウイルス感染症に直接関与する。したがって、血管内皮の機能障害は人間の疾患の特徴であり、内皮機能不全は、（これらに限定されないが、）高血糖および糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）および循環器疾患、脳卒中を含む、肺高血圧症、末梢血管疾患、動脈硬化症、および高コレステロール血症を含む多くの臨床疾患のある患者によく見られる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、内皮細胞機能障害に関連する疾患の治療のための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、糖尿病の動物から単離された機能不全の内皮細胞の成長を正常化できること、ならびに肺高血圧症を患っている患者から単離された機能不全の内皮細胞の成長を正常化できることが発見された。本発明の組成物は、対照と比較して内皮細胞の増殖速度を増加させる一方で、有害な肺動脈高血圧（ＰＡＨ）内皮細胞の生存率を減少させることも示された。本発明の組成物はまた、内皮細胞を含む多くの細胞型における細胞恒常性を回復させるのに有用である。
【０００４】
これらの驚くべき結果は、組成物がヒトを含む哺乳類の多くの臨床疾患、特に内皮細胞に影響を与えるもの（糖尿病、脳卒中、末梢血管疾患、高血圧症、アテローム性動脈硬化症）の治療に有効であることを示す。有益な効果は、血管細胞の内皮細胞および内皮前駆細胞の刺激およびサポート、ならびに細胞の恒常性の回復または調節による血管の治癒および再生の増強に関連する可能性がある。
【０００５】
本発明の一実施形態では、（天然または合成（ＤまたはＬ）を含み、修飾、断片および類似体を含む）タンパク質または活性ポリペプチドを含む活性物質を含む本発明の組成物、製剤および／または薬剤を含む。ここで、ポリペプチドは、以下の表Ｉに列挙される配列ＩＤ番号０１〜０４の１つまたはそれ以上からのアミノ酸配列を含む。配列ＩＤ番号０１は、４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）の活性領域を含む断片を表し、配列ＩＤ番号０２、０３および０４はその断片を表す。
表Ｉ：配列ＩＤ番号：０１−０４：
配列ＩＤ番号：０１（２９３ａａ；ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｐｒｏｘ．３１ｋＤａ）ＭＡＤＤＡＧＡＡＧＧＰＧＧＰＧＧＰＧＭＧＮＲＧＧＦＲＧＧＦＧＳＧＩＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＡＲＧＧＫＡＥＤＫＥＷＭＰＶＴＫＬＧＲＬＶＫＤＭＫＩＫＳＬＥＥＩＹＬＦＳＬＰＩＫＥＳＥＩＩＤＦＦＬＧＡＳＬＫＤＥＶＬＫＩＭＰＶＱＫＱＴＲＡＧＱＲＴＲＦＫＡＦＶＡＩＧＤＹＮＧＨＶＧＬＧＶＫＣＳＫＥＶＡＴＡＩＲＧＡＩＩＬＡＫＬＳＩＶＰＶＲＲＧＹＷＧＮＫＩＧＫＰＨＴＶＰＣＫＶＴＧＲＣＧＳＶＬＶＲＬＩＰＡＰＲＧＴＧＩＶＳＡＰＶＰＫＫＬＬＭＭＡＧＩＤＤＣＹＴＳＡＲＧＣＴＡＴＬＧＮＦＡＫＡＴＦＤＡＩＳＫＴＹＳＹＬＴＰＤＬＷＫＥＴＶＦＴＫＳＰＹＱＥＦＴＤＨＬＶＫＴＨＴＲＶＳＶＱＲＴＱＡＰＡＶＡＴＴ
配列ＩＤ番号：２：（１５９ａａ；ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｐｒｏｘ．１７ｋＤａ）ＧＨＶＧＬＧＶＫＣＳＫＥＶＡＴＡＩＲＧＡＩＩＬＡＫＬＩＶＰＶＲＲＧＹＷＧＮＫＩＧＫＰＨＴＶＰＣＫＶＴＧＲＣＧＳＶＬＶＲＬＩＰＡＰＲＧＴＧＩＶＳＡＰＶＰＫＫＬＬＭＭＡＧＩＤＤＣＹＴＳＡＲＧＣＴＡＴＬＧＮＦＡＫＡＴＦＤＡＩＳＫＴＹＳＹＬＴＰＤ  ＬＷＫＥＴＶＦＴＫＳＰＹＱＥＦＴＤＨＬＶＫＴＨＴＲＶＳＶＱＲＴＱＡＰＡＶＡＴＴ
配列ＩＤ番号：３：（７５ａａ；ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｐｒｏｘ．８ｋＤａ）ＳＩＶＰＶＲＲＧＹＷＧＮＫＩＧＫＰＨＴＶＰＣＫＶＴＧＲＣＧＳＶＬＶＲＬＩＰＡＰＲＧＴＧＩＶＳＡＰＶＰＫＫＬＬＭＭＡＧＩ  ＤＤＣＹＴＳＡＲＧＣＴＡＴＬＧＮ
配列ＩＤ番号：４  ８７ａａ；ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｐｒｏｘ．９ｋＤａ）ＧＨＶＧＬＧＶＫＣＳＫＥＶＡＴＡＩＲＧＡＩＩＬＡＫＬＳＩＶＰＶＲＲＧＹＷＧＮＫＩＧＫＰＨＴＶＰＣＫＶＴＧＲＣＧＳＶＬＶＲＬＩＰＡＰＲＧＴＧＩＶＳＡＰＶＰＫＫＬＬＭＭＡＧＩＤＤ
【０００６】
本発明の第１の態様では、ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、配列ＩＤ番号１、２、３、４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。活性剤を含む製剤および医薬組成物の実施例において、活性剤は、米国特許番号２０１８／０１３３２８０に記載される配列ＩＤ番号１〜４の１つまたはそれ以上によるポリペプチドまたはその断片を含む活性剤を含む。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、内皮機能不全を特徴とする疾患の治療に使用するためのポリペプチドまたはポリペプチドを含む製剤を提供し、ポリペプチドは本明細書に開示されるポリペプチドまたはポリペプチド断片である。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。
【０００８】
ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。
【０００９】
ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列から成り得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列から成り得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列から成り得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列から成り得る。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列から成り得る。
【００１０】
内皮機能不全を特徴とする疾患は、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満症、および肺動脈高血圧症から選択することができる。内皮機能不全を特徴とする疾患は、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化である可能性がある。内皮機能不全を特徴とする疾患は肥満である可能性がある。内皮機能不全を特徴とする疾患は、肺動脈高血圧症である可能性がある。
【００１１】
製剤は経口医薬製剤であって良い。製剤は非経口医薬製剤であって良い。製剤は局所製剤であって良い。
【００１２】
製剤は、１つまたはそれ以上の医薬的に許容可能な担体および／または１つまたはそれ以上の医薬的に許容可能な希釈剤および／または１つまたはそれ以上の医薬的に許容可能な賦形剤を含み得る。製剤は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体を含み得る。製剤は、１またはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤を含み得る。製剤は、１またはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。
【００１３】
製剤は、水性医薬製剤であって良い。ペプチドは、水性医薬製剤中に０．０５〜５μｇ／Ｌの濃度で存在し得る。例えば、ペプチドは、０．０８〜３μｇ／Ｌの濃度で存在し得るか、または０．１〜１μｇ／Ｌで存在し得る。ペプチドは、少なくとも０．０５μｇ／Ｌ、例えば少なくとも０．７、０．１または０．５μｇ／Ｌの濃度で存在し得る。ペプチドは、５μｇ／Ｌ以下、例えば４、３または２μｇ／Ｌ以下（例えば、１μｇ／Ｌ以下）の濃度で存在し得る。水性医薬製剤は緩衝剤を含み得る。緩衝液は、約７〜約８のｐＨを有しても良く、例えば、緩衝液は、約７．２〜約７．６のｐＨ、例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨ（約７．４のｐＨ、例えば、７．３〜７．５のｐＨ）を有しても良い。緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水であり得る。
【００１４】
第３の態様では、本発明は、内皮細胞の増殖を調節する方法を提供し、この方法は、内皮細胞をポリペプチドまたはポリペプチドを含む製剤と接触させる工程を含み、ポリペプチドまたは製剤は、本明細書に開示されるポリペプチドまたは製剤（例えば、本発明の態様または実施形態のポリペプチドまたは製剤）である。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性の配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み得る。接触は、水溶液中で行われ得る。この方法は、インビトロ法であり得る。
【００１５】
第４の態様では、本発明は、内皮細胞増殖を調節するためのポリペプチドを含むポリペプチドまたは製剤の使用を提供し、ポリペプチドまたは製剤は、本明細書に開示されるポリペプチドまたは製剤である（例えば、本発明の態様または実施形態のポリペプチドまたは製剤）。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み得る。
【００１６】
第５の態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチド（例えば、本発明の態様または実施形態のポリペプチド）を含む組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、内皮機能不全を特徴とする疾患を治療する方法を提供する。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその活性断片もしくは類似体を含み得る。内皮機能不全を特徴とする疾患は、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満症、および肺動脈高血圧症から選択することができる。内皮機能不全を特徴とする疾患は、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化である可能性がある。内皮機能不全を特徴とする疾患は肥満である可能性がある。内皮機能不全を特徴とする疾患は、肺動脈高血圧症である可能性がある。
【００１７】
第６の態様では、本発明は、内皮機能不全を特徴とする疾患の治療用の薬剤の製造のための、本明細書に開示される少なくとも１つのポリペプチド（例えば、本発明の態様または実施形態のポリペプチド）の使用を提供する。ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。内皮機能不全を特徴とする疾患は、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満および肺動脈高血圧症である可能性がある。内皮機能不全を特徴とする疾患は、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化から選択され得る。内皮機能不全を特徴とする疾患は肥満である可能性がある。内皮機能不全を特徴とする疾患は、肺動脈高血圧症である可能性がある。
【００１８】
第２、第３、第４、第５または第６の態様のいずれかにおいて、ポリペプチドまたは少なくとも１つのポリペプチドは、第１または第２の態様で定義されたポリペプチドであり得る。
【００１９】
第３または第４の態様のいずれかにおいて、製剤は、第２の態様で定義された製剤であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ペプチド分子による内皮細胞の処理が、細胞増殖アッセイによって測定され、相対光学密度（ＯＤ）として示されるように、内皮細胞の数を増加させることを示す。ＩＭＧ−１は、全長ペプチドで処理された細胞を示し、命名法ＩＭＧ−１は、配列ＩＤ番号１を示し、ＩＭＧ−２は、１７ｋＤａのフラグメントで処理された細胞を示し、ＩＭＧ−２ｘは、１４ｋＤａのペプチドフラグメントで処理された細胞を示し、命名ＩＭＧ−２およびＩＭＧ−２ｘは、全長フラグメントの切断後に精製されたフラグメントサイズを示し、ＩＭＧ−２は配列ＩＤ番号２に対応し、ＩＭＧ−２ｘは全長タンパク質のＮ末端領域のフラグメントに対応する。
【図２】図２は、ペプチド分子による内皮細胞の処理が、培養中のＣＤ３１／ＣＤ１３３陽性細胞のパーセントによって測定されるように、内皮前駆細胞の数を増加させることを示す。ＩＭＧ−１は、全長ペプチドで処理された細胞を示し、ここで、名称ＩＭＧ−１は、配列ＩＤ番号１を指す。ＩＭＧ−２は、１７ｋＤａのフラグメントで処理された細胞を示し、ＩＭＧ−２ｘは、１４ｋＤａのペプチドフラグメントで処理された細胞を示し、ＩＭＧ−２およびＩＭＧ−２ｘという名称は、完全長フラグメントの切断後に精製されたフラグメントサイズを指す。
【図３】図３は、糖尿病関連の心臓合併症および高血圧に対するＩＭＧ−１の効果を示す。ＩＭＧ−１によるＺｕｃｋｅｒ糖尿病性脂肪ラットの治療は、経口投与か静脈内投与かにかかわらず、収縮期血圧と拡張期血圧の両方についてｍｍＨｇで測定される正常化された血圧になる。ＩＭＧ−１は、配列ＩＤ番号１に対応する完全長ペプチドを示す。破線は静脈内投与により処置されたラットを示し、破線および点線は経口投与により処置されたラットを示す。
【図４】図４は、肺カテーテル法を受けている（Ｂｃｌ−２陰性；すなわち、非肺動脈高血圧症患者）患者から収集された内皮細胞の治療が、細胞の相対的生存率によって測定されるように、Ｂｃｌ−２陰性肺高血圧症内皮細胞の細胞増殖の増加をもたらすことを示す。グラフにおいて、ＩＭＧ−１は全長ペプチド（配列ＩＤ番号１）を示し、ＩＭＧ−２は１７ｋＤａフラグメント（配列ＩＤ番号２）（全長タンパク質の切断後に精製された）を示す。
【図５】図５は、肺カテーテル法を受けているＢｃｌ−２陽性患者から収集された内皮細胞の治療が、細胞の相対的生存率によって測定されるように、Ｂｃｌ−２陽性肺高血圧症内皮細胞増殖の障害をもたらすことを示す。グラフにおいて、ＩＭＧ−１は全長ペプチド（配列ＩＤ番号１）を示し、ＩＭＧ−２は１７ｋＤａフラグメント（配列ＩＤ番号２）（全長タンパク質の切断後に精製された）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
この開示では、以下の用語を使用して、本発明の異なる態様を説明する。これらの用語は説明の目的でのみ使用されており、本発明の任意の態様の範囲を限定することを意図しない。
【００２２】
本明細書で使用される「活性成分」、「化合物」、および／または「活性剤」は互換的に使用され、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド断片、またはそれらの類似体を指し、配列ＩＤ番号１；または配列ＩＤ番号２、または配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、またはそれらの組み合わせの１またはそれ以上から選択されたアミノ酸配列を有するそれらに対する任意の修飾を含む。活性成分／化合物を含む本発明の例示的な製剤は、本明細書では、活性化合物の特定の投与量または濃度を意味することなく、製剤に関して「ＩＭＧ−１」または「ＩＭＧ−２」という命名法を使用して言及され得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「医薬製剤」、「医薬組成物」、「製剤」、または「組成物」は、（交換可能に）液体（水性、ゲル、または軟膏）、またはある量の活性化合物を含む固体形態を指し、直接または再構成後のヒトまたは他の動物などの哺乳動物への投与に適するように調製される。必要に応じて、製剤は、薬学的に許容される担体、緩衝液、等張剤、界面活性剤および／または添加剤、ならびに同時治療または併用治療が効果的であり得る追加の活性剤を含み得る。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療する」または「治療」という用語、および本明細書で使用する他の文法的同等物には、疾患または状態の症状の緩和、緩和または改善、追加の症状の防止、根本的な代謝原因の改善または防止、症状、疾患または状態の阻害、例えば、疾患または状態の進行の停止、疾患または状態の緩和、疾患または状態の退行の原因、疾患または状態によって引き起こされる状態の緩和、または疾患の症状の停止または状態、および予防が含まれる。この用語はさらに、治療効果および／または予防効果を達成することを含む。治療効果とは、治療される基礎疾患の根絶または改善を意味する。また、患者が依然として根本的な障害に苦しむ可能性があるにもかかわらず、患者において改善が観察されるように、根本的な疾患に関連する１つまたはそれ以上の生理学的症状の根絶または改善により治療効果が達成される。予防上の利益のために、組成物は、特定の疾患を発症するリスクのある患者、またはこの疾患の診断がなされていなくても、疾患の生理学的症状の１つまたはそれ以上を報告する患者に投与され得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」は、記載された効果を達成するのに十分な活性化合物の量を指す。糖尿病または高血圧などのヒトなどの哺乳動物の状態を治療するための治療有効量は、糖尿病の血糖値の低下、高血圧の血圧の低下、または高トリグリセリド血症または高コレステロール血症のコレステロールの低下など、患者または患者集団において臨床的に関連のあるエンドポイントを達成できる活性化合物の量である。非限定的な例として、ＩＭＧ−１組成物を含む製剤の有効量の投与は、（糖尿病動物モデルにおいて）血中グルコースを２００ｍｇ／ｄＬ未満に低下させること、血圧を１４０／９０ｍｍＨｇ未満に下げること、総コレステロールを２００ｍｇ／ｄＬ未満に下げることが動物研究で示される。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」という用語は、配列間の同一性または類似性に関して表現された２つまたはそれ以上のアミノ酸配列間の同一性を指す。配列同一性は、同一性の割合で測定できる。パーセンテージが高いほど、配列はより同一になる。同一性のパーセンテージは、配列の全長にわたって計算される。アミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用して整列させた場合、比較的高度の配列同一性を持つ。オーソロガスタンパク質が、より遠くに関連する種（例えば、ヒトおよび線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の配列）と比較して、より密接に関連する種（例えば、ヒトおよびマウスの配列）に由来する場合、この相同性はより重要である。
【００２７】
比較のために配列を整列させる方法は、当技術分野でよく知られる。さまざまなプログラムとアラインメントアルゴリズムについては、Ｓｍｉｔｈ&Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ&Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ&Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ&Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ&Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，１９９２；ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４．Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０に記載され、配列アラインメント法と相同性計算の詳細な考察を示す。配列同一性のレベルは、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）を使用して決定可能であり、生物学的情報センター（ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，ＵＳ）およびインターネット上で利用可能である。
【００２８】
本発明は、本開示のタンパク質またはペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するタンパク質およびペプチドを含み、そのようなタンパク質は、本開示の対応するタンパク質またはペプチドの活性を有し得る。
【００２９】
本発明は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４の１つまたはそれ以上に対応するタンパク質、ポリペプチドペプチドフラグメント、または類似体（天然または合成のいずれか）、またはその活性領域、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤または追加の活性剤と組み合わせを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口（舌下を含む）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内）、および／または経皮、鼻腔内および吸入投与を含む皮膚／局所用に処方され得る。
【００３０】
本発明は、薬学的使用のために製剤化された開示の活性物質（例えば、本明細書に開示されるタンパク質、ポリペプチドペプチドフラグメント、または類似体）を含み、任意で薬学的に許容される希釈剤、賦形剤および／または担体をさらに含む製剤を提供する。したがって、本発明は、少なくとも１つの活性成分に加えて、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤および／または担体を含み得る医薬製剤を含む。そのような製剤は、本開示の方法で使用されても良い。追加的に、または代替的に、薬学的処方物は、緩衝液、安定剤、および／または当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような物質は無毒であるべきであり、有効成分の効力を妨げるべきではない。担体または他の物質の正確な性質は、任意の適切な経路であり得る投与経路によるだろう。投与経路は経口でも良い。投与経路は、非経口経路、特に注入または注射（針ありまたはなし）によるものであり得る。投与経路は皮下注射であっても良い。投与経路は、静脈内注射または注入であり得る。
【００３１】
また、機能不全の内皮細胞活性に関連するかまたはそれによって引き起こされる哺乳動物における１つまたは複数の状態の予防、発症の遅延、または重症度の軽減の方法が提供される。
【００３２】
所望の生物学的効果を達成するために必要とされる特定の製剤の化合物の量、範囲、または投与量は、それが意図される用途、投与経路、対象、および受信者（体重、年齢（成人または小児）、性別）による。用量は、単一の単位用量として、いくつかの別個の単位用量として、または連続的な注入／吸収として対象に投与することができる。組成物は、降圧剤またはコレステロール低下剤などの他の化合物または医薬品との同時投与に適する場合がある。
【００３３】
本発明および開示はまた、以下の番号付けされた条項の主題を含む。
１．内皮機能不全を特徴とする哺乳動物の疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、１またはそれ以上の配列ＩＤ番号１〜４のタンパク質または活性ポリペプチド、または活性断片またはその類似体を含む治療的有効量の組成物を投与する工程を含む、方法。
２．１記載の方法において、前記疾患は、アテローム性動脈硬化症、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病を含む糖尿病、肥満、肺動脈高血圧を含む高血圧、高コレステロール血症、および高脂血症などの心血管疾患からなる群から選択される、方法。
３．内皮細胞増殖を調節する方法であって、配列ＩＤ番号１〜４記載のポリペプチドを含む組成物、または活性断片またはその類似体の有効量を投与する工程を含む、方法。
４．１〜３いずれか記載の方法において、糖尿病、高血糖症、高血圧症、高コレステロール血症、代謝障害、および／または肥満症の１つまたはそれ以上を治療するための製剤から選択される活性剤の同時投与をさらに含む、方法。
５．タンパク質またはポリペプチドの治療有効量を有する医薬製剤であって、配列ＩＤ番号１〜４記載のアミノ酸配列、または活性フラグメント、またはその類似体、および１つまたはそれ以上の医薬賦形剤、担体、等張化剤、界面活性剤、または緩衝液を含む、医薬製剤。
６．配列ＩＤ番号１〜４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質または活性ポリペプチド、または活性断片、またはそれらの類似体を含む、組成物。
【００３４】
本発明はまた、例証および非網羅的であることが意図され、それらに限定されないものとして理解されるべきである実施例および実験結果を通じて説明される。
【実施例１】
【００３５】
配列ＩＤ番号０１に対応する全長ポリペプチドをヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ）で消化した。ヒドロキシルアミンは、完全長タンパク質を、位置Ｐ１のＡｓｎのアミノ酸１３４、位置Ｐ１'のＧｌｙで２つのサブユニット：１４ｋＤａフラグメントと１７ｋＤａフラグメントに切断する。得られた１４ｋＤａおよび１７ｋＤａのフラグメントを非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、可視化してからゲルから電気溶出した。次に、フラグメントをヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＣＡＤＭＥＣ）培養物（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃから入手可能）に加えた。ＣＡＤＭＥＣは、メーカーの指示に従って、５，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェル皿で培養した。７２時間のインキュベーション後、細胞をＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）にかけた。Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（ＭＴＴ）は、細胞増殖、生存率、細胞毒性を定量するための比色アッセイである。このアッセイは、電子カップリング試薬の存在下でのテトラゾリウム塩ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の開裂に基づく。次に、細胞を増殖試薬で検出し、増殖試薬は、生細胞内で、細胞の還元酵素によって黄色のテトラゾールＭＴＴから紫色のホルマザン型に変換される。可溶化後、走査型マルチウェル分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）を使用してホルマザン色素を定量する。測定された吸光度は、生存細胞の数に直接相関する。よって、光学密度（ＯＤ）の増加は細胞数の増加を意味する。
【００３６】
全長ペプチドまたは１７ｋＤａフラグメントのいずれかで処理されたＣＡＤＭＥＣは、対照を超える内皮細胞の数の著しい増加（それぞれ１６４％および１５７％）を示したが、１４ｋＤａフラグメントで処理された細胞では、細胞数において増加を示さなかった（結果は図１に示す）。さらに、活性剤として配列ＩＤ番号１および配列ＩＤ番号２を含む処方物での処置は、対照と比較して内皮前駆細胞の数を増加させることが示された。配列ＩＤ番号３または４を含む製剤は、それらの共有された配列および機能領域を考えると、同様の結果を示すことが期待される。
【００３７】
ＣＡＤＭＥＣ細胞を、全長ペプチド、１４ｋＤａフラグメント、１７ｋＤａフラグメントのいずれかを含む０．５ｕｇ／ｍＬの製剤で処理し、７２時間増殖させた。７２時間のインキュベーション後、細胞をＣＤ１３３およびＣＤ３１について染色し、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析で分析した。ＣＤ３１／ＣＤ１３３である細胞は、内皮前駆細胞であると考えられた。全長ペプチドおよび１７ｋＤａフラグメントで処理された両方の細胞培養試料は、図１に示されるように、対照と比較して内皮前駆細胞の数の増加を示した（４．３％と比較して１１％および９．８％）。２および以下の表２を参照。
ペプチド 内皮前駆細胞
（ＣＤ３１／ＣＤ１３３二重陽性）
ＩＭＧ−１（配列ＩＤ番号１）            １１％
ＩＭＧ−２（１７ｋＤａフラグメント）
（配列ＩＤ番号２）                  ９．８％
ＩＭＧ−２ｘ（１４ｋＤａフラグメント）  ３．４％
コントロール                        ４．４％
【実施例２】
【００３８】
ラットのザッカー糖尿病性脂肪（ＺＤＦ）系統は広く知られており、肥満、高血圧、高コレステロールに関連する２型糖尿病の研究に広く使用される。ＺＤＦ系統は、早期発症糖尿病の近交系ラットモデルであり、すべてのｆａ／ｆａオスラットは、Ｐｕｒｉｎａ  ５００８の特別な食事を与えられたら１０〜１２週齢で糖尿病を発症する。ＺｕｃｋｅｒＤｉａｂｅｔｉｃ  Ｆａｔｔｙ（ＺＤＦ）ラットは、彼らの体重を増やすためのプリナ５００８を与えられた。試験の前に、動物の血糖値を評価した。研究では、２００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値を持つラットのみが使用された。動物を無作為に群に分け、無処置、１日１回１０μｇ（完全長ペプチド）を静脈内投与（ＩＶ）、および１日１回２００μｇ（完全長ペプチド）を経口投与（ＰＯ）した。用量は約２０μｇ／ｋｇ／日〜３３．５μｇ／ｋｇ／日（ＩＶ）、および４０１μｇ／ｋｇ／日〜６７０μｇ／ｋｇ／日（ＰＯ）の範囲だった。動物はこの食餌を３５日間維持し、体重を週２回測定した。３５日後、動物を犠牲にした。
【００３９】
糖尿病関連心合併症および高血圧症に対するＩＭＧ−１による治療の効果を評価した。空腹時血糖値（ＦＢＧ）は、ラット全体で、ならびに摂食後３時間、およびハンドヘルドグルコメーターを使用した被験物質投与後に評価された。完全長ペプチドで処理されたＺＤＦラットは、投与されたモダリティに関係なく、処理後３日で血中グルコースレベルの著しい低下を示し、すべての処理された動物は７日までに正常なＦＢＧレベル（２００ｍｇ／ｄＬ未満のレベル）を示した。ＺＤＦラットの血圧は、ＣＯＤＡ非侵襲性血圧テールカフシステム血圧モニターを使用して週に２回監視された。
【００４０】
図３は、全長ペプチドで処置された動物対それらの対照動物における収縮期および拡張期血圧レベルを示す。完全長ペプチド（経口または静脈内のいずれか）による治療は、糖尿病の動物モデルにおいて血圧を正常化することを示した。治療の３日以内に、完全長ペプチドで治療したラットはより低い血圧を示し、完全長ペプチドを経口投与したＺＤＦラットは７日目までに正常血圧を達成したが、静脈内完全長ペプチドを投与したラットは１０日目まで正常血圧を達成した（ＩＶおよびＰＯの１２０／８２ｍｍＨｇおよび１１５／８０ｍｍＨｇは完全長ペプチドにそれぞれ投与された）。対照的に、処理された動物と比較して、コントロール（未処理）のＺＤＦラットは高血圧（＞１４０／９０ｍｍＨｇ）を有し、それを維持した。
【実施例３】
【００４１】
ＩＭＧ−１およびＩＭＧ−２による治療がＢｃｌ−２陽性肺高血圧症内皮細胞の成長を損なうおよび／または減少させることを示す別の研究が行われた。
【００４２】
内皮細胞は、スワンガンツ（肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ））を受ける患者から分離された−新規の技術を使用した右心カテーテル法（ＲＨＣ）（Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１３  Ｊｕｌ；３２（７）：７４６−９）。単離された内皮細胞は、内皮細胞増殖キット−ＢＢＥ（ＡＴＣＣから入手可能）が補充された血管細胞基礎培地で培養される。スワンガンツカテーテル法は、心臓と肺につながる動脈の右側に細い管（カテーテル）を通すことである。これは、心臓の機能と血流および心臓内および周囲の血圧を監視するために行われる。ＰＡＥＣは、肺動脈高血圧症の患者のＲＨＣから取得できることを示す（ＰＡＨ；世界保健機関グループ１）。
【００４３】
肺動脈高血圧症は、肺内皮細胞の機能障害、血管リモデリング、小血管喪失、および閉塞性血管障害を特徴とする進行性の疾患であり、肺血管抵抗の増加、その後の右心不全、および早期死亡につながる。ＰＡＨ患者から分離されたＰＡＥＣＳは、過剰増殖性、アポトーシス耐性があり、他のマーカーの中でも特にＢｃｌ−２を発現する。Ｂｃｌ−２（Ｂ細胞リンパ腫２の略）は、細胞死（アポトーシス）を調節するレギュレータータンパク質のＢｃｌファミリーのメンバーであり、Ｂｃｌ−２は重要な役割を果たすミトコンドリアの外膜に局在する細胞の生存を促進し、アポトーシス促進タンパク質の作用を阻害する役割を果たす。
【００４４】
ＲＨＣを受けている患者からの細胞が単離され、活性剤としてＩＭＧ−１またはＩＭＧ−２を含む組成物で処理された場合（それぞれ配列ＩＤ番号１および２に対応）、Ｂｃｌ−２が低い（非ＰＡＨ患者）ことが発見された）細胞の細胞増殖は４０％以上増加した。Ｂｃｌ−２陽性のＰＡＨ患者由来の細胞である一方で、ＩＭＧ−１およびＩＭＧ−２ペプチドによる治療は、Ｂｃｌ−２陽性の細胞生存率を５０％減少させることが示された。
【００４５】
図４は、本明細書に開示されるペプチドを含む組成物がＢｃｌ−２陰性肺高血圧症内皮細胞の増殖を促進することを示し、図５は、本明細書に開示されるペプチドを含む組成物が、血圧降下剤としてのペプチドの使用および肺動脈高血圧症の治療のためのペプチドの使用を支持することを示し、Ｂｃｌ−２陽性肺高血圧症内皮細胞の増殖障害を促進すること示す。
【００４６】
非ＰＡＨ患者（ウエスタンブロット分析で確認されたＢｃｌ−２陰性）と処理済みのＩＭＧ−１およびＩＭＧ−２からのＰＡＥＣは、細胞増殖の顕著な増加を示し、平均３５％の増殖と、４８時間後で細胞増殖３１％（それぞれＩＭＧ−１およびＩＭＧ−２）ｖｓ対照で１５．６％、９６時間後の処理７８％および７７％ｖｓ３３％を示す。９６時間の期間にわたって約４０％の細胞増殖の全体的な増加を示す（図４）。ＰＡＨ患者からのＰＡＥＣ（Ｂｃｌ−２陽性、ウエスタンブロット分析で確認）は、細胞増殖の有意な減少があり、相対細胞数は４８時間での開始値の−２６％および−３０％に相当する（ＩＭＧ−１およびＩＭＧ−２それぞれ）、一方で対照は２６％の増加を示した。９６時間までに、ＩＭＧ−１およびＩＭＧ−２で処理した細胞は、−５１％（ＩＭＧ−１）および−４５％（ＩＭＧ−２）の相対細胞数を示した。対照は、処置されたＰＡＥＣと対照のＰＡＥＣの間の増殖の有意な減少を示す（図５）。
【００４７】
本明細書に記載の組成物および方法は、他の薬剤または治療法を含むか、またはそれらと組み合わせて使用することができる。一実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のペプチド分子を含む組み合わせを、障害を治療または予防するのに有効な量で、薬剤または治療手順またはモダリティと組み合わせて対象に投与することを含む。ペプチド分子および薬剤または治療手順または様式は、同時にまたは任意の順序で連続的に投与することができる。ペプチド分子および他の治療剤、手順または様式の任意の組み合わせおよび配列（例えば、本明細書に記載されるような）を使用することができる。ペプチド分子および／または他の治療剤、手順または様式は、活動性障害または活動性の低い疾患状態の期間中に投与することができる。ペプチド分子は、他の治療の前に、治療と同時に、または治療後に投与することができる。
【００４８】
本発明の製剤、ペプチド、ペプチド断片および組成物は、単に処理された対象を対照または未処理のサンプルから区別するために、グラフおよび図（「ＩＭＧ−１」または「ＩＭＧ−２」など）の命名法によって参照され得る。命名法は、いかなる方法でも限定することを意図しないものである。
【００４９】
本明細書に開示された実験は、一部、マウスモデルで行われ、細胞培養実験は哺乳動物（ヒト）細胞を利用した。アロメトリースケーリングを使用して、本明細書に開示されるポリペプチド活性剤を含む組成物の成人への投与のための適切かつ例示的な用量範囲を予測することが可能である。アロメトリースケーリングは経験的アプローチであり、薬物用量の交換は、体表面積に対する用量の正規化に基づいており、当技術分野で十分に特徴付けられ、理解される。このアプローチは、種間の解剖学的、生理学的、および生化学的プロセスにいくつかのユニークな特性があり、薬物動態学／生理学的時間の考えられる差異が、それ自体、アロメトリックスケーリングによって説明されることを前提とする。この方法は、実験目的の研究で頻繁に使用され、他の種に存在するデータに基づくおおよその線量を予測する。因子別用量法は経験的アプローチであり、前臨床毒性試験からの薬物の観察された有害作用レベル（ＮＯＡＥＬ）を使用して、ヒト等価用量（ＨＥＤ）を推定する。係数による線量法は、代謝率の違いを説明する体表面積の指数（０．６７）を適用して、動物と人間の間の線量を変換する。したがって、ＨＥＤは次の方程式で決定される。
ＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ＝動物のＮＯＡＥＬｍｇ／ｋｇ）×（動物の体重［ｋｇ］／人間の体重［ｋｇ］）（１−０．６７）方程式（１）
【００５０】
本明細書に開示される例示的な製剤に基づいて、体重が約３００ｇのラットのＮＯＡＥＬ値は、３００μｇ／ｋｇ−１７００μｇ／ｋｇ（１日２回）である。
【００５１】
ヒト研究の開始用量範囲を計算するには：
ＨＥＤμｇ／ｋｇ＝３００×（０．３０／６０）（０．３３）＝５２．２１μｇ／ｋｇ、最大２９５．８６μｇ／ｋｇ（１日２回）。したがって、６０ｋｇのヒトの場合、例示的な用量は３．１３３ｇから１７．７５３ｇまでであり、１日２回だろう。
【００５２】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語およびそれらの変形は、「含むがこれらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、または工程を除外することを意図しない（および除外しない）。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈が他に必要としない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈が他を必要としない限り、単数性と同様に複数を企図するものとして理解されるべきである。
【００５３】
本発明の特定の態様、実施形態、または例に関連して説明された特徴、特性、化合物、化学部分、または基は、本明細書に記載された他の任意の態様、実施形態、または例に不適合でない限り適用可能であると理解されるべきである。本明細書に開示されているすべての機能（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示されている方法またはプロセスのすべての工程は、少なくともいくつかのそのような機能および／または工程は相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、前述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示された特徴の新規のもの、または新規の組み合わせ、または方法または工程の新規のもの、または新規の組み合わせに及ぶ。
【００５４】
本明細書に開示された実施形態の修正および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者によってなされ得るので、本開示は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本出願で引用されるすべての刊行物および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021510157.tif 000008
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