(57)【要約】  本発明は、骨折又は骨欠損の処置のための方法に関する。本発明は、部分的なギャップ欠損部（ｇａｐ  ｄｅｆｅｃｔ）における骨組織の治癒及び架橋を加速するための抗グレムリン−１抗体の有効な使用を開示し；グレムリン−１活性の阻害剤が、骨折非癒合を処置又は予防するための治療の改善をもたらし得ることを明らかにする。
2021513960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨折又は骨欠損の処置に用いるための、グレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項２】
抗グレムリン−１抗体又はその機能的活性断片、変異体若しくは誘導体である、請求項１に記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項３】
機能的活性抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖである、請求項２に記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項４】
抗体が、配列番号３、４、５及び６から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲ配列及び／又は配列番号７、８及び９から選択される少なくとも１つのＬＣＤＲ配列を含む、請求項２〜３のいずれかに記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項５】
抗体が、配列番号１０の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び／又は配列番号１１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項６】
抗体が、ＨＣＤＲ１に対する配列番号３又は４の配列、ＨＣＤＲ２に対する配列番号５の配列、ＨＣＤＲ３に対する配列番号６の配列、ＬＣＤＲ１に対する配列番号７の配列、ＬＣＤＲ２に対する配列番号８の配列及びＬＣＤＲ３に対する配列番号９の配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号１０の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１１の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項７】
抗体が、Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５から選択される少なくとも１つの残基を含むグレムリン−１上のエピトープに結合し、前記残基の付番が配列番号１に従う、請求項２〜６のいずれかに記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項８】
骨折又は骨欠損が癒合遷延又は非癒合骨折である、請求項１〜７のいずれかに記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項９】
骨折又は骨欠損が、骨の完全性に影響を与える疾患に関連する、請求項１〜８のいずれかに記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項１０】
骨の完全性に影響を与える疾患が、骨粗しょう症、骨形成不全症、糖尿病、骨のページェット病、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性骨髄腫、原発性骨癌、骨に転移する癌、広汎性特発性骨増殖症、骨髄炎、腎疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又は重症型サラセミアである、請求項９に記載のグレムリン−１活性の阻害剤。
【請求項１１】
骨折又は骨欠損の処置のための医薬の製造のためのグレムリン−１活性の阻害剤の使用。
【請求項１２】
阻害剤が、抗グレムリン−１抗体又はその機能的活性断片、変異体若しくは誘導体である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
機能的活性抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
抗体が、配列番号３、４、５及び６から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲ配列及び／又は配列番号７、８及び９から選択される少なくとも１つのＬＣＤＲ配列を含む、請求項１２〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
抗体が、配列番号１０の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び／又は配列番号１１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
抗体が、ＨＣＤＲ１に対する配列番号３又は４の配列、ＨＣＤＲ２に対する配列番号５の配列、ＨＣＤＲ３に対する配列番号６の配列、ＬＣＤＲ１に対する配列番号７の配列、ＬＣＤＲ２に対する配列番号８の配列及びＬＣＤＲ３に対する配列番号９の配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号１０の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１１の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
抗体が、Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５から選択される少なくとも１つの残基を含むグレムリン−１上のエピトープに結合し、前記残基の付番が配列番号１に従う、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
骨折又は骨欠損が癒合遷延又は非癒合骨折である、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
骨折又は骨欠損が、骨の完全性に影響を与える疾患に関連する、請求項１〜１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
骨の完全性に影響を与える疾患が、骨粗しょう症、骨形成不全症、糖尿病、骨のページェット病、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性骨髄腫、原発性骨癌、骨に転移する癌、広汎性特発性骨増殖症、骨髄炎、腎疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又は重症型サラセミアである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
治療的有効量のグレムリン−１活性の阻害剤を投与することを含む、骨折又は骨欠損の処置のための方法。
【請求項２２】
阻害剤が、抗グレムリン−１抗体又はその機能的活性断片、変異体若しくは誘導体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
機能的活性抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗体が、配列番号３、４、５及び６から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲ配列及び／又は配列番号７、８及び９から選択される少なくとも１つのＬＣＤＲ配列を含む、請求項２２〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
抗体が、配列番号１０の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び／又は配列番号１１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
抗体が、ＨＣＤＲ１に対する配列番号３又は４の配列、ＨＣＤＲ２に対する配列番号５の配列、ＨＣＤＲ３に対する配列番号６の配列、ＬＣＤＲ１に対する配列番号７の配列、ＬＣＤＲ２に対する配列番号８の配列、ＬＣＤＲ３に対する配列番号９の配列を含み；重鎖可変領域が、配列番号１０の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１１の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
抗体が、Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５から選択される少なくとも１つの残基を含むグレムリン−１上のエピトープに結合し、前記残基の付番が配列番号１に従う、請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
骨折又は骨欠損が癒合遷延又は非癒合骨折である、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
骨折又は骨欠損が、骨の完全性に影響を与える疾患に関連する、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
骨の完全性に影響を与える疾患が、骨粗しょう症、骨形成不全症、糖尿病、骨のページェット病、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性骨髄腫、原発性骨癌、骨に転移する癌、広汎性特発性骨増殖症、骨髄炎、腎疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又は重症型サラセミアである、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨折又は骨欠損の処置のための方法に関する。本発明は、部分的なギャップ欠損部（ｇａｐ  ｄｅｆｅｃｔ）における骨組織の治癒及び架橋を加速するための抗グレムリン−１抗体の有効な使用を開示し；グレムリン−１活性の阻害剤が、骨折非癒合を処置又は予防するための治療の改善をもたらし得ることを明らかにする。
【背景技術】
【０００２】
骨折は、骨組織における破損又は亀裂であり、転倒又は衝撃など、外傷の結果であり得るが、骨の完全性に影響を及ぼす疾患の結果としても起こり得る。
【０００３】
非安定化骨折は軟骨内骨化の過程を通じて治癒し、これは血餅又は血腫の形成を通じて開始される。これは、免疫細胞及び周囲の骨格幹細胞集団を調整する炎症反応を伴う。血腫はその後、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ；２００２）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ；２００９）及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ；２０１０）を含む様々な増殖因子の作用を通じて、石灰化軟骨性仮骨で置き換えられる。破骨細胞及び骨芽細胞の作用を通じて、石灰化仮骨は線維性骨に置き換わる。最後のリモデリング段階は、線維性骨が層板骨に置き換わることを含む。患者の年齢及び疾患状態によって、この過程の完了には何年もかかり得る。
【０００４】
骨折は一般に、副木、ギプス又はブレースなどの支持体の使用を介して、安定化を通じて臨床的に処置される。複雑骨折を含む極端なケースでは、外科的介入が必要とされ得、骨に直接取り付けられる創内及び創外固定器の使用を含む。これらの処置を使用しても、患者のおよそ１０％で組織修復過程が不十分であり（Ｅｉｎｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ；２０１４）、その結果、骨癒合遷延（骨折後６か月で癒合に至らない）又は非癒合という結果になる。非癒合は、３か月連続して骨折治癒所見が付随する放射線学的特徴を欠いており、９か月内で治癒が不完全であるものとして定義される（Ｂｕｚａ  ｅｔ  ａｌ；２０１６）。非癒合骨折及び重症骨欠損を修復するための現在の外科的技術は、利用可能な材料の量及び質の点で制限されることが多い。一般的に使用される処置は、自家又は同種間移植を含むが、これらには、それぞれドナー部位の病的状態（Ｇｏｕｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ；１９９７）及び感染症（Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ；２００５）のさらなるリスクがある。
【０００５】
骨欠損は、外傷又は疾患による骨の喪失である。
【０００６】
現在、骨折及び骨欠損の処置の改善に対する未だ対処されていない大きな医学的ニーズがある。従って、本発明の目的は、骨折又は骨欠損の処置のための新しい方法を提供することである。
【０００７】
本発明は、骨折又は骨欠損の処置での使用のためのグレムリン−１活性の阻害剤を提供する。本発明は、部分的なギャップ欠損部（ｇａｐ  ｄｅｆｅｃｔ）における骨組織の治癒及び架橋を加速するための抗グレムリン−１抗体の有効な使用を開示し；グレムリン−１活性の阻害剤が、骨折非癒合を処置又は予防するための治療の改善をもたらし得ることを明らかにする。
【発明の概要】
【０００８】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての科学及び技術用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で言及される刊行物は全て、参照により組み込まれる。
【０００９】
本明細書中に記載の実施形態のいずれも組み合わせ得ることが理解されよう。
【００１０】
本発明は、骨折又は骨欠損の処置での使用のためのグレムリン−１活性の阻害剤を提供する。本発明はまた、骨折又は骨欠損の処置のための医薬の製造のためのグレムリン−１活性の阻害剤の使用も提供する。本発明は、治療的有効量のグレムリン−１活性の阻害剤を投与することを含む、骨折又は骨欠損の処置のための方法をさらに提供する。
【００１１】
グレムリン−１（Ｄｒｍ及びＣＫＴＳＦ１Ｂ１としても知られる）は、（とりわけＣｅｒｂｅｒｕｓ及びＤａｎと共に）システインノット分泌タンパク質のＤＡＮファミリーの一部を形成する１８４アミノ酸の糖タンパク質である。グレムリンは、おそらくＶＥＧＦＲ２のアゴニズムを通じたものであろう血管新生促進の役割が明らかになっているのと同時に、ＢＭＰ−２、４及び７に結合し、それらのシグナル伝達能を阻害する。グレムリン−１の主な役割は発生中であり、腎臓形成中及び肢芽形成中に重要である。
【００１２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達は、軟骨内骨形成を制御することが知られており、グレムリン１（ＧＲＥＭ１）は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７へのその結合を通じたこの経路の天然のアンタゴニストの１つである（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ；１９９８）。骨芽細胞におけるＧＲＥＭ１の条件的欠失の結果、ＢＭＰシグナル伝達／活性の鋭敏化が起こり、インビボでの骨形成が促進され（Ｇａｚｚｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ；２００７）、一方で、同じ細胞型におけるコンディショナル過剰発現により、骨減少症及び自然骨折が引き起こされる（Ｇａｚｚｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ；２００５）。さらに、グローバルノックアウトはＢＬ６バックグラウンドで胚致死であるが、子の４９％はＣ５７ＢＬ／６／ＦＶＢの混合型の遺伝的背景で出生後２４時間よりも長く生存し、発生上の骨格欠損が大量に存在した一方で、骨形成速度の上昇が観察され得た（Ｃａｎａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ；２０１２）。このＧＲＥＭ１の発生上の機能にもかかわらず、このタンパク質の阻害のみが出生後の骨折修復を促進することを示唆するデータはない。実際には、軟骨内骨形成は胚発生期の骨格形成の主要な機序であるが、細胞動員を調節する機序は、出生後の骨折修復と比較した場合、異なる過程である（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ；１９９９）。炎症の役割は成人の骨修復における重要な因子として示されており、従って、骨格形成過程を制御する発生因子は、出生後の修復機序に対して単純に当てはめられ得ない。
【００１３】
本発明で使用される場合、グレムリン−１という用語は、典型的には、ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＯ６０５６５（配列番号１）で示されるような配列を有する。グレムリン−１という用語は、以下のグレムリン−１ポリペプチドも指し得る：
（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドを伴う又は伴わない配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、即ち配列番号２１で示されるような成熟ペプチド配列を含み得るか又はそれからなり得るもの；又は
（ｂ）（配列番号２１に示されるような）Ｎ末端シグナルペプチドを伴う又は伴わない配列番号１のアミノ酸配列に対して１つ以上のアミノ酸置換、修飾、欠失又は挿入を有する誘導体であり、配列番号２０のアミノ酸配列など、グレムリン−１の活性を保持するもの。
（ｃ）その変異体、このような変異体は、典型的には、配列番号１（又は配列番号２０又は２１）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の同一性を（又は約９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性さえも）保持する。言い換えれば、このような変異体は、配列番号１と約６０％〜約９９％の同一性、適切には配列番号１と約８０％〜約９９％の同一性、より適切には配列番号１と約９０％〜約９９％の同一性、最も適切には配列番号１と約９５％〜約９９％の同一性を保持し得る。変異体は以下でさらに記載する。
【００１４】
以下でさらに論じるように、残基番号は、典型的には、配列番号１の配列に基づいて引用される。しかし、残基の付番は、上で論じたように、当業者によって誘導体又は変異体配列に対して容易に当てはめられ得る。残基番号が引用される場合、本発明は、変異体又は誘導体配列上のこれらの残基も包含する。
【００１５】
発明者らは、ヒトグレムリン−１のみを、及びＡｂ７３２６と呼ばれる抗体と複合体化して結晶化した（Ｆａｂ断片）。グレムリン−１の結晶化により、ＢＭＰ結合部位における推定残基を決定することが可能となった。さらに、アロステリック阻害抗体であるＡｂ７３２６との結晶化により、抗体エピトープ中の残基を決定することが可能になった（国際公開第２０１８／１１５０１７Ａ２号パンフレット）。このエピトープに結合する抗体は、骨折又は骨欠損の処置における治療薬としての可能性を有する。
【００１６】
グレムリン１活性の阻害剤
本発明によるグレムリン−１活性の阻害剤は、グレムリン−１の活性を低下させるか又は遮断する薬剤である。本発明による阻害剤は、グレムリン−１活性を部分的又は完全に阻害し得る。本発明での使用の阻害剤としては、グレムリン−１に若しくはグレムリン−１をコードする核酸分子に結合可能であるか又はグレムリン−１の発現を阻害可能である阻害剤が挙げられるが限定されない。このような阻害剤は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）、炭水化物、脂質及び低分子であり得るが限定されない。
【００１７】
一実施形態では、グレムリン−１活性の阻害剤は、抗グレムリン−１抗体又はその機能的活性断片、変異体若しくは誘導体である。
【００１８】
本明細書中で言及される場合、「抗体」という用語は、抗体全体及び何らかの抗原結合断片（即ち「抗原結合部分」）又はその１本鎖を含む。抗体又は免疫グロブリンは、典型的には、ジスルフィド結合によって相互接続される少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲ又はＶＨと省略）及び重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲ又はＶＬと省略）及び軽鎖定常領域から構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する。
【００１９】
抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。
【００２０】
本発明での使用のための抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得、典型的にはモノクローナル抗体である。本発明での使用のための抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ナノボディ、ヒト若しくはヒト化抗体又はそのいずれかの抗原結合部分であり得る。
【００２１】
ポリクローナル抗体は、関心のある抗原での適切な動物の免疫付与など、通常の方法により作製し得る。その後、動物から血液を採取し得、免疫グロブリン分画を精製する。
【００２２】
グレムリン−１に対する抗体は、動物の免疫付与が必要である場合、周知の及び通常のプロトコールを使用して、動物、例えば非ヒト動物にそのポリペプチドを投与することによって得られ得、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ  ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６）を参照のこと。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ラクダ、ラマ又はブタなどの多くの温血動物に免疫付与し得る。しかし、ウサギ、マウス及びラットが一般的に最適である。
【００２３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）などの当技術分野で公知のいずれかの方法によって調製され得る。
【００２４】
本発明での使用のための抗体はまた、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３−７８４８ｌ；国際公開第９２／０２５５１号パンフレット；国際公開第２００４／０５１２６８号パンフレット及び同第２００４／１０６３７７号パンフレットに記載の方法により、特異的抗体の産生について選択される１個のリンパ球から作製された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによって、単リンパ球抗体法を使用して作製され得る。
【００２５】
本発明での使用のための抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して作製され得、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１−５０），Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７−１８６），Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２−９５８），Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ，１９９７  １８７  ９−１８），Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１−２８０）及び国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；同第９１／１０７３７号パンフレット；同第９２／０１０４７号パンフレット；同第９２／１８６１９号パンフレット；同第９３／１１２３６号パンフレット；同第９５／１５９８２号パンフレット；同第９５／２０４０１号パンフレット；及び米国特許第５，６９８，４２６号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，７５０，７５３号明細書；同第５，８２１，０４７号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，７５０，７５３号明細書；同第５，８２１，０４７号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，５１６，６３７号明細書；同第５，７８０，２２５号明細書；同第５，６５８，７２７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書及び同第５，９６９，１０８号明細書により開示されるものを含む。
【００２６】
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が全てヒト起源であるか、又はヒト起源の配列と実質的に同一であるが必ずしも同じ抗体に由来するわけではない抗体である。完全ヒト抗体の例としては、例えば欧州特許第０５４６０７３号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，７７０，４２９号明細書、欧州特許第０４３８４７４号明細書及び同第０４６３１５１号明細書中の一般用語に記載のように、例えば上記のファージディスプレイ法により産生される抗体及びマウス免疫グロブリン可変及び場合によっては定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物により置換されているマウスにより産生される抗体が挙げられ得る。
【００２７】
或いは、本発明による抗体は、非ヒト哺乳動物に対してグレムリン−１免疫原で免疫付与し；この哺乳動物からの抗体調製物を得て；グレムリン−１を認識するモノクローナル抗体をそこから生じさせることを含む方法によって作製し得る。
【００２８】
本発明での使用のための抗体分子は、完全長の重鎖及び軽鎖、又はその断片若しくは抗原結合部分を有する完全な抗体分子を含み得る。抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原に選択的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体及びその断片及び抗原結合部分は、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、２価、３価又は４価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であり得るが限定されない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３），２０９−２１７参照）。これらの抗体断片を作製及び製造するための方法は当技術分野で周知である（例えばＶｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１参照）。本発明での使用のための他の抗体断片としては、国際公開第２００５／００３１６９号パンフレット、同第２００５／００３１７０号パンフレット及び同第２００５／００３１７１号パンフレットに記載のＦａｂ及びＦａｂ’断片及び国際公開第２００９／０４０５６２号パンフレットに記載のＦａｂ−ｄＡｂ断片が挙げられる。多価抗体は、複数の特異性を含み得るか、又は単特異性であり得る（例えば国際公開第９２／２２８５３号パンフレット及び同第２００５／１１３６０５号パンフレットを参照）。これらの抗体断片は、当業者にとって公知の従来の技術を使用して得られ得、断片は、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングされ得る。
【００２９】
一例では、本発明での使用のための機能的活性抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖである。
【００３０】
本発明での使用のための抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであり得る。特に、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインが使用され得る。或いは、抗体エフェクター機能が必要とされない場合は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプが使用され得る。一例では、アイソタイプは、Ａｎｇａｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ  ３０（１），ｐ１０５−１０８，１９９３に記載のようなＩｇＧ４Ｐである。
【００３１】
本発明での使用のための抗体は、（ａ）関心のある免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニック又はトランスクロモソーマルである動物（例えばマウス）又はそこから調製されるハイブリドーマから単離される抗体、（ｂ）例えば遺伝子移入体から関心のある抗体を発現するように形質転換される宿主細胞から単離される抗体、（ｃ）組み換え、コンビナトリアル抗体ライブラリから単離される抗体及び（ｄ）他のＤＮＡ配列に対して免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む何らかの他の手段により調製、発現、作製又は単離される抗体など、組み換え手段により、調製、発現、作製又は単離され得る。
【００３２】
本発明での使用のための抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり得る。本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明での使用のためのヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。しかし、本明細書中で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことを意図しない。
【００３３】
このようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。このようなヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。
【００３４】
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロ免疫付与、続くエプスタインバーウイルスでのリンパ球の形質転換によって調製され得る。
【００３５】
「誘導体」という用語は、抗体の何らかの修飾形態、例えば、抗体及び別の薬剤又はエフェクター分子の複合物を指す。
【００３６】
エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明での使用のための抗体に連結され得る単一の部分を形成するように連結された２つ以上のそのような分子を含み得る。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが所望される場合、これは、抗体断片が直接又はカップリング剤を介するかのいずれかで、エフェクター分子に連結される標準的な化学的又は組み換えＤＮＡ手順により調製され得る。このようなエフェクター分子を抗体に複合化するための技術は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照）。特定の化学的手順としては、例えば国際公開第９３／０６２３１号パンフレット、同第９２／２２５８３号パンフレット、同第８９／００１９５号パンフレット、同第８９／０１４７６号パンフレット及び同第２００３／０３１５８１号パンフレットに記載されているものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えば、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット及び欧州特許第０３９２７４５号明細書に記載されるような組み換えＤＮＡ手順を使用して達成され得る。
【００３７】
エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を延長させ、及び／又は抗体の免疫原性を減少させ、及び／又は免疫系への上皮障壁を横切る抗体の送達を促進し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又は国際公開第２００５／１１７９８４号パンフレットに記載のものなどのアルブミン結合化合物が挙げられる。
【００３８】
「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された、ＣＤＲ移植抗体分子を指すものとする。さらなるフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内でなされ得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「ＣＤＲ移植抗体分子」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークに移植されるドナー抗体（例えばマウス又はラットのモノクローナル抗体）からの１つ以上のＣＤＲ（必要に応じて１つ以上の修飾ＣＤＲを含む）を含有する、抗体分子を指す。概説については、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照のこと。一実施形態では、ＣＤＲ全体が移されるのではなく、本明細書中で上述したＣＤＲのいずれか１つからの特異性決定残基の１つ以上のみがヒト抗体フレームワークに移される（例えばＫａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照）。一実施形態では、本明細書中で上述した１つ以上のＣＤＲからの特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移される。別の実施形態では、本明細書中で上述した各ＣＤＲからの特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移される。
【００４０】
ＣＤＲ又は特異性決定残基が移植される場合、マウス、霊長類及びヒトのフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、何らかの適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列が使用され得る。適切には、本発明での使用のためのＣＤＲ移植抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域並びに１つ以上のＣＤＲ又は上記の特異性決定残基を含む可変ドメインを有する。従って、一実施形態では、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、中和ＣＤＲ移植抗体が提供される。
【００４１】
本発明で使用され得るヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，上記）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に対して使用され得、ＲＥＩは軽鎖に対して使用され得、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方に対して使用され得る。或いは、ヒト生殖系列配列を使用し得；これらは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／（Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００５）３３（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １），Ｄ６７１−Ｄ６７４を参照）で利用可能である。
【００４２】
本発明での使用のためのＣＤＲ移植抗体では、アクセプター重鎖及び軽鎖は必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、必要に応じて異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。
【００４３】
また、本発明での使用のためのＣＤＲ移植抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体の場合と全く同じ配列である必要はない。例えば、稀な残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプについてより頻繁に発生する残基に変更し得る。或いは、アクセプターフレームワーク領域の選択残基は、それらがドナー抗体における同じ位置で見られる残基に対応するように変更され得る（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復させるのに必要な最小限のものに維持されるべきである。変更する必要があり得るアクセプターフレームワーク領域における残基を選択するためのプロトコールは、国際公開第９１／０９９６７号パンフレットに記載される。
【００４４】
抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることもまた当業者により理解されよう。これらの修飾のタイプ及び程度は、抗体を発現させるために使用される宿主細胞株並びに培養条件に依存することが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化における変化を含み得る。高頻度の修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用による、カルボキシ末端塩基性残基（リジン又はアルギニンなど）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４，１９９５に記載のとおり）。
【００４５】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダのいずれかのＣＬドメインを含む。
【００４６】
抗体又は断片などの生体分子は、酸性及び／又は塩基性の官能基を含有し、それにより分子に正又は負の正味電荷を与える。全体の「観察された」電荷の量は、実体の絶対アミノ酸配列、３Ｄ構造における荷電基の局所環境及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又は表面が正味電荷を帯びないｐＨである。一実施形態では、本開示による抗体又は断片は、少なくとも７の等電点（ｐＩ）を有する。一実施形態では、抗体又は断片は、８．５、８．６、８．７、８．８又は９など、少なくとも８の等電点を有する。一実施形態では、抗体のｐＩは８である。＊＊ＥｘＰＡＳＹ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ（Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５），５７１−６０７参照）などのプログラムを使用して、抗体又は断片の等電点を予測し得る。
【００４７】
本発明での使用のための抗体は、配列番号４〜６（それぞれＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３）の少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列を含み得る。これらは、Ｋａｂａｔ法を使用して決定されるように例のＡｂ７３２６抗体のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３配列である。
【００４８】
ＣＤＲ配列を決定するためのＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ法は、当技術分野（並びに他の技術）で周知である。ＣＤＲ配列は、何らかの適切な方法を使用して決定され得、本発明では、Ｋａｂａｔが通常使用されるが、一方で他の技術も同様に使用され得る。現在の例において、配列番号３は、Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｋａｂａｔ定義の組み合わせを使用して決定される場合のＡｂ７３２６  ＨＣＤＲ１配列を提示する。
【００４９】
本発明での使用のための抗体は、配列番号７〜９（それぞれＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３）の少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含み得る。これらは、Ｋａｂａｔ法を使用したＡｂ７３２６のＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列である。
【００５０】
一実施形態では、本抗体は、少なくとも配列番号６のＨＣＤＲ３配列を含む。
【００５１】
典型的には、本抗体は、配列番号４〜６から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列及び配列番号７〜９から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む。本抗体は、配列番号４〜６から選択される少なくとも２つの重鎖ＣＤＲ配列及び配列番号７〜９から選択される少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲ配列を含み得る。本抗体は、典型的には、配列番号４〜６の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列（それぞれＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３）及び配列番号７〜９の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列（それぞれＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３）を含む。本抗体は、キメラ、ヒト又はヒト化抗体であり得る。
【００５２】
本抗体は、配列番号１０又は１２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列（Ａｂ７３２６変異体１及び２のＨＣＶＲ）を含み得る。本抗体は、配列番号１１又は１３の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列（Ａｂ７３２６変異体１及び２のＬＣＶＲ）を含み得る。本抗体は、好ましくは、配列番号１０又は１２の重鎖可変領域配列及び配列番号１１又は１３の軽鎖可変領域配列（特に配列番号１０／１１又は１２／１３のＨＣＶＲ／ＬＶＣＲ対）を含む。
【００５３】
Ａｂ７３２６変異体１及び２は、重鎖可変領域中の１個のアミノ酸及び軽鎖可変領域中の１個のアミノ酸が次のように異なる：
・重鎖可変領域変異体１は、位置６にグルタミン酸（Ｅ）を有する（配列番号１０）
・重鎖可変領域変異体２は、位置６にグルタミン（Ｑ）を有する（配列番号１２）
・軽鎖可変領域変異体１は位置７にセリン（Ｓ）を有する（配列番号１１）
・軽鎖可変領域変異体２は位置７にスレオニン（Ｔ）を有する（配列番号１３）
【００５４】
従って、一実施形態では、本抗体は、配列番号１０の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列を含み、位置６のグルタミン酸残基がグルタミン残基（Ｅ６Ｑ）で置換され；ここで残基付番は配列番号１０に従う。
【００５５】
一実施形態では、本抗体は、配列番号１２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列を含み、位置６のグルタミン残基がグルタミン酸残基で置換され（Ｑ６Ｅ）；ここで、残基付番は配列番号１２に従う。
【００５６】
一実施形態では、本抗体は、配列番号１１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、位置７のセリン残基がスレオニン残基で置換され（Ｓ７Ｔ）；ここで、残基付番は配列番号１１に従う。
【００５７】
一実施形態では、本抗体は、配列番号１３の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、位置７のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ７Ｓ）；ここで、残基付番は配列番号１３に従う。
【００５８】
一実施形態では、本抗体は、ＨＣＤＲ１に対する配列番号３又は４の配列、ＨＣＤＲ２に対する配列番号５の配列、ＨＣＤＲ３に対する配列番号６の配列、ＬＣＤＲ１に対する配列番号７の配列、ＬＣＤＲ２に対する配列番号８の配列、及びＬＣＤＲ３に対する配列番号９の配列を含み；ここで重鎖可変領域は、配列番号１０の配列に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１１の配列に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列を含む。
【００５９】
一実施形態では、本抗体は、ＨＣＤＲ１に対する配列番号３又は４の配列、ＨＣＤＲ２に対する配列番号５の配列、ＨＣＤＲ３に対する配列番号６の配列、ＬＣＤＲ１に対する配列番号７の配列、ＬＣＤＲ２に対する配列番号８の配列、及びＬＣＤＲ３に対する配列番号９の配列を含み；ここで重鎖可変領域は、配列番号１２の配列に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３の配列に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列を含む。
【００６０】
本抗体は、
配列番号１４マウス全長ＩｇＧ１重鎖変異体１又は
配列番号２８マウス全長ＩｇＧ１重鎖変異体２又は
配列番号３０ヒト全長ＩｇＧ１重鎖変異体１又は
配列番号１６ヒト全長ＩｇＧ１重鎖変異体２又は
配列番号２２ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体１又は
配列番号３４ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体２、又は
配列番号１８  Ｆａｂ重鎖変異体１又は
配列番号３２  Ｆａｂ重鎖変異体２
の重鎖（Ｈ鎖）配列を含み得る。
【００６１】
本抗体は、
配列番号１５マウス全長ＩｇＧ１軽鎖変異体１又は
配列番号２９マウス全長ＩｇＧ１軽鎖変異体２又は
配列番号３１ヒト全長ＩｇＧ１軽鎖変異体１又は
配列番号１７ヒト完全長ＩｇＧ１軽鎖変異体２又は
配列番号２３ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ軽鎖変異体１又は
配列番号３５ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ軽鎖変異体２又は
配列番号１９  Ｆａｂ軽鎖変異体１又は
配列番号３３  Ｆａｂ軽鎖変異体２
の軽鎖（Ｌ鎖）配列を含み得る。
【００６２】
一例では、本抗体は、
配列番号１４／１５マウス全長ＩｇＧ１変異体１又は
配列番号２８／２９マウス全長ＩｇＧ１変異体２又は
配列番号３０／３１ヒト全長ＩｇＧ１変異体１又は
配列番号１６／１７ヒト全長ＩｇＧ１変異体２又は
配列番号２２／２３ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ変異体１又は
配列番号３４／３５ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ変異体２又は
配列番号１８／１９  Ｆａｂ軽鎖変異体１又は
配列番号３２／３３  Ｆａｂ軽鎖変異体２
の重鎖／軽鎖配列対を含む。
【００６３】
対応する配列の変異形は入れ替えられ得る。例えば、本抗体は、
配列番号１４／２９マウス全長ＩｇＧ１重鎖変異体１／軽鎖変異体２、又は
配列番号２８／１５マウス全長ＩｇＧ１重鎖変異体２／軽鎖変異体１、又は
配列番号３０／１７ヒト全長ＩｇＧ１重鎖変異体１／軽鎖変異型体２、又は
配列番号１６／３１ヒト全長ＩｇＧ１重鎖変異体２／軽鎖変異体１、又は
配列番号２２／３５ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体１／軽鎖変異体２、又は
配列番号３４／２３ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体２／軽鎖変異体１、又は
配列番号１８／３３Ｆａｂ重鎖変異体１／軽鎖変異体２、又は
配列番号３２／１９Ｆａｂ重鎖変異体２／軽鎖変異体１
の重鎖／軽鎖配列対を含み得る。
【００６４】
本抗体は、キメラ、ヒト又はヒト化抗体であり得る。
【００６５】
或いは、本抗体は、上に列挙した特定の配列の１つの変異体であり得るか、又はそれを含み得る。例えば、変異体は、上記のアミノ酸配列のいずれかの置換、欠失又は付加変異体であり得る。
【００６６】
変異抗体は、上記で論じた特定の配列からの、１、２、３、４、５個、最大１０個、最大２０個又はそれを超える（典型的には最大５０個まで）アミノ酸置換及び／又は欠失を含み得る。「欠失」変異体は、個々のアミノ酸の欠失、２、３、４又は５個のアミノ酸などのアミノ酸の小さな群の欠失、又は特定のアミノ酸ドメインの欠失などのより大きなアミノ酸領域の欠失又は他の特性を含み得る。「置換」変異体は、典型的には、１つ以上のアミノ酸を同じ数のアミノ酸で置換し、保存的アミノ酸置換をなすことを含む。例えば、アミノ酸は、同様の特性を有する代替アミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸又は別の脂肪族アミノ酸で置換され得る。適切な置換基を選択するために使用し得る２０種類の主要なアミノ酸のいくつかの特性は次のとおりである：
【００６７】
【表１】
2021513960.tif 000003
【００６８】
「誘導体」又は「変異体」は一般に、天然アミノ酸の代わりに、配列中に出現するアミノ酸がその構造類似体であるものを含む。配列で使用されるアミノ酸はまた、誘導体化又は修飾され得、例えば標識され得、これによって抗体の機能の提供に著しく悪影響が及ぼされることはない。
【００６９】
上記のような誘導体及び変異体は、抗体の合成中、又は作製後の修飾によって、又は抗体が、核酸の、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発又は酵素的切断及び／又はライゲーションの既知の技術を使用した組み換え形態である場合に、調製され得る。
【００７０】
変異抗体は、本明細書中で開示されるアミノ酸配列（特にＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列及びＨ−及びＬ−鎖配列）に対して、約６０％を超える、又は約７０％を超える、例えば７５又は８０％を超える、典型的には約８５％を超える、例えば約９０又は９５％を超えるアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。さらに、本抗体は、これらの配列に対して開示される正しいＣＤＲを保持しながら、本明細書中で開示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列及びＨ−及びＬ−鎖配列に対して、約６０％を超える、又は約７０％を超える、例えば７５又は８０％、典型的には約８５％を超える、例えば約９０又は９５％を超えるアミノ酸同一性を有する変異体であり得る。変異体は、（一部の状況では正確なＣＤＲを保持しながら）本明細書中で開示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列に対して、及びＨ−及びＬ−鎖配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を保持し得る。
【００７１】
変異体は、典型的には、約６０％〜約９９％の同一性、約８０％〜約９９％の同一性、約９０％〜約９９％の同一性又は約９５％〜約９９％の同一性を保持する。このレベルのアミノ酸同一性は、全長ポリペプチドのサイズに依存して、関連する配列番号の配列の全長にわたって、又は配列の一部にわたって、例えば、約２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００個又はそれを超えるアミノ酸にわたって見られ得る。
【００７２】
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」とは、以下のパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、上記）を使用して評価した場合に明記される値を有する配列を指す：
ペアワイズアライメントパラメータ−方法：ａｃｃｕｒａｔｅ、行列：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップ伸長ペナルティ：０．１０；
複数のアライメントパラメータ−行列：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、％アイデンティティー・フォー・ディレイ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｅｌａｙ）：３０、ペナライズ・エンド・ギャップ（ｐｅｎａｌｉｚｅ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ）：ｏｎ、ギャップ分離距離：０、負行列：ｎｏ、ギャップ伸長ペナルティ：０．２０、残基固有ギャップペナルティ：ｏｎ、親水性ギャップペナルティ：ｏｎ、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定の残基での配列同一性は、単純に誘導体化されている同一の残基を含むものとする。
【００７３】
従って、これらの鎖の機能又は活性を維持する特定の配列及び誘導体及び変異体を有する抗体が本発明での使用のために提供される。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「誘導体」は、反応性誘導体、例えばマレイミドなどのチオール選択的反応基を含むものとする。反応基は、直接又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結され得る。このような基の残基は、一部の例では、抗体断片とポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されよう。
【００７５】
ポリマーは、合成又は天然ポリマー、例えば場合によっては置換される直鎖又は分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー又は分岐若しくは非分岐多糖、例えばホモ若しくはヘテロ多糖であり得る。
【００７６】
合成ポリマー上に存在し得る特異的な任意の置換基は、１つ以上のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基を含む。
【００７７】
合成ポリマーの具体例としては、場合によっては置換される直鎖又は分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に場合によっては置換されるポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体などが挙げられる。
【００７８】
具体的な天然ポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体が挙げられる。
【００７９】
ポリマーのサイズは、必要に応じて変化させ得るが、一般的には５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａの平均分子量の範囲である。ポリマーのサイズは特に、例えば特定の組織に局在する能力又は循環半減期を延長する能力など、生成物の使用目的に基づいて選択され得る（概説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照）。従って、例えば、生成物が循環から出て組織に浸透することを目的とする場合、例えば、５０００Ｄａ前後の分子量を有する低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環中に残留する用途の場合、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、より高分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。
【００８０】
適切なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）又は、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体などのポリアルキレンポリマー及び特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するものが挙げられる。
【００８１】
一例では、本発明での使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に連結される。１つの特定の例では、本抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する何らかの利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば何らかの遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を通じて連結され得る。このようなアミノ酸は、抗体断片に天然に存在し得るか又は、組み換えＤＮＡ法を使用して断片へと改変され得る（例えば米国特許第５，２１９，９９６号明細書、同第５，６６７，４２５号明細書、国際公開第９８／２５９７１号パンフレット、国際公開第２００８／０３８０２４号パンフレットを参照）。一例において、抗体分子は、修飾されたＦａｂ断片であり、ここで、修飾は、エフェクター分子の連結を可能にするためのその重鎖のＣ末端への１つ以上のアミノ酸の付加である。適切には、さらなるアミノ酸は、エフェクター分子が連結され得る１つ以上のシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する。２つ以上のＰＥＧ分子を連結するために複数の部位を使用し得る。
【００８２】
抗体は、Ｈ鎖／Ｌ鎖、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲ配列に関して上記で定義したものに対して、グレムリン−１への結合に競合し得るか又はそれと同じエピトープに結合し得る。特に、抗体は、配列番号４／５／６／７／８／９のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列の組み合わせを含む抗体とグレムリン−１への結合に対して競合し得るか、又はそれと同じエピトープに結合し得る。抗体は、配列番号１０／１１若しくは１２／１３のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列対又は配列番号１４／１５若しくは１６／１７の全長鎖を含む抗体とグレムリン−１への結合に対して競合し得るか、又はそれらと同じエピトープに結合し得る。
【００８３】
「エピトープ」は、抗体により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的又は機能的なものと定義され得る。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、高次構造、即ち非直線性アミノ酸からも構成され得る。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面基である決定基を含み得、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特性及び／又は特異的な電荷特性を有し得る。
【００８４】
当技術分野で公知の通常の方法を使用することにより、抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか、又は参照抗体との結合に対して競合するか否かを容易に決定し得る。例えば、試験抗体が本発明での使用のための参照抗体と同じエピトープに結合するか否かを決定するために、参照抗体が飽和条件下でタンパク質又はペプチドに結合するようにする。次に、試験抗体がタンパク質又はペプチドに結合する能力を評価する。試験抗体が参照抗体との飽和結合後にタンパク質又はペプチドに結合することが可能である場合、試験抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付け得る。一方で、試験抗体が参照抗体との飽和結合後にタンパク質又はペプチドに結合可能ではない場合、試験抗体は、本発明の参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。
【００８５】
抗体が参照抗体との結合に対して競合するか否かを判定するために、上記の結合方法を２つの方向で行う。第１の方向では、参照抗体が飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合するようにして、その後、タンパク質／ペプチド分子への試験抗体の結合を評価する。第二の方向では、試験抗体が飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合するようにして、その後、タンパク質／ペプチドへの参照抗体の結合を評価する。両方の方向で、最初の（飽和）抗体のみがタンパク質／ペプチドに結合可能である場合、試験抗体及び参照抗体はタンパク質／ペプチドへの結合に対して競合すると結論付ける。当業者によって理解されるように、参照抗体との結合に対して競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合しない場合があり、重複又は隣接するエピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【００８６】
２つの抗体は、それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じ又は重複するエピトープに結合する。即ち、１、５、１０、２０、又は１００倍過剰の一方の抗体が、競合結合アッセイで測定する場合、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、７５％、９０％又はさらには９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照）。或いは、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸突然変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少させるか又は排除するいくつかのアミノ酸突然変異が他方の抗体の結合を減少させるか又は排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【００８７】
次いで、さらなる通常の実験（例えばペプチド突然変異及び結合分析）を実行して、観察された試験抗体の結合欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものか否か、又は立体遮断（又は別の現象）が観察される結合欠如の原因であるか否かを確認し得る。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用可能な何らかの他の定量的又は定性的な抗体結合アッセイを使用して実施し得る。
【００８８】
例の抗グレムリン−１抗体Ａｂ７３２６は、グレムリン−１の以下の残基に結合することが分かっている：Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５；ここで、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５は１つのグレムリン１単量体上に存在し、Ｉｌｅ１３１は第２のグレムリン１単量体上に存在する。付番は、配列番号１のＵｎｉＰｒｏｔエントリーＯ６０５６５に基づく。例のセクションで論じるように、これらのエピトープ残基は、グレムリン−１−Ａｂ７３２６  Ｆａｂ複合体から４ÅでＮＣＯＮＴ分析を使用して同定された。
【００８９】
従って、本発明での使用のための抗体は、Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５（配列番号１に基づき残基に付番）から選択される少なくとも１個の残基を含むエピトープに結合し得る。本発明での使用のための抗体は、これらの残基の２、３、４、５、６、７、８又は９個全て（好ましくは少なくとも５個の残基）を含むエピトープに結合し得る。
【００９０】
本発明における使用のための抗体はまた、Ｉｌｅ１３１が他の残基に対して異なるグレムリン−１単量体上に存在するエピトープも認識し得る。
【００９１】
これらの残基は、ヒトグレムリン−１の特定の配列に対して提供されるが、当業者は、通常の技術を使用して、これらの残基の位置を他の対応するグレムリン配列に当てはめ得る。従って、これらの他のグレムリン配列内の対応する残基を含むエピトープに結合する抗体も、本発明での使用のために提供される。
【００９２】
特定のエピトープに結合する抗体に対してスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載のような通常のクロスブロッキングアッセイを行い得る。他の方法としては、アラニンスキャニング突然変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）又はペプチド切断分析が挙げられる。さらに、エピトープ切り出し、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾などの方法を使用し得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。このような方法は、当技術分野で周知である。
【００９３】
抗体エピトープはまた、Ｘ線結晶解析によっても決定され得る。従って、本発明での使用のための抗体は、グレムリン−１に結合する抗体のＸ線結晶解析を通じて評価し得る。エピトープは、特に、抗体パラトープ残基の４Å以内のグレムリン−１上の残基を決定することにより、このように同定され得る。
【００９４】
例えば、標準的なＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングにより、グレムリン−１への結合について抗体を試験し得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、標的タンパク質との陽性反応を示すハイブリドーマについてスクリーニングするためにも使用し得る。抗体の結合選択性はまた、例えばフローサイトメトリーにより、標的タンパク質を発現する細胞への抗体の結合を監視することによっても決定され得る。従って、スクリーニング法は、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットを実施することによって、又はフローサイトメトリーによって、グレムリン−１に結合可能である抗体を同定する段階を含み得る。
【００９５】
抗体はグレムリン−１を選択的（又は特異的）に認識し得る。抗体又は他の化合物は、それが選択的であるタンパク質に優先的に又は高い親和性で結合するが、他のタンパク質に対して実質的に結合しないか又は低親和性で結合する場合、タンパク質を「選択的に結合」又は「選択的に認識する」。抗体の選択性は、上記のように抗体が他の関連タンパク質に結合するか否か、又はそれらを区別するか否かを判定することによってさらに試験し得る。本発明での使用のための抗体は、典型的にはヒトグレムリン−１を認識する。
【００９６】
抗体は、関連タンパク質に対して、又はヒトグレムリン１に対する、及び他の種由来のグレムリン１に対する交差反応性も有し得る。
【００９７】
特異的（又は選択的）であることにより、本抗体は何らかの他の分子との顕著な交差反応性なく関心のあるタンパク質に結合することが理解されよう。交差反応性は、本明細書中に記載の何らかの適切な方法によって評価され得る。抗体が、関心のあるタンパク質と結合する場合の強度の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％の強度で他の分子に結合する場合、抗体の交差反応性が顕著であると見なされ得る。特異的（又は選択的）である抗体は、関心のあるタンパク質に結合する強度の約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満の強度で別の分子に結合し得る。本抗体は、それが関心のあるタンパク質に結合する強度の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満又は約５％未満、約２％未満又は約１％未満の強度で他の分子に結合し得る。
【００９８】
従って、本発明での使用に適した抗体は、（ヒト）グレムリン−１に対して高い親和性結合を有し得る。本抗体は、＜１ｎＭ未満、好ましくは＜５００ｐＭの解離定数（ＫＤ）を有し得る。一例では、本抗体は、２００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。一例では、本抗体は、１００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。当業者にとって周知であるように、表面プラズモン共鳴アッセイ、飽和アッセイ又はＥＬＩＳＡ若しくはＲＩＡなどのイムノアッセイなど、様々な方法を使用して、その標的抗原に対する抗体の結合親和性を判定し得る。結合親和性を決定するための例示的な方法は、Ｋｒｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ；４４（５）：９１６−２５．（Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｙ  １１））に記載のように、ＣＭ５センサーチップを使用してＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での表面プラズモン共鳴分析による。
【００９９】
例の抗グレムリン−１抗体、Ａｂ７３２６は、ＢＭＰ結合部位から遠位のエピトープに結合するグレムリン−１活性のアロステリック阻害剤である。（国際公開第２０１８／１１５０１７  Ａ２号パンフレット）Ａｂ７３２６はグレムリン−１に非常に高い親和性で結合し、Ｋｄ値＜１００ｐＭであり、本発明での使用に特に有用であると予想される。
【０１００】
グレムリン−１活性の阻害剤は、グレムリン−１の機能のいずれかに影響を与え得るが、通常、ＢＭＰ（ＢＭＰ２、４及び／又は７）へのグレムリン−１の結合を低下させる。グレムリン−１はＢＭＰの負の調節因子であり、結合が低下するとＢＭＰを通じたシグナル伝達が増加する。
【０１０１】
ＢＭＰの結合及びシグナル伝達は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって検出され得る。本願の例は、薬剤がグレムリン−１のＢＭＰへの結合を減少させるか否かを試験するための２つの機能アッセイを記載する。例３は、Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイを記載し、ここで、Ｉｄ１遺伝子は、ＢＭＰシグナル伝達の標的遺伝子である。このアッセイにおけるシグナルの増加は、薬剤がＢＭＰへのグレムリン−１の結合を減少させるか否かを判定するために使用され得る。例５は、ＳＭＡＤリン酸化アッセイを記載する。ＳＭＡＤ１、５及び８は、ＢＭＰシグナル伝達時にリン酸化される。従って、ＳＭＡＤリン酸化の増加を使用して、薬剤がグレムリン−１のＢＭＰへの結合を低下させるか否かを判定し得る。
【０１０２】
適切な抗体を同定及び選択したら、抗体のアミノ酸配列を当技術分野で公知の方法によって同定し得る。縮重プライマーを使用して、抗体をコードする遺伝子をクローニングし得る。抗体は、通常の方法により組み換え産生され得る。
【０１０３】
Ａｂ７３２６の完全長重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列の例を配列リストで提供する：
・配列番号２４（ヒトＩｇＧ１重鎖ＤＮＡ変異体１）
・配列番号２５（ヒトＩｇＧ１軽鎖ＤＮＡ変異体１）
・配列番号２６（ヒトＩｇＧ４Ｐ重鎖ＤＮＡ変異体１）
・配列番号２７（ヒトＩｇＧ４Ｐ軽鎖ＤＮＡ変異体１）
【０１０４】
医薬組成物、投与量及び投与計画
本発明での使用のためのグレムリン−１活性の阻害剤は、医薬組成物中で提供され得る。本医薬組成物は通常は無菌であり、典型的には薬学的に許容可能な担体及び／又はアジュバントを含む。本発明での使用のための医薬組成物は、薬学的に許容可能なアジュバント及び／又は担体をさらに含み得る。
【０１０５】
本発明での使用のための医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩を含み得る。「薬学的に許容可能な塩」は、親分子の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。このような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。担体は、非経口、例えば静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路、例えば注射又は点滴による投与経路に適切であり得る。或いは、担体は、局所、表皮又は粘膜投与経路などの非経口以外の投与に適切であり得る。担体は経口投与に適切であり得る。投与経路に応じて、阻害剤は、阻害剤を不活性化し得る酸及び他の自然条件の作用からそれを保護するための材料でコーティングされ得る。
【０１０７】
薬学的に許容可能な担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明での使用のための医薬組成物において使用され得る適切な水性担体の例としては、水、緩衝化した水及び生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、又は塩化ナトリウムを組成物中に含めることが望ましい。
【０１０８】
医薬組成物は通常、製造及び保管の条件下で無菌であり、安定でなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム又は高薬物濃度に適した他の秩序構造として処方され得る。
【０１０９】
本発明での使用のための医薬組成物は、さらなる活性成分を含み得る。
【０１１０】
グレムリン−１活性の阻害剤及び本発明による処置の方法での使用のための説明書を含むキットも想定される。
【０１１１】
本発明での使用のための薬剤又はその製剤若しくは組成物は、治療的及び／又は予防的処置のために投与し得る。
【０１１２】
治療用途において、障害又は状態に既に罹患している対象に、状態又はその症状の１つ以上を治癒させるか、緩和するか又は部分的に阻止するのに十分な量で薬剤を投与する。このような治療的処置の結果、症状の重症度が軽減され得るか、又は無症状期間の頻度が増加し得るか又は無症状期間の持続時間が延長され得る。これを達成するのに十分な量は、「治療的有効量」として定義される。
【０１１３】
予防用途において、障害又は状態のリスクがある対象に、状態又はその症状の１つ以上の続く影響を防ぐか又は軽減するのに十分な量で薬剤を投与する。これを達成するのに十分な量は、「予防的に有効な量」として定義される。各目的に対する有効量は、疾患又は損傷の重症度並びに対象の体重及び全身状態に依存する。
【０１１４】
投与のための対象は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。ヒトへの投与は典型的である。
【０１１５】
本発明での使用のための薬剤又は医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法の１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与され得る。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変動する。本発明での使用のための薬剤又は医薬組成物のための投与経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下又は脊髄投与経路、例えば注射又は点滴によるものなどの非経口経路が挙げられる。或いは、局所、表皮又は粘膜投与経路などの非経口ではない経路を介して薬剤又は医薬組成物を投与し得る。薬剤又は医薬組成物は経口投与用であり得る。
【０１１６】
本発明での使用のための阻害剤又は医薬組成物の適切な投与量は、熟練した医師によって決定され得る。本発明での使用のための医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性なく、特定の患者、組成物及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るように変動させ得る。選択される投与量レベルは、使用される特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の持続時間、年齢、性別、体重、状態、全般的健康状態及び処置されている患者の以前の病歴及び医療分野で周知の同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存する。
【０１１７】
適切な用量は、例えば、処置しようとする患者の体重について、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。例えば、適切な投与量は、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。
【０１１８】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回用量を投与し得るか、いくつかの分割用量を経時的に投与し得るか、又は用量は、治療状況によって示されるように比例的に減少又は増加させ得る。本明細書中で使用される場合の単位剤形は、処置しようとする対象に対して単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体を伴って所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性物質を含有する。
【０１１９】
投与は単回投与又は複数回投与であり得る。同じ又は異なる経路を介して、及び同じ又は異なる場所に、複数回の用量を投与し得る。或いは、用量は徐放性製剤を介し得、その場合、必要とされる投与頻度はより少ない。投与量及び頻度は、患者における阻害剤の半減期及び所望の処置の持続時間に応じて変動し得る。
【０１２０】
本発明での使用のための薬剤、製剤又は医薬組成物は１つ以上の他の治療剤と同時投与され得る。２つ以上の薬剤の併用投与は、多くの異なる方法で達成され得る。両方を単一の組成物で一緒に投与し得るか、又はそれらを併用療法の一部として別個の組成物中で投与し得る。例えば、一方を他方の前、後又はそれと同時に投与し得る。
【０１２１】
治療適応
本発明によるグレムリン−１活性の阻害剤は、骨折又は骨欠損の処置のために提供される。骨折は、骨組織における破損又は亀裂であり、転倒又は衝撃など、外傷の結果であり得るが、骨の完全性に影響を及ぼす疾患の結果としても起こり得る。骨欠損は、外傷又は疾患による骨の喪失である。
【０１２２】
骨折は、身体のあらゆる骨の骨折であり得る。
【０１２３】
骨欠損は、身体のあらゆる骨の骨欠損であり得る。
【０１２４】
一実施形態では、骨折は、癒合遷延性又は非癒合骨折である。癒合遷延骨折は、骨折後６か月以内に癒合に到達しない骨折として定義される。非癒合骨折は、３か月連続で骨折治癒に付随する放射線学的特徴の欠如が認められることと合わせて、９か月以内に完全に治癒していないものとして定義される（Ｅｉｎｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ；２０１４；Ｂｕｚａ  ｅｔ  ａｌ；２０１６）。癒合遷延又は非癒合発生を起こし易い骨折の例としては、脛骨、橈骨遠位端、大腿骨頸部及び舟状骨が挙げられる。
【０１２５】
一実施形態では、骨折又は骨欠損は、骨の完全性に影響を与える疾患の結果として発生する。骨の完全性に影響を与える疾患の例としては、骨粗しょう症、骨形成不全症、糖尿病、骨のページェット病、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性骨髄腫、原発性骨癌（例えば骨肉腫、ユーイング肉腫及び軟骨肉腫）、骨に転移する癌（例えば乳癌、前立腺癌及び肺癌）、広汎性特発性骨増殖症、骨髄炎、腎疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び重症型サラセミアが挙げられるが限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、ＨＥＫ−ＩＤ１レポーター遺伝子アッセイにおける免疫付与由来抗体に対するシグナルの回復パーセンテージを示す。
【図２】図２は、ＨＥＫ−ＩＤ１レポーター遺伝子アッセイにおけるライブラリ由来抗体に対するシグナルの回復パーセンテージを示す。
【図３】図３は、ヒトグレムリン（図３Ａ）及びマウスグレムリン（図３Ｂ）の滴定によるＨＥＫ−ＩＤ１レポーター遺伝子アッセイに対する結果及び、ＢＭＰのシグナル伝達の回復における抗体７３２６（抗体ＰＢ３７６として示す）の効果を示す。
【図４】図４は、可能なＢＭＰ結合領域及びＦａｂエピトープが強調表示された、グレムリン−Ｆａｂ複合体の構造モデルを示す。
【図５】図５は、取得したＸ線画像における、骨折修復中の仮骨／骨組織を欠く領域の検査を示す。デフィニエンス（ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ）画像解析を使用して、組織を欠く欠損内の領域を定量化し、その後、対照群と抗グレムリン１処置群とを比較した。結果はラット１０匹／群の平均±ＳＤとして示す。マンホイットニーＵ検定により測定した場合、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６】図６は、３ｍｍの大腿骨欠損内のＬＭＢ（低ミネラル骨；新たに形成された骨）及びＨＭＢ（高ミネラル骨；成熟骨）の検査を示す。パネルＡ：新たに形成された骨又は成熟骨を検出するための大腿骨欠損領域の３ＤμＣｔ分析。骨量／組織量のパーセンテージを測定し、対照と抗グレムリン１処置との間で全対象（合計）を比較した。低レスポンダー（ＬＲ不完全架橋）及び高レスポンダー（ＨＲ完全架橋）として分けられた動物における対照群と抗グレムリン１処理群との間の比較も行った。結果は平均±ＳＤとして示す。マンホイットニーＵ検定により測定した場合、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。パネルＢ：対照及び抗グレムリン１処理後のＬＲ及びＨＲ群の３Ｄ骨量レンダリングを示す代表的なμＣｔ。
【図７】図７は、大腿骨欠損の組織形態計測分析を示す。骨量／組織量のパーセンテージ（ＢＶ／ＴＶ（％））、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）及び骨梁間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）を、対照群と抗グレムリン１処理群との間で比較した。結果はラット１０匹／群の平均±ＳＤとして示す。マンホイットニーＵ検定により測定した場合、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８】図８は、総ＢＶ／ＴＶ％の３ＤμＣＴ分析及び２Ｄ組織形態計測分析の相関関係を示す。ＬＭＢ（低ミネラル骨；新たに形成された骨）及びＨＭＢ（高ミネラル骨；成熟骨）の両群において、３ｍｍの大腿骨欠損内で相関を行い、２Ｄ組織形態計測スコアデータと比較した（ｎ＝２０）。ピアソンのスコアは、３ＤμＣＴ分析と２Ｄ組織形態計測分析との間のＢＶ／ＴＶ％の有意な相関を示す。
【０１２７】
以下の例は、本発明を例示する。
【０１２８】
例
例１−タンパク質の発現、精製、再折り畳み及び構造決定
タンパク質発現及び封入体の調製
ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを使用してＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現に最適化された切断型ヒトグレムリン−１コード配列（配列番号２０）を改変ｐＥＴ３２ａベクター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にクローニングし、Ｎ末端６Ｈｉｓ−ＴＥＶタグ付きのグレムリン配列（ｐＥＴ−ｈグレムリン１）をコードするベクターを作製した。
【０１２９】
発現される配列：
2021513960.tif 000004
；配列番号２（６Ｈｉｓ−ＴＥＶタグの非グレムリン残基をイタリック体で示す）。ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｏ６０５６５及び配列番号１に基づく配列付番。
【０１３０】
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換するために、ｐＥＴ−ｈグレムリン１プラスミドＤＮＡを使用した。１個のアンピシリン耐性コロニーをＬＢ／Ａｍｐ寒天プレートから拾い、ＬＢ／Ａｍｐの１００ｍＬスターター培養に接種するために使用した。３７℃で１６時間振盪（２００ｒｐｍ）した後、２５ｍＬのスターター培養物を使用して５００ｍＬの２ｘＴＹ／Ａｍｐ培地に接種した。ＯＤ６００が３に達するまで、培養物を３７℃で振盪（２５０ｒｐｍ）した。続いて、培養液に２０ｍＬのＭＯＰＳ＋グリセロール供給混合物（１Ｍ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．４、４０％グリセロール、０．５％ＭｇＳＯ４、０．４２％ＭｇＣｌ２）を補充し、３００μＭ  ＩＰＴＧで誘導し、１７℃、１８０ｒｐｍで１６時間、さらに温置した。細胞を遠心分離で回収した（４℃にて４，０００ｇ、２０分間）。
【０１３１】
細胞ペレットを溶解緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．３５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ及び３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で４℃にて再懸濁し、３，５００ｇ、４℃で３０分間の遠心分離により不溶性分画を回収した。ペレット化した封入体を洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．０）中で再懸濁することにより３回洗浄し、その後、２１，０００ｇで１５分間遠心分離した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不含の洗浄緩衝液を使用して、さらに２回洗浄した。
【０１３２】
可溶化
封入体を変性緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｓ４Ｏ６及び１００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ３、ｐＨ８．５）中で再懸濁し、室温で１６時間撹拌し、２１，０００ｇで１５分間遠心分離することにより清澄化した。
【０１３３】
再折り畳み前の精製
可溶化した封入体を８Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＭＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ２６／６０カラム（１２０ｍＬ）に載せた。グレムリン−１タンパク質を含有する分画を６Ｍ尿素、２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０で希釈し、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ陽イオン交換カラムに載せ、１０カラム体積（１０ＣＶ）にわたり１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶出した。精製変性ｈグレムリン−１タンパク質を含有する分画をプールした。
【０１３４】
再折り畳み
変性させ精製したグレムリン１タンパク質を再折り畳み緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＧＳＨ及び５ｍＭ  ＧＳＳＧ、０．５ｍＭシステイン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍアルギニン）に０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるまで滴下して添加し、５日間にわたり一定の撹拌を行いながら４℃で温置した。５日後、グレムリン−１タンパク質を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。
【０１３５】
透析後、タンパク質をヘパリンＨｉＴｒａｐカラムに載せ、２０ＣＶにわたり０〜１００％ヘパリン溶出緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）の勾配を使用して溶出した。正しく折り畳まれたタンパク質を１Ｍ  ＮａＣｌで溶出し、一方で誤って折り畳まれたタンパク質はより低い塩濃度で溶出した。
【０１３６】
１Ｍ  ＮａＣｌで溶出したタンパク質を濃縮し、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＳ７５  ２６／６０カラム上でさらに精製した。
【０１３７】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ゲルでシフト）によってタンパク質の特徴を調べ、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用して、予想される分子量及びジスルフィド結合の正しい配置があり、細胞アッセイ（ＩＤ１レポーターアッセイ）で活性であることが示された。
【０１３８】
グレムリン１構造決定
６．６ｍｇ／ｍＬのグレムリン１溶液及びｐＨ４．１の０．１Ｍクエン酸、１Ｍ塩化リチウム及び２７％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を１：１の比で混合することにより、ハンギングドロップ法を使用して、グレムリン１タンパク質結晶を成長させた。データ収集前に、結晶化緩衝液に２０％グリセロールを添加することによって結晶を凍結保護した。回折データはダイヤモンド光源で収集し、ＸＤＳを使用して処理した（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  ６６，１２５−１３２）。回折データの統計を以下の表でまとめる：
【０１３９】
【表２】
2021513960.tif 000005
【０１４０】
グレムリン１の構造は、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔ（２００７），４０，６５８−６７４）を使用した分子置換及び独自のグレムリン１／Ｆａｂ複素座標から入手可能なグレムリン１モデルによって解析した。得られたグレムリン−１のモデルは、２つの二量体として構成された４コピーのグレムリン１単量体を含有した。Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６（４），４８６−５０１）を使用してモデル補正を行い、Ｒｅｆｍａｃ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ  ＲＥＦＭＡＣ５  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．２０１１；６７（Ｐｔ４）：３５５−３６７）を使用して座標を精密化した。最終的な座標は、Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ６６：１２−２１）で検証した。モデル精密化統計のまとめを上の表２で示す。
【０１４１】
例２−グレムリン−１におけるＢＭＰ結合残基
上記で議論したように、グレムリン−１は、ＤＡＮファミリーとして知られるサブグループ内の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストタンパク質ファミリーに属する。ＤＡＮファミリー内で、グレムリン−１はグレムリン−２（ＰＲＤＣ）と最大の相同性を共有する。
【０１４２】
例１で分解した２．７Åヒトグレムリン−１構造は、公開されるマウスグレムリン−２構造と共通する多くの特性を共有する（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７−１４２９）。全体的な折り畳みは非常によく似ており、グレムリン１の２コピーが逆平行の非共有結合二量体を形成し、アーチ状に配置される。各単量体は、指の反対側の手首の端に向かってシスチン−ノットモチーフを備えた特徴的な指−手首−指の配置を採用する。タンパク質間の配列同一性は、２つの構造で見える配列内で５２％から６７％に上昇する。最も高度に保存される領域は、主要な接触残基が全て１００％保存されている広範な二量体の境界面にある。
【０１４３】
マウスグレムリン−２（ＰＲＤＣ）及びＤＡＮ（ＮＢＬ１）へのＢＭＰの２、４、７結合に関与する残基は、突然変異誘発を使用して識別された（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７−１４２９及びＮｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，４７５９−４７７１）。予測されるＢＭＰ結合エピトープは、二量体の凸面上の両方の単量体にまたがる疎水性パッチを包含する。突然変異誘発により６個の残基；Ｔｒｐ７２、Ｐｈｅ９６、Ｔｙｒ９８、Ｐｈｅ１０４、Ｔｙｒ１０５及びＰｈｅ１１７が同定され、これらはヒトグレムリン−１（マウスグレムリン−２配列に基づき付番）において１００％保存される。相同性の程度は、両方のタンパク質で同一の高次構造を採用する側鎖の配置にまで及ぶ。
【０１４４】
グレムリンＰＤＢファイルで使用されるアミノ酸付番は、構造アライメントに基づいて、公開されるマウスのグレムリン−２構造の付番と一致する。これにより、構造を説明する際、アミノ酸の同種比較が可能になる。しかし、明確にするために、ＢＭＰ結合で役割を果たすと識別された重要な残基を、配列番号１のＰＤＢファイル及びＵｎｉＰｒｏｔファイルに基づく付番とともに括弧付きで以下に示す：
Ｔｒｐ７２（９３）、Ｐｈｅ９６（１１７）、Ｔｙｒ９８（１１９）、Ｐｈｅ１０４（１２５）、Ｔｙｒ１０５（１２６）及びＰｈｅ１１７（１３８）。
【０１４５】
マウスグレムリン−２及びヒトグレムリン−１の両方において、疎水性ＢＭＰ結合エピトープは、各タンパク質のＮ末端残基によって形成されるアルファヘリックスによって部分的に埋め込まれる。ＢＭＰ結合のモデルが提案されており、それによりＮ末端が屈曲し得、完全なＢＭＰ結合界面が露出される（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７−１４２９）。本分析において、表面をレンダリングして各タンパク質上のＢＭＰ結合面の類似性を明らかにする前に、ヒトグレムリン−１及びマウスグレムリン−２構造からＮ末端残基を除去した。
【０１４６】
文献では、ＢＭＰ結合に影響がある６個のリサイズ（ｒｅｓｉｄｅｓ）の突然変異誘発についてのみ説明する。実際のＢＭＰエピトープが、隣接するアミノ酸を包含するより大きな表面積をカバーする可能性がある。グレムリン−１の表面上で、突然変異が起こったものの６Å以内の全ての残基を強調することにより、治療薬により標的とされる可能性があり得るグレムリン−１のより大きな領域が明らかになる。この、より広範な領域には、ヒトグレムリン−１の以下のアミノ酸が包含される：
Ａｓｐ９２−Ｌｅｕ９９
Ａｒｇ１１６−Ｈｉｓ１３０
Ｓｅｒ１３７−Ｓｅｒ１４２
Ｃｙｓ１７６−Ｃｙｓ１７８
（配列番号１に基づく付番）
【０１４７】
公開された情報をヒトグレムリン−１の結晶構造情報と組み合わせることにより、ＢＭＰとの相互作用を遮断する治療的介入のための可能性のある経路としてそれ自身を提供するヒトグレムリン−１の領域が特定された。
【０１４８】
例３−Ｈｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイ
背景
Ｈｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイは、クローン１２  Ｈｅｋ２９３−Ｉｄ１レポーター細胞を使用する。この細胞株に対してＩｄ１転写因子で安定的に遺伝子移入を行った。Ｉｄ１は、ＢＭＰシグナル伝達経路における転写因子である。グレムリンはＢＭＰに結合して、その受容体への結合を妨げ、レポーター遺伝子からのルシフェラーゼシグナルを減少させることが知られている。従って、このレポーターアッセイを使用して、抗グレムリン抗体をスクリーニングし、グレムリンとＢＭＰとの相互作用を遮断するものが存在するか否かを確認することが可能である。この相互作用の遮断がある場合、これらの細胞においてルシフェラーゼシグナルの回復が見られる。
【０１４９】
方法
クローン１２細胞は、１０％ＦＣＳ、１ｘＬ−グルタミン及び１ｘＮＥＡＡを含有するＤＭＥＭ中で培養した。細胞がＩｄ１遺伝子発現を失わないことを確実にするために、ハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍＬ）の存在下でも細胞を増殖させた。細胞は、０．５％ＦＣＳ、１ｘＬ−グルタミン及び１ｘＮＥＡＡを含有するＤＭＥＭ中でアッセイした。ハイグロマイシンＢは、細胞をアッセイしている短時間では不要である。
【０１５０】
細胞をＰＢＳ中で洗浄し、細胞解離緩衝液を使用して持ち上げ、スピンし、カウントし、その後、７０μＬ中５ｘ１０４個／ウェルで播種した（密度７．１４ｘ１０５／ｍＬ）。使用したプレートは、白色の不透明なポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６ウェル滅菌済みプレートであった。沈下させるために細胞を約３〜４時間インキュベーターに入れる。ＢＭＰヘテロ二量体は、４ｍＭ  ＨＣｌ中２００μｇ／ｍＬになるように再構成した。ガラスバイアルを使用してＢＭＰをアッセイ培地で１０μｇ／ｍＬに希釈し、新しい作業用ストックを得た。
【０１５１】
ポリプロピレンプレートにおいて、最大最終用量が１μｇ／ｍＬの８ポイントの用量反応曲線のために、グレムリン−１を１：２希釈した。
【０１５２】
ウェルあたり２０μＬのさらなる体積の培地を添加し、プレートを３７℃で４５分間温置した。
【０１５３】
細胞のみを含有するウェルを除く全ウェルに１００ｘで調製したＢＭＰを添加した。全ウェルをアッセイ培地で最大６０μＬにして、３７℃でさらに４５分間温置する。
【０１５４】
温置後、３０μＬの試料をアッセイプレートのウェルごとに移し、発光シグナルを測定する前に２０〜２４時間温置した。
【０１５５】
Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏを予め室温で解凍した。試薬を添加する前に、アッセイプレートを約１０〜１５分間室温に冷却した。室温にて振盪機上で２０分間、ｃｅｌｌ  ｓｔｅａｄｙ  ｇｌｏ試薬（１００μＬ）を添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ２上でｃｅｌｌ  ｔｉｔｒｅ  ｇｌｏプロトコールを使用して発光を測定することにより、ルシフェラーゼシグナルを検出した。
【０１５６】
最大信号はＢＭＰを含有するウェルから生じ、最小信号は細胞のみを含有するウェルから生じた。
【０１５７】
結果
ＢＭＰ４／７に対するブロッキング活性を確認するために、グレムリン１の全長及び切断型をＨｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイで試験した。
【０１５８】
用量反応アッセイからの阻害のパーセンテージは、アッセイにおける最大及び最小シグナルに基づいて計算し、４パラメータのロジスティカルフィット（ｌｏｇｉｓｔｉｃａｌ  ｆｉｔ）を使用してデータをフィットさせた。曲線の屈曲点に基づいてＩＣ５０を計算した。
【０１５９】
【表３】
2021513960.tif 000006
【０１６０】
結論
グレムリン１は、Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいてＢＭＰ  ４／７シグナル伝達を阻害可能であった。
【０１６１】
例４−抗グレムリン１抗体の産生
例１に記載のように精製グレムリン−１を使用する免疫付与により、及びライブラリパニングにより、抗グレムリン−１抗体を得た。ライブラリは、献血から増幅されたＶ領域を有するナイーブヒトライブラリとして社内で作製された。
【０１６２】
免疫付与により、免疫付与の最初のラウンドからグレムリン−１に結合する２６種類の異なる抗体が生じた。これらの抗体をスクリーニングアッセイでの試験のためにスケールアップし、精製した。
【０１６３】
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの組み換えヒトグレムリンを使用して、ライブラリからの２５種類のヒト及びマウス交差反応性抗体をパニングした。スクリーニングアッセイでの試験のために、１０種類の抗体をスケールアップ用に選択し、ｓｃＦｖとして精製した。
【０１６４】
例５−抗グレムリン１抗体のスクリーニング
例３に記載のＨｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイを使用して、及びＳＭＡＤリン酸化を測定することによって、抗体をスクリーニングした。ＳＭＡＤ１、５及び８は、ＢＭＰシグナル伝達時にリン酸化される。従って、グレムリン−１の阻害剤はＳＭＡＤリン酸化を増加させる。
【０１６５】
Ａ５４９細胞において又はヒト肺線維芽細胞においてＳＭＡＤリン酸化アッセイを行った。ＭＳＤを使用してリン酸化レベルを決定した。
【０１６６】
結果
Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいて、免疫付与由来の抗体による明らかなヒットはなかった（ＢＭＰ４／７ヘテロ二量体に対して１０倍過剰の抗体を試験）。結果を図１で示す。
【０１６７】
対照的に、多くのライブラリ由来の抗体は、Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイでシグナルを回復可能であった（５０％グレムリン用量で５０倍過剰の抗体）（図２）。これらのうち、Ａｂ２４１６及びＡｂ２４１７には高レベルのエンドトキシンが含有された。Ａｂ７３２６は、１０倍過剰及び８０％阻害のグレムリン−１濃度で遮断能を維持した。
【０１６８】
さらなる結果を図３Ａ（ヒトグレムリン）及び３Ｂ（マウスグレムリン）で示す。これらの図は、１５ｎＭまでのＡｂ７３２６（ＰＢ３７６と表示）の滴定を示す。Ａｂ７３２６は、ヒト（ＩＣ５０が１．３ｎＭ）又はマウス（ＩＣ５０が０．２ｎＭのグレムリン）のいずれかによって遮断される場合、ＢＭＰのシグナル伝達を回復することが示された。この抗体は、ヒト及びマウスの両方のＩｇＧ１として機能する。
【０１６９】
マウス及びヒトの全長ＩｇＧ１の配列を以下に示す。マウス及びヒトの全長ＩｇＧ１タンパク質を合成するために、適切な抗体定常ドメインを含むベクターに、ライブラリ由来のＡｂ７３２６可変領域を再クローニングした。
【０１７０】
Ａｂ７３２６はナイーブヒトライブラリ由来であったので、ＡｂをｓｃＦｖとしてクローニングする場合、７３２６可変領域を全長Ａｂ又はＦａｂとして再クローニングするために、プライマー／縮重プライマーのプールを使用してＶＨ及びＶＫをＰＣＲ増幅する必要があった。次に、増幅ＰＣＲ産物を消化し、マウス及びヒトのベクターに同時にクローニングした。ＶＨ及びＶＫをプライマーのプール／縮重プライマーによって増幅した場合、ＰＣＲ過程中に微妙に異なるプライマーのアニーリングに由来する１個のアミノ酸残基が異なる、生成物の２つの変異体型が得られた。
【０１７１】
以下で示されるように、重鎖可変領域の２つの変異体型は位置６の１個のアミノ酸が異なり、軽鎖可変領域の２つの変異体型は位置７の１個のアミノ酸が異なった：
・重鎖可変領域変異体１は、位置６にグルタミン酸（Ｅ）を有する。
・重鎖可変領域変異体２は、位置６にグルタミン（Ｑ）を有する。
・軽鎖可変領域変異体１は位置７にセリン（Ｓ）を有する。
・軽鎖可変領域変異体２は位置７にスレオニン（Ｔ）を有する。
【０１７２】
マウス全長ＩｇＧ１−重鎖変異体１（配列番号１４）
2021513960.tif 000007
【０１７３】
マウス全長ＩｇＧ１−軽鎖変異体１（配列番号１５）
2021513960.tif 000008
【０１７４】
マウス全長ＩｇＧ１−重鎖変異体２（配列番号２８）
2021513960.tif 000009
【０１７５】
マウス全長ＩｇＧ１−軽鎖変異体２（配列番号２９）
2021513960.tif 000010
【０１７６】
ヒト全長ＩｇＧ１−重鎖変異体１（配列番号３０）
2021513960.tif 000011
【０１７７】
ヒト全長ＩｇＧ１−軽鎖変異体１（配列番号３１）
2021513960.tif 000012
【０１７８】
ヒト全長ＩｇＧ１−重鎖変異体２（配列番号１６）
2021513960.tif 000013
【０１７９】
ヒト全長ＩｇＧ１−軽鎖変異体２（配列番号１７）
2021513960.tif 000014
【０１８０】
抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法（上記配列で太字で強調表示）を使用して決定した。Ｃｈｏｔｈｉａの定義を使用したさらなるＨＣＤＲ１残基はイタリック体で示す。定常領域配列に下線を付す。
【０１８１】
抗グレムリン１抗体によるｐ−ＳＭＡＤシグナル伝達の回復を以下の表４で示す。
【０１８２】
【表４】
2021513960.tif 000015
【０１８３】
結果は、ＢＭＰ単独（対照ＢＭＰ）によるＳＭＡＤリン酸化のパーセンテージとして示す。特発性肺線維症患者からの肺線維芽細胞を使用して実験を行った。ｒｈグレムリン−１及び抗グレムリン−１抗体を室温で４５分間予め温置した。次に、ｒｈグレムリン−１及び抗グレムリン−１抗体をＢＭＰとともに細胞に３０分間添加した。
【０１８４】
次に表５は、ＳＭＡＤリン酸化アッセイでのさらなる結果を示し、抗グレムリン−１抗体によるグレムリン１−ＢＭＰ複合体からのＢＭＰ−２又はＢＭＰ４／７の置換を調べた。特発性肺線維症患者からの肺線維芽細胞を使用して実験を再度行った。ｒｈＢＭＰ−２又はｒｈＢＭＰ４／７をｒｈグレムリン−１と室温で１時間予め温置した。ＢＭＰ−２−又はＢＭＰ４／７−グレムリン−１複合体を様々な濃度の抗グレムリン−１抗体とともに４℃で一晩温置した。抗体濃度はプレート上の最終濃度を表す。
【０１８５】
【表５】
2021513960.tif 000016
【０１８６】
表５で示す結果は、Ａｂ７３２６が、既に複合体化したＢＭＰ−２又はＢＭＰ４／７をグレムリン１−ＢＭＰ複合体から置き換え得ることを示す。Ａｂ７３２６は、比較抗体２４８４よりもはるかに低い濃度でこの置換を達成し得る。これにより、Ａｂ７３２６がアロステリック阻害剤であることの証拠が提供され、Ａｂ７３２６に対する結合部位がグレムリン−１上の既知のＢＭＰ結合領域から遠位であるという発明者らの知見と一致する。従って、Ａｂ７３２６は、ＢＭＰがグレムリン−１に対して複合体形成する場合でさえもアロステリック結合部位に接近可能であり、その結果、グレムリン活性の阻害が顕著に改善される。
【０１８７】
例６−７３２６Ｆａｂとの複合体におけるグレムリン−１の結晶構造の取得
Ａｂ７３２６Ｆａｂとの複合体におけるヒトグレムリン−１の結晶構造は、２．１Åの分解能で解析した。Ｆａｂ配列を以下で示す：
【０１８８】
重鎖：配列番号１８
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
【０１８９】
軽鎖：配列番号１９
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０１９０】
次に、ＣＣＰ４ソフトウェアＮＣＯＮＴを使用して、グレムリン１とＦａｂとの間において４Åで全ての接触を同定した。以下の残基を同定した：Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５（配列番号１のＵｎｉＰｒｏｔ配列に基づく付番（マウスグレムリン−２の付番と一致する構造ファイルにおいてＩｌｅ１１０、Ｌｙｓ１２６、Ｌｙｓ１２７、Ｐｈｅ１２８、Ｔｈｒ１２９、Ｔｈｒ１３０、Ａｒｇ１４８、Ｌｙｓ１５３及びＧｌｎ１５４として付番））。
【０１９１】
図４は、グレムリン−Ｆａｂ複合体の構造モデルを示し、Ｆａｂエピトープ残基をＢＭＰ結合領域と比較して示す。
【０１９２】
Ａｂ７３２６は、アロステリックに作用する、即ちＢＭＰ結合領域から離れて結合する阻害抗体である。
【０１９３】
例７−グレムリン１への抗グレムリン１抗体Ａｂ７３２６の結合に対する親和性測定
方法
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用したビアモレキュラー（ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ）相互作用分析によって、ヒトグレムリン１に対する抗グレムリンｍＩｇＧの親和性を測定した。固定化抗マウスＦｃ表面により抗グレムリンｍＩｇＧが捕捉され、捕捉されたｍＩｇＧに対してグレムリン１を滴定した。
【０１９４】
約１６００応答単位（ＲＵ）のレベルまで６００秒の活性化及び非活性化注入を使用して、アミンカップリング化学を介してＣＭ４センサーチップのフローセル２上に１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０中５０μｇ／ｍＬで捕捉リガンド（ヤギ抗マウスＩｇＧのａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片特異的、１１５−００６−０７１，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）をランニング緩衝液として、流速１０μＬ／分で使用した。フローセル２の場合のように、表面を活性化及び非活性化することにより、しかし捕捉リガンドを省略することにより、フローセル１において参照面を調製した。
【０１９５】
アッセイ緩衝液は、最終ＮａＣｌ濃度を３００ｍＭプラス１％ＣＭＤ４０にするために、ＨＢＳ−ＥＰ＋プラス余分な１５０ｍＭ  ＮａＣであった。抗グレムリンｍＩｇＧ（ランニング緩衝液中５μｇ／ｍＬ）の６０秒注入をフローセル１及び２に通過させ、固定化抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ表面上でおよそ１００ＲＵの捕捉レベルを得た。組み換えヒトグレムリン１を５ｎＭからランニング緩衝液中で滴定し（２倍希釈を使用）、フローセル１及び２に３０μＬ／分の流速で３分間注入した後、５分間の解離相が続いた。緩衝液のみの対照も含まれた。５０ｍＭ  ＨＣｌの６０秒注入、５ｍＭ  ＮａＯＨの３０秒注入及び５０ｍＭ  ＨＣｌの３０秒注入により、１０μＬ／分の流速で表面を再生した。
【０１９６】
動態データは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して決定した。
【０１９７】
親和性測定を２５℃で行った。
【０１９８】
結果
５回の測定に対する平均ＫＤ値と見なされる結合親和性は、１００ｐＭを下回ることが分かった。
【０１９９】
例８．グレムリン−１活性の阻害は、骨折修復のインビボモデルにおいて治癒及び架橋を加速する。
８．１材料及び方法
ラット骨折モデル及び薬物投与
長骨の部分的欠損モデルは、骨の治癒及び再生の研究に広く使用されてきた（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ；２０１４）。本研究では、１０週齢の雄ラットにおいて３ｍｍの大腿骨欠損を作製し、８穴ＰＥＥＫプレート（ＲＩＳ．６０２．１０５，ＲＩＳｙｓｔｅｍ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して安定化させた。骨に穴をあけてネジで固定する前に、骨に対してプレートを骨幹の中央に鉗子により固定した。０．４４ｍｍのギグリーソーを使用して、３ｍｍの骨折間隙を作製した。欠陥のサイズ／一貫性／固定化は、Ｆａｘｉｔｒｏｎ（ＭＸ−２０−ＤＣ５，Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｂｉｏｐｔｉｃｓ  ＬＬＣ，ＵＳＡ）を使用してＸ線イメージングによって品質管理し、この時点を第０日として定めた。
【０２００】
表１で概説するように、週１回の投与を第１日に開始し、８週間行った。
【０２０１】
その後、仮骨形成及び治癒の進行を評価するために、試験の生存期間中、第１１、２５、３９及び５７日にＸ線画像を得た。
【０２０２】
捕捉したＸ線画像において骨組織を欠く欠損領域を定量化するために、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析を利用した。
【０２０３】
【表６】
2021513960.tif 000017
【０２０４】
骨折治癒のマイクロＣＴ分析
マイクロＣＴ（ＳｋｙＳｃａｎ  １０７６）を使用して１７．２μｍの解像度で大腿骨（骨折側）をスキャンした。骨折部を中央にして仮骨のおよそ１５ｍｍの領域を得た。走査はＳｋｙｓｃａｎ  ＮＲＥＣＯＮソフトウェア（１．７．１０）を使用して再構築し、次に再構築したスライスをさらにセグメント化して、大腿骨骨折欠損の中間点から計算された３ｍｍの定められた領域で固定ピンを取り除いた。３Ｄにおける骨折仮骨の組織形態計測分析は、ＳｋｙＳｃａｎソフトウェア（ｖ．１．１３．１）によって実行した。３ｍｍの大腿骨骨折欠損内の中間点を決定し、測定した各四肢について、中間点に対して１．５ｍｍ遠位及び近位のスライスをセグメント化した。続いて、再構築したデータセットの２値化及びセグメント化を２つの定義済みしきい値に従って実行し、一方は低石灰化仮骨を表し（従って新たに形成された骨を定量）、他方は成熟骨を定める。大腿骨欠損の不完全な架橋の基準を満たすことに基づいて低レスポンダーとして、又は骨折部位の架橋を示す高レスポンダーとして分類された動物の大腿骨において、これらのデータのさらなるセグメント化を行った。
【０２０５】
骨折の組織形態計測分析
大腿骨を２４時間にわたり１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、低温にてメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）中で包埋した。厚さ５０μｍの切片をトルイジンブルーで染色して、治癒ギャップ欠損部（ｇａｐ  ｄｅｆｅｃｔ）の骨成分を定量した。組織形態計測パラメータは、骨折欠損部位の海綿骨において測定した。画像解析により測定を行った。
【０２０６】
統計分析
結果は平均値±ＳＤとして提示した。統計分析は、特に明記されない限り、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで両側マンホイットニーＵ検定を使用して実行した。
【０２０７】
８．２結果
試験の生存期間中に得られたＸ線画像の分析から、抗グレムリン−１抗体が骨折治癒を加速し、対照群及び処置群では２５日後に有意に分かれることが示された（Ｐ＜０．０５）。この効果は、本試験の残りの期間について明らかであった（図５）。
【０２０８】
末端試料のＭｉｃｒｏ−ＣＴ分析により、抗グレムリン−１抗体（３０ｍｇ／ｋｇ／週に１回）による処置が骨折仮骨部位内に新たに形成される骨の増加につながることが明らかになった（Ｐ＝０．０６）。
【０２０９】
このモデルでの骨折非癒合の発生率は介入なしでおよそ６０％である（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ；２０１４）。グレムリン−１阻害が非癒合発生率を低下させたか否かを試験するために、低レスポンダー（ＬＲ）及び高レスポンダー（ＨＲ）として動物を分類した。グレムリン−１の阻害の結果、対照と比較して、低レスポンダー群でＬＭＢ（低ミネラル骨；新たに形成された骨）（Ｐ＜０．０１）及びＨＭＢ（高ミネラル骨；成熟骨）（Ｐ＜０．０１）内の骨量／組織量のパーセンテージ（ＢＶ／ＴＶ％）が有意に上昇し、従って非癒合を生じ得るコホートの修復進行が示される。
【０２１０】
さらに、抗グレムリン−１処理に応答して高レスポンダー群でＬＭＢ及びＨＭＢ  ＢＶ／ＴＶ％が増加する傾向（有意ではない）があった（図６Ａ、ＬＲ及びＨＲの代表的な画像を図６Ｂで示す）。
【０２１１】
骨折部位の組織学的切片において骨パラメータの二次元組織形態計測分析を行った（図７）。抗グレムリン−１抗体での処置により、対照と比較して、骨量／組織量のパーセンテージ（ＢＶ／ＴＶ％）が有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。抗グレムリン−１は、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）を有意に増加させ（Ｐ＜０．００１）、骨梁間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）を有意に減少させ（Ｐ＜０．０１）、抗グレムリン−１での処置による骨梁の増加が示される。
【０２１２】
骨折部分のμＣｔ分析及び２次元組織形態計測分析においてセグメント化されたＬＭＢ及びＨＭＢ群を比較することによって、二次元組織形態計測分析と三次元μＣｔ分析との間の相関を調べた（図８）。ピアソンの相関関係によって評価した比較により、ＬＭＢ群（Ｐ＜０．０００１）及びＨＭＢ群（Ｐ＜０．０００１）における組織形態計測とμＣＴ分析との間で有意な正の相関が明らかとなり、従って各データセットからのデータが検証された。
【０２１３】
８．３結論
中和抗グレムリン−１抗体を使用してグレムリン−１活性を阻害した結果、骨折修復が加速され、２５日後には対照群と処置群との間で有意差が明らかになった（抗体３回投与）。さらに、骨折部位の末端分析から、低レスポンダー動物における骨組織の形成促進が示されたが、これらの動物ではそうでない場合は非癒合が生じたであろうと思われる。従って、グレムリン−１活性の阻害は、非癒合骨折の予防又は処置のための有望な治療法であり、非癒合発生の傾向がある骨折、例えば、脛骨、橈骨遠位端、大腿骨頸部及び舟状骨の処置のために特に価値があり得る。
【０２１４】
配列番号１（ヒトグレムリン−１；Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｏ６０５６５）
MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
【０２１５】
配列番号２（Ｎ末端タグ付きの結晶学で使用されるヒト切断型グレムリン−１）
MGSSHHHHHHSSGENLYFQGSAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
【０２１６】
配列番号３（Ａｂ７３２６  ＨＣＤＲ１  Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの組み合わせ）
GYTFTDYYMH
【０２１７】
配列番号４（Ａｂ７３２６  ＨＣＤＲ１  Ｋａｂａｔ）
DYYMH
【０２１８】
配列番号５（Ａｂ７３２６  ＨＣＤＲ２  Ｋａｂａｔ）
LVDPEDGETIYAEKFQG
【０２１９】
配列番号６（Ａｂ７３２６  ＨＣＤＲ３  Ｋａｂａｔ）
DARGSGSYYPNHFDY
【０２２０】
配列番号７（Ａｂ７３２６  ＬＣＤＲ１  Ｋａｂａｔ）
KSSQSVLYSSNNKNYLA
【０２２１】
配列番号８（Ａｂ７３２６  ＬＣＤＲ２  Ｋａｂａｔ）
WASTRES
【０２２２】
配列番号９（Ａｂ７３２６  ＬＣＤＲ３  Ｋａｂａｔ）
QQYYDTPT
【０２２３】
配列番号１０（Ａｂ７３２６重鎖可変領域変異体１）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSS
【０２２４】
配列番号１１（Ａｂ７３２６軽鎖可変領域変異体１）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIK
【０２２５】
配列番号１２（Ａｂ７３２６重鎖可変領域変異体２）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSS
【０２２６】
配列番号１３（Ａｂ７３２６軽鎖可変領域変異体２）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIK
【０２２７】
配列番号１４（マウス全長ＩｇＧ１重鎖変異体１）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
【０２２８】
配列番号１５（マウス全長ＩｇＧ１軽鎖変異体１）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
【０２２９】
配列番号１６（ヒト全長ＩｇＧ１重鎖変異体２）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２３０】
配列番号１７（ヒト全長ＩｇＧ１軽鎖変異体２）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２３１】
配列番号１８（Ｆａｂ重鎖変異体１）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
【０２３２】
配列番号１９（Ｆａｂ軽鎖変異体１）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２３３】
配列番号２０（Ｎ末端タグなしの結晶学で使用されるヒト切断型グレムリン−１）
AMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
【０２３４】
配列番号２１（アミノ酸１〜２１のシグナルペプチドを欠く配列番号１の成熟グレムリン−１配列）
KKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
【０２３５】
配列番号２２（ヒトＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体１）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
【０２３６】
配列番号２３（ヒトＩｇＧ４Ｐ軽鎖変異体１）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２３７】
配列番号２４（ヒトＩｇＧ１重鎖ＤＮＡ変異体１）
caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgcaaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatgggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgacacttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggatgctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcgcttctacaaagggcccctccgtgttcccgctcgctccatcatcgaagtctaccagcggaggcactgcggctctcggttgcctcgtgaaggactacttcccggagccggtgaccgtgtcgtggaacagcggagccctgaccagcggggtgcacacctttccggccgtcttgcagtcaagcggcctttactccctgtcatcagtggtgactgtcccgtccagctcattgggaacccaaacctacatctgcaatgtgaatcacaaacctagcaacaccaaggttgacaagaaagtcgagcccaaatcgtgtgacaagactcacacttgtccgccgtgcccggcacccgaactgctgggaggtcccagcgtctttctgttccctccaaagccgaaagacacgctgatgatctcccgcaccccggaggtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcacatgaggacccagaggtgaagttcaattggtacgtggatggcgtcgaagtccacaatgccaaaactaagcccagagaagaacagtacaattcgacctaccgcgtcgtgtccgtgctcacggtgttgcatcaggattggctgaacgggaaggaatacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgccggcaccgatcgagaaaactatctccaaagcgaagggacagcctagggaacctcaagtctacacgctgccaccatcacgggatgaactgactaagaatcaagtctcactgacttgtctggtgaaggggttttaccctagcgacattgccgtggagtgggaatccaacggccagccagagaacaactacaagactacccctccagtgctcgactcggatggatcgttcttcctttactcgaagctcaccgtggataagtcccggtggcagcagggaaacgtgttctcctgctcggtgatgcatgaagccctccataaccactatacccaaaagtcgctgtccctgtcgccgggaaag
【０２３８】
配列番号２５（ヒトＩｇＧ１軽鎖ＤＮＡ変異体１）
gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgcaagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcctcccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcactgacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccgacctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
【０２３９】
配列番号２６（ヒトＩｇＧ４Ｐ重鎖ＤＮＡ変異体１）
caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgcaaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatgggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgacacttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggatgctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcgcttctacaaagggcccctccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtctaccgccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctcctccagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccccccctgccctgcccctgaatttctgggcggaccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctccagcatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctccttcttcctgtactctcggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtcttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagcctgggcaag
【０２４０】
配列番号２７（ヒトＩｇＧ４Ｐ軽鎖ＤＮＡ変異体１）
gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgcaagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcctcccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcactgacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccgacctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
【０２４１】
配列番号２８（マウス全長ＩｇＧ１重鎖変異体２）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
【０２４２】
配列番号２９（マウス全長ＩｇＧ１軽鎖変異体２）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
【０２４３】
配列番号３０（ヒト全長ＩｇＧ１重鎖変異体１）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２４４】
配列番号３１（ヒト全長ＩｇＧ１軽鎖変異体１）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２４５】
配列番号３２（Ｆａｂ重鎖変異体２）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
【０２４６】
配列番号３３（Ｆａｂ軽鎖変異体２）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２４７】
配列番号３４（ヒトＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体２）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
【０２４８】
配列番号３５（ヒトＩｇＧ４Ｐ軽鎖変異体２）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２４９】
参考文献
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【図１】
2021513960.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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