(57)【要約】  本発明によれば、抗体は、システイン部位特異的挿入抗体であり、システイン挿入部位は、ｋａｐｐａ／λ軽鎖定常領域軽鎖の第１１０位、第１１１位、第１４２位、ＩｇＧ抗体重鎖定常領域重鎖の第２５４位、第２５５位、第２５８位、第２５９位、第３５４位、第３５５位、第３５７位、第３７８位、第３７９位、第３８６位、第３８７位、第４１０位から選択される１つ又は複数の部位を含む、システイン改変抗体−毒素複合体が提供される。【選択図】  図１
2021517581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体は、システイン部位特異的挿入抗体であり、
システイン挿入部位は、ｋａｐｐａ／λ軽鎖定常領域軽鎖の第１１０位、第１１１位、第１４２位、ＩｇＧ抗体重鎖定常領域重鎖の第２５４位、第２５５位、第２５８位、第２５９位、第３５４位、第３５５位、第３５７位、第３７８位、第３７９位、第３８６位、第３８７位、第４１０位から選択される１つ又は複数の部位を含む、システイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項２】
システイン挿入部位のアミノ酸配列は、
ＬＣ−１１０ｉｎｓ：ＥＩＫＲＴＣＶＡＡＰＳ
ＬＣ−１１１ｉｎｓ：ＩＫＲＴＶＣＡＡＰＳＶ
ＬＣ−１４２ｉｎｓ：ＮＮＦＹＰＣＲＥＡＫＶ
ＨＣ−２５４ｉｎｓ：ＩＳＲＴＰＣＥＶＴＣＶ
ＨＣ−２５５ｉｎｓ：ＳＲＴＰＥＣＶＴＣＶＶ
ＨＣ−２５８ｉｎｓ：ＰＥＶＴＣＣＶＶＶＤＶ
ＨＣ−２５９ｉｎｓ：ＥＶＴＣＶＣＶＶＤＶＳ
ＨＣ−３５４ｉｎｓ：ＰＳＲＤＥＣＬＴＫＮＱ
ＨＣ−３５５ｉｎｓ：ＳＲＤＥＬＣＴＫＮＱＶ
ＨＣ−３５７ｉｎｓ：ＤＥＬＴＫＣＮＱＶＳＬ
ＨＣ−３７８ｉｎｓ：ＩＡＶＥＷＣＥＳＮＧＱ
ＨＣ−３７９ｉｎｓ：ＡＶＥＷＥＣＳＮＧＱＰ
ＨＣ−３８６ｉｎｓ：ＧＱＰＥＮＣＮＹＫＴＴ
ＨＣ−３８７ｉｎｓ：ＱＰＥＮＮＣＹＫＴＴＰ
ＨＣ−４１０ｉｎｓ：ＫＬＴＶＤＣＫＳＲＷＱ
のうちの１つ又は複数を含む、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項３】
高活性細胞毒素は、リンカーを介して挿入されたシステイン遊離チオール基（−ＳＨ）に部位特異的結合し、
リンカーと挿入されたシステインとが結合した抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、ＥＩＫＲＴＣＶＡＡＰＳ、ＩＫＲＴＶＣＡＡＰＳＶ及びＮＮＦＹＰＣＲＥＡＫＶであり、
リンカーと挿入されたシステインとが結合した抗体の重鎖のアミノ酸配列は、ＩＳＲＴＰＣＥＶＴＣＶ、ＳＲＴＰＥＣＶＴＣＶＶ、ＰＥＶＴＣＣＶＶＶＤＶ、ＥＶＴＣＶＣＶＶＤＶＳ、ＰＳＲＤＥＣＬＴＫＮＱ、ＳＲＤＥＬＣＴＫＮＱＶ、ＤＥＬＴＫＣＮＱＶＳＬ、ＩＡＶＥＷＣＥＳＮＧＱ、ＡＶＥＷＥＣＳＮＧＱＰ、ＧＱＰＥＮＣＮＹＫＴＴ、ＱＰＥＮＮＣＹＫＴＴＰ、ＫＬＴＶＤＣＫＳＲＷＱであり、
Ｃは、目的抗体の軽鎖又は重鎖に挿入されたシステインである、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項４】
前記抗体軽鎖は、ｋａｐｐａ又はλアイソタイプを含む、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項５】
前記抗体重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを含む、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項６】
前記システインは、チオール基を含む、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項７】
チオール基は、化学的に結合することができる、請求項６に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項８】
高活性細胞毒素は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＢＤ、ＳＮ−３８、Ｄｏｘ、Ａｍａｎｉｔｉｎ及びその類似体から選択され、分子式は、
【化１】
2021517581.tif 000043
【化２】
2021517581.tif 000044
【化３】
2021517581.tif 000045
【化４】
2021517581.tif 000046
【化５】
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【化６】
2021517581.tif 000048
である、請求項３に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項９】
毒素／抗体比（ＤＡＲ）は１．６−２．０又は３．２−４．０である、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項１０】
前記部位特異的結合の手順は以下の通りであり、
まず、還元剤で抗体を還元し、抗体上の改変したシステイン残基上のマスキングを除去し、陽イオン交換クロマトグラフィー又は限外濾過及び液体交換等の方式によりＤＴＴ及びマスキング基を除去し、
そして、酸化剤で抗体を酸化し、抗体の鎖間ジスルフィド結合を再結合させ、
最後に、ｐａｙｌｏａｄを加えて抗体上の改変したシステイン残基上の遊離チオール基に結合させ、陽イオン交換クロマトグラフィー又は限外濾過及び液体交換等の方式により抗体分子に結合していないｐａｙｌｏａｄを除去する、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、その製造方法及び使用に関し、特にシステイン改変抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）、その製造方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体−毒素複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）は、標的療法のホットな分野である。米国での販売が承認されている２つの薬物であるＡｄｃｅｔｒｉｓとＫａｄｃｙｌａは、優れた臨床効果を示しており、５０以上のＡＤＣ薬物が臨床段階の研究を行っている。本発明は、非部位特異的結合的ＡＤＣに比べ、薬物の均一性が良好で、副作用が小さい等の利点を有し、前臨床研究の結果が非部位特異的結合ＡＤＣよりもはるかに優れていることを示している新しいシステイン改変抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の化合物システイン改変抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）では、システイン挿入部位は、軽鎖の第１１０位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＥＩＫＲＴＣＶＡＡＰＳ）、軽鎖の第１１１位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＩＫＲＴＶＣＡＡＰＳＶ）、軽鎖の第１４２位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＮＮＦＹＰＣＲＥＡＫＶ）、重鎖の第２５４位（アミノ酸配列：ＩＳＲＴＰＣＥＶＴＣＶ）、重鎖の第２５５位（アミノ酸配列：ＳＲＴＰＥＣＶＴＣＶＶ）、重鎖の第２５８位（アミノ酸配列：ＰＥＶＴＣＣＶＶＶＤＶ）、重鎖の第２５９位（アミノ酸配列：ＥＶＴＣＶＣＶＶＤＶＳ）、重鎖の第３５４位（アミノ酸配列：ＰＳＲＤＥＣＬＴＫＮＱ）、重鎖の第３５５位（アミノ酸配列：ＳＲＤＥＬＣＴＫＮＱＶ）、重鎖の第３５７位（アミノ酸配列：ＤＥＬＴＫＣＮＱＶＳＬ）、重鎖の第３７８位（アミノ酸配列：ＩＡＶＥＷＣＥＳＮＧＱ）、重鎖の第３７９位（アミノ酸配列：ＡＶＥＷＥＣＳＮＧＱＰ）、重鎖の第３８６位（アミノ酸配列：ＧＱＰＥＮＣＮＹＫＴＴ）、重鎖の第３８７位（アミノ酸配列：ＱＰＥＮＮＣＹＫＴＴＰ）、重鎖の第４１０位（アミノ酸配列：ＫＬＴＶＤＣＫＳＲＷＱ）のうちの１つ又は複数の挿入部位を含む。１つ又は複数の前記システイン挿入変異を含む抗体は、その親抗体の抗原との結合能力（親和力）を保持する。その軽鎖を介して挿入されたシステインのチオール基及び／又は重鎖を介して挿入されたシステインのチオール基は、ｐａｙｌｏａｄと抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）の部位特異的結合を行い、毒素／抗体比ＤＡＲは、１．６−２．０又は３．２−４．０である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】実施例１６の結果図である。
【図２】実施例１６の結果図である。
【図３】実施例１６の結果図である。
【図４】実施例１７の結果図である。
【図５】実施例１７の結果図である。
【図６】実施例１７の結果図である。
【図７】実施例１７の結果図である。
【図８】実施例１８の結果図である。
【図９】実施例１８の結果図である。
【図１０】実施例１８の結果図である。
【図１１】実施例１８の結果図である。
【図１２】実施例１８の結果図である。
【図１３】実施例１９の結果図である。
【図１４】実施例１９の結果図である。
【図１５】実施例２０の結果図である。
【図１６】実施例２０の結果図である。
【図１７】実施例２０の結果図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
実施例
実施例１：ｍｃの合成
【化１】
2021517581.tif 000003
３０ｍｌ氷酢酸に６−アミノカプロン酸３．９ｇ（０．０３ｍｏｌ）及び１．２ｅｑの無水マレイン酸３．５ｇ（０．０３６ｍｏｌ）を加えた。反応液を１２０℃で４〜６時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、加熱を停止させ、室温まで自然に冷却した。６０℃で減圧濃縮してほとんどの酢酸を除去した。得られた黄褐色粘稠液を水に入れ、さらに酢酸エチル２０ｍｌ×３を加えて抽出し、有機層を合わせた。有機層を順に水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮して黄褐色油状物を得、５０ｍｌ水を加えて撹拌し、類白色固体が析出した後、濾過し、５０℃で減圧乾燥させ、目的製品５．０８ｇを得た。収率は８０％であった。ｍｐ：８９−９２℃。ｍ／ｚ：２１２．２［Ｍ＋Ｈ］＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＤＭＳＯ）：１３．２１（ｂｒ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）、６．７５（ｓ，２Ｈ，ＣＯＣＨ＝ＣＨＣＯ）、３．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＮＣＨ２ＣＨ２）、２．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ＣＨ２ＣＯＯＨ）、１．５２−１．６８（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、１．３０−１．４２（ｍ，２Ｈ，ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）。
【０００６】
実施例２：Ｍｃ−ＯＳｕの合成
【化２】
2021517581.tif 000004
窒素ガスの保護下で５０ｍｌアセトニトリルに４．７ｇ（２２ｍｍｏｌ）ＭＣ及び２５ｇ（２２ｍｍｏｌ）ＨＯＳｕを加えた。４．５ｇ（２２ｍｍｏｌ）ＤＣＣを２５ｍｌアセトニトリルに溶解し、内温を約０℃に保持しながら反応液にゆっくりと滴下した。反応液を０℃で２時間反応させた後、室温で一晩反応させた。濾過し、濾過ケーキをアセトニトリル１０ｍｌ×３で洗浄し、濾液を減圧濃縮して乾燥させた。得られた油状物を室温で６時間減圧乾燥させ、淡褐色固体６．４ｇを得た。収率は９５％であった。生成物を精製せずにそのまま次の反応に用いた。
ｍ／ｚ：３０９．２［Ｍ＋Ｈ］＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＣＤＣｌ３）：１〜２（ｍ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ）、２．６８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯ），２．９５（ｓ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ）、３．６８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ）、６．８１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）。
【０００７】
実施例３：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕの合成
【化３】
2021517581.tif 000005
１００ｍｌＴＨＦに１０ｇのＦｍｏｃ−Ｖａｌ及び３．４ｇのＨＯＳｕを加えた。６ｇのＤＣＣを５０ｍｌアセトニトリルに溶解し、内温を約０℃に保持しながら反応液にゆっくりと滴下した。反応液を室温で２４時間撹拌しながら反応させた。濾過し、濾過ケーキをＴＨＦで洗浄し、濾液を減圧濃縮し、透明油状物を得た。油状物を精製せずにそのまま次の反応に用いた。ｍ／ｚ：４３７．４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０００８】
実施例４：Ｆｍｏｃ−ｖｃの合成
【化４】
2021517581.tif 000006
２０ｍｌＴＨＦに４．０ｇ（１．０５ｅｑ）のＣｉｔ及び炭酸水素ナトリウムの水溶液６０ｍｌ（ＮａＨＣＯ３  ２ｇ，１．０５ｅｑ）を加えた。２２．３５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕを６０ｍｌＤＭＥに溶解し、さらに反応液に加えた。反応液を室温下で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応系に１５％クエン酸水溶液１１０ｍｌを加え、ＥＡで２回抽出し、有機層を合わせ、減圧濃縮して白色固体を得た。白色固体にメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１００ｍｌを加え、撹拌し、濾過し、濾過ケーキを４０℃で４時間減圧乾燥させ、製品４．８３ｇを得た。収率は６５％であった。ｍ／ｚ：４９７．６（Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＤＭＳＯ）：０．９２（６Ｈ，ｍ）、１．３５〜１．６５（４Ｈ，ｍ）、２．１０（１Ｈ，ｍ）、３．０１（２Ｈ，ｑ）、３．９９（１Ｈ，ｔ）、４．０１−４．４５（２Ｈ，ｍ）、４．４５（２Ｈ，ｔ）、５．４６（２Ｈ，ｂｒ）、６．０３（１Ｈ，ｔ）、７．２０−８．０２（８Ｈ，ｍ）、８．２５（１Ｈ，ｄ）。
【０００９】
実施例５：Ｆｍｏｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨの合成
【化５】
2021517581.tif 000007
反応フラスコにＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２／１混合溶媒６０ｍｌを加え、さらに２ｇ（４．２ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−ｖｃ及び１．０４ｇ（２ｅｑ）のＰＡＢＯＨを加え、撹拌して一部を溶解した後、２．０ｇ（２ｅｑ）のＥＥＤＱを加えた。反応系を室温の条件下で暗所で２．０日間撹拌しながら反応させた。反応終了後、４０℃で減圧濃縮し、白色固体を得た。白色固体を収集し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１００ｍｌを加え、撹拌し、濾過し、濾過ケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、得られた白色固体を４０℃で減圧乾燥させ、製品２．２ｇを得た。収率は約８８％であった。ｍ／ｚ：６０２．６（Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＤＭＳＯ）：０．９５（６Ｈ，ｍ）、１．４５〜１．６９（４Ｈ，ｍ）、２．１０（１Ｈ，ｍ）、３．１１（２Ｈ，ｍ）、３．９９（１Ｈ，ｍ）、４．３０（２Ｈ，ｄ）、４．０５〜−４．６６（２Ｈ，ｍ）、４．５５（２Ｈ，ｄ）、５．２１（１Ｈ，ｔ）、５．５１（２Ｈ，ｂｒ）、６．１１（１Ｈ，ｔ）、７．０９−８．１０（１２Ｈ，ｍ）、８．２１（１Ｈ，ｄ）、１０．５１（１Ｈ，ｂｒ）。
【００１０】
実施例６：ｖｃ−ＰＡＢＯＨの合成
【化６】
2021517581.tif 000008
１０ｍｌＮＭＰに４９０ｍｇ（０．８１５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨを加え、撹拌して溶解させ、さらにジエチルアミン２ｍｌを加えた。室温下で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、４０℃で減圧濃縮し、得られた油状物に２０ｍｌＤＣＭを加え、撹拌して晶析させ、濾過し、濾過ケーキをＤＣＭで洗浄し、得られた固体を減圧乾燥し、製品２７７ｍｇを得た。収率は９０％であった。ｍ／ｚ：３８０．２（Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＤＭＳＯ）：０．８９（６Ｈ，ｍ），１．３１〜１．６１（４Ｈ，ｍ），１．８２（１Ｈ，ｍ），２．８６（１Ｈ，ｍ），２．８９（２Ｈ，ｄ），４．３８（２Ｈ，ｄ），４．４４（１Ｈ，ｍ），５．０１（１Ｈ，ｂｒ），５．３５（２Ｈ，ｂｒ），５．８４（１Ｈ，ｂｒ），７．１４（２Ｈ，ｄ），７．４２（２Ｈ，ｄ），８．０８（１Ｈ，ｂｒ），９．８８（１Ｈ，ｂｒ）。
【００１１】
実施例７：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨの合成
【化７】
2021517581.tif 000009
１０ｍｌＮＭＰに２０５ｍｇ（０．５４ｍｍｏｌ）のｖｃ−ＰＡＢＯＨ及び１８４ｍｇ（１．１ｅｑ）のＭＣ−ＯＳｕを加え、その後、室温で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、４０℃で減圧濃縮し、得られた油状物に２０ｍｌメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加え、撹拌して晶析させた。濾過し、濾過ケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、製品３１０ｍｇを得た。収率は１００％であった。ｍ／ｚ：５７３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＤＭＳＯ）：０．８９（６Ｈ，ｍ）、１．１５−１．９９（１０Ｈ，ｍ）、２．１１（１Ｈ，ｍ）、２．３１（２Ｈ，ｔ）、３．２１（２Ｈ，ｍ）、３．５３（２Ｈ，ｔ）、４．３２（１Ｈ，ｔ）、４．５１（１Ｈ，ｍ）、４．５９（２Ｈ，ｂｒ）、５．２４（１Ｈ，ｂｒ）、５．５６（２Ｈ，ｂｒ）、６．２０（１Ｈ，ｂｒ）、７．１２（２Ｈ，ｓ）、７．２３（２Ｈ，ｄ），７．５８（２Ｈ，ｄ）、７．９４（１Ｈ，ｄ），８．１７（１Ｈ，ｄ）、１０．２１（１Ｈ，ｂｒ）。
【００１２】
実施例８：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＰＮＰの合成
【化８】
2021517581.tif 000010
窒素ガスの保護下で１６８．６ｍｇ（０．２９４ｍｍｏｌ）のｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨを５ｍｌ無水ピリジンに溶解し、反応系を約０℃に冷却した。ＰＮＰ１７９ｍｇ（３ｅｑ）を５ｍｌＤＣＭに溶解し、それを反応系にゆっくりと加えた。約０℃に１０分間保持した後、氷浴を取り外し、室温で３時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、７０ｍｌのＥＡ及び１００ｍｌの１５％クエン酸水溶液を加え、有機層を分取した。有機層を順にクエン酸、水、飽和食塩水で洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮し、淡黄色油状物を得、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで晶析させ、類白色固体８６ｍｇを得た。収率は４０％であった。ｍ／ｚ：７３８（Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：０．８４（６Ｈ，ｍ）、１．１１−１．８４（１０Ｈ，ｍ）、２．０５（１Ｈ，ｍ）、２．１５（２Ｈ，ｔ）、３．０９（２Ｈ，ｍ）、３．３２（２Ｈ，ｔ）、４．１２（１Ｈ，ｍ）、４．３８（１Ｈ，ｍ）、５．１５（２Ｈ，ｓ）、６．６１（２Ｈ，ｓ）、６．８４（１Ｈ，ｄ），７．６１（１Ｈ，ｄ）、７．２１（２Ｈ，ｄ），７．５０（２Ｈ，ｄ）、７．６１（２Ｈ，ｄ），８．１８（２Ｈ，ｄ）、９．５９（１Ｈ，ｂｒ）。
【００１３】
実施例９：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの合成
【化９】
2021517581.tif 000011
２ｍｌＤＭＦに２０ｍｇのｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（１．５ｅｑ）及び３ｍｇのＨＯＢＴを加えた。室温でしばらく撹拌した後、１３ｍｇのＭＭＡＥ、０．５ｍｌのピリジン、２５ｕｌのＤＩＥＡを加えた。反応液を室温で２日間撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応液をそのまま分取カラムで精製し、必要な成分を収集した後、濃縮して凍結乾燥させ、約１０ｍｇ製品を得た。収率は約４２％であった。ｍ／ｚ：１３１７．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００１４】
実施例１０：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの合成
【化１０】
2021517581.tif 000012
実施例９と同様にして約１２．５ｍｇのｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを得た。収率は４５．２％であった。ｍ／ｚ：１３４５．７（Ｍ＋Ｈ）＋
【００１５】
実施例１１：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＰＢＤの合成
【化１１】
2021517581.tif 000013
実施例９と同様にして約９．５ｍｇのｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＰＢＤを得た。収率は３２．５％であった。ｍ／ｚ：１３２５．４（Ｍ＋Ｈ）＋
【００１６】
実施例１２：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＤＯＸの合成
【化１２】
2021517581.tif 000014
実施例９と同様にして約１１．２ｍｇのｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＤＯＸを得た。収率は３８．９％であった。ｍ／ｚ：１１４３．２（Ｍ＋Ｈ）＋
【００１７】
実施例１３：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＳＮ−３８の合成
【化１３】
2021517581.tif 000015
１００ｍｇの１０−Ｏ−Ｂｏｃ−ＳＮ−３８を１０ｍｌ乾燥ジクロロメタンで溶解させた後、２５．６ｍｇ（１ｅｑ）ＤＭＡＰを加え、０℃でトリホスゲンのジクロロメタン溶液（６２ｍｇトリホスゲンを２ｍｌジクロロメタンで溶解させたもの）を滴下し、その後、引き続き０℃で２時間反応させ、減圧でジクロロメタンを除去し、１０ｍｌ乾燥ＤＭＦで溶解させた後、１４４ｍｇのｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨを加え、室温で２４時間撹拌し、分取液体クロマトグラフィーにより分離して４１ｍｇのｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＳＮ−３８を得た。二段階の総収率は１９．７％であった。ｍ／ｚ：１０６３．２（Ｍ＋Ｈ）＋
【００１８】
実施例１４：２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ抗体の発現及び精製
ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞を用いて２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ抗体を発現した。トランスフェクションの前日、６×１０５個／ｍＬの密度で細胞を３００ｍＬのＦ１７完全培地（ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  Ｆ１７発現培地、Ｇｉｂｃｏ社）を含む１Ｌ振盪フラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍの条件下で細胞培養用シェーカーで一晩培養した。翌日にＰＥＩで抗体発現プラスミドのトランスフェクションを行った（プラスミド：ＰＥＩ＝２：１）。トランスフェクションの翌日に、２．５％（ｖ／ｖ）でＴＮ１フィード培地を加え、引き続き４日間培養した後、遠心分離し、上清を収集した。
【００１９】
収集された細胞発現上清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィー用カラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ＬＸ，ＧＥ社）を通し、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）で溶離し、捕捉された抗体を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）により１／１０（ｖ／ｖ）でｐＨ７．０に調節し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーカラムＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，ＧＥ社）により多量体及びエンドトキシンなどの不純物を除去し、抗体緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に交換し、ＵＶ２８０ｎｍの目標ピークサンプルを収集し、限外濾過用遠沈管（３０ＫＤ，Ｐａｌｌ社）を通して２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
この方法で得られた２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ抗体の濃度は２ｍｇ／ｍｌであり、目的抗体モノマー（ＰＯＩ％）は９０％を超えた。次の実験に用いた。
【００２０】
実施例１５：２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを結合することで２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを製造する。
細胞で発現した２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶離した直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に交換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは白色粉末であり、ＤＭＡに溶解して使用まで保存した。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後、２０℃で２時間反応させた。その後、サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプル中のＤＴＴ及びマスキング基を除去した。その後、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させ、抗体鎖間ジスルフィド結合を再結合させた。そして、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインを結合させ、均一に混合した後、２５℃で２時間反応させた。反応終了後にＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合されていないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００２１】
実施例１６：ＨＩＣ−ＨＰＬＣによる毒素／抗体比ＤＡＲの測定
高速液体疎水クロマトグラフィー方法によりＴＤＣサンプルを分析し、対応するピーク面積に基づいてＤＡＲを計算した。具体的な方法は以下の通りである。
カラム：Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ（登録商標）ＨＩＣＢｕ‐ＮＰ５（５μｍ，４．６ｘ３５ｍｍ）
移動相：Ａ：２Ｍ硫酸アンモニウム，０．０２５Ｍ、ｐＨ７のリン酸緩衝液；Ｂ：０．０２５Ｍ、ｐＨ７のリン酸緩衝液；Ｃ：１００％イソプロパノール
緩衝液Ａで平衡化し、緩衝液Ｂと緩衝液Ｃでグラジエント溶離し、２５℃、２１４ｎｍで検出した。
2021517581.tif 000016
2021517581.tif 000017
2021517581.tif 000018
2021517581.tif 000019
【００２２】
図１Ａ−１Ｄ：ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ  ＤＡＲをそれぞれ検出した。
【００２３】
図１に基づいて計算した結果、部位特異的結合ＤＡＲは１．６−１．７であり、その化合物均一性に優れている。
【００２４】
表１：２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１１ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１４２ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ和２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５４ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ
【００２５】
【表１】
2021517581.tif 000020
【００２６】
表１から分かるように、システイン挿入変異改変により部位特異的結合を行ったＴＤＣ化合物の結合効率はいずれも高かく（理論最大値２．０）、ＤＡＲは１．６以上であった。
【００２７】
実施例１７：ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＴＤＣ抗体骨格の安定性状況及びＴＤＣの凝集状況の検出
ＴＤＣ抗体骨格サンプルを３７℃で保存し、０、７、１４、２１日目にそれぞれＳＥＣ−ＨＰＬＣによりその凝集状況を分析した。具体的な方法は以下の通りである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ  ｍＡｂ  ＨＲ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）
移動相：０．１Ｍ硫酸ナトリウム；０．１Ｍ、ｐＨ６．７のリン酸緩衝液
２５℃、２８０ｎｍで検出した。
2021517581.tif 000021
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2021517581.tif 000023
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【００２８】
【表２】
2021517581.tif 000025
【００２９】
図２Ａ−２Ｄは、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓの０、７、１４、２１日目のＳＥＣ結果を示す。データから分かるように、サンプルは３７℃で３週間保存された後に非常に安定した。
【００３０】
表２：ＳＥＣ−ＨＰＬＣによりＴＤＣ抗体骨格２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ及び２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓの凝集状況を検出した結果、サンプルを３７℃で３週間した後に、モノマーＰＯＩの含有量はほとんど変化しなかった。
【００３１】
２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１１ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１４２ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５４ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  
【００３２】
【表３】
2021517581.tif 000026
【００３３】
表３から分かるように、システイン部位特異的結合によるＴＤＣ化合物の目標モノマーの含有量は９０％以上であった。
【００３４】
実施例１８：システイン挿入変異により改変された骨格抗体及び親抗体２Ａ１のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和力
間接ＥＬＩＳＡ法により２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１１ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１４２ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ和２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５４ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び２Ａ１のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する相対親和力を比較した。具体的な手順は以下の通りである。
【００３５】
組換えＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｈｉｓ＊６で培養プレートをコーティングし、魚皮ゼラチンでブロッキングし、各挿入変異抗体をそれぞれ希釈し（最高濃度１０ｕｇ／ｍｌ、４倍段階希釈、合計１１個の濃度）、ＨＲＰで標識された二次抗体でインキュベートし、ＴＭＢで発色させ、４５０ｎｍでの吸収を検出した。検出結果についてＡ４５０−濃度で描画した。図３及び表３に示すように、システイン挿入変異を行った後の抗体は、２Ａ１と類似した親和力を保持し、ＥＣ５０値が非常に近かった。これは、２Ａ１上の軽鎖又は重鎖挿入変異はＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原との親和力に影響を与えないことを示している。
2021517581.tif 000027
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【００３６】
【表４】
2021517581.tif 000032
【００３７】
図３及び表４：２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１０ｉｎｓ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１１ｉｎｓ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１４２ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５５ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５８ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５９ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５４ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５５ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７９ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８６ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ抗体は、２Ａ１と抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩとの親和力を保持する。
【００３８】
実施例１９：細胞毒性薬効の検出
以下の実験によりＴＤＣ細胞毒性活性を測定する。
ＴＤＣをＥＧＦＲ過剰発現又はＥＧＦＲＶＩＩＩ発現のヒト腫瘍細胞培地に加え、細胞を７２時間培養した後、細胞生存率を測定した。細胞のインビトロ実験により細胞生存率、細胞毒性及び本発明のＴＤＣ誘発性プログラム細胞死を測定した。
細胞増殖試験により抗体−毒素複合体のインビトロ薬効を測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙは市販品である（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ａ）は、比色法により細胞増殖及び細胞毒性実験における生細胞の数を測定する試薬である。この試薬は、新型のテトラゾール化合物［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ；ＭＴＳ］及び電子カップリング剤（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ；ＰＥＳ）を含む。ＰＥＳは、増強された化学安定性を有するため、ＭＴＳと混合して安定した溶液を形成することができる。このような便利な「単一溶液」の形態は、第一世代ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙをもとに改良したものである。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙに用いる電子カップリング剤ＰＭＳとＭＴＳ溶液は別々に提供される。ＭＴＳ（Ｏｗｅｎ'ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）は、細胞により着色されたフォルマザン生成物に生物学的に還元され、そのまま培地に溶解することができる（図１）。この変換は、代謝が活発な細胞における脱水素酵素により生成したＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの作用下で達成される可能性がある。検出の際に、少量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを培養プレートウェルの培地にそのまま加え、１−４時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍでの吸光度値を読み取ればよい。
2021517581.tif 000033
【００３９】
４９０ｎｍで検出されたフォルマザン生成物の量と培養中の生細胞の数と比例している。ＭＴＳのフォルマザン生成物が組織培地に可溶であるため、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙは、ＭＴＴ又はＩＮＴ法に比べ、操作ステップがより少ない。
【００４０】
本発明では、Ａ４３１（ＥＧＦＲ過剰発現細胞）及びＵ８７−ＥＧＦＲＶＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ変異体安定細胞系）をインビトロ薬効検出の研究系として用いる。９６ウェルプレートには、細胞を６０００／ウェルで接種し、２４時間後、抗体を投与した。Ａ４３１及びＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩに対応する投与濃度は２００ｎＭ−１０ｐＭ（４倍希釈）であり、Ｕ８７−ＥＧＦＲＶＩＩＩに対する投与濃度は５００ｎＭ−３０ｐＭであった。処理した７２時間後に、ＭＴＳにより細胞活性を検出した。
2021517581.tif 000034
2021517581.tif 000035
【００４１】
図４Ａ−４Ｂ：ＥＧＦＲｗｔ過剰発現のヒト皮膚扁平上皮がん細胞Ａ４３１及びＥＦＧＲｖＩＩＩ過剰発現のヒト神経膠腫細胞株Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのＩＣ５０の検出結果。
【００４２】
【表５】
2021517581.tif 000036
【００４３】
表５の結果から分かるように、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１１ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１４２ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣと、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５４ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣは、ＥＧＦＲｗｔ過剰発現細胞系Ａ４３１及びＥＧＦＲｖＩＩＩ発現安定性株Ｕ８７−ＥＧＦＲＶＩＩＩに対する細胞毒性活性に相当するものを有している。
【００４４】
本発明は、実施例に開示の実施形態の範囲に限定されず、これらの実施例は、本発明のいくつかの態様を例示するものであり、機能的に同等の任意の実施形態は、全て本発明の範囲に含まれる。本明細書に示され、説明されているものに加えて、本発明の様々な変形も当業者にとって自明なものであり、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【００４５】
実施例２０：血漿安定性の検出
所定量のＴＤＣサンプルをヒトＩｇＧが除去されたヒト血漿に加え、各ＴＤＣについて３チューブずつ準備し、３７℃の水浴でインキュベートし、それぞれ０時間、２４時間、９６時間インキュベートした後、ＴＤＣサンプルを取り出し、各チューブにＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ  ＬＸ  Ｌｏｔ：＃１０２２１４７９  ＧＥ、ＰＢＳ洗浄済み）１００ｕｌを加え、縦型混合器で２時間振盪しながら吸着させ、洗浄、溶離した後、インキュベートされたＴＤＣを得た。所定時間インキュベートされたＴＤＣサンプルをＨＩＣ−ＨＰＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより検出し、サンプルの血漿安定性を判定した。
2021517581.tif 000037
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【００４６】
図５Ａ−５Ｄ：２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ  ２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ  ＨＩＣ−ＨＰＬＣの血漿安定性検出結果から分かるように、いずれも良好な血漿安定性を有する。
【００４７】
【表６】
2021517581.tif 000041
【００４８】
実施例２１：担癌マウスの薬効検出
ヒト膵臓腺がん細胞ＢｘＰＣ３のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ等のＴＤＣ結合薬物のインビボ薬効を評価した。５×１０６でＡ４３１細胞を４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背中に皮下注射し、マウス腫瘍の平均サイズが約１５０〜２００ｍｍ３まで増殖した後、６匹／群でランダムに群分けした。１日目に、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ  ＴＤＣ）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓＴＤＣ）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓＴＤＣ）を５ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈に単回投与した（図６）。テータは、測定時の腫瘍平均体積±ＳＥを示す。
2021517581.tif 000042
【００４９】
図６：２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ  ＴＤＣ）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓＴＤＣ）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓＴＤＣ）を５ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈に単回投与した結果、抗腫瘍効果が顕著である。
【図１】
2021517581.tif 000049
【図２】
2021517581.tif 000050
【図３】
2021517581.tif 000051
【図４】
2021517581.tif 000052
【図５】
2021517581.tif 000053
【図６】
2021517581.tif 000054
【図７】
2021517581.tif 000055
【図８】
2021517581.tif 000056
【図９】
2021517581.tif 000057
【図１０】
2021517581.tif 000058
【図１１】
2021517581.tif 000059
【図１２】
2021517581.tif 000060
【図１３】
2021517581.tif 000061
【図１４】
2021517581.tif 000062
【図１５】
2021517581.tif 000063
【図１６】
2021517581.tif 000064
【図１７】
2021517581.tif 000065
【配列表】
2021517581000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月24日(2020.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体と高活性細胞毒素を含むシステイン改変抗体−毒素複合体であって、
抗体は、１つ又は複数のシステイン挿入部位に挿入されたシステインを有し、
システイン挿入部位は、ｋａｐｐａ／λ軽鎖定常領域軽鎖の第１１０位、第１１１位、第１４２位、ＩｇＧ抗体重鎖定常領域重鎖の第２５４位、第２５５位、第２５８位、第２５９位、第３５４位、第３５５位、第３５７位、第３７８位、第３７９位、第３８６位、第３８７位、第４１０位から選択される１つ又は複数の部位を含む、システイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項２】
システイン挿入部位のアミノ酸配列は、
ＬＣ−１１０ｉｎｓ：  ＥＩＫＲＴＣＶＡＡＰＳ（配列番号：４５）
ＬＣ−１１１ｉｎｓ：  ＩＫＲＴＶＣＡＡＰＳＶ（配列番号：４６）
ＬＣ−１４２ｉｎｓ：  ＮＮＦＹＰＣＲＥＡＫＶ（配列番号：４７）
ＨＣ−２５４ｉｎｓ：  ＩＳＲＴＰＣＥＶＴＣＶ（配列番号：４８）
ＨＣ−２５５ｉｎｓ：  ＳＲＴＰＥＣＶＴＣＶＶ（配列番号：４９）
ＨＣ−２５８ｉｎｓ：  ＰＥＶＴＣＣＶＶＶＤＶ（配列番号：５０）
ＨＣ−２５９ｉｎｓ：  ＥＶＴＣＶＣＶＶＤＶＳ（配列番号：５１）
ＨＣ−３５４ｉｎｓ：  ＰＳＲＤＥＣＬＴＫＮＱ（配列番号：５２）
ＨＣ−３５５ｉｎｓ：  ＳＲＤＥＬＣＴＫＮＱＶ（配列番号：５３）
ＨＣ−３５７ｉｎｓ：  ＤＥＬＴＫＣＮＱＶＳＬ（配列番号：５４）
ＨＣ−３７８ｉｎｓ：  ＩＡＶＥＷＣＥＳＮＧＱ（配列番号：５５）
ＨＣ−３７９ｉｎｓ：  ＡＶＥＷＥＣＳＮＧＱＰ（配列番号：５６）
ＨＣ−３８６ｉｎｓ：  ＧＱＰＥＮＣＮＹＫＴＴ（配列番号：５７）
ＨＣ−３８７ｉｎｓ：  ＱＰＥＮＮＣＹＫＴＴＰ（配列番号：５８）
ＨＣ−４１０ｉｎｓ：  ＫＬＴＶＤＣＫＳＲＷＱ（配列番号：５９）
のうちの１つ又は複数を含む、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項３】
高活性細胞毒素は、リンカーを介して挿入されたシステインのチオール基に結合することにより、挿入されたシステインに結合され、
リンカー及び抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、ＥＩＫＲＴＣＶＡＡＰＳ（配列番号：４５）、ＩＫＲＴＶＣＡＡＰＳＶ（配列番号：４６）及びＮＮＦＹＰＣＲＥＡＫＶ（配列番号：４７）であり、
リンカー及び抗体の重鎖のアミノ酸配列は、ＩＳＲＴＰＣＥＶＴＣＶ（配列番号：４８）、ＳＲＴＰＥＣＶＴＣＶＶ（配列番号：４９）、ＰＥＶＴＣＣＶＶＶＤＶ（配列番号：５０）、ＥＶＴＣＶＣＶＶＤＶＳ（配列番号：５１）、ＰＳＲＤＥＣＬＴＫＮＱ（配列番号：５２）、ＳＲＤＥＬＣＴＫＮＱＶ（配列番号：５３）、ＤＥＬＴＫＣＮＱＶＳＬ（配列番号：５４）、ＩＡＶＥＷＣＥＳＮＧＱ（配列番号：５５）、ＡＶＥＷＥＣＳＮＧＱＰ（配列番号：５６）、ＧＱＰＥＮＣＮＹＫＴＴ（配列番号：５７）、ＱＰＥＮＮＣＹＫＴＴＰ（配列番号：５８）、ＫＬＴＶＤＣＫＳＲＷＱ（配列番号：５９）であり、
Ｃは、システイン改変抗体の軽鎖又は重鎖における挿入されたシステインである、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項４】
前記抗体軽鎖は、ｋａｐｐａ又はλアイソタイプを含む、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項５】
前記抗体重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを含む、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項６】
前記挿入されたシステインは、高活性細胞毒素に結合される前にチオール基を含む、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項７】
チオール基は、化学的に結合することができる、請求項６に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項８】
高活性細胞毒素は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＢＤ、ＳＮ−３８、Ｄｏｘ、Ａｍａｎｉｔｉｎ及びその類似体から選択され、分子式は、
【化１】
2021517581.tif 000066
【化２】
2021517581.tif 000067
【化３】
2021517581.tif 000068
【化４】
2021517581.tif 000069
【化５】
2021517581.tif 000070
【化６】
2021517581.tif 000071
である、請求項３に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項９】
高活性細胞毒素／抗体比（ＤＡＲ）は１．６−２．０又は３．２−４．０である、請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項１０】
マスキングされたチオール基及びマスキング基を有するマスキングされたシステインを含むシステイン改変抗体を還元し、
還元剤でマスキングされたシステインからマスキング基を除去し、遊離マスキング基、及びチオール基を有するマスキングされていないシステインを含む還元された抗体を形成し、
陽イオン交換クロマトグラフィー又は限外濾過により、遊離マスキング基及び過剰の還元剤を除去し、
酸化剤で還元された抗体を酸化し、抗体の鎖間ジスルフィド結合を再結合させ、
高活性細胞毒素を挿入されたシステインのチオール基に結合させ、システイン改変抗体−毒素複合体を形成し、
陽イオン交換クロマトグラフィー又は限外濾過により結合されていない高活性細胞毒素を除去する、
ことにより製造される請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
本発明の化合物システイン改変抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）では、システイン挿入部位は、軽鎖の第１１０位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＥＩＫＲＴＣＶＡＡＰＳ、配列番号：４５）、軽鎖の第１１１位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＩＫＲＴＶＣＡＡＰＳＶ、配列番号：４６）、軽鎖の第１４２位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＮＮＦＹＰＣＲＥＡＫＶ、配列番号：４７）、重鎖の第２５４位（アミノ酸配列：ＩＳＲＴＰＣＥＶＴＣＶ、配列番号：４８）、重鎖の第２５５位（アミノ酸配列：ＳＲＴＰＥＣＶＴＣＶＶ、配列番号：４９）、重鎖の第２５８位（アミノ酸配列：ＰＥＶＴＣＣＶＶＶＤＶ、配列番号：５０）、重鎖の第２５９位（アミノ酸配列：ＥＶＴＣＶＣＶＶＤＶＳ、配列番号：５１）、重鎖の第３５４位（アミノ酸配列：ＰＳＲＤＥＣＬＴＫＮＱ、配列番号：５２）、重鎖の第３５５位（アミノ酸配列：ＳＲＤＥＬＣＴＫＮＱＶ、配列番号：５３）、重鎖の第３５７位（アミノ酸配列：ＤＥＬＴＫＣＮＱＶＳＬ、配列番号：５４）、重鎖の第３７８位（アミノ酸配列：ＩＡＶＥＷＣＥＳＮＧＱ、配列番号：５５）、重鎖の第３７９位（アミノ酸配列：ＡＶＥＷＥＣＳＮＧＱＰ、配列番号：５６）、重鎖の第３８６位（アミノ酸配列：ＧＱＰＥＮＣＮＹＫＴＴ、配列番号：５７）、重鎖の第３８７位（アミノ酸配列：ＱＰＥＮＮＣＹＫＴＴＰ、配列番号：５８）、重鎖の第４１０位（アミノ酸配列：ＫＬＴＶＤＣＫＳＲＷＱ、配列番号：５９）のうちの１つ又は複数の挿入部位を含む。１つ又は複数の前記システイン挿入変異を含む抗体は、その親抗体の抗原との結合能力（親和力）を保持する。その軽鎖を介して挿入されたシステインのチオール基及び／又は重鎖を介して挿入されたシステインのチオール基は、ｐａｙｌｏａｄと抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）の部位特異的結合を行い、毒素／抗体比ＤＡＲは、１．６−２．０又は３．２−４．０である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
実施例１５：２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを結合することで２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを製造する。
細胞で発現した２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ（配列番号：３４）抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶離した直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に交換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは白色粉末であり、ＤＭＡに溶解して使用まで保存した。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後、２０℃で２時間反応させた。その後、サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプル中のＤＴＴ及びマスキング基を除去した。その後、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させ、抗体鎖間ジスルフィド結合を再結合させた。そして、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインを結合させ、均一に混合した後、２５℃で２時間反応させた。反応終了後にＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合されていないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
図２Ａ−２Ｄは、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ（配列番号：３６）の０、７、１４、２１日目のＳＥＣ結果を示す。データから分かるように、サンプルは３７℃で３週間保存された後に非常に安定した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
表２：ＳＥＣ−ＨＰＬＣによりＴＤＣ抗体骨格２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ（配列番号：３４）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ（配列番号：４２）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ（配列番号：３６）及び２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ（配列番号：４４）の凝集状況を検出した結果、サンプルを３７℃で３週間した後に、モノマーＰＯＩの含有量はほとんど変化しなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
図３及び表４：２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１０ｉｎｓ（配列番号：１６）、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１１１ｉｎｓ（配列番号：１８）、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ１４２ｉｎｓ（配列番号：２０）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５４ｉｎｓ（配列番号：２２）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５５ｉｎｓ（配列番号：２４）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５８ｉｎｓ（配列番号：２６）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ２５９ｉｎｓ（配列番号：２８）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５４ｉｎｓ（配列番号：３０）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５５ｉｎｓ（配列番号：３２）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３５７ｉｎｓ（配列番号：３４）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７８ｉｎｓ（配列番号：３６）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３７９ｉｎｓ（配列番号：３８）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８６ｉｎｓ（配列番号：４０）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ３８７ｉｎｓ（配列番号：４２）、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４１０ｉｎｓ（配列番号：４４）抗体は、２Ａ１と抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩとの親和力を保持する。
【国際調査報告】
2021517581.tif 000072
2021517581.tif 000073
2021517581.tif 000074
2021517581.tif 000075
2021517581.tif 000076
2021517581.tif 000077