(57)【要約】  本開示は、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子配列を含むレンチウイルスベクターおよびそのようなレンチウイルスベクターを使用する方法を提供する。本明細書に開示される肝臓標的化レンチウイルスベクターは、遺伝子療法のために使用することができ、ここで、レンチウイルス遺伝子送達は、小児（例えば、新生児）または成人対象の標的化細胞（例えば、肝細胞）のゲノムの中への、導入遺伝子発現カセットの安定した組入れを可能にし、低いレンチウイルスベクター用量（例えば、５×１０１０以下、例えば、１．５×１０９以下または１×１０８ＴＵ／ｋｇ以下）でのＦＶＩＩＩ発現の向上（例えば、１００倍の向上）を達成する。本開示は、血友病（例えば、血友病Ａ）などの出血障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子核酸配列を含む肝臓標的化レンチウイルスベクターを低い投薬量（１×１０８ＴＵ／ｋｇ以下から１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ）で投与することを含む方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において出血障害を処置する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの、５×１０１０以下の形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）の少なくとも１用量を該対象に投与することを含み、該ヌクレオチド配列は、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｖ）配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｖｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ）配列番号６のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または
（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の任意の組合せ
を有する、前記方法。
【請求項２】
それを必要とする対象において出血障害を処置する方法であって、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの、５×１０１０以下の形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）の少なくとも１用量を該対象に投与することを含み；
（ａ）該第１の核酸配列は、
（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または
（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性
を有する、
（ｂ）該第２の核酸配列は、
（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または
（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性
を有する、または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の任意の組合せであり；
該Ｎ末端部分および該Ｃ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する、前記方法。
【請求項３】
用量は、約５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０８ＴＵ／ｋｇまたは約１×１０８ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
用量は、約５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、約９．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満または約１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
用量は、１×１０８〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８〜５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８〜１×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８〜１×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、６×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、７×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、８×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、９×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、または４．５×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
用量は、１×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜１×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜９×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜８×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜７×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜６×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜４×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜３×１０９ＴＵ／ｋｇ、および１×１０９〜２×１０９ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
用量は、１×１０１０〜２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．１×１０１０〜１．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．２×１０１０〜１．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．３×１０１０〜１．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０１０〜１．６×１０１０ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
用量は、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
用量は、約１．０×１０９ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
用量は、約３．０×１０９ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
用量は、約６．０×１０９ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
用量は、約１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、または約１．３×１０１０ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
用量は、２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．６×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．７×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．８×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、または２．９×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．１×１０９ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
用量は、５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．６×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．７×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．８×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、または５．９×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．１×１０９ＴＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
レンチウイルスベクターの投与の２４時間〜４８時間後の血漿ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む核酸分子を含む参照ベクターを投与した対象と比較して増加する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
血漿ＦＶＩＩＩ活性は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍または少なくとも約２００倍に増加する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
レンチウイルスベクターは、単一用量または複数用量で投与される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
レンチウイルスベクターは静脈内注射を通して投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
対象は小児対象である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
対象は成人対象である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
レンチウイルスベクターは組織特異的プロモーターを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的肝臓細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的肝臓細胞は肝細胞である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
単離された核酸分子は肝細胞のゲノムに安定して組み入れられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
出血障害は血友病Ａである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
単離された核酸分子はＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６（配列番号７１）を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
単離された核酸分子はＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ（配列番号７２）を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
レンチウイルスベクターの用量は一度に投与されるかまたは少なくとも２つの部分用量に分割される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
レンチウイルスベクターの投与は少なくとも２回反復される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、シグナルペプチドをコードする該核酸配列は、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１〜５７；
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１〜５７；
（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜５７；
（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜５７；
（ｖ）配列番号５のヌクレオチド１〜５７；
（ｖｉ）配列番号６のヌクレオチド１〜５７；
（ｖｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１〜５７；
（ｖｉｉｉ）配列番号７１のヌクレオチド１〜５７；または
（ｉｘ）配列番号６８のヌクレオチド１〜５７
に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）核酸分子またはその一部のヒトコドン適合指数は、配列番号１６と比較して増加する；
（ｂ）該ヌクレオチド配列またはその一部の最適コドン頻度は、配列番号１６と比較して増加する；
（ｃ）該ヌクレオチド配列またはその一部は、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの百分率と比較してより高いＧ／Ｃヌクレオチドの百分率を含有する；
（ｄ）該ヌクレオチド配列またはその一部の相対的同義コドン使用頻度は、配列番号１６と比較して増加する；
（ｅ）該ヌクレオチド配列またはその一部のコドンの有効数は、配列番号１６と比較して低減する；
（ｆ）該ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列（配列番号２１および２２）を含有する；
（ｇ）該ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメント（配列番号２３および２４）を含有する；および
（ｈ）その任意の組合せ
からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、異種アミノ酸配列をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、ＸＴＥＮ、トランスフェリン、アルブミンまたはＰＡＳ配列である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
異種アミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端に連結されるか、または、表３から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の中の２つのアミノ酸の間に挿入される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＦＶＩＩＩポリペプチドは完全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
レンチウイルスベクターは脂質コートを含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
脂質コートは１つまたはそれ以上のＣＤ４７ポリペプチドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＣＤ４７ポリペプチドはヒトＣＤ４７ポリペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
脂質コートは高濃度のＣＤ４７ポリペプチドを含む、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
脂質コートはＭＨＣ−Ｉポリペプチドを含まない、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
脂質コートは、高濃度のＣＤ４７ポリペプチドを含み、ＭＨＣ−Ｉポリペプチドを含まない、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
レンチウイルスベクターは宿主細胞中で産生される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
宿主細胞はＣＤ４７を発現する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
宿主細胞はＭＨＣ−Ｉを発現しない、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
宿主細胞はＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉ−である、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
宿主細胞はＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉ−  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全開示はここに参照により本明細書に組み入れる、２０１８年２月１日に出願の米国特許仮出願第６２／６２５，１４５号、２０１８年５月１５日に出願の同第６２／６７１，９１５号、および２０１９年１月１６日に出願の同第６２／７９３，１５８号への優先権を請求する。
【０００２】
電子的に提出された配列表への参照
電子的に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：６０９６２８＿ＳＡ９＿４６０ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：２０４，２０３バイト；作成日：２０１９年１月３１日）の配列表の内容は、参照により本明細書に完全に組み入れる。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固経路は、血小板の表面の第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）および第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）の酵素複合体（Ｘａｓｅ複合体）の形成を一部含む。ＦＩＸａは、その補因子ＦＶＩＩＩａ無しで比較的弱い触媒活性を有するセリンプロテアーゼである。Ｘａｓｅ複合体は第Ｘ因子（ＦＸ）を第Ｘａ因子（ＦＸａ）に切断し、それは次に第Ｖａ因子（ＦＶａ）と相互作用してプロトロンビンを切断してトロンビンを生成する。血友病Ａは、ＦＶＩＩＩ活性の欠損をもたらすＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）遺伝子における突然変異および／または欠失によって引き起こされる出血障害である（非特許文献１）。一部の場合には、患者は、抗ＦＶＩＩＩ抗体などのＦＶＩＩＩ阻害剤の存在によるＦＶＩＩＩの低減したレベルを有する。
【０００４】
この疾患は、特発性出血を予防するＦＶＩＩＩ活性の回復を標的にする補充療法によって処置することができる。出血症状をオンデマンドで処置するか、または予防的に処置することによって出血症状の発生を予防するために利用可能である、血漿由来の組換えＦＶＩＩＩ生成物がある。これらの生成物の半減期（１０〜１２時間）に基づき（非特許文献２；非特許文献３）、処置レジメンは頻繁な静脈内投与、一般的に予防のためには週に２〜３回、オンデマンド処置のためには１日に１〜３回を必要とする（非特許文献４）。そのような頻繁な投与は不便であり、高コストである。
【０００５】
低コストの組換えＦＶＩＩＩタンパク質を患者に提供することにおける主要な障害は、商業生産の高いコストである。ＦＶＩＩＩタンパク質は、異種発現系で十分に発現せず、同様のサイズのタンパク質より２〜３桁低い。（非特許文献５）。ＦＶＩＩＩ発現の生物学の我々の理解における進歩は、より強力なＦＶＩＩＩ変異体の開発につながった。例えば、生化学的研究は、ＦＶＩＩＩＢドメインがＦＶＩＩＩ補因子活性のために不必要であることを実証した。Ｂドメインの欠失は、完全長野生型ＦＶＩＩＩに対してｍＲＮＡレベルの１７倍の増加および分泌タンパク質の３０％の増加をもたらした。（非特許文献６）。それにもかかわらず、異種系において効率的に発現するＦＶＩＩＩ配列の必要性がなお当技術分野に存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｅｙｖａｎｄｉら２００６年
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｅ  Ｇ．Ｃ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：６６０〜７頁（１９９７）
【非特許文献３】Ｍｏｒｆｉｎｉ、Ｍ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ９（増補１）：９４〜９９頁；考察１００（２００３）
【非特許文献４】Ｍａｎｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｍ．Ｊ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５７：５３５〜５４４頁（２００７）
【非特許文献５】Ｌｙｎｃｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．；４：２５９〜７２頁（１９９３）
【非特許文献６】Ｔｏｏｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：５９３９〜４２頁（１９８６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、それを必要とする対象において出血障害を処置する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの、５×１０１０ＴＵ／ｋｇ形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）以下（例えば、５×１０９以下または１０８ＴＵ／ｋｇ以下）の少なくとも１用量を対象に投与することを含み、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｖ）配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｖｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｖｉｉｉ）配列番号６のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または（ｉｘ）（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の任意の組合せを有する
方法を提供する。
【０００８】
本開示は、それを必要とする対象において出血障害を処置する方法であって、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの、５×１０１０ＴＵ／ｋｇ以下（例えば、５×１０９以下または１０８ＴＵ／ｋｇ以下）の少なくとも１用量を対象に投与することを含み；（ａ）ここで、第１の核酸配列は：（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する；（ｂ）第２のヌクレオチド配列は：（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の任意の組合せであり；ここで、Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する方法を提供する。
【０００９】
上で開示される方法の一部の実施形態では、用量は、約９．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０８ＴＵ／ｋｇまたは約１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０９ＴＵ／ｋｇまたは約１×１０９ＴＵ／ｋｇである。
【００１０】
一部の実施形態では、用量は、約９．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約９×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約８×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約７×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約６×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約４×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約３×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約２×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０８未満ＴＵ／ｋｇまたは約１×１０８未満ＴＵ／ｋｇ、約５×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約４×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約３×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約２×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約１×１０１０未満ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約９×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約８×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約７×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約６×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約４×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約３×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約２×１０９未満ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０９未満ＴＵ／ｋｇまたは約１×１０９未満ＴＵ／ｋｇである。
【００１１】
一部の実施形態では、用量は、１×１０８〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８〜５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８〜１×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８〜１×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、６×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、７×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、８×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、９×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、または４．５×１０１０〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、１×１０９〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜９×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜８×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜７×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜６×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜４×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０９〜３×１０９ＴＵ／ｋｇ、および１×１０９〜２×１０９である。一部の実施形態では、用量は、１×１０１０〜２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．１×１０１０〜１．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．２×１０１０〜１．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．３×１０１０〜１．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０１０〜１．６×１０１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、１．５×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．６×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．７×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．８×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、または２．９×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．１×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、約３．０×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．６×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．７×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．８×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、または５．９×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．１×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、約６．０×１０９ＴＵ／ｋｇである。
【００１２】
上で開示される方法の一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの投与の２４時間〜４８時間後の血漿ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む核酸分子を含む参照ベクターを投与した対象と比較して増加する。一部の実施形態では、血漿ＦＶＩＩＩ活性は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍に増加する。
【００１３】
上で開示される方法の一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、単一用量または複数用量で投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、静脈内注射を通して投与される。一部の実施形態では、対象は、小児対象である。一部の実施形態では、対象は、成人対象である。
【００１４】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、組織特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する。一部の実施形態では、標的肝臓細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。一部の実施形態では、標的肝臓細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、肝細胞のゲノムに安定して組み入れられる。一部の実施形態では、出血障害は、血友病Ａである。
【００１５】
上で開示される方法の一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６（配列番号７１）を含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ（配列番号７２）を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、一度に投与されるか、または２つの部分用量、３つの部分用量、４つの部分用量、５つの部分用量もしくは６つの部分用量に分割される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの投与は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回または少なくとも１０回繰り返される。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、ここで、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１〜５７；（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１〜５７；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜５７；（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜５７；（ｖ）配列番号５のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉ）配列番号６のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉｉｉ）配列番号７１のヌクレオチド１〜５７；または（ｉｘ）配列番号６８のヌクレオチド１〜５７に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００１７】
一部の実施形態では、核酸分子（または、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）は、以下からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を含む：（ａ）核酸分子またはその一部のヒトコドン適合指数は、配列番号１６と比較して増加する；（ｂ）ヌクレオチド配列またはその一部の最適コドン頻度は、配列番号１６と比較して増加する；（ｃ）ヌクレオチド配列またはその一部は、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの百分率と比較してより高いＧ／Ｃヌクレオチドの百分率を含有する；（ｄ）ヌクレオチド配列またはその一部の相対的同義コドン使用頻度は、配列番号１６と比較して増加する；（ｅ）ヌクレオチド配列またはその一部のコドンの有効数は、配列番号１６と比較して低減する；（ｆ）ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列（配列番号２１および２２）を含有する；（ｇ）ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメント（配列番号２３および２４）を含有する；ならびに（ｈ）その任意の組合せ。
【００１８】
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、異種アミノ酸配列（例えば、半減期延長剤）をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、ＸＴＥＮ、トランスフェリン、アルブミンまたはＰＡＳ配列である。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端に連結されるか、または、表３から選択される１つもしくはそれ以上の挿入部位のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の中の２つのアミノ酸の間に挿入される。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、完全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｊは、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する図である。図１Ａは、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。図１Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（配列番号２）のヌクレオチド配列を示す。図１Ｃは、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（配列番号７０）のヌクレオチド配列を示す。図１Ｄは、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（配列番号７１）のヌクレオチド配列を示す。図１Ｅは、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（配列番号３）のヌクレオチド配列を示す。図１Ｆは、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２（配列番号４）のヌクレオチド配列を示す。図１Ｇは、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（配列番号５）のヌクレオチド配列を示す。図１Ｈは、ｃｏＦＶＩＩＩ−２６（配列番号６）のヌクレオチド配列を示す。図１Ｉおよび１Ｊは、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）の非コドン最適化ヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ示す（それぞれ、配列番号１６および１７）。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図１−４】図１−３の続き。
【図１−５】図１−４の続き。
【図１−６】図１−５の続き。
【図１−７】図１−６の続き。
【図１−８】図１−７の続き。
【図１−９】図１−８の続き。
【図１−１０】図１−９の続き。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｊは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列におけるコドン使用頻度バイアス調整を示す図である。図２Ａは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、例えば、非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする野生型ヌクレオチド配列（コドン最適化の前の）におけるコドンの相対頻度を示す。非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ配列のヒトコドン適合指数（ＣＡＩ）は７４％である。図２Ｂは、８８％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−１変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。図２Ｃは、９１％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−３変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。図２Ｄは、９７％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−４変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。図２Ｅは、８３％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−５変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。図２Ｆは、８３％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−６変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。図２Ｇは、９１％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−５２変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。図２Ｈは、９１％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−６２変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。図２Ｉは、８８％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−２５変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。図２Ｊは、８８％のヒトＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−２６変異体配列におけるコドンの相対頻度を示す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図２−４】図２−３の続き。
【図２−５】図２−４の続き。
【図３】ｃｏＦＶＩＩＩ−１翻訳開始部位の上流に配置され、合成エンハンサー、ｍＴＩＲエンハンサーおよびｍＴＩＲプロモーターを含む、ＥＴ強化トランスチレチンプロモーターの制御下のｐｃＤＮＡ３主鎖の中のｃｏＦＶＩＩＩ−１を含む、ＦＶＩＩＩ−３０３のプラスミド地図を提供する図である。
【図４】５μｇのＦＶＩＩＩ−３０３（ｃｏＦＶＩＩＩ−１；丸）または５μｇのＦＶＩＩＩ−３１１（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ；四角）の流体力学的注射の後のＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩの血漿活性のグラフ図を示す図である。ＦＶＩＩＩの血漿活性は、注射の２４、４８および７２時間後のＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって判定した。ＦＶＩＩＩ−３１１の発現レベルに正規化された７２時間後の相対活性レベルを示す。
【図５】ｃｏＦＶＩＩＩ−５２翻訳開始部位の上流に配置され、合成エンハンサー、ｍＴＴＲエンハンサーおよびｍＴＴＲプロモーターを含む、ＥＴプロモーターの制御下のレンチウイルスプラスミドの中のｃｏＦＶＩＩＩ−５２を含む、ｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２のプラスミド地図を示す図である。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｃは、様々なＦＶＩＩＩコードヌクレオチドの流体力学的注射の後のＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩの血漿活性のグラフ図を示す図である。ＦＶＩＩＩの血漿活性は、注射の２４、４８および７２時間後のＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって判定した。図６Ａは、５μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１（黒丸）、５μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−３（三角形）、５μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−４（逆三角形）、５μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５（ひし形）または５μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６（白丸）の流体力学的注射の後のＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩの血漿活性を示す。図６Ｂは、５μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１（丸）、５μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（三角形）または５μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−２６（逆三角形）の流体力学的注射の後のＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩの血漿活性を示す。図６Ｃは、２０μｇのＬＶ−２１１６（非コドン最適化（ＷＴ）ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列；白丸）、２０μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１（三角形）、２０μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（四角）または２０μｇのＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６２（黒丸）の流体力学的注射の後のＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩの血漿活性を示す。示すように、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）および／またはＬＶ−２１１６（図６Ｃ）の発現レベルに正規化された、７２時間後の相対活性レベルを各プラスミドについて示す。
【図６−２】図６−１の続き。
【図６−３】図６−２の続き。
【図７】ＬＶ−２１１６（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）対照と比較して、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって測定した、ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６またはｃｏＦＶＩＩＩ−６２を含む１Ｅ８ＴＵ／マウスレンチウイルスベクターによる注射の２４日後のＨｅｍＡマウスにおける血漿ＦＶＩＩＩ活性を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｃは、ＸＴＥＮに融合させたＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする様々なコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する図である。図８Ａは、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮ（配列番号１９）のヌクレオチド配列を示し、ここで、１４４アミノ酸を有するＸＴＥＮ（「ＸＴＥＮ１４４」；配列番号１８；下線付き）をコードするヌクレオチド配列は、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２ヌクレオチド配列の中に挿入される。図８Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ（配列番号２０）のヌクレオチド配列を示し、ここで、１４４アミノ酸を有するＸＴＥＮ（「ＸＴＥＮ１４４」；配列番号１８；下線付き）をコードするヌクレオチド配列は、ｃｏＦＶＩＩＩ−１ヌクレオチド配列の中に挿入される。図８Ｃは、ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ（配列番号７２）のヌクレオチド配列を示し、ここで、１４４アミノ酸を有するＸＴＥＮ（「ＸＴＥＮ１４４」；配列番号１８；下線付き）をコードするヌクレオチド配列は、ｃｏＦＶＩＩＩ−６ヌクレオチド配列の中に挿入される（例えば、成熟ＦＶＩＩＩ配列に対応するアミノ酸残基７４５）。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−２の続き。
【図９】ＥＴプロモーターの制御下のレンチウイルスベクターの中のｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮを含む、ｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮのプラスミド地図を提供する図である。本明細書に記載されるように、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする残りのコドン最適化核酸分子の各々を含むレンチウイルスベクターを、ｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮと同様に構築し、ここでは、同じＸＴＥＮ配列が挿入されてＦＶＩＩＩのＢ−ドメインを置き換えた。
【図１０−１】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする様々なコドン最適化ヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡ（図１０Ａ）またはレンチウイルスベクター（図１０Ｂ）による注射の後の、ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ活性を示す図である。図１０Ａは、５μｇのＦＶＩＩＩ−３１１（非コドン最適化、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩコードヌクレオチド配列；四角）、５μｇのＦＶＩＩＩ−３０３（ｃｏＦＶＩＩＩ−１；小さい丸）またはＦＶＩＩＩ−３０６（ｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ１４４；大きな丸）による流体力学的注射の後のＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩの血漿活性のグラフ図を示す。ＦＶＩＩＩ−３１１に正規化された７２時間後の相対活性を各プラスミドについて示す。図１０Ｂは、ＬＶ−２１１６（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）対照と比較して、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって測定した、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２またはｃｏＦＶＩＩＩ−５２ＸＴＥＮを含むレンチウイルスベクターの１Ｅ８ＴＵ／マウスによる注射の２１日後のＨｅｍＡマウスにおける血漿ＦＶＩＩＩ活性を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１１−１】図１１Ａは、完全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示す。図１１Ｂは、完全長ヒトフォン−ウィルブラント因子（配列番号４４）のアミノ酸配列を示す。図１１Ｃおよび１１Ｄは、４２アミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチドのアミノ酸およびヌクレオチド配列（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４；それぞれ配列番号４６および４７）をそれぞれ示す。１４４アミノ酸を有する様々なＸＴＥＮポリペプチドのアミノ酸配列は、図１１Ｅ、１１Ｇ、１１Ｉ、１１Ｋ、１１Ｍ、１１Ｏ、１１Ｑ、１１Ｓ、１１Ｕおよび１１Ｗ（それぞれ、配列番号４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および６６）に示し、対応するヌクレオチド配列は、図１１Ｆ、１１Ｈ、１１Ｊ、１１Ｌ、１１Ｎ、１１Ｐ、１１Ｒ、１１Ｔ、１１Ｖおよび１１Ｘ（それぞれ、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７）に示す。図１１Ｙは、ＥＴプロモーター（配列番号６９）のヌクレオチド配列を示す。図１１Ｚは、ｃｏＦＶＩＩＩ−１（配列番号６８）のヌクレオチド配列を示す。（国際公開番号ＷＯ２０１４／１２７２１５、配列番号１、を参照する）。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１１−３】図１１−２の続き。
【図１１−４】図１１−３の続き。
【図１１−５】図１１−４の続き。
【図１１−６】図１１−５の続き。
【図１２−１】図１２Ａは、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇのＬＶ−ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（丸）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６（四角）またはＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６ＸＴＥＮ（三角形）のＩＶ投与の後の１４日齢ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩの血漿活性（ＩＵ／ｍＬ）のグラフ図である。図１２Ｂは、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−３、ｃｏＦＶＩＩＩ−４、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５またはｃｏＦＶＩＩＩ−２６を発現するレンチウイルスベクターの約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇをＩＶ投与した、１４日齢ＨｅｍＡマウスの処置から１５０日後のベクターコピー数（ＶＣＮ）のグラフ図である。図１２Ｃは、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−３、ｃｏＦＶＩＩＩ−４、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５またはｃｏＦＶＩＩＩ−２６を発現するレンチウイルスベクターの約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇをＩＶ投与した、１４日齢ＨｅｍＡマウスの処置から２１日後のＦＶＩＩＩの血漿活性（ＩＵ／ｍＬ）のグラフ図である。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−５変異体を発現するレンチウイルスで処置した５匹のＨｅｍＡマウスにおける、ＦＶＩＩＩの血漿活性レベル（図１３Ａ）および抗ＦＶＩＩＩ抗体レベル（図１３Ｂ）を図示するグラフ図である。１４日齢のＨｅｍＡ腹子に、静脈内注射によってｃｏＦＶＩＩＩ−５変異体を発現するレンチウイルスの概ね１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇを投与した。各マウスは、番号によって呼ぶ（すなわち、１、２、３、４および５；図１３Ａおよび１３Ｂ）。
【図１４】レンチウイルス処置の２１日後のＦＶＩＩＩの血漿活性によって立証されるＬＶ−ＦＶＩＩＩ発現レベルと抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在の間の相関のグラフ図である。各データポイントは、単一のＨｅｍＡマウスに対応する。各マウスは、本明細書に開示されるｃｏＦＶＩＩＩ変異体の１つを発現するレンチウイルスの静脈内注射による１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇの用量を受けた。水平線は、平均のＦＶＩＩＩ血漿活性を示す。
【図１５】レンチウイルス処置の１５０日後のベクターコピー数（ＶＣＮ）と抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在の間の相関のグラフ図である。各データポイントは、単一のＨｅｍＡマウスに対応する。各マウスは、本明細書に開示されるｃｏＦＶＩＩＩ変異体の１つを発現するレンチウイルスの静脈内注射による１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇの用量を受けた。水平線は、平均ＶＣＮを示す。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２変異体を発現するレンチウイルスで処置した２匹のＨｅｍＡマウス（ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＡおよびｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ｂ）における、ＦＶＩＩＩの血漿活性レベル（図１６Ａ）および抗ＦＶＩＩＩ抗体レベル（図１６Ｂ）を図示するグラフ図である。１４日齢のＨｅｍＡ腹子に、静脈内注射によってｃｏＦＶＩＩＩ−５２変異体を発現するレンチウイルスの概ね１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇを投与した。図１６Ｃおよび１６Ｄは、図１６Ａおよび１６ＢのｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ａ（図１６Ｃ）およびｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ｂ（図１６Ｄ）マウスから収集された肝臓組織におけるＦＶＩＩＩ発現（暗色の染色）のためのＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色を示す像である。
【図１７】野生型Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ；三角形）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮ（丸）またはｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ（逆三角形）変異体を発現するレンチウイルスで処置したＨｅｍＡ新生児マウスにおける、長期のＦＶＩＩＩ発現を示すグラフ図である。新生児のＨｅｍＡマウスに、静脈内注射によってｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮまたはｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮを発現するレンチウイルスの概ね１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇを投与した。ＦＶＩＩＩの血漿活性は、概ね１６週にわたって測定した。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（図１８Ａ）またはｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ（図１８Ｂ）を発現するレンチウイルスによるＨｅｍＡマウスの処置に対応した、用量反応結果のグラフ図である。
【図１９】肝臓標的化遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの概略図である。ＳＤ：スプライスドナー部位；ＳＡ：スプライス受容部位；ＧＡ：トランケーションされたｇａｇ配列；ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答エレメント；ＥＴ：強化トランスチレチン；ＦＶＩＩＩ：第ＶＩＩＩ因子；１４２Ｔ：ｍｉＲ−１４２のための標的配列；Ｗｐｒｅ：突然変異したマーモット肝炎ウイルス転写後調節エレメント；Ψ（パッケージングシグナル）。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｂは、ＦＶＩＩＩの血漿活性（図２０Ａ）およびＦＶＩＩＩの血漿抗原レベル（図２０Ｂ）によって測した、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉｆｒｅｅ  ２９３Ｔ細胞から生成されるｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮを発現する３×１０９ＴＵ／ｋｇのレンチウイルスを投与した、雄ピグテールマカクにおけるピークの循環ＦＶＩＩＩレベルのグラフ図である。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−６を発現する３×１０９ＴＵ／ｋｇまたは６×１０９ＴＵ／ｋｇのレンチウイルスを投与した雄ピグテールマカクにおける、ヒトＦＶＩＩＩ活性（図２１Ａ）およびヒトＦＶＩＩＩ抗原レベル（図２１Ｂ）のピークの血漿レベルのグラフ図である。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮを発現する１×１０９または３×１０９ＴＵ／ｋｇのレンチウイルスを投与した雄ピグテールマカクにおける、ヒトＦＶＩＩＩ活性（図２２Ａ）および平均ヒトＦＶＩＩＩ抗原レベル（図２２Ｂ）のピークの血漿レベルのグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を使用した肝臓標的化レンチウイルス遺伝子療法を記載する。参照により本明細書に完全に組み入れる、国際公開ＷＯ２０１７１３６３５８を参照。
【００２１】
したがって、一部の態様では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むコドン最適化核酸分子を含むレンチウイルスベクターの投与を含む遺伝子療法に関する。特定の態様では、本開示は、血友病（例えば、血友病Ａ）などの出血障害を処置する方法であって、肝臓（例えば、肝細胞）を標的にしたコドン最適化第ＶＩＩＩ因子核酸配列を含むレンチウイルスベクターを対象に投与することを含む方法に関する。本開示は、標的化細胞のゲノムの中へのコドン最適化第ＶＩＩＩ因子核酸配列を含む導入遺伝子発現カセットの安定した組入れをもたらす遺伝子療法アプローチを通して、当技術分野の重要な必要性を満たす。
【００２２】
このシステムは、レンチウイルスベクターを５×１０１０の形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）以下、例えば、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ以下、または約１．５×１０９ＴＵ／ｋｇ以下、または約１０８ＴＵ／ｋｇ以下の少なくとも１用量で対象に投与した場合、標的化細胞（例えば、肝細胞）における第ＶＩＩＩ因子の増加した長期発現を実証する。
【００２３】
具体的な実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号７１（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６）を含むか、それからなるか、本質的になる、コドン最適化核酸配列を含む。
【００２４】
一部の他の具体的な実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号７２（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ）を含むか、それからなるか、本質的になる、コドン最適化核酸配列を含む。
【００２５】
本明細書に開示される肝臓標的化レンチウイルスベクターは、小児（例えば、新生児）または成人対象の標的化細胞（例えば、肝細胞）のゲノムの中への、ＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化核酸を含む導入遺伝子発現カセットの安定した組入れを可能にし、低いレンチウイルスベクター用量（例えば、５×１０１０以下、例えば、１０９ＴＵ／ｋｇ以下または１０８ＴＵ／ｋｇ以下）でのＦＶＩＩＩ発現の向上（例えば、１００倍の向上）を達成する。開示されるレンチウイルスベクターは非常に低い用量（例えば、１０９ＴＵ／ｋｇ以下または１０８ＴＵ／ｋｇ以下）で循環ＦＶＩＩＩの治療レベルを達成することができるので、これらのベクターは、レンチウイルスベクター処置に関連した潜在的な急性毒性を有意に低減することができる。さらに、レンチウイルスベクター、特に第３世代のベクターの使用は、対象のゲノムの中で潜在的に生涯の組入れをもたらすことができる。他の遺伝子送達システム（例えば、ＡＡＶ）に対するレンチウイルスベクター（１０ｋｂ）の高い能力は、導入遺伝子の中へのより多くの調節エレメント、例えば、異なる組織（例えば、肝細胞および肝臓内皮細胞）におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現を制御するだろうプロモーターの包含を可能にする。本明細書に開示されるレンチウイルスベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ処置で使用することができる。
【００２６】
本開示の例示的な構築物は、付随する図面および配列表に例示される。
【００２７】
明細書および請求項の明確な理解を提供するために、以下の定義を下に提供する。
【００２８】
Ｉ．定義
用語「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」の実体とは、その実体の１つまたはそれ以上を指す点に留意する：例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。このように、用語「ａ」（または、「ａｎ」）、「１つまたはそれ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用することができる。
【００２９】
本明細書で、用語「約」は、概ね、だいたい、前後またはほぼを意味するものとして使用される。用語「約」が数値範囲と一緒に使用されるとき、それは、示される数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、用語「約」は、明記される値の上下の数値を上下（高低）１０％の分散によって変更するために、本明細書で使用される。
【００３０】
本開示のための用語「単離された」は、その元の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生体物質（細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体）を指す。例えば、植物または動物に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然に存在する隣接核酸から分離される同じポリヌクレオチドは「単離された」と考えられる。精製の特定のレベルは要求されていない。宿主細胞において発現される組換えで生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって分離されたか、分画されたか、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えのポリペプチドと同様に、本開示において単離されたと考えられる。
【００３１】
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形、または、一本鎖形もしくは二本鎖ヘリックスの形の任意のそのリン酸エステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルを指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の一次および二次構造だけを指し、それをいかなる特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語は、とりわけ線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイルＤＮＡおよび染色体に見出される、二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論では、本明細書で、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同性の配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向の配列だけを与える通常の慣例によって配列を記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡが限定されずに含まれる。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の核酸を含む。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に一般的に翻訳されないが、それはコード領域の一部であると考えることができるが、いずれの隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなども、コード領域の一部でない。コード領域の境界は、生じるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドン、および生じるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンによって一般的に決定される。２つ以上のコード領域が、例えば単一のベクターの上の単一のポリヌクレオチド構築物に、または例えば別個の（異なる）ベクターの上の別個のポリヌクレオチド構築物に存在することができる。その結果、次に、単一のベクターは単一のコード領域だけを含有することができるか、２つ以上のコード領域を含むことができる。
【００３３】
哺乳動物細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は、粗い小胞体を越えた成長しているタンパク質鎖の移行が開始されると成熟したタンパク質から切断される、分泌シグナルペプチドに関連している。当業者は、シグナルペプチドがポリペプチドのＮ末端に一般的に融合していること、および、完全なまたは「完全長の」ポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌された、または「成熟した」形態を生成することを知っている。ある特定の実施形態では、天然のシグナルペプチド、またはそれと作動可能に関連するポリペプチドの分泌を方向付ける能力を保持するその配列の機能的誘導体。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。
【００３４】
用語「下流」は、参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流のヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。
【００３５】
用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流のヌクレオチド配列は、コード領域または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写の開始部位の上流に位置する。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子調節領域」または「調節領域」は、コード領域の上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。コード領域が真核細胞における発現を意図している場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列はコード配列の３’側に通常位置する。
【００３７】
遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上のコード領域と作動可能に関連するプロモーターおよび／または他の発現（例えば、転写または翻訳）制御エレメントを含むことができる。作動可能な関連では、遺伝子産物、例えばポリペプチドのためのコード領域は、遺伝子産物の発現を調節領域（複数可）の影響下または制御下に置くような方法で１つまたはそれ以上の調節領域と関連する。例えば、コード領域およびプロモーターは、プロモーター機能の誘導がコード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、およびプロモーターとコード領域の間の連結の性質が遺伝子産物の発現を方向付けるプロモーターの能力に干渉しないか、またはＤＮＡ鋳型の転写される能力に干渉しない場合、「作動可能に関連する」。プロモーター以外の他の発現制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終止シグナルも、遺伝子産物発現を方向付けるためにコード領域に作動可能に関連することができる。
【００３８】
「転写制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を可能にするＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを指す。様々な転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（イントロン−Ａと一緒の前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子から誘導されるもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビン、ならびに真核生物細胞における遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が含まれる。さらなる適する転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導可能プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。
【００３９】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにピコルナウイルスから誘導されるエレメント（特に、リボソーム内部進入部位またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用される用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生成する過程を指す。それは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または他の任意のＲＮＡ生成物へのポリヌクレオチドの転写、およびポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を限定されずに含む。発現は、「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用されるように、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡであっても、または転写物から翻訳されるポリペプチドであってもよい。本明細書に記載される遺伝子産物には、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、またはタンパク分解性切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。本明細書で使用される用語「収量」は、遺伝子の発現によって生成されるポリペプチドの量を指す。
【００４１】
「ベクター」は、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または移入のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、付着しているセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントを付着させることができるレプリコンであってよい。「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの複製の自律的な単位として機能する、すなわちそれ自身の制御下での複製が可能である、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。用語「ベクター」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を細胞に導入するためのウイルス性のビヒクルと非ウイルス性のビヒクルの両方を含む。例えばプラスミド、改変された真核生物ウイルスまたは改変された細菌ウイルスを含めて、当技術分野で多数のベクターが公知であり、使用される。適するベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、相補的な粘着末端を有する選択されたベクターに適当なポリヌクレオチド断片をライゲーションすることによって達成することができる。
【００４２】
ベクターを組み込んだ細胞の選択または同定を可能にする選択可能なマーカーまたはレポーターをコードするように、ベクターを工学的に操作することができる。選択可能なマーカーまたはレポーターの発現は、ベクター上に含有される他のコード領域を組み込み、発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。当技術分野で公知であり、使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、以下のものが含まれる：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどへの耐性を提供する遺伝子；および、表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など。当技術分野で公知であり、使用されるレポーターの例には、以下のものが含まれる：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など。選択可能なマーカーは、レポーターであると考えることもできる。
【００４３】
用語「選択可能なマーカー」は、マーカー遺伝子の作用、すなわち、抗生物質耐性、除草剤耐性、比色マーカー、酵素、蛍光性マーカーなどに基づいて選択することができる、同定用因子、通常、抗生物質または化学物質耐性遺伝子を指し、ここで、この作用は、目的の核酸の継承を追跡するために、および／または目的の核酸を継承した細胞もしくは生物体を同定するために使用される。当技術分野で公知であり、使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、以下のものが含まれる：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどへの耐性を提供する遺伝子；および、表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など。
【００４４】
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の作用に基づいて同定することができる、同定用因子をコードする核酸を指し、ここで、この作用は、目的の核酸の継承を追跡するために、目的の核酸を継承した細胞もしくは生物体を同定するために、および／または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定するために使用される。当技術分野で公知であり、使用されるレポーター遺伝子の例には、以下のものが含まれる：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など。選択可能なマーカー遺伝子は、レポーター遺伝子と考えることもできる。
【００４５】
「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは天然の遺伝子から完全に誘導することができるか、天然に見出される異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントで構成されるか、合成ＤＮＡセグメントを含むこともできる。当業者は、異なるプロモーターが異なる組織もしくは細胞型において、または発達の異なる段階で、または異なる環境もしくは生理的条件に応答して遺伝子の発現を方向付けることができることを理解する。ほとんどの細胞型においてほとんどのときに遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と呼ばれる。特異的細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。発達または細胞分化の特異的段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「発達特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理の後に誘導されて、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導可能なプロモーター」または「調節可能なプロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されているとは限らないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【００４６】
プロモーター配列は転写開始部位がその３’末端に一般的に結合し、上流（５’方向）に伸長してバックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列の中には、転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって都合良く規定される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の役割を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００４７】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡの中の特異的ヌクレオチド配列の中で結合して切断する酵素を指す。
【００４８】
用語「プラスミド」は、細胞の中心的代謝の一部でなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形である遺伝子をしばしば有する染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、任意の供給源から誘導される一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状、環状またはスーパーコイル状の、自己複製配列、ゲノム組入れ配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってよく、そこでは、適当な３’非翻訳配列とともに選択される遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である特異な構築物に、いくつかのヌクレオチド配列が連結されているか組み換えられている。
【００４９】
「クローニングベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどの、逐次的に複製し、複製開始点を含む単位長の核酸である「レプリコン」を指し、付着しているセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントをそれに対して付着させることができる。ある特定のクローニングベクターは、１つの細胞型、例えば細菌における複製、および別の細胞型、例えば真核細胞における発現が可能である。クローニングベクターは、ベクターを含む細胞の選択のために使用することができる１つまたはそれ以上の配列、および／または目的の核酸配列の挿入のための１つまたはそれ以上の多重クローニング部位を一般的に含む。
【００５０】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞への挿入の後に、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたビヒクルを指す。挿入された核酸配列は、上記の調節領域との作動可能な関係に置かれる。
【００５１】
ベクターは、当技術分野で周知である方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体によって宿主細胞に導入される。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「培養」、「培養すること」および「培養すること」は、細胞の増殖もしくは分裂を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件の下で細胞をインキュベートすること、または細胞を生存状態に維持することを意味する。本明細書で使用されるように、「培養された細胞」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した細胞を意味する。
【００５３】
本明細書で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含するものであり、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結される単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、具体的長さの生成物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の鎖または複数の鎖を指すために使用される他の任意の用語が「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたは互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性切断または天然に存在しないアミノ酸による改変を限定されずに含む、ポリペプチドの発現後の改変の生成物も指すものである。ポリペプチドは天然の生物供給源から誘導することができるか、または組換え技術で生成することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは、化学的合成を含む任意の方法で生成することができる。
【００５４】
用語「アミノ酸」には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リシン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が含まれる。非伝統的なアミノ酸も本開示の範囲内であり、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１〜３３６頁（１９９１）に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体が含まれる。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２頁（１９８９）および上記のＥｌｌｍａｎらの手法を使用することができる。簡潔には、これらの手法は、天然に存在しないアミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することと、続くＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳を含む。非伝統的アミノ酸の導入は、当技術分野で公知のペプチド化学を使用して達成することもできる。本明細書で使用されるように、用語「極性アミノ酸」は、ゼロ総電荷を有するが、それらの側鎖の異なる部分にノンゼロ部分電荷を有するアミノ酸を含む（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電的相互作用に関与することができる。本明細書で使用されるように、用語「荷電アミノ酸」は、それらの側鎖にノンゼロ総電荷を有することができるアミノ酸を含む（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電的相互作用に関与することができる。
【００５５】
ポリペプチドの断片またはバリアントおよび任意のその組合せも本開示に含まれる。本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子を指す場合の用語「断片」または「バリアント」は、参照ポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃバリアントへのＦｃＲｎ結合親和性、ＦＶＩＩＩバリアントの凝固活性またはＶＷＦ断片へのＦＶＩＩＩ結合活性）の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片には、本明細書の他の場所で議論される特異的抗体断片に加えてタンパク分解性断片ならびに欠失断片が含まれるが、天然に存在する完全長ポリペプチド（または、成熟したポリペプチド）は含まれない。本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子のバリアントには、上記の断片、およびアミノ酸の置換、欠失または挿入のために変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。バリアントは、天然に存在するもの、または天然に存在しないものであってもよい。天然に存在しないバリアントは、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を使用して生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。
【００５６】
「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で規定されている。したがって、ポリペプチドの中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換えられる場合、その置換は保存的であると考えられる。別の実施形態では、アミノ酸のひもは、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似しているひもで保存的に置き換えることができる。
【００５７】
当技術分野で公知であるように、用語「同一性パーセント」は、配列の比較で判定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当技術分野で、「同一性」は、そのような配列のひもの間の一致によって判定される、場合によってポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、以下に記載されるものを非限定的に含む、公知の方法によって容易に計算することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、パートＩ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）。同一性を判定する好ましい方法は、試験する配列の間で最高の一致を与えるように設計される。同一性を判定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁（１９９０））およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１５  ＵＳＡ）などの、配列分析ソフトウェアを使用して実行することができる。本出願の文脈の範囲内で、配列分析ソフトウェアが分析のために使用される場合、特に明記しない限り、分析の結果は参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書で使用されるように、「デフォルト値」は、最初に初期化されるときにソフトウェアと一緒に当初ロードする任意のセットの値またはパラメータを意味する。本開示の最適化されたＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列および参照配列の間の同一性パーセントを判定する目的のために、同一性パーセントを計算するために本開示の最適化されたＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列の中のヌクレオチドに対応する参照配列のヌクレオチドだけを使用する。例えば、Ｂドメインを含有する完全長ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を本開示の最適化されたＢドメイン欠失（��ＤＤ）ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列と比較するとき、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含むアラインメントの部分は、同一性パーセントを計算するために使用される。Ｂドメイン（これは、アラインメントに大きな「ギャップ」をもたらす）をコードする完全長ＦＶＩＩＩ配列の部分のヌクレオチドは、ミスマッチとして数えられない。さらに、本開示の最適化されたＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列またはその指定部分（例えば、配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４）と参照配列の間の同一性パーセントの判定では、同一性パーセントは、一致したヌクレオチドの数を最適化されたＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ配列の完全配列または、本明細書に列挙されるその指定部分のヌクレオチドの総数で割ることによって計算される。
【００５８】
本明細書で使用されるように、「本開示の最適化されたＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列のヌクレオチドに対応するヌクレオチド」は、参照ＦＶＩＩＩ配列との同一性を最大にするような本開示の最適化されたＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列のアラインメントによって同定される。参照ＦＶＩＩＩ配列中の同等のアミノ酸を同定するために使用される数は、本開示の最適化されたＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列中の対応するアミノ酸を同定するために使用される数に基づく。
【００５９】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、それが本来は天然に連結していない第２のアミノ酸配列に連結している第１のアミノ酸配列を含む。別個のタンパク質に通常は存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチドの中に一緒に持ってくることができるか、または、同じタンパク質に通常は存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド、例えば、本開示の第ＶＩＩＩ因子ドメインのＩｇ  Ｆｃドメインとの融合における新しい配置に置くことができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作製し、翻訳することによって作製される。キメラタンパク質は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合によって第１のアミノ酸配列に関連付けられた第２のアミノ酸配列をさらに含むことができる。
【００６０】
本明細書で使用されるように、用語「挿入部位」は、異種部分を挿入することができる位置のすぐ上流にある、ＦＶＩＩＩポリペプチドまたはその断片、バリアントもしくは誘導体の中の位置を指す。「挿入部位」は番号で規定され、この番号は、挿入位置のすぐＮ末端側にある、挿入部位が対応する成熟した天然のＦＶＩＩＩ（配列番号１５、図１１Ａ）の中のアミノ酸の番号である。例えば、「ａ３は配列番号１５のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位に異種部分を含む」というフレーズは、異種部分が配列番号１５のアミノ酸１６５６およびアミノ酸１６５７に対応する２つのアミノ酸の間に位置することを示す。
【００６１】
本明細書で使用される「アミノ酸のすぐ下流」というフレーズは、アミノ酸の末端カルボキシル基のすぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸のすぐ上流」というフレーズは、アミノ酸の末端アミン基のすぐ隣の位置を指す。
【００６２】
本明細書で使用されるように、用語「挿入された」、「挿入される」、「に挿入される」または文法的に関連した用語は、天然の成熟したヒトＦＶＩＩＩの類似した位置に対する、組換えＦＶＩＩＩポリペプチドの中の異種部分の位置を指す。本明細書で使用されるように、これらの用語は、天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩに対する組換えＦＶＩＩＩポリペプチドの特徴を指し、組換えＦＶＩＩＩポリペプチドが作製されたいかなる方法またはプロセスを示しも、暗示も、意味もしない。
【００６３】
本明細書で使用されるように、用語「半減期」は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半分が動物の循環および／または他の組織から消去されるのに必要とされる時間で表すことができる。所与のポリペプチドの消去曲線が時間の関数として構築される場合、曲線は、通常迅速なα相およびより長いβ相による二相性である。α相は、一般的に脈管内と脈管外の空間の間の投与されたＦｃポリペプチドの平衡化を表し、一部、ポリペプチドのサイズによって判定される。β相は、脈管内空間におけるポリペプチドの異化作用を一般的に表す。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は一相性であり、したがってアルファ相を有さず、単一のベータ相だけである。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で使用される用語半減期は、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。
【００６４】
本明細書で使用される用語「連結される」は、共有結合または非共有結合で第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列にそれぞれ連結される第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列は第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に直接的に連結または並置させることができるか、あるいは、介在配列で第１の配列を第２の配列に共有結合させることができる。用語「連結される」は、Ｃ末端またはＮ末端での第１のアミノ酸配列の第２のアミノ酸配列への融合を意味するだけでなく、第１のアミノ酸配列（または、第２のアミノ酸配列）全体の第２のアミノ酸配列の（または、第１のアミノ酸配列それぞれの）任意の２つのアミノ酸の中への挿入も含む。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸配列に連結することができる。第１のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のヌクレオチド配列に連結することができる。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド（ポリペプチド鎖の場合）またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖の場合）または任意の化学部分（ポリペプチドおよびポリヌクレオチド鎖の場合）であってよい。用語「連結される」は、ハイフン（−）によっても示される。
【００６５】
本明細書で使用されるように、用語「と会合した」は、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ酸鎖の間で形成される共有結合または非共有結合を指す。一実施形態では、用語「と会合した」は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合を意味する。この会合は、コロン、すなわち（：）によって示すことができる。別の実施形態では、それは、ペプチド結合以外の共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基の上のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合によって会合し、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用した２３９および２４２に対応する位置（２２６または２２９位、ＥＵナンバリングシステム）で２つのジスルフィド結合によって会合している。共有結合の例には、限定されずに、ペプチド結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、不可知な結合、ベント結合、双極子結合、パイバックボンド、二重結合、三重結合、四重結合、５重結合、６重結合、コンジュゲーション、超共役、芳香族性、多座性または反結合が含まれる。非共有結合の非限定的な例には、イオン結合（例えば、カチオン−パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素複合体、低障壁水素結合または対称性の水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力または化学的極性が含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される用語「単量体−二量体ハイブリッド」は、ジスルフィド結合によって互いと会合する第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、ここで、第１の鎖は凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子、および第１のＦｃ領域を含み、第２の鎖は、凝固因子無しの第２のＦｃ領域を含むか、それから本質的になるか、それからなる。したがって、単量体−二量体ハイブリッド構築物は、１つの凝固因子だけを有する単量体態様および２つのＦｃ領域を有する二量体態様を含むハイブリッドである。
【００６７】
本明細書で使用されるように、止血は、出血もしくは大出血の停止もしくは鈍化；または、血管もしくは身体部分を通しての血流の停止もしくは鈍化を意味する。
【００６８】
止血障害は、本明細書で使用されるように、フィブリン凝塊を形成する能力の障害または欠損による、自然発生的なまたは外傷の結果としての出血傾向によって特徴付けられる、遺伝的に継承したかまたは後天性の状態を意味する。そのような障害の例には、血友病が含まれる。３つの主な形態は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損、軽度の出血傾向）である。他の止血障害には、例えば、フォン・ウィルブラント病、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠損、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常、ＧＰＩｂの欠陥または欠損であるベルナール−スリエ症候群が含まれる。ｖＷＦの受容体ＧＰＩｂが欠損し、一次凝塊形成（一次止血）の喪失および出血傾向の増加、ならびにＧｌａｎｚｍａｎおよびＮａｅｇｅｌｉの血小板無力症（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ血小板無力症）につながることがある。肝不全（急性および慢性の形態）では、肝臓による凝固因子の生成が不十分であり、これは、出血リスクを増加させることがある。
【００６９】
本開示の単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターは、予防的に使用することができる。本明細書で使用されるように、用語「予防的治療」は、出血エピソードの前の分子の投与を指す。一実施形態では、全身止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、受けようとしている。例えば、本開示のレンチウイルスベクターは、予防薬として手術の前後に投与することができる。本開示のレンチウイルスベクターは、急性出血エピソードを制御するために、手術中に、または後に投与することができる。手術には、これらに限定されないが、肝移植、肝臓切除、歯科処置または幹細胞移植が含まれ得る。
【００７０】
本開示のレンチウイルスベクターは、要求に応じた治療のためにも使用される。用語「要求に応じた治療」は、出血エピソードの症状に応答した、または出血を引き起こす可能性のある活動の前の、本明細書で開示されたレンチウイルスベクターの投与を指す。一態様では、要求に応じた治療は、損傷の後など出血が開始するとき、または手術の前など出血が予想されるときに対象に与えることができる。別の態様では、要求に応じた治療は、接触競技などの出血のリスクを増加させる活動の前に与えることができる。
【００７１】
本明細書で使用されるように、用語「急性出血」は、根底にある原因に関係なしに出血エピソードを指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば、第ＶＩＩ因子欠損）、血小板障害または凝固因子に対する抗体の発達による耐性を有してもよい。
【００７２】
本明細書で使用されるように、治療する、治療、治療することは、例えば疾患または状態の重症度の低減；疾患経過期間の低減；疾患または状態に関連した１つまたはそれ以上の症状の改善；疾患または状態を必ずしも治癒せず、疾患または状態に関連した１つまたはそれ以上の症状の予防もなしに、疾患または状態を有する対象に有益な作用を提供することを指す。一実施形態では、用語「治療すること」または「治療」は、本開示のレンチウイルスベクターを投与することによって、対象において、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または２０ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩトラフレベルを維持することを意味する。別の実施形態では、治療することまたは治療は、ＦＶＩＩＩトラフレベルを約１から約２０ＩＵ／ｄＬ、約２から約２０ＩＵ／ｄＬ、約３から約２０ＩＵ／ｄＬ、約４から約２０ＩＵ／ｄＬ、約５から約２０ＩＵ／ｄＬ、約６から約２０ＩＵ／ｄＬ、約７から約２０ＩＵ／ｄＬ、約８から約２０ＩＵ／ｄＬ、約９から約２０ＩＵ／ｄＬ、または約１０から約２０ＩＵ／ｄＬの間で維持することを意味する。疾患または状態の処置または処置することは、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を、非血友病対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％と同等のレベルに維持することを含むこともできる。一実施形態では、用語「処置すること」または「処置」は、本開示のレンチウイルスベクターを投与することによって、対象において少なくとも約３０ＩＵ／ｄＬ、４０ＩＵ／ｄＬ、５０ＩＵ／ｄＬ、６０ＩＵ／ｄＬ、７０ＩＵ／ｄＬ、８０ＩＵ／ｄＬ、９０ＩＵ／ｄＬ、１００ＩＵ／ｄＬ、１１０ＩＵ／ｄＬ、１２０ＩＵ／ｄＬ、１３０ＩＵ／ｄＬ、１４０ＩＵ／ｄＬまたは１５０ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩトラフレベルを維持することを意味する。別の実施形態では、処置することまたは処置は、約１０〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約２０〜約２３ＩＵ／ｄＬ、約３０〜約４０ＩＵ／ｄＬ、約４０〜約５０ＩＵ／ｄＬ、約５０〜約６０ＩＵ／ｄＬ、約６０〜約７０ＩＵ／ｄＬ、約７０〜約８０ＩＵ／ｄＬ、約８０〜約９０ＩＵ／ｄＬ、約９０〜約１００ＩＵ／ｄＬ、約１１０〜約１２０ＩＵ／ｄＬ、約１２０〜約１３０ＩＵ／ｄＬ、約１３０〜約１４０ＩＵ／ｄＬまたは約１４０〜約１５０ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩトラフレベルを維持することを意味する。疾患または状態の処置または処置することは、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を、非血友病対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％または１５０％と同等のレベルに維持することを含むこともできる。処置のために必要とされる最小限のトラフレベルは、１つまたはそれ以上の公知の方法によって測定することができ、各個人のために調整する（増加または低下させる）ことができる。
【００７３】
本明細書で使用されるように、「投与すること」は、薬学的に許容される第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸分子、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、または本開示の第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸分子を含むベクターを、薬学的に許容される経路を通して対象に与えることを意味する。投与経路は静脈内、例えば、静脈内注射および静脈内注入であってよい。さらなる投与経路には、例えば、皮下、筋肉内、経口、経鼻および肺投与が含まれる。核酸分子、ポリペプチドおよびベクターは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一環として投与することができる。
【００７４】
本明細書で使用されるように、「それを必要とする対象」というフレーズは、例えば止血を向上させるために、本開示の核酸分子、ポリペプチドまたはベクターの投与から利益を受けるであろう哺乳動物対象などの対象を含む。一実施形態では、対象には、これらに限定されないが、血友病の個体が含まれる。別の実施形態では、対象には、これらに限定されないが、ＦＶＩＩＩ阻害物質を発生させ、したがってバイパス療法を必要とする個体が含まれる。対象は、成人または未成年（例えば、１２才未満）であってよい。
【００７５】
本明細書で使用されるように、用語「凝固因子」は、対象において出血エピソードを予防するかその期間を短くする、天然に存在するかまたは組換えで生成される分子またはその類似体を指す。言い換えると、それは、凝固促進活性を有する、すなわち、血液の凝集または凝固を引き起こす不溶性フィブリンのメッシュへのフィブリノーゲンの変換の役割を担う分子を意味する。「活性化可能な凝固因子」は、活性型に変換することが可能である不活性型（例えば、その酵素前駆体の形態）にある凝固因子である。
【００７６】
本明細書で使用されるように、凝固活性は、フィブリン凝塊の形成を完了させる、および／または大出血もしくは出血エピソードの重症度、期間もしくは頻度を低減する生化学反応のカスケードに参加する能力を意味する。
【００７７】
本明細書で使用されるように、用語「異種」または「外因性」は、所与の場面、例えば細胞またはポリペプチドにおいて通常は見出されない分子を指す。外因性または異種分子を細胞に導入することができ、例えばトランスフェクションまたは遺伝子操作の他の形態による細胞の操作の後にだけ存在するか、または異種アミノ酸配列が、それが天然に見出されないタンパク質に存在することができる。
【００７８】
本明細書で使用されるように、用語「異種ヌクレオチド配列」は、所与のポリヌクレオチド配列と一緒に天然に存在しないヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩの半減期を延長することが可能なポリペプチドをコードする。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩの流体力学半径を増加させるポリペプチドをコードする。他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、その生物活性にも機能（例えば、その凝血促進活性）にも有意に影響を与えることなく、ＦＶＩＩＩの１つまたはそれ以上の薬物動態学的特性を向上させるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドにリンカーによって連結または接続される。異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド部分の非限定的な例には、免疫グロブリン定常領域またはその一部、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、トランスフェリン、米国特許出願第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、アルブミン結合小分子、ＸＴＥＮ配列、ＦｃＲｎ結合部分（例えば、ＦｃＲｎに結合する完全Ｆｃ領域またはその部分）、単鎖Ｆｃ領域（ＳｃＦｃ領域、例えば、ＵＳ２００８／０２６０７３８、ＷＯ２００８／０１２５４３またはＷＯ２００８／１４３９５４５に記載のもの）、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、ペプチドおよびとりわけ５０％未満から５０％超の様々な程度の二次構造を有する、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される２つのタイプのアミノ酸の６〜４０アミノ酸の短いポリペプチド、またはその２つ以上の組合せが含まれる。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、非ポリペプチド部分に連結される。非ポリペプチド部分の非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合小分子、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体または任意のその組合せが含まれる。
【００７９】
本明細書で使用されるように、用語「Ｆｃ領域」は、天然のＩｇのＦｃ領域に対応するポリペプチドの部分、すなわち、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体結合によって形成されるものと規定される。天然のＦｃ領域は、別のＦｃ領域とホモダイマーを形成する。対照的に、本明細書で使用されるように、用語「遺伝子融合Ｆｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）は、単一のポリペプチド鎖の中で遺伝子的に連結される（すなわち、単一の連続した遺伝子配列にコードされる）Ｆｃドメインで構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。
【００８０】
一実施形態では、「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４としたときの、ＩｇＧの残基２１６）のすぐ上流のヒンジ領域から始まり抗体のＣ末端で終わる、単一のＩｇ重鎖の部分を指す。したがって、完全なＦｃドメインは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを少なくとも含む。
【００８１】
Ｉｇ定常領域のＦｃ領域は、Ｉｇアイソタイプにより、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびにヒンジ領域を含むことができる。ＩｇのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、安定性の増加、血清中半減期の増加（Ｃａｐｏｎら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５頁を参照のこと）、ならびに新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体への結合性を含むいくつかの望ましい特性をキメラタンパク質に与える（米国特許第６，０８６，８７５号、第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１）、これらは参照により本明細書に完全に組み入れる。
【００８２】
本開示のヌクレオチド配列との比較において本明細書で使用される場合、「参照ヌクレオチド配列」は、ＦＶＩＩＩ配列に対応する部分が最適化されていないこと以外は、本開示のヌクレオチド配列と事実上同一であるポリヌクレオチド配列である。例えば、配列番号１のコドン最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩおよび、その３’末端で配列番号１に連結される単鎖Ｆｃ領域をコードする異種ヌクレオチド配列からなる核酸分子のための参照ヌクレオチド配列は、配列番号１６の元の（または、「親」の）ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩおよび、その３’末端で配列番号１６（図１Ｉ）に連結される単鎖Ｆｃ領域をコードする同一の異種ヌクレオチド配列からなる核酸分子である。
【００８３】
本明細書で使用される「コドン適合指数」は、コドン使用頻度バイアスの尺度を指す。コドン適合指数（ＣＡＩ）は、遺伝子の参照セットに対する所与のタンパク質コード遺伝子配列の偏差を測定する（Ｓｈａｒｐ  ＰＭおよびＬｉ  ＷＨ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（３）：１２８１〜９５頁（１９８７））。ＣＡＩは、遺伝子配列の全長（コドンで測定された）にわたる各コドンに関連付けられた重量の幾何平均を求めることによって計算される：
【数１】
2021512126.tif 000002
【００８４】
アミノ酸ごとに、ＣＡＩにおけるそのコドンの各々の重量は、コドンの観察された頻度（ｆｉ）とそのアミノ酸の同義コドン（ｆｊ）の頻度の間の比として計算される：
【数２】
2021512126.tif 000003
【００８５】
本明細書で使用されるように、ヌクレオチド配列に関する用語「最適化される」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指し、ここで、ポリヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチド配列の特性を強化するように突然変異している。一部の実施形態では、最適化は、転写レベルを増加させるために、翻訳レベルを増加させるために、定常状態のｍＲＮＡレベルを増加させるために、基本転写因子などの調節タンパク質の結合性を増減するために、スプライシングを増減するために、または、ポリヌクレオチド配列によって生成されるポリペプチドの収量を増加させるために実行される。それを最適化するためにポリヌクレオチド配列に加えることができる変更の例には、コドン最適化、Ｇ／Ｃ含有量最適化、反復配列の除去、冨ＡＴエレメントの除去、潜在性スプライス部位の除去、転写または翻訳を抑圧するシス作用性エレメントの除去、ポリＴまたはポリＡ配列を加えるか除去すること、転写開始部位の周囲にコザックコンセンサス配列などの転写を強化する配列を加えること、ステムループ構造を形成するかもしれない配列の除去、不安定化配列の除去、および２つ以上のその組合せが含まれる。
【００８６】
ＩＩ．ＦＶＩＩＩレンチウイルス遺伝子療法
出血障害、特に血友病Ａのための可能な処置として、体細胞遺伝子療法が探求された。遺伝子療法は、ＦＶＩＩＩをコードするベクターの単回投与の後のＦＶＩＩＩの連続的内因性生成を通して血友病を治療するその能力のために、血友病のための特に魅力的な治療法である。血友病Ａは、その臨床上の発現症状が血漿の中を微量（２００ｎｇ／ｍｌ）で循環する単一遺伝子生成物（ＦＶＩＩＩ）の欠乏に完全に起因しているので、遺伝子補充アプローチに好適である。
【００８７】
レンチウイルスベクターは、組入れを通して導入遺伝子発現を持続するそれらの大きな包容力および能力のために、遺伝子送達ビヒクルとして注目を集めている。レンチウイルスベクターは多数のｅｘ−ｖｉｖｏ細胞療法臨床プログラムで評価され、有望な効能および安全性プロファイルをもたらしている。
【００８８】
本開示は、遺伝子療法方法において使用されるとき、対象における発現の増加を実証し、より大きな治療効能を潜在的にもたらす、コドン最適化ＦＶＩＩＩ配列を含むレンチウイルスベクターを提供することによって、当技術分野の重要な必要性を満たす。本開示の実施形態は、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上のコドン最適化核酸分子を含むレンチウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含む宿主細胞（例えば、肝細胞）、および、開示されるレンチウイルスベクターの使用方法（例えば、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターを使用した出血障害のための治療法）に関する。
【００８９】
一般に、本明細書に開示される処置の方法は、ＦＶＩＩＩ凝固因子をコードする少なくとも１つのコドン最適化核酸配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクターの投与を含み、ここで、ＦＶＩＩＩ凝固因子をコードする核酸配列は好適な発現制御配列に作動可能に連結され、それは、一部の実施形態では、レンチウイルスベクター（例えば、複製欠陥レンチウイルスウイルスベクター）に組み込まれる。
【００９０】
本開示は、それを必要とする対象において出血障害（例えば、血友病Ａ）を処置する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの、５×１０１０以下の形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）（または１０９以下のＴＵ／ｋｇ、または１０８以下のＴＵ／ｋｇ）の少なくとも１用量を対象に投与することを含む方法を提供し、ここで、ヌクレオチド配列は：
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｖ）配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｖｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ）配列番号６のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または
（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の任意の組合せ
を有する。
【００９１】
本開示は、それを必要とする対象において出血障害（例えば、血友病Ａ）を処置する方法であって、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの、５×１０１０以下の形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）（または１０９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０８ＴＵ／ｋｇ以下）の少なくとも１用量を対象に投与することを含む方法も提供し；
（ａ）ここで、第１の核酸配列は、
（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または
（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性
を有し、
（ｂ）ここで、第２のヌクレオチド配列は、
（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；
（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性；または
（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性
を有し、または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の任意の組合せ
であり、
ここで、Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【００９２】
一部の実施形態では、用量は、約５．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０１０ＴＵ／ｋｇまたは約１．０×１０１０ＴＵ／ｋｇである。
【００９３】
一部の実施形態では、用量は、約９．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約９．０×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約８．０×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約７．０×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約６．０×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約５．０×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０９ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０９ＴＵ／ｋｇまたは約１．０×１０９ＴＵ／ｋｇである。
【００９４】
一部の実施形態では、用量は、約９．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約９．０×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約８．０×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約７．０×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約６．０×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約５．０×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０８ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０８ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０８ＴＵ／ｋｇまたは約１．０×１０８ＴＵ／ｋｇである。
【００９５】
一部の実施形態では、用量は、５．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．６×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．１×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．６×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．１×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．６×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．１×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．６×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．１×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満、または１．０×１０１０ＴＵ／ｋｇ未満である。
【００９６】
一部の実施形態では、用量は、９．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、９．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、８．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、７．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、６．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、５．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、４．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、３．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、２．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．９×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．８×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．７×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．６×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．４×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．３×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．２×１０９ＴＵ／ｋｇ未満、１．１×１０９ＴＵ／ｋｇ未満または１．０×１０９ＴＵ／ｋｇ未満である。
【００９７】
一部の実施形態では、用量は、９．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、９．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、８．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、７．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、６．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、５．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、４．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、３．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、２．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．９×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．８×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．７×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．６×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．４×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．３×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．２×１０８ＴＵ／ｋｇ未満、１．１×１０８ＴＵ／ｋｇ未満または１．０×１０８ＴＵ／ｋｇ未満である。
【００９８】
一部の実施形態では、用量は、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、５．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、６×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、６．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、７×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、８×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、８．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、９×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、９．５×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、６×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、７×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、８×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、８．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、９×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、９．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１０１０ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇまたは４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇである。
【００９９】
一部の実施形態では、用量は、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜４．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜４×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜３．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜３×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜２．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜１０１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜９×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜８．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜８×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜７．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜７×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜６×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜４．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜４×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜３×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜２×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜１．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜１×１０９ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜９．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜９×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜８．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜８×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜７．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜７×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜６．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜６×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜４．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜４×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜３．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜３×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜２．５×１０８ＴＵ／ｋｇ、１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜２×１０８ＴＵ／ｋｇ、または１×１０８ＴＵ／ｋｇ〜１．５×１０８ＴＵ／ｋｇである。
【０１００】
一部の実施形態では、用量は、１×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜２×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．１×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜１．９×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．２×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜１．８×１０１０ＴＵ／ｋｇ、１．３×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜１．７×１０１０ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０１０ＴＵ／ｋｇ〜１．６×１０１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、約１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、１．５×１０１０ＴＵ／ｋｇである。
【０１０１】
一部の実施形態では、用量は、１×１０９ＴＵ／ｋｇ〜２×１０９ＴＵ／ｋｇ、１．１×１０９ＴＵ／ｋｇ〜１．９×１０９ＴＵ／ｋｇ、１．２×１０９ＴＵ／ｋｇ〜１．８×１０９ＴＵ／ｋｇ、１．３×１０９ＴＵ／ｋｇ〜１．７×１０９ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０９ＴＵ／ｋｇ〜１．６×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、１．５×１０９ＴＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、用量は、約３．０×１０９ＴＵ／ｋｇである。
【０１０２】
一部の実施形態では、用量は、２．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．６×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．７×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、２．８×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、または２．９×１０９ＴＵ／ｋｇ〜３．１×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、約３．０×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、３．０×１０９ＴＵ／ｋｇである。
【０１０３】
一部の実施形態では、用量は、５．５×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．５×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．６×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．４×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．７×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．３×１０９ＴＵ／ｋｇ、５．８×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．２×１０９ＴＵ／ｋｇ、または５．９×１０９ＴＵ／ｋｇ〜６．１×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、約６．０×１０９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、６．０×１０９ＴＵ／ｋｇである。
【０１０４】
一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与の２４時間、３６時間または４８時間後の血漿ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む核酸分子を含む参照ベクターを投与した対象における血漿ＦＶＩＩＩ活性と比較して増加する。
【０１０５】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの投与の４８時間後の血漿ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む核酸分子を含む参照ベクターを投与した対象における血漿ＦＶＩＩＩ活性と比較して増加する。
【０１０６】
別の実施形態では、配列番号１６を含む参照核酸分子、参照核酸分子を含む参照ウイルスベクター、または参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象と比較して、レンチウイルスベクターの投与の約２１日後に血漿ＦＶＩＩＩ活性は増加する。
【０１０７】
一部の実施形態では、血漿ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む参照核酸分子、参照核酸分子を含む参照ウイルスベクター、または参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象と比較して、レンチウイルスベクターの投与の約６時間後、約１２時間後、約１８時間後、約２４時間後、約３６時間後、約４８時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、約１０日後、約１１日後、約１２日後、約１３日後、約１４日後、約１５日後、約１６日後、約１７日後、約１８日後、約１９日後、約２０日後、約２１日後、約２２日後、約２３日後、約２４日後、約２５日後、約２６日後、約２７日後、または約２８日後に増加する。
【０１０８】
一部の実施形態では、対象における血漿ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む参照核酸分子を投与した対象におけるレベルと比較して、または参照核酸分子を含む参照ウイルスベクターを投与した対象におけるレベルと比較して、または参照核酸分子によってコードされるポリペプチドの投与の後の対象におけるレベルと比較して、対象における基礎レベルに関して少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍に増加する。
【０１０９】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、単一用量または複数用量で投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、一度に投与されるか、または複数の部分用量、例えば、２つの部分用量、３つの部分用量、４つの部分用量、５つの部分用量、６つの部分用量もしくは６を超える部分用量に分割される。一部の実施形態では、１を超えるレンチウイルスベクターが投与される。
【０１１０】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回または少なくとも１０回繰り返して投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、静脈内注射を通して投与される。
【０１１１】
一部の実施形態では、対象は小児対象であるが、他の態様では、対象は成人対象である。
【０１１２】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの組織特異的プロモーター、すなわち、特定の組織または細胞型におけるＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を調節するだろうプロモーターを含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの中の組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する。一部の実施形態では、標的肝臓細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。一部の実施形態では、標的肝臓細胞は、肝細胞である。
【０１１３】
レンチウイルスベクターは全ての肝臓細胞型を形質導入させることができるので、異なる細胞型における導入遺伝子（例えば、ＦＶＩＩＩ）の発現は、レンチウイルスベクターの中の異なるプロモーターを使用して制御することができる。したがって、レンチウイルスベクターは、異なる組織または細胞型、例えば異なる肝臓組織または細胞型におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現を制御するだろう特異的プロモーターを含むことができる。したがって、一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓内皮組織におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現を制御するだろう内皮特異的プロモーター、または、肝細胞におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現を制御する肝細胞特異的プロモーター、または両方を含むことができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓以外の組織におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現を制御する１つの組織特異的プロモーターまたは複数の組織特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、標的細胞または標的組織のゲノム、例えば、肝細胞のゲノムまたは肝臓の内皮細胞のゲノムに安定して組み入れられる。
【０１１５】
一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中のＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６（配列番号７１）を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【０１１６】
他の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中のＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ（配列番号７２）を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【０１１７】
一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中のＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、ここで、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１〜５７；（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１〜５７；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜５７；（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜５７；（ｖ）配列番号５のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉ）配列番号６のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉｉｉ）配列番号７１のヌクレオチド１〜５７；または（ｉｘ）配列番号６８のヌクレオチド１〜５７に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中の単離された核酸分子は、以下からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を含む：（ａ）核酸分子またはその一部のヒトコドン適合指数は、配列番号１６と比較して増加する；（ｂ）ヌクレオチド配列またはその一部の最適コドン頻度は、配列番号１６と比較して増加する；（ｃ）ヌクレオチド配列またはその一部は、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの百分率と比較してより高いＧ／Ｃヌクレオチドの百分率を含有する；（ｄ）ヌクレオチド配列またはその一部の相対的同義コドン使用頻度は、配列番号１６と比較して増加する；（ｅ）ヌクレオチド配列またはその一部のコドンの有効数は、配列番号１６と比較して低減する；（ｆ）ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列（配列番号２１および２２）を含有する；（ｇ）ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメント（配列番号２３および２４）を含有する；ならびに（ｈ）その任意の組合せ。
【０１１９】
一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中の単離された核酸分子は、異種アミノ酸配列（例えば、半減期延長剤）をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、ＸＴＥＮ、トランスフェリン、アルブミンまたはＰＡＳ配列である。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に連結されるか、または、表３から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の中の２つのアミノ酸の間に挿入される。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、完全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである。
【０１２１】
本明細書に開示されるレンチウイルスベクターは、出血凝固障害、出血性関節症、筋肉ブリード、口ブリード、出血、筋肉への出血、口出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血および腸腰筋鞘における出血からなる群から選択される出血性疾患または障害の処置への治療的に有益だろう遺伝子療法アプローチを使用して、哺乳動物、例えばヒト患者において、ｉｎ  ｖｉｖｏで低い投薬量（例えば、１０１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０８ＴＵ／ｋｇ以下）で使用することができる。一実施形態では、出血性の疾患または障害は、血友病である。別の実施形態では、出血性の疾患または障害は、血友病Ａである。
【０１２２】
一部の実施形態では、標的細胞（例えば、肝細胞）は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの低い用量（例えば、１０１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０８ＴＵ／ｋｇ以下）により、患者に投与される前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理される。ある特定の実施形態では、標的細胞（例えば、肝細胞）は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの約３．０×１０９ＴＵ／ｋｇにより、患者に投与される前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理される。さらに別の実施形態では、患者からの細胞（例えば、肝細胞）は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの低い用量（例えば、１０１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０８ＴＵ／ｋｇ以下）により、患者に投与される前にｅｘ  ｖｉｖｏで処理される。
【０１２３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの投与（例えば、１０１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０８ＴＵ／ｋｇ以下で投与される）後の血漿ＦＶＩＩＩ活性は、生理的に正常な循環ＦＶＩＩＩレベルと比較して少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも約２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％増加する。
【０１２４】
一実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与後の血漿ＦＶＩＩＩ活性は、生理的に正常な循環ＦＶＩＩＩレベルと比較して少なくとも約３，０００％〜約５，０００％増加する。一部の実施形態では、本明細書に記載される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの投与の２１日後、血漿ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む参照核酸分子を含む対応するレンチウイルスベクターを投与した対象と比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍増加する。
【０１２５】
本開示は、それを必要とする対象において止血障害（例えば、血友病Ａなどの出血障害）を処置、予防または改善する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの治療的有効量を対象に投与することを含み、ここで、レンチウイルスベクターは、５×１０１０以下のＴＵ／ｋｇ、１０９以下のＴＵ／ｋｇ、または１０８以下のＴＵ／ｋｇの少なくとも１用量で投与される、方法も提供する。
【０１２６】
本開示のレンチウイルスベクターによる処置、改善および予防は、バイパス療法であってよい。バイパス療法を受ける対象は、凝固因子、例えばＦＶＩＩＩへの阻害物質が既に生じているか、または凝固因子阻害物質を生じやすくてもよい。
【０１２７】
本開示のレンチウイルスベクターは、フィブリンクロットの形成を促進することによって、止血障害を処置または予防する。本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、凝固カスケードのメンバーを活性化することができる。凝固因子は、外因性の経路、内因性の経路または両方における参加者であってよい。
【０１２８】
本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＶＩＩＩで治療できることが知られている止血障害を処置するために使用することができる。本開示の方法を使用して処置できる止血障害には、限定されずに、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンウィルブラント病、第ＸＩ因子欠乏症（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠乏症、ならびにフィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠乏症または構造的な異常、出血性関節症、筋肉ブリード、口ブリード、出血、筋肉への出血、口出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血および腸腰筋鞘における出血が含まれる。
【０１２９】
対象への投与のための組成物は、ＦＶＩＩＩ凝固因子（遺伝子療法適用のために）ならびにＦＶＩＩＩポリペプチド分子をコードする本開示の最適化ヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、投与のための組成物は、本開示のレンチウイルスベクターとｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させた細胞である。
【０１３０】
一部の実施形態では、止血障害は、遺伝性の障害である。一実施形態では、対象は、血友病Ａを有する。他の実施形態では、止血障害は、ＦＶＩＩＩの欠乏症の結果である。他の実施形態では、止血障害は、欠陥のあるＦＶＩＩＩ凝固因子の結果であってよい。
【０１３１】
別の実施形態では、止血障害は、後天性の障害であってよい。後天性の障害は、根底にある二次性の疾患または状態から生じることができる。無関係な状態は、一例として、しかし限定されずに、がん、自己免疫性疾患または妊娠であってよい。後天性の障害は、高齢から、または根底にある二次性の障害を処置するための医薬品（例えば、がん化学療法）から生じることができる。
【０１３２】
本開示は、止血障害または止血障害の獲得をもたらす二次性の疾患もしくは状態を有しない対象を処置する方法にも関する。したがって、本開示は、全身止血剤を必要とする対象を処置する方法であって、本開示のレンチウイルスベクターの治療的有効量を投与することを含む方法に関する。例えば、一実施形態では、全身止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、または受けようとしている。本開示のレンチウイルスベクターは、予防薬として手術の前後に投与することができる。
【０１３３】
本開示のレンチウイルスベクターは、急性出血症状を制御するために、手術中に、または術後に投与することができる。手術には、肝移植、肝臓切除または幹細胞移植を限定されずに含めることができる。
【０１３４】
別の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、止血障害を有していない急性出血症状を有する対象を処置するために使用することができる。急性出血症状は、重度の外傷、例えば、手術、自動車事故、創傷、裂傷銃撃または無制御の出血をもたらす任意の他の外傷事象から生じることができる。
【０１３５】
レンチウイルスベクターは、止血障害を有する対象を予防的に処置するために使用することができる。レンチウイルスベクターは、止血障害を有する対象で急性出血症状を処置するために使用することもできる。
【０１３６】
別の実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの投与および／またはＦＶＩＩＩタンパク質導入遺伝子の以降の発現は、対象において免疫応答を誘導しない。一部の実施形態では、免疫応答は、ＦＶＩＩＩに対する抗体の発達を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、サイトカイン分泌を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞およびＴ細胞の両方の活性化を含む。一部の実施形態では、免疫応答は阻害性免疫応答であり、ここでは、対象における免疫応答は、免疫応答を起こさなかった対象におけるＦＶＩＩＩの活性と比較してＦＶＩＩＩタンパク質の活性を低減する。ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与によるＦＶＩＩＩタンパク質の発現は、ＦＶＩＩＩタンパク質または単離された核酸分子もしくはレンチウイルスベクターから発現されるＦＶＩＩＩタンパク質に対する阻害性免疫応答を阻止する。
【０１３７】
一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、止血を促進する少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて投与される。止血を促進する前記他の薬剤は、実証された凝固活性を有する治療薬である。一例として、しかし限定されずに、止血剤は、第Ｖ因子、Ｖ第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビンまたはフィブリノーゲン、または前のいずれかの活性型を含むことができる。凝固因子または止血剤は、抗線維素溶解薬、例えば、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸を含むこともできる。
【０１３８】
本開示の一実施形態では、組成物（例えば、レンチウイルスベクター）は、対象に投与されたときにＦＶＩＩＩが活性化可能な形態で存在するものである。そのような活性化可能な分子は、対象への投与の後に凝固部位においてｉｎ  ｖｉｖｏで活性化させることができる。
【０１３９】
本開示のレンチウイルスベクターは、静脈内、皮下、筋肉内に、または任意の粘膜表面を通して、例えば、経口、舌下、口腔内、舌下、経鼻、直腸、経膣により、または肺経路を通して投与することができる。レンチウイルスベクターは、所望の部位へのベクターの徐放を可能にするバイオポリマー固体支持体の中に植え込むか、またはそれに連結させることができる。
【０１４０】
一実施形態では、レンチウイルスベクターの投与経路は、非経口である。本明細書で用いる用語非経口は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与を含む。非経口投与の静脈内形態が好ましい。投与の全てのこれらの形態は本開示の範囲内にあると明らかに予想されるが、特に静脈内または動脈内の注射または点滴のためには、投与のための形態は注射用溶液になるだろう。通常、注射のための好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含むことができる。しかし、本明細書の教示に適合する他の方法では、レンチウイルスベクターは、有害な細胞集団の部位に直接的に送達し、それによって、治療剤への患部組織の曝露を増加させることができる。
【０１４１】
非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。本開示では、薬学的に許容される担体には、限定されずに、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％食塩水が含まれる。他の一般的非経口ビヒクルには、リン酸ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、補液および栄養素補液、電解質補液、例えば、リンガーブドウ糖をベースにするものなどが含まれる。保存剤および他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。
【０１４２】
より詳細には、注射用に適する医薬組成物には、無菌の水性溶液（水溶性）または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液の即時使用調製物のための無菌の粉末が含まれる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易な注射針通過が存続する程度まで流動性であるべきである。それは、製造および保存条件下で安定であるべきであり、好ましくは細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であってもよい。例えばレシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合は要求される粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。
【０１４３】
微生物活動の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合には、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含ませることが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含ませることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。
【０１４４】
いずれの場合にも、無菌の注射溶液は、必要に応じて本明細書に列挙された成分の１つまたはその組合せと一緒に、適当な溶媒に必要な量で活性化合物（例えば、ポリペプチド自体または他の活性剤との組合せ）を組み込み、続いて濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクルの中に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、有効成分と前もって濾過滅菌したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を与える、真空乾燥およびフリーズドライである。注射のための調製物は、加工されて、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルなどの容器に充てんされ、当技術分野で公知の方法により、無菌条件下で密封される。さらに、調製物は、キットの形でパッケージして、販売することができる。そのような製造品は、関連する組成物が、凝固障害を患っているかまたはその素因を有する対象を処置するために有益であることを示すラベルまたは添付文書を好ましくは有する。
【０１４５】
医薬組成物は、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐薬または停留浣腸として直腸投与のために製剤化することもできる。
【０１４６】
状態の処置のための本開示の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与される他の医薬品、および処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含む、多くの異なる因子によって異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を処置することもできる。安全性および効能を最適化するために、当業者に公知であるルーチンの方法を使用して、処置投薬量を滴定することができる。
【０１４７】
レンチウイルスベクターは、単一の用量としてまたは複数用量として投与することができ、ここで、複数用量は連続的にまたは特定の時間間隔で投与することができる。最適な用量範囲および／または投与スケジュールを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いることができる。凝固因子活性を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、当技術分野で公知である。さらに、有効用量は、動物モデル、例えば血友病のイヌ（Ｍｏｕｎｔら  ２００２年、Ｂｌｏｏｄ  ９９（８）：２６７０頁）から得られる用量反応曲線から推定することができる。
【０１４８】
上記の範囲内の中間の用量も、本開示の範囲内にあるものである。そのような用量を毎日、隔日、毎週または実験的分析によって判定される任意の他のスケジュールにしたがって、対象に投与することができる。例示的な処置は、長期、例えば少なくとも６カ月にわたる複数の投薬による投与を必要とする。
【０１４９】
本開示のレンチウイルスベクターは、複数の機会に投与することができる。単一の投薬の間隔は、日単位、週単位、月単位または年単位であってもよい。患者での改変されたポリペプチドまたは抗原の血中レベルの測定によって指示されるとき、間隔は不規則であってもよい。本開示のレンチウイルスベクターの投薬量および頻度は、患者における導入遺伝子によってコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドの半減期によって異なる。
【０１５０】
本開示のレンチウイルスベクターの投与の投薬量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかによって異なってもよい。予防的適用では、本開示のレンチウイルスベクターを含有する組成物は、患者の抵抗性を強化するかまたは疾患の影響を最小にするために、疾患状態にまだない患者に投与される。そのような量は、「予防的有効用量」と規定される。長期間にわたって比較的低い頻度の間隔で、比較的低い投薬量が投与される。一部の患者は、残りの存命期間中、処置を受け続ける。
【０１５１】
本開示のレンチウイルスベクターは、場合により、処置（例えば、予防的または治療的）を必要とする障害または状態の処置で有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０１５２】
本明細書で使用されるように、補助療法と一緒のまたは組み合わせた本開示のレンチウイルスベクターの投与は、療法および開示されるポリペプチドの逐次的、同時、共存する、並行した、併存する、または同時発生的投与または適用を意味する。当業者は、組み合わせた治療レジメンの様々な構成成分の投与または適用の時間は、処置の全体的効果を強化するために調整することができることを理解するであろう。当業者（例えば、医師）は、選択される補助療法および本明細書の教示に基づいて、不相応な実験なしで有効な併用療法レジメンを見極めることが容易にできるだろう。
【０１５３】
本開示のレンチウイルスベクターは、薬剤または複数の薬剤と（例えば、併用療法レジメンを提供するために）一緒にまたは組み合わせて使用することができることがさらに理解される。本開示のレンチウイルスベクターと組み合わせることができる例示的な薬剤には、処置する特定の障害のための現在の医療標準に相当する薬剤が含まれる。そのような薬剤は、性質が化学的または生物学的であってよい。用語「生物学的」または「生物学的薬剤」は、生体および／またはそれらの生成物から作製される、治療薬としての使用を目的にした任意の薬学的に活性な薬剤を指す。
【０１５４】
本開示のレンチウイルスベクターと組み合わせて使用される薬剤の量は、対象によって異なることができるか、または当技術分野で公知であるものによって投与することができる。例えば、ＧＯＯＤＭＡＮ  ＆  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ  １２３３〜１２８７頁の、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、第９版１９９６年）を参照。別の実施形態では、医療標準と一貫したそのような薬剤の量が、投与される。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、免疫抑制薬、抗アレルギーまたは抗炎症剤と一緒に投与される。これらの薬剤は、本明細書において処置される対象の免疫系を抑制するかまたは覆い隠す作用をする物質を一般に指す。これらの薬剤には、サイトカイン生成を抑制するか、自己抗原発現を下方制御もしくは抑制するか、またはＭＨＣ抗原を覆い隠す物質が含まれる。そのような薬剤の例には、２−アミノ−６−アリール−５置換ピリミジン；アザチオプリン；シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片のための抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；糖質副腎皮質ステロイドなどのステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンおよびデキサメタゾン；抗インターフェロン−γ、−βまたは−α抗体、抗腫瘍壊死因子−α抗体、抗腫瘍壊死因子−β抗体、抗インターロイキン−２抗体および抗ＩＬ−２受容体抗体を含むサイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種の抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ−Ｔ抗体；ＬＦＡ−３結合性ドメインを含有する可溶性ペプチド；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアリン；およびラパマイシンが含まれる。ある特定の実施形態では、薬剤は、抗ヒスタミン剤である。本明細書で使用される「抗ヒスタミン剤」は、ヒスタミンの生理作用と拮抗する薬剤である。抗ヒスタミン剤の例は、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン、クロモリンナトリウム、アステミゾール、マレイン酸アザタジン、マレイン酸ブロフェニラミン、マレイン酸カルビノキサミン、塩酸セチリジン、フマル酸クレマスチン、塩酸シプロヘプタジン、ｄ−マレイン酸ブロムフェニラミン、ｄ−マレイン酸クロルフェニラミン、ジメンヒドリネート、塩酸ジフェンヒドラミン、コハク酸ドキシラミン、塩酸フェキソフェンダジン、塩酸テルフェナジン、塩酸ヒドロキシジン、ロラチジン、塩酸メクリジン、クエン酸トリペラナミン、塩酸トリペレナミンおよび塩酸トリプロリジンである。
【０１５６】
免疫抑制、抗アレルギーまたは抗炎症性の薬剤を、レンチウイルスベクター投与レジメンに組み込むことができる。例えば、免疫抑制または抗炎症性の薬剤の投与は、開示されるレンチウイルスベクターの投与の前に開始することができ、その後単回またはそれ以上の回数の投与を続けることができる。ある特定の実施形態では、免疫抑制または抗炎症性の薬剤は、レンチウイルスベクターの前投薬として投与される。
【０１５７】
以前に議論したように、本開示のレンチウイルスベクターは、凝固障害のｉｎ  ｖｉｖｏ処置のための薬学的に有効な量で投与することができる。この点に関しては、本開示のレンチウイルスベクターは、投与を促進し、活性剤の安定性を促進するために製剤化することができることが理解される。好ましくは、本開示による医薬組成物は、生理的食塩水、無毒の緩衝液、保存剤などの薬学的に許容される、無毒の無菌の担体を含む。当然ながら、本開示の医薬組成物は、ポリペプチドの薬学的に有効な量を提供するために、単一のまたは複数の用量で投与することができる。
【０１５８】
凝固系の機能を調査するために、いくつかの試験が利用可能である：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭ（登録商標）アッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲを判定するためにも使用される）、フィブリノーゲン試験（しばしばクラウス方法による）、血小板数、血小板機能試験（しばしばＰＦＡ−１００による）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿を正常な血漿と混合した場合に異常が修正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ−二量体、遺伝子検査（例えば、Ｖ因子ライデン、プロトロンビン突然変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセルクサリヘビ蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、その他の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはオイグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。
【０１５９】
ａＰＴＴ試験は、「内因性」（接触活性化経路とも呼ばれる）および一般的な凝固経路の効能を測定する性能指示器である。この試験は、市販されている組換え凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固活性を測定するために一般的に使用される。それは、外因性の経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と一緒に使用される。
【０１６０】
ＲＯＴＥＭ（登録商標）分析は、止血の完全なカイネティクス：凝固時間、クロット形成、クロットの安定性および溶解に関する情報を提供する。トロンボエラストメトリーにおける異なるパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線溶またはこれらの相互作用に影響する多くの因子に依存する。このアッセイは、二次性の止血の完全な像を提供することができる。
【０１６１】
ＩＩＩ．レンチウイルスベクター
レンチウイルスには、ウシレンチウイルス群、ウマレンチウイルス群、ネコレンチウイルス群、ヒツジヤギレンチウイルス群および霊長類レンチウイルス群のメンバーが含まれる。遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの開発は、Ｋｌｉｍａｔｃｈｅｖａら（１９９９）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４：４８１〜４９６頁にレビューされている。遺伝子療法のために好適なレンチウイルスベクターの設計および使用は、例えば、米国特許第６，２０７，４５５号および第６，６１５，７８２号に記載されている。レンチウイルスの例には、限定されずに、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２偽型、ＨＩＶ−１／ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびウシ免疫不全ウイルスが含まれる。
【０１６２】
本開示のレンチウイルスベクターの概略図は、図１９に提示される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、「第三世代」レンチウイルスベクターである。本明細書で使用されるように、用語「第三世代」レンチウイルスベクターは、第二世代ベクターシステムの特徴を有し、機能的ｔａｔ遺伝子をさらに欠いているレンチウイルスパッケージングシステム、例えばｔａｔ遺伝子が欠失しているかまたは不活性化されているものを指す。一般的に、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別個の発現構築物の上で提供される。例えば、Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３〜８４７１頁を参照。本明細書で使用されるように、「第二世代」レンチウイルスベクターシステムは、機能的アクセサリー遺伝子を欠いているレンチウイルスパッケージングシステム、例えば、アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失しているかまたは不活性化されているものを指す。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１〜８７５頁を参照。本明細書で使用されるように、「パッケージングシステム」は、組換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス構築物のセットを指す。一般的に、パッケージングシステムの構築物は、パッケージング細胞に最終的に組み込まれる。
【０１６３】
一部の実施形態では、本開示の第三世代レンチウイルスベクターは、自己不活性化レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ．Ｇ偽型レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子発現のための肝細胞特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、肝細胞特異的プロモーターは、強化されたトランスチレチンプロモーターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子生成物への免疫応答を低減するために、ｍｉＲ−１４２のための１つまたはそれ以上の標的配列を含む。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中へｍｉＲ−１４２のための１つまたはそれ以上の標的配列を組み込むことは、所望の導入遺伝子発現プロファイルを可能にする。例えば、ｍｉＲ−１４２のための１つまたはそれ以上の標的配列を組み込むことは、血管内および血管外の造血系における導入遺伝子発現を抑制することができるが、導入遺伝子発現は非造血細胞において維持される。本開示のレンチウイルスベクターシステムで処置した腫瘍傾向のあるマウスでは、いかなる発がんも検出されていない。Ｂｒｏｗｎら（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １１０：４１４４〜５２頁、Ｂｒｏｗｎら（２００６）Ｎａｔ．Ｎｅｄ．１２：５８５〜９１頁およびＣａｎｔｏｒｅら（２０１５）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７（２７７）：２７７ｒａ２８を参照。
【０１６４】
本開示のレンチウイルスベクターは、本明細書に記載されるＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質のための最適化されたコード配列は、発現制御配列に作動可能に連結される。本明細書で使用されるように、２つの核酸配列は、それらが、各構成成分核酸配列がその機能を保持することを可能にするような方法で共有結合するとき、作動可能に連結される。コード配列および遺伝子発現制御配列は、それらが、コード配列の発現または転写および／または翻訳を遺伝子発現制御配列の影響下または制御下に置くような方法で共有結合するとき、作動可能に連結すると言われる。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を誘導するプロモーター領域の能力に干渉しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物をタンパク質に翻訳する能力に干渉しない場合、作動可能に連結すると言われる。したがって、遺伝子発現配列は、結果として生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、遺伝子発現配列がそのコード核酸配列の転写を実行することが可能ならば、コード核酸配列に作動可能に連結されているだろう。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することが可能な組換えレンチウイルスのベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓細胞（例えば、肝細胞）に感染することが可能な組換えレンチウイルスのベクターである。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、レトロウイルスで見出される３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを一般的に有し、これらには２つの長い末端反復配列（ＬＴＲ）配列が隣接する。ｇａｇ遺伝子は、内部構造的な（マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし；ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する役目をする。ＬＴＲは、ウイルス複製のために必要な全ての他のシス作用性配列を含有する。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘ（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２および／またはＳＩＶにおける）を含む追加の遺伝子を有する。
【０１６６】
ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合性部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なキャプシド形成（Ｐｓｉ部位）のために必要な配列は、５’ＬＴＲに隣接している。キャプシド形成（または、感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）のために必要な配列がウイルスゲノムから欠落している場合、シス欠陥はゲノムＲＮＡのキャプシド形成を阻止する。
【０１６７】
しかし、結果として生じる突然変異体は、全てのビリオンタンパク質の合成を誘導することが可能なままである。本開示は、非分裂細胞に感染することが可能な組換えレンチウイルスを生成する方法であって、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔを有する２つまたはそれ以上のベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトすることを含む方法を提供する。本明細書で下に開示されるように、ある特定の適用のために機能的ｔａｔ遺伝子を欠くベクターが望ましい。したがって、例えば、第１のベクターは、ウイルスのｇａｇおよびウイルスのｐｏｌをコードする核酸を提供することができ、別のベクターは、ウイルスのｅｎｖをコードする核酸を提供してパッケージング細胞を生成することができる。本明細書でトランスファーベクターと特定される異種遺伝子をそのパッケージング細胞に提供するベクターを導入することは、目的の外来遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を放出する産生細胞を与える。
【０１６８】
ベクターおよび外来遺伝子の上記の構成により、第２のベクターは、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子をコードする核酸を提供することができる。ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルスを含むほとんどいかなる好適なウイルスから導くことができる。一部の実施形態では、ｅｎｖタンパク質は、ヒトおよび他の種の細胞の形質導入を可能にする広宿主性エンベロープタンパク質である。
【０１６９】
レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例には、以下のものが限定されずに含まれる：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶまたはＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶまたはＨＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶまたはＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶまたはＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。他のｅｎｖ遺伝子、例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）プロテインＧ（ＶＳＶ  Ｇ）、肝炎ウイルスおよびインフルエンザのそれも使用することができる。一部の実施形態では、ウイルスのｅｎｖ核酸配列は、本明細書の他の場所に記載される調節配列と作動可能に会合する。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するベクターの能力を損なうことなしに、ＨＩＶ病原性遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失している。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域の欠失を含む。Ｕ３領域の欠失は、完全な欠失または部分的欠失であってもよい。
【０１７１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を含む本開示のレンチウイルスベクターは、細胞の中で、（ａ）ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）異種ｅｎｖ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列；にトランスフェクトすることができ、ここで、レンチウイルスベクターは機能的ｔａｔ遺伝子を欠いている。他の実施形態では、細胞は、ｒｅｖ遺伝子を含む第４のヌクレオチド配列でさらにトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘおよびｎｅｆ、またはその組合せから選択される機能的遺伝子を欠いている。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ｇａｇタンパク質、Ｒｅｖ応答エレメント、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）またはその任意の組合せをコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドの標的化および／または活性を向上させる１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に発現する。１つまたはそれ以上のポリペプチドは、レンチウイルスベクターがコードすることができるか、または宿主細胞からのレンチウイルスベクターの出芽の間に組み入れることができる。レンチウイルスの生成の間、ウイルス粒子は産生宿主細胞から出芽する。出芽の過程で、ウイルス粒子は脂質コートを身につけ、それは宿主細胞の脂質膜に由来する。その結果、ウイルス粒子の脂質コートは、宿主細胞の表面に前から存在していた膜結合ポリペプチドを含むことができる。
【０１７４】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト対象への投与の後にレンチウイルスベクターへの免疫応答を抑制する１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に発現する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの表面は、１つまたはそれ以上のＣＤ４７分子を含む。ＣＤ４７は「自己のマーカー」タンパク質であり、それはヒト細胞の上で遍在的に発現される。ＣＤ４７の表面発現は、ＣＤ４７およびマクロファージによって発現されるＳＩＲＰαの相互作用を通して、内在性細胞のマクロファージ誘導食作用を抑制する。高レベルのＣＤ４７を発現する細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトマクロファージの標的にされ、破壊される可能性は低い。
【０１７５】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、その表面に高濃度のＣＤ４７ポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７の高い発現レベルを有する細胞系において生成される。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７ｈｉｇｈ細胞で生成され、ここで、細胞は細胞膜の上にＣＤ４７の高い発現を有する。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７ｈｉｇｈ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞で生成され、ここで、ＨＥＫ  ２９３Ｔは細胞膜の上にＣＤ４７の高い発現を有する。一部の実施形態では、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞は、未改変のＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞と比較してＣＤ４７の増加した発現を有するように改変される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７である。
【０１７６】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の表面発現をほとんど有しないか有しない。表面に発現されるＭＨＣ−Ｉは、感染を示すタンパク質断片などの、細胞内からの「非自己」タンパク質のペプチド断片を提示し、細胞に対する免疫応答を促進する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ−Ｉｌｏｗ細胞で生成され、ここで、細胞は細胞膜の上にＭＨＣ−Ｉの低減された発現を有する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ−Ｉ−（または、「ＭＨＣ−Ｉｆｒｅｅ」、「ＭＨＣ−１ｎｅｇ」または「ＭＨＣ陰性」）細胞において生成され、ここで、細胞はＭＨＣ−Ｉの発現を欠いている。
【０１７７】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高濃度のＣＤ４７ポリペプチドを含み、ＭＨＣ−Ｉポリペプチドを欠いている脂質コートを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉｌｏｗ細胞系、例えば、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉｌｏｗ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞系において生成される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉｆｒｅｅ細胞系、例えば、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉｆｒｅｅ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞系において生成される。
【０１７８】
レンチウイルスベクターの例は、米国特許第９，０５０，２６９号、ならびに国際公開第９９３１２５１号、国際公開第９７１２６２２号、国際公開第９８１７８１５号、国際公開第９８１７８１６号および国際公開第９８１８９３４号に開示され、それらは参照により完全に本明細書に組み入れる。
【０１７９】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０１８０】
一部の実施形態では、核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０１８１】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プロモーター、標的配列、または両方に作動可能に連結される。他の実施形態では、核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プロモーター、標的配列、または両方に作動可能に連結される。他の実施形態では、核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プロモーター、標的配列、または両方に作動可能に連結される。他の実施形態では、核酸配列は、（ｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プロモーター、標的配列、または両方に作動可能に連結される。他の実施形態では、核酸配列は、（ｉ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プロモーター、標的配列、または両方に作動可能に連結される。他の実施形態では、核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プロモーター、標的配列、または両方に作動可能に連結される。他の実施形態では、核酸配列は、（ｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プロモーター、標的配列、または両方に作動可能に連結される。他の実施形態では、核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号６のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プロモーター、標的配列、または両方に作動可能に連結される。他の実施形態では、核酸配列は、（ｉ）配列番号６のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０１８９】
本開示のレンチウイルスベクターは、５×１０１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０８ＴＵ／ｋｇ以下の用量で投与される場合、治療的に有効である。そのような投薬量では、本開示のレンチウイルスベクターの投与は、それを必要とする対象において、対象における基礎レベルに関して、配列番号１６を含む参照核酸分子を投与した対象におけるレベルと比較して、参照核酸分子を含む参照ウイルスベクターを投与した対象におけるレベルと比較して、または参照核酸分子によってコードされるポリペプチドの投与の後の対象におけるレベルと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍の、血漿ＦＶＩＩＩ活性の増加をもたらすことができる。
【０１９０】
ＩＶ．組織特異的発現
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの中に、例えば最適化ＦＶＩＩＩ導入遺伝子に作動可能に連結される、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含ませることが有益である。したがって、本開示は、最適化ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列に作動可能に連結されるか、さもなければレンチウイルスベクターの中に挿入される、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的も提供する。レンチウイルスベクターに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の１つより多いコピーは、システムの効果を増加させることができる。
【０１９１】
異なるｍｉＲＮＡ標的配列も、含まれる。例えば、１つより多い導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクターは、同じであっても異なってもよい、１つより多いｍｉＲＮＡ標的配列の制御下の導入遺伝子を有することができる。ｍｉＲＮＡ標的配列は縦に並んでもよいが、他の配置も含まれる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含有する導入遺伝子発現カセットは、アンチセンス配向でレンチウイルスベクターの中に挿入することもできる。アンチセンス配向は、さもなければ産生細胞に毒性であるかもしれない遺伝子生成物の発現を回避するための、ウイルス粒子の生成において役立つことができる。
【０１９２】
他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、同じかまたは異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのコピーを含む。しかし、ある特定の他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、いかなるｍｉＲＮＡ標的配列も含まない。ｍｉＲＮＡ標的配列を含ませるかどうか（および、その数）の選択は、意図される組織標的、要求される発現レベル等などの公知のパラメータによって導かれる。
【０１９３】
一実施形態では、標的配列は、骨髄関連の前駆体において最も効果的に、およびより初期のＨＳＰＣにおいて少なくとも部分的に発現をブロックすることが報告されている、ｍｉＲ−２２３標的である。ｍｉＲ−２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含む分化した骨髄細胞における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ−２２３標的は、リンパまたは赤血球系統における頑強な導入遺伝子発現に依存する遺伝子療法適用に好適である可能性もある。ｍｉＲ−２２３標的は、ヒトＨＳＣにおいて非常に効果的に発現をブロックすることもできる。
【０１９４】
別の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１４２標的（ｔｃｃａｔａａａｇｔ  ａｇｇａａａｃａｃｔ  ａｃａ（配列番号４３））である。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、４コピーのｍｉＲ−１４２標的配列を含む。ある特定の実施形態では、造血特異的マイクロＲＮＡの相補配列、例えばｍｉＲ−１４２（１４２Ｔ）は、レンチウイルスベクターの３’非翻訳領域に組み入れられ、導入遺伝子コード転写物をｍｉＲＮＡ媒介下方制御に対して感受性にする。この方法により、造血系統抗原提示細胞（ＡＰＣ）において導入遺伝子発現を阻止することができ、一方、非造血細胞では維持される（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６年）。この戦略は、ストリンジェントな転写後調節を導入遺伝子発現に課すことができ、したがって、導入遺伝子の安定した送達および長期発現を可能にする。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１４２調節は、形質導入された細胞の免疫介在性の除去を阻止し、および／または抗原特異的調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を誘導し、および導入遺伝子によってコードされる抗原への頑強な免疫寛容を媒介する。
【０１９５】
一部の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ  Ｃ−ＺおよびＬｏｄｉｓｈ  Ｈ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５）１７（２）：１５５〜１６５頁は、ｍｉＲ−１８１、マウス骨髄の中のＢ細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡを開示する（ＣｈｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、２００５年）。それは、一部のヒトｍｉＲＮＡが白血病に関連付けられていることも開示する。
【０１９６】
標的配列は、ｍｉＲＮＡに完全または部分的に相補的であってもよい。用語「完全に相補的」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。用語「部分的に相補的」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に一部だけ相補的であり、それによって、部分的に相補的な配列はｍｉＲＮＡによってなお認識されることを意味する。言い換えると、本開示との関連で、部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識すること、およびそのｍｉＲＮＡを発現する細胞における導入遺伝子発現の阻止または低減を達成することにおいて有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３またはＷＯ２０１０／１２５４７１に記載され、これらは参照により完全に本明細書に組み入れる。
【０１９７】
Ｖ．ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
本開示は、レンチウイルス遺伝子療法に関し、ここで、レンチウイルスベクターは、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（核酸）配列を含むコドン最適化核酸分子を含む。一部の実施形態では、コドン最適化核酸分子は、完全長ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、コドン最適化核酸分子は、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードし、ここで、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全部または一部が欠失している。
【０１９８】
特定の一実施形態では、核酸分子は、配列番号１７（図１）またはその断片に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１７またはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０１９９】
一部の実施形態では、核酸分子は、シグナルペプチドまたはその断片を含むＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、核酸分子は、シグナルペプチドを欠くＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１７のアミノ酸１〜１９を含む。
【０２００】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１または（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０２０１】
特定の一実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１または配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１を含む。
【０２０２】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１または（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０２０３】
一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１または配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１を含む。別の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１７９２〜４３７４または配列番号４のヌクレオチド１７９２〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１７９２〜４３７４または配列番号４のヌクレオチド１７９２〜４３７４を含む。
【０２０４】
さらに別の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４または配列番号４のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号３のヌクレオチド１７９２〜４３７４または配列番号４のヌクレオチド１７９２〜４３７４）に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２０５】
特定の一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４または配列番号４のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号３のヌクレオチド１７９２〜４３７４または配列番号４のヌクレオチド１７９２〜４３７４）を含む。
【０２０６】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４または（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２０８】
特定の一実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４または配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４を含む。一部の実施形態では、上記の第２の核酸配列に連結される第１の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド５８〜１７９１または配列番号６のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２０９】
他の実施形態では、上記の第２の核酸配列に連結される第１の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１〜１７９１または配列番号６のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２１０】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４）または（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２１２】
特定の一実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４または配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４または配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４）を含む。一部の実施形態では、上記の第２の核酸配列に連結される第１の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド５８〜１７９１または配列番号６のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２１３】
他の実施形態では、上記の第２の核酸配列に連結される第１の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１〜１７９１または配列番号６のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２１４】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜１７９１、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜１７９１、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜１７９１、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜１７９１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。他の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５８〜１７９１、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド５８〜１７９１、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８〜１７９１、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜１７９１を含む。
【０２１５】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１〜１７９１、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１〜１７９１、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１〜１７９１、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０２１６】
一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１〜１７９１、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１〜１７９１、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１〜１７９１、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１〜１７９１を含む。別の実施形態では、第１のヌクレオチド配列に連結される第２のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２〜４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２〜４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２１７】
特定の一実施形態では、第１のヌクレオチド配列に連結した第２のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２〜４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２〜４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜４３７４を含む。他の実施形態では、第１のヌクレオチド配列に連結される第２のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４を含む。
【０２１８】
別の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２〜４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２〜４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜４３７４とに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０２１９】
特定の一実施形態では、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２〜４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２〜４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜４３７４を含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１のヌクレオチド１７９２〜４３７４、配列番号２のヌクレオチド１７９２〜４３７４、配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜４３７４、または配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜４３７４）に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。
【０２２０】
一実施形態では、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１のヌクレオチド１７９２〜４３７４、配列番号２のヌクレオチド１７９２〜４３７４、配列番号７０のヌクレオチド１７９２〜４３７４、または配列番号７１のヌクレオチド１７９２〜４３７４）を含む。
【０２２１】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５８〜４３７４に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２２】
他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２３】
他の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１のヌクレオチド５８〜４３７４）または配列番号１のヌクレオチド５８〜４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１のヌクレオチド１〜４３７４）または配列番号１のヌクレオチド１〜４３７４を含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド５８〜４３７４に対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４に対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２５】
他の実施形態では、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号２のヌクレオチド５８〜４３７４）または配列番号２のヌクレオチド５８〜４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド１〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号２のヌクレオチド１〜４３７４）または配列番号２のヌクレオチド１〜４３７４を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号７０のヌクレオチド５８〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２７】
他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７０のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号７０のヌクレオチド５８〜４３７４）と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２８】
他の実施形態では、核酸配列は、配列番号７０に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２２９】
他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７０のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号７０のヌクレオチド５８〜４３７４）または配列番号７０のヌクレオチド５８〜４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７０のヌクレオチド１〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号７０のヌクレオチド１〜４３７４）または配列番号７０のヌクレオチド１〜４３７４を含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド５８〜４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２３１】
他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号７１のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、核酸配列は、配列番号７１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２３２】
他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号７１のヌクレオチド５８〜４３７４）または配列番号７１のヌクレオチド５８〜４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド１〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号７１のヌクレオチド１〜４３７４）または配列番号７１のヌクレオチド１〜４３７４を含む。
【０２３３】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８〜４３７４に対して少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号３のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号３のヌクレオチド５８〜４３７４）または配列番号３のヌクレオチド５８〜４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号３のヌクレオチド１〜４３７４）または配列番号３のヌクレオチド１〜４３７４を含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド５８〜４３７４に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２３６】
他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号４のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２３７】
他の実施形態では、核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号４のヌクレオチド５８〜４３７４）または配列番号４のヌクレオチド５８〜４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド１〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号４のヌクレオチド１〜４３７４）または配列番号４のヌクレオチド１〜４３７４を含む。
【０２３８】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド５８〜４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２３９】
他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号５に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド５８〜４３７４）または配列番号５のヌクレオチド５８〜４３７４を含む。
【０２４１】
さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド１〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド１〜４３７４）または配列番号５のヌクレオチド１〜４３７４を含む。
【０２４２】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド５８〜４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２４３】
他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号６のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０２４５】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号６のヌクレオチド５８〜４３７４）または配列番号６のヌクレオチド５８〜４３７４を含む。
【０２４６】
さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド１〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号６のヌクレオチド１〜４３７４）または配列番号６のヌクレオチド１〜４３７４を含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドである。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、コドン最適化される。
【０２４８】
特定の一実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１〜５７；（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１〜５７；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜５７；（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜５７；（ｖ）配列番号５のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉ）配列番号６のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１〜５７；（ｖｉｉｉ）配列番号７１のヌクレオチド１〜５７；または（ｉｘ）配列番号６８のヌクレオチド１〜５７に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。
【０２４９】
配列番号１〜６、７０および７１は、出発または「親」または「野生型」のＦＶＩＩＩヌクレオチド配列である、配列番号１６の最適化されたバージョンである。配列番号１６は、Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩをコードする。配列番号１〜６、７０および７１は、ＦＶＩＩＩ（配列番号１６）の特異的Ｂドメイン欠失形態に由来するが、本開示のレンチウイルス遺伝子療法は、ＦＶＩＩＩの他のバージョンをコードする核酸の最適化されたバージョンにも関することを理解すべきである。例えば、ＦＶＩＩＩの他のバージョンは、完全長ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩの他のＢ−ドメイン欠失（下に記載される）、またはＦＶＩＩＩ活性を保持するＦＶＩＩＩの他の断片を含むことができる。
【０２５０】
特に明記しない限り、本明細書で使用される「ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド」は、凝固におけるその正常な役割にある機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドという用語は、凝固経路における完全長野生型第ＶＩＩＩ因子の機能を保持する、その機能的断片、変異体、類似体または誘導体を含む。
【０２５１】
「ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド」は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩＩポリペプチドまたはＦＶＩＩＩと互換的に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例には、限定されずに、凝固を活性化する能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、または、Ｃａ２＋およびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を活性化形態Ｘａにその後変換する、第ＩＸ因子とのテナーゼ複合体を形成する能力が含まれる。
【０２５２】
一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、２つのポリペプチド鎖を含み、第１の鎖はＦＶＩＩＩ重鎖を有し、第２の鎖はＦＶＩＩＩ軽鎖を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、単鎖のＦＶＩＩＩである。単鎖のＦＶＩＩＩは、成熟ＦＶＩＩＩ配列に対応するアミノ酸残基１６４５および／または１６４８で１つまたはそれ以上の突然変異または置換を含有することができる。参照により本明細書に完全に組み入れる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４５７８４を参照する。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスのＦＶＩＩＩタンパク質であり得る。さらに、ヒト由来のＦＶＩＩＩと他の種由来のＦＶＩＩＩの間の比較によって、機能に必要とされる可能性の高い保存残基が特定された（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ７９：３１７〜２２（１９９８）；ＵＳ６，２５１，６３２）。
【０２５３】
ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は、本明細書で使用されるように、内部アミノ酸配列の同一性およびトロンビンによるタンパク質切断の部位により定義される、当技術分野で公知のＢドメインと同一であり、例えば、全長ヒトＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８である。他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、以下のアミノ酸残基により定義される：Ａ１，残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；Ａ２，残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；Ａ３，残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１，残基Ａｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２；Ｃ２，残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列、残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９は、通常、ＦＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドと称される。また、ブタ、マウスおよびイヌのＦＶＩＩＩに関するＢドメインを含む、ドメインの全てに関する境界の位置も、当技術分野で公知である。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの一例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）組換えＢＤＤ  ＦＶＩＩＩである（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。
【０２５４】
「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、その各々は参照により本明細書に完全に組み入れる、米国特許第６，３１６，２２６号、６，３４６，５１３号、７，０４１，６３５号、５，７８９，２０３号、６，０６０，４４７号、５，５９５，８８６号、６，２２８，６２０号、５，９７２，８８５号、６，０４８，７２０号、５，５４３，５０２号、５，６１０，２７８号、５，１７１，８４４号、５，１１２，９５０号、４，８６８，１１２号および６，４５８，５６３号に開示される、完全または部分的欠失を有することができる。一部の実施形態では、本開示のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６，３１６，２２６号（また、米国特許第６，３４６，５１３号）の第４欄４行目から第５欄２８行目および実施例１〜５に開示される欠失のうちのいずれか１つを含む。
【０２５５】
一部の実施形態では、本開示のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，２０３号（また、米国特許第６，０６０，４４７号、同第５，５９５，８８６号、および同第６，２２８，６２０号）の第２欄、２６〜５１行目および実施例５〜８に開示される欠失を有する。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，９７２，８８５号の第１欄２５行目〜第２欄４０行目；米国特許第６，０４８，７２０号の第６欄１〜２２行目および実施例１；米国特許第５，５４３，５０２号の第２欄１７〜４６行目；米国特許第５，１７１，８４４号の第４欄２２行目〜第５欄３６行目；米国特許第５，１１２，９５０号の第２欄５５〜６８行目、図２、および実施例１；米国特許第４，８６８，１１２号の第２欄２行目から第１９欄２１行目および表２；米国特許第７，０４１，６３５号の第２欄１行目から第３欄１９行目、第３欄４０行目から第４欄６７行目、第７欄４３行目から第８欄２６行目、および第１１欄５行目から第１３欄３９行目；または米国特許第６，４５８，５６３号の第４欄２５〜５３行目に記載の欠失を有する。
【０２５６】
一部の実施形態では、参照により本明細書に完全に組み入れる、国際公開第９１／０９１２２号に開示されるように、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは大部分のＢドメインの欠失を有するが、２つのポリペプチド鎖への一次翻訳産物のｉｎ  ｖｉｖｏタンパク分解性プロセシングに必須である、Ｂドメインのアミノ末端配列をなお含有する。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、アミノ酸７４７〜１６３８の欠失、すなわち、Ｂドメインの事実上完全な欠失で構築される。参照により本明細書に完全に組み入れる、ＨｏｅｂｅｎＲ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８〜７３２３頁（１９９０）。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩのアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２の欠失を含有することもできる。参照により本明細書に完全に組み入れる、Ｍｅｕｌｉｅｎ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２（４）：３０１〜６頁（１９８８）。
【０２５７】
本開示の一部である追加のＢドメイン欠失には、例えば、以下のものが含まれる：アミノ酸９８２〜１５６２または７６０〜１６３９（Ｔｏｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）８３、５９３９〜５９４２頁）、７９７〜１５６２（Ｅａｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：８３４３〜８３４７頁）、７４１〜１６４６（Ｋａｕｆｍａｎ（国際公開第８７／０４１８７号））、７４７〜１５６０（Ｓａｒｖｅｒら、ＤＮＡ（１９８７）６：５５３〜５６４頁）、７４１〜１６４８（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ出願第８８／００８３１号））、８１６〜１５９８または７４１〜１６８９（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ  ８２：１６〜２５頁、欧州特許第２９５５９７号）の欠失、これらの各々は参照により本明細書に完全に組み入れる。上述の欠失の各々は、任意のＦＶＩＩＩ配列に加えることができる。
【０２５８】
Ｂ−ドメイン欠失を含むいくつかの機能的ＦＶＩＩＩ分子が、以下の特許、米国特許第６，３１６，２２６号および米国特許第６，３４６，５１３号、両方ともＢａｘｔｅｒに帰属する；Ｉｎ２Ｇｅｎに帰属する米国特許第７，０４１，６３５号；Ｃｈｉｒｏｎに帰属する米国特許第５，７８９，２０３号、米国特許第６，０６０，４４７号、米国特許第５，５９５，８８６号および米国特許第６，２２８，６２０号；Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍに帰属する米国特許第５，９７２，８８５号および米国特許第６，０４８，７２０号、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋに帰属する米国特許第５，５４３，５０２号および米国特許第５，６１０，２７８号；Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｇに帰属する米国特許第５，１７１，８４４号；Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｓ．Ａ．に帰属する米国特許第５，１１２，９５０号；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに帰属する米国特許第４，８６８，１１２号に開示され、これらの各々は参照により本明細書に完全に組み入れる。
【０２５９】
Ａ．コドン最適化
一実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含み、ここで、核酸配列はコドン最適化されている。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードし、コドン最適化に付される出発核酸配列は、配列番号１６である。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列は、ヒト発現のためにコドン最適化される。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列は、マウス発現のためにコドン最適化される。配列番号１〜６、７０および７１は、ヒト発現のために最適化された、配列番号１６のコドン最適化バージョンである。
【０２６０】
様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指す場合の用語「コドン最適化」は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更すること無しに宿主生物体の一般的なコドン使用頻度を反映するための、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの変更を指す。そのような最適化は、少なくとも１つ、または１つを超える、またはかなりの数のコドンを、その生物体の遺伝子においてより頻繁に使用される１つまたはそれ以上のコドンによって置き換えることを含む。
【０２６１】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における逸脱は、遺伝子をコードする配列における変動を可能にする。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特異的塩基に制限されるので、ヌクレオチドの６４個の可能な組合せがあり、そのうちの６１個がアミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは翻訳を終了するシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかについて示す「遺伝子コード」が、本明細書において表１として複製される。結果として、多くのアミノ酸が１つより多いコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは４つのトリプレットによって、セリンおよびアルギニンは６つによってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンはただ１つのトリプレットによってコードされる。この同義性は、ＤＮＡ塩基組成が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更すること無しに広範囲にわたって変化することを可能にする。
【０２６２】
【表１】
2021512126.tif 000004
【０２６３】
成長するペプチド鎖において特定のアミノ酸の挿入をコードするための特定のコドンの使用に関して、多くの生物体はバイアスを示す。生物体の間でのコドン使用頻度の差であるコドン選好性またはコドンバイアスは、遺伝子コードの同義性によって与えられ、多くの生物体について文書で十分に立証されている。コドンバイアスはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率としばしば相関し、それは、代わって翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性にとりわけ依存すると考えられている。細胞における選択されたｔＲＮＡの優位性は、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを一般的に反映する。したがって、コドン最適化に基づいて所与の生物体における最適な遺伝子発現のために、遺伝子を仕立てることができる。
【０２６４】
様々な動物、植物および微生物種のために利用可能な多数の遺伝子配列を考慮して、コドン使用頻度の相対頻度が計算されている。コドン使用頻度表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２０１２年６月１８日に訪問した）で利用可能な「コドン使用頻度データベース」で利用可能である。Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２頁（２０００）を参照する。
【０２６５】
所与のポリペプチド配列をコードするために最適頻度でコドンをランダムに割付けすることは、アミノ酸ごとにコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列にランダムに帰属させることによって、手動で実行することができる。さらに、最適配列を計算するために、様々なアルゴリズムおよびコンピュータソフトウェアプログラムを使用することができる。
【０２６６】
一部の実施形態では、核酸分子は、１つまたはそれ以上の特性を含む：（ａ）核酸分子またはその一部は、配列番号１６と比較して増加したヒトコドン適合指数を有する；（ｂ）ヌクレオチド配列またはその一部は、配列番号１６と比較して増加した最適コドン頻度を有する；（ｃ）ヌクレオチド配列またはその一部は、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの百分率と比較してより高いＧ／Ｃヌクレオチドの百分率を含有する；（ｄ）ヌクレオチド配列またはその一部は、配列番号１６と比較して増加した相対的同義コドン使用頻度を有する；（ｅ）ヌクレオチド配列またはその一部は、配列番号１６と比較してコドンの有効数が低減している；（ｆ）ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列（配列番号２１および２２）を含有する；（ｇ）ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメント（配列番号２３および２４）を含有する；（ｉ）ヌクレオチド配列は、ポリＴ配列を含有しない、（ｊ）ヌクレオチド配列は、ポリＡ配列を含有しない；または（ｋ）その任意の組合せ。一部の実施形態では、核酸分子は、（ａ）から（ｊ）のうちの、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または１０個の特徴を含有する。
【０２６７】
Ｂ．コドン適合指数
一実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、ヒトコドン適合指数は、配列番号１６と比較して増加している。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、少なくとも約０．８８（８８％）、少なくとも約０．８９（８９％）、少なくとも約０．９０（９０％）、少なくとも約０．９１（９１％）、少なくとも約０．９２（９２％）、少なくとも約０．９３（９３％）、少なくとも約０．９４（９４％）、少なくとも約０．９５（９５％）、少なくとも約０．９６（９６％）、少なくとも約０．９７（９７％）、少なくとも約０．９８（９８％）、または少なくとも約０．９９（９９％）であるヒトコドン適合指数を有することができる。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８８（８８％）であるヒトコドン適合指数を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．９１（９１％）であるヒトコドン適合指数を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．９７（９７％）であるヒトコドン適合指数を有する。
【０２６８】
特定の一実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列のヒトコドン適応インデックスは、配列番号１６に対して増加する。
【０２６９】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、少なくとも約０．８８（８８％）、少なくとも約０．８９（８９％）、少なくとも約０．９０（９０％）、または少なくとも約．９１（９１％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。特定の一実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８８（８８％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．９１（９１％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。
【０２７０】
別の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４または（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列のヒトコドン適応インデックスは、配列番号１６に対して増加する。
【０２７１】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）または少なくとも約０．８８（８８％）であるヒトコドン適合指数を有する。特定の一実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８３（８３％）であるヒトコドン適合指数を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８８（８８％）であるヒトコドン適合指数を有する。
【０２７２】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１、２、３、４、５、６、７０または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ここで、ヌクレオチド配列のヒトコドン適合指数は、配列番号１６と比較して増加している。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、または少なくとも約０．８８（８８％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。
【０２７３】
特定の一実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．７５（７５％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８３（８３％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８８（８８％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．９１（９１％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．９７（９７％）であるヒトコドン適応インデックスを有する。
【０２７４】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１６に対して増加した最適コドン頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｏｄｏｎ）（ＦＯＰ）を有する。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子のＦＯＰは、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６４、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約７９、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０である。
【０２７５】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１６に対して増加した相対同義コドン使用頻度（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）（ＲＣＳＵ）を有する。一部の実施形態では、単離された核酸分子のＲＣＳＵは、１．５を超える。他の実施形態では、単離された核酸分子のＲＣＳＵは、２．０を超える。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子のＲＣＳＵは、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２．０、少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、または少なくとも約２．７である。
【０２７６】
さらに他の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１６に対して減少したコドンの有効数を有する。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、約５０より少ない、約４５より少ない、約４０より少ない、約３５より少ない、約３０より少ない、または約２５より少ないコドンの有効数を有する。特定の一実施形態では、単離された核酸分子は、約４０、約３５、約３０、約２５、または約２０のコドンの有効数を有する。
【０２７７】
Ｃ．Ｇ／Ｃ含量の最適化
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６のＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高いパーセンテージのＧ／Ｃヌクレオチドを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、または少なくとも約６０％であるＧ／Ｃ含量を有する。
【０２７８】
特定の一実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、配列番号１６のＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高いパーセンテージのＧ／Ｃヌクレオチドを含有する。
【０２７９】
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、または少なくとも約５８％であるＧ／Ｃ含量を有する。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５８％であるＧ／Ｃ含量を有する。
【０２８０】
別の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４）、または（ｉｖ）配列番号６の１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４）と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、配列番号１６のＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高いパーセンテージのＧ／Ｃヌクレオチドを含有する。
【０２８１】
他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、または少なくとも約５７％であるＧ／Ｃ含量を有する。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５２％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５５％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５７％であるＧ／Ｃ含量を有する。
【０２８２】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、（ｉ）ヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列は、配列番号１６のＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高いパーセンテージのＧ／Ｃヌクレオチドを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約４５％であるＧ／Ｃ含量を有する。
【０２８３】
特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５２％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５５％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５７％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５８％であるＧ／Ｃ含量を有する。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約６０％であるＧ／Ｃ含量を有する。
【０２８４】
「Ｇ／Ｃ含量」（またはグアニン−シトシン含量）、または「Ｇ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージ」は、グアニンまたはシトシンのいずれかである、ＤＮＡ分子中の窒素塩基のパーセンテージを指す。Ｇ／Ｃ含量は、以下の式：
【数３】
2021512126.tif 000005
を使用して計算することができる。
【０２８５】
ヒト遺伝子のＧ／Ｃ含量は非常に不均一であり、一部の遺伝子は２０％程度の低いＧ／Ｃ含量を有し、他の遺伝子は９５％程の高いＧ／Ｃ含量を有する。一般的に、Ｇ／Ｃリッチな遺伝子は、より高度に発現される。実際に、遺伝子のＧ／Ｃ含量の増加が、遺伝子発現の増加を導く場合があり、これはほとんどが転写の増加とｍＲＮＡレベルが非常に安定した状態であることに起因することが実証されている。Ｋｕｄｌａら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、４（６）：ｅ１８０頁（２００６）を参照のこと。
【０２８６】
Ｄ．マトリックス結合領域様配列
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大６、最大５、最大４、最大３、または最大２個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大１個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有しない。
【０２８７】
特定の一実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大６、最大５、最大４、最大３、または最大２個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大１個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有しない。
【０２８８】
別の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４）または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下または２つ以下のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、１つ以下のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有しない。
【０２８９】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大６、最大５、最大４、最大３、または最大２個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大１個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有しない。
【０２９０】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の自己複製配列（ＡＲＳ）および核−マトリックス結合領域（ＭＡＲ）と配列類似性を共有するヒトＦＶＩＩＩヌクレオチド配列におけるＡＴリッチエレメントを同定した。（Ｆａｌｌｕｘら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６：４２６４〜４２７２頁（１９９６））。これらのエレメントのうちの１つは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核因子に結合し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子の発現を抑制することが実証されている。同上。これらの配列は、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の転写抑制の原因となる可能性があると仮定されている。よって、一実施形態では、全てのＭＡＲ／ＡＲＳ配列は、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失している。親ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）には、４つのＭＡＲ／ＡＲＳ  ＡＴＡＴＴＴ配列（配列番号２１）と３つのＭＡＲ／ＡＲＳ  ＡＡＡＴＡＴ配列（配列番号２２）が存在する。これらの部位の全ては、最適化されたＦＶＩＩＩ配列（配列番号１〜６）のＭＡＲ／ＡＲＳ配列を破壊するよう突然変異させた。これらのエレメントのそれぞれの位置、および最適化された配列における対応するヌクレオチドの配列を以下の表２に示す。
【０２９１】
【表２】
2021512126.tif 000006
【表３】
2021512126.tif 000007
【０２９２】
Ｅ．不安定化配列
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下または５つ以下の不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の不安定化エレメントを含有する。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含有しない。
【０２９３】
特定の一実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対してより少ない不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の不安定化エレメントを含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含有しない。
【０２９４】
別の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４）；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４）と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対してより少ない不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の不安定化エレメントを含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含有しない。
【０２９５】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対してより少ない不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の不安定化エレメントを含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含有しない。
【０２９６】
親ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）には１０個の不安定化エレメント：６個のＡＴＴＴＡ配列（配列番号２３）および４個のＴＡＡＡＴ配列（配列番号２４）が存在する。一実施形態では、これらの部位の配列が突然変異して、最適化されたＦＶＩＩＩの配列番号１〜６、７０、および７１における不安定化エレメントを破壊した。これらのエレメントのそれぞれの位置、および最適化された配列における対応するヌクレオチドの配列を表２に示す。
【０２９７】
Ｆ．潜在的プロモーター結合部位
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下または５つ以下の潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の潜在的プロモーター結合部位を含有する。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含有しない。
【０２９８】
特定の一実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない潜在的プロモーター結合部位を含有する。
【０２９９】
他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下または５つ以下の潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の潜在的プロモーター結合部位を含有する。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含有しない。
【０３００】
別の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４）；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下または５つ以下の潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の潜在的プロモーター結合部位を含有する。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含有しない。
【０３０１】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜４３７４、または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１、２、３、４、５、６、７０または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下または５つ以下の潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の潜在的プロモーター結合部位を含有する。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含有しない。
【０３０２】
ＴＡＴＡボックスは、真核生物のプロモーター領域において見出されることが多い調節配列である。これらは、一般的な転写因子であるＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の結合部位としての役割を果たす。ＴＡＴＡボックスは、通常、配列ＴＡＴＡＡ（配列番号２８）またはそれに近いバリアントを含む。しかしながら、コード配列内のＴＡＴＡボックスは、全長タンパク質の翻訳を阻害し得る。野生型ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）には、１０個の潜在的プロモーター結合部位：５個のＴＡＴＡＡ配列（配列番号２８）および５個のＴＴＡＴＡ配列（配列番号２９）が存在する。一部の実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個のプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。一部の実施形態では、少なくとも５個のプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。他の実施形態では、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８個のプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。一実施形態では、少なくとも９個のプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。特定の一実施形態では、全てのプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。各潜在的プロモーター結合部位の位置および最適化された配列における対応するヌクレオチドの配列を表３に示す。
【０３０３】
Ｇ．他のＣｉｓ作用型ネガティブ調節領域
上述のＭＡＲ／ＡＲＳ配列、不安定化エレメント、および潜在的プロモーター部位に加えて、いくつかのさらなる潜在的阻害配列を、野生型ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）において特定することができる。２つのＡＵリッチ配列エレメント（ＡＲＥ）を、最適化されていないＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列におけるポリＡ部位（ＡＡＡＡＡＡＡ；配列番号２６）、ポリＴ部位（ＴＴＴＴＴＴ；配列番号２５）、およびスプライス部位（ＧＧＴＧＡＴ；列番号２７）と一緒に、特定することができる（ＡＴＴＴＴＡＴＴ（配列番号３０）；およびＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号３１））。１つまたはそれ以上のこれらのエレメントは、最適化されたＦＶＩＩＩ配列から除去することができる。これらの部位のそれぞれの位置および最適化された配列における対応するヌクレオチドの配列を表２に示す。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上のシス作用性の負の調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列またはその任意の組合せを含有しない。
【０３０５】
別の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号５のヌクレオチド１７９２〜４３７４）または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号６のヌクレオチド１７９２〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上のシス作用性の負の調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列またはその任意の組合せを含有しない。
【０３０６】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜４３７４、または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１、２、３、４、５、６、７０または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上のシス作用性の負の調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列またはその任意の組合せを含有しない。
【０３０７】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１、（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列はスプライス部位ＧＧＴＧＡＴ（配列番号２７）を含有しない。
【０３０８】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列はポリＴ配列（配列番号２５）を含有しない。
【０３０９】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列はポリＡ配列（配列番号２６）を含有しない。
【０３１０】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列、およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで、第１の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８〜１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８〜１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１〜１７９１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、一緒にＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列はＡＲＥエレメント（配列番号３０または配列番号３１）を含有しない。
【０３１１】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜４３７４、または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１、２、３、４、５、６、７０または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列はスプライス部位ＧＧＴＧＡＴ（配列番号２７）を含有しない。
【０３１２】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜４３７４、または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドの無い、配列番号１、２、３、４、５、６、７０または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列はポリＴ配列（配列番号２５）を含有しない。
【０３１３】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列は、ポリＡ配列（配列番号２６）を含有しない。
【０３１４】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８〜２２７７および２３２０〜４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８〜４３７４）と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；ヌクレオチド配列は、ＡＲＥエレメント（配列番号３０または配列番号３１）を含有しない。
【０３１５】
他の実施形態では、本開示の最適化されたＦＶＩＩＩ配列は、１つまたはそれ以上の抗ウイルスモチーフ、ステムループ構造、およびリピート配列を含まない。
【０３１６】
さらに他の実施形態では、転写開始部位を囲むヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣ（配列番号３２）、配列中、下線を付したヌクレオチドは開始コドンである。）に変化した。他の実施形態では、制限部位を付加または除去して、クローニングプロセスを促進する。
【０３１７】
Ｈ．異種ヌクレオチド配列
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列をさらに含む。異種ヌクレオチド配列は、本開示の最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列に５’末端、３’末端で連結することができるか、または、最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列の中間に挿入することができる。したがって、一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされる異種アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるＦＶＩＩＩアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に連結されるか、または、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列の２つのアミノ酸の間に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、表３から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位の２つのアミノ酸の間に挿入することができる。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、参照により本明細書に完全に組み入れる、国際公開番号２０１３／１２３４５７  Ａ１および２０１５／１０６０５２  Ａ１または米国公開番号２０１５／０１５８９２９  Ａ１に開示される任意の部位で、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドの中に挿入することができる。
【０３１８】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされる異種アミノ酸配列は、Ｂドメインまたはその断片の中に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１５）のアミノ酸７４５に対応するアミノ酸の直ぐ下流のＦＶＩＩＩの中に挿入される。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩは、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１５）に対応するアミノ酸７４６〜１６４６の欠失を含み、異種ヌクレオチド配列によってコードされる異種アミノ酸配列は、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１５）に対応するアミノ酸７４５の直ぐ下流に挿入される。
【０３１９】
【表４】
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【０３２０】
他の実施形態では、単離された核酸分子は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、全ての異種ヌクレオチド配列は同一である。一部の実施形態では、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、他の異種ヌクレオチド配列と異なる。一部の実施形態では、本開示は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つを超える異種ヌクレオチド配列をタンデムで含むことができる。
【０３２１】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩ分子の半減期を増加させることができる異種部分（「半減期延長剤」）である。
【０３２２】
一部の実施形態では、異種部分は、本開示のタンパク質に組み込まれた場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長と関連する非構造的特徴または構造的特徴のいずれかを有するペプチドまたはポリペプチドである。非限定例として、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、ＸＴＥＮ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、バリアント、もしくは組合せが挙げられる。特定の一実施形態では、異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、トランスフェリン、アルブミン、またはＰＡＳ配列である。
【０３２３】
一部の態様では、異種部分は、フォンビルブランド因子またはその断片を含む。他の関連する態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントの任意の誘導体、バリアント、もしくは組合せのような非ポリペプチド部分に対する結合部位（例えば、システインアミノ酸）を含む場合がある。一部の態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントの任意の誘導体、バリアント、もしくは組合せのような非ポリペプチド部分に対する結合部位として機能するシステインアミノ酸を含む。
【０３２４】
具体的な一実施形態では、第１の異種ヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である半減期延長分子である第１の異種部分をコードし、第２の異種ヌクレオチド配列は、同じく当技術分野で公知である半減期延長分子であってもよい第２の異種部分をコードする。ある特定の実施形態では、第１の異種部分（例えば、第１のＦｃ部分）および第２の異種部分（例えば、第２のＦｃ部分）は、互いと会合して二量体を形成する。一実施形態では、第２の異種部分は第２のＦｃ部分であり、ここで、第２のＦｃ部分は第１の異種部分、例えば第１のＦｃ部分に連結しているかまたはそれと会合する。例えば、第２の異種部分（例えば、第２のＦｃ部分）は、リンカーによって第１の異種部分（例えば、第１のＦｃ部分）に連結することができるか、または、共有結合もしくは非共有結合により第１の異種部分と会合することができる。
【０３２５】
一部の実施形態では、異種部分は、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２５００、少なくとも約３０００、または少なくとも約４０００個のアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドである。
【０３２６】
他の実施形態では、異種部分は、約１００〜約２００アミノ酸、約２００〜約３００アミノ酸、約３００〜約４００アミノ酸、約４００〜約５００アミノ酸、約５００〜約６００アミノ酸、約６００〜約７００アミノ酸、約７００〜約８００アミノ酸、約８００〜約９００アミノ酸、または約９００〜約１０００アミノ酸を含むか、それから本質的になるかまたはそれからなるポリペプチドである。
【０３２７】
ある特定の実施形態では、異種部分は、その生体活性または機能に重大な影響を及ぼすことなく、ＦＶＩＩＩタンパク質の１つまたはそれ以上の薬物動態特性を改善する。
【０３２８】
ある特定の実施形態では、異種部分は、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を増加させる。他の実施形態では、異種部分は、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質またはその断片（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質切断後の異種部分を含む断片）の可視化または局在化を促進する。本開示のＦＶＩＩＩタンパク質またはその断片の可視化および／または局在化は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはこれらの組合せである。
【０３２９】
他の実施形態では、異種部分は、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質またはその断片（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質切断後の異種部分を含む断片）の安定性を増加させる。本明細書で使用されるように、用語「安定性」は、環境条件（例えば、温度上昇または低下）に応じて、ＦＶＩＩＩタンパク質の１つまたはそれ以上の物理特性の維持についての当技術分野で認識される尺度を指す。ある特定の態様では、物理特性は、ＦＶＩＩＩタンパク質の共有結合による構造の維持（例えば、タンパク質分解、望ましくない酸化または脱アミド化のないこと）である。他の態様では、物理特性は、正確にフォールディングされた状態のＦＶＩＩＩタンパク質の存在（例えば、可溶性または不溶性の凝集または沈殿のないこと）でもある。
【０３３０】
一態様では、ＦＶＩＩＩタンパク質の安定性は、ＦＶＩＩＩタンパク質の生体物理特性、例えば、温度安定性、ｐＨアンフォールディングプロファイル、グリコシル化の安定な除去、溶解度、生化学的機能（例えば、タンパク質、レセプターまたはリガンドに結合する能力）など、および／またはこれらの組合せをアッセイすることにより測定される。別の態様では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性により実証される。一態様では、タンパク質安定性の尺度は、熱安定性、すなわち、熱の負荷に対する耐性である。安定性は、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）などのような当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。熱安定性を測定する方法として、これらに限定されないが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）、および熱負荷アッセイが挙げられる。
【０３３１】
ある特定の態様では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも１つの半減期延長剤、すなわち、ＦＶＩＩＩタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を、異種部分を欠く対応するＦＶＩＩＩタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に対して増加させる、このような異種部分を含む。ＦＶＩＩＩタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、当業者に公知の任意の方法、例えば、活性アッセイ（染色体アッセイまたは一段階凝固ａＰＴＴアッセイ）、ＥＬＩＳＡ、ＲＯＴＥＭ（登録商標）などによって決定することができる。
【０３３２】
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の半減期延長剤の存在は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を、このような１つまたはそれ以上の半減期延長剤を欠く対応するタンパク質の半減期と比較して増加させる。半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、このような半減期延長剤を欠く対応するＦＶＩＩＩタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期より、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長い。
【０３３３】
一実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、このような半減期延長剤を欠く対応するタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期より、約１．５倍から約２０倍、約１．５倍から約１５倍、または約１．５倍から約１０倍長い。別の実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、このような半減期延長剤を欠く対応するタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期と比較して、約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍、約２倍から約５倍、約２倍から約４倍、約２倍から約３倍、約２．５倍から約１０倍、約２．５倍から約９倍、約２．５倍から約８倍、約２．５倍から約７倍、約２．５倍から約６倍、約２．５倍から約５倍、約２．５倍から約４倍、約２．５倍から約３倍、約３倍から約１０倍、約３倍から約９倍、約３倍から約８倍、約３倍から約７倍、約３倍から約６倍、約３倍から約５倍、約３倍から約４倍、約４倍から約６倍、約５倍から約７倍、または約６倍から約８倍延長される。
【０３３４】
他の実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
【０３３５】
さらに他の実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、約１５時間から約２週間、約１６時間から約１週間、約１７時間から約１週間、約１８時間から約１週間、約１９時間から約１週間、約２０時間から約１週間、約２１時間から約１週間、約２２時間から約１週間、約２３時間から約１週間、約２４時間から約１週間、約３６時間から約１週間、約４８時間から約１週間、約６０時間から約１週間、約２４時間から約６日間、約２４時間から約５日間、約２４時間から約４日間、約２４時間から約３日間、または約２４時間から約２日間である。
【０３３６】
一部の実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩタンパク質の対象当たりの平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日間）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日間）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日間）、約８４時間、約９６時間（４日間）、約１０８時間、約１２０時間（５日間）、約６日間、約７日間（１週間）、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、または約１４日間である。
【０３３７】
１つまたはそれ以上の半減期延長剤をＦＶＩＩＩのＣ末端もしくはＮ末端に融合させるかまたはＦＶＩＩＩ内に挿入することができる。
【０３３８】
１．免疫グロブリン定常領域またはその一部
別の態様では、異種部分は、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えば、Ｆｃ領域）を含む。一実施形態では、本開示の単離された核酸分子は、免疫グロブリン定常領域またはその一部をコードする異種核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその部分は、Ｆｃ領域である。
【０３３９】
免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ（定常重鎖）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２など）で示されるドメインから構成される。アイソタイプ、（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＤ、またはＩｇＥ）に応じて、定常領域は、３つまたは４つのＣＨドメインから構成される。いくつかのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ）定常領域は、ヒンジ領域も含有する。Ｊａｎｅｗａｙら  ２００１年、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【０３４０】
本開示のＦＶＩＩＩタンパク質を生成するための免疫グロブリン定常領域またはその一部は、いくつかの異なる供給源から得ることができる。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来することも理解される。さらに、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来する。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
【０３４１】
種々の免疫グロブリン定常領域の遺伝子配列（例えば、ヒト定常領域の遺伝子配列）が、公的にアクセス可能な寄託物の形態で利用可能である。特定のエフェクター機能を有する（または特定のエフェクター機能を欠く）か免疫原性を低下させる特定の改変を伴う定常領域ドメインの配列を選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、好適なＩｇ定常領域の配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその部分）は、技術分野で認識される技法を使用して、これらの配列から導出される。次いで、前述の方法のいずれかを使用して得られる遺伝子材料を変更または合成して、本開示のポリペプチドを得ることができる。この開示の範囲が、定常領域のＤＮＡ配列の対立遺伝子、バリアントおよび突然変異を包含することがさらに認識されるであろう。
【０３４２】
免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列は、例えば、目的のドメインを増幅するために選択されるポリメラーゼ連鎖反応およびプライマーを使用してクローニングすることができる。抗体から免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列をクローニングするために、ｍＲＮＡを、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離し、ＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲによって抗体の遺伝子を増幅させることができる。ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；および、例えば、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」  Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｈｏら  １９８９．  Ｇｅｎｅ  ７７：５１頁；Ｈｏｒｔｏｎら  １９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１７：２７０頁に詳述されている。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域のプライマーによってまたは公開された重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始することができる。ＰＣＲは、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するためにも使用することができる。この場合には、コンセンサスプライマーまたはマウス定常領域のプローブのようなより大きな相同なプローブによって、ライブラリーをスクリーニングすることができる。抗体遺伝子の増幅に好適な多数のプライマーセットが当技術分野で公知である（例えば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（ＢｅｎｈａｒおよびＰａｓｔａｎ．  １９９４．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：１５０９頁）；ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，  Ｆ．ら  １９９４．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７３：３３頁）；抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋら  １９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １６０：１２５０頁）。抗体配列のクローニングは、参照によって本明細書に組み入れる、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号にさらに記載される。
【０３４３】
本明細書で使用される免疫グロブリン定常領域は、全てのドメインおよびヒンジ領域またはそれらの部分を含むことができる。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む。
【０３４４】
本明細書で使用されるように、用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブＩｇのＦｃ領域に対応するポリペプチドの部分として、すなわち、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体会合によって形成されるような部分として定義される。ネイティブＦｃ領域は、別のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。対照的に、用語「遺伝子的に融合されるＦｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）は、本明細書で使用されるように、単一ポリペプチド鎖内で遺伝子的に連結される（すなわち、単一の連続の遺伝子配列でコードされる）Ｆｃドメインから構成される合成の二量体Ｆｃ領域を指す。参照によってその全体として本明細書に組み入れる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／００６６３５号を参照のこと。
【０３４５】
一実施形態では、「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり（すなわち、重鎖定常領域の第１の残基を１１４として、ＩｇＧの残基２１６）、抗体のＣ末端で終わる、単一のＩｇ重鎖の部分を指す。したがって、完全Ｆｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。
【０３４６】
免疫グロブリン定常領域またはその部分は、ＦｃＲｎ結合パートナーである場合がある。ＦｃＲｎは、成体の上皮組織で活性であり、腸の管腔、肺気道、鼻腔面、膣表面、結腸および直腸表面において発現される（米国特許第６，４８５，７２６号）。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎに結合する免疫グロブリンの一部である。
【０３４７】
ＦｃＲｎレセプターは、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列が公知である（Ｓｔｏｒｙら  １９９４年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：２３７７頁）。ＦｃＲｎレセプターは、ＩｇＧ（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのような他の免疫グロブリンクラスではなく）に比較的低いｐＨで結合し、ＩｇＧを管腔中で漿膜の方向に経細胞的に能動輸送し、次いで、間質液中で見られる比較的高いｐＨでＩｇＧを遊離する。これは、肺および腸の上皮（Ｉｓｒａｅｌら  １９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９２：６９頁）  腎近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら  ２００２年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２８２：Ｆ３５８頁）ならびに鼻腔上皮、膣表面、および胆道系表面を含む成体の上皮組織（米国特許第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３号、同第６，０８６，８７５号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６）において発現される。
【０３４８】
本開示において有用なＦｃＲｎ結合パートナーは、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎレセプターの完全結合領域を含む他の断片を含む、ＦｃＲｎレセプターによって特異的に結合される分子を包含する。ＦｃＲｎレセプターに結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら  １９９４年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９頁）。ＦｃのＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接合部に近い。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触は全て、単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーとして、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全結合領域を含むＩｇＧの他の断片が挙げられる。主な接触部位として、ＣＨ２ドメインの２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４位のアミノ酸残基、ならびにＣＨ３ドメインの３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６位のアミノ酸残基が挙げられる。免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片、または領域のアミノ酸ナンバリングに対してなされる言及は全て、Ｋａｂａｔら  １９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．に基づく。
【０３４９】
ＦｃＲｎに結合したＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎによって、上皮バリアを越えて効率的に運ぶことができるので、所望の治療用分子を全身投与するための非侵襲的手段をもたらす。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現する細胞によって貪食される。しかし、これらの融合タンパク質は、分解の対象にはならずに、リサイクルされて、再度血液循環に入るので、これらのタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が増加する。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域の部分は、典型的には、ジスルフィド結合と他の非特異的相互作用を介して、別のＦｃ領域または別のＦｃＲｎ結合パートナーと会合して、二量体、およびそれより高次の多量体を形成するＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーである。
【０３５０】
２つのＦｃＲｎレセプターが、単一のＦｃ分子と結合することができる。結晶学的データから、各ＦｃＲｎ分子が、Ｆｃホモ二量体の単一のポリペプチドと結合することが示唆される。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合パートナー、例えば、ＩｇＧのＦｃ断片を生物活性分子に連結させることにより、生物活性分子の経口送達、口腔内送達、舌下送達、直腸送達、膣内送達、経鼻的なエアロゾル投与によるかもしくは経肺経路による送達、または眼局所経路による送達の手段が得られる。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ因子タンパク質は、侵襲的に、例えば、皮下、静脈内に投与することができる。
【０３５１】
ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、ＦｃＲｎレセプターが特異的に結合し、その結果、Ｆｃ領域をＦｃＲｎレセプターによって能動輸送できる分子または部分である。特異的な結合とは、生理的条件下で、比較的安定である複合体を形成する２つの分子を指す。通常、親和性が低く、中程度から高度の容量を有する非特異的な結合と区別されるように、特異的な結合は、高い親和性と、低度から中程度の容量によって特徴付けられる。典型的には、親和性定数ＫＡが、１０６Ｍ−１を超えるか、または１０８Ｍ−１を超える場合に、結合は、特異的であると考えられる。必要な場合、非特異的結合は、結合条件を変えることによって、特異的な結合に実質的な影響を及ぼすことなく低減される。分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度のような適切な結合条件などは、当業者であれば、通常の技法を使用して最適化することができる。
【０３５２】
ある特定の実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、１つまたはそれ以上のトランケートされたＦｃ領域であって、トランケートされているにもかかわらず、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合特性をＦｃ領域に付与するのに十分である、トランケートされたＦｃ領域を含む。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＥＵの番号付けで、ＩｇＧ１の２８２〜４３８位周辺のアミノ酸を含む（主要な接触部位は、ＣＨ２ドメインの２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４位のアミノ酸と、ＣＨ３ドメインの３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６位のアミノ酸残基である）。よって、本開示のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含むかまたはそれからなる場合がある。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むいずれかのアイソタイプの重鎖に由来する場合がある。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が使用される。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が使用される。
【０３５３】
Ｆｃ領域は、いくつかの異なる供給源から得ることができる。一実施形態では、ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、Ｆｃ部分は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来する場合がある。さらに、Ｆｃドメインまたはその部分のポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来する場合がある。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
【０３５４】
ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントにより、前記野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ部分によって付与される少なくとも１つのエフェクター機能に変化がもたらされる（例えば、Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）もしくは補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合するか、または抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）、食作用、もしくは補体依存性細胞障害性（ＣＤＣＣ）を誘発するＦｃ領域の能力の改善または低下）。他の実施形態では、Ｆｃバリアントにより、操作されたシステイン残基がもたらされる。
【０３５５】
本開示のＦｃ領域は、エフェクター機能および／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎの結合を変化させる（例えば、増強または低減する）ことが知られている技術分野で認識されるＦｃバリアントを用いることができる。具体的には、本開示のＦｃ領域は、例えば、それらのそれぞれを参照によって本明細書に組み入れる、国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ８８／０７０８９Ａ１号、同第ＷＯ９６／１４３３９Ａ１号、同第ＷＯ９８／０５７８７Ａ１号、同第ＷＯ９８／２３２８９Ａ１号、同第ＷＯ９９／５１６４２Ａ１号、同第ＷＯ９９／５８５７２Ａ１号、同第ＷＯ００／０９５６０Ａ２号、同第ＷＯ００／３２７６７Ａ１号、同第ＷＯ００／４２０７２Ａ２号、同第ＷＯ０２／４４２１５Ａ２号、同第ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２号、同第ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２号、同第ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２号、同第ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２号、同第ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２号、同第ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２号、同第ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２号、同第ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２号、同第ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２号、同第ＷＯ０４／０４４８５９号、同第ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１号、同第ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２号、同第ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２号、同第ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２号、同第ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１号、同第ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２号および同第ＷＯ０６／０８５９６７Ａ２号；米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６５号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６６号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６７号、同第ＵＳ２００７／０２４３１８８号、同第ＵＳ２００７／０２４８６０３号、同第ＵＳ２００７／０２８６８５９号、同第ＵＳ２００８／００５７０５６号；または米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、同第７，０８３，７８４号、同第７，４０４，９５６号、および同第７，３１７，０９１号に開示されているアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上に、変更（例えば、置換）を含むことができる。一実施形態では、具体的な変更（例えば、当技術分野において開示されている１つまたはそれ以上のアミノ酸の具体的な置換）は、開示されているアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上においてなされる。別の実施形態では、開示されているアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上において異なる変更（例えば、当技術分野において開示されている１つまたはそれ以上のアミノ酸位置の異なる置換）がなされる。
【０３５６】
部位特異的突然変異誘発などのような十分に認識されている手順に従って、ＩｇＧのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを改変して、ＦｃＲｎが結合することになる改変型ＩｇＧもしくはＦｃ断片またはその部分を得ることができる。このような改変として、ＦｃＲｎ接触部位から離れた部位の改変と、ＦｃＲｎへの結合を保持するかまたはさらには増強する、接触部位内の改変が挙げられる。例えば、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性を有意に喪失することなく、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｆｃγ１）における以下の単一のアミノ酸残基を置換することができる：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４ＡおよびＫ４４７Ａ（例えば、Ｐ２３８Ａは、位置数２３８における野生型プロリンのアラニンへの置換を表す）。一例として、具体的な実施形態では、Ｎ２９７Ａ突然変異を組み込んで、高度に保存されたＮ糖鎖付加部位を除去している。アラニンに加えて、上で特定した位置の野生型アミノ酸を他のアミノ酸で置換することができる。突然変異を個々にＦｃに組み込んで、ネイティブＦｃと異なるＦｃ領域を１００個超もたらすことができる。さらに、これらの個々の突然変異のうちの２つ、３つ、またはそれ以上の組合せを一緒に組み込んで、何百ものさらなるＦｃ領域をもたらすことができる。
【０３５７】
上記のうちの特定の突然変異により、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーに、新たな機能を付与することができる。例えば、一実施形態では、Ｎ２９７Ａを組み込んで、高度に保存されたＮ糖鎖付加部位を除去している。この突然変異の作用は、免疫原性を低減することであり、それによって、Ｆｃ領域の循環血液中半減期が増強すること、およびＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、Ｆｃ領域がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡに結合するのを不可能とすることである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら  １９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：８４７頁；Ｆｒｉｅｎｄら  １９９９年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１６３２頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら  １９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：６５９１頁）。上記の突然変異に起因する新たな機能のさらなる例として、いくつかの例では、ＦｃＲｎに対する親和性を野生型の親和性よりも増加させることができる。この親和性の増加は、「会合」速度の上昇、「解離」速度の低下または「会合」速度の上昇と「解離」速度の低下の両方を反映することができる。ＦｃＲｎに対する親和性を増加させると考えられる突然変異の例として、これらに限定されないが、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが挙げられる（Ｓｈｉｅｌｄｓら  ２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：６５９１頁）。
【０３５８】
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃガンマレセプターは、下流のヒンジ領域、一般的には、２３４〜２３７位のアミノ酸内の、ＩｇＧ上の結合部位を認識すると考えられる。したがって、新たな機能および免疫原性の潜在的な減少の別の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１の２３３〜２３６位のアミノ酸「ＥＬＬＧ」（配列番号４５）を、ＩｇＧ２の対応する配列「ＰＶＡ」（１つのアミノ酸が欠失している）で置換することによるなど、この領域の突然変異に起因する場合がある。このような突然変異が導入された場合、様々なエフェクター機能を媒介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩが、ＩｇＧ１に結合しなくなることが示されている。ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ  １９９５年、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７頁およびＡｒｍｏｕｒら  １９９９年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：２６１３頁。
【０３５９】
別の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ヒンジ領域またはその一部に、第２の免疫グロブリン定常領域またはその一部と１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するアミノ酸配列を含む。第２の免疫グロブリン定常領域またはその一部は、第２のポリペプチドに連結して、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２のポリペプチドを一体とすることができる。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、エンハンサー部分である。本明細書で使用されるように、用語「エンハンサー部分」は、ＦＶＩＩＩの凝固促進活性を増強することが可能な分子、その断片またはポリペプチドの構成成分を指す。エンハンサー部分は、可溶性組織因子（ｓＴＦ）のような補因子であるか、または凝固促進ペプチドである。よって、ＦＶＩＩＩの活性化の際に、エンハンサー部分は、ＦＶＩＩＩの活性を増強するために利用可能である。
【０３６０】
ある特定の実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｉｇ定常領域の抗原依存性エフェクター機能、特に、タンパク質の循環血液中半減期を変化させる、免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えば、Ｆｃバリアント）に対するアミノ酸置換を含む。
【０３６１】
２．ｓｃＦｃ領域
別の態様では、異種部分は、ｓｃＦｃ（単鎖Ｆｃ）領域を含む。一実施形態では、本開示の単離された核酸分子は、ＳｃＦｃ領域をコードする異種核酸配列をさらに含む。ｓｃＦｃ領域は、同じ直鎖状ポリペプチド鎖内に、フォールディングして（例えば、分子内または分子間フォールディングして）、Ｆｃペプチドリンカーによって連結される１つの機能性ｓｃＦｃ領域を形成することが可能な、少なくとも２つの免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えば、Ｆｃ部分またはＦｃドメイン（例えば、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のＦｃ部分またはドメイン））を含む。例えば、一実施形態では、半減期を改善するかもしくは免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）、食作用、または補体依存性細胞障害性（ＣＤＣＣ））を誘発する、および／または製造性を改善する目的で、本開示のポリペプチドは、そのＳｃＦｃ領域を介して、少なくとも１つのＦｃレセプター（例えば、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲレセプター（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）、または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ））に結合することが可能である。
【０３６２】
３．ＣＴＰ
別の態様では、異種部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットの１つのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはその断片、バリアントもしくは誘導体を含む。組換えタンパク質に挿入された１つまたはそれ以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させることが知られている。例えば、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、米国特許第５，７１２，１２２号を参照のこと。
【０３６３】
例示的なＣＴＰペプチドとして、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号３３）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号３４）が挙げられる。例えば、参照によって組み入れる、米国特許出願公開第２００９／００８７４１１Ａ１号を参照のこと。
【０３６４】
４．ＸＴＥＮ配列
一部の実施形態では、異種部分は、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列、その断片、バリアント、または誘導体を含む。本明細書で使用されるように、「ＸＴＥＮ配列」は、低分子親水性アミノ酸で主に構成され、生理的条件下では二次構造もしくは三次構造をとる程度が低いかまたはそれをとらない、天然に存在しない、実質的に非反復の配列を有する伸長したポリペプチドを指す。異種部分として、ＸＴＥＮは、半減期延長部分としての機能を果たすことができる。さらに、ＸＴＥＮは、これらに限定されないが、薬物動態パラメータおよび溶解特性の増強を含む所望の特性をもたらすことができる。
【０３６５】
ＸＴＥＮ配列を含む異種部分の、本開示のタンパク質への組み込みにより、以下の有利な特性：立体配座の柔軟性、水溶解性の向上、高度なプロテアーゼ耐性、低免疫原性、哺乳動物レセプターへの低結合性、または流体力学的（またはストークス）半径の増大という有益な特性のうちの１つまたはそれ以上をタンパク質に付与することができる。
【０３６６】
特定の態様では、ＸＴＥＮ配列は、より長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加のような薬物動態特性を向上させることができ、その結果、本開示のタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏに留まり、ＸＴＥＮという異種部分を有さないこと以外は同じであるタンパク質と比較して増加した期間、凝固促進活性を有する。
【０３６７】
一部の実施形態では、本開示に関して有用なＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約２０超から約３０００個のアミノ酸残基、３０超から約２５００個の残基、４０超から約２０００個の残基、５０超から約１５００個の残基、６０超から約１０００個の残基、７０超から約９００個の残基、８０超から約８００個の残基、９０超から約７００個の残基、１００超から約６００個の残基、１１０超から約５００個の残基、または１２０超から約４００個の残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、長さが、４２個のアミノ酸より長く、１４４個のアミノ酸より短い、アミノ酸配列を含む。
【０３６８】
本開示のＸＴＥＮ配列は、５から１４個（例えば、９から１４個）のアミノ酸残基のうちの１つもしくはそれ以上の配列モチーフ、または配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、そのモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される４から６種のアミノ酸（例えば、５種類のアミノ酸）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。ＵＳ２０１０−０２３９５５４Ａ１を参照のこと。
【０３６９】
一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、配列の約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％または約１００％が、表４から選択される単一のモチーフファミリーから選択される非重複配列の複数ユニットからなる（その結果、ファミリー配列が得られる）非重複配列モチーフを含む。
【０３７０】
本明細書で使用されるように、「ファミリー」は、ＸＴＥＮが、表４からの単一のモチーフカテゴリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤのＸＴＥＮのみから選択されるモチーフを有することと、およびファミリーモチーフに由来しないＸＴＥＮにおける任意の他のアミノ酸が、必要とされる特性を実現するために、例えば、コードヌクレオチドによる制限部位の組み込み、切断配列の組み込みを可能とするために、またはＦＶＩＩＩの十分な連結を実現するために選択されることを意味する。ＸＴＥＮファミリーの一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの非重複配列モチーフを複数ユニット含み、得られたＸＴＥＮは、上記の範囲の相同性を示す。他の実施形態では、ＸＴＥＮは、表４のモチーフファミリーのうちの２つまたはそれ以上からのモチーフ配列を複数ユニットを含む。
【０３７１】
これらの配列は、以下にさらに詳しく説明されている、モチーフのアミノ酸組成によって付与される実効電荷、親水性、二次構造の欠如、または反復性の欠如のような特性を含む所望の物理的／化学的特徴を実現するように選択することができる。この段落で説明される上記の実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、ＸＴＥＮに組み込まれるモチーフを選択およびアセンブルして、約３６から約３０００個のアミノ酸残基のＸＴＥＮを実現することができる。
【０３７２】
【表５】
2021512126.tif 000009
【０３７３】
本開示のキメラタンパク質において、異種部分として使用することができるＸＴＥＮ配列の例は、例えば、そのそれぞれを参照によってその全体として本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０９１１２２Ａ１号、同第ＷＯ２０１０／１４４５０２Ａ２号、同第ＷＯ２０１０／１４４５０８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１／０２８２２８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１／０２８２２９Ａ１、もしくは同第ＷＯ２０１１／０２８３４４Ａ２号に開示されている。
【０３７４】
ＦＶＩＩＩに挿入または連結するために、ＸＴＥＮは様々な長さを有する場合がある。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列の長さは、融合タンパク質において実現される特性または機能に基づいて選択される。意図する特性または機能に応じて、ＸＴＥＮは、長さが短いかもしくは中程度の配列または担体としての役割を果たすことができるより長い配列である。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約６から約９９個のアミノ酸残基という短いセグメント、約１００から約３９９個のアミノ酸残基という中程度の長さ、および約４００から約１０００個、かつ最大で約３０００個のアミノ酸残基というより長い長さを含む。よって、ＦＶＩＩＩに挿入または連結されるＸＴＥＮは、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約１４４、約２８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約８６４、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、または最大で約３０００個のアミノ酸残基長の長さを有する場合がある。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、約６から約５０、約５０から約１００、約１００から１５０、約１５０から２５０、約２５０から４００、約４００から約５００、約５００から約９００、約９００から１５００、約１５００から２０００、または約２０００から約３０００個のアミノ酸残基長である。
【０３７５】
ＦＶＩＩＩに挿入または連結されるＸＴＥＮの正確な長さは、ＦＶＩＩＩの活性に有害な影響を及ぼさなければ、様々である。一実施形態では、本発明で使用されるＸＴＥＮのうちの１つまたはそれ以上は、４２個のアミノ酸、７２個のアミノ酸、１４４個のアミノ酸、２８８個のアミノ酸、５７６個のアミノ酸、または８６４個のアミノ酸長さを有し、ＸＴＥＮファミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤのうちの１つまたはそれ以上から選択することができる。
【０３７６】
一部の実施形態では、本開示で使用されるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、ＡＧ２００４、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ＵＳ２０１０−０２３９５５４Ａ１を参照のこと。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、ＡＧ１４４、ＡＧ２８８、ＡＧ５７６、ＡＧ８６４、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０３７７】
本開示のキメラタンパク質において、異種部分として使用することができる例示的なＸＴＥＮ配列として、ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４（配列番号４７によってコードされる配列番号４６、それぞれ図１１Ｃおよび図１１Ｄ）、ＸＴＥＮ  １４４−２Ａ（配列番号４９によってコードされる配列番号４８、それぞれ図１１Ｅおよび図１１Ｆ）、ＸＴＥＮ  Ａ１４４−３Ｂ（配列番号５１によってコードされる配列番号５０、それぞれ図１１Ｇおよび図１１Ｈ）、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−４Ａ（配列番号５３によってコードされる配列番号５２、それぞれ図１１Ｉおよび図１１Ｊ）、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−５Ａ（配列番号５５によってコードされる配列番号５４、それぞれ図１１Ｋおよび図１１Ｌ）、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−６Ｂ（配列番号５７によってコードされる配列番号５６、それぞれ図１１Ｍおよび図１１Ｎ）、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−１（配列番号５９によってコードされる配列番号５８、それぞれ図１１Ｏおよび図１１Ｐ）、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ａ（配列番号６１によってコードされる配列番号６０、それぞれ図１１Ｑおよび図１１Ｒ）、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｂ（配列番号６３によってコードされる配列番号６２、それぞれ図１１Ｓおよび図１１Ｔ）、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｃ（配列番号６５によってコードされる配列番号６４、それぞれ図１１Ｕおよび図１１Ｖ）、およびＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｆ（配列番号６７によってコードされる配列番号６６、それぞれ図１１Ｗおよび図１１Ｘ）が挙げられる。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号１８によってコードされる。
【０３７８】
一部の実施形態では、ＸＴＥＮのアミノ酸の１００％未満が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択されるか、または配列の１００％未満が、表４からの配列モチーフもしくは本発明で提供されるＸＴＥＮ配列からなる。このような実施形態では、ＸＴＥＮの残りのアミノ酸残基は、他の１４種の天然Ｌ−アミノ酸のうちのいずれかから選択されるが、ＸＴＥＮ配列が、親水性アミノ酸を少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％含有するように、親水性アミノ酸から優先的に選択することができる。
【０３７９】
共役構築物において利用されるＸＴＥＮにおける疎水性アミノ酸の含有率は、５％未満、または２％未満、または１％未満である。ＸＴＥＮの構築の際に、あまり好ましくない疎水性残基として、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが挙げられる。さらに、ＸＴＥＮ配列は、以下のアミノ酸：メチオニン（例えば、酸化を回避するため）、またはアスパラギンおよびグルタミン（脱アミド化を回避するため）を５％未満または４％未満または３％未満または２％未満または１％未満または０％含有することができる。
【０３８０】
１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＣ末端もしくはＮ末端に挿入することができるか、または、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の２つのアミノ酸の間に挿入することができる。例えば、ＸＴＥＮは、表３から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位の２つのアミノ酸の間に挿入することができる。ＸＴＥＮ挿入を許すＦＶＩＩＩの中の部位の例は、例えば、本明細書に参照により完全に組み入れる、国際公開番号ＷＯ２０１３／１２３４５７  Ａ１または米国特許公開番号２０１５／０１５８９２９  Ａ１に見出すことができる。
【０３８１】
５．アルブミン、またはその断片、誘導体もしくはバリアント
一部の実施形態では、異種部分は、アルブミンまたはその機能性断片を含む。完全長形態では６０９個のアミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、またはＨＡ）は、血清の浸透圧のかなりの部分を担っており、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書で使用されるように、用語「アルブミン」は、完全長アルブミンまたはその機能性断片、バリアント、誘導体、もしくはアナログを含む。アルブミンまたはその断片もしくはバリアントの例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２００８／０１９４４８１  Ａ１号、同第２００８／０００４２０６  Ａ１号、同第２００８／０１６１２４３  Ａ１号、同第２００８／０２６１８７７  Ａ１号、もしくは同第２００８／０１５３７５１  Ａ１号、またはＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００８／０３３４１３  Ａ２号、同第ＷＯ２００９／０５８３２２  Ａ１号、もしくは同第ＷＯ２００７／０２１４９４  Ａ２号に開示されている。
【０３８２】
一実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳおよびＰＥＧからなる群から選択される第２の異種部分にさらに連結されたアルブミン、その断片、またはバリアントを含む。
【０３８３】
６．アルブミン結合部分
ある特定の実施形態では、異種部分は、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、またはこれらの任意の組合せを含むアルブミン結合部分である。
【０３８４】
例えば、アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、ドメイン抗体を含む抗体または抗体断片である場合がある（米国特許第６，６９６，２４５号を参照のこと）。アルブミン結合タンパク質は、例えば、連鎖球菌タンパク質Ｇのもののような細菌アルブミン結合ドメインである場合がある（Ｋｏｎｉｇ，ＴおよびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１８、７３〜８３頁）。共役パートナーとして使用することができるアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００６９３９５号またはＤｅｎｎｉｓら（Ｄｅｎｎｉｓら（２００２）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７、３５０３５〜３５０４３頁）に記載されているように、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓというコンセンサス配列（配列中、Ｘａａ１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、Ｘａａ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである）を有するものである。
【０３８５】
Ｋｒａｕｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３７８：１９０〜１９４頁（１９９６）およびＬｉｎｈｕｌｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １１：２０６〜２１３頁（２００２）に開示されているように、連鎖球菌タンパク質Ｇからのドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの一例である。アルブミン結合ペプチドの例として、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号３５）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００２年、２７７：３５０３５〜３５０４３頁（２００２）を参照のこと。アルブミン結合抗体断片の例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、ＭｕｌｌｅｒおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ９：３１９〜３２６頁（２００７）；Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５６：３０３〜３１７頁（２００７）、およびＨｏｌｔら、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｃｉ．、２１：２８３〜２８８頁（２００８）に開示されている。このようなアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２０：２２８６〜２２９２頁（２００９）に開示されている２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。
【０３８６】
脂肪酸、特に、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）および長鎖脂肪酸様アルブミン結合化合物を使用して、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長することができる。ＬＣＦＡ様アルブミン結合化合物の例は、１６−（１−（３−（９−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）カルボニルオキシ）−メチル）−７−スルホ−９Ｈ−フルオレン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イルチオ）ヘキサデカン酸である（例えば、ＷＯ２０１０／１４０１４８を参照のこと）。
【０３８７】
７．ＰＡＳ配列
他の実施形態では、異種部分は、ＰＡＳ配列である。ＰＡＳ配列は、本明細書で使用されるように、アラニン残基およびセリン残基を主に含むかまたはアラニン残基、セリン残基、およびプロリン残基を主に含むアミノ酸配列であって、生理的条件下でランダムコイル立体配座を形成するアミノ酸配列を意味する。したがって、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質において異種部分の一部として使用することができるアラニン、セリン、およびプロリンを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるビルディングブロック、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。ただし、ＰＡＳ配列における微量成分として、アラニン、セリン、およびプロリン以外の残基が付加される場合、アミノ酸ポリマーがランダムコイル立体配座を形成できることは、当業者であれば分かる。
【０３８８】
用語「微量成分」は、本明細書で使用されるように、アラニン、セリン、およびプロリン以外のアミノ酸を、ＰＡＳ配列に、ある特定の程度まで、例えば、最大で約１２％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個、最大で約１０％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１０個、最大で約９％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約９個、最大で約８％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約８個、約６％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約６個、約５％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約５個、約４％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約４個、約３％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約３個、約２％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約２個、約１％、すなわち、１００個のアミノ酸うちの約１個付加できることを意味する。アラニン、セリン、およびプロリンと異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択することができる。
【０３８９】
生理的条件下では、ＰＡＳ配列伸長体は、ランダムコイル立体配座を形成し、それによって、ＦＶＩＩＩタンパク質に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性の増加を媒介することができる。ランダムコイルドメインは、それ自体が安定な構造または機能を持たないため、ＦＶＩＩＩタンパク質によって媒介される生体活性は、本質的に保持される。他の実施形態では、ランダムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は、特に、血漿中でのタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電挙動、細胞表面レセプターへの結合またはインターナリゼーションに関して、生物学的に不活性であるが、生分解性を有し、それにより、ＰＥＧのような合成ポリマーを上回る明らかな利点をもたらす。
【０３９０】
ランダムコイル立体配座を形成するＰＡＳ配列の非限定例は、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号３６）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号３７）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号３８）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号３９）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号４０）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号４１）およびＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号４２）またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ＰＡＳ配列のさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０  Ａ１号およびＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００８／１５５１３４  Ａ１号から公知である。
【０３９１】
８．ＨＡＰ配列
ある特定の実施形態では、異種部分は、グリシンリッチホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。ＨＡＰ配列は、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、１２０個のアミノ酸、１４０個のアミノ酸、１６０個のアミノ酸、１８０個のアミノ酸、２００個のアミノ酸、２５０個のアミノ酸、３００個のアミノ酸、３５０個のアミノ酸、４００個のアミノ酸、４５０個のアミノ酸、または５００個のアミノ酸長を有するグリシン反復配列を含む場合がある。一実施形態では、ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合または連結された部分の半減期を延長することが可能である。ＨＡＰ配列の非限定例として、これらに限定されないが、（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）が挙げられる。一実施形態では、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態では、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。
【０３９２】
９．トランスフェリンまたはその断片
ある特定の実施形態では、異種部分は、トランスフェリンまたはその断片である。いずれかのトランスフェリンを使用して、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質を作製することができる。一例として、野生型ヒトＴＦ（ＴＦ）は、およそ７５ＫＤａの６７９個のアミノ酸タンパク質であり（糖鎖付加は考慮せず）、２つの主要ドメイン、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）およびＣ（約３４０個のアミノ酸）を有し、遺伝子重複に起因すると考えられる。その全てを参照によってその全体として本明細書に組み入れる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照のこと。トランスフェリンは、２つのドメイン、ＮドメインおよびＣドメインを含む。Ｎドメインは、Ｎ１ドメインおよびＮ２ドメインという２つのサブドメインを含み、Ｃドメインは、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインという２つのサブドメインを含む。
【０３９３】
一実施形態では、トランスフェリン異種部分として、トランスフェリンスプライスバリアントが挙げられる。一例では、トランスフェリンスプライスバリアントは、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアント、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＡ６１１４０である場合がある。別の実施形態では、キメラタンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列の１つまたはそれ以上のドメイン、例えば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはこれらの任意の組合せを含む。
【０３９４】
１０．クリアランスレセプター
ある特定の実施形態では、異種部分は、クリアランスレセプター、その断片、バリアント、または誘導体である。ＬＲＰ１は、第Ｘ因子のような種々のタンパク質のレセプター媒介性クリアランスに関与する６００ＫＤａの膜内在性タンパク質である。例えば、Ｎａｒｉｔａら、Ｂｌｏｏｄ  ９１：５５５〜５６０頁（１９９８）を参照のこと。
【０３９５】
１１．フォンビルブランド因子またはその断片
ある特定の実施形態では、異種部分は、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）またはその１つもしくはそれ以上の断片である。
【０３９６】
ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしても知られている）は、血漿中に存在し、内皮（バイベルパラーデ小体内）、巨核球（血小板のα顆粒）、および内皮下結合組織において構成的に産生される大きな多量体糖タンパク質である。基本的なＶＷＦ単量体は、２８１３個のアミノ酸のタンパク質である。各単量体は、Ｄ’およびＤ３ドメイン（一体になって、第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂレセプター、ヘパリン、および／またはおそらくはコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（このドメインが活性化すると、ＲＧＤドメインが血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合する）、ならびにタンパク質のＣ末端にある「システインノット」ドメイン（ＶＷＦは、このドメインを血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）およびβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）という、特有の機能を有するいくつかの特有のドメインを含有する。
【０３９７】
ヒトＶＷＦの２８１３個の単量体アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＮＰ０００５４３．２として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＮＭ００５５２．３として報告されている。配列番号４４（図１１Ｂ）は、配列番号４３によってコードされるアミノ酸配列である。Ｄ’ドメインは、配列番号４４の７６４から８６６位のアミノ酸を含む。Ｄ３ドメインは、配列番号４４の８６７から１２４０位のアミノ酸を含む。
【０３９８】
血漿中では、ＦＶＩＩＩの９５〜９８％は、完全長ＶＷＦとの強固な非共有結合複合体中で循環する。ｉｎ  ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩＩの適切な血漿中レベルを維持するために、この複合体の形成が重要である。Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ．  ９２（１１）：３９８３〜９６（１９９８）；Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ５（７）：１３５３〜６０頁（２００７）。重鎖の３７２および７４０位と、軽鎖の１６８９位におけるタンパク質分解により、ＦＶＩＩＩが活性化される場合、ＦＶＩＩＩに結合したＶＷＦが、活性化ＦＶＩＩＩから外れる。
【０３９９】
ある特定の実施形態では、異種部分は、完全長フォンビルブランド因子である。他の実施形態では、異種部分は、フォンビルブランド因子断片である。本明細書で使用されるように、用語「１つのＶＷＦ断片」または「複数のＶＷＦ断片」は、ＦＶＩＩＩと相互作用し、完全長ＶＷＦによってＦＶＩＩＩに通常もたらされる、少なくとも１つまたはそれ以上の特性、例えば、ＦＶＩＩＩａに対する早期活性化を防止すること、早期タンパク質分解を防止すること、早期クリアランスをもたらすことのあるリン脂質膜との会合を防止すること、ネイキッドＦＶＩＩＩには結合することができるがＶＷＦの結合したＦＶＩＩＩには結合することができないＦＶＩＩＩクリアランスレセプターへの結合を防止すること、および／またはＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖の相互作用を安定化することを保持する任意のＶＷＦ断片を意味する。具体的な実施形態では、異種部分は、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含む（ＶＷＦ）断片である。Ｄ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、これらの１つまたはそれ以上の断片、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＶＷＦドメインをさらに含むことができる。ＶＷＦ断片に融合したＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドのさらなる例は、その両方を参照によってその全体として本明細書に組み入れる、２０１２年７月３日に出願された米国仮特許出願第６１／６６７，９０１号、および米国特許出願公開第２０１５／００２３９５９  Ａ１号に開示されている。
【０４００】
１２．リンカー部分
ある特定の実施形態では、異種部分は、ペプチドリンカーである。
【０４０１】
本明細書で使用されるように、用語「ペプチドリンカー」または「リンカー部分」は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における２つのドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。
【０４０２】
一部の実施形態では、ペプチドリンカーをコードする異種ヌクレオチド配列は、本開示の最適化ＦＶＩＩＩポリヌクレオチド配列と、例えばアルブミンなどの上記の異種部分の１つをコードする異種ヌクレオチド配列の間に挿入することができる。ペプチドリンカーは、キメラポリペプチド分子に柔軟性を提供することができる。リンカーは一般的に切断されないが、そのような切断が望ましいことがある。一実施形態では、これらのリンカーは、プロセシングの間、除去されない。
【０４０３】
本開示のキメラタンパク質中に存在することができるタイプのリンカーは、切断部位（すなわち、プロテアーゼ切断部位基質、例えば、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子、またはトロンビン切断部位）を含み、その切断部位のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両側に追加のリンカーを含むことができる、プロテアーゼで切断可能なリンカーである。これらの切断可能なリンカーは、本開示の構築物に組み込まれると、異種の切断部位を有するキメラ分子を生じる。
【０４０４】
一実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖に含まれるＦｃ領域を形成するように、ｃｓｃＦｃリンカーを介して連結された２つまたはそれ以上のＦｃドメインもしくはＦｃ部分を含む。ｃｓｃＦｃリンカーは、少なくとも１つの細胞内プロセシング部位、すなわち、細胞内酵素によって切断される部位に隣接している。少なくとも１つの細胞内プロセシング部位でポリペプチドが切断されると、少なくとも２本のポリペプチド鎖を含むポリペプチドが得られる。
【０４０５】
他のペプチドリンカーを、本開示の構築物において、例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質をＦｃ領域に接続するために、場合により使用することができる。本開示との関連で使用することができるいくつかの例示的なリンカーとして、例えば、下にさらに詳述されているＧｌｙＳｅｒアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。
【０４０６】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、天然に存在しないものである。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸からなる第１の直鎖状配列を、自然には連結されないかまたは自然には遺伝的に融合されないアミノ酸からなる第２の直鎖状配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（天然に存在することができるかまたは存在することができない）を含む。例えば、一実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変形態である（例えば、付加、置換または欠失のような突然変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、自然には生じない直鎖状配列で生じる天然に存在するアミノ酸を含むことができる。さらに別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含むことができる。
【０４０７】
例えば、ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、同一のＦｃ部分に融合させ、それによって、ホモ二量体ｓｃＦｃ領域を形成することができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、異なるＦｃ部分（例えば、野生型Ｆｃ部分およびＦｃ部分バリアント）に融合させ、それによって、ヘテロ二量体ｓｃＦｃ領域を形成することができる。
【０４０８】
別の実施形態では、ペプチドリンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ｓｃＦｃまたはｃｓｃＦｃリンカーは、免疫グロブリンヒンジおよびｇｌｙ−ｓｅｒリンカーの少なくとも一部分を含む。本明細書で使用されるように、用語「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。ある特定の実施形態では、前記ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの２つの他の配列の間に挿入することができる。他の実施形態では、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの別の配列の一端または両端に結合する。また他の実施形態では、２つまたはそれ以上のｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーに直列に組み込まれる。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）上流の少なくとも一部、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）中央の少なくとも一部、および一連のｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基を含む。
【０４０９】
本開示のペプチドリンカーは、少なくとも１つのアミノ酸長であり、様々な長さである。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１から約５０アミノ酸長である。この関連で使用する場合、用語「約」は、＋／−２個のアミノ酸残基を示す。リンカー長は、正の整数でなければならないため、約１から約５０アミノ酸長の長さは、１〜３から４８〜５２アミノ酸長の長さを意味する。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１０から約２０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５から約５０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約２０から約４５アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５から約３５または約２０から約３０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００または２０００アミノ酸長である。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、２０または３０アミノ酸長である。
【０４１０】
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００個のアミノ酸を含むことができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００個のアミノ酸を含むことができる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００個のアミノ酸を含むことができる。ペプチドリンカーは、１〜５個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１０〜５０個のアミノ酸、５０〜１００個のアミノ酸、１００〜２００個のアミノ酸、２００〜３００個のアミノ酸、３００〜４００個のアミノ酸、４００〜５００個のアミノ酸、５００〜６００個のアミノ酸、６００〜７００個のアミノ酸、７００〜８００個のアミノ酸、８００〜９００個のアミノ酸、または９００〜１０００個のアミノ酸を含むことができる。
【０４１１】
ペプチドリンカーは、当技術分野で公知の技法を使用して、ポリペプチド配列に導入することができる。改変は、ＤＮＡ配列解析によって確認することができる。プラスミドＤＮＡを使用して、産生されるポリペプチドが安定して産生されるように宿主細胞を形質転換することができる。
【０４１２】
Ｉ．単量体−二量体ハイブリッド
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列をさらに含む本開示の単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩを含む単量体−二量体ハイブリッド分子をコードする。
【０４１３】
本明細書で使用される用語「単量体−二量体ハイブリッド」は、ジスルフィド結合によって互いに会合する第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、第１の鎖は、第ＶＩＩＩ因子および第１のＦｃ領域を含み、第２の鎖は、ＦＶＩＩＩを含まない第２のＦｃ領域を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。よって、単量体−二量体ハイブリッド構築物は、１つの凝固因子のみを有する単量体の態様、および２つのＦｃ領域を有する二量体の態様を含むハイブリッドである。
【０４１４】
Ｊ．発現制御要素
一部の実施形態では、本開示の核酸分子またはベクターは、少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む。発現制御配列は、本明細書で使用されるように、プロモーター配列またはプロモーターとエンハンサーの組合せのような任意の調節ヌクレオチド配列であって、その配列が作動可能に連結するコード核酸の効率的な転写と翻訳を促す、配列である。例えば、本開示の単離された核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結される。
【０４１５】
遺伝子発現制御配列は、例えば、哺乳動物またはウイルスのプロモーター、例えば構成的または誘導可能なプロモーターであってよい。哺乳動物の構成的プロモーターとして、これらに限定されないが、以下の遺伝子に関するプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、ベータアクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターが挙げられる。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルスからのプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。
【０４１６】
他の構成的プロモーターは、当業者に知られている。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとして、誘導性プロモーターも挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で誘導されて、転写および翻訳を促進する。他の誘導性プロモーターは、当業者に知られている。
【０４１７】
一実施形態では、本開示は、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下で、導入遺伝子を発現させることを含む。別の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝特異的プロモーターの例として、これらに限定されないが、マウスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ１−アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。特定の実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターは、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａら、１９８６年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６：４６９７頁に記載される。Ｆ８プロモーターは、ＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９９５年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：１１８２８〜１１８３８に記載される。
【０４１８】
１つまたはそれ以上のエンハンサーを使用して、発現レベルをさらに高めて、治療効能を達成することができる。１つまたはそれ以上のエンハンサーは、単独でまたは１つまたはそれ以上のプロモーターエレメントと一緒に提供することができる。典型的には、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメントおよび組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサーは、α１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーの１つまたはそれ以上の複製を含む（Ｒｏｕｅｔら、１９９２年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：２０７６５〜２０７７３頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：３９５〜４０４頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３３４：５７７〜５８４頁；Ｉｌｌら、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８：Ｓ２３〜Ｓ３０頁）。別の実施形態では、エンハンサーは、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６のような肝特異的転写因子結合部位に由来し、Ｅｎｈ１は、ＨＮＦ１、（センス）−ＨＮＦ３、（センス）−ＨＮＦ４、（アンチセンス）−ＨＮＦ１、（アンチセンス）−ＨＮＦ６、（センス）−ＥＢＰ、（アンチセンス）−ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む。
【０４１９】
特定の例では、本開示に有用なプロモーターは、配列番号６９（すなわち、ＥＴプロモーター；図１１Ｙ）を含み、この配列は、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ６６１２６５としても公知である。Ｖｉｇｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１（５）：７６３頁（２００５）も参照のこと。他の好適なベクターおよび遺伝子調節エレメントの例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れるＷＯ０２／０９２１３４、ＥＰ１３９５２９３、または米国特許第６，８０８，９０５号、同第７，７４５，１７９号、もしくは同第７，１７９，９０３号に記載される。
【０４２０】
一般に、発現制御配列は、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含むものとする。特に、そのような５’非転写配列は、作動可能に連結されたコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、所望によりエンハンサー配列または上流の活性化因子配列を場合により含む。
【０４２１】
ＶＩ．医薬組成物
本明細書に開示されるレンチウイルス遺伝子療法ベクターまたは本開示の宿主細胞（例えば、本明細書に開示されるレンチウイルス遺伝子療法ベクターが標的にする肝細胞）を含有する組成物は、好適な薬学的に許容される担体を含有することができる。例えば、それらは、作用部位への送達のために設計された調製物への活性化合物のプロセシングを促進する、賦形剤および／または補助剤を含有することができる。
【０４２２】
医薬組成物は、ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内投与）用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは複数回用量容器内に保存剤を加えた状態で供給することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤のような形態をとり、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤のような製剤化剤を含有する場合がある。あるいは、活性成分は、好適なビヒクル、例えば、パイロジェンフリー水で構成される粉末形態である場合がある。
【０４２３】
非経口投与用の好適な製剤として、水溶性形態、例えば、水溶性塩である、活性化合物の水性液剤も挙げられる。さらに、適切な油性注射用懸濁剤としての活性化合物の懸濁剤を投与することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとして、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、エチルオレエートまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射用懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含む、懸濁剤の粘度を向上させる物質を含有することができる。場合によって、懸濁剤は、安定剤も含有することができる。リポソームを使用して、細胞または間質腔への送達用に、本開示の分子を封入することもできる。例示的な薬学的に許容される担体は、生理学的に適合可能な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどである。一部の実施形態では、組成物は、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される物質（湿潤剤など）または活性成分の貯蔵寿命もしくは有効性を向上させる少量の補助物質（湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝剤など）を含む。
【０４２４】
本開示の組成物は、例えば、液体（例えば、注射用溶液および注入用溶液）、分散液、懸濁液、半固体および固体の剤形を含む、種々の形態である。好ましい形態は、投与方法と治療用途に応じて変わる。
【０４２５】
組成物は、液剤、マイクロエマルジョン剤、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の規則構造体として製剤化することができる。滅菌注射用液剤は、必要に応じて、上で列挙した成分のうちの１つまたは組合せとともに、活性成分を所要量で適切な溶媒中に投入し、ろ過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散剤は、塩基性分散媒と上で列挙した他の成分のうちの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに活性成分を投入することによって調製される。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌散剤の場合には、好ましい調製方法は、事前に滅菌ろ過した溶液から、活性成分といずれかの所望の追加成分との粉末をもたらす真空乾燥と凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散剤の場合には所要の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の吸収時間の延長は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを組成物中に含むことによって実現することができる。
【０４２６】
活性成分は、放出制御製剤または放出制御デバイスを用いて製剤化することができる。このような製剤およびデバイスの例として、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系が挙げられる。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤およびデバイスの調製方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照のこと。
【０４２７】
注射用デポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマー内の薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製することができる。薬物とポリマーとの比率、および用いられるポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の例示的な生分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリアンハイドライドである。注射用デポー製剤は、薬物をリポソームまたはマイクロエマルジョン中に捕捉することによっても調製することができる。
【０４２８】
補足的な活性化合物を組成物中に組み込むことができる。一実施形態では、本開示のキメラタンパク質は、他の凝固因子、またはそのバリアント、断片、アナログもしくは誘導体とともに製剤化される。例えば、凝固因子として、これらに限定されないが、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子またはこれらのいずれかの組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）もしくは活性化形態が挙げられる。止血剤の凝固因子として、抗線溶薬、例えば、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸も挙げることができる。
【０４２９】
投与レジメンを調整して、最適な所望の応答をもたらすことができる。例えば、単回ボーラス投与を行うことも、経時的に、数回の分割投与を行うことも、または治療状況の緊急性によって示されるのに応じて、用量を比例的に減少または増加させることもできる。投与のし易さおよび投薬量の均一化のために、非経口組成物を投薬量単位形態で製剤化するのが有益である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．  １９８０年）を参照のこと。
【０４３０】
活性化合物に加えて、液体剤形は、水、エチルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルのような不活性成分を含有することができる。
【０４３１】
好適な医薬担体の非限定例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにも記載されている。賦形剤のいくつかの例として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、ｐＨ緩衝試薬、および湿潤剤または乳化剤も含有することができる。
【０４３２】
経口投与用には、医薬組成物は、従来の手段によって調製した錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。組成物は、液剤、例えば、シロップ剤または懸濁剤として調製することもできる。液体は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素添加食用脂）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分別植物油）、および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を含むことができる。調製剤は、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤も含むことができる。あるいは、組成物は、水または別の好適なビヒクルで構成するための乾燥生成物として供給することができる。
【０４３３】
口腔内投与用では、組成物は、従来のプロトコールに従って、錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることができる。
【０４３４】
吸入による投与用では、本開示に従って使用するための化合物は、利便的には、賦形剤を含むか含まないかにかかわらず、霧状化エアロゾル剤の形態または場合によって、噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素もしくは他の好適な気体とともに、圧縮パックもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。加圧エアロゾル剤の場合には、投薬量単位は、バルブを搭載して定量した量を送達することによって決定することができる。化合物とラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、例えば、吸入器または注入器において使用するためのゼラチンのカプセル剤およびカートリッジを製剤化することができる。
【０４３５】
医薬組成物は、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐薬または停留浣腸として直腸投与のために製剤化することもできる。
【０４３６】
一実施形態では、医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードする最適化核酸分子を含むレンチウイルスベクター、および薬学的に許容される担体を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードする最適化核酸分子を含むレンチウイルスベクターを含む宿主細胞（例えば、肝細胞）、および薬学的に許容される担体を含む。
【０４３７】
一部の実施形態では、組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および経口投与からなる群から選択される経路で投与される。非経口投与は、静脈内投与または皮下投与である場合がある。
【０４３８】
他の実施形態では、組成物を使用して、それを必要とする対象における出血性疾患または状態を処置する。出血性疾患または状態は、出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、大出血、筋肉内への大出血、口腔大出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、頭蓋内大出血、腹腔内大出血、胸腔内大出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血、腸腰筋外筒内出血およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、対象は、手術を受けることが予定されている。また他の実施形態では、処置は、予防的であるかまたは要求に応じるものである。
【０４３９】
本明細書に記載の様々な態様、実施形態、および選択肢は全て、いずれかおよび全ての変形形態で組み合わせることができる。
【０４４０】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願を、個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照によって組み入れられることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参照によって本明細書に組み入れる。
【実施例】
【０４４１】
本開示について概ね説明してきたが、本明細書において提供される実施例を参照することによって、さらに深い理解を得ることができる。これらの実施例は、例示を目的とするに過ぎず、限定を意図するものではない。
【実施例１】
【０４４２】
コドン最適化戦略
コドン使用頻度バイアスを制御することによって、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（配列番号１；図１Ａ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（配列番号２；図１Ｂ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（配列番号７０；図１Ｃ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（配列番号７１；図１Ｄ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（配列番号３；図１Ｅ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２（配列番号４；図１Ｆ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（配列番号５；図１Ｇ）、およびｃｏＦＶＩＩＩ−２６（配列番号６；図１Ｈ）を含む８つのコドン最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩバリアントを作成した。オンラインツールＥｕｇｅｎｅを使用して、以前に記載されたようにコドン最適化を促進し（Ｇａｓｐａｒら、「ＥｕＧｅｎｅ：ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８：２６８３〜８４頁（２０１２）を参照のこと）、コドン適合指数（ＣＡＩ）および相対的同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）のようないくつかのコドン使用頻度パラメータをモニタリングした（表５）。すべてのバリアントをＣＡＩ≧８３％およびＲＳＣＵ≧１．６３に調整したが、一方、親Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、最適化前に、ＣＡＩ  ７４％およびＲＳＣＵ  １．１２を有する（表５）。
【０４４３】
【表６】
2021512126.tif 000010
【０４４４】
ＣＡＩの全体的な向上に加えて、８つのバリアントを、図２に示されているように、最適化されていないＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列と比較したコード領域にわたるＣＡＩの分布に基づいて３つのクラスに設計した（図２Ａ）。第１のクラスは、コード領域全体にわたり、高いＣＡＩが均一に分布しているＢＤＤ  ＦＶＩＩＩバリアントを含む（図２Ｃ〜２Ｆを参照のこと）。第１のクラスには、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（図２Ｃ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（図２Ｄ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（図２Ｅ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（図２Ｆ）、および以前に記載されたｃｏＦＶＩＩＩ−１（国際公開第２０１４／１２７２１５号（配列番号１）を参照のこと）が含まれる（図２Ｂ）。第２のクラスは、コード配列のＮ末端側半分のＣＡＩの方が低く、コード配列のＣ末端側半分のＣＡＩの方が高いＢＤＤ−ＦＶＩＩＩバリアントを含む（図２Ｇおよび２Ｈを参照のこと）。第２のクラスには、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（図２Ｇ）およびｃｏＦＶＩＩＩ−６２（図２Ｈ）が含まれる。第３のクラスは、コード配列のＮ末端側半分のＣＡＩの方が高く、コード配列のＣ末端側半分のＣＡＩの方が低いＢＤＤ  ＦＶＩＩＩバリアントを含む（図２Ｉおよび２Ｊを参照のこと）。第３のクラスには、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（図２Ｉ）およびｃｏＦＶＩＩＩ−２６（図２Ｊ）が含まれる。
【０４４５】
いかなる理論にも拘束される訳ではないが、ＣＡＩが高いほど、タンパク質への翻訳が速くなり、これらの３つのクラスは、最初から最後まで、異なるタンパク質合成速度を示す可能性があると推測された。例えば、ＣＡＩの低い方の領域の翻訳は、ＣＡＩの高い方の領域の翻訳よりもゆっくり進行する。その場合、例えば、低い方のＣＡＩを有するｃｏＦＶＩＩＩ−５２またはｃｏＦＶＩＩＩ−６２のＮ末端側半分の翻訳が最初にゆっくりと進み、その後、ＣＡＩが高い方のＣ末端側半分の翻訳が、より速く進むようである。このことは、全体的なタンパク質合成のペースを落とすことのない、翻訳中のタンパク質フォールディングおよび翻訳後修飾にとって好ましい。Ｎ末端側半分のＣＡＩの方が高く、Ｃ末端側半分のＣＡＩの方が低いｃｏＦＶＩＩＩ−２５およびｃｏＦＶＩＩＩ−２６バリアントでは、反対の効果が見られる場合がある。
【０４４６】
ｍＲＮＡの安定性を確保するために、すべてのＦＶＩＩＩコドン最適化バリアントを調整して、クリプティックスプライス部位、未成熟ポリＡ部位、ＲＮＡ不安定モチーフ（ＡＲＥ）、および反復配列を含む多くの部位を取り除き、ＧＣ含有率を調整した（表２を参照のこと）。
【実施例２】
【０４４７】
ｐｃＤＮＡ３プラスミドからのｃｏＦＶＩＩＩバリアントのクローニングおよび発現
様々なＦＶＩＩＩバリアントを含有する発現プラスミドをｉｎ  ｖｉｖｏ発現用に設計した。最適化されていないＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（図１Ｉ；配列番号１６）とｃｏＦＶＩＩＩ−１（図１１Ｚ；配列番号６８）のポリヌクレオチドを、ＣＭＶプロモーターをＥＴプロモーターに置き換えたｐｃＤＮＡ３骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした（図３を参照のこと）。得られたプラスミドのＦＶＩＩＩ−３１１（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）とＦＶＩＩＩ−３０３（ｃｏＦＶＩＩＩ−１）は、それぞれ、最適化されていないＢＤＤ  ＦＶＩＩＩとｃｏＦＶＩＩＩ−１の発現を駆動する。
【０４４８】
Ｈｅｍ  Ａマウスにおいて、ＦＶＩＩＩ−３０３またはＦＶＩＩＩ−３１１のＤＮＡ５μｇ／マウスの水圧注入によって、ＦＶＩＩＩ−３１１とＦＶＩＩＩ−３０３のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を評価した。注射の２４、４８、および７２時間後に、血漿試料を採取し、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって、ＦＶＩＩＩ活性を決定した。
【０４４９】
図４に示したように、ＦＶＩＩＩ−３１１で処置したマウスの血漿中ＦＶＩＩＩ活性（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ；四角）が注射の７２時間後に７４±４３ｍＵ／ｍＬであったのに対して、ＦＶＩＩＩ−３０３で処置したマウスの血漿中ＦＶＩＩＩ活性（ｃｏＦＶＩＩＩ−１；円）は注射の７２時間後に４５２±１７０ｍＵ／ｍＬであった（図４）。このことにより、ｃｏＦＶＩＩＩ−１の発現が、最適化されていないＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比べて、およそ６倍増大したことが示される。
【実施例３】
【０４５０】
レンチウイルスベクター系を使用するｃｏＦＶＩＩＩバリアントのクローニングと発現
コドン最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩバリアントの発現レベルをさらに評価するために、ＥＴプロモーターの制御下で、コード配列をレンチウイルスプラスミドにクローニングした（Ａｍｅｎｄｏｌａら、「Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｄｕａｌ−ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌ．２３：１０８〜１６頁（２００５）、国際公開第２０００／０６６７５９Ａ１号を参照のこと）。ｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２のプラスミドマップは、図５に示されており；最適化されていないＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（ＬＶ−２１１６）、ｃｏＦＶＩＩＩ−１（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１）、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−３）、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−４）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５）、およびｃｏＦＶＩＩＩ−６（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６２）、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−２５）、およびｃｏＦＶＩＩＩ−２６（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−２６）を含有するプラスミドは、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２断片を、ＮｈｅＩおよびＳａｌＩ部位を使用して、指定した各コード配列で置き換えた以外は同様にして構築した（表６）。
【０４５１】
【表７】
2021512126.tif 000011
【０４５２】
レンチウイルスコドン最適化ＦＶＩＩＩバリアントは、ＨｅｍＡマウスにおいて、ＤＮＡ５μｇ／マウス（図６Ａ、６Ｂ）またはＤＮＡ２０μｇ／マウス（図６Ｃ）の用量の水圧注入によって評価した。図６に示したように、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（図６Ａ；三角）、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（図６Ａ；逆三角）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（図６Ａ；ダイヤモンド）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（図６Ａ；白丸）、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（図６Ｂ；三角）、ｃｏＦＶＩＩＩ−２６（図６Ｂ；逆三角）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（図６Ｃ；四角）、およびｃｏＦＶＩＩＩ−６２（図６Ｃ；黒丸）はそれぞれ、ｃｏＦＶＩＩＩ−１（図６Ａ、円；図６Ｂ、円；および図６Ｃ、三角）よりも高いＦＶＩＩＩ活性を示した。特に、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５とｃｏＦＶＩＩＩ−２６は、注射の７２時間後に同様の発現レベルを示し、ｃｏＦＶＩＩＩ−１の活性よりも約３倍高い活性に達し（図６Ｂ）、これは、換算すると、最適化されていない親ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比較して２４倍高いＦＶＩＩＩ活性となる（図４を参照のこと）。ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（四角）およびｃｏＦＶＩＩＩ−６２（黒丸）はいずれも、注射の７２時間後にさらに高い発現を達成し、それぞれ、ｃｏＦＶＩＩＩ−１（三角）よりも６倍および４倍、それぞれ、最適化されていない親ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（白丸）よりも５０倍および３０倍高い発現を示した（図６Ｃ）。これらのデータによって、コード配列のＮ末端側半分のＣＡＩの方が低いことと、コード配列のＣ末端側半分のＣＡＩの方が高いこととを組み合わせると、ＣＡＩの分布がこれと逆である場合と比較して、ＦＶＩＩＩを発現に対してより有益となることが示されている。
【実施例４】
【０４５３】
ＨｅｍＡマウスにおけるコドン最適化ＦＶＩＩＩバリアントのレンチウイルスによる長期発現
水圧注入の７２時間後のＨｅｍＡマウスにおいて、ＦＶＩＩＩの高発現を駆動することが特定されたバリアントを、レンチウイルスベクター媒介遺伝子移入による長期ＦＶＩＩＩ発現について評価した。レンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞において、一過性トランスフェクションによって生成し、超遠心分離によって、約５Ｅ９ＴＵ／ｍｌまで濃縮した。次いで、レンチウイルスベクターを１２〜１４日齢のＨｅｍＡマウスに、後眼窩注射によって、１Ｅ８ＴＵ／マウスの用量で投与した。ＬＶ−２１１６（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ；図７）を注射したマウスでは、レンチウイルスの注射の２１日後に、平均血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、約０．０４ＩＵ／ｍｌであった。ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、およびｃｏＦＶＩＩＩ−６２はそれぞれ、注射後２１日目に、ＬＶ−２１１６（最適化されていないＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ）対照よりも高い循環ＦＶＩＩＩレベルをもたらした。特に、注射後２１日目に、ｃｏＦＶＩＩＩ−１とｃｏＦＶＩＩＩ−５の注射によって、約１．８ＩＵ／ｍＬの血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルがもたらされ、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２によって、約４．９ＩＵ／ｍＬの血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルがもたらされ、ｃｏＦＶＩＩＩ−６によって、約４．６ＩＵ／ｍＬの血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルがもたらされ、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２によって、約２．５ＩＵ／ｍＬの血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルがもたらされた（図７）。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６とＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２を注射したマウスで観察された血漿中ＦＶＩＩＩレベルは、それぞれ、４．６ＩＵ／ｍｌおよび４．９ＩＵ／ｍｌであり、これらは、ＬＶ−２１１６（最適化されていないＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）対照を注射したマウスで観察された血漿中レベルよりも１００倍超高い。
【実施例５】
【０４５４】
ｃｏＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合構築物
ＸＴＥＮが、定常状態のＦＶＩＩＩ発現を向上させる能力について試験した。最初に、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２およびｃｏＦＶＩＩＩ−１のヌクレオチド１１９３に（またはコードされるポリペプチドの最初の７６４アミノ酸の後に）、１４４アミノ酸のＸＴＥＮのコード配列（「ＸＴＥＮ１４４」；配列番号１８）を挿入して、それぞれ、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮ（図８Ａ；配列番号１９）およびｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ（図８Ｂ；配列番号２０）を作成した。次いで、上記のように、ＥＴプロモーターの制御下で、ｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ配列をｐｃＤＮＡ３骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ＦＶＩＩＩ−３０６発現プラスミドを作成し；上記で開示されたように、ＥＴプロモーターの制御下で、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮ配列をレンチウイルスプラスミドにクローニングして、ｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮを作成した（図９）。ＦＶＩＩＩ−３０６（ｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ）を、５μｇのＤＮＡ／マウスで、水圧注入によってＨｅｍＡマウスに投与した。ＦＶＩＩＩ−３０３（ｃｏＦＶＩＩＩ−１；図１０Ａ、小円）およびＦＶＩＩＩ−３１１（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ；図１０Ａ、四角）と比較した場合、ｃｏＦＶＩＩＩ−１へのＸＴＥＮ１４４の融合（ＦＶＩＩＩ−３０６；図１０Ａ、大円）は、注射の７２時間後のＨｅｍＡマウスにおいて、それぞれ、約５倍および約３３倍高いＦＶＩＩＩ発現をもたらした。ＸＴＥＮ挿入がＦＶＩＩＩの発現に及ぼす効果をまた、ＨｅｍＡマウスにおいて、レンチウイルスベクターを使用して評価した（図１０Ｂ）。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮを１２〜１４日齢のＨｅｍＡマウスに、１Ｅ８ＴＵ／マウスで、後眼窩注射によって投与した。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ５２およびＬＶ−２１１６（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）と比較した場合、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２へのＸＴＥＮ１４４の融合により（図１０Ｂ）、注射後２１日目のＨｅｍＡマウスにおいて、それぞれ、約４倍および４５０倍高いＦＶＩＩＩ発現がもたらされた。
【０４５５】
ｃｏＦＶＩＩＩ−３、ｃｏ−ＦＶＩＩＩ−４、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５、およびｃｏＦＶＩＩＩ−２６をそれぞれＸＴＥＮ１４４に融合したとともに、ＥＴプロモーターに融合したものを含むレンチウイルスベクターを、上記のように作製することになる。ＦＶＩＩＩタンパク質の発現についてこのベクターを試験する。
【実施例６】
【０４５６】
ｃｏＦＶＩＩＩ構築物の発現
図９に示したように、標準的な分子クローニング技法によって、コドン最適化ＦＶＩＩＩバリアントをレンチウイルスプラスミドにクローニングした。次いで、一過性トランスフェクションを通じて、レンチウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞において生成し、超遠心分離によって単離した。
【０４５７】
ＦＶＩＩＩレンチウイルスベクターを１４日齢のＨｅｍＡ仔マウスに、静脈内注射によって、１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇのＬＶ−ＦＶＩＩＩバリアントの用量で投与した。ＬＶ−ＦＶＩＩＩによる処置後２１日目に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性を測定し、ＬＶ−ＦＶＩＩＩによる処置後１５０日目に、ＬＶ−ＦＶＩＩＩで処置した動物から採取した剖検肝臓試料において、細胞当たりのベクターコピー数（ＶＣＮ）を測定した。投与したＬＶ−ＦＶＩＩＩバリアントにかかわらず、ＶＣＮ値は、すべての動物において同程度であったが（図１２Ｂ）、ｃｏＦＶＩＩＩバリアントで処置した動物におけるＦＶＩＩＩ活性レベルは、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩで処置した動物よりも３０〜１００倍高かった（図１２Ａおよび１２Ｃ；表７）。これらのデータによって、ＦＶＩＩＩコドンの最適化が、レンチウイルスベクターによる設定において、ＦＶＩＩＩの発現を向上させることが示される。
【０４５８】
【表８】
2021512126.tif 000012
【実施例７】
【０４５９】
レンチウイルスによる処置後のＨｅｍＡマウスにおける、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子発現媒介性免疫応答
ＦＶＩＩＩの長期発現と抗ＦＶＩＩＩ抗体の形成について、実施例６のＬＶ−ＦＶＩＩＩで処置したマウスを評価した。ＦＶＩＩＩの発現は、血漿中ＦＶＩＩＩ活性によって示されるように、同じ処置群内の動物間で異なっていた（図１３Ａ）。例えば、ｃｏＦＶＩＩＩ−５バリアントを発現するレンチウイルスベクターで処置した３匹のマウス（指定した１、２、および３）では、およそ１６週間にわたって、ＦＶＩＩＩの一貫した発現が示されたが、一方、同じレンチウイルスベクターで処置した３匹の同腹マウス（指定した４、５、および６）では、処置の約１０週間後までに、血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルの急落が示された（図１３Ａ）。マウス１、２、および３で一貫した血漿中ＦＶＩＩＩ活性が観察されたことは、抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルが検出不能であったかまたは非常に低かったことと相関していた（図１３Ｂ；マウス１、２、および３）。これに対して、血漿中ＦＶＩＩＩ活性の急落を示したマウスでは、抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルの向上も示された（図１３Ｂ；マウス４、５、および６）。これらのデータによって、動物のサブセットでは、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現により、抗ＦＶＩＩＩ抗体の形成が誘導され、その結果生じた抗ＦＶＩＩＩ抗体が、トランスジェニックＦＶＩＩＩタンパク質を循環血液から消失させることが示唆される。
【０４６０】
ＦＶＩＩＩ発現と抗ＦＶＩＩＩ抗体形成の間の関係を評価した。実施例６のＬＶ−ＦＶＩＩＩで処置したマウスを、抗ＦＶＩＩＩ抗体陰性マウスと、抗ＦＶＩＩＩ抗体陽性マウスの２つの群に分けた。図１４に示したように、生理学的レベルでのトランスジェニックＦＶＩＩＩ発現によっては、トランスジェニックＦＶＩＩＩに対する免疫応答は誘導されない（図１４、円）。しかしながら、超生理学的レベルのＦＶＩＩＩ発現によっては、抗ＦＶＩＩＩ抗体の形成が誘導され、その結果、ＦＶＩＩＩ発現レベルが高いほど、抗ＦＶＩＩＩ抗体が誘導される可能性が高くなるようである。これらのデータから、ＦＶＩＩＩ遺伝子療法による処置を受けた患者において、生理学的レベルのＦＶＩＩＩ発現を維持することが有益であることが示唆される。
【０４６１】
ＦＶＩＩＩ発現によって誘導される免疫応答によって、導入遺伝子を発現する肝細胞が消失するかどうかを確かめるために、抗ＦＶＩＩＩ抗体陽性マウスと陰性マウスからの剖検肝臓試料において、ベクターコピー数（図１５）とＦＶＩＩＩ  ＲＮＡ転写レベル（図１６）を評価した。図１５に示したように、ベクターコピー数の分布は、抗ＦＶＩＩＩ抗体陽性マウスと抗ＦＶＩＩＩ抗体陰性マウスにおいて同じであったことから、抗ＦＶＩＩＩ抗体の発現にかかわらず、ＬＶ−ＦＶＩＩＩが組み込まれた細胞が維持されたことが示された。このことにより、ＬＶ−ＦＶＩＩＩ媒介ＦＶＩＩＩ導入遺伝子発現によって、ＦＶＩＩＩ発現肝細胞に対して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が誘導されないことが示唆される。これらの結果を更に確認するために、ＦＶＩＩＩ  ＲＮＡの転写をＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって評価した（図１６Ｃおよび１６Ｄ）。肝臓摘出時に、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ｂマウスは、循環ＦＶＩＩＩが検出不能であり、抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルが高かった（図１６Ａおよび１６Ｂ）。しかしながら、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ｂマウスからの肝組織におけるＲＮＡ転写シグナルとＦＶＩＩＩ−ＲＮＡ陽性細胞数は、ＦＶＩＩＩ−５２−Ａマウス（剖検時の循環ＦＶＩＩＩが約４ＩＵ／ｍｌであった）に匹敵した。したがって、実験用ＨｅｍＡマウスにおいて、ＦＶＩＩＩ発現によって、ＣＴＬ応答は誘導されなかった。
【実施例８】
【０４６２】
ＬＶ−ＦＶＩＩＩで処置したＨｅｍＡマウス新生仔におけるＦＶＩＩＩの長期発現
肝臓を標的にすることによる小児のＨｅｍＡ患者の処置にレンチウイルス系を使用することの有効性を評価するために、２日齢のＨｅｍＡマウスに、側頭静脈注射によって、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２ＸＴＥＮ、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ６−ＸＴＥＮ、またはｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを発現するレンチウイルスベクターを約１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ投与した。バリアントと対照の両方に対して、一貫したＦＶＩＩＩの長期発現が観察され、処置したマウスの分裂肝細胞において、組み込まれたＦＶＩＩＩ発現カスケードが維持されたことが実証された（図１７）。これらのデータから、ＬＶ−ＦＶＩＩＩを使用して、小児のＨｅｍＡ患者と成人のＨｅｍＡ患者の両方を処置することが可能であることが示唆される。
【実施例９】
【０４６３】
ＨｅｍＡマウス新生仔におけるＬＶ−ＦＶＩＩＩの評価
遺伝子置き換えのためのレンチウイルスベクター（ＬＶ）によるｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法によって、複数の適応症に対する、且つ処置した患者のうち腫瘍形成のエビデンスを示さなかった患者における複数年のフォローアップに関して、臨床有効性が実証されている。ＬＶ−ＦＩＸの全身送達は、持続的なＦＩＸ発現を媒介し、血友病動物モデルにおいて十分に耐えられるものである。高いパッケージング能、遺伝子組み込みを介した導入遺伝子の長期発現を持続する能力、ヒト集団における既存の抗ＬＶ抗体（ａｂｓ）の欠損ならびに前臨床および臨床現場において実証された有望なｉｎ  ｖｉｖｏプロファイルにより、ＬＶは、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達用、特に、ＦＶＩＩＩのようなｃＤＮＡサイズの大きい候補遺伝子用の有望なビヒクルとなる。
【０４６４】
血友病Ａ（ＨｅｍＡ）の処置にＬＶ−ＦＶＩＩＩを使用できる可能性を評価するために、マイクロＲＮＡ−１４２標的配列を複数コピー含有するＬＶ系に、肝細胞特異的プロモーターの制御下に置いたコドン最適化ヒトＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩ）バリアントを構築して、抗原提示細胞におけるＦＶＩＩＩ発現を最小限にし、抗ＦＶＩＩＩ抗体を誘導する可能性を低下させた。ＬＶ−ｈＦＶＩＩＩベクターを２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成し、超遠心分離によって１０００倍に濃縮し、ＨｅｍＡマウスモデルにおいて評価した。ＬＶ−ｈＦＶＩＩＩの静脈内投与後、ＦＶＩＩＩ活性および抗原アッセイによって、循環ｈＦＶＩＩＩレベルをモニタリングし、定量ＰＣＲによってＬＶ  ＤＮＡコピーを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって導入遺伝子ＲＮＡを測定することによって、肝臓におけるＬＶ形質導入効率を評価し、全抗ｈＦＶＩＩＩ抗体ＥＬＩＳＡによって、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体を測定した。
【０４６５】
新生期に処置したＨｅｍＡマウスでは、すべてのＬＶ−ｈＦＶＩＩＩバリアントにおいて、持続的なＦＶＩＩＩの発現が観察された。用量１ｋｇ当たりの１．５Ｅ１０形質導入単位において、コドン最適化ｈＦＶＩＩＩをコードするＬＶ（ＬＶ−ｃｏｈＦＶＩＩＩ）によって、循環ＦＶＩＩＩは、野生型ｈＦＶＩＩＩをコードするＬＶよりも、３０〜１００倍高くなったが（図１２Ｃ）、肝細胞におけるベクターコピー数と、ＦＶＩＩＩ  ＲＮＡ陽性細胞のパーセントは、すべての試験群において同程度であった（図１２Ｂ）。コドン最適化と、ＸＴＥＮ（ペイロードの流体力学的サイズを増大させることによって、循環半減期を改善することが推定される非構造化親水性ポリペプチド）とを組み合わせたところ（ＬＶ−ｃｏｈＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ）、血漿において、３０〜５０ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性が得られ、この値は、正常な循環ＦＶＩＩＩレベルの３，０００〜５，０００％を表す（図１２Ａ、図１７）。さらに、ｈＦＶＩＩＩが超生理学的レベルのマウスでのみ、抗ｈＦＶＩＩＩ  ａｂｓが検出されたが（図１４）、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体陽性マウスにおいて、ＬＶ形質導入細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答は観察されなかった（図１５および１６Ａ〜１６Ｄ）。本発明者らの結果により、血友病Ａのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法用ＬＶ−ＦＶＩＩＩのさらなる開発が支持される。
【実施例１０】
【０４６６】
ＨｅｍＡマウスにおけるＬＶ−ＦＶＩＩＩ処置の用量応答
ＨｅｍＡマウスにおけるＬＶ−ＦＶＩＩＩ処置の用量応答を決定するために、１２〜１４日齢のＨｅｍＡ仔マウスを、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６またはＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮで、後眼窩注射によって、４つの用量レベル：１．３ｘ１０１０ＴＵ／ｋｇ、４．５ｘ１０９ＴＵ／ｋｇ、１．５ｘ１０９ＴＵ／ｋｇおよび８．３ｘ１０８ＴＵ／ｋｇで処置した。
【０４６７】
処置したマウスのＬＶ−ＦＶＩＩＩ媒介ＦＶＩＩＩの発現レベルをＦＶＩＩＩ発色アッセイで測定し、ピークＦＶＩＩＩ発現レベルを図１８Ａ（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６）および図１８Ｂ（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ）においてプロットした。
【０４６８】
ＬＶ−ＦＶＩＩＩ処置後に、１．３  Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ、４．５ｘ１０９ＴＵ／ｋｇ、１．５ｘ１０９ＴＵ／ｋｇおよび８．３ｘ１０８ＴＵ／ｋｇ処置群に対する平均ピークＦＶＩＩＩ発現レベルは、それぞれ、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６に関する標準の８８２％、６６２％、１５％および１２％；それぞれ、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮに関する標準の１７９３％、４３１％、１０％および１０％である。
【０４６９】
現在のＦＶＩＩＩ置換療法では、ＦＶＩＩＩ予防のために標的とするトラフレベルは、標準の１〜３％であり、血友病Ａを有する患者に有意な保護をもたらす。検査した最も低いＬＶ−ＦＶＩＩＩ用量である、８．３ｘ１０８ＴＵ／ｋｇでは、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６処置とＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ処置の両方によって、ＨｅｍＡマウスにおける循環ＦＶＩＩＩの標準の１０％以上がもたらされ、１ｘ１０９ＴＵ／ｋｇのＬＶ−ＦＶＩＩＩ処置が血友病Ａ患者にとって治療上有益である可能性があることを示唆する。
【実施例１１】
【０４７０】
ブタオザルにおける２つのレンチウイルスベクターの試験的単回用量ＩＶ注入研究
１．目的：この研究の目的は、それぞれ、血友病Ａ処置のためのブタオザルにおけるレンチウイルスベクター（ＬＶ）第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法の用量／応答関係を決定することである。
【０４７１】
２．検査系および正当性：ブタオザル（ミナミブタオザル（Ｍ．  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ））、ナイーブな雄、１〜５年齢、２〜５ｋｇ。ブタオザルは、ＬＶ遺伝子療法についてのこの用量／応答研究に対する適切な薬理学的に活性なモデルである。この時点で、実験動物の研究には、提出書類をサポートすることが必要とされ、下位の種は、ＬＶ用量応答関係について研究するのに実行可能なモデルとはみなされない。使用される動物の数は、意味のある結果をもたらすのに必要な最小限の数である。
【０４７２】
３．動物の飼育、収容、および環境条件：動物の飼育および収容に関する一般的手順は、ＡＡＡＬＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ推奨、「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（国立研究評議会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）、現行版）に記載される現行の要件、アメリカ合衆国農務省（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）が改正された動物福祉法（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）の要件で記載する現行の要件に合致することになり、検査施設のＳＯＰに従うことになる。研究開始前に、研究設計は再調査され、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【０４７３】
３．１  隔離と順化：ＮＨＰを隔離し、順化させる。すべての動物は、健康なＮＨＰのみが投与されることを保証するために実施される、糞便検査、ＴＢ検査、身体検査、および臨床病理学の健康スクリーニング（血液学と血清化学のみ）を受ける。隔離の間、動物はまた、およそ１週間の間隔をあけて２回採血される。
【０４７４】
約４ｍＬの目標体積を有する全血試料を、クエン酸ナトリウムを含有するチューブ（複数可）中に回収し、遠心分離までウェットアイス上に置く。体積に応じて、血漿を、アリコート当たり約５００μＬの４つの目標アリコートに分け、液体窒素上で直ちに凍結させた。約１ｍＬの目標体積を有する全血試料を、抗凝固剤を含有しないが、血清セパレーターゲル（ＳＳＴチューブ）を含有するチューブ内に回収する。ＳＳＴチューブを室温で少なくとも３０分間凝固させ、次いで、遠心分離して、およそ３００μＬの目標血清を得る（体積に応じて）。一旦分離した血清は、ドライアイス上で直ちに凍結させる。すべてのチューブを、１３００相対遠心力（ＲＣＦ）の設定で、少なくとも１０分間遠心分離する。クエン酸ナトリウムのチューブは、４℃の温度に設定した冷却遠心機で処理し、ＳＳＴチューブは、室温に設定した遠心機で処理し、すべての試料は、処理後、分析用に輸送されるまで−８５〜−６０℃に維持するよう設定した冷凍庫内で凍結される。
【０４７５】
投与開始前に、ＮＨＰを拘束椅子に慣れさせる。ＮＨＰを、少なくとも３回の事象で最大で連続して１時間の椅子での拘束を受け入れるように、徐々に順化させる。動物は、十分な時間をかけてそれらのホームケージに戻ることができるように、１時間を最大さらに２０分超えて、椅子にいる場合があることにも留意されたい。
【０４７６】
３．２  動物の収容および環境条件：ＮＨＰは、研究の間に２回かまたは３回収容される。ＮＨＰは、事象（明白な臨床兆候、ケージの仲間による顕著な攻撃など）によって分離が正当とされる場合には、研究中に１匹で収容される。１匹で収容されるいずれの動物も、本発明者らの獣医スタッフによって決定された栄養強化を受ける。
【０４７７】
研究室の温度および湿度の範囲は、それぞれ、６４〜８４°Ｆおよび５０±２０％に設定する。光サイクルは１２時間のオン／１２時間のオフを維持するよう設定する。空気交換と加圧の読み取り値は、外部の顧問医師によって少なくとも年に２回モニタリングされ、最低限、１時間に１０回の新鮮な空気への交換を条件とした環境制御を確保する。
【０４７８】
３．３．  給餌：指定した絶食期間または研究事象の間に動物がそのホームケージを離れている場合（例えば、用量投与および採血のために拘束椅子に置かれている場合）を除き、サルには、１日に２回、ＰＭＩ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｄｉｅｔ  ５０４８を給餌する。飼料には、新鮮な果物および／または新鮮な野菜および／またはサプリメントも補充される。
【０４７９】
ＰＭＩ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｄｉｅｔの各ロットの分析報告は、製造業者によって提供される。許容可能な基準および研究の目的または実施を妨げるレベルの夾雑物を含まないことを保証するために分析報告を再調査する。分析結果を検査施設の記録に保持する。飼料サプリメントには分析を必要としない。
【０４８０】
３．４  水：動物には、拘束期間中（例えば、採血、椅子への順化および投与などの間）を除き、自動給水システムによってＷｅｓｔ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎの上水道から、新鮮な水を自由に与える。
【０４８１】
水の供給については、許容可能な基準および研究の目的または実施を妨げるレベルの夾雑物を含まないことを保証するために定期的に分析する。結果を検査施設の記録に保持する。
【０４８２】
４．検査および対照物：
【０４８３】
【表９】
2021512126.tif 000013
【０４８４】
４．３  検査物および対照物構成成分の予備試料：持続期間が４週間を超えるため、保存記録用の予備の目標１ｍＬの試料をこの研究の各検査物から得る。
【０４８５】
４．４  使用されていないバルク検査物の処分：使用されていない製剤化された検査物はいずれも、将来の研究で使用するために保持されるか、治験依頼者の委任した実験室に輸送されるか、処分されるか、または返却される。
【０４８６】
４．５  製剤の調製、取扱い、および保存：製剤を使用するために検査物を用意する。この研究では製剤は調整されない。
【０４８７】
４．６  製剤の分析および安定性：この研究では、製剤の分析または安定性について実施されない。
【０４８８】
５．実験設計
５．１  群への振分けおよび識別：群への振分けの前に、動物をその刺青によって識別する。投与に使用される動物は、体重のデータに基づき、層別無作為化プログラム（Ｐｒｏｖａｎｔｉｓ）を使用して、無作為に振り分けられる。
【０４８９】
投与群への割当て後に、この研究内で特有の動物識別番号で各動物を割り当て、ケージカードで識別した。各ケージカードは、以下に限定されないが、研究番号、群への割当て、および動物識別番号を含む情報を含む。刺青を使用して、ケージカードの研究動物番号と一致させる。
【０４９０】
５．２  用量投与：以下の通りの各動物へのそれぞれ１日目の投与前に、動物に麻酔前投与レジメンを投与する（スローボーラス注射による）。
【０４９１】
【表１０】
2021512126.tif 000014
【０４９２】
以下の各目標用量レベルで、動物に検査物を投与する。
【０４９３】
【表１１】
2021512126.tif 000015
【０４９４】
各動物は、頭部または伏在静脈にカテーテル処置され、それぞれの用量レベルで、シリンジポンプ（例えば、ＫＤＳ２２０またはその等価物）を使用して、静脈内投与（１ｍＬ／分を目標とする）を１回受け、続いて、０．９％の塩化ナトリウム溶液の０．４〜０．８ｍＬのフラッシュを受ける。フラッシュ時間は、投与時間の終了と考えられる。
【０４９５】
５．３  臨床観察：死亡率および／または瀕死に関する観察を、受容日と剖検日に少なくとも１回、およびその後、隔離、順化、および研究期間は、週７日で１日に２回行う。
【０４９６】
動物の受容から継続して生存期間の最終日まで、投与前に最低１回およびそれに続く投与の２時間後（＋／−１５分）に少なくとも１回、ケージ側の臨床観察を実証する際の各投与日を除き、少なくとも１日に１回ケージ側の臨床観察を実施する。
【０４９７】
５．４  体重：隔離中に少なくとも１回および群への振分けのための動物選択前（１週前）に１回、個々の体重をすべての動物について記録し、１、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０および５３日目に体重を記録する。各群に関して１日目に記録した体重を、投与のための用量体積決定に使用する。
【０４９８】
５．５  臨床病理：臨床病理（血液学、臨床化学および凝固）評価のための検体を以下の予定に従って採取する。すべてのＮＨＰを各採取間隔の前に一晩絶食させる。
【０４９９】
【表１２】
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【０５００】
血液学、臨床化学、および凝固評価のために、大腿血管または他の好適な末梢血管から採血する（試料当たり１．５〜３．０ｍＬを目標とする）。血液の体積は、ＩＡＣＵＣのガイドラインに適応するよう調整することに留意されたい。血液学のためのチューブには、抗凝固剤としてＫ３  ＥＤＴＡが含まれる。血清化学の決定のために使用されるチューブには、抗凝固剤は含まれないが、血清セパレーターゲルが含まれる。凝固のためのチューブには、抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムが含まれる。
【０５０１】
必要であれば、臨床病理評価のために、瀕死の動物から、可能であれば採血する。臨床病理結果、および臨床病理学者の報告は、最終報告に含まれる。
【０５０２】
５．５．１  血液学：評価される血液学パラメータは、以下の通りである：
【０５０３】
【表１３】
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【０５０４】
血液学の検体（残留血液）は、分析後に廃棄する。
【０５０５】
５．５．２  臨床化学：評価される臨床化学パラメータは、以下の通りである：
【０５０６】
【表１４】
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【０５０７】
分析後の残留血清は、研究の終了前に廃棄する。
【０５０８】
５．５．３  凝固：評価される凝固パラメータは、以下の通りである：
【０５０９】
【表１５】
2021512126.tif 000019
【０５１０】
凝固検体（残留血液）は、分析後に廃棄する。
【０５１１】
５．６  生化学分析による分析と薬物動態評価
５．６．１  検体の採血：生化学分析による分析のための血液試料を採血し、以下の予定に従って処理して血漿と血清とする。８日目までに採取した血漿および血清を、第ＶＩＩＩ因子の発現が血清から決定され、潜在的サイトカイン評価が血漿および血清から決定される、セクション４．３に列挙したＰＩに輸送する。
（ｉ）絶食要件：他の手順のための絶食と同時でなければ、採決前に動物を絶食させない。
（ｉｉ）目標体積が約１ｍＬの全血試料をクエン酸ナトリウムを含有するチューブ内に回収し、遠心分離までウェットアイス上に置く。体積に応じて、血漿を、アリコート当たり約１００μＬの４つの目標アリコートに分け、液体窒素上で直ちに凍結させ、次いで、分析のために輸送されるまで−８５°〜−６０℃を維持するよう設定した冷凍庫内で保存する。
（ｉｉｉ）約１ｍＬの目標体積を有する全血試料を、抗凝固剤を含有しないが、血清セパレーターゲル（ＳＳＴチューブ）を含有するチューブ内に回収する。チューブを室温で少なくとも３０分間凝固させ、次いで、遠心分離して、およそ２００μＬの血清を含有する２つの目標アリコートを得る（体積に応じて）。一旦分離した血清は、ドライアイス上で直ちに凍結させ、次いで、分析のために輸送されるまで−８５°〜−６０℃を維持するよう設定した冷凍庫内で保存する。
（ｉｖ）すべてのチューブを、１３００相対遠心力（ＲＣＦ）の設定で、少なくとも１０分間遠心分離する。クエン酸ナトリウムのチューブは、４℃の温度に設定した冷却遠心機で処理し、ＳＳＴチューブは、室温に設定した遠心機で処理する。
（ｖ）採取部位：大腿血管または別の好適な血管。
（ｖｉ）最終的な保存：凍結（−８５°〜−６０℃）
【０５１２】
【表１６】
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【０５１３】
【表１７】
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【０５１４】
５．６．２  第ＶＩＩＩ因子の発現とサイトカイン評価：第ＶＩＩＩ因子の発現を血漿から決定し、血清から潜在的サイトカイン評価を決定する。
【０５１５】
５．６．３  末梢血単核球（ＰＢＭＣ）：各サルから採血した約１０ｍＬ（３０日目には約４ｍＬのみ）からＰＢＭＣを単離する。血液を１容積のＰＢＳで希釈し、１５ｃｃのコニカルチューブ中の１容積のフィコールの上にそれを穏やかに重ねる。チューブを、６５０×ｇで、２０℃にて３０分間、ブレーキオフで遠心分離する。ＰＢＭＣ層を回収し、ＤＰＢＳで洗浄し、４５０×ｇで、２０℃にて１０分間遠心分離し（ブレーキを有する）、塩化アンモニウム（１〜３ｍＬ）中に細胞ペレットを再懸濁させ、５分間インキュベートして赤血球を溶解させ、ＤＰＢＳで２回洗浄し、１５０×ｇで、２０℃にて１０分間遠心分離し（ブレーキを有する）、次いで、凍結媒体（９０％のＦＢＳ／１０％のＤＭＳＯ）中に再懸濁させる。単離したＰＢＭＣを、−８５°〜−６０℃を維持するよう設定した冷凍庫内で保存する。
【０５１６】
【表１８】
2021512126.tif 000022
【０５１７】
５．７  剖検
５．７．１  予定されていない剖検：死亡したかまたは予定されていない間隔で終了したすべての研究動物について完全剖検を実施する。死亡していた動物は、重度に自己融解していなければ、完全剖検される。可能な場合、診察可能な委員会認定の獣医病理学者により、すべての予定されていない剖検を行う。安楽死の前に、実行可能なように、臨床病理のための血液試料を採取する努力をする。採取する場合、組織を適切な固定剤中で固定し、それらのうちのどれが、組織病理学的評価のために処理されるかまたは廃棄されるかを決定する。
【０５１８】
５．７．２  予定された剖検：５３日目に動物を安楽死させる。剖検の前に動物を秤量し、剖検に移送するためにケタミン（ＩＭ注射により１０ｍｇ／ｋｇ）で鎮静させ、バルビツール酸系過量服薬の投与によって人道的に絶命させ、その後全採血する。
【０５１９】
（可能な場合）診察可能な委員会認定の獣医病理学者により、すべての予定された剖検を行う。各剖検には、体の外表面およびすべての開口部；頭蓋、胸部、腹部および骨盤腔ならびにそれらの内容物の調査；ならびに組織の採取が含まれる。
【０５２０】
以下に列挙した組織を、存在する場合、すべての動物から採取し、処理する。
【０５２１】
組織病理学：肝臓と脾臓の切片を採取し、１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中に入れる。サルの識別は、剖検中に得られた組織に関して保持される。
器官重量のデータは回収されない。
【０５２２】
ＤＮＡおよびＲＮＡ試料の採取：肝臓の右葉、肝臓の左葉、肝臓の中葉、肝臓の方形葉、肝臓の尾状葉および脾臓に関して：
【０５２３】
【表１９】
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【０５２４】
脳（大脳皮質）、心臓の左心室、心臓の右心室、右の腎臓、右の腋窩リンパ節、肺、右の精巣、左の精巣、胸腺、筋肉（右外側の腓腹筋）に関して：
【０５２５】
【表２０】
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【０５２６】
組織病理学的評価に使用しなかった肝臓の試料および脾臓の試料を上記のように急速凍結し、ＤＮＡおよびＲＮＡの抽出ならびに分子解析を可能にするためにＰＩに輸送する。
【０５２７】
すべての他の組織と残骸を廃棄する。
【０５２８】
５．７．３  組織の処理：組織病理学的評価のために採取した肝臓および脾臓の切片をトリミングし、通常通りに処理し、パラフィンで包埋し、およそ５ミクロンに切片化し、ガラススライド上に載せて、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色する。
【０５２９】
５．７．４．組織病理学的評価：本研究の病理医は、顕微鏡用に調製された各スライドを調査する。予定外の剖検（研究中に死亡した動物）で特定されたいずれの肉眼病変も顕微鏡により調査する。内部ピアレビューを実施する。解剖病理学のコメントもこの研究のファイルと最終報告に含まれる。
【０５３０】
６．統計分析：Ｐｒｏｖａｎｔｉｓのシステムを使用して、バテル（Ｂａｔｔｅｌｌｅ）で回収したすべての適切な定量的生存中データを、パラメトリックまたはノンパラメトリック分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、検査物の効果について分析する。すべてのデータについて、正規性はシャピロ・ウィルク検定によって決定し、等分散性はルビーン検定によって決定する。パラメトリック仮説に適合するようデータをログ変換する。正規分布し、群間で均一であると決定されたパラメトリックデータについて、ＡＮＯＶＡ  Ｆ検定を使用して、群平均間に差があるかどうかを決定する。ＡＮＯＶＡ  Ｆ検定が有意であれば、次いで、対照と各比較群の間の差についての検定を、ダネット検定を使用して行い、多重比較用に調製する。正規分布していないおよび／または不均一なノンパラメトリックデータについて、クラスカル・ワリス検定を使用して、群平均間に差があるかどうかを決定する。クラスカル・ワリス検定が有意であれば、次いで、対照と各比較群の間の差についての検定を、ウィルコクソン検定およびボンフェローニ・ホルム法を使用して行い、多重検定用に補正する。すべての統計検定は、指定される場合、多重比較の後に、０．０５の有意差レベルで実施する（ｐ＜０．０５）。
【実施例１２】
【０５３１】
ブタオザルにおける単回用量のＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ６ＸＴＥＮ研究
３頭のブタオザル（体重３．５〜４．３ｋｇ）をＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉｆｒｅｅ  ２９３Ｔ細胞から生成したＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮで、１．５ｍＬ／分の注入速度で静脈内（ＩＶ）注入により、３Ｅ９ＴＵ／ｋｇの用量で処置した。抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体形成を制御するために、ＬＶ処置の１日前から７日目まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）（メチルプレドニゾロン）の筋肉内注射により、動物を毎日処置した。ＬＶ処置の３０分前に、潜在的アレルギー反応を制御するために、４ｍｇ／ｋｇの用量で、ポララミン（デクスクロルフェニラミン）のＩＶ注射でも動物を処置した。血漿試料を、ＬＶ処置後７、１０、および１４日目に採取し、ヒトＦＶＩＩＩ活性および抗原レベルに関して分析した。３頭の動物におけるピーク血漿中レベルは、それぞれ、１８７ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、および１３１ｎｇ／ｍＬのヒトＦＶＩＩＩ抗原レベル（図２０Ｂ）に対応して、ＦＶＩＩＩ活性に関する基準の１０２％、５４％、および６７％で測定した（図２０Ａ）。これらのデータによって、非ヒト霊長類における治療上有益なヒトＦＶＩＩＩ発現が、比較的低いＬＶ用量レベルで達成されることが実証される。
【実施例１３】
【０５３２】
ブタオザルにおけるパイロットＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ６およびＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６ＸＴＥＮ用量応答研究
１０頭のブタオザル（体重３．５〜４．３ｋｇ）をＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ−Ｉｆｒｅｅ  ２９３Ｔ細胞から生成したＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６またはＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮで、１．５ｍＬ／分の注入速度で静脈内（ＩＶ）注入により、処置した。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６に関する用量は、３Ｅ９ＴＵ／ｋｇまたは６Ｅ９ＴＵ／ｋｇであり、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮに関する用量は、１Ｅ９ＴＵ／ｋｇまたは３Ｅ９ＴＵ／ｋｇであった。抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体形成を制御するために、ＬＶ処置の１日前から７日目まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）（メチルプレドニゾロン）の筋肉内注射により、動物を毎日処置した。ＬＶ処置の３０分前に、潜在的アレルギー反応を制御するために、４ｍｇ／ｋｇの用量で、ポララミン（デクスクロルフェニラミン）のＩＶ注射でも動物を処置した。血漿試料をＬＶ処置後０、１、３、７、１４、２１、２８、４５および６０日目に採取し、ヒトＦＶＩＩＩ活性および抗原レベルに関して分析した。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６処置後には、３Ｅ９または６Ｅ９ＴＵ／ｋｇ処置群のピーク血漿中レベルを、それぞれ、５ｎｇ／ｍＬまたは９ｎｇ／ｍＬの平均ヒトＦＶＩＩＩ抗原レベル（図２１Ｂ）に対応して、それぞれ、ＦＶＩＩＩ活性に関する基準の５％または１２％で平均した（図２１Ａ）。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ処置後には、１Ｅ９または３Ｅ９ＴＵ／ｋｇ処置群のピーク血漿中レベルを、それぞれ、３１ｎｇ／ｍＬまたは１４０ｎｇ／ｍＬの平均ヒトＦＶＩＩＩ抗原レベル（図２２Ｂ）に対応して、それぞれ、ＦＶＩＩＩ活性に関する基準の２０％または７５％で平均した（図２２Ａ）。これらのデータは、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６とＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮの両方によって、非ヒト霊長類において、治療上有益なヒトＦＶＩＩＩ発現を達成されることを実証する。
【０５３３】
特定の実施形態についての前記記載は、本開示の一般的性質を十分に明らかにしているため、他者が、過度な実験をすることなく、本開示の一般的概念から逸脱することなく、当技術分野の知識を適用することによって、このような特定の実施形態を容易に修正するおよび／またはそれに種々の応用を適用することができる。したがって、このような適応および修正は、本明細書に提示される教示およびガイダンスに基づき、本開示の実施形態の意味および均等物の範囲内にあることが意図される。本明細書の表現法または用語法は説明を目的とするものであって限定を目的とするものではなく、その結果、本明細書の用語法または表現法は教示とガイダンスを考慮して当業者に解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【０５３４】
本開示の他の実施形態は、本明細書および本明細書に開示された本開示の実施を考慮して当業者に明らかである。本明細書および実施例は例示として考慮されるに過ぎず、本開示の真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【０５３５】
本明細書で引用したすべての特許および刊行物は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
2021512126.tif 000044
【図６−３】
2021512126.tif 000045
【図７】
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【図８−１】
2021512126.tif 000047
【図８−２】
2021512126.tif 000048
【図８−３】
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【図９】
2021512126.tif 000050
【図１０−１】
2021512126.tif 000051
【図１０−２】
2021512126.tif 000052
【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
2021512126.tif 000058
【図１２−１】
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【図１２−２】
2021512126.tif 000060
【図１３】
2021512126.tif 000061
【図１４】
2021512126.tif 000062
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2021512126.tif 000065
【図１８】
2021512126.tif 000066
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021512126.tif 000073
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