(57)【要約】本発明は、ＣｐＧ−ＤＮＡによって産生されたモノクロナール抗体、またはその機能的断片において、前記モノクロナール抗体、またはその機能的断片は、下記のポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか１つのポリペプチド配列を含むことを特徴とするモノクロナール抗体、またはその機能的断片：配列番号１で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号２で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で記載されるＣＤＲ３領域を含む重鎖と、配列番号４で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号５で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で記載されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖とで構成されるモノクロナール抗体及びその用途に関する。
2021517579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｐＧ−ＤＮＡによって産生されたモノクロナール抗体、またはその機能的断片であって、
前記モノクロナール抗体、またはその機能的断片は、下記のポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか１つのポリペプチド配列を含むことを特徴とする、モノクロナール抗体、またはその機能的断片：
配列番号１で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号２で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で記載されるＣＤＲ３領域を含む重鎖と、配列番号４で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号５で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で記載されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖とで構成されるモノクロナール抗体。
【請求項２】
前記機能的断片は、単一の側鎖抗体（ｓｃＦｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体、またはその機能的断片。
【請求項３】
前記機能的断片は、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体、またはその機能的断片。
【請求項４】
前記機能的断片は、請求項１に記載のＣＤＲ部位を含む軽鎖又は重鎖であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体、またはその機能的断片。
【請求項５】
前記機能的断片は、請求項１に記載のＣＤＲ部位を含む可変ドメイン（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体、またはその機能的断片。
【請求項６】
前記モノクロナール抗体は、配列番号７又は配列番号１５で記載されるポリペプチド配列を含む重鎖、及び配列番号８又は配列番号１６で記載されるポリペプチド配列を含む軽鎖であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体。
【請求項７】
前記ＣｐＧ−ＤＮＡは、配列番号９で記載される塩基配列であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体。
【請求項８】
請求項１に記載のモノクロナール抗体またはその機能的断片を有効成分として含む、抗菌用組成物。
【請求項９】
前記組成物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内寄生菌または薬剤耐性菌に対して抗菌活性を有することを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ブドウ球菌、リステリア、サルモネラまたは大腸菌に対する抗菌活性を有することを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
ＣｐＧ−ＤＮＡによって産生されたモノクロナール抗体、またはその機能的断片を含む、抗菌用組成物。
【請求項１２】
前記モノクロナール抗体、またはその機能的断片は、下記のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物：
配列番号１で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号２で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で記載されるＣＤＲ３領域を含む重鎖と、配列番号４で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号５で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で記載されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖とで構成されるモノクロナール抗体。
【請求項１３】
前記モノクロナール抗体は、配列番号７又は配列番号１５で記載されるポリペプチド配列を含む重鎖、及び配列番号８又は配列番号１６で記載されるポリペプチド配列を含む軽鎖であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ブドウ球菌、リステリア、サルモネラまたは大腸菌に対する抗菌活性を有することを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
ＣｐＧ−ＤＮＡを動物に投与して、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ブドウ球菌、リステリア、サルモネラまたは大腸菌に対する抗菌活性を有する抗体を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌用抗体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性免疫システムは、ホストに潜在的に害になる物質及び侵入する病原体に対する第一線の防御となる。病原体の認識は、先天性免疫細胞においてＰＲＲｓ（ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）を介したＰＡＭＰｓ（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）として知られる保存された構造に依存する。ＴＬＲｓ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）は、主要なよく研究されたＰＲＲｓであり、ＴＬＲｓの活性化は、サイトカイン、ケモカイン及び多数の免疫細胞を産生して免疫を誘導し、これは、細菌、ウイルス及び寄生虫のような病原体に対する防御を行う。
【０００３】
ＴＬＲ９（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９）は、ホストにおいて免疫調節の効果を誘導するバクテリアＤＮＡを検出する公知の受容体である。バクテリアＤＮＡ及びＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含む合成オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＤＮＡ）は、多数の細胞を活性化して増殖させ、Ｔｈ１媒介のサイトカインをＴＬＲ９の刺激を通じて産生する。
【０００４】
ところが、ＣｐＧ−ＤＮＡ刺激によって産生された抗体及びその作用については知られていない。
【０００５】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、直接患者を相手にする臨床医にとって大きな関心事であり、これは、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌によって引き起こされる感染よりも高い致死率及び発病率を示す。さらに、このような感染は、より長期間の入院時間及び抗菌物質により、さらに高いコストをもたらし、その結果、このような病原体によって感染した患者の治療には、非常に高いコストが発生するようになる。
【０００６】
バンコマイシンは、ＭＲＳＡによって引き起こされる感染の治療のために選択できる最初の抗菌剤であった。２００４年のバンコマイシンに対するＭＲＳＡ菌株の耐性に対する内容は、医学−科学共同体が懸念を示してきた。現在、ＭＲＳＡは、現在使用できる全ての薬品に耐性がある病原体、すなわち、恐ろしい「スーパーバグ又はスーパーバクテリア」の最も強力な候補である。
【０００７】
通常、院内感染においてＭＲＳＡ有病率（全ての感染の中でＭＲＳＡによって引き起こされる黄色ブドウ球菌の比率）は、過去数十年にわたって漸進的に増加している。米国の３３７の病院での１２６８ＩＣＵ（集中治療ユニット）を含め、Ｊａｒｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．によって行われた研究において、ＩＣＵ内でＭＲＳＡによって引き起こされた感染数は、６６０件から２１８４件に変更され、有病率も３５％から６４．４％に増大した。日本において、ＭＲＳＡによって引き起こされる院内感染（ＨＩｓ）の有病率は、憂慮すべき数値、すなわち、６０％〜９０％を示す。米国で行われた研究において、百分位数は、１９７４年２％から１９９７年５０％に変わった。
【０００８】
ＭＲＳＡ菌株は、ＰＢＰ２ａのようなβ−ラクタムクラスで抗菌剤に対する非常に低い親和力を有するペニシリン結合タンパク質を提供する。遺伝子ｍｅｃＡにコード化されるこのような酵素の存在下で、細菌は、甚だしくはβ−ラクタムの存在下でもペプチドグリカンを成功裏に合成する。β−ラクタムに対する耐性以外にも、病院ＭＲＳＡ菌株は、治療のために一番目に選択されるグリコペプチド（バンコマイシン及びテイコプラニン）の使用と共に、他の利用可能な抗菌性クラスに対しても耐性を示す。
【０００９】
ＰＢＰ２ａに対抗してＤＮＡワクチンを使用する２種類の研究は、このようなタンパク質は免疫原性があり、その獲得された免疫反応は、マウスモデルで行われた研究において、ＭＲＳＡに対抗する防御を付与することができることを示した。しかし、院内感染において、ほとんどの患者は免疫抑制されたことが知られている。このような場合には、ワクチンは、細菌感染を制御するために適切な時間内に防御的抗体を生成できないはずである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２０１０−０１０８４２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、ＣｐＧ−ＤＮＡ刺激によって産生された抗体を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、ＣｐＧ−ＤＮＡ刺激によって産生された抗体の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、ＣｐＧ−ＤＮＡによって産生されたモノクロナール抗体、またはその機能的断片において、前記モノクロナール抗体、またはその機能的断片は、下記のポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか１つのポリペプチド配列を含むことを特徴とするモノクロナール抗体、またはその機能的断片：配列番号１で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号２で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で記載されるＣＤＲ３領域を含む重鎖と、配列番号４で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号５で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で記載されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖とで構成されるモノクロナール抗体を提供する。
【００１４】
本発明の一具現例において、前記機能的断片は、単一の側鎖抗体（ｓｃＦｖ）；抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）；本発明の抗体のＣＤＲ部位を含む軽鎖又は重鎖；及び本発明の抗体のＣＤＲ部位を含む可変ドメイン（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）のうちの１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００１５】
本発明の他の具現例において、前記モノクロナール抗体は、配列番号７又は配列番号１５で記載されるポリペプチド配列を含む重鎖、及び配列番号８又は配列番号１６で記載されるポリペプチド配列を含む軽鎖であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１６】
本発明の他の具現例において、前記ＣｐＧ−ＤＮＡは、配列番号９で記載される塩基配列からなることが好ましいが、これに限定されない。
【００１７】
また、本発明は、前記本発明のモノクロナール抗体またはその機能的断片を有効成分として含む抗菌用組成物を提供する。
【００１８】
本発明の一具現例において、前記組成物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内寄生細菌（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）または薬剤耐性菌に対して抗菌活性を有することが好ましく、前記組成物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ブドウ球菌、大腸菌、サルモネラまたはリステリアに対する抗菌活性を有することがより好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
また、本発明は、ＣｐＧ−ＤＮＡによって産生されたモノクロナール抗体、またはその機能的断片を含む抗菌用組成物を提供する。
【００２０】
本発明の一具現例において、前記モノクロナール抗体、またはその機能的断片は、下記のポリペプチド配列を含むことを特徴とするモノクロナール抗体、またはその機能的断片：配列番号１で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号２で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で記載されるＣＤＲ３領域を含む重鎖と、配列番号４で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号５で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で記載されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖とで構成されるモノクロナール抗体であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２１】
また、本発明は、ＣｐＧ−ＤＮＡを動物に投与して、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ブドウ球菌、大腸菌、サルモネラまたはリステリアに対する抗菌活性を有する抗体を産生する方法を提供する。
【００２２】
以下、本発明を説明する。
【００２３】
本発明において、本発明者らは、バクテリア−反応性の抗体の産生においてＣｐＧ−ＤＮＡの新規な機能を提案する。
【００２４】
ＣｐＧ−ＤＮＡでのマウスの前処理は、Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染からマウスの生存を増加させ、マウス組織からバクテリアを除去した。ＣｐＧ−ＤＮＡの単独投与は、獲得免疫（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を増加させる方向に腹腔内で特に免疫細胞群を調節した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染は、腹腔内、骨髄及び脾臓において全細胞数の大きな減少を誘導した反面、ＣｐＧ−ＤＮＡでマウスの前処理は、一般的に免疫細胞群を保護した。ＣｐＧ−ＤＮＡでマウスの感染は、バクテリア−反応性の抗体の増加を誘導し、これは、腹腔及び血清でＴＬＲ９−依存の経路を介して様々な種のバクテリアと結合することができた。ＣｐＧ−ＤＮＡによる腹腔内細胞の刺激は、インビトロでバクテリア−反応性の抗体を誘導した。バクテリア−反応性の抗体は、ＣｐＧ−ＤＮＡに反応して腹腔内Ｂ１及びＢ２細胞の両方から産生し、その抗体は、マウスの腹腔内で食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を促進した。バクテリア−反応性のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、ＣｐＧ−ＤＮＡで刺激された−腹膜Ｂ細胞から選択した。本発明者らは、バクテリアに反応性を有するモノクロナール抗体を確立し、その抗体配列を、ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇを通じて安定したヒト骨格にヒト化した。その精製されたモノクロナール抗体は、様々なバクテリアに反応性を有し、マクロファージ株及び１次腹腔細胞においてＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の食菌作用を促進した。
【００２５】
バクテリア−反応性のモノクロナール抗体の注射は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染後、生存率の増加及びバクテリア除去の治療効果を有した。その精製されたバクテリア−反応性のヒト化されたモノクロナール抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）は、様々なバクテリア（Ｇ（＋）及びＧ（−）バクテリア）に反応し、ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体の注射は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１の感染後、生存率の増加及びバクテリア除去の治療効果を有した。したがって、本発明者らは、ＣｐＧ−ＤＮＡが、腹腔内でバクテリア−反応性の抗体の産生を誘導し、免疫細胞群を保護して免疫システムの抗菌活性を促進することを提案する。
【００２６】
また、本発明者らは、バクテリア感染によって引き起こされる緊急な臨床状況の治療において、その分離されたモノクロナール抗体及びヒト化モノクロナール抗体が有用であることを提案する。
【００２７】
また、本発明は、上記の本発明の抗体または単一の側鎖抗体（ｓｃＦｖ）切片を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
【００２８】
また、本発明は、上記の本発明の抗体またはその単一の側鎖抗体（ｓｃＦｖ）切片を有効成分として含有する感染予防又は治療用組成物を提供する。
【００２９】
また、本発明は、上記の本発明の抗体またはその単一の側鎖抗体（ｓｃＦｖ）切片を有効成分として含有する抗感染組成物を提供する。
【００３０】
本発明の薬学は、薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤などをさらに含むことができる。
【００３１】
本発明で使用可能な担体としては、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子のように、ゆっくりと代謝される巨大分子が挙げられる。例えば、ハイドロクロライド、ハイドロブロマイド、ホスフェート及びスルフェートなどの無機酸の塩；アセテート、プロピオネート、マロネート及びベンゾエートなどの有機酸の塩のような薬学的に許容可能な塩；水、塩水、グリセロール及びエタノールのような液体、及び水和剤、乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助的物質を使用することができる。
【００３２】
薬学的に許容可能な担体に関しては、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｉｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９１］に記載されている。
【００３３】
また、前記組成物は、薬学的分野における通常の方法によって、患者の身体内の投与に適する単位投与型の製剤、好ましくは、タンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態で剤形化して、当業界で通常使用する投与方法を用いて、経口、または静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髓膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む非経口投与経路によって投与されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
このような目的に適する剤形としては、錠剤、丸剤、糖剤（ｄｒａｇｅｅ）、散剤、カプセル剤、シロップ剤、溶液剤、ゲル剤、懸濁剤、エマルション、マイクロエマルションなどの様々な経口投与用製剤；及び注射用アンプルのような注射剤、注入剤及びハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）のような噴霧剤などのような非経口投与用製剤が好ましい。注射又は注入用製剤の場合には、懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態を取ることができ、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤のような製剤化剤を含むことができる。また、前記抗体分子は、使用の前に適切な無菌液体で再調整して使用できる乾燥された形態で製剤化されてもよい。
【００３５】
本発明の組成物は、有効成分として、消化管内で分解されやすい抗体分子を含むので、前記組成物が消化管を用いる経路によって投与されなければならない場合には、分解から抗体を保護し、抗体を放出した後には消化管に吸収される薬剤を含むことが好ましい。
【００３６】
本発明ではまた、本発明の抗体を前記に記載されたような様々な方法により動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与する段階を含む感染症を予防又は治療する方法を提供する。
【００３７】
本発明の組成物又は薬学的製剤の有効成分として前記抗体は、ヒトを含む哺乳動物に対して、一日に０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重を１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、有効成分の実際の投与量は、予防又は治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢及び性別、薬剤の組み合わせ、反応敏感性及び治療に対する耐性／反応などの様々な関連因子に照らして決定されなければならないものと理解されるべきであり、したがって、前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
本発明の機能的抗体断片としては、軽鎖、重鎖、可変領域、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含有するペプチドなどが挙げられる。
【００３９】
Ｆａｂは、ＩｇＧをタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（重鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４０】
本発明のＦａｂは、本発明の抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、当該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、当該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することによって発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
【００４１】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（重鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４２】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明の抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはＳ−Ｓ結合させて作製することができる。Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４３】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を使用して連結したＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドであって、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４４】
本発明のｓｃＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを収得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製し、当該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することによって発現させて製造することができる。
【００４５】
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性が同一または異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片であり、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性、または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４６】
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、例えば、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを収得し、３〜１５残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製し、当該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することによってＤｉａｂｏｄｙを発現させて製造することができる。
【００４７】
また、ｌｉｎｋｅｒ  Ｐの長さが３〜１０であるときはｔｒｉｂｏｄｙが形成されて、ｔｒｉｂｏｄｙで含むことができる。
【００４８】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、当該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換されるアミノ酸残基は、Ｒｅｉｔｅｒなどによって記載された方法［参照：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明を通じて分かるように、本発明の抗体は、免疫細胞群を保護して免疫システムの抗菌活性を促進する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＣｐＧ−ＤＮＡがＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染からマウスを保護することを示した図である。（Ａ）実験過程の模式図。ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与した。７日後、マウスにｉ．ｖ．でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（１×１０７  ＣＦＵ）を注射した。（Ｂ）マウスの生存を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２感染７日後に記録した。各処理群における生存マウスのパーセントを示した（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）。（Ｃ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２感染２日後、そのマウスを犠牲にし、指示された組織を除去し、ＰＢＳ溶液で均質化した。その溶液を希釈し、アガープレートにプレーティングして、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（ｎ＝５／ｇｒｏｕｐ）のＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を測定した。（Ｄ）感染２日後、指示された組織の組織病理。スケールバー、１０μｍ。１８２６、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６；ＭＷ２、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２。この結果は、３回の独立した実験の代表値で示した。
【図２】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染後、マウスの腹腔、脾臓及び骨髄で細胞群の変化を示した図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与し、７日後、そのマウスにｉ．ｖ．でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（１×１０７  ＣＦＵ）を注射し、２日後、マウスを犠牲にし、腹腔、脾臓細胞及び骨髄細胞を集めて蛍光付き抗体で染色し、流動細胞分析法を通じて細胞群を分析した。（Ａ）腹腔細胞、（Ｂ）骨髄細胞。（Ｃ）脾臓細胞。ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ。１８２６、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６。ＭＷ２、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２。この結果は、３回の独立した実験の代表値で示した。
【図３】ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の投与によるマウスの腹腔内の抗体の産生を示した図である。マウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６又はｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１を記載された時間の間に投与し、投与１、３及び７日目に腹腔（Ａ）及び血清（Ｂ）の上澄液を集めて全ＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡで測定した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。この結果は、３回の独立した実験の代表値で示した。
【図４】マウスの腹腔及び血清においてＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の投与によるバクテリア−反応性の抗体の生成を示した図である。（Ａ，Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与し、７日後、そのマウスにｉ．ｖ．でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（１×１０７  ＣＦＵ）を注射し、２日後、マウスを犠牲にし、腹腔及び血清の上澄液をマウスから集めた。腹腔（Ａ）及び血清（Ｂ）のバクテリア−反応性の抗体を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２コーティングされたプレートを使用してキャプチャーし（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）、総ＩｇＧ及び各ＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅの量をＥＬＩＳＡで測定した。１８２６、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６。ＭＷ２、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２。（Ｃ−Ｆ）ＢＡＬＢ／ｃ（Ｃ，Ｄ）及びＴＬＲ９−／−（Ｅ，Ｆ）マウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与し、７日後、腹腔（Ｃ，Ｅ）及び血清（Ｄ，Ｆ）の上澄液を集めた。グラム（Ｇｒａｍ）陽性バクテリアに反応する抗体の量を測定するために、記載されたバクテリアをｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅコーティングされたプレートにコーティングした。総ＩｇＧの量をＥＬＩＳＡで決定した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。この結果は、３回の独立した実験の代表値で示した。
【図５】マウスの腹腔細胞においてＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の処理でインビトロでバクテリア−反応性の抗体の生成を示した図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＰＢＳ、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６またはｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡを７日間投与した。（Ａ）腹腔の細胞を集めてＰＢＳ、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６またはｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１で刺激し、４８時間後、細胞培養上澄液を集めて総ＩｇＧの量をＥＬＩＳＡで測定した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。（Ｂ）ＰＢＳ注射されたマウス由来の腹腔細胞にＰＢＳ、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６またはｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１で刺激した。グラム陽性バクテリアに反応する抗体の量を測定するために、記載されたバクテリアをｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅコーティングされたプレートにコーティングし、細胞培養上澄液を適用した。総ＩｇＧの量をＥＬＩＳＡで決定した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。（Ｃ）ＢＡＬＢ／ｃにｉ．ｐ．でＰＢＳまたはＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与した後、腹腔のＢ１及びＢ２細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ  ＩＩで蛍光標識された抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＣＤ１９及び抗マウスＣＤ２３抗体で分離した。（Ｄ及びＥ）腹腔由来の分離されたＢ１細胞及びＢ２細胞を、ＰＢＳまたはＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６で刺激し、４８時間後、細胞培養上澄液を集めた。総ＩｇＧ（Ｄ）及びグラム陽性バクテリアに反応する抗体（Ｅ）の量を、ＥＬＩＳＡで決定した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。１８２６、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６；２０４１、ｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１。この結果は、３回の独立した実験の代表値で示した。
【図６】マウスマクロファージ株においてＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６−誘導された多クローン抗体による食菌作用の増加を示した図である。（Ａ及びＢ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＰＢＳ（Ａ）またはＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６（Ｂ）を投与し、７日後、腹腔の上澄液を集めて、多クローン抗体をプロテインＡ親和ビーズで精製した。その精製された抗体を還元（ｒｅｄｕｃｉｎｇ；Ｒ）または非還元（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ；ＮＲ）サンプルバッファーで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０溶液で染色した。（Ｃ）抗体（１０μｇ／ｍｌ）のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２に対する結合能力をＥＬＩＳＡで測定した。ＰＣ  Ａｂ、ＰＢＳ−投与された腹腔由来の精製された抗体。１８２６  ＰＣ  Ａｂ、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６−投与された腹腔由来の精製された抗体。吸光度を４５０ｎｍで読んだ。（Ｄ）ＦＩＴＣ−標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（３×１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）を、ＰＢＳ、ＰＣ  Ａｂまたは１８２６  ＰＣ  Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）で１時間培養し、ＲＡＷ２６４．７細胞に処理し、１時間後、ＲＡＷ２６４．７細胞をＰＢＳで洗浄し、固定化した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｎｏ．３３２５８で染色して核（ｂｌｕｅ）を観察した。共焦点イメージは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の食菌作用を示す。スケールバー、１０μｍ。（Ｅ）食菌作用指数を分析した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。食菌作用指数は、マクロファージによって摂取されたＦＩＴＣ−標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の数を意味する。この結果は、３回の独立した実験の代表値で示した。
【図７】バクテリア−反応性のモノクロナール抗体を生成するＨＡＴ及びＨＴ培地でハイブリドーマクローンのスクリーニングを示した図である。（Ａ）ＨＡＴ培地で細胞融合実験の初期スクリーニングのＥＬＩＳＡ結果。ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６−投与されたマウスの腹膜細胞を集めてマウスＳＰ２／０  ｍｙｅｌｏｍａ細胞と融合した。バクテリア−反応性の抗体−産生ハイブリドーマクローンを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２コーティングされたプレートを使用してＨＡＴ培地でスクリーニングした。（Ｂ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２コーティングされたプレートを使用した図７Ａ由来の６クローンのＥＬＩＳＡ結果。（Ｃ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２コーティングされたプレートを使用した図７Ｂ由来の４クローンのＥＬＩＳＡ結果。（Ｄ）図７Ａ由来の３Ｆ５ハイブリドーマクローンからバクテリア−反応性の抗体を産生するクローンを選択するために、ＨＴ培地でリミッティング希釈方法を用いてサブクローニングした。（Ｅ）バクテリア結合に対するハイブリドーマクローン培養上澄液をＥＬＩＳＡを使用して分析した。
【図８】ハイブリドーマ細胞クローン３Ｆ５Ｈ６から分離された重鎖及び軽鎖の可変ドメインのｃＤＮＡ配列を示す。（Ａ）重鎖可変ドメインの配列。（Ｂ）軽鎖可変ドメインの配列。予測アミノ酸配列をｃＤＮＡ配列の下に記載する。
【図９】ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６−刺激されたマウス腹腔のＢ細胞から産生されたモノクロナール抗体による食菌作用の増加を示した図である。（Ａ）バクテリア−反応性のモノクロナール抗体の産生。バクテリア−反応性のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ細胞（３Ｆ５Ｈ６クローン）を、標準ハイブリドーマ技術によってＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６−投与されたマウス腹腔のＢ細胞から得た。３Ｆ５Ｈ６クローンによって誘導されたマウスの腹水（ａｓｃｉｔｅ）を分離して、そのモノクロナール抗体をプロテインＡ親和カラムクロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０溶液で染色した。Ｒ、ｒｅｄｕｃｉｎｇ；ＮＲ、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ。（Ｂ）モノクロナール抗体のｉｓｏｔｙｐｅを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２−コーティングされたプレートを使用してＥＬＩＳＡで決定した。（Ｃ）抗体のバクテリア−反応性を、ＥＬＩＳＡで記載されたグラム陽性（Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）バクテリア−コーティングされたプレートを使用して評価した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。（Ｄ−Ｇ）ＦＩＴＣ−標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２細胞（３×１０８  ＣＦＵ／ｍＬ）を、ＰＢＳ、正常マウスＩｇＧまたはｍ３Ｆ５Ｈ６モノクロナール抗体（１０μｇ／ｍＬ）で１時間培養し、インビトロでＲＡＷ２６４．７細胞（Ｄ及びＥ）及び腹腔細胞（Ｆ及びＧ）に処理し、１時間後、その細胞をＰＢＳで洗浄し、固定化した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｎｏ．３３２５８で染色して核（ｂｌｕｅ）を観察した。（Ｄ及びＦ）共焦点イメージは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の食菌作用を示す。スケールバー、１０μｍ。ＲＡＷ、ＲＡＷ２６４．７細胞；（Ｅ及びＧ）食菌指数を分析した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。（Ｈ）バクテリア−反応性のモノクロナール抗体による食菌作用の増加。ＦＩＴＣ−標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２細胞（３×１０８  ＣＦＵ／ｍＬ）を正常マウスＩｇＧまたはｍ３Ｆ５Ｈ６モノクロナール抗体（１０μｇ／ｍＬ）で１時間培養し、ｉ．ｐ．でＢＡＬＢ／ｃマウスに注射し、１時間後、腹膜細胞をマウスから集めて、マクロファージ、樹状細胞及び好中球に対して特定細胞特異的なマーカーを用いて染色した。食菌作用のレベルを流動細胞分析法により分析した（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。この結果は、３回の独立した実験の代表値で示した。
【図１０】ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６−刺激されたマウス腹腔のＢ細胞から産生されたモノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６モノクロナール抗体）のバクテリア−反応性の特性を示した図である。（Ａ）バクテリア−反応性のモノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６）または正常マウスＩｇＧ（Ｎｏｒ  ｍＩｇＧ）を、Ｇｒａｍ（−）バクテリア（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１，Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １１４１８，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４０１４５，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４１２９３）でコーティングされたプレートを使用してキャプチャーし（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）、滴定曲線をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）バクテリア−反応性のモノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６）または正常マウスＩｇＧ（Ｎｏｒ  ｍＩｇＧ）を、細胞内寄生バクテリア（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）でコーティングされたプレートを使用してキャプチャーし（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）、滴定曲線をＥＬＩＳＡで測定した。
【図１１】バクテリア−反応性のモノクロナール抗体のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２−感染したマウスの生存率に対する効果を示した図である。（Ａ）実験過程の概略図。（Ｂ）８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｉ．ｖ．でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（１．５×１０７  ＣＦＵ）を注射した後、ｉ．ｖ．でＰＢＳ、正常マウスＩｇＧまたはｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ（２５ｍｇ／Ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を注射した後、生存率を７日間モニターした（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）。（Ｃ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２感染２日後、記載された組織でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２のＣＦＵを決定した（ｎ＝５／ｇｒｏｕｐ）。（Ｄ）感染後２日目に記載された組織の組織病理（Ｄ２）。（Ｅ）感染後３０日目に記載された組織の組織病理（Ｄ３０）。スケールバー、１０μｍ。ＭＷ２、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２。この結果は、３回の独立した実験の代表値で示した。
【図１２】ヒト化抗体の構築のための配列分析、及び本発明の野生型マウス由来の抗体であるｍ３Ｆ５Ｈ６、ヒト化抗体の構築に使用されたヒトＶＨ１−Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅ骨格を有するサマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）抗体、ヒト化抗体であるｈ３Ｆ５Ｈ６のアミノ酸配列を可変重鎖と可変軽鎖とに分けて一直線に整列した図である。大括弧（［］）は、それぞれのＣＤＲ領域を示し、下線は、バーニヤ領域に該当するアミノ酸を示し、アスタリスク（＊）は、親和度の維持のために、マウスｍ３Ｆ５Ｈ６野生型抗体から由来したアミノ酸に逆置換した部分を示す。黒三角（▲）は、バーニヤ領域に該当しないアミノ酸を、親和度の維持のために、マウスｍ３Ｆ５Ｈ６野生型抗体から由来したアミノ酸に逆置換した部分を示す。このとき、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングナンバリングに従って定義した。
【図１３】ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）の精製を示した図である。ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）をプロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ）アガロースカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色で同定した。
【図１４】バクテリアを認知するヒト化バクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）の特性を示した図である。（Ａ）ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）または正常ヒトＩｇＧを、Ｇｒａｍ（＋）バクテリア（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２，Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｓ，ｐｙｏｇｅｎｅｓ）でコーティングされたプレートを使用してキャプチャーし（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）、滴定曲線をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）または正常ヒトＩｇＧ（正常ｈＩｇＧ）を、Ｇｒａｍ（−）バクテリア（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １１４１８，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４０１４５，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４１２９３）でコーティングされたプレートを使用してキャプチャーし（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）、滴定曲線をＥＬＩＳＡで測定した。
【図１５】バクテリアを認知するヒト化バクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）の特性を示した図である。ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）または正常ヒトＩｇＧを、細胞内寄生バクテリア（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）でコーティングされたプレートを使用してキャプチャーし（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）、滴定曲線をＥＬＩＳＡで測定した。
【図１６】ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２−感染したマウスの生存率に対する効果を示した図である。（Ａ）実験過程の概略図。（Ｂ）８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｉ．ｖ．でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（１．５×１０７  ＣＦＵ）を注射した後、ｉ．ｖ．でＰＢＳ、正常ヒトＩｇＧ（正常ｈＩｇＧ）またはｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ（２５ｍｇ／Ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を注射した後、生存率を７日間モニターした（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）。（Ｃ）感染後２日目に記載された組織の組織病理（Ｄ２）。スケールバー、１０μｍ。ＭＷ２、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２。
【図１７】コブラ毒因子（ｃｏｂｒａ  ｖｅｎｏｍ  ｆａｃｔｏｒ；ＣＶＦ）をマウスの腹腔に投与して補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を除去し、このマウスにおいて、ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２−感染したマウスの生存率に対する効果を示した図である。（Ａ）実験過程の概略図。（Ｂ）８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｉ．ｐ．でＣＶＦ（３０μｇ／ｍｏｕｓｅ）を投与し、６時間後に、ｉ．ｖ．でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（１×１０７  ＣＦＵ）を注射した後、ｉ．ｖ．でＰＢＳまたはｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ（２５ｍｇ／Ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を注射した後、生存率を７日間モニターした（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）。
【図１８】ＣｐＧ−ＤＮＡがＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染からマウスを保護することを示した図である。（Ａ）実験過程の模式図。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与した。７日後、マウスに、ｉ．ｐ．でＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１（１×１０６  ＣＦＵ）を注射した。（Ｂ）マウスの生存を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染の２日間記録した。各処理群における生存マウスのパーセントを示した（ｎ＝１２／ｇｒｏｕｐ）。（Ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染１日後、そのマウスを犠牲にし、指示された組織を除去し、ＰＢＳ溶液で均質化した。その溶液を希釈し、アガープレートにプレーティングして、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１（ｎ＝５／ｇｒｏｕｐ）のＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を測定した。（Ｄ）感染１日後、指示された組織の組織病理。スケールバー、１０μｍ。１８２６、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６。
【図１９】ＣｐＧ−ＤＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染から、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）が除去されたマウスを保護することを示した図である。（Ａ）ＣＶＦが補体を除去することを確認する実験過程の模式図。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与した。７日後、マウスにｉ．ｐ．でＣＶＦ（３０μｇ／ｍｏｕｓｅ）を投与し、血清において補体（Ｃ３）の量をＥＬＩＳＡによって測定した。（Ｃ）補体が除去されたマウスにおいて、ＣｐＧ−ＤＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染からマウスを保護する実験過程の模式図。（Ｄ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与した。７日後、マウスにｉ．ｐ．でＣＶＦ（３０μｇ／ｍｏｕｓｅ）を投与し、６時間後に、マウスにｉ．ｐ．でＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１（３×１０５  ＣＦＵ）を注射した（ｎ＝１２／ｇｒｏｕｐ）。マウスの生存を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染の２日間記録した。
【図２０】ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）のＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１−感染したマウスの生存率に対する効果を示した図である。８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１（５×１０６  ＣＦＵ）を注射した後、ｉ．ｖ．でＰＢＳ、正常ヒトＩｇＧ（正常ｈＩｇＧ）またはｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ（２５ｍｇ／Ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を注射した後、生存率を１８時間モニターした（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、非限定的な実施例によって本発明をより詳細に説明する。但し、以下の実施例は、本発明を例示するための意図で記載されたものであって、本発明の範囲は、以下の実施例によって制限されるものと解釈されない。
【００５２】
実施例１：実験動物
【００５３】
８週齢のＢＡＢＬ／ｃマウスをＮａｒａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から購入し、ＢＡＬＢ／ｃ  ＴＬＲ９ノックアウトマウスは、Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。そのマウスを、特定の無菌（ＳＰＦ）条件にて、適当な温度（２０〜２５℃及び湿度（３２〜３７％）で維持した。そのマウスを、痛みを最小化するためにイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）（ＪＷ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）麻酔下で犠牲にした。全ての動物研究のプロトコルは、翰林大学の動物実験倫理委員会の承認を受けた（Ｐｅｒｍｉｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｈａｌｌｙｍ  ２０１４−６６，２０１５−５４，２０１６−２２，２０１６−３６）。
【００５４】
実施例２：ＣｐＧ−ＤＮＡ
【００５５】
ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６及びｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１をＧｅｎｏＴｅｃｈ（Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。この配列の骨格をホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で変形した。下記のオリゴデオキシヌクレオチドの配列を使用した：ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６、５’−ＴＣＣＡＴＧＡ  ＣＧＴＴＣＣＴＧＡ  ＣＧＴＴ−３’（配列番号９）、ｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１、５’−ＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号１０）。ｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１を陰性対照群として使用した。ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を蒸留水で希釈し、５０μｇのＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を、記載された時間の間、マウスに腹腔（ｉ．ｐ．）注射した。
【００５６】
実施例３：バクテリアの培養及びインビボ感染の研究
【００５７】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＫＣＣＭ  １２１０３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，ＫＣＣＭ  ４０４１６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，ＫＣＣＭ  １１８７３）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＫＣＣＭ  ４０２０３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１（ＫＣＣＭ  １２１１９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ＫＣＣＭ  １１８０３）、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １１４１８（ＫＣＣＭ  １１４１８）、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４０１４５（ＫＣＣＭ  ４０１４５）、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４１２９３（ＫＣＣＭ  ４１２９３）を韓国微生物保存センタ（ＫＣＣＭ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、菌株ＭＷ２（ＭＲＳＡ）は、イ・ボクリュル教授（Ｐｕｓａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得た。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、イ・グンウク教授（Ｈａｌｌｙｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）は、パク・ユンギョン教授（Ｃｈｏｓｕｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得た。
【００５８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを除いた全ての菌株は、３７℃でＬｙｓｏｇｅｎｙ  ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）にて培養した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を３７℃で２％ＮａＣｌが補充されたＣｏｌｕｍｂｉａ  ｂｒｏｔｈにて培養した。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地で培養した。全てのバクテリアを一晩培養し、１／５０希釈された新鮮培地でＯＤ６０００．５〜０．６、対数期の中間に達するまで再培養し、集めた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２をＰＢＳで洗浄し、遠心分離した後、ＰＢＳに５×１０７  ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）／ｍＬで懸濁した。０．２ｍＬのバクテリア懸濁液を、マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。注射されたマウスを２日又は７日間、死亡率又は回復を観察した。本発明者らは、感染したマウスから、生存率、組織病理、組織でのバクテリアロード（ＣＦＵ）、組織の細胞群を調査し、腹腔及び血清における抗体の量を測定した。
【００５９】
実施例４：Ｈ＆Ｅ染色
【００６０】
各組織のパラフィン（Ｐａｒａｆｆｉｎ）充填及び切片を、通常の方法（Ｋｗｏｎ，Ｓ．，Ｄ．Ｋｉｍ，Ｂ．Ｋ．Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｃｈｏ，Ｋ．Ｄ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｅ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｈ．Ｊ．Ａｈｎ，Ｊ．Ｎ．Ｓｅｏ，Ｋ．Ｃ．Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｌｅｅ，ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｋｗｏｎ．２０１２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３３１２１；Ｗｅｉｓｓ，Ａ．Ｔ．，Ｎ．Ｍ．Ｄｅｌｃｏｕｒ，Ａ．Ｍｅｙｅｒ，ａｎｄ  Ｒ．Ｋｌｏｐｆｌｅｉｓｃｈ．２０１１．Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ４８：８３４−８３８）により製造した。
【００６１】
マウスにＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を感染させた後、肝臓、肺、腎臓及び脾臓を含む組織を準備し、スライドにマウントし、４０℃で一晩乾燥した後、その組織スライドを６０℃で３０分間培養してパラフィンを溶かした。その組織をキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で培養し、一連の１００〜７０％エタノールで再水和し、蒸留水で洗浄した。組織をＧｉｌｌ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｖ（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で染色し、水で洗浄し、エオシン（Ｅｏｓｉｎ）Ｙ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で２次的に染色した。染色された組織を７０〜１００％エタノールで脱水し、キシレンで培養し、Ｍａｌｉｎｏｌ（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でマウントした。染色された組織をＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ２００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）で観察した。
【００６２】
実施例５：ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）の分析
【００６３】
感染後２日目に、各組織を集めて、重量を測り、ＰＢＳで２ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてステンレススチールビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で均質化した。その混合溶液を、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ｂｒｏｔｈ−Ｂａｃｔｏアガーを含む６ウェルプレートに移した後、コロニーを３７℃で一晩培養した後、カウントした。
【００６４】
実施例６：血清、腹膜細胞、脾臓細胞、及び骨髄細胞の調製
【００６５】
マウスにおいてＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２で感染２日後、マウスをイソフルランで麻酔した。血清を、心臓パンチング方法によりマウスから得た。
【００６６】
Ｆｏｒｔｉｅｒ，Ａ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｌ．Ａ．Ｆａｌｋ．２００１．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４：Ｕｎｉｔ  １４  １１；Ｐｉｎｅｄａ−Ｔｏｒｒａ，Ｉ．，Ｍ．Ｇａｇｅ，Ａ．  ｄｅ  Ｊｕａｎ，ａｎｄ  Ｏ．Ｍ．Ｐｅｌｌｏ．２０１５．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １３３９：１０１−１０９；Ｒａｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｎ．Ｄｉｔｔｅｌ．２０１０．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．；Ｓｔａｇｇ，Ａ．Ｊ．，Ｆ．Ｂｕｒｋｅ，Ｓ．Ｈｉｌｌ，ａｎｄ  Ｓ．Ｃ．Ｋｎｉｇｈｔ．２００１．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６４：９−２２に記載されているように、腹膜細胞、脾臓細胞、及び骨髄細胞を、マウスから、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地に集めた。
【００６７】
細胞を集めた後、赤血球を赤血球破砕バッファー（１４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２））により除去した。その調製された細胞をインビトロにてＣｐＧ−ＤＮＡで刺激するために、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地で懸濁し、９６ウェル組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，Ｆａｌｃｏｎ，Ｍｅｘｉｃｏ）に分注した。
【００６８】
実施例７：流動細胞分析法
【００６９】
マウスから準備された細胞を、１０分間、抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＣＤ１６／３２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）でブロッキングし、下記の蛍光標識抗体：抗マウスＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）、ＣＤ２３、Ｆ４／８０、Ｌｙ−６Ｇ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ＵＳＡ）で染色した。そのサンプルを、１％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）により分析した。
【００７０】
実施例８：ＥＬＩＳＡ
【００７１】
マウスにＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６投与及び／又はＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２感染によるバクテリア−特異的な抗体の生成を決定するために、本発明者らは、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅコーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｉｔｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用した。一晩成長したバクテリアを、２回、ＰＢＳで１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して洗浄し、通常のＥＬＩＳＡコーティングバッファーに再浮遊した。
【００７２】
各ウェルを、１００ｕＬの再懸濁されたバクテリアで、４℃で一晩コーティングした。培養後、そのバクテリアを、０．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）でＰＢＳにて１５分間常温で固定した。ＰＢＳで２回洗浄した後、各ウェルを、１００ｍＭグリシン及び０．１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ  １６４０溶液で培養し、ＰＢＳで２回洗浄した。そのバクテリアコーティングされたウェルを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて常温で１時間ブロッキングした。
【００７３】
血清、腹腔の上澄液及び腹膜細胞の培養又は精製された抗体を、各ウェルに継代希釈して添加し、常温で１時間培養した。そのサンプルを、ＰＢＳ−Ｔ（０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識ヒツジ抗マウス（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を含む抗体を、常温で１時間ウェルに添加した。
【００７４】
ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を青色（ｂｌｕｅ−ｃｏｌｏｒ）の表現に使用し、ＴＭＢ  Ｓｔｏｐ溶液（ＫＰＬ）で黄色（ｙｅｌｌｏｗ−ｃｏｌｏｒ）を維持するために固定化し、４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ２５０  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して吸光度を測定した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡで抗体の量を決定するために、ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を４℃で一晩コーティングした。そのウェルを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間常温でブロッキングし、総ＩｇＧ及びＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅｓの量を、Ｋｗｏｎ，Ｓ．，Ｄ．Ｋｉｍ，Ｂ．Ｋ．Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｃｈｏ，Ｋ．Ｄ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｅ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｈ．Ｊ．Ａｈｎ，Ｊ．Ｎ．Ｓｅｏ，Ｋ．Ｃ．Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｌｅｅ，ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｋｗｏｎ．２０１２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３３１２１に記載されているようにＥＬＩＳＡで測定した。
【００７６】
実施例９：インビトロでＣｐＧ−ＤＮＡでマウス腹膜細胞の刺激
【００７７】
腹膜細胞を、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地にマウスから集めた。赤血球を除去した後、その細胞を、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。５μｇ／ｍＬのＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を各細胞培養プレートに処理した。４８時間後、細胞培養上澄液を集めて抗体の量を定量化するために、ＥＬＩＳＡで分析した。
【００７８】
実施例１０：マウス腹膜細胞由来のＢ細胞のソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）
【００７９】
抗マウスＣＤ１９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＢ細胞の指定のために染色し、抗マウスＣＤ２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＢ１及びＢ２細胞の分離されたソーティングのために染色した。抗マウスＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、リンパ球からｎｏｎ−Ｂ細胞を分離するために、Ｔ細胞の染色に使用した。腹膜細胞を抗体で染色し、洗浄し、ソーティングバッファー（ｓｏｒｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０，１％  ＦＢＳ  ｄｉｌｕｔｅｄ  ｉｎ  ＰＢＳ）で懸濁した。Ｂ１細胞及びＢ２細胞をＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でソーティングした。
【００８０】
実施例１１：マウスの腹腔から多クローン抗体の精製
【００８１】
マウスにｉ．ｐ．でＰＢＳ又はＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与し、７日後に、腹腔の上澄液を遠心分離によって得て腹膜細胞を除去した。腹腔の細胞が除去された上澄液の多クローン抗体を、プロテインＡ親和クロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）により精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２に対するこれら抗体の結合力を、前記のようにＥＬＩＳＡで測定した。
【００８２】
実施例１２：バクテリア−反応性のモノクロナール抗体を得るための腹腔のＢ細胞からハイブリドーマ細胞の産生
【００８３】
バクテリア−反応性の抗体を生成するハイブリドーマ細胞を得るために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｉ．ｐ．で５０μｇのＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を注射した。マウスの腹膜細胞を７日後に集めて、マウスＳＰ２／０  ｍｙｅｌｏｍａ細胞と融合し、バクテリア−反応性の抗体−生成ハイブリドーマクローン（ｍ３Ｆ５Ｈ６）を標準ハイブリドーマ技術（Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｓ．Ｋｗｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ｒｈｅｅ，Ｋ．Ｄ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｅ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｍ．Ｊ．Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｇ．Ｓｕｈ，Ｄ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｌｅｅ，ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｋｗｏｎ．２０１１．ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：２９；Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｗ．Ｍ．，Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｄ．Ｓａｎｔｏｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ．２００６．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ２：Ｕｎｉｔ  ２  ５）によりスクリーニングした。
【００８４】
腹水を得るために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でプリスティンを注射した後に、ハイブリドーマクローンを注射した。９〜１１日後、腹水をマウスの腹腔から集めた。そのモノクロナール抗体を、腹水からプロテインＡ親和クロマトグラフィー（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｉｓｏｔｙｐｅ及びモノクロナール抗体のバクテリア−反応性を、前記のようにＥＬＩＳＡで測定した。
【００８５】
実施例１３：バクテリア−反応性のモノクロナール抗体の可変重鎖及び軽鎖（Ｆａｂ）のクローニング
【００８６】
バクテリア−反応性のモノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６）を産生するハイブリドーマ細胞を培養し、全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から抽出し、ｃＤＮＡを逆転写で合成した。バクテリア−反応性のモノクロナール抗体のＦａｂ配列をクローニングするために、生成したｃＤＮＡをＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び次のプライマーを使用して増幅した。：重鎖ｐｒｉｍｅｒｓ、ＩＧＧ２ｂ：ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ（配列番号１１）、５’ＭＨ２：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ（配列番号１２）；ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ、３’Ｋｃ：ＧＧＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ（配列番号１３）、５’Ｍｋ：ＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ（配列番号１４）。
【００８７】
標準ＰＣＲ反応を２５サイクル行った。ＰＣＲ産生物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に直接ライゲーションした。クローニングされたマウスＩｇ挿入物をＤＮＡ塩基配列分析法により分析した。
【００８８】
実施例１４：可変切片（Ｆｖ）の配列分析及び分子モデリング
【００８９】
ｍ３Ｆ５Ｈ６の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）により分析した（Ｙｅ  Ｊ，Ｍａ  Ｎ，Ｍａｄｄｅｎ  ＴＬ，Ｏｓｔｅｌｌ  ＪＭ．ＩｇＢＬＡＳＴ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３４−４０２７）。６つのＣＤＲｓ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）をＫａｂａｔナンバリング（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｗｕ  ＴＴ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；１４７５：１７０９−１７１９）によって決定し、ｍ３Ｆ５Ｈ６ｍＡｂの一部の骨格（ＦＲ）残基をヒトＶＨ１−Ｖｋ１サブファミリーにグラフトさせたが、この場合には、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）骨格、マウス及びヒト化された３Ｆ５Ｈ６Ｆｖアミノ酸配列の３次元構造をｗｅｂモデリングプログラム、ＲＯＳＩＥを使用してシミュレーションした（Ｌｙｓｋｏｖ  Ｓ，Ｃｈｏｕ  ＦＣ，Ｃｏｎｃｈｕｉｒ  ＳＯ，Ｄｅｒ  ＢＳ，Ｄｒｅｗ  Ｋ，Ｋｕｒｏｄａ  Ｄ，Ｘｕ  Ｊ，Ｗｅｉｔｚｎｅｒ  ＢＤ，Ｒｅｎｆｒｅｗ  ＰＤ，Ｓｒｉｐａｋｄｅｅｖｏｎｇ  Ｐ，Ｂｏｒｇｏ  Ｂ，Ｈａｖｒａｎｅｋ  ＪＪ，Ｋｕｈｌｍａｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８５：ｅ６３９０６）。このプログラムは、重鎖及び軽鎖のＦＲｓ及びＣＤＲｓに対するほとんどのホモロゴステンプレートを同定し、このテンプレート構造を最適化されたモデルとして組み合わせる。
【００９０】
実施例１５：３Ｆ５Ｈ６ヒト化抗体の構築
【００９１】
非ヒト（マウス）由来の抗体のＣＤＲｓ決定
【００９２】
ヒト化を行うためには、一番最初に抗体のＣＤＲｓを決定することが必要である。ＣＤＲｓを決定する方法には、アミノ酸配列の多様性を基準とするＫａｂａｔナンバリング、ループ領域の構造を基準とするＣｈｏｔｈｉａナンバリング（Ｄｕｎｂａｒ  Ｊ，Ｋｒａｗｃｚｙｋ  Ｋ，Ｌｅｅｍ  Ｊ，Ｂａｋｅｒ  Ｔ，Ｆｕｃｈｓ  Ａ，Ｇｅｏｒｇｅｓ  Ｇ，Ｓｈｉ  Ｊ，Ｄｅａｎｅ  ＣＭ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４；４２：Ｄ１１４０−１１４６）、可変部位構造の高い保存の程度を基準とするＩＭＧＴナンバリング（Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１；２９１：２０７−２０９）などがあるが、最も広く使用されるものがＫａｂａｔナンバリングである。Ｋａｂａｔナンバリングに従って、バクテリア−反応性のマウス由来の抗体のＣＤＲｓを決定した（図８参照）。
【００９３】
ヒト化抗体の構築に適するヒト抗体骨格の選定及び野生型抗体のＣＤＲ部位移植
【００９４】
ヒト抗体の可変部位は、アミノ酸配列によって、大きく、重鎖は７種のｓｕｂｔｙｐｅ（ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７）、軽鎖は１７種のｓｕｂｔｙｐｅ（κ１、κ２、κ３、κ４、κ５、κ６、λ１、λ２、λ３、λ４、λ５、λ６、λ７、λ８、λ９、λ１０、λ１１）に分かれる。それぞれのｓｕｂｔｙｐｅは、アミノ酸配列が異なるため、生物物理学的構造が異なり、それによって安定性も異なり、これによって、自然なヒト抗体レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）で使用される頻度数も異なる（Ｔｉｌｌｅｒ  Ｔ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  Ｉ，Ｄｅｐｐｅ  Ｄ，Ｓｉｅｇｅｒｓ  Ｋ，Ｓｔｒｏｈｎｅｒ  Ｒ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｔ，Ｂｅｒｅｎｑｕｅｒ  Ｍ，Ｐｏｕｊｏｌ  Ｄ，Ｓｔｅｈｌｅ  Ｊ，Ｓｔａｒｋ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．ＭＡｂｓ，２０１３；５３：４４５−４７０）。
【００９５】
通常、ＣＤＲ移植法を用いてヒト化抗体を作製する際には、できる限りＣＤＲの構造を維持させるために、野生型非ヒト由来の抗体と配列相同性が非常に高いヒト骨格に移すようになるが、この場合、移されるヒト化抗体のｓｕｂｔｙｐｅが自然に安定性や頻度数の低いｓｕｂｔｙｐｅである場合、ヒト化後に安定性の低い抗体が得られる可能性がある。
【００９６】
バクテリア−反応性のマウス由来の抗体のヒト化に適する骨格を決定するために、Ｉｇｂｌａｓｔ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を介して、既存の野生型抗体と最も配列相同性が高いヒト抗体の可変部位のｓｕｂｔｙｐｅを検索した。その結果、ヒト抗体のＶＨ１、Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅと最も相同性が高いことを確認した。したがって、本発明では、抗原に対する親和度及びその機能は維持しながら、安定性が高いヒト化抗体を構築するために、ＶＨ１−Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅのヒト抗体骨格に抗原結合部位を移植した。ＶＨ１−Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅは、治療用抗体（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）の骨格を使用した（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌ  Ａ，Ｑｉｎ  Ｆ，Ｄａｋａｐｐａｑａｒｉ  Ｎ，Ｃｏｆｉｅｌｌ  Ｒ，Ｆａａｓ  ＳＪ，Ｂｏｗｄｉｓｈ  ＫＳ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；１８０：６９９−７０５）。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の不変領域は、商業化された治療用抗体（Ｈｅｒｐｃｅｐｔｉｎ）の骨格を使用した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの熱力学的安定性及び発現収率は、既存の研究結果によって十分に証明されており、特に、様々なマウス抗体のヒト化に成功裏に使用されてきた（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ，Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ，Ｇｏｒｍａｎ  ＣＭ，Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，Ｈｅｎｎｅｒ  Ｄ，Ｗｏｎｇ  ＷＬ，Ｒｏｗｌａｎｄ  ＡＭ，Ｋｏｔｔｓ  Ｃ  Ｃａｒｖｅｒ  ＭＥ，Ｓｈｅｐａｒｄ  ＨＭ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９２；８９１０：４２８５−４２８９；Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  Ｖ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ，Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７；５７２０：４５９３−４５９９）。
【００９７】
野生型マウス抗体のＣＤＲ部位移植及び親和度の維持のための追加的な保存アミノ酸の選定
【００９８】
上述したように、単純なＣＤＲ移植法によって構築されたヒト化抗体が、野生型非ヒト由来の抗体と比較したとき、その機能が減少する場合がたびたび発生するため、機能の喪失を懸念して、ＣＤＲ移植と同時に、抗体骨格に位置しながらＣＤＲループ構造に影響を及ぼし得るバーニヤ領域に位置するアミノ酸を追加で逆置換したクローン（ｈ３Ｆ５Ｈ６）で進行した。バーニヤ領域に位置するアミノ酸は、可変部位内の計３０個で、可変重鎖部位に１６個、可変軽鎖部位に１４個が存在し、野生型マウス抗体と、選定されたＶＨ１−Ｖｋ１ヒト抗体骨格ｓｕｂｔｙｐｅとの間の配列分析によって、全体３０個のバーニヤ領域のアミノ酸のうち、可変重鎖部位に６個（６８、７０、７２、７４、９７、９８）、可変軽鎖部位に４個（３６、４９、６９、７１）のアミノ酸の配列が異なることを確認した（図１１参照）。特に、可変重鎖部位内の２６−３０番の４個のアミノ酸は、文献上でＣＤＲ１とＣＤＲ２内の相互作用によるカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の維持に重要な役割を果たす（Ｆｏｏｔｅ  Ｊ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２；２２４２：４８７−４９９）。したがって、移植された野生型抗体のＣＤＲの構造を安定化させるものと予想されるので、既存のマウス抗体の配列を用いることが好ましい。重鎖可変部位内の７１番のアミノ酸も同様に、ＣＤＲ１及び２の配置を決定するのに重要な役割を果たし、この位置に、体積が大きい残基を有するアミノ酸（リシン又はアルギニン）あるいは小さい残基を有するアミノ酸（バリン、アラニン）のどちらが来るかによって、ＣＤの特性が決定される。野生型マウス抗体は、重鎖内の７４番にリシンを有しているが、これは、ヒトＶＨ１  ｓｕｂｔｙｐｅ骨格内の７４番のグルタミンと反対の特性を有しているので、逆置換し、追加でヒトＶＨ１  ｓｕｂｔｙｐｅの重鎖可変部位内の６８、７０、７２番のアミノ酸を野生型マウス抗体のアミノ酸配列に逆置換した。
【００９９】
配列分析のためのヒトＶＨ１−Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅの塩基及びアミノ酸配列は、前記のｓｕｂｔｙｐｅの骨格を有している抗体、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）のものを使用した。
【０１００】
バーニヤ領域以外にも、安定性に影響を及ぼすＶＨ／ＶＬインターフェースアミノ酸は、その残基が抗体の表面ではなく内部に向かっているので、可変重鎖部位及び軽鎖部位の結合を安定化させて抗体全体の安定性に影響を及ぼす領域であり、このような理由から、ほとんど抗体は同じアミノ酸残基からなっている。
【０１０１】
まず、アミノ酸配列の分析によって一次的に得られた候補クローン及び野生型マウス抗体の可変部位配列をモデリングオンラインサーバ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｏｓｉｅ．ｒｏｓｅｔｔａｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ／；Ｌｙｓｋｏｖ  Ｓ，Ｃｈｏｕ  ＦＣ，Ｃｏｎｃｈｕｉｒ  ＳＯ，Ｄｅｒ  ＢＳ，Ｄｒｅｗ  Ｋ，Ｋｕｒｏｄａ  Ｄ，Ｘｕ  Ｊ，Ｗｅｉｔｚｎｅｒ  ＢＤ，Ｒｅｎｆｒｅｗ  ＰＤ，Ｓｒｉｐａｋｄｅｅｖｏｎｇ  Ｐ，Ｂｏｒｇｏ  Ｂ，Ｈａｖｒａｎｅｋ  ＪＪ，Ｋｕｈｌｍａｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８５：ｅ６３９０６）内の抗体モデリングパートにそれぞれ入力して予測された構造を得た。得られたそれぞれの構造は、ＣＤＲループの構造的変化を観察するために、タンパク質の構造を重畳させた。重畳構造上で、移植された６個のＣＤＲｓが、野生型マウス抗体のＣＤＲｓと比較したときに大きく外れない構造を有することを確認し、特に、抗原結合に影響を及ぼし得るＣＤＲループ内のアミノ酸残基の方向がほとんど一致することを確認した。
【０１０２】
実施例１６：ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体の構築及び発現
【０１０３】
Ｉｎｔａｃｔ  ＩｇＧフォーマットを有するヒト化されたＩｇＧ１  Ａｂを得るために、ＶＨ及びＶｋコーディング遺伝子を、５’及び３’末端の両方に制限酵素位を含むように合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）。この遺伝子を、ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞から哺乳類細胞発現のために、ヒトＩｇＧ１固定部位（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）又はヒトカッパ鎖固定部位（ＣＬ）を運搬する変形されたｐｃＤＮＡ  ３．４発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体をＨＥＫ  ２９３Ｆ発現システムを用いて産生し、５〜７日間培養した後、製造業者のプロトコルに従って、プロテインＡ親和クロマトグラフィーを使用して精製した。マウス親及びヒト化された抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってその純度を評価した。
【０１０４】
実施例１７：ＩｇＧ形態のヒト化抗体遺伝子の作製
【０１０５】
設計されたヒト化抗体の塩基配列は、基本的に、商業化された高収率の治療用抗体サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）の塩基配列に従うものの、それと異なる部分は、コドンの使用頻度を考慮（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）して塩基配列に変換し、ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列は、５’と３’の両末端に動物細胞発現ベクターへのクローニングのための制限酵素の認識配列を導入して合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）。
【０１０６】
合成された遺伝子は、Ｂｉｏｎｅｅｒ社で提供する基本ベクターであるｐＢＨＡベクターにクローニングされた状態で受けることができ、完全なＩｇＧ形態への発現のために、重鎖不変領域、軽鎖不変領域がそれぞれ入っている動物発現ベクターに合成時に導入していた制限酵素認識配列を用いてクローニングした。このとき、重鎖及び軽鎖の不変領域のアミノ酸及び塩基配列は、商業化された高収率の治療用抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の塩基配列に従う。
【０１０７】
実施例１８：抗体の発現及び精製
【０１０８】
ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体の発現は、軽鎖、重鎖発現ベクターとポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物をＨＥＫ２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞に一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が入っている振盪フラスコで培養することによってなされる。詳細な方法は、次の通りである。
【０１０９】
振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で２００ｍＬのトランスフェクションを行った後、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種して、１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養した。それぞれのヒト化抗体を産生するために、それによる重鎖及び軽鎖プラスミドを１０ｍｌ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に重鎖１２５μｇ、軽鎖１２５μｇの計２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈し、ＰＥＩ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合して、室温で１０分間反応させた。
【０１１０】
その後、反応させた混合培地を、先の１００ｍｌで播種した細胞に入れ、１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で４時間培養した後、残りの１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地を追加して、５日〜７日間培養すれば、細胞が産生したタンパク質、すなわち、ＩｇＧ形態のヒト化抗体は、細胞によって細胞外に分泌されて培地に蓄積される。そのため、ヒト化抗体は、細胞培養後、２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して採取した細胞培養上澄液からタンパク質Ａセファロースカラム（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。
【０１１１】
このとき、精製方法は、タンパク質Ａカラム会社で提供する標準プロトコルを参照し、精製されたタンパク質は、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）内の溶液を用いて５６２ｎｍの波長で吸光度を測定し、描かれた標準曲線に従ってその量を定量した。精製された抗体の大きさ及び純度は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図１２に示したように、本発明のバクテリア−反応性のヒト化抗体であるｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧは、約１５０ｋＤａの分子量を有し、９９％以上の純度に精製されることを確認した。
【０１１２】
実施例１９：バクテリアの蛍光標識
【０１１３】
ＯＤ６０００．５〜０．６（３×１０８  ＣＦＵ）まで成長したＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を集め、洗浄して、７０％エタノールで１時間固定した。その固定されたバクテリアを、０．０２ｍＭ  ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）にて常温で３０分間標識し、無血清ＨＢＳＳで洗浄した後、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．４％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで再懸濁した。
【０１１４】
実施例２０：インビトロで食菌作用アッセイ
【０１１５】
マウスマクロファージ株、ＲＡＷ２６４．７をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入し、その細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。
【０１１６】
ＲＡＷ２６４．７細胞及びマウス腹膜細胞を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）コーティングされたガラス上で１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で一晩培養した。ＦＩＴＣ−標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２をＰＢＳ又は抗体で１時間培養した後、そのバクテリアを１２ウェルプレートに添加し、１時間培養後、その細胞を４％パラホルムアルデヒド（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で固定し、ＰＢＳで洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｎｏ．３３２５８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、常温で核を同定するために染色した。そのマウントされた細胞を、ＬＳＭ  ７１０  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。食菌作用指数を、先に記載された（Ｓｕｎ，Ｒ．，Ｌ．Ｑｉｕ，Ｆ．Ｙｕｅ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｚｈａｎｇ，ａｎｄ  Ｌ．Ｓｏｎｇ．２０１３．Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：３８−４５）ように、ＲＡＷ２６４．７細胞及びマウス腹膜細胞で食菌されたＦＩＴＣ−標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の数をカウントして測定した。
【０１１７】
実施例２１：マウスの腹腔でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の摂取
【０１１８】
マウスの腹腔で食菌作用に対する抗体の影響を決定するために、そのマウスにｉ．ｐ．でＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を注射し、１時間後、腹膜細胞を集めて特定の細胞マーカー；ａｎｔｉ−Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、及びＧｒ−１抗体で染色した。腹腔内のマクロファージ、樹状細胞、及び好中球の食菌作用を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＦＡＣＳ分析によって測定した。
【０１１９】
実施例２２：インビボでＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２感染に対する抗体の効果の分析
【０１２０】
ＢＡＢＬ／ｃマウスにｉ．ｖ．で１．５×１０７  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を注射した後、正常マウスＩｇＧ、モノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６）、正常ヒトＩｇＧ、ヒト化された抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）（２５ｍｇ／ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を静脈内注射した。正常マウスＩｇＧは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。抗体の注射後、７日（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２）後の生存率をモニターした。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２又は感染２日後、そのマウスを犠牲にし、記載された組織を除去した後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２のＣＦＵ及び組織病理をモニターした。
【０１２１】
実施例２３：インビボでＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２感染に対する補体除去されたマウスにおける抗体の効果の分析
【０１２２】
ＢＡＢＬ／ｃマウスにｉ．ｐ．でｃｏｂｒａ  ｖｅｎｏｍ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＶＦ，３０μｇ／ｍｏｕｓｅ，Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を投与し、６時間後に、ｉ．ｖ．で１×１０７  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を注射した後、ヒト化された抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）（２５ｍｇ／ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を静脈内注射した後に生存率をモニターした。
【０１２３】
実施例２３：インビボでＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染に対する補体除去されたマウスにおけるＣｐＧ−ＤＮＡの効果の分析
【０１２４】
ＢＡＢＬ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ（５０μｇ／マウス）を注射した後、７日後に、マウスにｉ．ｐ．でＣＶＦ（３０μｇ／ｍｏｕｓｅ）を投与し、６時間後に、血清において補体（Ｃ３）の量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃ３  ｍｏｕｓｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ−１５７７１１）で確認した。ＢＡＢＬ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ（５０μｇ／マウス）を注射した後、７日後に、マウスにｉ．ｐ．でＣＶＦ（３０μｇ／ｍｏｕｓｅ）を投与し、６時間後に、５×１０６  ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１を注射した。注射されたマウスを、２日間、死亡率又は回復を観察した。
【０１２５】
実施例２４：インビボでＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染に対する抗体の効果の分析
【０１２６】
ＢＡＢＬ／ｃマウスにｉ．ｐ．で５×１０６  ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１を注射した後、正常ヒトＩｇＧ、ヒト化された抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）（２５ｍｇ／ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を静脈内注射した。正常マウスＩｇＧはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。抗体の注射後、１８時間（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１）後の生存率をモニターした。
【０１２７】
上記の実施例の結果を、以下で詳述する。
【０１２８】
ＣｐＧ−ＤＮＡの投与は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２で感染後、組織においてバクテリアの除去を促進し、マウスの生存を増加させる
【０１２９】
本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染に対する抗菌効果を証明するための動物モデルとして選択し、図１Ａに記載された方法によって実験を行った。まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与し、７日後、そのマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）でＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を注射した後、生存率を７日間モニターした。何らの処理もしていないＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２注射されたマウスと比較して、バクテリア感染前にＣｐＧ−ＤＮＡで前処理されたマウスの生存率は、６０％まで（図１Ｂ）増加した。
【０１３０】
特定の組織におけるバクテリア感染の評価のために、肝臓、肺、腎臓及び脾臓を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の静脈内注射２日後に切り出してその組織を均質化し、その均質体をアガー培地で培養して除去し、ＣＦＵをカウントした。全てのテストされた組織は、バクテリアによって感染し、腎臓で最大のＣＦＵを有し、組織におけるバクテリアロードは、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の前処理によって全て減少した（図１Ｃ）。
【０１３１】
次に、各組織の組織病理を観察した。バクテリア感染後、マウスの腎臓で膿瘍（ａｂｓｃｅｓｓ）部位が現れたが、それは、感染の前にＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６で前処理した場合には検出されなかった（図１Ｄ）。したがって、本発明者らは、マウスにＣｐＧ−ＤＮＡの前処理は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染後にバクテリアの除去を促進し、生存率を増加させると結論を下した。
【０１３２】
ＣｐＧ−ＤＮＡの投与は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染後、骨髄、脾臓、腹腔の細胞群を調節し、保護する
【０１３３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染に対する保護効果と関連する機序を調査するために、本発明者は、実験計画に従って、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の腹腔、脾臓、骨髄においてＦＡＣＳで細胞群を分析した（図１Ａ）。ｌｙｍｐｈｏｉｄ細胞（Ｂ及びＴ細胞）及びＭｙｅｌｏｉｄ細胞（マクロファージ、樹状細胞、及び好中球）の群は、種々の他の組織でＣｐＧ−ＤＮＡの投与及びＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染によって差別的に変わった（図２）。
【０１３４】
腹腔でｍｙｅｌｏｉｄ細胞及びｌｙｍｐｈｏｉｄ細胞の群の比率は、ＣｐＧ−ＤＮＡによって逆転した（図２Ａ）。ｍｙｅｌｏｉｄ細胞群は、ＣｐＧ−ＤＮＡの投与によって減少した反面（ＰＢＳ対照群の６１％）、腹腔のｌｙｍｐｈｏｉｄ細胞の群は、ＣｐＧ−ＤＮＡによって増加した（ＰＢＳ対照群の１６０％）。ｍｙｅｌｏｉｄ細胞の主要群は、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージであった。たとえＦ４／８０−ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞群は非常に小さいが、それは、ＣｐＧ−ＤＮＡの投与によって増加した（ＰＢＳ対照群の３倍）。ｌｙｍｐｈｏｉｄ細胞の場合、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＴ細胞群の増加は著しく（ＰＢＳ対照群の４．６倍）、総Ｂ細胞群はほぼ同一であった。
【０１３５】
本発明者らがＢ細胞群を詳細に分析すると、ＣｐＧ−ＤＮＡによってＢ１（ＣＤ２３−）細胞群は減少し、Ｂ２（ＣＤ２３＋）細胞群は若干増加した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を感染させたとき、好中球を除いた全ての細胞群が減少し、ＣｐＧ−ＤＮＡの前処理は、たとえ細胞群の大きさは非処理対照群と比較して小さいが、細胞群を著しく回復させた（図２Ａ）。
【０１３６】
骨髄において、ＣｐＧ−ＤＮＡによってｍｙｅｌｏｉｄ細胞群は増加し（ＰＢＳ対照群の１５０％）、ｌｙｍｐｈｏｉｄ群は減少した（ＰＢＳ対照群の６５％）（図２Ｂ）。ｍｙｅｌｏｉｄ細胞の主要群はＦ４／８０−Ｇｒ−１＋好中球であった。ｌｙｍｐｈｏｉｄ細胞の主要群はＢ細胞、特にＢ１細胞であった。腹腔とは異なって、Ｂ−１及びＢ−２細胞群の比率はＣｐＧ−ＤＮＡによって変化しなかった。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染は、全ての群の著しい減少を誘導し、ＣｐＧ−ＤＮＡによる前処理によって、その減少は逆転した（図２Ｂ）。
【０１３７】
脾臓において、ＣｐＧ−ＤＮＡの投与によって誘導された細胞群の著しい変化はなかった（図２Ｃ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を感染させる際、ｌｙｍｐｈｏｉｄ細胞群の減少が観察された（ＰＢＳ対照群の６０％）。ＣｐＧ−ＤＮＡをバクテリア感染前に前処理する際、細胞群はＰＢＳ対照群よりも大きくなった。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２感染単独と比較して、ＣｐＧ−ＤＮＡによる前処理は、ｌｙｍｐｈｏｉｄ及びｍｙｅｌｏｉｄ細胞群をいずれも２倍以上増加させた（図２Ｃ）。
【０１３８】
これらの結果に基づいて、本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染は、腹腔、骨髄及び脾臓において全細胞数の減少を誘導し、ＣｐＧ−ＤＮＡによるマウスの前処理は、これらの組織において免疫細胞を保護するという結論を得た。この現象は、組織から誘導された細胞数は、感染したマウスの生存率を増加させることを示唆している。最も重要なことであるが、ＣｐＧ−ＤＮＡは、Ｂ２細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージのような適応性免疫細胞を増加させる方向に腹膜細胞の群を変化させた（図２Ａ）。したがって、本発明者らは、腹腔細胞は、本実験システムにおいて、ＣｐＧ−ＤＮＡの抗菌効果と関連する主要な調節細胞であると考える。
【０１３９】
インビボ及びインビトロでＣｐＧ−ＤＮＡの投与によるバクテリア−反応性の抗体の誘導
【０１４０】
本発明者らは、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６をｉ．ｐ．で注射し、抗体の生成を確認するために、複数の時間で腹腔及び血清の上澄液を分析した。Ｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１を陰性対照群として使用した。総ＩｇＧのレベルは、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の投与後３日及び７日目に腹腔上澄液で著しく増加し、血清では著しい変化はなかった（図３）。
【０１４１】
ＣｐＧ−ＤＮＡの投与がＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２感染したマウスの生存率を増加させるのであれば、一部のバクテリア−反応性の抗体が腹腔でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６によって誘導される可能性がある。本発明者らは、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の投与及びＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の静脈内注射後に、マウスから腹腔上澄液及び血清を集め（図１Ａ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２に反応する全ＩｇＧ及びＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅｓのレベルを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２でコーティングされたプレートを使用して測定した。ＣｐＧ−ＤＮＡ単独は、腹腔で反応性総ＩｇＧの増加を誘導したが、血清では著しい変化はなかった。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染は、腹腔及び血清で反応性ＩｇＧの生成を減少させた。しかし、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６のバクテリア感染前の事前投与は、反応性ＩｇＧの増加した生成を著しく誘導した。ＩｇＧ３  ｉｓｏｔｙｐｅは、全ての場合において最も豊富であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２−反応性のＩｇＧ３  ｉｓｏｔｙｐｅは、ＣｐＧ−ＤＮＡ−処理された群で著しく増加した（図４Ａ及び図４Ｂ）。
【０１４２】
マウスにおいてＣｐＧ−ＤＮＡによって誘導される抗体をさらに調査するために、ＰＢＳ又はＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６をｉ．ｐ．で注射し、７日後、腹腔上澄液及び血清を分析した。ＣｐＧ−ＤＮＡ−誘導されたＩｇＧが様々な種のグラム陽性バクテリアに結合できるかを決定するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡアッセイを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ．でコーティングされたプレートを使用して行った。
【０１４３】
各バクテリア−反応性のＩｇＧのレベルは、腹腔及び血清でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の処理によって増加した（図４Ｃ及び図４Ｄ）。ＣｐＧ−ＤＮＡの処理がバクテリア−反応性の抗体を産生するＴＬＲ９信号伝達を活性化するかを調査するために、ＢＡＬＢ／ｃ  ＴＬＲ９−／−マウスを用いて同じ実験を行った。ＴＬＲ９−／−マウスの腹腔及び血清において、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の処理によって誘導されたバクテリア−反応性の抗体の著しい変化はなかった（図４Ｅ及び図４Ｆ）。したがって、本発明者らは、ＣｐＧ−ＤＮＡが、バクテリア−反応性の抗体の生成を、ＴＬＲ９を介して誘導するという結論を得た。
【０１４４】
バクテリア−反応性の抗体の生成がインビトロでＣｐＧ−ＤＮＡによって誘導されるかを決定するために、腹腔の免疫細胞をマウスから集め、インビトロでＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６及びｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡ  ２０４１で刺激した後、細胞培養上澄液を抗体の量を測定するために分析した。図５Ａから分かるように、一般的なＩｇＧの産生が、ＰＢＳ又はｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡと比較して、ＣｐＧ−ＤＮＡに対して著しく増加した。マウスを、まず、インビボでＣｐＧ−ＤＮＡでプライミングした後、腹腔細胞をインビトロで刺激する際、基本ＩｇＧの生成が対照群よりも高かったが、ＣｐＧ−ＤＮＡ処理の追加的な効果は非常に弱かった（図５Ａ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された腹膜細胞から分泌された抗体の結合力を決定するために、本発明者らは、４つのグラム陽性菌種でバクテリア−反応性のＩｇＧの量を測定した。バクテリア−反応性のＩｇＧの生成は、ＣｐＧ−ＤＮＡに対して著しく増加したが、ＰＢＳ又はｎｏｎ−ＣｐＧ−ＤＮＡに対しては反応性抗体がほとんど発見されなかった（図５Ｂ）。
【０１４５】
Ｂ細胞が、バクテリア−反応性の抗体をＣｐＧ−ＤＮＡに反応して分泌するかを調査するために、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６をマウスにｉ．ｐ．で注射し、９日後、マウスの腹腔の免疫細胞を集めて、腹膜リンパ球からＣＤ２３−ＣＤ１９＋Ｂ細胞（Ｂ１細胞）及びＣＤ２３＋ＣＤ１９＋（Ｂ２細胞）をソーティングし（図５Ｃ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６でインビトロでその細胞を刺激した。Ｂ１及びＢ２細胞がいずれも、ＩｇＧの増加した量をＣｐＧ−ＤＮＡ刺激に対して分泌した（図５Ｄ）。しかし、インビトロでＢ細胞によるＩｇＧの生成のレベルは、腹腔細胞の分離前にＣｐＧ−ＤＮＡでマウスを前処理する際に減少し、ＣｐＧ−ＤＮＡによってＢ細胞の活性の調節を示唆している（図５Ｄ）。
【０１４６】
グラム陽性菌−コーティングされたプレートを使用して測定された各バクテリア−反応性のＩｇＧのレベルは、バクテリア−反応性のＩｇＧの生成が、インビトロでＣｐＧ−ＤＮＡ刺激によって増加し、インビボでＣｐＧ−ＤＮＡでプライミングは、抗体生成の活性を調節することを示唆している（図５Ｅ）。これらの結果は、ＣｐＧ−ＤＮＡ−誘導されたバクテリア−反応性の抗体は、ＣｐＧ−ＤＮＡに反応して腹腔のＢ１及びＢ２の両方から産生することを示唆している。
【０１４７】
ＣｐＧ−ＤＮＡによって誘導された腹腔内バクテリア−反応性の抗体は食菌作用を促進する
【０１４８】
本発明者らは、ＣｐＧ−ＤＮＡによって誘導された腹腔内バクテリア−反応性の抗体が食菌作用を促進してバクテリア感染に抵抗できるかを調査した。本発明者らは、ＰＢＳ注射されたマウスの腹腔上澄液から多クローン抗体を精製した（図６Ａ）。腹腔溶液をＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を注射し、７日後にマウスから得て多クローン抗体を精製した（図６Ｂ）。腹腔内のＩｇＧの量は、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の投与によって、ＰＢＳ対照群と比較して約２．５倍増加した（７．５μｇ／ｍｏｕｓｅ対３μｇ／ｍｏｕｓｅ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２に対する抗体の結合力をＥＬＩＳＡで測定した。その結果、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の投与によって誘導された抗体は、ＰＢＳ注射されたマウス由来と比較して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２に対するさらに高い結合力を有することを示した（図６Ｃ）。
【０１４９】
次に、本発明者らは、食菌作用と関連するこれら抗体の効果を決定した。ＦＩＴＣ標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を、精製された抗体と培養した後、食菌作用アッセイを、共焦点顕微鏡でマウスマクロファージ株ＲＡＷ２６４．７で行った（図６Ｄ及び図６Ｅ）。食菌作用指数は、抗体によって増加し、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６注射された腹腔由来の抗体は、ＰＢＳ注射された対照群由来と比較して、さらに効果的であった（１．１９倍）。
【０１５０】
バクテリア−反応性のモノクロナール抗体を生成するハイブリドーマクローンの選択及び食菌作用に対するそのモノクロナール抗体の抗菌効果
【０１５１】
本発明者らは、ＣｐＧ−ＤＮＡによって誘導された活性化されたＢ細胞クローンは、抗菌抗体を分泌し、その抗体は、腹腔でマクロファージ、樹状細胞及び好中球を介して食菌作用を促進することを提案した。
【０１５２】
ＣｐＧ−ＤＮＡ−誘導されたバクテリア−反応性の抗体を分泌するＢ細胞クローンを構築するために、マウスにｉ．ｐ．でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を注射し、７日後、腹膜細胞を集めてＳＰ２／０  ｍｙｅｌｏｍａ細胞と融合した。本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２に対して反応するモノクロナール抗体を分泌するハイブリドーマクローンを分離し、ｍ３Ｆ５Ｈ６と命名した（図７）。
【０１５３】
バクテリア−反応性のモノクロナール抗体の可変ドメインのクローニング
【０１５４】
重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコーディングするｃＤＮＡ配列を、通常の重鎖及び軽鎖プライマーを使用してバクテリア−反応性のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ細胞（ｍ３Ｆ５Ｈ６）からクローニングした。ＤＮＡシークエンシングによって確認された配列を図８に示した。その配列を、ＩｇＢＬＡＳＴプログラムを用いて公知の配列とのホモロジーを分析した（Ｙｅ  Ｊ，Ｍａ  Ｎ，Ｍａｄｄｅｎ  ＴＬ，Ｏｓｔｅｌｌ  ＪＭ．ＩｇＢＬＡＳＴ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３４−４０）。
【０１５５】
モノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）をｍ３Ｆ５Ｈ６クローン−注射された腹水から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図９Ａ）。３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧのアイソタイプＩｇＧ２ｂであり（図９Ｂ）、グラム陽性菌に対するｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧの結合力をＥＬＩＳＡで確認した（図９Ｃ）。
【０１５６】
ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧのＲＡＷ２６４．７細胞の食菌作用に対する効果を調査するために、食菌作用アッセイを、ＦＩＴＣ標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を使用してＰＢＳ、マウス正常ＩｇＧまたはｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧで培養した後に行った（図９Ｄ及び図９Ｅ）。本発明者らは、マウス腹腔細胞の食菌作用に対するｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧの効果も調査した（図９Ｆ及び図９Ｇ）。この結果は、ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧがＲＡＷ２６４．７細胞及びマウス腹腔細胞がマウス正常ＩｇＧと比較して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を結合する活性を増加させることを示唆している（１．５〜１．８倍）。
【０１５７】
マウスの腹腔において食菌作用に対するｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧの効果を直接調査するために、マウスにｉ．ｐ．でｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧを、ＦＩＴＣ標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２細胞で前処理した後に注射した。その次に、マクロファージ、樹状細胞及び好中球のような食菌性免疫細胞の効果を確認するために、流動細胞分析法によって腹腔細胞を分析した（図９Ｈ）。正常ＩｇＧ対照群と比較して、ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧは、腹腔でマクロファージ及び樹状細胞の食菌作用をさらに効果的に増加させた。しかし、好中球の食菌作用には効果がなかった。この結果は、ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧが、マウス腹膜細胞でさらに効果的な食菌作用の媒介者であり、食菌性免疫細胞が、ＣｐＧ−ＤＮＡによって誘導された抗体の抗菌効果と関連し得ることを示唆している。
【０１５８】
モノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）のバクテリア−反応性
【０１５９】
モノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）のグラム陽性菌に対する結合力をＥＬＩＳＡで確認した（図９Ｃ）。また、モノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）のグラム陰性菌（図１０Ａ）、及び細胞内寄生細菌（図１０Ｂ）に対する結合力をＥＬＩＳＡで確認した。
【０１６０】
ＣｐＧ−ＤＮＡで刺激された腹膜Ｂ細胞由来のバクテリア−反応性のモノクロナール抗体（ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）はＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染に対する治療効果を有する
【０１６１】
ｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧのマウスにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染に対する抗菌効果を実証するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を感染させた後、ＰＢＳ、正常ＩｇＧ、及びｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧを投与した後、死亡率、組織内感染及び組織病理を実験スケジュールに従って観察した（図１１Ａ）。抗体なしにＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２で感染した全てのマウスは、感染５日後に死亡したが、３０％の正常ＩｇＧ注射されたマウス及び７０％のｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ注射されたマウスは、感染後７日まで生存した（図１１Ｂ）。
【０１６２】
特定の組織においてＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染を調査するために、肝臓、肺、腎臓及び脾臓を感染２日後に得てＣＦＵアッセイを行った。本発明者らは、組織、特に腎臓においてｍ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧの投与によるバクテリアロードが減少したことを観察した（図１１Ｃ）。組織の組織病理を感染２日後にモニターした。バクテリアバードン（ｂｕｒｄｅｎ）は腎臓でのみ発見され、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２注射されたマウスと比較して、抗体注射されたマウスでは、バクテリアバードンが著しく少なく検出された（図１１Ｄ）。
【０１６３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染３０日後に、本発明者らは、肝臓、肺、腎臓及び脾臓の組織病理を調査した。バクテリアバードンや多くの炎症性免疫細胞が、抗体注射されたマウスの腎臓では検出されなかった（図１１Ｅ）。総合すると、本発明者らは、ＣｐＧ−ＤＮＡ−誘導された抗体の投与が、増加した生存率を誘導し、正常ＩｇＧと比較して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２注射されたマウスでさらに高いバクテリア除去の効果を誘導することを確認した。
【０１６４】
バクテリア−反応性のヒト化された抗体の産生及び特性
【０１６５】
臨床にモノクロナール抗体の適用のために、その抗体を、ヒトでの免疫原性を減少させるヒト化作業を行わなければならない。したがって、本発明者らは、得られたモノクロナール抗体ｍ３Ｆ５Ｈ６の免疫グロブリン可変ドメイン配列をＩｇＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｙｅ  Ｊ，Ｍａ  Ｎ，Ｍａｄｄｅｎ  ＴＬ，Ｏｓｔｅｌｌ  ＪＭ．ＩｇＢＬＡＳＴ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３４−４０）を使用して分析し、その可変ドメインサブタイプがマウスＶＨ１−Ｖｋ１に属することを見出した。ｍ３Ｆ５Ｈ６  ｍＡｂのヒト化のために、本発明者らは、ＶＨ１−Ｖｋ１骨格を、この骨格が最も共通的にヒト生殖系列（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）レパートリーで観察されるという事実（Ｃａｒａｖｅｌｌａ  ＪＡ，Ｗａｎｇ  Ｄ，Ｇｌａｓｅｒ  ＳＭ，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ  Ａ．Ｃｕｒｒ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２０１０；６２：１２８−１３８）を参考にして選択した。本発明者らは、ヒトＶＨ１−Ｖｋ１骨格に一部の骨格配列、この場合にはサマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）骨格とＣＤＲ部位を一般に確立された方法でグラフトした（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｗｕ  ＴＴ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；１４７５：１７０９−１７１９）。ｍ３Ｆ５Ｈ６及びヒト化されたモノクロナール抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）由来の構造をモデル化して比較し、それらは互いに同一ではないが、類似することを示した（図１２）。
【０１６６】
本発明者ら、組換えヒト化されたモノクロナール抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）をＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞を使用して産生し（図１３）、その反応性を評価した（図１４及び図１５）。そのヒト化された抗体は、ＥＬＩＳＡに基づいてＧｒａｍ（＋）バクテリア（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２，Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｓ，ｐｙｏｇｅｎｅｓ）とＧｒａｍ（−）バクテリア（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １１４１８，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４０１４５，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４１２９３）（図１４）及び細胞内寄生細菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（図１５）に対しては特異的に反応することを確認した。
【０１６７】
バクテリア−反応性のヒト化された抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染に対する治療効果を有する
【０１６８】
マウスにおいてＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染に対するｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧの抗菌効果を実証するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を感染させた後、ｉ．ｖ．でＰＢＳ、正常ヒトＩｇＧ、及びｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧを投与し、死亡率及び組織病理を実験スケジュールに従って観察した（図１６Ａ）。
【０１６９】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を感染させた、抗体を投与していない全てのマウスは、５日後に全部死んだが、１０％の正常ＩｇＧ注射されたマウスと３０％のｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ注射されたマウスは、感染後７日目まで生存した（図１６Ｂ）。組織の組織病理を、感染後２日目にモニターした。抗体注射されたマウスが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２のみが注射されたマウスと比較して、バクテリアバードン（ｂｕｒｄｅｎｓ）は腎臓でのみ発見され、さらに小さいバクテリアバードンが発見された（図１６Ｃ）。
【０１７０】
ＢＡＢＬ／ｃマウスにｉ．ｐ．でｃｏｂｒａ  ｖｅｎｏｍ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＶＦ，３０μｇ／ｍｏｕｓｅ）を投与し、６時間後にｉ．ｖ．で１×１０７  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を注射した後、ヒト化された抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６）（２５ｍｇ／ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を静脈内注射した後に生存率をモニターした。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２を感染させたＣＦＶを投与し、抗体を投与していない全てのマウスは、４日後に全部死んだが、２０％のｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ注射されたマウスは、感染後７日目まで生存した（図１７）。補体非依存的にｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２の感染を抑制することを示した。
【０１７１】
ＣｐＧ−ＤＮＡの投与は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１で感染後、組織でバクテリアの除去を促進し、マウスの生存を増加させる
【０１７２】
本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１の感染に対する抗菌効果を証明するための動物モデルとして選択し、図１８Ａに記載された方法によって実験を行った。まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与し、７日後、そのマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）でＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１を注射した後、生存率を２日間モニターした。何の処理もしていないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１注射されたマウスと比較して、バクテリア感染前にＣｐＧ−ＤＮＡで前処理されたマウスの生存率は、１００％まで（図１８Ｂ）増加した。
【０１７３】
特定の組織におけるバクテリア感染の評価のために、肝臓、肺、腎臓及び脾臓を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１のｉ．ｐ．注射１日後に切り出してその組織を均質化し、その均質体をアガー培地で培養して除去し、ＣＦＵをカウントした。全てのテストされた組織及び血液と腹腔はバクテリアによって感染し、組織においてバクテリアロードは、ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６の前処理によって全て減少した（図１８Ｃ）。
【０１７４】
次に、各組織の組織病理を観察した。バクテリア感染後、マウスの組織で膿瘍（ａｂｓｃｅｓｓ）部位は検出されなかった（図１８Ｄ）。したがって、本発明者らは、マウスにＣｐＧ−ＤＮＡの前処理は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１の感染後にバクテリアの除去を促進し、生存率を増加させると結論を下した。
【０１７５】
マウスにおいてＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１の感染に対するＣｐＧ−ＤＮＡの抗菌効果が補体非依存的であることを実証するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）でＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与して７日後、そのマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）でＣＶＦを注射した後、血清内の補体（Ｃ３）の量を測定した（図１９Ａ）。ＣＶＦの投与後に、血清で補体が全て減少することを確認した（図１９Ｂ）。ＣｐＧ−ＤＮＡ  １８２６を投与して７日後、そのマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）でＣＶＦを注射した後、６時間後にＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１をｉ．ｐ．で感染させた（図１９Ｃ）。バクテリア感染前にＣｐＧ−ＤＮＡで前処理されたマウスの生存率は、２０％まで（図１９Ｄ）増加した。したがって、本発明者らは、マウスにＣｐＧ−ＤＮＡの前処理は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１の感染後、補体非依存的にバクテリアの除去を促進し、生存率を増加させると結論を下した。
【０１７６】
バクテリア−反応性のヒト化された抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１の感染に対する治療効果を有する
【０１７７】
マウスにおいてＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１の感染に対するｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧの抗菌効果を実証するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１を感染させた後、ｉ．ｖ．でＰＢＳ、正常ヒトＩｇＧ、及びｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧを投与し、死亡率を観察した。ヒト化されたバクテリア−反応性の抗体（ｈ３Ｆ５Ｈ６  ＩｇＧ）の投与も、正常ＩｇＧよりも、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染したマウスでさらに高いバクテリア除去及び生存率が増加することを確認した（図２０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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