(57)【要約】  本発明は、二量体の治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域の融合タンパク質、その製造方法、及びそれを含む組成物に関する。【選択図】図１
2021507705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）で示される、酵素融合タンパク質：
【化１】
2021507705.tif 000010
・・・・（１）
ここで、Ｘ及びＸ’は治療学的酵素であって、それぞれ独立して同一または異なる種類の酵素であり、
Ｌ及びＬ’はリンカーであって、それぞれ独立して同一または異なる種類のリンカーであり；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり；
｜は、共有結合であり；
：は、共有または非共有結合である。
【請求項２】
前記治療学的酵素は、非共有結合を通じて二量体を形成するものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項３】
前記治療学的酵素は、互いに逆平行（anti-parallel）で二量体を形成したものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項４】
前記酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて安定性が増加し、リソソーム受容体に対する結合力が減少したものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項５】
前記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性αグルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリルスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ,Ｂ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ,Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6-sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）からなる群から選択される、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項６】
前記酵素は、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａまたはβ−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）である、請求項５に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型免疫グロブリンＦｃ領域において少なくとも１つ以上のアミノ酸に置換（substitution）、追加（addition）、除去（deletion）、修飾（modification）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された変形が起きたものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸がプロリンで置換されたり；７１番目のアミノ酸がグルタミンで置換されたり；または２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換されたものである、請求項７に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換が起こらないものである、請求項８に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン；（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；及び（ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン中の１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域またはヒンジ領域の一部との組み合わせで構成された群から選択されるものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、単量体（monomer）の形態である、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなるものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ジスルフィド結合を形成することができる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が除去されたり、天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されたり、補体結合部位が除去されたり、またはＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されたものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非糖鎖化されたものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来した免疫グロブリンＦｃ断片である、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項１６に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンＩｇＧ４  Ｆｃ領域のヒンジ領域がＩｇＧ１ヒンジ領域で置換された、請求項１７に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１９】
前記酵素融合タンパク質は、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵素融合タンパク質を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２１】
前記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）、グリコーゲン蓄積病（Glycogen storage disease）、スフィンゴリピドーシス（sphingolipidosis）、ニーマン・ピック病（Niemann-Pick disease）、ファブリー病（Fabry' s disease）、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ハンター症候群（Hunter syndrome）、及びマロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）からなる群から選択されるものである、請求項２０に記載のリソソーム蓄積症の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、酵素のリソソーム受容体に対する結合力を減少させるものである、請求項１９に記載のリソソーム蓄積症の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項２６】
（ａ）請求項２５に記載の形質転換体を培養して培養物を得る段階；及び
（ｂ）前記培養物から酵素融合タンパク質を回収する段階を含む、酵素融合タンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二量体の治療学的酵素を含む酵素融合タンパク質、その製造方法と、それを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソームは、タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖類及び脂質のような巨大分子を分解する機能をする細胞質小器官である。リソソームの内部は酸性の環境であり、生物学的巨大分子の加水分解を促進する加水分解酵素（hydrolase enzymes）を含有する。リソソームは、エンドサイトーシス（endocytosis）を通じた分子の吸収においてなんらかの役割をすることが明らかになっている。
【０００３】
リソソーム蓄積症（Lysosomal Storage Disorders, LSDs）は、遺伝的代謝疾患の一種であり、リソソームの機能が失われて現れる。リソソーム蓄積症は、脂質、タンパク質、多糖類などの物質を分解する酵素の欠乏が原因で現れるが、通常、１０万人に１人の割合で現れ、劣性疾患として遺伝される。リソソーム蓄積症は、このように分解作用をする特定の酵素が欠乏していたり、その量が非常に少ない場合に現れ、このように分解酵素が欠乏したとき、余分な物質が分解されずに蓄積され、最終的には、細胞の機能にも問題を起こすようになる。他の多くの遺伝性疾患と同様に、リソソーム蓄積症は、父母から遺伝される。また、それぞれの疾患は、それぞれ異なる酵素を翻訳する、互いに異なる遺伝子の変異により発生する。このような疾患の原因となる酵素は、通常、同様の生化学的特性を有し、すべてのリソソーム蓄積症は、リソソーム内の非正常的な物質の蓄積により発生する。現在知られている代表的なリソソーム蓄積症としては、ニーマン・ピック病（Niemann-Pick disease）、ファブリー病（Fabry' s disease）、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ハンター症候群（Hunter syndrome）、マロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）などのような、約５０種の疾患が知られている。
【０００４】
リソソーム蓄積症中の一つとして知られているファブリー病（Fabry' s disease）は、リソソームに存在する加水分解酵素であるα−ガラクトシダーゼＡ（alpha-galactosidase  A）の酵素活性の欠乏または不足による結果として現れる糖脂質（glycosphingolipid）の先天性代謝異常の一種である。
【０００５】
α−ガラクトシダーゼＡは、Ｇｂ３（globotriaosylceramide）をラクトシルセラミド（lactosylceramide）で分解する酵素であり、上記酵素の異常により血管壁と身体の多様な部位にＧｂ３が非正常的に蓄積されることにより、ファブリー病が発症されることが知られている。
【０００６】
リソソーム蓄積症を治療するための方法として、代表的には、酵素補充療法（ERT:enzyme-replacement therapy）があり、関連して多くの研究が進められている（Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26; 199(5):723-34（非特許文献１））。特に、リソソーム蓄積症は、特定の酵素の遺伝的欠陥が原因で起こる疾病であるため、欠陥のある酵素の補充治療が不可欠である。酵素補充療法は、リソソーム蓄積症おいて標準となる治療であり、不足している酵素を補うことにより、既存の症状が緩和されたり、疾患の進行を遅らせる効果を見ることができる。
【０００７】
しかし、このような治療効果を示すタンパク質は、一般的に安定性が低く、容易に変性され、血液中のタンパク質加水分解酵素により分解されるので、血中濃度及び活性を維持するためには、患者に頻繁に投与しなければならない。
【０００８】
しかし、大部分が注射剤の形態で患者に投与されるタンパク質医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射を打つことは、患者に多大な苦痛を引き起こすようになる。このような問題点を解決するために、治療学的酵素類の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長時間高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このような治療学的酵素類の持続性製剤は、治療学的酵素類の安定性を高めると共に、薬物自体の活性が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発してはならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許公開第９７／３４６３１号
【特許文献２】国際特許公開第９６／３２４７８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26; 199(5):723-34
【非特許文献２】van der Neut Kolfschoten, et at., Science、317:1554-1557. 2007
【非特許文献３】H.Neurath、R.L.Hill, The Proteins、Academic Press、New York, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
目的とする疾患に対する治療効果を有する治療剤であり、生体内で安定して持続性が増加されながら、融合されたタンパク質の活性が維持される治療剤の開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一つの目的は、下記化学式（１）で示される、酵素融合タンパク質を提供することにある。
【００１３】
【化１】
2021507705.tif 000003
・・・・（１）
【００１４】
ここで、Ｘ及びＸ’は治療学的酵素であって、それぞれ独立して同一または異なる種類の酵素であり、
Ｌ及びＬ’はリンカーであって、それぞれ独立して同一または異なる種類のリンカーであり；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり；
｜は、共有結合であり；
：は、共有または非共有結合である。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記酵素融合タンパク質を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、前記酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することにある。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供することにある。
【００１９】
本発明のもう一つの目的は、前記形質転換体を培養して培養物を得る段階；及び前記培養物から酵素融合タンパク質を回収する段階を含む酵素融合タンパク質を製造する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、二量体の治療学的酵素を含む融合タンパク質に関し、上記治療学的酵素に免疫グロブリンＦｃ領域が融合して治療学的酵素の安定性が高くなり、腎臓による酵素除去メカニズムが減少された、酵素融合タンパク質に関する。本発明の酵素融合タンパク質は、増加された持続時間により患者に有用に利用することができ、二量体の治療学的酵素を含むことにより、製造段階を減少させることができ、生産コストの削減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質の活性を測定した図である。
【図２】アガルシダーゼβ及びα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性を比較した図である。
【図３】アガルシダーゼβ及びα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞内の吸収活性を比較した図である。
【図４】アガルシダーゼβ及びα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明を具現する一つの態様は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が融合した酵素融合タンパク質である。
【００２３】
一つの具体例による酵素融合タンパク質であって、上記酵素融合タンパク質は、下記化学式（１）で示される、酵素融合タンパク質であることを特徴とする。
【００２４】
【化２】
2021507705.tif 000004
・・・・（１）
【００２５】
ここで、Ｘ及びＸ’は治療学的酵素であって、それぞれ独立して同一または異なる種類の酵素であり、
Ｌ及びＬ’はリンカーであって、それぞれ独立して同一または異なる種類のリンカーであり；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり；
｜は、共有結合であり；
：は、共有または非共有結合である。
【００２６】
先の具体例による酵素融合タンパク質であって、上記治療学的酵素は、非共有結合を通じて二量体を形成するものである、酵素融合タンパク質であることを特徴とする。
【００２７】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記治療学的酵素は、互いに逆平行（anti-parallel）で二量体を形成したことを特徴とする。
【００２８】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて安定性が増加し、リソソームの受容体に対する結合力が減少したことを特徴とする。
【００２９】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性αグルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリルスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ,Ｂ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ,Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6-sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）からなる群から選択されることを特徴とする。
【００３０】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記酵素は、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａまたはβ−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）であることを特徴とする。
【００３１】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型免疫グロブリンＦｃ領域において少なくとも１つ以上のアミノ酸に置換（substitution）、追加（addition）、除去（deletion）、修飾（modification）及びこれらの組み合わせからなる群から選択された変形が起きたことを特徴とする。
【００３２】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸がプロリンで置換されたり；７１番目のアミノ酸がグルタミンで置換されたり；または２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換されたことを特徴とする。
【００３３】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換が起こらないことを特徴とする。
【００３４】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン；（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；及び（ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン中の１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域またはヒンジ領域の一部との組み合わせで構成された群から選択されることを特徴とする。
【００３５】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、単量体（monomer）の形態であることを特徴とする。
【００３６】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなることを特徴とする。
【００３７】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ジスルフィド結合を形成することができる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が除去されたり、天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されたり、補体結合部位が除去されたり、またはＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されたことを特徴とする。
【００３８】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、非糖鎖化されたことを特徴とする。
【００３９】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来の免疫グロブリンＦｃ断片であることを特徴とする。
【００４０】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
【００４１】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域であることを特徴とする。
【００４２】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記免疫グロブリンＩｇＧ４  Ｆｃ領域のヒンジ領域がＩｇＧ１ヒンジ領域で置換されたことを特徴とする。
【００４３】
先の具体例のいずれか一つによる酵素融合タンパク質であって、上記酵素融合タンパク質は、配列番号１３からなるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００４４】
本発明を具現する他の態様は、上記酵素融合タンパク質を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
一つの具体例による組成物であって、上記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）、グリコーゲン蓄積病（Glycogen storage disease）、スフィンゴリピドーシス（sphingolipidosis）、ニーマン・ピック病（Niemann-Pick disease）、ファブリー病（Fabry' s disease）、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ハンター症候群（Hunter syndrome）、及びマロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）からなる群から選択されることを特徴とする。
【００４５】
先の具体例による組成物であって、前記組成物は、酵素のリソソーム受容体に対する結合力を減少させることを特徴とする。
【００４６】
本発明を具現する他の態様は、上記酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４７】
本発明を具現する他の態様は、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００４８】
本発明を具現する他の態様は、上記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。
【００４９】
本発明を具現する他の態様は、酵素融合タンパク質を製造する方法を提供する。
一つの具体例による酵素融合タンパク質を製造する方法であって、上記形質転換体を培養して培養物を得る段階、及び前記培養物から酵素融合タンパク質を回収する段階を含むことを特徴とする。
【００５０】
本発明を実施するための具体的な内容を説明すると、次の通りである。一方、本願で開示されるそれぞれの説明と実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。また、下記記述される具体的な叙述により、本発明の範疇が限定されるとは言えない。
【００５１】
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを使用して本出願に記載された本発明の特定の態様に対する多数の等価物を認知したり、確認することができる。さらに、このような同等物は、本発明に含まれるものと意図される。
【００５２】
本明細書の全般を通じて、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが使用されるだけでなく、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（N-methylglycine）などのような他のアミノ酸に対して一般的に許容される３文字コードが使用される。また、本明細書において略語で言及されたアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に基づいて記載された。
【００５３】
アラニンＡ  アルギニンＲ
アスパラギンＮ  アスパラギン酸Ｄ
システインＣ  グルタミン酸Ｅ
グルタミンＱ  グリシンＧ
ヒスチジンＨ  イソロイシンＩ
【００５４】
ロイシンＬ  リジンＫ
メチオニンＭ  フェニルアラニンＦ
プロリンＰ  セリンＳ
スレオニンＴ  トリプトファンＷ
チロシンＹ  バリンＶ
【００５５】
本発明を具現する一つの態様は、下記化学式（１）で示される、酵素融合タンパク質を提供する。
【００５６】
【化３】
2021507705.tif 000005
・・・・（１）
【００５７】
ここで、Ｘ及びＸ’は治療学的酵素であって、それぞれ独立して同一または異なる種類の酵素であり、
Ｌ及びＬ’はリンカーであって、それぞれ独立して同一または異なる種類のリンカーであり；
Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり；
｜は、共有結合であり；
：は、共有または非共有結合である。
【００５８】
本発明における用語、「酵素融合タンパク質」とは、治療学的酵素に免疫グロブリンＦｃ領域が融合したものであり、免疫グロブリンＦｃ領域の融合により、免疫グロブリンＦｃ領域と融合されない治療学的酵素に比べて、治療学的酵素の活性は維持されながらも、リソソーム受容体に対する結合力が減少し、血中半減期が増加するものであってもよい。本発明の酵素融合タンパク質は、酵素補充療法（enzymatic replacement therapy, ERT）の薬物として使用することができる。上記酵素補充療法は、疾病の原因となる欠乏または不足酵素を補うことにより、低下した酵素機能の回復を通じて疾病を予防または治療することができる。
【００５９】
本発明者らは、治療学的酵素類の血中半減期を増加させるために、免疫グロブリンＦｃ領域との融合タンパク質を作製した。ここで、Ｆｃ領域は、糖化を抑制するために潜在的な糖化配列を置換させ、さらに、ＩｇＧ４  Ｆｃのｈｉｎｇｅ配列を置換させて鎖交換（chain exchange）が抑制されたＩｇＧ４  Ｆｃ誘導体を使用した。
【００６０】
また、本発明の酵素融合タンパク質を製造するにおいて、免疫グロブリンＦｃ領域と融合される治療学的酵素が二量体、特に逆平行（anti-parallel）の形態で連結された二量体を形成する場合、酵素の活性を維持しながらも、体内持続性が増加するだけでなく、上記酵素融合タンパク質の製造段階を減らすことができ、効率的な生産が可能であることを確認した。
【００６１】
そこで、本発明の酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域が融合されない治療学的酵素に比べて安定性が増加しながらも酵素活性を維持することができ、生産コストが削減される利点を有する。
【００６２】
本発明における用語、「治療学的酵素」とは、酵素の不足、欠乏、機能異常などにより発症する疾病を治療するための酵素であり、酵素補充療法（enzyme replacement therapy）、投与などを通じて前記疾患を有する個体を治療することができる酵素を意味する。具体的には、リソソーム酵素の不足または欠乏などにより発症するリソソーム蓄積症の治療のための酵素であってもよいが、これに限定されない。
【００６３】
本発明の酵素融合タンパク質に含まれる治療学的酵素は、特に制限されず、融合されていない形態の治療学的酵素より生体内持続時間を増やして利点を得ることができる治療学的酵素であれば、本発明の酵素融合タンパク質に含むることができる。本発明の一実施形態において上記酵素融合タンパク質は、治療学的酵素の融合タンパク質である。
【００６４】
本発明の酵素融合タンパク質に含まれる治療学的酵素は、非共有結合を通じて二量体を形成するものであってもよいが、これに限定されない。具体的には、上記治療学的酵素は、融合タンパク質が形質転換体で発現され、免疫グロブリンＦｃ領域が二量体（dimer）を形成するとき、治療学的酵素も二量体（dimer）を形成するものであってもよい。
【００６５】
このような治療学的酵素の二量体は、互いに同一な２個の酵素が二量体を形成したものであってもよく、または、互いに異なる２個の酵素が二量体を形成したものであってもよく、上記二量体を構成する酵素は、体内で目的とする活性を有する以上、具体的な種類に限定されない。
【００６６】
一方、前記二量体を構成する治療学的酵素は、互いに連結される方向に沿って、平行二量体（parallel dimer）または逆平行二量体（anti-parallel dimer）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６７】
本発明の実施例では、治療学的酵素であるα−ガラクトシダーゼが免疫グロブリンＦｃ領域と融合して発現された融合タンパク質を製造し、上記融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域が二量体（dimer）を形成しながらα−ガラクトシダーゼが非共有結合を通じて逆平行二量体を形成することを確認した。また、前記融合タンパク質が免疫グロブリンＦｃ領域と融合された形態でも酵素の活性を維持することを確認した（実施例２）。
【００６８】
さらに他の実施例では、α−ガラクトシダーゼが免疫グロブリンＦｃ領域と融合された融合タンパク質とＦｃ領域が融合されていないアガルシダーゼβを比較し、Ｆｃ領域との融合にもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性及び細胞内吸収活性を維持することを確認し（実施例２及び３）、Ｆｃ領域との融合により薬物動態に優れていることを確認した（実施例４）。
【００６９】
本発明における用語、「平行二量体（parallel dimer）」とは、それぞれの単量体が二量体を形成する際に、それぞれの単量体のアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端が同じ方向に二量体を形成することを意味する。この時、二量体の形成は、非共有結合または共有結合であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７０】
本発明における用語、「逆平行二量体（anti-parallel dimer）」とは、それぞれの単量体が二量体を形成する際に、それぞれの単量体のアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端が互いに異なる方向に二量体を形成することを意味する。この時、二量体の形成は、非共有結合または共有結合であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７１】
言い換えれば、本発明の酵素融合タンパク質において、（i）１つの治療学的酵素（Ｘ）のＮ末端と他の１つの治療学的酵素（Ｘ’）のＮ末端が同じ方向に二量体を形成したり、（ii）１つの治療学的酵素（Ｘ）のＣ末端と他の１つの治療学的酵素（Ｘ’）のＣ末端が同じ方向に二量体を形成したり、（iii）１つの治療学的酵素（Ｘ）のＮ末端と他の１つの治療学的酵素（Ｘ’）のＣ末端が同じ方向に二量体を形成したり、または（iv）１つの治療学的酵素（Ｘ）のＣ末端と他の一つの治療学的酵素（Ｘ’）のＮ末端が同じ方向に二量体を形成することができる。上記（i）及び（ii）の場合を平行二量体、上記（iii）及び（iv）の場合を逆平行二量体といい、上記二量体の形成は、共有結合（covalent bond）または非共有結合（non-covalent bond）によるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７２】
具体的には、上記二量体の形成において、平行または逆平行二量体の形成は、免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成することにより、これに連結された単量体のα−ガラクトシダーゼＡが共有または非共有結合を通じて二量体を形成するものであってもよい。
【００７３】
本発明の逆平行二量体の形態の治療学的酵素を含む融合タンパク質は、これを製造する過程において、製造段階を減少させて生産コストを削減させることができ、生体内でｐＨの変化による二量体の形態の不安定性を減少させながら酵素活性を維持することができる優れた利点がある。
【００７４】
本発明の上記治療学的酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性αグルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリルスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ,Ｂ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ,Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ  （beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6-sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）からなる群から選択される治療学的酵素であってもよく、ヒト由来の酵素であってもよいが、リソソーム蓄積症に対する治療効果を有する治療学的酵素であれば、酵素の由来や種類の制限なしに本発明に含まれることができる。
【００７５】
より具体的には、上記酵素は、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａまたはβ−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）であってもよい。
【００７６】
本発明における用語、「α−ガラクトシダーゼ（alpha galactosidase)A」とは、脾臓、脳、肝臓などのリソソームに存在する酵素であり、糖脂質と糖タンパクにおいて末端のαガラクトシル（galactosyl）の一部を加水分解する酵素であって、ホモ二量体（homodimeric）の糖タンパクである。具体的には、上記α−ガラクトシダーゼＡはセラミドｔｒｉｈｅｘｏｓｉｄｅを加水分解し、ガラクトースとグルコースでｍｅｌｉｂｉｏｓｅの加水分解を触媒することが知られており、特に、リソソーム蓄積症であるファブリー病（Fabry' s disease）に関連することが知られている。
【００７７】
本発明において、上記α−ガラクトシダーゼＡは、組換え形態であるアガルシダーゼα（agalidase alpha）またはアガルシダーゼβ（agalsidae beta）と混用されてもよく、これと同等の活性を有し、リソソーム蓄積症に治療効果を示す酵素である限り、配列や由来、製法などに制限なく本発明の範疇に含むことができる。具体的には、上記α−ガラクトシダーゼは、配列番号５のポリヌクレオチド配列によりコードされてもよくき、配列番号６のアミノ酸配列を含むことができるが、これに限定されない。
【００７８】
本発明の治療学的酵素は、天然型酵素であってもよく、前記天然型酵素の一部として構成された断片、あるいは一部のアミノ酸の置換（substitution）、追加（addition）、除去（deletion）、修飾（modification）及びこれらの組み合わせからなる群から選択された変形が起きた、治療学的酵素のアナログ（analog）も天然型治療学的酵素と同等の活性を有する限り、本発明に制限なく含まれる。
【００７９】
また、前記治療学的酵素のアナログは、天然型治療学的酵素のアミノ及び／またはカルボキシの末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が追加されたものをすべて含む。
【００８０】
上記置換または追加されたアミノ酸は、ヒトタンパク質において通常観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然発生アミノ酸を使用することができる。非定型アミノ酸の商業源には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐとＧｅｎｚｙｍｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと定型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、または韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成及び購入が可能であるが、特にこれに限定されない。
【００８１】
本発明における用語、「断片」とは、天然型治療学的酵素または天然型治療学的酵素のアナログのアミノ末端もしくはカルボキシの末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去された形態をいう。治療学的酵素の活性を有する限り、断片の大きさや除去されるアミノ酸の種類に関係なく、本発明の範囲に含まれる。
【００８２】
上記治療学的酵素アナログは、当該治療学的酵素のバイオシミラーとバイオベターの形態を含むが、バイオシミラーの例を挙げれば、公知の治療学的酵素と発現宿主の差異、糖化の様相と程度の差異、特定位置の残基が当該酵素の基準配列に照らしてみると、１００％置換ではない場合、その置換度の差異も、本発明の酵素融合タンパク質で使用することができるバイオシミラー酵素に該当する。上記治療学的酵素は、当業界において知られている方法で準備または製造することができ、具体的には、遺伝子組換えを通じて、動物細胞、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、生きている動物などから生産することができ、生産方法は、これに限定されず、商業的に利用可能な治療学的酵素を購入して使用することができるが、これに限定されない。
【００８３】
また、前記治療学的酵素またはそのアナログと６０％、７０％、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、上記治療学的酵素は、遺伝子組換え技術により微生物から得たり、商業的に利用可能なものであってもよいが、これに限定されない。
【００８４】
本発明における用語、「相同性」とは、野生型（wild type）アミノ酸配列及び野生型核酸配列との類似度を示すためのものであり、相同性の比較は、肉眼または購入が容易な比較プログラムを使用して行われる。市販中のコンピュータプログラムは、２個以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができる。相同性（％）は、隣接する配列に対して計算することができる。
【００８５】
上記治療学的酵素またはその誘導体の配列及びこれをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩなど、公知のデータベースから得ることができる。
【００８６】
上記治療学的酵素は、当業界において知られている方法で準備または製造することができ、具体的には、動物細胞発現ベクターを挿入した動物細胞を培養し、培養物から精製することができ、または商業的に利用可能な酵素を購入して使用することができるが、これに限定されない。
【００８７】
本発明の酵素融合タンパク質は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域がペプチドリンカーを通じて融合されたものであってもよい。即ち、上記化学式（１）のＬまたはＬ’は、ペプチドリンカーであってもよいが、免疫グロブリンＦｃ領域と治療学的酵素を融合することができる限り、特に制限されるものではない。
【００８８】
前記ペプチドリンカーは、１個以上のアミノ酸を含むことができ、例えば、１個から１０００個のアミノ酸を含むことができ、当業界において知られている任意のペプチドリンカーは、その例として［ＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＳ］ｘリンカー及び［ＧＧＧＧＳ］ｘリンカーなどを含み、ここで、ｘは１以上の自然数（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）であってもよいが、これに限定されない。具体的には、本発明のペプチドリンカーは、１０〜５０個、より具体的には、２０〜４０個のアミノ酸配列で構成されてもよく、配列番号１１のアミノ酸配列で構成されるものであってもよい。
【００８９】
本発明の目的上、治療学的酵素の活性を維持しながら、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を連結することができる限り、ペプチドリンカーが治療学的酵素及び免疫グロブリンＦｃに融合される位置は制限されない。具体的には、治療学的酵素及び免疫グロブリンＦｃ領域の両末端、より具体的には、治療学的酵素のＣ末端、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端であってもよいが、これに限定されない。
【００９０】
本発明における用語、「Ｎ末端」または「Ｃ末端」とは、それぞれタンパク質のアミノ末端及びカルボキシル末端を意味するものであり、その例として、これに限定されないが、Ｎ末端またはＣ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｎ末端またはＣ末端の周囲のアミノ酸残基をすべて含むことができ、具体的には、最末端から最初の〜２０番目のアミノ酸残基を含むことができる。
【００９１】
本発明の一実施例では、治療学的酵素であるα−ガラクトシダーゼとリンカーＩｇＧ４を遺伝子レベルで融合されるように合成し、治療学的酵素のＣ末端にＩｇＧ４のＮ末端が融合された融合タンパク質（配列番号１３）を製造し、前記融合タンパク質が形質導入された形質転換体で発現されることを確認した（実施例２）。
【００９２】
本発明において、前記ペプチドリンカーは、単量体の免疫グロブリンＦｃ領域が形成する二量体の免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ連結されるものであってもよく、各免疫グロブリンＦｃ領域に連結されるリンカーは、互いに同一または異なる種類であってもよい。
【００９３】
本発明の酵素融合タンパク質の一構成要素（moiety）である免疫グロブリンＦｃ領域は、単量体の免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成したものであってもよい。
【００９４】
本発明における用語、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／または重鎖定常領域３（ＣＨ３）の部分を含む部位を意味する。本発明の目的上、このようなＦｃ領域は、変異されたヒンジ領域を含むことができるが、これに限定されない。具体的には、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型免疫グロブリンＦｃ領域に少なくとも１つ以上のアミノ酸に置換（substitution）、追加（addition）、除去（deletion）、修飾（modification）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された変形が起きたものであってもよいが、これに限定されない。
【００９５】
免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物を製造するにおいて、キャリアとして用いられる物質であり、タンパク質を安定化し、腎臓から除去されることを防止するために、最近では、免疫グロブリンＦｃ領域を利用した融合タンパク質の研究が活発に行われている。免疫グロブリンは、血液の主要な構成成分としてＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのように５種類があるが、融合タンパク質の研究に頻繁に使用される種類はＩｇＧであり、これは、ＩｇＧ１〜４の４つのｓｕｂｔｙｐｅに分類される。免疫グロブリンＦｃ領域を利用した融合タンパク質は、タンパク質のサイズを増加させて腎臓から除去されることを防止し、ＦｃＲｎ受容体と結合して細胞内にｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ及びｒｅｃｙｃｌｉｎｇを通じて血中半減期を増加させる役割をする。
【００９６】
このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）領域を含むことができ、前記ヒンジ領域により単量体である免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成することができるが、これに限定されるものではない。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等または向上された効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／または軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／またはＣＨ３に該当する非常に長い、一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。
【００９７】
具体的には、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、及び５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン中の１個または２個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせであってもよい。しかし、これに制限されるものではない。より具体的には、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００９８】
一つの例として、上記ヒンジ領域は、下記アミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失または変異されたものであってもよい。
【００９９】
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro  （配列番号１４）
【０１００】
具体的には、上記ヒンジ領域の一部が欠失し、一つのシステイン（Cys）残基のみを含むように変異されたものであってもよく、鎖交換（chain exchange）に関与するセリン（Ser）残基をプロリン（Pro）残基で置換されたものであってもよい。より具体的には、上記ヒンジ配列の２番目のセリン残基がプロリン残基で置換されたものであってもよいが、これに限定されない。
【０１０１】
本発明において、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型ヒンジ領域または変異されたヒンジ領域を含むことにより、Ｆｃ領域における鎖交換及び単量体の形成が起こらないだけでなく、融合された治療学的酵素の安定性を向上させることができる。
【０１０２】
本発明において、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、単量体（monomer）の形態であってもよいが、これに限定されない。具体的には、前記化学式（１）においてＦである免疫グロブリンＦｃ領域は、単量体の形態でペプチドリンカーを通じて単量体の治療学的酵素と融合発現されるものであってもよい。上記単量体の免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成することにより、上記免疫グロブリンＦｃ領域に融合された治療学的酵素も非共有結合により二量体を形成することができるが、これに限定されるものではない。
【０１０３】
薬物のキャリアとして利用される免疫グロブリンＦｃ領域は、意図しない免疫反応を引き起こし得るという短所があることが知られている。例えば、抗体依存性細胞傷害（ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）または補体依存性細胞傷害（CDC, complement-dependent cytotoxicity）のようなエフェクター機能（effector function）を有するようになる。このような機能は、免疫グロブリンＦｃ領域のＦｃ受容体との結合、補体結合、またはＦｃ領域の糖化（glycosylation）を通じて起こるようになる。また、Ｆｃそのものの生体内の不安定性が発生しやすい。
【０１０４】
本発明者らは、免疫グロブリンＦｃ領域内のヒンジ領域の配列を置換することにより、これらの問題点を解決しようとした。具体的には、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、糖化を調節するために潜在的糖化配列が置換されたものであるか、または鎖交換に関与する配列が置換されたものであってもよく、または、二つの場合の両方に該当されてもよい。より具体的には、本発明の酵素融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換が起こらないものであってもよい。
【０１０５】
具体的には、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換及びＮ−グリコシル化を防止するために、配列番号８の免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸及び／または７１番目のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよい。より具体的には、配列番号８の免疫グロブリンＦｃ領域の１）２番目のアミノ酸（セリン）がプロリンで置換されたり、２）７１番目のアミノ酸（アスパラギン）がグルタミンで置換されたり、または３）２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換されたものであり得、具体的には、配列番号９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリンＦｃ領域であってもよいが、これに限定されない。上記に言及された変異以外にも、治療学的酵素の安定性を増大させる、薬物のキャリアとして適した変異を含有することができる。
【０１０６】
具体的には、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンＩｇＧ４  Ｆｃのヒンジ領域がＩｇＧ１ヒンジ領域で置換されたものであってもよいが、これに限定されない。
【０１０７】
本発明の一実施例では、免疫グロブリンＦｃの２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換し、鎖交換及びＮ−グリコシル化が減少するようにした（実施例１）。
【０１０８】
本発明における用語、「鎖交換（chain exchange）」とは、ＩｇＧ４  Ｆｃタンパク質融合体のキャリアとして使用するとき、生体内に存在するＩｇＧ４とハイブリッドを形成したり、単量体として存在して元来の構造を変更させて治療学的に低い活性を有する構造を有するようになる問題を意味することで、タンパク質が融合された融合タンパク質である、タンパク質融合体を治療用目的として使用するときに、大きな困難があることが報告された（van der Neut Kolfschoten, et at., Science、317:1554-1557. 2007（非特許文献２））。
【０１０９】
また、他の具体的な態様において、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が置換（substitution）、追加（addition）、除去（deletion）、修飾（modification）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された変異が起きたことを意味する。
【０１１０】
例えば、ＩｇＧ  Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として利用することができる。
【０１１１】
また、ジスルフィド結合を形成することができる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されたりなどもできるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号（特許文献１）、国際特許公開第９６／３２４７８号（特許文献２）などに開示されている。
【０１１２】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知となっている（H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979（非特許文献３））。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）及びアミド化（amidation）などで修飾（modification）されてもよい。
【０１１３】
また、上述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。
【０１１４】
さらに、このようなＦｃ領域は、ヒト、牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、またはモルモットなどの動物の生体内で分離した天然型から得ることもでき、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換えまたはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体の免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して取得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを利用してＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態では、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え免疫グロブリンＦｃ領域である。
【０１１５】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去、または非糖鎖化された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を利用した遺伝子工学的方法のような常法が利用されてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（c1q）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で、薬物のキャリアとしての本来の目的に、より合致する形態は、糖鎖が除去されたり、非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域であると言える。
【０１１６】
本発明における用語、「糖鎖の除去（Deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、非糖鎖化（Aglycosylation）は原核動物、より具体的な実施形態では、大腸菌で生産して糖鎖化されないＦｃ領域を意味する。
【０１１７】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたは牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であることができ、より具体的な実施形態では、ヒト起源である。
【０１１８】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態では、ヒトの血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、より具体的な実施形態では、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったＩｇＧ由来である。より具体的な実施形態において、上記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、さらに具体的な実施形態において上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ領域であり、最も具体的な実施形態において、上記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は配列番号９であり、これをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７であってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１１９】
一方、本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＤ  Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２個以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【０１２０】
また、本発明の治療学的酵素または酵素融合タンパク質は、Ｎ末端及び／またはＣ末端が変形されないものであってもよいが、生体内のタンパク質切断治療学的酵素から保護し、安定性を増加させるために、そのＮ末端及び／またはＣ末端などが化学的に修飾されたり、有機団で保護されたり、またはペプチド末端などにアミノ酸が追加されて変形された形態も本発明に係る治療学的酵素または酵素融合タンパク質の範疇に含まれる。Ｃ末端が変形されない場合、本発明に係る治療学的酵素または酵素融合タンパク質の末端はカルボキシル基を有するが、特にこれに限定されるものではない。
【０１２１】
特に、化学的に合成したタンパク質の場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているため、このような電荷を除去するために、Ｎ末端をアセチル化（acetylation）及び／またはＣ末端をアミド化（amidation）することができるが、特にこれに限定されない。
【０１２２】
本明細書において特に言及がなければ、本発明に係る「酵素」または「融合タンパク質」に対する明細書の詳細な説明や請求の範囲の記述は、当該酵素または融合タンパク質はもちろん、当該酵素または融合タンパク質の塩（例えば、上記融合タンパク質の薬学的に許容可能な塩）、またはその溶媒和物の形態をすべて含む範疇にも適用される。したがって、明細書において「酵素」または「融合タンパク質」とだけ記載されていても、当該記載内容は、その特定の塩、その特定の溶媒和物、その特定の塩の特定の溶媒和物も同様に適用される。このような塩の形態は、例えば、薬学的に許容される任意の塩を使用した形態であってもよい。上記塩の種類は特に制限されない。ただし、個体、例えば、哺乳類に安全かつ効果的な形態であることが望ましいが、特にこれに限定されるものではない。
【０１２３】
上記用語、「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、またはアレルギー反応などを誘発することなく、目的とする用途に効果的に使用可能な物質を意味する。
【０１２４】
本発明における用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、または塩基から誘導された塩を含む。適合した酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。適合した塩基から誘導された塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、及びアンモニウムなどを含むことができる。
【０１２５】
また、本発明における用語、「溶媒和物」とは、本発明に係る酵素、融合タンパク質またはその塩が溶媒分子と複合体を形成したものをいう。
【０１２６】
本発明の酵素融合タンパク質は、当業界の公知の方法で製造することができる。
【０１２７】
本発明の一実施例では、治療学的酵素であるα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）をペプチドリンカー免疫グロブリンＦｃと融合された形態で発現する組換えベクターを製造し、これをＣＨＯ細胞株で発現させて製造した（実施例１〜２）。
【０１２８】
しかし、本発明の酵素融合タンパク質は、上記実施例で記述された方法以外にも、公知となった他の方法により製造することができる。本発明の酵素融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【０１２９】
本発明に係る酵素融合タンパク質は、リソソーム蓄積症に対する治療効果を示す治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を融合させ、治療学的酵素の活性を維持しながら、体内安定性を高めることにより、治療学的酵素の半減期を増加させることができる。特に、変異された免疫グロブリンＦｃ領域と融合された治療学的酵素は、鎖交換及び糖化が弱化され、Ｆｃ領域と融合されない治療学的酵素に比べてリソソーム受容体に対する結合力が低く、高い持続性を有することができ、これは、リソソーム蓄積症の治療において、有用な効果を示すものである。
【０１３０】
本発明を具現する他の一つの態様は、上記酵素融合タンパク質を有効成分として含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【０１３１】
本発明に係る組成物は、治療学的酵素の生体内持続性及び安定性が増加したことを特徴とする。
【０１３２】
具体的には、本発明の薬学的組成物の酵素融合タンパク質は、α−ガラクトシダーゼＡ（alpha-galactosidase）と免疫グロブリンＦｃ領域が融合したものであってもよいが、これに限定されない。
【０１３３】
また、本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成するとき、融合タンパク質内の治療学的酵素であるα−ガラクトシダーゼＡも二量体を形成するものであってもよく、より具体的には、上記α−ガラクトシダーゼＡの二量体は、相互非共有結合による二量体の形成であり、特に、互いに逆平行の方向に二量体を形成することを特徴とする。
【０１３４】
本発明における用語、「リソソーム（lysosome）」とは、細胞質に存在する小器官の一つであり、加水分解酵素を多く含んでおり、体内で巨大分子、細菌などの異物質を分解し、上記分解された産物が細胞の他の部分でリサイクルされるように助ける小器官である。上記リソソームの機能は、多数の酵素により行われるが、変異や不足などにより、特定の酵素が機能を喪失することになると、リソソームの分解機能が失われる結果となり、最終的には、分解されるべき巨大分子などが細胞内に蓄積されて細胞の損傷などを誘発し、これにより、疾病が発症する。
【０１３５】
本発明における用語、「リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）」とは、上記のようなリソソーム機能の喪失に起因する稀な遺伝病を意味し、欠陥のある酵素を利用した酵素補充療法（enzymatic replacement therapy）が必須である。上記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）、グリコーゲン蓄積病（Glycogen storage disease）、スフィンゴリピドーシス（sphingolipidosis）、ニーマン・ピック病（Niemann-Pick disease）、ファブリー病（Fabry’s disease）、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ハンター症候群（Hunter syndrome）、及びマロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）などが含まれてもよい。  
【０１３６】
本発明における用語、「ファブリー病（Fabry’s disease）」とは、リソソーム蓄積症の一つであり、性染色体劣性で遺伝し、Ｘ染色体が不活性化して発生する。リソソームに存在する加水分解酵素であるα−ガラクトシダーゼＡ（alpha-galactosidase  Ａ）の活性が欠乏したり、不足して現れる糖脂質（glycosphingolipid）の先天性代謝異常である。上記α−ガラクトシダーゼＡの異常により血管壁と身体の様々な部位、例えば、皮膚、腎臓、心臓、神経系にＧｂ３（globotriaosylceramide）が非正常に蓄積され、血流と栄養供給の減少に影響を与えることが知られている。発汗の減少、先端知覚異常症、重度の痛み、被角血管腫、角膜混濁、心臓虚血、心筋梗塞、腎臓異常などの症状が現れ、最終的には、腎臓が機能しなくなって死亡に至る。
【０１３７】
本発明における用語「予防」とは、上記酵素融合タンパク質またはそれを含む組成物の投与により目的とする疾患、リソソーム蓄積症を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、上記酵素融合タンパク質またはそれを含む組成物の投与により目的とする疾患、例えば、リソソーム蓄積症の症状が好転したり、有利になるすべての行為を意味する。
【０１３８】
本発明における用語「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、特にこれに限定されないが、前記組成物が、生体内の標的に到達することができる任意の一般的な経路を通じて投与することができ、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。しかし、経口投与時のペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが望ましい。具体的には、注射剤の形態で投与することができる。また、薬学的組成物は、有効成分が標的細胞に移動することができる任意の装置により投与することができる。
【０１３９】
本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与されることができ、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与することができる。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を異にすることができる。具体的には、本発明の融合タンパク質の望ましい全用量は、一日に患者の体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜５００ｍｇであってもよい。しかし、上記結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率など、多様な要因を考慮し、患者に対する有効投与量が決定されるため、このような点を考慮するとき、当分野の通常の知識を有する者であれば、上記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができる。本発明に係る薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【０１４０】
本発明の酵素融合タンパク質の実際の投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である治療学的酵素の種類に応じて決定される。本発明の酵素融合タンパク質は、血中持続性と生体内活性が非常に優れるため、本発明の酵素融合タンパク質を含む薬学的組成物の投与量、投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。
【０１４１】
本発明に係る薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。このような担体は、非自然に存在するものであってもよい。
【０１４２】
本発明における用語、「薬学的に許容可能な」とは、治療効果を示すことができる程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合または同時使用される薬物など、医学分野でよく知られている要素に応じて当業者により容易に決定することができる。
【０１４３】
薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、及び香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤及び安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤及び保存剤などを使用することができる。
【０１４４】
本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造されてもよい。例えば、経口投与の際には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウエハーなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態に製造することができる。その他にも溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル及び徐放性製剤などに剤形化することができる。
【０１４５】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用されてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含むことができる。
【０１４６】
また、前記酵素融合タンパク質は、生理食塩水または有機溶媒のように薬剤として許容された様々なキャリア（carrier）と混合して使用されてもよく、安定性や吸収性を増加させるために、グルコース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）またはグルタチオンのような抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤、低分子タンパク質または他の安定化剤（stabilizers）などが薬剤として使用されてもよい。
【０１４７】
これに限定されないが、本発明の上記薬学的組成物は、上記成分（有効成分）を０．０１〜９９％重量比体積で含有することができる。
【０１４８】
本発明を具現する他の態様は、本発明に係る酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１４９】
本発明の酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、これに限定されるものではないが、治療学的酵素をコードする部分とペプチドリンカー免疫グロブリンＦｃ領域をコードする部分が連結された形態のポリヌクレオチドとなってもよく、具体的には、治療学的酵素のＣ末端に免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端がＧＧＧＧＳリンカーを通じて連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよいが、これに限定されない。より具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１２の配列を含むことができるが、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域の融合タンパク質をコードすることができる以上、これに限定されない。
【０１５０】
本発明を具現する他の態様は、上記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
【０１５１】
本発明における用語、「組換えベクター」とは、適切な宿主内で目的とするペプチド、例えば、酵素融合タンパク質を発現させることができるように目的のペプチド、例えば、酵素融合タンパク質が適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ製造物を意味する。本発明に係る組換えベクターは、典型的にはクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されてもよく、原核細胞または真核細胞を宿主細胞にして構築されてもよい。
【０１５２】
上記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。組換えベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。
【０１５３】
本発明で使用される組換えベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界において知られている任意のベクターを用いて作製することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、または組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージを挙げることができる。本発明で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知となった発現ベクターを使用することができる。
【０１５４】
上記組換えベクターは、本発明の酵素融合タンパク質を生産するために宿主細胞を形質転換させるのに使用される。また、本発明の一部である、このような形質転換細胞は、本発明の核酸断片及びベクターの増殖に使用されたり、本発明の酵素融合タンパク質の組換え生産に使用された培養された細胞または細胞株であってもよい。
【０１５５】
本発明における用語、「形質転換」とは、標的タンパク質（例えば、治療学的酵素、酵素融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現することができるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドが宿主細胞内で発現できさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置したり、染色体外に位置するかに関係なく、これらすべてを含む。
【０１５６】
また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現することができるものであれば、如何なる形態で導入されるものであれ構わない。例えば、上記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含むことができる。上記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよいが、これに限定されない。
【０１５７】
また、上記における用語、「作動可能に連結された」とは、本発明において目的とするペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、上記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【０１５８】
本発明に適した宿主は、本発明のポリヌクレオチドを発現させる限り、特に制限されない。本発明に使用することができる宿主の特定の例としては、大腸菌（E. coli）のようなエシェリキア（Escherichia）属細菌；バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）のようなバチルス（Bacillus）属細菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のようなシュードモナス（Pseudomonas）属細菌；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のような酵母；スポドプテラ・フルギペルダ（Sf9）のような昆虫細胞；及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣなどのような動物細胞がある。
【０１５９】
本発明を具現する他の態様は、上記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。
【０１６０】
本発明の発現ベクターが導入された形質転換体は、本発明の目的上、酵素融合タンパク質を発現及び生産することができる限り、限定されないが、大腸菌（E. coli）のようなエシェリキア（Escherichia）属細菌；バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）のようなバチルス（Bacillus）属細菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のようなシュードモナス（Pseudomonas）属細菌；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のような酵母；スポドプテラ・フルギペルダ（SF9）のような昆虫細胞；及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣなどのような動物細胞であってもよい。
【０１６１】
本発明を具現する他の態様は、本発明に係る酵素融合タンパク質を製造する方法を提供する。
【０１６２】
具体的には、上記製造方法は、（ａ）形質転換体を培養して培養物を得る段階；及び（ｂ）培養物から酵素融合タンパク質を回収する段階を含むことができるが、これに限定されない。
【０１６３】
本発明において、形質転換体の培養に使用される培地は、適切な方法で宿主細胞培養の要件を満たさなければならない。宿主細胞の生長のために培地中に含むことができる炭素源は、製造された形質転換体の種類に応じて当業者の判断により適宜選択することができ、培養時期及び量を調節するために、適した培養条件を採択することができる。
【０１６４】
使用し得る糖源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これら物質は、個別に、または混合物として使用されてもよい。
【０１６５】
使用し得る窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別にまたは混合物として使用することができる。
【０１６６】
使用し得るリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。
【０１６７】
最後に、上記の物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が使用されてもよい。上記原料は、培養途中に培養物に適切な方式により回分式または連続式で添加することができる。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基性化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で使用して培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。  
【０１６８】
本発明に係る形質転換体の培養は、通常、２０℃〜４５℃、具体的には、２５℃〜４０℃の温度で行われる。また、培養は、所望の治療学的酵素または酵素融合タンパク質の生成量が最大に得られるまで継続されるが、このような目的で、培養は、通常、１０〜１６０時間持続することができる。
【０１６９】
前述したように、宿主細胞に応じて適切な培養条件を造成すれば、本発明に係る形質転換体は、インスリンアナログを生産するようになり、ベクターの構成及び宿主細胞の特徴に基づいて生産された治療学的酵素または酵素融合タンパク質は、宿主細胞の細胞質内、ペリプラズム間隙（periplasmic space）または細胞外に分泌されてもよい。
【０１７０】
宿主細胞内または外で発現されたタンパク質は、常法で精製することができる。精製方法の例としては、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（例えば、アセトン、エタノールなどを利用したタンパク質画分沈殿など）、透析、ゲルろ過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー及び限外ろ過などの技法を単独または組み合わせて適用することができる。
【０１７１】
本発明を具現する他の一つの態様は、上記酵素融合タンパク質またはそれを含む組成物を個体に投与する段階を含むリソソーム蓄積症の予防または治療方法を提供する。
【０１７２】
本発明の酵素融合タンパク質は、リソソーム蓄積症を予防または治療することができる治療学的酵素を含むため、これを含む酵素融合タンパク質、または上記酵素融合タンパク質を含有する薬学的組成物の投与により、リソソーム蓄積症が疑われる個体で予防または治療することができる。
【０１７３】
本発明における用語、「個体」とは、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）が疑われる個体であって、上記リソソーム蓄積症の疑いのある個体は、当該疾患が発症された又は発症しうるヒトを含むマウス、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明の酵素融合タンパク質またはそれを含む組成物で治療可能な個体は、制限なく含まれる。
【０１７４】
本発明の方法は、酵素融合タンパク質を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含むことができる。適切な総１日使用量は、正しい医学的判断の範囲内で処置医により決定されてもよく、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって異なる製剤が使用されるかどうかをはじめとした具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物とともに使用されたり、同時に使用される薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子に応じて異なって適用することが望ましい。
【０１７５】
一方、これに限定されないが、上記リソソーム蓄積症の予防または治療方法は、一つ以上のリソソーム蓄積症に対する治療的活性を有する化合物または物質を投与することをさらに含む併用療法であってもよい。
【０１７６】
本発明における用語、「併用」とは、同時、個別または順次投与を示すものと理解されなければならない。上記投与が順次または個別の場合、２次成分の投与間隔は、上記併用の有益な効果を失わないようにするものでなければならない。
【０１７７】
上記リソソーム蓄積症に対する治療的活性を有する酵素融合タンパク質の投与用量は、患者の体重１  ｋｇ当たり約０．０００１μｇ〜５００ｍｇであってもよいが、特にこれに限定されない。
【０１７８】
本発明を具現する他の態様は、上記酵素融合タンパク質、またはこれを含む組成物をリソソーム蓄積症に対する予防または治療用薬剤（もしくは薬学的組成物）の製造に使用する用途を提供する。
【０１７９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、ひたすら本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではない。
【０１８０】
［実施例１：酵素融合タンパク質の作製］
本発明者らは、逆平行（anti-parallel）二量体の治療学的酵素を含む酵素融合タンパク質を生産するために、天然型α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）とリンカー（配列番号１０）、Ｆｃ免疫グロブリン領域（配列番号７）を遺伝子レベルで融合して発現ベクターに合成した。
【０１８１】
構築された融合タンパク質の配列中、Ｆｃ領域から鎖交換（chain exchange）とＮ−グリコシル化部位（N-glycosylation site）を除去するために、部位特異的変異（site-directed mutagenesis）ＰＣＲ法を用いた。
【０１８２】
具体的には、配列番号１、２のプライマーを用いて鎖交換に関与するＦｃ領域（配列番号８）の２番目のアミノ酸であるセリン（Serine）をプロリン（Proline）に置換し、配列番号３、４のプライマーを利用してＮ−グリコシル化が行われるＦｃ領域の７１番目のアミノ酸であるアスパラギン（Asparagine）をグルタミン（Glutamine）に置換した。
【０１８３】
【表１】
2021507705.tif 000006
【０１８４】
合成されたα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターであるＸＯＧＣベクターに制限酵素を用いて挿入した。ＢａｍＨＩとＸｈｏＩの制限酵素は、α−ガラクトシダーゼとＦｃ免疫グロブリン領域をいずれも切断しない制限酵素である。上記制限酵素で切断されたα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃを同じ制限酵素で切断されたＸ０ＧＣベクターに挿入してα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質を発現するベクターを完成した。α−ガラクトシダーゼは、免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成する際に逆平行二量体を形成する。
【０１８５】
α−ガラクトシダーゼ−ＦｃのＤＮＡ及びタンパク質配列は、下記表２の通りである。表２のタンパク質配列において下線は信号配列を、太字はアミノ酸が置換された部分を、そしてイタリック体はリンカーを示す。
【０１８６】
【表２】
2021507705.tif 000007
2021507705.tif 000008
【０１８７】
前記実施例で製造された酵素融合タンパク質発現ベクターをα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃと命名した。
【０１８８】
［実施例２：酵素融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性の確認］
《実施例２−１：α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質の製造》
上記実施例で製造したα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ発現ベクター（pX0GC-alpha galactosidase-Fc）をＣＨＯ−Ｓ細胞株に形質導入し、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質を大量生産し得る細胞株を作製した。
【０１８９】
具体的には、無血清培地（FreeStyle CHO Expression Medium、Thermo Fisher社、cat.No. 12651014）を利用してＣＨＯ−Ｓ細胞を１Ｌの三角フラスコ（Erlenmeyer flask; Corning社、cat. No. 431147）で浮遊培養し、培養容器内の細胞が５×１０8個まで増殖したとき、フリースタイルマックス（Thermo Fisher社、cat. No. 16447-100）を用いて形質転換させた。即ち、二つのチューブにそれぞれ１０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ（Thermo Fisher社、cat. No. 12309-019）を入れ、一つのチューブには５００νｇのＤＮＡを入れ、もう一つのチューブには５００νＬのフリースタイルマックスを入れて両溶液を混合し、室温で１０分間静置した後、予め新しいフリースタイルＣＨＯ発現培地（Thermo Fisher社、cat. No. 12651014）で交換しておいた細胞に入れた。上記細胞を３７、５％ＣＯ2、１２５ｒｐｍの条件で、培養器で約９６時間培養した。
【０１９０】
その後、培養４日目に遠心分離を通じて培養上澄み液を回収した後、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ生産による酵素活性の変化を測定するために、上記上澄み液からｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験管酵素活性の測定を行った。
【０１９１】
《実施例２−２：α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性の確認》
α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性を確認するために、前記生産されたα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質を酵素基質として知られているｐＮＰ−Ｇａｌ（p-nitrophenyl-aD-galactopyranoside）と３７℃で３０分間の温度平衡をなすようにした。その後、基質溶液とα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃを３７℃で３０分間反応させ、その吸光度を測定することにより、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性を測定した。
【０１９２】
その結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性の測定から、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃの発現量が１，６４９ｎｇ／ｍＬであることを確認した（図１）。このような結果は、本発明の酵素融合タンパク質のα−ガラクトシダーゼが逆平行二量体を形成し、上記逆平行二量体のα−ガラクトシダーゼがその酵素活性を有意な水準で維持することを示唆することである。
【０１９３】
《実施例２−３：α−ガラクトシダーゼ及びα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性の比較》
一方、前記実施例で製造されたα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質をＦｃ領域が結合していないアガルシダーゼβ（Agalsidase beta）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性を比較しようとした。
【０１９４】
具体的には、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ及びアガルシダーゼβを酵素基質であるｐＮＰ−Ｇａｌ（p-nitrophenyl-aD-galactopyranoside）と３７℃で３０分間の温度平衡をなすようにした後、基質溶液とα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質を、３７℃で２０分間反応させた。その後、最終的に生成される４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌに対する吸光度を測定することにより、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ及びアガルシダーゼβの酵素活性を測定して比較した。
【０１９５】
その結果、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ及びアガルシダーゼβの酵素活性（specific activity）がそれぞれ７０．９、６７．６μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであることを確認した（図２）。このような結果から、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質がＦｃ領域が結合していない酵素と比較して９５．４％と類似した活性を有することを確認した。これは、Ｆｃ領域の結合にも、本発明のα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質は、酵素活性を喪失しないことを意味する。
【０１９６】
［実施例３：α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞内の吸収活性の確認］
α−ガラクトシダーゼは、マンノース−６−リン酸受容体（M6PR, mannose-6-phosphate receptor）を通じて細胞に吸収された後、作用することが知られている。そこで、本発明者らはα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃの融合タンパク質が示す細胞吸収活性を次のように確認した。
【０１９７】
具体的には、Ｍ６ＰＲを発現することが知られているＣＣＤ９８６ＳＫ細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）にアガルシダーゼβ及びα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ処理した後、３７℃で細胞内吸収を誘導した。２４時間後、細胞内に存在するアガルシダーゼβ及びα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質を、酵素活性測定法を使用して確認した。
【０１９８】
α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度と細胞内の吸収量との間の関係を分析した結果、最高の吸収速度の半分を示すミカエリス・メンテン（Michaelis-Menten）定数であるＫｍ値は１１．５５ｎＭと、アガルシダーゼβと（Ｋｍ＝１０．９２ｎＭ）類似した細胞内の吸収活性を示した（図３）。そのことから、Ｆｃ領域の結合にも、本発明のα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質は、細胞内の吸収活性を喪失しないことを確認した。
【０１９９】
［実施例５：α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質のＩＣＲマウスにおける薬物動態の確認］
各群別に採血時点当り３匹のＩＣＲマウス（mouse）にアガルシダーゼβ（対照群）と、上記実施例で製造したα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質（試験群）の血液内安定性及び薬物動態係数を比較した。
【０２００】
具体的には、対照群と試験群を、アガルシダーゼを基準として、各１．０ｍｇ／ｋｇずつ静脈内及び皮下注射した。対照群の静脈内注射投与群は、注射後、０、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２及び４時間後に採血した。試験群の静脈内注射群は、注射後、０、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６時間後に採血し、皮下注射投与群は、注射後、０、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、及び２１６時間後に採血した。血清内のタンパク質量はｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験管酵素活性の測定を通じて定量化した。
【０２０１】
その結果、α−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質の場合、Ｆｃ領域が結合していない対照群に比べて血中半減期（Ｔ1/2）、血中最高薬物濃度（Ｃmax）、ＡＵＣ（area under curve）がすべて増加した。上記ＡＵＣは、薬物分子に対する体内露出度を示す（図４、表３）。そのことから、Ｆｃ領域の結合により、本発明のα−ガラクトシダーゼ−Ｆｃ融合タンパク質が投与経路とは無関係に、高い血中半減期、血中最高薬物濃度（Ｃmax）、生体内利用率（ＡＵＣ）を示すことを確認した。
【０２０２】
【表３】
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【０２０３】
このような結果は、リソソーム蓄積症に治療効果を有することが知られている治療学的酵素の一例であるアルファガラクトシダーゼの半減期増加及び生体内利用率を増加させた本発明の新たな形態の融合タンパク質が酵素活性を維持しながら、リソソーム蓄積症の治療剤として使用できることを示唆するものである。
【０２０４】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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