(57)【要約】本発明は、バイオテクノロジーに関し、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害除草剤に対する耐性を付与するための新規の組換えＤＮＡ分子及び操作されたタンパク質を提供する。本発明はまた、この組換えＤＮＡ分子を含有する除草剤耐性トランスジェニック植物、種子、細胞、及び植物部位、ならびにそれらの使用方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、組換えＤＮＡ分子であって、前記タンパク質が、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、前記置換が、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される、前記組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記タンパク質が、前記アミノ酸置換のうちの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号２４〜１２４及び２４９〜２６３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記タンパク質がＨｅｍＧクラスプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ酵素を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、前記酵素における長鎖インサートループに位置する、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記異種プロモーターが、植物細胞において機能的である、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記核酸分子が、前記タンパク質を細胞内で局在化させるように機能する輸送配列をコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結されている、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記組換えＤＮＡ分子が植物細胞のゲノムに含まれる、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子によってコードされる操作されたタンパク質。
【請求項１１】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位。
【請求項１２】
前記トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位が、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に対して耐性である、請求項１１に記載のトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位。
【請求項１３】
前記ＰＰＯ除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、フルチアセットメチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される、請求項１２に記載のトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位。
【請求項１４】
前記トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位が、少なくとも第２の除草剤に対して耐性である、請求項１３に記載のトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位。
【請求項１５】
植物、種子、細胞、または植物部位へのＰＰＯ除草剤耐性の付与方法であって、前記植物、種子、細胞、または植物部位において、請求項１０に記載の操作されたタンパク質を異種発現させることを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記除草剤耐性が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、フルチアセットメチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に対するものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
除草剤耐性植物の生産方法であって、
ａ）植物細胞を請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換するステップと、
ｂ）前記組換えＤＮＡ分子を含む前記植物細胞から植物を再生させるステップと、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記植物またはその後代をＰＰＯ除草剤耐性により選択するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記再生された植物をそれ自体とまたは第２の植物と交配して、後代を生み出すステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１１に記載のトランスジェニック植物または種子を含む植物成長区域に有効量の少なくとも１種のＰＰＯ除草剤を適用することを含み、前記トランスジェニック植物または種子が、前記ＰＰＯ除草剤に対して耐性である、植物成長区域における雑草成長の制御方法または阻止方法。
【請求項２１】
前記ＰＰＯ除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、フルチアセットメチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の特定方法であって、前記方法が、
ａ）除草剤耐性ＰＰＯ酵素活性を欠いたＥ．ｃｏｌｉ株を、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む細菌発現ベクターで形質転換することと、
ｂ）前記形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを増殖させて、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を特定することと、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
除草剤耐性遺伝子のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を植物細胞において発現させることと、
ｂ）ＰＰＯ除草剤に対して耐性を示す植物細胞を特定することと、
を含む、前記方法。
【請求項２４】
ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤に対して耐性である植物の生産方法であって、
ａ）請求項１１に記載の植物を得ることと、
ｂ）前記植物を、前記少なくとも１種の他の除草剤に対する耐性を備える第２の植物と交配することと、
ｃ）前記交配から生じる、ＰＰＯ除草剤及び前記少なくとも１種の他の除草剤に対する耐性を備える後代植物を選択することと、
を含む、前記方法。
【請求項２５】
除草剤耐性雑草の発生の低減方法であって、
ａ）作物成長環境で請求項１１に記載の植物を栽培することと、
ｂ）ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤を前記作物成長環境に適用することと、を含み、前記作物植物が、前記ＰＰＯ除草剤及び前記少なくとも１種の他の除草剤に対して耐性である、前記方法。
【請求項２６】
前記ＰＰＯ除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、フルチアセットメチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１種の他の除草剤が、ＡＣＣａｓｅ阻害剤、ＡＬＳ阻害剤、ＥＰＳＰＳ阻害剤、合成オーキシン、光合成阻害剤、グルタミン合成阻害剤、ＨＰＰＤ阻害剤、ＰＰＯ阻害剤、及び長鎖脂肪酸阻害剤からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＣＣａｓｅ阻害剤が、アリールオキシフェノキシプロピオネートもしくはシクロヘキサンジオンであり、前記ＡＬＳ阻害剤が、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン（ｔｒｉａｚｏｌｏｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、もしくはトリアゾリノンであり、前記ＥＰＳＰＳ阻害剤が、グリホサートであり、前記合成オーキシンが、フェノキシ除草剤、安息香酸、カルボン酸、もしくはセミカルバゾンであり、前記光合成阻害剤が、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、もしくは尿素であり、前記グルタミン合成阻害剤が、グルホシネートであり、前記ＨＰＰＤ阻害剤が、イソオキサゾール、ピラゾロン、もしくはトリケトンであり、前記ＰＰＯ阻害剤が、ジフェニルエーテル、Ｎ−フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、もしくはピリミジンジオンであり、または前記長鎖脂肪酸阻害剤が、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、もしくはピラゾールである、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮出願第６２／５９９，３８６号の優先権の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、農業、植物バイオテクノロジー、及び分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを阻害する除草剤に対する耐性を提供する操作されたタンパク質をコードする、組換えＤＮＡ分子及びそれらの使用方法に関する。
【０００３】
配列表の組み込み
コンピュータが読み取り可能な形式の配列表が、電子提出により本願と共に提出され、参照によりその全体が本願に援用される。この配列表は、ＭＯＮＳ４２９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前のファイルに含まれ、このファイルはサイズが２９６キロバイトであり（オペレーティングシステムＭＳ  Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）、２０１８年１２月１３日に作成された。
【背景技術】
【０００４】
農業作物生産は、多くの場合、バイオテクノロジーの方法を用いて作り出されたトランスジェニック形質を利用する。導入遺伝子としても知られる異種遺伝子を植物に導入して、トランスジェニック形質を生み出すことができる。植物における導入遺伝子の発現は、除草剤耐性等の形質を植物に付与する。除草剤耐性であるトランスジェニック形質の例としては、グリホサート耐性、グルホシネート耐性、及びジカンバ耐性が挙げられる。一般的に使用される除草剤に対して抵抗性の雑草種の増加に伴い、新たな除草剤耐性形質が当該分野で必要とされている。特に対象となる除草剤には、ＰＰＯ除草剤と称される、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ、ＥＣ  １．３．３．４）を阻害する除草剤が含まれる。ＰＰＯ除草剤は、多種多様な除草剤抵抗性雑草の制御を提供し、故に、作付体系において、これらの除草剤に対する耐性を付与する形質は、１つまたは複数の他の除草剤耐性形質（複数可）と組み合わせて特に有用なものとなっている。本発明は、植物においてＰＰＯ除草剤耐性を提供するのに有用な、新規の操作された除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを提供する。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本発明は、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、組換えＤＮＡ分子を提供し、該タンパク質は、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、該タンパク質は、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、及び少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される。一部の実施形態では、該タンパク質は、該アミノ酸置換のうちの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個を含む。別の実施形態では、該タンパク質は、配列番号２４〜１２４及び２４９〜２６３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、該タンパク質は、ＨｅｍＧクラスプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ酵素を含む。さらなる実施形態では、少なくとも第１のアミノ酸置換は、そのようなＨｅｍＧクラスプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ酵素の長鎖インサートループに位置する。なおもさらなる実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ分子は、植物細胞のゲノムに含まれる。
【０００６】
ある特定の実施形態では、異種プロモーター、例えば、植物細胞において機能的なプロモーターが、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結されており、該タンパク質は、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される。結果として得られるそのようなＤＮＡ分子は、該タンパク質を細胞内で局在化させるように機能する輸送配列をさらに含んでもよい。
【０００７】
別の態様では、本発明は、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子等の、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ構築物を提供し、該タンパク質は、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される。別の実施形態では、操作されたタンパク質は、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子によってコードされる。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子等の、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位を提供し、該タンパク質は、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される。一実施形態では、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位は、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に対して耐性である。別の実施形態では、ＰＰＯ除草剤は、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、フルチアセットメチル、オキサジアルギル（ｏｘａｄｉａｒｇｙｌ）、オキサジアゾン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される。さらなる実施形態では、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位は、少なくとも第２の除草剤に対して耐性である。
【０００９】
別の態様では、本発明は、植物、種子、細胞、または植物部位へのＰＰＯ除草剤耐性の付与方法であって、本発明の操作されたタンパク質を該植物、種子、細胞、または植物部位において異種発現させることを含む、該方法を提供する。一部の実施形態では、除草剤耐性は、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、フルチアセットメチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に対するものである。
【００１０】
なおも別の態様では、本発明は、ａ）植物細胞を、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子等の、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子で形質転換するステップであって、該タンパク質が、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換が、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される、該ステップと、ｂ）該組換えＤＮＡ分子を含む該植物細胞から植物を再生させるステップと、を含む、除草剤耐性植物の生産方法を提供する。一実施形態では、該方法は、該植物またはその後代をＰＰＯ除草剤耐性により選択するステップをさらに含む。別の実施形態では、該方法は、再生された植物をそれ自体とまたは第２の植物と交配して、後代を生み出すステップをさらに含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物または種子等の、本明細書に提供されるようなトランスジェニック植物または種子を含む植物成長区域に、有効量の少なくとも１種のＰＰＯ除草剤を適用することを含む、植物成長区域における雑草成長の制御方法または阻止方法を提供し、該タンパク質は、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択され、該トランスジェニック植物または種子は、ＰＰＯ除草剤に対して耐性である。ある特定の実施形態では、ＰＰＯ除草剤は、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、フルチアセットメチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される。
【００１２】
なおも別の態様では、本発明は、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の特定方法を提供し、該方法は、ａ）除草剤耐性ＰＰＯ酵素活性を欠いたＥ．ｃｏｌｉ株を、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子等の、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子を含む細菌発現ベクターで形質転換することであって、該タンパク質が、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換が、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される、該形質転換することと、ｂ）該形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを増殖させて、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を特定することと、を含む。
【００１３】
なおもさらなる態様では、本発明は、ａ）植物細胞において、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子等の、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子を発現させることであって、該タンパク質が、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換が、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される、該発現させることと、ｂ）ＰＰＯ除草剤に対して耐性を示す植物細胞を特定することと、を含む、除草剤耐性遺伝子のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ａ）除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子等の、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物を得ることであって、該タンパク質が、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換が、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される、該得ることと、ｂ）該植物を、少なくとも１種の他の除草剤に対する耐性を備える第２の植物と交配することと、ｃ）該交配から生じる、ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤に対する耐性を備える後代植物を選択することと、を含む、ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤に対して耐性である植物の生産方法を提供する。
【００１５】
なおも別の態様では、本発明は、ａ）作物成長環境で、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子等の、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物を栽培することであって、該タンパク質が、配列番号１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ配列番号１の残基１２５〜１４６に対応する位置に少なくとも第１のアミノ酸置換を含み、該置換が、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎからなる群から選択される、該栽培することと、ｂ）ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤を作物成長環境に適用することと、を含み、該作物植物が、ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤に対して耐性である、除草剤耐性雑草の発生の低減方法を提供する。一実施形態では、ＰＰＯ除草剤は、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、フルチアセットメチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される。別の実施形態では、少なくとも１種の他の除草剤は、ＡＣＣａｓｅ阻害剤、ＡＬＳ阻害剤、ＥＰＳＰＳ阻害剤、合成オーキシン、光合成阻害剤、グルタミン合成阻害剤、ＨＰＰＤ阻害剤、ＰＰＯ阻害剤、及び長鎖脂肪酸阻害剤からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＡＣＣａｓｅ阻害剤は、アリールオキシフェノキシプロピオネートもしくはシクロヘキサンジオンであり、ＡＬＳ阻害剤は、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン（ｔｒｉａｚｏｌｏｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、もしくはトリアゾリノンであり、ＥＰＳＰＳ阻害剤は、グリホサートであり、合成オーキシンは、フェノキシ除草剤、安息香酸、カルボン酸、もしくはセミカルバゾンであり、光合成阻害剤は、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、もしくは尿素であり、グルタミン合成阻害剤は、グルホシネートであり、ＨＰＰＤ阻害剤は、イソオキサゾール、ピラゾロン、もしくはトリケトンであり、ＰＰＯ阻害剤は、ジフェニルエーテル、Ｎ−フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、もしくはピリミジンジオンであり、または長鎖脂肪酸阻害剤は、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、もしくはピラゾールである。
【００１６】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開の写しは、要請及び必要な料金の支払いに応じて特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】２３種の微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のサブセットの長鎖インサートループの配列アライメントを示し、このうち保存された長鎖インサートループが黒色で強調表示される。配列は、Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１）に対する全体的な配列同一性の大きい順に配置されている。ＨｅｍＧ００１及びＨｅｍＧ００３は、Ｈ＿Ｎ９０に対する全体的な配列同一性が７０％を上回るＨｅｍＧ  ＰＰＯタンパク質を表す。ボックスで囲まれていない次の１５個の配列は、Ｈ＿Ｎ９０に対する全体的な配列同一性が５０〜７０％であるＨｅｍＧ  ＰＰＯタンパク質を表す。最後の５つの配列のボックスは、Ｈ＿Ｎ９０に対する全体的な配列同一性が４０〜５０％であるＨｅｍＧ  ＰＰＯタンパク質を表す。
【図１Ｂ】２３種の微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のサブセットの長鎖インサートループの配列アライメントを示し、このうち保存された長鎖インサートループが黒色で強調表示される。配列は、Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１）に対する全体的な配列同一性の大きい順に配置されている。ＨｅｍＧ００１及びＨｅｍＧ００３は、Ｈ＿Ｎ９０に対する全体的な配列同一性が７０％を上回るＨｅｍＧ  ＰＰＯタンパク質を表す。ボックスで囲まれていない次の１５個の配列は、Ｈ＿Ｎ９０に対する全体的な配列同一性が５０〜７０％であるＨｅｍＧ  ＰＰＯタンパク質を表す。最後の５つの配列のボックスは、Ｈ＿Ｎ９０に対する全体的な配列同一性が４０〜５０％であるＨｅｍＧ  ＰＰＯタンパク質を表す。
【図２】全ての可能なｍＲＮＡのトリプレットコドン（ここで、ＤＮＡ分子におけるＴは、ＲＮＡ分子においてＵで置き換えられる）及び各コドンによってコードされるアミノ酸を示す、普遍的な遺伝暗号表を示す。
【図３】微生物ゲノムスクリーニングによるＨ＿Ｎ９０（配列番号１）の長鎖インサートループ内の各残基で見出される全ての変異の図表を示す。上部にわたる黒色のボックスは、天然Ｈ＿Ｎ９０配列を表す。Ｈ＿Ｎ９０配列の下のボックスは、２０個のアミノ酸の各々を列挙する。Ｈ＿Ｎ９０配列の上に列挙される数字は、相対的なアミノ酸位置を指定する。灰色で塗りつぶされた陰影は、配列同一性５０％以上の群において特定されるアミノ酸変異を表す。灰色の縦縞の陰影は、配列同一性４０％〜５０％の群において特定されるアミノ酸変異を表す。残りの白色の塗りつぶされていないボックスは、開始微生物データセットにおいて全体的な配列同一性４０％以上では観察されないアミノ酸変異を表す。
【図４】酵素機能アッセイから得られた結果の図表を示す。上部にわたる黒色のボックスは、天然Ｈ＿Ｎ９０配列（配列番号１）を表す。Ｈ＿Ｎ９０配列の下のボックスは、２０個のアミノ酸の各々を列挙する。Ｈ＿Ｎ９０配列の上に列挙される数字は、相対的なアミノ酸位置である。灰色の縦縞の陰影は、当該アミノ酸修飾により酵素が機能不全となったことを示す。黒文字を有する薄灰色の陰影は、当該アミノ酸修飾が酵素機能の障害を引き起こしたことを示す。白文字を有する濃い灰色の陰影は、当該アミノ酸変化が酵素を完全に機能的に維持したことを示す。黒色の陰影は、Ｈ＿Ｎ９０配列における天然アミノ酸を表す。残りの白色の塗りつぶされていないボックスは、このアッセイにおいて試験されていないアミノ酸変異を表す。
【図５】除草剤耐性アッセイから得られた結果の図表バージョンを示す。耐性は、Ｈ＿Ｎ９０耐性と比べて測定した。上部にわたる黒色のボックスは、天然Ｈ＿Ｎ９０配列（配列番号１）を表す。Ｈ＿Ｎ９０配列の下のボックスは、２０個のアミノ酸の各々を列挙する。Ｈ＿Ｎ９０配列の上に列挙される数字は、相対的なアミノ酸位置である。灰色の縦縞の陰影は、０〜２４の相対的耐性スコアを表し、これは当該アミノ酸修飾が除草剤耐性をほとんどから全く付与しなかったことを示す。灰色の横縞の陰影は、２５〜４９の相対的耐性スコアを表し、これは当該アミノ酸修飾が弱い除草剤耐性を付与したことを示す。黒文字を有する薄灰色で塗りつぶされた陰影は、５０〜７４の相対的耐性スコアを表し、これは当該アミノ酸修飾が中程度の除草剤耐性を付与したことを示す。白文字を有する濃い灰色で塗りつぶされた陰影は、７５〜１００の相対的耐性スコアを表し、これは当該アミノ酸修飾が良好な除草剤耐性を付与したことを示す。濃い灰色の陰影及び太い黒枠を有するボックスは、１００超の相対的耐性スコアを示すアミノ酸修飾を表し、これは当該アミノ酸修飾がＨ＿Ｎ９０の除草剤耐性よりも良好な除草剤耐性を付与したことを示す。黒色の陰影は、Ｈ＿Ｎ９０配列における天然アミノ酸を表す。残りの白色の塗りつぶされていないボックスは、このアッセイにおいて試験されていないアミノ酸変異を表す。
【００１８】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｈ＿Ｎ９０のアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号２〜配列番号１０は、保存された長鎖インサートループを有する微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号１１〜配列番号２３は、長鎖インサートループ内に変異を有する多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号２４〜配列番号１２４及び配列番号２４９〜配列番号２６３は、各々が長鎖インサートループに対する突然変異を組み込む、１１６種の組換えＨｅｍＧ  ＰＰＯバリアントのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号１２５は、配列番号１をコードするＤＮＡ配列である。
【００２３】
配列番号１２６〜配列番号１４７は、それぞれ配列番号２〜配列番号２３をコードするＤＮＡ配列である。
【００２４】
配列番号１４８〜配列番号２４８及び配列番号２６４〜配列番号２７８は、それぞれ配列番号２４〜配列番号１２４及び配列番号２４９〜配列番号２６３をコードするＤＮＡ配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下の説明及び定義は、本発明をよりよく定義し、本発明の実施にあたり当業者を導くために提供される。別途注記のない限り、用語は、関連技術分野における通常の知識を有する者により、従来の用法に従って理解されるべきである。
【００２６】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、クロロフィル及びヘムの両方の生合成経路において機能し、これらの生合成経路において、それはプロトポルフィリノーゲンＩＸをプロトポルフィリンＩＸに変換する。除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、１種または複数のＰＰＯ除草剤の適用に感受性でない細胞、植物、及び種子を生産するのに有用であり、また農業及び雑草制御の方法で有用である。本発明は、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである新規の操作されたタンパク質、ならびにこれらをコードする組換えＤＮＡ分子、これらを含む組成物、及びこれらの使用方法を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、細胞、植物、及び種子において発現させるための操作された除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする組換えＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ構築物を提供する。別の実施形態では、本発明は、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、操作されたタンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、タンパク質操作及びバイオインフォマティクスツールを用いて、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを得、それを改善するための方法及び組成物を提供する。本発明は、ＰＰＯ除草剤に対して耐性である細胞、植物、及び種子を生産するための方法及び組成物、ならびにそれらの細胞、植物、及び種子を用いた雑草制御方法をさらに提供する。
【００２７】
本発明は、新規の操作されたタンパク質及びそれらをコードする組換えＤＮＡ分子を提供する。本明細書で使用されるとき、「操作された」という用語は、自然界で通常見出されない、人間の介入によって作り出された非天然ＤＮＡ、タンパク質、細胞、または生物を指す。「操作されたタンパク質」、「操作された酵素」、または「操作されたＰＰＯ」とは、そのアミノ酸配列が、バイオテクノロジー、タンパク質設計、またはタンパク質操作、例えば、分子生物学、タンパク質生化学、細菌形質転換、植物形質転換、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発を用いた指向性進化、ゲノム編集、遺伝子編集、遺伝子クローニング、ＤＮＡライゲーション、ＤＮＡ合成、タンパク質合成、及びＤＮＡシャフリングの技法のうちの１つまたは複数を用いて、実験室で考案され、作り出された、タンパク質、酵素、またはＰＰＯを指す。例えば、操作されたタンパク質は、野生型タンパク質のコード配列と比べて１つまたは複数の欠失、挿入、または置換を有してもよく、各欠失、挿入、または置換は、１つまたは複数のアミノ酸からなってもよい。遺伝子操作を用いて、本明細書に記載されるような、除草剤耐性であり、かつ野生型ＰＰＯタンパク質と比べて少なくとも第１のアミノ酸置換を含む操作されたＰＰＯ等の、操作されたタンパク質をコードするＤＮＡ分子を作り出すことができる。
【００２８】
本明細書に提供される操作されたタンパク質の例は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎ（それらの全ての可能な組み合わせを含む）から選定される１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む、除草剤耐性ＰＰＯであり、ここで、アミノ酸置換（複数可）の位置は、配列番号１に記載されるアミノ酸位置に対するものである。具体的な実施形態では、本明細書に提供される操作されたタンパク質は、そのような置換の任意の組み合わせのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれよりも多くを含む。
【００２９】
一実施形態では、本発明によって提供される操作されたタンパク質は、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する。本明細書で使用されるとき、「除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ」とは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼが、１種または複数のＰＰＯ除草剤（複数可）の存在下で、そのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性の少なくとも一部を維持する能力を意味する。「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性」という用語は、プロトポルフィリノーゲンＩＸの６電子酸化（電子の除去）を触媒してプロトポルフィリンＩＸを形成させる、すなわち、プロトポルフィリノーゲンの脱水素化を触媒してプロトポルフィリンを形成させる能力を意味する。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素活性は、当該技術分野で既知の任意の手段によって、例えば、１種または複数のＰＰＯ除草剤（複数可）の存在下でのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの生成物の生産またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの基質の消費が、蛍光、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または質量分析（ＭＳ）を介して測定される、酵素アッセイによって、測定することができる。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素活性を測定するためのアッセイの別の例は、組換えプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを、さもなければＰＰＯ活性を欠いた細菌細胞において発現させ、組換えプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼがこのノックアウト表現型を補完する能力を測定する、本明細書に記載されるアッセイ等の細菌アッセイである。本明細書で使用されるとき、「ｈｅｍＧノックアウト株」とは、それがヘム不含増殖培地上で増殖することができないか、またはヘムの不在下でその増殖が、機能的ＨｅｍＧを含むその他の点では同質遺伝子型の株と比べて検出可能に損なわれるような程度にまで、ＨｅｍＧ活性を欠いた、Ｅ．ｃｏｌｉ等の生物または生物の細胞を意味する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｈｅｍＧノックアウト株は、当該技術分野の知識に照らして、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列（Ｅｃｏｇｅｎｅ受託番号ＥＧ１１４８５、Ｓａｓａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍＧ  ｇｅｎｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２”Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３９：１１５５−１１６１，１９９３）に照らして、調製されてもよい。
【００３０】
操作されたタンパク質は、とりわけ、改変されたＶｍａｘ、Ｋｍ、Ｋｉ、ＩＣ５０、基質特異性、阻害剤／除草剤特異性、基質選択性、パートナータンパク質または膜等の細胞内の他の構成成分と相互作用する能力、及びタンパク質安定性等の、修飾された特性（複数可）または有用なタンパク質特性の新規の組み合わせを有する新たなタンパク質を生産するように、野生型タンパク質配列を変化させるかまたは修飾することによって生産されてもよい。修飾は、タンパク質における特定のアミノ酸位置で行われてもよく、自然界において（すなわち、野生型タンパク質において）その同じ位置で見出される典型的なアミノ酸を代替のアミノ酸で置換することによって行われてもよい。アミノ酸修飾は、タンパク質配列における単一アミノ酸置換として、または、１つもしくは複数の他のアミノ酸置換（複数可）、欠失、もしくは付加等の１つもしくは複数の他の修飾と組み合わせて、行われてもよい。本発明の一実施形態では、操作されたタンパク質は、野生型タンパク質と比較して１つもしくは複数の除草剤に対する減少した感受性をもたらす特性、または操作されたタンパク質を発現するトランスジェニック植物に１つもしくは複数の除草剤に対する耐性を付与する能力をもたらす特性等の、改変されたタンパク質特性を有する。一実施形態では、したがって、本発明は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎ、ならびにそれらの全ての組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を有する、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するＰＰＯ酵素等の操作されたタンパク質、及びそれをコードする組換えＤＮＡ分子を提供し、ここで、アミノ酸置換（複数可）の位置は、配列番号１に記載されるアミノ酸位置に対するものである。具体的な実施形態では、本明細書に提供される操作されたタンパク質は、そのような置換の任意の組み合わせのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれよりも多くを含み、ここで、修飾は、配列番号１として提供されるアミノ酸配列における位置と機能において同等の位置に対応する位置で行われる。組換えまたは操作されたＨｅｍＧバリアントＰＰＯのアミノ酸配列が表１に提供される。
【表１−１】
2021506232.tif 000002
【表１−２】
2021506232.tif 000003
【００３１】
突然変異対象のＰＰＯ酵素のアミノ酸配列を、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するＰＰＯ酵素のアミノ酸配列とアライメントすることによって、同様の修飾を任意のＰＰＯ酵素の類似した位置において行うことができる。アライメントに使用することができる、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するＰＰＯ酵素をコードする配列の一例は、配列番号１である。図１Ａ及び１Ｂは、配列番号１のＰＰＯ酵素であるＨ＿Ｎ９０、例となる既知のＰＰＯ酵素（配列番号２〜１０）、及び多様なＰＰＯ酵素（配列番号１１〜２３）のアライメントを示す。図１Ａ及び１Ｂに示されるような配列同一性情報を用いて、例えば、配列番号２〜２３のタンパク質において、本明細書に記載されるアミノ酸修飾を行って、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するＰＰＯ酵素を生成することは、当業者の技能の範囲内に十分にある。微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯのアミノ酸配列が表２に提供される。
【表２】
2021506232.tif 000004
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「組換え」という用語は、遺伝子操作の結果であり、人間の介入によって作り出された非天然型ＤＮＡ、タンパク質、細胞、種子、または生物を指す。「組換えＤＮＡ分子」とは、互いに対して異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子等の、天然には存在せず、したがって人間の介入の結果であるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子の例は、異種プロモーターに作動可能に連結された除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする、本明細書に提供されるＤＮＡ分子である。「組換えタンパク質」とは、操作されたタンパク質等の、天然には存在せず、したがって人間の介入の結果であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。組換え細胞、種子、または生物は、トランスジェニックまたは異種ＤＮＡまたはタンパク質を含む細胞、種子、または生物、例えば、本発明のＤＮＡ構築物または操作されたタンパク質を含むトランスジェニック植物細胞、種子、または植物である。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「野生型」とは、天然型であることを意味する。「野生型ＤＮＡ分子」、「野生型タンパク質」とは、ＤＮＡ分子またはタンパク質の天然型バージョン、すなわち、自然界に既存のＤＮＡ分子またはタンパク質のバージョンである。ＤＮＡ分子またはタンパク質の野生型バージョンは、組換えまたは操作されたＤＮＡ分子またはタンパク質との比較に有用であり得る。本発明によって提供される操作されたタンパク質との比較に有用な野生型タンパク質の例は、配列番号１として提供されるＥ．ｃｌｏａｃａｅ（Ｈ＿Ｎ９０）由来のＰＰＯ酵素である。
【００３４】
「野生型植物」とは、天然型植物である。そのような野生型植物もまた、組換えまたは操作されたＤＮＡ分子またはタンパク質を含む植物との比較に有用であり得る。組換えまたは操作されたＤＮＡ分子またはタンパク質を含む植物との比較に有用な野生型植物の例は、除草剤耐性形質を付与するタンパク質等の操作されたＤＮＡ分子またはタンパク質を含む植物と同じ種類の植物であり得、したがって、除草剤耐性形質を含む植物とは遺伝的に明確に異なる。
【００３５】
ある特定の実施形態では、野生型植物もまた使用されるか、または「対照植物」と称されてもよい。本明細書で使用されるとき、「対照」とは、比較目的で設計された実験対照を意味する。例えば、トランスジェニック植物分析における対照植物は、実験植物（すなわち、試験対象の植物）と同じ種類の植物であるが、実験植物のトランスジェニックインサート、組換えＤＮＡ分子、またはＤＮＡ構築物を含有しない。トランスジェニック植物との比較に有用な対照植物の例としては、トウモロコシ植物については、非トランスジェニックＬＨ２４４トウモロコシ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１７３）、ダイズ植物との比較については、非トランスジェニックＡ３５５５ダイズ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０７）、ワタ植物との比較については、非トランスジェニックＣｏｋｅｒ  １３０（Ｐｌａｎｔ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（ＰＶＰ）番号８９００２５２）、セイヨウアブラナまたはＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ植物との比較については、非トランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ変種６５０３７稔性回復系統（Ｃａｎａｄａ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｅｒｓ’Ｒｉｇｈｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ０６−５５１７）、コムギ植物との比較については、非トランスジェニックコムギ変種Ｓａｍｓｏｎ  ｇｅｒｍｐｌａｓｍ（ＰＶＰ  １９９４）が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」という用語は、５’（上流）末端から３’（下流）末端へと読み取られるゲノム起源または合成起源の２本鎖ＤＮＡ分子（すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基またはポリヌクレオチド分子のポリマー）を指す。本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、連邦規則の合衆国法典§１．８２２の第３７編のそれに対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１及び３における表に記載される。
【００３７】
本開示は、Ｌ１２５Ｉ、Ｌ１２５Ｖ、Ｒ１２６Ａ、Ｙ１２７Ｗ、Ｐ１２８Ａ、Ｐ１２８Ｄ、Ｐ１２８Ｅ、Ｐ１２８Ｋ、Ｐ１２８Ｌ、Ｐ１２８Ｑ、Ｐ１２８Ｒ、Ｐ１２８Ｓ、Ｐ１２８Ｔ、Ｒ１２９Ａ、Ｒ１２９Ｅ、Ｒ１２９Ｇ、Ｒ１２９Ｈ、Ｒ１２９Ｉ、Ｒ１２９Ｋ、Ｒ１２９Ｌ、Ｒ１２９Ｎ、Ｒ１２９Ｑ、Ｒ１２９Ｓ、Ｙ１３０Ｌ、Ｒ１３１Ａ、Ｗ１３２Ａ、Ｗ１３２Ｆ、Ｗ１３２Ｉ、Ｗ１３２Ｋ、Ｗ１３２Ｌ、Ｗ１３２Ｐ、Ｗ１３２Ｒ、Ｗ１３２Ｓ、Ｗ１３２Ｔ、Ｗ１３２Ｖ、Ｗ１３２Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｄ１３４Ａ、Ｄ１３４Ｎ、Ｄ１３４Ｑ、Ｄ１３４Ｔ、Ｋ１３５Ａ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３５Ｒ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｔ、Ｋ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ａ、Ｍ１３７Ａ、Ｍ１３７Ｃ、Ｍ１３７Ｉ、Ｍ１３７Ｌ、Ｍ１３７Ｓ、Ｍ１３７Ｖ、Ｉ１３８Ｌ、Ｉ１３８Ｍ、Ｉ１３８Ｖ、Ｑ１３９Ａ、Ｑ１３９Ｃ、Ｑ１３９Ｅ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｈ、Ｑ１３９Ｋ、Ｑ１３９Ｌ、Ｑ１３９Ｍ、Ｑ１３９Ｒ、Ｑ１３９Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｌ１４０Ｃ、Ｌ１４０Ｆ、Ｌ１４０Ｇ、Ｌ１４０Ｈ、Ｌ１４０Ｉ、Ｌ１４０Ｍ、Ｌ１４０Ｎ、Ｌ１４０Ｑ、Ｌ１４０Ｓ、Ｌ１４０Ｔ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４０Ｙ、Ｉ１４１Ｖ、Ｍ１４２Ｌ、Ｍ１４２Ｓ、Ｍ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ａ、Ｍ１４４Ａ、Ｔ１４５Ａ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｋ、及びＧ１４６Ｎ、ならびにそれらの全ての組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を有する、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を提供し、ここで、アミノ酸置換（複数可）の位置は、配列番号１に記載されるアミノ酸位置に対するものである。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「タンパク質コードＤＮＡ分子」という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用されるとき、「タンパク質」という用語は、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸の鎖を指し、生物学的に機能的な方式で折り畳まれているかまたは配置されているポリペプチド鎖、及びそうでないポリペプチド鎖の両方が含まれる。本明細書で使用されるとき、「タンパク質コード配列」とは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。本明細書で使用されるとき、「配列」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の順次の配置を意味する。「ＤＮＡ配列」とは、一連のヌクレオチドまたは一連のヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を指してもよく、「タンパク質配列」とは、一連のアミノ酸または一連のアミノ酸を含むタンパク質を指してもよい。タンパク質コード配列の境界は通常、５’末端の翻訳開始コドン及び３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、ある分子を、その天然の状態で典型的にそれと関連している他の分子から少なくとも部分的に分離することを指す。一実施形態では、「単離された」という用語は、その天然の状態で通常は当該ＤＮＡ分子に隣接する核酸から分離されているＤＮＡ分子を指す。例えば、細菌に天然に存在するタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、そのタンパク質をコードするＤＮＡ分子が天然に見出される細菌のＤＮＡ内にそれがなかったとすれば、単離されたＤＮＡ分子であろう。故に、例えば組換えＤＮＡまたは植物形質転換技法の結果として、自然界では関連することがないであろう１つまたは複数の他のＤＮＡ分子（複数可）に融合されたまたは作動可能に連結されたＤＮＡ分子は、本明細書において単離されたと見なされる。そのような分子は、宿主細胞の染色体に組み込まれるか、他のＤＮＡ分子と共に核酸溶液中に存在する場合であっても、単離されたと見なされる。
【００４０】
当該技術分野で周知のいくつもの方法を用いて、本明細書に開示されるようにＤＮＡ分子、またはその断片を単離し、操作することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、特定の開始ＤＮＡ分子を増幅するか、または元の分子のバリアントを生産することができる。ＤＮＡ分子、またはその断片はまた、一般的に自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いることにより実施されているように、化学的手段により断片を直接合成することによって等、他の技法によって得ることもできる。
【００４１】
遺伝暗号の縮重の故に、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示される改変または操作されたタンパク質等のタンパク質をコードし得る。例えば、図２は、全ての可能なｍＲＮＡのトリプレットコドン（ここで、ＤＮＡ分子におけるＴは、ＲＮＡ分子においてＵで置き換えられる）及び各コドンによってコードされるアミノ酸を示す、普遍的な遺伝暗号表を提供する。本明細書に記載されるアミノ酸置換を有するＰＰＯ酵素をコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野で既知の方法及び図２に提供される情報を用いて、野生型ＰＰＯ酵素をコードするＤＮＡ配列に突然変異を導入することによって生産することができる。本明細書に記載されるものと同じまたは本質的に同じ改変または操作されたタンパク質をコードする代替的なＤＮＡ配列を作り出すことは、当業者の技能の範囲内に十分にある。これらのバリアントまたは代替的なＤＮＡ配列は、本明細書に記載される実施形態の範囲内にある。本明細書で使用されるとき、「本質的に同じ」配列への言及は、本明細書に記載される実施形態のＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質の機能的活性を著しく改変しないアミノ酸置換、欠失、付加、または挿入をコードする配列を指す。野生型または操作されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列のアレルバリアントもまた、本明細書に記載される実施形態の範囲内に包含される。具体的に例示されるかまたは野生型もしくは操作されたＰＰＯ酵素に天然に存在するもの以外のアミノ酸の置換もまた、当該置換を有するＰＰＯ酵素が本明細書に記載される実質的に同じ機能的活性を依然として保持する限り、本明細書に記載される実施形態の範囲内に企図される。
【００４２】
ＤＮＡ操作に有用な配列（制限酵素認識部位または組換えに基づくクローニング部位等）、植物において好ましい配列（植物コドン使用頻度またはＫｏｚａｋコンセンサス配列等）、またはＤＮＡ構築物の設計に有用な配列（スペーサーまたはリンカー配列等）を提供することが望ましい場合、本発明の組換えＤＮＡ分子は、当該技術分野で既知の方法によって、完全にまたは部分的にのいずれかで合成され、修飾されてもよい。本発明は、本明細書に提供される組換えＤＮＡ分子またはアミノ酸配列のうちのいずれかに対して少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、及び少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、組換えＤＮＡ分子及び操作されたタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、「配列同一性パーセント」または「配列同一性％」という用語は、試験（「対象」）配列（またはその相補鎖）と比較した参照（「問い合わせ」）配列（またはその相補鎖）の直鎖状ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列における、これら２つの配列を最適にアライメントしたときに（比較ウィンドウにわたって参照配列の総計２０パーセント未満となる適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、欠失、またはギャップを用いて）同一のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指す。比較ウィンドウをアライメントするための配列の最適なアライメントは、当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法等のツールによって、ならびに、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装、例えば、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の配列分析ソフトウェアパッケージの一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、ＭＥＧＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５）、ならびにＭＵＳＣＬＥ（第３．６版）（ＲＣ  Ｅｄｇａｒ，“ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（５）：１７９２−７（２００４））によって、例えばデフォルトパラメータを用いて、実施されてもよい。試験配列及び参照配列のアライメントしたセグメントについての「同一性割合（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）」は、アライメントされている参照配列のセグメントの部分、すなわち、全参照配列または参照配��のより小さい規定部分において、これら２つのアライメントした配列によって共有される同一の構成要素の数を構成要素の総数で除したものである。配列同一性パーセントは、同一性割合に１００を乗じたものとして表される。１つまたは複数の配列の比較は、全長配列もしくはその一部分に対するものであっても、またはより長い配列に対するものであってもよい。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡ構築物」とは、２つ以上の異種ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、導入遺伝子の発現に有用であり、ベクター及びプラスミドに含まれてもよい。ＤＮＡ構築物は、組換え細菌またはトランスジェニック植物及び細胞を生産するために形質転換（すなわち、宿主細胞への異種ＤＮＡの導入）用のベクターに入れて使用されてもよい（また、そのようなものとして、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部位のプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに含まれてもよい）。本明細書で使用されるとき、「ベクター」とは、細菌または植物形質転換に使用され得る任意の組換えＤＮＡ分子を意味する。本発明によって提供されるＤＮＡ分子は、例えば、植物において当該ＤＮＡ分子によってコードされる操作されたタンパク質の発現に影響を及ぼすように機能する異種遺伝子発現エレメントに作動可能に連結されたＤＮＡ分子を有する、ＤＮＡ構築物の一部として、ベクターに挿入することができる。ＤＮＡ構築物及びベクターの作製方法及び使用方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）ＩＳＢＮ：９７８−１−９３６１１３−４２−２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２０１２）を含めた手引き書及び実験室マニュアルに詳述される。ＤＮＡ構築物、またはＤＮＡ構築物を含むベクターのための構成要素には、以下のような、転写可能な核酸配列に作動可能に連結された１つまたは複数の遺伝子発現エレメントが含まれる：作動可能に連結されたＤＮＡを発現させるためのプロモーター、作動可能に連結されたタンパク質コードＤＮＡ分子、及び作動可能に連結された３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。本発明の実施において有用な遺伝子発現エレメントには、以下の種類のエレメントのうちの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない：プロモーター、５’ＵＴＲ、エンハンサー、リーダー、シス作用性エレメント、イントロン、輸送配列、３’ＵＴＲ、及び１つまたは複数の選択可能マーカー導入遺伝子。
【００４４】
「導入遺伝子」という用語は、植物形質転換法によって等、人間の介入の結果として生物のゲノムに人工的に組み込まれたＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用されるとき、「トランスジェニック」という用語は、導入遺伝子を含むことを意味し、例えば「トランスジェニック植物」とは、そのゲノム内に導入遺伝子を含む植物を指し、「トランスジェニック形質」とは、植物ゲノムに組み込まれた導入遺伝子の存在によって伝えられるかまたは付与される特性または表現型を指す。そのようなゲノム改変の結果として、トランスジェニック植物は、関連する野生型植物とは明確に異なるものであり、トランスジェニック形質は、野生型植物において天然には見出されない形質である。本発明のトランスジェニック植物は、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子及び操作されたタンパク質を含む。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「異種」という用語は、自然界では通常関連していない、例えば、異なる源に由来するか、またはいずれの他の様態でも自然界で通常一緒に見出されない、２つ以上のものの間の関係を指す。例えば、ＤＮＡ分子またはタンパク質は、別のＤＮＡ分子、タンパク質、細胞、植物、種子、または生物に対して、自然界では通常一緒にまたは同じ関連で見出されない場合、異種であり得る。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ分子は、第２のＤＮＡ分子に対して、これら２つのＤＮＡ分子が同じ関連で自然界では通常一緒に見出されない場合、異種である。例えば、タンパク質コード組換えＤＮＡ分子は、作動可能に連結されたプロモーターに対して、そのような組み合わせが自然界では通常見出されない場合、異種である。同様に、タンパク質は、輸送ペプチド等の作動可能に連結された第２のタンパク質に対して、そのような組み合わせが自然界では通常見出されない場合、異種である。別の実施形態では、ＰＰＯ酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、植物細胞において機能的である作動可能に連結されたプロモーターに対して、そのような組み合わせが自然界では通常見出されない場合、異種である。組換えＤＮＡ分子はまた、それが挿入される細胞、種子、または生物に対して、その細胞、種子、または生物においてそれが天然には存在しないであろう場合、異種であり得る。
【００４６】
「異種タンパク質」とは、それが天然には存在しない植物、種子、細胞、組織、もしくは生物に存在するか、またはそれが天然には連結されないタンパク質に作動可能に連結されている、タンパク質である。異種タンパク質の例は、任意の植物、種子、細胞、組織、または生物において発現させられる、本明細書に記載される少なくとも第１のアミノ酸置換を含む操作されたＰＰＯ酵素である。別の例は、遺伝子操作の技法を用いて、それが天然には連結されない輸送ペプチドもしくは除草剤耐性タンパク質等の第２のタンパク質に作動可能に連結されたタンパク質、またはそれが天然には存在しない植物細胞に導入されたタンパク質である。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結された」とは、一方が他方の機能に影響を及ぼし得るような様態で連結された２つ以上のＤＮＡ分子または２つ以上のタンパク質を意味する。作動可能に連結されたＤＮＡ分子または作動可能に連結されたタンパク質は、単一の連続した分子の一部であってもよく、隣接している場合も、していない場合もある。例えば、プロモーターは、ＤＮＡ構築物においてタンパク質コードＤＮＡ分子に対して、プロモーターが導入遺伝子の発現に影響を及ぼし得るようにこれら２つのＤＮＡ分子が配置されている場合、作動可能に連結されている。
【００４８】
本発明のＤＮＡ構築物は、本発明によって提供されるタンパク質コードＤＮＡ分子に作動可能に連結されたプロモーターを含んでもよく、そうすることでプロモーターが操作されたタンパク質の発現を駆動する。本発明の実施において有用なプロモーターには、細菌または植物プロモーター等の、作動可能に連結されたＤＮＡ分子を発現させるために細胞において機能するプロモーターが含まれる。植物プロモーターは多様であり、当該技術分野で周知であり、例えば、誘導性、ウイルス、合成、構成的、時間的調節型（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）、空間的調節型（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）、または空間時間的調節型（ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）のプロモーターが含まれる。
【００４９】
本発明の一実施形態では、本明細書に提供されるＤＮＡ構築物は、ＰＰＯ酵素をコードする異種ＤＮＡ配列に作動可能に連結された輸送配列をコードするＤＮＡ配列を含み、そうすることで輸送配列がタンパク質分子の細胞内局在化を容易にする。輸送配列は、当該技術分野でシグナル配列、標的ペプチド、標的配列、局在化配列、及び輸送ペプチドとして知られている。輸送配列の例は、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）、ミトコンドリア輸送配列（ＭＴＳ）、または葉緑体・ミトコンドリア二重輸送ペプチドである。タンパク質の細胞内局在化を容易にすることによって、輸送配列は、組換えタンパク質の蓄積を増加させるか、タンパク質をタンパク質分解から保護するか、または除草剤耐性のレベルを向上させ得、それによって、除草剤の適用後の細胞、種子、または生物の損傷のレベルを低減し得る。本発明に関連して使用され得るＣＴＰ及び他の標的分子は、当該技術分野で周知である。輸送配列をコードするＤＮＡ配列が、本明細書に提供されるようなＰＰＯ酵素をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されてもよい。そのような作動可能な連結は、ＰＰＯ配列の５’末端における開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）の除去を伴い得るが、それを行うことは必要ではなく、輸送配列は、開始メチオニンコドンの除去の有無にかかわらずタンパク質分子の細胞内局在化を容易にしよう。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「導入遺伝子発現」、「導入遺伝子を発現させること」、「タンパク質発現」、及び「タンパク質を発現させること」とは、ＤＮＡ分子をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写し、ｍＲＮＡをポリペプチド鎖に翻訳し、このポリペプチド鎖が最終的にタンパク質へと折り畳まれるプロセスを通した、タンパク質の生産を意味する。タンパク質コードＤＮＡ分子が、ＤＮＡ構築物において、組換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞において当該タンパク質を発現させるのに使用するための異種プロモーターに作動可能に連結されてもよい。
【００５１】
一態様では、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子または操作されたタンパク質を含む細胞、組織、植物、及び種子を提供する。組換えＤＮＡ分子または操作されたタンパク質を含むこれらの細胞、組織、植物、及び種子は、１種または複数のＰＰＯ除草剤（複数可）に対する耐性を呈する。
【００５２】
そのような細胞、組織、植物、及び種子の１つの生産方法は、植物形質転換によるものである。本発明と共に使用するのに好適な宿主植物細胞の形質転換のための方法には、ＤＮＡを細胞に導入することができる（例えば、組換えＤＮＡ構築物が植物染色体に安定に組み込まれる）いずれの方法も含まれ、それらは当該技術分野で周知である。２つの有効かつ広く利用されている細胞形質転換のための方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換及び微粒子銃媒介形質転換である。微粒子銃法は、例えば、米国特許第ＵＳ５，５５０，３１８号、同第ＵＳ５，５３８，８８０号、同第ＵＳ６，１６０，２０８号、及び同第ＵＳ６，３９９，８６１号に例示説明される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法は、例えば、米国特許第ＵＳ５，５９１，６１６号に記載され、同特許は参照によりその全体が本明細書に援用される。本発明の組換えＤＮＡ分子または操作されたタンパク質を有する細胞が、そのような細胞を植物へと再生させる前または再生させた後に、例えばそのコードされた酵素活性によって、組換えＤＮＡ分子または操作されたタンパク質の存在により選択され得る。
【００５３】
本発明の細胞、植物、及び種子の別の生産方法は、部位特異的組み込みまたはゲノム編集を用いたゲノム修飾によるものである。ゲノム編集法の使用を通した植物ゲノムの標的修飾を用いて、植物ゲノムＤＮＡの修飾を通して改善された植物系統を作り出すことができる。本明細書で使用される「部位特異的組み込み」とは、目的とする１つまたは複数の核酸の、植物ゲノムへの標的化された挿入を可能にするゲノム編集法を指す。野生型ＤＮＡ配列もしくは既存のトランスジェニック配列を改変するか、またはＤＮＡを既定の染色体部位で植物ゲノムに挿入するのに好適な方法には、当該技術分野で既知のいずれの方法も含まれる。例となる方法には、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、操作もしくは天然メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸ系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ系）等の配列特異的ヌクレアーゼの使用が含まれる。いくつかの実施形態は、Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １７０（４）：１９１７−１９２８（２０１６）によって記載されるような、１本鎖オリゴヌクレオチドを用いて植物ゲノムにおいて精確な塩基対修飾を導入することによる、ゲノム編集の方法に関する。核酸配列を修飾するか、欠失させるか、またはゲノムＤＮＡに挿入するためのゲノム編集の方法は、当該技術分野で既知である。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の操作されたＰＰＯコード配列等の操作されたタンパク質をコードする配列を有する植物ゲノム、またはそのような操作されたタンパク質を含む発現カセット内での、ＰＰＯコード配列または別の現存のトランスジェニックインサート等の現存のコード配列の修飾または置き換えを提供する。いくつかの実施形態は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、操作もしくは天然メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸ系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ系）等の、既知のゲノム編集法の使用に関する。
【００５５】
したがって、いくつかの実施形態は、部位特異的ヌクレアーゼ及び任意選択でゲノム修飾を行うための任意の関連するタンパク質（複数可）をコードする、発現カセット（複数可）を含む、組換えＤＮＡ構築物に関してもよい。これらのヌクレアーゼ発現カセット（複数可）は、テンプレート化された編集のためのドナーテンプレートもしくは本明細書に記載されるようなＰＰＯタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットと同じ分子もしくはベクター内に（シスで）、または別個の分子もしくはベクター（トランスで）上に、存在してもよい。所望のゲノム部位または遺伝子座においてゲノムＤＮＡを切断して２本鎖切断（ＤＳＢ）または切れ目を生じさせる、異なる配列特異的ヌクレアーゼ（またはタンパク質の複合体もしくはガイドＲＮＡまたは両方）を伴う、部位特異的組み込みのためのいくつかの方法が、当該技術分野で既知である。当該技術分野で理解されるように、ヌクレアーゼ酵素によって導入されたＤＳＢまたは切れ目を修復するプロセス中に、ドナーテンプレートＤＮＡ、導入遺伝子、または発現カセットは、ＤＳＢまたは切れ目の部位でゲノムに組み込まれるようになり得る。組み込み対象のＤＮＡにおける相同アーム（複数可）の存在は、修復プロセス中の、相同組換えによる植物ゲノム中への挿入配列の採用及び標的化を促進し得るが、挿入事象は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通して起こってもよい。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「２本鎖切断誘導剤」という用語は、ＤＮＡ分子において２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することができる任意の薬剤を指す。一部の実施形態では、２本鎖切断誘導剤は、部位特異的ゲノム修飾酵素である。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「部位特異的ゲノム修飾酵素」という用語は、配列特異的様態でヌクレオチド配列を修飾することができる任意の酵素を指す。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、１本鎖切断を誘導することによってゲノムを修飾する。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、２本鎖切断を誘導することによってゲノムを修飾する。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、シチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、アデニンデアミナーゼを含む。本開示では、部位特異的ゲノム修飾酵素には、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、デアミナーゼ、ヘリカーゼ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、配列特異的ヌクレアーゼである。
【００５８】
一態様では、エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノート（アルゴノートタンパク質の非限定的な例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルゴノート（ＴｔＡｇｏ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓアルゴノート（ＰｆＡｇｏ）、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）が挙げられる）、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼの非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名、Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、そのホモログ、またはその修飾バージョンが挙げられる）から選択される。
【００５９】
一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、リコンビナーゼである。リコンビナーゼの非限定的な例としては、本明細書に提供されるＤＮＡ認識モチーフに結合させたチロシンリコンビナーゼが挙げられ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、及びＴｎｐ１リコンビナーゼからなる群から選択される。ある態様では、本明細書に提供されるＣｒｅリコンビナーゼまたはＧｉｎリコンビナーゼは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはＣａｓ９ヌクレアーゼに繋がれる。別の態様では、本明細書に提供されるＤＮＡ認識モチーフに結合させたセリンリコンビナーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、及びＴＰ−９０１インテグラーゼからなる群から選択される。別の態様では、本明細書に提供されるＤＮＡ結合ドメインに結合させたＤＮＡトランスポザーゼは、ＴＡＬＥ−ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴＡＬＥ−Ｍｕｔａｔｏｒからなる群から選択される。
【００６０】
本明細書に提供される目的とするＤＮＡのうちのいずれも、目的とするＤＮＡ及び提供される部位特異的ゲノム修飾酵素を導入することによって、染色体配列の標的部位に組み込むことができる。本明細書に提供されるいずれの方法も、本明細書に提供される任意の部位特異的ゲノム修飾酵素を利用することができる。
【００６１】
一態様では、本発明は、ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性である細胞、植物、及び種子を提供する。そのような細胞、植物、及び種子は、雑草制御及び作物生産等の農業の方法において有用である。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「除草剤」とは、１つまたは複数の植物の成長を制御するか、阻止するか、または妨害するために使用される任意の分子である。例となる除草剤には、とりわけ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤（例えば、アリールオキシフェノキシプロピオネート及びシクロヘキサンジオン）；アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤（例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、及びトリアゾリノン）；５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤（例えば、グリホサート）、合成オーキシン（例えば、フェノキシ、安息香酸、カルボン酸、セミカルバゾン）、光合成（光化学系ＩＩ）阻害剤（例えば、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、及び尿素）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤（例えば、グルホシネート及びビアラホス）、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤（例えば、イソオキサゾール、ピラゾロン、及びトリケトン）、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害剤（例えば、ジフェニルエーテル、Ｎ−フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、及びピリミジンジオン）、極長鎖脂肪酸阻害剤（例えば、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、及びピラゾール）、セルロース生合成阻害剤（例えば、インダジフラム）、光化学系Ｉ阻害剤（例えば、パラコート）、微小管集合阻害剤（例えば、ペンディメタリン）、及びフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）阻害剤（例えば、ノルフルラゾン）が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「ＰＰＯ除草剤」とは、プロトポルフィリノーゲンＩＸの脱水素化を触媒して、ヘム及びクロロフィルの前駆体であるプロトポルフィリンＩＸを形成させるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）の酵素活性を標的とし、それを阻害する化学物質である。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの阻害は、活性酸素種の形成を引き起こして、細胞膜の破壊、及び最終的には影響を受けやすい細胞の死滅をもたらす。ＰＰＯ除草剤は当該技術分野で周知であり、市販されている。ＰＰＯ除草剤の例としては、ジフェニルエーテル（アシフルオルフェン、その塩及びエステル、アクロニフェン、ビフェノックス、その塩及びエステル、エトキシフェン、その塩及びエステル、フルオロニトロフェン、フリルオキシフェン、ハロサフェン、クロメトキシフェン、フルオログリコフェン、その塩及びエステル、ラクトフェン、その塩及びエステル、オキシフルオルフェン、ならびにホメサフェン、その塩及びエステル等）、チアジアゾール（フルチアセットメチル及びチジアジミン等）、ピリミジンジオンまたはフェニルウラシル（ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル、エチル［３−２−クロロ−４−フルオロ−５−（１−メチル−６−トリフルオロメチル−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−３−イル）フェノキシ］−２−ピリジルオキシ］アセテート（ＣＡＳ登録番号３５３２９２−３１−６及び本明細書でＳ−３１００と称される）、フルプロパシル、サフルフェナシル、及びチアフェナシル等）、フェニルピラゾール（フルアゾラート、ピラフルフェン、及びピラフルフェンエチル等）、オキサジアゾール（オキサジアルギル及びオキサジアゾン等）、トリアゾリノン（アザフェニジン、ベンカルバゾン、カルフェントラゾン、その塩及びエステル、ならびにスルフェントラゾン等）、オキサゾリジンジオン（ペントキサゾン等）、Ｎ−フェニルフタルイミド（シニドン−エチル、フルミクロラック、フルミクロラック−ペンチル、及びフルミオキサジン等）、ベンゾオキサジノン誘導体（１，５−ジメチル−６−チオキソ−３−（２，２，７−トリフルオロ−３，４−ジヒドロ−３−オキソ−４−プロパ−２−イニル−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−６−イル）−１，３，５−トリアジナン−２，４−ジオン等）、フルフェンピル及びフルフェンピル−エチル、ピラクロニル、ならびにプロフルアゾールが挙げられるが、これらに限定されない。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及び本発明によって提供される細胞、種子、植物、及び植物部位は、１種または複数のＰＰＯ除草剤（複数可）に対する除草剤耐性を呈する。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）」または「除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」とは、１種または複数の除草剤（複数可）の存在または適用によって全くまたは部分的に影響を受けない、例えば、適用されたときに除草剤の毒性作用に抵抗する能力を意味する。細胞または生物は、それが１種または複数の除草剤（複数可）の存在下で少なくとも何らかの正常な成長または表現型を維持することが可能である場合、「除草剤耐性」である。形質は、その存在が、細胞、植物、または種子に、野生型または対照細胞、植物、または種子と比較して、除草剤に対する改善された耐性を付与することができる場合、除草剤耐性形質である。除草剤耐性形質を含む作物は、成長し続けることができ、除草剤の存在によって受ける影響が最小限である。標的酵素は、それが除草剤の存在下で野生型または対照酵素と比べて改善された酵素活性を呈する場合、「除草剤耐性」である。除草剤耐性は、特定の除草剤に対する完全または部分的な非感受性であり得、特定の除草剤に対する耐性または非感受性パーセント（％）として表され得る。
【００６５】
本発明の除草剤耐性形質を用いて生産され得る、企図される植物には、例えば、とりわけ、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ属）、及びＢｒａｓｓｉｃａ植物等の作物植物を含めた、任意の植物が含まれ得る。
【００６６】
除草剤は、雑草を制御するための方法として、本発明によって提供される植物及び種子を含む植物成長区域に適用され得る。本発明によって提供される植物及び種子は、除草剤耐性形質を含み、したがって、１種または複数のＰＰＯ除草剤の適用に対して耐性である。除草剤の適用は、推奨される商業的率（ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｒａｔｅ）（１Ｘ）またはその任意の分数もしくは倍数、例えば、推奨される商業的率の２倍（２Ｘ）であってもよい。除草剤の率は、除草剤及び製剤に応じて、１エーカー当たりのポンド酸当量（ｌｂ  ａｅ／エーカー）もしくは１ヘクタール当たりのグラム酸当量（ｇ  ａｅ／ｈａ）として、または１エーカー当たりのポンド有効成分（ｌｂ  ａｉ／エーカー）もしくは１ヘクタール当たりのグラム有効成分（ｇ  ａｉ／ｈａ）として表され得る。除草剤の適用は、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤を含む。植物成長区域は、除草剤の適用時に雑草植物を含む場合も、含まない場合もある。雑草を制御するためにある区域において使用するためのＰＰＯ除草剤（複数可）の除草剤的有効用量は、成長期にわたりラベル率（複数可）の約０．１Ｘ〜約３０Ｘの範囲からなってもよい。いくつかの例となるＰＰＯ除草剤についての１Ｘラベル率が表３に提供される。１エーカーは２．４７１０５ヘクタールに相当し、１ポンドは４５３．５９２グラムに相当する。除草剤率は、英国式とメートル法との間で以下のように変換することができる：（ｌｂ  ａｉ／ａｃ）に１．１２を乗じる＝（ｋｇ  ａｉ／ｈａ）及び（ｋｇ  ａｉ／ｈａ）に０．８９を乗じる＝（ｌｂ  ａｉ／ａｃ）。
【表３】
2021506232.tif 000005
【００６７】
除草剤の適用は、１種のＰＰＯ除草剤、２種のＰＰＯ除草剤、もしくはいくつかのＰＰＯ除草剤の組み合わせまたは任意の他の適合性除草剤と順次であっても、またはそれらとタンク混合されてもよい。１種の除草剤または２種以上の除草剤（組み合わせてまたは単独で）の複数回の適用、例えば、２回適用（植え付け前の適用及び発芽後の適用または発芽前の適用及び発芽後の適用等）または３回適用（植え付け前の適用、発芽前の適用、及び発芽後の適用または発芽前の適用及び発芽後の２回適用等）が、多種多様な双子葉雑草、単子葉雑草、または両方の制御のために、本発明のトランスジェニック植物を含む区域に成長期にわたり使用されてもよい。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「雑草」とは、任意の望まれない植物である。植物は、農業または園芸目的で全般的に望ましくないと見なされ得るか（例えば、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ種）、または特定の状況下で望ましくないと見なされ得る（例えば、異なる種の畑における１つの種の作物植物、別名、自生植物）。
【００６９】
本発明のトランスジェニック植物、後代、種子、植物細胞、及び植物部位はまた、１つまたは複数の追加の形質を含有してもよい。追加の形質は、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を含有する植物を、１つまたは複数の追加の形質（複数可）を含有する別の植物と交配することによって導入されてもよい。本明細書で使用されるとき、「交配すること」とは、後代植物を生み出すために２つの個々の植物を繁殖させることを意味する。こうして２つの植物を交配して、各親由来の望ましい形質を含有する後代を生み出してもよい。本明細書で使用される「後代」とは、親植物の任意の世代の子孫を意味し、トランスジェニック後代は、本発明によって提供される、少なくとも１つの親植物から受け継がれるＤＮＡ構築物を含む。
【００７０】
追加の形質（複数可）はまた、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物と共に、その追加のトランスジェニック形質（複数可）のためのＤＮＡ構築物で同時形質転換することによって（例えば、全てのＤＮＡ構築物が、植物形質転換に使用される同じベクターの一部として存在する状態で）、または追加の形質（複数可）を、本発明によって提供されるＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物に挿入するかもしくはその逆を行うことによって（例えば、トランスジェニック植物または植物細胞に対して植物形質転換法またはゲノム編集法のうちのいずれかを用いることによって）、導入されてもよい。そのような追加の形質には、増加した昆虫抵抗性、増加した水使用効率、増加した収率性能、増加した乾燥抵抗性、増加した種子品質、改善された栄養品質、交雑種子生産、及び除草剤耐性が含まれるが、これらに限定されず、ここにおける形質は、野生型植物と比べて測定される。例となる追加の除草剤耐性形質には、とりわけ、ＡＣＣａｓｅ阻害剤（例えばアリールオキシフェノキシプロピオネート及びシクロヘキサンジオン）、ＡＬＳ阻害剤（例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、及びトリアゾリノン）、ＥＰＳＰＳ阻害剤（例えば、グリホサート）、合成オーキシン（例えば、フェノキシ、安息香酸、カルボン酸、セミカルバゾン）、光合成阻害剤（例えば、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、及び尿素）、グルタミン合成阻害剤（例えば、グルホシネート）、ＨＰＰＤ阻害剤（例えば、イソオキサゾール、ピラゾロン、及びトリケトン）、ＰＰＯ阻害剤（例えば、ジフェニルエーテル、Ｎ−フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、及びピリミジンジオン）、及び長鎖脂肪酸阻害剤（例えば、クロロアセトアミド（ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｍｉｎｄｅｓ）、オキシアセトアミド、及びピラゾール）等の１種または複数の除草剤に対するトランスジェニックまたは非トランスジェニック耐性が含まれ得る。追加の除草剤耐性形質を生み出すのに有用な除草剤耐性タンパク質の例は、当該技術分野で周知であり、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（例えば、ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ、２ｍＥＰＳＰＳ）、グリホサートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）、除草剤耐性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）／アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、除草剤耐性４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、除草剤耐性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸ジオキシゲナーゼ（ＴｆｄＡ）、Ｒ−２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸ジオキシゲナーゼ（ＲｄｐＡ）、Ｓ−２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸ジオキシゲナーゼ（ＳｄｐＡ）、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）、及びチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例となる昆虫抵抗性形質には、とりわけ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｃｏ���ｅｏｐｔｅｒａ目、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ目、Ｄｉｐｔｅｒａ目、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目、及びＯｒｔｈｏｐｔｅｒａ目のうちの１つまたは複数内の１つまたは複数の昆虫メンバーに対する抵抗性が含まれ得る。そのような追加の形質は当業者に周知であり、例えば、そのようなトランスジェニック形質の一覧が、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）のＡｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＰＨＩＳ）によって提供される。
【００７１】
ＰＰＯ除草剤に対して耐性であるトランスジェニック植物及び後代は、当該技術分野で既知の任意の繁殖方法により使用されてもよい。２つ以上の形質を含む植物系統において、それらの形質は独立して分離しているか、連結されているか、または３つ以上のトランスジェニック形質を含む植物系統においては両方の組み合わせであってもよい。親植物への戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配もまた企図され、栄養繁殖も同様である。異なる形質及び作物に一般的に使用される繁殖方法の説明は、当業者に周知である。特定の植物または種子における導入遺伝子（複数可）の存在を確認するために、様々なアッセイが行われてもよい。そのようなアッセイには、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＰＣＲ、及びＤＮＡ配列決定等の分子生物学アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によるまたは酵素機能による、タンパク質生成物の存在の検出等の生化学的アッセイ、葉または根のアッセイ等の植物部位アッセイ、ならびにまた、植物全体の表現型に分析によるものが含まれる。
【００７２】
植物遺伝子型へのトランスジェニック形質の遺伝子移入は、戻し交配変換プロセスの結果として達成される。トランスジェニック形質が遺伝子移入された植物遺伝子型は、戻し交配変換遺伝子型、系統、近交系、または交雑系と称され得る。同様に、所望のトランスジェニック形質を欠いた植物遺伝子型は、未変換遺伝子型、系統、近交系、または交雑系と称され得る。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「〜を含むこと」という用語は、「〜を含むが、これらに限定されないこと」を意味する。
【００７４】
本発明を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を逸脱することなく、修正形態、変形形態、及び均等な実施形態が可能であることが明らかとなろう。さらに、本開示における実施例は非限定的な例として提供されることが理解されるべきである。
【実施例】
【００７５】
実施例１：微生物ＨｅｍＧタンパク質の長鎖ループ内での配列多様性
ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の多様なセットを、このタンパク質の長鎖インサートループ内での多様性について調査した。長鎖インサートループは、微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の特性を規定しており、主要な保存残基と共にしておよそ２５残基長である（Ｂｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）４８：６７０５−６７１１）。
【００７６】
ゲノム分析を、種々の微生物由来の１，０１３個のＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列の開始セットを用いて実施した。このタンパク質の全体的な配列多様性及び長鎖インサートループ内での多様性の両方を捕捉するようにアルゴリズムを設計した。次いで、これらの配列を、開始セット内でのそれらの全体的な配列類似性に基づいて群に分類した。
【００７７】
第１の群を作成するために、開始セットからの、除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するＨｅｍＧ  ＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１）に対する配列同一性が７０％以上の全ての配列を特定した。次いで、１回目の分析において特定された任意の配列に対して７０％以上の配列同一性を有する配列を特定するために、分析を繰り返した。最後に、２回目の分析において特定された任意の配列に対して７０％以上の配列同一性を有する配列を特定するために、検索を３回目に繰り返した。３回の分析の結果を一緒にプールして、総計２７３個のＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列に上る、７０％以上の配列同一性分析の３回の反復からの配列を表す第１の群を作成した。
【００７８】
開始セットからの残りの群分けされていない配列に焦点を合わせることにより、第２の群を作成した。ＨｅｍＧ  ＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ９０に対する配列同一性が５０％〜７０％である全ての配列を特定した。次いで、１回目の分析において特定された任意の配列に対して７０％以上の配列同一性を有する配列を特定するために、分析を繰り返した。最後に、２回目の分析において特定された任意の配列に対して７０％以上の配列同一性を有する配列を特定するために、検索を３回目に繰り返した。３回の分析の結果を一緒にプールして、総計２７８個のＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列に上る、３回の全ての反復分析からの配列を表す第２の群を作成した。
【００７９】
開始セットからのなおも残りの群分けされていない配列に焦点を合わせることにより、第３の群を作成した。ＨｅｍＧ  ＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ９０に対する配列同一性が４０％〜５０％である全ての配列を特定した。次いで、１回目の分析において特定された任意の配列に対して７０％以上の配列同一性を有する配列を特定するために、分析を繰り返した。２回目の分析において特定された任意の配列に対して７０％以上の配列同一性を有する配列を特定するために、３回目の検索を行ったが、この最後の反復分析は、開始セットからのいずれの追加の配列も捕捉しなかった。２回の分析の結果を一緒にプールして、総計６６個のＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列に上る、両反復分析からの配列を表す第３の群を作成した。
【００８０】
次いで、これら３つの配列の群を、長鎖インサートループ内の２５個のアミノ酸の各々で見出される変異の分析に使用した。各ＰＰＯからの長鎖インサートループ配列を特定し、まとめた。驚くべきことに、このドメイン内の配列変異は、第１及び第２の群について、組み合わせたときにこれらの２つの群の配列が最大５０％の全体的な配列変異を有し、５５１個の多様な配列を表したにもかかわらず、同様であることが見出された。図３は、３つの群からの６１７個の配列の間の、長鎖インサートループ内で見出された変異の概要を提供する。長鎖インサートループの２５個のアミノ酸位置の間で、６１７個のＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列から２１１個の異なるアミノ酸が特定された。図１Ａ及び図１Ｂは、２３種の微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列のサブセットの長鎖インサートループ（黒色で強調表示される）の配列アライメントを示す。
【００８１】
長鎖インサートループ内で見出された変異を代表するように、１７種のＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列からなる群を選択した。ペアワイズ配列アライメントを用いて比較したときに、これら１７種の多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のタンパク質配列は、配列の全長にわたっておよそ１５％〜９８％の同一性の範囲の同一性パーセントを有する。これらの１７種の多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素を、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性及び除草剤耐性に関して試験した。
【００８２】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ細菌スクリーニング系を用いて、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に関してタンパク質を試験し、こうしてそれらが機能的ＰＰＯ酵素であることを確認した。このスクリーニング系は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素（本明細書でＨ＿Ｎ１０と称され、配列番号２に対応する）に対する遺伝子ノックアウトを含有するＥ．ｃｏｌｉ株における、機能的レスキューアッセイを使用した。ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株を、それぞれＰＰＯ酵素のうちの１つに対する発現カセットを含有する細菌発現ベクターで形質転換し、ＬＢ培地上で培養した。ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株は、伝統的な細菌培地（例えば、ＬＢ培地）上では最小限の増殖を示したが、細菌培地に遊離ヘムを補充する場合、または機能的プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを細胞において発現させた場合、正常な増殖を回復可能であった。比較用の以下の２つの対照を使用した：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び非形質転換細胞。ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの２種（ＨｅｍＧ０１４及びＨｅｍＧ０１５）は、ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性なし）をレスキューすることができず、２種は、より緩徐な増殖を伴う部分的なレスキューを示し（中間）、残りの１３種は、完全なレスキュー表現型を示した（機能的）。結果が表４に示される。
【００８３】
植物細胞における除草剤耐性に関して１７種の多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素を試験するために、プロトプラスト除草剤耐性アッセイを設計した。１７種の多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をコードする組換えＤＮＡ分子（双子葉植物の発現のためにコドン最適化した）を合成し、植物形質転換ベクターにクローニングした。発現構築物は、植物プロモーター、葉緑体輸送ペプチド、及び３’非翻訳領域に作動可能に連結された１７種の多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの１つをコードする組換えＤＮＡ分子を含有していた。ダイズプロトプラストを、標準的方法を用いて、植物形質転換ベクターで形質転換した。形質転換されたプロトプラストを１．０μＭ濃度でのＰＰＯ除草剤Ｓ−３１００または疑似処理剤（陰性対照）の存在下で増殖させた。次いで、プロトプラストをＰＰＯ除草剤耐性に関してアッセイし、１００で設定したＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ９０のスコアに対して標準化した。アッセイを４回の反復実験において２つのバッチで行った。相対的耐性スコアを各々について平均化し、標準誤差を算出した（ＳＥ）。ＧＦＰ対照アッセイは、０の耐性スコアを有し、ダイズプロトプラストが除草剤耐性タンパク質の不在下でＰＰＯ除草剤に対して耐性でないことが確認された。多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの２種（ＨｅｍＧ０１４及びＨｅｍＧ０１５）は、耐性を全く提供しなかった一方で、他の１４種は、Ｈ＿Ｎ９０と比べて２４〜８９の範囲の耐性スコアを提供した。結果が表４に示される。
【００８４】
次いで、多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの１５種をトランスジェニック植物において発現させ、トランスジェニック植物をＰＰＯ除草剤耐性に関して分析した。１５種の多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をコードする組換えＤＮＡ分子（双子葉植物または単子葉植物の発現のためにコドン最適化した）を合成し、植物形質転換ベクターにクローニングした。発現構築物は、植物プロモーター、葉緑体輸送ペプチド、及び３’非翻訳領域に作動可能に連結された１５種の多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの１つをコードする組換えＤＮＡ分子を含有していた。
【００８５】
トウモロコシ細胞を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該技術分野で既知の標準的方法を用いて、これらのベクターで形質転換した。再生させたＲ０トランスジェニック小植物体を温室で成長させた。耐性を評価するために、植物に、およそＶ２〜Ｖ４成長段階で、ＰＰＯ除草剤Ｓ３１００を８０ｇ／ｈａの率で噴霧した。処理から１〜１４日後に植物を損傷に関して評価し、損傷スコアを記録する。２０％以下の可視的損傷スコアを有する植物のパーセンテージを、全ての植物について多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の各々につき算出した。個々の植物の２５％以上が良好な耐性（２０％以下の可視的損傷スコア）を示す任意の構築物が、除草剤耐性を付与するのに効果的と見なされる。多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの８種（ＨｅｍＧ００１、ＨｅｍＧ００２、ＨｅｍＧ００３、ＨｅｍＧ００４、ＨｅｍＧ００５、ＨｅｍＧ００６、ＨｅｍＧ０１１、及びＨｅｍＧ０１２）が、ＰＰＯ除草剤に対する耐性を実証する（処理後に２０％以下の損傷を有する）相当な数のトウモロコシ植物を提供した。結果が表４に示される。
【００８６】
ダイズ細胞を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該技術分野で既知の標準的方法を用いて、これらのベクターで形質転換した。再生させたＲ０トランスジェニック小植物体を温室で成長させた。耐性を評価するために、植物に、およそＶ２〜Ｖ４成長段階で、ＰＰＯ除草剤Ｓ３１００を２０ｇ／ｈａの率で噴霧した。処理から１〜１４日後に植物を損傷に関して評価し、損傷スコアを記録する。２０％以下の可視的損傷スコアを有する植物のパーセンテージを、全ての植物について多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の各々につき算出した。個々の植物の２５％以上が良好な耐性（２０％以下の可視的損傷スコア）を示す任意の構築物が、除草剤耐性を付与するのに効果的と見なされる。多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの１０種（ＨｅｍＧ００１、ＨｅｍＧ００２、ＨｅｍＧ００３、ＨｅｍＧ００４、ＨｅｍＧ００５、ＨｅｍＧ００６、ＨｅｍＧ００７、ＨｅｍＧ００９、ＨｅｍＧ０１１、及びＨｅｍＧ０１３）が、ＰＰＯ除草剤に対する耐性を実証する（処理後に２０％以下の損傷を有する）相当な数のダイズ植物を提供した。結果が表４に示される。
【表４】
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【００８７】
安定に形質転換されたトウモロコシ及びダイズ（または両方）において試験した１５種の多様なＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうち、１０種が除草剤耐性を付与するのに効果的（２０％以下の可視的損傷スコアを有する植物を２５％超生み出す）であることが見出された。植物に除草剤耐性を付与するのに効果的であるこれらのＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の配列は、ＨｅｍＧ００１（配列番号１１）、ＨｅｍＧ００２（配列番号１２）、ＨｅｍＧ００３（配列番号１３）、ＨｅｍＧ００４（配列番号１４）、ＨｅｍＧ００５（配列番号１５）、ＨｅｍＧ００６（配列番号１６）、ＨｅｍＧ００７（配列番号１７）、ＨｅｍＧ００９（配列番号１９）、ＨｅｍＧ０１１（配列番号２１）、及びＨｅｍＧ０１３（配列番号２３）として提供される。
【００８８】
実施例２：長鎖インサートループバリアントの機能的特性解析
ＨｅｍＧタンパク質の長鎖インサートループはＰＰＯ酵素機能に必須であるとして記載されており、それらの残基のうちの多くが高度に保存されていることが報告される（Ｂｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）４８：６７０５−６７１１）。長鎖インサートループ内にアミノ酸変異を導入した組換えＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素を作り出し、次いで、細菌アッセイにおいて酵素機能に対する変化に関して分析した。
【００８９】
実施例２に記載したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ細菌スクリーニング系を用いて、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に関してバリアントタンパク質を試験した。このアッセイは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に関してバリアントタンパク質を迅速かつ容易にアッセイする手段を提供する。
【００９０】
長鎖インサートループに突然変異を組み込む組換えＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素を以下のように設計した。長鎖インサートループの各アミノ酸を独立に考慮し、その位置で特定される変異の量及びその変異のどれほどが配列群のうちのどれで見出されたかに基づいて、優先順位でランク付けした。この評定に基づいて、長鎖インサートループ内の２５個のアミノ酸のうちの２１個を突然変異誘発のために選択した。これらの２１個の位置の各々で観察される変異を表すためにＨ＿Ｎ９０配列において突然変異を作り出して、１０９個の単一アミノ酸バリアントをもたらした。さらに、Ｈ＿Ｎ９０配列を用いてアラニン走査突然変異誘発を行って、Ｈ＿Ｎ９０においてすでにアラニンでなかった長鎖インサートループ内の各位置にアラニンを有する突然変異体を生み出し、１０個の追加のバリアントをもたらした。次いで、総計１１９個の単一アミノ酸バリアントをスクリーニングに使用した。
【００９１】
次いで、これら１１９個のバリアントをコードする組換えＤＮＡ分子を合成し、細菌形質転換ベクターにおいて発現構築物にクローニングした。各バリアントについて、全ヌクレオチド配列は、突然変異体アミノ酸に対するコドンを除いてＨ＿Ｎ９０ヌクレオチド配列のそれと同一に維持した。発現構築物は、植物プロモーター、ＡＰＧ６葉緑体輸送ペプチド、及び３’非翻訳領域に作動可能に連結された１１９個のバリアントをコードする組換えＤＮＡ分子の各々を含有していた。陽性対照は、植物プロモーター、ＡＰＧ６葉緑体輸送ペプチド、及び３’非翻訳領域に作動可能に連結されたＨ＿Ｎ９０コード配列を含有する発現構築物からなっていた。各ベクターをｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の中に個々に導入して形質転換させた。陰性対照として、疑似形質転換（ベクターの存在なし）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させるためのベクターをｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の中に個々に導入して形質転換させた。
【００９２】
１１９個のバリアントの各々を、ＬＢプレート上でｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株に正常な増殖を回復させるその能力に関してスクリーニングした。全てのプレートは、３名の個人により盲検的にかつ独立して、増殖なし（バリアントは補完しない）、緩徐な増殖（バリアントは低減された酵素機能を有する）、または正常な増殖（バリアントは完全な酵素機能を有し、完全な相補性を提供する）に関してスコア化した。増殖は、プレート上のコロニーの数ではなく、コロニーのサイズに基づいて測定し、３名の個人は、全ての評価に関して合意した。表５は、アッセイの結果を示す。このアッセイにおいて、１１９個のバリアントのうちの１０５個が正常な増殖を回復させ、これらのバリアントが完全なＰＰＯ機能を有することが示唆された。１１９個のバリアントのうちの６個は、有意により緩徐な増殖速度でコロニー増殖を示し、これらのバリアントが低減されたＰＰＯ機能を有することが示唆された。１１９個のバリアントのうちの８個は、コロニー増殖を示さず、これらのバリアントがＰＰＯ機能を有しないことが示唆された。陽性対照の全てが予想通り相補性を示したが、Ｈ＿Ｎ１０構築物は、Ｈ＿Ｎ９０構築物よりも緩徐な増殖を示した。図４は、このアッセイの結果の図表を示す。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【００９３】
このアッセイの結果は、長鎖インサートループがＨｅｍＧ  ＰＰＯタンパク質において高度に保存されているが、酵素機能を維持することに関して、このループ内の残基のうちの多くで柔軟性が存在することを示唆する。長鎖インサートループ内の残基の変化が酵素機能の喪失をもたらすと述べる公開報告に基づいて（Ｚｗｅｒｓｃｈｋｅ，Ｄ．，Ｋａｒｒｉｅ，Ｓ．，Ｊａｈｎ，Ｄ．ａｎｄ  Ｊａｈｎ，Ｍ．（２０１４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３４（４），ａｒｔ：ｅ００１２４．ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＳＲ２０１４００８１）、これは予想外であった。このアッセイにおいて、特にＧ１２３、Ｌ１２５、Ｙ１２７、Ｉ１３８、Ｌ１４０、Ｉ１４１、Ｍ１４２、及びＧ１４７の位置で行われた突然変異により、改変された酵素機能が見出され、これらの位置における変化が酵素機能を変化させるために重要であることが示された。
【００９４】
実施例３：長鎖インサートループバリアントの除草剤耐性特性解析
長鎖インサートループ内にアミノ酸変異を導入した組換えＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素を作り出し、植物において除草剤感受性に対する変化に関して分析した。バリアントが植物細胞においてＰＰＯ除草剤に対する耐性を付与し得るかどうかを決定するために、プロトプラスト除草剤耐性アッセイを設計した。
【００９５】
ダイズプロトプラストを、標準的方法を用いて、実施例２に記載したのと同じ発現構築物で、ただし植物形質転換ベクターを用いて形質転換した。形質転換されたプロトプラストを１．０μＭ濃度でのＰＰＯ除草剤Ｓ−３１００または疑似処理剤（陰性対照）の存在下で増殖させた。次いで、プロトプラストをＰＰＯ除草剤耐性に関してアッセイし、ＧＦＰ対照及びＨ＿Ｎ９０に対して表した（実験間の比較を可能にするために相対的耐性スコアを導出できるようにする）。アッセイを４回の反復実験において２つのバッチで行った。相対的耐性スコアを各々について平均化し、標準誤差を算出した（ＳＥ）。ＧＦＰ対照アッセイは、０の耐性スコアを有し、ダイズプロトプラストが除草剤耐性タンパク質の不在下でＰＰＯ除草剤に対して耐性でないことが確認された。Ｎ−Ｎ９０アッセイは、１００の耐性スコアを有した。表６は、アッセイの結果を示す。１３個のバリアントは、耐性をほとんどから全く付与せず（非形質転換対照またはＧＦＰ対照と同等）、６個のバリアントは、弱い耐性を付与し（ＣＴＰなしＨ＿Ｎ９０対照と同等）、９個のバリアントは、わずかな耐性を付与し（Ｈ＿Ｎ１０対照と同等）、７９個のバリアントは、良好な耐性を付与した（ＣＴＰありＨ＿Ｎ９０対照と同等）。１２個のバリアントは、１００超の相対的耐性スコアを有した（ＣＴＰありＨ＿Ｎ９０対照よりも良好）。これらの１２個のバリアントにおけるアミノ酸変化は、７つの残基位置に位置し、これらの位置のうちの４つが、１００を上回る傾向があるバリアントを１つよりも多くもたらす。このことは、これらの７つのアミノ酸部位が改善された除草剤耐性に関して特に対象となることを示唆する。図５は、このアッセイの結果の図表を示す。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【００９６】
３９個のバリアント（加えて対照）のサブセットをさらなる分析のために選択した。これらのバリアントを、上述のＳ−３１００耐性アッセイと同様のアッセイにおいて、３種の追加のＰＰＯ除草剤であるフルミオキサジン、スルフェントラゾン、及びラクトフェンに対する耐性に関して試験した。形質転換されたプロトプラストをフルミオキサジン（５ｎＭ）、スルフェントラゾン（１μＭ）、及びラクトフェン（１μＭ）で処理した。表７は、アッセイの結果を示す。試験した３９個のバリアントのうち、３０個がフルミオキサジン、スルフェントラゾン、またはラクトフェンに対して良好な耐性を示し、９個が良好でない耐性（「ＰＴ」と表示される、５０を下回る耐性スコア）を有した。良好な耐性を示した３０個のバリアントのうち、８個が、１種または複数の除草剤に対する耐性において、Ｓ−３１００と比べて実験変動を超える変化を示した。これらの８個のバリアントのうち、４個のバリアントは、除草剤のうちの１種または複数に対するより高い耐性を付与した一方で（これは、下記の表７において「より高い」と表示される）、４個のバリアントは、除草剤のうちの１種または複数に対するより低い耐性を付与した（これは、下記の表７において「より低い」と表示される）。「ＮＳＤ」と表示されるバリアントは、耐性スコアの差異が所与のデータ点について標準誤差未満である耐性スコアを有した。
【表７−１】
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【表７−２】
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【００９７】
フルミオキサジン、スルフェントラゾン、またはラクトフェンに対する耐性スコアにおいて、Ｓ−３１００に対するそれらの耐性スコアと比較して有意な差異を実証した８個のバリアントのうち、６個のバリアントが疎水性残基Ｍ１３７、Ｌ１４０、及びＭ１４２に位置していた。残基Ｍ１３７〜Ｍ１４２にまたがる領域は、多数の疎水性残基（とりわけＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａ）を含有する。この疎水性領域の分析は、これらの残基が、酵素バリアントの機能性を調節する上で固有に重要であることを示唆する。さらに、これらの残基は、異なるＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を調節する上で固有に重要である。
【００９８】
形質転換されたプロトプラストは、ジフェニルエーテル（アシフルオルフェン、その塩及びエステル、アクロニフェン、ビフェノックス、その塩及びエステル、エトキシフェン、その塩及びエステル、フルオロニトロフェン、フリルオキシフェン、ハロサフェン、クロメトキシフェン、フルオログリコフェン、その塩及びエステル、ラクトフェンの塩及びエステル、オキシフルオルフェン、ならびにホメサフェン、その塩及びエステル等）、チアジアゾール（フルチアセットメチル及びチジアジミン等）、ピリミジンジオンまたはフェニルウラシル（ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル、エチル［３−２−クロロ−４−フルオロ−５−（１−メチル−６−トリフルオロメチル−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−３−イル）フェノキシ］−２−ピリジルオキシ］アセテート（ＣＡＳ登録番号３５３２９２−３１−６及び本明細書でＳ−３１００と称される）、フルプロパシル、サフルフェナシル、及びチアフェナシル等）、フェニルピラゾール（フルアゾラート、ピラフルフェン、及びピラフルフェンエチル等）、オキサジアゾール（オキサジアルギル及びオキサジアゾン等）、トリアゾリノン（アザフェニジン、ベンカルバゾン、ならびにカルフェントラゾン、その塩及びエステル等）、オキサゾリジンジオン（ペントキサゾン等）、Ｎ−フェニルフタルイミド（シニドン−エチル、フルミクロラック、及びフルミクロラック−ペンチル等）、ベンゾオキサジノン誘導体（１，５−ジメチル−６−チオキソ−３−（２，２，７−トリフルオロ−３，４−ジヒドロ−３−オキソ−４−プロパ−２−イニル−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−６−イル）−１，３，５−トリアジナン−２，４−ジオン等）、フルフェンピル及びフルフェンピル−エチル、ピラクロニル、ならびにプロフルアゾール等の、他のＰＰＯ除草剤で攻撃してもよい。疑似処理剤を陰性対照として用いることができる。
【００９９】
実施例４：コンビナトリアルバリアントの機能的特性解析及び除草剤耐性特性解析
ＨｅｍＧ  ＰＰＯ配列における長鎖インサートループ内に２つ以上のアミノ酸修飾を含むように、バリアントを設計する。次いで、ＰＰＯ活性を決定するために、これらのコンビナトリアルバリアントＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をアッセイする。コンビナトリアルバリアントＨｅｍＧ  ＰＰＯのＤＮＡ配列を合成し、発現カセットにクローニングする。発現カセットを含む細菌形質転換ベクターを、実施例２に記載したような初期高スループット細菌レスキュースクリーニングのために、ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の中に導入して形質転換させることができる。コンビナトリアルバリアントを、ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の正常な増殖を回復させるそれらの能力に関してスクリーニングする。
【０１００】
コンビナトリアルバリアントＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をまた、植物細胞にＰＰＯ除草剤に対する耐性を付与するそれらの能力に関してアッセイする。コンビナトリアルバリアントＨｅｍＧ  ＰＰＯのＤＮＡ配列を含有する発現カセットを植物形質転換ベクターと共に使用して、ダイズプロトプラストを形質転換する。プロトプラスト耐性アッセイを実施例３に記載したように実施し、コンビナトリアルバリアントを、植物細胞に除草剤耐性を付与するそれらの能力に関してスクリーニングする。
【０１０１】
実施例５：植物におけるバリアントＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の発現及び試験
上記の実施例に記載した微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯバリアントを、安定に形質転換された植物において発現させてもよく、これらの植物をＰＰＯ除草剤耐性に関して分析することができる。
【０１０２】
微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯバリアントのうちの２５種を、安定に形質転換されたトウモロコシまたはダイズ（または両方）において除草剤耐性に関して試験した。植物プロモーター、輸送配列、及び３’ＵＴＲに作動可能に連結されたバリアントＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を含む（タンパク質コード配列を単子葉植物または双子葉植物の発現のために最適化して）、植物形質転換ベクターを構築した。
【０１０３】
トウモロコシにおいては、トウモロコシ細胞を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該技術分野で既知の標準的方法を用いて、植物形質転換ベクターで形質転換した。再生させたＲ０トランスジェニック小植物体を温室で成長させる。Ｒ０植物に、およそＶ２〜Ｖ４成長段階で、Ｓ３１００を８０ｇ／ｈａの率で噴霧した。次いで、処理から１〜１４日後に植物を損傷に関して評価し、損傷スコアを記録した。トランスジェニックＤＮＡインサートの単一コピーを有するトランスジェニック植物（すなわち、単一事象植物）を特定し、単一コピーのみを含有し、かつ除草剤噴霧試験に合格したＲ０植物を自家受粉させて、Ｒ１種子を生み出した。
【０１０４】
ダイズにおいては、切除した胚を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該技術分野で既知の標準的方法を用いて、植物形質転換ベクターで形質転換した。再生させたＲ０トランスジェニック小植物体を温室で成長させた。Ｒ０植物に、およそＶ２〜Ｖ４成長段階で、Ｓ３１００を２０ｇ／ｈａの率で噴霧した。次いで、処理から１〜１４日後に植物を損傷に関して評価し、損傷スコアを記録した。トランスジェニックＤＮＡインサートの単一コピーを有するトランスジェニック植物（すなわち、単一事象植物）を特定し、単一コピーのみを含有し、かつ除草剤噴霧試験に合格したＲ０植物を自家受粉させて、Ｒ１種子を生み出した。いくつかのバリアントＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素に関しては、Ｒ１植物を温室で成長させ、およそＶ２〜Ｖ４成長段階で、Ｓ３１００を６０ｇ／ｈａの率で噴霧した。次いで、処理から１〜１４日後に植物を損傷に関して評価し、損傷スコアを記録する。
【０１０５】
２０％以下の可視的損傷スコアを有するトランスジェニックダイズ及びトウモロコシ植物を、除草剤耐性スクリーニングに合格し、故にＰＰＯ除草剤に対する耐性を実証するものとして、スコア化した。総計の植物のうちの、除草剤耐性スクリーニングに合格した各バリアントＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のパーセンテージを算出した。個々の植物の２５％以上が良好な耐性（２０％以下の可視的損傷スコア）を示す任意の構築物が、除草剤耐性を付与するのに効果的と見なされる。
【０１０６】
この試験は、プロトプラストアッセイ（上述のように実施した）から得られた結果が、植物全体において得られた結果と一致することを実証し、スクリーニングツールとしてのプロトプラストアッセイの使用の有効性が確認された。安定に形質転換されたトウモロコシまたはダイズ（または両方）において試験した２５種の微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯバリアントのうち、２０種が除草剤耐性を付与するのに効果的（２０％以下の可視的損傷スコアを有する植物を２５％超生み出す）であることが見出された。これらの２０種のうち、１４種は、陽性対照Ｈ＿Ｎ９０よりも高い有効性結果を有した。結果が表８に提供される。
【表８】
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【０１０７】
ワタにおいては、切除した胚（Ｃｏｋｅｒ  １３０）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該技術分野で既知の標準的方法を用いて、これらのベクターで形質転換することができる。再生させたＲ０トランスジェニック小植物体を温室で成長させ、上述のように試験する。
【０１０８】
これらのトランスジェニック植物を用いて、他の除草剤を耐性に関して試験することができる。これは、例えば、各ＨｅｍＧ  ＰＰＯにつき複数のトランスジェニック植物を成長させ、植物を群に分割することによって、行うことができる。耐性を評価するために、これらの群にＰＰＯ除草剤（複数可）（群当たり１種のＰＰＯ除草剤）を噴霧する。例えば、トランスジェニック植物に、およそ本葉２〜４枚の成長段階で、ラクトフェンをおよそ２２０ｇ  ａｉ／ｈａもしくは４４０ｇ  ａｉ／ｈａで、またはフルミオキサジンをおよそ２１０ｇ／ｈａもしくは４２０ｇ／ｈａで噴霧する。次いで、処理から１〜１４日後に植物を損傷に関して評価し、損傷スコアを記録する。噴霧を行わないトランスジェニック植物は、噴霧を行わない非トランスジェニック植物との表現型比較に使用する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021506232.tif 000024
【配列表】
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【国際調査報告】
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