(57)【要約】腫瘍の癌細胞への薬物のソノポレーションを誘導するためのシステム及びその方法。システムは、超音波周波数で電気エネルギーを提供するように構成された発電機；発電機に電気的に接続され、電気エネルギーを動作パラメーターによって定義された低強度パルス超音波に変換するように構成された超音波プローブ、前記動作パラメーターは、周波数、デューティサイクル、超音波の動作時間を含む；オペレーターが腫瘍のタイプ、薬物のタイプ、二次腫瘍の局在、身体測定値及び腫瘍のグレードを含む構成データを入力できるようにする入力デバイス；及び入力された構成データに基づいて動作パラメーターの値を決定し、前記決定された値に従って動作するように発電機及び超音波プローブを制御するように構成されたプロセッサを含み、周波数の値は、腫瘍のタイプ、腫瘍の局在、腫瘍のグレード、及び身体測定値に基づいて決定され、デューティサイクルの値は、薬物、腫瘍のタイプ及び腫瘍のグレードに基づいて決定され、前記動作時間の値は、少なくとも腫瘍のタイプと薬物のタイプに基づいて決定される。
2021507797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物の腫瘍の癌細胞へのソノポレーションを誘導するためのシステムであって、‐超音波周波数で電気エネルギーを提供するように構成された発電機；
‐発電機に電気的に接続され、電気エネルギーを、超音波の周波数とデューティサイクルを含む動作パラメーターによって定義された低強度非集束パルス超音波に変換するように構成された少なくとも１つの超音波プローブ；
システムはさらに以下を含むことを特徴とする：
‐オペレーターが腫瘍のタイプと薬物のタイプを含む構成データを入力できるようにする入力デバイス；及び
‐入力された構成データに基づいて前記動作パラメーターの値を決定するように構成され、ここで、周波数の値は、少なくとも腫瘍のタイプに基づいて決定され、デューティサイクルの値は、少なくとも薬物のタイプと腫瘍のタイプに基づいて決定される；及び
前記決定された値に従って動作するように発電機及び超音波プローブを制御するように構成されたプロセッサ。
【請求項２】
動作パラメーターが超音波の振幅を含み、システムが、プローブとがん細胞の間に介在する任意の媒体によって引き起こされる超音波の減衰を補償するために超音波プローブの周波数及び振幅を自動的に調整するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
デューティサイクルと同期して周波数及び振幅を自動的に調整するように構成されている、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
プローブが複数の超音波トランスデューサーを含み、前記トランスデューサーの第１のサブセットが電気エネルギーを超音波に変換してソノポレーションを誘発する超音波放射体として構成され、前記トランスデューサーの第２のサブセットが介在する任意の媒体で反射された超音波をプロセッサが読み取り可能な電気信号に変換する超音波受信機として構成され、プロセッサは
‐トランスデューサーの第１のサブセットによって放射された超音波とトランスデューサーの第２のサブセットによって受信された超音波との間の周波数と振幅の差を計算する；及び
‐放射された超音波の振幅と周波数の値を調整して、上記の違いを補正する
ようにプログラムされている、請求項１〜３のいずれかに記載のシステム。
【請求項５】
プローブが、ソノポレーションを誘発するために電気エネルギーを超音波に変換する超音波放射体として、及び介在する任意の媒体で反射された超音波をプロセッサによって読み取り可能な電気信号に変換する超音波受信機として構成された１つの超音波トランスデューサーを含み、プロセッサは
‐放射された超音波と前記トランスデューサーによって受信された超音波との間の周波数と振幅の差を計算する；及び
‐放射された超音波の振幅と周波数の値を調整して、上記の違いを補正する
ようにプログラムされている、請求項１から３のいずれかに記載のシステム。
【請求項６】
周波数の値のリスト及びデューティサイクルの値のリストを格納するコンピュータ可読メモリを含み、プロセッサが
‐周波数の値を腫瘍のタイプに割り当てる；及び
‐デューティサイクルの値を、腫瘍のタイプと薬物のタイプを含む２つの構成データに割り当てる
ように構成される、請求項１〜５のいずれかに記載のシステム。
【請求項７】
腫瘍のタイプが、ヒト乳管癌、エストロゲン非依存性ヒト乳腺癌、ヒト膵臓腺癌、ヒト黒色腫；ヒト黒子黒色腫、ヒト黒子悪性黒色腫；ヒト表在性黒色腫；ヒト末端黒斑性黒色腫、ヒト粘膜黒色腫、ヒト結節性黒色腫、ヒトポリープ状黒色腫、ヒト小細胞黒色腫；ヒトスピッツ様黒色腫、ヒトブドウ膜黒色腫、及びヒト線維形成性黒色腫、肝細胞癌からなる群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載のシステム。
【請求項８】
構成データが、癌細胞が属する患者の身体測定値を含み、前記身体測定値は、腹囲、ボディマスインデックス、乳房周囲、胸郭周囲、及び体脂肪率からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載のシステム。
【請求項９】
周波数の値が、人体測定値にも基づいて決定される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記プロセッサは、腫瘍のタイプと、腹囲、ボディマスインデックス、乳房周囲、胸郭周囲、及び体脂肪率からなる群から選択される少なくとも１つの身体測定値とを含む構成データのセットに周波数の値を割り当てるように構成される、請求項２及び９に記載のシステム。
【請求項１１】
構成データが腫瘍のグレードを含み、腫瘍のグレードが、原発又は原始腫瘍、及び二次腫瘍又は転移からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
腫瘍の前記グレードが二次腫瘍又は転移である場合、構成データが二次腫瘍の局在を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
デューティサイクルの値が、二次腫瘍の局在にも基づいて決定される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
腫瘍のタイプ、薬物のタイプ、及び腫瘍のグレードを含む構成データのセットにデューティサイクルの値を割り当てるように前記プロセッサが構成されている、請求項２及び１２に記載のシステム。
【請求項１５】
腫瘍のグレードが二次腫瘍、又は転移である場合、腫瘍のタイプ、薬物のタイプ、及び二次腫瘍の局在を含む構成データのセットにデューティサイクルの値を割り当てるようにプロセッサが構成されている、請求項２及び１４に記載のシステム。
【請求項１６】
薬物のタイプが、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、イリノテカン、リポソームイリノテカン及びフルオロウラシルからなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
動作パラメーターが超音波の動作時間を含み、前記動作時間の値が少なくとも腫瘍のタイプ及び薬物のタイプに基づいて決定される、請求項１から１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
プロセッサが、腫瘍のタイプ及び薬物のタイプを含む２つの構成データに動作時間の値を割り当てるように構成されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
動作時間は、
‐超音波が投与される１つの時間枠；又は
‐超音波が投与される少なくとも２つの時間枠であって、前記２つの少なくとも２つの時間窓は超音波が投与されない１つの時間枠によって隔てられている時間枠
にある、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２０】
周波数の決定された値が０．６ＭＨｚと３ＭＨｚとの間に含まれ、及び／又はデューティサイクルの決定された値が１２％未満である、請求項１から１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
薬物の細胞へのソノポレーションを誘導するための超音波を制御する方法であって、
‐オペレーターによって入力された、腫瘍のタイプ、薬物のタイプ、腫瘍のグレード、及び身体測定値を含む構成データを読み取ること；
‐少なくとも腫瘍のタイプと薬物のタイプに基づいて、周波数とデューティサイクルを含む超音波の動作パラメーターの値を決定すること；
‐前記決定された値に従って動作するように少なくとも１つの超音波プローブを制御すること、ここで前記少なくとも１つのプローブは発電機に電気的に接続され、電気エネルギーを超音波に変換するように構成されており、読み取り、決定、及び制御の動作はプロセッサによって実行される
を含む、上記方法。
【請求項２２】
動作パラメーターの値を決定することは、腫瘍のタイプに周波数の値を割り当てること；及びデューティサイクルの値を腫瘍のタイプと薬物のタイプを含む２つの構成データに割り当てることにある、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記動作パラメーターは、超音波の動作時間を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
コンピュータ上で実行されたときに請求項２１又は２２又は２３に記載の方法を実行するように適合されたコード部分を含むコンピュータプログラム。
【請求項２５】
コンピュータ上で実行されたときに、請求項２１又は２２又は２３に記載の方法を実行するためのコンピュータプログラムコードを格納するコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的（すなわち、腫瘍）への薬物の取り込みを増強するために、腫瘍の癌細胞への薬物のソノポレーション（sonoporation、音響穿孔法）を誘導するためのシステムに関する。本発明はまた、癌細胞への薬物のソノポレーションを誘導し、それにより標的への薬物の取り込みを改善するような方法で超音波を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環器疾患に次いで、癌は現在、世界で２番目に多い死因である。国際がん研究機関（The International Agency for Research on Cancer）は、人口の高齢化により、２０３０年には約２１７０万人のがん症例が増加し、死亡率が１３００万人になると予測されている。既知の腫瘍学的治療は、化学療法及び／又は放射線療法及び／又は腫瘍塊の外科的除去に基づいている。特に、従来の化学療法は、癌細胞に対する選択性の欠如に悩まされているため、全身レベルと局所レベルの両方で副作用を引き起こす可能性がある。さらに、腫瘍は投与された化学療法薬に耐性を示すことが多い。これらの理由により、過去数十年の間に、リポソームと呼ばれる特殊な脂質構造を使用して薬物送達の選択性を改善するために、いくつかの技術が開発された。リポソームは、薬物（例えば、化学療法剤、抗炎症剤、細胞毒性剤など）を含むコア、典型的には水性コアを有する封入された脂質小滴を一般的に含むナノキャリアである。特に、化学療法剤を封入するためのリポソームは、通常、リポソーム自体の、したがってリポソームに含まれる薬物の血液中の循環時間を延長できる構造で設計されている。血液中の寿命が長くなると、リポソームとターゲット（つまり、腫瘍）との相互作用が長くなるが、これは、腫瘍を通過する血液の通過回数が増えると、透過性と保持（ＥＰＲ）の効果が向上するためである。したがって、腫瘍への薬物の全体的な取り込みが強化され、輸送された薬物の治療指数の顕著な改善がもたらされる[Deshpande P.P., Biswas S., and V. P Torchilin V.P., “Current trends in the use of liposomes for tumor targeting” Nanomedicine 2013 September; 8(9)]（「腫瘍標的化のためのリポソームの使用における現在の傾向」)、[Torchilin V.P. “Targeted pharmaceutical nanocarriers for cancer therapy and imaging”. AAPS J. 2007; 9(2): 128‐147]（「癌治療及びイメージングのための標的化された製薬ナノキャリア」)。しかしながら、化学療法剤のリポソーム製剤が使用されたとしても、リポソームの自然分解後の自然放出によって得られる選択性レベル及び治療効果は、まだ完全に満足できるものではない。これらの理由により、現在臨床使用が承認されているナノ医薬品が薬物を自発的に放出する場合でも、外部から与えられた刺激によってそのような放出を誘発するいくつかの技術が実験的に試験されている。薬物放出の制御の改善は、局所的な温度上昇によって薬物放出を刺激し、それ自体で細胞毒性効果を引き起こし、腫瘍及び周囲の組織の凝固壊死を誘発する高強度集束超音波を使用して達成できることが十分に確立されている（ＥＰ１７７４９８９Ｂ１）。衝撃波はまた、人体、組織、又は細胞内に物質を押し込むことを目的とした医療処置を行うために使用され、したがって、ワクチン、麻酔薬、抗生物質などを提供するために使用された（ＵＳ２００９／２８１４６４Ａ１）。
【０００３】
局所加熱及び腫瘍細胞の壊死後の癌性物質の拡散に関連する起こり得る毒性の副作用を回避するために、より最近では、パルス低強度非集束超音波（ｐＬＩＮＦＵ）が採用された。ｐＬＩＮＦＵは、リポソームの「インソネーション」及び細胞膜の「ソノポレーション」を実行できる。用語「インソネーション」は、特に、リポソームの内側から外側への薬物放出の誘導を指す。用語「ソノポレーション」は、代わりに、リポソームの細胞への進入を助けるための細胞膜における一時的な非致死的穿孔の作成を指す。高強度集束超音波とは異なり、ｐＬＩＮＦＵに関連する低エネルギー（＜３Ｗ／ｃｍ２）は、熱効果を最小限に抑えることが実証されている[Rizzitelli S., Giustetto P., Faletto D., Delli Castelli D., Aime S., Terreno E. “The release of Doxorubicin from liposomes monitored by MRI and triggered by a combination of US stimuli led to a complete tumor regression in a breast cancer mouse model.”, J Control Release, 2016; 230: 57-63.]（「ＭＲＩによって監視され、ＵＳの刺激の組み合わせによって引き起こされるリポソームからのドキソルビシンの放出は、乳癌マウスモデルの完全な腫瘍退縮をもたらした。」）
【０００４】
ｐＬＩＮＦＵは、ＷＯ２０１６／１９６７４１で説明されている方法とシステムで採用されているような、パルス低強度集束超音波、又はＰＬＩＦＵと比較すると、同じ周波数、圧電直径、及び励起サイクル数での異なる超音波分布フィールドによって特徴付けられる。
【０００５】
ｐＬＩＮＦＵは、ｐＬＩＮＦＵを生成する圧電トランスデューサーの平坦な形状により、ｐＬＩＦＵよりも規則的な形状分布を持っている。
【０００６】
さらに、そのような平坦な形状は、代わりに、２つ以上の圧電トランスデューサーからの超音波ビームの収束によって生成される、ｐＬＩＦＵによって得られるボリュームよりも大きなボリュームをソノポレーション（音響穿孔）することを可能にする。
【０００７】
さらに、少なくとも２つの超音波ビームの収束点では、干渉現象が発生する可能性があり、それらによって引き起こされる結果として生じる歪みを見積もる可能性がない。従来技術のｐＬＩＦＵシステムは、この現象を低減する方法を採用しているが、媒体又は超音波が通過する生物組織の不均一性は、他の予測できない干渉を引き起こす可能性がある。
【０００８】
これらの理由により、ｐＬＩＮＦＵの場合のみ、ソノポレーションに使用される超音波が設定された周波数と設定されたデューティサイクルで標的細胞に到達することを保証できる。実際、ソノポレーションは、ソノポレーションされる細胞のタイプとそのような細胞の膜に入れられる薬剤のタイプに依存する特定の周波数とデューティサイクル値でのみ、ナノメートルスケールで生物物理現象を生成する。
【０００９】
実際、パルス超音波は、放射期間（オン期間）と無音期間（オフ期間）の交互から構成される。オフ期間は、放射期間を中断し、オン期間と交互になる。
【００１０】
より具体的には、オン期間は、薬物を含むベクターの特性及び細胞膜の特性に依存するはずである。ベクトルの共鳴効果に由来する振動は、細胞膜と相互作用して、細孔の開口を促進し、超音波の直接的な影響から細胞を保護する。オフ期間の持続時間は、細胞細孔の開閉特性の関数として決定される。オフ期間は、細孔が開かれると細胞膜をさらに刺激しない機能を有し、同じ細孔が閉じている間、細胞区画へのベクターの侵入を促進する。
【００１１】
オン期間がオフ期間なしで長期間採用された場合、結果は細胞膜の継続的かつ長期的なストレスとなり、薬剤の正確な細胞内蓄積を妨害することに加えて、細胞に過剰なストレスレベル及び薬物の出入りを同時に引き起こすインアンドアウト現象を引き起こす可能性がある。
【００１２】
さらに、長時間の刺激は細胞死を引き起こす可能性があり、その結果、細胞質の内容物（薬物を含む）が漏れ、血流を通じて他の望ましくない部位に運ばれるリスクがある。
【００１３】
上記の理由により、周波数とデューティサイクルの特定の値を持つ超音波ビームのみが、振動パルス又はフォノンを生成することによって、格子レベルで膜と相互作用することができる。後者は、フォノニックパルスの周波数と膜リン脂質の運動の周波数の比較可能な値のおかげで格子点を介して伝播し、膜成分の転位を引き起こし、したがって膜の一時的な細孔開口の現象を引き起す。
【００１４】
非集束ビーム（すなわち、ｐＬＩＮＦＵ）が使用される場合、放射ビームを構成する超音波間に建設的な干渉も破壊的な干渉もない。これにより、すべてのコンポーネントビームが、治療対象のすべての組織特性と使用する薬物に応じて確立されたパルスを確実に尊重できるようになる。
【００１５】
フォノニックパルスの伝播、したがって膜細孔の一時的な開口のトリガーは、音響ストリーミング効果によっても影響される。後者は、細胞膜などの振動構造の近くの流体の小規模な渦として定義される。この現象は、拡散速度と膜透過性に影響を与えることが知られており、より具体的には、有用な経路、すなわち、超音波ビームが音圧自体によって変形した組織と相互作用することなく移動できる経路を減少させることが知られている。[Nowicki A., Kowalewski T., Secomski W., Wo'jcik J., “Estimation of acoustical streaming: theoretical model, Doppler measurements and optical visualization”, European Journal of Ultrasound 1998, 7: 73-81].「音響ストリーミングの評価：理論モデル、ドップラー測定、及び視覚化」
【００１６】
音響ストリーミング効果は、ｐＬＩＦＵ又はｐＬＩＮＦＵが適用される場合は異なる。ｐＬＩＦＵの場合、有用な経路の減少に加えて、組織から圧電トランスデューサーに戻る信号の歪みが発生する可能性がある。そのような歪みは、ソノポレーションされる組織に特有で特徴的ではなく、したがって、標的細胞に到達する超音波ビームの周波数及びデューティサイクルの予測における不確実性のさらなる原因である。このため、ソノポレーションに使用される超音波が、膜との最良の相互作用のために最適に設定された周波数とデューティサイクルの値で標的細胞に到達することを保証することはさらに困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、
‐薬物の選択性と薬物の癌細胞への取り込みを改善することを可能にするシステム
を提供することである。
これは、フォノン振動の発生を通じて細胞ソノポレーションを誘導するためのｐＬＩＮＦＵを投与することによる本発明のシステムによって達成される。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、
‐薬物の癌細胞へのソノポレーションを誘導するための超音波を制御する方法
を提供することである。
【００１９】
以下の例で示されているように、ソノポレーション処置によって達成される細胞死のパーセンテージは、使用される薬物のタイプと脅威となる腫瘍のタイプの組み合わせに依存する。より具体的には、以下にリストされたヒトの癌細胞のインビトロでの実験的試験の結果は、重要な細胞死のパーセンテージを達成するために、ｐＬＩＮＦＵのデューティサイクルは薬物と癌細胞のタイプに従って調整されるべきであることを示した。細胞膜の細孔の開閉の正しいタイミングを保証するために、ｐＬＩＮＦＵの投与の一時的な期間、すなわち動作時間も重要である。
【００２０】
これらの結果に基づいて、本発明は、オペレーターによって入力された構成データに従ってソノポレーションを誘発するｐＬＩＮＦＵの周波数及びデューティサイクルを制御するためのシステム及び関連方法を提供し、前記構成データは、少なくとも腫瘍のタイプ及び薬物のタイプを含む。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本説明の目的のために、「低強度超音波」という表現は、３Ｗ／ｃｍ２未満の出力密度を有する超音波を表しており、「腫瘍のタイプ」という表現は、組織型及び腫瘍が位置している臓器（器官）を指すことを表す。したがって、「腫瘍のタイプ」の非限定的な例は、「ヒト乳管癌」、「ヒト膵臓腺癌」、「エストロゲン非依存性ヒト乳腺癌」、「ヒト粘膜黒色腫」、「ヒト結節性黒色腫」、「肝細胞癌」等である。さらに、本説明の目的のために、「薬物」という言葉は、吸入、注射、喫煙、消費、皮膚のパッチを介して吸収されたとき、又は舌の下で溶解したとき、身体の一時的な生理学的（及び／又は心理的）な変化を引き起こす（栄養サポートを提供する食品以外の）任意の物質、及び医療画像の組織及び／又は構造のコントラストや可視性を向上させるために使用できる任意の物質（つまり、コントラスト媒体）を指すことを意図していると述べられている。本発明の目的のために、用語「薬物」は、単一の物質又は薬剤だけでなく、２つ以上の物質又は薬剤の溶液、組成物又は混合物をも指すために使用されることは明らかである。本発明の好ましい実施形態は、化学療法リポソームの癌細胞へのソノポレーションを誘導するためのシステムであるが、同じシステムが、リポソームにカプセル化されていない化学療法薬にも、及び任意の細胞毒性剤（すなわち、標的細胞を殺すことができる薬剤）又は細胞増殖抑制剤（すなわち、標的細胞の増殖又は細胞分裂を抑制する能力を有する薬剤）についても使用できることをここに述べる。さらに、本発明のシステムは、化学療法薬以外の任意の医薬（例えば、抗炎症薬）のソノポレーション、及び腫瘍以外の任意の病変に使用することができる。後者の場合、「腫瘍のタイプ」という表現は、組織型及び病理学によって影響を受ける臓器を示す「病理のタイプ」という表現に置き換えることができる。
【００２２】
上記の目的は、本発明によって、以下を備えるシステムを提供することによって達成される：
‐超音波周波数で電気エネルギーを提供するように構成された発電機；
‐発電機に電気的に接続され、電気エネルギーを、超音波の周波数とデューティサイクルを含む動作パラメーターによって定義された低強度非集束パルス超音波に変換するように構成された少なくとも１つの超音波プローブ；
システムはさらに以下を含むことを特徴とする：
‐オペレーターが腫瘍のタイプと薬剤のタイプを含む構成データを入力できるようにする入力デバイス；及び
‐入力された構成データに基づいて前記動作パラメーターの値を決定するように構成され、ここで、周波数の値は、少なくとも腫瘍のタイプに基づいて決定され、デューティサイクルの値は、少なくとも薬物のタイプと腫瘍のタイプに基づいて決定される；及び
前記決定された値に従って動作するように発電機及び超音波プローブを制御するように構成されたプロセッサ。
【００２３】
より具体的には、入力された構成データに基づく動作パラメーターの値の決定は、以下のステップを通じてプロセッサによって実行される：
‐腫瘍のタイプに周波数の値を割り当てる；及び
‐デューティサイクルの値を、腫瘍のタイプと薬物のタイプを含む２つの構成データに割り当てる。
【００２４】
この目的のために、システムは、周波数の値のリスト及びデューティサイクルの値のリストを格納するコンピュータ可読メモリを含む。
【００２５】
本発明のシステムにおいて、薬物のタイプは、好ましくは、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、イリノテカン及びリポソームイリノテカン及びフルオウラシルからなる群から選択され、デューティサイクルの決定値は、好ましくは、１２％未満である。
【００２６】
上記の目的は、以下を含む方法を提供することによる本発明によっても達成される。
‐オペレーターによって入力された構成データを読み取る、この構成データは、腫瘍のタイプ、薬物のタイプ、腫瘍のグレード、及び身体測定値を含む；
‐少なくとも腫瘍のタイプと薬物のタイプに基づいて超音波の動作パラメーターの値を決定する、前記パラメーターは周波数とデューティサイクルを含む；
‐前記決定された値に従って動作するように少なくとも１つの超音波プローブを制御する、前記少なくとも１つのプローブは発電機に電気的に接続され、電気エネルギーを超音波に変換するように構成されており；読み取り、決定、及び制御の動作は、プロセッサによって実行される。
【００２７】
本発明はまた、上で詳述した方法を実行するように適合されたコード部分を含むコンピュータプログラム、及びコンピュータ上で実行されるときにそのような方法を実行するためのコンピュータプログラムコードを格納するコンピュータ可読媒体に関する。
【００２８】
周波数の値は、少なくとも腫瘍のタイプに基づいて決定する必要があるが、表面的ではなく、特定の身体領域（腹部など）に限局しているタイプの腫瘍については、他の構成データも考慮する必要があると考えられている。実際、超音波の侵入の深さは超音波周波数によって影響され、侵入の深さは周波数が低いほど大きくなることが知られている。たとえば、軟組織では、平均浸透深度（つまり、超音波の強度が初期強度に対して５０％減少する深度）は、超音波周波数が１ＭＨｚの場合４〜５ｃｍ、周波数が３ＭＨｚの場合約１．５ｃｍである。代わりに、軟組織の最大浸透深度は超音波周波数が１ＭＨｚの場合１０〜１２ｃｍであり、超音波周波数が３ＭＨｚの場合３〜４ｃｍである。本発明を参照すると、周波数への侵入の深さの依存性は、周波数が腫瘍のタイプに依存していると述べることによって暗黙的に考慮される。実際、腫瘍のタイプが、例えば黒色腫の１つである場合、腫瘍は体表にあり、腫瘍のタイプが乳管癌である場合、腫瘍は体表の下の特定の深さにある。これらの理由から、周波数は腫瘍のタイプを考慮して決定されると述べることは、一般に、周波数は体表面下の腫瘍の深さに関する情報も考慮して決定されることを意味する。ただし、体の領域にある腫瘍のタイプ（膵臓腺癌など）によっては、その大きさが個人間で大きく異なる場合がある。これらの場合、個人間の身体の違い（腹部の周長など）は、超音波が腫瘍に到達することを保証するために必要な周波数の決定に大きな影響を与える可能性がある。結果として、超音波周波数の値は、患者の身体測定値に基づいて決定されるべきである。より具体的には、ヒト膵臓腺癌の場合、そのような身体測定のいくつかの例は、腹囲、ボディマスインデックス及び体脂肪率であり得る。ヒト乳管癌及びエストロゲン非依存性ヒト乳腺癌の場合、そのような身体測定値のいくつかの例は、乳房周囲、ボディマスインデックス、体脂肪率、胸郭周囲であり得る。したがって、本発明のシステムでは、構成データは、癌細胞が属する患者の身体測定値をさらに含むことができ、前記身体測定値は、腹囲、ボディマスインデックス、乳房周囲、胸郭周囲、及び体脂肪率からなる群から選択され、周波数の値は、身体測定値にも基づいて決定できる。本発明のシステムでは、周波数の決定された値は、０．６ＭＨｚと３ＭＨとの間に含まれる。
【００２９】
デューティサイクルの値は、少なくとも腫瘍のタイプと薬物のタイプに基づいて決定する必要があるが、腫瘍が転移又は二次腫瘍である場合、その局在は「腫瘍のタイプ」の名称で示されたものと異なる可能性があると考えられており、細胞は、したがって、対応する原始腫瘍の細胞とは異なる。なぜなら、それらは腫瘍が発生した器官とは異なる器官に属しているからである。以下の例で詳述されるように、デューティサイクルは、ソノポレーションを誘導することが望まれる細胞のタイプに従って変えなければならないので、デューティサイクルは、最終的な二次腫瘍の局在に従って変えなければならない。これらの理由により、本発明のシステムでは、構成データは、腫瘍のグレード、及びそれが転移である場合、前記転移の局在をさらに含むことができる。
【００３０】
癌細胞への薬物の効果的なソノポレーションを得るために関連するさらなる動作パラメーターは、動作時間、すなわち超音波の投与の時間間隔である。以下の例で詳細に説明するように、動作時間の値は、薬物の細胞への効果的なソノポレーションを保証するためにも関連がある。このため、本発明のシステムでは、動作パラメーターは、動作時間を含むことができ、前記動作時間の値は、少なくとも腫瘍のタイプ及び薬物のタイプに基づいて決定される。
【００３１】
本発明のシステムはさらに、超音波プローブの周波数及び振幅を自動的に調整して、プローブと癌細胞との間に挿入された媒体によって引き起こされる超音波の減衰を補償するように構成される。さらに、周波数と振幅の自動調整は、デューティサイクルと同期して行われる。
【００３２】
これらの特徴及び他の特徴は、請求されるより一般的な原理の非限定的な例として読まれる、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明の助けにより、より明確にされる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
説明は添付の図面を参照する。
【図１ａ】図１ａは、パクリタキセルをヒト乳管癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（５０μＭ、１０μＭ、０．５μＭ）で得られた結果を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、パクリタキセルアルブミンをヒト乳管癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（５０μＭ、１０μＭ、０．５μＭ）で得られた結果を示す。
【図２ａ】図２ａは、ドキソルビシンをヒト乳管癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（１０００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）で得られた結果を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、リポソームドキソルビシンをヒト乳管癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（１０００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）で得られた結果を示す。
【図３ａ】図３ａは、パクリタキセルをエストロゲン非依存性ヒト乳腺癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（５０μＭ、１０μＭ、０．５μＭ）で得られた結果を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、パクリタキセルアルブミンをエストロゲン非依存性ヒト乳腺癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（５０μＭ、１０μＭ、０．５μＭ）で得られた結果を示す。
【図４ａ】図４ａは、ドキソルビシンをエストロゲン非依存性ヒト乳腺癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（１０００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）で得られた結果を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、リポソームドキソルビシンをエストロゲン非依存性ヒト乳腺癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（１０００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）で得られた結果を示す。
【図５ａ】図５ａは、パクリタキセルをエストロゲン非依存性ヒト乳腺癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（５０μＭ、１０μＭ、０．５μＭ）で得られた結果を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、パクリタキセルアルブミンをヒト膵臓腺癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（５０μＭ、１０μＭ、０．５μＭ）で得られた結果を示す。
【図６ａ】図６ａは、イリノテカンをヒト膵臓腺癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（５０μＭ、１０μＭ、０．０５μＭ）で得られた結果を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、フルオロウラシルと共にリポソームイリノテカンをヒト膵臓癌細胞にインビトロ投与することにより得られる細胞死のパーセンテージを示し、前記投与は超音波の投与と同時に行われる。図は、異なる総濃度（５０μＭ、１０μＭ、０．０５μＭ）で得られた結果を示す。
【図７】図７は、癌細胞におけるフルオレセインアミン（ＦＡ）の内在化の実験と比較した結果を示す。図７は、特に、５つの実験条件におけるヒト膵臓腺癌細胞へのＦＡの取り込みを示し、前記条件は、超音波の投与の効果を調査するために特別に設計されている。
【図８】図８ａは、ＦＡのヒト膵臓腺癌細胞への取り込みの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって得られた画像を示し、ＦＡは単独で、すなわち超音波及び薬物の投与なしで投与される。  図８ｂは、ＦＡのヒト膵臓腺癌細胞への取り込みの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって得られた画像を示し、前記ＦＡは、超音波を投与せずにリポソームイリノテカンと一緒に投与される。  図８ｃは、ＦＡのヒト膵臓腺癌細胞への取り込みの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって得られた画像を示し、このＦＡは、リポソームイリノテカンと共に、デューティサイクル１２％のパルス超音波の投与と同時に投与される。  図８ｄは、ＦＡのヒト膵臓腺癌細胞への取り込みの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって得られた画像を示し、このＦＡは、デューティサイクル１％のパルス超音波の投与後にリポソームイリノテカンと一緒に投与される。  図８ｅは、ＦＡのヒト膵臓腺癌細胞への取り込みの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって得られた画像を示し、このＦＡは、リポソームイリノテカンと一緒に、デューティサイクル１％のパルス超音波の投与と同時に投与される。
【図９】図９ａは、Ｐｒｏｈａｎｃｅ（Ｇｄ３＋）による細胞膜の細孔の閉鎖の動態を示す。  図９ｂは、Ｐｒｏｈａｎｃｅとリポソームによる細胞膜の細孔の閉鎖の動態を示す。  図９ｃは、Ｔｅｔｒａｍｅｒによる細胞膜の細孔の閉鎖の動態を示す。  図９ｄは、Ｔｅｔｒａｍｅｒとリポソームによる細胞膜の細孔の閉鎖の動態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明のシステムの好ましい実施形態は、以下を含む。
‐超音波周波数で電気エネルギーを提供するように構成された発電機；
‐発電機に電気的に接続された超音波プローブであって、
‐電気エネルギーを、超音波の周波数、デューティサイクル、及び動作時間を含む動作パラメーターによって定義される低強度非集束パルス超音波に変換するように構成された上記超音波プローブ；
‐オペレーターが腫瘍のタイプ、薬物のタイプ、癌細胞が属する患者の身体測定値及び腫瘍のグレードを含む構成データを入力できるようにする入力デバイス；及び
‐入力された構成データに基づいて前記動作パラメーターの値を決定するように構成されたプロセッサであって、ここで、周波数の値は腫瘍のタイプと身体測定値に基づいて決定され、デューティサイクルの値は少なくとも薬物のタイプと腫瘍のタイプに基づいて決定され；
決定された値に従って動作するように発電機と超音波プローブを制御するように構成された上記プロセッサ。
【００３５】
より具体的には、本発明のシステムは、周波数の値のリスト及びデューティサイクルの値のリストを格納するコンピュータ可読メモリを含み、したがって、プロセッサは
‐周波数の値を腫瘍のタイプに割り当てる；及び
‐デューティサイクルの値を、腫瘍のタイプと薬物のタイプを含む２つの構成データに割り当てる
ように構成される。
【００３６】
システムの好ましい実施形態によって生成される超音波の出力密度は、３Ｗ／ｃｍ２未満である。
【００３７】
入力装置は、システムと統合されたタッチスクリーンであることが好ましい。入力デバイスの他の例は、ラップトップ、タブレット、およびスマートフォンである。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、オペレーターが入力するように要求される最初の構成データは、薬物のタイプである。薬物のタイプは、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、イリノテカン、リポソームイリノテカン及びフルオロウラシルからなる群から選択される。
【００３９】
メニューリストから選択するか、薬剤のタイプを打ち込んで入力した後、オペレーターは腫瘍のタイプを選択するように要求され得る。腫瘍のタイプは、ヒト乳管癌、エストロゲン非依存性ヒト乳腺癌及びヒト膵臓腺癌からなる群から選択される。次に、腫瘍のグレードは、次の２つのオプションを選択して入力する必要がある：原発腫瘍（すなわち、原始腫瘍）と二次腫瘍（すなわち、転移）。選択した腫瘍のグレードが：
‐原発腫瘍の場合、薬物のタイプと腫瘍のタイプに基づいてデューティサイクルが決定され、
‐二次腫瘍の場合、二次腫瘍の局在もまたオペレーターが入力する必要がある。この場合、デューティサイクルは、薬物のタイプ、腫瘍のタイプ、及び二次腫瘍の局在に基づいて決定される。
【００４０】
この場合、プロセッサは、腫瘍のタイプ、薬物のタイプ、腫瘍のグレード、及び最終的には二次腫瘍の局在を含む構成データのセットにデューティサイクルの値を割り当てるように構成されている。
【００４１】
たとえば、入力した腫瘍のグレードが原発性の場合、入力した腫瘍のタイプはヒト乳管癌又はエストロゲン非依存性ヒト乳腺癌であり、入力した薬物のタイプはパクリタキセル又はパクリタキセルアルブミン又はドキソルビシン又はリポソームドキソルビシンであり、割り当てられたデューティサイクルは９％である。
【００４２】
たとえば、入力された腫瘍のグレードが原発性で、入力された腫瘍のタイプがヒト膵臓腺癌で、入力された薬物のタイプがパクリタキセル又はパクリタキセルアルブミン又はイリノテカン又はリポソームイリノテカン又はフルオロウラシルである場合、割り当てられるデューティサイクルは１％である。
【００４３】
腫瘍のグレードを選択した後、人体測定を入力する必要がある。オペレーターが指定する必要がある人体測定は、腫瘍のグレードが原発腫瘍である場合は腫瘍のタイプによって、腫瘍のグレードが二次腫瘍である場合は二次腫瘍の局在によって異なる。例えば、人体測定は、腫瘍のタイプがヒト膵臓腺癌である場合は腹囲を含み、腫瘍のタイプがヒト乳管癌である場合は乳房周囲を含み得る。次に、そのような身体測定値に基づいて周波数が決定される。
【００４４】
この場合、プロセッサは、腫瘍のタイプと、腹囲、ボディマスインデックス、乳房周囲、胸郭周囲、及び体脂肪率からなる群から選択される少なくとも１つの身体測定値を含む構成データのセットに周波数の値を割り当てるように構成されている。腫瘍が異なる深度に及ぶ場合、本発明のシステムは、異なる深度に対応する異なる周波数で動作する２つのプローブを含むこともできる。
【００４５】
前述の構成データの入力が完了した後、別の腫瘍に関連する別のパラメーターのセットを選択する可能性もオペレーターに与えられる。例えば、構成データの第１のセットが原発腫瘍を指す場合、前記原発腫瘍の転移に関する構成データも設定することが可能である。本発明のシステムは、実際、２つのプローブを提供することができ、１つは原発腫瘍用の第１のプローブ及び転移用の第２のプローブである。第１のプローブから放射される超音波は、薬物のタイプと原発腫瘍のタイプに応じたデューティサイクルを持つが、第２のプローブから放射される超音波は、薬物のタイプ、原発腫瘍のタイプ、及び二次腫瘍の局在のタイプに応じたデューティサイクルを持つ。
【００４６】
入力された構成データに基づいて、各プローブの動作時間も決定される。より具体的には、腫瘍のタイプ及び薬物のタイプに従って、動作時間は以下を含み得る：‐超音波が投与される１つの時間枠；又は
‐超音波が投与される２つ以上の時間枠；この枠は、超音波が投与されない１つの時間枠によって隔てられている。オペレーターは、この最小動作時間を受け入れるか、最小動作時間を掛けた整数で構成される別の構成データを入力するように求められ、動作時間になる。
【００４７】
この場合、プロセッサは、動作時間の値を、腫瘍のタイプと薬物のタイプを含む一連の構成データに割り当てるように構成されている。
【００４８】
最後に、本発明のシステムの好ましい実施形態では、プローブは複数の超音波トランスデューサーを備えることができ、前記トランスデューサーの第１のサブセットは、ソノポレーションを誘発するために電気エネルギーを超音波に変換する超音波放射体として構成され、前記トランスデューサーの第２のサブセットは、挿入さ介在する任意の媒体で反射された超音波をプロセッサによって読み取り可能な電気信号に変換するための超音波受信機として構成され、プロセッサは以下のようにプログラムされる：
‐トランスデューサーの第１のサブセットによって放射された超音波とトランスデューサーの第２のサブセットによって受信された超音波との間の周波数と振幅の差を計算する；及び
‐放射された超音波の振幅と周波数の値を調整して、上記の違いを補正する。
【００４９】
トランスデューサーの第１と第２のサブセットは、１つのトランスデューサーのみでオーバーラップすることもできる。この場合、プローブは、電気エネルギーを超音波に変換してソノポレーションを誘発する超音波放射体として、及び、介在する任意の媒体で反射された超音波をプロセッサが読み取り可能な電気信号に変換する超音波受信機として構成された、１つの超音波トランスデューサーを含み、このプロセッサは以下のようにプログラムされている：
‐発信された超音波と前記トランスデューサーによって受信された超音波との間の周波数と振幅の差を計算する。そして
‐放射された超音波の振幅と周波数の値を調整して、上記の違いを補正する。
【実施例】
【００５０】
例
本発明のシステムは、ヒト乳癌の２つの細胞株及びヒト膵臓腺癌の１つの細胞株を使用してインビトロで試験された。
【００５１】
特に、以下の細胞株が採用された：
‐ＭＣＦ‐７：ヒト乳管癌；
‐ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１：エストロゲン非依存性ヒト乳腺癌；
‐ＭｉａＰａＣａ‐２：ヒト膵臓腺癌。
【００５２】
次の表は、試験した細胞株の組み合わせと薬剤のタイプをまとめたものである。
【表１】
2021507797.tif 000003
【００５３】
各組み合わせについて、３つの主要な実験条件で細胞死のパーセンテージを測定した。
‐薬物の投与（以下、「ＮＯ‐ＵＳ」条件と呼ぶ）；
‐薬物の投与と、１ＭＨｚの周波数と１秒の期間の非集束パルス低強度超音波の同時投与、この薬物は一意の用量で投与される；
‐周波数が１ＭＨｚ、期間が１秒の非集束パルス低強度超音波の投与と、それに続く薬物の投与；及び
‐薬物の投与、及び１ＭＨｚの周波数、及び１秒の期間の非集束パルス低強度超音波の同時投与、この薬物は、同じ濃度の２つの用量で投与される（以下、「ＵＳ‐ＤＣ」条件と呼ぶ）。
【００５４】
ＮＯ‐ＵＳ以外のすべての実験条件は、デューティサイクルの異なる値に対して複製され、各実験条件は、３つの異なる薬物の総濃度に対して複製された。各細胞株及び各薬物のタイプについて、いくつかの動作時間も試験した。ＵＳ‐ＤＣ条件では、第１の用量の薬物の最初の投与と２０秒間の超音波の同時投与を行った後、第２の用量の薬物の２回目の投与と２０秒間の超音波の同時投与により、より良い結果が得られた。
【００５５】
結果を以下の表に示し、図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂに示す。
【００５６】
特に、表は、上記の３つの異なる薬物の総濃度について、ＵＳの条件とＵＳ‐ＤＣの条件で得られた結果をまとめたものである。後者の条件では、治療の有効性をよりよく表すものとして示されるように、デューティサイクルの２つの値が選択される。特に、細胞株ＭＣＦ‐７及びＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１の場合、デューティサイクルの次の値に対する結果が表示される：
‐デューティサイクル＝１２％（ＵＳ‐ＤＣ＝１２％）
‐デューティサイクル＝９％（ＵＳ‐ＤＣ＝９％）
細胞株ＭｉａＰａＣａ‐２の場合、デューティサイクルの次の値に関連する結果が表示される：
‐デューティサイクル＝１２％（ＵＳ‐ＤＣ＝１２％）
‐デューティサイクル＝１％（ＵＳ‐ＤＣ＝１％）。
【００５７】
例１
次の表では、３つの条件でＭＣＦ‐７の細胞に投与された３つの異なる濃度のパクリタキセルについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにパクリタキセルの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のパクリタキセルの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：パクリタキセルの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のパクリタキセルの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝９％：パクリタキセルの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝９％）の同時投与、その後のパクリタキセルの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００５８】
【表２】
2021507797.tif 000004
上記の表の結果を図１ａにグラフで示す。
【００５９】
例２
次の表では、３つの条件でＭＣＦ‐７の細胞に投与された３つの異なる濃度のパクリタキセルアルブミンについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにパクリタキセルアルブミンの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：パクリタキセルアルブミンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
ＵＳ‐ＤＣ＝９％：パクリタキセルアルブミンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与（デューティサイクル＝９％）、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００６０】
【表３】
2021507797.tif 000005
上記の表の結果を図１ｂにグラフで示す。
【００６１】
例３
次の表では、３つの条件でＭＣＦ‐７の細胞に投与された３つの異なる濃度のドキソルビシンについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにドキソルビシンの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のドキソルビシンの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：第１の用量のドキソルビシンの最初の投与とｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の２０秒間の同時投与、その後の第２の用量のドキソルビシンの２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝９％：第１の用量のドキソルビシンの最初の投与とｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝９％）の２０秒間の同時投与、その後の第２の用量のドキソルビシンの２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００６２】
【表４】
2021507797.tif 000006
上記の表の結果を図２ａにグラフで示す。
【００６３】
例４
次の表では、３つの条件でＭＣＦ‐７の細胞に投与された３つの異なる濃度のリポソームドキソルビシンについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにリポソームドキソルビシンの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のリポソームドキソルビシンの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：リポソームドキソルビシンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のリポソームドキソルビシンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝９％：リポソームドキソルビシンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝９％）の同時投与、その後のリポソームドキソルビシンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００６４】
【表５】
2021507797.tif 000007
上記の表の結果を図２ｂにグラフで示す。
【００６５】
例５
次の表では、３つの条件でＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１の細胞に投与された３つの異なる濃度のパクリタキセルについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにパクリタキセルの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のパクリタキセルの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：パクリタキセルの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のパクリタキセルの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝９％：パクリタキセルの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝９％）の同時投与、その後のパクリタキセルの第２の用量の投与の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００６６】
【表６】
2021507797.tif 000008
上記の表の結果を図３ａにグラフで示す。
【００６７】
例６
次の表では、３つの条件でＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１の細胞に投与された３つの異なる濃度のパクリタキセルアルブミンについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにパクリタキセルの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：パクリタキセルアルブミンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝９％：パクリタキセルアルブミンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝９％）の同時投与、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００６８】
【表７】
2021507797.tif 000009
上記の表の結果を図３ｂにグラフで示す。
【００６９】
例７
次の表では、３つの条件でＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１の細胞に投与された３つの異なる濃度のドキソルビシンについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与しないパクリタキセルの第１の用量（ＮＯ‐ＵＳ）の最初の投与と、その後のドキソルビシンの第２の用量の２回目の投与：
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：第１の用量のドキソルビシンの最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後の第２の用量のドキソルビシンの２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝９％：第１の用量のドキソルビシンの最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝９％）の同時投与、その後の第２の用量のドキソルビシンの２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００７０】
【表８】
2021507797.tif 000010
上記の表の結果を図4aにグラフで示す。
【００７１】
例８
次の表では、３つの条件でＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１の細胞に投与された３つの異なる濃度のリポソームドキソルビシンについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにパクリタキセルの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のリポソームドキソルビシンの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：リポソームドキソルビシンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のリポソームドキソルビシンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝９％：リポソームドキソルビシンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝９％）の同時投与、その後のリポソームドキソルビシンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００７２】
【表９】
2021507797.tif 000011
上記の表の結果を図４ｂにグラフで示す。
【００７３】
例９
次の表では、３つの条件でＭｉａＰａＣａ２の細胞に投与された３つの異なる濃度のパクリタキセルについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにパクリタキセルの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のパクリタキセルの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：パクリタキセルの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のパクリタキセルの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１％：パクリタキセルの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１％）の同時投与、その後のパクリタキセルの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００７４】
【表１０】
2021507797.tif 000012
上記の表の結果を図５ａにグラフで示す。
【００７５】
例１０
次の表では、３つの条件でＭｉａＰａＣａ２の細胞に投与された３つの異なる濃度のパクリタキセルアルブミンについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにパクリタキセルアルブミンの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：パクリタキセルアルブミンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１％：パクリタキセルアルブミンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１％）の同時投与、その後のパクリタキセルアルブミンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００７６】
【表１１】
2021507797.tif 000013
上記の表の結果を図５ｂにグラフで示す。
【００７７】
例１１
次の表では、３つの条件でＭｉａＰａＣａ２の細胞に投与された３つの異なる濃度のイリノテカンについての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにイリノテカンの第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後イリノテカンの第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：イリノテカンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のイリノテカンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１％：イリノテカンの第１の用量の最初の投与と２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１％）の同時投与、その後のイリノテカンの第２の用量の２回目の投与と、さらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００７８】
【表１２】
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上記の表の結果を図６ａにグラフで示す。
【００７９】
例１２
次の表では、３つの条件でＭｉａＰａＣａ２の細胞に投与された３つの異なる濃度のリポソームイリノテカンとフルオロウラシル（ＦＵ）についての細胞死のパーセンテージが報告されている。
‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにリポソームイリノテカンとフルオロウラシルを含む溶液の第１の用量の最初の投与（ＮＯ‐ＵＳ）、その後のリポソームイリノテカンとフルオロウラシルを含む溶液の第２の用量の２回目の投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：リポソームイリノテカンとフルオロウラシルを含む溶液の第１の用量の最初の投与、及び２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１２％）の同時投与、その後のリポソームイリノテカンとフルオロウラシルを含む溶液の第２の用量の２回目の投与、及びさらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与；
‐ＵＳ‐ＤＣ＝１％：リポソームイリノテカンとフルオロウラシルを含む溶液の第１の用量の最初の投与、及び２０秒間のｐＬＩＮＦＵ（デューティサイクル＝１％）の同時投与、その後のリポソームイリノテカンとフルオロウラシルを含む溶液の第２の用量の２回目の投与、及びさらに２０秒間のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００８０】
【表１３】
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上記の表の結果を図６ｂにグラフで示す。
【００８１】
例１３
この例は、フルオレセインアミン（ＦＡ）の内在化の実験に関連している。図７は、特に５つの実験条件でのヒト膵臓腺癌細胞へのＦＡの取り込みを示す。この条件は、超音波の投与の効果を比較するために特別に設計されている。試験した実験条件は次のとおりである。
ＦＡ‐ＮＯ‐ＵＳ‐ＮＯ‐ＤＲＵＧ：薬物を投与せず、超音波を投与せずに、ＦＡのみを投与する。
ＦＡ‐ＬＩ‐ＮＯ‐ＵＳ：超音波を投与せずにＦＡ及びリポソームイリノテカン（ＬＩ）を投与。
ＵＳ‐ＤＣ＝１２％：ＦＡとリポソームイリノテカン（ＬＩ）の投与、デューティサイクル１２％のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
ＵＳ‐ＰＲＥ‐ＤＣ＝１％：デューティサイクル１％のｐＬＩＮＦＵの投与、その後のＦＡとリポソームイリノテカン（ＬＩ）の投与。
ＵＳ‐ＤＣ＝１％：ＦＡとリポソームイリノテカン（ＬＩ）の投与、デューティサイクル１％のｐＬＩＮＦＵの同時投与。
【００８２】
図７では、ＦＡ内在化（％）、すなわち細胞培養ウェルから界面活性剤液体を除去した後に測定されたＦＡのパーセンテージ、つまり細胞内のＦＡのパーセンテージをグラフで示す。
【００８３】
この例の実験結果は、２時間のインキュベーション後に共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）でも分析した。図８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、８ｅは、前述の５つの実験条件における、ヒト膵臓腺癌細胞へのＦＡの取り込みを示す。図７から、ＵＳ‐ＤＣ＝１％の条件で、より高いＦＡ内在化％が得られることが推定できる。
【００８４】
これらの画像から、ＦＡのみ（白で表示）が細胞（灰色で表示）に蓄積されていないことがわかる（図８ａ）。ＦＡをリポソームイリノテカンと一緒に投与すると（図８ｂ）、より高い蛍光密度が観察されるが、細胞外膜周囲レベルでのみである。それは、リポソーム膜のポリエチレングリコールのポリマー鎖とＦＡの間のより大きな化学的相互作用で説明することができる。図８ｃ及び図８ｄ（それぞれＵＳ‐ＤＣ＝１２％及びＵＳ‐ＰＲＥ‐ＤＣ＝１％）では、細胞内のＦＡの存在が明らかになり、ＵＳ‐ＤＣ＝１％条件に対応する図８ｅにおいてＦＡ内在化の最高レベルが示される。ＵＳ‐ＰＲＥ‐ＤＣ＝１％条件では、おそらく超音波の投与後、細胞膜がソノポレーションの前に持っていた透過性に戻るのに数十秒かかるという事実のために、ＦＡ内在化の特定のグレードが達成される。
【００８５】
例１４
この例は、乳がん細胞の細孔の開閉に関する研究に関連している。
【００８６】
グラフ（図９ａ、９ｂ、９ｃ、９ｄ）の各ポイントについて、サンプルにソノポレーションを行う。すべてのサンプルに同量の細胞が含まれている。
【００８７】
Ｘ軸には、細胞のソノポレーションが終了してから、細胞内で内在化を測定する必要がある物質を追加するまでの時間が報告される。
【００８８】
内在化の実験は次のとおりである。
‐時間０分：１分間のソノポレーションが完了するとすぐに、一定量のＰｒｏｈａｎｃｅ（磁気共鳴用の造影剤）が細胞培養に加えられる。１分後、細胞が分離される。
‐時間１分：１分間のソノポレーション、その１分後、一定量のＰｒｏｈａｎｃｅが細胞培養に追加され、さらに１分後に細胞が分離される。
‐時間ｎ分：１分間のソノポレーション、そのｎ分後、一定量のＰｒｏｈａｎｃｅが細胞培養に追加される。さらに１分後、細胞が分離される。
【００８９】
これらの試験は、他の細胞のタイプで行われた試験に加えて、細胞の細孔の閉鎖時間が次の要素に依存することを示す。
‐細胞のタイプ；
‐薬物分子のタイプ（ＰｒｏｈａｎｃｅとＴｅｔｒａｍｅｒは、異なる組成とサイズの薬理学的分子の存在をシミュレートした）
‐ベクター剤（リポソーム）の有無
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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