(57)【要約】  ヒトインスリンアナログを含有する組成物。特に、ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体を含有する組成物が提供される。当該アシル化誘導体組成物は、既存のインスリンアナログ及びそのアシル化誘導体組成物よりも、より安定している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体を含有する医薬組成物であって、前記ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体が、以下の一般式Ｉ、
Ｓ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ  （Ｉ）
（式中、Ｓは、Ｂ鎖の３０位でトレオニンが欠失しているヒトインスリンであり、−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚは、前記インスリンアナログのアシル化修飾基であり、
Ｗは、−ＯＣ（ＣＨ２）ｎＣＯ−を有するジアシル構造であり、ここで、ｎは、２〜１０の整数であり、前記構造のアシル基の1つは、親インスリン若しくはそのアナログのＡ鎖（配列番号１で示される配列）若しくはＢ鎖のＮ末端におけるアミノ酸残基のα-アミノ基と、又は前記Ｂ鎖のリシン残基のε-アミノ基と、アミド結合を形成し、
Ｘは、カルボン酸基を含むジアミノ化合物であり、そのアミノ基の1つと、Ｗにおけるアシル基とを結合することによりアミド結合を形成し、
Ｙは、−Ｄ（ＣＨ２）ｍ−であり、ここで、ｍは、６〜３２の整数、好ましくは１０〜１６の整数、より好ましくは１２〜１４の整数であり、Ｄは、存在しないか又はＣＯ−であり、
Ｚは、−ＣＯＯＨである）
により表される構造を有し、
前記組成物が更に、安定剤、保存剤、ｐＨ調節剤、及び浸透圧調整剤からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含有する、医薬組成物。
【請求項２】
前記ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体のＷが、前記Ｂ鎖の前記リシン残基の前記ε-アミノ基とアミド結合を形成する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体のｎが、２〜５の整数、好ましくは２である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体のＸが、−ＨＮ（ＣＨ２）ｐＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−であり、pが、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、より好ましくは２〜４の整数、最も好ましくは４である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体の−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚが、以下の構造
【化１】
2021512124.tif 000026
好ましくは、
【化２】
2021512124.tif 000027
を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体が、亜鉛と錯体を形成し、好ましくは、アシル化インスリンの６個すべての分子が、４個を超える亜鉛原子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記安定剤が、塩化ナトリウムから選択され、前記塩化ナトリウムの濃度が、好ましくは５〜２０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記保存剤が、フェノール及び／又はｍ−クレゾールから選択され、前記ｐＨ調節剤が、酸及び／又はアルカリから選択され、前記浸透圧調整剤が、グリセリン及び／又はマンニトールから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
以下の成分、
０．１％〜０．５％、好ましくは０．３％〜０．４％のリシンＢ２９(Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、
０．０５％〜０．５％、好ましくは０．１％〜０．２％のフェノール、
０．０５％〜０．５％、好ましくは０．１％〜０．２％のｍ−クレゾール、
１％〜３％、好ましくは１．５％〜２％のグリセリン、
０．０１％〜０．２％、好ましくは０．０５％〜０．０６％の塩化ナトリウム、
を含有し、
６個すべての前記インスリンが、それぞれ４個を超える亜鉛原子を含み、
前記ｐＨ調節剤、及び注射用水が、好ましくは６〜８の、より好ましくは７．４〜７．８のｐＨ値を有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
以下の成分、
リシンＢ２９(Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン  ３．７２ｍｇ、
フェノール  １．５ｍｇ、
Ｍ−クレゾール  １．７２ｍｇ、
グリセリン  １９．６ｍｇ、
塩化ナトリウム  ０．５８ｍｇ、
酢酸亜鉛  １０９．７６μｇ、
水酸化ナトリウム、塩酸を含有し、注射用水で１ｍｌとし、好ましくは６〜８、より好ましくは７．４〜７．８、最も好ましくは７．６のｐＨ値を有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
速効型インスリンを更に含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
インスリンアナログのアシル化誘導体と、安定剤、保存剤、ｐＨ調節剤、及び浸透圧調整剤からなる群から選択されるいずれか１つ以上とを混合するステップを含む、請求項１〜１０のいずれか１項の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項１３】
糖尿病を治療するための薬剤の調製における、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、糖尿病を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中国特許出願ＣＮ２０１８１００９９６６０．８（２０１８年２月１日出願）の優先権を主張し、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体を含有する医薬組成物及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病を治療するための第一選択薬として、ヒトインスリンは、作用の持続時間が短く、それにより頻繁に注射する必要があり、患者にとって非常に不便である。従って、半減期がより長く人体に対する作用期間が長い、いくつかのインスリンアナログ及びその誘導体を得るために、人々は尽力している。それらの中で、アシル基（ａｃｙｌａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）を用いるヒトインスリン又はその類似体の修飾は、インスリンの半減期を増加させる効果的な方法である。出願人の特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９５３７７号（特許文献１）は、Ｂ２９位が長鎖脂肪酸で置換されＢ３０位のアミノ酸が欠失しているヒトインスリンアナログを提供し、そのヒトインスリンアナログの構造及び生物活性を開示する。国際公開第９５０７９３１号（特許文献２）は、Ｂ２９位がテトラデシル側鎖に結合しＢ３０位のアミノ酸が欠失しているインスリン（すなわち、Ｄｅｓ（３０）ヒトインスリン）類似体、及びその調製物を開示する。国際公開第２００５０１２３４７号（特許文献３）は、Ｂ２９位がグルタミン酸及び長鎖脂肪酸で置換され、Ｂ３０位のアミノ酸が欠失しているヒトインスリンアナログを開示する。国際公開第２００７０７４１３３号（特許文献４）は、上記インスリンアナログの調製物を開示し、そして特許において開示され塩化ナトリウムを含有するＬｙｓＢ２９（Ｎε−ヘキサデカノジアシル（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｄｉａｃｙｌ）−γ−グルタミルｄｅ（Ｂ３０）ヒトインスリン（インスリンデグルデク）調製物を開示する。しかし、ＦＤＡにより公開されている情報（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｎｄａ／２０１５／２０３３１３Ｏｒｉｇ１ｓ０００＿２０３３１４Ｏｒｉｇ １ｓ０００ＰｈａｒｍＲ．ｐｄｆ（非特許文献１）)では、塩化ナトリウムがインスリンデグルデクの全身曝露（ｓｙｓｔｅｍ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）における低下をもたらすことが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９５３７７号
【特許文献２】国際公開第９５０７９３１号
【特許文献３】国際公開第２００５０１２３４７号
【特許文献４】国際公開第２００７０７４１３３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｎｄａ／２０１５／２０３３１３Ｏｒｉｇ１ｓ０００＿２０３３１４Ｏｒｉｇ １ｓ０００ＰｈａｒｍＲ．ｐｄｆ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の問題を解決するために、市場におけるインスリンデグルデクの製剤から、塩化ナトリウムは除去されている。
【０００７】
インスリンの全身曝露における低下は、実際に作用可能なインスリンの量の低下をもたらし、それにより、その血糖低下作用が減少する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明により、本発明のインスリンのアシル化誘導体に関して、塩化ナトリウムを含有する液体調製物が、高分子重合体の生成を減少させるだけでなく、インスリンの血糖低下作用に影響を及ぼさないことが、驚いたことに見出される。
【０００９】
（本発明の内容）
本発明は、ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体を含有する医薬組成物を提供し、ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体は、以下の一般式Ｉ、
Ｓ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｉ）
（式中、Ｓは、Ｂ鎖の３０位でトレオニンが欠失しているヒトインスリン（配列番号２で示されるＢ鎖の欠失）、すなわち、Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンであり、−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚは、前記インスリンアナログのアシル化修飾基であり、
Ｗは、−ＯＣ（ＣＨ２）ｎＣＯ−を有するジアシル構造であり、ここで、ｎは、２〜１０の整数であり、前記構造のアシル基の1つは、親インスリン若しくはその類似体のＡ鎖（配列番号１で示される配列）若しくはＢ鎖のＮ末端におけるアミノ酸残基のα−アミノ基と、又は前記Ｂ鎖のリシン残基のε−アミノ基と、アミド結合を形成し、
Ｘは、カルボン酸基を含むジアミノ化合物であり、そのアミノ基の1つと、Ｗにおけるアシル基とを結合することによりアミド結合を形成し、
Ｙは、−Ｄ（ＣＨ２）ｍ−であり、ここで、ｍは、６〜３２の整数、好ましくは１０〜１６の整数、より好ましくは１２〜１４の整数であり、Ｄは、存在しないか又はＣＯ−であり、
Ｚは、−ＣＯＯＨである）、により表される構造を有し、
前記組成物は更に、安定剤、保存剤、ｐＨ調節剤、及び浸透圧調整剤からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含有する。
【００１０】
好ましくは、Ｗは、前記Ｂ鎖の前記リシン残基の前記ε-アミノ基とアミド結合を形成する。好ましくは、ｎは、２〜５の整数、好ましくは２である。
【００１１】
Ｂ鎖の３０位でトレオニンが欠失しているヒトインスリンは、ヒトインスリンアナログであり、ここでＡ及びＢ鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである。
Ａ鎖：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ                      配列番号１
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫ      配列番号２
【００１２】
Ｘにより表されるカルボン酸基を含むジアミノ化合物は、−ＨＮ（ＣＨ２）ｐＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−であってもよく、ここでpは、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、より好ましくは２〜４の整数、最も好ましくは４である。
【００１３】
本発明の特に好ましい実施形態において、−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚが、以下の構造、
【化１】
2021512124.tif 000002
好ましくは、
【化２】
2021512124.tif 000003
を有する。
【００１４】
本発明において特に好ましいヒトインスリンアナログのアシル化誘導体は、慣習的にＮα−（ＨＯＯＣ（ＣＨ２）１４ＣＯ）−Ｎε−（ＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−（ＮεＢ２９−Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン))−Ｌｙｓ−ＯＨ又はＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル））Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンと命名され得て、以下の式（Ｉａ）の特異的構造、
【化３】
2021512124.tif 000004
より好ましくは、以下の式（Ｉｂ）の構造、
【化４】
2021512124.tif 000005
を有する。
【００１５】
本発明の特に好ましい実施形態において、ヒトインスリンアナログの前記アシル化誘導体は、亜鉛と錯体を形成し、これは、ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体の六量体（６−ｍｅｒ）であり、ここで、各六量体は、４個を超える亜鉛原子を含み、すなわち、アシル化インスリンの６分子は、４を超える亜鉛原子を含み、より好ましくは５〜８個の亜鉛原子、特に好ましくは５個の亜鉛原子を含む。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、前記安定剤は、塩化ナトリウムから選択されるがこれに限定されず、塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは５〜２０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭであり、最も好ましくは１０ｍＭである。本発明において塩化ナトリウムの濃度に言及するとき、当該濃度は、最終生成物における塩化ナトリウムの濃度を指す。
【００１７】
本発明の他の実施形態において、前記保存剤は、フェノール及び／又はｍ−クレゾールから選択されるが、これらに限定されない。前記ｐＨ調節剤は、酸及び／又はアルカリから選択され、好ましくは塩酸及び／又は水酸化ナトリウムから選択されるが、これらに限定されない。前記浸透圧調整剤は、グリセロール及び／又はマンニトールから選択されるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態において、前記亜鉛は、任意の亜鉛塩であってもよいが、好ましくは酢酸亜鉛である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、前記組成物は、
０．１％〜０．５％、好ましくは０．３〜０．４％のリシンＢ２９(Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、
０．０５％〜０．５％、好ましくは０．１％〜０．２％のフェノール、
０．０５％〜０．５％、好ましくは０．１％〜０．２％のｍ−クレゾール、
１％〜３％、好ましくは１．５％〜２％のグリセロール、
０．０１％〜０．２％、好ましくは０．０５％〜０．０６％の塩化ナトリウム、
（ここでアシル化インスリンの６個すべての分子は、４個を超える亜鉛原子を含む）、
ｐＨ調節剤、及び注射用水、を含有する。
【００２０】
ｐＨ値は、好ましくは６〜８、より好ましくは７．４〜７．８、最も好ましくは７．６である。
【００２１】
本発明の含有量は、組成物の総量に従って、組成物の総量における各成分の質量（ｇ）体積（１００ｍＬ）分率を指し、例えば、含有量０．０５％は、１００ｍＬの溶液中における０．０５ｇの物質の含有量を指し、その他の含有量も同様である。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、当該組成物は、
リシンＢ２９(Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン  ３．７２ｍｇ、
フェノール  １．５ｍｇ、
ｍ−クレゾール  １．７２ｍｇ、
グリセロール  １９．６ｍｇ、
塩化ナトリウム  ０．５８ｍｇ、
酢酸亜鉛  １０９．７６μｇ、
水酸化ナトリウム、塩酸を含有し、注射用水で１ｍｌとする。
【００２３】
ｐＨ値は、好ましくは６〜８、より好ましくは７．４〜７．８、最も好ましくは７．６である。
【００２４】
本発明の実施形態において、前記組成物は更に、薬学的に許容可能な担体を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態において、前記組成物は、前述のヒトインスリンアナログのアシル化誘導体に加えて、速効型インスリンを含有してもよい。速効型インスリン（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ）は、超短時間作用型インスリンとしても公知であり、注入後に短時間で作用する。皮下注射後１０〜１５分で効果が現れ、ピーク時間は１〜２時間で、４〜６時間持続する。当該技術分野における従来の速効型インスリンとしては、例えば、インスリンアスパルト（ｉｎｓｕｌｉｎ ａｓｐａｒｔ）（例えば、 ＮｏｖｏＲａｐｉｄ）及びインスリンリスプロ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｓｐｒｏ）（例えば、Ｈｕｍａｌｏｇ）が挙げられる。
【００２６】
本発明はまた、当該医薬組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、インスリンアナログのアシル化誘導体と、安定剤、保存剤、ｐＨ調節剤、及び浸透圧調整剤からなる群から選択されるいずれか１つ以上とを混合するステップを含む。
【００２７】
本発明はまた、糖尿病を治療するための薬剤の調製における当該医薬組成物の使用を提供する。
【００２８】
本発明の医薬組成物の具体的な剤形を、限定する必要はない。
【００２９】
更に、本発明は、ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、糖尿病を治療するための方法を提供する。
【００３０】
本発明において、保存剤及び静菌剤は、同じ意味を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】２５℃±２℃でのインスリンデグルデク注射及びＩＮＳ−Ｃ注射の加速安定性の検査結果を示す−ＲＲＴ１．０５不純物。
【図２】２５℃±２℃でのインスリンデグルデク注射及びＩＮＳ−Ｃ注射の加速安定性の検査結果を示す−他の総不純物。
【図３】２５℃±２℃でのインスリンデグルデク注射及びＩＮＳ−Ｃ注射の加速安定性の検査結果を示す−高分子タンパク質。
【図４】２５℃±２℃でのインスリンデグルデク注射及びＩＮＳ−Ｃ注射の長期安定性の検査結果を示す−ＲＲＴ１．０５不純物。
【図５】２５℃±２℃でのインスリンデグルデク注射及びＩＮＳ−Ｃ注射の長期安定性の検査結果を示す−他の総不純物。
【図６】２５℃±２℃でのインスリンデグルデク注射及びＩＮＳ−Ｃ注射の長期安定性の検査結果を示す−高分子タンパク質のＲＲＴ１．０５不純物。
【図７】０〜２４時間以内の投与後のＳＴＺラットの血中グルコースレベル変化曲線を示す。
【図８】投与後のＳＤラットの血漿濃度−時間曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は更に、以下の実施形態及び実験例により、詳細に説明される。これらの実施形態及び実験例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の特定の状態を規定しない実験例は、製造に有益な従来の状態、又は原材料若しくは商品の製造業者により提案される状態と、一般的に一致する。別段の定めがない限り、試薬は、市販の従来の試薬である。
【００３３】
実施例1：リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンの調製
【００３４】
【化５】
2021512124.tif 000006
【００３５】
１．Ｎα−（ヘキサデカン二酸）−Ｎε−（３−アシルプロピオン酸−ＯＳｕ）リシンの調製
Ｘ０１（１５０ｇ、５２４．５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ（２．５Ｌ）に室温にて加えその後、触媒量のＤＭＦ（１．０ｍＬ）を加え、塩化オキサリル（４９ｍＬ）を１００ｍＬ定圧滴下漏斗へ加えてゆっくり反応ボトルに滴下した。約２時間の塩化オキサリルの滴下の間、ガスが生じ、それを連続的に脱気する必要があった。滴下完了後、混合物を室温にて１．５時間撹拌し、その後ＴＨＦを減圧下で遠心脱水した（ｓｐｉｎ−ｄｒｉｅｄ）。ＤＣＭ（８００ｍＬ）及びｔｅｒｔ−ブタノール（５００ｍＬ）を反応フラスコに加え、室温にて一晩撹拌した。ｔｅｒｔ−ブタノール及び塩化メチレンを遠心脱水し、ジクロロメタン（１Ｌ）を加え、混合物をろ過して、不溶性固体を除去した。ろ液を遠心脱水し、カラムにより精製した。所望の成分を収集し、遠心脱水し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル生成物Ｘ０３を回収しながら、石油エーテルで再結晶し、５４ｇの生成物Ｘ０２を得た。
【００３６】
Ｘ０２（２８．５ｇ、８３．３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（５．５４ｇ、４８．１ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルカルボジイミド（７．６ｍＬ）を室温にて加えた。１日間の室温での撹拌の後、ＴＬＣが反応の基本的完了を示した。次いで、反応混合物をろ過して、不溶性固体を除去した。溶媒を減圧下で遠心脱水し、混合物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、２８．５ｇのＸ０４を得た。
【００３７】
Ｘ０４（２２ｇ、５０．１ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２５０ｍＬ）に溶解させ、室温にて撹拌した。リシン誘導体（２０．５ｇ、５５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２１ｍＬ）を反応系にそれぞれ加え、室温にて２４時間撹拌した。反応系を珪藻土によりろ過し、ＴＨＦにより３回洗浄した。溶媒を遠心脱水し、混合物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、３１ｇの生成物Ｘ１１を得た。
【００３８】
Ｘ１１（３０．６ｇ、４６．３ｍｍｏｌ）を、無水エタノール（２００ｍＬ）に溶解し、室温で撹拌した。その後６．０ｇの１０％Ｐｄ/Ｃを加えた。水素ガスを充填し、混合物を激しく撹拌しながら室温にて一晩反応させた。混合物を珪藻土により吸引ろ過し、無水エタノールにより３回洗浄した。ろ液を遠心脱水し、２４．５ｇの粗生成物Ｘ１２を得て、次の反応に直接用いた。
【００３９】
Ｘ１２（２４ｇ、４５．６ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１２．７ｍＬ）を加え、冷却して温度を０℃にした。コハク酸無水物（５．２ｇ、５２ｍｍｏｌ）をバッチにおける反応系に加え、連続して３０分間０℃にて撹拌した。その後、反応系を室温に移し、一晩撹拌した。ＴＨＦを減圧下で遠心脱水した。残渣をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解させ、５％クエン酸溶液により２回（５００ｍＬ×２）洗浄し、飽和食塩水により１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で遠心脱水し、２９．０ｇの粗生成物Ｘ１３を得て、次の反応に直接用いた。
【００４０】
Ｘ１３（２８．５ｇ、４５．５ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（５．５４ｇ、４８．２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルカルボジイミド（７．６ｍＬ）を室温にて加えた。１日間の室温での撹拌の後、ＴＬＣが反応の基本的完了を示した。次いで、反応混合物をろ過して、不溶性固体を除去した。溶媒を減圧下で遠心脱水し、混合物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、２８．５ｇの生成物Ｘ１４を得た。
【００４１】
Ｘ１４（３．０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）に溶解し、室温で４５分間撹拌した。次いで、トリフルオロ酢酸を低温にて減圧下で遠心脱水し、無水エーテルを加え、固体沈殿物を得て、次いでその沈殿物をろ過した。ろ過ケークを無水エーテルにより３回洗浄し、固体を乾燥し、１．８ｇの生成物Ｘ１５を得た。
【００４２】
２．リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンの調製
Ｂ鎖上の３０位でトレオニンが欠失している、５３ｍｇのヒトインスリン（８ｍｇ/ｍＬ、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．５緩衝液）を取り、そのｐＨを１．５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で約１０．７５に調節し、次いで緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．５緩衝液）を用いて４ｍｇ/ｍＬの定容量にした。Ｎα−（ヘキサデカン二酸）−Ｎε−（３−アシルプロピオン酸−ＯＳｕ）リシン（１８ｍｇ）を７ｍＬのアセトニトリルに懸濁し、１．７５ｍＬのこの溶液を、ヒトインスリン（Ｂ鎖上の３０位でトレオニンが欠失している）の溶液に１５分間毎に加え、撹拌しながら反応を開始し、これらを４回に分けて行い、添加完了後、時間調整（タイミング）を開始した。反応の１時間後、溶液ｐＨを酢酸で約７．５に調整し、反応を終了させて、粗溶液を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、反応プロセスを制御した。
【００４３】
３．リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンの調製
前駆体含有粗製溶液を水で希釈して、有機層の含有量を約１５％（ｖ：ｖ）にし、０．４５μｍフィルタ膜によりろ過し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、精製溶液を得た。
【００４４】
４．リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンの限外ろ過及び凍結乾燥
精製溶液を、限外ろ過膜パッケージシステムを用いて注射用水に置き換え、凍結乾燥して、２６ｍｇの凍結乾燥物を得た。得られた分子の構造式は次のとおりである。
【化６】
2021512124.tif 000007
【００４５】
５．リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンの構造の確認
リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンのマススペクトルにより測定された分子量は、６２０３．３７Ｄａであり、これは、６２０３．２１Ｄａの理論分子量と一致する。
【００４６】
標的生成物をＶ８プロテアーゼで消化し、酵素分解生成物をＬＣ−ＭＳ分析により分析し、その結果は、４１６．２３Ｄａ（Ａ１−Ａ４）、２９６８．２９Ｄａ（Ａ５−Ａ１７、Ｂ１−Ｂ１３）、１３７６．５７Ｄａ（Ａ１８−Ａ２１、Ｂ１４−Ｂ２１）及び１５１０．８４Ｄａ（Ｂ２２−Ｂ２９）の分子量をそれぞれ有する合計４つのペプチド断片が生成されたことを示し、これは、ペプチド断片の理論分子量と一致する。これらのうち、Ｂ２２−Ｂ２９ペプチド断片は、脂肪酸鎖で修飾されているペプチド断片である。ＬＣ−ＭＳ/ＭＳを使用して、二次イオン質量分析法でＢ２２−Ｂ２９ペプチドを分析し、質量分析法により、Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイルの修飾部位が、Ｂ２９位のリシンであることが確認された（詳細は、下の表を参照）。更に、エドマン分解を使用してＢ鎖アミノ酸を配列決定したとき、Ｂ２９位のリシンが修飾されたので、２９回目のサイクルは標準のアミノ酸ピークに対応することができなかった。実験結果は、予想と一致した。上記の実験結果を合わせて、修飾部位が予想と一致したことが確認された。
【００４７】
【化７】
2021512124.tif 000008
Ｂ２２−Ｂ２９ペプチド断片の二次イオン質量分析法ｂ／ｙイオンの模式図
【００４８】
Ｂ２２−Ｂ２９ペプチド断片の二次イオン質量分析法ｂ／ｙイオンの表
【００４９】
2021512124.tif 000009
【００５０】
実施形態２：ＩＮＳ−Ｃ注射液の調製
当該実施形態において、ＩＮＳ−Ｃは、リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンを表す。
【００５１】
ＩＮＳ−Ｃ注射液の処方（ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）は、以下の通りである。
【００５２】
2021512124.tif 000010
【００５３】
注：酢酸亜鉛の分子式：C4H6O4Zn・2H2O
【００５４】
当該処方における賦形剤の含有量に従って、使用のために溶液をそれぞれ調製した。
【００５５】
ＩＮＳ−Ｃの活性医薬成分の処方量で賦形剤を混合し、標的量の９０％に注射用水を補充し、ＮａＯＨ溶液又はＨＣｌ溶液でｐＨを７．４〜７．８に調整し、標的ｐＨは７．６であり、次いで注射用水を全量まで添加し、混合物をよく混合した。
【００５６】
試料を採取し、特性、ｐＨ、ＩＮＳ−Ｃ含有量、フェノール含有量、及びｍ−クレゾール含有量を調べた。各指標の標準は以下のとおりである。特性  無色明澄な液体、ｐＨ  ７．４〜７．８、ＩＮＳ−Ｃの含有量  ９７．０％〜１０３．０％、フェノールの含有量  １．４６〜１．５５ｍｇ/ｍＬ、ｍ−クレゾールの含有量  １．６７〜１．７７ｍｇ/ｍＬ。
【００５７】
混合物を０．２２μｍのＰＶＤＦ膜でろ過し、ボトル当たり１．１ｍＬの容量に従って１．０５ｍＬ〜１．１５ｍＬの充填量でろ液を２ｍＬ中性ホウ珪酸ガラス注射ボトルに充填した。ボトルに栓をして蓋を被せた。充填プロセスの間、充填量をモニタし、フィルタ素子の完全性をろ過の前後で試験した。ボトルを光検査に供し、包装した。
【００５８】
実施例３：ＩＮＳ−Ｃ注射液における塩化ナトリウム濃度のスクリーニング
ＩＮＳ−Ｃは、当該実施形態において、リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンを表す。
【００５９】
処方の情報は以下の通りである。
【００６０】
2021512124.tif 000011
【００６１】
組成物の安定性に対する塩化ナトリウムの効果を評価し、その結果は以下の通りであった。
【００６２】
【表１】
2021512124.tif 000012
【００６３】
表１は、塩化ナトリウムが高分子の形成及び他の不純物の形成を低減させることができ、活性物質の安定性を改善させることを示す。
【００６４】
実施形態４：ＩＮＳ−Ｃ注射とインスリンデグルデク注射液との間の安定性比較
ＩＮＳ−Ｃは、当該実施形態において、リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンを表す。
【００６５】
ＩＮＳ−Ｃ注射液とインスリンデグルデク注射液の処方情報は、以下の通りである。
【００６６】
2021512124.tif 000013
【００６７】
Ａ．加速試験
インスリンデグルデク注射液及び３バッチのＩＮＳ−Ｃ注射液のパイロット試験試料を２５℃±２℃での加速試験条件下に置き、試料を判定のためにそれぞれ０、１、２、３、及び６ヶ月で採取し、各指標を調べた。
【００６８】
Ｂ．長期試験
インスリンデグルデク注射液及び３バッチのＩＮＳ−Ｃ注射液のパイロット試験試料を５℃±３℃の低温にて長期保存のために置き、試料を測定、一定間隔での採取及び測定のためにそれぞれ３、６、９、１２、１８、２４及び３６ヶ月で採取した。インスリンデグルデク注射液の調査のための開始点を、その送達時間に基づいて計算した。
【００６９】
【表２】
2021512124.tif 000014
【００７０】
注：外観は、無色、明澄及び透明な溶液である。
【００７１】
【表３−１】
2021512124.tif 000015
【表３−２】
2021512124.tif 000016
【００７２】
注：ＩＮＳ−Ｃ注射液の正立試料と倒立試料との安定性の試験結果間に有意な差異は無い。倒立状態（比較的激しい）の結果のみをここで挙げる。ここで外観は、無色、明澄及び透明な溶液である。
【００７３】
【表４】
2021512124.tif 000017
【００７４】
注：ＩＮＳ−Ｃ注射液の正立試料と倒立試料との安定性の試験結果間に有意な差異は無い。倒立（比較的激しい）状態の結果のみをここで挙げる。ここで外観は、無色、明澄及び透明な溶液である。
【００７５】
実施形態５：ＳＴＺ−誘導Ｉ型糖尿病モデルに対するＩＮＳ−Ｃ注射液及びインスリンデグルデク注射液の血糖降下作用の調査
ＩＮＳ−Ｃは、当該実施形態において、リシンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リシン−Ｎε−オキソブタノイル))Ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンを表す。
【００７６】
１．試験試料
【００７７】
2021512124.tif 000018
【００７８】
２．試験試料の調製
試験試料を、７．５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量下で４℃にて暗所で保存した。投与時に薬物の温度を室温に戻した。
【００７９】
３．実験動物
【００８０】
2021512124.tif 000019
【００８１】
４．実験方法
ＳＰＦラットを実験室環境で７日間飼育し、標準飼料、２０〜２５℃の温度で４０〜６０％湿度の標準ケージを与えた。モデリング1日前に、ラットを１６時間絶食させ、ＳＴＺ（６５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した。1時間後、ラットに飼料を与えた。モデルが確立された後、毎日、十分な量の飲用水（通常より２〜３倍多い量の飲用水を与える）及び飼料を与え、乾燥したままにするため敷料を1日１〜２回交換した。空腹時の血中グルコースを５日目（６時間空腹）に測定し、血中グルコースレベル＞１６．７ｍｍｏｌ/Ｌを有するラットを選択した。血中の糖レベルに基づいて、ラットを無作為に５群に分けた。動物群分け及び投与情報は次のとおりである。
【００８２】
2021512124.tif 000020
【００８３】
投与前に絶食は必要なく、各薬剤を皮下注射した。対照群には、ＩＮＳ−Ｃは取り除いたがＩＮＳ−Ｃ処方の他の成分を含有する、同容量の溶液を注射し、投与後、全てのコースの絶食を行った。ラットの血中グルコースレベルを投与後１、２、４、６、８、１０、１２及び２４時間にて測定した。
【００８４】
すべてのデータをＥｘｃｅｌドキュメントに入力し、平均±ＳＥＭにより表した。有意差の基準としてＰ＜０．０５を有する、一元配置又は二元配置分散分析比較方法に基づき、ＳＰＳＳソフトウェアを用いてデータの統計分析を実施した。
【００８５】
５．結果
対照群の基礎血中グルコースレベルは、投与前に２６．６ｍｍｏｌ/Ｌであり、投与後徐々に低下し、２４時間後１０．１ｍｍｏｌ/Ｌに達し、血中グルコースの変化値は、１５．５ｍｍｏｌ/Ｌであった。インスリンデグルデク投与の陽性薬剤群における投与前後の血中グルコースの変化値は、２０．１ｍｍｏｌ/Ｌであった。インスリンデグルデク陽性薬剤群における血中グルコースレベルは、投与後１、２、４、６、８、１０及び１２時間にて対照群と著しく異なり、これは、動物モデル及び実験方法の有効性を示している。
【００８６】
対照群と比較して、試験薬剤のＩＮＳ−Ｃは、投与後２４時間以内で動物の血中グルコースレベルを著しく低下させることができた。血中グルコース値から分かるように、試験薬剤群の血中グルコース値（３．９±０．６ｍｍｏｌ/Ｌ）は、対照群（１０．１±３．３ｍｍｏｌ/Ｌ）より低く、またインスリンデグルデク（６．４±１．４ｍｍｏｌ/Ｌ）よりも低く、これは、ＩＮＳ−Ｃ注射液が良好な長時間作用型血糖降下作用を有することを示している。各群の０〜２４時間以内の血中グルコース低下における差異を比較し、具体的な値を表５に示す。
【００８７】
【表５】
2021512124.tif 000021
【００８８】
注：対照群、インスリンデグルデク群：Ｎ=１０、ＩＮＳ−Ｃ群：Ｎ＝９；＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ 対照群
【００８９】
同じ実験方法に従って、ラットの血糖低下に対する塩化ナトリウム無しのＩＮＳ−Ｃ注射液及びインスリンデグルデク注射液の効果を比較した。結果により、この血糖低下曲線が上記の実験のものと基本的に同じであることが示され、塩化ナトリウムの有無がＩＮＳ−Ｃの曝露にほとんど影響を及ぼさないことが証明された。
【００９０】
実施例６：塩化ナトリウム含有調製物、塩化ナトリウム非含有調製物、及び正常なラットにおいて室温で２０時間保持した後の塩化ナトリウム含有調製物の薬物動態特性の調査
【００９１】
実験動物
【００９２】
2021512124.tif 000022
【００９３】
１.実験方法：
ＳＤラットを５日間動物室に慣れさせ、２０〜２５℃の温度で４０〜６０％湿度の標準ケージを与えた。投与前に、体重に従ってそれらを無作為に３群に分けた。群分け情報は次のとおりである。
【００９４】
2021512124.tif 000023
【００９５】
群１及び群２：塩化ナトリウム非含有ＩＮＳ−Ｃ調製物（６００ｎｍｏｌ/ｍＬ）又は塩化ナトリウム含有ＩＮＳ−Ｃ調製物（６００ｎｍｏｌ/ｍＬ）を投与前にブランク（ｂｌａｎｋ）溶媒で５０ｎｍｏｌ/ｍＬに希釈した。群３：塩化ナトリウム含有ＩＮＳ−Ｃ調製物（６００ｎｍｏｌ/ｍＬ）を暗所及び室温環境において２０時間保持し、次いで投与前にブランク溶媒で５０ｎｍｏｌ/ｍＬに希釈し、ここで塩化ナトリウム群における塩化ナトリウム濃度は、０．５８ｍｇ/ｍＬであった。投与前に絶食は必要なく、各試験薬を１回皮下注射した。投与前並びに投与後０．５、１、２、４、８、１２及び２４時間の時点当たり約０．２ｍＬで、頸静脈穿刺を介して各動物から血液試料を収集し、凝固剤を含有する試験管に入れた。血液試料を収集し、ラベル付きの遠心分離管に保管し、血清を遠心分離し分けた（遠心分離条件：５０００ｒｐｍ、１０分、２〜８℃）。
【００９６】
ＬＣ−ＭＳ/ＭＳにより、薬物濃度について血清試料を測定し、主な薬物動態パラメータを計算し、スチューデントｔ−検定を用いて統計学的差異を分析した。
【００９７】
２．実験結果：
血中薬物濃度−時間曲線を得るために、各タイミングで平均血中薬物濃度（個別の血中薬物濃度については表７を参照）は縦座標として示され、時点は横座標として示される（図８）。この結果により、経時的な動物の３群における試験薬の濃度の傾向は、基本的に同じであることが示される。主な薬物動態パラメータは、表６に示される。この結果により、群間の主な薬物動態パラメータは、統計学的差異が無く、基本的に同じであることが示される。
【００９８】
実験結果により、調製物への塩化ナトリウムの追加は、ラットの薬物動態特性に有意な影響を及ぼさず、室温で２０時間保持することは、試験薬の薬物動態特性に有意な影響を及ぼさないことが示される。
【００９９】
【表６】
2021512124.tif 000024
【０１００】
【表７】
2021512124.tif 000025
【０１０１】
本発明の具体的な実施形態は前述で示されたが、前述の実施形態は単に例示的なものであり、本発明の原理及び本質から逸脱することなく様々な変更又は修正がなされ得ることが、当業者により理解されるべきである。従って、本発明の保護の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。
【図１】
2021512124.tif 000028
【図２】
2021512124.tif 000029
【図３】
2021512124.tif 000030
【図４】
2021512124.tif 000031
【図５】
2021512124.tif 000032
【図６】
2021512124.tif 000033
【図７】
2021512124.tif 000034
【図８】
2021512124.tif 000035
【配列表】
2021512124000001.app
【国際調査報告】
2021512124.tif 000036
2021512124.tif 000037
2021512124.tif 000038
2021512124.tif 000039
2021512124.tif 000040
2021512124.tif 000041
2021512124.tif 000042
2021512124.tif 000043
2021512124.tif 000044
2021512124.tif 000045