(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、変異コンセンサスＰＲＡＭＥ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸分子である。変異コンセンサスＰＲＡＭＥ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含むベクター、組成物、およびワクチンを開示する。ＰＲＡＭＥを発現する腫瘍を有する対象を治療する方法、およびＰＲＡＭＥを発現する腫瘍を予防する方法を開示する。変異コンセンサスＰＲＡＭＥ抗原を開示する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項６】
前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、組成物。
【請求項８】
請求項５または６に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項５もしくは６に記載のベクターを含む、ワクチン。
【請求項１２】
抗原をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記抗原が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ワクチン。
【請求項１３】
抗原をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記抗原が、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列を含む、ワクチン。
【請求項１４】
前記核酸分子が、配列番号１に示される核酸配列または配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４に示される配列を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１５】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１６】
アジュバントをさらに含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記アジュバントが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳである、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
異常なＰＲＡＭＥ発現を特徴とする細胞を有する対象を治療する方法であって、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のワクチンの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
対象においてがんを治療する方法であって、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のワクチンの治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記がんが、卵巣がんである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記がんが、上皮性卵巣がんである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、漿液性卵巣がんである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
異常なＰＲＡＭＥ発現を特徴とする細胞に対して対象にワクチン接種する方法であって、免疫応答を誘発するのに有効な量の１１〜１７のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項２４】
対象において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のワクチンの治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記誘発される免疫応答が、細胞性応答、体液性免疫応答、または細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞性免疫応答が、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、もしくはそれらの両方の誘導または分泌を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記誘発される免疫応答が、ＰＲＡＭＥ抗原を発現する細胞、腫瘍、またはがんの増殖を促進する１つ以上の免疫抑制因子の阻害を含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与することが、エレクトロポレーションを含む、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ワクチンが、前記対象の１つ以上の部位に投与される、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
薬剤として使用するための、配列番号１に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３１】
薬剤として使用するための、配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３２】
がんの治療における薬剤としての使用のための、配列番号１に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３３】
がんの治療における薬剤として使用するための、配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３４】
薬剤の調製において使用するための、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３５】
薬剤の調製において使用するための、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３６】
がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３７】
がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５９８，２９０号の優先権および利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１２月１２日に作成され、１０４４０９＿０００４４５＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、７，２３１バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）の抗原およびそれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、かかるＰＲＡＭＥ免疫原および／または核酸分子を含むワクチンに関する。本発明はさらに、免疫応答を誘導し、ＰＲＡＭＥを発現するがん細胞および腫瘍を有する対象を予防および／または治療するためにワクチンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんは、世界中で主要な死因の１つであり、米国では、２番目に多い死因であり、４人に１人近くの死を占める。がんワクチン市場は急速に成長している。有効な腫瘍ワクチンは、腫瘍の増殖を予防するために有用であり得、かつ／または進行がんの患者の標準治療のより有効で毒性が低い代替品として有用であり得る。がんと関連する抗原、したがって抗腫瘍ワクチンの標的はＰＲＡＭＥである。
【０００５】
ＰＲＡＭＥは、当初、ヒトメラノーマにおいてＨＬＡ−Ａ２４制限抗原ペプチドをコードする遺伝子として特定され、自己細胞傷害性Ｔ細胞性免疫応答を引き起こす。ヒトＰＲＡＭＥ遺伝子は、２２番染色体（ＨＳＡ２２）に位置し、ＰＲＡＭＥがレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）経路を妨害する７つのロイシンリッチ（ＬＸＸＬＬ）モチーフを有するタンパク質をコードし、ＲＡ誘導性分化、成長停止、およびアポトーシスの阻害につながる（Ｅｐｐｉｎｇ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＰＲＡＭＥ  ｉｓ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １２２，８３５−８４７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００５．０７．００３（２００５））。このように、ＰＲＡＭＥは、シグナル伝達経路の転写抑制因子として機能し、ＰＲＡＭＥの過剰発現は、腫瘍形成をもたらす。
【０００６】
精巣を除くほとんどすべての正常な成人組織でその発現が低いか、または存在しないため、ＰＲＡＭＥは、がん精巣抗原（ＣＴＡ）とみなされる。メラノーマに加えて、ＰＲＡＭＥは、急性および慢性白血病、多発性骨髄腫、髄芽腫、肉腫、頭頸部がん、乳がん、非小細胞肺がん、腎がん、ならびに卵巣がんを含む、他の様々なヒト悪性腫瘍で過剰発現する。卵巣がんの研究では、ＰＲＡＭＥ発現は、外科的試料の１００％で特定された（ｎ＝２７）（Ｂｒｅｎｎｅ，Ｋ．，Ｎｙｍｏｅｎ，Ｄ．Ａ．，Ｒｅｉｃｈ，Ｒ．＆Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．ＰＲＡＭＥ（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ）ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｒｏｍ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３７，２４０−２４７，ｄｏｉ：１０．１３０９／ＡＪＣＰＧＡ９５ＫＶＳＡＵＤＭＦ（２０１２））。
【０００７】
がんの予防、診断、および治療は、多くの異なる形態をとり得る。予防には、素因（例えば、特定の遺伝的バリアント）のスクリーニング、挙動の改変（例えば、喫煙、食事、および身体活動の量）、およびウイルスに対するワクチン接種（例えば、ヒト乳頭腫ウイルスＢ型肝炎ウイルスなど）が含まれる。治療には、化学療法、放射線療法、および腫瘍またはがん性組織の外科的切除などを含み得る。多数の予防および治療法が利用可能であるにもかかわらず、かかる方法は、がんを効果的に予防および／または治療する上で限られた成功しか収めないことが多い。
【０００８】
がんの治療および予防のためのワクチンは、興味深いものである。しかしながら、腫瘍細胞抗原を標的とする既存のワクチンは、インビボでの不十分な抗原発現により制限されている。したがって、当技術分野では、がんを予防および／または治療し、がんに罹患している対象の死亡率を低減するための安全かつ効果的なワクチンおよびそれらの使用方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、配列番号１を含む核酸分子、および配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１に示される核酸配列を含む。さらなる実施形態では、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４に示される核酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、核酸分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。さらなる実施形態では、核酸分子は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、ベクターは、請求項１に記載の核酸分子を含む。
【００１０】
さらに別の実施形態では、核酸分子は、ＰＲＡＭＥ抗原をコードする。いくつかの実施形態では、コードされるＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされるＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２を含む。
【００１１】
本明細書に記載される核酸分子は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１に示される核酸配列を含む。特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４に示される核酸配列を含む。さらなる実施形態では、ベクターは、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、ベクターは、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、ベクターは、請求項１に記載の核酸分子を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸は、制御性要素に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、制御性要素は、プロモーターおよび／またはポリアデニル化シグナルである。さらなる実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である。なおさらなる実施形態では、ポリ−アデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である。
【００１３】
配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列を含む、ＰＲＡＭＥ抗原タンパク質が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２を含む。
【００１４】
ワクチンは、ＰＲＡＭＥ抗原を含み、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列を含む抗原も提供される。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号１を含む核酸分子によってコードされる。
【００１５】
開示されるＰＲＡＭＥ抗原をコードする核酸分子を含むワクチンが本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、コードされるＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされるＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号１を含む核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、プラスミドまたはウイルスベクターを含むがこれらに限定されないベクターに組み込まれる。
【００１６】
開示されるワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。特定の実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳである。
【００１７】
異常なＰＲＡＭＥ発現を特徴とする細胞を有する対象を治療するための方法であって、ワクチンの治療有効量を投与することを含む方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、投与は、エレクトロポレーションステップを含む。他の実施形態では、投与は、対象の１つ以上の部位で行われる。
【００１８】
対象においてがんを治療する方法であって、方法が、ワクチンの治療有効量を対象に投与することを含む、方法が本明細書でさらに記載される。異常なＰＲＡＭＥ発現を特徴とする細胞に対して対象にワクチン接種するための方法も提供され、免疫応答を誘発するのに有効な量でワクチンを投与することを含む。この開示で教示される方法で投与されるワクチンは、上述されるような核酸を含む。いくつかの実施形態では、投与は、エレクトロポレーションステップを含む。他の実施形態では、投与は、対象の１つ以上の部位で行われる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、薬剤として使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療における薬剤として使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、薬剤の調製において使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療のための薬剤の調製において使用するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ＰＲＡＭＥの図式表現を示す。図１Ａは、ＰＲＡＭＥタンパク質における７つの推定核内受容体（ＮＲ）ボックス（ＬＸＸＬＬモチーフ）のアミノ酸残基番号の位置のグラフ表示を提供する。図１Ｂは、各ＮＲボックスについて、隣接するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列データを提供する。
【図１Ｂ】ＰＲＡＭＥの図式表現を示す。図１Ａは、ＰＲＡＭＥタンパク質における７つの推定核内受容体（ＮＲ）ボックス（ＬＸＸＬＬモチーフ）のアミノ酸残基番号の位置のグラフ表示を提供する。図１Ｂは、各ＮＲボックスについて、隣接するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列データを提供する。
【図２】改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥとヒトＰＲＡＭＥ配列との配列アラインメントを提供する。
【図３】一般に、ｐＧＸ１４２１を生成するクローニング反応を示す。
【図４】合成コンセンサスＰＲＡＭＥをトランスフェクトした細胞株におけるＰＲＡＭＥ抗原の発現のウエスタンブロット分析による確認を示す。
【図５】合成コンセンサスＰＲＡＭＥの発現を、対照（ｐＶＡＸ）と比較するイムノアッセイの結果を示す。
【図６】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて実施した免疫原性試験の免疫化および採血スケジュールを示す。
【図７】マウスにおけるｐＧＸ１４１１の用量応答を示す。
【図８Ａ】ｐＧＸ１４１１がマウスにおいて免疫原性であることの確認を示す。
【図８Ｂ】ｐＧＸ１４１１の投与後のマウスまたは未処理マウスにおける免疫応答をグラフで示す。
【図９Ａ】マウスにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を決定するためのフローサイトメトリー分析の結果をグラフで示す。詳細には、図９Ａおよび図９Ｂは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＩＦＮγを産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｂ】マウスにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を決定するためのフローサイトメトリー分析の結果をグラフで示す。詳細には、図９Ａおよび図９Ｂは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＩＦＮγを産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃおよび図９Ｄは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＣＤ１０７ａ＋を産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｄ】図９Ｃおよび図９Ｄは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＣＤ１０７ａ＋を産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅおよび図９Ｆは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＴＮＦαを産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｆ】図９Ｅおよび図９Ｆは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＴＮＦαを産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図１０】未処理対照と比較した、５、２５、および５０μｇのｐＧＸ１４１１による処理後のエンドポイント力価をグラフで示す。
【図１１】がん性組織の免疫組織化学染色を示す。
【図１２】合成コンセンサスＰＲＡＭＥおよび改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥを投与したマウスにおける免疫応答の比較をグラフで示す。
【図１３】非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究についての免疫化および採血スケジュール示す。
【図１４Ａ】ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した細胞性免疫原性を示す。図１４Ａは、経時的な免疫化群による平均ＩＦＮγ応答を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、個々のＮＨＰについてのＩＦＮγ応答を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、群内のバリエーションとともに群内のＩＦＮγ応答を示す。ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ６００６の投与のタイミングは、矢印１〜４で示した。
【図１５Ａ】ｐＧＸ１４２１およびＰＧＸ６００６を投与したＮＨＰにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。図１５Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答をグラフで示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＣＤ８＋応答をグラフで示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答をグラフで示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、免疫化後のＣＤ８＋Ｔ細胞表現型における変化を示す。
【図１６Ａ】ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ１４２１がｐＧＸ６００６（ＩＬ−１２）と組み合わせて誘導する細胞性免疫応答を示す。図１６Ａは、ｐＧＸ１４２１を投与した個々のＮＨＰにおけるＩＦＮγ応答を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ６００６の両方を投与した個々のＮＨＰにおけるＩＦＮγ応答を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１６Ａおよび図１６Ｂに示される応答の比較を提供する。ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ１４２１をｐＧＸ６００６と組み合わせて投与するタイミングは、矢印１〜４で示した。
【図１７Ａ】フローサイトメトリーで特徴付けしたｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ１４２１とｐＧＸ６００６との組み合わせによって誘導される細胞性免疫応答を示す。図１７Ａは、任意の個々のレシピエントにおける最小のＣＤ４＋応答を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαの違いを示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ｐＧＸ１４２１単独投与よりも大きいｐＧＸ１４２１／ｐＧＸ６００６投与のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαの違いを示す。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、ｐＧＸ１４２１を単独でまたはｐＧＸ６００６と組み合わせて投与したＮＨＰにおけるＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答を示す。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαの違いを示す。
【図１８Ａ】ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＩＦＮγ応答（図１８Ａ）と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたそれらの応答（図１８Ｂ）とを比較した。
【図１８Ｂ】ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＩＦＮγ応答（図１８Ａ）と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたそれらの応答（図１８Ｂ）とを比較した。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、比較を容易にするために、図１８Ａおよび図１８Ｂのデータを組み合わせる。ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１、およびｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与のタイミングは、矢印１〜４で示した。
【図１９Ａ】ｐＧＸ１４２１をｐＧＸ６００６と組み合わせて投与することによって誘導される細胞性免疫応答と、ｐＧＸ１４１１をｐＧＸ６００６と組み合わせて投与することによって誘導されるそれらの同じ応答と、を示す。詳細には、図１９Ａは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｄは、これらの２つの群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｅは、これらの２つの群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｄは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ａは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｄは、これらの２つの群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｅ】図１９Ｂは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｅは、これらの２つの群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｆ】図１９Ｃは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｆは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ＰＲＡＭＥ抗原を含むワクチンに関する。ワクチンは、ＰＲＡＭＥを発現するがんの治療および／または予防を提供する。本発明のワクチンは、治療を必要とする対象のがんの特定の予防または治療のための特定のがん抗原の任意の組み合わせを提供することができる。
【００２２】
組換えがん抗原の核酸およびそのコードされるアミノ酸配列を設計するための１つの方法は、天然がん抗原の全体的なアミノ酸配列において特定のアミノ酸を変化させる変異を導入することによるものである。変異の導入は、がん抗原をあまり改変しないため、哺乳動物対象、好ましくはヒトまたはイヌ対象にわたり普遍的に適用することはできないが、結果として生じるアミノ酸配列は、免疫応答を生成するために、寛容性を破壊するか、または外来抗原と見なされるように十分に変化する。別の様式は、それに対応する天然がん抗原に対して少なくとも８５％〜最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％〜最大９８％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９３％〜最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは、少なくとも９５％〜最大９８％の配列同一性を有するコンセンサス組換えがん抗原を作製することであり得る。いくつかの実施形態では、組換えがん抗原は、それに対応する天然がん抗原に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性である。天然がん抗原は、特定のがんまたはがん腫瘍に通常関連する抗原である。がん抗原に応じて、がん抗原のコンセンサス配列は、哺乳動物種全体、または種のサブタイプ内、またはウイルス株全体、または血清型にわたることができる。いくつかのがん抗原は、がん抗原の野生型アミノ酸配列と大きく異ならない。いくつかのがん抗原は、種にわたり多岐の核酸／アミノ酸配列を有し、コンセンサス配列を生成できない。これらの事例では、組換えがん抗原は、寛容性を破壊して生成し、それに対応する天然がん抗原に対して少なくとも８５％〜最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％〜最大９８％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９３％〜最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは、少なくとも９５％〜最大９８％の配列同一性を有する免疫応答が生成される。いくつかの事例では、組換えがん抗原は、それに対応する天然がん抗原に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性である。前述のアプローチを組み合わせて、最終的な組換えがん抗原が、上述される天然がん抗原アミノ酸配列との類似性パーセントを有するようにすることができる。
【００２３】
本開示のＰＲＡＭＥ抗原は、異なる種または種内の異なるアイソフォームからのＰＲＡＭＥのアミノ酸または核酸配列に由来する合成コンセンサスＰＲＡＭＥ抗原であり得、したがって、合成コンセンサスＰＲＡＭＥ抗原は非天然である。合成コンセンサスＰＲＡＭＥ抗原は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）と相互作用または相互作用を媒介するタンパク質ドメイン内のアミノ酸置換も含む。詳細には、アミノ酸残基４８７および４８８でのロイシンアミノ酸残基は、バリン残基によって置換され得る。さらに、ＰＲＡＭＥ抗原は、それぞれ、発現および免疫原性を増強するために、コザック制御性配列および／またはＩｇＥリーダー配列を含み得る。
【００２４】
組換えＰＲＡＭＥは、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価の抗体応答を誘導し、それにより、抗原を発現するがんまたは腫瘍に対して直接的もしくは反応性である免疫応答を誘導または誘発する。いくつかの実施形態において、誘導または誘発された免疫応答は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性免疫応答の両方であり得る。いくつかの実施形態では、誘導または誘発された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の誘導または分泌を含むことができる。他の実施形態では、誘導または誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生される可溶性因子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ−１、および免疫チェックポイント分子を上方制御する因子を低減または阻害することができる。
【００２５】
ワクチンは、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わせて、細胞性および体液性免疫応答の両方の刺激を増強できる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１抗体を使用すると、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを防止する。全体として、免疫系により認識されるようにがん抗原を設計することは、腫瘍細胞による他の形態の免疫抑制を克服するのに役立ち、これらのワクチンは、抑制または阻害療法（抗ＰＤ−１および抗ＰＤＬ−１抗体療法など）と組み合わせて使用して、Ｔ細胞および／またはＢ細胞応答をさらに増強できる。
【００２６】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先される。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及したすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。
【００２７】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（複数可））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（複数可））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（複数可））」、およびそれらの変形の用語は、追加の行為または構造の可能性を排除しない、制限のない過渡的な句、用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」には、文脈から明確に指示されない限り、複数の参照が含まれる。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、「からなる」および「本質的にからなる」他の実施形態も企図する。
【００２８】
本明細書の数値範囲の列挙については、列挙された範囲の最小値および最大値と同じ程度の精度を有する各々の介在する値が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて７および８の数値が企図され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数値が、明示的に企図される。
【００２９】
本明細書で使用される「アジュバント」は、本明細書で記載されるＰＲＡＭＥ抗原および／または本明細書で記載される抗原をコードする核酸分子の免疫原性を増強するために本明細書で記載されるワクチンに追加される任意の分子を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、およびそれらの誘導体を含む。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製された抗体、またはその任意の混合物であり得、それに由来する所望されるエピトープまたは配列に対して十分な結合特異性を示す。
【００３１】
「ＰＲＡＭＥ抗原」とは、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６を含む、変異ＰＲＡＭＥアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。ＰＲＡＭＥ抗原は、他のタンパク質からのものなどのシグナルペプチドを任意で含み得る。例えば、シグナルペプチドを含むＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【００３２】
本明細書で使用される「コード化配列」または「コード化核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード化配列は、核酸が投与される対象または哺乳動物の細胞における発現を指示することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御要素に作動可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。
【００３３】
本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、核酸がヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間のワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味し得ることを意味する。
【００３４】
本明細書で使用される、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、異なる生物からの同じ遺伝子に対する複数の配列のアラインメントの分析に基づいたポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。コンセンサス配列を含むタンパク質および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンを使用して、抗原に対して広範な免疫を誘導することができる。
【００３５】
本明細書で使用される「定電流」は、同じ組織に送達される電気パルスの持続時間にわたって、組織または該組織を規定する細胞によって受け取られるまたは経験される電流を表す。電気パルスは、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスから送達される。本明細書で提供されるエレクトロポレーションデバイスは、好ましくは瞬間的なフィードバックを有するフィードバック要素を有するので、この電流は、電気パルスの寿命にわたって該組織内で一定のアンペア数のままである。フィードバック要素は、パルスの持続時間全体で組織（または細胞）の抵抗を測定し、エレクトロポレーションデバイスにその電気エネルギー出力を変化（例えば、電圧を増加）させることができるため、同じ組織の電流は電気パルス全体で（マイクロ秒のオーダーで）、またパルス間で一定のままである。いくつかの実施形態において、フィードバック要素は、コントローラを含む。
【００３６】
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」は、互換的に使用され得、かつ提供されたエレクトロポレーションデバイスの能動的応答を意味し得、これは、電極間の組織の電流を測定し、それに応じて電流を一定レベルに維持するために、ＥＰデバイスによって供給されるエネルギー出力を変更することを含む。この一定レベルは、パルス配列または電気治療の開始前にユーザによって事前設定される。フィードバックは、電気回路が、電極間の組織の電流を継続的にモニタリングし、そのモニタリングされた電流（または組織内の電流）をプリセット電流と比較し、エネルギー出力調整を継続的に行って、モニタリングされた電流をプリセットレベルに維持するため、エレクトロポレーションデバイスのエレクトロポレーション構成要素、例えば、コントローラによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、瞬間的であり得る。
【００３７】
本明細書で使用される「分散電流」は、本明細書で記載される電気穿孔デバイスの様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、ここで、パターンは、エレクトロポレーションされている組織の任意の領域におけるエレクトロポレーション関連熱ストレスの発生を最小化、または好ましくは排除する。
【００３８】
本明細書で互換的に使用される「エレクトロポレーション」、「電気透過性」、または「動電学的増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微視的経路（細孔）を誘導する膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、水などの生体分子が細胞膜の一方の側からもう一方の側へと通過することができる。
【００３９】
核酸配列に関して本明細書で使用される「断片」は、本明細書で開示される抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することが可能なポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載のタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。断片は、追加された異種シグナルペプチドを除いて、以下に示される１つ以上の核酸配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。断片は、以下に示される１つ以上の核酸配列の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得、さらに任意で、異種シグナルペプチドをコードする配列を含み、同一性パーセントを計算する際に含まれない。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード化配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード化配列は、コード化配列の断片に連結され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、断片は、以下に示される少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも２０ヌクレオチド以上、少なくとも３０ヌクレオチド以上、少なくとも４０ヌクレオチド以上、少なくとも５０ヌクレオチド以上、少なくとも６０ヌクレオチド以上、少なくとも７０ヌクレオチド以上、少なくとも８０ヌクレオチド以上、少なくとも９０ヌクレオチド以上、少なくとも１００ヌクレオチド以上、少なくとも１５０ヌクレオチド以上、少なくとも２００ヌクレオチド以上、少なくとも２５０ヌクレオチド以上、少なくとも３００ヌクレオチド以上、少なくとも３５０ヌクレオチド以上、少なくとも４００ヌクレオチド以上、少なくとも４５０ヌクレオチド以上、少なくとも５００ヌクレオチド以上、少なくとも５５０ヌクレオチド以上、少なくとも６００ヌクレオチド以上、少なくとも６５０ヌクレオチド以上、少なくとも７００ヌクレオチド以上、少なくとも７５０ヌクレオチド以上、少なくとも８００ヌクレオチド以上、少なくとも８５０ヌクレオチド以上、少なくとも９００ヌクレオチド以上、少なくとも９５０ヌクレオチド以上、または少なくとも１０００ヌクレオチド以上を含むことができる。
【００４１】
ポリペプチド配列に関する「断片」または「免疫原性断片」は、本明細書に開示される抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。断片は、以下の様々なアミノ酸配列の少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。コンセンサスタンパク質の断片は、追加された異種シグナルペプチドを除いて、コンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。断片は、以下に示される１つ以上のアミノ配列の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得、さらに任意で、異種シグナルペプチドを含み、同一性パーセントを計算する際に含まれない。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、コンセンサスタンパク質の断片は、本明細書に開示されるタンパク質配列の少なくとも２０アミノ酸以上、少なくとも３０アミノ酸以上、少なくとも４０アミノ酸以上、少なくとも５０アミノ酸以上、少なくとも６０アミノ酸以上、少なくとも７０アミノ酸以上、少なくとも８０アミノ酸以上、少なくとも９０アミノ酸以上、少なくとも１００アミノ酸以上、少なくとも１１０アミノ酸以上、少なくとも１２０アミノ酸以上、少なくとも１３０アミノ酸以上、少なくとも１４０アミノ酸以上、少なくとも１５０アミノ酸以上、少なくとも１６０アミノ酸以上、少なくとも１７０アミノ酸以上、少なくとも１８０アミノ酸以上を含むことができる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード化配列は、核酸分子が投与される対象の細胞における発現を指示することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御要素に作動可能に連結された開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用する場合、「発現可能な形態」という用語は、対象の細胞に存在する場合に、コード化配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード化配列に機能的に連結された必要な制御性要素を含む遺伝子構築物を指す。
【００４４】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、ある程度の相補性を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）があり得る。完全に相補的な配列が、標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、機能的用語「実質的に相同」を使用して言及される。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合に、本明細書で使用される「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズできるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合に、本明細書で使用される「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸鋳型配列にハイブリダイズできる（すなわち、その相補体である）プローブを指す。
【００４５】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が、特定の領域にわたって同じである特定の割合の残基を有することを意味する。割合は、２つの配列を最適に整列し、指定された領域にわたり２つの配列を比較し、一致した位置の数を得るために、両方の配列で同一の残基が発生する位置の数を決定し、一致した位置の数を指定された領域の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることで計算できる。２つの配列の長さが異なる場合、またはアラインメントによって１つ以上の互い違いの末端が生成され、指定された比較領域に単一配列のみが含まれる場合、単一配列の残基は分母に含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等と見なすことができる。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用して実施できる。
【００４６】
本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバック機構を論じるときに使用され得、オームの法則に従って電流値に変換できるため、事前設定された電流との比較が可能になる。
【００４７】
本明細書で使用される「免疫応答」は、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性、または体液性応答、またはその両方の形態であり得る。
【００４８】
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントは、所定の核酸と同じ目的で使用できる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。
【００４９】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであることができ、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、塩基の組み合わせは、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む。核酸は、化学合成法または組換え法によって得ることができる。
【００５０】
本明細書で使用される「作動可能に連結される」は、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置できる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターとプロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく対応することができる。
【００５１】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し得、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組み合わせであり得る。
【００５２】
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、細胞における核酸の発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対ほど離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的または差次的に遺伝子構成成分の発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが含まれる。
【００５３】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書において互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端で連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を指向する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質が産生される細胞からその分泌を容易することが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、しばしば成熟タンパク質と称される、タンパク質の残りの部分から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端（すなわち、Ｎ末端）で連結される。
【００５４】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複雑な混合物などにおいて、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨで特異的配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）であり得る（標的配列は過剰で存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％は平衡で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブについては（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、そして長いプローブについては（例えば、約５０ヌクレオチド超）少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、正のシグナルは背景ハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳで洗浄。
【００５５】
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫化されることを望む、またはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットであり得る。
【００５６】
本明細書で使用される「実質的に相補的」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００５７】
本明細書で使用される「実質的に同一」は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または核酸に関して、第１の配列が第２の配列の補体と実質的に相補的であることを意味する。
【００５８】
本明細書で使用される「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、阻止する、または完全に排除することにより疾患から動物を保護することを意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の抑制は、疾患の誘導後であるが、その臨床的出現の前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の阻止は、疾患の臨床的出現後に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。
【００５９】
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその一部の補体、（ｉｉｉ）参照核酸またはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味する。
【００６０】
ペプチドまたはポリペプチドに関して本明細書で使用される「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドを意味する。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似する特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、当該技術分野において典型的にわずかな変化を伴うと認識されている。これらのわずかな変化は、当該技術分野において理解されるように、一部、アミノ酸の疎水性親水性指数を考慮することによって同定され得る。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷を考慮することに基づく。類似する疎水性親水性指数のアミノ酸が置換され、尚もタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野において既知である。一態様では、±２の疎水性親水性指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈において、アミノ酸の親水性を考慮することにより、抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な手段である、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能となる。米国特許第４，５５４，１０１号が、参照により本明細書に完全に組み込まれる。類似する親水性値を有するアミノ酸を置換することにより、当該技術分野において理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸で実施することができる。アミノ酸の疎水性親水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性により明らかにされるように、アミノ酸の相対類似性および特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【００６１】
バリアントは、完全な遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
【００６２】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種核酸配列を含有するか、それを含み得る。
【００６３】
ワクチン
本明細書に記載されるＰＲＡＭＥ抗原またはかかる抗原をコードする核酸分子を含むワクチンが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２６に示されるアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥ抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥ抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原をコードする核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド５５〜１５８４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原をコードする核酸分子は、配列番号１に示される核酸配列を含む。ワクチンは、抗原に対する免疫応答を対象において生じさせることが可能であり得る。免疫応答は、治療的または予防的免疫応答であり得る。ワクチンは、以下により詳細に記載されるように、ベクターまたは複数のベクターを含み得る。
【００６４】
ワクチンは、がん、例えば、ＰＲＡＭＥを発現するがんまたは腫瘍から保護するために使用することができる。ワクチンは、ＰＲＡＭＥを発現する卵巣がんを予防および／または治療するために、それを必要とする対象において使用することができる。ワクチンは、ＰＲＡＭＥおよびＰＲＡＭＥを発現するがんに対する細胞性および／または抗体応答を、それを必要とする対象において誘導することができる。本開示のいくつかの実施形態では、ワクチンは、ＰＲＡＭＥの異常な発現を特徴とする細胞に対する細胞性および／または抗体応答を保護、予防、治療、および／または誘導するために使用することができる。本開示のいくつかの実施形態では、ワクチンは、ＰＲＡＭＥ、使用際には上皮性卵巣がん細胞、さらに詳細には漿液性卵巣がん細胞の異常な発現を特徴とする卵巣がん細胞に対する細胞性および／または抗体応答を保護、予防、治療、および／または誘導するために使用できる。
【００６５】
本明細書に記載されるがんワクチンの開発には、免疫系によって認識されず、自己抗原であるがん抗原、例えばＰＲＡＭＥを同定することを含む。同定されたがん抗原は、免疫系により認識されるために、自己抗原から外来抗原に変更される。組換えがん抗原の核酸およびアミノ酸配列を自己から外来抗原に再設計すると、免疫系による抗原の寛容性が破壊される。寛容性を破壊するために、いくつかの再設計手段を用いて、以下で記載するようにがん抗原を生成することができる。
【００６６】
寛容性を破壊することは、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価の抗体応答を誘導し、それにより、抗原を発現するがんまたは腫瘍に対して直接的もしくは反応性である免疫応答を誘導または誘発する。いくつかの実施形態において、誘導または誘発された免疫応答は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性免疫応答の両方であり得る。いくつかの実施形態では、誘導または誘発された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の誘導または分泌を含むことができる。他の実施形態において、誘導または誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生される可溶性因子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ−１、および免疫チェックポイント分子を上方制御する因子を低減または阻害することができる。
【００６７】
特定の実施形態において、ワクチンは、（１）ＣＤ８+（ＣＴＬ）などの細胞傷害性Ｔリンパ球を増加させて、腫瘍細胞を攻撃して殺傷する、（２）Ｔヘルパー細胞応答を増加させる、ならびに／または（３）ＩＦＮ−γおよびＴＦＮ−α、または好ましくは前述のすべてを介した炎症応答を増加させることにより、クリアランスを媒介するか、または腫瘍細胞の増殖を防止できる。ワクチンは、腫瘍フリー生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、および４５％で増強できる。ワクチンは、免疫化後に、腫瘍質量を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％で低減できる。このワクチンは、骨髄由来サプレッサー細胞から分泌されるサイトカインである単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の増加を防止および遮断できる。ワクチンは、腫瘍生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％で増強できる。
【００６８】
ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫応答を約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍で増強できる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫応答を約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍で増強できる。
【００６９】
ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象におけるＩＦＮ−γレベルと比較して、ワクチンを投与された対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベルを約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍で増強できる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象におけるＩＦＮ−γレベルと比較して、ワクチンを投与された対象におけるＩＦＮ−γレベルを約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍で増強できる。
【００７０】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号に開示されており、参照により本明細書に完全に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、それが染色体に組み込まれるのを阻害する要素または試薬をさらに含むことができる。
【００７１】
ワクチンは、がん抗原をコードするＲＮＡを含み得る。ＲＮＡワクチンは、細胞に導入することができる。
【００７２】
ワクチンは、弱毒生ワクチン、組換えベクターを使用して抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンであり得、例えば、これらに限定されないが、ワクチンは、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、および同第６，５８９，５２９に記載され、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、核酸ワクチンは、分子アジュバントのコード化配列をさらに含み得、いくつかの事例において、分子アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳであり得。いくつかの事例において、分子アジュバントは、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、抗プログラム死受容体１（ＰＤ−１）、および抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）を含む、チェックポイント阻害剤である。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳについてのコード化配列は、１つ以上の抗原についてのコード化配列を含む１つ以上の核酸分子に含まれ得る。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳのコード化配列は、別個のプラスミドなどの別個の核酸分子上に含まれ得る。
【００７４】
本発明のワクチンは、ワクチンのそれ自体が疾患または死亡を引き起こさないように安全である、疾患から保護する、中和抗体の誘導する、保護Ｔ細胞応答を誘導する、投与の簡易性、少ない副反応、生物学的安定性、低い用量あたりのコストを提供するなどの有効なワクチンに要求される特徴を有することができる。ワクチンは、以下で論ずるように、がん抗原を含有することによりこれらの特徴のいくつかまたはすべてを達成することができる。
【００７５】
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下により詳細に記載される。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／もしくは分化、Ｂ細胞提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達など、免疫系の任意の成分の抑制を防止する任意の核酸またはタンパク質である。以下でさらに詳細に記載するように、ワクチンは、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わせて、細胞性および体液性免疫応答の両方の刺激を増強できる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１抗体を使用すると、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを防止する。
【００７６】
抗原
上述されるように、ワクチンは、抗原または抗原をコードする核酸分子を含むことができる。抗原は、ＰＲＡＭＥ、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＲＡＭＥは、精巣で発現するが、通常は、または比較的少量で、正常な非がん性組織で発現する。ＰＲＡＭＥタンパク質は、レチノイン酸受容体のリプレッサーであり、理論に縛られることなく、このリプレッサーは、レチノイン酸によって誘導される細胞増殖およびアポトーシスの停止を抑制することにより、がん細胞に成長の利点を与えると考えられている。例えば、ＰＲＡＭＥは、いくつかの形態のがんに関連しており、既知のがん抗原である。ＰＲＡＭＥ発現は、子宮内膜がん、精巣がん、メラノーマ、および卵巣がんにおいて増強される。
【００７７】
したがって、ワクチンは、ＰＲＡＭＥを発現するがんに罹患する対象を治療するために使用することができる。ワクチンは、ＰＲＡＭＥを発現するがんもしくは腫瘍を有する対象を治療するため、または対象のそのような腫瘍の発達を予防するためにも使用され得る。本開示のＰＲＡＭＥ抗原は、天然の「正常な」ＰＲＡＭＥ抗原とは異なり、したがって、ＰＲＡＭＥ抗原を発現する腫瘍に対する治療または予防を提供する。したがって、天然ＰＲＡＭＥ遺伝子とは異なるＰＲＡＭＥ抗原配列（すなわち、バリアントＰＲＡＭＥ遺伝子または配列）が本明細書で提供される。本発明のいくつかの態様は、配列番号１に示される核酸配列を含む核酸分子を含むワクチンを提供し、いくつかの態様は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子を含むワクチンを提供する。
【００７８】
上述される異種配列を含む単離された核酸分子が提供される。上述される異種配列からなる単離された核酸分子が提供される。上述される異種配列を含む単離された核酸分子は、プラスミド、ウイルスベクター、および以下に記載されるような他の形態の核酸分子などのベクターに組み込まれ得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、核酸分子は、プラスミドに組み込まれる。他の実施形態では、核酸分子は、ベクターに組み込まれる。本開示のいくつかの態様は、配列番号１のヌクレオチド酸配列を有するか、または配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組成物を提供する。
【００７９】
ＰＲＡＭＥ抗原をコードする配列を有する核酸分子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、プラスミドまたはウイルスベクターを含むがこれらに限定されないベクターに組み込まれる。ＰＲＡＭＥ抗原をコードするコード化配列は、上述される配列を有する。
【００８０】
上述される異種アミノ酸配列を含むタンパク質分子が提供される。上述される異種アミノ酸配列からなるタンパク質分子が提供される。上述される配列を有するタンパク質およびポリペプチドが本明細書に提供される。本開示のタンパク質およびポリペプチドは、ＰＲＡＭＥ抗原およびＰＲＡＭＥ免疫原と称され得る。ＰＲＡＭＥ抗原は、ＰＲＡＭＥ抗原を発現するがんおよび／または腫瘍に対する免疫応答を誘発することが可能である。
【００８１】
一態様では、転写を増加するための低ＧＣ含有リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化、ならびに可能な限り、シス作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の排除の１つ以上を含む、コンセンサス抗原が転写および翻訳の改善を提供することが望ましい。
【００８２】
いくつかの態様では、複数の株にわたって広範な免疫応答を生成するコンセンサス抗原を生成し、コンセンサス抗原が、すべての利用可能な完全長配列の組み込み、各位置で最も一般的に生じるアミノ酸を利用するコンピュータが生成した配列、および株間での交差反応の増加のうちの１つ以上を有することが望ましい。
【００８３】
ＰＲＡＭＥ抗原は、２つ以上の種に由来するコンセンサス抗原（または免疫源）配列であり得る。ＰＲＡＭＥ抗原は、コンセンサス配列および／または発現を改善するための修飾（複数可）を含み得る。修飾は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増加させるためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）の追加、および／またはＰＲＡＭＥ抗原の免疫原性を増加させるための免疫グロブリンリーダー配列の追加を含み得る。ＰＲＡＭＥ抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＰＲＡＭＥコンセンサス抗原は、血球凝集素（ＨＡ）タグを含むことができる。ＰＲＡＭＥコンセンサス抗原は、対応するコドン最適化ＰＲＡＭＥ抗原よりも強力かつ幅広い細胞性および／または体液性免疫応答を誘発するように設計できる。
【００８４】
ＰＲＡＭＥコンセンサス抗原は、タンパク質の１つ以上の機能ドメインに１つ以上のバリアント体を含むことができ、それにより、対応するコドン最適化ＰＲＡＭＥ抗原より強力かつより広範な細胞性および／または体液性免疫応答を誘発する。１つ以上の変異は、ＲＡＲとの相互作用を媒介するＰＲＡＭＥタンパク質のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の置換であり得る。
【００８５】
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたワクチン
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下でより詳細に記載する。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／もしくは分化、Ｂ細胞提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達など、免疫系の任意の成分の抑制を防止する任意の核酸またはタンパク質である。
【００８６】
かかる阻害剤は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸はまた、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。小分子は、低分子量、例えば、８００ダルトン未満の酵素基質、タンパク質もしくは核酸により結合されたリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの制御因子として機能する、有機または無機化合物であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列であり得る。他の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００８８】
１．免疫チェックポイント分子
免疫チェックポイント分子は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸はまた、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。小分子は、低分子量、例えば、８００ダルトン未満の酵素基質、タンパク質もしくは核酸により結合されたリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの制御因子として機能する、有機または無機化合物であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００８９】
ａ．ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１
免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ−１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされる細胞表面タンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞に発現しているため、これらの細胞の運命および／または分化に寄与する。特に、ＰＤ−１は、Ｔ細胞制御因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーの１型膜タンパク質であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルを負に制御し、それにより免疫応答を負に制御する。ＰＤ−１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を負に制御することができるため、ＣＤ８媒介細胞傷害性を阻害し、腫瘍の成長を促進する。
【００９０】
ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２という２つのリガンドを有し、それは、Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ−Ｌ１は、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦ処理に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）で、かつＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達時にＴ細胞およびＢ細胞で上方制御される。ＰＤ−Ｌ１は、骨髄腫、肥満細胞腫、およびメラノーマを含む多くの腫瘍細胞株で発現する。
【００９１】
２．抗免疫チェックポイント分子抗体
上述されるように、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体であり得る。抗体は、抗原（すなわち、上述される免疫チェックポイント分子）と結合または反応することができる。したがって、抗体は、抗免疫チェックポイント分子抗体または免疫チェックポイント分子抗体と考慮され得る。抗体は、含まれる核酸配列によりコードすることができる。
【００９２】
抗体は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含むことができる。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、および／またはヒンジ領域を含むことができる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含むことができる。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。
【００９４】
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域のうちの３つの超可変領域を含むことができる。重鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と示される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与することができる。
【００９５】
軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットには、ＶＬ領域のうちの３つの超可変領域を含むことができる。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と示される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与することができる。
【００９６】
抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得、ＣＤＲに対して支持を提供し、ＣＤＲの空間的な関係を相互に定義する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間にそれぞれ挿入される。ＣＤＲセットは、重または軽鎖Ｖ領域のうちの３つの超可変領域を含み得る。重または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、「ＣＤＲ３」と示される。したがって、抗原結合部位は、重および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含み得る。
【００９７】
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含むことができる。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含むことができる。
【００９８】
追加的に、タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片を生成し、その２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々、無傷の抗原結合部位を含む共有ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、Ｆ（ａｂ’）2断片を含むいくつかの断片を提供でき、両方の抗原結合部位を含む。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含むことができる。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含むことができる。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含むことができる。
【００９９】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望される抗原と結合する非ヒト種からの抗体であり得る。
【０１００】
ａ．ＰＤ−１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ−１抗体（本明細書では「ＰＤ−１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ−１抗体は、ニボルマブであり得る。抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
【０１０１】
ｂ．ＰＤ−Ｌ１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（本明細書では「ＰＤ−Ｌ１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
【０１０２】
ベクター
ワクチンは、ＰＲＡＭＥ抗原をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含むことができる。１つ以上のベクターが、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含む核酸配列を有することができる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【０１０３】
１つ以上のベクターは、発現構築物であり得、これは、一般的に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞転写および翻訳機構によって生成される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として機能し、発現ベクター上で運ばれる遺伝子の効率的な転写につながる制御性配列を含むように多くの場合設計されている。本発明のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質を発現する。
【０１０４】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローニングされた遺伝子との間の距離の調整、ならびに転写終結配列およびＰＴＩＳ（携帯型翻訳開始配列）の挿入などの発現エンハンサーを有し得る。
【０１０５】
ベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸であり得る。環状プラスミドおよび直鎖状核酸は、適切な対象細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指示することが可能である。ベクターは、抗原をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを有することができ、終結シグナルに機能的に連結され得る。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含有し得る。ベクターは、ＰＲＡＭＥ抗原または他のコード化配列、制御性配列、ならびに選択および／またはスクリーニングマーカーコード化配列を含むがこれらに限定されない所望の断片をベクターにクローニングするために必要な、またはその効率を高める配列を含み得る。目的のヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下であり得、宿主細胞が、一部の特定の外部刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織または器官または発生段階に特異的であり得る。
【０１０６】
ベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、ＰＲＡＭＥ抗原をコードする核酸により細胞にトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞は、抗原の発現が起こる条件下で培養および維持される。
【０１０７】
プラスミドは、合成の、抗原に対する免疫応答を誘発できるコンセンサス抗原、かかるタンパク質の断片、かかるタンパク質のバリアント、バリアントまたは融合タンパク質の断片をコードするコード化配列を含む、本明細書に開示されたＰＲＡＭＥ抗原の１つ以上をコードする核酸配列を含み得、これらは、コンセンサスタンパク質および／またはコンセンサスタンパク質の断片および／またはコンセンサスタンパク質のバリアントおよび／またはコンセンサスタンパク質のバリアントの断片の組み合わせで構成される。
【０１０８】
単一のプラスミドは、単一の抗原のコード化配列、２つの抗原のコード化配列、３つの抗原のコード化配列、または４つの抗原のコード化配列を含有し得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、プラスミドは、ＣＣＲ２０を単独で、またはこれらのプラスミドの一部としてコードするコード化配列をさらに含み得る。同様に、プラスミドは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８のコード化配列をさらに含み得る。
【０１１０】
プラスミドは、コード化配列の上流であり得る開始コドン、およびコード化配列の下流であり得る終止コドンをさらに含み得る。開始および終止コドンは、コード化配列を伴うインフレームであり得る。
【０１１１】
プラスミドは、コード化配列に動作可能に連結されるプロモーターも含み得る。コード化配列に動作可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）などのヒト遺伝子からのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターでもあり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許公開第２００４／０１７５７２７号に記載されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
プラスミドは、コード化配列の下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１１３】
プラスミドは、コード化配列の上流のエンハンサーも含み得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶからのものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、それぞれの内容は参照により完全に組み込まれる。
【０１１４】
プラスミドは、プラスミドを染色体外で維持し、細胞においてプラスミドの複数コピーを産生するために、哺乳類の複製起点も含み得る。プラスミドは、ｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であり得る。プラスミドは、エプスタインバールウイルスの複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得、組み込みなしで高コピーのエピソーム複製を生成し得る。プラスミドの骨格は、ｐＡＶ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
【０１１５】
プラスミドはまた、制御性配列を含み得、プラスミドを保有する細胞における遺伝子発現に好適であり得る。コード化配列は、宿主細胞におけるコード化配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。
【０１１６】
コード化配列は、免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列も含み得る。リーダー配列は、コード化配列の５’であり得る。この配列によってコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ末端Ｉｇリーダー、続いてコンセンサス抗原タンパク質を含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
【０１１７】
プラスミドはｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであってもよく、これは昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、これはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。
【０１１８】
ベクターは、細胞ゲノムに組み込むことによって標的細胞を形質転換するか、または染色体外で存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）であり得る。
【０１１９】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１２０】
エレクトロポレーションにより対象に効率的に送達され、１つ以上の所望の抗原を発現することができる直鎖状核酸ワクチンまたは直鎖状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、任意のリン酸骨格を欠く任意の直鎖状ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、１つ以上の抗原をコードし得る。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含有し得る。抗原の発現はプロモーターにより制御され得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現に無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
【０１２１】
ＬＥＣは、局在化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、抗原を発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１２２】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
【０１２３】
ベクターは、プロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離された核酸の発現を制御することが可能な任意のプロモーターであり得る。かかるプロモーターは、本明細書に記載される抗原配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用性配列要素である。異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、ベクター内の転写開始からほぼ同じ距離に配置し得、それは、その自然な設定での転写開始部位からである。しかしながら、この距離の差異は、プロモーターの機能を喪失することなく調整され得る。
【０１２４】
プロモーターは、転写物、リボソーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な抗原およびシグナルをコードする核酸配列に動作可能に連結され得る。
【０１２５】
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞において発現に有効であると示される別のプロモーターであり得る。
【０１２６】
ベクターは、機能的なスプライスドナーおよびアクセプター部位を有するエンハンサーおよびイントロンを含み得る。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含有し得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得てもよい。
【０１２７】
ベクターを調整する方法
本明細書で論じられるＰＲＡＭＥ抗原をコードする核酸分子を含むベクターを調製する方法が本明細書で提供される。哺乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップ後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ベクターを大規模な発酵タンクにおいて細胞培養物に播種するために使用することができる。
【０１２８】
以下により詳細に説明されるＥＰ装置で使用するためのベクターは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００８年５月２３日に出願された実施対象の同時係属中の米国特許出願第１２／１２６，６１１号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究で使用されるＰＲＡＭＥ抗原をコードする核酸分子は、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術は、米国出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、２００７年７月３日に取得された許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、当業者に一般的に既知である様々な装置およびプロトコルも含むか、またはそれらも組み込む。上記に参照される出願および特許である、米国出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれが、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
ワクチンの賦形剤および他の成分
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤はトランスフェクション促進剤であり得、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などの界面活性剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。
【０１３０】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであり、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在し得る。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞などの界面活性剤も含み得、遺伝子構築物とともに投与されるヒアルロン酸も使用され得る。ＤＮＡプラスミドワクチンは、脂質、リポソーム（ＤＮＡ−リポソーム混合物として、レシチンリポソームまたは当該技術分野において既知の他のリポソームを含む）（例えばＷ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などのトランスフェクション促進剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤も含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。ワクチンにおけるトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１３１】
薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、代替えのプラスミドにおいて発現されるか、またはワクチンにおいて上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２８、ＩＬ−３３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１〜、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ，ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、欠失したシグナル配列をコードするシグナル配列またはコード化配列を有し、任意選択でＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチド、もしくはＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード化配列を含むＩＬ−１５、およびそれらの機能断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３３、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、アジュバントは、１つ以上のタンパク質および／またはＣＣＬ−２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３３、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、もしくはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上の核酸分子であり得る。ＩＬ−１２構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号および対応する米国出願第０８／９５６，８６５号、ならびに２０１２年１２月１１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９０１７号、および２０１４年６月１２日に出願され、２０１１年１２月１２日に出願された対応する米国出願第１４／３６５，０８６号、ならびに２０１６年２月２６日に出願された同第１５／０５５，００２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号および対応する米国出願第１０／５６０，６５０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号および対応する米国出願第１２／１６０，７６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳＩ０／０４８８２７号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２８構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号および対応する米国出願第１２／９３６，１９２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２，４５２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２，４５２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、およびＭＥＣ構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号および対応する米国出願第１１／７１９，６４６号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および他の免疫調節剤の例は、米国出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節剤の例は、米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１，Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、ＩＬ−２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードするものを含む。
【０１３４】
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願された米国出願第０２１，５７９号（参照により完全に組み込まれる）に記載される遺伝子ワクチン促進剤をさらに含み得る。
【０１３５】
ワクチンは、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で抗原およびプラスミドを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約１０ナノグラム〜約８００マクログラムの核酸分子を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約０．１〜約５００マクログラムの核酸分子を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約１〜約３５０マクログラムの核酸分子を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約０．１マクログラム〜約１０ミリグラム、約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムの抗原またはそのプラスミドを含有し得る。
【０１３６】
ワクチンは、使用される投与モードにより製剤化され得る。注射可能なワクチン薬学的組成物は、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含であり得る。等張製剤または溶液を使用することができる。等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。ワクチンは、血管収縮剤を含み得る。等張溶液は、リン酸緩衝食塩水を含み得る。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む安定剤は、製剤を長期間室温または周囲温度で安定させることができる。
【０１３７】
ワクチンの薬学的組成物
ワクチンは、薬学的組成物の形態であり得る。薬学的組成物は、ワクチンを含むことができる。薬学的組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）〜約１０ミリグラム（ｍｇ）のワクチンの核酸分子を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約２５ｎｇ〜約５ｍｇのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５０ｎｇ〜約１ｍｇのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０マイクログラム〜約８０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５マイクログラム〜約６０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０ｎｇ〜約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５ｎｇ〜約４５マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムのワクチンのＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ以上のワクチンの核酸分子を含み得る。
【０１３９】
他の実施形態において、薬学的組成物は、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇ（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、最大１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラム（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、最大１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子を含み得る。
【０１４０】
薬学的組成物は、使用される投与モードにより製剤目的のための他の薬剤をさらに含み得る。薬学的組成物が注射可能な薬組成物である場合、それらは、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含である。等張製剤を使用することが好ましい。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としてはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。
【０１４１】
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。一実施形態では、トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在する。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞などの界面活性剤も含み得、遺伝子構築物とともに投与されるヒアルロン酸も使用され得る。いくつかの実施形態では、トランスフェクション促進剤は、脂質、ＤＮＡ−リポソーム混合物としてのレシチンリポソームまたは当技術分野で既知の他のリポソームを含むリポソーム（例えば、ＷＯ／９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。ワクチンにおけるトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満であり得る。
【０１４３】
ワクチン接種の方法
上述の薬学的製剤を使用して、ＰＲＡＭＥを発現するがんを治療および／または予防するための方法が本明細書に提供される。対象におけるＰＲＡＭＥを発現するがんの治療および／または予防に上述の薬学的製剤を使用する方法も本明細書に記載される。対象にワクチン接種する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の薬学的製剤を、それを必要する対象に投与する方法も本明細書に記載される。集合的に本明細書に記載の薬学的製剤を使用する治療方法と称される本明細書に記載の方法は、治療的および／または予防的免疫応答を誘導するために、本明細書に記載される１つ以上のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含み得る。ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強するために対象に投与され得る。ワクチンの投与は、トランスフェクトされた細胞において発現され、細胞の表面に送達されると、免疫系が、抗原を認識し、細胞性、液性、または細胞性および液性応答を誘導する核酸分子としての本明細書に開示されるがん抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの投与は、本明細書で論じられるワクチンを対象に投与することにより、対象において、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を誘導または誘発するために使用され得る。
【０１４４】
ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節するために対象に投与され、それにより免疫応答を増強させることができる。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。哺乳動物にワクチンを投与し、それによりベクターを哺乳動物の細胞に導入すると、トランスフェクトされた細胞が本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上を発現および分泌する。これらの分泌されたタンパク質または合成抗原は、１つ以上のがん抗原に対して作られた抗体、および１つ以上のがん抗原に特異的に対するＴ細胞応答を含み得る免疫応答を開始する免疫系により異物として認識される。いくつかの例では、本明細書で論じられるワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、抗原刺激を受けた免疫系を有し、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を接種された場合、抗原刺激を受けた免疫系は、液性、細胞性、または細胞性および液性両方の免疫応答によるものかにかかわらず、本明細書に開示される後のがん抗原を迅速に除去することができる。
【０１４５】
ワクチンの核酸分子の投与方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、その両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
ワクチンを哺乳動物に投与して、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、好ましくはヒト、ウシ、またはブタであり得る。ワクチンは同様に、免疫応答を誘発するために、非ヒト対象、例えば、ニワトリに投与され得る。
【０１４７】
ワクチンの用量は、経時的にキログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム〜１０ｍｇ（構成成分／ｋｇ体重／回）の活性構成成分であり得、２０マイクログラム〜１０ｍｇ構成成分／ｋｇ体重／回であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
【０１４８】
ワクチンにより免疫応答を生成する方法
ワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、哺乳動物または非哺乳動物対象において免疫応答を生成することができる。免疫応答は、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原に指向される抗体および／またはキラーＴ細胞を生成することができる。そのような抗体およびＴ細胞が単離され得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態は、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を生成する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態は、上述のがん抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に対して対象に予防的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、がん抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に罹患している対象に治療的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。ワクチンの投与前に本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を発現するがんまたは腫瘍の診断は、日常的に行うことができる。
【０１５０】
ワクチンによるがん治療の方法
ワクチンは、哺乳動物またはそれを必要とする対象において、卵巣がん、特に上皮性卵巣がんなどであるがこれらに限定されないＨＰＶ媒介ＰＲＡＭＥ発現がんに対して反応性または指向性である免疫応答を生成または誘発するために使用され得る。誘発された免疫応答は、がんまたは腫瘍の成長を防止できる。誘発された免疫応答は、がん性または腫瘍細胞の転移を防止および／または低減することができる。したがって、ワクチンは、ワクチンを投与された哺乳動物または対象におけるがんまたは腫瘍を治療および／または予防する方法で使用することができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ワクチンの投与は、（１）単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の産生を遮断する抗体を生成し、それにより骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を遅延し、腫瘍成長を抑制するＢ細胞応答による液性免疫、（２）腫瘍細胞を攻撃し、殺傷するＣＤ８+などの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の増加、（３）Ｔヘルパー細胞応答の増加、（４）ならびにＩＦＮ−γおよびＴＦＮ−αによる炎症応答の増加、または好ましくは前述のすべてを誘導することにより、腫瘍細胞のクリアランスを媒介するか、またはその成長を妨げることができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、ワクチンを投与された対象において、様々な組織または系（例えば、脳または神経系など）に損傷を与えないか、またはその炎症を引き起こさない液性免疫応答および／または抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を生成することができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ワクチンの投与は、対象における無腫瘍生存率を増加させ、腫瘍量を低減させ、またはそれらの組み合わせであり得る。ワクチンの投与により、対象の無腫瘍生存率を、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％増加させることができる。ワクチンの投与により、免疫化後の対象において、腫瘍量を、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、および７０％低減することができる。ワクチンの投与は、ＰＲＡＭＥが媒介するレチノイン酸受容体の阻害を防止および遮断することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、がん性もしくは腫瘍細胞または組織を標的とする抗原特異的免疫応答を確立して、ワクチンを投与された対象において、損傷を与える、または病気もしくは死を引き起こすことなく、１つ以上のがん抗原を発現するがんまたは腫瘍を除去または排除するために、抹消に投与され得る（以下により詳細に説明される）。
【０１５５】
ワクチンの投与は、対象における細胞性免疫応答を、約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態において、ワクチンの投与は、対象における細胞性免疫応答を約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
【０１５６】
ワクチンの投与は、対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベルを、約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態において、ワクチンの投与は、対象におけるＩＦＮ−γレベルを約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
【０１５７】
ワクチンの用量は、経時的にキログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム〜１０ｍｇ（構成成分／ｋｇ体重／回）の活性構成成分であり得、２０マイクログラム〜１０ｍｇ構成成分／ｋｇ体重／回であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
【０１５８】
投与経路
ワクチンまたは薬学的組成物は、経口、非経口、舌下、経皮的、直腸に、経粘膜的、局所的、吸入により、頬側投与により、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および／もしくは関節内、またはそれらの組み合わせにより投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学診療に従って適切に許容される製剤として投与することができる。獣医は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎｓ）」、または電気穿孔法（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法により投与され得る。
【０１５９】
ワクチンのベクターは、インビボエレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、ナノ粒子促進トランスフェクション（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ならびに組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、および組換えワクシニアなどの組換えベクターを伴うまたは伴わないＤＮＡ注射（ＤＮＡ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含む、いくつかの周知の技術により哺乳動物に投与され得る。１つ以上のがん抗原のワクチンがインビボエレクトロポレーションとともにＤＮＡ注射により投与され得る。
【０１６０】
エレクトロポレーション
ワクチンまたは薬学的組成物は、エレクトロポレーションにより投与され得る。エレクトロポレーションによるワクチンの投与は、可逆性細孔を細胞膜において形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得るエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザによって入力される予め調整された電流と同等の定電流である。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーション構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。エレクトロポレーション構成要素は、コントローラ、電流波形発生装置、インピーダンステスター、波形ロガー、入力素子、ステータス報告要素、通信ポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーションデバイスの様々な要素のうちの１つ以上を含み、それらを組み込むことができる。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボエレクトロポレーションデバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して達成され得る。
【０１６１】
本発明のＤＮＡワクチンの投与を容易にし得るエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション法の例には、米国特許第７，２４５，９６３号、米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの投与を容易にするために使用することができる他のエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション法には、同時係属および共同所有の２００７年１０月１７日に出願された米国特許出願第１１／８７４，０７２号、２００６年１０月１７日に出願された米国出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に提出された第６０／９７８，９８２号で提供されているものが含まれ、これらはすべて、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを容易にするためのモジュール電極システムおよびそれらの使用を記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクタ、および電源を備え得る。オペレーターは、支持構造に載置される複数の針電極を把持し、それらを身体もしくは植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次に、生体分子を、皮下針により選択された組織内に投与する。プログラム可能な定電流パルスコントローラを作動させ、定電流電気パルスを複数の針電極に適用する。適用された定電流電気パルスは、生体分子を、複数の電極間の細胞に導入するのを容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを効果的に容易にするために使用することができるエレクトロポレーションデバイスを記載している。エレクトロポレーションデバイスは、操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を備える。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御に基づいた一列の電極とパルスパラメータの入力との間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを作り出し、電流波形データの保存および取得を可能にする。エレクトロポレーションデバイスは、一連の針電極を有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および着脱可能なガイドディスクも備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１６４】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく他の組織または臓器にも深く浸透させるのに適している。電極アレイの構成により、注射針は標的臓器にも完全に挿入され、注射は電極によって予め描かれた領域の標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【０１６５】
加えて、エレクトロポレーションデバイスおよびその使用を組み込むいくつかの実施形態において企図される、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された国米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、および２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載されるもののエレクトロポレーションデバイスがある。さらに、様々なデバイスのいずれかを使用したＤＮＡの投与に関係する２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注射する方法が注目された２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号に提供される主題を網羅する特許が、本明細書で企図される。上記の特許は、その全体が参照により組み込まれる。
【０１６６】
ワクチンを調整する方法
本明細書で論じられるワクチンに含まれるベクターを調製するための方法が本明細書において提供される。ベクターは、最終的なサブクローニングステップの後、当技術分野で既知の方法を使用して、大規模発酵タンク内の細胞培養に播種するために使用され得る。
【０１６７】
本発明のＥＰ装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００７年５月２３日に出願された米国特許公開第２００９／０００４７１６号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術は、米国出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、２００７年７月３日に取得された許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、当業者に一般的に既知である様々な装置およびプロトコルも含むか、またはそれらも組み込む。上記に参照される出願および特許である、米国出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれが、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって図示される多くの態様を有する。
【実施例】
【０１６９】
本発明は、以下の実施例においてさらに図示される。これらの実施形態は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に実例として示されることを理解するべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を様々な使用および条件に適応させることができる。したがって、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０１７０】
実施例１
合成コンセンサスＰＲＡＭＥ
ヒトコンセンサスＰＲＡＭＥを生成するために、１０個のＰＲＡＭＥ配列をＧｅｎＢａｎｋから収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）。選択したＰＲＡＭＥ配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、
【０１７１】
ＮＰ＿００６１０６．１、ＡＦＸ６５４８３．１、ＸＰ＿００１０９０５１６．１、ＡＦＩ３５０５４．１、ＡＦＪ７１４０５．１、ＸＰ＿００３８０５９５６．１、ＸＰ＿５２５６４３．２、ＢＡＫ６２４２４．１、ＸＰ＿００３９１９２１１．１、およびＸＰ＿００３９１９２１２．１である。
【０１７２】
ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（バージョン１３．０．０．３５７）を使用して、コンセンサス配列を生成した。上に列挙される配列をＭｅｇＡｌｉｇｎに取り込み、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントした。得られたＰＲＡＭＥ配列は、天然ヒトＰＲＡＭＥ配列と９５．１％〜９５．５％の相同性を共有する。
【０１７３】
合成コンセンサスＰＲＡＭＥ  ＤＮＡ配列が得られたら、より高いレベルの発現を得るために、上流のコザック配列およびＩｇＥリーダーをＮ末端に追加した。さらに、この遺伝子のコドン使用法は、ホモサピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合した。加えて、ＧＣ含有量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域、ならびに内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ−部位、リボソームエントリー部位などのｃｉｓ−作動配列モチーフを避けた、ＲＮＡ最適化を実施した。レチノイン酸シグナル伝達抑制における発現されたＰＲＡＭＥ分子の潜在的な機能を排除するために、２つの点変異（Ｌ４８７ＶおよびＬ４８８Ｖ）をＰＲＡＭＥの核内受容体ボックスＬＲＥＬＬに導入し、改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥを得た。この改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥタンパク質配列は、ヒト天然ＰＲＡＭＥタンパク質と９４．７％〜９５．１％の同一性を共有する。合成コンセンサスＰＲＡＭＥの特徴を表１に提供する。
【表１】
2021506255.tif 000003
【０１７４】
図２を参照すると、改変したコンセンサスＰＲＡＭＥと５つのヒトＰＲＡＭＥ配列との配列アラインメントは、配列間のアミノ酸の違いを示している。改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥのアミノ酸残基４８７および４８８でのロイシンからバリンへの置換は、強調されたアミノ酸の違いの１つである。アラインメントした配列間の同一性の割合を表２に示す。
【表２】
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【０１７５】
改変していない合成コンセンサスＰＲＡＭＥと改変したコンセンサスＰＲＡＭＥとの比較を表３に提供する。
【表３】
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【０１７６】
図３を参照すると、合成した合成コンセンサスＰＲＡＭＥを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下に配置された発現カセットとともにＩｎｏｖｉｏの発現ベクターｐＧＸ０００１にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧＸ１４２１と命名し、完全長配列決定を実施して配列を確認した。
【０１７７】
ｐＧＸ１４２１は、合成コンセンサスＰＲＡＭＥタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドである。関連するｍＲＮＡ産生は、ヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ０００１骨格（改変したｐＶＡＸ１発現ベクター、元のｐＶＡＸ１は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手した）には、生産目的のためのカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）が含まれる。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。
【０１７８】
改変をｐＶＡＸ１に導入してｐＧＸ０００１を創出し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なｐＶＡＸ１の報告された配列に基づいて同定した。これらの改変は以下に列挙されており、プラスミド増幅、ならびに抗原の転写および翻訳に関して問題は検出されていない。
【０１７９】
Ｃ＞Ｇ  ２４１  ＣＭＶプロモーター内
【０１８０】
Ｃ＞Ｔ  １１５８  骨格、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）の下流
【０１８１】
Ａ＞  −  ２０９２  骨格、カナマイシン耐性遺伝子の下流
【０１８２】
Ｃ＞Ｔ  ２４９３  複製起点のｐＵＣ（ｐＵＣ  ｏｒｉ）
【０１８３】
Ｇ＞Ｃ  ２９６９  ＲＮＡＳｅＨ部位の上流のｐＵＣ  Ｏｒｉの最端
【０１８４】
塩基対２、３、および４は、ＣＭＶプロモーターの上流の骨格においてＡＣＴからＣＴＧに変更される。
【０１８５】
実施例２
ＰＲＡＭＥ発現
ＰＲＡＭＥ発現を、合成コンセンサスＰＲＡＭＥ（ｐＧＸ１４１１）または対照をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした細胞株で調査し、合成抗原が発現したかを判断した。市販の抗ＰＲＡＭＥ抗体およびβ−アクチン対照抗体を使用した細胞株のウエスタンブロット分析は、ｐＧＸ１４１１を用いてトランスフェクトしたそれらの細胞のみが正しい分子量で遊走したＰＲＡＭＥタンパク質の発現を示したことを示している（図４）。間接免疫蛍光アッセイは、ＰＲＡＭＥ遺伝子発現を横紋筋肉腫細胞およびＨｅｋ２９３細胞におけるｐＶＡＸ発現と比較した。図５を参照すると、合成コンセンサスＰＲＡＭＥは、両方の細胞株で発現したが、ｐＶＡＸ陰性対照は発現しなかった。
【０１８６】
実施例３
マウスにおける免疫原性
免疫原性研究を、図６に示した免疫化および採血スケジュールに従ってＣ５７Ｂｌ／６マウスで実施した。簡単に言うと、免疫化あたり５、１０、１５、２５、および５０μｇのｐＧＸ１４１１を、第０週目（初回免疫化）、第２週目、第４週目、およびＥＬＩＳｐｏｔの時点でマウスに投与した。マウスは、第０週（ベースライン測定）および第５週目の時点で採血した。最も効果的な用量を決定するために用量応答研究を最初に実施し、図７を参照すると、調査したすべての用量は、未処理よりも大きな応答をもたらした。最大１５μｇまでｐＧＸ１４１１  ＤＮＡの用量を増加させると、応答がわずかに増加した。２５および５０μｇのｐＧＸ１４１１  ＤＮＡの高用量では、応答はプラトーに達した。
【０１８７】
合成コンセンサスＰＲＡＭＥは、マウスにおいて高度に免疫原性であり（図８Ａ）、免疫優性エピトープは、エピトープマッピングにより同定された（図８Ｂおよび表４）。簡単に言うと、コンセンサスＰＲＡＭＥ全体におよぶペプチドが産生され、各々が８アミノ酸ずつ重複する１５アミノ酸残基を含有する。これらのペプチドを３つのペプチドプールにプールした（表４）。未処理およびｐＧＸ１４１１免疫化マウスからの脾細胞を、マウスＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで３つのペプチドプールで刺激した。結果を図８Ａに示す。免疫優性エピトープは、ペプチドマトリックスマッピングアプローチを使用して同定した（図８Ｂ）。免疫優性エピトープには表４で下線が引かれている。
【表４】
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【０１８８】
ｐＧＸ１４１１によって誘導された抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、未処理およびｐＧＸ１４１１処理マウスからのペプチド刺激脾細胞の細胞内サイトカイン染色によって評価した。ｐＧＸ１４１１処置マウスからのＣＤ４細胞がｐＧＸ１４１１での処置後にＩＦＮ−γのわずかではあるが有意な増加を示した（図９Ａ）一方、ＣＤ８＋細胞は、およそ１０倍大きい有意な増加をもたらした（図９Ｂ）。ＴＮＦ−αおよびＣＤ１０７ａ＋の場合、ＣＤ８＋細胞がｐＧＸ１４１１処置で有意により大きな増加をもたらした（図９Ｄおよび図９Ｆ）一方、ＣＤ４＋細胞の場合、未処理とｐＧＸ１４１１処置との間に差はなかった（図９Ｃおよび図９Ｅ）。全体として、合成コンセンサスＰＲＡＭＥは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を誘導し、ＣＤ８＋は、より高いサイトカイン応答を示す。
【０１８９】
図１０に示すように、エンドポイント力価は、ｐＧＸ１４１１、すなわち５、２５、および５０μｇの用量応答様式で決定した。試験した各用量は、未処理と比較してエンドポイント力価を増加させたが、用量の増加は、エンドポイント力価応答を有意に増加しなかった。ｐＧＸ１４１１誘導抗体が、ヒトがんにおいて発現した天然ＰＲＡＭＥを認識できるかを決定するために、図１１に示されるように、がんにおけるｐＧＸ１４１１の応答性を免疫組織化学により調査した。ヒトがん生検の組織切片を、未処理またはｐＧＸ１４１１処置マウスからの血清で染色した。ビオチン化二次抗体で処理した後、組織切片を過酸化水素を含むジアミノベンジジンで染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。市販のＰＲＡＭＥ抗体を用いた組織染色を比較として使用した。陽性染色は、ｐＧＸ１４１１ワクチン接種マウス血清および市販のＰＲＡＭＥ抗体を用いてメラノーマがん組織試料で検出されたが、未処理マウス血清では検出されなかった。したがって、ｐＧＸ１４１１を用いたワクチン接種は、ＰＲＡＭＥ特異的抗体を誘導する能力を有する。
【０１９０】
ｐＧＸ１４２１によってコードされた改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥは、ｐＧＸ１４１１によってコードされた改変していない合成コンセンサスＰＲＡＭＥによって生成されるものと同様の免疫応答を誘導する。図１２を参照すると、ｐＧＸ１４２１によるこの誘発された免疫応答は、マウスにおけるＥＬＩＳｐｏｔによって調査された際にｐＧＸ１４１１により誘発されたものに匹敵する。ｐＧＸ１４１１およびｐＧＸ１４２１の両方は、５μｇの用量で、未処理のベースラインレベル（０ＳＦＵ／１０6ＰＢＭＣ）と比較して、およそ９００ＳＦＵ／１０6の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をもたらした。
【０１９１】
実施例４
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における免疫原性
免疫原性研究を、図１３に示した免疫化および採血スケジュールに従って、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で実施した。ｐＧＸ１４２１は、免疫化後２週間ごとに採血する第０、４、８、および１２週目に、最適化されたアカゲザルＩＬ−１２（ｐＧＸ６００６）で、反対側の肢に交互に５Ｐ  ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）を筋肉内（ＩＭ）に送達した。図１４Ａ〜図１４Ｃを参照すると、細胞性免疫原性がＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ、ＩＣＳによって評価され、測定されたＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ６００６による４回の免疫化で全体的な増加を明らかにした。３回目の免疫化後、ＩＦＮγは、ベースラインレベルと比較しておよそ６００ＳＦＵ／１０6ＰＢＭＣに増加した。４回目の免疫化は、およそ７００ＳＦＵ／１０6のＰＢＭＣを用いた３回目の免疫と比較して、応答をわずかにブーストした（図１４Ａ）。個々の応答は、図１４Ｂおよび図１４Ｃに示し、６匹のＮＨＰのうち２匹は、３回目の免疫化後に平均よりも大きい応答を有する。これは、６匹のＮＨＰのうち３匹に増加し、４回目の免疫化後に平均よりも大きい応答を有する。全体として、３回目の免疫化から２週間後（１０週目）に、第０週目と比較して、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された６匹のＮＨＰのうち６匹が応答した。
【０１９２】
図１５Ａ〜図１５Ｄを参照すると、ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ６００６は、ＣＤ８+Ｔ細胞応答と比較して最小限のＣＤ４+Ｔ細胞応答を誘導する。ＣＤ４+Ｔ細胞応答は、あらゆるＮＨＰにも見られなかったが、強固なＣＤ８+Ｔ細胞応答は、ＮＨＰ  ５８４０および５９６７において、４回目の免疫化から２週間後に、最も高いＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答を有するＮＨＰにおいてＩＣＳより検出された（図１５Ｃ）。
【０１９３】
実施例５
ＰＲＡＭＥ誘導免疫原性に対するｐＧＸ６００６のアジュバント効果の特徴づけ
表５に示すように、１５匹のＮＨＰを３つの群に分け、ｐＧＸ６００６のアジュバント効果を決定した。免疫化および採血スケジュールは、３つの群すべてで同じであり、図１３に示される。
【表５】
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【０１９４】
図１６Ａ〜図１６Ｃを参照すると、ＩＬ−１２は、ｐＧＸ１４２１によってコードされるＰＲＡＭＥに対するＩＦＮγ応答をＰＤ３（第１０週目）およびＰＤ４（第１４週目）の２週間で有意に増加させた。３回目の免疫化後、ｐＧＸ１４２１単独で誘導された平均ＩＦＮγ  ＳＦＵ（１０８±１２４）は、ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ６００６を併用して誘導された平均応答（６０９±５９７、ｐ＜０．０８）よりも有意に低かった。ＩＦＮγ応答は、４回目の免疫化後に群２でブーストした（１６３６±９９９  ＳＦＵ、ｐ＜０．０８、図１６Ｃ）。
【０１９５】
ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ１４２１とｐＧＸ６００６との組み合わせによって誘導される細胞性免疫応答は、２週間のＰＤ４（第１４週目、図１７Ａ〜図１７Ｃ）でフローサイトメトリーによりさらに特徴づけした。図１７Ａに示すように、いずれかの群のＣＤ４+Ｔ細胞区画で検出された最小の応答があった。ｐＧＸ６００６なしでｐＧＸ１４２１を投与した場合、ＣＤ８+Ｔ細胞区画で最小の応答を検出した（図１７Ｂ）。２週間のＰＤ４群のｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１で検出されたＰＲＡＭＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の大部分は、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの両方を産生した。集団の残りは、主にＩＦＮγ産生のみに陽性であった。ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１で誘導した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ１０７ａおよびグランザイムＢの両方に陽性であり、ＣＴＬおよびエフェクタ機能の可能性を示す（図１７Ｃ）。
【０１９６】
ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１およびｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１によって誘導された細胞性免疫応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ（図１８Ａ〜図１８Ｃ）および２週間のＰＤ４のフローサイトメトリー（第１４週目、図１９Ａ〜図１９Ｆ）により比較した。ｐＧＸ６００６と組み合わせたＰＧＸ１４１１によって誘導された２週間のＰＤ３（６６６±５９７ＳＦＵ）およびＰＤ４（１９３１±２７９５ＳＦＵ）のＰＲＡＭＥ特異的ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１に匹敵した（ＰＤ３：６０９±５９７；ＰＤ４：１６３６±９９９  ＳＦＵ）。研究中の任意の時点で、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１およびｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１によって誘導されたＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答の間に有意差はなかった（図１８Ｃ）。フローサイトメトリーによるさらなる特徴づけは、２週間のＰＤ４のｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１と比較して、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１でＣＤ４+Ｔ細胞応答がより強固になる傾向を示した（図１９Ａ）。ＣＤ８+Ｔ細胞区画における表現型および応答の大きさは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１およびｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１に匹敵した（図１９Ｂおよび図１９Ｃ）。
【０１９７】
要約すると、ＰＲＡＭＥに対する細胞性免疫応答は、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１およびｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１に匹敵した。ｐＧＸ６００６によってコードされたＩＬ−１２を含めると、ｐＧＸ１４２１によって誘導される細胞性免疫応答が有意に増加した。
【０１９８】
合成コンセンサスＰｒａｍｅのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）をそれぞれ表６および表７に示す。
【０１９９】
前述の詳細な説明および付随する実施例は一例にすぎず、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されないことが理解される。
【０２００】
本開示の実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者には明らかであろう。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含む、本開示の実施形態に対するそのような変更および修正は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【表６】
2021506255.tif 000008
【表７】
2021506255.tif 000009
【図１Ａ】
2021506255.tif 000010
【図１Ｂ】
2021506255.tif 000011
【図２】
2021506255.tif 000012
【図３】
2021506255.tif 000013
【図４】
2021506255.tif 000014
【図５】
2021506255.tif 000015
【図６】
2021506255.tif 000016
【図７】
2021506255.tif 000017
【図８Ａ】
2021506255.tif 000018
【図８Ｂ】
2021506255.tif 000019
【図９Ａ】
2021506255.tif 000020
【図９Ｂ】
2021506255.tif 000021
【図９Ｃ】
2021506255.tif 000022
【図９Ｄ】
2021506255.tif 000023
【図９Ｅ】
2021506255.tif 000024
【図９Ｆ】
2021506255.tif 000025
【図１０】
2021506255.tif 000026
【図１１】
2021506255.tif 000027
【図１２】
2021506255.tif 000028
【図１３】
2021506255.tif 000029
【図１４Ａ】
2021506255.tif 000030
【図１４Ｂ】
2021506255.tif 000031
【図１４Ｃ】
2021506255.tif 000032
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
2021506255.tif 000036
【図１６Ａ】
2021506255.tif 000037
【図１６Ｂ】
2021506255.tif 000038
【図１６Ｃ】
2021506255.tif 000039
【図１７Ａ】
2021506255.tif 000040
【図１７Ｂ】
2021506255.tif 000041
【図１７Ｃ】
2021506255.tif 000042
【図１７Ｄ】
2021506255.tif 000043
【図１７Ｅ】
2021506255.tif 000044
【図１７Ｆ】
2021506255.tif 000045
【図１８Ａ】
2021506255.tif 000046
【図１８Ｂ】
2021506255.tif 000047
【図１８Ｃ】
2021506255.tif 000048
【図１９Ａ】
2021506255.tif 000049
【図１９Ｂ】
2021506255.tif 000050
【図１９Ｃ】
2021506255.tif 000051
【図１９Ｄ】
2021506255.tif 000052
【図１９Ｅ】
2021506255.tif 000053
【図１９Ｆ】
2021506255.tif 000054
【配列表】
2021506255000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月4日(2020.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
ＰＲＡＭＥは、当初、ヒトメラノーマにおいてＨＬＡ−Ａ２４制限抗原ペプチドをコードする遺伝子として特定され、自己細胞傷害性Ｔ細胞性免疫応答を引き起こす。ヒトＰＲＡＭＥ遺伝子は、２２番染色体（ＨＳＡ２２）に位置し、ＰＲＡＭＥがレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）経路を妨害する７つのロイシンリッチ（ＬＸＸＬＬ（配列番号３））モチーフを有するタンパク質をコードし、ＲＡ誘導性分化、成長停止、およびアポトーシスの阻害につながる（Ｅｐｐｉｎｇ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＰＲＡＭＥ  ｉｓ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １２２，８３５−８４７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００５．０７．００３（２００５））。このように、ＰＲＡＭＥは、シグナル伝達経路の転写抑制因子として機能し、ＰＲＡＭＥの過剰発現は、腫瘍形成をもたらす。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１Ａ】ＰＲＡＭＥの図式表現を示す。図１Ａは、ＰＲＡＭＥタンパク質における７つの推定核内受容体（ＮＲ）ボックス（ＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号３））のアミノ酸残基番号の位置のグラフ表示を提供する。図１Ａは、左から順に配列番号５８〜６３及び４をそれぞれ開示する。図１Ｂは、各ＮＲボックスについて、隣接するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列データを提供する。図１Ｂは、上から順に配列番号３、及び６４〜７０をそれぞれ開示する。
【図１Ｂ】ＰＲＡＭＥの図式表現を示す。図１Ａは、ＰＲＡＭＥタンパク質における７つの推定核内受容体（ＮＲ）ボックス（ＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号３））のアミノ酸残基番号の位置のグラフ表示を提供する。図１Ａは、左から順に配列番号５８〜６３及び４をそれぞれ開示する。図１Ｂは、各ＮＲボックスについて、隣接するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列データを提供する。図１Ｂは、上から順に配列番号３、及び６４〜７０をそれぞれ開示する。
【図２】改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥとヒトＰＲＡＭＥ配列との配列アラインメントを提供する。図２は、上から順に、配列番号７１〜７４、及び７４をそれぞれ開示する。
【図３】一般に、ｐＧＸ１４２１を生成するクローニング反応を示す。
【図４】合成コンセンサスＰＲＡＭＥをトランスフェクトした細胞株におけるＰＲＡＭＥ抗原の発現のウエスタンブロット分析による確認を示す。
【図５】合成コンセンサスＰＲＡＭＥの発現を、対照（ｐＶＡＸ）と比較するイムノアッセイの結果を示す。
【図６】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて実施した免疫原性試験の免疫化および採血スケジュールを示す。
【図７】マウスにおけるｐＧＸ１４１１の用量応答を示す。
【図８Ａ】ｐＧＸ１４１１がマウスにおいて免疫原性であることの確認を示す。
【図８Ｂ】ｐＧＸ１４１１の投与後のマウスまたは未処理マウスにおける免疫応答をグラフで示す。
【図９Ａ】マウスにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を決定するためのフローサイトメトリー分析の結果をグラフで示す。詳細には、図９Ａおよび図９Ｂは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＩＦＮγを産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｂ】マウスにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を決定するためのフローサイトメトリー分析の結果をグラフで示す。詳細には、図９Ａおよび図９Ｂは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＩＦＮγを産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃおよび図９Ｄは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＣＤ１０７ａ＋を産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｄ】図９Ｃおよび図９Ｄは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＣＤ１０７ａ＋を産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅおよび図９Ｆは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＴＮＦαを産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図９Ｆ】図９Ｅおよび図９Ｆは、それぞれ、未処理対照と比較して、ｐＧＸ１４１１を受けたマウスにおいてＴＮＦαを産生するためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を示す。
【図１０】未処理対照と比較した、５、２５、および５０μｇのｐＧＸ１４１１による処理後のエンドポイント力価をグラフで示す。
【図１１】がん性組織の免疫組織化学染色を示す。
【図１２】合成コンセンサスＰＲＡＭＥおよび改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥを投与したマウスにおける免疫応答の比較をグラフで示す。
【図１３】非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究についての免疫化および採血スケジュール示す。
【図１４Ａ】ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した細胞性免疫原性を示す。図１４Ａは、経時的な免疫化群による平均ＩＦＮγ応答を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、個々のＮＨＰについてのＩＦＮγ応答を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、群内のバリエーションとともに群内のＩＦＮγ応答を示す。ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ６００６の投与のタイミングは、矢印１〜４で示した。
【図１５Ａ】ｐＧＸ１４２１およびＰＧＸ６００６を投与したＮＨＰにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。図１５Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答をグラフで示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＣＤ８＋応答をグラフで示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答をグラフで示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、免疫化後のＣＤ８＋Ｔ細胞表現型における変化を示す。
【図１６Ａ】ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ１４２１がｐＧＸ６００６（ＩＬ−１２）と組み合わせて誘導する細胞性免疫応答を示す。図１６Ａは、ｐＧＸ１４２１を投与した個々のＮＨＰにおけるＩＦＮγ応答を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ６００６の両方を投与した個々のＮＨＰにおけるＩＦＮγ応答を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１６Ａおよび図１６Ｂに示される応答の比較を提供する。ｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ１４２１をｐＧＸ６００６と組み合わせて投与するタイミングは、矢印１〜４で示した。
【図１７Ａ】フローサイトメトリーで特徴付けしたｐＧＸ１４２１およびｐＧＸ１４２１とｐＧＸ６００６との組み合わせによって誘導される細胞性免疫応答を示す。図１７Ａは、任意の個々のレシピエントにおける最小のＣＤ４＋応答を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαの違いを示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ｐＧＸ１４２１単独投与よりも大きいｐＧＸ１４２１／ｐＧＸ６００６投与のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαの違いを示す。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、ｐＧＸ１４２１を単独でまたはｐＧＸ６００６と組み合わせて投与したＮＨＰにおけるＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答を示す。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαの違いを示す。
【図１８Ａ】ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＩＦＮγ応答（図１８Ａ）と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたそれらの応答（図１８Ｂ）とを比較した。
【図１８Ｂ】ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＩＦＮγ応答（図１８Ａ）と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたそれらの応答（図１８Ｂ）とを比較した。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、比較を容易にするために、図１８Ａおよび図１８Ｂのデータを組み合わせる。ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１、およびｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与のタイミングは、矢印１〜４で示した。
【図１９Ａ】ｐＧＸ１４２１をｐＧＸ６００６と組み合わせて投与することによって誘導される細胞性免疫応答と、ｐＧＸ１４１１をｐＧＸ６００６と組み合わせて投与することによって誘導されるそれらの同じ応答と、を示す。詳細には、図１９Ａは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｄは、これらの２つの群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｅは、これらの２つの群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｄは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ａは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｄは、これらの２つの群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｅ】図１９Ｂは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｅは、これらの２つの群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【図１９Ｆ】図１９Ｃは、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４２１の投与によって誘導されたＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答と、ｐＧＸ６００６と組み合わせたｐＧＸ１４１１の投与によって誘導されたＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ細胞応答と、を示しており、図１９Ｆは、群間のＩＮＦγおよびＴＮＦαを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
合成コンセンサスＰＲＡＭＥ  ＤＮＡ配列が得られたら、より高いレベルの発現を得るために、上流のコザック配列およびＩｇＥリーダーをＮ末端に追加した。さらに、この遺伝子のコドン使用法は、ホモサピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合した。加えて、ＧＣ含有量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域、ならびに内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ−部位、リボソームエントリー部位などのｃｉｓ−作動配列モチーフを避けた、ＲＮＡ最適化を実施した。レチノイン酸シグナル伝達抑制における発現されたＰＲＡＭＥ分子の潜在的な機能を排除するために、２つの点変異（Ｌ４８７ＶおよびＬ４８８Ｖ）をＰＲＡＭＥの核内受容体ボックスＬＲＥＬＬ（配列番号４）に導入し、改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥを得た。この改変した合成コンセンサスＰＲＡＭＥタンパク質配列は、ヒト天然ＰＲＡＭＥタンパク質と９４．７％〜９５．１％の同一性を共有する。合成コンセンサスＰＲＡＭＥの特徴を表１に提供する。
【表１】
2021506255.tif 000055
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
合成コンセンサスＰＲＡＭＥは、マウスにおいて高度に免疫原性であり（図８Ａ）、免疫優性エピトープは、エピトープマッピングにより同定された（図８Ｂおよび表４）。簡単に言うと、コンセンサスＰＲＡＭＥ全体におよぶペプチドが産生され、各々が８アミノ酸ずつ重複する１５アミノ酸残基を含有する。これらのペプチドを３つのペプチドプールにプールした（表４）。未処理およびｐＧＸ１４１１免疫化マウスからの脾細胞を、マウスＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで３つのペプチドプールで刺激した。結果を図８Ａに示す。免疫優性エピトープは、ペプチドマトリックスマッピングアプローチを使用して同定した（図８Ｂ）。免疫優性エピトープには表４で下線が引かれている。
【表４】
2021506255.tif 000056
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2021506255000001.app
【国際調査報告】
2021506255.tif 000057
2021506255.tif 000058