(57)【要約】  本発明は、新規なワクチンの免疫補助剤に関するものとして、より具体的には、IL-12タンパク質及びIL-21タンパク質を有効成分として含むか、または前記IL-12タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび前記IL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含むTリンパ球特異的免疫反応促進用ワクチンの免疫補助剤に関するものである。
2021512950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-12タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびIL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、Tリンパ球特異的免疫反応促進用ワクチンの免疫補助剤。
【請求項２】
下記に構成される群から選択される少なくとも１以上を含む、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤：
前記IL-12タンパク質を構成するp35鎖（IL-12p35）及びp40鎖（IL-12p40）をそれぞれコードするポリヌクレオチドおよび前記IL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、一つないし3つのベクター;及び
前記IL-12p35、IL-12p40及びIL-21タンパク質をそれぞれコードする、mRNA分子。
【請求項３】
Bリンパ球特異的免疫反応を起こさずに、Tリンパ球特異的免疫反応を促進する、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項４】
前記IL-12p35タンパク質が、配列番号１に記載されているアミノ酸配列で構成されている、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項５】
前記IL-12p40タンパク質は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列で構成されているヒトIL-12p40である、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項６】
前記IL-21タンパク質は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列で構成されているヒトIL-21である、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項７】
下記のいずれか１以上をさらに含む、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤：
MIP-1α タンパク質をコードするポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されたMIP-1α遺伝子コンストラクト;及び
前記MIP-1αタンパク質をコードするポリヌクレオチドが前記IL-12p35、IL-12p40およびIL-21タンパク質のいずれか一つ以上にIRESまたはリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドによって動作可能に連結された複合遺伝子コンストラクト;及び
MIP-1αタンパク質をコードする、mRNA分子。
【請求項８】
前記MIP-1αタンパク質が、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列で構成されている、請求項７に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項９】
前記MIP-1α遺伝子コンストラクトが、別の発現ベクターに含まれるか、前記IL-12タンパク質を構成するp35鎖（IL-12p35）及びp40鎖（IL-12p40）をそれぞれコードするポリヌクレオチドおよび前記IL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、１つないし３つのベクターのいずれか１以上のベクター内に含まれる、請求項７に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載の免疫ワクチン補助剤;及び
感染性ウイルス由来の抗原または前記抗原をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された抗原の遺伝子コンストラクト又は前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを有効成分として含む、ウイルス感染の予防及び治療用ワクチン組成物。
【請求項１１】
前記感染性ウイルス由来の抗原は、EBV（Epstein-Barr virus）、HAV（hepatitis A virus）、HBV（hepatitis B virus）、HCV（hepatitis C virus）、HDV（hepatitis D virus）、HEV（hepatitis E virus）、 ハンターンウイルス（Hantaan virus）、CMV（cytomegalovirus）、HIV（human immunodeficiency virus）、インフルエンザウイルス（influenza virus）、HPV（human papilloma virus）、ポリオウイルス（poliovirus）、エボラウイルス（ebola virus）、ロタウイルス（rotavirus） 、デングウイルス（dengue virus）、ウエストナイルウイルス（West Nile virus）、黄熱病ウイルス（yellow fever virus）、アデノウイルス（adenovirus）、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、BKウイルス（BK virus）、天然痘ウイルス（smallpox virus）、ジカウイルス（Zika virus）、重症熱性血小板減少症候群ウイルス（SFTS virus）またはHSV（herpes simplex virus）由来の抗原である、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載のワクチン免疫補助剤;及び
癌抗原、
前記癌抗原をコードするポリヌクレオチド;
前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された遺伝子コンストラクト、または
前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター
を有効成分として含む、癌治療用ワクチン組成物。
【請求項１３】
前記癌抗原は、ヒトパピローマウイルス（HPV）由来の抗原、癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen）、前立腺特異抗原（PSA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、Her2 / neu 、MUC-1、BCR / ABL、α - フェトプロテイン（AFP）、エプスタインバールウイルス（EBV）由来の抗原、ヒトB型肝炎ウイルス（HBV）由来の抗原、ヒトC型肝炎ウイルス（HCV）由来の抗原、癌抗原-125 （CA-125）、癌抗原-72-4（CA-72-4）、癌抗原-15-3（CA-15-3）、または癌抗原-19-9（CA-19-9）である、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載の免疫ワクチン補助剤をワクチン組成物と一緒に、または前記のワクチン組成物の投与前後で個体に投与する段階を含む、前記ワクチン組成物によるTリンパ球特異的免疫反応の促進方法。
【請求項１５】
前記ワクチン補助剤は、生体内の電気穿孔法により、個体に投与される、 請求項14に記載のTリンパ球特異的免疫反応の促進方法。
【請求項１６】
前記個体のB細胞特異的免疫反応は誘導せずにTリンパ球特異的な免疫反応のみを選択的に誘導する、請求項１４に記載のTリンパ球特異的免疫反応の促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2018年2月2日付に出願された大韓民国特許出願第2018-0013329号に対する優先権を主張する。前記出願明細書は、本書に全体として参考に挿入される。
【０００２】
本発明は、ワクチンの免疫補助剤に関するものとして、より具体的には、T細胞特異的免疫反応を選択的に強化させることにより、抗がんワクチンなどの治療効果を極大化させることができる新規なワクチンの免疫補助剤に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、病原菌感染に対する防御を目的と抗原に対する免疫反応を生成するようにするために使用される医薬品として最近開発されているワクチンらは、主に組み換えタンパク質（recombinant protein）を抗原として使用している。組み換えタンパク質は、死菌ワクチンや弱毒化生ワクチンに比べて副作用が少なく、安全ですが、免疫原性が低いので、感染防御に十分な免疫力を生成するためにワクチンの免疫補助剤（vaccine adjuvant）を共に使用する。
【０００４】
ワクチンの免疫補助剤は、作用機転によって大きく抗原の伝達体、免疫増強剤、免疫反応を刺激すると同時に、抗原に対するマトリックスとして作用することなどの3つの種類に区別される。ワクチンの免疫補助剤を効果的に使用すると、（1）組換え抗原の免疫原性を増加させ、（2）抗原投与量を減らすか、または免疫化の回数を減らすことができ、（3）免疫力が弱い幼児や高齢者の免疫原性を向上させるなどの様々な効果を得ることができる。しかし、これらのワクチンの免疫補助剤の有用性にもかかわらず、まだ人間用ワクチンに使用できるように許可を受けたワクチンの免疫補助剤が多くない、これワクチンの免疫補助剤として選択されるために考慮すべき事項らが多いからだ。理想的なワクチンの免疫補助剤の条件は、安全性及び耐藥性に優れ、製造方法が簡単で、コストが安くなければならない点である。また、体内半減期が長く、生分解が可能であり、免疫補助剤自体については免疫反応を誘発してはならない。特にこの中でも、ワクチンの免疫補助剤の安全性の問題が最も重要視される。
【０００５】
現在、ヨーロッパとアメリカで承認を受け、ワクチンに使用されているワクチンの免疫補助剤としては、アルミニウム塩、MF59、AS03、AS04などがある。アルミニウム塩は、主にAl（OH）3またはAlPO4形態で使用されるが、一般的に、タンパク質抗原を吸着して、ゆっくり放出することで、免疫増強効果を示すと考えられた。しかし、最近にアルミニウム塩が樹状細胞（dendritic cell）を活性化させて、インターロイキン（IL）-1β及びIL-18のようなサイトカインの分泌を促進させることが知られている。アルミニウム塩は、いくつかのワクチンに広く使用され、非常に安全であると考えられているが、アレルギー反応を誘発し、神経毒性もあると推定されている。また、抗体が媒介された体液性免疫反応は、強く誘導するが、細胞性免疫反応はほとんど誘導しておらず、凍結保存が不可能だという短所がある。
【０００６】
ノバルティス（Novartis）社のMF59（Ott et al., Pharm Biotechnol. 6：277-296、1995）及びGSK社のAS03（Li et al., J. Virol．80（3）：1414-1426, 2006）は、水中油（oil-in-water、o/w）乳剤（emulsion）の形態の免疫補助剤としてすべてスクワラン（squalene）を基本成分とする。水中油乳化液免疫補助剤は、抗原提示細胞（antigen-presenting cell）を活性化させ、抗原吸収およびサイトカインの分泌を促進させて、ケモカイン受容体（chemokine receptor）の発現を増加させ、抗原提示細胞らの移動を増加させる。MF59及びAS03は、2009年流行した新型インフルエンザに関するワクチンにおいて抗原の免疫原性を増加させ、使用抗原量を減少させる目的で使用されており、臨床試験での抗体生成率及び交差防御効能を増加させる効果があることが確認された。スクワラン以外に人間に利用可能な自然の中で作られる乳剤を利用して、さまざまな乳化液免疫補助剤が開発されているが、過剰な免疫反応及び毒性のために実用化の難しさがある。リポソーム、免疫刺激複合体、ウイルス類似粒子などの微粒子伝達体らも免疫補助剤として開発されているが、通常、これらは抗原をカプセル化してワクチン伝達体及び補助剤として開発されている。特にリポソームに対する研究が活発だが、リポソームは、抗原をカプセル化すると同時に、ワクチン伝達や免疫補助剤として活動できる脂質層を構成する合成球体として、脂質層の数、電荷、構成、および製造方法によって、その活性が違ってくる。リポソームは、タンパク質及び多糖類抗原に対して体液性免疫および細胞性免疫を増強させる。しかし、製造上の困難や、安定性などに使用が制限されており、特に、免疫反応を高める補助剤としての役割よりも抗原伝達体に、より近いので、強力な免疫活性作用のために、免疫刺激成分を追加する必要がある。現在GSK社は、リポソームにモノホスホリルリピドA（monophosphoryl lipid A、MPL）を添加した免疫補助剤AS01Bを開発し、これを結核及びマラリア疾患に対するワクチンの免疫補助剤として適用するために開発している（WO96/33739A）。
【０００７】
しかし、前記ワクチンの免疫補助剤らは、細胞性免疫反応を増強させるものの、主に体液性免疫が必要なウイルスなどの感染性疾患の予防のためのワクチン組成物の免疫補助効果のために開発されたもので、癌などの細胞性免疫反応が必要な疾患に対する予防および治療用ワクチンに対する効果はまだ検証されてないのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、まだT細胞に特異的な免疫反応を強化させることにより、癌などの細胞性免疫反応の強化が必要な疾患の予防及び治療はもちろん、従来のウイルスなどの感染によって誘発される感染性疾患の予防及び治療にも効率的なワクチンの免疫補助剤の開発が切実に要求されているのが実情である。そこで、本発明者らは、前記問題点を含む様々な問題点を解決するためには、T細胞免疫反応特異的な免疫強化を通じてワクチンの効能を増進させることができる新規なワクチンの免疫補助剤を提供しようとする。しかし、本発明は、前記目的によって限定されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一観点によれば、IL-12タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびIL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含むTリンパ球特異的免疫反応促進用ワクチンの免疫補助剤が提供される。
【００１０】
本発明の他の観点によれば、IL-12タンパク質及びIL-21タンパク質を有効成分として含むTリンパ球特異的免疫反応促進用ワクチンの免疫補助剤が提供される。
【００１１】
本発明の他の観点によれば、前記免疫ワクチン補助剤及び免疫化対象抗原を有効成分として含むTリンパ球特異的免疫反応促進用ワクチン組成物が提供される。
【００１２】
なお、本発明の他の観点によれば、前記免疫ワクチン補助剤をワクチン組成物と一緒に、または前記のワクチン組成物による投与前後に個体に投与する段階を含む前記ワクチン組成物によるTリンパ球特異的免疫反応促進方法が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一実施例によるワクチン補助剤は、抗体の生成には影響を与えることなく抗原に特異的に反応するT細胞を選択的に増加させるT細胞 - 特異的免疫反応を画期的に強化させるため、様々な感染性ウイルスによる感染予防及び治療はもちろん、子宮頸癌などのがんの細胞性免疫の強化を通じた免疫治療剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１ａは、本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤であるBD-121の遺伝子コンストラクトを概略的に示した概略図であり、図１ｂは、本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤であるBD-121Aの遺伝子コンストラクトを概略的に示した概要図である。
【図２】図２は、本発明の一実施例によって製造された14價HPV DNAワクチンBD-14の遺伝子コンストラクトを概略的に示した概要図である。
【図３】図３は、本発明の一実施例によって製造されたCMV DNAワクチンの遺伝子コンストラクトを概略的に示した概要図である。
【図４】図４ａは、本発明の一実施例によって製造されたHSV-2 DNAワクチンに含まれるBD-02Bの遺伝子コンストラクトを概略的に示した概要図であり、図４ｂは、本発明の一実施例によって製造されたHSV-2 DNAワクチンに含まれるBD-02Cの遺伝子コンストラクトを概略的に示した概要図である。
【図５】図５は、本発明の一実施例によって製造されたSFTS DNAワクチンの遺伝子コンストラクトを概略的に示した概要図である。
【図６】図６は、従来の2價HPV DNAワクチン単独または本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤BD-121との併用投与時の抗原特異的なT細胞免疫反応を分析したELISPOT分析の結果を示すグラフである。
【００１５】
【図７】図７ａは、本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤hBD-121コンストラクトトで形質感染されたCOS-7細胞の培養上澄み液内のIL-12およびIL-21の濃度をELISAで分析した結果を示すグラフである。図７ｂは、本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤mBD-121コンストラクトトで形質感染されたCOS-7細胞の培養上澄み液内のIL-12およびIL-21の濃度をELISAで分析した結果を示すグラフである。図７ｃは、本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤hBD-121コンストラクト及びmBD-121にそれぞれ形質感染されたCOS-7細胞の細胞破砕液内のIL-12およびIL-21の発現程度をウェスタンブロット分析を通じて確認した結果を示す。
【図８】図８ａは、本発明の一実施例によって製造されたCMV DNAワクチン及び本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121の投与スケジュールを概略的に示すものである。図8bは、本発明の一実施例によって製造されたCMV DNAワクチンを単独で、またはIL-12、IL-21または本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121と併用投与時CMV抗原 - 特異的に反応した脾臓細胞を計数した結果を示したグラフである。図8cは、本発明の一実施例によって製造されたCMV DNAワクチンを単独で、またはIL-12、IL-21または本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121と併用投与時抗原 - 特異的な抗体反応を分析した結果を示すグラフである。
【図９】図９ａは、本発明の一実施例によって製造されたHBV DNAワクチンを単独で、または本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121と併用投与時HBV抗原（HBsAg、HBcAg及びPreS1/S2） - 特異的に反応した脾臓細胞を計数した結果を示したグラフである。図９ｂは、本発明の一実施例によって製造されたHBV DNAワクチンを単独で、または本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121と併用投与時HBsAg-特異的抗体反応を分析した結果を示したグラフである。
【００１６】
【図１０】図１０ａは、本発明の一実施例によって製造されたSFTS DNAワクチン及び本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121の投与スケジュールを示す。図１０ｂは、本発明の一実施例によって製造されたSFTS DNAワクチンを単独で、または本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121と1回併用投与時（ プライミング ）SFTS抗原（GnGc、NP及びNS）- 特異的に反応した脾臓細胞を計数した結果を示したグラフである。図１０ｃは、本発明の一実施例によって製造されたSFTS DNAワクチンを単独で、または本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121と2回併用投与時（プライミング及びブースティング）SFTS抗原（GnGc、NPおよびNS）- 特異的に反応した脾臓細胞を計数した結果を示したグラフである。
【図１１】図１１ａは、本発明の一実施例によって製造されたSFTS DNAワクチンを単独で、または本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121との混合比を異にして、1回併用投与時（プライミング） SFTS抗原（GnGc、NP及びNS）- 特異的に反応した脾臓細胞を計数した結果を示したグラフである。図１１ｂは、本発明の一実施例によって製造されたSFTS DNAワクチンを単独で、または本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121との混合比を異にして2回併用投与時（プライミング及びブースティング）SFTS抗原（GnGc、NP及びNS）- 特異的に反応した脾臓細胞を計数した結果を示したグラフである。
【図１２】図１２ａは、本発明の一実施例によって製造されたHSV-2 DNAワクチン（BD02）及び、本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121の投与スケジュールを示す。図１２ｂは、本発明の一実施例によって製造されたHSV-2 DNAワクチン（BD02）単独投与群（BD-02B+BD-02C）及び、本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121との併用投与群（BD02 DP）において時間の経過に伴うHSV-2病理学的指数の変化を記録したグラフである。図１２ｃは、本発明の一実施例によって製造されたHSV-2 DNAワクチン（BD02）単独投与群（BD-02B+BD-02C）及び、本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121との併用投与群（BD02 DP）において時間の経過に伴う実験動物の生存率の変化を記録したグラフである。
【００１７】
【図１３】図１３ａは、本発明の一実施例によって製造されたHSV-2 DNAワクチン（BD02）および、本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121の投与量を調節して投与した動物実験の投与スケジュールを示す。図１３ｂは、本発明の一実施例によって製造されたHSV-2 DNAワクチン（BD02）及び、本発明の一実施例によって製造されたワクチンの免疫補助剤であるBD-121Aの投与量を調節して、1次接種した（プライミング）実験動物のワクチンの免疫補助剤の投与量に応じたHSV-2抗原（gD、UL39およびICP4）- 特異的に反応した脾臓細胞の数を記録したグラフである。
【図１４】図１４は、従来の2價HPV DNAワクチンに対する本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤BD-121によるT細胞特異的免疫反応増進効果を抗原 - 特異的に反応した脾臓細胞を計数することにより、分析した結果を示すグラフである。
【図１５】図１５ａは、本発明の一実施例によって製造された14價HPV DNAワクチン及び本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤BD-121またはBD-121Aの投与スケジュールを示す。図１５ｂは、本発明の一実施例によって製造された14價HPV DNAワクチンに対する本発明の一実施によるワクチンの免疫補助剤BD-121およびBD-121AによるT細胞特異的免疫反応増進効果を抗原-特異的に反応した脾臓細胞を計数することにより、分析した結果を示すグラフである。
【図１６】図１６ａは、実験動物である、カニクイザル（cynomolgus monkey）に対する本発明の一実施例によるHSV-2 DNAワクチン（BD-02）及び、本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤BD-121Aの効果を分析するための前臨床実験の投与スケジュールを示す。図１６ｂは、本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤なしでBD-02単独投与群（左側）およびBD-121A併用投与群（右側）での投与前（VS）、1回投与時（VT1）および2回投与時（VT2）のHSV-2抗原（gD2及びUL39）- 特異的に反応した脾臓細胞を計数した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一観点によれば、IL-12タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびIL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含むTリンパ球特異的免疫反応促進用ワクチンの免疫補助剤が提供される。
【００１９】
このとき、前記ワクチンの免疫補助剤は、下記からなる群から選択される1つ以上を含むことができる：
前記IL-12を構成するp35鎖（IL-12p35）及びp40鎖（IL-12p40）をそれぞれコードするポリヌクレオチドおよび前記IL-21タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含む一つないし三つのベクター; 及び
前記IL-12p35、IL-12p40およびIL-21タンパク質をそれぞれコードするmRNA分子。
【００２０】
併せて、上述したワクチンの免疫補助剤は、前記のIL-21p35、IL-12p40およびIL-21のうち一部は、タンパク質として含まれ、残りは発現ベクターおよび/またはmRNA分子のような異種分子が混用されて使用されることも可能である。
【００２１】
この時、前記一つないし三つのベクターは、前記IL-12p35、IL-12p40およびIL-21を発現させることができるよう、前記ポリヌクレオチドがプロモーターのような調節配列に作動可能に連結された遺伝子コンストラクトを含むことができる。前記ワクチンの免疫補助剤は、前記のIL-12p35、IL-12p40およびIL-21をそれぞれコードするポリヌクレオチドらが、個々の発現ベクター内に挿入されたり（3ベクターシステム）一つまたは二つの発現ベクター内に挿入されることにより（単一ベクターまたは二重ベクターシステム）一つないし三つのベクターで構成されることができる。これらの単一ベクターないし三重ベクターシステムの具体的な具現例は、下記の通りである： 
【００２２】
i）前記IL-12p35、IL-12p40およびIL-21タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドがプロモーターにそれぞれ作動可能に連結された第1ないし第3の遺伝子コンストラクトを含む第1発現ベクター;
ii）前記第1ないし第3の遺伝子コンストラクトをそれぞれ含む第2ないし第4発現ベクター
iii）前記第1ないし第3の遺伝子コンストラクトのうち2つ及び残りの一つがそれぞれ含まれている第5発現ベクター及び第6発現ベクター;
iv）前記IL-12p35およびIL-12p40のうちいずれか一つにIL-21が連結された融合タンパク質、及び前記IL-12p35およびIL-12p40のうち前記融合タンパク質に含まれていないペプチド;
v）前記ivの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された第4の遺伝子コンストラクト及び、前記ivのペプチドをコードするポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された第5の遺伝子コンストラクトを含む第7発現ベクター;
vi）前記第4の遺伝子コンストラクト及び第5の遺伝子コンストラクトをそれぞれ含む第8発現ベクター及び第9発現ベクター;
vii）前記IL-12p35、IL-12p40およびIL-21タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドのうち少なくとも2以上が内部リボソーム進入部位（IRES）に連結されたポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された第6の遺伝子コンストラクト;及び選択的に前記三ポリヌクレオチドのうち、前記第6の遺伝子コンストラクトに含まれていないポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された第7の遺伝子コンストラクトを含む第10発現ベクター;および
viii）前記第6の遺伝子コンストラクトを含む第11発現ベクター及び選択的に前記第7の遺伝子コンストラクトを含む第12発現ベクター。
前記ワクチンの免疫補助剤は、Bリンパ球特異的免疫反応を起こさずに、Tリンパ球特異的免疫反応を促進することが可能である。
【００２３】
前記ワクチンの免疫補助剤において、前記IL-12p35タンパク質は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列で構成されているヒトIL-12p35と相同性90％以上、好ましくは95％以上のアミノ酸配列で構成されることができ、人体内で免疫反応を誘導していないレベルの高い相同性を持つ非人間例えば霊長類や類人猿由来のIL-12p35の使用も可能である。前記IL-12p40タンパク質は、配列番号2に記載されているアミノ酸配列で構成されているヒトIL-12p40と相同性90％以上、好ましくは95％以上のアミノ酸配列で構成されることができ、人体内での免疫反応を誘導していないレベルの高い相同性を持つ非人間例えば霊長類や類人猿由来のIL-12p40の使用も可能である。前記IL-12p35およびIL-12p40は韓国登録特許第0399728号に記載された配列また使用可能である。前記IL-21タンパク質は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列で構成されているヒトIL-21と相同性90％以上、好ましくは95％以上のアミノ酸配列で構成されることができ、人体内での免疫反応を誘導していないレベルの高い相同性を持つ非人間例えば霊長類や類人猿由来のIL-21の使用も可能である。
【００２４】
前記ワクチンの免疫補助剤は、下記のいずれか1つ以上をさらに含むことができる：
MIP-1αタンパク質をコードするポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されたMIP-1α遺伝子コンストラクト;及び
前記MIP-1αタンパク質をコードするポリヌクレオチドが前記IL-12p35、IL-12p40およびIL-21タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドのいずれか1つ以上にIRESまたはリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドによって動作可能に連結された複合遺伝子コンストラクト;及び
前記MIP-1αタンパク質をコードするmRNA分子。
【００２５】
前記ワクチンの免疫補助剤において、前記MIP-1αタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記IL-12p35、IL-12p40およびIL-21タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドにペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドまたはIRESを通じて動作可能に連結されたり、別の遺伝子コンストラクトの形態で提供されることができる。すなわち、前記MIP-1α遺伝子コンストラクトは、別の発現ベクターに含まれるか、前記IL-12を構成するp35鎖（IL-12p35）及びp40鎖（IL-12p40）をそれぞれコードするポリヌクレオチドおよび前記IL-21タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含む一つないし三つのベクターのいずれか一つ以上のベクター内に含まれることができる。すなわち、前記MIP-1α遺伝子コンストラクトは、前記ワクチンの免疫補助剤の具現例に記載された第1発現ベクターないし第12発現ベクターで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の発現ベクター内に含まれることができる。
【００２６】
前記ワクチンの免疫補助剤において、前記MIP-1αタンパク質は、配列番号10に記載されるアミノ酸配列で構成されているMIP-1αタンパク質と相同性90％以上、好ましくは95％以上のアミノ酸配列で構成されることができ、人体内で免疫反応を誘導していないレベルの高い相同性を持つ非人間例えば霊長類や類人猿由来のMIP-1αタンパク質の使用も可能である。
【００２７】
本発明の他の観点によれば、IL-12タンパク質及びIL-21タンパク質を有効成分として含むワクチンの免疫補助剤が提供される。
【００２８】
前記ワクチンの免疫補助剤において、前記IL-12タンパク質は、p35鎖（IL-12p35）及びp40鎖（IL-12p40）で構成されたものである可能性がある。
【００２９】
前記ワクチンの免疫補助剤は、MIP-1αタンパク質をさらに含むことができる。
前記IL-12タンパク質、IL-21タンパク質及びMIP-1αは、上述した通りである。
【００３０】
本書において使用される用語「作動可能に連結された（operably linked to）」とは、目的とする核酸配列（例えば、試験管内（in vitro）転写/翻訳システムにおいてまたは宿主細胞において）が、この発現が行われるようにする方式で、前記の調整配列に連結されていることを意味する。
【００３１】
前記「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む意味である。調節配列には、多くの宿主細胞において目的とする核酸が恒常的に発現されるように指示すること、特定の組織の細胞のみを目的とする核酸が発現されるように指示すること（例えば、組織特異的調節配列）、および特定の信号によって発現が誘導されるように指示すること（例えば、誘導性調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び希望タンパク質発現のレベルなどの因子に応じて異なることができるということは、当業者であれば理解できる。
【００３２】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、前記融合タンパク質を発現することができる。前記真核細胞および原核細胞において発現を可能にする調節配列らは、当業者によく知られている。上述したように、これらは通常の転写開始を担当する調節配列及び、選択的に転写物の転写終結および安定化を担当するポリ-Aシグナルを含む。追加の調節配列らは、転写調節因子のほか、翻訳増進因子および／または天然 - の組み合わせ、または 異種性プロモーター領域を含むことができる。例えば、哺乳類宿主細胞において発現を可能にする可能な調節配列らは、CMV-HSVチミジンキナーゼプロモーター、SV40、RSV-プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、 人間腎臓要素1α-プロモーター、グルココルチコイド - 誘導性MMTV-プロモーター（モロニーマウス腫瘍ウイルス）、メタロチオネイン- 誘導性またはテトラサイクリン - 誘導性プロモーターまたは、CMV増幅製又はSV40-増幅剤のような増幅剤を含む。神経細胞内の発現のために、神経細繊維-プロモーター（neurofilament-promoter）、PGDF-プロモーター、NSE-プロモーター、PrP-プロモーターまたはthy-1-プロモーターらが使用できることが考えられている。前記プロモーターらは、当分野で知られており、文献（Charron, J. Biol. Chem. 1995, 270：25739-25745）に記載されている。原核細胞内発現のために、lac-プロモーター、tac-プロモーターまたはtrp-プロモーターを含む多数のプロモーターらが開示されている。転写を開始することができる因子らに加えて、前記調節配列らは、本発明の一実施例によるポリヌクレオチドの下流（downstream）にSV40-ポリ-A部位またはTK-ポリ-A部位のような転写終結シグナルを含むこともできる。本書において、適当な発現ベクターらは、当分野で知られており、その例としては、オカヤマ-ベルク(Okayama-Berg)  cDNA発現ベクターpcDV1（Parmacia）、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogene）、pSPORT1（GIBCO BRL）、 pGX-27（特許第1442254号）、pX（Pagano（1992）Science 255、1144-1147）、酵母2-ハイブリッド（two-hybrid）ベクター、例えばpEG202及びdpJG4-5（Gyuris（1995）Cell 75、791 -803）または原核発現ベクター、例えば、ラムダgt11（Lambda gt11）またはpGEX（Amersham Pharmacia）がある。本発明の核酸分子らに加えて、ベクターは、分泌シグナルをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。前記の分泌シグナルらは、当業者によく知られている。また、使用された発現システムによって、融合タンパク質を細胞区画に導くことができるリーダー配列（leader sequence）が、本発明の一実施例によるポリヌクレオチドのコーディング配列に組み合わせされ、好ましくは、解読されたタンパク質またはそのタンパク質を細胞質周辺または細胞外媒質に直接分泌することができるリーダー配列である。
【００３３】
また、本発明のベクターは、例えば、標準の組換えDNA技術によって製造されることができ、標準組換えDNA技術には、例えば、平滑末端及び接着末端ライゲーション、適切な末端を提供するための制限酵素処理、不適切な結合を防止するために、アルカリフォスファターゼ処理によるリン酸基の除去及びT4 DNAリガーゼによる酵素的な連結などが含まれる。化学的合成または遺伝子組換え技術によって得られた信号ペプチドをコーディングするDNA、本発明のIL-12およびIL-21タンパク質をそれぞれコードするDNAを適切な調節配列が含まれているベクターに組換えすることにより、本発明のベクターが製造できる。前記調節配列が含まれているベクターは、商業的に購入または製造することができ、本発明の一実施例では、DNAワクチンの製造用ベクターであるpGX-27を製造し、使用した。
【００３４】
本発明の一実施例により前記発現ベクターは、宿主細胞において、前記タンパク質を発現するようにすることができる発現ベクターであることができ、前記発現ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、人工人間染色体などいかなる形態を示しても差し支えない。
【００３５】
本発明で使用される用語「融合タンパク質」は、二つ以上のタンパク質またはタンパク質内の特定の機能を担当するドメインがそれぞれのタンパク質またはドメインが本来の機能を担うように連結された組み換えタンパク質（recombinant protein）を意味する。前記二つ以上のタンパクまたはドメインの間には、通常、柔軟な構造を有するリンカーペプチド（linker peptide）が挿入されることができる。前記リンカーペプチドは、（G4S）n（単位体 ：配列番号50、nは1〜10の整数）、（GS）n（nは1〜10の整数）、（GSSGGS）n（単量体：配列番号51、nは1〜10の整数）、KESGSVSSEQLAQFRSLD（配列番号52）、EGKSSGSGSESKST（配列番号53）、GSAGSAAGSGEF（配列番号54）、（EAAAK）n（単位体：配列番号55、nは1〜10の整数）、CRRRRRREAEAC （配列番号56）、A（EAAAK）4ALEA（EAAAK）4A（配列番号57）、GGGGGGGG（配列番号58）、GGGGGG（配列番号59）、AEAAAKEAAAAKA（配列番号60）、PAPAP（配列番号61）、（Ala-Pro）n（nは1〜10の整数）、VSQTSKLTRAETVFPDV（配列番号62）、PLGLWA（配列番号63）、TRHRQPRGWE（配列番号64）、AGNRVRRSVG（配列番号65）、RRRRRRRR（配列番号66）、GFLG（配列番号67）、およびGSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE（配列番号68）などが含まれることができる。
【００３６】
前記発現ベクターは、一つまたは二つ以上の免疫増進ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができ、前記免疫増進ペプチドはCD28、ICOS（inducible costimulator）、CTLA4（cytotoxic T lymphocyte associated protein 4）、PD1（programmed cell death protein 1）、BTLA（B and T lymphocyte associated protein）、DR3（death receptor 3）、4-1BB、CD2、CD40、CD30、CD27、SLAM（signaling lymphocyte activation molecule）、2B4（CD244）、NKG2D（natural-killer group 2、member D）/ DAP12（DNAX-activating protein 12）、TIM1（T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1）、TIM2、TIM3、TIGIT、CD226、CD160、LAG3（lymphocyte activation gene 3） 、B7-1、B7-H1、GITR（glucocorticoid-induced TNFR family related protein）、Flt3リガンド（fms-like tyrosine kinase 3 ligand）、フラゼリン（flagellin）、HVEM（herpesvirus entry mediator）またはOX40L [ligand for CD134 （OX40）、CD252]の細胞質ドメイン、またはこれらのうち二つ以上の連結体であることができる。
【００３７】
前記発現ベクターは、分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができ、前記の分泌シグナル配列は、細胞内において発現される組み換えタンパク質の細胞外に分泌を誘導し、tPA（tissue plasminogen activator）シグナル配列、 HSV gDs（単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ds）シグナル配列または成長ホルモンシグナル配列のことができる。
【００３８】
本発明の他の観点によれば、前記免疫ワクチン補助剤及び感染性ウイルス由来の抗原または前記抗原をコードするポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された抗原の遺伝子コンストラクトまたはこれを含む発現ベクターを有効成分として含むウイルス感染の予防および治療用ワクチン組成物が提供される。
【００３９】
前記ワクチン組成物において、前記感染性ウイルス由来の抗原は、EBV（Epstein-Barr virus）、HAV（hepatitis A virus）、HBV（hepatitis B virus）、HCV（hepatitis C virus）、HDV（hepatitis D virus）、HEV（hepatitis E virus）、ハンターンウイルス（Hantaan virus）、CMV（cytomegalovirus）、HIV（human immunodeficiency virus）、インフルエンザウイルス（influenza virus）、HPV（human papilloma virus）、ポリオウイルス（poliovirus）、エボラウイルス（ebola virus）、ロタウイルス（rotavirus）、デングウイルス（dengue virus）、ウエストナイルウイルス（West Nile virus）、黄熱病ウイルス（yellow fever virus）、アデノウイルス（adenovirus）、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、BKウイルス（BK virus）、天然痘ウイルス（smallpox virus）、ジカウイルス（Zika virus）、重症熱性血小板減少症候群ウイルス（SFTS virus）またはHSV（herpes simplex virus）由来の抗原であることができる。
【００４０】
本発明の他の観点によれば、前記ワクチンの免疫補助剤および癌抗原、前記癌抗原をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された抗原の遺伝子コンストラクトまたはこれを含む発現ベクターを有効成分として含む癌治療用ワクチン組成物が提供される。
【００４１】
前記癌治療用ワクチン組成物において、前記癌抗原は、ヒトパピローマウイルス（HPV）由来の抗原、癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen）、前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、Her2/neu、MUC-1、BCR/ABL、α-フェトプロテイン（AFP）、エプスタインバールウイルス（EBV）由来の抗原、ヒトB型肝炎ウイルス（HBV）由来の抗原、ヒトC型肝炎ウイルス（HCV）由来の抗原、癌抗原-125 （CA-125）、癌抗原-72-4（CA-72-4）、癌抗原-15-3（CA-15-3）、または癌抗原-19-9（CA-19-9）であることができる。
【００４２】
前記ワクチン組成物は、前記担体に加えて、薬学的に許容可能な補助剤、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。
【００４３】
本書で使用される用語「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容され、人間に投与されるとき、通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれに類似の反応を起こさない組成物をいう。前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、 アルギナート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、および鉱物油を挙げることができる。また、充填材、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、および防腐剤などをさらに含むことができる。
【００４４】
前記ワクチン組成物は、前記ワクチンの免疫補助剤のほか、一般的に使用されるワクチンの免疫補助剤をさらに含むことができているが、これらのワクチンの免疫補助剤としては、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）、MF59、virosome、AS04 [アルミニウムヒドロキシド及びモノホスホリルリピドA（MPL）の混合物]、AS03（DL-α-tocopherol、squalene及び乳化剤のpolysorbate 80の混合物）、CpG、Flagellin、Poly I：C、AS01、AS02、ISCOMs及びISCOMMATRIXなどが使用されることができる。
【００４５】
本書で使用される「補助剤（adjuvant）」または「ワクチンの免疫補助剤（vaccine adjuvant）」は、ワクチンの免疫反応を向上させる目的で投与される薬学的または免疫学的製剤を意味する。
【００４６】
また、本発明に一実施例によるワクチンの免疫補助剤またはこれを含むワクチン組成物は、哺乳動物に投与時、活性成分の迅速な放出、または持続または遅延された放出が可能なように当業界に公知された方法を使用して製剤化することができる。製剤は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態を含む。
【００４７】
本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤またはこれを含むワクチン組成物は、様々な経路で投与することができ、例えば、経口、非経口、例えば坐剤、経皮、静脈、腹腔、筋肉内、 病変内、鼻腔、脊椎管内投与で投与されることができ、また、徐放型または連続的または反復的放出のための移植裝置を使用して投与することができる。投与回数は、所望の範囲内で、一日に1回、または数回に分けて投与することができ、投与期間も特に限定されない。
【００４８】
本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤またはこれを含むワクチン組成物は、一般的な全身性投与または局所性投与、例えば、筋肉内注射または静脈注射の方式で投与されることが可能ですが、DNAワクチン組成物として提供される場合、最も好ましくには、エレクトロポレーター（electroporator）を利用して注入することができる。前記エレクトロポレーターは市販されているDNAの薬物体内注入用エレクトロポレーター、例えば、イタリアのIGEA社のGlinporatorTM、韓国のJCBIO社のCUY21EDIT、スイスのSupertech社のSP-4a、韓国のSLVAXiGEN社のOrbiJectorなどが使用されることができる。
【００４９】
本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤またはこれを含むワクチン組成物の投与経路は、目的組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与することができる。このような投与経路は、非経口投与、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、滑膜腔内投与されることが可能ですが、これに限定されない。
【００５０】
本発明の一実施例によるワクチンの免疫補助剤またはこれを含むワクチン組成物は、一般的に使用される薬学的に許容可能な担体と一緒に適合した形態に製剤化することができる。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、適切な油、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどのような非経口投与用担体などがあり、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロライド、メチル - またはプロピルパラベン、およびクロロブタノールがある。また、本発明に係る組成物は、その投与方法や剤形に応じて、必要な場合には、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張剤、保存剤、 吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適切に含むことができる。前記に例示されたものをはじめとして、本発明に適した薬学的に許容される担体及び製剤は、文献[Remington's Pharmaceutical Sciences、最新版]に詳細に記載されている。
【００５１】
前記ワクチン組成物の患者に対する投与量は、患者の身長、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、一般的な健康、および同時に投与される他の藥物らを含む多くの要因らによって異なる。薬学的に活性なDNAは、100ng/体重（kg） -  10mg/体重（kg）の量で投与されることができ、より好ましくは1〜500μg/ kg（体重）で投与されることができ、最も好ましくは5〜50μg/ kg（体重）で投与されることがありますが、前記の要素らを考慮して、投与量を調節することができる。
【００５２】
なお、本発明のワクチン組成物は、薬学的に有効な量に投与される。
【００５３】
本書で使用される用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵/危険割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路、および排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。本発明のワクチン組成物は、0.1mg/kg〜1g/kgの容量で投与されることができ、より好ましくは1mg/kg〜500mg/kgの投与量で投与される。一方、前記投与量は、患者の年齢、性別および状態に応じて適切に調節することができる。
【００５４】
なお、この発明の他の観点によれば、前記免疫ワクチン補助剤をワクチン組成物と一緒に、または前記のワクチン組成物の投与前後で個体に投与する段階を含む前記ワクチン組成物によるTリンパ球特異的免疫反応を促進方法が提供される。
【００５５】
前記の方法において、前記免疫ワクチン補助剤は、生体内の電気穿孔法によって投与することができる。
【００５６】
前記方法は、前記の個体のB細胞特異的免疫反応は誘導せずにTリンパ球特異的な免疫反応のみを選択的に誘導することを特徴とする。
【００５７】
以下、実施例及び実験例を通じて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、異なる多様な形態で実装することができるもので、以下の実施例及び実験例は、本発明の開示が完全にするようにし、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されているものである。
【実施例】
【００５８】
実施例１：ヒトIL-12及びIL-21発現ベクターの製造
１−１：単一ベクターシステム
本発明者らはIL-12及びIL-21が一つのベクターを通じて発現されるように、単一のベクターシステムを考案した。
【００５９】
このため、具体的に、本発明者らは、ヒトIL-12タンパク質の2つの小単位体である配列番号１に記載されているアミノ酸配列で構成されるhIL-12p35および配列番号２に記載されているアミノ酸配列で構成されるhIL-12p40ポリペプチドを、それぞれコードするポリヌクレオチド（配列番号４および５）を配列番号６に記載される核酸配列を有するEMCV-由来の内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、IRES）で連結し、前記hIL-12p40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの3 '-末端に配列番号７に記載されるRSVプロモーター（pRSV）、および配列番号3に記載されるアミノ酸配列で構成されているヒトIL-21タンパク質（hIL-21）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）を順次連結した遺伝子コンストラクトを製造した後、前記の遺伝子コンストラクトをpGX-27ベクター（韓国登録特許第1442254号）のマルチクローニング部位に挿入して、本発明の一実施例によるベクターを製造し、これを「hBD-121」と命名した（図１ａ）。
【００６０】
１−２：二重ベクターシステム
本発明者らは、前記IL-12およびIL-21が、別のベクターに挿入されて発現されるように、二重ベクターシステムを考案した。
【００６１】
前記二重ベクターシステムは、以下のように製造される：
前記hIL-12p35ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）及びhIL-12p40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を配列番号６に記載されている核酸配列を有するEMCV-IRESに連結し、これをpGX-27ベクターのマルチクローニング部位に挿入し、同様に、ヒトIL-21タンパク質（hIL-21）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）もpGX-27ベクターのマルチクローニング部位に挿入して、二重のベクターシステムを製造する。
【００６２】
１−３：三重ベクターシステム
IL-12の場合、hIL-12p35ポリペプチド及びhIL-12p40ポリペプチドからなる二量体タンパク質であるために、前記のhIL-12p35ポリペプチド及びhIL-12p40ポリペプチドは、独立したベクターから発現することができる。このように、本発明の一実施例によれば、前記のhIL-12p35ポリペプチド、hIL-12p40ポリペプチド及びIL-21は、それぞれ独立して構成された三つのベクターを通じて発現されることができる。これを見た発明者らは、便宜上「三重ベクターシステム」と命名した。
【００６３】
前記三重ベクターシステムは、下記のように製造することができる：
前記hIL-12p35ポリペプチド、hIL-12p40ポリペプチド及びhIL-21をそれぞれコードするポリヌクレオチド（配列番号4,5、および8）をpGX-27ベクターのマルチクローニング部位に挿入して三重ベクターシステムを製造する。
【００６４】
実施例２：ヒトIL-12、IL-21およびMIP-1α発現ベクターの製造
配列番号１に記載されているアミノ酸配列で構成されているhIL-12p35ポリペプチド及び配列番号２に記載されているアミノ酸配列で構成されているhIL-12p40ポリペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチド（配列番号４および５）を、配列番号６に記載されている核酸配列を有するEMCV-由来の内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、IRES）で連結し、前記hIL-12p40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの3‘-末端に配列番号７に記載されているRSVプロモーター（pRSV）、および配列番号3に記載されるアミノ酸配列で構成されているヒトIL-21タンパク質（hIL-21）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）が順次連結されたポリヌクレオチドに配列番号９に記載されている核酸配列で構成されている人間EF-1αプロモーター（pEF-1α）及び配列番号１０に記載されるアミノ酸配列で構成されている人間MIP-1αタンパク質（hMIP-1α）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）を順次連結した遺伝子コンストラクトを製造してpGX-27ベクターのマルチクローニング部位に挿入し、これをhBD-121Aと命名した（図１ｂ）。
【００６５】
実施例３：マウスIL-12およびIL-21発現ベクターの製造
マウスIL-12タンパク質の2つの小単位体である配列番号１２に記載されているアミノ酸配列で構成されているmIL-12p35ポリペプチド及び配列番号１３に記載されるアミノ酸配列で構成されているmIL-12p40ポリペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチド（配列番号１４および１５）を配列番号６に記載されている核酸配列を有するEMCV-由来の内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、IRES）で連結し、前記mIL-12p40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの3‘-末端に配列番号７に記載されているRSVプロモーター（pRSV）、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列で構成されているマウスのIL-21タンパク質（mIL-21）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を順次連結した遺伝子コンストラクトを製造した後、前記の遺伝子コンストラクトをpGX-27ベクターのマルチクローニング部位に挿入して、本発明の一実施例によるベクターを製造し、これを「mBD-121」と命名した（図１ａ）。
【００６６】
実施例４：マウスIL-12、IL-21およびMIP-1α発現ベクターの製造
配列番号１２に記載されているアミノ酸配列で構成されているmIL-12p35ポリペプチド及び配列番号１３に記載されるアミノ酸配列で構成されているmIL-12p40ポリペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチド（配列番号１４および１５）を配列番号６に記載されている核酸配列を有するEMCV-由来の内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、IRES）で連結し、前記mIL-12p40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号８）の3 '-末端に配列番号７に記載されているRSVプロモーター（pRSV）、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列で構成されているマウスのIL-21タンパク質（mIL-21）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）が順次連結されたポリヌクレオチドに配列番号９に記載されている核酸配列で構成されている人間EF-1αプロモーター（pEF-1α）及び配列番号１８に記載されているアミノ酸配列で構成されているマウスMIP-1αタンパク質（mMIP-1α）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１９）を順次連結した遺伝子コンストラクトを製造してpGX-27ベクターのマルチクローニング部位に挿入し、これをmBD-121Aと命名した（図1b）。
【００６７】
実施例５：HPV DNAワクチンコンストラクトの製造
本発明者らは、14價HPV DNAワクチンを製造するために、高危険群に属する6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型および59型のヒトパピローマウイルス（human papilloma virus、HPV）の早期発現タンパク質E6およびE7抗原を混合した融合タンパク質の形態で発現させるために、各タイプのE6抗原およびE7抗原のN-末端断片及びC-末端断片をコードするポリヌクレオチドをPCR反応を通じて得た後、図2および表1に開示された順番のように連結して、3つの遺伝子コンストラクトを製造した後、これをそれぞれpGX-27ベクターに挿入することにより、 HPV DNAワクチンコンストラクトを製造し、これをそれぞれBD-14A、BD-14BおよびBD-14Cと命名し、前記３つのベクターを含む組成物をBD-14と命名した。前記のように3ベクターシステムにHPV 14價DNAワクチンコンストラクトを製造した理由は、挿入される遺伝子コンストラクトのサイズが大きすぎる場合pGX-27ベクターの容量上非効率だからだ。
【００６８】
図２および下記表１に示すように、各タイプのHPV E6及びE7抗原は、それぞれ、一部の配列が重複しているN-末端断片及びC-末端断片に割った後、E6のN-末端断片の後ろE7末端のC - 末端断片が連結された融合ポリペプチドが（GS）5リンカーペプチドでE7のN-末端断片の後ろE6のC-末端断片が連結された融合ポリペプチドが再び連結された構造を有し、これらの各タイプの抗原の単位体の4つないし5つが前記（GS）5リンカーに連結されて一つのベクターに含まれるように作製しをした。一つの発現ベクターに挿入される各サブタイプの種類は、表１に例示的に記載されているが、これは例示的なものに過ぎず、いかなる他の順序で製造してもよい。
【００６９】
【表１】
2021512950.tif 000003
【００７０】
実施例２：ヒトIL-12及びIL-21発現ベクターの製造
実施例６：CMV DNAワクチンコンストラクトの製造
本発明者らはCMV DNAワクチンコンストラクトを製造するために、CMV糖タンパク質B（gB）及びpp65タンパク質が含まれているタンパク質をコードするポリヌクレオチドを製造した後pGX-27ベクターのマルチクローニング部位に挿入してCMV DNAワクチンコンストラクトを製造した（図５）。
【００７１】
実施例７：HBV DNAワクチンコンストラクトの製造
本発明者らはHBV DNAワクチンコンストラクトを製造するために、preS1、preS2、S抗原、表面抗原および核抗原を発現するようにHBV DNAワクチンコンストラクトを製造した後、これをpGX-27ベクターに挿入した。
【００７２】
実施例８：HSV-2 DNAワクチンコンストラクトの製造
本発明者らはHSV-2 DNAワクチンコンストラクトを製造するために、HSV-2のUL39抗原を5つの切片（N1：UL3921-154（Δ78-104）、C2：UL391117-1142、N2：UL39165-227、 N4-C1：UL39398-1116、N3：UL39208-398）で割った後、これ混ぜ配置されたHSV-2のシャッフルド（shuffled）UL-39抗原及び前記シャッフルドUL-39をコードする遺伝子コンストラクトをpGX-27ベクターのマルチクローニング部位に挿入することにより、HSV-2 DNAワクチンコンストラクトを製造した。
【００７３】
具体的に、shuffled-UL39 plasmid DNAは、UL39-N1（配列番号32、UL39-C2（配列番号33）、UL39-N2（配列番号34）、UL39-N4-C1（配列番号35）、およびUL39-N3（配列番号36）の部分に分けられた形態を基盤に、UL39-N1、UL39-C2、UL39-N2、UL39-N4-C1、およびUL39-N3順序で順次連結された形態（配列番号37）をコードするポリヌクレオチド（配列番号38）を含む遺伝子コンストラクトを、前記pGX-27プラスミドベクターに挿入することにより、製作し（図4a）、これを「BD-02B」と命名した。
【００７４】
また、本発明者ら前記シャッフルドUL39抗原に加えて、他のHSV-2抗原、すなわち、シグナル配列（gD1-25）及び膜貫通ドメイン（gD350-363）が除去されたGlycoprotein D（gD26-349）、配列番号39）、核の位置化配列（NLS、ICP0510-516）が除去されたinfected cell polypeptide 0（ICP0Δ510-516、配列番号40）及びRS1.3部分（ICP767-1318）が除去されたinfected cell polypeptide 4（ICP4Δ767-1318、配列番号41）が連結されtPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4融合タンパク質（配列番号42）をコードするポリヌクレオチド（配列番号43）が含まれる遺伝子コンストラクトをpGX-27ベクターに挿入することにより、tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNAを製造した（図4b）。前記2つのプラスミドのすべて効率的な発現のためにコドン最適化されたtPAの分泌シグナル配列（配列番号22）および、免疫系活性タンパク質であるFMS-like tyrosine kinase 3 ligand（Flt3L、配列番号24）がN-末端に付加された形態の融合タンパク質の形態で発現されるように考案されたplasmid DNAである。前記製造されたDNAのワクチン用プラスミドDNAは、「BD-02C」と命名し、前記BD-02BおよびBD-02Cで構成されたDNAワクチン組成物を「BD-02」と命名した。
【００７５】
実施例９：SFTS DNAワクチンコンストラクトの製造
本発明者らはSFTSの抗原RdRP（RNA dependent RNA polymerase）を除いたGnGc（Glycoprotein N and C、配列番号４４）、NP（nucleocapsid、配列番号４５）、NS（nonstructural protein、配列番号４６）抗原を発現することができように、各タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４７ないし４９）を分離されたSFTSウイルスゲノムを鋳型としてPCR反応を通じて増幅した後、それぞれCMVプロモーター（pCMV）、RSVプロモーター（pRSV）及びEF-1aプロモーター（pEF-1α）に作動可能なように連結した後、pGX-27プラスミドDNAに挿入して、SFTS DNAワクチンである組換えプラスミドDNA（SFTS plasmid DNA）を作製した（図５）。
【００７６】
実験例１：IL-12およびIL-21のワクチン免疫補助剤としての可能性を確認
本発明者らはIL-12およびIL-21のタンパク質及びDNAの形態のワクチン免疫補助剤としての可能性を確認するための予備実験を行った。このため、具体的に、16型及び18型に対するHPV 2價DNAワクチンを単独でそしてIL-12および/またはIL-21と一緒に個体に投与して免疫反応を調べた。
【００７７】
具体的には、韓国公開特許公報第10-2017-0045254号に記載された16型/18型2價HPV DNAワクチンコンストラクト2μgをC57BL/6マウスの大腿筋にOrbiJector（SLVAXiGEN、Korea）生体内のエレクトロポレーターを利用して、2週間の間隔でmIL-12コンストラクトおよび/またはmIL-21コンストラクト各2μgと共に二回投与した。次に、2回目の投与日から2週後に脾臓を摘出し、HPV 16およびHPV18に反応する脾臓免疫細胞の数を計数した（図６）。
【００７８】
その結果、図6に示すように、IL-12またはIL-21単独処理時に比べてIL-12およびIL-21の同時処理されたマウスにおいての免疫反応を示した細胞が著しく増加することを確認しており、特に18型HPVにおいて、その効果が大胆に確認した。
【００７９】
前記の結果は、IL-12およびIL-21が併用処理時のワクチンの免疫反応を相乗的に増加させることができるサイトカインであることを示唆している結果である。
【００８０】
実験例２：BD-121の発現分析
２−１：ELISA分析
本発明者らは、前記の実施例2および4において、それぞれ製造された本発明の一実施例によるhBD-121コンストラクト及びmBD-121コンストラクトを細胞に形質導入した後、これらの形質転換細胞においてIL-12及びIL-21が正常に発現するか否かを調査した。具体的にCOS-7細胞株を100 mm culture dishに接種し、16時間培養した後の空ベクター（mock plasmid DNA）及び実施例2-1において製造されたhBD-121 plasmid DNA及び実施例4において製造されたmBD-121 plasmid DNAにLipofectamine 2000を用いて、それぞれ形質感染させ、37℃のCO2培養基において、3日間培養した後、各条件のCOS-7細胞の培養上澄み液を回収して検体として使用した。検体内に存在するIL-12およびIL-21タンパク質らは、それぞれIL-12およびIL-21を特異的に認識する抗体（IL-12：R＆D Systems、Cat＃D1200、IL-21：BioLegend、Cat＃433808）を利用したELISA分析方法を用いて定量した（図7aおよび7b）。
【００８１】
その結果、図7aで示すように、hBD-121 plasmid DNAを導入した検体内のタンパク質の発現量はhIL-12の場合、4μgDNA導入時4,000 pg / mlを上回って正常に発現されることを確認しており、hIL-21やはり4μgのDNA導入時なんと200 ng / mlのに近い数値を示し、非常高発現していることを確認できた。併せて、図7bで示すように、マウスコンストラクトも人間コンストラクトと同様の結果を示した。一方、空ベクターを導入した対照群の場合、両タンパク質のすべて全く発現されないが、本発明のワクチンの免疫補助剤発現システムが正常に動作することを確認できた。
【００８２】
１−２：ウェスタンブロット分析
本発明者らは、前記実験例1-1で得られた細胞の細胞破砕液を対象にSDS-PAGE電気泳動を行い、ナイロン膜で転写した後、抗-IL-12A抗体（Abcam、Cat＃ab131039）、抗-IL-12B抗体（Abcam、Cat＃ab133752）および抗-IL-21抗体（Abcam、Cat＃ab5978）を用いてウェスタンブロット分析を行った（図７ｃ）。
【００８３】
その結果、図７ｃにおいて確認されているように、IL-12およびIL-21のすべて本発明の一実施例によるBD-121プラスミドDNAの形質導入によって正常に発現されることを確認した。
【００８４】
実験例３：BD-121の様々なウイルスに対する免疫反応増進効果の分析
続いて、本発明者らは、前記実験例2の結果から、実際の本発明の一実施例によるBD-121コンストラクトが、様々なウイルスに対する免疫反応を増進させるかどうかについて調査した。
【００８５】
３−１：CMVに対するT細胞 - 特異的免疫反応及び抗体反応
まず、本発明者らは、前記の実施例6において製造されたCMV DNAワクチンコンストラクト0.5μgを単独で、またはBD-121  0.5μgと共に一回C57BL/6マウスの大腿筋にOrbiJector（SLVAXiGEN、Korea）生体内のエレクトロポレーターを利用して接種した。このとき、比較群でBD121の構成要素であるIL-12およびIL-21をそれぞれ発現する発現ベクターを単独で、または組み合わせて（IL-12+IL-21）、それぞれ0.5μgずつCMV DNAワクチンコンストラクト0.5μgと共に投与した（表2）。ワクチン接種2週後に実験動物を犠牲にした後、脾臓を摘出し、CMVに対するT細胞 - 特異的免疫反応を前記CMV DNAワクチンに含まれるCMVの抗原であるCMVpp65及びCMVgBペプチドプールを使用したex vivo ELISPOT分析法を利用して分析した（図8a）。CMVgB-特異的抗体反応は、得られた血漿を用いてCMV-特異的抗体反応ELISA試験法を使用して分析した（図8a乃至8c）。
【００８６】
【表２】
2021512950.tif 000004
【００８７】
その結果、図８ｂで示されるように、本発明の一実施例によるBD-121ワクチンの免疫補助剤は、CMV DNAワクチン単独処理時と比較時、大幅に高いT-細胞特異的免疫反応を惹起した。具体的に、CMV DNAワクチン単独処理時CMVpp65及びCMVgB特異的な免疫反応は、それぞれ300 SFCs（spot forming cells）及び700 SFCs である反面、BD-121併用投与を通じてCMVpp65及びCMVgB特異的な免疫反応は、それぞれ2,000 SFCs及び2,100 SFCsで約3〜7倍の抗原 - 特異的なT細胞反応を増加することを確認した。反面に、図８ｃで示すように、CMV-特異的抗体の生成程度を分析した結果、本発明のBD-121は、むしろCMV DNAワクチン単独処理時よりも低い抗体反応を誘導することを確認した。これらの点は、本発明の一実施例によるBD-121が非選択的に免疫反応を増加させる方式ではなく、T細胞特異的な免疫反応、すなわち、細胞性免疫反応を選択的に強化することにより、免疫増進を誘発することを示してある。
【００８８】
３−２：HBVに対するT細胞-特異的免疫反応および抗体反応
前記実施例7において製造されたHBV DNAワクチンコンストラクト2μgを単独で、またはBD-121 2μgと共に２週の間隔でC57BL / 6マウスの大腿筋にOrbiJector（SLVAXiGEN、Korea）生体内のエレクトロポレーターを用いして接種し（それぞれプライミング及びブースティング）、二番目のワクチン接種日、つまり、ブースティングから２週後に実験動物を犠牲にした後、脾臓を摘出し、HBVに対するT細胞 - 特異的免疫反応を前記HBV DNAワクチンコンストラクトに含まれるHBV抗原（HBsAg、HBcAg、およびPreS1 / S2）ペプチドのプールを利用したex vivo ELISPOT分析により分析した。併せて、HBsAg-特異的抗体反応は、得られた血漿を用いてHBV-特異的抗体反応をELISA試験法を通じて分析した（図9a及び9b）。
【００８９】
その結果、図９ａで示されたように、本発明の一実施例によるBD-121ワクチンの免疫補助剤は、HBV DNAワクチンコンストラクト単独処理時と比較時大幅に高いT-細胞特異的免疫反応を惹起した。特にHBsAg抗原及びHBcAg抗原に反応する脾臓の免疫細胞の数が急激に増加した。しかし、図9bで示すように、HBV-特異的抗体の生成程度を分析した結果、本発明のBD-121は、むしろHBV DNAワクチンコンストラクト単独処理時よりも抗体力価の増加をさせないことを確認した。本発明のBD-121によるT細胞 - 特異的免疫反応に対する選択的な強化は、特定のウイルス抗原に限られた事項ではなく、ほとんどの感染性ウイルスについても同様の様相で表示される現象であることを確認させてくれるものである。
【００９０】
３−３：SFTSに対するT細胞 - 特異的免疫反応及び抗体反応
空ベクターでpGX-27（G1）を投与したり、前記実施例9において製造されたSFTS DNAワクチン12μgを単独で（G2）またはBD-121 12μgと共に（G3）2週間の間隔でC57BL / 6マウスの大腿筋にOrbiJector（SLVAXiGEN、Korea）生体内のエレクトロポレーターを用いて接種して（ブースティング）、一部のマウス（n=5）は、一番目の接種（プライミング）した後、犠牲にして脾臓を摘出した後、SFTSに対するT細胞 - 特異的免疫反応を前記SFTS DNAワクチンに含まれるSFTSの抗原であるGnGc、NP及びNSを使用したELISPOT分析を通じて分析し、残りの実験動物（n=5）らは、二番目にワクチン接種日（ブースティング）から２週後に犠牲にした後、脾臓を摘出し、SFTSに対するT細胞 - 特異的免疫反応を前記のようなELISPOT分析を通じて分析した（図１０ａ乃至１０ｃ）。
【００９１】
その結果、図10bで示されたように、本発明の一実施例によるBD-121ワクチンの免疫補助剤は、SFTS DNAワクチン単独処理時と比較時のプライミングだけでも顕著なT細胞 - 特異的免疫反応を誘発し、図１０ｃで示されように、ブースティング時には、T細胞 - 特異的免疫反応がさらに増加した。 反面に、SFTS DNAワクチン単独投与時には、ブースティングによる免疫反応の増進が観察されなかった。したがって、本発明の一実施例によるBD-121は、1次接種によるプライミングはもちろん、２次接種によるブースティング時より効果的なワクチン補助効果を示すことが確認された。
【００９２】
続いて、本発明者らは、前記SFTS DNAワクチン及び、本発明の一実施例によるBD-121ワクチンの免疫補助剤の接種率を異にしてプライミング及びブースティングの効果を比較した。
【００９３】
具体的に、空ベクター（mock DNA、G1）、SFTS DNAワクチン単独（G2）、SFTS DNAワクチン：BD-121=1：0.3（G3）、SFTS DNAワクチン：BD-121=1：1（G4）及びSFTS  DNAワクチン：BD-121=1：3（G5）を前記のように、2週間の間隔でC57BL/6マウスの大腿筋にOrbiJector（SLVAXiGEN、Korea）生体内のエレクトロポレーターを用いて接種して（ブースティング）、一部のマウス（n=5）は、一番目の接種（プライミング）した後犠牲にして脾臓を摘出した後、SFTSに対するT細胞 - 特異的免疫反応を前記SFTS DNAワクチンに含まれるSFTSの抗原であるGnGc、NP及びNSを使用したELISPOT分析を通じて分析し、残りの実験動物（n=5）らは、 二番目にワクチン接種日（ブースティング）から2週後に犠牲にした後、脾臓を摘出し、SFTSに対するT細胞 - 特異的免疫反応を前記のようにELISPOT分析を通じて分析し、血漿を得て、SFTS-特異的抗体反応を分析した（表３、図１１ａおよび１１ｂ）。
【００９４】
【表３】
2021512950.tif 000005
【００９５】
その結果、図11aで示すように、 プライミング時にはSFTS DNAワクチン単独投与群及びSFTS DNAワクチン及び、本発明の一実施例によるBD-121を1：0.3の割合で投与した群の間に有意な差がありませんでしたが、投与の割合を1：1に増加させた実験群の場合、明確なT細胞 - 特異的免疫反応増進効果が現れた。一方、ブースティングの場合には、図11bに示されたように、投与の割合1：0.3の場合にも、SFTS単独投与時よりも顕著なT細胞 - 特異的免疫反応の増加が確認された。これはBD-121ワクチンの免疫補助剤が投与量依存的にT細胞 - 特異的免疫反応を増進させることができていることを示して結果である。
【００９６】
３−４: HSV-2に対するT細胞 - 特異的免疫反応
本発明者らは、前記の実施例８において製造されたHSV-2 DNAワクチンコンストラクト投与時、本発明の一実施例によって製造されたBD-121AのT細胞 - 特異的免疫反応が強化されているかを調査した。
【００９７】
具体的に、対照群に空DNA（pGX-27）投与群（n = 10）、前記実施例８において製造されたBD-02B 0.49μgおよびBD-02C 0.49μg投与群（n = 11）、BD-02B 1.4μg及びBD-02C 1.4μg投与群（n = 9）、BD-02B 0.49μg、BD-02C 0.49μg、およびBD121A 0.49μg投与群（n = 11）、BD-02B 1.4μg、BD-02C 1.4μg及びBD121A 1.4μg投与群（n = 10）に分けて、2週間の間隔でC57BL / 6マウスの大腿筋にOrbiJector（SLVAXiGEN、Korea）生体内のエレクトロポレーターを用いて接種して（プライミング及びブースティング）、ブースティング1週間後の雌の個体間の性ホルモンサイクルを合わせるためにDepo-provera 2 mgを投与し、ブースティング２週間後HSV-2を感染させた後、ブースティング２週間後、実験動物の時間の経過に伴う病理学的点数及び生存率を分析した（図１２ａ乃至１２ｃ）。
【００９８】
その結果、図12bに示すように、本発明の一実施例によるBD121Aを一緒に投与した実験群の病理学的点数がBD-02単独投与群に比べて、より低く、このような現象は、投与量依存的に認められた。併せて、時間の経過に伴う生存率分析の結果、図１２ｃに示すように、BD-02単独投与群の場合、対照群に比べて、投与量依存的な生存度の増加を示したが、本発明の一実施例によるBD-121A併用投与群（BD02 DP）では、実験動物の生存度が著しく増加した。特にBD-02+BD-121A（BD02 DP）1.4μg投与群の場合、HSV-2感染18日経過後にも斃死した動物はなかった。
【００９９】
続いて、本発明者らはBD-02及びBD121Aの最適な配合比率を確認するために、様々なBD-02及びBD121Aを様々な割合（BD-02B：BD-02C：BD121A = 2：2：0.2、2：2：0.6、2：2：2及び各群別 n = 5 + 5）で調節して実験動物に2週間の間隔で二度（プライミング及びブースティング）C57BL / 6マウスの大腿筋にOrbiJector（SLVAXiGEN、Korea）生体内のエレクトロポレーターを用いて接種し、 各群あたり5匹はプライミング2週間後、残りの群あたり5匹はブースティングの2週間後に犠牲にした後、脾臓を摘出し、BD-02に含まれている様々なHSV-2抗原に反応する脾臓免疫細胞の数をELISPOT分析で計数した（表4及び図13a及び13b）。
【０１００】
【表４】
2021512950.tif 000006
【０１０１】
その結果、図13bに示すように、BD-02だけを単独投与した実験群（BD-02B+ BD-02C）では、プライミング2週間後には、T細胞 - 特異的免疫反応が観察されなかった。反面、本発明の一実施例によるBD121A併用投与群（BD02 DP）では、1：1：0.6まではBD121A濃度依存的なT細胞 - 特異的免疫反応の増加が確認された。しかし、それ以上の投与量では、 より以上のT細胞 - 特異的な免疫反応の増加が確認されなかった。したがって、本発明の一実施例によるBD-02及びBD121Aワクチン組成物におけるBD-02B：BD-02C：BD121Aの配合割合は、2：2：0.6でも意味のある免疫増強効能が表示されることを確認した。
【０１０２】
３−５：HPVに対するT細胞 - 特異的免疫反応の分析
本発明者らは韓国公開特許公報第10-2017-0045254号に記載された16型/18型2價HPV DNAワクチンコンストラクトを用いて、BD-121のT細胞 - 特異的免疫反応を強化するかどうかを調査した。
【０１０３】
具体的には、実験動物であるC57BL / 6マウスを対照群である空ベクター群（pGX-27投与、n = 10）、前記2價HPV DNAワクチンコンストラクト単独投与群（n = 10）、前記2價HPV DNAワクチンコンストラクト8μg+ BD-121 1μg投与群（n = 10）、及び前記2價HPV DNAワクチンコンストラクト8μg+ BD-121 3μg投与群（n = 10）で割った後、一番目のワクチン投与（プライミング）2週間経過後、実験動物の半分（各実験群あらりn = 5）は、犠牲にして脾臓を摘出し、プライミングによるT細胞 - 特異的免疫反応を分析するために使用し、残りの半分（各実験群あたりn = 5）は、プライミング2週間経過後、2次接種（ブースティング）をしており、同様にブースティング2週間経過後、実験動物を犠牲にして脾臓を摘出した後、抗原に特異的に反応する脾臓免疫細胞の数をELISPOT分析に係数する方法でT細胞 - 特異的免疫反応を分析した（図14）。
【０１０４】
その結果、図14に示すように、前記2價HPV DNAワクチンコンストラクト単独投与時には、T細胞 - 特異的な免疫反応が微々たるものでしたが、本発明の一実施例によるBD-121投与時の濃度依存的なT細胞 - 特異的な免疫反応を強化した。
【０１０５】
続いて、本発明者らは、本発明の一実施例によって製造された前記HPV 14 DNAワクチン（BD-14A）に対するBD-121およびBD-121Aのワクチン免疫補助剤としての性能を確認するために、前記実施例5において製造されたBD-14（BD-14A、BD-14BおよびBD-14C）を単独、またはBD-121Aと共に併用投与した後、T細胞 - 特異的免疫反応を分析した（表5）。
【０１０６】
【表５】
2021512950.tif 000007
【０１０７】
具体的にはC57BL / 6マウスを実験動物にして、対照群に空ベクター投与群（n = 10）、BD-14 2μg投与群（n = 10）、BD-14 2μg+MIP-1α2μg投与群（n = 10）、BD-14 2μg+ BD-121 2μg 投与群（n = 10）およびBD-14 2μg+BD-121 2μg+Mip-1α2μg 投与群（n = 10）で割った後、一番目のワクチン投与（プライミング）2週間経過後、実験動物の半分（各実験群あたりn=5）は、犠牲にして脾臓を摘出し、プライミングによるT細胞 - 特異的免疫反応を分析するために使用し、残りの半分（各実験群あたりn=5）は、プライミング2週間経過後、2次接種（ブースティング）をしており、同様にブースティング2週間経過後、実験動物を犠牲にして脾臓を摘出した後、抗原に特異的に反応する脾臓免疫細胞の数をELISPOT分析に係数する方法でT細胞 - 特異的免疫反応を分析した（図15aおよび15b）。
【０１０８】
その結果、図１５ｂに示すように、BD-121およびBD-121Aは、すべてBD-10A単独投与群およびBD-10AおよびMIP-1α併用投与群に比べてT細胞 - 特異的免疫反応を大幅に強化した。
【０１０９】
実験例４：前臨床分析
本発明者らは、前記の実施例３の結果から、本発明の一実施例によるBD-121が、様々なウイルス抗原に対して抗体の生成に大きな影響を与えず、T細胞 - 特異的な免疫反応を強化することを確認した。これ実際の動物モデルを用いた前臨床研究でもDNAワクチン単独投与時より、ウイルス感染による病理学的症状を緩和させることができるかどうかを調査した。
【０１１０】
具体的には、実験動物としてカニクイザル（Cynomolgus monkey）を実験群あたり3匹ずつ使用し、投与群はBD-02単独、またはBD-121Aを併用投与群に分けた。各投与群は、1.8 mgのDNAを電気穿孔法、筋肉の経路で3週間の間隔2回投与をしており、投与前の時点（VS、-14日および-5日）、1回の投与後の時点（VT1、21日）、及び2回投与した後の時点（VT2、35日）にBD-02特異的免疫反応の評価を行った（図16a）。各時点で分離されたPBMC（peripheral blood mononuclear cell）をBD-02に含まれる抗原であるHSV-2 gD及びUL39抗原に対するpeptide poolで刺激した後特異的に反応細胞をex vivo ELIPOST分析法を通じて評価してSFC（spot forming cells）で表記した。
【０１１１】
その結果、図16bに示すようにBD-02特異的な免疫反応は、投与前の時点では観察されなかったのに対し、投与後、投与回数依存的に増加することを確認した。特にBD-02単独投与群に比べてBD-121A併用投与によりBD-02特異的免疫反応が非常に大きく上昇することを確認し、投与回数が増減することにより格差がさらに大きくなる結果を観察した。
【０１１２】
上述したように、本発明の一実施例によるBD-121およびBD-121Aは、様々なウイルスの感染から抗体生成能に大きな影響を与えず、前記ウイルスの様々な抗原に対してT細胞 - 特異的な免疫反応を画期的に強化させることが確認された。したがって、本発明の一実施例によるBD-121およびBD-121Aは、抗体の生成には影響を与えずに抗原に特異的に反応するT細胞を選択的に増加させるT細胞 - 特異的免疫反応を画期的に強化させるため、様々な感染性ウイルスによる感染の予防及び治療はもちろん、子宮頸癌などのがんの細胞性免疫の強化を通じた免疫治療剤として有用に使用することができる。例えば、抗癌免疫治療反応の場合、がん細胞（tumor cell）または癌関連抗原（tumor-associatd antigen）に対する抗体反応の治療的効果はほとんどないことが知られているので、癌細胞または癌関連抗原 - 特異的T細胞反応を効率的に増加させることが非常に重要な要素である。 HSV-2またはHPVのようなウイルス感染に対する治療免疫反応はまた、抗体反応ではなく、T細胞の反応が決定的な役割をするため、T細胞の反応を効率的に増加させることが非常に重要である。このような理由から、抗原またはワクチン特異的T細胞反応のみを選択的に向上させることができるBD-121およびBD-121Aの適用は、前記の様々な疾患に対する新しい治療剤の開発につながることができる長所がある。
【０１１３】
本発明は、上述した実施例及び実験例を参考に説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、そこから様々な変形及び均等な他の実施例が可能であるという点を理解するだろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付された特許請求の範囲の技術的思想によって定められなければならないだろう。
【０１１４】
本発明の一実施例による免疫補助剤は、様々な感染性ウイルスによる感染の予防及び治療はもちろん、子宮頸癌などのがんの細胞性免疫の強化を通じた免疫治療剤として有用に使用することができる。
【０１１５】
配列表フリーテキスト
配列番号1は、ヒトIL-12p35ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号2は、ヒトIL-12p40ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号3は、ヒトIL-21ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号4は、前記ヒトIL-12p35ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号5は、前記ヒトIL-12p40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号6は、EMCV-由来の内部リボソーム進入部位の核酸配列である。
配列番号7は、RSVプロモーターの核酸配列である。
配列番号8は、前記ヒトIL-12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号9は、ヒトEF-1αプロモーターの核酸配列である。
配列番号10は、ヒトMIP-1αポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号11は、前記のヒトMIP-1αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号12は、マウスIL-12p35ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号13は、マウスIL-12p40ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号14は、前記のマウスIL-12p35ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号15は、前記のマウスIL-12p40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号16は、マウスIL-21ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号17は、前記のマウスIL-21ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号18は、マウスMIP-1αポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号19は、前記マウスMIP-1αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号20は、（GS）5リンカーペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号21は、前記（GS）5リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号22は、tPAリーダーペプチドのアミノ酸配列であり、
配列番号23は、前記tPAリーダーペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号24は、シグナル配列が切断されたFlt3Lポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号25は、前記のFlt3Lポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号26、28および30は、それぞれ、本発明の一実施例によるDNAワクチンコンストラクトに含まれるシャッフルド抗原融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号27、29、および31は、それぞれ、前記シャッフルド抗原融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号32は、UL39-N1ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号33は、UL39-C2ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号34は、UL39-N2ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号35は、UL39-N4-C1ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号36は、UL39-N3ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号37は、前記UL39-N1、UL39-C2、UL39-N2、UL39-N4-C1、およびUL39-N3順次連結されたシャッフルドUL39抗原タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号39は、シグナル配列及び膜貫通ドメインが除去されたHSV-2糖タンパク質D（gD）のアミノ酸配列である。
配列番号40は、核の位置化配列が除去されたICP0タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号41は、RS1.3部分が除去されたICP4タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号42は、tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号43は、前記配列番号42に記載されている融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号44は、SFTSの抗原GnGcタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号45は、SFTSのNPタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号46は、SFTSのNSタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号47ないし49は、それぞれ、前記GnGc、NP及びNSタンパク質をコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号50〜68は、本発明で使用することができる様々なリンカーペプチドのアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月1日(2020.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-12タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびIL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含み、ワクチン単独投与時よりも低い抗体反応を誘導することを特徴とする、Tリンパ球特異的免疫反応促進用ワクチンの免疫補助剤。
【請求項２】
下記を含む、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤：
前記IL-12タンパク質を構成するp35鎖（IL-12p35）及びp40鎖（IL-12p40）をそれぞれコードするポリヌクレオチドおよび前記IL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、一つないし3つのベクターを含む組成物;または
前記IL-12p35、IL-12p40及びIL-21タンパク質をそれぞれコードする、mRNA分子を含む組成物。
【請求項３】
前記IL-12p35タンパク質が、配列番号１に記載されているアミノ酸配列で構成されている、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項４】
前記IL-12p40タンパク質は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列で構成されているヒトIL-12p40である、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項５】
前記IL-21タンパク質は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列で構成されているヒトIL-21である、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項６】
下記のいずれか１以上をさらに含む、請求項１に記載のワクチンの免疫補助剤：
MIP-1α タンパク質をコードするポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されたMIP-1α遺伝子コンストラクト;及び
前記MIP-1αタンパク質をコードするポリヌクレオチドが前記IL-12p35、IL-12p40およびIL-21タンパク質のいずれか一つ以上にIRESまたはリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドによって動作可能に連結された複合遺伝子コンストラクト;及び
MIP-1αタンパク質をコードする、mRNA分子。
【請求項７】
前記MIP-1αタンパク質が、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列で構成されている、請求項６に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項８】
前記MIP-1α遺伝子コンストラクトが、別の発現ベクターに含まれるか、前記IL-12タンパク質を構成するp35鎖（IL-12p35）及びp40鎖（IL-12p40）をそれぞれコードするポリヌクレオチドおよび前記IL-21タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、１つないし３つのベクターのいずれか１以上のベクター内に含まれる、請求項６に記載のワクチンの免疫補助剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の免疫ワクチン補助剤;及び
感染性ウイルス由来の抗原または前記抗原をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された抗原の遺伝子コンストラクト又は前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを有効成分として含む、ウイルス感染の予防及び治療用ワクチン組成物。
【請求項１０】
前記感染性ウイルス由来の抗原は、EBV（Epstein-Barr virus）、HAV（hepatitis A virus）、HBV（hepatitis B virus）、HCV（hepatitis C virus）、HDV（hepatitis D virus）、HEV（hepatitis E virus）、ハンターンウイルス（Hantaan virus）、CMV（cytomegalovirus）、HIV（human immunodeficiency virus）、インフルエンザウイルス（influenza virus）、HPV（human papilloma virus）、ポリオウイルス（poliovirus）、エボラウイルス（ebola virus）、ロタウイルス（rotavirus）、デングウイルス（dengue virus）、ウエストナイルウイルス（West Nile virus）、黄熱病ウイルス（yellow fever virus）、アデノウイルス（adenovirus）、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、BKウイルス（BK virus）、天然痘ウイルス（smallpox virus）、ジカウイルス（Zika virus）、重症熱性血小板減少症候群ウイルス（SFTS virus）またはHSV（herpes simplex virus）由来の抗原である、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載のワクチン免疫補助剤;及び
癌抗原、
前記癌抗原をコードするポリヌクレオチド;
前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結された遺伝子コンストラクト、または
前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター
を有効成分として含む、癌治療用ワクチン組成物。
【請求項１２】
前記癌抗原は、ヒトパピローマウイルス（HPV）由来の抗原、癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen）、前立腺特異抗原（PSA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、Her2 / neu 、MUC-1、BCR / ABL、α-フェトプロテイン（AFP）、エプスタインバールウイルス（EBV）由来の抗原、ヒトB型肝炎ウイルス（HBV）由来の抗原、ヒトC型肝炎ウイルス（HCV）由来の抗原、癌抗原-125（CA-125）、癌抗原-72-4（CA-72-4）、癌抗原-15-3（CA-15-3）、または癌抗原-19-9（CA-19-9）である、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の免疫ワクチン補助剤をワクチン組成物と一緒に、または前記のワクチン組成物の投与前後で個体に投与する段階を含む、前記ワクチン組成物によるTリンパ球特異的免疫反応の促進方法。
【請求項１４】
前記ワクチン補助剤は、生体内の電気穿孔法により、個体に投与される、請求項１３に記載のTリンパ球特異的免疫反応の促進方法。
【請求項１５】
前記個体のB細胞特異的免疫反応は誘導せずにTリンパ球特異的な免疫反応のみを選択的に誘導する、請求項１３に記載のTリンパ球特異的免疫反応の促進方法。
【国際調査報告】
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