(57)【要約】  本発明は、少なくとも部分的に一体化している、凝集ＯＲＣ繊維、フィブリノゲン、及びトロンビンを含む止血組成物、並びに、粉末状止血組成物を形成する方法であって、非水性低沸点溶媒中にフィブリノゲンの粒子、トロンビン、ＯＲＣ繊維を含む混合物の懸濁液を形成する工程と、懸濁液を高剪断混合反応容器内で攪拌及び剪断する工程と、水を添加して粒子を凝集させる工程と、非水性溶媒を蒸発させる工程と、組成物を乾燥及び篩分けする工程と、を含み、かくして粉末状止血組成物を形成する方法を目的とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末状止血組成物を形成する方法であって、
ａ）非水性低沸点溶媒中にフィブリノゲンの粒子、トロンビン、ＯＲＣ繊維を含む混合物の懸濁液を形成する工程と、
ｂ）前記懸濁液を高剪断混合反応容器内で攪拌及び剪断する工程と、
ｃ）水を添加して粒子を凝集させる工程と、
ｄ）前記非水性溶媒を蒸発させる工程と、
ｅ）前記組成物を乾燥及び篩分けする工程と、を含み、
かくして前記粉末状止血組成物を形成する、方法。
【請求項２】
前記非水性低沸点溶媒が、ヒドロフルオロエーテルＣ４Ｆ９ＯＣＨ３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非水性低沸点溶媒が、ＨＦＥ７１００を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記懸濁液がリジン又はトリスを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記懸濁液が塩化カルシウムを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水が、フィブリノゲンの完全な凝固を防止する量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記水が、５０％未満のフィブリノゲンをフィブリンに変換させる量で添加される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、止血及び組織封止を促進するための剤及び材料、より具体的には、改善された効力を有する再吸収性止血粒子、特に、フィブリノゲン、トロンビン、及び酸化再生セルロースで作製された粒子凝集体、並びにこのような組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な状況において、ヒトを含む動物は、創傷が原因で、あるいは外科的処置の間に、出血に見舞われることがある。状況によっては、出血は比較的軽いものであり、通常の血液凝固作用が、簡単な応急処置の実施に加われば、それだけで十分である。他の状況では、相当な出血が起こることがある。これらの状況では通常、専門的な設備及び物資、並びに適切な救助を施すように訓練された人員が必要となる。
【０００３】
外科的処置中の出血は、多くの形態で顕在化し得る。それは、離散したものであるか、又は広い表面積から拡散したものであり得る。出血は、高容量若しくは低容量の大小の血管、動脈（高圧）又は静脈（低圧）からのものであり得る。出血は容易にアクセス可能であり得るか、又はアクセスが難しい部位に由来する場合もある。出血の制御は、失血を最小限に抑え、術後合併症を低減させ、手術室での手術の時間を短くするために、外科的処置において必須かつ重要である。出血を制御するための適切な方法又は製品の選択は、出血の重症度、出血源の解剖学的場所及び隣接する重要な構造の近接性、出血が離散した出血源からのものであるか又はより広い表面積からのものであるか、出血源の視認性及び正確な特定、並びに出血源へのアクセスが挙げられるがこれらに限定されない、多くの因子に依存する。
【０００４】
止血を達成するための従来の方法には、外科的技術、縫合糸、結紮糸又はクリップ、及びエネルギーに基づく凝固又は焼灼の使用が挙げられる。これらの従来の対策が非効果的又は非実用的なとき、補助的な止血技術及び製品が通常利用される。
【０００５】
上記の問題に対処するため、過剰な出血を制御するための又は止血に対する補助剤としての材料が開発されてきた。局所用吸収性止血材（Topical Absorbable Hemostat、ＴＡＨ）は、外科用途で広く使用されている。ＴＡＨは、織布又は不織布又はスポンジに基づく形態などの様々な形態の製品を包含し、典型的には、ポリグラクチン９１０、酸化セルロース、酸化再生セルロース（oxidized regenerated cellulose、ＯＲＣ）、ゼラチン、コラーゲン、キチン、キトサン、デンプンなどのラクチド−グリコリドベースのコポリマーを含む、天然ポリマーから合成ポリマーに及ぶ、またこれらの組み合わせである、少なくとも部分的に再吸収可能な材料から作られる。ゼラチンは、局所トロンビン溶液を含むか又は含まない、様々な形態で使用される。生物学的に活性な局所止血製品（局所トロンビン溶液、フィブリンシーラントなど）及び様々な合成局所シーラントも広く使用されている。
【０００６】
止血性能を改善するために、上記ＴＡＨ材料をベースとするスカフォールドを、トロンビン及びフィブリノゲンなどの生物由来の凝固因子と組み合わせることができる。
【０００７】
その生分解性及びその殺菌性、並びに止血特性により、酸化セルロース並びに酸化再生セルロースは、神経外科、腹部手術、心臓血管手術、胸部手術、頭部及び頸部手術、骨盤手術、並びに皮膚及び皮下組織処置などの様々な外科的処置において局所性止血用創傷包帯として長い間使用されてきた。粉末、織布、不織布、編地、及びその他の形態で作られるか否かにかかわらず、酸化セルロース材料に基づいた様々な種類の止血材を形成するための数多くの方法が知られている。現在利用される止血用創傷包帯には、セルロース繊維の均質性を増加させた酸化セルロースである酸化再生セルロース（ＯＲＣ）を含む編み布地又は不織布が含まれる。
【０００８】
多くの外科的処置のための安全かつ有効な止血を提供するＯＲＣが、１９６０年代に導入された。ＯＲＣ止血材の作用機序は、材料が水を吸収することで始まり、続いて、わずかに膨潤して出血部位においてタンポン充填をもたらすと考えられる。ＯＲＣ繊維は、最初に、流体、血液タンパク質、血小板、及び細胞を捕捉して、ゲル様の「疑似血餅」を形成し、これが血流に対する障壁として作用し、続いて、固体フィブリン塊を形成するためのマトリクスとして作用する。ＯＲＣ布地は、そのマトリクス構造に緩い編地を有し、その隣接する周囲に迅速にぴったりと一致し、他の吸収剤よりも管理が容易であるが、その理由は、手術器具に粘着せず、切り取って容易にサイズを整えることができるためである。これによって、外科医は、全ての出血が止まるまで、セルロースを適所にしっかりと保持することができる。
【０００９】
最も一般的に使用される局所止血剤のうちの１つは、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）から作製されたＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）オリジナル吸収性止血材である。ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）吸収性止血材は、結紮又は他の従来の制御方法が非実用的又は非効果的であるとき、毛細血管性、静脈性、及び小動脈性出血の制御を支援するために、外科的処置において補助的に使用される。吸収性止血材のＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）ファミリーは、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）の一部門、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙから市販されている全ての止血用創傷包帯を含む、４つの主な製品グループからなる。
【００１０】
ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）Ｏｒｉｇｉｎａｌ止血材は、薄黄色のギブス包帯を備える白色の布地であり、かすかなキャラメル様の芳香を有する。当該止血材は、強固であり、ほつれることなく縫合又は切断することができる。
【００１１】
ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）ＮＵ−ＫＮＩＴ（登録商標）吸収性止血材は、類似しているが、より密度の高い編地を有するので、引張強度がより高い。当該止血材は、出血を制御するために所定の場所に巻いたり縫合したりすることができるので、外傷及び移植手術における使用が特に推奨される。
【００１２】
ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）ＦＩＢＲＩＬＬＡＲ（商標）吸収性止血材形態の製品は、層状構造を有し、これによって、特定の出血部位において止血を行うのに必要な任意の量のＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）ＦＩＢＲＩＬＬＡＲ（商標）止血材を外科医が鉗子で剥がし、把持することができるようになる。ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）ＦＩＢＲＩＬＬＡＲ（商標）止血材形態は、到達しづらいか又は不規則な形状の出血部位では、編地形態よりも便利であることがある。当該止血材は、整形外科／脊椎及び神経外科的手術における使用が特に推奨される。
【００１３】
ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）ＳＮｏＷ（商標）吸収性止血材形態の製品は、構造化された不織布である。ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）ＳＮｏＷ（商標）止血材は、構造化された不織布であることから、内視鏡用途のためのＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）の他の形態よりも便利であることがある。当該止血材は、高度に適応可能であるので、開腹手術及び最小侵襲性手術の両方において推奨される。
【００１４】
酸化セルロースを含有する市販の吸収性止血材の他の例には、Ｇｅｌｉｔａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＢＶ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によるＧｅｌｉｔａＣｅｌ（登録商標）吸収性セルロース包帯が挙げられる。商業的に入手可能な上記の酸化セルロース止血材は、止血をもたらすための多孔質構造を有する編物又は不織布である。
【００１５】
フィブリノゲン及びトロンビンは、血管損傷後に止血の達成に関与する重要なタンパク質であり、血餅形成に必須である。フィブリノゲン及びトロンビンは、典型的な凝固反応を開始することなく粉末形態で又は非水性懸濁液中で合わせることができるので、タンパク質が可溶である水性媒体又は他の液体環境中で当該タンパク質が水和するまでフィブリン塊の形成が阻止される。粉末形態のこれらのタンパク質の混合物は、局所止血、組織修復、薬物送達などを含む様々な潜在的な生物医学的用途を有する。更に、これらタンパク質の混合物を粉末形態で担体若しくは基材、又は他の医療用具に充填して、例えば止血用具として使用することができる製品を形成することもできる。
【００１６】
フィブリン糊として知られているフィブリンシーラントは、数十年間にわたって病院で使用されている。フィブリンシーラントは、２つの液体成分、すなわちフィブリノゲン含有成分及びトロンビン含有成分からなる場合が多く、これらの固有の不安定性のために冷凍保管される。時としてフィブリンシーラント製品は、２つのフリーズドライ成分からなり、これらは結合注射器又は他の二連式送達デバイスによって使用及び送達の直前に再構成を必要とする。フリーズドライ配合物は、典型的に安定しているが、フィブリノゲン成分は、再構成することが困難である。現在市場で入手可能な、又は開発中の多くの止血配合物は、多くの場合で凍結乾燥トロンビンと組み合わせて凍結乾燥フィブリノゲンを利用し、止血配合物は、乾燥粉末、半液体ペースト、液体配合物の形態で塗布されるか、又は任意に吸収性布地スカフォールド等の支持スカフォールド上に配置される。
【００１７】
止血並びに組織封止及び接着特性が強化された包帯を提供するために、トロンビン、フィブリン、及びフィブリノゲンが挙げられるがこれらに限定されない治療剤が、ゼラチンベースの担体、多糖ベースの担体、グリコール酸又は乳酸ベースの担体、及びコラーゲンマトリックスを含む包帯の担体又は基材と組み合わせられている。このような包帯の例は、米国特許第６，７６２，３３６号「Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｂａｎｄａｇｅ」、米国特許第６，７３３，７７４号「Ｃａｒｒｉｅｒ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｉｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ」、国際公開第２００４／０６４８７８号「Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、及び欧州特許第１８０９３４３（Ｂ１）号「Ａ  ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｅｄ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｗｏｕｎｄ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ」に開示されている。
【００１８】
欧州特許第１４９３４５１（Ｂ１）号「Ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｎｄｅｒ」には、トロンビン及びフィブリノゲンなどの酸感受性種、並びに他の酸感受性の生物製剤及び医薬品のための担体としてカルボン酸酸化セルロースを使用するのは問題があると開示されている。これは、０．０３５〜４．３５ｍｍの指定の平均公称粒径を有する生体適合性酸化セルロース粒子と、キトサン以外の生体適合性、多孔質、水溶性の多糖バインダ成分と、任意追加的に、トロンビン、フィブリノゲン、又はフィブリンから選択される止血剤と、からなる止血組成物であって、当該水溶性多糖と当該酸化セルロース粒子との重量比が、３：９７〜１５：８５であり、当該組成物は、好適な溶媒に溶解した当該多糖バインダ成分を有するポリマー溶液を提供する工程と、当該生体適合性酸化セルロース粒子を提供する工程と、当該ポリマー溶液全体にわたり実質的に均質に当該酸化セルロース粒子を分散させて実質的に均質な分散液を形成するのに効果的な条件下で当該ポリマー溶液を当該酸化セルロース粒子と接触させる工程と、当該粒子が全体にわたり分散した当該ポリマー溶液を、当該実質的に均質な分散液を固化させるのに効果的な条件に供する工程と、固化した分散液から当該溶媒を除去して、当該止血組成物を形成する工程と、を含むプロセスによって得ることのできる多孔質フォームスポンジである、止血組成物を更に開示している。
【００１９】
露国特許出願公開第２２３５５３９（Ｃ１）号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｗｄｅｒ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ」には、トロンビン及びフィブリノゲンを含む水性媒体に基剤として部分酸化セルロースを混合することを含む、止血効果を惹起する粉末様材料を調製する方法が開示されている。ゼラチン、イプシロン−アミノカプロン酸、及びリゾチームを指定の物質に添加し、更に、布地としてのジアルデヒドセルロースを部分酸化セルロースとして使用する、すなわち、アルデヒド基の含量は以下の成分比で４〜６％である：ジアルデヒドセルロース、１ｇ；フィブリノゲン、１８〜２２ｍｇ；ゼラチン、２７〜３３ｍｇ；イプシロン−アミノカプロン酸、４５〜５５ｍｇ；リゾチーム、９．５〜１０．５ｍｇ；トロンビン、３５０Ｕ；水、６．５ｍＬ。方法は、総含量の半分量のゼラチン及び総含量の半分量の水中にフィブリノゲン、イプシロン−アミノカプロン酸を含有する溶液を調製することと、残りの量の水中、トロンビン、リゾチーム、及び残りの量のゼラチンの溶液を別個に調製することとを含む。調製した溶液中に、半分量のジアルデヒドセルロースを３〜４時間保持し、半完成生成物を絞り、空気中で乾燥させ、複合粉砕に供する。
【００２０】
米国特許出願公開第２００６０１５９７３３（Ａ１）号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ａ  ｗｏｕｎｄ」には、カルボン酸酸化セルロース基材の酸性の性質によって、トロンビン又はフィブリノゲンを含む酸感受性タンパク質を、接触した際に急速に変性及び不活化できることが開示されている。トロンビン及び第ＸＩＩＩ因子の酵素活性の多くは、反応中に失われることがある。これによって、カルボン酸酸化セルロースを、トロンビン、フィブリノゲン、フィブリン、又は他の酸感受性生物製剤及び医薬品の担体として使用することが困難になる。その特許出願には、中和されたカルボン酸酸化セルロース及びタンパク質ベースの止血剤、例えば、トロンビン、フィブリノゲン、及びフィブリンを含む止血創傷包帯が公知であることが更に開示されている。中和されたカルボン酸酸化セルロース系材料（carboxylic-oxidized cellulosic materials）は、当該材料をトロンビン適合性にするために、トロンビンを添加する前にセルロース上の酸基を中和することによって、弱有機酸の塩基性塩の水又はアルコール溶液で酸性カルボン酸−酸化セルロースを処理してセルロース系材料のｐＨを５〜８に上昇させることによって調製される。酸中和剤、イプシロンアミノカプロン酸（epsilon aminocaproic acid、ＥＡＣＡ）の存在下で酸性カルボン酸酸化再生セルロース又は他の材料にトロンビンを添加して、トロンビンが止血材として機能することができる領域に当該材料のｐＨを上昇させたトロンビン止血パッチが開示された。このような中和されたカルボン酸酸化セルロースはトロンビン適合性であり得るが、もはや殺菌性ではなく、その理由は、酸化セルロースの抗菌活性がその酸性の性質に起因するものであるためである。
【００２１】
米国特許第７０９４４２８（Ｂ２）号「Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ」には、少なくとも１つの凝固促進性金属イオン、例えば、銀（Ｉ）又は水銀（ＩＩ）と、少なくとも１つの凝固促進性バイオポリマー、例えば、コラーゲン、トロンビン、プロトロンビン、フィブリン、フィブリノゲン、ヘパリナーゼ、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩＩ因子、フォンビルブラント因子、セレクチン、凝固促進性毒、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ〜ＩＩＩａ、プロテアーゼ、又は血漿とを含む止血組成物が開示されている。創傷に塗布するためのペースト、ドウ、糊、液体、凍結乾燥粉末、又は発泡体の形態の組成物を提供することができる。止血組成物は、凝固促進性金属イオンと組み合わせて少なくとも１つの凝固促進性バイオポリマーを含み、当該凝固促進性金属イオンは、当該凝固促進性バイオポリマーの非存在下におけるその有効止血濃度を下回る濃度で当該組成物中に存在し、止血組成物は、銀（Ｉ）及びコラーゲン、銀（Ｉ）及びトロンビン、銀（Ｉ）及びプロトロンビン、銀（Ｉ）及びフィブリン、銀（Ｉ）及びフィブリノゲン、銀（Ｉ）及びヘパリナーゼ、銀（Ｉ）及び第ＶＩＩａ因子、銀（Ｉ）及び第ＶＩＩＩ因子、銀（Ｉ）及び第ＩＸａ因子、銀（Ｉ）及び第Ｘａ因子、銀（Ｉ）及び第ＸＩＩ因子、銀（Ｉ）及びフォンビルブラント因子、銀（Ｉ）及びセレクチン、銀（Ｉ）及び凝固促進性毒、銀（Ｉ）及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤、銀（Ｉ）及び糖タンパク質ＩＩｂ〜ＩＩＩａ、銀（Ｉ）及びプロテアーゼ、銀（Ｉ）及び血漿、水銀（ＩＩ）及びコラーゲン、水銀（ＩＩ）及びトロンビン、水銀（ＩＩ）及びプロトロンビン、水銀（ＩＩ）及びフィブリン、水銀（ＩＩ）及びフィブリノゲン、水銀（ＩＩ）及びヘパリナーゼ、水銀（ＩＩ）及び第ＶＩＩａ因子、水銀（ＩＩ）及び第ＶＩＩＩ因子、水銀（ＩＩ）及び第ＩＸａ因子、水銀（ＩＩ）及び第Ｘａ因子、水銀（ＩＩ）及び第ＸＩＩ因子、水銀（ＩＩ）及びフォンビルブラント因子、水銀（ＩＩ）及びセレクチン、水銀（ＩＩ）及び凝固促進性毒、水銀（ＩＩ）及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤、水銀（ＩＩ）及び糖タンパク質ＩＩｂ〜ＩＩＩａ、水銀（ＩＩ）及びプロテアーゼ、並びに水銀（ＩＩ）及び血漿からなる群から選択される。また、本発明の止血組成物は、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、セルロース、酸化セルロース、メチルセルロース、又はアルブミンなどであるが、これらに限定されない担体を含んでいてもよい。これらを使用して、マトリクス、好適な粘度、送達性、接着性、又は創傷への塗布を容易にするために本明細書における組成物に付与されることが望ましい他の特性を提供することができる。これら特徴を付与する多数の他の担体が本明細書に包含される。
【００２２】
米国特許第６１６２２４１（Ａ）号「Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅａｌａｎｔｓ」には、医学的に許容できる期間組織からの血流を停止させるのに有効な量の止血剤が組み込まれている、架橋性基を含む生体適合性、生分解性のヒドロゲル組織シーラントを含む止血組織シーラントが開示されている。
【００２３】
米国特許第６１７７１２６（Ｂ１）号「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｗｏｕｎｄｓ」には、創傷を封止及び／又は治癒するための材料を生産するプロセスであって、ｉ）２枚以上の板を有する容器に液体組成物を充填することであって、当該板の少なくとも２枚に１つ以上の流通穴が穿孔されており、当該穿孔板のうちの少なくとも１枚が別の当該穿孔板に対して移動可能である、ことと、ｉｉ）当該容器の下を搬送方向に担体を搬送することと、ｉｉｉ）当該液体組成物が当該容器の下を搬送されている当該担体上に滴り落ちるように当該穿孔板を互いに対して連続的に移動させ、それによって当該液体組成物を当該担体に実質的に均等に塗布することと、を含むプロセスが開示されている。
【００２４】
国際公開第２０１４１３５６８９（Ａ２）号「Ｐｏｗｄｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ」には、トロンビン及びフィブリノゲンを含む医療用途に好適な無菌粉末組成物であって、トロンビン粉末が液体原料から生成され、当該原料がトロンビンの溶液又は懸濁液、好ましくは溶液を含み、当該粉末が、無菌噴霧乾燥又は無菌流動床乾燥から選択されるプロセスによって液体を除去することによって生成され、当該原料から液体を除去して得られた粉末が、当該液体原料のトロンビンの効力又は活性の少なくとも８０％を示し、フィブリノゲン粉末が、原料から液体を除去することによって生成され、当該原料が、無菌噴霧乾燥又は無菌流動床乾燥によって、フィブリノゲンの溶液又は懸濁液、好ましくは溶液を含み、当該組成物が、医療用途のための無菌最終医薬製品としてパッケージ化される、組成物が開示されている。
【００２５】
米国特許出願公開第２０１０／０１１９５６３号「ＳＯＬＩＤ  ＦＩＢＲＩＮＯＧＥＮ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ」には、フィブリノゲンを含み、更に、（ａ）アルブミン、（ｂ）非イオン界面活性剤、（ｃ）塩基性アミノ酸又はその塩、並びに（ｄ）酸性アミノ酸、その塩、中性アミノ酸、及びその塩からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸又はその塩、を含む、固体フィブリノゲン製剤が開示されている。
【００２６】
止血配合物の配合に関連する更なる特許文献としては、以下のものが挙げられる。
米国特許第９７１７８２１（Ｂ２）号「Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｗｏｕｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ」、
米国特許第７０５２７１３（Ｂ２）号「Ｃａｒｒｉｅｒ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｉｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ」、
米国特許第９７２４２１３（Ｂ２）号「Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、
米国特許第８８４０８７７（Ｂ２）号「Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｖｉａ  ｉｍｉｎｅ  ｂｏｎｄｓ」、
米国特許第６２００５８７（Ｂ１）号「Ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅａｌａｎｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｏｒ  ｓａｌｔ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、
米国特許第８８４６１０５（Ｂ２）号「Ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅａｌａｎｔ」、
米国特許出願公開第２０１６００１５７９２（Ａ１）号「ＰＯＷＤＥＲ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  ＴＨＲＯＭＢＩＮ  ＡＮＤ  ＦＩＢＲＩＮＯＧＥＮ」、
米国特許第６５９６３１８（Ｂ２）号「Ｆｉｂｒｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、
韓国特許第１６２４６２５（Ｂ１）号「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ」、
韓国特許第１５８８６３３（Ｂ１）号「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｅｌ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」、
韓国特許第８０４４３４（Ｂ１）号「Ｆｉｂｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｌｕｅ  ｇｒａｎｕｌａｔｅ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｜  Ｆｉｂｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｌｕｅ  ｇｒａｎｕｌａｔｅ  ａｎｄ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ」。
【００２７】
米国特許第９７９５７７３（Ｂ２）号「Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ  ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ」、
米国特許第７３５１４２２（Ｂ２）号「Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｆｉｂｅｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｗｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ」、
中国特許第１０１７１６３８３（Ａ）号「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｜  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｔａｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ」
米国特許第５４８４９１３（Ａ）号「Ｃａｌｃｉｕｍ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈｅｍｏｓｔａｔ」、
欧州特許第９１８５４８（Ｂ１）号「ＵＳＥ  ＯＦ  ＯＸＩＤＩＺＥＤ  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ  ＦＯＲ  ＣＨＲＯＮＩＣ  ＷＯＵＮＤ  ＨＥＡＬＩＮＧ」。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
塗布のし易さ及び止血の迅速な開始を容易にする、改善された止血形態及び材料が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、フィブリノゲン、トロンビン、及び酸化再生セルロース繊維を含む凝集体を含む止血材を目的とする。いくつかの態様では、止血材は、塩化カルシウム、トリスなどの添加剤を更に含む。別の態様では、本発明は、フィブリノゲン、トロンビン、及びＯＲＣの粉末の混合物を非水性溶媒に懸濁させ、ノズルを通して懸濁液を基材上に噴霧し、当該基材から止血材を除去し、篩分けすることによって、当該止血材を作製する方法を目的とする。
【００３０】
更に別の実施形態では、本発明は、当該止血材を患者の創傷の上及び／又は中に塗布することによって創傷を治療する方法を目的とする。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、粉末状止血組成物を形成する方法であって、非水性低沸点溶媒中にフィブリノゲンの粒子、トロンビン、ＯＲＣ繊維を含む混合物の懸濁液を形成し、ノズルを通して当該懸濁液を基材上に噴霧し、当該非水性溶媒を蒸発させ、当該基材から当該組成物を分離し、当該組成物を篩分けし、かくして粉末状止血組成物を形成する、方法に関する。非水性低沸点溶媒は、ＨＦＥ７１００などであるがこれに限定されないヒドロフルオロエーテルＣ４Ｆ９ＯＣＨ３であってよい。懸濁液は、トリス及び／又は塩化カルシウムを更に含み得る。液体懸濁液は、約９０重量％のフィブリノゲン、約８重量％のトロンビン、及び約２．５重量％の塩化カルシウムを含むフィブリンシーラント粉末を含有し得る。懸濁している粉末状止血組成物の、フィブリンシーラント粉末とＯＲＣとの重量比は、約１：１〜約１０：１であり得る。懸濁している粉末状止血組成物は、主に約２５０〜約８５０マイクロメートル、より好ましくは約３５５〜約８５０マイクロメートルの範囲の粒径測定値を有する粉末の形態であり得る。得られた粉末状止血組成物は、少なくとも部分的に一体化している、凝集したＯＲＣ繊維、フィブリノゲン、及びトロンビンを含み、トリス及び／又は塩化カルシウムを更に含み得る。
【００３２】
本発明は、更に、得られた上記止血組成物を創傷の上及び／又は中に塗布することによって創傷を治療する方法を目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】製造プロセスの概略図である。
【図２】水中における本発明の組成物及び比較組成物のゲル化を評価する試験バイアルを示す写真である。
【図３】本発明の組成物及び比較組成物と接触した血液の凝固を評価する試験バイアルを示す写真である。
【図４】本発明の組成物及び比較組成物と接触した血液の凝固を評価する試験バイアルを示す写真である。
【図５】比較組成物の可溶化試験の結果を示す複合写真である。
【図６】本発明の組成物の可溶化試験の結果を示す複合写真である。
【図７】比較組成物の可溶化試験の結果を示す複合写真である。
【図８】様々な粒径の本発明の組成物の可溶化試験の結果を示す複合写真である。
【図９】本発明の組成物のうちの１つのＳＥＭ画像を示す。
【図１０】ＨＳＭ製造プロセスの概略図である。
【図１１】ＨＳＭ製造反応容器の概略図である。
【図１２】実施例９のＨＳＭ法によって調製された本発明の止血粉末を示す。
【図１３】ｋＰａを単位とするゲル強度のチャートを示す。
【図１４】様々な溶媒／バインダを使用して製造された止血粉末の動物モデルにおける試験の結果を示す。
【図１５】アセトン及びポリマーＲＧ５０２を使用して止血粉末を調製するためのＨＳＭ製造プロセスの概略ブロック図である。
【図１６】アセトン及び水を使用して止血粉末を調製するためのＨＳＭ製造プロセスの概略ブロック図である。
【図１７】９６％のエタノールを使用して止血粉末を調製するためのＨＳＭ製造プロセスの概略ブロック図である。
【図１８】ＨＦＥ／水を使用して止血粉末を調製するためのＨＳＭ製造プロセスの概略ブロック図である。
【図１９】様々な溶媒／バインダを用いて得られた止血粉末の密度特性を示す。
【図２０】様々な溶媒／バインダを用いて得られた止血粉末のゲル強度特性を示す。
【図２１】長さ１．２ｃｍの切開部を有する肺漏出モデルを示す。
【図２２】収縮した肺上でゲルを形成する（２分間計数された）本発明の止血粉末を示す。
【図２３】３０ｃｍのＨ２Ｏで肺漏出を封止するゲルを形成する本発明の止血粉末を示す。
【図２４】長さ１ｃｍの切開部を有する肺漏出モデルを示す。
【図２５】３０ｃｍのＨ２Ｏで肺漏出を封止するゲルを形成する本発明の止血粉末を示す。
【図２６】４０ｃｍのＨ２Ｏ圧力で部分的に剥離したゲルを形成する本発明の止血粉末を示す（矢印は剥離領域を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明者らは、止血にとって非常に有益な驚くべき特性を有する止血材、及びそれを作製するプロセスを見出した。
【００３５】
本発明に係る止血材は、酸化セルロースベースの繊維材料、より好ましくは、酸化再生セルロース粉末、フィブリノゲン粉末、及びトロンビン粉末から作製される。本発明に係る止血材は、粉末の形態の少なくとも部分的に一体化しているＯＲＣ繊維、フィブリノゲン、及びトロンビンを表す。
【００３６】
図１を参照すると、本発明に係る止血材を作製するプロセスの概略ブロック図が示され、当該プロセスは、以下の工程を含む：
・フィブリノゲン、トロンビン、及びＯＲＣの乾燥粉末を調製する工程
・フィブリノゲン、トロンビン、及びＯＲＣの粉末の混合物を、周囲条件下で急速蒸発することができる非水性溶媒に懸濁させる工程
・ノズルを通して当該懸濁液を基材上に噴霧する工程
・当該非水性溶媒を蒸発させ、得られた止血材料を乾燥させる工程
・当該基板から当該止血材料を除去／分離し、篩分けし、このようにして、粉末の形態の少なくとも部分的に一体化しているＯＲＣ繊維、フィブリノゲン、及びトロンビンを形成する工程。
【００３７】
一実施形態では、ｐＨ調整のために、粉末形態のトリス又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンバッファを、フィブリノゲン、トロンビン、及びＯＲＣの混合物に添加する。続いて、混合組成物をＨＦＥに添加して懸濁液を形成した。一実施形態では、ＨＦＥの蒸発による噴霧中の材料流の冷却／冷し効果によって、得られた止血材の上又は中に一部の周囲水分が吸収されるようになる。このようにして吸収された任意の過剰な水分は、真空オーブン乾燥における最終乾燥工程において除去される。
【００３８】
本発明の一態様によれば、本発明の止血材におけるフィブリノゲン／トロンビン混合物とＯＲＣ粉末との重量比は、約１：１〜約１０：１である。
【００３９】
本発明の一態様によれば、本発明の止血材は、２５０〜８５０マイクロメートルのサイズを有する粒子を含む。
【００４０】
本発明の一態様によれば、本発明の止血材は、粉末形態の、実質的に均一に分布している、少なくとも部分的に一体化しているＯＲＣ繊維、フィブリノゲン、及びトロンビンを含む。
【００４１】
本発明の一態様によれば、本発明の止血材は、高い均一性、一体性、迅速なゲル化／凝固、及び強い接着力を有する。
【００４２】
本発明の一態様によれば、懸濁液が噴霧される回収表面又は基材は、不活性不織布フェルト若しくはメッシュ又は鋼板を含む。
【００４３】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、フィブリノゲン、トロンビン、及び酸化再生セルロース繊維を含む凝集体を含む止血材を目的とする。いくつかの態様では、止血材は、塩化カルシウムなどの添加剤、並びにトリス及び／又はリジンなどの緩衝剤を更に含む。
【００４４】
別の態様では、本発明は、揮発性非水性溶媒が、混合ブレード／インペラのエアシールを介して、かつ／又は真空管を介してなど、任意の好適なポートを介して蒸発することを可能にしながら、高剪断混合（High Shear Mixing、ＨＳＭ）装置内で非水性溶媒にフィブリノゲン、トロンビン、及びＯＲＣ粉末の混合物を懸濁し、高剪断混合及び規則的な混合及び／又は攪拌を実施することによる、上記で説明された止血材を製造するための方法を目的とする。任意選択的に、粒子の結合／凝集／クランピングを補助するために、混合中に少量の水又は水溶液が反応容器に導入される。非水性低沸点溶媒は、ＨＦＥ７１００などであるがこれに限定されないヒドロフルオロエーテルＣ４Ｆ９ＯＣＨ３であってよい。
【００４５】
本発明の一実施形態によると、止血凝集粉末は、ＯＲＣ微細繊維又は粉末、トロンビン、フィブリノゲン、リジン（緩衝液／ｐＨ調整剤として）、カルシウム塩を含む。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、こうした粉末状止血製品の製造プロセスは、低速混合ブレード及び高速剪断ブレードを有する高剪断混合／剪断反応容器（High Shear mixing/shearing reactor）中で、粉末状の個々の成分をＨＦＥと混合し、ＨＦＥ（揮発性非水性溶媒）中懸濁液を生成する工程を含む。混合が実行されると、ＨＦＥは、混合ブレード及び／又は真空管のエアシールを通して蒸発し得る。粒子の結合／凝集／クランピングを補助するために、少量の水が反応容器に導入される。
【００４７】
本発明の一実施形態によれば、止血粉末の製造方法であって、ＯＲＣ粉末、トロンビン、フィブリノゲン、リジン、ＨＦＥ（揮発性非水性溶媒）中のカルシウム塩を形成する工程と、懸濁液を高速剪断ブレードで攪拌する工程（及び任意選択的に低速ミキサで成分を同時に連続的に混合する工程）と、粒子の結合／凝集／クランピングを補助するために、少量の水を反応容器に添加する工程と、ＨＦＥを反応容器から完全に蒸発させる工程と、を含み、かくして、止血粉末を形成する、方法。
【００４８】
実施例１．止血組成物の調製
本発明の止血組成物の個々の成分を下記の通り調製した。
【００４９】
フィブリノゲン。凍結乾燥、フリーズドライなどを含むフィブリノゲン粉末を調製する任意の方法を利用することができる。本実施例では、噴霧乾燥法（噴霧乾燥機製造業者：ＰｒｏＣｅｐＴ、型番４Ｍ８−ＴｒｉＸ）によってフィブリノゲン粉末を調製した。フィブリノゲン溶液は、Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａに所在するＢｉｏｓｅａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＯ．ＬＴＤから市販される、ＷＦＩ中にフィブリノゲン、アルブミン、及びその他の必要な試薬を含む配合物である。まず、フィブリノゲン溶液を熱風中で噴霧ノズルを通して霧化させ、続いて、直ちに乾燥させた。噴霧乾燥パラメータは、表１に示す通りであった。
【００５０】
【表１】
2021513431.tif 000002
【００５１】
トロンビン。凍結乾燥、フリーズドライなどを含むトロンビン粉末を調製する任意の方法を利用することができる。本実施例では、トロンビン配合物溶液を用いて噴霧乾燥法によってトロンビン粉末を調製した。トロンビン溶液は、Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａに所在するＢｉｏｓｅａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＯ．ＬＴＤから市販される、ＷＦＩ中にトロンビン、アルブミン、及びその他の必要な試薬を含む配合物であった。噴霧乾燥パラメータは、表２に示す通りであった。
【００５２】
【表２】
2021513431.tif 000003
【００５３】
続いて、８９．７重量％のフィブリノゲン及び７．８重量％のトロンビン及び２．５重量％の塩化カルシウムの比で複合体を調製するために、トロンビン及びフィブリノゲンの粉末を一緒に混合して、フィブリンシーラント粉末を形成した。
【００５４】
フィブリノゲン及びトロンビンの供給源は、フィブリノゲン及びトロンビンを得るために分画された、Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａに所在するＢｉｏｓｅａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＯ．ＬＴＤによって供給されるブタ血漿であった。
【００５５】
ＯＲＣ粉末は、Ｓｕｒｇｉｃｅｌオリジナル布地を加工することによって得ることができる。全ての目的のために参照により本明細書に援用される、Ｙｉ−Ｌａｎ  Ｗａｎｇによる、２０１５年１１月６日に出願された、「Ｃｏｍｐａｃｔｅｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ」と題された米国仮特許出願第６２／２５１７７３号を参照する。
【００５６】
簡潔に述べると、以下のプロセスにおいてＳｕｒｇｉｃｅｌオリジナル布地を加工することによってＯＲＣ粉末を得た：
１）布地を約約２インチ×８インチ片に分割及び切断し、
２）既知の粉砕方法を用いて、布地を粉末粒径（９４マイクロメートル未満のＤ５０）に粉砕する。調製に使用される方法のうちの１つは次のボールミル法である。これは、約１００グラムの布地を５００ｍＬのジルコニア製ジャーに入れ、続いて、１２又は１３個の２０ｍｍのジルコニア製ボール（ビー玉）を同じジャーに入れ、ジャーに蓋をし、Ｒｅｔｓｃｈ遊星ボールミル（型番ＰＭ１００）にジャーを固定し、布地を４５０ｒｐｍで２０分間粉砕し、粉砕された粉末を直径８インチ及び目開き３００マイクロメートルの篩上に移し、少し振盪することによってビー玉と粉末とを分離させて粉末を回収する。
【００５７】
同時噴霧方法を用いることによって、本発明の止血組成物を以下の通り調製した。１重量部のＯＲＣ繊維を、１重量部、又は２重量部、又は５重量部、又は１０重量部のフィブリンシーラント粉末と合わせた。したがって、一例として、１０ｇのＯＲＣ粉末を１０ｇ、２０ｇ、５０ｇ、又は１００ｇのフィブリンシーラント混合粉末と合わせて、２０ｇ、３０ｇ、５０ｇ、又は１００ｇの混合物を生成した。
【００５８】
それぞれのＯＲＣ：フィブリンシーラント比について、ｐＨを７．０に調整するために少量のトリスを添加した。粉末を湿潤表面上に置き、生じたｐＨを測定し、７の中性ｐＨを得るために必要なトリスの量を評価することによって、ｐＨを調整した。続いて、サンプルを廃棄した。続いて、対応する比例量のトリスの乾燥粉末を粉末混合物に添加した後、同時噴霧した。
【００５９】
トリスを乾燥形態で添加したので、ＯＲＣ自体は中和されていない。塗布中に粉末配合物全体を濡らし、トリスを溶解させたとき、ＯＲＣが中和される。ＦＳ及びＯＲＣ粉末の懸濁液を作製するために低沸点非水性溶媒を利用した。例えば、６１℃の沸点を有するＮｏｖｅｃ  ７１００  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｉｄとして３Ｍによって供給されているＨＦＥ７１００として入手した、ヒドロフルオロエーテルＣ４Ｆ９ＯＣＨ３を使用した。ＨＦＥ７１００溶媒を粉末組成物に添加し、１５０μｍの篩で濾過した。２０±５℃の温度のリザーバにおいて９０ｒｐｍ／分で一定に攪拌することによって、均等に分布している懸濁液を作製した。直径０．７ｍｍのノズルを通して、懸濁している成分を噴霧した。使用したノズルの種類は、Ｓｐｒａｙｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏ．により製造されたＢ１／８ＶＡＵ−３１６ＳＳ＋ＳＵＶ６７−３１６ＳＳであった。２０±５℃の温度の不織布又はステンレス鋼の基材上への、ノズルを通る流れは、１３０ｍＬ／分の流速であった。
【００６０】
懸濁液を噴霧したとき、ＨＦＥ７１００溶媒の大部分が蒸発していた。存在する場合は、ＨＦＥ７１００溶媒残渣及び粉末中の吸収された周囲水分は、２０±５℃で２４時間±５時間かけて真空乾燥オーブン内で蒸発することができた。
【００６１】
得られた止血組成物をすくい取るか剥がし取るか又は他の方法で基材から分離し、続いて、８５０μｍ、３５５μｍ、２５０μｍの目開きを有する篩に通した。
【００６２】
表３は、組成物を同時噴霧するために使用したパラメータを示す。
【００６３】
【表３】
2021513431.tif 000004
【００６４】
比較例として、同じ噴霧法ＨＦＥ７１００によって、ＯＲＣもトリスも含まない純粋なフィブリンシーラント混合組成物も調製した。
【００６５】
実施例２．機械的混合止血組成物対噴霧混合止血組成物のゲル化の比較
急速なゲル化及び強力なゲルの形成は、止血材にとって重要である。
【００６６】
同時噴霧法によって、上記の通り本発明の止血組成物を調製した。
【００６７】
乾燥粉末、すなわち、上記の通り得られたＦＳ又はＯＲＣ粉末を手で振盪することによって、同時噴霧を実施せずに容器内において手で振盪して均等に混合された組成物にすることによって、比較のための機械混合組成物を調製した。組成物は、トリスを含む同じ成分を全て含んでおり、違いは混合方法であった。
【００６８】
試験したフィブリンシーラント粉末のＯＲＣに対する比は、フィブリンシーラント（ＦＳ）：ＯＲＣ比−１：１、２：１、５：１、１０：１（重量基準）であった。したがって、１：１のＦＳ／ＯＲＣ比では、１部のフィブリンシーラント粉末（フィブリノゲン、トロンビン、塩化カルシウムを含む）を１部のＯＲＣ粉末と合わせる（重量による）。
【００６９】
続いて、機械混合組成物及び本発明の噴霧混合組成物を、水表面上に２００ｍｇの量で５０ｍＬのバイアル内の２０ｍＬの水に添加した。２分間ゲル化させた後、バイアルを上下逆さまにし、組成物のゲル化層が形成されたかどうかを観察し、形成された場合、ゲル化層によって封止され、形成されたゲル層によってバイアルの底部に保持された水が観察された。
【００７０】
次に、試験の終了時に上下逆さまにした試験バイアルの画像を示す図２を参照すると、
・試験バイアル１は、１：１ＦＳ／ＯＲＣ比の機械混合組成物を示し、
・試験バイアル２は、２：１ＦＳ／ＯＲＣ比の機械混合組成物を示し、
・試験バイアル３は、５：１ＦＳ／ＯＲＣ比の機械混合組成物を示し、
・試験バイアル４は、１０：１ＦＳ／ＯＲＣ比の機械混合組成物を示し、
・試験バイアル５は、ＯＲＣ粉末を含まない（フィブリンシーラント粉末のみ）機械混合組成物を示し、
・試験バイアル６は、１：１ＦＳ／ＯＲＣ比の本発明の止血組成物を示す。
【００７１】
図２に示される結果の解析は、試験バイアル１〜５ではゲル化が流体を保持するには不十分であり、バイアルの下部に流体が視認できることを示す。試験バイアル６では、流体はバイアルの上部に視認できる、すなわち、水はゲル化層によって保持され、重力下でバイアルの下部に移動するのが阻止されている。このように、全ての比の機械混合組成物及びＯＲＣを含まないフィブリンシーラント組成物ではゲル化が不十分であったが、１：１比で調製された本発明の止血組成物は、驚くほどに強力なゲル化を示した。
【００７２】
実施例３．インビトロにおける血液凝固試験
インビトロにおけるいくつかの本発明の組成物、及び比較組成物による血液凝固を以下の通り試験した。
【００７３】
２０ｍＬのクエン酸添加された全血（ブタ）を５０ｍＬのバイアルに添加した。２００ｍｇの試験した止血組成物を血液表面上に添加した。２分間凝固させた後、バイアルを上下逆さまにし、血液凝固を観察した。完全に凝固した場合、凝固した血液は、上下逆さまになったバイアルの上部に留まる。凝固が不完全な場合、血液は流体のままであり、重力によってバイアルの下部に流れる。
【００７４】
ＯＲＣの代わりにフィブリンシーラント粉末に添加した比較のための賦形剤は、トレハロース、ＰＥＧ４０００、マンニトール、及びアルファ−セルロース（α−セルロース）であった。全ての賦形剤は、Ａｌａｄｄｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。１０：１比、すなわち、１０部のフィブリンシーラント（ＦＳ）粉末を１部のそれぞれの賦形剤と合わせて、上記の通り噴霧法によって、トレハロース、ＰＥＧ４０００、マンニトール、又はアルファ−セルロースを含むフィブリンシーラント粉末混合物を調製した。２０ｍＬの血液に添加した本発明の組成物及び比較組成物の総量は２００ｍｇであった。
【００７５】
次に、試験の終了時に上下逆さまにした試験バイアルの画像を示す図３を参照すると、
・試験バイアル８は、２：１ＦＳ／ＯＲＣ比を有する本発明の止血組成物を示し、
・試験バイアル９は、５：１ＦＳ／ＯＲＣ比を有する本発明の止血組成物を示し、
・試験バイアル１０は、１：１ＦＳ／ＯＲＣ比を有する本発明の止血組成物を示し、
・試験バイアル１１は、同時噴霧によって作製された、ＯＲＣを含まず、フィブリンシーラント粉末のみを含む比較組成物を示し、
・試験バイアル１２は、１０：１ＦＳ／α−セルロース重量比でα−セルロースを添加した、フィブリンシーラント粉末を含む比較組成物を示し、
・試験バイアル１３は、１０：１ＦＳ／トレハロース重量比でトレハロースを添加した、フィブリンシーラント粉末を含む比較組成物を示し、
・試験バイアル１４は、１０：１ＦＳ／ＰＥＧ４０００重量比でＰＥＧ４０００を添加した、フィブリンシーラント粉末を含む比較組成物を示し、
・試験バイアル１５は、１０：１ＦＳ／マンニトール重量比でマンニトールを添加した、フィブリンシーラント粉末を含む比較組成物を示す。
【００７６】
図３に提示した結果の解析は、本発明の止血組成物を含む試験バイアル８〜１０では、血液が凝固しており、上下逆さまになったバイアルの上部に血餅が視認でき、凝固した血液が重力下でバイアルの下部に移動するのが阻止されていることを示す。このように、２：１、５：１、１：１ＦＳ／ＯＲＣ比で調製された本発明の止血組成物は、驚くほどに強力な血液の凝固を示した。また、バイアル１２中にα−セルロースを含む比較試料も、血液の凝固を示す。バイアル１１（ＯＲＣを含まず、フィブリンシーラント粉末のみ）、バイアル１３（トレハロースを添加したフィブリンシーラント粉末）、バイアル１４（ＰＥＧ４０００を添加したフィブリンシーラント粉末）、バイアル１５（マンニトールを添加したフィブリンシーラント粉末）内の比較例は、凝固を全く示さないか、不十分な凝固しか示さず、したがって、流体を保持するには凝固が不十分であり、流体はバイアルの下部に視認でき、すなわち、血液は流体のままであり、重力によってバイアルの下部に流れる。本発明の止血組成物は、驚くほどに強力な血液凝固を示した。
【００７７】
同一の試験方法を用いて、本発明の止血組成物及び容器内で乾燥粉末を手で振盪することによって調製された比較のための機械混合組成物、並びにＯＲＣを含まないフィブリンシーラント粉末のみについて、更なるインビトロにおける血液凝固試験を実施した。
【００７８】
次に、試験の終了時に上下逆さまにした試験バイアルの画像を示す図４を参照すると、
・試験バイアル１は、１：１ＦＳ／ＯＲＣ比の機械混合組成物を示し、
・試験バイアル２は、２：１ＦＳ／ＯＲＣ比の機械混合組成物を示し、
・試験バイアル３は、５：１ＦＳ／ＯＲＣ比の機械混合組成物を示し、
・試験バイアル４は、１０：１ＦＳ／ＯＲＣ比の機械混合組成物を示し、
・試験バイアル５は、Ｙｉ−Ｌａｎ  Ｗａｎｇによる、２０１５年１１月６日に出願された、「Ｃｏｍｐａｃｔｅｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ」と題された米国仮特許出願第６２／２５１７７３号に記載の通り調製された圧縮されたＯＲＣ粉末凝集体を含む比較組成物（２００ｍｇ）を示し、
・試験バイアル６は、同時噴霧法によって調製された、ＯＲＣを含まず、フィブリンシーラント粉末のみを含む比較組成物を示し、
・試験バイアル７は、１：１ＦＳ／ＯＲＣ比を有する本発明の止血組成物を示し、
・試験バイアル８は、２：１ＦＳ／ＯＲＣ比を有する本発明の止血組成物を示し、
・試験バイアル９は、５：１ＦＳ／ＯＲＣ比を有する本発明の止血組成物を示し、
・試験バイアル１０は、１０：１ＦＳ／ＯＲＣ比を有する本発明の止血組成物を示す。
【００７９】
図４に示される結果の解析は、全ての比の機械混合組成物、ＯＲＣ粉末のみ、及びＯＲＣを含まないフィブリンシーラント粉末を含む試験バイアル１〜６における比較例は、凝固を全く示さないか、不十分な凝固しか示さず、そのため、流体を保持するには凝固が不十分であり、流体はバイアルの下部に視認でき、すなわち、血液は流体のままであり、重力によってバイアルの下部に流れることを示す。対照的に、かつ図３に示した結果と同様に、本発明の止血組成物を含む試験バイアル７〜１０では、血液は凝固し、上下逆さまになったバイアルの上部に血液凝固が視認でき、凝固した血液は重力下でバイアルの下部に移動することが阻止されている。このように、１：１〜１０：１ＦＳ／ＯＲＣ比で調製された本発明の止血組成物は、驚くほどに強力な血液の凝固を示した。
【００８０】
実施例４．組成物の可溶化
体液と接触したときの粉末状止血組成物の迅速な可溶化又は溶解性は、迅速に止血するのに役立ち得、流体との迅速な相互作用を示す。可溶化の外観試験を以下の通り実施した：１グラムの試験した止血粉末状組成物を、純水の入ったトレイ内に置かれたスポンジ材上に配置された不織布を含む湿潤基材のある領域に均等に塗布した。試験した粉末状止血組成物を湿潤基材の表面に塗布した後、組成物の溶解性の目視観測を実施し、０時間（組成物の塗布直後、試験した組成物の塗布の１分後及び２分後に結果を記録した。
【００８１】
次に、図５を参照すると、容器内で乾燥粉末を手で振盪することによって調製された比較のための機械混合組成物の試験結果を示す複合画像を示す。ＦＳ／ＯＲＣ比１：１、２：１、５：１、１０：１、並びにＯＲＣを含まないＦＳ粉末に対して０分、１分、及び２分で撮影された画像。結果は、比較例では２分時点でさえも不十分な可溶化を示す。
【００８２】
次に、図６を参照すると、噴霧法によって調製された本発明の止血組成物の試験結果を示す複合画像を示す。ＦＳ／ＯＲＣ比１：１、２：１、５：１、１０：１、並びにＯＲＣを含まないＦＳ粉末に対して０分、１分、及び２分で撮影された画像。結果は、１分時点でさえも良好な可溶化を示し、そして、２分時点では非常に良好な可溶化を示し、１：１及び２：１比では１分で既に迅速な完全可溶化が観察され、全ての比に対して２分で良好な可溶化が観察された。純粋なＦＳは、比較例で２分時点においてさえも不十分な可溶化を示す。
【００８３】
次に、図７を参照すると、ＯＲＣの代わりにフィブリンシーラント粉末に賦形剤を添加した、ＦＳを含む比較組成物、並びにＯＲＣを含まないＦＳ粉末の試験結果を表す複合画像を示す。賦形剤は、トレハロース、ＰＥＧ４０００、マンニトールであった。１０：１ＦＳ／賦形剤比で上記の通り噴霧法によって、トレハロース、ＰＥＧ４０００、マンニトールを含むフィブリンシーラント粉末混合物を調製した。０分、１分、及び２分に撮影された画像を示す。結果は、比較例では２分時点でさえも不十分な可溶化を示す。
【００８４】
噴霧法によって調製された本発明の止血組成物の溶解性は、ＯＲＣ成分の濃度に影響を受けていた。低濃度のＯＲＣでさえも、組成物の溶解性が改善された。
【００８５】
実施例５．粒径の効果
本発明の止血組成物の性能に対する粒径の効果を評価した。８５０μｍ、３５５μｍ、及び２５０μｍの開口部を有する篩に組成物を逐次通すことによって粒径を制御した。本発明の組成物の粉末を、主に８５０μｍ超、主に３５５〜８５０μｍ、主に２５０〜３５５μｍ、及び主に２５０μｍ未満のサイズ群に分けた。５：１ＦＳ／ＯＲＣ比で作製された本発明の止血組成物を、溶解性について試験した。
【００８６】
次に図８を参照すると、噴霧法によって調製された本発明の止血組成物の試験結果を示す複合画像が示される。異なる粉末サイズ範囲について、０分、１分、及び２分に画像を撮影する。結果は、主に３５５〜８５０μｍの組成物では２分時点で特に優れた可溶化を示し、主に２５０〜３５５μｍの組成物では良好な可溶化を示し、主に８５０μｍ超及び主に２５０μｍ未満の組成物ではそれほど有効な可溶化を示さない。このように、主に２５０〜８５０μｍの範囲が良好な可溶化を示し、これは好ましい粒径範囲であり、主に３５５〜８５０μｍの範囲の粒子が特に好ましい。得られた粉末は、フィブリノゲン、トロンビン、及びＯＲＣの凝集体であり、出発物質の粒径よりも大きいサイズの粒子を多く有する。
【００８７】
実施例６．トリス添加の効果
トリスを添加した及びトリスを添加していない本発明の組成物の剥離試験を実施した。ｐＨ＝７を達成するためのトリス添加の量を滴定した。トリス粉末を粉砕し、１５０μｍの篩に通した。１５０μｍ未満の粉末を回収し、所定の量を乾燥混合物に添加して、組成物のｐＨを調整した後、同時噴霧した。
【００８８】
剥離試験を以下の通り実施した。０．５ｇの本発明の組成物を真皮組織に塗布し、複合二層マトリクスで覆い、これを３分間粉末に押し付け、組織からサンプルへの分離力をＩｎｓｔｒｏｎ引張試験機によって測定し、力／単位幅（Ｎ／ｍ）として記録した。複合二層マトリクスは、参照により本明細書に援用される、Ｄ．Ｓｈｅｔｔｙらによる「Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｅｄ  ｆａｂｒｉｃ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ」と題された米国特許第７，６６６，８０３号に記載されている通り、カルボン酸酸化再生セルロース編地（ＯＲＣ）にニードルパンチされた合成吸収性ポリ（グリコリド−コ−ラクチド）（ＰＧＬ、９０／１０モル／モル）不織布の層を含んでいた。
【００８９】
次に、表ＮＮを参照すると、本発明の配合物の接着力をＯＲＣ添加の関数として示す。ＯＲＣ含量が高くなるほどに接着力は低下するが、１：１ＦＳ粉末：ＯＲＣ繊維配合物でさえも相当な剥離力を有する。
【００９０】
次に、表４を参照すると、様々なＦＳ／ＯＲＣ比について、トリスを含む及び含まない本発明の配合物の接着力を、対応するｐＨ値と共に示す。ｐＨを７．０に調整するために、列挙した重量パーセントでトリスを添加した。全ての組成物が高い剥離力を示したが、同じＦＳ／ＯＲＣ比ではトリスの存在によって明らかにより高い剥離力が得られ、一部は２〜４倍高い剥離力を示した。
【００９１】
【表４】
2021513431.tif 000005
【００９２】
データの解析は、トリスの添加によって達成された中性ｐＨを有する本発明の組成物について、接着力又は剥離力の驚くべき改善を示す。しかし、力は幾分低い。
【００９３】
実施例７．粒子の特性評価
次に、５：１ＦＳ／ＯＲＣの本発明の組成物の拡大ＳＥＭ画像を示す図９を参照すると、組成物の成分が少なくとも部分的に一体化しており、すなわち、互いに付着しているか又は互いにコーティングされており、単なる機械混合では一体化していないことが明らかである。
【００９４】
粉末形態の本発明の組成物の試験は、成分が十分に混合されており、生物製剤がＯＲＣ繊維に密着していたことを示す。
【００９５】
実施例８．止血試験
本発明の止血組成物を用いた肝擦過傷モデルにおける止血効果のインビボ試験を以下の通り実施した。ブタ肝臓の表面上に３ｃｍ×３ｃｍの滲出領域を作製することによって肝擦過傷モデルを作製した。０．５ｇの５：１のＦＳ／ＯＲＣ比を有する本発明の止血組成物を塗布して、全くタンポン充填を適用することなく滲出領域を覆った。止血は２分未満で達成された。
【００９６】
本発明の止血組成物を用いた肝切除モデルにおける止血効果のインビボ試験を以下の通り実施した。一部の腹部手術で使用される外科的操作であるプリングル操作を使用することにより大きな非外傷性止血材をクランプとして適用して、肝切除モデルを作製した。最初に出血を制御するためにプリングル操作を適用し、次に、肝縁部に沿って長さ５ｃｍ幅５ｃｍの肝組織切片を作製して、胆管を露出させた。その直後、本発明の止血組成物粉末を塗布して切断面を覆い、出血が止まるまで生理食塩水を同時に噴霧した。続いて、プリングルクランプを解放して結果を調べた。止血が達成され、プリングルクランプを解放した後に胆管漏出が阻止されたことが観察された。止血は２分で達成された。
【００９７】
実施例９．高剪断反応容器における製造方法
本発明の一実施形態によれば、粉末状止血製品の製造プロセスは、低速混合ブレード及び高速剪断ブレードを有する高剪断混合／剪断反応容器中で、粉末状の個々の成分をＨＦＥと混合し、ＨＦＥ（揮発性非水性溶媒）中懸濁液を生成する工程を含む。混合が実行されると、ＨＦＥは、混合ブレード及び／又は真空管のエアシールを通して蒸発することができる。粒子の結合／凝集／クランピングを補助するために、少量の水が反応容器に導入される。水の量は、生物製剤の小部分が反応して粒子を形成するのに十分であるが、全ての生物製剤、すなわちトロンビン及びフィブリノゲンが完全に反応して、その結果、全てのフィブリノゲンをフィブリンに変換させるには十分ではない。フィブリンに変換されたフィブリノゲンの部分は、約０．１％〜約５０％、より好ましくは１％〜２５％、更により好ましくは２％〜１０％である。本発明に従って調製された止血粉末中に含有される凝固性フィブリノゲンの一定量が常に存在し、粉末が創傷上又は創傷内で使用される際に反応のために利用可能である。
【００９８】
本発明の一実施形態によれば、止血粉末の製造方法であって、ＯＲＣ粉末、トロンビン、フィブリノゲン、リジン、ＨＦＥ（揮発性非水性溶媒）中のカルシウム塩を形成する工程と、懸濁液を高速剪断ブレードで攪拌する工程（及び任意選択的に低速ミキサで成分を同時に連続的に混合する工程）と、粒子の結合／凝集／クランピングを補助するために、少量の水を反応容器に添加する工程と、ＨＦＥを反応容器から完全に蒸発させる工程と、を含み、かくして、止血粉末を形成する、方法。
【００９９】
図１０を参照すると、本発明に係る止血材を作製するプロセスの概略ブロック図が示され、当該プロセスは、
・フィブリノゲン、トロンビン、ＯＲＣ、任意に塩化カルシウム、及び任意にトリス及び／又はリジンなどの緩衝剤化合物の乾燥粉末混合物を調製する工程と、
・高剪断ミキサ反応容器内の周囲条件下で急速蒸発することができる非水性溶媒中に乾燥粉末混合物を懸濁させる工程と、
・懸濁液を高速剪断ブレードで撹拌し、任意選択的に、低速ミキサブレードで成分を同時に連続的に混合する工程と、
・粒子の結合／凝集／クランピングを補助するために少量の水を反応容器内に導入する工程と、
・反応容器から非水性溶媒を蒸発させ、得られた止血材料を乾燥させる工程と、
・得られた止血材を反応容器から除去し、任意に篩分けし、かくして凝集粉末形態の少なくとも部分的に一体化したＯＲＣ繊維、フィブリノゲン、及びトロンビンを形成する工程と、を含む。
【０１００】
一実施形態では、ｐＨ調整のために、粉末形態のリジン又はトリスを、フィブリノゲン、トロンビン、及びＯＲＣの混合物に添加する。
【０１０１】
本発明の一態様によれば、本発明の止血材は、粉末形態の、実質的に均一に分布している、少なくとも部分的に一体化しているＯＲＣ繊維、フィブリノゲン、及びトロンビンを含む。
【０１０２】
本発明の一態様によれば、本発明の止血材は、高い均一性、一体性、迅速なゲル化／凝固、及び強い接着力を有する。
【０１０３】
ここで図１１を参照すると、容器又はボウル５、原料混合及び懸濁のためのインペラ１（低速ミキサ）、高速剪断ブレード又はチョッパナイフ２、水（バインダ）添加用噴霧ノズル３、ＨＦＥ揮発性流体を除去するためのベント４、混合及び／又は剪断ブレードシール（blades seals）を介してＨＦＥ揮発性流体をパージするための任意の空気又は気体侵入のための経路６を備える高剪断混合（ＨＳＭ）反応容器の概略描画が示される。あるいは、専用の空気取入口が設けられてもよい（図示せず）。あるいは、真空をベント４に接続してもよい。
【０１０４】
ＨＳＭ反応容器は市販されている。本実施例で使用した反応容器は、Ｃｈｕａｎｇｚｈｉ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｃｈｉｎａ）から入手可能なＨＳＭモデルＭｉｎｉ−ＣＧであった。
【０１０５】
実施例１０．実施例１の噴霧法及び実施例９のＨＳＭ法によって作製された止血粉末の比較試験
本発明者らは、ＨＳＭ法（実施例９）の粒子を、ＨＦＥ懸濁液のノズルを介して噴霧することによって製造された粒子（実施例１）と比較した。試験結果は、ＨＳＭ法により製造された止血粉末は、実施例１のスペイング（spaying）法によって製造された粉末と比較して、同等の引張強度及び接着強度のような生理学的特性及び機能的性能を有し、また動物試験において同等の止血効果を有したことを示した。
【０１０６】
トリス緩衝液を配合した実施例１の粉末と、緩衝化合物としてリジンを使用した実施例９（ＨＳＭ法）で配合された粉末と、の比較は、止血粉末性能に実質的な差がないことを示した。
【０１０７】
有利なことに、止血粉末顆粒を調製するＨＳＭ法は、粉末が密閉環境内で造粒されることができ、プロセス中に材料が失われないように、実質的に密封されたシステムであるＨＳＭ装置を提供する利点を有する。汚染微生物数は、実施例１の噴霧法と比較して最小限に抑えることができる。
【０１０８】
図１２を参照すると、実施例９のＨＳＭ法によって調製された止血粉末が示されている。
【０１０９】
実施例１１．ＨＳＭ法を使用した止血組成物の調製：様々な溶媒／バインダの比較
本発明者らは、いくつかの異なる溶媒／バインダを使用して止血粉末を製造するためにＨＳＭ法（実施例９）を使用した。図１３を参照すると、ｋＰａを単位とするゲル強度のチャートが示され、ゲルは本発明の止血粉末によって形成され、こうした粉末は、４つの異なる溶媒及び／又はバインダのうちの１つを使用することによって製造された。ゲル強度は、いくつかの異なる試験点に関して示されている。チャートの第１のセグメントは、揮発性懸濁液溶媒としてのアセトンのゲル強度、及びバインダとしてのポリマーＲＧ５０２（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）のゲル強度を示す。第２のセグメントは、揮発性溶媒及びバインダとしてのエタノール／水の組み合わせのゲル強度を示す。第３のセグメントは、揮発性溶媒及びバインダとしてのアセトン／水の組み合わせのゲル強度を示す。第４のセグメントは、揮発性溶媒及びバインダとしてのＨＦＥ／水の組み合わせのゲル強度を示す。図１３のチャートから分かるように、ＨＦＥ／水の組み合わせが最も高いゲル強度を示す。
【０１１０】
ここで図１４を参照すると、様々な溶媒／バインダを使用することによって製造された止血粉末の動物モデルにおける試験の結果が示される（ダーマトーム肝臓表面モデル（dermatome liver surface model）上の止血試験）。図１４から分かるように、アセトン／ＲＧ５０２、エタノール／水、アセトン／水の組み合わせは全て、塗布後３分後に出血を示す。対照的に、本発明のＨＦＥ／水の組み合わせは、わずか１分後に出血の停止を示す。
【０１１１】
実施例１２．ＨＳＭ法及びポリマーＲＧ５０２／アセトンを使用した止血組成物の調製
フィブリノゲン粉末／トロンビン粉末／ＯＲＣ粉末／塩化カルシウム粉末、及びトリスを含む２００ｇの原料粉末を、表５に示す配合に従って調製した。バインダ／懸濁溶液を、７４．７ｇのアセトン及び８．３ｇのポリマーＲＧ５０２（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から調製し、ポリマーは完全に溶解させて十分に混合した。
【０１１２】
【表５】
2021513431.tif 000006
【０１１３】
製造プロセスの概略ブロック図を図１６に示す。全ての乾燥材料をＨＳＭのボウルに移し、７５ｒｐｍの混合ブレードインペラ速度、１０００ｒｐｍの高剪断ブレードチョッパ速度を用いて５分間予混合した。続いて、バインダ／懸濁溶液（ＲＧ５０２／アセトン）を、蠕動ポンプ及び噴霧ノズルによって６０ｇ／分の供給流量で乾燥材料上に噴霧した。ポリマー／アセトンの溶液は、原料粒子の結合を開始して粉末を形成する。
【０１１４】
続いて、インペラ速度を１５０ｒｐｍに上げ、チョッパ速度を３０００ｒｐｍに上げ、造粒後プロセスを５分間継続した。
【０１１５】
造粒後、篩（孔径１．７ｍｍ）を使用して材料を篩分けし、得られた粉末を篩の下に回収した。粉末を真空乾燥ボックスに移し、１時間乾燥させた。続いて、２つの篩（孔径１０６及び４２５μｍ）を使用して製品を篩分けした。最終粉末画分を２つの篩の間に回収した。
【０１１６】
実施例１３．ＨＳＭ法及び水／アセトンを使用した止血組成物の調製
フィブリノゲン粉末／トロンビン粉末／ＯＲＣ粉末／塩化カルシウム粉末、及びトリスを含む２００ｇの原料粉末を、表６に示す配合に従って調製した。バインダ／懸濁溶液を、６８ｇのアセトン及び１７ｇの精製水から調製し、完全に混合させた。
【０１１７】
【表６】
2021513431.tif 000007
【０１１８】
製造プロセスの概略ブロック図を図１８に示す。全ての乾燥材料をＨＳＭのボウルに移し、７５ｒｐｍの混合ブレードインペラ速度、１０００ｒｐｍの高剪断ブレードチョッパ速度を用いて５分間予混合した。続いて、バインダ／懸濁溶液（水／アセトン）を、蠕動ポンプ及び噴霧ノズルによって６０ｇ／分の供給流量で乾燥材料上に噴霧した。溶液は、原料粒子を結合して粉末を形成し始める。
【０１１９】
続いて、インペラ速度を１２０ｒｐｍに上げ、チョッパ速度を３０００ｒｐｍに上げ、造粒後プロセスを３分間継続した。
【０１２０】
造粒後、篩（孔径１．７ｍｍ）を使用して材料を篩分けし、得られた粉末を篩の下に回収した。粉末を真空乾燥ボックスに移し、真空下で１時間乾燥させた。続いて、２つの篩（孔径１０６及び４２５μｍ）を使用して製品を篩分けした。最終粉末画分を２つの篩の間に回収した。
【０１２１】
実施例１４．ＨＳＭ法及び９６％エタノールを使用した止血組成物の調製
フィブリノゲン粉末／トロンビン粉末／ＯＲＣ粉末／塩化カルシウム粉末、及びトリスを含む１５０ｇの原料粉末を、表７に示す配合に従って調製した。バインダ／懸濁溶液を、６０ｇの９６％エタノールから調製した。
【０１２２】
【表７】
2021513431.tif 000008
【０１２３】
略ブロック図を図２０に示す。全ての乾燥材料をＨＳＭのボウルに移し、７５ｒｐｍの混合ブレードインペラ速度、１０００ｒｐｍの高剪断ブレードチョッパ速度を用いて３分間予混合した。続いて、バインダ／懸濁溶液（９６％エタノール）を、蠕動ポンプ及び噴霧ノズルによって４ｇ／分の供給流量で乾燥材料上に噴霧した。溶液は、原料粒子を結合して粉末を形成し始める。
【０１２４】
続いて、インペラ速度を１２０ｒｐｍに上げ、チョッパ速度を１５００ｒｐｍに上げ、造粒後プロセスを３分間継続した。
【０１２５】
造粒後、篩（孔径７１０μｍ）を使用して材料を篩分けし、得られた粉末を篩の下に回収した。粉末を乾燥のためにトレイオーブンに移し、４５℃で０．５時間乾燥させた。
【０１２６】
続いて、２つの篩（孔径１００及び３１５μｍ）を使用して製品を篩分けした。最終粉末画分を２つの篩の間に回収した。
【０１２７】
実施例１５．ＨＳＭ法及びＨＦＥ／水を使用した止血組成物の調製
フィブリノゲン粉末／トロンビン粉末／ＯＲＣ粉末／塩化カルシウム粉末、及びトリスを含む１００ｇの原料粉末を、表８に示す配合に従って調製した。５００ｇのＨＦＥ７１００を利用した。
【０１２８】
【表８】
2021513431.tif 000009
【０１２９】
製造プロセスの概略ブロック図を図２２に示す。全ての乾燥材料をＨＳＭのボウルに移し、５００ｇのＨＦＥ７１００を添加した。２００ｒｐｍの混合ブレードインペラ速度を使用して、組成物を３分間予混合して懸濁液を形成した。続いて、蠕動ポンプ及び噴霧ノズルによって、９ｇの水を４．５ｇ／分の供給流速で懸濁液に噴霧した。溶液は、原料粒子を結合して粉末を形成し始める。
【０１３０】
続いて、インペラ速度を１００〜３００ｒｐｍに調整し、チョッパ速度を１５０〜１０００ｒｐｍに設定して、造粒プロセスを１０分間継続した。インペラ及びチョッパの封止圧力を０．０２ＭＰａに調整してＨＦＥを吹き飛ばして組成物を乾燥させた。
【０１３１】
造粒後、篩（孔径７１０μｍ）を使用して材料を篩分けし、得られた粉末を篩の下に回収した。粉末を乾燥のために真空ボックスに移し、０〜１０Ｐａの真空下で１２〜２４時間乾燥させた。
【０１３２】
続いて、２つの篩（孔径１０６及び３５５μｍ）を使用して製品を篩分けした。最終粉末画分を２つの篩の間に回収した。
【０１３３】
実施例１６．実施例１２、１３、１４、１５で得られた止血粉末配合物の比較
実施例１２、１３、１４、１５に説明される通りに得られた止血粉末を、それらの性能に関して比較した。含水量をカール・フィッシャー法により試験した。凝固時間に基づいてトロンビンの効力を試験した。凝固性タンパク質を、フィブリノゲンを定量化することによって試験した。粒径をレーザ粒径分析器によって試験した。密度を嵩密度として測定した。ゲル強度を引張強度試験として測定した。試験の結果を表９及び図１９、２０に示す。
【０１３４】
【表９】
2021513431.tif 000010
【０１３５】
有利なことに、ＨＦＥの揮発特性は、最終止血粉末製品の多孔性を増加させる可能性があり、これは、最終製品の密度の低下をもたらし、溶解時間又は再分散時間を加速させる。他の方法と比較して、実施例１５の粉末の密度は最も低く、一方で形成されたゲルの強度は最も高い。図１４に示されるように、止血性能もより優れていた。
【０１３６】
実施例１７．肺封止モデルにおける本発明の止血粉末の試験
肺漏出モデルに対する封止機能に関して本発明の止血粉末を試験するために、２つの研究を実施した。どちらの研究も、３０ｃｍのＨ２Ｏ圧力で示され、本発明の粉末はゲルを形成し、このゲルは肺組織にしっかりと付着し、漏出を非常に良好に封止した。圧力が４０ｃｍのＨ２Ｏであるとき、ゲルは剥離し始めたが、依然として漏出を封止することができた。
【０１３７】
図２１は、長さ１．２ｃｍの切開部を有する肺漏出モデルを示す。
【０１３８】
図２２は、収縮した肺上でゲルを形成する（２分間計数された）本発明の止血粉末を示す。
【０１３９】
図２３は、３０ｃｍのＨ２Ｏで肺漏出を封止するゲルを形成する本発明の止血粉末を示す。
【０１４０】
図２４は、長さ１ｃｍの切開部を有する肺漏出モデルを示す。
【０１４１】
図２５は、３０ｃｍのＨ２Ｏで肺漏出を封止するゲルを形成する本発明の止血粉末を示す。
【０１４２】
図２６は、４０ｃｍのＨ２Ｏ圧力で部分的に剥離したゲルを形成する本発明の止血粉末を示す（矢印は剥離領域を示す）。
【０１４３】
有利なことに、本発明の止血粉末は、肺漏出を封止することが可能であることが示される。
【０１４４】
〔実施の態様〕
（１）  粉末状止血組成物を形成する方法であって、
ａ）非水性低沸点溶媒中にフィブリノゲンの粒子、トロンビン、ＯＲＣ繊維を含む混合物の懸濁液を形成する工程と、
ｂ）前記懸濁液を高剪断混合反応容器内で攪拌及び剪断する工程と、
ｃ）水を添加して粒子を凝集させる工程と、
ｄ）前記非水性溶媒を蒸発させる工程と、
ｅ）前記組成物を乾燥及び篩分けする工程と、を含み、
かくして前記粉末状止血組成物を形成する、方法。
（２）  前記非水性低沸点溶媒が、ヒドロフルオロエーテルＣ４Ｆ９ＯＣＨ３を含む、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記非水性低沸点溶媒が、ＨＦＥ７１００を含む、実施態様２に記載の方法。
（４）  前記懸濁液がリジン又はトリスを更に含む、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記懸濁液が塩化カルシウムを更に含む、実施態様１に記載の方法。
【０１４５】
（６）  前記水が、フィブリノゲンの完全な凝固を防止する量で添加される、実施態様１に記載の方法。
（７）  前記水が、５０％未満のフィブリノゲンをフィブリンに変換させる量で添加される、実施態様１に記載の方法。
（８）  創傷を、実施態様１に記載の方法によって形成された止血組成物を前記創傷上及び／又は前記創傷内に塗布することによって治療する方法。
（９）  肺中の空気漏れを、実施態様１に記載の方法によって形成された止血組成物を前記肺上及び／又は前記肺内に塗布することによって治療する方法。
【図１】
2021513431.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021513431.tif 000015
【図６】
2021513431.tif 000016
【図７】
2021513431.tif 000017
【図８】
2021513431.tif 000018
【図９】
2021513431.tif 000019
【図１０】
2021513431.tif 000020
【図１１】
2021513431.tif 000021
【図１２】
2021513431.tif 000022
【図１３】
2021513431.tif 000023
【図１４】
2021513431.tif 000024
【図１５】
2021513431.tif 000025
【図１６】
2021513431.tif 000026
【図１７】
2021513431.tif 000027
【図１８】
2021513431.tif 000028
【図１９】
2021513431.tif 000029
【図２０】
2021513431.tif 000030
【図２１】
2021513431.tif 000031
【図２２】
2021513431.tif 000032
【図２３】
2021513431.tif 000033
【図２４】
2021513431.tif 000034
【図２５】
2021513431.tif 000035
【図２６】
2021513431.tif 000036
【国際調査報告】
2021513431.tif 000037
2021513431.tif 000038
2021513431.tif 000039