(57)【要約】  本明細書に記載の発明は、ウォゴニンで疼痛を治療するための組成物および方法に関する。特に、ウォゴニンで筋骨格痛および関節炎を治療するための組成物および方法が本明細書に記載されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において疼痛を軽減または緩和する方法であって、約１μＭ〜約５００μＭの治療有効量のウォゴニンまたはその誘導体を含む組成物を、疼痛を有する前記患者の１か所以上の部位に局部投与することと、前記疼痛を軽減または緩和することとを含む方法。
【請求項２】
前記疼痛が筋骨格痛および関節炎痛から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記筋骨格痛が、筋肉痛、筋挫傷、筋打撲、または筋断裂から生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記筋骨格痛が、腱痛、腱挫傷、腱打撲、または腱断裂から生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記関節炎痛が変形性関節症痛である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記関節炎痛が関節リウマチ痛である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記投与が、局所投与、経皮投与、皮下投与および局部注射から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記投与が経皮投与である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ウォゴニンの単回用量が３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇ〜約１．８７×１０−６ｇ／Ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ウォゴニンの１日用量が１日当たり１．１２×１０−８ｇ／Ｋｇ〜約５．６１×１０−６ｇ／Ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウォゴニンが、即時放出局所製剤、遅延放出局所製剤、連続的放出局所製剤、または持続放出局所製剤として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
１種以上の追加の抗炎症薬が、前記ウォゴニンの投与の前、後、または同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、約１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、１００μＭ、１２０μＭ、１４０μＭ、１６０μＭ、１８０μＭ、２００μＭ、２２０μＭ、２４０μＭ、２６０μＭ、２８０μＭ、３００μＭ、３２０μＭ、３４０μＭ、３６０μＭ、３８０μＭ、４００μＭ、４２０μＭ、４４０μＭ、４６０μＭ、４８０μＭ、および５００μＭのウォゴニンから選択されるウォゴニンの濃度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、液体、擦式剤、フォーム、クリーム、溶液、乳剤、ゲル、スプレー、ワイプ、ローション、もしくはパッチまたはそれらの組み合わせの形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がクリームである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記クリームが１種以上の経皮浸透促進剤を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者による前記疼痛の知覚が、前記ウォゴニンの投与後に約１０％〜約１００％軽減される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
患者において関節炎の関節を治療し、治癒を促進する方法であって、ウォゴニンまたはその誘導体を含む組成物を約１μＭ〜約５００μＭの治療有効量で前記患者の１か所以上の関節炎の関節に局部的に投与し、それによって前記関節炎の関節を治療し、治癒を促進することを含む、方法。
【請求項１９】
前記投与が、局所投与、経皮投与、皮下投与および局部注射から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与が前記関節炎の関節内の炎症を軽減する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ウォゴニンで治療されていない関節炎の関節と比較して、軟骨および滑液を含む前記関節炎の関節内またはその近くを取り囲むセラミドの発現が増加し、ＴＧＦ−β１が増加し、ＭＭＰ−１３が減少し、ＨｔｒＡ１が減少し、ＮＦκＢが減少し、ＡＧＥが減少する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ウォゴニンで治療されていない関節炎の関節と比較して、サイトカインＨｔｒＡ１、ＭＭＰ−１３、ＮＦκＢ、およびＡＧＥの前記発現が少なくとも２０％低下し、ＴＧＦ−β１、セラミド、およびＢＢＳ３が少なくとも２０％上昇する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記関節炎の関節が変形性関節症の関節である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療有効量が、嚢胞様病変（ＣＬＬ）の減少、ＯＡＲＳＩスコアの低下、および軟骨分解の一次繊毛経路の阻害のうちの１つ以上を含む効果を誘発する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
約１μＭ〜約５００μＭの濃度のウォゴニンまたはその誘導体と、美容的にまたは皮膚科学的に許容される担体とを含む局所疼痛組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、液体、擦式剤、フォーム、クリーム、溶液、乳剤、ゲル、スプレー、ワイプ、ローション、もしくはパッチ、またはそれらの組み合わせの形態である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、界面活性剤、乳化剤、脂肪、脂肪酸、トリグリセリド、溶媒、増粘剤、皮膚コンディショニング剤、キレート剤、芳香剤、浸透促進剤、およびそれらの組み合わせから選択される１種以上の賦形剤を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記１種以上の賦形剤が、セテアリルアルコール、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、グリセリン、シアバター、エトキシジグリコール、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ｐｅｇ−１００、ステアリン酸、ブチレングリコール、ジメチコン、セイヨウハッカ（ペパーミント）油、ヤシ油、ポリエチレングリコール、プルーナスアミグダルスダルシス（スイートアーモンド）油、アクリル酸ヒドロキシエチル／、アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウムコポリマー、セテアレス−２０、ジメチルスルホン、スクアラン、フェノキシエタノール、カプリリルグリコール、アクリレーツ／アクリル酸アルキルｃ１０−３０クロスポリマー、キサンタンガム、エチルヘキシルグリセリン、ヘキシレングリコール、グルタミン酸二酢酸四ナトリウム、ポリソルベート６０、イソステアリン酸ソルビタン、アロエバーバデンシス葉汁、およびメントール、ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ジメチルスルホン、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、ペパーミント油、ヤシ油、およびシアバターのうちの１つ以上を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が
ａ）．約０．０３％〜約５％のジメチルスルホン、
ｂ）．約１％〜約８％のポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、
ｃ）．約１％〜約７％のペパーミント油、
ｄ）．約０．３％〜約５０％のシアバター、
ｅ）．約０．１４％〜約２６％のヤシ油、および
ｆ）．約１５％〜約８５％の水を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ウォゴニンが約９０％〜約１００％純粋である、請求項２４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月９日に提出された米国仮特許出願第６２／６１５，０７２号、および２０１８年１１月６日に提出された米国仮特許出願第６２／７５６，１８８号の利益を主張し、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に記載の発明は、ウォゴニンで疼痛を治療するための組成物および方法に関する。特に、本明細書に記載されるのは、筋骨格痛および関節炎痛を治療するための組成物および方法である。
【背景技術】
【０００３】
筋骨格痛と関節炎痛は世界中の人々にとって重要な問題である。これらの状態から生じる疼痛は、炎症の異常と関連している。特に問題となるのは、変形性関節症（ＯＡ）であり、この疾患は、とりわけ米国（Ｕ．Ｓ．）において２７００万人以上が影響を受けている慢性疾患である。ＯＡは、肥満、関節負荷、急性損傷、加齢、関節のずれなどの危険因子に関連する多因子性疾患であると認識されている。肥満率が増加し、人口の平均年齢が進むにつれて、ＯＡの発生率も大幅に増加している。
【０００４】
関節の関節面を物理的に劣化させる異常なまたは過剰な機械的負荷の結果であるとかつては考えられていたが、最近の研究は、ＯＡの理解を「磨耗および断裂」の疾患から、疾患の進行を促進する炎症性バイオマーカーとリピドームバイオマーカーの両方が関与する代謝的に活性なプロセスに次第に移行している。研究者らは、ＯＡの進行におけるＨｔｒＡ１およびＭｍｐ−１３などのサイトカインの重要性を示している。ＯＡの進行を促進する炎症経路の一部として、マトリックス分解プロテアーゼＨｔｒＡ１およびＭＭＰ−１３は軟骨細胞から細胞周囲および細胞外マトリックスに分泌され、マトリックスの完全性および機能の低下となる。
【０００５】
これに関連して、研究者らは、ＯＡを治療するための可能性のある治療手段として、炎症の強力なブロッキングを探究している。例えば、炎症誘発性シグナル伝達の「強力かつ特定の抗サイトカイン治療」または「ブロッキング」などの言葉を用いて、ＯＡの治療への答えが説明されてきた（例えば、Ｋａｐｏｏｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１１；７（１）：３３〜４２およびＫａｌａｉｔｚｏｇｌｏｕ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｒｅｐ．２０１７；１９（８）を参照）。
【０００６】
しかし、今日まで、ＯＡに関連する疾患の病因を逆転させることができる良好な治療選択肢は存在しない。したがって、関節の再生と修復をもたらしながら、ＯＡの疼痛を治療するとともに、根本的な疾患メカニズムを処置できる安全で効果的な治療法に対する満たされていないニーズがある。さらに、筋骨格痛から生じる状態の安全かつ効果的な治療のための選択肢は限定されている。
【発明の概要】
【０００７】
ＯＡ疼痛および筋骨格痛を含む疼痛の治療における前述の限定は、低用量のウォゴニンまたはその誘導体の投与（例えば、局所投与）によって対処される。したがって、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、約１μＭ〜約５００μＭの治療有効量のウォゴニンまたはその誘導体を含む組成物を、疼痛を有する患者の１か所以上の部位に局部投与することと、疼痛を軽減または緩和することとを含む、患者において疼痛を軽減または緩和する方法である。いくつかの実施形態では、疼痛は、筋骨格痛および関節炎痛から選択される。いくつかの実施形態では、治療される筋骨格痛は、筋肉痛、筋挫傷、筋打撲、または筋断裂から生じる。他の実施形態では、筋骨格痛は、腱痛、腱挫傷、腱打撲、または腱断裂から生じる。いくつかの実施形態では、関節炎痛は、変形性関節症痛および関節リウマチ痛を含む。いくつかの実施形態では、患者による疼痛の知覚は、ウォゴニンの投与後に約１０％〜約１００％軽減する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、疼痛を軽減または緩和するための局所投与は経皮投与である。いくつかの実施形態では、ウォゴニンの単回用量は３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇ〜約１．８７×１０−６ｇ／Ｋｇであり、ウォゴニンの１日用量は１日当たり１．１２×１０−８ｇ／Ｋｇ〜約５．６１×１０−６である。いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、即時放出局所製剤、遅延放出局所製剤、連続的放出局所製剤、または持続放出局所製剤として投与される。いくつかの実施形態では、１種以上の追加の抗炎症薬が、ウォゴニンの局部投与の前、後、または同時に投与される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンで疼痛を治療または軽減するための組成物は、約１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、１００μＭ、１２０μＭ、１４０μＭ、１６０μＭ、１８０μＭ、２００μＭ、２２０μＭ、２４０μＭ、２６０μＭ、２８０μＭ、３００μＭ、３２０μＭ、３４０μＭ、３６０μＭ、３８０μＭ、４００μＭ、４２０μＭ、４４０μＭ、４６０μＭ、４８０μＭ、および５００μＭのウォゴニンから選択される濃度のウォゴニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、液体、擦式剤、フォーム、クリーム、溶液、乳剤、ゲル、スプレー、ワイプ、ローション、もしくはパッチまたはそれらの組み合わせの形態である。いくつかの実施形態では、組成物はクリームであり、クリームは１種以上の経皮浸透促進剤を含む。
【００１０】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、患者の１か所以上の関節炎の関節に局部的に約１μＭ〜約５００μＭの治療有効量のワゴニンを含む組成物を局所投与し、それにより、関節炎の関節を治療し、治癒を促進することを含む、患者において関節炎の関節を治療し、および治癒を促進する方法である。いくつかの実施形態では、ウォゴニンの投与は、関節炎の関節内の炎症を軽減する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、嚢胞様病変（ＣＬＬ）の減少、ＯＡＲＳＩスコアの低下、および軟骨分解の一次繊毛経路の阻害を含む効果を誘発する。
【００１１】
ウォゴニンの投与後のいくつかの実施形態では、ウォゴニンで治療されていない関節炎の関節と比較して、軟骨および滑液を含む関節炎の関節内またはその近くを取り囲むセラミドの発現が増加し、ＴＧＦ−β１が増加し、ＭＭＰ−１３が減少し、ＨｔｒＡ１が減少し、ＮＦκＢが減少し、ＡＧＥが減少する。ウォゴニンの投与後のいくつかの実施形態では、ウォゴニンで治療されていない関節炎の関節と比較して、サイトカインＨｔｒＡ１、ＭＭＰ−１３、ＮＦκＢ、およびＡＧＥの発現が２０％低下し、ＴＧＦ−β１およびセラミドの発現が２０％上昇する。いくつかの実施形態では、関節炎の関節は変形性関節症の関節である。
【００１２】
他のいくつかの実施形態は、約１μＭ〜約５００μＭの濃度のウォゴニンと、美容的にまたは皮膚科学的に許容される担体とを含む局所疼痛組成物である。いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、約９０％〜約１００％純粋である。いくつかの実施形態では、局所疼痛組成物は、液体、擦式剤、フォーム、クリーム、溶液、乳剤、ゲル、スプレー、ワイプ、ローション、もしくはパッチまたはそれらの組み合わせの形態である。いくつかの実施形態では、局所疼痛組成物は、界面活性剤、乳化剤、脂肪、脂肪酸、トリグリセリド、溶媒、増粘剤、皮膚コンディショニング剤、キレート剤、芳香剤、浸透促進剤、およびそれらの組み合わせから選択される１種以上の賦形剤を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、局所疼痛組成物中の担体は、セテアリルアルコール、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、グリセリン、シアバター、エトキシジグリコール、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ｐｅｇ−１００、ステアリン酸、ブチレングリコール、ジメチコン、セイヨウハッカ（ペパーミント）油、ヤシ油、ポリエチレングリコール、プルーナスアミグダルスダルシス（スイートアーモンド）油、アクリル酸ヒドロキシエチル／、アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウムコポリマー、セテアレス−２０、ジメチルスルホン、スクアラン、フェノキシエタノール、カプリリルグリコール、アクリレーツ／アクリル酸アルキルｃ１０−３０クロスポリマー、キサンタンガム、エチルヘキシルグリセリン、ヘキシレングリコール、グルタミン酸二酢酸四ナトリウム、ポリソルベート６０、イソステアリン酸ソルビタン、アロエバーバデンシス葉汁、メントール、およびそれらの組み合わせから選択される１種以上の賦形剤を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ジメチルスルホン、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、ペパーミント油、ヤシ油、およびシアバターを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ａ）．約０．０３％〜約５％のジメチルスルホン、ｂ）．約１％〜約８％のポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、ｃ）．約１％〜約７％のペパーミン油、ｄ）．約０．３％〜約５０％のシアバター、ｅ）．約０．１４％〜約２６％のヤシ油、およびｆ）．約１５％〜約８５％の水を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＤＭＭ膝不安定化手術を受けた後、１０μＭのウォゴニンまたはビヒクルで処置されたマウスの修正Ｍａｎｋｉｎスコアを比較する棒グラフである（＊ｐ＞０．０５）。
【図２】ＤＭＭ手術後のマウス膝関節におけるＨｔｒＡ１の組織染色である。パネルＡは、術後、ビヒクルで処置されたマウスの組織染色を表し、パネルＢは、術後１０μＭのウォゴニンで処置されたマウスの組織染色を表す。
【図３】ＤＭＭ膝不安定化手術後、表７に記載の試験クリーム組成物（ＴＣ）と偽クリーム組成物（偽）とで処置したマウスのＯＡＲＳＩスコアを比較した棒グラフである（＊ｐ＞０．０５）。
【図４】ＤＭＭ膝不安定化手術後、表７に記載の試験クリーム組成物（ＴＣ）と偽クリーム組成物（偽）とで処置したマウスの嚢胞様病変の数を比較した棒グラフである（＊ｐ＞０．０１）。
【図５】ＤＭＭ膝不安定化手術後、表７に記載の試験クリーム組成物（ＴＣ）と偽クリーム組成物（偽）とで処置したマウス膝関節の関節軟骨からのＮＦκβ陽性細胞の数を比較した棒グラフである（＊ｐ＞０．０１）。
【図６】ＤＭＭ膝不安定化手術後、表７に記載の試験クリーム組成物（ＴＣ）と偽クリーム組成物（偽）とで処置したマウス膝関節の関節軟骨からのＭｍｐ−１３陽性細胞の数を比較した棒グラフである（＊ｐ＞０．０１）。
【図７】ＤＭＭ膝不安定化手術後、表７に記載の試験クリーム組成物（ＴＣ）と偽クリーム組成物（偽）とで処置したマウス膝関節の関節軟骨からのＴＧＦ−β１陽性細胞の数を比較した棒グラフである（＊ｐ＞０．０５）。
【図８】１０μＭのウォゴニン、ＩＬ−１β、またはウォゴニン前処置に続いてＩＬ−１βで処置したヒト軟骨細胞からと、処置なしヒト軟骨細胞からのＲＮＡを用いた定量的ＲＴＰＣＲ後のＴＧＦ−β１ＰＣＲ産物を比較した棒グラフである。
【図９】１０μＭのウォゴニン、ＩＬ−１β、またはウォゴニン前処置に続いてＩＬ−１βで処置したヒト軟骨細胞からと、処置なしヒト軟骨細胞からのＲＮＡを用いた定量的ＲＴＰＣＲ後のＢＢＳ３ＰＣＲ産物を比較した棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の説明は、本明細書に記載の本発明の実施形態をより詳細に明らかにする。本明細書に記載の本発明の範囲、実施形態、または特定の態様から逸脱することなく、適切な修正および適合がなされ得ることが当業者には容易に明らかであるので、以下の実施形態は、本発明を限定することまたはその範囲を狭めることを意味しない。本明細書に引用されるすべての特許および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書を解釈する目的で、以下の用語および定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。以下に記載の定義が参照により本明細書に組み込まれている文書と矛盾する場合、以下に記載の定義が優先するものとする。
【００１８】
「患者」という用語は、哺乳動物およびヒトを含む任意の対象を指す。患者は、疾患を有しているか、または疾患を有している疑いがあり、そのため薬物で治療されている。場合によっては、患者は、イヌ、ニワトリ、ネコ、ウマ、または霊長類などの哺乳動物である。いくつかの例では、本明細書で使用される「患者」という用語は、ヒト（例えば、男性、女性、または子供）を指す。場合によっては、本明細書で使用される「患者」という用語は、動物モデル調査の実験動物を指す。患者または対象は、任意の年齢、性別、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００１９】
本明細書で使用される「有効成分」、「医薬品有効成分」、「生物活性剤」または「治療薬」という用語は、薬理効果、多くの場合、有益な効果をもたらす医薬品、有効成分、化合物、物質もしくは薬物、組成物、またはそれらの混合物を指す。有効成分は、任意の薬学的に許容される塩、水和物、結晶形またはその多形であってもよい。
【００２０】
本明細書で単独でまたは別の基の一部として使用される「アルキル」という用語は、１個以上の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。いくつかの実施形態では、アルキルは、１〜４個の炭素原子を表す。アルキルの代表的な例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルキルは直鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、アルキルは分岐していてもよい。
【００２１】
本明細書で単独または別の基の一部として使用される「アルコキシ」という用語は、オキシ基、−Ｏ−を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義される（したがって、ポリアルコキシなどの置換型を含む）アルキル基を指す。アルコキシの代表的な例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用される「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉを含む任意の適切なハロゲンを指す。
【００２３】
本明細書で使用される「単離された」および「精製された」という用語は、互換的に使用され、化合物、または化合物が自然に関連している自然発生の有機分子と、タンパク質とを含まない、少なくとも約３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、９９重量％、または１００重量％である化合物を含む組成物を指す。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ウォゴニンは、当技術分野で既知のまたは本明細書に記載の、例えば、高圧液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーを含む任意の方法によって、または合成によって精製または単離される。
【００２４】
本明細書で使用される「製剤」または「組成物」という用語は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた有効成分または薬物を指す。
【００２５】
本明細書で使用される「投与量」または「用量」という用語は、単回投与で治療効果を生み出すのに十分な量を含む有効成分製剤の任意の形態を表す。
【００２６】
本明細書で使用される「調節放出」という用語は、生理学的条件下またはインビトロ試験において、即時放出製剤よりも遅い速度で有効成分を放出する組成物を指す。
【００２７】
本明細書で使用される「即時放出」という用語は、投与後に有効成分の大部分（例えば、有効成分の５０％超）を放出する組成物を指す。
【００２８】
本明細書で使用される「徐放」という用語は、すべての有効成分よりも少ないものが最初に放出されるように、有効成分を長期間、例えば、数分、数時間、または数日にわたって放出する組成物を指す。徐放速度は、例えば、生理学的条件下またはインビトロ試験において、一定期間にわたって、剤形から特定の量の薬物または有効成分の放出をもたらすことができる。
【００２９】
本明細書で使用される「遅延放出」という用語は、遅延期間後に所望のプロファイルに従って有効成分を放出する組成物を指す。遅延期間は、組成物の投与から少なくとも約５分、１０分、２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、またはさらに長い時間であり得る。遅延期間の後、組成物は、即時放出されるか、または徐放プロファイルもしくは持続放出プロファイルに従って放出され得る。
【００３０】
本明細書で使用される「持続放出」という用語は、例えば、少なくとも約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、またはさらに長く、長時間にわたって有効成分を放出する組成物を指す。
【００３１】
「治療する」という用語は、ある障害に関連する状態、症状、またはパラメータを改善するのに有効な量、様式、またはモードで治療を施すことを指す。いくつかの実施形態では、治療するとは、関節炎（例えば、変形性関節症）または筋骨格痛から生じる疼痛の回復を指す。いくつかの実施形態では、治療するとは、関節炎（例えば、変形性関節症）および永久治癒などの疾患プロセスの回復を指す。
【００３２】
「局部投与」または「限局投与」という用語は、ＯＡ、ＯＡ疼痛、または筋骨格痛を有する１か所以上の組織への治療薬（すなわち、ウォゴニン）の投与を指す。局部投与とは、治療薬が、全身に投与されることなく、罹患した組織の近くに投与されることを意味する。局部投与後、活性剤はリンパ系または血管系で吸収され、その後組織から除去され得ると考えられる。しかし、作用機序は、主に、治療薬と罹患した組織との局部的相互作用によって生じると考えられている。
【００３３】
「予防」という用語は、統計的に有意な程度、または当分野の当業者が検出可能な程度のいずれかまで、障害の進行を防止または軽減することを指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、別段の指定がない限り、１つ以上を意味する。
【００３５】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、いくつかの実施例では、約１μＭ〜約５００μＭの局所的に適用される低用量のウォゴニンを用いて、ＯＡおよび筋骨格痛を治療する驚くほど効果的なアプローチを発見した。ウォゴニンの局所投与が関節の恒常性を回復させ、ＯＡ疾患プロセスの進行を抑止することも発見した。さらに、本発明者らは、ウォゴニンの局所投与が軟骨細胞の活性化を逆転させ、その結果、患部の軟骨にアポトーシスが生じ、それにより損傷した関節軟骨の治癒が促進されることを見出した。
【００３６】
ウォゴニンの局所投与によるこれらの実質的な効果は、これまで実現されたことはなかった。ウォゴニンは、伝統的な漢方薬であるコガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）の根に由来するフラボノイドである。ウォゴニンは、アトピー性皮膚炎、高脂血症、アテローム動脈硬化症などの炎症性疾患の治療に使用されている。最近では、ウォゴニンは、炎症を減少させ得るプロスタグランジンＥ２、ＴＬＲ４、ＮＯ、およびＭＭＰの産生をブロックすることにより、他の炎症性疾患、癌、および疼痛管理におけるその使用について調査されている。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１３６８１１号は、大用量のウォゴニン（すなわち、２００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射による全身適用に続くマウスホルマリン試験における疼痛症状の改善を記載した。しかし、このアプローチは、低用量でのウォゴニンの局所投与および局部投与が、ＯＡから生じる疼痛または筋骨格痛を軽減し得るかどうかを決定していない。この調査はまた、ウォゴニンがＯＡ疾患の進行を逆転させる関節の恒常性の回復に何らかの影響を与え得るかどうかを示さなかった。Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２３（５）ｐｐ．４４２〜４４８（２０１５）によって記述された別の調査では、ＯＡの疾患進行に関与し得る、ＩＬ−１βによる炎症の開始に続く関節軟骨内でのＭＭＰ−３発現に対するウォゴニンの関節内注射の効果が評価された。著者らはＭＭＰ−３発現の低下を示したが、この調査では、低用量のウォゴニンの局所投与が変形性関節症から生じる疼痛または筋骨格痛を寛解させ得るかどうか、または変形性関節症滑膜関節の機能的回復になり得るかどうかは決定されなかった。
【００３７】
それとは対照的に、本明細書に記載の方法および組成物は、全身に、または注射によって適用されるＯＡを治療するための非常に強力な抗炎症薬および他のアプローチを使用するという従来の予想に反している。本明細書に示すように、局所的なウォゴニンを低用量で利用することにより、ウォゴニンが炎症を最適に調節し、治癒プロセスを助ける自然の保護機構を増強する関節の修復および治癒を加速させることができる。したがって、ＯＡの炎症性要素を治療することは、かみそりの縁を歩くようなものであり、少ないと効果がなく、過度だとＯＡが悪化する。さらに、炎症のみを治療しても不十分である。プロテオグリカン、コラーゲン原線維などを生成し続け、関節の治癒につながるように、軟骨細胞がアポトーシス経路からオートファジーに切り替わることも必要である。したがって、本明細書に記載の方法および組成物は、あらゆる種類の変形性関節症の治療に適している。さらに、関節リウマチ痛を含む他の種類の関節炎は、低用量のウォゴニンの投与により回復し得ることが考えられる。
【００３８】
本明細書に記載するように、本発明者らは、開示した組成物が一次繊毛との新規の相互作用を通じて保護作用を示すことを発見した。一次繊毛は軟骨細胞に存在し、マウス軟骨細胞の一次繊毛は、負荷の増加に応じてシグナルプロセシングと関連する。一次繊毛は、以前に同定された、ＯＡに共通のＨＴＲＡ１−ＤＤＲ２−ＭＭＰ１３分解経路の増加によるＯＡを含む、軟骨の恒常性に関連している。
【００３９】
ＭＭＰ−１３発現の増加におけるＨｅｓ１の関与などのＯＡ進行での一次繊毛の役割に関するさらなる証拠が存在する。Ｈｅｓ１は、一次繊毛を介してソニックヘッジホッグシグナル伝達を調節するＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を介して作用する。
【００４０】
ＯＡにおける炎症の役割は明確に示されているが、それでも強力な抗炎症剤の使用によってこの疾患の進行を止められない。この疾患は単純な炎症よりも複雑に見える。例えば、ペプチドホルモンレプチンなどのアディポカインの相互作用、およびＯＡの開始における炎症が知られている。インスリン感受性の維持に関与するレプチンは、肥満者において高レベルで発現し、軟骨細胞でＭＭＰ−１３発現を増加することによる変形性関節症と相互関係がある。極度の肥満の場合、変形性関節症者のＢＭＩとともにＭＭＰ−１３の増加と、レプチン発現との間に強い正の相関が存在する。一次繊毛はレプチンの恒常性に密接に関与している。さらに、核因子カッパベータ（ＮＦκβ経路は、ＯＡの進行と密接に関連していることが示されている。ＮＦκβは一次繊毛によって調節されることが知られている。
【００４１】
一次繊毛は軟骨の恒常性の維持に密接に関与しており、ＯＡの治療はそれを考慮に入れなければならないが、炎症のブロッキングのみに依存してはならない。本明細書において、本発明者らは、ウォゴニン組成物が一次繊毛を通して作用することにより全体的に軟骨細胞に対して保護作用を示し、ウォゴニンの局所適用がＯＡ進行を減衰させ、それにより疾患を治療することを示す。これは、以前はウォゴニンによるものと考えられなかった新規の経路であり、局所的に適用される（例えば、クリームとして）と、変形性関節症の関節に強力で全体的な利点がある理由を説明する。
【００４２】
本明細書に示すように、局所的な経皮クリームで適用されるウォゴニンは、ＯＡの進行を抑止するのに有用である。本明細書に記載の方法により、および組成物で適用されたウォゴニンは、ＯＡ疾患が膝の不安定化手術により誘発されたマウスにおいてＯＡの進行をブロックする。本明細書に記載のように、いくつかの主要な指標によって明らかなように、関節の健康状態が回復する。さらに、本明細書に記載の方法および組成物によるウォゴニンの使用は、疾患が誘発された後に関節の健康状態を回復させ、治療前に進行させることができる。抗炎症薬は、関節の健康状態を回復させることは言うまでもなく、疾患の進行をブロックすることなく、ＯＡの症状（すなわち、疼痛）を治療するために長年にわたり使用されてきた。本明細書とともに提供されるデータは、局所的な経皮的治療が、ストレスを受けた軟骨細胞においてアポトーシスからオートファジーへの切り替えをもたらし、関節の健康状態、ＯＡの根本的な疾患病状を治療するためのプロセスを回復することを示している。
【００４３】
開示された方法および組成物の利点は２つある。第一に、方法および組成物は、ＯＡに部位特異的（すなわち、関節）治療を提供する。第二に、ＯＡに関連する軟骨細胞の活性化の生理学的結果を治療する。さらに、開示されたウォゴニンによる治療は、全身的に作用し、内臓への添加または損傷などの有害な副作用をもたらす、非ステロイド系抗炎症薬およびアヘン剤の使用を制限するまたは未然に防ぐ。
【００４４】
さらに、本明細書に記載の方法および組成物は、筋肉痛、筋挫傷、筋打撲、または筋断裂から生じる他の非関節炎性炎症性の筋骨格痛の局部投与および緩和に適している。同様に、本明細書に記載の方法および組成物は、腱痛、腱挫傷、腱打撲、または腱断裂から生じる疼痛の局部投与および緩和に適している。
【００４５】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、疼痛の治療のための化合物ウォゴニンまたはその誘導体の使用に関する。特に、本明細書に記載されているのは、ＯＡ、ＯＡ疼痛、および筋骨格痛の治療のためのウォゴニンまたはその誘導体の使用である。ウォゴニンの例示的な誘導体は知られており（例えば、Ｇｕｒｕｎｇ  Ｓ  Ｋ，およびＫｉｍ  Ｈ  Ｐ，Ｐａｒｋ  Ｈ．Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．Ｎｏｖ  ３２（１１  ｐｐ．１５０３〜８（２００９）を参照）、式Ｉによって表される。
【化１】
2021510161.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、−ＮＯ２、および−ＳＸから選択され、ＸはＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、疼痛の治療のためのウォゴニン（５，７−ジヒドロキシ−８−メトキシフラボン；ＣＡＳ登録番号６３２−８５−９）（以下に式ＩＩとして表示する）の使用に関する。特に、本明細書に記載するのは、ＯＡ、ＯＡ疼痛、および筋骨格痛の治療のための式ＩＩによるウォゴニンの使用である。
【化２】
2021510161.tif 000004
【００４７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、治療有効量でウォゴニンを含む組成物を投与することを含む、患者のＯＡから生じる疼痛を軽減または緩和するための方法である。ウォゴニンによる治療に適したＯＡの影響を受けた滑膜関節には、脊椎、上肢、肘、頭部、頸部、胸部、骨盤、会陰、または下肢の関節からの１か所以上の関節が含まれる。したがって、治療される滑膜関節としては、関節突起間関節、肩峰鎖骨関節、指手根中手骨関節、親指手根中手骨関節、烏口鎖骨関節、肘関節、中手骨間関節、指節間関節、中手指節間関節、手根中央関節、手首放射手根、遠位とう尺関節、中間とう尺関節、近位とう尺関節、肩関節、胸鎖関節、手首関節、顎関節、胸肋関節、胸骨剣結合、腰仙骨関節、仙腸関節、足首関節、股関節、指節間関節、または膝関節が挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、ＯＡを発症しやすい１か所以上の滑膜関節を含む手術に続いて投与される。ウォゴニンは、１か所以上の滑膜関節を含む手術の前、同時、または手術後に投与され得る。関節手術の種類としては、関節形成術、関節鏡手術、骨切り術、滑膜切除術、関節置換術、もしくは椎弓切除術、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンの投与は、筋骨格痛またはＯＡ痛を軽減または除去するのに有効な量を有する局所投与である。この量のウォゴニンは、ＯＡを有する関節の治癒を促進するのにも効果的である。一実施形態では、ウォゴニンの量は、列挙された範囲内の各整数を含めて、約１μＭ〜約５００μＭである。別の実施形態では、ウォゴニンの量は、列挙された範囲内の各整数を含めて、約１μＭ〜約４００μＭ、約１μＭ〜約３００μＭ、約１μＭ〜約２００μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５０μＭである。別の実施形態では、ウォゴニンの量は、列挙された範囲内の各整数を含めて、約１０μＭ〜約５００μＭ、約１０μＭ〜約４００μＭ、約１０μＭ〜約３００μＭ、約１０μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１００、または約１０μＭ〜約５０μＭである。別の実施形態では、ウォゴニンの量は、約１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、１００μＭ、１２０μＭ、１４０μＭ、１６０μＭ、１８０μＭ、２００μＭ、２２０μＭ、２４０μＭ、２６０μＭ、２８０μＭ、３００μＭ、３２０μＭ、３４０μＭ、３６０μＭ、３８０μＭ、４００μＭ、４２０μＭ、４４０μＭ、４６０μＭ、４８０μＭまたは約５００μＭである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、ＯＡまたは筋骨格痛から生じる疼痛を軽減するために治療上有効な単回用量として投与される。一実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇ〜約１．８７×１０−６ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇ〜約１．４９×１０−６ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇ〜約１．１２×１０−６ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇから約７．５×１０−７ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇ〜約４．４８×１０−７ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇ〜約２．２４×１０−７ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、約３．７３×１０−９ｇ／Ｋｇ、１．８７×１０−８ｇ／Ｋｇ、３．７３×１０−８ｇ／Ｋｇ、７．４７×１０−８ｇ／Ｋｇ、１．４９×１０−７ｇである。／Ｋｇ、２．２４×１０−７ｇ／Ｋｇ、２．９９×１０−７ｇ／Ｋｇ、３．７３×１０−７ｇ／Ｋｇ、４．４８×１０−７ｇ／Ｋｇ、５．２３×１０−７ｇ／Ｋｇ、５．９７×１０−７ｇ／Ｋｇ、６．７２×１０−７ｇ／Ｋｇ、７．５×１０−７ｇ／Ｋｇ、８．２×１０−７ｇ／Ｋｇ、８．９６×１０−７ｇ／Ｋｇ、９．７１×１０−７ｇ／Ｋｇ、１．０５×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．１２×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．１９×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．２７×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．３４×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．４２×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．４９×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．５７×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．６４×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．７２×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．７９×１０−６ｇ／Ｋｇ、または１．８７×１０−６ｇ／Ｋｇである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、１日当たりのウォゴニンの総用量は、１日当たり約１．１２×１０−８ｇ／ｋｇ〜約５．６１×１０−６ｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約１．１２×１０−８ｇ／Ｋｇ〜約４．４７×１０−６ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約１．１２×１０−８〜約３．３６×１０−６ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約１．１２×１０−８〜約２．３×１０−６ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約１．１２×１０−８〜約１．３４×１０−６ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、指定範囲内の各整数を含めて、約１．１２×１０−８ｇ／Ｋｇ〜約６．７２×１０−７ｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、用量は、約１．１２×１０−８ｇ／Ｋｇ、５．６１×１０−８ｇ／Ｋｇ、１．１２×１０−７ｇ／Ｋｇ、２．２×１０−７ｇ／Ｋｇ、４．４７×１０−７ｇ／Ｋｇ、６．７２×１０−７ｇ／Ｋｇ、８．９７×１０−７ｇ／Ｋｇ、１．１２×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．３４×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．５７×１０−６ｇ／Ｋｇ、１．８×１０−６ｇ／Ｋｇ、２．０×１０−６ｇ／Ｋｇ、２．３×１０−６ｇ／Ｋｇ、２．５×１０−６ｇ／Ｋｇ、２．７×１０−６ｇ／Ｋｇ、２．９×１０−６ｇ／Ｋｇ、３．１×１０−６ｇ／Ｋｇ、３．４×１０−６ｇ／Ｋｇ、３．６×１０−６ｇ／Ｋｇ、３．８×１０−６ｇ／Ｋｇ、４．０×１０−６ｇ／Ｋｇ、４．３×１０−６ｇ／Ｋｇ、４．５×１０−６ｇ／Ｋｇ、４．７×１０−６ｇ／Ｋｇ、４．９×１０−６ｇ／Ｋｇ、５．１×１０−６ｇ／Ｋｇ、５．３×１０−６ｇ／Ｋｇ、または５．６×１０−６ｇ／Ｋｇである。
【００５２】
一部の実施形態では、ウォゴニンの投与は、セラミド、ＴＧＦ−β１、ＭＭＰ−１３、ＨｔｒＡ１、ＮＦκＢ、およびＡＧＥを含むがこれらに限定されない１つ以上の炎症性バイオマーカー遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態では、ウォゴニンが投与される組織におけるＴＧＦ−β１の発現は、ウォゴニンで処置されていない組織と比較して、指定範囲内の各整数を含めて、約１０％〜約４０％増加する。いくつかの実施形態では、ウォゴニンが投与される組織におけるセラミドの発現は、ウォゴニンで処置されていない組織と比較して、指定範囲内の各整数を含めて、約１０％〜約４０％増加する。いくつかの実施形態では、ウォゴニンが投与される組織におけるＭＭＰ−１３の発現は、ウォゴニンで処置されていない組織と比較して、指定範囲内の各整数を含めて、約１０％〜約４０％増加する。いくつかの実施形態では、ウォゴニンが投与される組織におけるＮＦκＢの発現は、ウォゴニンで処置されていない組織と比較して、指定範囲内の各整数を含めて、約１０％〜約４０％減少する。いくつかの実施形態では、ウォゴニンが投与される組織におけるＡＧＥの発現は、ウォゴニンで処置されていない組織と比較して、指定範囲内の各整数を含めて、約１０％〜約４０％減少する。遺伝子発現のレベルの決定は、当技術分野で周知である。例えば、遺伝子発現のレベルは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学などによって決定することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、疼痛を有する１つ以上の組織における疼痛の知覚は、組織へのウォゴニンの投与後に軽減される。一部の実施形態では、ウォゴニンの投与後、疼痛の知覚は少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％も軽減される。いくつかの実施形態では、疼痛の軽減は、筋骨格組織にある。他のいくつかの実施形態では、疼痛の軽減は、ＯＡから生じる関節炎痛を有する関節にある。いくつかの他の実施形態では、疼痛の軽減は、関節リウマチから生じる関節炎痛を有する関節にある。疼痛を評価する方法は当技術分野で知られている。例えば、ＭｃＧｉｌｌ疼痛質問票（ＭＰＱ）、Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＩＣＯＡＰ）質問票、またはＯｓｔｅｏ−Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｓｙｍｐｔｏｍ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ  Ｓｃａｌｅ（ＯＡＳＩＳ）を使用して、変形性関節症の患者の疼痛を評価できる。
【００５４】
さらに、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＯＡＲＳＩ）スケールは、ＯＡの進行および関節の健康状態を評価するための全体的な手順を表しており、これを使用して、本明細書に記載の方法においてＯＡ疾患を評価できる。ＯＡＲＳＩスコアの減少は、関節の健康状態の改善およびＯＡ疾患の軽減を示す。したがって、いくつかの実施形態では、ウォゴニンの投与後、ＯＡＲＳＩスコアは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少する。いくつかの実施形態では、ＯＡＲＳＩスコアは、完全に治癒した関節または変形性関節症を有さない関節を表す量だけ減少する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、有効用量は、疼痛を有する患者の部位に１日１回以上投与される。投与量は、例えば、１日当たり１回、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の回数で投与され得る。いくつかの実施形態では、投与量は少なくとも１日当たり３回投与される。１種以上の剤形を、例えば、１、２、３、４、５、６、７日間、またはそれより長く投与することができる。１種以上の剤形を、例えば、１、２、３、４週間、またはそれより長く投与することができる。１種以上の剤形を、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月（１年）、２年、３年、４年、５年、５年以上、１０年、数十年、またはそれより長く投与することができる。対象またはそれを必要とする対象が疼痛の治療を必要としなくなるまで、１種以上の剤形を定期的な間隔で投与することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、化合物が、ウォゴニンと自然に関連する他の成分を実質的に含まないように、ウォゴニンが単離および精製される。いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、少なくとも約２０％純粋、３０％純粋、４０％純粋、５０％純粋、６０％純粋、７０％純粋、８０％純粋、９０％純粋、９５％純粋、９９％純粋、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、ウォゴニンが少なくとも約２０％純粋、３０％純粋、４０％純粋、５０％純粋、６０％純粋、７０％純粋、８０％純粋、９０％純粋、９５％純粋、９９％純粋、または１００％純粋になるように合成される。ウォゴニンの単離および精製は、当技術分野で既知の方法（例えば、米国特許公開第２０１３／０１３６８１号を参照）によって行うことができ、または合成的に調製することもでき、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）からも市販されている。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、組成物の一部として投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与、経皮投与、皮下投与または局部注射用に製剤化される。特に、本明細書に記載の組成物は、経皮投与用に製剤化される。いかなる理論にも縛られることなく、ウォゴニンを含む経皮組成物が適用されると、ウォゴニンは表皮の角質層を通過して、表皮、真皮、および皮下の組織層のより深い組織層に入ることができ、そこでウォゴニンは限局的な抗侵害受容効果、抗炎症効果、および関節治癒効果を発揮することができると考えられている。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、１か所以上の組織に局所的に投与される。いくつかの実施形態では、組織は筋骨格組織である。いくつかの実施形態では、組織は、ＯＡ疼痛を示している、またはＯＡ疼痛を受けやすい１か所以上の滑膜関節を覆う。ウォゴニンは、局部投与部位に一定時間、例えば少なくとも約３０分〜８時間以上留まり、疼痛を有する組織における疼痛の限局的軽減を示す。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンを含む経皮組成物は、液体、擦式剤、フォーム、クリーム、溶液、乳剤、ゲル、スプレー、ワイプ、ローション、軟膏、またはパッチの一部として提供される。いくつかの実施形態では、ウォゴニンまたはその誘導体を含む経皮製剤は、クリーム、ローション、軟膏または擦式剤である。
【００６０】
クリームまたは擦式剤などの適切な局所経皮組成物には、美容的にまたは皮膚科学的に許容される賦形剤および担体が含まれる。ウォゴニンは、組成物中に分散、溶解、または懸濁され得る。適切な賦形剤および担体には、当技術分野で知られている油、界面活性剤、乳化剤、増粘剤、芳香剤、溶媒、キレート剤、および浸透促進剤のうちの１種以上が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
適切な浸透促進剤は、皮膚に浸透し、活性物質の浸透の主要な障害である角質層の成分と相互作用することができるものである。浸透促進剤は、皮膚の抵抗を低下させ、したがって、皮膚を通過する活性物質の通過（流量）を増加させる。ほとんどの場合、それらは皮膚とビヒクルとの間の活性物質の分配比にも有益な影響を与える。例示的かつ非限定的な浸透促進剤としては、ジオキソラン誘導体、酢酸エチル、尿素、エタノール、短鎖一価アルコール（Ｃ２〜Ｃ６）、プロピレングリコール、エタノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ラウロカプラムおよび誘導体、脂肪酸（例えば、オレイン酸）、界面活性剤（例、デシルメチルスルホキシド）、テルペン、イソプロパノール、グリセロール、一価アルコール（Ｃ８〜Ｃ１４）、アルカン、ハロゲン化アルキル、アミド、ピロリドン誘導体、脂肪酸エステル、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、ペパーミント油などのエッセンシャルオイル、および当技術分野で既知の他の浸透促進剤（例えば、Ｈｅｒｍａｎ，ＡおよびＨｅｒｍａｎ  Ａ．Ｐ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．，６７，ｐｐ．４７３〜４８５（２０１４）を参照）が挙げられる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンを含む経皮組成物は、調節放出経皮製剤、即時放出経皮製剤、遅延放出経皮製剤、徐放性経皮製剤、または持続放出経皮製剤として製剤化される。化合物の経皮投与に適した例示的で非限定的な製剤は、米国特許第６，２３８，２８４号、同第５，７２５，８７６号、同第５，７１６，６３５号、同第５，６３３，００８号、同第５，６０３，９４７号、同第５，４２２，３６１号、同第５，４１１，７３９号、同第５，３６４，６３０号、同第５，２３０，８９６号、同第５，００４，６１０号、同第４，９４３，４３５号、同第４，９０８，２１３号、および同第４，８３９，１７４号に記載されている。例示的な経皮クリーム組成物を表１に示す。
【表１】
2021510161.tif 000005
【００６３】
いくつかの実施形態では、局所および経皮投与用の組成物は、以下の賦形剤または担体：セテアリルアルコール、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、グリセリン、シアバター、エトキシジグリコール、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ｐｅｇ−１００、ステアリン酸、ブチレングリコール、ジメチコン、セイヨウハッカ（ペパーミント）油、ヤシ油、ポリエチレングリコール、プルーナスアミグダルスダルシス（スイートアーモンド）油、アクリル酸ヒドロキシエチル／、アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウムコポリマー、セテアレス−２０、ジメチルスルホン、スクアラン、フェノキシエタノール、カプリリルグリコール、アクリレーツ／アクリル酸アルキルＣ１０〜Ｃ３０クロスポリマー、キサンタンガム、エチルヘキシルグリセリン、ヘキシレングリコール、グルタミン酸二酢酸四ナトリウム、ポリソルベート６０、イソステアリン酸ソルビタン、アロエバーバデンシス葉汁、もしくはメントールのうちの１種以上またはすべてを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、組成物は、ロールオン局所製剤である。いくつかの実施形態では、組成物は、以下の賦形剤または担体：水、アルコール、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、プロパンジオール、エトキシジグリコール、セイヨウハッカ（ペパーミント）油、ジメチコン、セテアリルアルコール、ステアリン酸グリセリル、オリーブ油脂肪酸加水分解カラスムギタンパクカリウム、セチルアルコール、キサンタンガム、フェノキシエタノール、カプリリルグリコール、オレイン酸グリセリル、スクレロチウムガム、レシチン、エチルヘキシルグリセリン、ヘキシレングリコール、プルラン、メントール、およびフィチン酸ナトリウムのうちの１種以上もしくはすべてを含む。
【００６５】
経皮組成物の適用は、知覚される疼痛に非常に近い皮膚上のいかなるところでもよい。例えば、筋骨格痛を治療するために、ウォゴニンを有する経皮クリームを、疼痛が知覚される罹患した組織の上にある皮膚に適用することができる。さらなる例として、膝から生じる関節炎痛を治療するために、ウォゴニンを有する経皮クリームを膝の周囲の皮膚に塗布することができる。疼痛および炎症の治療のための経皮クリームおよび局所クリームの適用は、当該技術分野で認められており、クリームの配置は、疼痛の種類に基づいて適合させることができる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンを含む組成物は、局部注射用に製剤化される。局部注射には、疼痛を示すか、または受けやすい組織の近くにウォゴニンを含む組成物を提供する任意の注射が含まれる。例えば、筋骨格痛を治療するために、疼痛が知覚されている場所の近くにウォゴニンを含む組成物を注射することができる。さらなる例として、関節炎の関節の治療は、関節へのウォゴニンを含む組成物の関節内注射によって達成することができる。関節内注射を含む注射用の方法および装置は、当業者に周知である。ウォゴニンの局部注射のための例示的な注射用組成物としては、ハンクス液、リンゲル液、または４１５生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合する水溶液が挙げられる。
【００６７】
他の非経口投与のための他の組成物には、本発明の水溶性型の化合物の水溶液が含まれる。さらに、ウォゴニンの懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を高める物質を含んでいる。任意に、懸濁液は、本発明の化合物の溶解度を増加させて高濃度の溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含む。
【００６８】
精製されたウォゴニンは、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、例えば、アンプルまたは複数回投与用容器などの単位剤形で、任意に保存剤を添加して提供される。組成物は、油性または水性ビヒクルでの懸濁液、溶液、または乳剤などの形態をとり、懸濁剤、安定剤、または分散剤などの製剤化剤を含む。あるいは、化合物または抽出物は、使用前に適切なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水で構成するための粉末形態である。ウォゴニンを含む注射用製剤は、携帯用キットまたはパッケージの形態で提供されてもよい。
【００６９】
組成物中のウォゴニンの量は、組成物の種類に依存し、本明細書に記載の所望の用量が投与されるように変えることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、指定範囲内のすべての整数を含めて、組成物の総質量の約０．０１重量％〜約９９重量％の量でウォゴニンを含む。一実施形態では、ウォゴニンは、指定範囲内のすべての整数を含めて、組成物の総質量の約０．０１％〜約７５％である。別の実施形態では、ウォゴニンは、指定範囲内のすべての整数を含めて、組成物の総質量の約０．０１％〜約５０％である。別の実施形態では、ウォゴニンは、指定範囲内のすべての整数を含めて、組成物の総質量の約０．０１％〜約３０％である。別の実施形態では、ウォゴニンは、指定範囲内のすべての整数を含めて、組成物の総質量の約０．０１％〜約１０％である。別の実施形態では、ウォゴニンは、指定範囲内のすべての整数を含めて、組成物の総質量の約０．１％〜約５％である。別の実施形態では、ウォゴニンは、指定範囲内のすべての整数を含めて、組成物の総質量の約０．０１％〜約１％である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ウォゴニンは、治療有効量の第２の薬剤、または第３の薬剤と組み合わせて患者に投与される。第２の薬剤は、対象において疼痛の治療または予防に有益であることが知られているかまたは推測される任意の薬理作用のある物質であり得る。例えば、第２の薬剤は、二次鎮痛剤である。二次鎮痛剤は、当技術分野の当業者に周知である。このような薬剤の非限定的な例としては、アスピリン、アセトアミノフェン（タイレノール）、または非ステロイド性抗炎症薬（ｎｓａｉｄ）と呼ばれる他のアスピリン様薬物、コデイン（コデインとともにタイレノール）、ヒドロコドン（ビコジンもしくはロータブ）、パーコセット、ペルコダン、もしくはプロポキシフェン（ダーボン）などの弱い麻薬、モルヒネ、デメロール、ジラウジッド、フェンタニル（デュラゲシクパッチ）、およびメサドンなどの強力なオピオイドが挙げられる。
【００７１】
本明細書で提供される医薬組成物での使用に適した治療薬のさらなる非限定的な例としては、例えば、ブチルピラゾリジン、フェニルブタゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、クロフェゾン、ケブゾン、酢酸誘導体および関連物質、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ゾメピラック、ジクロフェナク、アルクロフェナク、ブマジゾン、エトドラク、ロナゾラク、フェンチアザック、アセメタシン、ジフェンピラミド、オキサメタシン、プログルメタシン、ケトロラク、アセクロフェナク、ブフェキサマク、オキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、メロキシカム、メトトレキサート、プロピオン酸誘導体、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、ベノキサプロフェン、スプロフェン、ピルプロフェン、フルルビプロフェン、インドプロフェン、チアプロフェン酸、オキサプロジン、イブプロキサム、デキシブプロフェン、フルノキサプロフェン、アルミノプロフェン、デクスケトプロフェン、フェナム酸、メフェナム酸、トルフェナム酸、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、コキシブ、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、ナブメトン、ニフルミン酸、アザプロパゾン、グルコサミン、ベンジダミン、グルコサミノグリカンポリサルフェート、プロカゾン、オルゴテイン、ニメスリド、フェプラゾン、ジアセレイン、モルニフルメート、テニダップ、オキサセプロール、コンドロイチン硫酸、フェプラゾン、ジピロセチル、アセチルサリチル酸、キノリン、オキシシンコフェン、金剤、金チオリンゴ酸ナトリウム、金チオ硫酸ナトリウム、オーラノフィン、オーロチオグルコース、オーロチオプロール、ペニシラミン、もしくはブシラミンなどの抗炎症性および抗リウマチ性の活性原薬が挙げられる。
【００７２】
さらなる治療薬には、例えば、オピオイド、天然アヘンアルカロイド、モルヒネ、アヘン、ヒドロモルホン、ニコモルヒネ、オキシコドン、ジヒドロコドン、ジアモルヒネ、タペンタドール、パパベレタム、パパベレタム、コデイン、フェニルピペリジン誘導体、ケトベミドン、ペチジン、フェンタニル、ジフェニルプロピルアミン誘導体、デキストロモラミド、ピリトラミド、デキストロプロポキシフェン、ベジトラミド、メタドン、ベンゾモルファン誘導体、ペンタゾシン、フェナゾシン、オリパビン誘導体、ブプレノルフィン、モルフィナン誘導体、ブトルファノール、ナルブフィン、チリジン、トラマドール、デゾシン、サリチル酸と誘導体、アセチルサリチル酸、アロキシプリン、サリチル酸コリン、サリチル酸ナトリウム、サリチルアミド、サルサレート、エテンザミド、サリチル酸モルホリン、ジピロセチル、ベノリラート、ジフルニサル、サリチル酸カリウム、グアセチサール、カルバサラートカルシウム、サリチル酸イミダゾール、ピラゾロン、フェナゾン、メタミゾールナトリウム、アミノフェナゾン、プロピフェナゾン、ニフェナゾン、アニリド、パラセタモール、フェナセチン、ブセチン、プロパセタモールなどの鎮痛剤、例えば、リマゾリウム、グラフェニン、フロクタフェニン、ビミノール、ネホパム、フルピルチン、またはジコノチドなどの他の鎮痛剤および解熱剤を挙げることができる。
【００７３】
さらなる治療薬は、例えば、エーテル、ジエチルエーテル、ビニルエーテル、ハロゲン化炭化水素、ハロタン、クロロホルム、メトキシフルラン、エンフルラン、トリクロロエチレン、イソフルラン、デスフルラン、セボフルラン、バルビツール酸塩、メトヘキシタール、ヘキソバルビタール、チオペンタール、ナルコバルビタール、オピオイド麻酔薬、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、フェノペリジン、アニレリジン、レミフェンタニルなどの麻酔薬、例えば、ドロペリドール、ケタミン、プロパニジド、アルファキサロン、エトミデート、プロポフォール、ヒドロキシ酪酸、亜酸化窒素、エスケタミン、キセノン、アミノ安息香酸エステル、メタブテタミン、プロカイン、テトラカイン、クロロプロカイン、ベンゾカイン、アミド、ブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、ブタニリカイン、シンコカイン、エチドカイン、アルチカイン、ロピバカイン、レボブピバカイン、安息香酸エステル、コカインなどの他の一般的な麻酔薬、例えば、塩化エチル、ジクロニン、フェノール、カプサイシンなどの他の局所麻酔薬を挙げることができる。
【００７４】
以下に記載されるのは、本明細書に記載の実施形態、組成物、および方法の例であり、本開示にさらに記載される本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【００７５】
実施例１．クリームとして製剤化されたウォゴニンの変形性関節症のマウスモデルの処置
変形性関節症（ＯＡ）疼痛の治療のためのウォゴニンの使用を調べた。具体的には、浸透促進剤を含むクリームで局所的に適用される少量のウォゴニンを使用する利点を調べた。この調査では、表２に示すクリーム製剤を使用した。ウォゴニンを投与するための追加の例示的なクリーム製剤を表３に示す。
【００７６】
ＯＡマウスモデルを使用して、ウォゴニン処置の有効性を決定した。ＯＡ様疾患を、実験室のマウスの内側半月靭帯（ＤＭＭ）を外科的不安定化することで誘発した。膝関節の組織学的評価によるＯＡ進行を客観的に比較する方法として広く受け入れられている修正Ｍａｎｋｉｎスコアを使用して、膝の修復を評価した（Ｌａｒｋｉｎ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０１３；４：１２１およびＭａｎｋｉｎ  ＨＪ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９７４；２９１（２４）：１２８５−９２を参照）。マウスは、実験期間を通して活動を追跡するためにコンピューターにリンクされたアクティビティホイールケージに収容した。外科的介入から２４時間後に、患部の膝に以下の処置を局所的に適用した：０．０００００１４２ｇウォゴニン（５００μＭウォゴニン）（ｎ＝６）；０．００００００００２８ｇウォゴニン（１０μＭウォゴニン）（ｎ＝６）；および１０μＬのビヒクル（ｎ＝６）。処置は３日ごとに２８日間行なった。
【表２】
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【表３】
2021510161.tif 000007
【００７７】
実験を開始してから７日後、ビヒクルを投与されたマウスは、対照よりも大幅に高いホイール使用を示した。１０μＭおよび５００μＭのウォゴニンを投与されたマウスは、対照またはビヒクルのみよりも大幅に高いホイール使用を示した。１４日目まで、ビヒクルを投与されたマウスは、対照よりも大幅に高いホイール使用を示した。しかし、１０μＭのウォゴニンを投与されたマウスは、５００μＭを投与されたマウスよりも高いアクティビティホイールの使用を示した。２８日目に、このパターンが繰り返された。結果を表４にまとめる。
【表４】
2021510161.tif 000008
【００７８】
バイオマーカーの発現およびＭａｎｋｉｎスコア
ホイール使用のデータは有望であったが、炎症のみを阻害して疼痛をブロックすることは、ＯＡの進行をブロックするには不十分である。実験の終わりに（２８日目）、マウスを犠牲にし、膝を収集して、固定し、以前にＳｐｅｎｃｅｒ  Ｋ  ＭＳおよびＪｅｆｆｒｅｙ  Ｚ  Ｋａｒｔｃｈｎｅｒ  Ｗ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．２０１５；０４（０３）に報告されているように、修正ＭａｎｋｉｎスコアおよびＨｔｒＡ１発現について調査した。ＨｔｒＡ１は、ＯＡの進行に関連するバイオマーカーカスケードの最初のものである。
【００７９】
図１に示すように、薬理学的用量のウォゴニンにより、膝の不安定化手術を受けやすい関節が救出される。マウスの膝ＯＡは、内側半月靭帯の外科的不安定化（ＤＭＭ手術）によって誘発され、マウスを１０μＭのウォゴニンで処置した。対照はＤＭＭ＋ビヒクルであった。ＯＡの修正Ｍａｎｋｉｎスコアは、１０μＭのウォゴニン処置を受けたマウスにおいて統計的に（ｐ＞０．０５）低くかった。同様の結果が低用量で観察された。図２に示すように、ＤＭＭ手術を受けた膝関節の免疫組織化学染色を評価したところ、ウォゴニンはＨｔｒＡ１発現を阻害していた。対照／ビヒクルマウス（Ａ）は、軟骨細胞においてＨｔｒＡ１のユビキタス染色を示した。対照の膝における亀裂と粗い関節軟骨表面（矢印を参照）に注目されたい。ＨｔｒＡ１の発現は、１０μＭウォゴニンで処置されたマウスの膝において本質的に存在しなかった（Ｂ）。亀裂は認められず、関節軟骨表面は本質的に正常であった。
【００８０】
ウォゴニンで処置した膝の修正Ｍａｎｋｉｎスコア（図１）およびＨｔｒＡ１発現（図２）は、ウォゴニンの投与量を減らすとＯＡに対してさらなる保護が提供されたという点で、アクティビティホイールデータと同様のパターンをたどった。ＯＡ疼痛を治療し、ＯＡ疾患のプロセスを逆転させるためのウォゴニンなどの抗炎症剤の適度の量という考えは、現在の考えに対して反直感的である。我々の調査は、低用量のウォゴニン（５００μＭと比較して１０μＭ）がＯＡの進行を軽減する際に大きな利点をもたらすことを示した。実際、局所的に適用された１μＭの用量のウォゴニンは、修正Ｍａｎｋｉｎスコアで測定されたように、ＯＡを大幅に軽減するのに十分であることが観察されている。さらに、１μＭ未満の投与量のウォゴニンでは効果をもたらすには不十分であることが観察されている。５００μＭを超える投与量では、炎症およびバイオマーカーの抑制が多すぎる。したがって、従来の知識に反して、適度の用量の抗炎症剤を提供することにより、軟骨細胞が恒常性に戻り、軟骨修復／恒常性を示すことが可能になる。
【００８１】
実施例２．クリームまたは液体に製剤化されたウォゴニンの変形性関節症のマウスモデルの処置
ＤＭＳＯまたは浸透促進剤を含むクリームのいずれかで局所的に適用される少量のウォゴニンを使用して第２の実験を行った。表１に示すクリーム製剤を使用した。この調査では、ＯＡはＤＭＭ手術によって誘発された。手術から２４時間後に、処置を患部の膝に適用した。処置には、膝蓋腱の位置の皮膚に適用された１０μＬのＤＭＳＯ（５００μＭウォゴニン）中の０．０００００１４２ｇウォゴニン（ｎ＝５）、膝蓋腱の位置の皮膚に適用された１０μＬのＤＭＳＯ（ｎ＝５）、膝蓋腱の位置の皮膚に適用された０．００００００００２８ｇウォゴニン（１０μＬのＧ２クリームＥ／１０μＭのウォゴニン）（ｎ＝５）が含まれた。処置は３日ごとに２８日間行なった。手術直後、マウスをアクティビティホイールケージに入れ、ケージ内のホイールの使用をコンピューターで記録した。実験を開始してから７日後、ＤＭＳＯまたはクリーム中のいずれかのウォゴニンを投与されたマウスは、ＤＭＳＯのみよりも大幅に高いホイール使用を示した。１４日目まで、クリームを投与されたマウスは、依然として大幅に高いホイール使用を示したが、一方、ＤＭＳＯ処置またはＤＭＳＯ＋ウォゴニン処置の間には差はなかった。２８日目に、このパターンが繰り返された。結果を表５にまとめる。
【表５】
2021510161.tif 000009
【００８２】
バイオマーカーおよび膝のＭａｎｋｉｎスコアリングは、同様のパターンをたどり、したがって、高用量のウォゴニンは最初のうちは有益であったが、低用量のウォゴニンは実験を通して有益のままであった。これらのデータから、ウォゴニンの理想的用量は１μＭ〜５００μＭであると結論づける。ここでも、１μＭ未満では、ウォゴニンが効果をもたらすには不十分である。５００μＭを超えると、炎症およびセラミドの抑制が強すぎる。ＴＧＦ−β１が阻害され、軟骨細胞は恒常性に戻ることができず、軟骨修復となる。
【００８３】
実施例３．ウォゴニンの投与のためのロールオン製剤
ウォゴニンの投与のための例示的なロールオン製剤を表６に示す。
【表６】
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【００８４】
実施例４．変形性関節症におけるウォゴニンクリームの適用および膝関節の健康状態
方法
マウスおよび関節不安定化の手順
１７日齢、２８日齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（処置ｎ＝１２）、（偽ｎ＝５）を性別で無作為化し、内側半月板（ＤＭＭ）の不安定化を以前に記載されているのと同様に実施した（Ｌａｒｋｉｎ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０１３；４：１２１およびＭａｎｋｉｎ  ＨＪ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９７４；２９１（２４）：１２８５〜９２を参照）。手短に言うと、室内気を補充したイソフルランガスを使用してマウスに麻酔をかけ、毛皮を切り取り、外科用ヨードスクラブ剤で洗浄し、続いて７０％アルコールで洗浄して、右膝関節周囲の皮膚を準備した。残りの手順は、無菌技術を使用して、Ｗｉｌｄ  Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ  ３５５１１０（Ｗｉｌｄ  Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）外科用顕微鏡下で行なった。内側半月靱帯を鈍的切開により露出させ、関節領域を視覚化した。続いて、１１番メスを使用して半月靭帯を横に切開し、内側半月板の変位を可能にした。関節半月板の変位を目視で確認した。関節包および皮膚の両方を、７−０吸収性Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して閉じた。これらの手順は、Ｂｒｉｇｈａｍ  Ｙｏｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣによって承認されたプロトコル１６−０５０１に基づいて行った。
【００８５】
クリームの調製
治療クリームは、１０μＭのウォゴニンを含有するＡｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｗｏｎｄｅｒ（登録商標）であった。偽クリームは、基本的にはウォゴニンを含まないＡｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｗｏｎｄｅｒ（登録商標）であった。具体的には、表７に示すように、４５０ｍＬのバッチは、３８４ｍＬの再蒸留水、０．１２８ｇのジメチルスルホン（ＭＳＭ）、３０．９ｍＬのポリエチレングリコール、３５．５ｍＬのペパーミント油、０．６４ｇのヤシ油、および１．２８ｇのシアバターからなった。
【表７】
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【００８６】
組織調製
手術後２８日目にマウスを安楽死させ、右膝を回収し、４％パラホルムアルデヒドで固定してから、以前に記載されているように脱灰、およびパラフィン包埋を行った（Ｌａｒｋｉｎ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０１３；４：１２１およびＭａｎｋｉｎ  ＨＪ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９７４；２９１（２４）：１２８５〜９２）を参照）。以前に記載されているように（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、膝を切断し、対応する切片をサフラニンＯおよびファストグリーンで染色した。関節組織の写真は、ＣｅｌｌＳｅｎｓ（登録商標）ソフトウェアとＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１光学顕微鏡に接続したＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７２デジタルカメラとを使用して、１０倍と２０倍の倍率で撮像した。
【００８７】
関節の健康状態の分析
ＯＡスコアリング    Ｔｈｅ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＯＡＲＳＩ）（Ｇｌａｓｓｏｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０を参照）のスコアリングシステムを使用して、以前に記載されているようにＯＡの重症度を評価した（Ｈｏｌｔ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ−ｌｉｋｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｓｅｄｃ  ｍｏｕｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＨｔｒＡ１−Ｄｄｒ２−Ｍｍｐ−１３  ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ：ａ  ｎｅｗ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２０１２．２０（５）：ｐ．４３０〜９を参照）。
【００８８】
嚢胞様病変    嚢胞様病変は、以前に記載されているように、ＩｍａｇｅＪを使用して１０倍の倍率で計数した（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｅｃｋｅｔｔ，およびＬ．Ｓｃｈｏｎ，Ｃｙｓｔ−Ｌｉｋｅ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ａｔ  Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｏｓｓｅｏｕｓ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１７．１０１（５）：ｐ．５４９〜５５２を参照）。
【００８９】
免疫組織化学
以前に記載されているように、すべてのマウスからのマウス膝関節の連続切片を表すスライド上のＮＦκβの免疫組織化学（ＩＨＣ）（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｎａｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ  ｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８．１２：ｐ．８９〜９８を参照）。手短に言うと、スライドを脱パラフィンし、次いで５％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックした。１：２００希釈のＮＦκβに対するウサギポリクローナル一次抗体（ａｂ１６５０２  Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、１：２００希釈のＭｍｐ−１３（ａｂ３９０１２  Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、１：１００希釈のＴＧＦ−β１（ａｂ６４７１５  Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）。これらの抗体を検体に適用し、４℃で一晩インキュベートした。２日目に、スライドをＰＢＳですすぎ、ヤギ抗ウサギビオチン化二次抗体（ａｂ６４２５６  Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）とともにインキュベートした。スライドをＰＢＳですすぎ、次いでアビジン／ビオチンＡＢＣミックス（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット）とともにインキュベートした。３回目のすすぎの後、ペルオキシダーゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，ＮｏｖａＲＥＤ）を使用して呈色反応を開始した。陰性対照は、一次抗体を添加せずに染色することにより、調製した。染色強度の違いを、野生型対照と定性的に比較した。染色した細胞のブラインド計数は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を使用して行った。
【００９０】
細胞培養
ヒト軟骨細胞（ＴＣ２８ａ２  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、１０％ウシ胎児血清（Ｆ−２４４２−５０ＭＬ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補充したＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）ＤＭＥＭ（ＳＬＭ−１２０  Ｂ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中で８０％コンフルエンスまで培養した。処置は、以下からなった：
１．無処置プレート：古い培地を除去し、１０ｍＬの新鮮な培地と交換する。４時間インキュベートする。培地を除去し、ＰＢＳで３回すすぎ、製造元のプロトコル（Ｒ１０５４  ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って全ＲＮＡを収集する。
２．（ＤＭＳＯに溶解した）１０μＭのウォゴニンで処置する。古い培地を除去し、ウォゴニンを含む１０ｍＬの馴化培地と交換する。４時間インキュベートする。培地を除去し、ＰＢＳで３回すすぎ、製造元のプロトコル（Ｒ１０５４  ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って全ＲＮＡを収集する。
３．（ｄｄｓ水に溶解した）１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βで処置する。古い培地を除去し、ＩＬ−１βを含む１０ｍＬの馴化培地と交換する。４時間インキュベートする。培地を除去し、ＰＢＳで３回すすぎ、製造元のプロトコル（Ｒ１０５４  ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って全ＲＮＡを収集する。
４．１０μＭのウォゴニンで処置し、１時間待って、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βを加え、４時間インキュベートする。古い培地を除去し、ウォゴニンを含む１０ｍＬの馴化培地と交換する。１時間インキュベートする。１０μＬの１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βを加える。細胞培養皿内で培地をピペットで静かに上下させて３回混合する。４時間インキュベートする。培地を除去し、ＰＢＳで３回すすぎ、製造元のプロトコル（Ｒ１０５４  ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って全ＲＮＡを収集する。
【００９１】
製造元のプロトコル（１７２５０３８  ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って、全ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
【００９２】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴＰＣＲ）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍと、ソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを使用して行った。ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎベースのＰｒｉｍｅＴｉｍｅアッセイ（ＩＤＴ）を使用して、ヒトＴＧＦ−β１およびＢＢＳ３を検出した。プライマー配列は以下の通りであった。
【表８】
2021510161.tif 000012
【００９３】
統計分析
処置したマウスおよび無処置マウスの２８日目のＭａｎｋｉｎスコアおよびＯＡＲＳＩスコアの統計的有意性を、二元配置分散分析検定を使用して得た。嚢胞様病変（ＣＬＬ）とＮＦκβ染色された細胞との違いを、混合モデル（ＡＮＯＶＡ）統計的手法によって決定した。すべての統計分析は、Ｂｒｉｇｈａｍ  Ｙｏｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの統計学部によって行われた。
【００９４】
結果
変形性関節症の評価
Ｔｈｅ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＯＡＲＳＩ）は、従来のＭａｎｋｉｎスコアリングシステムの代わりに関節のＯＡを評価するためのさらに全体的な手順を開発した（Ｇｌａｓｓｏｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＯＡＲＳＩ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  −  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２０１０．１８  Ｓｕｐｐｌ  ３：ｐ．Ｓ１７−２３を参照）。ＯＡＲＳＩスコアリングを、関節の健康状態を評価するために、サフラニンＯで染色した膝切片で行なった。表７（ＴＣ）による試験組成物で処置されたマウスは、０．４２６の平均スコアを有したが、偽クリーム（ＳＣ）で処置されたマウスは、１．３３２の平均スコアを有した（図３）。二元配置分散分析検定で分析した場合、ＴＣで処置されたマウスは、ＳＣで処置されたマウスと比較して、ＯＡＲＳＩスコアが有意に低かったＰ＜０．０５。ＴＣを使用すると、ＯＡＲＳＩスコアが大幅に減少した。＊Ｐ＜０．０５
【００９５】
嚢胞様病変
関節の健康状態のために新たに識別されるマーカーは、タイドマーク、軟骨の石灰化ゾーン、およびセメントラインからなる軟骨骨接合部の嚢胞様病変（ＣＬＬ）の欠如または存在である（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｅｃｋｅｔｔ，およびＬ．Ｓｃｈｏｎ，Ｃｙｓｔ−Ｌｉｋｅ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ａｔ  Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｏｓｓｅｏｕｓ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１７．１０１（５）：ｐ．５４９〜５５２参照）。ＣＬＬの数は、ＴＣおよびＳＣ処置マウスのサフラニンＯ／ファストグリーン染色した膝切片で計数した。ＴＣを投与されたマウスは、ＳＣマウスの１１と比較して、平均６．２のＣＬＬを示した（図４）。混合モデル（ＡＮＯＶＡ）統計的手法によって決定されたように、ＳＣマウス（ｐ＜０．０１）と比較して、ＴＣマウスにおいてＣＬＬが有意に少なかった。ＴＣを使用すると、ＣＣＬの数が大幅に減少した。＊Ｐ＜０．０１
【００９６】
免疫組織化学分析
免疫組織化学を行って、ＴＣおよびＳＣ処置したマウスからのマウス膝関節の切片で、ウォゴニンと一次繊毛との相互作用を評価した。スライドをＮＦκβ、Ｔｇｆ−β１またはＭｍｐ−１３に対する抗体で染色した。免疫組織化学染色の定性的な結果を、脛骨プラトーのすぐ遠位にある関節軟骨の定義された２００×９００ピクセル領域内の、それぞれのバイオマーカーに対して陽性染色された細胞のパーセンテージと、軟骨細胞の総数とを算出することにより定量的に分析した。すべての定量分析はＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して行った。ＡＮＯＶＡ検定を使用して、活性化ＮＦκβに対して陽性染色された軟骨細胞が大幅に少ないことを観察し、ＴＣ試料とＳＣ試料間のＮＦκβに対する陽性染色の平均パーセンテージと平均軟骨細胞数の違いを検出した（図５）。ＴＣを使用すると、ＮＦκβに対する染色細胞数が大幅に減少した。＊Ｐ＜０．０１
【００９７】
ＡＮＯＶＡ検定を使用して、活性化ＴＧＦ−β１に対して陽性染色された軟骨細胞が大幅に多いことを観察し、ＴＣ試料とＳＣ試料間のＴＧＦ−β１に対する陽性染色の平均パーセンテージと平均軟骨細胞数の違いを検出した（図７）。ＴＣを使用すると、ＴＧＦ−β１に対する染色細胞数が大幅に増加した。＊Ｐ＜０．０５
【００９８】
ＡＮＯＶＡ検定を使用して、活性化Ｍｍｐ−１３に対して陽性染色された軟骨細胞が大幅に少ないことを観察し、ＴＣ試料とＳＣ試料間のＭｍｐ−１３に対する陽性染色の平均パーセンテージと平均軟骨細胞数の違いを検出した（図５）。ＴＣを使用すると、Ｍｍｐ−１３に対する染色細胞数が大幅に減少した。＊Ｐ＜０．０１
【００９９】
リアルタイムＰＣＲでアッセイすると、ＩＬ−１βへの曝露後にヒト軟骨細胞におけるＴＧＦ−β１の遺伝子発現の８０％の低下が観察された。しかし、細胞をウォゴニンで前処置した場合、低下は４０％未満であった。ウォゴニン単独でも同様の結果が得られた。
【０１００】
ウォゴニンへの暴露後、ヒト軟骨細胞におけるＢＢＳ３の遺伝子発現の１２５％の増加が観察された。ＩＬ−１βはＢＢＳ３遺伝子発現に影響を及ぼさなかったが、ウォゴニン応答をほぼ半分まで低下させた。
【０１０１】
膝の不安定化手術後ランニングホイールの使用が大幅に高いにも関わらず、ＮＦκβ、Ｍｍｐ−１３の活性化が少ない、Ｔｇｆ−β１の活性化が多いとともに、ＣＬＬが少ない、ＯＡＲＳＩスコアが低いことは、低レベルのウォゴニンを含むＴＣが軟骨の恒常性を促進するように軟骨分解の一次繊毛経路をブロックすることを示唆している。
【０１０２】
ＢＢＳ３は、ＢＢＳｏｍｅの構成成分である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ３（Ｂｂｓ３）ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ＢＢＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｂｂｓ３  ｕｎｉｑｕｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．ＰＮＡＳ  １０８（５１）：２０６７８〜２０６８３を参照）。ＢＢＳｏｍｅが繊毛に入るにはＢＢＳ３を必要とする。ＢＢＳｏｍｅは、繊毛タンパク質を繊毛に運ぶ、または繊毛からそれを除去する役割を果たすことができる。したがって、繊毛の存在下でのＢＢＳ３の増加は、ＢＢＳｏｍｅが何をどの方向に輸送しているかによる、抗炎症反応であり得る。いずれにせよ、これらの結果は、ウォゴニンが一次繊毛に大幅な影響（ＢＢＳ３発現の１．２５倍の増加）を及ぼすことを明確に示している。局所クリーム中の適度の用量のウォゴニンは、関節の健康状態を促進し、この疾患の新規の療法となる。
【０１０３】
膝の不安定化手術後、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｗｏｎｄｅｒ（登録商標）によるウォゴニンの局所適用で処置したマウスにおいて、ＯＡＲＳＩスコアおよびＣＬＬが大幅に減少することを我々は立証する。さらに、我々が立証するのは、一次繊毛が、軟骨の恒常性の維持に密接に関与し、ＮＦκβに対して陽性染色された細胞数の大幅な減少またはＴＧＦ−β１の増加によって証明され、治療に関連して、これらはともに、一次繊毛によって調節されることである。ＯＡの治療では、炎症のブロックのみに依存するのではなく、一次繊毛が関節の恒常性に果たす役割を考慮する必要がある。ウォゴニンが一次繊毛を介して作用することにより、軟骨細胞に対する保護作用を全体的に示しており、ウォゴニンの局所適用によりＯＡの進行が弱まり、疾患が治療されることを我々は立証する。これは、以前はウォゴニンによるものと考えられなかった新規の経路であり、クリームで局所的に適用されると変形性関節症の関節に強力で全体的な利点をもたらす理由を説明している。
【０１０４】
本明細書では本発明は、その記載の実施形態に関連して説明されているが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、具体的に説明されていない追加、修正、置換、および削除を行うことができることを当業者には理解されよう。したがって、前述の詳細な説明は、限定ではなく例示と見なされることを意図しており、本発明の趣旨および範囲を定義することを意図するのは、すべての均等物を含む、以下の請求項であることを理解されたい。
【図１】
2021510161.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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