(57)【要約】  本開示は、式ＡＦＰ−ＰＥＧを有する改変不凍タンパク質に関する。［式中、ＡＦＰは不凍タンパク質であり、ＰＥＧはポリ（アルキレングリコール）単位であり、ＰＥＧは、熱ヒステリシス活性に関与しない、かつアミン、チオール、ヒドロキシ、カルボキシレート、アミド、およびグアニジンから選択される官能基を側鎖に有する、ＡＦＰ中のアミノ酸に連結している］同様のものを含む配合物、それを使用して生物学的組織、器官、または体を保護する方法、および改変不凍タンパク質を合成する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＡＦＰ−ＰＥＧを有する改変不凍タンパク質であって、式中、
ａ）ＡＦＰは不凍タンパク質であり、
ｂ）ＰＥＧはポリ（アルキレングリコール）単位であり、
ｃ）前記ＰＥＧは、直接的な氷表面結合に関与しない、かつアミン、チオール、ヒドロキシ、カルボキシレート、アミド、およびグアニジンから選択される官能基を側鎖に有する、前記ＡＦＰ中のアミノ酸に連結している、改変不凍タンパク質。
【請求項２】
前記ＰＥＧは、式Ｒ−（ＯＣａＨ２ａ）ｎＯ−を有し、式中、Ｒはアルキル基、ｎは少なくとも４の整数であり、かつａは少なくとも２の整数である、請求項１に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項３】
ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル基であり、かつｎは少なくとも６の整数である、請求項２に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項４】
ｎは多くとも５００の整数であり、かつａは多くとも２の整数である、請求項３に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項５】
前記ＰＥＧは本質的にモノアルコキシポリ（エチレングリコール）からなる、請求項１から４のいずれか一項に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項６】
前記ＰＥＧは、０．３から２０ｋＤａの重量平均分子量または数平均分子量を有する、請求項５に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項７】
前記ＡＦＰは、Ｉ型ＡＦＰ、ＩＩ型ＡＦＰ、ＩＩＩ型ＡＦＰ、ＩＶ型ＡＦＰ、昆虫ＡＦＰ、植物ＡＦＰ、不凍糖タンパク質（ＡＦＧＰ）、ならびにこれらのＡＦＰおよびＡＦＧＰの組換え型およびシステイン置換変異体型から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項８】
前記ＡＦＰは前記ＩＩＩ型ＡＦＰである、請求項７に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項９】
氷の存在下である場合に、０℃より低い温度で前記氷を融解させる、請求項１から８のいずれか一項に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項１０】
前記改変不凍タンパク質は、対応する改変されていない不凍タンパク質の温度より低い温度で前記氷を融解させる、請求項９に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項１１】
前記改変不凍タンパク質は０℃未満の温度で氷結晶の成長を阻害する能力を有し、前記能力は対応する改変されていない不凍タンパク質の能力より大きい、請求項１から１０のいずれか一項に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項１２】
前記改変不凍タンパク質は０℃未満の温度の対応する水溶液の氷核形成を阻害する能力を有し、前記能力は対応する改変されていない不凍タンパク質の能力より大きい、請求項１から１０のいずれか一項に記載の改変不凍タンパク質。
【請求項１３】
ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載の改変不凍タンパク質と、
ｂ）前記改変不凍タンパク質を溶解するのに十分な量の水と
を含む、配合物。
【請求項１４】
前記水は、生理学的に適合する緩衝液を含む、請求項１３に記載の配合物。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の配合物を含む、凍結保護剤。
【請求項１６】
請求項１５に記載の凍結保護剤をさらに含む、生物学的組織。
【請求項１７】
改変不凍タンパク質を合成する方法であって、
ａ）直接的な氷表面結合に関与しない、アミン、チオール、ヒドロキシ、カルボキシレート、アミド、およびグアニジンから選択される官能基を側鎖に有するアミノ酸を有する不凍タンパク質（ＡＦＰ）を、０．３から２０ｋＤａの重量平均分子量または数平均分子量を有する、官能基化ポリ（アルキレングリコール）と反応させる段階であって、前記官能基化ポリ（アルキレングリコール）は、前記アミン、チオール、ヒドロキシ、カルボキシレート、アミド、またはグアニジン官能基と反応して前記改変ＡＦＰを形成することができる反応基を含有する、反応させる段階と、
ｂ）前記改変ＡＦＰを精製する段階と
を備える、方法。
【請求項１８】
前記ＡＦＰはＮ末端および／またはリシン残基を有し、前記官能基化ポリ（アルキレングリコール）は式ＲＯ−ＰＥＧ−ＤＣＡ−ＮＨＥの化合物を含み、式中、Ｒはアルキル基であり、ＰＥＧは式ＲＯ−（ＣａＨ２ａ）ｎＯ−を有し、式中、ｎは少なくとも４の整数であり、かつａは少なくとも２の整数であり、ＤＣＡはジカルボン酸ブロックであり、かつＮＨＥはＮ−ヒドロキシルエステル基である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ジカルボン酸ブロックは式−ＣＯ−Ｒ′−ＣＯ−を有し、かつ前記Ｎ−ヒドロキシルエステル基は式−Ｏ−ＮＲ″２を有し、式中、Ｒ′はアルキレン、アリーレン、またはアラルキレン基であり、かつＲ″は置換または非置換のアルキル、アリール、アラルキル、またはカルボキシル基であり、または一緒に、Ｒ″２は置換または非置換の環状アルキレン、アラルキレン、ラクタム、またはイミド基である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記官能基化ポリ（アルキレングリコール）は、メトキシポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルグルタル酸エステル（ｍＰＥＧ−ＳＧ）を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＦＰは、システイン残基を有し、前記官能基化ポリ（アルキレングリコール）は、α，β−不飽和アミドまたはイミドに直接的または間接的に連結されるアルコキシポリ（アルキレングリコール）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記官能基化ポリ（アルキレングリコール）は式ＲＯ−ＰＥＧ−ＣＡ−ＮＵＡの化合物を含み、式中、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル基であり、ＰＥＧは式ＲＯ−（ＣａＨ２ａ）ｎＯ−を有し、式中、ｎは少なくとも４の整数であり、かつａは少なくとも２の整数であり、ＣＡはカルボキシル基含有アルキレン、アリーレン、またはアラルキレン連結基であり、かつＮＵＡは式ＮＲ'''２を有し、式中、各Ｒ'''は独立して置換または非置換のアルキル、α，β−不飽和アルケニル、アリール、アラルキル、α，β−不飽和アラルケニル、カルボキシル、またはα，β−不飽和アルケノイル基であり、かつ少なくとも１つのＲ'''は、α，β−不飽和アルケニル、アラルケニル、またはアルケノイル基、または一緒に、Ｒ'''２は置換または非置換のα，β−不飽和ラクタムまたはイミド基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記官能基化ポリ（アルキレングリコール）は、メトキシポリ（エチレングリコール）−マレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
生物学的組織、器官、または体を保護する方法であって、
ａ）請求項１５に記載の凍結保護剤を前記生物学的組織、器官、または体と接触させるかまたは結合させる段階と、
ｂ）前記凍結保護剤および前記生物学的組織、器官、または体を０℃以下の温度まで冷却する段階と
を含む方法。
【請求項２５】
前記生物学的組織、器官、または体は、本質的に前記生物学的組織または器官からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記凍結保護剤および前記生物学的組織、器官、または体を０℃またはそれより低い温度まで冷却する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記凍結保護剤および前記生物学的組織または器官を０℃またはそれより低い温度まで冷却する、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不凍タンパク質（ＡＦＰ）の分野、特に、それに連結された１または複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が含有されるＡＦＰ、ＡＦＰを作製する方法、およびＡＦＰを使用する方法（たとえば、生物医学的応用および／または凍結保存）に関する。
【背景技術】
【０００２】
不凍タンパク質（ＡＦＰ）は、魚、昆虫、および植物などの様々な生物に見出され、それらの生細胞を零下環境における凍害から保護している。
【０００３】
北極の魚は、水温がセ氏−１．９度である低温環境で生き延びることができる［Ｓｃｈｏｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐａｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４９（１９５７）５−２４］。魚が苛酷な水温下で生き延びる助けとなる、不凍タンパク質（ＡＦＰ）と呼ばれる特定のタンパク質を北極圏の魚（ノトテニア亜目の魚）が含有するというＤｅＶｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の１９６０年代の調査結果［ＤｅＶｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６３（１９６９）１０７３−１０７５］。単離された魚ＡＦＰの第１の部類は、不凍糖タンパク質（ＡＦＧＰ）である。これらのタンパク質は、南極のノトテニア亜目の魚および北方のタラにおいて見られ、２．６ｋＤａと３．３ｋＤａとの間の分子量を有する。これらのタンパク質は、２つの重要な構造的特徴：（１）トリペプチド反復単位（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ）ｎ、および（２）二糖が付着したトレオニンのヒドロキシル基からなる［Ｈａｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０  （２００３）１３８１−１３９２；Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，６４（１９９３）２５２−２５９；Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（１９９７）１４６５２−１４６６０］。魚不凍タンパク質の第２の部類は、それに付着される糖を有さず、さらにＩ型ＡＦＰ、ＩＩ型ＡＦＰ、ＩＩＩ型ＡＦＰ、およびＩＶ型ＡＦＰに分類される。Ｉ型ＡＦＰは、カレイにおいて見られ、３．３ｋＤａから４．５ｋＤａの分子量を有する［Ｄｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ．，５４（１９７６）３７５‐３８０］。Ｉ型ＡＦＰは、アラニン豊富であり、その二次構造として単一のアルファヘリックス構造を有する［Ｈａｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６４（１９９９）６５３−６６５；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，４（１９９０）２４６０−２４６８；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９６（１９９６）６０１−６１８；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２８（２００１）２６５−２７３］。ＩＩ型不凍タンパク質は、ケムシカジカ、キュウリウオ科の魚、およびニシンに見られる［Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１９９２）１６０６９−１６０７５］。ＩＩ型不凍タンパク質は、１１ｋＤａと２４ｋＤａとの間の範囲の分子量を有し、ジスルフィド結合を含む混合二次構造を有する。ＩＩ型ＡＦＰは、推定で１２０アミノ酸残基を有する（システイン豊富）。ＩＩ型ＡＦＰの天然の供給源のうち２つ（キュウリウオ科の魚およびニシン）は、その氷結合活性にＣａ２＋イオンが直接的に関与しているためにカルシウム依存性であることが公知である［Ｙｅｈ、上記を参照；Ｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８５（１９９２）３３５−３４０；Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８４（１９９６）２８５−２８８］。ＩＩＩ型ＡＦＰは、オーシャンパウト、ゲンゲ科の魚、オオカミウオにみられる［Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９（１９９３）１１５４−１１５７；Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１９９６）１３２５−１３３７；Ｇａｒｎｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（２０１０）９０６３−９０７１］。ＩＩＩ型ＡＦＰは、６ｋＤａから７ｋＤａの分子量、および合計６２〜６９のアミノ酸残基を有する。ＩＩＩ型ＡＦＰにおいて、１２より多くのアイソフォームが見いだされた［Ｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２６３（１９８８）１２０４９−１２０５５］。ＩＩＩ型ＡＦＰは、ベータサンドイッチ二次構造、および球状三次構造を有する。ＩＶ型ＡＦＰは、北西大西洋領域に所在するロングホーンスカルピンにおいて見出された［Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４０２（１９９７）１７−２０］。ＩＶ型ＡＦＰの分子量は、〜１２ｋＤａであり、〜１０８アミノ酸残基を含有する。ＩＶ型不凍タンパク質は、二次構造のためのアルファヘリックス、およびその三次構造のためのヘリックス束を有する［同書］。
【０００４】
チャイロコメノゴミムシダマシ、トウヒノシントメハマキ、およびトビムシモドキ（ｓｎｏｗ  ｆｌｅａ）などの異なるファミリ由来の３種類の昆虫ＡＦＰ［Ｔｏｍｃｈａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１（１９８２）７１６−７２１；Ｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（２０００）３２２−３２４；Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８８（１９９７）７２７−７２８］、ならびに冬ライ麦（ライムギ）、およびライグラス（ペレニアルライグラス）由来の植物ＡＦＰ［Ｗｏｒｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２（１９９８）１１５−１１７；Ｓｉｄｅｂｏｔｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（２０００）２５６］も、見出された。
【０００５】
ＡＦＰの作用機構は、特異的な氷表面に結合して［Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２７（２００２）１０１−１０６］、または代替的に、水−ＡＦＰ−氷界面を形成して［Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１２５（２００６）０９１１０２；Ｆｌｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１８）］、それにより種氷結晶の成長を阻害するその能力に起因する。同じ機構によって、ＡＦＰはまた、組織を損傷する大きい氷結晶を生成するおそれがある氷の再結晶を阻害することができる［Ｒｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，５３（１９９９）１８５−１９２；Ｋｏｕｓｈａｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，６６（１９９７）１１４−１２１；Ａｎｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０５（２００１）８７５−８８９；Ｂａａｒｄｓｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６０１（２００２）４９−５４；Ｄｅｌｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７１（１９９６）２３４６−２３５５；Ｇｒａｅｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（１９９９）１１８４２−１１８４７；Ｔａｋａｍｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２７６（２００９）１４７１−１４７９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７４（１９９８）２１４２−２１５１］。この機構は、水中の粒子（塩、イオン、または電解質など）による凝固点降下の束一性効果とは根本的に異なる。束一性効果の欠点は、生細胞の浸透の変化に対する悪影響であり、一方でＡＦＰは、その作用機構がはるかに効率的であるため、浸透に実質的に影響を与えない［Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（１９９７）３８１１−３８１６］。ＡＦＰが生体を凍害から保護する別の機構は、種氷結晶の核形成を阻害することによる［Ｆｌｏｒｅｓ、上記を参照］。したがって、ＡＦＰは、血小板、哺乳類細胞、組織、および器官を低い貯蔵温度で保存する期間を延長するなどの生物医学的応用の可能性を有する［Ｋｏｕｓｈａｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ，４４（１９９７）４２１−４２５；Ｔａｔｓｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ，４８（１９９６）４４１−４４７；Ｔａｂｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６８（１９９６）３０５−３１３］。
【０００６】
ＰＥＧ化は、共有化学結合を形成することによって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基または単位をタンパク質または他の化学物質（たとえば、治療用タンパク質および薬物などの巨大分子）に付着させるプロセスである［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２５２（１９７７）３５７８‐３５８１］。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、エチレングリコール反復単位−ＯＣＨ２ＣＨ２−を有する生体適合性かつ生分解性の直鎖ポリマである［Ｈａｒｒｉｓ，"Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ），"ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ．），Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２］。モノメトキシポリ（エチレングリコール）（ＭＰＥＧ）は、ポリマ鎖の一方の末端に１つの官能性ヒドロキシ（−ＯＨ）基のみを有し、他方の末端に不活性−ＯＣＨ３基を有するＰＥＧの誘導体である。１つのＰＥＧ鎖における２つの−ＯＨ官能基による架橋結合を避けるためにＰＥＧ鎖の不活性末端が必要とされる場合、ＭＰＥＧは、バイオコンジュゲートの調製のために用いられる。
【０００７】
ＰＥＧは一般に、可溶性が高い。研究により、各エチレングリコールサブユニットは、ポリマの親水性に起因して、２つから３つの水分子と会合されていることが明らかになった［Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２（２００３）２１４−２２１］。ＰＥＧおよび化学修飾されたＰＥＧは、生物学、化学、生物医学、および薬理学の分野において広く使用されている［Ｈａｒｒｉｓ（１９９２）、上記を参照；Ｍａｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，４（２０１２）５６１−５８９；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，６（１９９５）１５０−１６５；Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３（１９９６）５６５−５７２］。ＰＥＧおよびその誘導体の有益な特性は、それらの無毒性、非免疫原性、生体適合性、生分解性、および高水溶性に起因する［同書］。ＰＥＧは、内部的使用および局所的使用両方に関して、米国食品医薬品局により認可されている［Ｈａｒｒｉｓ  （１９９２）、上記を参照］。ＰＥＧは、特性がＰＥＧおよび出発基質の特性を合わせた複合物を作製するために、多様な基質の共有結合性修飾剤として使用されてきた［Ｈａｒｒｉｓ，"Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，"ｉｎ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２］。研究において、生物学的ナノ粒子の表面へのＰＥＧコーティングにより、生物学的ナノ粒子の水溶性が高められ、腎クリアランスが低減され、制御型薬物放出が向上され、血中寿命が長くなり、医用材料の毒性が緩和され得ることが示された［Ｈａｒｒｉｓ（２００３）、上記を参照；Ｍａｒｓｈａｌｌ、上記を参照；Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４（２００７）１４８２−１４８７；Ｈａｓｓａｎ  Ｎａｍａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｒａｎｉａｎ  Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１４（２００５）９２１−９２７］。ＰＥＧは免疫系が認識する結合部位を有さず、その結果ＰＥＧ化成分はより長い時間血流中にとどまり、その目的をよりよく果たすことができるという事実に起因して、ＰＥＧはまた、マスキング剤とみなされる［Ｍｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１３（２０１２）１０５−１１９］。
【０００８】
この「背景技術」セクションは、背景情報のためにのみ提供される。この「背景技術」における記述は、この「背景技術」セクションにおいて開示される主題が、本開示に先行する技術を構成することを認めるものではなく、この「背景技術」セクションのいかなる部分も、この「背景技術」セクションを含む本出願の任意の部分が本開示に先行する技術を構成することを認めるものとして使用されるべきではない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の実施形態は、ＰＥＧ化されたＩＩＩ型ＡＦＰおよび他のＡＦＰ、そのようなＰＥＧ化ＡＦＰの合成、ならびに生物学的および生物医学的用途におけるそのようなＰＥＧ化ＡＦＰの使用に関する。ＰＥＧ化ＡＦＰは、ＰＥＧの好ましい特性を有し、ＡＦＰの不凍特性を保持または向上させるため、生物医学的用途に対して有用である。本発明のＰＥＧ化ＡＦＰは、天然には見出されていない新規な不凍特性を有する。
【００１０】
様々な異なる新規な不凍活性が、本発明のＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰに見出された。当該不凍特性は、（１）ＰＥＧ化ＡＦＰの氷核形成を阻害する能力の増大に起因するバルク凝固点降下の増大；（２）凍結したＰＥＧ化ＡＦＰ溶液のバルク融点の低下；および（３）ＰＥＧ化ＡＦＰ溶液中の種氷結晶の融点低下を含む。さらに、ＰＥＧ化ＡＦＰは公知の不凍特性（すなわち、ＡＦＰ溶液中での種氷結晶の成長の阻害）をなお保持する。他の型のＡＦＰのＰＥＧ化も、そのような現象を示す場合がある。ＰＥＧ化ＡＦＰは、その新規な特性（たとえば、その高められた不凍活性）およびその期待される広い生体適合性に起因して、生細胞（たとえば、血液細胞、骨髄、精子、および胚）、組織、器官、および全身を含む生体系の凍結保存のための生物学的用途において有用である場合がある。（本明細書において、「生体適合性」は生体系または組織から局所的または全身性［免疫］応答を誘発しないことによって、材料を生物学的に適合可能にする、材料の特性を指す場合がある。）
【００１１】
本発明のこれらの利点および他の利点は、以下の様々な実施形態の詳細な説明から容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＩＩＩ型ＡＦＰの配列の概要である。
【００１３】
【図２Ａ】ＨＰＬＣ１２アイソフォームの３Ｄ構造を示す。
【図２Ｂ】ＨＰＬＣ１２アイソフォームの３Ｄ構造を示す。
【００１４】
【図３】ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタル酸エステル（ＳＧ）を用いてＩＩＩ型ＡＦＰをＰＥＧ化するための合成経路を示す。
【００１５】
【図４】ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いてＩＩＩ型ＡＦＰをＰＥＧ化するための合成経路を示す。
【００１６】
【図５】ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタル酸エステル（２，０００Ｄａ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【００１７】
【図６】野生ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【００１８】
【図７Ａ】ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図７Ｂ】ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００１９】
【図８】ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００２０】
【図９】ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタル酸エステルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（５５０Ｄａ）を示す。
【００２１】
【図１０】ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００２２】
【図１１】ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタル酸エステルのＨＰＬＣクロマトグラムである（ＭＷ＝２，０００Ｄａ）。
【００２３】
【図１２】ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００２４】
【図１３】ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いて合成したＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００２５】
【図１４】ＩＩＩ型ＡＦＰとｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）とのモル比１：１０で、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００２６】
【図１５】ＩＩＩ型ＡＦＰとｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）とのモル比１：１で、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いて合成したＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００２７】
【図１６】ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）を用いたＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００２８】
【図１７】ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）を用いて合成した精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００２９】
【図１８】ｐＨ＝６．５でｍＰＥＧ−ＳＧ（ＭＷ＝２，０００Ｄａ）を用いて合成したＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００３０】
【図１９Ａ】精製した単一ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図１９Ｂ】精製した二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００３１】
【図２０】ＡＣ６６変異体（７，０７６．１８Ｄａ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００３２】
【図２１】ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（５５０Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＡＣ６６変異体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００３３】
【図２２】ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２，０００Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＡＣ６６変異体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【００３４】
【図２３】（ａ）〜（ｆ）は、以下：（ａ）種氷結晶が形成される；（ｂ）および（ｃ）六方晶系の氷結晶への成長；（ｄ）および（ｅ）成長して星状結晶を形成；（ｆ）氷シートが形成される、のとおり、純水中の純氷結晶の形成および／または成長の写真画像を示す。
【００３５】
【図２４】（ａ）〜（ｆ）は、以下：（ａ）から（ｄ）氷結晶は両錐形状へと成長する；および（ｅ）から（ｆ）氷結晶はバルク溶液に突発（ｂｕｒｓｔ）する、のとおり、０．５１４ｍＭのＩＩＩ型ＡＦＰの存在下の氷結晶の成長の写真画像を示す。
【００３６】
【図２５】氷結晶の突発点対ＩＩＩ型ＡＦＰ／ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ濃度のグラフである。
【００３７】
【図２６】（ａ）〜（ｃ）は、下降する温度に相関した、２ｍＭのＩＩＩ型ＡＦＰの存在下での氷結晶の成長を示す写真であり、図２６（ａ）は突発前の氷結晶の塊を示し、図２６（ｂ）は、より低い温度でのより広い範囲への氷結晶の突発を示し、図２６（ｃ）はさらに低い温度での針状結晶の生成を示す。
【００３８】
【図２７】（ａ）〜（ｆ）は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた０．４７３ｍＭのＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの存在下での氷結晶の成長を示す写真であり、図２７（ａ）から（ｄ）は、両錐形状に成長する種氷結晶を示し、図２７（ｅ）および（ｆ）はバルク溶液に先端部を通って突発する氷結晶を示す。
【００３９】
【図２８】（ａ）〜（ｆ）は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）を用いた０．９４５ｍＭのＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの存在下での氷結晶の成長を示す写真であり、図２８（ａ）から（ｄ）は、両錐形状に成長する種氷結晶を示し、図２８（ｅ）および（ｆ）はバルク溶液に先端部通って突発する氷結晶を示す。
【００４０】
【図２９】ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液における種氷結晶の融点を示すグラフである。
【００４１】
【図３０】ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ（２．１２ｍＭ、ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ））のバルク凍結プロセスを測定する実験の写真を示す。
【００４２】
【図３１】野生型ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液のＮＩＦＰをそれらの濃度の関数として示すグラフである。
【００４３】
【図３２】ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いてＰＥＧ化したＩＩＩ型ＡＦＰの０．４７ｍＭ溶液におけるバルク融解プロセスの写真画像を示す。
【００４４】
【図３３】凍結したバルクＩＩＩ型ＡＦＰ溶液およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液の完全融点をそれらの濃度の関数として示すグラフである。
【００４５】
【図３４】アリルモノスルホンＰＥＧ剤を用いて、ジスルフィド結合または極めて接近した２つのチオール反応基を有するタンパク質をＰＥＧ化する合成方式を示す。
【００４６】
【図３５】アリルモノスルホンＰＥＧ剤を用いた、タンパク質上のポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）へのＰＥＧの部位特異的共有結合共役の合成方式を示す。
【００４７】
【図３６】ＰＥＧ化により改変され得るアミノ酸配列およびその部位を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
ここから本発明の様々な本実施形態に詳細に言及し、その例は添付の図面において例示される。本発明は以下の実施形態とともに説明されるが、説明は、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。これに反して、本発明は、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨および範囲内に含まれる場合がある代替物、修正、および均等物を包含することを意図するものである。さらに、以下の詳細な説明において、多数の具体的な詳細は、本発明の十分な理解を提供するために記載される。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細がなくとも実践され得ることは、当業者には容易に明らかとなろう。本発明の態様を不必要に不明瞭にすることがないように、他の例、周知の方法、手順、要素、および回路は、詳細には説明されていない。
【００４９】
本発明の実施形態の技術的提案は以下の実施形態において図面と併せて、完全にかつ明確に説明される。説明は、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。本発明の説明される実施形態に基づいて、他の実施形態は、当業者によって創造的な貢献なしで得ることができ、本発明に付与される法的保護の範囲内にある。
【００５０】
さらに、互いに排他的な特徴および／またはプロセスを除いて、本文献において開示されるすべての特徴、手段、またはプロセスは、可能なあらゆる方法およびあらゆる組み合わせで、組み合わせることができる。本明細書、請求項、要約、および図において開示される特徴はいずれも、別段の定めがない限り、他の同等の特徴または類似の目的、目標、および／または機能を有する特徴によって置換されることができる。
【００５１】
本発明は、その様々な態様において、例示的な実施形態に関して以下でさらに詳細に説明される。
【００５２】
本発明の目的は、ＰＥＧ化ＡＦＰ、およびＰＥＧ化ＡＦＰを作製する方法、および天然に見られない、ＰＥＧ化ＡＦＰの新規な不凍特性を利用するための方法を提供することを含む。ＩＩＩ型ＡＦＰは、ＰＥＧ化を行うための例として使用されてきた。ＩＩＩ型ＡＦＰは、１つの平面および１つのほぼ平面を有する球状である全体構造を有する。ＩＩＩ型ＡＦＰは、少なくとも１２の異なるアイソフォーム（図１）を含む［Ｈｅｗ、上記を参照；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，４（１９９０）２４６０−２４６８］。配列は、オーシャンパウトＡＦＰ成分（ＨＰＬＣ１、４、６、７、９、１１、および１２）、オーシャンパウトＡＦＰ  ｃＤＮＡクローン（ｃ１ｏ、ｃ７）、２つのオオカミウオゲノムクローン（１．５、１．９）、Ｌｙｃｏｄｅｓ  ｐｏｌａｒｉｓ  ＡＦＰ（Ｌ．Ｐ．）、Ｒｈｉｇｏｐｈｉｌａ  ｄｅａｒｂｏｒｎｉ  ＡＦＰ（Ｒ．Ｄ．）、およびＡｕｓｔｒｏｌｙｃｉｃｔｈｙｓ  ｂｒａｃｈｙｃｅｐ／ｚａｌｕｓ  ＡＦＰ（ＡＢ１およびＡＢ２）に由来した［Ｄａｖｉｅｓ，Ｆａｓｅｂ．Ｊ．，（１９９０）、上記を参照］。それらのアミノ酸配列の長さは６２から６９アミノ酸の範囲である。ＩＩＩ型ＡＦＰは、典型的に、ＳＰおよびＱＡＥアイソフォームの混合物としてインビボで産生される［Ｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（１９８８）１２０４９−１２０５５；Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２（２００５）４８２−４９２］。各群内のアミノ酸配列同一性は、ＳＰアイソフォームに関して約９０％、ＱＡＥアイソフォームに関して約７５％であり、一方でＳＰアイソフォームとＱＡＥアイソフォームとの間のアミノ酸配列同一性は、わずか約５５％である［Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，８４（２００３）１２２８−１２３７；Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３８４（１９９６）２８５−２８８；Ｓｏｅｎｎｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），４（１９９６）１３２５−１３３７；Ｓｏｅｎｎｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９（１９９３）１１５４−１１５７；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７４（１９９８）２１４２−２１５１］。図１における破線の配列／残基は、異なるアイソフォーム間の類似を示す。リシン残基およびＮ末端は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルグルタル酸エステル）を用いる場合にＰＥＧ化され得る部位であるため、リシン残基をより詳細に検討した。アミノ酸配列：  ＮＱＡＳＶ  ＶＡＮＱＬ  ＩＰＩＮＴ  ＡＬＴＬＶ  ＭＭＲＳＥ  ＶＶＴＰＶ  ＧＩＰＡＥ  ＤＩＰＲＬ  ＶＳＭＱＶ  ＮＲＡＶＰ  ＬＧＴＴＬ  ＭＰＤＭＶ  ＫＧＹＰＰ  Ａを有するＨＰＬＣ１２は、１つのリシン残基を有する唯一の異性体であり、一方で、他の異性体は、２から３つのリシン残基を有する。結果として、単一ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰおよび複数ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの両方が作製された。公知の異性体のうちいずれかに由来するリシン残基またはＮ末端で氷結合残基であるものはない。このことは、図２Ａ〜図２Ｂ［Ａｎｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＣＳＢ  ＰＢＤ，１９９７］におけるＨＰＬＣ１２の構造に注目し、構造中に、ＨＰＬＣ１２および他のＩＩＩ型ＡＦＰアイソフォームのリシン残基の位置を特定することにより、確認される。リシン以外に、Ｎ末端（破線矢印によって特定される）もＰＥＧ化される場合がある。繰り返しになるが、種々のアイソフォームの各々におけるＮ末端は、氷結合表面上にない。グルタミンが、アイソフォーム４、５、および６のＨＰＬＣ成分においてＮ末端で同定されている。ＤａｖｉｅｓとＨｅｗによれば、これらのグルタミンアミノ酸は環化されてピロリジンカルボン酸（または環状ラクタム）を形成する［Ｄａｖｉｅｓ，Ｆａｓｅｂ．Ｊ．，（１９９０）、上記を参照］。これにより、いかなるエドマン分解も阻止される。しかしながら、他のアイソフォームはＮ末端が環化していないため、ＰＥＧ化が可能な状態のままである。
【００５３】
図１は、ＩＩＩ型ＡＦＰの配列の概要である。配列は、オーシャンパウトＡＦＰ成分（ＨＰＬＣ１、４、６、７、９、１１、および１２）、オーシャンパウトＡＦＰ  ｃＤＮＡクローン（ｃ１ｏ、ｃ７）、オーシャンパウトＡＦＰゲノムクローン（λ５、λ３）、オオカミウオＡＦＰゲノムクローン（１．５、１．９）、Ｌｙｃｏｄｅｓ  ｐｏｌａｒｉｓ  ＡＦＰ（Ｌ．Ｐ．）、Ｒｈｉｇｏｐｈｉｌａ  ｄｅａｒｂｏｒｎｉ  ＡＦＰ（Ｒ．Ｄ．）、およびＡｕｓｔｒｏｌｙｃｉｃｔｈｙｓ  ｂｒａｃｈｙｃｅｐ／ｚａｌｕｓ  ＡＦＰ（ＡＢ１およびＡＢ２）に由来した［Ｄａｖｉｅｓ，Ｆａｓｅｂ．Ｊ．，（１９９０）、上記を参照］。図２Ａ〜図２Ｂは、ＨＰＬＣ１２アイソフォームの３Ｄ構造を示す［Ａｎｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照］。矢印によって示されるアミノ酸は、アイソフォームのすべての中で、ｍＰＥＧ−ＳＧを用いるＰＥＧ化の可能部位（たとえば、リシン残基）である。ＨＰＬＣ１２アイソフォームにおける６６番目のアラニン残基（カルボキシレート末端、氷結合部位ではない）を置換するシステイン残基を有するＡＣ６６変異体も、ＰＥＧ化に使用した。ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（ｍＰＥＧ−マレイミド）をシステイン側鎖に付着させた。  例示的なＰＥＧ化ＡＦＰを合成する例示的な方法  ｍＰＥＧ−ＳＧを用いた野生ＩＩＩ型ＡＦＰのＰＥＧ化
【００５４】
図３は、ｍＰＥＧ−ＳＧを用いてＩＩＩ型ＡＦＰをＰＥＧ化するための合成経路を示す。ここで、リシンの側鎖におけるアミン基を用いてアミン基との反応を表した。ＰＥＧ化タンパク質および関連する化学的方法に関する複数の研究論文がある［Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６４（２０１２）１１６−１２７；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２（２００１）４０５−４１７；Ｐａｓｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１６１（２０１２）４６１−４７２；Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１６（２０１１）４２３−４４０］。タンパク質をＰＥＧ化するための最も応用のきく手法の１つは、第一級アミンの使用を包含する。リシンのＮ末端および側鎖は第一級アミンからなる。Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、タンパク質標識用試薬に組み込まれている最も一般的なアミンを標的とする官能基である（カルバマート結合を形成する）［Ｒｏｂｅｒｔｓ、上記を参照；Ｐａｓｕｔ、上記を参照］。この一連の実験においてｍＰＥＧ−ＳＧをＩＩＩ型ＡＦＰに付着させるために使用するＮＨＳエステルの種類は、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタル酸エステル（ｍＰＥＧ−ＳＧ）である。この類の化学反応は、エステルの求核アシル基置換反応方法として公知である［Ｒｏｂｅｒｔｓ、上記を参照；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、上記を参照；Ｐａｓｕｔ、上記を参照；Ｐａｙｎｅ、上記を参照］。一般的な機構はアミノリシスと名付けられており、この機構では、第一級アミンを使用してエステルの開裂が処理される。図３に示すように、リシンの側鎖またはＮ末端上の第一級アミン（求核剤）は、ｍＰＥＧ−ＳＧ中のＮＨＳエステルのカルボニル炭素（求電子剤）を攻撃する。これが生じる場合、カルボニル炭素で四面体型中間体が形成される。カルボニル基のパイ電子は、カルボニル酸素に移動し、負に帯電した酸素を形成する。
【００５５】
一方で、カルボニル炭素に付着されたリシンのアミンは、正に帯電する。次に、脱離基（ＮＨＳ）は置換され、プロトンを共に運んでいき、最終ＰＥＧ化生成物における中性のアミドをもたらす。
【００５６】
野生ＩＩＩ型ＡＦＰは、Ａ／Ｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ）から購入した。野生ＩＩＩ型ＡＦＰの推定平均分子量は、６，８５６Ｄａである。ｍＰＥＧ−ＳＧ  ２，０００およびｍＰＥＧ  ５５０は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．（ノースカロライナ州、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ）から購入した。モル比１０：１のｍＰＥＧ−ＳＧとＩＩＩ型ＡＦＰとを量り分け、各々をそれ自身のエッペンチューブに入れた。次いで、ｐＨ７．４の最低限量の０．０１Ｍホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でｍＰＥＧ−ＳＧを溶解した。ＩＩＩ型ＡＦＰも最低限量のＰＢＳ中に溶解した。ｍＰＥＧ−ＳＧ溶液を、ＩＩＩ型ＡＦＰを含有するエッペンチューブに移した。４℃の低温室で２４時間、ボルテックスで混合することにより、これらを反応させた。
【００５７】
リシンのε−アミノ残基のｐＫａ値は、約９．３〜９．５であり、タンパク質のＮ末端にあるα−アミノ基のｐＫａ値は約７．６〜８である。Ｎ末端での選択的ＰＥＧ化は、弱酸性条件（たとえば、ｐＨ６〜６．５）で反応を実施することによって達成され得る。そのようなｐＨの緩衝液中で、リシンアミンはプロトン化され、その結果ＰＥＧ化剤に対して低い反応性を有し、一方で遊離α−アミノ基の大きい画分（プロトン化された形態と平衡にある）が存在し、結合に利用可能となる［Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、上記を参照］。そのような選択性に関して、ＰＥＧ化剤の反応性は低くなければならない（たとえば、アルデヒドＰＥＧにおけるように）が、ｍＰＥＧ−ＳＧの反応性は、比較的高い。
【００５８】
ｍＰＥＧ−ＳＧの高い反応性にもかかわらず、モル比５：１でｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）とＩＩＩ型ＡＦＰ（７，０００Ｄａ）との量を別々のエッペンドルフバイアルに量り分けた。ｍＰＥＧ−ＳＧを、ｐＨ＝６．５のＰＢＳ溶液（０．０１Ｍ）に溶解し、次に、ＩＩＩ型ＡＦＰを含有するエッペンチューブに移した。次に、ボルテックスを用いて完全に溶解するまで混合物を混合し、次に、４℃の低温室で２４時間ボルテックスしながら放置して反応させた。  ｍＰＥＧ−マレイミドを用いたＡＣ６６変異体のＰＥＧ化
【００５９】
図４は、ｍＰＥＧ−マレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）を用いてＩＩＩ型ＡＦＰ変異体ＡＣ６６をＰＥＧ化するための例示的な合成経路を示す。ここで、システインをＡＣ６６変異体におけるシステイン残基を表すために使用する。ｍＰＥＧ−ＭＡＬは、酸性条件下でもチオールに対して非常に反応性である［Ｒｏｂｅｒｔｓ、上記を参照；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、上記を参照；Ｐａｓｕｔ、上記を参照；Ｐａｙｎｅ、上記を参照］。ＡＣ６６変異体のＰＥＧ化に関して、マレイミドのベータ炭素へのシステインスルフヒドリルの求核付加の機構（チオール−マイケル付加と呼ばれる）が起こると考えられている（図４を参照されたい）。
【００６０】
ＡＣ６６変異体をＰｅｐｍｉｃ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中華人民共和国）によって合成した。ＡＣ６６変異体の平均分子量は、７，０６７．４４Ｄａである。分子量が２，０００Ｄａ、および別個に分子量が５５０ＤａのｍＰＥＧ−マレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）をＣｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、ノースキャロライナ州）から購入した。モル比１０：１のｍＰＥＧ−ＭＡＬとＡＣ６６変異体の試料を個別に量り分け、次に、２つの別々のエッペンドルフバイアルに入れたＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４、０．０１Ｍ）中に別々に溶解した。２つの反応物質を１つのエッペンチューブに結合し、４℃の低温室でボルテックスしながら、約２４時間、反応させた。
【００６１】
これらの合成アプローチは、アミン官能基またはチオール官能基を有するアミノ酸を有する任意のＡＦＰに適用することができる。加えて、（１）ＰＥＧ基は、エーテル化または当業者に公知の他の手法を用いて、他の官能基（たとえば、ヒドロキシ基［−ＯＨ］、カルボキシレート基［−ＣＯＯ−］、アミド基［−ＣＯＮＨ２または−ＣＯＮＲＨ、ここで、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ７〜Ｃ１０アラルキルなどの有機基などである］、グアニジン基［−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２］など）を有するアミノ酸残基に付着させることができ、（２）アミン基、チオール基、ヒドロキシ基、カルボキシレート基、アミド基、グアニジン基、または他の官能基を有する１または複数のアミノ酸を有する他のＡＦＰ型（たとえば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＶ型、昆虫、植物、天然に存在するＡＦＰの組換え型、合成［たとえば、［Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ］ｎなどの公知のＡＦＰの公知の反復単位を含むか、本質的にそれからなり、ここで、ｎは３以上［たとえば、４、５、６、８、１０、または１２］および任意選択で３０以下［たとえば、２０、１５、または１２］］などである）は、本明細書で開示されるＰＥＧ化手法のうち任意のもの、または当業者に公知の他のＰＥＧ化手法を用いてＰＥＧ化することができる。１または複数の非氷結合部位でのＡＦＰのＰＥＧ化は、ＡＦＰの不凍活性を保持し増強するが、ＡＦＰの他のいかなる部位でのＰＥＧ化も、本発明によって排除されない。  例示的なＰＥＧ化ＡＦＰの精製
【００６２】
サイズ排除カラム（１３０Å、２．７μｍ、７．８×３００ｍｍ）をＡｇｉｌｅｎｔ社（カリフォルニア州、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）から購入した。カラムは、高多孔性２．７μｍシリカ粒子で構成されていた。単一カラムおよび２つの直列に接続されたカラム両方を精製のために使用した。試料調製は、凍結乾燥粗生成物を量り分けること、およびそれをＰＢＳに溶解して必要な濃度（１０〜２０ｍｇ／ｍＬ）を得ることからなった。等張溶液のＰＢＳを溶媒として用い、注入量５０μＬを１実施毎に使用した（各実施は約１時間かかった）。試料を画分回収器によって試験管に回収した（０．５ｍＬ／分毎に）。ＨＰＬＣクロマトグラフの吸収ピークに相関または対応する試験管内の試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検査および／または分析した。
【００６３】
透析を使用して精製した生成物を脱塩した。脱塩が済むと、次に、精製した試料を凍結乾燥して乾燥粉末を得た。使用まで乾燥粉末を−２０℃で保存した。  ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの不凍活性の決定
【００６４】
温度制御型冷却ステージを有する熱電温度制御装置であるＯｔａｇｏ浸透圧計（Ｏｔａｇｏ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ）、およびオリンパスＢＸ５１顕微鏡（８００倍の最大倍率および１ミクロン（１マイクロメートル）の分解能）、およびＲＥＴＩＧＡ  ２０００Ｒ  Ｃｏｌｏｒ  Ｖｉｄｅｏ  Ｃａｍｅｒａを使用して不凍活性を決定した。
【００６５】
試料を保持するために、直径がそれぞれ０．６ｍｍの６つの穴を有する金属ディスクを使用した。Ｂ型液浸油を、各穴の底部に穴の側壁の表面まで入れた。その後、ＡＦＰ試料溶液（およそ０．１〜０．１５マイクロリットル）を、各穴のＢ型油の上部まで加えた。最後に、Ａ型液浸油を穴の試料の上に加えた。Ａ型油は、Ｂ型油より低い密度を有する。シリコーン伝熱化合物（たとえば、ペースト）を冷却ステージに綿棒で塗り、金属ディスクをシリコーン化合物の上に設置した。熱ステージ全体をガラスシートで覆い、ガラスシートを真空用グリースで封止した。熱ステージを顕微鏡ステージの上に設置した。次に、温度制御装置を瞬間凍結モードに設定した。バルク凍結のための−２０℃未満の標的温度、および４秒毎に０．１℃の降温速度を設定した。
【００６６】
試料が凍結されると、温度を５〜６分毎に〜１℃の速度で上昇させた。温度を−２℃から６〜１０秒毎に０．１℃でゆっくりと上昇させることによって、バルクの融解が観察された。種氷結晶を捕獲に関して、種氷結晶が捕獲されるまで、微調整つまみを使用して温度を上下に変化させた。次いで、温度を６〜１０秒毎に０．１℃下げて、氷結晶の突発点を観察した。次いで、温度を６〜１０秒毎に０．１℃上昇させて、氷結晶の融点を観察した。すべての温度は、０℃の水の凝固点／融点を使用して補正した。  結果および考察−−ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａおよび５５０Ｄａ）を用いたＰＥＧ化野生ＩＩＩ型ＡＦＰ
【００６７】
図５におけるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルは、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）の平均分子量が２，１５７Ｄａであることを示す。図６におけるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルは、平均分子量が６，８５６Ｄａである複数アイソフォームを野生型ＩＩＩ型ＡＦＰが含有することを示す。
【００６８】
図７Ａは、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルを示す。モル比１０：１のｍＰＥＧ−ＳＧと野生型ＩＩＩ型ＡＦＰ、およびｐＨ＝７．４を有する緩衝液を使用した。図７ＡにおけるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルは、ｍＰＥＧ−ＳＧとＩＩＩ型ＡＦＰとのモル比が１０：１である場合、単一ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ（平均分子量が８，９１３Ｄａ）、および二重ＰＥＧ化ＡＦＰ（平均分子量が１０，８８８Ｄａ）が生成されることを示す。未反応のｍＰＥＧ−ＳＧ（平均分子量が２，０５９Ｄａ）および未反応のＩＩＩ型ＡＦＰ（平均分子量が７，１４２Ｄａ）も、粗生成物中に残存した。
【００６９】
図７Ｂは、ｐＨ＝６．５を有する緩衝溶液を使用した場合の、同一の実験の結果を示す。単一ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰおよび二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ両方が生成された。ＰＥＧ−ＳＧの反応性は非常に高く、結果として、Ｎ末端に対して選択的な反応は、低ｐＨ緩衝液を使用すると奏功しなかった。
【００７０】
二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの割合を低減するために、ｐＨ＝７．４の緩衝液中での反応に、より小さいモル比（たとえば、１：２）のｍＰＥＧ−ＳＧとＩＩＩ型ＡＦＰとを使用した。図８は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示し、ここで、モル比１：２のｍＰＥＧ−ＳＧとＩＩＩ型ＡＦＰ、およびｐＨ＝７．５を有する緩衝液を使用した。得られた生成物は、主に単一ＰＥＧ化ＡＦＰ（８，９３２Ｄａ）であったが、収率は比較的低かった。単一ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰが示されており、平均分子量は８，９３２Ｄａである。残存する未反応のＩＩＩ型ＡＦＰおよび遊離ｍＰＥＧ−ＳＧも、スペクトル中に見ることができる。
【００７１】
図９は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）の平均分子量が８５５Ｄａであることを示す。図１０は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示し、ここで、モル比１０：１のｍＰＥＧ−ＳＧとＩＩＩ型ＡＦＰ、およびｐＨ＝７．４の緩衝液を使用した。単一ＰＥＧ化生成物および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ両方が生成された。未反応のｍＰＥＧ−ＳＧおよびＩＩＩ型ＡＦＰは、粗生成物中に残存した。
【００７２】
単一サイズ排除カラムを有する高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を初めに用いて、粗生成物を精製した。図１１は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）の対照ピークを示す。ｍＰＥＧ−ＳＧは、溶出時間が２９分であり、チューブ１１番に回収された。図１２は、ＩＩＩ型ＡＦＰの対照ピークを示す。最大ピークは、溶出時間が２５分であり、チューブ８番に回収された。対照試料をカラムにかけた後、粗精製ＰＥＧ化生成物をカラムにかけた。図１３は、ＩＩＩ型ＡＦＰとｍＰＥＧ−ＳＧとのモル比１：１０で、ｍＰＥＧ−ＳＧエステル（ＭＷ＝２，０００Ｄａ）を用いて合成したＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。左側の最初の２つの最大ピークは、ＰＥＧ化生成物（２３分で溶出された）である。中央の２つの最大ピークは、元のＩＩＩ型ＡＦＰ（約２５分で溶出された）である。右側の最後のピークは、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）（約２９分で溶出された）である。
【００７３】
図１４は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。８，９１３Ｄａ付近のピークは、単一ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ由来であり、１０，８８８Ｄａ付近のピークは、二重ＰＥＧ化ＡＦＰ由来である。
【００７４】
単一および二重標識化ＰＥＧ化生成物の質量パーセントはそれぞれ、７５．４９％および２４．５１％である。合計４．１ｍｇのＰＥＧ化生成物が生成された。これは８２．０％の収率に対応する。単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰは単一カラムを用いて分離されなかったが、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）およびＩＩＩ型ＡＦＰは精製した生成物において完全に除去された。  生成物の加重モル平均分子量（ＭＷｍａ）は、以下のとおり算出した：
【数１】
2021517143.tif 000002
は、ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液の濃度を計数するために用い、式中、ＭＷ１およびＭＷ２はそれぞれ、単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの分子量を表し、（Ｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（重量パーセント））１および（Ｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（重量パーセント））２はそれぞれ、生成物中の単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの質量パーセントである。  したがって、
【数２】
2021517143.tif 000003
であることが見出された。
【００７５】
図１５は、ＩＩＩ型ＡＦＰとｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）とのモル比１：２で、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いて合成したＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムである。左側の１番目のピークは、ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ（約２３分で溶出された）である。２番目のピークは、ＩＩＩ型ＡＦＰ（約２６分で溶出された）である。右側の最後のピークは、未反応ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）（約２９分で溶出された）である。
【００７６】
図１６は、ＩＩＩ型ＡＦＰとｍＰＥＧ−ＳＧとのモル比１：１０で、ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）を用いて合成したＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。左側の1番目のピークは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルにおいて何も認められなかったため、定義されていない。２番目のピークは、ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ（約３５分で溶出された）である。３番目のピークは、ＩＩＩ型ＡＦＰ（約４３分で溶出された）である。右側の最後のピークは、未反応ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）（約５０分で溶出された）である。
【００７７】
図１７は、対応する精製ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。７，７９１Ｄａおよび８，２３２Ｄａ付近で部分的に重なるピークはそれぞれ、単一ＰＥＧ化および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰを表す。単一および二重ＰＥＧ化生成物の質量パーセントはそれぞれ、５４．７５％および４５．２５％である。合計３．８ｍｇのＰＥＧ化生成物が生成された。これは７６．０％の収率をもたらす。未反応ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）およびＩＩＩ型ＡＦＰを完全に除去された。単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰは単一カラムを用いて分離されなかった。  生成物の加重モル平均分子量（ＭＷｍａ）は：
【数３】
2021517143.tif 000004
である。
【００７８】
２つの直列に接続されたサイズ排除カラムがＡＦＰのＰＥＧ化の粗生成物を精製するために使用された。図１８は、ＩＩＩ型ＡＦＰとｍＰＥＧ−ＳＧとのモル比１：５で、ｐＨ＝６．５でｍＰＥＧ−ＳＧ（ＭＷ＝２，０００Ｄａ）を用いて合成したＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰは、２つの直列に接続されたカラムを用いて分離された。図１９Ａは、精製単一ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルを示し、図１９Ｂは、精製二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルを示す。  結果および考察−−ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（５５０Ｄａおよび２，０００Ｄａ）を用いたＰＥＧ化ＡＣ６６変異体
【００７９】
図２０は、ＡＣ６６変異体のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦスペクトルを示す。ピーク分子量は７，０７６．１７Ｄａである。図２１は、ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（５５０Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＡＣ６６変異体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。ＰＥＧ化ＡＣ６６変異体は、７，６５０Ｄａを有する。図２２は、ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２，０００Ｄａ）を用いた粗精製ＰＥＧ化ＡＣ６６変異体のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルを示し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは生成物が平均分子量９，１００Ｄａを有することを示す。ＡＣ６６  ＩＩＩ型ＡＦＰのｍＰＥＧ−ＭＡＬ（５５０Ｄａおよび２，０００Ｄａ）との反応により、単一ＰＥＧ化生成物のみが生成された。したがって、ＡＦＰの特定のおよび／または所定のアミノ酸残基を置換するためにシステインを使用する部位特異的変異誘発により、実質的にすべてのＡＦＰの部位特異的ＰＥＧ化が可能になり得る。  結果および考察−−ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの不凍特性  水中およびＩＩＩ型ＡＦＰ溶液中での氷結晶の成長
【００８０】
純水中の純氷結晶の成長および／または形成の顕微鏡下の写真画像を、図２３のａ）〜ｆ）［Ｇｕｎｓｅｎ，ｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＳＵＬＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ，２００８，ｐｐ．８１］に、以下：ａ）種氷結晶形成される；ｂ）およびｃ）六方晶系氷結晶への成長；ｄ）およびｅ）成長して星状結晶を形成；ｆ）氷シートが形成される［同書］のとおり、示す。（円／点は、溶液中の気泡の画像である。）初期の種氷結晶は、凍結および解凍の反復によって水温を変化させることによって得た。種氷結晶が捕獲された後、溶液を冷却することにより種氷結晶を六方晶系氷結晶形状に成長させた（ｂおよびｃ）。結晶はプリズム面から水相へとさらに成長し、星状結晶を形成した（ｄおよびｅ）。最終的に、より大きい氷シートが形成される（ｆ）。これらの画像は、氷結晶がプリズム面上で成長し、一方でベーサル面上の成長はそれほど促進されていないことを示す。
【００８１】
図２４（ａ）〜（ｆ）は、ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液（０．５１４ｍＭ）中の氷結晶の成長の写真画像を示す。図２４（ａ）から（ｄ）は、両錐形状に成長する氷結晶（円で囲まれている）を示す。図２４（ｅ）〜（ｆ）は、バルク溶液に突発する氷結晶を示す。（写真中の濃い色の円／点は、溶液中の気泡の画像である。）わずかに０℃より低い温度で種氷結晶を捕獲した。この氷結晶は、温度が上昇する（０℃に近づく）場合、消失する傾向があったが、温度が降下する場合、成長した。この氷結晶は、切頭両錐の形状に成長し、次に、より低い温度で完全な両錐に成長した。最終的に、結晶は、その先端部からバルク溶液へと突発し、これが溶液全体の凍結を引き起こした。種々の濃度のＩＩＩ型ＡＦＰ溶液について観察すると、ＡＦＰ濃度に依存して、このタンパク質により、０℃未満の特定の温度で氷結晶の突発が阻害され得ることが示される。突発点は、ＡＦＰの不凍活性のうちの１つを示す。
【００８２】
図２５において、野生ＩＩＩ型ＡＦＰおよびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの濃度の関数として、氷結晶の突発点を示す。突発点はＩＩＩ型ＡＦＰ濃度の増大とともに減少した。この現象は、ＩＩＩ型ＡＦＰの、氷結晶の成長を阻害する能力を示す。
【００８３】
低いＡＦＰ濃度（＜〜１．７ｍＭ）では、種氷結晶は容易に生成することができた。次に、温度が降下していくにしたがって、種氷結晶は両錐形状へと成長した。最終的に、種氷結晶は、バルク溶液に先端部から突発した。しかしながら、高濃度（＞１．７ｍＭ）では、単一両錐氷結晶を生成することは困難であるが、形状が両錐として明確には定義されない可能性がある氷結晶の塊は生成された。温度の低下とともに結晶はより大きい氷結晶へと突発し、ここで突発点が定められた。温度のさらなる低下により、いくらかの針状結晶の生成が引き起こされた。たとえば、図２６（ａ）〜（ｃ）に示すように、２ｍＭのＩＩＩ型ＡＦＰの存在下で、温度の低下に応じた氷結晶の成長が観察された。−０．９４℃（図２６（ａ））で、氷結晶の塊が突発前に見られた。−０．９５℃（図２６（ｂ））で、氷結晶は、より広い範囲または体積に突発し、次に、−０．９６℃（図２６（ｃ））で、針結晶が生成した。さらに低い温度で、より多くの針状氷結晶が生成し、針状氷結晶はバルク氷と一緒に溶液全体へと成長した。  ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液中での氷結晶の成長
【００８４】
図２７（ａ）〜（ｃ）および（ｅ）〜（ｇ）および図２８（ａ）〜（ｆ）はそれぞれ、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ；＝０．４７ｍＭ）およびｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ；＝０．９４５ｍＭ）を用いた単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰを混合した溶液における氷結晶の写真画像を示す。図２７（ａ）〜（ｄ）および図２８（ａ）〜（ｄ）は、両錐形状に成長する種氷結晶を示し、図２７（ｅ）〜（ｆ）および図２８（ｅ）〜（ｆ）はバルク溶液に先端部から突発する氷結晶を示す。同様に、ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液におけるように、温度を０℃未満で変化させることによって種氷結晶を得た。これらの氷結晶は、切頭両錐の形状に成長し、次に、温度の低下とともに完全な両錐に成長した。最終的に、結晶は、その先端部からバルク溶液へと突発した。この現象は、低濃度の野生ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液中での氷結晶の成長と同様である。
【００８５】
突発点対混合した単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの濃度も図２５に示す。図２５は、ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰが両錐氷結晶の成長を阻害することができることを示す。実験誤差がその差異より大きい可能性はあるが、ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰは、野生ＩＩＩ型ＡＦＰより低い温度に対して両錐氷結晶を保持できる場合がある。全体としては、ＩＩＩ型ＡＦＰにおけるＰＥＧ鎖の存在は、ＩＩＩ型ＡＦＰのこの不凍活性を増大したか、または変更しなかった。
【００８６】
上記で考察してきたように、リシン残基／Ｎ末端はＰＥＧ化のための部位であった。これらの部位は、ＩＩＩ型ＡＦＰにおいて非氷結合部位である。したがって、実験結果は、氷表面とＩＩＩ型ＡＦＰの氷結合表面との相互作用が、氷結晶の成長阻害において主要な役割を果たすことを示す。  ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液中での単一氷結晶の融点
【００８７】
ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰが、野生型ＩＩＩ型ＡＦＰが融解可能であるものより低い温度で種氷結晶を融解させることが見出された。野生型ＩＩＩ型ＡＦＰが融解可能であるのは、〜０℃である。２，０００ＤａのＰＥＧを用いたＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰは、５５０ＤａのＰＥＧを用いてＰＥＧ化されたものより融点を少し低下させた。濃度の増大とともに融点は減少した。この現象は図２９に概要を示し、ここで、ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液における種氷結晶の融点対ＡＦＰモル濃度がプロットされている。このことは、今までのところ、いかなる公知のＡＦＰにも見られなかった新たな不凍現象である。ＩＩＩ型ＡＦＰに付着されたＰＥＧ鎖は氷結晶の突発点を著しくは変化させなかったが、当該ＰＥＧ鎖は種氷結晶を０℃未満の温度で融解させた。この現象は、氷結晶の融解が、非氷結合残基に付着されたＰＥＧ鎖によって誘発されたことを示す。非氷結合残基に付着された長くフレキシブルなＰＥＧ鎖は、増大したエントロピに起因して、ＷＡＩ（水−ＡＦＰ−氷）相間または界面領域の融点を低下させると考えられる。  水、ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液、およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液のバルク凝固点
【００８８】
水、ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液、およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液のバルク凝固点も検討された。単一氷結晶の突発点の検討において、単一氷結晶を捕獲するために温度を変化させる代わりに、ここでは、冷却速度毎秒−０．１℃で室温から−２０℃未満の温度に直接的に溶液を凍結させた。図３０は、混合した単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ（２．１２ｍＭ、ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ））の溶液における水のバルク凍結プロセスのスナップ写真（たとえば、写真）を示す。暗い画像は、氷マトリックスの形成を示す。バルク氷マトリックスは、光の透過が遮断される温度である−１８．４６℃まで得られないことが認められた。温度の低下とともに丸い点は暗色になり、溶液がさらに凝固することを示した。
【００８９】
図３１は、ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液のバルク凝固点対それらの濃度を示す。ＡＦＰ溶液を調製するために使用した水のバルク凝固点は、−１６．５６℃であることを観察した。ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液のそれは、より低い温度で凍結した。バルク凝固点降下は、ＡＦＰがその溶液中の氷の核形成を阻害することができることを示す［Ｆｌｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，（２０１８）］。この現象は、スピン標識化Ｉ型ＡＦＰに関する先の研究において言及されている（同書）。この凝固点は、「核形成阻害凝固点」（ＮＩＦＰ）と定義される場合がある。ＮＩＦＰは、ＡＦＰ濃度の増大とともに低下する。ここで、発明者らの新たな発見は、ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＮＩＦＰが野生型ＩＩＩ型ＡＦＰのＮＩＦＰより低く、２ｋＤａのｍＰＥＧ−ＧＳを用いたＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのＮＩＦＰが最も低く、その濃度についてほとんど独立しているということである。ＩＩＩ型ＡＦＰに付着されたＰＥＧ鎖が長いほど、そのＮＩＦＰを、より短いＰＥＧ鎖のＮＩＦＰより低下させた。  凍結した水、ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液、およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液のバルク融点
【００９０】
図３２は、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いた、０．４７ｍＭの混合された単一および二重ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのバルク融解現象を示す。図３２（ａ）から（ｄ）の写真は、凍結したバルク溶液を示す。図３２（ｅ）から（ｇ）は、溶液を通過する光によって示されるように、融解し始めるバルク溶液を示し、図３２（ｈ）は、バルク溶液が完全に融解したことを示す（明るい光が溶液を通過する）。
【００９１】
図３３は、バルク凍結溶液の完全融点対ＩＩＩ型ＡＦＰ、ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）を用いたＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ、およびｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いたＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの濃度を示す。野生型ＩＩＩ型ＡＦＰのバルク融点は、すべての濃度に関して〜０℃である。しかしながら、ＰＥＧ化ＡＦＰ溶液のバルク凍結溶液は、０℃より低い温度で融解した。濃度の増大とともにバルク融点は低下し、ｍＰＥＧ−ＳＧ（２，０００Ｄａ）を用いたＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰは、ｍＰＥＧ−ＳＧ（５５０Ｄａ）を用いたＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰのバルク融点よりわずかに低いバルク融点を有する。バルク融点が、ＩＩＩ型ＡＦＰおよびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液中の対応する単一氷結晶の融点のバルク融点と同様であることが認められた。図３３に示すように、バルク凍結ＰＥＧ化ＡＦＰ溶液は、完全融点より低い温度で融解し始めた。
【００９２】
氷マトリックスの融点降下は、非氷結合残基に付着された長くフレキシブルなＰＥＧ鎖によって引き起こされ、ＷＡＩ（水−ＡＦＰ−氷）界面領域での融点を、野生型ＩＩＩ型ＡＦＰより低下させた可能性があると理解される。
その他のＰＥＧ化の方法
第一級アミン含有残基でのＰＥＧ化
【００９３】
反応性アミン残基としては、リシン、Ｎ末端、ならびにＡＦＰに組み込まれる他の天然および人工の残基または成分が挙げられる。以下の官能基化ＰＥＧを使用して、氷結合に関与しないアミノ酸上のそのようなアミン基と反応させ、したがってＰＥＧ化ＡＦＰを作製することができるが、本発明はこれらの官能基化ＰＥＧに限定されない。
【００９４】
ｍＰＥＧ−ＳＣＭ（ＰＥＧ−ＮＨＳ：スクシンイミジルカルボキシルメチルエステル）
【化１】
2021517143.tif 000005
ｍＰＥＧ−ＳＧ（ＰＥＧ−ＮＨＳ：スクシンイミジルグルタル酸エステル）
【化２】
2021517143.tif 000006
ｍＰＥＧ−ＳＳ（ＰＥＧ−ＮＨＳ：スクシンイミジルコハク酸エステル）
【化３】
2021517143.tif 000007
ｍＰＥＧ−ＧＡＳ（グルタルアミドスクシンイミジルエステル）
【化４】
2021517143.tif 000008
ｍＰＥＧ−ＳＡＳ（ＰＥＧ  ＮＨＳ：スクシンアミドスクシンイミジルエステル）
【化５】
2021517143.tif 000009
を含むが、これらに限定されないＰＥＧ−ＮＨＳ（ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）生成物。
【００９５】
ｍＰＥＧ−ＡＡ（単官能ＰＥＧカルボキシルメチル酸）
【化６】
2021517143.tif 000010
ｍＰＥＧ−ＧＡ（単官能ＰＥＧグルタル酸）
【化７】
2021517143.tif 000011
ｍＰＥＧ−ＳＡ（単官能ＰＥＧコハク酸）
【化８】
2021517143.tif 000012
ｍＰＥＧ−ＧＡＡ（単官能ＰＥＧグルタルアミド酸）
【化９】
2021517143.tif 000013
ｍＰＥＧ−ＳＡＡ（単官能ＰＥＧスクシンアミド酸）
【化１０】
2021517143.tif 000014
を含むが、これらに限定されないカルボン酸官能基を有するＰＥＧ。
【００９６】
ｍＰＥＧ−トレシル（２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルクロリド活性化ＰＥＧ）
【化１１】
2021517143.tif 000015
ｍＰＥＧ−トシラート（トシルまたはトルエンスルホナートで官能基化されたＰＥＧ）
【化１２】
2021517143.tif 000016
ｍＰＥＧ−メシラート（メシルまたはメタンスルホナートで官能基化されたＰＥＧ）
【化１３】
2021517143.tif 000017
などのスルホン酸で官能基化されたＰＥＧ。
【００９７】
ｍＰＥＧ−クロリド（直鎖単官能クロリドＰＥＧ）
【化１４】
2021517143.tif 000018
(  ｍＰＥＧ−ブロミド（直鎖単官能ブロモＰＥＧ）
【化１５】
2021517143.tif 000019
などのハロゲンで官能基化されたＰＥＧ。
【００９８】
他のＰＥＧ化試薬は：
ｍＰＥＧ−エポキシド（単官能グリシジルエーテルＰＥＧ）
【化１６】
2021517143.tif 000020
ｍＰＥＧ−ＮＰＣ（単官能ＰＥＧニトロフェニルカルボナート）
【化１７】
2021517143.tif 000021
ｍＰＥＧ−シアヌル（ＰＥＧシアヌル酸クロリド）
【化１８】
2021517143.tif 000022
を含むが、限定されない。
【００９９】
選択的Ｎ末端ＰＥＧ化は、リシンのε−アミノ残基（ｐＫａ＝９．３〜９．５）とタンパク質Ｎ末端のα−アミノ基（ｐＫａ＝７．６〜８）との間の異なるｐＫａ値に起因して実施することができる。Ｎ末端での選択的ＰＥＧ化は、ｐＨ＝６〜６．５の培地中での反応を実施することによって達成される。これらの緩衝液中で、リシン残基はプロトン化され、その結果、側鎖アミノ基でＰＥＧ化剤との結合は起こらず、一方で、プロトン化された形態と平衡して、遊離α−アミノ基の大きい画分が存在し、ＰＥＧ化に利用可能となる。
カルボキシル基含有残基でのＰＥＧ化
【０１００】
反応性カルボキシル基残基としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｃ末端、ならびにＡＦＰ中の他の天然および人工の残基または成分が挙げられる。以下の官能基化ＰＥＧを使用して、氷結合に関与しないアミノ酸上のそのようなカルボキシル基と反応させ、したがってＰＥＧ化ＡＦＰを作製することができるが、本発明はこれらの官能基化ＰＥＧに限定されない。
ｍＰＥＧ−ＯＨ（ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、メトキシＰＥＧ）
【化１９】
2021517143.tif 000023
ｍＰＥＧ−ヒドラジド（単官能ＰＥＧヒドラジド）
【化２０】
2021517143.tif 000024
ｍＰＥＧ−アミン（直鎖単官能ＰＥＧアミンＮＨ２）
【化２１】
2021517143.tif 000025
ｍＰＥＧ−メシラート（メシルまたはメタンスルホナートで官能基化されたＰＥＧ）
【化２２】
2021517143.tif 000026
ｍＰＥＧ−トシラート（トシルまたはトルエンスルホナートで官能基化されたＰＥＧ）
【化２３】
2021517143.tif 000027
ｍＰＥＧ−クロリド（直鎖単官能クロリドＰＥＧ）
【化２４】
2021517143.tif 000028
ｍＰＥＧ−ブロミド（直鎖単官能ブロモＰＥＧ）
【化２５】
2021517143.tif 000029
ヒドロキシル基含有残基でのＰＥＧ化
【０１０１】
反応性ヒドロキシル残基としては、セリン、スレオニン、ならびにＡＦＰ中の他の天然および人工の残基または成分が挙げられる。以下の官能基化ＰＥＧを使用して、氷結合に関与しないアミノ酸上のヒドロキシル基と反応させ、したがってＰＥＧ化ＡＦＰを作製することができるが、本発明はこれらの官能基化ＰＥＧに限定されない。
ｍＰＥＧ−ＡＡ（単官能ＰＥＧカルボキシルメチル酸）
【化２６】
2021517143.tif 000030
ｍＰＥＧ−ＧＡ（単官能ＰＥＧグルタル酸）
【化２７】
2021517143.tif 000031
ｍＰＥＧ−ＳＡ（単官能ＰＥＧコハク酸）
【化２８】
2021517143.tif 000032
ｍＰＥＧ−ＧＡＡ（単官能ＰＥＧグルタルアミド酸）
【化２９】
2021517143.tif 000033
ｍＰＥＧ−ＳＡＡ（単官能ＰＥＧスクシンアミド酸）
【化３０】
2021517143.tif 000034
ｍＰＥＧ−メシラート（メシルまたはメタンスルホナートで官能基化されたＰＥＧ）
【化３１】
2021517143.tif 000035
ｍＰＥＧ−トシラート（トシルまたはトルエンスルホナートで官能基化されたＰＥＧ）
【化３２】
2021517143.tif 000036
ｍＰＥＧ−クロリド（直鎖単官能クロリドＰＥＧ）
【化３３】
2021517143.tif 000037
ｍＰＥＧ−ブロミド（直鎖単官能ブロモＰＥＧ）
【化３４】
2021517143.tif 000038
ｍＰＥＧ−エポキシド（単官能グリシジルエーテルＰＥＧ）
【化３５】
2021517143.tif 000039
ｍＰＥＧ−ＮＰＣ（単官能ＰＥＧニトロフェニルカルボナート）
【化３６】
2021517143.tif 000040
ｍＰＥＧ−シラン（ポリエチレングリコールＰＥＧ−シラン）
【化３７】
2021517143.tif 000041
チオール基含有残基のＰＥＧ化
【０１０２】
反応性チオ残基としては、システイン、ならびにＡＦＰ中の他の天然および人工の残基または成分が挙げられる（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（２０００）８５４８‐８５５３；Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（１９９４）７６１０‐７６１６；Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８（１９９０）３４３‐３４６）。以下の官能基化ＰＥＧを使用して、氷結合に関与しないアミノ酸上のチオ基と反応させ、したがってＰＥＧ化ＡＦＰを作製することができるが、本発明はこれらの官能基化ＰＥＧに限定されない。
ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（単官能ＰＥＧマレイミド）
【化３８】
2021517143.tif 000042
ｍＰＥＧ−ＳＨ（単官能ＰＥＧチオールまたはスルフヒドリル）
【化３９】
2021517143.tif 000043
ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ（ＰＥＧ−ＰＤＰまたはオルトピリジルジスルフィド）
【化４０】
2021517143.tif 000044
ｍＰＥＧ−アクリラート（単官能重合性ＰＥＧアクリラート）
【化４１】
2021517143.tif 000045
ｍＰＥＧ−アクリルアミド（単官能重合性ＰＥＧアクリルアミド）
【化４２】
2021517143.tif 000046
ｍＰＥＧ−ビニルスルホン（ＰＥＧ  ＶＳ、ビニルスルホン）
【化４３】
2021517143.tif 000047
糖タンパク質に対するＰＥＧ化／グリカンＰＥＧ化
【０１０３】
ｍＰＥＧ−ボロン酸は糖タンパク質またはグリカンと反応することができるため、ＡＦＧＰの部位特異的ＰＥＧ化を行うために使用することができる。
架橋ＰＥＧ化（ジスルフィド架橋でのＰＥＧ化）
【０１０４】
ジスルフィド架橋も、選択的タンパク質ＰＥＧ化のための部位であり得る。たとえば、チャイロコメノゴミムシダマシ不凍タンパク質中のジスルフィド結合は、そのようなＡＦＰをＰＥＧ化するために用いることができる。ジスルフィド架橋は、特異的で交差官能基化モノスルホンＰＥＧを用いて、最初にＢｒｏｃｃｈｉｎｉおよび共同研究者によって、提案された［Ｓｈａｕｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２（２００６）３１２２−３３２３；Ｂａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１８（２００７）６１−６７；Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，６０（２００８）３−１２］。ＰＥＧ化剤は、硫黄原子の正しい空間的位置を確実にするために極めて接近した２つのチオール反応基を有し、したがって、２つの硫黄原子間に３炭素架橋が形成され、それにより、ジスルフィド結合の元の空間的距離を維持する（図３４を参照されたい；上記参照のＢｒｏｃｃｈｉｎｉから適合させている）。  ヒスチジンタグにおけるＰＥＧ化
【０１０５】
タンパク質上のポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）へのＰＥＧの部位特異的共有結合共役が達成された。Ｈｉｓタグ部位特異的ＰＥＧ化は、Ｃ末端上の６ヒスチジンＨｉｓタグを有するドメイン抗体（ｄＡｂ）（ｄＡｂ−Ｈｉｓ６）、およびＮ末端上の８ヒスチジンＨｉｓタグを有するインターフェロンα−２ａ（ＩＦＮ）（Ｈｉｓ８−ＩＦＮ）によって達成された［Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２３（２０１２）２４８‐２６３］（ＰＥＧ−モノ−スルホンでのビスアルキル化によるＨｉｓタグでの部位特異的ＰＥＧ化のための可能な機構を示す図３５を参照されたい［Ｃｏｎｇから適合させている］）。
ＴＧａｓｅ媒介ＰＥＧ化
【０１０６】
酵素法が、タンパク質のＧｌｎ残基のγ−カルボキサミド基でのＰＥＧ部分の共有結合的付着のためにトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を利用するように開発されている［Ｆｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５４（１９８３）１−５６；Ｓａｔｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｒｅｖ．，５４（２００２）４８７‐５０４］。この目的のために、アミノ基を含有するＰＥＧ誘導体を使用した（ＰＥＧ−ＮＨ２）。  カルボキサミド基を含有するタンパク質の部位特異的ＰＥＧ化は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ、ＥＣ２．３．２．２３）の使用によって達成される。それは、ＴＧａｓｅがＧｌｎ残基での以下の反応：
【化４４】
2021517143.tif 000048
を触媒するためである。
Ａｓｎ残基へのＰＥＧ化
【０１０７】
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＰＥＧ）−ＯＨ（Ｎ２−フルオレニルメチオキシカルボニル−Ｎ４−｛１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデシル｝−Ｌ−アスパラギン）の合成は、文献［Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６（２０１１）１１８８‐１１９２］において報告されている。したがって、ＰＥＧ単位は、氷結合に関与しないアスパラギン残基を有するタンパク質に加えることができる。  他の官能基化ＰＥＧ
【０１０８】
図３６に、ＰＥＧ化によって改変され得るタンパク質中のアミノ酸および部位の概要を示す｛Ｐａｓｕｔ、２０１２＃５２４｝。
【０１０９】
官能基化ＰＥＧは、単一官能基化ＰＥＧに加えて、二重官能基化ＰＥＧ（たとえば、直鎖ＰＥＧの両端の、ヒドロキシル基または他の官能基を有する）も含むことができ、官能基は、上記の官能基またはＰＥＧ化を可能にする他の官能基の任意の組み合わせであってもよい。ＰＥＧはまた、分岐していてもよく、分岐ＰＥＧは、ＰＥＧ化を可能にする上記の（または他の）官能基を用いた複数官能基を有してもよい。ＰＥＧ単位の分子量は、実質的にすべての範囲（たとえば、少なくとも約０．１５ｋＤａ以上）を包含する。  ＰＥＧ化の対象となるＡＦＰの範囲
【０１１０】
現在、不凍糖タンパク質（ＡＦＧＰ）、ならびにＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ型ＡＦＰを含む、５種類の魚ＡＦＰが発見されている。ＡＦＰは、チャイロコメノゴミムシダマシ、トウヒノシントメハマキ、およびトビムシモドキなどの昆虫、ならびに冬ライ麦（ライムギ）およびライグラス（ペレニアルライグラス）などの植物においても見出されている。ここで、ＡＦＰはまた、本明細書で開示されるＡＦＧＰを含む。ＡＦＰは種々の構造を有し、多様な種において見出されているが、ＡＦＰはすべて、特異的な氷表面に結合し、かつ零下環境における種氷結晶成長および氷再結晶を阻止することによって、同様の不凍機能を呈する。ＡＦＰはまた、氷の核形成を阻害する（本明細書および上記参照のＦｌｏｒｅｓ（２０１８）における結果を参照されたい）。したがって、類似の機能的能力を有する他のＡＦＰ化合物は、本明細書で開示される方法に同様に有用であると考えられ、ＡＦＰの範囲内に含まれる。さらに、不凍特性および／または熱ヒステリシス特性を有するＡＦＰの任意の誘導体も、ＡＦＰの範囲内に含まれる。  他の種類のＡＦＰでのＰＥＧ化
【０１１１】
すべての種類のＡＦＰは、本明細書において概要を示す方法および他の方法に従ってＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ化ＡＦＰはすべて、その種類に関わらず、ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰと類似の特性を共有すると予想される。本発明のＰＥＧ化ＡＦＰは、１、２、またはそれより多いＰＥＧ鎖を含有してもよく、ＰＥＧ鎖は、直鎖であっても分岐であってもよい。２つ以上のＡＦＰはまた、１または複数の多官能基化ＰＥＧによって合わせて連結され得る。
【０１１２】
ＡＦＰの不凍活性変異体を使用してＰＥＧ化ＡＦＰを作製することができる。変異体は、ペプチドおよびタンパク質の固相合成などの化学合成によって作製することができる［Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１８（２０１３）４３７３−４３８８］。部位特異的変異誘発［Ｔｓｕｔｓｕｍｉ、上記を参照；Ｋｕａｎ、上記を参照；Ｇｏｏｄｓｏｎ、上記を参照；Ｃａｓｔｏｒｅｎａ‐Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１０：Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｔｅｃｈ，ｏｐｅｎ  ａｃｃｅｓｓ  ｂｏｏｋ（２０１６），ｐｐ．１５９−１７３］も、不凍活性変異体を作製するために使用することができる。この方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質分子の構造および生物学的活性を研究するために、かつタンパク質工学のために用いられる。方法の両方を、任意のペプチドまたはタンパク質の特異的な位置で天然の残基を所望のＰＥＧ化可能なアミノ酸で置換するために用いることができる。所望のアミノ酸は、ＰＥＧ化のためのシステインおよびリシンの側鎖などの側鎖を含有してもよい。結論
【０１１３】
野生型ＩＩＩ型ＡＦＰおよびそのＰＥＧ化型の溶液における凍結および融解現象を研究した。観察は、
バルク凝固点阻害；
バルク融点低下；
種氷結晶融点低下；および
単一氷結晶突発点阻害を含む。
【０１１４】
本明細書において決定される冷却および加熱プロセス中のＩＩＩ型ＡＦＰ溶液およびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液の実験的現象から、以下の結論を出すことができる。
（Ａ）ＩＩＩ型ＡＦＰおよびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの両方は、氷結晶の形状を構築し、氷結晶の成長および突発を阻害する。ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの、氷結晶の突発点を阻害する能力は、野生型ＩＩＩ型ＡＦＰのそれより低いとまではいかなくとも同様である。
（Ｂ）ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰは、０℃より低い温度で種氷結晶を融解させることができ、一方で、野生型ＩＩＩ型ＡＦＰ溶液における種氷結晶は、〜０℃で融解する。
（Ｃ）野生型ＩＩＩ型ＡＦＰおよびＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの両方は、−１６〜−２０℃まで下がったそれらの溶液中での、（核形成が生じると即時にバルク凍結を誘発する）氷結晶の核形成を阻害することができる。しかしながら、ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰの阻害能力はより高い。
（Ｄ）ＰＥＧ化ＩＩＩ型ＡＦＰは、０℃より低い温度でバルク凍結溶液を完全に融解させることができ、一方で、野生型ＩＩＩ型ＡＦＰのバルク凍結溶液は、〜０℃で融解する。
【０１１５】
ＰＥＧは、内部的使用およびさらには局所的使用に関して、米国食品医薬品局により認可されている［Ｈａｒｒｉｓ（１９９２）、上記を参照］。ＰＥＧの有益な特性は、それらの無毒性、非免疫原性、生体適合性、生分解性、および高水溶性に起因する［Ｈａｒｒｉｓ（１９９２）、上記を参照；Ｍａｈｏｕ、上記を参照；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、上記を参照；Ｍａｒｓｈａｌｌ、上記を参照］。ＰＥＧは免疫系が認識する結合部位を有さず、その結果ＰＥＧ化成分はより長い時間血流中にとどまり、その目的をよりよく果たすことができるという事実に起因して、ＰＥＧはマスキング剤として作用する［Ｍｉｌｌａ、上記を参照］。したがって、ＰＥＧ化ＡＦＰは、生物医学的用途のために好ましいＰＥＧのこれらの特性を担持する。
【０１１６】
生体器官／組織の凍結保存は、器官が、様々の種類の細胞、血管、および細胞間構造を含有して大変複雑であるため、難しいことである。凍結保護剤の毒性、および大きい氷結晶の形成は、特に解凍プロセス中では、生体器官／組織凍結保存にとって、２つの主な致命的な因子である。本発明は、凍結した生体組織および器官の完全な再生を可能にする凍結保護剤への足がかりを提供する。
【０１１７】
ＰＥＧ化ＡＦＰは、以下の理由に起因して、生物凍結保存のための生物学的に適合した有利な凍結保護剤であり得る：
（１）凍結保護剤を作製するためにＰＥＧ化ＡＦＰを使用すると、毒性のまたは生物学的に適合しない有機溶媒の使用を回避できる。
（２）ＰＥＧ化ＡＦＰは非免疫原性である。ＰＥＧ化ＡＦＰを含む、またはそれからなる水ベースの凍結保護剤の注入は、すべてではないにしても、ほとんどの生体系において免疫応答を引き起こさない。
（３）ＰＥＧ化ＡＦＰは、大変低い（たとえば、ゼロ未満）温度まで氷核形成を阻害することができるため、ＰＥＧ化ＡＦＰは、凍結プロセス中の氷結晶が大きく成長することを阻止することができる。そのような低温の凍結溶液により、凍結プロセスがより急速に起こることが可能になり、より大きい氷結晶が形成される可能性が減ずる。
（４）ＰＥＧ化ＡＦＰは、より大きい、組織を損傷する氷結晶を生成するおそれがある、解凍プロセス中の氷の再結晶を阻害することができる。これは、０℃より低い温度の凍結ＰＥＧ化ＡＦＰ溶液中で氷が融解し、当該溶液は、より高温の水よりも、水分子が再び集まってより大きい氷結晶を形成するために与えられる動的エネルギが減るためである。
【０１１８】
本発明のＰＥＧ化ＡＦＰは、生細胞、たとえば、血液細胞、骨髄、精子、胚、組織、器官、および場合により全身（たとえば、実質的に完全な植物、動物、またはヒトの体）を含む生体系の凍結保存のための生物学的用途において有用である。
【０１１９】
本明細書の具体的な実施形態の前述の説明は、例示および説明の目的で提示された。この説明は、網羅的であること、または開示される厳密な形態に本発明を限定することを、意図するものではなく、上記の教示の観点から、明らかに多くの修正および変更が可能である。実施形態は、本発明の原理およびその実際の応用を最良に説明し、それにより、他の当業者が、本発明、および企図される特定の使用に適するように様々に修正された様々な実施形態を最良に利用することを可能にするために、選ばれかつ記載された。本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲およびその均等物によって定義されることが意図される。
【図１】
2021517143.tif 000049
【図２Ａ】
2021517143.tif 000050
【図２Ｂ】
2021517143.tif 000051
【図３】
2021517143.tif 000052
【図４】
2021517143.tif 000053
【図５】
2021517143.tif 000054
【図６】
2021517143.tif 000055
【図７Ａ】
2021517143.tif 000056
【図７Ｂ】
2021517143.tif 000057
【図８】
2021517143.tif 000058
【図９】
2021517143.tif 000059
【図１０】
2021517143.tif 000060
【図１１】
2021517143.tif 000061
【図１２】
2021517143.tif 000062
【図１３】
2021517143.tif 000063
【図１４】
2021517143.tif 000064
【図１５】
2021517143.tif 000065
【図１６】
2021517143.tif 000066
【図１７】
2021517143.tif 000067
【図１８】
2021517143.tif 000068
【図１９Ａ】
2021517143.tif 000069
【図１９Ｂ】
2021517143.tif 000070
【図２０】
2021517143.tif 000071
【図２１】
2021517143.tif 000072
【図２２】
2021517143.tif 000073
【図２３】
2021517143.tif 000074
【図２４（ａ）】
2021517143.tif 000075
【図２４（ｂ）】
2021517143.tif 000076
【図２４（ｃ）】
2021517143.tif 000077
【図２４（ｄ）】
2021517143.tif 000078
【図２４（ｅ）】
2021517143.tif 000079
【図２４（ｆ）】
2021517143.tif 000080
【図２５】
2021517143.tif 000081
【図２６（ａ）】
2021517143.tif 000082
【図２６（ｂ）】
2021517143.tif 000083
【図２６（ｃ）】
2021517143.tif 000084
【図２７】
2021517143.tif 000085
【図２８（ａ）】
2021517143.tif 000086
【図２８（ｂ）】
2021517143.tif 000087
【図２８（ｃ）】
2021517143.tif 000088
【図２８（ｄ）】
2021517143.tif 000089
【図２８（ｅ）】
2021517143.tif 000090
【図２８（ｆ）】
2021517143.tif 000091
【図２９】
2021517143.tif 000092
【図３０】
2021517143.tif 000093
【図３１】
2021517143.tif 000094
【図３２−１】
2021517143.tif 000095
【図３２−２】
2021517143.tif 000096
【図３３】
2021517143.tif 000097
【図３４】
2021517143.tif 000098
【図３５】
2021517143.tif 000099
【図３６】
2021517143.tif 000100
【配列表】
2021517143000001.app
【国際調査報告】
2021517143.tif 000101
2021517143.tif 000102
2021517143.tif 000103