(57)【要約】  本発明は、慢性気道疾患の処置、特に喘息の処置での組合せ療法及びその使用に関する。この組合せ療法は、（ｉ）ＩＬ−５：ＩＬ−５Ｒのアンタゴニスト、並びに、（ｉｉ）ＩＬ−４：ＩＬ−４Ｒのアンタゴニスト及び／又はＩＬ−１３：ＩＬ−１３Ｒのアンタゴニストを含む。本発明は又、ＩＬ−４Ｒαに結合する抗原結合ドメイン及びＩＬ−５に結合する抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体を提供する。この二重特異性抗体は、慢性気道疾患、特に喘息の処置に使用できる。【選択図】図１
2021513974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト;並びに
(ii)IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニスト、
を含む組合せ。
【請求項２】
(i)IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト;及び、
(ii)IL-4Rαのアンタゴニスト
を含む、請求項１記載の組合せ。
【請求項３】
IL-5、IL-4及びIL-13を介したシグナル伝達を阻害する、請求項１又は２記載の組合せ。
【請求項４】
前記(i)のアンタゴニストは抗体分子である、かつ／又は、(ii)の少なくとも一のアンタゴニストは抗体分子である、請求項１〜３いずれか1項記載の組合せ。
【請求項５】
前記(i)のアンタゴニストは、IL-5、好ましくはヒトIL-5に結合する抗体分子である、請求項１〜４いずれか1項記載の組合せ。
【請求項６】
前記(ii)のアンタゴニストは、IL-4Rα、好ましくはヒトIL-4Rαに結合する抗体分子である、請求項２〜５いずれか1項記載の組合せ。
【請求項７】
前記(i)の抗体分子、及び／又は、前記(ii)の抗体分子は、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、一本鎖抗体(scFv)、F(ab’)2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、一本アーム(一価)抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、VHH抗体、又はそれら抗原結合断片の、組合せ、アセンブリ若しくはコンジュゲーションにより形成されたいずれかの抗原結合分子、から構成される群から独立して選択される、請求項４〜６いずれか1項記載の組合せ。
【請求項８】
前記(i)の抗体分子及び／又は前記(ii)の抗体分子は、IgG抗体である、請求項４〜６いずれか1項記載の組合せ。
【請求項９】
前記(i)の抗体分子及び／又は前記(ii)の抗体分子は、非ヒト抗体のヒト化又は生殖細胞系列のバリアントである、請求項４〜８いずれか1項記載の組合せ。
【請求項１０】
前記非ヒト抗体は、ラクダ類由来である、請求項９記載の組合せ。
【請求項１１】
前記(i)の抗体分子及び／又は前記(ii)の抗体分子は、ヒトIgGの、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン及び／又はCH3ドメインを含む、請求項４〜１０いずれか1項記載の組合せ。
【請求項１２】
前記(i)の抗体分子及び／又は前記(ii)の抗体分子は、ヒトIgG、好ましくはIgG1と高い相同性を示す、請求項４〜１１いずれか1項記載の組合せ。
【請求項１３】
前記(i)の抗体分子及び／又は前記(ii)の抗体分子は、ヒトIgG、好ましくはIgG1由来のFcドメインを含む、請求項４〜１２いずれか1項記載の組合せ。
【請求項１４】
前記Fcドメインは、FcRnへの結合親和性を増大させるために、１以上のアミノ酸置換により改変されている、請求項１３記載の組合せ。
【請求項１５】
前記Fcドメインは、アミノ酸置換:H433K及びN434Fを含む、請求項１４記載の組合せ。
【請求項１６】
前記Fcドメインは、アミノ酸置換:M252Y、S254T、T256E、H433K及びN434Fを含む、請求項１４記載の組合せ。
【請求項１７】
前記(ii)のアンタゴニストは、IL-4Rαに結合する抗体分子であって、該抗体分子は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含み、該VH及びVLドメインは、
(i)配列番号3を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号2を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号1を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号12を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号11を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号10を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
(ii)配列番号6を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号5を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号4を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号15を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号14を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号13を含む、又は、それから構成されるLCDR1、及び、
(iii)配列番号9を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号18を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
から構成される群から選択されるCDR配列を含む、請求項２〜１６いずれか1項記載の組合せ。
【請求項１８】
前記(ii)のアンタゴニストは、IL-4Rαに結合する抗体分子であって、該抗体分子は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含み、該VH及びVLドメインは、
(i)配列番号27を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号26を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号25を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号36を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号35を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号34を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
(ii)配列番号30を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号29を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号28を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号39を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号37を含む、又は、それから構成されるLCDR1、及び、
(iii)配列番号33を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号32を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号31を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号42を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号41を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号40を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
から構成される群から選択されるCDR配列を含む、請求項２〜１６いずれか1項記載の組合せ。
【請求項１９】
前記(ii)のアンタゴニストはIL-4Rαに結合する抗体分子であって、該抗体分子は:
(i)配列番号19のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号20のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(ii)配列番号21のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号22のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、並びに、
(iii)配列番号23のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号24のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、
から構成される群から選択される可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含む、請求項２〜１８いずれか1項記載の組合せ。
【請求項２０】
前記(ii)のアンタゴニストは、IL-4Rαに結合する抗体分子であって、該抗体分子は:
(i)配列番号43のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号44のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号45のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号46のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;並びに、
(iii)配列番号47のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号48のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、
から構成される群から選択される可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含む、請求項２〜１８いずれか1項記載の組合せ。
【請求項２１】
前記(i)のアンタゴニストは、IL-5に結合する抗体分子であって、該抗体分子は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含み、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号54を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号53を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号52を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
(ii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号57を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号55を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
(iii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1:X;配列番号59を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
(iv)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号61を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号60を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1、並びに、
(v)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号62を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
から構成される群から選択されるCDR配列を含む、請求項２〜２０いずれか1項記載の組合せ。
【請求項２２】
前記(i)のアンタゴニストは、IL-5に結合する抗体分子であって、該抗体分子は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含み、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号72を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号71を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号70を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号74を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号73を含む、又は、それから構成されるLCDR1、並びに、
(ii)配列番号72を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号71を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号70を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号75を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号73を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
から構成される群から選択されるCDR配列を含む、請求項２〜２０いずれか1項記載の組合せ。
【請求項２３】
前記(i)のアンタゴニストは、IL-5に結合する抗体分子であって、該抗体分子は:
(i)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号64のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号65のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iii)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号66のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iv)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号67のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(v)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号68のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;並びに、
(vi)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号69のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、
から構成される群から選択される可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含む、請求項２〜２２いずれか1項記載の組合せ。
【請求項２４】
前記(i)のアンタゴニストはIL-5に結合する抗体分子であって、該抗体分子は:
(i)配列番号76のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号77のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号76のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号78のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;並びに、
(iii)配列番号76のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号79のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、
から構成される群から選択される可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含む、請求項２〜２２いずれか1項記載の組合せ。
【請求項２５】
前記(i)の抗体分子及び／又は前記(ii)の抗体分子は、酸性pH下で、中性pH下より低い抗原結合活性を示す、請求項４〜２４いずれか1項記載の組合せ。
【請求項２６】
前記(i)の抗体分子はIL-5に結合する抗体分子であり、前記(ii)の抗体分子はIL-4Rαに結合する抗体分子である、請求項２５記載の組合せ。
【請求項２７】
酸性pH下での前記抗原結合活性と、中性pH下でのそれとの比率が、KD(酸性pH下)/KD(中性pH下)により評価して少なくとも2である、請求項２５又は２６記載の組合せ。
【請求項２８】
前記(i)のアンタゴニスト及び前記(ii)のアンタゴニストは、共配合される、請求項１〜２７いずれか1項記載の組合せ。
【請求項２９】
前記(i)のアンタゴニストはIL-5に結合する抗体分子であり、前記(ii)のアンタゴニストはIL-4Rαに結合する抗体分子である、請求項２８記載の組合せ。
【請求項３０】
前記(i)のアンタゴニスト及び前記(ii)のアンタゴニストは、1:1又は1:2又は2:1の比に従い配合される、請求項２８又は２９記載の組合せ。
【請求項３１】
前記(i)のアンタゴニスト及び前記(ii)のアンタゴニストは、別々に提供される請求項１〜２７いずれか1項記載の組合せ。
【請求項３２】
前記(i)のアンタゴニストはIL-5に結合する抗体分子であり、前記(ii)のアンタゴニストはIL-4Rαに結合する抗体分子である、請求項３１記載の組合せ。
【請求項３３】
IL-4Rαに結合する抗体分子及びIL-5に結合する抗体分子を含み、該抗体分子は多重特異性抗体内で組み合わされている、請求項１〜２７いずれか1項記載の組合せ。
【請求項３４】
前記IL-4Rαに結合する抗体分子、及び、前記IL-5に結合する抗体分子は、二重特異性抗体内で組み合わされている、請求項３３記載の組合せ。
【請求項３５】
前記組合せは、１以上の追加的な治療薬を含む、請求項１〜３４いずれか1項記載の組合せ。
【請求項３６】
IL-4Rαに結合する抗原結合領域、及びIL-5に結合する抗原結合領域を含む、二重特異性抗体。
【請求項３７】
前記IL-4Rαに結合する抗原結合領域は、第一の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含み、前記IL-5に結合する抗原結合領域は、第二の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含む、請求項３６記載の二重特異性抗体。
【請求項３８】
前記抗体は、IL-4Rαに結合する第一VH-VL対及びIL-5に結合する第二VH-VL対を有するIgG抗体である、請求項３７記載の二重特異性抗体。
【請求項３９】
前記抗体は、それに結合している少なくとも一のscFv断片を有するIgG抗体である、請求項３６又は３７記載の二重特異性抗体。
【請求項４０】
前記IL-4Rαに結合する抗原結合領域は前記IgG内に含まれ、前記IL-5に結合する抗原結合領域は少なくとも一の前記scFv断片内に含まれる、請求項３９記載の二重特異性抗体。
【請求項４１】
前記IL-4Rαに結合する抗原結合領域は第一の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含み、前記IL-5に結合する抗原結合領域は第二の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含み、
該第一VH-VLドメイン対は:
(i)配列番号3を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号2を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号1を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号12を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号11を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号10を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号6を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号5を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号4を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号15を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号14を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号13を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(iii)配列番号9を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号18を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
から選択されるCDR配列を含み、かつ、
該第二VH-VLドメイン対は:
(i)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号54を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号53を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号52を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号57を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号55を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1:X;配列番号59を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iv)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号61を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号60を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(v)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号62を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1、
から選択されるCDR配列を含む、請求項３６〜４０いずれか１項記載の二重特異性抗体。
【請求項４２】
IL-4Rαに結合する前記抗原結合領域及び／又はIL-5に結合する前記第二抗原結合領域は、非ヒト抗体の、ヒト化若しくは生殖細胞系列のバリアント、又はそれらの抗原結合断片である、請求項３６〜４１いずれか１項記載の二重特異性抗体。
【請求項４３】
前記非ヒト抗体は、ラクダ類抗体又はその抗原結合断片である、請求項４２記載の二重特異性抗体。
【請求項４４】
IL-4Rαに結合する前記抗原結合領域、及び／又は、IL-5に結合する前記抗原結合領域は、酸性pH下で、中性pH下より低い抗原結合活性を示す、請求項３６〜４３いずれか１項記載の二重特異性抗体。
【請求項４５】
酸性pH下での前記抗原結合活性と、中性pH下でのそれとの比率が、KD(酸性pH下)/KD(中性pH下)により評価して少なくとも2である、請求項４４記載の二重特異性抗体。
【請求項４６】
ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用される、請求項１〜３５いずれか1項記載の組合せ、又は請求項３６〜４５いずれか１項記載の二重特異性抗体。
【請求項４７】
ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用されるIL-5:IL-5Rのアンタゴニストであって、IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニストとの組合せで投与される、前記アンタゴニスト。
【請求項４８】
ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用されるIL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニストであって、IL-5:IL-5Rのアンタゴニストと組み合せて投与される、前記アンタゴニスト。
【請求項４９】
前記IL5:IL-5RのアンタゴニストはIL-5に結合する抗体分子であり、前記IL-4:IL-4R又はIL-13:IL-13RのアンタゴニストはIL-4Rαに結合する抗体分子である、請求項４７又は４８記載の使用のためのアンタゴニスト。
【請求項５０】
ヒト対象の慢性気道疾患を処置する方法であって、請求項１〜３５いずれか１項記載の組合せ、又は請求項３６〜４５いずれか１項記載の二重特異性抗体の有効量を、対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
前記慢性気道疾患は:喘息;慢性副鼻腔炎(CRS);免疫グロブリンG4関連疾患(IgG4-RD);慢性閉塞性肺疾患(COPD);慢性気管支炎;気腫;慢性血管浮腫;バレット食道を含む杯細胞化生を特徴とする疾患;進行中の好酸球性食道炎;鼻ポリポーシス;慢性副鼻腔炎;チャーグ・ストラウス症候群;アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);好酸球増多症候群;水疱性類天疱瘡及び嚢胞性線維症、から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記慢性気道疾患は、増加した粘液産生を特徴とする、請求項５０又は５１記載の方法。
【請求項５３】
前記慢性気道疾患は、気管支過敏症を特徴とする、請求項５０〜５２いずれか１項記載の方法。
【請求項５４】
前記慢性気道疾患は喘息である、請求項５０〜５３いずれか１項記載の方法。
【請求項５５】
前記方法は、重症喘息、重症の難治性喘息又はII型喘息の処置のためのものである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記方法は、アトピー性又はアレルギー性喘息の処置のためのものである、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
杯細胞化生(GCM)が減少する、請求項５０〜５６いずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
気管支過敏症(BHR)が軽くなる、請求項５０〜５７いずれか１項記載の方法。
【請求項５９】
更に、慢性気道疾患を処置するための、１以上の追加的な治療薬を投与することを含む、請求項５０〜５８いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組合せ療法、及びそれらの慢性気道疾患の処置における使用、特に、喘息の処置における使用に関する。本組合せ療法は、(i)IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト、並びに(ii)IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニストを含む。組合せのアンタゴニストは抗体分子でもよく、好ましくは、本組合せ療法は、IL-4Rαに結合する抗体分子及びIL-5に結合する抗体分子を含む。組合せ療法は、通常、2型サイトカインIL-4、IL-13及びIL-5を介したシグナル伝達を阻害する。本発明は又、IL-4Rαに結合する抗原結合ドメイン及びIL-5に結合する抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体を提供する。二重特異性抗体は、慢性気道疾患、特に喘息の処置に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
慢性気道疾患(又は、慢性呼吸器疾患)は、気道及び他の肺構造の慢性疾患である。最も一般的な形態の慢性気道疾患のいくつかは、喘息、並びに慢性気管支炎及び気腫を含む慢性閉塞性肺疾患である。
【０００３】
喘息は、咳、喘鳴及び胸部圧迫感の症状を引き起こす、誘導気管支の慢性炎症性疾患である。これは、世界中で最大3億人が罹患している疾患である。喘息患者で発生する気道閉塞は、さまざまな経過をたどり、無症状期間は、環境アレルゲン及びウィルス感染によってしばしば引き起こされる病状悪化期間により中断される。一般的な症状は、冷気や運動等の刺激に反応して気道が収縮する体質である気管支過敏症(BHR)である。
【０００４】
喘息患者は又、気道リモデリングの症状を示し、それにより気道壁は肥厚化し、腺上皮又は粘膜腺内の粘液産生杯細胞の数が増加し、これは杯細胞化生(GCM)と称される現象である。杯細胞は、繊毛エスカレータを覆う粘液の粘弾性と水和を制御するムチンを産生する。喘息患者では、痰はしばしば非常に乾燥しているため、粘液栓塞及び重度の気道閉塞を引き起こす可能性がある。現在、GCMを低減させ、粘液クリアランスを改善する治療法の選択肢はほとんど存在しない。
【０００５】
歴史的に、喘息治療アプローチは、コルチコステロイド及びβ2-アゴニストの吸入等の非特異的薬剤の使用を含んでいたが、その成功の度合いは様々だった。しかし、「喘息」は今や、それぞれ異なる臨床的、生理学的、及び分子的な特徴を示す複数のフェノタイプを表す雑多な障害である、と理解されている(Wenzel SEの文献、(2015) Nature Medicine; 18(5): 716-725; Rayらの文献、(2015) Am J Physiol - Lung Cellular and Molecular Physiology; 308: 130-140)。
【０００６】
喘息それぞれが、別個の病原的な分子メカニズムにより引き起こされるから、異なる病因を有し、治療に対して異なる反応を示すだろう、との認識を持って、喘息の臨床的サブセットをグループ分けする試みがなされてきた(Gauthierらの文献、(2015) American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine; 192(6): 660-668)。特定されたサブセット例は、症状が発現する年齢に応じて、早発性又は遅発性喘息;観察された炎症の存在と種類に応じて、好酸球性、好中球性、又は非炎症性喘息;運動誘発性喘息;肥満関連喘息;イエダニ(HDM)等のアレルゲン吸入に対するアレルギー性感作及び血清中アレルゲン特異的IgEの増加を特徴とするアトピー型喘息;コルチコステロイド反応性として表される、軽度又は中程度の喘息;重症喘息;並びに、2型炎症パターンを共有する個体を表す2型サイトカイン関連喘息、を含むものである。重要なことは、これらグループ間の明確な境界区分の欠如により、多くのフェノタイプが重複し、患者は複数のグループの臨床的又は病理学的特徴を示すため、処置に対する個別的な応答を予測することが困難になる場合があることである。
【０００７】
これら機構的に別個のグループ、「エンドタイプ」とも称される、の理解が深まり、関連する細胞性又は分子性バイオマーカーが同定され始めている。気管支生検又は肺摘出サンプルでは、喘息はしばしば、好酸球、マスト細胞及びCD4＋Tリンパ球の蓄積という特徴を示し、これら細胞は、上皮及び粘膜固有層内で2型サイトカインIL-4及び／又はIL-5を産生する。しかし、この2型炎症性の症状は、たった50％の、喘息、特に早発性喘息、アトピー性体質、及び高い血中好酸球数を示す、患者でのみ検出可能である。反対に、喘息、特に、ステロイド応答性に劣る患者の一部では、気道浸潤物は、主に好中球で構成されている。これら好中球は、17型Tヘルパーリンパ球又はγδT細胞等のIL-17産生細胞によって気道へ補充されるのだろう(Lambrecht及びHammadの文献、(2015) Nat. Immunol. 16(1): 45-56)。
【０００８】
慢性気道疾患に関係する分子的経路を、特に標的とする薬剤が、開発されつつある。例えば、アレルギー性疾患のために、多くの抗体療法が開発されている(Sheridan C の文献、(2018) Nature Biotechnology; 36: 3-5; Godarらの文献、(2017)モノクローナル抗体s: Taylor & Francis; 1-12)。これらには、IL-4Rαに結合するdupilumab(デュピルマブ)、IgEを標的とするomalizumab(オマリズマブ)、IL-5を標的とするmepolizumab(メポリズマブ)及びreslizumab(レスリズマブ)、並びに、IL-13と結合するtralokinumab(トラロキヌマブ)が含まれる。しかし、この分野では、改善された療法への要求がいまだ存在している。
【発明の概要】
【０００９】
(発明の概要)
本発明は、複数の2型サイトカインシグナル伝達経路を標的とすることに基づく。2型サイトカインは、それらがTヘルパー2型細胞(TH2細胞)により放出されるため、初めにそのように称された。喘息等の慢性気道疾患では、2型サイトカインはTH2細胞だけではなく、好塩基球、マスト細胞及び好酸球等の細胞からも放出される。2型サイトカインは、慢性気道疾患、特に喘息の病因に重要な役割を果たす。驚くべきことに、標的とする複数のII型サイトカイン、特にIL-5、IL-4及びIL-13は、慢性気道疾患の根底にある状態及び症状を緩和する予期されなかった相乗効果をもたらすことが発見された。従って、本発明の組合せ療法は、慢性気道疾患の処置に特に適している。
【００１０】
第一の態様では、本発明は、(i)IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト;並びに、(ii)IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニスト、を含む組合せを提供する。IL-4受容体複合体及びIL-13受容体複合体は共通のサブユニットであるIL-4Rαを共有するため、IL-4RαのアンタゴニストはIL-4：IL-4R及びIL-13：IL-13Rシグナル伝達経路の両方のアンタゴニストとして機能できる。これに続く好ましい実施態様では、本発明の組合せは、IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト及びIL-4Rαのアンタゴニストを含む。このIL-5:IL-5Rのアンタゴニストは好ましくは、IL-5のアンタゴニストである。該組合せは、IL-5、IL-4及びIL-13を介したシグナル伝達を阻害することもある。
【００１１】
組合せのアンタゴニストは、抗体分子でもよい。従って、ある実施態様では、IL-5:IL-5Rのアンタゴニストは抗体分子である、かつ／又は、IL-4:IL-4Rのアンタゴニストは抗体分子である、かつ／又は、IL-13:IL-13Rのアンタゴニストは抗体分子である。好ましい実施態様では、本組合せは、IL-5、好ましくはヒトIL-5に結合する抗体分子であるIL-5:IL-5Rのアンタゴニスト、及び、IL-4Rαに結合する抗体分子であるIL-4Rα、好ましくはヒトIL-4Rαのアンタゴニストを含む。
【００１２】
ある実施態様では、本組合せの抗体分子は、抗体軽鎖可変ドメイン(VL);抗体重鎖可変ドメイン(VH);一本鎖抗体(scFv);F(ab’)2断片;Fab断片;Fd断片;Fv断片;一本アーム(一価)抗体;ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はそれら抗原結合断片の、組合せ、アセンブリ若しくはコンジュゲーションにより形成されたいずれかの抗原結合分子、から構成される群から独立して選択される。好ましい実施態様では、本組合せは、IL-4Rαに結合する抗体分子及びIL-5に結合する抗体分子を含み、この抗体分子は、抗体軽鎖可変ドメイン(VL);抗体重鎖可変ドメイン(VH);一本鎖抗体(scFv);F(ab’)2断片;Fab断片;Fd断片;Fv断片;一本アーム(一価)抗体;ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はそれら抗原結合断片の、組合せ、アセンブリ若しくはコンジュゲーションにより形成されたいずれかの抗原結合分子、から構成される群から独立して選択される。この組合せの抗体分子は、VHH抗体でもよい。好ましい実施態様では、本組合せの抗体分子はIgG抗体である。
【００１３】
ある実施態様では、本組合せの抗体分子、例えば、IL-4Rαに結合する抗体分子及び／又はIL-5に結合する抗体分子は、非ヒト抗体の、ヒト化若しくは生殖細胞系列のバリアント、又はそれらの抗原結合断片であり、例えば、ラクダ類由来抗体又はその抗原結合断片である。
【００１４】
ある実施態様では、本組合せの抗体分子、例えば、IL-4Rαに結合する抗体分子及び／又はIL-5に結合する抗体分子は、ヒトIgGの、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン及び／又はCH3ドメインを含む。あるいは、この抗体分子は、ヒトIgG、好ましくはIgG1と高い相同性を示してもよい。
【００１５】
ある実施態様では、本組合せの抗体分子、例えば、IL-4Rαに結合する抗体分子及び／又はIL-5に結合する抗体分子は、ヒトIgG、好ましくはIgG1由来のFcドメインを含む。このFcドメインは、未改変でもよいが、例えば、FcRn(胎児性Fc受容体)への結合親和性を高めるために、１以上のアミノ酸置換により改変されていてもよい。好ましい実施態様では、本抗体分子は、Fcドメイン、好ましくはアミノ酸置換:H433K及びN434F;又はM252Y、S254T、T256E、H433K及びN434Fを含む、ヒトIgG由来のFcドメインを含むことができる。Fcドメインの番号は、EUナンバリングスキームに従って付与される。
【００１６】
ある実施態様では、本組合せの抗体分子、例えば、IL-4Rαに結合する抗体分子及び／又はIL-5に結合する抗体分子は、pH依存性抗原結合活性を示し、特に、酸性pH下で、中性pH下より低い抗原結合活性を示す。酸性pH下での抗原結合活性と、中性pH下でのそれとの比率が、解離定数比:KD(酸性pH下)/KD(中性pH下)により評価して少なくとも2でもよい。
【００１７】
前記組合せの配合に関しては、IL-5:IL-5R並びにIL-4:IL-4R及び／又はIL-13:IL-13Rアンタゴニストは、共配合されても(co-formulated)、別々に提供されてもよい。該アンタゴニストが共配合される実施態様では、アンタゴニストは、1:1比で配合されてもよく、非等モル比で配合されてもよい。例えば、IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト、好ましくはIL-5のアンタゴニスト、及びIL-4Rαのアンタゴニストを含む組み合わせのために、アンタゴニストは、例えば1:2又は2:1の比で配合されてもよい。
【００１８】
該組合せがIL-4Rαのアンタゴニスト及びIL-5のアンタゴニストを含み、そのアンタゴニストが抗体分子である実施態様では、本組合せは、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体内で組み合わされている抗体分子を含むことができる。
【００１９】
ある実施態様では、本組合せは、１以上の追加的な治療薬を含む。
【００２０】
第二の態様では、本発明は、IL-4Rαに結合する抗原結合領域、及びIL-5に結合する抗原結合領域を含む、二重特異性抗体を提供する。
好ましい実施態様では、IL-4Rαに結合する抗原結合領域及び／又はIL-5に結合する抗原結合領域は、非ヒト抗体のヒト化若しくは生殖細胞系列のバリアント、又はそれらの抗原結合断片、好ましくはラクダ類抗体又はその抗原結合断片である。ある実施態様では、IL-4Rαに結合する抗原結合領域は、第一の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含み、IL-5に結合する抗原結合領域は、第二の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含む。二重特異性抗体は、IL-4Rαに結合する第一VH-VL対及びIL-5に結合する第二VH-VL対を有するIgG抗体でもよい。ある実施態様では、二重特異性抗体は、それに結合している少なくとも一のscFv断片を有するIgG抗体である。
【００２１】
本発明の二重特異性抗体は、pH依存性抗原結合を示しても良い。例えば、IL-4Rαに結合する抗原結合領域及び／又はIL-5に結合する抗原結合領域は、
酸性pH下で、中性pH下より低い抗原結合活性を示してもよい。ある実施態様では、酸性pH下での抗原結合活性と、中性pH下でのそれとの比率が、KD(酸性pH下)/KD(中性pH下)により評価して少なくとも2である。
【００２２】
複数の2型サイトカインシグナル伝達経路を標的とする、本組合せ及び二重特異性抗体は、慢性気道疾患、特に喘息の処置に、特に有用であることが発見された。従って、本発明の更なる態様では、ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用するために、本発明の第一の態様の組合せ、又は本発明の第二の態様の二重特異性抗体が提供される。更に、ヒト対象の慢性気道疾患を処置する方法が提供され、この方法は、本発明の第一の態様の組合せ、又は本発明の第二の態様の二重特異性抗体の有効量を、対象へ投与することを含む。
【００２３】
ある実施態様では、慢性気道疾患は:喘息;慢性副鼻腔炎(CRS);免疫グロブリンG4関連疾患(IgG4-RD);慢性閉塞性肺疾患(COPD);慢性気管支炎;気腫;慢性血管浮腫;バレット食道を含む杯細胞化生を特徴とする疾患;進行中の好酸球性食道炎;鼻ポリポーシス;慢性副鼻腔炎;チャーグ・ストラウス症候群;アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);好酸球増多症候群;水疱性類天疱瘡及び嚢胞性線維症、から選択される。
【００２４】
本発明の方法で処置される慢性気道疾患は、増加した粘液産生又は悪化した気管支過敏症を特徴としてもよい。好ましい実施態様では、処置される慢性気道疾患は、喘息、任意で重症喘息、重症の難治性喘息、II型高値(TypeII High)喘息、アトピー性又はアレルギー性喘息である。
【００２５】
本明細書に記載の方法は、慢性気道疾患、好ましくは喘息を、杯細胞化生(又はGCM)を減少させて処置するために役立つだろう。代わりに又は追加的に、この方法は、慢性気道疾患、好ましくは喘息を、気管支過敏症(BHR)を減少させることにより処置するために役立つだろう。この方法は更に、例えば、患者へ、慢性気道疾患を処置するための１以上の追加的な治療薬を投与する、追加的なステップを含むこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
（図面の簡単な説明）
【図１】図1は、IL-4が誘導するHT-2細胞の増殖、及びIL-5が誘導するTF-1細胞の増殖のインビトロ細胞アッセイで評価したIL-4Rα単一特異性抗体及びIL-5単一特異性抗体両方の、中和活性を示す。IL-4Rα単一特異性抗体 (正方形)及びIL-5単一特異性抗体 三角形)は、マウスIL-4及びIL-5が誘導したHT-2及びTF-1細胞の増殖を、それぞれ強力に阻害した。結果を、2回の独立した実験中の3組±SEMの平均として示す。
【００２７】
【図２】図2は、様々な濃度(0〜20μg/mL)でのモノクローナル抗体(IL-4Rα抗体、IL-5抗体又は無関係なIgG2a抗体)と、固定化された標的(IL-4Rα又はIL-5)との間の相互作用を表示する表面プラズモン共鳴（SPR）センサーグラムを示す。
【００２８】
【図３】図3は、モノクローナル抗体(IL-4Rα抗体、IL-5抗体又は無関係なIgG2a抗体)及びその標的(IL-4Rα又はIL-5)で構成される混合物と、固定化されたタンパク質(IL-4、IL-13Rα又はIL-5Rα)との間の相互作用を表示するSPRセンサーグラムを示す。
【００２９】
【図４】図4は、IL-4Rαモノクローナル抗体処置前後の、FACSで分析された、精製B細胞のMHCクラスII抗原を示す。IL-4Rαモノクローナル抗体は、精製B細胞でIL-4誘導されるMHCクラスII抗原を、強力に阻害した。
【００３０】
【図５】図5は、喘息のインビボマウスモデルでのIL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体の効果を試験するための実験結果を示す。Aは、イエダニ(HDM)マウスモデルを使用した、実験設定の図的表示である。IL-4Rα及びIL-5抗体処置は、感作期及びチャレンジ期の両方の間、HDM処置されたC57BL/6Jマウスへの注入により行われた。Bは、IL-4Rα単一特異性抗体、IL-5単一特異性抗体、IL-4α/IL-5単一特異性抗体の組合せ、又は無関係なIgG2a抗体を投与されたマウスの、FACSで分析された、気管支肺胞洗浄液(BAL)中の異なる細胞数を示す。IgG2a処置されたHDM感作誘導マウスでは、好酸球細胞数は、アレルゲンチャレンジで増加した。IL-4Rα単一特異性抗体、IL-5単一特異性抗体での処置後、及びIL-4α/IL-5単一特異性抗体の組合せでの処置後は、コントロールIgG2a抗体処置と比較して、好酸球細胞数の有意な減少が観察された。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、コントロールIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001、****P≦0.0001を示す。
【００３１】
【図６】図6は、喘息のインビボマウスモデルとして、イエダニ(HDM)マウスモデルを使用した実験設定の図的表示である。IL-4Rα及びIL-5抗体処置は、チャレンジ期の間のみ、HDM処置されたC57BL/6Jマウスへの注入により行われた。
【００３２】
【図７】図7は、IL-4Rα単一特異性抗体、IL-5単一特異性抗体、IL-4Rα/IL-5単一特異性抗体の組合せ、又は無関係なIgG2a抗体を投与されたマウスの、FACSで分析された、BAL中の異なる細胞数を示す。IgG2a処置されたHDM感作誘導マウスでは、好酸球細胞数は、アレルゲンチャレンジで増加した。IL-4Rα単一特異性抗体での処置後、又はIL-5単一特異性抗体での処置後は、コントロールIgG2a抗体処置と比較して、好酸球細胞数の有意な減少が観察された。IL-4α/IL-5単一特異性抗体の組合せでの処置後は、更なる好酸球細胞数の減少が観察された。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、コントロールIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、**P≦0.01、***P≦0.001、****P≦0.0001を示す。
【００３３】
【図８】図8は、ELISAで決定された、３日間エクス・ビボでHDM再刺激された腸間膜リンパ節(MLN)細胞によるIL-5及びIL-13サイトカインの産生を示す。アレルゲン再刺激されたMLN細胞培養物でのエフェクターサイトカインIL-5及びIL-13のインビトロ産生は、IgG2a処置されたHDM感作誘導マウスでのアレルゲンチャレンジによりブーストされた。しかし、この応答は、IL-4Rα単一特異性抗体及び両方の単一療法の組合せでの処置後は有意に減少した。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、コントロールIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、**P≦0.01、***P≦0.001を示す。
【００３４】
【図９】図9は、ELISAで決定された、IL-4Rα単一特異性抗体、IL-5単一特異性抗体、IL-4Rα/IL-5単一特異性抗体の組合せ、又は無関係なIgG2a抗体で処置後の、HDM特異的IgE及びIgG1の血清レベルを示す。HDM特異的IgG1及びIgEの血清濃度は、IgG2a処置されたマウスでのアレルゲンチャレンジによりブーストされた。IL-4Rαモノクローナル抗体及びIL-4Rα/IL-5モノクローナル抗体の組合せは、アレルゲン誘導されたIgG1及びIgEでのこの増加を、有意に減少できた。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、*P≦0.05、ns:有意ではない、**P≦0.01、****P≦0.0001を示す。
【００３５】
【図１０】図10は、IL-4Rα単一特異性抗体、IL-5単一特異性抗体、及びIL-4Rα/IL-5単一特異性抗体の組合せで処置されたマウスの肺中でのムチン、Muc5AC、Agr2、及びSpdefの発現を示す。Aは、IL-4Rα単一特異性抗体、IL-5単一特異性抗体、IL-4Rα/IL-5単一特異性抗体の組合せ、又は無関係なIgG2a抗体で処置された後の、マウス肺中のMuc5AC共焦点染色を示す。Bは、qRT-PCRで決定された、Muc5ac及びAgr2の肺mRNA発現レベルを示す。これら２個の遺伝子のmRNA発現レベルは、マウス内でのPBSチャレンジと比較して、HDMチャレンジにより誘導された。IL-4Rα及びIL-5抗体単独では、Muc5ac又はAgr2 mRNAレベルのこの増加を有意に逆転しなかった。しかし、単一特異性IL-4Rαモノクローナル抗体及びIL-5モノクローナル抗体両方の組合せは、HDMが介在するMuc5ac又はAgr2 mRNAレベルの増加を有意に減少させた。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、**P≦0.01、****P≦0.0001を示す。
【００３６】
【図１１】図11は、増量したメタコリン用量への曝露後に、flexiVent (SCIREQ社、(登録商標))を使用して測定した気管支過敏症(BHR)を示す。データは、グループ当り少なくともn＝6マウスでの３個の独立した実験を表示する。気管支の過敏反応性は、コントロールIgG2a抗体処置と比較して、IL-4Rα/IL-5単一特異性抗体の組合せでの処置後に有意に減少し、抵抗レベルは、PBSだけを投与されてチャレンジを受けないマウスで観察されたレベルに戻った。結果を平均±SEMとして示す。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、*P≦0.05を示す。
【００３７】
【図１２】図12は、適切に対になった、目的とする二重特異性IL-4Rα/IL-5抗体を単離するための、抗イディオタイプのデュアルな精製プロセスの概略図である。(a)異なる重鎖及び軽鎖対から形成された４種の可能な組合せの混合物から、IL-4Rα単一特異性抗体の正確なHC/LC対のみを認識する抗イディオタイプVHHを使用して、この対を含む抗体を取り出した。(b)IL-5単一特異性抗体の正確なHC/LC対のみを認識するVHH抗体を含む第二の抗イディオタイプカラムを使用して、αIL-5単一特異性抗体の適切に対になったHC/LCを含む二重特異性抗体を採取した。(c)前記により、正確なHC/LC対を有する、目的としたIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を単離した。
【００３８】
【図１３】図13は、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体のデュアル標的特性を検証する。A.コートされたIL-4Rα-Fc上に、IL-4Rα単一特異性抗体又はIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を逐次的に注入し、続いてIL-4Rα-Fc又はIL-5の2回目の注入を行った後に、SPRシグナルを測定した。二重特異性の1個のアームはコートされたIL-4Rαへ結合し、別のアームは注入されたIL-5へ結合した。B.コートされたIL-5上に、IL-5単一特異性抗体又はIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を逐次的に注入し、続いてIL-4Rα-Fc又はIL-5の2回目の注入を逐次的に行った後に、SPRシグナルを測定した。二重特異性の1個のアームはコートされたIL-5へ結合し、別のアームは注入されたIL-4Rαへ結合した。
【００３９】
【図１４】図14は、チャレンジ期の間のみ、抗体処置剤をHDM処置されたC57BL/6Jマウスへ注入する、実験設定の図的表示を示す。標的の等モル阻害を比較し、抗体の総量の違いを排除するため、下記用量の抗体をそれぞれのマウスに投与した:75μgの無関係なIgG2a抗体と組合せた、それぞれ75μgの単一特異性抗体; 組み合わせて注入した、それぞれ75μgの単一特異性抗体;又は150μgのIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体。
【００４０】
【図１５】図15は、IL-4Rα単一特異性抗体、IL-5単一特異性抗体、IL-4α/IL-5単一特異性抗体の組合せ、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体、又は無関係なIgG2a抗体を投与された、HDM処置されたマウスの、FACSで分析された、BAL中の異なる細胞数を示す。感作化マウスでのHDMチャレンジは、BAL液中の好酸球数を増加させた。単一特異性IL-4Rα及びIL-5抗体(75μg＋75μg)両方の組合せを投与されるマウス及びIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を投与されるマウスへの注入後は、この好酸球数の増加が有意に減少した。両方の単一特異性抗体の組合せ、及び二重特異性抗体は、コントロールでIgG2a抗体投与された、HDM処置マウスと比較して、好酸球数の有意な減少を生じた。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、***P≦0.001、****P≦0.0001を示す。
【００４１】
【図１６】図16は、ELISAで決定された、３日間エクス・ビボでHDM再刺激された腸間膜リンパ節(MLN)細胞によるIL-5及びIL-13サイトカインの産生を示す。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、***P≦0.001、****P≦0.0001を示す。
【００４２】
【図１７】図17は、ELISAで決定された、IL-4Rα単一特異性抗体、IL-5単一特異性抗体、IL-4Rα/IL-5単一特異性抗体の組合せ、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体、又は無関係なIgG2a抗体で処置後のHDM特異的IgE及びIgG1の血清レベルを示す。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001を示す。
【００４３】
【図１８】図18は、qRT-PCRで決定された、Muc5ac、Agr2、及びSpdefの肺mRNA発現レベルを示す。これら２個の遺伝子のmRNA発現レベルは、マウス内でのPBSチャレンジと比較してHDMチャレンジにより誘導された。IL-4Rα及びIL-5抗体単独では、Muc5ac又はAgr2 mRNAレベルのこの増加を有意に逆転しなかった。しかし、単一特異性IL-4Rαモノクローナル抗体及びIL-5モノクローナル抗体両方の組合せ、及びIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、Muc5ac又はAgr2 mRNAレベルのHDMを介した増加を有意に減少させた。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、*P≦0.05、**P≦0.01、****P≦0.0001を示す。
【００４４】
【図１９】図19は、増加したメタコリン用量への曝露後に、flexiVent(SCIREQ社、(登録商標))を使用して測定したBHRを示す。データは、グループ当りn＝6マウスでの２個の独立した実験を表示する。気管支の過敏反応性は、IL-4Rα/IL-5単一特異性抗体の組合せでの処置後、及びIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体での処置後に、コントロールIgG2a抗体での処置と比較して有意に減少した。単一特異性抗体の組合せでの処置後又は二重特異性抗体での処置後の抵抗レベルは、PBSだけを投与されてチャレンジを受けないマウスで観察されたレベルに戻った。結果を平均±SEMとして示す。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、*P≦0.05を示す。
【００４５】
【図２０】図20は、２個のIL-5scFv断片へ結合しているIL-4Rα IgGを有する、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体の構造を示す。IL-4Rα IgGのFabアームは、抗体36B7のVH及びVLドメイン配列(それぞれ配列番号45及び46参照)を有する。IL-5scFv断片のVH及びVLドメインは、抗体95G7から由来し、それぞれ配列番号76及び79で表される配列を有する。
【００４６】
【図２１】図21は、IL-5が誘導したTF-1細胞の増殖のインビトロ細胞アッセイで評価した、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体の中和活性を示す。図20の二重特異性抗体を、１個のIL-4Rαモノクローナル抗体(36B7)及び２個のIL-5モノクローナル抗体(95G7hIgG1及び95A7mIgG2a)と共に試験した。
【００４７】
【図２２】図22は、喘息のインビボマウスモデルとして、イエダニ(HDM)マウスモデルを使用した実験設定の図的表示である。IL-4Rα及びIL-5抗体処置は、チャレンジ期の間のみ、HDM処置されたC57BL/6Jマウスへの注入により行われた。
【００４８】
【図２３】図23は、IL-4Rα/IL-5単一特異性抗体の組合せ、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体(Bs 4Rsc5)、又は無関係なIgG2a抗体を投与した、HDM処置されたマウスの、FACSで分析された、BAL中の異なる細胞数を示す。感作化されたマウスでのHDMチャレンジは、BAL液中の好酸球及びリンパ球数を増加させた。この細胞数の増加は、単一特異性IL-4Rα及びIL-5抗体両方の組合せを投与したマウス、及びIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を投与したマウスへの注入後は、有意に減少した。P値は、一元配置ANOVAテストを反映し、無関係のIgG2抗体に対して、ns:有意ではない、***P≦0.001、****P≦0.0001を示す。
【００４９】
【図２４】図24は、qRT-PCRで決定された、Muc5ac、Agr2、及びSpdefの肺mRNA発現レベルを示す。これら２個の遺伝子のmRNA発現レベルは、マウス内でのPBSチャレンジと比較してHDMチャレンジにより誘導された。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（詳細な記載）
（A.定義）
本明細書に別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明の技術分野の当業者によって、通常理解されている意味を有するものとする。
【００５１】
「組合せ療法」−本明細書で使用する用語「組合せ療法」は、対象、例えばヒト対象が、2以上の治療薬を与えられる処置を指す。本発明の「組合せ」は、「組合せ療法」として使用されるためのものである。２以上の治療薬は、通常は、単一の疾患、本明細書では慢性気道疾患、を処置するために投与される。本発明の組合せ又は組合せ療法は、複数の2型サイトカインシグナル伝達経路を標的とするアンタゴニストを組み合わせる。特に、本明細書に記載の組合せ療法は、サイトカイン:サイトカイン受容体:IL-5:IL-5R;IL-4:IL-4R及びIL-13:IL-13Rを標的とする。これらサイトカイン-サイトカイン受容体は、本明細書で更に詳細に記載される。好ましい実施態様では、アンタゴニストは、それらサイトカイン又はサイトカイン受容体それぞれの標的へ特異的に結合する抗体分子である。本明細書に記載されるとおり、本組合せ療法に含まれるアンタゴニストは、それを必要とする対象又は患者への投与のために、共配合されてもよく、例えば別個の組成物として別々に提供されてもよい。IL-4Rαに結合する抗体分子及びIL-5に結合する抗体分子を含む該組合せの実施態様において、本組合せの抗体分子は、単一の抗体内に、例えば二重特異性抗体等の多重特異性抗体形式で含まれてもよい。
【００５２】
「アンタゴニスト」−本明細書で使用する用語「アンタゴニスト」は、その標的サイトカイン又はサイトカイン受容体の機能を阻害できる任意の薬剤又は分子を意味する。本明細書で使用されるIL-5:IL-5Rのアンタゴニストは、その同族受容体複合体「IL-5R」へのIL-5の結合によって開始されるシグナル伝達を阻害できる任意の薬剤又は分子を意味する。本明細書で使用されるIL-4:IL-4Rのアンタゴニストは、その同族I型受容体複合体「IL-4R」へのIL-4の結合によって開始されるシグナル伝達を阻害できる任意の薬剤又は分子を意味する。本明細書で使用されるIL-13:IL-13Rのアンタゴニストは、その同族受容体複合体「IL-13R」へのIL-13の結合によって開始されるシグナル伝達を阻害できる任意の薬剤又は分子を意味する。本明細書で説明されるとおり、2型サイトカインIL-5;IL-4及びIL-13が結合する受容体複合体は、通常、２個の受容体サブユニットから構成される。例えばIL-5:IL-5Rのアンタゴニストは、IL-5とその受容体複合体との会合を阻害し、又はIL-5R複合体の２個のサブユニット(IL-5Rα及びβc)間の会合を阻害して、IL-5により介されるシグナル伝達を阻害するか遮断するだろう。同様に、IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニストも、サイトカイン(IL-4又はIL-13)とその受容体複合体との会合を阻害し、又はIL-4R又はIL-13R複合体の２個のサブユニット間の会合を阻害して、IL-4又はIL-13により介されるシグナル伝達を阻害するか遮断するだろう。本明細書で説明されるとおり、IL-4R及びIL-13R複合体は、共通の受容体サブユニットIL-4Rαを共有する。更に又、サイトカインIL-4は、それ自体のI型受容体複合体「IL-4R」を介してだけでなく、IL-13R複合体を介しても、シグナル伝達することができる。従って、IL-4Rαのアンタゴニストは、IL-4R及びIL-13R複合体両方を妨害して、IL-4及びIL-13両方を介するシグナル伝達を阻害できる。更に又、いくつかの場合には、IL-13R複合体のアンタゴニストは、IL-4を介するシグナル伝達を阻害することもある。
【００５３】
本発明の組合せで使用されるIL-5:IL-5R、IL-4:IL-4R及びIL-13:IL-13Rアンタゴニストは、任意の適切な薬剤又は分子の形を取ってもよい。ある実施態様では、アンタゴニストは、標的の発現、例えば、IL-4Rα又はIL-5発現をダウンレギュレートして、その標的の機能を阻害することもある。別の実施態様では、アンタゴニストは、サイトカイン又は受容体サブユニットへ直接結合して、その標的の機能を阻害することもある。本明細書で説明される通り、IL-5:IL-5Rのアンタゴニストは、サイトカインIL-5(IL-5のアンタゴニストと称される)又はIL-5Rサブユニット(IL-5Rαのアンタゴニスト若しくはβcのアンタゴニストと称される)の一つに結合することもある。同様に、IL-4:IL-4Rのアンタゴニストは、サイトカインIL-4(IL-4のアンタゴニストと称される)又はI型IL-4Rサブユニット(IL-4Rαのアンタゴニスト若しくはγcのアンタゴニストと称される)の一つに結合することもある。
【００５４】
好ましい実施態様では、アンタゴニストはその標的に特異的である。例えば、IL-4Rαのアンタゴニスト(又はIL-4Rαアンタゴニスト)は、他の分子標的と比較してIL-4Rαの機能を優先的に阻害するだろう。IL-5アンタゴニストは、他の分子標的と比較してIL-5の機能を優先的に阻害するだろう。アンタゴニストは、通常、それらの標的と直接的な相互作用をすることにより、例えばIL-4Rα若しくはIL-5mRNA又はタンパク質へ選択的に結合することにより、求められるレベルの特異性を達成するだろう。アンタゴニストとして作用できる適切な薬剤又は分子には、阻害性RNA種、例えばsiRNA又はshRNA、小分子阻害剤、生物学的アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、本組合せのアンタゴニストは抗体分子である。
【００５５】
「抗体分子」−本明細書で使用する用語「抗体分子」は、改変抗体、ヒト化抗体、生殖細胞系列抗体、及びそれらの抗原結合断片等のバリアントを含む、全長抗体及びそれらの抗原結合断片を包含するものである。用語「抗体」は、通常は、２本の重鎖及び２本の軽鎖の組合せを有するヘテロ四量体免疫グロブリンポリペプチドであって、該ポリペプチドは、目的の抗原(例えば、IL-4Rα又はIL-5)への有意な特異的免疫反応活性を有するもの、を指す。IgGクラスの抗体として、抗体は、分子量約23,000ダルトンの２本の同一のポリペプチド軽鎖、及び、分子量53,000〜70,000の２本の同一の重鎖を含む。これら４本の鎖はジスルフィド結合で接続されて「Y」立体配置を形成し、この軽鎖は、「Y」の口の部分から始まって可変領域へ続く重鎖を挟んでいる(bracket)。抗体の軽鎖は、カッパ又はラムダ(κ、λ)のいずれかとしてクラス分けされる。それぞれの重鎖クラスは、カッパ又はラムダ軽鎖のいずれかと結合できる。一般的に、軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合をし、２本の重鎖の「テール」部分は、共有結合性のジスルフィド結合により、又は免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞又は遺伝子設計された宿主細胞内で産生される時は非共有結合により、互いに結合している。重鎖内では、アミノ酸配列は、Y立体配置の分岐した両端のN末端からそれぞれの鎖の下部にあるC末端まで続く。
【００５６】
当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン、(γ、μ、α、δ、ε)としてクラス分けされ、それらの中にはいくつかのサブクラスもある(例えば、γ1〜γ4)ことを認識するだろう。抗体の「クラス」をそれぞれIgG、IgM、IgA、IgD、又はIgEとして決定するのは、これら鎖の特性による。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等は、充分に特徴付けられており、機能的特性をもたらすことが知られている。本明細書で使用する用語「抗体分子」は、抗体の任意のクラス又はサブクラスからの、完全長抗体又はその抗原結合断片を包含する。
【００５７】
本明細書で使用する用語「抗体分子」は又、「重鎖のみ抗体」又は「VHH抗体」を包含することも意図される。用語「重鎖のみ抗体」又は「VHH抗体」は、ラクダ、ラマ、アルパカを含むラクダ科の種によってのみ産生される抗体のタイプを指す。重鎖のみ抗体は、２本の重鎖で構成され、軽鎖は欠損している。重鎖はそれぞれ可変ドメインをN末端に有し、これら可変ドメインは、従来のヘテロ四量体抗体の重鎖の可変ドメイン、即ち前記VHドメイン、と区別するために、「VHH」ドメインと称される。
【００５８】
一般的用語「抗体分子」に包含される抗原結合断片に関して、これら断片は、完全長の抗体、又は、抗原結合活性を保持しつつ、無傷若しくは完全な抗体よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体鎖の一部若しくは部分である。本明細書で使用する用語「抗体分子」は、抗体軽鎖可変ドメイン(VL);抗体重鎖可変ドメイン(VH);一本鎖抗体(scFv);F(ab’)2断片;Fab断片;Fd断片;Fv断片;一本アーム(一価)抗体;ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はそれら抗原結合断片の、組合せ、アセンブリ若しくはコンジュゲーションにより形成されたいずれかの抗原結合分子、から選択される抗原結合断片を包含することを意図する。本明細書で使用する用語「抗体分子」は更に、ユニボディ;ドメイン抗体;及び、ナノボディから構成される群から選択される抗体断片を包含することを意図する。断片は、例えば無傷又は完全な抗体若しくは抗体鎖の、化学的又は酵素的処置を介するか、又は組換えの手法により、得ることができる。
【００５９】
「可変領域」又は「可変ドメイン」−用語「可変領域」及び「可変ドメイン」は、本明細書では互換的に使用され、同等の意味を有することが意図される。用語「可変」は、可変ドメインVH及びVLのある部分が、抗体間の配列において広範囲に異なる事実を指し、それは、その標的抗原に対するそれぞれ抗体の特別な結合及び特異性に利用される。ただし、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分散されているわけではない。それは、VLドメイン及びVHドメインのそれぞれで「超可変ループ」と呼ばれる3個のセグメントに集中しており、抗原結合部位部分を形成している。Vラムダ軽鎖ドメインの第一、第二、及び第三超可変ループは、本明細書でL1(λ)、L2(λ)及びL3(λ)と称され、VLドメイン内に、残基24-33(9、10又は11アミノ酸残基から構成されるL1(λ))、49-53(3残基から構成されるL2(λ))及び90-96(5残基から構成されるL3(λ))を含むものとして定義されることもある(Moreaらの文献、Methods 20:267-279 (2000))。Vカッパ軽鎖ドメインの第一、第二、及び第三超可変ループは、本明細書でL1(κ)、L2(κ)及びL3(κ)と称され、VLドメイン内に、残基25-33(6、7、8、11、12又は13残基から構成されるL1(κ))、49-53(3残基から構成されるL2(κ))及び90-97(6残基から構成されるL3(κ))を含むものとして定義されることもある(Moreaらの文献、Methods 20:267-279 (2000))。VHドメインの第一、第二、及び第三超可変ループは、本明細書でH1、H2及びH3と称され、VHドメイン内に、残基25-33(7、8又は9残基から構成されるH1)、52-56(3又は4残基から構成されるH2)及び91-105(高度に可変な長さのH3)を含むものとして定義されることもある(Moreaらの文献、Methods 20:267-279 (2000))。
【００６０】
特に明記しない限り、用語L1、L2及びL3は、それぞれVLドメインの第一、第二、及び第三超可変ループを指し、Vカッパ及びVラムダ両方のアイソタイプから得られる超可変ループを包含する。用語H1、H2及びH3は、それぞれVHドメインの第一、第二、及び第三超可変ループを指し、γ、ε、δ、α又はμを含む任意の公知の重鎖アイソタイプから得られる超可変ループを包含する。
【００６１】
超可変ループL1、L2、L3、H1、H2及びH3は、それぞれ下記に定義される「相補性決定領域」又は「CDR」の一部を含むものでもよい。用語「超可変ループ」及び「相補性決定領域」は厳密には同義ではなく、その理由は、超可変ループ(HV)は構造に基づいて定義されているのに対し、相補性決定領域(CDR)は配列可変性に基づいて定義されており(Kabatらの文献、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983)、HVとCDRの制限は、いくつかのVH及びVLドメインで異なる場合があるからである。
【００６２】
VL及びVHドメインのCDRは、通常、下記アミノ酸、軽鎖可変ドメイン内の残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及び89-97(LCDR3)、並びに、重鎖可変ドメイン内の残基31-35又は31-35b(HCDR1)、50-65(HCDR2)及び95-102(HCDR3)、を含むものとして定義できる(Kabatらの文献、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。従って、HVは対応するCDR内に含まれてもよく、本明細書でVH及びVLドメインの「超可変ループ」に言及する場合は、特に明記しない限り、対応するCDRを包含すると解釈されるべきであり、その逆も同様である。
【００６３】
可変ドメインの更に高度に保存された部分は、下記に定義されるフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。ネイティブ重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、4個のFR(それぞれFR1、FR2、FR3及びFR4)を含み、3個の超可変ループによって接続された、βシート立体配置を、主にとっている。各鎖それぞれの超可変ループはFRによって極めて接近して一緒に保持され、残りの鎖の超可変ループとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造分析により、相補性決定領域によって形成される結合部位の配列及び形状との関係が、明らかになった(Chothiaらの文献、J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)); Tramontanoらの文献、J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990))。それらの高い配列可変性にもかかわらず、6個のループ中5個は、「カノニカル構造」と呼ばれる、ほんの僅かなレパートリーの主鎖立体構造をとる。これら立体構造は、第一にループ長さによって決定され、第二に、ループ内及びフレームワーク領域内の特定位にある、鍵となる残基の存在によって決定され、その残基は、それらのパッキング、水素結合又は異常な主鎖立体構造を呈する能力により、立体構造を決定する。
【００６４】
「CDR」−本明細書で使用する用語「CDR」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖ポリペプチド両方の可変領域内に見られる、不連続な、抗原を結合する部位を意味する。これら特別な領域は、Kabatらの文献、J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) 及び Kabatらの文献、Sequences of protein of immunological interest. (1991), 並びにChothiaらの文献、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 及びMacCallumらの文献、J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)により記載されており、それら定義が互いに比較された場合、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含むものである。上記記載の文献それぞれにより定義されたCDRを包含するアミノ酸残基を、比較のために示す。好ましくは、用語「CDR」は、配列比較に基づいてKabatにより定義されたCDRである。
【００６５】
表１:CDR定義
【表１】
2021513974.tif 000003
1:残基番号は、前記Kabatらの命名法に従った。
2:残基番号は、前記Chothiaらの命名法に従った。
3:残基番号は、前記MacCallumらの命名法に従った。
【００６６】
「フレームワーク領域」−本明細書で使用する用語「フレームワーク領域」又は「FR領域」は、可変領域部分であって(例えば、KabatのCDR定義を使用する)CDR部分ではないアミノ酸残基を含む。従って、可変領域フレームワークは、約100-120アミノ酸長さの間であって、CDRの外側のアミノ酸のみを含む。重鎖可変ドメインの特別例として、及び、Kabatらにより定義されたCDRとして、フレームワーク領域1は、アミノ酸1-30を包含する可変領域のドメインに対応し;フレームワーク領域2は、アミノ酸36-49を包含する可変領域のドメインに対応し;フレームワーク領域3は、アミノ酸66-94を包含する可変領域のドメインに対応し;フレームワーク領域4は、アミノ酸103から可変領域末端までの可変領域ドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域も同様に、それぞれの軽鎖可変領域CDRによって分離される。同様に、Chothiaら又はMcCallumらの文献によるCDR定義を使用して、フレームワーク領域境界は、前記のように、それぞれのCDR末端により分離されている。好ましい実施態様では、CDRはKabatにより定義されたものである。
【００６７】
天然抗体では、それぞれの単量体抗体上に存在する6個のCDRは、アミノ酸の短く不連続な配列であり、抗体が水性環境でその三次元立体配置を呈する場合に、抗原結合部位を形成するように特異的に配置されている。重鎖及び軽鎖可変ドメインの残りの部分は、アミノ酸配列の分子間可変性がより少なく、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は、主にβシート立体構造を採用し、CDRはループを形成して、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成する。従って、これらフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性の相互作用によって6個のCDRを正しい方向に配置するための足場を形成するように作用する。配置されたCDRによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を定める。この相補的表面は、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。CDRの配置は、当業者により容易に同定できる。
【００６８】
「定常領域」−本明細書で使用する用語「定常領域」は、可変ドメイン又は可変領域の外側の、抗体分子部分を指す。免疫グロブリン軽鎖は、通常、「CL又はCL1ドメイン」と称される単一ドメイン「定常領域」を有する。このドメインはVLドメインのC末端に存在する。免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリンのクラス（γ、μ、α、δ、ε）に応じてそれらの定常領域が異なる。重鎖γ、α、及びδは、CH1ドメイン及びCH2ドメインを分ける可撓性ヒンジ領域を備えた、3個の免疫グロブリンドメイン（CH1、CH2、CH3と称される）から構成される定常領域を有する。重鎖μ及びεは、4個のドメイン（CH1-CH4）から構成される定常領域を有する。重鎖の定常ドメインは、VHドメインのC末端に配置されている。
【００６９】
重鎖及び軽鎖免疫グロブリン中のアミノ酸の番号付けは、Y立体配置の分岐した両端のN末端から、各鎖の最下部のC末端まで続く。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常ドメインを定義するために、異なる番号付けスキームが使用される。EUの番号付けスキームに従い、IgG分子の重鎖定常ドメインは下記のように特定される：CH1-アミノ酸残基118-215;CH2-アミノ酸残基231-340;CH3-アミノ酸残基341-446。Kabat番号付けスキームに従い、IgG分子の重鎖定常ドメインは下記のように特定される:CH1-アミノ酸残基114-223;CH2-アミノ酸残基244-360;CH3-アミノ酸残基361-477。「Fcドメイン」又は「Fc領域」は、通常、CH2及びCH3ドメインを含む重鎖の定常領域部分を特定する。Fc領域は又、ヒンジ領域からのいくつかの残基を含むこともある。「ヒンジ領域」は、CH1ドメインをCH2ドメインとつなぐ重鎖分子の部分を含む。「ヒンジ領域」は、CH1ドメインをCH2ドメインとつなぐ重鎖分子の部分を指す。このヒンジ領域は約25残基を含み、可撓性であり、そのため2個のN末端抗原結合領域が独立に動くことを可能にする。ヒンジ領域は3個の別個のドメイン、上部、中央及び下部ヒンジドメインへと細分することができる(Roux K.H.らの文献、J. Immunol. 161:4083-90 1998)。「完全ヒト」ヒンジ領域を含む本発明の抗体は、下記表2に示すヒンジ領域配列の一つを含むものでもよい。
【００７０】
表２:ヒトのヒンジ配列
【表２】
2021513974.tif 000004
【００７１】
「特異性」及び「多重特異性抗体」−本明細書に記載の組合せ療法で使用するための抗体分子は、特定の標的抗原に結合する。抗体分子はそれらの標的抗原に「特異的に結合する」ことが好ましく、この用語「特異的に結合する」は、所定の標的、例えばIL-4Rα及びIL-5と優先的に免疫反応できる、任意の抗体分子の能力を指す。本組合せ及び方法の抗体分子は、単一特異性であって、特定の標的に特異的に結合する１以上の結合部位を含んでも良い。本組合せ及び方法の抗体分子は、「多重特異性抗体」フォーマット、例えば二重特異性抗体に組み込まれても良く、この多重特異性抗体は、２以上の標的抗原に結合するものである。例えば、一の実施態様では、本発明の組合せは、IL-4Rαに特異的に結合する第一の抗体分子及びIL-5に特異的に結合する第二の抗体分子を含む二重特異性抗体を含む。複数の特異性を達成するために、「多重特異性抗体」は、通常は、異なるVH-VL対を有する重鎖及び軽鎖ポリペプチドの異なる組合せ又は対を含むように設計される。多重特異性、特に二重特異性抗体は、ネイティブな抗体の全体的な立体構造、例えばFc領域へコンジュゲートされている異なる特異性のFabアームを有するY形抗体、を採用するように設計されてもよい。別の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、非ネイティブの立体構造、例えば、異なる特異性を有する可変ドメイン又は可変ドメイン対がFc領域の反対側の末端に配置される構造、を採用するように設計されても良い。
【００７２】
「改変抗体」−本明細書で使用する用語「改変抗体」は、天然に存在しないような、変更された抗体の合成形態、例えば、少なくとも２本の重鎖部分を含むが２本の完全重鎖を含まない抗体（ドメイン欠損された抗体又はミニボディ等）;2以上の異なる抗原又は単一抗原上の異なるエピトープへ結合するように変更された抗体の多重特異的形態（例えば、二重特異性、三重特異性等））;scFv分子に接続された重鎖分子等がある。scFv分子は当分野で公知であり、例えば米国特許第5,892,019号に記載されている。更に、用語「改変抗体」は、多価形態の抗体（例えば、三価、四価等、同一抗原の3個以上のコピーに結合する抗体）を含む。別の実施態様では、本発明の改変抗体は、CH2ドメインを欠く少なくとも一の重鎖部分を含み、かつ、受容体リガンド対の一員の結合部分を含むポリペプチドの結合ドメインを含む、融合タンパク質である。
【００７３】
「ヒト化置換」−本明細書で使用する用語「ヒト化置換」は、抗体のVH又はVLドメイン内の特定の位置に存在するアミノ酸残基が、参照ヒトVH又はVLドメイン中の同等の位置に生じるアミノ酸残基で置き換えられる、アミノ酸置換を指す。参照ヒトVH又はVLドメインは、ヒト生殖細胞系列によってコードされたVH又はVLドメインでもよい。ヒト化置換は、本明細書で定義されるように、抗体のフレームワーク領域及び／又はCDRで行うことができる。
【００７４】
「ヒト化バリアント」−本明細書で使用する用語「ヒト化バリアント」又は「ヒト化抗体」は、参照抗体と比較して1以上の「ヒト化置換」を含むバリアント抗体を指し、参照抗体の部分(例えば、VHドメイン及び／若しくはVLドメイン又は、少なくとも一のCDRを含むそれらの一部)は、非ヒト種に由来するアミノ酸を有し、「ヒト化置換」は非ヒト種由来のアミノ酸配列内で起こる。
【００７５】
「生殖細胞系列バリアント」−用語「生殖細胞系列バリアント」又は「生殖細胞系列抗体」は、本明細書で特別に「ヒト化バリアント」を指すために使用され、その中での「ヒト化置換」は、抗体のVH又はVLドメイン内の特定の1又は複数の位置に存在する１以上のアミノ酸残基が、ヒト生殖細胞系列によりコードされた参照ヒトVH又はVLドメイン内の同等の位置で生じているアミノ酸残基によって置き換えられて生じるものである。全ての「生殖細胞系列のバリアント」のためには、生殖細胞系列のバリアント内で置換された置換アミノ酸残基は、単独のヒト生殖細胞系列をコードするVH又はVLドメインからのみ、又はそれらから主に、採用されるのが通常である。用語「ヒト化バリアント」及び「生殖細胞系列のバリアント」は、しばしば互換的に使用される。１以上の「ヒト化置換」をラクダ類由来(例えば、ラマ由来の)VH又はVLドメインへ導入すると、ラクダ類(ラマ)由来VH又はVLドメインの「ヒト化バリアント」を生じる。その中で置換されたアミノ酸残基が、単一のヒト生殖細胞系列をコードするVH又はVLドメイン配列から主に、又はそれらからのみ由来する場合、その結果は、ラクダ類(ラマ)由来VH又はVLドメインの「ヒト生殖細胞系列のバリアント」となるかもしれない。
【００７６】
「親和性バリアント」−本明細書で使用する用語「親和性バリアント」は、参照抗体と比較してアミノ酸配列に１以上の変化を示すバリアント抗体を指し、この親和性バリアントは、標的抗原に対して、参照抗体と比較して変化した親和性を示す。例えば、親和性バリアントは、標的、例えばIL-4Rα又はIL-5に対して、参照IL-4Rα又はIL-5抗体と比較して、変化した親和性を示すだろう。好ましくは、親和性バリアントは、標的抗原に対して、参照抗体と比較して改善された親和性を示すだろう。親和性バリアントは通常、参照抗体と比較して、CDRのアミノ酸配列内に1以上の変化を示す。そのような置換は、CDRの所定の位置に存在する元のアミノ酸を異なるアミノ酸残基により置き換えた、天然のアミノ酸残基又は非天然のアミノ酸残基でもよい。このアミノ酸置換は保存的でも非保存的でもよい。
【００７７】
「IL-5:IL-5R」−本明細書で使用する用語「IL-5」は、インターロイキン-5サイトカインを指し、用語「IL-5R」は、インターロイキン5サイトカインが結合する受容体複合体を指す。用語「IL-5:IL-5R」は、本明細書では、IL-5サイトカイン／サイトカイン受容体シグナル伝達複合体を示すために使用される。サイトカインIL-5は又、B-細胞分化因子I、好酸球分化因子、及びT細胞代替因子(TRF)として知られている。IL-5のヒトホモログは、134アミノ酸長さである(http://www.uniprot.org/uniprot/P05113)。本明細書で使用する用語「IL-5」は、タンパク質の全てのスプライスバリアントを包含することを意図する。単量体性IL-5には活性がなく、機能のためにホモ二量体が必要である。１個のIL-5ホモ二量体が、１個のIL-5受容体（IL-5R）と結合する。IL-5の受容体は2個のサブユニットから構成される。第一のサブユニットは、「IL-5受容体サブユニットアルファ」又は「IL-5Rα」であり、IL-5R-アルファ、IL-5RA、CDw125及びCD 抗原、CD125としても知られ、このサブユニットは、受容体複合体のリガンド結合部分を形成する。IL-5Rαのヒトホモログは、420アミノ酸長さである（http://www.uniprot.org/uniprot/Q01344）。IL-5R複合体の第二のサブユニットは、非リガンド結合の共通のシグナル変換ベータサブユニット又はベータ鎖（βc）である。IL-5は、限られた数の間葉系細胞種から分泌される。IL-5を発現することが知られている細胞には、好酸球、NK細胞、TC2CD8＋T細胞、マスト細胞、CD45＋CD4＋T細胞、ガンマデルタT細胞、及びIL-1ベータ活性化内皮細胞が含まれる。IL-5は、B細胞及び好酸球の増殖、細胞生存、及び成熟、並びにエフェクター機能に関与する遺伝子の発現を調節することが知られている。
【００７８】
「IL-4:IL-4R」−本明細書で使用する用語「IL-4」はインターロイキン-4サイトカインを指し、用語「IL-4R」はインターロイキン4サイトカインが結合するI型受容体複合体を指す。用語「IL-4:IL-4R」は、IL-4サイトカイン/I型サイトカイン受容体シグナル伝達複合体を示すために使用される。サイトカインIL-4は又、B細胞刺激因子1（BSF-1）、ビネトラキン(Binetrakin)、リンパ球刺激因子1として知られている。IL-4のヒトホモログは153アミノ酸長さである(http://www.uniprot.org/uniprot/P05112)。本明細書で使用する用語「IL-4」は、タンパク質の全てのスプライスバリアントを包含することを意図する。IL-4のI型受容体は２個のサブユニットで構成される。第一のサブユニットは、「IL-4Rα」、インターロイキン-4受容体サブユニットアルファ、インターロイキン-4結合サブユニット、及びCD124としても知られる。IL-4Rαは、クラスIサイトカイン受容体ファミリー内で広く発現している140kDa膜貫通型糖タンパク質である。IL-4Rαのヒトホモログは825アミノ酸長さである（http://www.uniprot.org/uniprot/P24394）。本明細書で使用する用語「IL-4Rα」は、タンパク質の全てのスプライスバリアントを包含することを意図する。I型IL-4受容体複合体内では、IL-4Rαは第二のサブユニットである共通ガンマ鎖(γc)と会合し、このγcサブユニットはIL-4に対するIL-4Rαの親和性を向上させ、IL-4を介する下流のシグナル伝達へ効果を及ぼす。IL-4受容体複合体は、例えば、B細胞、T細胞、単球、好酸球、及び線維芽細胞内に存在し、IL-4RαはJAK1/2/3-STAT6経路に結合する。IL-4応答は、Th2分化の促進、並びにアレルギー性炎症部位でのIgE産生、及び、ケモカイン及び粘液の産生の調節に関与している。
【００７９】
「IL-13:IL-13R」−本明細書で使用する用語「IL-13」は、インターロイキン-13サイトカインを指し、用語「IL-13R」は、インターロイキン13サイトカインが結合する受容体複合体を指す。IL-13受容体は又、IL-4のためのII型受容体としても作用する。用語「IL-13:IL-13R」は、IL-13サイトカイン/サイトカイン受容体シグナル伝達複合体を示すために使用される。IL-13のヒトホモログは、146アミノ酸長さである(http://www.uniprot.org/uniprot/P35225)。本明細書で使用する用語「IL-13」は、タンパク質の全てのスプライスバリアントを包含することを意図する。IL-13の受容体は、２個のサブユニットで構成される。第一のサブユニットは「IL-4Rα」であり、インターロイキン-4受容体サブユニットアルファ、インターロイキン-4結合サブユニット、及びCD124としても知られる。先に記載されているように、このサブユニットは、IL-4受容体及びIL-13受容体両方で共通する。IL-13受容体複合体内で、IL-4Rαは、第二のサブユニット、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ1、又は「IL-13Rアルファ1」、又は「IL-13Rα1」、又は「IL-13RA1」と会合する。この第二のサブユニットは、IL-13のためのリガンド結合サブユニットとして作用する。IL-4Rα及びIL-13Rα1サブユニットから構成されるIL-13R複合体は、IL-13(IL-13Rα1への結合を介して)及びIL-4(IL-4Rαへの結合を介して)に応答し、この受容体複合体へ結合するサイトカインは、JAK1/2/3-STAT6経路を介してシグナル伝達を開始する。IL-4:IL-4R複合体と同様に、IL-4Rα及びIL-13Rα1サブユニットから構成されるIL-13R複合体を介したシグナル伝達は、アレルギー性炎症部位でのIgE産生、及び、ケモカイン及び粘液の産生の調節に関与している。IL-4及びIL-13サイトカイン-受容体シグナル伝達経路に関する追加情報は、例えば、McCormick及びHellerの文献（2015）Cytokine75（1）：38-50にあり、その内容は、それ全体が本明細書に組み込まれている。
【００８０】
「慢性気道疾患」−本明細書で使用する用語「慢性気道疾患」は、「慢性呼吸器疾患（CRD）」とほとんど同じ意味で使用されることもあり、気道及び肺の他の構造の任意の疾患を意味することを意図する。慢性気道疾患の最も一般的な形態のいくつかは、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、職業性肺疾患及び肺高血圧症である。タバコの煙に加えて、他の危険因子には、大気汚染、職業的な化学物質と粉塵、及び小児期の頻繁な下気道感染症が含まれる。他の慢性気道疾患には、慢性副鼻腔炎(CRS);免疫グロブリンG4関連疾患(IgG4-RD);慢性気管支炎;気腫;慢性血管浮腫;バレット食道等の杯細胞化生が特異的な疾患;進行中の好酸球性食道炎;鼻ポリポーシス;慢性副鼻腔炎;チャーグ・ストラウス症候群;アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);好酸球増多症候群;水疱性類天疱瘡、及び嚢胞性線維症、が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
「喘息」−本明細書で使用される「喘息」は、肺中の気道の炎症に関連するあらゆる疾患又は状態を意味することを意図する。通常は、炎症は気道の神経末端の感度に影響を与え、それらが容易に刺激されるようになる。喘息発作の間、気道の内壁が腫れて気道が狭くなり、肺に出入りする空気の流れが減少する。喘息は、それぞれが異なる臨床的、生理学的及び分子的特徴を示す、マルチフェノタイプを示す不均一な疾患である。喘息亜型の例示として、重症喘息、重症の難治性喘息、軽度又は中程度の喘息、肥満関連喘息、運動誘発性喘息、アスピリン誘導性喘息、アトピー性又はアレルギー性喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、無顆粒球性(paucigranulocytic)又は非炎症性喘息、早発性喘息、遅発性喘息、II型高喘息、II型低喘息、及びI型/Th17喘息が含まれる。
【００８２】
（B.2型サイトカインシグナル伝達を阻害するための組合せ療法）
本発明は、組合せ又は組合せ療法、及びそれらの慢性気道疾患の処置における使用、特に、喘息の処置における使用に関する。本発明の組合せは、2型サイトカイン及び／又はそれらのそれぞれの受容体を標的とするアンタゴニストに関する。本発明の組合せが標的とするサイトカイン及びサイトカイン受容体には、IL-5及びその受容体IL-5R;IL-4及びそのI型受容体IL-4R;及びIL-13及びその受容体IL-13Rが含まれる。
【００８３】
第一の態様では、本発明は、(i)IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト、並びに(ii)IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニスト、を含む組合せを提供する。一の実施態様では、前記組合せは、IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト、及びIL-4:IL-4Rのアンタゴニストを含む。更なる実施態様では、前記組合せは、IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト及びIL-13:IL-13Rのアンタゴニストを含む。より更なる実施態様では、前記組合せは、IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト、IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト、及びIL-13:IL-13Rのアンタゴニストを含む。ある実施態様では、前記組合せは、IL-5及びIL-4を介したシグナル伝達を阻害する。ある実施態様では、前記組合せは、IL-5及びIL-13を介したシグナル伝達を阻害する。好ましい実施態様では、前記組合せは、IL-5、IL-4及びIL-13を介したシグナル伝達を阻害する。
【００８４】
理論に拘束されるものではないが、本発明の組合せは、2型サイトカイン活性を遮断する組合せ効果のおかげで、慢性気道疾患、特に喘息の処置に特別に効果的であると考えられる。IL-4、IL-13及びIL-5は2型サイトカインであり、本発明の組合せは、これら3個全てのサイトカインを介するシグナル伝達を阻害できる。「2型免疫応答」は、Tヘルパー(TH2)細胞として知られるCD4＋T細胞の亜群によって主に調節される免疫応答を指す。ただし、気道2型免疫応答は又、好酸球、マスト細胞、好塩基球、TH2細胞、グループ2の自然リンパ球（ILC2）及びIgE産生B細胞によっても介される。
【００８５】
IL-4、IL-13及びIL-5は、B細胞によるIgE産生、好酸球の活性化及び補充、並びに粘液産生を引き起こす。2型サイトカインは、気道上皮細胞の活性化、エフェクター細胞（マスト細胞、好酸球、及び好塩基球）の化学的誘引、並びに上皮及び上皮下マトリックスのリモデリングを含む、下流イベントのカスケードを駆動させる。例えば喘息等の慢性気道疾患では、IL-4、IL-13及びIL-5を介した異常なシグナル伝達は、気道好酸球増加、気道リモデリング、気管支過敏症が生じる可能性が、ある（Lambrecht及びHammadの文献（2015）同書を参照）。関連するリモデリングの変化には、平滑筋細胞の変化（過形成及び肥大）、粘液細胞の変化（杯細胞化生）、及び導管のリモデリングが含まれてもよい。同時に、これらの気道における炎症性及び病理学的変化は、対象者が吸入された増悪剤に対する悪化した反応を示す可能性を高くする。
【００８６】
本発明者らは、IL-4、IL-13及びIL-5を介したシグナル伝達を遮断することにより、驚くべき相乗効果が観察されることを示した。この効果は、IL-4及びIL-13のみを遮断するIL-4Rα単剤療法、又はIL-5のみを遮断するIL-5単剤療法による処置と比較すると確認できる。本明細書で提供されるデータは、IL-5:IL-5Rシグナル伝達軸を標的とするアンタゴニスト並びにIL-4:IL-4R及び／又はIL-13:IL-13Rシグナル伝達軸を標的とするアンタゴニストを含む本発明の組合せ療法が、相乗効果を生じることを示す。この効果は、慢性気道疾患のインビボモデルでの、減少したムチン産生レベル(杯細胞化生の指標)及び、減少した気管支過敏症レベルで確認できる。重要なことは、本発明の組合せ療法は、2型サイトカインを標的とするアンタゴニストを含み、インビボモデルの気管支過敏症を完全に予防することが示されたことである。
【００８７】
本発明の組合せは、(i)IL-5:IL-5R;並びに(ii)IL-4:IL-4R及び／又はIL-13:IL-13Rを標的とするアンタゴニストを含む。本明細書に記載の用語「アンタゴニスト」は、
その標的の機能を阻害できる任意の薬剤又は分子を広義に意味して使用される。例えば、IL-5:IL-5Rアンタゴニストは、IL-5を介したシグナル伝達を阻害して、IL-5サイトカイン-IL-5受容体複合体の機能を阻害するだろう。同様に、IL-4:IL-4Rアンタゴニストは、IL-4を介したシグナル伝達を阻害して、IL-4サイトカイン-IL-4受容体複合体の機能を阻害するだろう。同じように、IL-13:IL-13Rアンタゴニストは、IL-13を介したシグナル伝達を阻害して、IL-13サイトカイン-IL-13受容体複合体の機能を阻害するだろう。
【００８８】
本明細書に記載の2型サイトカイン-受容体対のアンタゴニスト、すなわちIL-5:IL-5R、IL-4:IL-4R及びIL-13:IL-13Rのアンタゴニストは、通常は、サイトカイン-受容体複合体の一成分を標的とするか、それと相互作用する。例えば、IL-5:IL-5Rのアンタゴニストは、IL-5と相互作用して、IL-5:IL-5Rシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を阻害することもある。あるいは、IL-5:IL-5Rのアンタゴニストは、受容体サブユニットIL-5Rαと相互作用して、IL-5:IL-5Rシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を阻害することもある。好ましい実施態様では、IL-5:IL-5Rのアンタゴニストは、IL-5のアンタゴニストである。同様に、IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及びIL-13:IL-13Rのアンタゴニストは、それぞれサイトカインIL-4及びIL-13と相互作用するか、受容体サブユニットと相互作用して、それぞれIL-4及び／又はIL-13のシグナル伝達を阻害することもある。
【００８９】
特に好ましいのは、本発明の組合せが、受容体サブユニットIL-4Rαのアンタゴニストを含むことである。更に好ましくは、前記組合せはIL-5のアンタゴニスト及びIL-4Rαのアンタゴニストを含む。IL-4Rαを標的とすることが好ましい理由は、この受容体サブユニットが、IL-4のI型受容体複合体の一部を（γcと共に）形成し、同様に、IL-13受容体複合体の一部を（IL-13Rα1と共に）形成するためである。従って、IL-4Rαのアンタゴニストは、IL-4:IL-4R及びIL-13:IL-13Rのアンタゴニストとして同時に作用することができ、それにより、IL-4及びIL-13両方を介するシグナル伝達を阻害することができる。特に、IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト、好ましくはIL-5のアンタゴニスト、及びIL-4Rαのアンタゴニストを含む組合せは、IL-5、IL-4及びIL-13を介するシグナル伝達を阻害できる。本明細書に記載の組合せのアンタゴニストは、好ましくは、それらのそれぞれのヒト標的に結合する。
【００９０】
好ましい実施態様では、IL-5:IL-5R、IL-4:IL-4R及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニストは抗体分子である。更に好ましくは、本組合せは、IL-5に結合する抗体分子及びIL-4Rαに結合する抗体分子を含む。
【００９１】
ある実施態様では、本組合せは、IL-5:IL-5Rアンタゴニストとして、IL-5に結合する抗体分子を含む。あるいは、本組合せは、IL-5:IL-5Rアンタゴニストとして、IL-5Rαに結合する抗体分子を含むものでもよい。本明細書に記載の組合せに組み込むことのできるIL-5及びIL-5R抗体分子は、任意の適切な、当業に公知のIL-5及びIL-5Rα抗体を含む。例示的な抗体には、IL-5に結合するメポリズマブ(mepolizumab)（Nucala社、(登録商標)）及びレスリズマブ(reslizumab)（Cinquair社、(登録商標)）、並びにIL-5Rαに結合するベンラリズマブ(benralizumab)（Fasenra社、(登録商標)）が含まれる。
【００９２】
ある実施態様では、本組合せは、IL-4:IL-4Rアンタゴニストとして、IL-4に結合する抗体分子を含む。ある実施態様では、本組合せは、IL-13:IL-13Rアンタゴニストとして、IL-13に結合する抗体分子を含む。好ましい実施態様では、本組合せはIL-4Rαに結合する抗体分子を含む。先に記載されているように、このアンタゴニストは、IL-4Rαサブユニットが両方のIL-4及びIL-13受容体複合体で共通するために、IL-4:IL-4R及びIL-13:IL-13R両方のアンタゴニストとして作用する。本明細書に記載の組合せに組み込むことのできる、IL-4及びIL-13シグナル伝達経路を標的とする抗体分子は、任意の適切な、当業に公知のIL-4、IL-13、IL-4Rα及びIL-13Rα1抗体を含む。これらの抗体には、IL-4Rα受容体に対する完全ヒト化モノクローナル抗体であるデュピルマブ(dupilumab)(Dupixent社、(登録商標))が含まれる。同様に、Sheridan C.の文献、(2018) Nat. Biotechnol. 36(1): 3-5参照。
【００９３】
本組合せの抗体分子、例えばIL-4Rαに結合する抗体分子、及び、IL-5に結合する抗体分子は、それらのそれぞれの標的への免疫反応性を示す任意の適切な抗体分子から選択してもよい。前記のとおり、用語「抗体分子」は、それらの抗原結合断片に加えて、完全長抗体をも意味するものとして本明細書で使用される。
【００９４】
本明細書に記載の組合せの抗体は、ヒト治療用途が意図されるため、通常はIgA、IgD、IgE、IgG、IgM型、しばしばIgG型であり、この場合、これらは4個のサブクラス、IgG1、IgG2a及びIgG2b、IgG3又はIgG4のいずれかに属すことができる。好ましい実施態様では、本組合せの抗体分子はIgG抗体、任意でIgG1抗体である。本抗体は、それらがそれらの標的に対して適切な免疫特異性を示すならば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)でもよい。モノクローナル抗体は、高度に特異性があり、単一の抗原部位に対するものであるため、好ましい。
【００９５】
本明細書に記載の組合せの抗原結合断片は、通常は完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含むことができる。この抗体断片の例には、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、二重特異性Fab’断片、及びFv断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、一本鎖可変断片(scFv)及び、抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる(引用により本明細書中に組み込まれているHolliger及びHudsonの文献、(2005) Nature Biotechnol. 23:1126-36参照)。
【００９６】
本明細書に記載の組合せの抗体分子は、高いヒト相同性を示してもよい。高いヒト相同性を示すこれら抗体分子は、ヒト生殖細胞系列配列に対して充分に高い％配列同一性を示す、ネイティブな非ヒト抗体のVH及びVLドメインを含む抗体を含むものでもよい。ある実施態様では、この抗体分子は、非ヒト抗体の、ヒト化バリアント又は生殖細胞系列化バリアントである。
【００９７】
ある実施態様では、本明細書に記載の組合せの抗体分子は、ラクダ類由来でもよい。ラクダ類由来抗体は、重鎖のみ抗体、即ちVHH抗体でもよく、従来のヘテロ四量体抗体でもよい。好ましい実施態様では、本組合せの抗体分子は、ラクダ類のヘテロ四量体抗体由来である。
【００９８】
例えば、本抗体分子は、ラクダ類を目的の標的で免疫化するステップを含む方法によって得られた、免疫ライブラリから選択してもよい。ラクダ類は、標的タンパク質若しくはそのポリペプチド断片で免疫化するか、又は、そのタンパク質若しくはそのポリペプチド断片を発現するmRNA分子若しくはcDNA分子で免疫化してもよい。ラクダ類種内で抗体を作製し、ラクダ類の免疫ライブラリから好ましい標的に対する抗体を選択する方法は、例えば、引用により本明細書中に組み込まれている国際特許出願番号WO2010/001251に記載されている。
【００９９】
ある実施態様では、本抗体分子は、ラクダ科ファミリー種のVHドメイン又はVLドメインから得られる、少なくとも一の超可変(HV)ループ又は相補性決定領域を含む点において、ラクダ科類由来でもよい。特に、本抗体分子は、非近交系のラクダ類、例えばラマを、例えばIL-4Rα及びIL-5で能動免疫化することで得られるVH及び／若しくはVLドメイン、又はそれらのCDRを含むものでもよい。
【０１００】
本文脈において用語「から得られる」は、抗体分子のHV又はCDRが、ラクダ科の免疫グロブリン遺伝子によって最初にコードされたアミノ酸配列（又はそのマイナーバリアント）を具体化するという意味での構造的関係を意味する。しかしこれは、抗体分子を調製するために使用される作製プロセスに関して、必ずしも特別な関係を意味するわけではない。
【０１０１】
ラクダ類由来の抗体分子は、中でもとりわけ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコ又はラクダを含む、任意のラクダ類の種由来でも良い。
【０１０２】
ラクダ類由来のVH及びVLドメイン、又はそれらのCDRを含む抗体分子は、通常は組換え発現されたポリペプチドであり、キメラポリペプチドでもよい。用語「キメラポリペプチド」は、他の方法では連続的に隣接しない2以上のペプチド断片の近接配置によって作製される人工（非天然）ポリペプチドを指す。この定義に含まれるのは、例えばラクダ類及びヒトのような、２以上の種によってコードされたペプチド断片の並立配置によって作製される「種」キメラポリペプチドである。
【０１０３】
ある実施態様では、完全VHドメイン及び／又は完全VLドメインは、ラクダ科ファミリー種から得ることができる。このラクダ類由来VHドメイン及び／又はラクダ類由来VLドメインは、次に、タンパク質設計の対象としてもよく、１以上のアミノ酸置換、挿入又は欠失がラクダ類アミノ酸配列へ導入される。これらの設計された変化には、好ましくはラクダ類配列に関するアミノ酸置換が含まれる。このような変化には、ラクダ類をコードするVH又はVLドメインの１以上のアミノ酸残基が、ホモログの、ヒトをコードするVH又はVLドメインからの同じ残基で置き換わっている「ヒト化」又は「生殖細胞系列化」が含まれる。
【０１０４】
ラクダ類(例えば、ラマ)を、例えばIL-4Rα又はIL-5で能動免疫化して得られる単離されたラクダ類VH及びVLドメインは、本明細書に記載の組合せに使用するための抗体分子を設計のベースとして使用できる。無傷のラクダ類VH及びVLドメインから出発して、出発したラクダ類配列からは離れる１以上のアミノ酸置換、挿入又は欠失を設計することもできる。ある実施態様では、これら置換、挿入又は欠失は、VHドメイン及び／又はVLドメインのフレームワーク領域内に存在してもよい。
【０１０５】
別の実施態様では、ラクダ類由来のVH及びVLドメイン(又は設計されたそれらのバリアント)並びに、非ラクダ類抗体由来の１以上の定常ドメイン、例えばヒトをコードする定常ドメイン(又は設計されたそれらのバリアント)を含む、「キメラ」抗体分子を提供する。このような実施態様では、例えば（設計したアミノ酸配列バリエーションの導入前は）両方のVH及びVLがラマ(Lama glama)由来、又は両方のVH及びVLがアルパカ(Lama pacos)由来のように、両方のVHドメイン及びVLドメインがラクダ類の同一種から得られることが好ましい。このような実施態様では、両方のVH及びVLドメインは、単一の動物、特に、目的の抗原で能動免疫化されている単一の動物に由来するものでもよい。
【０１０６】
ラクダ科VH及び／又はVLドメインの一次(primary)アミノ酸配列内の変化を別に設計する場合に、個々のラクダ類由来の超可変ループ若しくはCDR、又はそれらの組合せを、ラクダ類VH/VLドメインから単離して、別の(即ち、非ラクダ科)フレームワーク、例えばヒトVH/VLフレームワークへ、CDR移植法により移植することもできる。
【０１０７】
非限定的な実施態様では、本組合せの抗体分子は(それぞれ重鎖及び軽鎖からの)CH1ドメイン及び／若しくはCLドメインを含んでもよく、そのアミノ酸配列は、完全ヒト又は実質的なヒトでもよい。ヒト治療用途に意図される抗体分子のためには、通常は、抗体の完全定常領域、又は少なくともその一部は、完全な又は実質的なヒトアミノ酸配列を有する。従って、１以上、又は任意の組合せの、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCLドメイン(並びに、存在する場合はCH4ドメイン)は、そのアミノ酸配列に関して完全な又は実質的なヒトであっても良い。CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及び／若しくはCLドメイン(並びに／又は、存在する場合はCH4ドメイン)は、ヒト抗体、好ましくはヒトIgG抗体、更に好ましくはサブタイプIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4のヒトIgG1抗体に由来してもよい。
【０１０８】
有利には、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCLドメイン(並びに、存在する場合はCH4ドメイン)は全て、完全な又は実質的なヒトアミノ酸配列を有してもよい。ヒト化若しくはキメラ抗体、又は抗体断片の定常領域の文脈において、用語「実質的なヒト」は、ヒト定常領域と、少なくとも90%、又は少なくとも92%、又は少なくとも95%、又は少なくとも97%、又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を指す。本文脈における用語「ヒトアミノ酸配列」は、生殖細胞系列で、再構成され、かつ体細胞的に変異した遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列を指す。本発明は又、「完全なヒト」のヒンジ領域の存在が明白に必要な実施形態を除いて、ヒト配列に関して１以上のアミノ酸付加、欠失又は置換によって変更された、「ヒト」配列の定常ドメインを含むポリペプチドも考慮する。
【０１０９】
（Fc領域の改変）
本組合せの抗体分子は、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域内、特にFc領域内に、１以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有することもある。アミノ酸置換は、異なる天然アミノ酸によって、又は非天然若しくは改変されたアミノ酸によって、置換されるアミノ酸の取り換えを生じてもよい。(例えば、N-又はO-結合グリコシル化部位の付加又は欠失による)グリコシル化パターン内の変化等の、他の構造的改変も又、許容される。
【０１１０】
組合せの抗体分子は、Fc領域内で改変されて、胎児性受容体FcRnへの結合親和性を増加させてもよい。増加した結合親和性は、酸性pH(例えば、ほぼ、約pH5.5〜約pH6.0)で測定可能だろう。増加した結合親和性は又、中性pH(例えば、ほぼpH6.9〜約pH7.4) でも測定可能だろう。「増加した結合親和性」は、未改変のFc領域に対して、FcRnへの増加した結合親和性を意味する。通常は、未改変のFc領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の野生型アミノ酸配列を保持する。このような実施態様では、改変されたFc領域を有する抗体分子の増加したFcRn結合親和性は、野生型IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の、FcRnに対する結合親和性に対して測定されるだろう。
【０１１１】
好ましい実施態様では、Fc領域内の１以上のアミノ酸残基を、異なるアミノ酸で置換して、FcRnへの結合を増加させても良い。FcRn結合を増強させて、それにより抗体の薬物動態を改善するいくつかのFc置換が報告されている。そのような置換は、例えば、Zalevskyらの文献、(2010) Nat. Biotechnol. 28(2):157-9; Hintonらの文献、(2006) J Immunol. 176:346-356; Yeungらの文献、(2009) J Immunol. 182:7663-7671; Presta LG. の文献、(2008) Curr. Op. Immunol. 20:460-470; 及びVaccaroらの文献、(2005) Nat. Biotechnol. 23(10):1283-88内に報告されており、これらの内容は、全体が本明細書中に組み込まれる。
【０１１２】
好ましい実施態様では、本明細書に記載の組合せの１以上の抗体分子は、アミノ酸置換H433K及びN434Fを含む、又は、それらから構成される、改変されたヒトIgG Fcドメインを含み、前記Fcドメイン番号付けはEU番号付けに従う。更に好ましい実施態様では、本明細書に記載の組合せの１以上の抗体分子は、アミノ酸置換M252Y、S254T、T256E、H433K及びN434Fを含む、又は、それらから構成される、改変されたヒトIgG Fcドメインを含み、前記Fcドメイン番号付けはEU番号付けに従う。
【０１１３】
ある実施態様では、本組合せの抗体分子、例えばIL-4Rα及び／又はIL-5抗体分子は、対応する野生型IgG配列に対して、2以下、3以下、4以下、5以下、6以下、7以下、8以下、9以下、10以下、12以下、15以下、20以下の置換から構成される、改変されたヒトIgG Fcドメインを含む。
【０１１４】
これら抗体分子は又、改変されて、化学療法薬、毒素(例えば、細菌性、真菌性、植物性、若しくは動物性起源の酵素活性のある毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素(即ち、放射性複合体)等の細胞毒性薬剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫結合体を形成してもよい。Fc領域も又、引用により本明細書中に組み込まれているChan及びCarterの文献、(2010) Nature Reviews: Immunology 10:301-316に記載のように、半減期延長のために設計されてもよい。
【０１１５】
特別な実施態様では、Fc領域は、エフェクター機能が存在しないように設計できる。ある実施態様では、本発明の抗体分子は、低下したエフェクター機能を有する天然IgGアイソタイプ、例えばIgG4由来のFc領域を有することができる。IgG4由来のFc領域は、更に改変されて、例えば、インビボでIgG4分子間のアームの交換を最小化する改変の導入により、治療的有用性を増加してもよい。IgG4由来のFc領域は、改変されてS228P置換を含むものでもよい。
【０１１６】
ある実施態様では、本組合せの抗体分子は、グリコシル化に関して改変されてもよい。例えば、脱グリコシル化(aglycoslated)抗体を作製できる(即ち、グリコシル化欠失抗体)。グリコシル化を変更して、例えば、標的抗原への抗体の親和性を増加できる。このような糖改変は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位の変更により達成できる。例えば、１以上のアミノ酸置換を行うことにより、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除を生じ、それによりその部位でのグリコシル化を排除できる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させるだろう。
【０１１７】
（pH依存性抗体）
本組合せの抗体分子は、pH依存性抗原結合を示しても良い。
【０１１８】
抗原に結合した抗体は細胞に取り込まれ、エンドソーム-リソソーム系分解経路に輸送される。初期エンドソーム内でそれら抗原から分離され得る抗体は、細胞表面へ戻して再利用できる。エンドソーム区画内で、その抗原と高い親和性で結合する抗体は、通常、分解のためにリソソームへ輸送される。抗体分子がpH依存性の抗原結合活性を有した場合、初期エンドソーム性pHでは、血漿pHと比較して、その抗原に対して低い結合親和性を有する場合、その抗体は更に効率的に細胞表面へ再利用されることが、先に示されている。これは、抗体の血漿中半減期を延長して、同じ抗体を複数の抗原へ結合可能とする。このため、本明細書に記載の組合せの抗体分子、例えばIL-4Rα及び/又はIL-5抗体分子は、pH依存性抗原結合を示すことが有利である。
【０１１９】
抗体分子におけるpH依存性抗原結合活性を設計する方法は、例えば、引用により本明細書中に組み込まれている欧州特許出願番号EP2275443に記載されている。抗体分子におけるpH依存性抗原結合を設計する方法も又、引用により本明細書中に組み込まれている国際特許出願番号WO2018/206748に記載されている。本明細書に記載の抗体分子は、欧州特許出願番号EP2275443又は国際特許出願番号WO2018/206748に記載の方法に従い、それらがpH依存性抗原結合を示すように改変されてもよい。
【０１２０】
本明細書に記載の組合せのpH依存性抗体分子では、抗原結合活性は、血漿pHでの抗原結合活性と比較して、エンドソーム性pHでは低い。エンドソーム性pHは通常、酸性pHであるが、血漿pHは通常、中性pHである。従って、本組合せの抗体分子、例えば本明細書に記載のIL-4Rα及び/又はIL-5抗体分子は、それらの抗原結合活性が、中性pHの場合の抗原結合活性と比較して、酸性pHでより低いようなpH依存性抗原結合を示しても良い。エンドソーム性pH又は「酸性pH」は、約pH4.0〜約pH6.5、好ましくは約pH5.5〜約pH6.5、好ましくは約pH5.5〜約pH6.0、好ましくはpH5.5、pH5.6、pH5.7又はpH5.8のpHでもよい。血漿pH又は「中性pH」は、約pH6.9〜約pH8.0、好ましくは約pH7.0〜約pH8.0、好ましくは約pH7.0〜約pH7.4、好ましくはpH7.0又はpH7.4のpHでもよい。
【０１２１】
ある実施態様では、本抗体分子、例えばIL-4Rα抗体分子及び／又はIL-5抗体分子は、pH5.8での抗原結合活性が、pH7.4での抗原結合活性と比較して低いような、pH依存性結合を示す。このpH依存性抗体分子、例えばIL-4Rα抗体分子及び／又はIL-5抗体分子は、酸性pH又はpH5.8での抗体-抗原相互作用の解離定数(KD)は、中性pH又はpH7.4での抗体-抗原相互作用の解離定数(KD)よりも高い、特徴を示すこともある。ある実施態様では、本抗体分子、例えば、IL-4Rα抗体分子及び／又はIL-5抗体分子は、pH5.8での抗原へのKD及びpH7.4での抗原へのKDの比(KD(pH5.8)/KD(pH7.4))が2以上、4以上、6以上、8以上、10以上、12以上であるようなpH依存性結合を示す。
【０１２２】
本抗体分子のpH依存性抗原結合活性は、酸性pHでの抗原結合能力を損なわせ、及び／又は、中性pHでの抗原結合能力を増加させるように、抗体分子を改変することにより設計してもよい。例えば、本抗体分子は、抗体分子の少なくとも一のアミノ酸をヒスチジンで置換することにより、又は少なくとも一のヒスチジンを抗体分子に挿入することにより、改変されてもよい。そのようなヒスチジン突然変異（置換又は挿入）部位は特に限定されず、突然変異又は挿入する前と比較して、エンドソーム性pH（例えば、pH5.8）での抗原結合活性が、血漿pH（例えば、pH7.4）でのそれよりも低い限り、どの部位でも許容される。
【０１２３】
ある実施態様では、本抗体分子、例えばIL-4Rα抗体分子及び／又はIL-5抗体分子は、可変ドメインへの１以上の置換の導入によりｐＨ依存性抗原結合を示すように設計してもよい。好ましい実施態様では、本抗体分子、例えばIL-4Rα抗体分子及び／又はIL-5抗体分子は、抗体分子のCDRに１以上の置換を導入することにより、pH依存性抗原結合を示すように設計してもよい。この置換は、１以上のHis残基を、可変ドメイン、好ましくは重鎖及び／又は軽鎖CDRの１以上の部位に導入して、pH依存性抗原結合を与えてもよい。非ヒスチジン置換はまた、本明細書に記載のpH依存性抗体の可変ドメイン、特にCDRに組み込まれることもできる。本抗体分子、例えば、IL-4Rα抗体分子及び／又はIL-5抗体分子は、国際特許出願番号WO2018/206748に記載の方法に従い設計してもよい。
【０１２４】
好ましい実施態様では、前記CDR、VH及び／又はVLドメイン配列を有する、本明細書に記載の例示的IL-4Rα及びIL-5抗体は、それらがpH依存性抗原結合を示すように設計される。例えば、本明細書に記載の例示的IL-4Rα及び／又はIL-5抗体分子のCDR配列は、pH依存性抗原結合を示す抗体分子を作製するために、１以上のヒスチジン置換の導入により改変されてもよい。
【０１２５】
特に好ましい実施態様では、本明細書に記載の組合せのpH依存性抗体、例えば、IL-4Rα及び／又はIL-5抗体分子は、胎児性受容体FcRnに対する結合親和性が増加したFcドメインを含む。FcRnに対するFcドメインの結合親和性を増加させる可能性のある置換は、本明細書の他の場所に記載されており、そのような置換は、本組合せのpH依存性抗体分子に組み込むことができる。
【０１２６】
特に好ましい実施態様では、本組合せはpH依存性IL-4Rα抗体分子及びpH依存性IL-5抗体分子を含み、一個又は両方の抗体分子は、アミノ酸置換H433K及びN434Fを含む、又は、それらから構成される、改変されたヒトIgG Fcドメインを含み、該Fcドメイン番号付けはEU番号付けに従う。更に好ましい実施態様では、本組合せはpH依存性IL-4Rα抗体分子及びpH依存性IL-5抗体分子を含み、一個又は両方の抗体分子は、アミノ酸置換M252Y、S254T、T256E、H433K及びN434Fを含む、又は、それらから構成される、改変されたヒトIgG Fcドメインを含み、該Fcドメイン番号付けはEU番号付けに従う。
【０１２７】
（例示的なIL-4Rα抗体及びIL-5抗体）
前記のとおり、好ましい実施態様では、本組合せはIL-5に結合する抗体分子及びIL-4Rαに結合する抗体分子を含む。このような実施態様では、本組合せは、3個全ての2型サイトカイン、IL-5、IL-4及びIL-13、を介するシグナル伝達を阻害できる。
【０１２８】
ヒトIL-4Rαに結合し、本明細書に記載の組合せに組み込める抗体分子は、可変重鎖CDR3(HCDR3)、可変重鎖CDR2(HCDR2)及び可変重鎖CDR1(HCDR1)、可変軽鎖CDR3(LCDR3)、可変軽鎖CDR2(LCDR2)及び可変軽鎖CDR1(LCDR1)の組合せを含む抗体分子を含み、該組合せは下記:
(i)配列番号3を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号2を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号1を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号12を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号11を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号10を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号6を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号5を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号4を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号15を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号14を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号13を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iii)配列番号9を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号18を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iv)配列番号91を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号18を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(v)配列番号92を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号97を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(vi)配列番号93を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号98を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号96を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(vii)配列番号94を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号98を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(viii)配列番号95を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号98を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から選択される。
【０１２９】
IL-4Rαに結合し、本明細書に記載の組合せに組み込める抗体分子には又、可変重鎖CDR3(HCDR3)、可変重鎖CDR2(HCDR2)及び可変重鎖CDR1(HCDR1)、可変軽鎖CDR3(LCDR3)、可変軽鎖CDR2(LCDR2)及び可変軽鎖CDR1(LCDR1)の組合せを含む抗体分子を含み、該組合せは下記:
(i)配列番号27を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号26を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号25を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号36を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号35を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号34を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号30を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号29を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号28を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号39を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号37を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(iii)配列番号33を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号32を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号31を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号42を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号41を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号40を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から選択される。
【０１３０】
ある実施態様では、ヒトIL-4Rαに結合する前記抗体分子は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含む、又は、それから構成される抗体分子から選択され、該VH及びVLドメインは下記:
(i)配列番号19を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号20を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号21を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号22を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iii)配列番号23を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号24を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iv)配列番号99を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号100を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(v)配列番号101を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号102を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(vi)配列番号103を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号104を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(vii)配列番号105を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号106を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;並びに、
(viii)配列番号107を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号108を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から選択される。
【０１３１】
ある実施態様では、IL-4Rαに結合する前記抗体分子は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含む、又は、それらから構成される抗体分子から選択され、該VH及びVLドメインは下記:
(i)配列番号43を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれの少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%であるアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号44を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号45を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれの少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%であるアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号46を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;並びに、
(iii)配列番号47を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれの少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%であるアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号48を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から選択される。
【０１３２】
ヒトIL-5に結合し、本明細書に記載の組合せに組み込める抗体分子は、可変重鎖CDR3(HCDR3)、可変重鎖CDR2(HCDR2)及び可変重鎖CDR1(HCDR1)、可変軽鎖CDR3(LCDR3)、可変軽鎖CDR2(LCDR2)及び可変軽鎖CDR1(LCDR1)の組合せを含む抗体分子を含み、該組合せは下記:
(i)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号54を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号53を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号52を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号57を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号55を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号59を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iv)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号61を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号60を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(v)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号62を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から選択される。
【０１３３】
IL-5に結合し、本明細書に記載の組合せに組み込める抗体分子は、可変重鎖CDR3(HCDR3)、可変重鎖CDR2(HCDR2)及び可変重鎖CDR1(HCDR1)、可変軽鎖CDR3(LCDR3)、可変軽鎖CDR2(LCDR2)及び可変軽鎖CDR1(LCDR1)の組合せを含む抗体分子を含み、該組合せは下記:
(i)配列番号72を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号71を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号70を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号74を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号73を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(ii)配列番号72を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号71を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号70を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号75を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号73を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から選択される。
【０１３４】
ある実施態様では、ヒトIL-5に結合する抗体分子は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含む、又は、それらから構成される抗体分子から選択され、該VH及びVLドメインは下記:
(i)配列番号63を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号64を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号63を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号65を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iii)配列番号63を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号66を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iv)配列番号63を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号67を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(v)配列番号63を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号68を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;並びに、
(vi)配列番号63を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号69を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から選択される。
【０１３５】
ある実施態様では、IL-5に結合する抗体分子は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含む、又は、それらから構成される抗体分子から選択され、該VH及びVLドメインは下記:
(i)配列番号76を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号77を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号76を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号78を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;並びに、
(iii)配列番号76を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号79を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から選択される。
【０１３６】
好ましい実施態様では、本組合せは、ヒトIL-4Rαへ結合する、CDR、VH及び／又はVL配列を有する抗体分子、並びに、ヒトIL-5へ結合する、CDR、VH及び／又はVL配列を有する抗体分子を含む。
【０１３７】
特定の抗体分子が、特定のアミノ酸配列に関連付けて定義されるVHドメイン又は重鎖と、やはり特定のアミノ酸配列に関連付けて定義されるVLドメイン又は軽鎖の組合せを含むものとして特定される場合、挙げられたそれぞれ特別なVH/VL又は重鎖/軽鎖の組合せのためのこの定義は(特に明記しない限り)、記載されたVH/重鎖アミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有するVHドメイン/重鎖、並びに、記載されたVL/軽鎖アミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有するVLドメイン/軽鎖の組合せによって形成される抗体分子を含むものである、と認識されるであろう。
【０１３８】
記載されたドメイン/鎖アミノ酸配列との%配列同一性により定義されたそれぞれのドメイン/鎖は、CDR領域外の、フレームワーク領域内又は他の領域内のアミノ酸配列バリエーションを示しつつ、記載されたVH/VLドメイン又は重鎖/軽鎖アミノ酸配列内に存在するものと同一のCDR配列を保持してもよい。
【０１３９】
ある実施態様では、前記のCDR配列を有すると定義された、又は、前記の特別なVH/VLドメインアミノ酸配列との特別な割合の同一性を有すると定義された、IL-4Rα及び／又はIL-5抗体分子は、そこからCDR、VH及び／若しくはVL配列が由来した、抗体若しくはそれらの抗原結合断片の、ヒト化、生殖細胞系列化、若しくは親和性バリアントである。
【０１４０】
好ましい実施態様では、前記のCDR配列を有する例示的IL-4Rα及びIL-5抗体分子は、例えば高いヒト相同性を示し、そのCDR配列が由来する抗体又はそれらの抗原結合断片の、ヒト化、若しくは生殖細胞系列化バリアントである。
【０１４１】
非限定的な実施態様では、本明細書に記載のCDR、VH及び／又はVL配列を有する例示的IL-4Rα及びIL-5抗体分子は、CH1ドメイン及び／又はCLドメイン(それぞれ重鎖及び軽鎖に由来する)を含み、それらのアミノ酸配列は完全な又は実質的なヒトでもよい。ヒト治療用途を意図する抗体分子として通常は、抗体の完全定常領域、又は少なくともその一部が、完全な又は実質的なヒトアミノ酸配列を有する。従って、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCLドメイン(及び、存在する場合はCH4ドメイン)の１以上又は任意の組合せは、そのアミノ酸配列に関しては完全な又は実質的なヒトでも良い。
【０１４２】
有利には、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCLドメイン(及び、存在する場合はCH4ドメイン)は、全て完全な又は実質的なヒトアミノ酸配列を有してもよい。ヒト化又はキメラ抗体、又は抗体断片の定常領域の文脈において、用語「実質的なヒト」は、ヒト定常領域と少なくとも90%、又は少なくとも92%、又は少なくとも95%、又は少なくとも97%、又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を指す。本文脈において用語「ヒトアミノ酸配列」は、生殖細胞系列、再構成されて体細胞変異した遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子でコードされたアミノ酸配列を指す。本発明は又、「完全なヒト」のヒンジ領域の存在が明白に必要な実施形態を除いて、ヒト配列に対して１以上のアミノ酸付加、欠失又は置換で変更された、「ヒト」配列の定常ドメインを含むポリペプチドを想定する。本明細書に記載の例示的Fc領域改変はいずれも、前記のCDR及び／又はVH/VLドメイン配列を有するIL-4Rα及び／又はIL-5抗体へ組み込まれてもよい。好ましい実施態様では、前記のCDR及び／又はVH/VLドメイン配列を有するIL-4Rα及び／又はIL-5抗体は、アミノ酸置換H433K及びN434Fを含む、又は、それらから構成される、改変されたヒトIgG Fcドメインを含み、前記Fcドメイン番号付けはEU番号付けに従う。好ましい実施態様では、前記のCDR及び／又はVH/VLドメイン配列を有するIL-4Rα及び／又はIL-5抗体は、アミノ酸置換M252Y、S254T、T256E、H433K及びN434Fを含む、又は、それらから構成される、改変されたヒトIgG Fcドメインを含む。
【０１４３】
非限定的な実施態様では、本明細書に記載の例示的CDR、VH及び／又はVL配列を有するIL-4Rα及びIL-5抗体分子は、前記のように改変されてpH依存性抗原結合を示してもよい。例えば、本明細書に記載の例示的CDR、VH及び／又はVL配列を有するIL-4Rα及びIL-5抗体分子を改変して、pH5.8での抗原結合活性が、pH7.4での抗原結合活性と比較して低くなるようなpH依存性結合を持たせても良い。抗体を設計してpH依存性抗原結合を付与するための前記方法は、CDR、VH及び／又はVL配列を有する、本明細書に記載の任意の例示的IL-4Rα及びIL-5抗体分子に適用されても良い。例えば、可変ドメイン及び／又はCDR領域は、pH依存性結合を付与するために、ヒスチジン置換又は挿入で改変してもよい。
【０１４４】
本出願内で特に明記されない限り、２個のアミノ酸配列間の%配列同一性は、最適な様式で整列されたこれら2つの配列を比較することによって決定でき、そこで比較されるアミノ酸配列は、これら２個の配列間の最適な配列のために、参照配列に対して付加又は欠失を含むことができる。同一性割合は、2個の配列間でアミノ酸残基が同一である同一の位置の数を決定し、この同一の位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、得られた結果へ100を掛けて、これら２個の配列間の同一性パーセンテージを得ることで計算できる。例えば、ネットサイト上で利用可能な（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html）、BLASTプログラム、「BLAST2配列」(Tatusovaらの文献、"Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)を使用することが可能であり、それらで使用されるパラメータはデフォルトで設定されており(特に「open gap penalty」: 5、及び「extension gap penalty」:2のパラメータ用に選ばれるマトリックスは、例えば、プログラムで推奨されるマトリックス「BLOSUM 62」である)、比較する２個の配列間の同一性のパーセンテージが、プログラムにより直接に計算される。
【０１４５】
（C.組合せの配合）
本組合せの異なるアンタゴニスト又は抗体分子は、任意の様式で組合せ又は配合し、組合せ療法が、必要とする対象又は患者へ、好ましくはヒト対象又は患者へ適用されてもよい。組合せは、単回用量投与又は多回用量投与のために配合できる。
【０１４６】
ある実施態様では、本組合せのアンタゴニスト又は抗体分子は、共配合される即ち、単一の医薬組成物として配合される、別個の分子である。アンタゴニスト又は抗体分子が共配合される実施態様では、本組合せ又は組成物は、２成分の同時投与に適している。この組成物は、単回用量投与又は多回用量投与のためにも配合できる。アンタゴニスト又は抗体分子が共配合される実施態様では、アンタゴニスト又は抗体分子は、等量で、例えば異なるサイトカイン又は受容体を標的とする第一及び第二アンタゴニスト又は抗体分子を含む組合せのための1:1の比に従い、配合されてもよい。あるいは、本アンタゴニスト又は抗体分子は、異なるアンタゴニスト又は抗体分子の比が1:1ではないように配合されてもよい。例えば、本組合せが、異なる標的へ結合する第一及び第二アンタゴニスト又は抗体分子を含む、若しくは、それらから構成される実施態様では、第一及び第二アンタゴニスト又は抗体分子の比は、2:1、任意で3:1、任意で4:1でもよい。あるいは、本アンタゴニスト又は抗体分子は、1:2、任意で1:3、任意で1:4の比に従って配合されてもよい。
【０１４７】
ある実施態様では、本組合せのアンタゴニスト又は抗体分子は、別々に、例えば、個々の組成物として配合される。このアンタゴニスト又は抗体分子を別々に配合する実施態様では、異なる成分又は組成物を、同時又は別々に投与する可能性が存在する。本アンタゴニスト若しくは抗体分子又はそれらを含む別個の組成物を別々に投与する場合、アンタゴニスト/抗体分子又は組成物は、いずれの順序で逐次投与してもよい。例えば、IL-4Rαに結合する抗体分子を最初に投与し、次にIL-5に結合する抗体分子を投与しても、その逆でもよい。このアンタゴニスト/抗体分子又は組成物の投与間隔は、任意の適切な時間間隔でよい。異なる組成物の投与は、一度(単回用量投与用)でも、繰り返して(多回用量投与用)行ってもよい。
【０１４８】
ある実施態様では、アンタゴニストは抗体分子であり、本組合せの抗体分子は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体として組み合わせてもよい。例えば、本組合せがIL-4Rαに結合するFab断片及びIL-5に結合するFab断片を含む場合、２個のFab断片は、IgG Fc部分へコンジュゲートされた２個のFab領域を有する、単一の二重特異性抗体分子へ組み込まれてもよい。
【０１４９】
本発明の二重特異性又は多重特異性抗体は、任意の適切な二重特異性/多重特異性抗体フォーマットに従い構成してもよい。例えば、本組合せの抗体分子は、抗体が、例えば、Y形抗体のそれぞれのFabアームが異なる結合特異性を有する状態で、異なる標的へ「トランス」結合するような、二重特異性又は多重特異性抗体フォーマットへ組み込むことができる。別の実施態様では、本抗体分子は、標的が「シス」配置で結合するような、二重特異性又は多重特異性抗体フォーマットへ組み込むことができる。例えば、抗原へ結合可能なFab領域又は可変ドメインは、IgG Fc部分の反対側の末端へ配置できる。
【０１５０】
二重特異性又は多重特異性抗体は、第一標的への結合特異性を有する２個のY形Fabアームを備えたネイティブなIgG構造、及び、第二標的への結合特異性を有するFcドメインのC末端に配置された１以上の追加的な抗原結合ドメインを有してもよい。例えば、一の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、ネイティブなIgG構造上に存在するFab領域の２個の古典的な抗原結合ドメインがIL-4Rαへ結合し、FcドメインのC末端に配置された１以上のVHHドメインがIL-5に結合するように構成される。ネイティブなIgG構造上に存在するFab領域の２個の古典的な抗原結合ドメインがIL-5に結合し、FcドメインのC末端に配置された１以上のVHHドメインがIL-4Rαへ結合するような、逆の立体配置も又、可能である。
【０１５１】
あるいは、二重特異性又は多重特異性抗体は、第一標的への結合特異性を有する２個のY形Fabアームを備えたネイティブなIgG構造、及び、FcドメインのC末端に配置された、第二標的への結合特異性を有する１以上のscFv断片を有してもよい。例えば、一の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、ネイティブなIgG構造上に存在するFab領域の２個の古典的な抗原結合ドメインがIL-4Rαへ結合し、FcドメインのC末端に配置された１以上のscFvドメインがIL-5に結合するように構成される。ネイティブなIgG構造上に存在するFab領域の２個の古典的な抗原結合ドメインがIL-5に結合し、FcドメインのC末端に存在する１以上のscFvドメインがIL-4Rαへ結合する、逆の立体配置も又、可能である。このような実施態様では、二重特異性抗体は、IgG FcドメインのC末端に存在する２個のscFvドメインから構成されてもよい。
【０１５２】
二重特異性又は多重特異性抗体は、1個のFab領域が異なる抗原結合ドメイン、例えばVHHドメインによって置換された、非対称なIgG抗体でもよい。例えば、別の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、IL-4Rαに結合する、抗体の1個の完全なアーム上のFab領域、及び、IL-5に結合して第二のFab領域の代わりをするVHHドメインを含む、ネイティブなIgG構造に類似する構成にしてもよい。抗体の1個の完全なアーム上のFab領域がIL-5に結合し、IL-4Rαへ結合するVHHドメインが第二のFab領域と置き換わった、逆の立体配置も又、可能である。
【０１５３】
本アンタゴニストが抗体分子であって、その抗体分子が共配合される実施態様に関して、並びに／又は、複数の抗体分子が別個の組成物として提供される、及び／若しくは、抗体分子が多重特異性抗体フォーマットの形で提供される実施態様に関しては、本抗体分子は任意の適切な医薬担体又は賦形剤を使用して配合することができる。ヒト治療的用途のための抗体を配合する技術は、当分野で良く知られ、例えば、それらの内容全体が本明細書中に組み込まれているWangらの文献、(2007) Journal of Pharmaceutical Sciences, 96:1-26により報告されている。抗体分子が別々に配合された実施態様では、医薬担体又は賦形剤は、異なる組成物に関して異なっても同一でもよい。
【０１５４】
本組成物の製剤化に使用できる医薬として許容し得る賦形剤には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン等、緩衝物質、例えばリン酸塩等、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩等、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂肪、が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５５】
ある実施態様では、組成物は、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注入、皮下、硬膜外、経鼻、経口、経直腸、局所、吸入、口腔内（例えば、舌下）、及び経真皮の投与の、任意の適切な投与経路を介して対象に投与するために配合処方されるが、これらに限定されるものではない。アンタゴニスト又は抗体分子が別々に配合される実施態様では、それぞれの組成物は、異なる経路を介して投与されるように配合されてもよい。
【０１５６】
ある実施態様では、組成物は１以上の追加的な治療薬を含む。追加的な治療薬は、慢性気道疾患の予防又は治療に適した薬剤でもよい。１以上の追加的な薬剤が、本組合せのアンタゴニスト又は抗体分子と比べて、同一経路を介して又は異なる経路を介して、投与するために配合できる。
【０１５７】
（D.二重特異性IL-4Rα及びIL-5抗体）
上記の通り、本明細書に記載の組合せの抗体分子は、多重特異性抗体フォーマット、例えば二重特異性抗体フォーマットで提供されてもよい。好ましい実施態様では、本組合せは、二重特異性抗体フォーマットで提供された、IL-5に結合する抗体分子及びIL-4Rαに結合する抗体分子を含む。
【０１５８】
従って、更なる本発明の態様で本明細書で提供されるのは、IL-4Rαに結合する抗原結合領域及びIL-5に結合する抗原結合領域を含む二重特異性抗体である。このような二重特異性抗体は、本明細書で用語「IL-4Rα/IL-5二重特異性」抗体と称される。別々のIL-4Rα及びIL-5抗体分子に関して本明細書に記載される全ての実施態様は、本発明のこの更なる態様へも同様に適用される。特に、本明細書に記載の二重特異性抗体の「抗原結合領域」は、VHH抗体を含む、本明細書に記載されている、任意の抗体又は抗原結合断片の形態を取ることができる。
【０１５９】
本発明の二重特異性抗体は、本明細書に記載されるような任意の適切な二重特異性/多重特異性抗体フォーマットに従い構成できる。例えば、二重特異性抗体は、標的が「トランス」配置、即ち分子の同じ末端、又は「シス」配置、即ち分子の反対側の両末端、のいずれかで結合するように構成してもよい。
【０１６０】
ある実施態様では、二重特異性抗体は、抗原結合領域が２個のFabアーム内に含まれるネイティブなIgG構造を有する。第一のFabアームはIL-4Rαへの結合特異性を示してもよく、第二のFabアームはIL-5への結合特異性を示してもよい。別の実施態様では、二重特異性抗体は、ネイティブなIgG構造を有し、Fc領域のC末端に配置された１以上の追加的な抗原結合領域を、追加的に含むことができる。このような実施態様では、ネイティブなIgGの２個のFabアームは、同一の標的、例えばIL-4Rαへ結合してもよく、Fc領域のC末端に配置された１以上の追加的な抗原結合領域は第二の標的、例えばIL-5へ結合してもよい。１以上の追加的な抗原結合領域は、限定されるものではないがVHHドメイン又はscFvを含む、任意の適切な抗原結合形態をとってもよい。
【０１６１】
一の実施態様では、本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-4Rαに結合するFab領域、及びIL-5に結合するVHHドメインを含む。一の実施態様では、本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-5に結合するFab領域、及びIL-4Rαに結合するVHHドメインを含む。
【０１６２】
一の実施態様では、本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-4Rαに結合するFab領域、及びIL-5に結合するscFvを含む。一の実施態様では、本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-5に結合するFab領域、及びIL-4Rαに結合するscFvを含む。好ましい実施態様では、本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-4Rαに結合するIgG抗体、及びIL-5に結合する１以上のscFvを含む、又は、それらから構成される。このような実施態様では、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-4Rαに結合するIgG抗体、及びIL-5に結合する２個のscFv断片を含む、又は、それらから構成されるものでもよい。IL-5に結合する１以上のscFv断片は、好ましくはIgG抗体のFc領域のC末端に、即ち、IL-4Rαへ結合する２個のFabアームとは反対側のFc領域末端に、配置される。
【０１６３】
本発明の二重特異性抗体は、1のFab領域(又はFabアーム)が異なる抗原結合領域又はドメイン、例えばVHHドメインによって置き換えた、非対称なIgG抗体として構成してもよい。一の実施態様では、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-4Rαに結合する抗体の1個の完全なアーム上のFab領域、及び、IL-5に結合する第二のFab領域に代わるVHHドメインを含む、ネイティブなIgG構造に類似する構成である。逆の立体配置も又、可能であり、その場合、抗体の1個の完全なアーム上のFab領域がIL-5に結合し、第二のFab領域と置き換わったVHHドメインがIL-4Rαへ結合する。
【０１６４】
本発明の、即ち、本明細書に記載の任意のフォーマットに従い構成されているIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、ヒトIL-4Rへ結合する抗原結合領域を含むことができ、該抗原結合領域は可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含むことができ、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号3を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号2を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号1を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号12を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号11を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号10を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号6を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号5を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号4を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号15を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号14を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号13を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iii)配列番号9を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号18を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iv)配列番号91を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号18を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(v)配列番号92を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号97を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(vi)配列番号93を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号98を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号96を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(vii)配列番号94を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号98を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(viii)配列番号95を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号98を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から構成される群から選択されるCDR配列を含む。
【０１６５】
本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-4Rへ結合する抗原結合領域を含むことができ、該抗原結合領域は可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含むことができ、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号27を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号26を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号25を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号36を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号35を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号34を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号30を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号29を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号28を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号39を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号37を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(iii)配列番号33を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号32を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号31を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号42を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号41を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号40を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から構成される群から選択されるCDR配列を含む。
【０１６６】
ヒトIL-4Rαへ結合する抗原結合領域は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含むことができ、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号19を含むアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号20を含むアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号21を含むアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号22を含むアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iii)配列番号23を含むアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号24を含むアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iv)配列番号99を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号100を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(v)配列番号101を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号102を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(vi)配列番号103を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号104を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(vii)配列番号105を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号106を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;及び、
(viii)配列番号107を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号108を含む、若しくは、それから構成されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から構成される群から選択される。
【０１６７】
IL-4Rαへ結合する抗原結合領域は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含むことができ、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号43のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号44のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号45のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号46のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;及び、
(iii)配列番号47のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号48のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から構成される群から選択される。
【０１６８】
本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、ヒトIL-5へ結合する抗原結合領域を含むことができ、該抗原結合領域は可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含むことができ、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号54を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号53を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号52を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号57を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号55を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号59を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iv)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号61を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号60を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(v)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号62を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から構成される群から選択されるCDR配列を含む。
【０１６９】
本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-5へ結合する抗原結合領域を含むことができ、該抗原結合領域は可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含むことができ、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号72を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号71を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号70を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号74を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号73を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(ii)配列番号72を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号71を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号70を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号75を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号38を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号73を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から構成される群から選択されるCDR配列を含む。
【０１７０】
ヒトIL-5へ結合する抗原結合領域は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含むことができ、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号64のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号65のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iii)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号66のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iv)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号67のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(v)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号68のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;及び、
(vi)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号69のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から構成される群から選択される。
【０１７１】
IL-5へ結合する抗原結合領域は、可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)を含むことができ、該VH及びVLドメインは:
(i)配列番号76のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号77のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号76のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号78のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;及び、
(iii)配列番号76のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号79のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から構成される群から選択される。
【０１７２】
記載されたドメイン/鎖アミノ酸配列との%配列同一性により定義されたそれぞれのドメイン/鎖は、CDR領域外の、フレームワーク領域内又は他の領域内のアミノ酸配列バリエーションを示しつつ、記載されたVH/VLドメイン又は重鎖/軽鎖アミノ酸配列内に存在するものと同一のCDR配列を保持してもよい。
【０１７３】
好ましい実施態様では、本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-4Rαへ結合する抗原結合領域及びIL-5に結合する抗原結合領域を含むことができ、該IL-4Rαに結合する抗原結合領域は第一の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含み、かつ該IL-5に結合する抗原結合領域は第二の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含み、
該第一VH-VLドメイン対は:
(i)配列番号3を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号2を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号1を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号12を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号11を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号10を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号6を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号5を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号4を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号15を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号14を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号13を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(iii)配列番号9を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号8を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号7を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号18を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号17を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号16を含む、又は、それから構成されるLCDR1;から選択されるCDR配列を含み、かつ、
該第二VH-VLドメイン対は:
(i)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号54を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号53を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号52を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号57を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号55を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(ii)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号59を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1;
(iv)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号61を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号60を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1;及び、
(v)配列番号51を含む、又は、それから構成されるHCDR3;配列番号50を含む、又は、それから構成されるHCDR2;配列番号49を含む、又は、それから構成されるHCDR1;配列番号62を含む、又は、それから構成されるLCDR3;配列番号56を含む、又は、それから構成されるLCDR2;配列番号58を含む、又は、それから構成されるLCDR1、から選択されるCDR配列を含む。
【０１７４】
好ましい実施態様では、本発明のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、IL-4Rαへ結合する抗原結合領域及びIL-5に結合する抗原結合領域を含むことができ、該IL-4Rαに結合する抗原結合領域は第一の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含み、かつ該IL-5に結合する抗原結合領域は第二の可変重鎖ドメイン(VH)及び可変軽鎖ドメイン(VL)対を含み、
該第一VH-VLドメイン対は:
(i)配列番号19のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号20のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号21のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号22のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;及び、
(iii)配列番号23のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号24のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;から選択され、かつ、
該第二VH-VLドメイン対は:
(i)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号64のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(ii)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号65のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iii)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号66のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(iv)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号67のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
(v)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号68のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;及び、
(vi)配列番号63のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び、配列番号69のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン、から選択される。
【０１７５】
好ましい実施態様では、本明細書に記載の二重特異性抗体の抗原結合領域は、高いヒト相同性を示す。例えば、本抗原結合領域は、そのCDR配列が由来するVH及び／又はVLドメインのヒト化又は生殖細胞系列のバリアントでもよい。
【０１７６】
本発明の二重特異性抗体は又、完全な又は実質的なヒトであるアミノ酸配列を有する１以上の定常ドメインを含むものでもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体は、ヒトIgG抗体、例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4から由来するFcドメインを含むものでもよい。
【０１７７】
Fcドメインを有する本発明の二重特異性抗体は、本明細書に記載のように、Fc領域内で改変されて、胎児性受容体FcRnへの結合親和性を増強されてもよい。例えば、FcRnへの結合を増加させるために、Fc領域内の１以上のアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基で置換してもよい。Fc領域内の好ましいアミノ酸置換は、本明細書に記載されており、本発明の二重特異性抗体へも同様に適用される。
【０１７８】
本発明の二重特異性抗体は、本明細書に記載のように、pH依存性抗原結合活性を持つように改変しても良い。特に、本二重特異性抗体を、酸性pHでのIL-4Rα及び／又はIL-5結合活性が、中性pHの場合の結合活性と比較して低くなるように、改変しても良い。本二重特異性抗体は、抗体分子のIL-4Rα抗原結合領域及び／若しくはIL-5抗原結合領域の少なくとも一のアミノ酸をヒスチジンで置換することにより、又は少なくとも一のヒスチジンを抗体分子の一方又は両方の抗原結合領域へ挿入することにより、改変してもよい。ヒスチジン置換及び／又は挿入は、本明細書に記載のように、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインのCDR内の１以上の部位で、好ましく導入される。
【０１７９】
（E.処置方法）
本明細書に記載の組合せ療法及び二重特異性抗体は、ヒト対象の慢性気道疾患を処置する方法で使用される。
【０１８０】
従って、本発明は、ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用される、(i)IL-5:IL-5Rのアンタゴニスト;並びに、(ii)IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニスト、を含む組合せを提供する。本発明は又、ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用される、IL-4Rαに結合する抗原結合領域、及びIL-5に結合する抗原結合領域を含む、二重特異性抗体を提供する。本発明は、ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用されるIL-5:IL-5R IL-5のアンタゴニストを提供し、そのアンタゴニストは、IL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニストと組み合せて投与される。本発明は、ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用されるIL-4:IL-4Rのアンタゴニスト及び／又はIL-13:IL-13Rのアンタゴニストを提供し、そのアンタゴニストはIL-5:IL-5Rのアンタゴニストと組み合せて投与される。好ましい実施態様では、本発明は、ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用される、IL-5のアンタゴニストを提供し、そのアンタゴニストはIL-4Rαのアンタゴニストと組み合せて投与される。更に好ましい実施態様では、本発明は、ヒト対象の慢性気道疾患の処置に使用される、IL-4Rαのアンタゴニストを提供し、そのアンタゴニストはIL-5のアンタゴニストと組み合せて投与される。更に好ましい実施態様では、本方法で使用されるアンタゴニストは抗体分子である。
【０１８１】
より更なる態様では、本発明は、ヒト対象の慢性気道疾患を処置する方法であって、本発明の第一の態様の組合せ、又は本発明の第二の態様の二重特異性抗体、の有効量を、対象へ投与することを含む方法、を提供する。本発明の第一の態様の組合せ及び本発明の第二の態様の二重特異性抗体に関する上記記載の全ての実施態様は、本明細書に記載の方法へも同様に適用可能である。
【０１８２】
ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、慢性気道疾患を処置するためのものである。本明細書に記載されるように、慢性気道疾患は、気道及び肺の他の構造の任意の疾患を包含する。非限定的例としては、喘息;慢性副鼻腔炎(CRS);免疫グロブリンG4関連疾患(IgG4-RD);慢性閉塞性肺疾患(COPD);慢性気管支炎;気腫;慢性血管浮腫;バレット食道を含む杯細胞化生を特徴とする疾患;進行中の好酸球性食道炎;鼻ポリポーシス;慢性副鼻腔炎;チャーグ・ストラウス症候群;アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);好酸球増多症候群;水疱性類天疱瘡及び嚢胞性線維症、が含まれる。
【０１８３】
ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、粘液産生の増加を特徴とする慢性気道疾患を処置するためのものである。粘液産生の増加を特徴とする疾患の一例は、嚢胞性線維症である。更なる実施態様では、本明細書に記載の方法は、気管支過敏症を特徴とする慢性気道疾患を処置するためのものである。
【０１８４】
好ましい実施態様では、本明細書に記載の方法は、喘息を処置するためのものである。例示的喘息亜型には、重症喘息、重症の難治性喘息、軽度又は中程度の喘息、肥満関連喘息、運動誘発性喘息、アスピリン誘導性喘息、アトピー性又はアレルギー性喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、無顆粒球性(paucigranulocytic)又は非炎症性喘息、早発性喘息、遅発性喘息、II型高喘息、II型低喘息、及びI型/Th17喘息、が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８５】
好ましい実施態様では、本明細書に記載の方法は、アトピー性又はアレルギー性喘息の処置のためのものである。アトピー性又はアレルギー性喘息は、アレルギー性感作と同時に生じる疾患として臨床的に定義される喘息の形態であり、アレルギー性感作は、血清IgE抗体の存在により明確化され、及び／又は、イエダニ(HDM)、動物のふけ、真菌胞子、植物若しくは木の花粉、又はピーナッツ等の吸入若しくは摂取された普通のアレルゲンの(リポ)タンパク質に対する皮膚プリックテスト陽性により明確化される(Lambrecht及びHammadの文献、(2015)同上)。早発性喘息症例の大部分は、アレルギー性又はアトピー型である。従って、本発明の方法はまた、早発性喘息の処置のためのものでもある。
【０１８６】
更に好ましい実施態様では、本明細書に記載の方法は、II型高(又はII型Hi)喘息を処置するためのものである。II型高喘息は、2型サイトカイン分子の特性が存在することを特徴とする。II型高喘息の患者は、通常、II型低喘息患者と比べて、より高いIL-13及びIL-5レベルを示し、より多数の好酸球及びマスト細胞を有し、より重いアトピー及びSBM(上皮下基底膜)肥厚化を示す(Wenzelの文献、(2012)同上、及びGauthierらの文献、(2015)同上を参照)。本発明の組合せ及び二重特異性抗体は、複数の2型サイトカインのシグナル伝達経路を標的とする。従って、本明細書に記載の組合せ及び二重特異性抗体は、II型高喘息のヒト対象の処置に特に効果的だろう。
【０１８７】
ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、重症喘息、又は重症の難治性喘息を処置するためのものである。
【０１８８】
ほとんど全ての病状の喘息は、病理学的には杯細胞化生又はGCMに関連している。GCMは、IL-4及び／又はIL-13及び上皮成長因子受容体のリガンドの影響下で、繊毛細胞とクララ細胞の杯細胞への分化転換によって引き起こされる。従って、ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、杯細胞化生を減少させることによって喘息を処置するためのものである。このような実施態様では、処置前の杯細胞化生レベルと比べて、杯細胞化生が減少する。
【０１８９】
喘息患者の大部分も含まれる慢性気道疾患の患者は又、気管支過敏症（BHR）を患う。BHRは、さまざまな気道狭窄刺激に対する鋭敏化の増大として定義される。喘息及び慢性閉塞性肺疾患（COPD）のほとんどの患者は、このような鋭敏化の増大を示す。ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、気管支の過敏性を低下させることにより慢性気道疾患を処置するためのものである。好ましい実施態様では、本明細書に記載の方法は、気管支過敏性を低下させることにより喘息を処置するためのものである。このような実施態様では、気管支過敏性は、処置前の気管支過敏性のレベルと比べて低下する。気管支の過敏反応性は、気管支チャレンジテストで評価できる。これには、メタコリン又はヒスタミン等の製品が最もよく使用される。これらの化学物質は、正常な個人でも気管支痙攣を引き起こすが、気管支過敏症の人はより低い閾値を有する。
【０１９０】
大多数の喘息患者も含まれる慢性気道疾患の患者は又、過度の粘液産生を示す。ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、粘液産生の減少によって慢性気道疾患を処置するためのものである。好ましい実施態様では、本明細書に記載の方法は、粘液産生の減少によって喘息を処置するためのものである。このような実施態様では、粘液産生は、処置前の粘液産生のレベルと比べて減少している。粘液産生は、ムチンの発現及び／又は活性、例えばmuc5ACの発現及び／又は活性を測定することにより評価できる。ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、処置前の発現及び／又は活性と比べて、ムチンの発現及び／又は活性が減少することによって、慢性気道疾患を処置するためのものである。ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、処置前の発現及び／又は活性と比べて、ムチンの発現及び／又は活性が減少することによって、喘息を処置するためのものである。
【０１９１】
慢性気道疾患は又、肺機能の低下を特徴とする。努力呼気量(FEV)は肺機能の尺度であり、肺活量計を使用して評価できる。努力呼気量(FEV)は、人が強制呼吸中にどのくらい空気を吐き出せかを測定する。努力呼気肺活量（FVC）は、FEVテスト中に吐き出された空気の総量である。FEV1/FVC比は又、Tiffeneau-Pinelli指標と呼ばれ、総肺活量に対する、努力呼出の最初の1秒間に被験者が吐き出すことのできる肺活量の割合を表す算出比である。FEV1/FVC比の通常の値は約70〜80％である。ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、肺機能を改善することにより慢性気道疾患を処置するためのものである。好ましい実施態様では、本明細書に記載の方法は、肺機能を改善することにより、喘息を処置するためのものである。このような実施態様では、肺機能が、処置前の肺機能と比べて改善される。ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、処置前のFEV1/FVC比と比べてFEV1/FVC比を増大させることにより、慢性気道疾患を処置するためのものである。ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、処置前のFEV1/FVC比と比べてFEV1/FVC比を増大させることにより、喘息を処置するためのものである。
【０１９２】
本明細書に記載の方法は又、慢性気道疾患と関連する併存症、例えば、喘息と関連する併存症を処置するために使用される。重症喘息は:慢性副鼻腔炎;鼻ポリポーシス;アレルギー性鼻炎;呼吸機能障害;声帯機能不全;不安及びうつ病;肥満症;睡眠時無呼吸症候群（OSAS）;胃食道逆流症(GERD);気管支拡張症;アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);及び好酸球性多発血管炎性肉芽腫症(EGPA)(Porsbjerg及びMenzies-Gowの文献、(2017) Respirology 22:651-661を参照)を含む、多くの併存症と関連するが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載の方法は、任意の上記記載の喘息併存症を処置するために使用できる。
【０１９３】
本明細書に記載の方法は、更に治療薬の投与を含んでも良い。ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、慢性気道疾患処置用の１以上の追加的な治療薬の投与を含む。本発明の組合せ又は二重特異性抗体は、追加的な治療薬と、別々に、同時に、逐次的に、又は、同時に重複して投与できる。
【０１９４】
本明細書に記載の方法で処置される患者又は対象は、コルチコステロイド処置等の治療を、既に受けていても良い。本明細書に記載の方法で処置される患者又は対象は、「コルチコステロイド反応性」又は「コルチコステロイド非反応性」として分類されてもよい。患者又は対象は、慢性気道疾患と関連する１以上の症状を示すこともある。ある実施態様では、患者又は対象は、慢性気道疾患の治療のための医療看護を受けている、及び／又は慢性気道疾患の治療のための医療看護を積極的に求めている個人でもよい。
【０１９５】
ある実施態様では、本明細書に記載の方法で処置される患者又は対象は、高い好酸球増加を特徴とする疾患患者でもよい。高い好酸球レベルを有する患者では、デュピルマブ（dupilumab）等、IL-4Rαを標的とする、ある種の既存の薬剤は、患者の循環好酸球レベルが許容できないほど高くなるため、処方できない。理論によって範囲を縛るものではないが、IL-4Rαアンタゴニスト、例えばIL-4Rα抗体、及びIL-5アンタゴニスト、例えばIL-5抗体との組合せ処置は、IL-5は好酸球増殖を促進するため、好酸球レベルが高い患者に適していると考えられる。IL-5とIL-4Rαとを組み合わせた阻害は、IL-4Rα抗体療法で観察される好酸球レベルの増加を防止又は軽減する可能性がある。
【０１９６】
(参考文献の組込み)
様々な刊行物が、前述の説明において及び以下の実施例を通じて引用されており、その各々は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【実施例】
【０１９７】
（実験的実施態様）
本発明は、以下の非限定的実施例により、更に理解されるであろう。
【０１９８】
（実施例1:中和性IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体の作製）
（A.  ラマ免疫化及びライブラリ構築:）
フランス動物福祉法に従って屋外で飼育された２頭のラマを、片方の肩に組換えマウスIL-4Rα-Fcを、もう片方の肩に組換えマウスIL-5（R＆D Systems社）を、筋肉内経由で免疫し、6週間毎週追加免疫した。簡潔に言えば、最初の2週間は、彼らへ、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で緩衝し、不完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich社）と混合した100μgのIL-4Rα-Fc及び50μgのIL-5を与え、残りの4週間は、50μgのIL-4Rα-Fc及び25μgのIL-5を与えた。Fabライブラリの作製は、以前に記載した出願人私有のSIMPLE抗体プラットフォームを使用して実施した（その内容は、それ全体が本明細書に組み込まれている国際特許出願番号WO2010/001251参照）。最後の免疫化から5日後、末梢血リンパ球を含む400mLの血液をラマから採取し、Ficoll-Paqueグラジエントでの遠心分離により精製し、全RNAの抽出に使用した。次に、逆転写酵素を使用して、全RNAをランダムにプライミングされたcDNAに変換し、ラマIgG1のVH-CH1領域及びVL-CLドメイン（カッパ及びラムダ）をコードする遺伝子配列を単離し、ファージミドベクターpCB3へサブクローニングした。pCB3ベクターは、ファージpIIIエンベロープタンパク質へ融合されたFab断片として、組換え抗体の発現を可能にする。
【０１９９】
ヒトIL-4Rα及びヒトIL-5に結合する組換え抗体を作製するために、並行して研究を行った。前記記載と同じプロトコルに従い、ラマを、組換えヒトIL-4Rα-Fc及び組換えヒトIL-5で、筋肉内経由免疫化した。
【０２００】
（B.IL-4Rα及びIL-5へ結合するFabの選択）
大腸菌(E.coli)株TG1(オランダ菌類カルチャーコレクション、Netherlands Culture Collection of Bacteria)を、組換えファージミドを使用して形質転換し、Fab発現ファージライブラリ（免疫化ラマあたり1個のラムダ及び1個のカッパライブラリ）を作製した。ラマを、結晶化可能な断片（Fc）部に結合したIL-4Rαで免疫化したため、Fc結合抗原結合断片（Fab）を発現するファージに対する逆（counter）選択を、最初に、無関係なヒト抗体で実行した。得られたFab発現ファージは108〜109範囲の多様性を有し、次に、以前に記載されているように、固定化された組換えビオチン化IL-4Rα-Fc又はIL-5に吸着され、トリプシンを使用して溶出した(De Haardらの文献、(1999) Journal of Biological Chemistry, 274: 18218-30)。選択を3回行い、IL-4Rα又はIL-5特異的Fabを発現するファージを濃縮した。最後に、TG1大腸菌を、選択したファージで感染させ、個々のコロニーを分離した。大腸菌株TG1のペリプラズムへのFabの分泌を、低グルコース濃度（0.1％w/v）下で、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（Sigma-Aldrich社）を使用して誘導し、菌のFab含有ペリプラズム画分を収集した。
【０２０１】
(C.Fabのスクリーニング、特性評価及び作製)
マウス又はヒト標的それぞれへのFabの結合、及び、それらを中和するそれらの能力は、Biacore 3000装置(GE Healthcare社)を使用して表面プラズモン共鳴(SPR)により決定した。IL-4Rα-Fc及びIL-5を、酢酸ナトリウム緩衝液中でのアミンカップリングを使用して、カルボキシメチルデキストランセンサーチップ(CM-5)上に固定化した（GE Healthcare社）。Fab含有ペリプラズム抽出物を、流速30μL/分で担持した。Fabのオフレートを90秒間で測定した。
【０２０２】
(D.単一特異性抗体作製、精製及び特性評価)
IL-4Rα-及びIL-5-特異的に選択されたFab断片を強力に中和するVH及びVL(ラムダ又はカッパ)ドメインをコードするcDNAを改変し、それぞれFc受容体又はCL(ラムダ又はカッパ)により介される抗体エフェクター機能を無効にする変異を含む、マウスIgG2a(又はヒトIgG1)のCH1、CH2及びCH3ドメインをコードするcDNAを含む、２個の別々なpUPE哺乳類発現ベクターとした。次に、得られた最良の強力中和能を有する抗IL-4Rα及び抗IL-5 IgG2a（又はIgG1）分子の作製（哺乳類細胞の一過性トランスフェクションによる）及び精製（プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる）を、以前に記載されたように行った(Basilicoらの文献、(2014) Journal of Clinical Investigation 124:3172)。
選択された抗体のCDR、VH、及びVL配列を下記表3〜14に示す。
【０２０３】
【表３】
2021513974.tif 000005
【０２０４】
【表４】
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【０２０５】
【表５】
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【０２０６】
【表６】
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【０２０７】
【表７】
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【０２０８】
【表８】
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【０２０９】
【表９】
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【０２１０】
【表１０】
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【０２１１】
【表１１】
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【０２１２】
【表１２】
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【０２１３】
【表１３】
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【０２１４】
【表１４】
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【０２１５】
（実施例2:IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体のインビトロ特性評価）
マウスIL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体(m4RMP36B7及びm5MP95G7)の、それぞれの標的へインビトロで結合するそれらの能力、及び、IL-4Rα及びIL-5シグナル伝達により介される細胞的効果を阻害するそれらの能力を試験した。
【０２１６】
（A.IL4-及びIL5-誘導されるHT-2及びTF-1細胞増殖の阻害）
IL-4Rα及びIL-5単一特異性抗体両方の中和活性を、マウスIL-4及びマウスIL-5それぞれがHT-2及びTF-1細胞の増殖を誘導する、インビトロ細胞アッセイにより評価した。
【０２１７】
ヒトTF-1細胞(赤芽球、ATCC(登録商標)CRL-2003(商標))及びマウスHT-2クローンA5E細胞(IL-2依存性Tリンパ球、ATCC(登録商標)CRL-1841(商標))を、37℃で5％（v/v）CO2と、RPMI1640（Sigma社）、10％（v/v）熱不活化ウシ胎仔血清（Sigma社）、1Xゲンタマイシン(gentamycin)（Sigma社）、及び2ng/mLヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（R＆D Systems社）又はヒトIL-2（R＆D Systems社）を、それぞれ含む増殖培地で培養した。アッセイ培地は、TF-1細胞用にヒトGM-CSF無し、HT-2細胞用にヒトIL-2無しの増殖培地であった。TF-1細胞用の0.5ng/mLマウスIL-5（R＆D Systems社）又はHT-2細胞用のマウスIL-4（R＆D Systems社）をアッセイ培地に添加した。抗体を、TF-1細胞用に1ngのマウスIL-5を含む、又はHT-2細胞用に0.75ngのマウスIL-4を含むアッセイ培地で、TF-1細胞用では10倍、HT-2細胞用では5倍に段階希釈した。細胞を37℃で1時間インキュベートした後、洗浄し、TF-1細胞は1.1×106細胞/mL、HT-2細胞は0.2×106細胞/mLの最終容量で再懸濁した。次に細胞を各ウェルに加え、続いてCellTiter 96(登録商標)AQueous One溶液試薬（Promega社）を添加した。3時間インキュベーション後、吸光度を測定した。
【０２１８】
図1に示すように、IL-4Rα(正方形)及びIL-5(三角形)単一特異性抗体は、マウスIL-4及びIL-5が誘導するHT-2及びTF-1細胞増殖それぞれを、強力に阻害した。特に、IL-4Rα抗体及びIL-5抗体はそれぞれ、0.2nM及び0.6nMを同等のEC50で、マウスIL-4及びIL-5により誘導される細胞性増殖を遮断できた。
【０２１９】
（B.IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体のそれぞれIL-4Rα及びIL-5への結合）
図2は、様々な濃度(0〜20μg/mL)でのモノクローナル抗体(IL-4Rα抗体、IL-5抗体若しくは無関係なIgG2a抗体)と、固定化された標的(IL-4Rα又はIL-5)との間の相互作用の代表的な表面プラズモン共鳴（SPR）センサーグラムを示す。両方のモノクローナル抗体はそれらの標的へ結合する一方、無関係なIgG2aはいずれの標的にも結合しなかった。IL-4Rα及びIL-5単一特異性抗体は、それぞれ8E-11M及び2E-12Mの親和性でそれらの標的へ結合した。
【０２２０】
更に、単一特異性抗体のそれぞれの標的と競合する能力をSPRで試験した。図3は、(IL-4Rα、IL-5若しくは無関係なIgG2aの)モノクローナル抗体及びその標的(IL-4Rα又はIL-5)で構成される混合物と、固定化されたタンパク質(IL-4、IL-13Rα又はIL-5Rα)との間の競合的相互作用のSPR代表的なセンサーグラムを示す。IL-4Rαモノクローナル抗体及びIL-4Rαで構成される混合物は、固定化されたIL-4リガンドへのIL-4Rαの結合を阻害した。IL-4Rαモノクローナル抗体及びIL-13で構成される混合物は、固定化されたIL-13Rαへの、IL-13の結合を阻害した。同様に、IL-5モノクローナル抗体及びIL-5で構成される混合物は、固定化されたIL-5Rαへの、IL-5の結合を阻害した。
【０２２１】
(C.FACSで分析された、精製B細胞の、IL-4で誘導されたMHCクラスII抗原の阻害)
FACS分析を使用して、IL-4Rα単一特異性抗体が、B細胞の表面へのMHCクラスIIの移行を誘導することが知られている、マウスIL-4と競合するかどうかを試験した。
【０２２２】
FACS分析のために、B細胞を、製造者のプロトコルに従って、磁気活性化細胞選別マウス抗CD19マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社）を使用して収集した。精製B細胞（5×105細胞/mL）を24ウェルプレート（Costar社）内で、IL-4（0.1ng/mL）有り若しくは無しで、500ng/mLの抗IL-4Rα又は無関係のIgG2a抗体の存在下で、又は阻害剤有り若しくは無しの培地コントロールで、16時間培養した。細胞を洗浄し、氷上でラットIgG2b抗マウスFcγR単一特異性Ab2.4G2（Bioceros社）と共に20分間プレインキュベートして、IgG Fc受容体をブロックした。次に、細胞をMHCクラスII（M5/114.15.2、eBioscience社）及びCD19（1D3、eBioscience社）に対する抗体で染色した後、4℃で30分間インキュベートし、次に洗浄した。死細胞は、固着可能な生存判別染色（eFluor506、eBioscience社）を使用して、分析から除外した。染色した細胞をLSR Fortessaフローサイトメーター（BD Biosciences社）で分析した。最終分析及び画像出力は、FlowJo v10.0.7ソフトウェア（Tree Star社）を使用して行った。
【０２２３】
図4に示すように、B細胞でのMHCクラスII抗原発現は、IL-4存在下の方がIL-4無しより有意に強かった。IL-4Rαモノクローナル抗体は、精製B細胞でIL-4誘導されるMHCクラスII抗原の発現を、強力に阻害した。
【０２２４】
（実施例３:マウスのイエダニ(HDM)モデルでの、抗マウスIL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体のインビボ特性評価）
イエダニ(HDMダーマトファゴイデス(Dermatophagoides)種)は、世界で最も一般的なアレルゲンの1つである。喘息患者の50〜85％はHDMアレルギーである。HDMへの長時間の曝露は、粘液細胞密度の増加及び気道過敏応答性を伴う気道のリモデリングにつながり、HDM曝露の中止後もそれは治まらない。マウスHDMモデルは、喘息の研究に有効なインビボモデルである。
【０２２５】
(実験設定1)
メスのC57Bl/6J野生型マウスをThe Jackson Laboratoryから入手した。本実験は、炎症研究について、VIB-UGent Center倫理委員会によって承認された。全てのマウスは6〜8週齢の間に使用された。実験は、齢が一致するグループを使用して行った。図5Aに示すように、実験の設計には、完全感作及びチャレンジ期間を通して与えられる抗体処置を含むものであった。0日目に、マウスを、気管内経由イソフルラン(isofluorane)（空気中2.5％）で軽く麻酔し、1μgのHDM（Greer Laboratories社）を投与した。6〜10日目に、マウスを、鼻腔内経由イソフルラン（空気中2.5％）で軽く麻酔し、10μgのHDMでチャレンジを毎日行った。1日前、1、6、8及び10日目に、マウスを次のいずれかで処置した。（i）IL-4Rα単一特異性抗体（m4RMP36B7）、（ii）IL-5単一特異性抗体（m5MP95G7）、（iii）IL-4Rα及びIL-5単一特異性抗体（m4RMP36B7及びm5MP95G7）の組合せ、又は、（iv）無関係なIgG2a抗体。1日前日と1日目は感作期を表し、6日目、8日目、10日目はチャレンジ期を表す。グループあたり少なくともn＝6匹のマウスを処置した。
【０２２６】
（A.喘息のマウスHDMモデルへ組み合せて注入された、強力な中和能を有するIL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体は、好酸球増加を減少させる。）
BAL液の収集及び分析。14日目に、マウスを安楽死させた。気管支肺胞洗浄（BAL）を、3×1mLのEDTA含有PBSを使用してカニューレ気管挿入により行い、BAL液の細胞組成は、先に記載されているように蛍光活性化細胞選別（FACS）によって決定した(Deckersらの文献、(2017) Journal of Allergy and Clinical Immunology 140(5), 1364-1377; Dullaersらの文献、(2017) Journal of Allergy and Clinical Immunology, 140:76-88; Schuijsらの文献、(2015)Science, 349:1106-10)。
【０２２７】
図5Bは、IL-4Rαモノクローナル抗体、IL-5モノクローナル抗体、IL-4Raモノクローナル抗体及びIL-5モノクローナル抗体の組合せ、又は無関係なIgG2a抗体を投与されたマウスの、気管支肺胞(broncheoalveolar)洗浄液の、異なる細胞数を示す。細胞はFACS分析により数えられた。IgG2a処置されたHDM感作誘導マウスでは、好酸球細胞数は、アレルゲンチャレンジで増加した。コントロールIgG2a抗体による処置と比較して、IL-4α/IL-5単一特異性抗体の組合せによる処置後に、好酸球細胞数の有意な減少が観察された。
【０２２８】
(実験設定2)
第二の実験的プロトコルを、マウスのHDMモデルにおけるIL-4Rα及びIL-5抗体の効果を臨床的に関連する治療設定で更に試験するために設計した。図6に示す実験設計は、抗体処置を含む手順が、チャレンジ期の間のみ行われ、感作期中では行われない点で、図5Aの実験設定とは異なる。従って、マウスは、6、8、及び10日目のみ、チャレンジ4時間前に、それらの処置(IL-4Rα単一特異性抗体;IL-5単一特異性抗体;IL-4Rα/IL-5単一特異性抗体(複数)、又は無関係なIgG2a抗体)を受けた。マウスへ、いずれかの単一特異性抗体をそれぞれ150μg、それぞれの単一特異性を組合せて注入される150μg、又は、無関係のマウスIgG2aモノクローナル抗体150μgを投与した。グループあたり少なくともn＝6匹のマウスを処置した。
【０２２９】
続いて、このプロトコルに従い処置されたマウスを、BAL液中の炎症性細胞の総数(図7);縦隔リンパ節でのサイトカイン産生(図8);血清免疫グロブリン産生(図9);杯細胞化生の兆候(図10);及び、気管支過敏症(図11)に関して評価した。
【０２３０】
（A強力な中和能を有するIL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体は、喘息のマウスHDMモデルへ組合せの形で注入されると、好酸球増加を減少させる。）
BAL液の収集及び分析。14日目に、マウスを安楽死させた。気管支肺胞洗浄（BAL）を、3×1mLのEDTA含有PBSを使用してカニューレ気管挿入により行い、BAL液の細胞組成は、先に記載されているように蛍光活性化細胞選別（FACS）によって決定した(Deckersらの文献、(2017) Journal of Allergy and Clinical Immunology 140(5), 1364-1377; Dullaersらの文献、(2017) Journal of Allergy and Clinical Immunology, 140:76-88; Schuijsらの文献、(2015) Science, 349:1106-10)。
【０２３１】
図7は、IL-4Rαモノクローナル抗体、IL-5モノクローナル抗体、IL-4Rα/IL-5の組合せモノクローナル抗体、又は、無関係なIgG2a抗体を投与された、HDM処置されたマウスの、FACSにより分析された、BALの異なる細胞数を示す。無関係なIgG2a抗体で処置されたマウスでは、PBSチャレンジを受けたマウスと比較して、気道HDM曝露は、BAL液中の炎症性細胞の総数を増加させた。更に特に、それは、好酸球、リンパ球及びマクロファージの数を増加させた。興味深いことには、コントロールIgG2a抗体による処置と比較して、単剤療法での処置後に、好酸球数は有意に減少した。好酸球の最小数は、本組合せ療法で処置されたマウスで観察された。
【０２３２】
（B.IL-4Rαモノクローナル抗体及びIL-4Rα/IL-5モノクローナル抗体組合せは、サイトカイン産生を減少させる。）
IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体による、アレルゲン再刺激された腸間膜リンパ節(MLN)細胞におけるサイトカイン産生への効果を、インビトロで試験した。単一細胞懸濁液（2×106細胞/mL）を、100μmの細胞ふるいを通して臓器を均質化することによって、MLNから得た。細胞を生体外で15μg/mL HDMを使用して96丸底プレートで3日間再刺激し、上清を収集し、Read-SET-Go！(登録商標)ELISAセット（eBioscience社）を使用してサイトカイン産生を決定した。
【０２３３】
図8に示すように、アレルゲン再刺激されたMLN細胞の培養物におけるエフェクターサイトカインIL-5及びIL-13のインビトロ産生は、IgG2a処置されたHDM感作誘導マウスでのアレルゲンチャレンジによってブーストされた。しかし、この応答は、IL-4Rα単一特異性抗体、並びに、IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体組合せで処置した後に有意に減少した一方、IL-5単一特異性抗体は有意な効果を示さなかった。
【０２３４】
（C.IL-4Rαモノクローナル抗体、及び、IL-4Rα/IL-5モノクローナル抗体組合せは、HDM特異的IgE及びIgG1の産生を減少させる。）
血液を腸骨静脈から採取し、次に血清を調製して、HDM特異的IgG1及びIgEの量を前記記載のとおりに決定した(Schuijsらの文献、(2015) Science, 349:1106-10)。
【０２３５】
図9に示すように、HDM特異的IgG1及びIgEの血清濃度は、IgG2a抗体処置されたマウスでのアレルゲンチャレンジによってブーストされた。IL-4Rαモノクローナル抗体及びIL-4Rα/IL-5モノクローナル抗体組合せは、アレルゲン誘導IgGのこの増加を有意に減少できた。IL-4Rαモノクローナル抗体、IL-5モノクローナル抗体、及びIL-4Rα/IL-5モノクローナル抗体組合せは、アレルゲン誘導IgEの増加を有意に減少できた。
【０２３６】
（D.IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体の組合せは、Muc5AC及びAgr2の発現を減少させる。）
肺中のムチン発現を、免疫染色により評価した。肺にPBS/OCT（1：1）溶液を注入し、液体窒素内で瞬間冷凍し、先に記載されているようにMuc5AC免疫蛍光染色のために更に処理するまで-80℃を保持した(Deckersらの文献、(2017) Journal of Allergy and Clinical Immunology 140(5),1364-1377)。
【０２３７】
杯細胞化生（GCM）は、IL-13によって引き起こされ、喘息のマウス及びヒトの気道に存在する、ゲル形成ムチンであるMuc5ACの産生を増加させることを特徴とする。IgG2a抗体処置され、HDM感作誘導されたマウスでは、HDMチャレンジは、PBSチャレンジと比較して、気道上皮におけるMuc5AC発現をアップレギュレートした（図10A）。Muc5ACの染色増加は、IL-4Rα又はIL-5抗体単剤療法による影響を受けなかった。しかし著しく異なることに、IL-4Rα/IL-5抗体組合せで処置したマウスの肺は、他のHDMで感作及びチャレンジしたグループと比較して、Muc5ACの染色強度を非常に低下させた。
【０２３８】
IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体のGCMに対する効果を確認し、かつ定量化するために、Muc5acのmRNA発現レベルを、GCMに関与する別のIL-13/STAT6下流標的遺伝子であるAgr2と同様に、肺組織におけるqRT-PCRで測定した。
【０２３９】
肺を、液体窒素内で瞬間冷凍し、先に記載されているようにリアルタイム・定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）のためにさらに処理するまで、-80℃を保持した(Dullaersらの文献、(2017) Journal of Allergy and Clinical Immunology, 140:76-88)。簡潔に言えば、TriPure Isolation Reagent（Roche社、マンハイム、ドイツ）を使用して、製造者のプロトコルに従って、RNAを取得して分離した。Transcriptor High Fidelity cDNA合成キット（Roche社）を使用してRNAを逆転写し、参照遺伝子（Rpl13a、Hprt及びSdha）に対してLightCycler 480システム（Roche社）でSYBRグリーンベースのqRT-PCRを使用してサンプルを分析した。
【０２４０】
図10Bに示すように、これら2個の遺伝子のmRNA発現レベルは、マウス内でのHDMチャレンジによって誘導された。IL-4Rα及びIL-5抗体単独では、Muc5ac mRNA又はAgr2 mRNAのこのレベル増加を有意に逆転しなかった。しかし、IL-4Rαモノクローナル抗体及びIL-5モノクローナル抗体組合せは、Muc5ac又はAgr2 mRNAレベルの、HDMを介した増加を有意に減少した。
【０２４１】
（E.IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体の組合せは、肺抵抗を減少させる。）
気管支過敏症（BHR）は、ムスカリン受容体アゴニスト、メタコリン、のような少量の気管支収縮剤に反応して気道が収縮する傾向である。肺機能は、動的抵抗の侵襲的測定を使用して行った（Flexivent、Scireq社）。
【０２４２】
最後のHDMチャレンジの24時間後、非特異的気道反応性を、超音波ネブライザを使用して、覚醒マウスをエアロゾル化PBSに曝露してベースライン値を設定し、続いてエアロゾル化メタコリン濃度（0〜400μg/kg-1）を増加させて測定した。動的抵抗の侵襲的測定のために、マウスをウレタンで麻酔し、気管切開し、18-Gカテーテルで挿管し、続いてFlexivent装置（SCIREQ社）による機械的人工呼吸を行った。呼吸頻度は一回呼吸量0.2mLで120呼吸/分に設定され、2mL H2Oの呼気終末陽圧を適用した。動的抵抗は、標準化された吸入動作を10秒ごとに2分間行った後に記録した。メタコリンの次の用量を投与する前に、ベースライン抵抗が回復した。
【０２４３】
図11に示すように、コントロールIgG2a抗体処置されたマウス、HDMチャレンジを受けて感作化されたマウスでは、メタコリンは、PBSチャレンジを受けたHDM感作誘導マウスと比較して気道抵抗の増加を引き起こした。IL-5及びIL-4Rα抗体での処置は、BHRを有意に減少させなかった。しかし、IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体の組合せで処置されたマウスは、BHRの発症から完全に保護された。これらの結果は、慢性気道疾患の基本的な態様の処置において、IL-4Rα/IL-5抗体の組合せの相乗効果を示す。
【０２４４】
全体として見ると、これらの結果は、HDM処置されたマウスのチャレンジ中に与えられたαIL-5及びαIL-4Rαの単一特異性抗体組合せは、GCM及びBHRを含む喘息の重要な態様で相乗効果を持つことを示した。
【０２４５】
統計分析は、GraphPad Prismソフトウェアv7.01及びGenstatソフトウェアv19を使用して行った。すべての実験で、結果は平均±平均の標準誤差（SEM）として表し、グループ間の差異は一元配置ANOVAテストを使用して計算した。グループ間の差異は、HDMで感作化されてチャレンジを受け、コントロールIgG2抗体で処置されたグループに対して、*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001、及び****P≦0.0001の場合に、有意であると見なした。
【０２４６】
（実施例4:IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体の作製及びインビトロ特性評価）
IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を、4RMP36B7 IL-4Rα抗体及び5MP95G7 IL-5抗体の配列を使用して作製した。抗体のFc部分を、二重特異性抗体の文脈において正確な鎖対を促進する、「Knob-into-hole」様変異を含むように改変した(Ridgwayらの文献、(1996) Protein Engineering, Design and Selection, 9:617-21)。特に、IL-4Rα抗体4RMP36B7は、マウスFc領域のCH3ドメイン内で、置換T366S、L368A、及びY407Vを導入するように設計した。IL-5抗体5MP95G7は、マウスFc領域のCH3ドメイン内で、置換T366Wを導入するように設計した。
【０２４７】
Godarら(2016, Scientific Reports, 6:31621)の文献に記載のように、IL-4Rα及びIL-5抗体の２本の変異重鎖及び２本の軽鎖を共発現させ、正確な重鎖-軽鎖対を含む二重特異性抗体を、抗イディオタイプVHH抗体を使用して精製した。この精製プロセスを図12に概略的に図示する。
【０２４８】
IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体の純度を、高分解能分光法を使用して確認し、この抗体の二重(dual)標的特性はBIAcoreによって確認した。
【０２４９】
（A.IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体の、IL-4Rα及びIL-5への結合）
図13に示すように、IL-4Rα/IL-5抗体の二重特異性は、SPRを使用して確認した。二重特異性抗体は、チップに固定化されたIL-4Rα-Fcへ特異的に結合し、次にIL-5を追加するとシグナル増加が観察された。これは、二重特異性抗体がコーティングされたIL-4Rαと結合でき、かつ、溶液中のIL-5にも結合できたことを示した（図13A）。この実験は逆の順序で行われ、図13Bに示すように分子の二重特異性が確認された。
【０２５０】
まとめると、これらの結果は、デュアルな抗イディオタイプアプローチは、純粋で機能的なIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体の単離を可能にすることを示す。
【０２５１】
（実施例5:マウスHDMモデルにおける抗マウスIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体のインビボ特性評価）
実施例4で作製したIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を、上記実施例3記載のマウスHDMモデルで試験した。実験的プロトコルは、図14に示す。
マウスへ、HDM感作化及びチャレンジプロトコルを適用し、チャレンジ期のみ抗体処置を行った。
【０２５２】
IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体のインビボ活性を、単剤療法（IL-4Rα又はIL-5単一特異性抗体）及び組合せ（αIL-4Rα/αIL-5単一特異性抗体）と比較した。標的の等モル阻害を比較し、抗体総量の違いを排除するために、抗体を次の用量とした:個々の抗体を試験するために、それぞれ75μgの単一特異性抗体及び75μgの無関係なIgG2a抗体の組合せ;それぞれ75μgの単一特異性抗体を、注入時に組合せた;並びに、150μgの二重特異性抗体。
【０２５３】
続いて、このプロトコルに従い処置されたマウスを、BAL液中の炎症性細胞の総数(図15);縦隔リンパ節でのサイトカイン産生(図16);血清免疫グロブリン産生(図17);杯細胞化生の兆候(図18);及び、気管支過敏症(図19)に関して評価した。実験的プロトコルは、上記実施例3に記載の通り行った。
【０２５４】
（A.喘息のマウスHDMモデルへ注入された、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、好酸球増加を低減させる。）
図15に示すように、感作化マウスでのHDMチャレンジは、BAL液中の好酸球の数を増加させた。この好酸球数の増加は、IL-4Rα及びIL-5抗体の組合せ（75μg＋75μg）を投与されたマウスで有意に減少した。とりわけ、二重特異性IL-4Rα/IL-5抗体（150μg）は、アレルゲンチャレンジで誘発された気道好酸球増加及びリンパ球増加の低減では、IL-4Rα及びIL-5両方のモノクローナル抗体の組合せと同じくらい効果的であった。
【０２５５】
（B.IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、サイトカイン産生を低下させる。）
図16に示すように、HDM誘導されたMLN2型サイトカイン（IL-5及びIL-13）レベルは、IL-4Rα及びIL-5抗体の組合せ、並びに二重特異性抗体による処置後は、有意に減少した。
【０２５６】
（C.IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、HDM特異的IgE及びIgG1の産生を減少させる。）
図17に示すように、HDM特異的IgE及びIgG1も又、IL-4Rα及びIL-5抗体の組合せ並びに二重特異性抗体で処置した後は、有意に減少した。
【０２５７】
（D.IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、Muc5AC及びAgr2の発現を減少させる。）
杯細胞化生（GCM）に対する二重特異性抗体の効果を試験及び比較するために、Muc5ac及びAgr2のmRNA発現レベルを肺組織内で測定した。HDM感作化されてチャレンジを受けたマウスで観察された、Muc5ac及びAgr2発現の増加は、IL-4Rα及びIL-5抗体の組合せ、並びに、二重特異性抗体によって有意に減少した（図18）一方、個々のIL-4Rα及びIL-5抗体処置では、有意な効果を示さなかった。
【０２５８】
（E.IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、肺抵抗を軽減する。）
IL-4Rα及びIL-5抗体の組合せによる処置、並びに二重特異性抗体による処置は、メタコリンで誘導させた気管支収縮によって評価したとおり、HDM誘導BHRから、同じように肺を保護した。図19に示すように、IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体の組合せ、並びに二重特異性抗体で処置されたマウスは、BHRの発症から完全に保護された。反対に、個々のIL-4Rα及びIL-5抗体で処置された、HDMで感作化され、チャレンジを受けたマウスで観察された耐性は、有意に減少しなかった。これは、慢性気道疾患、特に喘息の基本的な態様の処置における、組合せ療法（個々のIL-4Rα及びIL-5抗体の共投与のフォーマット、又は二重特異性抗体のいずれか）の相乗効果を証明する。
【０２５９】
これら結果をまとめると、IL-4Rα及びIL-5を同時に標的とする１個の二重特異性抗体を、HDMで誘導された喘息モデルのチャレンジ期に投与した場合、すべての顕著な喘息の特徴を軽減するのに有効であることが示された。
【０２６０】
（実施例６：IL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体のインビトロ特性評価）
ヒトIL-4Rα及びIL-5モノクローナル抗体(h4RMP5D1、h4RMP3B2、4RMP3D6及びh5MP90A9、h5MP90D9、h5MP92B4、h5MP90C8、h5MP90E7、h5MP90G7)を、インビトロでそれぞれの標的に結合して、実施例2に記載のIL-4Rα及びIL-5シグナル伝達により介される細胞効果を阻害する能力について試験した。次善最適な細胞増殖を生じる濃度でhIL-4及びhIL-5を使用するように、増殖アッセイを改変した。結果を下記表に示す。
【０２６１】
表１５
【表１５】
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【０２６２】
表１６
【表１６】
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【０２６３】
（実施例7:第二のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体の作製及びインビトロ特性評価）
第二のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を、4RMP36B7 IL-4Rα抗体及び5MP95G7 IL-5抗体の配列を使用して作製した。5MP95G7抗体のVH-VLドメインを、15又は20いずれかのアミノ酸リンカー(15GS＝(GGGS)3若しくは20GS＝(GGGS)4)を有する一本鎖Fv(scFv)断片として作製し、２個のこれらscFv断片を、4RMP36B7 IgG抗体のFcドメインのC末端へ(GGGS)3コネクター(15GS)を介して接続した。更に又、scFvを安定させるために、２個の突然変異を、１個はVH95G7（G44C）、もう一個はVL97G7（G100C）に導入した。この第二のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体の概略図を図20に示す。
【０２６４】
この第二のIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を、TF-1細胞のIL-5誘導性増殖を阻害するその能力について試験した。二重特異性抗体を、IL-4Rα抗体36B7hIgG1並びにIL-5抗体95G7hIgG1及び95G7mIgG2aと共に試験した。
【０２６５】
アッセイは本質的に、前記実施例２で記載したように行った。具体的には、固定濃度のmIL-5(R＆D Systems社)を、抗体の５倍段階希釈（100nMから開始）でプレインキュベートし、500.000ヒトTF-1細胞(赤芽球、ATCC(登録商標)CRL-2003(商標))へ加え(マウスIL-5最終濃度(R＆D Systems社)0.25ng/mL)、その細胞を5％CO2で37℃で48時間インキュベートした。20μlのCellTiter 96(登録商標)AQueous One溶液試薬（Promega社）を添加し、細胞を37℃で3時間インキュベートした。吸光度をA490対A655で測定した。
結果を図21及び下記表17に示す。
【０２６６】
表１７
【表１７】
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【０２６７】
予想された通り、IL-4Ra抗体はTF-1細胞の増殖に全く効果を示さなかった一方、ヒトIgG1又はマウスIgG2a抗体のいずれかとして構成した95A7抗体は、IL-5誘導される細胞増殖を阻害できた。興味深いことに、IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体は、95A7 IgG抗体よりもはるかに高い強さ＝100倍の強度向上で、IL-5誘導性細胞増殖を阻害できた。言い換えると、IL-4Rα IgG抗体のFc領域のC末端でscFv断片として構成された95A7抗体のVH-VLドメインは、ネイティブなIgG構造でFabアームとして構成される場合よりもはるかに強力であった。
【０２６８】
（実施例8:マウスHDMモデルにおける抗マウスIL-4Rα/IL-5 IgG-scFv二重特異性抗体のインビボ特性評価）
前記実施例７に記載されたIL-4Rα/IL-5二重特異性抗体を、前記実施例３及び５に記載のマウスHDMモデルで試験した。実験プロトコルを図22に示す。マウスにHDM感作及びチャレンジプロトコルを適用し、チャレンジ期でのみ抗体処置を行った。
【０２６９】
IL-4Rα/IL-5二重特異性抗体（4Rsc5）のインビボ活性を、抗mIL-4Rα(36B7)及び抗mIL5(95G7)の組合せと比較した。それぞれの注入は、150μg若しくは75μgの二重特異性(4Rsc5)、又は組合せ(その場合、それぞれの抗体75μgで合計150μgとするか、それぞれの抗体36.75μgで注入あたりの用量75μg)のいずれかであった。
【０２７０】
続いて、このプロトコルに従い処置されたマウスを、BAL液中の好酸球及びリンパ球細胞の総数（図23）、並びに、muc5a、spdef及びagr2の発現（図24）に関して評価した。実験的プロトコルを、前記実施例3に記載のように行った。
【０２７１】
（実施例9:ヒトIL-4Rα抗体の設計）
ヒトIL-4Rαモノクローナル抗体＝4RMP3D6を、Cyno/Rhesus(カニクイザル／アカゲザル)IL-4Rαと交差反応するように設計した。4RMP3D6のバリアントを、エラーが発生しやすいPCRアプローチを使用して、ランダム突然変異誘発(mutatagenesis)によって作製した。このために、GeneMorphII EZClone ドメイン突然変異誘発キット（Agilent社）を使用した。供給元の推奨に従い、4RMP3D6のVH及びVKに突然変異を導入した。変異したVH（VHm＊）及びVK（VKm＊）を更に、CH1及びCK定常ドメインを含むファージミドベクター（PCB13）にクローン化して、変異Fabライブラリを作製した。
【０２７２】
シーケンシングは、この手順が各Vドメイン（VHとVK）内で約3〜5個のアミノ酸置換へ導くことを示した。いくつかのライブラリ（VHm＊/VKwt、VHwt/VKm＊及びVHm＊/VKm＊）を作製し、カニクイザル(cynomolgus)組換えIL-4Rα（agroBioscience社 cat♯ILR-C52H8）でのファージディスプレイ選択の数回のラウンドに使用した。3ラウンドの選択の後、クローンを（ラウンド2及び3から）選択し、ペリプラズム抽出物からFabを作製し、SPRで試験した。SPRのために、Biacore 3000を、ヒトIL-4Rα又はカニクイザルIL-4RαのいずれかでコーティングされたCM5チップと組み合わせて使用した。結合(R0)及び解離(kd、s-1)は、下記表18に示すとおりに記録された。
【０２７３】
表１８
【表１８】
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【０２７４】
選択した抗体のCDR、VH及びVL配列を下記表19〜21に示す。
【０２７５】
【表１９】
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【０２７６】
【表２０】
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【０２７７】
【表２１】
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【図１】
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【図２】
2021513974.tif 000025
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021513974.tif 000030
【図８】
2021513974.tif 000031
【図９】
2021513974.tif 000032
【図１０Ａ】
2021513974.tif 000033
【図１０Ｂ】
2021513974.tif 000034
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2021513974.tif 000039
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月10日(2020.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021513974000001.app
【国際調査報告】
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2021513974.tif 000051
2021513974.tif 000052