(57)【要約】  本発明は、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２（３Ｈ）−オン系化合物（１）の結晶形及びその製造方法並びにＰＤＥ４受容体関連疾患を治療する薬物の製造における応用を提供する。
2021512076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末Ｘ線回折パターンは、１４．１０±０．２°、１９．０７±０．２°、２１．７９±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、化合物１のＡ結晶形。
【化１】
2021512076.tif 000018
【請求項２】
粉末Ｘ線回折パターンは、１０．６９±０．２°、１２．３１±０．２°、１３．４５±０．２°、１４．１０±０．２°、１４．６２±０．２°、１９．０７±０．２°、２０．３３±０．２°、２１．７９±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、請求項１に記載の化合物１のＡ結晶形。
【請求項３】
粉末Ｘ線回折パターンは、６．２５±０．２°、８．９３±０．２°、１０．６９±０．２°、１２．３１±０．２°、１３．４５±０．２°、１４．１０±０．２°、１４．６２±０．２°、１８．１６±０．２°、１９．０７±０．２°、２０．３３±０．２°、２１．７９±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、請求項２に記載の化合物１のＡ結晶形。
【請求項４】
ＸＲＰＤパターンは、図１に示すとおりである、請求項３に記載の化合物１のＡ結晶形。
【請求項５】
示差走査熱量曲線は、２０１．７０℃±２℃に吸熱ピークの開始点を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物１のＡ結晶形。
【請求項６】
ＤＳＣパターンは、図２に示すとおりである、請求項５に記載の化合物１のＡ結晶形。
【請求項７】
熱重量分析曲線における１００．００±２℃での重量の減量は０．０２０３９％に達する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物１のＡ結晶形。
【請求項８】
ＴＧＡパターンは、図３に示すとおりである、請求項７に記載の化合物１のＡ結晶形。
【請求項９】
化合物１を、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒と水との混合溶媒、ケトン系溶媒と水との混合溶媒又はエーテル系溶媒と水との混合溶媒に添加し、加熱して溶解させ、その後、降温して晶析させることにより製造することを含む、化合物１のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１０】
前記アルコール系溶媒は、メタノール、エタノール及びイソプロパノールから選択される、請求項９に記載の化合物１のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１１】
前記ケトン系溶媒は、アセトン及びブタノンから選択される、請求項９に記載の化合物１のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１２】
前記エーテル系溶媒は、エチレングリコールジメチルエーテルから選択される、請求項９に記載の化合物１のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１３】
アルコール系溶媒と水との混合溶媒は、エタノールと水との混合溶媒から選択される、請求項９に記載の化合物１のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１４】
前記アルコール系溶媒と水との混合溶媒において、アルコール系溶媒と水との体積比は、１：０．２〜１．５から選択される、請求項１３に記載の化合物１のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１５】
ＰＤＥ４受容体関連疾患を治療する薬物の製造における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物１のＡ結晶形の使用。
【請求項１６】
前記ＰＤＥ４関連疾患は、乾癬、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患を意味する、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１月２９日出願の第ＣＮ２０１８１００８５７０４．１号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２（３Ｈ）−オン系化合物の結晶形及びその製造方法に関し、前記結晶形の、ＰＤＥ４関連疾患を治療する薬物の製造における応用をさらに含む。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）は、主に単核食細胞が免疫刺激物質に応答するときに放出されるサイトカインである。ＴＮＦαは、細胞の分化、リクルート、増殖及びタンパク質の分解などのほとんどの過程を促進することができる。低いレベルの場合、ＴＮＦαは、感染性因子、腫瘍及び組織損傷を防止する保護作用を有する。しかし、ＴＮＦαは、多すぎて放出されると、疾患を誘発し、例えば、ＴＮＦαが哺乳動物又はヒトに投与されると、炎症、発熱、心血管への作用、出血、血液凝固及び急性感染とショック状態に似ている急性反応を誘発するか又は悪化させる。動物体又は人体内に過剰な又は制御されないＴＮＦαが産生すると、通常、内毒素血症及び／又は毒素性ショック症候群、悪液質、成人呼吸窮迫症候群、癌（例えば固形腫瘍及び血液系腫瘍）、心臓病（例えばうっ血性心不全）、ウイルス感染、遺伝性疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患という疾患に罹患することを提示する。
【０００４】
癌は、特に破壊性がある疾患であり、血液中のＴＮＦαレベルの向上は、癌の罹患又は癌の拡散のおそれがあることを提示する。一般的に、癌細胞は健康体の循環系に生存することができず、その理由の１つは、血管内壁が腫瘍細胞の遊出の障壁となることである。研究から、内皮細胞上のＥＬＡＭ−１は、結腸癌細胞の、サイトカインで処理された内皮への接着促進を仲介できることがわかった。
【０００５】
環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）は、多くの疾患及び病症において役割を果たす。炎症の場合、白血球中のｃＡＭＰ濃度の上昇は、白血球の活性化を抑制すると共に、ＴＮＦα及びＮＦ−κＢなどを含む炎症制御因子が放出される。ｃＡＭＰレベルの向上は、気道平滑筋の弛緩にもつながる。
【０００６】
ｃＡＭＰ不活性化の主な細胞メカニズムとしては、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）と呼ばれるアイソザイムによりｃＡＭＰが破壊される。１１種類のＰＤＥファミリーが知られている。これまで、ＰＤＥ４酵素を抑制することが、炎症メディエータの放出や気道平滑筋の弛緩への抑制に特に効果的であることが確認されたため、ＰＤＥ４酵素は既に薬物標的の一つとして注目を浴びている。異なる遺伝子コードに基づいて、ＰＤＥ−４ファミリーは、４つのサブタイプ（ＰＤＥ−４Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に分類することができる。炎症細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞及び好中球など）におけるＰＤＥ−４Ａ、ＰＤＥ−４Ｂ及びＰＤＥ−４Ｄの発現は、ＰＤＥ−４Ｃより高い。ＰＤＥ４酵素を抑制してｃＡＭＰレベルを上昇させることで、ＴＮＦαレベルを調節し、疾患を治療するという目的を達成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、粉末Ｘ線回折パターンが１４．１０±０．２°、１９．０７±０．２°、２１．７９±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する化合物１のＡ結晶形を提供する。
【化１】
2021512076.tif 000003
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１のＡ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、１０．６９±０．２°、１２．３１±０．２°、１３．４５±０．２°、１４．１０±０．２°、１４．６２±０．２°、１９．０７±０．２°、２０．３３±０．２°、２１．７９±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する。
【０００９】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１のＡ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、６．２５±０．２°、８．９３±０．２°、１０．６９±０．２°、１２．３１±０．２°、１３．４５±０．２°、１４．１０±０．２°、１４．６２±０．２°、１８．１６±０．２°、１９．０７±０．２°、２０．３３±０．２°、２１．７９±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する。
【００１０】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１のＡ結晶形のＸＲＰＤパターンは、図１に示すとおりである。
【００１１】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１のＡ結晶形のＸＲＰＤパターンの解析データは、表１に示すとおりである。
【００１２】
【表１】
2021512076.tif 000004
【００１３】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１のＡ結晶形の示差走査熱量曲線は、２０１．７０℃±２℃に吸熱ピークの開始点を有する。
【００１４】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１のＡ結晶形のＤＳＣパターンは、図２に示すとおりである。
【００１５】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１のＡ結晶形の熱重量分析曲線における１００．００±２℃での減量は０．０２０３９％に達する。
【００１６】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１のＡ結晶形のＴＧＡパターンは、図３に示すとおりである。
【００１７】
本発明は、化合物１を、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒と水との混合溶媒、ケトン系溶媒と水との混合溶媒又はエーテル系溶媒と水との混合溶媒に添加し、加熱して溶解させ、その後、降温して晶析させることにより製造することを含む、Ａ結晶形の製造方法をさらに提供する。
【００１８】
本発明のいくつかの態様では、上記アルコール系溶媒は、メタノール、エタノール及びイソプロパノールから選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの態様では、上記ケトン系溶媒は、アセトン及びブタノンから選択される。
【００２０】
本発明のいくつかの態様では、上記エーテル系溶媒は、エチレングリコールジメチルエーテルから選択される。
【００２１】
本発明のいくつかの態様では、上記アルコール系溶媒と水との混合溶媒は、エタノールと水との混合溶媒から選択される。
【００２２】
本発明のいくつかの態様では、上記アルコール系溶媒と水との混合溶媒において、アルコール系溶媒と水との体積比は、１：０．２〜１．５から選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの態様では、ＰＤＥ４受容体関連疾患を治療する薬物の製造における、上記化合物１のＡ結晶形の使用がさらに提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの態様では、上記ＰＤＥ４関連疾患とは、乾癬、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患を指す。
【発明の効果】
【００２５】
化合物１のＡ結晶形は、特性が安定し、吸湿性が低く、製薬化の見通しがよい。化合物１のＡ結晶形は、アルコール系溶媒、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アルコール系溶媒と水との混合溶媒、アセトニトリルと水との混合溶媒又はアセトンと水との混合溶媒のいずれにおいても良好な安定性を有する。化合物１のＡ結晶形は４０℃／相対湿度７５％の加速条件で良好な安定性を有し、化合物１のＡ結晶形は２５℃／相対湿度６０％の長期条件下で良好な安定性を有する。
【００２６】
化合物１は、ホスホジエステラーゼ４Ｂサブタイプ（ＰＤＥ４Ｂ）を抑制する優れたインビトロ活性を示す。化合物１は、ｈＰＢＭＣにおいて、ＴＮＦα産生を抑制する優れたインビトロ活性を示し、かつアプレミラストよりも優れる。
【００２７】
化合物１は、０．３、１及び３ミリグラム／キログラムの３つの用量群において、コラーゲン誘発性関節炎の症状に対していずれも顕著な改善作用を有する。かつ１ミリグラム／キログラムと３ミリグラム／キログラムの用量群において、関節炎の病理学的病変に対して顕著な改善を有し、３つの用量群は、関節炎の病理学的スコアにおいて明らかな用量反応関係を示す。３ミリグラム／キログラムの化合物１の治療効果（臨床的スコア及び関節炎の病理学的スコア）は、５ミリグラム／キログラムのアプレミラストより優れる。
【００２８】
定義及び説明
特に断りのない限り、本明細書で使用される以下の用語及び文句は、以下の意味を含むことを意図する。特定の文句又は用語は、特に定義がない限り、不明確又は不明瞭であるとみなされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書には商品名が記載される場合、その対応する商品又はその活性成分を意味する。
【００２９】
本発明の中間体化合物は、以下に列挙する具体的な実施形態、それらを他の化学合成方法と組み合わせることによって形成される実施形態、及び当業者に周知の均等な置換形態を含む、当業者に周知の様々な合成方法によって製造でき、好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の具体的な実施形態における化学反応は、適切な溶媒中で完成され、前記溶媒は、本発明の化学変化及びそれに必要な試薬と材料に適するべきである。本発明の化合物を取得するために、当業者が既存の実施形態に基づいて合成ステップ又は反応流れを変更するか又は選択する必要がある場合がある。
【００３１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明を何ら限定するものではない。
【００３２】
本発明で使用される全ての溶媒は市販されており、さらに精製することなく使用することができる。
【００３３】
本発明は、以下の略語を使用する。ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドを表し、ＭｓＯＨは、メタンスルホン酸を表し、ＥｔＯＨは、エタノールを表し、ＮａＯＨは、水酸化ナトリウムを表す。
【００３４】
化合物は、人工的に又はＣｈｅｍＤｒａｗソフトウェアで命名され、市販の化合物は、サプライヤーによるカタログ名称を採用する。
【００３５】
本発明の粉末Ｘ線回折（Ｘ−ｒａｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）方法
機器型番：ブルカーＤ８ａｄｖａｎｃｅ  Ｘ線回折計
試験方法：約１０〜２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出に使用する。
詳細なＸＲＰＤパラメータは以下のとおりである：
Ｘ線管：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）
Ｘ線管電圧：４０ｋＶ、Ｘ線管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４−４０ｄｅｇ
ステップ幅：０．０２ｄｅｇ
ステップ時間：０．１２秒
サンプルプレート回転数：１５ｒｐｍ
【００３６】
本発明の示差走査熱量分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法
機器型番：ＴＡ  Ｑ２０００示差走査熱量計
試験方法：サンプル（〜１ｍｇ）をＤＳＣアルミニウムパン内に入れて試験を行い、５０ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの升温速度で、サンプルを２５℃から３５０℃に加熱する。
【００３７】
本発明の熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法
機器型番：ＴＡ  Ｑ５０００ＩＲ熱重量分析計
試験方法：サンプル（２〜５ｍｇ）をＴＧＡ白金パン内に入れて試験を行い、２５  ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの升温速度で、サンプルを室温から３５０℃に加熱する。
【００３８】
本発明の動的蒸気吸着分析（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｖａｐｏｒ  Ｓｏｒｐｔｉｏｎ、ＤＶＳ）方法
機器型番：ＳＥＭ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−１動的蒸気吸着装置
試験条件：サンプル（１０〜２０ｍｇ）をＤＶＳサンプルプレート内に入れて試験を行う。
詳細なＤＶＳパラメータは以下のとおりである：
温度：２５℃
平衡：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１％／ｍｉｎ（最短：１０ｍｉｎ、最長：１８０ｍｉｎ）
乾燥：０％ＲＨで１２０ｍｉｎ乾燥させる
ＲＨ（％）試験勾配：１０％
ＲＨ（％）試験勾配範囲：０％−９０％−０％
吸湿性の評価分類は以下のとおりである：
【表２】
2021512076.tif 000005
【００３９】
本発明の含有量測定方法
機器型番：ＤＡＤ検出器付きアジレント１２６０高速液体クロマトグラフ又はＰＤＡ検出器付き島津ＬＣ−２０Ａ高速液体クロマトグラフ
クロマトグラフィー条件の具体的なパラメータは以下のとおりである：
クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２３０ｎｍ
注入量：１０μＬ
稼働時間：６０ｍｉｎ
移動相Ａ：０．０４％トリフルオロ酢酸水溶液（Ｖ／Ｖ）
移動相Ｂ：アセトニトリル
希釈剤：アセトニトリル：純水＝３：１（ｖ／ｖ）
ニードル洗浄液：アセトニトリル：純水＝３：１（ｖ／ｖ）
勾配溶出手順：
【表３】
2021512076.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】化合物１のＡ結晶形のＣｕ−Ｋα放射によるＸＲＰＤパターンである。
【図２】化合物１のＡ結晶形のＤＳＣパターンである。
【図３】化合物１のＡ結晶形のＴＧＡパターンである。
【図４】化合物１のＡ結晶形のＤＶＳパターンである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の内容をよりよく理解するために、以下に具体的な実施例を参照してさらに説明するものの、具体的な実施形態は本発明の内容を限定するものではない。
【００４２】
実施例１：化合物１のＡ結晶形の製造
【化２】
2021512076.tif 000007
【００４３】
ステップ１：化合物３の合成
室温で、化合物ｂ（１０．００ｇ、３９．７７ｍｍｏｌ）、化合物２（９．７８ｇ、３５．７９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアミン（１０．２８ｇ、７９．５３ｍｍｏｌ、１３．８９ｍＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００．００ｍＬ）に溶解し、窒素ガスで３回置換し、窒素ガス雰囲気下で反応混合物を１２０℃に加熱し、かつ１６時間撹拌反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、反応混合物に水（４００ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮し、残留物に対してカラムクロマトグラフィー（溶出剤：酢酸エチル／石油エーテル＝１／４−１／２、体積比）を行い、目的化合物３を得た。
【００４４】
ＭＳ‐ＥＳＩｍ／ｚ： ５０９．８［Ｍ＋Ｎａ］＋、５１１．８［Ｍ＋Ｎａ＋２］＋．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：８．２７（ｓ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９０‐６．８６（ｍ、２Ｈ）、６．８１（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．７２（ｑ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０４（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．８０（ｓ、３Ｈ）、３．６８（ｄｄ、Ｊ＝６．６、１４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．４０（ｄｄ、Ｊ＝６．４、１４．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．５２（ｓ、３Ｈ）、２．４５（ｓ、３Ｈ）、１．４０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）．
【００４５】
ステップ２：化合物４の合成
室温で、化合物３（１２．１０ｇ、２４．７８ｍｍｏｌ）及びオルトフルオロフェニルボロン酸（５．２０ｇ、３７．１７ｍｍｏｌ）をジオキサン（１５０．００ｍＬ）及び水（５０．００ｍＬ）に溶解し、窒素ガス雰囲気下で炭酸カリウム（１０．２７ｇ、７４．３４ｍｍｏｌ）と［１，１’‐ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウムジクロロメタン錯体（２．０２ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）を添加し、窒素ガス雰囲気下で反応混合物を８０℃に加熱し、かつ１４時間撹拌反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、反応混合物に水（５００ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（３００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮し、残留物に対してカラムクロマトグラフィー（溶出剤：酢酸エチル／石油エーテル＝１／１０‐１／４、体積比）を行い、目的化合物４を得た。
【００４６】
ＭＳ‐ＥＳＩｍ／ｚ：５０４．１［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：８．０７（ｓ、１Ｈ）、７．４２（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８‐７．３０（ｍ、１Ｈ）、７．１８‐７．０６（ｍ、３Ｈ）、６．９８‐６．８９（ｍ、２Ｈ）、６．８３（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．８２（ｑ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．１３‐４．００（ｍ、３Ｈ）、３．８１（ｓ、３Ｈ）、３．４３（ｄｄ、Ｊ＝６．４、１４．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．５５（ｓ、３Ｈ）、２．２３（ｓ、３Ｈ）、１．４１（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）．
【００４７】
ステップ３：化合物５の合成
室温で、化合物４（９．２０ｇ、１８．２７ｍｍｏｌ）及び塩化アンモニウム（９．７７ｇ、１８２．７０ｍｍｏｌ）にメタノール（２００．００ｍＬ）を添加し、０℃で亜鉛粉末（１１．９５ｇ、１８２．７０ｍｍｏｌ）を２０バッチに分けて添加し、反応混合物を０℃で１６時間撹拌反応させた。反応終了後、反応混合物を濾過して亜鉛粉末を除去し、濾液を減圧下で濃縮して残留物を得た。残留物をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、懸濁液を濾過して不溶物を除去し、濾液を減圧下で濃縮して化合物５を得た。
【００４８】
ＭＳ‐ＥＳＩｍ／ｚ：４７４．０［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：７．５５（ｓ、１Ｈ）、７．４２‐７．３２（ｍ、１Ｈ）、７．２０（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．１３（ｔ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８‐７．０３（ｍ、２Ｈ）、６．８８（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０（ｓ、１Ｈ）、４．１９‐４．０７（ｍ、２Ｈ）、４．００‐３．９０（ｍ、１Ｈ）、３．８７（ｓ、３Ｈ）、３．５８（ｄｄ、Ｊ＝６．０、１４．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．７８（ｓ、３Ｈ）、２．０５（ｓ、３Ｈ）、１．４７（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）．
【００４９】
ステップ４：化合物１の合成
室温で、化合物５（９．３０ｇ、１９．６４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１９．８７ｇ、１９６．４０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２００．００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、トリホスゲン（２．３３ｇ、７．８６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５０．００ｍＬ）溶液を上記反応液に滴下し、滴下終了後、窒素ガス雰囲気下で反応混合物を０℃で３時間撹拌反応させた。反応終了後、反応混合物に水（２００ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮し、残留物に対してカラムクロマトグラフィー（溶出剤：酢酸エチル／石油エーテル＝１／３‐２／１、体積比）を行い、化合物１を得た。
【００５０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：１０．１３‐１０．０１（ｍ、１Ｈ）、７．８７（ｓ、１Ｈ）、７．３９‐７．３２（ｍ、１Ｈ）、７．３１（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８‐７．１５（ｍ、３Ｈ）、７．１１（ｔ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７４（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．１４（ｄｄ、Ｊ＝４．８、９．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．８６（ｄｄ、Ｊ＝９．４、１４．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．０９‐３．９７（ｍ、２Ｈ）、３．８８（ｄｄ、Ｊ＝４．４、１４．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．７６（ｓ、３Ｈ）、２．７０（ｓ、３Ｈ）、２．１６（ｓ、３Ｈ）、１．３５（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）．
【００５１】
ステップ５：化合物１のＡ結晶形の製造
室温で、化合物１（６．４５ｇ、１２．９１ｍｍｏｌ）に水（１６０．００ｍＬ）及びエタノール（１７０．００ｍＬ）を添加し、反応混合物を９０℃で０．５時間撹拌し、撹拌過程において反応溶液が徐々に清澄になった。反応混合物を撹拌中に２０℃まで徐々に冷却し、かつ２０℃で１６時間撹拌を続け、撹拌期間に白色固体が多く析出した。白色固体を濾過によって収集し、４５℃の真空オーブンで１８時間乾燥させて化合物１のＡ結晶形を得た。
【００５２】
ＭＳ‐ＥＳＩｍ／ｚ：５００．２［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：９．９７（ｓ、１Ｈ）、７．９４（ｓ、１Ｈ）、７．４６‐７．３９（ｍ、１Ｈ）、７．３８（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２６‐７．２２（ｍ、３Ｈ）、７．１７（ｔ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．８１（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．２２（ｄｄ、Ｊ＝４．８、９．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．９３（ｄｄ、Ｊ＝９．６、１４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．１３‐４．０３（ｍ、２Ｈ）、３．９５（ｄｄ、Ｊ＝４．８、１４．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．８３（ｓ、３Ｈ）、２．７７（ｓ、３Ｈ）、２．２３（ｓ、３Ｈ）、１．４２（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）．
【００５３】
実験例１：Ａ結晶形の異なる溶媒中での安定性試験
５０ｍｇのＡ結晶形を複数分取り、それぞれ下記表中の単一又は混合溶媒に添加し、４０℃の条件で２日撹拌した後に遠心分離した。全てのサンプル中の固体を収集し、真空オーブン中（４０℃）で一晩乾燥させ、その結晶形の状態をＸＲＰＤで検出した。結果を表２に示す。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
実験結論：化合物１のＡ結晶形は、アルコール系溶媒、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アルコール系溶媒と水との混合溶媒、ケトン系溶媒と水との混合溶媒、アセトニトリルと水との混合溶媒又はアセトンと水との混合溶媒のいずれにおいても良好な安定性を有する。
【００５６】
実験例２：化合物１のＡ結晶形の吸湿性に関する研究
実験材料：ＳＥＭ  ＤＶＳ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−１動的蒸気吸着装置
実験方法：化合物１のＡ結晶形１０〜２０ｍｇをＤＶＳサンプルプレート内に入れて試験を行う。
実験結果：化合物１のＡ結晶形のＤＶＳパターンは、図４に示すとおりであり、△Ｗ＝０．０８％である。
実験結論：化合物１のＡ結晶形の２５℃及び８０％ＲＨでの吸湿による重量増加は０．０８％であり、０．２％より小さく、吸湿性がないか又はほとんどない。
【００５７】
実験例３：化合物１のＡ結晶形の高温、高湿及び強光条件下での固体安定性試験
『原薬と製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬典２０１５版四部通則９００１）に準じ、化合物１のＡ結晶形の高温（６０℃、開口）、高湿（室温／相対湿度９２．５％、開口）及び強光（４５００±５００ｌｕｘ、９０μｗ／ｃｍ２、封口）条件での安定性を考察した。
【００５８】
化合物１のＡ結晶形を１．５ｇ秤量し、開口した時計皿に入れ、薄く一層に敷いた。高温及び高湿条件で放置したサンプルをデシケータに入れて考察し、５日目、１０日目及び３０日目にサンプリングして検出し、検出結果と０日目の初期検出結果とを比較し、強光条件で放置したサンプルに透明な蓋を被せ、パラフィルムで密封し、５日目、１０日目にサンプリングして検出し、検出結果と０日目の初期検出結果とを比較した。試験結果を以下の表３に示す。
【００５９】
【表５】
2021512076.tif 000009
【００６０】
結論：化合物１のＡ結晶形は、高温、高湿又は強光条件のいずれにおいても良好な安定性を有する。
【００６１】
実験例４：化合物１のＡ結晶形の加速条件での固体安定性試験
『原薬と製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬典２０１５版四部通則９００１）に準じ、化合物１のＡ結晶形の高温及び高湿の加速条件（４０℃／相対湿度７５％、密封）での安定性を考察した。
【００６２】
化合物１のＡ結晶形を１．４ｇ秤量し、二層低密度ポリエチレン袋に入れ、各層の低密度ポリエチレン袋をそれぞれ封口して密封し、さらにアルミ箔袋に入れてヒートシールし、１月目、２月目、３月目及び６月目にサンプリングして検出し、検出結果と０日目の初期検出結果とを比較した。この試験を３回繰り返し、異なるバッチの化合物１のＡ結晶形を毎回採用し、試験結果を以下の表４に示す。
【００６３】
【表６】
2021512076.tif 000010
【００６４】
結論：化合物１のＡ結晶形は４０℃／相対湿度７５％の加速条件で良好な安定性を有する。
【００６５】
実験例５：化合物１のＡ結晶形の長期条件での固体安定性試験
『原薬と製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬典２０１５版四部通則９００１）に準じ、化合物１のＡ結晶形の長期条件（２５℃／相対湿度６０％、密封）での安定性を考察した。
【００６６】
化合物１のＡ結晶形を１．４ｇ秤量し、二層低密度ポリエチレン袋に入れ、各層の低密度ポリエチレン袋をそれぞれ封口して密封し、さらにアルミ箔袋に入れてヒートシールし、３月目、６月目、９月目、１２月目及び１８月目にサンプリングして検出し、検出結果と０日目の初期検出結果とを比較した。この試験を３回繰り返し、異なるバッチの化合物１のＡ結晶形を毎回採用する。試験結果を以下の表５に示す。
【００６７】
【表７】
2021512076.tif 000011
【００６８】
結論：化合物１のＡ結晶形は、２５℃／相対湿度６０％の長期条件で良好な安定性を有する。
【００６９】
試験例１：化合物１のホスホジエステラーゼ４Ｂサブタイプ（ＰＤＥ４Ｂ酵素）に対する抑制活性
該生物学的実験は、蛍光偏光によってＡＭＰ／ＧＭＰ発現を測定し、すなわちＡＭＰ／ＧＭＰ抗体結合を追跡することにより、酵素の活性を示すものである。
【００７０】
試薬：
実験緩衝溶液：１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン‐塩酸緩衝溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び１％ＤＭＳＯ。
酵素：組み換えヒトＰＤＥ４Ｂ（遺伝子登録番号ＮＭ＿００２６００、アミノ酸３０５末端）は、Ｎ末端ＧＳＴタグを使用して、Ｓｆ９昆虫細胞におけるバキュロウイルスによって発現される。ＭＷ＝７８ｋＤａである。
基質：１μＭ  ｃＡＭＰ
検出：ＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３追跡。
【００７１】
操作ステップ：
１．組み換えヒトＰＤＥ４Ｂ酵素と基質（１μＭ  ｃＡＭＰ）をそれぞれ新たに調製された実験緩衝溶液に溶解し、
２．上記ＰＤＥ４Ｂ酵素緩衝溶液を反応ウェルに移し、
３．音響技術（エコー５５０  ナノリットル範囲）により、１００％ＤＭＳＯに溶解された化合物１をＰＤＥ４Ｂ酵素緩衝溶液の反応ウェルに添加し、かつ室温で１０分間インキュベートし、
４．その後、基質緩衝溶液を上記反応ウェルに添加して、反応を開始させ、
５．室温で１時間インキュベートし、
６．検出混合物（ＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３追跡）を添加して、反応を停止させ、かつ徐々に混合しながら９０分間インキュベートした。蛍光偏光の測定範囲はＥｘ／Ｅｍ＝６２０／６８８である。
【００７２】
データ分析：蛍光偏光シグナルは、ＡＭＰ／ＧＭＰ標準曲線及びＥｘｃｅｌソフトウェアによって、ＤＭＳＯ対照に対する％酵素活性を計算し、ｎＭに換算した。曲線の当てはめは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（作図医学グラフ）を使用した。
【００７３】
【表８】
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【００７４】
結論：化合物１は、ホスホジエステラーゼ４Ｂサブタイプ（ＰＤＥ４Ｂ）を抑制する優れたインビトロ活性を示す。
【００７５】
試験例２：インビトロでヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）においてＴＮＦα産生を抑制する作用の評価
化合物１の、リポ多糖（ＬＰＳ）により誘発されるヒト末梢血単核細胞におけるＴＮＦα産生に対する抑制活性
操作ステップ：
１．正常ヒト全血を採取し、ＥＤＴＡ−Ｋ２抗凝固チューブで凝固を防止し、
２．Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によりＰＢＭＣを単離し、計数し、細胞濃度を２ｘ１０６／ｍＬに調整し、
３．Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに２ｘ１０５個の細胞を添加し、１ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭという異なる濃度の化合物を添加し、１ウェル当たり２００μｌの反応系を用い、重複ウェルを２つ設け、
４．２４時間培養し、上清を採取し、
５．上清中のＴＮＦαのレベルをＥＬＩＳＡにより検出し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより抑制曲線を当てはめ、かつＩＣ５０を計算する
【００７６】
【表９】
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【００７７】
結論：化合物１は、ｈＰＢＭＣにおいて、ＴＮＦα産生を抑制する優れたインビトロ活性を示し、かつアプレミラストよりも優れる。
【００７８】
試験例３：インビボＣＩＡモデル
実験目的：
コラーゲン誘発性マウス関節炎モデルは、薬物で乾癬性関節炎を治療する薬効を評価するための動物モデルであり、その発症機序及び症状はいずれも乾癬性関節炎疾患と明らかな相関性を有する。モデルについては、ＩＩ型コラーゲンを注射することで骨コラーゲンに対するＢ細胞、Ｔ細胞の反応性を活性化し、活性化されたＢ細胞及びＴ細胞が関節部位に入って関節の炎症を誘発させることにより、関節部位の発赤腫脹、関節軟骨及び関節包の損傷などの症状のような、ヒト乾癬性関節炎に似ている一連の症状を誘発させる。臨床前に薬物で乾癬性関節炎を治療する候補化合物を評価する過程において、コラーゲン誘発性マウス関節炎は、その有効性を評価するために使用されることが多い。
【００７９】
今回の実験の目的は、コラーゲン誘発性マウス関節炎に対する化合物１の治療効果を考察することにより、その後の臨床研究に臨床前の薬力学的関連情報を提供することである。
【００８０】
実験方法：
１．ＩＩ型コラーゲン／完全フロイントアジュバントで免疫する
酢酸の調製：酢酸を１００ｍＭに希釈し、０．２２ミクロンの濾過膜で濾過した後、４℃で保存した。
ウシＩＩ型コラーゲン溶液：ウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を酢酸溶液に溶解し、かつ４℃で放置して一晩保存した。
乳剤の調製：一晩保存されたＣＩＩ溶液を等体積の完全フロイントアジュバントと混合し、溶液が安定した乳剤を形成するまで高速ホモジナイザーでホモジネートした。
リポ多糖（ＬＰＳ）の調製：ＬＰＳを秤量し、生理食塩水を添加し、安定した溶液を形成するまで均一に混合し、濃度を０．３ｍｇ／ｋｇとした。
【００８１】
２．関節炎の誘発：
マウスを異なる治療群にランダムに割り当てた。１回目の免疫の日を０日目とし、その後の日を順に番号付けした。ＤＢＡ／１マウスをイソフルランで麻酔した後、調製したコラーゲン乳剤を尾部に皮下注射した。２３日目に、１００マイクロリットルのＬＰＳ溶液を腹腔内注射した。正常群のマウスを免疫する必要がない。
【００８２】
３．投与及び用量設計
２７日目に、平均臨床的スコアが１点程度に達すると、発症程度が適切なマウスを６０匹選択し、体重及びスコアに基づいて、改めてランダムに群分けし、各群に１０匹のマウスがある。
【００８３】
陽性対照薬物としてのデキサメタゾンの０．３ミリグラム／キログラムの用量群は、ＣＩＡモデルにおいて一般的に使用された用量であり、また、前期予備実験の結果に基づいて化合物１と対照化合物としてのアプレミラストの関連用量の設計を決定する。第１群は正常マウスであり、如何なる処理もしないものであり、第２群は溶媒対照群であり、溶媒を投与するものであり、第３群にデキサメタゾンが投与され、用量が０．３ミリグラム／キログラムであり、第４群にアプレミラストが投与され、用量が５ミリグラム／キログラムであり、第５群、第６群、第７群に化合物１が投与され、用量がそれぞれ０．３、１及び３ミリグラム／キログラムである。１日１回投与し、合計１１日間継続した。胃内投与体積は１０ミリリットル／キログラムである。
【００８４】
【表１０】
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【００８５】
４．関節炎発症指標の測定
臨床観察：免疫前７日から免疫後２３日目まで、ＤＢＡ／１マウスの基本的な健康状態及び体重変化を毎日観察した（１週間に１回記録した）。２３日目後、実験が終了するまで、マウスの健康状態、発症状況、及び体重変化を毎日観察した（１週間に少なくとも３回記録した）。
【００８６】
臨床的スコア：ＬＰＳの注射後、マウスの発症状況を毎日観察した。マウスが発症し始めた後（関節炎の臨床症状が現れ）、病変の異なる程度（発赤腫脹、関節変形）に基づいて０‐４点の基準に従ってスコアリングし、各肢の最高スコアが４点であり、動物１匹あたりの最高スコアが１６点であった。スコア基準を表９に示す。１週間に少なくとも３回スコアリングする
【００８７】
【表１１】
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【００８８】
病理：３８日目にマウスを安楽死させた。マウスの２つの後肢を取り、１０％ホルマリン溶液で浸し、ギ酸溶液で脱灰し、パラフィンで包埋し、切片にし、ヘマトキシリン‐エオシン染色（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ  ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＨＥ）を行い、顕微鏡で写真を撮影して観察した。関節の損傷程度を炎症性細胞浸潤、パンヌス形成、軟骨損傷、骨吸収などの４つの点から評価し、かつ０‐４点の基準に従ってスコアリングした。
【００８９】
各項目のスコア基準は表１０のとおりである：
【表１２】
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【００９０】
５．統計学的処理
実験データは平均数±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表され、体重と臨床的スコアは２元配置分散分析（Ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を採用し、病理学的スコア及びＡＵＣはｔ検定を採用し、ｐ＜０．０５の時に有意差があると考えた。
【００９１】
実験結果：
１．臨床的スコア：
１回目の免疫後２５日目（２回目の免疫後２日目）に、マウスに関節炎の臨床症状が現れ始めた。２７日目に投与を開始する。溶媒対照群の平均臨床的スコアが徐々に上昇し、３６日目に８．３点に達し、コラーゲン誘発性関節炎モデルが成功裏に確立されたことを提示した。
【００９２】
溶媒対照群と比較して、化合物１の０．３、１及び３ミリグラム／キログラムは、いずれも実験終点（３７日目）での関節炎マウスの臨床的スコアを顕著に低減することができ、３つの用量での平均臨床的スコアが３．６（ｐ＜０．０００１）、４．３（ｐ＜０．００１）及び３．５（ｐ＜０．０００１）に低下した。したがって、化合物１は０．３ミリグラム／キログラムの低い用量であってもコラーゲン誘発関節炎を効果的に軽減することができる。０．３ミリグラム／キログラムのデキサメタゾンで治療すると、コラーゲン誘発性関節炎の臨床的スコアを顕著に低減することができ、３０日目から臨床的スコアが０点に維持され、溶媒対照群との有意差（ｐ＜０．０００１）が現れ、かつ試験が終了するまで継続し、５ミリグラム／キログラムのアプレミラスト群は、臨床的スコアの上昇をも抑制し、かつ３３日目から溶媒対照群との有意差が現れ、かつ試験が終了するまで継続し、３７日目に、臨床症状の平均スコアが４．２であり、溶媒対照群と比較して３．７  （ｐ＜０．００１）低下した。
【００９３】
各群の動物１匹あたりの臨床的スコアの曲線を分析することにより、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、群間の曲線下面積の平均値により、溶媒対照群に対する各投与群の抑制率を計算した。溶媒対照群と比較して、デキサメタゾン群及びアプレミラスト群は、関節炎動物の臨床的スコアを顕著に低減し、抑制率はそれぞれ９６．４％（ｐ＜０．０００１）と４１．３％（ｐ＜０．０５）であり、化合物１は０．３、１及び３ミリグラム／キログラムの３つの用量のいずれにおいても関節炎動物の臨床的スコアの曲線下面積を顕著に低減することができ、抑制率はそれぞれ４３．９％（ｐ＜０．０５）、３９．４％（ｐ＜０．０５）、及び５１．７％（ｐ＜０．０１）であった。化合物１の１ミリグラム／キログラム群は、アプレミラストの５ミリグラム／キログラム群の抑制率に相当し（両群はいずれもｐ＜０．０５であり）、同時に化合物１の３ミリグラム／キログラム群の抑制率は、アプレミラストの５ミリグラム／キログラム群より優れた（ｐ値はそれぞれ＜０．０１と＜０．０５である）。
【００９４】
２．組織の病理学的スコア
各群のマウスの２つの後肢を切片にしてＨ．Ｅ．染色を行い、２つの後肢の総スコアを取った。溶媒対照群の関節炎マウスについて、病理学的スコアの総スコアは、２０．２０±１．１５である。溶媒対照群と比較して、対照化合物としてのアプレミラストは、５ミリグラム／キログラム用量でも関節炎マウスの病理学的スコアを顕著に低減することができ、１３．９０±１．８９（ｐ＜０．０５）まで低減することができ、化合物１は、１及び３ミリグラム／キログラム用量で関節炎マウスの病理学的スコアを顕著に低減することができ、１４．００±２．４３（ｐ＜０．０５）と９．２０±１．８３（ｐ＜０．０００１）にそれぞれ低下した。化合物１の１ミリグラム／キログラム群は、アプレミラストの５ミリグラム／キログラム群の関節炎の病理学的スコアの効果に相当し（両群はｐ＜０．０５であり）、同時に化合物１の３ミリグラム／キログラム群の関節炎の病理学的スコアの効果は、アプレミラストの５ミリグラム／キログラム群より優れた（ｐ値はそれぞれ＜０．０００１と＜０．０５である）。
【００９５】
３．結論
化合物１は、０．３、１及び３ミリグラム／キログラムの３つの用量群において、コラーゲン誘発性関節炎の症状に対していずれも顕著な改善作用を有する。かつ１ミリグラム／キログラムと３ミリグラム／キログラムの用量群において、関節炎病の理学的病変に対して顕著な改善を有し、３つの用量群は、関節炎の病理学的スコアにおいて明らかな用量反応関係を示す。３ミリグラム／キログラムの化合物１の治療効果（臨床的スコア及び関節炎の病理学的スコア）は、５ミリグラム／キログラムのアプレミラストより優れる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2021512076.tif 000024
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