(57)【要約】本発明は、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片を提供する。
2021506272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトβＳグロビンポリペプチドに結合する抗βＳグロビンまたはその抗原結合断片であって、前記抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変領域、および配列番号４〜６のいずれか１つに記載される重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変領域を含有する、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に記載される軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変領域、および配列番号４に記載される重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変領域を含有する、請求項１に記載の抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２に記載される軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変領域、および配列番号５に記載される重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変領域を含有する、請求項１に記載の抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３に記載される軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変領域、および配列番号６に記載される重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変領域を含有する、請求項１に記載の抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記ヒトβＳグロビンポリペプチドに結合する前記抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖配列、および配列番号８に記載される可変重鎖配列を含有する、請求項１に記載の抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１に記載の抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片、および検出可能な標識を含有する、結合体。
【請求項８】
前記検出可能な標識は、ハプテン、蛍光色素、蛍光タンパク質、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、ポリペプチド、酵素、発光性化合物、またはオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項７に記載の結合体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗βＳグロビン抗体を含有するハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）の定めのもと、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，２６０号明細書の利益を主張するものであり、当該出願は、その全体で参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表に関する声明
本出願に関する配列表は紙媒体の代わりにテキストフォーマットで提出され、本明細書に参照により援用される。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０９３＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは９ＫＢであり、２０１８年１２月１３日に作成された。そして本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【０００３】
本発明は、鎌状β−グロビン（βＳ）抗体、またはその抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連分野に関する記載
異常ヘモグロビン症は世界で最も普遍的な遺伝性疾患であり、異常なβ−グロビンの合成または構造から発生する。異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビンの構造および／または合成における変化から発生する異常なヘモグロビン分子の存在を含む、多様な遺伝性の血液障害群である。通常、ヘモグロビンは、４つのタンパク質サブユニットからなる。β−グロビンの２つのサブユニットと、α−グロビンの２つのサブユニットである。これらタンパク質サブユニットのそれぞれが、ヘムと呼ばれる鉄を含有する分子に付着（結合）する。ヘムはそれぞれ、その中心に鉄分子を含有し、１つの酸素分子に結合することができる。赤血球中のヘモグロビンは、肺で酸素分子に結合する。その後、これら細胞は血流を通って移動し、酸素を全身の組織へと運搬する。最も普遍的な異常ヘモグロビン症としては、鎌状赤血球症、β−サラセミア、およびα−サラセミアが挙げられる。
【０００５】
鎌状赤血球症には、赤血球の鎌状化から生じる任意の症候性の貧血状態が含まれる。鎌状赤血球貧血のβＳ／βＳは、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の共通型であり、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）が原因である。ＨｂＳは、２つのβＳグロビンサブユニットと、２つのα−グロビンサブユニットの四量体である。ＨｂＳは、β−グロビンの６位でグルタミン酸（Ｅ）がバリン（Ｖ）と置き換わることで生じ、Ｇｌｕ６ＶａｌまたはＥ６Ｖと記載される。翻訳後に最初のアミノ酸が除去されるため、Ｅ６Ｖの位置は最終タンパク質産物中のアミノ酸の位置を指す。グルタミン酸をバリンで置き換えることで、異常なＨｂＳサブユニットが生じ、互いに接着して、長く硬直した分子を形成する。この分子が赤血球を鎌状（三日月状）の形状に曲げる。鎌状の細胞は通常より早く死ぬため、赤血球の不足が生じることとなる（貧血）。さらに、鎌状赤血球は硬いため、小さな血管を塞ぐことがある。そのため重度の疼痛と、器官のダメージが生じる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は概して、改善された抗鎌状グロビン抗体およびその断片を提供する。抗体またはその抗原結合断片は、βＳの検出に使用され得る。βＳは、β−グロビンの６位でグルタミン酸（Ｅ）をバリン（Ｖ）と置き換えることで生成され、Ｇｌｕ６ＶａｌまたはＥ６Ｖと記載される。翻訳後に最初のアミノ酸が除去されるため、Ｅ６Ｖの位置は最終タンパク質産物中のアミノ酸の位置を指す。
【０００７】
様々な実施形態において、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３に記載されるＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖配列、および配列番号４〜６に記載されるＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖配列を含有する。
【０００８】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、βＳ、Ｅ６Ｖ変異を認識する。
【０００９】
ある実施形態では、ヒトβＳグロビンポリペプチドに結合する抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。
【００１０】
特定の実施形態では、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載される１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号４〜６のいずれか１つに記載される１つまたは複数の重鎖ＣＤＲを含有する。
【００１１】
一部の実施形態において、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖配列、および／または配列番号８に記載される可変重鎖配列を含有する。
【００１２】
様々な実施形態では、結合体は、本明細書において予期される抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片、および検出のための手段を含有する。
【００１３】
様々な実施形態では、結合体は、本明細書において予期される抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片、および検出手段を含有する。
【００１４】
様々な実施形態では、結合体は、本明細書において予期される抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片、および検出可能な標識を含有する。
【００１５】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、ハプテン、蛍光色素、蛍光タンパク質、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、ポリペプチド、酵素、発光性化合物、またはオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１６】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択される蛍光色素である：Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ（商標）、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ（商標）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（ＴｘＲｅｄ）。
【００１７】
ある実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択されるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）（ＡＦ）色素である：ＡＦ３５０、ＡＦ４０５、ＡＦ４８８、ＡＦ５００、ＡＦ５１４、ＡＦ５３２、ＡＦ５４６、ＡＦ５５５、ＡＦ５６８、ＡＦ５９４、ＡＦ６１０、ＡＦ６３３、ＡＦ６３５、ＡＦ６４７、ＡＦ６８０、ＡＦ７００、ＡＦ７１０、ＡＦ７５０、ＡＦ７９０およびＡＦ８００。
【００１８】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択されるＱＤｏｔ（登録商標）である：Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５、およびＱｄｏｔ（登録商標）８００。
【００１９】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択されるＤｙＬｉｇｈｔ（商標）色素（ＤＬ）である：ＤＬ５４９、ＤＬ６４９、ＤＬ６８０およびＤＬ８００。
【００２０】
ある実施形態では、検出可能な標識は、フルオレセインまたはその誘導体、フルオレセインイソチオシアネート、カルボキシフルオレセイン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、トリニトロフェノール（ＴＮＰ）、およびビオチンからなる群から選択されるハプテンである。
【００２１】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択されるＣｙ色素である：Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびＣｙ７．５。
【００２２】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択される蛍光分子である：フィコエリトリン（ＰＥ、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ））、Ｂ−フィコエリトリン（ＢＰＥ）、ペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびＣ−フィコシアニン。
【００２３】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択される蛍光色素である：Ａｔｔｏ  ３９０、Ａｔｔｏ  ４２５、Ａｔｔｏ  ４６５、Ａｔｔｏ  ４８８、Ａｔｔｏ  ４９５、Ａｔｔｏ  ５１４Ａｔｔｏ  ５２０、Ａｔｔｏ  ５３２、Ａｔｔｏ  ５５０、Ａｔｔｏ  ５６５、Ａｔｔｏ  ５９０、Ａｔｔｏ  ５９４、Ａｔｔｏ  ６１０、Ａｔｔｏ  ６２０、Ａｔｔｏ  ６３３、Ａｔｔｏ  ６４７、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｔｔｏ  ６６５、Ａｔｔｏ  ６８０、Ａｔｔｏ  ７００、Ａｔｔｏ  ７２５、Ａｔｔｏ  ７４０、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）４３６、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）６００、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）６４５、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）７０２、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）７８０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ４８０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ５１０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ６０５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）６５０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）７１１、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）７８６、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ３９５（ＢＵＶ３９５）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ４９６（ＢＵＶ４９６）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ５６３（ＢＵＶ５６３）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ６６１（ＢＵＶ６６１）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ７３７（ＢＵＶ７３７）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ８０５（ＢＵＶ８０５）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｂｌｕｅ  ５１５（ＢＢ５１５）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｂｌｕｅ  ７００（ＢＢ７００）、ならびにＩＲ  Ｄｙｅ  ６８０、ＩＲ  Ｄｙｅ  ６８０ＬＴ、ＩＲ  Ｄｙｅ  ７００、ＩＲ  Ｄｙｅ  ７００ＤＸ、ＩＲ  Ｄｙｅ  ８００、ＩＲ  Ｄｙｅ  ８００ＲＳおよびＩＲ  Ｄｙｅ  ８００ＣＷ。
【００２４】
ある実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択されるタンデム蛍光色素である：ＲＰＥ−Ｃｙ５、ＲＰＥ−Ｃｙ５．５、ＲＰＥ−Ｃｙ７、ＲＰＥ−ＣＦ５９４、ＲＰＥ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）タンデム結合体；ＲＰＥ−Ａｌｅｘａ６１０、ＲＰＥ−ＴｘＲｅｄ、ＡＰＣ−Ｈ７、ＡＰＣ−Ｒ７００、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ６００、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ６１０、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ７５０、ＡＰＣ−Ｃｙ５、ＡＰＣ−Ｃｙ５．５およびＡＰＣ−Ｃｙ７。
【００２５】
ある実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群から選択される蛍光タンパク質である：ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、およびｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ。
【００２６】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素である。
【００２７】
ある実施形態では、検出可能な標識は、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、ｍＩｎ）、ヨウ素（１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタニウム（ｌａｎｔｈａｎｉｕｍ）（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９  Ｍｏ）、パラジウム（１０３  Ｐｄ）、リン（３２  Ｐ）、プラセオジム（１４２  Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテロイウム（ｒｕｔｈｅｒｏｉｕｍ）（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレニウム（７５Ｓｅ）、（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、およびイットリウム（９０Ｙ）からなる群から選択される放射性核種を含有する。
【００２８】
特定の実施形態では、本明細書において予期される抗体を含むハイブリドーマが提供される。
【００２９】
様々な実施形態では、抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが予期される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、抗βＳ抗体を用いた正常赤血球と鎌状赤血球のＨｂＳ染色を示す。
【図２】図２は、抗βＳ抗体を用いた、正常ヘモグロビン（Ａ／Ａ）、鎌状形質（Ａ／Ｓ）、および鎌状ヘモグロビン（Ｓ／Ｓ）を有する患者の血液のＨｂＳ染色を示す。
【図３】図３は、抗βＳ抗体で染色された、正常ヘモグロビン（Ａ／Ａ）、鎌状形質（Ａ／Ｓ）、および鎌状ヘモグロビン（Ｓ／Ｓ）を有する患者の赤血球の割合を示す。
【図４】図４は、抗βＳ抗体で染色された、正常ヘモグロビン（Ａ／Ａ）、鎌状形質（Ａ／Ｓ）、および鎌状ヘモグロビン（Ｓ／Ｓ）を有する患者の赤血球の割合を示す。赤血球は、抗鎌状β−グロビンをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入され、赤血球分化が行われた骨髄の富化ＣＤ３４＋細胞から取得された。
【図５】図５は、抗βＳ抗体で染色された、正常ヘモグロビン（Ａ／Ａ）、鎌状形質（Ａ／Ｓ）、および鎌状ヘモグロビン（Ｓ／Ｓ）を有する患者の赤血球の割合を示す。赤血球は、ＣＤ３４＋細胞に対して富化され、抗鎌状β−グロビンをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入され、そして赤血球分化が行われたプレリキサホル動員末梢血から取得された。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
配列番号に関する簡単な説明
配列番号１〜３は、軽鎖ＣＤＲ配列の例示的アミノ酸配列を記載する。
配列番号４〜６は、重鎖ＣＤＲ配列の例示的アミノ酸配列を記載する。
配列番号７は、例示的可変ドメイン軽鎖を記載する。
配列番号８は、例示的可変ドメイン重鎖を記載する。
配列番号９は、ヒトβＳ−グロビンアミノ酸配列を記載する。
配列番号１０〜２０は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
【００３２】
Ａ．概要
本発明は概して、改善された抗βＳ−グロビン抗体およびその抗原結合断片、組成物、ならびにその診断的用途に関する。
【００３３】
βＳグロビンは、β−グロビンの６位でグルタミン酸（Ｅ）がバリン（Ｖ）と置き換わることで生じ、Ｇｌｕ６ＶａｌまたはＥ６Ｖと記載される。
【００３４】
組み換え（すなわち操作された）ＤＮＡ、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの合成、免疫アッセイ、組織培養、形質転換（例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法）、酵素反応、精製に関する方法、ならびに関連する技術および手順は概して、本明細書全体を通じて引用および検討されるように、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学の概論ならびに各論の様々な参照文献において記載されるように実施されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ，１９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）；Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｕｌｉｅ  Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ  Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｋ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎ��ｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  ＣＣ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびに例えばＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの雑誌の研究論文を参照のこと。
【００３５】
Ｂ．定義
本開示を詳細に記載する前に、本明細書において使用される用語の定義を提供することで、その理解の助けとなるであろう。
【００３６】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似した、または均等の方法および材料を、特定の実施形態の実施または検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法および材料の実施形態を開示する。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。
【００３７】
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」といった冠詞は、本明細書において、当該冠詞の文法上の対象の１つまたは複数（すなわち少なくとも１つ、または１つもしくは複数）を指すために使用される。例示として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、１つの要素、または１つもしくは複数の要素を意味する。
【００３８】
選択肢（例えば「または」）の使用は、いずれか１つ、両方、またはその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。
【００３９】
「および／または」という用語は、いずれか１つ、またはその選択肢の両方を意味すると理解されたい。
【００４０】
本明細書全体を通じて、別段であることが要求されない限り、「含む」および「含むこと」という文言は、記載される工程、または要素、または工程もしくは要素の群の含有を示唆するが、任意の他の工程、または要素、または工程もしくは要素の群の除外は示唆しないことを理解されたい。「〜からなる」とは、「〜からなる」という文言に続くものを含むが、それらに限定されることを意味する。ゆえに、「〜からなる」という文言は、列記される要素が必要または義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に〜からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、および列記される要素に対し、本開示中に特定される活性もしくは作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。ゆえに、「本質的に〜からなる」という文言は、列記される要素が必須または義務であり、しかし列記される要素の活性または作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。
【００４１】
本明細書全体を通じて「１つの実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造または特徴が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。ゆえに本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに特定の性質、構造または特徴は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされ得る。さらに、１つの実施形態でのある性質の肯定的な列挙は、特定の実施形態では当該性質の除外の根拠として機能することを理解されたい。
【００４２】
追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。
【００４３】
Ｃ．抗体
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００４４】
「抗体」という用語は、抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する少なくとも軽鎖もしくは重鎖の免疫グロブリン可変領域またはその断片を含有するポリペプチドである結合物質を指し、そうした抗原としては免疫細胞により認識されるものなどの抗原性決定基を含有する例えばペプチド、脂質、多糖、または核酸が挙げられる。
【００４５】
「単離抗体またはその抗原結合断片」は、その自然環境の構成要素から特定され、ならびに分離および／または採取されたものである。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「特異的結合アフィニティ」または「特異的に結合する」または「特異的に結合された」または「特異的結合」または「特異的に標的化」という用語は、バックグラウンド結合よりも高い結合アフィニティでの、βＡＴ８７Ｑ−グロビンへの抗βＡＴ８７Ｑ−グロビン抗体またはその抗原結合断片の結合を記載する。抗体またはその抗原結合断片は、例えば約１０５  Ｍ−１以上のアフィニティまたはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡結合定数）で、βＡＴ８７Ｑ−グロビンと結合する、または会合する場合に、βＡＴ８７Ｑ−グロビンポリペプチドに「特異的に結合する」。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、標的に、約１０６  Ｍ−１、１０７  Ｍ−１、１０８  Ｍ−１、１０９  Ｍ−１、１０１０  Ｍ−１、１０１１  Ｍ−１、１０１２  Ｍ−１、または１０１３  Ｍ−１以上のＫａで結合する。「高アフィニティ」抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも１０７  Ｍ−１、少なくとも１０８  Ｍ−１、少なくとも１０９  Ｍ−１、少なくとも１０１０  Ｍ−１、少なくとも１０１１  Ｍ−１、少なくとも１０１２  Ｍ−１、少なくとも１０１３  Ｍ−１またはそれ以上のＫａを有する。
【００４７】
あるいはアフィニティは、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として規定されてもよい（例えば１０−５  Ｍ〜１０−１３  Ｍ以下）。本明細書において予期される抗体またはその抗原結合断片のアフィニティは、従来的な技術を使用して、例えば競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）により、または結合関連性アッセイにより、もしくは標識リガンドを使用した置換アッセイにより容易に決定され得、または例えばＢｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイスを使用して、または例えばＣｏｒｎｉｎｇ社およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社からそれぞれ入手可能なＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサー技術を使用して、容易に決定され得る（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；および米国特許第５，２８３，１７３号、第５，４６８，６１４号、ならびにその均等物を参照のこと）。
【００４８】
１つの実施形態では、特異的結合のアフィニティは、バックグラウンド結合よりも約２倍高い、バックグラウンド結合よりも約５倍高い、バックグラウンド結合よりも約１０倍高い、バックグラウンド結合よりも約２０倍高い、バックグラウンド結合よりも約５０倍高い、バックグラウンド結合よりも約１００倍高い、またはバックグラウンド結合よりも約１０００倍高い。
【００４９】
「抗原（Ａｇ）」とは、動物へ注射される、または吸収される組成物（例えば癌特異的タンパク質を含む組成物など）を含む、動物において抗体産生またはＴ細胞反応を刺激し得る化合物、組成物または物質を指す。抗原は、例えば本開示抗原などの異種抗原により誘導される産物を含む、特異的な液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態では、標的抗原は、βＡＴ８７Ｑ−グロビンポリペプチドのエピトープである。
【００５０】
「エピトープ」または「抗原性決定基」とは、結合物質が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、連続的なアミノ酸から形成されることができ、またはタンパク質の三次元フォールディングによって並置される非連続的なアミノ酸からも形成されることができる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒へ暴露されても保持されるのに対して、三次元フォールディングにより形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒を用いた処理によって失われる。典型的にはエピトープは、固有の空間構造にある少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個、約９個、または約８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００５１】
抗体は、例えばラクダＩｇ、リャマＩｇ、アルパカＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ラクダ科ＶＨＨ、ナノボディ）、ならびに全長抗体の抗原結合に寄与する部分などのその抗原結合断片を含む。当該用語はさらに、例えばキメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）、ヘテロ複合体化抗体（例えば二特異性抗体）、およびその抗原結合断片などの遺伝子操作型も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照のこと。
【００５２】
当業者には理解されるように、および本明細書において別段に記載されるように、完全抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖を含有する。各重鎖は、可変領域と、第一、第二および第三の定常領域からなり、一方で各軽鎖は、可変領域と定常領域からなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γおよびμとして分類される。哺乳動物の軽鎖は、λまたはκとして分類される。α、δ、ε、γおよびμの重鎖を含有する免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭとして分類される。完全抗体は、「Ｙ」の形状をとる。Ｙの幹は、互いに結合した２つの重鎖の第二および第三の定常領域（そしてＩｇＥとＩｇＭについては第四の定常領域）からなり、ジスルフィド結合（鎖間）がヒンジに形成される。重鎖のγ、αおよびδは、３つのタンデム（一列）のＩｇドメインから構成される定常領域、および柔軟性を追加するためのヒンジ領域を有する。重鎖μおよびεは、４つの免疫グロブリンドメインから構成される定常領域を有する。第二および第三の定常領域はそれぞれ「ＣＨ２ドメイン」および「ＣＨ３ドメイン」と呼称される。Ｙの各アームは、一つの重鎖の可変領域と第一の定常領域を含み、それらは一つの軽鎖の可変領域および定常領域に結合される。軽鎖および重鎖の可変領域が、抗原結合に寄与する。
【００５３】
軽鎖および重鎖の可変領域は、「フレームワーク」領域を含有し、この領域に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる３個の超可変領域が割り込んでいる。ＣＤＲは、従来的な方法により規定または特定されることができ、例えばＫａｂａｔら（Ｗｕ，ＴＴ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−５０，（１９７０）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０−２４４３（１９８７）；（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと。当該文献は参照により本明細書に援用される）による配列、またはＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１−９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９））による構造により規定され、または特定され得る。
【００５４】
軽鎖ＣＤＲを予測するための規則の例示としては、以下が挙げられる：ＣＤＲ−Ｌ１は、約２４番目の残基で始まり、Ｃｙｓが先行し、約１０〜１７残基である。その後にＴｒｐが続く（典型的にはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎであるが、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕもある）。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の末端から約１６残基で始まり、一般的にはＩｌｅ−Ｔｙｒが先行するが、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅが先行する場合もあり、７残基である。そしてＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の末端から約３３残基で始まり、Ｃｙｓが先行し、７〜１１残基である。その後にＰｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ（配列番号２１）（ＸＸＸは任意のアミノ酸）が続く。
【００５５】
重鎖ＣＤＲを予測するための規則の例示としては、以下が挙げられる：ＣＤＲ−Ｈ１は、約２６番目の残基で始まり、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（配列番号２２）が先行し、１０〜１２残基である。その後にＴｒｐ（典型的にはＴｒｐ−Ｖａｌであるが、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ａｌａもある）が続く。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の末端から約１５残基で始まり、一般的にはＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号２３）が先行するが多くの変動がある。１６〜１９残基であり、その後にＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続く。そしてＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の末端から約３３残基で始まり、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（典型的にはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）が先行し、３〜２５残基である。その後にＴｒｐ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ（配列番号２４）が続く。
１つの実施形態では、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法に従い決定される。
【００５６】
１つの実施形態では、軽鎖ＣＤＲならびに重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ法に従い決定され、重鎖ＣＤＲ１は、ＡｂＭ法に従い決定される。ＡｂＭ法はＫａｂａｔ法とＣｌｏｔｈｉａ法の中間から構成される。例えば、Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ  Ｎ  ＆  Ｒｅｅｓ  ＡＲ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２０００  Ｄｅｃ；１３（１２）：８１９−２４およびＭｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；２４８：５１−９１を参照のこと。ＣＤＲを予測するためのプログラムは公的に入手可能であり、例えば、ＡｂＹｓｉｓ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）がある。
【００５７】
様々な軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の配列は、例えばヒトなどの種の中で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成する軽鎖および重鎖の組み合せのフレームワーク領域であり、ＣＤＲを三次元空間中に配置し、整列させる役割を負う。ＣＤＲは主に抗原エピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲは、典型的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼称され、Ｎ末端から連続的に番号付けされている。そして典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖により識別される。従って、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と呼称され、一方で抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と呼称される。異なる特異性の抗体（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体によって変化するが、ＣＤＲ内のごく限られた数のアミノ酸の位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）と呼ばれる。
【００５８】
軽鎖ＣＤＲの例示としては、配列番号１〜３に記載されるＣＤＲ配列が挙げられる。重鎖ＣＤＲの例示としては、配列番号４〜６に記載されるＣＤＲ配列が挙げられる。
【００５９】
「ＶＬ」または「ＶＬ」への参照は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂまたは本明細書に開示される他の抗体断片のものを含む。軽鎖可変領域の例示としては、配列番号７に記載される軽鎖可変領域配列が挙げられる。
【００６０】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への参照は、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂまたは本明細書に開示される他の抗体断片のものを含む。重鎖可変領域の例示としては、配列番号８に記載される重鎖可変領域配列が挙げられる。
【００６１】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンにより産生される抗体、または一つの抗体の軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞により産生される抗体である。モノクローナル抗体は当業者に公知の方法により生成され、例えばミエローマ細胞と免疫脾臓細胞の融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより生成される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【００６２】
「キメラ抗体」は、例えばヒトなどのある種に由来するフレームワーク残基と、例えばマウスなどの別の種に由来するＣＤＲ（一般的に抗原結合に寄与する）を有している。特に好ましい実施形態では、抗体は、キメラ抗体またはその抗原結合断片である、抗原特異的結合ドメインを含有する。
【００６３】
好ましい実施形態では、抗体は、ヒト抗体（例えばヒトモノクローナル抗体）、またはヒトβＡＴ８７Ｑ−グロビンポリペプチドに特異的に結合するその断片である。ヒト抗体は、上述のように公知のヒト定常ドメイン配列を含むヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を組み合わせることにより構築され得る。あるいはヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により作製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体作製用のヒトミエローマとマウス−ヒトのヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）に記載されている。トランスジェニック動物（例えばマウス）を使用しても、内在的な免疫グロブリンの産生を伴わずにヒトの完全レパートリーを産生させることができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。遺伝子シャッフリングを使用して、非ヒト、例えば齧歯類抗体から、ヒト抗体を誘導することもできる。この場合、ヒト抗体は、開始非ヒト抗体と類似したアフィニティと特異性を有している（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３を参照のこと）。従来的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と違い、この技術は完全なヒト抗体を提供するものであり、非ヒト起源のＦＲ残基またはＣＤＲ残基は有していない。
【００６４】
１つの実施形態では、抗体は、「ヒト化」抗体である。ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えばマウス、ラットまたは合成）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と称される。１つの実施形態では、ヒト化免疫グロブリンにおいて、すべてのＣＤＲはドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要はないが、もしあれば、ヒト免疫グロブリンの定常領域と実質的に同一でなければならない。すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％以上同一でなければならない。ゆえに、場合によりＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンのすべての部分が、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、追加的な保存的アミノ酸置換を有してもよく、この置換は、抗原結合または他の免疫グロブリンの機能に実質的な影響を与えない。ヒト化抗体は、遺伝子操作により構築されてもよい（例えば米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【００６５】
特定の実施形態では、その抗βＡＴ８７Ｑ−グロビン抗原結合断片は、ラクダＩｇ、リャマＩｇ、アルパカＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ラクダ科ＶＨＨ、ナノボディ）としての形式をとる。
【００６６】
「ラクダＩｇ」または「ラクダ科ＶＨＨ」とは、本明細書において使用される場合、重鎖抗体の公知の最小抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ，ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２１：３４９０−３４９８（２００７））。「重鎖抗体」または「ラクダ科抗体」とは、２つのＶＨドメインを含有するが、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８（１９９９）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。
【００６７】
「免疫グロブリンの新規抗原受容体」の「ＩｇＮＡＲ」とは、１つの可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインと、５つの定常新規抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなる、サメ免疫レパートリーからの抗体クラスを指す。ＩｇＮＡＲは、公知の最小免疫グロブリン系タンパク質スキャホールドのいくつかを象徴しており、高度に安定的で、効率的な結合特性を保有している。その固有の安定性は、（ｉ）マウス抗体に存在する従来的な抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインと比較して、相当な数の荷電および親水性の表面露呈残基を呈する基盤的Ｉｇスキャホールド、および（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋およびループ内の水素結合のパターンを含む相補性決定領域（ＣＤＲ）ループにおける構造的性質の安定化、の両方に起因し得る。
【００６８】
抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成され、各々が一つの抗原結合部位を有している。残りの「Ｆｃ」断片は、容易に結晶化するという能力を反映した名称となっている。ペプシン処理ではＦ（ａｂ’）２断片が生成され、この断片は２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋させることもできる。
【００６９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。１つの実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、緊密な非共有結合をしている１つの重鎖軽鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインは、柔軟性のあるペプチドリンカーにより共有結合されてもよく、それにより軽鎖と重鎖は、二本鎖Ｆｖ種と類似した「二量体」構造で結合し得る。この構造では、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。まとめると、６個のＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を与えることとなる。しかし１つの可変ドメイン（すなわち抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含有する、Ｆｖの半分）であっても、抗原を認識し、結合する能力を有している。ただし、結合部位全体と比べると、アフィニティは低い。
【００７０】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含有し、そして軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片とは異なり、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む、少数の残基が付加されている。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’の本明細書における呼称であり、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を担持している。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして生成された。他の抗体の化学的連結も公知である。
【００７１】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖中で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）につながれた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有する（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上で２つのドメイン間にペアを形成するには短すぎるリンカーを使用することで、それらドメインは、別の鎖の相補的なドメインとのペア形成を余儀なくされ、２つの抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、二価または二特異性であってもよい。ダイアボディについては、例えばＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  １９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに詳細が記載されている。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００７２】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」とは、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４−４９０）。
【００７３】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含有し、これらドメインは、１つのポリペプチド鎖中に、いずれかの方向で存在する（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含有しており、それによってｓｃＦｖは抗原結合に望ましい構造を形成することができる。ｓｃＦｖのレビューについては例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）、２６９−３１５ページを参照のこと。
【００７４】
好ましい実施形態では、抗βＳ−グロビン抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスｓｃＦｖ、ヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングされてもよい。そうしたハイブリドーマの作製は、日常的に行われている。可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用され得る技術は、例えばＯｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３−３８３７に記載されている。
【００７５】
様々な実施形態において、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３に記載されるＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖配列、および／または配列番号４〜６に記載されるＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖配列を含有する。一部の実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖配列、および／または配列番号８に記載される可変重鎖配列を含有する。
【００７６】
例示的なβＳ−グロビン特異的結合断片は、少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含有するβＳ−グロビンに特異的な免疫グロブリン可変領域である。「ヒトフレームワーク領域」とは、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型（すなわち天然の）フレームワーク領域、当該領域中の約５０％未満（例えば好ましくは約４５％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満）のアミノ酸が欠失または置換されたヒト免疫グロブリン可変領域の改変フレームワーク領域（例えば、対応する位置で非ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１つまたは複数のアミノ酸残基で置換されている）、または当該領域中の約５０％未満（例えば、４５％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満）のアミノ酸が欠失または置換され、１つの態様では免疫原性が低下した非ヒト免疫グロブリン可変領域の改変フレームワーク領域（例えば、暴露残基の位置で欠失もしくは置換され、および／または対応する位置でヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１つまたは複数のアミノ酸残基で置換されている）を指す。
【００７７】
ある実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型フレームワーク領域である。他のある実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域の改変フレームワーク領域であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の位置でアミノ酸が欠失または置換されている。他の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、非ヒト免疫グロブリン可変領域の改変フレームワーク領域であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の位置でアミノ酸が欠失または置換されている。
【００７８】
特定の実施形態において提供されるβＡＴ８７Ｑ−グロビン特異的結合ドメインはさらに１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲを含有する。そうしたＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３、ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３から選択される非ヒトＣＤＲまたは改変非ヒトＣＤＲであってもよい。ある実施形態では、βＡＴ８７Ｑ−グロビン特異的結合ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２、および軽鎖ＣＤＲＬ３を含有する軽鎖可変領域、ならびに（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ２、および重鎖ＣＤＲＨ３を含有する重鎖可変領域、を含有する。
【００７９】
１つの実施形態では、βＳ−グロビン特異的結合ドメインは、配列番号１〜３に記載される軽鎖ＣＤＲ配列セットを含有する。特定の実施形態では、βＳ−グロビン特異的結合ドメインは、配列番号１〜３に記載される軽鎖ＣＤＲ配列セットに対し、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列を含有する。
【００８０】
１つの実施形態では、βＳ−グロビン特異的結合ドメインは、配列番号４〜６に記載される重鎖ＣＤＲ配列セットを含有する。特定の実施形態では、βＳ−グロビン特異的結合ドメインは、配列番号４〜６に記載される重鎖ＣＤＲ配列セットに対し、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する重鎖ＣＤＲ配列を含有する。
【００８１】
特定の実施形態では、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載される１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号４〜６のいずれか１つに記載される１つまたは複数の重鎖ＣＤＲを含有する。ある実施形態では、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖配列、および／または配列番号８に記載される可変重鎖配列を含有する。
【００８２】
特定の実施形態では、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載される１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号４〜６のいずれか１つに記載される１つまたは複数の重鎖ＣＤＲを含有する。ある実施形態では、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖配列に対し、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する可変軽鎖配列、および／または配列番号８に記載される可変重鎖配列に対し、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する可変重鎖配列を含有する。
【００８３】
Ｄ．結合体
様々な実施形態において、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片、および標識を含有する結合体が提供される。好ましい実施形態において、結合体は、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片、および検出可能な標識または検出可能なシグナルを生じさせることができる標識を含有する。より好ましい実施形態において、結合体は、検出可能な標識に連結された、抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片を含有する。さらにより好ましい実施形態において、結合体は、検出可能な標識に共有結合された、または化学的に連結された抗βＳグロビン抗体またはその抗原結合断片を含有する。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「標識」という用語は、検出可能な標識、または検出可能なシグナルを生じさせることができる標識を指す。特定の実施形態では、標識は、放射性核種、核酸、低分子またはポリペプチドを含有する。一部の実施形態では、標識は、直接的に検出可能である。一部の実施形態では、標識は、間接的に検出可能である。
【００８５】
特定の実施形態において予期される結合体における使用に適した検出可能な標識の例示としては限定されないが、ハプテン、蛍光分子、蛍光色素、蛍光タンパク質、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、放射性核種、ポリペプチド、酵素、発光性化合物、またはオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００８６】
特定の実施形態における検出可能標識としての使用に適した分子の例示としては限定されないが、以下が挙げられる：Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）；Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）；Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）；Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ（商標）；Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ（商標）；Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（ＴｘＲｅｄ）；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）（ＡＦ）色素、例えばＡＦ３５０、ＡＦ４０５、ＡＦ４８８、ＡＦ５００、ＡＦ５１４、ＡＦ５３２、ＡＦ５４６、ＡＦ５５５、ＡＦ５６８、ＡＦ５９４、ＡＦ６１０、ＡＦ６３３、ＡＦ６３５、ＡＦ６４７、ＡＦ６８０、ＡＦ７００、ＡＦ７１０、ＡＦ７５０、ＡＦ７９０およびＡＦ８００；ＱＤｏｔ（登録商標）ナノ結晶、例えばＱｄｏｔ（登録商標）５２５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５、およびＱｄｏｔ（登録商標）８００；ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）色素（ＤＬ）、例えばＤＬ５４９、ＤＬ６４９、ＤＬ６８０およびＤＬ８００；フルオレセイン、またはその誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート、カルボキシフルオレセイン、およびジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン；ジゴキシゲニン；ジニトロフェノール（ＤＮＰ）；トリニトロフェノール（ＴＮＰ）；ビオチン；Ｃｙ色素、例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびＣｙ７．５；フィコエリトリン（ＰＥ、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ））；Ｂ−フィコエリトリン（ＢＰＥ）；ペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；Ｃ−フィコシアニン；Ａｔｔｏ（登録商標）色素、例えばＡｔｔｏ  ３９０、Ａｔｔｏ  ４２５、Ａｔｔｏ  ４６５、Ａｔｔｏ  ４８８、Ａｔｔｏ  ４９５、Ａｔｔｏ  ５１４、Ａｔｔｏ  ５２０、Ａｔｔｏ  ５３２、Ａｔｔｏ  ５５０、Ａｔｔｏ  ５６５、Ａｔｔｏ  ５９０、Ａｔｔｏ  ５９４、Ａｔｔｏ  ６１０、Ａｔｔｏ  ６２０、Ａｔｔｏ  ６３３、Ａｔｔｏ  ６４７、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｔｔｏ  ６６５、Ａｔｔｏ  ６８０、Ａｔｔｏ  ７００、Ａｔｔｏ  ７２５、およびＡｔｔｏ  ７４０；Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）色素、例えば、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）４３６、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）６００、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）６４５、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）７０２、およびＳｕｐｅｒ  Ｂｒｉｇｈｔ（商標）７８０；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）色素、例えば、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ４８０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ５１０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ６０５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）６５０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）７１１、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）７８６、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ３９５（ＢＵＶ３９５）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ４���６（ＢＵＶ４９６）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ５６３（ＢＵＶ５６３）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ６６１（ＢＵＶ６６１）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ７３７（ＢＵＶ７３７）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ８０５（ＢＵＶ８０５）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｂｌｕｅ  ５１５（ＢＢ５１５）、およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｂｌｕｅ  ７００（ＢＢ７００）；ならびにＩＲ  Ｄｙｅｓ、例えば、ＩＲ  Ｄｙｅ  ６８０、ＩＲ  Ｄｙｅ  ６８０ＬＴ、ＩＲ  Ｄｙｅ  ７００、ＩＲ  Ｄｙｅ  ７００ＤＸ、ＩＲ  Ｄｙｅ  ８００、ＩＲ  Ｄｙｅ  ８００ＲＳ、およびＩＲ  Ｄｙｅ  ８００ＣＷ。
【００８７】
検出可能標識としての使用に適したタンデム蛍光色素分子の例示としては限定されないが、以下が挙げられる：ＲＰＥ−Ｃｙ５、ＲＰＥ−Ｃｙ５．５、ＲＰＥ−Ｃｙ７、ＲＰＥ−ＣＦ５９４、ＲＰＥ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）タンデム結合体；ＲＰＥ−Ａｌｅｘａ６１０、ＲＰＥ−ＴｘＲｅｄ、ＡＰＣ−Ｈ７、ＡＰＣ−Ｒ７００、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ６００、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ６１０、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ７５０、ＡＰＣ−Ｃｙ５、ＡＰＣ−Ｃｙ５．５およびＡＰＣ−Ｃｙ７。
【００８８】
検出可能標識としての使用に適した蛍光タンパク質の例示としては限定されないが、以下が挙げられる：ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、およびｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ。
【００８９】
検出可能標識としての使用に適した酵素の例示としては限定されないが、以下が挙げられる：アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ。
【００９０】
検出可能標識としての使用に適した放射性核種の例示としては限定されないが、以下が挙げられる：炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、ｍＩｎ）、ヨウ素（１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタニウム（ｌａｎｔｈａｎｉｕｍ）（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９  Ｍｏ）、パラジウム（１０３  Ｐｄ）、リン（３２  Ｐ）、プラセオジム（１４２  Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテロイウム（ｒｕｔｈｅｒｏｉｕｍ）（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレニウム（７５Ｓｅ）、（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、およびイットリウム（９０Ｙ）。
【００９１】
特定の実施形態では、結合体は、１つまたは複数の標識に結合された、連結された、または関連付けられた（例えば共有結合された）抗体または抗体断片を含有する。ある実施形態では、標識は、抗体または断片に、直接的もしくは間接的（例えばリンカー基を介する）に結合、連結または関連付けられてもよい。抗体は、当該抗体および標識がそれぞれ、他方と反応することができる置換基を保有する場合、１つまたは複数の標識に直接共通結合され得る。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、一方は例えば無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と反応することができ、または他方には充分な脱離基（例えばハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができてもよい。
【００９２】
特定の実施形態では、一価もしくは多価のリンカーまたはスペーサーを介して、抗体または抗体断片と、１つまたは複数の標識を連結、結合または関連づけることが望ましい場合がある。リンカーまたはスペーサーを使用して、抗体と標識の間に充分な距離を置き、立体障害を回避、または抗体の結合能力への干渉を回避してもよい。当業者には、ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方の、様々な二官能性試薬または多官能性試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォードに記載されるものなど）を、リンカー基として採用し得ることが明白である。連結は、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化炭水化物残基を通して行われ得る。そうした技法を記載する多くの参照文献があり、例えばＲｏｄｗｅｌｌらの米国特許第４，６７１，９５８号が挙げられる。
【００９３】
ある実施形態では、リンカーは、約１〜１００原子、１〜８０原子、１〜６０原子、１〜４０原子、１〜３０原子、１〜２０原子、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０原子の全鎖長を有しており、この場合において鎖中の原子は、Ｃ、Ｓ、Ｎ、ＰおよびＯから構成される。
【００９４】
本発明の特定の実施形態に有用なリンカーまたは結合の例示としては、限定されないが以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−トリアゾール−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−（ＣＨ２）０−６−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）−（ＣＨ２）０−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−（ＣＨ２）０−６−ＣＨ（ＣＯＮＨ−ＰＥＧ）−（ＣＨ２）０−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）０−６−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）−（ＣＨ２）０−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）０−６−ＣＨ（ＣＯＮＨ−ＰＥＧ）−（ＣＨ２）０−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−（ＣＨ２）０−６−ＣＨ（ＣＯＮＨ−ＰＥＧ）−（ＣＨ２）０−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−（ＣＨ２）０−６−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）−（ＣＨ２）０−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−  −Ｃ＝Ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−スクシンイミド−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ジアゾジカルボキサミド−（フェニル）−Ｊ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、式中、ＪはＯ、ＣＨ２、ＮＨ、Ｓ、ＮＨ（ＣＯ）、（ＣＯ）ＮＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−６−、（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−６−、−Ｃ（Ｓ）−（ＣＨ２）０−６−、−（ＣＨ２）１−６−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−６−、−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−６−、−（ＣＨ２）１−６−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−６  −、−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−６  −、（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−（ＣＨ２）２−６、（ＣＨ２）１−６−Ｃ（Ｏ−（ＣＨ２）２−６−、分枝または非分枝−Ｃ１−Ｃ１６−アルキル、分枝または非分枝−Ｃ１−Ｃ１６−アルキルであって、炭素原子の内の１つは任意でヘテロ原子で置換され得るもの、Ｒ２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、Ｒ２−Ｓ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、Ｒ２−トリアゾール−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、Ｒ２−ＮＨ−Ｏ−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、Ｒ２＝Ｎ−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）［すなわち−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−２０］からなる群から選択される１〜３個の二官能性または三官能性の置換架橋有機ラジカルである。
【００９５】
特定の実施形態では、結合体は、以下のように、ポリペプチド系標識、例えば蛍光タンパク質または酵素に、本明細書において別段に予期されるポリペプチドリンカーを介して共有結合された抗βＳ−グロビン抗体または抗体断片を含有する。
【００９６】
Ｅ．ポリペプチド
様々なポリペプチドが本明細書において予期され、限定されないが、抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。
【００９７】
「ポリペプチド」「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、反対であることが明記されない限り、従来的な意味に従う。すなわちアミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは特定の長さに限定されない。例えばポリペプチドは、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含有してもよい。ポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの翻訳後修飾を含んでもよく、ならびに当分野に公知の天然および非天然の他の修飾を含んでもよい。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチド分子またはポリペプチド分子のインビトロでの単離および／または精製を指す。すなわち、インビボでの物質と実質的に関連づけられていない。特定の実施形態では、単離ポリペプチドは、合成ポリペプチド、半合成ポリペプチド、または組み換え源から取得された、もしくは誘導されたポリペプチドである。
【００９９】
同様に、「単離された細胞」とは、インビボの組織または器官から取得され、実質的に細胞外マトリクスを含まない細胞を指す。
【０１００】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入により、天然ポリペプチドとは異なっている場合がある。そうしたバリアントは、天然であってもよく、または例えば上述のポリペプチド配列の１つまたは複数を改変することにより合成的に生成されてもよい。例えば特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入を導入することにより、抗βＳ−グロビン抗体またはその抗原結合断片の結合アフィニティおよび／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書において予期される参照配列のいずれかに対し、少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、当該バリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持している。特定の実施形態では、生物学的活性は、結合アフィニティである。
【０１０１】
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示としては、結合ドメインなどが挙げられる。本明細書において使用される場合、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、天然ポリペプチドの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の活性を保持するポリペプチド断片を指す。ある実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸の長さのアミノ酸鎖を含有し得る。ある実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸の長さである。特に有用なポリペプチド断片としては、抗体の抗原結合ドメインまたは断片を含む機能性ドメインが挙げられる。抗βＳ−グロビン抗体の場合では、有用な断片としては限定されないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域；重鎖または軽鎖の可変領域；２つのＣＤＲを含む抗体鎖または可変領域の部分、などが挙げられる。
【０１０２】
ポリペプチドは、ポリペプチドの合成、精製もしくは識別をし易くするため（例えばポリ−Ｈｉｓ）、または固形支持体へのポリペプチドの結合を強化するためのリンカーまたは他の配列に、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合されてもよく、または結合されてもよい。
【０１０３】
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む、様々な方法で改変されてもよい。そうした操作のための方法は、当分野において一般的に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の突然変異により作製され得る。突然変異誘導およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当分野に公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第  ４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびそれらにおいて引用される参照文献を参照のこと。対象タンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得る。
【０１０４】
ある実施形態では、ポリペプチドバリアントは、１つまたは複数の保存的置換を含有する。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似した性能を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、ペプチド化学分野の当業者であれば、そうした置換によって、当該ポリペプチドの二次構造および疎水親水的性質が実質的に変化しないと予測するであろう。特定の実施形態において予期されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に改変を行ってもよく、それでも所望の特徴を有するバリアントポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子が取得される。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更し、均等な、または改善されたバリアントポリペプチドを生成することが望ましい場合、当業者は、例えば表１に従い、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変えることができる。
表１−アミノ酸コドン
【表１】
2021506272.tif 000003
【０１０５】
どのアミノ酸残基が、生物活性を無効化することなく置換、挿入または欠失させ得るかを決定するガイダンスは、当分野に公知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、またはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアなどを使用して見出すことができる。本明細書に開示されるタンパク質バリアント中のアミノ酸の変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち類似した荷電アミノ酸、または非荷電アミノ酸の置換であることが好ましい。保存的アミノ酸変化には、その側鎖で関連付けられているアミノ酸ファミリーの１つの置換を含む。天然アミノ酸は一般的に以下の４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、合わせて芳香族アミノ酸として分類される場合もある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般的に得られる分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域中の一アミノ酸置換は概して、生物活性を大きくは変化させないと認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照のこと）。
【０１０６】
そうした変更を行うにあたり、アミノ酸の疎水親水的指標が考慮されてもよい。タンパク質に相互作用的な生物機能を与える際のアミノ酸の疎水親水的指標の重要性は、当分野には広く理解されている。（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２、参照により本明細書に援用される）。各アミノ酸には、その疎水性と電荷特性に基づいて疎水親水的指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１０７】
当分野において、あるアミノ酸が類似した疎水親水的指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換されても、類似した生物活性を有するタンパク質がもたらされ得ること、すなわち生物機能的に均等なタンパク質が取得され得ることが知られている。そうした変更を行うにあたり、疎水親水的指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。親水性に基づいて類似アミノ酸の置換が効果的に行われ得ることも当分野において理解されている。
【０１０８】
米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似した親水性値を有する別のアミノ酸と置換されても、生物学的に均等な、そして特に免疫学的に均等なタンパク質が取得され得ることが理解されている。そうした変更において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
【０１０９】
上述のように、アミノ酸の置換は、アミノ酸側鎖の置換基の相対的な類似性、例えば疎水性、親水性、荷電、大きさなどの相対的な類似性に基づいてもよい。
【０１１０】
ポリペプチドバリアントは、グリコシル型、他の分子との凝集性結合体、および関連性のない化学部分との共有結合体（例えばペグ化分子）をさらに含む。当分野において知られるように、共有結合性バリアントは、アミノ酸鎖中に存在する基に、またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基に、官能基を関連付けることにより調製されてもよい。バリアントには、アレルバリアント、種バリアント、および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎｓ）も含まれる。タンパク質の機能的活性に影響を及ぼさない領域の切断または欠失もバリアントである。
【０１１１】
特定の実施形態において予期されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、例えばリンカー配列により関連付けられた軽鎖可変領域または重鎖可変領域などの融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【０１１２】
融合ポリペプチドは任意でリンカーを含んでもよく、当該リンカーを使用して、１つもしくは複数のポリペプチド、またはポリペプチド内のドメインを結合させることができる。ペプチドリンカー配列を採用して任意の２つ以上のポリペプチド構成要素を、各ポリペプチドが適切な二次構造および三次構造へとフォールディングされるために充分な距離をとって分離させてもよく、それによりポリペプチドドメインが、その望ましい機能を発揮することが可能となる。そうしたペプチドリンカー配列は、当分野において標準的な技術を使用して融合ポリペプチドへと組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づき選択されてもよい：（１）柔軟な拡張立体構造をとる能力、（２）第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチド上の機能性エピトープと相互作用し得る二次構造をとらない能力、および（３）ポリペプチドの機能性エピトープと反応する可能性がある疎水性または荷電性の残基の欠落。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含有する。他の近しい中性アミノ酸、例えばＴｈｒやＡｌａなどもリンカー配列に使用され得る。リンカーとして有用に採用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に記載されるものが挙げられる。特定の融合ポリペプチドセグメントが非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含有し、当該領域を使用して機能性ドメインを分離させ、立体干渉を防ぐことができる場合には、リンカー配列は必要ない。好ましいリンカーは、典型的には、柔軟性のあるアミノ酸下位配列であり、当該配列は組み換え融合タンパク質の一部として合成される。リンカーポリペプチドは、１〜２００アミノ酸の長さ、１〜１００アミノ酸の長さ、または１〜５０アミノ酸の長さであってもよく、当該数値の間のすべての整数値が含まれる。
【０１１３】
リンカーの例としては限定されないが、以下のアミノ酸配列が挙げられる：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ、式中、ｎは少なくとも１、２、３、４または５の整数である；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；ＧＧＧ（配列番号１０）；ＤＧＧＧＳ（配列番号１１）；ＴＧＥＫＰ（配列番号１２）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと）；ＧＧＲＲ（配列番号１３）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号１５）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１６）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１７）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１８）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１９）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号２０）。あるいは、ＤＮＡ結合部位とそのペプチドの両方をモデリングすることができるコンピュータープログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ＆  Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４））を使用して、またはファージディスプレイ法により、可塑性リンカーが合理的に設計されてもよい。
【０１１４】
融合ポリペプチドは、典型的にはＣ末端〜Ｎ末端で結合されるが、Ｃ末端〜Ｃ末端、Ｎ末端〜Ｎ末端、またはＭ末端〜Ｃ末端で結合されることもできる。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であってもよく、または指定の順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、保存的に改変されたバリアント、多型バリアント、アレル、突然変異体、下位配列、および種間ホモログを含み得るが、ただし融合ポリペプチドの望ましい活性は保存されるものとする。融合ポリペプチドは、化学合成法により、または２つの部分の間の化学的結合により作製されてもよく、または他の標準的な方法を使用して一般的に調製されてもよい。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書において別段に検討されるように適切な転写制御因子または翻訳制御因子に操作可能に連結される。
【０１１５】
１つの実施形態では、融合パートナーは、タンパク質の発現を、そのままの組み換えタンパク質よりも高い収率で補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度を高めるように、またはタンパク質が所望の細胞内コンパートメントへと標的化され得るように、または融合タンパク質の細胞膜を通過する輸送が促進されるように選択されてもよい。
【０１１６】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載される各ポリペプチドドメインの間に、ポリペプチド切断シグナルをさらに含有してもよい。それに加えて、ポリペプチド切断部位を、任意のリンカーペプチド配列内に挿入することもできる。ポリペプチド切断シグナルの例としては、例えばプロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、および自己切断ウイルスオリゴペプチド（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照のこと）といったポリペプチド切断認識部位が挙げられる。
【０１１７】
Ｆ．ポリヌクレオチド
好ましい実施形態では、本明細書において予期される抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または組み換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドには、一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書において予期される参照配列のいずれかに対し、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを含む。様々な例示的実施形態において、ポリヌクレオチドは、限定されないが、配列番号１〜２０に記載されるポリペプチド配列を含む、本明細書において予期されるポリペプチドをコードする。
【０１１８】
特定の実施形態では、少なくとも約５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、もしくは２０００、またはそれ以上の連続するアミノ酸残基のポリペプチド、ならびにすべての中間の長さのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本文脈において、「中間の長さ」とは、例えば６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などの引用されている値の間の任意の長さを意味すると容易に理解されるであろう。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と相当の配列同一性を呈するポリヌクレオチド、または本明細書において規定されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失され、または異なるヌクレオチドと置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関し当分野において、参照ポリヌクレオチドに対して変異、付加、欠失および置換を含むある変更が為され、それにより変更されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または生物活性を保持し得ると理解されている。
【０１２０】
「配列同一性」、または例えば「〜に対して５０％同一の配列」を含む、という文章は、本明細書において使用される場合、比較ウィンドウ上で配列が、ヌクレオチド毎で同一である、またはアミノ酸ごとで同一である程度を指す。ゆえに「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウ上の２つの最適アライメント配列を比較する工程、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が、両方の配列中に存在する位置の数を決定して、合致位置数を算出する工程、合致位置数を、比較ウィンドウ中の総位置数（すなわちウィンドウサイズ）で割る工程、および結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を算出する工程、により計算されてもよい。本明細書に記載される参照配列のいずれかに対し、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、当該ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持している。
【０１２１】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列相関性を記載するために使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、および「実質的同一性」が挙げられる。「参照配列」は、少なくとも１２個、しばしば１５〜１８個、通常は少なくとも２５個の単量体単位の長さであり、単位にはヌクレオチド残基およびアミノ酸残基が含まれる。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）当該２つのポリヌクレオチドの間で似ている配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部のみ）と、（２）２つのポリヌクレオチドの間で相違する配列、を含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は、多くの場合、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」上で比較し、配列類似性の局所領域を特定および比較することにより実施される。「比較ウィンドウ」とは、少なくとも６個の連続する位置、通常は約５０〜１００個、より普遍的には約１００〜１５０個の連続する位置の概念的なセグメントを指し、２つの配列が最適にアライメントされた後、そのセグメント中で配列は同じ連続位置数の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適アライメントを目的として、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較し約２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含む場合がある。比較ウィンドウの整列のための最適な配列アライメントは、アルゴリズム（米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）をコンピューター実装することで実施されてもよく、または選択される様々な方法のいずれかにより行われる検査と最適アライメント（すなわち比較ウィンドウ上で最も高い相同性百分率を生じさせるアライメント）により実施されてもよい。参照も、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９により開示されるように、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムに対して作製されてもよい。配列解析の詳細な検討については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５のＵｎｉｔ  １９．３に見出すことができる。
【０１２２】
本明細書において使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」とは、自然状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチドを指し、例えば、通常では当該断片と隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。「単離ポリヌクレオチド」はさらに、自然界では存在せず、ヒトの手により作製された相補的ＤＡＮ（ｃＤＮＡ）、組み換えＤＮＡ、または他のポリヌクレオチドも指す。
【０１２３】
ポリヌクレオチドの方向性を説明する用語としては、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチド末端）、および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチド末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５〜３’の方向で、または３’〜５’の方向でアノテーションされることができる。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関しては、５’〜３’鎖が、「センス」鎖、「プラス」鎖または「コーディング」鎖と指定される。その理由は、当該配列は、プレメッセンジャー（ｐｒｅｍＲＮＡ）の配列と［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりのＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除き］同一であるためである。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関し、相補的な３’〜５’鎖は、ＲＮＡポリメラーゼにより転写された鎖であり、「鋳型」鎖、「アンチセンス」鎖、「マイナス」鎖または「非コーディング」鎖と指定される。本明細書において使用される場合、「逆方向」という用語は、３’〜５’方向で記載された５’〜３’配列を指し、または５’〜３’の方向で記載された３’〜５’配列を指す。
【０１２４】
「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成の規則に関連するポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を指す。例えばＤＮＡ配列の５’  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  ３’の相補鎖は、３’  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ａ  Ｃ  ５’である。後者の配列はしばしば、左側に５’末端、右側に３’末端を置いて、５’  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｔ  ３’のように逆相補として記載される。自身の逆相補と同一である配列は、パリンドローム配列と呼ばれる。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基の一部のみが、塩基対形成規則に従い合致する。または核酸の間に、「完全な」または「全体の」相補性があってもよい。
【０１２５】
さらに当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドまたはそのバリアント断片をコードするヌクレオチド配列は多数存在することを認識するであろう。これらポリヌクレオチドの一部は、任意の天然配列のヌクレオチド配列に対し、最小の相同性を担持する。とはいえコドン使用頻度の差異によって変化するポリヌクレオチドが予期され、特定の実施形態では例えばヒトおよび／または霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが予期される。
【０１２６】
ポリヌクレオチドは、当分野で公知および利用可能な様々な確立された技術のいずれかを使用して調製され、操作され、および／または発現され得る。所望のポリペプチドを発現するために、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクターに挿入されてもよい。
【０１２７】
本明細書に引用されるすべての公表文献、特許出願および登録特許が、個々の公表文献、特許出願または登録特許のそれぞれが具体的に、および個々に参照により援用されることが示されているように、参照により本明細書に援用される。
【０１２８】
前述の実施形態は、明確性および理解を目的として、図および実施例により詳細に記載されているが、本明細書に予期される教示に照らし、特定の変化および改変が、添付の請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、解説のみを目的として提供されるものであり、限定ではない。当業者であれば、本質的に類似した結果を得るために変えられ得る、または改変され得る重要ではない様々なパラメーターが容易に認識されるであろう。
【実施例】
【０１２９】
実施例１
検証解析
ＨｂＳ染色およびＦＡＣＳ分析
ＨｂＳ染色について、１０μＬの全血を、０．１％ＨＳＡを含有する１ｍＬのＰＢＳで三回洗浄し、０．０５％グルタルアルデヒドを含有する３００μＬのＰＢＳ中で１０分間、室温で固定した。０．１％のＨＳＡを含有する６００μＬのＰＢＳを洗浄した細胞に加え、細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞沈殿物を、０．１％のＨＳＡを含有する１ｍＬのＰＢＳで二回洗浄した。細胞沈殿物を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する３００μＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、室温で４分間、インキュベートした。０．１％のＨＳＡを含有する６００μＬのＰＢＳを再懸濁細胞に加え、細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を、０．１％のＨＳＡを含有する３００μＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。
【０１３０】
１０μＬの細胞懸濁液を、３０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）および１０μＬの抗ＨｂＳ抗体と混合した。混合液を室温で３０分間インキュベートした。１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を混合液に加え、４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞沈殿物を、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞沈殿物を、１０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。
【０１３１】
１０μＬの細胞懸濁液を、４０μＬのＦＡＣＳ緩衝液および１μＬの二次抗体と混合した。混合液を室温で１５分間、遮光しながらインキュベートした。１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を混合液に加え、４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞沈殿物を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【０１３２】
ＬＶＶ形質導入およびベクターのコピー数（ＶＣＮ：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）
ヒトＣＤ３４＋細胞を、前刺激培地（ＳＣＧＭ（幹細胞増殖培地：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１００ｎｇ／ｍＬ  ｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ  ｈＴＰＯおよび１００ｎｇ／ｍＬ  Ｆｌｔ３−Ｌ）中に、１ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度で４８時間、再懸濁させた。培養された細胞に、レンチウイルスベクター（ＬＶＶ：ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）を形質導入した。各１００μＬのサンプルに対し、ＳＣＧＭ中の４ｘ１０５個のｈＣＤ３４＋細胞と、４０μＬのＬＶＶおよび１０μＬの１０ｘサイトカインを、９６ウェルの平底プレートにて混合した。ｈＣＤ３４＋細胞に、２４±２時間、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで形質導入を行った。
【０１３３】
形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞をＳＣＧＭで洗浄し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−ＬおよびＩＬ−３を含む２ｍＬのＳＣＧＭ中に再懸濁させ、標準的な１２ウェルの非付着性組織培養プレートに移した。標準的な加湿組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）において、さらに６日間、細胞を維持した。その後、ｑＰＣＲを使用してベクターコピー数（ＶＣＮ）分析を行った。ｑＰＣＲは、ベクターと内因性対照遺伝子の両方に特異的なプライマーとプローブを使用して実施した。ＶＣＮは、ベクターのシグナル量を、内因性対照遺伝子の量で割ることにより決定された。
【０１３４】
ＨＳＣインビトロ赤血球分化
２４時間のＬＶＶ形質導入を行った後、細胞を洗浄し、適切な量のＨＦ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＩＭＤＭ、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２０ｎｇ／ｍＬ  ｈＳＣＦ、１ｎｇ／ｍＬ  ｈＩＬ−３、２ＩＵ／ｍＬ  ＥＰＯ、２０％  熱非働化ＦＢＳ）中に、約５．０ｘ１０５細胞／ｍＬの細胞密度に再懸濁させ、非組織培養処理プレート上に播種した。ＨＦ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ中で細胞を７日間培養して、２〜３日毎にチェックを行い、密度を１．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持した。７日間の培養の後、細胞を室温で５分間、３００ｘｇで遠心分離させ、３．０〜５．０ｘ１０５細胞／ｍＬの密度で、ＨＦ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＩＭＤＭ、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ＩＵ／ｍＬ  ＥＰＯ、２０％  熱非働化ＦＢＳ、２００ｕｇ／ｍＬ  アポ−トランスフェリン）中に再懸濁させた。細胞を、非組織培養処理プレート上に播種して、ＨＦ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ中で７日間培養した。培養密度は、５．０ｘ１０５細胞／ｍＬに維持された。７日間の培養後、細胞を、ＣＤ２３５ａ（ＧＰＡ）発現に関してモニタリングした。ＨｂＳの割合は、４〜７日間以上の培養の後にフロー分析により決定した。
【０１３５】
実施例２
正常赤血球と鎌状赤血球のＨｂＳ染色
正常な全血と、鎌状赤血球症の患者の全血を固定、透過処理し、１つにまとめた。細胞を、ＨｂＳ抗体（Ｃｌｏｎｅ  １５Ｈ４．Ｄ９．Ｇ５）を用いておよそ３０分間、室温で染色した。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＡＰＣ結合抗マウス二次抗体（Ａｂｃａｍ  ＃Ａｂ１３０７８２）を用いて１５分間、室温で染色した。Ａ／Ａ（正常ヘモグロビン；ＨｂＡ）およびＳ／Ｓ（鎌状ヘモグロビン；ＨｂＳ）の赤血球は２つのピークで現れ、分離された。フローサイトメトリーのＡＰＣチャンネルの電圧を上げても、２つのピークがさらに分離されることはなかった。これらの結果から、ＨｂＳ抗体は、Ｓ−ヘモグロビンに特異的であり、Ａ−ヘモグロビンには特異的ではないことが示される。図１。
【０１３６】
実施例３
鎌状赤血球を検出するためのＨｂＳ抗体の力価測定
正常ヘモグロビン（Ａ／Ａ）、鎌状形質（Ａ／Ｓ）、および鎌状ヘモグロビン（Ｓ／Ｓ）の患者の全血を固定し、透過処理を行った。細胞を、実施例２に記載されるようにＨｂＳ抗体で染色した。Ａ／Ｓピークは、Ａ／ＡピークとＳ／Ｓピークの間にあった。さらにＡ／Ｓ赤血球を、様々な濃度のＨｂＳ抗体（２．５μＬ、５μＬ、１０μＬ、および１５μＬ）で染色した。Ａ／Ｓピークは、異なるＨｂＳ量でも大きなシフトを示さず、１サンプルあたりのＨｂＳ染色には２．５μＬのＨｂＳ抗体で充分であった。図２。
【０１３７】
実施例４
ＨｂＳ染色は、Ｓ−ヘモグロビン陽性細胞の割合を決定することができる。
正常（Ａ／Ａ）および鎌状赤血球の患者（Ｓ／Ｓ）の全血を固定し、透過処理を行って、様々な比率で混合した（４：１、２：１、１：１、１：２および１：４）。細胞を、実施例２に記載されるようにＨｂＳ抗体で染色した。Ｓ−ヘモグロビン陽性細胞の割合は、フロー分析により決定された。検出されるＨｂＳの量は、ＨｂＡ：ＨｂＳの比率が下がるにつれて、増加した。図３。
【０１３８】
実施例５
鎌状赤血球症（Ｓ／Ｓ）の骨髄細胞は、抗鎌状化β−グロビンをコードするレンチウイルスベクターを用いた形質導入の後、ＨｂＳ発現の低下を示した。
鎌状赤血球症患者（Ｓ／Ｓ）の骨髄からＣＤ３４＋細胞が富化された。細胞は前刺激され、モックが形質導入され（サンプル１）、または抗鎌状化β−グロビンをコードするレンチウイルスベクターが形質導入された（サンプル２〜４）。細胞に１４日間のインビトロ赤血球分化を行い、その後、実施例２に記載されるようにＨｂＳ抗体を用いて染色を行った。抗鎌状化β−グロビンをコードするＬＶＶを形質導入された細胞は、モックを形質導入された細胞と比較して、５６．３％から２８．０％へのＨｂＳ発現の低下を示した。図４。
【０１３９】
実施例６
鎌状赤血球症（Ｓ／Ｓ）の動員末梢血細胞は、抗鎌状化β−グロビンをコードするレンチウイルスベクターを用いた形質導入の後、ＨｂＳ発現の低下を示した。
鎌状赤血球症患者は、プレリキサホルを用いて処理され、末梢血細胞が動員された。動員末梢血を、ＣＤ３４＋細胞に対して富化させた。ＣＤ３４＋細胞はサイトカインを用いて前刺激され、モックが形質導入され（サンプル１）、または抗鎌状化β−グロビンをコードするレンチウイルスベクターが形質導入された（サンプル２〜３）。細胞に１４日間のインビトロ赤血球分化を行い、その後、実施例２に記載されるようにＨｂＳ抗体を用いて染色を行った。抗鎌状化β−グロビンをコードするＬＶＶを形質導入された細胞は、モックを形質導入された細胞と比較して、８３．０％から平均で５９．０％へのＨｂＳ発現の低下を示した。図５。
【０１４０】
一般的に以下の請求の範囲において、使用される用語は、請求の範囲を本明細書に開示される特定の実施形態に限定するとは解釈されず、請求の範囲は、当該請求の範囲が権利付与される均等の全範囲に沿って、すべての可能性のある実施形態を含むと解釈されるものとする。したがって、請求の範囲は、本開示により限定されない。
【図１】
2021506272.tif 000004
【図２】
2021506272.tif 000005
【図３】
2021506272.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021506272.tif 000009
2021506272.tif 000010