(57)【要約】  本発明は、切断放出セグメントを含む活性化可能な組換えポリペプチド組成物に関する。一部の事例では、活性化可能な組換えポリペプチド組成物は、切断可能な放出セグメントにより結合部分構造に連結されたＸＴＥＮであって、切断されたとき、前記結合部分構造が、エフェクターＴ細胞を標的腫瘍またはがん細胞と結合させ、腫瘍細胞またはがん細胞の細胞溶解を果たすことが可能である、ＸＴＥＮを含む。本発明は、切断可能な活性化可能な組換え組成物を作製および使用する組成物および方法も提供する。
2021507706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の放出セグメント（ＲＳ１）を含む組換えポリペプチドであって、前記ＲＳ１が、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質である、組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記ＲＳ１が、表１に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
前記ＲＳ１が、表２に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも９４％の配列、または少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
標的組織または細胞上の標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する第１の結合部分構造（ＦＢＭ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
前記哺乳動物プロテアーゼが、前記標的組織もしくは細胞により産生されるか、または前記標的組織もしくは細胞と共局在化される、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
前記ＲＳ１が、セリンプロテアーゼおよび／またはシステインプロテアーゼおよび／またはメタロプロテイナーゼの基質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
前記ＲＳ１が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼから選択されるプロテアーゼの基質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
前記ＲＳ１が、表３に記載のプロテアーゼの基質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項９】
前記ＲＳ１が、複数のプロテアーゼによる１カ所、２カ所または３カ所の切断部位での切断の基質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＲＳ１が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼから選択される２つまたはそれより多くのプロテアーゼによる２カ所またはそれより多くの切断部位での切断の基質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＲＳ１が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼから選択される３つまたはそれより多くのプロテアーゼによる３カ所またはそれより多くの切断部位での切断の基質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１２】
レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼによる前記ＲＳ１の切断の速度が、等モル濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされたときの、同じプロテアーゼによる配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列の切断の速度と比較して、少なくとも２倍速い、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼによる前記ＲＳ１の切断の速度が、等モル濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされたときの、同じプロテアーゼによる配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列の切断の速度と比較して、少なくとも２倍遅い、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＲＳ１が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼによる切断の基質であり、前記ＲＳ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的競合アッセイにおいて配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列の同じプロテアーゼによる切断と比較して少なくとも０．２ｌｏｇ２、または０．４ｌｏｇ２、または０．８ｌｏｇ２、または１．０ｌｏｇ２高い切断効率を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＲＳ１が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼによる切断の基質であり、前記ＲＳ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的競合アッセイにおいて配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列の同じプロテアーゼによる切断と比較して少なくとも０．２ｌｏｇ２、または０．４ｌｏｇ２、または０．８ｌｏｇ２、または１．０ｌｏｇ２低い切断効率を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＦＢＭが、抗体、サイトカイン、細胞受容体、またはその断片である、請求項４〜１５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１７】
第１の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ１）をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＸＴＥＮ１が、表８または表１０に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＸＴＥＮ１が、ＡＥ  １４４＿１Ａ、ＡＥ  １４４＿２Ａ、ＡＥＥ１４４＿２Ｂ、ＡＥ  １４４＿３Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ  １４４＿４Ａ、ＡＥ  １４４＿４Ｂ、ＡＥ  １４４＿５Ａ、ＡＥ  １４４＿６Ｂ、ＡＥ２８４、ＡＥ２８８＿１、ＡＥ２８８＿２、ＡＥ２８８＿３、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＥ８６４＿２、ＡＥ８６５、ＡＥ８６６、ＡＥ８６７およびＡＥ８６８から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７または１８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＦＢＭ、前記ＲＳ１、および前記ＸＴＥＮ１を含み、未切断の状態で、Ｎ末端からＣ末端へＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１またはＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭの構造配置を有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２１】
前記哺乳動物プロテアーゼによる前記ＲＳ１の切断時に、前記ＸＴＥＮ１および前記ＦＢＭが前記組換えポリペプチドから放出される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２２】
前記ＦＢＭが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、線状抗体、および単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗体断片である、請求項４〜２１のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
前記抗体断片が、形質細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、マスト細胞、樹状細胞、調節性Ｔ細胞（ＲｅｇＴ細胞）、ヘルパーＴ細胞、骨髄性細胞およびＮＫ細胞から選択されるエフェクター細胞の表面に発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合親和性を有する、請求項２２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２４】
前記エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項２３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２５】
前記エフェクター細胞抗原が、ＣＤ３である、請求項２３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２６】
前記抗体断片が、ＣＤ３に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＶＬおよびＶＨが、表４に記載の配列から選択される、請求項２６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２８】
前記抗体断片が、ＣＤ３に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２９】
前記抗体断片が、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、これらの各々が表４のモノクローナル抗体に由来する、請求項２８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３０】
ペプチドリンカーにより前記ＦＢＭに融合された第２の結合部分構造（ＳＢＭ）を含み、前記ＳＢＭが、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する抗体断片であり、前記抗体断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、線状抗体、単一ドメイン抗体、および単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択されるか、または前記ＦＢＭおよびＳＢＭの前記ＶＬおよびＶＨが、単鎖ディアボディとして構成されている、請求項４〜２９のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３１】
前記標的細胞マーカーが、腫瘍細胞またはがん細胞上のマーカーである、請求項３０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３２】
前記標的細胞マーカーが、表５に記載の標的細胞マーカーから選択される、請求項３０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３３】
前記標的細胞マーカーが、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカルＮｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウ���依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）から選択される、請求項３０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３４】
前記ＳＢＭが、前記標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３５】
前記ＶＬおよびＶＨが、表５に記載の配列から選択される、請求項３４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３６】
前記抗原断片が、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、これらの各々が表５に記載のモノクローナル抗体に由来する、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３７】
前記ＦＢＭ、前記ＳＢＭ、前記ＲＳ１および前記ＸＴＥＮ１を含み、未切断の状態で、Ｎ末端からＣ末端へＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ、またはダイアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、もしくはＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ダイアボディの構造配置を有し、前記ダイアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３８】
表１４に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３９】
前記哺乳動物プロテアーゼにより前記ＲＳ１が切断され、前記組換えポリペプチドから前記ＦＢＭおよびＳＢＭが放出された時点で、前記ＦＢＭおよびＳＢＭが、融合したままであり、前記ＣＤ３抗原を有するＴ細胞および前記標的細胞マーカーを有する腫瘍細胞に結合すること、ならびに前記Ｔ細胞および前記腫瘍細胞を連結させることが、前記Ｔ細胞と前記腫瘍細胞の両方を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて可能である、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４０】
放出されたＦＢＭおよびＳＢＭの、前記Ｔ細胞および前記腫瘍細胞への前記結合が、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、細胞溶解または細胞内成分の放出の定量により判定して、前記腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を生じさせる、請求項３９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４１】
前記組換えポリペプチドの前記放出されたＦＢＭおよびＳＢＭが、等モル濃度で行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、細胞溶解または細胞内成分の放出の定量により判定して、未切断の組換えポリペプチドによって果たされる細胞溶解と比較して前記腫瘍細胞のより大量の細胞溶解を果たすことが可能である、請求項４０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４２】
前記組換えポリペプチドの前記放出されたＦＢＭおよびＳＢＭにより果たされる細胞溶解の量が、等モル濃度で行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、細胞溶解または細胞内成分の放出の定量により判定して、前記未切断の組換えポリペプチドによって果たされる細胞溶解と比較して少なくとも１０倍多い、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍、または少なくとも１０，０００倍多い、請求項４０または４１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４３】
前記腫瘍細胞の前記細胞傷害活性および／または細胞溶解が、前記Ｔ細胞の標的特異的活性化により媒介される、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４４】
前記放出されるＦＢＭおよびＳＢＭにより果たされる前記Ｔ細胞の活性化の量が、等モル濃度で行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴ細胞由来エフェクター分子の定量により判定して、前記未切断の組換えポリペプチドにより果たされる活性化と比較して少なくとも１０倍多い、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍多い、または少なくとも１０，０００倍多い、請求項４３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４５】
前記哺乳動物プロテアーゼにより前記ＲＳ１が切断され、前記組換えポリペプチドから前記ＦＢＭおよびＳＢＭが放出された時点で、前記ＦＢＭおよびＳＢＭが、融合したままであり、ＣＤ３抗原または標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、等モル濃度でアッセイされたときの、前記ＣＤ３抗原に対するまたは前記標的細胞マーカーに対する前記未切断の組換えポリペプチドの結合親和性と比較して、前記ＣＤ３抗原および／または前記標的細胞マーカーに対する結合親和性の増大を示す、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４６】
前記ＣＤ３抗原に対する放出されたＦＢＭの結合親和性、または前記標的細胞マーカーに対する放出されたＳＢＭの結合親和性が、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて解離定数（Ｋｄ）定数として判定して、等モル濃度でアッセイされたときの、前記ＣＤ３抗原に対するまたは前記標的細胞マーカーに対する前記未切断の組換えポリペプチドの結合親和性と比較して、少なくとも３倍、または少なくとも１０倍大きい、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍大きい、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４７】
前記組換えポリペプチドの前記放出されたＦＢＭの前記ＣＤ３抗原への結合のＫｄ定数が、１０−５〜１０−９Ｍの間であり、前記放出されたＳＢＭの標的特異的マーカーへの結合のＫｄが、１０−５〜１０−９Ｍの間である、請求項４６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４８】
前記標的細胞マーカーに対する前記放出されたＳＢＭの結合親和性が、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＫｄ定数として判定して、等モル濃度でアッセイされたときの、前記ＣＤ３抗原に対する前記放出されたＦＢＭのより低い結合親和性と比較して、少なくとも１桁大きい、請求項４６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４９】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、ＦＡＣＳに基づくヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光測定ユーロピウム放出アッセイ、カルセインＡＭ放出アッセイ、測光ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定３Ｈ−Ｔｈｄ組込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光測定ローダミン１２３アッセイ、ＦＡＣＳに基づくホスファチジルセリン曝露によりモニターされるアポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡに基づくＴＵＮＥＬ試験アッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、カスパーゼ活性アッセイ、細胞に基づくＬＤＨ放出アッセイ、および細胞形態アッセイ、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５０】
ｉ）哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質である第２の放出セグメント（ＲＳ２）と、ｉｉ）第２のＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ２）とをさらに含み、未切断の状態で、前記組換えポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ダイアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１（式中、前記ダイアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）、またはＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ダイアボディ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２（式中、前記ダイアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）の構造配置を有する、請求項１７〜４９のいずれか一項の請求項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５１】
前記ＸＴＥＮ２が、表８または表１０に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含む、請求項５０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５２】
前記ＸＴＥＮ２が、ＡＥ  １４４＿１Ａ、ＡＥ  １４４＿２Ａ、ＡＥＥ１４４＿２Ｂ、ＡＥ  １４４＿３Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ  １４４＿４Ａ、ＡＥ  １４４＿４Ｂ、ＡＥ  １４４＿５Ａ、ＡＥ  １４４＿６Ｂ、ＡＥ２８４、ＡＥ２８８＿１、ＡＥ２８８＿２、ＡＥ２８８＿３、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＥ８６４＿２、ＡＥ８６５、ＡＥ８６６、ＡＥ８６７およびＡＥ８６８から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５３】
前記ＲＳ２配列が、前記ＲＳ１配列と比較して同一である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５４】
前記ＲＳ２配列が、前記ＲＳ１配列と比較して異なり；表１または表２に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％または少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５５】
前記ＲＳ２配列が、前記ＲＳ１配列と比較して異なり、表１または表２の配列から選択される配列を含む、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５６】
表１５または表１８に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５７】
ＲＳ１、ＲＳ２、ＦＢＭ、ＳＢＭ、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２を含む組換えポリペプチドであって、
ａ．前記ＲＳ１およびＲＳ２が、各々、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質であり、各々、表２の配列から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９７％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｂ．前記ＦＢＭが、エフェクター細胞に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり；
ｃ．前記ＳＢＭが、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり；
ｄ．前記ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２が、各々、表１０に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；および
ｅ．前記組換えポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ダイアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１の構造配置を有し、前記ダイアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む、組換えポリペプチド。
【請求項５８】
前記エフェクター細胞が、Ｔ細胞であり、前記標的細胞マーカーが、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカルＮｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）から選択される、請求項５６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５９】
前記ＲＳ２配列が、前記ＲＳ１配列と比較して異なり、各々が、表３に記載の異なるプロテアーゼの基質である、請求項５０〜５８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６０】
前記ＲＳ１および前記ＲＳ２配列が、同一であり、各々が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡおよびマトリプターゼから選択される２つまたはそれより多くのプロテアーゼの基質である、請求項５０〜５８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６１】
前記哺乳動物プロテアーゼにより前記ＲＳ１および前記ＲＳ２が切断され、前記組換えポリペプチドから前記ＦＢＭおよびＳＢＭが放出された時点で、前記ＦＢＭおよびＳＢＭが、融合したままであり、前記Ｔ細胞所有の前記ＣＤ３抗原および前記腫瘍細胞所有の前記標的細胞マーカーに結合すること、ならびに前記ＣＤ３抗原および前記標的細胞マーカーを連結させることが、前記Ｔ細胞と前記腫瘍細胞の両方を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて可能である、請求項５０〜６０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６２】
Ｔ細胞と腫瘍細胞の両方を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて前記標的細胞マーカー抗原を有する前記腫瘍細胞の溶解を誘導する未切断の状態の前記組換えポリペプチドの能力が、等モル濃度でアッセイされたときの細胞溶解または細胞内成分の放出の定量により判定して、前記ＲＳ１およびＲＳ２の切断により前記組換えポリペプチドから放出された前記ＦＢＭまたは前記ＳＢＭにより誘導される溶解と比較して、少なくとも２桁低い、または少なくとも３桁低い、または少なくとも４桁低い、請求項６１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６３】
ＣＤ３抗原または標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける前記未切断の組換えポリペプチドの前記ＣＤ３抗原に対するまたは前記標的細胞マーカーに対する結合親和性が、等モル濃度でアッセイされたときの、第２の放出セグメントおよび第２のＸＴＥＮを含まない未切断の組換えポリペプチドの前記ＣＤ３抗原に対するまたは前記標的細胞マーカーに対する結合親和性と比較して、Ｋｄ定数として判定して、少なくとも１桁小さい、請求項５０〜６０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６４】
ＣＤ３抗原または標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける前記未切断の組換えポリペプチドの前記ＣＤ３抗原に対するまたは前記標的細胞マーカーに対する結合親和性が、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＫｄ定数として判定して、等モル濃度でアッセイされたときの、前記ＲＳ１および前記ＲＳ２の切断により前記組換えポリペプチドから放出された前記ＦＢＭまたは前記ＳＢＭのＣＤ３抗原または標的細胞マーカーに対する結合親和性と比較して、少なくとも２桁小さい、または少なくとも３桁小さい、または少なくとも４桁小さい、請求項５０〜６０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６５】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、細胞に基づく競合的結合アッセイ、ＦＡＣＳに基づくヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光測定ユーロピウム放出アッセイ、カルセインＡＭ放出アッセイ、測光ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定３Ｈ−Ｔｈｄ組込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光測定ローダミン１２３アッセイ、ＦＡＣＳに基づくホスファチジルセリン曝露によりモニターされるアポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡに基づくＴＵＮＥＬ試験アッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、カスパーゼ活性アッセイ、細胞に基づくＬＤＨ放出アッセイ、および細胞形態アッセイ、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド
【請求項６６】
腫瘍を有する対象への前記組換えポリペプチドの投与時に、前記組換えポリペプチドの前記放出セグメントが、前記腫瘍または周囲組織が、前記放出セグメントが基質である１つまたは複数のプロテアーゼを発現している、前記腫瘍に近接すると、切断され得る、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６７】
前記プロテアーゼにより前記放出セグメントが切断され、前記組換えポリペプチドから前記ＦＢＭおよびＳＢＭが放出された時点で、前記対象において、融合したＦＢＭとＳＢＭが、前記ＣＤ３抗原を有するＴ細胞、および前記ＳＢＭのリガンドである腫瘍特異的マーカーを有する腫瘍細胞に結合すること、ならびに前記Ｔ細胞および前記腫瘍細胞を連結させることが可能である、請求項６６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６８】
免疫学的シナプスを形成する、前記放出されたＦＢＭおよびＳＢＭによる前記ＣＤ３抗原を有する前記Ｔ細胞、および前記腫瘍細胞マーカーを有する前記腫瘍細胞の結合時に、前記結合の結果として、１つまたは複数のＴ細胞由来エフェクター分子が前記Ｔ細胞により放出されることになる、請求項６７に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６９】
前記１つまたは複数のエフェクター分子が、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン２、パーフォリン、およびグランザイムから選択される、請求項６８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７０】
前記ＣＤ３抗原を有する前記Ｔ細胞、および前記腫瘍特異的マーカーを有する前記腫瘍細胞の結合時に、前記腫瘍細胞の溶解が、前記Ｔ細胞由来エフェクター分子により果たされる、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７１】
前記未切断の組換えポリペプチドおよび前記融合したＦＢＭとＳＢＭが、各々、等モル用量で対象に投与されたとき、前記未切断の組換えポリペプチドが、前記組換えポリペプチドに連結されていない前記融合したＦＢＭとＳＢＭの終末相半減期と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍の終末相半減期を対象への単一用量の投与後に示す、請求項３０〜７０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７２】
前記組換えポリペプチドの前記放出セグメントを切断することが可能な１つまたは複数の腫瘍関連プロテアーゼを有する対象への前記組換えポリペプチドの治療有効単一用量の投与後、前記組換えポリペプチドから切断され、放出された、前記融合したＦＢＭおよびＳＢＭが、前記対象における切断されていない対応する組換えポリペプチドの終末相半減期と比較して、５分の１、１０分の１、または２０分の１、または３０分の１、または５０分の１、または１００分の１以下の終末相半減期を示す、請求項３０〜７０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７３】
前記組換えポリペプチドの前記放出セグメントを切断することが可能な腫瘍関連プロテアーゼを有する対象への前記組換えポリペプチドの治療有効単一用量の投与後、前記放出されたＦＢＭおよびＳＢＭの血漿Ｃｍａｘ濃度が、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、または約０．１ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌを超えない、請求項３０〜７０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７４】
前記組換えポリペプチドの前記放出セグメントを切断することが可能な腫瘍関連プロテアーゼを有する対象への前記組換えポリペプチドの治療有効単一用量の投与後、前記放出されたＦＢＭおよびＳＢＭの血漿曲線下面積が、前記対象における未切断の組換えポリペプチドの血漿曲線下面積と比較して、１０分の１以下、または３０倍分の１以下、または１００分の１以下である、請求項３０〜７０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７５】
前記対象が、マウス、ラット、サル、イヌおよびヒトからなる群から選択される、請求項６６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７６】
前記請求項のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドと１つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項７７】
皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、くも膜下腔内、または筋肉内投与用に製剤化される、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
液体形態である、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
単回注射用の充填済み注射器内にある、請求項７８に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
投与前に再構成される凍結乾燥粉末として製剤化される、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
対象の疾患の処置のための医薬の調製における請求項３０〜７０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドの使用。
【請求項８２】
前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液性腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞性慢性リンパ性白血病からなる群から選択される、請求項８１に記載の使用。
【請求項８３】
対象の疾患を処置する方法であって、請求項１７〜７５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドの１または複数の治療有効用量または前記組換えポリペプチドを含む医薬組成物の１または複数の治療有効用量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項８４】
前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害または骨髄異形成障害を含む、原発性血液悪性腫瘍、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、あるいはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記医薬組成物または組換えポリペプチドが、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回または月１回投与される１または複数の治療有効用量として前記対象に投与される、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記医薬組成物または組換えポリペプチドが、少なくとも２週間、または少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月、または少なくとも４ヶ月、または少なくとも５ヶ月、または少なくとも６ヶ月の期間にわたって１または複数の治療有効用量として前記対象に投与される、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記用量が、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、くも膜下腔内、または筋肉内投与される、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記用量が、安全性および有効性を最大にするために耐容性に応じて急速投与量としてまたは５分〜９６時間の注入により投与される、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記用量が、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項８３〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
初回用量が、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇからなる群から選択され、後続の用量が、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４．ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項８３〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記対象への前記投与が、前記対象において少なくとも約３日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日間、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ〜少なくとも約２ｎｇ／ｍＬのまたはそれより高い前記組換えポリペプチドの血漿濃度を生じさせる、請求項８３〜８８のいずれか一項または組合せに記載の方法。
【請求項９２】
前記対象が、マウス、ラット、サルおよびヒトからなる群から選択される、請求項８３〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
疾患の処置のための方法に使用するための、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項３０〜７０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドであって、前記方法が、治療有効用量を使用する１回または複数回の連続投与を含む処置レジメンに必要に応じて従って、前記疾患に罹患している対象に前記医薬組成物または前記組換えポリペプチドを投与するステップを含む、医薬組成物または組換えポリペプチド。
【請求項９４】
前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害または骨髄異形成障害を含む、原発性血液悪性腫瘍、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、請求項９３に記載の使用のための医薬組成物または組換えポリペプチド。
【請求項９５】
前記処置レジメンが、特定処置サイクルの一部である、請求項９３または９４に記載の使用のための医薬組成物または組換えポリペプチド。
【請求項９６】
前記特定処置サイクルが、各処置サイクルに従って週２回、週に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、または月に１回、前記医薬組成物または前記組換えポリペプチドを投与することを含む、請求項９５に記載の使用のための医薬組成物または組換えポリペプチド。
【請求項９７】
前記処置レジメンが、前記対象の前記疾患に関連する臨床パラメーターまたはエンドポイントの改善をもたらす、請求項９３〜９６のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物または組換えポリペプチド。
【請求項９８】
前記臨床パラメーターまたはエンドポイントが、完全、部分的または不完全奏功としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；再発までの期間；転移までの期間；全生存期間；生活の質の向上；および症状の改善からなる群の１つまたは任意の組合せから選択される、請求項９７に記載の使用のための医薬組成物または組換えポリペプチド。
【請求項９９】
請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物と、容器と、前記容器上のまたは前記容器と関連付けられたラベルまたは添付文書とを含む、キット。
【請求項１００】
（ａ）請求項１〜７５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｂ）（ａ）の前記ポリヌクレオチドの補体を含む、単離された核酸。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された組換え調節配列とを含む、発現ベクター。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項１０３】
原核生物である、請求項１０２に記載の宿主細胞。
【請求項１０４】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０３に記載の宿主細胞。
【請求項１０５】
活性化可能なポリペプチド組成物を製造する方法であって、
ａ．活性化可能な組換えポリペプチドをコードする核酸構築物を含む宿主細胞を、前記活性化可能な組換えポリペプチドの発現に至る条件下で培養するステップであって、前記活性化可能な組換えポリペプチドが、ＲＳ１、ＲＳ２、ＦＢＭ、ＳＢＭ、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２を含み、
ｉ．前記ＲＳ１およびＲＳ２が、各々、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質であり、各々が、表１または表２の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．前記ＦＢＭが、ＣＤ３に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり、
ｉｉｉ．前記ＳＢＭが、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカルＮｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウム���存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）から選択される標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり、
ｉｖ．前記ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２が、各々、表８または表１０に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ｖ．前記組換えポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ダイアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１の構造配置を有し、前記ダイアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む、ステップと、
ｂ．前記活性化可能なポリペプチド組成物を回収するステップと
を含む方法。
【請求項１０６】
前記活性化可能な組換えポリペプチドが、前記ＲＳ１およびＲＳ２を切断することが可能な１つまたは複数のプロテアーゼによる前記ＲＳ１およびＲＳ２の切断により活性化され、その結果、前記組成物から前記ＦＢＭおよび前記ＳＢＭが放出されることになり、前記ＦＢＭおよびＳＢＭが融合したままである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
未切断の状態の前記活性化可能な組換えポリペプチドの前記ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２が、前記ＦＢＭの前記ＣＤ３への特異的結合および前記ＳＢＭの前記標的細胞マーカーへの特異的結合に干渉し、その結果、未切断の状態の前記活性化可能な組換えポリペプチドの前記ＦＢＭのＣＤ３への解離定数（Ｋｄ）または前記ＳＢＭの前記標的細胞マーカーへの解離定数（Ｋｄ）が、等モル濃度で前記標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定されたとき、前記ＲＳ１およびＲＳ２の切断により前記活性化可能な組換えポリペプチドから放出される前記ＦＢＭまたは前記ＳＢＭと比較して少なくとも１００倍大きくなる、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１２月２１日に出願した米国特許仮出願第６２／６０９，２９６号および２０１８年１２月１７日に出願した米国特許仮出願第６２／７８０，７１９号の優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
がん治療の主要目的は、健康な細胞および組織を可能な限り未損傷のまま残して腫瘍細胞を特異的に破壊することである。最近関心を呼んでいるアプローチは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞が、腫瘍細胞を攻撃して破壊するように誘導される、腫瘍に対する免疫応答を誘導するアプローチである。
【０００３】
腫瘍関連抗原に対する親和性を有する無傷モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の使用は、がん治療分野にうまく応用されているが、不良な生体内分布をもたらす無傷ＭＡｂの大きいサイズと、血液プール中でのそれらの長期存続は、それらの有用性を制限する。加えて、腫瘍壊死および不均一な抗原分布に起因して、無傷ＭＡｂで腫瘍の中心部分に到達することは不可能であることが多い。これを克服するために、より小さい抗体断片を使用することによって、迅速に腫瘍に局在することおよびより深く腫瘍に侵入することができ、血流から迅速に除去することもできる。この目的を達成するには、ＭＡｂに由来する単鎖断片（ｓｃＦｖ）のほうが、無傷ＭＡｂよりも良好な生体内分布を生じ、効率的に腫瘍細胞を標的とすることができる。ｓｃＦｖの前記利点にもかかわらず、単一特異性ｓｃＦｖの使用が、罹患組織と健康な組織の両方により共通して発現される標的に対するがん化学療法におけるそれらの十分な臨床的展開を阻んでいる。このおよび他の欠点を克服するために、特別に設計された二重特異性抗体の使用は、がん細胞を死滅させるように免疫エフェクター細胞に指示するように設計することができる点で異なるアプローチを提示する。二重特異性抗体は、２つのモノクローナル抗体に由来する異なる結合特異性の利益を単一の組成物に兼備し、したがって、単一特異性抗体では不可能である適用範囲のアプローチまたは組合せを可能にする。このアプローチは、二重特異性抗体の一方のアームが腫瘍関連抗原またはマーカーに結合すること、さらに、他方のアームが、エフェクター細胞のマーカー（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３分子）に結合すると、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン２、４および１０、パーフォリンならびにグランザイムなどのエフェクター分子の放出によりそれらの細胞傷害活性を誘発することに依拠する。抗体工学の進歩は、ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を含む、エフェクター細胞を腫瘍標的に向け直すためのいくつかの二重特異性抗体形式および組成物の開発につながった。ＢｉＴＥは、腫瘍部位でのＴ細胞のポリクローナル集団の動員および活性化により機能し、共刺激も従来のＭＨＣ認識も必要とすることなくそのように機能する。しかし、ＢｉＴＥ組成物が非常に短い半減期を有し、その結果、治療効果を達成するのに十分な時間にわたってＢｉＴＥを治療域内で維持するために４〜８週間の持続注入を必要とすることに加えて、ある特定の患者については、数あるサイトカインの中でも特にＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマの放出により媒介される、「サイトカインストーム」または「サイトカイン放出症候群」（Ｌｅｅ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１４  １２４（２）：１８８−１９５）と称される重篤な副作用を経験するという、二重の問題が依然としてある。
【０００４】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解によりタンパク質およびペプチドを切断することが可能である、酵素である。プロテアーゼは、多様な機能に関与し、多くのタンパク質の運命および活性を調節し、生物活性分子を作出または不活性化し、細胞増殖および分化、組織形態形成および再構築に影響を与え、タンパク質のプロセシングに寄与し、さらには分子シグナル伝達に関与する。プロテアーゼの作用およびタンパク質応答の結果として、それらは、血管新生、創傷修復、止血、血液凝固、炎症、免疫、壊死、アポトーシス、およびがんを含む疾患の増悪または寛解の一因となる。一例として、研究により、様々なヒトがんにおいて予後マーカーとしてのマトリプターゼの価値が示されている。前立腺および子宮頸がんの場合、マトリプターゼｍＲＮＡおよびタンパク質は、がん性病変では正常組織と比較して上方制御され、マトリプターゼ発現と腫瘍の病理組織学的悪性度の間には正の相関がある（Ｌｅｅ  ＪＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｇｒａｄｅｓ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．  Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．  （２００５）  ３６（６）：６２６−３３）。マトリプターゼは、正常な卵巣には低レベルで発現されるが、早期卵巣癌には高度に発現される（Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＴＡＤＧ−１５  （ＳＴ１４／Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ／ＭＴ−ＳＰ１）：  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  （２００５）  ９２（２）：２７８−８３）。同様に、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、それらが、ほぼすべてのヒトがんに存在することから、重要ながんマーカーである。ＭＭＰは、腫瘍に隣接する間質中の健康な線維芽細胞、がん関連線維芽細胞、によって発現されることもあり、または血管新生、腫瘍成長、および転移を促進することにより腫瘍環境に影響を及ぼし得る非線維芽細胞性のがん細胞によって発現されることもある（Ｂｈｏｗｍｉｃｋ，  Ｎ．Ａ．，  Ｓｔｒｏｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３２  （２００４），  ｐｐ．  ３３２−３３７）。同様に、レグマインは、ヒト固形腫瘍の大多数に過剰発現される（Ｌｉｕ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｇｕｍａｉｎ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｉｓ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｆｏｒ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ／Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ａ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００３）  ６３（１１）：２９５７−２９６４）。腫瘍プロテアーゼの必須機能は、腫瘍細胞が正常組織に侵入することおよび正常組織において浸潤方式で成長することを可能にするために、細胞外基質を溶解することである。これらのプロテアーゼはまた、例えば、腫瘍を制限する、そうでなければ阻害する���とになる、抗体、サイトカイン、増殖因子、補体因子、凝固因子および媒介因子を、切断および不活性化することにより、身体の防御機構から腫瘍を保護する。これらのがん関連プロテアーゼの存在のため、活性化可能な二重特異性抗体断片組成物であって、がんまたは腫瘍細胞プロテアーゼの付近で選択的に活性化され、その結果、エフェクター細胞をがん細胞標的に方向付け、それらの細胞を死滅させることができる、前記組成物を設計する必要があることは、今では認知されている。
プロテアーゼ感受性ペプチドを治療用生物製剤に組み込んで、ある特定の特性を未処理の薬物もしくは生物製剤におよび／またはプロテアーゼで処理された薬物もしくは生物製剤の製品に付与することができるため、罹患組織に関連するプロテアーゼの新規ペプチド基質を同定する必要があり、これらのペプチド基質を、様々なプロドラッグ治療用、診断用および予防用組成物に、そのような組成物を活性化して治療指数および治療結果を改善するための重要な機構として組み込む必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｅｅ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１４  １２４（２）：１８８−１９５
【非特許文献２】Ｌｅｅ  ＪＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｇｒａｄｅｓ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．  Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．  （２００５）  ３６（６）：６２６−３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
二重特異性抗体形式の薬理学的利点を提供する代替治療薬だが、安全性が増大された、副作用が低減された、選択性が増大された、および／またはより必要な投薬頻度が低いまたは単回注射による投薬しか必要としない投与経路などの薬学的もしくは薬物動態学的特性が増強された、代替治療薬が、依然としてかなり必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、がん、自己免疫および炎症性障害を含むがこれらに限定されない、疾患の処置または予防に有用である、切断可能な放出セグメント（ＲＳ）を含む組換えポリペプチドを提供する。本明細書に記載される放出セグメントを含む組換えポリペプチドは、未だ対処されていない要求に対処することができ、本明細書に記載される有益な特性をもたらす目的に合わせた設計を含む１つまたは複数の態様の点で優れている。
【０００８】
第１の態様では、本開示は、第１の放出セグメント（ＲＳ１）を含む組換えポリペプチドであって、前記ＲＳ１が、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質である、組換えポリペプチドを提供する。一実施形態では、ＲＳ１は、表１に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＲＳ１は、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である。別の実施形態では、ＲＳ１は、表２に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＲＳ１は、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である。別の実施形態では、ＲＳ１は、表１の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＲＳ１は、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である。別の実施形態では、ＲＳ１は、表２の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＲＳ１は、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である。
【０００９】
別の態様では、本開示は、ＲＳ１を含む組換えポリペプチドであって、標的組織または細胞上の標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する第１の結合部分構造（ＦＢＭ）をさらに含む組換えポリペプチドを提供する。一実施形態では、ＦＢＭは、抗体、サイトカイン、細胞受容体、またはその断片である。組換えポリペプチドがＲＳ１およびＦＢＭを含む、一実施形態では、ＲＳ１は、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質であり、前記哺乳動物プロテアーゼは、標的組織もしくは細胞により産生されるか、または標的組織もしくは細胞と共局在化される。組換えポリペプチドがＲＳ１およびＦＢＭを含む、別の実施形態では、ＲＳ１は、複数の哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質であり、前記哺乳動物プロテアーゼは、標的組織もしくは細胞により産生されるか、または標的組織もしくは細胞と共局在化される。対象組成物のＲＳ１は、セリンプロテアーゼおよび／またはシステインプロテアーゼおよび／またはメタロプロテイナーゼの基質であり得る。一実施形態では、ＲＳ１は、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼから選択されるプロテアーゼの基質である。別の実施形態では、ＲＳ１は、表３に記載のプロテアーゼの基質である。一部の実施形態では、実施形態のＲＳ１は、ＲＳ１配列中の１カ所、２カ所または３カ所の切断部位での複数のプロテアーゼによる切断用に設計される。前述のものの一実施形態では、ＲＳ１は、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼから選択される２つまたはそれより多くのプロテアーゼによる２カ所またはそれより多くの切断部位での切断の基質である。前述のものの別の実施形態では、ＲＳ１は、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼから選択される３つまたはそれより多くのプロテアーゼによる３カ所またはそれより多くの切断部位での切断の基質である。
【００１０】
特定の特徴として、対象組成物の放出セグメントを、切断部位の各々で哺乳動物プロテアーゼによる異なる切断の速度を有するように設計することができる。放出セグメントの設計の際、切断の速度は、実施例４３で説明されるように、セリン、システインおよびメタロプロテイナーゼにより切断され得るアミノ酸配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照放出セグメントに対して決定した。一実施形態では、本開示は、ＲＳ１およびＦＢＭを含む組換えポリペプチドであって、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼによる前記ＲＳ１の切断の速度が、等モル濃度下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされたときの、同じプロテアーゼによる配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列の切断の速度と比較して、少なくとも２倍速い、組換えポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、ＲＳ１およびＦＢＭを含む組換えポリペプチドであって、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼによる前記ＲＳ１の切断の速度が、等モル濃度下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされたときの、同じプロテアーゼによる配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列の切断の速度と比較して、少なくとも２倍遅い、組換えポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、ＲＳ１およびＦＢＭを含む組換えポリペプチドであって、前記ＲＳ１が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼによる切断の基質であり、前記ＲＳ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的競合アッセイにおいて配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列の同じプロテアーゼによる切断と比較して少なくとも０．２ｌｏｇ２、または０．４ｌｏｇ２、または０．８ｌｏｇ２、または１．０ｌｏｇ２高い切断効率を有する、組換えポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、ＲＳ１およびＦＢＭを含む組換えポリペプチドであって、前記ＲＳ１が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼによる切断の基質であり、前記ＲＳ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的競合アッセイにおいて配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列の同じプロテアーゼによる切断と比較して少なくとも０．２ｌｏｇ２、または０．４ｌｏｇ２、または０．８ｌｏｇ２、または１．０ｌｏｇ２低い切断効率を有する、組換えポリペプチドを提供する。
【００１１】
別の態様では、本開示は、ＲＳ１と、ＦＢＭと、少なくとも第１の嵩高な部分構造とを含む、組換えポリペプチドに関する。様々な組換えポリペプチド組成物についての１つの利点は、それらを、無傷の組成物が、放出セグメントを切断することおよびＦＢＭをその活性が最も望ましい部位で放出することが可能である哺乳動物プロテアーゼが存在する標的組織またはある特定の細胞環境に近接すると、活性化され得る、プロドラッグの形態に、組み立てることができることである。例えば、ＦＢＭは、組換えポリペプチドが無傷の未切断状態であるとき、嵩高な部分構造の遮蔽効果に起因してそのリガンドに対する結合親和性がより低い。標的組織、例えば腫瘍組織、に共局在している哺乳動物プロテアーゼによる放出セグメントの切断によって放出されると、ＦＢＭは、嵩高な部分構造によりもはや遮蔽されないので、標的細胞マーカーへのその完全な結合能を取り戻す。一部の実施形態では、嵩高な部分構造は、第１の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ１）である。一実施形態では、ＸＴＥＮ１は、表８または表１０に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、前記ＸＴＥＮ１は、ＡＥ  １４４＿１Ａ、ＡＥ  １４４＿２Ａ、ＡＥＥ１４４＿２Ｂ、ＡＥ  １４４＿３Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ  １４４＿４Ａ、ＡＥ  １４４＿４Ｂ、ＡＥ  １４４＿５Ａ、ＡＥ  １４４＿６Ｂ、ＡＥ２８４、ＡＥ２８８＿１、ＡＥ２８８＿２、ＡＥ２８８＿３、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＥ８６４＿２、ＡＥ８６５、ＡＥ８６６、ＡＥ８６７、ＡＥ８６７＿２およびＡＥ８６８から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＲＳ１と、ＦＢＭと、ＸＴＥＮ１とを含む、組換えポリペプチドは、未切断状態の場合にはＮ末端からＣ末端へＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１の構造配置を有する。別の実施形態では、ＲＳ１と、ＦＢＭと、ＸＴＥＮ１とを含む、組換えポリペプチドは、未切断状態の場合にはＮ末端からＣ末端へＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭの構造配置を有する。したがって、ＲＳ１と、ＦＢＭと、ＸＴＥＮ１とを含む、組換えポリペプチドの実施形態では、哺乳動物プロテアーゼによるＲＳ１の切断のときに、ＸＴＥＮ１およびＦＢＭが、組換えポリペプチドから放出される。
【００１２】
別の態様では、本開示は、ＲＳ１と、ＦＢＭと、ＸＴＥＮ１とを含む、組換えポリペプチドであって、前記ＦＢＭが抗体断片である、組換えポリペプチドに関する。一実施形態では、ＦＢＭは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、線状抗体および単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗体断片である。一部の実施形態では、ＦＢＭ抗体断片は、形質細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、マスト細胞、樹状細胞、調節性Ｔ細胞（ＲｅｇＴ細胞）、ヘルパーＴ細胞、骨髄性細胞およびＮＫ細胞から選択されるエフェクター細胞の表面に発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合親和性を有する。一実施形態では、ＦＢＭ抗体断片は、Ｔ細胞の表面に発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合親和性を有する。別の実施形態では、ＦＢＭ抗体断片は、ＣＤ３に対する結合親和性を有する。ＣＤ３に対する結合親和性を有するＦＢＭ抗体断片の一実施形態では、抗体断片は、ＣＤ３に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ３に対する結合親和性を有するＦＢＭ抗体断片の別の実施形態では、抗体断片は、表４に記載の配列から選択されるＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ３に対する結合親和性を有するＦＢＭ抗体断片の別の実施形態では、抗体断片は、ＣＤ３に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤ３に対する結合親和性を有するＦＢＭ抗体断片の別の実施形態では、抗体断片は、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、これらの各々が表４のモノクローナル抗体に由来する。
【００１３】
別の態様では、本開示は、ＲＳ１と、ＸＴＥＮ１と、ＦＢＭと、第２の結合部分構造（ＳＢＭ）とを含む、組換えポリペプチドであって、前記ＳＢＭが、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する抗体断片である、組換えポリペプチドに関する。一実施形態では、ＦＢＭおよびＳＢＭは、各々、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、線状抗体および単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗体断片であり、またはＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨは、単鎖ディアボディとして構成されている。一部の実施形態では、ＳＢＭ抗体断片は、腫瘍細胞またはがん細胞上の標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する。一実施形態では、ＳＢＭ抗体断片は、表５に記載の標的細胞マーカーから選択される標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する。別の実施形態では、ＳＢＭ抗体断片は、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカル（ｎｏｎ−ｘａｎｏｎｉｃａｌ）Ｎｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３��ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管（Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ）抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）から選択される標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する。別の実施形態では、ＳＢＭ抗体断片は、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。別の実施形態では、ＳＢＭ抗体断片は、モノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含み、前記ＶＬおよびＶＨは、表５に記載の配列から選択される。別の実施形態では、ＳＢＭ抗体断片は、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、これらの各々が、表５に記載のモノクローナル抗体に由来する。組換えポリペプチドが、ＦＢＭ、ＳＢＭ、ＲＳ１およびＸＴＥＮ１を含む、上述の実施形態では、未切断状態の場合、組換えポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ、またはディアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、またはＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ディアボディ（式中のディアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）の構造配置を有する。一実施形態では、本開示は、ＦＢＭと、ＳＢＭと、ＲＳ１と、ＸＴＥＮ１とを含む、組換えポリペプチドであって、表１４に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチドを提供する。上述の実施形態の特定の計画された特徴として、哺乳動物プロテアーゼによりＲＳ１が切断され、組換えポリペプチドからＦＢＭおよびＳＢＭが放出された時点で、ＦＢＭおよびＳＢＭは、融合したままであり、ＣＤ３抗原を有するＴ細胞およ���標的細胞マーカーを有する腫瘍細胞に結合すること、ならびに前記Ｔ細胞および前記腫瘍細胞を連結させることが、前記Ｔ細胞と前記腫瘍細胞の両方を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて可能である。融合したＦＢＭとＳＢＭによるＣＤ３抗原を有するＴ細胞および標的細胞マーカーを有する腫瘍細胞の結合および連結のときに、前記Ｔ細胞および前記腫瘍細胞の結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、細胞溶解または細胞内成分の放出の定量により判定して、前記腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を生じさせる結果となる。ＲＳ１が切断され、ＦＢＭおよびＳＢＭが放出される、組換えポリペプチドの一実施形態では、放出された、融合したＦＢＭとＳＢＭは、等モル濃度下で行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、細胞溶解または細胞内成分の放出の定量により判定して、未切断組換えポリペプチドによって果たされる細胞溶解と比較して腫瘍細胞のより大量の細胞溶解を果たすことが可能である。一実施形態では、組換えポリペプチドの放出されたＦＢＭおよびＳＢＭにより果たされる細胞溶解の量は、等モル濃度下で行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、細胞溶解または細胞内成分の放出の定量により判定して、未切断組換えポリペプチドにより果たされる細胞溶解と比較して少なくとも１０倍多い、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍、または少なくとも１０，０００倍多い。上述の実施形態では、腫瘍細胞の細胞傷害活性および／または細胞溶解は、Ｔ細胞の標的特異的活性化により媒介され得る。一実施形態では、放出されたＦＢＭおよびＳＢＭにより果たされるＴ細胞の活性化の量は、等モル濃度下で行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴ細胞由来エフェクター分子の定量により判定して、未切断組換えポリペプチドにより果たされる活性化と比較して少なくとも１０倍多い、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍多い、または少なくとも１０，０００倍多い。対象組換えポリペプチドの設計により付与される特定の特徴として、哺乳動物プロテアーゼによりＲＳ１が切断され、組換えポリペプチドからＦＢＭおよびＳＢＭが放出された時点で、ＦＢＭおよびＳＢＭは、融合したままであり、ＣＤ３抗原または標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、等モル濃度下でアッセイされたときの、ＣＤ３抗原に対するまたは標的細胞マーカーに対する無傷の未切断組換えポリペプチドの結合親和性と比較して、ＣＤ３抗原および／または標的細胞マーカーに対する結合親和性の増大を示す。一実施形態では、ＣＤ３抗原に対する放出されたＦＢＭの結合親和性、または標的細胞マーカーに対する放出されたＳＢＭの結合親和性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＫｄ定数として判定して、等モル濃度下でアッセイされたときの、ＣＤ３抗原に対するまたは標的細胞マーカーに対する無傷の未切断組換えポリペプチドの結合親和性と比較して、少なくとも１０倍大きい、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍大きい。上述の実施形態では、��換えポリペプチドの放出されたＦＢＭのＣＤ３抗原への結合のＫｄ定数は、１０−５〜１０−９Ｍの間であり、放出されたＳＢＭの標的特異的マーカーへの結合のＫｄは、１０−５〜１０−９Ｍの間である。別の実施形態では、標的細胞マーカーに対する放出されたＳＢＭの結合親和性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＫｄ定数として判定して、等モル濃度下でアッセイされたときの、ＣＤ３抗原に対する放出されたＦＢＭのより低い結合親和性と比較して、少なくとも１桁大きい。用いられるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、ＦＡＣＳに基づくヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光測定ユーロピウム放出アッセイ、カルセインＡＭ放出アッセイ、測光ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定３Ｈ−Ｔｈｄ組込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光測定ローダミン１２３アッセイ、ＦＡＣＳに基づくホスファチジルセリン曝露によりモニターされるアポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡに基づくＴＵＮＥＬ試験アッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、カスパーゼ活性アッセイ、細胞に基づくＬＤＨ放出アッセイ、および細胞形態アッセイ、またはこれらの任意の組合せから選択され得る。
【００１４】
別の態様では、本開示は、上記の、ＲＳ１、ＦＢＭ、ＳＢＭ、実施形態に記載されたエレメントを有するＸＴＥＮ１を含む、組換えポリペプチドであって、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質である第２の放出セグメント（ＲＳ２）と第２のＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ２）とをさらに含む組換えポリペプチドに関する。本開示は、組換えポリペプチドの種々の構成を企図しており、未切断状態の場合、前記組換えポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ディアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１（この式中のディアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）、またはＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ディアボディ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２（この式中のディアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）の構造配置を有する。一実施形態では、組換えポリペプチドのＸＴＥＮ２は、表８または表１０に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、組換えポリペプチドのＸＴＥＮ２は、ＡＥ  １４４＿１Ａ、ＡＥ  １４４＿２Ａ、ＡＥＥ１４４＿２Ｂ、ＡＥ  １４４＿３Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ  １４４＿４Ａ、ＡＥ  １４４＿４Ｂ、ＡＥ  １４４＿５Ａ、ＡＥ  １４４＿６Ｂ、ＡＥ２８４、ＡＥ２８８＿１、ＡＥ２８８＿２、ＡＥ２８８＿３、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＥ８６４＿２、ＡＥ８６５、ＡＥ８６６、ＡＥ８６７、ＡＥ８６７＿２、およびＡＥ８６８から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。対象組換えポリペプチドの一部の実施形態では、ＲＳ２配列は、ＲＳ１配列と比較して同一である。他の実施形態では、ＲＳ２配列は、ＲＳ１配列と比較して異なり、各々が、表１または表２の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＲＳ２配列は、ＲＳ１配列と比較して異なり、各々が、表１または表２の配列から選択される配列を含む。別の実施形態では、本開示は、ＸＴＥＮ１と、ＲＳ１と、ＳＢＭと、ＦＢＭと、ＲＳ２とＸＴＥＮ２とを含む、組換えポリペプチドであって、表１５または表１８に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチドを提供する。
【００１５】
一実施形態では、本開示は、ＲＳ１と、ＲＳ２と、ＦＢＭと、ＳＢＭと、ＸＴＥＮ１と、ＸＴＥＮ２とを含む、組換えポリペプチドであって、ｉ）前記ＲＳ１およびＲＳ２が、各々、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質であり、各々、表２の配列から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９７％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ｉｉ）前記ＦＢＭが、エフェクター細胞に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり；ｉｉｉ）前記ＳＢＭが、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり；ｉｖ）前記ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２が、各々、表１０に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびｖ）前記組換えポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ディアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１（この式中のディアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）の構造配置を有する、組換えポリペプチドを提供する。上述の実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞であり、標的細胞マーカーは、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカルＮｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジ���ステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）から選択される。ＲＳ１およびＲＳ２配列は、同一であることもあり、またはそれらは、表２から選択される異なる配列であることもある。一実施形態では、ＲＳ２配列は、ＲＳ１配列と比較して異なり、各々が、表３に記載の異なるプロテアーゼの基質である。別の実施形態では、ＲＳ１およびＲＳ２配列は、同一であり、各々が、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡおよびマトリプターゼから選択される２つまたはそれより多くのプロテアーゼの基質である。上述の実施形態の特定の計画された特徴として、哺乳動物プロテアーゼによりＲＳ１およびＲＳ２が切断され、組換えポリペプチドからＦＢＭおよびＳＢＭが放出された時点で、ＦＢＭおよびＳＢＭは、融合したままであり、ＣＤ３抗原を有するＴ細胞および標的細胞マーカーを有する腫瘍細胞に結合すること、ならびに前記Ｔ細胞および前記腫瘍細胞を連結させることが、前記Ｔ細胞と前記腫瘍細胞の両方を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて可能である。上述の実施形態の別の計画された特徴として、Ｔ細胞と腫瘍細胞の両方を含��ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて標的細胞マーカー抗原を有する腫瘍細胞の溶解を誘導する未切断状態の組換えポリペプチドより低い能力は、等モル濃度下でアッセイされたときの細胞溶解または細胞内成分の放出の定量により判定して、ＲＳ１およびＲＳ２の切断により組換えポリペプチドから放出されたＦＢＭまたはＳＢＭにより誘導されるより大量の溶解と比較して、少なくとも２桁低い、または少なくとも３桁低い、または少なくとも４桁低い。ＲＳ１と、ＲＳ２と、ＦＢＭと、ＳＢＭと、ＸＴＥＮ１と、ＸＴＥＮ２とを含む、組換えポリペプチドの上述の実施形態の別の特定の計画された特徴として、ＣＤ３抗原または標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＣＤ３抗原に対するまたは標的細胞マーカーに対する未切断組換えポリペプチドの結合親和性は、Ｋｄ定数として判定して、等モル濃度下でアッセイされたときの、ＲＳ１、ＲＳ２、ＦＢＭ、ＳＢＭ、ＸＴＥＮ１を含むが、第２の放出セグメントおよび第２のＸＴＥＮを含まない、未切断組換えポリペプチドのＣＤ３抗原に対するまたは標的細胞マーカーに対する結合親和性と比較して、少なくとも１桁低い。一実施形態では、ＣＤ３抗原または標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける、ＲＳ１と、ＲＳ２と、ＦＢＭと、ＳＢＭと、ＸＴＥＮ１と、ＸＴＥＮ２とを含む、未切断組換えポリペプチドの、ＣＤ３抗原に対するまたは標的細胞マーカーに対する結合親和性は、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＫｄ定数として判定して、等モル濃度下でアッセイされたときの、ＲＳ１およびＲＳ２の切断により前記組換えポリペプチドから放出されたＦＢＭまたはＳＢＭのＣＤ３抗原または標的細胞マーカーに対する結合親和性と比較して、少なくとも２桁小さい、または少なくとも３桁小さい、または少なくとも４桁小さい。用いられるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、ＦＡＣＳに基づくヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光測定ユーロピウム放出アッセイ、カルセインＡＭ放出アッセイ、測光ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定３Ｈ−Ｔｈｄ組込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光測定ローダミン１２３アッセイ、ＦＡＣＳに基づくホスファチジルセリン曝露によりモニターされるアポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡに基づくＴＵＮＥＬ試験アッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、カスパーゼ活性アッセイ、細胞に基づくＬＤＨ放出アッセイ、および細胞形態アッセイ、またはこれらの任意の組合せから選択され得る。
【００１６】
本明細書で提供される組換えポリペプチド組成物は、治療薬および診断薬を含む、様々な目的に有用であり得る。一態様では、本開示は、対象に投与される組換えポリペプチド組成物に関する。当業者には理解されると予想されるが、腫瘍などの標的細胞を有する対象に、上記の、実施形態に記載されたエレメントを有する組換えポリペプチドが投与されると、前記組換えポリペプチドの放出セグメントは、腫瘍または周囲組織が、放出セグメントが基質である１つまたは複数のプロテアーゼを発現している、腫瘍に近接すると、切断され得る。一実施形態では、対象においてプロテアーゼにより放出セグメントが切断され、投与された組換えポリペプチドからＦＢＭおよびＳＢＭが放出された時点で、融合したＦＢＭとＳＢＭは、対象において、ＣＤ３抗原を有するＴ細胞、およびＳＢＭのリガンドである腫瘍特異的マーカーを有する腫瘍細胞に結合すること、ならびに前記Ｔ細胞および前記腫瘍細胞を連結させることが可能である。免疫学的シナプスを形成する、ＣＤ３抗原を有するＴ細胞および腫瘍細胞マーカーを有する腫瘍細胞の放出されたＦＢＭおよびＳＢＭによる結合のときに、前記結合の結果として、１つまたは複数のＴ細胞由来エフェクター分子がＴ細胞により放出されることになる。一実施形態では、１つまたは複数のエフェクター分子は、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン２、パーフォリン、およびグランザイムから選択される。ＣＤ３抗原を有するＴ細胞、および腫瘍特異的マーカーを有する腫瘍細胞の結合のときに、対象における腫瘍細胞の溶解が、Ｔ細胞由来エフェクター分子により果たされる。上述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、イヌおよびヒトからなる群から選択される。
【００１７】
別の態様では、本開示は、対象組換えポリペプチドおよび対象への投与後に放出される成分についての薬物動態学的特性に関する。一実施形態では、未切断組換えポリペプチドおよび融合したＦＢＭとＳＢＭが、各々、等モル用量で対象に投与されたとき、未切断の組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドに連結されていない融合したＦＢＭとＳＢＭの終末相半減期と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍の終末相半減期を対象への単一用量の投与後に示す。別の実施形態では、組換えポリペプチドの放出セグメントを切断することが可能な１つまたは複数の腫瘍関連プロテアーゼを有する対象への組換えポリペプチドの治療有効単一用量の投与後、組換えポリペプチドから切断され、放出された、融合したＦＢＭとＳＢＭは、前記対象における切断されていない対応する組換えポリペプチドの終末相半減期と比較して、５分の１、１０分の１、または２０分の１、または３０分の１、または５０分の１、または１００分の１以下の終末相半減期を示す。別の実施形態では、組換えポリペプチドの放出セグメントを切断することが可能な腫瘍関連プロテアーゼを有する対象への組換えポリペプチドの治療有効単一用量の投与後、放出された、融合したＦＢＭとＳＢＭの血漿Ｃｍａｘ濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、または約０．１ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌを超えない。別の実施形態では、組換えポリペプチドの放出セグメントを切断することが可能な腫瘍関連プロテアーゼを有する対象への組換えポリペプチドの治療有効単一用量の投与後、放出されたＦＢＭおよびＳＢＭの血漿曲線下面積は、前記対象における未切断組換えポリペプチドの血漿曲線下面積と比較して、１０分の１以下、または３０分の１以下、または１００分の１以下である。上述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、イヌおよびヒトからなる群から選択される。
【００１８】
本開示は、本明細書に記載される組換えポリペプチドのいずれかを、１つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤とともに含む、医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、くも膜下腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。別の実施形態では、医薬組成物は、液体形態である。別の実施形態では、医薬組成物は、単回注射用の充填済み注射器内にある。別の実施形態では、医薬組成物は、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として製剤化される。
【００１９】
本開示は、対象の疾患の処置のための医薬の調製における、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの組換えポリペプチドの使用を企図している。一実施形態では、医薬により処置される疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液性腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞性慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。
【００２０】
別の態様では、本開示は、対象における疾患を処置する方法に関する。一実施形態では、本開示は、対象の疾患を処置する方法であって、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの組換えポリペプチドの１もしくは複数の治療有効用量または前記組換えポリペプチドを含む医薬組成物の１もしくは複数の治療有効用量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、方法により処置される疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害または骨髄異形成障害を含む、原発性血液悪性腫瘍、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。別の実施形態では、本開示は、医薬組成物または組換えポリペプチドが、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回または月１回投与される１または複数の治療有効用量として対象に投与される、処置の方法を提供する。処置の方法の別の実施形態では、医薬組成物または組換えポリペプチドは、少なくとも２週間、または少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月、または少なくとも４ヶ月、または少なくとも５ヶ月、または少なくとも６ヶ月の期間にわたって１または複数の治療有効用量として対象に投与される。処置の方法では、用量は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、くも膜下腔内、または筋肉内投与され得る。処置の方法の別の実施形態では、医薬組成物または組換えポリペプチド用量は、安全性および有効性を最大にするために耐容性に応じて急速投与量としてまたは５分〜９６時間の注入により投与される。処置の方法の上述の実施形態では、用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも��０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。処置の方法の別の実施形態では、初回用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇからなる群から選択され、後続の用量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４．ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。処置の方法の別の実施形態では、対象への投与は、対象において少なくとも約３日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日間、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ〜少なくとも約２ｎｇ／ｍＬのまたはそれより高い組換えポリペプチドの血漿濃度を生じさせる結果となる。処置の方法の上述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サルおよびヒトからなる群から選択される。
【００２１】
別の態様では、本開示は、処置レジメンに関する。一実施形態では、処置レジメンは、疾患の処置のための方法に使用するための本明細書に記載される組換えポリペプチドまたは医薬組成物を使用し、前記方法は、治療有効用量を使用する２回またはそれより多くの連続投与を含む処置レジメンに必要に応じて従って、疾患に罹患している対象に前記医薬組成物または前記組換えポリペプチドを投与するステップを含む。レジメンにより処置される疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害または骨髄異形成障害を含む、原発性血液悪性腫瘍、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。別の実施形態では、処置レジメンでの使用のための医薬組成物または組換えポリペプチドは、特定処置サイクルの一部である。処置サイクルは、各処置サイクルに従って週２回、週に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、または月に１回、医薬組成物または組換えポリペプチドを投与することを含み得る。上述のレジメン実施形態では、処置レジメンは、対象の疾患に関連する臨床パラメーターまたはエンドポイントの改善をもたらす。対象の疾患に関連する臨床パラメーターまたはエンドポイントは、完全、部分的または不完全奏功としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；再発までの期間；転移までの期間；全生存期間；生活の質の向上；および症状の改善からなる群の、１つまたは任意の組合せであり得る。
【００２２】
別の態様では、本開示は、キットを提供する。一実施形態では、本開示は、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの医薬組成物を、容器、および前記容器上のまたは前記容器に関連付けられたラベルまたは添付文書とともに含む、キットを提供する。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの補体を含む、１つまたは複数の単離された核酸を提供する。本開示は、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された組換え調節配列とを含む、発現ベクターも提供する。本開示は、前述の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞も提供する。一実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。別の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００２４】
別の態様では、本開示は、活性化可能な組換えポリペプチドを製造する方法に関する。一実施形態では、本開示は、活性化可能な組換えポリペプチド組成物を製造する方法であって、ａ）前記活性化可能な組換えポリペプチドをコードする核酸構築物を含む宿主細胞を、前記活性化可能な組換えポリペプチドの発現に至る条件下で培養するステップであって、前記活性化可能な組換えポリペプチドが、ＲＳ１、ＲＳ２、ＦＢＭ、ＳＢＭ、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２を含み、ｉ）前記ＲＳ１およびＲＳ２が、各々、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質であり、各々、表１または表２の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）前記ＦＢＭが、ＣＤ３に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり、ｉｉｉ）前記ＳＢＭが、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカルＮｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導���ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）から選択される標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり、ｉｖ）前記ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２が、各々、表８または表１０に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｖ）前記組換えポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ディアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１（この式中のディアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）の構造配置を有する、ステップと、ｂ）前記活性化可能なポリペプチド組成物を回収するステップとを含む方法を提供する。前述の方法では、活性化可能な組換えポリペプチドは、ＲＳ１およびＲＳ２を切断することが可能な１つまたは複数のプロテアーゼによるＲＳ１およびＲＳ２の切断により活性化され、その結果、組成物からＦＢＭおよびＳＢＭが放出されることになり、前記ＦＢＭおよびＳＢＭは、融合したままである。方法の一実施形態では、未切断状態の前記活性化可能な組換えポリペプチドのＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、ＦＢＭのＣＤ３への特異的結合およびＳＢＭの前記標的細胞マーカーへの特異的結合に干渉し、その結果、未切断状態の活性化可能な組換えポリペプチド���ＦＢＭのＣＤ３への解離定数（Ｋｄ）またはＳＢＭの標的細胞マーカーへの解離定数（Ｋｄ）は、等モル濃度下で標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定されたとき、ＲＳ１およびＲＳ２の切断により活性化可能な組換えポリペプチドから放出されたＦＢＭまたはＳＢＭと比較して少なくとも１００倍大きくなる。
【００２５】
本発明の特徴および利点を、例示的な実施形態が記載されている以下の詳細な説明および添付図を参照することによってさらに説明することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、種々の図において使用した種々の概略図を、それらが示すものの説明と共に示す図である。
【００２７】
【図２】図２は、切断されていない「プロ」形態の、および腫瘍関連プロテアーゼによる作用を受けた後の切断された状態のＰｒｏＴＩＡ組成物（本明細書に記載の組換えポリペプチド組成物の形態）を示す図である。この図はまた、当該組成物の両方の形態の非限定的性質の一部も記載する。
【００２８】
【図３】図３は、図３ＡにＰｒｏＴＩＡの切断されていない「プロ」形態を示し、図３Ｂに切断された形態を示す図である。切断されていない形態は各々が細胞表面抗原を有するエフェクター細胞および腫瘍関連細胞の近傍に示されている；しかし、図３Ａの切断されていない形態は、結合部分構造上のＸＴＥＮの立体的な障害および遮蔽効果に起因して、２つの細胞に同時に結合することができないが、結合部分構造が放出された図３Ｂの切断された形態では、２つの細胞に同時に結合することが可能になり、エフェクター細胞による標的腫瘍関連細胞に対する免疫活性化が可能になる。
【００２９】
【図４】図４は、放出セグメントおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造または腫瘍抗原結合部分構造のいずれかに付着することができることを例示するＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの配置の略図である。
【００３０】
【図５】図５は、２つの放出セグメントおよび２つのＸＴＥＮが結合部分構造と連結している、ＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの配置の略図である。図５Ａの場合では、一方のＲＳおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造と連結しており、他方のＲＳおよびＸＴＥＮが腫瘍抗原結合部分構造と連結しており、組成物はｓｃＦｖ配置になっている。図５Ｂの場合では、両方のＲＳおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造（左側）または腫瘍抗原結合部分構造（右側）のいずれかに付着しており、結合部分構造はディアボディ配置になっている（したがって、組成物を組換え型で産生させることが可能になる）。
【００３１】
【図６】図６は、ＸＴＥＮがＸＴＥＮポリペプチドであり、ＲＳおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造と連結しているか（左側）、またはＲＳおよびＸＴＥＮが腫瘍抗原結合部分構造と連結している（右側）ＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの配置の略図である。図６Ａ〜Ｄは、結合部分構造の代替Ｎ末端およびＣ末端の配置を示す。
【００３２】
【図７】図７は、２つの放出セグメントおよび２つのＸＴＥＮが結合部分構造と連結している、ＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの配置の略図である。図７Ａの場合では、一方のＲＳおよび一方のＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造と連結しており、他方のＲＳおよびＸＴＥＮが腫瘍抗原結合部分構造と連結しており、組成物はｓｃＦｖ配置になっている。図７Ｂの場合では、両方のＲＳおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造（右側）または腫瘍抗原結合部分構造（左側）に付着しており、結合部分構造はディアボディ配置になっている（したがって、組成物を組換え型で産生させることが可能になる）。
【００３３】
【図８】図８は、ＲＳおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造（左側）または腫瘍抗原結合部分構造（右側）のいずれかと連結している、ＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの配置の略図である。図８Ａは、結合部分構造をＸＴＥＮとして示す。図８Ｂは、結合部分構造をアルブミンとして示す。図８Ｃは、結合部分構造をＦｃ断片として示す。
【００３４】
【図９】図９は、２つの放出セグメントおよび２つのＸＴＥＮが結合部分構造と連結しているＰｒｏＴＩＡ組成物の配置の略図である。図９Ａは、２つのＲＳおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造および腫瘍抗原結合部分構造の両方と連結している（左側）、腫瘍抗原結合部分構造と連結している（中央）またはエフェクター細胞結合部分構造と連結している（右側）３つの配置を示す。図９Ｂは、１つのＲＳおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造と連結しており、１つのＲＳおよびアルブミンが腫瘍抗原結合部分構造と連結している（左上）、１つのＲＳおよびＸＴＥＮが腫瘍抗原結合部分構造と連結しており、１つのＲＳおよびアルブミンがエフェクター細胞結合部分構造と連結している（右上）、ＲＳおよびＸＴＥＮとＲＳおよびアルブミンの両方が腫瘍抗原結合部分構造と連結している（左下）、ならびに、ＲＳおよびＸＴＥＮとＲＳおよびアルブミンの両方がエフェクター細胞結合部分構造と連結している（右下）、４つの配置を示す。図９Ｃは、１つのＲＳおよびＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分構造と連結しており、１つのＲＳおよびＦｃが腫瘍抗原結合部分構造と連結している（左上）、１つのＲＳおよびＸＴＥＮが腫瘍抗原結合部分構造と連結しており、１つのＲＳおよびＦｃがエフェクター細胞結合部分構造と連結している（右上）、ＲＳおよびＸＴＥＮとＲＳおよびＦｃの両方が腫瘍抗原結合部分構造と連結している（左下）、ならびにＲＳおよびＸＴＥＮとＲＳおよびＦｃの両方がエフェクター細胞結合部分構造と連結している（右下）、４つの配置を示す。
【００３５】
【図１０】図１０は、腫瘍組織におけるより浸透性が高い脈管構造により、組織内にＰｒｏＴＩＡが血管外遊出することが可能になり、そこで、腫瘍関連プロテアーゼがＲＳに作用し、それを切断し、結合部分構造を放出させることができ、それにより今度はエフェクター細胞と腫瘍関連細胞を共に結合させ、連結することができる、腫瘍組織（左側）および正常組織（右側）の近傍にあるＰｒｏＴＩＡの略図である。正常組織の場合では、血管外遊出がより密接な脈管構造関門によって遮断されるか、またはＰｒｏＴＩＡが血管外遊出する場合では、ＰｒｏＴＩＡは「プロ」形態のままになる一方で、エフェクター細胞に結合することができ、腫瘍細胞は存在しないか、もしくは存在する場合には、結合部分構造を放出させるためには不十分なプロテアーゼが存在し、免疫学的シナプスは形成されないという正味の効果を有する。
【００３６】
【図１１】図１１は、各々がリンカーによって接合したＶＨ／ＶＬ対を有し、タンデムフォーマットにあるエフェクター細胞結合部分構造と腫瘍抗原結合部分構造のｓｃＦｖ配置の略図である。
【００３７】
【図１２】図１２は、各々がリンカーによって接合したＶＨ／ＶＬ対を有する、エフェクター細胞結合部分構造と腫瘍抗原結合部分構造の単鎖ディアボディ配置の略図である。
【００３８】
【図１３】図１３は、構築物の略図である。図１３Ａは、一般的な構築物設計の略図である。図１３Ｂおよび１３Ｃは、エフェクター細胞結合部分構造および腫瘍抗原結合部分構造がｓｃＦｖ配置（図１３Ｂ）［分子内の長いリンカー（Ｌ）または分子間の短いリンカー（ｌ）のいずれかによって連結した可変重（ＶＨ）ドメインと可変軽（ＶＬ）ドメイン］および単鎖ディアボディ配置（図１３Ｃ）［長いリンカー（Ｌ）または分子間の短いリンカー（ｌ）のいずれかによって連結したＶＨドメインおよびＶＬドメイン］の種々の順列にあるＰｒｏＴＩＡ組成物の略図を示す。
【００３９】
【図１４】図１４は、実施例２に記載されている、切断されていないＡＣ１２７８の発酵培地からの精製を示す図である。図１４Ａは、ＡＣ１２７８の発酵培地からのＩＭＡＣ捕捉の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す；図１４Ｂは、ＨＩＣ仕上げステップにおける画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す；図１４Ｃは、ＩｍｐＲｅｓ−Ｑ仕上げステップにおける画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００４０】
【図１５】図１５は、実施例２に記載されている、切断されていないＡＣ１２７８のロット放出分析を示す図である。図１５Ａは、切断されていないＡＣ１２７８（実線）のＸＴＥＮ長さ標準（破線）に対するロット放出分析ＳＥＣクロマトグラフィーを示す；図１５Ｂは、切断されていないＡＣ１２７８のロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【００４１】
【図１６】図１６は、実施例２に記載されている、切断されていないＡＣ１２７８を使用した、切断されたＰｒｏＴＩＡ−Ａの調製を示す図である。図１６Ａは、ＭＭＰ−９による消化反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す；図１６Ｂは、切断されたＸＴＥＮセグメントを除去するためのＭＭＰ−９による消化混合物のＩＭＡＣ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００４２】
【図１７】図１７は、実施例２に記載されている、切断されたＡＣ１２７８のロット放出分析を示す図である。図１７Ａは、切断されたＡＣ１２７８（実線）の球状タンパク質標準物質（破線）に対するロット放出分析ＳＥＣクロマトグラフィーを示す；図１７Ｂは、切断されたＡＣ１２７８のロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【００４３】
【図１８】図１８は、実施例３に記載されている、切断されていないＡＣ１４７６の発酵培地からの精製を示す図である。図１８Ａは、ＡＣ１４７６の発酵培地からのＩＭＡＣ捕捉の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す；図１８Ｂは、ＨＩＣ仕上げステップにおける画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す；図１８Ｃは、ＩｍｐＲｅｓ−Ｑ仕上げステップにおける画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００４４】
【図１９】図１９は、実施例３に記載されている、切断されていないＡＣ１４７６のロット放出分析を示す図である。図１９Ａは、切断されていないＡＣ１４７６（実線）のＸＴＥＮ長さ標準（破線）に対するロット放出分析ＳＥＣクロマトグラフィーを示す；図１９Ｂは、切断されていないＡＣ１４７６の、クーマシー染色を伴うロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す；図１９Ｃは、切断されていないＡＣ１４７６の、銀染色を伴うロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【００４５】
【図２０】図２０は、実施例３に記載されている、切断されていないＡＣ１４７６の追加的なロット放出分析を示す図である。図２０Ａは、切断されていないＡＣ１４７６のロット放出ＥＳＩ−ＭＳを示す；図２０Ｂは、切断されていないＡＣ１４７６のロット放出カチオン交換クロマトグラフィーを示す。
【００４６】
【図２１】図２１は、実施例３に記載されている、切断されていないＡＣ１４７６を使用した、切断されたＰｒｏＴＩＡ−Ａの調製を示す図である。図２１Ａは、ＭＭＰ−９による消化反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す；図２１Ｂは、切断されなかった基質、ならびに切断されたＸＴＥＮセグメントを除去するためのＭＭＰ−９による消化混合物のアニオン交換画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００４７】
【図２２】図２２は、実施例３に記載されている、切断されたＡＣ１４７６のロット放出分析を示す図である。図２２Ａは、切断されたＡＣ１４７６（実線）の球状タンパク質標準物質（破線）に対するロット放出分析ＳＥＣを示す；図２２Ｂは、切断されたＡＣ１４７６の、クーマシー染色を伴うロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す；図２２Ｃは、切断されたＡＣ１４７６の、銀染色を伴うロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【００４８】
【図２３】図２３は、実施例３に記載されている、切断されたＡＣ１４７６の追加的なロット放出分析を示す図である。図２３Ａは、切断されたＡＣ１４７６のロット放出ＥＳＩ−ＭＳを示す；図２３Ｂは、切断されたＡＣ１４７６のロット放出カチオン交換クロマトグラフィーを示す。
【００４９】
【図２４】図２４は、実施例４に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのそのリガンドとの結合を示す図である。
【００５０】
【図２５】図２５は、実施例６に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００５１】
【図２６】図２６は、実施例６に記載されている、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特異性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００５２】
【図２７】図２７は、実施例６に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００５３】
【図２８】図２８は、実施例９に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのＰＫを決定するための実験からの結果を示す図である。
【００５４】
【図２９】図２９は、Ｔ細胞結合組成物の代替のＮ末端からＣ末端への配置の略図である。図２９Ａは、エフェクター細胞結合部分構造（ＥＣＢＭ）、その後、放出部位セグメント（ＲＳ）およびＸＴＥＮという配置を示し、図２９Ｂは、ＸＴＥＮ、その後、ＲＳセグメント、次いでＥＣＢＭという配置を示す。
【００５５】
【図３０】図３０は、実施例６に記載されている、ＳＫ−ＯＶ−３におけるプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００５６】
【図３１】図３１は、実施例１０に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定するための実験からの腫瘍体積結果を示す図である。
【００５７】
【図３２】図３２は、実施例１０に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定するための実験からの体重結果を示す図である。
【００５８】
【図３３】図３３は、実施例１２に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのサイトカインプロファイルを決定するための実験からの結果を示す図である。図３３Ａは、ＩＬ−２を検出するためのアッセイの結果を示し、図３３Ｂは、ＩＬ−４の検出の結果を示す。
【００５９】
【図３４】図３４は、実施例１２に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのサイトカインプロファイルを決定するための実験からの結果を示す図である。図３４Ａは、ＩＬ−６を検出するためのアッセイの結果を示し、図３４Ｂは、ＩＬ−１０の検出の結果を示す。
【００６０】
【図３５】図３５は、実施例１２に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのサイトカインプロファイルを決定するための実験からの結果を示す図である。図３５Ａは、ＩＦＮ−ガンマを検出するためのアッセイの結果を示し、図３５Ｂは、ＴＮＦ−アルファの検出の結果を示す。
【００６１】
【図３６】図３６は、放出セグメントＲＳＲ−１５１７のアミノ酸配列および列挙されているプロテアーゼがペプチドを切断することができる３つの切断部位の位置を示す図である。
【００６２】
【図３７】図３７は、実施例５５に記載されている、培養上清中に放出されたカスパーゼ３／７を測定する、ｈｕＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂに対する細胞傷害性アッセイからの結果を示す図である。
【００６３】
【図３８】図３８は、実施例１３に記載されている、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定するための実験からのＨＣＴ−１１６腫瘍体積結果を示す図である。
【００６４】
【図３９】図３９は、実施例１３に記載されている、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗ＨＣＴ−１１６腫瘍効果を決定するための実験からの体重結果を示す図である。
【００６５】
【図４０】図４０は、実施例１４に記載されている、ヒト精製ＣＤ３陽性Ｔ細胞を用いたＳＫ−ＯＶ−３におけるプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００６６】
【図４１】図４１は、実施例１４に記載されている、ヒト精製ＣＤ３陽性Ｔ細胞を用いたＯＶＣＡＲ−３におけるプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００６７】
【図４２】図４２は、実施例８に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、ＰＢＭＣおよびＳＫ−ＯＶ−３細胞の共培養物中のＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を測定するための実験からの結果を示す図である。図４２Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９の活性化を示し、図４２Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を示す。
【００６８】
【図４３】図４３は、実施例８に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、ＰＢＭＣとＳＫ−ＯＶ−３細胞の共培養物中のＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を測定するための実験からの結果を示す図である。図４３Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を示し、図４３Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を示す。
【００６９】
【図４４】図４４は、実施例８に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、精製されたＣＤ３＋細胞およびＳＫ−ＯＶ−３細胞の共培養物中のＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を測定するための実験からの結果を示す図である。図４４Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９の活性化を示し、図４４Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を示す。
【００７０】
【図４５】図４５は、実施例８に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、精製されたＣＤ３＋細胞とＳＫ−ＯＶ−３細胞の共培養物中のＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を測定するための実験からの結果を示す図である。図４５Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を示し、図４５Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を示す。
【００７１】
【図４６】図４６は、実施例８に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、精製されたＣＤ３＋細胞とＯＶＣＡＲ３細胞の共培養物中のＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を測定するための実験からの結果を示す図である。図４６Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９の活性化を示し、図４６Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を示す。
【００７２】
【図４７】図４７は、実施例８に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、精製されたＣＤ３＋細胞とＯＶＣＡＲ３細胞の共培養物中のＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を測定するための実験からの結果を示す図である。図４７Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を示し、図４７Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化を示す。
【００７３】
【図４８】図４８は、実施例８に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、ＰＢＭＣとＯＶＣＡＲ３細胞の共培養物中のＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を測定するための実験からの結果を示す図である。図４８Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９の活性化を示し、図４８Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を示す。
【００７４】
【図４９】図４９は、実施例８に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、ＰＢＭＣとＯＶＣＡＲ３細胞の共培養物中のＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびグランザイムＢの両方の活性化を測定するための実験からの結果を示す図である。図４９Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９およびグランザイムＢの両方の活性化を示し、図４９Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびグランザイムＢの両方の活性化を示す。
【００７５】
【図５０】図５０は、実施例１５に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、精製されたＣＤ３＋細胞とＳＫ−ＯＶ−３細胞の共培養物中のサイトカインＩＬ−２およびＩＬ−４の放出を測定するための実験からの結果を示す図である。図５０Ａは、放出されたＩＬ−２の濃度を示し、図５０Ｂは、放出されたＩＬ−４の濃度を示す。
【００７６】
【図５１】図５１は、実施例１５に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、精製されたＣＤ３＋細胞とＳＫ−ＯＶ−３細胞の共培養物中のサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１０の放出を測定するための実験からの結果を示す図である。図５１Ａは、放出されたＩＬ−６の濃度を示し、図５１Ｂは、放出されたＩＬ−１０の濃度を示す。
【００７７】
【図５２】図５２は、実施例１５に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた、精製されたＣＤ３＋細胞とＳＫ−ＯＶ−３細胞の共培養物中のサイトカインＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマの放出を測定するための実験からの結果を示す図である。図５２Ａは、放出されたＴＮＦ−アルファの濃度を示し、図５２Ｂは、放出されたＩＦＮ−ガンマの濃度を示す。
【００７８】
【図５３】図５３は、実施例１６に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのＣＤ３εδリガンドに対する結合曲線を示す図である。
【００７９】
【図５４】図５４は、実施例１７に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｒｈＥｐＣＡＭリガンドに対する結合特異性を示す図である。
【００８０】
【図５５】図５５は、実施例１８に記載されている、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定するための実験からのＳＷ４８０腫瘍体積結果を示す図である。
【００８１】
【図５６】図５６は、実施例１８に記載されている、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗ＳＷ４８０腫瘍効果を決定するための実験からの体重結果を示す図である。
【００８２】
【図５７】図５７は、実施例２３に記載されている、ヒトＰＢＭＣを伴うＳＫＯＶ３における、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００８３】
【図５８】図５８は、実施例２３に記載されている、ヒトＰＢＭＣを伴うＯＶＣＡＲ３における、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００８４】
【図５９】図５９は、実施例２３に記載されている、ヒトＰＢＭＣを伴うＨＣＴ１１６における、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００８５】
【図６０】図６０は、実施例２３に記載されている、ヒトＰＢＭＣを伴うＳＷ４８０における、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００８６】
【図６１】図６１は、実施例２５に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定するための実験からのＨＣＴ−１１６腫瘍体積結果を示す図である。
【００８７】
【図６２】図６２は、実施例２６に記載されている、ＯＶＣＡＲ−３およびＰＢＭＣを有する対照群１、ＰＢＭＣのみを有する群８およびＯＶＣＡＲ−３のみを有する群９におけるヒトＣＡ１２５レベルを示す図である。
【００８８】
【図６３】図６３は、実施例２６に記載されている、低用量プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（群２）、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（群４）、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（群６）の抗腫瘍効果を決定するための実験からのヒトＣＡ１２５レベルを示す図である。
【００８９】
【図６４】図６４は、実施例２６に記載されている、高用量プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（群３）、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（群５）、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（群７）の抗腫瘍効果を決定するための実験からのヒトＣＡ１２５レベルを示す図である。
【００９０】
【図６５】図６５は、実施例２７に記載されている、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するマウスの腹腔内に投与されたプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと、それに対して静脈内に投与されたプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定するための実験からのヒトＣＡ１２５レベルを示す図である。
【００９１】
【図６６】図６６は、実施例２７に記載されている、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するマウスの腹腔内に投与されたプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと、それに対して静脈内に投与されたプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定するための実験からの総腫瘍体積を示す図である。
【００９２】
【図６７】図６７は、実施例２７に記載されている、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するマウスにおけるプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと、それに対してベバシズマブの抗腫瘍効果を決定するための実験からの総腫瘍体積を示す図である。
【００９３】
【図６８】図６８は、実施例２８に記載されている、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３バリアントのＣＤ３イプシロン／デルタリガンドに対する結合を示す図である。
【００９４】
【図６９】図６９は、実施例３０に記載されている、静脈内投与されたプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの（図６９Ａ）血漿および（図６９Ｂ）腹水での薬物動態に関する結果を示す図である。
【００９５】
【図７０】図７０は、実施例３０に記載されている、腹腔内投与されたプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（図７０Ａ）血漿および（図７０Ｂ）腹水での薬物動態に関する結果を示す図である。
【００９６】
【図７１】図７１Ａ〜Ｆは、実施例３３に記載されている、ＢｉＴＥとして構成された構築物と比較した、無傷ＰｒｏＴＩＡ構築物、切断されたＰｒｏＴＩＡ構築物および切断不可能なＰｒｏＴＩＡ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性評価からの試料のサイトカインアッセイからの結果を示す図である。
【００９７】
【図７２】図７２は、実施例３４に記載されている、カプラン・マイヤープロットとしてグラフ化した、切断された活性化された形態と比較した無傷ＰｒｏＴＩＡの最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００９８】
【図７３】図７３Ａ〜Ｆは、実施例３４に記載されている、投薬されたマウスの経時的な体重としてグラフ化した、切断された活性化された形態と比較した無傷ＡＣ１５５３  ＰｒｏＴＩＡの最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）を決定するための実験からの結果を示す図である。
【００９９】
【図７４−１】図７４は、実施例４１に記載されている、放出セグメント−ＸＴＥＮバリアントの作製からのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。図７４Ａは、ＲＳ−ＸＴＥＮバリアント発現の力価分析である。図７４（Ｂ）〜（Ｄ）は、ＲＳ−ＸＴＥＮバリアントＡＣ１６０２、ＡＣ１６０９、ＡＣ１６１０、ＡＣ１６０４、ＡＣ１６０８、ＡＣ１６１１、ＡＣ１６１２、ＡＣ１６４９、ＡＣ１６５０の一段階ＩＭＡＣ精製を示す。図７４Ｅは、精製されたＲＳ−ＸＴＥＮバリアントのロット放出からのゲルを示す。
【図７４−２】同上。
【図７４−３】同上。
【０１００】
【図７５】図７５は、実施例４２に記載されている、がんに関係付けられる７種のヒトプロテアーゼに供した場合のＡＣ１６１１の切断プロファイルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【０１０１】
【図７６】図７６は、実施例４３に記載されている、ＡＣ１６１１を参照として用いた、ＲＳ−ＸＴＥＮバリアントのｕＰＡ消化のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【０１０２】
【図７７】図７７は、実施例５６に記載されている、ビヒクルおよび処置群における体重決定の結果を示す図である。
【０１０３】
【図７８】図７８は、実施例５７に記載されている、処置群における体重決定の結果を示す図である。
【０１０４】
【図７９】図７９は、実施例６０に記載されている、ビヒクルおよび処置群における腫瘍体積の結果を示す図である。図７９Ａは、０．５ｍｇ／ｋｇで投薬された動物の結果を示し、図７９Ｂは、０．１ｍｇ／ｋｇで投薬された動物の結果を示す。
【０１０５】
【図８０】図８０は、実施例６１に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと比較した、プロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の向け直された細胞傷害性アッセイの結果を示す図である。図８０Ａは、ヒトＰＢＭＣを用いたＡＣ１９５５およびＡＣ１９５８のＨＣＴ−１１６細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏカスパーゼ３／７アッセイの結果を示す。図８０Ｂは、ヒトＰＢＭＣを用いたＡＣ１９５５およびＡＣ１９５８のＨＴ−２９細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏカスパーゼ３／７アッセイの結果を示す。
【０１０６】
【図８１−１】図８１は、実施例６２に記載されている、アポトーシス細胞のカスパーゼ３／７活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞に基づくアッセイで評価した、プロテアーゼで処理された抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断不可能なＡＣ２０３９）と比較した、プロテアーゼで処理されていない抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物であるＡＣ２０３８およびＡＣ２０４０の向け直された細胞傷害性アッセイからの結果を示す図である。図８１Ａは、ＢＴ４７４をヒトＰＢＭＣと共に用いた結果を示す。図８１Ｂは、ＳＫ−ＯＶ−３およびヒトＰＢＭＣを用いた結果を示す。図８１Ｃは、ＪＩＭＴ−１をヒトＰＢＭＣと共に用いた結果を示す。図８１Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をヒトＰＢＭＣと共に用いた結果を示す。
【図８１−２】同上。
【０１０７】
【図８２】図８２は、実施例６３に記載されている、プロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果をセツキシマブに対して決定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ実験からの結果を示す図である。図８２Ａは、ＨＴ−２９腫瘍細胞を有する動物からの腫瘍体積結果を示す。図８２Ｂは、ＨＴ−２９腫瘍細胞を有する動物からの体重結果を示す。
【０１０８】
【図８３】図８３は、実施例６４に記載されている、確立された乳腺腫瘍モデルにおけるプロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ実験からの結果を示す図である。図８３Ａは、ＢＴ−４７４腫瘍細胞を有する動物からの腫瘍体積結果を示す。図８３Ｂは、ＢＴ−４７４腫瘍細胞を有する動物からの体重結果を示す。
【０１０９】
【図８４】図８４は、実施例４６に記載されている、製剤化された原薬のロット放出分析のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【０１１０】
【図８５】図８５は、実施例４６に記載されている、製剤化された原薬のロット放出ＨＰＬＣ分析を示す図である。図８５Ａは、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示し、図８５Ｂは、ＨＩ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【０１１１】
【図８６】図８６は、実施例４７に記載されている、製剤化された原薬のロット放出分析を示す図である。図８６Ａは、製剤化された原薬のロット放出分析のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図８６Ｂは、製剤化された原薬のロット放出分析のＥＳＩ−ＭＳを示す。
【０１１２】
【図８７】図８７は、実施例４６に記載されている、製剤化された原薬のロット放出ＨＰＬＣ分析を示す図である。図８７Ａは、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示し、図８７Ｂは、ＨＩ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
本開示の実施形態の説明を受ける前に、そのような実施形態が、単に例として提供されること、および本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代替形態を本発明の実施の際に利用することができることを理解されたい。本発明から逸脱することなく、非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態をすぐに当業者は思いつくと予想される。
【０１１４】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本発明の実践または試験の際に使用することができるが、好適な方法および材料が下で説明される。矛盾がある場合、定義を含めて本特許明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法および例は、説明に役立つものに過ぎず、限定することを意図したものではない。本発明から逸脱することなく、非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態をすぐに当業者は思いつくと予想される。
定義
【０１１５】
本願に関して、以下の用語は、別段の特記がない限り、それらに帰する意味を有する。
【０１１６】
本明細書および特許請求の範囲を通して使用される場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、それらの後に上限が具体的に述べられている場合を除き、それらが「少なくとも１つ」、「少なくとも第１の」、「１つまたは複数」または「複数」の言及成分またはステップを意味するという意味で使用される。したがって、「切断配列」は、本明細書で使用される場合、「少なくとも第１の切断配列」を意味するが、複数の切断配列を含む。任意の単剤の量と同様に、組合せについての操作可能な限度およびパラメーターは、本開示に照らせば当業者には分かると予想される。
【０１１７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では同義で使用される。ポリマーは、線状であってもよく、または分岐していてもよく、ポリマーは、修飾されたアミノ酸を含むこともあり、ポリマーに非アミノ酸が割り込んでいることもある。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば標識成分とのコンジュゲーション、により修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。
【０１１８】
ポリペプチドの構造に関して本明細書で使用される場合、「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）および「Ｃ末端」（または「カルボキシル末端」）は、ポリペプチドの最も端にあるアミノおよびカルボキシル末端をそれぞれ指す。
【０１１９】
用語「単量体（の）」は、ポリペプチドに適用される場合、同じまたは異なる配列の１つまたは複数の追加のポリペプチドと実質的に会合していない単一の連続アミノ酸配列であるような、ポリペプチドの状態を指す。ポリペプチドの単量体状態は、サイズ排除クロマトグラフィーにより同じ分子量の単一タンパク質様実体として突き止めることができる。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、ＤまたはＬ光学異性体とアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物の両方を含むがこれらに限定されない、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。標準１または３文字コードを使用して、アミノ酸を表記することもある。
【０１２１】
用語「天然Ｌアミノ酸」または「Ｌアミノ酸」は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）のＬ光学異性体形を意味する。
【０１２２】
用語「天然に存在しない」は、配列に適用される場合、および本明細書で使用される場合、哺乳動物に見られる野生型もしくは天然に存在する配列に対応するものを有さない、そのような配列に相補的でない、またはそのような配列との高度の相同性を有さない、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、天然に存在しないポリペプチドまたは断片は、適切にアライメントされたときに天然配列と比較して最大９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％またはよりいっそう低いアミノ酸配列同一性を共有し得る。
【０１２３】
用語「親水性」および「疎水性」は、水に関して物質が有する親和性の程度を指す。親水性物質は、水に対して強い親和性を有し、水に溶解する傾向、水と混合する傾向、または水により湿潤される傾向があり、その一方で、疎水性物質は、水に対する親和性を実質的に欠き、水をはじく傾向および水を吸収しない傾向があるが、水に溶解する傾向も、水と混合する傾向も、水によって湿潤される傾向もない。アミノ酸をそれらの疎水性に基づいて特徴付けることができる。いくつかの尺度が開発されてきた。一例は、Ｈｏｐｐ，  ＴＰ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  （１９８１）  ７８：３８２４に収載されている、Ｌｅｖｉｔｔ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （１９７６）  １０４：５９により開発された尺度である。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルアミンである。親水性アミノ酸アスパルテート、グルタメート、およびセリン、およびグリシンは、特に興味深い。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。
【０１２４】
生物活性タンパク質に適用される（および抗体に適用されない）ときの「断片」は、治療活性および／または生物活性の少なくとも一部分を保持する切断型の生物活性タンパク質である。生物活性タンパク質に適用されるときの「バリアント」は、生物活性タンパク質の治療活性および／または生物活性の少なくとも一部分を保持する、天然生物活性タンパク質との配列相同性を有するタンパク質である。例えば、バリアントタンパク質は、参照生物活性タンパク質と比較して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を共有し得る。本明細書で使用される場合、用語「生物活性タンパク質バリアント」は、例えば、部位特異的突然変異誘発、コードする遺伝子の合成、挿入によるような、意図的に修飾された、または突然変異によって偶発的に修飾されたタンパク質であって、活性を保持する前記タンパク質を含む。
【０１２５】
用語「配列バリアント」は、１つまたは複数のアミノ酸挿入、欠失または置換によりそれらの天然なまたは元の配列と比較して修飾されているポリペプチドを意味する。挿入は、タンパク質のどちらかもしくは両方の末端に位置することもあり、および／またはアミノ酸配列の内部領域内の位置にあることもある。非限定的な例は、ＸＴＥＮ中のアミノ酸の異なるアミノ酸での置換である。欠失バリアントの場合、本明細書に記載のポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。したがって、欠失バリアントは、記載されるポリペプチド配列のすべての断片を含む。置換バリアントの場合、ポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置き換えられる。一態様では、置換は、本来は保存的であり、このタイプの保存的置換は、当技術分野において周知である。抗体または生物活性ポリペプチドに関して、配列バリアントは、未修飾ポリペプチドの結合親和性または生物活性の少なくとも一部分をそれぞれ保持することになる。
【０１２６】
用語「部分構造」は、より大きい組成物の成分を意味するか、または連続したもしくは不連続の配列としてより大きいポリペプチドに結合されるタンパク質様部分などの、より大きい組成物に組み込まれるように意図されているものを意味する。より大きい組成物の部分構造は、所望される機能性を付与することができる。例えば、抗体断片は、そのリガンドに結合する能力を保持することができるが、より小さい分子サイズを有することおよび単鎖形式であることができる。ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮが付随する結果として生じるより大きい組成物の分子量および／または半減期を増加させるという機能性を付与することができる。
【０１２７】
用語「放出セグメント」または「ＲＳ」は、１つまたは複数のプロテアーゼにより認識され切断され得る１つまたは複数の切断部位をその配列中に有するペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「哺乳動物プロテアーゼ」は、体液、細胞、組織中に通常存在するプロテアーゼであって、哺乳動物のある特定の標的組織または細胞に、例えば罹患組織（例えば腫瘍）に、より高レベルで見られ得るプロテアーゼを意味する。ＲＳ配列を、対象の標的組織内もしくは標的組織に近接して存在するまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで導入される様々な哺乳動物プロテアーゼまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断されるように、操作することができる。被定義切断部位を認識することが可能である他の同等のプロテアーゼ（内在性または外来性）を利用することができる。ＲＳ配列を、具体的には、利用されるプロテアーゼに適応または適合させることができ、ＲＳ配列に、組成物の隣接するポリペプチドに結合させるためのリンカーアミノ酸、例えば結合部分構造およびＸＴＥＮ、を組み入れることができると、考えられる。
【０１２８】
第２のポリペプチドに連結されることになる第１のポリペプチドに言及するときの用語「内に」は、第１または第２のポリペプチドのＮ末端を第２または第１のポリペプチドのＣ末端にそれぞれ接続する追加の成分の連結または融合、ならびに第２のポリペプチドの配列への第１のポリペプチドの挿入を包含する。例えば、ＲＳ成分が、組換えポリペプチド「内に」連結されるとき、ＲＳは、Ｎ末端に連結されることもあり、Ｃ末端に連結されることもあり、またはＸＴＥＮポリペプチドの任意の２つのアミノ酸の間に挿入されることもある。
【０１２９】
「活性」は、本明細書で提供される組成物の形態に適用される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより測定されるのか、臨床効果により測定されるのかを問わず、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、細胞もしくは生理応答、細胞溶解、細胞死、または組成物のエフェクター成分について当技術分野において一般に公知の効果を含むがこれらに限定されない、作用または効果を指す。
【０１３０】
「エフェクター細胞」は、本明細書で使用される場合、標的細胞に対して効果をもたらすことが可能なあらゆる真核細胞を含む。例えば、エフェクター細胞は、標的細胞の膜完全性の喪失、核濃縮、核崩壊、アポトーシス、溶解および／または死滅を誘導することができる。別の例では、エフェクター細胞は、標的細胞の分裂、成長、分化、または標的細胞のシグナル伝達の別様の変更を誘導することができる。エフェクター細胞の非限定的な例としては、形質細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞、Ｂ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、万能細胞、樹状細胞、調節性Ｔ細胞（ＲｅｇＴ細胞）、ヘルパーＴ細胞、骨髄性細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１３１】
「エフェクター細胞抗原」は、細胞表面分子、例えば、タンパク質、糖タンパク質またはリポタンパク質を限定ではないが含む、エフェクター細胞により発現される分子を指す。例示的なエフェクター細胞抗原としては、ＣＤ３複合体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ９５、ＣＤ１０７およびＣＤ１５４のタンパク質、ならびにエフェクター細胞に関連する、エフェクター細胞に結合する、エフェクター細胞内で発現される、もしくはエフェクター細胞により発現され、放出される、サイトカインなどの、エフェクター分子を挙げることができる。エフェクター細胞抗原は、対象組換えポリペプチドの結合部分構造の結合対応物としての機能を果たすことができる。対象組成物が結合し得るエフェクター細胞抗原の非限定的な例としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ９５、ＣＤ１０７およびＣＤ１５４などの細胞表面の抗原、ならびにＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファから選択されるＴｈ１サイトカインが挙げられる。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「ＥＬＩＳＡ」は、本明細書に記載のまたはそうでなければ当技術分野において公知の酵素結合免疫吸着検定法を指す。
【０１３３】
「宿主細胞」は、本明細書に記載されるものなどの、外来性核酸が導入された対象ベクターのレシピエントであり得るまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含む。子孫は、自然突然変異、偶発的突然変異または意図的突然変異のため、元の親細胞と（形態の点でまたは全ＤＮＡ補体のゲノミクスの点で）必ずしも完全に同一である必要はない。宿主細胞は、本開示のベクターがｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を含む。
【０１３４】
本明細書で開示される様々なポリペプチドに使用されるときの「単離された」は、その天然の環境の成分からまたはより複雑な混合物から（例えば、タンパク質精製中に）同定および分離および／または除去されたポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、ポリペプチドの診断的または治療的使用に概して干渉することになる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を含み得る。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、それをその天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。加えて、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、分子の濃度または単位体積当たりの数がその天然に存在する対応物のものより一般に高いことから、その天然に存在する対応物と区別可能である。一般に、組換え手段により作製され、宿主細胞に発現されたポリペプチドは、「単離された」ものであると見なされる。
【０１３５】
「単離された核酸」は、ポリペプチドコード核酸の天然源において元々会合している少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定され、分離されている核酸分子である。例えば、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、自然界に見られる形態または設定のもの以外のものである。したがって、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、天然細胞に存在するような特定のポリペプチドコード核酸分子と区別される。しかし、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、ポリペプチドを通常発現する細胞に含有されるポリペプチドコード核酸分子を、例えば、前記核酸分子が、天然細胞のものとは異なる染色体位置または染色体外位置にある場合には含む。
【０１３６】
「キメラ」タンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つの領域を配列内の天然に存在するものとは異なる位置に含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。前記領域は、通常は別々のタンパク質中に存在し得、一緒に融合ペプチドに持ち込まれるか、またはそれらは、通常は同じタンパク質中に存在し得るが、融合ポリペプチド内に新たな配置で配置される。キメラタンパク質は、例えば、化学合成により作出されることもあり、またはペプチド領域が所望の関係性でコードされているポリヌクレオチドの組換えによる作出もしくは翻訳により作出されることもある。
【０１３７】
「融合した／された／される」および「融合」は、本明細書では同義で使用され、２つまたはそれより多くのペプチドまたはポリペプチド配列の組換え手段による結合を指す。「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、本来は天然に連結されていない第２のアミノ酸配列に連結されている第１のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
「未切断（の）」および「未切断状態」は、本明細書では同義で使用され、プロテアーゼにより切断も消化もされていない、したがって、ポリペプチドが無傷のままである、ポリペプチドを指す。
【０１３９】
「ＸＴＥＮ化された」は、組換え手段によるか、化学的架橋手段によるかを問わず、ペプチドまたはポリペプチドへの１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチド（下で説明される）の連結または融合により修飾された、ペプチドまたはポリペプチドを表すために使用される。
【０１４０】
「作動可能に連結した／された／されている」は、連結されているＤＮＡ配列が、連続しており、読み取り相にあるかまたはインフレームであることを意味する。「インフレーム融合」は、２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合させて、元のＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する形で、より長い連続的ＯＲＦを形成することを指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがポリペプチド配列の転写に影響を与える場合には、ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されている。したがって、結果として生じる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされているポリペプチドに対応する２つまたはそれより多くのセグメント（これらのセグメントは、本来、通常はそのように結合されていない）を含有する単一のタンパク質である。
【０１４１】
「架橋させること／すること」および「コンジュゲートさせること／すること」は、本明細書では同義で使用され、２つの異なる分子の化学反応による共有結合での結合を指す。架橋させること／することは、当技術分野において公知であるように、１または複数の化学反応で行われ得る／起こり得る。
【０１４２】
ポリペプチドに関して、「線状配列」または「配列」は、ポリペプチドの一次構造において配列中の互いに隣接する残基が連続している、ポリペプチド中のアミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端（Ｎ末端からＣ末端）への方向での順序である。「部分配列」は、一方向または両方向に追加の残基を含むことが公知であるポリペプチドの一部についての線状配列である。
【０１４３】
「異種（の）」には、それが比較されることになる実体の他の部分とは遺伝子型的に明確に異なる実体に由来するという意味がある。例えば、その天然コード配列から除去され、その天然配列以外のコード配列に動作可能に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。用語「異種（の）」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較されることになる実体の他の部分とは遺伝子型的に明確に異なる実体に由来することを意味する。
【０１４４】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同義で使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドにせよ、リボヌクレオチドにせよ、それらの類似体にせよ、単数の核酸はもちろん複数の核酸も包含する、任意の長さのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、いかなる三次元構造を有するものであってもよく、公知のまたは未知の、いかなる機能を果たすものであってもよい。次のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：連鎖解析から単数の遺伝子座（複数の遺伝子座）が定義された遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーを組み立てる前にもたらされることもあり、または組み立てた後にもたらされることもある。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいることもある。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、さらに修飾されることもある。
【０１４５】
用語「ポリヌクレオチドの補体」は、参照配列と比較して相補的な塩基配列および逆の配向を有し、したがって、参照配列と完全な忠実度でハイブリダイズすることができる、ポリヌクレオチド分子を表す。
【０１４６】
「組換え（の）」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／またはライゲーションステップを含み得る組換えステップと、宿主細胞において組換えタンパク質の発現を生じさせる結果となる他の手順との、様々な組合せの産物であることを意味する。
【０１４７】
用語「遺伝子」および「遺伝子断片」は、本明細書では同義で使用される。これらの用語は、転写され、翻訳された後に特定のタンパク質をコードしていることが可能である少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、そのポリヌクレオチドが、全コード領域またはそのセグメントをカバーし得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有することを条件に、ゲノムのものまたはｃＤＮＡであり得る。「融合遺伝子」は、連結されている少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドで構成されている遺伝子である。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、通常はアミノ酸に翻訳されないとはいえ、コード領域の一部と見なされることがあるが、いずれの隣接配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部でない。コード領域の境界は、結果として得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする、５’末端の開始コドンと、結果として生じるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする、３’末端の翻訳停止コドンとによって、通常は決定される。本開示の２つまたはそれより多くのコード化領域は、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一のベクター上に、存在することができ、または別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別々の（異なる）ベクター上に、存在することができる。したがって、単一のベクターは、１つだけのコード領域を含有することができ、または２つもしくはそれより多くのコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターは、下で説明されるような結合部分構造−Ａおよび結合部分構造−Ｂを別々にコードすることができるということになる。加えて、本開示のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、異種コード領域を、本開示の結合部分構造をコードする核酸に融合されているにせよ、融合されていないにせよ、コードすることができる。異種コード領域には、限定ではないが、特殊化したエレメントまたはモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種機能的ドメインが含まれる。
【０１４９】
用語「下流」は、参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
【０１５０】
用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、転写のコード領域または開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、大半のプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。
【０１５１】
「相同性」または「相同の」または「同一性」は、同義で、２つもしくはそれより多くのポリヌクレオチド配列間のまたは２つもしくはそれより多くのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性もしくは相同性を判定するためにＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラムを使用するとき、デフォルト設定を使用することができ、またはｂｌｏｓｕｍ４５もしくはｂｌｏｓｕｍ８０などの適切なスコア行列を選択して、同一性、類似性もしくは相同性スコアを最適化することができる。好ましくは、相同であるポリヌクレオチドは、本明細書で定義されるようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであって、それらの配列が最適にアライメントされ、比較されたとき、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、よりいっそう好ましくは９９％の配列同一性を有するものである。相同であるポリペプチドは、匹敵する長さの配列にわたって最適にアライメントされたとき、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５〜９９％同一である配列同一性を好ましくは有する。
【０１５２】
「ライゲーション」は、ポリ核酸に適用される場合、２つの核酸断片または遺伝子間にホスホジエステル結合を形成してそれらを連結させるプロセスを指す。ＤＮＡ断片または遺伝子を一緒にライゲートするには、ＤＮＡの末端が互いに適合しなければならない。一部の場合には、末端は、エンドヌクレアーゼ消化後に直接適合することになる。しかし、エンドヌクレアーゼ消化後に一般に生成される付着末端をまず平滑末端に変換して、それらをライゲーションに適合するようにする必要があり得る。
【０１５３】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドがその標的配列と、他の配列より検出可能に高度に（例えば、バックグラウンドより少なくとも２倍多く）ハイブリダイズすることになる、条件への言及を含む。一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、一部は、洗浄ステップが行われる温度および塩濃度に関して述べられる。通常は、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３でＮａイオン約１．５Ｍ未満、通常はＮａイオン濃度（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、温度が、短いポリヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いポリヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である条件であり、例えば、「ストリンジェントな条件」は、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１５分間の、各々０．１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中、６０℃〜６５℃での、３回の洗浄を含み得る。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度を使用することができる。ＳＳＣ濃度は、ＳＤＳが約０．１％で存在する場合、約０．１〜２×ＳＳＣの幅があり得る。そのような洗浄温度は、通常は、被定義イオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解点より約５℃〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全一致プローブにハイブリダイズする、温度（被定義イオン強度およびｐＨ下での）である。Ｔｍを算出する方程式、および核酸ハイブリダイゼーションの条件は、周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１において見つけることができる。通常は、ブロッキング試薬が、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするために使用される。そのようなブロッキング試薬としては、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの剪断され、変性されたサケ精子ＤＮＡが挙げられる。約３５〜５０％  ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶媒も、特定の状況下で、例えばＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに、使用することができる。これらの洗浄条件の有用な変形形態は、当業者には容易に分かると予想される。
【０１５４】
用語「同一性パーセント」、「配列同一性パーセンテージ」および「同一性％」は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、標準アルゴリズムを使用してアライメントされた少なくとも２つポリヌクレオチド配列間の残基一致パーセンテージを指す。そのようなアルゴリズムは、比較されることになる配列に標準化された再現可能な方法でギャップを挿入して、２配列間のアライメントを最適化することができ、したがって、２配列のより有意義な比較を達成することができる。同一性パーセントは、被定義ポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定されることもあり、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きい被定義ポリペプチド配列から取った断片、例えば、連続する少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０または少なくとも４５０残基の断片の長さにわたって測定されることもある。このような長さは例示的なものに過ぎず、本明細書で表、図または配列表に示される配列によって裏付けられるいずれの断片長も、同一性パーセンテージが測定され得る長さを説明するために使用され得ることは、理解される。配列同一性パーセンテージは、２つの最適にアライメントされた配列を比較ウインドウにわたって比較すること、一致した位置（同一の残基が両方のポリペプチド配列に存在する位置）の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割ること、そしてその結果に１００を掛けて、配列同一性パーセンテージを得ることにより、算出される。異なる長さの配列が比較される場合、最短配列が、比較ウインドウの長さを規定する。保存的置換は、配列同一性を算出するときに考慮されない。
【０１５５】
本明細書で同定されるポリペプチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」および「同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントすること、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入すること、および保存的置換を配列同一性の一部と見なさないことによって、最適なアライメントを得た後、匹敵する長さの第２の参照ポリペプチド配列またはその一部分のアミノ酸残基と同一である問い合わせ配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野における技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較されることになる配列の完全長にわたって最適なアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。同一性パーセントは、被定義ポリペプチド配列全体の長さにわたって測定されることもあり、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きい被定義ポリペプチド配列から取った断片、例えば、連続する少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０または少なくとも１５０残基の断片の長さにわたって測定されることもある。そのような長さは例示的なものに過ぎず、本明細書で表、図または配列表に示される配列によって裏付けられるいずれの断片長も、同一性パーセンテージが測定され得る長さを説明するために使用され得ることは、理解される。
【０１５６】
ポリヌクレオチド配列に関して使用される「反復性」は、例えば、所与の長さの同一のヌクレオチド配列の出現頻度などの、配列中の内部相同性の程度を指す。反復性は、例えば、同一配列の出現頻度を解析することにより測定することができる。
【０１５７】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが、遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。この用語は、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を限定ではないが含む。発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのどちらかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングを伴う核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解切断を伴うポリペプチドを、さらに含む。
【０１５８】
「ベクター」または「発現ベクター」は、同義で使用され、挿入された核酸分子を宿主細胞内および／または間に移入する核酸分子、好ましくは、適切な宿主において自己複製する前記核酸分子を指す。この用語は、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために主として機能するベクターと、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主として機能するベクターの複製と、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターとを含む。上記機能の１つより多くを提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されたときにポリペプチドに転写および翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、所望の発現産物を生じさせるように機能することができる発現ベクターから構成される好適な宿主細胞を通常は含意する。
【０１５９】
「血清分解耐性」は、ポリペプチドに適用される場合、血清または血漿中のプロテアーゼが通常は関与する、血液またはその成分中での分解に耐える、ポリペプチドの能力を指す。血清分解耐性は、タンパク質とヒト（または、適宜、マウス、ラット、イヌ、サル）血清または血漿とを併せることにより、通常は様々な日数（例えば、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日）にわたって、通常は約３７℃で測定され得る。これらの時点の試料をウエスタンブロットアッセイにかけることができ、タンパク質は、抗体で検出される。抗体は、タンパク質中のタグに対するものであってもよい。タンパク質が、ウエスタンで単一のバンドを示す場合、タンパク質のサイズは、注入されたタンパク質のサイズと同一であり、その場合には、分解は起こっていない。この例示的な方法では、ウエスタンブロットまたは同等の手法により判断して、タンパク質の５０％が分解される時点が、タンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
【０１６０】
用語「ｔ１／２」、「半減期」、「終末相半減期」、「消失半減期」および「循環半減期」は、本明細書では同義で使用され、本明細書で使用される場合、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして算出される終末相半減期を意味する。Ｋｅｌは、対数濃度対時間曲線の終端線形部分の線形回帰により算出される終末相消失速度定数である。半減期は、生存生物体内に蓄積された投与物質の半量が正常な生物学的プロセスにより代謝または消失されるのに必要な時間を概して指す。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が、時間の関数として作成されたとき、その曲線は、通常は二相性であり、急速なα相とより長いベータ相を有する。ヒトにおけるヒト抗体の典型的なベータ相半減期は、２１日である。半減期は、任意の体液からの定時試料を使用して測定され得るが、最も典型的には血漿試料で測定される。
【０１６１】
用語「分子量」は、分子中の構成原子の原子量の総和を一般に指す。分子量は、理論的には、分子中の構成原子の原子質量を合計することにより決定することができる。ポリペプチドに関して適用されるとき、分子量は、アミノ酸組成に基づいて、その組成中の各タイプのアミノ酸の分子量の加算により算出されるか、またはＳＤＳ電気泳動ゲルでの分子量標準との比較からの推定により算出される。分子の算出分子量は、１つまたは複数の分析手法により決定される場合の分子の分子量を一般に指す、分子の見かけの分子量とは異なり得る。「見かけの分子量係数」および「見かけの分子量」は、関連語であり、ポリペプチドに関して使用されるとき、これらの用語は、特定のアミノ酸またはポリペプチド配列により示される見かけの分子量の相対的増減の尺度を指す。見かけの分子量は、例えば、「みかけのｋＤ」単位で測定されるような、球状タンパク質標準と比較することによる、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または同様の方法を使用して決定することができる。見かけの分子量係数は、見かけの分子量と「分子量」との比であり、後者は、上で説明したようなアミノ酸組成に基づく加算により、またはＳＤＳ電気泳動ゲルでの分子量標準との比較からの推定により、算出される。見かけの分子量および見かけの分子量係数の決定は、米国特許第８，６７３，８６０号に記載されている。
【０１６２】
用語「流体力学的半径」または「ストークス半径」は、溶液中の分子の有効半径（ｎｍでのＲｈ）であって、その分子が、溶液中を移動し、溶液の粘度による抵抗を受ける物体であると仮定することにより測定される、有効半径である。本開示の実施形態では、ＸＴＥＮポリペプチドの流体力学的半径測定値は、より直観的な尺度である「見かけの分子量係数」と相関する。タンパク質の「流体力学的半径」は、水溶液中のその拡散速度にはもちろん、巨大分子のゲル中でのその泳動能力にも影響を与える。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量により決定され、形状および稠密度を含む、その構造によっても決定される。流体力学的半径を決定する方法は、米国特許第６，４０６，６３２号および同第７，２９４，５１３号に記載されているようなサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用による方法など、当技術分野において周知である。大半のタンパク質は、流体力学的半径が最小である、タンパク質が有することができる最も稠密な三次元構造である、球状構造を有する。一部のタンパク質は、ランダムな開放型、非構造化または「線状」立体構造をとり、結果として、同様の分子量の典型的な球状タンパク質と比較してはるかに大きい流体力学的半径を有する。
【０１６３】
「拡散係数」は、表面を通る面外の単位濃度勾配当たりのモル流束の大きさを意味する。希薄種の輸送の場合、拡散に起因する流束は、溶媒と溶質の相互作用についての単一の特性である分散係数のみに依存するフィックの第１法則により得られる。
【０１６４】
「生理条件」は、生存宿主における一連の条件はもちろん、生存対象のそれらの条件を模倣する、温度、塩濃度、ｐＨを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件も指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでの使用のための生理的に適切な条件の宿主は、確立されている。一般に、生理的緩衝液は、生理濃度の塩を含有し、約６．５〜約７．８、好ましくは約７．０〜約７．５の範囲の中性ｐＨに調整される。様々な生理的緩衝液が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に収載されている。生理的に適切な温度は、約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３５℃〜約３７℃の範囲である。
【０１６５】
用語「結合部分構造」は、本明細書では最も広い意味で使用され、具体的には、抗原またはリガンド、例えば、細胞表面受容体、標的細胞マーカー、または抗原もしくは糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、または組織もしくは細胞内もしくはその表面に存在し得る結合部位、に対する特異的親和性を有する、サイトカイン、細胞受容体、抗体もしくは抗体断片のカテゴリーを含むように意図されている。
【０１６６】
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の抗原結合活性を示すことを条件に抗体断片を含む、様々な抗体構造を包含する。完全長抗体は、例えば、モノクローナル、組換え、キメラ、脱免疫化、ヒト化およびヒト抗体であり得る。
【０１６７】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、想定されるバリアント抗体を除けば、同一であり、および／または同一のエピトープに結合し、前記バリアント抗体は、例えば、自然に存在する突然変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じるものであり、そのようなバリアントは、一般に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を概して含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示すものであり、この修飾語句を、いずれかの特定の方法による抗体の産生を求めるものと解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体を、様々な手法により作製することができ、そのような手法としては、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を有するトランスジェニック動物を利用する方法が挙げられるが、これらに限定されず、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的方法は、当技術分野において公知であり、または本明細書に記載される。
【０１６８】
「抗体断片」は、無傷抗体以外の分子であって、無傷抗体の一部分を含み、無傷抗体が結合する抗原に結合する、分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ディアボディ、単鎖ディアボディ、線状抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ科動物抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体分子、および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
「ｓｃＦｖ」または「単鎖断片可変」は、短い可動性のペプチドリンカーにより結合されている、可変重（「ＶＨ」）鎖と可変軽（「ＶＬ」）鎖の領域またはＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖の２つのコピーの領域を含む、抗体断片形式を指すために、本明細書では同義で使用される。ｓｃＦｖは、実際には抗体の断片ではないが、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質であり、Ｎ末端からＣ末端へＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬのどちらかの配向でＥ．ｃｏｌｉにおいて機能的な形態で容易に発現され得る。
【０１７０】
用語「抗原」、「標的細胞マーカー」および「リガンド」は、結合部分構造、抗体、抗体断片または抗体断片に基づく分子が結合するまたは結合特異性を有する、構造または結合決定基を指すために、本明細書では同義で使用される。
【０１７１】
用語「エピトープ」は、抗体、抗体断片または結合部分構造が結合する、抗原分子上の特定の部位を指す。エピトープは、抗体、抗体断片または結合部分構造のリガンドである。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３」または「表面抗原分類３」は、公知のすべてのＣＤ３サブユニット、例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３アルファおよびＣＤ３ベータを、個々の形態でまたは独立して組み合わせられた形態で含む、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３複合体を意味する。ＣＤ３イプシロン、ガンマおよびデルタの細胞外ドメインは、免疫グロブリン様ドメインを含有し、したがって、そのため、免疫グロブリンスーパーファミリーの一部と見なされる。
【０１７３】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」または「結合特異性」は、結合部分構造のその対応する標的に対する高度の結合親和性を指すために本明細書では同義で使用される。概して、特異的結合は、本明細書で開示されるアッセイの１つまたは複数により測定して、約１０−６Ｍ未満、例えば、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍの解離定数またはＫｄを有することになる。
【０１７４】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合性相互作用の総計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１相互作用を表す固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性を一般に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。本明細書で使用される場合、「より大きい結合親和性」または「結合親和性増大」は、より低いＫｄ値を意味し、例えば、１×１０−９Ｍは、１×１０−８Ｍより大きい結合親和性であり、その一方で、「より小さい結合親和性」は、より高いＫｄ値を意味し、例えば、１×１０−７Ｍは、１×１０−８Ｍより小さい結合親和性である。
【０１７５】
「阻害定数」または「Ｋｉ」は、同義で使用され、酵素−阻害剤複合体の解離定数、または阻害剤の酵素に対する結合親和性の逆数を意味する。
【０１７６】
「解離定数」または「Ｋｄ」は、同義で使用され、リガンド「Ｌ」とタンパク質「Ｐ」との親和性、すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどの程度強く結合するのかを意味する。これは、式Ｋｄ＝［Ｌ］［Ｐ］／［ＬＰ］を使用して算出することができ、この式中、［Ｐ］、［Ｌ］および［ＬＰ］は、タンパク質、リガンドおよび複合体のモル濃度をそれぞれ表す。用語「ｋｏｎ」は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知であるような抗体／抗原複合体を形成するための抗体の抗原に対する会合についての会合速度定数を指すように意図されている。用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知であるような抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数を指すように意図されている。フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴などの手法を使用して、結合事象を検出することができる。アッセイは、可溶性抗原もしくは受容体分子を含むこともあり、または細胞により発現される受容体への結合を判定することもある。そのようなアッセイは、増殖、細胞死、アポトーシスおよび細胞遊走についてのアッセイを含む、細胞に基づくアッセイを含み得る。対象組成物の標的リガンドに対する結合親和性は、結合アッセイもしくは競合結合アッセイ、例えば、米国特許第５，５３４，６１７号に記載されているような、チップに結合された受容体もしくは結合タンパク質を用いるＢｉａｃｏｒｅアッセイ、またはＥＬＩＳＡアッセイ；本明細書の実施例で説明されるアッセイ；放射性受容体アッセイ；または当技術分野において公知の他のアッセイを使用して、アッセイすることができる。次いで、標準的な方法、例えば、ｖａｎ  Ｚｏｅｌｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９８）  １９）１２）：４８７により記載されているようなスキャッチャード分析、または当技術分野において公知の他の方法を使用して、結合親和定数を決定することができる。
【０１７７】
用語「アンタゴニスト」は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示される天然ポリペプチドの生物活性を部分的にまたは完全に遮断、阻害または中和する任意の分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、天然ポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させるステップ、および前記天然ポリペプチドに通常は関連付けられる１つまたは複数の検出可能な生物活性の変化を測定するステップを含み得る。本開示に関して、アンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、または生物活性タンパク質の効果を低下させる任意の他の分子を含み得る。
【０１７８】
「標的細胞マーカー」は、細胞表面受容体、サイトカイン受容体、抗原、腫瘍関連抗原、糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質を含むがこれらに限定されない、標的細胞により発現される分子；抗原決定基；または標的組織もしくは細胞内もしくはその表面に存在し得る結合部位を指し、これらは、結合部分構造のリガンドとしての機能を果たすことができる。標的細胞マーカーの非限定的な例としては、表５の標的マーカーが挙げられる。
【０１７９】
「標的組織」は、がんまたは炎症状態などの、しかしこれらに限定されない、病状の原因であるまたは一部である、組織を指す。罹患標的組織の供給源は、体内臓器、腫瘍、がん性細胞もしくはがん性細胞の集団、またはマトリックスを形成するもしくはがん性細胞の集団に関連して見いだされる細胞、骨、皮膚、病状の一因となるサイトカインもしくは因子を産生する細胞を含む。
【０１８０】
「限定培地」は、培養での細胞の生存および／または成長に必要な栄養およびホルモン要求量を含む、したがって、培地の成分が分かっている、培地を指す。旧来、限定培地は、成長および／または生存に必要な栄養および増殖因子を添加することにより処方されている。概して、限定培地は、次のカテゴリーの１つまたは複数からの少なくとも１つの成分を提供する：ａ）すべての必須アミノ酸、通常は、２０種のアミノ酸にシステインを加えた基本セット；ｂ）エネルギー源、通常は、グルコースなどの炭水化物の形態のもの；ｃ）低濃度で要求される、ビタミンおよび／または他の有機化合物；ｄ）遊離脂肪酸；ならびにｅ）微量元素（ここでの微量元素は、通常はマイクロモル範囲の極低濃度で概して要求される、無機化合物または天然に存在する元素と定義される）。限定培地には、次のカテゴリーのいずれかからの１つまたは複数の成分が必要に応じて補充されることもある：ａ）１つまたは複数の分裂促進剤；ｂ）塩および緩衝剤、例えば、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩のようなもの；ｃ）ヌクレオシドおよび塩基、例えば、アデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチンなど：ならびにｄ）タンパク質および組織加水分解物。
【０１８１】
用語「アゴニスト」は、その最も広い意味で使用され、本明細書で開示される天然ポリペプチドの生物活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子としては、具体的には、アゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、小有機分子などが挙げられる。天然ポリペプチドのアゴニストを同定するための方法は、天然ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させるステップ、および前記天然ポリペプチドに通常は関連付けられる１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定するステップを含み得る。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」または「緩和すること」または「寛解させること」は、本明細書では同義で使用される。これらの用語は、治療利益および／または予防利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望される結果を得るためのアプローチを指す。治療利益とは、処置されることになる基礎障害の根絶または寛解を意味する。また、治療利益は、生理的症状の１つもしくは複数についての根絶もしくは寛解により実現されるか、または対象が依然として基礎障害に罹患している可能性があるにもかかわらず対象において改善が観察されるような、基礎障害に関連する１つもしくは複数の臨床パラメーターの改善により実現される。予防利益のために、組成物が、特定の疾患を発症するリスクのある対象に投与されることもあり、または疾患の生理的症状の１つもしくは複数を報告する対象に、たとえこの疾患の診断が下されていなくても、投与されることもある。
【０１８３】
「治療効果」または「治療利益」は、本明細書で使用される場合、生物活性タンパク質が有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導することができること以外の、本開示のポリペプチドの投与の結果として生じる、ヒトまたは他の動物における疾患の軽減、寛解もしくは予防または基礎障害に関連する１つもしくは複数の臨床パラメーターの改善あるいはヒトもしくは動物の肉体的もしくは精神的健康を別様に増強することを含むがこれらに限定されない、生理的効果を指す。予防利益のために、組成物が、特定の疾患、過去の疾患の再発、疾患の状態もしくは症状を発症するリスクがある対象に投与されることもあり、または疾患の生理的症状のうちの１つもしくは複数を報告する対象に、たとえこの疾患の診断が下されていなくても、投与されることもある。
【０１８４】
用語「治療有効量」および「治療有効用量」は、本明細書で使用される場合、単独でのまたはポリペプチド組成物の一部としてのどちらかでの薬物または生物活性タンパク質の量であって、１用量または反復用量で対象に投与されたとき、病態または病状の任意の症状、態様、測定パラメーターまたは特徴に対して任意の検出可能な有益な効果を及ぼすことが可能である量を指す。そのような効果は、必ずしも有益である必要はない。治療有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１８５】
用語「等モル用量」は、対象に投与される物質の量が、その用量に使用された物質の分子量に基づき、等モル量を有することを意味する。
【０１８６】
用語「治療上有効で非毒性の用量」は、本明細書で使用される場合、対象において深刻な毒性効果を伴うことなくまたは本質的に伴うことなく、腫瘍もしくはがん細胞の枯渇、腫瘍除去、腫瘍縮小または疾患の安定化を生じさせるのに十分高い、本明細書で定義されるとおりの組成物の耐容可能な用量を指す。そのような治療上有効で非毒性の用量を、当技術分野において説明されている用量漸増研究により決定することができ、そのような用量は、重篤な有害な副作用を誘発する用量未満であるはずである。
【０１８７】
用語「用量レジメン」は、本明細書で使用される場合、組成物の連続投与される複数（すなわち、少なくとも２またはそれよりも多い）用量についてのスケジュールであって、前記用量が、病態または病状の任意の症状、態様、測定パラメーター、エンドポイントまたは特徴に対して持続的な有益な効果をもたらすように治療有効量で与えられる、スケジュールを指す。
【０１８８】
用語「がん」および「がん性（の）」は、非調節細胞成長／増殖を典型的に特徴とする哺乳動物の生理的状態を指す、または記述する。がんの例としては、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害または骨髄異形成障害を含む、原発性血液悪性腫瘍、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
「腫瘍特異的マーカー」は、本明細書で使用される場合、がん細胞上または内に見られる抗原を指す。
【０１９０】
「標的細胞」は、対象組成物の結合部分構造、抗体または抗体断片のリガンドを有する細胞であって、がん細胞、腫瘍細胞および炎症細胞を含む、疾患もしくは病的状態に関連するまたはそのような疾患もしくは病的状態を引き起こす細胞を指す。標的細胞のリガンドは、「標的細胞マーカー」または「標的細胞抗原」と本明細書では称され、細胞表面の受容体または抗原、サイトカイン、サイトカイン受容体、ＭＨＣタンパク質、および外因的に提示されるサイトゾルタンパク質またはペプチドを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、エフェクター細胞を含まないと予想される。
Ｉ．一般技術
【０１９１】
本開示の実践は、別段の指示がない限り、当技術分野における技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の手法を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１；  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，１９８７；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．；  ”ＰＣＲ  ２：    ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，  Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９５；    ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８；  ”Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ”  １１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ２００５；およびＦｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，  ”Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，  ＮＪ，  ２０００を参照されたく、これらの参考文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
宿主細胞を様々な培地で培養することができる。市販の培地、例えば、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）は、真核細胞の培養に好適である。加えて、血清を欠くが、ホルモン、増殖因子、または特定の細胞型の生存および／もしくは成長に必要な任意の他の因子が補充されている、限定培地で、動物細胞を成長させることができる。細胞生存を支持する限定培地は、生存率、形態、代謝能、およびおそらく細胞の分化能を維持するのに対して、細胞成長を促進する限定培地は、細胞増殖または繁殖に必要なすべての化学物質を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞の生存および成長を支配する一般的なパラメーターは、当技術分野において十分に確立されている。種々の細胞培養系において制御され得る物理化学的パラメーターは、例えば、ｐＨ、ｐＯ２、温度、およびモル浸透圧濃度である。細胞の栄養要求量は、通常は、最適な環境を提供するために開発された標準培地処方物に備えられている。栄養素は、アミノ酸およびその誘導体、炭水化物、糖、脂肪酸、複合脂質、核酸誘導体、ならびにビタミンといった、いくつかのカテゴリーに分類することができる。細胞の代謝を維持するための栄養素は別として、大半の細胞は、無血清培地中で増殖するために、次の群のうちの少なくとも１つからの１つまたは複数のホルモンも必要とする：ステロイド、プロスタグランジン、増殖因子、下垂体ホルモン、およびペプチドホルモン（Ｓａｔｏ，  Ｇ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  ”Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉａ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８２）。ホルモンに加えて、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生存および成長のために輸送タンパク質、例えば、トランスフェリン（血漿鉄輸送タンパク質）、セルロプラスミン（銅輸送タンパク質）、および高密度リポタンパク質（脂質担体）を必要とし得る。最適なホルモンまたは輸送タンパク質のセットは、各細胞型によって異なると予想される。これらのホルモンまたは輸送タンパク質の大半が外部から添加されており、またはまれに、特定の因子を必要としない変異細胞系が見つかっている。過度の実験を行わなくても、細胞培養を維持するために必要な他の要因が、当業者には分かると予想される。
【０１９３】
原核宿主細胞を成長させるための成長培地は、栄養ブロス（液体栄養培地）またはＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）を含む。好適な培地は、限定培地および非限定培地を含む。一般に、培地は、細菌の成長に必要なグルコースなどの炭素源、水、および塩を含有する。培地は、アミノ酸および窒素の供給源、例えば、牛肉抽出物もしくは酵母抽出物（非限定培地の場合）、または既知量のアミノ酸（限定培地の場合）も含む。一実施形態では、成長培地は、ＬＢブロス、例えば、ＬＢ  ＭｉｌｌｅｒブロスまたはＬＢ  Ｌｅｎｎｏｘブロスである。ＬＢブロスは、ペプトン（カゼインの酵素的消化産物）、酵母抽出物、および塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、抗生物質を含む選択培地が使用される。この培地では、抗生物質に対する耐性を有する所望の細胞のみが成長することになる。
ＩＩ．組換えポリペプチドおよび活性化可能な抗体組成物
【０１９４】
本開示は、各々が本明細書でより詳しく説明される、結合部分構造、放出セグメント（ＲＳ）および嵩高な部分構造という成分の３つのカテゴリーを少なくとも含む、組換えポリペプチドを提供する。本開示は、従来の抗体に基づく治療およびサイトカインに基づく治療と比較して薬学的におよび治療的に有利な特性を組成物に付与するように特に設計されている、組換えポリペプチドの構成も提供する。
【０１９５】
第１の態様では、本開示は、標的リガンドに結合するように設計された第１の結合部分構造（ＦＢＭ）と、哺乳動物プロテアーゼの基質である放出セグメントと、ＸＴＥＮなどの嵩高な部分構造とを含む組換えポリペプチド組成物であって、前記ＦＢＭが、抗体、サイトカイン、細胞受容体、またはその断片である、組換えポリペプチド組成物を提供する。単一の結合部分構造を含む組換えポリペプチドを、組成物にプロドラッグ特性を付与して、循環血中にあるときまたは健康な組織に曝露されたときには前記組成物の反応性を低くさせるが、前記組換えポリペプチドに組み込まれたＲＳを切断することが可能であるプロテアーゼを産生するかまたはそのようなプロテアーゼと共局在化された罹患組織または細胞に近接すると、ＦＢＭおよびＸＴＥＮが放出され、その結果、ＸＴＥＮはもはやＦＢＭを遮蔽しないので、ＦＢＭがそのリガンドに対するその完全な結合親和性能力を取り戻すように、設計することができる。一部の実施形態では、対象組成物への組み込みに好適なＦＢＭは、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン（例えば、これらに限定されないが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、顆粒球コロニー刺激因子、Ｃ−Ｃケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、単球走化性タンパク質またはＭＣＰ−１、単球炎症性タンパク質またはＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（成長関連癌遺伝子またはＧＲＯ／ＫＣとも呼ばれる、ＩＬ−８）、Ｃケモカイン（リンホタクチン）、およびＣＸＸＸＣケモカイン（フラクタルカイン）を含む。他の実施形態では、対象組成物への組み込みに好適なＦＢＭは、表５の標的細胞マーカーを含むがこれらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する結合親和性を有する抗体断片を含む。上述の実施形態では、組換えポリペプチドは、表１もしくは２のＲＳ１および表８もしくは１０のＸＴＥＮ、またはそれらの配列バリアント（下で、より詳しく説明されるような）をさらに含む。
【０１９６】
第２の態様では、本開示は、２つの抗体断片と、１つまたは複数の放出セグメントと、１つまたは複数のＸＴＥＮとを含む、組換えポリペプチド組成物であって、前記ＸＴＥＮが、放出セグメントの切断により活性化可能であり、その結果、前記抗体断片が、前記組成物から放出され、それらのそれぞれのリガンドに対するそれらの完全な結合親和性能力を取り戻す、組換えポリペプチド組成物を提供する。２つの抗体断片を有するそのような組換えポリペプチドは、本明細書では、活性化可能な抗体組成物（ＡＡＣ）とも称される。一実施形態では、第２の結合部分構造（ＳＢＭ）に融合した第１の結合部分構造（ＦＢＭ）を有するＡＡＣであって、前記ＦＢＭとＳＢＭが両方とも抗体断片である、ＡＡＣは、少なくとも第１の放出セグメントおよび少なくとも第１のＸＴＥＮをさらに含む。
【０１９７】
本明細書に記載されるＡＡＣ構築物は、旧来のモノクローナル抗体および他のより小さい二重特異性分子に勝る複数の治療上の利点をもたらす。特に注目すべきは、本開示のＡＡＣの条件次第の活性化である。無傷の未切断ＡＡＣは、放出セグメントにより前記ＡＡＣに繋留されている嵩高い非構造化ＸＴＥＮの遮蔽効果のため、それらの所期の対象細胞マーカーに結合する能力が低下している。したがって、罹患していない正常組織に対する本開示の例示的組成物の特異的活性は、類似の抗体および抗体断片のものと比較すると有意に低下される。ＡＡＣポリペプチドが、それらの所望の作用部位（例えば、腫瘍細胞またはがん細胞などの罹患組織の近位）で活性化することができること、その一方で、この部位への進行中には本質的に不活性のままであることは、治療指数が改善された強力かつ特異的な治療薬、および本明細書で開示されるものなどの複数の標的細胞に適用することができる容易に設計可能かつ製造可能な形式が見込まれる、がん免疫療法の分野における進歩である。
【０１９８】
ＦＢＭおよびＳＢＭ抗体断片を有する本明細書に記載されるＡＡＣは、細胞傷害性エフェクター細胞、例えばＴ細胞、を動員することにより、標的細胞マーカーを発現する細胞の特異的標的化および死滅を可能にするように、設計される。無傷の未切断ＡＡＣは、ＲＳ内に位置するプロテアーゼ切断部位のいずれかに対するプロテアーゼ切断により組成物から放出されるまで、ＸＴＥＮが、結合部分構造を遮蔽して、それらのリガンドに対するそれらの結合親和性を低下させることから、プロドラッグ形態である。これは、プロドラッグ形式でない二重特異性Ｔ細胞誘導抗体治療薬と比較して、罹患組織または細胞に対する組成物の特異性を改善する。対照的に、標的細胞マーカーとＲＳを切断することが可能なプロテアーゼとが高度に発現される標的細胞または罹患組織の微小環境でＡＡＣを特異的に活性化することにより、ＡＡＣ構築物の二重特異性結合部分構造およびＸＴＥＮは、ＲＳの切断のときに放出され、融合したＦＢＭ抗体断片とＳＢＭ抗体断片は、細胞傷害性エフェクター細胞と標的細胞マーカーを発現する細胞とを高度に特異的な方式で架橋させることによって、Ｔ細胞の細胞傷害能を標的細胞に方向付けることができる。
【０１９９】
ＡＡＣの例示的特徴として、放出されると、未切断ＡＡＣと比較してはるかに小さいサイズを有する融合したＦＢＭ−ＳＢＭ抗体断片が、遊離して標的部位、例えば腫瘍塊、を透過して、標的細胞および細胞傷害性Ｔ細胞に到達し、それらに結合し、それらを連結させる。加えて、この全プロセスが、組成物の内在化に依存しない。一実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＣ構築物は、表面に発現されたＣＤ３に結合することによって細胞傷害性Ｔ細胞と会合し、前記ＣＤ３がＴ細胞受容体複合体の一部になり、その結果、特定の標的細胞マーカーを発現する細胞のその後の溶解を媒介するＴ細胞活性化を引き起こす。それ故、ＡＡＣは、強い、特異的かつ効率的な標的細胞死滅を提示すると考えられる。
【０２００】
理論により拘束されるものではないが、本明細書に記載されるＡＡＣは、プロテアーゼを多く含む微小環境（例えば、腫瘍）において、細胞傷害性エフェクター細胞による標的細胞死滅を刺激して、ＡＡＣの標的特異的標的化部分構造が結合した特定の標的細胞マーカーを発現する細胞を除去すると考えられる。そのような場合、細胞は選択的に除去され、それによって、毒性副作用の可能性が低下する。罹患細胞または罹患組織に関連することが公知のプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
本開示のＡＡＣは、認知されているモノクローナル抗体および他のより小さい二重特異性分子に勝るさらなる治療上の利点およびの薬学的利点をもたらすことができる。従来の二重特異性分子は、病原性細胞に関連する細胞特異的マーカーを有する標的細胞に結合するように設計される。一部の場合には、健康な細胞または組織が標的細胞と同じマーカーを発現するときに、毒性および望ましくない副作用が起こり得る。本開示のＡＡＣにとっての１つのメリットは、ＣＤ３および標的細胞への結合が、腫瘍細胞などの標的細胞を保有する疾患組織により発現されるまたはそのような疾患組織に関連するプロテアーゼによる結合部分構造の放出のときに増強され、これにより、放出された、融合したＦＢＭ抗体断片とＳＢＭ抗体断片の標的細胞マーカーおよびエフェクター細胞への結合が可能になり、その結果、免疫学的シナプスが作出されることである。図１１および１２を参照して、例示的実施形態では、ＡＡＣの２つの抗体断片結合部分構造は、短いリンカーによって互いに融合され、そしてまた、ＸＴＥＮに、罹患組織と共局在化された１つまたは複数のプロテアーゼによる切断のときにＸＴＥＮからの融合したＦＢＭ抗体断片とＳＢＭ抗体断片の放出を可能にするために１つまたは複数の切断部位を有する放出セグメントによって、接続される。ＡＡＣの結合部分構造は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、線状抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体および単鎖可変断片抗体分子（ｓｃＦｖ）を含む、単鎖結合部分構造の任意の形式であり得る。２つの融合した抗体断片ＦＢＭとＳＢＭを、ＶＬとＶＨとそれらを結合するリンカーとの選択的構成により、単鎖ディアボディ形式で構成することもできる。
【０２０２】
腫瘍などの罹患組織を結合することが可能なポリペプチド組成物は、治療薬の組織侵入および分布の増進に最適なサイズを有する。しかし、これは、初回通過腎クリアランスを低減させたいおよび正常組織における血行路からの血管外漏出を低減させたいという要望により相殺される。腎臓は、一般に約５０ｋＤａ未満の分子を濾過して取り除くため、タンパク質治療薬の設計でクリアランスを低減させる取り組みは、アルブミンのようなタンパク質との融合またはポリエチレングリコールポリマーの付加による分子サイズの増大に重点が置かれている。しかし、タンパク質治療薬のサイズを増大させることは、腎クリアランスおよび血管外漏出を防止することができる一方で、より大きいサイズは、標的組織への分子の侵入を妨げもする。本明細書に記載される例示的ＡＡＣは、これを、放出セグメントを有する結合部分構造とＸＴＥＮなどの嵩高な部分構造との融合により回避し、この融合は、組成物の見かけの分子量（下で、より詳しく説明される）を大きく増加させるので正常な血管系における急速な腎クリアランスおよび血管外漏出を防止することになり、その一方で、標的組織に関連するプロテアーゼのＲＳに対する作用によりＸＴＥＮを放出させることができ、その結果、小さいサイズを有する結合部分構造が放出されることになり、したがって、組織侵入および分布の増進ならびに最適な有効性を可能にする。このように、ＸＴＥＮは、半減期の延長、正常血管系における血管外漏出の低減、溶解度上昇、健康な組織への結合の低減、治療指数の上昇、およびプロドラック形式を含むがこれらに限定されない、いくつかの有利な特性を、ＡＡＣ実施形態に付与する。
【０２０３】
例示的な実施形態では、本開示は、対象細胞のリガンドに方向付けられた単鎖結合部分構造ポリペプチドと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞リガンドに方向付けられた別の単鎖結合部分構造ポリペプチドとを有するＡＡＣであって、前記ポリペプチドを有することによって、ＡＡＣのこの成分の構成が、ブリナツモマブ（ＢｉＴＥ（登録商標）組成物とも称される）などの二機能性結合組成物に類似したものになる、ＡＡＣを提供する。代表的な標的細胞マーカーは、がん細胞の表面に見られる抗原、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、または表５の標的マーカーのいずれかである。実施形態では、ＡＡＣポリペプチドは、ＦＢＭおよびＳＢＭを含み、これらは、表７のものなどの可動性リンカーによって連結されたｓｃＦｖであることもあり、または単鎖ディアボディとして構成されることもある。ＦＢＭおよびＳＢＭの各々は、それらのそれぞれのリガンドに対して、典型的な単鎖結合部分構造に匹敵する結合親和性を有するが、無傷の未切断ＡＡＣ組成物のＸＴＥＮは、前記組成物の結合部分構造を包囲する可動性、非構造化ＸＴＥＮの能力に起因する立体障害によって、無傷組成物の両方のｓｃＦｖのそれらのそれぞれのリガンドに結合する能力を大きく低下させるように機能する。プロテアーゼ切断部位のいずれかでのＲＳのプロテアーゼ切断のときに、融合した結合部分構造がＸＴＥＮから分離し、その結果、融合した抗標的結合部分構造と抗ＣＤ３結合部分構造が、それらのそれぞれのリガンドに協調的に結合し、標的細胞とエフェクターＴ細胞の間に免疫学的シナプスを形成することが可能になる。組換えポリペプチドが、サイトカインまたは抗サイトカインなどの単一の抗標的結合部分構造を含有する、実施形態では、放出された結合部分構造は、同様に、ＲＳに対するプロテアーゼの作用による無傷組成物からの放出のときにそのリガンドに結合する能力の増強を有することになる。
ＩＩＩ．放出セグメント
【０２０４】
別の態様では、本開示は、疾患組織もしくは疾患組織に近接して見られる細胞に関連するまたはそのような疾患組織もしくは細胞により産生される１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である、放出セグメント（ＲＳ）ペプチドを提供する。そのようなプロテアーゼは、表３のプロテアーゼを含むがそれらに限定されない、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびセリンプロテアーゼなどのプロテアーゼのクラスを、これらに限定されないが、含むことができる。ＲＳは、哺乳動物プロテアーゼによるＲＳの切断により活性化され得るプロドラッグ形式をもたらす、対象組換えポリペプチドへの組み込みに、数ある中でも特に、有用である。本明細書に記載されるように、ＲＳは、対象組換えポリペプチド組成物に組み込まれ、組み込まれた結合部分構造をＸＴＥＮに連結させ（この構成は、下で、より詳細に説明される）、したがって、ＲＳが基質である１つまたは複数のプロテアーゼの作用によるＲＳの切断のときに、結合部分構造およびＸＴＥＮは組成物から放出され、もはやＸＴＥＮにより遮蔽されない結合部分構造は、それらのリガンドに対する完全な結合能を取り戻す。第１および第２の抗体断片を含むそれらの組換えポリペプチド組成物の場合、組成物は、本明細書では、活性化可能な抗体組成物（ＡＡＣ）とも称される。
【０２０５】
一実施形態では、本開示は、最適にアライメントされたとき、表１に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有する第１の放出セグメント（ＲＳ１）配列を含む、活性化可能な組換えポリペプチドであって、前記ＲＳ１が、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である、活性化可能な組換えポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、最適にアライメントされたとき、表１に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を各々が有する、ＲＳ１および第２の放出セグメント（ＲＳ２）配列を含む、活性化可能な組換えポリペプチドであって、前記ＲＳ１および前記ＲＳ２が、各々、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である、活性化可能な組換えポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、最適にアライメントされたとき、表２に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９７％、または１００％の同一性を有する第１のＲＳ（ＲＳ１）配列を含む、活性化可能な組換えポリペプチドであって、前記ＲＳが、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である、活性化可能な組換えポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、最適にアライメントされたとき、表２に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を各々が有する、ＲＳ１および第２の放出セグメント（ＲＳ２）配列を含む、活性化可能な組換えポリペプチドであって、前記ＲＳ１および前記ＲＳ２が、各々、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼの基質である、活性化可能な組換えポリペプチドを提供する。ＲＳ１とＲＳ２とを含む活性化可能な組換えポリペプチドの実施形態では、２つの放出セグメントが同一であることもあり、またはそれらの配列が異なることもある。
【０２０６】
本開示は、表３のプロテアーゼを含む、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから選択される、１つ、２つまたは３つの異なるクラスのプロテアーゼの基質である、放出セグメントを企図している。特定の特徴として、ＲＳは、これらに限定されないが、腫瘍、がん細胞および炎症組織などの、疾患組織もしくは細胞に密接に関連して見いだされるまたはそのような疾患組織もしくは細胞と共局在化されたプロテアーゼの基質として機能し、ＲＳの切断のときに、そうでなければ対象組換えポリペプチド組成物のＸＴＥＮにより遮蔽される（したがって、それらのそれぞれのリガンドに対するより低い結合親和性を有する）結合部分構造が、組成物から放出され、標的および／またはエフェクター細胞リガンドに対するそれらの完全な結合能を取り戻す。別の実施形態では、対象組換えポリペプチド組成物のＲＳは、表３のプロテアーゼを含むがそれらに限定されない、標的細胞内に位置する細胞プロテアーゼの基質である、アミノ酸配列を含む。対象組換えポリペプチド組成物の別の特定の特徴として、２クラスまたは３クラスのプロテアーゼの基質であるＲＳは、代表例が図３６に示されている異なるプロテアーゼによりＲＳ配列の異なる位置で切断され得る配列を想定して設計された。したがって、２クラス、３クラス、またはそれより多くのクラスのプロテアーゼの基質であるＲＳは、ＲＳ配列に２カ所、３カ所または複数カ所の明確に異なる切断部位を有するが、とは言え、単一のプロテアーゼによる切断の結果として、ＲＳを含む組換えポリペプチド組成物から結合部分構造およびＸＴＥＮの放出が生じることになる。
【０２０７】
一実施形態では、対象組換えポリペプチド組成物への組み込みのための本開示のＲＳは、メプリン、ネプリライシン（ＣＤ１０）、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ−１、Ａディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２８（ＭＤＣ−Ｌ）、トロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２、ゼラチナーゼＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３、ストロメライシン１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７、マトリライシン１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−８（ＭＭＰ−８、コラゲナーゼ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９、ゼラチナーゼＢ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１０（ＭＭＰ−１０、ストロメライシン２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１１（ＭＭＰ−１１、ストロメライシン３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１２（ＭＭＰ−１２、マクロファージエラスターゼ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１３（ＭＭＰ−１３、コラゲナーゼ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１４（ＭＭＰ−１４、ＭＴ１−ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１５（ＭＭＰ−１５、ＭＴ２−ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１９（ＭＭＰ−１９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２３（ＭＭＰ−２３、ＣＡ−ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２４（ＭＭＰ−２４、ＭＴ５−ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２６（ＭＭＰ−２６、マトリライシン２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２７（ＭＭＰ−２７、ＣＭＭＰ）、レグマイン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＸ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、セクレターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、トロンビン、プロテアーゼ特異的抗原（ＰＳＡ、ＫＬＫ３）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、エラスターゼ、トリプターゼ、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、ＤＥＳＣ１、ヘプシン（ＨＰＮ）、マトリプターゼ、マトリプターゼ−２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４（ＣＡＰ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫファミリー）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、およびＫＬＫ１４からなる群から選択される１つまたは複数のプロテアーゼの基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＡＤＡＭ１７の基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＢＭＰ−１の基質である。一実施形態では、ＲＳは、カテプシンの基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＨｔｒＡ１の基質である。一実施形態では、ＲＳは、レグマインの基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ−１の基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ−２の基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ−７の基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ−９の基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ−１１の基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ−１４の基質である。一実施形態では、ＲＳは、ｕＰＡの基質である。一実施形態では、ＲＳは、マトリプターゼの基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＴ−ＳＰ１の基質である。一実施形態では、ＲＳは、好中球エラスターゼの基質である。一実施形態では、ＲＳは、トロンビンの基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＴＭＰＲＳＳ３の基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＴＭＰＲＳＳ４の基質である。一実施形態では、対象組換えポリペプチド組成物のＲＳは、レグマイン、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼからなる群から選択される、少なくとも２つのプロテアーゼの基質である。別の実施形態では、対象組換えポリペプチド組成物のＲＳは、レグマイン、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼの基質である。
表１：  放出セグメント配列。
【表１−１】
2021507706.tif 000003
【表１−２】
2021507706.tif 000004
【表１−３】
2021507706.tif 000005
表２：  放出セグメント配列
【表２−１】
2021507706.tif 000006
【表２−２】
2021507706.tif 000007
【表２−３】
2021507706.tif 000008
【表２−４】
2021507706.tif 000009
【表２−５】
2021507706.tif 000010
【表２−６】
2021507706.tif 000011
【表２−７】
2021507706.tif 000012
【表２−８】
2021507706.tif 000013
【表２−９】
2021507706.tif 000014
【表２−１０】
2021507706.tif 000015
【０２０８】
別の態様では、対象組換えポリペプチドへの組み込みのためのＲＳを、それらが基質である様々なプロテアーゼに対する異なる切断速度および異なる切断効率を有するような選択的感受性を示すように、設計することができる。所与のプロテアーゼは、腫瘍、血液がん、または炎症組織もしくは炎症部位を含むがこれらに限定されない、罹患組織において、健康な組織または循環血中と比較して異なる濃度で見いだされ得るので、本開示は、組換えポリペプチドが、標的細胞または組織およびその共局在しているプロテアーゼに近接すると、プロドラッグ形態から優先的に活性形態へ（すなわち、ＲＳの切断後の組換えポリペプチドからの結合部分構造およびＸＴＥＮの分離および放出により）変換され、その結果、放出された抗体断片結合部分構造が、循環血中に残存するプロドラッグ形態と比較して罹患組織におけるリガンドへのより大きい結合能力を有することを確実にするために、所与のプロテアーゼが、健康な組織または循環血におけるＲＳの切断の速度と比較してより高いまたは低い切断効率を有するように個々のアミノ酸配列が操作されたＲＳを提供する。そのような選択的設計により、結果として得られる組成物の治療指数を改善することができ、その結果、そのような部位特異的活性化を組み込んでいない従来の治療薬と比べて副作用が低減されることになる。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、切断効率は、反応が行われる生化学的アッセイ（実施例でさらに詳述される）において各々がプロテアーゼ酵素に付されたときに切断されたＲＳを含む被験基質のパーセンテージの、切断された対照ＡＣ１６１１基質のパーセンテージに対する比のｌｏｇ２値と定義され、前記生化学的アッセイにおいて、初期基質濃度は、６μＭであり、反応は、３７℃で２時間インキュベートされた後、ＥＤＴＡの添加により停止され、消化産物および未切断基質の量を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析して、切断されたパーセンテージの比が確立される。切断効率は、次のように算出される：
【化１】
2021507706.tif 000016
したがって、−１の切断効率は、切断された被験基質の量が、対照基質のものと比較して５０％であったことを意味し、その一方で、＋１の切断効率は、切断された被験基質の量が、対照基質のものと比較して２００％であったことを意味する。対照と比べて被験プロテアーゼによるより速い切断の速度は、より高い切断効率をもたらすことになり、対照と比べて被験プロテアーゼによるより遅い切断の速度は、より低い切断効率をもたらすことになる。実施例で詳述されるように、アミノ酸配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照ＲＳ配列ＡＣ１６１１（ＲＳＲ−１５１７）は、プロテアーゼであるレグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡおよびマトリプターゼによる適切なベースライン切断効率を、個々のプロテアーゼによる切断の速度についてｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的アッセイで試験したときに有すると、確証された。ＲＳペプチド中の個々の位置におけるアミノ酸の選択的置換により、ＲＳのライブラリーが作出され、７つのプロテアーゼのパネルに対して評価され（実施例でより十分に詳述される）、その結果、所望の切断効率を有するＲＳを獲得するための適切なアミノ酸置換についてのガイドラインを確立するために使用されるプロファイルが得られた。所望の切断効率を有するＲＳを作製する際、親水性アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳおよびＴを使用する置換が好ましいが、ＲＳが、プロテアーゼによる切断に対する感受性を少なくともある程度保持するのであれば、他のＬアミノ酸を所与の位置において置換して切断効率を調整することができる。活性を保持するまたは生じさせるためのペプチドにおけるアミノ酸の保存的置換は、十分に当業者の知識および能力の範囲内である。一実施形態では、本開示は、レグマイン、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼにより切断されるＲＳであって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的競合アッセイにおいて配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列ＲＳＲ−１５１７の同じプロテアーゼによる切断と比較して少なくとも０．２ｌｏｇ２、または０．４ｌｏｇ２、または０．８ｌｏｇ２、または１．０ｌｏｇ２高い切断効率で切断されるＲＳを提供する。別の実施形態では、本開示は、レグマイン、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼにより切断されるＲＳであって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的競合アッセイにおいて配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列ＲＳＲ−１５１７の同じプロテアーゼによる切断と比較して少なくとも０．２ｌｏｇ２、または０．４ｌｏｇ２、または０．８ｌｏｇ２、または１．０ｌｏｇ２低い切断効率で切断されるＲＳを提供する。一実施形態では、本開示は、レグマイン、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼによるＲＳの切断の速度が、配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列ＲＳＲ−１５１７と比較して少なくとも２倍、または少なくとも４倍、または少なくとも８倍、または少なくとも１６倍速い、ＲＳを提供する。別の実施形態では、本開示は、レグマイン、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼによるＲＳの切断の速度が、配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴを有する対照配列ＲＳＲ−１５１７と比較して少なくとも２倍、または少なくとも４倍、または少なくとも８倍、または少なくとも１６倍遅い、ＲＳを提供する。
【０２１０】
別の態様では、本開示は、複数のＲＳを含むＡＡＣであって、各ＲＳ配列が、表１に記載の配列の群から選択され、前記ＲＳが、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンから選択される１〜６個のアミノ酸により互いに連結されている、ＡＡＣを提供する。一実施形態では、ＡＡＣは、第１のＲＳと、前記第１のＲＳとは異なる第２のＲＳとを含み、この場合、各ＲＳ配列は、表１に記載の配列の群から選択され、前記ＲＳは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンから選択される１〜６個のアミノ酸により互いに連結されている。別の実施形態では、ＡＡＣは、第１のＲＳと、前記第１のＲＳとは異なる第２のＲＳと、前記第１および第２のＲＳとは異なる第３のＲＳとを含み、この場合、各配列は、表１に記載の配列の群から選択され、前記第１および第２および第３のＲＳは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンから選択される１〜６個のアミノ酸により互いに連結されている。ＡＡＣの複数のＲＳは、複数のプロテアーゼにより異なる切断速度または異なる切断効率で切断され得る配列を形成するように連結され得ることが、特に意図される。別の実施形態では、本開示は、表１および２に記載の配列の群から選択されるＲＳ１およびＲＳ２と、表８および１０に記載の配列の群から選択されるＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２とを含むＡＡＣであって、前記ＲＳ１が、前記ＸＴＥＮ１と結合部分構造の間に融合されており、前記ＲＳ２が、前記ＸＴＥＮ２と結合部分構造の間に融合されている、ＡＡＣを提供する。そのような組成物は、健康な組織と比較してまたは正常な循環血中にある場合と比較して、複数のプロテアーゼを発現する罹患標的組織によってより容易に切断されることになり、その結果、結合部分構造を有する、結果として生じる断片は、標的組織、例えば、腫瘍に、より容易に侵入することになり、標的細胞およびエフェクター細胞（または単一の結合部分構造を想定して設計されたＡＡＣの場合には標的細胞だけ）に結合してそれらを連結させる能力の増強を有することになることが、企図される。
表３：  標的組織のプロテアーゼ。
【表３−１】
2021507706.tif 000017
【表３−２】
2021507706.tif 000018
【表３−３】
2021507706.tif 000019
【０２１１】
本開示のＲＳは、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、および組換えポリペプチドの局所的活性化が望ましい他の状態の処置のための治療薬としての組換えポリペプチドへの組み入れに有用である。対象組成物は、未だ対処されていない要求に対処し、注射のときに活性である従来の抗体治療薬または二重特異性抗体治療薬と比較して、向上した終末相半減期、標的化送達、および健康な組織に対する毒性の低減を伴う改善された治療可能比を含む、１つまたは複数の態様の点で優れている。
ＩＶ．結合部分構造
【０２１２】
別の態様では、本開示は、リガンドに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部分構造（ＦＢＭ）を含む組換えポリペプチドを提供する。一実施形態では、結合部分構造は、抗体、サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、またはその断片から選択される。別の実施形態では、結合部分構造は、細胞受容体、またはその断片である。別の実施形態では、結合部分構造は、細胞受容体または標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する抗体断片である。
【０２１３】
一部の実施形態では、本開示は、第１の結合部分構造（ＦＢＭ）と第２の結合部分構造（ＳＢＭ）とを含むＡＡＣである、組換えポリペプチドであって、前記結合部分構造の各々が、それらのそれぞれのリガンドに対する特異的結合親和性を有する、組換えポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＡＡＣは、第１および第２の結合部分構造を含み、これらの結合部分構造の各々が抗体断片である。そのような組成物では、疾患組織の標的細胞マーカーに対して方向付けられた結合部分構造は、エフェクター細胞マーカーに方向付けられた第２の結合部分構造と組み合わせて使用され、それ故、それは、二機能性である。本明細書で使用される場合、抗体断片は、目的の標的リガンドに結合すること、特に、特異的に結合することが可能である抗原結合ドメインを含有する抗体断片である。そのような実施形態では、抗体断片は、抗体の軽鎖および／もしくは重鎖の可変もしくは超可変領域（ＶＬ、ＶＨ）、可変断片（Ｆｖ）、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、線状抗体、単一ドメイン抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＢＨＨもしくはＢＮＡＲ型の単一ドメイン重鎖免疫グロブリン、単一ドメイン軽鎖免疫グロブリン、または標的もしくはエフェクター細胞に付随する標的タンパク質にもしくは標的タンパク質上のエピトープに結合することが可能な抗体断片を含有する当技術分野において公知の他のポリペプチドであり得るが、これらに限定されない。抗体断片のＶＬおよびＶＨを単鎖ディアボディ構成で構成することもできる。一実施形態では、ポリペプチドの２つの結合部分構造のうちの第１の結合部分構造は、エフェクター細胞リガンド（例えば、これらに限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＴＣＲａ、ＴＣＲｐ、ＣＤ２８など）に標的化された抗体断片を含有し、第２の結合部分構造は、疾患標的化ドメイン（例えば、疾患組織または細胞により産生される標的細胞マーカー）を有する抗体断片を含有する。
【０２１４】
本開示により企図される抗体断片の起源は、天然に存在する抗体もしくはその断片、天然に存在しない抗体もしくはその断片、ヒト化抗体もしくはその断片、合成抗体もしくはその断片、ハイブリッド抗体もしくはその断片、または操作された抗体もしくはその断片に由来し得る。所与の標的マーカー対する抗体を生成する方法は、当技術分野において周知である。例えば、モノクローナル抗体を、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  （１９７５）により記載されたハイブリドーマ法を使用して作製してもよく、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製してもよい。抗体およびそれらの断片、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ）の構造は、よく理解されている。標的細胞マーカーの所望の抗原結合部分構造を有するポリペプチドを生成する方法は、当技術分野において公知である。
【０２１５】
対象組成物のためのＶＬおよびＶＨおよびＣＤＲドメインを得ることができる治療用モノクローナル抗体は、当技術分野において公知である。そのような治療用抗体としては、多くのリンパ腫、白血病および一部の自己免疫障害の処置に使用されるキメラ抗ＣＤ２０抗体である、リツキシマブ、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号を参照されたい）；慢性リンパ球性白血病のための使用に承認されており、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅにより開発が進められている、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、関節リウマチおよび再発寛解型多発性硬化症について開発中の、抗ＣＤ２０抗体である、オファツムマブ；非ホジキンまたはホジキンリンパ腫のためにＮｏｖａｒｔｉｓにより開発された抗ＣＤ４０抗体である、ルカツムマブ（ＨＣＤ１２２）（例えば、米国特許第６，８９９，８７９号を参照されたい）；ＣＤ２０を発現する細胞に結合するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎにより開発された抗体であって、非ホジキンリンパ腫を処置するための抗体である、ＡＭＥ−１３３；ＣＤ２０を発現する細胞に結合するＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．により開発された抗体であって、免疫血小板減少性紫斑病を処置するための抗体である、ベルツズマブ（ｈＡ２０）；低悪性度Ｂ細胞リンパ腫の処置のためにＩｎｔｒａｃｅｌにより開発されたＨｕｍａＬＹＭ；および関節リウマチの処置のための抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発されたオクレリズマブ（例えば、米国特許出願第２００９０１５５２５７号を参照されたい）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された、乳がんの処置用に承認されたヒト化抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である、トラスツズマブ（例えば、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）；前立腺がん、乳がんおよび卵巣がんの処置に関してＧｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＨＥＲ２二量体化阻害剤抗体である、ペルツズマブ；（例えば、米国特許第４，７５３，８９４号を参照されたい）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現しているＫＲＡＳ野生型転移性結腸直腸がんおよび頭頸部がんを処置するために使用されるＩｍｃｌｏｎｅおよびＢＭＳにより開発された抗ＥＧＦＲ抗体である、セツキシマブ（米国特許第４，９４３，５３３号；ＰＣＴ  ＷＯ９６／４０２１０を参照されたい）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１としても公知）に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体であり、転移性結腸直腸がんの処置用にＡｍｇｅｎにより現在市販されている、パニツムマブ（米国特許第６，２３５，８８３号を参照されたい）；Ｇｅｎｍａｂにより開発された完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であって、頭頸部扁平上皮癌の処置のための上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体である、ザルツムマブ（例えば、米国特許第７，２４７，３０１号を参照されたい）；頭頸部扁平上皮癌、上咽頭がん、および神経膠腫の処置に関してＢｉｏｃｏｎ、ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｕｂａ、およびＯｎｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｕｒｏｐｅ）により開発されたＥＧＦＲに対するキメラ抗体であ���、ニモツズマブ（例えば、米国特許第５，８９１，９９６号；米国特許第６，５０６，８８３号を参照されたい）；結腸直腸がん、肺がん、食道がんおよび胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）の処置のために武田薬品工業株式会社により開発された上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するヒト化モノクローナルである、マツズマブ（例えば、米国特許出願公開第２００９０１７５８５８Ａ１号を参照されたい）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂおよびＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡにより開発された転移性結腸直腸がん、転移性非小細胞肺がんおよび頭頸部がんの処置に使用される上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体である、セツキシマブ（例えば、米国特許第６，２１７，８６６を参照されたい）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）およびＴ細胞リンパ腫の処置用にＢａｙｅｒ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａにより市販されているＣＤ５２に対するヒト化モノクローナル抗体である、アレムツズマブ；臓器移植を受けた患者における急性拒絶反応を軽減するために施される免疫抑制生物製剤として使用されるＯｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎにより開発された抗ＣＤ３抗体である、ムロモナブ−ＣＤ３；Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の一部の形態のための処置としてＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧにより開発された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、イブリツモマブチウキセタン；細胞傷害性キレート剤チウキセタンに連結され、これに放射性同位元素が結合されている抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体であって、急性骨髄性白血病を処置するために使用されるＣｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈにより開発された抗体である、ゲムツズマブオゾガマイシン；Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＣＤ１４７抗体である、ＡＢＸ−ＣＢＬ；Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＩＬ８抗体である、ＡＢＸ−ＩＬ８；Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＭＵＣ１８抗体である、ＡＢＸ−ＭＡ１；Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発中の抗ＭＵＣ１である、ペムツモマブ（Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）；Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発された抗ＭＵＣ１抗体である、Ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）；Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発されたＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）；Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発されたＨｕＢＣ−１、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発されたチオプラチン（ＡＳ１４０７）；Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗アルファ−４−ベータ−１（ＶＬＡ４）およびアルファ−４−ベータ−７抗体である、ＡＮＴＥＧＲＥＮ（ナタリズマブ）；Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体である、ＶＬＡ−１  ｍＡｂ；Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体である、ＬＴＢＲ  ｍＡｂ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより開発された抗ＴＧＦ−β２抗体である、ＣＡＴ−１５２；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＡｂｂｏｔｔにより開発された抗ＩＬ−１２抗体である、Ｊ６９５；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＧｅｎｚｙ���ｅにより開発された抗ＴＧＦβ１抗体である、ＣＡＴ−１９２；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより開発された抗エオタキシン１抗体である、ＣＡＴ−２１３；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．により開発された抗Ｂｌｙｓ抗体である、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．により開発された抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体である、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体である、ハーセプチン；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗組織因子抗体である、抗組織因子（ＡＴＦ）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＩｇＥ抗体である、ゾレア（オマリズマブ）；ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発されたＭＬＮ−０２抗体（旧名ＬＤＰ−０２）；Ｇｅｎｍａｂにより開発された抗ＣＤ４抗体である、ＨｕＭａｘ  ＣＤ４（登録商標）；中外製薬株式会社により開発された、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａ）、および抗ＩＬ６Ｒ抗体；ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎにより開発された抗ＩＬ１５である、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５；ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘにより開発されたＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ；ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘおよびＯｘｆｏｒｄ  ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓにより開発された抗ヘパラナーゼＩ抗体である、Ｈｕｍａｘ−Ｃａｎｃｅｒ；ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎにより開発されたＨｕＭａｘ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ；Ｇｅｎｍａｂにより開発されたＨｕＭａｘ−ＴＡＣ；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、ＩＤＥＣ−１３１；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ４抗体である、ＩＤＥＣ−１５１（クレノリキシマブ）；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ８０抗体である、ＩＤＥＣ−１１４；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ２３である、ＩＤＥＣ−１５２；Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗ＫＤＲ抗体；Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗ｆｌｋ−１抗体である、ＤＣ１０１；Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗ＶＥカドヘリン抗体；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体である、ＣＥＡ−ＣＩＤＥ（ラベツズマブ）；黒色腫の処置に関してＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより開発された抗ＣＴＬＡ４抗体である、ヤーボイ（イピリムマブ）；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された抗ＣＤ２２抗体である、Ｌｕｍｐｈｏｃｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発されたＡＦＰ−Ｃｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発されたＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発されたＬｋｏＣｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発されたＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ；Ｍｅｄａｒｅｘにより開発された抗ＣＴＬＡ４抗体である、ＭＤＸ−０１０；Ｍｅｄａｒｅｘにより開発された抗ＣＤ３０抗体である、ＭＤＸ−０６０；Ｍｅｄａｒｅｘにより開発されたＭＤＸ−０７０；Ｍｅｄａｒｅｘにより開発されたＭＤＸ−０１８；ＭｅｄａｒｅｘおよびＩｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓにより開発された抗ＨＥＲ２抗体である、ＯＳＩＤＥＭ（ＩＤＭ−１）；ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂにより開発された抗ＣＤ４抗体である、ＨｕＭａｘ（登録商標）−ＣＤ４；ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂにより開発された抗ＩＬ１５抗体である、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓにより開発された抗細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体、ＭＯＲ２０１；Ｐｆｉｚｅｒにより開発された抗ＣＴＬＡ−４抗体である、トレメリムマブ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓにより開発された抗ＣＤ３抗体である、ビシリズマブ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓにより開発された抗ａ５β１インテグリン；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓにより開発された抗ＩＬ−１２；Ｘｏｍａにより開発された抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体である、ＩＮＧ−１；およびＸｏｍａにより開発された抗ベータ２インテグリン抗体である、ＭＬＮ０１が挙げられるが、これらに限定されず、この段落における上述の抗体参照物のすべては、参照により本明細書に明確に組み込まれる。上記抗体の配列は、公開されているデータベース、特許、または参考文献から入手することができる。加えて、モノクローナル抗体、ならびに抗ＣＤ３抗体からのＶＨおよびＶＬ配列（および、一部の場合には、ＣＤＲ配列の指摘を伴う）の非限定的な例は、表４に提示され、がん、腫瘍、または標的細胞マーカーに対するモノクローナル抗体ならびにＶＨおよびＶＬ配列（および、一部の場合には、ＣＤＲ配列の指摘を伴う）の非限定的な例は、表５に提示される。
【０２１６】
ある特定の事例では、対象ＡＡＣ組成物に組み込まれるエフェクター細胞に対する抗体断片についての重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域は、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ−３４またはＩ２Ｃ、ＴＲ−６６またはＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆｌ  １１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１およびＷＴ−３１などの、公知の抗ＣＤ３抗体に由来する。一部の実施形態では、対象ＡＡＣのエフェクター細胞結合部分構造は、表４に記載の対のＶＬとＶＨ配列を含む単鎖抗体断片である。上述の実施形態では、ＶＬおよびＶＨは、表６に記載の配列から選択される親水性アミノ酸の長いリンカーにより連結されており、ｓｃＦｖは、表７に記載の配列の群から選択される親水性アミノ酸の短いリンカーにより互いに連結されている。一実施形態では、ＶＬおよびＶＨを連結させるために使用される長いリンカーは、表６のＬ７であり、２つのｓｃＦｖを融合させる分子間リンカーは、表７のＳ−１またはＳ−２である。別の実施形態では、本開示は、単鎖ディアボディを含むＡＡＣ組成物であって、フォールディング後、第１のドメイン（ＶＬまたはＶＨ）が、最後のドメイン（ＶＨまたはＶＬ）と対合されて１つのｓｃＦｖを形成し、中間の２つのドメインが、対合されて別のｓｃＦｖを形成し、第１のドメインと第２のドメイン、および第３のドメインと最後のドメインが、表７に記載の配列から選択される親水性アミノ酸の短いリンカーにより互いに融合され、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインが、表６から選択される長いリンカーにより融合される、ＡＡＣ組成物を提供する。当業者には理解されると予想されるが、短いリンカーおよび長いリンカーの選択は、隣接する可変ドメインの誤った対合を防止することによって、第１の結合部分構造および第２の結合部分構造のＶＬおよびＶＨを含む単鎖ディアボディ構成の形成を助長するためのものである。
表４：  抗ＣＤ３モノクローナル抗体および配列
【表４−１】
2021507706.tif 000020
【表４−２】
2021507706.tif 000021
表５：  抗標的細胞モノクローナル抗体および配列
【表５−１】
2021507706.tif 000022
【表５−２】
2021507706.tif 000023
【表５−３】
2021507706.tif 000024
【表５−４】
2021507706.tif 000025
【表５−５】
2021507706.tif 000026
【表５−６】
2021507706.tif 000027
【表５−７】
2021507706.tif 000028
【表５−８】
2021507706.tif 000029
【表５−９】
2021507706.tif 000030
【表５−１０】
2021507706.tif 000031
【表５−１１】
2021507706.tif 000032
【表５−１２】
2021507706.tif 000033
【表５−１３】
2021507706.tif 000034
【表５−１４】
2021507706.tif 000035
【表５−１５】
2021507706.tif 000036
【０２１７】
表６：  分子間の長いリンカー
【表６】
2021507706.tif 000037
表７：  分子間の短いリンカー
【表７】
2021507706.tif 000038
Ｖ．嵩高な部分構造および伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）
【０２１８】
別の態様では、本開示は、少なくとも第１の嵩高な部分構造を含む組換えポリペプチドであって、前記嵩高な部分構造が、構築物の質量を増加させることと構築物のサイズを増加させること両方のために対象組成物に組み込まれるが、分子が下でより詳しく説明される無傷の未切断状態であるときに結合部分構造のそれらのリガンドに結合する能力を大きく低下させるのにも役立つ、組換えポリペプチドに関する。一部の実施形態では、本開示は、ＲＳのＮ末端またはＣ末端に融合された単一の嵩高な部分構造を含む組換えポリペプチドであって、前記ＲＳが、結合部分構造と前記嵩高な部分構造の間に位置する、組換えポリペプチドを提供する。嵩高な部分構造の非限定的な例としては、伸長組換えポリペプチド（本明細書において下で説明されるような、ＸＴＥＮ）；アルブミン結合ドメイン；アルブミン；ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリンおよびアラニンからなる少なくとも３５０アミノ酸残基のポリペプチド；脂肪酸；エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）（ＷＯ２０１６０８１８８４に記載されているように、ＥＬＰの個々のサブユニットまたは構成要素は、ヒトタンパク質エラスチンに見られる５アミノ酸モチーフに由来し、このモチーフが何度も反復されてＥＬＰ生体高分子を形成する）、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＧＡ、およびヒドロキシエチルデンプン（ｈｙｄｏｘｙｌｅｔｈｙｌ  ｓｔａｒｃｈ）が挙げられる。
【０２１９】
好ましい実施形態では、本開示は、少なくとも第１のＸＴＥＮを含む組換えポリペプチドであって、前記ＸＴＥＮが、ＲＳのＮまたはＣ末端に融合されており、そしてまたこれが、隣接する結合部分構造に融合されている、組換えポリペプチドを提供する。別の実施形態では、組換えポリペプチドは、２つの異なるＸＴＥＮ配列を含み、前記２つのＸＴＥＮは、組成物の２つのＲＳに各々連結されており、そしてまた前記組成物の２つのＲＳが、結合部分構造に連結されている。一実施形態では、組換えポリペプチド組成物は、最適にアライメントされたとき、表８または表１０に記載の配列の群から選択される匹敵する長さのＸＴＥＮ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＸＴＥＮ配列を含む。別の実施形態では、組換えポリペプチドは、各配列が、最適にアライメントされたとき、表８に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、第１および第２のＸＴＥＮ配列（ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２）を含む。別の実施形態では、組換えポリペプチドは、各配列が、最適にアライメントされたとき、表１０に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、第１および第２のＸＴＥＮ配列（ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２）を含む。
【０２２０】
理論により拘束されるものではないが、嵩高な部分構造の組み込みは、ある特定の特性を付与する；１）組成物がその無傷のプロドラッグ形態であるときに結合部分構造を遮蔽して標的細胞マーカーおよびエフェクター細胞抗原に対する結合親和性を低下させる嵩高な部分構造ＸＴＥＮを、組換えポリペプチド組成物に備えさせる；ｉｉ）対象に投与されたときに半減期の向上をもたらす嵩高な部分構造ＸＴＥＮを、組換えポリペプチド組成物に備えさせる；ｉｉｉ）無傷組成物の溶解度および安定性に寄与することによって、対象組成物の薬学的特性を増強する；およびｉｖ）血管系において正常な組織および臓器では血管外漏出を低減させるが、より大きい細孔径を有する罹患組織（例えば、腫瘍）ではある程度の血管外漏出を許容し、さらに、ある特定の哺乳動物プロテアーゼの作用により組成物から放出され得ることによって、組成物の結合部分構造が、罹患組織、例えば腫瘍に、より容易に侵入すること、ならびにエフェクター細胞および腫瘍細胞上の標的細胞マーカーに結合し、それらを連結させることを可能にする、嵩高な部分構造ＸＴＥＮを、組換えポリペプチド組成物に備えさせるために、対象組成物の設計に組み込まれた。これらの要求を満たすために、本開示は、１つまたは複数のＸＴＥＮを含む組成物であって、前記ＸＴＥＮが、結果として生じる組成物に質量および流体力学的半径の増加をもたらす、組成物を提供する。実施形態のＸＴＥＮポリペプチドは、それが、質量および流体力学的半径の増加をもたらすばかりでなく、その可動性、非構造化特徴が、組成物の結合部分構造に対して遮蔽効果をもたらすことによって、標的細胞マーカーおよび／もしくはエフェクター細胞抗原を発現しないかまたは低減されたレベルの標的細胞マーカーおよび／もしくはエフェクター細胞抗原を発現する正常組織においてまたは正常組織の血管系において抗原に結合する尤度を低下させ、単鎖抗体断片結合部分構造の発現および回収中にそれらの溶解度を向上させ、正しいフォールディングを増進させることから、ある特定の利点を対象組成物の設計にもたらす。
【０２２１】
ＸＴＥＮは、生理条件下で低度の二次構造もしくは三次構造を有するかまたは二次構造も三次構造も有さない、天然に存在しない実質的に非反復的な配列を有し、後続の段落で説明される追加の特性も有する、ポリペプチドである。ＸＴＥＮは、通常は、少なくとも約１００〜少なくとも約１０００個またはそれより多くのアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２００〜少なくとも約９００個のアミノ酸を有し、これらのうちの大多数またはすべてが、グリシン、セリン、トレオニン、グルタメートおよびプロリンから選択される小さい親水性アミノ酸である。本明細書で使用される場合、ＸＴＥＮは、全抗体または抗体断片（例えば、単鎖抗体およびＦｃ断片）を特に除外する。ＸＴＥＮポリペプチドは、それらが、例えば、本明細書に記載される対象ＡＡＣ組成物の二重特異性結合部分構造を含む組成物に連結されたときに、ある特定の望ましい特性を付与する、様々な役割を果たすことから、融合パートナーとして有用性がある。結果として生じる組成物は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する結合部分構造と比較して増強された特性、例えば、増強された薬物動態学的、物理化学的、薬理学的特性、ならびに改善された毒物学的および薬学的特性を有し、このことが、前記組成物を、結合部分構造が使用されることが当技術分野において公知である、ある特定の状態の処置において有用なものにする。
【０２２２】
ＸＴＥＮの非構造化特徴および物理化学的特性は、４〜６種類の親水性アミノ酸に偏って限定される全アミノ酸組成に、定量可能な、実質的に非反復的な設計のアミノ酸配列に、および結果として生じるＸＴＥＮポリペプチド長に、一部は起因する。ＸＴＥＮに共通の、しかし天然ポリペプチドには滅多に見られない、有利な特徴として、本明細書で開示されるＸＴＥＮの特性は、長さの様々な範囲内で、同様の特性を有し、それらが連結される組成物に増強された特性を付与し、その多くが本実施例で実証される、表８および１０の例示的配列の多様性により証明されるように、絶対的な一次アミノ酸配列に縛られない。実際、具体的には、本開示の組成物は、表８または１０に具体的に列挙されているＸＴＥＮに限定されず、むしろ、実施形態は、最適にアライメントされたとき、表８または表１０の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を、それらは本明細書に記載されるＸＴＥＮの特性を示すので、含むと考えられる。そのようなＸＴＥＮが有する特性は、タンパク質よりも非タンパク質様の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、または「ＰＥＧ」）に類似していることが確立されている。本開示のＸＴＥＮは、次の有利な特性のうちの１つまたは複数を示す：被定義の均一長（所与の配列について）、立体構造上の可動性、二次構造の低減または欠如、高いランダムコイル形成度、高い水溶性度、高いプロテアーゼ耐性度、低い免疫原性、哺乳動物の受容体への少ない結合、被定義の荷電度、および流体力学的（またはストークス）半径増加；本開示のＸＴＥＮを融合パートナーとして特に有用なものにする、ある特定の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と同様の特性。
【０２２３】
対象組換えポリペプチドおよびＡＡＣのＸＴＥＮ成分は、伸長したポリマー長にもかかわらず、生理条件下で変性ペプチド配列のように挙動するように設計される。「変性（した）」は、溶液中のペプチドの状態であって、ペプチド骨格の立体構造の大きい自由度を特徴とする状態を表す。大半のペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下または高温で、変性立体構造をとる。変性立体構造のペプチドは、例えば、特徴的な円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲにより判定して長距離相互作用の欠如を特徴とする。「変性立体構造」および「非構造化立体構造」は、本明細書では同義で使用される。一部の実施形態では、本開示は、生理条件下で二次構造が実質的にない変性配列に、生理条件下で、似ているＸＴＥＮ配列を含む、組成物を提供する。「実質的にない」は、この文脈で使用される場合、アルゴリズムまたは分光光度アッセイを含む、本明細書に記載される方法により測定または判定して、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または少なくとも約９９％が、二次構造に寄与しないことを意味する。
【０２２４】
対象ＸＴＥＮのおよびそれらが組み込まれる対象ポリペプチド組成物の物理化学的特性を判定および確認するための様々な十分に確立された方法およびアッセイが、当技術分野において公知である。そのような特性としては、二次または三次構造、溶解度、タンパク質凝集、安定性、絶対分子量および見かけの分子量、純度および均一性、融解特性、夾雑ならびに含水量が挙げられるが、これらに限定されない。そのような特性を測定する方法としては、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＨＰＬＣ−逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、およびＵＶ／可視分光法が挙げられる。特に、二次構造は、分光光度法で、例えば、「遠ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）での円偏光二色性分光法により、測定され得る。二次構造エレメント、例えば、アルファ−ヘリックスおよびベータ−シートは、各々、ＣＤスペクトルの特徴的形状および大きさを生じさせ、これらの構造エレメントの欠如もＣＤスペクトルの特徴的形状および大きさを生じさせる。二次構造を、米国特許出願公開第２００３０２２８３０９Ａ１号に記載されているような周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，  Ｐ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３：  ２２２−４５）およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎアルゴリズム（「ＧＯＲ  ＩＶアルゴリズム」）（Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｂｒａｔ  ＪＦ，  Ｒｏｂｓｏｎ  Ｂ．  （１９９６），  ＧＯＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５４０−５５３）などの、ある特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズムによって、ポリペプチド配列について予測することもできる。所与の配列について、アルゴリズムは、二次構造がある程度存在するのか、または全く存在しないのかを、例えばアルファ−ヘリックスもしくはベータ−シートを形成する配列の残基の総数および／もしくはパーセンテージとして、またはランダムコイルを形成する（二次構造を欠く）結果となると予測される配列の残基のパーセンテージとして表して、予測することができる。ポリペプチド配列は、ワールドワイドウェブ上の、例えば、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ１のサイトを使用する、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム、およびｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｇｏｒ４．ｈｔｍｌにおけるＧＯＲ  ＩＶアルゴリズム（両方とも、２０１７年１２月８日にアクセスした）を使用して、解析することができる。ランダムコイルは、立体構造に依存する形で鎖長に伴って増減する固有粘度測定を使用することによる方法（Ｔａｎｆｏｒｄ，  Ｃ．，  Ｋａｗａｈａｒａ，  Ｋ．  ＆  Ｌａ��ａｎｊｅ，  Ｓ．  （１９６６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４１  ，  １９２１−１９２３）、およびサイズ排除クロマトグラフィーによる方法（Ｓｑｕｉｒｅ，  Ｐ．  Ｇ．，  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍ  ｃｏｉｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｂｙ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，  １９８１，  ５，４３３−４４２）を含む、様々な方法により、判定することができる。さらなる方法は、Ａｒｎａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ  （２００６）  ４８，  １−１３に開示されている。
【０２２５】
一実施形態では、対象組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより判定して０％〜約５％未満の範囲のアルファ−ヘリックスパーセンテージおよび０％〜約５％未満の範囲のベータ−シートパーセンテージを有し、ＧＯＲ  ＩＶアルゴリズムにより判定して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のランダムコイル形成を有する。別の実施形態では、開示される組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより判定して約２％未満のアルファ−ヘリックスパーセンテージおよび約２％未満のベータ−シートパーセンテージを有し、ＧＯＲ  ＩＶアルゴリズムにより判定して少なくとも約９０％のランダムコイル形成を有する。別の実施形態では、組成物のＸＴＥＮ配列は、円偏光二色性により測定して二次構造を実質的に欠いている。
【０２２６】
一実施形態では、本開示の対象組成物に使用されるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ  １４４＿１Ａ、ＡＥ  １４４＿２Ａ、ＡＥＥ１４４＿２Ｂ、ＡＥ  １４４＿３Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ  １４４＿４Ａ、ＡＥ  １４４＿４Ｂ、ＡＥ  １４４＿５Ａ、ＡＥ  １４４＿６Ｂ、ＡＥ２８８＿１、ＡＥ２８８＿２、ＡＥ２８８＿３、ＡＥ２８４、ＡＥ２９２、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＥ８６４＿２、ＡＥ８６５、ＡＥ８６６、ＡＥ８６７、ＡＥ８６７＿２およびＡＥ８６８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
【０２２７】
対象組成物中のＸＴＥＮのアミノ酸の１００％未満がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される、または配列の１００％未満が表８もしくは表１０のＸＴＥＮ配列からなる、一部の実施形態では、ＸＴＥＮの残りのアミノ酸残基は、他の１４の天然Ｌアミノ酸のいずれかから選択されるが、ＸＴＥＮ配列が少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％親水性アミノ酸を含有するように、親水性アミノ酸から優先的に選択される。対象組成物に利用されるＸＴＥＮ中の疎水性アミノ酸の含有量は、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含有量であり得る。ＸＴＥＮの構築に不利である疎水性残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニンが挙げられる。加えて、ＸＴＥＮ配列は、次のアミノ酸を５％未満もしくは４％未満もしくは３％未満もしくは２％未満もしくは１％未満含有することがあり、または全く含有しないこともある：メチオニン（例えば、酸化を回避するために）、またはアスパラギンおよびグルタミン（アミド分解を回避するために）。
【０２２８】
一実施形態では、本開示のＡＡＣ実施形態に利用される、ある特定のＸＴＥＮについてのアミノ鎖配列が、表８に示される。
表８：  ＸＴＥＮポリペプチド
【表８−１】
2021507706.tif 000039
【表８−２】
2021507706.tif 000040
【表８−３】
2021507706.tif 000041
【表８−４】
2021507706.tif 000042
【表８−５】
2021507706.tif 000043
【表８−６】
2021507706.tif 000044
【表８−７】
2021507706.tif 000045
【０２２９】
本開示は、中等度の長さから表８のものまでのＸＴＥＮを含む組成物、ならびに組成物に組み込まれた表８のＸＴＥＮのＮまたはＣ末端に１２アミノ酸のモチーフが付加されている、より長い長さのＸＴＥＮを含む組成物を企図している。一実施形態では、対象組成物は、表９に記載のモチーフの群から選択される１つまたは複数のモチーフの１つまたは複数のコピーが付加された、表８のＸＴＥＮを含む。
表９：  １２アミノ酸のＸＴＥＮ配列モチーフおよびモチーフファミリー
【表９】
2021507706.tif 000046
【０２３０】
別の実施形態で、本開示の実施形態に利用される、ある特定のＸＴＥＮについてのアミノ酸配列が、表１０に示される。一実施形態では、ＡＡＣは、最適にアライメントされたとき、表１０に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１のＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ１）を含む。他の実施形態では、ＡＡＣは、最適にアライメントされたとき、表１０に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＸＴＥＮ１および第２のＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ２）を含む。前述のものの一実施形態では、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、同一である。前述のものの別の実施形態では、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、異なる。別の実施形態では、ＡＡＣは、最適にアライメントされたとき、表８および１０に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２を含む。別の実施形態では、ＡＡＣは、最適にアライメントされたとき、表８および１０に記載の配列から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、組成物のＮ末端またはＣ末端にＨＨＨＨＨＨまたはＨＨＨＨＨＨＨＨのＨｉｓタグを含む、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２を含む。
表１０：  ＸＴＥＮポリペプチド
【表１０−１】
2021507706.tif 000047
【表１０−２】
2021507706.tif 000048
【０２３１】
本開示に従って使用することができる、および米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号、もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際特許出願番号ＷＯ２０１００９１１２２Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２、ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１、ＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２、ＷＯ２０１４／０１１８１９Ａ２、もしくはＷＯ２０１５／０２３８９１において開示されている、ＸＴＥＮ配列の追加の例。
ＶＩ．組換えポリペプチドおよびＡＡＣの構成および特性
【０２３２】
ある特定の構造、活性、薬学的および薬理学的特性を付与するために活性化可能なプロドラッグ形態で設計され、作出される、組換えポリペプチドを提供することが、本開示の目的である。この組換えポリペプチドの設計により付与される特性では、結合部分構造を遮断してそれらのリガンドに対するそれらの結合親和性を低下させる組換えポリペプチドのＸＴＥＮ成分が、結合部分構造をＸＴＥＮに融合している放出セグメントの切断により、組成物から放出されるまで、結合部分構造は、それらのリガンドへの結合能力が低下している。
【０２３３】
第１の結合部分構造を有する対象組成物の設計は、１）標的細胞上の所望の標的細胞マーカーに結合する能力がある結合部分構造を有する組成物；２）１つまたは複数のＸＴＥＮを有する組成物であって、前記ＸＴＥＮが、ｉ）組成物が無傷の形態であるときに結合部分構造を遮蔽し、標的細胞マーカーに対する結合親和性を低下させる（ひいてはプロドラッグ形態にする）、ｉｉ）対象に投与されたときの半減期の向上をもたらす、ｉｉｉ）罹患組織（例えば、腫瘍）と比較して正常な組織および臓器における血行路からの無傷組成物の血管外漏出を低減させる、およびｉｖ）従来の抗体治療薬と比較して増大した安全性プロファイルをもたらす、組成物；および３）ＲＳが、罹患組織もしくは細胞の近位にあるまたは罹患組織もしくは細胞と共局在化された１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断されると、活性化され、それによって結合部分構造が放出され、その結果、結合部分構造が、標的リガンドに対するその完全な結合親和性能力を取り戻すという、少なくとも３つの特性を考慮することにより推進された。対象組成物の設計は、ＸＴＥＮおよび放出セグメント（ＲＳ）成分のこれらの特性を活用するものであり、結合部分構造に対するそれらの配置によって、下記の説明に役立つ実施例での結果により証明されるように、前述の特性が実現される。
【０２３４】
単一の結合部分構造と、単一のＲＳと、単一のＸＴＥＮとを有する、組換えポリペプチドの実施形態では、組換えポリペプチドは、未切断状態の場合にはＮ末端からＣ末端へＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１またはＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭの構造配置を有し得る。
【０２３５】
他の実施形態では、本開示は、抗体断片である２つの結合部分構造を有し、活性化可能である、組換えポリペプチド（「ＡＡＣ」と称される）であって、第１の結合部分構造が、エフェクター細胞を標的とし、第２の結合部分構造が、疾患組織または細胞に関連付けられる細胞マーカーを標的とし、これらの結合部分構造の両方が、それらのそれぞれのリガンドに対する特異的結合親和性を有する、組換えポリペプチドを提供する。第１の結合部分構造および第２の結合部分構造（それぞれ、ＦＢＭおよびＳＢＭ）を有する対象組成物の設計は、１）免疫学的シナプスを形成する結果となる、エフェクター細胞および標的細胞に結合してそれらを連結させる能力がある二重特異性結合部分構造を有する組成物；２）ＸＴＥＮを有する組成物であって、前記ＸＴＥＮが、ｉ）組成物が無傷のプロドラッグ形態であるときに両方の結合部分構造を遮蔽し、標的およびエフェクター細胞リガンドに対する結合親和性を低下させる、ｉｉ）対象に投与されたときの半減期の向上をもたらす、ｉｉｉ）罹患組織（例えば、腫瘍）と比較して正常な組織および臓器における血行路からの無傷組成物の血管外漏出を低減させる、およびｉｖ）従来の二重特異性細胞傷害性抗体治療薬と比較して増大した安全性プロファイルをもたらす、組成物；および３）ＲＳが、罹患組織の近位にある１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断されると、活性化され、それによって二重特異性結合部分構造が放出され、その結果、それらが、標的リガンドに対するそれらの完全な結合親和性能力を取り戻すという、少なくとも３つの特性を考慮することにより推進された。対象組成物の設計は、ＸＴＥＮおよび放出セグメント（ＲＳ）成分のこれらの特性を活用するものであり、二重特異性結合部分構造に対するそれらの配置によって、下記の説明に役立つ実施例での結果により証明されるように、前述の特性が実現される。
【０２３６】
図１１および１２を参照して、例示的実施形態では、ＡＡＣの２つの結合部分構造は、短いリンカーにより互いに接続されており、そしてまた、放出セグメント（ＲＳ）ペプチドによりＸＴＥＮに接続されており、前記放出セグメントペプチドは、切断部位のいずれか１つまたはすべての切断のときに結合部分構造のＸＴＥＮからの分離および放出を可能にするように設計された３つ以下の異なる切断部位を含む。２つの結合部分構造と、単一のＲＳと、単一のＸＴＥＮとを有する、ＡＡＣの実施形態では、ＡＡＣは、未切断状態の場合にはＮ末端からＣ末端へＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ、またはディアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、もしくはＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ディアボディ（式中のディアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）の構造配置を有し得る。上述のＡＡＣ構成については、上記のように、ＦＢＭは、表４の抗体を含む、エフェクター細胞に対する結合親和性を有する抗体に由来するＶＬおよびＶＨを有し、ＳＢＭ  ＶＬおよびＶＨは、表５の抗体を含むがこれらに限定されない、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する抗体に由来し、放出セグメントは、表１または表２の配列に対して８８〜１００％の同一性を有する配列を有し、ＸＴＥＮは、表８または表１０の配列に対して９０〜１００％の同一性を有する配列を有する。
【０２３７】
他の実施形態では、本開示は、２つの結合部分構造と、２つのＲＳと、２つのＸＴＥＮとを有する、ＡＡＣを提供する。これらのＡＡＣの設計は、対象に投与されたとき健康な組織または細胞へのＡＡＣの意図せぬ結合を低減させるために第２のＸＴＥＮを追加することによりＦＢＭおよびＳＢＭ抗体断片のそれぞれのリガンドに対する未切断組成物の結合親和性をさらに低下させ、それによって、１つのＲＳおよび１つのＸＴＥＮしか有さないＡＡＣと比較して対象組成物の治療指数をさらに改善することを考慮することにより推進された。実施例で説明されるように、第２のＲＳおよび第２のＸＴＥＮの追加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされたときに単一のＲＳおよびＸＴＥＮを有するＡＡＣと比べてＦＢＭおよびＳＢＭ抗体断片のそれぞれのリガンドに対する無傷の未切断ＡＡＣの結合親和性の驚くべき低下をもたらし、疾患の動物モデルにおいて毒性の低下ももたらした。２つの結合部分構造と、２つのＲＳと、２つのＸＴＥＮとを有する、ＡＡＣの実施形態では、ＡＡＣは、未切断状態の場合にはＮ末端からＣ末端へＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ディアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１（この式中のディアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）、またはＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ディアボディ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２（この式中のディアボディは、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む）の構造配置を有し得る。上述のＡＡＣ構成については、上記のように、ＦＢＭは、表４の抗体を含む、エフェクター細胞に対する結合親和性を有する抗体に由来するＶＬおよびＶＨを有し、ＳＢＭ  ＶＬおよびＶＨは、表５の抗体を含むがこれらに限定されない、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する抗体に由来し、放出セグメントは、表１または表２の配列に対して８８〜１００％の同一性を有する配列を有し、ＸＴＥＮは、表８または表１０の配列に対して９０〜１００％の同一性を有する配列を有する。
【０２３８】
ＡＡＣから放出される各結合部分構造の結合親和性が、それぞれの標的リガンドに対して、例えば、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイでアッセイされたとき、切断されていない無傷組成物の結合部分構造と比較して大きいことが、本開示の目的である。一実施形態では、プロテアーゼによるＲＳの切断により組成物から放出されるエフェクター細胞結合部分構造の結合親和性は、放出されたエフェクター細胞抗原に対して、前記エフェクター細胞抗原を細胞表面に有するエフェクター細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイで測定して、または結合しているエフェクター細胞抗原を用いてＥＬＩＳＡで測定して、同等の条件下、例えば、等モル濃度下でアッセイされたときの無傷ＡＡＣのエフェクター細胞結合部分構造と比較して、少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、または少なくとも１０，０００倍大きい。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、ＣＤ３である。他の実施形態では、プロテアーゼによるＲＳの切断により組成物から放出される標的細胞結合部分構造の結合親和性は、標的マーカーまたは標的細胞抗原に対して、前記抗原を細胞表面に有する腫瘍細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイで測定して、または結合しているエフェクター細胞抗原を用いてＥＬＩＳＡで測定して、同等の条件下、例えば、等モル濃度下でアッセイされたときの無傷ＡＡＣの標的細胞結合部分構造と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、または少なくとも１０，０００倍大きい。上述のものの一実施形態では、標的マーカー、または標的細胞の抗原は、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６  βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グロボＨ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される。具体的には、この段落の実施形態では、ＸＴＥＮの遮蔽効果は、活性化可能な組換えポリペプチド組成物の無傷のプロドラッグ形態の上述の実施形態の両方の結合部分構造に適用されると考えられ、ＲＳの切断によるＡＡＣからのＸＴＥＮの放出のときに、それぞれの結合部分構造の完全な結合能が取り戻されると考えられる。
【０２３９】
特定の理論により拘束されるものではないが、上記のようにＡＡＣの二重特異性結合部分構造形式を使用すると、放出された、融合したＦＢＭ抗体断片とＳＢＭ抗体断片が、予備刺激および／または共刺激を一切必要とせずに細胞傷害性エフェクター細胞の動員により標的細胞を死滅させることが可能であると考えられる。さらに、エフェクター細胞の予備刺激および／または共刺激に依存しないことは、放出された結合部分構造により媒介される並外れて高い細胞傷害性に大いに寄与する可能性がある。一部の実施形態では、放出されたＦＢＭは、腫瘍細胞またはがん細胞に関連付けられる標的細胞マーカーに対する結合特異性を有するＳＢＭ（リンカーペプチドによりＦＢＭに連結されたままである）によって標的細胞マーカーを事前選択するために、結合特異性を考慮して設計されており、したがって、そのＦＢＭは、細胞傷害性エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ細胞））に結合し、それらを連結させる能力があり、それによって、免疫学的シナプスをもたらし、および標的腫瘍またはがん細胞に対する放出されたサイトカインおよびエフェクター分子の選択的な、方向付けられた、局所的効果をもたらし、その結果、その腫瘍またはがん細胞が、損傷され、または破壊されて、対象に治療利益をもたらすことになる。一実施形態では、エフェクター細胞抗原に結合する放出されたＦＢＭは、エフェクター細胞の１つまたは複数の機能をモジュレートして、標的腫瘍細胞に対する細胞溶解効果をもたらす、またはそのような細胞溶解効果に寄与することが可能である。エフェクター細胞抗原は、エフェクター細胞または他の細胞により発現され得る。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、エフェクター細胞の細胞表面に発現される。非限定的な例は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ１０７、およびＣＤ１５４である。したがって、対象組成物の構成が、組成物が投与される対象において活性形態の組成物を健康な組織または健康な細胞と比較して標的腫瘍組織またはがん細胞に選択的にまたは偏って送達し、その結果、治療利益を得ることを意図したものであることは、当業者には理解されると予想される。上述のことから明らかであるように、本開示は、所望の特性をもたらすように設計された構成のポリペプチドの大きなファミリーを提供する。
【０２４０】
無傷ＡＡＣのＸＴＥＮを遮蔽し、付随してＴ細胞および標的細胞への結合を低減させる、ＡＡＣの設計が、対象に投与されたとき全身曝露中にＴｈ１  Ｔ細胞関連サイトカインまたは他の前炎症性メディエーターの産生の低減をもたらし、その結果、全体的な副作用および安全性プロファイルが、ＸＴＥＮなどの嵩高な部分構造に連結されていない二重特異性結合組成物と比較して改善されることが、本開示の目的である。細胞免疫の重要な成分として、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマの産生は、Ｔｈ１応答の顕著な特徴（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｓ．  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  （Ｔｈ１  ｖｅｒｓｕｓ  Ｔｈ２）．  Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００．  ８５（１）：９−１８）、特に、抗ＣＤ３により刺激されたＴ細胞におけるＴｈ１応答の顕著な特徴であり（Ｙｏｏｎ，  Ｓ．Ｈ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４−ＣＤ４＋  Ｔｈ１  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２００９．  ４１（３）：１６１−１７０）、Ｉｌ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０もまた、二重特異性抗体組成物についての細胞傷害性応答に重要な前炎症性サイトカインである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｎｌｅａｓｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ＣＤ１９／ＣＤ３  ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ  （ＢｉＴＥ（登録商標））  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （２０１５）  ２７（１）：  ３１−３７）。一実施形態では、無傷の未切断ＡＡＣは、無傷の未切断ＡＡＣがエフェクター細胞および標的細胞と接触しているとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞に基づくサイトカイン刺激アッセイ（例えば、下記の実施例で説明されるもの）において、同等の条件下、例えば、等モル濃度下で行われる前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞に基づく刺激サイトカインアッセイにおけるプロテアーゼ処理ＡＡＣの対応する第１および第２の放出された結合部分構造（これらは、放出後も連結されたままである）により刺激されるサイトカインレベルと比較して、３分の１以下、または４分の１以下、または５分の１以下、または６分の１以下、または７分の１以下、または８分の１以下、または９分の１以下、または１０分の１以下、または２０分の１以下、または３０分の１以下、または５０分の１以下、または１００分の１以下、または１０００分の１以下の、Ｔｈ１および／または前炎症性サイトカインの産生をもたらす能力の低下を示す。Ｔｈ１および／または前炎症性サイトカインの非限定的な例は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマである。上述のものの一実施形態では、Ｔｈ１サイトカインの産生は、ＰＢＭＣまたはＣＤ３＋Ｔ細胞などのエフェクター細胞と、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカルＮｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリー���ンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有する標的細胞とを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで、アッセイされる。前述のものの別の実施形態では、アッセイされるサイトカインは、ＩＬ−２である。前述のものの別の実施形態では、アッセイされるサイトカインは、ＴＮＦ−アルファである。前述のものの別の実施形態では、アッセイされるサイトカインは、ＩＦＮ−ガンマである。別の実施形態では、ＡＡＣの放出された結合部分構造により結合され得る標的細胞マーカーを有する腫瘍を有する対象に投与された無傷の未切断ＡＡＣは、前記対象において、等モル濃度の投薬を受けた腫瘍に罹患している匹敵する対象におけるプロテアーゼ処理ＡＡＣの対応する放出された結合部分構造により産生されるサイトカインレベルと比較して、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、６分の１以下、７分の１以下、８分の１以下、９分の１以下、１０分の１以下、２０分の１以下、３０分の１以下、５０分の１以下、１００分の１以下、または１０００分の１以下の、Ｔｈ１および／または前炎症性サイトカインの全身的産生をもたらす能力の低下を示す。前述の実施形態では、対象から除去した血液、体液または組織試料からのサイトカインを評定することができる。前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サルおよびヒトであり得る。しかし、対象ＡＡＣの利点として、組成物の細胞溶解特性は、サイトカインによる予備刺激を必要としないこと；結合部分構造により標的細胞に結合されたエフェクター細胞の免疫学的シナプスの形成は、標的細胞において細胞溶解またはアポトーシスを果たすのに十分なものであることが、判明した。とは言うものの、前炎症性サイトカインの産生は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによるにせよ、腫瘍に罹患している対象の処置のモニタリングでにせよ、対象ＡＡＣの効力または効果を評定するために有用なマーカーである。
【０２４１】
上で言及した結合部分構造実施形態に従って、標的細胞マーカー抗原を認識する結合部位が、破壊すべき標的細胞を高効率で捕捉するために高い結合親和性を有すると有利である。好ましい実施形態では、放出される標的細胞結合部分構造の標的細胞結合部分構造が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイで判定して１０−７〜１０−１０Ｍの範囲のＫｄ値での親和性を有するので、本開示のＡＡＣには、腫瘍細胞を死滅させるために何度も使用することができるという利点がある。標的細胞マーカーに結合するための二重特異性結合部分構造の親和性が高すぎると、組成物は、発現している標的細胞に結合してその表面に残存し、そのため、遊離して別の細胞に結合することができなくなる。一実施形態では、対象ＡＡＣの放出されたエフェクター細胞結合部分構造は、詳細な例が下記の実施例で説明されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイで判定して、１０−５〜１０−８Ｍの間の結合定数を有する。別の実施形態では、対象ＡＡＣの放出されたエフェクター細胞結合部分構造（ＦＢＭ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＫｄ定数として判定して、標的細胞マーカーに対するＳＢＭのより大きい結合親和性と比較して少なくとも１桁小さい、エフェクター細胞リガンドに対するより小さい結合親和性を有する。
【０２４２】
別の態様では、ＡＡＣのＲＳが、標的細胞の環境で哺乳動物プロテアーゼにより切断され、プロドラッグ形態から活性化形態またはアポタンパク質形態に変換されると、組成物からの二重特異性結合部分構造およびＸＴＥＮの切断および放出のときに、融合したＦＢＭとＳＢＭが、エフェクター細胞（例えば、ＣＤ３を有するＴ細胞）と、ＳＢＭの標的となる標的細胞の標的細胞マーカーを有する腫瘍またはがん細胞とに結合し、それらを連結させ、そうするとエフェクター細胞が活性化されることが、設計組成物の特徴である。ＡＡＣのＲＳが切断され、結合部分構造が放出される、一実施形態では、エフェクター細胞および標的細胞のその後の同時に起こる結合は、エフェクター細胞の少なくとも３倍、または１０倍、または３０倍、または１００倍、または３００倍、または１０００倍の活性化をもたらし、前記活性化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞に基づくアッセイで評定される、サイトカインの産生、細胞溶解性タンパク質、または標的細胞の溶解により評定される。別の実施形態では、ＣＤ３抗原を有するＴ細胞、および標的細胞の標的細胞マーカーを有する腫瘍細胞の、放出された結合部分構造による同時に起こる結合であって、腫瘍細胞を溶解することが可能なＴ細胞由来エフェクター分子の放出をもたらす結合によって、免疫学的シナプスが形成される。エフェクター細胞活性化および／または細胞溶解を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例としては、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、ＦＡＣＳに基づくヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、ＥＬＩＳＡ、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光測定ユーロピウム放出アッセイ、カルセインＡＭ放出アッセイ、測光ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定３Ｈ−Ｔｈｄ組込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光測定ローダミン１２３アッセイ、ＦＡＣＳに基づくホスファチジルセリン曝露によりモニターされるアポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡに基づくＴＵＮＥＬ試験アッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、および細胞形態アッセイ、またはサイトカイン、細胞溶解性タンパク質、もしくは細胞の溶解についてのアッセイのための当技術分野において公知の他のアッセイ、または下記の実施例の方法が挙げられる。
【０２４３】
対象組成物を使用する対象の処置に関して、ＡＡＣが、プロドラッグ形態で存在し、疾患組織または細胞と共局在化されたプロテアーゼの作用によってある特定の細胞環境に入るとより活性の高い形態に変換されることは、当業者には理解されると予想される。標的組織におけるプロテアーゼの作用による組成物からの放出のときに、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第１の結合部分構造、および腫瘍特異的マーカーもしくは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有する連結された第２の結合部分構造は、標的細胞に対するエフェクター細胞に結合してこれらの細胞を連結させる、それらの能力を完全に取り戻し、その結果、免疫学的シナプスが形成される。免疫学的シナプスの形成に起因して、エフェクター細胞が活性化され、それに伴って、様々なシグナル経路が、新たな遺伝子転写、およびエクソサイトーシスによるその小胞のエフェクター分子内容物の放出のスイッチを入れる。エフェクター細胞の型に依存して、異なるサイトカインおよびリンホカインが放出され、例えば、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）は、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−アルファのようなサイトカインを放出し、その一方で、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）は、Ｂ細胞を刺激するＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３のようなサイトカインを放出し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、標的を死滅させるパーフォリンおよびグランザイムのような細胞傷害性分子（総称して「エフェクター分子」）を放出する。具体的には、ＡＡＣの放出された二重特異性結合部分構造による、非常に低いエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比での標的腫瘍細胞へのエフェクター細胞の同時結合とそれらが一緒に連結するときに、腫瘍細胞が、前記エフェクター細胞により細胞間の免疫学的シナプスに放出されたエフェクター分子による作用を受け、その結果、腫瘍細胞の損傷、パーフォリン媒介溶解、グランザイムＢ誘導細胞死および／またはアポトーシスが生じることになると、考えられる。したがって、別の態様では、活性化可能な組換えポリペプチド組成物が、腫瘍に罹患している対象に投与されたとき、プロドラッグ形態は、正常な組織における循環系には残存するが、腫瘍のより透過性の高い血管系では血管外漏出することができ、その結果、このアセンブリのプロドラッグ形態は、腫瘍と共局在化されたプロテアーゼにより活性化され、放出された結合部分構造は、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）、および前記組成物のＳＢＭの標的となる標的細胞マーカーを発現する腫瘍細胞に結合してそれらを連結させ、そうすると、エフェクター細胞が活性化され、腫瘍細胞の溶解が果たされることが、設計組成物の特徴である。上述のものの一実施形態では、腫瘍細胞とエフェクター細胞の両方に結合している、対象の腫瘍内の放出された結合部分構造は、対応する無傷の未切断ＡＡＣと比較して、エフェクター細胞を活性化する能力の少なくとも１０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍の増大を示す。上述のものの別の実施形態では、腫瘍細胞とエフェクター細胞の両方に結合している、対象の腫瘍内の放出された結合部分構造は、切断されていない対応する無傷ＡＡＣと比較して、腫瘍細胞を溶解する能力の少なくとも１０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍の増大を示す。上述の実施形態では、エフェクター細胞活性化および／または細胞傷害性を、当技術分野において公知の従来の方法、例えば、活性化されたエフェクター細胞のサイトメトリー測定、サイトカインのアッセイ、腫瘍サイズの測定により、または病理組織診断により、アッセイすることができる。上述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、イヌ、サルおよびヒトであり得る。特に、具体的には、対象組成物は、プロドラッグ形態の結合部分構造に対する結合親和性に対するＸＴＥＮの遮蔽効果と立体障害の組合せにより達成される、治療指数の向上および毒性または副作用の低減を有するが、ＲＳが基質であるプロテアーゼを産生する標的組織（例えば、腫瘍）の近位にあるまたはそのような標的組織内にある二重特異性結合部分構造を放出することができる（ＲＳに切断配列を含めることにより達成される）ように、設計されると考えられる。
【０２４４】
一般に、組成物に組み込まれる約４００残基より長い累積長を有するＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていないタンパク質と比較して組換えタンパク質の流体力学的半径の増加、見かけの分子量の増加、および見かけの分子量係数の増加をもたらす。例えば、ＸＴＥＮの組み込みは、おおよそ３〜５ｎｍの糸球体孔径（約７０ｋＤａの見かけの分子量に相当する）を超えて対象組成物の流体力学的半径を効果的に拡大することができ（Ｃａｌｉｃｅｔｉ．  ２００３．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．    Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５５：１２６１−１２７７）、その結果、循環タンパク質の腎クリアランスが低減され、相応じて終末相半減期が増加することになる。ＸＴＥＮによりもたらされる流体力学的半径の増加はまた、５〜１２ｎｍの平均細孔径を有する正常な、健康な組織の領域では循環系からの無傷のプロドラッグ形態のＡＡＣの血管外漏出を低減させるが、上皮細胞間結合部位がより多孔性である場合、腫瘍を透過する血管内の無傷組成物分子の退出を可能にする。正常な血管より高い血管透過性などの、腫瘍血管系の様々な機能が損なわれることは、昔から知られている（Ｄｕｒａｎ−Ｒｅｙｎａｌｓ，  Ｆ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｅｓ  ａｎｄ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３５：９８−１０７  （１９３９）；Ｂａｂｓｏｎ  ＡＬ，  Ｗｉｎｎｉｃｋ  Ｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｒａｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ１４：６０６−６１１  （１９５４））。これらの損なわれた機能は、腫瘍組織で検出される血漿タンパク質の、正常組織で検出される場合より高い濃度の一因となる。この現象は、Ｍａｅｄａおよび共同研究者により解明されており（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｙ，  Ｍａｅｄａ  Ｈ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４６：６３８７−６３９２  （１９８６）；Ｍａｅｄａ  Ｈ，  Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｙ．  Ｔｕｍｏｒｉｔｒｏｐｉｃ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇｓ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  ６：１９３−２１０  （１９８９））、彼らは、この現象を、巨大分子が腫瘍内に蓄積する最終結果を伴う、腫瘍血管の透過性の増大と腫瘍における機能的リンパ管のクリアランス速度の低下との組合せに起因する血管透過性・滞留性亢進効果として記載した。非内在性巨大分子の通過に対する大半の非類洞毛細血管の毛細血管壁の細孔径の生理学的上限は、５〜１２ｎｍの範囲であることは、一般に公知である（Ｈｅｍａｎｔ  Ｓａｒｉｎ．  Ｊ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓ  Ｒｅｓ．  ２０１０；  ２：１４）が、脳腫瘍と末梢腫瘍の両方の血管・腫瘍関門における内皮細胞間間隙は、直径４０ｎｍ〜２００ｎｍのまたはそれを超える範囲にわたると報告されている（Ｓａｒｉｎ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ���ｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００９  ７：５１）。本開示の目的では、対象ＡＡＣは、ＸＴＥＮの追加による細孔径のこの差を利用して、正常な組織では無傷ＡＡＣの血管外漏出が低減されるが、腫瘍血管系の漏出性環境または他の炎症領域では、無傷アセンブリが血管外漏出し、その腫瘍環境でプロテアーゼにより活性化されて、エフェクターおよび標的細胞に結合部分構造を放出することができるように、設計された。ＡＡＣのＲＳの場合、設計は、ＡＡＣが、罹患組織、例えば、１つまたは複数のプロテアーゼを生産する腫瘍に近接すると、腫瘍により発現された１つまたは複数のプロテアーゼに対して感受性であるＲＳ配列がプロテアーゼにより切断され得る（上で、より詳しく説明された）、環境を活用する。プロテアーゼの作用により、組成物の放出セグメント（ＲＳ）が切断されて、ＸＴＥＮから結合部分構造が分離され、その結果、特に、放出された結合部分構造について、分子量および流体力学的半径が低減された成分が得られる。理解されると予想されるが、組成物の分子量および流体力学的半径の減少は、放出された結合部分構造が、溶液中でより自由に移動することができ、組織および腫瘍内のより小さい孔隙を通って移動することができ、腫瘍血管系のより大きい細孔からより容易に血管外漏出することができ、より容易に腫瘍に侵入することができるという特性も付与し、その結果、エフェクター細胞および腫瘍細胞に結合してそれらを連結させる能力が増大することになる。そのような特性を種々のアッセイによって測定することができる。
【０２４５】
ＡＡＣのＲＳが哺乳動物プロテアーゼにより切断される、一実施形態では、ＡＡＣからの二重特異性結合部分構造およびＸＴＥＮの切断および放出のときに、結合部分構造は、リン酸緩衝食塩水中で、無傷ＡＡＣ組成物と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍大きい拡散係数を有する。別の実施形態では、無傷ＡＡＣ組成物の見かけの分子量は、前記見かけの分子量がサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により判定されたとき、哺乳動物プロテアーゼによるＲＳの切断により放出された結合部分構造より少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。別の実施形態では、無傷ＡＡＣ組成物の流体力学的半径は、流体力学的半径がサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により判定されたとき、哺乳動物プロテアーゼによるＲＳの切断により放出された結合部分構造より少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。別の実施形態では、本開示は、ＡＡＣから結合部分構造およびＸＴＥＮを放出させるためのＲＳの切断のときに放出される結合部分構造の流体力学的半径が、流体力学的半径がサイズ排除クロマトグラフィーにより評定されたとき、無傷ＡＡＣの流体力学的半径の約３０％未満、または約４０％未満、または約５０％未満である、ＡＡＣを提供する。別の実施形態では、本開示は、ＡＡＣから結合部分構造およびＸＴＥＮを放出させるためのＲＳの切断のときに放出される結合部分構造の流体力学的半径が、流体力学的半径がサイズ排除クロマトグラフィーにより判定されたときに約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または３ｎｍ未満である、ＡＡＣを提供する。別の実施形態では、本開示は、ＡＡＣから結合部分構造およびＸＴＥＮを放出させるためのＲＳの切断のときに、流体力学的半径がサイズ排除クロマトグラフィーにより判定して約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または３ｎｍ未満の流体力学的半径を有する放出された結合部分構造が、無傷ＡＡＣと比較して腫瘍組織へのより大きい透過能を有する、ＡＡＣを提供する。別の実施形態では、本開示は、流体力学的半径がサイズ排除クロマトグラフィーにより評定されたとき、無傷の未切断ＡＡＣの流体力学的半径が、約８ｎｍより大きい、または約９ｎｍより大きい、または約１０ｎｍより大きい、または約１２ｎｍより大きい、ＡＡＣを提供する。
【０２４６】
対象組成物は、対象に投与されたとき、それらの設計およびＸＴＥＮへの連結により、ＸＴＥＮに連結されていない対応する結合部分構造と比較して増強された薬物動態学的特性を有すると考えられる。一実施形態では、治療有効用量を使用して対象に投与されるＡＡＣ組成物は、対象への投与時または投与後、対象において、組成物に連結さていない対応する結合部分構造と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または１００倍大きく増加される終末相半減期を示す。別の実施形態では、治療有効用量を使用して対象に投与されるＡＡＣ組成物は、対象への投与時または投与後、組成物に連結されていない対応する結合部分構造と比較して少なくとも２５％、５０％、１００％、２００％、または少なくとも３００％のまたはそれを超える曲線下面積（ＡＵＣ）の増加を示す。別の実施形態では、治療有効用量を使用して対象に投与されるＡＡＣ組成物は、対象への投与時または投与後、組成物に連結さていない対応する結合部分構造と比較して少なくとも２５％小さい、または５０％、または１００％、または２００％、または少なくとも３００％小さい、より小さい分布容積を示す。一実施形態では、治療有効用量を使用して対象に投与されるＡＡＣ組成物は、対象への投与後、少なくとも約２０時間、または少なくとも約３０時間、または少なくとも約３２時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間、または少なくとも約７日、または少なくとも約１０日、または少なくとも約１４日の終末相半減期を示す。別の態様では、腫瘍などの、しかしこれに限定されない、罹患組織に付随するプロテアーゼによって優先的に活性化される対象ＡＡＣの設計のため、対象の循環血中の放出された結合部分構造の濃度が低くなり、それによって、保護ＸＴＥＮおよび放出セグメントを有さない二重特異性組成物と比較して改善された安全性プロファイルおよびより低い副作用発生率に寄与することになると、具体的に考えられる。一実施形態では、本開示は、キメラポリペプチド組成物の対象への単回投与時または投与後に組成物のＲＳを切断することが可能なプロテアーゼによるＲＳの切断によりＡＡＣから放出される結合部分構造の血漿Ｃｍａｘ濃度が、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、または約０．０３ｎｇ／ｍｌ、または約０．１ｎｇ／ｍｌ、または約０．３ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌを超えない、ＡＡＣを提供する。別の実施形態では、本開示は、組成物のＲＳを切断することが可能なプロテアーゼによりＲＳが切断された、キメラポリペプチド組成物の対象への単回投与後のＡＡＣから放出される結合部分構造の血漿Ｃｍａｘ濃度が、同じ対象における無傷ＡＡＣの血漿レベルの１０分の１以下、または３０分の１以下、または１００分の１以下、または１０００分の１以下である、ＡＡＣを提供する。この段落の上述の実施形態では、対象は、マウス、またはラット、またはイヌ、またはサル、またはヒトである。
【０２４７】
本明細書に記載されるＡＡＣ構築物は、旧来のモノクローナル抗体および他のより小さい二重特異性分子に勝る複数の治療上の利点をもたらす。特に注目すべきは、本開示のＡＡＣの条件次第の活性化である。構築物は、放出セグメントによりＡＡＣに繋留されている嵩高い非構造化ＸＴＥＮの遮蔽効果のため、それらの所期の標的細胞マーカーに結合する能力が低下している。したがって、罹患していない正常組織に対する本開示の例示的組成物の特異的活性は、類似の抗体および抗体断片のものと比較して有意に低下される。ポリペプチドが、それらの所望の作用部位（例えば、腫瘍またはがん細胞などの罹患組織の近位）で活性化することができること、その一方で、この部位への進行中には不活性のままであることは、治療指数が改善された強力かつ特異的な治療薬、および容易に設計可能かつ製造可能な形式が見込まれる、がん免疫療法の分野における進歩である。
ＶＩＩ．組換えポリペプチド組成物の方法および使用
【０２４８】
別の態様では、本開示は、切断可能な組換えポリペプチド組成物、および活性化可能な抗体組成物、および組換えポリペプチドまたは活性化可能な抗体を含む医薬組成物であって、医療現場において、例えば、ある特定のがん、腫瘍または炎症性疾患の予防、処置および／または寛解において、特に有用である、前記組成物を提供する。
【０２４９】
ＴｃＲシグナル伝達を、特に、免疫抑制レジメンで広く臨床使用されている抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ部分を使用して、標的化することによる、Ｔ細胞応答のモジュレーションを含む、いくつかの治療戦略が、がん性疾患に罹患している対象の処置方法に使用するための組換えポリペプチド組成物を設計するために使用されている。ＣＤ３特異的モノクローナルＯＫＴ３は、ヒトでの使用が承認された初めてのそのようなモノクローナルであり（Ｓｇｒｏ，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０５  （１９９５），  ２３−２９）、移植において免疫抑制剤として広く臨床使用されている（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌ：  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ＯＫＴ３  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ７：４２２−４３０，  １９９３）。さらに、抗ＣＤ３モノクローナルは、部分的Ｔ細胞シグナル伝達およびクローンアネルギーを誘導することができる（Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８５  （１９９７），  １４１３−１４２２）。ＯＫＴ３は、シグナル伝達に不可欠である、Ｔ細胞の抗原認識構造（ＴＣＲ）と会合しているＣＤ３複合体である、Ｔ細胞膜におけるＣＤ３複合体と反応し、その機能を遮断する。これらのおよび他のそのようなＣＤ３特異的抗体は、サイトカイン産生（Ｖｏｎ  Ｗｕｓｓｏｗ，  Ｈｕｍａｎ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２７：１１９７−１２００  （１９８１））、増殖およびサプレッサーＴ細胞誘導を含む、様々なＴ細胞応答を誘導することができる。がんでは、細胞傷害性Ｔ細胞を利用してがん細胞を溶解する試みがなされている。理論により拘束されるものではないが、標的細胞溶解を果たすために、細胞傷害性Ｔ細胞は、直接細胞間接触を必要とすると考えられ、細胞傷害性Ｔ細胞上のＴＣＲは、標的細胞上の適切な抗原を認識し、それと会合しなければならない。これにより、免疫学的シナプスが作出され、その結果、細胞傷害性Ｔ細胞内でシグナル伝達カスケードが開始されて、Ｔ細胞活性化ならびに様々な細胞傷害性サイトカインおよびエフェクター分子の産生が引き起こされる。パーフォリンおよびグランザイムは、活性化された細胞傷害性Ｔ細胞中に存在する既成顆粒内に保管されている高毒性分子である。標的細胞の認識後、会合している細胞傷害性Ｔ細胞の細胞質顆粒は、細胞傷害性Ｔ細胞膜へと泳動して、最終的にそれと融合し、それらの内容物を免疫学的シナプスに方向付けられた方式で放出して標的細胞の膜内に細孔を形成し、その結果、腫瘍細胞の原形質膜を破壊する。生じた細孔は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するセリンプロテアーゼのファミリーであるグランザイムの侵入点としての役割を果たす。本開示は、標的細胞溶解を開始させるために、および有益な治療結果をもたらすために、エフェクター細胞に加えて、様々な悪性細胞、例えば腫瘍、を標的とするように操作されているＡＡＣを使用する方法であって、１つの結合部分構造が、ＣＤ３に結合し、それを使って細胞��害性Ｔ細胞を活性化し、その一方で、第２の結合部分構造を、特定の悪性腫瘍に特有である様々な異なる標的細胞マーカーを標的とするように設計することができ、免疫学的シナプスの作出のためにこれらの結合部分構造を互いに架橋させるように、前記ＡＡＣが設計されている、方法を企図している。この設計の特定の利点として、細胞傷害性エフェクター細胞とがん細胞の物理的結合は、抗原プロセシングのＭＨＣＩ／β２−ミクログロブリンの必要はもちろん共刺激分子の必要もなくす。重要な腫瘍細胞マーカーの例としては、表５のマーカーが挙げられるが、それらに限定されない。対象組成物ＡＡＣの様々な実施形態に組み込むことができる腫瘍特異的マーカー（上で、より詳細に説明された）の範囲のため、結果として生じる組成物は、固形腫瘍および血液腫瘍を含む様々ながんに対して有用性があることは、理解されると予想される。一実施形態では、本開示は、腫瘍に罹患している対象を処置する方法を提供する。処置されることになる腫瘍は、間質細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、リンパ球細胞、血管細胞、平滑筋細胞、間葉細胞、乳房組織細胞、前立腺細胞、腎臓細胞、脳細胞、結腸細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、胃細胞、泌尿生殖器細胞、子宮頸細胞、子宮細胞、小腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、胆嚢細胞、胆管細胞、食道細胞、唾液腺細胞、肺細胞、および甲状腺細胞からなる群から選択される細胞から生じる、腫瘍細胞を含み得る。組成物のさらなる利点として、細胞傷害性フェクター細胞は、架橋された標的がん細胞の損傷／破壊中に消費されないので、１つの標的細胞の溶解を引き起こした後、活性化されたエフェクター細胞は、遊離し、局所組織を通って他の標的がん細胞へとどんどん進み、標的抗原に結合し、さらなる細胞溶解を開始することができる。加えて、固形腫瘍のような局所的環境では、パーフォリンおよびグランザイムなどのエフェクター細胞分子の放出が、隣接しているが二重特異性結合ドメインの所与の分子により結合されていない腫瘍細胞の損傷をもたらすことになり、その結果、腫瘍の成長の停止または退縮が生じることになると、考えられる。
【０２５０】
したがって、標的細胞マーカーを有するがんまたは腫瘍に罹患している対象への、本明細書に記載のＡＡＣを含む医薬組成物の治療有効用量の投与後、前記組成物が、がんもしくは腫瘍細胞に付随するまたはがんもしくは腫瘍細胞と共局在化されたプロテアーゼによる作用を受けて、融合したＦＢＭとＳＢＭを放出することができ、したがって、免疫学的シナプスを標的細胞とエフェクター細胞の連結により作出することができ、その結果、標的細胞を溶解することが可能なエフェクター細胞由来エフェクター分子が、シナプスへと放出され、それによって、標的がんまたは腫瘍細胞のアポトーシス、細胞溶解、または死滅に至ることになるという、本開示の有用性は、理解されると予想される。さらに、ＡＡＣの使用は、放出された結合ドメインのエフェクター細胞および標的がん細胞への結合により免疫学的シナプスが形成されると「単回殺滅」に比べて持続性かつより全身性の有益な治療効果をもたらすことができることが、当業者には理解されると予想される。
【０２５１】
一態様では、本開示は、対象の疾患、例えばがんまたは炎症性疾患、を処置する方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、対象の疾患を処置する方法であって、本明細書に記載される組換えポリペプチドまたはＡＡＣを含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。医薬組成物の治療有効量は、個体の病態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起する抗体または抗体部分の能力などの、因子によって変わり得る。治療有効量は、対象組成物のいかなる毒性または有害効果よりも、治療上有益な効果のほうが上回る量でもある。予防有効量は、所望の予防結果を達成するために必要な期間にわたって必要とされる医薬組成物の量を指す。
【０２５２】
対象の疾患を処置する方法の一実施形態では、処置のための疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害または骨髄異形成障害を含む、原発性血液悪性腫瘍、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群であり得る。治療有効量は、がんまたは腫瘍を処置する（例えば、治癒するもしくは重症度を低下させる）ことまたは予防する（例えば、再発の尤度を低下させる）ことに役立つ点で有益な効果を生じさせることができる。対象の疾患を処置する方法の別の実施形態では、医薬組成物は、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回または月１回投与される２またはそれより多くの治療有効用量として対象に投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２週間、または少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月、または少なくとも４ヶ月、または少なくとも５ヶ月、または少なくとも６ヶ月の期間にわたって、２またはそれより多くの治療有効用量として対象に投与される。方法の別の態様では、第１の低いプライミング用量が、対象に投与され、その後、少なくとも２週間、または少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月、または少なくとも４ヶ月、または少なくとも５ヶ月、または少なくとも６ヶ月の投薬スケジュールにわたって１または複数のより高い維持用量が投与される。投与される初回プライミング用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇからなる群から選択され、投与される１または複数の後続の維持用量は、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４．ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０��ｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、くも膜下腔内または筋肉内投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、安全性および有効性を最大にするために耐容性に応じて、１もしくは複数の治療有効急速投与量としてまたは５分〜９６時間の注入により対象に投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、１もしくは複数の治療有効急速投与量としてまたは５分〜９６時間の注入により対象に投与され、前記用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４．ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、１もしくは複数の治療有効急速投与量としてまたは５分〜９６時間の期間にわたっての注入により対象に投与され、前記対象への投与は、前記対象において少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ〜少なくとも約２μｇ／ｍＬのまたはそれより高い無傷の未切断ＡＡＣのＣｍａｘ血漿濃度を生じさせる結果となり、このＣｍａｘ血漿濃度が、少なくとも約３日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日間維持される。治療有効用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、初回用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇからなる群から選択され、後続の用量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４．ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。上述の実施形態では、対象への投与は、対象において少なくとも約３日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日間、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ〜少なくとも約２ｎｇ／ｍＬのまたはそれより高い組換えポリペプチドの血漿濃度を生じさせる結果となる。方法の上述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サルおよびヒトであり得る。
【０２５３】
特に、医薬組成物は、上皮がん、好ましくは腺癌、または微小残存病変、より好ましくは早期固形腫瘍、進行性固形腫瘍もしくは転移性固形腫瘍の処置に使用することができる。加えて、本開示で提供される医薬組成物は、肉腫の処置に有用である。加えて、本開示で提供される組換えポリペプチドを含む医薬組成物は、リンパ腫および白血病の処置に有用であり、前記リンパ腫および白血病は、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害または骨髄異形成障害を含む、原発性血液悪性腫瘍；Ｂ細胞障害、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）を含み、ならびに／またはＢ細胞関連自己免疫疾患、例えば重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎もしくはグッドパスチャー症候群、を有する。加えて、本開示で提供される組換えポリペプチドを含む医薬組成物は、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸、子宮がん、腹膜の中皮腫、膵臓がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、および胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）を含む、腹水をもたらすがんの処置に有用である。
【０２５４】
一態様では、本開示は、組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物を含む、医薬組成物の投与により媒介される、がんまたは腫瘍において有益な効果を達成する方法を提供する。方法の一実施形態では、本開示は、医薬組成物の使用であって、前記組成物の１つの結合部分構造が、エフェクター細胞ＣＤ３抗原に結合する親抗体に由来し、第２の結合ドメインが、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカルＮｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）からなる群から選択される標的細胞マーカー抗原に結合する親抗体に由来する、前記医薬組成物の治療有効量の投与によって、それを必要とする対象のがんまたは腫瘍を処置する方法における、使用を提供する。方法の一実施形態では、医薬組成物の治療有効量の投与は、基礎がんまたは腫瘍障害の根絶または寛解をもたらし、その結果、対象が依然として基礎障害に罹患している可能性があるにもかかわらず対象において改善が観察される。
【０２５５】
別の実施形態では、本開示は、ＡＡＣを含む医薬組成物の使用であって、前記組成物の１つの結合部分構造が、表４の抗体からなる群から選択されるエフェクター細胞に対する親抗体に由来し、第２の結合部分構造が、表５の抗体からなる群から選択される標的細胞標的抗原に結合する親抗体に由来する前記医薬組成物であって、表１または表２の１つまたは複数のＲＳ、および表８または表１０の１つまたは複数のＸＴＥＮをさらに含み、前記ＡＡＣが、本明細書に記載の構成を有する、前記医薬組成物の治療有効量の投与によって、対象のがんまたは腫瘍を処置する方法における、使用を提供する。一実施形態では、方法の医薬組成物用量は、急速投与量として投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物用量は、各々、静脈内注入により投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物用量は、各々、腹部内注入により投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物用量は、各々、動脈内注入により投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物用量は、各々、皮下注射により投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物用量は、各々、筋肉内注射により投与される。この段落の上述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、イヌ、サルおよびヒトからなる群から選択される。
【０２５６】
別の態様では、本開示は、処置レジメンに従って対象のがんまたは腫瘍を処置する方法に関する。一実施形態では、本開示は、対象のがんまたは腫瘍を処置する方法であって、本明細書で開示される組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物を含む医薬組成物の治療有効量の２回またはそれより多くの連続投与を含む処置レジメンに従って疾患に罹患している対象に投与するステップを含む方法を提供する。本開示は、対象のがんまたは腫瘍を処置する方法であって、医薬組成物の治療有効量の２回またはそれより多くの連続投与を含む処置レジメンに従って疾患に罹患している対象に投与するステップを含み、医薬組成物の治療有効量の対象への投与が、＿＿を含む有益な治療効果を達成する、方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、対象のがんまたは腫瘍を処置する方法であって、本明細書で開示される医薬組成物の治療有効量の２回またはそれより多くの連続投与を含む処置レジメンに従って疾患に罹患している対象に投与するステップを含み、前記処置レジメンが、対象の疾患に関連付けられる臨床パラメーターまたはエンドポイントの改善をもたらす、方法を提供する。前述のことに関して、臨床パラメーターまたはエンドポイントは、完全、部分的または不完全奏功としての腫瘍縮小；無増悪期間；治療成功期間；バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；再発までの期間；転移までの期間；全生存期間；生活の質の向上；および症状の改善からなる群の１つまたは任意の組合せから選択される。
【０２５７】
別の態様では、本開示は、処置レジメンが特定処置サイクルの一部である、使用の方法に関する。方法の実施形態では、処置レジメンの特定処置サイクルは、本明細書で開示される組換えポリペプチドまたはＡＡＣを含む医薬組成物を、各処置サイクルに従って週２回、週に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、または月に１回、投与することを含む。方法の別の実施形態では、処置レジメンは、疾患の処置に使用され、前記疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害または骨髄異形成障害を含む、原発性血液悪性腫瘍、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。
【０２５８】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示される対象組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物を利用して、がん細胞などの標的細胞の死滅を誘導する、改善された方法であって、標的細胞または組織の死滅をもたらすか、またはアポトーシスを誘導するが、毒性および副作用が低い方法に関する。本発明の方法の特定の利点として、組成物の向上した特性は、組織および細胞への標的送達のため、および優れた治療指数を生じさせる結果となる向上した薬物動態学的特性、すなわち、毒性が低い改善された有効性のため、両方の理由で、より低用量の医薬製剤、または低減された投薬量、低減された投薬頻度および優れた用量レジメンを使用する処置方法を可能にする。したがって、対象組成物は、組換えポリペプチドにもＡＡＣにも連結されていない対応する結合部分構造と比較して優れた有効性および安全性を有することができる。なぜなら、結合された嵩高な部分構造は、健康な組織への非特異的結合を低減させることおよび健康な組織における循環系からの血管外漏出を防止することができる一方で、ＲＳの切断および嵩高な部分構造の放出のときにがんまたは腫瘍組織への侵入および結合の増強を可能にし、したがって、組成物の切断のときに放出された結合部分構造に対してプロドラッグ形態の差異のある局在化が生じる結果となるからである。一実施形態では、本開示は、標的細胞の死滅を誘導する方法であって、標的細胞およびエフェクター細胞を本明細書に記載されるＡＡＣと接触させるステップを含み、前記接触が、標的細胞において、膜完全性の喪失、核濃縮、核崩壊、内因性アポトーシス経路の誘導、外因性アポトーシス経路の誘導、アポトーシス、細胞溶解および細胞死からなる群から選択される効果を生じさせる結果となる、方法を提供する。効果は、標的細胞とエフェクター細胞の混合集団と、標的細胞マーカーおよびエフェクター細胞に対する結合親和性を有する組換えポリペプチドの有効量とを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞に基づくアッセイで、判定することができる。
【０２５９】
他の実施形態では、本開示は、がんに罹患している対象において、標的細胞の集団を含む、標的細胞の死滅を誘導する方法を提供する。方法の一実施形態では、方法は、組換えポリペプチドまたはＡＡＣを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。方法の別の実施形態では、方法は、１回または複数回連続投与される治療有効用量として医薬組成物を投与するステップを含む。方法の別の実施形態では、方法は、がんに罹患している対象において治療効果を達成するために必要な医薬組成物の量を決定するステップ、およびその量を２回またはそれより多くの連続用量として対象に投与するステップを含む。上述の方法では、がんは、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液性腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、黒色腫、泌尿生殖器がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌腫症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸、子宮がん、腹膜の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞性慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。方法の別の実施形態では、方法は、医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含み、この方法は、臨床パラメーターまたはエンドポイントの改善をもたらす。例示的な臨床パラメーターまたはエンドポイントは、全生存期間、症状エンドポイント、無病生存期間、客観的奏功率、完全奏功、奏功期間、無増悪生存期間、無増悪期間、治療成功期間、腫瘍測定値、腫瘍サイズ、腫瘍応答率、転移までの期間、およびバイオマーカー濃度であり得る。方法の別の実施形態では、方法は、医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含み、この方法は、対象における診断により関連付けられた副作用の頻度、期間または重症度を、ＡＡＣのＦＢＭおよびＳＢＭを含む組成物のミリモル／ｋｇでの同等用量の同等の対象への投与と比較して低減させる結果となり、前記副作用は、ＩＬ−２の血漿レベルの上昇、ＴＮＦ−アルファの血漿レベルの上昇、ＩＦＮ−ガンマの血漿レベルの上昇、敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、錯乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、見当識障害、および肝臓酵素の増加からなる群から選択される。
【０２６０】
本開示の方法は、所望のパラメーターまたは臨床効果を達成および／または維持するのに十分な期間にわたっての医薬組成物の治療有効量の連続用量の投与を含むことができ、治療有効量のそのような連続用量によって、医薬組成物の治療有効用量レジメン、すなわち、用量が、本明細書に記載されるがんおよび腫瘍を含むがそれらに限定されない、がんの病態または病状についての任意の臨床徴候もしくは症状、態様、測定パラメーターまたは特徴に対して持続的な有益な効果もたらすように治療有効量で与えられる、連続投与される用量のスケジュールが確立される。
【０２６１】
本発明の方法の場合、患者にとっての利便性を改善するために、投与間の間隔を増すために、および持続的な効果を達成するのに必要な薬物の量を低減させるために、ＡＡＣ組成物のより長く作用する組換えポリペプチドが好ましい。一実施形態では、処置の方法は、それを必要とする対象への組換えポリペプチドまたはＡＡＣを含む医薬組成物の治療有効用量の投与であって、医薬組成物の結合部分構造成分について確立された治療域内で費やされる時間が、融合タンパク質に連結されていないおよび同等モル用量で対象に投与される対応する結合部分構造成分と比較して増加する結果となる、投与を含む。一部の場合には、治療域で費やされる時間の増加は、組換えタンパク質にもＡＡＣにも連結されていないおよび同等モル用量で対象に投与される対応する結合部分構造成分と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍大きい。これらの方法により、さらに、それを必要とする対象に治療有効用量レジメンを使用して投与される医薬組成物の複数の連続用量の投与は、融合タンパク質に連結されていない対応する結合部分構造成分と比較して前記組成物の血中レベルについて連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間の増加をもたらすことができることとなる。前述の実施形態では、連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間で費やされる時間の増加は、融合タンパク質に連結されていないおよび標的化成分について確立された同等モル用量レジメンを使用して投与される対応する結合部分構造成分と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍であり得る。この段落に記載された上文における実施形態では、医薬組成物の投与は、組換えポリペプチドにもＡＡＣにも連結されていないおよび同等モル用量または用量レジメンで対象に投与される対応する結合部分構造成分と比較して、モルでのより低い単位用量の組換えポリペプチドまたはＡＡＣを使用して、対象がんまたは腫瘍の評定に有用であることが公知の少なくとも１つのパラメーターの改善をもたらすことができる。
【０２６２】
別の態様では、本開示は、ＡＡＣを製造する方法を提供する。一実施形態では、方法は、活性化可能な組換えポリペプチドをコードする核酸構築物を含む宿主細胞を、前記活性化可能な組換えポリペプチドの発現に至る条件下で培養するステップであって、前記活性化可能な組換えポリペプチドが、ＲＳ１、ＲＳ２、ＦＢＭ、ＳＢＭ、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２を含み、ｉ）前記ＲＳ１およびＲＳ２が、各々、哺乳動物プロテアーゼによる切断の基質であり、各々が、表１の配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）前記ＦＢＭが、ＣＤ３に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり、ｉｉｉ）前記ＳＢＭが、Ａ３３抗原、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＣＣＲ８、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、クローディン−１、クローディン１８．２、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２（ＣＬＥＣ１２）、Ｃｏｒａ抗原、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＤＬ３）、デスモグレイン４、デルタ様非カノニカルＮｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２、Ｆ１９抗原、胎児型アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＲＡ１）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、グロボヘキサノシルセラミド（グロボ−Ｈ）、ＧＤ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１、ＩＬ１３Ｒα２、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リンパ球抗原６（Ｌｙ−６）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン−４）、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、形質細胞抗原１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＳＭＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、シアリル化Ｔｎ抗原（ｓ  ＴＮ）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ソニックヘッジホグ（Ｓｈｈ）、ＳＡＳ、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、精子自己抗原タンパク質１７（ＳＰ１７）、ＴＡＧ７２、トムゼン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−抗原）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、Ｔｒｏｐ−２、Ｗｕｅ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）から選択される標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む抗体断片であり、ｉｖ）前記ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２が、各々、表８に記載の配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｖ）前記組換えポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１−ＲＳ１−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ２−ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＳＢＭ−ＦＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ＦＢＭ−ＳＢＭ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２−ＲＳ２−ディアボディ−ＲＳ１−ＸＴＥＮ１の構造配置を有し、ディアボディが、前記ＦＢＭおよびＳＢＭのＶＬおよびＶＨを含む、ステップと；前記活性化可能なポリペプチド組成物を回収するステップとを含む。前述の方法では、活性化可能な組換えポリペプチドは、ＲＳ１およびＲＳ２を切断することが可能な１つまたは複数のプロテアーゼによるＲＳ１およびＲＳ２の切断により活性化され、それによって組成物からＦＢＭおよびＳＢＭが放出されることになり、前記ＦＢＭおよびＳＢＭは、融合したままであり、未切断状態の前記活性化可能な組換えポリペプチドのＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、前記ＦＢＭのＣＤ３への特異的結合および前記ＳＢＭの標的細胞マーカーへの特異的結合に干渉し、その結果、未切断状態の前記活性化可能な組換えポリペプチドの前記ＦＢＭのＣＤ３への解離定数（Ｋｄ）または前記ＳＢＭの前記標的細胞マーカーへの解離定数（Ｋｄ）は、同等の条件下、例えば、等モル濃度下で前記標的細胞マーカーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定されたとき、前記ＲＳ１およびＲＳ２の切断により前記活性化可能な組換えポリペプチドから放出される前記ＦＢ��または前記ＳＢＭと比較して少なくとも１００倍大きくなる。
ＶＩＩＩ．核酸配列
【０２６３】
別の態様では、本開示は、組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物をコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物をコードするポリヌクレオチド分子に相補的な配列に関する。
【０２６４】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される実施形態での組換えポリヌクレオチドもしくはＡＡＣ組成物をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド配列の補体を提供する。一実施形態では、本開示は、表１１、表１４〜１６、もしくは表１８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、または前記ポリヌクレオチド配列の補体を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＡＣ組成物をコードする単離されたポリヌクレオチド配列であって、表１１、表１６または表１８に記載のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド配列を提供する。
【０２６５】
別の態様では、本開示は、組換えポリペプチド組成物もしくはＡＡＣ実施形態をコードするポリヌクレオチド配列、またはそれらの相同バリアントを含む、前記ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を産生する方法、ならびに前記ポリヌクレオチド配列により発現されるタンパク質を発現させる方法に関する。一般に、これらの方法は、タンパク質様組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物をコードするポリヌクレオチド配列を産生するステップ、およびコードする遺伝子を宿主細胞に適する発現ベクターに組み込むステップを含む。コードされた組換えポリペプチドまたはＡＡＣの産生のために、方法は、適切な宿主を発現ベクターで形質転換させるステップ、および形質転換された宿主細胞において結果として生じた組換えポリペプチドまたはＡＡＣの発現を引き起こすまたは可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって、組換えポリペプチドまたはＡＡＣを産生するステップを含み、前記組換えポリペプチドまたはＡＡＣは、本明細書に記載される方法によりまたは当技術分野において公知の標準的なタンパク質精製方法により回収される。分子生物学における標準的な組換え手法が、本開示のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製するために使用される。
【０２６６】
本開示に従って、組換えポリペプチド組成物をコードする核酸配列（またはその補体）は、適切な宿主細胞において発現を指示する組換えＤＮＡ分子を生成するために使用される。いくつかのクローニング戦略が本開示の実施に好適であり、それらの多くが、本開示の組成物をコードする遺伝子またはその補体を含む構築物を生成するために使用される。一実施形態では、クローニング戦略は、組成物の発現のための宿主細胞を形質転換させるために使用される組換えポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む組換えポリペプチド構築物をコードする遺伝子を作出するために使用される。この段落に記載された上文における上述の実施形態では、遺伝子は、結合部分構造と、放出セグメントと、嵩高な部分構造とを本明細書で開示される構成でコードするヌクレオチドを含み得る。
【０２６７】
１つのアプローチでは、組換えポリペプチド構築物に対応するＤＮＡ配列を含有する構築物が、まず調製される。そのような構築物の調製のための例示的な方法は、実施例で説明される。次いで、構築物は、組換えポリペプチド構築物の発現および回収のための原核生物宿主細胞などの宿主細胞の形質転換に好適な発現ベクターを作出するために使用される。所望される場合、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。発現ベクターの作出、宿主細胞の形質転換ならびにＸＴＥＮの発現および回収のための例示的な方法は、実施例で説明される。
【０２６８】
組換えポリペプチド構築物をコードする遺伝子は、完全に合成的に、または実施例でより詳しく説明される方法を含む、制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲおよびオーバーラップ伸長などの、酵素的プロセスと組み合わせられた合成により、どちらかで、１ステップまたは複数のステップで作製することができる。本明細書で開示される方法は、例えば、様々な成分（例えば、結合ドメイン、リンカー、放出セグメント、およびＸＴＥＮ）をコードするポリヌクレオチドの配列を所望の長さのおよび配列の遺伝子にライゲートするために、使用することができる。組換えポリペプチド組成物をコードする遺伝子は、標準的な遺伝子合成手法を使用してオリゴヌクレオチドから組み立てられる。遺伝子設計は、組換えポリペプチドの産生に利用されるＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に適したコドン使用頻度およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して、行うことができる。本開示の１つの方法では、構築物の成分をコードするポリヌクレオチドのライブラリーが、上で説明したように、作出されて組み立てられる。次いで、結果として得られた遺伝子が組み立てられ、結果として得られた遺伝子は、本明細書に記載されるように、宿主細胞を形質転換させ、組換えポリペプチド組成物を産生し、その特性の評価のために回収するために、使用される。
【０２６９】
次いで、組換えポリペプチド配列をコードする結果として得られたポリヌクレオチドを、個々に発現ベクターにクローニングすることができる。核酸配列は、様々な手順によりベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡは、当技術分野において公知の手法を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分は、一般に、シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。これらの成分のうちの１つまたは複数を含有する好適なベクターの構築は、当業者に公知である標準的なライゲーション手法を利用する。そのような手法は、当技術分野において周知であり、科学および特許文献に十分に記載されている。様々なベクターが、公的に入手可能である。ベクターは、例えば、組換えＤＮＡ手順に適便に付すことができる、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得、ベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存することになる。例えば、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであって、その複製が、染色体複製に依存しないベクター、例えば、プラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製されるものであり得る。
【０２７０】
本開示は、複製および制御配列を含有するプラスミド発現ベクターの使用であって、前記配列が、宿主細胞と適合し、宿主細胞により認識され、およびポリペプチドの制御された発現のためにポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されている、使用を提供する。ベクターは、通常、複製部位と、形質転換された細胞において表現型選択を生じさせることが可能であるタンパク質をコードする配列とを有する。そのようなベクター配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスについて周知である。使用することができる有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含む。「発現ベクター」は、好適な宿主においてポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を果たすことが可能な好適な制御配列に作動可能に連結されているＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を指す。必要条件は、ベクターが、選ばれた宿主細胞において複製可能であり、生存可能であることである。低または高コピー数ベクターを所望に応じて使用することができる。
【０２７１】
好適なベクターとしては、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡおよびＳｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ５７：３１−４０  （１９８８）により記載されたようなｃｏｌ  ＥＩ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸなどの公知の細菌プラスミドの誘導体、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド、ファージＤＮＡ、例えば、ＮＭ９８  ９などのファージＩの非常に多数の誘導体、ならびに他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば、２ミクロンプラスミド、または２ｍプラスミドの誘導体、ならびにセントロメアおよび組み込み酵母シャトルベクター；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは発現制御配列を利用するために修飾されたプラスミド；などが挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用することもできる酵母発現系は、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターなどを含むが、これらに限定されない。ベクターの制御配列は、転写を生じさせるプロモーター、そのような転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。プロモーターは、選ばれた宿主細胞において転写活性を示す、および宿主細胞にとって同種または異種のどちらかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る、任意のＤＮＡ配列であり得る。原核生物宿主に関して発現ベクターでの使用に好適なプロモーターは、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７５：６１５  （１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８１：５４４  （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７  （１９８０）；ＥＰ３６，７７６］、およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０：２１−２５  （１９８３）］を含み、すべてが、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。細菌系での使用のためのプロモーターは、組換えポリペプチド（単数／複数）をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有する。
【０２７２】
ＩＸ．組換えポリペプチドおよびＡＡＣ組成物を作製する方法
【０２７３】
別の態様では、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を使用して機能的タンパク質の高い発酵発現レベルで組換えポリペプチド組成物を作製する方法に関し、高い発現レベルで細胞傷害活性ポリペプチド構築物組成物を産生する方法において有用な構築物をコードする発現ベクターを用意する方法にも関する。
【０２７４】
一実施形態では、方法は、１）本明細書で開示される実施形態のいずれかの組換えポリペプチドまたはＡＡＣをコードするポリヌクレオチドを調製するステップ、２）生体システムにおける高レベルタンパク質発現のための適切な転写および翻訳配列の制御下にあるプラスミドまたは他のベクターであり得る発現ベクターに、前記ポリヌクレオチドをクローニングするステップ、３）適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換するステップ、および４）従来の栄養培地において組換えポリペプチド組成物の発現に好適な条件下で前記宿主細胞を培養するステップを含む。所望される場合、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＢＬ２１  Ｇｏｌｄである。この方法による、組換えポリペプチドまたはＡＡＣの発現は、宿主細胞の発現産物の少なくとも０．１ｇ／Ｌ、または少なくとも０．２ｇ／Ｌ、または少なくとも０．３ｇ／Ｌ、または少なくとも０．５ｇ／Ｌ、または少なくとも０．６ｇ／Ｌ、または少なくとも０．７ｇ／Ｌ、または少なくとも０．８ｇ／Ｌ、または少なくとも０．９ｇ／Ｌ、または少なくとも１ｇ／Ｌの発酵力価を生じさせる結果となり、この場合、発現されたタンパク質の少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％が、正しくフォールディングされる。本明細書で使用される場合、用語「正しくフォールディングされる」は、組成物の結合部分構造成分に、その標的リガンドに特異的に結合する能力があることを意味する。別の実施形態では、本開示は、組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物を産生する方法であって、組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物を含む、ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、ポリペプチド産物の発現に有効な条件下で、宿主細胞の乾燥重量１グラム当たり約１０ミリグラム（ｍｇ／ｇ）より高い濃度で、または発酵反応が６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度に達したら少なくとも約２５０ｍｇ／ｇ、もしくは約３００ｍｇ／ｇ、もしくは約３５０ｍｇ／ｇ、もしくは約４００ｍｇ／ｇ、もしくは約４５０ｍｇ／ｇ、もしくは約５００ｍｇ／ｇの前記ポリペプチドで、培養するステップを含み、発現されるタンパク質の結合部分構造が、正しくフォールディングされる、方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、組換えポリペプチド組成物またはＡＡＣを産生する方法であって、組換えポリペプチドまたはＡＡＣ組成物を含む、ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、ポリペプチド産物の発現に有効な条件下で、宿主細胞の乾燥重量１グラム当たり約１０ミリグラム（ｍｇ／ｇ）より高い濃度で、または発酵反応が６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度に達したら少なくとも約２５０ｍｇ／ｇ、もしくは約３００ｍｇ／ｇ、もしくは約３５０ｍｇ／ｇ、もしくは約４００ｍｇ／ｇ、もしくは約４５０ｍｇ／ｇ、もしくは約５００ｍｇ／ｇの前記ポリペプチドで、培養するステップを含み、発現されるポリペプチド産物が可溶性である、方法を提供する。
【０２７５】
以下は、本開示の組成物および組成物の評価についての実施例である。上で提供された一般的な説明を踏まえて、様々な他の実施形態を実行することができることが理解されよう。
【実施例】
【０２７６】
（実施例１）
放出セグメントおよびＸＴＥＮを有する抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡ構築物の構築
【０２７７】
抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３タンデムｓｃＦｖ、続いて多重特異性放出セグメント配列の１つ（ＢＳＲＳ−１、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ）をコードする遺伝子をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔにおいて合成し、それに、ｐＢＲ３２２−ＸＴＥＮ８６４デスティネーションベクターのＮｄｅＩ部位およびＢｓａＩ部位と適合するＮｄｅＩ制限部位およびＢｓａＩ制限部位を導入した。抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３タンデムｓｃＦｖおよびＢＳＲＳ−１を含有する制限酵素消化された遺伝子断片をｐＢＲ３２２−ＸＴＥＮ８６４ベクターにＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートし、それをＢＬ２１  Ｇｏｌｄ細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望の構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。最終的なベクターは、ＰｈｏＡプロモーターおよびＳＴＩＩ分泌リーダーの制御下のＸＴＥＮ＿８６４遺伝子と融合した放出セグメントとしてＢＳＲＳ−１を有する抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３二特異性タンデムｓｃＦｖの成分を有する（Ｎ末端からＣ末端へ）ＰｒｏＴＩＡ分子をコードする。得られた構築物はＡＣ１２７８であり、表１１に提示されるＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を有する。
【０２７８】
ＡＣ１４７６と称され、ＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列が同じく表１１に提示される別の放出セグメントを有する抗ＥｐＣＡＭ抗ＣＤ３−ＸＴＥＮをベースベクターｐＹＳ００４４−ＸＴＥＮ８６４−Ｈ６ベースベクター中に同様に構築した。強調されている配列はシグナルペプチドを表し、これは、分泌の間に切断され、最終的な成熟タンパク質には存在しない。
【０２７９】
同じ手順を使用して追加的なＰｒｏＴＩＡバリアントを構築し、それらのアミノ酸配列を表１４に列挙している。
表１１：放出セグメントを有する抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＸＴＥＮであるＡＣ１２７８およびＡＣ１４７６のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
【表１１−１】
2021507706.tif 000049
【表１１−２】
2021507706.tif 000050
【表１１−３】
2021507706.tif 000051
【表１１−４】
2021507706.tif 000052
【０２８０】
（実施例２）
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵培養物からの切断されていないＨｉｓ８−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４および切断されたＨｉｓ８−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４の産生
【０２８１】
１）Ｅ．ｃｏｌｉ発酵培養物からのＨｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の発現および精製
【０２８２】
融合タンパク質ＡＣ１２７８（ＭＫＫＮＩＡＦＬＬＡＳＭＦＶＦＳＩＡＴＮＡＹＡ−Ｈｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）を専売Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｍＥ０９８株において発現させた。１０Ｌの発酵培養物を３７℃で成長させ、温度を２６℃にシフトし、その後、塩の供給を枯渇させた。収集の間、発酵全ブロスを遠心分離して細胞をペレット化した。上清を採取し、次いで、酸綿状沈殿を使用して、内毒素および宿主細胞タンパク質の混入を減少させた。１Ｍの酢酸を使用し、上清のｐＨをｐＨ４．５まで徐々に低下させ、室温で３０分間インキュベートしたままにした。次いで、２ＭのＮａＯＨを使用してｐＨをまたｐＨ７．５まで上昇させ、４℃で終夜保持した。翌日、上清を、３ＭのＬｉｆｅＡｓｓｕｒｅフィルターカプセルを使用して０．２０μｍで濾過した。
【０２８３】
ＨｉｓアフィニティータグにおけるＮ末端完全性を確実にするために、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを第１の捕捉ステップとして使用した。５つの１０ｍＬ  ＲｅｄｉｓｅｐＲｆ  ２５Ｇカラムハウジング（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ）にＴｏｙｏＰｅａｒｌ−ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１０ｍＬを充填した。カラムを、０．５ＭのＮａＯＨを用いて消毒し、蒸留水で徹底的にすすぎ、次いで、０．１ＭのＮｉ２ＳＯ４を用いて荷電させ、５カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４の曇り点は２３℃であるので、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｗａｓｈ緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ｐＨ７．５）およびＷａｓｈ  ２緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を予め調製し、４℃で保管し、使用中氷上で維持した。カラム平衡化後、上清をカラムにローディングした。追跡用の３ＣＶの平衡化緩衝剤の後、カラムを１０ＣＶの低温Ｔｒｉｔｏｎ  Ｗａｓｈ緩衝剤で洗浄して内毒素を減少させ、その後、１０ＣＶの低温Ｗａｓｈ  ２緩衝剤で洗浄してＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を除去した。次いで、３ＣＶの溶出緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５）を用いてタンパク質をカラムから溶出させ、１ＣＶの画分（１０ｍＬ）を採取した。タンパク質の酸化を低減するために、５ｍＭのＥＤＴＡを各溶出物に添加した。負荷量、フロースルー、および溶出物を非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析した。ゲルに基づいて、溶出物ＣＶ１およびＣＶ２をさらなる処理のために取っておいた（図１４Ａ）。
【０２８４】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）をその後の仕上げステップとして選択した。２つの２０ｍＬ  ＲｅｄｉｓｅｐＲｆ  ２５Ｇカラムハウジング（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ）にＴｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｍＬを充填した。カラムを、０．５ＭのＮａＯＨを用いて消毒し、蒸留水で徹底的にすすぎ、５ＣＶの緩衝剤Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。溶出緩衝剤を、適切な体積の緩衝剤Ａと緩衝剤Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）を混合することにより、７５％緩衝剤Ａ、５０％緩衝剤Ａ、および２５％緩衝剤Ａで予め調製した。前のカラムステップからのＩＭＡＣ溶出物ＣＶ１およびＣＶ２を一緒にプールし、ローディング前に硫酸アンモニウムを１Ｍの最終濃度まで添加してフェニルカラムを予め平衡化した。ローディングおよび３ＣＶの緩衝剤Ａを用いた追跡後、７５％緩衝剤Ａ、５０％緩衝剤Ａ、２５％緩衝剤Ａ、および０％緩衝剤Ａの各々を３ＣＶで用いてカラムからの溶出を行った。負荷量、フロースルー、および溶出物を非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析した。ゲルに基づいて、洗浄物および７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４での溶出物ＣＶ１〜２（枠で囲われている）をさらなる処理のためにプールした（図１４Ｂ）。
【０２８５】
ＸＴＥＮのＣ末端完全性を確実にするため、および内毒素をさらに減少させるために、アニオン交換クロマトグラフィーを最終的な仕上げステップとして選択した。ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒのＸＫ１６カラムハウジングにＣａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍＬを充填し、０．５ＭのＮａＯＨを用いて消毒し、蒸留水で徹底的にすすぎ、２ＣＶの緩衝剤Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いてストリッピングし、５ＣＶの緩衝剤Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。ＨＩＣ溶出物プールを４倍希釈した後にカラムにローディングした。次いで、カラムを３ＣＶの３０％緩衝剤Ｂで洗浄し、３０％〜７０％の緩衝剤Ｂという勾配で１５ＣＶにわたって溶出した。溶出物を１／２ＣＶ（２．５ｍＬ）画分中に採取した。次いで、負荷量、フロースルー、および溶出物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析して、製剤化のためにプールする画分を決定した（図１４Ｃ）。
【０２８６】
２）製剤化および特徴付け
【０２８７】
所望の溶出画分（図１４Ｃにおいて枠で囲われている）を濃縮し、緩衝剤を５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に換えた。製剤化産物を０．２μｍで滅菌濾過した。産物の品質を決定するためのロット放出は、分子ふるいクロマトグラフィー分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を伴うものであった。ＳＥＣ分析に関しては、製剤化産物１０μｇを分析用ＳＥＣカラムに注入し、それにより、＞９５％の単量体産物が確認された（図１５Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、製剤化産物５μｇを４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにローディングし、クーマシーブルーで染色することによって行った。産物純度は＞９０％であった（図１５Ｂ）。
【０２８８】
３）酵素の活性化および保管
【０２８９】
組換えマウスＭＭＰ−９はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからチモーゲンとして供給され、酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）によって活性化する必要があった。ＡＰＭＡをまず０．１ＭのＮａＯＨ中に最終濃度１０ｍＭまで溶解させた後、０．１ＮのＨＣｌを使用してｐＨを中性に再調整した。ＡＰＭＡストックを５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５中に２．５ｍＭまでさらに希釈した。プロＭＭＰを活性化するために、１ｍＭのＡＰＭＡおよび１００μｇ／ｍＬのプロＭＭＰ−９を３７℃で３時間インキュベートした。活性化された酵素を５０％グリセロールの最終濃度まで添加し、次いで、−２０℃で数週間にわたって保管することができた。
【０２９０】
４）Ｈｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４のＭＭＰ−９による消化
【０２９１】
切断されたａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ−Ａを作製するために、製剤化されたＨｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４（ＰｒｏＴＩＡ−Ｘ）９．１２ｍｇを、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する反応混合物中、活性な組換えマウスＭＭＰ−９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）である酵素と基質のモル比１：２２３７、３７℃で２時間インキュベートした。ＢＳＲＳ１における特異的な消化を確認するために、非消化産物およびＭＭＰ−９による消化産物５μｇを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、その後、クーマシーブルーによって染色した。クーマシーブルー染色の使用により、ＭＭＰ−９による消化前の全長Ｈｉｓ８−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４（ＰｒｏＴＩＡ−Ｘ）およびＭＭＰ−９による消化後のＨｉｓ８−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３切断断片（ＰｒｏＴＩＡ−Ａ）を可視化することが可能になった（図１６Ａ）。
【０２９２】
５）ＭＭＰ−９による消化後の切断されたＨｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ−Ａの精製
【０２９３】
ＢＳＲＳ１におけるＭＭＰ−９による消化の確認後、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用して、ＭＭＰ−９を除去した。ポリプロピレンカラムハウジング（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５ｍＬにＴｏｙｏＰｅａｒｌ−ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２ｍＬを充填した。５ＣＶの平衡化緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いてカラムを平衡化した。次いで、消化混合物をカラムにローディングした。ローディングおよび１ＣＶの平衡化緩衝剤を用いた追跡後、カラムを３ＣＶの平衡化緩衝剤で洗浄した。３ＣＶの溶出緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５）を用いてタンパク質をカラムから溶出させ、１ＣＶの画分（２ｍＬ）を採取した。負荷量、フロースルー、および溶出物を非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析して、ＰｒｏＴＩＡ−Ａを含有する溶出物を決定した（図１６Ｂ）。
【０２９４】
６）切断されたＨｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３の製剤化および特徴付け
【０２９５】
所望の溶出物（図１６Ｂにおいて枠で囲われている）を濃縮し、緩衝剤を５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に換えた。産物の品質を決定するためのロット放出は、分子ふるいクロマトグラフィー分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を伴うものであった。ＳＥＣ分析に関しては、産物１０μｇを分析用ＳＥＣカラムに注入し、それにより、＞９５％の単量体産物が確認された（図１７Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に関しては、産物５μｇを４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにローディングし、これにより、＞９０％の産物純度が確認された（図１７Ｂ）。
【０２９６】
（実施例３）
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵培養物からの切断されていないＡＣ１４７６  ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）および切断されたＡＣ１４７６  ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）の産生
【０２９７】
１）Ｅ．ｃｏｌｉ発酵培養物からのＡＣ１４７６  ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）の発現および精製
【０２９８】
融合タンパク質ＡＣ１４７６（ＭＫＫＮＩＡＦＬＬＡＳＭＦＶＦＳＩＡＴＮＡＹＡ−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６））を専売Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｍＥ０９７株において発現させた。発酵培養物１０Ｌを３７℃で成長させ、塩の供給を枯渇させた後、温度を２８℃にシフトした。収集の間、発酵全ブロスを遠心分離して細胞をペレット化した。上清を、３ＭのＬｉｆｅＡｓｓｕｒｅフィルターカプセルを使用して０．２０μｍで濾過した。ＸＫ５０ハウジングカラムにＴｏｙｏｐｅａｒｌ−ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ−６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００ｍＬを充填し、４℃で蠕動ポンプに接続した。カラムを、０．５ＭのＮａＯＨを用いて消毒し、蒸留水で徹底的にすすぎ、０．１ＭのＮｉＳＯ４を用いて荷電させ、５ＣＶの平衡化緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。カラム平衡化後、上清をカラムにローディングし、その後、実施例２−１において上記のプロセスと同様にＴｒｉｔｏｎ  Ｗａｓｈ、Ｗａｓｈ  ２、および溶出を続けた。溶出物を１／４ＣＶ（２５ｍＬ）画分中に採取し、キレートを含まないニッケルにＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度まで添加した。負荷量、フロースルー、および溶出物を非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析した。ゲルに基づいて、溶出物２〜５（枠で囲われている）をさらなる処理のために取っておいた（図１８Ａ）。
【０２９９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）をその後の仕上げステップとして選択した。ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒのＸＫ２４ハウジングカラムにＴｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０ｍＬを充填した。カラムを、０．５ＭのＮａＯＨを用いて消毒し、蒸留水で徹底的にすすぎ、５ＣＶの緩衝剤Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。所望のＩＭＡＣ溶出物を前のカラムステップから一緒にプールし、硫酸アンモニウムを１Ｍの最終濃度まで添加した後、カラムにローディングした。溶出物を１／２ＣＶ（２５ｍＬ）画分中に１００％から５０％までの緩衝剤Ａという勾配で１０ＣＶにわたって採取した。負荷量、フロースルー、および溶出物を非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析した。ゲルに基づいて、枠で囲われている溶出物をさらなる処理のためにプールした（図１８Ｂ）。
【０３００】
アニオン交換クロマトグラフィーを最終的な仕上げステップとして選択した。ＸＫ２４ハウジングカラムにＣａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）３０ｍＬを充填し、０．５ＭのＮａＯＨを用いて消毒し、蒸留水で徹底的にすすぎ、２ＣＶの緩衝剤Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いてストリッピングし、５ＣＶの緩衝剤Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。溶出物プールの緩衝剤を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ  Ｂｉｏｍａｘ  １０ｋＤａを通し、透過液の伝導率が８ｍｓ／ｃｍになるまで２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５に換えた。透過液をＣａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓカラムにローディングし、次いで、カラムを３ＣＶの１０％および２０％緩衝剤Ｂで洗浄した。溶出物を１／４ＣＶ（７．５ｍＬ）画分中に２０％から７０％までの緩衝剤Ｂという勾配で１０ＣＶにわたって採取した。負荷量、フロースルー、および溶出物を非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析した。ゲルに基づいて、選択された溶出物（枠で囲われている）を製剤化のためにプールした（図１８Ｃ）。
【０３０１】
２）ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）の製剤化および特徴付け
【０３０２】
所望の溶出物を濃縮し、緩衝剤を５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に換えた。産物の品質を決定するためのロット放出を、ＳＥＣ分析（図１９Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１９Ｂ）について実施例２において確立されたプロトコールに従って実施した。さらに、２μｇを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、その後、銀染色を行った（図１９Ｃ）。ＳＥＣの結果を使用して、ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）の見かけの分子量および見かけの分子量係数（実際の分子量と比べて）ならびに流体力学的半径も決定した。決定された見かけの分子量は１．７ＭＤａであり、その結果、見かけの分子量係数は１２．３になり、算出される流体力学的半径は１０．８ｎｍになる。
【０３０３】
分子の同一性をさらに立証するために、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を実施し、実験的質量が１３８，６５２Ｄａであり、１３８，６５１Ｄａである理論分子量と比較した場合のΔ質量が＋１Ｄａであることが決定された（図２０Ａ）。分析的カチオン交換クロマトグラフィーのために、試料１０μｇを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＳＣＸ  ＮＰ３に、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５である移動相Ａおよび２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ４．５である移動相Ｂを用いてローディングした。０〜１００％のＢの直線勾配を２０分の過程中適用し、ただ１つの単一主要ピークが検出された（図２０Ｂ）。
【０３０４】
４）ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）のＭＭＰ−９による消化
【０３０５】
実施例２に記載のＭＭＰ−９活性化および消化プロトコールに従って、ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）（ＰｒｏＴＩＡ−Ｘ）２０ｍｇを消化したが、ほんの１：６０００モル濃度の活性な組換えマウスＭＭＰ−９である酵素と基質のモル比を使用した。非消化産物および消化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図２１Ａ）。
【０３０６】
５）ＭＭＰ−９による消化後の切断されたａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）の精製
【０３０７】
ＢＳＲＳ１におけるＭＭＰ−９による消化の確認後、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、切断された遊離のＸＴＥＮおよび切断されなかったＰｒｏＴＩＡ−Ｘを除去した。２つの５ｍｌポリプロピレンカラムハウジング（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にそれぞれＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）３ｍＬを充填し、ＣＩＰ（０．５ＭのＮａＯＨ、１ＭのＮａＣｌ）を用いて消毒し、蒸留水で徹底的にすすぎ、２ＣＶの緩衝剤Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ＰＨ７．５）を用いてストリッピングし、５ＣＶの緩衝剤Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。消化混合物をカラムにローディングした。ローディングおよび１ＣＶの緩衝剤Ａを用いた追跡後、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、および５００ｍＭのＮａＣｌの各々を２ＣＶで用いてカラムからの溶出を行った。負荷量、フロースルー、および溶出物を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析して、ＰｒｏＴＩＡ−Ａを含有する画分を決定した（図２１Ｂ）。
【０３０８】
６）切断されたａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３の製剤化および特徴付け
所望のＰｒｏＴＩＡ−Ａ画分を濃縮し、緩衝剤を５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に換えた。産物の品質を決定するためのロット放出を、ＳＥＣ分析（図２２Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２Ｂ）について実施例２において確立されたプロトコールに従って実施した。さらに、２μｇを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、その後、銀染色を行った（図２２Ｃ）。ＳＥＣの結果を使用して、ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３の見かけの分子量および見かけの分子量係数（実際の分子量と比べて）ならびに算出される流体力学的半径も決定した。決定された見かけの分子量は３９．８ｋＤａであり（後者は上記の無傷構築物の見かけの分子量の約２３分の１である）、これにより、見かけの分子量係数は０．７になり（後者は上記の無傷構築物の見かけの分子量係数の約１７分の１である）、流体力学的半径は２．３ｎｍになる（後者は上記の無傷構築物の流体力学的半径の約５分の１である）。
【０３０９】
分子の同一性をさらに立証するために、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を実施し、実験的質量が５８，０７１Ｄａであり、５８，０６７Ｄａである理論分子量と比較した場合のΔ質量が＋４Ｄａであることが決定された（図２３Ａ）。２）において前述のプロトコールを使用した分析的カチオン交換クロマトグラフィー（図２３Ｂ）によっても試料の均一性が確認された。
【０３１０】
（実施例４）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＥｐＣＡＭ結合アッセイ
【０３１１】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の結合能を、ＥｐＣＡＭ／ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検証した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、組換えヒトＥｐＣＡＭ（ｒｈＥｐＣＡＭ）（Ｓｉｎｏ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃１０６９４−Ｈ０８Ｈ９６０−ＥＰ−５０）を９６ウェル平底プレートに０．１μｇ／１００μＬの濃度でコーティングした。４℃で終夜インキュベートした後、アッセイプレートを洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間にわたってブロッキングした。プレートを再度洗浄し、その後、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（すなわち、放出セグメント切断配列を有さないＰｒｏＴＩＡおよびＡＣ１４８４、ＰｒｏＴＩＡキメラポリペプチドアセンブリ組成物）、およびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）をある用量範囲で導入した。切断不可能なＰｒｏＴＩＡ、およびプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡおよび処理されていないＰｒｏＴＩＡに対して利用した用量範囲は、０．０００６〜５ｎＭであり、これは、５ｎＭの出発濃度からの１：６倍段階希釈スキームを用いて実現した。プレートを振とうしながら室温で１時間インキュベートしておいて、切断不可能なＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡおよび切断されていないＰｒｏＴＩＡがプレートにコーティングされたｒｈＥｐＣＡＭに結合するようにした。結合しなかった成分を洗浄ステップで除去し、ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインＬ（ＰｉｅｒｃｅＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ＃３２４２０）を添加した。プロテインＬをｓｃＦｖのカッパ軽鎖に結合させるのに適切なインキュベーション期間後、あらゆる結合しなかった試薬を洗浄ステップによって除去し、その後、各ウェルにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加した。ＴＭＢはペルオキシダーゼの発色基質である。所望の呈色強度に達した後、０．２Ｎの硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。呈色の強度は、ｒｈＥｐＣＡＭ／プロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉された切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。生じた呈色の強度（測定されたＯＤ）をタンパク質濃度に対してプロットし、最大半量応答（ＥＣ５０）をもたらす切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、４パラメーターロジスティック回帰方程式を用いて導き出した。
【０３１２】
図２４に示されている通り、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３二特異性ＰｒｏＴＩＡ分子の結合活性と同様の結合活性を有し、各々、それぞれ３２０ｐＭおよび２８０ｐＭのＥＣ５０を有する。プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡは、ｒｈＥｐＣＡＭリガンドに対して１２０ｐＭのＥＣ５０で、無傷のプロテアーゼで処理されていない二特異性分子または切断不可能なＰｒｏＴＩＡ分子と比較して最も強力な結合活性を有する。データから、ＸＴＥＮ８６４が存在することにより抗ＥｐＣＡＭ部分構造のそのリガンドとの結合が少なくとも２．３倍妨げられたことが示唆される。
【０３１３】
（実施例５）
フローサイトメトリーによって評価される細胞結合
【０３１４】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の二重特異的結合も、ＣＤ３陽性ヒトジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞ならびにＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＴ３、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−３、ＢＴ−４７４、ＨＰＡＦ−ＩＩ、ＪＩＭＴ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＮＣＩ−Ｈ３２２、ＮＣＩ−Ｈ６６０、ＮＣＩ−Ｈ６９およびＰＣ３から選択されるＥｐＣＡＭ陽性ヒト細胞を利用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づくアッセイによって評価した。ＣＤ３＋細胞およびＥｐＣＡＭ＋細胞をある用量範囲の処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、ならびに抗ＣＤ３  ｓｃＦｖおよび抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ陽性対照と一緒に、１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを伴うＰＢＳを含有するＦＡＣＳ緩衝剤中、４℃で３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝剤で数回洗浄して結合しなかった試験材料を除去した後、細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓタグ抗体（Ａｂｃａｍ  ｃａｔ＃ａｂ１２０６）と一緒に４℃で３０分間インキュベートする。結合しなかったＦＩＴＣコンジュゲート抗体をＦＡＣＳ緩衝剤で数回洗浄することによって除去し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ）または同等の機器でのデータ取得のために細胞をＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁させた。全てのフローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）または等価物を用いて解析する。
【０３１５】
抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖはジャーカット細胞に結合することが予測されないが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは全て、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓタグ抗体単独と一緒にインキュベートしたジャーカット細胞と比較して蛍光強度が増大することによって示される通り、ジャーカット細胞に結合することが予測される。同様に、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは全て、ＥｐＣＡＭ陽性細胞に結合することが予測されるが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、ＥｐＣＡＭ陽性細胞に結合することが予測されない。これらのデータは、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の、それぞれジャーカットおよびＥｐＣＡＭを発現するヒト細胞系のパネルにおいて発現されるＣＤ３抗原およびＥｐＣＡＭ抗原の両方を認識する二特異性結合能力を反映することが予想される。さらに、ＸＴＥＮポリマーにより表面結合にいくらかの干渉がもたらされるので、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、ＣＤ３抗原およびＥｐＣＡＭ抗原の両方に対して、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡよりも低い親和性で結合することが予想される。
【０３１６】
（実施例６）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の細胞傷害性アッセイ
【０３１７】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の向け直された細胞傷害性を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクターとして、ならびにＳＷ４８０結腸細胞などの（またはＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＫＮ４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＴ３、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ３、ＢＴ−４７４、ＨＰＡＦ−ＩＩ、ＪＩＭＴ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＮＣＩ−Ｈ３２２、ＮＣＩ−Ｈ６６０、ＮＣＩ−Ｈ６９およびＰＣ３から選択される）ＥｐＣＡＭ陽性ヒト癌腫細胞を標的として使用することによって評価した。ＰＢＭＣを、スクリーニングされた健康なドナーから、地域の血液バンクまたはＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＩＶＴから得た全血またはリンパ球富化軟膜調製物のいずれかからのフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣを以下に考察するように適切な細胞密度でＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／２５ｍｍｏｌ／ｍＬのＨＥＰＥＳ中に再懸濁させ、使用するまで５％ＣＯ２加湿インキュベーター中、３７℃で培養した。切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３組成物（ＡＣ１４８４）、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３切断可能ＰｒｏＴＩＡ組成物および処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３切断可能ＰｒｏＴＩＡ組成物（ＡＣ１２７８＆ＡＣ１４７６）の細胞溶解活性を決定するために、３つの異なる型の細胞傷害性アッセイ、すなわち、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ、カスパーゼ３／７アッセイおよびＦＡＣＳに基づく分析を使用する。
【０３１８】
５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイの非放射性代替物として、ＬＤＨ放出アッセイでは、放射性アッセイにおいて５１Ｃｒが放出されるのとほぼ同じように細胞溶解の際に放出される安定な細胞質基質酵素ＬＤＨを定量的に測定する。培養上清中に放出されたＬＤＨを、テトラゾリウム塩を赤色ホルマザン生成物に変換する酵素的アッセイによって測定する。形成される呈色の量は溶解した細胞の数に比例する。
【０３１９】
したがって、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物および処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物のＳＷ４８０における細胞傷害性能を以下の通り分析した：まず、ＳＷ４８０およびＰＢＭＣの細胞密度を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩおよび５％ＦＣＳで構成されるアッセイ培地中それぞれ１ｍＬ当たり細胞２．５×１０５個および１ｍＬ当たり細胞１×１０６個に調整した。（フェノールレッドを含まない培地および５％ＦＣＳは、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ｃａｔ＃Ｇ１７８０）の使用に伴うバックグラウンド吸光度を最小限にするために使用した）。エフェクター対標的比５：１を実現するために、９６ウェル丸底プレートにおいて、アッセイウェル当たりＰＢＭＣの１００μＬの一定分量をＳＷ４８０細胞８０μＬの一定分量と共培養した。プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３組成物試料および処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３組成物試料をアッセイ培地中に所望の用量濃度まで希釈し、それぞれの実験ウェル２０μＬで添加し、全アッセイ体積を２００μＬにした。プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡを４４０ｎＭから出発する１２点の５倍段階希釈した用量濃度として評価して、０．０００００５〜４４ｎＭの最終的な用量範囲を得た。処理されていない切断されていないＰｒｏＴＩＡ組成物を１８４ｎＭから出発する１２点の５倍段階希釈した用量濃度として分析して、０．０００００２〜１８．４ｎＭの最終的な用量範囲を導き出した。エフェクターおよび標的細胞から放出される自然ＬＤＨ；放出される標的細胞最大ＬＤＨ；溶解溶液の添加および培養培地バックグラウンドに起因する体積補正対照を含むアッセイ対照もこの時点で準備した。放出される標的自然ＬＤＨに関しては、ＳＷ４８０細胞をアッセイ培地２００μＬ中、プロテアーゼで処理された組成物も処理されていない組成物も全く存在しない状態でインキュベートした。放出されるエフェクター自然ＬＤＨに関しては、ＰＢＭＣをアッセイ培地２００μＬ中、プロテアーゼで処理された組成物も処理されていない組成物も全く存在しない状態でインキュベートした。放出される標的細胞最大ＬＤＨは、１０×溶解溶液２０μＬをＳＷ４８０（総体積２２０μＬ）に添加し、標的細胞を溶解溶液の存在下で４５分間インキュベートした後に上清をＬＤＨ測定のために収集することによって決定した。体積補正対照は、１０×溶解溶液２０μＬをアッセイ培地２００μＬに添加することによって実現し、一方、培養培地バックグラウンドは、アッセイ培地２００μＬをインキュベートすることによって得た。次いで、全て２連で試験した、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物および処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物およびそれぞれのアッセイ対照全ての実験ウェルを含有するプレートを３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で終夜インキュベートしておいた。
【０３２０】
細胞溶解の結果として上清中に放出されるＬＤＨの量を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｙｔｏＴｏｘ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用し、製造業者の指示に従って測定した。簡単に述べると、アッセイプレートの各ウェルからの上清５０μＬを対応する平底酵素プレートのウェルに移した。酵素プレート中の各ウェルに、再構成された基質５０μＬを添加した。次いで、プレートに覆いをし、光から保護し、室温で３０分間インキュベートしておいた。所望のインキュベーション期間後、停止溶液５０μＬを各ウェルに添加し、４９０ｎｍにおける吸光度を記録した。
【０３２１】
次いで、データ解析を以下の通り実施した：
【０３２２】
１．実験Ｅ：Ｔ比５：１（平均）−培養培地バックグラウンド（平均）
【０３２３】
ＳＷ４８０標的、自然（平均）−培養培地バックグラウンド（平均）
【０３２４】
ＰＢＭＣエフェクター、自然（平均）−培養培地バックグラウンド（平均）
【０３２５】
２．ＳＷ４８０標的、最大（平均）−体積補正対照（平均）
【０３２６】
３．％特異的溶解＝［（実験−ＳＷ４８０標的、自然−ＰＢＭＣエフェクター、自然）／（ＳＷ４８０標的、最大−ＳＷ４８０標的、自然）］×１００
【０３２７】
４．次いで、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの用量濃度を％特異的溶解に対してプロットし、最大半量応答（ＥＣ５０）をもたらすタンパク質の濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、４パラメーターロジスティック回帰方程式を用いて導き出した。
【０３２８】
図２５に示されている通り、ＳＷ４８０細胞をプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物にＰＢＭＣの存在下で曝露させることにより、濃度依存性の細胞傷害性用量曲線がもたらされ、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性は無傷の処理されていないＰｒｏＴＩＡの活性の４８倍であった（それぞれＥＣ５０が２．５ｐＭ対１２０ｐＭ）。
【０３２９】
プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡの細胞傷害活性を、コンジュゲートしていない単一特異性抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖおよび単一特異性抗ＣＤ３  ｓｃＦｖの細胞傷害活性とＬＤＨアッセイで比較することにより、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの特異性をさらに評価した。簡単に述べると、ＰＢＭＣおよびＳＷ４８０細胞を上記の通り、９６ウェル丸底プレートでアッセイ培地中、エフェクター対標的比５：１で共培養した。プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、およびコンジュゲートしていない単一特異性抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖプラス単一特異性抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ試料を全て、全アッセイ体積２００μＬまで、最終的な用量範囲が０．００００５〜４５ｎＭである１２点の５倍段階希釈として評価した。実験ウェルと一緒に、上記の全ての関連性のあるアッセイ対照もアッセイプレートに含め、プレートを３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で終夜インキュベートした。
【０３３０】
細胞溶解の結果として上清中に放出されるＬＤＨの量を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｙｔｏＴｏｘ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用して測定し、結果を上記の通り解析した。
【０３３１】
予測通り、ＳＷ４８０細胞をプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡにＰＢＭＣの存在下で曝露させることにより、処理されていないＰｒｏＴＩＡと比較して細胞傷害性の増強が示される。重要なことに、単一特異性抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖと単一特異性抗ＣＤ３  ｓｃＦｖをＳＷ４８０標的細胞およびＰＢＭＣの存在下で組み合わせることでは、いかなる細胞傷害活性ももたらされなかった（図２６）。データから、誘導細胞傷害性のためにＣＤ３陽性細胞を標的細胞の付近に活性に動員するためには標的化ａＥｐＣＡＭ部分構造とａＣＤ３エフェクター部分構造を二特異性分子の形態で連結することが必要であることが示される。
【０３３２】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡに存在する放出セグメント切断配列は、それ自体で、腫瘍細胞によって放出されるプロテアーゼまたは活性化されたＣＤ３陽性Ｔ細胞によって放出されるプロテアーゼ（例えば、グランザイム）による切断を受けやすいという仮説も立てた。この仮説に対処するために、放出セグメントを有さない切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１３５７）を構築し、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１２７８）と併せて評価した。３種全てのＰｒｏＴＩＡを、ＰＢＭＣとＳＷ４８０の比５：１を使用してＬＤＨアッセイで分析し、５倍段階希釈スキームを用いて実現される０．００００５〜４５ｎＭの１２点用量濃度範囲で試験した。
【０３３３】
図２７に示されている通り、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の３２分の１である（ＥＣ５０が２８８ｐＭ対８．９ｐＭ）。興味深いことに、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（すなわち、放出セグメント切断配列を有さないＰｒｏＴＩＡ）の活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の３７１分の１である（ＥＣ５０が３３００ｐＭ対８．９ｐＭ）。結果から、切断可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子内に含有される放出セグメントが、腫瘍細胞および／または活性化されたＣＤ３陽性Ｔ細胞から放出される可能性があるプロテアーゼによるいくらかの切断を受けやすいことが示唆される。
【０３３４】
放出セグメントを有さない切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）、およびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）を卵巣起源のヒト細胞系においても評価した。この実験では、ＰＢＭＣとＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞を５：１の比で混合し、３種全てのＰｒｏＴＩＡ分子を上記の通りＬＤＨアッセイ１２点の５倍段階希釈の用量曲線として試験した。予測通り、ＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞系においてプロファイルされた３種のＰｒｏＴＩＡ分子の活性の傾向は、ＳＷ４８０結腸直腸細胞系において観察されたものと同様であることが見いだされた。ＳＫ−ＯＶ−３細胞では、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の４５分の１であり（ＥＣ５０が１３６ｐＭ対３ｐＭ）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の６００分の１であった（ＥＣ５０が１７９３ｐＭ対３ｐＭ）（図３０）。
【０３３５】
（実施例７）
フローサイトメトリーによって評価される細胞溶解
【０３３６】
２４時間後の細胞溶解をフローサイトメーターによって分析するために、ＥｐＣＡＭ陽性ＳＫ−ＯＶ−３標的細胞（またはＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＫＮ４５、ＭＴ３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＷ４８０、ＯＶＣＡＲ３、ＢＴ−４７４、ＨＰＡＦ−ＩＩ、ＪＩＭＴ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＮＣＩ−Ｈ３２２、ＮＣＩ−Ｈ６６０、ＮＣＩ−Ｈ６９およびＰＣ３の細胞系から選択される標的細胞）を、蛍光膜色素であるＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ色素（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ＃８８−０８７０−１６）を用い、製造業者の指示に従って標識する。あるいは、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃ＭＩＮＩ２６およびＰＫＨ２６ＧＬ）を使用することもできる。簡単に述べると、ＳＫ−ＯＶ−３細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、細胞２×１０６個をＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ標識キットで供給される希釈剤Ｃ、０．１ｍＬ中に再懸濁する。別の管中、ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ色素２μＬを、希釈剤Ｃ、０．５ｍＬと混合し、次いで、０．１ｍＬをＳＫ−ＯＶ−３細胞懸濁液に添加する。細胞懸濁液およびＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ色素を混合し、室温で２分間インキュベートする。次いで、ＦＣＳ、０．２ｍＬを添加することによって標識反応をクエンチする。標識された細胞を完全細胞培養培地（１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０）で２回洗浄し、生存細胞の総数をトリパンブルー排除によって決定する。総体積ウェル当たり２００μＬ中、エフェクター対標的比５：１として、９６ウェル丸底プレートにおいて、ウェル当たり１×１０５個のＰＢＭＣと２×１０４個のＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎで標識されたＳＫ−ＯＶ−３細胞を、示されている用量範囲濃度のプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ試料および処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ試料の不在下または存在下で共培養する。２４時間後に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ＃ＡＴ１０４）で収集し、２％ＦＣＳ／ＰＢＳで洗浄する。Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での細胞データ取得前に、細胞を、２．５マイクログラム／ｍＬの７−ＡＡＤ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ＃００−６９９３−５０）を補充した２％ＦＣＳ／ＰＢＳ、１００μＬに再懸濁して、生（７−ＡＡＤ陰性）細胞と死（７−ＡＡＤ陽性）細胞とを識別する。ＦＡＣＳデータをｇｕａｖａＳｏｆｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で解析し、７−ＡＡＤ陽性／ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ陽性細胞の数をＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ陽性細胞の総数で割ることによって死標的細胞のパーセンテージを算出する。
【０３３７】
ＰｒｏＴＩＡ濃度に対するパーセント細胞傷害性の用量反応死滅曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して４パラメーターロジスティック回帰方程式によって解析し、したがって、最大半量のパーセント細胞傷害性が誘導されるＰｒｏＴＩＡの濃度を決定する。
【０３３８】
フローサイトメトリーを利用した細胞傷害性の結果は、ＬＤＨアッセイを用いて得られる結果と一致することが予測される。ＳＫ−ＯＶ−３細胞を、プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物および切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物にＰＢＭＣの不在下で曝露させることによる影響はないことが予測される。同様に、ＰＢＭＣは、標的細胞を伴わないＰｒｏＴＩＡの存在下で活性化されるとは予測されない。これらの結果は、ＰＢＭＣを細胞傷害活性について刺激するためにはＰｒｏＴＩＡ組成物を標的細胞の表面上に密集させる必要があることを示すものであることが予測される。ＰＢＭＣおよび標的細胞の存在下では、プロテアーゼを用いて前処理されたまたは処理されていないＰｒｏＴＩＡに起因する濃度依存性細胞傷害効果が存在する。さらに、結果が、ＳＫ−ＯＶ−３細胞を処理されていないＰｒｏＴＩＡ（プロテアーゼなし）にＰＢＭＣの存在下で曝露させることにより、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡ組成物と比較して細胞傷害性の低減が示されることを示すものになることが予測される。
【０３３９】
上記の一連の細胞傷害性実験を、抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物および抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物などの他の二特異性ＰｒｏＴＩＡ組成物について実施する。これらの例では、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の代わりにＣＤ１９陽性標的細胞およびＨＥＲ２陽性標的細胞を使用する。ＣＤ１９発現細胞の細胞系の例としては、これだけに限定されないが、ＮＡＭＬ−６、Ｂｌｉｎ−１、ＳＫＷ６．４、Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉおよびＢＪＡＢが挙げられる。抗ＨＥＲ２標的化に関しては、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＨＣＣ−１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＪＩＭＴ−１、ＨＣＴ−１１６などのＨＥＲ２陽性細胞系が使用される。
【０３４０】
（実施例８）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＴ細胞活性化マーカーアッセイ
【０３４１】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡにより誘導される活性化マーカー（ＣＤ６９およびＣＤ２５）を測定するために、１×１０５個のＰＢＭＣまたは精製されたＣＤ３＋細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中、アッセイウェル当たり２×１０４個のＳＫ−ＯＶ−３細胞またはＯＶＣＡＲ３細胞と（すなわち、エフェクター対標的比５：１）、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）の存在下、９６ウェル丸底プレートにおいて、最終的な総体積２００μＬで共培養した。３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で２０時間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中、４℃で、ＰＥＣｙ５コンジュゲート抗ＣＤ４、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ８、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ２５、およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６９（抗体は全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのもの）を用いて染色し、ＦＡＣＳ緩衝剤で２回洗浄し、次いで、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でのデータ取得のためにＦＡＣＳ緩衝剤中に再懸濁させた。
【０３４２】
予測通り、ＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞系においてプロファイルされた３種のＰｒｏＴＩＡ分子のＴ細胞活性化マーカー発現傾向は、ＬＤＨ細胞傷害性アッセイによって観察されたものと同様であることが見いだされた。ＳＫ−ＯＶ−３細胞を使用すると、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）によるＰＢＭＣのＣＤ８集団およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９の活性化についての活性はプロテアーゼで処理されたＡＣ１４７６  ＰｒｏＴＩＡの活性の約７０分の１であり（ＣＤ８＋についてはＥＣ５０が５４０ｐＭ対６．７ｐＭであり、ＣＤ４＋についてはＥＣ５０が４３０ｐＭ対６．３ｐＭ）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）の活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の約１０００分の１であった（ＣＤ８＋についてはＥＣ５０が８７００ｐＭ対６．７ｐＭであり、ＣＤ４＋についてはＥＣ５０が６０００ｐＭ対６．３ｐＭ）（図４２）。
【０３４３】
同様に、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）によるＰＢＭＣ細胞のＣＤ８集団およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化についての活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の約６０分の１であり（ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１４７６）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）の活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の約１３００分の１であった（図４３）。
【０３４４】
作用機構がＣＤ３＋細胞を通じたものであることを確認するためにＳＫ−ＯＶ−３細胞を標的細胞として使用し、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）による精製されたＣＤ３＋細胞のＣＤ８集団およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９の活性化についての活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の約１００分の１であり（ＣＤ８＋についてはＥＣ５０が２６０ｐＭ対２．４ｐＭであり、ＣＤ４＋についてはＥＣ５０が２４０ｐＭ対２．２ｐＭである）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）の活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の約２０００分の１であった（ＣＤ８＋についてはＥＣ５０が５０００ｐＭ対２．４ｐＭであり、ＣＤ４＋についてはＥＣ５０が５０００ｐＭ対２．２ｐＭである）（図４４）。処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）による精製されたＣＤ３＋細胞のＣＤ８集団およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化についての活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の約１００分の１であり（ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１４７６）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）の活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の約２０００分の１であった（図４５）。
【０３４５】
ＯＶＣＡＲ３細胞を使用すると、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）による精製されたＣＤ３＋細胞のＣＤ８集団およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９の活性化についての活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の約１０分の１であり（ＣＤ８＋についてはＥＣ５０が１４ｐＭ対１．８ｐＭであり、ＣＤ４＋についてはＥＣ５０が１６ｐＭ対１．９ｐＭである）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）の活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の約１０００分の１であった（ＣＤ８＋についてはＥＣ５０が２０００ｐＭ対１．８ｐＭであり、ＣＤ４＋についてはＥＣ５０が１５００ｐＭ対１．９ｐＭである）（図４６）。処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）による精製されたＣＤ３＋細胞のＣＤ８集団およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９およびＣＤ２５の両方の活性化についての活性も、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の約１０分の１であり（ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１４７６）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）の活性も、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡ（ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１４７６）の活性の約１０００分の１であった。これらの結果から、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡが、アッセイ中、ＯＶＣＡＲ３細胞の存在下ではＳＫ−ＯＶ−３細胞と比較して大きな程度まで切断されたことが示唆される（図４７）。
【０３４６】
標的細胞の存在下での抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡによるＴ細胞の活性化のさらなる証拠として、ＣＤ６９およびグランザイムＢの誘導を測定した。ＰＢＭＣ（１×１０５個）をアッセイウェル当たり２×１０４個のＯＶＣＡＲ３細胞と（すなわち、エフェクター対標的比５：１）、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの存在下、９６ウェル丸底プレートにおいて、最終的な総体積２００μＬで共培養した。３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で２０時間インキュベートした後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝剤（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中、４℃で、ＰＥＣｙ５コンジュゲート抗ＣＤ４、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ８、およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６９（抗体は全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのもの）を用いて染色した。次いで、細胞を固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳを用いて透過処理した後、ＦＡＣＳ緩衝剤中、ＰＥコンジュゲート抗グランザイムＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃ＭＨＧＢ０４）を用いて染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝剤で洗浄し、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターでのデータ取得のためにＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁させた。
【０３４７】
予測通り、ＣＤ６９およびグランザイムＢの両方が、ＯＶＣＡＲ３細胞の存在下でＰｒｏＴＩＡ−活性化Ｔ細胞において発現される。さらに、ＣＤ４＋細胞と比較してより大きな分率のＣＤ８＋細胞がグランザイムＢを発現する（図４８および４９）。
【０３４８】
（実施例９）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の薬物動態
【０３４９】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの薬物動態をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて分析した。群１のマウス３匹にプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１２７８）を４ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、群２のマウス３匹には処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１２７８）を静脈内注射した。適切な時点で、血液をヘパリンリチウム添加管中に採取し、血漿に加工した。プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ動物に関しては、血漿採取時点は、投薬前、２分、１５分、３０分、２時間、４時間、８時間および２４時間であった。処理されていないＰｒｏＴＩＡマウスに関しては、血漿採取時点は、投薬前、４時間、８時間、２４時間、２日、４日、６日および７日であった。プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの血漿中濃度を、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡを標準物質として用いてｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＨｉｓタグサンドイッチＥＬＩＳＡによって数量化し、処理されていないＰｒｏＴＩＡの血漿中濃度を、切断されていないＰｒｏＴＩＡを標準物質として用いてｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって数量化した。
【０３５０】
簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｃａｔ＃４４２４０４）に、ウェル当たり０．１μｇ／１００μＬのｒｈＥｐＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃ＥＨＨ１０４１１１）をコーティングした。４℃で終夜インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、３％ＢＳＡを用いて室温で１時間にわたってブロッキングした。プレートを再度洗浄し、その後、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ標準物質、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ標準物質、適切な品質対照および血漿試験試料をある用量範囲で適切に添加した。プレートを振とうしながら室温で１時間インキュベートしておいて、ＰｒｏＴＩＡ標準物質、品質対照および試験試料がプレートにコーティングされたｒｈＥｐＣＡＭに結合するようにした。結合しなかった成分を数回の洗浄で除去した。プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡを検出するために、ビオチン化抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃ＢＡＭ０５０）を０．２μｇ／１００μＬで添加し、プレートを室温で１時間インキュベートしておいた。プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡを検出するために、ビオチン化抗ＸＴＥＮ抗体（専売抗体）を０．１μｇ／１００μＬで添加し、プレートを室温で１時間インキュベートしておいた。結合しなかったビオチン化試薬を洗い流した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ＃２１１３０）を１：３０，０００の希釈度で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。数回洗浄した後、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加した。所望の呈色強度に達したら、０．２Ｎの硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。呈色の強度は、それぞれｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＨｉｓタグサンドイッチＥＬＩＳＡおよびｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉されたプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡおよび処理されていないＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。血漿試料中に存在するＰｒｏＴＩＡの濃度を、適切なプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ標準曲線または処理されていないＰｒｏＴＩＡ標準曲線に対して、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して決定した。プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの終末相半減期（Ｔ１／２）の薬物動態算出をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて実施した。
【０３５１】
予想と一致して、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、約３．５時間という短い終末相消失半減期（Ｔ１／２）を有するが、一方プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ（ＸＴＥＮが付着している）は、３２時間という延長されたＴ１／２を有し（図２８）、これにより、無傷ＰｒｏＴＩＡ分子が、切断された分子よりも有意に長い半減期（少なくとも９倍）を有することが確認される。
【０３５２】
（実施例１０）
早期処置ＳＷ４８０モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性
【０３５３】
Ｔ細胞およびＢ細胞の欠乏、およびナチュラルキラー細胞の欠陥を特徴とする免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ有効性実験を実施した。マウスを無菌標準化環境条件下で維持し、ＵＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣＡｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）ガイドラインに従って実験を実施した。プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１２７８）の有効性を、ヒトＳＷ４８０癌腫異種移植モデルを使用して評価した。簡単に述べると、０日目に、群当たりＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス５匹のコホート６つに対し、１×１０７個のヒトＰＢＭＣと１×１０７個のＳＷ４８０細胞を混合して右側腹部に皮下注射した。ＳＷ４８０／ＰＢＭＣ接種の１時間後、コホート１にはビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を注射し、コホート２および３にはそれぞれプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．０４ｍｇ／ｋｇで、およびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．４ｍｇ／ｋｇで注射し、コホート４および５にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．１ｍｇ／ｋｇで、およびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを１ｍｇ／ｋｇで注射し、コホート６にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを１ｍｇ／ｋｇで注射した。コホート１〜５は、１日目から４日目まで毎日投与される４回の追加的な用量にさらに供したが、コホート６はこれに供さなかった。
【０３５４】
腫瘍を、計画された３５日間にわたって週２回、カリパスを用いて２つの直交する寸法で測定し、（幅２×長さ）／２の式を適用することによって腫瘍体積を算出した。体重、全身外観ならびに発作、振戦、嗜眠、過敏性、立毛、努力呼吸／呼吸促迫、呈色および腫瘍の潰瘍形成および死亡などの臨床所見も処置に関連する毒性の評価基準として密接にモニタリングした。試験エンドポイントを腫瘍体積２０００ｍｍ３または３６日までの生存のいずれか早い方と定義した。パーセント腫瘍成長阻害指数（％ＴＧＩ）を処置群それぞれについて、式：（（ＰＢＳビヒクル対照の平均腫瘍体積−ＰｒｏＴＩＡによる処置の平均腫瘍体積）／ＰＢＳビヒクル対照の平均腫瘍体積）×１００を適用することによって算出した。％ＴＧＩが≧６０％である処置群を治療的に活性であるとみなす。
【０３５５】
３６日目に、ヒトエフェクター細胞の存在下でＰＢＳビヒクルを用いて処置したコホート１のマウスでは腫瘍増悪が阻害されず、これにより、ヒトエフェクター細胞単独ではそれ自体で抗腫瘍効果を引き出すことができないことが実証された。ヒトエフェクター細胞の存在下、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．０４ｍｇ／ｋｇおよび０．４ｍｇ／ｋｇで用いた処置（それぞれコホート２および３）では、腫瘍成長の抑制に関して明らかな用量依存的応答が示され、０．４ｍｇ／ｋｇ用量群（％ＴＧＩ＝８４％）では０．０４ｍｇ／ｋｇ用量群（％ＴＧＩ＝７８％）よりも大きな保護がもたらされた。著しいことに、ヒトエフェクター細胞の存在下で抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを１ｍｇ／ｋｇで用いた処置（コホート５）によっても、モル濃度が等しい０．４ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ（コホート３）とほぼ同じ程度まで腫瘍成長が阻害された（％ＴＧＩ＝８３％）。データから、１ｍｇ／ｋｇで、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍環境において、十分な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡがプロテアーゼによって有効に切断されて活性がより大きいＸＴＥＮ付加されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分構造になって、観察された有効性がもたらされたことが示唆される。プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、０．１ｍｇ／ｋｇのコホート４では腫瘍退縮が欠如していたこと（％ＴＧＩ＝８％）から、この用量では、放出されたＸＴＥＮ付加されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分構造が、顕著な腫瘍退縮を誘導するためには不十分であったことが示唆される。単一の１ｍｇ／ｋｇ用量の抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡに供されたコホート６では、治療活性の閾値に達しなかったにもかかわらず（％ＴＧＩ＝５２％）、対照群と比較して腫瘍成長の抑制が示された（図３１）。結果から、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡがＳＷ４８０腫瘍環境において有効に切断されて、腫瘍増悪を阻害することができ、薬物濃度とそれに加えて曝露が薬効の決定における重要な因子であることが示唆される。
【０３５６】
注目すべきことに、全てのＰｒｏＴＩＡによる処置群およびビヒクル対照において有意な体重減少は観察されず、これにより、全ての処置の忍容性が良好であったことが示される（図３２）。
【０３５７】
プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡバリアントの抗腫瘍活性の特異性について、ＳＷ４８０／ＰＢＭＣを接種したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、上記の試験とほぼ同様であるが処置群当たり８匹のマウスを用いて実施する。この試験では、ＰＢＳビヒクル対照、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１３５７またはＡＣ１４８４）、二特異性陰性対照ＰｒｏＴＩＡ（ＣＤ３に対する結合活性を有するがＥｐＣＡＭに対する結合活性は有さない）、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１２７８、ＡＣ１４７６、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、ＡＣ１７１５）またはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた早期処置をＳＷ４８０／ＰＢＭＣ接種の１時間後に開始する。上記の試験において決定された通り１ｍｇ／ｋｇ用量濃度のプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを本試験で使用し、二特異性陰性対照ＰｒｏＴＩＡ、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ試験物およびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ試験物を全て等モル濃度で静脈内投与する。腫瘍体積、体重および臨床所見を１週間当たり２回、３５日間モニタリングする。
【０３５８】
ヒトエフェクター細胞の存在下でＰＢＳビヒクルおよび二特異性対照ＰｒｏＴＩＡを用いた処置では抗腫瘍効果が誘導されるとは予測されず、これにより、ヒトエフェクター細胞単独でも非ＥｐＣＡＭ標的化部分構造でも抗腫瘍効果を引き出すことができないことが実証される。これらの処置群のどちらのマウスも、試験エンドポイント（３５日目または腫瘍体積２０００ｍｍ３）を満たすことが予測される。ヒトエフェクターの存在下でのプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの５回の１日用量により、腫瘍成長の抑制が誘導されることが予測される。等モル濃度の切断不可能なＰｒｏＴＩＡはプロテアーゼによる切断の基質を含有しないので、これを用いた処置では腫瘍成長が最小に阻止されることが予想される。
【０３５９】
（実施例１１）
確立された結腸直腸腫瘍モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性
【０３６０】
確立された結腸直腸腫瘍モデルでは、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒｇｎｕｌｌ）マウスまたはＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスに、０日目にＳＷ４８０またはＨＣＴ−１１６腫瘍細胞を独立に埋め込む。（ＮＯＧマウスまたはＮＳＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を欠き、マクロファージが機能障害性であり、樹状細胞が機能障害性であり、補体活性が低下しているマウスをもたらすＩＬ−２Ｒｇ突然変異を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスである）。次いで、３日目〜１０日目の間のある時点でヒトＰＢＭＣを静脈内または腹腔内に導入する。ＳＷ４８０腫瘍およびＨＣＴ−１１６腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に達したら、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、無傷のプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な形態の抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた処置を、１週間当たり３回用量を３〜４週間として開始する。プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）のどちらによっても確立されたＳＷ４８０腫瘍およびＨＣＴ−１１６腫瘍の縮小または根絶が導かれ、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡでは経時的により良好な治療的曝露が付与され、その結果、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡよりも効果的な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルをもたらす潜在性を有することが予想される。プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡの間で、放出セグメントの差異が有効性プロファイルにおいて役割を果たす可能性が高いことも仮定される。
【０３６１】
切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）は腫瘍環境内でプロテアーゼによる切断の基質配列を含有しないので、腫瘍成長の阻止は最小であることが予想される。
【０３６２】
（実施例１２）
刺激された正常な健康ヒトＰＢＭＣ、ならびに無傷の抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを使用したヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビーズアレイ解析
【０３６３】
無傷の抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと、それに対して切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの、細胞に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴ細胞関連サイトカインの放出を刺激する能力の安全性評価として、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマを含むサイトカインのパネルを、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ試料および処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ試料を用いて刺激した、培養されたヒトＰＢＭＣ由来の上清に対するサイトメトリックビーズアレイ（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ：ＣＢＡ）を使用して分析した。抗ヒトＣＤ３抗体であるＯＫＴ３を陽性対照として使用し、無処理のウェルが陰性対照としての機能を果たした。
【０３６４】
簡単に述べると、ＯＫＴ３（０、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ）、ならびにプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭおよび２０００ｎＭのＡＣ１２７８）を９６ウェル平底プレートに、ウェルをバイオセーフティフード内で終夜蒸発させることによってドライコーティングした。次いで、ウェルを、ＰＢＳを用いて穏やかに１回洗浄し、２００μＬ中１×１０６個のＰＢＭＣを各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、その後、組織培養上清を各ウェルから採取し、放出されるサイトカインについて、有効な市販のＣＢＡキット（ＢＤ  ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット、ｃａｔ＃５５１８０９）を使用し、製造業者の指示に従って、フローサイトメトリーによって分析した。
【０３６５】
結果：
【０３６６】
検出されたサイトカインのレベルに関する生データを表１２に示し、図３３〜３５に図表で示す。
表１２：試験化合物に応答したサイトカインレベル
【表１２−１】
2021507706.tif 000053
【表１２−２】
2021507706.tif 000054
【０３６７】
予測通り、ＯＫＴ３により、評価した全てのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ）の頑強な分泌が誘導されたが、無処理のウェルでは誘導されず、それにより、ＣＢＡサイトカインアッセイの性能が確認された。プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた刺激により、特に１００ｎＭよりも高い濃度で、試験したサイトカインの全てについて有意なサイトカイン発現が誘発された。対照的に、無傷の切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子を１０〜２０００ｎＭの濃度範囲で刺激薬とした場合には、ベースラインレベルのＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマが検出された。プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡを用いて誘導した場合に適切なレベルのＩＬ−４が検出されたが、ＩＬ−４のレベルは、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡを用いて観察されたものよりは高くなかった（図３３〜３５）。これらのデータから、無傷ＰｒｏＴＩＡ組成物のＸＴＥＮポリマーにより考慮すべき遮蔽効果がもたらされ、ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分が組成物から放出されるところのプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡと比較して、ＰＢＭＣにより刺激されるサイトカイン応答が妨げられることが示唆される。
【０３６８】
（実施例１３）
早期処置ＨＣＴ−１１６モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性
【０３６９】
Ｔ細胞およびＢ細胞の欠乏、およびナチュラルキラー細胞の欠陥を特徴とする免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ有効性実験を実施した。マウスを無菌標準化環境条件下で維持し、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）ガイドラインに従って実験を実施した。プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）の有効性を、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（すなわち、放出セグメント切断配列を有さないＰｒｏＴＩＡおよびＡＣ１４８４である例）と共に、ヒトＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルを使用して評価した。簡単に述べると、０日目に、群当たりＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス５匹のコホート４つに対し、５×１０６個のヒトＰＢＭＣと５×１０６個のＨＣＴ−１１６細胞を混合して右側腹部に皮下注射した。ＨＣＴ−１１６／ＰＢＭＣ接種の１時間後、および等モル投薬に基づいて、コホート１にはビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を注射し、コホート２にはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．２１ｍｇ／ｋｇで注射し、コホート３にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで注射し、コホート４には切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．４９ｍｇ／ｋｇで注射した。コホート１〜４の全てを１日目から４日目まで毎日投与される４回の追加的な用量に供した。
【０３７０】
腫瘍を、計画された３５日間にわたって週２回、カリパスを用いて２つの直交する寸法で測定し、（幅２×長さ）／２の式を適用することによって腫瘍体積を算出した。体重、全身外観ならびに発作、振戦、嗜眠、過敏性、立毛、努力呼吸／呼吸促迫、呈色および腫瘍の潰瘍形成および死亡などの臨床所見も処置に関連する毒性の評価基準として密接にモニタリングした。試験エンドポイントを腫瘍体積２０００ｍｍ３または３５日までの生存のいずれか早い方と定義した。パーセント腫瘍成長阻害指数（％ＴＧＩ）を処置群それぞれについて、式：（（ＰＢＳ対照の平均腫瘍体積−ＰｒｏＴＩＡによる処置の平均腫瘍体積）／ＰＢＳ対照の平均腫瘍体積）×１００を適用することによって算出した。％ＴＧＩが≧６０％である処置群を治療的に活性であるとみなす。
【０３７１】
３５日目に、ヒトエフェクター細胞の存在下でビヒクルを用いて処置したコホート１のマウスでは腫瘍増悪は阻害されず、群の平均腫瘍体積１６５４±８７ｍｍ３で試験を終了し、これにより、ヒトエフェクター細胞単独ではそれ自体で抗腫瘍効果を引き出すことができないことが実証される。ヒトエフェクター細胞の存在下、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．２１ｍｇ／ｋｇで用いた処置（コホート２）では、頑強な腫瘍成長の抑制が示され、マウス５匹中２匹が、１８日目に測定可能な腫瘍体積が示されないことにより、完全な腫瘍退縮を示した。しかし、このコホートにおいて２５日目以降、腫瘍の再成長および増悪が観察され、その結果、５匹のマウス全てが、腫瘍量を有し、３５日目に平均腫瘍体積２９６±３３ｍｍ３で試験を終了した。重要なことに、ヒトエフェクター細胞の存在下で無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで用いた処置（コホート３）によっても、腫瘍成長の強力な阻害が付与された。実際、コホート３のマウス５匹中４匹が１８日目までに完全な腫瘍退縮を示した。このコホートは、３５日目に２匹のマウスがなお完全な退縮を保持しており、平均腫瘍体積４８±６７ｍｍ３で試験を終了した。重要なことに、０．４９ｍｇ／ｋｇ用量の切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡに供されたコホート４では、腫瘍増悪コホート２および３と同様に有効な持続的な阻害は少しも誘導されず、このコホートのマウス５匹中５匹が有意な腫瘍量を有したままであった。コホート４は、３５日目に群の平均腫瘍体積７４８±２７２ｍｍ３で試験を終了した。プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、０．２１ｍｇ／ｋｇ（コホート２）および無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、０．５ｍｇ／ｋｇ（コホート３）では、ＴＧＩがそれぞれ８２％および９７％であり、どちらも治療的に活性であると考えられる。切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡはＴＧＩが５５％であり、治療的に不活性であると考えられる。予測通り、無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの群の平均腫瘍体積は切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡコホートの平均腫瘍体積とは有意に異なることが見いだされる（スチューデントｔ検定、ｐ＝０．００１６）。目に見えるほどに、無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡコホートの群の平均腫瘍体積は、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡコホートの平均腫瘍体積とも有意に異なることが見いだされた（ｐ＝０．００２）。結果から、０．５ｍｇ／ｋｇでは、有意な量の抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡがｉｎ  ｖｉｖｏ  ＨＣＴ−１１６腫瘍環境に存在するプロテアーゼによって有効に切断されて高度に活性なＸＴＥＮ付加されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分構造になって、顕著な観察された腫瘍退縮が付与されたことが示唆される。この仮説は、放出セグメント基質を欠く切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子では持続的な腫瘍退縮の性質の欠如がもたらされたことによって十分に裏付けられる（図３８）。重要なことに、データから、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡではプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡよりも良好な治療的曝露が課され、したがって、より持続的な腫瘍退縮効果が報告されることも示唆される。
【０３７２】
注目すべきことに、全てのＰｒｏＴＩＡによる処置群およびビヒクル対照において有意な体重減少は観察されず、これにより、全ての処置が、一般に忍容性が良好であることが示される（図３９）。
【０３７３】
（実施例１４）
精製されたＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在下で抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の細胞傷害性アッセイ
【０３７４】
ＰｒｏＴＩＡ分子の細胞傷害活性がＣＤ３陽性Ｔ細胞によって媒介されることを実証するために、放出セグメントを有さない切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）、およびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）を、ＳＫ−ＯＶ−３ヒト卵巣細胞系およびＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣細胞系において、精製されたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在下でさらに評価した。精製されたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴから購入し、健康なドナーの全血からＭａｇＣｅｌｌｅｃｔヒトＣＤ３＋Ｔ細胞単離キットを使用した負の選択によって単離した。この実験では、精製されたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞をＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞またはＯＶＡＲ−３卵巣細胞と５：１の比で混合し、３種全てのＰｒｏＴＩＡ分子を上記の通りＬＤＨアッセイ１２点の５倍段階希釈の用量曲線として試験した。予測通り、ＳＫ−ＯＶ−３においてプロファイルされた３種のＰｒｏＴＩＡ分子の活性の傾向は、ＰＢＭＣ分析を用いてＳＫ−ＯＶ−３において観察されたものと同様であることが見いだされた（図３０）。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞によるＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞の細胞傷害性死滅では、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の５６分の１であり（ＥＣ５０が１３４ｐＭ対２．４ｐＭ）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の１０００分の１よりも低い（ＥＣ５０が２６６０ｐＭ対２．４ｐＭ）（図４０）。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞によるＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の細胞傷害性死滅では、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性の低さはプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の２分の１にすぎず（ＥＣ５０が０．７ｐＭ対０．３ｐＭ）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の２８７分の１である（ＥＣ５０が８６ｐＭ対０．３ｐＭ）（図４１）。結果から、ＰｒｏＴＩＡ分子の細胞傷害活性が、実際にＣＤ３陽性Ｔ細胞によって媒介されること、ならびに、切断可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子内に含有される放出セグメントの、腫瘍細胞および／または活性化されたＣＤ３陽性Ｔ細胞からアッセイ混合物中に放出されると仮定されるプロテアーゼによる影響の受けやすさが、細胞系間で異なる可能性が高いことが実証された。
【０３７５】
（実施例１５）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＴ細胞活性化マーカーおよびサイトカイン放出アッセイ
【０３７６】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡに誘導されるサイトカインの発現を測定するために、アッセイウェル当たり１×１０５個の精製されたＣＤ３＋細胞を、２×１０４個のＳＫ−ＯＶ−３細胞と（すなわち、エフェクター対標的比５：１）、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）の存在下、９６ウェル丸底プレートにおいて、最終的な総体積２００μＬで共培養した。３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で２０時間インキュベートした後、細胞の上清をサイトカイン測定のために収集した。このアッセイを、ＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＫＮ４５、ＭＴ３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＷ４８０、ＯＶＣＡＲ３およびＰＣ３の細胞系から選択される他の標的細胞を用いて、ならびに精製されたＣＤ３＋細胞の代わりにＰＢＭＣを用いて実施することもできる。
【０３７７】
細胞培養上清中に分泌されたインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマのサイトカイン分析を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｃａｔ＃５５０７４９）を使用し、製造業者の指示に従って定量化した。ＰｒｏＴＩＡの不在下では、精製されたＣＤ３＋細胞からはバックグラウンドを上回るサイトカイン分泌は予測されない。ＥｐＣＡＭ陽性標的細胞および精製されたＣＤ３＋細胞の存在下では、ＰｒｏＴＩＡにより、Ｔ細胞が活性化され、あるパターンのＴ細胞サイトカインが分泌され、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファなどのＴｈ１サイトカインの割合が高いことが予想される。
【０３７８】
予測通り、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡにより、評価した全てのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ）の頑強な分泌が誘導された（図５０〜５２参照）。精製されたＣＤ３＋細胞をＳＫ−ＯＶ−３細胞およびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１４７６）で刺激することにより、特に２０ｐＭよりも高い濃度で、試験したサイトカインの全てについて有意なサイトカイン発現が誘発された。対照的に、無傷の切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子（ＡＣ１４７６）を８〜２００ｐＭの濃度範囲で使用した場合に、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマのベースラインレベルが検出された（ＥＣ５０は４．３ｎＭである）。さらに、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子（ＡＣ１４８４）を４０ｐＭ〜１ｎＭの濃度範囲で使用した場合に、試験した全てのサイトカインのベースラインレベルが検出された。これらのデータから、無傷ＰｒｏＴＩＡ組成物のＸＴＥＮポリマーにより考慮すべき遮蔽効果がもたらされ、ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分が組成物から放出されるところのプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡと比較して、ＣＤ３＋Ｔ細胞により刺激されるサイトカイン応答が妨げられることが示唆される。
【０３７９】
（実施例１６）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＣＤ３結合特異性
【０３８０】
ＰｒｏＴＩＡは二特異性標的化組成物であるので、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の結合能をヒトＣＤ３に対する結合親和性についても評価した。これを、ＣＤ３ε＆δ／ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて決定した。このＥＬＩＳＡでは、組換えヒトＣＤ３（ｒｈＣＤ３ε＆δ）（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ  ｃａｔ＃ＣＤ３Ｅ＆ＣＤ３Ｄ−２１９Ｈ）を９６ウェル平底プレートに０．０２５μｇ／１００μＬの濃度でコーティングした。４℃で終夜インキュベートした後、アッセイプレートを洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間にわたってブロッキングした。プレートを再度洗浄し、その後、用量範囲の切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）を導入した。ＰｒｏＴＩＡの３つのバージョン全てに対して利用した用量範囲は０．００２〜１００ｎＭであり、これは、１００ｎＭの出発濃度からの１：６倍段階希釈スキームを用いて実現した。プレートを振とうしながら室温で１時間インキュベートしておいて、切断不可能なＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡがプレートにコーティングされたｒｈＣＤ３ε＆δに結合するようにした。結合しなかった成分を洗浄ステップで除去し、ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ＃３２４２０）を０．０５μｇ／１００μＬで添加した。適切なインキュベーション期間後、あらゆる結合しなかった試薬を洗浄ステップによって除去し、その後、各ウェルにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加した。所望の呈色強度に達した後、０．２Ｎの硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。呈色の強度は、ｒｈＣＤ３ε＆δ／プロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉された切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。生じた呈色の強度（測定されたＯＤ）をタンパク質濃度に対してプロットし、最大半量応答（ＥＣ５０）をもたらす切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、４パラメーターロジスティック回帰方程式を用いて導き出した。
【０３８１】
結果：図５３に示されている通り、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３二特異性ＰｒｏＴＩＡ分子の結合活性と同様の結合活性を有し、各々がそれぞれ１８００ｐＭおよび２２００ｐＭのＥＣ５０を有した。プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡは、ｒｈＣＤ３ε＆δリガンドに対するＥＣ５０が３１０ｐＭで、無傷のプロテアーゼで処理されていない二特異性分子または切断不可能なＰｒｏＴＩＡ分子と比較して最も強力な結合活性を有した。ＸＴＥＮ８６４遮断部分構造は抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分構造の直後に位置するので、ＸＴＥＮ８６４により、切断されていない抗ＣＤ３実体とそのリガンドとの結合に対して、ＣＤ３リガンドに結合するＰｒｏＴＩＡの切断され、放出された抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分と比較して約５．８倍の障害がもたらされる。
【０３８２】
（実施例１７）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の結合特異性
【０３８３】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）の結合特異性を、対照ＰｒｏＴＩＡ組成物である抗ＣＥＡ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４３２）および抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４０８）と併せて、標的細胞マーカー／ビオチンコンジュゲートプロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて評価した。抗ＣＥＡ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４３２）および抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４０８）はどちらも、標的化成分が異なるとしても、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）と同じ抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ成分を有する。ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、組換えヒトＥｐＣＡＭ（ｒｈＥｐＣＡＭ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃９６０−ＥＰ−５０）、組換えヒトＣＥＡ（Ａｂｃａｍ  ｃａｔ＃ａｂ７４２）および組換えヒトＨＥＲ２（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃ＨＥ２−Ｈ５２５）を９６ウェル平底プレートに０．１μｇ／１００μＬの濃度でコーティングした。４℃で終夜インキュベートした後、アッセイプレートを洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間にわたってブロッキングした。プレートを再度洗浄し、その後、ある用量範囲（０．０００７〜０．５ｎＭ、出発濃度０．５ｎＭからの１：３倍段階希釈スキームを用いて実現した）のプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）を、ＥｐＣＡＭをコーティングしたウェル、ＣＥＡをコーティングしたウェルおよびＨＥＲ２をコーティングしたウェルに導入した。対照としての機能を果たす、プロテアーゼで処理された抗ＣＥＡ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４３２）を同様の用量範囲でＣＥＡをコーティングしたウェルに導入し、プロテアーゼで処理された抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４０８）も同様の用量範囲でＨＥＲ２をコーティングしたウェルに導入した。プレートを振とうしながら室温で１時間インキュベートしておいて、種々のプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡがそれぞれの抗原をコーティングしたプレートに結合するようにした。結合しなかった成分を洗浄ステップで除去し、ビオチンコンジュゲートプロテインＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ＃２９９９７）を０．０５μｇ／１００μＬで添加した。適切なインキュベーション期間後、あらゆる結合しなかった試薬を洗浄ステップによって除去し、その後、各ウェルにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加した。所望の呈色強度に達した後、０．２Ｎの硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。呈色の強度は、適切な抗原をコーティングしたプレートによって捕捉されたそれぞれのプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。生じた呈色の強度（測定されたＯＤ）をＰｒｏＴＩＡ濃度に対してプロットし、それぞれの用量曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、４パラメーターロジスティック回帰方程式を用いて導き出した。
【０３８４】
結果：図５４に示されている通り（および図２４の結果と比較できる）、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、プレートにコーティングされたｒｈＥｐＣＡＭに用量依存的に結合して、１１０ｐＭのＥＣ５０をもたらす。同様に、プロテアーゼで処理された抗ＣＥＡ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡはＣＥＡ抗原をコーティングしたプレートに用量依存的に結合して、７０ｐＭのＥＣ５０をもたらし、プロテアーゼで処理された抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡはＨＥＲ２抗原をコーティングしたプレートに用量依存的に結合して、４７ｐＭのＥＣ５０をもたらす。著しいことに、ＣＥＡ抗原をコーティングしたプレートおよびＨＥＲ２抗原をコーティングしたプレートのどちらにも結合するプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡについては用量依存的結合が観察されず、これにより、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡが、ＥｐＣＡＭに特異的に結合し、ＣＥＡ抗原にもＨＥＲ２抗原にも結合しないことが示される。したがって、組成物は、それらの標的リガンドに対する特異的な結合親和性を示し、非特異的結合は示さなかった。
【０３８５】
（実施例１８）
早期処置ＳＷ４８０モデルにおける無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍性と切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍性
【０３８６】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子（ＡＣ１４７６）中に工学的に作製された放出セグメント（ＲＳ）の腫瘍環境におけるプロテアーゼによる影響の受けやすさも、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４８４）、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）と共に、ＳＷ４８０／ＰＢＭＣを接種したＮＯＤ／ＳＣＩＤ異種移植モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。実施例１０および１３に記載の試験とほぼ同様に、ＳＷ４８０／ＰＢＭＣ接種の１時間後（０日目と示される）、コホート１のマウスにビヒクル（ＰＢＳ＿０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を注射し、コホート２にはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．２１ｍｇ／ｋｇで注射し、コホート３には無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで注射し、コホート４には切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．４９ｍｇ／ｋｇで注射した。全てのコホート（すなわち、１〜４）を、１日目から４日目まで毎日投与される４回の追加的な用量でさらに処置した。腫瘍体積、体重および臨床所見を週に２回、標的の３５日間にわたってモニタリングする。
【０３８７】
図５５に示されている通り、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、０．２１ｍｇ／ｋｇ（コホート２）、無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、０．５ｍｇ／ｋｇ（コホート３）および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、０．４９ｍｇ／ｋｇ（コホート４）は全て、治療的に活性であると決定され、腫瘍成長阻害指数（％ＴＧＩ）はそれぞれ９３％、９５％および８０％である。したがって、等モルで投薬すると、無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは腫瘍で富化されるプロテアーゼによって有効に切断されて高度に活性な放出された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（ＸＴＥＮ部分構造と連結していない）になって、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと同等の腫瘍退縮有効性を示す。予測通り、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、腫瘍増悪の阻害において効果的ではあるが、無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡよりも有効性が低く、これにより、放出セグメントが存在することで、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３結合ドメインの放出が可能になることによって組成物の治療有効性が改善されることが示唆される。
【０３８８】
図５６に示されている通り、ＳＷ４８０異種移植モデルにおいて、コホート２および３でいくらかの体重減少が観察され、これにより、いくらかの可能性のある毒性が示唆される。最小有効用量、投薬回数の減少および確立された腫瘍モデルにおける評価を評価する追加的な実験によりこの最初の知見がさらに解明されよう。
【０３８９】
（実施例１９）
ＯＶＣＡＲ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性。
【０３９０】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性をまた、重症免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスまたはＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒｇｎｕｌｌ）マウスの腹腔内に埋め込まれたヒト卵巣ＯＶＣＡＲ−３種の細胞系を使用して評価する。ＮＯＧマウスおよびＮＳＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の欠乏、ならびにマクロファージ、樹状細胞および補体系の機能障害を特徴とする。簡単に述べると、０日目に、群当たりＮＯＧマウスまたはＮＳＧマウス５匹のコホート７つに対し、５〜１０×１０６個のＯＶＣＡＲ−３細胞を腹腔内に埋め込み、その後、１４日目に、５〜１０×１０６個のＰＢＭＣを静脈内に導入する。１６日目に、処置を開始し、コホート１にはビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を毎日、５回用量（ｑｄ×５）で注射し、コホート２にはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．２１ｍｇ／ｋｇで、ｑｄ×５で注射し、コホート３にはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを１．０５ｍｇ／ｋｇで１週間に１回（ｑｗ）注射し、コホート４にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄ×５で注射し、コホート５にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを２．５ｍｇ／ｋｇで、ｑｗで注射し、コホート６には切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．４９ｍｇ／ｋｇで、ｑｄ×５で注射し、コホート７には切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを２．４５ｍｇ／ｋｇで、ｑｗで注射する。全てのコホートを、翌週、もう１回の処置サイクルに供した。マウスを、挙動および生存について毎日モニタリングし、体重および腹部膨満について週２回モニタリングする。腫瘍発生の徴候としてＣＡ１２５を決定するために血液を３０日目、４０日目、５０日目および６０日目に採取した。動物の体重が０日目から３０％増加した場合、その動物を試験エンドポイントを満たしていると定義し、屠殺し、剖検する。
【０３９１】
ＯＶＣＡＲ−３腫瘍の成長は、体重の増加、腹部径の増加および循環ＣＡ１２５レベルの上昇によってモニタリングされる腹腔内の腹水の発生によって証明される。プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）のどちらによっても生存の改善および腹水形成されないことまたは遅延が導かれることが予想される。プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡはより良好な治療的曝露を有し、それにより、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡよりも効果的な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルが導かれることも予測される。切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡでも腫瘍成長は阻止されるが、放出セグメントを有するプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡによって実証されるものよりもはるかに少ない程度であるとも予測される。
【０３９２】
（実施例２０）
ＯＶＣＡＲ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＰＫ性質。
【０３９３】
プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのＰＫおよび生体内分布プロファイルを、独立に金属で標識した分子の混合物としてＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて評価する。照射処置したＢＡＬＢ／ｃヌードマウス各々に、０日目にＯＶＣＡＲ−３細胞１千万個を腹腔内注射する。腹部膨満が目に見えて観察された時および／または動物の体重が０日目と比べて１０〜１５％増加したときに処置を開始する。ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するマウス２０匹のうち、１８匹を選択し、それらの個々の体重に応じて群当たり動物９匹の群２つにランダム化する。マウス９匹の群の一方に対して、等モル濃度の、金属１で標識したプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、金属２で標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび金属３で標識した切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡで構成される混合物を１．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射する。動物９匹の群の他方には、同じＰｒｏＴＩＡ混合物を１．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与する。
【０３９４】
同じ群内の動物間（すなわち、静脈内投与群および腹腔内投与群）で交代させ、試験物投与後０．５時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、３日目、５日目および７日目の時点で頸静脈／下顎静脈穿刺によって血液をヘパリンリチウム管中に採取する。血液を４℃、１３００ｇで１０分間遠心分離することによって血漿に加工し、分析時まで−８０℃で保管する。
【０３９５】
試験物投与後４時間、８時間、２４時間、４８時間、３日目、５日目および７日目の時点で静脈内投与群および腹腔内投与群の両方から、同じ群内の動物で交代させ、腹水を採取する。腹水試料をすぐに４℃、３００ｇで１０分間遠心分離し、流体成分を分析時まで−８０℃まで凍結させておく。
【０３９６】
各群から３匹のマウスを３日目、５日目および７日目に致死させる。臓器（脳、心臓、肝臓、肺、脾臓、および膵臓）および腹膜腔内の腫瘍小結節を収集し、秤量し、急速冷凍し、分析時まで−８０℃で保管する。
【０３９７】
全ての試料（血液、腹水、正常な臓器および腫瘍組織）をＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析）によって分析する。静脈内群では、少量の３種全てのＰｒｏＴＩＡが腹水中に検出されることが予測される。血漿成分中、金属２で標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび金属３で標識した切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、金属１で標識したプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡよりも長い全身半減期を示すことが予測される。腹腔内群では、３種全てのＰｒｏＴＩＡバージョンが腹水中で検出可能であることが予測される。腹腔内空間に腫瘍が存在することに起因して、金属２で標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび金属３で標識した切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡが金属１で標識したプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと比較して長い腹膜腔中での保持時間を有するかどうかは不明である。３種全てのＰｒｏＴＩＡバージョンが、静脈内経路と比較して遅い時間に、かつ低濃度で血漿中に検出されることが予測される。３種全てのＰｒｏＴＩＡバージョンが、腹膜腔から抽出された腫瘍小結節では高濃度で存在するが、正常な臓器では最小に存在するかまたは存在しないことが予測される。
【０３９８】
（実施例２１）
ＳＫ−ＯＶ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性。
【０３９９】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性をまた、重症免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスまたはＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒｇｎｕｌｌ）マウスの腹腔内に埋め込まれたヒト卵巣ＳＫ−ＯＶ−３種の細胞系を使用して評価する。ＮＯＧマウスおよびＮＳＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の欠乏、ならびにマクロファージ、樹状細胞および補体系の機能障害を特徴とする。簡単に述べると、０日目に、群当たりＮＯＧマウスまたはＮＳＧマウス５匹のコホート７つに対し、５〜１０×１０６個のＳＫ−ＯＶ−３細胞を腹腔内に埋め込み、その後、５日目に５〜１０×１０６個のＰＢＭＣを腹腔内に導入する。７日目に、処置を開始し、コホート１にはビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を毎日、５回用量（ｑｄ×５）で注射し、コホート２にはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．２１ｍｇ／ｋｇで、ｑｄ×５で注射し、コホート３にはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを１．０５ｍｇ／ｋｇで１週間に１回（ｑｗ）注射し、コホート４にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄ×５で注射し、コホート５にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを２．５ｍｇ／ｋｇで、ｑｗで注射し、コホート６には切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．４９ｍｇ／ｋｇで、ｑｄ×５で注射し、コホート７には切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを２．４５ｍｇ／ｋｇで、ｑｗで注射する。マウスを、挙動および生存について毎日モニタリングし、体重および腹部膨満について週２回モニタリングする。動物の体重が０日目から３０％増加した場合、動物を試験エンドポイントを満たしていると定義し、屠殺し、剖検する。
【０４００】
ＳＫ−ＯＶ−３の成長は、体重の増加および腹部径の増加によってモニタリングされる腹腔内の腹水の発生によって証明される。プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）のどちらによっても生存の改善および腹水形成されないことまたは腹水形成の遅延が導かれることが予想される。プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡでは、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡと比較してより良好な治療的曝露、より効果的な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルが付与されることも予測される。切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡでも腫瘍成長は阻止されるが、放出セグメントを有するプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡによって示されるものよりもはるかに小さい規模であることも予測される。
【０４０１】
（実施例２２）
ヒト悪性腹水試料における抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の性能。
【０４０２】
ヒト悪性腹水を、これだけに限定されないが、進行した、再発した、および不応性の卵巣癌（腺癌および粘液性）、結腸直腸癌、胃癌、胆管／胆管細胞癌、ファーター膨大部癌、膵癌および非明細胞腎癌の患者を含む原発性腹腔内ＥｐＣＡＭ陽性上皮悪性腫瘍を有する患者から採取する。試料採取前３０日以内に化学療法、免疫学的治療、生物学的製剤および／またはコルチコステロイド治療を受けている患者は除外する。悪性腹水を室温、３００〜４００ｇで１０分間遠心分離し、流体およびペレット成分を収集する。これだけに限定されないが、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、マトリプターゼおよびｕＰＡを含めたヒトプロテアーゼの流体成分中の濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（ヒトＭＭＰ−９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃ＫＨＣ３０６１または等価物；ヒトＭＭＰ−２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃ＫＨＣ３０８１または等価物；ヒトマトリプターゼ、Ｅｎｚｏ  ｃａｔ＃ＡＤＩ−９００−２２１；およびヒトｕＰＡ、Ａｂｃａｍ  ｃａｔ＃１１９６１１）を使用し、製造業者の指示に従って定量化する。腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）中に見いだされるプロテアーゼによって切断される無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）の率を、既知濃度のＰｒｏＴＩＡを腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）成分中にスパイクし、混合物を３７℃で、０．５時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、３日、４日、５日および７日という指定された時点で一定分量を抜き取りながらインキュベートすることによって決定する。次いで、それぞれの時点で存在する無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの量を、対応する無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３を標準物質として用いたｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡで分析する。
【０４０３】
簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｃａｔ＃４４２４０４）に、ウェル当たり０．１μｇ／１００μＬのｒｈＥｐＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃ＥＨＨ１０４１１１）をコーティングする。４℃で終夜インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、３％ＢＳＡを用いて室温で１時間にわたってブロッキングする。プレートを再度洗浄し、その後、無傷の、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ標準物質、適切な品質対照およびＰｒｏＴＩＡをスパイクした腹水試験試料をある用量範囲で適切に添加する。プレートを、室温で１時間、振とうしながらインキュベートしておいて、ＰｒｏＴＩＡ標準物質、品質対照および試験試料がプレートにコーティングされたｒｈＥｐＣＡＭに結合するようにする。結合しなかった成分を数回の洗浄で除去する。ビオチン化抗ＸＴＥＮ抗体（専売抗体）を０．１μｇ／１００μＬで添加し、プレートを室温で１時間インキュベートしておく。結合しなかったビオチン化試薬を洗い流した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ＃２１１３０）を１：３０，０００の希釈度で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。数回洗浄した後、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加する。所望の呈色強度に達したら、０．２Ｎの硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定する。呈色の強度は、ｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉される無傷ＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。腹水試験試料中に存在する無傷ＰｒｏＴＩＡの濃度を、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して無傷ＰｒｏＴＩＡ標準曲線に対して決定する。ｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて検出される無傷ＰｒｏＴＩＡの減少速度（すなわち、半減期）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して決定する。放出セグメントの差異が、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡの間での代謝速度に関して役割を果たす可能性が高いと仮定される。
【０４０４】
腹水ペレットを、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＡ１２５およびＣＤ５６の発現について表現型決定する。ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３について陽性である試験された悪性腹水試料を、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡを用いた細胞傷害分析のために使用する。簡単に述べると、腹水細胞１×１０５個を適量の腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）で再構成し、３連で２４時間にわたって２４ウェルプレートに接着させる。細胞を、用量濃度のプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いて４８時間にわたって処理し、その後、カスパーゼ３／７を、発光性カスパーゼ３／７基質を使用し、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  ｃａｔ＃Ｇ８０９１）による指示の通り定量化する。発光シグナルはカスパーゼ−３／７活性に比例するので、次いで、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの用量濃度を発光シグナルに対してプロットし、最大半量応答（ＥＣ５０）をもたらすタンパク質の濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、４パラメーターロジスティック回帰方程式を用いて導き出す。進行した、再発した、および不応性のＥｐＣＡＭ陽性がん患者に由来するヒト悪性腹水は、無傷抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡが、強力な細胞傷害活性を発揮するＸＴＥＮ付加されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分構造に切断されその後活性化されるために必要な成分を全て含有することが予想される。腫瘍除去の徴候としてのＥｐＣＡＭ陽性細胞の数の減少；ならびＴ細胞活性化を反映するにＣＤ６９およびグランザイムなどのＴ細胞活性化マーカーの増加も予測される。
【０４０５】
（実施例２３）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のカスパーゼ３／７アッセイ
【０４０６】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の向け直された細胞傷害性を、アポトーシス細胞のカスパーゼ３／７活性によっても評価した。上記のＬＤＨ細胞傷害性アッセイと同様に、ＰＢＭＣまたは精製されたＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＳＷ４８０細胞、ＳＫ−ＯＶ−３細胞およびＯＶＡＲ−３細胞などのＥｐＣＡＭ陽性腫瘍標的細胞とエフェクター５対標的１の比で混合し、ＨＣＴ−１１６と１０：１の比で混合した。３種全てのＰｒｏＴＩＡバージョンを上記のＬＤＨアッセイと同様に１２点の５倍段階希釈用量濃度として試験した。
【０４０７】
細胞溶解したら、培養上清中に放出されたカスパーゼ３／７を、「グロー型」発光シグナルを生じさせるカスパーゼ３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  ｃａｔ＃Ｇ８０９１）による発光性カスパーゼ３／７基質切断の量によって測定した。発光の量はカスパーゼ活性の量に比例する。
【０４０８】
予測通り、ＳＫ−ＯＶ−３腫瘍細胞系、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞系、ＨＣＴ−１１６腫瘍細胞系およびＳＷ４８０腫瘍細胞系においてプロファイルされたプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性の傾向は、ＬＤＨアッセイ分析において観察された活性と一致することが見いだされた。ヒトＰＢＭＣによるＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞の細胞傷害性死滅に関しては、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の１２分の１であり（ＥＣ５０が１４０ｐＭ対１２ｐＭ）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の３９０分の１である（ＥＣ５０が４７００ｐＭ対１２ｐＭ）（図５７）。ＰＢＭＣによるＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の細胞傷害性死滅に関しては、プロテアーゼで切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの活性の４分の１であり（ＥＣ５０が９．８ｐＭ対２．５ｐＭ）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の４２０分の１である（ＥＣ５０が１０４３ｐＭ対２．５ｐＭ）（図５８）。ＰＢＭＣによるＨＣＴ−１１６結腸直腸細胞の細胞傷害性死滅に関しては、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと無傷のプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡはほぼ同様の活性を有し（ＥＣ５０が１．８ｐＭ対３．６ｐＭ）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の１３０分の１である（ＥＣ５０が２４０ｐＭ対１．８ｐＭ）（図５９）。ＰＢＭＣによるＳＷ４８０結腸直腸細胞の細胞傷害性死滅に関しては、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡとプロテアーゼで切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡも同様の活性を示し（ＥＣ５０が２ｐＭ対１ｐＭ）、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡの活性の７０分の１である（ＥＣ５０が１４８ｐＭ対２ｐＭ）（図６０）。結果から、切断不可能なＰｒｏＴＩＡが、ＸＴＥＮ付加されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分構造よりも一貫して活性が低いことが実証された。使用した細胞系に応じて、無傷の、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡの活性は、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡと比較して同様の活性から１２分の１の活性までにわたり、これにより、放出セグメントの、腫瘍細胞および／または活性化されたＣＤ３陽性Ｔ細胞からアッセイ混合物中に放出されると仮定されるプロテアーゼによる影響の受けやすさの程度の差異が示唆される。
【０４０９】
（実施例２４）
種々のプロテアーゼを使用したＡＣ１４７６  ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）のタンパク質分解切断
【０４１０】
本実験は、実施例３において前述したａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）ＡＣ１４７６をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、および好中球エラスターゼを含めた多数の腫瘍関連プロテアーゼによって切断することができることを実証するために行った。
【０４１１】
１．酵素の活性化
【０４１２】
使用した酵素は全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。組換え好中球エラスターゼおよび組換えヒトマトリプターゼは活性化された酵素として提供され、使用するまで−８０℃で保管した。組換えマウスＭＭＰ−２および組換えマウスＭＭＰ−９はチモーゲンとして供給され、酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）による活性化が必要であった。ＡＰＭＡをまず０．１ＭのＮａＯＨ中に最終濃度１０ｍＭまで溶解させた後、０．１ＮのＨＣｌを使用してｐＨを中性に再調整した。ＡＰＭＡストックを５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５中に２．５ｍＭまでさらに希釈した。プロＭＭＰを活性化するために、１ｍＭのＡＰＭＡおよび１００μｇ／ｍＬのプロＭＭＰを３７℃で１時間（ＭＭＰ−２）または３時間（ＭＭＰ−９）インキュベートした。活性化された酵素にグリセロールを最終濃度５０％まで添加し、次いで、各々を−２０℃で保管した。
【０４１３】
２．酵素による消化
【０４１４】
酵素のパネルを使用して、ＡＣ１４７６  ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）ＰｒｏＴＩＡ組成物を消化した。１０μＭの基質組成物を各酵素それぞれと一緒に以下の酵素対基質モル比でインキュベートした：ＭＭＰ−２（１：２００）、ＭＭＰ−９（１：２０００）、マトリプターゼ（１：１２．５）、および好中球エラスターゼ（１：１０００）。反応物を３７℃で２時間インキュベートした後、ゲルローディング色素および８０℃に加熱することによって消化を停止させた。
【０４１５】
３．切断の分析
【０４１６】
消化されなかった材料および消化された材料５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにローディングし、クーマシーブルーで染色することによって試料の分析を実施した。ＢＳＲＳ−１放出セグメントにおいて各プロテアーゼにより処理されると、基質からＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて検出可能な２つの断片が生じ、小さな断片はａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３（結合ドメインを有する活性化された第１の部分形態）を含有し、他方は放出されたＸＴＥＮを含有し、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて無傷形態よりもわずかに小さい見かけの分子量で移動する。同じく放出されたＸＴＥＮを消化する好中球エラスターゼに関しては、ゲルにおいて活性化された形態ならびに他のより小さな断片が観察された；後者は配列に沿った種々の場所におけるＸＴＥＮの切断に起因する。結果から、試験した全てのプロテアーゼにより、構築物が意図された通りに切断され、結合ドメインが放出されたことが確認される。
【０４１７】
（実施例２５）
確立された結腸直腸腫瘍モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性
【０４１８】
確立された結腸直腸腫瘍モデルでは、ＨＣＴ−１１６腫瘍細胞をＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒｇｎｕｌｌ）マウスに０日目に独立に埋め込んだ（ＮＯＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を欠き、マクロファージが機能障害性であり、樹状細胞が機能障害性であり、補体活性が低下しているマウスをもたらすＩＬ−２Ｒｇ突然変異を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスである）。次いで、４日目にヒトＰＢＭＣを静脈内に導入した。ＨＣＴ−１１６腫瘍の体積が１００〜１５０ｍｍ３に達したら、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた処置を開始し、等モル濃度の２１．６ｎｍｏｌ／ｋｇで１週間当たり３回、４週間にわたって行った。これは、１．２６ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、および３．０ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび３．０ｍｇ／ｋｇの切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと等しい。
【０４１９】
プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）のどちらでも、ビヒクルで処置した対照群と比較して、確立されたＨＣＴ−１１６腫瘍の有意な縮小が導かれた（それぞれｐ＝０．００４およびｐ＝０．００１）。切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）は、腫瘍環境内でのプロテアーゼによる切断の基質配列を含有しないので、予測通りこれにより腫瘍成長は阻止されなかった（ｐ＝０．１９８）（図６１）。
【０４２０】
（実施例２６）
ＯＶＣＡＲ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性
【０４２１】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性をまた、重症免疫不全ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒｇｎｕｌｌ）マウスの腹腔内に埋め込んだヒト白金抵抗性ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞系を使用して評価した。ＮＯＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の欠乏、ならびにマクロファージ、樹状細胞および補体系の機能障害を特徴とする。０日目に、８つのコホート（群当たりＮＯＧマウス６匹の群１〜７；およびＮＯＧマウス８匹の群９）に、ＯＶＣＡＲ−３細胞１０×１０６個を腹腔内に埋め込んだ。ＮＯＧマウス５匹で構成される群８も０日目に準備し、ＯＶＣＡＲ−３接種は行わなかった。ヒトＣＡ１２５レベルのベースライン（検出限界未満）から２０日目の３００〜４００Ｕ／ｍＬまでの上昇に反映される腫瘍細胞の進行が観察されたら、群１〜８に対して１０×１０６個のＰＢＭＣを腹腔内に導入した。群９はＰＢＭＣを全く受けなかった。ＰＢＭＣ接種日に処置を開始し、群１、８および９にはビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を注射し、群２にはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．２１ｍｇ／ｋｇで注射し、群３にはプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを１．０５ｍｇ／ｋｇで注射し、群４にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで注射し、群５にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを２．５ｍｇ／ｋｇで注射し、群６には切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．４９ｍｇ／ｋｇで注射し、群７には切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを２．４６ｍｇ／ｋｇで注射した。全てのコホートを、週２回、４週間にわたって処置した。マウスを挙動および生存について毎日モニタリングし、体重および腹部膨満について週２回モニタリングした。腫瘍発生の徴候としてＣＡ１２５を決定するために２８日目、４２日目および４８日目に血液を採取した。
【０４２２】
ＯＶＣＡＲ−３腫瘍の成長は循環ヒトＣＡ１２５レベルの上昇によって最も明白に証明された。図６２に示されている通り、ＣＡ１２５レベルは、群１（ＯＶＣＡＲ３＋ＰＢＭＣ）では２０日目の３７８±１８７Ｕ／ｍＬから４８日目の６５０６±７９１１Ｕ／ｍＬまで上昇し、群９（ＯＶＣＡＲ−３のみ）では２０日目の３７９±１１１Ｕ／ｍＬから４８日目の１０７２±２３６Ｕ／ｍＬまで上昇した。ＯＶＣＡＲ−３細胞を伴わずにＰＢＭＣのみを有する群８のＣＡ１２５レベルは試験全体を通し検出限界未満であった。
【０４２３】
予測通り、プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）のどちらによっても、経時的に循環ＣＡ１２５のレベルの低下が導かれた。これは両方の用量レベルで実証された。図６３（低用量）および図６４（高用量）に示されている通り、ＣＡ１２５レベルは、群２（０．２１ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ）では２０日目の３５２±１３２Ｕ／ｍＬから４８日目の２０．４±３９Ｕ／ｍＬまで低下し、群３（１．０５ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ）では２０日目の３５４±１２５Ｕ／ｍＬから４８日目の５０±１０３Ｕ／ｍＬまで低下し、群４（０．５ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ）では２０日目の３５１±１２６Ｕ／ｍＬから４８日目の９６±４５Ｕ／ｍＬまで低下し、群５（２．５ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ）では２０日目の３４８±１２０Ｕ／ｍＬから４８日目の７±１０Ｕ／ｍＬまで低下した。
【０４２４】
切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡによる処置群では、経時的なＣＡ１２５レベルの上昇が実証された。群６（０．４９ｍｇ／ｋｇの切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ）では２０日目の３４４±１１８Ｕ／ｍＬから４８日目の３４２６±４１７０Ｕ／ｍＬまでのＣＡ１２５の上昇が見られ、群７（２．４６ｍｇ／ｋｇの切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ）では、２０日目の３５１±１１３Ｕ／ｍＬから４８日目の１９０５±２５３４Ｕ／ｍＬまでのＣＡ１２５の上昇が実証された。
【０４２５】
（実施例２７）
標準治療に対する、ＯＶＣＡＲ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性
【０４２６】
腹腔内投与されたプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（したがって、ＰｒｏＴＩＡが無傷のままである）のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を、静脈内に対して、ならびにベバシズマブに対して、重症免疫不全ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒｇｎｕｌｌ）マウスの腹腔内に埋め込んだヒト白金抵抗性ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞系を使用して評価した。ＮＯＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の欠乏、ならびにマクロファージ、樹状細胞および補体系の機能障害を特徴とする。０日目に、群当たりＮＯＧマウス６匹のコホート８つ（群１〜７および群９）に、１０×１０６個のＯＶＣＡＲ−３細胞を腹腔内に埋め込んだ。ＮＯＧマウス６匹で構成される群８も０日目に準備し、ＯＶＣＡＲ−３接種は行わなかった。ヒトＣＡ１２５レベルのベースライン（検出限界未満）から２１日目のおよそ６５０Ｕ／ｍＬまでの上昇に反映される腫瘍細胞の進行が観察されたら、群１〜８に対してＰＢＭＣ、１０×１０６個を静脈内に導入した。群９はＰＢＭＣを全く受けなかった。ＰＢＭＣ接種日に処置を開始し、群１、８および９にはビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を静脈内注射し、群２にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与し、群３にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを２．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与し、群４にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、群５にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを２．５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、群６にはベバシズマブを２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、群７にはベバシズマブを５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。全てのコホートを、週２回、４週間にわたって処置した。マウスを挙動および生存について毎日モニタリングし、体重および腹部膨満について週２回モニタリングした。腫瘍発生の徴候としてＣＡ１２５を決定するために、２７日目、３４日目、４１日目、４８日目および屠殺時に血液を採取した。
【０４２７】
ＯＶＣＡＲ−３腫瘍の成長は循環ヒトＣＡ１２５レベルの上昇によって最も明白に証明された。ＣＡ１２５レベルは、群１（ＯＶＣＡＲ３＋ＰＢＭＣ）では２１日目の６８２±２５９Ｕ／ｍＬから屠殺時の１７２７±７４９Ｕ／ｍＬまで上昇し、群９（ＯＶＣＡＲ−３のみ）では２１日目の６７１±２１２Ｕ／ｍＬから屠殺時の３５５４±２９０８Ｕ／ｍＬまで上昇した。ＯＶＣＡＲ−３細胞を伴わずにＰＢＭＣのみを有する群８のＣＡ１２５レベルは試験全体を通し検出限界未満であった。
【０４２８】
ＣＡ１２５によってモニタリングされた通り、静脈内投与されたプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）は腹腔内投与と同程度に効果的であった（図６５）。ＣＡ１２５レベルは、群２（プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）では２１日目の６７９±２４２Ｕ／ｍＬから屠殺時の８９１±８９７Ｕ／ｍＬまでわずかに上昇し、群３（プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、２．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）では２１日目の６７７±２４１Ｕ／ｍＬから屠殺時の２２８±２６９Ｕ／ｍＬまで低下し、群４（プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）では２１日目の６６１±２１６Ｕ／ｍＬから屠殺時の６６１±８６１Ｕ／ｍＬまで比較的変化しないままであり、群５（プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、２．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）では２１日目の６５８±２００Ｕ／ｍＬから屠殺時の１８０±３４８Ｕ／ｍＬまで低下した。
【０４２９】
全ての動物の屠殺時の総腫瘍体積によってモニタリングした場合、静脈内投与されたプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、特に高用量群間で、腹腔内経路による投与よりも優れていた。屠殺時の全ての動物についての総腫瘍体積は、群３（プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、２．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）では２６００ｍｍ３であり、群５（プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、２．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）では４６０ｍｍ３であった（図６６）。
【０４３０】
全ての動物の屠殺時の総腫瘍体積によってモニタリングした場合、静脈内投与された２．５ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（群５）は２ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブによる処置コホートよりも優れており、総腫瘍体積が小さかった。屠殺時の全ての動物についての総腫瘍体積は、群５（プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、２．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）では４６０ｍｍ３であり、これと比較して、群６（ベバシズマブ、２ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）では２９００ｍｍ３であり、群７（ベバシズマブ、５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）では４６３０ｍｍ３であった（図６７）。
【０４３１】
（実施例２８）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＣＤ３結合アッセイ
【０４３２】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の結合能を、ＣＤ３イプシロン−デルタ／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検証した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、組換えヒトＣＤ３（ｒｈＣＤ３）（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ  ｃａｔ＃ＣＤ３Ｅ＆ＣＤ３Ｄ−２１９Ｈ）を９６ウェル平底プレートに０．２５μｇ／１００μＬの濃度でコーティングした。４℃で終夜インキュベートした後、アッセイプレートを洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間にわたってブロッキングした。プレートを再度洗浄し、その後、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（すなわち、放出セグメント切断配列を有さないＰｒｏＴＩＡおよびＡＣ１４８４、ＰｒｏＴＩＡキメラポリペプチドアセンブリ組成物）およびプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、ＡＣ１７１５）をある用量範囲で導入した。切断不可能なおよびプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡに対して利用した用量範囲は、３，６００〜０．０７７ｎｇ／ｍＬであり、出発濃度３，６００ｎｇ／ｍＬからの１：６倍段階希釈スキームを用いて実現した。プレートを振とうしながら室温で１時間インキュベートしておいて、切断不可能なＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで切断されていないＰｒｏＴＩＡがプレートにコーティングされたｒｈＣＤ３ε＆δに結合するようにした。結合しなかった成分を洗浄ステップで除去し、専売ビオチン化抗ＸＴＥＮモノクローナル抗体を添加した。抗ＸＴＥＮ抗体がＰｒｏＴＩＡ上のＸＴＥＮポリペプチドに結合することが可能になる適切なインキュベーション期間後、あらゆる結合しなかった試薬を洗浄ステップによって除去し、その後、各ウェルにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加した。ＴＭＢはペルオキシダーゼの発色基質である。所望の呈色強度に達した後、０．２Ｎの硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。呈色の強度は、ｒｈＣＤ３ε＆δ／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉された、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの濃度、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。生じた呈色の強度（測定されたＯＤ）をタンパク質濃度に対してプロットし、最大半量応答（ＥＣ５０）をもたらす切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、４パラメーターロジスティック回帰方程式を用いて導き出した。
【０４３３】
図６８に示されている通り、ＡＣ１６９３以外の全てのプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡが、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３二特異性ＰｒｏＴＩＡ分子ＡＣ１４８４の結合活性（ＥＣ５０が２７ｎｇ／ｍＬ）と同様の結合活性を有する。ＥＣ５０は、ＡＣ１６８４では３１ｎｇ／ｍＬであり、ＡＣ１６８５では２９ｎｇ／ｍＬであり、ＡＣ１６８６では２６ｎｇ／ｍＬであり、ＡＣ１６９５では２８ｎｇ／ｍＬであり、ＡＣ１７１４では３０ｎｇ／ｍＬであり、ＡＣ１７１５では３４ｎｇ／ｍＬである。ＥＣ５０が９ｎｇ／ｍＬであるＡＣ１６９３のみが、ｒｈＣＤ３ε＆δリガンドに対して、切断不可能なＡＣ１４８４の３倍活性な結合を有する。データから、放出セグメント組成の差異が、ＰｒｏＴＩＡのＴ細胞上に見いだされるＣＤ３抗原への結合に影響を及ぼし得ることが示唆される。
【０４３４】
（実施例２９）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の薬物動態
【０４３５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡバリアント（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）の薬物動態を、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）と併せて分析する。各ＰｒｏＴＩＡを、群当たり３匹のマウスを用い、４ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で評価する。投薬前、４時間、８時間、２４時間、２日、４日、６日および７日の適切な時点で、血液をヘパリンリチウム添加管中に採取し、血漿に加工する。ＰｒｏＴＩＡの血漿中濃度を、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡを標準物質として用い、ｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって数量化する。
【０４３６】
簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｃａｔ＃４４２４０４）に、ウェル当たり０．１μｇ／１００μＬのｒｈＥｐＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃ＥＨＨ１０４１１１）をコーティングする。４℃で終夜インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、３％ＢＳＡを用いて室温で１時間にわたってブロッキングする。次いで、プレートを再度洗浄し、その後、プロテアーゼで処理されていないおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ標準物質、適切な品質対照および血漿試験試料をある用量範囲で適切に添加する。プレートを室温で振とうしながら１時間インキュベートしておいて、ＰｒｏＴＩＡ標準物質、品質対照および試験試料がプレートにコーティングされたｒｈＥｐＣＡＭに結合するようにする。結合しなかった成分を数回の洗浄で除去する。検出のために、ビオチン化抗ＸＴＥＮ抗体を０．１μｇ／１００μＬで添加し、プレートを室温で１時間インキュベートしておく。結合しなかったビオチン化試薬を洗い流した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ＃２１１３０）を１：３０，０００の希釈度で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。数回洗浄した後、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加する。所望の呈色強度に達したら、０．２Ｎの硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定する。呈色の強度は、ｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉されたプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能なＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。血漿試料中に存在するＰｒｏＴＩＡの濃度を、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して適切なプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ標準曲線または切断不可能なＰｒｏＴＩＡ標準曲線に対して決定する。プロテアーゼで切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの終末相半減期（Ｔ１／２）の薬物動態算出をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて実施する。
【０４３７】
結果は、異なるプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡバリアント間で、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡに対しても消失半減期（Ｔ１／２）の差異を示すものではないことが予想される。
【０４３８】
（実施例３０）
ＯＶＣＡＲ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＰＫ性質
【０４３９】
ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、プロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのＰＫプロファイルを、独立に金属で標識した分子の混合物として評価した。照射処置したＢＡＬＢ／ｃヌードマウス各々に、０日目にＯＶＣＡＲ−３細胞１千万個を腹腔内注射する。腹部膨満が目に見えて観察された時および／または動物の体重が０日目から１０〜１５％増加したときに処置を開始した。ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するマウス２０匹のうち、１８匹を選択し、それらの個々の体重に応じて群当たり動物９匹の群２つにランダム化する。マウス９匹の群の一方には、等モル濃度の、ルテチウム（Ｌｕ）で標識したプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ、ホルミウム（Ｈｏ）で標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびテルビウム（Ｔｂ）で標識した切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを含む混合物を１．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。動物９匹の群の他方には、同じＰｒｏＴＩＡ混合物を１．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与する。
【０４４０】
マウス当たりの採血および処置での取り扱いには限定があるので、同じ群内の動物間（すなわち、静脈内投与群および腹腔内投与群）で交代させ、試験物投与後０．５時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、３日目、５日目および７日目の時点で頸静脈／下顎静脈穿刺によって血液をヘパリンリチウム管中に採取した。血液を４℃、１３００ｇで１０分間遠心分離することによって血漿に加工し、分析時まで−８０℃で保管した。
【０４４１】
試験物投与後４時間、８時間、２４時間、４８時間、３日目、５日目および７日目の時点で、同じ群内の動物間で交代させ、静脈内投与群および腹腔内投与群の両方から腹水を採取した。腹水試料をすぐに４℃、３００ｇで１０分間遠心分離し、流体成分を分析時まで−８０℃まで凍結させておいた。全ての試料（血液および腹水）をＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析）によって分析した。
【０４４２】
静脈内投与群の血漿区画では、Ｈｏで標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびＴｂで標識した切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは１９．５時間という同様の半減期を示した。予測通り、Ｈｏで標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、Ｌｕで標識したプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと比較して長い全身半減期を有した（１９．５時間対２時間）（図６９Ａ）。腹水区画では、３種全てのＰｒｏＴＩＡが、Ｔｍａｘ４８時間で約４％の注射用量（ＩＤ）／ｇという低等価量で検出可能であった。少量にもかかわらず、３種全てのＰｒｏＴＩＡが、ＡＵＣ４−１６８が約４００％ＩＤ／ｇ×ｈであったことに反映される通り、腹膜腔内で長い曝露を示した（図６９Ｂ）。
【０４４３】
腹腔内投与群の血漿区画では、Ｈｏで標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびＴｂで標識した切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは約８時間でＣｍａｘに達し、それぞれ２１．４時間および２２．９時間という同等の半減期が実証された。Ｈｏで標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡはＬｕで標識したプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと比較して長い全身半減期を示した（２１．４時間対６．５時間）（図７０Ａ）。腹水区画では、Ｈｏで標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびＴｂで標識した切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは４時間のＣｍａｘ、約１０％のＩＤ／ｇで検出され、一方、Ｌｕで標識したプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは４８時間のＣｍａｘ、約１６％ＩＤ／ｇで検出された。Ｈｏで標識したプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡとＴｂで標識した切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの曝露は、ほぼ同等であったが（ＡＵＣ４−１６８が６８４％ＩＤ／ｇ×ｈ）、Ｌｕで標識したプロテアーゼで切断された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの曝露は、ＡＵＣ４−１６８が１４５８％ＩＤ／ｇ×ｈであり、２倍であると思われた（図７０Ｂ）。これは、いくらか予想外であったが、それにもかかわらず、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡが腫瘍関連プロテアーゼによって代謝されず、腫瘍標的に即座に接近し、したがって、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能なＰｒｏＴＩＡと比較して腹腔内腫瘍環境内により良好に保持されたと考えると、考えられ得る。
【０４４４】
結果から、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡが、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有する疾患マウスの全身的循環において安定であり、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡと比較して１０倍に改善された半減期を有することが実証された。腹膜腔内では、３種全てのＰｒｏＴＩＡ（すなわち、プロテアーゼで処理された、プロテアーゼで処理されていないおよび切断不可能な）が長い曝露を有し、これは腫瘍標的相互作用に起因する可能性が高い。
【０４４５】
（実施例３１）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のカスパーゼ３／７アッセイ
【０４４６】
プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）の、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）に対して向け直された細胞傷害性をアポトーシス細胞のカスパーゼ３／７活性によっても評価した。上記のカスパーゼ細胞傷害性アッセイと同様に、ＰＢＭＣを、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ヒト膵腫瘍細胞系）、ＨＣＴ−１１６（ヒト結腸直腸腫瘍細胞系）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒトトリプルネガティブ乳房細胞系）などのＥｐＣＡＭ陽性腫瘍標的細胞とエフェクター１０対標的１の比で混合し、全てのＰｒｏＴＩＡバリアントを、上記のカスパーゼアッセイと同様に、８点または１２点のいずれかの５倍段階希釈用量濃度として試験した。この３種の細胞系は、高ＥｐＣＡＭ抗原発現細胞、中間ＥｐＣＡＭ抗原発現細胞および低ＥｐＣＡＭ抗原発現細胞を表すものとして選択し、ＨＰＡＦ−ＩＩは細胞当たり１１０万のＥｐＣＡＭ抗原を発現し、ＨＣＴ−１１６は細胞当たり５００，０００のＥｐＣＡＭ抗原を発現し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、細胞当たり１３，０００のＥｐＣＡＭ抗原を発現する。
【０４４７】
細胞溶解したら、培養上清中に放出されたカスパーゼ３／７を、「グロー型」発光シグナルを生じさせるカスパーゼ３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  ｃａｔ＃Ｇ８０９１）による発光性カスパーゼ３／７基質切断の量によって測定した。発光の量はカスパーゼ活性の量に比例する。
【０４４８】
ＥｐＣＡＭ高発現ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞系において評価した場合、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡバリアントの間で、活性は、同様の活性（ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）から約６分の１の活性（ＡＣ１６８６）までにわたった（表１３）。
【０４４９】
ＥｐＣＡＭ中間発現ＨＣＴ−１１６細胞系において評価した場合、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡバリアントの間で、活性は、同様の活性（ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）から約７分の１の活性（ＡＣ１６８６）までにわたった（表１３）。
【０４５０】
ＥｐＣＡＭ低発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系において評価した場合、全てのＰｒｏＴＩＡ（プロテアーゼで処理されていないおよび切断不可能な）が、高ＥｐＣＡＭ発現細胞系および中間ＥｐＣＡＭ発現細胞系において観察されたものよりもはるかに低い活性を示した。プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡバリアントの間で、活性は、同様の活性（ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）から４分の１の活性（ＡＣ１６８４）までにわたった（表１３）。
【０４５１】
上の実施例でプロファイルされた、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡとそれに対する切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性の傾向と一致して、切断不可能なＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）の活性は、試験した高ＥｐＣＡＭ発現細胞系、中間ＥｐＣＡＭ発現細胞系および低ＥｐＣＡＭ発現細胞系３種全てにおいて、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ全て（ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）と比較して一貫して乏しい。（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系において同等の活性を有するＡＣ１６８４およびＡＣ１４８４が唯一の例外である）。プロテアーゼで処理されていないものと切断不可能なものの活性の差異倍率は、ＥｐＣＡＭ高発現ＨＰＡＦ−ＩＩではおよそ６０倍であり、ＨＣＴ−１１６では約３７倍であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では約３．６倍である。
【０４５２】
結果から、強力な細胞傷害活性をもたらすためには標的細胞当たりおよそ≧５００，０００のＥｐＣＡＭ発現が十分であり、標的細胞当たりおよそ≦１３，０００のＥｐＣＡＭ発現でははるかに乏しい細胞傷害活性が誘導されることが実証された。ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５によって表されるＰｒｏＴＩＡ放出セグメント組成の差異が、エフェクターＰＢＭＣの存在下で特異的な標的細胞を死滅させるＰｒｏＴＩＡの細胞傷害活性に影響を及ぼし得る。結果から、評価した高ＥｐＣＡＭ発現細胞系、中間ＥｐＣＡＭ発現細胞系および低ＥｐＣＡＭ発現細胞系３種全てにおいて、切断不可能なＰｒｏＴＩＡがプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３バリアントよりも一貫して活性が低いことも実証される。
表１３：  ＨＰＡＦ−ＩＩヒト細胞株、ＨＣＴ−１１６ヒト細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト細胞株におけるプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３バリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
【表１３】
2021507706.tif 000055
【０４５３】
（実施例３２）
標準治療に対する、ＯＶＣＡＲ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性。
【０４５４】
プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡバリアントの間での、ならびにベバシズマブに対するｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を、重症免疫不全ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒｇｎｕｌｌ）マウスの腹腔内に埋め込んだヒト白金抵抗性ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞系を使用して評価する。ＮＯＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の欠乏、ならびにマクロファージ、樹状細胞および補体系の機能障害を特徴とする。０日目に、群当たりＮＯＧマウス６匹のコホート９つ（群１〜９）に対して、１０×１０６個のＯＶＣＡＲ−３細胞を腹腔内に埋め込む。ヒトＣＡ１２５レベルのベースラインから（検出限界未満）およそ６５０Ｕ／ｍＬ（およそ２１日目）までの上昇によってモニタリングされる通り腫瘍細胞が進行したことが観察されたら、群１〜９に対して１０×１０６個のＰＢＭＣを静脈内に導入する。ＰＢＭＣ接種日に処置を開始し、群１にはビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を静脈内注射し、群２〜８には、各々に、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡバリアント（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）の１つを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、群９にはベバシズマブを２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与する。全てのコホートを週２回、４週間にわたって処置する。挙動および生存について毎日モニタリングし、体重および腹部膨満について週２回モニタリングする。腫瘍発生の徴候としてＣＡ１２５を決定するために、２７日目、３４日目、４１日目、および４８日目および屠殺時に血液を採取する。全てのマウスを５５日目の試験エンドポイントで屠殺し、その時点で、腹水体積を測定し、腹膜腔において見いだされる全ての腫瘍小結節の総数および質量を計数する。
【０４５５】
ＯＶＣＡＲ−３腫瘍の成長は、循環ヒトＣＡ１２５レベルの上昇によって明白に証明されることになる。群１ビヒクルにおけるＣＡ１２５レベルは経時的に有意に上昇することが予想される。群９ベバシズマブにおけるＣＡ１２５レベルも経時的に上昇するが群１ビヒクルにおいて観察されるものよりも程度が低いことが予測される。群２〜７におけるＣＡ１２５レベルは、種々のプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６８４、ＡＣ１６８５、ＡＣ１６８６、ＡＣ１６９３、ＡＣ１６９５、ＡＣ１７１４、およびＡＣ１７１５）によって付与される有効性に起因して経時的に低下することが予測される。これらのバリアントは異なる放出セグメントを有するので、プロテアーゼで処理されていないバリアントの間で有効性の程度（すなわち、ＣＡ１２５減少の大きさ）に差異が観察される可能性は十分にある。
【０４５６】
腹水体積および全ての動物の屠殺時の総腫瘍体積によってモニタリングした場合、静脈内投与されたプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、群１および９よりも優れることが予測される。群１および９は、腫瘍成長に起因して屠殺時に腹水体積を有することが予測される。群２〜８では、種々のプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡによって付与される有効性に起因して最小の腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）および腫瘍小結節が予測される。これらのバリアントは異なる放出セグメントを有するので、プロテアーゼで処理されていないバリアントの間で有効性の程度に差異が観察される可能性は十分にある。
【０４５７】
（実施例３３）
ＰｒｏＴＩＡとそれに対するＢｉＴＥ等価物のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性評価。
【０４５８】
ＰｒｏＴＩＡの毒性を、マウスＥｐＣＡＭタンパク質およびマウスＣＤ３εタンパク質に結合する代理分子を使用することによって評価した。この分子に起因する主要な毒性は、マウスリンパ球におけるＥｐＣＡＭ陽性細胞の発現に起因するサイトカイン放出症候群である。試験物は、ＡＣ１５５３Ｘ、ＡＣ１５５３Ａ、およびＡＣ１４７６Ａであった。ＡＣ１５５３Ｘは、実施例２４においてより詳細に記載されている、８６４アミノ酸のＸＴＥＮタンパク質（ＡＥ８６４）と連結した抗マウスＣＤ３  ｓｃＦｖと融合した抗マウスＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖからなる１３８ｋＤａの組換え分子である。ａＣＤ３  ｓｃＦｖと隣のＸＴＥＮの間に腫瘍関連プロテアーゼ感受性切断部位を工学的に作製した。独特のプロテアーゼ切断部位の挿入により、ＡＣ１５５３ＸをＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、およびマトリプターゼなどの腫瘍関連プロテアーゼによって選択的に切断して、融合した抗マウスＥｐＣＡＭおよび抗マウスＣＤ３  ｓｃＦｖ細胞傷害性部分構造を放出させることが可能になる。ＡＣ１５５３Ａは、ＡＣ１５５３Ｘを腫瘍関連プロテアーゼによって切断することによって生成することができるＢｉＴＥ分子と同等のフォーマットに構成されており、マウスＥｐＣＡＭおよびマウスＣＤ３δ／ε受容体を認識する。ＡＣ１４７６Ａは、ヒトＥｐＣＡＭおよびヒトＣＤ３δ／ε受容体を認識する二特異性分子であり、マウスＥｐＣＡＭもマウスＣＤ３分子も認識しないので、これを毒性評価において陰性対照として使用する。
【０４５９】
正常なＢＡＬＢ／ｃマウスに、対照非結合性ＢｉＴＥ等価物（ＡＣ１４７６Ａ）５００μｇ、様々な量のＢｉＴＥ等価物（５０、１５０、および５００μｇ／ｋｇ；ＡＣ１５５３Ａ）、ならびに対応するモル量のＰｒｏＴＩＡ（１２０、３６０、および１，２００μｇ／ｋｇ；ＡＣ１５５３Ｘ）を投薬した。投薬後０時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、２４時間、および４８時間に血液を採取し、サイトカインレベルをＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−ａ、およびＩＮＦ−ｇについて、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘサイトカイン分析キット（カタログ番号ＭＨＳＴＣＭＡＧ−７０Ｋ）を使用してルミネックスアッセイによって決定した。
【０４６０】
結果：インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ；図７１Ｅ）以外は、サイトカインの全てが、ＡＣ１５５３Ａでは対応する用量のＡＣ１５５３Ｘよりも有意に高かった（結果、図７１を参照されたい）。ＡＣ１５５３Ａに関しては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａについての最大サイトカイン誘導は投薬後約４時間であり、ＩＬ−１０およびＩＮＦ−ｇについては投薬後約１０時間であった。ＡＣ１５５３Ｘに関しては、サイトカインの誘導は概し投薬後約６〜１０時間まで遅延し、誘導の大きさはＡＣ１５５３Ａよりもはるかに小さかった。対照ＡＣ１４７６Ａによる処置によるサイトカインの誘導は非常にわずかまたは検出不可能であった。対照ＡＣ１４７６Ａを用いて処置したマウスからの結果は白抜きの円であり、５０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａは白抜きのひし形の点線であり、１５０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａは白抜きのひし形の破線であり、５００μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａは白抜きのひし形の実線である。１２０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘを用いて処置したマウスからの結果は黒塗りの三角形の点線であり、３６０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘは黒塗りの三角形の破線であり、１，２００μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘは黒塗りの三角形の実線である。サイトカイン濃度が血清１ｍＬ当たりのピコグラム数として示され、血液採取時間に対してプロットされている。
【０４６１】
結論：サイトカイン誘導は、ＡＣ１５５３Ａによる処置ではＡＣ１５５３Ｘによるものよりもはるかに高く、これにより、ＡＣ１５５３Ｘで処置したマウスに対してＡＣ１５５３Ａで処置したマウスにおけるはるかに大きなサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）が示される。これは特にＩＬ−６の場合であり（図７１Ｃ）、ＩＬ−６は、臨床的に意義のあるパラメーターであり、ＣＲＳ処置の重要な標的である。ＩＬ−６に関しては、最高用量のＡＣ１５５３Ａにより、最低用量のＡＣ１５５３Ｘによる処置と同様のＩＬ−６レベルが生じ、投薬の差異が１０倍であることを考慮すると、ＡＣ１５５３ＸがＣＲＳを引き起こすことにおける安全性に関してＡＣ１５５３Ａの安全性と比べて１０倍の改善を有することが示唆される。
【０４６２】
（実施例３４）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰｒｏＴＩＡの最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）の決定
【０４６３】
ＰｒｏＴＩＡの毒性を、マウスＥｐＣＡＭタンパク質およびマウスＣＤ３εタンパク質に結合する代理分子を使用することによって評価した。この分子に起因する主要な毒性は、マウスリンパ球におけるＥｐＣＡＭ陽性細胞の発現に起因するサイトカイン放出症候群である。試験物は、実施例２４に記載のＡＣ１５５３ＸおよびＡＣ１５５３Ａであった。正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに、様々な量のＡＣ１５５３Ａ（５０μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ）、ならびに対応するモル量のＡＣ１５５３Ｘ（１２０μｇ／ｋｇ、３６０μｇ／ｋｇ、および１，２００μｇ／ｋｇ）を投薬し、マウスの健康および体重を投薬後１４日間にわたってモニタリングした。
【０４６４】
高用量のＡＣ１５５３Ａ（５００μｇ／ｋｇ）を用いて処置したマウスは全て処置後３日目までに死亡し（マウス５匹中５匹）、中用量のＡＣ１５５３Ａ（１５０μｇ／ｋｇ）を用いて処置したマウスでは、試験中にマウス５匹中３匹の死亡がもたらされた（図７２）。低用量のＡＣ１５５３Ａではマウスの死亡は全くもたらされなかった。これは、ＡＣ１５５３Ａの対応するモル当量の後にマウスの全てが生存したＡＣ１５５３Ｘによる処置とは対照的である。図７２は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＡＣ１５５３Ｘによる処置およびＡＣ１５５３Ａによる処置のカプラン・マイヤープロットを示す。群当たり５匹のマウスを、１２０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘ（黒塗りの三角形の点線）、３６０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘ（黒塗りの三角形の破線）、および１，２００μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘ（黒塗りの三角形の実線）、ならびに対応するモル量のＡＣ１５５３Ａで処置した。５０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａが白抜きのひし形の点線で示されており、１５０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａが白抜きのひし形の破線で示されており、５００μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａが白抜きのひし形の実線で示されている（生存しているマウスのパーセンテージを種々の時点に対してプロットした）。
【０４６５】
結果：高用量のＡＣ１５５３Ａ（５００μｇ／ｋｇ）を用いて処置したマウスは、処置の２日後に１０％を上回る体重減少を示し、全てのマウスが３日以内に死亡した（図７３Ａ）。中用量のＡＣ１５５３Ａ（１５０μｇ／ｋｇ）を用いて処置したマウスは、投薬後２〜４日以内に１０〜２０％の体重減少を示し、３匹のマウスが死亡した一方で、残りの２匹のマウスの体重は投薬前の体重レベルまで回復した（図７３Ｂ）。低用量のＡＣ１５５３Ａ（５０μｇ／ｋｇ）を用いて処置したマウスは、処置の２日後に１０％以内の一過性の体重減少を示し、マウスの体重は全て投薬前のレベルと等しいまたはそれを上回るまで回復した（図７３Ｃ）。ＡＣ１５５３Ｘに関しては、高用量（１，２００μｇ／ｋｇ）マウスは投薬の２〜３日後に１０％を上回る体重減少を示したが、体重は全て正常レベルまで回復した（図７３Ｆ）。ＡＣ１５５３Ｘの中用量および低用量に関しては、体重減少は些細なものである（図７３Ｄ、Ｅ）。パーセント体重変化を、薬物投薬後の時間に対してプロットする。パーセント体重は、マウスの体重を薬物投薬後に時々取得し、元の薬物投薬前の体重で割り、１００を掛けることによって算出する［（薬物投薬後の体重／薬物投薬前の体重）×１００］。群当たり５匹のマウスを、１２０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘ（黒塗りの三角形の点線）、３６０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘ（黒塗りの三角形の破線）、１，２００μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ｘ（黒塗りの三角形の実線）、ならびに対応するモル量のＡＣ１５５３Ａで処置した。５０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａが白抜きのひし形の点線で示されており、１５０μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａが白抜きのひし形の破線で示されており、５００μｇ／ｋｇのＡＣ１５５３Ａが白抜きのひし形の実線で示されている。各線は１匹のマウスの体重変化を表す。
【０４６６】
結論：中用量のＡＣ１５５３Ａで処置した場合にマウス５匹中３匹が死亡し、高用量を用いた場合には全てのマウス（５匹中５匹）が死亡したという事実から、マウスにおけるＡＣ１５５３Ａの最大耐量が５０〜１５０μｇ／ｋｇの間であることが示唆される。ＡＣ１５５３Ｘを種々の薬物量で用いて処置したマウスは全てが生存したので、結果から、マウスにおけるＡＣ１５５３Ｘの最大耐量は１，２００μｇ／ｋｇよりも大きいことが示唆される。
【０４６７】
（実施例３５）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の結合親和性
【０４６８】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）のヒトＥｐＣＡＭおよびヒトＣＤ３に対する結合親和性を、２つの方法によって：１）組換えＥｐＣＡＭおよびＣＤ３抗原を用いた表面プラズモン共鳴を使用して、ならびに２）ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３発現細胞を用いたフローサイトメトリーを使用して測定した。ＡＣ１５１６はＡＣ１４７６のコドン最適化バージョンであり、これらは同じアミノ酸配列を共有することに留意されたい。
【０４６９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合実験をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００で実施した。抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのヒトＥｐＣＡＭへの結合を評価するために、Ｆｃタグが付されたＥｐＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃９６０−ＥＰ−０５０）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用してカルボキシメチル化デキストランチップ上に捕捉した。次いで、３種のＰｒｏＴＩＡ分子［処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＡＣ１５１６）、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１５１６）、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＡＣ１４８４）］の各々のＥｐＣＡＭチップへの結合を、完全な動態解析およびＫｄ決定のために、５〜６の異なる濃度で実施した。ヒトＥｐＣＡＭへの結合のＫｄは、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡについては１１．４ｎＭであり、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡについては１．１５ｎＭであり、切断不可能なＰｒｏＴＩＡについては１０．０ｎＭであることが決定された。
【０４７０】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡのヒトＣＤ３への結合を評価するために、Ｈｉｓタグが付されたＣＤ３εδ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ、ｃａｔ＃ＣＤ３Ｅ＆ＣＤ３Ｄ−２１９Ｈ）を、ＥＤＣおよびＮＨＳを使用してカルボキシメチル化デキストランチップ上に捕捉した。次いで、３種のＰｒｏＴＩＡ分子［処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＡＣ１５１６）、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１５１６）、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＡＣ１４８４）］の各々のＣＤ３チップへの結合を、完全な動態解析およびＫｄ決定のために、５〜６の異なる濃度で実施した。ヒトＣＤ３への結合のＫｄは、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡについては１５．３ｎＭであり、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡについては２．２２ｎＭであり、切断不可能なＰｒｏＴＩＡについては２７．８ｎＭであることが決定された。
【０４７１】
ＥｐＣＡＭ発現細胞およびＣＤ３発現細胞への抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの結合の結合定数を、蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡとの競合結合によって決定した。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｃ２マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃Ａ２０３４７）と、システインを含有する、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ突然変異体（ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１５３１）とのコンジュゲーションによって作製した。結合実験を、細胞１０，０００個に対して、結合緩衝剤（リン酸塩緩衝食塩水中１％ウシ血清アルブミン）１００μＬの総体積で、４℃で１時間にわたって実施した。細胞を低温結合緩衝剤で１回洗浄し、次いで、リン酸塩緩衝食塩水中２％ホルムアルデヒド中に再懸濁させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターですぐに分析した。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの結合により、見かけのＫｄがヒトＥｐＣＡＭを安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ）に対しては０．８５ｎＭであり、ＣＤ３＋ジャーカット細胞に対しては２．６ｎＭであることが明らかになった。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡのＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ細胞への競合結合によりもたらされる見かけの結合定数は、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）については２．９ｎＭであり、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１４７６）については０．２９ｎＭであった。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡのＣＤ３＋ジャーカット細胞への競合結合によりもたらされる見かけの結合定数は、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）については３１ｎＭであり、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１４７６）については１．１ｎＭであった。
【０４７２】
ＳＰＲおよびフローサイトメトリーのどちらによっても、ＥｐＣＡＭのプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡに対する結合親和性は処理されていないＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能なＰｒｏＴＩＡよりも約１０倍強力であった。プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡについてのＣＤ３に対する結合親和性は処理されていないＰｒｏＴＩＡおよび切断不可能なＰｒｏＴＩＡよりも強力であり、ＳＰＲでは約１０倍、およびフローサイトメトリーでは約３０倍であった。これらのデータから、ＸＴＥＮにより、無傷の処理されていないＰｒｏＴＩＡプロドラッグ形態の結合親和性がプロテアーゼで処理された活性化されたＰｒｏＴＩＡと比較して低下するという結論が裏付けられる。ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３の両方に対する結合親和性の低下により、処理されていないＰｒｏＴＩＡが循環中または健康な組織においてその標的に結合する可能性が低くなる。
【０４７３】
（実施例３６）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＴ細胞活性化マーカーアッセイ
【０４７４】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡにより誘導される活性化マーカー（ＣＤ６９およびＣＤ２５）を測定するために、１×１０５個のＰＢＭＣまたは精製されたＣＤ３＋細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中、アッセイウェル当たり２×１０４個のＳＫ−ＯＶ−３細胞またはＯＶＣＡＲ３細胞と（すなわち、エフェクター対標的比５：１）、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６９５）の存在下、９６ウェル丸底プレートにおいて、最終的な総体積２００μＬで共培養する。３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で２０時間インキュベートした後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝剤（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中、４℃で、ＰＥＣｙ５コンジュゲート抗ＣＤ４、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ８、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ２５、およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６９（抗体は全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのもの）を用いて染色し、ＦＡＣＳ緩衝剤で２回洗浄し、次いで、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でのデータ取得のためにＦＡＣＳ緩衝剤中に再懸濁させる。
【０４７５】
カスパーゼ３／７細胞傷害性アッセイによって観察された通り、Ｔ細胞活性化マーカー発現には、３種のＰｒｏＴＩＡ分子［処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＡＣ１６９５）、プロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１６９５）、および切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＡＣ１４８４）］について同様の傾向があることが予想される。ＳＫ−ＯＶ−３細胞を使用すると、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６９５）によるＰＢＭＣのＣＤ８集団およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９の活性化についての活性はプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１６９５）の５０分の１〜１００分の１であることが予想され、切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）の活性はプロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１６９５）の約１０００分の１であることが予想される。
【０４７６】
（実施例３７）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のサイトカイン放出アッセイ
【０４７７】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡに誘導されるサイトカインの発現を測定するために、アッセイウェル当たり１×１０５個の精製されたＣＤ３＋細胞を２×１０４個のＳＫ−ＯＶ−３細胞と（すなわち、エフェクター対標的比５：１）、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６９５）の存在下、９６ウェル丸底プレートにおいて、最終的な総体積２００μＬで共培養する。３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で２０時間インキュベートした後、細胞の上清をサイトカイン測定のために収集する。このアッセイを、ＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＫＮ４５、ＭＴ３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＷ４８０、ＯＶＣＡＲ３およびＰＣ３の細胞系から選択される他の標的細胞を用いて、ならびに精製されたＣＤ３＋細胞の代わりにＰＢＭＣを用いて実施することもできる。
【０４７８】
細胞培養上清中に分泌されたインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマのサイトカイン分析を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｃａｔ＃５５０７４９）を使用し、製造業者の指示に従って定量化する。ＰｒｏＴＩＡの不在下では、精製されたＣＤ３＋細胞からはバックグラウンドを上回るサイトカイン分泌は予測されない。ＥｐＣＡＭ陽性標的細胞および精製されたＣＤ３＋細胞の存在下では、ＰｒｏＴＩＡにより、Ｔ細胞が活性化され、あるパターンのＴ細胞サイトカインが分泌され、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファなどのＴｈ１サイトカインの割合が高いことが予想される。
【０４７９】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡにより、評価した全てのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ）の頑強な分泌が誘導されることが予想される（図５０〜５２を参照されたい）。精製されたＣＤ３＋細胞をＳＫ−ＯＶ−３細胞およびプロテアーゼで処理された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１６９５）で刺激することにより、特に２０ｐＭよりも高い濃度で、試験するサイトカインの全てについて有意なサイトカイン発現が誘発されることが予想される。対照的に、無傷の切断されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子（例えば、ＡＣ１６９５）を約１００ｐＭまでの濃度で使用した場合には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマのベースラインレベルが予測される。さらに、約１ｎＭまでの濃度での切断不可能な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子（例えば、ＡＣ１４８４）について、試験する全てのサイトカインのベースラインレベルが予測される。
【０４８０】
（実施例３８）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の結合親和性
【０４８１】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６９５）のヒトＥｐＣＡＭおよびヒトＣＤ３に対する結合親和性を、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３発現細胞を用い、フローサイトメトリーを使用して測定する。
【０４８２】
ＥｐＣＡＭ発現細胞およびＣＤ３発現細胞への抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの結合の結合定数を、蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡとの競合結合によって測定する。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｃ２マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃Ａ２０３４７）と、システインを含有する、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ突然変異体（ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１５３１）とのコンジュゲーションによって作製した。結合実験を、細胞１０，０００個に対して、結合緩衝剤（リン酸塩緩衝食塩水中１％ウシ血清アルブミン）１００μＬの総体積で、４℃で１時間にわたって実施する。細胞を低温結合緩衝剤で１回洗浄し、次いで、リン酸塩緩衝食塩水中２％ホルムアルデヒド中に再懸濁させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターですぐに分析する。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡの結合は、見かけのＫｄ値がヒトＥｐＣＡＭを安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ）に対してはおよそ１ｎＭであり、ＣＤ３＋ジャーカット細胞に対してはおよそ３ｎＭであることが予測される。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡのＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ細胞への競合結合によりもたらされる見かけの結合定数は、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６９５）については１桁ｎＭになり、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１６９５）についてはｎＭ未満になることが予想される。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡのＣＤ３＋ジャーカット細胞への競合結合によりもたらされる見かけの結合定数は、処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１６９５）については２桁ｎＭになり、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１６９５）についてはおよそ１桁ｎＭになることが予想される。
表１４：  ＰｒｏＴＩＡ構築物のアミノ酸配列
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【表１４−７】
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【表１４−８】
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【表１４−９】
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【表１４−１０】
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【表１４−１１】
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【表１４−１２】
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【表１４−１３】
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【表１４−１４】
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【表１４−１５】
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【表１４−１６】
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【表１４−１７】
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【表１４−１８】
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表１５：  ＰｒｏＴＩＡ構築物のアミノ酸配列
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１５−１１】
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【表１５−１２】
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【０４８３】
（実施例３９）
放出セグメントＲＳＲ−１５１７を有するＸＴＥＮベースベクターの構築
【０４８４】
放出セグメントＲＳＲ−１５１７（アミノ酸配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴ）を有するＸＴＥＮベースベクターＡＣ１６１１を、Ｔ７ｌａｃプロモーターの制御下でＨＤ２−Ｖ５−ＸＴＥＮ１４４−ＲＳＲ−１５１７−ＸＴＥＮ７１２−Ｈ８（ここで、ＨＤ２配列はＭＫＮＰＥＱＡＥＥＱＡＥＥＱＲＥＥＴであり、およびＶ５はＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴである）のタンパク質をコードするようにｐＮＬ０３５６をＰＣＲによって改変することで構築した。ＡＣ１６１１上の放出セグメントＲＳＲ−１５１７のコード配列は、別の放出セグメントとの置き換えが可能になるように独特のＮｈｅＩ制限部位およびＢｓａＩ制限部位に挟まれている。ライゲーション反応後、形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望の構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。得られた構築物はＡＣ１６１１であり、表１６に提示されるＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を有する。
表１６：放出セグメントを有するＡＣ１６１１  ＸＴＥＮのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
【表１６−１】
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【表１６−２】
2021507706.tif 000087
【０４８５】
（実施例４０）
放出セグメント−ＸＴＥＮバリアントの振とうフラスコでの発現
【０４８６】
放出セグメント−ＸＴＥＮバリアント構築物を、Ｔ７プロモーターの制御下で発現されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１＿ＤＥ３株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。対応するプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１＿ＤＥ３のグリセロールストックを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ  Ｂｒｏｔｈ培地６ｍＬに接種し、３７℃で、２００分−１、終夜インキュベートすることによって発端培養物を調製した。終夜発端培養物を、ＺＹ自己誘導培地およそ２５０ｍＬに１：５０で接種し、２６℃で２６時間にわたって、２００分−１で成長させた。次いで、細胞を、即時使用のために１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって収集したか、または使用するまで−８０℃で凍結させておいた。
【０４８７】
ＺＹ自己誘導培地は、以下の成分を混合することによって作製した：ＺＹ培地（バクトトリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇおよび水９２５ｍＬ；オートクレーブしたもの）９２８ｍＬ、１ＭのＭｇＳＯ４、１ｍＬ、５０×５０５２溶液（グリセロール２５ｇ、グルコース（Ｆｉｓｈｅｒ  ＦＬＢＰ３５０−１）２．５ｇ、ａ−ラクトース（Ｓｉｇｍａ  Ｌ３６２５）１０ｇ、および水７３ｍｌ；滅菌濾過したもの）２０ｍＬ、２０×ＮＰＳ溶液（１００ｍＬにするために、６．６ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、１４．２ｇのＮａ２ＨＰＯ４を水９０ｍＬに溶解させる；滅菌濾過したもの）５０ｍｌおよびカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬ。
【０４８８】
（実施例４１）
Ｅ．ｃｏｌｉ振とうフラスコ培養物からの放出セグメント−ＸＴＥＮバリアントの精製
【０４８９】
１）溶解、清澄化および力価分析
【０４９０】
細胞ペレットを、５０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ４．０に１：４で再懸濁させた。再懸濁させた細胞を１５分にわたって８０℃まで加熱し、その後、すぐに氷上で３０分間冷却した。次いで、溶解物を、４℃、４，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離することによって清澄化した。上清を採取し、０．２μｍで濾過した。
【０４９１】
各構築物の力価を、清澄化溶解物５μＬを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを製造業者の仕様書に従って使用した通常の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い、クーマシー染色を伴って分析することによって推定した。図７４Ａは、３種のＲＳバリアントの例示的な力価分析であり、矢印は、産物が移動した場所を示し、見かけの分子量は大まかに１６０ｋＤａ分子量マーカー付近である。
【０４９２】
２）一段階ＩＭＡＣ精製
【０４９３】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を捕捉ステップとして使用した。各バリアントについて、１０ｍＬのポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＴｏｙｏＰｅａｒｌ−ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５ｍＬを充填した。カラムを、５カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。清澄化された細胞溶解物のｐＨを７．５に調整した後、カラムにローディングした。ローディング完了後、カラムを３ＣＶの平衡化緩衝剤で洗浄した後、３ＣＶの２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのイミダゾールを用いて溶出する。１ＣＶの画分（５ｍＬ）を採取した。
【０４９４】
図７４Ｂ（ＡＣ１６０２、ＡＣ１６０９、およびＡＣ１６１０）、図７４Ｃ（ＡＣ１６０４、ＡＣ１６０８、ＡＣ１６１１）、および図７４Ｄ（ＡＣ１６１２、ＡＣ１６４９、ＡＣ１６５０）に示されている通り、負荷量、フロースルー、および溶出物を非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析して、タンパク質が溶出した画分およびそれらの純度を決定した。
【０４９５】
３）ＨＰＬＣによる数量化およびロット放出
【０４９６】
上述の一段階ＩＭＡＣ精製されたバリアントを、非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで並行して分析した（図７４Ｅ）。純度は酵素的スクリーニングのために十分であるとみなされ、各バリアントの濃度を、逆相ＨＰＬＣを実行することによって評価し、既知濃度の化合物の標準曲線を用いて数量化した。
【０４９７】
結論：本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける種々のＲＳ−ＸＴＥＮ構築物の発現が実行可能であり、一段階ＩＭＡＣ精製がこれらのバリアントをその後の酵素的スクリーニングアッセイのために適切な数量および品質で作製するために十分なものであることを実証した。
【０４９８】
（実施例４２）
酵素の活性化、保管およびＲＳＲ−１５１７を含有するＸＴＥＮ  ＡＣ１６１１の消化
【０４９９】
この実施例では、ＲＳＲ−１５１７を含有するＸＴＥＮ構築物ＡＣ１６１１を試験管中、組換えヒトｕＰＡ、マトリプターゼ、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１４を含めた種々の腫瘍関連プロテアーゼによって切断することができることを実証する。
【０５００】
１．酵素の活性化
【０５０１】
使用した酵素は全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。組換えヒトｕ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）および組換えヒトマトリプターゼは活性化された酵素として提供され、使用するまで−８０℃で保管した。組換えマウスＭＭＰ−２、組換えヒトＭＭＰ−７、および組換えマウスＭＭＰ−９はチモーゲンとして供給され、酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）による活性化が必要であった。ＡＰＭＡをまず０．１ＭのＮａＯＨ中に最終濃度１０ｍＭまで溶解させた後、０．１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを中性に再調整した。ＡＰＭＡストックの２．５ｍＭまでのさらなる希釈を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２中で行った。プロＭＭＰを活性化するために、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２中１ｍＭのＡＰＭＡおよび１００μｇ／ｍＬのプロＭＭＰを３７℃で１時間（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７）または２４時間（ＭＭＰ−９）インキュベートした。ＭＭＰ−１４を活性化するために、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９、１ｍＭのＣａＣｌ２中０．８６μｇ／ｍＬの組換えヒトフューリンおよび４０μｇ／ｍＬのプロＭＭＰ−１４を３７℃で１．５時間インキュベートした。レグマインを活性化するために、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４、１００ｍＭのＮａＣｌ中１００μｇ／ｍＬのプロレグマインを３７℃で２時間インキュベートした。１００％Ｕｌｔｒａｐｕｒｅグリセロールを全ての活性化された酵素（ｕＰＡおよびＭＴＳＰ１を含む）に５０％グリセロールの最終濃度まで添加し、次いで、−２０℃で数週間にわたって保管した。
【０５０２】
２．酵素による消化
【０５０３】
酵素のパネルを試験して、ＡＣ１６１１に対する各酵素の切断効率を決定した。６μＭの基質を各酵素と一緒に以下の酵素と基質のモル比および条件でインキュベートした：２０μＬの反応物中、ｕＰＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５中１：２５）、マトリプターゼ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９、５０ｍＭのＮａＣｌ中、１：２５）、レグマイン（５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５、２５０ｍＭのＮａＣｌ中、１：２０）、ＭＭＰ−２（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２中、１：１２００）、ＭＭＰ−７（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２中、１：１２００）、ＭＭＰ−９（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２中、１：２０００）、およびＭＭＰ−１４（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、３ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのＺｎＣｌ２中、１：３０）。反応物を３７℃で２時間インキュベートした後、ＭＭＰ反応物の場合ではＥＤＴＡを２０ｍＭまで添加することによって、ｕＰＡおよびマトリプターゼ反応物の場合では８５℃で１５分間加熱することによって、およびレグマインの場合ではｐＨを８．５に調整することによって停止させた。
【０５０４】
３．切断効率の分析。
【０５０５】
図７５に示されている通り、消化されなかった基質（１２μＭ）２μＬおよび消化された（６μＭ）反応混合物４μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥにローディングし、Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色することにより、切断産物のパーセンテージを決定するための試料の分析を実施した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対応するバンドの強度を分析し、切断のパーセントを決定した。種々のプロテアーゼにより放出セグメントにおいて切断されると、基質であるＲＳＲ−１５１７を含有するＸＴＥＮから２つの断片が生じ、より大きな断片を％切断算出に利用したが（反応生成物の数量を反応に供された最初の総基質で割る）、より小さな産物のバンドの強度は量化するには低すぎた。現行の標準の実験条件下でのＡＣ１６１１の切断のパーセンテージは、ｕＰＡ、マトリプターゼ、レグマイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４についてそれぞれ３１％、１４％、１６％、４０％、５１％、３８％、３０％である。
【０５０６】
結論：特定の放出セグメントＲＳＲ−１５１７（アミノ酸配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴ）を選択し、７種の酵素全てについて現行の標準の実験条件下での切断のパーセンテージによって定義されるその切断プロファイルを決定した。この放出セグメントは、全ての酵素に関して中間の切断効率を有し、したがって、スクリーニング中、正確な順位付けが可能になるように、より速いまたはより遅いバリアントの切断をアッセイウインドウ内に入れる。
【０５０７】
（実施例４３）
ＲＳＲ−１５１７（ＡＣ１６１１）を対照として使用した放出セグメントのスクリーニング
【０５０８】
ここで、放出セグメントのスクリーニングをどのように実施するかの例としてｕＰＡを選択する。同じ手順を７種の腫瘍関連プロテアーゼ全てに適用して、各基質に対する相対的な切断プロファイルを定義した。この切断プロファイルは、各酵素について各基質が対照基質ＲＳＲ−１５１７と比較した場合にどのくらい良好に切断され得るかを説明する７つの数字のアレイである。
【０５０９】
１．酵素による消化
【０５１０】
全ての放出セグメント含有ＸＴＥＮバリアントおよび対照ＡＣ１６１１を、個々のエッペンドルフチューブ中に、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２中１２μＭまで希釈した。ｕＰＡのマスターミックスを、各基質と１：１で混合した後に総反応体積が２０μＬになり、最初の基質濃度が６μＭになるように調製し、エンドポイントにおいて反応産物および切断されなかった基質を可視化できるようにするために、酵素に応じて酵素と基質の比を１：２０〜１：３０００の間で変動させた。全ての反応物を３７℃で２時間インキュベートした後、ＥＤＴＡを最終濃度２０ｍＭで添加することによって停止させた。全ての産物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後、Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌによって分析した。各ゲルについて、異なるゲル間の示差的な染色を正規化するために染色対照としてＡＣ１６１１消化産物を常に含めた（図７６）。
【０５１１】
２．相対的な切断効率の算出
【０５１２】
個々の基質についての切断のパーセンテージをＩｍａｇｅＪソフトウェアによって解析し、以前に記載されている通り算出した。各バリアントについて、相対的な切断効率を以下の通り算出する：
【化２】
2021507706.tif 000088
【０５１３】
相対的な切断効率における＋１値は、上記の実験条件下で、その基質によりＡＣ１６１１対照と比較して２倍の産物がもたらされたことを示し、一方、相対的な切断効率における−１値は、その基質によりＡＣ１６１１対照と比較して５０％の産物しかもたらされなかったことを示す。
【０５１４】
この実験では、ＡＣ１６１１の切断のパーセンテージ（％切断）は、ＩｍａｇｅＪによって数量化して、２０％である。この実験においてスクリーニングした基質では、２１％、３９％、１％、５８％、２４％、６％、１５％、１％、１％、および２５％の切断が実証され、ここで、１％は検出限界未満であることを本質的に表し、正確な値を示すものではない。上記の式に基づいて算出された相対的な切断効率は、それぞれ０．０８、０．９５、−４．３４、１．５１、０．２６、−１．７６、−０．４７、−４．３４、−４．３４、および０．３２であった。
【０５１５】
結論：ｕＰＡに供した場合の、同じ実験においてＡＣ１６１１と比較した、１０種の放出セグメントバリアントの相対的な切断効率を決定した。同様の手順に従って、参照対照としてＲＳＲ１５１７（ＡＣ１６１１）を使用して１３４種の放出セグメントの切断プロファイルを決定した。その結果が表１７に列挙されている。これらの放出セグメントは個々の酵素ならびに組合せについて広範囲の切断効率を網羅する。例えば、ＲＳＲ−１４７８はＭＭＰ−１４に対して−２．００値を有する、つまり、この基質ではＭＭＰ−１４を用いて消化した場合に参照対照ＲＳＲ−１５１７と比較して２５％の産物しかもたらされなかった。ＲＳＲ−１９５１などのある特定の放出セグメントは、試験した７種のプロテアーゼ全てに対してより良好な基質であると思われる。これらのより速い放出セグメントは、全身毒性が低い／管理しやすいものであれば診療所において有用であることが証明され得るが、有効性（いかに速く切断が起こってＰｒｏＴＩＡが活性化された形態になるかに一部応じる）に関しては改善が必要である。
表１７：  対照としてＲＳＲ−１５１７を使用した、７種のヒトプロテアーゼに供した場合の放出セグメントの切断プロファイル
【表１７−１】
2021507706.tif 000089
【表１７−２】
2021507706.tif 000090
【表１７−３】
2021507706.tif 000091
【表１７−４】
2021507706.tif 000092
【０５１６】
（実施例４４）
内部標準としてＲＳＲ−１５１７を使用した競合的消化
【０５１７】
この競合アッセイは、同じ実験内の異なるバイアルにおける反応物間の酵素濃度または反応条件のあらゆる変動性が最小限になるように展開する。同じ例において対照基質および目的のＲＳの両方に関して解明するために、新しい対照プラスミドを構築する。
【０５１８】
１．ＲＳＲ−１５１７を含有する内部標準の分子クローニング
【０５１９】
２つの内部標準プラスミド、ＡＣ１８３０（ＨＤ２−Ｖ５−ＡＥ１４４−ＲＳＲ−１５１７−ＸＴＥＮ２８８）およびＡＣ１８４０（ＨＤ２−Ｖ５−ＡＥ１４４−ＲＳＲ−１５１７−ＸＴＥＮ４３２）を、実施例３９に記載のＡＣ１６１１と同様に、Ｃ末端ＸＴＥＮの長さの差異だけを伴って構築する。
【０５２０】
２．酵素による消化
【０５２１】
精製されたＡＣ１８３０またはＡＣ１８４０および目的のＲＳを、個々の基質の最終濃度が６μＭになるようにアッセイ緩衝剤中で混合し、希釈することによって２×基質溶液を調製する。酵素マスターミックスを、２×基質溶液と１：１で混合した後に総反応体積が２０μＬになり、各成分の最終的な基質濃度が３μＭになり、酵素と基質の比がアッセイ展開において選択された通りになるように調製する。反応物を３７℃で２時間インキュベートした後、上記の手順によって停止させる。
【０５２２】
３．相対的な切断効率の算出
【０５２３】
反応混合物を非還元４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。内部標準と目的の基質は分子量が異なるので、切断されると、同じ試料レーンに４つのバンドが目に見えるはずである。両方についての切断のパーセンテージを算出することができ、相対的な切断効率を実施例４３のものと同じ式から導き出すことができる：
【化３】
2021507706.tif 000093
【０５２４】
唯一の差異は、ここでは両方の値を同じバイアル中の反応混合物から算出するが、以前は同じ酵素ミックスを共有する２つの反応から算出した。
【０５２５】
結論：内部標準としてＲＳＲ−１５１７を用いたこの競合的消化アッセイでは、実施例４３に記載のアッセイと比較してアッセイ間の変動性が少ないと予想する。この方法が今後の放出セグメントスクリーニングに適合されると予測する。
【０５２６】
（実施例４５）
放出部位を２つ有するＰｒｏＴＩＡ分子の構築
【０５２７】
Ｎ末端ＸＴＥＮおよびＣ末端ＸＴＥＮの両方を有するＰｒｏＴＩＡを生成するために、ＸＴＥＮ２９２を、Ｎ末端の骨格ＤＮＡに対する１７〜２１ｂｐの５’相同性領域およびＣ末端の切断不可能な放出部位（ＲＳＲ３０２８、アミノ酸配列ＴＴＧＥＡＧＥＡＡＧＡＴＳＡＧＡＴＧＰ）を含むプライマーを使用してプラスミドからＰＣＲ増幅した。抗ＥｐＣＡＭ抗体４Ｄ５ＭＯＣＢの軽鎖および重鎖の一部をコードするＰＣＲ産物の第２のセットを、Ｎ末端のＲＳＲ３０５８およびＣ末端の４Ｄ５ＭＯＣＢの重鎖に対する１６〜２１ｂｐの５’相同性領域を含むプライマーを使用して増幅した。これらのＰＣＲ断片を、４Ｄ５ＭＯＣＢ重鎖の残り／抗ＣＤ３タンデムｓｃＦｖ、切断不可能な放出部位であるＲＳＲ３０５８の第２のコピーおよび６×ＨＩＳアフィニティータグを有するＸＴＥＮ８６７をコードする、ＢｓｉＷＩ−ＳａｃＩＩを用いて消化した骨格ベクターに、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を使用してクローニングした。最終的なベクターは、ＰｈｏＡプロモーターおよびＳＴＩＩ分泌リーダーの制御下で、ＸＴＥＮ２９２、切断不可能なＲＳＲ３０５８、６×ＨＩＳアフィニティータグを有するＸＴＥＮ＿８６７と融合したＲＳＲ３０５８を有する抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３二特異性タンデムｓｃＦｖの成分（Ｎ末端からＣ末端へ）を有するＰｒｏＴＩＡ分子をコードする。得られた構築物はＡＣ１８８６であり、表１８に提示されるＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を有する。
【０５２８】
ＡＣ１８８６を鋳型として使用して、ＸＴＥＮ２９２、切断可能な放出セグメントＲＳＲ２２９５、ＸＴＥＮ＿８６８と融合したＲＳＲ２２９５を有する抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３二特異性タンデムｓｃＦｖをコードする２つのＰｒｏＴＩＡ構築物を創出した。どちらのプラスミドもＡＣ１８８６を鋳型として使用した２つの一般的なＰＣＲ産物を利用した；第１のプラスミドは、６×ＨＩＳアフィニティータグおよびベクター骨格に対する５’相同性領域を有するＸＴＥＮ２９２および第１のＲＳＲ２２９５をコードする３’相同性領域をコードし、第２のプラスミドは、タンデムｓｃＦｖに対して５’側および３’側のＲＳＲ２２９５セグメントをコードする５’相同性領域および３’相同性領域を有する抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３二特異性タンデムｓｃＦｖをコードする。第３の断片は、２つの構築物間で異なる。ＡＣ１９５５の第３の断片は、ＸＴＥＮ８６８およびＣ−Ｔａｇアフィニティータグ（アミノ酸配列ＥＰＥＡ）を、第２のＲＳＲ２２９５をコードする５’相同性領域および骨格ベクターに対する３’相同性領域と共にコードするものであった。ＡＣ１９５４の第３の断片は、ＸＴＥＮ８６６および６×ＨＩＳアフィニティータグを、第２のＲＳＲ２２９５をコードする５’相同性領域および骨格ベクターに対する３’相同性領域と共にコードするものであった。ＡＣ１９５５およびＡＣ１９５４のどちらに関しても、３つのＰＣＲ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔを使用してＢｓｉＷＩ−ＮｏｔＩで消化したＡＣ１８８６にクローニングした。最終的なベクターＡＣ１９５５は、表１８に提示されるＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を有するＰｈｏＡプロモーターおよびＳＴＩＩ分泌リーダーの制御下で、６×ＨＩＳアフィニティータグ、ＸＴＥＮ２９２、ＲＳＲ２２９５、抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３二特異性タンデムｓｃＦｖ、ＲＳＲ２２９５、ＸＴＥＮ８６８およびＣ−Ｔａｇアフィニティータグの成分（Ｎ末端からＣ末端へ）を有するＰｒｏＴＩＡ分子をコードする。最終的なベクターＡＣ１９５４は、表１１に提示されるＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を有するＰｈｏＡプロモーターおよびＳＴＩＩ分泌リーダーの制御下で、６×ＨＩＳアフィニティータグ、ＸＴＥＮ２９２、ＲＳＲ２２９５、抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３二特異性タンデムｓｃＦｖ、ＲＳＲ２２９５、ＸＴＥＮ８６６および６×ＨＩＳアフィニティータグの成分（Ｎ末端からＣ末端へ）を有するＰｒｏＴＩＡ分子をコードする。異なる放出セグメントまたは腫瘍特異的ｓｃＦｖを有するＰｒｏＴＩＡ構築物を、ＡＣ１９５４またはＡＣ１９５５をＤｒａＩＩＩ−ＢｔｓＩで消化し、その後、ＸＴＥＮ２９２に対する１７〜２０ｂｐの５’相同性領域およびＣ末端ＸＴＥＮに対する３’相同性領域を有する、構造放出部位−腫瘍ｓｃＦｖ−抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ−放出部位を含有するＰＣＲ産物のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ媒介性クローニングを行うことによってクローニングした。構築物ＡＣ１９４８、ＡＣ１９５２およびＡＣ１９６９を作製するための骨格としてＡＣ１９５４を使用した。構築物ＡＣ１９７２、ＡＣ１９７６、ＡＣ２００９、ＡＣ２０７８、ＡＣ２０８４を作製するための骨格としてＡＣ１９５５を使用し、これらの構築物の配列を表１２に提示する。
表１８：実施例４５のＰｒｏＴＩＡ構築物のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
【表１８−１】
2021507706.tif 000094
【表１８−２】
2021507706.tif 000095
【表１８−３】
2021507706.tif 000096
【表１８−４】
2021507706.tif 000097
【表１８−５】
2021507706.tif 000098
【表１８−６】
2021507706.tif 000099
【表１８−７】
2021507706.tif 000100
【表１８−８】
2021507706.tif 000101
【表１８−９】
2021507706.tif 000102
【表１８−１０】
2021507706.tif 000103
【表１８−１１】
2021507706.tif 000104
【表１８−１２】
2021507706.tif 000105
【表１８−１３】
2021507706.tif 000106
【表１８−１４】
2021507706.tif 000107
【表１８−１５】
2021507706.tif 000108
【表１８−１６】
2021507706.tif 000109
【表１８−１７】
2021507706.tif 000110
【０５２９】
（実施例４６）
単一のＸＴＥＮ−ＰｒｏＴＩＡの作製
【０５３０】
発現：フォーマットａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＲＳ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４＿Ｈｉｓ（６）に適合する構築物を、専売Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｍＥ０９８株において発現させ、転位置の間に切断されたＮ末端分泌リーダー配列（ＭＫＫＮＩＡＦＬＬＡＳＭＦＶＦＳＩＡＴＮＡＹＡ−）によってペリプラズムに分配させた。発酵培養物を、動物を含まない複合培地を用いて３７℃で成長させ、温度を２６℃にシフトした後、リン酸塩を枯渇させた。収集の間、発酵全ブロスを遠心分離して細胞をペレット化した。収集時に、総体積および細胞湿重量（ＷＣＷ；上清に対するペレットの比）を記録し、ペレット化した細胞を採取し、−８０℃で凍結させた。
【０５３１】
回収：凍結細胞ペレットを、３０％細胞湿重量を標的として溶解緩衝剤（１７．７ｍＭのクエン酸塩、２２．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）に再懸濁させた。再懸濁液をｐＨ４で平衡化し、次いで、出力温度をモニタリングし、１５±５℃に維持しながら８００±５０バールで２回の通過によってホモジナイズした。ホモジネートのｐＨが指定の範囲内（ｐＨ４．０±０．２）にあることを確認した。
【０５３２】
清澄化：内毒素および宿主細胞不純物を減少させるために、ホモジネートが低温（１０±５℃）、酸性（ｐＨ４．０±０．２）綿状沈殿を終夜（１５〜２０時間）受けるようにした。不溶性画分を除去するために、綿状沈殿したホモジネートを２〜８℃、１６，９００ＲＣＦで４０分間遠心分離し、上清を保持した。上清をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（ＭＱ）でおよそ３倍に希釈し、次いで、５ＭのＮａＣｌを用いて７±１ｍＳ／ｃｍに調整した。核酸、脂質、および内毒素を除去するため、ならびに濾過助剤として機能させるために、上清を０．１％（ｍ／ｍ）珪藻土に調整した。濾過助剤を懸濁したままにするために、上清をインペラによって混合し、３０分間にわたって平衡化した。デプスフィルターからなるフィルタートレイン、その後、０．２２μｍのフィルターを組み立て、次いで、ＭＱでフラッシングした。２５±５ｐｓｉｇの圧力降下が維持されるようにフローをモジュレートしながら上清をフィルタートレインを通してポンピングした。複合緩衝系を捕捉クロマトグラフィーのための所望の範囲に調整するために（クエン酸塩とＮａ２ＨＰＯ４の比に基づいて）、濾液を、５００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を用いて、最終的なＮａ２ＨＰＯ４とクエン酸塩の比が９．３３：１になるように調整し、緩衝させた濾液のｐＨが指定の範囲内（ｐＨ７．０±０．２）にあることを確認した。
【０５３３】
精製：ＡＥＸ捕捉：二量体、凝集体、および大きなトランケートを単量体産物から分離するため、ならびに内毒素および核酸を除去するために、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを利用して、電気陰性Ｃ末端ＸＴＥＮドメイン（ＡＥ８６４）を捕捉した。ＡＥＸ１固定相（ＧＥ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、ＡＥＸ１移動相Ａ（１２．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７．８ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａＣｌ）、およびＡＥＸ１移動相Ｂ（１２．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７．８ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ）を本明細書において使用した。カラムを、ＡＥＸ１移動相Ａを用いて平衡化した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって測定された総タンパク質濃度に基づいて、濾液を２８±４ｇ／Ｌの樹脂を標的としてカラムにローディングし、ＡＥＸ１移動相Ａで追跡し、次いで、３０％Ｂへのステップで洗浄した。結合した材料を、３０％Ｂから６０％Ｂまでの勾配で２０ＣＶにわたって溶出させた。画分を、（局所）ベースラインを≧１００ｍＡＵ超えるＡ２２０にしながら１ＣＶの一定分量に採取した。溶出画分を分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣに基づいてプールした。
【０５３４】
ＩＭＡＣ中間精製：Ｃ末端完全性を確実にするために、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して、Ｃ末端ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ（６））を捕捉した。ＩＭＡＣ固定相（ＧＥ  ＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、ＩＭＡＣ移動相Ａ（１８．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．７ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのイミダゾール）、およびＩＭＡＣ移動相Ｂ（１８．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．７ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）を本明細書において使用した。カラムを亜鉛溶液で荷電させ、ＩＭＡＣ移動相Ａを用いて平衡化した。ＡＥＸ１プールをｐＨ７．８±０．１、５０±５ｍＳ／ｃｍ（５ＭのＮａＣｌを用いて）に調整し、１ｍＭのイミダゾールを、２ｇ／Ｌの樹脂を標的としてＩＭＡＣカラムにローディングし、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）が（局所）ベースラインに戻るまでＩＭＡＣ移動相Ａを用いて追跡した。結合した材料を２５％ＩＭＡＣ移動相Ｂへのステップで溶出させた。Ａ２８０が（局所）ベースラインを≧１０ｍＡＵ超えたらＩＭＡＣ溶出物採取を開始し、２ＣＶを２ｍＭのＥＤＴＡにするのに十分なＥＤＴＡを予めスパイクした容器に方向付け、２ＣＶが採取されたら終了した。溶出をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０５３５】
プロテインＬ中間精製：Ｎ末端完全性を確実にするために、プロテインＬを使用して、分子（具体的にはａＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ）のＮ末端の近くに存在するカッパドメインを捕捉した。プロテインＬ固定相（ＧＥ  Ｃａｐｔｏ  Ｌ）、プロテインＬ移動相Ａ（１６．０ｍＭのクエン酸塩、２０．０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ４．０±０．１）、プロテインＬ移動相Ｂ（２９．０ｍＭのクエン酸塩、７．０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ２．６０±０．０２）、およびプロテインＬ移動相Ｃ（３．５ｍＭのクエン酸塩、３２．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０±０．１）を本明細書において使用した。カラムを、プロテインＬ移動相Ｃを用いて平衡化した。ＩＭＡＣ溶出物をｐＨ７．０±０．１および３０±３ｍＳ／ｃｍ（５ＭのＮａＣｌおよびＭＱを用いて）に調整し、２ｇ／Ｌの樹脂を標的としてプロテインＬカラムにローディングし、次いで、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）が（局所）ベースラインに戻るまでプロテインＬ移動相Ｃを用いて追跡した。カラムをプロテインＬ移動相Ａで洗浄し、プロテインＬ移動相ＡおよびＢを使用して、低ｐＨ溶出を実施した。結合した材料をおよそｐＨ３．０で溶出させ、採取体積１０部分ごとに１部分の０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を予めスパイクした容器に採取した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０５３６】
ＨＩＣ仕上げ：Ｎ末端バリアント（絶対的なＮ末端の４残基はプロテインＬ結合に必須ではない）および全体的なコンフォメーションバリアントを分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用した。ＨＩＣ固定相（ＧＥ  Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＩｍｐＲｅｓ）、ＨＩＣ移動相Ａ（２０ｍＭのヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．５±０．１）およびＨＩＣ移動相Ｂ（１Ｍの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．５±０．１）を本明細書において使用した。カラムを、ＨＩＣ移動相Ｂを用いて平衡化した。調整したプロテインＬ溶出物を、２ｇ／Ｌの樹脂を標的としてＨＩＣカラムにローディングし、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）が（局所）ベースラインに戻るまでＨＩＣ移動相Ｂを用いて追跡した。カラムを５０％Ｂで洗浄した。結合した材料を、５０％Ｂから０％Ｂまでの勾配を用いて７５ＣＶにわたって溶出させた。Ａ２８０が（局所）ベースラインを≧３ｍＡＵ超えるようにしながら画分を１ＣＶの一定分量に採取した。溶出画分を分析し、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＨＩ−ＨＰＬＣに基づいてプールした。
【０５３７】
製剤化：産物を製剤緩衝剤に換えるためおよび産物を標的濃度（０．５ｇ／Ｌ）にするために、アニオン交換を再度使用して、Ｃ末端ＸＴＥＮ（ＡＥ８６４）を捕捉した。ＡＥＸ２固定相（ＧＥ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、ＡＥＸ２移動相Ａ（２０ｍＭのヒスチジン、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．５±０．２）、ＡＥＸ２移動相Ｂ（２０ｍＭのヒスチジン、１ＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．５±０．２）、およびＡＥＸ２移動相Ｃ（１２．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７．８ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ７．０±０．２）を本明細書において使用した。カラムを、ＡＥＸ２移動相Ｃを用いて平衡化した。ＨＩＣプールをｐＨ７．０±０．１および７±１ｍＳ／ｃｍ（ＭＱを用いて）に調整し、２ｇ／Ｌの樹脂を標的としてＡＥＸ２カラムにローディングし、次いで、Ａ２８０が（局所）ベースラインに戻るまでＡＥＸ２移動相Ｃを用いて追跡した。カラムをＡＥＸ２移動相Ａ（２０ｍＭのヒスチジン、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．５±０．２）で洗浄した。ＡＥＸ２移動相ＡおよびＢを使用して［ＮａＣｌ］ステップを生じさせ、溶出を実施した。結合した材料を３８％ＡＥＸ２移動相Ｂへのステップで溶出させた。Ａ２８０が（局所）ベースラインを≧５ｍＡＵ超えたらＡＥＸ２溶出物採取を開始し、２ＣＶが採取されたら終了した。ＡＥＸ２溶出物をＢＳＣ内、０．２２μｍで濾過し、一定分量を取り、標識し、バルク原薬（ＢＤＳ）として−８０℃で保管した。バルク原薬（ＢＤＳ）を、種々の分析方法により、全てのロット放出基準を満たすことを確認した。全体的な品質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し（図８４）、単量体と二量体および凝集体の比をＳＥ−ＨＰＬＣによって分析し（図８５Ａ）、Ｎ末端品質および産物の均一性をＨＩ−ＨＰＬＣによって分析した（図８５Ｂ）。
【０５３８】
（実施例４７）
二重ＸＴＥＮ−ＰｒｏＴＩＡの作製
【０５３９】
分子ＡＣ１９５５：Ｈｉｓ（６）＿ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＲＳＲ２２９５−ａＥＧＦＲ−ａＣＤ３−ＲＳＲ２２９５−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４＿ＥＰＥＡ
【０５４０】
発現：ＡＣ１９５５を専売Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｍＥ０９８株において発現させ、転位置の間に切断されたＮ末端分泌リーダー配列（ＭＫＫＮＩＡＦＬＬＡＳＭＦＶＦＳＩＡＴＮＡＹＡ−）を介してペリプラズムに分配させた。発酵培養物を、動物を含まない複合培地を用いて３７℃で成長させ、温度を２６℃にシフトした後、リン酸塩を枯渇させた。収集の間、発酵全ブロスを遠心分離して細胞をペレット化した。収集時に、総体積および細胞湿重量（ＷＣＷ；上清に対するペレットの比）を記録し、ペレット化した細胞を採取し、−８０℃で凍結させた。
【０５４１】
回収：凍結細胞ペレットを、３０％細胞湿重量を標的として溶解緩衝剤（１００ｍＭのクエン酸塩）に再懸濁させた。再懸濁液をｐＨ４．４で平衡化し、次いで、出力温度をモニタリングし、１５±５℃に維持しながら１７，０００±２００バールでホモジナイズした。ホモジネートのｐＨが指定の範囲内（ｐＨ４．４±０．１）であることを確認した。
【０５４２】
清澄化：内毒素および宿主細胞不純物を減少させるために、ホモジネートが低温（１０±５℃）、酸性（ｐＨ４．４±０．１）綿状沈殿を終夜（１５〜２０時間）受けるようにした。不溶性画分を除去するために、綿状沈殿したホモジネートを２〜８℃、８，０００ＲＣＦで４０分間遠心分離し、上清を保持した。核酸、脂質、および内毒素を除去するため、ならびに濾過助剤として機能させるために、上清を０．１％（ｍ／ｍ）珪藻土に調整した。濾過助剤を懸濁したままにするために、上清をインペラによって混合し、３０分間にわたって平衡化した。デプスフィルターからなるフィルタートレイン、その後、０．２２μｍのフィルターを組み立て、次いで、ＭＱでフラッシングした。２５±５ｐｓｉｇの圧力降下が維持されるようにフローをモジュレートしながら上清をフィルタートレインを通してポンピングした。
【０５４３】
精製：プロテインＬ捕捉：宿主細胞タンパク質、内毒素、および核酸を除去するために、プロテインＬを使用して、ＡＣ１９５５分子のａＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ内に存在するカッパドメインを捕捉した。プロテインＬ固定相（Ｔｏｓｏｈ  ＴＰ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ−６５０Ｆ）、プロテインＬ移動相Ａ（１１．５ｍＭのクエン酸塩、２４．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ５．０）、およびプロテインＬ移動相Ｂ（１１ｍＭのリン酸塩、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ２．０）を本明細書において使用した。カラムを、プロテインＬ移動相Ａを用いて平衡化した。濾液をｐＨ５．５±０．２に調整し、２〜４ｇ／Ｌの樹脂を標的としてプロテインＬカラムにローディングし、次いで、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）が（局所）ベースラインに戻るまでプロテインＬ移動相Ａを用いて追跡した。結合した材料を、移動相Ｂを用いて溶出させ、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を０．４ＣＶで予めスパイクした２ＣＶ画分として採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０５４４】
ＩＭＡＣ中間精製：Ｎ末端完全性を確実にするために、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して、ＡＣ１９５５分子のＮ末端ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ（６））を捕捉した。ＩＭＡＣ固定相（ＧＥ  ＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、ＩＭＡＣ移動相Ａ（１２．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７．８ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０）、およびＩＭＡＣ移動相Ｂ（５０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５）を本明細書において使用した。カラムを、ＩＭＡＣ移動相Ａを用いて平衡化した。プロテインＬ溶出物をｐＨ７．８±０．１および５０±５ｍＳ／ｃｍ（５ＭのＮａＣｌを用いて）に調整した。調整したプロテインＬプールを２ｇ／Ｌの樹脂を標的としてＩＭＡＣカラムにローディングし、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）が（局所）ベースラインに戻るまでＩＭＡＣ移動相Ａを用いて追跡した。結合した材料を、ＩＭＡＣ移動相Ｂを用いて溶出させた。ＩＭＡＣ溶出物を、２００ｍＭのＥＤＴＡを０．０２ＣＶで予めスパイクした２ＣＶ画分として採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０５４５】
Ｃ−タグ中間精製：Ｃ末端完全性を確実にするために、Ｃ−タグアフィニティークロマトグラフィーを使用して、Ｃ末端ＥＰＥＡタグを捕捉した。Ｃ−タグ固定相（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃ−ｔａｇＸＬ）、Ｃ−タグ移動相Ａ（５０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５）、およびＣ−タグ移動相Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．６ＭのＭｇＣｌ２、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０）を本明細書において使用した。カラムを、Ｃ−タグ移動相Ａを用いて平衡化した。ＩＭＡＣ溶出物を、２ｇ／Ｌの樹脂を標的としてＣ−タグカラムにローディングし、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）が（局所）ベースラインに戻るまでＣ−タグ移動相Ａを用いて追跡した。結合した材料を、Ｃ−タグ移動相Ｂを用いて溶出させた。Ｃ−タグ溶出物を２ＣＶ画分として採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０５４６】
ＡＥＸ仕上げ：二量体および凝集体を単量体産物から分離するために、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを利用して、電気陰性Ｎ末端およびＣ末端ＸＴＥＮドメインを捕捉した。ＡＥＸ１固定相（ＢＩＡ  ＱＡ−８０）、ＡＥＸ１移動相Ａ（５０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５）、およびＡＥＸ１移動相Ｂ（５０ｍＭのヒスチジン、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５）を本明細書において使用した。カラムを、ＡＥＸ移動相Ａを用いて平衡化した。Ｃ−タグ溶出物をＭＱで１０ｍＳ／ｃｍまで希釈し、２ｇ／Ｌの樹脂を標的としてローディングし、次いで、２８０ｎｍにおける吸光度が（局所）ベースラインに戻るまでＡＥＸ移動相Ａを用いて追跡した。結合した材料を、０％Ｂから１００％Ｂまでの勾配を用いて６０ＣＶにわたって溶出させた。（局所）ベースラインを≧２ｍＡＵ超えるＡ２８０にしながら画分を１ＣＶの一定分量に採取した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣによって分析し、≧９８％が単量体であることが見いだされた画分をさらなる処理のためにプールした（ＡＥＸプール）。
【０５４７】
製剤化：産物を製剤緩衝剤に換えるためおよび産物を標的濃度（０．５ｇ／Ｌ）にするために、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を使用した。面積が０．１ｍ２である１０ｋＤａの膜および１５ｐｓｉのＴＭＰ標的を使用して、ＡＥＸプールを０．５ｇ／Ｌまで濃縮し、次いで、製剤緩衝剤（５０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５）を用いて１０倍に希釈した。ＡＥＸプールを１０倍に濃縮し、さらに２回、１０倍に希釈した。回収された製剤化産物をＢＳＣ中、０．２２μｍで濾過し、一定分量を取り、標識し、バルク原薬（ＢＤＳ）として−８０℃で保管した。ＢＤＳを、種々の分析方法により、全てのロット放出基準を満たすことを確認した。全体的な品質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し（図８６Ａ）、単量体と二量体および凝集体の比をＳＥ−ＨＰＬＣによって分析し（図８７Ａ）、Ｎ−産物の均一性をＨＩ−ＨＰＬＣによって分析した（図８７Ｂ）。同一性をＥＳＩ−ＭＳによって確認した（図８６Ｂ）。
【０５４８】
（実施例４８）
フローサイトメトリーによって評価される細胞結合
【０５４９】
抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の二重特異的結合も、ＣＤ３陽性ヒトジャーカット細胞およびＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、ＮＣＩ−Ｈ１５７３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＦａＤｕ、およびＳＣＣ−９から選択されるＥＧＦＲ陽性ヒト細胞またはＥＧＦＲを発現する安定なＣＨＯ細胞系を利用したフローサイトメトリーに基づくアッセイによって評価した。ＣＤ３＋細胞およびＥＧＦＲ＋細胞をある用量範囲の処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５５、２つのＸＴＥＮおよび２つのＲＳを含む）、プロテアーゼで処理されたＡＣ１９５５、ならびに抗ＣＤ３  ｓｃＦｖおよび抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ陽性対照と一緒に、２％ＢＳＡおよび５ｍＭのＥＤＴＡを伴う、ＨＢＳＳを含有する結合緩衝剤中、４℃で３０分間インキュベートする。結合緩衝剤で洗浄して、結合しなかった試験材料を除去した後、細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓタグ抗体（Ａｂｃａｍ  ｃａｔ＃ａｂ１２０６）と一緒に４℃で３０分間インキュベートする。結合しなかったＦＩＴＣコンジュゲート抗体を結合緩衝剤で洗浄することによって除去し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ）または同等の機器でのデータ取得のために細胞を結合緩衝剤に再懸濁させる。全てのフローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）または等価物を用いて解析する。
【０５５０】
抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖはジャーカット細胞に結合することは予測されないが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、処理されていないＡＣ１９５５、およびプロテアーゼで処理されたＡＣ１９５５は全て、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓタグ抗体単独と一緒にインキュベートしたジャーカット細胞と比較して蛍光強度が増大することによって示される通り、ジャーカット細胞に結合することが予測される。同様に、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ、プロテアーゼで処理されたＡＣ１９５５、および処理されていないＡＣ１９５５は全て、ＥＧＦＲ陽性細胞に結合することが予測されるが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、ＥＧＦＲ陽性細胞に結合することが予測されない。これらのデータは、抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の、それぞれジャーカットおよびＥＧＦＲを発現するヒト細胞系のパネルにおいて発現されるＣＤ３抗原およびＥＧＦＲ抗原の両方を認識する二特異性結合能力を反映することが予想される。さらに、ＸＴＥＮポリマーにより表面結合にいくらかの干渉がもたらされるので、処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、ＣＤ３抗原およびＥｐＣＡＭ抗原の両方に対して、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡよりも低い親和性で結合することが予想される。
【０５５１】
（実施例４９）
フローサイトメトリーによって評価される細胞溶解
【０５５２】
抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物による細胞溶解をヒトＰＢＭＣおよびＥＧＦＲ陽性細胞系を利用したフローサイトメトリーによって評価する。ＥＧＦＲ陽性ＨＣＴ−１１６標的細胞（またはＨＴ−２９、ＮＣＩ−Ｈ１５７３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＦａＤｕ、およびＳＣＣ−９から選択される標的細胞またはＥＧＦＲを発現する安定なＣＨＯ細胞系）を、蛍光膜色素であるＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ色素（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ＃８８−０８７０−１６）を用い、製造業者の指示に従って標識する。あるいは、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃ＭＩＮＩ２６およびＰＫＨ２６ＧＬ）を使用することもできる。簡単に述べると、ＨＣＴ−１１６細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、細胞２×１０６個をＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ標識キットで供給される希釈剤Ｃ、０．１ｍＬ中に再懸濁する。別の管中、ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ色素２μＬを、希釈剤Ｃ、０．５ｍＬと混合し、次いで、０．１ｍＬをＨＣＴ−１１６細胞懸濁液に添加する。細胞懸濁液とＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ色素を混合し、室温で２分間インキュベートする。次いで、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）０．２ｍＬを添加することによって標識反応をクエンチする。標識された細胞を完全細胞培養培地（１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０）で２回洗浄し、生存細胞の総数をトリパンブルー排除によって決定する。エフェクター対標的比１０：１として、ウェル当たり２００μＬの総体積で、９６ウェル丸底プレートにおいてウェル当たり１×１０５個のＰＢＭＣを１×１０４個のＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎで標識されたＨＣＴ−１１６細胞と、示されている用量範囲濃度のプロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５５、２つのＸＴＥＮおよび２つのＲＳを含む）試料および処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５５、２つのＸＴＥＮおよび２つのＲＳを含む）試料の不在下または存在下で共培養する。２４時間後に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ＃ＡＴ１０４）で収集し、２％ＦＣＳ／ＰＢＳで洗浄する。Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での細胞データ取得前に、細胞を、２．５マイクログラム／ｍＬの７−ＡＡＤ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ＃００−６９９３−５０）を補充した２％ＦＣＳ／ＰＢＳ、１００μＬに再懸濁して、生（７−ＡＡＤ陰性）細胞と死（７−ＡＡＤ陽性）細胞とを識別する。ＦＡＣＳデータをｇｕａｖａＳｏｆｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で解析し、７−ＡＡＤ陽性／ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ陽性細胞の数をＣｅｌｌＶｕｅ  Ｍａｒｏｏｎ陽性細胞の総数で割ることによって死標的細胞のパーセンテージを算出する。
【０５５３】
ＰｒｏＴＩＡ濃度に対するパーセント細胞傷害性の用量反応死滅曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して４パラメーターロジスティック回帰方程式によって解析し、したがって、最大半量のパーセント細胞傷害性が誘導されるＰｒｏＴＩＡの濃度を決定する。
【０５５４】
フローサイトメトリーを利用した細胞傷害性の結果は、ＬＤＨおよびカスパーゼを含めた他の細胞傷害性アッセイを用いて得られる結果と一致することが予測される。ＨＣＴ−１１６細胞をプロテアーゼで切断された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物および切断されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物にＰＢＭＣの不在下で曝露させることによる影響はないことが予測される。同様に、ＰＢＭＣは、標的細胞を伴わないＰｒｏＴＩＡの存在下で活性化されるとは予測されない。これらの結果は、ＰＢＭＣを細胞傷害活性について刺激するためにはＰｒｏＴＩＡ組成物を標的細胞の表面上に密集させる必要があることを示すものであることが予測される。ＰＢＭＣおよび標的細胞の存在下では、プロテアーゼを用いて前処理されたまたは処理されていないＰｒｏＴＩＡに起因する濃度依存性細胞傷害効果が存在する。さらに、結果は、ＨＣＴ−１１６細胞を処理されていないＰｒｏＴＩＡ（プロテアーゼなし）にＰＢＭＣの存在下で曝露させることにより、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡ組成物と比較して細胞傷害性の低減が示されることを示すものになることが予測される。
【０５５５】
（実施例５０）
抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＴ細胞活性化マーカーアッセイ
【０５５６】
抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡにより誘導される活性化マーカー（ＣＤ６９およびＣＤ２５）を測定するために、１×１０５個のＰＢＭＣまたは精製されたＣＤ３＋細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中、アッセイウェル当たり１×１０４個のＨＣＴ−１１６細胞またはＨＴ−２９細胞（すなわち、エフェクター対標的比１０：１）と、抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５５、２つのＸＴＥＮおよび２つのＲＳを含む）の存在下、９６ウェル丸底プレートにおいて、最終的な総体積２００μＬで共培養する。３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で２０時間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中、４℃で、ＰＥＣｙ５コンジュゲート抗ＣＤ４、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ８、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ２５、およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６９（抗体は全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのもの）を用いて染色し、ＦＡＣＳ緩衝剤で２回洗浄し、次いで、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でのデータ取得のためにＦＡＣＳ緩衝剤中に再懸濁させる。
【０５５７】
３種のＰｒｏＴＩＡ分子のＴ細胞活性化マーカー発現傾向は、ＬＤＨおよびカスパーゼを含めた細胞傷害性アッセイによって観察されるものと同様であることが予想される。処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５５）によるＰＢＭＣまたはＣＤ３＋細胞のＣＤ８集団およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９の活性化についての活性はプロテアーゼで処理されたＡＣ１９５５  ＰｒｏＴＩＡの活性よりも低いことが予想され、切断不可能な抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９９１）の活性は処理されていないＡＣ１９５５の活性よりも低いことが予想される。
【０５５８】
（実施例５１）
刺激された正常な健康ヒトＰＢＭＣならびに無傷抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを使用したヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビーズアレイ解析
【０５５９】
無傷抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡと、それに対して切断された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５５、２つのＸＴＥＮおよび２つのＲＳを含む）の、細胞に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴ細胞関連サイトカインの放出を刺激する能力の安全性評価として、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマを含むサイトカインのパネルを、プロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ試料および処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ試料を用いて刺激した、培養されたヒトＰＢＭＣ由来の上清に対するサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用して分析した。抗ヒトＣＤ３抗体であるＯＫＴ３を陽性対照として使用し、無処理のウェルが陰性対照としての機能を果たした。
【０５６０】
簡単に述べると、ＯＫＴ３（０、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ）ならびに、プロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭおよび２０００ｎＭのＡＣ１９５５）を９６ウェル平底プレートに、ウェルをバイオセーフティフード内で終夜蒸発させることによってドライコーティングする。次いで、ウェルを、ＰＢＳを用いて穏やかに１回洗浄し、２００μＬ中１×１０６個のＰＢＭＣを各ウェルに添加する。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、その後、組織培養上清を各ウェルから採取し、放出されるサイトカインについて、有効な市販のＣＢＡキット（ＢＤ  ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット、ｃａｔ＃５５１８０９）を使用し、製造業者の指示に従って、フローサイトメトリーによって分析する。
【０５６１】
ＯＫＴ３により、評価した全てのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ）の頑強な分泌が誘導されるが、無処理のウェルでは誘導されないことが予想され、それにより、ＣＢＡサイトカインアッセイの性能が確認される。プロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを用いた刺激により、特に１００ｎＭよりも高い濃度で、試験したサイトカインの全てについて有意なサイトカイン発現が誘発されることが予想される。対照的に、無傷の切断されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子を１０〜２０００ｎＭの濃度範囲で刺激薬とした場合には、ベースラインレベルのＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマが予測される。これらのデータにより、無傷ＰｒｏＴＩＡ組成物のＸＴＥＮポリマーにより考慮すべき遮蔽効果がもたらされ、ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３部分が組成物から放出されるところのプロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡと比較して、ＰＢＭＣにより刺激されるサイトカイン応答が妨げられることが裏付けられる。
【０５６２】
（実施例５２）
精製されたＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在下での抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の細胞傷害性アッセイ。
【０５６３】
ＰｒｏＴＩＡ分子の細胞傷害活性がＣＤ３陽性Ｔ細胞によって媒介されることを実証するために、放出セグメントを有さない切断不可能な抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９９１、２つのＸＴＥＮを含む）、およびプロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよび処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５５、２つのＸＴＥＮおよび２つのＲＳを含む）を、ＥＧＦＲ＋ヒト細胞系（例えば、ＨＣＴ−１１６またはＨＴ−２９）において、精製されたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在下で評価する。精製されたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶから購入し、これらはそこで健康なドナーの全血からＭａｇＣｅｌｌｅｃｔヒトＣＤ３＋Ｔ細胞単離キットを使用した負の選択によって単離される。この実験では、精製されたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞をＥＧＦＲ＋細胞系と約１０：１の比で混合し、３種全てのＰｒｏＴＩＡ分子を上記の通りＬＤＨアッセイにおいて１２点の５倍段階希釈の用量曲線として試験した。ＣＤ３＋細胞を用いてプロファイルされる３種のＰｒｏＴＩＡ分子の活性の傾向は、ＰＢＭＣを用いた同じ細胞系のプロファイルと同様であることが予想される。処理されていないＡＣ１９５５の活性は、プロテアーゼで処理されたＡＣ１９５５の活性よりも低いことが予想され、切断不可能なＡＣ１９９１の活性は、処理されていないＡＣ１９５５の活性よりも低いことが予想される。そのような結果から、ＰｒｏＴＩＡ分子の細胞傷害活性が実際にＣＤ３陽性Ｔ細胞によって媒介されることが実証されることになる。切断可能な抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ分子内に含有される放出セグメントの、腫瘍細胞および／または活性化されたＣＤ３陽性Ｔ細胞からアッセイ混合物中に放出されると仮定されるプロテアーゼによる影響の受けやすさは細胞系間で異なる可能性が高い。
【０５６４】
（実施例５３）
抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＴ細胞活性化マーカーおよびサイトカイン放出アッセイ
【０５６５】
抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡに誘導されるサイトカインの発現を測定するために、アッセイウェル当たり、精製されたＣＤ３＋細胞を、ＨＣＴ−１１６細胞と（すなわち、エフェクター対標的比約１０：１）、抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５５、２つのＸＴＥＮおよび２つのＲＳを含む）の存在下、９６ウェル丸底プレートにおいて、最終的な総体積２００μＬで共培養する。３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で２０時間インキュベートした後、細胞の上清をサイトカイン測定のために収集する。このアッセイを、ＨＴ−２９、ＮＣＩ−Ｈ１５７３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＦａＤｕ、およびＳＣＣ−９から選択される他の標的細胞を用いて、ならびに精製されたＣＤ３＋細胞の代わりにＰＢＭＣを用いて実施することもできる。
【０５６６】
細胞培養上清中に分泌されたインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマのサイトカイン分析を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｃａｔ＃５５０７４９）を使用し、製造業者の指示に従って定量化する。ＰｒｏＴＩＡの不在下では、精製されたＣＤ３＋細胞からはバックグラウンドを上回るサイトカイン分泌は予測されない。ＥＧＦＲ陽性標的細胞および精製されたＣＤ３＋細胞の存在下では、ＡＣ１９５５により、Ｔ細胞が活性化され、あるパターンのＴ細胞サイトカインが分泌され、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファなどのＴｈ１サイトカインの割合が高いことが予想される。プロテアーゼで処理されたＡＣ１９５５では無傷ＡＣ１９５５と比較して低濃度でＴ細胞が活性化され、Ｔ細胞サイトカインが分泌されることが予測され、これにより、ＰｒｏＴＩＡにおけるＸＴＥＮポリマーの遮蔽効果が裏付けられる。
【０５６７】
（実施例５４）
抗マウスＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のカスパーゼ３／７アッセイ
【０５６８】
抗マウスＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の向け直された細胞傷害性を、アポトーシス細胞のカスパーゼ３／７活性のアッセイによって評価した。マウス脾細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓から、２枚の顕微鏡スライドの端のすりガラスラベル部分の間ですりつぶし、赤血球をＡＣＫで溶解させ、４０マイクロメートルのフィルターを通して濾過することによって機械的に解離させた。マウスＣＤ３細胞を、マウス脾細胞からＥａｓｙＳｅｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｃａｔ＃１９８５１）を使用した負の選択によって精製した。精製されたＣＤ３陽性Ｔ細胞を、４Ｔ１、ｍｓＥｐ−ＣＴ２６（平均マウスＥｐＣＡＭ密度が５００，０００である、マウスＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＴ２６の安定なプール）、およびｍｓＥｐ−ＣＴ２６−３（平均マウスＥｐＣＡＭ密度が細胞当たり４１０，０００である、マウスＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＴ２６のクローン）などのマウスＥｐＣＡＭ陽性腫瘍標的細胞と、エフェクター細胞５または１０対標的細胞１の比で混合し、３種全てのＰｒｏＴＩＡバージョンを８点または１２点の５倍または８倍段階希釈用量濃度として試験した。
【０５６９】
細胞溶解したら、培養上清中に放出されたカスパーゼ３／７を、「グロー型」発光シグナルを生じさせるカスパーゼ３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  ｃａｔ＃Ｇ８０９１）によって切断された発光性カスパーゼ３／７基質の量によって測定した。発光の量はカスパーゼ活性の量に比例する。
【０５７０】
結果：表１９に示されている通り、切断不可能なＡＣ１８６７およびＡＣ１５５４の活性は、試験したマウスＥｐＣＡＭ発現細胞系の全てにおいて、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１６９６およびＡＣ１５５３）と比較して一貫して乏しい。予測通り、プロテアーゼで切断されたＡＣ１６９６およびＡＣ１５５３が最も活性が高く、切断可能な、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ構築物の活性は放出セグメント配列および標的細胞系に応じて変動した。
【０５７１】
表１９：マウス細胞株における抗マウスＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３バリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
【表１９−１】
2021507706.tif 000111
【表１９−２】
2021507706.tif 000112
【０５７２】
（実施例５５）
抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のカスパーゼ３／７アッセイ
【０５７３】
抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物の向け直された細胞傷害性を、アポトーシス細胞のカスパーゼ３／７活性によるアッセイによって評価した。マウス脾細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓から、２枚の顕微鏡スライドの端のすりガラスラベル部分の間ですりつぶし、赤血球をＡＣＫで溶解させ、４０マイクロメートルのフィルターを通して濾過することによって機械的に解離させた。マウスＣＤ３細胞を、マウス脾細胞からＥａｓｙＳｅｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｃａｔ＃１９８５１）を使用した負の選択によって精製した。精製されたＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ｈＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂ（ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯのクローン）、ＨＣＴ−１１６、ｈＥｐ−ＬＬ／２（ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたルイス肺細胞系のプール）、およびｈＥｐ−ＬＬ／２−１からｈＥｐ−ＬＬ／２−５まで（ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたルイス肺のクローン５種）などのヒトＥｐＣＡＭ陽性腫瘍標的細胞とエフェクター細胞５〜１０対標的細胞１の比で混合し、３種全てのＰｒｏＴＩＡバージョンを８点または１２点の５倍または８倍段階希釈用量濃度として試験した。
【０５７４】
細胞溶解したら、培養上清中に放出されたカスパーゼ３／７を、「グロー型」発光シグナルを生じさせるカスパーゼ３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  ｃａｔ＃Ｇ８０９１）による発光性カスパーゼ３／７基質切断の量によって測定した。発光の量はカスパーゼ活性の量に比例する。
【０５７５】
結果：表２０に示されている通り、単一のＸＴＥＮ部分構造を有するＰｒｏＴＩＡに関しては、試験したヒトＥｐＣＡＭ発現細胞系全てにおいて、切断不可能なＡＣ１９１６の活性はプロテアーゼで処理されていないＡＣ１７８３と比較して一貫して乏しい。２つのＸＴＥＮ部分構造を有するＰｒｏＴＩＡに関しては、切断不可能なＡＣ１９４９およびＡＣ１９５６の活性は、プロテアーゼで処理されていないＡＣ１９４８およびＡＣ１９５７と比較して乏しい。興味深いことに、ヒトＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖおよびマウスＣＤ３  ｓｃＦｖを有するプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９４８）の活性は、ヒトＥｐＣＡＭおよびマウスＣＤ３単鎖ディアボディを有するプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５７）の活性よりも低かった。この傾向は、切断不可能なヒトＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖおよびマウスＣＤ３  ｓｃＦｖ（ＡＣ１９４９）ならびにヒトＥｐＣＡＭおよびマウスＣＤ３単鎖ディアボディを有する切断不可能なＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９５６）についても観察された。予測通り、プロテアーゼで切断されたＡＣ１７８３およびＡＣ１９４８の活性が最も高かった。ｈｕＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂに対する細胞傷害性についてのデータは図３７に含まれている。
【０５７６】
表２０：マウス細胞株における抗マウスＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３バリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
【表２０】
2021507706.tif 000113
【０５７７】
（実施例５６）
Ｂ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊマウスにおける抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）の決定
【０５７８】
単一のＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡの毒性をＢ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｏｃｋ＃００８４２６）において、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質およびマウスＣＤ３タンパク質に結合する代理分子を使用して評価した。Ｂ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊは、ヘミ接合性ヒトＥｐＣＡＭトランスジェニックマウス系統である。試験物は、切断されていないＡＣ１７８３（ＲＳＲ−２２９５）、切断されたＡＣ１７８３、および切断不可能なＡＣ１９１６（ＲＳＲ−３０５８）であった。Ｂ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊマウスに、様々な量の切断されていないＡＣ１７８３（０．８７、２．６、および８．７ｎｍｏｌ／ｋｇ）、切断されたＡＣ１７８３（０．２６、０．８７、および２．６ｎｍｏｌ／ｋｇ）、および切断不可能なＡＣ１９１６（２．６、８．７、および２６．１ｎｍｏｌ／ｋｇ）を投薬し、マウスの健康および体重を投薬後１４日間にわたってモニタリングした。
【０５７９】
結果：ＡＣ１７８３を２．６ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹中１匹およびＡＣ１７８３を８．７ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹全てが処置後５日目までに死亡した。プロテアーゼにより切断されたＡＣ１７８３を２．６ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹中１匹が処置後８日目までに死亡した。切断不可能なＡＣ１９１６を２６ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹中１匹が処置後５日目までに死亡した。各試験物について用量依存的体重減少が観察された（図７７）。観察されたデータから、ＭＴＤが、切断されていないＡＣ１７８３については０．８７ｎｍｏｌ／ｋｇから２．６ｎｍｏｌ／ｋｇの間、切断されたＡＣ１７８３については０．８７ｎｍｏｌ／ｋｇから２．６ｎｍｏｌ／ｋｇの間、および切断不可能なＡＣ１９１６については８．７ｎｍｏｌ／ｋｇから２６．１ｎｍｏｌ／ｋｇの間であることが示される。
【０５８０】
結論：単回投与後の体重減少および死亡によって評価される抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ構築物の毒性から、切断不可能なＡＣ１９１６のＭＴＤが切断されたＡＣ１７８３の１０倍であることによって観察される通り、ＸＴＥＮによりｉｎ  ｖｉｖｏ活性がマスキングされることが示される。切断されていないＡＣ１７８３は、切断されたＡＣ１７８３と同様のＭＴＤを有し、これにより、Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／ＪトランスジェニックマウスにおいてＡＣ１７８３のｉｎ  ｖｉｖｏ切断が起こることが示唆される。
【０５８１】
（実施例５７）
Ｂ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊマウスにおける抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）の決定
【０５８２】
１つまたは２つのＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡ構築物の毒性を、Ｂ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｏｃｋ＃００８４２６）において、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質およびマウスＣＤ３タンパク質に結合する代理分子を使用して評価した。Ｂ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊは、ヘミ接合性ヒトＥｐＣＡＭトランスジェニックマウス系統である。試験物は、切断されていないＡＣ１７８３（ＲＳＲ−２２９５、単一のＸＴＥＮ）、切断されていないＡＣ１９４８（ＲＳＲ−２２９５、２つのＸＴＥＮ）、切断されたＡＣ１９４８、および切断不可能なＡＣ１９４９（ＲＳＲ−３０５８、２つのＸＴＥＮ）であった。Ｂ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊマウスに、様々な量の切断されていないＡＣ１７８３（０．８７、２．６、および８．７ｎｍｏｌ／ｋｇ）、切断されていないＡＣ１９４８（０．８７、２．６、８．７、２６．１、および７８．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、切断されたＡＣ１９４８（０．２６、０．８７、２．６、および８．７ｎｍｏｌ／ｋｇ）、または切断不可能なＡＣ１９４９（８．７、２６．１、および７８．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）を投薬し、マウスの健康および体重を投薬後１４日間にわたってモニタリングした。
【０５８３】
結果：０．８７ｎｍｏｌ／ｋｇまたは２．６ｎｍｏｌ／ｋｇのＡＣ１７８３を用いて処置したマウス５匹中１匹および８．７ｎｍｏｌ／ｋｇのＡＣ１７８３を用いて処置したマウス５匹中４匹が処置後４日目までに死亡した。ＡＣ１９４８を８．７ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹中１、２匹、２６．１ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹中３匹、および７８．３ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹全てが、それぞれ処置後７日目、４日目、および３日目に死亡した。プロテアーゼにより切断されたＡＣ１９４８を０．２６ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹中１匹、２．６ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹中３匹、および８．７ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹全てが処置後４日目までに死亡した。切断不可能なＡＣ１９４９を７８．３ｎｍｏｌ／ｋｇで用いて処置したマウス５匹中１匹は処置後４日目までに死亡した。各試験物について用量依存的体重減少が観察された（図７８）。観察されたデータから、ＭＴＤが、切断されていないＡＣ１７８３については０．８７ｎｍｏｌ／ｋｇ未満であり、切断されていないＡＣ１９４８については２．６ｎｍｏｌ／ｋｇから８．７ｎｍｏｌ／ｋｇの間であり、切断されたＡＣ１９４８については０．２６ｎｍｏｌ／ｋｇ未満であり、切断不可能なＡＣ１９４９については２６．１ｎｍｏｌ／ｋｇから７８．３ｎｍｏｌ／ｋｇの間であることが示される。
【０５８４】
結論：単回投与後の体重減少および死亡によって評価される抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ構築物の毒性から、切断不可能なＡＣ１９４９のＭＴＤが切断されたＡＣ１９４８の少なくとも１００倍であることによって観察される通り、２つのＸＴＥＮによりｉｎ  ｖｉｖｏ活性がマスキングされることが示される。切断されていないＡＣ１９４８のＭＴＤは切断されたＡＣ１９４８の少なくとも１０倍であり、これにより、ＡＣ１９４８がＴｇ（ＴＡＣＳＴＤ１）０２Ｌｅｉｊ／Ｊトランスジェニックマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでほんの一部しか切断されないことが示唆される。
【０５８５】
（実施例５８）
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗マウスＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）の決定
【０５８６】
ＰｒｏＴＩＡ構築物の毒性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、マウスＥｐＣＡＭタンパク質およびマウスＣＤ３タンパク質に結合する代理分子を使用して評価した。１つのＸＴＥＮおよび種々の率の放出セグメント配列を有する試験物を使用していくつかの試験を実施した。
【０５８７】
試験物を０．８７ｎｍｏｌ／ｋｇから７８．３ｎｍｏｌ／ｋｇの間のレベルで投薬し（群当たり３匹、４匹、または５匹のマウス）、マウスの健康および体重を投薬後１４日間にわたってモニタリングした。
【０５８８】
結果：表２１は、放出セグメント配列の率およびプロテアーゼ包含性に応じた体重減少および死亡によって観察された毒性の差異と共に結果の概要を示す。
【０５８９】
結論：単回投与後の体重減少および死亡によって評価される抗マウスＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ構築物の毒性から、切断不可能なＡＣ１８６７のＭＴＤが切断されたＡＣ１６９６の９０倍であることによって観察される通り、ＸＴＥＮによりｉｎ  ｖｉｖｏ活性がマスキングされることが示される。切断されていない、１つのＸＴＥＮＰｒｏＴＩＡ構築物のＭＴＤは、放出セグメントに応じて、切断されたＡＣ１６９６の１０〜９０倍であり、これにより、含まれるプロテアーゼおよび放出セグメントの率がｉｎ  ｖｉｖｏ活性に影響を及ぼすことが実証される。
【０５９０】
表２１：  ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗マウスＥｐＣＡＭ×抗マウスＣＤ３バリアントのＭＴＤのｉｎ  ｖｉｖｏにおける決定
【表２１】
2021507706.tif 000114
【０５９１】
（実施例５９）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の結合親和性
【０５９２】
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ構築物のヒトＥｐＣＡＭおよびヒトＣＤ３に対する結合親和性を、ｈｕＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂ（ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞系）およびジャーカット細胞を用い、フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０５９３】
ＥｐＣＡＭ発現細胞およびＣＤ３発現細胞への抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの結合の結合定数を、蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡとの競合結合によって測定した。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｃ２マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃Ａ２０３４７）と、システインを含有する、プロテアーゼで処理されたＰｒｏＴＩＡ突然変異体（ＭＭＰ−９で処理されたＡＣ１５３１）とのコンジュゲーションによって作製した。結合実験を、細胞１０，０００個に対して、結合緩衝剤（２％ＦＣＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ＨＢＳＳ）１００μＬの総体積で、４℃で１時間にわたって実施した。細胞を低温結合緩衝剤で１回洗浄し、次いで、リン酸塩緩衝食塩水中２％ホルムアルデヒド中に再懸濁させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターですぐに分析した。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＡＣ１５３１の結合の見かけのＫｄ値は、ｈＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂに対しては１ｎＭであり、ＣＤ３＋ジャーカット細胞に対しては６ｎＭであることが見いだされた。
【０５９４】
１０，０００個のｈＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂ細胞に対して、１．５ｎＭの蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＡＣ１５３１を用い、結合緩衝剤（２％ＦＣＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ＨＢＳＳ）１００μＬの総体積で、４℃で１時間にわたって競合結合実験を実施した。細胞を低温結合緩衝剤で１回洗浄し、次いで、リン酸塩緩衝食塩水中２％ホルムアルデヒド中に再懸濁させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターですぐに分析した。
【０５９５】
結合アッセイの結果を表２２に要約する。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＡＣ１５３１の、ｈＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂ細胞への、切断されたＰｒｏＴＩＡとの競合結合の結果、ｈＥｐ．２に対する見かけの結合定数は０．５〜０．８ｎＭであったが、一方、単一のＸＴＥＮを有する切断されていないＰｒｏＴＩＡは、より弱いｈＥｐ．２結合定数（６．１〜８．９ｎＭ）を示し、２つのＸＴＥＮを有する切断されていないＰｒｏＴＩＡは最も弱いｈＥｐ．２結合定数（１００ｎＭ）を示した。
【０５９６】
１０，０００個のジャーカット細胞に対して、１０ｎＭの蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＡＣ１５３１を用い、結合緩衝剤（２％ＦＣＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ＨＢＳＳ）１００μＬの総体積で、４℃で１時間にわたって競合結合実験を実施した。細胞を低温結合緩衝剤で１回洗浄し、次いで、リン酸塩緩衝食塩水中２％ホルムアルデヒド中に再懸濁させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターですぐに分析した。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＡＣ１５３１の、ジャーカット細胞への、切断されたＰｒｏＴＩＡとの競合結合の結果、ｈＣＤ３．３に対する見かけの結合定数は１２ｎＭであったが（表２２）、一方、単一のＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡはより弱いｈＣＤ３．３結合定数（１２８〜１５８ｎＭ）を示し、２つのＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡは最も弱いｈＣＤ３．３結合定数（４１２ｎＭ）を示した。蛍光標識した、プロテアーゼで処理されたＡＣ１５３１の、ジャーカット細胞への、切断されたＰｒｏＴＩＡとの競合結合の結果、ｈＣＤ３．９に対する見かけの結合定数は７５ｎＭであったが、一方、単一のＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡはより弱いｈＣＤ３．９結合定数（３７０ｎＭ）を示し、２つのＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡは最も弱いｈＣＤ３．９結合定数（９３０ｎＭ）を示した。
【０５９７】
結論：１つのＸＴＥＮ（ＡＣ１７０３およびＡＣ１９６８）による抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ構築物の遮蔽により、ｈＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂ細胞におけるヒトＥｐＣＡＭに対する結合親和性が、切断された構築物（切断されたＡＣ１６９５および切断されたＡＣ１９６８）と比較して約１０分の１に弱まった。２つのＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡでは、結合親和性が約１００分の１に低下した（ＡＣ１８８６およびＡＣ１９５２、それぞれ切断されたＡＣ１６９５および切断されたＡＣ１９６８と比較して）。１つのＸＴＥＮ（ＡＣ１７０３）による抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３．３  ＰｒｏＴＩＡ構築物の遮蔽により、ジャーカット細胞におけるヒトＣＤ３に対する結合親和性が切断されたＡＣ１６９５と比較して約１０分の１に弱まり、一方、１つのＸＴＥＮ（ＡＣ１９６８）による抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３．９  ＰｒｏＴＩＡ構築物の遮蔽により、ジャーカット細胞におけるヒトＣＤ３に対する結合親和性は切断されたＡＣ１９６８と比較して約５分の１に弱まった。２つのＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡでは、結合親和性がＣＤ３．３については約３０分の１低下し、ＣＤ３．９については１０分の１低下した（それぞれ、ＡＣ１８８６、切断されたＡＣ１６９５と比較して、およびＡＣ１９５２、切断されたＡＣ１９６８と比較して）。全体として、データから、１つのＸＴＥＮによりＰｒｏＴＩＡの抗ＥｐＣＡＭおよび抗ＣＤ３ドメインの両方が遮蔽され、２つのＸＴＥＮによりドメインの両方がさらに遮蔽されることが実証される。
【０５９８】
表２２：  ｈＥｐ−ＣＨＯ  ４−１２Ｂ細胞またはジャーカット細胞への競合結合による抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗ヒトＣＤ３バリアントの結合定数
【表２２】
2021507706.tif 000115
【０５９９】
（実施例６０）
確立された乳腺腫瘍モデルにおける、異なる放出部位組成物を有する抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）の抗腫瘍性。
【０６００】
確立された乳腺腫瘍モデルにおいて、ＢＴ−４７４腫瘍細胞を、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウスまたはＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスに、０日目にマトリゲルの存在下、皮下に独立に埋め込んだ。（ＮＯＧマウスまたはＮＳＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を欠き、マクロファージが機能障害性であり、樹状細胞が機能障害性であり、補体活性が低下しているマウスをもたらすＩＬ−２Ｒγ突然変異を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスである）。次いで、ＢＴ−４７４腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３に達したら、ヒトＰＢＭＣを静脈内に導入した。ビヒクル、異なる放出部位組成を有する、プロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１７１４、ＡＣ１６８４およびＡＣ１６８６）ならびに陽性対照として抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１５０３）を用いた処置を、１週間当たり３回、４週間にわたる静脈内投薬として開始した。コホート１はビヒクルによる処置群であった。コホート２および３は、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇで投薬したＡＣ１７１４による処置群であった。コホート４および５は、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇで投薬したＡＣ１６８４による処置群であった。コホート６は、０．１ｍｇ／ｋｇで投薬したＡＣ１６８６による処置群であり、コホート７は０．５ｍｇ／ｋｇで投薬した抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３陽性対照ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１５０３）であった。
【０６０１】
腫瘍を、計画された４５日間にわたって週２回、カリパスを用いて２つの直交する寸法で測定し、（幅２×長さ）／２の式を適用することによって腫瘍体積を算出した。体重、全身外観ならびに発作、振戦、嗜眠、過敏性、立毛、努力呼吸／呼吸促迫、呈色および腫瘍の潰瘍形成および死亡などの臨床所見も処置に関連する毒性の評価基準として密接にモニタリングした。パーセント腫瘍成長阻害指数（％ＴＧＩ）を処置群それぞれについて、式：（（群２ビヒクル対照の平均腫瘍体積−ＰｒｏＴＩＡによる処置の平均腫瘍体積）／群２ビヒクル対照の平均腫瘍体積）×１００を適用することによって算出した。％ＴＧＩが≧６０％である処置結果を治療的に活性であるとみなした。
【０６０２】
結果：腫瘍体積データが図７９Ａおよび７９Ｂに示されている。４５日目に、ビヒクルで処置したコホート１のマウスでは腫瘍増悪は阻害されず、腫瘍負荷が４１０±２１５ｍｍ３であり、これにより、ヒトエフェクター細胞単独ではそれ自体で抗腫瘍効果を引き出すことができないことが実証される。予測通り、ヒトエフェクター細胞の存在下で抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３陽性対照ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで用いた処置（ＡＣ１５０３、コホート７）では、明白な抗腫瘍退縮が示され、％ＴＧＩは９５％であった。ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＣ１７１４抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇで用いた処置（それぞれコホート２および３）では、腫瘍成長が用量依存的に阻害された。０．５ｍｇ／ｋｇでは、ＡＣ１７１４は％ＴＧＩが９４％で治療的に活性であり、０．１ｍｇ／ｋｇでは、％ＴＧＩが５０％で治療的に不活性であった。ＡＣ１７１４と比較して異なる放出セグメントを有するＡＣ１６８４は、０．１ｍｇ／ｋｇ（％ＴＧＩが３４％）ならびに０．５ｍｇ／ｋｇ（％ＴＧＩが４１％）で治療的に不活性であった。０．１ｍｇ／ｋｇで投薬されたＡＣ１６８６も治療的に活性であることが認められなかった（％ＴＧＩが４１％）。
【０６０３】
結論：データから、０．５ｍｇ／ｋｇで、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＴ−４７４腫瘍環境において十分なＡＣ１７１４抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡがプロテアーゼによって有効に切断されて活性がより大きい、ＸＴＥＮ付加されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分構造になって、観察された頑強な抗腫瘍応答がもたらされたことが示唆される。ＡＣ１６８４およびＡＣ１６８６はどちらも、ＢＴ−４７４において活性な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分構造をもたらしてあらゆる有意な有効性を引き出すことにおいてＡＣ１７１４と比較してはるかに有効性が低かった。
（実施例６１）
抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏカスパーゼ３／７アッセイ
【０６０４】
プロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９９１）と比較した、プロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物（例えば、ＡＣ１９５５およびＡＣ１９５８）の向け直された細胞傷害性を、アポトーシス細胞のカスパーゼ３／７活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞に基づくアッセイにおいて評価した。上記の実施例に記載のカスパーゼ細胞傷害性アッセイと同様に、ＰＢＭＣをＥＧＦＲ陽性腫瘍標的細胞とエフェクター細胞１０対標的細胞１の比で混合し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間または４８時間インキュベートした。全てのＰｒｏＴＩＡバリアントを、１２点の５倍段階希釈の用量濃度を使用して試験した。アッセイしたヒト腫瘍標的細胞系は、ＦａＤｕ（頭頸部の扁平上皮癌、ＳＣＣＨＮ）、ＳＣＣ−９（ＳＣＣＨＮ）、ＨＣＴ−１１６（ＫＲＡＳ突然変異を有する結腸直腸腫瘍）、ＮＣＩ−Ｈ１５７３（ＫＲＡＳ突然変異を有する結腸直腸腫瘍）、ＨＴ−２９（ＢＲＡＦ突然変異を有する結腸直腸腫瘍）およびＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異）であった。細胞系は、野生型ＥＧＦＲおよびＴ７９０Ｍ、ＫＲＡＦおよびＢＲＡＦ突然変異を有する結腸直腸腫瘍およびＳＣＣＨＮ腫瘍を表すように選択した。
【０６０５】
細胞溶解したら、培養上清中に放出されたカスパーゼ３／７を、「グロー型」発光シグナルを生じさせるカスパーゼ３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  ｃａｔ＃Ｇ８０９１）による発光性カスパーゼ３／７基質切断の量によって測定した。発光の量はカスパーゼ活性の量に比例する。
【０６０６】
結果：アッセイの結果が図８０ＡおよびＢおよび表２３に示されている。ＥＧＦＲ  ＫＲＡＳ突然変異体ＨＣＴ−１１６細胞系において評価した場合、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡバリアントＡＣ１９５５のＥＣ５０活性は３，４０８ｐＭであり、ＡＣ１９５８のＥＣ５０活性は７７８ｐＭであった。切断不可能なＰｒｏＴＩＡであるＡＣ１９９１のＥＣ５０活性は＞１００，０００ｐＭであり、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡのＥＣ５０活性は０．８ｐＭであった。
【０６０７】
ＥＧＦＲ  ＢＲＡＦ突然変異体ＨＴ−２９細胞系において評価した場合、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡバリアントＡＣ１９５５のＥＣ５０活性は１０，９３０ｐＭであり、ＡＣ１９５８のＥＣ５０活性は１２，１００ｐＭであった。切断不可能なＰｒｏＴＩＡであるＡＣ１９９１のＥＣ５０活性は＞１００，０００ｐＭであり、プロテアーゼで切断されたＰｒｏＴＩＡのＥＣ５０活性は０．８ｐＭであった。
【０６０８】
２種の、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡバリアント（例えば、ＡＣ１９５５およびＡＣ１９５８）は、ＨＣＴ−１１６における活性には４倍の差異があり、ＨＴ−２９においては活性が同様であった。しかし、どちらのバリアントも、試験した２種のＥＧＦＲ突然変異細胞株における活性は切断された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの１，０００分の１未満〜１５，０００分の１であった。予測通り、切断不可能なＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１９９１）の活性は、評価したＰｏＴＩＡバージョンの中で最小の活性であり、ＥＣ５０は１００，０００ｐＭよりも大きかった。
【０６０９】
結論：結果から、抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡが、ＥＧＦＲ  ＫＲＡＳ突然変異細胞系およびＥＧＦＲ  ＢＲＡＦ突然変異細胞系に対して細胞傷害性に活性であることが実証される。２つのＸＴＥＮを有する切断されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９５５）により、細胞傷害活性の強力なマスキングがもたらされ、細胞傷害性は切断された形態の４０００分の１〜１４，０００分の１であった。
表２３：  ＨＴ−２９ヒト細胞株およびＨＣＴ−１１６ヒト細胞株におけるプロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３バリアント、プロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３バリアントおよびプロテアーゼで切断不可能な抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３バリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
【表２３】
2021507706.tif 000116
【０６１０】
（実施例６２）
抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏカスパーゼ３／７アッセイ
【０６１１】
プロテアーゼで処理された抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで切断不可能な抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ２０３９）と比較した、プロテアーゼで処理されていない抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ組成物（例えば、ＡＣ２０３８およびＡＣ２０４０）の向け直された細胞傷害性を、アポトーシス細胞のカスパーゼ３／７活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞に基づくアッセイにおいて評価した。上記のカスパーゼ細胞傷害性アッセイと同様に、ＰＢＭＣをＨｅｒ２陽性腫瘍標的細胞とエフェクター細胞５対標的細胞１の比で混合し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。上記のカスパーゼアッセイと同様に、全てのＰｒｏＴＩＡバリアントを１２点の５倍段階希釈の用量濃度を使用して試験した。アッセイに使用したヒトＨｅｒ２発現乳腺腫瘍細胞系は、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３、ＪＩＭＴ−１、Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ−７、ＭＢＡ−ＭＢ−２３１、ヒトＨｅｒ２発現卵巣腫瘍細胞系ＳＫ−ＯＶ−３、ヒトＨｅｒ２発現胃腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＮＫ７、ＳＮＵ−２１６、ＮＵＧＣ−４、およびＲＴ−１１２などのヒトＨｅｒ２発現膀胱細胞系であった。細胞系は、異なるがん型だけでなく、細胞当たり異なるレベルのＨｅｒ２発現も表すように選択し、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＫ−ＢＲ−３、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＭＮＫ７は高レベルのＨｅｒ２を発現するものであり、ＪＩＭＴ−１、ＳＮＵ−２１６、ＮＵＧＣ−４およびＲＴ−１１２は中間レベルのＨｅｒ２を発現するものであり、Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は低〜ゼロレベルのＨｅｒ２を発現するものであった。
【０６１２】
細胞溶解したら、培養上清中に放出されたカスパーゼ３／７を、「グロー型」発光シグナルを生じさせるカスパーゼ３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  ｃａｔ＃Ｇ８０９１）による発光性カスパーゼ３／７基質切断の量によって測定した。発光の量はカスパーゼ活性の量に比例する。
【０６１３】
結果：アッセイの結果が図８１Ａ〜Ｄおよび表２４に示されている。Ｈｅｒ２高ＢＴ−４７４細胞系において評価した場合、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡバリアントＡＣ２０３８およびＡＣ２０４０のＥＣ５０活性は、それぞれ６６，０２０ｐＭおよび７，７２９ｐＭであった。比較すると、プロテアーゼで処理されたＡＣ２０３８のＥＣ５０活性は、１．５ｐＭであり、切断不可能なＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ２０３９）のＥＣ５０活性は＞１００，０００ｐＭであった。
【０６１４】
Ｈｅｒ２高ＳＫ−ＯＶ−３種の細胞系において評価した場合、プロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡバリアントＡＣ２０３８およびＡＣ２０４０のＥＣ５０活性はそれぞれ１４，１４０ｐＭおよび６，１２７ｐＭであった。比較すると、プロテアーゼで処理されたＡＣ２０３８のＥＣ５０活性は１ｐＭであり、切断不可能なＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ２０３９）のＥＣ５０活性は＞１００，０００ｐＭであった。
【０６１５】
Ｈｅｒ２中間ＪＩＭＴ−１細胞系において評価した場合、プロテアーゼで処理されていないＡＣ２０３８およびＡＣ２０４０ならびに切断不可能なＰｒｏＴＩＡであるＡＣ２０３９のＥＣ５０活性は＞１００，０００ｐＭであったのと比較して、プロテアーゼで処理されたＡＣ２０３８のＥＣ５０活性は５２ｐＭであった。
【０６１６】
Ｈｅｒ２低ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系において評価した場合、プロテアーゼで処理されていないＡＣ２０３８およびＡＣ２０４０ならびに切断不可能なＰｒｏＴＩＡであるＡＣ２０３９のＥＣ５０活性は＞１００，０００ｐＭであったのと比較して、プロテアーゼで処理されたＡＣ２０３８のＥＣ５０活性は１２４ｐＭであった。
【０６１７】
２種の、プロテアーゼで処理されていない抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡバリアントであるＡＣ２０３８とＡＣ２０４０の比較をＳＫ−ＯＶ−３およびＢＴ−４７４などのＨｅｒ２高発現細胞系においてアッセイした。２種のバリアント間のＥＣ５０活性の差異は、たったの２倍〜９倍であった。著しいことに、試験したＢＴ−４７４細胞系およびＳＫ−ＯＶ−３細胞系において、どちらのＰｒｏＴＩＡバリアントの活性も、切断された抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの活性の４４０分の１〜１４，０００分の１であった。予測通り、切断不可能なＰｒｏＴＩＡであるＡＣ２０３９の活性は、評価したＰｏＴＩＡバージョンの中で最小の活性であり、ＥＣ５０は１００，０００ｐＭよりも大きかった。
【０６１８】
結論：結果から、プロテアーゼで処理された抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは高度に活性であり、Ｈｅｒ２高発現細胞系よびＨｅｒ２中間発現細胞系における頑強な大きさの死滅を伴ったが、死滅の活性および大きさはＨｅｒ２低発現細胞系では不十分であったことが実証される。上でプロファイルされたプロテアーゼで処理されていないＰｒｏＴＩＡの活性の傾向と一致して、２つのＸＴＥＮを有する抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ２０３８）により、細胞傷害活性の強力なマスキングがもたらされ、ＥＣ５０活性の活性は少なくとも１４，０００分の１よりも大きく低下した。
表２４：  ＢＴ−４７４ヒト細胞株、ＳＫ−ＯＶ−３ヒト細胞株、ＪＩＭＴ−１ヒト細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト細胞株におけるプロテアーゼで処理された抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３バリアント、プロテアーゼで処理されていない抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３バリアントおよびプロテアーゼで切断不可能な抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３バリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
【表２４】
2021507706.tif 000117
【０６１９】
（実施例６３）
早期処置ＨＴ−２９  ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍性
【０６２０】
Ｔ細胞およびＢ細胞の欠乏ならびにナチュラルキラー細胞の欠陥を特徴とする免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ有効性実験を実施した。マウスを無菌標準化環境条件下で維持し、ＵＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ））ガイドラインに従って実験を実施した。プロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９５５）の有効性を、ＥＧＦＲ  ＢＲＡＦ突然変異体ヒトＨＴ−２９腺癌異種移植モデルを使用して評価した。簡単に述べると、０日目に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス６匹に対して、マウス当たり３×１０６個のＨＴ−２９細胞を右側腹部の皮下に埋め込んだ（コホート１）。同じ日に、それぞれ群当たり６匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからなるコホート２〜７に対し、マウス当たり６×１０６個のヒトＰＢＭＣと３×１０６個のＨＴ−２９細胞の混合物を右側腹部に皮下注射した。ＨＴ−２９またはＨＴ−２９／ＰＢＭＣ混合物を接種した４時間後に、処置を開始した。コホート１および２には、ビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を静脈内注射し、コホート３および４にはプロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡをそれぞれ０．０５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇで注射し、コホート５および６にはプロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．１４３ｍｇ／ｋｇおよび１．４３ｍｇ／ｋｇで注射し、コホート７にはセツキシマブを５０ｍｇ／ｋｇで注射した。コホート１〜６は、１日目から７日目まで毎日投与された、７回の追加的な用量をさらに受けた（全部で８用量）。コホート７には、セツキシマブを４週間にわたって週に２回、合計で８用量を投薬した。
【０６２１】
腫瘍を、計画された３３日間にわたって週２回、カリパスを用いて２つの直交する寸法で測定し、（幅２×長さ）／２の式を適用することによって腫瘍体積を算出した。体重、全身外観ならびに発作、振戦、嗜眠、過敏性、立毛、努力呼吸／呼吸促迫、呈色および腫瘍の潰瘍形成および死亡などの臨床所見も処置に関連する毒性の評価基準として密接にモニタリングした。パーセント腫瘍成長阻害指数（％ＴＧＩ）を処置群それぞれについて、式：（（群２ビヒクル対照の平均腫瘍体積−ＰｒｏＴＩＡによる処置の平均腫瘍体積）／群２ビヒクル対照の平均腫瘍体積）×１００を適用することによって算出した。％ＴＧＩが≧６０％である処置結果を治療的に活性であるとみなす。
【０６２２】
結果：結果が図８２ＡおよびＢに示されている。３３日目に、ビヒクルで処置したコホート１の腫瘍細胞を有するマウスの腫瘍負荷はわずか２５０±１１３ｍｍ３であった。ヒトエフェクター細胞の存在下でビヒクルを用いて処置したコホート２のマウスでは、腫瘍増悪は阻害されず、腫瘍負荷は２３８±２２８ｍｍ３であり、これにより、ヒトエフェクター細胞単独ではそれ自体で抗腫瘍効果を引き出すことができないことが実証される。ヒトエフェクター細胞の存在下で、プロテアーゼで処理された抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．０５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇで用いた処置（それぞれコホート３および４）では、明白な抗腫瘍退縮が示され、どちらも％ＴＧＩは９９％であった。重要なことに、ヒトエフェクター細胞の存在下で抗ＥＧＲＦ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．１４３ｍｇ／ｋｇおよび１．４３ｍｇ／ｋｇで用いた処置（それぞれコホート５および６）によっても腫瘍成長が用量依存的に阻害され、％ＴＧＩは０．１４３ｍｇ／ｋｇ用量群については７０％であり、１．４３ｍｇ／ｋｇコホートでは９６％であった。データから、０．１４３ｍｇ／ｋｇおよび１．４３ｍｇ／ｋｇで、十分な量の抗ＥＧＲＦ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡがｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍環境においてプロテアーゼによって有効に切断されて活性がより大きい、ＸＴＥＮ付加されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３部分構造になって、観察された有効性がもたらされたことが示唆される。重要なことに、５０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブで処置したコホート７では、腫瘍退縮が誘導されず、％ＴＧＩは−２０％であった。
【０６２３】
結論：結果から、プロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９５５）がＥＧＦＲ  ＢＲＡＦ突然変異体ＨＴ−２９腫瘍環境において有効に切断され、腫瘍増悪を阻害するために効果的であることが示唆される。さらに、プロテアーゼで処理されていない抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡは、抗腫瘍活性がセツキシマブよりも優れている。注目すべきことに、全てのＰｒｏＴＩＡによる処置群およびビヒクル対照において有意な体重減少は観察されず、これにより、全ての処置の忍容性が良好であったことが示される。
【０６２４】
（実施例６４）
確立された乳腺腫瘍モデルにおける、１つまたは２つのＸＴＥＮを有する抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼにより誘発される免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）の抗腫瘍性
【０６２５】
確立された乳腺腫瘍モデルにおいて、ＢＴ−４７４腫瘍細胞を、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウスまたはＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスに、０日目にマトリゲルの存在下、皮下に独立に埋め込んだ。（ＮＯＧマウスまたはＮＳＧマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を欠き、マクロファージが機能障害性であり、樹状細胞が機能障害性であり、補体活性が低下しているマウスをもたらすＩＬ−２Ｒγ突然変異を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスである）。次いで、ＢＴ−４７４腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３に達したら、ヒトＰＢＭＣを静脈内に導入した。ビヒクル、１つのＸＴＥＮポリマーを有するプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９６８）および２つのＸＴＥＮポリマーを有する抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９５２）を用いた処置を、静脈内に、４週間にわたって１週間当たり３用量として開始した。コホート１はビヒクルによる処置群であり、コホート２はＡＣ１９６８、０．５ｍｇ／ｋｇによる処置群であり、コホート３はＡＣ１９５２、０．５ｍｇ／ｋｇによる処置群であった。
【０６２６】
腫瘍を、計画された４５日間にわたって週２回、カリパスを用いて２つの直交する寸法で測定し、（幅２×長さ）／２の式を適用することによって腫瘍体積を算出した。体重、全身外観ならびに発作、振戦、嗜眠、過敏性、立毛、努力呼吸／呼吸促迫、呈色および腫瘍の潰瘍形成および死亡などの臨床所見も処置に関連する毒性の評価基準として密接にモニタリングした。パーセント腫瘍成長阻害指数（％ＴＧＩ）を処置群それぞれについて、式：（（群２ビヒクル対照の平均腫瘍体積−ＰｒｏＴＩＡによる処置の平均腫瘍体積）／群２ビヒクル対照の平均腫瘍体積）×１００を適用することによって算出した。％ＴＧＩが≧６０％である処置群を治療的に活性であるとみなす。
【０６２７】
結果：結果が図８３ＡおよびＢに示されている。暫定２７日目に、ビヒクルで処置したコホート１のマウスでは、腫瘍増悪が阻害されず、腫瘍負荷は２１９±３０ｍｍ３であり、これにより、ヒトエフェクター細胞単独ではそれ自体で抗腫瘍効果を引き出すことができないことが実証される。予測通り、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＣ１９６８抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで用いた処置（コホート２）では、明白な抗腫瘍退縮が示され、％ＴＧＩは６８％であった。重要なことに、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＣ１９５２抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡを０．５ｍｇ／ｋｇで用いた処置（コホート３）によっても、頑強な抗腫瘍応答が引き出され、７６％の％ＴＧＩがもたらされた。
【０６２８】
結論：暫定データから、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＴ−４７４腫瘍環境において、０．５ｍｇ／ｋｇで、２つのＸＴＥＮを有するプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９５２）と、１つのＸＴＥＮポリマーを有するプロテアーゼで処理されていない抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９６８）が同様に効果的であることが示唆される。注目すべきことに、全てのＰｒｏＴＩＡによる処置群およびビヒクル対照において有意な体重減少は観察されず、これにより、全ての処置の忍容性が良好であったことが示される。
【０６２９】
（実施例６５）
非ヒト霊長類における抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡの単回用量および複数回用量による薬物動態の決定
【０６３０】
抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３  ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１９５５）の単回静脈内投与および多数回静脈内投与後の薬物動態学（ＰＫ）および一般忍容性を、ナイーブな健康非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（例えば、カニクイザル）において評価する。簡単に述べると、雌サル１匹および雄サル１匹に、橈側皮静脈を介した静脈内注入を行った。両方の動物を２週間にわたってモニタリングする。有害事象が観察されなければ、動物を、３週間にわたって３日毎に１回の用量として開始される複数回用量レジメンに供する（試験中全部で９用量）。試験全体を通して特定の時点で、薬物動態学、サイトカイン、血液学および血清化学のアッセイのために血液を採取する。
【０６３１】
動物のモニタリングは、試験の持続時間中１日１回または１日２回の体重、摂食量、体温およびケージ横での観察を含む。動物を、全体的な健康および外観；疼痛および窮迫の徴候；発熱、悪寒、悪心、嘔吐および皮膚の完全性についてモニタリングする。投薬日に、動物を、ＰｒｏＴＩＡ投与の前後に注射副反応について確認する。
【０６３２】
血漿中に存在するＡＣ１９５５の量を、電気化学発光ストレプトアビジンプレート上に検出用としてスルホタグが付された抗ＸＴＥＮ抗体を用いて捕捉されたＥＧＦＲ−ビオチンを使用したサンドイッチＥＬＩＳＡで定量化する。Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、曲線下面積、半減期および曝露プロファイルを含めた薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを使用して解析する。
【０６３３】
サイトカインパネルは、Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームを使用したＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦαの測定値を含む。
【０６３４】
血液学的パネルは、白血球、赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン体積、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球分布幅、血小板、平均血小板体積、％好中球、％リンパ球、％単球、％好酸球および％好塩基球の測定値を含む。
【０６３５】
血清生化学的パネルは、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総タンパク質、アルブミン、アルカリホスファターゼ、グロブリン、アルブミン／グロブリン比、γ−グルタミントランスフェラーゼ、グルコース、尿素、クレアチニン、カルシウム、総コレステロール、トリグリセリド、総ビリルビン、ナトリウム、カリウム、塩素およびクレアチンキナーゼの測定値を含む。
【０６３６】
ＡＣ１９５５により、１．７μｇ／ｋｇの用量では、いかなる有害事象も引き出されないことが予想される。サイトカイン症候群、悪寒、発熱、悪心、嘔吐および皮疹は予測されない。血液学的および臨床パネルは正常範囲内に入るはずである。ＸＴＥＮ付加されたタンパク質の歴史的データに基づいて、ＡＣ１９５５のＴ１／２は３〜５日であることが予測される。
【０６３７】
（実施例６６）
非ヒト霊長類における抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３の用量範囲に関する所見
【０６３８】
ＮＨＰにおけるＡＣ１９５５の最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）を、健康なナイーブカニクイザルにおいて、コホート当たり雌サル１匹および雄サル１匹を用いて行う。コホート１には、ＡＣ１９５５を２５．５μｇ／ｋｇで橈側皮静脈を介して静脈内注入する。両方のサルを１週間にわたってモニタリングする。発熱、悪寒、皮疹、悪心、嘔吐、異常な血液学的性質および血清生化学的性質などの有害事象が観察されなければ、動物を、３週間にわたって１週間当たり２回用量（コホート当たり全部で７用量）として開始される、複数回用量レジメンに供する。特定の時点で、薬物動態学、サイトカイン、免疫構成、血液学的および血清生化学的分析のために採血する。
【０６３９】
コホート１において第１の用量の後１週間で有害事象が観察されなければ、コホート２におけるＡＣ１９５５の用量を３倍に漸増させて７６．５ｍｇ／ｋｇにする。コホート２の投薬レジメン、モニタリングおよび血液採取は、コホート１のものと同様にする。コホート２における第１の用量の後１週間で有害事象が観察されなければ、コホート３におけるＡＣ１９５５の用量をさらに３倍に漸増させて２３０μｇ／ｋｇにする。有害事象が観察されるまでＡＣ１９５５の３倍の用量漸増を進める。
【０６４０】
動物のモニタリングは、試験の持続時間中１日１回または１日２回の体重、摂食量、体温およびケージ横での観察を含む。動物を、全体的な健康および外観；疼痛および窮迫の徴候；発熱、悪寒、悪心、嘔吐および皮膚の完全性についてモニタリングする。投薬日に、動物を、ＰｒｏＴＩＡ投与の前後の注射部位の反応についても確認する。
【０６４１】
血漿中に存在するＡＣ１９５５の量を、電気化学発光ストレプトアビジンプレート上に検出用としてスルホタグが付された抗ＸＴＥＮ抗体を用いて捕捉されたＥＧＦＲ−ビオチンを使用したサンドイッチＥＬＩＳＡで定量化する。Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、曲線下面積、半減期および曝露プロファイルを含めた薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを使用して解析する。
【０６４２】
サイトカインパネルは、Ｂｅｃｋｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙを使用したＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαの測定値を含む。
【０６４３】
免疫構成は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ６９、Ｆｏｘｐ３およびＰＤ−１の測定値を含む。
【０６４４】
血液学的パネルは、白血球、赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン体積、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球分布幅、血小板、平均血小板体積、％好中球、％リンパ球、％単球、％好酸球および％好塩基球の測定値を含む。
【０６４５】
血清生化学的パネルは、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総タンパク質、アルブミン、アルカリホスファターゼ、グロブリン、アルブミン／グロブリン比、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、グルコース、尿素、クレアチニン、カルシウム、総コレステロール、トリグリセリド、総ビリルビン、ナトリウム、カリウム、塩素およびクレアチンキナーゼの測定値を含む。
【０６４６】
ＡＣ１９５５は、いくらかの有害事象が引き出される用量レベルのうちの１つで最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）に的中することが予想される。予測される有害事象は、悪寒、発熱、悪心、嘔吐、皮疹、および異常な血液学的性質および化学的性質の読み取り値、サイトカインのスパイクのうちの１つまたはそれらの組合せであり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４−１】
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【図７４−２】
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【図７４−３】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１−１】
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【図８１−２】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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