(57)【要約】  本開示は、核酸サンプルを配列決定するためのチップ、システム、及び方法を提供する。タグ付きヌクレオチドを、膜中にナノポアを含む反応チャンバ中に供給する。このタグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み得、このタグは、ナノポアを用いて検出可能である。次に、このタグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込み得る。ナノポアを用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの組込み時に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出し得る。タグがヌクレオチドから放出されている場合には、このタグを、ナノポアを用いて検出し得る。【選択図】図４８
2021506292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）：
【化１】
2021506292.tif 000030
の改変ヌクレオチドポリマーを含むヒンジ付きゲート化合物であって、
ここで、式中、
Ｒ１は第１のレポーターユニットであり、１〜１２個のモノマーユニットのオリゴマーを含むものである；
Ｂは、１ｍｅｒ〜８ｍｅｒの長さの主鎖オリゴヌクレオチド、リンカーモノマーユニット、及び前記主鎖オリゴヌクレオチドユニットに相補的な３ｍｅｒ〜８ｍｅｒの長さの分枝オリゴヌクレオチドを含む嵩高構造であり、ここで、前記分枝オリゴヌクレオチドは前記リンカーモノマーユニットに共有結合で付着しており、前記主鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得るものである；
Ｒ２は第２のレポーターユニットであり、１〜１２個のモノマーユニットのオリゴマーを含むものである；並びに
Ｎは、１〜６個の炭素スペーサー又は核酸を含むスペーサーユニットである；
前記ヒンジ付きゲート化合物。
【請求項２】
前記第２のレポーターユニットＲ２は、前記第１のレポーターユニットＲ１に続いてＢがナノポアに引き込まれる場合でのＲ１の滞留時間と比べて、Ｒ２に続いてＢがナノポアに引き込まれる場合に少なくとも１００倍長い滞留時間を有する、請求項１に記載のヒンジ付きゲート化合物。
【請求項３】
前記第１のレポーターユニットＲ１は、前記第２のレポーターユニットＲ２に続いてＢがナノポアに引き込まれる場合でのＲ２の滞留時間と比べて、Ｒ１に続いてＢがナノポアに引き込まれる場合に少なくとも１００倍長い滞留時間を有する、請求項１に記載のヒンジ付きゲート化合物。
【請求項４】
ａ．前記第１のレポーターユニットＲ１はオリゴマーからなり、前記モノマーユニットは、ｄＴ−カルボキシル、ＳｐＣ２、ＳｐＣ３、及びｄＳｐから選択され；並びに
ｂ．前記第２のレポーターユニットＲ２はオリゴマーからなり、前記モノマーユニットは、ｄＴｍｐ、ＳｐＣ１２、ＳｐＣ６、Ｓｐ１８、及びピロリジン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｉｎｅ）から選択される；
請求項１に記載のヒンジ付きゲート化合物。
【請求項５】
ａ．前記第２のレポーターユニットＲ２はオリゴマーからなり、前記モノマーユニットは、ｄＴ−カルボキシル、ＳｐＣ２、ＳｐＣ３、及びｄＳｐから選択され；
ｂ．前記第１のレポーターユニットＲ１はオリゴマーからなり、前記モノマーユニットは、ｄＴｍｐ、ＳｐＣ１２、ＳｐＣ６、Ｓｐ１８、及びピロリジン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｉｎｅ）から選択される；
請求項１に記載のヒンジ付きゲート化合物。
【請求項６】
前記改変ヌクレオチドポリマーは、式（Ｉａ）
【化２】
2021506292.tif 000031
又は式（Ｉｂ）
【化３】
2021506292.tif 000032
の構造を含み、
式中、
第１のレポーターユニットＲ１は、改変ヌクレオチドモノマーユニットの９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドαであり、
第２のレポーターユニットＲ２は、改変ヌクレオチドモノマーユニットの９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドβであり、続いてＢがナノポアに引き込まれる場合のＲ２の滞留時間は、続いてＢがナノポアに引き込まれる場合のＲ１の滞留時間と比べて少なくとも１００倍長い、
請求項１に記載のヒンジ付きゲート化合物。
【請求項７】
（ａ）一本鎖核酸とハイブリダイズし得るハイブリダイゼーション部分；
（ｂ）２個の端部を有するループ構造であって、各端部は前記ハイブリダイゼーション部分に付着しており、ここで、前記ループ構造は請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒンジ付きゲート化合物を含む、前記ループ構造；及び
（ｃ）前記ループ構造の前記端部の間の前記ハイブリダイゼーション部分に位置する切断可能な基；
を含む核酸プローブ。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーション部分は少なくとも２個のヌクレオチドの核酸配列を含み、前記ループ構造の第１の端部は第１のヌクレオチドに付着しており、前記ループ構造の第２の端部は第２のヌクレオチドに付着している、請求項７に記載の核酸プローブ。
【請求項９】
前記切断可能な基は、前記２個のヌクレオチドの間に位置している、請求項８に記載の核酸プローブ。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーション部分は少なくとも３個のヌクレオチドの核酸配列を含み、前記ループ構造の第１の端部は第１のヌクレオチドに付着しており、前記ループ構造の第２の端部は第３のヌクレオチドに付着している、請求項８に記載の核酸プローブ。
【請求項１１】
前記ハイブリダイゼーション部分は少なくとも４個のヌクレオチドの核酸配列を含み、前記ループ構造の第１の端部は第１のヌクレオチドに付着しており、前記ループ構造の第２の端部は第４のヌクレオチドに付着している、請求項８に記載の核酸プローブ。
【請求項１２】
検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いてサンプル中の標的核酸分子を配列決定する方法であって、
（ａ）一本鎖標的核酸分子と、請求項７に記載の複数個の核酸プローブとを接触させるステップ；
（ｂ）酵素を使用して、前記複数個のハイブリダイズした核酸プローブを重合させるステップ；
（ｃ）前記切断可能な基を切断して、それにより、展開可能なループ構造を展開させて、展開糸を得るステップ；
（ｄ）前記展開糸を前記ナノポアに通すステップであって、ここで、前記ゲートは前記展開糸が逆方向で前記ナノポアを通ることを防止するものである、前記ステップ；及び
（ｅ）前記ナノポアを用いて、前記展開糸中の前記ループ構造を検出するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて標的分子を検出する及び／又は定量する方法であって、
（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中において、前記標的分子と、タグ付きヌクレオチドを含む核酸バーコード分子とを接触させるステップであって、ここで、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドは、ヌクレオチド又はジヌクレオチドに結合しているタグを含み、前記タグは一方向性のヒンジ付きゲートを含む展開可能なループ構造を含み、前記タグは前記ナノポアを用いて検出可能である、前記ステップ；
（ｂ）前記展開可能なループ構造を展開させるステップ；及び
（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記タグが前記ナノポアを通って引っ張られた場合に、前記個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１４】
検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて標的核酸分子を検出する及び／又は定量する方法であって、
（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを含む核酸配列を供給するステップであって、ここで、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドは、ヌクレオチド又はジヌクレオチドに結合しているタグを含み、前記タグは一方向性のヒンジ付きゲートを含む展開可能なループ構造を含み、前記タグは前記ナノポアを用いて検出可能である、前記ステップ；
（ｂ）前記展開可能なループ構造を展開させるステップ；及び
（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記タグが前記ナノポアを通って引っ張られた場合に、前記個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１５】
検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて標的分子を検出する及び／又は定量する方法であって、
（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中において、前記標的分子と、タグ付きヌクレオチドを含む核酸バーコード分子とを接触させるステップであって、ここで、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドは、ヌクレオチド又はジヌクレオチドに結合しているタグを含み、前記タグは一方向性のヒンジ付きゲートを含む展開可能なループ構造を含み、前記タブは前記ナノポアを用いて検出可能である、前記ステップ；
（ｂ）前記展開可能なループ構造を展開させるステップ；及び
（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記タグが前記ナノポアを通って引っ張られた場合に、前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプル中の核酸分子を配列決定する方法であって、
（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、ここで、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドは、ヌクレオチド又はジヌクレオチドに結合しているタグを含み、前記タグは一方向性のヒンジ付きゲートを含み、前記タグは前記ナノポアを用いて検出可能である、前記ステップ；
（ｂ）酵素を用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドを、前記核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップ；及び
（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記タグが前記ナノポアを通って引っ張られた場合に、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、前記個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップ；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]核酸配列決定とは、核酸サンプルの配列情報を提供するために使用され得るプロセスである。そのような配列情報は、対象の診断及び／又は処置に有用であり得る。例えば、対象の核酸配列を使用して、遺伝性疾患を同定し得、遺伝性疾患を診断し得、且つ遺伝性疾患の処置を潜在的に開発し得る。別の例として、病原体に関する研究は、伝染病の処置につながる場合がある。
【０００２】
[0002]核酸を配列決定するために使用され得る方法が利用可能である。しかしながら、そのような方法は高価であり、且つ対象を診断するために及び／又は処置するために必要な可能性がある期間内に及び正確さで配列情報を提供しない場合がある。
【発明の概要】
【０００３】
[0003]一本鎖核酸分子をナノポアに通す核酸配列決定の方法は、診断目的及び／又は処置目的のデータを提供するには不十分であり得るか又はその他の点で不適切であり得る感度を有する場合がある。核酸分子を構成する核酸塩基（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及び／又はウラシル（Ｕ））は、互いに十分に区別されるシグナルを生じない場合がある。具体的には、プリン（即ちＡ及びＧ）はサイズ、形状、及び電荷が互いに類似しており、いくつかの場合には十分には区別されないシグナルを生じる。同様に、ピリミジン（即ちＣ、Ｔ、及びＵ）はサイズ、形状、及び電荷が互いに類似しており、いくつかの場合には十分には区別されないシグナルを生じる。本明細書で認識されていることは、核酸分子の同定及び核酸の配列決定のための改善された方法が必要とされているということである。
【０００４】
[0004]いくつかの実施形態では、ヌクレオチド組込み事象（例えば、テンプレート鎖に相補的である核酸鎖へのヌクレオチドの組込み）は、ナノポアにタグを提示し、及び／又はナノポアにより検出されるヌクレオチドからタグを放出する。各タイプのヌクレオチド（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ）に対して固有のタグが放出される及び／又は提示されることから、組み込まれた塩基を同定し得る（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ）。
【０００５】
[0005]いくつかの実施形態では、タグは、ナノポアと相互作用するタグを検出する期間に基づいて成功裏に組み込まれたヌクレオチドに起因する。この期間を、ナノポアを通るヌクレオチドタグの自由な流れと関連する期間と比べて長くし得る。同様に、成功裏に組み込まれたヌクレオチドタグの検出期間を、組み込まれていないヌクレオチド（例えば、テンプレート鎖にミスマッチしているヌクレオチド）の期間と比べて長くし得る。
【０００６】
[0006]いくつかの場合では、このナノポアにはポリメラーゼが会合しており（例えば、このナノポアに共有結合で連結されている）、このポリメラーゼは、ヌクレオチド組込み事象を実施する。タグ付きヌクレオチドがポリメラーゼと会合している場合には、ナノポアによりタグを検出し得る。場合によっては、組み込まれていないタグ付きヌクレオチドは、ナノポアを通り抜ける。この方法は、タグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の長さに基づいて、組み込まれていないヌクレオチドと会合しているタグと、組み込まれているヌクレオチドと会合しているタグとを識別し得る。一実施形態では、組み込まれていないヌクレオチドは、約１ミリ秒未満にわたりナノポアにより検出され、組み込まれているヌクレオチドは、少なくとも約１ミリ秒にわたりナノポアにより検出される。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態では、このポリメラーゼは、少なくとも１ミリ秒にわたりナノポアによりタグが検出可能である遅い動態的ステップを有し、平均検出時間は約１００ｍｓである。このポリメラーゼは、変異ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【０００８】
[0008]このポリメラーゼを変異させて、このポリメラーゼがヌクレオチドを核酸鎖（例えば成長している核酸鎖）に組み込む速度を低下させ得る。場合によっては、例えばテンプレート核酸鎖のメチル化により、ヌクレオチド及び／又はテンプレート鎖を官能化させて立体障害を生じさせることにより、ヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれる速度を低下させ得る。いくつかの場合では、メチル化ヌクレオチドを組み込むことにより、この速度を低下させる。
【０００９】
[0009]ある態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法は、（ａ）ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、このタグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み、このタグは、このナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップと、（ｃ）ナノポアを用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に及び／又は組込み時に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップであって、このタグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合している場合にナノポアを用いて検出される、ステップとを含む。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態では、このタグは、ポリメラーゼと会合している間に複数回検出される。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態では、電極を、タグ検出期間の間に再充電する。
【００１２】
[0012]いくつかの実施形態では、この方法は、タグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の長さに基づいて、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別する。
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態では、組み込まれていないタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、又は１０，０００である。
【００１４】
[0014]いくつかの実施形態では、組み込まれていないヌクレオチドと会合しているタグがナノポアと相互作用する期間に対する、組み込まれているヌクレオチドと会合しているタグがナノポアと相互作用する（及びナノポアを用いて検出される）期間の比率は、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、又は１０，０００である。
【００１５】
[0015]いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも約１ミリ秒の平均（ａｖｅｒａｇｅ）（又は平均（ｍｅａｎ））期間にわたり、ポリメラーゼと会合する。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態では、タグ付きヌクレオチドは、このヌクレオチドがポリメラーゼと会合していない場合には１ミリ秒（ｍｓ）未満でナノポアを通過する。
【００１７】
[0017]いくつかの実施形態では、タグは、ナノポアにより検出可能であるように選択される長さを有する。
【００１８】
[0018]いくつかの実施形態では、第１のタグ付きヌクレオチドの組込みは、第２のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグのナノポアによる検出に干渉しない。
【００１９】
[0019]いくつかの実施形態では、第１のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグのナノポアによる検出は、第２のタグ付きヌクレオチドの組込みに干渉しない。
【００２０】
[0020]いくつかの実施形態では、ナノポアは、少なくとも９５％の精度で、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別し得る。
【００２１】
[0021]いくつかの実施形態では、ナノポアは、少なくとも９９％の精度で、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別し得る。
【００２２】
[0022]いくつかの実施形態では、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグは、このタグが個々のタグ付きヌクレオチドが放出された場合に検出される。
【００２３】
[0023]ある態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法は、（ａ）ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、このタグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み、このタグは、このナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）酵素を用いて、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップと、（ｃ）個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、ナノポアを用いて、１種又は複数種の組み込まれていない個々のタグ付きヌクレオチドと会合している１種又は複数種のタグから、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを区別するステップとを含む。
【００２４】
[0024]いくつかの実施形態では、この酵素は、核酸ポリメラーゼであるか、又はテンプレートポリマーをベースとして新たに合成される鎖を伸長させ得るあらゆる酵素である。
【００２５】
[0025]いくつかの実施形態では、（ｂ）で組み込まれている個々のタグ付きヌクレオチドは、（ｂ）で組み込まれている個々のタグ付きヌクレオチドと組み込まれていない個々のタグ付きヌクレオチドとがナノポアを用いて検出される時間の長さ及び／又は時間の比率に基づいて、組み込まれていない個々のタグ付きヌクレオチドと区別される。
【００２６】
[0026]ある態様では、膜中のナノポアを用いて核酸を配列決定する方法は、（ａ）ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、このナノポアにより検出可能であるタグを含む、ステップと、（ｂ）このタグ付きヌクレオチドを、伸長している核酸鎖に組み込むステップであって、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグは、組込みの最中には、ナノポア中に滞留するか、又はナノポアの少なくとも一部に近接して滞留しており、組み込まれていないタグがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、１０，０００である、ステップと、（ｃ）ナノポアを用いてタグを検出するステップとを含む。
【００２７】
[0027]いくつかの実施形態では、組み込まれていないタグがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、又は１０，０００である。
【００２８】
[0028]いくつかの実施形態では、タグは、ヌクレオチドの組込み時に個々のヌクレオチドと会合したままである。
【００２９】
[0029]いくつかの実施形態では、個々のヌクレオチドと会合しているタグは、ヌクレオチドの組込み時に放出される。
【００３０】
[0030]いくつかの実施形態では、この方法は、ナノポアからタグを排出するステップをさらに含む。
【００３１】
[0031]いくつかの実施形態では、タグは、このタグがナノポアに入った方向とは逆の方向に排出される。
【００３２】
[0032]いくつかの実施形態では、タグは、少なくとも約１００ｍｓにわたりナノポア中に滞留する。
【００３３】
[0033]いくつかの実施形態では、タグは、少なくとも１０ｍｓにわたりナノポア中に滞留する。
【００３４】
[0034]いくつかの実施形態では、タグは、少なくとも約１ｍｓにわたりナノポア中に滞留する。
【００３５】
[0035]いくつかの実施形態では、タグ付きヌクレオチドは、１秒当たり最大約１個のヌクレオチドの割合で組み込まれる。
【００３６】
[0036]いくつかの実施形態では、ナノポアは、電圧パルスによりタグ分子を排出する。
【００３７】
[0037]いくつかの実施形態では、タグ分子は、電圧パルスにより少なくとも９９％の確率で排出される。
【００３８】
[0038]いくつかの実施形態では、ナノポアは、２個のタグ分子が同時にナノポア中に存在しないような期間内にタグ分子を排出する。
【００３９】
[0039]いくつかの実施形態では、ナノポアは、２個のタグ分子が同時にナノポア中に存在する確率が最大１％であるような期間内にタグ分子を排出する。
【００４０】
[0040]いくつかの実施形態では、タグは直径が約１．４ｎｍ未満である。
【００４１】
[0041]いくつかの実施形態では、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと会合している各タグは、このタグがこのヌクレオチドに付着している間に、ナノポアを用いて検出される。
【００４２】
[0042]いくつかの実施形態では、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグは、このタグが、この個々のタグ付きヌクレオチドから放出された場合に検出される。
【００４３】
[0043]ある態様では、核酸サンプルを配列決定するためのチップは、複数個のナノポアであって、電極に隣接して又は近接して配置されている膜中に少なくとも１個のナノポアを有する複数個のナノポアを含み、各ナノポアは、伸長している核酸鎖への個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、このタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出する。いくつかの実施形態では、このナノポアは個々にアドレス指定可能である。
【００４４】
[0044]いくつかの実施形態では、個々のナノポアは、ヌクレオチドと会合しているタグを、ナノポアを介した又はナノポアに隣接したこのタグのその後の通過の最中に検出する。
【００４５】
[0045]いくつかの実施形態では、このチップは、１平方ミリメートル当たり少なくとも５００個の個々にアドレス指定可能な電極を含む。いくつかの実施形態では、このチップは、１平方ミリメートル当たり少なくとも５０個の個々にアドレス指定可能な電極を含む。
【００４６】
[0046]いくつかの実施形態では、このチップは、タグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の長さに少なくとも部分的に基づいて、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別する。
【００４７】
[0047]いくつかの実施形態では、組み込まれていないタグがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、少なくとも約１．５である。
【００４８】
[0048]いくつかの実施形態では、第１のタグ付きヌクレオチドの組込みは、第２のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグのナノポアによる検出に干渉しない。
【００４９】
[0049]いくつかの実施形態では、第１のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグのナノポアによる検出は、第２のタグ付きヌクレオチドの組込みに干渉しない。
【００５０】
[0050]いくつかの実施形態では、ナノポアは、少なくとも９５％の精度で、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別し得る。
【００５１】
[0051]いくつかの実施形態では、ナノポアは、少なくとも９９％の精度で、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別し得る。
【００５２】
[0052]いくつかの実施形態では、電極は集積回路の一部である。
【００５３】
[0053]いくつかの実施形態では、電極は集積回路に連結されている。
【００５４】
[0054]いくつかの実施形態では、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと会合している各タグは、このタグがこのヌクレオチドに付着している間に、ナノポアを用いて検出される。
【００５５】
[0055]いくつかの実施形態では、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグは、このタグが、この個々のタグ付きヌクレオチドから放出された場合に検出される。
【００５６】
[0056]ある態様では、核酸サンプルを配列決定するためのチップは複数個のナノポアを含み、この複数個のナノポアは、電極に隣接して配置されている膜中に少なくとも１個のナノポアを含み、各ナノポアは、伸長している核酸鎖への、タグ種を含む核酸分子の組込み時に又はこの組込みの最中に、このタグ種を検出し得、組み込まれていないタグがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、少なくとも約１．５である。いくつかの実施形態では、この複数個のナノポアは個々にアドレス指定可能である。
【００５７】
[0057]いくつかの実施形態では、タグ種は、組込み時にナノポアを通り抜けない。
【００５８】
[0058]いくつかの実施形態では、このチップは、ナノポアからタグ種を排出するように構成されている。
【００５９】
[0059]いくつかの実施形態では、ナノポアは、電圧パルスによりタグ種を排出する。
【００６０】
[0060]いくつかの実施形態では、電極は集積回路の一部である。
【００６１】
[0061]いくつかの実施形態では、電極は集積回路に連結されている。
【００６２】
[0062]いくつかの実施形態では、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと会合している各タグは、このタグがこのヌクレオチドに付着している間に、ナノポアを用いて検出される。
【００６３】
[0063]いくつかの実施形態では、核酸分子のタグ種は、このタグ種がこの核酸分子から放出されることなく検出される。
【００６４】
[0064]ある態様では、核酸サンプルを配列決定するためのシステムは、（ａ）１個又は複数個のナノポアデバイスを含むチップであって、この１個又は複数個のナノポアデバイスのそれぞれは、電極に隣接する膜中にナノポアを含み、このナノポアデバイスは、ポリメラーゼによるタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出する、チップと、（ｂ）このチップに連結されているプロセッサであって、ナノポアデバイスから受信した電気信号に基づいて、核酸サンプルの核酸配列の特徴付けを補助するようにプログラムされているプロセッサとを含む。
【００６５】
[0065]いくつかの実施形態では、ナノポアデバイスは、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを、ナノポアを介した又はナノポアに隣接したこのタグのその後の進行中に検出する。
【００６６】
[0066]いくつかの実施形態では、ナノポアデバイスは、個々にアドレス指定可能なナノポアを含む。
【００６７】
[0067]いくつかの実施形態では、チップは、１平方ミリメートル当たり少なくとも５００個の個々にアドレス指定可能な電極を含む。いくつかの実施形態では、チップは、１平方メートル当たり少なくとも５０個の個々にアドレス指定可能な電極を含む。
【００６８】
[0068]いくつかの実施形態では、チップは、タグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の長さに少なくとも部分的に基づいて、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別する。
【００６９】
[0069]いくつかの実施形態では、組み込まれていないタグがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、少なくとも約１．５である。
【００７０】
[0070]いくつかの実施形態では、第１のタグ付きヌクレオチドの組込みは、第２のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグのナノポアによる検出に干渉しない。
【００７１】
[0071]いくつかの実施形態では、第１のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグのナノポアによる検出は、第２のタグ付きヌクレオチドの組込みに干渉しない。
【００７２】
[0072]いくつかの実施形態では、ナノポアは、少なくとも９５％の精度で、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別し得る。
【００７３】
[0073]いくつかの実施形態では、ナノポアは、少なくとも９９％の精度で、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別し得る。
【００７４】
[0074]いくつかの実施形態では、電極は集積回路の一部である。
【００７５】
[0075]いくつかの実施形態では、電極は集積回路に連結されている。
【００７６】
[0076]いくつかの実施形態では、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと会合している各タグは、このタグがこのヌクレオチドに付着している間に、ナノポアを用いて検出される。
【００７７】
[0077]いくつかの実施形態では、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグは、このタグが、この個々のタグ付きヌクレオチドから放出された場合に検出される。
【００７８】
[0078]いくつかの実施形態では、所与の駆動力（例えば、ナノポアに又はナノポアを含む膜に印加される電位（Ｖ＋））を使用して、ナノポアの少なくとも一部中に及びナノポアの少なくとも一部を通るようにタグを導く。タグは、ナノポアの開口からナノポア中に導かれ得る。次いで、この駆動力を反転させて（例えば、反対の極性の電位を印加して、即ちＶ−）、開口を介してナノポアからタグの少なくとも一部を排出させ得る。次いで、駆動力を再び印加して（例えばＶ＋）、タグの少なくとも一部を、開口を介してナノポア中に入れる。或いは、タグの極性を反転させ得、Ｖ−、Ｖ＋、及びＶ−等の一連の電位を使用してもよい。これにより、ナノポアを用いてタグを検出し得る期間を増加させ得る。
【００７９】
[0079]いくつかの実施形態では、ナノポア及び／又はタグは、このナノポア中において、ヌクレオチドと会合しているタグが、一方向（例えば細孔中へ）に移動する可能性が別の方向（例えば細孔外へ）に移動する可能性よりも高いようなエネルギー地形を生じるように構成されている。
【００８０】
[0080]いくつかの実施形態では、テンプレートサンプル鎖中の改変塩基（例えばメチル化）の検出を、タグ付きヌクレオチドのタグが、新たに合成される鎖へのヌクレオチドタグのヌクレオチド部分の組込みの最中に及び／又はこの組込み時にポリメラーゼと会合している間にナノポアにより検出される時間の差により検出し得る。場合によっては、ヌクレオチドタグが酵素と会合している時間は、サンプル配列の対向するヌクレオチドがメチル化ヌクレオチドである場合には、非メチル化ヌクレオチドと比べて長い。
【００８１】
[0081]本明細書で説明されているタグ付きヌクレオチドの例は、切断可能なタグで改変されている任意の天然に存在するヌクレオチドであり得るか、又は切断可能なタグで改変されている合成の非天然ヌクレオチド類似体であり得る。例えば、切断可能なタグ又は切断不能なタグで改変されているユニバーサル塩基を使用して、サンプル鎖中の塩基の数を単純に計数し得る。
【００８２】
[0082]本明細書で説明されているタグ付きヌクレオチドの例は、二量体ヌクレオチド又は二量体単位として伸長され得る二量体ヌクレオチド類似体であり得、タグは、ポリメラーゼ酵素との会合の時間及びナノポアデバイスにより検出されるシグナルレベルに基づいて、二量体ヌクレオチドの複合二量体組成を報告する。
【００８３】
[0083]タグが酵素と会合している時間を使用して、組み込まれているヌクレオチドと組み込まれていないヌクレオチドとを区別し得るが、印加電位又は変化する印加電位に対するナノポア中のタグの固有の電流レベル及び／又は電気的反応も、様々なヌクレオチドと会合しているタグの間の区別を可能にする。
【００８４】
[0084]ある態様では、核酸を配列決定する方法は、ナノポア及び検知電極に近接する回路に交流（ＡＣ）波形を印加するステップを含み、テンプレート核酸鎖と相補的な伸長している核酸鎖に組み込まれるヌクレオチドと会合しているタグは、この波形が第１の極性を有する場合に検出され、この電極は、この波形が第２の極性を有する場合に再充電される。
【００８５】
[0085]別の態様では、核酸分子を配列決定する方法は、（ａ）電極に隣接する膜中のナノポアに、１個又は複数個のタグ付きヌクレオチドを供給するステップと、（ｂ）前記１個又は複数個のタグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸分子に相補的な鎖に組み込むステップと、（ｃ）前記電極に印加された交流（ＡＣ）波形を用いて、前記タグ付きヌクレオチドと会合しているタグを１回又は複数回検出するステップであって、前記タグは、前記タグが、前記鎖中に組み込まれている前記個々のタグ付きヌクレオチドに付着している間に検出される、ステップとを含む。
【００８６】
[0086]いくつかの実施形態では、この波形は、少なくとも約１秒、１０秒、３０秒、１分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、又は１カ月の期間にわたり電極が枯渇しないようなものである。
【００８７】
[0087]いくつかの実施形態では、タグの同一性は、測定される電流と、様々な電圧での波形により印加される電圧との関係により決定される。
【００８８】
[0088]いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、又はこれらのあらゆる誘導体を含む。
【００８９】
[0089]いくつかの実施形態では、テンプレート核酸鎖の塩基のメチル化は、この塩基がメチル化されている場合にこの塩基がメチル化されていない場合と比べて長い期間にわたりタグが検出されることにより、決定される。
【００９０】
[0090]ある態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸又はそのセグメントの長さを決定する方法は、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、少なくとも２個の異なる塩基を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合している同一のタグを含み、このタグは、前記ナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に又は組込み後に、前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップとを含む。
【００９１】
[0091]ある態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸又はそのセグメントの長さを決定する方法は、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み、このタグは、このタグが存在しない場合の電流と比べて、前記ナノポアを通って流れる電流の大きさを低減し得る、ステップと、（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込み、前記ナノポアを通って流れる電流の大きさを低減するステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込み間の期間を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノポアを通って流れる電流の大きさは、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込み間の期間の最中に、最大電流の少なくとも８０％まで戻る。
【００９２】
[0092]いくつかの実施形態では、全てのヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合している同一のタグを有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの少なくとも一部は、ヌクレオチドを同定するタグを有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの最大２０％は、ヌクレオチドを同定するタグを有する。いくつかの実施形態では、全てのヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及び／又はウラシル（Ｕ）であると同定される。いくつかの実施形態では、核酸又はそのセグメントの全ては、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）である。
【００９３】
[0093]ある態様では、複数個のサブユニットを有するタンパク質を構築する方法は、（ａ）複数個の第１サブユニットを準備するステップと、（ｂ）複数個の第２のサブユニットを準備するステップであって、この第２のサブユニットは、第１のサブユニットに関して改変されている、ステップと、（ｃ）第１の比率で第１のサブユニットと第２のサブユニットとを接触させて、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを有する複数個のタンパク質を形成するステップであって、この複数個のタンパク質は、第２のサブユニットに対する第１のサブユニットの複数の比率を有する、ステップと、（ｄ）この複数個のタンパク質を分画して、第２のサブユニットに対する第１のサブユニットの第２の比率を有するタンパク質を富化させるステップであって、この第２の比率は、（ｎ−１）個の第１のサブユニット当たり１個の第２のサブユニットであり、「ｎ」は、このタンパク質を構成するサブユニットの数である、ステップとを含む。
【００９４】
[0094]いくつかの実施形態では、このタンパク質はナノポアである。
【００９５】
[0095]いくつかの実施形態では、このナノポアは、アルファ−溶血素に対して少なくとも８０％相同である。
【００９６】
[0096]いくつかの実施形態では、第１のサブユニット又は第２のサブユニットは精製タグを含む。
【００９７】
[0097]いくつかの実施形態では、この精製タグはポリヒスチジンタグである。
【００９８】
[0098]いくつかの実施形態では、分画を、イオン交換クロマトグラフィーを使用して実施する。
【００９９】
[0099]いくつかの実施形態では、第２の比率は、６個の第１のサブユニット当たり１個の第２のサブユニットである。
【０１００】
[00100]いくつかの実施形態では、第２の比率は、５個の第１のサブユニット当たり２個の第２のサブユニットであり、第２のサブユニットのそれぞれに単一のポリメラーゼが付着している。
【０１０１】
[00101]いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは化学的反応性部分を含み、この方法は、（ｅ）この化学的反応性部分に実体を付着させるための反応を実施するステップをさらに含む。
【０１０２】
[00102]いくつかの実施形態では、このタンパク質はナノポアであり、この実体はポリメラーゼである。
【０１０３】
[00103]いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは野生型である。
【０１０４】
[00104]いくつかの実施形態では、第１のサブユニット及び／第２のサブユニットは組換えである。
【０１０５】
[00105]いくつかの実施形態では、第１の比率は第２の比率とほぼ等しい。
【０１０６】
[00106]いくつかの実施形態では、第１の比率は第２の比率と比べて大きい。
【０１０７】
[00107]いくつかの実施形態では、この方法は、第２の比率のサブユニットを有するタンパク質を二重層に挿入するステップをさらに含む。
【０１０８】
[00108]いくつかの実施形態では、この方法は、第２の比率のサブユニットを有するタンパク質を用いて核酸分子を配列決定するステップをさらに含む。
【０１０９】
[00109]別の態様では、ナノポアは複数個のサブユニットを含み、これらのサブユニットの内の１個にはポリメラーゼが付着しており、且つこれらのサブユニットの内の少なくとも１個又は全て未満は第１の精製タグを含む。
【０１１０】
[00110]いくつかの実施形態では、このナノポアは、アルファ−溶血素に対して少なくとも８０％相同である。
【０１１１】
[00111]いくつかの実施形態では、全てのサブユニットは、第１の精製タグ又は第２の精製タグを含む。
【０１１２】
[00112]いくつかの実施形態では、第１の精製タグはポリヒスチジンタグである。
【０１１３】
[00113]いくつかの実施形態では、第１の精製タグは、ポリメラーゼが付着しているサブユニット上に存在する。
【０１１４】
[00114]いくつかの実施形態では、第１の精製タグは、ポリメラーゼが付着していないサブユニット上に存在する。
【０１１５】
[00115]別の態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法は、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み、このタグは、前記ナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップであって、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合している場合に前記ナノポアを用いて検出され、前記検出することは、（ｉ）前記ナノポアを横切る印加電圧を供給すること、及び（ｉｉ）前記印加電圧にて前記検知電極で電流を測定することを含む、ステップと、（ｄ）前記印加電圧を較正するステップとを含む。
【０１１６】
[00116]いくつかの実施形態では、前記較正することは、（ｉ）前記タグ分子に対する複数のエスケープ電圧（ｅｓｃａｐｅ  ｖｏｌｔａｇｅ）を測定すること、（ｉｉ）測定されたエスケープ電圧と基準点との差異を算出すること、及び（ｉｉｉ）この算出された差異だけ印加電圧をシフトさせることを含む。
【０１１７】
[00117]いくつかの実施形態では、時間に対する予想されるエスケープ電圧の分布が推定される。
【０１１８】
[00118]いくつかの実施形態では、基準点は、測定されたエスケープ電圧の平均値又は中央値である。
【０１１９】
[00119]いくつかの実施形態では、この方法は、予想されるエスケープ電圧分布中の検出された変動を除去する。
【０１２０】
[00120]いくつかの実施形態では、この方法を、検知電極にそれぞれ隣接する複数個の個々にアドレス指定可能なナノポアに対して実施する。
【０１２１】
[00121]いくつかの実施形態では、印加電圧は経時的に低下する。
【０１２２】
[00122]いくつかの実施形態では、ナノポア中におけるタグの存在により、印加電圧にて検知電極により測定される電流が低減される。
【０１２３】
[00123]いくつかの実施形態では、タグ付きヌクレオチドは複数個の異なるタグを含み、この方法は、この複個数の異なるタグのそれぞれを検出する。
【０１２４】
[00124]いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ａ）〜（ｃ）の実施と比較した場合に、この方法の精度を増加させる。
【０１２５】
[00125]いくつかの実施形態では、（ｄ）は、電気化学的条件の変化を経時的に補償する。
【０１２６】
[00126]いくつかの実施形態では、（ｄ）は、複数個のナノポアを有するデバイスにおいて、電気化学的条件が異なる様々なナノポアを補償する。
【０１２７】
[00127]いくつかの実施形態では、（ｄ）は、この方法のそれぞれの実施に対する異なる電気化学的条件を補償する。
【０１２８】
[00128]いくつかの実施形態では、この方法は、（ｅ）電流利得の変動及び／又は電流オフセットの変動を較正するステップをさらに含む。
【０１２９】
[00129]いくつかの実施形態では、前記タグは、前記ポリメラーゼと会合している間に複数回検出される。
【０１３０】
[00130]いくつかの実施形態では、電極を、タグ検出期間の間に再充電する。
【０１３１】
[00131]いくつかの実施形態では、この方法は、前記タグ付きヌクレオチドが前記ナノポアにより検出される時間の長さに基づいて、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別する。
【０１３２】
[00132]別の態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法は、（ａ）この核酸サンプルから反復核酸配列を除去して、配列決定用に一本鎖核酸分子を生成すること、（ｂ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み、このタグは、前記ナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｃ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップと、（ｄ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップであって、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合している場合に前記ナノポアを用いて検出される、ステップとを含む。
【０１３３】
[00133]いくつかの実施形態では、反復核酸配列は、少なくとも２０個の連続した核酸塩基を含む。
【０１３４】
[00134]いくつかの実施形態では、反復核酸配列は、少なくとも２００個の連続した核酸塩基を含む。
【０１３５】
[00135]いくつかの実施形態では、反復核酸配列は、核酸塩基の少なくとも２０個の連続した反復サブユニットを含む。
【０１３６】
[00136]いくつかの実施形態では、反復核酸配列は、核酸塩基の少なくとも２００個の連続した反復サブユニットを含む。
【０１３７】
[00137]いくつかの実施形態では、反復核酸配列は、この反復核酸配列に相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーションにより除去される。
【０１３８】
[00138]いくつかの実施形態では、反復核酸配列に相補的な核酸配列は、固体支持体上に固定されている。
【０１３９】
[00139]いくつかの実施形態では、この固体支持体は表面である。
【０１４０】
[00140]いくつかの実施形態では、この固体支持体はビーズである。
【０１４１】
[00141]いくつかの実施形態では、反復核酸配列に相補的な核酸配列は、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡを含む。
【０１４２】
[00142]いくつかの実施形態では、このＣｏｔ−１  ＤＮＡは、約５０〜約１００個の核酸塩基の長さを有する反復核酸配列に富む。
【０１４３】
[00143]別の態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法は、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み、このタグは、前記ナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）ナノポアにリンカーによって付着しているポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップであって、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合している場合に前記ナノポアを用いて検出される、ステップとを含む。
【０１４４】
[00144]いくつかの実施形態では、リンカーは可撓性である。
【０１４５】
[00145]いくつかの実施形態では、リンカーは少なくとも５ナノメートルの長さである。
【０１４６】
[00146]いくつかの実施形態では、リンカーは直接付着である。
【０１４７】
[00147]いくつかの実施形態では、リンカーはアミノ酸を含む。
【０１４８】
[00148]いくつかの実施形態では、ナノポア及びポリメラーゼは単一のポリペプチドを含む。
【０１４９】
[00149]いくつかの実施形態では、リンカーは核酸又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１５０】
[00150]いくつかの実施形態では、リンカーは非共有結合を含む。
【０１５１】
[00151]いくつかの実施形態では、リンカーはビオチン及びストレプトアビジンを含む。
【０１５２】
[00152]いくつかの実施形態では、下記の内の少なくとも１つ：（ａ）ポリメラーゼのＣ末端はナノポアのＮ末端に付着している、（ｂ）ポリメラーゼのＣ末端はナノポアのＣ末端に付着している、（ｃ）ポリメラーゼのＮ末端はナノポアのＮ末端に付着している、（ｄ）ポリメラーゼのＮ末端はナノポアのＣ末端に付着している、及び（ｅ）ポリメラーゼはナノポアに付着しており、ポリメラーゼ及びナノポアの少なくとも一方は末端で付着していない。
【０１５３】
[00153]いくつかの実施形態では、リンカーは、タグがナノポアを用いて検出されるように、ナノポアに対してポリメラーゼを配向させる。
【０１５４】
[00154]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、２個以上のリンカーによりナノポアに付着している。
【０１５５】
[00155]いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号２〜３５の内の１つ若しくは複数又はそれから生成されるＰＣＲ生成物を含む。
【０１５６】
[00156]いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１〜３５の内の１つ若しくは複数又はそれから生成されるＰＣＲ生成物によりコードされるペプチドを含む。
【０１５７】
[00157]いくつかの実施形態では、ナノポアは、アルファ−溶血素に対して少なくとも８０％相同である。
【０１５８】
[00158]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｈｉ−２９に対して少なくとも８０％相同である。
【０１５９】
[00159]別の態様では、タグ分子は、（ａ）第１のセグメント及び第２のセグメントを含む第１のポリマー鎖であって、第２のセグメントは第１のセグメントと比べて狭い、第１のポリマー鎖と、（ｂ）２個の端部を含む第２のポリマー鎖であって、第１の端部は、第２のセグメントに隣接する第１のポリマー鎖に固定されており、且つ第２の端部は、第１のポリマー鎖に固定されておらず、タグ分子は、第２のポリマー鎖が第２のセグメントに隣接して整列する第１の方向でナノポアに通され得る、第２のポリマー鎖とを含む。
【０１６０】
[00160]いくつかの実施形態では、タグ分子は、第２ポリマー鎖が第２のセグメントに隣接して整列しない第２の方向でナノポアに通され得ない。
【０１６１】
[00161]いくつかの実施形態では、第２のポリマー鎖は、第２のポリマー鎖が第２のセグメントに隣接して整列しない場合に第１のポリマー鎖と塩基対を形成する。
【０１６２】
[00162]いくつかの実施形態では、第１のポリマー鎖はヌクレオチドに固定されている。
【０１６３】
[00163]いくつかの実施形態では、第１のポリマー鎖は、伸長している核酸鎖にヌクレオチドが組み込まれている場合にヌクレオチドから放出される。
【０１６４】
[00164]いくつかの実施形態では、第１のポリマー鎖は、ヌクレオチドの末端リン酸塩に固定されている。
【０１６５】
[00165]いくつかの実施形態では、第１のポリマー鎖はヌクレオチドを含む。
【０１６６】
[00166]いくつかの実施形態では、第２のセグメントはａ−塩基性ヌクレオチドを含む。
【０１６７】
[00167]いくつかの実施形態では、第２のセグメントは炭素鎖を含む。
【０１６８】
[00168]別の態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法は、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中にタグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み、このタグは、前記ナノポアを用いて検出可能であり、このタグは、（ｉ）第１のセグメント及び第２のセグメントを含む第１のポリマー鎖であり、第２のセグメントは第１のセグメントと比べて狭い、第１のポリマー鎖と、（ｉｉ）２個の端部を含む第２のポリマー鎖であり、第１の端部は、第２のセグメントに隣接する第１のポリマー鎖に固定されており、且つ第２の端部は、第１のポリマー鎖に固定されておらず、タグ分子は、第２のポリマー鎖が第２のセグメントに隣接して整列する第１の方向でナノポアに通され得る、第２のポリマー鎖とを含む、ステップと、（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップであって、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合している場合に前記ナノポアを用いて検出される、ステップとを含む。
【０１６９】
[00169]いくつかの実施形態では、タグ分子は、第２のポリマー鎖が第２のセグメントに隣接して整列しない第２の方向でナノポアに通され得ない。
【０１７０】
[00170]いくつかの実施形態では、前記タグは、前記ポリメラーゼと会合している間に複数回検出される。
【０１７１】
[00171]いくつかの実施形態では、電極は、タグ検出期間の間に再充電される。
【０１７２】
[00172]いくつかの実施形態では、タグは、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中にナノポアに入り込み、タグは、電極が最充電されている場合にはナノポアから出ない。
【０１７３】
[00173]いくつかの実施形態では、この方法は、前記タグ付きヌクレオチドが前記ナノポアにより検出される時間の長さに基づいて、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別する。
【０１７４】
[00174]いくつかの実施形態では、組み込まれていないタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、少なくとも１．５である。
【０１７５】
[00175]別の態様では、核酸配列決定の方法は、（ａ）配列決定する一本鎖核酸を準備するステップと、（ｂ）複数個のプローブを準備するステップであって、このプローブは、（ｉ）この一本鎖核酸とハイブリダイズし得るハイブリダイゼーション部分と、（ｉｉ）２個の端部を有するループ構造であり、各端部はハイブリダイゼーション部分に付着している、ループ構造と、（ｉｉｉ）このループ構造の端部の間のハイブリダイゼーション部分に位置する切断可能な基とを含み、このループ構造は、このループ構造が逆方向にナノポアを挿通することを防止するヒンジ付きゲートを含む、ステップと、（ｃ）ハイブリダイゼーション部分と配列決定する一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションにより決定される順序で複数個のプローブを重合し、
【０１７６】
[00176]切断可能な基を切断して、配列決定する展開糸（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｔｈｒｅａｄ）を生成するステップと、（ｄ）この展開糸をナノポアに挿通するステップであって、ヒンジ付きゲートは、展開糸が逆方向にナノポアを挿通することを防止する、ステップと、（ｅ）ナノポアを用いて、ハイブリダイゼーション部分と配列決定する一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションにより決定される順序で、展開糸のループ構造を検出し、それにより、配列決定する一本鎖核酸を配列決定するステップとを含む。
【０１７７】
[00177]いくつかの実施形態では、ループ構造は狭いセグメントを含み、ヒンジ付きゲートは、２個の端部を含むポリマーであり、第１の端部は、狭いセグメントに隣接するループ構造に固定されており、第２の端部はループ構造に固定されておらず、ループ構造は、ヒンジ付きゲートが狭いセグメントに隣接して整列する第１の方向でナノポアに通され得る。
【０１７８】
[00178]いくつかの実施形態では、ループ構造は、ヒンジ付きゲートが狭いセグメントに隣接して整列しない逆方向でナノポアに通され得ない。
【０１７９】
[00179]いくつかの実施形態では、ヒンジ付きゲートは、このヒンジ付きゲートが狭いセグメントに隣接して整列しない場合にループ構造と塩基対を形成する。
【０１８０】
[00180]いくつかの実施形態では、ヒンジ付きゲートはヌクレオチドを含む。
【０１８１】
[00181]いくつかの実施形態では、狭いセグメントはａ−塩基性ヌクレオチドを含む。
【０１８２】
[00182]いくつかの実施形態では、狭いセグメントは炭素鎖を含む。
【０１８３】
[00183]いくつかの実施形態では、電極は、検出の期間の間に再充電される。
【０１８４】
[00184]いくつかの実施形態では、電極が再充電された場合には、展開糸は逆方向でナノポアを通らない。
【０１８５】
[00185]本開示のさらなる態様及び利点は、本開示の例示的実施形態のみが示されており且つ説明されている下記の詳細な説明から、当業者に容易に明らかになるだろう。実現されるように、本開示は他の及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全てが本開示から逸脱することなく、様々な明白な観点で変更が可能である。従って、図面及び説明は、本質的には例示的と見なすべきであり、限定的と見なすべきではない。
【０１８６】
参照による組込み
[00186]本明細書で言及されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的に且つ個々の示されている場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
[00187]本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴及び利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す下記の詳細な説明、及び添付図面への参照により得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】[00188]図１は、本方法のステップを模式的に示す。
【図２Ａ】[00189]図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、ナノポア検出器の例を示し、図２Ａでは、ナノポアが電極上に配置されており、図２Ｂでは、ナノポアがウェルを覆う膜に挿入されており、図２Ｃでは、ナノポアが、突出している電極の上にある。
【図２Ｂ】[00189]図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、ナノポア検出器の例を示し、図２Ａでは、ナノポアが電極上に配置されており、図２Ｂでは、ナノポアがウェルを覆う膜に挿入されており、図２Ｃでは、ナノポアが、突出している電極の上にある。
【図２Ｃ】[00189]図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、ナノポア検出器の例を示し、図２Ａでは、ナノポアが電極上に配置されており、図２Ｂでは、ナノポアがウェルを覆う膜に挿入されており、図２Ｃでは、ナノポアが、突出している電極の上にある。
【図３】[00190]図３は、本デバイス及び本方法の構成要素を示す。
【図４】[00191]図４は、放出されるタグが、このタグがポリメラーゼと会合している間にナノポアにより検出される、核酸配列決定の方法を示す。
【図５】[00192]図５は、タグが、ヌクレオチド組込み事象時に放出されず、ナノポアにより検出される、核酸配列決定の方法を示す。
【図６】[00193]図６は、ナノポア中に短期間滞留するタグにより生成されたシグナルの一例を示す。
【図７】[00194]図７は、ナノポア検出器のアレイを示す。
【図８】[00195]図８は、ナノポアを含むがウェルを含まないチップセットアップの一例を示す。
【図９】[00196]図９は、テストチップセルアレイの配置の一例を示す。
【図１０】[00197]図１０は、セルのアナログ回路の一例を示す。
【図１１】[00198]図１１は、超小型測定回路の一例を示す。
【図１２】[00199]図１２は、超小型測定回路の一例を示す。
【図１３】[00200]図１３は、ヌクレオチドのリン酸塩に付着したタグ分子の一例を示す。
【図１４】[00201]図１４は、代替タグの位置の例を示す。
【図１５】[00202]図１５は、検出可能なＴＡＧ−ポリリン酸塩、及び検出可能なＴＡＧを示す。
【図１６】[00203]図１６は、シーケンサーを制御するように構成されているコンピュータシステムを示す。
【図１７】[00204]図１７は、溶血素ナノポアへのｐｈｉ２９ポリメラーゼのドッキングを示す。
【図１８】[00205]図１８は、２つの限定的な動態的ステップを示す、ポリメラーゼの滞留時間の確率密度を示す。
【図１９】[00206]図１９は、ナノポアの、検出回路付近側の結合パートナーと会合するタグを示す。
【図２０】[00207]図２０は、ナノポアからの流出と比べて容易にナノポアを通って流れる有刺タグを示す。
【図２１】[00208]図２１は、波形の例を示す。
【図２２】[00209]図２２は、４種の核酸塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）に関する、抽出シグナル対印加電圧のプロットを示す。
【図２３】[00210]図２３は、４種の核酸塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の複数回の実行に関する、抽出シグナル対印加電圧のプロットを示す。
【図２４】[00211]図２４は、４種の核酸塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の複数回の実行に関する、パーセント基準導電性差（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（％ＲＣＤ）対印加電圧のプロットを示す。
【図２５】[00212]図２５は、核酸ポリメラーゼの進行を遅らせるためのオリゴヌクレオチドスピードバンプの使用を示す。
【図２６】[00213]図２６は、ポリメラーゼに加えて、ヘリカーゼ又は核酸結合タンパク質等の第２の酵素又はタンパク質の使用を示す。
【図２７】[00214]図２７は、規定の数の改変サブユニットを有する多量体タンパク質を形成する方法の一例を示す。
【図２８】[00215]図２８は、様々な数の改変サブユニットの分布を有する複数個のナノポアの分画の一例を示す。
【図２９】[00216]図２９は、様々な数の改変サブユニットの分布を有する複数個のナノポアの分画の一例を示す。
【図３０】[00217]図３０は、印加電圧の較正の一例を示す。
【図３１】[00218]図３１は、ヒンジ付きゲートを有するタグ付きヌクレオチドの一例を示す。
【図３２】[00219]図３２は、ヒンジ付きゲートを有するタグ付きヌクレオチドを使用する核酸の配列決定の一例を示す。
【図３３】[00220]図３３は、エクスパンダマー（ｅｘｐａｎｄａｍｅｒ）配列決定での使用のためのプローブの一例を示す。
【図３４】[00221]図３４は、重合しているエクスパンダマープローブの一例を示す。
【図３５】[00222]図３５は、配列決定される展開糸を生成するための、切断可能な基の切断の一例を示す。
【図３６】[00223]図３６は、展開糸のナノポアを挿通の一例を示す。
【図３７】[00224]図３７は、非ファラデー導電の一例を示す。
【図３８】[00225]図３８は、２個のタグ分子の捕獲の一例を示す。
【図３９】[00226]図３９は、配列決定される核酸と、タグ付きヌクレオチドと、ナノポア及びポリメラーゼの間の融合との間に形成された三元複合体の一例を示す。
【図４０】[00227]図４０は、タグ付きヌクレオチドが存在することなく、ナノポアを通って流れる電流の一例を示す。
【図４１】[00228]図４１は、様々なタグ付きヌクレオチドを識別するための電流レベルの使用の一例を示す。
【図４２】[00229]図４２は、様々なタグ付きヌクレオチドを識別するための電流レベルの使用の一例を示す。
【図４３】[00230]図４３は、様々なタグ付きヌクレオチドを識別するための電流レベルの使用の一例を示す。
【図４４】[00231]図４４は、タグ付きヌクレオチドを使用して核酸分子を配列決定するための電流レベルの使用の一例を示す。
【図４５】[00232]図４５は、タグ付きヌクレオチドを使用して核酸分子を配列決定するための電流レベルの使用の一例を示す。
【図４６】[00233]図４６は、タグ付きヌクレオチドを使用して核酸分子を配列決定するための電流レベルの使用の一例を示す。
【図４７】[00234]図４７は、タグ付きヌクレオチドを使用して核酸分子を配列決定するための電流レベルの使用の一例を示す。
【図４８】[00235]図４８は、（α）９個及び（β）９個のレポーターユニットを含む例示的な非対称改変ヌクレオチドポリマーの一方向移動を模式的に示す。
【図４９】[00236]図４９は、二本鎖領域（例えば、二本鎖嵩高構造）に隣接するポリマー内に配置されているアミダイトで構成されている様々なレポーターユニットに関する、イオン流電流レベル（Ｉ／Ｉ０）特性を示す。
【図５０】[00237]図５０は、図４９と同一のアミダイトユニットに関する滞留時間特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１８９】
[00238]本発明の様々な実施形態が本明細書において示されており且つ説明されているが、そのような実施形態は例示のみの目的で記載されていることが当業者には明らかであるだろう。当業者は、多くのバリエーション、変更、及び置き換えを、本発明から逸脱することなく思い付くことができる。本明細書で説明されている本発明の実施形態に対する様々な変更が用いられ得ることを理解すべきである。
【０１９０】
[00239]用語「ナノポア」は、本明細書で使用される場合、通常は、膜中に形成されるか又は別の方法で設けられる孔、チャネル、又は通路を指す。膜は、有機膜（例えば脂質二重層）であってもよいし、合成膜（例えば、ポリマー物質で形成されている膜）であってもよい。この膜は、ポリマー物質であってもよい。このナノポアは、検知回路に、又は検知回路（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路若しくは電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路）に連結されている電極に、隣接して配置されていてもよいし近接して配置されていてもよい。いくつかの例では、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍのオーダーの特徴的な幅又は直径を有する。一部のナノポアはタンパク質である。アルファ溶血素は、タンパク質ナノポアの一例である。
【０１９１】
[00240]用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、通常は、１個又は複数個の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、又はこれらのバリアントから選択される１個又は複数個のサブユニットを含んでもよい。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵ、又はこれらのバリアントを含み得る。ヌクレオチドは、伸長している核酸鎖に組み込まれ得る任意のサブユニットを含み得る。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵ、又は１個若しくは複数個の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵに特異的であるか又はプリン（即ち、Ａ若しくはＧ、又はこれらのバリアント）若しくはピリミジン（即ち、Ｃ、Ｔ、若しくはＵ、又はこれらのバリアント）に相補的であるあらゆる他のサブユニットであり得る。サブユニットは、個々の核酸塩基又は塩基の群（例えば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＣ、ＣＡ、若しくはこれらのウラシルカウンターパート）が分解されることを可能にし得る。いくつかの例では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）、又はこれらの誘導体である。核酸は、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。
【０１９２】
[00241]用語「ポリメラーゼ」は、本明細書で使用される場合、通常は、重合反応を触媒し得るあらゆる酵素を指す。ポリメラーゼの例として、核酸ポリメラーゼ、転写酵素、又はリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは重合酵素であり得る。
【０１９３】
サンプルを配列決定するための方法及びシステム
[00242]本明細書で説明されているのは、１個又は複数個のナノポアを使用するか又は用いて核酸を配列決定するための方法、デバイス、及びシステムである。この１個又は複数個のナノポアは、集積回路の一部であるか又は集積回路に連結されている電極に隣接して配置されているか又は近接して検知する膜（例えば脂質二重層）中に存在していてもよい。
【０１９４】
[00243]いくつかの例では、ナノポアデバイスは、電極に隣接しているか又は近接して検知する膜中の単一のナノポアを含む。他の例では、ナノポアデバイスは、センサー回路又は検知電極に近接する少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０００個、又は１０，０００個のナノポアを含む。１個又は複数個のナノポアは、個々の電極及び検知集積回路、又は複数個の電極及び検知集積回路と関連していてもよい。
【０１９５】
[00244]システムは、１個又は複数個のナノポアデバイスを含む反応チャンバを含み得る。ナノポアデバイスは、個々にアドレス指定可能なナノポアデバイス（例えば、このシステム中の他のナノポアデバイスから独立してシグナルを検出してアウトプットを提供し得るデバイス）であり得る。個々にアドレス指定可能なナノポアは、個々に読み取り可能であり得る。場合によっては、個々にアドレス指定可能なナノポアは、個々に書き込み可能であり得る。代替として、個々にアドレス指定可能なナノポアは、個々に読み取り可能であり得、且つ個々に書き込み可能であり得る。このシステムは、サンプル調製及び本開示の様々な操作（例えば核酸配列決定）を容易にするための１個又は複数個のコンピュータプロセッサを含み得る。このプロセッサは、ナノポアデバイスに連結され得る。
【０１９６】
[00245]ナノポアデバイスは、複数個の個々にアドレス指定可能な検知電極を含み得る。各検知電極は、この電極に隣接する膜と、この膜中の１個又は複数個のナノポアとを含み得る。
【０１９７】
[00246]本開示の方法、デバイス、及びシステムは、（例えば、テンプレートに相補的な伸長鎖へのヌクレオチドの組込み時での）個々のヌクレオチド組込み事象を正確に検出し得る。酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ）は、伸長しているポリヌクレオチド鎖にヌクレオチドを組み込み得る。本明細書で提供される酵素（例えばポリメラーゼ）は、ポリメラーゼ鎖を生成し得る。
【０１９８】
[00247]追加されるヌクレオチドは、対応するテンプレート核酸鎖に相補的であり得、このテンプレート核酸鎖は、伸長鎖にハイブリダイズされる（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））。ヌクレオチドは、このヌクレオチドの任意の位置に結合しているタグ（又はタグ種）を含み得、この位置として、このヌクレオチドのリン酸塩（例えばガンマリン酸塩）部分、糖部分、又は窒素塩基部分が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、タグは、ヌクレオチドタグの組込み中に、タグがポリメラーゼと会合している間に検出される。このタグは、ヌクレオチドの組込み、並びにその後のこのタグの切断及び／又は放出の後に、このタグがナノポアを通って移動するまで検出され続けられ得る。場合によっては、ヌクレオチド組込み事象により、ナノポアを通り抜けて検出されるヌクレオチドからタグが放出される。このタグは、ポリメラーゼにより放出され得るか、又は任意の適切な方法（例えば、限定されないが、このポリメラーゼの近くに位置する酵素による切断）で切断され得る／放出され得る。この方法では、組み込まれた塩基は同定され得（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ）、なぜならば、各タイプのヌクレオチド（即ち、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル）から固有のタグが放出されるからである。いくつかの状況下では、ヌクレオチド組込み事象はタグを放出しない。そのような場合では、組み込まれたヌクレオチドに結合しているタグは、ナノポアを用いて検出される。いくつかの例では、このタグは、ナノポアを通って移動し得るか、又はナノポアに近接して移動し得、且つナノポアを用いて検出され得る。
【０１９９】
[00248]本開示の方法及びシステムは、例えば、所与の期間内に少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、５００００個、又は１０００００個の核酸塩基（「塩基」）の分解能で、核酸組込み事象の検出を行い得る。いくつかの例では、ナノポアデバイスを使用して個々の核酸組込み事象を検出し、各事象は個々の核酸塩基と関連している。他の例では、ナノポアデバイスを使用して、複数個の塩基と関連している事象を検出する。例えば、このナノポアデバイスにより検知されたシグナルは、少なくとも２個、３個、４個、又は５個の塩基由来の統合シグナルであり得る。
【０２００】
[00249]いくつかの場合では、タグはナノポアを通り抜けない。このタグは、ナノポアにより検出されて、このナノポアを通り抜けることなくこのナノポアから出る（例えば、このタグがこのナノポアに入った方向とは逆の方向から出る）ことができる。このナノポアからこのタグが能動的に排出されるようにチップを構成し得る。
【０２０１】
[00250]いくつかの場合には、タグは、ヌクレオチド組込み事象時に放出されない。場合によっては、ヌクレオチド組込み事象は、ナノポアにタグを「提示する」（即ち、タグを放出しない）。このタグは、放出されることなくナノポアにより検出され得る。このタグは、検出のためにナノポアにこのタグを提示するのに十分な長さのリンカーにより、ヌクレオチドに付着していてもよい。
【０２０２】
[00251]ヌクレオチド組込み事象は、リアルタイムで（即ち、この組込み事象の発生と同時に）且つナノポアを用いて検出されてもよい。いくつかの場合では、このナノポアに付着しているか又は近接する酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノポアを通るか又はナノポアに隣接する核酸分子の流れを促進し得る。ヌクレオチド組込み事象又は複数個のヌクレオチドの組込みは、１個又は複数個のタグ種（又は本明細書における「タグ」）を放出し得るか又は提示し得、これらはナノポアにより検出され得る。タグがナノポアを通って流れるか又はナノポアに隣接して流れる時に、タグがナノポア中に滞留している時に、及び／又はタグがナノポアに提示されている時に、検出が起こり得る。場合によっては、ナノポアに付着しているか又は近接する酵素は、１個又は複数個のヌクレオチドの組込み時のタグの検出を補助し得る。
【０２０３】
[00252]本開示のタグは、原子又は分子であってもよいし、原子又は分子の集まりであってもよい。タグは、光学的な、電気化学的な、磁気的な、又は静電気的な（例えば、誘導的な、容量的な）特徴を示し得、この特徴はナノポアを用いて検出され得る。
【０２０４】
[00253]本明細書で説明されている方法は、単一分子の方法であってもよい。即ち、検出されるシグナルは、単一分子（即ち、単一のヌクレオチド組込み）により生成され、複数個のクローン分子からは生成されない。この方法は、ＤＮＡ増幅を必要としない場合がある。
【０２０５】
[00254]ヌクレオチド組込み事象は、複数種のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ（Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、又はウリジン（Ｕ）である））を含む混合物から発生してもよい。ヌクレオチド組込み事象は、必ずしも、単一タイプのヌクレオチド（例えばｄＡＴＰ）を含む溶液から発生しない。ヌクレオチド組込み事象は、必ずしも、複数種のヌクレオチドの交替溶液（例えば、ｄＡＴＰ、続いてｄＣＴＰ、続いてｄＧＴＰ、続いてｄＴＴＰ、続いてｄＡＴＰ）から発生しない。場合によっては、複数種のヌクレオチド（例えば、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ等の二量体）がリガーゼにより組み込まれる。
【０２０６】
核酸の同定及び配列決定の方法
[00255]核酸を配列決定する方法は、配列決定する核酸を有する生体サンプルを回収するステップと、この生体サンプルから核酸サンプルを抽出するか又は別の方法で単離するステップと、場合によっては、この核酸サンプルを、配列決定のために調製するステップとを含み得る。
【０２０７】
[00256]図１は、核酸サンプルを配列決定する方法を図示する。この方法は、生体サンプル（例えば、組織サンプル、液体サンプル）から核酸分子を単離するステップと、この核酸サンプルを、配列決定のために調製するステップとを含む。いくつかの場合では、この核酸サンプルを細胞から抽出する。核酸を抽出するための技術の例は、リゾチーム、超音波処理、抽出、高圧、又はこれらの任意の組み合わせの使用である。この核酸は、場合によっては細胞フリー核酸であり、細胞からの抽出を必要としない。
【０２０８】
[00257]場合によっては、核酸サンプルは、この核酸サンプルからタンパク質、細胞壁残屑、及び他の成分を除去するステップを含むプロセスにより、配列決定のために調製されてもよい。このことを達成するために、多くの市販品（例えばスピンカラム）が利用可能である。エタノール沈殿及び遠心分離を使用してもよい。
【０２０９】
[00258]核酸サンプルは、複数個のフラグメントに分割されてもよく（又は破砕されてもよく）、それにより、例えばアレイに複数個のナノポアを含むデバイスを用いた核酸配列決定が容易になり得る。しかしながら、配列決定する核酸分子の破砕は必須ではない場合がある。
【０２１０】
[00259]いくつかの場合には、長い配列が決定される（即ち、「ショットガン配列決定」法が必要ではない場合がある）。任意の適切な長さの核酸配列が決定されてもよい。例えば、少なくとも約５個、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約８００個、約１０００個、約１５００個、約２０００個、約２５００個、約３０００個、約３５００個、約４０００個、約４５００個、約５０００個、約６０００個、約７０００個、約８０００個、約９０００個、約１００００個、約２００００個、約４００００個、約６００００個、約８００００個、又は約１０００００個等の塩基が配列決定されてもよい。いくつかの場合には、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも８００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも２５００個、少なくとも３０００個、少なくとも３５００個、少なくとも４０００個、少なくとも４５００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１００００個、少なくとも２００００個、少なくとも４００００個、少なくとも６００００個、少なくとも８００００個、少なくとも１０００００個等の塩基が配列決定される。いくつかの場合には、配列決定される塩基は連続している。いくつかの場合には、配列決定される塩基は連続していない。例えば、所与の数の塩基が連続的に配列決定され得る。他の例では、１個又は複数個の配列決定される塩基が、配列情報が決定されていない及び／又は利用可能ではない１個又は複数個のブロックに分離されてもよい。いくつかの実施形態では、テンプレートを（例えば循環核酸テンプレートを使用して）複数回配列決定し得、場合によっては、冗長な配列情報が作成される。場合によっては、ソフトウェアを使用して配列を提供する。場合によっては、核酸サンプルを、配列決定の前に分割してもよい。いくつかの場合には、核酸サンプル鎖を処理して、所与の二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ領域を環状に作製し、この二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ領域の対応するセンス部分及びアンチセンス部分が、この環状ＤＮＡ又は環状ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に含まれてもよい。そのような場合には、そのような分子から配列決定された塩基は、データアセンブリ、及び塩基位置の読み取りのチェックを容易に可能にし得る。
【０２１１】
ナノポア配列決定及び分子検出
[00260]本明細書で提供されるのは、ナノポアを用いて核酸分子を配列決定するためのシステム及び方法である。このナノポアは、検知回路（例えば集積回路）の検知電極に隣接して配置された膜に形成されていてもよいし、又は別の方法で組み込まれていてもよい。この集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であってもよい。いくつかの例では、この集積回路は、電界効果トランジスタ又は相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。この検知回路は、このナノポアを有するチップ又は他のデバイスに位置していてもよいし、外部配置等のチップ又はデバイスの外に位置していてもよい。半導体は、任意の半導体（例えば、限定されないが、ＩＶ群半導体（例えばシリコン）及びＩＩＩ−Ｖ群半導体（例えばガリウムヒ素））であり得る。
【０２１２】
[00261]場合によっては、核酸又はタグがナノポアを通って流れるか又はナノポアに隣接して流れる場合に、検知回路は、この核酸又はタグと関連する電気シグナルを検出する。この核酸は、より大きな鎖のサブユニットであってもよい。このタグは、ヌクレオチド組込み事象の副生成物であってもよいし、タグ付き核酸と、ナノポア又はナノポアに隣接する種（例えば、核酸からタグを切断する酵素）との間の他の相互作用の副生成物であってもよい。このタグは、ヌクレオチドに付着したままであってもよい。検出されたシグナルは収集され、メモリ位置に保存され、後に核酸の配列を構築するために使用され得る。収集されたシグナルを処理して、検出したシグナル中の任意の異常（例えばエラー）を説明してもよい。
【０２１３】
[00262]図２は、参照により本明細書に全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１９３５７０号明細書で説明されている方法に従って調製され得るような、温度コントロールを有するナノポア検出器（又はセンサー）の一例を示す。図２Ａを参照すると、このナノポア検出器は、導電性溶液（例えば塩溶液）２０７と接触している上部電極２０１を含む。底部導電性電極２０２は、ナノポア２０６に近いか、隣接しているか、又は近接しており、ナノポア２０６は膜２０５に挿入されている。場合によっては、底部導電性電極２０２は、電気回路が半導体基板２０４に埋め込まれている半導体２０３に埋め込まれている。半導体２０３の表面は、疎水性であるように処理されていてもよい。検出されるサンプルは、ナノポア２０６中の孔を通り抜ける。半導体チップセンサーはパッケージ２０８中に置かれており、次いで、このパッケージ２０８は、温度コントロール要素２０９の近くにある。温度コントロール要素２０９は、熱電加熱デバイス及び／又は冷却デバイス（例えばＰｅｌｔｉｅｒデバイス）であってもよい。複数個のナノポア検出器がナノポアアレイを形成してもよい。
【０２１４】
[00263]図２Ｂを参照すると、同様の数字は同様の要素を表し、膜２０５はウェル２１０上に配置され得、センサー２０２はこのウェルの表面の一部を形成する。図２Ｃは、電極２０２が、処理された半導体表面２０２から突出している一例を示す。
【０２１５】
[00264]いくつかの例では、膜２０５は底部導電性電極２０２上に形成されており、半導体２０３上には形成されていない。そのような場合には、膜２０５は、底部導電性電極２０２と結合相互作用を形成してもよい。しかしながら、場合によっては、膜２０５は、底部導電性電極２０２及び半導体２０３の上に形成されている。代替として、膜２０５は、半導体２０３上に形成され得て底部導電性電極２０３上には形成され得ないが、底部導電性電極２０２の上に延びていてもよい。
【０２１６】
[00265]場合によっては電極検出により、ナノポアを使用して核酸分子を間接的に配列決定してもよい。間接的な配列決定は、伸長鎖に組み込まれたヌクレオチドがナノポアを通過しない任意の方法であり得る。この核酸分子は、ナノポアから任意の適切な距離内を、及び／又はナノポアに近接して、場合によっては、ヌクレオチド組込み事象から放出されたタグがナノポア中で検出されるような距離内を、通る場合がある。
【０２１７】
[00266]ヌクレオチド組込み事象の副生成物を、ナノポアにより検出してもよい。「ヌクレオチド組込み事象」とは、伸長しているポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの組込みのことである。副生成物は、所与のタイプのヌクレオチドの組込みと相関していてもよい。ヌクレオチド組込み事象は通常、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素により触媒され、各位置における組込みのために利用可能なヌクレオチドの中から選択すべく、テンプレート分子との塩基対相互作用を使用する。
【０２１８】
[00267]核酸サンプルを、タグが付いたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を使用して配列決定してもよい。いくつかの例では、核酸分子を配列決定する方法は、（ａ）タグ付きヌクレオチドを組み込む（例えば重合する）ステップであって、個々のヌクレオチドと会合しているタグが組込み時に放出される、ステップと、（ｂ）ナノポアを用いて、放出されたタグを検出するステップとを含む。いくつかの場合には、この方法は、個々のヌクレオチドに付着しているか又は個々のヌクレオチドから放出されたタグを、ナノポアを通って導くステップをさらに含む。放出されたか又は付着しているタグを任意の適切な技術により導いてもよく、場合によっては、酵素（若しくは分子モーター）及び／又は孔の両端の電圧差を用いて導いてもよい。或いは、放出されたか又は付着しているタグを、酵素を使用することなくナノポアを通って導いてもよい。例えば、このタグを、本明細書で説明されているように、ナノポアの両端の電圧差により導いてもよい。
【０２１９】
プレロードされるタグによる配列決定
[00268]ナノポア中にロードされることなく放出されたタグは、このナノポアから拡散して、このナノポアから検出され得ない。これにより、核酸分子の配列決定においてエラーが生じる場合がある（例えば、核酸の位置を見落とす、又は間違った順序でタグを検出する）。本明細書で提供されるのは、核酸分子を配列決定する方法であって、タグがヌクレオチドから放出される前にタグ分子がナノポア中に「プレロード」される、方法である。プレロードされたタグは、プレロードされていないタグと比べて、ナノポアにより検出される可能性がはるかに高まり得る（例えば、少なくとも約１００倍高い可能性）。また、タグのプレロードにより、タグ付きヌクレオチドが、伸長している核酸鎖に組み込まれているかどうかを決定するためのアプローチが提供される。組み込まれているヌクレオチドと会合しているタグは、組み込まれることなくナノポアを通り抜ける（及びナノポアにより検出される）タグ（例えば、平均約１ミリ秒（ｍｓ）未満）と比べて、長い期間（例えば、平均少なくとも５０ｍｓ）にわたりナノポアと会合し得る。いくつかの例では、組み込まれているヌクレオチドと会合しているタグは、少なくとも約１ミリ秒（ｍｓ）、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、又は２５０ｍｓ超の平均期間にわたり、ナノポアと会合し得るか、又はナノポアに隣接する酵素（例えばポリメラーゼ）に保持され得るか、若しくは別の方法でこの酵素に結合し得る。いくつかの例では、組み込まれているヌクレオチドと関連するタグシグナルは、平均検出存続期間が少なくとも約１ミリ秒（ｍｓ）、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、又は２５０ｍｓ超であり得る。タグは、結合している、組み込まれるヌクレオチドに結合していてもよい。組み込まれているヌクレオチドに起因する平均検出存続期間と比べて平均検出存続期間が短いタグシグナル（例えば、約１ｍｓ未満）は、このタグに結合している、組み込まれていないヌクレオチドに起因している場合がある。場合によっては、少なくとも「ｘ」の平均検出存続期間は、組み込まれているヌクレオチドに起因し得、且つ「ｘ」未満の平均検出存続期間は、組み込まれていないヌクレオチドに起因し得る。いくつかの例では、「ｘ」は、０．１ｍｓ、１ｍｓ、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、１００ｍｓ、１秒であり得る。
【０２２０】
[00269]タグを、膜中に少なくとも１個のナノポアを有するナノポアデバイスを用いて検出してもよい。このタグは、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、この個々のタグ付きヌクレオチドと会合していてもよい。本明細書で提供される方法は、ナノポアを用いて、１個又は複数個の組み込まれていない個々のタグ付きヌクレオチドと会合している１個又は複数個のタグから、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを区別するステップを含み得る。場合によっては、このナノポアデバイスは、組込みの最中に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出する。タグ付きヌクレオチド（伸長している核酸鎖に組み込まれているか、又は組み込まれていない）は、このナノポアデバイスにより（場合によっては、このナノポアデバイスの電極及び／又はナノポアを用いて）、所与の期間にわたり、検出されるか、決定されるか、又は区別される。このナノポアデバイスがタグを検出する期間は、タグ及び／又はこのタグに結合しているヌクレオチドが酵素（例えば、核酸鎖へのヌクレオチドの組込みを容易にする酵素（例えばポリメラーゼ））により保持される期間と比べて、短くてもよく、場合によっては実質的に短くてもよい。いくつかの例では、タグは、組み込まれているタグ付きヌクレオチドが酵素と会合している期間内に電極により複数回検出され得る。例えば、タグは、組み込まれているタグ付きヌクレオチドが酵素と会合している期間内に、電極により少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、２００回、３００回、４００回、５００回、１０００回、１０，０００回、１００，０００回、又は１，０００，０００回検出され得る。
【０２２１】
[00270]検出時間又は検出の平均時間のあらゆる列挙は、ある割合の、述べた時間又は平均時間を上回るか又は下回る検出時間を許容する場合がある。場合によっては、複数個の核酸塩基を配列決定する場合の検出時間は、統計的に分布している（例えば、指数分布又はＧａｕｓｓｉａｎ分布）。指数分布は、例えば図１８に示すように、平均検出時間を下回る比較的大きな割合の検出時間を有し得る。
【０２２２】
[00271]いくつかの例では、タグをプレロードすることは、タグがヌクレオチドに付着している間に、ナノポアの少なくとも一部を通るようにタグの少なくとも一部を導くことを含み、このヌクレオチドは、核酸鎖（例えば、伸長している核酸鎖）に組み込まれているか、核酸鎖への組込みを受けているか、又は核酸鎖にまだ組み込まれていないが核酸鎖への組込みを受ける可能性がある。いくつかの例では、タグをプレロードすることは、ヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれる前に、又はヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれている最中に、ナノポアの少なくとも一部を通るようにタグの少なくとも一部を導くことを含む。場合によっては、タグをプレロードすることは、ヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれた後に、ナノポアの少なくとも一部を通るようにタグの少なくとも一部を導くことを含み得る。
【０２２３】
[00272]図３は、本方法の主要な構成要素を示す。ここで、ナノポア３０１は膜３０２中に形成されている。このナノポアには、酵素３０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ）が会合している。場合によっては、この酵素は、下記で説明するようにナノポアに共有結合で付着している。このポリメラーゼは、配列決定する一本鎖核酸分子３０４と会合している。この一本鎖各鎖分子は、いくつかの場合では環状であるが、このことは必須ではない。場合によっては、この核酸分子は直線状である。いくつかの実施形態では、この核酸分子の一部には核酸プライマー３０５がハイブリダイズしている。場合によっては、このプライマーは、（例えば、環状テンプレートの周りを最初に回った後に、取り換えられた、新たに生成された核酸鎖がナノポアを通ることを防止するために）ヘアピンを有する。ポリメラーゼは、テンプレートとして一本鎖核酸分子を使用して、プライマー上へのヌクレオチドの組込みを触媒する。ヌクレオチド３０６は、本明細書で説明されているようなタグ種（「タグ」）３０７を含む。
【０２２４】
[00273]図４は、「プレロードされる」タグを用いて核酸を配列決定する方法を示す。パートＡは、図３で説明されている主要な構成要素を示す。パートＣは、ナノポア中にロードされたタグを示す。「ロードされる」タグは、適切な時間（例えば、少なくとも０．１ミリ秒（ｍｓ）、少なくとも１ｍｓ、少なくとも５ｍｓ、少なくとも１０ｍｓ、少なくとも５０ｍｓ、少なくとも１００ｍｓ、又は少なくとも５００ｍｓ、又は少なくとも１０００ｍｓ）にわたり、ナノポア中に位置し、及び／又はナノポア中か若しくはナノポア付近に留まるものであり得る。場合によっては、「プレロードされる」タグは、ヌクレオチドから放出される前にナノポアにロードされる。いくつかの場合には、タグが、ヌクレオチド組込み事象時に放出された後にナノポアを通り抜ける（及び／又はナノポアにより検出される）可能性が適切に高い（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、又は少なくとも９９．９９９％）場合には、このタグはプレロードされる。
【０２２５】
[00274]パートＡからパートＢへの推移では、ヌクレオチドは、ポリメラーゼと会合するようになっている。会合しているヌクレオチドは、一本鎖核酸分子と塩基対を形成する（例えば、ＡとＴ、及びＧとＣ）。多くのヌクレオチドが、一本鎖核酸分子と塩基対を形成しないポリメラーゼと一時的に会合するようになる場合があることが認識される。対形成しないヌクレオチドはポリメラーゼにより拒絶され得、通常は、ヌクレオチドが塩基対を形成する場合にのみ、ヌクレオチドの組込みが進行する。対形成しないヌクレオチドは、通常は、正確に対形成したヌクレオチドがポリメラーゼと会合したままである時間スケールと比べて短い時間スケール内で拒絶される。対形成しないヌクレオチドは、少なくとも約１００ナノ秒（ｎｓ）、１ｍｓ、１０ｍｓ、１００ｍｓ、１秒の期間（平均）内に拒絶され得るが、正確に対形成したヌクレオチドは、より長い期間（例えば、少なくとも約１ミリ秒（ｍｓ）、１０ｍｓ、１００ｍｓ、１秒、又は１０秒の平均期間）にわたりポリメラーゼと会合したままである。図４のパートＡ及びパートＢの間にナノポアを通り抜ける電流は、場合によっては３〜３０ピコアンペア（ｐＡ）であってもよい。
【０２２６】
[00275]図４、パートＣは、ナノポアへのポリメラーゼの結合を示す。このポリメラーゼは、ナノポアが存在する膜又はナノポアに印加される電圧（例えば、ＤＣ電圧又はＡＣ電圧）により、ナノポアに引き寄せられてもよい。同様に、図１７もナノポアへのポリメラーゼの結合を示し、この場合には、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ）とアルファ−溶血素ナノポアとの結合である。タグは、電気力（例えば、膜及び／又はナノポアに印加される電圧により生じた電場の存在下で生じた力）による結合の最中に、ナノポアに引き込まれ得る。いくつかの実施形態では、図４のパートＣの最中にナノポアを通って流れる電流は、約６ｐＡ、約８ｐＡ、約１０ｐＡ、約１５ｐＡ、又は約３０ｐＡである。ポリメラーゼは、伸長している核酸鎖分子にヌクレオチドを組み込むため、及びタグ分子を放出するために、異性化及びリン酸転移反応を受ける。
【０２２７】
[00276]パートＤでは、ナノポアを通り抜けるタグが示されている。このタグは、本明細書で記載されているようにナノポアにより検出される。このサイクル（即ち、パートＡ〜Ｅ、又はＡ〜Ｆ）を繰り返すことにより、核酸分子の配列決定が可能となる。
【０２２８】
[00277]場合によっては、伸長している核酸分子に組み込まれていないタグ付きヌクレオチドも、図４のパートＦに示すようにナノポアを通り抜ける。この組み込まれていないヌクレオチドは、場合によってはナノポアにより検出される可能性があるが、この方法は、ヌクレオチドがナノポア中で検出される時間に少なくとも部分的に基づいて、組み込まれているヌクレオチドと組み込まれていないヌクレオチドとを識別する手段を提供する。組み込まれていないヌクレオチドに結合しているタグはナノポアを迅速に通り抜け、短い期間（例えば１００ｍｓ未満）にわたり検出されるが、組み込まれているヌクレオチドに結合しているタグはナノポア中にロードされ、長い期間（例えば少なくとも１００ｍｓ）にわたり検出される。
【０２２９】
[00278]いくつかの実施形態では、この方法は、タグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の長さに基づいて、組み込まれている（例えば重合した）タグ付きヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別する。このタグは、組み込まれてない場合と比べて、組み込まれている場合に長い時間にわたりナノポアに近接して留まり得る。いくつかの場合には、ポリメラーゼを変異させて、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグ付きヌクレオチドとの間の時間差を増加させる。組み込まれていないタグがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、任意の適切な値であり得る。いくつかの実施形態では、組み込まれていないタグがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれているタグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、約１．５、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、又は約１０００である。いくつかの実施形態では、組み込まれていないタグがナノポアにより検出される時間に対する、組み込まれている（例えば重合した）タグ付きヌクレオチドがナノポアにより検出される時間の比率は、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１４、少なくとも約１６、少なくとも約１８、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、又は少なくとも約１０００である。
【０２３０】
[00279]タグがナノポア中にロードされる（及び／又はナノポアにより検出される）時間は、任意の適切な値である。場合によっては、タグは、平均して約１０ミリ秒（ｍｓ）、約２０ｍｓ、約３０ｍｓ、約４０ｍｓ、約５０ｍｓ、約６０ｍｓ、約８０ｍｓ、約１００ｍｓ、約１２０ｍｓ、約１４０ｍｓ、約１６０ｍｓ、約１８０ｍｓ、約２００ｍｓ、約２２０ｍｓ、約２４０ｍｓ、約２６０ｍｓ、約２８０ｍｓ、約３００ｍｓ、約４００ｍｓ、約５００ｍｓ、約６００ｍｓ、約８００ｍｓ、又は約１０００ｍｓにわたり、ナノポアにより検出される。いくつかの場合には、タグは、平均して少なくとも約１０ミリ秒（ｍｓ）、少なくとも約２０ｍｓ、少なくとも約３０ｍｓ、少なくとも約４０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約６０ｍｓ、少なくとも約８０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、少なくとも約１２０ｍｓ、少なくとも約１４０ｍｓ、少なくとも約１６０ｍｓ、少なくとも約１８０ｍｓ、少なくとも約２００ｍｓ、少なくとも約２２０ｍｓ、少なくとも約２４０ｍｓ、少なくとも約２６０ｍｓ、少なくとも約２８０ｍｓ、少なくとも約３００ｍｓ、少なくとも約４００ｍｓ、少なくとも約５００ｍｓ、少なくとも約６００ｍｓ、少なくとも約８００ｍｓ、又は少なくとも約１０００ｍｓにわたり、ナノポアにより検出される。
【０２３１】
[00280]いくつかの例では、少なくとも約１ｍｓ、少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約８０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、少なくとも約１２０ｍｓ、少なくとも約１４０ｍｓ、少なくとも約１６０ｍｓ、少なくとも約１８０ｍｓ、少なくとも約２００ｍｓ、少なくとも約２２０ｍｓ、少なくとも約２４０ｍｓ、又は少なくとも約２６０ｍｓの期間にわたりシグナルを生成するタグは、テンプレートの少なくとも一部に相補的な伸長鎖に組み込まれているヌクレオチドに起因する。場合によっては、約１００ｍｓ未満、約８０ｍｓ未満、約６０ｍｓ未満、約４０ｍｓ未満、約２０ｍｓ未満、約１０ｍｓ未満、約５ｍｓ未満、又は約１ｍｓ未満の期間にわたりシグナルを生成するタグは、伸長鎖に組み込まれていないヌクレオチドに起因する。
【０２３２】
[00281]核酸分子は、（図５に示すように）直線状であり得る。場合によっては、図３に示すように、核酸分子３０４は環状である（例えば、環状ＤＮＡ、環状ＲＮＡ）。環状化（例えば一本鎖）核酸を、複数回配列決定し得る（例えば、ポリメラーゼ３０３は、この環を完全に周回し、テンプレートの再配列決定部位を出発する）。環状ＤＮＡは、一緒にライゲートされる同一のゲノム位置に対して、センス鎖及びアンチセンス鎖であってもよい（場合によっては、より頑強で正確な読み取りが行われるのが可能になる）。環状核酸は、適切な精度（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、又は少なくとも９９．９９％の精度）が達されるまで配列決定され得る。場合によっては、核酸は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１２回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも１００回、又は少なくとも１０００回配列決定される。
【０２３３】
[00282]ある態様では、本明細書で説明されている方法及びデバイスは、組み込まれていないヌクレオチドと比べて長い期間にわたりナノポアにより検出される及び／又は検出可能である、組み込まれているヌクレオチドに部分的に基づいて、組み込まれているヌクレオチドと、組み込まれていないヌクレオチドとを識別する。いくつかの場合では、配列決定される核酸鎖にハイブリダイズした第２の核酸鎖（二本鎖核酸）の移動により、組み込まれているヌクレオチドの検出と、組み込まれていないヌクレオチドの検出との間の時間差が増加する。図３を参照すると、第１の配列決定の後、ポリメラーゼは二本鎖核酸と遭遇し得（例えば、プライマー３０５と遭遇した時から始まる）、第２の核酸鎖は、配列決定を継続するためにテンプレートから移動される必要があり得る。この移動により、テンプレートが一本鎖である場合と比べて、ポリメラーゼが減速され得、及び／又はヌクレオチド組込み事象の速度が低下し得る。
【０２３４】
[00283]いくつかの場合には、テンプレート核酸分子は、一本鎖テンプレートへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション由来の二本鎖である。図２５は、複数個のオリゴヌクレオチド２５００がハイブリダイズしている例を示す。示されている方向２５０２でのポリメラーゼ２５０１の進行により、テンプレートからオリゴヌクレオチドが移動する。ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドが存在しなかった場合と比べて緩やかに進行し得る。場合によっては、本明細書で説明されているオリゴヌクレオチドの使用により、組み込まれていないヌクレオチドと比べて長い期間にわたりナノポアにより検出される及び／又は検出可能である、組み込まれているヌクレオチドに部分的に基づいて、組み込まれているヌクレオチドと、組み込まれていないヌクレオチドとの間の分解能が改善される。オリゴヌクレオチドは任意の適切な長さであり得る（例えば、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１２個、約１４個、約１６個、約１８個、又は約２０個の塩基長）。オリゴヌクレオチドは、天然塩基（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及び／又はウラシル（Ｕ））、ユニバーサル塩基（例えば、５−ニトロインド−ル、３−ニトロピロール、３−メチル７−プロピニルイソカルボスチリル（ＰＩＭ）、３−メチルイソカルボスチリル（ＭＩＣＳ）、及び／又は５−メチルイソカルボスチリル（５ＭＩＣＳ））、又は任意の割合でのこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０２３５】
[00284]場合によっては、核酸ポリメラーゼは、非メチル化核酸テンプレートと比べて、メチル化核酸テンプレートと共に緩やかに進行する。ある態様では、本明細書で説明されている方法及び／又はデバイスは、メチル化核酸を使用する、及び／又は核酸分子をメチル化する。場合によっては、メチル基は、シトシンピリミジン環の５位及び／又はアデニンプリン環の６番窒素に存在し、及び／又はこれらに付加される。配列決定する核酸は、核酸をメチル化する生物から単離されてもよい。場合によっては、核酸は、（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素を使用することにより）インビトロでメチル化され得る。時間をかけて、非メチル化塩基からメチル化塩基を区別して使用してもよい。これによりエピジェネティクス研究が可能となり得る。
【０２３６】
[00285]場合によっては、メチル化塩基は、特徴的な電流又は電流／時間プロットの特徴的な形状に基づいて、非メチル化塩基から識別可能である。例えば、タグ付きヌクレオチドは、（例えば、ポリメラーゼにおける立体配座の差異に起因して）核酸テンプレートが所与の位置でメチル化塩基を有するかどうかに応じて、様々な遮断電流を発生させ得る。場合によっては、Ｃ塩基及び／又はＡ塩基がメチル化されており、対応するＧタグ付きヌクレオチド及び／又はＴタグ付きヌクレオチドの組込みにより電流が変化する。
【０２３７】
核酸の配列決定用の酵素
[00286]本方法は、酵素（例えば、ポリメラーゼ、転写酵素、又はリガーゼ）を使用して、本明細書で説明されているナノポア及びタグ付きヌクレオチドにより、核酸分子を配列決定し得る。場合によっては、この方法は、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）を用いてタグ付きヌクレオチドを組み込む（例えば重合する）ステップを含む。場合によっては、このポリメラーゼは変異しており、タグ付きヌクレオチドを受容する。このポリメラーゼはまた、変異されて、タグがナノポアにより検出される時間（例えば、図４のパートＣの時間）を増加させ得る。
【０２３８】
[00287]いくつかの実施形態では、この酵素は、ヌクレオチドのリン酸塩連結により核酸鎖を生成するあらゆる酵素である。場合によっては、ＤＮＡポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ若しくはそのバリアント、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（ｅｘｏ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９Ｖ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｂｃｔポリメラーゼ、又はこれらのバリアント、変異体、若しくは相同体である。相同体は、任意の適切な割合の相同性（例えば、限定されないが、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性）を有し得る。
【０２３９】
[00288]図３を参照すると、酵素３０３はナノポア３０１に付着していてもよい。ナノポアへの酵素の付着のための適切な方法として、分子内ジスルフィド結合の形成等の架橋が挙げられる。このナノポア及び酵素はまた、融合タンパク質（即ち、単一のポリペプチド鎖によりコードされる）であってもよい。融合タンパク質を製造する方法は、酵素のコード配列を、（間にストップコドンを伴うことなく）ナノポアのコード配列にインフレームで且つ隣接して融合させるステップと、この融合配列を単一のプロモーターから発現させるステップとを含み得る。いくつかの例では、酵素３０３は、分子ステープル又はタンパク質フィンガーを使用して、ナノポア３０１に付着していてもよいし別の方法でナノポア３０１に結合していてもよい。場合によっては、酵素は、中間分子を介して付着している（例えば、酵素に及びナノポアの両方にビオチンが結合し、両方のビオチンにストレプトアビジン四量体が連結される）。酵素はまた、抗体と共にナノポアに付着され得る。場合によっては、互いの間に共有結合を形成するタンパク質（例えば、ＳｐｙＴａｇ（商標）／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（商標）システム）を使用して、ナノポアにポリメラーゼを付着させる。場合によっては、ナノポアには、ホスファターゼ酵素、又はヌクレオチドからタグを切断する酵素も付着している。
【０２４０】
[00289]ＤＮＡポリメラーゼは、いくつかの場合にはｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼである。このポリメラーゼを変異させて、変異していないポリメラーゼと比べて、伸長している核酸分子へのタグ付きヌクレオチドの組み込みを容易にし得、及び／又はこの組込みに関するこの変異ポリメラーゼの効率を改善させ得る。このポリメラーゼを変異させて、ポリメラーゼの活性部位領域へのヌクレオチド類似体（例えばタグ付きヌクレオチド）の移行を改善し得、及び／又はこの活性領域におけるこのヌクレオチド類似体を配位させ得る。
【０２４１】
[00290]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ヌクレオチド類似体（例えばＶｅｎｔＡ  ４８８Ｌ）を受容するポリメラーゼの活性領域に対して相同（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のアミノ酸位置が同一）であるアミノ酸配列を有する活性領域を有する。
【０２４２】
[00291]ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼの適切な変異として下記が挙げられるが、これらに限定されない：残基５０５〜５２５の欠失、残基５０５〜５２５内の欠失、Ｋ１３５Ａ変異、Ｅ３７５Ｈ変異、Ｅ３７５Ｓ変異、Ｅ３７５Ｋ変異、Ｅ３７５Ｒ変異、Ｅ３７５Ａ変異、Ｅ３７５Ｑ変異、Ｅ３７５Ｗ変異、Ｅ３７５Ｙ変異、Ｅ３７５Ｆ変異、Ｅ４８６Ａ変異、Ｅ４８６Ｄ変異、Ｋ５１２Ａ変異、及びこれらの組み合わせ。場合によっては、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｌ３８４Ｒ変異をさらに含む。適切なＤＮＡポリメラーゼは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９５０５号明細書で説明されている。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、変異Ｎ６２Ｄ、Ｌ２５３Ａ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４８４Ｅ、及び／又はＫ５１２Ｙを有するｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０２４３】
[00292]ｐｈｉ２９  ポリメラーゼへの適切な変異は、タグ付きヌクレオチドの組込みの改善を付与する変異に限定されない。他の変異（例えば、アミノ酸の置換、挿入、欠失、及び／又は外因性の特徴）も、変異されていない（野生型）ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼと比べて、限定されないが、金属イオン配位の増加、エキソヌクレアーゼ活性の低下、ポリメラーゼ動的サイクルの１つ又は複数のステップでの反応速度の低下、分枝率の減少、補因子選択性の変更、収率の増加、熱安定性の増加、精度の増加、速度の増加、読み取り長の増加、耐塩性の増加、及び同類のものを付与し得る。
【０２４４】
[00293]ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼへの適切な変異として下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ｅ３７５位での変異、Ｋ５１２位での変異、並びにＬ２５３、Ａ４８４、Ｖ２５０、Ｅ２３９、Ｙ２２４、Ｙ１４８、Ｅ５０８、及びＴ３６８からなる群から選択される１箇所又は複数箇所の位置での変異。
【０２４５】
[00294]いくつかの実施形態では、Ｅ３７５位での変異は、Ｅ３７５Ｙ、Ｅ３７５Ｆ、Ｅ３７５Ｒ、Ｅ３７５Ｑ、Ｅ３７５Ｈ、Ｅ３７５Ｌ、Ｅ３７５Ａ、Ｅ３７５Ｋ、Ｅ３７５Ｓ、Ｅ３７５Ｔ、Ｅ３７５Ｃ、Ｅ３７５Ｇ、及びＥ３７５Ｎからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの場合には、Ｋ５１２位での変異は、Ｋ５１２Ｙ、Ｋ５１２Ｆ、Ｋ５１２Ｉ、Ｋ５１２Ｍ、Ｋ５１２Ｃ、Ｋ５１２Ｅ、Ｋ５１２Ｇ、Ｋ５１２Ｈ、Ｋ５１２Ｎ、Ｋ５１２Ｑ、Ｋ５１２Ｒ、Ｋ５１２Ｖ、及びＫ５１２Ｈからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、Ｅ３７５位での変異はＥ３７５Ｙ置換を含み、且つＫ５１２位での変異はＫ５１２Ｙ置換を含む。
【０２４６】
[00295]場合によっては、変異型ｐｈｉ２９ポリメラーゼは、Ｌ２５３Ａ、Ｌ２５３Ｃ、Ｌ２５３Ｓ、Ａ４８４Ｅ、Ａ４８４Ｑ、Ａ４８４Ｎ、Ａ４８４Ｄ、Ａ４８４Ｋ、Ｖ２５０Ｉ、Ｖ２５０Ｑ、Ｖ２５０Ｌ、Ｖ２５０Ｍ、Ｖ２５０Ｃ、Ｖ２５０Ｆ、Ｖ２５０Ｎ、Ｖ２５０Ｒ、Ｖ２５０Ｔ、Ｖ２５０Ｙ、Ｅ２３９Ｇ、Ｙ２２４Ｋ、Ｙ２２４Ｑ、Ｙ２２４Ｒ、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ１４８Ａ、Ｙ１４８Ｋ、Ｙ１４８Ｆ、Ｙ１４８Ｃ、Ｙ１４８Ｄ、Ｙ１４８Ｅ、Ｙ１４８Ｇ、Ｙ１４８Ｈ、Ｙ１４８Ｋ、Ｙ１４８Ｌ、Ｙ１４８Ｍ、Ｙ１４８Ｎ、Ｙ１４８Ｐ、Ｙ１４８Ｑ、Ｙ１４８Ｒ、Ｙ１４８Ｓ、Ｙ１４８Ｔ、Ｙ１４８Ｖ、Ｙ１４８Ｗ、Ｅ５０８Ｒ、及びＥ５０８Ｋからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【０２４７】
[00296]いくつかの場合には、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ５１０、Ｅ５１５、及びＦ５２６からなる群から選択される１箇所又は複数箇所での変異を含む。この変異は、Ｄ５１０Ｋ、Ｄ５１０Ｙ、Ｄ５１０Ｒ、Ｄ５１０Ｈ、Ｄ５１０Ｃ、Ｅ５１５Ｑ、Ｅ５１５Ｋ、Ｅ５１５Ｄ、Ｅ５１５Ｈ、Ｅ５１５Ｙ、Ｅ５１５Ｃ、Ｅ５１５Ｍ、Ｅ５１５Ｎ、Ｅ５１５Ｐ、Ｅ５１５Ｒ、Ｅ５１５Ｓ、Ｅ５１５Ｔ、Ｅ５１５Ｖ、Ｅ５１５Ａ、Ｆ５２６Ｌ、Ｆ５２６Ｑ、Ｆ５２６Ｖ、Ｆ５２６Ｋ、Ｆ５２６Ｉ、Ｆ５２６Ａ、Ｆ５２６Ｔ、Ｆ５２６Ｈ、Ｆ５２６Ｍ、Ｆ５２６Ｖ、及びＦ５２６Ｙからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含み得る。本開示の方法により使用され得るＤＮＡポリメラーゼの例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／００３４６０２号明細書で説明されている。
【０２４８】
[00297]ポリメラーゼは、ナノポアによるタグの検出に適している動態的速度プロファイルを有し得る。この速度プロファイルは、ヌクレオチド組込みの全体的な速度を指し得、及び／又はヌクレオチド組込みの任意のステップ（例えば、ヌクレオチド付加、例えば閉鎖状態に対する若しくは閉鎖状態からの酵素的異性化、補因子の結合又は放出、生成物の放出、伸長している核酸への核酸の組込み、又は転座）の速度を指し得る。
【０２４９】
[00298]本開示のシステムにより、配列決定と関連する１つ又は複数の事象の検出が可能となり得る。この事象は、動態的に観察可能であり得、及び／又は非動態的に観察可能であり得る（例えば、ポリメラーゼと接触することなく、ナノポアを通って遊走するヌクレオチド）。
【０２５０】
[00299]ポリメラーゼは、配列決定事象の検出が可能となるように適合され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼの速度プロファイルは、タグが、平均で約０．１ミリ秒（ｍｓ）、約１ｍｓ、約５ｍｓ、約１０ｍｓ、約２０ｍｓ、約３０ｍｓ、約４０ｍｓ、約５０ｍｓ、約６０ｍｓ、約８０ｍｓ、約１００ｍｓ、約１２０ｍｓ、約１４０ｍｓ、約１６０ｍｓ、約１８０ｍｓ、約２００ｍｓ、約２２０ｍｓ、約２４０ｍｓ、約２６０ｍｓ、約２８０ｍｓ、約３００ｍｓ、約４００ｍｓ、約５００ｍｓ、約６００ｍｓ、約８００ｍｓ、又は約１０００ｍｓにわたり、ナノポア中にロードされる（及び／又はナノポアにより検出される）ようなものであり得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼの速度プロファイルは、タグが、平均して少なくとも約５ミリ秒（ｍｓ）、少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約２０ｍｓ、少なくとも約３０ｍｓ、少なくとも約４０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約６０ｍｓ、少なくとも約８０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、少なくとも約１２０ｍｓ、少なくとも約１４０ｍｓ、少なくとも約１６０ｍｓ、少なくとも約１８０ｍｓ、少なくとも約２００ｍｓ、少なくとも約２２０ｍｓ、少なくとも約２４０ｍｓ、少なくとも約２６０ｍｓ、少なくとも約２８０ｍｓ、少なくとも約３００ｍｓ、少なくとも約４００ｍｓ、少なくとも約５００ｍｓ、少なくとも約６００ｍｓ、少なくとも約８００ｍｓ、又は少なくとも約１０００ｍｓにわたり、ナノポア中にロードされる（及び／又はナノポアにより検出される）ようなものであり得る。いくつかの場合には、タグは、平均して約８０ｍｓ〜２６０ｍｓ、約１００ｍｓ〜２００ｍｓ、又は約１００ｍｓ〜１５０ｍｓにわたり、ナノポアにより検出される。
【０２５１】
[00300]場合によっては、ポリメラーゼ反応は、ヌクレオチド又はポリリン酸生成物がポリメラーゼ酵素に結合している中間体から進行する２つの動態的ステップと、ヌクレオチド及びポリリン酸生成物がポリメラーゼ酵素に結合していない中間体から進行する２つの動態的ステップとを示す。これらの２つの動態的ステップは、酵素異性化、ヌクレオチド組込み、及び生成物の放出を含み得る。場合によっては、これらの２つの動態的ステップは、テンプレートの転座及びヌクレオチドの結合である。
【０２５２】
[00301]図１８は、１つの動態的ステップが存在する場合には、滞留時間としてのナノポア中でのタグの所与の滞留時間の指数関数的な減少の可能性が増加し得１８００、ナノポア中でのタグの滞留時間が短くなる可能性（従って、ナノポアにより検出されない可能性）が比較的高い分布１８０１が生じることを示す。図１８はまた、２つ以上の動態的ステップ（例えば、観察可能な又は「遅い」ステップ）が存在する場合１８０２には、ナノポア中でのタグの非常に早い滞留時間の可能性は、１つの遅いステップを有する場合１８０１と比較して比較的低い１８０３ことも示す。換言すると、２つの指数関数の追加により、ガウス関数又はガウス分布１８０２を得ることができる。加えて、２つの遅いステップに関する確率分布は、滞留時間に対する確率密度のプロットにおいてピークを示す１８０２。このタイプの滞留時間分布は、本明細書で説明されている核酸の配列決定に対して有利であり得る（例えば、組み込まれたタグの高い割合を検出することが望ましい場合）。比較的多いヌクレオチド組込み事象により、分単位よりも長い期間にわたりナノポア中にタグがロードされる（Ｔｍｉｎ、これは、いくつかの場合には１００ｍｓ超であり得る）。
【０２５３】
[00302]場合によっては、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを野生型酵素に対して変異させて、２つの動態的に遅いステップを得る、及び／又はナノポアによるタグの検出に適している速度プロファイルを得る。場合によっては、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼは、４８４位、１９８位、及び３８１位から選択される少なくとも１つのアミノ酸の置換又は置換の組み合わせを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｅ３７５Ｙ、Ｋ５１２Ｙ、Ｔ３６８Ｆ、Ａ４８４Ｅ、Ａ４８４Ｙ、Ｎ３８７Ｌ、Ｔ３７２Ｑ、Ｔ３７２Ｌ、Ｋ４７８Ｙ、１３７０Ｗ、Ｆ１９８Ｗ、Ｌ３８１Ａ、及びこれらの任意の組み合わせから選択される。適切なＤＮＡポリメラーゼは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，１３３，６７２号明細書で説明されている。
【０２５４】
[00303]酵素の動態はまた、この酵素と接触する溶液の含有物の操作により影響を受け得る、及び／又は制御され得る。例えば、非触媒的二価イオン（例えば、ストロンチウム（Ｓｒ２＋）等の、ポリメラーゼ機能を促進しないイオン）と、触媒的二価イオン（例えば、マグネシウム（Ｍｇ２＋）及び／又はマンガン（Ｍｎ２＋）等の、ポリメラーゼ機能を促進するイオン）とを混合して、ポリメラーゼを減速させ得る。非触媒的イオンに対する触媒的イオンの比率は任意の適切な値であり得、約２０、約１５、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、約１、約０．５、約０．２、又は約０．１が挙げられる。場合によっては、この比率は、一価の塩（例えば塩化カルシウム（ＫＣｌ））の濃度、温度、及び／又はｐＨに依存する。一例では、溶液は、１マイクロモル濃度のＭｇ２＋と、０．２５マイクロモル濃度のＳｒ２＋とを含む。別の例では、溶液は、３マイクロモル濃度のＭｇ２＋と、０．７マイクロモル濃度のＳｒ２＋とを含む。マグネシウム（Ｍｇ２＋）及びマンガン（Ｍｎ２＋）の濃度は任意の適切な値であり得、酵素の動態に影響を及ぼすために変動され得る。一例では、溶液は、１マイクロモル濃度のＭｇ２＋と、０．２５マイクロモル濃度のＭｎ２＋とを含む。別の例では、溶液は、３マイクロモル濃度のＭｇ２＋と、０．７マイクロモル濃度のＭｎ２＋とを含む。
【０２５５】
プレロードされたタグ分子のナノポア配列決定
[00304]標的鎖に相補的な核酸鎖の合成の最中に、タグを、組み込まれているヌクレオチドから放出されることなく検出し得る。タグはリンカーによりヌクレオチドに付着し得、その結果、タグはナノポアに提示される（例えば、タグは、ナノポアの少なくとも一部に垂れ下がるか又は別の方法でナノポアの少なくとも一部を通って伸長する）。リンカーの長さは、タグがナノポアの少なくとも一部まで伸びるか又はナノポアの少なくとも一部を通って伸長することが可能となるのに十分な長さであり得る。いくつかの場合には、タグは、電圧差によりナノポアに提示される（即ち、ナノポア中に移動する）。細孔中にタグを提示するための他の方法も適している場合がある（例えば、酵素、磁石、電場、圧力差の使用）。いくつかの場合には、タグには能動的な力が印加されない（即ち、タグはナノポア中に拡散する）。
【０２５６】
[00305]本発明のある態様は、核酸を配列決定する方法を提供する。この方法は、タグ付きヌクレオチドを組み込む（例えば重合する）ステップを含む。個々のヌクレオチドと会合しているタグは、組込み時にこのヌクレオチドから放出されることなくナノポアにより検出され得る。
【０２５７】
[00306]核酸サンプルを配列決定するためのチップは、複数の個々にアドレス指定可能なナノポアを含み得る。この複数個の内の個々にアドレス指定可能なナノポアは、集積回路に隣接して配置されている膜中に形成されている少なくとも１個のナノポアを含み得る。それぞれの個々にアドレス指定可能なナノポアは、個々のヌクレオチドと会合しているタグを検出し得る。このヌクレオチドは組み込まれ得（例えば重合し得）、このタグは、組込み時にこのヌクレオチドから放出されなくてもよい。
【０２５８】
[00307]この方法の一例を図５に示す。ここで、核酸鎖５００は、ナノポア５０２を横切って通過するか、又はナノポア５０２に近接して通過する（しかし、５０１で矢印により示されているようには通らない）。酵素５０３（例えばＤＮＡポリメラーゼ）は、テンプレート５００として第１の核酸分子を使用して、一度に１個のヌクレオチドを組み込むことにより、伸長している核酸鎖５０４を伸長する（即ち、この酵素はヌクレオチド組込み事象を触媒する）。タグはナノポア５０２により検出される。このタグは、ある期間にわたりナノポア中に滞留してもよい。
【０２５９】
[00308]酵素５０３は、ナノポア５０２に付着していてもよい。ナノポアに酵素を付着させる適切な方法として、分子内ジスルフィド結合の形成等の架橋、及び／又は上記で説明したような融合タンパク質の生成が挙げられる。場合によっては、ナノポアにホスファターゼ酵素も付着している。この酵素は、切断されたタグ上の残余のリン酸塩にさらに結合して、ナノポア中での滞留時間をさらに増加させることにより、より明確なシグナルを生成し得る。適切なＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられ、上記で説明したものがさらに挙げられるが、これに限定されない。
【０２６０】
[00309]引き続き図５を参照すると、酵素は、タグ分子（表示５０５での白丸）に付着しているヌクレオチド（表示５０５での黒丸）のプールから引き出す。各タイプのヌクレオチドは異なるタグ分子に付着しており、そのため、タグがナノポア５０２中に滞留している場合には、ナノポアで生成されたか又はナノポアと関連しているシグナルに基づいて、タグを互いに区別し得る。
【０２６１】
[00310]場合によっては、タグは、ヌクレオチド組込み事象時にナノポアに提示され、且つヌクレオチドから放出される。場合によっては、放出されたタグは、ナノポアを通過する。このタグは、いくつかの場合にはナノポアを通り抜けない。いくつかの場合には、ヌクレオチド組込み事象時に放出されているタグは、少なくとも部分的にナノポア中での滞留時間により、ナノポアを通って流れ得るがヌクレオチド組込み事象時に放出されていないタグと識別される。場合によっては、少なくとも約１００ミリ秒（ｍｓ）にわたりナノポア中に滞留するタグは、ヌクレオチド組込み事象時に放出され、１００ｍｓ未満にわたりナノポア中に滞留するタグは、ヌクレオチド組込み事象時に放出されない。場合によっては、タグは、第２の酵素又はタンパク質（例えば核酸結合タンパク質）により捕捉され得、及び／又はナノポアを通って導かれ得る。第２の酵素は、ヌクレオチド組込み時（例えば、ヌクレオチド組込みの最中又はその後）にタグを切断し得る。タグとヌクレオチドとの間のリンカーが切断されてもよい。
【０２６２】
[00311]図２６に示すように、第２の酵素又はタンパク質２６００は、ポリメラーゼに付着し得る。いくつかの実施形態では、第２の酵素又はタンパク質は、二本鎖テンプレートの一本鎖テンプレートへの解離を促進する核酸ヘリカーゼである。場合によっては、第２の酵素又はタンパク質は、ポリメラーゼに付着していない。第２の酵素又はタンパク質は、テンプレートの一本鎖の維持を補助するために一本鎖核酸テンプレートに結合する核酸結合タンパク質であり得る。この核酸結合タンパク質は、一本鎖核酸分子に沿ってスライドし得る。
【０２６３】
[00312]組み込まれているヌクレオチドは、ヌクレオチドと会合しているタグがナノポアを用いて検出される時間の長さに基づいて、組み込まれていないヌクレオチドと区別されてもよい。いくつかの例では、核酸鎖に組み込まれているヌクレオチド（「組み込まれているヌクレオチド」）と会合しているタグは、少なくとも約５ミリ秒（ｍｓ）、１０ｍｓ、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、６０ｍｓ、７０ｍｓ、８０ｍｓ、９０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、３００ｍｓ、４００ｍｓ、又は５００ｍｓの平均期間にわたり、ナノポアにより検出されるか、又はナノポアを用いて検出される。組み込まれていない（例えば遊離して流動している）ヌクレオチドと会合しているタグは、平均して約５００ｍｓ、４００ｍｓ、３００ｍｓ、２００ｍｓ、１００ｍｓ、９０ｍｓ、８０ｍｓ、７０ｍｓ、６０ｍｓ、５０ｍｓ、４０ｍｓ、３０ｍｓ、２０ｍｓ、１０ｍｓ、５ｍｓ、又は１ｍｓ未満の期間にわたり、ナノポアにより検出される。いくつかの状況下では、組み込まれているヌクレオチドと会合しているタグは、平均して少なくとも約１００ｍｓの期間にわたりナノポアにより検出され、且つ組み込まれていないヌクレオチドと会合しているタグは、平均して１００ｍｓ未満である期間にわたりナノポアにより検出される。
【０２６４】
[00313]いくつかの例では、組み込まれているヌクレオチドに結合しているタグは、ナノポア中でのタグの滞留時間に基づいて、又はナノポアを用いて、組み込まれていないヌクレオチドから検出されるシグナルに基づいて、伸長している相補鎖に組み込まれていないヌクレオチドと会合しているタグから識別される。組み込まれていないヌクレオチドは、約１ナノ秒（ｎｓ）〜１００ｍｓ又は約１ｎｓ〜５０ｍｓの間の期間にわたり検出可能であるシグナル（例えば、電圧差、電流）を生成し得、組み込まれているヌクレオチドは、約５０ｍｓ〜５００ｍｓ又は１００ｍｓ〜２００ｍｓの間の存続期間を有するシグナルを生成し得る。いくつかの例では、組み込まれていないヌクレオチドは、約１ｎｓ〜１０ｍｓ又は１ｎｓ〜１ｍｓの期間にわたり検出可能であるシグナルを生成し得る。場合によっては、組み込まれていないタグは、組み込まれているタグがナノポアにより検出可能である期間と比べて長い期間（平均）にわたり、ナノポアにより検出可能である。
【０２６５】
[00314]場合によっては、組み込まれているヌクレオチドは、組み込まれていないヌクレオチドと比べて短い期間にわたり、ナノポアにより検出され、及び／又はナノポアにより検出可能である。本明細書で説明されているように、これらの時間の差異及び／又は比率を使用して、ナノポアにより検出されるヌクレオチドが組み込まれているか否かを決定し得る。
【０２６６】
[00315]検出期間は、ナノポアを通るヌクレオチドの自由な流れに基づき得、組み込まれていないヌクレオチドは、約１ナノ秒（ｎｓ）〜１００ｍｓ又は約１ｎｓ〜５０ｍｓの期間にわたりナノポアで滞留し得るか又はナノポアに近接し得、組み込まれているヌクレオチドは、約５０ｍｓ〜５００ｍｓ又は１００ｍｓ〜２００ｍｓの時間にわたりナノポアで滞留し得るか又はナノポアに近接し得る。この期間は処理条件に基づいて変動し得るが、組み込まれているヌクレオチドは、組み込まれていないヌクレオチドの滞留時間と比べて長い滞留時間を有し得る。
【０２６７】
[00316]重合（例えば組込み）及び検出は両方とも、互いに干渉することなく進行し得る。いくつかの実施形態では、第１のタグ付きヌクレオチドの重合は、第２のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグのナノポア検出に、認識できるほどには干渉しない。いくつかの実施形態では、第１のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグのナノポア検出は、第２のタグ付きヌクレオチドの重合に干渉しない。場合によっては、タグは、ナノポアにより検出されるのに、及び／又はヌクレオチド組込み事象を妨げることなく検出されるのに、十分な長さである。
【０２６８】
[00317]タグ（又はタグ種）は、１個の検出可能な原子若しくは分子、又は複数個の検出可能な原子若しくは分子を含み得る。場合によっては、タグは、核酸分子のリン酸基、糖、又は窒素塩基等の任意の位置に連結されている、１個又は複数個のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、又はそれらの誘導体を含む。いくつかの例では、タグは、核酸塩基のリン酸基に共有結合で連結されている、１個又は複数個のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、又はこれらの誘導体を含む。
【０２６９】
[00318]タグは、長さが少なくとも約０．１ナノメートル（ｎｍ）、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、又は１０００ｎｍであり得る。
【０２７０】
[00319]タグは、反復サブユニットの尾部を含んでもよく、例えば、複数個のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、又はこれらの誘導体を含んでもよい。例えば、タグは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、又はこれらの誘導体の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０００個、１０，０００個、又は１００，０００個のサブユニットを有する尾部タンパク質を含み得る。このサブユニットは、核酸のリン酸基に連結されている末端で互いに連結され得る。タグ部分の他の例として、あらゆるポリマー物質が挙げられ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリスルホネート、アミノ酸、又は任意の完全に若しくは部分的に正に帯電しているか、負に帯電しているか、又は帯電していないポリマーが挙げられる。
【０２７１】
[00320]タグ種は、組込みの最中に組み込まれる核酸分子のタイプに特有である電子的特徴を有し得る。例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシルである核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシルそれぞれに特有の１個又は複数個の種を有するタグ種を有してもよい。
【０２７２】
[00321]図６は、ナノポアにより検出される場合に、異なるタグにより生成される異なるシグナルの一例を示す。４種の異なるシグナル強度（６０１、６０２、６０３、及び６０４）が検出される。これらは、４種の異なるタグに対応し得る。例えば、ナノポアに提示される及び／又はアデノシン（Ａ）の組込みより放出されるタグは、振幅６０１を有するシグナルを生成し得る。ナノポアに提示される及び／又はシトシン（Ｃ）の組込みにより放出されるタグは、より高い振幅６０３を有するシグナルを生成し得、ナノポアに提示される及び／又はグアニン（Ｇ）の組込みにより放出されるタグは、さらに高い振幅６０４を有するシグナルを生成し得、ナノポアに提示される及び／又はチミン（Ｔ）の組込みにより放出されるタグは、さらに高い振幅６０２を有するシグナルを生成し得る。図６はまた、ヌクレオチド組込み事象時にナノポアから放出されている及び／又はナノポアに提示されるタグ分子の検出の一例も示す。本明細書で説明されている方法は、ナノポアに挿入され、その後に切断されるタグ（例えば図４、Ｄを参照されたい）と、浮遊しており切断されていないタグ（例えば図４、Ｆを参照されたい）とを識別し得る。
【０２７３】
[00322]本明細書で提供される方法は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、又は少なくとも約９９．９９％、又は少なくとも約９９．９９９％、又は少なくとも約９９．９９９９％の精度で、放出されている（又は切断されている）タグと、放出されていない（又は切断されていない）タグとを識別し得る。
【０２７４】
[00323]図６を参照すると、電流の大きさは、タグにより任意の適切な量（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％）減少し得る。いくつかの実施形態では、電流の大きさは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少する。いくつかの実施形態では、電流の大きさは、最大５％、最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、最大９５％、又は最大９９％減少する。
【０２７５】
[00324]この方法は、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの間の期間（例えば、図６における期間６０５）を検出するステップをさらに含み得る。個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの間の期間は、大きい電流を有し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド組込み事象の間にナノポアを通って流れる電流の大きさは、（例えば、タグが存在しない場合の）最大電流の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％である（例えば、これらに戻る）。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド組込み事象の間にナノポアを通って流れる電流の大きさは、最大電流の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％である。個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの間の期間の最中における電流の検出及び／又は観察により、いくつかの場合（例えば、連続して３個以上の同一の塩基等の核酸の反復ストレッチを配列決定する場合）には、配列決定の精度が改善され得る。ヌクレオチド組込み事象の間の期間は、クロックシグナルとして使用され得、このクロックシグナルにより、配列決定される核酸分子又はそのセグメントの長さが得られる。
【０２７６】
[00325]本明細書で説明されている方法は、組み込まれている（例えば重合している）タグ付きヌクレオチドと、重合していないタグヌクレオチド（例えば、図５における５０６及び５０５）とを識別し得る。いくつかの例では、組み込まれているタグ付きヌクレオチドは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、又は少なくとも約９９．９９％、又は少なくとも約９９．９９９％、又は少なくとも約９９．９９９９％の精度で、組み込まれていないタグヌクレオチドから識別され得る。
【０２７７】
タグとナノポアとの間の会合
[00326]一態様では、本明細書で説明されている方法及びデバイスは、タグがナノポアと会合する及び／又はナノポアにより検出可能である時間（又は時間の比率）に部分的に基づいて、核酸分子に組み込まれているタグ付きヌクレオチドと、組み込まれていないタグ付きヌクレオチドとを識別する。いくつかの場合には、ヌクレオチドとポリメラーゼとの間の相互作用により、タグがナノポアと会合する及び／又はナノポアにより検出可能である時間が増加する。場合によっては、タグは、ナノポアと相互作用する、及び／又はタグと会合する。
【０２７８】
[00327]タグは、ナノポアから除去されるよりもナノポアに比較的に容易に挿入され得る。いくつかの場合には、タグは、ナノポアを出るタグと比べて迅速に及び／又は少ない力でナノポアに入る。ナノポアと会合すると、タグは、ナノポアに入った方向からナノポアを出るタグと比べて、迅速に及び／又は少ない力でナノポアを通り抜け得る。
【０２７９】
[00328]タグとナノポアとの間の会合は、任意の適切な力又は相互作用であり得、例えば、非共有結合、可逆的力、静電気的力、若しくは動電気的力、又はこれらの任意の組み合わせであり得る共有結合であり得る。場合によっては、タグは、ナノポアと相互作用するように設計されており、ナノポアは、タグと相互作用するように変異しているか若しくは設計されており、又はタグ及びナノポアの両方が、互いの会合を形成するように設計されているか、若しくは選択されている。
【０２８０】
[00329]タグとナノポアとの間の会合は、任意の適切な強度であり得る。場合によっては、この会合は十分に強く、その結果、ナノポアからタグを排出することなく電極を再充電し得る。ナノポアの両端の電圧極性を反転させて電極を再充電し得、いくつかの場合には、再び反転させて、タグがナノポアに残ることなくタグを検出し得る。
【０２８１】
[00330]図１９は、タグ付きヌクレオチド１９０２のタグ部分が、ナノポア１９０１におけるポリメラーゼと反対側の親和性パートナー（例えば親和性分子）又は結合パートナー１９０３と結合する及び／又は相互作用する例を示す。この親和性分子又は結合パートナー１９０３は、ナノポア１９０１から分離され得るが、ナノポアに連結されており、又は代替として、ナノポア１９０１の一部であり得る。この結合パートナーを、ナノポア又は膜等の任意の適切な表面に付着し得る。いくつかの例では、タグ分子と結合パートナーとの任意の適切な組み合わせを使用し得る。いくつかの場合には、タグ分子及び結合パートナーは、互いにハイブリダイズする核酸分子を含む。いくつかの場合には、タグ分子及び結合パートナーは、互いに結合するストレプトアビジン及びビオチンを含む。代替として、結合パートナー１９０３は、ナノポア１９０１の一部であり得る。
【０２８２】
[00331]図２０は、タグ付きヌクレオチドが、ヌクレオチド部分２００１と、刺を有するタグ部分２００２とを含む例を示す。このタグ部分は、タグがナノポアに入った方向でナノポアから出るよりも容易に（例えば迅速に及び／又は少ない力で）タグがナノポア２００３を通って流れるように形成されている（例えば刺を有する）。一実施形態では、このタグ部分は一本鎖核酸を含み、塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）は、タグ付きヌクレオチドのヌクレオチド部分２００１に向かって指す角度で、この核酸タグの骨格に接続されている（即ち、刺を形成する）。代替として、ナノポアは、（例えば、ナノポアから）第１の方向に沿ったタグ部分の流れを許容し、且つ第２の方向（例えば、第２の方向に対して反対の方向）に沿ったタグ部分の流れを防ぐフラップ又は他の障害物を含み得る。このフラップは、任意のヒンジ付き障害物であり得る。
【０２８３】
[00332]（例えば、ナノポアの細孔部分で）ナノポアと結合するために及び／又は会合するために、（例えば、定向進化を使用して）タグを設計してもよいし選択してもよい。いくつかの実施形態では、タグは、ナノポアに結合する疎水性、親水性、正に帯電した、及び負に帯電したアミノ酸残基の配列を有するペプチドである。いくつかの実施形態では、タグは、ナノポアと結合する塩基の配列を有する核酸である。
【０２８４】
[00333]ナノポアを変異させてタグ分子と会合させてもよい。例えば、ナノポアを、タグ分子に結合する疎水性、親水性、正に帯電した、及び負に帯電したアミノ酸残基の配列を有すように、（例えば、定方向進化を使用して）設計し得るか、又は選択し得る。アミノ酸残基は、ナノポアの前庭及び／又はポアに存在し得る。
【０２８５】
ナノポアからタグの排出
[00334]本開示は、タグ分子がナノポアから排出される方法を提供する。例えば、ヌクレオチド組込み事象時（例えば、配列決定の最中）に、タグがナノポア中に滞留しているか又はナノポアに提示される場合に、タグ分子を排出するようにチップを適合させ得る。タグは、このタグが（例えば、このタグがナノポアを通り抜けることなく）ナノポアに入った反対方向に排出されてもよく、例えば、このタグは、第１の開口からナノポアに導かれて、第１の開口とは異なる第２の開口からナノポアから排出されてもよい。或いは、タグは、このタグがナノポアに入った開口から排出されてもよく、例えば、このタグは、第１の開口からナノポアに導かれて、第１の開口からナノポアから排出されてもよい。
【０２８６】
[00335]本発明の一態様は、核酸サンプルを配列決定するためのチップであって、このチップは、複数個の個々にアドレス指定可能なナノポアを含み、この複数個の内の個々にアドレス指定可能なナノポアは、集積回路に隣接して配置されている膜に形成されている少なくとも１個のナノポアを有し、各個々にアドレス指定可能なナノポアは、このナノポアからタグ分子を排出するように適合されている、チップを提供する。いくつかの実施形態では、このチップは、タグがナノポアに入った方向でタグを排出する（又は本方法により排出される）ように適合される。場合によっては、ナノポアは、電圧パルス又は一連の電圧パルスによりタグ分子を排出する。電圧パルスは、約１ナノ秒〜１分又は１０ナノ秒〜１秒の持続時間を有してもよい。
【０２８７】
[00336]ナノポアは、２個のタグ分子が同時にナノポア中に存在しないような期間内にタグ分子を排出する（又は本方法により排出される）ように適合されてもよい。いくつかの実施形態では、２個の分子が同時にナノポア中に存在する確率は、最大１％、最大０．５％、最大０．１％、最大０．０５％、又は最大０．０１％である。
【０２８８】
[00337]いくつかの場合には、ナノポアは、タグがナノポアに入った場合の約０．１ｍｓ、０．５ｍｓ、１ｍｓ、５ｍｓ、１０ｍｓ、又は５０ｍｓ（と比べて短い期間）内にタグ分子を排出するように適合される。
【０２８９】
[00338]タグは、電位（又は電圧）を使用してナノポアから排出され得る。この電圧は、場合によっては、ナノポアにタグを引っ張るために使用される極性とは反対の極性であり得る。この電圧は、少なくとも約１ナノ秒、１０ナノ秒、１００ナノ秒、５００ナノ秒、１マイクロ秒、１００マイクロ秒、１ミリ秒（ｍｓ）、５ｍｓ、１０ｍｓ、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、３００ｍｓ、４００ｍｓ、５００ｍｓ、６００ｍｓ、７００ｍｓ、８００ｍｓ、９００ｍｓ、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、１００秒、２００秒、３００秒、４００秒、５００秒、又は１０００秒の周期を有する交流電流（ＡＣ）波形を用いて印加され得る。
【０２９０】
交流電流（ＡＣ）波形
[00339]核酸鎖を、ナノポアを通り抜けさせることにより核酸分子を配列決定することは、（例えば、分子がナノポアを通って移動する方向が反転しないように）直流電流を印加することを必要とする可能性がある。しかしながら、直流を使用して長期間にわたりナノポアセンサーを操作することは、電極の組成を変化させる可能性があり、ナノポアの両端のイオン濃度をアンバランスにする可能性があり、且つ他の望ましくない影響を有する可能性がある。交流電流（ＡＣ）波形を印加することにより、これらの望ましくない効果を回避し得、且つ下記で説明するような特定の利点を有し得る。タグ付きヌクレオチドを利用した、本明細書で説明されている核酸配列決定方法は、ＡＣが印加された電圧と完全に互換性があり、従って、前記利点を達成するために使用され得る。
【０２９１】
[00340]犠牲電極、又は通電反応で分子特性を変化させる電極（例えば、銀を含む電極）、又は通電反応で分子特性を変化させる電極を使用する場合には、検出サイクルの最中に電極を再充電する能力は有利であり得る。電極は、検出サイクルの最中に枯渇し得ないが、場合によっては、電極は、検出サイクルの最中に枯渇する場合がある。再充電により、電極が完全に枯渇する等の所与の枯渇限界に達することを防止し得、この枯渇限界は、電極が小さい場合（例えば、電極は、平方ミリメートル当たり少なくとも５００個の電極を有する電極の配列を提供するのに十分小さい場合）に問題となる可能性がある。場合によっては、電極の寿命が増減し、電極の幅に少なくとも部分的に依存する。
【０２９２】
[00341]いくつかの場合では、電極は、多孔質及び／又は「海綿状」である。多孔質電極は、非多孔性電極と比べて、バルク液体への二重層の静電容量を増強させ得る。多孔質電極を、界面活性剤の存在下において表面上に金属（例えば貴金属）を電気めっきすることにより形成し得る。電気めっきされる金属は、任意の適切な金属であり得る。この金属は、貴金属（例えば、パラジウム、銀、オスミウム、イリジウム、白金、銀、又は金）であり得る。場合によっては、この表面は、金属表面（例えば、パラジウム、銀、オスミウム、イリジウム、白金、銀、又は金）である。場合によっては、この表面は直径が約５ミクロンであり、且つ滑らかである。界面活性剤は、この表面にナノメートルスケールの間隙空間を作成し得、この表面を多孔質又は「海綿状」にする。多孔質及び／又は海綿状の電極を製造するための別の方法は、金属酸化物（例えば、酸化白金）を堆積させて還元剤（例えば、４％のＨ２）に暴露することである。この還元剤は、金属酸化物（例えば、酸化白金）を金属（例えば、白金）に還元し得、そうすることにより、海綿状及び／又は多孔質の電極が得られる。（例えばパラジウム）海綿は、電解液を吸収して、大きな有効表面積を作成し得る（例えば、電極トップダウン面積１平方ミクロン当たり３３ピコファラッド）。本明細書で説明されているように多孔質にすることにより電極の表面積を増加させることによって、完全に枯渇しない静電容量を有する電極を作成し得る。
【０２９３】
[00342]いくつかの場合には、（例えば、核酸を、ナノポアを通り抜けさせることにより核酸を配列決定する場合での）長い期間にわたる検出の最中に、ナノポアの両端の保存された極性の電圧差を維持する必要性により、電極が枯渇し、且つ検出の継続時間及び／又は電極のサイズが制限される可能性がある。本明細書で説明されているデバイス及び方法は、検出時間をより長くし得（例えば無限にし得）、及び／又は電極を（例えば、検出の最中での電極枯渇以外の考慮すべき事項により制限されるような）任意の小さなサイズに縮小し得る。本明細書で説明されているように、タグは、ポリメラーゼと会合しているほんの一部の時間にわたり検出され得る。検出期間の間に、ナノポアの両端の電圧の極性及び／又は大きさを切り替える（例えば、ＡＣ波形を印加する）ことにより、電極を再充電し得る。場合によっては、タグは複数回（例えば、１００ミリ秒の期間に２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、１００回、１０００回、１０，０００回、１００，０００回、１，０００，０００回、又はより多い回数）検出される。
【０２９４】
[00343]いくつかの場合には、ナノポアの両端の電圧の極性は周期的に反転される。この電圧の極性を、任意の適切な時間（例えば、約１ｍｓ、約５ｍｓ、約１０ｍｓ、約１５ｍｓ、約２０ｍｓ、約２５ｍｓ、約３０ｍｓ、約４０ｍｓ、約５０ｍｓ、約６０ｍｓ、約８０ｍｓ、約１００ｍｓ、約１２５ｍｓ、約１５０ｍｓ、約２００ｍｓ等）にわたり持続する検出期間後に反転させ得る。電極を再充電する最中（即ち、電圧の極性が、タグ検出の場合の電圧の極性と反対である場合）の期間及び電場の強度は、電極がその検出前の状態（例えば、電極の質量）に戻るようなものである。ナノポアの両端の正味の電圧は、いくつかの場合にはゼロである（例えば、正電圧の期間は、適切に長い時間スケール（例えば、１秒、１分、又は５分）にわたり、負電圧の期間をキャンセルする）。場合によっては、ナノポアに印加される電圧は、ナノポアに隣接するか又は近接する検知電極により正味ゼロの電流が検出されるように平衡を保つ。
【０２９５】
[00344]いくつかの例では、交流電流（ＡＣ）波形が、膜中のナノポア又は膜に隣接する電極に印加されて、タグが、ナノポアを通って又はナノポアに近接して引っ張られ、放出される。このＡＣ波形は、少なくとも１０マイクロ秒、１ミリ秒（ｍｓ）、５ｍｓ、１０ｍｓ、２０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、３００ｍｓ、４００ｍｓ、５００ｍｓのオーダーの周波数を有し得る。この波形は、交互に且つ順次にタグを捕獲してタグを放出し、又は他の方法でタグを複数の方向（例えば相反する方向）に動かすことを補助し得、これにより、タグがナノポアと会合している期間全体が増加し得る。充電及び放電のこのバランスは、ナノポア電極及び／又は所与のタグからのより長いシグナルの生成を許容し得る。
【０２９６】
[00345]いくつかの例では、ＡＣ波形を印加して、タグ付きヌクレオチド（例えば、組み込まれているタグ付きヌクレオチド）と会合しているタグの少なくとも一部をナノポアに繰り返し導き、且つナノポアの外へタグの少なくとも一部を導く。タグ、又はタグに結合しているヌクレオチドは、酵素（例えばポリメラーゼ）により保持されてもよい。酵素により保持される単一のタグのこの繰り返しのローディング及び排出は、タグを検出するより多くの機会を有利に提供し得る。例えば、タグが４０ミリ秒（ｍｓ）にわたり酵素により保持され、（ナノポア中にタグを導くために）５ｍｓにわたり高いＡＣ波形が印加され、（ナノポアの外へタグを導くために）５ｍｓにわたり低いＡＣ波形が印加される場合には、ナノポアを使用してタグを約４回読み取り得る。複数回の読み取りにより、ナノポアの中へと及び／又は外へと通るタグと関連するエラー等のエラーの訂正が可能になり得る。
【０２９７】
[00346]波形は、（例えば、ある期間にわたり繰り返す）規則的な形状、及び（例えば、１時間、１日、又は１週間等の任意の適切な長期にわたり繰り返さない）不規則な形状のいずれかを含む任意の適切な形状を有し得る。図２１は、いくつかの適切な（規則的な）波形を示す。波形の例として、三角波、（パネルＡ）、正弦波（パネルＢ）、鋸歯状波、方形波、及び同類のものが挙げられる。
【０２９８】
[00347]例えば交流電流（ＡＣ）波形の印加時に、何らかの理由で、ナノポアの両端の電圧の極性の反転（即ち、正から負へ、又は負から正へ）を実施し得、この理由として下記が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）電極を再充電する（例えば、金属電極の化学組成を変化させる）、（ｂ）膜のシス側及びトランス側でイオン濃度の平衡を再び保つ、（ｃ）ナノポアの両端で非ゼロ印加電圧を再確立する、並びに／又は（ｄ）二重層の静電容量を変更する（例えば、金属電極と分析物の界面とに存在する電圧若しくは電荷を、所望のレベル（例えばゼロ）に再設定する）。
【０２９９】
[00348]図２１Ｃは、大きさに比例して上方に延びる正電圧及び大きさに比例して下方に延びる負電圧を帯びたナノポアの両端のゼロ電位差の水平な破線を示す。どのような波形であっても、「デューティサイクル」は、正方向２１００における電圧対時間プロットの曲線下複合面積と、負方向２１０１における曲線下複合面積とを比較する。場合によっては、正面積２１００は負面積２１０１と等しい（即ち、正味のデューティサイクルはゼロである）が、ＡＣ波形は任意のデューティサイクルを有し得る。いくつかの場合には、最適化されたデューティサイクルを有するＡＣ波形の公正な使用を使用して、下記の内の任意の１つ又は複数を達成し得る：（ａ）電気化学的に電極のバランスがとれている（例えば、充電も枯渇もない）、（ｂ）膜のシス側とトランス側と間のイオン濃度のバランスがとれている、（ｃ）ナノポアの両端の印加電圧が既知である（例えば、電極の容量性二重層が周期的に再設定され、極性の各反転と同程度までコンデンサが放電するため）、（ｄ）（例えば、極性の各反転によりタグを排出して再捕捉することにより）タグ分子がナノポア中で複数回同定される、（ｅ）タグ分子の各読み取りから追加の情報を捕捉する（例えば、測定された電流は、各タグ分子に関する印加電圧の異なる関数であり得るため）、（ｆ）ナノポアセンサーの高密度を達成する（例えば、金属電極組成は変化していないため、電極を構成する金属の量により制約されない）、並びに／又は（ｇ）チップの低消費電力が達成される。これらの利点は、デバイスの継続的な長期動作（例えば、少なくとも１時間、少なくとも１日、少なくとも１週間）を可能にし得る。
【０３００】
[00349]いくつかの状況下では、ナノポアの両端への正電位の印加時に第１の電流を測定し、ナノポアの両端に（例えば、正電位と等しい絶対量の）負電位の印加時に第２の電流を測定する。第１の電流及び第２の電流は異なり得るが、場合によっては、第１の電流は第２の電流と等しくなり得る。例えば、第１の電流は第２の電流と比べて小さくてもよい。いくつかの場合には、正電流及び負電流の内の一方のみが測定される。
【０３０１】
[00350]場合によっては、ナノポアは、比較的小さい電圧にて比較的長い期間にわたり、タグ付きヌクレオチドを検出し（例えば、図２１、表示２１００）、比較的大きい電圧にて比較的短い期間にわたり、電極を再充電する（例えば、図２１、表示２１０１）。場合によっては、検出のための期間は、電極の再充電のための期間と比べて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍長い。
【０３０２】
[00351]いくつかの場合には、波形は入力に応じて変更される。場合によっては、この入力は電極の枯渇のレベルである。場合によっては、極性及び／又は電圧の大きさは、電極の枯渇又は通電イオンの枯渇に少なくとも部分的に基づいて変化し、波形は不規則である。
【０３０３】
[00352]短期間にわたり（例えば、約５秒未満、約１秒未満、約５００ｍｓ未満、約１００ｍｓ未満、約５０ｍｓ未満、約１０ｍｓ未満、又は約１ｍｓ未満の期間にわたり）繰り返し検出して電極を再充電する能力により、不変の直流（ＤＣ）電位及びＤＣ電流を維持し得る電極と比べて小さい電極の使用が可能になり、ナノポアを通るポリヌクレオチドを配列決定するために使用される。より小さい電極は、表面上の多数の検出部位（例えば、電極、検知回路、ナノポア、及びポリメラーゼを含む）を可能にし得る。
【０３０４】
[00353]この表面は、別々の部位の任意の適切な密度（例えば、所与の時間内又は所定のコストで核酸サンプルを配列決定するのに適した密度）を含む。ある実施形態では、この表面は、１ｍｍ２当たり約５００個の部位以上の別々の部位の密度を有する。いくつかの実施形態では、この表面は、１ｍｍ２当たり約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個、約１０００個、約２０００個、約３０００個、４０００個、約５０００個、約６０００個、約７０００個、約８０００個、約９０００個、約１００００個、約２００００個、約４００００個、約６００００個、約８００００個、約１０００００個、又は約５０００００個の部位の別々の部位の密度を有する。いくつかの実施形態では、この表面は、１ｍｍ２当たり少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個、少なくとも約２０００個、少なくとも約３０００個、少なくとも約４０００個、少なくとも約５０００個、少なくとも約６０００個、少なくとも約７０００個、少なくとも約８０００個、少なくとも約９０００個、少なくとも約１００００個、少なくとも約２００００個、少なくとも約４００００個、少なくとも約６００００個、少なくとも約８００００個、少なくとも約１０００００個、又は少なくとも約５０００００個の部位の別々の部位の密度を有する。
【０３０５】
[00354]電極は、ヌクレオチド組込み事象の前、間若しくは最中、又は後に再充電され得る。場合によっては、電極は、約２０ミリ秒（ｍｓ）、約４０ｍｓ、約６０ｍｓ、約８０ｍｓ、約１００ｍｓ、約１２０ｍｓ、約１４０ｍｓ、約１６０ｍｓ、約１８０ｍｓ、又は約２００ｍｓで再充電される。場合によっては、電極は、約２０ミリ秒（ｍｓ）未満、約４０ｍｓ未満、約６０ｍｓ未満、約８０ｍｓ未満、約１００ｍｓ未満、約１２０ｍｓ未満、約１４０ｍｓ未満、約１６０ｍｓ未満、約１８０ｍｓ未満、約２００ｍｓ、約５００ｍｓ未満、又は約１秒未満で再充電される。
【０３０６】
チップは、切断されているタグと切断されていないタグとを識別し得る
[00355]別の態様は、核酸サンプルを配列決定するためのチップを提供する。一例では、チップは、複数個の個々にアドレス指定可能なナノポアを含む。この複数個の内の個々にアドレス指定可能なナノポアは、集積回路に隣接して配置されている膜中に形成されている少なくとも１個のナノポアを有し得る。各個々にアドレス指定可能なナノポアは、タグ分子がヌクレオチドに結合しているか又はヌクレオチドに結合していないかを決定するように適合され得るか、又は異なるタグ間の変化を読み取るように適合され得る。
【０３０７】
[00356]場合によっては、チップは、複数個の個々にアドレス指定可能な複数のナノポアを含み得る。この複数個の内の個々にアドレス指定可能なナノポアは、集積回路に隣接して配置されている膜中に形成されている少なくとも１個のナノポアを有し得る。各個々にアドレス指定可能なナノポアは、タグ分子が、組み込まれている（例えば重合している）ヌクレオチド又は組み込まれていないヌクレオチドに結合しているかどうかを決定するように適合され得る。
【０３０８】
[00357]本明細書で説明されているチップは、放出されているタグと放出されていないタグと（例えば、図４におけるＤ対Ｆ）を識別し得る。いくつかの実施形態では、このチップは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、又は少なくとも約９９．９９％の精度で、放出されているタグと放出されていないタグとを識別し得る。このレベルの精度を、約５個、４個、３個、又は２個の連続ヌクレオチドの群を検出する場合に達成し得る。場合によっては、この精度は、単一塩基分解能（即ち、１個の連続ヌクレオチド）に関して達成される。
【０３０９】
[00358]本明細書で説明されているチップは、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドと（例えば、図５における５０６及び５０５）を識別し得る。いくつかの実施形態では、このチップは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、又は少なくとも約９９．９９％の精度で、組み込まれているタグ付きヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドとを識別し得る。このレベルの精度を、約５個、４個、３個、又は２個の連続ヌクレオチドの群を検出する場合に達成し得る。場合によっては、この精度は、単一塩基分解能（即ち、１個の連続ヌクレオチド）に関して達成される。
【０３１０】
[00359]ナノポアは、電気信号の差異に少なくとも部分的に基づいて、タグ分子がヌクレオチドに結合しているか又はヌクレオチドに結合していないかの決定を補助し得る。場合によっては、ナノポアは、ナノポア中の滞留時間に少なくとも部分的に基づいて、タグ分子がヌクレオチドに結合しているか又はヌクレオチドに結合していないかの決定を補助し得る。ナノポアは、タグ又はタグ付きヌクレオチドがナノポアを出る電圧である脱落電圧（ｆａｌｌ−ｏｕｔ  ｖｏｌｔａｇｅ）に少なくとも部分的に基づいて、タグ分子がヌクレオチドに結合しているか又は結合していないかの決定を補助し得る。
【０３１１】
チップは、切断されたタグを高い割合で捕捉し得る
[00360]別の態様は、核酸サンプルを配列決定するためのチップを提供する。一例では、チップは、複数個の個々にアドレス指定可能なナノポアを含む。この複数個の内の個々にアドレス指定可能なナノポアは、集積回路に隣接して配置されている膜中に形成されている少なくとも１個のナノポアを含み得る。各個々にアドレス指定可能なナノポアは、タグ付きヌクレオチドの組込み（例えば重合）時に放出されるタグ分子の大部分を捕捉するように適合され得る。
【０３１２】
[00361]このチップは、（例えば、適切に高い精度で核酸配列を決定するために）タグの任意の適切に高い割合を捕捉するように構成され得る。いくつかの実施形態では、このチップは、タグ分子の少なくとも９０％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、又は少なくとも９９．９９％を捕捉する。
【０３１３】
[00362]いくつかの実施形態では、ナノポアは、単一の電流レベルで、複数個の異なるタグ分子（例えば、４個のヌクレオチドの組込み時に放出される４個の異なるタグ分子）を捕捉する。このチップは、タグ分子が放出されるのと同じ順序でタグ分子を捕捉するように適合され得る。
【０３１４】
デバイスのセットアップ
[00363]図８は、本明細書で説明されているように核酸を配列決定するために及び／又はタグ分子を検出するために使用され得るナノポアデバイス１００（又はセンサー）を模式的に示す。脂質二重層を含むナノポアは、抵抗及び静電容量を特徴とし得る。ナノポアデバイス１００は、導電性固体基板１０６の脂質二重層適合性表面１０４上に形成されている脂質二重層１０２を含み、脂質二重層適合性表面１０４は、脂質二重層非適合性表面１０５により絶縁されていてもよく、且つ導電性固体基板１０６は絶縁材料１０７により電気的に絶縁されていてもよく、脂質二重層１０２は、脂質二重層非適合性表面１０５上に形成されている非晶質脂質１０３により囲まれていてもよい。脂質二重層１０２には、特徴付けられているタグ分子、及び／又は脂質二重層１０２の２つの側の間の小さいイオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−）の通過に十分に大きいナノポア１１０を有する単一のナノポア構造１０８が埋め込まれ得る。水分子の層１１４は、脂質二重層適合性表面１０４上で吸収されて、脂質二重層１０２と脂質二重層適合性表面１０４との間に挟まれ得る。親水性の脂質二重層適合性表面１０４上で吸収される水性膜１１４は、脂質分子の順序付けを促進し、脂質二重層適合性表面１０４上での脂質二重層の形成を容易にし得る。核酸分子１１２及びタグ付きヌクレオチドの溶液を含むサンプルチャンバ１１６は、脂質二重層１０２上に設けられ得る。この溶液は、電解質を含む水溶液であり得、且つ最適なイオン濃度に緩衝され得、且つナノポア１１０を開口し続けるために最適なｐＨで維持され得る。このデバイスは、脂質二重層の両端に電気的刺激（例えば電圧バイアス）を与えるために、並びに脂質二重層の電気的特徴（例えば、抵抗、静電容量、及びイオン電流の流れ）を検知するために、可変電圧源１２０に連結されている一対の電極１１８（負のノード１１８ａ及び正のノード１１８ｂを含む）を含む。正電極１１８ｂの表面は、脂質二重層適合性表面１０４の一部であるか、又はこの一部を形成する。導電性固体基板１０６は、電極１１８の内の一方の一部に連結され得るか、又はこの一部を形成し得る。このデバイス１００はまた、電気刺激を制御するため、及び検出されたシグナルを処理するために、電気回路１２２も含んでもよい。いくつかの実施形態では、可変電圧源１２０は、電気回路１２２の一部として含まれる。電気回路１２２は、増幅器、積分器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、及び／又は様々な他の構成要素を含んでもよい。電気回路１２２は、シリコン基板１２８内で集積された集積電気回路であってもよく、メモリ１２６に連結されているコンピュータプロセッサ１２４にさらに連結されていてもよい。
【０３１５】
[00364]脂質二重層適合性表面１０４は、脂質二重層の形成を容易にするために、イオン伝達及びガス形成に適した様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、導電性又は半導電性の親水性材料を使用し得、なぜならば、これらの材料は、脂質二重層の電気的特性の変化の良好な検出を可能にし得るからである。例示的な材料として、Ａｇ−ＡｇＣｌ、Ａｕ、Ｐｔ、又はドープシリコン若しくは他の半導体材料が挙げられる。場合によっては、電極は犠牲電極ではない。
【０３１６】
[00365]脂質二重層非適合性表面１０５は、脂質二重層の形成に適していない様々な材料から形成され得、これらの材料は概して疎水性である。いくつかの実施形態では、非導電性の疎水性材料が好ましく、なぜならば、この材料は、互いから脂質二重層領域を分離することに加えて、脂質二重層領域を電気的に絶縁するからである。脂質二重層非適合性材料の例として、例えば、窒化ケイ素（例えばＳｉ３Ｎ４）及びテフロン（登録商標）、疎水性分子でシラン化された酸化ケイ素（例えばＳｉＯ２）が挙げられる。
【０３１７】
[00366]一例では、図８のナノポアデバイス１００は、アルミニウム材料１０６上にコーティングされている脂質二重層適合性銀（Ａｇ）表面１０４上に形成されているジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質二重層１０２に埋め込まれている単一のアルファ溶血素（ａＨＬ）タンパク質１０８を有するアルファ溶血素（ａＨＬ）ナノポアデバイスである。脂質二重層適合性Ａｇ表面１０４は、脂質二重層非適合性窒化ケイ素表面１０５により絶縁されており、アルミニウム材料１０６は、窒化ケイ素材料１０７により電気的に絶縁されている。アルミニウム１０６は、シリコン基板１２８に組み込まれている電気回路１２２に接続されている。チップ上に配置されているか又はカバープレート１２８から下方に延びている銀−塩化銀電極は、核酸分子を含む水溶液と接触する。
【０３１８】
[00367]ａＨＬナノポアは、７個の個々のペプチドのアセンブリである。ａＨＬナノポアの入口又は前庭は直径が約２６オングストロームであり、ｄｓＤＮＡ分子の一部を収容するのに十分な幅である。この前庭から、ａＨＬナノポアは最初に広がり、次いで直径が約１５オングストロームのバレルへと狭くなり、このバレルは、単一のｓｓＤＮＡ分子（又はより小さなタグ分子）が通り抜けるのに十分な幅であるが、ｄｓＤＮＡ分子（又はより大きなタグ分子）が通り抜けるには十分に幅ではない。
【０３１９】
[00368]ＤＰｈＰＣに加えて、ナノポアデバイスの脂質二重層は、様々な考慮すべき事項（例えば、使用されるナノポアの種類、特徴付けられる分子の種類、並びに形成される脂質二重層の様々な物理的、化学的及び／又は電気的特徴（例えば、形成される脂質二重層の安定性及び透過性、抵抗、並びに静電容量））に基づいて選択される様々な他の適切な両親媒性材料から構築され得る。両親媒性材料の例として様々なリン脂質が挙げられ、例えば下記が挙げられる：パルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−コリン（ＰＯＰＣ）及びジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１、２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びスフィンゴミエリン。
【０３２０】
[00369]上記で示したａＨＬナノポアに加えて、ナノポアは、様々な他の種類のナノポアであり得る。例として、γ溶血素、ロイコシジン、メリチン、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、並びに様々な他の天然に存在する、改変された天然の、及び合成のナノポアが挙げられる。適切なナノポアを、ナノポアの細孔径に対する分析物分子のサイズ等の分析物分子の種々な特徴に基づいて選択し得る。例えば、約１５オングストロームの限定的な細孔径を有するａＨＬナノポア。
【０３２１】
電流測定
[00370]場合によっては、様々な印加電圧で電流を測定してもよい。これを達成するために、所望の電位を電極に印加し得、印加された電位は、続いて測定全体を通して維持され得る。下記で説明するように、実行では、この目的のためにオペアンプ積分器トポロジーを使用し得る。この積分器は、静電容量性フィードバックにより電極で電圧電位を維持する。この積分器回路は、優れた直線性、セル間の整合性を提供し得、且つ特徴を相殺し得る。このオペアンプ積分器は概して、必須の性能を達成するために大きなサイズを必要とする。よりコンパクトな積分器トポロジーを下記で説明する。
【０３２２】
[00371]場合によっては、電圧電位「Ｖｌｉｑｕｉｄ」は、チップ上の全てのセルに共通の電気電位（例えば３５０ｍＶ）を与えるチャンバに印加され得る。この積分器回路は、一般的な液体電位と比べて高い電位に電極（電気的に積分コンデンサの天板である）を初期化し得る。例えば、４５０ｍＶでのバイアスにより、電極と液体の間に正の１００ｍＶの電位を付与し得る。この正の電圧電位により、電流は、電極から液体チャンバ接点へと流れ得る。この場合には、キャリアは下記である：（ａ）二層の電極（トランス）側から二層の液体リザーバ（シス）側へ細孔を通って流れるＫ＋イオン、及び（ｂ）下記の電気化学反応：Ａｇ＋Ｃｌ−→ＡｇＣｌ＋ｅ−に従って銀電極と反応するトランス側の塩素（Ｃｌ−）イオン。
【０３２３】
[00372]場合によっては、Ｋ＋は、（二層のトランスからのシス側に）封入されたセルから流出し、Ｃｌ−は塩化銀に変換される。二重層の電極側は、電流の流れの結果として脱塩され得る。場合によっては、銀／塩化銀液体スポンジ材料又はマトリックスは、回路を完成するために、電気チャンバ接点で生じる逆反応においてＣｌ−イオンを供給するためのリザーバとして機能し得る。
【０３２４】
[00373]場合によっては、電子は、測定される電流を生成する積分コンデンサの上面側へと最終的には流れる。電気化学反応により、銀は塩化銀へと変換され、電流は、変換される利用可能な銀が存在する限りにのみ、流れ続ける。場合によっては、限定された銀の供給が、電流に依存する電極の寿命につながる。いくつかの実施形態では、枯渇しない電極材料（例えば、白金）が使用される。
【０３２５】
[00374]タグは、不変の電気電位をナノポア検出器に印加した場合には、ナノポアを通って流れるイオン電流を調節し得、これにより、タグの同一性の決定するための電流の記録が可能になる。しかしながら、不変の電気電位は、異なるタグ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧと会合しているタグ）を十分に識別し得ない。ある態様では、印加電圧を変化させて（例えば、電圧の範囲にわたり掃引して）、（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、又は少なくとも９９．９９％の信頼度で）タグを同定し得る。
【０３２６】
[00375]印加電圧を、図２１に示す波形の内のいずれかに従うことを含む任意の適切な方法で変化させ得る。この電圧を、約１２０ｍＶ〜約１５０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約１５０ｍＶ等の任意の適切な範囲にわたり変化させ得る。
【０３２７】
[00376]図２２は、抽出シグナル（例えば、微分対数コンダクタンス（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｏｇ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）（ＤＬＣ））対ヌクレオチドであるアデニン（Ａ、緑色）、シトシン（Ｃ、青色）、グアニン（Ｇ、黒色）及びチミン（Ｔ、赤色）に関する印加電圧を示す。図２３は、複数個のヌクレオチド（多くの実験試行）に関する同一の情報を示す。ここに示すように、シトシンは、１２０ｍＶではチミンと識別することが比較的容易であるが、１５０ｍＶでは互いを識別することが難しい（例えば、抽出シグナルは、１５０ｍＶではＣ及びＴに関してほぼ等しいため）。同様に、チミンは、１２０ｍＶではアデニンと識別することが難しいが、１５０ｍＶでは識別することが比較的容易である。従って、一実施形態では、印加電圧を、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴのそれぞれを識別するために、１２０ｍＶ〜１５０ｍＶで変化させ得る。
【０３２８】
[00377]図２４は、ヌクレオチドであるアデニン（Ａ、緑色）、シトシン（Ｃ、青色）、グアニン（Ｇ、黒色）、及びチミン（Ｔ、赤色）に関する印加電圧の関数としてのパーセント基準導電性差（％ＲＣＤ）を示す。％ＲＣＤ（本質的に、３０Ｔ基準分子に参照される各分子の導電性の差である）をプロットすることにより、オフセットを取り除いて実験間の変動を得ることができる。図２４は、１７回／２０回の試行の最初のブロックからの個々のＤＮＡ波形を含む。全ての単一ヌクレオチドＤＮＡの％ＲＣＤは、全１７回の良好な試行について番号５０〜２００を捕捉する。ヌクレオチドの各々が識別可能である電圧を示す。
【０３２９】
[00378]図２２〜２４は、ヌクレオチドに関して変化した印加電圧に対する反応を示し、印加電圧を変化させるという概念を、タグ分子（例えば、タグ付きヌクレオチドに付着している）を識別するために使用し得る。
【０３３０】
セル回路
[00379]セル回路の一例を図１２に示す。印加電圧Ｖａは、ＭＯＳＦＥＴ電流コンベヤゲート１２０１の前方のオペアンプ１２００に印加される。また、電極１２０２と、デバイス１２０３により検出される核酸及び／又はタグの抵抗ともここに示す。
【０３３１】
[00380]印加電圧Ｖａは、電流コンベヤゲート１２０１を駆動し得る。次いで、電極で生じた電圧はＶａ−Ｖｔであり、Ｖｔは、ＭＯＳＦＥＴの閾値電圧である。いくつかの場合には、これにより、ＭＯＳＦＥＴの閾値電圧は、プロセス、電圧、温度、さらにはチップ内のデバイス間でも相当に変動し得ることから、電極に印加される実際の電圧の制限された制御がもたらされる。このＶｔの変動は、サブスレッショルドリーク効果が作用し始め得る低電流レベルで、より大きい可能性がある。従って、印加電圧のよりよい制御をもたらすために、オペアンプを、電流コンベヤデバイスと共にフォロワフィードバック構成で使用し得る。このことにより、ＭＯＳＦＥＴの閾値電圧の変動から独立して、電極に印加される電圧がＶａであることが保証される。
【０３３２】
[00381]セル回路の別の例を図１０に示し、このセル回路は、積分器、比較器、及び制御ビットをシフトし同時に比較器出力の状態をシフトアウトするデジタル論理を含む。このセル回路は、本明細書で提供されるシステム及び方法と共に使用するために適合され得る。Ｂ１ラインを通るＢ０は、シフトレジスタから出てもよい。アナログ信号はバンク内の全てのセルにより共有され、デジタルラインは、セルからセルへのデイジーチェーンであり得る。
【０３３３】
[00382]セルデジタル論理は、５ビットのデータシフトレジスタ（ＤＳＲ）、５ビットの並列ロードレジスタ（ＰＬＲ）、制御論理、及びアナログ積分器回路を含む。ＬＩＮ信号を使用して、ＤＳＲ内にシフトされる制御データをＰＬＲに並列ロードする。これらの５ビットは、セル内でスイッチを制御するデジタル「ブレークビフォーメーク」タイミング論理を制御する。加えて、デジタル論理は、コンパレータ出力の切り替えを記録するためのセットリセット（ＳＲ）ラッチを有する。
【０３３４】
[00383]このアーキテクチャは、個々のセル電流に比例する可変サンプルレートを送る。より高い電流は、より低い電流と比べて１秒当たりのサンプルが多くなり得る。電流測定の分解能は、測定される電流に関係している。小さな電流は、大きい電流と比べて細かい分解能で測定され得、このことは、固定分解能測定システムを上回る利点であり得る。積分器の電圧振幅を変化させることにより、ユーザーがサンプルレートを調整することを可能にするアナログ入力が存在する。これにより、生物学的に速いプロセスを分析するためにサンプルレートを増加させることが可能であり得るか、又は生物学的に遅いプロセスを分析するためにサンプルレートを遅くする（及びそれにより精度を得る）ことが可能であり得る。
【０３３５】
[00384]積分器の出力は電圧ＬＶＢ（低電圧バイアス）へと初期化され、次いで電圧ＣＭＰまで積分される。積分器の出力がこれら２つのレベルの間で振動する度に、サンプルが生成される。そのため、電流が大きいほど積分器の出力が速く振動し、従ってサンプルレートがより速くなる。ＣＭＰ電圧が低下した場合も同様に、新たなサンプルを生成するために必要な積分器の出力振動が減少し、従ってサンプルレートが増加する。そのため、ＬＶＢとＣＭＰとの間の電圧差を減少させるだけで、サンプルレートを増加させる機構が得られる。
【０３３６】
[00385]ナノポアをベースとする配列決定チップは、アレイとして構成される、自律的に動作するか又は個々にアドレス指定可能なセルを多数組み込み得る。例えば、１００万個のセルのアレイは、１０００行のセル×１０００列のセルで構成され得る。このアレイは、ヌクレオチド組込み事象時に放出されたタグが例えばナノポアにより検出される場合に、コンダクタンス差を測定することにより、核酸分子の並行配列決定を可能にする。さらに、この回路の実装により、タグ間の識別で価値があり得るポア−分子複合体のコンダクタンス特性を決定することが可能になる。
【０３３７】
[00386]統合されたナノポア／二重層電子セル構造は、電流測定を実施するために適切な電圧を印加し得る。正確に実施するためには、例えば、（ａ）電極の電圧電位を制御すること、及び（ｂ）同時に電極電流をモニタリングすることの両方が必須な場合がある。
【０３３８】
[00387]さらに、セルを互いに独立して制御することが必須な場合がある。セルの独立した制御は、異なる物理的状態にあり得る多数のセルを管理するために必要とされる場合がある。電極に印加される区分線形電圧波形刺激の正確な制御を、セルの物理的状態の間で移行するために使用し得る。
【０３３９】
[00388]回路のサイズ及び複雑さを低減するために、２つの別々の電圧を印加するための論理を用意することが十分な場合がある。これにより、セルの２つの独立したグルーピング及び対応する状態移行刺激を適用することが可能となる。状態移行は、比較的低い発生率で本質的に確率論的である。そのため、適切な制御電圧をアサートし、続いて所望の状態移行が生じているかどうかを決定するために測定を実施し得ることが極めて有益な場合がある。例えば、適切な電圧をセルに印加し、次いで電流を測定して、二重層が形成されているかどうかを決定し得る。セルは、下記の２つの群に分けられる：（ａ）二層形態を有しており、もはや電圧を印加する必要がないもの。このセルは、同一状態に留まるヌル操作（ＮＯＰ）をもたらすために印加されている０Ｖバイアスを有し得る、及び（ｂ）二重層が形成されていないもの。このセルは、電圧が印加されている二層構造を再び有する。
【０３４０】
[00389]実質的な単純化及び回路サイズの縮小は、許容可能な印加電圧を２つに制約し、物理的状態の間でバッチのセルを繰り返し移行させることにより達成され得る。例えば、許容可能な印加電圧を制約することにより、少なくとも１．１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、又は１００個の因子の減少が達成され得る。
【０３４１】
[00390]小型測定回路を使用する本発明のさらに別の実装を、図１１に示す。いくつかの場合には、この小型測定回路を使用して、本明細書で説明されている高いアレイ密度が達成され得る。この回路はまた、電極に電圧を印加し、同時に低レベルの電流を測定するようにも設計されている。
【０３４２】
[00391]セルは超小型積分器（ＵＣＩ）として動作し、基本的な操作を本明細書で説明する。セルは、Ｅｌｅｃｔｒｏｄ−Ｓｅｎｓｅ（ＥＬＳＮＳ）接続を介して電気化学的に活性な電極（例えばＡｇＣｌ）に電気的に接続されている。ＮＭＯＳトランジスタＭ１１は、下記の２つの独立した機能を実施する：（１）（Ｖｇ１Ｖｔ１）により与えられるＥＬＳＮＳノードに電圧を印加するためのソースフォロワとして動作し、（２）コンデンサＣ１からＥＬＳＮＳノードへと電子を移動するための電流コンベヤとして動作する（逆の場合も同じ）。
【０３４３】
[00392]いくつかの場合には、制御された電圧電位をＥＬＳＮＳ電極に印加してもよく、これは、電極ソースフォロワＭｌｌのゲートの電圧を変化させるだけで変動され得る。さらに、Ｍｌｌソース端子からの任意の電流は、Ｍｌｌドレイン端子に直接的に且つ正確に伝播され、コンデンサＣ０に蓄積し得る。そのため、Ｍｌｌ及びＣ０は、超小型積分器として一緒に作動する。この積分器を使用して、下記：Ｉ＊ｔ＝Ｃ＊Ｖ（Ｉは電流であり、ｔは時間であり、Ｃは静電容量であり、Ｖは電圧変化である）に従って、コンデンサ上に集積された電圧の変化を測定することにより、電極に／電極から供給された／減少した電流を決定し得る。
【０３４４】
[00393]場合によっては、固定された間隔ｔ（例えば１ｍｓ毎）に電圧変化を測定する。
【０３４５】
[00394]トランジスタＭ２は、コンデンサ電圧をバッファリングするため、及び積分電圧の低インピーダンス表現を実現するために、ソースフォロワとして構成されてもよい。これにより、電荷共有がコンデンサの電圧を変化することを防止する。
【０３４６】
[00395]トランジスタＭ３は、多くの他のセルと共有される列として接続されているアナログ電圧出力ＡＯＵＴを有する行アクセスデバイスとして使用され得る。単一セルの電圧が測定されるように、ＡＯＵＴシグナルに接続されている列の単一の行のみが有効になる。
【０３４７】
[00396]代替実装では、トランジスタＭ２のドレインを行選択可能な「スイッチドレール（ｓｗｉｔｃｈｅｄ  ｒａｉｌ）」に接続することにより、トランジスタＭ３を省略し得る。
【０３４８】
[00397]トランジスタＭ４を使用して、セルを、電圧が積算される所定の開始電圧に再設定してもよい。例えば、高電圧（例えばＶＤＤ＝１．８Ｖまで）をＲＳＴ及びＲＶの両方に印加することにより、（ＶＤＤ−ＶＴ５）のプレチャージ値までコンデンサが近づく。正確な開始値は、セル対セル（Ｍ４及びＭ２のＶｔの変動に起因する）、並びにリセットスイッチ熱ノイズ（ｓｑｒｔ（ＫＴＣ）ノイズ）に起因する測定対測定の両方を変動させてもよい。その結果、相関２重サンプリング（ＣＤＳ）技術を使用して、積分期間中の実際の電圧変化を決定するために、積分器の開始電圧及び終了電圧を測定する。
【０３４９】
[00398]トランジスタＭ４のドレインが、制御された電圧ＲＶ（リセット電圧）に接続されていてもよいことにも留意されたい。通常の動作では、これはＶＤＤへと駆動されてもよいが、低電圧へと駆動されてもよい。Ｍ４の「ドレイン」が実際にグランドへと駆動される場合には、電流の流れが反転されてもよい（即ち、電流が、Ｍ１及びＭ４を介して電極から回路に流れ、ソース及びドレインの概念が交換されてもよい）。場合によっては、このモードで回路を動作させる場合には、（液体基準に対して）電極に印加される負電圧は、（Ｖｇ１及びＶｇ５が、少なくともＲＶと比べて大きい閾値であると仮定して）このＲＶ電圧によって制御される。そのため、ＲＶの接地電圧を使用して、（例えば、エレクトロポレーション又は二層の形成を達成するために）電極に負電圧を印加してもよい。
【０３５０】
[00399]アナログデジタル変換器（ＡＤＣ、図示せず）は、一定期間の間に積分された電流を決定するために、リセット直後にＡＯＵＴ電圧を測定し、積分期間後に再び測定する（ＣＤＳ測定を実施する）。そして、ＡＤＣは、列毎に実装されてもよいし、複数の列の間に単一のＡＤＣを共有するアナログｍｕｘとして列毎に使用される個別のトランジスタであってもよい。この列ｍｕｘ係数は、ノイズ、精度、及びスループットの要件に応じて変更されてもよい。
【０３５１】
[00400]任意の時点で、各セルは、下記の４種の異なる物理的状態の内の１つであり得る：（１）液体に短絡している、（２）形成された二層、（３）二層＋ポア、（４）二層＋ポア＋核酸及び／又はタグ分子。
【０３５２】
[00401]いくつかの場合には、状態間でセルを移動させるために、電圧を印加する。ＮＯＰ操作を使用して、あるセルを特定の所望の状態に残し、他のセルは、印加電位により刺激されて、ある状態から別へと移動する。
【０３５３】
[00402]このことは、２つ（又はより多く）の異なる電圧を有することにより達成され得、これらの電圧は、液体の電位に対して電極に印加される電圧を制御するために間接的に使用されるＭ１ソースフォロワのゲート電圧に印加されてもよい。そのため、トランジスタＭ５を使用して電圧Ａを印可し、トランジスタＭ６を使用して電圧Ｂを印可する。そのため、アナログｍｕｘとしてＭ５及びＭ６が一緒に動作し、ＳＥＬＡ又はＳＥＬＢのいずれかを高駆動させて電圧を選択する。
【０３５４】
[00403]全てのセルが可能な異なる状態であってもよいことから、且つＳＥＬＡ及びＳＥＬＢが相補的であることから、各セルでメモリ素子を使用して、電圧Ａ又はＢの間を選択し得る。このメモリ素子は、サイクル毎にリフレッシュされた動的素子（コンデンサ）であり得るか、又は単純なチーターラッチメモリ素子（クロス接続されたインバータ）であり得る。
【０３５５】
オペアンプテストチップ構造
[00404]いくつかの例では、テストチップは、各６６個のセンサーセルからなる４つの別々の群（別名バンク）に配置されている２６４個のセンサーのアレイを含む。各群は、各列に２２個のセンサー「セル」を有する３つの「列」に順に分割されている。「セル」の名称は、理想的には二脂質層及び挿入されたナノポアからなる仮想セルが、このアレイ中の２６４個のセンサーの各々の上方に形成されている（しかしながら、デバイスは、そのように装着されたセンサーセルの一部のみで成功裏に動作してもよい）ことを考慮して適切である。
【０３５６】
[00405]ダイの表面に取り付けられた導電性シリンダー内に含まれる液体に電圧電位を印加する単一のアナログＩ／Ｏパッドが存在する。この「液体」電位は細孔の上側に印加され、検出器アレイ中の全てのセルに共通である。細孔の底面には露出した電極が存在し、各センサーセルは、その電極に別個の底部側電位を印加し得る。次いで、上部液体接続と、細孔の底部側の各セルの電極接続との間で電流が測定される。センサーセルは、細孔内を通るタグ分子により変調された場合に、細孔を通り抜ける電流を測定する。
【０３５７】
[00406]場合によっては、５個のビットが各センサーセルのモードを制御する。図９を続けて参照すると、アレイ中の２６４個のセルのそれぞれが個別に制御され得る。値は６６個のセルの群に別々に適用される。群中の６６個のセルのそれぞれのモードは、データシフトレジスタ（ＤＳＲ）に３３０（６６＊５個のビット／セル）デジタル値を連続的にシフトインすることにより制御される。これらの値は、６６個のセルの各群に対して別々のピン対を有するＫＩＮ（クロック）及びＤＩＮ（ｄａｔ  ｉｎ）ピンを使用して、アレイにシフトされる。
【０３５８】
[00407]そのため、３３０個のクロックを使用して、ＤＳＲシフトレジスタに３３０個のビットをシフトさせる。対応するＬＩＮ＜ｉ＞（ロード入力）が高くアサートされる場合には、第２の３３０ビット並行ロードレジスタ（ＰＬＲ）が、このシフトレジスタから並列ロードされる。ＰＬＲが並列にロードされるのと同時に、セルの状態値がＤＳＲにロードされる。
【０３５９】
[00408]完全な動作は、ＤＳＲに３３０個のデータビットをシフトインするための３３０個のクロック、高くアサートされたＬＩＮ信号を含む単一のクロックサイクル、続いてＤＳＲからシフトされた捕捉状態データを読み込むための３３０回のクロックサイクルからなり得る。３３０個のビットがアレイから読み出されている間に、新たな３３０個のビットが同時にＤＳＲにシフトされ得るように、この動作はパイプライン化されている。そのため、５０ＭＨｚのクロック周波数では、読み取りのためのサイクル時間は、３３１／５０ＭＨｚの＝６．６２ｕｓである。
【０３６０】
配列決定のためのナノポアのアレイ
[00409]本開示は、核酸配列を配列決定するためのナノポア検出器（又はセンサー）のアレイを提供する。図７を参照すると、複数個の核酸分子が、ナノポア検出器のアレイで配列決定され得る。ここで、各ナノポアの位置（例えば７０１）は、場合によってはポリメラーゼ酵素及び／又はホスファターゼ酵素に付着しているナノポアを含む。一般的に、本明細書の他の箇所で説明されているように、各アレイ位置にセンサーもが存在する。
【０３６１】
[00410]いくつかの例では、核酸ポリメラーゼに付着しているナノポアのアレイが提供され、タグ付きヌクレオチドは、ポリメラーゼにより組み込まれる。重合中に、タグは、（例えば、ナノポア中に若しくはナノポアを通って放出されるか若しくは通過することにより、又はナノポアに提示されることにより）ナノポアにより検出される。ナノポアのアレイは、任意の適切な数のナノポアを有し得る。いくつかの場合には、このアレイは、約２００個、約４００個、約６００個、約８００個、約１０００個、約１５００個、約２０００個、約３０００個、約４０００個、約５０００個、約１００００個、約１５０００個、約２００００個、約４００００個、約６００００個、約８００００個、約１０００００個、約２０００００個、約４０００００個、約６０００００個、約８０００００個、約１００００００個等のナノポアを含む。いくつかの場合には、このアレイは、少なくとも２００個、少なくとも４００個、少なくとも６００個、少なくとも８００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１００００個、少なくとも１５０００個、少なくとも２００００個、少なくとも４００００個、少なくとも６００００個、少なくとも８００００個、少なくとも１０００００個、少なくとも２０００００個、少なくとも４０００００個、少なくとも６０００００個、少なくとも８０００００個、又は少なくとも１００００００個のナノポアを含む。
【０３６２】
[00411]場合によっては、単一のヌクレオチドの組込み時に、単一のタグが放出され及び／又は提示され、ナノポアにより検出される。他の場合では、複数個のヌクレオチドの組込み時に、複数個のタグが放出される、及び／又は提示される。ナノポアに隣接するナノポアセンサーは、個々のタグ又は複数個のタグを検出し得る。複数個のタグと関連する１つ又は複数のシグナルが検出されて、平均化シグナルを得るために処理されてもよい。
【０３６３】
[00412]タグは、時間の関数としてセンサーにより検出され得る。経時的に検出されたタグを使用して、例えば、センサーデータを記録して、このデータから配列情報を生成するようにプログラムされているコンピュータシステム（例えば図１６を参照されたい）を用いて、核酸サンプルの核酸配列を決定し得る。
【０３６４】
[00413]ナノポア検出器のアレイは、高密度の別個の部位を有し得る。例えば、単位面積（即ち密度）当たり比較的多数の部位は、携帯式であり、低コストであり、又は他の有利な特徴を有する、より小型のデバイスの構築を可能にする。アレイ中の個々の部位は、個々にアドレス指定可能な部位であり得る。ナノポア及び検知回路を含む多数の部位は、例えば並列配列決定を介して、比較的多数の核酸分子の一度の配列決定を可能にし得る。そのようなシステムは、スループットを増加させ得、及び／又は核酸サンプルを配列決定するコストを削減し得る。
【０３６５】
[00414]核酸サンプルは、別個の部位を含む表面を備えた基板を有するセンサー（又は検出器）を使用して配列決定されてもよく、各個々の部位は、ナノポア、ポリメラーゼ、及び場合によっては、ナノポアに付着している少なくとも１個のホスファターゼ酵素、及びナノポアに隣接する検知回路を有する。このシステムは、この基板と流体連通するフローセルをさらに含んでもよく、このフローセルは、この基板に１種又は複数種の試薬を送達するように適合される。
【０３６６】
[00415]この表面は、任意の適切な密度の別個の部位（例えば、所与の時間内に又は所与のコストで核酸サンプルを配列決定するのに適した密度）を含む。各別個の部位はセンサーを含み得る。この表面は、１ｍｍ２当たり約５００個の部位以上の密度の別個の部位を有してもよい。いくつかの実施形態では、この表面は、１ｍｍ２当たり約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個、約１０００個、約２０００個、約３０００個、４０００個、約５０００個、約６０００個、約７０００個、約８０００個、約９０００個、約１００００個、約２００００個、約４００００個、約６００００個、約８００００個、約１０００００個、又は約５０００００個の部位の密度の別個の部位を有する。場合によっては、この表面は、１ｍｍ２当たり少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１００００個、少なくとも２００００個、少なくとも４００００個、少なくとも６００００個、少なくとも８００００個、少なくとも１０００００個、又は少なくとも５０００００個の部位の密度の別個の部位を有する。
【０３６７】
タグ付きヌクレオチド
[00416]場合によっては、タグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチド組込み事象で切断してナノポアを用いて検出し得るタグを含む。このタグは、このヌクレオチドの５’リン酸塩に付着し得る。いくつかの場合には、このタグはフルオロフォアではない。このタグは、その電荷、形状、サイズ、又はこれらの任意の組み合わせにより検出可能であり得る。タグの例として、種々なポリマーが挙げられる。各種のヌクレオチド（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）は概して、固有のタグを含む。
【０３６８】
[00417]タグは、ヌクレオチド上の任意の適切な位置に配置され得る。図１３は、タグ付きヌクレオチドの一例を示す。ここで、他の改変も許容可能ではあるが、Ｒ１は概してＯＨであり、Ｒ２はＨ（即ち、ＤＮＡの場合）又はＯＨ（即ち、ＲＮＡの場合）である。図１３では、Ｘは任意の適切なリンカーである。場合によっては、このリンカーは切断可能である。リンカーの例として、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、又はＣＨ２が挙げられるが、これらに限定されない。位置Ｚに適した化学基の例として、Ｏ、Ｓ、又はＢＨ３が挙げられる。塩基は、核酸への組込みに適した任意の塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、又はこれらの誘導体）である。場合によっては、ユニバーサル塩基も許容可能である。
【０３６９】
[00418]リン酸塩の数（ｎ）は、任意の適切な整数値（例えば、ヌクレオチドが核酸分子に組み込まれ得るようなリン酸塩の数）である。いくつかの場合には、全種のタグ付きヌクレオチドが同数のリン酸を有するが、このことは必須ではない。いくつかの用途では、各種のヌクレオチドに異なるタグが存在し、様々なタグを識別するためにリン酸塩の数を必ずしも使用するわけではない。しかしながら、場合によっては、複数種のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、又はＵ）が同一のタグ分子を有し、あるヌクレオチドを別と識別する能力は、（ｎに関して異なる値を有する様々な種類のヌクレオチドによる）リン酸塩の数により少なくとも部分的に決定される。いくつかの実施形態では、ｎの値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であるか、又はより大きい。
【０３７０】
[00419]適切なタグを下記で説明する。いくつかの場合には、このタグは、化合物の残余の電荷に対して逆の符号の電荷を有する。このタグが付着している場合には、化合物全体の電荷は中性であり得る。このタグの放出により、２個の分子が生じ得、即ち、荷電タグ及び荷電ヌクレオチドが生じ得る。荷電タグはナノポアを通り抜け、場合によっては検出される。
【０３７１】
[00420]適切なタグ付きヌクレオチドのより多くの例を図１４に示す。タグは、糖分子、塩基分子、又はこれらの任意の組み合わせに付着していてもよい。図１３を参照すると、Ｙはタグであり、Ｘはリンカー（場合によっては切断可能である）である。さらに、Ｒ１は、存在する場合には、一般にＯＨ、−ＯＣＨ２Ｎ３、又は−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、Ｒ２は、存在する場合には、一般にＨである。また、Ｚは、一般にＯ、Ｓ、又はＢＨ３であり、ｎは、任意の整数（例えば、１、２、３、又は４）である。場合によっては、Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦＦ、又はＮＨである。
【０３７２】
[00421]図１４を続けて参照すると、各ｄＮＰＰ類似体上の塩基の種類は、他の３種のｄＮＰＰ類似体のそれぞれ上の塩基の種類と一般に異なり、各ｄＮＰＰ類似体上のタグの種類は、他の３種のｄＮＰＰ類似体のそれぞれ上のタグの種類と一般に異なる。適切な塩基として、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、若しくはチミン、又はこれらのそれぞれの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、又は５−メチルシトシンの内の１つである。
【０３７３】
[00422]Ｒ１が−Ｏ−ＣＨ２Ｎ３である場合には、本方法は、−ＣＨ２Ｎ３が除去されて３’位に付着しているＯＨ基が生じるように、組み込まれるｄＮＰＰ類似体を処理して、それにより、さらなるｄＮＰＰ類似体の組込みが可能になる、処理するステップをさらに含み得る。
【０３７４】
[00423]Ｒ１が−Ｏ−２−ニトロベンジルである場合には、本方法は、−２−ニトロベンジルが除去されて３’位に付着しているＯＨ基が生じるように、組み込まれるヌクレオチド類似体を処理して、それにより、さらなるｄＮＰＰ類似体の組込みが可能になる、処理するステップをさらに含み得る。
【０３７５】
タグの例
[00424]タグは、ナノポア中で検出され得る任意の化学基又は分子であり得る。場合によっては、タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪族酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、又はこれらの組み合わせの内の１つ又は複数を含む。
【０３７６】
[00425]タグは、化合物中のリン酸塩の数のバランスをとるために適切な数のリシン又はアルギニンをさらに含むことも企図される。
【０３７７】
[00426]場合によっては、タグはポリマーである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はポリマーの一例であり、下記：
【化１】
2021506292.tif 000003
のような構造を有する。
【０３７８】
[00427]任意の数のエチレングリコールユニット（Ｗ）を使用し得る。いくつかの場合には、Ｗは０〜１００の整数である。場合によっては、エチレングリコールユニットの数は、ヌクレオチドの種類毎に異なる。ある実施形態では、４種のヌクレオチドは、１６個、２０個、２４個、又は３６個のエチレングリコールユニットを有するタグを含む。場合によっては、タグは、クマリン系色素等の追加の識別可能な部分をさらに含む。場合によっては、ポリマーは帯電している。いくつかの場合には、ポリマーは帯電しておらず、タグは高濃度の塩（例えば３〜４Ｍ）で検出される。
【０３７９】
[00428]本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有する、分枝した及び直鎖の両方の飽和脂肪族炭化水素基を含み、非置換であってもよいし置換されていてもよい。本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む、直鎖の又は分枝した非芳香族炭化水素ラジカルを指し、非芳香族炭素−炭素二重結合の最大可能な数が存在してもよく、且つ非置換であってもよいし置換されていてもよい。用語「アルキニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む、直鎖の又は分枝した炭化水素ラジカルを指し、非芳香族炭素−炭素三重結合の最大可能な数が存在してもよく、且つ非置換であってもよいし置換されていてもよい。用語「置換されている」は、アルキル又はヒドロカルビル等の上記で説明されているような官能基を指し、この官能基では、通常の原子価が維持され、且つ置換により安定した化合物が生じるならば、この官能基に含まれる水素原子への少なくとも１個の結合は、非水素原子又は非炭素原子への結合に置き換えられる。置換基として、炭素原子又は水素原子への１個又は複数個の結合が、ヘテロ原子への１個又は複数個の結合（例えば二重結合又は三重結合）に置き換えられている基も挙げられる。
【０３８０】
[00429]場合によっては、タグは、（例えば、方向を反転させることなく）一方向でのみナノポアを通り抜け得る。このタグは、このタグに付着しているヒンジ付きゲートであって、一方向でタグと整列されている場合にはナノポアを通り抜けるほどに薄いが、別方向で配列されている場合にはナノポアを通り抜けないゲートを有し得る。図３１を参照すると、本開示は、第１のセグメント３１１０及び第２のセグメント３１１５を含む第１のポリマー鎖３１０５を含むタグ分子を提供し、第２のセグメントは第１のセグメントと比べて狭い。第２のセグメントは、ナノポアの最も狭い開口と比べて小さい幅を有し得る。このタグ分子は、２個の端部を含む第２のポリマー鎖３１２０を含み得、第１の端部は、第２のセグメントに隣接する第１のポリマー鎖に固定されており、第２の端部は、第１のポリマー鎖に固定されていない。このタグ分子は、第２のポリマー鎖が第２のセグメント３１２５に隣接して整列する第１方向で、ナノポアを通され得る。場合によっては、このタグ分子は、第２のポリマー鎖が第２のセグメント３１３０に隣接して整列していない第２の方向で、ナノポアに通され得ない。第２の方向は第１の方向と反対であり得る。
【０３８１】
[00430]第１及び／又は第２のポリマー鎖は、ヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合では、第２のポリマー鎖が第２のセグメントに隣接して整列していない場合には、第２のポリマー鎖は第１のポリマー鎖と塩基対を形成する。いくつかの場合には、第１のポリマー鎖はヌクレオチド３１３５（例えば、このヌクレオチドの末端リン酸塩）に固定されている。伸長している核酸鎖にヌクレオチドが組み込まれる際に、第１のポリマー鎖はヌクレオチドから放出され得る。
【０３８２】
[00431]第２のセグメントは、ゲート（第２のポリマー）と整列した場合には、ナノポアを通り抜け得るほどに薄い任意のポリマー又は他の分子を含み得る。例えば、第２のセグメントは、ａ−塩基性ヌクレオチド（即ち、いかなる核酸塩基も有しない核酸鎖）又は炭素鎖を含み得る。
【０３８３】
[00432]本開示はまた、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法も提供する。図３２を参照すると、この方法は、ナノポアを含む反応チャンバ中にタグ付きヌクレオチド３２０５を供給するステップを含み得、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドタグは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み、このタグはナノポアを用いて検出可能である。このタグは、第１のセグメント及び第２のセグメントを含む第１のポリマー鎖を含み、第２のセグメントは、第１のセグメントと２個の端部を含む第２のポリマー鎖と比べて狭く、第１の端部は、第２のセグメントに隣接する第１のポリマー鎖に固定されており、第２の端部は第１のポリマー鎖に固定されていない。このタグ分子は、第２のポリマー鎖が第２のセグメントに隣接して整列する第１の方向３２１０でナノポアに通され得る。
【０３８４】
[00433]この方法は、ポリメラーゼ３２１５を用いて重合反応を実行するステップであって、それにより、核酸サンプルからの一本鎖核酸分子３２２５に相補的な伸長鎖３２２０に、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを組み込む、ステップを含む。この方法は、ナノポア３２３０を用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップを含み得、このタグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合している場合にナノポアを用いて検出される。
【０３８５】
[00434]場合によっては、このタグ分子は、第２のポリマー鎖が第２のセグメントに隣接して整列していない第２の方向でナノポアに通され得ない。
【０３８６】
[00435]このタグは、ポリメラーゼと会合しつつ複数回検出され得る。いくつかの実施形態では、電極は、タグ検出期間の間に再充電される。場合によっては、タグは、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中にナノポアに入り込み、このタグは、電極が再充電される場合にナノポアから出ない。
【０３８７】
タグを付着させる方法
[00436]タグを付着させるために任意の適切な方法を使用し得る。一例では、（ａ）環状トリメタリン酸塩の産生を可能にする条件下で、ヌクレオチド三リン酸と、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルホルムアミドとを接触させるステップ；（ｂ）ステップａ）から得られる生成物と求核試薬とを接触させて、−ＯＨ官能化化合物又は−ＮＨ２官能化化合物を形成するステップ；及び（ｃ）タグを末端リン酸塩に間接的に結合させることを可能にする条件下で、ステップｂ）の生成物と、−ＣＯＲ基が付着しているタグとを反応させ、それによりヌクレオチド三リン酸類似体を形成するステップによって、タグを末端リン酸塩に付着させ得る。
【０３８８】
[00437]場合によっては、この求核試薬は、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＯＨ、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＮＨ２、又は
【化２】
2021506292.tif 000004
である。
【０３８９】
[00438]いくつかの場合には、この方法は、ステップｂ）において、ステップａ）から得られる生成物と、構造：
【化３】
2021506292.tif 000005
を有する化合物とを接触させ、その後に又は同時に、生成物とＮＨ４ＯＨとを接触させて、構造：
【化４】
2021506292.tif 000006
を有する化合物を形成することを含む。次いで、ステップｂ）の生成物を、タグを末端リン酸塩に間接的に結合させることを可能にする条件下で、−ＣＯＲ基が付着しているタグと反応させ得、それにより、構造：
【化５】
2021506292.tif 000007
を有するヌクレオチド三リン酸類似体が形成され、ここで、Ｒ１は、ＯＨであり、Ｒ２は、Ｈ又はＯＨであり、塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリン、又は５−メチルピリミジンである。
【０３９０】
タグの放出
[00439]タグは任意の方法で放出され得る。タグは、伸長している核酸鎖へのタグを有するヌクレオチドの組込みの最中又は後に放出され得る。場合によっては、このタグはポリリン酸塩に付着しており（例えば図１３）、核酸分子へのヌクレオチドの組込みにより、タグが付着しているポリリン酸塩が放出される。この組込みは、ナノポアに付着し得る少なくとも１個のポリメラーゼにより触媒され得る。いくつかの場合には、この細孔には、少なくとも１個のホスファターゼ酵素も付着している。このホスファターゼ酵素は、ポリリン酸塩からタグを切断してタグを放出し得る。場合によっては、ホスファターゼ酵素は、ポリメラーゼ反応中にポリメラーゼにより生成されるピロリン酸塩が、細孔に入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するように配置されている。
【０３９１】
[00440]場合によっては、タグはポリリン酸塩に付着していない（例えば図１４を参照されたい）。この場合には、このタグは、切断可能であり得るリンカー（Ｘ）により付着している。切断可能に蓋をされている及び／又は切断可能に連結されているヌクレオチド類似体の製造方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６６４，０７９号明細書に開示されている。このリンカーは、必ずしも切断可能ではない。
【０３９２】
[00441]このリンカーは、任意の適切なリンカーであってもよく、任意の適切な方法で切断され得る。このリンカーは光切断可能であってもよい。ある実施形態では、ＵＶ光を使用して、光化学的に切断可能なリンカー及び部分を光化学的に切断する。ある実施形態では、光切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分である。
【０３９３】
[00442]−ＣＨ２Ｎ３基をＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で処理して、この−ＣＨ２Ｎ３基をｄＮＰＰ類似体又はｒＮＰＰ類似体の３’Ｏ原子から除去してもよく、それにより３’ＯＨ基が作成される。
【０３９４】
タグの検出
[00443]いくつかの場合には、ポリメラーゼは、複数個の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及び／又はＵ）を含むタグ付きヌクレオチドのプールから引き出す。ポリメラーゼと様々な種類のタグ付き塩基とを繰り返し接触させることも可能である。この場合には、各種のヌクレオチドは固有の塩基を有することは必須でない場合があるが、異なる塩基型との間での循環により、場合によってはこのプロセスにコスト及び複雑さが加えられるが、この実施形態は本発明に包含される。
【０３９５】
[00444]図１５は、いくつかの実施形態では、（例えば、テンプレートと対形成するプライマー塩基を伸長させるためにポリメラーゼを使用する）核酸分子へのタグ付きヌクレオチドの組込みにより、検出可能なタグ−ポリリン酸塩が放出され得ることを示す。場合によっては、タグ−ポリリン酸塩は、ナノポアを通り抜ける際に検出される。いくつかの実施形態では、タグ−ポリリン酸塩は、ナノポア内に滞留する際に検出される。
【０３９６】
[00445]場合によっては、この方法は、（例えば、タグが同一である場合であっても）ポリリン酸塩を含むリン酸塩の数に基づいてヌクレオチドを識別する。それにもかかわらず、各種のヌクレオチドは一般に、固有のタグを有する。
【０３９７】
[00446]図１５を参照すると、タグがナノポア中に入る及び／又はナノポアを通り抜けてイオン電流を測定する前に、タグ−ポリリン酸塩化合物をホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ）で処理してもよい。
【０３９８】
[00447]タグは、ヌクレオチドから放出された後に、ナノポアを通って流れ得る。いくつかの場合には、電圧を印加して、タグをナノポアから引き出す。放出されたタグの少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９、又は少なくとも９９．９９％は、ナノポアを通って転位し得る。
【０３９９】
[00448]いくつかの場合には、タグは、検出される期間にわたりナノポア中に滞留する。いくつかの場合には、電圧を印加して、タグをナノポアに引き込み、タグを検出し、タグをナノポアから排出し、又はこれらの任意の組み合わせを行う。タグは、ヌクレオチド組込み事象時に、放出され得るか、又はヌクレオチドに結合したままであり得る。
【０４００】
[00449]タグは、（少なくとも部分的に）その電荷に起因して、ナノポア中で検出され得る。いくつかの場合には、タグ化合物は、第１の正味電荷を有する交互帯電化合物であって、化学的、物理的、又は生物学的な反応の後に、異なる第２の正味電荷を有する交互帯電化合物である。いくつかの場合には、タグの電荷の大きさは、化合物の残余の電荷の大きさと同一である。ある実施形態では、タグは正電荷を有し、タグを除去により化合物の電荷が変化する。
【０４０１】
[00450]場合によっては、タグがナノポア中に入る及び／又はナノポアを通過する際に、電子的変化が発生し得る。場合によっては、この電子的変化は、電流振幅の変化、ナノポアのコンダクタンスの変化、又はこれらの任意の組み合わせである。
【０４０２】
[00451]ナノポアは、生物学的であってもよいし合成であってもよい。また、細孔はタンパク質性であり、例えば、細孔はアルファ溶血素タンパク質であることも企図される。合成ナノポアの例は、固体状態の細孔又はグラフェンである。
【０４０３】
[00452]場合によっては、ポリメラーゼ酵素及び／又はホスファターゼ酵素がナノポアに付着している。融合タンパク質又はジスルフィド架橋は、タンパク質性ナノポアに付着させる方法の例である。固体状態のナノポアの場合には、ナノポア付近の表面への付着は、ビオチン−ストレプトアビジン連結を介してもよい。ある例では、ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ基で官能化されているアルカンチオール自己組織化単分子膜で修飾されている金表面を介して固体表面に付着しており、アミノ基は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ基への付着のために、ＮＨＳエステルに改変されている。
【０４０４】
[00453]この方法を、任意の適切な温度で実施し得る。いくつかの実施形態では、この温度は４℃〜１０℃である。いくつかの実施形態では、この温度は周囲温度である。
【０４０５】
[00454]この方法を、任意の適切な溶液中で及び／又は緩衝液中で実施してもよい。いくつかの場合には、この緩衝液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳでｐＨ７．０〜８．０に緩衝化されている３００ｍＭのＫＣｌである。いくつかの実施形態では、この緩衝液は二価の陽イオンを含まない。場合によっては、この方法は二価カチオンの存在の影響を受けない。
【０４０６】
核酸サンプルを配列決定するためのコンピュータシステム
[00455]本開示の核酸配列決定システム及び方法は、コンピュータシステムを用いて制御され得る。図１６は、核酸配列決定システム１６０２に接続されているコンピュータシステム１６０１を含むシステム１６００を示す。コンピュータシステム１６０１は、１つのサーバーであってもよいし、複数のサーバーであってもよい。コンピュータシステム１６０１は、サンプルの調製及び処理、並びに配列決定システム１６０２による核酸配列決定を制御するようにプログラムされ得る。本明細書の他の箇所で説明されているように、配列決定システム１６０２は、ナノポアベースのシーケンサー（又は検出器）であってもよい。
【０４０７】
[00456]このコンピュータシステムは、本発明の方法を実装するようにプログラムされ得る。コンピュータシステム１６０１は、シングルコアプロセッサ若しくはマルチコアプロセッサであり得るか又は並列処理のための複数のプロセッサであり得る中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」も同様）１６０５を含む。コンピュータシステム１６０１はまた、メモリ１６１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１６１５（例えばハードディスク）、１つ又は複数のシステムと通信するための通信インターフェース１６２０（例えばネットワークアダプタ）、並びに周辺機器１６２５（例えば、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、及び／又は電子ディスプレイアダプタ）も含む。メモリ１６１０、記憶装置１６１５、インターフェース１６２０、及び周辺機器１６２５は、マザーボード等の通信バス（実線）を介してＣＰＵ１６０５と通信する。記憶装置１６１５は、データを記憶するためのデータストレージユニット（又はデータレポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１６０１は、通信インターフェース１６２０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）に動作可能にされ得る。このネットワークは、インターネット（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）、ネットワーク間のネットワーク（ｉｎｔｅｒｎｅｔ）及び／若しくはエクストラネット、又はインターネット（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）と通信するイントラネット及び／若しくはエクストラネットであり得る。このネットワークは、分散コンピューティングを可能にし得る１つ又は複数のコンピュータサーバーを含み得る。
【０４０８】
[00457]本発明の方法は、コンピュータシステム１６０１の電子記憶場所（例えばメモリ１６１０又は電子ストレージユニット１６１５）に記憶された、機械（又はコンピュータプロセッサ）実行可能コード（又はソフトウェア）により実装され得る。使用中に、このコードは、プロセッサ１６０５により実行され得る。場合によっては、このコードはストレージユニット１６１５から取得され得、プロセッサ１６０５による迅速なアクセスのためにメモリ１６１０に記憶される。いくつかの状況下では、電子記憶ユニット１６１５は除外され得、機械実行可能命令がメモリ１６１０に記憶される。
【０４０９】
[00458]このコードは、プレコンパイルされて、コードを実行するように適合されているプロセッサを有する機械による使用のために構成され得るか、又は実行中にコンパイルされ得る。このコードは、このコードをプレコンパイルされた様式で又はコンパイルされた様式として実行し得るように選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
【０４１０】
[00459]コンピュータシステム１６０１は、ユーザープロファイル情報（例えば、名称、物理アドレス、電子メールアドレス、電話番号、インスタントメッセージ（ＩＭ）ハンドル、教育情報、仕事情報、社会的好み及び／又は社会的嫌悪、並びにユーザー又は他のユーザーへの潜在的な関連性の他の情報）を記憶するように適合され得る。そのようなプロファイル情報は、コンピュータシステム１６０１の記憶装置１６１５に記憶され得る。
【０４１１】
[00460]本明細書で提供されるシステム及び方法（例えばコンピュータシステム１６０１）の態様は、プログラミングで具体化され得る。この技術の様々な態様は、典型的にある種の機械可読媒体で実行されるか又は具体化される機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連データの形式の「製品」又は「製造品」であると考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ）又はハードディスク等の電子記憶ユニットに記憶され得る。「ストレージ」タイプのメディアは、コンピュータ、プロセッサ等、又はその関連するモジュールの実体メモリ（例えば、様々な半導体メモリ、テープ装置、ディスク装置、及び同類のもの）の内のいずれか又は全てを含み得、これらは、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的ストレージを提供し得る。ソフトウェアの全て又は一部は、時々、インターネット又は様々な他の通信ネットワークを介して通信され得る。そのような通信は、例えば、あるコンピュータ又はプロセッサから別のものへのソフトウェアのローディングを可能にし得、例えば、管理サーバー又はホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得る。そのため、ソフトウェア要素を担持し得る別のタイプのメディアは、例えば、有線の及び光有線のネットワーク、並びに様々なエアリンクを介してローカルデバイス間の物理インターフェースを横切って使用される光波、電波、及び電磁波を含む。そのような波を運ぶ物理的要素（例えば、有線若しくは無線のリンク、光リンク、又は同類のもの）も、ソフトウェアを担持する媒体と見なし得る。本明細書で使用される場合、非一時的に制限されていない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」等の用語である有形の「ストレージ」媒体は、実行のためのプロセッサへの命令の供給に関与するあらゆる媒体を指す。
【０４１２】
[00461]従って、コンピュータ実行可能コード等の機械可読媒体は、有形の記憶媒体、搬送波媒体、又は物理伝送媒体が挙げられるがこれらに限定されない多くの形態を取り得る。不揮発性記憶媒体として、例えば光ディスク又は磁気ディスクが挙げられ得、例えば、例えば図示されているようなデータベースを実装するために使用され得る任意のコンピュータ等の記憶デバイスの内のいずれかが挙げられる。揮発性記憶媒体として、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリ等のダイナミックメモリが挙げられる。有形の伝送媒体として、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを含むワイヤ等の銅線及び光ファイバが挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号若しくは電磁信号の形態又は音波若しくは光波の形態（例えば、無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）のデータ通信中に生成されるもの）を取り得る。従って、コンピュータ可読媒体の一般的な形態として、例えば下記が挙げられる：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、あらゆる他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、又はＤＶＤ−ＲＯＭ、あらゆる他の光媒体、カード紙パンチテープ、孔のパターンを有するあらゆる他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、あらゆる他のメモリチップ又はカートリッジ、搬送波輸送データ若しくは命令、そのような搬送波を運ぶケーブル若しくはリンク、又はコンピュータがプログラミングコード及び／若しくはデータを読み取り得るあらゆる他の媒体。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためのプロセッサに１つ又は複数の命令の１つ又は複数のシーケンスを運ぶことに関与し得る。
【０４１３】
[00462]本開示のシステム及び方法を使用して、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びタンパク質等の様々なタイプの生体サンプルを配列決定し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で説明されている方法、デバイス、及びシステムを使用して、生体サンプル（例えばタンパク質又は核酸）を選別し得る。選別されたサンプル及び／又は分子を、さらなる分析のために、様々なビンに導き得る。
【０４１４】
配列決定の精度
[00463]本明細書で提供される方法は、個々のヌクレオチド組込み事象（例えば単一分子事象）を正確に識別し得る。この方法は、単一のパスで（即ち、所与の核酸分子を再配列決定する必要がなく）個々のヌクレオチド組込み事象を正確に識別し得る。場合によっては、本明細書で提供される方法を使用して、核酸分子を配列決定し得、及び再配列決定し得、又はタグ付き分子と会合しているタグを単回若しくは複数回検知し得る。例えば、ナノポアを用いて、タグを少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、２００回、３００回、４００回、５００回、６００回、７００回、８００回、９００回、１０００回、又は１０，０００回検知し得る。タグは、例えば、ナノポアを有する膜に印加される電圧を用いて、検知されてもよいし、及び再検知されてもよく、この電圧により、タグをナノポアに引き込み得るか、又はナノポアからタグを排出し得る。
【０４１５】
[00464]核酸を配列決定する方法は、約４σと比べて大きい精度で個々のヌクレオチド組込み事象を識別するステップを含む。場合によっては、ヌクレオチド組込み事象は、ナノポアを用いて検出される。ヌクレオチドと会合しているタグは組込み時に放出され得、このタグはナノポアを通り抜ける。いくつかの場合には、タグは解放されない（例えば、ナノポアに提示される）。さらに別の実施形態では、タグは放出されるが滞留する（例えば、ナノポアを通り抜けない）。異なるタグが、各種のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）と会合し得、及び／又はこれらのヌクレオチドから放出され得、ナノポアにより検出される。エラーとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）タグを検出することに失敗する、（ｂ）タグを誤識別する、（ｃ）タグが存在しない場合にタグを検出する、（ｄ）間違った順序でタグを検出する（例えば、２個のタグが、第１の順序で放出されるが、第２の順序で検出される）、（ｅ）ヌクレオチドから放出されていないタグが、放出されているとして検出される、（ｆ）組み込まれているヌクレオチドに付着していないタグが、伸長しているヌクレオチド鎖に組み込まれていると検出される、又はこれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、個々のヌクレオチドの組込み事象を識別する精度は、１００％−エラーが発生する割合（即ちエラー率）である。
【０４１６】
[00465]個々のヌクレオチド組込み事象を識別する精度は、任意の適切な割合である。個々のヌクレオチドの組込み事象を識別する精度は、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．９％、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％等であり得る。場合によっては、個々のヌクレオチド組込み事象を識別する精度は、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９９％、少なくとも９９．９９９９％等である。いくつかの場合には、個々のヌクレオチド組込み事象を識別する精度は、単位シグマ（σ）で報告される。シグマとは、不良のない製品の割合等のエラー率を報告するために経営管理及び製造戦略で使用されることがある統計的変数のことである。ここで、シグマ値は、下記のような関係に従って精度と交換可能に使用され得る：４σは９９．３８％の精度であり、５σは９９．９７７％の精度であり、６σは９９．９９９６６％の精度である。
【０４１７】
[00466]本明細書で説明されている方法に従って、個々のヌクレオチド組込み事象を識別することを使用して、核酸配列を正確に決定し得る。いくつかの場合には、核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）の核酸配列の決定は、エラーを含む。エラーの例として、欠失（核酸を検出することに失敗する）、挿入（本当は存在しない核酸を検出する）、及び置換（間違った核酸を検出する）が挙げられるが、これらに限定されない。（例えば、バイオインフォマティクス技術に従って）測定された核酸配列と真の核酸配列とを整列させ、欠失、挿入、及び／又は置換である核酸位置の割合を決定することにより、核酸配列決定の精度を決定し得る。エラーは、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせである。精度は０％〜１００％の範囲であり、１００％は、核酸の配列の完全に正しい決定である。同様に、エラー率は１００％であり、精度が０％〜１００％の範囲であり、０％のエラー率は核酸の配列の完全に正しい決定である。
【０４１８】
[00467]本明細書で説明されている方法に従って及び／又は本明細書で説明されているデバイスを使用して実施される場合の核酸配列決定の精度は、高い。この精度は任意の適切な高い値である。いくつかの場合には、この精度は、約９５％、約９５．５％、約９６％、約９６．５％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．９％、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％等である。いくつかの場合には、この精度は、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９９％、少なくとも９９．９９９９％等である。いくつかの場合には、この精度は、約９５％〜９９．９９９９％、約９７％〜９９．９９９９％、約９９％〜９９．９９９９％、約９９．５％〜９９．９９９９％、約９９．９％〜９９．９９９９％等である。
【０４１９】
[00468]高い精度を、複数のパスを実施することにより（即ち、例えば、核酸を、ナノポアを通り抜けさせるか又はナノポアに近接して通過させ、核酸分子の核酸塩基を配列決定することにより、核酸分子を複数回配列決定することによって）達成し得る。複数のパスからのデータを組み合わせ得る（例えば、他の繰り返されたパスからのデータを使用して、第１のパスの欠失、挿入、及び／又は置換を訂正する）。いくつかの状況下では、例えば、ナノポア又は膜に印加される電圧（例えばＤＣ電圧又はＡＣ電圧）を反転させることによってナノポアに通して又はナノポアに隣接してタグを複数回通過させることにより、タグの検出精度を増加させ得る。この方法は、わずかなパス（読み取り、配列決定範囲の多重度とも称される）で高い精度を提供する。パスの数は任意の適切な数であり、整数である必要はない。いくつかの実施形態では、核酸分子は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１２回、１４回、１６回、１８回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回等配列決定される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、最大１回、最大２回、最大３回、最大４回、最大５回、最大６回、最大７回、最大８回、最大９回、最大１０回、最大１２回、最大１４回、最大１６回、最大１８回、最大２０回、最大２５回、最大３０回、最大３５回、最大４０回、最大４５回、最大５０回等配列決定される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、約１回〜１０回、約１回〜５回、約１回〜３回等配列決定される。精度のレベルは、最大２０個のパスから収集されたデータを組み合わせることにより達成され得る。いくつかの実施形態では、精度のレベルは、最大１０個のパスから収集されたデータを組み合わせることにより達成される。いくつかの実施形態では、精度のレベルは、最大５個のパスから収集されたデータを組み合わせることにより達成される。場合によっては、精度のレベルは単一パスで達成される。
【０４２０】
[00469]エラー率は、任意の適切に低い割合である。いくつかの場合には、エラー率は、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、約０．１％、約０．０１％、約０．００１％、約０．０００１％等である。いくつかの場合には、エラー率は、最大１０％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、最大０．５％、最大０．１％、最大０．０１％、最大０．００１％、最大０．０００１％等である。いくつかの場合には、エラー率は、１０％〜０．０００１％、３％〜０．０００１％、１％〜０．０００１％、０．０１％〜０．０００１％等である。
【０４２１】
反復配列の除去
[00470]ゲノムＤＮＡは、核酸配列決定反応を実施する際に、場合によっては、目的ではない反復配列を含む可能性がある。本明細書で提供されるのは、（例えば、反復配列（例えばＣｏｔ−１  ＤＮＡ）に相補的な配列とのハイブリダイゼーションにより）この反復配列を除去する方法である。
【０４２２】
[00471]ある態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法は、核酸サンプルから反復核酸配列を除去して、配列決定のために一本鎖核酸分子を得るステップを含む。この方法は、ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ナノポアを用いて検出可能であるヌクレオチドに結合されているタグを含む、ステップをさらに含む。場合によっては、この方法は、ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップを含む。この方法は、ナノポアを用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップであって、このタグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合している場合にナノポアを用いて検出される、ステップを含み得る。
【０４２３】
[00472]場合によっては、反復配列は反応から物理的に除去されないが、（例えば、反復配列を二本鎖にして配列決定反応から効率的に「取り除く」Ｃｏｔ−１  ＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより）配列決定され得ず、反応混合物中に残っている。場合によっては、反復配列は二本鎖にされる。
【０４２４】
[00473]反復配列は、任意の適切な長さを有し得る。場合によっては、反復核酸配列は、約２０個、約４０個、約６０個、約８０個、約１００個、約２００個、約４００個、約６００個、約８００個、約１０００個、約５０００個、約１００００個、又は約５００００個の核酸塩基を含む。場合によっては、反復核酸配列は、少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約４００個、少なくとも約６００個、少なくとも約８００個、少なくとも約１０００個、少なくとも約５０００個、少なくとも約１００００個、又は少なくとも約５００００個の核酸塩基を含む。場合によっては、塩基は連続している。
【０４２５】
[00474]反復核酸配列は、任意の数の反復サブユニットを有し得る。場合によっては、この反復サブユニットは連続している。いくつかの実施形態では、反復核酸配列は、約２０個、約４０個、約６０個、約８０個、約１００個、約２００個、約４００個、約６００個、約８００個、又は約１０００個の、核酸塩基の反復サブユニットを含む。場合によっては、反復核酸配列は、少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約４００個、少なくとも約６００個、少なくとも約８００個、又は少なくとも約１０００個の、核酸塩基の反復サブユニットを含む。
【０４２６】
[00475]場合によっては、反復核酸配列は、この反復核酸配列に相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーションにより除去される。反復核酸配列に相補的な核酸配列は、表面又はビーズ等の固体支持体上に固定され得る。場合によっては、反復核酸配列に相補的な核酸配列は、（約５０〜約１００個の核酸塩基の長さを有する反復核酸配列の一例である）Ｃｏｔ−１  ＤＮＡを含む。
【０４２７】
ナノポアの構築及び挿入
[00476]本明細書で説明されている方法は、ポリメラーゼが付着しているナノポアを使用し得る。場合によっては、（例えば、１個のみの核酸分子が各ナノポアで配列決定されるように）ナノポア毎に１個のみのポリメラーゼを有することが望ましい。しかしながら、アルファ−溶血素（αＨＬ）等の多くのナノポアは、複数個のサブユニット（例えば、αＨＬの場合には７個のサブユニット）を有する多量体タンパク質であり得る。サブユニットは、同じポリペプチドの同一のコピーであり得る。本明細書で提供されるのは、非改変サブユニットに対する改変サブユニットの規定の比率を有する多量体タンパク質（例えばナノポア）である。同様に、本明細書で提供されるのは、非改変サブユニットに対する改変サブユニットの規定の比率を有する多量体タンパク質（例えばナノポア）を製造する方法である。
【０４２８】
[00477]図２７を参照すると、複数個のサブユニットを有するタンパク質を構築する方法は、複数個の第１のサブユニット２７０５を準備し、且つ複数個の第２のサブユニット２７１０を準備するステップであって、第２のサブユニットは、第１サブユニットと比較した場合に改変されている、ステップを含む。場合によっては、第１サブユニットは、（例えば、天然源から精製されたか又は組換えにより産生された）野生型である。第２のサブユニットは、任意の適切な方法で改変され得る。場合によっては、第２のサブユニットは、（例えば、融合タンパク質として）付着しているタンパク質（例えばポリメラーゼ）を有する。改変サブユニットは、化学的に反応性の部分（例えば、連結を形成するのに適したアジド基又はアルキン基）を含み得る。場合によっては、この方法は、反応（例えばクリックケミストリー環化付加）を実施して、化学的に反応性の部分に実体（例えばポリメラーゼ）を付着させるステップをさらに含む。
【０４２９】
[00478]この方法は、第１の比率で第１のサブユニットと第２のサブユニット２７１５とを接触させて、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを有する複数個のタンパク質２７２０を形成するステップをさらに含み得る。例えば、ポリメラーゼを付着させるのに適した反応性基を有する１部の改変αＨＬサブユニットと、６部の野生型αＨＬサブユニットとを、（即ち１：６である第１の比率で）混合し得る。これら複数個のタンパク質は、第２のサブユニットに対する第１のサブユニットの複数の比率を有し得る。例えば、混合サブユニットは、非改変サブユニット対する改変の化学量論の分布（例えば、１：６、２：５、３：４）を有するいくつかのナノポアを形成し得る。
【０４３０】
[00479]場合によっては、このタンパク質は、サブユニットを単に混合することにより形成される。例えばαＨＬナノポアの場合には、界面活性剤（例えばデオキシコール酸）は、αＨＬモノマーが細孔構造を採用することを誘発し得る。ナノポアまた、脂質（例えば、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）、又は１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ））、及び適度な温度（例えば約１００°Ｃ未満）を使用しても形成され得る。場合によっては、ＤＰｈＰＣと緩衝液とを混合することにより、大きい多層状小胞（ＬＭＶ）が生成され、この溶液にαＨＬサブユニットを添加して、この混合物を３０分にわたり４０℃でインキュベートすることにより、細孔が形成される。
【０４３１】
[00480]２種の異なる種類のサブユニット（例えば、天然の野生型タンパク質、及び単一点変異を含み得る第２のαＨＬモノマー）を使用する場合には、得られるタンパク質は、（例えば、野生型及び変異体タンパク質の）混合化学量論を有し得る。これらのタンパク質の化学量論は、細孔形成反応で使用される２種のタンパク質の濃度比に依存する式に従い得る。この式は、下記の通りである：
１００Ｐｍ＝１００［ｎ！／ｍ！（ｎ−ｍ）！］・ｆｍｕｔｍ・ｆｗｔｎ〜ｍ
ここで、
Ｐｍ＝ｍの数の変異体サブユニットを有するポアの確率
ｎ＝サブユニットの総数（例えば、αＨＬの場合は７個）
ｍ＝「変異体」サブユニットの数
ｆｍｕｔ＝一緒に混合した変異体サブユニットの割合又は比率
ｆｗｔ＝一緒に混合した野生型サブユニットの割合又は比率。
【０４３２】
[00481]この方法は、この複数個のタンパク質を分画して、第２サブユニット２７２５に対する第１のサブユニットの第２の比率を有するタンパク質を富化させることをさらに含み得る。例えば、１個のみの改変サブユニット（１：６の第２の比率）を有するナノポアタンパク質を単離し得る。しかしながら、あらゆる第２の比率が適している。第２の比率の分布はまた、１個又は２個の改変サブユニットを有するタンパク質を富化させるように分画し得る。図２７に示すように、タンパク質を形成するサブユニットの総数は、必ずしも７とは限らない（例えば、別のナノポアを使用し得るか、又は６個のサブユニットを有するアルファ−溶血素ナノポアが生じ得る）。場合によっては、１個のみの改変サブユニットを有するタンパク質が富化される。そのような場合には、第２の比率は、（ｎ−１）個の第１のサブユニット当たり１個の第２のサブユニットであり、ｎは、タンパク質を構成するサブユニットの数である。
【０４３３】
[00482]第１の比率は第２の比率と同一であり得るが、このことは必須ではない。場合によっては、変異モノマーを有するタンパク質は、変異サブユニットを有しないものと比べて低い効率で生じ得る。この場合には、第１の比率は、第２の比率と比べて大きい可能性がある（例えば、６個の非変異サブユニットに対する１個の変異という第２の比率がナノポアで望ましい場合には、適切な数の１：６タンパク質の形成には、１：６と比べて大きい比率でサブユニットを混合することが必要な場合がある）。
【０４３４】
[00483]サブユニットの第２の比率が様々なタンパク質は、分離において様々に挙動し得る（例えば保持時間が異なる）。場合によっては、これらのタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー又は親和クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを使用して分画される。第１及び第２のサブユニットは改変以外が同一であり得ることから、タンパク質上の改変の数は、分離の基礎となり得る。場合によっては、第１又は第２のサブユニットは、分画を可能にするか又は分画の効率を改善する精製タグを（例えば改変に加えて）有する。場合によっては、ポリ−ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）、ストレプトアビジンタグ（Ｓｔｒｅｐ−タグ）、又は他のペプチドタグが使用される。いくつかの場合には、第１及び第２のサブユニットはそれぞれ異なるタグを含み、分画ステップは各タグに基づいて分画する。Ｈｉｓ−タグの場合には、低いｐＨでタグ上に電荷が生じる（ヒスチジン残基は、側鎖のｐＫａ未満で正に帯電するようになる）。αＨＬ分子の内の１つの電荷は他と比べて有意に異なることから、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の「電荷タグ付き」αＨＬサブユニットを有するオリゴマーを分離し得る。原則として、この電荷タグは、均一な電荷を担持する任意のアミノ酸の鎖であり得る。図２８及び図２９は、Ｈｉｓ−タグに基づくナノポアの分画の例を示す。図２８は、２８０ナノメートルでの紫外吸光度、２６０ナノメートルでの紫外吸光度、及び導電率のプロットを示す。ピークは、改変サブユニット及び非改変サブユニットの比率が様々なナノポアに対応する。図２９は、Ｈｉｓ−タグ及びＳｔｒｅｐ−タグの両方を使用するαＨＬナノポア及びその変異体の分画を示す。
【０４３５】
[00484]場合によっては、実体（例えば、ポリメラーゼ）は、分画２７３０の後にタンパク質に付着する。このタンパク質はナノポアであり得、この実体はポリメラーゼであり得る。いくつかの場合には、この方法は、第２の比率のサブユニットを有するタンパク質を二重層に挿入するステップをさらに含む。
【０４３６】
[00485]いくつかの状況下では、ナノポアは複数個のサブユニットを含み得る。ポリメラーゼは、これらのサブユニットの内の１個に付着し得、これらのサブユニットの内の少なくとも１個又は全て未満は第１の精製タグを含む。いくつかの例では、ナノポアは、アルファ−溶血素又はその変異体である。いくつかの場合には、全てのサブユニットは、第１の精製タグ又は第２の精製タグを含む。第１の精製タグは、（例えば、ポリメラーゼが付着しているサブユニット上の）ポリヒスチジンタグであり得る。
【０４３７】
リンカー
[00486]本明細書で説明されている方法は、核酸配列決定等のナノポア検出のために、ナノポアに付着している酵素（例えばポリメラーゼ）を使用し得る。場合によっては、酵素とナノポアとの連結は、本システムの性能に影響を及ぼす可能性がある。例えば、細孔（アルファ−溶血素）へのＤＮＡポリメラーゼの付着を操作することにより、タグ付きヌクレオチドの濃度を効果的に増加させ得、それによりエントロピー障壁を低下させる。場合によっては、ポリメラーゼはナノポアに直接付着している。他の場合では、ポリメラーゼとナノポアとの間でリンカーが使用される。
【０４３８】
[00487]本明細書で説明されているタグ配列決定は、電位により誘発されるαＨＬポアへの特定のタグヌクレオチドの効率的な捕捉から利益を得ることができる。この捕捉は、ＤＮＡテンプレートに基づくポリメラーゼプライマー伸長の最中又は後に起こり得る。捕捉の効率を改善する一つの方法は、ポリメラーゼとαＨＬポアとの間の接続を最適化することである。限定されないが、最適化するための接続には下記の３つの特徴がある：（ａ）接続の長さ（有効なタグ付きヌクレオチド濃度を増加させ得、捕捉の動態に影響を及ぼし得、及び／又はエントロピー障壁を変化させ得る）；（ｂ）接続の柔軟性（コネクターの立体構造の変化の動態に影響を及ぼし得る）；並びに（ｃ）ポリメラーゼとナノポアとの間の接続の数及び位置（利用可能な立体構造状態の数を減少させ得、それにより適切なポアポリメラーゼ配向の可能性を増加させ、有効なタグ付きヌクレオチド濃度を増加させ得、及びエントロピー障壁を低下させ得る）。
【０４３９】
[00488]酵素及びポリメラーゼは、任意の適切な方法で接続され得る。場合によっては、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が直接融合するか、又はアミノ酸のリンカーにより融合する。この融合は任意の順序であり得る。場合によっては、（例えばクリックケミストリーにより）化学結合が形成される。場合によっては、接続は非共有結合である（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によるか又はＰＤＺ、ＧＢＤ、ＳｐｙＴａｇ、Ｈａｌｏタグ若しくはＳＨ３リガンド等のタンパク質−タンパク質タグによる分子ステープル）。
【０４４０】
[00489]場合によっては、リンカーは、ペプチド、核酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーである。リンカーは、任意の適切な長さであり得る。例えば、リンカーは、約５ナノメートル（ｎｍ）、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、又は約１００ｎｍの長さであり得る。場合によっては、リンカーは、少なくとも約５ナノメートル（ｎｍ）、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、又は少なくとも約１００ｎｍの長さである。場合によっては、リンカーは、最大約５ナノメートル（ｎｍ）、最大約１０ｎｍ、最大約１５ｎｍ、最大約２０ｎｍ、最大約４０ｎｍ、最大約５０ｎｍ、又は最大約１００ｎｍの長さである。リンカーは、強固であり得るか、柔軟であり得るか、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。場合によっては、リンカーは使用されない（例えば、ポリメラーゼはナノポアに直接付着している）。
【０４４１】
[00490]場合によっては、複数個のリンカーが酵素とナノポアとを接続する。ポリメラーゼとナノポアとの間の接続の数及び位置は変更され得る。例として下記が挙げられる：ポリメラーゼＮ末端に対するαＨＬ  Ｃ末端、ポリメラーゼＣ末端に対するαＨＬ  Ｎ末端、及び末端ではないアミノ酸の間の接続。
【０４４２】
[00491]ある態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法は、ナノポアを含む反応チャンバ中にタグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、このタグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ナノポアを用いて検出可能である、ヌクレオチドに結合しているタグを含む、ステップを含む。この方法は、リンカーによりナノポアに付着しているポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを組み込む、ステップを含み得る。この方法は、ナノポアを用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップであって、このタグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合している場合にナノポアを用いて検出される、ステップを含み得る。
【０４４３】
[00492]場合によっては、リンカーは、タグがナノポアを用いて検出されるように、ナノポアに対してポリメラーゼを方向付ける。いくつかの場合には、ポリメラーゼは、２個以上のリンカーによりナノポアに付着している。
【０４４４】
[00493]場合によっては、リンカーは、配列番号２〜３５又はそれらから生成されるＰＣＲ生成物の内の１つ又は複数を含む。いくつかの場合には、リンカーは、配列番号２〜３５又はそれらから生成されるＰＣＲ生成物の内の１つ又は複数によりコードされるペプチドを含む。
【０４４５】
【表１−１】
2021506292.tif 000008
【表１−２】
2021506292.tif 000009
【表１−３】
2021506292.tif 000010
【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
2021506292.tif 000013
【０４４６】
印加電圧の較正
[00494]単一分子のナノポアセンサーデバイスからの分子固有の出力シグナルは、電解液に囲まれているイオン不透過性膜の両端の電気化学的電位差の存在に由来し得る。この膜貫通電位差は、電極表面で生じる犠牲的（即ちファラデー）反応又は非犠牲的（即ち容量性）反応のいずれかを介して、このデバイス内のエレクトロニクスにより検出され得るナノポア固有の電気化学的電流の強さを決定し得る。
【０４４７】
[00495]ナノポアの任意の所与の状態（即ち、オープンチャネル、捕捉状態等）の場合、時間依存性の膜貫通電位は、時間の関数としてナノポア複合体を通って流れる生じた電流を決定し得る入力シグナルとして作用し得る。このナノポア電流は、ナノポアセンサーデバイスにより特定の分子シグナル出力を提供し得る。オープンチャネルのナノポア電流は、ナノポアと、チャネルを通るイオンの流れを部分的に遮断する捕捉分子と間の相互作用により、様々な程度に調節され得る。
【０４４８】
[00496]これらの調節は、捕捉されている分子の種類に対する特異性を示し得、これにより、いくつかの分子をこれらのナノポアの電流変調から直接識別することが可能になる。所与の分子の種類、及びデバイス条件の固定されたセットの場合には、この種の捕捉された分子によるオープンチャネルナノポア電流の変調の程度は、印加される膜貫通電位に応じて変化し得、各種の分子が特定の電流対電圧（Ｉ−Ｖ）曲線にマッピングされる。
【０４４９】
[00497]印加電圧の設定と膜貫通電位との間の系統的に可変のオフセットは、横軸の電圧に沿って、このＩ−Ｖ曲線の水平方向のシフトを導入し得、出力シグナルとしてナノポアセンサーデバイスにより報告される、測定された電流信号に基づいて、分子同定の精度が潜在的に低下する。従って、印加電位と膜貫通電位との間の制御されていないオフセットは、同一条件下で同一分子の測定値を正確に比較する場合に問題となり得る。
【０４５０】
[00498]外部印加電位と実際の膜貫通電位との間のこのいわゆる「電位オフセット」は、実験内及び実験間の両方で変動し得る。電位オフセットの変動は、初期条件での両方の変動により、及びナノポアセンサーデバイス内の電気化学的条件の時間依存的変動（ドリフト）により、引き起こされ得る。
【０４５１】
[00499]各実験の印加電圧と膜貫通電位との間の時間依存的オフセットを較正することにより、本明細書で説明されているように、これらの測定エラーを取り除き得る。物理的に、ナノポアにより捕捉された分子のエスケープ事象を観察する確率は、印加される膜貫通電位に依存し得、この確率の分布は、同一条件下では分子の同一サンプルに関して同一であり得る（例えば、割合がサンプル間で変動しないならば、サンプルは様々な種類の分子の混合物であってもよい）。場合によっては、固定されたサンプルの種類に関してエスケープ事象が起こる電圧の分布は、印加電位と膜貫通電位との間のオフセットの測定値を提供する。この情報は、ナノポアの両端の印加電圧を較正するために使用され得、実験内及び実験間の電位オフセットに起因するエラーの系統的な原因が排除され、分子同定及び他の測定の精度が改善される。
【０４５２】
[00500]同一の分子サンプル及び試薬で動作される所与のナノポアセンサー装置の場合、エスケープ電圧の分布の期待値は、（各個々の事象は、無作為な変動を条件として確率過程であり得るが）単一分子のエスケープ事象の統計的サンプルから推定され得る。この推定は、実験内の電位オフセットの時間的なドリフトを説明するために時間依存的であり得る。このことにより、印加電圧の設定とポアで感じられる実際の電圧との間の可変差を訂正し得、Ｉ−Ｖ空間にプロットされる場合に、水平方向の全ての測定値を効果的に「並べる」。
【０４５３】
[00501]場合によっては、電位（即ち電圧）オフセット較正は、電流利得及び電流オフセットの変動を考慮しておらず、これらの変動は、ナノポア電流測定の精度及び再現性の改善のためにも較正され得る。しかしながら、電位オフセット較正は一般に、電流利得及び電流オフセットの変動の推測でエラーを防止するために、ゲイン及びオフセットの補正の前に行われ、なぜならば、これらは順に、フィッティング電流（ｆｉｔｔｉｎｇ  ｃｕｒｒｅｎｔ）対電圧（Ｉ−Ｖ）曲線を含み得、これらのフィットの結果は、電圧オフセットの変動による影響を受けるからである。即ち、Ｉ−Ｖ空間における（水平方向での）左から右へデータのシフトは、その後の電流利得及び電流オフセット電流のフィットでエラーを導入する可能性がある。
【０４５４】
[00502]図３０は、時間に対するナノポアを通る電流のプロット（実線）及び印加電圧（破線）のプロットを示す。電流は、分子がナノポア３００５中で捕捉された場合には減少し得る。印加電圧が時間３０１０をかけて減少することから、分子がナノポア３０１５から落ちるまで電流が減少し、そのとき、電流は、印加電圧で期待されるレベルまで増加する。分子が落ちる印加電圧は、分子の長さに依存し得る。例えば、３０個の塩基を有するタグは約４０ｍＶで落ち得、５０個の塩基を有するタグは約１０ｍＶで落ち得る。様々なナノポア又は同一のナノポアの経時的に異なる測定値に関して、転落電圧に変動３０２０が存在し得る。この転落電圧を期待値に調整することにより、データが、より解釈しやすくなり得、及び／又はより正確になり得る。
【０４５５】
[00503]ある態様では、本明細書で提供されるのは、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプルを配列決定する方法である。この方法は、ナノポアを含む反応チャンバ中にタグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ナノポアを用いて検出可能である、ヌクレオチドに結合しているタグを含む、ステップを含み得る。この方法は、ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを組み込むステップを含み得る。この方法は、次いで、ナノポアを用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップであって、このタグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合している場合にナノポアを用いて検出される、ステップを含み得る。場合によっては、この検出するステップは、ナノポアの両端で印加電圧を印加し、この印加電圧で検知電極により電流を測定することを含む。
【０４５６】
[00504]場合によっては、印加電圧は較正される。この較正は、検知電極に関して、期待されるエスケープ電圧分布対時間を推定することを含み得る。次いで、この較正は、期待されるエスケープ電圧分布と基準点（例えば、ゼロ等の任意の基準点）との間の差異を算出し得る。次いで、この較正は、算出された差異だけ印加電圧をシフトさせ得る。場合によっては、印加電圧は経時的に減少する。
【０４５７】
[00505]場合によっては、時間に対する期待されるエスケープ電圧の分布が推定される。いくつかの場合には、基準点はゼロボルトである。この方法は、期待されるエスケープ電圧分布の検出される変動を除去し得る。場合によっては、この方法は、それぞれが検知電極に隣接する複数個の独立してアドレス指定可能なナノポア上で実施される。
【０４５８】
[00506]いくつかの実施形態では、ナノポア中のタグの存在は、印加電圧にて検知電極により測定される電流を減少させる。場合によっては、タグ付きヌクレオチドは複数個の異なるタグを含み、この方法は、複数個の異なるタグのそれぞれを検出する。
【０４５９】
[00507]いくつかの場合には、この較正は、較正なしでのこの方法の実施と比較した場合に、この方法の精度を増加させる。場合によっては、この較正は、経時的な電気化学的条件の変化を補償する。いくつかの場合には、この較正は、複数個のナノポアを有するデバイスの様々な電気化学的条件を有する様々なナノポアを補償する。いくつかの実施形態では、この較正は、この方法のそれぞれの性能に関して異なる電気化学的条件を補償する。場合によっては、この方法は、電流利得の変動及び／又は電流オフセットの変動を校正するステップをさらに含む。
【０４６０】
エクスパンダマー配列決定方法
[00508]本開示は、エクスパンダマー配列決定を使用して核酸分子を配列決定する方法を提供する。エクスパンダマー配列決定は、配列決定される核酸と比べて長く、且つ配列決定される核酸分子に由来する配列を有する展開ポリマーを作成するいくつかのステップを含む。この展開ポリマーをナノポアに通して、その配列を決定し得る。本明細書で説明されているように、この展開ポリマーは、この展開ポリマーが一方向のみでナノポアを通り得るように、この展開ポリマー上にヒンジ付きゲートを有し得る。この方法のステップを図３３〜３６に示す。展開による核酸配列決定（即ちエクスパンダマー）に関するさらなる情報は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３２４，３６０号明細書に見出され得る。
【０４６１】
[00509]図３３を参照すると、ある態様では、核酸配列決定の方法は、配列決定される一本鎖核酸を準備するステップと、複数個のプローブを準備するステップとを含む。このプローブは、この一本鎖核酸とハイブリダイズし得るハイブリダイゼーション部分３３０５と、２個の端部を有するループ構造３３１０であって、各端部はハイブリダイゼーション部分に付着している、ループ構造３３１０と、このループ構造の端部の間のハイブリダイゼーション部分に位置する切断可能な基３３１５とを含む。このループ構造は、このループ構造が逆方向でナノポアを通ることを防止するヒンジ付きゲート３３２０を含む。
【０４６２】
[00510]図３４を参照すると、この方法は、ハイブリダイゼーション部分と配列決定される一本鎖核酸３４１０とのハイブリダイゼーションにより決定される順序で、複数個のプローブを重合するステップ３４０５を含み得る。図３５を参照すると、この方法は、切断可能な基を切断して、配列決定される展開糸を得るステップ３５０５を含み得る。
【０４６３】
[00511]図３６を参照すると、この方法は、展開糸３６１０をナノポア３６１５に通すステップ３６０５であって、ヒンジ付きゲートは、展開糸が逆方向３６２０でナノポアを通ることを防止する、通すステップ３６０５を含み得る。この方法は、ナノポアを用いて、ハイブリダイゼーション部分と配列決定される一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションにより決定される順序で、展開糸のループ構造を検出し、それにより、配列決定される一本鎖核酸を配列決定するステップを含み得る。
【０４６４】
[00512]場合によっては、このループ構造は狭いセグメントを含み、このヒンジ付きゲートは、２個の端部を含むポリマーであり、第１の端部は、狭いセグメントに隣接するループ構造に固定されており、第２の端部はループ構造に固定されていない。このループ構造は、このヒンジ付きゲートが狭いセグメントに隣接して整列する第１の方向でナノポアに通され得る。いくつかの実施形態では、このループ構造は、このヒンジ付きゲートが狭いセグメントに隣接して整列しない逆方向でナノポアに通され得ない。
【０４６５】
[00513]場合によっては、このヒンジ付きゲートはヌクレオチドを含む。このヒンジ付きゲートは、このヒンジ付きゲートが狭いセグメントに隣接して整列しない場合にループ構造と塩基対を形成し得る。
【０４６６】
[00514]この狭いセグメントは、十分に狭い任意のポリマー又は分子を含み得る、その結果、このヒンジ付きゲートがこの狭いセグメントと整列している場合には、このポリマーはナノポアを通り抜け得る。場合によっては、この狭いセグメントは、ａ−塩基性ヌクレオチド（即ち、ヌクレオチド塩基が付着していない核酸側鎖）又は炭素鎖を含む。
【０４６７】
[00515]いくつかの場合には、電極は、検出期間の間に再充電される。展開糸は一般に、電極が再充電されている場合には、逆方向でナノポアを通らない。
【０４６８】
ヒンジ付きゲートの構造
[00516]本開示は、ヒンジ構造を挟む少なくも２個の異なるレポーターユニットを含む特定の非対称改変ヌクレオチドポリマー構造であって、この改変ヌクレオチドポリマーは、電圧極性が反転されている場合であってもナノポアを通って一方向に移動する、非対称改変ヌクレオチドポリマー構造を提供する。
【０４６９】
[00517]この改変ヌクレオチドポリマーのナノポアを通って一方向に移動する能力は、ヒンジ構造によるだけでなく、このヒンジ構造を挟む２個のレポーターユニットの明確な構造によっても駆動される。これら２個の異なるレポーターユニット構造は、方向が反転することなくＡＣ電流の存在下であっても単一方向での改変ヌクレオチドポリマーの移動を促進する異なるイオン流電流特性及び滞留時間特性を示すように設計されている。
【０４７０】
[00518]従って、一実施形態では、提供されるのは、構造式（Ｉ）：
【化６】
2021506292.tif 000014
の改変ヌクレオチドポリマーを含むヒンジ付きゲート化合物であって、
式中、
Ｒ１は第１のレポーターユニットであり、１〜１２個のモノマーユニットのオリゴマーを含み、
Ｂは、１ｍｅｒ〜８ｍｅｒの長さの主鎖オリゴヌクレオチド、リンカーモノマーユニット、及び主鎖オリゴヌクレオチドユニットに相補的な３ｍｅｒ〜８ｍｅｒの長さの分枝オリゴヌクレオチドを含む嵩高構造であり、この分枝オリゴヌクレオチドは、リンカーモノマーユニットに共有結合で付着しており、且つ主鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得、
Ｒ２は第２のレポーターユニットであり、１〜１２個のモノマーユニットのオリゴマーを含み、
Ｎは、１〜６個の炭素スペーサー又は核酸を含むスペーサーユニットである、
ヒンジ付きゲート化合物である。
【０４７１】
[00519]いくつかの実施形態では、第２のレポーターユニットＲ２は、第１のレポーターユニットＲ１、続いてＢがナノポアに引き込まれる場合でのＲ１の滞留時間と比べて、続いてＢがナノポアに引き込まれる場合に少なくとも１００倍長い滞留時間を有する。いくつかの実施形態では、第１のレポーターユニットＲ１は、第２のレポーターユニットＲ２、続いてＢがナノポアに引き込まれる場合でのＲ２の滞留時間と比べて、続いてＢがナノポアに引き込まれる場合に少なくとも１００倍長い滞留時間を有する。
【０４７２】
[00520]いくつかの実施形態では、Ｒ１はオリゴマーからなり、モノマーユニットは、ｄＴ−カルボキシル、ＳｐＣ２、ＳｐＣ３、及びｄＳｐから選択され、第２のレポーターユニットＲ２はオリゴマーからなり、モノマーユニットは、ｄＴｍｐ、ＳｐＣ１２、ＳｐＣ６、Ｓｐ１８、及びピロリジン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｉｎｅ）から選択される。いくつかの実施形態では、第２のレポーターユニットＲ２はオリゴマーからなり、モノマーユニットは、ｄＴ−カルボキシル、ＳｐＣ２、ＳｐＣ３、及びｄＳｐから選択され、第１のレポーターユニットＲ１はオリゴマーからなり、モノマーユニットは、ｄＴｍｐ、ＳｐＣ１２、ＳｐＣ６、Ｓｐ１８、及びピロリジン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｉｎｅ）から選択される。レポーターユニットで使用され得るモノマーユニットの更なる例を、下記でさらに詳細に説明する（表１を参照されたい）。
【０４７３】
[00521]ヒンジ付きゲート化合物は、式（Ｉａ）
【化７】
2021506292.tif 000015
又は式（Ｉｂ）
【化８】
2021506292.tif 000016
の構造を含む改変ヌクレオチドポリマーをさらに含み得、
式中、第１のレポーターユニットＲ１は、改変ヌクレオチドモノマーユニットの９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドαであり、第２のレポーターユニットＲ２は、改変ヌクレオチドモノマーユニットの９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドβであり、続いてＢがナノポアに引き込まれる場合のＲ２の滞留時間は、続いてＢがナノポアに引き込まれる場合のＲ１の滞留時間と比べて少なくとも１００倍長い。
【０４７４】
[00522]式（Ｉａ）の構造は、７ｍｅｒの「分枝」オリゴヌクレオチド（例えば、改変モノマーユニットＹに５’末端を介して共有結合で付着している３’−ＣＧＧＣＧＧＣ）であって、より長いオリゴヌクレオチド（例えば３５〜４５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）の一部である分枝オリゴヌクレオチドを含み得る。別の実施形態では、式（Ｉｂ）の構造は、７ｍｅｒの「分枝」オリゴヌクレオチド（例えば、改変モノマーユニットＹに３’末端を介して共有結合で付着している５’−ＣＧＧＣＧＧＣ）であって、より長いオリゴヌクレオチド（例えば３５〜４５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）の一部である分枝オリゴヌクレオチドを含み得る。この共有結合的付着を、典型的なリンカー化学（例えば、アミノリンカー、クリック−化学リンカー、又はデンドリマーリンカー）を使用して行い得る。
【０４７５】
[00523]この分枝オリゴヌクレオチドは、より長いオリゴヌクレオチド上の相補的な配列とハイブリダイズして、それにより二本鎖領域が形成されるように設計されていてもよい。この短い二本鎖領域は、ナノポア中で捕捉された場合には嵩高構造として作用し、それにより、最適なナノポア検出のために、隣接する９ｍｅｒのレポーターユニットを配置する。
【０４７６】
[00524]２個の異なる９−ｍｅｒのレポーターユニット（α９及びβ９）は、ポリマーがナノポア（例えばアルファ−溶血素）を通る場合に明確に異なるイオン電流フローレベル及び滞留時間をもたらすように設計されている。本明細書の他の箇所で説明されているように、分枝に隣接するこれら２個のレポーターユニットのイオン電流フローレベル及び滞留時間特性を調整することにより、全体としての改変ヌクレオチドポリマーの通り抜け動作が制御されて、一方向性が維持され得る。
【０４７７】
[00525]例えば、α９レポーターユニットは、９個のカルボキシル−ｄＴヌクレオチドで設計され得る。これらのモノマーユニットは、非常に短い滞留時間及び非常に高いイオンフロー電流レベルを有する。嵩高構造の反対側の調整されたβ９レポーターユニットは、９個のヌクレオシドメチルホスホネートユニット（Ｔｍｐ）で設計され得る。このＴｍｐユニットは、（カルボキシル−ｄＴ滞留時間と比べて）１００倍長い滞留時間で、非常に低いイオンフロー電流レベルをもたらす。嵩高構造の片側のレポーターユニットの滞留時間は、反対側のレポーターユニットの滞留時間を比べて１００倍長いことから、ナノポアを通る逆方向への通り抜け動作は、前方への通り抜けのわずか１％の割合で発生する。そのため、改変ヌクレオチドポリマーは、全体として、ナノポアを通って本質的に単一方法のみに移動する。正に帯電したレポーターユニットを使用することにより、前方への通り抜けと逆方向への通り抜けとの間のさらに大きい差異を達成し得た。
【０４７８】
[00526]レポーターユニットの移動方向を単一方向に制御する能力は、バーコーディングアプリケーション等の一連のレポーターユニットを検出しようとする場合に特に有用であり、極性の迅速な反転により電極の寿命が大幅に増加され得るＡＣモードのナノポア検出を使用する場合にも必須であり、それにより、より少ないエラーでより長い読み取りが可能になる。しかしながら、極性の迅速な反転は、検出される改変ヌクレオチドポリマーの通り抜けの反転を引き起こし、それにより検出エアーが増加する。
【０４７９】
[00527]（α）９レポーターユニット及び（β）９レポーターユニットを含む例示的な非対称改変ヌクレオチドポリマーの一方向移動の概要を、図４８に示す。
【０４８０】
レポーターユニット（Ｒ）
[00528]本開示の改変ヌクレオチドポリマーを含む化合物は、モノマーユニットを含む一連のレポーターユニットを含む。このレポーターユニットは、４〜１０個のヌクレオチド若しくは４〜２５個のヌクレオチド類似体（又は他のモノマーユニット）を含む、改変ヌクレオチドポリマーの一部である。このレポーターユニットは嵩高構造（Ｂ）に隣接して配置されており、その結果、嵩高構造がポアを通り抜け得ないために嵩高構造が停止した場合に、このレポーターユニットは、ナノポアのバレル中に位置する。ナノポアのバレル中でのレポーターユニット（Ｒ）の存在により、ナノポアにより検出可能な固有のシグナル（例えば、電流レベル及び／又は滞留時間）が生じる。
【０４８１】
[00529]本開示の改変ヌクレオチドポリマーで有用なレポーターユニットは、４〜１０個のヌクレオチドモノマーユニット又は４〜２５個のヌクレオチド類似体モノマーユニットを含む。一般に、このモノマーユニットは、アミダイトカップリング化学によりヌクレオチドポリマー中に合成的に挿入された任意のタイプであり得る。本開示のレポーターユニットはヌクレオチドモノマーユニット及び／又はヌクレオチド類似体モノマーユニットを含み得ることが企図される。ヌクレオチド類似体モノマーユニットは一般に、天然に存在する（又は標準的な）ヌクレオチドモノマー単位（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、及びｄＵ）と比較して実質的に変更されている電荷及び立体的嵩高さを有する構造を有する。ヌクレオチド類似体モノマーユニットの変更された電荷及びサイズ特性により、印可された電圧電位下であるナノポアに入る際に、滞留する際に、及び／又は通り抜ける際に、４種の標準的なヌクレオチドモノマーユニットと比較して広い範囲のナノポアにより検出可能なシグナル（例えば、レポーターユニット電流及び／又は滞留時間）をレポーターユニットが生じ得ることが可能になる。
【０４８２】
[00530]任意の特定の機構により限定されることを意図することなく、改変ヌクレオチドポリマーのレポーターユニットは、嵩高構造に隣接するポリマー中に位置しており、その結果、このレポーターユニットはナノポアのバレル中に滞留すること、且つこの位置により、電圧電位下でのナノポアを通るイオンの流れの最適なレベルの測定可能な変化が起こることが考えられる。この変化により、ナノポアＯ．Ｃ．電流に対して、大きい測定されたレポーターユニット電流及び／又は滞留時間がもたらされ、且つ、この変化は、特定のレポーターユニットの同定に最適であり、そのため特定の改変ヌクレオチドポリマーバーコードユニットの同定に最適である。
【０４８３】
[00531]改変ヌクレオチドポリマー中のレポーターユニットの存在により生じるナノポアにより検出可能な測定値の変化は、減少した又は増加したイオン流を含み得、且つレポーターユニット電流及び／又は滞留時間を生じる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体モノマーユニットを含むレポーターユニットが使用され、これにより、天然に存在するヌクレオチドを含むレポーターユニットと比較して滞留時間が大幅に増加する。増加した滞留時間は、より正確で（ｐｒｅｃｉｓｅ）且つ正確な（ａｃｃｕｒａｔｅ）の測定を可能にすることから、ナノポア検出システムでの使用に特に有利であり、これにより、測定される改変ヌクレオチドポリマーバーコード及び任意の関連する分析物のよりよい且つより正確な同定がさらにもたらされる。いくつかの実施形態では、レポーターユニット（Ｒ）により生じた検出可能な滞留時間は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、又は少なくとも１０倍である。いくつかの実施形態では、レポーターユニット（Ｒ）により生じた検出可能な滞留時間は、少なくとも３００ｍｓｅｃ、少なくとも５００ｍｓｅｃ、少なくとも７５０ｍｓｅｃ、少なくとも１０００ｍｓｅｃ、少なくとも２０００ｍｓｅｃ、又は少なくとも５０００ｍｓｅｃである。
【０４８４】
[00532]ヌクレオチド類似体モノマーユニットを含むレポーターユニットの重要な特徴は、多種多様な利用可能なヌクレオチド類似体、及びアミダイトカップリング化学による改変ヌクレオチドポリマーへのこの構造の挿入の容易さである。例えば、表１（下記）は、本開示の改変ヌクレオチドポリマー中のレポーターユニット（Ｒ）を合成するために使用され得る３００種を超える例示的なアミダイト試薬（例えば、ホスホラミダイト又はホスホンアミダイト）を列挙する。表１で列挙されているアミダイト試薬の各々は市販されているが、ヌクレオチド類似体構造が公開されているアミダイト試薬が、数千ではないにしても数百存在しており、本開示の改変ヌクレオチドポリマー中のレポーターユニットの調製での使用のために当業者に利用可能であるだろう。
【０４８５】
[00533]
【表２−１】
2021506292.tif 000017
【表２−２】
2021506292.tif 000018
【表２−３】
2021506292.tif 000019
【表２−４】
2021506292.tif 000020
【表２−５】
2021506292.tif 000021
【表２−６】
2021506292.tif 000022
【表２−７】
2021506292.tif 000023
【表２−８】
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【表２−９】
2021506292.tif 000025
【表２−１０】
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【表２−１１】
2021506292.tif 000027
【表２−１２】
2021506292.tif 000028
【０４８６】
【表３】
2021506292.tif 000029
【０４８７】
[00534]上記の表１で列挙されているアミダイト試薬を使用して、標準的なアミダイトカップリング化学により、改変ヌクレオチドポリマー中の嵩高構造に隣接するレポーターユニットを挿入し得る。即ち、ホスホラミダイト（又はホスホンアミダイト）試薬の各々は、アミダイトカップリング反応でヌクレオチドポリマーと反応して、このポリマーに、特定のヌクレオチド類似体構造を有するモノマーユニットが挿入される。このようにして得られるレポーターユニットは、４〜２５個のリン酸塩（又はホスホネート）連結を含む。そのため、表１の３００種を超えるアミダイト試薬のリストは、本開示の改変ヌクレオチドポリマー中のレポーターユニットとして合成され得るモノマーユニットの数千の可能な組み合わせを効果的に提供する。そのため、構造式（Ｉ）の改変ヌクレオチドポリマーが、表１のヌクレオチド類似体モノマーを含む（即ち、表１のアミダイト試薬の反応から得られる）レポーターユニット（Ｒ）を含むバーコードユニットを少なくとも含み得ることが企図される。
【０４８８】
[00535]表１で開示されているヌクレオチド類似体モノマーユニットの内のいくつかは、市販のオリゴヌクレオチド合成カタログにおいて、「スペーサー」（例えば「ｉＳｐ」）、「色素」（例えば「ｉＣｙ３」）、又は「リンカー」（例えば「ヘキシニル」）としても称されていることに留意すべきである。本明細書に記載されている実施例で説明されているレポーターユニットの内のいくつかは、公知のオリゴヌクレオチド合成命名法を使用して称される（例えば、一般に使用されるオリゴヌクレオチド命名法のさらなる詳細に関しては、ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍでのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのウェブサイトを参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示の改変ヌクレオチドポリマーのバーコードユニット（及び関連する使用方法）で有用なレポーターユニットは、本明細書におけるレポーターユニットの内のいずれかを含み得、このレポーターユニットして、ｄＳｐ、ＳｐＣ３、ＳｐＣ６、ＳｐＣ１２、Ｓｐ１８、ピロリジン、スペルミン、ｄＴ−カルボキシル、Ｃｙ３、ｄＴｍｐ、及びこれらの組み合わせからなる群が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８９】
[00536]改変ヌクレオチドポリマーのレポーターユニット（例えば、表１からのヌクレオチド類似体を含む）の設計は、モノマーユニットの数、所望のナノポア検出特性、及び特定の使用方法に依存し得る。本明細書でより詳細に開示されているように、嵩高構造及びレポーターユニットを含む改変ヌクレオチドポリマーは、ナノポア検出システムを使用して溶液中の分析物を配列決定する並びに検出する及び／又は定量する方法で使用され得る。本明細書では、ナノポア検出を使用する広範なアッセイスキームが企図されている。そのため、本開示は、ナノポア検出システムを使用する広範なアッセイスキームにわたり有用なナノポアにより検出可能な様々なシグナルを生じるレポーターユニットを有する改変ヌクレオチドポリマーを調製するためのツールを当業者に提供する。
【０４９０】
非配列決定方法及び応用
[00537]本明細書で説明されているデバイス及び方法を使用して、核酸サンプル及び／又は核酸分子の核酸配列以外のこれらの特定の特性（例えば、配列の長さ、又はサンプル中の核酸の架橋の程度が挙げられるがこれに限定されない核酸サンプルの品質のあらゆる尺度）を測定し得る。場合によっては、核酸分子の配列を決定しないことが望ましい可能性がある。例えば、個々のヒト（又はウマ等の他の生物）は、ゲノム中の特定の反復配列（例えば、マイクロサテライト、単純反復配列（ＳＳＲ）、又は短いタンデム反復（ＳＴＲ）として既知である）の長さを決定することにより同定され得る。（例えば、個人の人種、疾患にかかる可能性、及び同類のものを特定しないように）ＳＴＲの配列及び／又はＳＴＲの前（５’）若しくは後（３’）で見出されるＤＮＡの配列を知ることなく、（例えば、親子関係又は犯罪の加害者を特定するために）１つ又は複数のＳＴＲの長さを知りたいと望まれる場合がある。
【０４９１】
[00538]ある態様では、方法は、ゲノム中に存在する１つ又は複数のＳＴＲを同定する。任意の数のＳＴＲ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はより多く）を同定し得る。ＳＴＲは、任意の数の核酸塩基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、又はより多くの塩基）を有する反復セグメント（例えば、配列番号１−ＡＧＧＴＣＴ  ＡＧＧＴＣＴ  ＡＧＧＴＣＴ  ＡＧＧＴＣＴ  ＡＧＧＴＣＴ  ＡＧＧＴＣＴ  ＡＧＧＴＣＴの「ＡＧＧＴＣＴ」）を含み得る。ＳＴＲは、任意の数の反復される反復セグメントを含み得、概して連続して反復される（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、又はより多くの回数反復される）。
【０４９２】
[00539]ヌクレオチド組込み事象の数及び／又は核酸若しくはそのセグメントの長さを、タグ付きヌクレオチドの一部、大部分、又は全てに付着している同一のタグを有するヌクレオチドを使用することにより決定し得る。（放出前にナノポア中にプレロードされるか、又はタグ付きヌクレオチドからの放出後にナノポアに導かれる）タグの検出は、ヌクレオチド組込み事象が起こったことを示すが、この場合には、どのヌクレオチドが組み込まれているかは同定されない（例えば、配列情報は決定されない）。
【０４９３】
[00540]いくつかの実施形態では、全てのヌクレオチド（例えば、全てのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、シトシン（Ｃ）ヌクレオチド、グアニン（Ｇ）ヌクレオチド、チミン（Ｔ）ヌクレオチド、及び／又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチド）は、ヌクレオチドに結合している同一のタグを有する。しかしながら、場合によっては、このことは必須でない場合がある。ヌクレオチドの少なくとも一部は、（例えば、一部の配列情報が決定されるように）ヌクレオチドを同定するタグを有し得る。場合によっては、（例えば、いくつかの核酸の位置が配列決定されるように）ヌクレオチドの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、又は約５０％は、ヌクレオチドを同定するタグを有する。配列決定される核酸の位置は、核酸鎖に沿って無作為に分布され得る。場合によっては、（例えば、全てのアデニンが配列決定されるように）単一種のヌクレオチドの全てが同定タグを有する。場合によっては、ヌクレオチドの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％が、ヌクレオチドを同定するタグを有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの最大５％、最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大４０％、又は最大５０％は、ヌクレオチドを同定するタグを有する。いくつかの実施形態では、全ての核酸又はそのセグメントは、短いタンデム反復（ＳＴＲ）である。
【０４９４】
[00541]ある態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸又はそのセグメントの長さを決定する方法は、ナノポアを含む反応チャンバ中にタグ付きヌクレオチドを供給するステップを含む。このヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合している同一のタグを含む様々な塩基（例えば、少なくとも２種の異なる塩基）を有し得、このタグは、ナノポアを用いて検出可能である。この方法は、ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを組み込むステップをさらに含み得る。この方法は、ナノポアを用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に又は後に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップをさらに含み得る。
【０４９５】
[00542]ある態様では、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸又はそのセグメントの長さを決定する方法は、ナノポアを含む反応チャンバ中にタグ付きヌクレオチドを供給するステップを含む。タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合しているタグを含み得、このタグは、このタグが存在しない場合の電流と比較して、ナノポアを通って流れる電流の大きさを減少させ得る。
【０４９６】
[00543]いくつかの実施形態では、この方法は、ポリメラーゼを用いて重合反応を実行して、それにより、核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを組み込み、ナノポアを通って流れる電流の大きさを減少させるステップをさらに含む。電流の大きさを、任意の適切な量（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％）減少させ得る。いくつかの実施形態では、電流の大きさは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少する。いくつかの実施形態では、電流の大きさは、最大５％、最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、最大９５％、又は最大９９％減少する。
【０４９７】
[00544]この方法は、ナノポアを用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの間の期間（例えば、図６における期間６０５）を検出するステップをさらに含み得る。個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの間の期間は、大きい電流を有し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド組込み事象の間にナノポアを通って流れる電流の大きさは、（例えば、タグが存在しない場合の）最大電流の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％である（例えばこれらに戻る）。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド組込み事象の間にナノポアを通って流れる電流の大きさは、最大電流の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％である。
【０４９８】
[00545]場合によっては、ＳＴＲの前（５’）又は後（３’）に核酸の一部を配列決定して、このＳＴＲが、（例えば、複数種のプライマーが複数種のＳＴＲに向けられる多重コンテキストにおいて）ナノポア中で決定される長さを有しているかを明らかにする。場合によっては、約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、又はより多くの核酸は、ＳＴＲの前（５’）又は後（３’）に配列決定される。
【０４９９】
[00546]他の実施形態では、提供されるのは、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて標的分子を検出する及び／又は定量する方法であって、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中において、標的分子と、タグ付きヌクレオチドを含む核酸バーコード分子とを接触させるステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドは、ヌクレオチド又はジヌクレオチドに結合しているタグを含み、前記タグは、一方向性のヒンジ付きゲートを含む展開可能なループ構造を含み、前記タグは、前記ナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）前記展開可能なループ構造を展開させるステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、タグがナノポアを通って引っ張られた場合に、前記個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップとを含む方法である。いくつかの実施形態では、一方向性のヒンジ付きゲートを含むタグは、逆電位又は逆電圧の印加中のタグの滞留時間と比べて少なくとも１００倍短い、ナノポアへの電位又は電圧の印加中の滞留時間を有する。さらなる実施形態では、前記展開可能なループ構造は狭いセグメントを含み、ゲートは、２個の端部を含むポリマーであり、第１の端部は、狭いセグメントに隣接するループ構造に固定されており、第２の端部はループ構造に固定されていない。さらなる実施形態では、前記展開されたループ構造は、ゲートが狭いセグメントに隣接して整列する第１の方法でナノポアに通され得、前記展開されたループ構造は、ゲートが狭いセグメントに隣接して整列しない逆方向でナノポアに通され得ない。
【０５００】
[00547]標的分子は、任意の既知の標的分子（例えば、核酸、改変核酸、ポリペプチド、及び小分子）であり得る。いくつかの実施形態では、核酸バーコード分子は、核酸又はポリペプチド等の親和性部分と会合し得、この核酸バーコード分子として、抗体、抗体フラグメント、ＤＮＡ結合タンパク質、又はＲＮＡ結合タンパク質が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、この方法は、ナノポア中でタグを検出するステップの前に、標的分子に親和性部分を結合させるステップをさらに含む。
【０５０１】
[00548]別の実施形態では、提供されるのは、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて標的核酸分子を検出する及び／又は定量する方法であって、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを含む核酸配列を供給するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドは、ヌクレオチド又はジヌクレオチドに結合しているタグを含み、前記タグは、一方向性のヒンジ付きゲートを含む展開可能なループ構造を含み、前記タグは、前記ナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）前記展開可能なループ構造を展開させるステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、タグがナノポアを通って引っ張られた場合に、前記個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップとを含む方法である。
【０５０２】
[00549]別の実施形態では、提供されるのは、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて標的分子を検出する及び／又は定量する方法であって、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中において、標的分子と、タグ付きヌクレオチドを含む核酸バーコード分子とを接触させるステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドは、ヌクレオチド又はジヌクレオチドに結合しているタグを含み、前記タグは、一方向性のヒンジ付きゲートを含む展開可能なループ構造を含み、前記タブは、前記ナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）前記展開可能なループ構造を展開させるステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、タグがナノポアを通って引っ張られた場合に、前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップとを含む方法である。
【０５０３】
[00550]別の実施形態では、提供されるのは、検知電極に隣接する膜中のナノポアを用いて核酸サンプル中の核酸分子を配列決定する方法であって、（ａ）前記ナノポアを含む反応チャンバ中に、タグ付きヌクレオチドを供給するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドは、ヌクレオチド又はジヌクレオチドに結合しているタグを含み、前記タグは、一方向性のヒンジ付きゲートを含み、前記タグは、前記ナノポアを用いて検出可能である、ステップと、（ｂ）酵素を用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドを、前記核酸サンプルからの一本鎖核酸分子に相補的な伸長鎖に組み込むステップと、（ｃ）前記ナノポアを用いて、タグがナノポアを通って引っ張られた場合に、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの最中に、前記個々のタグ付きヌクレオチド又はタグ付きジヌクレオチドと会合しているタグを検出するステップとを含む方法である。
【０５０４】
パターンマッチング
[00551]本開示はまた、既知の（又は参照）シグナルを有するナノポアデバイスにより検出されるシグナルのパターンをマッチングさせるための電子リーダーも提供する。本明細書の他の箇所で説明されているように、ナノポアデバイスは、膜中にナノポアを含み得る。既知のシグナルは、記憶場所（例えば、リモートデータベース、又はナノポアデバイスを含むチップ上に位置する記憶場所）で維持され得る。電子リーダーは、パターンマッチアルゴリズムを用いてパターンをマッチさせ得、電子リーダーのコンピュータプロセッサを用いて実行され得る。電子リーダーは、チップ上に位置していてもよい。
【０５０５】
[00552]パターンマッチングは、例えばナノポアデバイスによりデータが収集されている間に、リアルタイムに実行され得る。代替として、最初にデータを収集し、続いて、このデータを処理してパターンをマッチさせることにより、パターンマッチングが実行され得る。
【０５０６】
[00553]場合によっては、このリーダーは、ユーザーにとって関心のある１つ又は複数の核酸配列のリスト（本明細書では「ホワイトリスト」も同様）を含み、ユーザーにとって関心のない１つ又は複数の他の核酸配列のリスト（又は複数のリスト）（本明細書では「ブラックリスト」も同様）を含む。核酸組込み事象等の核酸検出の最中に、このリーダーは、ホワイトリストにある核酸配列を検出して記録し得、且つブラックリストにある核酸配列を検出し得ない、又は記録し得ない。
【実施例】
【０５０７】
実施例１−非ファラデー伝導
[00554]図３７は、非ファラデー伝導が変調からナノポアを分離し得ることを示す。図の縦軸は、−３０〜３０の範囲のピコアンペア（ｐＡ）で測定された電流である。横軸は、０〜２の範囲の秒（ｓ）で測定された時間である。波形は、４０％のデューティサイクルを有する。データポイント３７０５は、二重層の上下で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液及び３ｍＭのＳｒＣｌ２を含む１５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．５の存在下において、海綿状の白金作用電極で測定された電流である。２４０ｎＭの粘着性ポリメラーゼ及び０．０４６４Ｏ．Ｄ．の５ＧＳサンドイッチが存在する。脂質は、７５％のホスファチジルエタノラミン（ＰＥ）及び２５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）である。作用電極と対電極（ＡｇＣｌペレット）を横切るシミュレートされた電圧３７１０を、プロット上にフィットするように１００を乗じて示す。ナノポア−ポリメラーゼ複合体３７１５を横切るシミュレートされた電気化学電位を、プロット上にフィットするように１００を乗じて示す。電流３７２０を、集積回路エンファシス（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｅｍｐｈａｓｉｓ）（ＳＰＩＣＥ）モデルを備えたシミュレーションプログラムを使用してシミュレートする。
【０５０８】
実施例２−タグの捕捉
[00555]図３８は、交流電流（ＡＣ）システムにおいてナノポア中で捕捉されている２個のタグを示す。図の縦軸は、０〜２５の範囲のピコアンペア（ｐＡ）で測定された電流である。横軸は、約７６９〜７８０の範囲の秒（ｓ）で測定された時間である。第１のタグ３８０５は、約１０ｐＡで捕捉されている。第２のタグ３８１０は、約５ｐＡで捕捉されている。オープンチャネル電流３８１５は、約１８ｐＡである。タグの迅速に捕捉に起因して、オープンチャネル電流ではデータポイントがほとんど見られない。波形は、１０Ｈｚ及び４０％のデューティサイクルにて０〜１５０ｍＶである。溶液は１５０ｍＭのＫＣｌを含む。
【０５０９】
実施例３−タグの配列決定
[00556]図３９は、配列決定されるテンプレートＤＮＡ分子３９０５と、溶血素ナノポア３９１０及びＤＮＡポリメラーゼ３９１５の融合物と、タグ付きヌクレオチド３９２０との間で形成された三元複合体３９００の一例を示す。ポリメラーゼ３９１５は、タンパク質リンカー３９２５によりナノポア３９１０に付着している。ナノポア／ポリメラーゼ構築物は、ナノポアの７個のポリペプチド単量体の内の１個のみが、付着したポリメラーゼを有するように、形成されている。タグ付きヌクレオチド３９２０の一部はナノポアを通り、ナノポアを通過する電流に影響を及ぼす。
【０５１０】
[00557]図４０は、配列決定されるがタグ付きヌクレオチドを有しないテンプレートＤＮＡの存在下で、ナノポアを通って流れる電流を示す。ナノポアと接触している溶液は、１００ｍＶの印加電圧で、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＳｒＣｌ２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５を有する。電流は１８ピコアンペア（ｐＡ）付近のままであり、少数の例外４００５がある。この例外は電子ノイズであり得、且つ水平時間軸上の１個のみのデータポイントであり得る。例えば適応シグナル処理アルゴリズム等の、シグナルからノイズを識別するアルゴリズムを使用して、電子ノイズを軽減し得る。
【０５１１】
[00558]図４１、図４２、及び図４３は、異なるタグが異なる電流レベルを生じることを示す。全ての例では、ナノポアと接触している溶液は、１００ｍＶの印加電圧で、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＳｒＣｌ２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５を有する。図４１は、チミン（Ｔ）４１１０と識別されているグアニン（Ｇ）４１０５を示す。タグは、約８〜１０ｐＡの電流レベルを有する（Ｔに関する）ｄＴ６Ｐ−Ｔ６−ｄＳｐ８−Ｔ１６−Ｃ３と、約４又は５ｐＡの電流レベルを有する（Ｇに関する）ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−３０Ｔ−Ｃ６とである。図４２は、アデニン（Ａ）４２１０と識別されているグアニン（Ｇ）４２０５を示す。タグは、約６〜７ｐＡの電流レベルを有する（Ａに関する）ｄＡ６Ｐ−Ｔ４−（Ｓｐ１８）−Ｔ２２−Ｃ３と、約４又は５ｐＡの電流レベルを有する（Ｇに関する）ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−３０Ｔ−Ｃ６とである。図４３は、シトシン（Ｃ）４３１０と識別されているグアニン（Ｇ）４３０５を示す。タグは、約１〜３ｐＡの電流レベルを有する（Ｃに関する）ｄＧ６Ｐ−Ｔ４−（Ｓｐ１８）−Ｔ２２−Ｃ３と、約４又は５ｐＡの電流レベルを有する（Ｇに関する）ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−３０Ｔ−Ｃ６とである。
【０５１２】
[00559]図４４、図４５、図４６、及び図４７は、タグ付きヌクレオチドを使用する配列決定の例を示す。配列決定されるＤＮＡ分子は一本鎖であり、配列ＡＧＴＣＡＧＴＣ（配列番号３６）を有し、２個の隣接するヘアピン構造により安定化されている。全ての例では、ナノポアと接触している溶液は、１００ｍＶの印加電圧で、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＳｒＣｌ２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５を有する。この溶液には、グアニン（ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−３０Ｔ−Ｃ６）、アデニン（ｄＡ６Ｐ−Ｔ４−（Ｓｐ１８）−Ｔ２２−Ｃ３）、シトシン（ｄＣ６Ｐ−Ｔ４−（Ｓｐ１８）−Ｔ２２−Ｃ３）、及びチミン（ｄＴ６Ｐ−Ｔ６−ｄＳｐ８−Ｔ１６−Ｃ３）に対応する４種のタグが含まれている。図４４は、４個の連続したタグ付きヌクレオチド（即ち、Ｃ４４０５、Ａ４４１０、Ｇ４４１５、及びＴ４４２０）が、配列番号３６における配列ＧＴＣＡに対応して同定される一例を示す。タグは、伸長鎖に組み込まれる前に、ナノポア中に及びナノポアから外へ数回通過し得る（例えば、各組込み事象に関して、電流レベルは、オープンチャネル電流と、タグを識別する減少した電流レベルとの間で数回切り替わり得る）。
【０５１３】
[00560]電流減少の持続時間は、何らかの理由のために試行間で異なる可能性があり、この理由として、タグがナノポアに入って出る時間が異なること、及び／又はタグがポリメラーゼにより短時間保持されるが、伸長している核酸鎖に完全には組み込まれないことが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、電流減少の持続時間は試行間でほぼ一致する（例えば、最大で約２００％、１００％、５０％、又は２０％変動する）。場合によっては、酵素、印加電圧の波形、二価イオン及び／若しくは一価イオンの濃度、温度、並びに／又はｐＨは、電流減少の持続時間が試行間でほぼ一致するように選択される。図４５は、図４４に示したように同定される配列番号３６中の同一配列ＧＴＣＡを示す（即ち、この場合では、同定されるタグ付きヌクレオチドは、Ｃ４５０５、Ａ４５１０、Ｇ４５１５、及びＴ４５２０である）。場合によっては、電流は長期間にわたり減少したままである（例えば、４５２０で示すように約２秒）。
【０５１４】
[00561]図４６は、配列番号３６中の配列ＡＧＴＣＡに対応する、同定される５個の連続したタグ付きヌクレオチド（即ち、Ｔ４６０５、Ｃ４６１０、Ａ４６１５、Ｇ４６２０、Ｔ４６２５）を示す。図４７は、配列番号３６中の配列ＡＧＴＣＡＧに対応する、同定される５個の連続したタグ付きヌクレオチド（即ち、Ｔ４７０５、Ｃ４７１０、Ａ４７１５、Ｇ４７２０、Ｔ４７２５、Ｃ４７３０）を示す。
【０５１５】
実施例４−レポーターユニットのイオン流電流レベル及び滞留時間特性の設計
[00562]二本鎖領域（例えば二本鎖嵩高構造）に隣接するポリマー内に位置するレポーターユニットの電流レベル及び滞留時間の両方を、ナノポア検出のための所望のレベルまで選択的に「調整」することを可能にする改変ヌクレオチドポリマーを開発している。例えば、図４９のデータにより示されるように、新規のアミダイトユニットで構成されているレポーターユニットを使用して、多種多様なイオン電流フローレベル（Ｉ／Ｉｏ）が利用可能である。同様に、図５０に示すデータにより示されるように、これらの同一のアミダイトユニットを使用して、多種多様な滞留時間を得ることができる。
【図１】
2021506292.tif 000033
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2021506292.tif 000035
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021506292.tif 000041
【図８】
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【図９】
2021506292.tif 000043
【図１０】
2021506292.tif 000044
【図１１】
2021506292.tif 000045
【図１２】
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【図１３】
2021506292.tif 000047
【図１４】
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【図１５】
2021506292.tif 000049
【図１６】
2021506292.tif 000050
【図１７】
2021506292.tif 000051
【図１８】
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【図１９】
2021506292.tif 000053
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2021506292.tif 000059
【図２６】
2021506292.tif 000060
【図２７】
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【図２８】
2021506292.tif 000062
【図２９】
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【図３０】
2021506292.tif 000064
【図３１】
2021506292.tif 000065
【図３２】
2021506292.tif 000066
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2021506292.tif 000069
【図３６】
2021506292.tif 000070
【図３７】
2021506292.tif 000071
【図３８】
2021506292.tif 000072
【図３９】
2021506292.tif 000073
【図４０】
2021506292.tif 000074
【図４１】
2021506292.tif 000075
【図４２】
2021506292.tif 000076
【図４３】
2021506292.tif 000077
【図４４】
2021506292.tif 000078
【図４５】
2021506292.tif 000079
【図４６】
2021506292.tif 000080
【図４７】
2021506292.tif 000081
【図４８】
2021506292.tif 000082
【図４９】
2021506292.tif 000083
【図５０】
2021506292.tif 000084
【配列表】
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【国際調査報告】
2021506292.tif 000085
2021506292.tif 000086
2021506292.tif 000087