(57)【要約】  本発明は、サツマイモを育苗する前に、サツマイモの種芋サンプルを無作為に選択し、種芋サンプルの全ＤＮＡと全ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ法により、種芋が持っているウイルスの状況をそれぞれ検出し、種芋が持っているウイルスの種類と種芋のウイルス保有率により、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度を予測する、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サツマイモを育苗する前に、サツマイモの種芋サンプルを無作為に選択し、種芋サンプルの全ＤＮＡと全ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ法により、種芋が持っているウイルスの状況をそれぞれ検出し、種芋が持っているウイルスの種類と種芋のウイルス保有率により、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度を予測することを特徴とする、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項２】
ウイルスは、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＣ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＶ、ＳＰＶ２、ＣＭＶ、ＳＰＣＳＶ、及びＳｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓを含むことを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項３】
サツマイモを育苗する前に、無作為に選択されるサツマイモの種芋の検出サンプルの重量比は８〜１５％であることを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項４】
ＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ法による検出に使用される特異的なプライマーは下記の通りであることを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【表１】
2021506332.tif 000007
【請求項５】
ＰＣＲの反応系において、２×Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ １０．０μＬ、５ ｐｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマーとリバースプライマー各２．０μＬ、１００〜４００ｎｇ／μＬのＤＮＡテンプレート１．５μＬ、ＲＮａｓｅフリー水で２０．０μＬとなるまでに補充することを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項６】
ＰＣＲの反応プログラムにおいて、９５℃で５ｍｉｎ初期変性させる；９５℃で３０ｓ変性させ、５３〜５７℃で３０ｓアニーリングさせ、７２℃で５０ｓ伸長させるサイクルが３５回行われる；７２℃で７ｍｉｎ伸長させることを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項７】
サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率を予測する計算式は、
予測するウイルス性疾患の発症率（％）＝検出された種芋サンプルのウイルス保有率 × ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率
であることを請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項８】
ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率が０．７９７であることを特徴とする、請求項７に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項９】
サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の重症度はサツマイモの育苗期における中重症発症状況であり、
予測するウイルス性疾患の中重症発症率（％）＝検出された種芋サンプルのＳＰＣＳＶとＰｏｔｙｖｉｒｕｓとの混合ウイルスのウイルス保有率
であることを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法に関するものであり、生物工学の技術分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
サツマイモは、我が国の重要な食用作物と、都市部と農村部の住民の食事バランスを改善する健康食品である。現在、サツマイモは、我が国の農業産業の構造調整における優位性のある作物と、農民の収入を増加させる重要な収益性の換金作物である。世界において、我が国はサツマイモの最大の生産国で、長年にわたって栽培面積が７０００万ムー程度であり、世界中の栽培面積の約４５％を占めている。ウイルス性疾患は、サツマイモの重要な病害の一つであり、サツマイモの収量の低下と品種の劣化を引き起こす可能性があり、サツマイモの生産に対する危害が非常に大きい。現在、世界中で報告されているサツマイモに感染するウイルスが３０種類以上であり、我が国では、サツマイモに存在するウイルスは主に下記のいくつかの種類がある。（１）Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ属のウイルスであって、主にサツマイモ斑紋モザイクウイルス（ＳＰＦＭＶ）、サツマイモウイルスＣ（ＳＰＶＣ）、サツマイモウイルスＧ（ＳＰＶＧ）、サツマイモ潜在ウイルス（ＳＰＬＶ）、サツマイモウイルス２（ＳＰＶ２）などが含まれる。品種にもよるが、Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓウイルスは、通常、５〜９４％の収量損失を引き起こす可能性がある；（２）サツマイモ萎黄病矮化ウイルス（ＳＰＣＳＶ）であって、サツマイモに感染した後、通常、１５〜８８％の収量損失を引き起こす可能性があり、かつＳＰＣＳＶは複数種のウイルスとの相乗作用により病害を形成でき、より深刻な収量損失、さらに収穫量が０になることを引き起こす可能性がある；（３）サツマイモ双生ウイルス（Ｓｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓ）であって、サツマイモに感染するベゴモウイルス属（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）ウイルスは、ほかの植物に感染するＢｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓと明らかに違い、このようなウイルスを「Ｓｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓ」と称する。Ｓｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓは、サツマイモに存在する重要なウイルスの一つであり、国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）の第１０回報告によれば、Ｓｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓは１３個の種を含み、それぞれが、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｇｏｌｄｅｎ ｖｅｉｎ Ｋｏｒｅａ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＧＶＫＲＶ）、サツマイモ葉巻ウイルス（ＳＰＬＣＶ）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｃａｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＣＶ）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｃｈｉｎａ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＣＮＶ）、Ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  Ｇｅｏｒｇｉａ  ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＧＶ）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｇｕａｎｇｘｉ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＧＶ）Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｈｅｎａｎ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＨｎＶ）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｓｉｃｈｕａｎ ｖｉｒｕｓ １（ＳＰＬＣＳｉＶ−１）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｓｉｃｈｕａｎ ｖｉｒｕｓ ２（ＳＰＬＣＳｉＶ−２）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＳＰＶ）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ＳｏｕｔｈＣａｒｏｌｉｎａ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＳＣＶ）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｕｇａｎｄａ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＵＶ）、及びＳｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＭＶ）である。我が国では、少なくとも八つの種が存在し、Ｓｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓがサツマイモに感染すると、通常、１１〜８６％の収量損失を引き起こす可能性がある；（４）例えば、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）などのその他のウイルス。
【０００３】
現在、サツマイモウイルス性疾患に対する予防・治療は、主に「健康な苗を植える」ことを核心とした予防・制御戦略を採用し、主な施策は、「種芋の早期警戒、育苗期においてできるだけ早く罹病苗を除くこと」などを含む。それらの施策の主な目的は、育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度を低下させ、発症した苗を本田に植えることを防止することで、本田期におけるウイルス性疾患の発症率と収量損失を低減させるためである。上述の目的を達成するために、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発生リスクを予測できる方法を構築する必要があり、当該方法は、サツマイモを育苗する前に、育苗期におけるウイルス性疾患の発生の可能性及び重症度を予測し、ウイルス性疾患の発生リスクを評価し、リスクの高い種芋を早めに処理することで、サツマイモのウイルス性疾患の発生を予防・制御する目的を達成でき、種芋の薯苗企業のビジネスリスクと農家の経済的損失を効果的に低減することもでき、我が国のサツマイモのウイルス性疾患の警戒と予防・制御レベルの向上に重要な意義がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来技術の欠点に対して、本発明の目的は、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法を提供することであり、当該方法は、サツマイモを育苗する前に種芋が持っているウイルスの状況を検出し、種芋が持っているウイルスの種類と種芋のウイルス保有率により、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度を予測し、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発生リスクを警戒し、サツマイモウイルス性疾患の予防・制御に有効な手段を提供している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を実現するために、本発明が採用した技術案は以下の通りである。
【０００６】
サツマイモを育苗する前に、サツマイモの種芋サンプルを無作為に選択し、種芋サンプルの全ＤＮＡと全ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ法により、種芋が持っているウイルスの状況をそれぞれ検出し、種芋が持っているウイルスの種類と種芋のウイルス保有率により、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度を予測する、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【０００７】
ウイルスはＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＣ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＶ、ＳＰＶ２、ＣＭＶ、ＳＰＣＳＶ、及びＳｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓを含む。
【０００８】
サツマイモを育苗する前に、無作為に選択されるサツマイモの種芋の検出サンプルの重量比は８〜１５％である。
【０００９】
ＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ法による検出に使用される特異的なプライマーは下記の通りである。
【００１０】
【表１】
2021506332.tif 000002
【００１１】
ＰＣＲの反応系において、２×Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ １０．０μＬ、５ｐｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマーとリバースプライマー各２．０μＬ、１００〜４００ｎｇ／μＬのＤＮＡテンプレート１．５μＬ、ＲＮａｓｅフリー水で２０．０μＬとなるまでに補充する。
【００１２】
ＰＣＲの反応プログラムにおいて、９５℃で５ｍｉｎ初期変性させる；９５℃で３０ｓ変性させ、５３〜５７℃で３０ｓアニーリングさせ、７２℃で５０ｓ伸長させるサイクルが３５回行われる；７２℃で７ｍｉｎ伸長させる。
【００１３】
サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率を予測する計算式は以下の通りである。
【００１４】
予測するウイルス性疾患の発症率（％）＝検出された種芋サンプルのウイルス保有率×ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率
【００１５】
ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率は０．７９７である。
【００１６】
サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の重症度は、サツマイモの育苗期における中重症発症状況であり、予測するウイルス性疾患の中重症発症率（％）＝検出された種芋サンプルのＳＰＣＳＶとＰｏｔｙｖｉｒｕｓとの混合ウイルスのウイルス保有率。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、我が国のサツマイモに感染する主なウイルスであるＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＣ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＶ、ＳＰＶ２、ＣＭＶ、ＳＰＣＳＶ、及びＳｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓに対するものであり、上記のウイルスに対する特異的なプライマーを設計し、サツマイモを育苗する前に、種芋が持っているウイルスの状況を検出し、種芋が持っているウイルスの種類と種芋のウイルス保有率により、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度を予測し、サツマイモウイルス性疾患の発生リスクを警戒する。本発明の予測方法は、大量な圃場試験によって得られるもので、サツマイモの育苗によって検証されており、実際の結果が予測値に近く、信頼性が高く、市場に既存のサツマイモ品種、とくに商薯１９に適用でき、サツマイモ種芋の貯蔵期で育苗期における病害の発生リスクの早期かつ正確な予測が実現される。本発明は、種芋の薯苗企業のビジネスリスクと農家の経済的損失を効果的に低減することができ、我が国のサツマイモウイルス性疾患の警戒と予防・制御レベルの向上に重要な意義がある。
【００１８】
以下、実施例を組み合わせて、本発明の具体的な実施形態をさらに詳細に説明する。本文において、Ｓｗｅｅｐｏはｓｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓの略語である。
【実施例】
【００１９】
実施例１、種芋が持っているウイルスの種類と育苗期における病害の重症度との関係
１、材料： 
１．１ 試験用サツマイモの種芋：本発明で使用される種芋は、前年の異なる植栽地で収穫され、穴蔵に保存された種芋である。品種は商薯１９（Ｓ１９）であり、異なる区画から収穫された１７５個の種芋を無作為に選択し、番号を付けた後、メスでサツマイモの塊根の中央部の皮とそれにつながるイモの肉の部分を掘り出し、液体窒素で粉砕し、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）抽出用として、−７０℃の超低温冷蔵庫に保存しておく。
【００２０】
１．２ 育苗：サンプリングしたサツマイモの塊根を、栄養価の高いボウルで育て、ボウルあたり１つのイモとなるように、温室に置き、サツマイモの塊根が発芽する時間を記録し、育苗期における病害の発症率と重症度を調査する。
【００２１】
２、プライマーの設計と合成：
ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＣ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＶ、ＳＰＶ２、ＣＭＶ、ＳＰＣＳＶ、及びＳｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓゲノム配列により、ＤＮＡＭＡＮソフトウェアを用いて配列を比較し、上述のウイルスの検出用の特異的なプライマー（表１）を設計し、プライマーは、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ (Ｓｈａｎｇｈａｉ) Ｃｏ., Ｌｔｄ.により合成されるものである。
【００２２】
【表２】
2021506332.tif 000003
【００２３】
３、核酸抽出とＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲ検出：
Ｐｌａｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｍａｒｋ、Ｔａｉｗａｎ）で全ＲＮＡを抽出し、ＥＺ−１０ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ., Ｌｔｄ.、中国上海）で全ＤＮＡを抽出する。テンプレートとして、ＲＮＡサンプル８００ｎｇを取り、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡの第一鎖を合成し、上記の具体的な作業はいずれも対応するキットの説明書を参照して行う。合成されたｃＤＮＡと抽出された全ＤＮＡをそれぞれテンプレートとし、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ (Ｄａｌｉａｎ) Ｃｏ., Ｌｔｄ、中国大連）を用いてＰＣＲ増幅する。反応系において、２×Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ１０．０μＬ、５ｐｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマーとリバースプライマー各２．０μＬ、１００〜４００ｎｇ／μＬの全ＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）テンプレート１．５μＬ、ＲＮａｓｅフリー水で２０．０μＬとなるまでに補充する。増幅プログラムにおいて、９５℃で５ｍｉｎ初期変性させる；９５℃で３０ｓ変性させ、５３〜５７℃で３０ｓアニーリングさせ、７２℃で５０ｓ伸長させるサイクルが３５回行われる；７２℃で７ｍｉｎ伸長させる。増幅産物は１％のアガロースゲル電気泳動で検出され、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ Ｍｉｎｉ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、ＵＳＡ）ゲルイメージャーで観察され、検出結果を記録する。
【００２４】
４、増幅断片の配列分析：
ＰＣＲ増幅産物を、Ｃｙｃｌｅ−Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−ｔｅｋ、ＵＳＡ）により精製・回収した後、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ (Ｓｈａｎｇｈａｉ) Ｃｏ., Ｌｔｄ.に委託して直接にシークエンシングする。シークエンシングして得られた配列を、ＤＮＡＭＡＮとＢＬＡＳＴオンラインソフトウェアにより、ソートして分析する。結果から、本発明で得られる各ウイルスの核酸断片の配列と、対応するウイルスの配列との同一性がいずれも９８％以上であることが示され、設計した検出用プライマーはいずれも特異的なプライマーであると言える。
【００２５】
５、育苗期におけるウイルス性疾患の調査：サツマイモが出芽した後に、定期的に調査を行い、サツマイモの塊根ごとに病害の重症度を調査する。症状のタイプと病害のレベルを記録する。ウイルス性疾患の等級基準は下記の通りである。 
０級：植物が正常であり、葉がいずれの症状もない；
１級：植物の一部の葉がやや縮んでしまい、或いは軽度のモザイク病にかかっている；
３級：植物の全部又は大部分の葉が縮んで、黄変やモザイク病にかかっており、新葉の葉脈透化症状が顕著で、植物が軽度に矮小化する；
５級：植物全体の葉が小さくなり、軽度の奇形があり、葉が縮んで、葉脈透化が起こり、或いは黄変症状が伴って、植物が顕著に矮小化する；
７級：植物全体の葉が小さくなり、葉に顕著な奇形があり、やや革質なものになり、縮んで、葉脈透化が起こり、或いは黄変症状が伴って、植物が深刻に矮小化する；
９級：植物全体の葉が小さくなり、葉に深刻な奇形があり、革質なものになり、縮んで葉脈透化が深刻であり、カールした葉があり、植物が深刻に矮小化する。
【００２６】
下記の式によりウイルス保有種芋のウイルスの発症率を算出する。
【００２７】
ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率（％）＝ウイルス性疾患を発症した数／ウイルス保有種芋の総数×１００
【００２８】
６、結果分析
本発明の種芋が持っているウイルスの種類とサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の重症度との関係を表２に示す。
【表３】
2021506332.tif 000004
【００２９】
表２から分かるように：
（１）種芋が持っているウイルスは、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症を引き起こす可能性が高い。本発明では、１７５個の種芋についてウイルス検出を行った。それらの中で、１５３個の種芋はウイルスを持っているが、２２個の種芋はウイルスが検出されなかった。種芋のウイルス保有率は８７．４％（１５３／１７５）であり、１５３個のウイルス保有種芋を育苗した後に、１２２個の種芋の薯苗が発症したが、３１個の種芋の薯苗は発症しなかった。従って、ウイルス保有種芋の薯苗のウイルス性疾患の発症確率が７９．７％（１２２／１５３）であった。
【００３０】
（２）種芋が単一のウイルスを持っている場合、育苗期における症状の重症度は相対的に軽い。本発明では、１種のウイルス（ＳＰCＳＶ、ＳＰＦＭＶ又はＳｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓを含む）を持っているサツマイモの塊根が７３個検出され、それらの中で、２８個のサツマイモの塊根（３８．４％）の薯苗にウイルスの症状が見られなかったが、３９個のサツマイモの塊根（５３．４％）の薯苗は軽度（１級）〜中度（３級〜５級）のウイルスの症状を示し、６個のサツマイモの塊根（８．２％）の薯苗は重度（７級〜９級）の症状を示した。
【００３１】
（３）種芋が持っているウイルスの組み合わせは、育苗期におけるウイルス性疾患の症状の重症度に影響を与える。種芋が持っているウイルスの種類が多いほど、育苗期におけるウイルス性疾患の症状はより深刻になり、とくに、ＳＰＣＳＶと、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＶＣ及びＳＰＬＶ等のＰｏｔｙｖｉｒｕｓウイルスとの
1594344651089_0
は、ウイルス性疾患の重症度を顕著に増大させる。例えば、本発明で検出された６１個のＳＰＣＳＶの感染とＰｏｔｙｖｉｒｕｓウイルスの感染との組み合わせにおいて、発症率は１００％であり、かつ症状の重症度はいずれも中度（３級〜５級）又は重度（７級〜９級）であった。
【００３２】
上記のように、（１）種芋が持っているウイルスは、サツマイモの育苗期における薯苗の発症を引き起こす可能性が高い；（２）種芋がＳＰＣＳＶ、ＳＰＦＭＶ又はＳｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓなどの１種のウイルスを持っている場合、育苗期における症状の重症度として、主に軽度（０級〜１級）又は中度（３級〜５級）を示した；（３）種芋がＳＰＣＳＶとＰｏｔｙｖｉｒｕｓとの混合ウイルスを持っている場合、育苗期における発症率が１００％であり、症状の重症度として、中度（３級〜５級）又は重度（７級〜９級）を示した。
【００３３】
上記の検出結果により、予測するサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度（中重症発症率）は以下の通りである。
【００３４】
予測するウイルスの発症率（％）＝検出された種芋サンプルのウイルス保有率 × ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率
【００３５】
予測するウイルス性疾患の中重症発症率（％）＝検出された種芋サンプルのＳＰＣＳＶとＰｏｔｙｖｉｒｕｓとの混合ウイルスのウイルス保有率
【００３６】
実施例２、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法の応用
材料：穴蔵に保存される２バッチの異なる地域（洛陽、許昌）由来の種芋から、ぞれぞれ、ウイルス検出用のサンプルとして一部のサツマイモの塊根を無作為に選択し、品種は商薯１９（Ｓ１９）である。第１バッチの種芋の総質量は約４００ｋｇであり、計１５個のサツマイモの塊根（約７．５ ｋｇ）を選択し、サンプル量は総質量の約１．９％を占めている；第２バッチの種芋の総質量は約４００ ｋｇであり、計９２個のサツマイモの塊根（約４６ ｋｇ）を選択し、サンプル量は総質量の約１１．５ ％を占めている。ウイルスの種類の検出方法は実施例１の場合と同じである。
【００３７】
２、育苗：通常の方法により上記の２バッチの種芋をそれぞれ温室で育苗する。
【００３８】
３、病状の調査：種芋を育苗してから３０日前後で、育苗期における発症の状況を調査する。小区画調査には、対角線法（５箇所）を採用し、株ごとに植物の病害の重症度を調査する。等級基準は実施例１のと同じである。
【００３９】
下記の式により予測するウイルスの発症率、重症度、及び実際のウイルス性疾患の発症率、重症度を算出する。
【００４０】
予測するウイルス性疾患の発症率（％）＝検出された種芋サンプルのウイルス保有率 × ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率（実施例１と同じ。）
【００４１】
実際のウイルス性疾患のの発症率（％）＝ウイルス性疾患を発症した株の数／調査した株の総数×１００
【００４２】
予測するウイルス性疾患の中重症発症率（％）＝検出された種芋サンプルのＳＰＣＳＶとＰｏｔｙｖｉｒｕｓとの混合ウイルスのウイルス保有率
【００４３】
実際のウイルス性疾患の中重症発症率（％）＝中重度ウイルス性疾患を発症した株の数／調査した株の総数×１００
【００４４】
４、結果分析
本発明の種芋の育苗期における症状の重症度の調査結果を表３に示す。
【００４５】
【表４−１】
2021506332.tif 000005
【表４−２】
2021506332.tif 000006
【００４６】
表３から分かるように：
（１）第１バッチの種芋としては、計１５個のサツマイモの塊根を無作為に選択し、ウイルス検出により、７個のサツマイモの塊根がウイルスを持っており、ウイルス保有率が４６．７％（７／１５）であった；ＳＰＣＳＶとＰｏｔｙｖｉｒｕｓとの混合ウイルスのウイルス保有率が６．７％（１／１５）であった；実施例１の実験結果により、当該バッチの種芋のウイルス性疾患の発症率が３７．２％（４６．７％×０．７９７）であると予測される；中度（３級〜５級）又は重度（７級〜９級）の発症率が６．７％であると予測される。
【００４７】
当該バッチの種芋を育苗した。実際の育苗期における病状の調査結果は、調査した株の総数が９８４株であり、それらの中で、０級であるものが７４２株、１級であるものが２１２株、３級〜５級であるものが３０株、７級〜９級であるものが０株であると示している。実際のウイルス性疾患の発症率は２４．６％であり、中度（３級〜５級）又は重度（７級〜９級）の発症率は３．０％（３０／９８４）であり、予測値に近い。
【００４８】
（２）第２バッチの種芋としては、計９２個のサツマイモの塊根を無作為に選択し、ウイルス検出により、８５個のサツマイモの塊根がウイルスを持っており、ウイルス保有率が９２．４％（８５／９２）であった；ＳＰＣＳＶとＰｏｔｙｖｉｒｕｓとの混合ウイルスのウイルス保有率が３０．４％（２８／９２）であった；実施例１の実験結果により、当該バッチの種芋のウイルス性疾患の発症率が７３．６％（９２．４％×０．７９７）であると予測される；中度（３級〜５級）又は重度（７級〜９級）の発症率が３０．４％であると予測される。
【００４９】
当該バッチの種芋を育苗した。実際の育苗期における病状の調査結果は、調査した株の総数が２７４５株であり、それらの中で、０級であるものが８５７株、１級であるものが３２３株、３級〜５級であるものが１０６２株、７級〜９級であるものが５０３株であることを示している。ウイルス性疾患の発症率が６８．８％であり、中度（３級〜５級）又は重度（７級〜９級）の発症率が５７．０％（１５６５／２７４５）であり、予測値に近いから、本発明の予測方法の信頼性が高く、予測結果が非常に高い参考価値があると言える。２バッチのサンプリングの検出結果から分かるように、サンプル量が大きいほど、予測値は実測値により近く、検出コスト、ワークロード及び予測精度に対する要求を総合的に考慮すると、８〜１５％のサンプル量が比較的に適宜であるため推奨する。
【００５０】
上記において説明したのは、本発明の最も好ましい実施例にすぎず、当業者にとって、本発明において様々な修正や変更を行うことができる。本発明の技術的思想および趣旨から逸脱しない範疇で行ったいかなる変形、同価置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月10日(2020.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サツマイモを育苗する前に、サツマイモの種芋サンプルを無作為に選択し、種芋サンプルの全ＤＮＡと全ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ法により、種芋が持っているウイルスの状況をそれぞれ検出し、種芋が持っているウイルスの種類と種芋のウイルス保有率により、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度を予測し、
前記ウイルスは、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＣ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＶ、ＳＰＶ２、ＣＭＶ、ＳＰＣＳＶ、及びＳｗｅｅｐｏｖｉｒｕｓｅｓを含み、
サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率を予測する計算式は、
予測するウイルス性疾患の発症率（％）＝検出された種芋サンプルのウイルス保有率 × ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率
であり、
ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率が０．７９７であり、
サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の重症度はサツマイモの育苗期における中重症発症状況であり、
予測するウイルス性疾患の中重症発症率（％）＝検出された種芋サンプルのＳＰＣＳＶとＰｏｔｙｖｉｒｕｓとの混合ウイルスのウイルス保有率
であり、
前記のサツマイモを育苗する前に、無作為に選択されるサツマイモの種芋の検出サンプルの重量比は８〜１５％である、ことを特徴とする、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項２】
ＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ法による検出に使用される特異的なプライマーは下記の通りであることを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【表１】
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【請求項３】
ＰＣＲの反応系において、２×Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ １０．０μＬ、５ ｐｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマーとリバースプライマー各２．０μＬ、１００〜４００ｎｇ／μＬのＤＮＡテンプレート１．５μＬ、ＲＮａｓｅフリー水で２０．０μＬとなるまでに補充することを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【請求項４】
ＰＣＲの反応プログラムにおいて、９５℃で５ｍｉｎ初期変性させる；９５℃で３０ｓ変性させ、５３〜５７℃で３０ｓアニーリングさせ、７２℃で５０ｓ伸長させるサイクルが３５回行われる；７２℃で７ｍｉｎ伸長させることを特徴とする、請求項１に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
【国際調査報告】
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