(57)【要約】【要約書】酸媒介開裂を使用したリガンド−薬物複合体を分析する方法、および本方法を実行するためのキットが本明細書で提供される。さらに、リガンド−薬物複合体の分析および開発のための方法の様々な応用も提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のリガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）を分析する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣを含むサンプルを提供する工程であって、前記ＬＤＣはリガンドおよび分析標的を含み、前記分析標的は薬物分子またはその一部を含む、提供する工程；ならびに
ｂ．前記サンプルを１〜３０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記ＬＤＣから前記分析標的の放出を誘導する、接触させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
ａ．前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する工程；および
ｂ．放出された前記分析標的の量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）にかけることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にかけることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ａ．前記サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程；および
ｂ．前記測定したリガンドの量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルを前記トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記ＬＤＣを収集する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＤＣを収集する工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記ＬＤＣの標準曲線を使用して行われる、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ．固定量の内部標準を前記サンプルに加える工程であって、前記内部標準は前記リガンドおよび第二分析標的を含み、前記第二分析標的は前記ＬＤＣの標識誘導体である、加える工程；
ｂ．前記サンプルを１〜３０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記ＬＤＣから前記分析標的のおよび前記内部標準から前記第二分析標的の放出を誘導する、接触させる工程；
ｃ．前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を測定する工程；ならびに
ｄ．前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量に基づいて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する工程
をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二分析標的が前記分析標的と異なる分子量を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記内部標準が前記ＬＤＣの同位体標識版を含む、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記同位体標識が安定または不安定である、請求書１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記同位体標識が重水素または炭素１３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記ＬＤＣおよび前記内部標準を収集する工程をさらに含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＤＣまたは前記内部標準を収集する前記工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リガンドが抗体またはその機能性断片であり、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂およびプロテインＬ樹脂から選択される樹脂と前記サンプルを接触させることによって、前記ＬＤＣまたは前記内部標準が前記サンプルから収集される、請求項７または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが１０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分析標的がテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
リガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）の安定性を決定する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣに曝露した後に異なる時点で単一源から第一サンプルおよび第二サンプルを取得する工程；
ｂ．請求項２〜２０のいずれか一項に記載の方法で前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記ＬＤＣを分析する工程であって、それによって、前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記ＬＤＣから放出された分析標的の量を決定する、分析する工程；ならびに
ｃ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的の量を比較することによって、前記ＬＤＣの安定性を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
ａ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程；ならびに
ｂ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的と前記リガンドの量の比率を決定する工程
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプル、前記第一サンプル、または前記第二サンプルが、哺乳類の組織または哺乳類の水性体液に由来する生物サンプルである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物サンプルが、血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿のうちの一つから取得される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物サンプルが血漿から取得される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血漿が前記ＬＤＣで処理された、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記血漿が前記ＬＤＣで治療されているヒト対象に由来する、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
サンプル中のＬＤＣを定量する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣを含むサンプルを提供する工程であって、前記ＬＤＣが分析標的を含み、前記分析標的が薬物分子を含む、提供する工程；
ｂ．前記サンプルに内部標準を添加する工程であって、前記内部標準が、前記ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む、添加する工程；
ｃ．前記サンプルから前記ＬＤＣおよび前記内部標準を抽出する工程；
ｄ．前記ＬＤＣおよび前記内部標準を１〜３０体積％の濃度のＴＦＡ水溶液と接触させる工程であって、前記ＴＦＡが、前記ＬＤＣから前記分析標的をおよび前記内部標準から前記第二分析標的を放出させる、接触させる工程；ならびに
ｅ．前記ＬＤＣから放出された前記分析標的および前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を決定する工程であって、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が前記サンプル中のＬＤＣの量と相関する、決定する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を用いて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が決定され、前記ＬＤＣから放出された分析標的の量が、前記サンプル中の前記ＬＤＣの抗体に結合した前記薬物分子の濃度と相関する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＬＤＣの標準曲線を用いて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が決定される、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記分析標的がＭＭＡＦまたはテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記分析標的がｍｃＭＭＡＦを含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記分析標的および前記第二分析標的がテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含み、前記第二分析標的が６以上の炭素および１３または６以上の重水素によって同位体標識されている、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記分析標的および前記第二分析標的がペグ化リンカーＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥを含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記分析標的および前記第二分析標的がＭＭＡＥを含み、前記第二分析標的が６以上の炭素および１３または６以上の重水素によって同位体標識されている、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＬＤＣおよび前記内部標準を１０体積％の濃度の前記ＴＦＡ水溶液と接触させる、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中のＬＤＣの量を決定するためのキットであって、
ａ．前記ＬＤＣのための内部標準であって、前記ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ薬物分子を含む、内部標準；および
ｂ．１〜３０体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液
を含む、キット。
【請求項３９】
前記内部標準が同位体標識されている、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
サンプル中のＬＤＣの量を決定するためのキットであって、
ａ．標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、前記標識リンカー−薬物複合体が、前記リガンドに共役し、それによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド；ならびに
ｂ．１〜３０体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液
を含む、キット。
【請求項４１】
前記内部標準が同位体標識されている、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１７年１１月２２日付けで出願した米国特許出願第６２／５９０，１６９号の恩典を主張するものであり、これらの特許の開示内容は、全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
リガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）は標的療法の関心が高まっていることから注目されている。ＬＤＣは、細胞毒性薬、典型的には強い全身毒性を有する小分子薬物、および組織または細胞特異的抗原に対して高い選択的リガンド（例えば、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）のケースでは抗体）からなり、血液循環では比較的安定なリンカーを介して相互連結されているが標的環境においては細胞毒性薬を放出する。抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、次世代の標的療法として、特に腫瘍学においてはかなり有望である。非常に強力な細胞毒性薬を病変組織に送達するために抗体の免疫学的特異性の活用が抗腫瘍活性を改善させ、そしてオフターゲット毒性を制限する。この手法は現在、ＦＤＡに認可された２種類のＡＤＣ、すなわちブレンツキシマブ  ベドチンおよびＡｄｏ−トラスツズマブ  エムタンシン（Ｖｅｒｍａら、２０１２、Ｙｏｕｎｅｓら、２０１０）（Ｖｅｒｍａら、２０１２、Ｙｏｕｎｅｓら、２０１０）で使用に成功しており、多くの前臨床試験および治療実験で注目されている。
【０００３】
ＬＤＣの薬物動態プロファイル、毒性および化学安定性の改善に向けて集中的な研究活動が進められている。大部分のＬＤＣは薬物負荷が変化するリガンドの不均一な混合物であり、これは、可変数の薬物または薬物−リンカー分子が１つのリガンドに結合し得ることを意味する。一旦、ＬＤＣが生物環境に置かれると、例えば薬物または薬物−リンカーは消失し、さらなる不均質をもたらす。大部分のＡＤＣは、内因性リジンやシステイン残基を介した抗体への強力な細胞毒性薬の結合にアミドやチオエーテル化学を利用し、マレイミド−システイン共役が臨床病期ＡＤＣプログラムに多く使用されている一方、マレイミドは幾分かの共役後不安定性を提示することが示されている。したがって、薬物の標的特異的送達を確保し、そしてオフターゲット毒性を制限するために薬物−抗体結合の安定性を改善することがＬＤＣにとって必要である。
【０００４】
そのような改善型ＬＤＣの開発には一般的に複数の生物分析アッセイを必要とする。生体内変化、および薬物または薬物リンカーの安定性は、様々な分析方法を用いて、経時的または生物環境に曝露した後にリガンドに対して安定に結合する薬物の濃度を測定することでアッセイができる。そのようなアッセイは、以降の測定のために薬物またはその一部を放出する手段が必要である。これは酵素的切断によって行ってもよい。しかしながら、一部の薬物および薬物リンカーは酵素によって切断されない。したがって、放出された薬物またはその一部の検出および定量に適切な分析方法と共に、使用に適したＬＤＣから薬物および薬物リンカーを切断する代替手段が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本出願の開示は、サンプル中のＬＤＣを測定、分析および定量し、それによってリガンドに共役した薬物の量を決定する方法を提供する。具体的には、当該方法は、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液の酸で処理することによってＬＤＣから放出し得る分析標的を含むＬＤＣを使用する。さらに、ＬＤＣから放出された分析標的の測定に基づくＬＤＣの量、濃度および安定性を決定する方法を提供することを含む。本明細書で提供されるＬＤＣ分析方法は、高い安定性と低い毒性をもった新規なＬＤＣを開発するのに不可欠な手段ということができる。
【０００６】
より具体的には、１つの態様において、本発明は、サンプル中のリガンド−薬物複合体  （ＬＤＣ）を分析する方法であって、（ａ）ＬＤＣを含むサンプルを提供する工程であって、ここでＬＤＣはリガンドと分析標的を含み、分析標的は薬物分子またはその一部を含む、工程；および（ｂ）サンプルを１〜３０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、ＬＤＣから分析標的の放出を誘導する、接触させる工程を含む、上記方法を提供する。
【０００７】
一部の実施形態においては、方法は、（ａ）ＬＤＣから放出された分析標的の量を測定する工程；および（ｂ）放出された分析標的の量を用いて、サンプル中の薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程をさらに含む。
【０００８】
一部の実施形態においては、ＬＤＣから放出された分析標的の量を測定する工程は、分析標的を液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）にかけることを含む。一部の実施形態においては、ＬＤＣから放出された分析標的の量を測定する工程は、分析標的を液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にかけることを含む。
【０００９】
一部の実施形態においては、方法は、（ａ）サンプル中のリガンド量を測定する工程；および（ｂ）リガンドの測定量を使用して、サンプル中の薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程をさらに含む。
【００１０】
一部の実施形態においては、方法は、サンプルをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程の前に、サンプルからＬＤＣを収集する工程をさらに含む。一部の実施形態においては、ＬＤＣを収集する工程は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる。
【００１１】
一部の実施形態においては、ＬＤＣから放出された分析標的の量を測定する工程は、ＬＤＣの標準曲線を使用して行われる。
【００１２】
一部の実施形態においては、方法は、（ａ）サンプルに固定量の内部標準を添加する工程であって、ここで内部標準はリガンドおよび第二分析標的を含み、第二分析標的はＬＤＣの標識誘導体である、工程；（ｂ）サンプルを１〜３０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、ＬＤＣから分析標的のおよび内部標準から第二分析標的の放出を誘導する、接触させる工程；（ｃ）内部標準から放出された第二分析標的の量を測定する工程；ならびに（ｄ）内部標準から放出された第二分析標的の量に基づいてＬＤＣから放出された分析標的の量を測定する工程をさらに含む。
【００１３】
一部の実施形態においては、第二分析標的は分析標的と異なる分子量を有する。一部の実施形態においては、内部標準はＬＤＣの同位体標識版を含む。一部の実施形態においては、同位体標識は安定または不安定である。一部の実施形態においては、同位体標識は重水素または炭素１３である。
【００１４】
一部の実施形態においては、方法は、サンプルをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程の前に、サンプルからＬＤＣおよび内部標準を収集する工程をさらに含む。一部の実施形態においては、ＬＤＣまたは内部標準を収集する工程は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる。一部の実施形態においては、リガンドは抗体またはその機能性断片であり、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂およびプロテインＬ樹脂から選択される樹脂とサンプルを接触させることによってＬＤＣまたは内部標準がサンプルから抽出される。
【００１５】
一部の実施形態においては、サンプルを１０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる。
【００１６】
一部の実施形態においては、薬物分子はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。一部の実施形態においては、薬物分子はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。
【００１７】
一部の実施形態においては、分析標的はテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、リガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）の安定性を決定する方法であって、（ａ）ＬＤＣに曝露した後に異なる時点で単一源から第一サンプルおよび第二サンプルを取得する工程；（ｂ）本明細書で提供された方法で第一サンプルおよび第二サンプル中のＬＤＣを分析する工程であって、それによって、第一サンプルおよび第二サンプル中のＬＤＣから放出された分析標的の量を決定する、分析する工程；ならびに（ｃ）第一サンプルおよび第二サンプル中の放出された分析標的の量を比較することによってＬＤＣの安定性を決定する工程を含む、方法を提供する。
【００１９】
一部の実施形態においては、該方法は、（ａ）第一サンプルおよび第二サンプル中のリガンドの量を測定する工程；ならびに（ｂ）第一サンプルおよび第二サンプル中の放出された分析標的とリガンドの量の比率を決定する工程をさらに含む。
【００２０】
一部の実施形態においては、サンプル、第一サンプル、または第二サンプルは、哺乳類の組織または哺乳類の水性体液に由来する生物サンプルである。一部の実施形態においては、生物サンプルは、血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿のうちの一つから取得される。一部の実施形態においては、生物サンプルは血漿から取得される。一部の実施形態においては、血漿はＬＤＣで処理された。一部の実施形態においては、血漿はＬＤＣで治療されているヒト対象に由来する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中のＬＤＣを定量する方法であって、（ａ）ＬＤＣを含むサンプルを提供する工程であって、ここでＬＤＣは分析標的を含み、分析標的は薬物分子を含む、工程；（ｂ）サンプルに内部標準を添加する工程であって、ここで内部標準は、ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む、工程；（ｃ）ＬＤＣおよび内部標準をサンプルから抽出する工程；（ｄ）ＬＤＣおよび内部標準を１〜３０体積％の濃度のＴＦＡ水溶液と接触させる工程であって、ここでＴＦＡは、ＬＤＣから分析標的を、および内部標準から第二分析標的を放出させる、工程；ならびに（ｅ）ＬＤＣから放出された分析標的および内部標準から放出された第二分析標的の量を決定する工程であって、ここでＬＤＣから放出された分析標的の量はサンプル中のＬＤＣの量と相関する、工程を含む、方法を提供する。
【００２２】
一部の実施形態においては、ＬＤＣから放出された分析標的の量は、内部標準から放出された第二分析標的の量を用いて決定され、ここでＬＤＣから放出された分析標的の量はサンプル中のＬＤＣの抗体に共役した薬物分子の濃度と相関する。
【００２３】
一部の実施形態においては、ＬＤＣから放出された分析標的の量は、ＬＤＣの標準曲線を使用して決定される。
【００２４】
一部の実施形態においては、薬物分子はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。一部の実施形態においては、分析標的はＭＭＡＦまたはテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含む。いくつかの実施形態では、分析標的はｍｃＭＭＡＦを含む。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含み、第二分析標的は６以上の炭素および１３または６以上の重水素によって同位体標識されている。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はペグ化リンカーＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥを含む。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はＭＭＡＥを含み、第二分析標的は６以上の炭素および１３または６以上の重水素によって同位体標識されている。
【００２５】
一部の実施形態においては、ＬＤＣおよび内部標準は、１０体積％の濃度のＴＦＡ水溶液と接触させる。
【００２６】
一態様では、本発明は、サンプル中のＬＤＣ量を決定するためのキットであって、（ａ）ＬＤＣのための内部標準であって、ここで内部標準は、ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ薬物分子を含む、内部標準；および（ｂ）１〜３０体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液を含む、キットを提供する。一部の実施形態においては、内部標準は同位体標識されている。
【００２７】
別の態様では、本発明は、サンプル中のＬＤＣ量を決定するためのキットであって、（ａ）標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、ここで標識リンカー−薬物複合体は、リガンドに共役することによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド；ならびに（ｂ）１〜３０体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液を含む、キットを提供する。一部の実施形態においては、内部標準は同位体標識されている。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】２つのｍＡｂ−ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣのエクスビボ安定性プロファイルを提供する。ラットのクエン酸血漿にＡＤＣをスパイクし、サンプルを各時点で分析した。ＡＤＣをプロテインＡアフィニティー樹脂上に捕捉して、薬物は１０％ＴＦＡ水溶液を用いて放出させた。次いで、放出された薬物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。各時点は、ｔ０で観察された共役した薬物に対するパーセントを反映する。
【図２】患者サンプルからの、ＡＤＣの経時的薬物負荷の変化を示す。ｍＡｂ−ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣで治療した患者からの臨床サンプルは、３週間（ｑ３ｗ）おきに、または６週間（ｑ６ｗ）おきに分析した。プロテインＡアフィニティー捕捉、１０％ＴＦＡ媒介放出、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる薬物定量の後、サンプルは、さらにＥＬＩＳＡを使用して抗体濃度を分析した。ＴＦＡ処理はテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを放出し、放出されたテトラペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。結果は、経時的に抗体あたりの薬物としてプロットした。
【図３】ｍＡｂ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのインビボ安定性プロファイルを提供する。酸放出産物ＭＭＡＥは、記載された方法にしたがって分析し、共役した薬物の量として経時的にプロットした。
【図４】図４Ａは、抗体ＣＨ２ドメインのヒンジ領域近傍でシステインへ変換するために選択した部位をもつ、推定の分子構造を示す。部位は最初に、ＦｃとＦａｂの間のヒンジ近位にあるＦｃフラグメント上で同定された（左パネル）。これらの部位は、共結晶構造１Ｅ４Ｋに示されるようなＣＤ１６結合部位と一致する（中央パネル）。Ｆｃ、ＦａｂおよびＣＤ１６の相対的配向は、無傷抗体結晶構造１ＨＺＨの上にＣＤ１６をドッキングして生成されたモデルで見ることができる（右パネル）。図４Ｂは、鋳型として１ＨＺＨを使用して計算した変換部位の溶媒露出度を示す。図４Ｃは、分子表面に投影されたモデル化したｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ変異体について計算された静電ポテンシャルを提供する。これらの部位は、改変された共役部位近くの高い酸性または塩基性要素のいずれにも一貫した傾向を示さなかった。
【図５】タンパク質分解と質量分析によって確認された薬物共役部位を示す。野生型（ＷＴ  Ｆｃ）、改変システイン抗体（Ｓ２３９Ｃ）およびＡＤＣ（Ｓ２３９Ｃ＋薬物）は、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ（Ｅ２３３位とヒンジジスルフィド結合に対してＣ末端を切断する（図５、左））で消化し、それに続いて飛行時間質量分析法によりＦｃフラグメントを分析した。野生型ＡＤＣを消化する際、得られたＦｃフラグメントは、共役の兆候を示さない２４，０５４Ｄａの質量を有し、２３３位のＮ末端側にある全ての共役部位と一致した（最上パネル）。Ｓ２３９Ｃ抗体の消化では、セリンとシステインの間の質量差に相当する１６Ｄａ質量が追加された合計２４，０７０ＤａのＦｃフラグメントが得られた（中央パネル）。Ｓ２３９Ｃ純粋２負荷ＡＤＣの消化では９４２Ｄａ質量が追加された合計２４，９９５ＤａのＦｃフラグメントが生じ、これはセリンとシステインの質量差と薬物リンカーの追加に相当する（下部パネル）。
【図６】裸の抗体、天然４負荷ＡＤＣおよび改変システイン抗体（Ｋ３２６Ｃ、Ｅ２６９Ｃ、Ａ３２７ＣおよびＳ２３９Ｃ）のインビボ活性を示す。抗体は、単回用量１０ｍｇ／ｋｇの７８６−０異種移植実験で活性を試験した。２負荷Ｓ２３９Ｃ改変システインは、天然４負荷および全ての他の改変システイン変異体ＡＤＣより優れていた。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、血漿中のＡＤＣマレイミド安定性を表すデータを提供する。図７Ａは、抗体と薬物リンカーを共役するために使用される可逆的ミカエル付加を工程１が示す、スキームを提供する。工程２は、複合体を安定化し、薬物−リンカーの損失を回避する潜在的な加水分解反応を示す。図７Ｂは、薬物−リンカー複合体の経時的な安定性を示す。データは、ラット血漿を用いたＡＤＣ接種時の逆ミカエル反応を介した共役薬物の消失を示す。２負荷Ｓ２３９Ｃ改変システインは、天然４負荷および全ての他の改変システイン変異体ＡＤＣより安定である。各構築物についてのｔ＝０時間と比較した終了時の薬物負荷百分率を表２に示す。
【００２９】
図は、単に説明するだけの目的で本発明の種々の実施形態を表す。当業者は、本明細書に図示された構造および方法の代替実施形態が本明細書に記載した発明の原理から逸脱することなく使用し得ることは以下の説明から容易に認識するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
定義
特に断りがない限り、本明細書で使用される技術および科学的用語の全ては、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用するとき、次の用語は以下に帰せられる意味を有する。
【００３１】
「リガンド−薬物複合体」または「ＬＤＣ」は、医薬品、例えば、細胞毒性薬または細胞増殖抑制剤に共役したリガンド（例えば、抗体）を意味する。「リガンド」には、ポリマー、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、環状ペプチドおよび糖ペプチドを含むペプチド、または任意の他の細胞結合分子もしくは物質が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、リガンドは、アプタマー（オリゴヌクレオチドまたはペプチド）、ならびに種々のタンパク質、例えばインターフェロン、リンホカイン、ノッティン、アドネクチン、アンチカリン、ダルピン、アビマー、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインおよびセンチリンを含む。追加のリガンドとしては、ホルモン、成長因子、コロニー刺激因子、ビタミン、および栄養素輸送分子が含まれる。好適なリガンドとしては、例えば、抗体、例えば完全長抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。抗体はまた、二重特異性抗体および多特異的抗体を含む。
【００３２】
「抗体−薬物複合体」または「ＡＤＣ」は、抗体、抗原結合断片、または医薬品に共役したその工学変異体を指す。典型的には、抗体−薬物複合体は細胞表面の標的抗原（例えば、ＣＤ７０）に結合し、続いて細胞に抗体−薬物複合体が内在化し、その後細胞中に薬物を放出する。抗体またはその抗原−結合断片は医薬品と共有結合または非共有結合し得る。特定の実施形態では、ＬＤＣの薬物、特にＡＤＣの薬物は、リガンドまたはより具体的には抗体にリンカーを介して共役している。リンカーは一般的には、薬物への共役および化学スペーサによって分離されたリガンドへの共役から生じる残基を含む。化学スペーサは、単純に炭化水素鎖、アルケニレン（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、式中ｎは選択した整数、またはｎは２−１０である）、または１つ以上の酸素、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）、硫黄、もしくはアミノ基（例えば、ＮＨまたはＮアルキル）を含むヘテロアルケニレン鎖であり得る。リンカーは構造的により複雑であってもよく、例えば、リンカーは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）基、もしくは他の親水性基で置換されてもよく、または例えばβ−グルクロニダーゼによって脱離されるβ−グルクロニドのように基の切断がリンカーを開裂させるような開裂可能な基を含み得る。
【００３３】
リンカーは、薬物にリガンドを連結する化学種である。典型的には、ＬＤＣは２つの共役工程によって形成される。リンカー前駆体は、ほとんどの場合スペーサによって分離され、任意に置換された２つの異なる反応基を有したヘテロ二官能性種であり、最も多くは薬物分子と反応し、１つの反応基を保持するリンカー−薬物結合体を形成する。ヘテロ二官能性リンカー前駆体は、異なる反応性を有する２つの反応基の間にスペーサを含む。例えば、ヘテロ二官能性リンカー前駆体は、１つの末端にアミノ反応基および他の末端にチオール反応基を含み得る。他のより特定の例では、ヘテロ二官能性リンカー前駆体は、薬物のアミンと反応しカルバメートを形成するためのカーボネートを含み得る。他のより特定の例では、ヘテロ二官能性リンカー前駆体は、薬物のアミンと反応しアミドを形成するためのアジドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステルまたはスルホ−ＮＨＳエステル）を含み得る。そのような各アミン反応基は、選択した既知条件下でチオールとの反応用に選択されるマレイミド基をもつリンカー前駆体では対をな靜置している場合がある。薬物に共役した後、反応基の１つがリンカー−薬物複合体に残留する。
【００３４】
次いで、反応基を保持するリンカー−薬物複合体はリガンドへの薬物の共役のための試薬として使用し得る。例えば、リガンド共役試薬はリガンド上のチオール基との反応のためにマレイミド基を含むことができる。より一般的には、リガンド共役試薬はリガンド上の基との共役のために任意の好適な反応基を含むことができる。反応基は、例えばアミン基、カルボキシレート基、チオール基またはヒドロキシル基と反応し得る。
【００３５】
「分析標的」は、リガンド−薬物複合体から放出または脱離され、１つ以上の公知の分析技術、例えば質量分析によって検出または測定（定量化）される薬物またはその一部を指す。分析標的は、少なくとも薬物またはその一部を含み、さらにリンカーの一部を含み得る。分析標的の量は、分析標的が放出または脱離されてくるリガンド−薬物複合体の量を表す。より具体的には、分析標的はＬＤＣの薬物またはＬＤＣの薬物の一部である。薬物がアウリスタチンである特定の実施形態では、分析標的は薬物から放出されるテトラペプチドであり得る。
【００３６】
内部標準が使用される場合、分析標的は内部標準から放出または脱離される薬物またはその一部であり得る。典型的な実施形態では、内部標準から放出される分析標的は、リガンド−薬物複合体から放出される分析標的と、例えば、異なる分子量を持つこと、および／または標識することによって区別することができる。
【００３７】
用語「抗体」は、抗原の存在に応答して身体によって生成され、そして抗原、ならびに抗原結合断片およびその工学変異体に結合する免疫グロブリンタンパクを意味する。したがって、用語「抗体」は、例えば無傷モノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ法で生成された抗体）および抗原結合抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ディアボディ、単鎖抗体、ｓｃＦｖフラグメント、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。遺伝子学的に改変された無傷抗体および断片、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、ディアボディ、ミニ抗体、直鎖抗体、多価または多特異性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体なども含まれる。したがって、用語「抗体」は拡張的に使用され、抗体の抗原結合部位を含み、そしてその抗原に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質が含まれる。
【００３８】
「抽出する」、「抽出される」、「抽出」および「抽出している」という用語は、いくつかのタンパク質および他の分子を含む不均質サンプルからのＬＤＣまたはＡＤＣの単離を指す。不均質サンプル、特に生物サンプルからＬＤＣまたはＡＤＣを選択的に抽出することが可能な、当該技術分野で公知の適切な方法または材料は、本明細書に記載の方法に使用することができる。抽出は、例えばアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーおよび免疫沈降を含み得る。
【００３９】
リガンドまたは抗体が結合する種を含む樹脂へのＬＤＣまたはＡＤＣの結合は抽出に使用することができる。抗体結合タンパク質はＡＤＣの抽出に使用できる。例えば、サンプルからのＡＤＣの抽出は、プロテインＡカラム上でのサンプルの通過、またはサンプルとプロテインＡ樹脂との接触およびその後のサンプルからの樹脂の除去が、抗体を捕捉するために必然的に含まれ、これによってサンプルからＡＤＣが抽出し得る。ＡＤＣの表面タンパク質に関しては、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬを抽出用に使用し得る。プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬへの所定の抗体の結合のための構造的要件は、当該技術分野においては公知であり、当業者は所定の抗体と共に使用する適切な表面タンパク質をそれらから選択することができる。これらのタンパク質を使用する抽出に有用な材料には、例えば、ビーズ状アガロースまたは磁気ビーズまたはプロテインＡ、プロテインＧもしくはプロテインＬが共有結合で固定化されている類似の支持材料などの樹脂が含まれる。
【００４０】
「細胞内で開裂された」および「細胞内開裂」という用語は、リガンド−薬物複合体（例えば、抗体−薬物複合体）に関する細胞内での代謝プロセスまたは反応を指し、それによって共有結合、例えば、薬物部分とリガンドユニットの間のリンカーが壊れて、細胞内に遊離薬物または抗体から解離した他の代謝産物が生じる。したがって、薬物−リンカー−リガンド複合体の開裂部分が細胞内代謝産物である。
【００４１】
「放出する」、「放出される」、および「放出している」という用語は、本明細書に記載の酸媒介切断法によるＬＤＣからの分析標的の細胞外切断を指す。所定の数のリンカー−薬物結合体を担持（すなわち、共役）している所定のＬＤＣに関しては、一般的に、放出された分析標的の量は、放出反応に使用される酸濃度（下記参照）、反応の温度および圧力（下記参照）および用いられる反応時間によって変化するであろう。サンプルからサンプルまでの結果の一貫性に関しては、同じ酸濃度および反応条件を用いる必要がある。本明細書に記載した酸処理ではＬＤＣから全ての分析標的を放出する必要がない。必要なのは、用いられる分析方法を考慮して、分析標的の精密で正確な測定値を取得するのに十分な分析標的の量を放出することである。
【００４２】
「接触する」、「接触される」、および「接触している」という用語は、試験サンプルまたは対照サンプル（生物サンプルを含む）でもよいサンプルに酸または試薬を添加することを指し、だから、サンプルの成分は酸または試薬が利用できるように作られており、その結果反応を起こすことができる。本明細書の方法における酸添加と関連する反応は、ＬＤＣまたはより具体的にはＡＤＣからの分析標的の放出である。
【００４３】
「細胞傷害効果」は、標的細胞の枯渇、排除および／または殺傷を意味する。「細胞毒性薬」は、細胞に対して細胞傷害効果を持つことによって、標的細胞の枯渇、排除および／または殺傷を媒介する化合物を指す。当該用語は、放射性同位体（例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、６０Ｃ、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤ならびに低分子毒素または合成類縁体およびそれらの誘導体を含む細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素を含む。特定の実施形態では、細胞毒性薬は抗体に結合し、または抗体と組み合わせて投与される。適切な細胞毒性薬はさらに本明細書に記載されている。
【００４４】
「細胞毒性」は、リガンド−薬物複合体化合物またリガンド−薬物複合体の細胞内代謝産物の殺細胞、細胞増殖抑制性もしくは抗増殖効果を指す。細胞毒性は、細胞の半分が生存する単位体積当たりの濃度（モルまたは質量）である、ＩＣ５０値で表現し得る。
【００４５】
「患者」または「対象」という用語は、予防または治療処置のいずれかを受けるヒトおよび非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウスなど、そしてそれらのトランスジェニック種のような他の哺乳動物の対象を含む。
【００４６】
「標準曲線」または「検量線」という用語は、定量的な研究手法として使用されるグラフを指す。標準曲線を作成するために、既知の特性をもつ複数のサンプルを測定してグラフ化することにより、後でグラフに内挿して未知サンプルに関する同じ特性の判断が可能になる。既知特性を持つサンプルが標準であり、グラフは標準曲線である。標準曲線は、未知量の検体を含み得るサンプル中の検体の量または濃度を測定する場合に特に使用される。標準曲線単独の使用は外部標準の使用を意味する。当該技術分野では理解されるように、定量される所定の検体（すなわち、ＬＤＣ）の標準曲線は、一般にサンプル中の予想される検体の濃度範囲に広げる必要がある。再び、当該技術分野では理解されるように、標準曲線の準備に使用されるサンプルは、検体が測定される試験サンプルおよび任意の対照サンプルと同様の工程で処理される。標準曲線はまた、内部標準の使用と組み合わせて用いることができる。この場合は、内部標準の一定量（または固定量）が既知の検体濃度の標準曲線を作成するために使用される各サンプルに添加される。同じ一定量の内部標準が各試験サンプルおよび任意のブランクまたは対照サンプルに添加される。外部標準のような標準曲線（検量線）の使用、ならびにＭＳ、ＬＣ―ＭＳおよびＬＣ―ＭＳ／ＭＳ法を含む分析法による検体の定量用に内部標準を添加した標準曲線の使用との併用の詳細は当該技術分野では周知である。当業者は、本明細書で論じられた生物サンプルを含む様々なサンプル中の検体濃度の決定におけるそのような分析手法の使用方法を理解している。
【００４７】
「内部標準」は、定量される化学種（例えばＬＤＣ）と同様に選択的分析において挙動する化学種であるが、使用されている分析法での化学種とは区別できる。典型的には、内部標準は、定量される化学種と区別するために標識されるが、用いられる標識は定量される化学種の挙動と比較してその挙動に顕著に異なる影響を及ぼさない。好ましくは、定量される化学種の測定値（例えば、検体ピーク面積）に影響を及ぼすあらゆる物が同様に内部標準の測定にも影響を及ぼすであろう。定量される化学種とその内部標準の比率は、好ましくは試験サンプル中の化学種の測定値より小さいバラツキを示す。質量分析法で使用する場合、内部標準は定量される化学種とは異なる分子量を有する。
【００４８】
ほとんどの場合、重水素（２Ｈ）および炭素１３（１３Ｃ）などの安定同位体による標識が使用される。標識は、検体と内部標準の分離測定を可能にしなければならない。好ましくは、同位体標識された内部標準は、定量される化学種の分子量と少なくとも３ａｍｕ（すなわち、３個以上の２Ｈまたは１３Ｃで標識）相違する。より具体的には、標識は６ａｍｕ以上の分子量の相違をもたらす。内部標準はまた、定量される化学種のサロゲートでもあり得る。サロゲート内部標準は、例えば、水素の代わりにメチル基または他の低分子アルキルに置換、あるいはハロゲン、例えば水素の代わりにフッ素に置換するなど、原子または化学基を異なる基で置換することで定量される化学種と構造的に異なる。そのようなサロゲートは、同位体標識された内部標準を容易に得ることができない場合に特に使用し得る。
【００４９】
「決定する」、「決定される」および「決定している」という用語は、分析標的の量の測定値および１つ以上の相関因子の既知量に基づいて特定の検体の濃度または量を確認することを意味する。当該技術分野においては理解されるように、検体濃度は他の測定値の結果と結合して、検体の他の構造的および物理的特性を決定することができる。
【００５０】
商標が本明細書で使用される場合、商標は、文脈によって明らかにそうでない限り、商標の製品の製剤、ジェネリック医薬品、および医薬品有効成分（複数）を含む。
【００５１】
他の解釈上の取決め
本明細書に列挙した範囲は、記載の終点を含む範囲内の全値の省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群の任意の数字、数字の組み合わせまたは下位域を含むことが理解される。
【００５２】
他に示されない限り、１つ以上の立体中心を有する化合物への言及は、各立体異性体および全てのそれらの立体異性体の組み合わせを意図する。
【００５３】
リガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）を分析するためのアッセイ
一態様では、本発明は、サンプル中のリガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）を分析する方法であって、（ａ）ＬＤＣを含むサンプルを提供し、ここでＬＤＣはリガンドおよび分析標的を含み、分析標的は薬物分子またはその一部を含む；（ｂ）サンプルを１〜３０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、ＬＤＣから分析標的の放出を誘導する、接触させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態においては、方法は、（ａ）ＬＤＣを含むサンプルを提供し、ここでＬＤＣは分析標的を含み、分析標的は薬物分子を含む；（ｂ）サンプルに内部標準を添加し、ここで内部標準は、ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む；（ｃ）サンプルからＬＤＣおよび内部標準を抽出する；（ｄ）ＬＤＣおよび内部標準を１〜３０体積％の濃度のＴＦＡ水溶液と接触させる、ここでＴＦＡは、ＬＤＣから分析標的および内部標準から第二分析標的を放出させる；（ｅ）ＬＤＣから放出された分析標的および内部標準から放出された第二分析標的の量を決定し、ここでＬＤＣから放出された分析標的の量はサンプル中のＬＤＣ量と相関する工程を含む。
【００５４】
リガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）を含むサンプル
本発明は、サンプル中のリガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）を分析する方法を提供する。ＬＤＣはリガンドおよび分析標的を含む複合体である。分析標的は、薬物分子またはその一部を含む。ＬＤＣまたはＬＤＣを含むと思われている種々のサンプルは、本明細書で提供される方法を使用して分析にかけることができる。具体的には生物サンプルを分析できる。
【００５５】
サンプル
生物または非生物サンプル中のＬＤＣは本明細書で提供される方法によって分析することができる。好ましい実施形態において、サンプルは哺乳動物対象に由来する生物サンプルである。具体的には、一部の実施形態において、生物サンプルは以下の血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿の１つから得られている。
【００５６】
一部の実施形態においては、サンプルはインビボでＬＤＣと接触させた生物サンプルである。例えば、サンプルは、ＬＤＣに曝露された対象に由来する生物サンプルの場合がある。一部の実施形態においては、サンプルはＬＤＣの投与後の一定時点で得られる。一部の実施形態においては、サンプルはＬＤＣの投与後の複数の時点で得られる。一部の実施形態においては、サンプルはＬＤＣの投与前に得られる。
【００５７】
一部の実施形態においては、サンプルはエクスビボでＬＤＣと接触させた生物サンプルである。一部の実施形態においては、サンプルは一定期間、ＬＤＣと接触させる。一部の実施形態においては、ＬＤＣと異なる期間接触させた多数のサンプルを分析にかける。一部の実施形態においては、サンプルはＬＤＣへの曝露前に得られる。
【００５８】
リガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）
リガンド
一部の実施形態においては、リガンドは標的分子に対して特異的親和性を有しているタンパク質である。一部の実施形態においては、リガンドは抗体である。有用なポリクローナル抗体は、免疫動物の血清に由来する抗体分子の不均質集団である。有用なモノクローナル抗体は、特定の抗原決定基（例えば、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化学物質、核酸、またはそれらの断片）に対する抗体の均質集団である。対象抗原に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、連続細胞株の培養によって抗体分子を生産する当該技術分野で公知の任意の技術を用いて調製することができる。
【００５９】
有用なモノクローナル抗体としては、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラヒト−マウス（または他種）モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、完全長抗体およびそれらの抗原結合断片を含む。ヒトモノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の多数の任意の技術によって作成し得る（例えば、Ｔｅｎｇら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８０：７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２−７９；およびＯｌｓｓｏｎら、１９８２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３−１６）。
【００６０】
抗体は、標的細胞（例えば、がん細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原）に免疫特異的に結合する抗体または腫瘍細胞もしくは基質に結合した他の抗体の機能的活性断片、誘導体もしくは類似体であり得る。この関連で、「機能的活性」とは、断片、誘導体または類縁体が、抗体からこれらが誘導されるその抗体と同じ抗原を認識する抗イディオタイプ抗体を引き出すことができることを意味する。具体的には、例示的な実施形態において、免疫グロブリン分子のイディオタイプ抗体の抗原性は、抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列のＣ末端であるフレームワークおよびＣＤＲ配列の欠失によって強めることができる。どのＣＤＲ配列が抗原に結合するかを決定するために、ＣＤＲ配列を含む合成ペプチドが、当該技術分野において公知の任意の結合試験法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）を用いた抗原との結合アッセイに使用できる。（Ｋａｂａｔら、１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｋａｂａｔ  Ｅら、１９８０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２５（３）：９６１−９６９を参照されたい）。
【００６１】
他の有用な抗体としては、例えば、これらに限定されないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖｓ、単鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｖなどの抗体の断片、または抗体と同じ特異性を有した任意の他の分子などが含まれる。
【００６２】
さらに、例えば、標準組み換えＤＮＡ技術を使用して作成し得るヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組み換え抗体は有用な抗体である。キメラ抗体は、分子の異なる部分が異なる動物種に由来する、例えばマウスモノクローナルに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である（例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号および米国特許第４，８１６，３９７号を参照）。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有するからの非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の組み換えＤＮＡ技術、例えば、参照によりそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ８７／０２６７１：欧州特許公開０１８４１８７：欧州特許公開０１７１４９６：欧州特許公開０１７３４９４：国際公開ＷＯ８６／０１５３３：米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許公開０１２０２３：Ｂｅｒｔｅｒら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３：Ｌｉｕら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３：Ｌｉｕら、１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６：Ｓｕｎら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７，Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５：Ｗｏｏｄら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：４４６−４４９：およびＳｈａｗら、１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２−１２０７：Ｏｉら、１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４：米国特許第５，２２５，５３９号：Ｊｏｎｅｓら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５：Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４：およびＢｅｉｄｌｅｒら、１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載された方法を使用して作ることができる。
【００６３】
完全ヒト抗体は特に望ましく、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現する能力はないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して生産することが可能である。
【００６４】
抗体としては、共有結合により抗体が抗原結合免疫特異性を保持することが可能になる限り、すなわち、そのような任意の分子種の共有結合によって改変される類似体および誘導体がいずれも含まれる。例えば、限定するためではないが、抗体の誘導体および類似体としては、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／妨害基、タンパク質分解的切断、細胞抗体ユニットまたは他のタンパク質への連結などによってさらに修飾されているものが含まれる。任意の多数の化学修飾は、これらに限定されないが、特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン存在下での代謝合成などを含む公知技術によって行うことができる。さらに、類似体または誘導体は１つ以上の非天然アミノ酸を含むことができる。
【００６５】
抗体は、Ｆｃ受容体と相互作用するアミノ酸残基に修飾（例えば、置換、欠失または付加）をもつ場合がある。特に、抗体は、抗ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体の間の相互作用に関与するとして同定されたアミノ酸残基に修飾をもつことが可能である（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ９７／３４６３１を参照）。
【００６６】
がん細胞抗原に対して免疫特異的な抗体は市販されており、または、例えば化学合成もしくは組み換え発現技術のように当業者に公知の任意の方法によって作成できる。がん細胞抗原に免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースまたは類似のデータベース、公表文献から、または定常クローニングおよびシーケンシングによって入手することができる。
【００６７】
特定の実施形態においては、有用な抗体は、活性化リンパ球上で発現した受容体または受容体複合体に結合することができる。受容体または受容体複合体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパクを含み得る。適切な免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバーの非限定的な例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２Ｏ、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、およびＩＣＯＳである。適切なＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの非限定的な例は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテグリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、およびＡＰＯ−３である。適切なインテグリンの非限定的な例は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３、およびＣＤ１０４である。適切なレクチンの非限定的な例は、Ｃ型、Ｓ型およびＩ型レクチンである。
【００６８】
一部の実施形態においては、リガンドは受容体リガンドである。受容体リガンドは、特定の細胞型、組織または器官に豊富な結合パートナーを有し得る。リガンドは、受容体の自然発生アゴニストもしくはアンタゴニスト、または受容体に対して親和性を有する合成分子の場合がある。受容体リガンドは、タンパク質、核酸または、例えばペプチド、ビタミンおよび炭水化物などの他の受容体リガンドの場合もある。一実施形態において、リガンドは葉酸受容体に対して親和性を有する葉酸である。
【００６９】
一部の実施形態においては、リガンドは薬物が標的器官または組織を標的にするために使用、開発されてきたターゲティング部位である。当該技術分野で公知のそのような部位特異的リガンドを使用して、そして本明細書で提供される方法に用いることができる。
【００７０】
薬物
ＬＤＣの薬物は、細胞毒性、細胞増殖抑制性また免疫抑制剤として本明細書で言及している任意の細胞毒性、細胞増殖抑制性また免疫抑制薬にもすることができる。薬物は、リンカーを含む試薬前駆体の適切な反応基、例えばアミノ基、カルボン酸基、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、またはアルデヒドもしくはケトン基と結合を形成し得るアミノ、アルキルアミノ基またはカルボキシレートのような官能基を有する。一実施形態において、薬物はリンカーに結合してアミドまたはカルバメートを生成する。一実施形態において、薬物はアミド結合によってリンカーに結合する。一実施形態において、薬物は単一のアミド結合を含む。一実施形態において、薬物はカルバメートによってリンカーに結合し、そして薬物はアミド結合を含む。特定の実施形態では、ＴＦＡ処理は、リンカーへのアミド結合または薬物の内部アミド結合の切断によって薬物またはその一部を放出させる。
【００７１】
細胞毒性または免疫抑制剤の有用なクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、ＤＮＡ副溝結合体、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、モノ白金、ビス白金、三核白金錯体およびカルボプラチンなどの白金錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、ふっ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、予備成形化合物、プリン抗代謝物、プロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼＩ抑制剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。特に有用な細胞毒性薬クラスは、例えば、ＤＮＡ副溝結合体、ＤＮＡアルキル化剤およびチューブリン抑制剤を含む。例示的な細胞毒性薬としては、例えば、アウリスタチン、カンプトセシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシンおよびメイタンシノイド（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）ならびにビンカアルカロイドが挙げられる。薬物を含む選択ベンゾジアゼピンは、ＷＯ２０１０／０９１１５０、ＷＯ２０１２／１１２７０８、ＷＯ２００７／０８５９３０、およびＷＯ２０１１／０２３８８３に記載されている。
【００７２】
例示的な実施形態においては、薬物は１つ以上、２つ以上、３つ以上または４つ以上のアミノ酸基を含むペプチド性薬物である。例示的な実施形態においては、薬物は、Ｎ末端、Ｎ−メチル化アミノ酸基を含むペプチド性薬である。さらなる例示的な実施形態においては、薬物は、Ｎ末端、アルキル側基を有するＮ−メチル化アミノ酸を含むペプチド性薬である。さらなる例示的な実施形態においては、薬物は、Ｎ末端、Ｎ−メチル化アラニン、Ｎ−メチル化イソロイシン、Ｎ−メチル化ロイシンまたはＮ−メチル化バリンを有するペプチド性薬である。さらなる例示的な実施形態においては、薬物は、Ｎ末端、Ｎ−メチル化バリンを有するペプチド性薬である。
【００７３】
好ましい実施形態では、薬物はアウリスタチンである。アウリスタチンは、これらに限定されないが、ＡＥ、ＡＦＰ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＭＭＡＦおよびＭＭＡＥを含む。アウリスタチンの合成および構造は、あらゆる目的のために参照によりそれぞれの全部が本明細書に援用される米国特許公開第２００３−００８３２６３号、第２００５−０２３８６４９号、第２００５−０００９７５１号、第２００９−０１１１７５６号、および第２０１１−００２０３４３号：国際特許公開ＷＯ０４／０１０９５７、国際特許公開ＷＯ０２／０８８１７２、および米国特許第７，６５９，２４１号および第８，３４３，９２８号に記載されている。本発明の例示的なアウリスタチンはチューブリンに結合し、所望の細胞株上に細胞毒性または細胞増殖抑制効果に与える。一実施形態において、例示的なアウリスタチンはＮ−末端、Ｎ−メチル化アミノ酸を含む。より具体的には、例示的なアウリスタチンは、Ｎ−末端Ｎ、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリンなどのアルキル側鎖を有するＮ−メチル化アミノ酸を含む。さらに具体的には、例示的なアウリスタチンはＮ−末端、Ｎ−メチル化バリンを含む。
【００７４】
他の個別の細胞毒性薬または免疫抑制剤としては、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カリケアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、ダカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メイタンシン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、パリトキシン、プリカマイシン、プロカルバジン、リゾキシン、ストレプトゾトシン、テニポシド、６−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ−１６およびＶＭ−２６が挙げられる。
【００７５】
好適な細胞毒性薬としては、ＤＮＡ副溝結合体（例えば、エンジインおよびレキシトロプシン、ＣＢＩ化合物；米国特許第６，１３０，２３７号を参照）、デュオカルマイシン（米国公開第２００６００２４３１７号を参照）、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、ディスコデルモライド、エリュテロビン、およびミトキサントロンも含まれる。
【００７６】
抗チューブリン剤の例としては、これらに限定されないが、タキサン（例えば、タキソール．ＲＴＭ．（パリタキセル）、タキソテール．ＲＴＭ．（ドセタキセル））、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルセミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモライド、およびエリュテロビンが挙げられる。メイタンシンおよびメイタンシノイドは抗チューブリン剤の別のグループである（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉら、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１および米国特許第８，１６３，８８８号を参照）。
【００７７】
例示的なアウリスタチン薬剤は、次式またはそれらの薬剤的に許容できる塩を有し、式中の波線はリンカーに結合する部位を示す：
2021504695.tif 000003
（モノメチルアウリスタチンＦ）、および
2021504695.tif 000004
（モノメチルアウリスタチンＥ）
。
【００７８】
リンカーを介したリガンドへの結合のための別のアウリスタチン薬剤は、次式またはそれらの薬剤的に許容できる塩を有し、式中の波線はリンカーに結合する部位を示す：
2021504695.tif 000005
。
【００７９】
ＬＤＣの調製に有用な、そして具体的にはＡＤＣの調製に有用な追加的細胞毒性化合物は、米国特許第６，８８４，８６９号に記載されたものであり、特に細胞毒性化合物の記載に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書における追加的な記載は、記載された細胞毒性化合物をもった薬物複合体の調製を説明する。
【００８０】
リンカー
薬物をリンカーに結合するための一般的手順は当該技術分野では公知である。例えば、米国特許第８，１６３，８８８号、第７，６５９，２４１号、第７，４９８，２９８号、米国公開ＵＳ２０１１０２５６１５７、ならびに国際出願ＷＯ２０１１０２３８８３およびＷＯ２００５１１２９１９を参照されたい。
【００８１】
リンカーは細胞内条件下で開裂可能であり、例えば、リンカーの開裂が細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）でリガンドから治療薬を放出する。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーの場合がある。細胞内開裂剤としては、カテプシンＢとＤおよびプラスミンを含めることができる（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３，１９９９を参照）。例えば、がん組織で高発現するチオール依存性プロテアーゼカテプシンＢによって開裂可能なペプチドリンカーを使用することができる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＶａｌ−Ｃｉｔペプチドを含むリンカー）。リンカーはまた、細胞内グリコシダーゼによって切断される糖リンカー（例えば、グルクロニダーゼによって開裂可能なグルクロニドリンカー）を含む炭水化物リンカーであり得る。
【００８２】
リンカーはまた、硫黄（チオール）を介してリガンドに結合し、抗体のタンパク質分解によって放出されるマレイミド−アルキレンリンカーまたはマレイミド−アリールリンカーなどの非開裂性リンカーとすることができる。
【００８３】
抗体は、例えば、抗体のアミン基（例えば、Ｎ末端アミノ基またはリシンのようなアミノ酸側基のアミン基）、チオール基（−ＳＨ、例えばシステイン残基のもの）、カルボキシレート（例えば、Ｃ末端カルボキシレート、またはグルタミン酸のようなアミノ酸側鎖のもの）またはヒドロキシ基（例えば、セリン残基）を介するなど、任意の適切な反応基を介して１つ以上のリンカーに共役することができる。
【００８４】
例示的なＡＤＣにおいては、モノメチルアウリスタチンＥはプロテアーゼ開裂ペプチドリンカーを介して抗体へ共役しており、モノメチルアウリスタチンＦはリンカーマレイミドカプロン酸（ｍｃ）を介して抗体に共役する。リンカーは、さらに溶解度または薬物動態を調節する化学基を含み得る。例えば、例示的なリンカーはペグ化されている。特定の例示的リンカー−薬物結合体は、
2021504695.tif 000006
ｍｃ−ＭＭＡＦであり、式中、リンカーのマレイミド基はリガンドそして特に抗体のチオール基と反応する；あるいは
2021504695.tif 000007
ＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥであり、式中、リンカーはペグ化されており、そしてグルクロン酸（グルクロニダーゼによって開裂可能）を含み、リンカーのマレイミド基はリガンドのチオール基と反応し得る。上記のリンカー薬物結合体を含むＬＤＣにおいては、本明細書に記載した酸処理がｍｃ−ＭＭＡＦからテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（この場合Ｄａｐはドラプロリンである）、およびＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥからＭＭＡＥ薬物全体を放出させる。ＬＤＣおよびＡＤＣのための内部標準は、例えばリンカー−薬物結合体の標識によって調製が可能であり、ここで標識は本明細書に記載された酸による処理で放出される。ｍｃ−ＭＭＡＦに共役したＬＤＣおよびＡＤＣの例示的な内部標準としては、放出されたテトラペプチド中で重水素化または１３Ｃによって標識されたものが含まれる。ｍｃ−ＭＭＡＦに共役したＬＤＣおよびＡＤＣの例示的な内部標準としては、重水素化または放出されたＭＭＡＥ中の１３Ｃによって標識されたものが含まれる。上記構造において、１３Ｃまたは重水素化が予想される部位は「＊」で示される。
【００８５】
本明細書の定量法は、一般に本明細書で分析標的として指定したＬＤＣの断片の放出を採用しており、これがＬＤＣ全体を代表して分析標的が定量される。分析標的の定量により、放出された分析標的の量、サンプル中のＬＤＣ中の分析標的の量および／またはサンプル中のＬＤＣの量の測定が可能となる。何かの判断においては、適切な公知方法によって、サンプル中のリガンド量を知り、または決定すること、あるいは、所定のＬＤＣに共役する薬物分子数（または平均数）を知り、または決定することが必要である。さらに具体的には、本明細書の分析標的はＬＤＣの薬物分子またはＬＤＣの薬物分子の一部である。薬物はリンカー種によってＬＤＣのリガンドに共役しているため、分析標的は薬物またはその一部に加えてリンカー全体またはその一部も含み得る。特定の実施形態において、本明細書の分析標的はＬＤＣに共役する薬物である。特定の実施形態において、本明細書の分析標的はＬＤＣに共役する薬物の一部である。本明細書の特定な実施形態では、薬物はペプチドまたはその誘導体であり、そして分析標的はペプチド薬物またはペプチド薬物のペプチド部分である。特定の実施形態において、薬物がペプチドまたはその誘導体である場合、分析標的は、ジペプチドもしくはその誘導体、トリペプチドもしくはその誘導体、またはテトラペプチドもしくはその誘導体である。
【００８６】
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって媒介される開裂
本発明の方法は、１〜３０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液とサンプルを接触させて、ＬＤＣから分析標的の放出を誘導する工程を含む。ＴＦＡのアセトニトリル溶液も用いることができる。
【００８７】
用いるＴＦＡ濃度は、１〜２０％、１〜１０％、２．５〜３０％、２．５〜２０％、２．５〜１０％、５〜１５％、７〜１３％、９〜１１％、または９．５〜１０．５％の体積百分率の場合があり、全範囲が包括される。ＴＦＡ濃度は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、または約３０％の全体積百分率である。好ましい実施形態では、ＴＦＡは１０体積％である。
【００８８】
ＴＦＡ濃度は水中、サンプル混合物中または任意の他の許容可能な溶媒中への１００％ＴＦＡの希釈結果とし得る。ＴＦＡは、サンプルに添加する前に希釈してもよく、またはサンプル混合物自体を希釈してもよい。
【００８９】
ＴＦＡ反応は、可変の時間および温度条件下で行い得る。例えば、反応は２０〜８０℃、例えば約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃で行い得る。
【００９０】
ＴＦＡ反応は、典型的には周囲圧力で行われる。有意な圧力損失がなく、そのような反応で反応圧力を変えることができることは当業者には自明であろう。圧力の変化は温度の変化を要件とし得ることは自明であろう。高圧下で実施される反応ではより低い反応温度を使用することができる。酸の濃度、反応時間および反応温度は、分析標的の所望の放出レベルを達成するために反応圧力と共に本明細書に記載した範囲内で変更し得る。
【００９１】
反応は、約１２〜２４時間、１０〜２０時間、または１５〜１７時間の期間実施し得る。しかしながら、選択した分析方法が所望の確度と精度の測定値を与えることを可能にする酸濃度、温度、時間、および圧力の任意の組み合わせを使用し得る。他の箇所でも述べられているように、所定の実験または定量の結果の一貫性に関しては、所与の実験または定量化用の全試験サンプル（未知）、全対照群および全較正用サンプルに対して用いられる反応条件は同じにする必要がある。例示的な一実施形態において、開裂反応は７０℃および周囲圧力でＴＦＡ１０％を用いて約１６時間行った。
【００９２】
これらに限定されないが、例えば、他のフッ素化酸、有機または無機酸などのその他の酸が記載した方法で使用し得る。具体的な代替酸としてはトリフルオロメタンスルホン酸が含まれる。揮発性の酸は一般に塩酸などの無機酸の方が好ましい。
【００９３】
分析標的の測定
一部の実施形態においては、方法はサンプル中の分析標的を測定する工程をさらに含む。サンプルで遭遇することが予想される濃度範囲で分析標的の定量に適した分析方法を使用することができる。
【００９４】
一部の実施形態においては、ＬＤＣまたは内部標準は分析標的の測定前にサンプルから抽出される。分析標的は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって収集が可能である。一部の実施形態においては、ＬＤＣまたは内部標準は、リガンドとして抗体または機能性断片を含む。これらの場合、ＬＤＣまたは内部標準は、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂およびプロテインＬ樹脂から選択される樹脂とサンプルを接触させることによって収集できる。
【００９５】
一部の実施形態においては、分析標的は、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を使用して検出し定量化される。より具体的には、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）が使用される。ＭＳ／ＭＳ法では、分析標的の選択した親イオンの１つ以上のフラグメントイオンが観察された。最初のＭＳ段階で、当該技術分野で公知のように分析標的の親イオンを選択し、そして親イオンをフラグメンテーション、典型的には衝突誘起フラグメンテーションにかけて、例えば、質量関数（ｍ／ｚ）としてイオン電流ピークを生成させる各フラグメントと関連するイオン電流の測定によって定量が可能な１つ以上のそれぞれのフラグメントイオンを生成させる。親イオンおよび１つ以上のそのフラグメントイオンが由来する化学種の定量のためにフラグメントの積分ピーク面積を測定できる。本明細書に記載の分析標的の測定への適用では１つ以上のフラグメントが、放出された分析標的の親イオンに由来する。
【００９６】
本明細書に記載の分析標的の定量に任意のＭＳ／ＭＳ法を使用できるが、トリプル四重極または四重極イオントラップを用いる方法がより一般的に使用される。本明細書の方法に使用される質量分析計は、サンプルの質量スペクトル全体または、より典型的には対象の質量スペクトルの選択部分を観察するように操作し得る。特に、ＭＳ／ＭＳ法においては、選択した親イオンの１つ以上のフラグメントイオンからの信号（例えば、イオン電流）を監視し得る。選択反応モニタリング（ＳＲＭ）操作を用いて選択親イオンから生成された単一断片イオンを観察することができる。あるいは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）操作を用いて選択親イオンから生成された１つ以上のフラグメントイオンを観察することができる。用語のフラグメントイオンの使用は、選択したイオンの解離またはフラグメンテーションによりＭＳ／ＭＳで生成されるイオンに関連する。方法は、当該技術分野では公知であり、一般に、フラグメントイオンおよびフラグメントイオンではない他の生成イオンを含むプロダクトイオンをより多く生成する選択親イオンの反応を伴う検体の定量に有用であることが理解されよう。そのような全プロダクトイオンを生成するＭＳ／ＭＳ法は、本明細書に記載の方法で類似的に用いることができる。
【００９７】
一部の実施形態においては、様々なサンプル中の分析標的の定量用に適した液体クロマトグラフィー法が使用される。
【００９８】
一部の実施形態においては、方法は、外部標準として標準曲線（検量線）の使用、およびＭＳ、ＬＣ―ＭＳ、ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ法による検体の定量用に内部標準を添加した標準曲線の使用の併用を含む。一部の実施形態においては、標準曲線を使用して、本明細書で論じた生物サンプルを含む、様々なサンプル中の検体の濃度を決定することができる。具体的には、内部標準からの検体量を使用してＬＤＣから検体量を決定することができる。特定の実施形態においては、内部標準からの検体量を使ってＬＤＣからの検体量の決定用の標準曲線を作成する。それらの実施形態において、内部標準からの検体およびＬＤＣからの検体は標識によって区別が可能である。
【００９９】
濃度アッセイ
一部の実施形態においては、方法はサンプル中のＬＤＣの濃度を決定する工程をさらに含む。本発明はまた、サンプル中のＬＤＣ中のリガンドに共役する薬物の濃度を決定する方法を提供する。
【０１００】
定量分析は、好ましくはアッセイ内の較正を含む。標準曲線は、例えばＬＤＣの濃度を増やした一連の少なくとも６つのサンプルを調製することで作成できる。内部標準を標準曲線サンプルに添加し、次いでサンプルをプロテインＡおよび上述のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法によって処理する。各標準のピーク面積を内部標準について得られたピーク面積で割り、そして得られたピーク面積比を標準濃度の関数としてプロットする。一部の実施形態においては、少なくとも６つのデータポイントを、例えば線形回帰分析を使って曲線に当て嵌める。
【０１０１】
安定性アッセイ
一部の実施形態においては、方法を使用してＬＤＣの安定性を決定する。
【０１０２】
１つの例示的アッセイにおいては、ＬＤＣを滅菌血漿に置いて、３７℃で保温静置した。保温静置の開始時点と１時間〜１週間以上の様々な時点で、一定分量を取り出し、−８０℃で凍結させる。当該時点の終了後に、サンプルは、リガンドおよび共役薬物を特異的に抽出するタンパク質精製法にかけた。例えば、抗体−薬物複合体は、プロテインＡアフィニティー樹脂に流して抗体を捕捉してもよく、そしてその後、樹脂を緩衝液で洗浄する。リガンド−薬物複合体の捕捉後、１−３０体積％のトリフルオロ酢酸で処理することで捕捉したリガンドから薬物が放出される。放出された薬物は、次いで標準ＬＣ−ＭＳ法で定量が可能であり、保温静置前のアリコートについて測定された薬物の量で除した各時点で測定した薬物の量を使って、各時点でリガンドに共役したまま残っている薬物の百分率を決定することができる。本アッセイの精度は、同じ薬物−リンカーの同位体標識版を用いて調製される内部標準リガンド−薬物複合体を含めることによって、例えば、それから放出される薬物は、質量差によって試験薬物−リンカーから放出される薬物からＬＣ−ＭＳアッセイで独立して検出できる。この同位体標識内部標準リガンド−薬物複合体は、リガンド捕捉工程（例えば、プロテインＡ）の直前に等量で各サンプルに添加される。ＬＤＣから放出された薬物または薬物の一部の定量は、次いで内部標準を使って従来型液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法によって行う。薬物動態アッセイに使用する質量分析法は当該技術分野では公知である。（例えば、Ｗａｎｔら、Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  １７：６８１−６９１（２００３）；Ｏｋｅｌｅｙら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６：８８８−８９７（２０１０）；Ｓｉｎｇｈら、ＤＭＤ（２０１７）；Ａｌｌｅｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９：７５９−７６５（２００８）を参照されたい）。
【０１０３】
他の実施形態では、ＬＤＣが対象に投与され、ＬＤＣの投与後の異なる時点で対象からサンプルを取得する。多数のサンプルを、ＬＤＣからの分析標的の測定に関して本明細書で提供される方法にかける。一部の実施形態においては、内部標準はＬＤＣと一緒に投与される。サンプル中のＬＤＣの量を比較し、それを使用して経時でＬＤＣの安定性を決定できる。
【０１０４】
一部の実施形態においては、ＬＤＣがエクスビボでサンプルに添加される。サンプルは、ＬＤＣの添加後の種々の時点の後に収集される。多数のサンプルを、ＬＤＣからの分析標的の測定に関して本明細書で提供される方法にかける。一部の実施形態においては、内部標準はＬＤＣと一緒にサンプルに添加される。サンプル中のＬＤＣの量を比較し、それを使用して経時的にエクスビボでＬＤＣの安定性を決定できる。
【０１０５】
他のアッセイ
本明細書で提供される方法を使用し、リガンドあたりの薬物の平均数を決定できる。例えば、リガンドあたりの薬物の平均数は、本明細書に記載した方法によって得られたリガンド共役薬物の濃度をリガンドの濃度で割ることによって測定できる。
【０１０６】
他の実施形態においては、本明細書に記載した酸媒介開裂法および関連分析法は、サンプル中のＬＤＣの量の決定、またはＬＤＣに共役した薬物の量の決定に依存する様々な実験に使用が可能である。本明細書の方法は、例えば、疾患または障害の治療用臨床薬の開発の背景においてＬＤＣからの薬物の放出動態の決定に使用できる。本明細書の方法はまた、ＬＤＣの薬物動態の試験に使用可能である。本明細書の方法を使用し、臨床応用におけるＬＤＣの使用を評価できる。
【０１０７】
キット
別の態様では、サンプル中のＬＤＣの測定またはＬＤＣに共役した薬物量の測定のためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載したアッセイの実行に有用な１つ以上の化学物質および一般的には１つ以上の化学成分を含む。キットには、典型的には、一緒に包装された別々の容器に選択された量で異なる化学成分が提供され、そしてアッセイを実行するための取扱説明書が含まれる場合がある。所定のキット内の化学成分の量は、一般的に各キットに対して選択されたアッセイ数を実行するための選択された量で提供される。例えば、各キットは、１つのアッセイを実行するために設計される場合があり、その結果、与えられたアッセイの全工程を実行するのに十分な量の全化学種が提供される。キットはまた、アッセイを実行するのに必要な試薬または溶剤を供給する場合がある。キットは、例えば、サンプルから所定のＬＤＣまたはＬＤＣの一種を抽出するための試薬を提供できる。一実施形態では、本明細書のキットは、任意のＡＤＣを含む任意の所定のＬＤＣに対して適切に標識された内部標準を含む。キットの内部標準は、標識が薬物中に配置されている同位体標識ＬＤＣとすることができる。そのようなキットはまた、標準曲線の調製用の未標識ＬＤＣを含み得る。
【０１０８】
別の実施形態では、キットは、任意の選択抗体を含む任意の選択リガンドを、リンカーおよび薬物に共役させるための反応基を含有する標識リンカー−薬物結合体を含む試薬を含む。より具体的には、試薬が薬物または薬物の一部で標識されるため、分析標的の放出時に標識が分析標的と共に放出される。キットはさらに、選択リガンドまたは抗体との共役を実行するための試薬または溶媒を含む場合がある。キットはまた、未標識ＬＤＣの調製のための未標識リンカー−薬物試薬を含み得る。キットはさらに、未標識または標識分析標的、例えば酸処理によって放出される薬物または薬物の一部を含み得る。特定の実施形態において、キットは、Ｌ−ｍｃ−ＭＭＡＦまたはＬ−ＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥの測定用の内部標準として役立つ、任意の選択リガンドまたは抗体に共役する同位体標識ｍｃ−ＭＭＡＦまたは同位体標識ＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥを含む。そのようなキットは臨床用途に適したＬＤＣの開発のための研究支援として使うことができる。そのようなキットはまた、患者に負荷しているＬＤＣまたはＬＤＣ薬の監視に必要な臨床応用に使用することができる。
【０１０９】
一部の実施形態においては、キットは、リンカー−薬物結合体を共役するための一対の試薬、そして単一の共役反応に必要な試薬に加えて別包装でリガンドも含み得る。キットは、反応を実行するための溶媒または緩衝液、そして使用説明書を含む場合があり得る。リガンドと薬物−リンカーの結合方法は当該技術分野では公知である。（例えば、Ｌｙｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５２，ｐｇｓ．１２３−１３８，２０１２；Ｓｕｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１６：１２８２−１２９０，２００５を参照されたい）。内部標準および試薬は安定または不安定同位体によって同位体標識されている。安定同位体としては、これらに限定されないが、２Ｈ、１３Ｃ、および１５Ｎが含まれる。放射性同位体または不安定同位体としては、これらに限定されないが、３Ｈ、１４Ｃ、および１２Ｎが含まれる。
【０１１０】
あるいは、内部標準は、異なる分子量を付与するが、同位体標識をしない構造修飾によってＬＤＣから区別し得る。例えば、内部標準は、分析標的のある位置に水素の代わりにメチル基またはハロゲンを含み得る。これは、分子量を変化させるが、内部標準がＴＦＡと反応する仕方は実質的に変えない効果がある。当該技術分野では理解されているように、使用される所定の検体用の任意の内部標準は、所定の分析方法で検体として挙動するのを確実にするために評価されなければならない。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は例示のために提供されており、限定するためではない。
【０１１２】
実施例１：アッセイ法
実験サンプル、キャリブレータおよび内部標準（ＩＳ）の調製
１．ＡＤＣキャリブレータの希釈物は、下記濃度の抗体結合薬物（ＡＤＣ）でサンプル基質（例えば、緩衝液、血漿など）に調製した。
ａ．８点の検量線：１０μＭ、４μＭ、１．６μＭ、６４０ｎＭ、２５６ｎＭ、１０２．４ｎＭ、４１ｎＭ、１６．４ｎＭのＡＤＣ等量。
ｂ．ブランクを含めた（ＡＤＣなし、サンプル基質のみ）
２．ＡＤＣ内部標準（「ＩＳ」）の希釈は、５００ｎＭのＡＤＣ等量の単一濃度でサンプル基質に調製した。
３．一定体積のＡＤＣ  ＩＳを、一定体積の各キャリブレータまたは未知サンプルと合わせて、最終体積を２５０μｌ〜１０００μｌの範囲とした。
【０１１３】
ＡＤＣキャリブレータとＩＳの設定濃度（工程１と２）およびＩＳをＡＤＣキャリブレータおよびサンプルと混合した後の最終体積（工程３）は、実験ごとに変化する；これらの値は分析対象のＡＤＣにも依存する；この方法は広範囲の用途に適合する。
【０１１４】
９６ウェルフィルタープレートの調製
プロテインＡアガロースＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケア）は、１部のアガロース樹脂対３部の緩衝材のスラリー比で緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に平衡化した。
【０１１５】
スラリー（２００μｌ樹脂）の８００μｌをフィルタープレートに添加し、４℃で５分間、１２５０ｘｇで遠心分離し、水相を除去した。
【０１１６】
このポイント以降の各遠心分離工程について、９６ウェルポリプロピレン製２ｍｌ希釈ブロックを使用して、緩衝材、サンプルおよびキャリブレータ流体、洗浄水および溶出体積を収集した。
【０１１７】
サンプル捕捉と溶出
１．２００μｌのＡＤＣキャリブレータ（＋ＩＳ）と実験サンプル（＋ＩＳ）を２００μｌのプロテインＡ樹脂に加えて振とうした（１時間、４℃、約１０００ｒｐｍ）。
２．プレートを４℃で５分間、２０００ｘｇで遠心分離し、サンプル基質を除去した。
３．洗浄緩衝液を加えて（１Ｘ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４；２００〜４００μｌ）、４℃で５分間、２０００ｘｇで遠心分離し、サンプル基質の除去を完了した。
４．洗浄工程は、溶出前に１〜３回行った。
５．樹脂からＡＤＣを溶出するために２００μｌのＩｇＧ溶出緩衝材（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、プレートを振とう機に置いた（１時間、４℃、約１０００ｒｐｍ）。
６．プレートを４℃で５分間、２０００ｘｇで遠心分離し、ＡＤＣ／ＩＳを溶出した。
７．工程４と５を繰り返して樹脂からＡＤＣ／ＩＳの溶出を完了した。溶出したＡＤＣ／ＩＳを１つにまとめた最終容積は４００μｌであった。
【０１１８】
サンプル処理
１．ＡＤＣ／ＩＳキャリブレータおよびサンプル（ＩｇＧ溶出緩衝液中）を６０℃で４時間、窒素ガス下またはプレートが乾燥するまで蒸発させた。
２．４００μｌの１０体積％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（水希釈）を加えて、プレートをテフロン（商標）被覆シリコンプレートマットで密封した。
３．密封したプレートをジャケット付きサーモミキサーに配置し、一晩温置した（７０℃で約１６時間、約６００〜８００ｒｐｍ）。
４．プレートを４℃で５分間、２０００ｘｇで遠心分離し、凝縮沈降させた。
５．ＡＤＣ／ＩＳキャリブレータおよびサンプル（１０体積％ＴＦＡ中）を４０℃で４時間、窒素ガス下またはプレートが乾燥するまで蒸発させた。
６．５００μｌの氷冷１００％ＭｅＯＨを加えて、プレートをプレートシーラーで覆い、振とう機上に置いた（４℃で２０分間、約１０００ｒｐｍ）。
７．プレートを４℃で５分間、４０００ｘｇで遠心分離し、デブリを沈降させた。
８．容積５００μｌの４００μｌをオートサンプラープレートに移した。
９．ＡＤＣ／ＩＳキャリブレータおよびサンプル（１００％ＭｅＯＨ中）をプレートが乾燥するまで４０℃、窒素ガス下で蒸発させた。
１０．サンプルは、０．１％ギ酸（ＦＡ）中の９５／５ＣＨ３ＣＮ（アセトニトリル、ＣＡＮ）／Ｈ２Ｏの１０００μｌまたは０．１％ＦＡ中の２０％アセトニトリルで再構成した。工程は、使用したクロマトグラフィーの種類に依存した。
【０１１９】
サンプル分析
１．ＬＣカラムと質量分析計を平衡化した。
２．２０μＬの再構成サンプルをＬＣに注入した。
３．放出された分析標的の適切なクロマトグラフィーを提供する質量分析計直結型ＬＣカラムを使用し、分析標的と内部標準フラグメントイオンは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）操作法を用いて測定した。
４．分析標的のピーク面積は、内部標準分析標的について得られたピーク面積で割った。得られた分析標的／ＩＳピーク面積比は、分析標的キャリブレータ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数としてプロットし、点を線形回帰曲線に当て嵌めた。サンプルから測定された応答比は、標準曲線によって決定された線の方程式を使って定量した。
【０１２０】
次の分析は、ＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥ共役抗体から分析標的としてＭＭＡＥを放出することを特に指向した。
１．タンデム質量分析計に接続した５０ｘ３．０ｍｍ  ５μｍのシリカ系カラム（ＢＥＴＡＳＩＬ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を液体クロマトグラフィーに取り付け、両方を平衡化した。
２．２０μＬの再構成サンプルをＬＣに注入した。
３．移動相Ａ（Ｈ２Ｏ中の０．１％ギ酸）と移動相Ｂ（ＡＣＮ中の０．１％ギ酸）は以下の勾配（表１）を使用し、予測されるＭＭＡＥ（分析標的）保持時間は１．１６分であった。
（表１）ＬＣ勾配
2021504695.tif 000008
４．ＭＭＡＥ濃度は、７１８ｍ／ｚから６８６ｍ／ｚ（ＭＭＡＥの前駆体とフラグメントイオン）および７２６ｍ／ｚから６９４ｍ／ｚ（ｄ８−ＭＭＡＥの前駆体とフラグメントイオン）の遷移を選択的に監視する多重反応モニタリング（ＭＲＭ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを使用して決定した。
５．各ＭＭＡＥ標準のピーク面積は、内部標準ｄ８−ＭＭＡＥで得られたピーク面積で割った。得られたＭＭＡＥ／ｄ８−ＭＭＡＥ面積比は、ＭＭＡＥ標準濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数としてプロットし、点は線形回帰曲線に当て嵌めた。サンプルから測定された応答比は、標準曲線によって決定された線の方程式を使って定量した。ＭＭＡＥ測定の場合、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを取得し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ機器メーカー（Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）１．６．１およびＭｕｌｔｉｑｕａｎｔ（商標）バージョン２．１、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）から入手可能な操作およびデータ解析ソフトウェアを用いて処理した。
【０１２１】
実施例２：抗体−薬物複合体のエクスビボ安定性
２種類のＡＤＣのエクスビボ安定性は、酸触媒加水分解法を使用して評価した。ＡＤＣ１とＡＤＣ２は、マレイミドカプロイルリンカー（ｍｃ）を使用した強力な抗有糸分裂性の抗チューブリンアウリスタチ誘導体（モノメチルアウリスタチンＦ）であるｍｃＭＭＡＦに結合した抗体である。
【０１２２】
薬物へのマレイミドリンカーは一般に以下として表される。
2021504695.tif 000009
【０１２３】
ｍｃリンカーが上記のリンカーの場合、ｎは５である。ｍｃＭＭＡＦは、上記種の場合にｎは５、および薬物はＭＭＡＦである。
【０１２４】
ｍｃＭＭＡＦリンカー−薬物結合体は酵素的に開裂しない。
【０１２５】
保存
・ＡＤＣ１−ＰＢＳ中７．１ｍｇ／ｍＬ（４．３薬物／ｍＡｂ；２０３．５ｕＭ  ｍｃＭＭＡＦ当量）
・ＩＳ１−ＰＢＳ中４．４ｍｇ／ｍＬ（４．０薬物／ｍＡｂ；１１７．３ｕＭ  ｍｃＭＭＡＦ当量）
・ＡＤＣ２−ＰＢＳ中５．５ｍｇ／ｍＬ（４．１薬物／ｍＡｂ；１５０．３ｕＭ  ｍｃＭＭＡＦ当量）
・ＩＳ２−ＰＢＳ中９．０ｍｇ／ｍＬ（３．８薬物／ｍＡｂ；２２８．０ｕＭ  標識ｍｃＭＭＡＦ当量）
【０１２６】
スプラーグドーリーラットのＮａ＋クエン酸血漿４ｍｌに２５０μｇ／ｍｌの濃度でＡＤＣ１またはＡＤＣ２をスパイクした。スパイクされた血漿の１ｍｌを標準曲線の作成に使用した。標準曲線サンプルは、ＡＤＣ１またはＡＤＣ２いずれかの連続希釈液を含んだ。
【０１２７】
スパイクされた血漿の残り３ｍｌから、４５０μｌを０時間、６時間、１日、２日、４日および７日の時点で取り出した。ＡＤＣ１（ＩＳ１）とＡＤＣ２（ＩＳ２）の内部標準を調製した。内部標準はそれぞれ１３Ｃ標識薬物（具体的には、ＭＭＡＦのフェニル環を６個の１３Ｃで標識）を含み、６ａｍｕが質量に加わった。内部標準は、ラットのクエン酸血漿で１０μＭの薬物−リンカー等量（［５Ｘ］濃度）に希釈した。
【０１２８】
９６ウェルサンプル／標準プレプレートの調製。２００μｌの各ＡＤＣサンプルと各標準曲線サンプルを３回混合し、リバースピペッティングで９６ウェル、３５０μｌ／ウェル内に予め置いた。５０μｌの内部標準をＡＤＣサンプルと標準曲線サンプルに加えた。それぞれ配置したサンプルを３〜５回混合した。
【０１２９】
９６ウェルフィルタープレートの調製。プロテインＡアガロースは、洗浄し、１部樹脂対３部緩衝液（８００μｌ中２００μｌ樹脂床）スラリー比でｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化した。プロテインＡアガロースの８００μｌのスラリー体積を、９６ウェルフィルタープレート上の適切な位置に加えた。プレートを４℃で５分間、１２５０ｘｇで遠心分離し、水相を除去した。
【０１３０】
２００μｌの各ＡＤＣサンプルと標準曲線サンプルを３回混合し、次いで、リバースピペッティングでフィルタープレート上の適切な位置に移した。
【０１３１】
プレートは、４℃で１時間、７５０−１０００ｒｐｍに設定したタイタープレートシェーカーに固定した。
【０１３２】
９６ウェルフィルタープレート分画を通した流体は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって９６ウェルの２ｍｌのコレクションプレートに回収した。
【０１３３】
各樹脂床は、２００μｌの緩衝液（４０ｍＭ  ＫＰＯ４、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１回洗浄した。洗浄画分は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって回収し、保存した。
【０１３４】
ＡＤＣ溶出２００μｌのＩｇＧ溶出緩衝液を各樹脂床に加え、プレートは、サーモミキサーに室温下、約１０００ｒｐｍで５分間置いた。溶離液は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって２ｍｌのコレクションプレートに回収した。別の２００μｌのＩｇＧ溶出緩衝液を各樹脂床に加え、プレートをサーモミキサーに室温下、約１０００ｒｐｍで５分間置いた。溶離液は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって２ｍｌのコレクションプレートに回収した。これによって４００μｌの最終溶出体積が得られた。
【０１３５】
溶離液は、６０℃で３〜４時間、窒素ガス下で蒸発させた。
【０１３６】
蒸発後、４００μｌの１０体積％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（水希釈）を各ウェルに添加した。テフロン被覆シリコンプレートマットを使用して９６ウェルプレートを密封した。プレートは、ジャケット付きサーモミキサー内に置いて、７０℃、約８５０ｒｐｍで一晩（約１６時間）保温静置した。
【０１３７】
９６ウェルプレートは、ハードスピン（４０００ｘｇ、５分間）にかけてタンパク質の沈殿物をペレット化した。３００μｌを回収し、新しい９６ウェル、２ｍｌのコレクションプレートに移した。プレートは、４０℃で２〜３時間、窒素ガス下で蒸発させた。
【０１３８】
各サンプルを溶解するために３００μｌの３３％ＣＨ３ＣＮ（アセトニトリル）／０．１体積％ギ酸に再懸濁し、３分間、約１０００ｒｐｍでボルテックスした。
【０１３９】
プレートを５分間、５００ｘｇで回転し、２００μｌの各サンプルをシラン化ガラスインサートでＨＰＬＣへ移した。
【０１４０】
２５μｌの各サンプルを四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析を介して分析した。
【０１４１】
全時点での対応標準曲線を処理し、そして放出されたＭＭＡＦの濃度を決定した。結果は、図１に示す。
【０１４２】
実施例３：臨床サンプル分析
ＡＤＣ３で治療した患者からの臨床サンプルを分析した。ＡＤＣ３はｍｃＭＭＡＦ共役抗体である。
【０１４３】
保存
・ＡＤＣ３−ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍＬ  ４薬物／ｍＡｂ
・ＩＳ３−ＰＢＳ中４．５９ｍｇ／ｍＬ（３．６薬物／ｍＡｂ；１１０．２μＭ  ｍｃＭＭＡＦ当量）
【０１４４】
ＡＤＣ３標準曲線サンプルをＫ２ＥＤＴＡヒト血漿中に希釈した。内部標準（５０μＭのＡＤＣ当量に希釈）もサンプルあたり１００μｌ／標準の準備のためＫ２ＥＤＴＡヒト血漿に希釈した。
【０１４５】
９６ウェルサンプル／標準プレプレートの調製。１００μｌの各サンプルと標準曲線サンプルを混合し、９６ウェル内に予め置いた。次に、２００μｌの内部標準を各サンプル／標準曲線サンプルに加えた。５００μｌのＰＢＳ−Ｔを各ウェルに添加した。
【０１４６】
９６ウェルフィルタープレートの調製。プロテインＡアガロースは、洗浄し、１部樹脂対３部緩衝液（８００μｌ中２００μｌ樹脂床）スラリー比でｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化し、そして使用前に４℃でストック溶液として貯蔵した。アガロースの８００μｌのスラリー体積（２００μｌ樹脂床）を９６ウェルフィルタープレート上の適切な位置に加えた。プレートを４℃で５分間、１２５０ｘｇで遠心分離し、水相を除去した。
【０１４７】
７００μｌの各サンプル／標準曲線サンプル／ＰＢＳ−Ｔを３回混合し、次いで、リバースピペッティングでフィルタープレート上の適切な位置に移した。
【０１４８】
プレートは、４℃で１時間、７５０〜１０００ｒｐｍに設定したタイタープレートシェーカーに固定した。
【０１４９】
９６ウェルフィルタープレート分画を通した流体は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって９６ウェルの２ｍｌのコレクションプレートに回収した。
【０１５０】
各樹脂床を２００μｌのＰＢＳで１回洗浄した。洗浄画分は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって回収し、保存した。
【０１５１】
ＡＤＣ溶出。２００μｌのＩｇＧ溶出緩衝液を各樹脂床に加え、そしてプレートは、サーモミキサーに４℃下、約１０００ｒｐｍで５分間置いた。
【０１５２】
溶離液は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって２ｍｌのコレクションプレートに回収した。別の２００μｌのＩｇＧ溶出緩衝液を各樹脂床に加え、プレートは、サーモミキサーに４℃、約１０００ｒｐｍで５分間置いた。溶離液は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって２ｍｌのコレクションプレートに回収した。これによって４００μｌの最終溶出体積が得られた。
【０１５３】
各ウェルに４０μｌの１００％ＴＦＡを加えて１０体積％ＴＦＡを得、テトラペプチド分析標的を放出させた。テフロン（商標）被覆シリコンプレートマットを使用して９６ウェルプレートを密封した。プレートは、ジャケット付きサーモミキサー内に置いて、化学的ヒュームフードに７０℃、約８５０ｒｐｍで一晩温置した。
【０１５４】
９６ウェルプレートは、ハードスピン（４０００ｘｇ、５分間）にかけてタンパク質の沈殿物をペレット化した。３００μｌを回収し、新しい９６ウェル、２ｍｌのコレクションプレートに移した。プレートは、４０℃で２〜３時間、窒素ガス下で蒸発させた。
【０１５５】
各サンプルを溶解するために２％アセトニトリル＋０．１％ギ酸の１００μｌに再懸濁し、３分間、約１０００ｒｐｍでボルテックスした。
【０１５６】
サンプル中の分析標的は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。サンプル中の抗体の量は、ＥＬＩＳＡアッセイ法で測定した。結果は、図２に示し、抗体あたりの薬物としてプロットした。
【０１５７】
実施例４：抗体−薬物複合体（分析物断片）のインビボ安定性
ＡＤＣ４の安定性は、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ４で処理したラットで分析した。ＡＤＣ４は、ペグ化モノメチルアウリスタチンＥ（ＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥ）共役抗体である。ＭＭＡＥリンカーは、ペグ化されており、そしてジアミノプロピオン酸および、β−グルクロニダーゼによって開裂するβ−グルクロニドを含有する（下記の構造を参照）。酸放出産物はＭＭＡＥ（分析標的）である。
【０１５８】
ｍａｌ−ｐｅｇ−カルバメート−ＭＭＡＥは構造：
2021504695.tif 000010
を有する。
【０１５９】
カルバメートを生成するためのリンカーのカルボネートのＭＭＡＥ共役は、ＴＦＡ処理によるＭＭＡＥ薬物全体の開裂を容易にすると考えられている。
【０１６０】
保存
・ＡＤＣ４、ＰＢＳ中５．４ｍｇ／ｍＬ（３６．０ｕＭ  ＡＤＣ）（７．９３薬物／ｍＡｂ；２８５．５ＭＭＡＥ当量）
・ＩＳ４、ＰＢＳ中７．０３ｍｇ／ｍＬ（４６．９ｕＭ  ＡＤＣ）（７．９３薬物／ｍＡｂ；３７１．９ｕＭ  ｄ８−ＭＭＡＥ当量）
【０１６１】
ラットのＫ２ＥＤＴＡ添加血漿にＡＤＣ４と内部標準をスパイクした。内部標準は２Ｈ−標識ＭＭＡＥを含み、質量に８Ｄａを加えた。ＭＭＡＥ標準曲線サンプルも調製した。
【０１６２】
前プレートを調製した（実施例１を参照）。
【０１６３】
９６ウェルフィルタープレートの調製。プロテインＡアガロースは、洗浄し、１部樹脂対３部緩衝液（８００μｌスラリー中２００μｌ樹脂床）スラリー比でｐＨ７．４のＰＢＳ中に平衡化した。アガロースの８００μｌのスラリー体積（２００μｌ樹脂床）を９６ウェルフィルタープレート上の適切な位置に加えた。プレートを４℃で５分間、１２５０ｘｇで遠心分離し、水相を除去した。
【０１６４】
前プレートからの各標準の２００μｌを３回混合した後、フィルタープレート上の適切な位置に移した。
【０１６５】
プレートは、４℃で１時間、約９００ｒｐｍに設定したタイタープレートシェーカー  に固定した。
【０１６６】
９６ウェルフィルタープレート分画を通した流体は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって９６ウェルの２ｍｌのコレクションプレートに回収した。
【０１６７】
各樹脂床は、ｐＨ７．４の１ＸＰＢＳの４００μｌで２回洗浄した。洗浄画分は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって回収し、保存した。
【０１６８】
ＡＤＣ溶出  ２００μｌのＩｇＧ溶出緩衝液を各樹脂床に加え、そしてプレートは、サーモミキサーに室温下、約９００ｒｐｍで５分間置いた。
【０１６９】
溶離液は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって２ｍｌのコレクションプレートに回収した。別の２００μｌのＩｇＧ溶出緩衝液を各樹脂床に加え、プレートは、サーモミキサーに室温下、約９００ｒｐｍで５分間置いた。溶離液は、４℃で５分間、２０００ｘｇの遠心分離によって２ｍｌのコレクションプレートに回収した。これによって４００μｌの最終溶出体積が得られた。
【０１７０】
サンプルは、６０℃で３〜４時間、窒素ガス下で蒸発させた。
【０１７１】
蒸発後、４００μｌの１０体積％ＴＦＡ（水で希釈）を各ウェルに添加した。テフロン被覆シリコンプレートマットを使用して９６ウェルプレートを密封した。プレートは、ジャケット付きサーモミキサー内に置いて、７０℃、約６５０ｒｐｍで一晩（約１６時間）保温静置した。
【０１７２】
９６ウェルプレートは、２０００ｘｇで５分間遠心分離し、ウェルの側面から凝集沈降させた。プレートは、４０℃で約４時間、窒素ガス下で蒸発させた。
【０１７３】
蒸発後、５００μｌの氷冷ＭｅＯＨを各ウェルに添加した。プレートは、プレートシーラーで被覆し、４℃で２０分間、タイタープレートシェーカーに置いた。
【０１７４】
プレートは、ハードスピン（４０００ｘｇ、５分間）にかけた。４００μｌ（５００μｌの全体積のうち）をオートサンプラープレートに移した。
【０１７５】
オートサンプラープレートは、乾燥するまで４０℃、窒素ガス下で蒸発させた。サンプルは、０．１％ＦＡ中９５／５アセトニトリル／水の１０００μｌで再構成した。
【０１７６】
サンプルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。結果は、図３に示す。
【０１７７】
実施例５：高い安定性をもった抗体−薬物複合体の開発
強力な細胞毒性薬に部位特異的に結合できる改変システイン抗体群（Ｓ２３９Ｃ、Ｅ２６９Ｃ、Ｋ３２６ＣおよびＡ３２７Ｃ）を作成し、本明細書で提供した方法でそれらの安定性を試験した。実験では、ほぼ１００％の安定性をもった均一な２負荷ＡＤＣが同定された。さらに、ＡＤＣの安定性がＨＩＣで測定された見掛け疎水性と相関することが観察されたことから、チオスクシンイミド加水分解を速めることなく安定性を付与する付加的手段として化学的隔離が示唆された。
【０１７８】
構造解析と分子モデリング
無傷抗体および、Ｆｃガンマ受容体３に結合するヒトＦｃ領域のタンパク質データベースファイル（それぞれの登録番号１ＨＺＨと１Ｅ４Ｋ）を解析に使用した。Ｐｙｍｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，２０１０）を使用して図４Ａに提供した分子構造モデルを作成した。鋳型としてのＦｃガンマ受容体３（登録番号１ＨＺＨ）に結合させたヒトＦｃ領域を使用し、選択残基（Ｋ３２６、Ｓ２３９、Ｅ２６９およびＡ３２７）をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでシステインに変換し、新しい残基に対する溶媒露出度をＧＥＴＡＲＥＡ（Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｂｒａｕｎ，１９９８）を使用して計算した。４つの残基に対する溶媒露出度は、図４Ｂに提示し、部位間で最大５倍の差異を示した。さらに、改変システイン抗体（Ｓ２３９Ｃ、Ｅ２６９Ｃ、Ｋ３２６ＣおよびＡ３２７Ｃ）についての静電計算は、ＡＰＢＳ（Ｂａｋｅｒら、２００１）を使用して実行し、図４Ｃに提示した。
【０１７９】
複合体の調製
追加的な重鎖システイン残基（Ｓ２３９Ｃ、Ｅ２６９Ｃ、Ｋ３２６ＣおよびＡ３２７Ｃ）で改変させたヒト化抗ＣＤ７０（ｈ１Ｆ６）（ＭｃＥａｒｃｈｅｎら、２００８）は、非開裂性アウリスタチン、マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンＦ（ｍｃＭＭＡＦ）、プロテアーゼ開裂性ピロロベンゾジアゼピンまたはサンドラマイシン（Ｂｉｏｍａｒ）薬リンカーに、以前に記載されたプロトコル（Ｊｅｆｆｒｅｙら、２０１３）にしたがって共役させた。簡潔に、抗体は、１０等量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）と１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加し、そして１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ  ９．０）を用いてｐＨ７．４に調整することで完全に還元した。反応液は、３７℃で１時間温置した後に２２℃に冷却し、３０等量のデヒドロアスコルビン酸を加えた。１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液  （ｐＨ３．７）でｐＨ６．５に調整し、１時間、２２℃で放置して酸化反応を進行させた。この結果、生来のジスルフィドは再構成したが、改変重鎖システインは還元状態のまま残り、共役に利用可能であった。次に、１Ｍ  のトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて溶液ｐＨ７．４まで再度上げた。次に、２．５等量の薬物−リンカーを添加して共役を行い、反応液を放置して３０分間、２２℃で進行させた。得られた複合体は、使い捨てＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。薬物負荷度および薬物結合部位は、ジチオスレイトールでＡＤＣを還元した後、ＰＬＲＰカラム上のＨＰＬＣ分析、および重鎖と軽鎖成分の統合処理（Ｓｕｎら、２００５）によって決定した。集合の度合はサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。ＨＰＬＣおよび質量分析ならびに本開示で記載された方法を使用した無傷ＡＤＣの分析から、予想されたｍＡｂあたり約２つの薬物をもったＡＤＣの均一集合（図５）を確認した；対照的に野生型ｍＡｂはこれらの条件下でいかなる薬物−リンカーも合体していない。
【０１８０】
ＥＣ部位結合確認
野生型（ＷＴ  Ｆｃ）、改変システイン抗体（Ｓ２３９Ｃ）および共役化ＡＤＣ（Ｓ２３９Ｃ＋薬物）は、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（シグマ  アルドリッチ）によるプロテアーゼ処理にかけた。Ｇｌｕ−Ｃによる消化により、２３３位のヒンジシステインのＣ末端を開裂したＦｃフラグメントが遊離した。このＦｃフラグメントの質量分光分析から、野生型ＡＤＣが消化された場合、発生したＦｃフラグメントは質量２４，０５４Ｄａ（図５、最上パネル）をもち、これは共役部位が全て２３３位のＮ末端側にあることと一致し、共役の兆しがないことを示した。Ｓ２３９Ｃ抗体の消化では、セリンとシステインの間の質量差に相当する質量１６Ｄａが追加されて合計２４，０７０ＤａのＦｃフラグメントが得られる（図５、中央パネル）。Ｓ２３９Ｃ純粋２負荷ＡＤＣの消化では、セリンとシステインの質量差および薬物リンカーの付加に相当する質量９４２Ｄａが追加されて合計２４，９９５ＤａのＦｃフラグメントが生じる（図５、下部パネル）。質量スペクトル（図５）は、変異体Ｆｃ領域だけが薬物リンカーを合体し、導入されたシステイン（Ｓ２３９Ｃ）が新しい結合部位であることを示す。全改変システイン抗体（Ｅ２６９Ｃ、Ｋ３２６ＣおよびＡ３２７Ｃ）で同様な結果が見られ、そして相当するＦａｂの質量スペクトル解析から、全内因性システインはジスルフィド結合として存在しており、薬物リンカーに共役していなかったことを示した（データの未提示）。
【０１８１】
エクスビボでのマレイミド安定性
ＩｇＧをプロテインＡ樹脂（ＰｒｏＳｅｐＡ、ミリポア）と保温静置し、４℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去（ウルトラフリー−ＭＣ遠心式フィルター、ミリポア）し、ラット血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＩＶＴ）からＩｇＧを取り出した。ＡＤＣをＩｇＧ枯渇血漿にスパイクした（０．２５ｍｇ／ｍＬ）。一定分量（２００μＬ）を直ぐに取り出して（ｔ＝０ｄ）、そして残りのサンプルを３７℃で７日間まで保温静置した。関連した時点で、被験物質と内部標準を抽出して消化した。ＭＭＡＦからのＮ末端アミノ酸に相当するテトラペプチド産物（Ｖａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ）を固相抽出法で精製し、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析により標準を基準に定量した。本開示方法を使用して、ＡＤＣからテトラペプチドを放出し、そして放出された量を定量した。
【０１８２】
本発明者らは、薬物複合体の逆マイケル損失を起こすマレイミド性向が共役部位に依存することを見出し、野生型の４薬物負荷ＡＤＣの感受性が最も高く、７日間で薬物負荷のおおよそ４０％が損失した（図７Ａ）。比較して、Ｓ２３９Ｃは最も安定し、同じ期間で損失は１０％未満であった。Ａ３２７Ｃ、Ｅ２６９ＣおよびＫ３２６Ｃは、それぞれ２１％、２８％および２６％の中程度の薬物損失を示した（図７Ｂ）。
【０１８３】
エクスビボでのマレイミド加水分解
ＩｇＧをプロテインＡ樹脂（ＰｒｏＳｅｐＡ、ミリポア）と保温静置し、４℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去（ウルトラフリー−ＭＣ遠心式フィルター、ミリポア）することでラット血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＩＶＴ）からＩｇＧを取り出した。ＡＤＣをＩｇＧ枯渇血漿にスパイクした（０．２５ｍｇ／ｍＬ）。一定分量（５００μＬ）を直ぐに取り出して（ｔ＝０ｄ）、そして残りのサンプルは、３７℃で７日間保温静置した。各サンプル（５００μＬ）を３００μＬのＰｒｏＳｅｐＡ樹脂と回転させてＡＤＣを捕捉し（５０％ＰＢＳスラリー、４℃、一晩）、次いで、ウルトラフリー−ＭＣスピンカップ（１分間、１１，０００ｘｇ）を通してろ過した。樹脂結合ＡＤＣは、ＰＢＳ（３ｘ５００μＬ）で洗浄し、３００μＬのＩｇＧ溶出緩衝液（サーモフィッシャーサイエンティフィック）でｐＨ８の１Ｍトリスの３０μＬに溶出した。溶離液の各サンプル（１００μＬ）は、１μＬのＰＮＧアーゼＦ（５００Ｕ／μＬ、ニューイングランド・バイオラボ）および５μＬのＬｙｓＣ（０．１μｇ／μＬ、プロメガ）と室温で３０分間、続けて３７℃で２５分間処理し、その後に１００ｍＭのジチオスレイトール（１０μＬ）を添加して、さらに１５分間、３７℃で保温静置した。サンプルは、ＰＬＲＰ−Ｓクロマトグラフィーとエレクトロスプレーイオン化（ＱＴＯＦ）質量分析を経由してＬＣ−ＭＳで分析した。データは、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．０のＭａｘＥｎｔ１解析によってデコンボリューションした。脱グリコシル化ＨＣ  ＦｃプラスｍｃＭＭＡＦおよび脱グリコシル化ＨＣ  ＦｃプラスｍｃＭＭＡＦプラス水のピーク高を使用して加水分解薬物のパーセントを計算した。
【０１８４】
保温静置前のサンプルは、一貫したマレイミド加水分解量（約１５％）を示し、これは全変異体ＡＤＣについては約２０Ｄａの質量の増加によって示された。保温静置後のサンプルは、Ｓ２３９Ｃ、Ａ３２７Ｃ、Ｅ２６９ＣおよびＫ３２７Ｃの場合にそれぞれ７％、９％、６１％、６５％と大きく異なる付加的開環レベルを有した（表３）。この結果は、逆ミカエル脱離反応に対する安定性と薬物リンカーの化学ミクロ環境による加水分解速度の増加との間でほぼ完全な逆相関を表す。
【０１８５】
（表３）薬物リンカー安定性、マレイミド加水分解、およびＡＤＣの疎水性
2021504695.tif 000011
【０１８６】
結合部位の生物物理学的特徴
チオスクシンイミド結合の加水分解と安定化のこれらの比率の相違の原因を調査するために、本発明者らは、改変させた結合部位のいくつかの特性の相違、すなわち、１）結合部位周囲の静電気環境（図４Ｃ）；２）改変システインの計算された溶媒露出度（図４Ｂ）；および３）各改変ＡＤＣの見掛け疎水性（表３）に注目した。
【０１８７】
局所荷電残基は陽子引き抜きを促進または回避する可能性があり、その結果、マレイミド結合体の安定または脱離が生じる。故に、本発明者らは、静電ポテンシャルによって改変Ｆｃ領域モデルの溶媒アクセス可能表面を解析した。結合部位を取り巻くこれらの電位の視覚評価から、Ｋ３２６ＣおよびＥ２６９ＣのＡＤＣでは、開環を促進するイオン性残基の一貫した置換がわかっていない。実際、これらの導入されたシステインは、それぞれ塩基性および酸性環境にあり、加水分解に対して安定性または感受性に相違を示さなかった。また、本発明者らは、同様にそれぞれ塩基性および酸性環境にあるＳ２３９ＣとＡ３２７Ｃを安定化させる可能性のある荷電残基を見出していない。
【０１８８】
複合体の加水分解は、チオスクシンイミドのカルボニル原子への溶媒分子の接近を要件とする。２３９位に結合したマレイミドは簡単に溶媒から遮蔽され、そのような反応に関与できない可能性がある。結合部位への溶媒接近がチオスクシンイミド加水分解傾向を予測できるかどうかを判断するために、本発明者らは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで作成したモデルのＣｏｎｎｏｌｌｙ分子表面を計算した。本発明者らは、曝露された表面と加水分解率の間に相関がないことを見出した（図４Ｂ）。しかしながら、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用すると、複合体の保持時間と薬物−リンカー安定性の間に相関が見出された。本アッセイはまた、安定性が最も小さく、そして最も速く加水分解する改変ＡＤＣ（Ｅ２６９ＣおよびＫ３２６Ｃ）が最大の見掛け疎水性を提示することを示す。
【０１８９】
競合結合
ＰＢＳ中の１ｘ１０５の抗原発現細胞株（７８６−０）を氷上の９６ウェルＶ−ボトムプレートの各ウェルに等分した。細胞を、６００ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７標識野生型ｍ１Ｆ６および濃度を増加させた（０．１９ｎＭ〜６００ｎＭ）非標識変異体ＡＤＣまたは野生型ＡＤＣと共に１時間培養した。細胞をペレット化してＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞をペレット化し、１２５μＬのＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁した。蛍光は、フローサイトメトリーで分析し、飽和した蛍光信号のパーセントを用いて標識抗体結合の比率を決定し、その後、勾配変化をもったシグモイド型用量反応曲線にデータを当て嵌めてＥＣ５０を推定した。
【０１９０】
競合抗体によって蛍光信号が５０％減少する濃度は表２にＩＣ５０として報告されている。野生型およびシステイン変異体は測定値に誤差内で同じであり、これはシステイン置換およびその後の共役がＡＤＣによる標的の関与に影響を与えないことを示す。このＡＤＣ群の相対親和性の測定に加えて、本発明者らは、抗原発現細胞に与える細胞傷害効果を試験した（表２）。驚くべきことに、変異体ＡＤＣの処方上の薬物用量が野生型ＡＤＣの半分しかなかった事実にもかかわらず、変異体ＡＤＣの全てがＣＤ７０陽性細胞と保温静置した場合に野生型ＡＤＣと類似の有効性を有した。
【０１９１】
（表２）変異体と野生型ＡＤＣの結合およびインビトロ活性
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【０１９２】
表２説明文：相対結合親和性を定量化するために、固定濃度の蛍光標識した親抗体を、濃度を増加させた非標識変異体または親抗体で滴定し、そして抗原発現細胞に適用した。競合抗体が蛍光信号を５０％減少させる濃度は、ＩＣ５０として報告する。インビトロ活性を評価するため、濃度を増加させたＡＤＣを抗原発現細胞に適用した。半最大応答を与えるＡＤＣの濃度をＥＣ５０として報告する。
【０１９３】
インビトロでの細胞毒性アッセイ
アメリカンタイプカルチャーコレクションから７８６−０細胞株を取得し、製造会社が推奨する培養条件で増殖させた。黒色側面の透明ボトム９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）にウェルあたり１５０μＬの増殖培地に細胞を固定した。２４時間後、保存薬物を５倍に階段的に希釈しながら滴定し、８点用量曲線を作成し、ウェルあたり５０μｌを２重に添加した。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で９６時間培養した。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（プロメガ）溶液と０．５時間培養して細胞毒性を測定し、次いで、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＸＣｉｔｅプレートリーダー（パーキンエルマー）で蛍光を測定した。エクセル（マイクロソフト）とグラフパッド（プリズム）を用いてデータを処理し、用量応答曲線を作成してＩＣ５０値を産出して、データを収集した。
【０１９４】
インビボ活性試験
７８６−Ｏモデルを構築するために、無胸腺ｎｕ／ｎｕ雌ドナーマウス（ハーラン）の右脇腹に５ｘ１０６細胞を移植した。ドナー腫瘍が約５００ｍｍ３［（ＬｘＷ２）／２］のときにマウスを安楽死させて腫瘍を無菌で切除し、約０．５ｘ０．５ｍｍ断片を殺菌した１３−ゲージトロカールに担持して麻酔マウスに移植した、腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、マウスを無作為に治療群に割り当て、単一時点で１０ｍｇ／ｋｇＡＤＣを腹腔内注射により投与した。腫瘍を週２度測定し、体積は式Ｖ＝（ＬｘＷ２）／２を用いて計算した。腫瘍が約１，０００ｍｍ３に達したときに動物を麻酔した。腫瘍体積は、式（ＡｘＢ２）／２を用いて計算し、式中、ＡとＢはそれぞれ最大と二番目に大きい腫瘍の垂直寸法である。マウスの平均腫瘍体積と重量を監視し、腫瘍体積が１，０００ｍｍ３に達したときにマウスを殺処分した。
【０１９５】
単回投与の７８６−０インビボ有効性モデル（図６）において、未治療マウスと比較したときに全ＡＤＣが腫瘍成長に顕著な影響を及ぼした。しかしながら、変異体間で成果に差異があった。変異体のうち、２負荷Ｓ２３９Ｃが最良の腫瘍成長抑制を示し、野生型４負荷ＡＤＣと類似して腫瘍成長を約２５日間遅くした。Ａ３２７Ｃは、有効性でＳ２３９Ｃよりわずかに低かった（腫瘍成長を１０日間遅くした）が、腫瘍成長の遅延がわずか約５日にとどまった同一活性をもつＥ２６９ＣおよびＫ３２６Ｃを上回った。
【０１９６】
参照による援用
本出願に列挙されている全ての公開、特許、特許出願および他の書類は、各個別の公開、特許、特許出願または他の書類が、個別にあらゆる目的で参照により援用されることが示されているのと同じ程度で、参照することによって、全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
【０１９７】
等価物
本開示は、とりわけカンナビノイド組成および同伴組成を提示する。本開示はまた、カンナビノイドおよび同伴組成を投与することによる神経変性疾患の治療法を提供する。様々な上記の明細書に含まれる特定の実施形態の例証および説明は制限されない。様々な変化は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく行うことができることは理解されよう。多くの変形は、本明細書の検討で当業者には自明となるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月30日(2020.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のリガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）を分析する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣを含むサンプルを提供する工程であって、前記ＬＤＣはリガンドおよび分析標的を含み、前記分析標的は薬物分子またはその一部を含む、提供する工程；ならびに
ｂ．前記サンプルを１〜３０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記ＬＤＣから前記分析標的の放出を誘導する、接触させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
ａ．前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する工程；および
ｂ．放出された前記分析標的の量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）にかけることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にかけることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ａ．前記サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程；および
ｂ．前記測定したリガンドの量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルを前記トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記ＬＤＣを収集する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＤＣを収集する工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記ＬＤＣの標準曲線を使用して行われる、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ．固定量の内部標準を前記サンプルに加える工程であって、前記内部標準は前記リガンドおよび第二分析標的を含み、前記第二分析標的は前記ＬＤＣの標識誘導体である、加える工程；
ｂ．前記サンプルを１〜３０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記ＬＤＣから前記分析標的のおよび前記内部標準から前記第二分析標的の放出を誘導する、接触させる工程；
ｃ．前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を測定する工程；ならびに
ｄ．前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量に基づいて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する工程
をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二分析標的が前記分析標的と異なる分子量を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記内部標準が前記ＬＤＣの同位体標識版を含む、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記同位体標識が安定または不安定である、請求書１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記同位体標識が重水素または炭素１３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記ＬＤＣおよび前記内部標準を収集する工程をさらに含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＤＣまたは前記内部標準を収集する前記工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リガンドが抗体またはその機能性断片であり、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂およびプロテインＬ樹脂から選択される樹脂と前記サンプルを接触させることによって、前記ＬＤＣまたは前記内部標準が前記サンプルから収集される、請求項７または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが１０体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分析標的がテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
リガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）の安定性を決定する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣに曝露した後に異なる時点で単一源から第一サンプルおよび第二サンプルを取得する工程；
ｂ．請求項２〜２０のいずれか一項に記載の方法で前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記ＬＤＣを分析する工程であって、それによって、前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記ＬＤＣから放出された分析標的の量を決定する、分析する工程；ならびに
ｃ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的の量を比較することによって、前記ＬＤＣの安定性を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
ａ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程；ならびに
ｂ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的と前記リガンドの量の比率を決定する工程
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプル、前記第一サンプル、または前記第二サンプルが、哺乳類の組織または哺乳類の水性体液に由来する生物サンプルである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物サンプルが、血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿のうちの一つから取得される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物サンプルが血漿から取得される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血漿が前記ＬＤＣで処理された、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記血漿が前記ＬＤＣで治療されているヒト対象に由来する、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
サンプル中のＬＤＣを定量する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣを含むサンプルを提供する工程であって、前記ＬＤＣが分析標的を含み、前記分析標的が薬物分子を含む、提供する工程；
ｂ．前記サンプルに内部標準を添加する工程であって、前記内部標準が、前記ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む、添加する工程；
ｃ．前記サンプルから前記ＬＤＣおよび前記内部標準を抽出する工程；
ｄ．前記ＬＤＣおよび前記内部標準を１〜３０体積％の濃度のＴＦＡ水溶液と接触させる工程であって、前記ＴＦＡが、前記ＬＤＣから前記分析標的をおよび前記内部標準から前記第二分析標的を放出させる、接触させる工程；ならびに
ｅ．前記ＬＤＣから放出された前記分析標的および前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を決定する工程であって、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が前記サンプル中のＬＤＣの量と相関する、決定する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を用いて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が決定され、前記ＬＤＣから放出された分析標的の量が、前記サンプル中の前記ＬＤＣの抗体に結合した前記薬物分子の濃度と相関する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＬＤＣの標準曲線を用いて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が決定される、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記分析標的がＭＭＡＦまたはテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記分析標的がｍｃＭＭＡＦを含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記分析標的および前記第二分析標的がテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含み、前記第二分析標的が６以上の炭素および１３または６以上の重水素によって同位体標識されている、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記分析標的および前記第二分析標的がペグ化リンカーＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥを含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記分析標的および前記第二分析標的がＭＭＡＥを含み、前記第二分析標的が６以上の炭素および１３または６以上の重水素によって同位体標識されている、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＬＤＣおよび前記内部標準を１０体積％の濃度の前記ＴＦＡ水溶液と接触させる、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中のＬＤＣの量を決定するためのキットであって、
ａ．前記ＬＤＣのための内部標準であって、前記ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ薬物分子を含む、内部標準；および
ｂ．１〜３０体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液
を含む、キット。
【請求項３９】
前記内部標準が同位体標識されている、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
サンプル中のＬＤＣの量を決定するためのキットであって、
ａ．標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、前記標識リンカー−薬物複合体が、前記リガンドに共役し、それによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド；ならびに
ｂ．１〜３０体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液
を含む、キット。
【請求項４１】
前記内部標準が同位体標識されている、請求項４０に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
一部の実施形態においては、分析標的はテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
一部の実施形態においては、薬物分子はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。一部の実施形態においては、分析標的はＭＭＡＦまたはテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む。いくつかの実施形態では、分析標的はｍｃＭＭＡＦを含む。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含み、第二分析標的は６以上の炭素および１３または６以上の重水素によって同位体標識されている。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はペグ化リンカーＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥを含む。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はＭＭＡＥを含み、第二分析標的は６以上の炭素および１３または６以上の重水素によって同位体標識されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
別の態様では、本発明は、サンプル中のＬＤＣ量を決定するためのキットであって、（ａ）標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、ここで標識リンカー−薬物複合体は、リガンドに共役することによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド；ならびに（ｂ）１〜３０体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液を含む、キットを提供する。一部の実施形態においては、内部標準は同位体標識されている。
[本発明1001]
サンプル中のリガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）を分析する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣを含むサンプルを提供する工程であって、前記ＬＤＣはリガンドおよび分析標的を含み、前記分析標的は薬物分子またはその一部を含む、提供する工程；ならびに
ｂ．前記サンプルを1〜30体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記ＬＤＣから前記分析標的の放出を誘導する、接触させる工程
を含む、方法。
[本発明1002]
ａ．前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する工程；および
ｂ．放出された前記分析標的の量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）にかけることを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にかけることを含む、本発明1002の方法。
[本発明1005]
ａ．前記サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程；および
ｂ．前記測定したリガンドの量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、本発明1002〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記サンプルを前記トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記ＬＤＣを収集する工程をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記ＬＤＣを収集する工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記ＬＤＣの標準曲線を使用して行われる、本発明1002〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
ａ．固定量の内部標準を前記サンプルに加える工程であって、前記内部標準は前記リガンドおよび第二分析標的を含み、前記第二分析標的は前記ＬＤＣの標識誘導体である、加える工程；
ｂ．前記サンプルを1〜30体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記ＬＤＣから前記分析標的のおよび前記内部標準から前記第二分析標的の放出を誘導する、接触させる工程；
ｃ．前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を測定する工程；ならびに
ｄ．前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量に基づいて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量を測定する工程
をさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記第二分析標的が前記分析標的と異なる分子量を有する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記内部標準が前記ＬＤＣの同位体標識版を含む、本発明1009〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記同位体標識が安定または不安定である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記同位体標識が重水素または炭素13である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記サンプルをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記ＬＤＣおよび前記内部標準を収集する工程をさらに含む、本発明1009〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記ＬＤＣまたは前記内部標準を収集する前記工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記リガンドが抗体またはその機能性断片であり、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂およびプロテインＬ樹脂から選択される樹脂と前記サンプルを接触させることによって、前記ＬＤＣまたは前記内部標準が前記サンプルから収集される、本発明1007または1015の方法。
[本発明1017]
前記サンプルが10体積％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と接触する、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記分析標的がテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
リガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）の安定性を決定する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣに曝露した後に異なる時点で単一源から第一サンプルおよび第二サンプルを取得する工程；
ｂ．本発明1002〜1020のいずれかの方法で前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記ＬＤＣを分析する工程であって、それによって、前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記ＬＤＣから放出された分析標的の量を決定する、分析する工程；ならびに
ｃ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的の量を比較することによって、前記ＬＤＣの安定性を決定する工程
を含む、方法。
[本発明1022]
ａ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程；ならびに
ｂ．前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的と前記リガンドの量の比率を決定する工程
をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記サンプル、前記第一サンプル、または前記第二サンプルが、哺乳類の組織または哺乳類の水性体液に由来する生物サンプルである、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記生物サンプルが、血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿のうちの一つから取得される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記生物サンプルが血漿から取得される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記血漿が前記ＬＤＣで処理された、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記血漿が前記ＬＤＣで治療されているヒト対象に由来する、本発明1025〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
サンプル中のＬＤＣを定量する方法であって、
ａ．前記ＬＤＣを含むサンプルを提供する工程であって、前記ＬＤＣが分析標的を含み、前記分析標的が薬物分子を含む、提供する工程；
ｂ．前記サンプルに内部標準を添加する工程であって、前記内部標準が、前記ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む、添加する工程；
ｃ．前記サンプルから前記ＬＤＣおよび前記内部標準を抽出する工程；
ｄ．前記ＬＤＣおよび前記内部標準を1〜30体積％の濃度のＴＦＡ水溶液と接触させる工程であって、前記ＴＦＡが、前記ＬＤＣから前記分析標的をおよび前記内部標準から前記第二分析標的を放出させる、接触させる工程；ならびに
ｅ．前記ＬＤＣから放出された前記分析標的および前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を決定する工程であって、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が前記サンプル中のＬＤＣの量と相関する、決定する工程
を含む、方法。
[本発明1029]
前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を用いて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が決定され、前記ＬＤＣから放出された分析標的の量が、前記サンプル中の前記ＬＤＣの抗体に結合した前記薬物分子の濃度と相関する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記ＬＤＣの標準曲線を用いて、前記ＬＤＣから放出された前記分析標的の量が決定される、本発明1028〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、本発明1028〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記分析標的がＭＭＡＦまたはテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含む、本発明1028〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記分析標的がｍｃＭＭＡＦを含む、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記分析標的および前記第二分析標的がテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅを含み、前記第二分析標的が6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記分析標的および前記第二分析標的がペグ化リンカーＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥを含む、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記分析標的および前記第二分析標的がＭＭＡＥを含み、前記第二分析標的が6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記ＬＤＣおよび前記内部標準を10体積％の濃度の前記ＴＦＡ水溶液と接触させる、本発明1028〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
サンプル中のＬＤＣの量を決定するためのキットであって、
ａ．前記ＬＤＣのための内部標準であって、前記ＬＤＣの標識誘導体であり、かつ薬物分子を含む、内部標準；および
ｂ．1〜30体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液
を含む、キット。
[本発明1039]
前記内部標準が同位体標識されている、本発明1038のキット。
[本発明1040]
サンプル中のＬＤＣの量を決定するためのキットであって、
ａ．標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、前記標識リンカー−薬物複合体が、前記リガンドに共役し、それによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド；ならびに
ｂ．1〜30体積％の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸ＴＦＡ水溶液
を含む、キット。
[本発明1041]
前記内部標準が同位体標識されている、本発明1040のキット。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【図１】２つのｍＡｂ−ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣのエクスビボ安定性プロファイルを提供する。ラットのクエン酸血漿にＡＤＣをスパイクし、サンプルを各時点で分析した。ＡＤＣをプロテインＡアフィニティー樹脂上に捕捉して、薬物は１０％ＴＦＡ水溶液を用いて放出させた。次いで、放出された薬物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。各時点は、ｔ０で観察された共役した薬物に対するパーセントを反映する。
【図２】患者サンプルからの、ＡＤＣの経時的薬物負荷の変化を示す。ｍＡｂ−ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣで治療した患者からの臨床サンプルは、３週間（ｑ３ｗ）おきに、または６週間（ｑ６ｗ）おきに分析した。プロテインＡアフィニティー捕捉、１０％ＴＦＡ媒介放出、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる薬物定量の後、サンプルは、さらにＥＬＩＳＡを使用して抗体濃度を分析した。ＴＦＡ処理はテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を放出し、放出されたテトラペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。結果は、経時的に抗体あたりの薬物としてプロットした。
【図３】ｍＡｂ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのインビボ安定性プロファイルを提供する。酸放出産物ＭＭＡＥは、記載された方法にしたがって分析し、共役した薬物の量として経時的にプロットした。
【図４】図４Ａは、抗体ＣＨ２ドメインのヒンジ領域近傍でシステインへ変換するために選択した部位をもつ、推定の分子構造を示す。部位は最初に、ＦｃとＦａｂの間のヒンジ近位にあるＦｃフラグメント上で同定された（左パネル）。これらの部位は、共結晶構造１Ｅ４Ｋに示されるようなＣＤ１６結合部位と一致する（中央パネル）。Ｆｃ、ＦａｂおよびＣＤ１６の相対的配向は、無傷抗体結晶構造１ＨＺＨの上にＣＤ１６をドッキングして生成されたモデルで見ることができる（右パネル）。図４Ｂは、鋳型として１ＨＺＨを使用して計算した変換部位の溶媒露出度を示す。図４Ｃは、分子表面に投影されたモデル化したｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ変異体について計算された静電ポテンシャルを提供する。これらの部位は、改変された共役部位近くの高い酸性または塩基性要素のいずれにも一貫した傾向を示さなかった。
【図５】タンパク質分解と質量分析によって確認された薬物共役部位を示す。野生型（ＷＴ  Ｆｃ）、改変システイン抗体（Ｓ２３９Ｃ）およびＡＤＣ（Ｓ２３９Ｃ＋薬物）は、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ（Ｅ２３３位とヒンジジスルフィド結合に対してＣ末端を切断する（図５、左））で消化し、それに続いて飛行時間質量分析法によりＦｃフラグメントを分析した。野生型ＡＤＣを消化する際、得られたＦｃフラグメントは、共役の兆候を示さない２４，０５４Ｄａの質量を有し、２３３位のＮ末端側にある全ての共役部位と一致した（最上パネル）。Ｓ２３９Ｃ抗体の消化では、セリンとシステインの間の質量差に相当する１６Ｄａ質量が追加された合計２４，０７０ＤａのＦｃフラグメントが得られた（中央パネル）。Ｓ２３９Ｃ純粋２負荷ＡＤＣの消化では９４２Ｄａ質量が追加された合計２４，９９５ＤａのＦｃフラグメントが生じ、これはセリンとシステインの質量差と薬物リンカーの追加に相当する（下部パネル）。
【図６】裸の抗体、天然４負荷ＡＤＣおよび改変システイン抗体（Ｋ３２６Ｃ、Ｅ２６９Ｃ、Ａ３２７ＣおよびＳ２３９Ｃ）のインビボ活性を示す。抗体は、単回用量１０ｍｇ／ｋｇの７８６−０異種移植実験で活性を試験した。２負荷Ｓ２３９Ｃ改変システインは、天然４負荷および全ての他の改変システイン変異体ＡＤＣより優れていた。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、血漿中のＡＤＣマレイミド安定性を表すデータを提供する。図７Ａは、抗体と薬物リンカーを共役するために使用される可逆的ミカエル付加を工程１が示す、スキームを提供する。工程２は、複合体を安定化し、薬物−リンカーの損失を回避する潜在的な加水分解反応を示す。図７Ｂは、薬物−リンカー複合体の経時的な安定性を示す。データは、ラット血漿を用いたＡＤＣ接種時の逆ミカエル反応を介した共役薬物の消失を示す。２負荷Ｓ２３９Ｃ改変システインは、天然４負荷および全ての他の改変システイン変異体ＡＤＣより安定である。各構築物についてのｔ＝０時間と比較した終了時の薬物負荷百分率を表２に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
例示的なＡＤＣにおいては、モノメチルアウリスタチンＥはプロテアーゼ開裂ペプチドリンカーを介して抗体へ共役しており、モノメチルアウリスタチンＦはリンカーマレイミドカプロン酸（ｍｃ）を介して抗体に共役する。リンカーは、さらに溶解度または薬物動態を調節する化学基を含み得る。例えば、例示的なリンカーはペグ化されている。特定の例示的リンカー−薬物結合体は、
2021504695.tif 000020
ｍｃ−ＭＭＡＦであり、式中、リンカーのマレイミド基はリガンドそして特に抗体のチオール基と反応する；あるいは
2021504695.tif 000021
ＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥであり、式中、リンカーはペグ化されており、そしてグルクロン酸（グルクロニダーゼによって開裂可能）を含み、リンカーのマレイミド基はリガンドのチオール基と反応し得る。上記のリンカー薬物結合体を含むＬＤＣにおいては、本明細書に記載した酸処理がｍｃ−ＭＭＡＦからテトラペプチドＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（この場合Ｄａｐはドラプロリンである）、およびＤＰＲ−ＰＥＧ−ｇｌｕｃ−カルバメート−ＭＭＡＥからＭＭＡＥ薬物全体を放出させる。ＬＤＣおよびＡＤＣのための内部標準は、例えばリンカー−薬物結合体の標識によって調製が可能であり、ここで標識は本明細書に記載された酸による処理で放出される。ｍｃ−ＭＭＡＦに共役したＬＤＣおよびＡＤＣの例示的な内部標準としては、放出されたテトラペプチド中で重水素化または１３Ｃによって標識されたものが含まれる。ｍｃ−ＭＭＡＦに共役したＬＤＣおよびＡＤＣの例示的な内部標準としては、重水素化または放出されたＭＭＡＥ中の１３Ｃによって標識されたものが含まれる。上記構造において、１３Ｃまたは重水素化が予想される部位は「＊」で示される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
エクスビボでのマレイミド安定性
ＩｇＧをプロテインＡ樹脂（ＰｒｏＳｅｐＡ、ミリポア）と保温静置し、４℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去（ウルトラフリー−ＭＣ遠心式フィルター、ミリポア）し、ラット血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＩＶＴ）からＩｇＧを取り出した。ＡＤＣをＩｇＧ枯渇血漿にスパイクした（０．２５ｍｇ／ｍＬ）。一定分量（２００μＬ）を直ぐに取り出して（ｔ＝０ｄ）、そして残りのサンプルを３７℃で７日間まで保温静置した。関連した時点で、被験物質と内部標準を抽出して消化した。ＭＭＡＦからのＮ末端アミノ酸に相当するテトラペプチド産物（Ｖａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））を固相抽出法で精製し、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析により標準を基準に定量した。本開示方法を使用して、ＡＤＣからテトラペプチドを放出し、そして放出された量を定量した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021504695000001.app
【国際調査報告】
2021504695.tif 000022
2021504695.tif 000023