(57)【要約】  本発明は、幹細胞を得る方法及びこのような幹細胞の使用を提供する。温熱で処置された幹細胞含有組織から幹細胞を単離する方法が提供される。これらの方法を実施することにより、幹細胞単離の収率、二次培養における幹細胞の増殖速度、並びに自己免疫疾患、肝疾患及び癌（これらに限定されない）を含む疾患における治療的使用のための幹細胞の治療効力を実質的に増加させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
温熱条件無しで単離された対照の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して向上した増殖速度及び治療効力を有するＭＳＣの単離のために、温熱条件でＭＳＣ含有組織を処置する方法であって、
（ａ）ＭＳＣ含有組織を得る工程、
（ｂ）最適化培地において前記ＭＳＣ含有組織を培養する工程、
（ｃ）温熱条件に前記ＭＳＣ含有組織を曝露させる工程、及び
（ｄ）内科疾患を処置するために治療用組成物を提供する工程、を含む、方法。
【請求項２】
前記温熱条件により、対照と比較して向上した増殖速度及び治療効力を有するＭＳＣ含有組織が生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温熱条件が、摂氏約３７〜約４０度（℃）の温度を含む、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記最適化培地が、成長因子（ｂＦＧＦ、ＥＧＦ）及びホルモン（デキサメタゾン）、抗生物質（Ｐｅｎ／Ｓｔｒａｐ、アムホテリシンＢ）、血清、及びゼノフリー血清代替物から選択される１つ以上の補助剤を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＳＣ含有組織が、臍帯血を含まず、臍帯血とは異なり、前記組織の羊膜上皮、血管（２つの動脈及び１つの静脈）、及びホウォートンゼリーストローマを含む固形成分をいずれも除外することなく完全な臍帯固形組織を含むヒト臍帯組織、を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト臍帯組織が、前記最適化培地において培養する前に酵素消化無しで前記組織を機械的に切断することにより分離される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト臍帯組織が、直径１〜１．５ｍｍを含む小さな切片に機械的に切断され、切断又は撹拌による機械的損傷後の前記組織の環境を維持するために洗浄されず、次いで培養に直接使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＳＣ含有組織を得る工程が、骨髄、脂肪組織、血液、羊水、歯髄及び胎盤から採取される組織を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
向上した増殖速度及び治療効力を有するＭＳＣを生じることが、抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、前記ＭＳＣの遊走分化を含む内科疾患を処置するための治療用組成物における適切な使用である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記温熱条件が、温熱処置に加えて、機械的切断又は撹拌、ＨＧＭＢ１、Ｓ１００Ｂなどのダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）及び二本鎖ＲＮＡなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）、熱ショックタンパク質、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）など）刺激、幹細胞遊走関連タンパク質（ＣＸＣＬ１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢなど）の刺激、及び、低酸素状態（＜２０％ Ｏ２）のうちの１つ以上を含んでもよい、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）が、ＨＧＭＢ１（クロマチン関連タンパク質高移動度群ボックス１）、Ｓ１００Ｂ、プリン代謝産物（ＡＴＰ、アデノシン、及び尿酸）を含むが、これらに限定されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）が、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、及び、二本鎖ＲＮＡを含むが、これらに限定されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記熱ショックタンパク質が、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ１１０を含むが、これらに限定されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症性サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８を含むが、これらに限定されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞遊走関連タンパク質が、ＣＸＣＬ１２（ストローマ細胞由来因子−１：ＳＤＦ−１）、ＣＣＬ２（単球走化性タンパク質−１：ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ５（活性化制御で、正常Ｔ細胞で発現、分泌される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）：ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ８、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢを含むが、これらに限定されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
内科疾患を処置するために治療用組成物を提供する工程が、自己免疫疾患、若しくは、肝疾患、又は癌を処置するための組成物を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記自己免疫疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性膵炎、１型糖尿病、全身性硬化症を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記肝疾患が、肝不全、肝硬変、脂肪肝、肝炎を含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６２/６３２，９８８（２０１８年２月２０日出願）の利益を受けることを請求し、全ての目的のために、参照することによりその全体が本明細書に記載されているかのように組み込まれる。
【０００２】
本開示は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）含有組織又は間葉系幹細胞を操作して向上した増殖能及び治療効力を有するＭＳＣを得るための、温熱条件を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に基づく治療の分野における主な課題は、インビトロにおける広範な継代の必要性なしで適切な段階で十分な量の細胞を生成することである。ＭＳＣは、制限された寿命を有し、インビトロ拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の間、ＭＳＣの増殖速度は低下していく。また、ＭＳＣの治療効力は、インビトロ培養拡張後に減少する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
（概要）
ＭＳＣに基づく治療は、ＭＳＣの治療効力（疾患の処置においてより効果的で一貫した結果を得るための、抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、幹細胞の遊走及び分化を含むが、これらに限定されない）を維持又は向上させる方法から利益を得ることができる。
【０００５】
ＭＳＣは通常、生理的状態において静止している一方、感染又は損傷などの病理学的環境において、ＭＳＣは活性化して機能的になり、栄養因子若しくは抗炎症因子を分泌すること及び／又は分化を通して失われた細胞を置換することにより、損傷を受けた組織を修復又は再生する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本明細書で開示されるいくつかの実施形態に従い、疾患模倣環境によるＭＳＣの事前調整により、ＭＳＣはより強力な増殖及び治療機能が付与される。例えば、ＭＳＣの複製及び分化能を制御するために、ＭＳＣ培養に低酸素状態が導入されている（特許ＰＣＴ/ＵＳ２０１０/０３２４５７号「幹細胞及び幹細胞因子の組成物並びにそれらを使用及び作製するための方法」）。以下でより詳細に記載される別個のアプローチにおいて、ＭＳＣ含有組織を（又はＭＳＣ自体を直接）操作して向上した増殖能及び治療効力を有するＭＳＣを得るために、温熱条件を使用する方法が提供される。 
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣを含有するヒト又は他の哺乳類組織を処置してインサイチュでＭＳＣを活性化し、結果として増殖速度及び幹細胞単離の収率を実質的に向上させるために及び／又は抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、単離後のＭＳＣの遊走及び分化を含む治療効力を向上させるために、温熱条件を使用する方法が提供される。特に、いくつかの実施形態において、温熱処置されたヒト臍帯組織から活性化された／プライミングされた（ｐｒｉｍｅｄ）ＭＳＣを導出するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、ヒト臍帯組織は、満期分娩からのものである。更なる実施形態において、ＭＳＣ含有組織（単離前）及びＭＳＣ（単離後）の両方を処置して増殖速度を向上させるために及び／又は抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、単離後のＭＳＣの遊走及び分化を含む治療効力を向上させるために、温熱を使用する方法が提供される。自己免疫疾患、神経疾患、肝疾患又は癌（これらを含むが限定されない）用の療法として本明細書に開示される方法に由来する、幹細胞（ＭＳＣ、神経幹細胞及び造血幹細胞を含むがこれらに限定されない）の組成物及び使用も提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、対照と比較して向上した増殖速度を有するＭＳＣを単離するために、温熱条件で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）含有組織を処置する方法が示される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ＭＳＣ含有組織を単離する工程、最適化培地においてＭＳＣ含有組織を培養する工程、温熱条件に組織を曝露させる工程、及び内科疾患を患う患者に療法を提供する工程、を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、温熱条件により、対照と比較して向上した増殖速度及び治療効力を有するＭＳＣ含有組織が生成される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、温熱条件は、摂氏３７〜約４０度（℃）を含む温度範囲から成る。より高い温度も、いくつかの実施形態において使用される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣ含有組織を培養するために使用される最適化培地は、成長因子（ｂＦＧＦ、ＥＧＦ）及びホルモン（デキサメタゾン）、抗生物質（Ｐｅｎ／Ｓｔｒａｐ、アムホテリシンＢ）、血清、及びゼノフリー血清代替物から選択される１つ以上の補助剤を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣ含有組織は、臍帯に由来してもよい。ヒト臍帯組織は、臍帯血が含まれず臍帯血とは異なり、組織の羊膜上皮、血管（２つの動脈及び１つの静脈）、及び、ホウォートンゼリーストローマ（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓ Ｊｅｌｌｙ Ｓｔｒｏｍａ）を含む固形成分をいずれも除外することなく完全な臍帯固形組織を含む。
【００１３】
１つの実施形態において、ヒト臍帯組織は、最適化培地において培養する前に酵素消化無しで組織を切断することにより、分解される。
【００１４】
１つの実施形態において、ヒト臍帯組織は、直径１〜１．５ｍｍを含む小さな切片に切断され、切断又は撹拌による損傷後の組織の環境を維持するために洗浄されず、次いで培養に直接使用される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣ含有組織は、骨髄、脂肪組織、血液、羊水、歯髄及び胎盤から採取されてもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態において、向上した増殖速度及び治療効力を有するＭＳＣは、抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、ＭＳＣの遊走分化を含む、内科疾患を処置するのに適切に使用される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、温熱条件は、温熱処置に加えて、切断又は撹拌、ＨＧＭＢ１、Ｓ１００Ｂなどのダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）及び二本鎖ＲＮＡなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）、熱ショックタンパク質、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）など）刺激、幹細胞遊走関連タンパク質（ＣＸＣＬ１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢなど）刺激及び低酸素状態（＜２０％ Ｏ２）、のうちの１つ以上を含んでもよい。
【００１８】
１つの実施形態において、ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）は、ＨＧＭＢ１（クロマチン関連タンパク質高移動度群ボックス１）、Ｓ１００Ｂ、プリン代謝産物（ＡＴＰ、アデノシン、及び尿酸）を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
１つの実施形態において、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）は、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、及び二本鎖ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
１つの実施形態において、熱ショックタンパク質は、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ１１０を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
１つの実施形態において、炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
１つの実施形態において、幹細胞遊走関連タンパク質は、ＣＸＣＬ１２（ストローマ細胞由来因子−１：ＳＤＦ−１）、ＣＣＬ２（単球走化性タンパク質−１：ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ５（活性化制御で、正常Ｔ細胞で発現、分泌される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）：ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ８、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢを含むが、これらに限定されない。
【００２３】
いくつかの実施形態において、当該療法は、自己免疫疾患若しくは肝疾患、又は癌を処置するために使用されてもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、当該療法は、様々な自己免疫疾患を処置する可能性がある。これらの疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性膵炎、１型糖尿病、全身性硬化症を含んでもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、当該療法は、様々な肝疾患を治療する可能性がある。これらの肝疾患は、肝不全、肝硬変、脂肪肝、肝炎を含んでもよい。
【００２６】
温熱条件無しで単離された対照ＭＳＣと比較して向上した増殖速度及び治療効力を有するＭＳＣの単離のために、温熱条件で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）含有組織を処置する方法、である。
【００２７】
別の実施形態において、温熱条件はまた、単離後のＭＳＣを処置又はＭＳＣ含有組織とＭＳＣとの両方を処置して、向上した増殖速度及び治療効力を有するＭＳＣを生成するために使用される。
【００２８】
温熱条件は、「ヒトの正常生理的深部体温の摂氏３７度（℃）よりも高い温度」である温熱を少なくとも含む。本発明において使用される温熱条件は、摂氏３７〜４０度を含むが、これに限定されない。
【００２９】
ＭＳＣ含有組織は、好ましくはヒト臍帯組織を含み、このヒト臍帯組織は、臍帯血が含まれず臍帯血とは異なり、組織の羊膜上皮、血管（２つの動脈及び１つの静脈）、及び、ホウォートンゼリーストローマを含む固形成分をいずれも除外することなく完全な臍帯固形組織を含む。
【００３０】
ＭＳＣ含有組織の他の例としては、骨髄、脂肪組織、血液、羊水、歯髄及び胎盤が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
ＭＳＣの治療効力は、抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、ＭＳＣの遊走分化を含むが、これらに限定されない。
【００３２】
他の実施形態において、温熱条件は、温熱処置に加えて、以下：機械的切断又は撹拌、ＨＧＭＢ１、Ｓ１００Ｂなどのダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）及び二本鎖ＲＮＡなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）、熱ショックタンパク質、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）など）刺激、幹細胞遊走関連タンパク質（ＣＸＣＬ１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢなど）刺激及び低酸素状態（＜２０％ Ｏ２）のうちの１つ以上を含んでもよい。
【００３３】
ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）は、ＨＧＭＢ１（クロマチン関連タンパク質高移動度群ボックス1）、Ｓ１００Ｂ、プリン代謝産物（ＡＴＰ、アデノシン、及び尿酸）を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）は、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、及び二本鎖ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
熱ショックタンパク質は、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ１１０を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
幹細胞遊走関連タンパク質は、ＣＸＣＬ１２（ストローマ細胞由来因子−１：ＳＤＦ−１）、ＣＣＬ２（単球走化性タンパク質−１：ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ５（活性化制御で、正常Ｔ細胞で発現、分泌される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）：ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ８、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
請求項３に記載のヒト臍帯組織からＭＳＣを単離するための方法では、好ましくは、酵素消化無しでの機械的切断により、組織分離が得られる。
【００３９】
当該方法では、ヒト臍帯組織は、小さな切片（直径１〜１．５ｍｍ）に機械的に切断され、組織培養に直接使用され、ここで切断又は撹拌による機械的損傷後の環境を維持するために、この切片の洗浄は行われない。
【００４０】
最適化培地及び補助剤（成長因子（ｂＦＧＦ、ＥＧＦ）及びホルモン（デキサメタゾン）、抗生物質（Ｐｅｎ／Ｓｔｒａｐ、アムホテリシンＢ）、血清を含む又は含まない、ゼノ（ｘｅｎｏ）を含む又は含まないものなど）でＭＳＣを培養及び増殖する方法。
【００４１】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患若しくは肝疾患及び癌を処置するためのＭＳＣの組成物及び使用も、提供される。
【００４２】
自己免疫疾患を処置する方法は、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性膵炎、１型糖尿病、全身性硬化症を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
肝疾患の治療方法の対象は、肝不全、肝硬変、脂肪肝、肝炎を含むがこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１（Ａ）〜（Ｂ）は、ＦＢＳシステムにおいて各群から単離され得る間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の総数を示す。３８℃で１時間誘導された組織ブロックからＭＳＣの数がより高い「クローリング（ｃｒａｗｌｉｎｇ）」であることを示す表（Ａ）及びグラフ（Ｂ）が提供される。各ブロックは平均して、３７℃の群よりも約２０％多いＭＳＣを生成した。
【図２】図２（Ａ）〜（Ｅ）は、ＦＢＳシステムにおいて温熱条件下で各群から単離されたＭＳＣを示す。（Ａ）３７℃、（Ｂ）３８℃１時間、（Ｃ）３８℃３０分、（Ｄ）３９℃３０分及び（Ｅ）３９℃１時間で単離された細胞の代表画像が提供される。
【図３】図３（Ａ）〜（Ｂ）は、ＵＧシステムにおいて各群から単離され得るＭＳＣの総数を示す。３８℃又は３９℃で１時間温熱にて誘導された組織ブロックから、ＭＳＣの数がより高い「クローリング」であることを示す表（Ａ）及びグラフ（Ｂ）が提供される。各ブロックでは、３７℃の群よりも４０％〜８０％多いＭＳＣが生成された。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｅ）は、ＵＧシステムにおいて温熱条件下で各群から単離されたＭＳＣを示す。ＦＢＳシステムにおいて（Ａ）３７℃、（Ｂ）３８℃１時間、（Ｃ）３８℃３０分、（Ｄ）３９℃３０分及び（Ｅ）３９℃１時間で単離された細胞の代表画像が提供される。
【図５】図５（Ａ）〜（Ｅ）は、ＵＧシステムにおいて温熱条件下で各群から単離されたＭＳＣの形態を示す。ＵＧシステムにおいて（Ａ）３７℃、（Ｂ）３８℃１時間、（Ｃ）３８℃３０分、（Ｄ）３９℃３０分及び（Ｅ）３９℃１時間で単離された細胞の代表画像が提供される。
【図６】図６は、ＦＢＳシステムにおける３８℃／１時間群の細胞が、継代と共に最も急速に増加したことを示す。ＦＢＳシステムにおいて各温熱条件下で単離された異なる継代のＭＳＣの総数が提供される。
【図７】図７は、ＵＧシステムにおける３８℃／１時間群の細胞が、継代と共に最も急速に増加したことを示す。ＦＢＳシステムにおいて各温熱条件下で単離された異なる継代のＭＳＣの総数が提供される。
【図８】図８（Ａ）〜（Ｂ）は、（Ａ）ＦＢＳ又は（Ｂ）ＵＧシステムにおけるＰ６で各群において単離された細胞の総数を示す。
【図９】図９は、細胞直径がＦＢＳシステムにおいて継代と共に増加することを示す。ＦＢＳシステムにおいて異なる温熱条件下で単離された各継代のＭＳＣの細胞直径を示すグラフが提供される。
【図１０】図１０は、細胞直径がＵＧシステムにおいて継代と共に増加することを示す。ＵＧシステムにおいて異なる温熱条件下で単離された各継代のＭＳＣの細胞直径を示すグラフが提供される。
【図１１】図１１は、温熱で単離された細胞が十分なＭＳＣ表現型を表すことを示す。異なる群において単離されたＭＳＣのフローサイトメトリーの結果（バイオマーカーＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲ（陰性）並びにＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５（陽性）を使用）が提供される。
【図１２】図１２（Ａ）〜（Ｄ）は、全ての群のＭＳＣが良好な増殖速度を表すことを示す。（Ａ及びＢ）ＦＢＳ又は（Ｃ及びＤ）ＵＧシステムにおける異なる温熱条件下で単離されたＭＳＣの増殖速度（ＣＣＫ−８細胞増殖分析）のグラフが提供される。
【図１３】図１３（Ａ）〜（Ｅ）は、ＦＢＳシステムにおいて、３９℃誘導群からのＭＳＣの老化が他の群のものより優位に高いことを示す。ＦＢＳシステムにおいて（Ａ）３７℃、（Ｂ）３８℃１時間、（Ｃ）３８℃３０分、（Ｄ）３９℃３０分及び（Ｅ）３９℃１時間で単離されたＭＳＣに対するＳＡ−β−ｇａｌ染色の代表画像が提供される。
【図１４】図１４（Ａ）〜（Ｅ）は、ＵＧシステムにおいて、３９℃誘導群からのＭＳＣの老化が他の群のものより優位に高いことを示す。ＵＧシステムにおいて（Ａ）３７℃、（Ｂ）３８℃１時間、（Ｃ）３８℃３０分、（Ｄ）３９℃３０分及び（Ｅ）３９℃１時間で単離されたＭＳＣに対するＳＡ−β−ｇａｌ染色の代表画像が提供される。
【図１５】図１５（Ａ）〜（Ｂ）は、各温熱条件下で単離されたＭＳＣが、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−αの分泌を有意に阻害し得ることを示す。ＰＢＭＣのＴＮＦ−α分泌に対する（Ａ）ＭＳＣ−ＦＢＳ又は（Ｂ）ＵＧ−ＦＢＳからの免疫抑制効果を示すグラフが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（詳細な説明）
いくつかの実施形態は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）含有組織又は幹細胞を直接処置して向上した増殖及び治療効力（抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、遊走、ホーミング、生着、又は分化特性を含む）を有するＭＳＣを生成するための他の疾患模倣条件の存在又は不在下での温熱様条件の使用に関する。ごく一般的な言い方をすると、少なくとも向上した増殖及び／又は治療特性を有する幹細胞集団を生成するために、他の疾患模倣条件の有無にかかわらず温熱条件で幹細胞含有組織をインキュベートすること、温熱条件の組織から幹細胞集団を単離すること、疾患模倣条件の幹細胞集団の存在又は不在化で温熱への曝露の有無にかかわらずインビトロで幹細胞集団を培養することにより、このような実施形態は実施され得る。ここで開示される幹細胞を用いる方法はまた、本発明の実施形態として企図される。
【００４６】
温熱
用語「温熱」、「温熱条件」及び「高温」は、通常のそれらの意味を有し、及び「正常な生理的ヒト体温である摂氏３７度よりも高い温度」を指すものとする。温熱条件は一般的に、摂氏３７度より高い、好ましくは摂氏３７〜４１度、より好ましくは摂氏３８度である任意の温度を意味する。正常な生理的ヒト体温は、異なる組織又は器官において変わり、よっていくつかの実施形態において、幹細胞含有組織用に使用される条件は、組織及び器官の起源に依存し、このような条件は、当業者に公知である。生理的体温は、健康な組織又は器官において通常見いだされる酸素レベルの範囲である。
【００４７】
本発明による使用のための疾患模倣条件は、炎症性サイトカイン、機械的切断又は攪拌、ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）、熱ショックタンパク質、幹細胞遊走関連タンパク質及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
いくつかの実施形態において、温熱条件は、摂氏約３７〜４１度の温度を含む。追加の実施形態において、温熱条件は、摂氏約３７．５〜約３８．５度の温度を含む。更なる実施形態において、温熱条件は、摂氏約３８度の間の温度を含む。いくつかの実施形態において、温熱条件は、一般的にこれらの範囲のいずれか又は特定の細胞に対する生理的温熱条件を模倣するこれらの範囲のいずれかの間の温熱条件に該当する。従って、いくつかの実施形態において、温度の培養条件は、摂氏３７．１、３７．２、３７．３、３７．４、３７．５、３７．６、３７．７、３７．８、３７．９、３８．０、３８．１、３８．２、３８．３、３８．４、３８．５、３８．６、３８．７、３８．８、３８．９、３９．０、３９．１、３９．２、３９．３、３９．４、３９．５、３９．６、３９．７、３９．８、３９．９、４０．０、４０．１、４０．２、４０．３、４０．４、４０．５、４０．６、４０．７、４０．８、４０．９、４１．０度又はこれらの数字のいずれかの間にある任意の他の温度条件に設定される。
【００４９】
１つの実施形態において、温熱条件は、幹細胞の生成中に導入される。当業者は、幹細胞生成のための温熱条件の導入のタイミングが、所望する幹細胞の特徴に依存することを理解するであろう。温熱条件は、幹細胞の生成中の任意のタイミングで導入され得る。温熱条件は、幹細胞含有組織の収集後、機械的又は酵素的方法によりこのような組織試料を任意の大きさの切片に分離後、幹細胞の初代培養（例えば外植）中、幹細胞のインビトロ拡張中（例えば、複数の細胞継代にわたって）、プライミング中（例えば、幹細胞が被験体への注入前の所望の生物学的活性を呈するように誘導されるとき）及びそれらの組み合わせを含むタイミングで導入されるが、これらに限定されない。
【００５０】
ＭＳＣ含有組織及び／又はＭＳＣは、高められた増殖速度及び治療効力（本明細書で開示されるような、抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、遊走、ホーミング、生着、又は分化特性を含む）を有する幹細胞の生成を可能にする任意の方法下で温熱条件に曝露され得る。幹細胞の増殖速度を指すのに使用される場合、「向上した」は、幹細胞の有糸分裂細胞の分裂速度における任意の測定可能な増加を意味する。幹細胞の治療効力を指すのに使用される場合、「向上した」は、幹細胞がインビトロ培養において拡張及び継代する際の、幹細胞の抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、遊走、ホーミング、生着又は分化特性を維持すること、又は喪失を阻害することを意味する。
【００５１】
生理的又は温熱培養条件は、本明細書に記載の温熱条件の範囲に到達可能な市販のチャンバーを使用することにより維持できる。温熱条件の温度に予め温められ、培養物の底部を温度制御加熱プラットフォームに接触させることにより維持された培養培地で幹細胞含有組織及び／又は幹細胞をインキュベートすることにより、温熱培養条件はまた、達成され得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の温度制御チャンバー、予め温めた培養培地及び温度制御加熱プラットフォームのうちいずれか２つ又は全ての方法が、温熱培養条件を達成するために使用され得る。
【００５２】
１つの実施形態において、ＭＳＣ含有組織及び／又は幹細胞が温熱条件に曝露される時間の長さは、制御される。このような実施形態では、幹細胞含有組織及び／又は幹細胞は、本明細書で開示される幹細胞の増殖及び／又は治療効力を向上させる任意の時間の間、温熱条件に曝露され得る。この時間は、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分又はそれ以上であってもよく、この時間は連続的であってもよい（例えば、組織収集からインビトロで培養した幹細胞の収集までの全時間）。培養物が温熱曝露の時間枠内にはない場合、培養物に対する典型的なインキュベーション条件は、５％ＣＯ２，２０％Ｏ２、湿度１００％、温度が摂氏約３７度である。 
【００５３】
間葉系幹細胞含有組織及び間葉系幹細胞
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）含有組織及びＭＳＣで実施されるいくつかの実施形態において、本発明は、幹細胞が存在する任意の組織及び本発明の方法下で増大され得る任意の幹細胞（又は幹細胞の組み合わせ）を操作するために使用され得る。本発明による使用のための適切な幹細胞含有組織は、ヒト又は他の哺乳類の臍帯組織、臍帯血、骨髄穿刺液、脂肪組織（すなわち脂肪）、胎盤、羊水、歯髄、末梢血、骨、軟骨、心臓、肺、腎臓、肝臓、脳、脊髄、皮膚及び腫瘍組織を含むが、これらに限定されない。本発明による使用のための適切な幹細胞は、多能性胚性幹細胞、ＭＳＣ、神経幹細胞、造血幹細胞、内皮前駆細胞、肝幹細胞、心臓幹細胞、皮膚幹細胞及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣ含有組織が使用される。すなわち、ＭＳＣ含有組織を処置するために他の疾患模倣条件の存在又は不在下で温熱を用いることにより、向上した増殖及び治療効力（抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、遊走、ホーミング、生着、又は分化特性を含む）を有するＭＳＣが生成される。ＭＳＣは、任意のヒト及び他の哺乳類の組織又は器官から単離され得、よってＭＳＣ含有組織は、ヒト又は他の哺乳類の臍帯組織、臍帯血、骨髄穿刺液、脂肪組織（すなわち脂肪）、胎盤、羊水、歯髄、末梢血、骨、軟骨、心臓、肺、腎臓、肝臓、脳、脊髄、皮膚及び腫瘍組織を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣ含有組織としてヒト臍帯組織が使用される。すなわち、ヒト臍帯組織を処置するために他の疾患模倣条件の存在又は不在下で温熱を用いることにより、向上した増殖及び治療効力（抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、遊走、ホーミング、生着、又は分化特性を含む）を有するＭＳＣが生成される。ヒト臍帯組織は、分娩直後に満期妊娠健康ドナーから無菌条件下で採集される。臍帯又はその切片は、適切な温度（好ましくは摂氏２〜８度）で維持された保存培地を含む滅菌容器において、分娩の臨床現場から処置実験室に輸送される。臍帯組織は、臍帯血が含まれず臍帯血とは異なり、羊膜上皮、２つの動脈及び１つの静脈、並びにホウォートンゼリーを含む。本発明のいくつかの実施形態において、臍帯組織は、温熱曝露及びＭＳＣ単離用のバルクとして使用される。すなわち、組織培養の前に、臍帯組織の成分は除去されない。
【００５６】
いくつかの実施形態によるＭＳＣ含有組織及び／又はＭＳＣ用の培養及び／又は継代条件は、本明細書に記載のＭＳＣ含有組織インキュベーション又はＭＳＣの拡張に適した任意の培養及び／又は継代条件を用いて、好ましくは基本成長培地としてＤＭＥＭ/Ｆ１２を用いて、実施されてもよい。すなわち、これらの実施形態は、向上した増殖及び治療効力（抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、遊走、ホーミング、生着、又は分化特性を含む）を有するＭＳＣを生成するために、本明細書に記載の他の疾患模倣因子の存在又は不在下で温熱と組み合わせた場合、任意の細胞培養及び／又は継代条件を用いて、好ましくは基本成長培地としてＤＭＥＭ/Ｆ１２を用いて実施されてもよい。本明細書で使用する用語「細胞培養及び／又は継代条件」は、基本成長培地、血清、栄養物、追加の成長因子補助剤、継代のための細胞コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）速度、継代中の細胞剥離及び解離用に使用される消化酵素、細胞播種密度、細胞バンク保存又は使用のために採取する細胞（継代）のステージ、及びこれらの組み合わせ、を含むが、これらに限定されない。 
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣ含有組織用の培養条件は、ＭＳＣの目的により、ＭＳＣ含有組織から単離される次のＭＳＣ用に使用される培養条件とは同一であるか又は異なっていてもよい。すなわち、ＭＳＣ含有組織としてヒト臍帯組織を使用する場合、ヒト臍帯組織用の培養条件は、ヒト臍帯組織由来ＭＳＣに対して使用される培養条件とは同一又は異なっていてもよい。
【００５８】
幹細胞バンキング
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される他の疾患模倣因子の存在又は不在下での温熱への幹細胞含有組織、幹細胞自体、又はその両方の曝露後に、向上した増殖及び治療効力（抗炎症、免疫調節、タンパク質分泌、遊走、ホーミング、生着、又は分化特性を含む）を有する、幹細胞の、好ましくはヒト臍帯組織からの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のバンクを生成する方法が提供される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法で生成される、向上した増殖及び治療効力を有するヒト臍帯組織からのＭＳＣは、細胞の適切な段階（継代）でバンクされる（ｂａｎｋｅｄ）。幹細胞の培養がひとたび確立すると、十分な細胞密度（例えば８０〜９０％のコンフルエンス）に到達するときに新鮮な培地に培養物が移送されるものとする。すなわち、細胞密度がコンフルエンスを超えている（例えば、１００％コンフルエンス）状態の細胞の単分子層の形成は、防止又は最小化させるべきである。あるいは、懸濁細胞培養システムにおいて細胞が接着する又は成長するのを防止するために、培養システムが撹拌され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、特定のドナーユニットからの幹細胞用の細胞バンクは、少なくとも１つのマスター細胞バンク（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）及び少なくとも１つのワーキング細胞バンク（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を含む。本明細書で使用される「マスター細胞バンク」は、単一のドナーからのヒト臍帯組織ユニットから調製された幹細胞のプールである。「ワーキング細胞バンク」は、マスター細胞バンク由来の幹細胞のプールである。
【００６１】
１つの実施形態では、細胞バンクにおける幹細胞は、本発明において凍結保存される。細胞の冷凍保存は、例えば、Ｄｏｙｌｅら，１９９５，Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（参照）に記載の方法などの任意の周知の方法に従って実行されてもよい。例えば、限定するのではなく、細胞は、例えばミリリットル当たり約１〜１０×１０６細胞数の密度で、１０〜９０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養培地などの「凍結培地」において懸濁されてもよい。細胞は、ガラス又はプラスチックアンプルに分注され、次いで密閉され、プログラム可能な冷凍庫の凍結チャンバーに移送される。凍結の最適速度は、経験的に決定される。例えば、融解熱を通して1分当たり約−１℃の温度の変化を与える凍結プログラムが、使用されてもよい。一旦アンプルが約−１８０℃到達すると、アンプルは、液体窒素貯蔵エリアに移送される。凍結保存された細胞は、数年間にわたって貯蔵され、凍結保存された細胞の試料を、生存能力及び／又は効力を維持するための貯蔵の確立後、適切な頻度（例えば、６又は１２ヶ月毎）でチェックするものとする。
【００６２】
本明細書で開示される細胞バンクにおける凍結保存された細胞は、解凍により「呼び起こされ（ｗｏｋｅｎ  ｕｐ）」てもよく、次いで、必要に応じて、マスター細胞バンクからワーキング細胞バンクを生成するため、又は、ワーキング細胞バンクから幹細胞治療剤を生成するために、使用されてもよい。解凍は、例えばアンプルを液体窒素から摂氏３７度の水槽に移送することにより、一般的に急速に行われる。アンプルの解凍された内容物は、本発明に記載の継代培養及び拡張のために、例えば成長因子有り又は無しの、１０％ ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ/ＤＦ１２などの適切な培地を含む培養容器に滅菌条件下で即座に移送されるものとする。
【００６３】
いくつかの実施形態において、１）幹細胞含有組織からの幹細胞の遊走を加速させ、幹細胞が親組織から離れて培養で個別に成長するのに必要な時間を減少させること、２）培養における幹細胞の増殖速度を上昇させて、細胞の特定の段階（継代）到達する又は細胞バンク貯蔵若しくは利用のための所望の数の幹細胞を得る時間を減少させることにより、特定の幹細胞含有組織からの幹細胞の製造のために、効率及びスケールアップ能力が向上される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、幹細胞の治療効力は、向上される。このような実施形態において、他の疾患模倣条件の存在又は不在下でその親の幹細胞含有組織、それら自体又は両方を温熱に曝露させることにより、幹細胞は増加した治療効力を得る。幹細胞が、インビトロ、インビボ、又は両方であれ、効力検定における読み取り情報で測定可能な増加を有する場合、幹細胞は向上した治療効力を有するとみなされ、そのことは、インビボ遊走、増殖、生存、生着、抗炎症、免疫調節、因子の分泌、及び／又は分化能力を反映する。
【００６５】
１つの実施形態において、幹細胞は、様々な自己免疫疾患及び障害における使用のために（例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ））提供される。本明細書で使用される用語「自己免疫疾患及び障害」は、例えば、体の免疫系が関節を攻撃して関節の圧痛、腫れ、及び機能障害を引き起こす関節リウマチ、体の免疫系が消化管を攻撃し、腹痛、下痢、発熱、及び体重減少を引き起こすクローン病、体の免疫系が、神経線維を覆うミエリンのオリゴデンドロサイトを攻撃し、神経機能障害を引き起こす多発性硬化症などの、体の免疫系が健康な細胞を攻撃し、攻撃された組織又は器官の通常の機能を損なう状態を指す。他の自己免疫疾患及び障害は、１型糖尿病、乾癬、全身性エリテマトーデス（ループス）、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血、セリアック病を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
他の実施形態において、幹細胞は、様々な肝疾患及び障害における使用のために生成される（例えばＭＳＣ）。本明細書で使用される用語「肝疾患及び障害」は、例えば、様々な原因からの慢性肝疾患により損傷及び肝不全が引き起こされる肝硬変、酒の飲みすぎにより肝炎が引き起こされるアルコール性肝炎など（これらに限定されない）を含む、肝臓に損傷を与える及び／又は肝臓が正常に機能することを妨げる任意の状態を指す。他の肝疾患及び障害は、非アルコール性脂肪性肝疾患及び感染性肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
他の実施形態において、様々な悪性疾患を治療するための薬物送達プラットフォームとしての使用のために、幹細胞は生成される（例えばＭＳＣ）。本明細書で使用される用語「悪性疾患」、「癌」又は「腫瘍」は、異常細胞が制御不能に分裂し、体の組織を破壊する任意の疾患を指す。悪性疾患は、乳癌、結腸癌、肺癌、肝癌、脳癌、及び胃癌を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
いくつかの実施形態において、治療剤としての幹細胞の組成物は、薬学的に許容可能な担体溶液において適切な量の細胞を懸濁させることにより製剤化される。溶液における幹細胞の最終濃度は、ミリリットル当たり１×１０５、ミリリットル当たり２×１０５、ミリリットル当たり５×１０５、ミリリットル当たり１×１０６、ミリリットル当たり１．５×１０６、ミリリットル当たり２×１０６、ミリリットル当たり３×１０６、ミリリットル当たり４×１０６又はミリリットル当たり５×１０６である。他の態様において、溶液における幹細胞の最終濃度は、治療の特定の目的により、ミリリットル当たり１×１０５からミリリットル当たり１×１０７の範囲のいずれかでよい。本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能な」は、ヒト又は他の哺乳類に、全身的に又は局所的に投与されるときに、任意の有害反応又は許容可能な有害反応（もしあるとしても）を引き起こさない担体溶液を意味する。このような担体は無毒で、体において炎症又はアネルギー（ａｎｅｒｇｉｃ）反応を生じず、良好な安全性プロフィールでヒト又は他の哺乳類において使用されている。本発明を実施するための薬学的に許容可能な担体は、例えば培養培地及びリン酸緩衝生理食塩水など、免疫性付与に有用な周知の成分のいずれかを含む。更なる生理学的に許容可能な担体及びその製剤は、周知であり、一般的に例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１８ｔｈ Ｅｄ.,Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ.,Ｅａｓｔｏｎ,Ｐa.,１９９０）及びｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（４ｔｈ Ｅｄ.,Ｒｏｗｅら Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ,Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ,Ｄ.Ｃ.）(参照）（それぞれ、参照することにより組み込まれる）に記載される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明における幹細胞の治療剤は、全身的に又は局所的に被験体に投与される。本明細書で使用される用語「全身的に」は、投与について、全身に作用されるように循環系に幹細胞治療剤を送達することを意図している。全身投与に対する一般的な経路は、静脈内注入、動脈内注入、門脈注入、腹腔内注入、及び鼻腔内注入を含むが、これらに限定されない。用語「局所的に」は、投与について、循環系以外の体の特定の部位（単数又は複数）に幹細胞溶液を送達することを意図している。局所投与に対する一般的な経路は、髄腔内注入、関節内注入、脳内注入、及び組織又は実質器官へ直接注入するいずれかの経路を含むが、これらに限定されない。 
【実施例】
【００７０】
実施例１：温熱条件を用いるＭＳＣ単離処置に対する試験
実験デザイン
【００７１】
【表１】
2021512654.tif 000002
【００７２】
温熱条件下でのＭＳＣ単離
各群の臍帯組織を切断及び接着し、それぞれ３７〜３９℃で３０分又は１時間インキュベートした。培養後、臍帯組織を３７℃で６時間培養し、次いで完成した培養培地（すなわち表ＸにおけるＦＢＳ又はＵＧシステム）を加えた。次いで細胞を約１０日間インキュベートした。細胞を次いでトリプシン処置し、計数した。各群の統計は、以下の通りである。
【００７３】
ＦＢＳシステムにおいて、ＭＳＣの数は、３８℃で１時間誘導した組織ブロックから、より高い「クローリング」であった。各ブロックは、平均して、３７℃の群よりも約２０％多いＭＳＣを生成した（図１及び図２）。
【００７４】
ＵＧシステムにおいて、３８℃又は３９℃で１時間温熱にて誘導された組織ブロックから、ＭＳＣの数がより高い「クローリング」であった。各ブロックでは、３７℃の群よりも４０％〜８０％多いＭＳＣが生成された（図３及び図４）。
【００７５】
この実験の結果より、温熱群の単離効率が３７℃群の単離効率よりも高いこと、３８℃群のＭＳＣ単離効率が３９℃群のＭＳＣ単離効率よりも高いこと、及び各システムにおいて、温熱１時間群が３０分群より効率的であったことが示される。
【００７６】
実施例２：温熱条件を用いて単離されたＭＳＣの拡張に関する試験
結果：
異なる温度で誘導された細胞を、対応する培養培地においてＰ６に向けて拡張させた。各継代の細胞内状態、細胞数及び細胞直径を、増殖中に統計的に分析した。（図５）
【００７７】
ＦＢＳシステムにおいて、細胞形態は、Ｐ６以内（Ｐ６を含む）の継代間では著しく異ならない。細胞数は、細胞の継代と共に、段階的に増加した。３８℃で１時間温熱にて誘導された細胞の総数は、他の群のものより有意に多かった。細胞直径は、継代と共にゆっくり増加し、群間の差は有意ではなかった。
【００７８】
ＵＧシステムにおいて、各群における細胞形態は、Ｐ４後（Ｐ４を含む）、著しく増大した。細胞数は、継代と共に、段階的に増加した。３８℃及び３９℃で１時間温熱にて誘導された細胞の数は、他の群のものより有意に多かった。Ｐ３後（Ｐ３を含む）の細胞の直径は、著しく増大し、３９℃群からの細胞の直径は、他の群のものより優位に大きかった。
【００７９】
２．１．細胞形態
ＦＢＳシステムにおいて、細胞はよく成長し、紡錘状であった。Ｐ３前（Ｐ３を含む）には、群間の形態の差異は、外見では分からず、Ｐ４後（Ｐ４を含む）に３９℃で誘導された細胞は、他の群のものより肉眼で大きかった。
【００８０】
ＵＧシステムにおいて、Ｐ３前（Ｐ３を含む）の各群における細胞は、比較的小さい大きさで群間に可視的な差はなく、よく成長した。しかしＰ４後（Ｐ４を含む）、細胞の大きさは、肉眼で増加した。
【００８１】
２．２．各継代における細胞数
ＦＢＳシステムにおける細胞の総数は、継代と共に、急速に増加した。１時間温熱で誘導した群における細胞の総数は、他の群のものよりも有意に多かった。Ｐ３後（Ｐ３を含む）３８℃／１時間の群の細胞数は、３９℃群のものより有意に多かった。Ｐ６における３８℃／１時間の群の総細胞数は、他の群のものより有意に多く、例えば３７℃の群よりも２．１５倍多い。（図６及び図８）
【００８２】
ＵＧシステムにおける細胞の総数は、各継代でＦＢＳシステムにおける総数より少なかった。１時間温熱で誘導した群における細胞の総数は、他の群のものよりも有意に多かった。Ｐ６における３８℃／１時間群での細胞総数が最も多く、例えば３７℃の群より１．２８倍多い。（図７及び図８）
【００８３】
２．３  各継代における細胞直径
各継代の細胞直径を測定した。継代と共に、細胞直径は、連続して増加した。ＦＢＳシステムにおける細胞直径は、よりなだらかに変化し、群間で有意差は存在しなかった。しかしＵＧシステムでは、細胞間の差は、より大きかった。Ｐ３後（Ｐ３を含む）、３９℃／３０分及び３９℃／１時間の群における細胞直径は、他の群のものよりも有意に大きかった。（図９及び図１０）
【００８４】
考察
１）連続的な培養後の各群における細胞の形態及び数
ＦＢＳシステムの最終収率は、ＵＧ群のものより有意に高く、その中でＦＢＳシステムにおける３８℃／１時間群が、最も高い効率を有した。
２）ＦＢＳシステムにおける３８℃／３０分群の細胞直径が、より安定し、群間差は有意ではなかった。ＵＧシステムにおける３９℃群の細胞直径は、Ｐ３後（Ｐ３を含む）の他の群のものより有意に大きかった。
【００８５】
実施例３：温熱条件を用いて単離されたＭＳＣ（Ｐ６）の機能についての研究
【００８６】
３．１  フローサイトメトリーを用いた表現型アッセイ（図１１）
陰性：ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲ
陽性：ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５
【００８７】
３．２  ＣＣＫ−８細胞アッセイ
全ての群のＭＳＣは、良好な増殖速度を示した。ＦＢＳシステムにおいて、３８℃／１時間群のＭＳＣが、最も高い増殖速度を有し、ＵＧシステムにおいて、３８℃／３０分群のＭＳＣが、最も高い増殖速度を有した。（図１２）
【００８８】
３．３  β−ｇａｌ老化アッセイ
ＦＢＳシステムにおいて、ＳＡ−β−ｇａｌ染色により、３９℃誘導群からのＭＳＣの老化が、他の群からのものより有意に高かったことが示された。（図１３）
【００８９】
ＵＧシステムにおいて、ＳＡ−β−ｇａｌ染色により、３９℃誘導群からのＭＳＣの老化が、他の群からのものより有意に高かったことが示された。（図１４）
【００９０】
３．４  ＴＮＦ−α免疫調節阻害アッセイ
７２時間のＭＳＣとＰＨＡ−ＰＢＭＣとの共培養後、上清におけるＴＮＦ−αの濃度をテストした。結果により、刺激を受けたＰＢＭＣがＴＮＦ−αを分泌でき、ＭＳＣとの共培養が、ＴＮＦ−αの分泌を有意に阻害できることが示される。阻害効果は、ＭＳＣの細胞数と正の相関関係がある。群間でＭＳＣから免疫抑制効果において有意差は存在しなかった。（図１５）
【００９１】
考察
１）ＣＣＫ−８増殖アッセイの結果より、３８℃群における細胞が安定的で、増殖速度は他の群のものより有意に高かった。３９℃群における細胞増殖速度は、他の群のものより有意に低かった。
【００９２】
２）フローサイトメトリーアッセイの結果より、各システムにおけるＰ６まで継代培養された細胞は、ＭＳＣ表現型を表すことが示された。
【００９３】
３）β−ｇａｌ細胞老化テストの結果により、３９℃群における細胞老化が、３８℃及び３７℃群におけるものより高かったことが示されたが、３８℃群と３７℃群との間に、老化における有意差はなかった。３０分及び１時間で誘導された細胞間に有意差はなかった。
【００９４】
４）ＴＮＦ−α免疫抑制アッセイの結果により、両方のシステムのＭＳＣが免疫抑制効果を有し、ＭＳＣの濃度がより高いときは免疫抑制効果がより強かったことが示された。
【００９５】
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「により特徴付けられる」と同義であり、包括的又は非限定的であり、追加の、列挙されない要素又は方法ステップを排除しない。
【００９６】
本発明ではＭＳＣに焦点が当てられている一方、温熱条件を使用することが、任意の種類の幹細胞の増殖及び治療機能を向上させるために、潜在的に使用され得ることが理解される。従って、向上した増殖及び治療機能を有する幹細胞を生成するための、任意の種類の幹細胞又は任意のそれらの起源の組織を処置する温熱条件の利用は、本発明の範囲内である。
【００９７】
上記の記載は、本発明のいくつかの方法及び物質を開示する。本発明は、方法及び物質における改変並びに製造方法及び装置における変更が可能である。このような変更は、本開示の考慮又はここで開示される本発明の実施から当業者に明らかになるであろう。結果として、本発明が、ここで開示される特定の実施形態に限定されることは意図されず、しかし本発明が、本発明の範囲及び趣旨内に入る変更及び代替を全て包含することを意図しない。
【００９８】
公開及び非公開出願、特許、及び参照文献を含む（しかしこれらに限定されない）、本明細書で引用した全ての参照は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれ、ここで本明細書の一部とされる。参照として組み込まれる公開物及び特許又は特許出願が、本明細書に含まれる開示に相反する範囲では、本明細書は、このように相反するものに取って代わる及び／又は優先することを意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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