(57)【要約】  本発明は、慢性B型肝炎の治療のための免疫化レジメンにおいて用途が見出され得る免疫原性組成物及びそれらの組み合わせに関する。免疫原性組成物は、HBs、HBc、HBcに融合したヒトインバリアント鎖（hIi）をコードするポリヌクレオチドを含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス（ChAd）ベクターを含む。別の免疫原性組成物は、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（MVA）ベクターを含む。別の免疫原性組成物は、組換えHBs、C末端切断型組換えHBc、並びにMPL及びQS-21を含有するアジュバントを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド、B型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードするポリヌクレオチド、及びHBcに融合したヒトインバリアント鎖(hIi)をコードするポリヌクレオチドを含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
ChAdベクターが、ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7及びPan 9からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
ChAdベクターが、ChAd155であり、hIi、HBc、2A及びHBcをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
ベクターが、配列番号7若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列、又は配列番号12若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列を含むhIiをコードするポリヌクレオチドに融合している、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列を含むHBc、並びに配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列を含むHBsをコードするポリヌクレオチドを含み、
HIi-HBc及びHBsをコードするポリヌクレオチドが、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込む配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによって分離される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
ベクターが、配列番号9のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は配列番号15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ベクターが、配列番号10に示されるヌクレオチド配列又は配列番号14に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードするポリヌクレオチドを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項８】
HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドが、口蹄疫ウイルス（FMDV）の2A切断領域をコードするポリヌクレオチドによって分離される、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ベクターが、配列番号11若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列を含むHBc、及び配列番号1若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列を含むHBsをコードするポリヌクレオチドを含み、HBc及びHBsをコードするポリヌクレオチドが、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込む配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによって分離される、請求項７又は８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
ベクターが、配列番号5のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
ベクターが、配列番号6に示されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、C末端切断型組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL及びQS-21を含有するアジュバントを含む、免疫原性組成物。
【請求項１３】
切断型組換えHBcが、野生型B型肝炎コア抗原タンパク質のアミノ酸1〜145、1〜146、1〜147、1〜148又はアミノ酸1〜149を含む、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
組換えHBc及び組換えHBsを1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1以上（例えば3:1〜5:1、例えば4:1）の比で含む、請求項１２又は１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
組換えHBs（配列番号1）、HBcのアミノ酸1〜149（配列番号2）、並びにMPL、QS-21、及びリン酸塩緩衝食塩溶液中のジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
以下：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物；
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物;並びに
c)組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)及びアジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせ。
【請求項１７】
前記組み合わせの構成要素a)の組成物が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物であり、前記組み合わせの構成要素b)の組成物が、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物であり、前記組み合わせの構成要素c)の組成物が、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組成物である、請求項１６に記載の免疫原性組み合わせ。
【請求項１８】
以下の構成要素：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物;
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物;並びに
c)組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)及びアジュバントを含む組成物
を、CHBの治療のために順次又は同時に構成要素を投与するための説明書と共に含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性B型肝炎の治療のための免疫化レジメンにおいて用途が見出され得る新規な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
B型肝炎ウイルス(HBV)感染症は、主要な公衆衛生問題である。世界中で、およそ2億5700万人が、HBVに感染している[WHO, 2017]。HBV感染症の臨床経過及び転帰は、主として感染時の年齢、及びウイルスと宿主免疫応答との間の複雑な相互作用によって駆動される[Ott, 2012; Maini, 2016］。したがって、HBVへの曝露は、自然に消散する急性肝炎をもたらし得るか、又は様々な形態の慢性感染症、例えば、不活性B型肝炎表面抗原(HBsAg)キャリア状態、慢性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌腫(HCC)に進行し得る[Liaw, 2009]。成人人口におけるHBsAgの保有率は、＞2%であり、東南アジア及び中国では5〜8%の割合、及びアフリカ地域では＞8%の割合である。慢性B型肝炎感染症を有する人(血清HBsAgが6ヶ月を超えて検出されると定義される)の15〜40%は、肝臓の続発症を発症し、その中で肝硬変(LC)、肝代償不全及びHCCが主な合併症である。
【０００３】
幼児において一般的に行われている予防的B型肝炎免疫化の実施は、多くの流行国においてB型肝炎の発生率及び有病率を低減するのに非常に有効であるが、それは、青年及び成人における慢性B型肝炎感染症(CHB)の有病率の強力な減少をまだもたらしておらず、導入後数十年まではHBV関連死に影響を与えるとは予想されていない。2015年、B型肝炎は、887,000人の死亡の原因となり、大部分が肝硬変及びHCCによるものであった[WHO, 2017]。
【０００４】
慢性B型肝炎の臨床管理は、疾患の進行を予防し、その結果としてHCCの発症を予防することによって、生存及び生活の質を改善することを目的とする[Liaw, 2013]。現在の治療戦略は、主に、HBV誘導性肝疾患の安定化を達成し、進行を予防するために、HBV DNA複製の長期抑制に基づく。血清HBV DNAレベルは、現在の全ての治療様式の基礎となるエンドポイントである。(検出可能な)B型肝炎e抗原(HBeAg)の喪失の達成は、別の貴重なバイオマーカーであるが、HBsAgの喪失は、HBV複製及びウイルスタンパク質発現の大幅な抑制を示すため、抗HBs血清変換の有無にかかわらず、「機能的治癒」を表す最適なエンドポイントと一般的に見なされている[Block, 2017; Cornberg, 2017]。現在、CHB患者には、ペグ化インターフェロンアルファ(PegIFNα)によるか、又はヌクレオチド（ヌクレオシド）類似体(NA)による、2つの主な治療選択肢がある[EASL, 2017]。有限期間の治療による長期免疫制御の誘導を目的とするPegIFNαは、持続的な、治療を離れた(off-treatment)制御を達成し得るが、永続的なウイルス学的応答及びB型肝炎表面抗原(HBsAg)喪失は、少ない割合の患者に限られる。さらに、その乏しい忍容性、及び長期的な安全性の懸念のため、かなりの数の患者が、このタイプの治療には不適格である。
【０００５】
NAは、HBVポリメラーゼ逆転写酵素活性の阻害を通してDNA複製を抑制することによって作用する。HBV治療のために欧州で承認されたNAとしては、HBV抵抗性に対する高障壁と関連するエンテカビル(entecavir、ETV)、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩(tenofovir disoproxil fumarate、TDF)及びテノホビルアラフェナミド(tenofovir alafenamide、TAF)、並びにHBV抵抗性に対する低障壁と関連するラミブジン(lamivudine、LAM)、アデホビルジピボキシル(adefovir dipivoxil、ADV)及びテルビブジン(telbivudine、TBV)が挙げられる。抵抗性に対する高障壁を有する強力なNAによる治療の主な利点は、大多数の服薬遵守患者においてHBV DNA抑制をもたらすその予測可能な高い長期抗ウイルス効力、及びその好ましい安全性プロファイルである。NAは通常HBV根絶を達成せず、NAの中断はHBV再発をもたらし得るため、NA治療の不利な点は、その長期的な治療レジメンである[Kranidioti, 2015]。機能的治癒を表すHBsAg喪失は、現在、CHBにおけるゴールドスタンダードの治療エンドポイントである[Block, 2017; Cornberg, 2017]が、NA治療ではめったに達成されない[Zoutendijk, 2011]。
【０００６】
HBsAg血清クリアランスの低い割合[Zoutendijk, 2011]及びNAを離れた(off-NA)ウイルス再発の高いリスク[Kranidioti, 2015]のため、ほとんどの患者は、長期又はさらには無期限のNA療法下に維持され、これは、療法に対する患者コンプライアンスの低下、金銭的コストの増加、並びに長期曝露による薬物毒性及び薬物耐性変異のリスクの増加と関連し得る[Terrault, 2015]。したがって、有限のレジメンで「機能的治癒」を達成するために、NA療法を補う新しい戦略が必要である。
【０００７】
現在探求されている新しい治療戦略は、新しい抗ウイルス戦略、並びにHBV特異的適応免疫応答をブーストする、又は肝内自然免疫を活性化する新規免疫療法戦略を含む[Durantel, 2016]。これまでのところ、これらの実験的治療のいずれも、有効であることが示されていない。評価されたワクチン接種戦略の中で、いずれも、ウイルスに対する免疫制御を回復させるのに非常に重要である、HBVコア抗原(HBcAg)に対する頑強な多機能性CD8+ T細胞応答を誘導することはできなかった[Lau, 2002; Li, 2011; Liang, 2011; Bertoletti, 2012; Boni, 2012]。HBV表面及び/又はプレS（PreS）抗原に基づく組換えワクチンに対する初期の努力は、予備的に抗体応答を誘導したが、HBV特異的CD8+ T細胞応答を誘導せず、臨床的又はウイルス学的な利益はなかった[Jung, 2002; Vandepapeliere, 2007]。HBVエンベロープを発現するDNAワクチンは、HBsAg及びHBcAgに特異的なT細胞応答を回復させることができず、したがって、NA中断後、患者において再発のリスクを減少させなかった[Fontaine, 2015]。新しい送達系を用いて、S、プレS1/S2をコードするDNAワクチン(プライムワクチン)及びMVAウイルスベクターワクチン(ブーストワクチン)は、T細胞誘導又はウイルス血症の低減を示さず、このことは、HBVプレS及び表面抗原単独が、患者を治癒するのに十分ではなかったことを示唆した[Cavenaugh, 2011］。より最近では、複数のHBV抗原及び新しい送達系を標的とするワクチン戦略が調査されている。組換えHBsAg/HBcAgワクチンは、患者の半分のみで、非常に低いレベル(すなわち、約50IU/ml)までウイルス量の減少をもたらした[Al-Mahtab, 2013]。S、プレS1/S2、コア、ポリメラーゼ及びXタンパク質を、遺伝的にアジュバント化されたIL-12と共にコードするDNAワクチンは、ラミブジン(lamivudine)と共に、患者の半分において多特異的T細胞応答及びウイルス量の＞2 log10減少を誘導した。しかし、HBsAgの定量的検出における変化、HBsAgの喪失、又はHBsAg血清変換は、いずれの患者でも観察されなかった[Yang, 2012]。GS-4774ワクチンは、HBVの大S、コア、及びXタンパク質を発現する酵母ベースのT細胞ワクチンであるが、ウイルス抑制CHB患者においてHBsAgの顕著な低減をもたらさなかった[Lok, 2016]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ウイルス学的又は臨床的再発無しに、患者が安全にNA療法を中断できるようにするために、HBsAgを取り除くことができる治療に対する満たされていない必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド、B型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸、及びHBcに融合したヒトインバリアント鎖(hIi)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む、免疫原性組成物が提供される。該組成物は、該組成物の、少なくとも1つの他の免疫原性組成物を用いたプライム-ブーストレジメンにおける投与により慢性B型肝炎を治療するための方法において用途が見出され得る。
【００１０】
さらなる態様では、B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む、免疫原性組成物が提供される。該組成物は、該組成物の、少なくとも1つの他の免疫原性組成物を用いたプライム-ブーストレジメンにおける投与により慢性B型肝炎を治療するための方法において用途が見出され得る。
【００１１】
さらなる態様では、組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、C末端切断型組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL(3-DモノホスホリルリピドA)及びQS-21(キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)の樹皮から精製されたトリテルペングリコシド)を含有するアジュバントを含む、免疫原性組成物が提供される。該組成物は、該組成物の、少なくとも1つの他の免疫原性組成物を用いたプライム-ブーストレジメンにおける投与により慢性B型肝炎を治療するための方法において用途が見出され得る。
【００１２】
さらなる態様では、以下：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物；
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物; 及び
c)組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)及びアジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００１３】
該免疫原性組み合わせは、該組成物のプライム-ブーストレジメンにおける投与により慢性B型肝炎（CHB）を治療するための方法において用途が見出され得る。
【００１４】
該免疫原性組み合わせは、該組成物の順次又は同時投与によりヒトにおいてCHBを治療するための方法において用途が見出され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ChAd155-HBV(hIi有り及び無し)による一次免疫化の14日後、及びMVA-HBVブースター免疫化の7日後の、HBc特異的(A)及びHBs特異的(B)CD8+ T細胞応答(個々の動物(中央値と共に)が表される)。
【図２】ChAd155-HBV(hIi有り及び無し)による一次免疫化の14日後、及びMVA-HBVブースター免疫化の7日後の、HBc特異的抗体応答(個々の動物(幾何平均力価(GMT)と共に)が表される)。
【図３】NaCl、50μlのAS01B-4中に製剤化されたHBc、HBs又はHBc-HBsの3回目の投与の7日後の、HBc及びHBs特異的CD4+ T細胞応答(5匹の動物のプール/群(中央値と共に)が表される)。
【図４】NaCl、50μlのAS01B-4中に製剤化されたHBc、HBs又はHBc-HBsの3回目の投与の7日後の、HBs特異的CD8+ T細胞応答(5匹の動物のプール/群(中央値と共に)が表される)。
【図５】NaCl、50μlのAS01B-4中に製剤化されたHBc、HBs又はHBc-HBsの3回目の投与の14日後の、抗HBc及び抗HBs抗体応答(個々の動物(幾何平均及び95%CIと共に)が表される)。
【図６Ａ−Ｂ】NaCl、HBc-HBs、HBc-HBsとアラム、HBc-HBsとAS01B-4、又はHBc-HBsとAS01E-4の3回目の投与の7日後の、HBs(A)及びHBc(B)特異的CD4+ T細胞応答(5匹の動物のプール/群(中央値と共に)が表される)。
【図６Ｃ】NaCl、HBc-HBs、HBc-HBsとアラム、HBc-HBsとAS01B-4、又はHBc-HBsとAS01E-4の3回目の投与の7日後の、HBs特異的CD8+(C)T細胞応答(5匹の動物のプール/群(中央値と共に)が表される)。
【図７】NaCl、HBc-HBs、HBc-HBsとアラム、HBc-HBsとAS01B-4、又はHBc-HBsとAS01E-4の3回目の投与の14日後の、HBs(A)及びHBc(B)特異的抗体応答(個々の動物(幾何平均及び95%CIと共に)が表される)。
【図８Ａ】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの2回目及び4回目の投与の7日後の、HBc(A)特異的CD8+ T細胞応答(個々の動物(中央値と共に))。
【図８Ｂ】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの2回目及び4回目の投与の7日後の、HBs(B)特異的CD8+ T細胞応答(個々の動物(中央値と共に))。
【図９】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの2回目及び4回目の投与の7日後の、HBc(A)又はHBs(B)特異的CD4+ T細胞応答(個々の動物(中央値と共に))。
【図１０】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの4回目の投与の7日後の、肝臓浸潤リンパ球中のHBc及びHBs特異的CD4+(A)及びCD8+(B)T細胞(3又は4匹の動物のプール(中央値と共に))。
【図１１】プライムブーストワクチンレジメン後のHBc特異的(A)及びHBs特異的(B)抗体応答(個々の動物(幾何平均と共に)が表される)。
【図１２】PBS又はChAd155-mIi-HBVベクター(109vp)の1回目及び2回目の注射の2週間後の、mIi、HBc及びHBs特異的IFNγELISpot応答。
【図１３】1回目及び2回目の注射の2週間後の、CB6F1マウスにおいてChAd155-mIi-HBV(109vp)の2回の投与により誘発された抗mIi抗体応答(ELISA)。
【図１４】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの2回目の投与の7日後及び4回目の投与の7日後の、HBc特異的脾臓(A)又は肝臓(B)CD8+ T細胞(個々の動物(中央値と共に))。
【図１５】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの2回目の投与の7日後及び4回目の投与の7日後の、HBc特異的脾臓(A)又は肝臓(B)CD4+ T細胞(個々の動物(中央値と共に))。
【図１６】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの2回目の投与の7日後及び4回目の投与の7日後の、HBs特異的脾臓(A)又は肝臓(B)CD8+ T細胞(個々の動物(中央値と共に))。
【図１７】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの2回目の投与の7日後及び4回目の投与の7日後の、HBs特異的脾臓(A)又は肝臓(B)CD4+ T細胞(個々の動物(中央値と共に))。
【図１８】23、65及び93日目(NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの投与前、2回目の投与の7日後及び4回目の投与の7日後)における抗HBs(A)及び抗HBc(B)結合抗体応答。
【図１９】38、65及び93日目(NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの1回目、2回目及び4回目の投与の7日後、群1、2、3)又は93日目(群4)におけるマウス(群1、2、3及び4)の血清において測定されたAST(A)及びALT(B)レベル。
【図２０】NaCl、後続の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブースト、又は同時の組換えタンパク質を伴う異種ベクタープライム-ブーストの投与前、2回目の投与の7日後及び4回目の投与の7日後の、AAV2/8-HBV注射マウスの血清におけるHBs抗原レベル。
【図２１】HBc-2A-HBs構築物の構造。
【図２２】hIi-HBc-2A-HBs構築物の構造。
【図２３】アジュバント化HBc、HBs及び様々な比のHBc/HBsによる2回目の免疫化の7日後の、CB6F1マウスの白血球におけるHBc及びHBs特異的CD4+ T細胞の頻度。
【図２４】アジュバント化HBc、HBs及び様々な比のHBc/HBsによる3回目の免疫化の7日後の、CB6F1マウスの白血球におけるHBc及びHBs特異的CD4+ T細胞の頻度。
【図２５】アジュバント化HBc、HBs及び様々な比のHBc/HBsによる2回目及び3回目の免疫化の7日後の、CB6F1マウスの白血球におけるHBs特異的CD8+ T細胞の頻度。
【図２６】アジュバント化HBc、HBs及び様々な比のHBc/HBsによる2回目の免疫化の14日後の、CB6F1マウスにおいて誘導された抗HBc及びHBs液性応答。
【図２７】アジュバント化HBc、HBs及び様々な比のHBc/HBsによる3回目の免疫化の14日後の、CB6F1マウスにおいて誘導された抗HBc及びHBs液性応答。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
配列表
配列番号1: HBsのアミノ酸配列
配列番号2: HBc切断体のアミノ酸配列
配列番号3: 口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサーのアミノ酸配列
配列番号4: 口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサーをコードするヌクレオチド配列
配列番号5: HBc-2A-HBsのアミノ酸配列
配列番号6: HBc-2A-HBsをコードするヌクレオチド配列
配列番号7: hIiのアミノ酸配列
配列番号8: hIiをコードするヌクレオチド配列
配列番号9: hIi-HBc-2A-HBsのアミノ酸配列
配列番号10: hIi-HBc-2A-HBsをコードするヌクレオチド配列
配列番号11: HBcのアミノ酸配列
配列番号12: hIi代替バリアントのアミノ酸配列
配列番号13: hI代替バリアントをコードするヌクレオチド配列
配列番号14: hIi-HBc-2A-HBsの代替核酸配列
配列番号15: hIi-HBc-2A-HBsの代替アミノ酸配列
【００１７】
発明の詳細な説明
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されるように定義される。
【００１８】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体にわたって、文脈が他に要求しない限り、語「含む(comprise)」、及び「含む(comprises)」及び「含むこと(comprising)」などの変形は、記載される整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を含むことを意味すると理解されるが、いずれの他の整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群も除外するものではない。
【００１９】
本明細書の本文全体にわたっていくつかの文書が引用される。本明細書に引用される各文書(全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書などを含む)は、上記又は下記にかかわらず、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明による開示に先行する権利を与えられないことの承認と解釈されるべきではない。本発明の一態様に関連して本明細書で提供される全ての定義は、本発明の他の態様にも適用される。
【００２０】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書で互換的に使用され、長さ、翻訳時修飾又は翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を指す。融合タンパク質(又は「キメラタンパク質」)は、2つ以上のペプチド結合タンパク質を含む組換えタンパク質である。融合タンパク質は、元々は別個のタンパク質をコードしていた2つ以上の遺伝子の連結により作られる。この融合遺伝子の翻訳は、単一の融合タンパク質をもたらす。タンパク質又はポリペプチドに関して、組換えとは、タンパク質が組換えポリヌクレオチドから発現されることを意味する。
【００２１】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書で互換的に使用され、ヌクレオチドモノマーから作製されるポリマー高分子を指す。適切には、本発明のポリヌクレオチドは、組換え型である。組換え型とは、ポリヌクレオチドが、天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドをもたらす、クローニング、制限又はライゲーションステップ、又は他の手順の少なくとも1つの生成物であることを意味する。
【００２２】
異種核酸配列は、宿主生物において見出される天然に存在する核酸配列から単離されていない、それから導出されていない、又はそれに基づいていない任意の核酸配列を指す。「天然に存在する」とは、天然に見出され、合成的に調製又は改変されていない配列を意味する。配列は、供給源から単離されているが、適切には供給源遺伝子の正常な機能を破壊しないように、(例えば、欠失、置換(変異)、挿入、又は他の改変によって)改変されている場合、供給源から「導出」されている。
【００２３】
適切には、本発明で使用されるポリヌクレオチドは、単離されている。「単離された」ポリヌクレオチドは、その元の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドは、それが天然系において共存する材料の一部又は全てから分離されている場合、単離されている。ポリヌクレオチドは、例えば、それがその天然環境の一部ではないベクターにクローニングされている場合、又はそれがcDNA内に含まれている場合、単離されていると見なされる。
【００２４】
用語「治療すること」は、慢性B型肝炎感染症に関して本明細書で使用される場合、CHBの症状を低減する、CHBの進行を予防する、又はCHBの1つ以上の検出可能なマーカーのレベルを低減する意図での適切な組成物の投与を指す。用語「治療」は、それに応じて解釈されるべきである。例えば、CHBの進行の予防は、ALT(アラニントランスアミナーゼ)レベル、肝線維症又は他の適切な検出可能なマーカーにより示される、肝疾患の発症の予防、又は既存の肝疾患の安定化を含み得る。CHBの他のマーカーは、ウイルス複製の指標である血清HBV DNAレベル、及びウイルス量の指標である血清HBs抗原レベルを含み、したがって、CHBの治療は、血清HBsAg(例えば、定量的イムノアッセイによって決定される)又はHBV DNA(例えば、Cobas(登録商標)HBVアッセイ(Roche)又は同等物によって決定される)のレベルを検出不可能なレベルまで低減すること(HBsAg又はHBV DNAの「クリアリング」)を含み得る。
【００２５】
「同時」投与は、本明細書で使用される場合、同じ進行中の免疫応答中の投与を指し、「同時に」は、それに応じて解釈されるべきである。好ましくは、両方の成分は同時に投与される(例えば、ベクターを含む組成物及びタンパク質を含む組成物の同時投与)が、一方の成分は、他方の成分の数分以内に(例えば、同じ医療予約又は医師の診察で)、又は数時間以内に投与することができる。このような投与は、共投与とも呼ばれる。別個の成分の同時投与は、同じ投与経路、例えば、筋肉内注射により行ってもよい。あるいは、別個の成分の同時投与は、異なる投与経路、例えば、筋肉内注射及び皮内注射、筋肉内及び鼻腔内投与、吸入及び皮下投与などにより行ってもよい。いくつかの実施形態では、同時投与は、アデノウイルスベクター、及びタンパク質成分の投与を指してもよい。他の実施形態では、共投与は、アデノウイルスベクター及び別のウイルスベクター、例えばポックスウイルス、例えばMVAの投与を指す。他の実施形態では、共投与は、アデノウイルスベクター、及びアジュバント化されているタンパク質成分の投与を指す。
【００２６】
「順次」投与は、第1の組成物の投与と、それに続く、かなりの時間後の第2の組成物の投与を指す。2つの順次投与間の期間は、1週〜12ヶ月、例えば、2週〜12週、例えば、1週、2週、4週、6週、8週又は12週、6ヶ月又は12ヶ月である。より具体的には、それは、4週〜8週であり、例えば、順次投与間の期間は、4週であってもよい。したがって、順次投与は、プライム-ブースト設定における最初の投与及びその後の投与、すなわち、最初の投与によって生じる進行中の免疫応答の間に第2の組成物の投与が実施されない場合を包含する。
【００２７】
「免疫原性組み合わせ」は、本明細書で使用される場合、単一の免疫化レジメン、例えばプライム-ブーストレジメンで順次及び/又は同時に投与される複数の別個に製剤化された免疫原性組成物を指し、それぞれの別個に製剤化された免疫原性組成物は、免疫原性組み合わせの構成要素である。
【００２８】
相同性の割合に関しては、2つの配列のペアワイズアラインメントを見ると、2つの配列間の整列された同一の残基(「同一性」)を観察することができる。同一性(又は相同性)の割合は、(a)同一性の数と、参照配列の全長との間の商に100を掛けることによって算出することができる(すなわち、同一性の割合=(同一性の数×100)/参照配列の長さ)。
【００２９】
組成物及び組み合わせ
本発明の一態様では、HBs及びHBcをコードするベクター挿入物を含む、ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7(C7とも呼ばれる)及びPan 9からなる群から選択されるChAdベクター、特にChAd63又はChAd155を含む、免疫原性組成物が提供される。一実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、口蹄疫ウイルス(FMDV)の2A切断領域をコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、FMDVの2A切断領域を組み込むスペーサーをコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、HBcはhIiに融合している。特定の実施形態では、組成物は、hIi、HBc、2A及びHBsをコードするポリヌクレオチドベクター挿入物、例えば、図22に示される構造を有する構築物をコードする挿入物を含むChAd155ベクターを含む。特定の実施形態では、ベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)及びHBs(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする。特定の実施形態では、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)は、hIi(例えば、配列番号7若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列、又は配列番号12若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)に融合している。例えば、HBc(例えば、配列番号11)は、hIi(例えば、配列番号7)に融合しているか、又はHBc(例えば、配列番号11)は、hIi(例えば、配列番号12)に融合している。1つの具体的な実施形態では、ベクターは、ChAd155ベクターである。一実施形態では、組成物は、配列番号9のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、組成物は、配列番号10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、組成物は
、配列番号15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、組成物は、配列番号14に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。
【００３０】
本発明の一態様では、口蹄疫ウイルス(FMDV)の2A切断領域をコードする配列によって分離される、HBc及びHBsをコードするベクター挿入物を含むMVAベクターを含む、免疫原性組成物が提供される。特定の実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、FMDVの2A切断領域を組み込むスペーサーをコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、組成物は、HBc、2A及びHBsをコードするポリヌクレオチドベクター挿入物、例えば、図21に示される構造を有する構築物をコードする挿入物を含むMVAベクターを含む。特定の実施形態では、ベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)及びHBs(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする。一実施形態では、組成物は、配列番号5のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む。一実施形態では、組成物は、配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む。
【００３１】
本発明の一態様では、全長組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、C末端で切断された組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む、免疫原性組成物が提供される。特定の実施形態では、切断型組換えHBcは、例えば、野生型コア抗原タンパク質のアセンブリドメインの145〜149アミノ酸、例えば、野生型B型肝炎コア抗原タンパク質のアミノ酸1〜145、1〜146、1〜147、1〜148又はアミノ酸1〜149を含む、HBcのアセンブリドメインを含む。一実施形態では、組成物は、全長組換えHBs、HBcのアミノ酸1〜149、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む。特定の実施形態では、組換えタンパク質HBs及びHBc抗原は、ウイルス様粒子の形態である。一実施形態では、組成物は、組換えHBc及び組換えHBsを1:1の比で含む。別の実施形態では、組成物中のHBc対HBsの比は、1より大きく、例えば、HBc対HBsの比は、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1以上、とりわけ3:1〜5:1、例えば3:1、4:1又は5:1、特に4:1の比であってもよい。特定の実施形態では、組成物は、組換えHBc及び組換えHBsを4:1以上の比で含む。特定の実施形態では、組成物は、全長組換えB型肝炎表面抗原(HBs)(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)、C末端で切断された組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む。特定の実施形態では、切断型組換えHBcは、HBcのアセンブリドメイン、例えば、HBcのアミノ酸1〜149(例えば、配列番号2又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)を含む。例えば、組成物は、全長組換えHBs（配列番号1）、HBcのアミノ酸1〜149（配列番号2）、並びにMPL、QS-21、及びリン酸塩緩衝食塩溶液中のジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含んでもよい。
【００３２】
さらなる態様では、以下：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物；
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物; 及び
c)組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)及びアジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００３３】
一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素a)の組成物は、HBc及びHBsをコードするベクター挿入物を含む、ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7(C7とも呼ばれる)及びPan 9からなる群から選択されるChAdベクター、特にChAd63又はChAd155を含む。一実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、口蹄疫ウイルス(FMDV)の2A切断領域をコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、FMDVの2A切断領域を組み込むスペーサーをコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、HBcはhIiに融合している。特定の実施形態では、免疫原性組み合わせの要素a)の組成物は、hIi、HBc、2A及びHBsをコードするポリヌクレオチドベクター挿入物、例えば、図22に示される構造を有する構築物をコードする挿入物を含むChAd155ベクターを含む。特定の実施形態では、ベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)及びHBs(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする。特定の実施形態では、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)は、hIi(例えば、配列番号7若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列、又は配列番号12若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)に融合している。例えば、HBc(例えば、配列番号11)は、hIi(例えば、配列番号7)に融合しているか、又はHBc(例えば、配列番号11)は、hIi(例えば、配列番号12)に融合している。1つの具体的な実施形態では、ベクターは、ChAd155ベクターである。一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素a)の組成物は、配列番号9のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素a)の組成物は、配列番号10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素a)の組成物は、配列番号15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素a)の組成物は、配列番号14に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。
【００３４】
一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素b)の組成物は、口蹄疫ウイルス(FMDV)の2A切断領域をコードする配列によって分離される、HBc及びHBsをコードするベクター挿入物を含むMVAベクターを含む。特定の実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、FMDVの2A切断領域を組み込むスペーサーをコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、免疫原性組み合わせの要素b)の組成物は、HBc、2A及びHBsをコードするポリヌクレオチドベクター挿入物、例えば、図21に示される構造を有する構築物をコードする挿入物を含むMVAベクターを含む。特定の実施形態では、ベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)及びHBs(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする。一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素b)の組成物は、配列番号5のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む。一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素b)の組成物は、配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む。
【００３５】
一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素c)の組成物は、全長組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、C末端で切断された組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む。特定の実施形態では、切断型組換えHBcは、例えば、野生型コア抗原タンパク質のアセンブリドメインの145〜149アミノ酸、例えば、野生型B型肝炎コア抗原タンパク質のアミノ酸1〜145、1〜146、1〜147、1〜148又はアミノ酸1〜149を含む、HBcのアセンブリドメインを含む。一実施形態では、免疫原性組み合わせの要素c)の組成物は、全長組換えHBs、HBcのアミノ酸1〜149、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む。特定の実施形態では、組換えタンパク質HBs及びHBc抗原は、ウイルス様粒子の形態である。一実施形態では、組成物は、組換えHBc及び組換えHBsを1:1の比で含む。別の実施形態では、組成物中のHBc対HBsの比は、1より大きく、例えば、HBc対HBsの比は、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1以上、とりわけ3:1〜5:1、例えば3:1、4:1又は5:1、特に4:1の比であってもよい。特定の実施形態では、免疫原性組み合わせの要素c)の組成物は、組換えHBc及び組換えHBsを4:1以上の比で含む。特定の実施形態では、組成物は、全長組換えB型肝炎表面抗原(HBs)(例えば、配列番号1)、C末端で切断された組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む。特定の実施形態では、切断型組換えHBcは、HBcのアセンブリドメイン、例えば、HBcのアミノ酸1〜149(例えば、配列番号2)を含む。例えば、免疫原性組み合わせの要素c)の組成物は、全長組換えHBs（配列番号1）、HBcのアミノ酸1〜149（配列番号2）、並びにMPL、QS-21、及び例えばリン酸塩緩衝食塩溶液中のジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む。
【００３６】
従って、1つの特定の実施形態では、本発明は、以下：
a)hIi、HBc、2A及びHBsをコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む組成物；
b)HBc、2A及びHBsをコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む組成物；並びに
c)組換えHBsタンパク質、組換え切断型HBcタンパク質、並びにMPL、QS-21、及びジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせを提供する。
【００３７】
1つのこのような実施形態では、免疫原性組み合わせは、以下：
a)配列番号9のアミノ酸配列をコードするか、又は配列番号15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む組成物；
b)配列番号5のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む組成物；並びに
c)配列番号1の組換えHBsタンパク質、配列番号2の組換え切断型HBcタンパク質、並びにMPL、QS-21、及びジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む組成物
を含む。
【００３８】
別の実施形態では、免疫原性組み合わせは、以下：
a)配列番号10のポリヌクレオチドベクター挿入物又は配列番号14のポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む組成物；
b)配列番号6のポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む組成物；並びに
c)配列番号1の組換えHBsタンパク質、配列番号2の組換え切断型HBcタンパク質、並びにMPL、QS-21、及びジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む組成物
を含む。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、以下の構成要素：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物;
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物; 並びに
c)組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)及びアジュバントを含む組成物
を、CHBの治療のために順次又は同時に構成要素を投与するための説明書と共に含むキットを提供する。
【００４０】
一実施形態では、キットの構成要素a)の組成物は、HBc及びHBsをコードするベクター挿入物を含む、ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7(C7とも呼ばれる)及びPan 9からなる群から選択されるChAdベクター、特にChAd63又はChAd155を含む。一実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、口蹄疫ウイルス(FMDV)の2A切断領域をコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、FMDVの2A切断領域を組み込むスペーサーをコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、HBcはhIiに融合している。特定の実施形態では、キットの構成要素a)の組成物は、hIi、HBc、2A及びHBsをコードするポリヌクレオチドベクター挿入物、例えば、図22に示される構造を有する構築物をコードする挿入物を含むChAd155ベクターを含む。特定の実施形態では、ベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)及びHBs(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする。特定の実施形態では、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)は、hIi(例えば、配列番号7若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列、又は配列番号12若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)に融合している。例えば、HBc(例えば、配列番号11)は、hIi(例えば、配列番号7)に融合しているか、又はHBc(例えば、配列番号11)は、hIi(例えば、配列番号12)に融合している。1つの具体的な実施形態では、ベクターは、ChAd155ベクターである。一実施形態では、キットの構成要素a)の組成物は、配列番号9のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、キットの構成要素a)の組成物は、配列番号10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、キットの構成要素a)の組成物は、配列番号15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。一実施形態では、キットの構成要素a)の組成物は、配列番号14に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む。
【００４１】
一実施形態では、キットの構成要素b)の組成物は、口蹄疫ウイルス(FMDV)の2A切断領域をコードする配列によって分離される、HBc及びHBsをコードするベクター挿入物を含むMVAベクターを含む。特定の実施形態では、HBs及びHBcをコードするポリヌクレオチドは、FMDVの2A切断領域を組み込むスペーサーをコードする配列によって分離される。特定の実施形態では、キットの構成要素b)の組成物は、HBc、2A及びHBsをコードするポリヌクレオチドベクター挿入物、例えば、図21に示される構造を有する構築物をコードする挿入物を含むMVAベクターを含む。特定の実施形態では、ベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)及びHBs(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする。一実施形態では、キットの構成要素b)の組成物は、配列番号5のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む。一実施形態では、キットの構成要素b)の組成物は、配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む。
【００４２】
一実施形態では、キットの構成要素c)の組成物は、全長組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、C末端で切断された組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む。特定の実施形態では、切断型組換えHBcは、例えば、野生型コア抗原タンパク質のアセンブリドメインの145〜149アミノ酸、例えば、野生型B型肝炎コア抗原タンパク質のアミノ酸1〜145、1〜146、1〜147、1〜148又はアミノ酸1〜149を含む、HBcのアセンブリドメインを含む。一実施形態では、キットの構成要素c)の組成物は、全長組換えHBs、HBcのアミノ酸1〜149、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む。特定の実施形態では、組換えタンパク質HBs及びHBc抗原は、ウイルス様粒子の形態である。一実施形態では、組成物は、組換えHBc及び組換えHBsを1:1の比で含む。別の実施形態では、組成物中のHBc対HBsの比は、1より大きく、例えば、HBc対HBsの比は、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1以上、とりわけ3:1、4:1又は5:1、特に4:1の比であってもよい。特定の実施形態では、キットの構成要素c)の組成物は、組換えHBc及び組換えHBsを4:1以上の比で含む。特定の実施形態では、組成物は、全長組換えB型肝炎表面抗原(HBs)(例えば、配列番号1)、C末端で切断された組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む。特定の実施形態では、切断型組換えHBcは、HBcのアセンブリドメイン、例えば、HBcのアミノ酸1〜149(例えば、配列番号2)を含む。例えば、キットの構成要素c)の組成物は、全長組換えHBs（配列番号1）、HBcのアミノ酸1〜149（配列番号2）、並びにMPL、QS-21、及び例えばリン酸塩緩衝食塩溶液中のジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む。
【００４３】
一実施形態では、キットは、以下の構成要素：
a)配列番号10のポリヌクレオチドベクター挿入物又は配列番号14のポリヌクレオチドベクター挿入物を含むChAd155ベクターを含む組成物；
b)配列番号6のポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む組成物；並びに
c)配列番号1の組換えHBsタンパク質、配列番号2の組換え切断型HBcタンパク質、並びにMPL、QS-21、及びジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む組成物
を、CHBの治療のために順次又は同時に構成要素を投与するための説明書と共に含む。
【００４４】
レジメン
本開示は、強力なCD8+ T細胞応答を誘導するための、B型肝炎コア(HBc)及びB型肝炎表面(HBs)抗原をコードする2つのウイルスベクターを用いた異種プライム-ブーストスケジュールを提供するワクチンレジメンであって、強力な抗原特異的CD4+ T細胞及び抗体応答を誘導するための、アジュバント化組換えHBc及びHBsタンパク質の順次又は同時投与を伴う、ワクチンレジメンを記載する。本開示はさらに、ワクチン組成物として用途が見出され得る免疫原性組成物及び組み合わせを記載する。このような組成物及び組み合わせは、開示されるレジメンにおいて使用され得る。開示されるワクチン組成物及びレジメンは、ヒト慢性HBV感染症のウイルス学的及び免疫学的特徴を再現するマウスモデルにおいて、肝変化の副作用の関連する兆候無しに、HBs及びHBc特異的抗体及びCD8+ T細胞応答、並びにHBs特異的CD4+ T細胞応答を首尾よく回復させた。
【００４５】
本明細書で記載される免疫原性組成物及び免疫原性組み合わせは、ヒトにおいて慢性B型肝炎感染症(CHB)を治療する方法であって、
a)ヒトに、B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物を投与するステップ;
b)ヒトに、B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物を投与するステップ; 及び
c)ヒトに、組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)及びアジュバントを含む組成物を投与するステップ
を含む、方法において用途が見出され得る。
【００４６】
一実施形態では、本方法のステップは、順次実施され、ステップa)がステップb)に先行し、ステップb)がステップc)に先行する。場合により、ステップc)は、繰り返されてもよい。特定の実施形態では、本方法のステップ間の期間は、2〜12週、例えば、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週又は12週である。一実施形態では、本方法のステップ間の期間は、4〜8週である。一実施形態では、本方法による組成物の順次投与間の期間は、4週である。別の実施形態では、ステップc)は、ステップa)及び/又はステップb)と同時に実施される。特定の実施形態では、同時のステップb)及びc)は、繰り返されてもよい。さらなる実施形態では、ステップcが繰り返され、本方法のステップは、以下の順: ステップa)、ステップb)、ステップc)、ステップc)で実施される。特定の実施形態では、本方法のステップ間の期間は、2〜12週、例えば、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週又は12週である。一実施形態では、本方法のステップ間の期間は、4〜8週である。一実施形態では、本方法による組成物の順次投与間の期間は、4週である。
【００４７】
別の態様では、免疫原性組成物及び免疫原性組み合わせは、ヒトにおいて慢性B型肝炎感染症(CHB)を治療する方法であって、
a)ヒトに、i)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物、及び同時に、ii)組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)及びアジュバントを含む組成物を投与するステップ; 及び
b)ヒトに、i)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物、及び同時に、組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)及びアジュバントを含む組成物を投与するステップ
を含む、方法において用途が見出され得る。
【００４８】
一実施形態では、本方法のステップは、順次実施され、ステップa)がステップb)に先行する。場合により、ステップb)は、繰り返されてもよい。場合により、ステップa)は、繰り返されてもよい。一実施形態では、本方法のステップは、ステップa)、続いてステップa)、続いてステップb)の順で実施される。或いは、本方法のステップは、ステップa)、続いてステップb)、続いてステップa)の順で実施されてもよい。場合により、ステップb)は、繰り返されてもよい。一実施形態では、本方法のステップは、ステップa)、続いてステップb)、続いてステップb)の順で実施される。代替の実施形態では、本方法のステップは、ステップb)、続いてステップa)、続いてステップb)の順で実施される。場合により、ステップb)は、2回以上繰り返されてもよい。場合により、ステップa)及びステップb)の両方が、繰り返されてもよい。一実施形態では、本方法のステップは、ステップa)、続いてステップb)、続いてステップb)、続いてステップb)の順で実施される。さらなる実施形態では、本方法のステップは、ステップa)、続いてステップa)、続いてステップb)、続いてステップb)、場合により続いてステップb)の順で実施される。特定の実施形態では、本方法のステップ間の期間は、2〜12週、例えば、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週又は12週である。一実施形態では、本方法のステップ間の期間は、4〜8週である。一実施形態では、本方法による組成物の順次投与間の期間は、4週である。
【００４９】
抗原
HBVの少なくとも9個の遺伝子型(AからI)が同定されており、それらのゲノムは8%を超えて異なっている。所与のHBV遺伝子型内で、4〜8%異なる複数の遺伝子亜型が同定されている。開示される方法において使用するための抗原は、複数の、好ましくは全てのHBV遺伝子型にわたる免疫学的適用範囲を提供するように適切に選択される。B型肝炎コアタンパク質抗原(HBc)は、遺伝子型及び遺伝子亜型にわたって高度に保存されており、B型肝炎表面タンパク質抗原(HBs)配列は、広範な中和応答の誘導を可能にする重要な交差遺伝子型保存(cross-genotype-preserved)B細胞エピトープを含むように適切に選択される。適切には、開示される方法及び組成物において使用するためのHBc及びHBsの配列は、遺伝子型/亜型A2由来のものに基づく。
【００５０】
適切には、開示される方法及び組成物において使用するためのHBs抗原は、小、中、又は大表面抗原タンパク質から導出される。特に、適切なHBs抗原は、HBV adw2株、遺伝子型Aの小(S)タンパク質を含む。例えば、適切なHBs抗原は、アミノ酸配列配列番号1の226アミノ酸を有する。組換えタンパク質として使用される場合、HBs抗原は、好ましくは、ウイルス様粒子に会合する。この抗原は、よく研究された市販のB型肝炎予防ワクチン(エンジェリックスB(Engerix B)、フェンドリックス(Fendrix)、ツインリックス(Twinrix)及びその他)に含まれ、遺伝子型にわたってB型肝炎に対する防御作用があることが実証されている。好ましくは、組換えHBsタンパク質抗原は、酵母から発現され、本発明のワクチン組成物及び方法において使用するために精製される。発現及び精製のための適切な方法は、例えばEP1307473B1から公知である。
【００５１】
B型肝炎コアタンパク質(HBc)は、ウイルスゲノムをパッケージングするヌクレオカプシドシェルの主要な成分である。このタンパク質(183〜185アミノ酸長)は、感染細胞の細胞質で発現され、グリコシル化されないままである。HBcは、149残基のアセンブリドメイン及び34〜36残基のRNA結合ドメイン(C末端における)を含む。開示される方法及び組成物において使用するためのHBc抗原は、全長であっても、又はC末端切断型タンパク質(RNA結合C末端を欠く)、例えば、野生型コア抗原タンパク質のアセンブリドメインの145〜149アミノ酸、例えば、野生型B型肝炎コア抗原タンパク質のアミノ酸1〜145、1〜146、1〜147、1〜148又はアミノ酸1〜149を含んでもよい。切断型タンパク質は、ヌクレオカプシド粒子に会合する能力を保持する。開示される方法及び組成物において使用するのに適したHBc抗原は、HBV adw2株、遺伝子型A由来のアミノ酸配列を有する。組換えタンパク質として使用される場合、HBc抗原は、C末端で野生型から適切に切断され、特に、抗原は、HBcのアミノ酸1〜149であってもよく、例えば、配列番号2のアミノ酸配列を有してもよい。好ましくは、組換えHBcタンパク質抗原は、大腸菌(E. coli)から発現され、本発明のワクチン組成物及び方法において使用するために精製される。大腸菌(E. coli)におけるウイルスタンパク質の組換え発現の方法は、当技術分野で周知である。
【００５２】
組換えタンパク質として使用される場合、HBc抗原は、好ましくは、ウイルス様粒子に会合する。ウイルスベクターから発現される場合、HBc抗原は、全長又は切断型であってよく、例えば、適切には全長HBc抗原(例えば、配列番号11)である。本明細書に開示される方法において使用するための組換えHBsタンパク質抗原の適切な用量は、投与あたり10μg〜投与あたり100μg、例えば、投与あたり10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、又は100μgである。本明細書に開示される方法において使用するための組換えHBc抗原タンパク質の適切な用量は、投与あたり10μg〜投与あたり100μg、例えば、投与あたり10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、又は100μgである。
【００５３】
抗原は、体内で免疫応答、とりわけ抗体の生成を誘導する物質である。抗原は、外来性、すなわち、病原性起源であっても、又は生物自体に由来してもよく、後者は自己抗原(self antigen)又は自己抗原(auto antigen)と呼ばれる。抗原は、MHC分子によって抗原提示細胞の表面上に提示することができる。MHC分子には2つのクラス、MHCクラスI(MHC-I)及びMHCクラスII(MHC-II)がある。MHC-II分子は、小胞体で合成され、MHCクラスIIコンパートメントにおいて小胞体を去る膜結合受容体である。内因性ペプチド、すなわち自己抗原が、MHC-II分子に結合し、提示されて免疫応答を生じるのを防ぐために、新生MHC-II分子は、MHC-II分子のペプチド結合溝をブロックする別のタンパク質であるインバリアント鎖と結合する。ヒトインバリアント鎖(hIi、原形質膜上で発現される場合はCD74としても知られる)は、細胞内及び免疫系全体でいくつかの役割を有する進化的に保存されたタイプII膜タンパク質である[Borghese, 2011］。MHCクラスIIコンパートメントが、貪食されて分解された外来タンパク質を含有する後期エンドソームに融合すると、インバリアント鎖は切断されて、MHC-II分子に結合したCLIP領域のみが残る。第2のステップでは、CLIPは、HLA-DM分子によって除去され、MHC-II分子が外来タンパク質の断片に自由に結合できるようになる。MHCクラスIIコンパートメントが原形質膜と融合すると、前記断片は、抗原提示細胞の表面上に提示され、したがって、他の細胞、主にTヘルパー細胞に外来抗原を提示する。
【００５４】
インバリアント鎖及び抗原の融合物をコードするアデノウイルス発現系が、ワクチン接種に使用される場合、前記抗原に対する免疫応答が増加することが知られており(WO2007/062656(US2011/0293704としても公開され、インバリアント鎖配列を開示する目的で参照により組み込まれる)を参照)、すなわち、インバリアント鎖は、抗原の免疫原性を増強し、hIiなどのインバリアント鎖は、時には、この効果の認識において「遺伝的アジュバント」と呼ばれる。さらに、前記アデノウイルス構築物は、プライム-ブーストワクチン接種レジメンの関係において免疫応答をプライミングするのに有用であることが判明している(WO2014/141176(US2016/0000904としても公開される); 及びWO2010/057501(US2010/0278904としても公開され、インバリアント鎖配列及びインバリアント鎖配列をコードするアデノウイルスベクターを開示する目的で参照により組み込まれる)を参照)。特に、hIi配列及びhIiは、CD8+ T細胞応答を増加させる可能性を有する[Spencer, 2014; Capone, 2014]。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法、使用及び組成物において使用するためのベクター内に含まれるヌクレオチド配列は、hIiをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。開示されるアデノウイルスベクターChAd155-hIi-HBVに含まれ得るhIiについてのアミノ酸配列は、配列番号7に示され、代替配列は、配列番号12に示される。これらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号8及び配列番号13に示される。適切には、hIiポリペプチドがHBc抗原にN末端で融合している融合タンパク質を生成するように、hIiをコードするヌクレオチド配列は、HBc抗原をコードするヌクレオチド配列に融合している。
【００５５】
ベクター
抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド(本明細書では「挿入物」とも呼ばれる)に加えて、本明細書に開示される方法及び組成物において使用するためのベクターはまた、ベクターによりトランスフェクトされた細胞における転写、翻訳及び/又は発現を可能にするように、コード化ポリヌクレオチドに作動可能に連結される従来の制御要素を含んでもよい。したがって、タンパク質抗原をコードするベクター挿入物ポリヌクレオチドは、適切な制御要素を有する発現カセットに組み込まれる。
【００５６】
発現制御要素は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列; 効率的RNAプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化(ポリA)シグナル、例えば、ウサギβ-グロビンポリA; 細胞質mRNAを安定化する配列; 翻訳効率を増強する配列(例えば、コザック(Kozak)コンセンサス配列); タンパク質安定性を増強する配列; 及び、所望の場合、コードされる生成物の分泌を増強する配列を含む。
【００５７】
プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の5'非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。プロモーターの例としては、以下に限定されないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、及び哺乳動物(ヒトを含む)由来のプロモーターが挙げられる。多数の発現制御配列、例えば、内在的、天然、構成的、誘導性及び/又は組織特異的であるプロモーターは当技術分野で公知であり、利用してもよい。
【００５８】
構成的プロモーターの例としては、TBGプロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター(場合によりRSVエンハンサーを有する)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(場合によりCMVエンハンサーを有し、例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照)、CASIプロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター、及びEF1aプロモーター(Invitrogen)が挙げられる。適切には、プロモーターは、CMVプロモーター又はそのバリアント、より適切にはヒトCMV(HCMV)プロモーター又はそのバリアントである。
【００５９】
アデノウイルスベクター
アデノウイルスは、様々な標的組織で非常に効率的な遺伝子導入を達成するその能力、及びその大きな導入遺伝子収容力に起因して、遺伝子導入用途に広く使用されている。通常、アデノウイルスのE1遺伝子は、欠失され、選択したプロモーター、目的の遺伝子のcDNA配列、及びポリAシグナルからなる導入遺伝子カセットで置き換えられ、複製欠損組換えウイルスをもたらす。ヒトアデノウイルスベクターは、動物モデル及びヒトにおいて、導入遺伝子に対するCD8+ T細胞応答の誘導のための強力なベクターであることが示されている。アデノウイルスは、広い親和性（tropism）を有し、複製細胞及び非複製細胞に感染する能力を有する。ヒトアデノウイルスに基づくベクターの臨床適用の主な制限は、一般集団における中和抗体の高い保有率である。代替種から単離されたアデノウイルスは、ヒトにおける既存の抗アデノウイルス免疫の問題を回避するための潜在的なワクチンベクターと考えられている。それらの中で、チンパンジー、ゴリラ又はボノボから導出されるサルアデノウイルスは、抗原の送達、及びヒトにおけるそれらの抗原に対する標的化T細胞及び/又は液性応答の誘発に使用するのに適している可能性がある。サルアデノウイルス、例えば、チンパンジーから導出されるものは、臨床研究において試験されている。チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒト集団において低い血清学的保有率を有し/血清学的保有率を有せず、ヒトにおいて病理学的疾患を引き起こすことが知られておらず、一部のChAdベクターは、臨床グレード材料の生成に以前使用された細胞株、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞293(HEK293)において高力価まで増殖させることができる。
【００６０】
複製不能又は複製欠損アデノウイルスは、少なくとも機能的欠失(又は「機能喪失」変異)、すなわち、遺伝子を完全に除去することなく遺伝子の機能を損なう欠失又は変異、例えば、人為的停止コドンの導入、活性部位又は相互作用ドメインの欠失又は変異、遺伝子の調節配列の変異又は欠失など、あるいはウイルス複製に必須である遺伝子産物をコードする遺伝子(例えば、E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4から選択されるアデノウイルス遺伝子の1つ以上(例えば、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2及び/又はE4 ORF1))の完全な除去を含むように作り変えられているため、複製することができないアデノウイルスである。適切には、E1及びE3遺伝子が欠失される。より適切には、E1、E3及びE4遺伝子が欠失される。
【００６１】
本明細書に開示される方法及び組成物において使用するのに適したベクターは、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクター、例えば、ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7(C7とも呼ばれる)又はPan 9である。そのような株の例は、WO03/000283、WO2005/071093、WO2010/086189及びWO2016/198621に記載されている。ChAd155ベクター(WO2016/198621(ChAd155ベクター配列及び方法を開示する目的で参照により組み込まれる)を参照)は、ChAd3ベクターと同じ系統発生アデノウイルス群(群C)に属する。一実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物において使用するためのベクターは、系統発生群CのChAdベクター、例えば、ChAd3又はChAd155である。1つの具体的な実施形態では、本明細書に開示される慢性B型肝炎を治療する方法は、ヒトに、B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含むChAd155ベクターを含む組成物を投与するステップを含む。本明細書に開示される方法において使用するためのChAdベクターの適切な用量は、投与あたり1×108〜1×1011ウイルス粒子(vp)、例えば、投与あたり約1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010又は1×1011ウイルス粒子(vp)である。
【００６２】
より具体的には、一実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物において使用するためのベクターは、2つのHBVタンパク質: HBc(コア、ヌクレオカプシドタンパク質)及びHBs(小表面抗原)から導出される配列の融合物をコードする複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターChAd155である。特定の具体的な実施形態では、ベクターは、HBc及びHBsを別個のタンパク質にプロセシングするための、口蹄疫ウイルスの2A切断領域をコードする配列を組み込むスペーサーである配列番号3(上流タンパク質のC末端における23アミノ酸尾部及び下流タンパク質のN末端における単一プロリンをもたらす)によって分離される、HBc及びHBsをコードするChAd155である。表面抗原からのコアの切断により、HBsの適切なフォールディングが可能になり、表面抗原に対する抗体応答の生成が可能になる。あるいは、アデノウイルスベクターは、HBs及びHBc抗原の独立した発現を可能にするデュアルプロモーター(バイシストロニック)ベクターであってもよい。
【００６３】
特定の実施形態では、HBcタンパク質をコードする遺伝子のN末端部分は、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスII結合インバリアント鎖p35アイソフォーム(すなわち、hIi又はCD74)をコードする遺伝子に融合してもよい。したがって、本明細書に開示される方法及び組成物において使用するための特定のChAd155ベクターは、hIi、HBc、2A及びHBsを含む、図22に示される構造を有する構築物をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含む。そのような構築物のアミノ酸配列は、配列番号9に示され、構築物のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号10に示される。代替のそのような構築物のアミノ酸配列は、配列番号15に示され、構築物のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号14に示される。
【００６４】
改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクター
改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)は、ヒト及び他の哺乳動物において複製欠損であり、ワクシニアウイルスから導出される。これはポックスウイルス科に属し、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)中でのワクシニアウイルスの570回を超える継代(これは複数の欠失をもたらし、その後、ウイルスは高度に弱毒化され、ヒト及び他の哺乳動物において複製欠損であった)によって天然痘ワクチン接種の安全性を改善するために最初に開発された。複製欠損は、ウイルス及び組換え遺伝子発現が損なわれないようにビリオンアセンブリの後期に生じ、MVAを、哺乳動物に感染を引き起こすことができない効率的な単一ラウンド発現ベクターにする。MVAは、その後、動物モデル及びヒトの両方において、導入遺伝子に対する抗原特異的免疫を誘導するウイルスベクターとして広く使用されている。MVAの記載は、Mayr A, et.al. (1978)及びMayr, A. et.al. (1975)に見出すことができる。
【００６５】
一実施形態では、MVAは、CEF細胞上のワクシニアウイルスの571回目の継代から得られたウイルスシードバッチ460 MGから導出される。別の実施形態では、MVAは、ウイルスシードバッチMVA 476 MG/14/78から導出される。さらなる実施形態では、MVAは、1978年12月31日より前に導出又は生成され、プリオン汚染がない。本明細書に開示される方法において使用するためのMVAベクターの適切な用量は、投与あたり1×106〜1×109プラーク形成単位(pfu)、例えば、投与あたり約1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108又は1×109pfuである。
【００６６】
1つの具体的な実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物において使用するためのベクターは、2つのHBVタンパク質: HBc(コアヌクレオカプシドタンパク質)及びHBs(小表面抗原)から導出される配列の融合物をコードするMVAである。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物において使用するためのベクターは、HBc及びHBsを別個のタンパク質にプロセシングするための、口蹄疫ウイルスの2A切断領域をコードする配列を組み込むスペーサーである配列番号3をコードするヌクレオチド配列(上流タンパク質のC末端における23アミノ酸尾部及び下流タンパク質のN末端における単一プロリンをもたらす)によって分離される、HBc及びHBsをコードするMVAである。したがって、本明細書に開示される方法及び組成物において使用するための特定のMVAベクターは、HBc、2A及びHBsを含む、図21に示される構造を有する構築物をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含む。そのような構築物のアミノ酸配列は、配列番号5に示され、アミノ酸挿入物構築物をコードするヌクレオチド配列は、配列番号6に示される。
【００６７】
医薬組成物
本明細書に開示される免疫原性組成物は、開示される方法において用途が見出され、適切には薬学的に許容される組成物である。適切には、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
【００６８】
ChAd又はMVAベクターを含む免疫原性組成物は、薬学的又は生理学的に許容される担体、例えば、等張食塩水又は他の等張塩溶液中のウイルスベクター粒子の懸濁液による投与用に調製してもよい。適切な担体は、当業者には明らかであり、投与経路に大きく依存する。
【００６９】
組換えタンパク質抗原を含む組成物は、それらが発現される細胞培養物からのタンパク質の単離及び精製、1つ以上の塩、界面活性剤及び/又は凍結保護剤を含む製剤化緩衝液中での懸濁によって調製し、凍結乾燥してもよい。例えば、適切な製剤化緩衝液は、凍結保護剤としての糖、又は糖の混合物、例えば、スクロース、トレハロース若しくはスクラロース、並びに界面活性剤としての非イオン性コポリマー、例えば、ポロキサマーを含んでもよい。投与のために、凍結乾燥された組換えタンパク質製剤は、注射又は吸入用の等張食塩水又は他の等張塩溶液などの薬学的又は生理学的に許容される担体中で再構成される。適切な担体は、当業者には明らかであり、投与経路に大きく依存する。再構成された組成物はまた、アジュバント、又はアジュバントの混合物を含んでもよい。一実施形態では、凍結乾燥された組換えタンパク質は、液体アジュバント系製剤において再構成される。
【００７０】
用語「担体」は、本明細書で使用される場合、治療活性成分が一緒に投与される希釈剤、賦形剤、又はビヒクルなどであるがこれらに限定されない薬理学的に不活性な物質を指す。液体担体としては、以下に限定されないが、水及び油、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などにおける食塩溶液などの無菌液体が挙げられる。食塩溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液はまた、特に注射可能溶液のための、液体担体として使用することができる。適切な医薬担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
【００７１】
本明細書に開示される方法において使用するための組成物は、組成物のベクター又は組換えタンパク質に加えて、アジュバント系を含んでもよい。用語「アジュバント」は、細胞性レベル又は液性レベルのいずれかで、組成物の抗原に対する免疫応答を増大させ、刺激し、活性化し、強化し、又は調節する薬剤を指し、例えば、免疫学的アジュバントは、抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体では免疫学的効果を有しない。本明細書に開示される免疫原性組成物は、組成物に含まれるベクターが、hIiなどの「遺伝的アジュバント」もコードするかどうかにかかわらず、製剤中に別個の成分としてアジュバントを含んでよい。
【００７２】
適切なアジュバントは、慢性状態及び破壊された免疫能力を有する対象において免疫応答を増強することができるものである。CHB患者は、ウイルスに対する効率的な自然免疫応答及び適応免疫応答を開始できないことを特徴とし、これにより、効率的なワクチン開発は困難になっている。これらの患者では、アジュバント化ワクチン製剤の1つの重要な機能は、細胞性免疫応答を、細胞内病原体の除去に重要であると認識されているTヘルパー1(Th1)プロファイルに向けることを目標とすべきである。
【００７３】
適切なアジュバントの例としては、以下に限定されないが、無機アジュバント(例えば、無機金属塩、例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)、有機非ペプチドアジュバント(例えば、サポニン、例えば、QS21、又はスクアレン)、油性アジュバント(例えば、フロイント(Freund)完全アジュバント及びフロイント(Freund)不完全アジュバント)、サイトカイン(例えば、IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、及びINF-γ)、粒子状アジュバント(例えば、免疫刺激複合体(ISCOMS)、リポソーム、又は生分解性ミクロスフェア)、ビロソーム、細菌性アジュバント(例えば、モノホスホリルリピドA(MPL)、例えば、3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)、又はムラミルペプチド)、合成アジュバント(例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ、又は合成リピドA)、合成ポリヌクレオチドアジュバント(例えば、ポリアルギニン又はポリリジン)、及び非メチル化CpGジヌクレオチド(「CpG」)を含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドが挙げられる。特に、アジュバントは、有機非ペプチドアジュバント(例えば、サポニン、例えば、QS21、又はスクアレン)及び/又は細菌性アジュバント(例えば、モノホスホリルリピドA(MPL)、例えば、3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL))であってもよい。
【００７４】
1つの適切なアジュバントは、モノホスホリルリピドA(MPL)、特に、3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)である。化学的には、それは、しばしば、4、5、又は6個のアシル化鎖を有する3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物として供給される。それは、GB 2122204Bで教示される方法によって精製及び調製することができ、この参考文献は、ジホスホリルリピドA及びその3-O-脱アシル化バリアントの調製も開示する。他の精製された合成リポ多糖が記載されている[米国特許第6,005,099号及びEP0729473B1; Hilgers, 1986; Hilgers, 1987; 及びEP0549074B1]。
【００７５】
サポニンも適切なアジュバントである[Lacaille-Dubois, 1996]。例えば、サポニンクイルA(Quil A)(南米の木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)の樹皮から導出される)、及びその画分は、米国特許第5,057,540号及びKensil, 1996; 及びEP 0 362 279 B1に記載されている。クイルAの精製画分、例えばQS21及びQS17は、免疫刺激物質としても公知である; それらの生成方法は、米国特許第5,057,540号及びEP 0 362 279 B1に開示されている。QS21の使用は、Kensil, 1991にさらに記載されている。QS21とポリソルベート又はシクロデキストリンとの組み合わせも公知である(WO 99/10008)。クイルAの画分、例えばQS21及びQS7を含む粒子状アジュバント系は、WO 96/33739及びWO 96/11711に記載されている。
【００７６】
上記のものなどのアジュバントは、担体、例えば、リポソーム、水中油型エマルション、及び/又は金属塩(アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムを含む)と共に製剤化してもよい。例えば、3D-MPLは、水酸化アルミニウム(EP 0 689 454)又は水中油型エマルション(WO 95/17210)と共に製剤化してもよい; QS21は、コレステロール含有リポソーム(WO 96/33739)、水中油型エマルション(WO 95/17210)又はアラム(WO 98/15287)と共に製剤化してもよい。
【００７７】
アジュバントの組み合わせ、特に、モノホスホリルリピドA及びサポニン誘導体の組み合わせ(例えば、WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241を参照)、より具体的には、WO 94/00153に開示されるQS21及び3D-MPLの組み合わせ、又はWO 96/33739に開示されるように、QS21が、コレステロール含有リポソーム(DQ)中でクエンチされる組成物を、開示される組成物中に利用してもよい。水中油型エマルション中のQS21、3D-MPL及びトコフェロールを含む強力なアジュバント製剤は、WO 95/17210に記載されており、開示される組成物において用途を見出し得る別の製剤である。したがって、適切なアジュバント系は、例えば、モノホスホリルリピドA、好ましくは3D-MPLの、アルミニウム塩との組み合わせ(例えば、WO00/23105に記載される)を含む。さらなる例示的なアジュバントは、QS21及び/又はMPL及び/又はCpGを含む。WO96/33739に開示されるように、QS21は、コレステロール含有リポソーム中でクエンチされてもよい。
【００７８】
したがって、開示される免疫原性組成物において使用するのに適したアジュバントは、MPL及びQS-21を含有するリポソームベースのアジュバントであるAS01である。リポソームは、MPL及びQS-21免疫エンハンサーのためのビヒクルであり、リン酸塩緩衝食塩溶液中のジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成される。AS01B-4は、AS01アジュバントの特に好ましいバリアントであり、PBS溶液中の、免疫エンハンサーのためのビヒクルとしてのDOPC/コレステロールリポソーム、及びソルビトールと共に、免疫エンハンサーQS-21(キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)の樹皮から精製されたトリテルペングリコシド)及びMPL(3-DモノホスホリルリピドA)で構成される。特に、AS01B-4の単回ヒト用量(0.5mL)は、50μgのQS-21及び50μgのMPLを含有する。AS01E-4は、AS01B-4の2倍希釈物に相当し、すなわち、ヒト用量あたり25μgのQS-21及び25μgのMPLを含有する。
【００７９】
一実施形態では、組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、切断型組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL及びQS-21を含むアジュバントを含む免疫原性組成物が提供される。一実施形態では、免疫原性組成物は、組換えHBs、切断型組換えHBc及びAS01アジュバントを含む。特定の実施形態では、免疫原性組み合わせは、4:1以上の比の切断型組換えHBc及び組換えHBs、並びにAS01アジュバント、例えばAS01B-4又はAS01E-4を含む組成物を含む。
【００８０】
一実施形態では、以下：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物;
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物; 並びに
c)組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL、QS-21、及びジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００８１】
別の実施形態では、以下：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物;
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物; 並びに
c)4:1以上の比の切断型組換えHBc及び全長組換えHBs、並びにMPL、QS-21、及びジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００８２】
別の実施形態では、以下：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物;
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物; 並びに
c)4:1以上の比の切断型組換えHBc及び全長組換えHBs、並びにAS01アジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００８３】
別の実施形態では、以下：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス(ChAd)ベクターを含む組成物;
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物; 並びに
c)4:1の比の、HBcのアミノ酸1〜149（例えば、配列番号2）からなる切断型組換えHBc及び全長組換えHBs（例えば、配列番号1）、並びにAS01B-4を含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００８４】
一実施形態では、以下：
a)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む複製欠損ChAd155ベクターを含む組成物;
b)B型肝炎表面抗原(HBs)をコードするポリヌクレオチド及びB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)をコードする核酸を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ベクターを含む組成物; 並びに
c)組換えB型肝炎表面抗原(HBs)、組換えB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc)、並びにMPL、QS-21、及びジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００８５】
別の実施形態では、以下：
a)口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むリンカーをコードするポリヌクレオチドによって分離される、HBsをコードするポリヌクレオチド及びHBcをコードするポリヌクレオチドを含む複製欠損ChAd155ベクターを含む組成物;
b)口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むリンカーをコードするポリヌクレオチドによって分離される、HBsをコードするポリヌクレオチド及びHBcをコードするポリヌクレオチドを含むMVAベクターを含む組成物; 並びに
c)4:1以上の比の切断型組換えHBc及び全長組換えHBs、並びにMPL、QS-21、及びジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールで構成されるリポソームを含むアジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００８６】
別の実施形態では、以下：
a)HBsをコードするポリヌクレオチド、及びHBcのN末端に融合したヒトインバリアント鎖(hIi)をコードするポリヌクレオチドを含む複製欠損ChAd155ベクターを含む組成物;
b)口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むリンカーをコードするポリヌクレオチドによって分離される、HBsをコードするポリヌクレオチド及びHBcをコードするポリヌクレオチドを含むMVAベクターを含む組成物; 並びに
c)4:1以上の比の切断型組換えHBc及び全長組換えHBs、並びにAS01アジュバントを含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００８７】
特定の実施形態では、免疫原性組み合わせの構成要素a)のChAdベクターのベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)及びHBs(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする。特定の実施形態では、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)は、hIi(例えば、配列番号7若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列、又は配列番号12若しくはそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)に融合している。例えば、HBc(例えば、配列番号11)は、hIi(例えば、配列番号7)に融合しているか、又はHBc(例えば、配列番号11)は、hIi(例えば、配列番号12)に融合している。
【００８８】
特定の実施形態では、免疫原性組み合わせの構成要素b)のMVAベクターのベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)及びHBs(例えば、配列番号1又はそれと少なくとも98%相同なアミノ酸配列)をコードする。例えば、ベクター挿入物は、口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサー(例えば、配列番号3)をコードする配列によって分離される、HBc(例えば、配列番号11)及びHBs(例えば、配列番号1)をコードする。
【００８９】
別の実施形態では、以下：
a)配列番号9のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物、又は配列番号15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含む複製欠損ChAd155ベクターを含む組成物;
b)配列番号5のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む組成物:並びに
c)4:1の比の、HBcのアミノ酸1〜149（例えば、配列番号2）からなる切断型組換えHBc及び全長組換えHBs（例えば、配列番号1）、並びにAS01B-4を含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００９０】
別の実施形態では、以下：
a)配列番号10を含むポリヌクレオチドベクター挿入物、又は配列番号14を含むポリヌクレオチドベクター挿入物を含む複製欠損ChAd155ベクターを含む組成物;
b)配列番号6を含むポリヌクレオチドベクター挿入物を含むMVAベクターを含む組成物:並びに
c)4:1の比の、HBcのアミノ酸1〜149（例えば、配列番号2）からなる切断型組換えHBc及び全長組換えHBs（例えば、配列番号1）、並びにAS01B-4を含む組成物
を含む、免疫原性組み合わせが提供される。
【００９１】
投与
特定の実施形態では、開示される免疫原性組成物及び免疫原性組み合わせは、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、又は局所経路を介して投与される。好ましくは、投与は、筋肉内経路を介する。
【００９２】
鼻腔内投与は、肺を含む完全な気道の粘膜への免疫原性組成物の投与である。より具体的には、組成物は、鼻の粘膜に投与される。一実施形態では、鼻腔内投与は、スプレー又はエアロゾルによって達成される。筋肉内投与は、個体の任意の筋肉への組成物の注射を指す。例示的な筋肉内注射は、三角筋、外側広筋、又は腹側臀部領域及び背腹臀部領域に投与される。好ましくは、投与は、三角筋に行われる。皮下投与は、皮下組織への組成物の注射を指す。皮内投与は、皮膚の層の間の真皮への組成物の注射を指す。局所投与は、針又は同等のデバイスで皮膚を貫通することなく、皮膚又は粘膜の任意の部分に組成物を投与することである。組成物は、口、鼻、生殖器領域及び/又は直腸の粘膜に局所的に投与してもよい。局所投与は、舌下投与及び/又は頬側投与などの投与手段を含む。舌下投与は、舌の下に組成物を投与することである(例えば、経口薄膜(OTF)を使用して)。頬側投与は、頬の頬側粘膜を介してベクターを投与することである。
【００９３】
本明細書に開示される免疫原性組成物及び組み合わせは、プライム-ブースト免疫化レジメンにおいて用途が見出され得る。したがって、プライム-ブースト免疫化方法であるCHBの治療方法において使用するための組成物が、本明細書に開示される。多くの場合、免疫原性組成物の単回投与は、有効な防御又は疾患の治療的処置に必要とされる数の長期免疫細胞を生成するのに十分ではない。その結果として、特定の病原体又は疾患に対する持続的かつ防御的な免疫を確立するために、又は所与の疾患を治療又は機能的に治癒するために、前記病原体又は疾患に特異的な生物学的調製物を繰り返し投与することが必要であり得る。同じ病原体又は疾患に対する免疫原性組成物又はワクチンの反復投与を含む投与レジメンは、「プライム-ブーストレジメン」と呼ばれる。一実施形態では、プライム-ブーストレジメンは、B型肝炎に対する免疫原性組成物の少なくとも2回の投与を含む。免疫原性組成物の最初の投与は、「プライミング」と呼ばれ、同じ免疫原性組成物、又は同じ病原体に対する免疫原性組成物の任意の後続の投与は、「ブースティング」と呼ばれる。免疫応答をブーストするための2、3、4又はさらには5回の投与も企図されることが理解されるべきである。プライムとブーストとの間の期間は、場合により、1週、2週、4週、6週、8週又は12週である。より具体的には、それは、4週又は8週である。2回以上のブーストが実施される場合、後続のブーストは、先行するブーストの1週、2週、4週、6週、8週又は12週、6ヶ月、又は12ヶ月後に投与される。例えば、任意の2つのブースト間の間隔は、4週又は8週であってもよい。
【００９４】
本明細書に開示される免疫原性組成物は、それぞれ異なる組成物において製剤化された（例えば、免疫原性組み合わせ）、さらなる免疫原性成分の投与を含む治療レジメンで投与され得る。組成物は、好都合には、同じ部位で又はその近くで、同位置に(co-locationally)投与される。例えば、成分は、同じ側若しくは四肢に(「同側(co-lateral)」投与)又は反対の側若しくは四肢に(「反対側(contra-lateral)」投与)、筋肉内投与することができる。例えば、反対側投与では、第1の組成物を、左三角筋に投与し、第2の組成物を、順次又は同時に、右三角筋に投与してもよい。あるいは、同側投与では、第1の組成物を、左三角筋に投与し、第2の組成物も、順次又は同時に、左三角筋に投与してもよい。
【００９５】
一般的な製造プロセス
●ChAd155-hIi-HBV:
組換え複製欠損サル(チンパンジー由来)アデノウイルス群CベクターChAd155に導入遺伝子として挿入されるDNA断片は、口蹄疫ウイルス(FMDV)の自己切断型2A領域[Donnelly et al. 2001]によって分離される、2つのHBVタンパク質抗原であるコアヌクレオカプシドタンパク質抗原HBc及び小表面抗原HBsから導出される。FMDVの2A領域は、HBc-HBs融合物の、別個のタンパク質抗原へのプロセッシングを可能にする。さらに、HBcタンパク質をコードする遺伝子のN末端部分は、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスII結合インバリアント鎖p35アイソフォーム(hIi)をコードする遺伝子に融合している。hIi-HBV導入遺伝子配列の略図が、(図22)に提供される。
【００９６】
2A領域(18アミノ酸)には、そのN末端に6アミノ酸のスペーサーが補充されている; この種のスペーサーは、2Aを介した切断の効率を高めることが報告されている。領域2Aを介したプロテアーゼ切断は、2Aアミノ酸配列中の最後のプロリンの直前の、2AのC末端で生じる。プロリンは、HBsタンパク質のN末端に残り、一方、プロリン切断部位に先行する23アミノ酸は、hIi-HBc-2Aポリペプチドと共に残る。
【００９７】
それにより、導入遺伝子の発現は、プロテアーゼプロセシングに続いて、2つの別個のポリペプチド: hIi-HBc-スペーサー-2A及びHBsの生成をもたらす。簡潔にするために、hIi-HBc-スペーサー-2Aポリペプチドは、hIi-HBcタンパク質と呼ばれる。細胞培養で発現させると、hIi-HBc抗原は、細胞培養上清で検出され、一方、HBsタンパク質は、細胞内画分で検出される。
【００９８】
抗原タンパク質をコードする発現カセット(宿主細胞における発現を可能にするように調節成分に作動可能に連結される)は、以前記載されたように(WO2016/198621(ChAd155ベクター配列及び方法を開示する目的で参照により組み込まれる)を参照)、ChAd155ベクタープラスミド構築物に会合されて、ChAd155-hIi-HBVを与える。hIi-HBV導入遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGH pA)の転写制御下にある。発現カセットは、HBs、HBc及びhIiアミノ酸配列をコードし、その中で、hIi配列は、HBcのHBc N末端に融合し、HBs及びHBc配列は、HBc及びHBsを別個のタンパク質にプロセシングするための口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサーによって分離される。
【００９９】
複製欠損である組換えChAd155アデノウイルスを生成するために、アデノウイルスの複製及び感染性に必要とされる欠失された遺伝子領域の機能は、ヘルパーウイルス又は細胞株、すなわち、補完又はパッケージング細胞株によって、組換えウイルスに供給されなければならない。特に適切な補完細胞株は、Procell92細胞株である。Procell92細胞株は、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーターの制御下のTetリプレッサー、及びG418耐性遺伝子と共にトランスフェクトされた、アデノウイルスE1遺伝子を発現するHEK 293細胞に基づく(Vitelli et al. PLOS One (2013) 8(e55435):1-9)。Procell92.Sは、浮遊状態での増殖に適合しており、毒性タンパク質を発現するアデノウイルスベクターの生成に有用である。
【０１００】
ChAd155-hIi-HBV原薬(Drug Substance)の生成:
ChAd155-hIi-HBVウイルス粒子(原薬)の製造は、感染時に5×105個細胞/mlの細胞密度でのProcell-92.S細胞の培養を含む。次いで、細胞に、200vp/細胞の感染多重度を使用して、ChAd155-hIi-HBVマスターウイルスシード(MVS)を感染させる。ChAd155-hIi-HBVウイルス回収物は、細胞溶解、溶解物の清澄化、及び濃縮(ろ過ステップ)後に、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む複数ステッププロセスによって精製される。
【０１０１】
ワクチン製剤化及び充填
精製されたChAd155-hIi-HBVバルク原薬は、その後、次のように処理される:
- 製剤化緩衝液中の精製ChAd155-hIi-HBV原薬の希釈。
- 滅菌ろ過。
- 最終容器の充填。
【０１０２】
ChAd155-hIi-HBVワクチンは、バイアルに入れられた液体製剤である。製剤化緩衝液は、トリス(Tris)(10mM)、L-ヒスチジン(10mM)、NaCl(75mM)、MgCl(1mM)及びEDTA(0.1mM)を、スクロース(5%w/v)、ポリソルベート-80(0.02%w/v)及びエタノール(0.5%w/v)と共に含み、HClでpH7.4に調整される(最終体積まで注射用水)。
【０１０３】
●MVA-HBV:
MVA-HBVは、HBVの2つの異なるタンパク質: コア及びSタンパク質(2Aペプチドによって分離される)を保有する組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)である。MVA-HBV構築物は、Anton Mayr教授によって記載された[Mayr, A. et al. 1978]弱毒継代571(MVA-571と呼ばれる)からのMVAウイルスシードバッチから導出された、MVA-Redベクター系[Di Lullo et al. 2010]から生成された。
【０１０４】
MVA-HBV導入遺伝子は、HBVのコアヌクレオカプシドタンパク質HBc及び小表面抗原HBsをコードする。HBc-HBs配列は、アデノウイルスベクターについて上に述べたように、融合タンパク質を別個のHBc及びHBs抗原にプロセシングすることを可能にする、口蹄疫ウイルスの自己切断型2A領域によって分離される。導入遺伝子の略図が、図21に提供される。
【０１０５】
導入遺伝子の発現は、プロテアーゼプロセシング後に、2つの別個のポリペプチド: HBc-スペーサー-2A及びHBsの生成をもたらす。簡潔にするために、HBc-スペーサー-2Aポリペプチドは、HBcタンパク質と呼ばれる。
【０１０６】
発現カセットは、MVAシャトルベクターp94-elisaRenにサブクローニングされ、トランスファーベクターp94-HBVを生成した。p94-HBVは、FlankIII-2領域及びFlankIII-1領域に隣接する、ワクシニアP7.5初期/後期プロモーター制御下の抗原発現カセットを含有し、相同組換えによるMVAのdel III中の挿入を可能にする。
【０１０７】
組換えウイルスの生成は、CEF細胞におけるインビボ(in vivo)組換えの2つの事象に基づいた。
【０１０８】
簡単に述べると、初代ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)にMVA-Redを感染させ、次いで、抗原導入遺伝子(及び合成プロモーターsPの制御下にあるEGFPマーカー遺伝子)を保有するp94-HBVによりトランスフェクトした。最初の組換え事象は、MVA-Redゲノム及びトランスファーベクターp94-HBVの両方に存在する相同配列(FlankIII-1領域及びFlankIII-2領域)の間で生じ、Hcredタンパク質遺伝子の、導入遺伝子/eGFPカセットとの置換をもたらす。MVA-Green中間体を含有する感染細胞は、FACSソーティングによって単離され、新鮮なCEFを感染させるために使用される。最初の組換えから生じる中間組換えMVAは、導入遺伝子及びeGFPカセットの両方を保有するが、反復Z領域の存在に起因して不安定である。
【０１０９】
したがって、Z領域が関与する自発的な第2の組換え事象が生じ、eGFPカセットを除去する。得られた組換えMVAは無色で、導入遺伝子カセットを保有する。
【０１１０】
最後に、マーカーレス(markerless)組換えウイルス(MVA-HBV)感染細胞を、FACSによって選別し、MVA-HBVを、終末希釈(terminal dilution)によってクローニングし、従来の方法によってCEF中で増殖させた。
【０１１１】
MVA-HBV原薬の生成
MVA-HBVウイルス粒子(原薬)は、1×106〜2×106個細胞/mlの細胞密度までニワトリ胚線維芽細胞(CEF)の初代細胞培養物中で製造され、次いで、MVA-HBVマスターウイルスシード(MVS)を、0.01〜0.5PFU/細胞の感染多重度で感染させる。MVA-HBVウイルス回収物は、遠心分離によるペレット化、再懸濁、及び分画勾配遠心分離ステップに基づく複数ステッププロセスによって精製される。
【０１１２】
ワクチン製剤化及び充填
精製されたMVA-HBVバルク原薬は、その後、次のように処理される:
- 製剤化緩衝液中の精製MVA-HBV DSの希釈。
- 最終容器の充填。
【０１１３】
MVA-HBVワクチンは、バイアルに入れられた液体製剤である。製剤化緩衝液は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンpH7.7(10mM)、NaCl(140mM)、及び最終体積までの注射用水を含む。
【０１１４】
●HBs-HBc組換えタンパク質混合物:
HBc原薬の生成
HBc組換えタンパク質(原薬)製造プロセスは、組換え大腸菌(E. coli)ワーキングシードを使用して前培養フラスコに接種すること、それに続く、発酵プロセス、並びに回収、抽出、清澄化、及び複数のクロマトグラフィー及びろ過ステップを含む複数ステップの精製プロセスからなる。
【０１１５】
HBs原薬の生成
HBs組換えタンパク質(原薬)製造プロセスは、組換え出芽酵母(S. cerevisiae)ワーキングシードを使用して前培養フラスコに接種すること、それに続く、発酵プロセス、並びに回収、抽出、清澄化、及び複数のクロマトグラフィー及びろ過ステップを含む複数ステップの精製プロセスからなる。
【０１１６】
ワクチン製剤化及び充填
精製されたHBs原薬及びHBc原薬は、凍結保護剤としてのスクロース、及び界面活性剤としてのポロキサマーを含む製剤化緩衝液中に希釈され、4mLの透明なガラスバイアルに充填され、凍結乾燥される。
【実施例】
【０１１７】
非臨床開発の目的:
特にHBcAgに対する、強力で機能的なCD8+及びCD4+ T細胞応答は、HBVクリアランス及び感染症の消散に関連している[Boni, 2012; Li, 2011; Liang, 2011; Lau, 2002; Bertoletti, 2012]。さらに、抗S抗体は、非感染肝細胞へのHBVの広がりを予防し、HBV複製の治療後のぶり返しを制御する鍵となり得る[Rehermann 2005; Neumann 2010]。提案されるワクチン接種レジメンは、強力なCD8+ T細胞応答を誘導するための、B型肝炎コア(HBc)抗原及びB型肝炎表面(HBs)抗原をコードする2つのウイルスベクター化ワクチン(ChAd155-hIi-HBV及びMVA-HBV)を用いた異種プライム-ブーストスケジュールであって、CHB患者において強力な抗原特異的CD4+ T細胞及び抗体応答を誘導するための、AS01B-4アジュバント化HBc-HBsタンパク質の順次又は同時投与を伴うものを含む。このワクチン誘導性免疫応答は、最終的に、HBV感染症の完全で永続的な制御のマーカーと見なされるHBsAg濃度の実質的な減少又はHBsAg喪失(すなわち、検出可能なレベルを下回るHBsAg濃度)につながるはずである。
【０１１８】
非臨床開発の主な目的は、次の通りであった:
●ベクター構築物の選択、hIiの包含、アジュバント系選択を含むタンパク質製剤の組成、及び免疫化のスケジュールを導くために、調査ワクチン成分、例えば、ChAd155-hIi-HBV、MVA-HBV及びHBc-HBs/AS01B-4の、ナイーブマウス及びHBV寛容マウスにおける免疫原性を実証すること。
●HBV寛容マウスにおける(非GLP研究)、及びNZWウサギで実施される反復投与GLP毒性研究における、完全なワクチンレジメンの安全性を実証すること。
●ワクチン接種動物におけるベクターの体内分布を記録すること(GLP研究)。
【０１１９】
動物モデルの選択のための非臨床戦略及び根拠
ベクター構築物の選択、アジュバント系選択を含むタンパク質製剤、及び免疫化のスケジュールを導くために、免疫原性パッケージを、最初に、健康なマウスにおいて生成した。
【０１２０】
ベクター構築物の選択、アジュバント系選択を含むタンパク質製剤、及び免疫化のスケジュールを支持するために、前臨床実験のほとんどは、AS01アジュバント化候補ワクチン及びアデノウイルスベクターによって誘発されるT細胞応答を評価するために以前に使用されたモデルである[Lorin, 2015]、近交系CB6F1(C57Bl/6及びBALB/cマウスのハイブリッド)マウスにおいて実施した。
【０１２１】
HLA.A2/DR1マウス(ヒトHLA-A2及びHLA-DR1分子についてのトランスジェニック)を使用して、候補ワクチンがHBc特異的CD8+ T細胞応答を誘導する能力を評価した(近交系CB6F1マウスではこの抗原に対する該応答が検出されなかったため)。これは、おそらく、調査ワクチンのHBc配列中にH2-Kb MHC-I制限免疫優性エピトープ(MGLKFRQL)が存在しないためであり、調査ワクチンのHBc配列は、HBV遺伝子型A/亜型adwの配列に基づいており、Riedlら[Riedl, 2014]によって報告されるように、エピトープ(MGLKIRQL)においてイソロイシン(I)がフェニルアラニン(F)に取って代わっており、1つのアミノ酸が異なる。HBV特異的CD4+ T細胞及び抗体を、同じHLA.A2/DR1マウスにおいて評価した。
【０１２２】
HBVは自然にはチンパンジー及びヒトのみに感染するため、治療ワクチンの効力を評価するために利用できる動物モデルは限られている。HBVゲノム全体が、宿主ゲノム中のウイルスゲノムの組み込みにより(HBVトランスジェニックマウス)、又は複製HBV DNAによる感染により、又はHBVゲノムを発現するベクターにより発現される、マウスモデルが開発されている。これらは慢性HBV病因を再現しないが、ウイルス複製中間体及びタンパク質は肝臓で検出することができ、免疫寛容が観察される。
【０１２３】
AAV2/8-HBV形質導入HLA.A2/DR1マウスモデルは、慢性HBV感染症のウイルス学的及び免疫学的特徴を再現し、
●ワクチンレジメンが、HBs及びHBc抗原に対する寛容を克服することができることを実証するため
●肝臓の組織学(ヘマトキシリン-エオシン[H&E]染色)及びALT/ASTレベルに対する、HBcAgを発現する肝細胞を潜在的に標的とする肝臓浸潤HBc特異的CD8+ T細胞の影響を評価するため
に選択された[Dion, 2013; Martin, 2015]。
【０１２４】
最後に、体内分布(スプラーグ-ドーリー(Sprague-Dawley)ラット)及び毒物学研究(NZWウサギ)についての標準的な動物モデルが、候補ワクチンを評価するために選択されている。なぜならば、それらは感染症のモデルではないが、ベクター発現タンパク質及び組換えタンパク質に対して薬理学的に関連する免疫応答を開始することができ、ワクチンの毒性試験に十分に受け入れられている種であるからである。これらの種はまた、AS01Bアジュバント及びその免疫エンハンサーであるMPL及びQS-21についての毒物学試験プログラムにおいて以前に使用されている。
【０１２５】
非臨床薬理学
筋肉内投与後の、調査ワクチン成分、例えば、ChAd155-hIi-HBV、MVA-HBV及びHBc-HBs/AS01B-4のナイーブ動物及びHBV寛容動物における免疫原性を実証するために、いくつかの前臨床研究を実施した。抗原特異的免疫原性プロファイルを、最初に、ウイルスベクター(ChAd155-hIi-HBV及びMVA-HBV)及びHBV組換えタンパク質アジュバント化調査ワクチン(HBc-HBs/AS01B-4)について別個に評価した。FTiH(first time in humans、ヒトへの最初の投与)で意図される完全なワクチンレジメンの免疫原性及び安全性プロファイルを、第2相において評価した。
【０１２６】
材料
非臨床免疫原性研究で使用されるAS01アジュバント系の用量
AS01B-4アジュバント系は、免疫エンハンサーQS-21(キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)の樹皮から精製されたトリテルペングリコシド)及びMPL(3-DモノホスホリルリピドA)、並びにこれらの免疫エンハンサーのためのビヒクルとしてのリポソーム、及びソルビトールから構成される。特に、AS01B-4の単回ヒト用量(0.5mL)は、50μgのQS-21及び50μgのMPLを含有する。ヒト用量の1/10、すなわち、50μlは、マウスに注射される体積である(5μgのQS-21及びMPLに相当する)。
【０１２７】
AS01E-4アジュバント系は、AS01B-4希釈の2倍希釈に相当する。ヒト用量の1/10、すなわち、50μlは、マウスに注射される体積である(2.5μgのQS-21及びMPLに相当する)。
【０１２８】
細胞性免疫応答-細胞内サイトカイン染色(ICS)
様々な時点で収集される末梢血白血球(PBL)、脾細胞、又は肝臓浸潤リンパ球の新鮮なプールを、HBc又はHBs配列をカバーする、11アミノ酸が重複する15マーのプールで、エクスビボ(ex vivo)で6時間刺激した。HBc及びHBs特異的細胞性応答を、IFN-γ及び/又はIL-2及び/又は腫瘍壊死因子(TNF)-αを発現するCD4+又はCD8+ T細胞の量を測定するICSによって評価した。ICSの結果を考慮するための技術的な受入基準は、取得したCD8+ T又はCD4+ T細胞の最小数が＞3000事象であることを含む。あるいは、IFN-γ-ELISpotを、ICSに対するのと同じペプチドを用いた脾細胞の再刺激後に実施した。
【０１２９】
液性免疫応答-酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
HBc及びHBs特異的抗体応答を、様々な時点における免疫化されたマウスの血清に対するELISAによって測定した。簡単に述べると、96ウェルプレートを、HBc又はHBs抗原でコーティングした。次いで、個々の血清サンプルを、段階希釈で添加し、2時間インキュベートした。次いで、ビオチン化抗マウスF(ab)'2断片を添加し、ストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体及びペルオキシダーゼ基質オルト-フェニレンジアミン二塩酸塩/H2O2とのインキュベーションにより、抗原-抗体複合体を明らかにした。各時点及び各抗原(HBc、HBs)について、分散分析(ANOVA)モデルを、固定効果として群、研究及び交互作用を含め、不均一分散モデルを使用して(群間の同一の分散は想定されなかった)、log10力価に適合させた。このモデルを使用して、幾何平均(及びそれらの95%CI)並びに幾何平均比及びそれらの95%CIを推定した。予め定義された基準が設定されていなかったため、分析は記述的であり、群間の比の95%CIを、多重性についての調整無しで計算した。
【０１３０】
ALT/AST測定
マウス血清中のALT及びASTのレベルを、以下の市販のキットを使用して定量化した:
●アラニンアミノトランスフェラーゼ活性アッセイキットSigma Aldrichカタログ#MAK052
●アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性アッセイキットSigma Aldrichカタログ#MAK055
【０１３１】
血清HBs抗原の定量化
マウス血清中の循環HBs抗原を、BIO-RAD製のMonolisa Anti-HBs PLUS(カタログ#72566)及び国際標準(Abbott Diagnostics)を使用して定量化した。
【０１３２】
組織病理学分析
肝臓(肝臓1つあたり1つの葉(lobe))を収集し、10%ホルムアルデヒド固定液中で保存した。顕微鏡検査用の全てのサンプルを、RITAガイドラインに基づいてトリミングし[Ruehl-Fehlert, 2003; Kittel 2004; Morawietz 2004]、パラフィンワックス中に包埋し、およそ4ミクロンの厚さに薄片化し、H&Eで染色した。組織学的活性(壊死性炎症性病変)及び線維症の等級付けを、メタビル(METAVIR)スコアリングシステムに従って実施した[Bedossa, 1996; Mohamadnejad, 2010; Rammeh, 2014]。炎症細胞病巣の等級付けを、Buchmannら[Buchmann, 2013]によって記載されるように、デスメット(Desmet)スコアに従って行った。
【０１３３】
各研究で実施される統計分析は、各個別の研究に関係するセクションで詳述される。
【０１３４】
［実施例1-HLA.A2/DR1トランスジェニックマウスモデルにおけるChAd155-HBV(hIi有り及び無し)プライム及びMVA-HBVブーストの評価］
目的
この実験の主な目的は、ChAd155-HBV(hIi有り又は無し)の1回投与によるプライミングとその後のMVA-HBVのブースター投与が、ヒトMHC-I/II分子についてトランスジェニックであるHLA.A2/DR1マウスにおいてHBcに対する強力なCD8+ T細胞応答を誘導することができるかどうかを決定することであった。さらに、hIi有りのChAd155-HBVと、hIi無しのChAd155-HBVとの間の直接比較を実施し、他の抗原について以前に報告されたように[Spencer, 2014; Capone, 2014]、HBc特異的CD8+ T細胞応答をさらに増加させるhIi配列の可能性を調査した。HBs特異的CD8+ T細胞応答、並びにHBc及びHBs特異的CD4+ T細胞及び抗体応答も評価した。
【０１３５】
研究設計
HLA.A2/DR1マウス(群あたり11匹のマウス)を、0日目に筋肉内経路により108vpのChAd155-HBV(hIi有り及び無し)で免疫化し、28日目に107pfuのMVA-HBV(hIi無し)でブーストした(表1)。1回目の免疫化(プライム)の14日後(14dpI)又は2回目の免疫化(ブースト)の7日後(7dpII)にマウスを犠牲にして、血清及び脾臓におけるHBc及びHBs特異的液性及び細胞性免疫応答をそれぞれ決定した。
【０１３６】
【表１】
2021506771.tif 000002
【０１３７】
統計分析
ANOVAモデルを、固定パラメーターとして2つの群(hIi有り又は無し)及び実験(プライム後の3つの実験の結果及びブースト後の2つの実験の結果)を含め、不均一分散モデルを使用して、log10 CD8+ T細胞頻度に適合させた。このモデルを使用して、幾何平均(及びそれらの95%CI)並びに幾何平均比及びそれらの95%CIを推定した。
【０１３８】
結果
HBc及びHBs特異的T細胞応答
ChAd155-HBVベクター及びChAd155-hIi-HBVベクターの両方は、HBc特異的CD8+ T細胞応答を誘導した(図1A)。hIiの存在は、HBc抗原に対してより高いCD8+ T細胞応答を誘導する傾向がある。ChAd155-hIi-HBVで免疫化されたマウスのMVA-HBVブーストは、HBc特異的CD8+ T細胞応答における3倍増加を誘導し、一方、ChAd155-HBV群について増加は観察されなかった。
【０１３９】
両方のベクターは、HBs特異的CD8+ T細胞応答を誘導し、MVA-HBVブースター効果は、ChAd155-HBV構築物でプライムされたマウスにおいてより顕著であった(図1B)。
【０１４０】
HBc及びHBs特異的CD4+ T細胞応答は低かった(データ示さず)。
【０１４１】
この実験の結果は、2つの他の類似した独立した実験の結果と一致した(データ示さず)。動物の利用可能性に関連する制限のため、各独立した研究は、群を比較するには検出力が不足していた（not statistically powered）が、3つの研究に対するメタ分析を実施して、プライミング後及びMVA-HBVブースト後の、ChAd155-HBV対ChAd155-hIi-HBVによって誘導されるHBc特異的CD8+ T細胞応答を比較した。
【０１４２】
統計分析は、プライム後及びMVA-HBVブースト後に、ChAd155-hIi-HBV構築物を使用するプライム-ブーストレジメンによって誘導されたHBc特異的CD8+ T細胞応答が、ChAd155-HBVを使用するプライム-ブーストレジメンによって誘発されたものよりも有意に高かったことを示し、このことは、HBc配列に融合したヒトインバリアント鎖配列の使用を支持した。
a. 投与Iの14日後、幾何平均比(hIi/hIi無し)は、3.27と推定された(95%CI: 1.57〜6.79)
b. 投与IIの7日後、幾何平均比(hIi/hIi無し)は、6.25と推定された(95%CI: 2.11〜18.51)
【０１４３】
HBc及びHBs特異的抗体応答
ChAd155-HBVによる免疫化は、HBc特異的抗体を誘導したが、ChAd155-hIi-HBVによる免疫化は誘導しなかった。MVA-HBVブースター後、抗HBc抗体応答は、ChAd155-HBV又はChAd155-hIi-HBVでプライムされた群間で同等であった(図2)。HBs特異的抗体応答は、検出されなかった(データ示さず)。
【０１４４】
結論
ChAd155-hIi-HBVは、ChAd155-HBVと比較した場合、HBcに対して最も高いCD8+ T細胞応答を誘導し、この応答は、MVA-HBVブースト後にさらに増加した。
【０１４５】
［実施例2-近交系マウス(CB6F1)におけるHBc-HBs/AS01B-4免疫原性研究］
目的
この免疫原性研究の主な目的は、HBc及びHBsタンパク質が、AS01B-4中に共製剤化された場合にHBc及びHBs特異的液性応答及びT細胞応答の両方を誘導することができるかどうかを決定することであった。
【０１４６】
研究設計
6〜8週齢のCB6F1マウス(群あたり30匹のマウス)を、50μlのAS01B-4中に製剤化されたHBc、HBs又はHBc-HBs(以下の表2に列挙される)により、0、14及び28日目に筋肉内に3回免疫化した。HBc及びHBs特異的T細胞応答を、2回目及び3回目の投与の7日後に新鮮なPBLで測定し、抗HBs及び抗HBc抗体応答を、2回目及び3回目の投与の14日後に測定した。
【０１４７】
【表２】
2021506771.tif 000003
【０１４８】
統計分析
統計分析を、不均一分散モデルを使用して1因子(群)を用いてlog10値に対するANOVAを使用して行い、すなわち、同一の分散は、異なるレベルの因子について想定されなかった。この分析は、時点(2回目及び3回目の免疫化後)、T細胞応答(CD4+及びCD8+ T細胞)及び抗原特異性(HBs及びHBc)により行われている。群間の幾何平均比及びそれらの95%信頼区間(CI)の推定値を、log10値に対する逆変換を使用して得た。多重性についての調整を、テューキー(Tukey)の方法を使用して実施した。多重性調整された95%信頼区間を提供した。
【０１４９】
結果
HBc及びHBs特異的T細胞応答
HBc/AS01B-4、HBs/AS01B-4又はHBc-HBs/AS01B-4によるマウスの免疫化は、両方の抗原に対する強力なCD4+ T細胞応答を誘導した(図3)。HBc特異的CD4+ T細胞応答の大きさは、HBc-HBs/AS01B-4製剤について、HBc/AS01B-4と比較して有意に低く(2.3倍、P値=0.0468)、このことは、HBc特異的T細胞応答に対するHBsの干渉を示唆した。それにもかかわらず、HBc特異的CD4+ T細胞のレベルは、対照群におけるものをはるかに上回り、依然として強いと考えられた。HBs特異的CD4+ T細胞応答のレベルに対して、そのような干渉は観察されなかった。
【０１５０】
HBs/AS01B-4又はHBc-HBs/AS01B-4製剤は、強力なHBs特異的CD8+ T細胞応答を誘導した(図4)。他者によって報告されるように[Riedl, 2014]、本発明者らのワクチン候補のHBc配列にはH2-Kb MHC-I制限免疫優性エピトープ-MGLKFRQL-が存在しないため、このマウスモデルで予想される通り、ワクチン候補のいずれも、検出可能なHBc特異的CD8+ T細胞応答を誘導しなかった(データ示さず)。
【０１５１】
HBc及びHBs特異的抗体応答
高レベルの抗HBc及び/又は抗HBs抗体が、3つの製剤のそれぞれによって誘導された(図5を参照)。HBc-HBs/AS01B-4製剤において、HBc/AS01B-4と比較して、有意に低いレベルの抗HBc抗体応答が観察された(2.35倍、P＜0.0001)。対照的に、HBc-HBs/AS01B-4組み合わせ中のHBcの存在は、抗HBs抗体応答に負の影響を与えなかった(図5)。
【０１５２】
結論
全ての製剤(HBs/AS01B-4、HBc/AS01B-4及びHBc-HBs/AS01B-4)は、免疫原性であり、両方の抗原に対して細胞性応答及び液性応答の両方を誘導した(HBc特異的CD8+ T細胞応答を除いて)(このモデルで予想される通り)。HBc-HBs/AS01B-4製剤によって誘発された抗HBc応答は、HBc/AS01B-4によって誘発されたものよりも低く、このことは、このマウスモデルにおけるHBsの存在に関連する干渉を示唆した。この干渉をさらに評価した; 実施例7を参照（実施例７では、HBc対HBsの比4:1が、抗HBs抗体応答に影響を与えることなく、抗HBc免疫応答(抗体及び特異的CD4+ T細胞)を回復させることができた）。この製剤、HBc-HBs 4-1/AS01B-4を、アジュバント化タンパク質製剤を用いたその後の非臨床免疫原性研究のために選択した。
【０１５３】
［実施例3-近交系マウス(CB6F1)におけるアジュバント比較実験］
目的
この実験の主な目的は、様々なアジュバント(アラム、AS01B-4又はAS01E-4)を用いて、又はアジュバント無しで製剤化された4:1の比のHBc抗原及びHBs抗原の、両方の抗原に対する強力なCD4+ T細胞及び液性応答を誘導する能力を比較することであった。
【０１５４】
研究設計
6〜8週齢のCB6F1マウス(群1〜4について35匹のマウス、及び群5について25匹のマウス)を、アラム、AS01B-4又はAS01E-4を用いて製剤化されたHBc-HBs抗原(4μg-1μg)(以下の表3に列挙される)により、0、14及び28日目に筋肉内に3回免疫化した。AS01E-4アジュバント系は、AS01B-4と比較して、半分の量の免疫エンハンサーQS-21及びMPLを含有する。2回目及び3回目の投与の7日後に新鮮なPBLについて、ペプチドのプールによるエクスビボ(ex vivo)での6時間の再刺激後、HBc及びHBs特異的T細胞応答を測定し、2回目及び3回目の投与の14日後にELISAによって抗HBs及び抗HBc抗体応答を測定した。
【０１５５】
【表３】
2021506771.tif 000004
【０１５６】
統計分析
統計分析のために、ANOVAモデルを、固定効果として群を含め、不均一分散モデルを使用して、log2 T細胞頻度及びlog10抗体力価に適合させた(群間の同一の分散は想定されておらず、NaCl群は分析から除外された)。このモデルを使用して、幾何平均(及びそれらの95%CI)並びに幾何平均比(3つの他の群に対するASO1B)及びそれらの95%CIを推定した。ダネット(Dunnett)の調整を、HBc及びHBs特異的CD4+ T細胞頻度(一次エンドポイント)及び3回目の投与の14日後に測定した抗HBs抗体力価(二次エンドポイント)に適用した。他の応答/時点については、分析は記述的であり、調整を適用しなかった。
【０１５７】
結果
HBc及びHBs特異的T細胞応答
AS01アジュバント化製剤は、アラムアジュバント化及び非アジュバント化製剤と比較して、有意に高いHBc特異的CD4+ T細胞応答を誘発した(図6B)。AS01B-4製剤とAS01E-4製剤との間に、統計的に有意な差は観察されなかった。CB6F1マウスで以前に観察されたように、HBc特異的CD8+ T細胞応答は、試験した製剤が何であれ、検出不可能であった(データ示さず)。
【０１５８】
AS01アジュバント化製剤について、アラムアジュバント化及び非アジュバント化製剤と比較して、HBs特異的CD4+(図6A)及びCD8+(図6C)T細胞応答は、有意に高かった。AS01B-4製剤とAS01E-4製剤との間に、統計的に有意な差は観察されなかった。
【０１５９】
HBc及びHBs特異的抗体応答
AS01アジュバント化製剤は、アラムアジュバント化及び非アジュバント化製剤と比較して、有意に高い抗HBc及び抗HBs総IgG応答を誘発した(図7)。AS01B-4及びAS01E-4アジュバント化製剤によって誘発された総IgG抗体応答は、統計的に異ならなかった。
【０１６０】
結論
全体として、AS01アジュバント系(AS01E-4又はAS01B-4)は、CB6F1マウスにおいて、アラムベース又は非アジュバント化製剤と比較して、HBc及びHBsに対して最も高い液性及び細胞性応答を誘導した。
【０１６１】
［実施例4-HLA.A2/DR1トランスジェニックマウスにおけるChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV/HBs-HBc/AS01B-4ワクチンレジメンの免疫原性評価］
目的
この研究の目的は、ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVウイルスベクターによるプライム/ブーストと、それに続く、又はそれと共投与される2用量のHBc-HBs 4-1/AS01B-4タンパク質からなる様々なワクチンレジメンの免疫原性を評価することであった。
【０１６２】
研究設計
第1群のマウス(N=16)を、0日目にChAd155-hIi-HBVにより免疫化し、続いて28日後にMVA-HBVにより免疫化した。2用量のHBc-HBs 4-1μg/AS01B-4を、このプライム/ブーストウイルスベクターレジメン後に14日間隔で注射した(表4)。第2群のマウス(N=16)を、0日目にChAd155-hIi-HBV及びHBc-HBs 4-1/AS01B-4により免疫化し、続いて28日後にHBc-HBs 4-1/AS01Bと共投与されるMVA-HBVによりブーストした。MVA-HBV及びHBc-HBs 4-1/AS01Bの2回の後続の共免疫化を、14日間隔で実施した(表4)。第3群のマウス(N=8)に、陰性対照としてNaClを注射した。マウスを、2回目及び4回目の免疫化の7日後（それぞれ、7dpII、7dpIV）に犠牲にして、HBc及びHBs特異的液性(血清)及び細胞性免疫応答(脾細胞及び肝臓浸潤リンパ球における)を決定した。
【０１６３】
この研究は記述的であり、統計的なサンプルサイズ正当化（justification）及び分析を実施しなかった。
【０１６４】
【表４】
2021506771.tif 000005
【０１６５】
結果
HBc及びHBs特異的CD8+ T細胞応答(脾細胞)
HBc-HBs 4-1/AS01B-4の、ChAd155-hIi-HBVベクター(プライムとして)及びMVA-HBVベクター(ブーストとして)との共投与(群2)は、7dpIIにおいて、ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVのみ(群1)の注射と比較した場合、HBc特異的CD8+ T細胞応答の4倍増加を誘導した(図8)。HBsに対する同様のCD8+ T細胞応答が、両方の群において誘導された(図8)。
【０１６６】
7dpIVでは、HBc特異的CD8+ T細胞応答は、HBc-HBs/AS01B-4の後続の投与後に明らかにブーストされた(7dpIIと比較して5倍増加)が、HBs特異的CD8+ T細胞応答はブーストされなかった(群1)。MVA-HBV/HBc-HBs 4-1/AS01B-4の2回の追加用量が共投与された場合、HBc又はHBs特異的CD8+ T細胞のさらなる増加は観察されなかった(群2)。
【０１６７】
HBc及びHBs特異的CD4+ T細胞応答(脾細胞)
低レベルのHBc及びHBs特異的CD4+ T細胞が、プライム-ブーストChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV免疫化後に検出され(それぞれ中央値0.17%及び0.11%)(群1)、一方、HBc-HBs 4-1/AS01B-4がプライム-ブーストChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVと共投与された場合、7dpIIにおいて、両方の抗原に対する強力な応答が観察された(群2)(図9)。
【０１６８】
ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVプライム-ブースト後のHBc-HBs 4-1/AS01B-4の後続の投与(群1)は、7dpIVにおいてHBc及びHBs特異的CD4+ T細胞応答を大幅に増強した(それぞれ中央値1.64%及び2.32%)。最後に、HBc-HBs/AS01B-4と共投与されるプライムブーストChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVですでにワクチン接種されているマウスに、2回の追加用量のMVA-HBV及びHBc-HBs/AS01B-4が共投与された場合、同じ時点において、HBs特異的CD4+ T細胞の頑強な増加が観察された(群2)。HBc特異的CD4+ T細胞は、その同じ群におけるIIの7日後(7dpost II)と同じレベルのままであった。
【０１６９】
肝臓浸潤リンパ球において測定されたHBc及びHBs特異的T細胞応答
最後の免疫化の7日後に、肝臓におけるワクチン誘導T細胞応答の存在を、ICSによって調査した。インビトロ(in vitro)再刺激及びICSを実施するのに十分な数の肝臓浸潤リンパ球を確保するために、3又は4個の肝臓の灌流後に回収された細胞のプールを、各データ点について構成した。データ点の数が少ないため、統計分析を実施せず、結果は記述的である。
【０１７０】
両方のワクチンレジメンは、ワクチン接種されたマウスの肝臓において検出可能なHBc及びHBs特異的CD4+ T細胞を誘発した(図10)。強力なHBc特異的CD8+ T細胞応答が、両方のワクチンレジメンでワクチン接種された動物の肝臓において測定され、一方、はるかに低い頻度のHBs特異的CD8+ T細胞が測定された。
【０１７１】
HBc及びHBs特異的抗体応答
ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVの、HBc-HBs 4-1/AS01B-4との共投与(群2)は、7dpIIにおいて最高量の抗HBc抗体を誘導した(図11)。MVA-HBV+HBc-HBs/AS01B-4の後続の注射は、抗HBc抗体応答のレベルをさらに増加させなかった(7dpIV)。ChAd155-hIi-HBV及びMVA-HBVで予備免疫化されたマウスにおいて、HBc-HBs/AS01B-4の注射後に、7dpIVにおいて、抗HBc特異的抗体応答の明らかな増加が観察された(群1)。ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVによる免疫化後の動物において抗HBs抗体応答が検出されなかったため、HBc-HBs/AS01B-4成分の存在は、強力な抗HBs抗体を誘発するためにスケジュールにおいて重要であるように思われた(図11)。応答の最大の大きさは、最後の免疫化後に共投与群(群2)において観察された。
【０１７２】
結論
HLA.A2/DR1トランスジェニックマウスでは、ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVは、低いが検出可能なHBc特異的CD4+ T細胞応答を誘発し、これは、HBc-HBs 4-1/AS01B-4によって明らかに増強された。ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVによる最初のプライム-ブースト免疫化は、強力なHBc及びHBs特異的CD8+ T細胞応答を誘導し、HBc特異的応答は、順次与えられたHBc-HBs/AS01B-4ブースト後にさらに増加した。
【０１７３】
興味深いことに、ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVが、HBc-HBs 4-1/AS01B-4と共投与された場合、2回のみの免疫化後に、高レベルのHBc及びHBs特異的CD4+及びCD8+ T細胞、及び抗体が誘導された。MVA-HBV+HBc-HBs/AS01B-4によるさらなる免疫化は、これらの応答のレベルをさらに増加させなかった。
【０１７４】
さらに、ワクチン誘導HBc及びHBs特異的CD4+及びCD8+ T細胞はまた、両方のワクチンレジメンでワクチン接種された動物の肝臓において検出された。
【０１７５】
［実施例5-ChAd155ベクターによってコードされた「インバリアント鎖」配列Iiに対するT及びB細胞寛容の評価: CB6F1マウスにおけるマウスIi配列(mIi)をコードするChAd155構築物の使用］
目的
マウスIi配列(mIi)をコードするChAd155構築物: ChAd155-mIi-HBVを使用する同種モデルにおいて「インバリアント鎖」配列Iiに対するT及びB細胞寛容を調査するために、CB6F1マウスにおいて免疫原性研究を実施した。
【０１７６】
研究設計
自己mIi特異的免疫応答の誘導を、高用量(109vp)のChAd155-mIi-HBVベクターによる2回の筋肉内免疫化(0及び14日目)後に、IFN-γELISpot(脾細胞における)及びELISA(血清における)によって評価した(表5)。
【０１７７】
【表５】
2021506771.tif 000006
【０１７８】
方法
T細胞応答について、マウスIi配列を包含し、プールに調製された、11アミノ酸により重複する15マーのペプチドを、IFN-γ-ELISpotアッセイにおいて抗原として使用した。抗体応答について、市販のマウスIi組換えタンパク質、及びマウスIiに特異的なモノクローナル抗体を、ELISAプレートをコーティングするために、及び陽性対照としてそれぞれ使用した。「ワクチン接種」の陽性対照として、HBc及びHBs特異的T細胞応答を、IFN-γ-ELISpotアッセイにおいてモニターした。
【０１７９】
結果
強力なHBc特異的T細胞応答及び低いが検出可能なHBs特異的T細胞応答が、ChAd155-mIi-HBVによる1回目及び2回目の免疫化後に測定された。注目すべきことに、HBc Kb制限優性クラスIエピトープ(MGLKFRQL)を、この構築物中に加え、このマウス系統におけるHBc特異的CD8+ T細胞応答のモニタリングを可能とし、脾細胞を、ELISpotアッセイにおいてこの特定の配列により再刺激した。1回目又は2回目の免疫化の2週間後、いずれの動物においても抗mIi抗体(図13)及びmIi特異的T細胞(図12)は検出されず、このことは、mIi配列に対する免疫寛容が維持されたことを示唆した。
【０１８０】
［実施例6-AAV2/8-HBV形質導入HLA.A2/DR1マウスにおけるChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV/HBc-HBs/AS01B-4ワクチンレジメンの免疫原性及び安全性の評価］
目的
AAV2/8-HBV形質導入HLA.A2/DR1マウスモデルは、慢性HBV感染症のウイルス学的及び免疫学的特徴を再現する。このモデルでは、マウスの肝臓は、複製能のあるHBV DNAゲノムを保有するアデノ随伴ウイルス血清型2/8(AAV2/8)ベクターにより形質導入される。
【０１８１】
AAV2/8-HBVベクターの5×1010vg(ウイルスゲノム)の単回尾静脈注射は、AAV2/8-HBV形質導入マウスの肝臓においてHBV複製及び遺伝子発現をもたらす[Dion; 2013]。HBV DNA複製中間体、HBV RNA転写産物、及びHBc抗原は、関連する重大な肝臓炎症無しに、注射後最大1年、肝臓において検出される。HBs及びHBe抗原、並びにHBV DNAは、最大1年、血清において検出することができる。さらに、HBV抗原に対する免疫寛容の確立は、慢性HBV感染症のこの代理モデルにおいて観察される。
【０１８２】
AAV2/8-HBV形質導入HLA.A2/DR1マウスにおいて実施されるこの研究の目的は、
●ワクチンレジメンが、HBs及びHBc抗原に対する寛容を克服することができることを実証すること
●肝臓の組織学(H&E染色)並びにAST及びALTレベル(肝臓機能に対する代理パラメーターとして)に対する、HBcAgを発現する肝細胞を潜在的に標的とする肝臓浸潤HBc特異的CD8+ T細胞の影響を評価すること
であった。
【０１８３】
研究設計
単独の又はHBc-HBs 4-1/AS01B-4と組み合わせた、ChAd155-hIi-HBV及びMVA-HBV(両方ともHBVコア[HBc]及び表面[HBs]抗原をコードする)と、それに続く、2回の追加用量のHBc-HBs 4-1/AS01B-4(単独で又はMVA-HBVと組み合わせて)による順次免疫化に基づく、2つの異なるワクチンレジメンを試験した(表6)。
【０１８４】
群1、2及び3のHLA.A2/DR1マウスを、0日目に5×1010vgのAAV2/8-HBVベクター(静脈内投与)により形質導入し、一方、群4は、免疫原性についての陽性対照として機能した(ワクチン接種前に寛容の確立無し)。
【０１８５】
群1の動物(N=21)を、31日目にChAd155-hIi-HBVにより、続いて58日目にMVA-HBVにより免疫化した。2用量のHBc-HBs 4-1μg/AS01B-4を、このプライム/ブーストウイルスベクターレジメン後72及び86日目に注射した(表6)。
【０１８６】
群2の動物(N=21)を、31日目にChAd155-hIi-HBVにより免疫化し、HBc-HBs 4-1/AS01B-4を共投与し、続いて58日目にHBc-HBs 4-1/AS01Bと共投与されるMVA-HBVによりブーストした。MVA-HBV及びHBc-HBs 4-1/AS01Bの2回の後続の共免疫化を、72及び86日目に実施した(表6)。
【０１８７】
群3の動物(N=21)に、31、58、72及び86日目にNaClを陰性対照として注射した。
【０１８８】
群4の動物(N=8)は、群2と同じワクチンレジメンを受けた(AAV2/8-HBVを形質導入されなかったことを除く)。
【０１８９】
全てのワクチンを、筋肉内に投与した。
【０１９０】
HBs循環抗原のレベルを、23、65及び93日目に血清において測定した(群1、2及び3)。
【０１９１】
HBs及びHBc特異的抗体応答を、ELISAによって、23日目(AAV2/8-HBV形質導入後)、65日目(2回目の免疫化の7日後)及び93日目(4回目の免疫化の7日後)に全ての動物の血清において測定した。HBs及びHBc特異的CD4+及びCD8+ T細胞応答を、エクスビボ(ex vivo)再刺激及びICS後に、脾細胞及び肝臓浸潤リンパ球において65日目(9匹の動物/群)及び93日目(12匹の動物/群)に評価した(群1、2及び3)。これらの免疫原性読み取りを、群4の動物(8匹の動物)について93日目にのみ実施した。
【０１９２】
肝臓関連の安全性パラメーターに関して、AST及びALTのレベルを、38、65及び93日目に血清において測定し、H&Eで染色した肝臓切片の顕微鏡検査を、65及び93日目に実施して、潜在的なワクチン関連の組織病理学的変化又は炎症を検出した(群1、2及び3)。
【０１９３】
【表６】
2021506771.tif 000007
【０１９４】
統計分析
AST及びALTレベル
性別、日、群及び3つの2×2交互作用を含む反復測定についてのANOVAモデルを、非構造化共分散構造を使用して、log10変換された酵素活性値に適合させた。モデルの仮説を検証した。5%レベルで有意ではない交互作用を、モデルから除去した。両方の酵素について、最終的なモデルは、性別、日、群、及び群と日との間の交互作用を含んだ。各時点での各群の酵素活性の幾何平均を、このモデルから導出した。目的の群比較は、幾何平均比(GMR)(これもこのモデルから導出した)により報告される。これら全ての統計は、両側95%信頼区間で表示される。これらのGMRを計算する際、多重性を考慮しなかった。
【０１９５】
全ての分析を、SAS 9.2を使用して実施した。
【０１９６】
液性応答
応答個体の数を算出するために、記述的統計を実施した。抗HBc又は抗HBs抗体応答の応答性についてのカットオフを、群3(AAV2/8-HBV形質導入されたがワクチン接種無し)で算出された幾何平均力価に基づいて定義した。
【０１９７】
細胞性応答
HBc、HBs特異的CD4+又はCD8+ T細胞のいずれかについての応答個体の数を定義するために、記述的分析を実施した。応答性についてのカットオフを、群3(AAV2/8-HBV形質導入されたがワクチン接種無し)で行われた測定の95パーセンタイルとして定義した。
【０１９８】
結果
HBc特異的CD8+及びCD4+ T細胞
AAV2/8-HBV形質導入HLA-A2/DR1マウスでは、HBc特異的CD8+又はCD4+ T細胞のバックグラウンドレベルは、試験した全ての時点で、免疫化無しでは非常に低い〜検出不可能であった(群3)。
【０１９９】
単独の(群1)又はHBc-HBs 4-1/AS01B-4と組み合わせた(群2)、ChAd155-hIi-HBV及びMVA-HBVベクターによる免疫化は、HBc特異的CD8+ T細胞を誘導し(IIの7日後にそれぞれ6/7及び9/9応答個体)、このことは、HBc抗原に対する寛容の回避を実証した(図14A)。単独の又はMVA-HBVと組み合わせた、HBc-HBs 4-1/AS01B-4の2回の追加用量は、4回目の投与の7日後に測定すると、これらのHBc特異的CD8+ T細胞応答を適度にのみ増加させ、群1において1%、及び群2において1.45%の中央値頻度に達した。群2におけるのと同じワクチンレジメンによって誘導されたHBc特異的CD8+ T細胞の頻度は、HBc抗原に対する免疫寛容に起因して予想される通り、群4の非形質導入HLA.A2/DR1マウスにおいてより高かった(8/8応答個体、頻度はIVの7日後に約4倍高かった)。HBc特異的CD8+ T細胞はまた、脾臓におけるのと同じプロファイルで、ワクチン接種されたマウスの肝臓において検出された(図14B)。
【０２００】
両方のワクチンレジメンは、AAV2/8-HBV形質導入HLA-A2/DR1マウスにおいて、非常に低い〜検出不可能なHBc特異的CD4+ T細胞を誘発し(群1及び2)、一方、非形質導入マウスでは頑強な応答が測定され(群4)、このことは、ワクチンレジメンが、これらの実験条件下で、HBc抗原に対するCD4+ T細胞寛容を克服しなかったことを示唆した(図15A、B)。
【０２０１】
HBs特異的CD8+及びCD4+ T細胞
単独の(群1)又はHBc-HBs 4-1/AS01B-4と組み合わせた(群2)、ChAd155-hIi-HBV及びMVA-HBVベクターによる免疫化は、AAV2/8-HBV形質導入マウスにおいて、HBs特異的CD8+ T細胞を誘発し、単独の又はMVA-HBVと組み合わせた2回の追加用量のHBc-HBs 4-1/AS01B-4後に、強度のさらなる増加はなかった(図16A)。ワクチン接種スケジュールの終了時(4回目の投与の7日後)、群1及び2の動物において測定されたHBs特異的CD8+ T細胞の頻度は、群4(非形質導入HLA.A2/DR1マウス、IVの7日後の中央値=0.62%、5/8応答個体)において検出されたものに近く、このことは、HBs抗原に対するT細胞寛容の克服を示唆した。HBs特異的CD8+ T細胞は、ワクチン接種された動物のほとんどにおいて、群1、2及び4の動物の肝臓において検出された(図16B)。
【０２０２】
HBs特異的CD4+ T細胞は、群2において2回目のワクチン接種の7日後から、及び群1において4回目のワクチン接種の7日後から、単独の又はベクターと組み合わせた、HBc-HBs 4-1/AS01B-4の投与後に誘導された(図17A)。群2の動物において使用されたワクチンスケジュールは、群1(IVの7日後の中央値=1.34%、11/12応答個体)の動物において使用されたワクチンスケジュールと比較して、HBs特異的CD4+ T細胞の約3倍高い頻度を誘発し(IVの7日後の中央値=3.7%、11/11応答個体)、群4(非形質導入HLA.A2/DR1マウス、IVの7日後の中央値=3%、8/8応答個体)におけるのと同様のレベルに達し、このことは、HBs抗原に対するT細胞寛容の完全な克服を示唆した。全身的CD4+ T細胞応答と同様に、HBs特異的CD4+ T細胞は、全てのワクチン接種された動物において、群1、2及び4の動物の肝臓において検出された(図17B)。
【０２０３】
HBs及びHBc特異的抗体応答
AAV2/8-HBVベクターの注射の23日後、抗HBs抗体応答は、HLA.A2/DR1マウスにおいて検出されず、このことは、HBs抗原に対する強力な液性寛容を示唆した。ChAd155-hIi-HBV及びMVA-HBVベクター単独(群1)による免疫化は、この寛容を破壊せず、一方、HBc-HBs 4-1/AS01B-4と組み合わせたベクターの免疫化は、65日目に21匹の動物のうち15匹において、抗HBs抗体応答の誘導をもたらした(群2)(図18A)。群1における2用量のHBc-HBs 4-1/AS01B-4のさらなる投与は、検出可能な抗HBs抗体を誘発し(93日目において116.8の幾何平均力価(GMT)及び8/12応答個体)、群2におけるHBc-HBs 4-1/AS01B-4と組み合わせた2回の追加用量のMVA-HBVは、11/11応答個体で、775のGMTまで抗HBs抗体応答の強度をさらに増加させた(93日目において群4の非AAV2/8-HBV形質導入動物(GMT=3933)におけるよりも約5倍低いままであるが)。
【０２０４】
同様に、HBc-HBs 4-1/AS01B-4成分がワクチンレジメンに存在する場合にのみ、抗HBc抗体応答が誘導され、群1(GMT=442.8; 12/12応答個体)と比較して、群2(GMT=1335.5; 11/11応答個体)の動物において93日目に3倍高いレベルが測定された(図18B)。群2におけるのと同じワクチンレジメンで非形質導入マウス(群4)において誘導された抗HBc抗体力価は、より高かった(約27倍、GMT=35782)。
【０２０５】
これらの結果は、ワクチンレジメンにおけるアジュバント化タンパク質成分の存在が、HBc抗原及びHBs抗原の両方に対する液性寛容を破壊するのに重要であることを示す。さらに、HBc-HBs 4-1/AS01B-4の4回の投与を含む、群2において使用されるワクチンレジメンは、最も高い抗HBc及び抗HBs抗体応答を誘発した(非AAV2/8-HBV形質導入マウス(群4)におけるよりも低いままであるが)。
【０２０６】
AST/ALTレベル
肝臓関連の炎症パラメーターとして、AST及びALTの血清活性を、38日目(1回目のワクチン接種の7日後)、65日目(2回目のワクチン接種の7日後)、及び/又は93日目(4回目の免疫化の7日後)に測定した(全ての群)。全体として、AST及びALTレベルは、AAV2/8-HBV形質導入HLA.A2/DR1マウスにおいてワクチンレジメンの過程中、安定しており(群1及び2)、ワクチンを受けていないマウス(群3)において測定されたものと同様であった(図19)。ASTレベルは、65日目において、対照群3と比較して、ワクチン群(群1及び2)の動物において統計的に有意に高いことが見出された。しかし、ASTレベルは、残りの動態と比較して、群3の動物において65日目に驚くほど低く、このことは、これらの差が、ワクチン群(群1及び2)におけるASTレベルの増加ではなく、この時点で対照群3で得られた特に予想外に低い値に起因するものであったことを示唆した(図19A)。
【０２０７】
群3の対照動物におけるのと比較して、群1の動物において38日目にわずかに低いALTレベルが測定されたが、この差は、臨床的に関連があるとは見なされなかった(図19B)。
【０２０８】
肝臓顕微鏡検査
H&Eで染色された肝臓切片の顕微鏡検査を、65及び93日目に実施して、潜在的なワクチン関連の組織病理学的変化又は炎症を検出した(群1、2及び3)(表7)。
【０２０９】
AAV2/8-HBV形質導入HLA-A2/DRマウスにおいて、65日目(HBc-HBs 4-1/AS01B-4有り又は無しの、2回目のウイルスベクター化ワクチンMVA-HBVの注射の7日後)、又は93日目(最後の注射の7日後)のいずれかに、検査項目に関連する顕微鏡的所見はなく、すなわち、ワクチン成分ChAd155-hIi-HBV、MVA-HBV及びHBc-HBs 4-1/AS01B-4の使用に関連し得る組織病理学的変化はなかった。
【０２１０】
さらに、対照動物3.13(限局性グレード1のピースミール壊死(piecemeal necrosis)を示した)を除いて、いずれの動物も、慢性肝炎の形態学的兆候を示さなかった。
【０２１１】
処置された動物で認められた他の顕微鏡的所見は、対照群でも生じ、発生率/規模が小さく、及び/又は同様の週齢のマウスでよく見られる背景所見である[McInnes, 2012]ため、偶発的な変化と考えられた。
【０２１２】
【表７】
2021506771.tif 000008
【０２１３】
AAV2/8-HBV注射マウスの血清中のHBs抗原レベル
Dionら[Dion, 2013]にすでに報告されているように、AAV2/8-HBVベクターによる注射の23日後、HBs抗原レベルは、雌と比較して、雄においてより高かった。これらのレベルは、ワクチン接種レジメンの検出可能な影響無しに、全ての群で安定したままであった(図20)。しかし、AAV2/8-HBV注射マウスは、HBsAgに対するワクチン効力を研究するための動物モデルではない。
【０２１４】
結論
HBc及びHBs抗原に対する免疫寛容が確立されている慢性HBV感染症の代理モデル、すなわち、AAV2/8-HBV形質導入HLA-A2/DR1マウスでは、両方の試験されたワクチンレジメンは、強力な免疫寛容のために予想されるように、非形質導入マウスにおけるよりも低いレベルではあるが、HBc及びHBs特異的IgG及びCD8+ T細胞応答、並びにHBs特異的CD4+ T細胞応答を誘導することによって寛容を回避した。ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBVベクターが、HBc-HBs 4-1/AS01B-4と共投与された場合、ワクチン誘導抗体及びT細胞応答の強度は、ベクター及びアジュバント化タンパク質が順次投与されるワクチンレジメンを用いた場合よりも高かった。さらに、AST及びALTの血清活性を測定し、肝臓組織病理学的評価を実施することによって、ワクチン関連の肝臓炎症を評価したが、非ワクチン接種のものと比較した場合、ワクチン群において肝臓酵素の増加は検出されず、いずれの顕微鏡的所見もワクチン処置に関連する可能性はなかった。まとめると、これらの結果は、試験されたワクチン候補が、これらの実験条件下で、肝変化の関連する兆候の検出無しに、HBs及びHBc特異的抗体及びCD8+ T細胞応答、並びにHBs特異的CD4+ T細胞応答を首尾よく回復させたことを示す。
【０２１５】
実施例1〜6の非臨床免疫学データの概要
AS01B-4アジュバント系中に製剤化されたワクチンタンパク質(HBc-HBs)によりワクチン接種されたCB6F1マウスにおける研究は、HBc誘導抗体及びCD4+ T細胞応答に対するHBs抗原の負の干渉を示唆した。それにもかかわらず、HBc-HBs/AS01B-4組み合わせワクチンは、両方のワクチン抗原に対する頑強な特異的CD4+ T細胞及び抗体応答を開始させることができた。
【０２１６】
- アラムベース又は非アジュバント化製剤と比較した場合、AS01ファミリーベースの製剤は、HBc抗原及びHBs抗原の両方に対する有意に高いCD4+ T細胞及び抗体応答を誘導した。
【０２１７】
HLA.A2/DR1トランスジェニックマウスにおけるChAd155-hIi-HBVの投与は、HBc抗原に対する強力なCD8+ T細胞応答を誘導し、より少ない程度でHBs抗原に対するCD8+ T細胞応答を誘導した。HBc抗原に対する応答は、構築物中のhIiの存在によって明らかに増強された。MVA-HBVの後続の投与は、HBc抗原に対するCD8+ T細胞応答をさらに増加させた: MVAブースト後、ChAd155-hIi-HBVでプライムされたマウスにおいて、ChAd155-HBVでプライムされたマウスに対して、HBc特異的CD8+ T細胞のより高い頻度が観察され、一方、HBs特異的CD8+ T細胞応答は、さらに増強されなかった。
【０２１８】
HLA.A2/DR1トランスジェニックマウスに投与された場合、完全なワクチン接種レジメン(すなわち、ウイルスベクター及びアジュバント化タンパク質の順次又は同時投与)は、両方のワクチン抗原に対する頑強なCD4+ T細胞、CD8+ T細胞及び抗体応答を誘導した。さらに、ワクチン誘導HBs及びHBc特異的CD4+及びCD8+ T細胞は、両方のワクチンレジメンでワクチン接種された動物の肝臓において検出された。
【０２１９】
マウスIi配列(mIi)をコードするChAd155構築物: ChAd155-mIi-HBVを使用する同種モデルにおいて「インバリアント鎖」配列(Ii)に対するT及びB細胞寛容を調査するために、CB6F1において免疫原性研究を実施した。自己mIi特異的免疫応答の誘導を、高用量(109vp)のChAd155-mIi-HBVベクターによる2回の免疫化(0及び14日目)後に評価した。1回目又は2回目の免疫化の2週間後、いずれの動物でも抗mIi抗体及びmIi特異的T細胞は検出されず、このことは、mIi配列に対する免疫寛容が維持されたことを示唆した。
【０２２０】
HBV抗原に対する免疫寛容が観察される前臨床のHBV持続性マウスモデル(AAV2/8-HBV形質導入HLA.A2/DR1マウス)では、ワクチンレジメンは、寛容を破壊することができ、HBc及びHBs特異的CD8+ T細胞、HBs特異的CD4+ T細胞、並びにHBs抗原及びHBc抗原の両方に対する抗体応答が誘導された(HBc特異的CD4+ T細胞応答は観察されなかったが)。しかし(及び予想通り)、AAV形質導入マウスにおけるワクチン誘導応答のレベルは、ナイーブHLA.A2/DR1マウスにおいて検出されたものよりも低かった。さらに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)及びALTの血清活性を測定し、肝臓組織病理学的評価を実施することによって、ワクチン関連の肝臓炎症を評価したが、非ワクチン接種群と比較した場合、ワクチン群において肝臓酵素の増加は検出されず、いずれの顕微鏡的所見もワクチン処置に関連する可能性はなかった。まとめると、これらの結果は、試験されたワクチン候補が、これらの実験条件下で、肝変化の関連する兆候の検出無しに、HBs及びHBc特異的抗体及びCD8+ T細胞応答、並びにHBs特異的CD4+ T細胞応答を首尾よく回復させたことを示す。
【０２２１】
［実施例7-様々なアジュバント化組換えタンパク質HBc/HBs比の免疫原性評価］
目的
実験の目的は、3回目の免疫化の7日後に実施例2(HBs抗原及びHBc抗原が1対1の比で混合された)で見られたような、HBc誘導CD4+ T細胞応答に対する、HBs抗原の負の干渉を確認することであった。さらなる目的は、この干渉を制限し、少なくとも強力なHBc特異的CD4+ T細胞応答を確実にする(同時に頑強なHBc及びHBs特異的抗体応答を生成しながら)ために、HBs/HBcの様々な比を評価することであった。
【０２２２】
研究設計
6〜8週齢のCB6F1マウス(群あたり30匹のマウス)を、50μlのAS01B-3又はAS01B-4中にHBc及びHBs抗原を含有する様々な製剤(表8に列挙される)により、0、14及び28日目に筋肉内(腓腹筋)に3回免疫化した。CB6F1マウスを無作為に研究群の1つに割り当てた。細胞内サイトカイン染色(ICS)によるHBc及びHBs特異的T細胞応答の評価を、5匹のマウスのプール6個/群から、2回目及び3回目の免疫化の7日後に収集された白血球を使用して行った。血清を、2回目及び3回目の免疫化の14日後に個々のマウスから収集し、統計的サンプルサイズ分析の結果、20匹の無作為化マウスの血清のみをHBc及びHBs特異的抗体総Ig応答の評価のために試験した。
【０２２３】
【表８】
2021506771.tif 000009
【０２２４】
統計分析
対応するHBc群と比較したHBc-HBs群の非劣性を評価した。対応するHBc-HBs群に対する、HBc群についての少なくとも1つのサイトカイン(IL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-α)を発現するHBc特異的CD4+ T細胞の頻度(%)の幾何平均比の95%CIのULが、投与IIIの7日後に2未満である場合、この非劣性に達する。これは最初の評価であり、基準が予め定義されていなかったため、多重性についての調整を適用しなかった。
【０２２５】
ANOVA(分散分析)モデルを使用して、2つの主要な目的に答えた。このモデルを、固定効果として群(4〜12)、交互作用を含め、不均一分散モデルを使用して(群間の同一の分散は想定されなかった)、投与III後のlog10 CD4+頻度に適合させた。このモデルを使用し、log10平均及び差の逆変換を使用して、幾何平均(及びそれらの95%CI)並びに幾何平均比及びそれらの95%CIを推定した。
【０２２６】
結果
抗原特異的CD4+ T細胞応答
全ての製剤は、2回目の免疫化後、強力な抗HBc及びHBs特異的CD4+ T細胞応答を誘導した(±1%)。AS01B-4中に等量のHBc及びHBsを含有する製剤によって誘発されたHBc特異的CD4+ T細胞応答の大きさは、HBc/AS01B-4単独群と比較した場合、より低い傾向があった(図23)が、比が±1.4(p=0.143)であったため、これらの差は統計的に有意ではなかった(図23)。3回目の免疫化後、AS01B-4中に等量のHBc及びHBsを含有する製剤によって誘発されたHBc特異的CD4+ T細胞応答の大きさは、HBc/AS01B-4単独群と比較した場合、統計的により低かった(GMR 0.391及び95%CI[0.184〜0.828])(図24)。これは、実施例2におけるHBc特異的CD4+ T細胞応答に対するHBsの干渉の観察を確認した。抗原がHBc及びHBs抗原の4対1の比で製剤化された場合、干渉はあまり顕著ではなかった。HBs特異的CD4+ T細胞応答を見ると、そのような負の影響は見られなかった(図23及び図24)。
【０２２７】
HBc対HBsの比をさらに増加させることによって、そのようなHBc特異的CD4+ T細胞応答がさらに回復する傾向があり(統計的には有意ではないが)、IFN-γ及び/又はIL-2及び/又はTNFαを発現する総HBc特異的CD4+ T細胞の中央値は最大1.7%であった。
【０２２８】
HBs特異的CD8+ T細胞応答を、2回目及び3回目の免疫化後に評価した(図25)。HBs特異的用量範囲応答は、2回目及び3回目の免疫化後に観察された。3回目の免疫化後、HBs特異的CD8+ T細胞応答は、等量のHBc抗原と共製剤化された場合、減少する傾向があった(GMR 0.66及び95%CI[0.337〜1.295])が、この比は、統計的に有意ではない(p=0.1717)。HBc特異的CD8+ T細胞応答は、低い〜検出不可能であった(0.1%未満、データ示さず)。
【０２２９】
抗原特異的抗体応答
全ての製剤は、2回目の免疫化後、AS01B-4アジュバント系中に1対1の比でHBs及びHBcを共製剤化した場合の負の影響無しに、高い、同様の抗HBc及びHBs総Ig応答を誘導した(図26)。抗HBc特異的総Ig応答は、3回目の免疫化後にブーストされた(図27)。AS01B-4アジュバント系中に1対1の比でHBs及びHBcを共製剤化した場合、HBc特異的抗体応答のレベルに対してHBs干渉が見られた。GMT比及び95%信頼区間は、1.88[1.44; 2.44]であり、p値＜0.0001であった。HBc対HBsの比を4増加させると、HBc液性応答の回復が可能になり、GMT比及び95%信頼区間は、1.37[1.04; 1.80]であり、p=0.0262であった。以前に報告されたように、HBcは、HBs特異的抗体応答のレベルに負の影響を与えなかった(図26及び27)。
【０２３０】
結論
これらの実験の結果は、両方の抗原を1/1比で共製剤化した場合に観察されるHBc特異的CD4+ T細胞及び液性応答に対する、HBsの負の干渉が、HBc/HBs比≧4を用いた製剤について克服されたことを示す。結果として、4μgのHBc及び1μgのHBsの用量を、さらなる前臨床実験のために選択した。
【０２３１】
配列表
配列番号1: HBsのアミノ酸配列
2021506771.tif 000010
【０２３２】
配列番号2: HBc切断体のアミノ酸配列
2021506771.tif 000011
【０２３３】
配列番号3: 口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサーのアミノ酸配列
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【０２３４】
配列番号4: 口蹄疫ウイルスの2A切断領域を組み込むスペーサーをコードするヌクレオチド配列
2021506771.tif 000013
【０２３５】
配列番号5: HBc-2A-HBsのアミノ酸配列
2021506771.tif 000014
【０２３６】
配列番号6: HBc-2A-HBsをコードするヌクレオチド配列
2021506771.tif 000015
2021506771.tif 000016
【０２３７】
配列番号7: hIiのアミノ酸配列
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【０２３８】
配列番号8: hIiをコードするヌクレオチド配列
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【０２３９】
配列番号9: hIi-HBc-2A-HBsのアミノ酸配列
2021506771.tif 000019
2021506771.tif 000020
【０２４０】
配列番号10: hIi-HBc-2A-HBsをコードするヌクレオチド配列
2021506771.tif 000021
【０２４１】
配列番号11: HBcのアミノ酸配列
2021506771.tif 000022
【０２４２】
配列番号12: hIi代替バリアントのアミノ酸配列
2021506771.tif 000023
【０２４３】
配列番号13: hI代替バリアントをコードするヌクレオチド配列
2021506771.tif 000024
【０２４４】
配列番号14: hIi-HBc-2A-HBsの代替核酸配列
2021506771.tif 000025
2021506771.tif 000026
【０２４５】
配列番号15: hIi-HBc-2A-HBsの代替アミノ酸配列
2021506771.tif 000027
【０２４６】
参考文献:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
2021506771.tif 000039
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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