(57)【要約】  本開示は、概して、ポリシアル酸と結合し、その活性を中和し得る免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）に関する。本技術の抗体は、それを必要とする対象においてポリシアル酸関連癌を検出および処置する方法において有用である。
2021517816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）ＶHは、ＤＹＹＩＨ（配列番号１）、ＲＹＹＩＨ（配列番号７）、ＧＹＹＩＨ（配列番号８）およびＮＹＹＩＨ（配列番号９）からなる群から選択されるＶH−ＣＤＲ１配列、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）、ＳＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１０）、ＲＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１１）、ＣＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１２）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＥＧ（配列番号１３）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号１４）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号１５）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＥＫＦＱＧ（配列番号１６）、およびＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＱＫＦＫＧ（配列番号１８）からなる群から選択されるＶH−ＣＤＲ２配列、およびＧＧＫＦＡＭＤＹ（配列番号３）のＶH−ＣＤＲ３配列を含み、ならびに／または
（ｂ）ＶLは、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号４）およびＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＫＴＹＬＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ１配列、ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶL−ＣＤＲ２配列、およびＦＱＧＴＨＶＰＹＴ（配列番号６）、ＦＱＧＴＨＶＰＹＩ（配列番号２１）、およびＦＱＧＴＨＥＰＹＴ（配列番号２２）からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプのＦｃドメインをさらに含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
Ｎ２９７ＡおよびＫ３２２Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むＩｇＧ４定常領域を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、ｓｃＦvおよびＦvからなる群から選択される、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項６】
高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）と結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体である、請求項１〜４または６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、もしくは１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、ならびに／または配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号６０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、もしくは１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む抗体。
【請求項９】
それぞれ、
ａ）配列番号２３および配列番号２４（キメラＰ３５）；
ｂ）配列番号２５および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２）；
ｃ）配列番号２５および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ１）；
ｄ）配列番号２６および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ２）；
ｅ）配列番号２６および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ１）；
ｆ）配列番号４８および配列番号４９（ＢＣ１３７）；
ｇ）配列番号５１および配列番号５２（ＢＣ１３７  ＫＳ２）；
ｈ）配列番号５３および配列番号５４（ＢＣ１３７  ＫＳ３４）；
ｉ）配列番号５５および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７）；
ｊ）配列番号５６および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４）；
ｋ）配列番号５７および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７  Ｄ３１Ｒ）；
ｌ）配列番号５８および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４  Ｄ３１Ｒ）；
ｍ）配列番号５５および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ４７）；
ｎ）配列番号５６および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ５４）；
ｏ）配列番号５９および配列番号６０（ＢＣ１６３）；
ｐ）配列番号７４および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ１；、
ｑ）配列番号７５および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ１）；
ｒ）配列番号７６および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ１）；
ｓ）配列番号７７および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ１）；
ｔ）配列番号７８および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ１）；
ｕ）配列番号７９および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ１）；
ｖ）配列番号８０および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ１）；
ｗ）配列番号８１および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ１）；
ｘ）配列番号７４および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ２）；
ｙ）配列番号７５および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ２）；
ｚ）配列番号７６および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ２）；
ａａ）配列番号７７および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ２）；
ｂｂ）配列番号７８および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ２）；
ｃｃ）配列番号７９および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ２）；
ｄｄ）配列番号８０および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ２）；
ｅｅ）配列番号８１および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ２）；
ｆｆ）配列番号７４および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ３）；
ｇｇ）配列番号７５および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ３）；
ｈｈ）配列番号７６および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ３）；
ｉｉ）配列番号７７および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ３）；
ｊｊ）配列番号７８および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ３）；
ｋｋ）配列番号７９および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ３）；
ｌｌ）配列番号８０および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ３）；ならびに
ｍｍ）配列番号８１および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ３）
からなる群から選択されるＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
（ａ）配列番号３７、３９、４１、４３、４４、４５、４７、２４、２７、２８、４９、５０、５２、５４、６０、８２、８３もしくは８４のうちいずれか１つ中に存在する軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して少なくとも９５％同一である軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および／または
（ｂ）配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４６、２３、２５、２６、２９、４８、５１、５３、５５、５６、５７、５８、５９、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０もしくは８１のうちいずれか１つ中に存在する重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して少なくとも９５％同一である重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列
を含む抗体。
【請求項１１】
（ａ）配列番号２４、２７、２８、４９、５０、５２、５４、６０、８２、８３もしくは８４のうちいずれか１つ中に存在するＬＣ配列に対して少なくとも９５％同一であるＬＣ配列および／または
（ｂ）配列番号２３、２５、２６、２９、４８、５１、５３、５５、５６、５７、５８、５９、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０もしくは８１のうちいずれか１つ中に存在するＨＣ配列に対して少なくとも９５％同一であるＨＣ配列
を含む抗体。
【請求項１２】
キメラ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
少なくとも３個の連続シアル酸残基を含む高ＤＰのエピトープと結合する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
Ｎ２９７ＡおよびＫ３２２Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含む、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むＩｇＧ４定常領域を含む、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項８〜１５のいずれか１項に記載の抗体をコードする組換え核酸配列。
【請求項１７】
配列番号９２〜１０８からなる群から選択される組換え核酸配列。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７に記載の組換え核酸配列を含む宿主細胞またはベクター。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片および医薬上許容される担体を含む組成物であって、抗体または抗原結合断片は、同位元素、色素、クロマジェン、造影剤、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、増殖因子、放射性核種、金属、リポソーム、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される物質にコンジュゲートされていてもよい、組成物。
【請求項２０】
請求項８〜１５のいずれか１項に記載の抗体および医薬上許容される担体を含む組成物であって、抗体は、同位元素、色素、クロマジェン、造影剤、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、増殖因子、放射性核種、金属、リポソーム、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される物質にコンジュゲートされていてもよい、組成物。
【請求項２１】
請求項１〜４、６または７のいずれか１項に記載の抗体であって、α−１，６−フコース修飾を欠く抗体。
【請求項２２】
請求項８〜１５のいずれか１項に記載の抗体であって、α−１，６−フコース修飾を欠く抗体。
【請求項２３】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄系細胞、形質細胞または肥満細胞と結合する、請求項７または１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＣＤ２２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１２３、ＴＣＲガンマ／デルタ、ＮＫｐ４６、ＫＩＲまたは小分子ＤＯＴＡハプテンと結合する、請求項７または１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
それを必要とする対象においてポリシアル酸（ｐｏｌｙＳｉａ）関連癌を処置する方法であって、対象に、ＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列を含む抗体の有効量を投与することを含み、各々は、
それぞれ、
ａ）配列番号２３および配列番号２４（キメラＰ３５）；
ｂ）配列番号２５および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２）；
ｃ）配列番号２５および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ１）；
ｄ）配列番号２６および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ２）；
ｅ）配列番号２６および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ１）；
ｆ）配列番号４８および配列番号４９（ＢＣ１３７）；
ｇ）配列番号５１および配列番号５２（ＢＣ１３７  ＫＳ２）；
ｈ）配列番号５３および配列番号５４（ＢＣ１３７  ＫＳ３４）；
ｉ）配列番号５５および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７）；
ｊ）配列番号５６および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４）；
ｋ）配列番号５７および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７  Ｄ３１Ｒ）；
ｌ）配列番号５８および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４  Ｄ３１Ｒ）；
ｍ）配列番号５５および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ４７）；
ｎ）配列番号５６および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ５４）；
ｏ）配列番号５９および配列番号６０（ＢＣ１６３）；
ｐ）配列番号７４および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ１）；
ｑ）配列番号７５および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ１）；
ｒ）配列番号７６および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ１）；
ｓ）配列番号７７および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ１）；
ｔ）配列番号７８および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ１）；
ｕ）配列番号７９および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ１）；
ｖ）配列番号８０および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ１）；
ｗ）配列番号８１および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ１）；
ｘ）配列番号７４および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ２）；
ｙ）配列番号７５および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ２）；
ｚ）配列番号７６および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ２）；
ａａ）配列番号７７および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ２）；
ｂｂ）配列番号７８および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ２）；
ｃｃ）配列番号７９および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ２）；
ｄｄ）配列番号８０および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ２）；
ｅｅ）配列番号８１および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ２）；
ｆｆ）配列番号７４および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ３）；
ｇｇ）配列番号７５および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ３）；
ｈｈ）配列番号７６および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ３）；
ｉｉ）配列番号７７および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ３）；
ｊｊ）配列番号７８および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ３）；
ｋｋ）配列番号７９および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ３）；
ｌｌ）配列番号８０および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ３）；ならびに
ｍｍ）配列番号８１および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ３）
からなる群から選択される配列を含み、
抗体は、ｐｏｌｙＳｉａと特異的に結合する、方法。
【請求項２６】
ｐｏｌｙＳｉａ関連癌が、小細胞または非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、下垂体腫瘍、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、乳癌または急性骨髄性白血病である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
抗体が、対象にさらなる治療薬と、別個に、逐次または同時に投与される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
さらなる治療薬が、アルキル化剤、白金剤、タキサン、ビンカ剤、抗エストロゲン薬、アロマターゼ阻害剤、卵巣抑制剤、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、細胞分裂停止性アルカロイド、細胞傷害性抗生物質、代謝拮抗剤、内分泌／ホルモン剤、ビスホスホネート療法剤のうち１種または複数である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで対象において腫瘍を検出する方法であって、
（ａ）対象に請求項８〜１５のいずれか１項に記載の抗体の有効量を投与することであって、抗体は高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を発現する腫瘍に局在するように構成されており、放射性同位元素で標識されていることと、
（ｂ）参照値よりも高い抗体によって放射された放射性レベルを検出することによって、対象において腫瘍の存在を検出することと
を含む方法。
【請求項３０】
対象が、癌を有すると診断されている、または癌を有すると疑われている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗体によって放射された放射性レベルが、陽電子放射型断層撮影または単一光子放出型コンピュータ断層撮影を使用して検出される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
対象に、放射性核種にコンジュゲートされた請求項８〜１５のいずれか１項に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートの有効量を投与することをさらに含む、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
放射性核種が、アルファ粒子放射性同位元素、ベータ粒子放射性同位元素、オージェ放射体またはそれらの任意の組合せである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ベータ粒子放射性同位元素が、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、165Ｄｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、177Ｌｕおよび67Ｃｕからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体および使用するための説明書を含むキット。
【請求項３６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体が、放射性標識、蛍光標識および発色性標識からなる群から選択される少なくとも１つの検出可能な標識にカップリングされている、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体と特異的に結合する二次抗体をさらに含む、請求項３５または３６に記載のキット。
【請求項３８】
放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合する、請求項７または１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項３９】
それを必要とする対象において固形腫瘍を検出する方法であって、
（ａ）対象に、放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび請求項３８に記載の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現する固形腫瘍に局在するように構成されていることと、
（ｂ）参照値より高い複合体によって放射された放射性レベルを検出することによって、対象において固形腫瘍の存在を検出することと
を含む方法。
【請求項４０】
プレターゲッティングされる放射免疫治療のために対象を選択する方法であって、
（ａ）対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび請求項３８に記載の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現する固形腫瘍に局在するように構成されていることと、
（ｂ）複合体によって放射された放射性レベルを検出することと、
（ｃ）複合体によって放射された放射性レベルが参照値よりも高い場合に、プレターゲッティングされる放射免疫治療のために対象を選択することと
を含む方法。
【請求項４１】
ｐｏｌｙＳｉａ関連癌を有すると診断された対象において放射線療法に対する腫瘍感受性を増大させる方法であって、対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび請求項３８に記載の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現する腫瘍に局在するように構成されていることを含む方法。
【請求項４２】
それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび請求項３８に記載の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現する腫瘍に局在するように構成されていることを含む方法。
【請求項４３】
ｐｏｌｙＳｉａ関連癌を有すると診断された対象において放射線療法に対する腫瘍感受性を増大させる方法であって、
（ａ）請求項３８に記載の二重特異性抗体の有効量を投与することであって、二重特異性抗体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現する腫瘍に局在するように構成されていることと、
（ｂ）対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンの有効量を投与することであって、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、二重特異性抗体と結合するように構成されていることと
を含む方法。
【請求項４４】
それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、
（ａ）請求項３８に記載の二重特異性抗体の有効量を投与することであって、二重特異性抗体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現する腫瘍に局在するように構成されていることと、
（ｂ）対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンの有効量を投与することであって、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、二重特異性抗体と結合するように構成されていることと
を含む方法。
【請求項４５】
放射性標識ＤＯＴＡハプテンの投与の前に対象に清澄剤の有効量を投与することをさらに含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象がヒトである、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
複合体が、静脈内に、筋肉内に、動脈内に、くも膜下腔内に、関節内に、眼窩内に、皮内に、腹膜内に、経気管的に、皮下に、脳室内に、経口的にまたは鼻腔内に投与される、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
放射性標識ＤＯＴＡハプテンが、アルファ粒子放射性同位元素、ベータ粒子放射性同位元素またはオージェ放射体を含む、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
放射性標識ＤＯＴＡハプテンが、213Ｂｉ、211Ａｔ、225Ａｃ、152Ｄｙ、212Ｂｉ、223Ｒａ、219Ｒｎ、215Ｐｏ、211Ｂｉ、221Ｆｒ、217Ａｔ、255Ｆｍ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、165Ｄｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、177Ｌｕ、67Ｃｕ、111Ｉｎ、67Ｇａ、51Ｃｒ、58Ｃｏ、99mＴｃ、103mＲｈ、195mＰｔ、119Ｓｂ、161Ｈｏ、189mＯｓ、192Ｉｒ、201Ｔｌ、203Ｐｂ、68Ｇａ、227Ｔｈまたは64Ｃｕを含む、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
ｐｏｌｙＳｉａ発現性腫瘍細胞に対するＴＤＣＣのためにＴ細胞を動員する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５１】
ｐｏｌｙＳｉａ発現性腫瘍細胞が、ｐｏｌｙＳｉａ特異的抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に対して耐性である、請求項５０に記載の抗体または抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／６４３，１４１号の利益および優先権を主張し、その開示内容は、参照により全文が本明細書に組み込まれる。
本技術は、概して、ポリシアル酸と特異的に結合する、免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の調製およびその使用に関する。特に、本技術は、ポリシアル酸中和抗体の調製ならびにポリシアル酸関連癌の検出および処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本技術の背景技術の以下の説明は、本技術の理解における補助として単に提供され、本技術の先行技術を説明するまたは構成すると認めるものではない。
異常なグリコシル化は、癌の特徴と長い間考えられてきた（Hakomori, S. (1994) Prog Brain Res 101, 241-250）。腫瘍関連炭水化物抗原は、腫瘍増殖、浸潤、脈管形成、転移および免疫性と関連しているとわかっている。特に、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸としても知られる）は、特に関連があるとわかっており、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２およびＧＭ３を含むいくつかの癌関連糖脂質中に含有される炭水化物単位である（Daniotti, J. L., et al. (2013) Front Oncol 3, 306）。
【発明の概要】
【０００３】
一態様では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）ＶHは、ＤＹＹＩＨ（配列番号１）、ＲＹＹＩＨ（配列番号７）、ＧＹＹＩＨ（配列番号８）およびＮＹＹＩＨ（配列番号９）からなる群から選択されるＶH−ＣＤＲ１配列、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）、ＳＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１０）、ＲＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１１）、ＣＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１２）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＥＧ（配列番号１３）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号１４）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号１５）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＥＫＦＱＧ（配列番号１６）、およびＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＱＫＦＫＧ（配列番号１８）からなる群から選択されるＶH−ＣＤＲ２配列、およびＧＧＫＦＡＭＤＹ（配列番号３）のＶH−ＣＤＲ３配列を含み、ならびに／または（ｂ）ＶLは、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号４）およびＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＫＴＹＬＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ１配列、ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶL−ＣＤＲ２配列、およびＦＱＧＴＨＶＰＹＴ（配列番号６）、ＦＱＧＴＨＶＰＹＩ（配列番号２１）、およびＦＱＧＴＨＥＰＹＴ（配列番号２２）からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００４】
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）ＶHは、配列番号１のＶH−ＣＤＲ１配列、配列番号２のＶH−ＣＤＲ２配列、配列番号３のＶH−ＣＤＲ３配列を含み、ならびに／または（ｂ）ＶLは、配列番号４、配列番号５、および配列番号６；配列番号２０、配列番号５、および配列番号６；配列番号４、配列番号５、および配列番号２２からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ１配列、ＶL−ＣＤＲ２配列およびＶL−ＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）および重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）ＶLは、配列番号４のＶL−ＣＤＲ１配列、配列番号５のＶL−ＣＤＲ２配列、配列番号６のＶL−ＣＤＲ３配列を含み、ならびに／または（ｂ）ＶHは、配列番号１、配列番号２、配列番号３；配列番号１、配列番号１１、および配列番号３；配列番号１、配列番号１２、配列番号３；配列番号１、配列番号１３、および配列番号３；配列番号７、配列番号２、および配列番号３；配列番号７、配列番号１１、および配列番号３；配列番号８、配列番号１０、および配列番号３；配列番号８、配列番号１２、および配列番号３；配列番号９、配列番号１１、および配列番号３；配列番号９、配列番号１２、配列番号３；配列番号１、配列番号１４、および配列番号３；配列番号１、配列番号１５、および配列番号３；配列番号１、配列番号１６、および配列番号３；ならびに配列番号１、配列番号１８および配列番号３からなる群から選択される、ＶH−ＣＤＲ１配列、ＶH−ＣＤＲ２配列およびＶH−ＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、ＶHは、ＶH−ＣＤＲ１配列、ＶH−ＣＤＲ２配列およびＶH−ＣＤＲ１配列を含み、ＶLは、ａ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５および６、ｂ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５および２２、ｃ）それぞれ、配列番号１、２、３、２０、５および６、ｄ）それぞれ、配列番号１、１１、３、４、５および６、ｅ）それぞれ、配列番号１、１２、３、４、５および６、ｆ）それぞれ、配列番号１、１３、３、４、５および６、ｇ）それぞれ、配列番号１、１３、３、４、５および２１、ｈ）それぞれ、配列番号７、２、３、４、５および６、ｉ）それぞれ、７、１１、３、４、５および６、ｊ）それぞれ、配列番号８、１０、３、４、５および６、ｋ）それぞれ、８、１２、３、４、５および６、ｌ）それぞれ、配列番号９、１１、３、４、５および６、ならびにｍ）それぞれ、配列番号９、１２、３、４、５および６からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ１配列、ＶL−ＣＤＲ２配列およびＶL−ＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００６】
抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプのＦｃドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ２９７ＡおよびＫ３２２Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含む。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むＩｇＧ４定常領域を含む。特定の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、ｓｃＦvおよびＦvからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、高い重合度を有するｐｏｌｙＳｉａ（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）（例えば、約１０〜２０個のＳｉａ単位、約２０〜３０個のＳｉａ単位、約３０〜５０個のＳｉａ単位、約５０〜７０個のＳｉａ単位、約７０〜１００個のＳｉａ単位、約１００〜２００個のＳｉａ単位または約２００〜４００個のＳｉａ単位のＤＰ）と結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、例えば、ＤＰ＞１０、ＤＰ＞２０、ＤＰ＞５０、ＤＰ＞１００またはＤＰ＞２００である高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合する。いくつかの実施形態では、エピトープは、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａに対して特異的であるコンホメーションエピトープである。いくつかの実施形態では、コンホメーションエピトープは、３個またはそれより多いＳｉａ単位を含む。いくつかの実施形態では、３個またはそれより多いＳｉａ単位は、連続単位であり得る。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＤＰ＞１０であるｐｏｌｙＳｉａと結合し、ＤＰが増大するにつれて、より高い親和性を有する。理論に捉われようとは思わないが、本明細書において開示される抗体または抗原結合断片は、２つのｓｃＦｖが１つのオクタシアル酸と結合し、各ｓｃＦｖが８個のＳｉａ単位のうち３個と接触することを示したｍＡｂ７３５  ｓｃＦｖの共結晶構造に基づいて、２つのＦａｂアームと協同的に結合して、単一の高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合すると仮定される（Nagae, M. et al. J Biol Chem. 288(47):33784-96(2013)）。
【０００７】
別の態様では、本開示は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、もしくは１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列および／または配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号６０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、もしくは１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む抗体を提供する。
【０００８】
特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号２３および配列番号２４（キメラＰ３５）；配列番号２５および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２）；配列番号２５および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ１）；配列番号２６および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ２）；配列番号２６および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ１）；配列番号４８および配列番号４９（ＢＣ１３７）；配列番号５１および配列番号５２（ＢＣ１３７  ＫＳ２）；配列番号５３および配列番号５４（ＢＣ１３７  ＫＳ３４）；配列番号５５および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７）；配列番号５６および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４）；配列番号５７および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７  Ｄ３１Ｒ）；配列番号５８および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４  Ｄ３１Ｒ）；配列番号５５および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ４７）；配列番号５６および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ５４）；配列番号５９および配列番号６０（ＢＣ１６３）；配列番号７４および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ１）；配列番号７５および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ１）；配列番号７６および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ１）；配列番号７７および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ１）；配列番号７８および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ１）；配列番号７９および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ１）；配列番号８０および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ１）；配列番号８１および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ１）；配列番号７４および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ２）；配列番号７５および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ２）；配列番号７６および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ２）；配列番号７７および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ２）；配列番号７８および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ２）；配列番号７９および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ２）；配列番号８０および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ２）；配列番号８１および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ２）；配列番号７４および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ３）；配列番号７５および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ３）；配列番号７６および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ３）；配列番号７７および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ３）；配列番号７８および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ３）；配列番号７９および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ３）；配列番号８０および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ３）；ならびに配列番号８１および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ３）からなる群から選択されるＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列を含む。
【０００９】
一態様では、本開示は、（ａ）配列番号３７、３９、４１、４３、４４、４５、４７、２４、２７、２８、４９、５０、５２、５４、６０、８２、８３もしくは８４のうちいずれか１つ中に存在する軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および／または（ｂ）配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４６、２３、２５、２６、２９、４８、５１、５３、５５、５６、５７、５８、５９、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０もしくは８１のうちいずれか１つ中に存在する重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を提供する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、（ａ）配列番号２４、２７、２８、４９、５０、５２、５４、６０、８２、８３もしくは８４のうちいずれか１つ中に存在するＬＣ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％同一であるＬＣ配列および／または（ｂ）配列番号２３、２５、２６、２９、４８、５１、５３、５５、５６、５７、５８、５９、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０もしくは８１のうちいずれか１つ中に存在するＨＣ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％同一であるＨＣ配列を含む抗体を提供する。
【００１１】
上記実施形態のいずれにおいても、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体である。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ２９７ＡおよびＫ３２２Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含む。特定の実施形態では、本技術の抗体は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むＩｇＧ４定常領域を含む。上記の実施形態のいずれかでは、抗体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ（例えば、約１０〜２０個のＳｉａ単位、約２０〜３０個のＳｉａ単位、約３０〜５０個のＳｉａ単位、約５０〜７０個のＳｉａ単位、約７０〜１００個のＳｉａ単位、約１００〜２００個のＳｉａ単位または約２００〜４００個のＳｉａ単位のＤＰ）と結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、例えば、ＤＰ＞１０、ＤＰ＞２０、ＤＰ＞５０、ＤＰ＞１００またはＤＰ＞２００である高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合する。いくつかの実施形態では、エピトープは、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａに対して特異的であるコンホメーションエピトープである。いくつかの実施形態では、コンホメーションエピトープは、３個またはそれより多いＳｉａ単位を含む。いくつかの実施形態では、３個またはそれより多いＳｉａ単位は、連続単位であり得る。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、α−１，６−フコース修飾を欠く。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ｐｏｌｙＳｉａ発現性腫瘍細胞に対するＴ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）のためにＴ細胞を動員する。いくつかの実施形態では、ｐｏｌｙＳｉａ発現性腫瘍細胞は、ｐｏｌｙＳｉａ特異的抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に対して耐性である。
【００１２】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体のいずれかをコードする組換え核酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号９２〜１０８からなる群から選択される組換え核酸配列。
別の態様では、本開示は、本明細書において開示される組換え核酸配列のいずれかを含む宿主細胞またはベクターを提供する。
一態様では、本開示は、本技術の抗体または抗原結合断片および医薬上許容される担体を含む組成物を提供し、抗体または抗原結合断片は、同位元素、色素、クロマジェン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）、造影剤、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、増殖因子、放射性核種、金属、リポソーム、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される物質にコンジュゲートされていてもよい。
【００１３】
本技術の二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄系細胞、形質細胞または肥満細胞と結合する。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＣＤ２２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１２３、ＴＣＲガンマ／デルタ、ＮＫｐ４６、ＫＩＲまたは小分子ＤＯＴＡハプテンと結合する。小分子ＤＯＴＡハプテンは、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ−Ｂｎ、ＤＯＴＡ−デスフェリオキサミン、ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2、Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2、ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2、ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2、ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2、ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2、Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ2、Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ2、Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ2、Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2、ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2、（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ2、Ｔｓｃｇ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2、（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｃｙｓ−ＮＨ2、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ2、Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2、およびＡｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2からなる群から選択され得る。
【００１４】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてｐｏｌｙＳｉａ関連癌を処置する方法であって、対象に本明細書において開示される抗体のうちいずれか１種の有効量を投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号２３および配列番号２４（キメラＰ３５）；配列番号２５および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２）；配列番号２５および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ１）；配列番号２６および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ２）；配列番号２６および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ１）；配列番号４８および配列番号４９（ＢＣ１３７）；配列番号５１および配列番号５２（ＢＣ１３７  ＫＳ２）；配列番号５３および配列番号５４（ＢＣ１３７  ＫＳ３４）；配列番号５５および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７）；配列番号５６および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４）；配列番号５７および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７  Ｄ３１Ｒ）；配列番号５８および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４  Ｄ３１Ｒ）；配列番号５５および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ４７）；配列番号５６および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ５４）；配列番号５９および配列番号６０（ＢＣ１６３）；配列番号７４および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ１）；配列番号７５および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ１）；配列番号７６および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ１）；配列番号７７および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ１）；配列番号７８および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ１）；配列番号７９および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ１）；配列番号８０および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ１）；配列番号８１および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ１）；配列番号７４および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ２）；配列番号７５および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ２）；配列番号７６および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ２）；配列番号７７および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ２）；配列番号７８および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ２）；配列番号７９および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ２）；配列番号８０および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ２）；配列番号８１および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ２）；配列番号７４および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ３）；配列番号７５および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ３）；配列番号７６および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ３）；配列番号７７および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ３）；配列番号７８および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ３）；配列番号７９および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ３）；配列番号８０および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ３）；ならびに配列番号８１および配列番号８４（再ヒト化  Ｐ３５Ｈ８Ｌ３）からなる群から選択されるＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列を含み、抗体は、ｐｏｌｙＳｉａと特異的に結合する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌は、小細胞または非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、下垂体腫瘍、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、乳癌または急性骨髄性白血病である。ｐｏｌｙＳｉａ関連癌は、転移性癌であり得る。
さらにまたはあるいは、方法のいくつかの実施形態では、抗体は、対象に、さらなる治療薬と別個に、逐次または同時に投与される。さらなる治療薬の例として、アルキル化剤、白金剤、タキサン、ビンカ剤、抗エストロゲン薬、アロマターゼ阻害剤、卵巣抑制剤、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、細胞分裂停止性アルカロイド、細胞傷害性抗生物質、代謝拮抗剤、内分泌／ホルモン剤、ビスホスホネート療法剤のうち１種または複数が挙げられる。
【００１６】
別の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象において腫瘍を検出する方法であって、（ａ）対象に本技術の抗体の有効量を投与することであって、抗体が高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現する腫瘍に局在するように構成されており、放射性同位元素で標識されていることと、（ｂ）参照値よりも高い抗体によって放射された放射性レベルを検出することによって、対象において腫瘍の存在を検出することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、癌を有すると診断されている、または癌を有すると疑われている。抗体によって放射された放射性レベルは、陽電子放射型断層撮影または単一光子放出型コンピュータ断層撮影を使用して検出され得る。
【００１７】
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、方法は、対象に放射性核種にコンジュゲートされた本技術の抗体を含むイムノコンジュゲートの有効量を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、放射性核種は、アルファ粒子放射性同位元素、ベータ粒子放射性同位元素、オージェ放射体またはそれらの任意の組合せである。ベータ粒子放射性同位元素の例として、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、165Ｄｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、177Ｌｕおよび67Ｃｕが挙げられる。方法のいくつかの実施形態では、正常組織において非特異的ＦｃＲ依存性結合は、排除または低減される（例えば、非グリコシル化をもたらすＦｃ領域におけるＮ２９７Ａ突然変異によって）。
【００１８】
また、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌の検出および／または処置のためのキットであって、本技術の少なくとも１種の免疫グロブリン関連組成物（例えば、本明細書に記載される任意の抗体または抗原結合断片）またはその機能的バリアント（例えば、置換バリアント）および使用するための説明書を含むキットが本明細書において開示される。特定の実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、１種または複数の検出可能な標識にカップリングされている。一実施形態では、１つまたは複数の検出可能な標識は、放射性標識、蛍光標識または発色標識を含む。
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリン関連組成物と特異的に結合する二次抗体をさらに含む。いくつかの実施形態では、二次抗体は、放射性標識、蛍光標識または発色標識からなる群から選択される少なくとも１つの検出可能な標識にカップリングされている。
【００１９】
一態様では、本開示は、それを必要とする対象において固形腫瘍を検出する方法であって、（ａ）対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンならびに放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよびｐｏｌｙＳｉａ抗原と結合する本技術の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が複合体の二重特異性抗体によって認識されるｐｏｌｙＳｉａ抗原を発現する固形腫瘍に局在するように構成されていることと、（ｂ）参照値より高い複合体によって放射された放射性レベルを検出することによって、対象において固形腫瘍の存在を検出することとを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、プレターゲッティングされる放射免疫治療のために対象を選択する方法であって、（ａ）対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンならびに放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよびｐｏｌｙＳｉａ抗原と結合する本技術の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が複合体の二重特異性抗体によって認識されるｐｏｌｙＳｉａ抗原を発現する固形腫瘍に局在するように構成されていることと、（ｂ）複合体によって放射された放射性レベルを検出することと、（ｃ）複合体によって放射された放射性レベルが参照値よりも高い場合に、プレターゲッティングされる放射免疫治療のために対象を選択することとを含む方法を提供する。
【００２０】
一態様では、本開示は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌を有すると診断された対象において放射線療法に対する腫瘍感受性を増大させる方法であって、対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンならびに放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよびｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を認識および結合する本技術の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が複合体の二重特異性抗体によって認識されるｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を発現する腫瘍に局在するように構成されていることを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンならびに放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよびｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を認識および結合する本技術の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が複合体の二重特異性抗体によって認識されるｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を発現する腫瘍に局在するように構成されていることを含む方法を提供する。
【００２１】
本明細書において開示される方法の上記の実施形態のいずれかでは、複合体は、静脈内に、筋肉内に、動脈内に、くも膜下腔内に、関節内に、眼窩内に、皮内に、腹膜内に、経気管的に、皮下に、脳室内に、経口的に、または鼻腔内に投与される。本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。さらにまたはあるいは、本明細書において開示される方法の上記の実施形態のいずれかでは、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、213Ｂｉ、211Ａｔ、225Ａｃ、152Ｄｙ、212Ｂｉ、223Ｒａ、219Ｒｎ、215Ｐｏ、211Ｂｉ、221Ｆｒ、217Ａｔ、255Ｆｍ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、165Ｄｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、177Ｌｕ、67Ｃｕ、111Ｉｎ、67Ｇａ、51Ｃｒ、58Ｃｏ、99mＴｃ、103mＲｈ、195mＰｔ、119Ｓｂ、161Ｈｏ、189mＯｓ、192Ｉｒ、201Ｔｌ、203Ｐｂ、68Ｇａ、227Ｔｈまたは64Ｃｕを含み、アルファ粒子放射性同位元素、ベータ粒子放射性同位元素またはオージェ放射体を含んでもよい。
【００２２】
一態様では、本開示は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌を有すると診断された対象において放射線療法に対する腫瘍感受性を増大させる方法であって、（ａ）対象に本技術の抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の有効量を投与することであって、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体がｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を発現する腫瘍に局在するように構成されていることと、（ｂ）対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンの有効量を投与することであって、放射性標識ＤＯＴＡハプテンが抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体と結合するように構成されていることとを含む方法を提供する。別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、（ａ）対象に本技術の抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の有効量を投与することであって、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体がｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を発現する腫瘍に局在するように構成されていることと、（ｂ）対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンの有効量を投与することであって、放射性標識ＤＯＴＡハプテンが抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体と結合するように構成されていることとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本技術の方法は、放射性標識ＤＯＴＡハプテンの投与の前に対象に清澄剤の有効量を投与することをさらに含む。
【００２３】
さらにまたはあるいは、本明細書において開示される方法の上記の実施形態のいずれかでは、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、213Ｂｉ、211Ａｔ、225Ａｃ、152Ｄｙ、212Ｂｉ、223Ｒａ、219Ｒｎ、215Ｐｏ、211Ｂｉ、221Ｆｒ、217Ａｔ、255Ｆｍ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、165Ｄｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、177Ｌｕ、67Ｃｕ、111Ｉｎ、67Ｇａ、51Ｃｒ、58Ｃｏ、99mＴｃ、103mＲｈ、195mＰｔ、119Ｓｂ、161Ｈｏ、189mＯｓ、192Ｉｒ、201Ｔｌ、203Ｐｂ、68Ｇａ、227Ｔｈまたは64Ｃｕを含み、アルファ粒子放射性同位元素、ベータ粒子放射性同位元素またはオージェ放射体を含んでもよい。本明細書において開示される方法の上記の実施形態のいずれかでは、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１（Ａ）および１（Ｂ）は、複数の癌細胞株でのポリシアル酸の発現を示す図である。
【図１Ｂ】図１（Ａ）および１（Ｂ）は、複数の癌細胞株でのポリシアル酸の発現を示す図である。
【図２】図２は、キメラＰ３５抗体を用いて染色された小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）患者由来異種移植片の免疫組織化学結果を示す図である。
【図３】図３は、４種のヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ  ＩｇＧ１抗体を使用する神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（１）の相対染色を示す図である。
【図４Ａ】図４（Ａ）は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ形式でのｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体の模式図を示す図である。
【図４Ｂ】図４（Ｂ）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体ＢＣ１３７の純度を示す図であり、主要なピーク（１６．０分）は十分に対形成されたＢｓＡｂ（分子量約２１０ｋＤａ）および塩バッファーピーク（２５分）である。
【図５Ａ】図５（Ａ）は、黒色腫細胞株Ｍ１４でのＢＣ１３７を用いるＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣ）を示す図である。
【図５Ｂ】図５（Ｂ）は、神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ−３２でのＢＣ１３７を用いるＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣ）を示す図である。
【図６】図６は、ＢＣ１３７および活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）を用いて処置された神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を用いるマウス異種移植研究における腫瘍体積を示す図である。
【図７Ａ】図７（Ａ）および７（Ｂ）は、２つの負電荷残基、ＶＨ：Ｄ３１およびＶＨ：Ｄ１０５を有する、結晶構造ＰＤＢ  ３ＷＤＢに基づく、結合しているオクタシアル酸を伴うｍＡｂ７３５の結合ポケットの静電ポテンシャルマップを示す図である。
【図７Ｂ】図７（Ａ）および７（Ｂ）は、２つの負電荷残基、ＶＨ：Ｄ３１およびＶＨ：Ｄ１０５を有する、結晶構造ＰＤＢ  ３ＷＤＢに基づく、結合しているオクタシアル酸を伴うｍＡｂ７３５の結合ポケットのリボン図における側面図を示す図である。
【図７Ｃ】図７（Ｃ）は、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２  ＩｇＧ１親のものおよび合理的エンジニアリングによって設計された突然変異を有するものの相対結合を示す図である。
【図８Ａ】図８（Ａ）は、ダイレクトスクリーニング法を使用する、合理的設計または酵母ディスプレイ親和性成熟に基づく親和性成熟クローンの結合動力学を示す図である。
【図８Ｂ】図８（Ｂ）は、親和性成熟クローンにおけるアミノ酸変化の位置を示す図である。
【図９Ａ】図９（Ａ）は、動力学的スクリーニング法を使用する、合理的設計または酵母ディスプレイ親和性成熟に基づく親和性成熟クローンの結合動力学を示す図である。
【図９Ｂ】図９（Ｂ）は、親和性成熟クローンにおけるアミノ酸変化の位置を示す図である。
【図１０Ａ】図１０（Ａ）は、神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２細胞での選択されたＢＣ１３７クローンのＴＤＣＣアッセイを示す図である。
【図１０Ｂ】図１０（Ｂ）は、黒色腫Ｍ１４、神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２および神経芽細胞腫ＳＫＮＳＨ細胞に対する選択されたＢＣ１３７クローンのＴＤＣＣのＥＣ５０値を示す図である。
【図１１】図１１は、ＢＣ１３７および選択された親和性成熟バリアントを用いて処置された神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を用いるマウス異種移植研究における腫瘍体積を示す図である。
【図１２】図１２は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ形式でのｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体の模式図を示す図である。
【図１３Ａ】図１３（Ａ）〜１３（Ｅ）は、（０、０．２５、０．５または１ｍｇ）ＢＣ１３７  ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体ＢＣ１６３および177Ｌｕ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを用いて処置された神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を用いるマウス異種移植研究の結果を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３（Ａ）〜１３（Ｅ）は、（０、０．２５、０．５または１ｍｇ）ＢＣ１３７  ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体ＢＣ１６３および177Ｌｕ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを用いて処置された神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を用いるマウス異種移植研究の結果を示す図である。
【図１３Ｃ】図１３（Ａ）〜１３（Ｅ）は、（０、０．２５、０．５または１ｍｇ）ＢＣ１３７  ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体ＢＣ１６３および177Ｌｕ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを用いて処置された神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を用いるマウス異種移植研究の結果を示す図である。
【図１３Ｄ】図１３（Ａ）〜１３（Ｅ）は、（０、０．２５、０．５または１ｍｇ）ＢＣ１３７  ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体ＢＣ１６３および177Ｌｕ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを用いて処置された神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を用いるマウス異種移植研究の結果を示す図である。
【図１３Ｅ】図１３（Ａ）〜１３（Ｅ）は、（０、０．２５、０．５または１ｍｇ）ＢＣ１３７  ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体ＢＣ１６３および177Ｌｕ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを用いて処置された神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を用いるマウス異種移植研究の結果を示す図である。
【図１４Ａ】図１４（Ａ）は、ヒト化クローンのヒト生殖系列含量を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４（Ｂ）は、ヒト化クローンのヒト生殖系列含量を示す図である。
【図１５Ａ】図１５（Ａ）および１５（Ｂ）は、それぞれ、配列番号２３および配列番号２４に対応する、キメラＰ３５−ＩｇＧ１抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図１５Ｂ】図１５（Ａ）および１５（Ｂ）は、それぞれ、配列番号２３および配列番号２４に対応する、キメラＰ３５−ＩｇＧ１抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図１６Ａ】図１６（Ａ）は、それぞれ、配列番号２５および配列番号９２に対応するヒト化Ｐ３５重鎖、Ｈ１のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１６Ｂ】図１６（Ｂ）は、それぞれ、配列番号２６および配列番号９３に対応するヒト化Ｐ３５重鎖、Ｈ２のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図１７Ａ】図１７（Ａ）は、それぞれ、配列番号２７および配列番号９４に対応するヒト化Ｐ３５軽鎖、Ｌ１のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７（Ｂ）は、それぞれ、配列番号２８および配列番号９５に対応するヒト化Ｐ３５軽鎖、Ｌ２のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図１８Ａ】図１８（Ａ）および１８（Ｂ）は、それぞれ、配列番号２５および配列番号２８に対応する、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２  ＩｇＧ１抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図１８Ｂ】図１８（Ａ）および１８（Ｂ）は、それぞれ、配列番号２５および配列番号２８に対応する、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２  ＩｇＧ１抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図１９】図１９は、Ｄ３１Ｒ突然変異を有するヒト化Ｐ３５重鎖の合理的に設計された親和性成熟クローンの重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号２９に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は太字で示されている。
【図２０】図２０は、ＤＳ４５、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号３０に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２１】図２１は、ＤＳ４７、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号３１に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２２】図２２は、ＤＳ５１、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号３２に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２３】図２３は、ＤＳ５３、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号３３に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２４】図２４は、ＤＳ５４、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号３４に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２５】図２５は、ＤＳ５５、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号３５に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２６Ａ】図２６（Ａ）および２６（Ｂ）は、ＫＳ２、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３６および配列番号３７に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２６Ｂ】図２６（Ａ）および２６（Ｂ）は、ＫＳ２、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３６および配列番号３７に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２７Ａ】図２７（Ａ）および２７（Ｂ）は、ＫＳ１０、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３８および配列番号３９に対応する。
【図２７Ｂ】図２７（Ａ）および２７（Ｂ）は、ＫＳ１０、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３８および配列番号３９に対応する。
【図２８Ａ】図２８（Ａ）および２８（Ｂ）は、ＫＳ２１、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４０および配列番号４１に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２８Ｂ】図２８（Ａ）および２８（Ｂ）は、ＫＳ２１、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４０および配列番号４１に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２９Ａ】図２９（Ａ）および２９（Ｂ）は、ＫＳ２３、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４２および配列番号４３に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図２９Ｂ】図２９（Ａ）および２９（Ｂ）は、ＫＳ２３、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４２および配列番号４３に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図３０】図３０は、ＫＳ２６、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号４４に対応する。
【図３１】図３１は、ＫＳ３０、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号４５に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図３２Ａ】図３２（Ａ）および３２（Ｂ）は、ＫＳ３４、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４６および配列番号４７に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図３２Ｂ】図３２（Ａ）および３２（Ｂ）は、ＫＳ３４、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２の親和性成熟クローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４６および配列番号４７に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図３３Ａ】図３３（Ａ）および３３（Ｂ）は、それぞれ、配列番号４８および配列番号９６に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＢＣ１３７の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。Ｆｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は、太字で示されている。
【図３３Ｂ】図３３（Ａ）および３３（Ｂ）は、それぞれ、配列番号４８および配列番号９６に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＢＣ１３７の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。Ｆｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は、太字で示されている。
【図３３Ｃ】図３３（Ｃ）および３３（Ｄ）は、それぞれ、配列番号４９および配列番号９７に対応する、ＢＣ１３７の軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。
【図３３Ｄ】図３３（Ｃ）および３３（Ｄ）は、それぞれ、配列番号４９および配列番号９７に対応する、ＢＣ１３７の軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。
【図３４Ａ】図３４（Ａ）および３４（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５０および配列番号９８に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体において使用するための修飾軽鎖（ＢＣ１３７−２軽鎖）のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。配列は、抗ＣＤ３  ｈｕＯＫＴ３  ｓｃＦｖ部分において２つのＣｙｓをＧｌｙ置換させ、ジスルフィド安定化を変更するように修飾されている。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。修飾Ｃｙｓ残基は、太字で示されている。
【図３４Ｂ】図３４（Ａ）および３４（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５０および配列番号９８に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体において使用するための修飾軽鎖（ＢＣ１３７−２軽鎖）のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。配列は、抗ＣＤ３  ｈｕＯＫＴ３  ｓｃＦｖ部分において２つのＣｙｓをＧｌｙ置換させ、ジスルフィド安定化を変更するように修飾されている。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。修飾Ｃｙｓ残基は、太字で示されている。
【図３５Ａ】図３５（Ａ）および３５（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５１および配列番号９９に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式での親和性成熟クローンＫＳ２の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換が太字で示されている。
【図３５Ｂ】図３５（Ａ）および３５（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５１および配列番号９９に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式での親和性成熟クローンＫＳ２の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換が太字で示されている。
【図３５Ｃ】図３５（Ｃ）および３５（Ｄ）は、それぞれ、配列番号５２および配列番号１００に対応する、軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。
【図３５Ｄ】図３５（Ｃ）および３５（Ｄ）は、それぞれ、配列番号５２および配列番号１００に対応する、軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。
【図３６Ａ】図３６（Ａ）および３６（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５３および配列番号１０１に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式での親和性成熟クローンＫＳ３４の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換が太字で示されている。
【図３６Ｂ】図３６（Ａ）および３６（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５３および配列番号１０１に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式での親和性成熟クローンＫＳ３４の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換が太字で示されている。
【図３６Ｃ】図３６（Ｃ）および３６（Ｄ）は、それぞれ、配列番号５４および配列番号１０２に対応する、軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列は、下線が引かれている。
【図３６Ｄ】図３６（Ｃ）および３６（Ｄ）は、それぞれ、配列番号５４および配列番号１０２に対応する、軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列は、下線が引かれている。
【図３７Ａ】図３７（Ａ）および３７（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５５および配列番号１０３に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式での親和性成熟クローンＤＳ４７の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図３７Ｂ】図３７（Ａ）および３７（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５５および配列番号１０３に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式での親和性成熟クローンＤＳ４７の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図３８Ａ】図３８（Ａ）および３８（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５６および配列番号１０４に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式での親和性成熟クローンＤＳ５４の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図３８Ｂ】図３８（Ａ）および３８（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５６および配列番号１０４に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式での親和性成熟クローンＤＳ５４の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図３９Ａ】図３９（Ａ）および３９（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５７および配列番号１０５に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式でのＤ３１Ｒ突然変異を有する親和性成熟クローンＤＳ４７の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図３９Ｂ】図３９（Ａ）および３９（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５７および配列番号１０５に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式でのＤ３１Ｒ突然変異を有する親和性成熟クローンＤＳ４７の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図４０Ａ】図４０（Ａ）および４０（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５８および配列番号１０６に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式でのＤ３１Ｒ突然変異を有する親和性成熟クローンＤＳ５４の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図４０Ｂ】図４０（Ａ）および４０（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５８および配列番号１０６に対応する、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂ形式でのＤ３１Ｒ突然変異を有する親和性成熟クローンＤＳ５４の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図４１Ａ】図４１（Ａ）および４１（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５９および配列番号１０７に対応する、ＢＣ１６３、ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図４１Ｂ】図４１（Ａ）および４１（Ｂ）は、それぞれ、配列番号５９および配列番号１０７に対応する、ＢＣ１６３、ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。可変ドメイン中の修飾残基ならびにＦｃドメイン中のＮ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ置換は太字で示されている。
【図４１Ｃ】図４１（Ｃ）および４１（Ｄ）は、それぞれ、配列番号６０および配列番号１０８に対応する、軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列は、下線が引かれている。
【図４１Ｄ】図４１（Ｃ）および４１（Ｄ）は、それぞれ、配列番号６０および配列番号１０８に対応する、軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す図である。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列は、下線が引かれている。
【図４２】図４２は、配列番号６１に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＤＳ４５のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図４３】図４３は、配列番号６２に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＤＳ４７のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図４４】図４４は、配列番号６３に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＤＳ５１のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図４５】図４５は、配列番号６４に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＤＳ５３のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図４６】図４６は、配列番号６５に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＤＳ５４のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図４７】図４７は、配列番号６６に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＤＳ５５のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図４８】図４８は、配列番号６７に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＫＳ２のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。
【図４９】図４９は、配列番号６８に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＫＳ１０のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図５０】図５０は、配列番号６９に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＫＳ２１のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図５１】図５１は、配列番号７０に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＫＳ２３のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。
【図５２】図５２は、配列番号７１に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＫＳ２６のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図５３】図５３は、配列番号７２に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＫＳ３０のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図５４】図５４は、配列番号７３に対応する、ｓｃＦｖ形式の親和性成熟クローンＫＳ３４のアミノ酸配列を示す図である。下線が引かれた配列は、ＧＳリンカー配列に対応する。ＣＤＲ配列およびＧＳリンカー配列に下線が引かれている。可変ドメイン中の修飾残基は、太字で示されている。
【図５５】図５５は、ＨＣ１、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号７４に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図５６】図５６は、ＨＣ２、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号７５に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図５７】図５７は、ＨＣ３、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号７６に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図５８】図５８は、ＨＣ４、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号７７に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図５９】図５９は、ＨＣ５、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号７８に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図６０】図６０は、ＨＣ６、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号７９に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図６１】図６１は、ＨＣ７、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号８０に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図６２】図６２は、ＨＣ８、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号８１に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図６３】図６３は、ＬＣ１、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号８２に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図６４】図６４は、ＬＣ２、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号８３に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図６５】図６５は、ＬＣ３、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に基づく再ヒト化軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、配列番号８４に対応する。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図６６】図６６は、神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ−３２  Ｌｕｃでヒト化Ｐ３５  ＩｇＧ１抗体を用いる抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイを示す図である。
【図６７】図６７は、フローサイトメトリーによって決定されるような、Ｍ１４黒色腫細胞株（ポリシアル酸＋）との、本明細書において開示される種々の再ヒト化ＨＰ３５クローンの相対結合を示す図である。
【図６８】図６８は、キメラＨＰ３５  ｐｏｌｙＳｉａ抗体に対して、本技術の種々の再ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の抗原結合特性および安定性を比較するヒートマップを示す図である。カラム１、１００万個細胞あたり１μｇでフローサイトメトリーによるＭ１４黒色腫細胞株との結合に基づくＭＦＩ、低結合（白色）から高結合（暗灰色）。カラム２、表面プラズモン共鳴によるコロミン酸との結合から得られるＫD（Ｍ）に従う結合親和性、低親和性（白色）から高親和性（暗灰色）。カラム３、ＨＰＣＬによる、３７℃で３週間のインキュベーション後の純度に基づく安定性、低純度（白色）から高純度（暗灰色）。クローンＬＣ２＋ＨＣ５が、その抗原との高い結合親和性によってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのさらなる特性決定のために選択された。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
当然のことではあるが、本技術の実質的な理解を提供するために、本方法の特定の態様、様式、実施形態、変法および特徴がさまざまな詳細レベルで以下に説明される。
本開示は、概して、ｐｏｌｙＳｉａ、特に、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと特異的に結合し、その生物活性を中和し得る免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を提供する。本技術の免疫グロブリン関連組成物は、それを必要とする対象においてｐｏｌｙＳｉａ関連癌を検出または処置する方法において有用である。したがって、本方法の種々の態様は、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の調製、特性決定および操作に関する。本技術の免疫グロブリン関連組成物は、単独で、または癌を処置するためのさらなる治療薬と組み合わせて有用である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である。
【００２６】
本方法の実施では、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多数の従来技術が使用される。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S.  Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); and Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunologyを参照のこと。ポリペプチド遺伝子発現産物（すなわち、遺伝子翻訳レベル）のレベルを検出および測定する方法は、本技術分野において周知であり、抗体検出および定量化技術などのポリペプチド検出法の使用を含む。(Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition. (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999)も参照のこと）
【００２７】
定義
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般に、この技術が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかに別のものを指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。一般に、本明細書において使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学、および核酸化学における実験手順および以下に記載されるハイブリダイゼーションは、周知であり、当技術分野で一般に使用されている。
【００２８】
本明細書において、数に関連して用語「約」は、一般に、別に記載されない限りまたは文脈から明らかでない限り、数のいずれかの方向（より多いまたはより少ない）で１％、５％または１０％の範囲内に入る数を含むように解釈される（このような数が、あり得る値の０％より少ないまたは１００％を超える場合を除く）。
本明細書において、対象への薬剤または薬物の「投与」は、その意図される機能を発揮するために対象へ化合物を導入または送達する任意の経路を含む。投与は、それだけには限らないが、経口で、鼻腔内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、腹膜内にまたは皮下に）、直腸性に、くも膜下腔内に、腫瘍内に、または局所的に含む任意の適した経路によって実施され得る。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。
【００２９】
「アジュバント」とは、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質を指す。これに関連して、アジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原または抗体に対する免疫応答を増強するために使用される。アジュバントは、対象に、ワクチンの投与の前、それと組み合わせて、またはその後に投与され得る。アジュバントとして使用される化学化合物の例として、アルミニウム化合物、オイル、ブロックポリマー、免疫刺激複合体、ビタミンおよびミネラル（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレンおよびビタミンＢ１２）、Ｑｕｉｌ  Ａ（サポニン）、細菌および真菌細胞壁構成成分（例えば、リポ多糖、リポタンパク質および糖タンパク質）、ホルモン、サイトカインおよび同時刺激因子が挙げられる。
【００３０】
本明細書において、用語「抗体」とは、例として、制限するものではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらの組合せおよび任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物において、ならびにサメ免疫グロブリンなどの非哺乳動物種において免疫応答の際に産生される同様の分子を含む免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子をまとめて指す。本明細書において、「抗体」（無傷の免疫グロブリンを含む）および「抗原結合断片」は、その他の分子との結合を実質的に排除するほど、対象の分子（または対象の高度に同様の分子の群）と特異的に結合する（例えば、生物学的サンプル中のその他の分子に対する結合定数よりも、少なくとも１０3Ｍ-1より大きい、少なくとも１０4Ｍ-1より大きいまたは少なくとも１０5Ｍ-1より大きい、対象の分子に対する結合定数を有する抗体および抗体断片）。用語「抗体」とはまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997Pierce Catalog and Handbook、1994-1995 (Pierce Chemical Co.、Rockford、Ill.);Kuby, J., Immunology,3rd Ed.、W.H. Freeman & Co.、New York、1997.も参照のこと。
【００３１】
より詳しくは、抗体は、少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含み、抗原のエピトープを特異的に認識し、結合するポリペプチドリガンドを指す。抗体は重鎖および軽鎖から構成され、その各々が重鎖可変（ＶH）領域および軽鎖可変（ＶL）領域と呼ばれる可変領域を有する。まとめて、ＶH領域およびＶL領域は、抗体によって認識される抗原に結合することに関与している。通常、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２つの種類がある。抗体分子の機能活性を決定する５種の主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域はまた、「ドメイン」としても知られる）。組合せでは、重鎖および軽鎖可変領域は、抗原と特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有し、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は、定義されている（参照により本明細書に組み込まれるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベースは、現在オンラインで維持されている。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。成分軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、主にβシートコンホメーションを採用し、ＣＤＲは、βシート構造と接続する、いくつかの場合には、βシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間、非共有結合相互作用によって正しい配向にＣＤＲを位置させるようにするスキャフォールドを形成するよう働く。
【００３２】
ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープとの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、通常、Ｎ末端から出発して逐次番号づけられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、また通常、個々のＣＤＲが位置している鎖によって同定される。したがって、ＶH ＣＤＲ３は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶL  ＣＤＲ１は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。ｐｏｌｙＳｉａと結合する抗体は、特定のＶH領域およびＶL領域配列、したがって、特定のＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原のための異なる組合せ部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体毎に異なるＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の制限された数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。「免疫グロブリン関連組成物」とは、本明細書において、抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体などを含む）ならびに抗体断片を指す。抗体またはその抗原結合断片は、抗原と特異的に結合する。
【００３３】
本明細書において、用語「抗体関連ポリペプチド」とは、可変領域を単独で、または以下のポリペプチド要素：抗体分子のヒンジ領域、ＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3ドメインのすべてもしくは一部と組み合わせて含み得る一本鎖抗体を含む、抗原結合性抗体断片を意味する。また、可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3ドメインの任意の組合せも本技術に含まれる。本方法において有用な抗体関連分子として、例えば、それだけには限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｓｄＦｖ）およびＶLまたはＶHドメインのいずれかを含む断片が挙げられる。例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶL、ＶH、ＣLおよびＣＨ1ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶHおよびＣＨ1ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶLおよびＶHドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶHドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989)および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。そのようなものとして、「抗体断片」または「抗原結合断片」は、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合性または可変領域を含み得る。抗体断片または抗原結合断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖ断片、ダイアボディー、線形抗体、一本鎖抗体分子および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００３４】
「二重特異性抗体」または「ＢｓＡｂ」は、本明細書において、別個の構造を有する２種の標的、例えば、２種の異なる標的抗原、同一標的抗原上の２種の異なるエピトープまたはハプテンおよび標的抗原もしくは標的抗原上のエピトープと同時に結合し得る抗体を指す。さまざまな異なる二重特異性抗体構造が、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体中の各抗原結合部分は、ＶHおよび／またはＶL領域を含み、いくつかのこのような実施形態では、ＶHおよび／またはＶL領域は、特定のモノクローナル抗体において見られるものである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部分を含有し、各々、異なるモノクローナル抗体に由来するＶHおよび／またはＶL領域を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部分を含有し、２つの抗原結合部分のうち一方は、第１のモノクローナル抗体に由来するＣＤＲを含有するＶHおよび／またはＶL領域を有する免疫グロブリン分子を含み、もう一方の抗原結合部分は、第２のモノクローナル抗体に由来するＣＤＲを含有するＶHおよび／またはＶL領域を有する抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡＢ、ｓｃＦｖなど）を含む。
【００３５】
本明細書において、「清澄剤」は、腎臓による迅速なクリアランスを促進するように、対象の血液コンパートメント中に存在する過剰の二重特異性抗体と結合する物質である。ハプテン投与（例えば、ＤＯＴＡ）に先立つ清澄剤の使用は、プレターゲッティングされる放射免疫治療（ＰＲＩＴ）系においてより良好な腫瘍対バックグラウンド比を促進する。清澄剤の例として、５００ｋＤ−デキストラン−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（Ｙ）（Orcutt et al., Mol Cancer Ther. 11(6): 1365-1372 (2012)）、５００ｋＤアミノデキストラン−ＤＯＴＡコンジュゲート、プレターゲッティング抗体に対する抗体などが挙げられる。
【００３６】
本明細書において、用語「コンジュゲートされた」は、当業者に公知の任意の方法による２つの分子の関連を指す。関連の適した種類として、化学的結合および物理的結合が挙げられる。化学的結合として、例えば、共有結合および配位結合が挙げられる。物理的結合として、例えば、水素結合、双極性相互作用、ファンデルワールス力、静電相互作用、疎水性相互作用および芳香族スタッキングが挙げられる。
【００３７】
本明細書において、用語「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、断片は、同一ポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶL）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶH）含む（ＶHＶL）。同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対形成させられ、２つの抗原結合部位が生成する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１および30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００３８】
本明細書において、用語「一本鎖抗体」または「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」とは、Ｆｖ断片、ＶLおよびＶHの２つのドメインの抗体融合分子を指す。一本鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子を有するポリマー、例えば、二量体、三量体またはその他のポリマーを含み得る。さらに、Ｆv断片、ＶLおよびＶHの２つのドメインは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶLおよびＶH領域が対形成して一価分子（一本鎖Ｆv（ｓｃＦv）として知られる）を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を使用してつなげられ得る。Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883。このような一本鎖抗体は、組換え技術または無傷の抗体の酵素的もしくは化学的切断によって調製され得る。
上記の抗体断片のいずれも、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同一方法で結合特異性および中和活性についてスクリーニングされる。
【００３９】
本明細書において、「抗原」とは、抗体（またはその抗原結合断片）が選択的に結合し得る分子を指す。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたはその他の天然に存在するもしくは合成化合物であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、炭水化物（例えば、ｐｏｌｙＳｉａ種）であり得る。抗原は、動物において免疫応答を生成するために動物に投与され得る。
用語「抗原結合断片」とは、抗原との結合に関与しているポリペプチドの一部を有する全免疫グロブリン構造の断片を指す。本技術において有用な抗原結合断片の例として、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）2、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2が挙げられるが、それらに限定されない。
「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）およびその結合パートナー（例えば、抗原または抗原性ペプチド）の単一結合部位間の総合非共有結合相互作用の強度を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫD）によって表され得る。親和性は、本明細書において記載されるものを含む当技術分野で公知の標準方法によって測定され得る。低親和性複合体は、一般に抗原から容易に解離する傾向がある抗体を含有するのに対し、高親和性複合体は、一般に抗原と長期間結合したままである傾向がある抗体を含有する。
本明細書において、用語「生物学的サンプル」とは、生存細胞に由来するサンプル材料を意味する。生物学的サンプルは、対象から単離された、組織、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物および生物学的流体（例えば、腹水または脳脊髄液（ＣＳＦ））ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含み得る。本技術の生物学的サンプルとして、それだけには限らないが、乳房組織、腎組織、子宮頸部、子宮内膜、頭部または頸部、胆嚢、耳下腺組織、前立腺、脳、下垂体腺、腎臓組織、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺組織、心組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、子宮、卵巣組織、副腎組織、精巣組織、扁桃腺、胸腺、血液、毛髪、頬側、皮膚、血清、血漿、ＣＳＦ、精液、前立腺液、精液、尿、糞便、汗、唾液、痰、粘液、骨髄、リンパおよび涙から採取されたサンプルが挙げられる。生物学的サンプルはまた、内臓の、または癌からの生検から得ることができる。生物学的サンプルは、診断もしくは研究のために対象から得ることができ、または対照として、もしくは基礎研究のために非罹患個体から得ることができる。サンプルは、例えば、静脈穿刺および外科的生検を含む標準方法によって得ることができる。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、ニードル生検によって得られた乳房、肺、膵臓、副腎、脳、腎臓、神経または筋肉組織サンプルである。外科的生検サンプルは、手術の時点で得られた新鮮サンプルまたは凍結サンプル、患者由来異種移植片または外科的試料について確立された細胞株から導くことができる。
本明細書において、用語「ＣＤＲグラフト抗体」とは、「アクセプター」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが、望ましい抗原特異性を有する「ドナー」抗体に由来するＣＤＲ「グラフト」によって置き換えられている抗体を意味する。
【００４０】
本明細書において、用語「キメラ抗体」とは、ある種に由来するモノクローナル抗体のＦｃ定常領域（例えば、マウスＦｃ定常領域）が、組換えＤＮＡ技術を使用して、別の種の抗体に由来する  Ｆｃ定常領域（例えば、ヒトＦｃ定常領域）と置き換えられている抗体を意味する。全般的に、Robinson et al.、PCT/US86/02269; Akira et al.、欧州特許出願第１８４，１８７号； Taniguchi、欧州特許出願第１７１，４９６号； Morrison et al.、欧州特許出願第１７３，４９４号； Neuberger et al.、ＷＯ８６／０１５３３； Cabilly et al.米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly et al.、欧州特許出願第０１２５，０２３号; Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988; Liu et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987; Liu et al., J. Immunol 139: 3521-3526, 1987; Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218, 1987; Nishimura et al., Cancer Res 47: 999-1005, 1987; Wood et al.、Nature 314: 446-449, 1885;およびShaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559, 1988を参照のこと。
【００４１】
本明細書において、用語「コンセンサスＦＲ」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク（ＦＲ）抗体領域を意味する。抗体のＦＲ領域は、抗原と接触しない。
本明細書において、「対照」は、比較目的で実験において使用される代替サンプルである。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、実験の目的が、特定の種類の疾患の処置のための治療薬の有効性の相関を判定することである場合には、陽性対照（所望の治療効果を示すとわかっている化合物または組成物）および陰性対照（療法を受け取らない、またはプラセボを受け取る対象またはサンプル）が通常使用される。
【００４２】
本明細書において、用語「有効量」とは、所望の治療効果および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、本明細書に記載される疾患もしくは状態または本明細書に記載される疾患もしくは状態と関連する１つもしくは複数の兆候もしくは症状の防止または減少をもたらす量を指す。治療または予防適用に関連して、対象に投与される組成物の量は、組成物、疾患の程度、種類および重症度ならびに個体の特徴、例えば、全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物に対する耐性に応じて変わる。当業者ならば、これらおよびその他の因子に応じて適当な投与量を決定できる。組成物はまた、１つまたは複数のさらなる治療用化合物と組み合わせて投与され得る。本明細書に記載される方法では、治療用組成物は、本明細書に記載される疾患または状態の１つまたは複数の兆候または症状を有する対象に投与され得る。本明細書において、組成物の「治療上有効な量」とは、疾患または状態の生理学的効果が寛解または排除される組成物レベルを指す。治療上有効な量は、１回または複数回の投与で与えられ得る。
【００４３】
本明細書において、用語「エフェクター細胞」とは、免疫応答の認知および活性化相とは対照的に、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を意味する。例示的免疫細胞として、骨髄またはリンパ系起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＢ細胞およびＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥満細胞および好塩基球が挙げられる。エフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を保持する。エフェクター細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導し得る、例えば、ＡＤＣＣを誘導可能な好中球。例えば、ＦｃαＲを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球は、標的細胞の特異的死滅および免疫系のその他の構成成分に対する抗原を提示することまたは抗原を提示する細胞と結合することに関与している。
【００４４】
本明細書において、用語「エピトープ」とは、抗体と特異的結合可能な抗原決定基を意味する。エピトープは、普通、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、普通、特異的三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。コンホメーションおよび非コンホメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者との結合は失われるが、後者との結合は失われない点で区別される。いくつかの実施形態では、ｐｏｌｙＳｉａの「エピトープ」は、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体が特異的に結合する高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ（例えば、ＤＰ＞１０、ＤＰ＞２０、ＤＰ＞５０、ＤＰ＞１００またはＤＰ＞２００）によって特異的に用いられるコンホメーションエピトープである。エピトープと結合する抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されるものなどの通常のクロスブロッキングアッセイを実施してもよい。このアッセイを使用して、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体が本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体と同一の部位またはエピトープと結合するか否かを決定できる。あるいは、またはさらに、当技術分野で公知の方法によってエピトープマッピングを実施してもよい。例えば、接触残基を同定するために、抗体配列をアラニンスキャニングなどによって突然変異させてもよい。異なる方法では、試験抗体を用いる、または試験抗体および特性決定されたまたは公知のエピトープ特異性を有する抗体を用いる競合アッセイにおいて異なるＤＰを有するｐｏｌｙＳｉａ種を使用してもよい。
本明細書において、「発現」は、適切な発現および機能のために必要な場合には以下のうち１つまたは複数を含む：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写、成熟ｍＲＮＡを生成するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよびその他のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用およびｔＲＮＡ利用能を含む）ならびに翻訳産物のグリコシル化および／またはその他の修飾。
【００４５】
本明細書において、用語「遺伝子」とは、プロモーター、エキソン、イントロンおよび発現を制御するその他の非翻訳領域を含む、ＲＮＡ産物の調節された生合成についてのすべての情報を含有するＤＮＡのセグメントを意味する。
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較目的でアラインされ得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列中の位置が、同一塩基またはアミノ酸によって占められる場合には、その位置で分子は相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有されるマッチするまたは相同な位置の数の関数である。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、２つの配列の比較においてアラインされた場合に、塩基（またはアミノ酸）のそのパーセンテージが同一であることを意味する、別の配列に対する「配列同一性」の特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）を有する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して決定できる。いくつかの実施形態では、アラインメントのためにデフォルトパラメータを使用する。１つのアラインメントプログラムとして、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴがある。特に、プログラムとして、以下のデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰがある：遺伝暗号＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０、予測＝１０、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記載＝５０シーケンス、ソートされるもの＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ、データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で見ることができる。生物学的に等価のポリヌクレオチドは、指定の相同性パーセントを有し、同一または類似の生物活性を有するポリペプチドをコードするものである。２つの配列は、互いに４０％未満の同一性または25%未満の同一性しか共有しない場合に「無関係」または「非相同」と思われる。
【００４６】
本明細書において、用語、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体では、またはドナー抗体では見られない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに改善するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、通常、２つの可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＦｖ）の実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサスＦＲ配列のものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性を改善する１つまたは複数のアミノ酸置換を含み得る。ＦＲ中のこれらのアミノ酸置換の数は、通常、Ｈ鎖において６以下であり、Ｌ鎖において３以下である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。例えば、Ahmed & Cheung, FEBS Letters 588(2):288-297(2014)を参照のこと。
【００４７】
本明細書において、用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与している抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶL中のおよそ残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびにＶH中のおよそ３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）ならびに／または「超可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、ＶL中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびにＶH中の２６〜３２（Ｈ１）、５２Ａ〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。
【００４８】
本明細書において、用語「同一」または「同一性」パーセントは、以下に記載されるデフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手作業によるアラインメントおよび目視検査、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトによって測定されるような）、２個以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して使用される場合、（比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大対応を求めて比較され、アラインされた場合に、指定の領域（例えば、本明細書において記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書において記載される抗体のアミノ酸配列）にわたって、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定のパーセンテージ（すなわち、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性）を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。このような配列は、次いで、「実質的に同一」であるといわれる。この用語はまた、試験配列の相補体を指す、またはそれに当てはまり得る。用語はまた、欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有するものを含む。いくつかの実施形態では、同一性は、少なくとも約２５個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長または５０〜１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長を有する領域にわたって存在する。
【００４９】
本明細書において、用語「無傷の抗体」または「無傷の免疫グロブリン」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチドおよび２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを有する抗体を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶHと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶLと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣLから構成される。ＶHおよびＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散剤する超可変性の領域にさらに細分できる。各ＶHおよびＶLは、以下の順序：ＦＲ1、ＣＤＲ1、ＦＲ2、ＣＤＲ2、ＦＲ3、ＣＤＲ3、ＦＲ4でアミノ末端からカルボキシル末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な相補系の第１の構成成分（Ｃｌｑ）を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子との結合を媒介し得る。
【００５０】
本明細書において、用語「個体」、「患者」または「対象」は、個体生物、脊椎動物、哺乳動物またはヒトであり得る。いくつかの実施形態では、個体、患者または対象は、ヒトである。
本明細書において用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得るあり得る天然に存在する突然変異を除いて同一である。例えば、モノクローナル抗体は、任意の真核細胞の、原核生物の、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体であり得るのであって、それが製造される方法に由来しない。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、通常、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な集団から得られているような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法に織る抗体の製造を必要とすると解釈されてはならない。モノクローナル抗体は、例えば、それだけには限らないが、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術を含む当技術分野で公知のさまざまな技術を使用して調製され得る。例えば、本方法に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得る、または組換えＤＮＡ方法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）を参照のこと。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００５１】
本明細書において、用語「医薬上許容される担体」は、医薬的投与と適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬化合物、等張性および吸収遅延化合物などを含むように意図される。医薬上許容される担体およびその製剤化は、当業者に公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に記載されている。
【００５２】
本明細書において、用語「ポリクローナル抗体」は、少なくとも２種（２）の異なる抗体産生細胞株に由来する抗体の調製物を意味する。この用語の使用は、抗原の異なるエピトープまたは領域と特異的に結合する抗体を含有する少なくとも２種（２）の抗体の調製物を含む。
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意のＲＮＡまたはＤＮＡを意味し、非修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドとして、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡならびに一本鎖またはより通常は、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、ポリヌクレオチドとは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドはまた、１つまたは複数の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性のためにまたはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。
【００５３】
本明細書において、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用されて、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いにつながれた２個以上のアミノ酸を含むポリマーを意味する。ポリペプチドとは、一般に、ペプチド、グリコペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短い鎖および一般に、タンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、または当技術分野で周知である化学的修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は、基本的な教本におよびより詳細な研究所に、ならびに多量の研究文献に十分に記載されている。
本明細書において、「ＰＲＩＴ」または「プレターゲッティングされる放射免疫治療」とは、骨髄などの正常組織に対する望ましくない毒性に寄与する、腫瘍をターゲッティングする抗体の遅い血液クリアランスを解決するマルチステッププロセスを指す。プレターゲッティングでは、放射性核種またはその他の診断もしくは治療薬は、小ハプテンに付着される。ハプテンならびに標的抗原に対する結合部位を有するプレターゲッティング二重特異性抗体が最初に投与される。次いで、結合していない抗体が循環から除去されることが可能にされ、続いて、ハプテンが投与される。
【００５４】
本明細書において、用語「組換え体」は、例えば、細胞または核酸、タンパク質またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変更によって修飾されていること、または材料がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内で見られない遺伝子を発現する、またはそうでなければ異常に発現される、発現不足である、または全く発現されない天然遺伝子を発現する。
本明細書において、治療的使用を用語「分離する」とは、異なる経路による同時のまたは実質的に同時の少なくとも２種の有効成分の投与を指す。
本明細書において、用語「逐次」治療的使用とは、異なる時間での少なくとも２種の有効成分の投与を指し、投与経路は、同一であるか、または異なっている。より詳しくは、逐次使用とは、有効成分のうち１種の、別のもの（単数または複数）の投与開始の前の全投与を指す。したがって、有効成分のうち１種を数分、数時間または数日かけて投与し、その後、その他の有効成分（単数または複数）を投与することすることが可能である。この場合には、同時処置はない。
【００５５】
本明細書において、「特異的に結合する」とは、別の分子（例えば、抗原）を認識し、結合するが、その他の分子を実質的に認識および結合しない分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を指す。本明細書において使用される、用語「特異的結合」、特定の分子（例えば、炭水化物抗原または炭水化物抗原上のエピトープ）と「特異的に結合する」または「にとって特異的である」とは、例えば、約１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍまたは１０-12Ｍの結合する分子に対するＫDを有する分子によって示され得る。用語「特異的に結合する」はまた、任意のその他の抗原または抗原の形態（例えば、低ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）と実質的に結合せずに、分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）が特定の抗原（例えば、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）と結合する結合を指す場合もある。
【００５６】
本明細書において、用語「同時の」治療的使用とは、同時のまたは実質的に同時の同一経路による少なくとも２種の有効成分の投与を指す。
本明細書において、用語「治療薬」は、有効量で存在する場合に、それを必要とする対象に所望の治療効果をもたらす化合物を意味するように意図される。
「処置すること」または「処置」は、本明細書において、ヒトなどの対象における本明細書において記載される疾患または障害の処置を対象とし、（ｉ）疾患もしくは障害を阻害すること、すなわち、その発生を停止すること、（ｉｉ）疾患もしくは障害を軽減すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと、（ｉｉｉ）障害の進行を減速することおよび／または（ｉｖ）疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状の進行を阻害、軽減もしくは減速することを含む。いくつかの実施形態では、処置は、疾患と関連する症状が、例えば、緩和される、低減される、治癒されるまたは緩解の状態に置かれることを意味する。
【００５７】
本明細書において記載されるような障害の処置の種々の様式は、完全な処置だけでなく、完全未満の処置も含み、いくつかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味するように意図されることも理解されたい。処置は、慢性疾患のための連続する長期の処置または急性状態の処置のための単回のもしくは２、３回の投与であり得る。
本明細書に記載される抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が考慮される。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性を改善することが、望ましい場合がある。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換が挙げられる。得られた抗体が所望の特性を有する限り、対象の抗体を得るために欠失、挿入および置換の任意の組合せが行われる。修飾はまた、タンパク質のグリコシル化のパターンの変化も含む。置換的突然変異誘発のための最大の対象の部位として、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ変更も考慮される。「保存的置換」は以下の表に示される。
【００５８】
【表１】
2021517816.tif 000003
【００５９】
置換的バリアントのうち１種類は、親抗体の１つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む。このような置換的バリアントを作製するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。具体的には、各部位ですべての可能性あるアミノ酸置換を作製するためにいくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）が突然変異される。このように作製された抗体バリアントは、各粒子内でパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として繊維状ファージ粒子から一価様式で提示される。ファージに提示されたバリアントは、次いで、本明細書において開示されるようなその生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施して抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を同定してもよい。あるいはまたはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体および抗原間の接触点を同定することが有益であり得る。このような接触残基および隣接残基は、本明細書において詳述される技術に従う置換の候補である。ひとたびこのようなバリアントを作製すれば、バリアントのパネルを本明細書において記載されるようなスクリーニングに付し、さらなる開発のために、１つまたは複数の関連アッセイにおいて同様のまたは優れた特性を有する抗体を選択してもよい。
ポリシアル酸
シアル酸はまたそれ自体で、ポリシアル酸（ｐｏｌｙＳｉａ）として知られる最大２００残基の長い鎖に一緒に連結されて見られることがあり、これは、α２−８−結合によって連結され、主に、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）ならびにその他のタンパク質のＮ結合型オリゴ糖鎖の外鎖上で見られる（Finne, J., et al. Biochem Biophys Res Commun 112, 482-487(1983)）。ＮＣＡＭは、神経外胚葉起源の細胞上で発現され、神経組織発達および再生において役割を果たす（Sadoul, R., et al. Nature 304, 347-349(1983)）。ｐｏｌｙＳｉａは、ＮＣＡＭ分子間の同種親和性相互作用および他の接着分子との異種親和性相互作用を調節する（Schreiber, S. C., et al. Gastroenterology 134, 1555-1566(2008)）。ｐｏｌｙＳｉａの生物学的特性は、重合（ＤＰ）の程度に応じて変わり、これは、胚発生では高いが、成体組織では低い（Rutishauser, U. Nat Rev Neurosci 9, 26-35(2008)）。高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａは、細胞接着に対して阻害効果を示し（Muhlenhoff, M., et al. Curr Opin Struct Biol 8, 558-564(1998); Johnson, C. P., et al. J Biol Chem 280, 137-145(2005)）、小細胞および非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、下垂体腫瘍、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫（Falconer, R. A., et al. Curr Cancer Drug Targets 12, 925-939 (2012)）、神経膠芽腫（Amoureux, M. C., et al. BMC Cancer 10, 91 (2010)）を含むいくつかの転移性癌で、および乳癌（Wang, X., et al. Int J Mol Med 37, 197-206 (2016)）において発現される。ｐｏｌｙＳｉａ  のＤＰは、神経芽細胞腫では５５Ｓｉａ単位より大きかった（Livingston, B. D., et al. J Biol Chem 263, 9443-9448 (1988)）。ｐｏｌｙＳｉａは、いくつかの腫瘍種類での広い発現およびほとんどの成体組織において実質的にないために、癌免疫療法の標的である。
【００６０】
モノ−およびジ−シアル酸（１〜２個のＳｉａ単位）、オリゴ−シアル酸（３〜５個のＳｉａ単位）およびｐｏｌｙＳｉａ（少なくとも８個のＳｉａ単位）に対していくつかのモノクローナル抗体が開発されている。Sato, C., and Kitajima, K. J Biochem 154, 115-136 (2013)を参照のこと。これらのうち、マウスｍＡｂ７３５（Bitter- Suermann, D., and Roth, J. Immunol Res 6, 225-237 (1987)）のみが、少なくとも１１個のＳｉａ単位を必要とする高ＤＰのＰｏｌｙＳｉａに対して最高特異性を有すると記載されている（Sato, C., and Kitajima, K. J Biochem 154, 115-136 (2013)）。ｍＡｂ７３５の結合動力学へのさらなる調査により、高ＤＰを有するｐｏｌｙＳｉａ（約２００個のＳｉａ単位）に対して高い親和性（ナノモル以下の解離定数ＫD）、より低い程度の重合に対して漸進的に弱い親和性が示された（Hayrinen, J., et al. Mol Immunol 39, 399-411 (2002)）。
【００６１】
本技術の免疫グロブリン関連組成物
本技術は、抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体またはその抗原結合断片）を作製および使用するための方法および組成物を記載する。本開示の抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリン関連組成物は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌の診断または処置において有用であり得る。本技術の範囲内の抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリン関連組成物として、例えば、それだけには限らないが、ｐｏｌｙＳｉａと特異的に結合するモノクローナル、キメラ、ヒト化およびダイアボディー、その相同体、誘導体または断片が挙げられる。本技術の範囲内の抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリン関連組成物としてまた、増強された抗腫瘍効力（例えば、Ｔ細胞動員またはペイロード送達による）のための二重特異性抗体形式の組成物が挙げられる。本開示はまた、本明細書において開示される抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体のいずれかの抗原結合断片を提供し、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦvおよびＦvからなる群から選択される。本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔシステムに従って定義される。
【００６２】
一態様では、本技術は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）ＶHは、ＤＹＹＩＨ（配列番号１）、ＲＹＹＩＨ（配列番号７）、ＧＹＹＩＨ（配列番号８）およびＮＹＹＩＨ（配列番号９）からなる群から選択されるＶH−ＣＤＲ１配列、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）、ＳＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１０）、ＲＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１１）、ＣＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１２）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＥＧ（配列番号１３）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号１４）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号１５）、ＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＥＫＦＱＧ（配列番号１６）、およびＷＩＹＰＧＳＧＮＴＫＹＳＱＫＦＫＧ（配列番号１８）からなる群から選択されるＶH−ＣＤＲ２配列、およびＧＧＫＦＡＭＤＹ（配列番号３）のＶH−ＣＤＲ３配列を含み、ならびに／または（ｂ）ＶLは、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号４）およびＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＫＴＹＬＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ１配列、ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶL−ＣＤＲ２配列、およびＦＱＧＴＨＶＰＹＴ（配列番号６）、ＦＱＧＴＨＶＰＹＩ（配列番号２１）、およびＦＱＧＴＨＥＰＹＴ（配列番号２２）からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）ＶHは、配列番号１のＶH−ＣＤＲ１配列、配列番号２のＶH−ＣＤＲ２配列、配列番号３のＶH−ＣＤＲ３配列を含み、および／または（ｂ）ＶLは、配列番号４、配列番号５、および配列番号６；配列番号２０、配列番号５、および配列番号６；配列番号４、配列番号５、および配列番号２２からなる群から選択されるＶL−ＣＤＲ１配列、ＶL−ＣＤＲ２配列およびＶL−ＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）および重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）ＶLは、配列番号４のＶL−ＣＤＲ１配列、配列番号５のＶL−ＣＤＲ２配列、配列番号６のＶL−ＣＤＲ３配列を含み、および／または（ｂ）ＶHは、配列番号１、配列番号２、配列番号３；配列番号１、配列番号１１、および配列番号３；配列番号１、配列番号１２、配列番号３；配列番号１、配列番号１３、および配列番号３；配列番号７、配列番号２、および配列番号３；配列番号７、配列番号１１、および配列番号３；配列番号８、配列番号１０、および配列番号３；配列番号８、配列番号１２、および配列番号３；配列番号９、配列番号１１、および配列番号３；配列番号９、配列番号１２、配列番号３；配列番号１、配列番号１４、および配列番号３；配列番号１、配列番号１５、および配列番号３；配列番号１、配列番号１６、および配列番号３；ならびに配列番号１、配列番号１８および配列番号３からなる群から選択される、ＶH−ＣＤＲ１配列、ＶH−ＣＤＲ２配列およびＶH−ＣＤＲ３配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、ＶHは、ＶH−ＣＤＲ１配列、ＶH−ＣＤＲ２配列およびＶH−ＣＤＲ１配列を含み、ＶLは、ＶL−ＣＤＲ１配列、ＶL−ＣＤＲ２配列およびＶL−ＣＤＲ３配列を含み、ａ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５および６、ｂ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５および２２、ｃ）それぞれ、配列番号１、２、３、２０、５および６、ｄ）それぞれ、配列番号１、１１、３、４、５および６、ｅ）それぞれ、配列番号１、１２、３、４、５および６、ｆ）それぞれ、配列番号１、１３、３、４、５および６、ｇ）それぞれ、配列番号１、１３、３、４、５および２１、ｈ）それぞれ、配列番号７、２、３、４、５および６、ｉ）それぞれ、７、１１、３、４、５および６、ｊ）それぞれ、配列番号８、１０、３、４、５および６、ｋ）それぞれ、８、１２、３、４、５および６、ｌ）それぞれ、配列番号９、１１、３、４、５および６、ならびにｍ）それぞれ、配列番号９、１２、３、４、５および６からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、それだけには限らないが、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ1およびＩｇＡ2を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭおよびＩｇＹのＦｃドメインをさらに含む。定常領域配列の限定されない例として、以下が挙げられる：
【００６７】
ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０（配列番号８５）
ＡＰＴＫＡＰＤＶＦＰＩＩＳＧＣＲＨＰＫＤＮＳＰＶＶＬＡＣＬＩＴＧＹＨＰＴＳＶＴＶＴＷＹＭＧＴＱＳＱＰＱＲＴＦＰＥＩＱＲＲＤＳＹＹＭＴＳＳＱＬＳＴＰＬＱＱＷＲＱＧＥＹＫＣＶＶＱＨＴＡＳＫＳＫＫＥＩＦＲＷＰＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＧＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ
ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７（配列番号８６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９（配列番号８７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００６８】
ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０（配列番号８８）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００６９】
ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１（配列番号８９）
ＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＬＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ
【００７０】
ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１（配列番号９０）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６（配列番号９１）
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＣＳＴＱＰＤＧＮＶＶＩＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＧＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＬＡＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
【００７１】
ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７（配列番号１７）
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＤＳＴＰＱＤＧＮＶＶＶＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＮＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＰＤＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＰＰＰＰＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＭＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４（配列番号１９）
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
いくつかの実施形態では、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号１７または８５〜９１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一である重鎖定常領域を含む。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号１９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一である軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ（例えば、約１０〜２０個のＳｉａ単位、約２０〜３０個のＳｉａ単位、約３０〜５０個のＳｉａ単位、約５０〜７０個のＳｉａ単位、約７０〜１００個のＳｉａ単位、約１００〜２００個のＳｉａ単位または約２００〜４００個のＳｉａ単位のＤＰ）と結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、例えば、ＤＰ＞１０、ＤＰ＞２０、ＤＰ＞５０、ＤＰ＞１００またはＤＰ＞２００を有する高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合する。いくつかの実施形態では、エピトープは、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａに対して特異的であるコンホメーションエピトープである。いくつかの実施形態では、コンホメーションエピトープは、３個またはそれより多いＳｉａ単位を含む。いくつかの実施形態では、３個またはそれより多いＳｉａ単位は、連続単位であり得る。
【００７２】
別の態様では、本開示は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、または１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む、単離された免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を提供する。
【００７３】
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号６０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、それぞれ、配列番号２３および配列番号２４（キメラＰ３５）；配列番号２５および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２）；配列番号２５および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ１）；配列番号２６および配列番号２８（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ２）；配列番号２６および配列番号２７（ヒト化Ｐ３５  Ｈ２Ｌ１）；配列番号４８および配列番号４９（ＢＣ１３７）；配列番号５１および配列番号５２（ＢＣ１３７  ＫＳ２）；配列番号５３および配列番号５４（ＢＣ１３７  ＫＳ３４）；配列番号５５および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７）；配列番号５６および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４）；配列番号５７および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ４７  Ｄ３１Ｒ）；配列番号５８および配列番号４９（ＢＣ１３７  ＤＳ５４  Ｄ３１Ｒ）；配列番号５５および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ４７）；配列番号５６および配列番号５０（ＢＣ１３７−２  ＤＳ５４）；配列番号５９および配列番号６０（ＢＣ１６３）；配列番号７４および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ１）；配列番号７５および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ１）；配列番号７６および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ１）；配列番号７７および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ１）；配列番号７８および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ１）；配列番号７９および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ１）；配列番号８０および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ１）；配列番号８１および配列番号８２（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ１）；配列番号７４および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ２）；配列番号７５および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ２）；配列番号７６および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ２）；配列番号７７および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ２）；配列番号７８および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ２）；配列番号７９および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ２）；配列番号８０および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ２）；配列番号８１および配列番号８３（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ２）；配列番号７４および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ１Ｌ３）；配列番号７５および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ２Ｌ３）；配列番号７６および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ３Ｌ３）；配列番号７７および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ４Ｌ３）；配列番号７８および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ５Ｌ３）；配列番号７９および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ６Ｌ３）；配列番号８０および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ７Ｌ３）；ならびに配列番号８１および配列番号８４（再ヒト化Ｐ３５Ｈ８Ｌ３）からなる群から選択されるＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列を含む。
【００７５】
免疫グロブリン関連組成物の上記の実施形態のいずれかでは、ＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ（例えば、約１０〜２０個のＳｉａ単位、約２０〜３０個のＳｉａ単位、約３０〜５０個のＳｉａ単位、約５０〜７０個のＳｉａ単位、約７０〜１００個のＳｉａ単位、約１００〜２００個のＳｉａ単位または約２００〜４００個のＳｉａ単位のＤＰ）と結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、例えば、ＤＰ＞１０、ＤＰ＞２０、ＤＰ＞５０、ＤＰ＞１００またはＤＰ＞２００を有する高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合する。いくつかの実施形態では、エピトープは、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａに対して特異的であるコンホメーションエピトープである。いくつかの実施形態では、コンホメーションエピトープは、３個またはそれより多いＳｉａ単位を含む。いくつかの実施形態では、３個またはそれより多いＳｉａ単位は、連続単位であり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、同一ポリペプチド鎖の構成成分である。その他の実施形態では、ＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成成分である。特定の実施形態では、抗体は、全長抗体である。
いくつかの実施形態では、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、ｐｏｌｙＳｉａと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、約１０-3Ｍ、１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍまたは１０-12Ｍの解離定数（ＫD）で高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合する。特定の実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。
【００７７】
特定の実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、以下の特徴のうち１つまたは複数を含む：（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号３７、３９、４１、４３、４４、４５、４７、２４、２７、２８、４９、５０、５２、５４、６０、８２、８３もしくは８４のうちいずれか１つ中に存在する軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である、および／または（ｂ）配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４６、２３、２５、２６、２９、４８、５１、５３、５５、５６、５７、５８、５９、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０もしくは８１のうちいずれか１つ中に存在する重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列。別の態様では、本明細書において提供される免疫グロブリン関連組成物中の１つまたは複数のアミノ酸残基は、別のアミノ酸と置換される。置換は、本明細書において定義されるような「保存的置換」であり得る。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、配列番号６１〜７３のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、（ａ）配列番号２４、２７、２８、４９、５０、５２、５４、６０、８２、８３もしくは８４のうちいずれか１つ中に存在するＬＣ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるＬＣ配列および／または（ｂ）配列番号２３、２５、２６、２９、４８、５１、５３、５５、５６、５７、５８、５９、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０もしくは８１のうちいずれか１つ中に存在するＨＣ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるＨＣ配列を含む。
【００７９】
特定の実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、Ｎ２９７ＡおよびＫ３２２Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含有する。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むＩｇＧ４定常領域を含有する。
例示的抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリン関連組成物のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、図１５〜６５に示されている。
【００８０】
いくつかの態様では、本明細書に記載される抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリン関連組成物は、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または遅い放出を促進するために構造修飾を含有する。いくつかの態様では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体）は、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または遅い放出を促進するために、ＣＨ２定常重鎖領域中に欠失を含有し得る。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または持続放出を促進するために、Ｆａｂ断片が使用される。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または持続放出を促進するために、Ｆ（ａｂ）’2断片が使用される。
一態様では、本技術は、本明細書に記載される免疫グロブリン関連組成物の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列を提供する。また、本明細書に記載される抗体のいずれかをコードする組換え核酸配列が本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号９２〜１０８からなる群から選択される。別の態様では、本技術は、本明細書に記載される免疫グロブリン関連組成物の重鎖または軽鎖をコードする任意の核酸配列を発現する宿主細胞を提供する。
【００８１】
本技術の免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体）は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれより多い多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、異なる重合度を有するｐｏｌｙＳｉａに対して特異的であり得る、またはｐｏｌｙＳｉａならびに異種組成物、例えば、異種ポリペプチドまたは固相支持体材料の両方に対して特異的であり得る。例えば、ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／０５７９３、Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991)、米国特許第５，５７３，９２０号、同４，４７４，８９３号、同５，６０１，８１９号、同４，７１４，６８１号、同４，９２５，６４８号、同６，１０６，８３５号、Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)を参照のこと。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、キメラである。特定の実施形態では、免疫グロブリン関連組成物は、ヒト化されている。
本技術の免疫グロブリン関連組成物は、さらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種ポリペプチドに組換えによって融合されてもよく、またはポリペプチドもしくはその他の組成物に化学的にコンジュゲートされてもよい（共有結合によるおよび非共有結合によるコンジュゲーションを含む）。例えば、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、検出アッセイにおいて標識として有用である分子およびエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物または毒素に組換えによって融合されても、コンジュゲートされてもよい。例えば、ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号およびＥＰ０３９６３８７を参照のこと。
本技術の免疫グロブリン関連組成物の上記の実施形態のいずれかでは、抗体または抗原結合断片は、同位元素、色素、クロマジェン、造影剤、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、増殖因子、放射性核種、金属、リポソーム、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される物質にコンジュゲートされていてもよい。化学的結合または物理的結合については、免疫グロブリン関連組成物上の官能基は、通常、物質上の官能基と会合する。あるいは、物質上の官能基は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基と会合する。
【００８２】
物質および免疫グロブリン関連組成物上の官能基は、直接会合し得る。例えば、物質上の官能基（例えば、スルフヒドリル基）は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基（例えば、スルフヒドリル基）と会合して、ジスルフィドを形成し得る。あるいは、官能基は、架橋剤（すなわち、リンカー）を介して会合することもある。架橋剤のいくつかの例が以下に記載されている。架橋剤は、物質または免疫グロブリン関連組成物のいずれかに付着され得る。コンジュゲート中の物質または免疫グロブリン関連組成物の数はまた、他方上に存在する官能基の数によって制限される。例えば、コンジュゲートと会合される物質の最大数は、免疫グロブリン関連組成物上に存在する官能基の数に応じて変わる。あるいは、物質と会合される免疫グロブリン関連組成物の最大数は、物質上に存在する官能基の数に応じて変わる。
【００８３】
さらに別の実施形態では、コンジュゲートは、１つの物質に会合された１つの免疫グロブリン関連組成物を含む。一実施形態では、コンジュゲートは、少なくとも１つの免疫グロブリン関連組成物に化学的に結合された（例えば、コンジュゲートされた）少なくとも１つの物質を含む。物質は、当業者に公知の任意の方法によって免疫グロブリン関連組成物に化学的に結合され得る。例えば、物質上の官能基は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基に直接付着され得る。適した官能基のいくつかの例として、例えば、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、マレイミド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびヒドロキシルが挙げられる。
【００８４】
物質はまた、架橋剤、例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどによって免疫グロブリン関連組成物に化学的に結合され得る。架橋剤は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、イリノイ州、ロックフォードから得ることができる。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．ウェブサイトは、助けとなり得る。さらなる架橋剤として、Ｋｒｅａｔｅｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂ．Ｖ．、オランダ、アムステルダムの米国特許第５，５８０，９９０号、同５，９８５，５６６号および同６，１３３，０３８号に記載された白金架橋剤が挙げられる。
【００８５】
あるいは、物質および免疫グロブリン関連組成物上の官能基は、同一であり得る。ホモ二機能性架橋剤は、通常、同一官能基を架橋するために使用される。ホモ二機能性架橋剤の例として、ＥＧＳ（すなわちエチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］）、ＤＳＳ（すなわち、ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＭＡ（すなわち、ジメチルアジピミデート．２ＨＣｌ）、ＤＴＳＳＰ（すなわち、３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］））、ＤＰＤＰＢ（すなわち、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン）およびＢＭＨ（すなわち、ビス−マレイミドヘキサン）が挙げられる。このようなホモ二機能性架橋剤はまた、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．から入手可能である。
【００８６】
その他の場合には、物質を免疫グロブリン関連組成物から切断することが有益であり得る。上記のＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．のウェブサイトはまた、例えば、細胞中で酵素によって切断され得る適した架橋剤の選択において当業者の助けとなり得る。したがって、物質は免疫グロブリン関連組成物から分離され得る。切断可能なリンカーの例として、ＳＭＰＴ（すなわち、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（すなわち、スルホスクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（すなわち、スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（すなわち、スルホスクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（すなわち、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミドヘキサノエート）およびＡＥＤＰ（すなわち、３−［（２−アミノエチル）ジチオ］プロピオン酸ＨＣｌ）が挙げられる。
【００８７】
別の実施形態では、コンジュゲートは、少なくとも１つの免疫グロブリン関連組成物と物理的に結合される少なくとも１つの物質を含む。物質を免疫グロブリン関連組成物と物理的に結合するために、当業者に公知の任意の方法が使用され得る。例えば、当業者に公知の任意の方法によって、免疫グロブリン関連組成物および物質が一緒に混合され得る。混合の順序は重要ではない。例えば、当業者に公知の任意の方法によって、物質は免疫グロブリン関連組成物と物理的に混合され得る。例えば、免疫グロブリン関連組成物および物質は、容器中に入れられ、例えば、容器を振盪することによって撹拌されて、免疫グロブリン関連組成物および物質が混合され得る。
免疫グロブリン関連組成物を、当業者に公知の任意の方法によって修飾することができる。例えば、免疫グロブリン関連組成物を、上記のように、架橋剤または官能基によって修飾してもよい。
【００８８】
Ａ．本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を調製する方法
一般的な概要。最初に、本技術の抗体が作製され得る標的ｐｏｌｙＳｉａ種が選択される。例えば、例えば、ＤＰ＞１０、ＤＰ＞２０、ＤＰ＞５０、ＤＰ＞１００またはＤＰ＞２００を有する高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａに対して、抗体が作製され得る。このような標的抗原に対する抗体を作製するための技術は、当業者に周知である。このような技術の例として、例えば、それだけには限らないが、ディスプレイライブラリー、異種またはヒトマウス、ハイブリドーマなどを含むものが挙げられる。ｐｏｌｙＳｉａに特異的な抗体の調製は、本明細書に記載されている。
ｐｏｌｙＳｉａに向けられた、組換えによって遺伝子操作された抗体および抗体断片、例えば、抗体関連ポリペプチドは、本開示に従って使用するのに適しているということは理解されなくてはならない。
【００８９】
本明細書において示される技術に付され得る抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体断片が挙げられる。抗体Ｆｖ含有ポリペプチド、例えば、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2抗体断片の高収率製造にとって有用な方法は、記載されている。米国特許第５，６４８，２３７を参照のこと。
一般に、抗体は、元来の種から得られる。より詳しくは、標的抗原に対して特異性を有する元来の種の抗体の軽鎖、重鎖または両方の可変部分の核酸またはアミノ酸配列が得られる。元来の種は、本技術の抗体または抗体のライブラリーを作製するのに有用であった任意の種、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなどである。
ファージまたはファージミドディスプレイ技術は、本技術の抗体を導くための有用な技術である。モノクローナル抗体を作製し、クローニングするための技術は、当業者に周知である。本技術の抗体をコードする配列の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で実施され得る。
【００９０】
配列をコードする核酸の縮重のために、本技術の実施において、天然に存在するタンパク質のものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするその他の配列が使用されてもよい。これらとして、それだけには限らないが、配列内で機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、したがって、サイレント変化をもたらす、上記のポリペプチドをコードする核酸配列のすべてまたは一部を含む核酸配列が挙げられる。本技術の免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、このようなバリアントがｐｏｌｙＳｉａ種を認識する作動抗体を形成する限り、標準方法（“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.）によって算出されるような最大２５％の配列相同性変動を許容することは理解される。例えば、ポリペプチド配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基が、機能的等価物として働く同様の極性の別のアミノ酸によって置換されてもよく、その結果、サイレント変化が得られる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスのその他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性天然アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。例えば、グリコシル化、タンパク質分解による切断、抗体分子またはその他の細胞性リガンドとの連結などによって、翻訳の間または翻訳後に異なって修飾されるタンパク質またはその断片または誘導体も本技術の範囲内に含まれる。さらに、免疫グロブリンをコードする核酸配列は、翻訳、開始および／または終止配列を作出および／または破壊して、コーディング領域の変動を作出する、および／または新規制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、または既存のものを破壊するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾をさらに促進するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで突然変異され得る。それだけには限らないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発、J. Biol. Chem. 253:6551、use of Tab linkers (Pharmacia)などを含む、当技術分野で公知の突然変異誘発のための任意の技術が使用されてもよい。
【００９１】
ポリクローナル抗血清および免疫原の調製。本技術の抗体または抗体断片を作製する方法は、通常、対象（一般に、マウスまたはウサギなどの非ヒト対象）を、精製ｐｏｌｙＳｉａ標的（例えば、例えば、ＤＰ＞１０、ＤＰ＞２０、ＤＰ＞５０、ＤＰ＞１００またはＤＰ＞２００を有する高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を用いて、または高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現するｐｏｌｙＳｉａ（＋）細胞株を用いて免疫処置することを含む。適当な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現されたｐｏｌｙＳｉａ種または化学合成されたｐｏｌｙＳｉａ種を含有し得る。
【００９２】
必要に応じて、ｐｏｌｙＳｉａ標的の免疫原性は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミン（ＯＶＡ）などのハプテンとの融合またはコンジュゲーションによって増大させ得る。多数のこのようなハプテンは、当技術分野で公知である。ポリペプチドに対する対象の免疫反応を増大させるために、ｐｏｌｙＳｉａ標的を、従来のアジュバント、例えば、フロイントの完全または不完全アジュバントと組み合わせてもよい。免疫学的反応を増大させるために使用される種々のアジュバントとして、それだけには限らないが、フロイントのもの（完全および不完全）、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチドまたはオイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトアジュバント、例えば、カルメット・ゲラン桿菌およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）または同様の免疫賦活性化合物が挙げられる。これらの技術は、当技術分野で標準である。
【００９３】
本技術の説明において、免疫応答は、「一次」または「二次」免疫応答として記載され得る。一次免疫応答は、「防御的」免疫応答とも記載され、特定の抗原、例えば、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａに対するいくつかの最初の曝露（例えば、最初の「免疫処置」）の結果として個体において生じた免疫応答を指す。いくつかの実施形態では、免疫処置は、抗原を含有するワクチンを用いる個体のワクチン接種の結果として生じ得る。例えば、ワクチンは、１つまたは複数の高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ種を含むｐｏｌｙＳｉａワクチンであり得る。一次免疫応答は、継時的に減弱または弱毒化になり得る、さらに消失し得る、または少なくとも検出され得ないように弱毒化になり得る。したがって、本技術はまた、本明細書において「記憶免疫応答」とも記載される「二次」免疫応答に関する。用語二次免疫応答は、一次免疫応答がすでに生成された後に個体において誘発される免疫応答を指す。
したがって、減弱または弱毒化になった既存の免疫応答を増強するために、または消失してしまった、またはもはや検出され得ないこれまでの免疫応答を再構築するために、二次免疫応答が誘発され得る。二次または記憶免疫応答は、体液性（抗体）応答または細胞性応答のいずれかであり得る。二次または記憶体液性応答は、抗原の最初の提示で生じた記憶Ｂ細胞の刺激の際に生じる。遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答は、ＣＤ４+Ｔ細胞によって媒介される細胞性二次または記憶免疫応答の種類である。抗原に対する最初の曝露は、免疫系を抗原刺激し、さらなる曝露は、ＤＴＨをもたらす。
【００９４】
適当な免疫処置後、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、対象の血清から調製され得る。必要に応じて、ｐｏｌｙＳｉａ標的に向けられた抗体分子は、ＩｇＧ画分を得るために周知の技術、例えば、ポリペプチドＡクロマトグラフィーによって、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、さらに精製され得る。
【００９５】
モノクローナル抗体。本技術の一実施形態では、抗体は、抗ｐｏｌｙＳｉａモノクローナル抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ｐｏｌｙＳｉａモノクローナル抗体は、ヒトまたはマウス抗ｐｏｌｙＳｉａモノクローナル抗体であり得る。高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａまたはその誘導体、断片、類似体または相同体に対するモノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養による抗体分子の製造を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術として、それだけには限らないが、ハイブリドーマ技術（例えば、Kohler & Milstein, 1975.  Nature 256: 495-497を参照のこと）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor, et al., 1983. Immunol. Today 4: 72を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Cole, et al., 1985.  In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。本技術の実施では、ヒトモノクローナル抗体が利用されてもよく、ヒトハイブリドーマを使用することによって（例えば、Cote, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030を参照のこと）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することによって（例えば、Cole, et al., 1985.  In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）製造されてもよい。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団が単離され得る。集団に由来する抗体の一部をコードする配列を増幅するために、抗体の保存された領域をコードする配列に由来するプライマーを利用するＰＣＲが使用され、次いで、抗体またはその断片、例えば、可変ドメインをコードするＤＮＡが、増幅された配列から再構築される。このような増幅された配列はまた、ファージまたは細菌での融合ポリペプチドの発現およびディスプレイのために、その他のタンパク質、例えば、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質をコードするＤＮＡと融合され得る。次いで、増幅された配列は発現され、例えば、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａまたはその誘導体、断片、類似体もしくは相同体に対する発現された抗体またはその断片の親和性に基づいて、さらに選択され得るまたは単離され得る。あるいは、抗ｐｏｌｙＳｉａモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、対象を免疫処置し、次いで、日常的な方法を使用して対象の脾臓からハイブリドーマを単離することによって調製され得る。例えば、Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol (1981) 73: 3-46)を参照のこと。標準方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることは、変動する特異性（すなわち、種々のエピトープに対する）および親和性のモノクローナル抗体をもたらす。所望の特性、例えば、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ結合を有する選択されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって発現されたように使用されてもよく、その特性を変更するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子に結合されてもよく、またはそれをコードするｃＤＮＡは、種々の方法で単離されてもよく、シーケンシングされてもよく、操作されてもよい。その他の操作として、貯蔵の際または対象への投与後に抗体の不安定性に寄与する特定のアミノアシル残基を置換または欠失することおよび高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａに対する抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の親和性を改善するための親和性成熟技術が挙げられる。
ハイブリドーマ技術。いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成される抗ｐｏｌｙＳｉａモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ技術は、当技術分野で公知の、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)において教示されたものを含む。ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を製造するためのその他の方法は、当業者には周知である。
【００９６】
ファージディスプレイ技術。上記で記載したように、本技術の抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイ技術の適用によって製造され得る。例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を使用して調製され得る。ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面にディスプレイされる。所望の結合特性を有するファージは、抗原、通常、固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択することによって、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法において使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えによって融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージである。さらに、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａまたはその誘導体、断片、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速な有効な同定を可能にするために、方法が、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適用され得る（例えば、Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989を参照のこと）。本技術の抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ方法のその他の例として、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990; Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４、ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、ＷＯ９６／０６２１３、ＷＯ９２／０１０４７（Medical Research Council et al.）、ＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）、ＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）および米国特許第５，６９８，４２６号、同５，２２３，４０９号、同５，４０３，４８４号、同５，５８０，７１７号、同５，４２７，９０８号、同５，７５０，７５３号、同５，８２１，０４７号、同５，５７１，６９８号、同５，４２７，９０８号、同５，５１６，６３７号、同５，７８０，２２５号、同５，６５８，７２７号および同５，７３３，７４３号に開示されるものが挙げられる。ジスルフィド結合によってポリペプチドを引きつけることによるバクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドをディスプレイするのに有用な方法は、Lohning、米国特許第６，７５３，１３６号によって記載されている。上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから得た抗体コーディング領域は、単離され、ヒト抗体を含む全抗体または任意のその他の所望の抗原結合断片を作製するために使用され、任意の哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2断片を組換え製造する���めの技術もまた、ＷＯ９２／２２３２４； Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869, 1992;およびSawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995; およびBetter et al., Science 240: 1041-1043, 1988に開示されるものなどの当技術分野で公知の方法を使用して使用され得る。
【００９７】
一般に、ディスプレイベクター中にクローニングされたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片は、抗体または抗体断片は、ファージまたはファージミド粒子の表面に存在するからであるので、良好な結合活性を維持するバリアントを同定するために適当な抗原に対して選択され得る。例えば、Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)を参照のこと。しかし、選択および／またはスクリーニングのために、抗体断片ライブラリーの溶解性ファージベクターへのクローニングなどのその他のベクターフォーマットが、このプロセスに使用され得る（修飾されたＴ７またはラムダＺａｐ系）。
【００９８】
組換え抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の発現。上記で記載されたように、本技術の抗体は、組換えＤＮＡ技術の適用によって製造され得る。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードする組換えポリヌクレオチド構築物は、通常、天然において付随するまたは異種のプロモーター領域を含む、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。そのようなものとして、本技術の別の態様は、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードする１つまたは複数の核酸配列を含有するベクターを含む。本技術の１つまたは複数のポリペプチドの組換え発現のために、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含有する核酸は、当技術分野で周知の、以下に詳述されるような組換えＤＮＡ技術によって、適当なクローニングベクターまたは発現ベクター（すなわち、挿入されたポリペプチドコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクター）に挿入される。ベクターの多様な集団を製造する方法は、Lerner et al.,米国特許第６，２９１，１６０号および同６，６８０，１９２号によって記載されている。
【００９９】
一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターがプラスミドの形態であることが多い。本開示では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的な形態であるので同義的に使用され得る。しかし、本技術は、同等の機能を果たす技術的にプラスミドではない発現ベクターのこのようなその他の形態、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むように意図される。このようなウイルスベクターは、対象の感染およびその対象における構築物の発現を可能にする。いくつかの実施形態では、発現制御配列は、真核細胞の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクト可能なベクターにおける真核細胞プロモーター系である。ベクターが適当な宿主に組み込まれると、宿主は、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードするヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体、例えば、交差反応性抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の収集および精製に適した条件下で維持される。全般的に、米国特許出願公開第２００２／０１９９２１３号を参照のこと。これらの発現ベクターは、通常、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分としてのいずれかで宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有する。ベクターはまた、細胞外抗体断片の分泌に向けるのに有用なシグナルペプチド、例えば、ペクチン酸リアーゼをコードしてもよい。米国特許第５，５７６，１９５号を参照のこと。
【０１００】
本技術の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で、ｐｏｌｙＳｉａ結合特性を有するタンパク質をコードする核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内に、「作動可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系における、またはベクターが宿主細胞に導入される場合宿主細胞において）、対象のヌクレオチド配列が、調節配列に連結されていることを意味することを意図される。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現のレベルなどのような因子に応じて変わり得るということは当業者によって理解されよう。組換えポリペプチド発現（例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体）のプロモーターとして有用である通常の調節配列として、例えば、それだけには限らないが、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびその他の解糖酵素のプロモーターが挙げられる。誘導性酵母プロモーターとして、中でも、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に由来するプロモーターが挙げられる。一実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードするポリヌクレオチドは、ａｒａ  Ｂプロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞において発現可能である。米国特許第５，０２８，５３０号を参照のこと。本技術の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書において記載されるような核酸によってコードされる融合ポリペプチドを含むポリペプチドまたはペプチド（例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体など）を産生できる。
【０１０１】
本技術の別の態様は、１つまたは複数の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードする核酸を含有する、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を発現する宿主細胞に関する。本技術の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞における抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の発現のために設計され得る。例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、真菌細胞、例えば、酵母、酵母細胞または哺乳動物細胞などの細菌細胞において発現され得る。適した宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに論じられる。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して転写され、翻訳され得る。確率論的に作製されるポリヌクレオチド配列の発現による、所定の特性を有するポリペプチド、例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の調製およびスクリーニングにとって有用な方法は、これまでに記載されている。米国特許第５，７６３，１９２号、同５，７２３，３２３号、同５，８１４，４７６号、同５，８１７，４８３号、同５，８２４，５１４号、同５，９７６，８６２号、同６，４９２，１０７号、同６，５６９，６４１号を参照のこと。
【０１０２】
原核生物におけるポリペプチドの発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で融合または非融合ポリペプチドいずれかの発現を指示する構成的または誘導プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸を、本明細書においてコードされるポリペプチドに普通、組換えポリペプチドのアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、通常、３つの目的：（ｉ）組換えポリペプチドの発現を増大させるため、（ｉｉ）組換えポリペプチドの溶解度を増大させるため、および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えポリペプチドの精製を補助するためを果たす。融合発現ベクターでは、融合ポリペプチドの精製後に融合部分からの組換えポリペプチドの分離を可能にするために、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解による切断部位が導入されることが多い。このような酵素およびその同族認識配列として、第Ｘ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。通常の融合発現ベクターとして、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合ポリペプチドまたはポリペプチドＡをそれぞれ標的組換えポリペプチドに融合する、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州、ビバリー）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）が挙げられる。
【０１０３】
適した誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315）およびｐＥＴ  １１ｄ（Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego、Calif. (1990) 60-89）が挙げられる。ポリペプチド融合によって多機能ポリペプチドを得るための、別個の活性ペプチドまたはタンパク質ドメインの標的化されたアセンブリーの方法は、Pack et al.,米国特許第６，２９４，３５３号、同６，６９２，９３５号によって記載されている。大腸菌における組換えポリペプチド発現、例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を最大化するための１つの戦略は、組換えポリペプチドをタンパク質分解性に切断する能力が損なわれた宿主細菌においてポリペプチドを発現することである。例えば、Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照のこと。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが、発現宿主、例えば、大腸菌において優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照のこと）。本技術の核酸配列のこのような変更は、標準ＤＮＡ合成技術によって実施され得る。
【０１０４】
別の実施形態では、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz、Cell 30: 933-943, 1982）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., Gene 54: 113-123, 1987）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州、サンディエゴ）およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州、サンディエゴ）が挙げられる。あるいは、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現されてもよい。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）における、ポリペプチド、例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165, 1983）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39）が挙げられる。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例として、例えば、それだけには限らないが、ｐＣＤＭ８（Seed, Nature 329: 840, 1987）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman, et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合には、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって提供されることが多い。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来する。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の発現に適している原核細胞および真核細胞両方のためのその他の適した発現系については、例えば、Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989のChapter 16および17を参照のこと。
【０１０６】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種において核酸の発現を指示可能である（例えば、組織特異的調節エレメント）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野で公知である。適した組織特異的プロモーターの限定されない例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的; Pinkert, et al., Genes Dev. 1: 268-277, 1987）、リンパ球特異的プロモーター（Calame and Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275, 1988）、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore, EMBO J. 8: 729-733, 1989）および免疫グロブリン（Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740;Queen and Baltimore, Cell 33: 741-748, 1983.）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター； Byrne and Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477, 1989）、膵臓特異的プロモーター（Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916）および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達によって調節されるプロモーターも包含される、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss, Science 249: 374-379, 1990）およびα−胎児タンパク質プロモーター（Campes and Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546, 1989)。
【０１０７】
本方法の別の態様は、本技術の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において同義的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後代も指すことは理解される。特定の修飾は突然変異または環境影響いずれかのために続く世代において生じ得るので、このような後代は、親細胞と実際同一ではない場合もあるが、本明細書における用語の範囲内に依然として含まれる。
【０１０８】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、大腸菌、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞などの細菌細胞において発現され得る。哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するための適した宿主である。Winnacker, From Genes To Clones(VCH Publishers, NY, 1987)を参照のこと。無傷の異種タンパク質を分泌可能ないくつかの適した宿主細胞株が当技術分野で開発されており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞および骨髄腫細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒトである。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含み得る。Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49, 1986。例示的発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Co et al., J Immunol. 148: 1149, 1992。その他の適した宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１０９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞中に導入され得る。本明細書において、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃またはウイルスベーストランスフェクションを含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための種々の技術分野で認識された技術を指すように意図される。哺乳動物細胞を形質転換するために使用されるその他の方法として、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられる（全般的には、Sambrook et al.，Molecular Cloningを参照のこと）。宿主細胞に形質導入するまたはトランスフェクトするための適した方法は、Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)およびその他の実験室マニュアルに見出すことができる。対象のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて周知の方法によって宿主細胞中に移行され得る。
【０１１０】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小画分のみが外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得るということがわかっている。これらの組み込み体を同定および選択するために、一般に、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、対象の遺伝子とともに宿主細胞中に導入される。種々の選択マーカーとして、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードするものと同一ベクターで宿主細胞中に導入され得る、または別個のベクターで導入され得る。導入される核酸を用いて安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、その他の細胞は死滅する）。
【０１１１】
培養中の原核細胞または真核細胞の宿主細胞などの本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を含む宿主細胞は、組換え抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を製造（すなわち、発現）するために使用され得る。一実施形態では、方法は、宿主細胞（抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体が産生されるような適した培地中で培養することを含む。別の実施形態では、方法は、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を、培地または宿主細胞から単離するステップをさらに含む。ひとたび発現されると、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体、例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体または抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体関連ポリペプチドの収集物は、培養培地および宿主細胞から精製される。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準手順に従って精製され得る。一実施形態では、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、Boss et al.米国特許第４，８１６，３９７号の方法によって宿主生物において産生される。普通、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体鎖は、シグナル配列とともに発現され、したがって、培養培地中に放出される。しかし、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体鎖が、宿主細胞によって自然に分泌されない場合には、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体鎖は、穏やかな洗浄剤を用いる処置によって放出され得る。組換えポリペプチドの精製は、当技術分野で周知であり、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー精製技術、カラムクロマトグラフィー、イオン交換精製技術、ゲル電気泳動などが挙げられる（全般的には、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag、N.Y.、1982)を参照のこと。
【０１１２】
抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入およびトランスジェニック動物の乳におけるその後の発現のために導入遺伝子に組み込まれ得る。例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、同５，３０４，４８９号および同５，８４９，９９２号を参照のこと。適した導入遺伝子は、乳腺特異的遺伝子、例えば、カゼインまたはβ−ラクトグロブリン由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能な連結にある軽鎖および／または重鎖のコード配列を含む。トランスジェニック動物の製造のためには、導入遺伝子は、受精した卵母細胞中にマイクロインジェクションされてもよい、または胚幹細胞のゲノム中に組み込まれてもよく、このような細胞の核は、除核された卵母細胞に移される。
【０１１３】
一本鎖抗体。一実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、一本鎖抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体である。本技術によれば、技術は、ｐｏｌｙＳｉａに特異的な一本鎖抗体の製造のために採用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。一本鎖Ｆｖおよび本技術の抗体を製造するために使用され得る技術の例として、米国特許第４，９４６，７７８号および同５，２５８，４９８号； Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993;およびSkerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988に記載されるものが挙げられる。
【０１１４】
キメラおよびヒト化抗体。一実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、キメラ抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体である。一実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体である。本技術の一実施形態では、ドナーおよびアクセプター抗体は、異なる種に由来するモノクローナル抗体である。例えば、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり（ヒトにおけるその抗原性を最小化するために）、その場合には、得られたＣＤＲ移植抗体は、「ヒト化」抗体と呼ばれる。
【０１１５】
組換え抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体、例えば、ヒトおよび非ヒト部分両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、標準組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得、本技術の範囲内である。ヒトにおける本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイにおけるこれらの物質の使用を含むいくつかの使用のために、キメラまたはヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を使用することがあり得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって製造され得る。このような有用な方法として、例えば、それだけには限らないが、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、米国特許第５，２２５，５３９号、欧州特許第１８４１８７号、欧州特許第１７１４９６号、欧州特許第１７３４９４号、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３、米国特許第４，８１６，５６７号、同５，２２５，５３９号、欧州特許第１２５０２３号、Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043; Liu, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu, et al., 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura, et al., 1987. Cancer Res. 47: 999-1005; Wood, et al., 1985. Nature 314: 446-449; Shaw, et al., 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones, et al., 1986. Nature 321: 552-525; Verhoeyan, et al., 1988に記載される方法が挙げられる。例えば、抗体は、ＣＤＲ移植（ＥＰ０２３９４００、ＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５，５３０，１０１号、同５，５８５，０８９号、同５，８５９，２０５号、同６，２４８，５１６号、ＥＰ４６０１６７）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ０５９２１０６、ＥＰ０５１９５９６、Padlan E. A., Molecular Immunology、28: 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994）およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む種々の技術を使用してヒト化され得る。一実施形態では、マウス抗ｐｏｌｙＳｉａモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡは、Ｆｃ定常領域をコードする配列を除去するように特別に選択された制限酵素を用いて消化され、ヒトＦｃ定常領域をコードするｃＤＮＡの同等部分が置換される(Robinson et al.、ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira et al.、欧州特許出願第１８４，１８７号； Taniguchi、欧州特許出願第１７１，４９６号； Morrison et al.、欧州特許出願第１７３，４９４号； Neuberger et al.、ＷＯ８６／０１５３３； Cabilly et al.、米国特許第４，８１６，５６７号； Cabilly et al.、欧州特許出願第１２５，０２３号； Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449;およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559;米国特許第６，１８０，３７０号；米国特許第６，３００，０６４号；同６，６９６，２４８号；同６，７０６，４８４号；同６，８２８，４２２号。
【０１１６】
一実施形態では、本技術は、ヒト抗マウス抗体（本明細書において以下、「ＨＡＭＡ」と呼ばれる）応答を誘導する可能性が低く、一方で、有効な抗体エフェクター機能は依然として有するヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の構築を提供する。本明細書において、抗体に関連して、用語「ヒト」および「ヒト化」は、ヒト対象において治療上許容される弱い免疫原性応答を誘発するように予測される任意の抗体に関する。一実施形態では、本技術は、ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体、重鎖および軽鎖免疫グロブリンを提供する。
【０１１７】
ＣＤＲ抗体。いくつかの実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、抗ｐｏｌｙＳｉａ  ＣＤＲ抗体である。全般的に、抗ｐｏｌｙＳｉａ  ＣＤＲ抗体を作製するために使用されるドナーおよびアクセプター抗体は、異なる種に由来するモノクローナル抗体であり、通常、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり（ヒトにおける抗原性を最小化するために）、その場合には、得られたＣＤＲ移植抗体は、「ヒト化」抗体と呼ばれる。移植は、アクセプター抗体の単一ＶHまたはＶL内の単一ＣＤＲ（またはさらに単一ＣＤＲの一部）のものであり得る、またはＶHおよびＶLの一方または両方内の複数のＣＤＲ（またはその一部）のものであり得る。得られたＣＤＲ移植抗体のｐｏｌｙＳｉａとの適切な結合を可能にするのに必要な数だけを置き換えることを必要とするが、アクセプター抗体のすべての可変ドメインの３つのＣＤＲすべてが置き換えられることが多い。ＣＤＲ移植およびヒト化抗体を作製する方法は、Queen et al.米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；およびWinter 米国特許第５，２２５，５３９号；およびＥＰ０６８２０４０によって教示される。ＶHおよびＶLポリペプチドを調製するのに有用な方法は、Winter et al.米国特許第４，８１６，３９７号；同６，２９１，１５８号；同６，２９１，１５９号；同６，２９１，１６１号；同６，５４５，１４２号；ＥＰ０３６８６８４；ＥＰ０４５１２１６；およびＥＰ０１２０６９４によって教示される。
【０１１８】
同一ファミリーおよび／または同一ファミリーメンバーから適したフレームワーク領域候補を選択した後、元の種からハイブリッドフレームワーク領域中にＣＤＲを移植することによって、重鎖および軽鎖可変領域のいずれかまたは両方が製造される。上記の態様のいずれかに関して、当業者に公知の従来の方法を使用して、ハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片のアセンブリーが達成され得る。例えば、本明細書において記載されるハイブリッド可変ドメイン（すなわち、標的種および元の種に由来するＣＤＲをベースとするフレームワーク）をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成および／またはＰＣＲによって製造され得る。ＣＤＲ領域をコードする核酸はまた、適した制限酵素を使用して元の種の抗体から単離され、適したライゲーション酵素を用いてライゲーションすることによって標的種フレームワーク中にライゲーションされ得る。あるいは、元の種の抗体の可変鎖のフレームワーク領域は、部位特異的突然変異誘発によって変更され得る。
【０１１９】
各フレームワーク領域に対応する複数の候補の中から選択してハイブリッドが構築されるので、本明細書において記載される原理に従う構築を受け入れる配列の多数の組合せが存在する。したがって、個々のフレームワーク領域の異なる組合せを有するメンバーを有するハイブリッドのライブラリーがアセンブルされ得る。このようなライブラリーは、ハイブリッドの、配列の電子データベース収集物または物理的収集物であり得る。
【０１２０】
このプロセスは、通常、移植ＣＤＲをフランキングするアクセプター抗体のＦＲを変更しない。しかし、当業者ならば、時には、ドナー抗体の対応するＦＲにより同様のＦＲを作製するために、所与のＦＲの特定の残基を置き換えることによって、得られた抗ｐｏｌｙＳｉａ  ＣＤＲ移植抗体の抗原結合親和性を改善できる。置換の適した位置は、ＣＤＲに隣接する、またはＣＤＲと相互作用可能なアミノ酸残基を含む（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９、特に列１２〜１６を参照のこと）。または当業者ならば、ドナーＦＲを用いて開始し、アクセプターＦＲまたはヒトコンセンサスＦＲとより同様であるように修飾できる。これらの修飾を行う技術は、当技術分野で公知である。特に、得られたＦＲが、その位置のヒトコンセンサスＦＲと適合する、またはこのようなコンセンサスＦＲに対して少なくとも９０％またはそれ以上同一である場合には、そのようにすることは、得られた修飾された抗ｐｏｌｙＳｉａ  ＣＤＲ移植抗体の抗原性を、完全ヒトＦＲを有する同一抗体と比較して有意に増大させない可能性がある。
【０１２１】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）。二重特異性抗体は、別個の構造を有する２種の標的、例えば、２種の異なる標的抗原、同一標的抗原上の２種の異なるエピトープまたはハプテンおよび標的抗原もしくは標的抗原上のエピトープと同時に結合し得る抗体である。ＢｓＡｂは、例えば、同一または異なる抗原の異なるエピトープを認識する重鎖および／または軽鎖を組み合わせることによって作製され得る。いくつかの実施形態では、二重特異性結合剤は、分子機能によって、２つの結合アームのうち一方（一方のＶＨ／ＶＬ対）上の１種の抗原（またはエピトープ）と結合し、その第２のアーム（異なるＶＨ／ＶＬ対）上の異なる抗原（またはエピトープ）と結合する。この定義によって、二重特異性結合剤は、２つの別個の抗原結合アーム（特異性およびＣＤＲ配列の両方において）を有し、結合する各抗原に対して一価である。
【０１２２】
本技術の二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）および二重特異性抗体断片（ＢｓＦａｂ）は、例えば、ｐｏｌｙＳｉａと特異的に結合する少なくとも１つのアームおよび第２の標的抗原と特異的に結合する少なくとも１つのその他のアームを有する。いくつかの実施形態では、第２の標的抗原は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄系細胞、形質細胞または肥満細胞の抗原またはエピトープである。さらにまたはあるいは、特定の実施形態では、第２の標的抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＣＤ２２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１２３、ＴＣＲガンマ／デルタ、ＮＫｐ４６およびＫＩＲからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＢｓＡｂは、細胞表面上にｐｏｌｙＳｉａを発現する腫瘍細胞と結合可能である。いくつかの実施形態では、ＢｓＡｂは、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍部位に向ける（または動員する）ことによって腫瘍細胞の死滅を促進するように遺伝子操作されている。その他の例示的ＢｓＡｂとして、ｐｏｌｙＳｉａに対して特異的な第１の抗原結合部位および小分子ハプテン（例えば、ＤＴＰ  Ａ、ＩＭＰ２８８、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ−Ｂｎ、ＤＯＴＡ−デスフェリオキサミン、本明細書に記載されるその他のＤＯＴＡキレート、ビオチン、フルオレセインまたはGoodwin, D A. et al, 1994, Cancer Res. 54(22):5937-5946に開示されるもの）に対して特異的な第２の抗原結合部位を有するものが挙げられる。
【０１２３】
さまざまな二重特異性融合タンパク質が、分子工学を使用して製造され得る。例えば、完全免疫グロブリンフレームワーク（例えば、ＩｇＧ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはそれらの組合せのいずれかを利用するＢｓＡｂが構築されている。いくつかの実施形態では、二重特異性融合タンパク質は、例えば、１種の抗原に対する単一結合部位を有するｓｃＦｖおよび第２の抗原に対する単一結合部位を有するＦａｂ断片を含む二価である。その他の実施形態では、二重特異性融合タンパク質は、四価であり、例えば、１種の抗原に対する２つの結合部位および第２の抗原に対する２つの同一のｓｃＦｖを有する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）を含む。タンデムで２つのｓｃＦｖ単位から構成されるＢｓＡｂは、臨床的に成功した二重特異性抗体形式であるとわかっている。いくつかの実施形態では、ＢｓＡｂは、腫瘍抗原（例えば、ｐｏｌｙＳｉａ）と結合するｓｃＦｖが、Ｔ細胞に関与する（例えば、ＣＤ３と結合することによって）ｓｃＦｖと連結されるように設計されている、２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をタンデムで含む。このようにして、Ｔ細胞は腫瘍部位に動員され、その結果、それらは腫瘍細胞の細胞傷害性死滅を媒介し得る。例えば、Dreier et al., J. Immunol. 170:4397-4402(2003); Bargou et al., Science 321 :974- 977(2008)）を参照のこと。
【０１２４】
ＢｓＡｂを製造するための最近の方法として、より一般的な免疫グロブリンアイソタイプよりも強力に架橋する、さらなるシステイン残基を有する操作された組換えモノクローナル抗体が挙げられる。例えば、FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225 (1997）を参照のこと。別のアプローチとして、必要とされる二重特異性を有する２つ以上の異なる一本鎖抗体または抗体断片セグメントを連結して組換え融合タンパク質を操作により作製することがある。例えば、Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163(1997)を参照のこと。分子工学を使用して、さまざまな二重特異性融合タンパク質が製造され得る。
【０１２５】
２つ以上の異なる一本鎖抗体または抗体断片を連結する二重特異性融合タンパク質は同様の方法で製造される。さまざまな融合タンパク質を製造するために組換え法が使用され得る。いくつかの特定の実施形態では、本技術によるＢｓＡｂは、重鎖および軽鎖およびｓｃＦｖを含む免疫グロブリンを含む。いくつかの特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、本明細書において開示される任意の抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結される。いくつかの特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、本明細書において開示される任意の抗ｐｏｌｙＳｉａ免疫グロブリンの軽鎖のＣ末端に連結される。種々の実施形態では、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して重鎖または軽鎖に連結される。重鎖ＦｄのｓｃＦｖへのインフレーム接続に必要な適当なリンカー配列が、ＰＣＲ反応によってＶLおよびＶkappaドメイン中に導入される。次いで、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片が、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含有するステージング（ｓｔａｇｉｎｇ）ベクターにライゲーションされる。得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築物が切り出され、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体のＶH領域をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターにライゲーションされる。得られたベクターは、二重特異性融合タンパク質の発現のために適当な宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれより長いアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、頑強な三次元構造をとらず、むしろポリペプチド（例えば、第１のおよび／または第２の抗原結合部位）に対して可動性を提供するという点を特徴とする。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｓＡｂに与えられる特定の特性、例えば、安定性の増大などに基づいて、本明細書に記載されるＢｓＡｂにおいて使用される。いくつかの実施形態では、本技術のＢｓＡｂは、Ｇ4Ｓリンカーを含む。いくつかの特定の実施形態では、本技術のＢｓＡｂは、（Ｇ4Ｓ）nリンカーを含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多い。
【０１２７】
Ｆｃ修飾。いくつかの実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、バリアントＦｃ領域を含み、前記バリアントＦｃ領域は、Sondermann et al., Nature,406:267-273(2000)によって開示されるものなどのＦｃ−Ｆｃ受容体相互作用の結晶学的および構造解析に基づいて、前記バリアントＦｃ領域が、Ｆｃ受容体と直接接触させる位置に置換を有さないという条件で、前記分子が、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）に対して変更された親和性を有するように、野生型Ｆｃ領域（または親のＦｃ領域）に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲと直接接触させるＦｃ領域内の位置の例として、アミノ酸２３４〜２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ７Ｅループ）およびアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループが挙げられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸修飾を有するバリアントＦｃ領域を有する本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、活性化および／または抑制性受容体に対して変更された親和性を有し、前記の１つまたは複数のアミノ酸修飾は、アラニンでのＮ２９７置換またはアラニンでのＫ３２２置換である。
グリコシル化修飾。いくつかの実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、親のＦｃ領域と比較してバリアントグリコシル化を有するＦｃ領域を有する。いくつかの実施形態では、バリアントグリコシル化は、フコースの不在を含み、いくつかの実施形態では、バリアントグリコシル化は、ＧｎＴ１欠損ＣＨＯ細胞における発現に起因する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、抗体の機能性、例えば、抗原に対する結合活性を変更することなく、対象の抗原（例えば、ｐｏｌｙＳｉａ）と結合する適当な参照抗体に対して修飾されたグリコシル化部位を有し得る。本明細書において、「グリコシル化部位」は、オリゴ糖（すなわち、一緒に連結された２個またはそれより多い単糖を含有する炭水化物）が、特異的に、共有結合によって付着する抗体中に任意の特定のアミノ酸配列を含む。
オリゴ糖側鎖は、通常、Ｎ−またはＯ−連結のいずれかによって抗体の骨格に連結される。Ｎ結合型グリコシル化とは、オリゴ糖部分のアスパラギン残基の側鎖への付着を指す。Ｏ結合型グリコシル化とは、オリゴ糖部分の、ヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、トレオニンへの付着を指す。例えば、フコースおよび末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む特定のオリゴ糖を欠くＦｃ−グリコフォームは、特定のＣＨＯ細胞において製造され、増強されたＡＤＣＣエフェクター機能を示し得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物の炭水化物内容は、グリコシル化部位を付加または欠失することによって修飾される。抗体の炭水化物内容を修飾する方法は、当技術分野で周知であり、本技術内に含まれる、例えば、すべて、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１８，１４９号、ＥＰ０３５９０９６Ｂ１、米国特許公開第ＵＳ２００２／００２８４８６号、国際特許出願公開ＷＯ０３／０３５８３５、米国特許公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許第６，２１８，１４９号、米国特許第６，４７２，５１１号を参照のこと。いくつかの実施形態では、抗体の１つまたは複数の内因性炭水化物部分を欠失することによって、抗体（またはその関連部分もしくは構成成分）の炭水化物内容が修飾される。いくつかの特定の実施形態では、本技術は、位置２９７をアスパラギンからアラニンに修飾することによって、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位を欠失することを含む。
【０１３１】
操作されたグリコフォームは、それだけには限らないが、エフェクター機能を増強または低減することを含むさまざまな目的のために有用であり得る。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法、例えば、操作された、もしくはバリアント発現株を使用することによって、１種もしくは複数の酵素、例えば、ＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）との同時発現によって、種々の生物もしくは種々の生物に由来する細胞株においてＦｃ領域を含む分子を発現させることによって、またはＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物（複数可）を修飾することによって作製され得る。操作されたグリコフォームを作製する方法は、当技術分野で公知であり、それだけには限らないが、Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 74:288-294; Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-3473、米国特許第６，６０２，６８４号、米国特許出願番号第１０／２７７，３７０号、米国特許出願番号第１０／１１３，９２９号、国際特許出願公開ＷＯ００／６１７３９Ａ１、ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１、ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１、ＷＯ０２／３０９５４Ａ１、ＰＯＴＩＬＬＥＧＥＮＴ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ、Ｉｎｃ．ニュージャージー州、プリンストン）、ＧＬＹＣＯＭＡＢ（商標）グリコシル化エンジニアリング技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、スイス、チューリッヒ）に記載されるものが挙げられ、それらの各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／０６１７３９、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49を参照のこと。
【０１３２】
融合タンパク質。一実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、融合タンパク質である。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、第２のタンパク質に融合された場合、抗原性タグとして使用され得る。ポリペプチドに融合され得るドメインの例として、異種シグナル配列だけでなく、その他の異種機能性領域も挙げられる。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して起こる場合もある。さらに、本技術の融合タンパク質はまた、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の特徴を改善するように遺伝子操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域は、宿主細胞からの精製またはその後の取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改善するために、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体のＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を促進するために抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体に付加され得る。このような領域は、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の最終調製に先立って除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを促進するためのペプチド部分の付加は、当技術分野ではよく知られており、日常的な技術である。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、ペプチドなどのマーカー配列に融合されてもよく、これは、融合されたポリペプチドの精製を促進する。選択実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、中でも、その多くが市販されているｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、チャッツワース）において提供されるタグである。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグ、「ＨＡ」タグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。Wilson et al., Cell 37: 767, 1984。
【０１３３】
したがって、これらの上記の融合タンパク質のいずれも、本技術のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用して遺伝子操作され得る。また、いくつかの実施形態では、本明細書において記載される融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期の増大を示す。
ジスルフィド結合された二量体構造（ＩｇＧによる）を有する融合タンパク質は、単量体で分泌されるタンパク質またはタンパク質断片単独と比較して、その他の分子に結合および中和することにおいてより有効であり得る。Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995。
【０１３４】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４５３３（カナダ対応物２０４５８６９）には、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質が、別のヒトタンパク質またはその断片と一緒に開示されている。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、療法および診断において有益であり、したがって、例えば、薬物動態特性の改善をもたらし得る。ＥＰ−Ａ０２３２２６２を参照のこと。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、精製された後にＦｃ部分を欠失または修飾することが望まれることもある。例えば、融合タンパク質が免疫処置の抗原として使用される場合には、Ｆｃ部分が、療法および診断を妨げることもある。創薬では、例えば、ｈＩＬ−５などのヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイを目的としてＦｃ部分と融合されている。Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459-9471, 1995。
【０１３５】
標識された抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体。一実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、標識部分、すなわち、検出可能な基とカップリングされている。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体にコンジュゲートされた特定の標識または検出可能な基は、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体のｐｏｌｙＳｉａとの特異的結合を大幅に干渉しない限り、技術の重大な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイおよびイメージングの分野では十分に開発されている。一般に、このような方法において有用なほとんどあらゆる標識が、本技術に適用され得る。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本技術の実施において有用な標識として、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉ、121Ｉ、131Ｉ、112Ｉｎ、99ｍＴｃ）、マイクロバブルなどのその他の造影剤（超音波イメージングのための）、18Ｆ、11Ｃ、15Ｏ（陽電子放射型断層撮影のための）、99mＴＣ、111Ｉｎ（単一光子放出型コンピュータ断層撮影のための）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるその他のもの）およびコロイド金などの熱量測定標識または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。このような標識の使用を記載する特許として、米国特許第３，８１７，８３７号、同３，８５０，７５２号、同３，９３９，３５０号、同３，９９６，３４５号、同４，２７７，４３７号、同４，２７５，１４９号および同４，３６６，２４１号が挙げられ、各々、すべての目的でその全文が参照により本明細書に組み込まれる。またHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.)も参照のこと。
【０１３６】
標識は、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に直接的にまたは間接的にカップリングされている。上記で示されたように、広範な標識が使用されてもよく、標識の選択は、必要な感受性、化合物とのコンジュゲーションの容易さ、安定性必要条件、入手可能な計測手段および廃棄規定などの因子に応じて変わる。
非放射性標識は、間接的な手段によって付着されることが多い。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合によって結合される。次いで、リガンドは、本質的に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合によって結合された抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子と結合する。いくつかのリガンドおよび抗リガンドが使用され得る。リガンドが、中性抗リガンド、例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾールを有する場合には、標識された天然に存在する抗リガンドとともに使用され得る。あるいは、任意のハプテン性または抗原性化合物が、抗体、例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体と組み合わせて使用され得る。
【０１３７】
分子はまた、シグナル生成化合物に直接的に、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲーションによってコンジュゲートされ得る。標識として対象の酵素は、主に、ヒドロラーゼ、特に、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼまたは酸化還元酵素、特に、ペルオキシダーゼとなる。標識部分として有用である蛍光化合物として、それだけには限らないが、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。標識部分として有用である化学発光化合物として、それだけには限らないが、例えば、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。使用され得る、種々の標識またはシグナル生成系の概要については、米国特許第４，３９１，９０４を参照のこと。
【０１３８】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合には、検出のための手段として、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合には、光の適当な波長を用いて蛍光色素を励起することおよび得られた蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などのような電子検出器を使用することによって視覚的に検出され得る。同様に、酵素的標識は、酵素に適当な物質を提供することおよび得られた反応生成物を検出することによって検出され得る。最後に、簡単な比色標識は、標識と関連する色を観察することによって簡単に検出され得る。したがって、種々の尿試験紙アッセイにおいて、コンジュゲートされた金はピンク色に見え、一方で、種々のコンジュゲートされたビーズは、ビーズの色に見える。
いくつかのアッセイ形式は、標識された構成成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、標識抗体、例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合には、抗原によってコーティングされた粒子が、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式では、標識されることを必要とする構成成分はなく、標識抗体の存在は、簡単な目視検査によって検出される。
【０１３９】
Ｂ．本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の同定および特性決定
本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を同定および／またはスクリーニングする方法。ｐｏｌｙＳｉａに対して所望の特異性を有するものについて、ｐｏｌｙＳｉａ種に対する抗体を同定およびスクリーニングするために有用な方法は、当技術分野で公知の任意の免疫学的に媒介される技術を含む。免疫応答の構成成分は、当業者に周知である種々の方法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出され得る。例えば、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球は、放射活性標識された標的細胞とともにインキュベートされ、これらの標的細胞の溶解は、放射活性の放出によって検出され得る、（２）ヘルパーＴリンパ球は、抗原および抗原提示細胞とともにインキュベートされ、サイトカインの合成および分泌は、標準方法によって測定され得る（Windhagen A et al., Immunity, 2: 373-80, 1995）、（３）抗原提示細胞は、全タンパク質抗原とともにインキュベートされ、ＭＨＣ上のその抗原の提示は、Ｔリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法のいずれかによって検出され得る（Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989）、（４）肥満細胞は、そのＦｃ−イプシロン受容体と架橋結合する試薬とともにインキュベートされ、ヒスタミン放出は、酵素イムノアッセイによって測定され得る（Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983）および（５）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。
【０１４０】
同様に、モデル生物（例えば、マウス）またはヒト対象いずれかにおける免疫応答の生成物はまた、当業者に周知である種々の方法によって検出され得る。例えば、（１）ワクチン接種に応じた抗体の製造は、臨床検査室において現在使用される標準方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって容易に検出され得る、（２）免疫細胞の炎症の部位への遊走は、皮膚の表面を引っ掻くことおよび引っ掻き部位にわたって遊走細胞を捕捉するために滅菌容器を置くことによって検出され得る（Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988）、（３）マイトジェンまたは混合リンパ球反応物に応じた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖は、3Ｈ−チミジンを使用して測定され得る、（４）ＰＢＭＣ中の顆粒球、マクロファージおよびその他の貪食細胞の食作用は、ＰＢＭＣを標識された粒子と一緒にウェル中に入れることによって測定され得る（Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988）および（５）免疫系細胞の分化は、ＰＢＭＣをＣＤ４およびＣＤ８などのＣＤ分子に対する抗体を用いて標識することおよびこれらのマーカーを発現するＰＢＭＣの画分を測定することによって測定され得る。
【０１４１】
一実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、複製可能な遺伝子パッケージの表面での高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａのディスプレイを使用して選択される。例えば、米国特許第５，５１４，５４８号、同５，８３７，５００号、同５，８７１，９０７号、同５，８８５，７９３号、同５，９６９，１０８号、同６，２２５，４４７号、同６，２９１，６５０号、同６，４９２，１６０号、ＥＰ５８５２８７、ＥＰ６０５５２２、ＥＰ６１６６４０、ＥＰ１０２４１９１、ＥＰ５８９８７７、ＥＰ７７４５１１、ＥＰ８４４３０６を参照のこと。所望の特異性を有する結合分子をコードするファージミドゲノムを含有する繊維状バクテリオファージ粒子を製造／選択するのに有用な方法は、記載されている。例えば、ＥＰ７７４５１１、ＵＳ５８７１９０７、ＵＳ５９６９１０８、ＵＳ６２２５４４７、ＵＳ６２９１６５０、ＵＳ６４９２１６０を参照のこと。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、酵母宿主細胞の表面上の高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａのディスプレイを使用して選択される。酵母表面ディスプレイによるＦｖポリペプチドの単離に有用な方法は、Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10によって記載されている。
いくつかの実施形態では、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、リボソームディスプレイを使用して選択される。リボソームディスプレイを使用してペプチドライブラリー中でリガンドを同定するのに有用な方法は、Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994およびHanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997によって記載されている。
所望の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の選択後、当業者に公知の任意の技術、例えば、原核細胞または真核細胞発現などによって前記抗体が大容量で製造され得ることが考慮される。例えば、それだけには限らないが、抗ｐｏｌｙＳｉａハイブリッド抗体または断片である抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来技術を使用して製造されてもよく、ＣＤＲおよび必要に応じて、元の種の抗体結合特異性を保持するために必要である可変領域フレームワークの最小部分（本明細書において記載される技術に従って遺伝子操作されるので）が、元の種の抗体に由来し、抗体の残部が、本明細書において記載されるように操作される標的種免疫グロブリンに由来し、それによって、ハイブリッド抗体重鎖の発現のためのベクターが生成する。
【０１４３】
ｐｏｌｙＳｉａ結合の測定。いくつかの実施形態では、ｐｏｌｙＳｉａ結合アッセイとは、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａおよび抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体が、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体間の結合に適した条件下で混合され、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体間の結合の量を評価するアッセイ形式を指す。結合の量は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの非存在下での結合の量、非特異的免疫グロブリン組成物の存在下での結合の量または両方であり得る適した対照と比較される。結合の量は、任意の適した方法によって評価され得る。結合アッセイ法として、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、蛍光エネルギー移動アッセイ、液体クロマトグラフィー、膜濾過アッセイなどが挙げられる。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体との高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ結合の直接測定のための生物物理学的アッセイとして、例えば、核磁気共鳴、蛍光、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥチップ）などがある。特異的結合は、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＲＥＴ、免疫沈降、ＳＰＲ、ＮＭＲ（２Ｄ−ＮＭＲ）、質量分析などによって決定される。候補抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の特異的結合が、候補抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の非存在下で観察される結合よりも少なくとも１パーセント多い場合には、候補抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体として有用である。
ｐｏｌｙＳｉａ中和の測定。本明細書において使用されるように、「ｐｏｌｙＳｉａ中和」とは、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の結合によるｐｏｌｙＳｉａの活性および／もしくは発現の低減またはｐｏｌｙＳｉａ部分を用いて修飾されたタンパク質の活性および／もしくは発現の低減を指す。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の、ｐｏｌｙＳｉａ活性／発現を中和する能力は、当技術分野で公知の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価され得る。
【０１４４】
本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の使用
全般。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、ｐｏｌｙＳｉａの局在性および／または定量化に関する当技術分野で公知の方法において有用である（例えば、適当な生理学的サンプル内の高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａのレベルの測定において使用するため、診断法において使用するため、ポリペプチドのイメージングにおいて使用するためなど）。本技術の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準技術によって高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを単離するために有用である。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、生物学的サンプル、例えば、哺乳動物血清または細胞からの免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ種の精製、ならびに宿主系において発現された組換えによって製造された免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの精製を促進し得る。さらに、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ種（例えば、血漿、細胞溶解物または細胞上清において）を検出して、免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの発現の量およびパターンを評価するために使用され得る。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、臨床試験手順の一部として組織における免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａレベルをモニタリングするために、例えば、所与の治療計画の有効性を判定するために診断的に使用され得る。上記で記載されるように、検出は、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を、検出可能な物質にカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）によって促進され得る。
【０１４５】
ｐｏｌｙＳｉａの検出。生物学的サンプル中の免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの有無を検出するための例示的方法は、試験対象から生物学的サンプルを得ることおよび生物学的サンプルを、免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを検出可能な本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体と接触させ、その結果、生物学的サンプルにおいて免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの存在が検出されることを含む。検出は、抗体に付着された検出可能な標識によって達成され得る。
用語「標識された」は、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体に関して、検出可能な物質を、抗体にカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）による抗体の直接標識ならびに二次抗体などの直接標識される別の化合物との反応性による抗体の間接標識を包含するように意図される。間接標識の例として、蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンを用いて検出され得るようなビオチンを用いるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される抗ｐｏｌｙＳｉａ  抗体は、１つまたは複数の検出可能な標識にコンジュゲートされる。このような使用のために、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、発色性、酵素的、放射性同位元素性、同位元素的、蛍光性、毒性、化学発光性、核磁気共鳴造影剤またはその他の標識の共有結合または非共有結合による付着によって検出可能に標識され得る。
【０１４７】
適した発色性標識の例として、ジアミノベンジジンおよび４−ヒドロキシアゾ−ベンゼン−２−カルボン酸が挙げられる。適した酵素標識の例として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０１４８】
適した放射性同位元素標識の例として、3Ｈ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃｕ、217Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄなどが挙げられる。111Ｉｎは、肝臓による125Ｉまたは131Ｉ標識化ｐｏｌｙＳｉａ結合性抗体の脱ハロゲン化の問題を避けるので、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングが使用される場合には、例示的同位元素である。さらに、この同位元素は、イメージングのためのより好都合なガンマ放射エネルギーを有する（Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)）。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ＤＰＴＡを用いてモノクローナル抗体にカップリングされた111Ｉｎは、非腫瘍性組織、特に、肝臓にはほとんど取り込まれないことを示し、腫瘍局在性の特異性を増強する（Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870(1987)）。適した非放射性同位元素標識の例として、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｔｒおよび56Ｆｅが挙げられる。
【０１４９】
適した蛍光標識の例として、152Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）標識およびフルオレサミン標識が挙げられる。適した毒素標識の例として、ジフテリア毒素、リシンおよびコレラ毒素が挙げられる。
化学発光標識の例として、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識およびエクオリン標識が挙げられる。核磁気共鳴造影剤の例として、重金属核、例えば、Ｇｄ、Ｍｎおよび鉄が挙げられる。
【０１５０】
本技術の検出方法は、生物学的サンプルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを検出するために使用され得る。免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、ラジオイムノアッセイおよび免疫蛍光が挙げられる。さらに、免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの検出のためのｉｎ  ｖｉｖｏ技術は、標識された抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を対象へ導入することを含む。例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、標準イメージング技術によって対象におけるその存在および位置が検出され得る放射活性マーカーを用いて標識されてもよい。一実施形態では、生物学的サンプルは、試験対象から得た高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを含有する。
イムノアッセイおよびイメージング。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、抗体ベース技術を使用して生物学的サンプル（例えば、ヒト血漿）において免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａレベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織における高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ発現が、古典的免疫組織学的方法を用いて研究され得る。Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985, 1985; Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987。ｐｏｌｙＳｉａ発現を検出するのに有用なその他の抗体ベース方法として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。適した抗体アッセイ標識は、当技術分野で公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識および放射性同位元素またはその他の放射活性物質、例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ、131Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）およびテクネチウム（99ｍＴｃ）ならびに蛍光標識、例えば、フルオレセイン、ローダミンおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ならびにビオチンが挙げられる。
【０１５１】
生物学的サンプルにおいて免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａレベルをアッセイすることに加えて、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａのｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに使用され得る。この方法にとって有用な抗体として、Ｘ−Ｘ線撮影、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ−Ｘ線撮影のために、適した標識として、検出可能な放射線を発するが、対象にとって明白に有害ではないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲにとって適したマーカーとして、重水素などの検出可能な特徴的なスピンを有するものが挙げられ、これは、関連ｓｃＦｖ  クローンの栄養分を標識することによって、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体中に組み込まれ得る。
【０１５２】
適当な検出可能なイメージング部分、例えば、放射性同位元素（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99ｍＴｃ）、放射性不透過性物質または核磁気共鳴によって検出可能な材料を用いて標識されている抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体が、対象中に導入される（例えば、非経口的に、皮下にまたは腹膜内に）。対象の大きさおよび使用されるイメージングシステムが、診断画像を作成するのに必要なイメージング部分の量を左右するということは、当技術分野では理解されよう。放射性同位元素部分の場合には、ヒト対象のためには、注入される放射能の量は、普通、約５〜２０ミリキュリーの99ｍＴｃの範囲となる。標識された抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は次いで、特異的標的抗原を含有する細胞の位置に蓄積する。例えば、標識された本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａが局在した細胞および組織において対象内に蓄積する。
【０１５３】
したがって、本技術は、医学的状態の診断方法であって、（ａ）個体の細胞または体液において本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の結合を測定することによって、免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの発現をアッセイすることと、（ｂ）サンプル中に存在する免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの量を、標準参照と比較することとを含み、標準と比較した免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａレベルの増大または減少が、医学的状態を示す方法を提供する。
アフィニティー精製。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａをサンプルから精製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、固相支持体上に固定化されている。このような固相支持体の例として、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースおよびセファロースなどの複合糖質、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズなどのアクリル樹脂が挙げられる。抗体をこのような固相支持体にカップリングする技術は、当技術分野で周知である（Weir et al., “Handbook of Experimental Immunology” 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974)）。
【０１５４】
抗原を抗体−支持体マトリックスに結合させる最も簡単な方法は、カラム中にビーズを集め、抗原溶液をカラムに流すことである。この方法の効率は、固定化抗体と抗原の間の接触時間に応じて変わり、これは低流速を使用することによって延長され得る。固定化抗体は、抗原を、それが流れ過ぎるときに捕捉する。あるいは、抗原は、抗原溶液を支持体（例えば、ビーズ）と混合することおよびスラリーを回転または振盪することによって抗体−支持体マトリックスと接触されてもよく、これによって、抗原と固定化抗体の間の最大接触が可能となる。結合反応が完了した後、ビーズの回収のために、スラリーはカラムに通される。適した洗浄バッファーを使用してビーズが洗浄され、次いで。純粋なまたは実質的に純粋な抗原が溶出される。
【０１５５】
対象の抗体ポリペプチドは、ビーズなどの固相支持体にコンジュゲートされ得る。さらに、第１のビーズなどの固相支持体はまた、必要に応じて、抗体ポリペプチドの支持体とのコンジュゲーションのための本明細書において開示されるものを含む任意の適した手段によって、第２のビーズまたはその他の支持体であり得る第２の固相支持体にコンジュゲートされてもよい。したがって、抗体ポリペプチドの固相支持体とのコンジュゲーションに関して本明細書において開示されるコンジュゲーション方法および手段のいずれも、第１の支持体の第２の支持体とのコンジュゲーションに適用されてもよく、第１および第２の固相支持体は、同一である場合も異なっている場合もある。
【０１５６】
抗体ポリペプチドを固相支持体とコンジュゲートさせるために使用するための架橋結合剤であり得る適当なリンカーとして、支持体の表面上に存在する官能基と、または抗体ポリペプチドとまたは両方と反応し得る種々の物質が挙げられる。架橋結合物質として有用である試薬として、ホモ二機能性、特に、ヘテロ二機能性試薬が挙げられる。有用な二機能性架橋結合物質として、それだけには限らないが、Ｎ−ＳＩＡＢ、ジマレイミド、ＤＴＮＢ、Ｎ−ＳＡＴＡ、Ｎ−ＳＰＤＰ、ＳＭＣＣおよび６−ＨＹＮＩＣが挙げられる。架橋結合物質は、抗体ポリペプチドと固相支持体の間の選択的に切断可能な結合を提供するように選択され得る。例えば、感光性架橋剤、例えば、３−アミノ−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸が、固相支持体から抗体ポリペプチドを切断するための手段として使用され得る（Brown et al., Mol. Divers, pp, 4-12 (1995); Rothschild et al., Nucl. Acids Res., 24:351-66 (1996)および米国特許第５，６４３，７２２号）。その他の架橋結合試薬は当技術分野で周知である（例えば、Wong (1991)、前掲;およびHermanson (1996)、前掲を参照のこと）。
【０１５７】
抗体ポリペプチドは、ビーズなどの固相支持体上に、カルボキシル基官能基付与されたビーズと、抗体ポリペプチドのアミノ末端の間で形成された共有結合アミド結合によって、または逆に、アミノ基官能基付与されたビーズと、抗体ポリペプチドのカルボキシル末端の間で形成された共有結合アミド結合によって固定化され得る。さらに、二機能性トリチルリンカーは、支持体、例えば、Ｗａｎｇ樹脂などの樹脂上の４−ニトロフェニル活性エステルに、アミノ樹脂による樹脂上のアミノ基またはカルボキシル基によって付着され得る。二機能性トリチルアプローチを使用すると、固相支持体は、抗体ポリペプチドが切断され、除去され得ることを確実にするために、ギ酸またはトリフルオロ酢酸などの揮発性酸を用いる処置を必要とし得る。このような場合には、抗体ポリペプチドは、固相支持体のウェルの底に、または固相支持体の平坦な表面上にビーズのないパッチとして堆積されてもよい。マトリックス溶液を加えた後、抗体ポリペプチドはＭＳ中に放出され得る。
【０１５８】
抗体ポリペプチドからアミノ連結されたトリチル基を切断するために、揮発性酸または適当なマトリックス溶液、例えば、３−ＨＰＡを含有するマトリックス溶液を使用することによって、酸不安定性リンカーとして疎水性トリチルリンカーも利用され得る。酸不安定性はまた、変更され得る。例えば、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメトキシトリチルは、抗体ポリペプチドの適当なｐ−置換された、またはより酸不安定性のトリチルアミン誘導体に変更されてもよい、すなわち、トリチルエーテルおよびトリチルアミン結合が抗体ポリペプチドに行われる。したがって、抗体ポリペプチドは、例えば、疎水性引力を破壊することによって、または必要に応じて、３−ＨＰＡなどのマトリックスが酸として作用する通常のＭＳ条件下を含む酸性条件下でトリチルエーテルもしくはトリチルアミン結合を切断することによって、疎水性リンカーから除去され得る。
【０１５９】
直交性に切断可能なリンカーもまた、第１の固相支持体、例えば、ビーズの第２の固相支持体への結合にとって、または対象のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチド）の固相支持体への結合にとって有用であり得る。このようなリンカーを使用すると、第１の固相支持体、例えば、ビーズが第２の固相支持体から、抗体ポリペプチドを支持体から切断することなく選択的に切断され得、次いで、後の時間に抗体ポリペプチドがビーズから切断され得る。例えば、ＤＴＴなどの還元剤を使用して切断され得るジスルフィドリンカーが、ビーズを第２の固相支持体に結合するために使用されてもよく、抗体ポリペプチドを支持体に固定化するために酸切断可能な二機能性トリチル基が使用されてもよい。必要に応じて、例えば、第１および第２の支持体間の連結は無傷なままで、抗体ポリペプチドの固相支持体との連結が、最初に切断され得る。トリチルリンカーは、共有結合または疎水性コンジュゲーションを提供し得るが、コンジュゲーションの性質に関わらず、トリチル基は、酸性条件において容易に切断される。
【０１６０】
例えば、ビーズは、ビーズの固相支持体との高密度結合、またはポリペプチドのビーズとの高密度結合が促進されるような、長さおよび科学的性質を有するように選択され得る連結基によって第２の支持体に結合され得る。このような連結基は、例えば、「ツリー状」構造を有し、それによって、固相支持体上の付着部位あたりに多様な官能基を提供し得る。このような連結基の例として、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ペンタエリスロールおよびトリス−ヒドロキシ−アミノメタンが挙げられる。
非共有結合関連。非共有結合相互作用によって、抗体ポリペプチドは、固相支持体にコンジュゲートされ得る、または第１の固相支持体はまた、第２の固相支持体にコンジュゲートされ得る。例えば、磁化されることが可能である強磁性材料で作製された磁性ビーズは、磁性固相支持体に引き寄せられ得る、また磁場の除去によって支持体から放出され得る。あるいは、固相支持体は、イオン性または疎水性部分を提供されてもよく、これは、それぞれ、イオン性または疎水性部分の、抗体ポリペプチド、例えば、付着されたトリチル基を含有する抗体ポリペプチドとの、または疎水性を有する第２の固相支持体との相互作用を可能にし得る。
【０１６１】
固相支持体はまた、特異的結合対のメンバーを提供されてもよく、したがって、相補性結合部分を含有する抗体ポリペプチドまたは第２の固相支持体にコンジュゲートされ得る。例えば、アビジンでまたはストレプトアビジンでコーティングされたビーズは、ビオチン部分が組み込まれた抗体ポリペプチドに、またはビオチンもしくはビオチンの誘導体、例えば、イミノビオチンでコーティングされた第２の固相支持体に結合され得る。
本明細書において開示される、そうでなければ当技術分野で公知の結合メンバーのいずれも逆転されてもよいということは理解されなくてはならない。したがって、ビオチンは、例えば、抗体ポリペプチドまたは固相支持体のいずれかに組み込まれてもよく、逆に、アビジンまたはその他のビオチン結合部分がそれぞれ支持体または抗体ポリペプチドに組み込まれる。本明細書において使用するために考慮されるその他の特異的結合対として、それだけには限らないが、ホルモンおよびその受容体、酵素およびその基質、ヌクレオチド配列およびその相補性配列、抗体および特異的に相互作用する抗原および当業者に公知のその他のこのような対が挙げられる。
【０１６２】
Ａ．本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の診断的使用
全般。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、診断方法において有用である。そのようなものとして、本技術は、対象における高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ活性の診断において抗体を使用する方法を提供する。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、任意のレベルのエピトープ結合特異性および高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａに対する極めて高い結合親和性を有するように選択され得る。一般に、イムノアッセイでは標的抗原を除去することなく非特異的に結合した材料を除去するために、抗体の結合親和性が高いほどよりストリンジェントな洗浄条件が実施され得る。したがって、診断アッセイにおいて有用な本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、普通、約１０8Ｍ-1、１０9Ｍ-1、１０10Ｍ-1、１０11Ｍ-1または１０12Ｍ-1の結合親和性を有する。さらに、診断試薬として使用される抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、少なくとも１２時間、少なくとも５（５）時間または少なくとも１（１）時間で標準条件下で平衡に達するための十分な動力学的結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）を有することが望ましい。
【０１６３】
抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、種々の標準アッセイ形式で免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを検出するために使用され得る。このような形式として、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイおよび免疫測定アッセイが挙げられる。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)、米国特許第３，７９１，９３２号、同３，８３９，１５３号、同３，８５０，７５２号、同３，８７９，２６２号、同４，０３４，０７４号、同３，７９１，９３２号、同３，８１７，８３７号、同３，８３９，１５３号、同３，８５０，７５２号、同３，８５０，５７８号、同３，８５３，９８７号、同３，８６７，５１７号、同３，８７９，２６２号、同３，９０１，６５４号、同３，９３５，０７４号、同３，９８４，５３３号、同３，９９６，３４５号、同４，０３４，０７４号および同４，０９８，８７６号を参照のこと。生物学的サンプルは、対象の任意の組織または体液から得ることができる。特定の実施形態では、対象は、前記がんの初期段階である。一実施形態では、癌の初期段階は、対象から得られたサンプルにおける高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａのレベルまたは発現パターンによって決定される。特定の実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、脳脊髄液（ＣＳＦ）および生検された身体組織からなる群から選択される。
【０１６４】
免疫測定またはサンドイッチアッセイは、本技術の診断方法のための１つの形式である。米国特許第４，３７６，１１０号、同４，４８６，５３０号、同５，９１４，２４１号および同５，９６５，３７５号を参照のこと。このようなアッセイは、１種の抗体、例えば、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体または固相に固定化された抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の集団および別の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体または溶液中の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の集団を使用する。通常、溶液抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体または抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の集団は標識される。抗体集団が使用される場合には、集団は、異なる重合度を有するｐｏｌｙＳｉａと結合する抗体を含有し得る。したがって、固相および溶液抗体の両方に同一集団が使用され得る。抗ｐｏｌｙＳｉａモノクローナル抗体が使用される場合には、固体および溶液相に対して、異なる結合特異性を有する第１および第２のｐｏｌｙＳｉａモノクローナル抗体が使用される。固相（「捕捉」とも呼ばれる）および溶液（「検出」とも呼ばれる）抗体は標的抗原と、いずれかの順序でまたは同時に接触され得る。固相抗体が第１に接触される場合には、アッセイは、フォワードアッセイであると呼ばれる。逆に、溶液抗体が第１に接触される場合には、アッセイは、リバースアッセイであると呼ばれる。標的が両抗体に同時に接触される場合には、アッセイは、同時アッセイと呼ばれる。ｐｏｌｙＳｉａを、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体と接触させた後、サンプルは、普通、約１０分〜約２４時間で変わる期間、普通、約１時間である期間の間インキュベートされる。次いで、洗浄ステップが実施されて、診断試薬として使用されている抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体に特異的に結合していないサンプルの構成成分が除去される。固相および溶液抗体が別個のステップで結合される場合には、洗浄は、いずれかまたは両方の結合ステップの後に実施されてもよい。洗浄後、結合は、通常、標識された溶液抗体の結合によって固相に連結された標識を検出することによって定量化される。普通、抗体または抗体の集団の所与の対および所与の反応条件について、既知濃度の標的抗原を含有するサンプルから較正曲線が準備される。試験されているサンプル中の免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの濃度が次いで、較正曲線（すなわち、標準曲線）からの補間から読み取られる。解析物は、平衡で結合した標識された溶液抗体の量から、または平衡が到達される前の一連の時点での結合した標識された溶液抗体の動力学的測定によって測定され得る。このような曲線の傾斜は、サンプル中の高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの濃度の尺度である。
【０１６５】
上記の方法において使用するための適した支持体として、例えば、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレンおよび誘導体化ナイロンメンブレンならびにまたアガロースなどの粒子、デキストランベースゲル、尿試験紙、微粒子、ミクロスフェア、磁性粒子、試験管、マイクロタイターウェル、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）などが挙げられる。固定化は、吸収によってでも、共有結合的付着によってでもよい。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体が、アビジンなどの表面に結合されたリンカーへの付着のためにビオチンなどのリンカー分子につながれてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、診断薬にコンジュゲートされた本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を提供する。診断薬は、放射性または非放射性標識、造影剤（例えば、磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影法または超音波のため）を含む場合があり、放射性標識は、ガンマ−、ベータ−、アルファ−、オージェ電子−、または陽電子−放射性同位元素であり得る。診断薬は、抗体部分、すなわち、抗体または抗体断片または部分断片にコンジュゲートされて投与される分子であり、抗原を含有する細胞の位置を決定することによって疾患の診断または検出において有用である。
【０１６６】
有用な診断薬として、それだけには限らないが、放射性同位元素、色素（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を用いる）、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられる。米国特許第６，３３１，１７５号には、ＭＲＩ技術およびＭＲＩ増強剤にコンジュゲートされた抗体の調製が記載されており、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、診断薬は、放射性同位元素、磁気共鳴イメージングにおいて使用するための増強剤および蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを負荷するために、それを、イオンを結合するために複数のキレート基が付着される長いテールを有する試薬と反応させることが必要である場合がある。このようなテールは、ポリリジン、多糖またはキレート基、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスーチオセミカルバゾン、ポリオキシムおよびこの目的のために有用であることがわかっている同様の基などが結合され得るペンダント基を有する、その他の誘導体化されたもしくは誘導体化可能な鎖などのポリマーであり得る。キレートは、標準化学を使用して本技術の抗体にカップリングされ得る。キレートは、普通、免疫反応性の最小の喪失および最小の凝集および／または内部架橋で分子との結合の形成を可能にする基によって抗体に連結される。キレートを抗体とコンジュゲートするためのその他の方法および試薬は、米国特許第４，８２４，６５９号に開示されている。特に有用な金属−キレートの組合せは、放射性イメージングのために診断用同位元素とともに使用される、２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む。同一キレートは、マンガン、鉄およびガドリニウムなどの非放射性金属と複合体形成されると、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体とともに使用される場合にＭＲＩにとって有用である。
【０１６７】
大環状キレート、例えば、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）は、さまざまな金属および放射性金属、例えば、それぞれ、ガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種とともに使用するためのものである。このような金属キレート複合体は、環の大きさを対象の金属に合わせることによって安定化され得る。その他のＤＯＴＡキレートの例として、（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2；（ｉｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｉｖ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｖ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｖｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｖｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ2；（ｉｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ2；（ｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ2；（ｘｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2；（ｘｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2；（ｘｉｉｉ）（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ2；（ｘｉｖ）Ｔｓｃｇ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｘｖ）（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｘｖｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｃｙｓ−ＮＨ2；（ｘｖｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ2；（ｘｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2；および（ｘｉｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2が挙げられる。
ＲＡＩＴのための223Ｒａなどの核種を安定に結合するために対象である大環状ポリエーテルなどのその他の環型キレートも考慮される。
【０１６８】
Ｂ．本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の治療的使用
本技術の免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌の処置にとって有用である。このような処置は、病的に高レベルの高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを有すると同定された患者（例えば、本明細書において記載される方法によって診断されたもの）において、またはこのような病的レベルと関連するとわかっている疾患を有すると診断された患者において使用され得る。一態様では、本開示は、それを必要とする対象においてｐｏｌｙＳｉａ関連癌を処置する方法であって、対象に、本技術の抗体（またはその抗原結合断片）の有効量を投与することを含む方法を提供する。本技術の抗体によって処置され得る癌の例として、それだけには限らないが、小細胞または非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、下垂体腫瘍、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、乳癌または急性骨髄性白血病が挙げられる。
【０１６９】
本技術の組成物は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌の処置において有用なその他の治療薬とともに使用され得る。例えば、本技術の抗体は、アルキル化剤、白金剤、タキサン、ビンカ剤、抗エストロゲン薬、アロマターゼ阻害剤、卵巣抑制剤、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、細胞分裂停止性アルカロイド、細胞傷害性抗生物質、代謝拮抗剤、内分泌／ホルモン剤、ビスホスホネート療法剤およびターゲッティングされる生物学的療法剤（例えば、ＵＳ６３０６８３２、ＷＯ２０１２００７１３７、ＷＯ２００５０００８８９、ＷＯ２０１００９６６０３などに記載される治療用ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１種のさらなる治療薬と、別個に、逐次または同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のさらなる治療薬は、化学療法薬である。特定の化学療法薬として、それだけには限らないが、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、エダトレキサート（１０−エチル−１０−デアザ−アミノプテリン）、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質が結合されたパクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾルミド（ｔｅｍｏｚｏｌｍｉｄｅ）、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン（ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、リュープロリド、アバレリックス、ブセルリン（ｂｕｓｅｒｌｉｎ）、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、ベバシズマブ、オキサリプラチン、メルファラン、エトポシド、メクロレタミン、ブレオマイシン、微小管毒、バンレイシ科のアセトゲニンまたはそれらの組合せが挙げられる。
本技術の組成物は、単回ボーラスとしてそれを必要とする対象に投与されてもよい。あるいは、投薬計画は、腫瘍の出現後種々の時間で実施される複数回投与を含んでもよい。
投与は、経口で、鼻腔内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、腹膜内にまたは皮下に）、直腸性に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、または局所的にを含む任意の適した経路で実施され得る。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。記載されるような医学的状態の処置の種々の様式は、完全な処置だけでなく、完全未満の処置も含み、いくつかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味するものとすることも理解されたい。
いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、１回または複数回用量でそれを必要とする対象に投与され得る医薬製剤を含む。投与計画は、所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整され得る。
【０１７０】
通常、治療効果を達成するのに十分な本技術の抗体組成物の有効量は、約  ０．０００００１ｍｇ／体重１キログラム／日〜約１０，０００ｍｇ／体重１キログラム／日の範囲である。通常、投与量範囲は、約０．０００１ｍｇ／体重１キログラム／日〜約１００ｍｇ／体重１キログラム／日である。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の投与については、投与量は、対象の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より普通は、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ毎週、２週毎または３週毎の範囲である。例えば、投与量は、１ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇ毎週、２週毎もしくは３週毎または１〜１０ｍｇ／ｋｇ毎週、２週毎もしくは３週毎の範囲内であり得る。一実施形態では、抗体の単回投与量は、０．１〜１０，０００マイクログラム／体重１ｋｇの範囲である。一実施形態では、担体中の抗体濃度は、送達されるミリリットルあたり０．２〜２０００マイクログラムの範囲である。例示的処置投与計画は、２週に１回または１カ月に１回または３〜６カ月毎に１回の投与を伴う。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、複数回投与され得る。単回投与量の間の間隔は、毎時、毎日、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔は、対象における抗体の血液レベルを測定することによって示されるので、不定期である場合もある。いくつかの方法では、投与量は、約７５μｇ／ｍＬ〜約１２５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ〜約１５０μｇ／ｍＬ、約１２５μｇ／ｍＬ〜約１７５μｇ／ｍＬまたは約１５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬの対象における血清抗体濃度を達成するように調整される。あるいは、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、徐放製剤として投与されることがあり、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、対象における抗体の半減期に応じて変わる。投与の投与量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて変わる。予防的適用では、比較的低い投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。治療的適用では、疾患の進行が低減もしくは終結されるまで、または対象が、疾患の症状の部分的もしくは完全寛解を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投与量が時には必要とされる。その後、患者は、予防的投与計画を投与され得る。
別の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象において腫瘍を検出する方法であって、（ａ）対象に本技術の抗体（またはその抗原結合断片）の有効量を投与することであって、抗体は、ｐｏｌｙＳｉａを発現する腫瘍に局在するように構成されており、放射性同位元素を用いて標識されていることと、（ｂ）参照値よりも高い抗体によって放射された放射性レベルを検出することによって、対象における腫瘍の存在を検出することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、参照値は、１グラムあたりの注入された用量（％ＩＤ／ｇ）として表される。参照値は、非腫瘍（正常）組織中に存在する放射性レベルを測定することおよび非腫瘍（正常）組織中に存在する平均放射性レベル±標準偏差をコンピュータによって計算することによって算出され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍および正常組織間の放射性レベルの比は、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１または１００：１である。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、対象は、癌を有すると診断されている、または癌を有すると疑われている。抗体によって放射される放射性レベルは、陽電子放射型断層撮影または単一光子放出型コンピュータ断層撮影を使用して検出され得る。
【０１７２】
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、方法は、対象に、放射性核種にコンジュゲートされた本技術の抗体を含むイムノコンジュゲートの有効量を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、放射性核種は、アルファ粒子放射性同位元素、ベータ粒子放射性同位元素、オージェ放射体またはそれらの任意の組合せである。ベータ粒子放射性同位元素の例として、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、165Ｄｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、177Ｌｕおよび67Ｃｕが挙げられる。アルファ粒子放射性同位元素の例として、213Ｂｉ、211Ａｔ、225Ａｃ、152Ｄｙ、212Ｂｉ、223Ｒａ、219Ｒｎ、215Ｐｏ、211Ｂｉ、221Ｆｒ、217Ａｔおよび255Ｆｍが挙げられる。オージェ放射体の例として、111Ｉｎ、67Ｇａ、51Ｃｒ、58Ｃｏ、99mＴｃ、103mＲｈ、195mＰｔ、119Ｓｂ、161Ｈｏ、189mＯｓ、192Ｉｒ、201Ｔｌおよび203Ｐｂが挙げられる。方法のいくつかの実施形態では、正常組織における非特異的ＦｃＲ依存性結合が排除または低減される（例えば、非グリコシル化をもたらすＦｃ領域におけるＮ２９７Ａ突然変異によって）。このようなイムノコンジュゲートの治療有効性は、曲線下面積（ＡＵＣ）腫瘍：ＡＵＣ正常組織比をコンピュータによって計算することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１または１００：１のＡＵＣ腫瘍：ＡＵＣ正常組織比を有する。
【０１７３】
ＰＲＩＴ。一態様では、本開示は、それを必要とする対象において固形腫瘍を検出する方法であって、（ａ）対象に、放射性標識ＤＯＴＡハプテンならびに放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原と結合する本技術の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が、複合体の二重特異性抗体によって認識される高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原を発現する固形腫瘍に局在するように構成されていることと、（ｂ）参照値よりも高い複合体によって放射された放射性レベルを検出することによって、対象において固形腫瘍の存在を検出することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【０１７４】
別の態様では、本開示は、プレターゲッティングされる放射免疫治療のために対象を選択する方法であって、（ａ）対象に、放射性標識ＤＯＴＡハプテンならびに放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原と結合する本技術の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が、複合体の二重特異性抗体によって認識される高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原を発現する固形腫瘍に局在するように構成されていることと、（ｂ）複合体によって放射された放射性レベルを検出することと、（ｃ）複合体によって放射された放射性レベルが、参照値よりも高い場合に、プレターゲッティングされる放射免疫治療のために対象を選択することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【０１７５】
ＤＯＴＡハプテンの例として、（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2；（ｉｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｉｖ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｖ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｖｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｖｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ2；（ｉｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ2；（ｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ2；（ｘｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2；（ｘｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2；（ｘｉｉｉ）（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ2；（ｘｉｖ）Ｔｓｃｇ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｘｖ）（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2；（ｘｖｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｃｙｓ−ＮＨ2；（ｘｖｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ2；（ｘｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2；（ｘｉｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2および（ｘｘ）ＤＯＴＡが挙げられる。放射性標識は、アルファ粒子放射性同位元素、ベータ粒子放射性同位元素またはオージェ放射体であり得る。放射性標識の例として、213Ｂｉ、211Ａｔ、225Ａｃ、152Ｄｙ、212Ｂｉ、223Ｒａ、219Ｒｎ、215Ｐｏ、211Ｂｉ、221Ｆｒ、217Ａｔ、255Ｆｍ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、165Ｄｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、177Ｌｕ、67Ｃｕ、111Ｉｎ、67Ｇａ、51Ｃｒ、58Ｃｏ、99mＴｃ、103mＲｈ、195mＰｔ、119Ｓｂ、161Ｈｏ、189mＯｓ、192Ｉｒ、201Ｔｌ、203Ｐｂ、68Ｇａ、227Ｔｈまたは64Ｃｕが挙げられる。
【０１７６】
本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、複合体によって放射される放射性レベルは、陽電子放射型断層撮影または単一光子放出型コンピュータ断層撮影を使用して検出される。さらにまたはあるいは、本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、対象は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌、例えば、小細胞または非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、下垂体腫瘍、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、乳癌または急性骨髄性白血病を有すると診断されている、またはそれを有すると疑われている。
【０１７７】
さらにまたはあるいは、本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、複合体は、静脈内に、筋肉内に、動脈内に、くも膜下腔内に、関節内に、眼窩内に、皮内に、腹膜内に、経気管的に、皮下に、脳室内に、経口的に、または鼻腔内に投与される。特定の実施形態では、複合体は、対象の脳脊髄液または血液中に投与される。
【０１７８】
本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、複合体によって放射される放射性レベルは、複合体が投与された２〜１２０時間の間の後に検出される。本明細書において開示される方法の特定の実施形態では、複合体によって放射される放射性レベルは、１グラム組織あたりの注入された用量パーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表される。参照値は、非腫瘍（正常）組織中に存在する放射性レベルを測定することおよび非腫瘍（正常）組織中に存在する平均放射性レベル±標準偏差をコンピュータによって計算することによって算出され得る。いくつかの実施形態では、参照値は、標準取り込み値（ＳＵＶ）である。Thie JA, J Nucl Med. 45(9):1431-4(2004)を参照のこと。いくつかの実施形態では、腫瘍および正常組織間の放射性レベルの比は、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１または１００：１である。
【０１７９】
別の態様では、本開示は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌を有すると診断された対象において放射線療法に対する腫瘍感受性を増大させる方法であって、（ａ）対象に、本技術の抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の有効量を投与することであって、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体は、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを発現する腫瘍に局在するように構成されることと、（ｂ）対象に、放射性標識ＤＯＴＡハプテンの有効量を投与することであって、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体と結合するように構成されることとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体は、腫瘍細胞を飽和するのに十分な条件下で、期間の間、投与される（例えば、投薬計画に従って）。いくつかの実施形態では、結合していない抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体は、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与後に血流から除去される。いくつかの実施形態では、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、結合していない抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体のクリアランスを可能にするのに十分であり得る期間の後に投与される。
【０１８０】
放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与後に１分〜４またはそれより多い日数の間任意の回数で投与され得る。例えば、いくつかの実施形態では、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与後、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、１．２５時間、１．５時間、１．７５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間またはその中の任意の範囲で投与される。あるいは、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与後、４またはそれより多い日数の後に任意の回数で投与され得る。
【０１８１】
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、方法は、放射性標識ＤＯＴＡハプテンの投与前に対象に清澄剤の有効量を投与することをさらに含む。清澄剤は、Ｃ８２５−ハプテンとコンジュゲートされ得る任意の分子（デキストランまたはデンドリマーまたはポリマー）であり得る。いくつかの実施形態では、清澄剤は、２０００ｋＤ、１５００ｋＤ、１０００ｋＤ、９００ｋＤ、８００ｋＤ、７００ｋＤ、６００ｋＤ、５００ｋＤ、４００ｋＤ、３００ｋＤ、２００ｋＤ、１００ｋＤ、９０ｋＤ、８０ｋＤ、７０ｋＤ、６０ｋＤ、５０ｋＤ、４０ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋＤ、１０ｋＤまたは５ｋＤ以下である。いくつかの実施形態では、清澄剤は、５００ｋＤアミノデキストラン−ＤＯＴＡコンジュゲート（例えば、５００ｋＤデキストラン−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（Ｙ）、５００ｋＤデキストラン−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（Ｌｕ）または５００ｋＤデキストラン−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（Ｉｎ）など）である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、清澄剤および放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、本技術の抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体のさらなる投与を伴わずに投与される。例えば、いくつかの実施形態では、本技術の抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体は、（ｉ）本技術の抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与（その結果、関連腫瘍細胞が飽和されてもよい）、（ｉｉ）放射性標識ＤＯＴＡハプテンの投与および任意に清澄剤、（ｉｉｉ）抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体のさらなる投与を伴わない、放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび／または清澄剤の任意のさらなる投与のうち少なくとも１つのサイクルを含むレジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、方法は、複数のこのようなサイクル（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いサイクル）を含み得る。
【０１８３】
さらにまたはあるいは、方法のいくつかの実施形態では、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体および／または放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、静脈内に、筋肉内に、動脈内に、くも膜下腔内に、関節内に、眼窩内に、皮内に、腹膜内に、経気管的に、皮下に、脳室内に、経口的に、または鼻腔内に投与される。
一態様では、本開示は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌を有すると診断された対象において放射線療法に対する腫瘍感受性を増大させる方法であって、対象に、放射性標識ＤＯＴＡハプテンならびに放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を認識し、結合する本技術の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が複合体の二重特異性抗体によって認識される高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を発現する腫瘍に局在するように構成されていることを含む方法を提供する。複合体は、静脈内に、筋肉内に、動脈内に、くも膜下腔内に、関節内に、眼窩内に、皮内に、腹膜内に、経気管的に、皮下に、脳室内に、経口的に、または鼻腔内に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【０１８４】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、（ａ）対象に本技術の抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の有効量を投与することであって、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体が高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を発現する腫瘍に局在するように構成されることと、（ｂ）対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンの有効量を投与することであって、放射性標識ＤＯＴＡハプテンが、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体と結合するように構成されることとを含む方法を提供する。抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体は、腫瘍細胞を飽和するのに十分な条件下で、期間の間、投与される（例えば、投薬計画に従って）。いくつかの実施形態では、結合していない抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体は、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与後に血流から除去される。いくつかの実施形態では、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、結合していない抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体のクリアランスを可能にするのに十分であり得る期間の後に投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【０１８５】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、放射性標識ＤＯＴＡハプテンの投与の前に対象に清澄剤の有効量を投与することをさらに含む。放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与後１分〜４またはそれより多い日数の間に任意の回数で投与され得る。例えば、いくつかの実施形態では、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与後、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、１．２５時間、１．５時間、１．７５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間またはその中の任意の範囲で投与される。あるいは、放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与後、４またはそれより多い日数の後に任意の回数で投与され得る。
【０１８６】
清澄剤は、５００ｋＤアミノデキストラン−ＤＯＴＡコンジュゲート（例えば、５００ｋＤデキストラン−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（Ｙ）、５００ｋＤデキストラン−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（Ｌｕ）または５００ｋＤデキストラン−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（Ｉｎ）など）であり得る。いくつかの実施形態では、清澄剤および放射性標識ＤＯＴＡハプテンは、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体のさらなる投与を伴わずに投与される。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体は、（ｉ）本技術の抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体の投与（その結果、関連腫瘍細胞が飽和されてもよい）、（ｉｉ）放射性標識ＤＯＴＡハプテンの投与および任意に清澄剤、（ｉｉｉ）抗ＤＯＴＡ二重特異性抗体のさらなる投与を伴わない、放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび／または清澄剤の任意のさらなる投与のうち少なくとも１つのサイクルを含むレジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、方法は、複数のこのようなサイクル（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いサイクル）を含み得る。
【０１８７】
また、それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、対象に放射性標識ＤＯＴＡハプテンならびに放射性標識ＤＯＴＡハプテンおよび高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を認識および結合する本技術の二重特異性抗体を含む複合体の有効量を投与することであって、複合体が複合体の二重特異性抗体によって認識される高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ抗原標的を発現する腫瘍に局在するように構成されていることを含む方法が本明細書において提供される。このような複合体の治療有効性は、曲線下面積（ＡＵＣ）腫瘍：ＡＵＣ正常組織比をコンピュータによって計算することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、複合体は、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１または１００：１のＡＵＣ腫瘍：ＡＵＣ正常組織比を有する。
【０１８８】
毒性。最適には、本明細書において記載される抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の有効量（例えば、用量）は、対象に実質的な毒性を引き起こすことなく治療的利益を提供する。本明細書において記載される抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の毒性は、細胞培養または実験動物における標準製薬手順によって、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対する致死用量）またはＬＤ100（集団の１００％に対する致死用量）を決定することによって決定され得る。毒性および治療効果の間の用量比が治療係数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータが、ヒトにおいて使用するための毒性ではない投与量範囲の策定において使用され得る。本明細書において記載される抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の投与量は、毒性がほとんどまたは全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形および利用される投与経路に従ってこの範囲内で変わり得る。正確な処方、投与経路、および投与量は、対象の状態を鑑みて個々の医師によって選択され得る。例えば、Fingl et al., In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 (1975)を参照のこと。
【０１８９】
医薬組成物の製剤化。本技術の方法に従って、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。医薬組成物は、一般に、組換えまたは実質的に精製された抗体および医薬上許容される担体を、対象への投与に適した形態で含む。医薬上許容される担体は、投与される個々の組成物の一部において、ならびに組成物を投与するために使用される個々の方法によって決定される。したがって、抗体組成物を投与するための医薬組成物のさまざまな適した製剤化がある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990を参照のこと）。医薬組成物は、一般に、無菌で、実質的に等張性として、米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全準拠して製剤化される。
【０１９０】
用語「医薬上許容される」、「生理学的に許容される」およびそれらの文法的変形は、それらが、組成物、担体、希釈剤および試薬を指す場合、同義的に使用され、材料が組成物の投与を妨げる程度に、望ましくない生理学的効果をもたらすことなく、対象に投与可能であることを表す。例えば、「医薬上許容される賦形剤」とは、一般に、安全な、非毒性の、望ましい医薬組成物の調製において有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用に、ならびにヒト医薬的使用に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合には気体であり得る。「医薬上許容される塩およびエステル」とは、医薬上許容される、所望の薬理学的特性を有する塩およびエステルを意味する。このような塩として、組成物中に存在する酸性プロトンが、無機または有機塩基と反応可能である場合に形成され得る塩が挙げられる。適した無機塩として、アルカリ金属、例えば、ナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアルミニウムと形成されたものが挙げられる。適した有機塩として、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどといった有機塩基と形成されたものが挙げられる。このような塩としてまた、無機酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸およびアルカン−およびアレン−スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸）と形成された酸付加塩が挙げられる。医薬上許容されるエステルとして、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシおよびホスホンオキシ基から形成されたエステル、例えば、Ｃ1-6  アルキルエステルが挙げられる。２つの酸性基が存在する場合には、医薬上許容される塩またはエステルは、モノ−酸−モノ−塩またはエステルまたはジ−塩またはエステルである場合があり、同様に、２つ以上の酸性基が存在する場合には、このような基のうちいくつかまたはすべてが塩化またはエステル化され得る。この技術において名付けられた抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、非塩化もしくは非エステル化形態で、または塩化および／もしくはエステル化形態で存在する可能性があり、このような抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の命名は、元の（非塩化および非エステル化）化合物およびその医薬上許容される塩およびエステルの両方を含むように意図される。また、本技術の特定の実施形態は、２つ以上の立体異性形で存在する可能性があり、このような抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の命名は、このような立体異性体のすべての単一立体異性体およびすべての混合物（ラセミか否かに関わらず）を含むように意図される。当業者ならば、特定の薬物および本技術の組成物の投与の適当なタイミング、順序および投与量を決定するのに困難はないであろう。
【０１９１】
このような担体または希釈剤の例として、それだけには限らないが、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび硬化油などの非水性ビヒクルも使用され得る。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および化合物の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来媒体または化合物が、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が考慮される。補足的活性化合物も組成物中に組み込まれる。
【０１９２】
本技術の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体組成物は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内経路によって、または吸入剤として投与され得る。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、種々のｐｏｌｙＳｉａ関連癌の処置において少なくとも部分的に有効であるその他の物質と組み合わせて投与されてもよい。
非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液として、以下の構成成分を挙げることができる：注射水、生理食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化化合物、酢酸、クエン酸またはリン酸などのバッファーおよび塩化ナトリウムまたはデキストロースなおの張力の調整のための化合物。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数可用量バイアルに封入され得る。
【０１９３】
注射用使用に適した医薬組成物として、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。静脈内投与のために、適した担体として、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州、パーシッパニー）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、無菌でなくてはならず、容易な注射性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなくてはならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張性化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物中に吸収を遅延する化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち１種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量で組み込むことと、それに続く、濾過滅菌によって調製され得る。一般に、分散物は、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製する方法は、事前に滅菌濾過されたその溶液から、有効成分および任意のさらなる所望の成分の散剤が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。本技術の抗体は、有効成分の持続性または拍動性放出を可能にするような方法で製剤化され得る、デポー注射液または留置調製物の形態で投与され得る。
【０１９４】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入されてもよく、錠剤に打錠されてもよい。経口治療的投与目的で、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用されてもよい。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するために流体担体を使用して調製されてもよく、流体担体中の化合物は経口的に適用され、素早く動かされ（ｓｗｉｓｈ）、吐出されるか飲み込まれる。医薬上適合する結合化合物および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または同様の性質の化合物のうちいずれも含有し得る：微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチなどの崩壊化合物、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味化合物またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーなどの矯味化合物。
吸入による投与のために、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。
【０１９５】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与のために、製剤中で浸透されるべき障壁に適当な浸透剤が使用される。このような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のための、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のためには、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、当技術分野で一般に知られるような、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリーム中に製剤化される。
抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体はまた、坐剤（例えば、ココアバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または直腸送達のための保留浣腸の形態で医薬組成物として調製され得る。
【０１９６】
一実施形態では、抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤などの抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を身体からの迅速な排出から保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかとなろう。材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃから商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、医薬上許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような方法に従って調製され得る。
【０１９７】
Ｃ．キット
本技術は、ｐｏｌｙＳｉａ関連癌の検出および／または処置のためのキットであって、本技術の少なくとも１種の免疫グロブリン関連組成物（例えば、本明細書に記載される任意の抗体または抗原結合断片）またはその機能的バリアント（例えば、置換バリアント）を含むキットを提供する。本技術のキットの上記の構成成分は、がんを伴うｐｏｌｙＳｉａの診断および／または処置のために、適した容器に詰められ、ラベルが付けられてもよい。上記の構成成分は、水性の、好ましくは、無菌の溶液として、または復元のための凍結乾燥された、好ましくは、無菌の製剤として、単位または複数回用量容器、例えば、密閉されたアンプル、バイアル、ボトル、シリンジおよび試験管中で貯蔵され得る。キットは、医薬組成物をより大きな容量にするために希釈するのに適した希釈剤を保持する第２の容器をさらに含み得る。適した希釈剤として、それだけには限らないが、医薬組成物の医薬上許容される賦形剤および生理食塩水溶液が挙げられる。さらに、キットは、医薬組成物を希釈するための説明書および／または希釈されるか否かに関わらず、医薬組成物を投与するための説明書を含み得る。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてもよく、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺され得るストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液などの医薬上許容されるバッファーを含むより多くの容器をさらに含み得る。その他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、適した宿主のうち１種または複数のための培養培地を含む、商業的およびユーザー観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。キットは、治療薬または診断薬の市販のパッケージ中に習慣的に含まれる説明書を含んでもよく、これは、このような治療薬または診断薬の、例えば、適応症、用法、投与量、製造、投与、禁忌症に関する情報および／または使用に関わる警告を含有する。
【０１９８】
キットは、生物学的サンプル、例えば、それだけには限らないが、例えば、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水または血液を含む、および身体組織の生検サンプルを含む任意の体液における免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの存在を検出するのに有用である。例えば、キットは、生物学的サンプル中の高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合可能な１種または複数の本技術のヒト化、キメラまたは二重特異性抗ｐｏｌｙＳｉａ  抗体（またはその抗原結合断片）、サンプル中の高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの量を決定する手段およびサンプル中の免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの量を標準と比較する手段を含み得る。抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の１種または複数は標識され得る。キット構成成分（例えば、試薬）は、適した容器中に詰められ得る。キットは、免疫反応性高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａを検出するためのキットを使用するための説明書をさらに含み得る。
抗体ベースのキットについては、キットは、例えば、１）第１の抗体、例えば、高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａと結合する、固相支持体に付着された、本技術のヒト化、キメラまたは二重特異性抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体（またはその抗原結合断片）と、任意に、２）高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａまたは第１の抗体のいずれかと結合し、検出可能な標識にコンジュゲートされている第２の異なる抗体とを含み得る。
キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質安定化剤を含み得る。キットは、検出可能な標識を検出するのに必要な構成成分、例えば、酵素または基質をさらに含み得る。キットはまた、アッセイされ、試験サンプルと比較され得る、対照サンプルまたは一連の対照サンプルを含有し得る。キットの各成分は、個々の容器内に封入されてもよく、種々の容器のすべては、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための説明書とともに単一パッケージ内にあり得る。本技術のキットは、キット容器上または中に書面の製品を含有し得る。書面の製品には、それを必要とする対象におけるがんを伴うｐｏｌｙＳｉａの処置のための、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａの検出のための、キット中に含有される試薬の使用方法が記載されている。特定の実施形態では、試薬の使用は、本技術の方法に従い得る。
【実施例】
【０１９９】
本技術は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは決して制限と解釈されてはならない。以下の実施例は、本技術の例示的抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の調製、特性決定および使用を実証する。以下の実施例は、本技術のキメラ、ヒト化および二重特異性抗体の製造ならびにその結合特異性およびｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性の特性決定を実証する。
【０２００】
（実施例１）
本技術のポリシアル酸抗体を作製および特性決定するための材料および方法
ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体の作製。ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂを、Xu H et al., Cancer Immunology Research 3:266-277 (2015)およびLopez-Albaitero A et al., OncoImmunology 6:e1267891 (2017)にこれまでに記載されたように、（Ｇ4Ｓ）3リンカーを介してＰ３５Ｈ１Ｌ２抗体の軽鎖のＣ末端でヒト化ＯＫＴ３  ｓｃＦｖを融合することによって構築した。Ｎ２９７ＡおよびＫ３２２Ａ突然変異を、抗体のＦｃ領域に導入して、それぞれＦｃＲおよび補体結合活性を排除した（Shields RL et al., Journal of Biological Chemistry 276:6591-6604(2001); Idusogie EE et al., Journal of Immunology 164:4178-4184(2000)）。次いで、ＤＮＡ構築物をＣＨＯ−Ｓ細胞中にトランスフェクトし、安定クローンを高レベルの抗体産生について選択した。大規模抗体精製のために、選択した安定クローンをシェーカーフラスコにおいて拡大した。１ステッププロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して上清から二重特異性抗体を精製した。
【０２０１】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析。ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、メリーランド州、コロンビア）を使用してＢＣ１３７の大きさおよび純度を解析した。分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）を使用して単量体種を同定し、種々の非バッファーピークの相対曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて単量体パーセントを算出した。
【０２０２】
Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）アッセイ。細胞傷害性アッセイを、51Ｃｒ放出アッセイまたはＰｉｅｒｃｅ  ＬＤＨ放出アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）の両方を使用して実施した。両アッセイのために、１４日間の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄに対する曝露によって活性化されたＴ細胞を、その後、ＰＢＭＣから得た選別された細胞を除いて、エフェクター細胞として使用し、ＰＢＭＣから得た選別された細胞は、事前刺激を伴わずにＴＤＣＣアッセイのために使用した。51Ｃｒアッセイを、Cheng M et al., International Journal of Cancer 136:476-486 (2015)においてこれまでに記載されたように実施した。ＬＤＨアッセイを、以下の改変を含む製造業者の説明書に従って実施した。手短には、９６ウェル丸底プレートの各アッセイウェルについて、１．５×１０4個標的細胞を、意図される（エフェクター：標的）Ｅ：Ｔ比に応じて可変数のエフェクター細胞とともにインキュベートした。次いで、抗体を種々の希釈で付加し、プレートを３７℃で１６時間インキュベートした。各条件を３連で行った。次いで、上清を、反応基質とともに平底プレートに移し、３０分間インキュベートし、その後、４９０ｎｍで読み取り、参照波長として６８０ｎｍを用いた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、曲線を４パラメータ非線形回帰モデルに対してフィッティングすることによってＥＣ50値を算出した。
【０２０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍療法。ＢＣ１３７の抗腫瘍効力を試験するために、ヒト腫瘍異種移植のために免疫不全マウスを使用した。神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を皮下に移植し、そこで、腫瘍細胞をＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｒａｇ２-/-ＩＬ２Ｒγ-/-（ＤＫＯ）マウス（現在、ＣＩＥＡ  ＢＲＧマウスとしてＴａｃｏｎｉｃ（ニューヨーク州、レンセリア）から市販されている）の側腹部に移植した。ノギスまたはデジタルデバイスＰｅｉｒａ  ＴＭ９００  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｅｉｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ベルギー、トゥルンホウト）を使用して腫瘍体積を毎週測定することによって腫瘍成長をモニタリングした。
【０２０４】
腫瘍移植後７日目に、処置を開始した。１００μｇのＢｓＡｂを各マウスに注入し（静脈内、週２回、５週）、翌日、１０００万個のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化Ｔ細胞（週１回、５週）を注入した。
【０２０５】
酵母ディスプレイを使用する親和性成熟。２０個のアミノ酸（Ｇ４Ｓ）3リンカーを用いて親のＰ３５  Ｈ１Ｌ２をｓｃＦｖ形式に変換し、酵母ディスプレイベクター中にクローニングした。Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２  ｓｃＦｖを、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、サンタクララ）を使用して無作為に突然変異させた。ＰＣＲ産物を、線形化ベクターと一緒に酵母中に電気穿孔し、ライブラリーを、ビオチン化ｐｏｌｙＳｉａを使用する４ラウンドの選別に付した。最後のラウンドから得た個々のクローンをＰＣＲ増幅し、突然変異パターンを解析するためにシーケンシングした。選択されたｓｃＦｖクローンのＢｓＡｂ形式への変換を、５０ｎｇの線形化ベクターおよび１：３ベクター対その他の３種の構成成分の挿入モル比を用いて、１ステップ４断片ライゲーション法を使用して行った。Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡライゲーションキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）を用いて、室温で１時間ライゲーションを行った。ＩＩ型制限酵素ＳａｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州、イプスウィッチ）を使用して、異なる構成成分間のシームレス連結を確実にした。選択されたクローンを、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）を製造業者の説明書に従って使用して一過性に発現させた。浸透フラスコ中で４〜５日培養した後に、Ｅｘｐｉ２９３細胞から得た上清を使用し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、イリノイ州、シカゴ）を使用して抗体を精製し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、ランチョドミンゲス）においてｐＨ８．０クエン酸バッファーに対して透析した。
【０２０６】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析。コロミン酸（約１００個のＳｉａ単位を有するｐｏｌｙＳｉａ）をＣＭ５チップ上に固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、イリノイ州、シカゴ）を使用して、５種の濃度の２倍段階希釈した抗体ＩｇＧまたはＢｓＡｂをチップ上に流した。２５℃で測定された結合動力学。センサーグラムを両方の１：１結合モデルとフィッティングして、動力学パラメータを導き出した。
【０２０７】
（実施例２）
キメラおよびヒト化Ｐ３５抗体の作製
密接に相同なヒト生殖系列配列を使用するＣＤＲグラフト法を使用して、キメラおよびヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を作製した。２種の異なるヒト化ＶＨ（Ｐ３５  Ｈ１、Ｐ３５  Ｈ２）およびヒト化ＶＬ（Ｐ３５  Ｌ１、Ｐ３５  Ｌ２）配列を組み合わせて、４種の異なるヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ  ＩｇＧ１抗体を作製した。図３は、４種の組合せ、Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１およびＨ２Ｌ２のフローサイトメトリーによる抗原−結合における相違を実証する。Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２は、最高結合を示し（図３）、さらに調査した。
これらの結果は、本技術の抗体またはその抗原結合断片は、高い結合親和性でポリシアル酸抗原と特異的に結合することを実証する。したがって、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、サンプルにおいて高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を検出する方法において、ならびに対象において腫瘍を検出する方法において有用である。
【０２０８】
（実施例３）
複数の癌細胞株でのｐｏｌｙＳｉａの発現
キメラＰ３５  ＩｇＧ１を使用して癌細胞株の大きなパネルでｐｏｌｙＳｉａの発現を試験した。アイソタイプ対応対照抗体（抗ＲＳＶパリビズマブ）を対照として使用し、平均蛍光強度が図１（Ａ）および１（Ｂ）に示されている。神経芽細胞腫、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）について、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）について、高レベルのｐｏｌｙＳｉａが観察された。ＡＭＬについて高レベルのｐｏｌｙＳｉａがこれまでに報告されていなかったことを考えると、ＡＭＬ細胞におけるｐｏｌｙＳｉａの検出は、予期しないものであった。
これらの結果は、本技術の抗体またはその抗原結合断片が、高い結合親和性でポリシアル酸抗原と特異的に結合することを実証する。したがって、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、サンプルにおいて高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を検出する方法において、ならびに対象において腫瘍を検出する方法において有用である。
【０２０９】
（実施例４）
ＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）でのｐｏｌｙＳｉａの発現
１４種の異なるＳＣＬＣ  ＰＤＸサンプルでのｐｏｌｙＳｉａの発現を、キメラＰ３５抗体を使用する免疫組織化学によって試験した。１〜４の段階分け尺度を使用してサンプルを評価すると、１４種のサンプルのうち１１種が、高レベルの染色の領域（等級３または４）を示した。図２を参照のこと。
これらの結果は、本技術の抗体またはその抗原結合断片が、ポリシアル酸抗原と高い結合親和性で特異的に結合することを実証する。したがって、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、サンプルにおいて高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を検出する方法において、ならびに対象において腫瘍を検出する方法において有用である。
【０２１０】
（実施例５）
ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体の作製
ｐｏｌｙＳｉａ（＋）細胞株に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）について試験した場合に、ヒト化Ｐ３５  ＩｇＧ１抗体は、抗腫瘍活性を示さなかった（図６６）。ヒト化Ｐ３５抗体に抗腫瘍特性を付与するために、Ｔ細胞に腫瘍死滅を再指示するためにｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３をターゲッティングする二重特異性抗体を作製した。図４（Ａ）は、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂの模式図を示す。作製された第１のＢｓＡｂは、Ｂｉｃｌｏｎｅ  １３７（ＢＣ１３７）を作製するためにＰ３５  Ｈ１Ｌ２配列を利用した。図４（Ｂ）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３二重特異性抗体ＢＣ１３７の純度を示し、２１０ｋＤａのおよそのＭＷを有するＢＣ１３７の主要なピーク（２８０ｎｍでの吸光度によって９５％）を有していた。ＢＣ１３７  ＢｓＡｂは、複数の凍結および解凍サイクル後にＳＥＣ−ＨＰＬＣによって安定なままであった。
【０２１１】
（実施例６）
ｐｏｌｙＳｉａ−ＢｓＡｂは、ヒト癌細胞株のＴ細胞細胞傷害性を再指示した
活性化ヒトＴ細胞（エフェクター／標的比：１０：１）を用いる２４時間乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害性アッセイにおいて、ＰｏｌｙＳｉａ（＋）細胞株黒色腫Ｍ１４および神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２を試験して、ＢＣ１３７によって再指示されたＴ細胞細胞傷害性を調べた。
図５（Ａ）〜５（Ｂ）は、ＢＣ１３７が１００ｎｇ／ｍｌ（約４５０ｐＭ）近くのＥＣ50値を示したことを実証する。ＢＣ１３７によって示された高いＴ細胞依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）は、ヒト化Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２抗体によって示されたＡＤＣＣの欠如を考えると予期しないものであった。
これらの結果は、本技術の抗体またはその抗原結合断片は、高い結合親和性でポリシアル酸抗原と特異的に結合することを実証する。したがって、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、サンプルにおいて高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を検出する方法において、ならびに対象において腫瘍を検出する方法において有用である。
【０２１２】
（実施例７）
ｐｏｌｙＳｉａ−ＢｓＡｂは、神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を用いるマウス異種移植研究において抗腫瘍効力を示した
ＢＣ１３７の抗腫瘍効力を試験するために、ヒト腫瘍異種移植のために免疫不全マウスを使用した。神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２腫瘍を、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｒａｇ２-/-ＩＬ２Ｒγ-/-（ＤＫＯ）マウスの側腹部で皮下移植した。図６に示されるように、抗体処置を伴わず、腫瘍のみおよび腫瘍＋活性化Ｔ細胞群の両方が、迅速な腫瘍成長を示した。対照的に、５週間にわたる１０用量のＢＣ１３７は、マウスを効率的に治癒し、少なくとも５０日間、腫瘍がないままであった。臨床毒性は観察されなかった。
総合すると、これらの結果は、本技術の抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍を検出し、腫瘍成長および／または転移の進行を阻害することができることを実証する。したがって、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、それを必要とする対象においてｐｏｌｙＳｉａ関連癌を検出および／または処置する方法において有用である。
【０２１３】
（実施例８）
コンピュータでのモデリングおよび合理的な設計による抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の親和性成熟
ＢＣ１３７の効力をさらに増大させようとして、合理的エンジニアリングおよびランダム突然変異誘発／酵母ディスプレイの両方によって親和性成熟を試みた。合理的エンジニアリングのために、これまでに解決されている（ＰＤＢ  ３ＷＤＢ）オクタシアル酸リガンドと結合しているｓｃＦｖの結晶構造に基づいて、ｍＡｂ７３５の結合ポケットで静電解析を行った。Ｂｉｏｖｉａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏモデリングソフトウェア（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用してＤｅｌＰｈｉアルゴリズムを使用して静電表面マップを作製した（図７（Ａ））。静電ポテンシャルマップは、２個の負電荷を有する残基（ポケットの表面のＶＨ：Ｄ３１および結合ポケット中深部のＶＨ：Ｄ１０５）を示した。図７（Ｂ）は、ｍＡＢ７３５の結合ポケットの断面リボン図を示す。理論に捉われようとは思わないが、Ｄ３１およびＤ１０５の電荷を、正電荷を有する残基に変更することによって、ｐｏｌｙＳｉａ結合が増強されると考えられる。Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２  ＩｇＧ１中にこれらの部位で突然変異を導入し、次いで、ｐｏｌｙＳｉａ（＋）神経芽細胞腫ＢＥ（１）ｎ細胞との結合について試験した。驚くべきことに、Ｄ１０５Ｈは、親のＰ３５  Ｈ１Ｌ２よりも弱い結合を示したが、一方で、Ｄ３１の正電荷を有するアミノ酸は、増強された結合を示し、Ｄ３１Ｒは、最も増強された結合を示した（図７（Ｃ））。
【０２１４】
これらの結果は、本技術の抗体またはその抗原結合断片は、高い結合親和性でポリシアル酸抗原と特異的に結合することを実証する。したがって、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、サンプルにおいて高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を検出する方法において、ならびに対象において腫瘍を検出する方法において有用である。
【０２１５】
（実施例９）
酵母ディスプレイによるｐｏｌｙＳｉａ−ＢｓＡｂの親和性成熟
ｐｏｌｙＳｉａ−ＢｓＡｂの効力をさらに改善しようとして、酵母ディスプレイ法を使用して、Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２に由来するｓｃＦｖを親和性成熟させた。２つのスクリーニング法、ダイレクト法および動力学的方法を利用した（Boder, E. T. and Wittrup, K. D, Biotechnol Prog., 1998, 14:55-62）。ダイレクト法では、酵母細胞を抗原とともに平衡状態までインキュベートし、その後、選別した。動力学的スクリーニングでは、酵母細胞を飽和量の標識された抗原を用いて染色し、続いて、非標識抗原を競合物質として添加した。配列解析に基づいて、ダイレクトスクリーニング法から６つのクローンを選択し、動力学的スクリーニング法から８つのクローンを選択し、コンピュータによる設計から１つのクローンを選択した（Ｄ３１Ｒ）。選択されたクローンで表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を実施した。
【０２１６】
ダイレクトスクリーニングから選択されたクローンはすべて、Ｄ３１およびＷ５０で突然変異を含有しており、それらのうち２つは、Ｋ３８で突然変異を有していた。続いて、クローンを解離定数（ＫD、図８（Ａ）〜８（Ｂ））によってランク付けした。クローンＤＳ５４は、最低ＫD、野生型クローンと比較した場合に親和性に関して２０倍を超える改善を示した。クローンＤＳ４７は、野生型クローンよりも１５倍遅い最小のＫoffを有していた。Ｄ３１Ｒは、野生型クローンと比較してほぼ２５０倍速い最速の結合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）を有する。２つのさらなるクローンを作製した、ＤＳ４７＋Ｄ３１ＲおよびＤＳ５４＋Ｄ３１Ｒ。
動力学的スクリーニングから選択されたクローンに関して（図９（Ａ）〜９（Ｂ））、ＫＳ３４は、野生型クローンを上回って親和性において３倍の改善を有していた。クローンＫＳ２は、野生型クローンよりも６倍超遅い、最も遅い解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を有していた。動力学的スクリーニングから得たクローンは、それらのほとんどがＤ６５Ｃの同一突然変異を共有するにもかかわらず、共通するアミノ酸の点でより少ない保存しか有していなかった。次いで、６つのクローンを変換して二重特異性形式に戻した。
【０２１７】
３つの細胞株を使用して、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂによって再指示されたＴ細胞細胞傷害性における選択したクローンの有効性を比較した。図１０（Ａ）〜１０（Ｂ）は、ｐｏｌｙＳｉａ×ＣＤ３  ＢｓＡｂによって再指示されたＴ細胞細胞傷害性において選択したクローンの有効性を実証する。ＥＣ50値は、クローンＤＳ４７およびＤＳ５４が野生型ＢｓＡｂよりも有効であることを実証する。
【０２１８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ療法研究において、ＤＫＯマウスにＰＢＭＣ（バフィーコート由来の不活性化されたもの）と混合された（１：１）ＩＭＲ−３２細胞を皮下移植した。ＢｓＡＢを用いる処置は、４日目に開始し（１００μｇ、ｉ．ｖ．、週２回、５週）、各週で腫瘍体積を測定した。ｐｏｌｙＳｉａ−ＢｓＡＢおよびクローン４７は、対照群（アイソタイプ対照および非グリコシル化ｈｕＯＫＴ３）およびクローン５４（図１１）と比較して抗腫瘍効果を示した。３８日目に、対照群の平均の腫瘍の大きさは、１６００ｍｍ3超に達し、一方で、ＢＣ１３７−２  ＤＳ４７の平均の腫瘍の大きさは、２８０ｍｍ3未満（８３％低減、ｐ＝０．００４）であり、ＢＣ１３７の平均の腫瘍の大きさは、３１０ｍｍ3（８１％低減、ｐ＝０．００５）であった。
これらの結果は、本技術の抗体またはその抗原結合断片は、高い結合親和性でポリシアル酸抗原と特異的に結合することを実証する。したがって、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、サンプルにおいて高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を検出する方法において、ならびに対象において腫瘍を検出する方法において有用である。
【０２１９】
（実施例１０）
ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ二重特異性抗体を使用するプレターゲッティングされる放射免疫治療
ヒト化Ｐ３５抗体が、プレターゲット放射免疫治療のために利用され得るか否かを判定するために、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ形式を使用してｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ  ＢｓＡｂを作製し、ここでは、ヒト化抗ＤＯＴＡ  ｓｃＦｖ（ｈｕＣ８２５）が、サイレントＦｃを用いてヒト化Ｐ３５  ＩｇＧ１の軽鎖のＣ末端に融合される（図１２）。Ｐ３５  Ｈ１Ｌ２を使用して、ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ  ＢｓＡｂ（ＢＣ１６３）を作製した。ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ  ＢｓＡｂの効力を試験するために、セラノスティックプレターゲッティングされる放射免疫治療（ＰＲＩＴ）実験を設計した。
【０２２０】
＞５００ｍｍ3腫瘍量を有するＩＭＲ−３２腫瘍を有するヌードマウスの群に、種々の用量のｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ  ＢｓＡｂ（０、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇおよび１ｍｇ）を注入した。抗体を週に１回３週間注入した（１ｍｇ  ＢｓＡｂを用いて２週間のみ投薬されたマウスを除く）。177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎおよび清澄剤を、４８時間後に注入した。処置を受けなかった、または177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを受け取ったマウス群は、迅速な腫瘍成長を示した（図１３（Ａ）〜１３（Ｂ））。０．２５、０．５または１．０ｍｇのＢＣ１６３を受け取ったマウス群は、ほぼ完全な腫瘍消失を示し、毒性の兆候はなかった（図１３（Ｃ）〜１３（Ｅ））。
患者における免疫原性の可能性をさらに最適化し、低減するために、８種のさらなる重鎖バリアント（８７〜８８％ヒト生殖系列含量）および３種のさらなる軽鎖バリアント（９２％ヒト生殖系列含量）を作製した（図１４（Ａ）〜１４（Ｂ））。
総合すると、これらの結果は、本技術の抗体または抗原結合断片は、腫瘍を検出し、放射線療法に対する腫瘍感受性を増大させ、腫瘍成長および／または転移の進行を阻害することができ、プレターゲッティングされる免疫療法の患者を選択するために使用できることを実証する。したがって、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、それを必要とする対象においてｐｏｌｙＳｉａ陽性癌を検出および処置する方法において有用である。
【０２２１】
（実施例１１）
再ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の治療効果の特性決定
コロミン酸に対する再ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の親和性値を、表面プラズモン共鳴によって測定した。再ヒト化ＨＰ３５重鎖（ＨＣ）バリアント１〜８は、それぞれ、配列番号７４〜８１に対応する。図５５〜６２を参照のこと。再ヒト化ＨＰ３５軽鎖（ＬＣ）バリアント１〜３は、それぞれ、配列番号８２〜８４に対応する。図６３〜６５を参照のこと。これらのアッセイの結果は、表２に示されている。
【０２２２】
【表２】
2021517816.tif 000004
加速貯蔵条件で再ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の長期安定性を評価するために、抗体溶液を、３７℃の温度制御インキュベーター中で貯蔵した。種々の時間でサンプルを取り出し、ＨＰＬＣによって整合性について解析した。表３に示されるように、３７℃で３週間後に、再ヒト化ｐｏｌｙＳｉａ抗体のほとんどが７６％〜９５％無傷であった。
【０２２３】
【表３】
2021517816.tif 000005
本技術の種々の再ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体のＭ１４黒色腫細胞との結合を、フローサイトメトリーを使用してアッセイした。図６７は、本技術の再ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図６８は、キメラＨＰ３５  ｐｏｌｙＳｉａ抗体に対して、本技術の種々の再ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の抗原結合特性および安定性を比較するヒートマップを示す。
これらの結果は、本技術の抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体または抗原結合断片が、生物学的サンプルにおいて高い重合度を有するポリシアル酸（高ＤＰ  ｐｏｌｙＳｉａ）を検出する方法ならびにそれを必要とする対象においてｐｏｌｙＳｉａ陽性癌を検出する方法において有用であることを実証する。
【０２２４】
（実施例１２）
再ヒト化抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体の治療効果の評価
図１４（Ａ）および１４（Ｂ）に示される８種のさらなる重鎖バリアント（８７〜８８％ヒト生殖系列含量）および３種のさらなる軽鎖バリアント（９２％ヒト生殖系列含量）は、ｐｏｌｙＳｉａ×ＤＯＴＡ  ＢｓＡｂの効力を試験するために、本明細書に記載される同一ＰＲＩＴ実験プロトコールを使用して試験される。本明細書において開示されるバリアント抗ｐｏｌｙＳｉａ抗体を受け取る腫瘍を有する動物は、腫瘍体積の低減を示すと予測される。
これらの結果は、本明細書において開示される免疫グロブリン関連組成物は、それを必要とする対象においてｐｏｌｙＳｉａ陽性癌を検出および処置する方法において有用であることを実証する。
【０２２５】
均等物
本技術は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるべきではなく、本技術の個々の態様の単一の例示として意図される。当業者には明らかなように、本技術の多くの改変および変法は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本技術の範囲内の機能的に同等の方法および装置は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変および変法は、本技術の範囲内にあることが意図される。この本技術は、特定の方法、試薬、化合物組成または生物学的システムに限定されず、これらはもちろん変わり得ることは理解されなければならない。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的としており、限定されることを意図するものではないことも理解されるべきである。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの観点から説明される場合、当業者は、開示がまた、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点から説明されることを認識するであろう。
当業者によって理解されるように、特に書面による説明を提供するという観点から、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲は、ありとあらゆるあり得る部分範囲およびその部分範囲の組合せも包含する。列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解して十分に説明し、有効にするものとして簡単に認識できる。限定されない例として、本明細書で論じられる各範囲は、下位３分の１、中３分の１、および上位３分の１などに容易に分解できる。また、当業者によって理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などのすべての言語は、列挙された数を含み、上記で論じたような部分範囲にその後分解され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個のセルを有するグループは、１個、２個、または３個のセルを持つグループを指す。同様に、１〜５個のセルを有するグループは、１、２、３、４、または５個のセルを有するグループなどを指します。
【０２２６】
本明細書で参照されるまたは引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲で、すべての図および表を含む、全文が参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
2021517816.tif 000006
【図１Ｂ】
2021517816.tif 000007
【図２】
2021517816.tif 000008
【図３】
2021517816.tif 000009
【図４Ａ】
2021517816.tif 000010
【図４Ｂ】
2021517816.tif 000011
【図５Ａ】
2021517816.tif 000012
【図５Ｂ】
2021517816.tif 000013
【図６】
2021517816.tif 000014
【図７（Ａ）】
2021517816.tif 000015
【図７（Ｂ）】
2021517816.tif 000016
【図７（Ｃ）】
2021517816.tif 000017
【図８Ａ】
2021517816.tif 000018
【図８Ｂ】
2021517816.tif 000019
【図９Ａ】
2021517816.tif 000020
【図９Ｂ】
2021517816.tif 000021
【図１０Ａ】
2021517816.tif 000022
【図１０Ｂ】
2021517816.tif 000023
【図１１】
2021517816.tif 000024
【図１２】
2021517816.tif 000025
【図１３Ａ】
2021517816.tif 000026
【図１３Ｂ】
2021517816.tif 000027
【図１３Ｃ】
2021517816.tif 000028
【図１３Ｄ】
2021517816.tif 000029
【図１３Ｅ】
2021517816.tif 000030
【図１４Ａ】
2021517816.tif 000031
【図１４Ｂ】
2021517816.tif 000032
【図１５Ａ】
2021517816.tif 000033
【図１５Ｂ】
2021517816.tif 000034
【図１６Ａ】
2021517816.tif 000035
【図１６Ｂ】
2021517816.tif 000036
【図１７Ａ】
2021517816.tif 000037
【図１７Ｂ】
2021517816.tif 000038
【図１８Ａ】
2021517816.tif 000039
【図１８Ｂ】
2021517816.tif 000040
【図１９】
2021517816.tif 000041
【図２０】
2021517816.tif 000042
【図２１】
2021517816.tif 000043
【図２２】
2021517816.tif 000044
【図２３】
2021517816.tif 000045
【図２４】
2021517816.tif 000046
【図２５】
2021517816.tif 000047
【図２６Ａ】
2021517816.tif 000048
【図２６Ｂ】
2021517816.tif 000049
【図２７Ａ】
2021517816.tif 000050
【図２７Ｂ】
2021517816.tif 000051
【図２８Ａ】
2021517816.tif 000052
【図２８Ｂ】
2021517816.tif 000053
【図２９Ａ】
2021517816.tif 000054
【図２９Ｂ】
2021517816.tif 000055
【図３０】
2021517816.tif 000056
【図３１】
2021517816.tif 000057
【図３２Ａ】
2021517816.tif 000058
【図３２Ｂ】
2021517816.tif 000059
【図３３Ａ】
2021517816.tif 000060
【図３３Ｂ】
2021517816.tif 000061
【図３３Ｃ】
2021517816.tif 000062
【図３３Ｄ】
2021517816.tif 000063
【図３４Ａ】
2021517816.tif 000064
【図３４Ｂ】
2021517816.tif 000065
【図３５Ａ】
2021517816.tif 000066
【図３５Ｂ】
2021517816.tif 000067
【図３５Ｃ】
2021517816.tif 000068
【図３５Ｄ】
2021517816.tif 000069
【図３６Ａ】
2021517816.tif 000070
【図３６Ｂ】
2021517816.tif 000071
【図３６Ｃ】
2021517816.tif 000072
【図３６Ｄ】
2021517816.tif 000073
【図３７Ａ】
2021517816.tif 000074
【図３７Ｂ】
2021517816.tif 000075
【図３８Ａ】
2021517816.tif 000076
【図３８Ｂ】
2021517816.tif 000077
【図３９Ａ】
2021517816.tif 000078
【図３９Ｂ】
2021517816.tif 000079
【図４０Ａ】
2021517816.tif 000080
【図４０Ｂ】
2021517816.tif 000081
【図４１Ａ】
2021517816.tif 000082
【図４１Ｂ】
2021517816.tif 000083
【図４１Ｃ】
2021517816.tif 000084
【図４１Ｄ】
2021517816.tif 000085
【図４２】
2021517816.tif 000086
【図４３】
2021517816.tif 000087
【図４４】
2021517816.tif 000088
【図４５】
2021517816.tif 000089
【図４６】
2021517816.tif 000090
【図４７】
2021517816.tif 000091
【図４８】
2021517816.tif 000092
【図４９】
2021517816.tif 000093
【図５０】
2021517816.tif 000094
【図５１】
2021517816.tif 000095
【図５２】
2021517816.tif 000096
【図５３】
2021517816.tif 000097
【図５４】
2021517816.tif 000098
【図５５】
2021517816.tif 000099
【図５６】
2021517816.tif 000100
【図５７】
2021517816.tif 000101
【図５８】
2021517816.tif 000102
【図５９】
2021517816.tif 000103
【図６０】
2021517816.tif 000104
【図６１】
2021517816.tif 000105
【図６２】
2021517816.tif 000106
【図６３】
2021517816.tif 000107
【図６４】
2021517816.tif 000108
【図６５】
2021517816.tif 000109
【図６６】
2021517816.tif 000110
【図６７】
2021517816.tif 000111
【図６８】
2021517816.tif 000112
【配列表】
2021517816000001.app
【国際調査報告】
2021517816.tif 000113
2021517816.tif 000114
2021517816.tif 000115
2021517816.tif 000116
2021517816.tif 000117