(57)【要約】  本発明は、バキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素および薬学的に許容される担体を含む、アクチノバシラス・プルロニューモニエによる感染から豚を防御するためのワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚をアクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から防御するためのワクチンであって、バキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素および薬学的に許容可能な担体を含むワクチン。
【請求項２】
前記ＲＴＸ毒素がＡｐｘＩであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ＲＴＸ毒素および薬学的に許容可能な担体を含むワクチンを動物に投与することによりアクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から豚を防御する方法において使用するための、バキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素。
【請求項４】
前記ワクチンが全身投与されることを特徴とする、請求項３に記載の方法に使用するためのＲＴＸ毒素。
【請求項５】
前記ワクチンが筋肉内または皮内のいずれかで投与されることを特徴とする、請求項４に記載の方法に使用するためのＲＴＸ毒素。
【請求項６】
ＲＴＸ毒素を薬学的に許容可能な担体と混合することにより、豚をアクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から防御するワクチンを製造するための、バキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素の使用。
【請求項７】
バキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素および薬学的に許容可能な担体を含むワクチンを豚に投与することによる、豚をアクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から防御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染から豚を防御するためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、養豚業に多大な経済的損失をもたらす世界的疾患である豚胸膜肺炎に対するワクチンに関する。豚胸膜肺炎の病原体は、パスツレラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）科に属するグラム陰性菌であるアクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＰＰ）である。本疾患はエアロゾル経路または感染豚との直接接触により伝播し、出血性、線維素性および壊死性の肺病変を特徴とする。臨床像は、過急性から慢性および無症候性のキャリア豚まで様々であり、非感染群に導入するとこの疾患を伝播する可能性がある。莢膜多糖類およびリポ多糖類（ＬＰＳ）Ｏ鎖成分に基づいて、１５種の血清型が記述されている。アクチノバシラス・プルロニューモニエの血清型タイピングおよびその他の遺伝子型タイピング法は、サーベイランスおよび疫学研究に大きく貢献している。これらのツールは、細菌の病原性タイプの根絶を目的とした抑制プログラムにおける意思決定のための重要な情報を提供する。北米では、血清型１、５および７が最も多いと報告されているが、ヨーロッパでは血清型２および９が最も多く分離されており、オーストラリアの豚からは血清型１５が優勢な分離株である。
【０００３】
アクチノバシラス・プルロニューモニエについて記載されている毒性因子には、ＬＰＳ、莢膜多糖類、Ａｐｘ毒素Ｉ−ＩＶ（いわゆるリピートイントキシンまたはＲＴＸ毒素）、外膜蛋白質（ＯＭＰ）および様々な鉄獲得系が含まれる。アクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素（Ａｐｘ毒素Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）は、Ｆｒｅｙ  ｉｎ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５７、Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．７（１９９５年７月）に記載されている。その後、ＡＰＰの４番目のＲＴＸ毒素（Ａｐｘ  ＩＶと呼ばれる）が見つかった（Ｄｒｅｙｆｕｓら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、９９（３−４）：２２７−２３８（２００４年４月１９日）を参照）。しかし、この細菌の病因のメカニズムと同様に、感染過程に対する各成分の全体的な寄与は依然として不明である。アクチノバシラス・プルロニューモニエに対する現在利用可能なワクチンのほぼ全ては、不活化全細胞バクテリンまたはＡｐｘ毒素と蛋白質のサブユニットの組み合わせのいずれかであり、場合によっては外膜画分と組み合わせられている。いずれの場合も、十分な防御を得るためにはリポ多糖（ＬＰＳ）がワクチン中に存在しなければならないことが一般的に理解されるようになった（Ｊｕｌｉｅｎ  Ｇｏｕｒｅら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００９、１０：８８（２００９年２月２４日発行）；Ｄｕｂｒｅｕｉｌら、Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １（２）：７３−９３（２０００年１２月））。実際、ＬＰＳとＡｐｘ毒素との間の特異的結合が、当該毒素の免疫原性の改善に主要な役割を果たすことが知られている（とりわけ、Ｒａｍｊｅｅｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７０（１）、ｐｐ．２２１−２３５（２００８）を参照）。このことは、Ａｐｘ毒素がＬＰＳとの複合体で存在する組合せサブユニットワクチンの十分な防御を説明しうる。
【０００４】
リポ多糖の深刻な欠点は、その内毒素的な性質であり、したがって、嗜眠、下痢、嘔吐、食欲の喪失または死亡さえも含まれるような複数の望ましくない副作用と関連している。したがって、一見すると、ワクチン中のＬＰＳの量を減らしたり、ＬＰＳを無害化したりすることは魅惑的ある。しかしながら、適切なＡＰＰワクチンはＬＰＳの存在に依存するため、一般的に知られているようにＬＰＳの量を低下させると、本質的にワクチンの有効性が低下する。これに代わる方法として、ＷＯ２０１１／０１５６１４で知られているように、ワクチンに抗生物質ポリミキシンを加えることで、ＬＰＳの負の影響が打ち消される可能性がある。しかし、規制の観点からは、ワクチンに抗生物質を加えることは厳しく制限されている。したがって、この解決策はすべての規制管轄区域で使用できるわけではない。
【０００５】
実際、このような高レベルの防御に到達するためには、少なくとも１つのＡｐｘ毒素がワクチン中に存在する必要があり、その毒素はＬＰＳのようなヘテロ分子との免疫学的複合体中に存在するというのが現在の理解である。精製されたＡｐｘ毒素はある程度の防御効果をもたらす可能性があることが知られているが（とりわけ、Ｂｈａｔｉａら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２９、１４７−１５８（１９９１年）参照）、適切な防御効果を得るには、ワクチン中の抗原として精製されたＡｐｘ毒素を用いることが十分ではないと理解されている。グラム陰性細菌の大腸菌で発現されたＡｐｘ毒素の多くの例が知られている。大腸菌によって産生された場合に「精製された」組換えＡｐｘ毒素と称されることはあっても、これらの場合のそれぞれにおいて、当該毒素は、大腸菌の細菌細胞壁に含まれるようなＬＰＳとの接触の結果として、ＬＰＳと複合体を形成する。ＬＰＳまたは別のヘテロ毒素と複合体を形成しない、精製されたＡｐｘ毒素を真に得るためのより魅力的な発現系もまた当該技術分野で知られている。Ｋｙｕｎｇ−Ｙｅｏｌ  Ｌｅｅらは、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８、３８１−３８９（２００６年）において、トランスジェニックタバコ植物で産生された組換えＡｐｘ毒素によるアクチノバシラス・プルロニューモニエ感染に対する防御免疫応答の誘導について報告している。しかし、豚における防御は示されなかった。また、ワクチンは４回連続経口投与する必要があった。豚へのワクチン接種の実際上、これは現実的な選択肢ではない。これに対応して、Ｍｉ−Ｙｏｕｎｇ  Ｋｉｍらは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １３２、１１６−１２３（２０１７年）において、Ａｐｘ毒素がトランスジェニックイネカルスで発現可能であり、精製毒素を鼻腔内投与した場合、マウスにおけるアクチノバシラス・プルロニューモニエの感染に対して少なくともある程度の防御効果が得られることを示した。しかしながら、豚における防御は示されておらず、ＡＰＰに対する防御を目的とした市販のワクチンと同等のレベルでの防御も示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｙｕｎｇ−Ｙｅｏｌ  Ｌｅｅら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８、３８１−３８９（２００６年）
【非特許文献２】Ｍｉ−Ｙｏｕｎｇ  Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １３２、１１６−１２３（２０１７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、アクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から子豚を十分に防御するための代替ワクチンを提供することであり、それは市販のＡＰＰワクチンを使用する際に到達した防御と同等のレベルであることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的を満たすために、豚をアクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から防御するためのワクチンが考案されており、そのワクチンはバキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素、および薬学的に許容可能な担体を含む。
【０００９】
驚くべきことに、ＬＰＳまたは他のヘテロ毒素が存在しない単離毒素を含む本発明のワクチンは、ポルシリス（登録商標）ＡＰＰ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダ国）のようなワクチンを使用する場合に得られる防御のレベルと比較してさえも、十分な防御をもたらし得る。そのようなバキュロウイルス発現は一般的に知られており、ウイルス性または細菌性病原体のいずれかの免疫原を発現させるために長年使用されてきたが、１種以上のＲＴＸ毒素を発現させることによってＡＰＰに対する適切なワクチンを提供するためには使用されていない。バキュロウイルスは６００種以上の昆虫種に感染することができるＤＮＡウイルスである。バイオテクノロジーで最も一般的に使用されているバキュロウイルスはオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）である。バキュロウイルスは環状二本鎖ＤＮＡ（〜１３４ｋｂ）を有しており、桿状のヌクレオカプシド内に詰め込まれ、宿主細胞由来の膜に包まれている。昆虫の感染後、バキュロウイルスは出芽型で細胞から放出されるか、ウイルス発現ポリヘドリンおよびｐ１０蛋白質からなる多角体内に埋め込まれ得る。ポリヘドリンとｐ１０蛋白質は豊富に発現しているが、バキュロウイルスの複製には不要であるため、ポリヒドリンまたはｐ１０プロモーターの制御下で異種遺伝子をクローニングして組換えバキュロウイルスを作製することができる。得られた組換えバキュロウイルスは、１９８０年代以来知られているように、強固な蛋白質発現のために培養昆虫細胞に感染させるために使用することができる。現在までに、様々な市販のバキュロウイルスベクター系が開発されており（例えば、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＰｒｏＥａｓｙ(商標)、ＡＢ  Ｖｅｃｔｏｒ）、遺伝子クローニングおよび組換えバキュロウイルス構築を「プラグ・アンド・プレイ」方式で可能にしている（例えば、Ｌｉｎ  ＳＹ、Ｃｈｅｎ  ＧＹ、Ｈｕ  ＹＣ、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ  ２０１１、５：１−１１参照）。さらに、バキュロウイルスゲノム中の特定のウイルス遺伝子（例えば、ｃｈｉＡおよびｖ−ｃａｔｈ）を欠失させることにより組換え蛋白質発現を改善するために、ｆｌａｓｈ
ＢＡＣ（商標）およびｆｌａｓｈＢＡＣＧＯＬＤ（商標）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ）等の多くの遺伝子操作されたバキュロウイルスベクターが開発されている（例えば、Ｈｉｔｃｈｍａｎ  ＲＢ、Ｐｏｓｓｅｅ  ＲＤ、Ｋｉｎｇ  ＬＡ、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９、３：４６−５４参照）。さらに、ＭｕｌｔｉＢａｃ（商標）システム（ジェネバ・バイオテック社）は、エンドヌクレアーゼやＣｒｅ−ｌｏｘＰ転位をホーミングすることにより、複数の遺伝子発現カセットを有するバキュロウイルスを迅速かつ柔軟に構築することができる。逆に、ＭｕｌｔｉＢａｃを基盤としたＳｗｅｅｔＢａｃ（商標）システムが、昆虫細胞の糖鎖付加問題を克服し、哺乳動物化蛋白質を発現するために開発されている（例えば、Ｐａｌｍｂｅｒｇｅｒ  Ｄ、Ｋｌａｕｓｂｅｒｇｅｒ  Ｍ、Ｂｅｒｇｅｒ  Ｉら、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ２０１３、４：７８−８３参照）。
【００１０】
本発明はまた、ＲＴＸ毒素および薬学的に許容可能な担体を含むワクチンを動物に投与することにより、アクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から豚を防御する方法において使用するためのバキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素をもたらした。
【００１１】
これに次いで、本発明は、バキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素を薬学的に許容可能な担体と混合することにより、豚をアクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から防御するワクチンを製造するための、バキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素の使用を可能にし、並びにバキュロウイルスによって組換え発現されたアクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素および薬学的に許容可能な担体を含むワクチンを豚に投与することによる、豚をアクチノバシラス・プルロニューモニエの感染から防御する方法を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
ワクチンは、被験動物に投与することが安全であり、病原性微生物に対するその動物の防御免疫を誘導することができる、すなわち、当該微生物による感染に対して成功的な防御を誘導することができる医薬組成物である。一般に、ワクチンは、基本的に、１種以上の抗原（生または不活化、全細胞、抽出物、精製画分またはサブユニット）を、薬学的に許容可能な担体、例えば、（任意に緩衝化された）水のような液体担体、または凍結乾燥ワクチンを得るために一般的に使用されるような固体担体と混合することを含む、周知の方法を使用することによって製剤化することができる。任意に、ワクチンの意図された用途または必要な特性に応じて、アジュバント、安定剤、粘度調整剤または他の成分のような他の物質を添加する。
【００１３】
薬学的に許容される担体は、生体適合性媒体、すなわち、投与後に被験動物に重大な副反応を誘発せず、ワクチン投与後に宿主動物の免疫系に抗原を提示することができる媒体である。そのような薬学的に許容される担体は、例えば、水および／またはいかなる他の生体適合性溶媒含む液体、或いは凍結乾燥ワクチンを得るために一般的に使用されるような固体担体（糖および／または蛋白質ベース）をであってよく、任意に免疫刺激剤（アジュバント）を含んでよい。任意に、安定剤、粘度調整剤または他の成分のような他の物質を、対応するワクチンの意図された用途または必要な特性に応じて添加する。
【００１４】
微生物による感染に対する防御は、その微生物による感染またはその感染から生じる障害の予防、改善または治癒、例えば、病原体による感染から生じる１つ以上の臨床徴候を予防または減少させるための助けとなる。
【００１５】
ワクチンの全身投与とは、ワクチンが身体の循環系、すなわち心血管系およびリンパ系を含む系に到達し、したがって、胃腸管のような特定の部位よりもむしろ身体全体に影響を及ぼすことを意味する。全身投与は、例えば、筋肉組織（筋肉内）、真皮（皮内）、皮膚の下（皮下）、ある種の粘膜下（粘膜下）、静脈（静脈内）等にワクチンを投与することによって行うことができる。
【００１６】
アクチノバシラス・プルロニューモニエのＲＴＸ毒素（Ａｐｘ毒素）は、アクチノバシラス・プルロニューモニエによって産生される蛋白毒素であり、豚胸膜肺炎の病因に大きく寄与する。ＡｐｘＩ（約１０５ｋＤａ）は強い溶血性と白血球に対して細胞毒性を示し、ａｐｘＩ−ＣＡＢＤオペロンの一部であるａｐｘＩＡ遺伝子（１０２３コドン）によってコードされている。ＡｐｘＩＩ（約１０５ｋＤａ）は溶血性が弱く、細胞毒性が中等度である。ａｐｘＩＩオペロンは構造遺伝子ａｐｘＩＩＡ（９５６コドン）とａｐｘＩＩＣ遺伝子を含む。ａｐｘＩＩＩＡ遺伝子（１０５２コドン）にコードされるＡｐｘＩＩＩ（約１２０ｋＤａ）は、非溶血性であるが、豚肺マクロファージに対して強い細胞毒性を示す。ＡｐｘＩＶは、ａｐｘＩＶＡ遺伝子によってコードされており、これは、異なる血清型において約１３８２〜約１８０５コドンの長さで変化する。ＡｐｘＩＶは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の鉄調節ＲＴＸ蛋白質であるＦｒｐＡおよびＦｒｐＣと有意な配列類似性を示す。一般に知られているように、ＡＰＰのＲＴＸ毒素の組換え発現は、天然に存在するＡｐｐｘ毒素の（適切な免疫応答を得るために必須ではない部分を除く）画分のみであり、天然に存在する毒素と１００％未満の重複領域における配列同一性を有し、好ましくは、天然に存在するＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ、ＡｐｘＩＩＩまたはＡｐｘＩＶのいずれかと７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９を超え、１００％までの同一性を有する蛋白質をもたらし得る。配列同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、初期パラメータでのｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して確立され得る。典型的には、Ａｐｘの免疫原性画分は、完全長蛋白質の少なくとも約３５％の長さを有しＩｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第７０巻、第１１号、第６４６４−６４６７頁（２００２年１１月）参照）、例えば、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５〜１００％の長さであるが、３５％よりもかなり小さい画分でさえも、免疫原として有効である可能性が示されている（Ｖａｃｃｉｎｅ、１７、４４１−４４７（１９９９）を参照）。
【００１７】
本発明の実施形態
第１の実施形態では、本発明のワクチンはＲＴＸ毒素ＡｐｘＩを含む。ＡｐｘＩは多くのＡＰＰ血清型により産生されるので、ワクチン中にこの毒素のみを有することにより広範な防御が得られる。
【００１８】
別の実施形態では、本発明のワクチンは、全身的に、例えば筋肉内または皮内投与によって投与される。
【００１９】
本発明は、以下の非限定的な実施例を用いてさらに説明される。
【実施例】
【００２０】
実施例１：ＡｐｘＩの組換え発現
トランスフェクトベクターｐＦａｓｔｂａｃ−ＡｐｘＩＡの構築
アクチノバシラス・プルロニューモニエ株４０７４、Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ５５１２８のＡｐｘＩＡアミノ酸配列に基づいてｒＡｐｘＩＡ遺伝子を合成した。バキュロウイルスポリヘドリン使用のために遺伝子のコドンを最適化し、Ｋｏｚａｋ配列（ＴＡＴＡＡＡＴ）および３’ヘキサヒスチジンタグを含めた。ｒＡｐｘＩＡ−Ｈｉｓ遺伝子は、ＢａｍＨＩ断片としてプラスミドｐＦａｓｔｂａｃ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）のポリヘドリンプロモーターの後ろにクローニングされ、プラスミドｐＦａｓｔｂａｃ−ＡｐｘＩＡ  ＴＡＴを生じた。
【００２１】
組換えバキュロウイルスＢａｃｄＣＣＡｐｘＩＡ−ＴＡＴの作製
組換えバキュロウイルスは、製造業者のプロトコールにしたがって、Ｂａｃ  ｔｏ  Ｂａｃシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）において上述のプラスミドを用いて作製した。形質転換に用いた大腸菌細胞は、キチナーゼおよびｖ−カテプシン遺伝子を欠失した親バキュロウイルス（Ｋａｂａ  ＳＡ、Ｓａｌｃｅｄｏ  ＡＭ、Ｗａｆｕｌａ  ＰＯ、Ｖｌａｋ  ＪＭ、ｖａｎ  Ｏｅｒｓ  ＭＭ：Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．；１２２（１）：１１３−８（２００４年１２月１日））を含んでいた。大腸菌細菌を動物成分無添加（ＡＣＦ）培地で増殖させた。
【００２２】
ＢａｃｄＣＣＡｐｘＩＡ−ＴＡＴ  ＤＮＡを大腸菌から単離し、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）９−９００細胞へのトランスフェクションに用いた。Ｓｆ９−９００細胞を動物化合物無添加培地で増殖させた。１１０ｋＤａのＡｐｘＩＡ蛋白質の発現は、抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイを用いて確認した。いったんトランスフェクション上清を増幅し、得られたウイルスストックをその後のすべてのウイルス培養に使用した。
【００２３】
バキュロウイルス産生ＡｐｘＩＡのＨｉｓｔａｇ精製
Ｓｆ９−９００細胞をＢａｃｄＣＣＡｐｘＩＡ−ＴＡＴバキュロウイルスに０．１の感染多重度で感染させた後、２７．５℃で４〜５日間培養した。これらの細胞から、ｒＡｐｘＩＡ−Ｈｉｓ蛋白質を、ＨＩＳｔｒａｐ  ＦＦカラムを用いるＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ蛋白質精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＵＳＡ）を用いて精製した。Ｌｙｓｉｓ緩衝液Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％トリトンＸ１１４）を用いて、ＢａｃｄＣＣＡｐｘＩＡ−ＴＡＴに感染させた昆虫細胞からライセートを作製した。遠心後、ペレットを洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、６Ｍ  尿素、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁し、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔに適用する前に０．４５μＭフィルターを用いて濾過した。変性洗浄緩衝液でカラムを平衡化した後、サンプルを３ｍｌ／分の速度でカラムに２回適用した。カラムに結合した蛋白質をレドックス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％酸化グルタチオン、０．０１％還元グルタチオン、１ｍＭ  ＤＴＴ）で復元し、溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｉｓ  ｐＨ＝８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５００ｍＭ  イミダゾール）を用いて線形イミダゾール勾配でカラムから溶出した。精製ＡｐｘＩ蛋白質を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を用いて、透析緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）に対して、該緩衝液を数回交換しつつ透析した。
【００２４】
実施例２：ワクチンの有効性
ワクチン製剤
２つの異なるワクチンを本研究のために作製した。第一のワクチンは、実施例１に記載の方法で得られた精製バキュロウイルス発現ＡｐｘＩを含んでいた。陽性対照として使用するための第２のワクチンは、市販のワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＰＰと同等であり、アクチノバシラス・プルロニューモニエの培養上清（したがってＬＰＳとの複合体型）から精製したＡｐｘＩおよびＡｐｘＩＩを含み、「天然ＡｐｘＩ＋ＡｐｘＩＩ」とも呼ぶ。この試験ワクチンは、市販のワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＰＰとは異なり、ＡｐｘＩＩＩ毒素を含有していなかった。しかし、血清型１０野生分離株による攻撃感染については、これは関連性がない（血清型１０はＡｐｘＩＩＩを産生しない。）。抗原を鉱油含有アジュバント（ＸＳｏｌｖｅ、ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダ国から入手可能）と混合し、各抗原の最終濃度を２５μｇ／ｍｌとした。
【００２５】
ワクチン接種プロトコール
アクチノバシラス・プルロニューモニエ非感染群の子豚８頭からなる３群を用いた。２種類のワクチンを５週齢と９週齢で２ｍｌ用量として筋肉内投与した。残りの８頭の子豚にＰＢＳを注射し、非ワクチン接種陰性対照群として用いた。定期的な間隔で、血清学的検査のために血液サンプルを採取した。 
【００２６】
アクチノバシラス・プルロニューモニエ血清型１０の攻撃感染
約１２週齢で、２４頭の子豚全頭が攻撃感染を受けた。攻撃複合物はアクチノバシラス・プルロニューモニエの血清型１０野生分離株（ＨＶ２１１株）であった。攻撃用培養物は、攻撃前に新たに調製した。子豚にアクチノバシラス・プルロニューモニエをエアロゾル経路で攻撃感染させた。エアロゾルはＤｅｖｉｌｂｉｓネブライザー（総量３０ｍｌ）を用いて投与した。攻撃投与量は平板計数により決定し、その懸濁液は７．０ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌを含んでいた。
【００２７】
攻撃感染後、呼吸器疾患およびその他の異常を７日間、毎日スコア化し、その後、生存動物を剖検した。
【００２８】
用いたスコアリングシステムは以下の通りであった：
【表１】
2021506833.tif 000002
【００２９】
動物福祉上の理由から、瀕死状態であることが判明した動物を安楽死させた。死亡していることが判明した豚または安楽死させた豚について、典型的なアクチノバシラス・プルロニューモニエ病変の有無を検査し、そのうち肺葉あたりの程度を０〜５スケール（動物あたりの最大スコア：３５）でスコア化した。また、生存動物の肺を攻撃後７日目にスコア化した。
【００３０】
結果
実験開始時にはすべての豚が血清学的に陰性であり、攻撃時には、コーティング抗原として天然ＡｐｘＩを用いたＥＬＩＳＡ法で測定したところ、ワクチン接種動物はＡｐｘＩに対して抗体陽転していた。主な抗体価は、バキュロ−ＡｐｘＩ群および天然ＡｐｘＩ＋ＡｐｘＩＩ群でそれぞれｌｏｇ２  １２．９±１．６および１３．１±１．１であった。攻撃結果の要約を表１に示し、個々の豚について観察された臨床異常を表２に示す。
【表２】
2021506833.tif 000003
【表３】
2021506833.tif 000004
【００３１】
両ワクチン接種群で、臨床的徴候、死亡率および肺病変の有意な減少が観察された。２つのワクチン群間の差は統計的に有意ではなかった。したがって、バキュロウイルスによって組換え発現させたＲＴＸ毒素を含むワクチンは、市販のワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（商標）ＡＰＰが提供する防御と類似した防御効果をもたらすと結論づけることができる。
【国際調査報告】
2021506833.tif 000005
2021506833.tif 000006
2021506833.tif 000007
2021506833.tif 000008