(57)【要約】  本明細書で提供される実施形態のいくつかは、遺伝子組換えＴ細胞の作製方法および遺伝子組換えＴ細胞の作製用組成物に関する。このような実施形態のいくつかにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、一定量の無血清培地中で培養される。いくつかの実施形態では、共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞をレンチウイルスベクターで形質導入し、形質導入したＴ細胞集団を、従来の方法よりも短期間で回収することができる。
2021512618.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体を含む遺伝子組換えＴ細胞を製造する方法であって、
単一の培養容器中の第１の培地にＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する工程；
前記単一の培養容器中に第２の培地を入れて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を共培養し、形質導入のためにイニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を得る工程；
イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を回収する工程；ならびに
イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をベクターで形質導入して、遺伝子組換えＴ細胞を得る工程
を含む方法。
【請求項２】
生物学的安全キャビネット（BSC）内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的安全キャビネット（BSC）の外で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記形質導入が、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を（たとえばCTS Dynabeads CD3/CD28で）磁気濃縮し、形質導入混合物と所定の時間にわたってインキュベートすることによって行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞に形質導入培地を加える前に、前記培養容器から培養培地が除去される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記所定の時間が、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約１２時間、または約２時間〜約５時間である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記所定の時間が終了した後、前記除去した培地が前記容器に再導入される、請求項６〜８のいずれか１項に記載方法。
【請求項１０】
前記形質導入混合物が前記ベクターを含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の培地が、サイトカイン非含有培地であるか、ウシ胎児血清もウシ胎仔血清もこの組み合わせも含んでいない培地である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第２の培地が、少なくとも１種のサイトカインを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記形質導入工程が、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の回収工程の後、２４時間にわたって行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第１の培地または第２の培地が、タンパク質添加剤をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記形質導入混合物が、硫酸プロタミンもしくはポリブレンまたはその両方をさらに含む、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記形質導入混合物が、インターロイキンをさらに含む、請求項６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記形質導入混合物が、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−７、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子組換えＣＤ４＋Ｔ細胞および前記遺伝子組換えＣＤ８＋Ｔ細胞が、前記形質導入工程の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後もしくは１４日後、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の日数が経過した後に回収される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ベクターが、治療用タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療用タンパク質が、サイトカイン、キメラサイトカインタンパク質、キメラ共刺激タンパク質、炎症促進性タンパク質もしくは抗炎症性タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ベクターが、キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、ヌクレアーゼを使用してさらに改変される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Casシステム、RNA誘導エンドヌクレアーゼ、組換えメガヌクレアーゼ、または再組換えホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記キメラ抗原受容体が、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＴ細胞受容体の細胞内ドメインを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子組換えＴ細胞が、たとえばＣＤ１９と特異的に結合または相互作用するキメラ抗原受容体（CAR）などの、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクターが、遺伝子タグをコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子タグが、末端切断型上皮成長因子受容体（EGFRt）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子組換えＴ細胞の製造工程、たとえば単一の容器中でＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を処理する工程などが、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間もしくは１４日間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間にわたって行われる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２１、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
キメラ抗原受容体を含む遺伝子組換えＴ細胞を製造する方法であって、
（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、第１の培地を含む２つの別々の画分に分け、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第１の画分とＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第２の画分として提供する工程；
（ｂ）第１の培地中の各画分に少なくとも１種のサイトカインを提供する工程；
（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第１の画分とＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第２の画分を混合し、混合細胞画分を得る工程；
（ｄ）前記混合細胞画分に磁気ビーズ（たとえばDynabeads（たとえばCTS Dynabeads CD3/CD28）など）を提供し、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気的に濃縮する工程；
（ｅ）前記磁気ビーズ（たとえばDynabeads）を除去する工程；
（ｆ）ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を含む混合細胞画分を、単一の培養容器に入れる工程；
（ｇ）少なくとも１種のサイトカインを含むサイトカイン混合物を含む第２の培地を提供し、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を得る工程；
（ｈ）イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をベクターで形質導入して、遺伝子組換えＴ細胞を得る工程；ならびに
（ｉ）前記細胞を回収する工程
を含む方法。
【請求項３４】
工程ｂ）の前記少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２１、またはこれらの組み合わせである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＩＬ−２１とＩＬ−１５とＩＬ−７が、１０：５：１の比率で提供される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程ｇ）の少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＩＬ−２１とＩＬ−１５とＩＬ−７が、２：０．２：１の比率で提供される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記形質導入が、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を（たとえばCTS Dynabeads CD3/CD28で）磁気濃縮し、形質導入混合物と所定の時間にわたってインキュベートすることによって行われる、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞に形質導入培地を加える前に、前記培養容器から培養培地が除去される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記所定の時間が、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約１２時間、または約２時間〜約５時間である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記所定の時間が終了した後、前記除去した培地が前記容器に再導入される、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2018年2月6日に出願された「閉鎖系におけるCAR-T細胞の製造方法」という名称の米国仮特許出願第62/627,129号の優先権を主張するものであり、この出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、遺伝子組換えＴ細胞の作製方法および遺伝子組換えＴ細胞の作製用組成物に関する。このような実施形態のいくつかにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、一定量の無血清培地中で培養される。いくつかの実施形態では、共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞をレンチウイルスベクターで形質導入し、形質導入したＴ細胞集団を、従来の方法よりも短期間で回収する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の遺伝子組換えは、研究分野、医療分野、生物工学分野、農業分野などの様々な分野で利用されている。宿主ゲノムへ遺伝子を挿入するにあたり、利用可能な技術がいくつかある。たとえば、細胞の核膜を通して核に直接核酸を注入したり、ウイルスベクターを使用して細胞に核酸を導入したりすることによって、遺伝子組換え細胞を作製してもよい。
【０００４】
ウイルスベクターを使用したトランスフェクションは、ウイルス形質導入として知られている技術において、遺伝子組換え細胞（Ｔ細胞など）の作製に使用される一般的な技術である。ウイルス（レンチウイルスやアデノウイルスなど）をキャリアとして使用して細胞に核酸を導入する。
【０００５】
ウイルスによる形質導入を使用して、細胞に遺伝子を挿入してもよく、細胞の遺伝子を組換えてもよく、たとえば、プラスミドを使用して哺乳動物細胞に遺伝子を挿入してもよく、哺乳動物細胞の遺伝子を組換えてもよい。ウイルスによる形質導入において使用されるプラスミドは、移入される遺伝子を含み、この移入遺伝子は、ウイルスタンパク質がウイルスゲノムを認識してこれをウイルス粒子にパッケージングするために利用するウイルス配列に挟まれている。このプラスミドは、感染性ビリオンの形成に必要とされるウイルス遺伝子を保有しうるその他のDNAコンストラクトと一緒に細胞内に挿入される。パッケージングコンストラクトによって発現されたウイルスタンパク質は、ウイルス粒子に移入および挿入されるDNA／RNA配列に結合しうる。通常、安全上の理由から、使用されるプラスミドには、ウイルスの形成に必要な配列のすべては含まれておらず、このことから、感染性ビリオンを得るためには、複数の種類のプラスミドを同時にトランスフェクトする必要がある。さらに、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子がパッケージングされないように、移入配列を保有するプラスミドのみが、ビリオンへの遺伝物質のパッケージングを可能にするパッケージングシグナルを含む。次に、トランスフェクト細胞からウイルスを回収し、遺伝子組換えを行う細胞に加える。これらのウイルスによる感染の初期段階は、天然ウイルスによる感染を模倣したものであり、移入された遺伝子が発現され、（レンチウイルス／レトロウイルスベクターの場合には）移入されるDNAが細胞のゲノムに挿入される。しかしながら、移入された遺伝物質は、ウイルス遺伝子をコードしないため、このような感染によって新たなウイルスは発生しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載の実施形態のいくつかは、最小限の物理的操作で、かつ従来の方法よりも短期間でレンチウイルス組換えＴ細胞を作製する方法に関する。いくつかの実施形態において、基礎培地、タンパク質添加剤およびサイトカインカクテルから調製したユニークな培地組成物中において、ＣＤ４ Ｔ細胞サブセットとＣＤ８ Ｔ細胞サブセットを共培養する。本発明のシステムでは、磁気的にＴ細胞を濃縮し、所定の時間または選択された時間にわたって、濃縮したＴ細胞を形質導入混合物とインサイチューでインキュベートすることによって、レンチウイルスによる組換えを行うこともできる。
【０００７】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、遺伝子組換えＴ細胞を製造する方法を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えＴ細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）を含む。このような方法のいくつかは、
単一の培養容器中の第１の培地にＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する工程；
前記単一の培養容器中に第２の培地を入れて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を共培養し、形質導入のためにイニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を得る工程；
イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を回収する工程；ならびに
イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をベクターで形質導入して、遺伝子組換えＴ細胞を得る工程
を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、すなわち、任意で、前記方法は、生物学的安全キャビネット（BSC）内で行われ、いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記方法は、生物学的安全キャビネット（BSC）の外で行われる。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。前記形質導入は、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を（たとえばCTS Dynabeads CD3/CD28で）磁気濃縮し、形質導入混合物と所定の時間にわたってインキュベートすることによって行うことが好ましい。いくつかの実施形態において、前記細胞に形質導入培地を加える前に、前記培養容器から培養培地が除去される。いくつかの実施形態において、前記所定の時間は、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約１２時間、または約２時間〜約５時間である。いくつかの実施形態において、前記所定の時間が終了した後、前記除去した培地は前記容器に再導入される。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物はベクターを含む。前記方法において、第１の培地は、サイトカイン非含有培地であることが好ましく、第２の培地は、少なくとも１種のサイトカイン（たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２１またはこれらの組み合わせ）を含むことが好ましい。いくつかの場合において、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはＩＬ−７である。前記方法において、前記形質導入工程は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のイニシエーション工程の後、２４時間にわたって行うことが好ましい。いくつかの実施形態におけるアプローチでは、第１の培地または第２の培地は、タンパク質添加剤をさらに含み、特定の場合、前記形質導入混合物は、硫酸プロタミンもしくはインターロイキンまたはその両方をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物は、硫酸プロタミンもしくはポリブレンまたはその両方をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物は、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−７、またはこれらの組み合わせを含む。前記方法を使用することによって、遺伝子組換えＣＤ４＋Ｔ細胞および遺伝子組換えＣＤ８＋Ｔ細胞が回収されることが好ましい。前記遺伝子組換えＣＤ４＋Ｔ細胞および前記遺伝子組換えＣＤ８＋Ｔ細胞は、前記形質導入工程の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後もしくは１４日後、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の日数が経過した後に回収される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸を含み、この治療用タンパク質は、サイトカイン、キメラサイトカインタンパク質、キメラ共刺激タンパク質、炎症促進性タンパク質、または抗炎症性タンパク質を含むことが望ましい。前記方法において、前記ベクターは、キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むことが好ましく、いくつかの実施形態において、前記イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ヌクレアーゼを使用してさら��改変されることが好ましい。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Casシステム、RNA誘導エンドヌクレアーゼ、組換えメガヌクレアーゼ、または再組換えホーミングエンドヌクレアーゼである。さらに、いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインもしくはＴ細胞受容体の細胞内ドメイン、またはこれらのドメインすべてを含む。前記方法によって、たとえばＣＤ１９と特異的に結合または相互作用するキメラ抗原受容体（CAR）などの、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する遺伝子組換えＴ細胞が得られることが好ましく、いくつかのアプローチでは、前記ベクターは、遺伝子タグ（たとえばEGFRt）をコードする第２の核酸をさらに含むことが好ましい。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えＴ細胞の製造工程、たとえば単一の容器中でＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を処理する工程などは、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間もしくは１４日間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間にわたって行ってもよい。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である。
【０００８】
第２の態様において、キメラ抗原受容体を含む遺伝子組換えＴ細胞を製造する方法を提供する。この方法は、
ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、第１の培地を含む２つの別々の画分に分け、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第１の画分とＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第２の画分として提供する工程；
ｂ）第１の培地中の各画分に少なくとも１種のサイトカインを提供する工程；
ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第１の画分とＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第２の画分を混合し、混合細胞画分を得る工程；
ｄ）前記混合細胞画分にDynabeads（たとえばCTS Dynabeads CD3/CD28）を提供し、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気的に濃縮する工程；
ｅ）Dynabeadsを除去する工程；
ｆ）ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を含む混合細胞画分を、単一の培養容器に入れる工程；
ｇ）少なくとも１種のサイトカインを含むサイトカイン混合物を含む第２の培地を提供し、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を得る工程；
ｈ）イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をベクターで形質導入して、遺伝子組換えＴ細胞を得る工程；ならびに
ｉ）前記細胞を回収する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、工程ｂ）の前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２１、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１とＩＬ−１５とＩＬ−７は、１０：５：１の比率である。いくつかの実施形態において、工程ｇ）の前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−７、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１とＩＬ−１５とＩＬ−７は、２：０．２：１の比率である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】遺伝子組換えＴ細胞の製造に関するいくつかの実施形態において使用してもよいG-Rex100MCS容器を示す。
【００１０】
【図２】遺伝子組換えＴ細胞の作製プロセスの代表的な一実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、遺伝子組換えＴ細胞の作製方法および遺伝子組換えＴ細胞の作製用組成物に関する。このような実施形態のいくつかにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、一定量の無血清培地中で培養される。いくつかの実施形態では、共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞をレンチウイルスベクターで形質導入し、形質導入したＴ細胞集団を、従来の方法よりも短期間で回収する。
【００１２】
治療に使用される遺伝子組換え細胞の現在の製造プロセスはコストが高く、遺伝子組換え細胞の市販製剤を製造するには、20,000ドル〜40,000ドルのコストがかかると推定される。また、遺伝子組換え細胞の製造自体も困難かつ労力を要し、無菌条件下で細胞のモニタリングおよび栄養供給を常時行う必要があり、市販の細胞培養バッグ（たとえば、Gibco社製の細胞培養バッグ、ミルテニー社製の細胞培養バッグ）において細胞を増殖させる技術が定まっていないという問題もある。さらに、遺伝子組換え細胞の製造プロセスは時間を要し、細胞製剤は、密接にモニタリングしながら、約14〜21日間またはそれ以上の時間をかけて増殖が行われ、このことから、同時に製造できる製剤の個数が制限されうる。概して、治療用の遺伝子組換え細胞の製造プロセスには多くの時間が必要とされ、大変な労力がかかる。本明細書で提供される実施形態のいくつかは、「開放系プロセス工程」を含む製造方法を含み、この方法では、単一のベクターを使用するか、または１部屋につき１人の患者を収容し、バイオセーフティキャビネット（BSC）（生物学的安全キャビネットとしても知られている）および遠心分離機を使用する。
【００１３】
本明細書で提供する方法の実施形態のいくつかは、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の効率的な形質導入および形質導入されたＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の効率的な増殖に関する。いくつかの実施形態において、形質導入されたＴ細胞には、キメラ抗原受容体などの治療薬が搭載されている。このような実施形態のいくつかにおいて、Ｔ細胞集団は、自家輸血において使用してもよい。いくつかの実施形態において、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満または３日未満で、対象の治療に十分な量の形質導入Ｔ細胞集団が提供できるように、形質導入細胞の増殖は十分に効率的である。いくつかの実施形態において、対象の治療に十分な量としては、形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の集団として、約200万個〜約20億個、約1000万個〜約10億個、約5000万個〜約10億個、約5億個〜約10億個、またはこれらの個数のいずれか２つによって定義される範囲内の個数を挙げることができる。いくつかの実施形態において、対象から得たＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、単一の容器に入れた一定量の培地中で培養される。いくつかの実施形態において、増殖培地は、無血清増殖培地である。いくつかの実施形態において、増殖培地には、少なくとも１種のサイトカインが添加される。いくつかの実施形態において、増殖培地には、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７が添加される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞などの遺伝子組換えＴ細胞は、単一の容器中で作製される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えＴ細胞の製造工程、たとえば単一の容器中でＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を処理する工程などは、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間もしくは１４日間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間にわたって行ってもよい。ユニークな培地の存在下において、２種類の細胞を共培養することによって、単一の容器中で、好ましくは７日間以内に、培養を完了させることができ、これに対して、従来の技術では、１４〜２１日間またはそれ以上の日数をかけて（たとえば１ヶ月間にわたって）培養を行う必要があり、２個の容器でこれら２つのサブセットをそれぞれ別々に増殖させる必要がある。本明細書に記載の実施形態を使用したインサイチュー形質導入は、従来の方法よりも非常に簡便で迅速であり、最小限の器具を使用し、完全な閉鎖系においてすべてのプロセスを実施することができる。
【００１５】
対象から得たＴ細胞から遺伝子組換えＴ細胞を作製する方法またはそのためのシステムの代表的な一実施形態を図２に示す。図２に示すように、Ｘ日目に、対象にアフェレーシスを実施してＴ細胞を得た後、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を選択およびソートし、液体窒素バンクに保存する。０日目に、保存しておいたＴ細胞をGRex容器中で培養することによってＴ細胞をイニシエートする。２日目に、イニシエートした細胞を、レンチウイルスベクターで形質導入する。７日目に、形質導入した細胞を回収し、保存することができる。
【００１６】
用語の定義
本開示において使用される用語は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有する。当業者であれば、本明細書全体を参照することにより、使用されている各用語を理解できるであろう。
【００１７】
本明細書において「a」または「an」は、１つまたは１つ以上を意味してもよい。
【００１８】
本明細書において「約」は、特定の値が、この値を決定するために用いられた方法に本質的に付随する誤差の変動または実験間での変動を含むことを示す。
【００１９】
本明細書で述べる「遺伝子組換え」または「遺伝子組換えされた」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、遺伝子工学技術を使用して改変した遺伝物質（核酸など）を使用して、細菌、Ｔ細胞、細菌細胞、真核細胞、昆虫、植物、哺乳動物などの生物や細胞を改変する方法が挙げられるが、これに限定されない。たとえば、まず、分子クローニング法を用いて目的の遺伝物質を単離し、複製することによってDNA配列を作製するか、あるいはDNAを合成し、得られたこのようなコンストラクトを宿主生物に挿入することによって、DNAなどの核酸を宿主ゲノムに挿入することができる。ヌクレアーゼを使用して、遺伝子を欠失させることができ、「ノックアウト」することもできる。遺伝子ターゲティングは、相同組換えにより内在性遺伝子を改変する別の技術であり、遺伝子欠失、エクソンの除去、遺伝子の付加または点突然変異導入を行うために使用することができる。
【００２０】
本明細書では、形質導入による遺伝子組換えについて述べる。「形質導入」とは、ベクターを使用して、DNAやRNAなどの遺伝物質を細胞に移入する方法を指す。一般的な技術では、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、および細胞透過性を向上させる化学試薬を使用する。DNAは、ウイルスまたはウイルスベクターにより移入することができる。本明細書では、免疫細胞であるＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を改変する方法について述べる。治療用遺伝子を高発現させるため、かつ／または細胞表面上のキメラ抗原受容体の発現量を増加させるために、たとえば、特定のタンパク質またはキメラ抗原受容体をコードする遺伝物質をＴ細胞に形質導入する。Ｔ細胞は、たとえば、ウイルスを使用して遺伝子組換えすることができる。遺伝子療法に一般に使用されるウイルスは、たとえば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルスまたはレンチウイルスである。
【００２１】
キメラ抗原受容体をコードする核酸を送達するための組換え感染性ウイルス粒子を利用した様々な形質導入技術が開発されてきた。このような形質導入技術は、現時点において、Ｔリンパ球を形質導入するためのアプローチとして好ましい。本明細書で述べるように、形質導入に使用するウイルスベクターとして、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスに由来するウイルスベクターを挙げることができる。このように、遺伝子導入方法および遺伝子発現方法としては様々なものが存在するが、このような方法は、哺乳動物細胞に遺伝物質を導入して発現させることを本質的な機能とする。前述した形質導入技術のいくつかは、造血細胞またはリンパ球に形質導入することを目的として使用することができ、このような形質導入技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション；プロトプラスト融合；エレクトロポレーション；または組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターもしくはレトロウイルスベクターによる感染が挙げられる。初代Ｔリンパ球への形質導入は、エレクトロポレーションまたはレトロウイルスもしくはレンチウイルスの感染によって成功を収めている。このように、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用することによって、真核細胞（たとえばＴ細胞）に非常に効率的に遺伝子を移入することができる。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルスの組み込みは制御下で行うことができ、細胞１個あたり１コピーまたは数コピーの新しい遺伝情報を安定して組み込むことができる。本明細書で述べるように、インサイチューで細胞に形質導入することができる。
【００２２】
「発現ベクター」または「ベクター」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子が挙げられるが、これに限定されない。通常、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、プロモーターの制御下に置かれた遺伝子はプロモーターに「作動可能に連結されている」と言われる。同様に、制御因子がコアプロモーターの活性を調節する場合、この制御因子とコアプロモーターは作動可能に連結されている。
【００２３】
ウイルスベクターは、細胞中の異種核酸を発現させるための制御因子を有していてもよい。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母、およびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、DNAまたはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００２４】
「spinoculation法」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、（細胞培養に）ウイルスを接種して、遠心することが挙げられるが、これに限定されない。
【００２５】
「培地」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、微生物または細胞の増殖を補助するように設計された固体、液体または半固体が挙げられるが、これらに限定されない。様々な種類の細胞を増殖させるために、様々な種類の培地が使用され、特定の場合、基礎培地と呼ばれることがある。本発明の実施形態のいくつかにおいて、培地は、単一の容器（たとえばG-Rex100MCS（図１）など）中において、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を含む細胞の増殖を補助するために添加される。基礎培地としては、たとえば、XVIVO-15（ロンザ社より販売）やPRIME-XV（Irvine Scientific社より販売）などの市販品が挙げられる。前記単一の容器は、ガス透過性であってもよく、柔軟な培養基材を含んでいてもよい。このような容器は、実質的に容量に制限がない栄養素／廃液リザーバーを備えている。また、このような容器は、テクスチャー加工された支持体を備え、このような支持体を備えることから、培養面での再現性が高くなっている。本発明のシステムは、閉鎖系と完全に適合する。実質的に培養の維持操作が必要とされないことが望ましく、このような容器であれば、容器内において様々な加工工程を行うことができ、物理的操作を最小限にすることができる。さらに、１週間で20億個を超える細胞の作製が可能であってもよく、培養バッグよりも廃液量が少なく済んでもよい。
【００２６】
「生物学的安全キャビネット（BSC）」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、所定のバイオセーフティーレベルが要求される病原体で汚染された材料、またはこのような病原体で汚染されている可能性のある材料を安全に取り扱うための、周囲が囲まれ換気された実験用作業空間が挙げられるが、これに限定されない。要求される生物学的封じ込めの程度に応じて、いくつかの種類のBSCが存在する。BSC内で作業する際のプロトコルは当業者に知られており、BSCは市販されている（たとえば、サーモサイエンティフィック社から生物学的安全キャビネットが販売されている）。
【００２７】
「タンパク質添加剤」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、細胞増殖用培地に添加される市販のタンパク質混合物が挙げられるが、これに限定されない。タンパク質添加剤は、民間企業から販売されているものであってもよく、たとえば、Knockout-SR（サーモフィッシャーサイエンティフィック社より販売）やウシ胎児血清などであってもよい。
【００２８】
「ヌクレアーゼ」または「エンドヌクレアーゼ」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断するように構成された酵素が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞の遺伝子組換えを行うために、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが該細胞に提供される。エンドヌクレアーゼとして、たとえば、CRISPR酵素や制限エンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態において、ウイルスベクターで細胞に形質導入する前に、ヌクレアーゼで細胞を遺伝子組換えしてもよい。
【００２９】
「制限酵素」または「制限エンドヌクレアーゼ」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、特定の認識ヌクレオチド配列のDNAまたはその近傍のDNAを認識してこれに結合し、制限切断部位で該DNAを切断することができる酵素が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼの認識部位は、特定の制限エンドヌクレアーゼに特異的である。
【００３０】
「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、TalエフェクターのDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって作製された人工制限酵素が挙げられるが、これに限定されない。Talエフェクターは、細菌由来のDNA結合タンパク質であり、Talエフェクター同士の間で高い相同性を持つ34個のアミノ酸モジュールからなり、各アミノ酸モジュールは、特定の１つのヌクレオチドに高い親和性で結合することができる。TALENモジュールの１２番目および１３番目の可変アミノ酸は、repeat variable dinucleotide（RVD）と呼ばれ、塩基特異性を付与し（たとえば、ＮＮ→Ｇ／Ａ、ＮＩ→Ａ、ＮＧ→Ｔ、ＮＫ→Ｇ、ＨＤ→Ｃ、およびＮＳ→Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ）、各TALENモジュールを組み合わせることによって、所望のヌクレオチド配列を標的とするTALENアレイを作製することができる。前述のアミノ酸配列とDNA認識要素の関係から、対応するRepeat Variable Diresidue（RVD）と接触する反復配列セグメントの組み合わせを選択することによって、特異的なDNA結合ドメインの作製が可能である。TALENを使用して、目的の細胞において二本鎖切断（DSB）を誘導すると、その細胞がいくつかの種類の修復機構の誘導し、その結果、ゲノム編集を行うことができる。
【００３１】
「ジンクフィンガータンパク質（ZFP）」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、真核生物由来のDNA結合タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。ゲノム編集用の最も一般的なZFPモチーフは、たとえば、Cys2-His2型フィンガーであり、種類ごとに特定のヌクレオチドトリプレットに特異的である。各ジンクフィンガーを組み合わせることによって、通常9〜18ヌクレオチド長の特定のDNA配列を標的とする人工ZFPドメインを作製することができる。「デザイナージンクフィンガータンパク質」は、様々な細胞のほぼすべての目的遺伝子に対して、機能ドメインをターゲティングする技術を広範囲に適用可能とすることを目的として、DNA結合特異性が意図的に再組換えされたジンクフィンガータンパク質を指す。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、様々な種類のヒト細胞において標的ゲノム操作を行うための強力なツールである。ZFNは、遺伝子組換えされたDNA結合性ジンクフィンガードメインが、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに連結されたものであり、相同組換えおよび非相同組換えの両方を刺激する二本鎖切断（DSB）を導入することができ、これを利用してゲノム操作を行うことができる。したがって、ZFPは、研究用途および遺伝子療法用途の両方において潜在的能力を備えている。
【００３２】
「Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、短い塩基長の反復配列を含み、各反復配列の後ろに、ウイルスへの暴露によって生じたスペーサーDNAの短いセグメントが続いているDNA遺伝子座が挙げられるが、これに限定されない。CRISPR領域は、CRISPRと関連するタンパク質をコードするcas遺伝子と関連している場合がある。CRISPR/Casシステムは、原核生物の免疫系であり、プラスミドやファージなどの外来遺伝因子に対する耐性を付与し、後天性免疫として機能する。CRISPRスペーサーは、真核生物で見られるRNAiとよく似た方法で、これらの外因遺伝因子を認識し切断する。ゲノム編集機構としては、RNA誘導エンドヌクレアーゼ、Casタンパク質および適切なガイドRNAを、特定の生物の細胞に送達することができ、所望の位置でこの生物のゲノムを切断することができる。CRISPRは、遺伝子のターゲティングおよび遺伝子組換え用の効率的な機構である。
【００３３】
「MegaTal」ヌクレアーゼは、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、組換え可能であるというTALエフェクターの特性と、メガヌクレアーゼ（MN）切断ドメインの切断配列特異性とを組み合わせたハイブリッドヌクレアーゼ構造が挙げられるが、これに限定されない。MegaTalの構造を利用することによって、ウイルスを使用した細胞送達方法およびウイルスを使用しない細胞送達方法と適合した活性かつ特異的なヌクレアーゼを作製することができる。
【００３４】
「キメラ抗原受容体（CAR）」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体または遺伝子組換え受容体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの受容体を使用して、たとえば、モノクローナル抗体またはその結合部分の特異性を所望の細胞（たとえばＴ細胞）に移植することができる。レシピエント細胞へのCARのコード配列の移植は、レトロウイルスベクターを使用して行われることが多い。CARの構造は、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変領域断片（scFv）を含んでいてもよく、このscFvが、CD3ζ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合されている。これらの分子は、scFvが標的細胞によって認識されると、これに応答してζシグナル伝達を誘導する。
【００３５】
「CD19」は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、Ｂリンパ球の抗原受容体と会合して抗原受容体依存性刺激の閾値を低下させることが可能な、白血球の表面上に存在するタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。CD19は、濾胞樹状細胞およびＢ細胞上に発現される。CD19は、Ｂリンパ芽球へと発達する過程において最も初期に見られるＢ系細胞系列に見られるが、形質細胞に成熟すると失われる。CD19は、主に、CD21およびCD81と一緒になってＢ細胞補助受容体として作用する。CD19は、活性化されると、その細胞内尾部がリン酸化され、そこにSrcファミリーキナーゼが結合し、PI-3キナーゼが動員される。Ｔ細胞と同様に、いくつかのＢ細胞表面分子が抗原受容体を形成し、Ｂリンパ球上で複合体を形成する。
【００３６】
全体として、本明細書に記載の遺伝子組換え細胞の作製方法の様々な実施形態は、完全な閉鎖系ですべての工程を行うことが可能であることが望ましく、このことから、この方法の実施に必要な培養器具やチューブ接続以上の物理的な隔たりなく、同じ空間で同時に、複数種のウイルスコンストラクト（たとえばレンチウイルスコンストラクト）を使用してこの方法を実施することにより、複数の患者に対してそれぞれに対応する製剤を作製することが可能となる。このことは、施設設計およびワークフロー設計にとって大きな意味合いを持ち、製造現場の空間およびスタッフを非常に効率よく利用することが可能となる。
【００３７】
前記方法を使用して、ウイルスによる形質導入により、キメラ抗原受容体（CAR）を発現するＴ細胞を作製してもよい。このＴ細胞は、本明細書に記載のシステムにおいて、その他の操作または遺伝子組換えを行ってもよく、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルスまたはレトロウイルスによって改変することが好ましい。
【００３８】
遺伝子組換えＴ細胞を作製するための特定の方法
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体を含む遺伝子組換えＴ細胞を製造する方法であって、
単一の培養容器中の第１の培地にＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する工程；
前記単一の培養容器中に第２の培地を入れて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を共培養し、形質導入のためにイニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を得る工程；
イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を回収する工程；ならびに
イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をベクターで形質導入して、遺伝子組換えＴ細胞を得る工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、生物学的安全キャビネット（BSC）内で行われる。いくつかの実施形態において、前記方法は、生物学的安全キャビネット（BSC）の外で行われる。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記形質導入は、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を（たとえばCTS Dynabeads CD3/CD28で）磁気濃縮し、形質導入混合物と所定の時間にわたってインキュベートすることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞に形質導入培地を加える前に、前記培養容器から培養培地が除去される。いくつかの実施形態において、前記所定の時間は、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約１２時間、または約２時間〜約５時間である。いくつかの実施形態において、前記所定の時間が終了した後、前記除去した培地は前記容器に再導入される。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物はベクターを含む。いくつかの実施形態において、第１の培地はサイトカイン非含有培地である。いくつかの実施形態において、第２の培地は、少なくとも１種のサイトカインを含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２１、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７である。いくつかの実施形態において、前記形質導入工程は、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の回収工程の後、２４時間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、第１の培地または第２の培地は、タンパク質添加剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物は、硫酸プロタミンもしくはポリブレンまたはその両方をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物は、インターロイキンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物は、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−７、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えＣＤ４＋Ｔ細胞および前記遺伝子組換えＣＤ８＋Ｔ細胞は、前記形質導入工程の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後もしくは１４日後、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の日数が経過した後に回収される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記治療用タンパク質は、サイトカイン、キメラサイトカインタンパク質、キメラ共刺激タンパク質、炎症促進性タンパク質、または抗炎症性タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ヌクレアーゼを使用してさらに改変される。いくつかの実施形態に��いて、前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Casシステム、RNA誘導エンドヌクレアーゼ、組換えメガヌクレアーゼ、または再組換えホーミングエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＴ細胞受容体の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えＴ細胞は、たとえばＣＤ１９と特異的に結合または相互作用するキメラ抗原受容体（CAR）などの、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、遺伝子タグをコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子タグはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えＴ細胞の製造工程、たとえば単一の容器中でＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を処理する工程などは、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間もしくは１４日間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間にわたって行ってもよい。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２１、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体を含む遺伝子組換えＴ細胞を製造する方法であって、
ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、第１の培地を含む２つの別々の画分に分け、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第１の画分とＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第２の画分として提供する工程；
ｂ）第１の培地中の各画分に少なくとも１種のサイトカインを提供する工程；
ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第１の画分とＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第２の画分を混合し、混合細胞画分を得る工程；
ｄ）前記混合細胞画分に磁気ビーズ（たとえばDynabeads（たとえばCTS Dynabeads CD3/CD28）など）を提供し、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気的に濃縮する工程；
ｅ）前記磁気ビーズ（たとえばDynabeads）を除去する工程；
ｆ）ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を含む混合細胞画分を、単一の培養容器に入れる工程；
ｇ）少なくとも１種のサイトカインを含むサイトカイン混合物を含む第２の培地を提供し、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を得る工程；
ｈ）イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をベクターで形質導入して、遺伝子組換えＴ細胞を得る工程；ならびに
ｉ）前記細胞を回収する工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、工程ｂ）の前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１である。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１とＩＬ−１５とＩＬ−７は、１０：５：１の比率である。いくつかの実施形態において、工程ｇ）の少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７である。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１とＩＬ−１５とＩＬ−７は、２：０．２：１の比率である。いくつかの実施形態において、前記方法は、生物学的安全キャビネット（BSC）内で行われる。いくつかの実施形態において、前記方法は、生物学的安全キャビネット（BSC）の外で行われる。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記形質導入は、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を（たとえばCTS Dynabeads CD3/CD28で）磁気濃縮し、形質導入混合物と所定の時間にわたってインキュベートすることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物はベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記形質導入工程は、イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の回収工程の後、２４時間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物は、硫酸プロタミンもしくはポリブレンまたはその両方をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物は、インターロイキンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記形質導入混合物は、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えＣＤ４＋Ｔ細胞および前記遺伝子組換えＣＤ８＋Ｔ細胞は、前記形質導入工程の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後もしくは１４日後、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の日数が経過した後に回収される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記治療用タンパク質は、サイトカイン、キメラサイトカインタンパク質、キメラ共刺激タンパク質、炎症促進性タンパク質、または抗炎症性タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記イニシエートされたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ヌクレアーゼを使用してさらに改変される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Casシステム、RNA誘導エンドヌクレアーゼ、組換えメガヌクレアーゼ、または再組換えホーミングエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび／またはＴ細胞受容体の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態に��いて、前記遺伝子組換えＴ細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、遺伝子タグをコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えＴ細胞の製造工程、たとえば単一の容器中でＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を処理する工程などは、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間もしくは１４日間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間にわたって行ってもよい。
【実施例】
【００４０】
実施例１−単一の容器における１段階プロセス
単一の容器において１段階プロセスを行うためのプロトコルの一例を表１に示す。
【表１】
2021512618.tif 000003
2021512618.tif 000004
2021512618.tif 000005
【００４１】
実施例２−単一の容器における１段階プロセス
単一の容器において１段階プロセスを行うためのプロトコルの一例を表２に示す。
【表２】
2021512618.tif 000006
2021512618.tif 000007
実施例３−単一の容器における１段階プロセスと従来のプロセスの比較
実施例１に記載のプロセスと実質的に同様の方法で、単一の容器において１段階プロセスを実施した。表３は、単一の容器における本発明の１段階プロセス（84121）と、PLAT-02臨床試験において使用された従来の遺伝子組換えＴ細胞の作製方法との比較を示す。PLAT-02臨床試験での方法では、ウシ胎児血清（FBS）を含む培地を入れたバッグ中で細胞を培養し、ＣＤ４集団とＣＤ８集団は別々に培養した。
【表３】
2021512618.tif 000008
【００４２】
本明細書で使用されている複数形および／または単数形の用語は、当業者であれば、本明細書の記載および／または用途に適するように、複数形の用語を単数のものとして、かつ／または単数形の用語を複数のものとして解釈することができる。本発明を明確なものとするために、様々な単数形／複数形の用語が意図的に使い分けられている。
【００４３】
当業者であれば、本明細書に記載の用語、特に添付の請求項（たとえば添付の請求項の本体部）に記載の用語は、通常、「オープンエンドな」用語であることを理解できるであろう（たとえば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（include）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、特定の数が請求項に記載されている場合、前述のような意図も請求項に明確に記載されており、特定の数が記載されていない場合はそのような意図も存在しないことも、当業者であれば理解できるであろう。具体的に説明をすれば、たとえば、後述の特許請求の範囲では、請求項を定義するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが記載されているからといって、不定冠詞「１つ（aまたはan）」を使用して構成要素が記載された請求項を、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「１つ（aまたはan）」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではない（たとえば、「１つ（aおよび／またはan）」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈すべきである）。これは、定冠詞を使用して記載された請求項でも同じである。また、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、「少なくとも」記載されたその数であるということを当業者であれば理解するであろう（たとえば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を意味する）。さらに、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。また、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、記載された用語のうちの１つ、記載された用語のいずれか、または記載された用語の両方を含む場合があると当業者であれば理解するであろ��。たとえば「ＡまたはＢ」という表現は、「ＡまたはＢ」または「ＡおよびＢ」を含む場合がある。
【００４４】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された各メンバーまたはそれらからなるサブグループについても記載されていると理解できるであろう。
【００４５】
第１の態様および第２の態様で述べた実施形態の特徴はいずれも、本明細書に記載のあらゆる態様および実施形態に適用可能である。さらに、第１の態様および第２の態様で述べた実施形態の特徴はいずれも、その一部または全体がそれぞれ独立して、本明細書に記載のその他の実施形態とどのようにでも組み合わせることができ、たとえば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の実施形態の全体またはその一部を組み合わせてもよい。
【図１】
2021512618.tif 000009
【図２】
2021512618.tif 000010
【国際調査報告】
2021512618.tif 000011
2021512618.tif 000012
2021512618.tif 000013