(57)【要約】  本発明がＳＮＣＡタンパク質発現減少にいたる、細胞におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ(例えば、イントロンエクソン接合部)を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。ＳＮＣＡタンパク質発現減少が医学的障害、例えば、神経学障害の処置に有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ−シヌクレイン(ＳＮＣＡ)転写物内の核酸配列と相補的である１０〜３０のヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、核酸配列が配列番号１のヌクレオチド７５９２〜７６３７を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
核酸配列が配列番号１のヌクレオチド７６０２〜７６２７を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
核酸配列が配列番号１のヌクレオチド７６０３〜７６２０に対応する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
核酸配列が配列番号１のヌクレオチド７６０４〜７６２０に対応する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＮＣＡ転写物が配列番号１を含む、請求項１〜４の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
連続的ヌクレオチド配列が１、２、３または４個のミスマッチを有する配列番号４〜配列番号２１を含む、請求項１〜５の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
連続的ヌクレオチド配列が配列番号４〜配列番号２１を含む、請求項１〜５の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
連続的ヌクレオチド配列が配列番号１５または配列番号７を含む、請求項１〜５の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがヒトＳＮＣＡ転写物を発現する細胞におけるヒトＳＮＣＡ転写物の発現を阻害できる、請求項１〜８の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
連続的ヌクレオチド配列が少なくとも１個のヌクレオチドアナログを含む、請求項１〜９の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ギャップマーである、請求項１〜１０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
交互フランクギャップマーである、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−３'の式を含み、ここで
(ｉ)領域ＢがＲＮａｓｅを動員できる少なくとも６ＤＮＡ単位の連続配列であり；
(ii)領域Ａは１〜１０ヌクレオチドの第一ウイング配列であり、該第一ウイング配列は１個以上のヌクレオチドアナログおよび所望により１個以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチドアナログの少なくとも１個はＡの３'末端に位置し；そして
(iii)領域Ｃは１〜１０ヌクレオチドの第二ウイング配列であり、該第二ウイング配列は１個以上のヌクレオチドアナログおよび所望により１個以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチドアナログの少なくとも１個はＣの５'末端に位置する、
請求項１１または１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
領域Ａが(ｉ)１〜１０ヌクレオチドアナログおよび０ＤＮＡ単位；(ii)１〜９ヌクレオチドアナログおよび１ＤＮＡ単位；(iii)１〜８ヌクレオチドアナログおよび１〜２ＤＮＡ単位；(iv)１〜７ヌクレオチドアナログおよび１〜３ＤＮＡ単位；(ｖ)１〜６ヌクレオチドアナログおよび１〜４ＤＮＡ単位；(vi)１〜５ヌクレオチドアナログおよび１〜５ＤＮＡ単位；(vii)１〜４ヌクレオチドアナログおよび１〜６ＤＮＡ単位；(viii)１〜３ヌクレオチドアナログおよび１〜７ＤＮＡ単位；(ix)１〜２ヌクレオチドアナログおよび１〜８ＤＮＡ単位；および(ｘ)１ヌクレオチドアナログおよび１〜９ＤＮＡ単位から選択されるヌクレオチドアナログおよびＤＮＡ単位を含む、
請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
領域Ｃが(ｉ)１〜１０ヌクレオチドアナログおよび０ＤＮＡ単位；(ii)１〜９ヌクレオチドアナログおよび１ＤＮＡ単位；(iii)１〜８ヌクレオチドアナログおよび１〜２ＤＮＡ単位；(iv)１〜７ヌクレオチドアナログおよび１〜３ＤＮＡ単位；(ｖ)１〜６ヌクレオチドアナログおよび１〜４ＤＮＡ単位；(vi)１〜５ヌクレオチドアナログおよび１〜５ＤＮＡ単位；(vii)１〜４ヌクレオチドアナログおよび１〜６ＤＮＡ単位；(viii)１〜３ヌクレオチドアナログおよび１〜７ＤＮＡ単位；(ix)１〜２ヌクレオチドアナログおよび１〜８ＤＮＡ単位；および(ｘ)１ヌクレオチドアナログおよび１〜９ＤＮＡ単位から選択されるヌクレオチドアナログおよびＤＮＡ単位を含む、
請求項１３または１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
領域Ａが図２および３の任意のＡＳＯから選択される第一ウイング設計であるおよび／または領域Ｃが図２および３の任意のＡＳＯから選択される第二ウイング設計であり、ここで、大文字はヌクレオチドアナログであり、小文字はＤＮＡである、請求項１３〜１５の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個のヌクレオチドアナログを含む、請求項１〜１６の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ヌクレオチドアナログまたはアナログがロックド核酸(ＬＮＡ)；２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ；２'−アミノ−ＤＮＡ；２'−フルオロ−ＤＮＡ；アラビノ核酸(ＡＮＡ)；２'−フルオロ−ＡＮＡ、ヘキシトール核酸(ＨＮＡ)、挿入核酸(ＩＮＡ)、拘束エチルヌクレオシド(ｃＥｔ)、２'−Ｏ−メチル核酸(２'−ＯＭｅ)、２'−Ｏ−メトキシエチル核酸(２'−ＭＯＥ)およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される１以上の糖修飾ヌクレオシドである、請求項１０〜１７の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
ヌクレオチドアナログまたはアナログが二環式糖を含む、請求項１０〜１７の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
二環式糖がｃＥｔ、２',４'−拘束２'−Ｏ−メトキシエチル(ｃＭＯＥ)、ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２'−Ｏ,４'−Ｃ−エチレン−架橋核酸(ＥＮＡ)、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡまたはチオ−ＬＮＡを含む、請求項１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
１以上のヌクレオチドアナログまたはアナログがＬＮＡを含む、請求項１０〜２０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが１個以上の５'メチルシトシン核酸塩基を含む、請求項１０〜２１の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの５'領域に２〜５個のＬＮＡを含む、請求項２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの３'領域に２〜５個のＬＮＡを含む、請求項２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが総スコア４以下のインビボ忍容性を有し、ここで、総スコアは１)活動過多；２)活動および覚醒低下；３)運動機能障害および／または運動失調；４)異常体位および呼吸；および５)震えおよび／または痙攣の５個のカテゴリーの単位スコアの合計であり、各カテゴリーの単位スコアは０〜４のスケールである、請求項１〜２４の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
インビボ忍容性が総スコア３、総スコア２、総スコア１または総スコア０以下である、請求項２５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、細胞におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少させる、請求項１〜２６の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現を少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％減少させる、請求項１〜２７の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧおよび少なくとも１個のヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧのアナログを含み、０.２以上の配列スコアを有し、該配列スコアは式Ｉにより計算される：
【数１】
2021510511.tif 000018
請求項１〜２８の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
１０〜２４のヌクレオチド長または１４〜２１のヌクレオチド長を有する、請求項１〜２９の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１のヌクレオチド長を有する、請求項１〜３０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
ヌクレオチド配列が図２および３の設計からなる群から選択される設計を有する配列番号４〜２１からなる群から選択される配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡである、請求項１〜３１の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
ヌクレオチド配列がＡＳＯ−００５４５９の設計を有する配列番号１５およびＡＳＯ−００５５７８またはＡＳＯ−００５５８４の設計を有する配列番号７を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、請求項３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
ヌクレオチド配列が図２および３の対応する化学構造を有する配列番号４〜２１からなる群から選択される配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、請求項１〜３１の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
ヌクレオチド配列がＡＳＯ−００５４５９、ＡＳＯ−００５５７８およびＡＳＯ−００５５８４を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
ＡＳＯがＣ１７１Ｈ２１４Ｎ５６Ｏ９０Ｐ１６Ｓ１６の分子式を含む、請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
ＡＳＯがＣ１８２Ｈ２２９Ｎ５８Ｏ９６Ｐ１７Ｓ１７の分子式を含む、請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
ＡＳＯがＣ１８１Ｈ２２７Ｎ５８Ｏ９６Ｐ１７Ｓ１７の分子式を含む、請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせから選択されるヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜３５の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
ヌクレオシド間結合が１以上の立体規定、修飾ホスフェート結合を含む、請求項３９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートであって、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に結合する、コンジュゲート。
【請求項４２】
非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分がタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたは任意のこれらの組み合わせを含む、請求項４１に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項４１または４２に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４４】
さらに治療剤を含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
治療剤がアルファ−シヌクレインアンタゴニストである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
アルファ−シヌクレインアンタゴニストが抗アルファ−シヌクレイン抗体またはそのフラグメントである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４１または４２に記載のコンジュゲートまたは請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物および使用指示を含む、キット。
【請求項４８】
請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４１または４２に記載のコンジュゲートまたは請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物および使用指示を含む、診断キット。
【請求項４９】
細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現を阻止または減少する方法であって、請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項４１または４２に記載のコンジュゲートまたは請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物をＳＮＣＡタンパク質発現細胞に投与することを含み、ここで、細胞のＳＮＣＡタンパク質発現が該投与後阻止または減少される、方法。
【請求項５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが投与後、細胞のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を阻害または減少する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの発現が投与後、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少される、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現を少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％減少させる、請求項４９〜５１の何れかに記載の方法。
【請求項５３】
細胞が神経細胞である、請求項４９〜５２の何れかに記載の方法。
【請求項５４】
対象に有効量の請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４１または４２に記載のコンジュゲートまたは請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物を投与することを含む、処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病を処置する方法。
【請求項５５】
医薬の製造のための、請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４１または４２に記載のコンジュゲートまたは請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物の使用。
【請求項５６】
処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の処置用医薬の製造のための、請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４１または４２に記載のコンジュゲートまたは請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物の使用。
【請求項５７】
治療に使用するための、請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４１または４２に記載のコンジュゲートまたは請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物。
【請求項５８】
処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の治療に使用するための、請求項１〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４１または４２に記載のコンジュゲートまたは請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物。
【請求項５９】
シヌクレイン病がパーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、多系統萎縮症、レビー小体型認知症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法、請求項５５または５６に記載の使用または請求項５７または５８に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６０】
対象がヒトである、請求項５４または５９に記載の方法、請求項５５、５６および５９の何れかに記載の使用または請求項５７〜５９の何れかに記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物が経口、非経腸、髄腔内、脳室内、肺、局所的または心室内投与される、請求項５４、５９および６０の何れかに記載の方法、請求項５５、５６、５９および６０の何れかに記載の使用または請求項５７〜６０の何れかに記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６２】
ヌクレオチドアナログが糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１０〜４０の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４１または４２に記載のコンジュゲート、請求項４３〜４６の何れかに記載の組成物、請求項４７または４８に記載のキット、請求項４９〜５４および５９〜６１の何れかに記載の方法、請求項５５、５６および５９〜６１の何れかに記載の使用または請求項５７〜６１の何れかに記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
糖修飾ヌクレオシドが親和性増強糖修飾ヌクレオシドである、請求項６２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、組成物、キット、方法、使用または使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願において電子的に提供した配列表の引用
本出願において電子的に提供した配列表(名称：3338.109PC01_SequenceListing_ST25.txt、サイズ：１３,８１７バイト；および作成日：２０１９年１月１０日)の内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アルファ−シヌクレイン(ＳＮＣＡ)タンパク質発現減少にいたる、細胞のアルファ−シヌクレイン(ＳＮＣＡ)転写物のイントロンエクソン接合部を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物(ＡＳＯ)に関する。ＳＮＣＡタンパク質発現減少は、多系統萎縮症、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)およびレビー小体型認知症などの一定範囲の医学的障害に有益であり得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
シヌクレインタンパク質ファミリーのメンバーであるアルファ−シヌクレイン(ＳＮＣＡ)は、主に神経組織内で発現される小可溶性タンパク質である。Marques O et al., Cell Death Dis. 19: e350 (2012)参照。多くの細胞型で発現されるが、神経細胞のシナプス前終末ないに優勢に局在化する。厳密な機能はまだ完全には解明されていないが、ＳＮＣＡは、シナプス伝達の制御に重要な役割を有することが示唆されている。例えば、ＳＮＣＡは、ＳＮＡＲＥ複合体形成における分子シャペロンとして機能し、これは神経細胞のシナプス小胞とシナプス前膜のドッキングに介在する。ＳＮＣＡは微小管関連タンパク質タウなどの他のタンパク質とも相互作用でき、これは、微小管安定化を助け、小胞輸送を制御する。
【０００４】
シナプス伝達制御におけるＳＮＣＡの役割のため、ＳＮＣＡ発現および／または機能の改変は重要な生物学的過程を妨害し得る。このような妨害は、脳内のＳＮＣＡタンパク質凝集体の異常蓄積により特徴づけられる神経変性疾患である、α−シヌクレイン病に寄与すると考えられている。従って、誤って折り畳まれた、凝集したかつリン酸化したＳＮＣＡタンパク質の不溶性封入体は、パーキンソン病(ＰＤ)、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症(ＤＬＢ)および多系統萎縮症(ＭＳＡ)などの疾患の病理学的特徴である。Galvin JE et al., Archives of Neurology 58: 186-190 (2001); and Valera E et al., J Neurochem 139 Suppl 1: 346-352 (Oct. 2016)参照。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
パーキンソン病などのα−シヌクレイン病は、特に高齢者で非常に多くみられる進行性神経変性脳障害である。Recchia A et al., FASEB J. 18: 617-26 (2004)参照。世界中で約７００万〜１０００万人がこのような障害をもって生活し、米国単独で毎年約６０,０００の新規症例があると推定される。一個人に対する医療費は年間＄２,５００を優に超え、治療的手術は患者あたり最大＄１００,０００の費用となり得る。それ故に、より強固かつ費用効率のよい処置選択肢の必要性が大きい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、アルファ−シヌクレイン(ＳＮＣＡ)転写物内の核酸配列と相補的である１０〜３０のヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)に関し、ここで、核酸配列は配列番号１のヌクレオチド７５９２〜７６３７を含む。ある実施態様において、核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７６０２〜７６２７を含む。他の実施態様において、核酸配列は配列番号１のヌクレオチド７６０３〜７６２０に対応する。ある実施態様において、核酸配列は配列番号１のヌクレオチド７６０４〜７６２０に対応する。ある実施態様において、ＳＮＣＡ転写物は配列番号１を含む。ある実施態様において、１個、２個、３個または４個のミスマッチを有する連続的ヌクレオチド配列である配列番号４〜配列番号２１を含む。他の実施態様において、連続的ヌクレオチド配列は配列番号４〜配列番号２１を含む。ある実施態様において、連続的ヌクレオチド配列は配列番号１５または配列番号７を含む。
【０００７】
ある実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＳＮＣＡ転写物を発現する細胞のヒトＳＮＣＡ転写物の発現阻害ができる。
【０００８】
ある実施態様において、連続的ヌクレオチド配列は少なくとも１個のヌクレオチドアナログを含む。ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは交互フランクギャップマーである。
【０００９】
ある実施態様において、ここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドは５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−３'の式を含み、ここで、(ｉ)領域Ｂは、ＲＮａｓｅを動員できる少なくとも６のＤＮＡ単位の連続配列であり；(ii)領域Ａは１〜１０ヌクレオチドの第一ウイング配列であり、該第一ウイング配列は１以上のヌクレオチドアナログおよび所望により１以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチドアナログの少なくとも１つはＡの３'末端に位置し；そして(iii)領域Ｃは１〜１０ヌクレオチドの第二ウイング配列であり、該第二ウイング配列は１以上のヌクレオチドアナログおよび所望により１以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチドアナログの少なくとも１つはＣの５'末端に位置する。
【００１０】
ある実施態様において、領域Ａは、(ｉ)１〜１０ヌクレオチドアナログおよび０ＤＮＡ単位；(ii)１〜９ヌクレオチドアナログおよび１ＤＮＡ単位；(iii)１〜８ヌクレオチドアナログおよび１〜２ＤＮＡ単位；(iv)１〜７ヌクレオチドアナログおよび１〜３ＤＮＡ単位；(ｖ)１〜６ヌクレオチドアナログおよび１〜４ＤＮＡ単位；(vi)１〜５ヌクレオチドアナログおよび１〜５ＤＮＡ単位；(vii)１〜４ヌクレオチドアナログおよび１〜６ＤＮＡ単位；(viii)１〜３ヌクレオチドアナログおよび１〜７ＤＮＡ単位；(ix)１〜２ヌクレオチドアナログおよび１〜８ＤＮＡ単位；および(ｘ)１ヌクレオチドアナログおよび１〜９ＤＮＡ単位から選択されるヌクレオチドアナログおよびＤＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ｃは、(ｉ)１〜１０ヌクレオチドアナログおよび０ＤＮＡ単位；(ii)１〜９ヌクレオチドアナログおよび１ＤＮＡ単位；(iii)１〜８ヌクレオチドアナログおよび１〜２ＤＮＡ単位；(iv)１〜７ヌクレオチドアナログおよび１〜３ＤＮＡ単位；(ｖ)１〜６ヌクレオチドアナログおよび１〜４ＤＮＡ単位；(vi)１〜５ヌクレオチドアナログおよび１〜５ＤＮＡ単位；(vii)１〜４ヌクレオチドアナログおよび１〜６ＤＮＡ単位；(viii)１〜３ヌクレオチドアナログおよび１〜７ＤＮＡ単位；(ix)１〜２ヌクレオチドアナログおよび１〜８ＤＮＡ単位；および(ｘ)１ヌクレオチドアナログおよび１〜９ＤＮＡ単位から選択されるヌクレオチドアナログおよびＤＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ａは図２および３の何れかのＡＳＯから選択される第一ウイング設計であるおよび／または領域Ｃは図２および３の任意のＡＳＯから選択される第二ウイング設計であり、ここで、大文字はヌクレオシドアナログおよび小文字はＤＮＡである。
【００１１】
ある実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個のヌクレオチドアナログを含む。ある実施態様において、ヌクレオチドアナログまたはアナログは、ロックド核酸(ＬＮＡ)；２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ；２'−アミノ−ＤＮＡ；２'−フルオロ−ＤＮＡ；アラビノ核酸(ＡＮＡ)；２'−フルオロ−ＡＮＡ、ヘキシトール核酸(ＨＮＡ)、挿入核酸(ＩＮＡ)、拘束エチルヌクレオシド(ｃＥｔ)、２'−Ｏ−メチル核酸(２'−ＯＭｅ)、２'−Ｏ−メトキシエチル核酸(２'−ＭＯＥ)およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される１以上の糖修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、ヌクレオチドアナログまたはアナログは二環式糖を含む。ある実施態様において、二環式糖は、ｃＥｔ、２',４'−拘束２'−Ｏ−メトキシエチル(ｃＭＯＥ)、ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２'−Ｏ,４'−Ｃ−エチレン−架橋核酸(ＥＮＡ)、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡまたはチオ−ＬＮＡを含む。ある実施態様において、１以上のヌクレオチドアナログまたはアナログはＬＮＡを含む。
【００１２】
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは１以上の５'メチルシトシン核酸塩基を含む。ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５'領域に２〜５個のＬＮＡを含む。ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３'領域に２〜５個のＬＮＡを含む。
【００１３】
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、総スコア４以下のインビボ忍容性を有し、ここで、総スコアは１)活動過多；２)活動および覚醒低下；３)運動機能障害および／または運動失調；４)異常体位および呼吸；および５)震えおよび／または痙攣の５カテゴリーの単位スコアの合計であり、各カテゴリーの単位スコアは０〜４のスケールである。ある実施態様において、インビボ忍容性は総スコア３、総スコア２、総スコア１または総スコア０以下である。
【００１４】
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、細胞におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少させる。他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現を少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％減少させる。
【００１５】
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧおよび少なくとも１つのヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧのアナログを含み、０.２以上の配列スコアを有し、該配列スコアは式Ｉにより計算される：
【数１】
2021510511.tif 000002
【００１６】
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは１０〜２４ヌクレオチド長または１４〜２１ヌクレオチド長を有する。他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド長を有する。
【００１７】
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、図２および３における設計からなる群から選択される設計を有する配列番号４〜２１からなる群から選択される配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡである。ある実施態様において、ヌクレオチド配列は、ＡＳＯ−００５４５９の設計を有する配列番号１５およびＡＳＯ−００５５７８またはＡＳＯ−００５５８４の設計を有する配列番号７を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。他の実施態様において、ヌクレオチド配列は、図２および３の対応する化学構造を有する配列番号４〜２１からなる群から選択される配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。ある実施態様において、ヌクレオチド配列は、ＡＳＯ−００５４５９、ＡＳＯ−００５５７８およびＡＳＯ−００５５８４を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。ある実施態様において、本発明のＡＳＯはＣ１７１Ｈ２１４Ｎ５６Ｏ９０Ｐ１６Ｓ１６の分子式を含む。ある実施態様において、ＡＳＯはＣ１８２Ｈ２２９Ｎ５８Ｏ９６Ｐ１７Ｓ１７の分子式を含む。他の実施態様において、ＡＳＯはＣ１８１Ｈ２２７Ｎ５８Ｏ９６Ｐ１７Ｓ１７の分子式を含む。
【００１８】
ある実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせから選択されるヌクレオシド間結合を含む。ある実施態様において、ヌクレオシド間結合は、１以上の立体拘束、修飾ホスフェート結合を含む。
【００１９】
本発明はまたここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に結合する。ある実施態様において、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
【００２０】
またここに提供されるのは、ここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。ある実施態様において、組成物は、さらに治療剤を含む。ある実施態様において、治療剤はアルファ−シヌクレインアンタゴニストである。ある実施態様において、アルファ−シヌクレインアンタゴニストは抗アルファ−シヌクレイン抗体またはそのフラグメントである。
【００２１】
本発明は、さらに、ここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物を含むキットを提供する。また提供されるのは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物を含む診断キットである。
【００２２】
本発明はまた細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現を阻止または減少する方法に関し、方法はここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物をＳＮＣＡタンパク質発現細胞に投与することを含み、ここで、細胞のＳＮＣＡタンパク質発現が投与後阻止または減少される。ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後、細胞のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を阻害または減少する。ある実施態様において、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの発現は、投与後、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少される。他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現を少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％減少させる。ある実施態様において、細胞は神経細胞である。
【００２３】
ここに提供されるのは、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物を投与することを含む、処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病を処置する方法である。ある実施態様において、シヌクレイン病は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、多系統萎縮症、レビー小体型認知症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
またここに提供されるのは、医薬の製造のための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物の使用である。本発明はまた処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の処置用医薬の製造のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物の使用を提供する。ある実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物は、処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の処置に使用するためである。他の実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物は治療に使用するためである。
【００２５】
ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物は、経口、非経腸、髄腔内、脳室内、肺、局所的または心室内投与される。
【００２６】
ある実施態様において、ヌクレオチドアナログは糖修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、糖修飾ヌクレオシドは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、アルファ−シヌクレインゲノム(一部)、ｍＲＮＡおよびタンパク質配列を示す。図１Ａの配列は部分的ＳＮＣＡゲノム配列(すなわち、配列番号１の残基６００１〜８４００)を表す。配列番号１は、配列番号１のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ−ｍＲＮＡで「ｕ」として示される以外、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列と同一である。図１Ｂの配列番号２は、配列番号２のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡで「ｕ」として示される以外、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ配列を表す。図１ＣはＳＮＣＡタンパク質配列(配列番号３)を示す。
【００２８】
【図２】図２は、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロンエクソン接合部を標的とするＡＳＯの例を示す。図２の各カラムは、配列のみを指定した配列の番号(配列番号)、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列における標的開始および末端位置、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ配列における標的開始および末端位置、設計番号(DES No.)、設計でのＡＳＯ配列、ＡＳＯ番号(ASO No.)および化学構造でのＡＳＯ配列を示す。
【００２９】
【図３】図３は、ウイング設計修飾と共に、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロンエクソン接合部を標的とするＡＳＯを示す。図３の各カラムは、配列のみを指定した配列の番号(配列番号)、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列における標的開始および末端位置、設計番号(DES No.)、設計でのＡＳＯ配列、ＡＳＯ番号(ASO No.)および化学構造でのＡＳＯ配列および同定したウイング設計修飾を示す。ＤＥＳ−３１６３９２、ＤＥＳ−３１６３９３、ＤＥＳ−３１６３９４およびＤＥＳ−３１６３９５は、配列番号７について可能なＡＳＯ設計を示す。ＤＥＳ−２８７０３１、ＤＥＳ−２８７９５７、ＤＥＳ−２８７９５９、ＤＥＳ−２８７９６２、ＤＥＳ−２８８９０６およびＤＥＳ−３１３４１３は、配列番号１２について可能なＡＳＯ設計を示す。ＤＥＳ−３１９５３６、ＤＥＳ−３１９５３７、ＤＥＳ−３２５０５８、ＤＥＳ−３２５０５９、ＤＥＳ−３２５０６０、ＤＥＳ−３２５０６１、ＤＥＳ−３２５０６２、ＤＥＳ−３２５０６３、ＤＥＳ−３２５０６４、ＤＥＳ−３２５０６５、ＤＥＳ−３２５０６６、ＤＥＳ−３２５０６７、ＤＥＳ−３２５０６８およびＤＥＳ−３２５０６９は、配列番号１４について可能なＡＳＯ設計を示す。ＤＥＳ−３２４６３６、ＤＥＳ−３２４６３７、ＤＥＳ−３２４６３８、ＤＥＳ−３２４６３９、ＤＥＳ−３２４６４０、ＤＥＳ−３２４６４１、ＤＥＳ−３２４６４２、ＤＥＳ−３２４６４３、ＤＥＳ−３２４６４４、ＤＥＳ−３２４６４５、ＤＥＳ−３２４６４６およびＤＥＳ３２４６４７は、配列番号１５について可能なＡＳＯ設計を示す。ＡＳＯ設計について、大文字はヌクレオチドアナログ(例えば、ＬＮＡまたは２'−Ｏ−メチル(ＯＭｅ))を示し、小文字はＤＮＡを示す。下線があるまたはない大文字は、２文字が異なるヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡおよび２'−Ｏ−メチルであり得ることを示す。例えば、下線が引かれた大文字は２'−Ｏ−メチルであってよく、一方下線がない大文字はＬＮＡである。化学構造カラムを伴うＡＳＯにおいて、ＯＭｅは２'−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、ＬはＬＮＡであり、ＤはＤＮＡであり、ＬまたはＤの後ろの数字は、ＬＮＡまたはＤＮＡの数を意味する。
【００３０】
【図４】図４は、ヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２)(「ＳＫ細胞」)およびＡ５３Ｔ−ＰＡＣトランスジェニックマウスから単離した初代神経細胞(「ＰＡＣ神経細胞」)両者における、ＰＡＣ神経細胞について実施例２ＡおよびＳＫ細胞について実施例２Ｅに記載のとおり、種々のＡＳＯとインビトロ培養した後の、ＳＮＣＡタンパク質発現パーセント減少を示す。ＳＫ細胞について、細胞を２５μMのＡＳＯで処理し、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現(ギャップＤＨに対して正規化)を対照のパーセントとして示す。ＰＡＣ神経細胞について、細胞を４０nMまたは５μMのＡＳＯで処理し、ＳＮＣＡタンパク質発現(チューブリンに対して正規化)をパーセント阻害として示す。値が示されていないとき、特定のＡＳＯを、その特定の条件下で試験しなかったことを示す。
【００３１】
【図５】図５は、インビトロでＡ５３Ｔ−ＰＡＣトランスジェニックマウスから単離した初代神経細胞のＳＮＣＡタンパク質発現減少における種々のＡＳＯの有効性を示す。実施例２Ａに記載のとおり、ＰＡＣ神経細胞を種々のＡＳＯの１０点滴定を用いてインビトロで培養し、ＡＳＯの有効性(ＩＣ５０)をＳＮＣＡ対チューブリン発現(μM)として示す。
【００３２】
【図６】図６は、ＡＳＯ処置Ａ５３Ｔ−ＰＡＣトランスジェニックまたはＷＴ(野生型)マウスの忍容性スコア(「Ｔｏｘスコア」)ならびにＳＮＣＡ  ｍＲＮＡおよびＳＮＣＡタンパク質発現におけるパーセント減少(またはノックダウン、「ＫＤ」)を示す(実施例４参照)。忍容性スコアを、ＡＳＯ投与投与後１日目(１Ｄ)および２８日目(２８Ｄ)について示す。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡおよびＳＮＣＡタンパク質発現のパーセント減少を、ＡＳＯ投与後３日目および２８日目に海馬(Hippo)、脳幹(ＢＳ)および線条体(Str)において示す。
【００３３】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣトランスジェニックマウスから単離した初代神経細胞のＳＮＣＡおよびチューブリン(Ｔｕｂ)タンパク質発現に対するＡＳＯ−００５４５９の効果を示す。神経細胞をＡＳＯ−００５４５９の１０点滴定で処理し、ＳＮＣＡおよびチューブリンタンパク質の量を測定した。α−Ｓｙｎ／Ｔｕｂ比(図７Ａ)およびＴｕｂレベル(図７Ｂ)のパーセント阻害が示される。各データ点は、個々の反復を表す。
【００３４】
【図８】図８は、ヒト神経細胞のＳＮＣＡ(丸)、タンパク質Ｓ(アルファ)(ＰＲＯＳ１(四角))およびチューブリン(ＴＵＢＢ３(三角))ｍＲＮＡは発現レベルに対するＡＳＯ−００５４５９の効果を示す。神経細胞を種々の濃度のＡＳＯ−００５４５９で６日間処理し、次いで、ｍＲＮＡレベルをQUANTIGENE(登録商標)アッセイで測定した。ｍＲＮＡ発現レベルを対照のパーセントとして示す。データを、２回測定の平均±ＳＤとして示す。
【００３５】
【図９】図９は、１００μgのＡＳＯ−００５４５９(白四角)または対照媒体(黒丸)ＩＣＶ投与３日後のＡ５３Ｔ−ＰＡＣマウスの海馬でのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲで測定し、ギャップＤＨ  ｍＲＮＡで正規化し、次いで媒体群の平均発現レベルに対して表した。水平線は１の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。データを、２回測定の平均±ＳＤとして示す。示す統計は、１元配置ＡＮＯＶＡとダネットの事後検定に基づく。＊＊＊  ｐ＜０.００１。
【００３６】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＡＳＯ−００５４５９で処置したマウスの平均体重の比較を示す。図１０Ａで、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウスに３.１３μg、１２.５μg、２５μgまたは５０μgのＡＳＯ−００５４５９を投与し、体重を処置後０週目、１週目および２週目に測定した。図１０Ｂで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１００μgのＡＳＯ−００５４５９を投与し、動物の体重を２８日間の経過中に週１回測定した。両図１０Ａおよび１０Ｂで、媒体対照を受けた動物を対照として使用した。データは、複数動物からの平均±ＳＤを表す(ｎ＝５)。示す統計は、２元配置ＡＮＯＶＡに基づく。
【００３７】
【図１１】図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、海馬(図１１Ａ)、脳幹(図１１Ｂ)および線条体(図１１Ｃ)投与１４日後のＡ５３Ｔ−ＰＡＣマウスの海馬(図１１Ａ)、脳幹(図１１Ｂ)および線条体(図１１Ｃ)でのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲで測定し、ギャップＤＨ  ｍＲＮＡで正規化し、次いで媒体群平均に対して表した。データは、複数動物からの平均±ＳＤを表す(ｎ＝５)。各丸は個々の動物を表す。水平線は１の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。示す統計は、１元配置ＡＮＯＶＡとダネットの事後検定に基づく。＊＊＊  ｐ＜０.００１。
【００３８】
【図１２】図１２は、ＡＳＯ−００５４５９処置１４日後のＡ５３Ｔ−ＰＡＣマウスの海馬(黒色)、脳幹(薄灰色)および線条体(濃灰色)で検出されたＡＳＯ−００５４５９レベルを示す。マウスは、ＩＣＶ投与で３.１３μg、１２.５μg、２５μgまたは５０μgのＡＳＯ−００５４５９を受けた。データは、複数動物からの平均±ＳＤを表す(ｎ＝５)。
【００３９】
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、ＡＳＯ−００５４５９処置１４日後のＡ５３Ｔ−ＰＡＣマウスの海馬(図１３Ａ)、脳幹(図１３Ｂ)および線条体(図１３Ｃ)におけるＡＳＯ−００５４５９暴露レベルとＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現の相関を示す。図１３Ｄは、海馬(丸)、脳幹(四角)および線条体(三角)からのデータを組み合わせて示す。各データ点は、個々の動物を表す。４パラメータ、非線形フィットを海馬(図１３Ａ)および脳幹(図１３Ｂ)について示す。
【００４０】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウスのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルに対するＡＳＯ−００５４５９の効果の用量応答曲線を示す。動物は１２.５μg(丸)、２５μg(四角)または５０μg(三角)のＡＳＯ−００５４５９を(ＩＣＶ注射で)受け、投与後２４時間、３日、４週、８週、１２週、１６週および２０週目に屠殺した。脳幹(図１４Ａ)および線条体(図１４Ｂ)の両方のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲで評価し、次いで媒体対照に対して正規化した。平均データを示す。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。
【００４１】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＡＳＯ−００５４５９投与４週後のＡ５３Ｔ−ＰＡＣマウスのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルに対するＡＳＯ−００５４５９の効果を示す。動物は媒体対照または種々の濃度のＡＳＯ−００５４５９(１２.５μg、２５μgまたは５０μg)を受けた。相対的ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベル(媒体対照に対して正規化した)を脳幹(図１５Ａ)および線条体(図１５Ｂ)両者について示す。各データ点は、個々の動物を表す。複数動物からの平均±ＳＤも示す。示す統計は１元配置ＡＮＯＶＡを使用する媒体群との比較と、複数比較のためのダネットの補正に基づく。水平線は１の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊＊＊ｐ＜０.０００１。
【００４２】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウスの脳組織のＳＮＣＡタンパク質発現レベルに対するＡＳＯ−００５４５９の効果の用量応答曲線を示す。動物は１２.５μg(丸)、２５μg(四角)または５０μg(三角)のＡＳＯ−００５４５９を(ＩＣＶ注射で)受け、投与後２４時間、３日、４週、８週、１２週、１６週および２０週目に屠殺した。ＳＮＣＡタンパク質レベルを脳幹(図１６Ａ)および線条体(図１６Ｂ)両者でＥＬＩＳＡにより測定し、次いで媒体対照に対して正規化した。平均データを示す。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。
【００４３】
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＡＳＯ−００５４５９投与８週後のＡ５３Ｔ−ＰＡＣマウスのＳＮＣＡタンパク質発現レベルに対するＡＳＯ−００５４５９の効果を示す。動物は媒体対照または種々の濃度のＡＳＯ−００５４５９(１２.５μg、２５μgまたは５０μg)を受けた。相対的ＳＮＣＡタンパク質発現レベル(媒体対照に対して正規化した)を脳幹(図１７Ａ)および線条体(図１７Ｂ)両者について示す。各データ点は、個々の動物を表す。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。複数動物からの平均±ＳＤも示す。示す統計は１元配置ＡＮＯＶＡを使用する媒体群との比較と、複数比較のためのダネットの補正に基づく。
【００４４】
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、カニクイザルの脳組織におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルに対するＡＳＯ−００５５７８およびＡＳＯ−００５５８４の効果を示す。図１８Ａで、動物は次のものを受けた：媒体対照(丸)、ＡＳＯ−００５５７８(四角、４mg)またはＡＳＯ−００５５８４(三角、４mg)。次いで、動物投与２週間後屠殺した。図１８Ｂで、動物は媒体対照またはＡＳＯ−００５５８４(８mg／動物)を受け、次いで投与後２週間(四角)および４週間(三角)に屠殺した。両図１８Ａおよび１８Ｂで、次の組織のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルを評価した：髄質(上左パネル)、尾状核被殻(上中パネル)、橋(上右パネル)、小脳(下左パネル)、腰部脊髄(下中パネル)および前頭前皮質(下右パネル)。図１８Ａおよび１８Ｂに示すＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルはギャップＤＨに対して正規化され、次いで対照群(「媒体」)の平均に対して相対的に示される。個々の動物および平均のデータ両者が示される。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。
【００４５】
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、ＡＳＯ−００５４５９投与後のカニクイザルにおけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡおよびＳＮＣＡタンパク質発現レベルの反応速度論を示す。動物の各々は媒体対照またはＡＳＯ−００５４５９(８mg)を受け、次いで、投与後２４時間、３日、２週、４週、８週、１３週または２０週に屠殺した。各時点で、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ(図１９Ａ)およびＳＮＣＡタンパク質(図１９Ｂ)の発現レベルを次の組織で評価した：髄質(上左パネル)、尾状核被殻(上中パネル)、橋(上右パネル)、小脳(下左パネル)、腰部脊髄(下中パネル)および前頭前皮質(下右パネル)。発現レベルは媒体対照のパーセンテージとして示す。個々の動物および平均のデータ両者が示される。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。
【００４６】
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＡＳＯ−００５４５９投与２週間後のカニクイザルのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ(図２０Ａ)およびＳＮＣＡタンパク質(図２０Ｂ)両者の相対的発現レベル(媒体対照のパーセンテージとして)を示す。動物は媒体対照または種々の濃度のＡＳＯ−００５４５９(２、４または８mg)を受けた。発現レベルを次の組織で評価した：髄質(上左パネル)、尾状核被殻(上中パネル)、橋(上右パネル)、小脳(下左パネル)、腰部脊髄(下中パネル)および前頭前皮質(下右パネル)。発現レベルは媒体対照のパーセンテージとして示す。個々の動物および平均のデータ両者が示される。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。
【００４７】
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＡＳＯ−００５４５９の連続的ヌクレオチド配列を示す。ＯｘｙＡ、ＯｘｙＴおよびＯｘｙＭＣはそれぞれアデニンベータＤ−オキシ−ＬＮＡ、チミンベータＤ−オキシ−ＬＮＡおよびメチルシトシンベータＤ−オキシ−ＬＮＡである；ＤＮＡｔ、ＤＮＡｃおよびＤＮＡａはそれぞれチミンＤＮＡ、シトシンＤＮＡおよびアデニンＤＮＡである；およびｓはホスホロチオエート結合である。
【００４８】
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ここに開示するＡＳＯ−００５４５９の分子構造を示す。提供される構造はＣ１７１Ｈ２１４Ｎ５６Ｏ９０Ｐ１６Ｓ１６の分子式を有し、Ｍ＋の各々はＨ＋、Ｎａ＋またはＮＨ４＋などの薬学的に許容されるカウンターイオンである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の詳細な記載
Ｉ. 定義
単数表現はその物の１またはそれ以上をいうことは注意すべきである；例えば「ヌクレオチド配列」は１以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、単数表現、「１以上」および「少なくとも１」は、ここでは相互交換可能に使用され得る。
【００５０】
さらに、「および／または」は、ここで使用されるとき、他方を伴うまたは伴わない、２つの特定の性質または要素の各々と解釈すべきである。故に、ここで「Ａおよび／またはＢ」などの表現で使用する用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの表現で使用する用語「および／または」は、次の態様を包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。
【００５１】
ある態様が用語「含む」を使用して記載されているとき、用語「からなる」および／または「から本質的になる」で記載される類似する態様も提供されると理解される。
【００５２】
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本発明に使用される多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。
【００５３】
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(ＳＩ)により認められた形態で示す。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。特に断らない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に５'から３'配向で記載する。アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ配向で記載する。ここに提供する表題は、本明細書を全体として参酌して得られ得る本発明の種々の態様を限定するものではない。従って、直ぐ下に定義する用語は、本明細書を全体として参酌してより完全に定義される。
【００５４】
用語「約」は、ここでは、おおよそ、大まかに、近辺またはその辺りを意味するために使用される。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用されるとき、その範囲が示す数値の上および下に境界を広げるように修飾される。一般に、用語「約」は、数値を、記載した値の例えば、１０パーセント上または下の(高いまたは低い)偏差まで、上および下に修飾し得る。例えば、「ＡＳＯは、ＡＳＯ投与後、細胞のＳＮＣＡタンパク質を少なくとも約６０％減少させる」なる記載があるならば、ＳＮＣＡレベルは５０％〜７０％の範囲で減少されることが含意される。
【００５５】
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(ＡＳＯ)は、ヌクレオチド間結合により互いに共有結合された、天然に存在するヌクレオシドまたはその修飾形態などのヌクレオシドのオリゴマーまたはポリマーをいう。本発明に有用なＡＳＯは、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオシドを含む。ＡＳＯは、ＡＳＯが標的核酸配列とハイブリダイズするように、標的核酸と相補性である。ここで使用する用語「アンチセンスＡＳＯ」、「ＡＳＯ」および「オリゴマー」は、用語「ＡＳＯ」と相互交換可能である。
【００５６】
用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、複数の核酸を包含することが意図される。ある実施態様において、用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、インビボまたはインビトロの標的配列、例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＤＮＡをいう。本用語が標的配列の核酸またはヌクレオチドをいうとき、該核酸またはヌクレオチドは細胞に天然に存在する配列であり得る。他の実施態様において、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本発明のＡＳＯの配列をいう。本用語がＡＳＯの配列をいうとき、該核酸またはヌクレオチドは天然に存在しない、すなわち、化学合成された、酵素的に産生された、組み換えにより産生されたまたはこれらの何れかの組み合わせであり得る。ある実施態様において、ＡＳＯの核酸またはヌクレオチドは合成または組み換えにより産生され、天然に存在する配列またはそのフラグメントではない。他の実施態様において、ＡＳＯの核酸またはヌクレオチドは、本来天然に存在しない少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含むため、天然に存在しない。用語「核酸」または「ヌクレオシド」は、ポリヌクレオチドに存在する単一核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのアナログをいう。「核酸」または「ヌクレオシド」は天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸を含む。ある実施態様において、用語「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は相互交換可能に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列をいうとき、言及されるのは、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵおよびそれらのアナログなどの塩基配列であることは認識される。
【００５７】
ここで使用する用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分およびホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基などの共有結合基(結合基)を含むグリコシドをいい、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドおよび修飾糖および／または塩基を含む天然に存在しないヌクレオチドの両者を包含し、ここでは「ヌクレオチドアナログ」とも称する。ここで、単一ヌクレオチド(単位)はモノマーまたは核酸単位とも称され得る。ある実施態様において、用語「ヌクレオチドアナログ」は、修飾糖部分を有するヌクレオチドをいう。修飾糖部分を有するヌクレオチド(例えば、ＬＮＡ)の非限定的例は、本明細書の他の箇所に示される。他の実施態様において、用語「ヌクレオチドアナログ」は、修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドをいう。修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドは、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
ここで使用する用語「ヌクレオシド」は、ＡＳＯのヌクレオシド間をヌクレオチド間結合により共有結合され得る、糖部分および塩基部分を含むグリコシドをいう。バイオテクノロジー分野において、用語「ヌクレオシド」はしばしば核酸モノマーまたは単位をいうために使用される。ＡＳＯに関連して、用語「ヌクレオシド」は、糖主鎖およびヌクレオチド間結合の存在が含意される、シトシン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、グアニン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、アデニン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、チミン(ＤＮＡ)およびウラシル(ＲＮＡ)を含む、塩基単独、すなわち、核酸塩基配列をいい得る。同様に、特にヌクレオチド間結合基の１以上が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は「ヌクレオシド」といい得る。例えば用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の結合の存在または性質が特定されていても、使用できる。
【００５９】
ここで使用する用語「ヌクレオチド長」は、ある配列のヌクレオチド(モノマー)の総数を意味する。例えば、配列AtTcctttacaccACAC(配列番号１５)は１７のヌクレオチドを有し、故に該配列のヌクレオチド長は１７である。用語「ヌクレオチド長」は、それ故に、「ヌクレオチド数」と相互交換可能に使用され得る。
【００６０】
当業者には認識されるとおり、オリゴヌクレオチドの５'末端ヌクレオチドは、５'末端基を含み得るが、５'ヌクレオチド間結合基を含まない。
【００６１】
ここで使用する「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチド部分である。「停止コドン」(ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ)は一般にアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部と見なされ得るのに対し、あらゆるフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「ＵＴＲ」)などはコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、一般に得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５'末端の開始コドンおよび得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３'末端の翻訳停止コドンにより決定される。
【００６２】
ここで使用する用語「非コード領域」は、コード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例は、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「ＵＴＲ」)、非コードエクソンなどを含むが、これらに限定されない。エクソンの一部は、各転写物の５'非翻訳領域(５'  ＵＴＲ)または３'非翻訳領域(３'  ＵＴＲ)全体または一部であり得る。非翻訳領域は転写物の効率的翻訳に重要であり、転写物の翻訳速度および半減期の制御のためである。
【００６３】
ヌクレオチド配列の文脈で使用するときの用語「領域」は、該配列のセクションをいう。例えば、用語「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補物内の領域」は、ヌクレオチド配列より短いが、少なくとも１０のヌクレオチドより長く、それぞれ特定のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補物内に位置する配列をいう。用語「部分−配列」または「部分配列」もヌクレオチド配列の領域をいい得る。
【００６４】
用語「下流」は、ヌクレオチド配列についていうとき、核酸またはヌクレオチド配列が対照ヌクレオチド配列の３'側に位置することを意味する。ある実施態様において、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流側に位置する。
【００６５】
用語「上流」は、対照ヌクレオチド配列の５'側に位置するヌクレオチド配列をいう。
【００６６】
特に断らない限り、ここに提供する配列は、５'末端(左)から３'末端(右)に記載される
【００６７】
ここで使用する用語「制御領域」は、コード領域の上流(５'非コード配列)、その中または下流(３'非コード配列)に位置し、結合コード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。制御領域はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ＵＴＲおよびステムループ構造を含み得る。コード領域の真核生物細胞での発現が想定されるならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列が、コード配列の３'に通常位置する。
【００６８】
ここで使用する用語「転写物」は、ＤＮＡの転写により合成され、処理後メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)になる一次転写物すなわち、前駆体メッセンジャーＲＮＡ(ｐｒｅ−ｍＲＮＡ)および処理されたｍＲＮＡそれ自体を意味し得る。用語「転写物」は、「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」および「ｍＲＮＡ」と相互交換可能に使用され得る。ＤＮＡ鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびその他などの成熟した機能的形態にいくつかの方法で変換され、修飾される。故に、用語「転写物」は、エキソン、イントロン、５'  ＵＴＲおよび３'  ＵＴＲを含み得る。
【００６９】
ここで使用する用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程をいう。ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)への転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含むが、これらに限定されない。発現は「遺伝子産物」を産生する。ここで使用する遺伝子産物は、遺伝子の転写により産生された核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡまたは転写物から翻訳されたポリペプチドであり得る。ここに記載する遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングされた核酸または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合またはタンパク質分解的開裂されたポリペプチドをさらに含む。
【００７０】
２以上の核酸について、用語「同一」またはパーセント「同一性」は、あらゆる保存的アミノ酸置換を配列同一性として考慮せずに、最大対応について比較およびアライン(必要であれば、ギャップ導入)したとき、同じであるまたは同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基が特定のパーセンテージで同一である２以上の配列をいう。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを使用してまたは目視により決定され得る。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントに使用できる種々のアルゴリズムおよびソフトウェアは当分野で知られる。
【００７１】
配列アラインメントアルゴリズムの一つのこのような非限定的例は、Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877により改変されたKarlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268のアルゴリズムであり、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに導入されている(Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)。ある実施態様において、Gapped BLASTを、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のとおり使用できる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２(Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480)、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２(Genentech, South San Francisco, California)またはMegalign(DNASTAR)は、配列のアラインに使用され得るさらなる公開された利用可能なソフトウェアプログラムである。ある実施態様において、２個のヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのギャッププログラムを使用して決定される(例えば、NWSgapdna.CMPマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または９０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用)。ある別の実施態様において、NeedlemanおよびWunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを組み込むＧＣＧソフトウェアパッケージのギャッププログラムを使用して、２アミノ酸配列間のパーセント同一性を決定できる(例えば、BLOSUM 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５を使用)。あるいは、ある実施態様において、複数ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、MyersおよびMiller(CABIOS, 4:11-17 (1989))を使用して決定される。例えば、パーセント同一性はＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)を使用して、残基表を伴うＰＡＭ１２０、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定され得る。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによる最大アラインメントのための適切なパラメータを決定できる。ある実施態様において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【００７２】
ある実施態様において、第一ヌクレオチド配列対第二ヌクレオチド配列のパーセンテージ同一性「Ｘ」は１００×(Ｙ／Ｚ)として計算され、ここで、Ｙは第一および第二配列のアラインメント(目視または特定の配列アラインメントプログラムによりアライン)において同一マッチとして採点されたアミノ酸残基数であり、Ｚは第二配列の残基総数である。第一配列の長さが第二配列より長いならば、第一配列対第二配列のパーセント同一性は、第二配列対第一配列のパーセント同一性より高い。
【００７３】
ポリヌクレオチド参照配列とアラインする単一ポリヌクレオチド標的配列内の異なる領域は、各々それ自体のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は最も近い１／１０に四捨五入されることは注意すべきである。例えば、８０.１１、８０.１２、８０.１３および８０.１４は８０.１に切り捨てられ、８０.１５、８０.１６、８０.１７、８０.１８および８０.１９は８０.２に切り上げられる。長さ値は常に整数であることもまた注意すべきである。
【００７４】
ここで使用する用語「相同」および「相同性」は用語「同一性」および「同一」と相互交換可能である。
【００７５】
用語「その天然に存在するバリアント」は、規定分類群、例えば、マウス、サルおよびヒトなどの哺乳動物に天然に存在するＳＮＣＡポリペプチド配列またはＳＮＣＡ核酸配列(例えば、転写物)のバリアントをいう。一般に、ポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」をいうとき、本用語また染色体転座または複製により染色体位置１７ｑ２１におよびそれ由来のｍＲＮＡなどのＲＮＡに見られる、ＳＮＣＡコードゲノムＤＮＡのあらゆるアレルバリアントも包含し得る。「天然に存在するバリアント」は、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来するバリアントも含み得る。特定のポリペプチド配列をいうとき、例えば、本用語はまた天然に存在するタンパク質も包含し、それは、従って、例えば、シグナルペプチド開裂、タンパク質分解的開裂、グリコシル化などにより共または翻訳後修飾により処理され得る。
【００７６】
本発明のＡＳＯ(またはその領域)とここに開示するもののような哺乳動物ＳＮＣＡタンパク質(例えば、ＳＮＣＡ遺伝子)をコードする核酸の標的領域の「相補性」の程度の決定において、「相補性」(また「相同性」または「同一性」)の程度は、ＡＳＯ(またはその領域)の配列と、それと最良にアラインする標的領域(または標的領域の逆相補物)の配列のパーセンテージ同一性(またはパーセンテージ相同性)として表す。パーセンテージは、２配列間で同一であるアライン塩基数をＡＳＯにおける連続的モノマーの総数で除し、１００を乗じて計算する。このような比較において、ギャップが存在するならば、このようなギャップは、本発明のＡＳＯと標的領域間で異なるギャップ内のモノマーの領域であるより、単にミスマッチであるのが好ましい。
【００７７】
ここで使用する用語「相補物」は、対照配列と相補的である配列を示す。相補性は、互いに逆平行で整列されたとき、鏡を見るのにおよび物の逆側を見るのによく似て、配列の各位置のヌクレオチド塩基が相補的であるように、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列間で共有される性質であるＤＮＡ複製および転写の塩基原則であることは周知である。それ故に、例えば、５'「ＡＴＧＣ」３'の配列相補物は３'「ＴＡＣＧ」５'または５'「ＧＣＡＴ」３'と記載し得る。ここで使用する用語「逆相補物」、「逆相補的」および「逆相補性」は、ここでは用語「相補物」、「相補的」および「相補性」と相互交換可能に使用する。
【００７８】
用語「対応」および「対応する」は、２個の別々の核酸またはヌクレオチド配列をいうとき、相同性および／または機能性に基づき互いに対応するまたは類似する配列領域を明確化するために使用できるが、特定の配列のヌクレオチドは異なって番号付けされ得る。例えば、遺伝子転写物の異なるアイソフォームは、選択的スプライシングおよび／または他の修飾に基づき、各アイソフォームでナンバリングが異なり得るヌクレオチド配列の類似または保存部分を有し得る。さらに、核酸またはヌクレオチド配列を特徴づけするとき異なるナンバリングシステムが使用され得ることは認識される(例えば、遺伝子転写物および配列ナンバリングを翻訳開始コドンから始めるかまたは５'ＵＴＲを含むか)。さらに、遺伝子または遺伝子転写物の種々のバリアントの核酸またはヌクレオチド配列は変わり得る。しかしながら、ここで使用する核酸またはヌクレオチド配列相同性および／または機能性を共有するバリアントの領域は、互いに「対応する」と考えられる。例えば、配列番号１(「参照配列」)のヌクレオチドＸ〜Ｙに対応するＳＮＣＡ転写物のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチドＸ〜Ｙと同一配列または類似配列を有するＳＮＣＡ転写物配列(例えば、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ)をいう。当業者は、ＳＮＣＡ転写物配列と配列番号１をアラインして、ＳＮＣＡ転写物配列における対応するＸおよびＹ残基を同定できる。
【００７９】
用語「対応するヌクレオチドアナログ」および「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチドアナログの核酸塩基と天然に存在するヌクレオチドが同じ対形成またはハイブリダイズ能力を有することを示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンと結合するとき、「対応するヌクレオチドアナログ」は、アデニンと結合するペントース単位(２−デオキシリボースと異なる)を含む。
【００８０】
ここで使用する用語「ＤＥＳ番号」または「DES No.」は、特定パターンのヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)およびヌクレオシドアナログ(例えば、ＬＮＡ)を有するヌクレオチド配列に与えられた固有の番号をいう。ここで使用するＡＳＯの設計は、大文字と小文字の組み合わせにより示す。例えば、ＤＥＳ−００５４５９は、LDLDDDDDDDDDDLLLL(すなわち、AtTcctttacaccACAC)のＡＳＯ設計を有するAtTcctttacaccACAC(配列番号１５)のＡＳＯ配列をいい、ここで、Ｌ(すなわち、大文字)はヌクレオシドアナログ(例えば、ＬＮＡ)を示し、Ｄ(すなわち、小文字)はヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)を示す。
【００８１】
ここで使用する用語「ＡＳＯ番号」または「ASO No.」は、要素の詳細な化学構造、例えば、ヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)、ヌクレオシドアナログ(例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ)、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＭＣ)および主鎖構造(例えば、ホスホロチオエートまたはホスホジエステル)を有するヌクレオチド配列に与えられた固有の番号をいう。例えば、ＡＳＯ−００５４５９は、OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMCをいう。
【００８２】
「有効性」は、通常、特に断らない限り、μM、nMまたはpMのＩＣ５０またはＥＣ５０値として表される。有効性はパーセント阻害の観点でも表し得る。ＩＣ５０は治療分子の中央阻害濃度である。ＥＣ５０は、媒体または対照(例えば、食塩水)に対する治療分子の中央有効濃度である。機能的アッセイにおいて、ＩＣ５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡ転写またはタンパク質発現を、該治療分子により達成される生物学的応答の５０％減ずる治療分子の濃度である。機能的アッセイにおいて、ＥＣ５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡ転写またはタンパク質発現の５０％を生じる治療分子の濃度である。ＩＣ５０またはＥＣ５０は、当分野で知られる多くの手段により計算され得る。
【００８３】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、それに対する診断、予後診断または治療が望まれるあらゆる対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含むヒト、家庭用動物、農業用動物、競技用動物および動物園の動物を含む。
【００８４】
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性を有効とし、該組成物が投与される対象に許容されない毒性であるさらなる成分を含まないような形態の調製物をいう。このような組成物は無菌であり得る。
【００８５】
ここに開示するＡＳＯの「有効量」は、具体的に述べる目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、記載する目的に関連して、経験的におよび日常的方法で決定され得る。
【００８６】
「処置」または「処置する」または「処置するためまたは「軽減する」または「軽減するため」などの用語は、(１)診断された病的状態または障害を治癒、減速または症状軽減するおよび／または進行停止させる治療手段および(２)標的病的状態または障害の発症を阻止および／または遅延させる予防的または防止的手段の両者をいう。それ故に、処置を含むものは、既に障害を有するもの；障害を有する素因があるもの；および障害を阻止すべきものを含む。ある実施態様において、対象は、患者が、疾患または障害と関連する症状の、例えば、完全な部分的なまたは一過性の軽減または消失を示すならば、ここに提供される方法により、本明細書の他の箇所に記載される疾患または状態が十分に「処置される」。
【００８７】
II. アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびＳＮＣＡ  ｍＲＮＡを含む、ＳＮＣＡ核酸、例えば、ＳＮＣＡ転写物などの哺乳動物α−Ｓｙｎをコードする核酸分子または哺乳動物α−Ｓｙｎをコードするこのような核酸分子の天然に存在するバリアントの機能の調節に使用するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる。本開示の文脈での用語「ＡＳＯ」は、２以上のヌクレオチドの共有結合により形成された分子(すなわち、オリゴヌクレオチド)をいう。
【００８８】
ＡＳＯは約１０〜約３０、例えば１０〜２０、１６〜２０または１５〜２５ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含む。ここで使用する用語「アンチセンスＡＳＯ」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、用語「ＡＳＯ」と相互交換可能である。
【００８９】
配列番号の言及は特定の核酸塩基配列を含むが、図２または３に示す何れかの設計または完全化学構造は含まない。さらに、ここでの図に開示するＡＳＯは代表的設計を示すが、特に断らない限り、図に示す特定の設計に限定されない。ここで、単一ヌクレオチド(単位)はモノマーまたは単位ともいい得る。本明細書で特定のＡＳＯ番号をいうとき、該記載は配列、特定のＡＳＯ設計および化学構造を含む。本明細書で特定のＤＥ番号をいうとき、該記載は配列および特定のＡＳＯ設計を含む。例えば、ある請求項(または本明細書)で配列番号１５をいうとき、attcctttacaccacacのヌクレオチド配列のみを含む。ある請求項(または本明細書)でＤＥＳ−００５４５９をいうとき、図に示すＡＳＯ設計(すなわち、AtTcctttacaccACAC)を伴うattcctttacaccacacのヌクレオチド配列を含む。あるいは、ＡＳＯ−００５４５９の設計を配列番号１５として記載でき、ここで５'末端からの最初のヌクレオチド、三番目のヌクレオチドおよび１４番目〜１７番目のヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えば、ＬＮＡであり、他のヌクレオチドの各々は非修飾ヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)である。ＡＳＯ番号は、配列およびＡＳＯ設計ならびにＡＳＯの特定の詳細を含む。それ故に、本明細書で記載されるＡＳＯ−００５４５９は、OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC(ここで、「ｓ」はホスホロチオエート結合を示す)を示す。
【００９０】
種々の実施態様において、本発明のＡＳＯはＲＮＡ(単位)を含まない。ある実施態様において、ＡＳＯは１以上のＤＮＡ単位を含む。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは直線状分子であるかまたは直線状分子として合成される。ある実施態様において、ＡＳＯは一本鎖分子であり、同じＡＳＯ(すなわち二本鎖)内の等しい領域と相補的である、例えば、少なくとも３、４または５連続的ヌクレオチドの短領域を含まない  −  この点に関し、ＡＳＯは(本質的に)二本鎖ではない。ある実施態様において、ＡＳＯは本質的に二本鎖ではない。ある実施態様において、ＡＳＯはｓｉＲＮＡではない。種々の実施態様において、本発明のＡＳＯは連続的ヌクレオチド領域全体からなり得る。それ故に、ある実施態様において、ＡＳＯは実質的に自己相補的ではない。
【００９１】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、何れかの薬学的に許容される塩の形態であり得る。ここで使用する用語「薬学的に許容される塩」は、ＡＳＯがその塩の形成により修飾(例えば、カチオンの付加)されている、本発明のＡＳＯの誘導体をいう。このような塩は、望ましくない毒性効果を付与することなく、ＡＳＯの所望の生物学的活性を保持する。ある実施態様において、本発明のＡＳＯはナトリウム塩の形態である。他の実施態様において、ＡＳＯはカリウム塩の形態である。
【００９２】
II.Ａ. 標的
好適には、本発明のＡＳＯはＳＮＣＡ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を下方制御(例えば、減少または除去)できる。この点に関し、本発明のＡＳＯは、一般に哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、例えば神経性細胞のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルの減少により、ＳＮＣＡタンパク質を間接的に阻害し得る。特に、本発明は、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡの１以上の領域を標的とするＡＳＯに関する。
【００９３】
ＳＮＣＡの同意語は知られ、ＮＡＣＰ、ＡＤアミロイドの非Ａ−ベータ成分、ＰＡＲＫ１、ＰＡＲＫ４およびＰＤ１を含む。ＳＮＣＡ遺伝子の配列は、公的に利用可能なAccession Number NC_000004.12下に見ることができ、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物の部分配列(残基６００１〜８４００)は、公的に利用可能なAccession Number NG_011851.1(配列番号１)下に見ることができる。ＳＮＣＡタンパク質配列は、一般に利用可能なAccession Numbers: P37840、A8K2A4、Q13701、Q4JHI3およびQ6IAU6下に見ることができ、この各々を引用により全体として本明細書に包含させる。ＳＮＣ遺伝子産物の天然バリアントは知られる。例えば、ＳＮＣＡタンパク質の天然バリアントは、から選択される１以上のアミノ酸置換を含み得る。それ故に、本発明のＡＳＯは、ＳＮＣＡタンパク質の天然バリアントの発現を減少または阻害するように設計され得る。
【００９４】
ＳＮＣＡの変異は１以上の病態の原因であることが知られている。本発明のＡＳＯは、１以上の変異を含むＳＮＰまたはあるいはスプライシングＳＮＣＡ転写物の発現の減少または阻害、そして結果として変異ＳＮＣＡタンパク質発現の減少に使用できる。ＳＮＣＡタンパク質変異体の例は、Ｄ２Ａ、Ｅ３５Ｋ、Ｙ３９Ｆ、Ｈ５０Ａ、Ｅ５７Ｋ、Ｇ６７＿Ｖ７１ｄｅｌ、Ｖ７１＿Ｖ８２ｄｅｌ、Ａ７６＿Ｖ７７ｄｅｌ、Ａ７６ｄｅｌ、Ｖ７７ｄｅｌ、Ａ７８ｄｅｌ、Ａ８５＿Ｆ９４ｄｅｌ、Ｙ１２５Ｆ、Ｙ１３３Ｆ、Ｙ１３６Ｆおよびこれらの任意の組み合わせから選択される１以上の変異を含むＳＮＣＡタンパク質を含むが、これらに限定されない。本発明のＡＳＯは、ＳＮＣＡタンパク質のあらゆる変異体の発現の減少または阻害のために設計され得る。
【００９５】
ＡＳＯの標的核酸配列の例はＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡである。図１Ａの配列番号１は、部分的ＳＮＣＡゲノム配列(残基６００１〜８４００)を表す。配列番号１は、配列番号１のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ−ｍＲＮＡで「ｕ」として示される以外、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列と同一である。ある実施態様において、「標的核酸」は、ＳＮＣＡタンパク質コード核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれに由来するＲＮＡ核酸、例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロン領域を含む。他の実施態様において、「標的核酸」は、ＳＮＣＡタンパク質コード核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれに由来するＲＮＡ核酸のエクソン領域を含む。ある実施態様において、例えば研究または診断に使用するとき、「標的核酸」は、上記ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸標的由来のｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る。ある実施態様において、部分的ＳＮＣＡゲノム配列はGenBank Accession No. NG_011851.1(残基６００１〜８４００)(配列番号１)として示す。ＳＮＣＡタンパク質をコードするｍＲＮＡは配列番号２として示す。図１Ｂ参照。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡによりコードされるＳＮＣＡタンパク質配列は配列番号３として示す。図１Ｃ参照。
【００９６】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物内の核酸配列、例えば、配列番号１のイントロンエクソン接合部に対応する領域と相補的な１０〜３０ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含み、ここで、核酸配列は配列番号１のヌクレオチド７,６０２〜７,６２７に対応する。
【００９７】
ある実施態様において、ＡＳＯはＳＮＣＡ転写物内の領域、例えば、配列番号１のヌクレオチド７,６０２〜７,６２７とハイブリダイズするまたは相補的であり、約０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９または１.０以上の配列スコアを有する。配列スコアの計算は本明細書の他の箇所に開示される。
【００９８】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物のイントロンエクソン接合部、例えば、配列番号１のイントロン１とエクソン２の間の接合部に対応する領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物の核酸配列または配列内の領域(「標的領域」)とハイブリダイズする連続的ヌクレオチド配列を含み、ここで、核酸配列は配列番号１のヌクレオチド７,６０２〜７,６２７に対応する。他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物の核酸配列または配列内の領域とハイブリダイズする連続的ヌクレオチド配列を含み、ここで、核酸配列は配列番号１のヌクレオチド７,６０２〜７,６２７に対応し、ここで、ＡＳＯはここに記載する設計(例えば、セクションII.Ｈ。例えば、ギャップマー設計、例えば、交互フランクギャップマー設計)または本明細書の他の箇所に示す化学構造(例えば、図２および３)の一つを有する。
【００９９】
ある実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド７,６０４〜７,６２０に対応する。他の実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド７,６０３〜７,６２０に対応する。他の実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド７,６０２〜７,６１９に対応する。ある実施態様において、ＡＳＯはＳＮＣＡ転写物、例えば、配列番号１のエクソン内の領域とハイブリダイズし、約０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９または１.０以上の配列スコアを有する。配列スコアの計算は本明細書の他の箇所に開示される。
【０１００】
ある実施態様において、標的領域は、３'末端、５'末端または両者で配列番号１のヌクレオチド７,６０２〜７,６２７±１０のヌクレオチドに対応する。他の実施態様において、標的領域は、３'末端、５'末端または両者で配列番号１のヌクレオチド７,６０４〜７,６２０±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８、±９または±１０のヌクレオチドに対応する。
【０１０１】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、生理学的条件、すなわち、インビボ条件下で標的核酸(例えば、ＳＮＣＡ転写物)にハイブリダイズできる。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、インビトロで標的核酸(例えば、ＳＮＣＡ転写物)にハイブリダイズできる。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ストリンジェントな条件下、インビトロで標的核酸(例えば、ＳＮＣＡ転写物)にハイブリダイズできる。インビトロでのハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件は、とりわけ、生産的細胞取り込み、ＲＮＡ到達性、温度、会合自由エネルギー、塩濃度および時間による(例えば、Stanley T Crooks, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Edition, CRC Press (2007)参照)。一般に、高〜中ストリンジェンシーの条件が、類似しない核酸間ではなく、実質的に類似する核酸間でのハイブリダイゼーションを可能とするために、インビトロハイブリダイゼーションで使用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５×食塩水−クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)緩衝液(０.７５Ｍ  塩化ナトリウム／０.０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム)中、１時間、４０℃でのハイブリダイゼーション、続いてサンプルの１×ＳＳＣで４０℃で１０回および１×ＳＳＣ緩衝液で室温で５回の洗浄を含む。インビボハイブリダイゼーション条件は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的配列のハイブリダイゼーションを支配する細胞内条件(例えば、生理学的ｐＨおよび細胞内イオン条件)からなる。インビボ条件は、比較的低ストリンジェンシー条件によりインビトロで模倣され得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、インビトロで２×ＳＳＣ(０.３Ｍ  塩化ナトリウム／０.０３Ｍ  クエン酸ナトリウム)、０.１％ＳＤＳで３７℃により実施され得る。４×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを含む洗浄溶液が３７℃で、１×ＳＳＣで４５℃での最終洗浄と共に使用できる。
【０１０２】
II.Ｂ. ＡＳＯ配列
本発明のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物の領域の相補物に対応する連続的ヌクレオチド配列、例えば、配列番号１に対応するヌクレオチド配列を含む。
【０１０３】
ある実施態様において、本発明は、計１０〜３０ヌクレオチド、例えば、１０〜１５ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含むＡＳＯを提供し、ここで、連続的ヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号２などの哺乳動物ＳＮＣＡ転写物の相補物内の領域と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有する。
【０１０４】
ＡＳＯは、哺乳動物ＳＮＣＡタンパク質をコードする核酸(例えば、配列番号１および２)の等価領域と十分に相補的(完全に相補的)である連続的ヌクレオチド配列を含む。ＡＳＯは、核酸配列または配列番号１のヌクレオチドＸ〜Ｙに対応する配列の領域と十分に相補的(完全に相補的)である連続的ヌクレオチド配列を含んでよく、ここで、ＸおよびＹは、図２に示すとおりそれぞれＮＧ＿０１１８５１.１のｐｒｅ−ｍＲＮＡ開始部位およびｐｒｅ−ｍＲＮＡ末端部位である。さらに、ＡＳＯは、本明細書の他の箇所に記載する設計(例えば、セクションII.Ｇ。例えば、ギャップマー設計、例えば、交互フランクギャップマー設計)または本明細書の他の箇所に示す化学構造(例えば、図２および３)を有し得る。ある実施態様において、ＡＳＯは、核酸配列または配列番号２のヌクレオチドＸ〜Ｙに対応する配列の領域と十分に相補的(完全に相補的)である連続的ヌクレオチド配列を含んでよく、ここで、ＸおよびＹはそれぞれｍＲＮＡ開始部位およびｍＲＮＡ末端部位である。
【０１０５】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯのヌクレオチド配列または連続的ヌクレオチド配列は、配列番号４〜２１から選択された配列(すなわち、図２および３の配列)と少なくとも約８０％配列同一性、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％配列同一性、少なくとも約９７％配列同一性、少なくとも約９８％配列同一性、少なくとも約９９％配列同一性、例えば、約１００％配列同一性(相同)を有する。ある実施態様において、ＡＳＯは、本明細書の他の箇所に記載する設計(例えば、セクションII.Ｇ.Ｉ、例えば、ギャップマー設計、例えば、交互フランクギャップマー設計)またはヌクレオシド本明細書の他の箇所に示す化学構造(例えば、図２および３)を有する。
【０１０６】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは図２および３に開示された設計(例えば、ＤＥＳ番号)を有する少なくとも１個のＡＳＯを含む。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは図２および３に開示された設計(例えば、ＤＥＳ番号)を有する少なくとも１個のＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図２および３に開示するＡＳＯより３'末端で１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチドまたは４個のヌクレオチド短い。他の実施態様において、本発明のＡＳＯは図２および３に開示された設計(例えば、ＤＥＳ番号)を有する少なくとも１個のＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図２および３に開示するＡＳＯより５'末端で１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチドまたは４個のヌクレオチド短い。さらに他の実施態様において、本発明のＡＳＯは図２および３に開示された設計(例えば、ＤＥＳ番号)を有する少なくとも１個のＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図２および３に開示するＡＳＯより５'末端および／または３'末端で１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチドまたは４個のヌクレオチド短い。
【０１０７】
他の実施態様において、本発明のＡＳＯは図２および３に開示された化学構造(例えば、ＡＳＯ番号)を有する少なくとも１個のＡＳＯを含む。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは図２および３に開示された化学構造(例えば、ＡＳＯ番号)を有する少なくとも１個のＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図２および３に開示するＡＳＯより３'末端で１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチドまたは４個のヌクレオチド短い。他の実施態様において、本発明のＡＳＯは図２および３に開示された化学構造(例えば、ＡＳＯ番号)を有する少なくとも１個のＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図２および３に開示するＡＳＯより５'末端で１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチドまたは４個のヌクレオチド短い。さらに他の実施態様において、本発明のＡＳＯは図２および３に開示された化学構造(例えば、ＡＳＯ番号)を有する少なくとも１個のＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図２および３に開示するＡＳＯより５'末端および／または３'末端で１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチドまたは４個のヌクレオチド短い。
【０１０８】
ある実施態様において、ＡＳＯ(またはその連続的ヌクレオチド部分)は、配列番号４〜２１およびその少なくとも１０連続的ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つを含むかまたはそれから選択され、ここで、ＡＳＯ(またはその連続的ヌクレオチド部分)は、所望により、対応するＳＮＣＡ転写物と比較したとき、１個、２個、３個または４個のミスマッチを含み得る。
【０１０９】
ある実施態様において、ＡＳＯは配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択される配列を含む。ある実施態様において、ＡＳＯは配列番号７(例えば、ＡＳＯ−００５５７８およびＡＳＯ−００５５８４の配列)および配列番号１５(例えば、ＡＳＯ−００５４５９の配列)からなる群から選択される配列を含む。
【０１１０】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは標的核酸配列(例えば、ＳＮＣＡ転写物)に結合し、アッセイ、例えば、ここに開示する定量的ＰＣＲまたはQUANTIGENE(登録商標)分析により測定して、インビボで３.１３μg、１２.５μg、２５μg、５０μgまたは１００μg用量で投与したとき、対照(例えば、ＧＡＤＰＨまたはチューブリンなどの内部対照または媒体対照単独を投与されたマウス)と比較してヒトＳＮＣＡ遺伝子(例えば、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣ)を発現するマウスの組織(例えば、脳領域)でＳＮＣＡ転写物の発現を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少または阻害できる。
【０１１１】
ある実施態様において、ＡＳＯは、アッセイ、例えば、ここに開示する高含量アッセイ(実施例２Ａ参照)により測定して、インビボで３.１３μg、１２.５μg、２５μg、５０μgまたは１００μg用量で投与したとき、対照(例えば、ＧＡＤＰＨまたはチューブリンなどの内部対照または媒体対照単独を投与されたマウス)と比較してヒトＳＮＣＡ遺伝子(例えば、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣ)を発現するマウスの組織(例えば、脳領域)でＳＮＣＡタンパク質発現少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少できる。
【０１１２】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは標的核酸配列(例えば、ＳＮＣＡ転写物)に結合し、アッセイ、例えば、ここに開示する定量的ＰＣＲまたはQUANTIGENE(登録商標)分析により測定して、インビボで１回または２回、２mg、４mgまたは８mg用量で投与したとき、対照(例えば、ＧＡＤＰＨまたはチューブリンなどの内部対照または媒体対照単独を投与されたカニクイザル)と比較して野生型ＳＮＣＡ遺伝子を発現するカニクイザルの組織(例えば、脳領域)でＳＮＣＡ転写物の発現を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少または阻害できる。
【０１１３】
ある実施態様において、ＡＳＯは、アッセイ、例えば、ここに開示する高含量アッセイ(実施例２Ａ参照)により測定して、インビボで１回または２回、２mg、４mgまたは８mg用量で投与したとき、対照(例えば、ＧＡＤＰＨまたはチューブリンなどの内部対照または媒体対照単独を投与されたカニクイザル)と比較して野生型ＳＮＣＡ遺伝子を発現するカニクイザルの組織(例えば、脳領域)でＳＮＣＡタンパク質を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少できる。
【０１１４】
他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、アッセイ、例えば、ここに開示するQUANTIGENE(登録商標)分析により測定して、神経細胞を５μM、３.３μM、１μM、４nM、４０nMまたは２００nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させたとき、対照(例えば、ＧＡＤＰＨまたはチューブリンなどの内部対照または食塩水単独と接触させた完全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するマウス初代神経細胞)と比較して完全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子(例えば、ＰＡＣ神経細胞)を発現するマウス初代神経細胞のインビトロＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少できる。
【０１１５】
さらに他の実施態様において、ＡＳＯは、アッセイ、例えば、ここに開示する高含量アッセイ(実施例２Ａ参照)により測定して、神経細胞を５μM、３.３μM、１μM、４nM、４０nMまたは２００nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させたとき、対照(例えば、ＧＡＤＰＨまたはチューブリンなどの内部対照または食塩水単独と接触させた完全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するマウス初代神経細胞)と比較して、完全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子(例えば、ＰＡＣ神経細胞)を発現するマウス初代神経細胞でインビトロＳＮＣＡタンパク質発現を少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％減少できる。
【０１１６】
ある実施態様において、ＡＳＯは、アッセイ、例えば、ここに開示する定量的ＰＣＲにより測定して、神経芽腫細胞を２５μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させたとき、対照(例えば、ＧＡＤＰＨまたはチューブリンなどの内部対照または食塩水単独と接触させた完全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現する神経芽腫細胞)と比較して、完全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するヒト神経芽腫細胞株(例えば、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２))でインビトロでのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少できる。
【０１１７】
ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯは、アッセイ、例えば、ここに開示する高含量アッセイ分析(実施例２Ａ参照)により測定して、神経芽腫細胞を２５μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させたとき、対照(例えば、ＧＡＤＰＨまたはチューブリンなどの内部対照または食塩水単独と接触させた完全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現する神経芽腫細胞)と比較して、完全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するヒト神経芽腫細胞株(例えば、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２))でインビトロでのＳＮＣＡタンパク質発現を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少できる。
【０１１８】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯはＳＮＣＡ転写物に結合し、細胞の正常(すなわち対照)発現レベルと比較して、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を少なくとも約１０％または約２０％、例えば、細胞の正常発現レベル(例えばＡＳＯまたはコンジュゲート非存在下の発現レベル)と比較して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％減少または阻害できる。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＳＯ投与後、細胞のＳＮＣＡタンパク質発現を、ＡＳＯに曝されていない細胞(すなわち、対照)と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％減少する。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＳＯ投与後、細胞のＳＮＣＡタンパク質発現を、ＡＳＯに曝されていない細胞(すなわち、対照)と比較して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％減少する。
【０１１９】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＡＳＯに曝されていない対照細胞と比較して、(１)ＡＳＯに曝されていない対照細胞と比較して、細胞におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を減少する；(２)細胞のカルシウム振動を顕著に減少させない；(３)細胞のチューブリン強度を顕著に減少させない；(４)細胞におけるα−Ｓｙｎタンパク質発現を減少する；および(５)任意のこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの性質を有する。
【０１２０】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、細胞、例えば、神経性細胞のカルシウム振動を顕著に減少させない。ＡＳＯが細胞のカルシウム振動を顕著に減少させないならば、ＡＳＯのこの性質は、ＡＳＯの神経毒性減少に対応する。ある実施態様において、カルシウム振動は、ＡＳＯに曝されていない細胞の振動の９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７５％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上または５０％以上である。
【０１２１】
カルシウム振動は、神経性細胞の適切な機能に重要である。皮質神経細胞のネットワークは、自発的カルシウム振動を受け、神経伝達物質グルタミン酸放出に至ることが示されている。カルシウム振動はまた神経細胞と関連神経膠の相互作用を、ネットワークにおける他の関連神経細胞に加えて制御でき、グルタミン酸に加えて他の神経伝達物質を放出する。カルシウム振動制御は、正常脳機能の神経網のホメオスタシスに必要である。(Shashank et al., Brain Research, 1006(1): 8-17 (2004); Rose et al., Nature Neurosci., 4:773 - 774 (2001); Zonta et al., J Physiol Paris., 96(3-4):193-8 (2002); Pasti et al., J. Neurosci., 21(2): 477-484 (2001))。グルタミン酸は、２つの別個のイオンチャネル、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸(ＡＭＰＡ)受容体およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸(ＮＭＤＡ)受容体も活性化する。
【０１２２】
ある実施態様において、本方法で測定されるカルシウム振動はＡＭＰＡ依存性カルシウム振動である。ある実施態様において、カルシウム振動はＮＭＤＡ依存性カルシウム振動である。ある実施態様において、カルシウム振動はガンマ−アミノ酪酸(ＧＡＢＡ)依存性カルシウム振動である。ある実施態様において、カルシウム振動はＡＭＰＡ依存性、ＮＭＤＡ依存性またはＧＡＢＡ依存性カルシウム振動の２以上の組み合わせであり得る。
【０１２３】
ある実施態様において、本方法で測定されるカルシウム振動はＡＭＰＡ依存性カルシウム振動である。ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動を測定するために、カルシウム振動はＭｇ２＋イオン(例えば、ＭｇＣｌ２)存在下で測定され得る。ある実施態様において、方法は、さらにＭｇ２＋イオン(例えば、ＭｇＣｌ２)を、ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動検出を可能にする量で加えることを含む。ある実施態様において、ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動検出を可能にする有効なイオン濃度は少なくとも約０.５mMである。他の実施態様において、ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動誘発に有効なイオン濃度は少なくとも約０.６mM、少なくとも約０.７mM、少なくとも約０.８mM、少なくとも約０.９mM、少なくとも約１mM、少なくとも約１.５mM、少なくとも約２.０mM、少なくとも約２.５mM、少なくとも約３.０mM、少なくとも約４mM、少なくとも約５mM、少なくとも約６mM、少なくとも約７mM、少なくとも約８mM、少なくとも約９mMまたは少なくとも約１０mMである。特定の実施態様において、方法に有用なＭｇ２＋イオン(例えば、ＭｇＣｌ２)濃度は１mMである。ある実施態様において、本方法に有用なＭｇ２＋イオン(例えば、ＭｇＣｌ２)濃度は約１mM〜約１０mM、約１mM〜約１５mM、約１mM〜約２０mMまたは約１mM〜約２５mMである。Ｍｇ２＋イオンは、炭酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸マグネシウム七水和物などのマグネシウム塩添加により添加され得る。
【０１２４】
ある実施態様において、カルシウム振動は、本方法で、細胞内カルシウムレベルの振動を検出する蛍光プローブの使用により測定される。例えば、細胞内カルシウム流動の検出は、細胞をカルシウムイオンと結合する、蛍光の検出可能な変化をもたらす蛍光色素(蛍光カルシウムインジケーターとして知られる)で染色することにより達成され得る(例えば、Molecular Probes. Eugene, OR, United States of Americaから入手可能なFluo-4 AMおよびFura Red AM色素)。
【０１２５】
他の実施態様において、本発明のＡＳＯは細胞のチューブリン強度を顕著に減少させない。ある実施態様において、チューブリン強度は、ＡＳＯに曝されていない(または食塩水に暴露された)細胞のチューブリン強度の９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７５％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上または５０％以上である。
【０１２６】
ある実施態様において、このような性質は、本発明のＡＳＯを０.０４nM〜４００μM濃度で使用したとき観察される。同一または異なる実施態様において、細胞のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡおよび／またはＳＮＣＡタンパク質の発現の阻害または減少は、ＡＳＯに曝されていない細胞の１００％未満、例えば９８％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、例えば７０％未満のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルをもたらす。発現レベルの調節は、標的タンパク質に対して生じた適当な抗体を使用する、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロッティングなどの方法による、ＳＮＣＡタンパク質レベルの測定により決定され得る。あるいは、発現レベルの調節は、例えば、ノーザンブロットまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルの測定により決定され得る。ｍＲＮＡレベルにより阻害を測定するとき、約０.０４nM〜約４００μM濃度などの適切な投与量を使用したときの下方制御レベルは、ある実施態様において、一般にＡＳＯ非存在下の細胞の正常レベルの約１０〜２０％レベルである。
【０１２７】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、総スコア４以下のインビボ忍容性を有し、ここで、総スコアは１)活動過多；２)活動および覚醒低下；３)運動機能障害および／または運動失調；４)異常体位および呼吸；および５)震えおよび／または痙攣の５カテゴリーの単位スコアの合計であり、各カテゴリーの単位スコアは０〜４のスケールである。ある実施態様において、インビボ忍容性は総スコア３、総スコア２、総スコア１または総スコア０以下である。ある実施態様において、インビボ忍容性の評価は、下記実施例のとおり決定される。
【０１２８】
ある実施態様において、ＡＳＯは、標的配列にハイブリダイズするとき１、２、３または４(またはそれ以上)のミスマッチに耐性であり、なお、所望の効果、すなわち、標的ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の下方制御を示すために標的に十分結合することができる。ミスマッチは、例えば、本明細書の他の箇所に開示する、ＡＳＯヌクレオチド配列の長さ延長および／またはヌクレオチドアナログ数の増加により相殺され得る。
【０１２９】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、標的配列とハイブリダイズするとき、３を超えるミスマッチを含まない。他の実施態様において、連続的ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズするとき、２個を超えるミスマッチを含まない。他の実施態様において、連続的ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズするとき、１を超えるミスマッチを含まない。
【０１３０】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、配列番号４〜２１の何れかによる配列内のヌクレオチド配列または領域、図２および３に記載する設計を有するＡＳＯ配列および図２および３に記載する化学構造を有するＡＳＯ配列を含む。
【０１３１】
しかしながら、ある実施態様において、ＡＳＯのヌクレオチド配列は、標的配列と非相補的である、さらなる５'または３'ヌクレオチド、例えば、独立して、１、２、３、４または５のさらなるヌクレオチド５'および／または３'を含み得ることは認識される。この点において、本発明のＡＳＯは、ある実施態様において、さらなるヌクレオチドにより５'および／または３'に隣接した連続的ヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様において、さらなる５'および／または３'ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドである。
【０１３２】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは０.２以上の配列スコアを有し、ここで、該配列スコアは式Ｉにより計算される：
【数２】
2021510511.tif 000003
【０１３３】
他の実施態様において、本発明のＡＳＯは０.２以上の配列スコアを有し、ここで、該配列スコアは式ＩＡにより計算される：
【数３】
2021510511.tif 000004
【０１３４】
これらの実施態様において、カットオフ値以上の配列スコアは、ＡＳＯの神経毒性減少に対応する。
【０１３５】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、約０.１、０.２、０.２５、０.３、０.３５、０.４、０.４５、０.５、０.５５、０.６、０.６５、０.７、０.７５、０.８、０.８５、０.９、０.９５または１.０以上の配列スコアを有する。ある実施態様において、本発明のＡＳＯはＳＮＣＡ転写物の非コード領域にハイブリダイズする連続的ヌクレオチド配列を含み、ここで、ＡＳＯの配列スコアは約０.１、０.２、０.２５、０.３、０.３５、０.４、０.４５、０.５、０.５５、０.６、０.６５、０.７、０.７５、０.８、０.８５、０.９、０.９５または１.０以上である。他の実施態様において、本発明のＡＳＯはＳＮＣＡ転写物のイントロン領域にハイブリダイズする連続的ヌクレオチド配列を含み、ここで、ＡＳＯの配列スコアは約０.１、０.２、０.２５、０.３、０.３５、０.４、０.４５、０.５、０.５５、０.６、０.６５、０.７、０.７５、０.８、０.８５、０.９、０.９５または１.０以上である。他の実施態様において、本発明のＡＳＯはＳＮＣＡ転写物のイントロンエクソン接合部にハイブリダイズする連続的ヌクレオチド配列を含み、ここで、ＡＳＯの配列スコアは約０.１、０.２、０.２５、０.３、０.３５、０.４、０.４５、０.５、０.５５、０.６、０.６５、０.７、０.７５、０.８、０.８５、０.９、０.９５または１.０以上である。これら実施態様の全てにおいて、配列スコアがカットオフ値以上であるとき、ＡＳＯの神経毒性は減少していると考えられる。
【０１３６】
II.Ｃ. ＡＳＯ長
ＡＳＯは、計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０連続的ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１３７】
ある実施態様において、ＡＳＯは、計約１０〜２２、例えば１０〜２１または１２〜１８、例えば１３〜１７または１２〜１６、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１連続的ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１３８】
ある実施態様において、ＡＳＯは、計１６、１７、１８、１９または２０(１６〜２０)連続的ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１３９】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、２２を超えないヌクレオチド、例えば２１または２０を超えないヌクレオチド、例えば１８を超えないヌクレオチド、例えば１５、１６または１７ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは２２未満のヌクレオチドを含む。ＡＳＯまたは連続的ヌクレオチド配列長について範囲が示されているとき、範囲は、範囲を規定する提供される下のおよび上の長さを含み、例えば１０〜３０(またはその間)は１０および３０の両者を含むと理解されるべきである。
【０１４０】
II.Ｄ. ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログ
本発明のある態様において、ＡＳＯは１以上の天然に存在しないヌクレオチドアナログを含む。ここで使用する「ヌクレオチドアナログ」は、糖および／または塩基部分の修飾により、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドなどの天然ヌクレオチドのバリアントである。アナログは、原則、オリゴヌクレオチドの状況において単に「サイレント」または天然ヌクレオチドの「等価物」であり、すなわち標的遺伝子発現の阻害にオリゴヌクレオチドが働く過程で機能的効果はない。このような「等価物」アナログは、それにも関わらず、例えば、製造が容易であるか安価であるまたは貯蔵または製造条件でより安定であるまたはタグまたはラベルを表すならば、有用であり得る。ある実施態様において、しかしながら、アナログは、例えば標的への結合親和性を高めることによりおよび／または細胞内ヌクレアーゼへの耐性を増加させることによりおよび／または細胞への輸送の容易さを高めることにより、ＡＳＯが発現阻害のために作用する方法で機能的効果を有する。ヌクレオシドアナログの特定の例は、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213およびスキーム１に記載される。
【０１４１】
II.Ｄ.１. 核酸塩基
用語核酸塩基は、核酸ハイブリダイゼーションで水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン)部分をいう。本発明の状況において、用語核酸塩基はまた天然に存在する核酸塩基とは異なるかもしれないが、核酸ハイブリダイゼーション中機能的である修飾核酸塩基も包含する。ある実施態様において、核酸塩基部分は、核酸塩基の修飾または置換により修飾である。この状況において、「核酸塩基」は天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンならびに天然に存在しないバリアントの両者をいう。このようなバリアントは、例えばHirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載される。
【０１４２】
ある実施態様において、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２'チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２,６−ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基などの置換プリンまたは置換ピリミジンのような修飾プリンまたはピリミジンに変えることにより、修飾される。
【０１４３】
核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵの文字コードにより示すことができ、ここで、各文字は所望により等価物機能の修飾核酸塩基を含む。例えば、オリゴヌクレオチドの例において、核酸塩基部分はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５−メチルシトシンから選択される。所望により、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【０１４４】
II.Ｄ.２. 糖修飾
本発明のＡＳＯは、修飾糖部分、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡで見られるリボース糖部分と比較した糖部分の修飾を有する１以上のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分が修飾された多数のヌクレオシドは、主として親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある性質の改善を目的として、製造されている。
【０１４５】
このような修飾は、例えば一般にリボース環(ＬＮＡ)のＣ２'炭素とＣ４'炭素の間にビラジカル架橋を有するヘキソース環(ＨＮＡ)または二環式環または一般にＣ２'炭素とＣ３'炭素の間に結合を欠く(例えば、ＵＮＡ)非結合リボース環での置換により、リボース環構造が修飾されるものを含む。他の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、ビシクロヘキソース核酸(ＷＯ２０１１／０１７５２１)または三環式核酸(ＷＯ２０１３／１５４７９８)を含む。修飾ヌクレオシドは、例えば、ペプチド核酸(ＰＮＡ)またはモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置き換えられている、ヌクレオシドも含む。
【０１４６】
糖修飾はまたリボース環の置換基を、ＲＮＡヌクレオシドで天然にみられる水素または２'−ＯＨ基以外の基に変えることによる修飾も含む。置換基は、例えば２'位、３'位、４'位または５'位に導入され得る。修飾糖部分を有するヌクレオシドはまた２'置換ヌクレオシドなどの２'修飾ヌクレオシドも含む。実際、２'置換ヌクレオシドの開発に多くの労力が集められており、多数の２'置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに取り込まれたとき、ヌクレオシド耐性増強および親和性増強などの有益な性質を有することが判明している。
【０１４７】
ある実施態様において、糖修飾は親和性増強糖修飾、例えば、ＬＮＡを含む。親和性増強糖修飾は、ＡＳＯの標的ＲＮＡ配列(例えば、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡのイントロン１／エクソン２接合部)への結合親和性を増強する。ある実施態様において、ここに開示する糖修飾を含むＡＳＯは、対照(例えば、このような糖修飾がないＡＳＯ)と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％増強された標的ＲＮＡ配列への結合親和性を有する。
【０１４８】
II.Ｄ.２.ａ ２'修飾ヌクレオシド
２'糖修飾ヌクレオシドは、２'位にＨまたは−ＯＨ以外の置換基を有する(２'置換ヌクレオシド)または２'結合ビラジカルを含む、ヌクレオシドであり、２'置換ヌクレオシドおよびＬＮＡ(２'−４'ビラジカル架橋)ヌクレオシドを含む。例えば、２'修飾糖は、オリゴヌクレオチドに結合親和性増強および／またはヌクレアーゼ耐性増加を付与し得る。２'置換修飾ヌクレオシドの例は、２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２'−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２'−アルコキシ−ＲＮＡ、２'−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ(ＭＯＥ)、２'−アミノ−ＤＮＡ、２'−フルオロ−ＲＮＡおよび２'−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例として、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213およびDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。下記は、一部２'置換修飾ヌクレオシドを図示する。
【化１】
2021510511.tif 000005
【０１４９】
II.Ｄ.２.ｂ ロックド核酸ヌクレオシド(ＬＮＡ)
ＬＮＡヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２'とＣ４'の間にリンカー基(ビラジカルまたは架橋と称される)を含む修飾ヌクレオシドである。これらヌクレオシドは、文献では架橋核酸または二環式核酸(ＢＮＡ)とも呼ばれる。
【０１５０】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯの修飾ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドは、式IIまたはIIIの一般構造を有する。
【化２】
2021510511.tif 000006
ここで、Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ(Ｒａ)−、−Ｃ(ＲａＲｂ)−から選択され、例えば、ある実施態様において、−Ｏ−であり；Ｂは核酸塩基または修飾核酸塩基部分であり；Ｚは隣接ヌクレオシドへのヌクレオシド間結合または５'末端基であり；Ｚ＊は隣接ヌクレオシドへのヌクレオシド間結合または３'末端基であり；およびＸは−Ｃ(ＲａＲｂ)−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ(Ｒａ)２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ(Ｒａ)−および＞Ｃ＝Ｚからなる群から選択される基である。
【０１５１】
ある実施態様において、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、ＮＨ−、ＮＲａＲｂ、−ＣＨ２−、ＣＲａＲｂ、−Ｃ(＝ＣＨ２)−および−Ｃ(＝ＣＲａＲｂ)−からなる群から選択される。ある実施態様において、Ｘは−Ｏ−である。
【０１５２】
ある実施態様において、Ｙは−Ｃ(ＲａＲｂ)−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ(Ｒａ)２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ(Ｒａ)−および＞Ｃ＝Ｚからなる群から選択される基である。ある実施態様において、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｃ(ＲａＲｂ)−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ(ＲａＲｂ)−Ｃ(ＲａＲｂ)−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ(ＲａＲｂ)Ｃ(ＲａＲｂ)Ｃ(ＲａＲｂ)−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)−および−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ−からなる群から選択される。
【０１５３】
ある実施態様において、Ｙは−ＣＨ２−、−ＣＨＲａ−、−ＣＨＣＨ３−、ＣＲａＲｂ−および−Ｘ−Ｙ−が一体となって−Ｃ(ＲａＲｂ)−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｃ(Ｒｂ)−、−Ｃ(Ｒａ)＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ(Ｒａ)２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ(Ｒａ)−および＞Ｃ＝Ｚからなる群から選択される１、２、３または４基／原子からなる二価リンカー基(ラジカルとも称する)であるものからなる群から選択される。
【０１５４】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙは、−Ｘ−ＣＨ２−、−Ｘ−ＣＲａＲｂ−、−Ｘ−ＣＨＲａ−、−Ｘ−Ｃ(ＨＣＨ３)−、−Ｏ−Ｙ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨＣＨ３−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３ＣＨ３)−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−,−Ｏ−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−Ｏ−ＮＣＨ２−、−Ｃ(＝ＣＨ２)−ＣＨ２−、−ＮＲａ−ＣＨ２−、Ｎ−Ｏ−ＣＨ２、−Ｓ−ＣＲａＲｂ−および−Ｓ−ＣＨＲａ−からなる群から選択されるビラジカルである。
【０１５５】
ある実施態様において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−である。
【０１５６】
ある実施態様において、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ(Ｒａ)−およびＲａから選択され、Ｒｂは存在するとき、各々独立して水素、場合により置換されているＣ１−６−アルキル、場合により置換されているＣ２−６−アルケニル、場合により置換されているＣ２−６−アルキニル、ヒドロキシ、場合により置換されているＣ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルコキシアルキル、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ(Ｃ１−６−アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ(Ｃ１−６−アルキル)−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ(Ｃ１−６−アルキル)アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは場合により置換されていてよく、２つのジェミナル置換基があるとき、ＲａおよびＲｂは、一体となって場合により置換されているメチレン(＝ＣＨ２)であってよく、ここで、全てのキラル中心に関して、不斉基はＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。
【０１５７】
ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は、独立して水素、場合により置換されているＣ１−６−アルキル、場合により置換されているＣ２−６−アルケニル、場合により置換されているＣ２−６−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルコキシアルキル、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ(Ｃ１−６−アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ(Ｃ１−６−アルキル)−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ(Ｃ１−６−アルキル)アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオおよびハロゲンからなる群から選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは場合により置換されていてよく、２つのジェミナル置換基があるとき、一体となってオキソ、チオキソ、イミノまたは場合により置換されているメチレンであり得る。
【０１５８】
ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊はメチルなどのＣ１−６アルキルおよび水素から独立して選択される。
【０１５９】
ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊は全て水素である。
【０１６０】
ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の何れかも水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の他方は水素以外、例えばメチルなどのＣ１−６アルキルである。
【０１６１】
ある実施態様において、Ｒａは水素またはメチルである。ある実施態様において、存在するとき、Ｒｂは水素またはメチルである。
【０１６２】
ある実施態様において、ＲａおよびＲｂの一方または両方は水素である。
【０１６３】
ある実施態様において、ＲａおよびＲｂの一方は水素であり、他方は水素以外である。
【０１６４】
ある実施態様において、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。
【０１６５】
ある実施態様において、ＲａおよびＲｂの両方はメチルである。
【０１６６】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドはＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示され、これら全て引用により本明細書に包含させ、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして一般的に知られるものを含む。
【０１６７】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このようなチオＬＮＡヌクレオシドはＷＯ９９／０１４２２６およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されている。
【０１６８】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このようなアミノＬＮＡヌクレオシドはＷＯ９９／０１４２２６およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されている。
【０１６９】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドはＷＯ００／０４７５９９およびMorita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76に開示され、これらは引用により本明細書に包含され、２'−Ｏ−４'Ｃ−エチレン架橋核酸(ＥＮＡ)として一般的に知られるものを含む。
【０１７０】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このような５'置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２００７／１３４１８１に開示されている。
【０１７１】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、ＲａおよびＲｂの一方または両方はメチルなどの水素以外であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の全ておよびＲ５およびＲ５＊の一方は水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の他方は水素以外、例えばメチルなどのＣ１−６アルキルである。このようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２０１０／０７７５７８に開示されている。
【０１７２】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２ＯＣＨ３)−(２'  Ｏ−メトキシエチル二環式核酸  −  Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81)である。ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２ＣＨ３)−(２'Ｏ−エチル二環式核酸  −  Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81)である。ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲａ−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このような６'置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ１００３６６９８およびＷＯ０７０９００７１に開示されている。
【０１７３】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２ＯＣＨ３)−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた当分野で環状ＭＯＥ(ｃＭＯＥ)としても知られ、ＷＯ０７０９００７１に開示されている。
【０１７４】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、Ｒ−またはＳ−配置いずれかの配置の二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−である。ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、一体となって、二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−(Seth et al., 2010, J. Org. Chem)である。ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このような６'メチルＬＮＡヌクレオシドは、当分野でｃＥＴヌクレオシドとしても知られ、ＷＯ０７０９００７１(ベータ−Ｄ)およびＷＯ２０１０／０３６６９８(アルファ−Ｌ)に記載のとおり(Ｓ)ｃＥＴまたは(Ｒ)ｃＥＴ立体異性体であり得る。
【０１７５】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、ここで、ＲａまたはＲｂは水素でなく、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。ある実施態様において、ＲａおよびＲｂは両者ともメチルである。このような６'二置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２００９００６４７８に開示されている。
【０１７６】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲａ−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このような６'置換チオＬＮＡヌクレオシドはＷＯ１１１５６２０２に開示されている。ある６'置換チオＬＮＡ実施態様において、Ｒａはメチルである。
【０１７７】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｃ(＝ＣＨ２)−Ｃ(ＲａＲｂ)−、例えば−Ｃ(＝ＣＨ２)−ＣＨ２−または−Ｃ(＝ＣＨ２)−ＣＨ(ＣＨ３)−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。このようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドはＷＯ０８１５４４０１およびＷＯ０９０６７６４７に開示されている。
【０１７８】
ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ(−ＯＲａ)−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。ある実施態様において、ＲａはメチルなどのＣ１−６アルキルである。このようなＬＮＡヌクレオシドはＮ置換ＬＮＡとしても知られ、ＷＯ２００８／１５０７２９に開示されている。ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は一体となって二価リンカー基−Ｏ−ＮＲａ−ＣＨ３−(Seth et al., 2010, J. Org. Chem)である。ある実施態様において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ(Ｒａ)−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。ある実施態様において、ＲａはメチルなどのＣ１−６アルキルである。
【０１７９】
ある実施態様において、Ｒ５およびＲ５＊の一方または両方は水素であり、置換されているとき、Ｒ５およびＲ５＊の他方はメチルなどのＣ１−６アルキルである。このような実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て水素であってよく、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨ(ＣＲａ)−、例えば−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ３)−から選択され得る。
【０１８０】
ある実施態様において、ビラジカルはＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−などの−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。ある実施態様において、ＲａはメチルなどのＣ１−６アルキルである。このようなＬＮＡヌクレオシドは配座固定ヌクレオチド(ＣＲＮ)としても知られ、ＷＯ２０１３０３６８６８に開示されている。
【０１８１】
ある実施態様において、ビラジカルはＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−などの−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ５＊の全ては全て水素である。ある実施態様において、ＲａはメチルなどのＣ１−６アルキルである。このようなＬＮＡヌクレオシドはＣＯＣヌクレオチドとしても知られ、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238に開示されている。
【０１８２】
特定しない限り、ＬＮＡヌクレオシドはベータ−Ｄまたはアルファ−Ｌステレオアイソフォームであり得ることは認識される。
【０１８３】
ＬＮＡヌクレオシドの特定の例をスキーム１に示す。
【化３】
2021510511.tif 000007
【０１８４】
実施例に記載するとおり、本発明のある実施態様において、オリゴヌクレオチドのＬＮＡヌクレオシドはベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドである。
【０１８５】
II.Ｅ. ヌクレアーゼ介在分解
ヌクレアーゼ介在分解は、相補的ヌクレオチド配列の分解に、このような配列と二本鎖を形成したとき、介在できるオリゴヌクレオチドをいう。
【０１８６】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは標的核酸のヌクレアーゼ介在分解により機能でき、ここで、本発明のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ、特におよびエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)、例えばＲＮａｓｅＨを動員できる。ヌクレアーゼ介在機構により作動するオリゴヌクレオチド設計の例は、一般に少なくとも５または６ＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマーが一端または両端で隣接するオリゴヌクレオチドである。
【０１８７】
II.Ｆ. ＲＮａｓｅＨ活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二本鎖であるとき、ＲＮａｓｅＨを動員し、相補的ＲＮＡ分子の開裂とその後の分解を誘発する能力をいう。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用し得る、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するインビトロ法を開示する。一般にオリゴヌクレオチドは、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１〜９５に提供される方法を使用して、相補的標的核酸配列と共に提供されたとき、pmol／ｌ／分で測定して、試験する修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーしか含まず、オリゴヌクレオチドの全モノマー間はホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドを使用したとき決定される初期速度の、少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％を超える初期速度を有するとき、ＲＮａｓｅＨを動員できるとみなされる。
【０１８８】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１〜９５に提供される方法を使用して、相補的標的核酸配列と共に提供されたとき、pmol／ｌ／分で測定して、試験する修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーしか含まず、２'置換を有さず、オリゴヌクレオチドの全モノマー間はホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドを使用したとき決定される初期速度の２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満の初期速度であるならば、本質的にＲＮａｓｅＨを動員できないとみなされる。
【０１８９】
II.Ｇ. ＡＳＯ設計
本発明のＡＳＯは、ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ両者を含み、ギャップマーの形であり得るヌクレオチド配列を含み得る。本発明のＡＳＯで使用し得るギャップマーの配置の例は、米国特許出願公開２０１２／０３２２８５１に記載される。
【０１９０】
ここで使用する用語ギャップマーは、１以上の親和性増強修飾ヌクレオシド(隣接物)が５'および３'で隣接している、オリゴヌクレオチド(ギャップ)を動員するＲＮａｓｅＨの領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドをいう。種々のギャップマー設計はここに記載される。用語ＬＮＡギャップマーは、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドをいう。用語混合ウイングギャップマーは、隣接領域が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドまたは非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば、２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２'−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２'−アルコキシ−ＲＮＡ、２'−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ(ＭＯＥ)、２'−アミノ−ＤＮＡ、２'−フルオロ−ＲＮＡおよび２'−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドなどの少なくとも１つの２'置換修飾ヌクレオシドを含む、ＬＮＡギャップマーをいう。ある実施態様において、混合ウイングギャップマーは、ＬＮＡヌクレオシド(例えば、５'または３')を含む一方の隣接物を有し、他方の隣接物(それぞれ３'または５')は２'置換修飾ヌクレオシドを含む。
【０１９１】
ある実施態様において、ＡＳＯの標的領域に対する増強親和性に加えて、あるヌクレオシドアナログはまたＲＮａｓｅ(例えば、ＲＮａｓｅＨ)結合および開裂に介在する。
【０１９２】
II.Ｇ.１. ギャップマー設計
ある実施態様において、本発明のＡＳＯはギャップマーである。ギャップマーＡＳＯは、ここで領域Ｂ(Ｂ)と称する少なくとも６ＤＮＡヌクレオチドの領域などの、ＲＮａｓｅＨなどのＲＮａｓｅを動員できるヌクレオチドの連続的ストレッチを含むＡＳＯであり、ここで、領域Ｂは５'および３'両側に親和性増強ヌクレオチドアナログの領域、例えば、ＲＮａｓｅを動員できるヌクレオチドの連続的ストレッチの５'および３'の１〜１０ヌクレオチドアナログが隣接し  −  これら領域をそれぞれ領域Ａ(Ａ)およびＣ(Ｃ)と称する。
【０１９３】
ある実施態様において、ギャップマーは交互フランクギャップマーであり、その例は下に記載される。ある実施態様において、交互フランクギャップマーは、伝統的ギャップマーより低いオフターゲット結合を示す。ある実施態様において、交互フランクギャップマーは、伝統的ギャップマーより良好な長期忍容性を有する。
【０１９４】
交互フランクギャップマーは、式(５'から３')Ａ−Ｂ−Ｃの(ポリ)ヌクレオチド配列を含み得て、ここで、領域Ａ(Ａ)(５'領域または第一ウイング配列)は少なくとも１つのヌクレオチドアナログ、例えば少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば１〜１０ヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡ単位を含み；領域Ｂ(Ｂ)は、(相補的ＲＮＡ分子、例えばｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ標的と二本鎖を形成したとき)ＲＮａｓｅを動員できる少なくとも６連続ヌクレオチド、例えばＤＮＡヌクレオチドを含み；領域Ｃ(Ｃ)(３'領域または第二ウイング配列)は少なくとも１個のヌクレオチドアナログ、例えば少なくとも１個のＬＮＡ単位、例えば１〜１０ヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡ単位を含み；ここで、領域ＡおよびＣは、任意の位置にＤＮＡヌクレオチド領域(例えば、ＤＮＡ挿入)のＡおよびＣ１〜３挿入を含み、ここで、これらＤＮＡ挿入は、いずれも１〜６ＤＮＡ単位長であり得る。
【０１９５】
ある他の実施態様において、ギャップマー、例えば、交互フランクギャップマーは、式(５'から３')、Ａ−Ｂ−Ｃまたは所望によりＡ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃの(ポリ)ヌクレオチド配列を有し、ここで、領域Ａ(Ａ)(５'領域)は少なくとも１つのヌクレオチドアナログ、例えば少なくとも１個のＬＮＡ単位、例えば１〜１０ヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡ単位を含み；領域Ｂ(Ｂ)は(相補的ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ標的と二本鎖を形成したとき)ＲＮａｓｅを動員できる少なくとも５連続ヌクレオチド、例えばＤＮＡヌクレオチドを含み；領域Ｃ(Ｃ)(３'領域)は少なくとも１個のヌクレオチドアナログ、例えば少なくとも１個のＬＮＡ単位、例えば１〜１０ヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡ単位を含み；領域Ｄ(Ｄ)は、存在するとき１、２または３個のヌクレオチド単位、例えばＤＮＡヌクレオチドを含む。
【０１９６】
ある実施態様において、領域Ａは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡ単位、例えば２〜５ヌクレオチドアナログ、例えば２〜５ＬＮＡ単位、例えば２〜５ヌクレオチドアナログ、例えば３〜５ＬＮＡ単位含む；および／または領域Ｃは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡ単位、例えば２〜５ヌクレオチドアナログ、例えば２〜５ＬＮＡ単位、例えば２〜５ヌクレオチドアナログ、例えば３〜５ＬＮＡ単位からなる。
【０１９７】
ある実施態様において、Ｂは、ＲＮａｓｅを動員できる５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３連続ヌクレオチドまたはＲＮａｓｅを動員できる６〜１４、７〜１４、８〜１４または７〜１０または７〜９、例えば８、例えば９、例えば１０または例えば１４連続ヌクレオチド含む。ある実施態様において、領域Ｂは、少なくとも５ＤＮＡヌクレオチド単位、例えば５〜２３ＤＮＡ単位、例えば５〜２０ＤＮＡ単位、例えば５〜１８ＤＮＡ単位、例えば６〜１４ＤＮＡ単位、例えば８〜１４ＤＮＡ単位、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ＤＮＡ単位含む。
【０１９８】
ある実施態様において、領域Ａは、ＬＮＡなどの３、４または５ヌクレオチドアナログからなり、領域Ｂは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ＤＮＡ単位からなり、領域ＣはＬＮＡなどの３、４または５ヌクレオチドアナログからなる。このような設計は(Ａ−Ｂ−Ｃ)５−１０−５、３−１４−３、３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４および４−７−３を含み、さらに１〜３ヌクレオチド単位、例えばＤＮＡ単位を有し得る領域Ｄを含み得る。
【０１９９】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯ、例えば、交互フランクギャップマーは５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−３'の式を含み、ここで、
(ｉ)領域Ｂは、ＲＮａｓｅを動員できる少なくとも５、６、７、８、９または１０、例えば、５〜１８ＤＮＡ単位の連続的配列であり；
(ii)領域Ａは１〜１０ヌクレオチドの第一ウイング配列であり、ここで、第一ウイング配列は１以上のヌクレオチドアナログおよび所望により１以上のＤＮＡ単位(例えば、ＤＮＡ挿入)を含み、ここで、ヌクレオチドアナログの少なくとも１つはＡの３'末端に位置し；そして
(iii)領域Ｃは１〜１０ヌクレオチドの第二ウイング配列であり、ここで、第二ウイング配列は１以上のヌクレオチドアナログおよび所望により１以上のＤＮＡ単位(例えば、ＤＮＡ挿入)を含み、ここで、ヌクレオチドアナログの少なくとも１個はＣの５'末端に位置する。
【０２００】
ある実施態様において、第一ウイング配列(式の領域Ａ)は、(ｉ)１〜１０ヌクレオチドアナログおよび０ＤＮＡ単位；(ii)１〜９ヌクレオチドアナログおよび１ＤＮＡ単位；(iii)１〜８ヌクレオチドアナログおよび１〜２ＤＮＡ単位；(iv)１〜７ヌクレオチドアナログおよび１〜３ＤＮＡ単位；(ｖ)１〜６ヌクレオチドアナログおよび１〜４ＤＮＡ単位；(vi)１〜５ヌクレオチドアナログおよび１〜５ＤＮＡ単位；(vii)１〜４ヌクレオチドアナログおよび１〜６ＤＮＡ単位；(viii)１〜３ヌクレオチドアナログおよび１〜７ＤＮＡ単位；(ix)１〜２ヌクレオチドアナログおよび１〜８ＤＮＡ単位；(ｘ)１ヌクレオチドアナログおよび１〜９ＤＮＡ単位から選択されるヌクレオチドアナログおよびＤＮＡ単位の組み合わせを含む。
【０２０１】
ある実施態様において、第二ウイング配列(式の領域Ｃ)は、(ｉ)１〜１０ヌクレオチドアナログおよび０ＤＮＡ単位；(ii)１〜９ヌクレオチドアナログおよび１ＤＮＡ単位；(iii)１〜８ヌクレオチドアナログおよび１〜２ＤＮＡ単位；(iv)１〜７ヌクレオチドアナログおよび１〜３ＤＮＡ単位；(ｖ)１〜６ヌクレオチドアナログおよび１〜４ＤＮＡ単位；(vi)１〜５ヌクレオチドアナログおよび１〜５ＤＮＡ単位；(vii)１〜４ヌクレオチドアナログおよび１〜６ＤＮＡ単位；(viii)１〜３ヌクレオチドアナログおよび１〜７ＤＮＡ単位；(ix)１〜２ヌクレオチドアナログおよび１〜８ＤＮＡ単位；(ｘ)１ヌクレオチドアナログおよび１〜９ＤＮＡ単位から選択されるヌクレオチドアナログおよびＤＮＡ単位を含む。
【０２０２】
ある実施態様において、ＡＳＯ式の領域Ａは、図２および３の何れかのＡＳＯの第一ウイング設計から選択される部分式を有しおよび／またはＡＳＯ式の領域Ｃは、図２および３の何れかのＡＳＯの第二ウイング設計から選択される部分式を有し、ここで、大文字はヌクレオチドアナログ(例えば、Ｌとしても記載し得る糖修飾アナログ)であり、小文字はＤＮＡ(Ｄとしても記載し得る)である。
【０２０３】
ある実施態様において、ＡＳＯ、例えば、交互フランクギャップマーは５'  Ａ−Ｂ−Ｃ  ３'の式を有し、ここで、領域Ｂは５〜１８ＤＮＡ単位の連続的配列であり、領域ＡはＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬまたはＬＬＬＤＬの式を有し、領域ＣはＬＬＤＬＬまたはＬＤＬＤＬＬの式を有し、ここで、ＬはＬＮＡ単位であり、ＤはＤＮＡ単位である。
【０２０４】
ある実施態様において、ＡＳＯは５'  Ａ−Ｂ−Ｃ  ３'の式を有し、ここで、領域Ｂは１０のＤＮＡ単位の連続的配列であり、領域ＡはＬＤＬの式を有し、領域ＣはＬＬＬＬの式を有し、ここで、ＬはＬＮＡ単位であり、ＤはＤＮＡ単位である。
【０２０５】
さらにギャップマー設計は、引用により全体として本明細書に包含させるＷＯ２００４／０４６１６０に開示される。引用により全体として本明細書に包含させるＷＯ２００８／１１３８３２は、‘ショートマー’ギャップマーＡＳＯを記載する。ある実施態様において、ここに提示するＡＳＯはこのようなショートマーギャップマーであり得る。
【０２０６】
ある実施態様において、ＡＳＯ、例えば、交互フランクギャップマーは計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド単位の連続的ヌクレオチド配列を含み、ここで、連続的ヌクレオチド配列は、式(５'−３')、Ａ−Ｂ−Ｃまたは所望によりＡ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃであり、ここで、領域Ａは１、２、３、４または５ヌクレオチドアナログ単位、例えばＬＮＡ単位からなり；領域Ｂは相補的ＲＮＡ分子(例えばｍＲＮＡ標的)と二本鎖を形成したときＲＮａｓｅを動員できる５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４連続的ヌクレオチド単位からなり；および領域Ｃは１、２、３、４または５ヌクレオチドアナログ単位、例えばＬＮＡ単位からなる。存在するとき、領域Ｄは単一ＤＮＡ単位からなる。
【０２０７】
ある実施態様において、Ａは１のＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ａは２ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ａは３ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ａは４ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ａは５個のＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ｃは１ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、Ｃは２ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ｃは３ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ｃは４ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ｃは５ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは６ヌクレオチド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは７ヌクレオチド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは８ヌクレオチド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは９ヌクレオチド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは１０ヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは１１ヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは１２個のヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは１３のヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは１４ヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは７〜２３ＤＮＡモノマーまたは５〜１８ＤＮＡモノマーを含む。ある実施態様において、領域Ｂは６〜２３ＤＮＡ単位、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ＤＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域ＢはＤＮＡ単位からなる。ある実施態様において、領域Ｂはアルファ−Ｌ配置である少なくとも１ＬＮＡ単位、例えば、アルファ−Ｌ配置である２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ＬＮＡ単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは少なくとも１アルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位を含むまたはここでアルファ−Ｌ−配置の全ＬＮＡ単位はアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。ある実施態様において、Ａ−Ｂ−Ｃに存在するヌクレオチド数は(ヌクレオチドアナログ単位−領域Ｂ−ヌクレオチドアナログ単位)１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４または１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４または１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３および３−１０−１から選択される。ある実施態様において、Ａ−Ｂ−Ｃのヌクレオチド数は２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４および４−７−３から選択される。他の実施態様において、ＡＳＯは、Ｂに１０ＤＮＡ単位、Ａ(第一ウイング)にＬＤＬＬＬおよびＣ(第二ウイング)にＬＬＤＬＬを含む。さらに他の実施態様において、ＡＳＯは、Ｂに９ＤＮＡ単位、ＡにＬＤＤＬＬおよびＣにＬＤＬＤＬＬを含む。さらに他の実施態様において、ＡＳＯは、Ｂに１０のＤＮＡ単位、ＡにＬＬＤＬＬおよびＣにＬＬＤＬＬを含む。さらなる実施態様において、ＡＳＯは、Ｂに９ＤＮＡ単位、ＡにＬＬＬＬＬおよびＣにＬＤＤＬＬを含む。ある実施態様において、領域ＡおよびＣの各々は３ＬＮＡモノマーを含み、領域Ｂは７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオシドモノマー、例えば、ＤＮＡモノマーからなる。ある実施態様において、ＡおよびＣ両者は各２個のＬＮＡ単位からなり、Ｂは７、８または９ヌクレオチド単位、例えばＤＮＡ単位からなる。種々の実施態様において、他のギャップマー設計は、領域Ａおよび／またはＣが２'−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖(２'−ＭＯＥ)を含むモノマーまたは２'−フルオロ−デオキシリボース糖を含むモノマーなどの３、４、５または６のヌクレオシドアナログからなり、領域ＢがＤＮＡモノマーなどの７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオシドからなり、ここで、領域Ａ−Ｂ−Ｃが３−８−３、３−９−３、３−１０−３、５−１０−５または４−１２−４モノマーを有するものを含む。さらなるギャップマー設計は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＷＯ２００７／１４６５１１Ａ２に開示される。
【０２０８】
ある実施態様において、交互の隣接ＡＳＯ領域Ａ、領域Ｂおよび領域Ｃ(Ａ−Ｂ−Ｃ)を含む少なくとも１０連続的ヌクレオチドを有し、ここで、領域Ｂは少なくとも５連続ヌクレオシド単位を含み、５'で１〜８連続的ヌクレオシド単位の領域Ａおよび３'で１〜８連続的ヌクレオシド単位の領域Ｃが隣接し、ここで、領域Ｂは、相補的ＲＮＡと二本鎖を形成するとき、ＲＮａｓｅＨを動員でき、ここで、領域Ａおよび領域Ｃは：
(ｉ)領域Ａは５'  ＬＮＡヌクレオシド単位および３'  ＬＮＡヌクレオシド単位および５'  ＬＮＡヌクレオシド単位と３'  ＬＮＡヌクレオシド単位の間に少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシド単位を含み、かつ領域Ｃは少なくとも２個の３'  ＬＮＡヌクレオシドを含む；
(ii)領域Ａは少なくとも１つの５'  ＬＮＡヌクレオシドを含み、かつ領域Ｃは５'  ＬＮＡヌクレオシド単位、少なくとも２個の末端３'  ＬＮＡヌクレオシド単位および５'  ＬＮＡヌクレオシド単位と３'  ＬＮＡヌクレオシド単位の間に少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシド単位を含む、および
(iii)領域Ａは５'  ＬＮＡヌクレオシド単位および３'  ＬＮＡヌクレオシド単位および５'  ＬＮＡヌクレオシド単位と３'  ＬＮＡヌクレオシド単位の間に少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシド単位を含み、かつ領域Ｃは５'  ＬＮＡヌクレオシド単位、少なくとも２末端３'  ＬＮＡヌクレオシド単位および５'  ＬＮＡヌクレオシド単位と３'  ＬＮＡヌクレオシド単位の間に少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシド単位を含む
からなる群から選択される。
【０２０９】
ある実施態様において、領域Ａまたは領域Ｃは１、２または３のＤＮＡヌクレオシド単位を含む。他の実施態様において、領域Ａおよび領域Ｃは１、２または３のＤＮＡヌクレオシド単位を含む。さらに他の実施態様において、領域Ｂは少なくとも５連続ＤＮＡヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４連続ＤＮＡヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｂは８、９、１０、１１または１２のヌクレオチド長である。他の実施態様において、領域Ａは２つの５'末端ＬＮＡヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ａは、式５'[ＬＮＡ]１−３[ＤＮＡ]１−３[ＬＮＡ]１−３または５'[ＬＮＡ]１−２[ＤＮＡ]１−２[ＬＮＡ]１−２[ＤＮＡ]１−２[ＬＮＡ]１−２を有する。他の実施態様において、領域Ｃは、式[ＬＮＡ]１−３[ＤＮＡ]１−３[ＬＮＡ]２−３  ３'または[ＬＮＡ]１−２[ＤＮＡ]１−２[ＬＮＡ]１−２[ＤＮＡ]１−２[ＬＮＡ]２−３３'を有する。さらに他の実施態様において、領域Ａは式５'[ＬＮＡ]１−３[ＤＮＡ]１−３[ＬＮＡ]１−３または５'[ＬＮＡ]１−２[ＤＮＡ]１−２[ＬＮＡ]１−２[ＤＮＡ]１−２[ＬＮＡ]１−２を有し、領域Ｃは２、３、４または５連続ＬＮＡヌクレオシド単位を含む。ある実施態様において、領域Ｃは式[ＬＮＡ]１−３[ＤＮＡ]１−３[ＬＮＡ]２−３３'または[ＬＮＡ]１−２[ＤＮＡ]１−２[ＬＮＡ]１−２[ＤＮＡ]１−２[ＬＮＡ]２−３３'を有し、領域Ａは１、２、３、４または５連続ＬＮＡヌクレオシド単位を含む。さらに他の実施態様において、領域Ａは、５'−３'でＬ、ＬＬ、ＬＤＬ、ＬＬＬ、ＬＬＤＬ、ＬＤＬＬ、ＬＤＤＬ、ＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＤＬ、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬ、ＬＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＤ、ＬＤＬＬＤ、ＬＤＤＤＬ、ＬＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＤＬ、ＬＬＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＬ、ＬＤＬＬＬＬ、ＬＬＬＤＤＬ、ＬＬＤＬＤＬ、ＬＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＬＬ、ＬＤＬＬＤＬ、ＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬ、ＬＬＤＤＤＬおよびＬＤＬＤＬＤからなる群から選択されるＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの配列を有し、ここで、ＬはＬＮＡヌクレオシドであり、ＤはＤＮＡヌクレオシドである。さらに他の実施態様において、領域Ｃは、５'−３'でＬＬ、ＬＬＬ、ＬＬＬＬ、ＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＬ、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ、ＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬＬ、ＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬ、ＬＤＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬＬおよびＬＬＤＬＤＬＬからなる群から選択されるＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの配列を有する。さらなる実施態様において、領域Ａは、５'−３'でＬＤＬ、ＬＬＤＬ、ＬＤＬＬ、ＬＤＤＬ、ＬＬＬＤＬ、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬ、ＬＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＤ、ＬＤＬＬＤ、ＬＤＤＤＬ、ＬＬＬＬＤＬ、ＬＬＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＬ、ＬＤＬＬＬＬ、ＬＬＬＤＤＬ、ＬＬＤＬＤＬ、ＬＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＬＬ、ＬＤＬＬＤＬ、ＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬ、ＬＬＤＤＤＬおよびＬＤＬＤＬＤＬからなる群から選択されるＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの配列を有し、領域Ｃは、５'−３'でＬＤＬＬ、ＬＬＤＬ、ＬＬＬＬＬ、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ、ＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬＬ、ＬＤＬＤ���Ｌ、ＬＤＤＤＬＬ、ＬＤＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬＬおよびＬＬＤＬＤＬＬからなる群から選択されるＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの配列を有する。
【０２１０】
ある実施態様において、交互の隣接ＡＳＯは、５'−３'でＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＤＤＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＤＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＤＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＤＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＤＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬ、ＬＬＬ���ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＤＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＤＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＤＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＤＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＤＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＤＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＤＬＬ、ＬＬＤＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＬＤＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＬＬＬＤＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬＬおよびＬＬＤＤＬＬＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＬＤＬＬからなる群から選択されるヌクレオシドの配列を含む連続的ヌクレオチドを有し、ＬはＬＮＡヌクレオシドであり、ＤはＤＮＡヌクレオシドである。他の実施態様において、ＬＮＡヌクレオシドはベータ−Ｄ−オキシＬＮＡである。
【０２１１】
さらに他の実施態様において、交互の隣接ＡＳＯは、５'−３'で、
【表１】
2021510511.tif 000008
からなる群から選択されるＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシド単位の交互の配列を含む連続的ヌクレオチドを有し、ここで、最初の数字はＬＮＡ単位数であり、次がＤＮＡ単位数であり、交互のＬＮＡおよびＤＮＡ領域が続く。
【０２１２】
他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、図２および３から選択されるＡＳＯ番号の何れかとして表される。
【０２１３】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯ(すなわち、ＡＳＯ−００５４５９)は１７のヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含み、これは、ＳＮＣＡ転写物の領域(すなわち、イントロン１とエクソン２の間の接合部)の相補物、すなわち、配列番号１のヌクレオチド７,６０４〜７,６２０に対応する。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、LDLDDDDDDDDDDLLLLのＡＳＯ設計(すなわち、AtTcctttacaccACAC)で配列番号１５に示すヌクレオチド配列(すなわち、attcctttacaccacac)を有し、ここで、Ｌはロックド核酸ヌクレオシド(すなわち、ＬＮＡ、例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ)を示し、Ｄはデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)を示す。従って、ＡＳＯ−００５４５９の５'末端から１番目、３番目および１４〜１７番目のヌクレオチドはベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、他のヌクレオチドの各々はＤＮＡである。他の実施態様において、ここに開示するＡＳＯはまた次の化学構造も有する：OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC(ここで、「ｓ」はホスホロチオエート結合を示す)。ＡＳＯ−００５４５９の構造式は図２１Ｂに提供され、ここで、Ｍ＋は薬学的に許容されるカウンターイオンである。ここで使用する用語「薬学的に許容されるカウンターイオン」は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではなく、それにより、薬学的に許容される塩形態の産生を可能とする、電気的中性の維持のためのイオン種を伴うイオンをいう。従って、ある実施態様において、薬学的に許容されるカウンターイオンはＨ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、Ｌｉ＋または１＋の荷電を有する任意の他のカチオンであり得る。ある実施態様において、薬学的に許容されるカウンターイオンはＨ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋またはこれらの組み合わせである。
【０２１４】
II.Ｈ. ヌクレオチド間結合
ここに記載するＡＳＯのモノマーは、結合基を介して一緒に結合される。好適には、各モノマーは結合基により３'隣接モノマーに結合される。
【０２１５】
本発明の状況で、ＡＳＯの末端の５'モノマーは、５'末端基を含んでも含まなくてもよいが、５'結合基を含まないことは当業者には理解される。
【０２１６】
用語「結合基」および「ヌクレオチド間結合」は、２つのヌクレオチドを一緒に共有カップリングできる基を意味することを意図する。特定のかつ好ましい例は、ホスフェート基およびホスホロチオエート基を含む。
【０２１７】
本発明のＡＳＯのヌクレオチドまたはその連続的ヌクレオチド配列は、結合基を介して一緒に結合される。好適には各ヌクレオチドは、結合基により３'隣接ヌクレオチドに結合される。
【０２１８】
適当なヌクレオチド間結合はＷＯ２００７／０３１０９１に挙げられたもの、例えばＷＯ２００７／０３１０９１の３４頁、第一段落に挙げられたヌクレオチド間結合(引用により全体として本明細書に包含させる)を含む。
【０２１９】
本発明で使用できる適当なヌクレオチド間結合の例は、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせを含む。
【０２２０】
ある実施態様において、ヌクレオチド間結合を、その通常のホスホジエステルから、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートなどのヌクレアーゼ攻撃にたいしてより耐性であるものに修飾するのが好ましい  −  これら２つは、ＲＮａｓｅＨにより開裂可能であり、標的遺伝子発現減少におけるアンチセンス阻害経路を可能とする。
【０２２１】
ここに提供する適当な硫黄(Ｓ)含有ヌクレオチド間結合は好ましいものであり得る。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合も、特にギャップマーのギャップ領域(Ｂ)に、好ましい。ホスホロチオエート結合はフランキング領域にも使用され得る(ＡおよびＣおよび、適当であれば、ＡまたはＣのＤへの結合および領域Ｄ内)。
【０２２２】
領域Ａ、ＢおよびＣは、しかしながら、特に、例えばヌクレオチドアナログの使用が、領域ＡおよびＣ内のヌクレオチド間結合をエンドヌクレアーゼ分解から保護するとき  −  例えば、領域ＡおよびＣがＬＮＡヌクレオチドを含むとき、ホスホジエステル結合などのホスホロチオエート以外のヌクレオチド間結合を含む。
【０２２３】
ＡＳＯのヌクレオチド間結合は、ＲＮａｓｅＨが標的ＲＮＡを開裂できるように、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであり得る。ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ耐性改善および製造の容易さなどのその他の理由により、好ましい。ある実施態様において、ヌクレオチド間結合は、１個以上の立体定義ヌクレオチド間結合を含む(例えば、立体定義修飾ホスフェート結合、例えば、規定立体化学構造を有するホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェート結合など)。用語「立体定義ヌクレオチド間結合」は「キラル制御ヌクレオチド間結合」と相互交換可能に使用され、リン原子の立体化学指定が、ＡＳＯ鎖内に特定の量のＲｐまたはＳｐのヌクレオチド間結合が存在するように制御される、ヌクレオチド間結合をいう。キラル結合の立体化学指定は、例えば、不斉合成により、制御され得る。少なくとも１つの立体定義ヌクレオチド間結合を有するＡＳＯは立体定義ＡＳＯということができ、これは、完全に立体定義されたＡＳＯおよび部分的に立体定義されたＡＳＯの両者を含む。
【０２２４】
ある実施態様において、ＡＳＯは完全に立体定義されている。完全に立体定義されたＡＳＯは、ＡＳＯの各ヌクレオチド間結合に定義されたキラル中心(ＲｐまたはＳｐ)を有するＡＳＯ配列をいう。ある実施態様において、ＡＳＯは、部分的に立体定義されている。部分的に立体定義されたＡＳＯは、少なくとも１つのヌクレオチド間結合に規定されたキラル中心(ＲｐまたはＳｐ)を有するが、全てのヌクレオチド間結合にではない、ＡＳＯ配列である。それ故に、部分的に立体定義されたＡＳＯは、少なくとも１つの立体定義結合に加えて、アキラルまたは立体配位が定義されていない結合を含み得る。ＡＳＯのヌクレオチド間結合が立体定義であるとき、所望の配置は、Ｒｐにしろ、Ｓｐにしろ、ＡＳＯの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または本質的に１００％に存在する。
【０２２５】
本発明のＡＳＯのある態様において、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログはホスホロチオエート基の手段により互いに結合させる。
【０２２６】
ホスホジエステル結合、例えば１個または２個の結合の、そうではないホスホロチオエートＡＳＯへの、特にヌクレオチド単位(一般に領域ＡおよびまたはＣの)間または隣への挿入は、ＡＳＯのバイオアベイラビリティおよび／または生体内分布を修飾できることが認識されている  −  引用により本明細書に包含させるＷＯ２００８／１１３８３２参照。
【０２２７】
上記の実施態様などの、適切であり、具体的に示されていないある実施態様において、全ての残りの結合基はホスホジエステルまたはホスホロチオエートまたはそれらの混合物である。
【０２２８】
ある実施態様において、ヌクレオチド間結合基全てホスホロチオエートである。
【０２２９】
ここに提供するような特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列をいうとき、種々の実施態様において、結合がホスホロチオエート結合であるとき、特にＬＮＡなどのヌクレオチドアナログ単位間の結合のために、ここに開示するような別の結合が使用でき、例えばホスフェート(ホスホジエステル)結合が使用できることは理解される。同様に、ここに提供するような特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列をいうとき、Ｃ残基が５−'メチル修飾シトシンとして割り当てられているとき、種々の実施態様において、ＡＳＯに存在する１以上のＣは非修飾Ｃ残基であり得る。
【０２３０】
２０１１年６月２日に公開され、引用により全体として本明細書に包含させる米国公報２０１１／０１３０４４１は、中性ヌクレオシド間結合により３'または５'末端に結合した少なくとも１つの二環式ヌクレオシドを有するＡＳＯ化合物を記載する。本発明のＡＳＯは、それ故に、１以上のホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ(３'−ＣＨ２−Ｎ(ＣＨ３)−Ｏ−５')、アミド−３(３'−ＣＨ２−Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)−５')、ホルムアセタール(３'−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−５')またはチオホルムアセタール(３'−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−５')などの中性ヌクレオシド間結合により３'または５'末端に結合した少なくとも１つの二環式ヌクレオシドを含み得る。
【０２３１】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、図２および３に記載するヌクレオチド間結合を有する。ここで例えば、図２および３で使用する、ホスホロチオエート結合は「ｓ」として示し、ホスホジエステル結合は「ｓ」がないことにより示される。
【０２３２】
II.Ｉ.コンジュゲート
ここで使用する用語コンジュゲートは、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第三領域)に共有結合したオリゴヌクレオチドをいう。
【０２３３】
本発明のオリゴヌクレオチドの１以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えば、活性、細胞分布、細胞取り込みまたはオリゴヌクレオチド安定性に影響することにより、オリゴヌクレオチドの薬理活性を改善し得る。ある実施態様において、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性および／または細胞取り込み改善により、オリゴヌクレオチドの薬物動態を修飾または増強する。特にコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の臓器、組織または細胞型に標的化させ、それにより、その臓器、組織または細胞型でのオリゴヌクレオチドの有効性を増強させ得る。同時に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの非標的細胞型、組織または臓器での活性、例えば、オフターゲット活性または非標的細胞型、組織または臓器での活性を減少させ得る。ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は適当なコンジュゲート部分を提供する。さらに適当なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体(ＡＳＧＰｒ)に結合できるものである。特に三価Ｎ−アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰｒへの結合に適する、例えばＷＯ２０１４／０７６１９６、ＷＯ２０１４／２０７２３２およびＷＯ２０１４／１７９６２０参照。
【０２３４】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびおよびその合成は、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 and Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による包括的レビューにも報告されている。
【０２３５】
ある実施態様において、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば細菌毒素)、ビタミン、ウイルスタンパク質(例えばカプシド)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０２３６】
II.Ｊ. 活性化ＡＳＯ
ここで使用する用語「活性化ＡＳＯ」は、ここに記載するコンジュゲートを形成するように、ＡＳＯの１以上のコンジュゲート部分、すなわち、それ自体核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能にする少なくとも１つの官能化部分に共有結合(すなわち、官能化)されている本発明のＡＳＯをいう。一般に、官能化部分は、ＡＳＯを、例えば、アデニン塩基の３'−ヒドロキシル基または環外ＮＨ２基、親水性であり得るスペーサーおよびコンジュゲート部分(例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を結合できる末端基を介してＡＳＯに共有結合できる化学基を含む。ある実施態様において、この末端基は保護されていない、例えば、ＮＨ２基である。他の実施態様において、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のような任意の適当な保護基で保護される。
【０２３７】
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＡＳＯの５'末端のコンジュゲート部分への共有結合を可能とするため、５'末端で官能化される。他の実施態様において、本発明のＡＳＯは３'末端で官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のＡＳＯは主鎖に沿ってまたはヘテロ環式塩基部分を官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、５'末端、３'末端、主鎖および塩基から独立して選択される１個を超える位置で官能化され得る。
【０２３８】
ある実施態様において、活性化本発明のＡＳＯは、官能化部分に共有結合した１個以上のモノマーの合成中に取り込まれることにより合成される。他の実施態様において、活性化本発明のＡＳＯは、官能化されていないモノマーを用いて合成され、ＡＳＯは合成完了後官能化される。
【０２３９】
III. 医薬組成物および投与経路
本発明のＡＳＯは医薬製剤および組成物で使用され得る。好適には、このような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。
【０２４０】
本発明のＡＳＯは、処置患者に重篤な副作用を引き起こすことなく、患者に治療有効量を送達するのに十分な量で、薬学的に許容される担体または希釈剤などのような単位製剤に包含され得る。しかしながら、ある形態の治療において、重篤な副作用は、治療処置の前向きな結果を確実にする観点で許容され得る。
【０２４１】
製剤された薬物は薬学的に許容される結合剤およびアジュバントを含み得る。カプセル、錠剤または丸剤は、例えば、次の化合物を含み得る：結合剤として微結晶セルロース、ガムまたはゼラチン；賦形剤としてデンプンまたはラクトース；滑沢剤としてステアレート；種々の甘味または風味剤。カプセル剤について、投与量単位は脂肪油などの液体担体を含み得る。同様に糖コーティングまたは腸溶性コーティングも投与量単位の一部であり得る。オリゴヌクレオチド製剤はまたミセルエマルジョンを形成する活性医薬成分と脂質のエマルジョンでもあり得る。
【０２４２】
本発明の医薬組成物は、局所または全身処置いずれが望まれるかおよび処置する領域により、多数の方法で投与され得る。投与は、(ａ)経口、(ｂ)例えば、ネブライザーを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送法による、肺；気管内、鼻腔内、(ｃ)上皮、経皮、眼および膣および直腸送達を含む粘膜への局所；または(ｄ)静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；または頭蓋内、例えば、髄腔内、脳室内または心室内投与を含む非経腸であり得る。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＩＶ、ＩＰ、経口、局所的でまたはボーラス注射として投与されまたは標的臓器に直接投与される。他の実施態様において、ＡＳＯは髄腔内または脳室内にボーラス注射として投与される。
【０２４３】
局所投与用医薬組成物および製剤は経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、スプレー剤、坐薬剤、液剤および散剤を含み得る。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、濃厚剤などが必要であるか望ましいことがある。局所製剤の例は、本発明のＡＳＯが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものを含む。経口投与用組成物および製剤は、散剤または顆粒剤、マイクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水または非水性媒体の懸濁液剤または溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤を含むが、これらに限定されない。非経腸、髄腔内、脳室内または心室内投与用組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤および、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または添加物などであるが、これらに限定されない他の適当な添加物も含み得る、無菌水溶液を含み得る。
【０２４４】
本発明の医薬組成物は、溶液、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない多様な成分から製造され得る。薬物の標的組織への送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアを含むが、これらに限定されない担体介在送達により増強され得る(Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27)。
【０２４５】
本発明の医薬製剤は、簡便には単位投与量形態で提示され得て、製薬業界で周知の慣用の技術により製造され得る。このような技術は、活性成分と医薬担体または添加物を結合させる工程を含む。一般に、製剤は均一にかつ密接に活性成分と液体担体または微粉砕固体担体または両者を結合させ、次いで、必要であれば、製品を形作ることにより製造される。
【０２４６】
非経腸、皮下、皮内または局所投与のために、製剤は無菌希釈剤、緩衝液、張性制御剤および抗細菌剤を含み得る。活性ＡＳＯは、制御された放出特性を備えたインプラントまたはマイクロカプセルを含む、分解または体からの即時の除去から保護する担体を用いて製造され得る。静脈内投与のために、担体は生理学的食塩水またはリン酸緩衝化食塩水であり得る。２００７年３月２２日公開の国際公開ＷＯ２００７／０３１０９１(Ａ２)は適当な薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントをさらに提供する  −  これは引用により本明細書に包含させる。
【０２４７】
IV. 診断
本開示は、さらに、ＳＮＣＡ関連疾患、例えば、シヌクレイン病の診断に有用な診断方法を提供する。シヌクレイン病の非限定的例は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を含むが、これらに限定されない。
【０２４８】
本発明のＡＳＯを、個体からの組織または体液のＳＮＣＡ転写物発現測定に使用し、正常組織または体液の標準ＳＮＣＡ転写物発現レベルと測定発現レベルを比較でき、ここで、標準と比較した発現レベル増加は、本発明のＡＳＯで処置可能な障害の指標である。
【０２４９】
本発明のＡＳＯを使用して、当業者に知られる何れかの方法を使用して、生物学的サンプルのＳＮＣＡ転写物レベルをアッセイし得る。(Touboul et. al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et. al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38); Stowe et. al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91)。
【０２５０】
「生物学的サンプル」は、個体、細胞株、組織培養またはＳＮＣＡ転写物を発現する可能性のある他の細胞源から得たあらゆる生物学的サンプルを意図する。哺乳動物から組織および体液を得る方法は、当分野で周知である。
【０２５１】
Ｖ. ＡＳＯを含むキット
本開示は、さらに、ここに記載する本発明のＡＳＯを含み、ここに記載する方法の実施に使用できる、キットを提供する。ある実施態様において、キットは、１個以上の容器に少なくとも１つのＡＳＯを含む。ある実施態様において、キットは、全対照、アッセイ実施の指示および結果の解析および提示に必要な何れかのソフトウエアを含む、検出アッセイに必要なおよび／または実施に十分な全ての要素を含む。当業者は、本発明のＡＳＯが当分野で周知の確立されたキット形式の一つに容易に取り込み得ることを認識する。
【０２５２】
VI. 使用方法
本発明のＡＳＯは治療および予防に利用され得る。
【０２５３】
ＳＮＣＡは、シナプス伝達制御に役割を有すると考えられる場所であるシナプス前末端で、神経細胞に優勢に発現される１４０アミノ酸タンパク質である。天然に折り畳まれていないモノマーおよび安定なα−ヘリックスの四量体の両者で天然に存在することが提案されており、翻訳後数個の修飾を受けていることが示されている。広く研究されている修飾の一つは、ＳＮＣＡのアミノ酸セリン１２９(Ｓ１２９)のリン酸化である。通常、ＳＮＣＡはＳ１２９で小さいパーセンテージでしか構成的にリン酸化(ｐＳ１２９)されないが、病的細胞内封入で見られる大多数がｐＳ１２９  ＳＮＣＡである。これら病的封入体は、誤って折り畳まれたＳＮＣＡタンパク質の凝集された、不溶性蓄積物からなり、集合的にシヌクレイン病として知られる神経変性疾患群の特徴である。
【０２５４】
シヌクレイン病で、ＳＮＣＡは神経細胞にレビー小体として知られる病的凝集体を形成し、これは、パーキンソン病(ＰＤ)、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)およびレビー小体型認知症(ＤＬＢ)両者の特徴である。本ＡＳＯは、それ故に、ＳＮＣＡ病的凝集体の数を減らすまたはＳＮＣＡ病的凝集体の形成を阻止することができる。さらに、グリア細胞質内封入体(ＧＣＩ)と称される異常ＳＮＣＡ富病巣がオリゴデンドロサイトに見られ、多系統萎縮症(ＭＳＡ)として知られる、急速に進行する、致死的シヌクレイン病の特徴を表す。ある実施態様において、本発明のＡＳＯはＧＣＩ数を減らすまたはＧＣＩ形成を阻止するオリゴデンドロサイトでの検出不可能なまたは低レベルのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現の報告は、ＳＮＣＡのある病的形態が、高度に発現される神経細胞から、オリゴデンドロサイトに伝播されることを示唆する。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＳＮＣＡ、例えば、病的形態のＳＮＣＡの神経細胞からの伝播を減少または阻止する。
【０２５５】
ＡＳＯを使用して、細胞および実験動物での、例えば、ＳＮＣＡタンパク質の合成を特異的に阻害(一般にｍＲＮＡの分解または阻害、それによるタンパク質形成阻止による)についての研究ができ、それにより、標的の機能的分析またはその治療介入の標的としての有用性の評価が促進される。さらに提供されるのは、インビトロまたはインビボで、細胞または組織と、有効量の本発明のＡＳＯの１個以上、コンジュゲートまたは組成物を接触させることを含む、細胞または組織におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡおよび／またはＳＮＣＡタンパク質の発現を下方制御する方法である。
【０２５６】
治療として、ＳＮＣＡ転写物および／またはＳＮＣＡタンパク質発現調節により処置され得る疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、ここに開示によりＡＳＯ化合物の投与により処置するさらに提供されるのは、治療的または予防有効量の本発明のＡＳＯの１個以上または組成物を投与することによる、ＳＮＣＡ転写物および／またはＳＮＣＡタンパク質の発現と関連する疾患または状態を有することが疑われるまたはその素因のあるヒをの処置するなどの哺乳動物を処置する方法である。本発明によるＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、一般に有効量で投与される。ある実施態様において、本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートは治療に使用される。
【０２５７】
本発明は、さらに、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症、多系統萎縮症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患などの、ここに記載する疾患の１個以上の処置に使用するための、本発明のＡＳＯ、を提供する。
【０２５８】
本発明は、さらに、有効量の１個以上のＡＳＯ、コンジュゲートまたはその医薬組成物をそれを必要とする動物(例えば処置が必要な患者)に投与することを含む、α−シヌクレイン病を処置する方法を提供する。
【０２５９】
ある実施態様において、疾患、障害または状態は、ＳＮＣＡ遺伝子転写物および／またはＳＮＣＡタンパク質の過発現と関連する。
【０２６０】
本発明はまた細胞または組織におけるＳＮＣＡ遺伝子転写物および／またはＳＮＣＡタンパク質の発現を阻害(例えば、減少)する方法も提供し、方法は、インビトロまたはインビボで、細胞または組織とここに開示の有効量の１個以上のＡＳＯ、そのコンジュゲートまたは医薬組成物を接触させて、ＳＮＣＡ遺伝子転写物の発現の低下に影響を与え、それによりＳＮＣＡタンパク質を減少させることを含む。
【０２６１】
ある実施態様において、ＡＳＯを、脳の１個以上の区画、例えば、海馬、脳幹、線条体または任意のこれらの組み合わせにおけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの発現の減少に使用する。他の実施態様において、ＡＳＯは、３日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目、１５日目、２０日目、２１日目または２５日目に、媒体(無ＡＳＯ)の投与または暴露後のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現と比較して、例えば、脳幹および／または線条体におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの発現を７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満または５％未満に減少させる。ある実施態様において、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの発現は、２８日目、３０日目、３２日目、３５日目、４０日目、４２日目、４５日目、４９日目、５０日目、５６日目、６０日目、６３日目、７０日目または７５日目まで、媒体(無ＡＳＯ)の投与または暴露後のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現と比較して、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下または５％以下に維持される。
【０２６２】
他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、髄質、尾状核被殻、橋、小脳、腰部脊髄、前頭前皮質および／または任意のこれらの組み合わせのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡおよび／またはＳＮＣＡタンパク質発現を減少させる。
【０２６３】
本発明はまた、医薬の製造のための、記載する本発明の本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートも提供する。本発明はまた、ここに記載する障害の処置に使用するためのまたはここに記載する障害の処置の方法のための、ＡＳＯまたはそのコンジュゲートを含む組成物も提供する。本発明はまた治療に使用するためのＡＳＯまたはコンジュゲートを提供する。本発明は、さらに、シヌクレイン病の処置に使用するための、ＡＳＯまたはコンジュゲートを提供する。
【０２６４】
本発明は、さらに、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の阻害を及ぼすように、細胞に本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートを投与することを含む、ＳＮＣＡ発現細胞におけるＳＮＣＡタンパク質を阻害する方法を提供する。
【０２６５】
本発明は、本発明によるＡＳＯまたはコンジュゲートを投与することを含む、処置を必要とする対象における神経過興奮を減少、軽減、予防または処置する方法を含む。
【０２６６】
本発明はまた、処置を必要とする患者に、ここに記載する本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートおよび／または本発明の医薬組成物を投与することを含む、ここに記載する障害を処置する方法も提供する。
【０２６７】
ＡＳＯおよび本発明による他の組成物を、ＳＮＣＡタンパク質の過発現または変異バージョンの発現と関連する状態の処理に使用し得る。
【０２６８】
本発明は、α−シヌクレイン病の処置などのための医薬として使用するための、本発明によるＡＳＯまたはコンジュゲートも提供する。ある実施態様において、α−シヌクレイン病はパーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症、多系統萎縮症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患である。
【０２６９】
本発明は、ここに記載する疾患、障害または状態の処置用医薬の製造における、本発明のＡＳＯ  の使用をさらに提供する。ある実施態様において、本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートを、α−シヌクレイン病、発作性疾患またはこれらの組み合わせの処置用医薬の製造に使用する。
【０２７０】
一般的に述べて、本発明の一態様は、哺乳動物に治療有効量の１個以上のＬＮＡ単位を含むＳＮＣＡ転写物を標的とするＡＳＯを投与することを含む、ＳＮＣＡの異常レベルと関連する状態(すなわち、α−シヌクレイン病)を有するかまたは疑われる哺乳動物を処置する方法に関する。本発明によるＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、一般に有効量で投与される。
【０２７１】
ここで述べる疾患または障害は、ある実施態様において、ＳＮＣＡ遺伝子またはタンパク質産物がＳＮＣＡタンパク質と関連するまたは相互作用する遺伝子の変異と関連し得る。それ故に、ある実施態様において、標的ｍＲＮＡは、ＳＮＣＡ配列の変異形態である。
【０２７２】
本発明の興味深い態様は、ここに記載する疾患、障害または状態の処置用医薬の製造における、ここに定義するＡＳＯ(化合物)またはここに定義するコンジュゲートの使用に関する。
【０２７３】
本発明の方法は、異常レベルのＳＮＣＡタンパク質が原因の疾患の処置または予防に用いられ得る。ある実施態様において、異常レベルのＳＮＣＡタンパク質が原因の疾患はα−シヌクレイン病である。ある実施態様において、α−シヌクレイン病はパーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を含む。
【０２７４】
換言すると、ある実施態様において、本発明は、さらに、本開示の本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、異常レベルのＳＮＣＡタンパク質を処置する方法に関する。
【０２７５】
本発明は、医薬として使用するためのＡＳＯ、組成物またはここに定義するコンジュゲートにも関する。
【０２７６】
本発明は、異常レベルのＳＮＣＡタンパク質またはＳＮＣＡタンパク質の変異体形態(例えば、ここに記載する疾患の一つと関連するもののようなアレルバリアント)の発現の処置用医薬の製造のための、ここに定義する化合物、組成物またはコンジュゲートの使用にさらに関する。
【０２７７】
処置を必要とする患者は、該疾患または障害を有するか有する可能性が高い患者である。
【０２７８】
本発明の実施には、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の慣用の技術が用いられる。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)参照。
【０２７９】
上に引用する全ての参考文献ならびに本明細書に引用する全ての引用文献は、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
【０２８０】
次の実施例は、説明のために提供し、限定のためではない。
【実施例】
【０２８１】
実施例１：ＡＳＯの構築
ここに記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡの種々の領域を標的とするよう設計した。ゲノムＳＮＣＡ配列について図１ＡおよびＳＮＣＡ  ｃＤＮＡについて図１Ｂを参照のこと。例えば、ＡＳＯを、図２に示すNG_011851.1のｐｒｅ−ｍＲＮＡ開始部位およびｐｒｅ−ｍＲＮＡ末端部位および／またはｍＲＮＡ開始部位およびそのｍＲＮＡの末端部位を使用して、示す領域を標的とするように構築した。ＡＳＯの配列例(例えば、配列番号)は図２および３に記載する。ある実施態様において、ＡＳＯを、ギャップマー(例えば、交互ギャップマー)であるように設計した。ＤＥＳ番号参照。
【０２８２】
図２および３は、選択配列に対するＡＳＯ設計の非限定的例を示す。同じ方法を、ここに開示する何れかの他の配列に適用できる。ギャップマーを、ロックド核酸  −  ＬＮＡ(大文字)を含むように構築した。例えば、ギャップマーは、５'末端および３'末端にベータ−デオキシＬＮＡを有することができ、ホスホロチオエート主鎖を有する。しかし、ＬＮＡを、何れかの他のヌクレオチドアナログに置き換えてよく、主鎖は他のタイプの主鎖であり得る(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはこれらの組み合わせ)。
【０２８３】
ＡＳＯを、当分野で周知の方法を使用して合成した。このようなＡＳＯの製造法の例は、Barciszewski et al., Chapter 10 - " Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)に記載され、その内容全体を引用により明示的に本明細書に包含させる。
【０２８４】
実施例２Ａ：初代神経細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の減少を測定する高含量アッセイ
ＳＮＣＡを標的とするＡＳＯを、初代マウス神経細胞のＳＮＣＡタンパク質発現を減少させるその能力について試験した。初代神経細胞培養を、Ａ５３Ｔ変異を有するヒトＳＮＣＡ遺伝子全体をマウスＳＮＣＡノックアウトバックグラウンドで担持するＰＡＣ−Ｔｇ(ＳＮＣＡＡ５３Ｔ)＋／＋；ＳＮＣＡ−／−(「ＰＡＣ−Ａ５３Ｔ」)マウスの前脳から確立した。Kuo Y et al., Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010)参照。マウスが関与する全ての方法は、Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee(ACUC)により承認されたAnimal Test Methods(ATM)に従い実施した。初代神経細胞を、製造業者のプロトコールに従うパパイン消化により産生した(Worthington Biochemical Corporation, LK0031050)。単離神経細胞を洗浄し、Ｂ２７(Gibco)、１.２５μM  Glutamax(Gibco)、１００単位／ml  ペニシリン、１００μg／mlストレプトマイシンおよび２５μg／mlアムホテリシンＢ添加神経基底培地(ＮＢＭ、Invitrogen)に再懸濁した。
【０２８５】
細胞を、多ウェルポリＤ−リシン被覆プレートに５,４００細胞／cm２で播種した(例えば３８４ウェルプレートで２５μl  ＮＢＭ中６,０００細胞／ウェル)。ＡＳＯを水で希釈し、細胞にＤＩＶ０１(すなわち、播種１日後)に加えた。ＡＳＯを培地中最終濃度の２倍で添加し、次いで、細胞に手作業により加えた。あるいは、ＡＳＯ水溶液をLabcyte ECHOアコースティックディスペンサーを使用して分配した。ＥＣＨＯ分配のために、２５０nlのＡＳＯ水溶液を培地中の細胞に加え、続いて新鮮ＮＢＭの等体積アリコートを加えた。一次スクリーニングのため、ＡＳＯを５μM、３.３μM、１μM、２００nMまたは４０nMの最終濃度で加えた。有効性決定のために、ＡＳＯの８〜１０点滴定を０.７５mM現役から調製し、次いで２.７〜４０００nMまたは４.５〜１０,０００nM範囲の最終濃度で培養細胞に加えた。ＡＳＯ−００００１０(TCTgtcttggctTTG、配列番号２２)およびＡＳＯ−０００８３８(AGAaataagtggtAGT、配列番号２３)(５μM)を、それぞれチューブリンおよびＳＮＣＡの参照対照阻害剤としてプレートに包含させた。細胞をＡＳＯと１４日間インキュベートし、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した。
【０２８６】
１４日間インキュベーション後、細胞を、ウェル中４％ホルムアルデヒド(J.T. Baker)および４％スクロース(Sigma)の最終濃度に固定剤を加えることにより固定した。細胞を１５分間固定し、固定剤をウェルから吸引した。次いで、細胞を、０.３％Triton-X 100および３％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)または３％正常ヤギ血清含有リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)溶液で２０分間透過性処理した。その後、透過処理緩衝液をウェルから吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次いで、一次抗体を０.１％Triton X-100および３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈した。１：１０００のウサギ抗ＳＮＣＡ(Abcam)および１：５００のニワトリ抗チューブリン(Abcam)の希釈を使用した。細胞を、一次抗体と２時間〜一夜インキュベートした。インキュベーション後、一次抗体染色溶液を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。３％ＢＳＡと共に０.１％Triton X-100を含むＰＢＳ中の１：５００希釈のヤギ−抗ニワトリAlexa 567抗体、ヤギ抗ウサギ−Alexa 488抗体およびHoechst(１０μg／ml)を含む二次染色溶液をウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。その後、二次染色溶液をウェルから吸引し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞洗浄後、６０μlのＰＢＳを各ウェルに加えた。次いで、プレートをＰＢＳユニットイメージングまで保存した。
【０２８７】
造影のために、プレートを核(Hoechst染色、チャネル１)、チューブリン伸長(Alexa 567、チャネル２)およびＳＮＣＡ(Alexa 488、チャネル３)を定量するためのSpot Detector bio-application(Cellomics)を使用するThermo-Fisher(Cellomics)CX5イメージャー上で走査した。対象カウント(核)をモニターしたが、データベースに公開しなかった。チューブリンにより被覆された総面積を特性SpotTotalAreaCh2として定量し、ＳＮＣＡの染色の総強度をSpotTotalIntenCh3として定量した。チューブリン測定は毒性のモニターのために含めた。ＳＮＣＡタンパク質減少を決定するために、ＳＮＣＡ強度対チューブリン染色面積比を計算し、結果を、合計として媒体処理ウェルおよびチューブリンまたはＳＮＣＡそれぞれの最大阻害ウェルとしてＡＳＯ−００００１０またはＡＳＯ−０００８３８ウェルを使用して％阻害中央として正規化した。
【０２８８】
実施例２Ｂ：自発的カルシウム振動測定
細胞内遊離カルシウム濃度振動(カルシウム振動)減少は、神経毒性増加に対応し、それ故に、インビボでの忍容性減少を示し得る。初代皮質神経細胞自発的カルシウム振動を測定するために、ラット初代皮質神経細胞をSprague-Dawleyラット胚(Ｅ１９)から調製した。簡潔には、脳皮質を切開し、３７℃で３０〜４５分間、パパイン／ＤＮａｓｅ／イーグル平衡塩溶液(ＥＢＳＳ)溶液でインキュベートした。細胞ペレットの摩砕および遠心分離後、プロテアーゼ阻害剤、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)およびＤＮａｓｅ含有ＥＢＳＳとのインキュベートにより反応を停止させた。次いで、細胞を摩砕し、２％Ｂ−２７、１００μg／ml  ペニシリン、８５μg／mlストレプトマイシンおよび０.５mM  グルタミン添加神経基底(ＮＢ、Invitrogen)で洗浄した。
【０２８９】
細胞を、２５,０００細胞／ウェル濃度で、３８４ウェルポリ−Ｄ−リシン被覆蛍光造影プレート(BD Biosciences)に、２５μl／ウェルで添加神経基底(ＮＢ)培地(Ｂ２７サプリメントおよび２mM  グルタミン含有)中播種した。細胞を、１２日間、３７℃で５％ＣＯ２で増殖させ、ＤＩＶ１２(すなわち、播種１２日後)のために２５μlのさらなる培地をＤＩＶ０４(すなわち、播種４日後)およびＤＩＶ０８(すなわち、播種８日後)に加えた。
【０２９０】
実験の日、ＮＢ培地をプレートから除去し、細胞を５０μl／ウェルの３７℃アッセイ緩衝液(ハンクス平衡塩溶液、２mM  ＣａＣｌ２および１０mM  Ｈｏｐｅｓ  ｐＨ７.４含有)で１回洗浄した。振動を１mM  ＭｇＣｌ２の存在下および非存在下両者で試験した。細胞に細胞永続的蛍光カルシウム色素、Fluo-4-AM(Invitrogen、Molecular Probes F14201)を付加した。Ｆｌｕｏ−４−ＡＭを、１０％pluronic F-127含有ＤＭＳＯで２.５mMで調製し、次いでアッセイ緩衝液で２.５μMの最終濃度に１：１０００希釈した。細胞を、１時間、２０μlの２.５μM  Ｆluo-4-AMと３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、さらに２０μlの室温アッセイ緩衝液を加え、細胞を暗所で室温で１０分間平衡化させた。
【０２９１】
プレートをＦＤＳＳ  ７０００蛍光プレートリーダー(Hamamatsu)で、励起波長４８５nmおよび放出波長５２５nmで読んだ。総蛍光記録時間は、全３８４ウェルで６００秒間で１Hz取得率であった。初期ベースラインシグナル(細胞内カルシウム測定)は、ＡＳＯ添加前９９秒間で確立した。ＡＳＯを、２０μlのアッセイ緩衝液中、７５μMで２５μMの最終濃度のためにＦＬＩＰＲの３８４ウェルヘッドに加えた。一部例でＡＳＯ−００００１３(OxyAs OxyTs OxyTs DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas OxyMCs OxyTs OxyT；ATTtccaaattcaCTT、配列番号２４)またはＡＳＯ−００００１０(TCTgtcttggctTTG、配列番号２２)などのタウを標的とするＡＳＯを対照として包含させた。
【０２９２】
蛍光時間系列強度測定(上記)をHamamatsuリーダーからエクスポートし、データ圧縮および正規化に適するIDBS E-Workbookの社内私的アプリケーションに移した。各３８４ウェルスクリーニングプレートで、最大４８までの個々のＡＳＯを４連のウェルで測定した。１２ウェルを陽性対照(ＡＳＯ−００００１０)に暴露し、これは、３００秒獲得時間枠でカルシウム振動カウントを顕著に減少させ、１２ウェルを陰性対照不活性ＡＳＯ(ＡＳＯ−００００１３)に暴露し、これは観察されるカルシウム振動を阻害しなかった。最後に、２４ウェルを試験ＡＳＯ希釈に使用したのと同じ濃度のＲＮａｓｅ−ＤＮａｓｅ−遊離水からなる媒体対照に付した。カルシウム振動頻度(３００秒期間にわたる)に対する個々のウェルの試験ＡＳＯの効果を、２４媒体対照ウェルで計測されたカルシウム振動の中央数の％対照として表した。個々の３８４ウェルアッセイプレートは、陽性および陰性ＡＳＯ対照(ＡＳＯ−００００１０およびＡＳＯ−００００１３)が、Ｃａアッセイで十分に特徴づけされた薬理活性を示し、媒体および薬理活性対照ウェルが、３００秒の実験時間にわたり最小約２０カルシウム振動を生じたならば、ＱＣ標準を通過した。
【０２９３】
実施例２Ｃ：ヒト神経細胞でｍＲＮＡ減少を測定するためのQUANTIGENE(登録商標)分析(９６ウェルアッセイ)
ＡＳＯがヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡを減少させる能力および／または可能性のあるヒトオフターゲットｍＲＮＡ種を、インビトロでQUANTIGENE(登録商標)分析により測定した。ヒト神経細胞(Cellular Dynamics Inc., "iNeurons")を、製造業者の明細にしたがい解凍し、播種し、培養した。これらのiNeuronsはCellular Dynamic所有の分化および精製プロトコールを使用して多能性幹(ｉＰＳ)細胞から誘導したヒト神経細胞の高度に純粋な集団である。
【０２９４】
溶解：細胞を、ウェルあたり５０,０００〜１００,０００細胞(試験するオフターゲットの発現による)でポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン被覆９６ウェルプレートに播種し、Ｂ２７、glutamaxおよびペニシリン−ストレプトマイシン添加神経基底培地に維持した。ＡＳＯを水で希釈し、ＤＩＶ０１(すなわち、播種１日後)に細胞に加えた。一点測定のために、０.５μMの最終ＡＳＯ濃度を一般に使用した。ＩＣ５０決定のために、神経細胞を５μMの最高濃度で１：４の７点濃度応答希釈で処理し、ＩＣ５０を規定した。次いで、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で６日間インキュベートして、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した
【０２９５】
インキュベーション後、培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、次のとおり溶解した。ライセートメッセンジャーＲＮＡ測定を、特別に設計されたＲＮＡ捕捉プローブセットを利用する分岐ＤＮＡ−シグナル増幅法を使用してＲＮＡを定量するQUANTIGENE(登録商標)2.0 Reagent System(AFFYMETRIX(登録商標))を使用して実施した。作業細胞溶解緩衝溶液を、５０μlプロテイナーゼＫを５mlの予め温めた(３７℃)混合物に添加し、ｄＨ２Ｏで１：４最終希釈に希釈することにより製造した。作業溶解緩衝液プレートに加え(試験するオフターゲットの発現により、１００〜１５０μl／ウェル)、１０回摩砕し、密封し、３０分間、５５℃でインキュベートした。溶解後、ウェルをさらに１０回摩砕し、プレートを−８０℃で保存するか直ぐにアッセイした。
【０２９６】
アッセイ：使用する特定の捕捉プローブ(すなわち、ＳＮＣＡ、ＰＲＯＳ１またはチューブリン)によって、ライセートを溶解混合物で希釈した(または希釈しなかった)。次いで、ライセートを、総体積８０μl／ウェルで捕捉プレート(捕捉プローブで被覆された９６ウェルポリスチレンプレート)に加えた。作業プローブセット試薬を、製造業者(QUANTIGENE(登録商標)2.0 AFFYMETRIX(登録商標))の指示に従い、無ヌクレアーゼ水(１２.１μl)、溶解混合物(６.６μl)、遮断剤(１μl)および特定２.０プローブセット(０.３μl)(ヒトＳＮＣＡ catalogue #SA-50528、ヒトＰＲＯＳ１ catalogue #SA-10542またはヒトベータ３チューブリンcatalogue #SA-15628)を合わせることにより産生した。次に、２０μl  作業プローブセット試薬を、捕捉プレートで８０μlライセート希釈物(またはバックグラウンドサンプルのために８０μl溶解混合物)に加えた。プレートを２４０ｇで２０秒間遠心分離し、次いで１６〜２０時間、５５℃でインキュベートしてハイブリダイズさせた(標的ＲＮＡ捕捉)。
【０２９７】
標的ＲＮＡのシグナル増幅および検出を、プレートを緩衝液で３回(３００μl／ウェル)洗浄し、あらゆる非結合物質を除去することにより開始した。次に、2.0 Pre-Amplifierハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、５５℃で１時間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄緩衝液を加え、３回吸引した。次いで、2.0 Amplifierハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、１時間、５５℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。次に2.0 Label Probeハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、１時間、５０℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。プレートを再び２４０ｇで２０秒間遠心分離して、何らかの過剰の洗浄緩衝液を除去し、次いで、2.0 Substrate(１００μl／ウェル)をプレートに加えた。プレートを５分間、室温でインキュベートし、次いで、プレートをPerkinElmer Envisionマルチラベルリーダーでルミノメーターモードで１５分以内に造影した。
【０２９８】
データ決定：目的の遺伝子について、平均アッセイバックグラウンドシグナルを各技術的反復の平均シグナルから減じた。次いで、目的の遺伝子のバックグラウンド減算、平均シグナルを、ハウスキーピングチューブリンＲＮＡのバックグラウンド減算、平均シグナルに対して正規化した。処理サンプルのパーセント阻害を、対照処理サンプルライセートに対して計算した。ＡＳＯで処理した細胞のQUANTIGENE(登録商標)アッセイの結果を、例えば、図８に示す。
【０２９９】
実施例２Ｄ：Ｒａｍｏｓ細胞におけるｍＲＮＡ減少を測定するためのQUANTIGENE(登録商標)分析(９６ウェルアッセイ)
ヒトオフターゲットＩＫＺＦ３(ＩＫＡＲＯＳファミリー亜鉛フィンガー３)ｍＲＮＡ減少の可能性を測定するために、Ｒａｍｏｓ細胞(ヒトリンパ球性細胞株)を使用した。Ｒａｍｏｓ細胞はＳＮＣＡを発現しないため、Ｒａｍｏｓ細胞で発現されるＲＢ１(ＲＢ転写コリプレッサー１)を、ＡＳＯ介在ノックダウンＩＫＺＦ３  ｍＲＮＡ発現評価のための陽性対照として使用した。ヒトＲＢ１  ｍＲＮＡ発現への結合およびノックダウンのために２つのＡＳＯを合成した。ベータ−２ミクログロブリン(β２Ｍ)をハウスキーピング遺伝子対照として使用した。Ｒａｍｏｓ細胞を、ＦＢＳ、グルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ添加ＲＰＭＩ培地の懸濁液で増殖させた。
【０３００】
溶解：細胞を、ウェル当たり２０,０００細胞でポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン被覆９６ウェルプレートに播種し、Ｂ２７、glutamaxおよびペニシリン−ストレプトマイシン含有神経基底培地に維持した。ＡＳＯを水で希釈し、播種１日後(ＤＩＶ０１)、１μMの最終濃度で細胞に加えた。ＡＳＯ処理後、細胞を３７℃で４日間インキュベートして、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を次のとおり溶解した。ライセートメッセンジャーＲＮＡ測定を、特別に設計されたＲＮＡ捕捉プローブセットを利用する分岐ＤＮＡ−シグナル増幅法を使用してＲＮＡを定量するQUANTIGENE(登録商標)2.0 Reagent System(AFFYMETRIX(登録商標))を使用して実施した。溶解混合物(QUANTIGENE(登録商標)2.0 AFFYMETRIX(登録商標))を３７℃で３０分間インキュベーターで予め温めた。懸濁液に細胞を溶解するために、１００μlの３Ｘ溶解緩衝液(１０μl／mlプロテイナーゼＫ含有)を、２００μlの懸濁液中の細胞に加えた。次いで、細胞を１０回摩砕して溶解させ、プレートを密封し、３０分間、５５℃でインキュベートした。その後、ライセートを−８０℃で保存するか直ぐにアッセイした。
【０３０１】
アッセイ：使用する特定の捕捉プローブ(すなわち、ＩＫＺＦ３、ＲＢ１およびβ２Ｍ)により、ライセートを溶解混合物で希釈した(または希釈しなかった)。次いで、ライセートを、総体積８０μl／ウェルで捕捉プレート(捕捉プローブで被覆された９６ウェルポリスチレンプレート)に加えた。作業プローブセット試薬を、製造業者(QUANTIGENE(登録商標)2.0 AFFYMETRIX(登録商標))の指示に従い、無ヌクレアーゼ水１２.１μl、溶解混合物６.６μl、遮断剤１μl、特定２.０プローブセット０.３μl(ヒトＩＫＺＦ３ catalogue #SA-17027、ヒトＲＢ１ catalogue #SA-10550またはヒトベータ−２ミクログロブリンcatalogue #SA-10012)を合わせることにより産生した。次いで２０μl  作業プローブセット試薬を、捕捉プレートで８０μlライセート希釈物(またはバックグラウンドサンプルのために８０μl溶解混合物)に加えた。次いでプレートを１６〜２０時間、５５℃でインキュベートしてハイブリダイズさせた(標的ＲＮＡ捕捉)。標的ＲＮＡのシグナル増幅および検出を、プレートを緩衝液で３回(３００μl／ウェル)洗浄し、あらゆる非結合物質を除去することにより開始した。次に、2.0 Pre-Amplifierハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、５５℃で１時間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄緩衝液を加え、３回吸引した。2.0 Amplifierハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を記載のとおり加え、１時間、５５℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。次に2.0 Label Probeハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、１時間、５０℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。プレートを再び２４０ｇで２０秒間遠心分離して、何らかの過剰の洗浄緩衝液を除去し、次いで、2.0 Substrate(１００μl／ウェル)をプレートに加えた。プレートを５分間、室温でインキュベートし、次いで、プレートをPerkinElmer Envisionマルチラベルリーダーを使用し、ルミノメーターモードで１５分以内に造影した。
【０３０２】
データ決定：目的の遺伝子について、平均アッセイバックグラウンドシグナル(すなわち、無ライセート、１Ｘ溶解緩衝液のみ)を各技術的反復の平均シグナルから減じた。次いで、目的の遺伝子のバックグラウンド減算、平均シグナルを、ハウスキーピングｍＲＮＡ(Ｒａｍｏｓ細胞ではベータ−２−ミクログロブリンであった)のバックグラウンド減算、平均シグナルに対して正規化した。処理サンプルのパーセント阻害を、未処理サンプルライセートの平均に対して計算した。ＡＳＯで処理した細胞のQUANTIGENE(登録商標)アッセイの結果を、表４に示す。
【０３０３】
実施例２Ｅ：ＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２)細胞でのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの減少を測定するためのｑＰＣＲアッセイ
ＳＮＣＡを標的とするＡＳＯ  ＳＡＮ−００５４５９を、ＡＴＣＣから得たヒトＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２)神経芽腫細胞(ＣＲＬ−２２７１)におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を減少させる能力について試験した。
【０３０４】
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２)細胞を、細胞培養培地(１０％ウシ胎児血清[Sigma, cat.no F7524]、１×GLUTAMAXTM[Sigma, cat.no 3050-038]、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液[Sigma, cat.no M7145]および０.０２５mg／mlゲンタマイシン[Sigma, cat.no G1397]添加ＭＥＭ[Sigma, cat.no M2279])で増殖させた。細胞を、５日毎にリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)[Sigma cat.no 14190-094]で洗浄し、続いて０.２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液(Sigma、Ｔ３９２４)を加え、３７℃で２〜３分間インキュベートし、摩砕してトリプシン処理し、その後細胞播種した。細胞を、最大１５継代培養に維持した。
【０３０５】
実験での使用のため、１２,５００細胞／ウェルを１００μL増殖培地中９６ウェルプレート(Nunc cat.no 167008)に播種した。オリゴヌクレオチドを７５０μM原液から調製した。ＰＢＳに溶解したＡＳＯを、細胞を最終濃度２５μMの一点試験のために播種した約２４時間後に加えた。細胞を、培地を一切交換することなく、４日間インキュベートした。有効性決定のために、８濃度のＡＳＯを１６〜５０,０００nMの最終濃度範囲で調整した。ＡＳＯ−００４３１６(CcAAAtcttataataACtAC、配列番号２５)およびＡＳＯ−００２８１６(TTCctttacaccACAC、配列番号１２)を対照として含めた。
【０３０６】
インキュベーション後、細胞を培地除去して集め、続いて１２５μL  PURELINK(登録商標)Pro 96溶解緩衝液(Invitrogen 12173.001A)および１２５μL  ７０％エタノールを加えた。ＲＮＡを製造業者の指示に従い精製し、５０μL水の最終体積で溶出し、１０〜２０ng／μlのＲＮＡ濃度を得た。ＲＮＡを、一工程ｑＰＣＲ反応前に水で１０倍希釈した。一工程ｑＰＣＲ反応のために、qPCR-mix(QauntaBioのqScript TMXLE 1-step RT-qPCR TOUGHMIX(登録商標)Low ROX, cat.no 95134-500)を２つのTaqmanプローブと１０：１：１比(ｑＰＣＲ  ｍix：プローブ１：プローブ２)で混合し、マスターミックスを作製した。TaqmanプローブはLifeTechnologiesから得た：ＳＮＣＡ：Hs01103383_m1；PROS1：Hs00165590_m1：ＴＢＰ：4325803；GAPDH4325792。次いで、マスターミックス(６μL)およびＲＮＡ(４μL、１〜２ng／μL)をｑＰＣＲプレート(MICROAMP(登録商標)光学３８４ウェル、4309849)で混合した。密封後、プレートを１０００ｇで１分間、ＲＴのクイックスピンに付し、ViiaTM 7システム(Applied Biosystems, Thermo)に移し、次のＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分；９５℃で３分；４０サイクルの９５℃で５秒、続いて１.６℃／秒での温度低下、続いて６０℃で４５秒。データをQUANTSTUDIOTM Real-Time PCR Softwareで分析した。
【０３０７】
実施例３：ヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ減少に対するＡＳＯ−００５４５９のインビトロ分析
ＡＳＯ−００５４５９は、ヒトＳＮＣＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロン１／エクソン２境界を標的とする１７塩基、ＬＮＡ修飾ＡＳＯである(図２、配列番号１５参照)。
【０３０８】
マウス神経細胞におけるＡＳＯ−００５４５９の有効性
実施例２Ａに記載する方法を使用して、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ減少の下流結果としてＳＮＣＡタンパク質発現を減少させる能力について、ＡＳＯ−００５４５９を試験した。簡潔には、ＰＡＣ−Ａ５３Ｔマウス由来初代神経細胞をＡＳＯ−００５４５９または対照ＡＳＯで１４日間処理した。細胞を固定し、ＳＮＣＡタンパク質およびチューブリンタンパク質レベルを高含量イメージングで測定した。チューブリンレベルを毒性モニターおよびＳＮＣＡタンパク質減少正規化のために測定した。
【０３０９】
下表１に示すとおり、細胞と４nMのＡＳＯ−００５４５９のインキュベーションは、ＳＮＣＡタンパク質発現を２１％減少させた。４０nMおよび５μMのＡＳＯ−００５４５９で、ＳＮＣＡタンパク質発現はそれぞれ８４％および８６％減少した。対照的に、ＡＳＯ−００５４５９はチューブリンタンパク質発現レベルへの効果が最小限であるか全くなかった。
【表２】
2021510511.tif 000009
ＳＤ＝標準偏差
Ｎ＝試験数
【０３１０】
有効性をさらに評価するため、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣ神経細胞を実施例２Ａに記載のとおりＡＳＯ−００５４５９の１０点滴定で処理し、ＳＮＣＡおよびチューブリンタンパク質に対する効果のＩＣ５０を決定した。図７Ａおよび７Ｂおよび表２(下記)に示すとおり、α−Ｓｙｎ／チューブリン比の濃度依存性減少が観察され、平均ＩＣ５０は７.４nMであった。この観察は、表１(上記)の一点活性データと一致した。さらに、ＡＳＯ−００５４５９のＴｕｂレベルに対する効果は無視できるであった。まとめて、これらの結果はＡＳＯ−００５４５９が全体的細胞生存能への効果は最小で、ＳＮＣＡタンパク質レベルを強力に減少させることを示す。
【表３】
2021510511.tif 000010
ＳＤ＝標準偏差
Ｎ＝試験数
【０３１１】
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２)細胞におけるＡＳＯ−００５４５９の効果
実施例２Ｅに記載の方法を使用して、ＡＳＯ−００５４５９を、４日間処理後のＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２)におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡを減少する能力について、試験した
【０３１２】
細胞と２５μM  ＡＳＯ−００５４５９のインキュベーションは、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ(２)細胞でＳＮＣＡ  ｍＲＮＡを９２％減少させた。
【０３１３】
ヒト神経細胞におけるＡＳＯ−００５４５９の有効性
ＳＮＣＡに対するＡＳＯ−００５４５９有効性を、実施例２Ｃに記載のとおり、一次ヒト神経細胞を使用して確認した。すなわち、ヒト神経細胞を、誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞から導いた。細胞を６日間ＡＳＯ−００５４５９または対照ＡＳＯで処理し、次いで、ｍＲＮＡレベルをQUANTIGENE(登録商標)アッセイで測定した。ヒト神経細胞がＡＳＯ−００５４５９のオフターゲットの可能性があるＰＲＯＳ１も発現するため、ＰＲＯＳ１  ｍＲＮＡレベルも、オフターゲット遺伝子に対するＡＳＯ−００５４５９の効果を評価するために測定した。さらに、チューブリン(ＴＵＢＢ)ｍＲＮＡを毒性モニターのために測定した。
【０３１４】
図８および表３(下記)に示すとおり、ＡＳＯ−００５４５９は、ヒト神経細胞で発現されるＳＮＣＡの濃度依存性減少を誘発し、平均ＩＣ５０は１００nMであった。このＩＣ５０は、ＰＡＣ−Ａ５３Ｔ神経細胞におけるＳＮＣＡタンパク質減少のＩＣ５０(表２、上記)より約１３倍弱かった。この有効性シフトの理由は明らかではないが、ＡＳＯ取り込み、代謝またはＳＮＣノックダウンの反応速度論の差異による可能性がある。ＡＳＯ−００５４５９はヒト神経細胞でＰＲＯＳ１  ｍＲＮＡの濃度依存性減少も示したが、ＩＣ５０はＳＮＣＡに対するＩＣ５０より３０〜５０倍弱かった。これらの結果は、ヒト神経細胞におけるＳＮＣＡに対するＡＳＯ−００５４５９活性を確認し、ＡＳＯ−００５４５９がＰＲＯＳ１と比較してＳＮＣＡに３０〜５０倍選択的であることを示す。
【表４】
2021510511.tif 000011
バッチ＝使用したＡＳＯ−００５４５９の特定のロット番号
【０３１５】
Ｒａｍｏｓ細胞におけるＡＳＯ−００５４５９の有効性
ＩＫＺＦ３はＡＳＯ−００５４５９について別の潜在的オフターゲットであるが、ＰＲＯＳ１と異なり、ヒト神経細胞で発現されない。その代わり、ＩＫＺＦ３はヒトリンパ球性細胞株であるＲａｍｏｓ細胞で強く発現される。Ｒａｍｏｓ細胞を１μM  ＡＳＯ−００５４５９で処理し、ＩＫＺＦ３  ｍＲＮＡ発現に対する効果を測定した。毒性モニターのために、ベータ−２ミクログロブリンｍＲＮＡも測定した。Ｒａｍｏｓ細胞がＳＮＣＡを発現しないため、別の遺伝子、ＲＢ１(ＲＢ転写コリプレッサー１)をＡＳＯ介在ノックダウンの陽性対照として使用した。ＡＳＯ−００６７５４(GGTgaggtttggtaGA、配列番号２６)およびＡＳＯ−００６７５５(GGTgaggtttggtagaAG、配列番号２７)はＲＢ１を標的とし、本試験に含めた。表４(下記)に示すとおり、１μM濃度で、ＡＳＯ−００５４５９はＩＫＺＦ３  ｍＲＮＡ発現に影響を与えず、ＡＳＯ−００５４５９のＳＮＣＡへの特異性が示された。ＡＳＯ−００５４５９はまたＲＢ１およびβ２Ｍ  ｍＲＮＡ発現にも影響を与えず、ＡＳＯ−００５４５９はＲａｍｏｓ細胞に毒性でないことが示される。対照的に、ＡＳＯ−００６７５４およびＡＳＯ−００６７５５(対照ＡＳＯ)は、ＲＢ１レベルをそれぞれ８７％および８３％減少させ、Ｒａｍｏｓ細胞におけるＡＳＯ活性を確認した。
【表５】
2021510511.tif 000012
バッチ＝使用したＡＳＯの特定のロット番号
【０３１６】
まとめて、ここに示す結果はＡＳＯ−００５４５９がＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ減少に協力且つ高度に選択的であり、これはその後ＳＮＣＡタンパク質レベルの減少に介在することを示す。結果はまたＡＳＯ−００５４５９がマウスおよびヒト神経細胞両者で十分に忍容性であることを示す。これらの治験は、シヌクレイン病処置のための疾患修飾治療としてのＡＳＯ−００５４５９の開発継続を支持する。
【０３１７】
実施例４：インビボ忍容性およびインビボＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ減少
選択ＡＳＯのインビボ忍容性を試験して、種々の動物モデル(すなわち、マウスおよびカニクイザル)に注射したとき、どのようにＡＳＯが許容されたかを確認した。
【０３１８】
マウス
対象Ａ５３Ｔ変異を有するヒトＳＮＣＡ遺伝子全体をマウスＳＮＣＡノックアウトバックグラウンドで担持する雄および雌(２〜３か月齢)ＰＡＣ−Ｔｇ(ＳＮＣＡＡ５３Ｔ)＋／＋；ＳＮＣＡ−／−(「ＰＡＣ−Ａ５３Ｔ」)マウスを、急性、長期およびＰＫ／ＰＤインビボ効果試験に使用した。一部例では、野生型(ＷＴ)Ｃ５７Ｂ／６マウスを使用して、長期(すなわち、４週間)健康評価をした。マウスを、４匹または５匹のグループで、温度制御飼育室で、餌および水は自由に摂取させて飼育した。マウスが関与する全ての方法は、Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee(ACUC)により承認されたAnimal Test Methods(ATM)に従い実施した。
【０３１９】
ＡＳＯ投与溶液調製：０.２μm  Whatmanフィルターおよび無ヌクレアーゼ遠心管を装着した無菌食塩水(１mL)シリンジを使用して、投与溶液を調製した。記載する量の水または食塩水をＡＳＯ粉末に加え、ボルテックス処理(約１分間)して、ＡＳＯ粉末を溶解させた。次いで、溶液を１０分間静置し、再び約１分間ボルテックス処理した。チューブを短く遠心して全ての液体をチューブの底に戻し、次いで、溶液を０.２μm  無菌フィルターをとおして、第二の無ＲＮａｓｅチューブに入れた。一次原液の少量をNanodropを使用する濃度分析のために１mg／mlに希釈した。分析サンプルを、手で倒置させながら３回ボルテックス処理して、徹底的に混合した。次いで、サンプルのＵＶ吸光度を、Nanodropで２６０nmで２回測定した(サンプルを入れる前に台を３回濯ぎ、拭いた)。試験サンプルは、分析が完了したら廃棄した。サンプルは、ＵＶ吸光度がサンプルの９０〜１１０％であるならば、投与の準備ができたとみなした。ＵＶ吸光度がサンプルの１１０％を超えているならば、二次希釈を調製した；吸光度が＜９０％であるならば、高い初期濃度で、上記と同様の工程に従い調製した。サンプルを使用するまで４℃で保存した。
【０３２０】
フリーハンド脳室内(ＩＣＶ)注射：HaleyおよびMcCormickの方法に従い、ＩＣＶ注射を２７または３０ゲージ針を備えたハミルトンマイクロシリンジを使用して実施した。針は、その脳内への浸透を制限するために、先端から２.５〜３mmにポリエチレンガードを備えた。マウスをイソフルラン麻酔(１〜４％)を使用して麻酔した。十分に麻酔されたら、一方の手の親指と人差し指で、首背部のたるんだ皮膚の部位でマウスを持った。次いで、優しく、しかし確かに圧をかけながら、動物の頭部を堅い平らな表面に押し付けて固定した。２７ 2/1ｇ針を備えた１０μL  ハミルトンシリンジを使用して投与を行った。次いで針先端を頭皮および頭蓋骨をとおして前項の約１mm側面および１mm後端に挿入した(すなわち、中線の右、眼線から測定して約３mm後ろ)。針が設置できたら、ＡＳＯを食塩水媒体中５μlの体積で与え、約３０秒間かけて注入した。針を、出す前５〜１０秒間その場に置いた。マウスを飼育ケージに戻し、約２〜４分間回復させた。マウスを薬物および／または投与の有害行動変化について、投与直後３０分間連続して観察した。この間、離れて３回を超えて痙攣したマウスは全て直ぐに屠殺し、２０の自動スコアを付した。薬物忍容性を投与後１時間±１５分間採点した。非忍容性を投与された動物(忍容性スコア＞４)は、１時間評価後直ぐに屠殺した。
【０３２１】
ＡＳＯ忍容性評価：ＡＳＯ投与動物を、投与直後評価し、あらゆる有害作用について２時間モニターした。急性忍容性(ＡＴ)試験について、マウスを投与時およびテイクダウン時、すなわちＡＳＯ注射３日後に再び評価した。長期健康評価について、マウスを、実験完了まで毎週秤量し、あらゆる健康および行動問題についてモニターした。最初の体重から１５％を超えて体重が減少したまたは忍容性問題を示したマウスを試験から除き、屠殺した。健康および忍容性評価を、次のチャートに従い実施した。
【表６】
2021510511.tif 000013
ａ  正常を「０」と採点する。動物を、投与後連続した時点で、個々に採点する。観察は、１時間±１５分、次いで２４時間±２時間、その後７日目(適切であれば)に採点する。痙攣は、前の観察ウインドで生じても１時間時点としてカウントする。ｔ総忍容性スコアを、個々のカテゴリースコアの合計に基づき計算し、可能な最高スコアは２０である。
【０３２２】
組織回収：最終行動および健康評価後、マウスを断頭台で断頭し、脳を直ぐに摘出した。各脳を２つの半球に分け、ａ)海馬を３日急性忍容性試験におけるｍＲＮＡ測定のために切断した；ｂ)半球の一方からの海馬、脳幹および線条体をｍＲＮＡ測定のために切断し、同時に他方の半球の同じ領域を用量応答時間経過ＰＫ／ＰＤ試験におけるタンパク質／ＰＫ測定のために切断した。
【０３２３】
試験のいくつかで、血液および脳脊髄液(ＣＳＦ)も、ＰＫ(血液)およびＰＫ／タンパク質(ＣＳＦ)測定のために採取した。血液およびＣＳＦを採取するために、マウスをイソフルラン(４％)で麻酔した。血液を２３Ｇ針を使用する心臓穿刺により採取した。採ったら、血液を２ml  BD Microtainer(K2EDTA BD #365974)チューブに移し、処理するまで氷上に置いた。血液を処理するために、チューブを４５００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。次いで、血漿を取り、０.５mlエッペンドルフチューブに入れ、使用するまで−８０℃で保存した。ＣＳＦを採取するために、胸腔を開けて心臓を露出させ、できるだけ多くの血液を、ＣＳＦの汚染を避けるために吸引した。ＣＳＦサンプルをマイクロピペットを使用して大槽から採取し、lo-bindタンパク質エッペンドルフチューブに入れた。次いで、チューブを４５００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。ＣＳＦを注意深く清潔なlo-bind ０.５mlエッペンドルフチューブに入れ、さらに使用するまで−８０℃で保存した。
【０３２４】
カニクイザルデータ
対象：試験開始時３.５〜１０.０kgの雄カニクイザルを使用した。それぞれＬ３またはＬ４椎骨に入る髄腔内脳脊髄液(ＣＳＦ)カテーテルをインプラントした。ポリレタンカテーテルの遠位先端はほぼＬ１椎骨まで髄腔内空間内を伸びた。近位末端を動物の背下部に位置する皮下アクセスポートに接続した。動物を試験開始前少なくとも２週間治癒させた。実験動物ケアは、Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory AnimalsおよびGuide for the Care and use of Laboratory Animals NRC (2011)(National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health)に従った。プロトコールはBristol-Myers Squibb CompanyのWallingford Animal Care and Use Committeeにより承認された。
【０３２５】
ＣＳＦおよび血液サンプリング：ＣＳＦポートを、無菌法を使用して皮下でアクセスし、ＣＳＦを霊長類拘束椅子に正立で座っている起きた動物からサンプリングした。約０.１mlのＣＳＦをカテーテルのデッドスペースおよびポートを浄化するために採取開始時に廃棄した。ＣＳＦを、最大０.５ml  ＣＳＦ／サンプルで自然流下により集めた。ＣＳＦを２,０００ｇで４℃で１０分間遠心分離した。上清をドライアイスまたは液体窒素で凍結させ、分析するまで−９０℃で保存した。
【０３２６】
血液を利用可能な静脈、一般に伏在静脈からサンプリングした。血液サンプルを問題の特定の測定により、多数の方法で調製した。血漿について、血液をＥＤＴＡ処理チューブに集めた。血清について、血液を血清セパレーターチューブに集め、少なくとも３０分間凝血させ、その後遠心分離した。凝固および凝固因子測定のため、血液をクエン酸処理チューブに集め、ＲＮＡ分析のため、血液をRNAlater含有チューブに集めた。処理後、サンプルをドライアイスまたは液体窒素で凍結させ、分析するまで凍結させたままにした。
【０３２７】
髄腔内投与：動物を、覚醒時、市販の拘束椅子を改変して使用して投与できるように訓練し、動物を伏臥位に維持した。ＳＮＣＡ標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)を食塩水に溶解し、濾過滅菌し、０.３３ml／分で１.０ml体積で投与し、続いて０.５ml  無菌水をフラッシュした。総注入時間は４.５分であった。動物は注入後３０分間、伏臥位に維持した。
【０３２８】
剖検：カニクイザルに、適切な体積の市販屠殺溶液を、ケタミンおよび／またはイソフルランで麻酔しながら投与した。剖検組織をその直後に得て、脳を切開のために湿った氷に載せた。目的領域を４〜６mmスライスを使用して、ASI Cyno Brain Matrixならびにフリーハンド技術を使用して切断した。サンプルを、RNAlaterに生のまま入れるかまたは後の分析のためドライアイスで凍結させた。ＣＮＳ組織をカニクイザルから迅速に切断し、いずれの軸も４mmを超えない長さの切片を集め、５mLのRNAlaterに入れた。サンプルを４℃で一夜保存し、次いで分析するまで保存するため−２０℃に移した。
【０３２９】
分析した脳領域は、髄質、橋、中脳、小脳、尾状核被殻(左右)、海馬(左右)、前頭前皮質(左右)、側頭皮質(左右)、頭頂皮質(左右)、後頭皮質(左右)および皮質下白質を含んだ。さらに、脊髄を頸部、胸部および腰部領域からサンプリングした。サンプルを肝臓、腎臓および心臓からも採取した。数例で、三叉神経核、脛骨神経および大動脈のサンプルを集め、これら領域でのオフターゲット薬理活性を試験した。
【０３３０】
マウスまたはサル組織、血漿およびＣＳＦにおけるＡＳＯ濃度のＥＬＩＳＡ定量：
組織を１：１比の血漿および水で均質化した。血漿(血漿およびＣＳＦ用)および血漿：水(組織サンプル用)で５０００〜４.９nMの２倍連続希釈により標準曲線を作成し、次いで５×ＳＳＣＴ(７５０mM  ＮａＣｌおよび７５mM  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０、０.０５％(ｖ／ｖ)Tween-20含有)単独および３５nM捕捉および３５nM検出試薬含有５×ＳＳＣＴでさらに計５０００倍まで希釈して、１〜１０００pMの標準範囲を得た。使用した希釈計数は予測されるサンプル濃度範囲により変わる。捕捉プローブはAAAGGAAと３'ビオチン(Exiqon)および検出プローブは５'  ＤｉｇＮ−イソプロピル１８リンカー−−ＧＴＧＴＧＧＴ(Exiqon)であった。
【０３３１】
実験サンプルおよび標準を、１：１比でClarity溶解緩衝液(Phenomenex, cat#AL0-8579)に加え、その後捕捉および検出緩衝液で希釈し、次いでＥＬＩＳＡプレートに移した。ＣＳＦサンプルを血漿(２倍)で希釈し、その後溶解緩衝液を加えた。ストレプトアビジン被覆プレート(Thermo 15119)を５×ＳＳＣＴ緩衝液で３回洗浄した。１００μlサンプルを加え、６０分間、室温でインキュベートした。０.０５％Tween-20含有ＰＢＳで１：４０００希釈した検出プローブ、１００μl抗Ｄｉｇ−ＡＰ  Ｆａｂフラグメント(Roche Applied Science, Cat. No. 11 093 274 910)を加え、６０分間、室温でインキュベートした。プレートを２×ＳＳＣＴ緩衝液で洗浄後、１００μl  Tropix CDP-star Sapphire II基質(Applied Biosystems)を３０分間、室温で加えた。アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を発光により測定した(Enspire-PerkinElmer)。
【０３３２】
アルファ−シヌクレインタンパク質測定：
脳組織サンプルを、ベッドホモジナイザーQiagen Tissuelyser IIを２５サイクル／秒で、５mmステンレス鋼ベッドで計２分使用して、ＲＩＰＡ緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０.５％デオキシコール酸ナトリウム、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム)中、１０ml／ｇ組織で均質化した。均質化サンプルを、氷上で３０分間インキュベートした。各サンプルの５０μLアリコートをＰＫ分析用に残した。残ったサンプルを２０,８００ｇで６０分間、４℃で遠心分離した。上清を保持し、分析に使用した。総タンパク質をPierce BCAタンパク質アッセイキット(23227)を使用して測定した。
【０３３３】
脳組織抽出物：ＳＮＣＡタンパク質を、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２  ＥＬＩＳＡを使用して測定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート(Costar)を１００μlの抗ＳＮＣＡ抗体ＭＪＦＲ１(Abcam)で、ＢｕｐＨ炭酸−炭酸水素緩衝液、ｐＨ９.４(Thermo Scientific)に希釈した０.１μg／ml濃度で、一夜(Ｏ／Ｎ)、４℃で被覆した。翌日、プレートをDulbecco's PBS (Life Technologies)で４回洗浄し、ＰＢＳ中３％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、無プロテアーゼ、Fraction V, Roche Diagnostic)で２〜３時間、室温(ＲＴ)または一夜、４℃で遮断した。標準および脳サンプル両者をRocheプロテアーゼ阻害剤(Roche 11836145001、１ペレット／２５ml)およびホスファターゼ阻害剤２＆３(Sigma、１：１００)含有１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで希釈した。ＳＮＣＡ野生型(rPeptide)を標準として使用した。サンプルをデュプリケート(５０μl／ウェル)で載せ、Ｏ／Ｎで４℃でインキュベートした。プレートをＲＴに平衡化した後、５０μlの検出抗体４Ｂ１２(Biolegend)(１％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳで１：４０００希釈)を各ウェルに加え、サンプルとＲＴで約２時間共インキュベートした。検出抗体は、アルカリホスファターゼ(Novus BiologicalsからのＡＰキット)とプレコンジュゲートさせた。次いでプレートを０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで４回洗浄し、１００μlのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II, T-2214, Life Technologies)で３０分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートを、アッセイ中一定に振盪させた(Titer plate shaker, speed 3)。データを、GraphPad Prismで分析した。脳組織の総タンパク質を、製造業者の指示に従い、Micro protein assay kit(Thermofisher #23235)を使用して測定した。
【０３３４】
脳脊髄液(ＣＳＦ)：ＳＮＣＡタンパク質を、製造業者の指示に従いU-PLEX Human SNCA Kit(cat# K151WKK-2, Meso Scale Discovery)で測定した。ＣＳＦサンプルを１０倍希釈した。Abcam mouse Hemoglobin ELISA kit(ab157715)を使用して、ＣＳＦサンプルでヘモグロビンを測定した。ＣＳＦサンプルをヘモグロビン測定のため４０倍希釈した。
【０３３５】
ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ測定
脳領域を回収し、RNA-later、ＲＮＡ安定化溶液を予め充填したRNA-later Tissue Protect tubes(Qiagen cat#76514)に入れた。RNA-later溶液中の組織は、４℃で１か月または−２０℃もしくは−８０℃で無限に保存できた。
【０３３６】
ＲＮＡ単離：RNeasy Plus Mini Kit：マウス海馬および皮質からのＲＮＡをRNeasy Plus Mini Kit(Qiagen cat#74134)を使用して単離した。組織サンプルを１０μl／mlの２−メルカプトエタノールおよび０.５％Reagent Dx含有６００μLまたは１２００μL  RLT Plus緩衝液体積で均質化した。６００μL溶解緩衝液を組織サンプルが＜２０mgであるならば使用し、１２００μl溶解緩衝液を組織サンプル＞２０mgで使用した。各均質化で、組織サンプルを６００μL  RLT Plus緩衝液(と１０μl／mlの２−メルカプトエタノールおよび０.５％Reagent Dx)および５mmステンレス鋼ビーズ(Ｑiagen cat#69989)を含む２.０mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ(Eppendorf cat#022600044)に移した。サンプルを、Qiagen's TissueLyser II装置を使用して均質化した。サンプルを２.０分間、２０Hzで処理し、サンプルを１８０°回転させ、さらに２.０分間、２０Hzで処理した。次いでサンプルを２.０分間、３０Hzで処理し、サンプルを１８０°回転させ、さらに２.０分間、３０Hzで処理した。処理が完全でないならば、長いおよび／または高頻度均質化を使用した。次いで６００μLの組織ライセートを２.０mL回収チューブのgDNA Eliminator spinカラムに移し、３０秒間、１０,０００ｇで遠心分離した。全遠心分離工程をＲＴで実施した。フロースルーを集め、等体積の７０％エタノールを加え、混合した。６００μLを２.０mL回収チューブに入れたRNeasy spinカラムに集め、サンプルを１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、残った６００μLサンプルをスピンカラムに加えた。スピンカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。カラムを７００μLの洗浄緩衝液ＲＷ１で洗浄し、１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次いでカラムを、キットプロトコールに記載のとおり、４体積のエタノールを含む５００μLの緩衝液ＲＰＥで２回洗浄した。カラムをまず初回洗浄のために１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離し、次いで二回目洗浄のために２.０分間、１０,０００ｇで遠視分離し、カラムを膜乾燥のために１.０分間、１０,０００ｇで１回遠心分離した。次いで、カラムを新しい１.５mL回収チューブに移し、３０μLの無ＲＮａｓｅ水を膜中心に直接加えた。膜を１０分間、ＲＴでインキュベートした。次いで、カラムを１.０分間、１０,０００ｇで遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡ含有溶出液を回収し、ＲＮＡ濃度が、NanoDrop分光光度計(Thermo)を使用するＵＶ吸光度により決定されるまで氷上に置いた。ＲＮＡサンプルを−８０℃で保存した。
【０３３７】
ＲＮＡ単離：RNEASY(登録商標)Plus Universal Mini Kiｔ：全ての他のカニクイザル、マウスおよびラット組織サンプルからのＲＮＡを、RNEASY(登録商標)Plus Universal Mini Kit(Qiagen cat#73404)を使用して単離した。均質化のために、５０μg以下の組織サンプルを、９００μL  QIAZOL(登録商標)溶解試薬および５mmステンレス鋼ビーズ(Qiagen cat#69989)を含む２.０mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ(Eppendorf cat#022600044)に移したサンプルを、Qiagen's TissueLyser II装置を使用して均質化した。を２.０分間、２０Hzで処理し、サンプルを１８０°回転させ、さらに２.０分間、２０Hzで処理した。次いでサンプルを２.０分間、３０Hzで処理し、サンプルを１８０°回転させ、さらに２.０分間、３０Hzで処理した。処理が完全でないならば、長いおよび／または高頻度均質化を使用した。均質化組織ライセートを新しい２.０mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブに入れ、ＲＴで５.０分間静置した。１００μLのgDNA Eliminator溶液を各チューブに加え、チューブを３０秒間激しく撹拌した。１８０μLのクロロホルム(Sigma cat#496189)を各チューブに加え、チューブを３０秒間激しく撹拌した。チューブをＲＴで３分間静置した。チューブを１２,０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、上部水相を新しい２.０mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブに約５００μL加えた。等体積の７０％エタノーを加え、混合した。以降の全遠心分離工程をＲＴで実施した。５００μLを２.０mL回収チューブに入れたRNeasy spinカラムに移し、サンプルを１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、残った５００μLサンプルをスピンカラムに加えた。スピンカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄し、カラムを２体積のエタノールを含む７００μLの洗浄緩衝液ＲＷＴで洗浄した。カラムを１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次いでカラムを、キットプロトコールに記載のとおり、４体積のエタノールを含む５００μLの緩衝液ＲＰＥで洗浄した。カラムをまず初回洗浄のために１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離し、次いで二回目洗浄のために２.０分間、１０,０００ｇで遠視分離し、カラムを膜乾燥のために１.０分間、１０,０００ｇで１回遠心分離した。次いで、カラムを新しい１.５mL回収チューブに移し、３０μLの無ＲＮａｓｅ水を膜中心に直接加えた。膜を１０分間、ＲＴでインキュベートした。カラムを１.０分間、１０,０００ｇで遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡ含有溶出液を回収し、ＲＮＡ濃度が、NanoDrop分光光度計(Thermo)を使用するＵＶ吸光度により決定されるまで氷上に置いた。ＲＮＡサンプルを−８０℃で保存した。
【０３３８】
逆転写によるｃＤＮＡ合成：３００ngのＲＮＡを、ＰＣＲ−９６−ＡＢ−Ｃマイクロプレート(Axygen cat#321-65-051)中、無ヌクレアーゼ水(Invitrogen cat#10977-015)を使用して１０.８μLの最終体積に希釈した。６.０μLを、次の物を含む反応混合物１の各ウェルに加えた：２.０μLの５０μMランダムデカマー(Ambion cat#AM5722G)および４.０μLの１×ｄＮＴＰミックス(Invitrogen cat#10297-018)。プレートを光学シーリングテープ(Applied Biosystems cat# 4360954)で密閉し、１.０分間、１,０００×ｇでＲＴで遠心分離した。次に、プレートを、９６ウェルThermal Cycler GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)を使用して、３.０分間、７０℃に加熱した。次いで、プレートを氷で完全に冷やした。次に、３.２５μLの反応混合物２(２μLの１０×標準緩衝液、１.０μLのＭＭＬＶ−ＲＴ  ２００Ｕ／μL  逆転写酵素酵素(Ambion cat#2044)および０.２５μLのＲＮａｓｅ阻害剤４０Ｕ／μL(Ambion cat#AM2682)含有)を各ウェルに加えた。プレートを光学シーリングテープで密閉し、１.０分間、１,０００×ｇでＲＴで遠心分離した。９６ウェルThermal Cyclerを使用して、プレートをプレートを９５℃で１０分間の後４２℃で６０分間加熱した。次いで、プレートを氷で冷却した。ｃＤＮＡプレートを、ＰＣＲ分析の準備ができるまで−２０℃で保存した。
【０３３９】
ＮＣＡおよびギャップＤＨ  ｍＲＮＡ発現増幅および定量のためのｑＰＣＲ：ｃＤＮＡを、ＰＣＲ−９６−ＡＢ−Ｃマイクロプレートで無ヌクレアーゼ水で５倍希釈した。１０μLの２×Taqman Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems cat#4369016)、１.０μLの２０×Taqmanプライマー−プローブセット(Applied Biosystems)および５.０μLの無ヌクレアーゼ水からなる１６μLのMaster Mix溶液を、３８４ウェル光学ＰＣＲプレート(Applied Biosystems cat#4483315)の各ウェルに加えた。４.０μLの希釈ｃＤＮＡを３８４ウェル光学ＰＣＲプレートの各ウェルに加えた。プレートを光学シーリングテープで密閉し、１.０分間、１,０００×ｇでＲＴで遠心分離した。ＰＣＲを、次のパラメーターを標準モードで使用するApplied Biosystems 700 HT Fast Real-Time PCRシステムで実施した：５０℃で２.０分間、９５℃で１０分間、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒間および６０℃で１.０分間。
【０３４０】
ｑＲＴ−ＰＣＲプライマー−プローブセット：Applied Biosystems(Thermo Fisher)のプライマー−プローブセットは次のものを含んだ：
ヒトアルファシヌクレイン(cat#Hs01103383_m1)ＦＡＭ標識
ヒトＰＲＯＳ１(cat#HS00165590_m1)ＦＡＭ標識
カニクイザルアルファシヌクレイン(cat#Mf02793033_m1)ＦＡＭ標識
カニクイザルギャップＤＨ(cat#Mf04392546_g1)ＦＡＭ標識
カニクイザルギャップＤＨ(cat#Mf04392546_g1)ＶＩＣ標識プライマー限定
ラットアルファシヌクレイン(cat#Rn01425141_m1)ＦＡＭ標識
ラットギャップＤＨ(cat#Rn01775763-g1)ＦＡＭ標識
ラットギャップＤＨ(cat#4352338E)ＶＩＣ標識プライマー限定
マウスギャップＤＨ(cat#Mm99999915-g1)ＦＡＭ標識
マウスギャップＤＨ(cat#4352339E)ＶＩＣ標識プライマー限定。
【０３４１】
実施例５：マウスにおけるＡＳＯ−００５４５９のインビボ活性および忍容性分析
ＡＳＯ−００５４５９は、ヒトＳＮＣＡ特異的ＬＮＡ修飾ＡＳＯである。インビトロ結果(上記)は、ＡＳＯ−００５４５９が初代神経細胞のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ減少に強力かつおよび選択的であることを示す。インビトロ結果は、ＡＳＯ−００５４５９が良好な忍容性であることも示唆する。
【０３４２】
Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウス
これらの結果がインビボでも当てはまるかを評価するために、１００μgのＡＳＯ−００５４５９をＡ５３Ｔ−ＰＡＣマウスにＩＣＶ注射で投与し、忍容性および海馬におけるＳＮＣＡ  ｍＲＮＡノックダウン(ＫＤ)両者を、実施例４(上記)のとおり注射３日後に評価した。
【０３４３】
表６(下記)に示すとおり、ＡＳＯ−００５４５９は忍容性が良好であり、全体的平均忍容性スコア１であった。さらに、ＡＳＯ−００５４５９は、投与３日後、海馬のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルを＞９０％に有意に低下させた(図９)。
【表７】
2021510511.tif 000014
【０３４４】
インビボでの活性評価のために、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウスに、ＡＳＯ−００５４５９を３.１３μg、１２.５μg、２５μgまたは５０μg濃度でＩＣＶ注射で投与した。忍容性を、投与後７日目および１４日目の体重測定により評価した。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を、投与１４日後評価し、そのとき動物を屠殺し、組織を採取した。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡノックダウンを海馬、脳幹および線条体の３脳領域で測定した。脳幹および線条体は、ＭＳＡおよびＰＤ患者脳で最も影響を受けている領域の二つである。別の試験で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１００μgのＡＳＯ−００５４５９を投与し、忍容性を投与後７日目、１４日目、２１日目および２８日目の体重測定により評価した。１００μg  ＡＳＯ−００５４５９を、ＩＣＶで野生型(ＷＴ)Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、体重および行動を４週間にわたりモニターした。ＡＳＯ−００５４５９がマウスＳＮＣＡを標的としないため、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現減少は、これら動物で測定しなかった。
【０３４５】
図１０Ａおよび１０Ｂに示すとおり、ＡＳＯ−００５４５９(全濃度)処置マウス(Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス両者)および対照媒体処置マウスで、体重に有意差はなかった。動物(Ｃ５７ＢＬ／６)は実験の経過中、何ら異常行動は示さなかった。表７(下記)参照。このような結果は、ＡＳＯ−００５４５９が良好な忍容性であることを示した。また、ＡＳＯ−００５４５９処置マウスで、試験した全３脳領域でＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現の有意かつ依存性依存的減少があった。図１１Ａ〜１１Ｃ参照。海馬で、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現は、３.１３μg、１２.５μg、２５μgおよび５０μg  ＡＳＯ−００５４５９でそれぞれ５３％、７３％、８０％および９６％減少した。類似の用量依存的ノックダウンが脳幹でも観察された。線条体で、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡノックダウンは、他の領域と比較して、より可変性であり、あまり強くなかった(図１１Ａ〜１１Ｃ)：それぞれ７５％および４６％ノックダウンが５０μgおよび２５μgのＡＳＯ−００５４５９で観察された。しかしながら、１２.５μgおよび３.１３μgのＡＳＯ−００５４５９で、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現の有意な減少はなかった。線条体での低活性について可能性のある説明は、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡノックダウンのＡＳＯレベルまたは反応速度論の差異であろう。
【表８】
2021510511.tif 000015
【０３４６】
ＡＳＯ−００５４５９レベルを、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウスの全３つの脳領域で測定した。図１２および表８(下記)に示すとおり、脳暴露はほぼ用量比例的であり、線条体を含む全３領域で類似した。種々の脳領域のＡＳＯ−００５４５９暴露−応答相関を図１３Ａ〜１３Ｄに示す。類似の暴露−応答相関が海馬および脳幹で観察され、それぞれ推定ＩＣ５０は１７９および２０６nMであった。比較として、線条体の暴露応答は比較的急であり、その領域でのＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ減少の遅い反応速度論を示唆する。図１３Ｃ参照。
【表９】
2021510511.tif 000016
【０３４７】
より広範な用量−応答／時間経過曲線を提供するために、ＡＳＯ−００５４５９を、再びＩＣＶフリーハンド注射によりＡ５３Ｔ−ＰＡＣマウスに脳室に直接投与した(０μg、１２.５μg、２５μgまたは５０μg)。動物を投与２４時間、３日、４週、８週、１２週、１６週および２０週後に屠殺し、脳幹および線条体のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を評価した。
【０３４８】
図１４Ａおよび１４Ｂに示すとおり(および上記データに一致して)、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウスへのＡＳＯ−００５４５９は、脳幹および線条体両者でＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルの有意な減少(対媒体対照)をもたらした。減少は時間および用量両者に依存的であるように見え、ピーク減少(約９０％)が脳幹で５０μg  ＡＳＯ−００５４５９で投与約４週間後に観察された(図１４Ａ)。線条体で、ピーク減少(約５５％)は、５０μg  ＡＳＯ−００５４５９で投与約３日後に観察された(図１４Ｂ)。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルは、媒体対照と比較して投与４週間でも有意に低いままであり(図１５Ａおよび１５Ｂ)、ベースライン対照に投与約１６週間後までに戻った(図１４Ａおよび１４Ｂ)。
【０３４９】
図１６Ａおよび１６Ｂ、動物へのＡＳＯ−００５４５９投与も、脳幹および線条体脳組織両者でＳＮＣＡタンパク質レベルの時間および用量依存的減少をもたらした。ピーク減少(約７５％)は、脳幹で５０μg用量で投与８週間後得られた(図１６Ａ)。線条体脳組織について、ピーク減少(約７５％)は、同様に５０μg用量であるが、投与４週間後得られた(図１６Ｂ)。個々のマウスの投与８週間後の発現レベルを図１７Ａ(脳幹)および１７Ｂ(線条体)に示す。ＳＮＣＡタンパク質レベルは投与約１２週間後に線条体でほぼベースラインに戻ったが、脳幹で、発現レベルは投与１６週間後でさえ、有意に減少していた(約２５％)。
【０３５０】
実施例７：カニクイザルのＳＮＣＡ標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)のインビボ活性および忍容性の分析
ＡＳＯ活性および忍容性をインビボでさらに評価するため、髄腔内ポートのあるカニクイザルモデル(カニクイザルＩＴ)を開発した。このモデルは、ＳＮＣＡのＡＳＯ−００５４５９介在ノックダウンならびに潜在的１塩基対ミスマッチオフターゲットＰＲＯＳ１およびＩＫＺＦ３のノックダウンの評価を可能とする。ＳＮＣＡ、ＰＲＯＳ１およびＩＫＺＦ３のＡＳＯ−００５４５９標的部位は、ヒトとカニクイザルで完全に保存される。
【０３５１】
実施例３に上記のとおり、各動物にＬ３またはＬ４椎骨に入る髄腔内脳脊髄液(ＣＳＦ)カテーテルをインプラントした。ＡＳＯ(ＡＳＯ−００５４５９、ＡＳＯ−００５５８４およびＡＳＯ−００５５７８)を食塩水に溶解し、動物に投与し、ＩＴポートを使用して４.５分間にわたり注入した(２動物／投与群)。動物の各々は次のものを受けた：(ｉ)ＡＳＯ−００５５７８(計４mg)、(ii)ＡＳＯ−００５５８４(計４mgまたは８mg)および(iii)ＡＳＯ−００５４５９(計８mg)。次いで、動物を投与後種々の時点で屠殺し、その時、組織をＡＳＯ暴露および活性の分析のために採取した。分析した脳領域は髄質(Ｍｅｄ)、橋(Ｖ−橋)、中脳(Ｖ−ＭＢ)、小脳(ＣＢＬ)、尾状核被殻(左右)(ＣａｕＰ)、海馬(左右)(Ｈｉｐ)、前頭前皮質(左右)(ＦｒＣ)、側頭皮質(左右)(ＴｅＣ)、頭頂皮質(左右)(ＰａＣ)、後頭皮質(左右)(Ｏｃｃ)および皮質下白質(ＷＭ)を含んだ。さらに、脊髄を頸部(ＣＳＣ)、胸部(ＴＳＣ)および腰部(ＬＳＣ)領域でサンプリングした。サンプルを肝臓、腎臓、心臓、三叉神経核、脛骨神経および大動脈からも採取し、これらの領域でのオフターゲット薬理活性を試験した。
【０３５２】
マウスで見られたのと同様、ＡＳＯはカニクイザルで有害作用は観察されず、良好な忍容性であった(データは示していない)。そして図１８Ａおよび下表９に示すとおり、ＡＳＯ−００５５７８またはＡＳＯ−００５５８４の動物への投与は、分析した全脳組織でＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルの有意な減少をもたらした。投与２週間後、ＡＳＯ−００５５７８は、髄質、尾状核被殻、橋、小脳、腰部脊髄および前頭前皮質でそれぞれ７５％、３２％、６５％、６９％、９８％および８７％の減少をもたらした。ＡＳＯ−００５５８４は、髄質、尾状核被殻、橋、小脳、腰部脊髄および前頭前皮質でそれぞれ５９％、４５％、６１％、５７％、９７％および８８％の減少をもたらした。類似する減少が、８mg  ＡＳＯ−００５５８４投与２週間および４週間の時点で観察された(図１８Ｂ)。ＡＳＯ−００５４５９も、カニクイザル脳の種々の領域でＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの強固なノックダウンを示した(表９)。
【０３５３】
【表１０】
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【０３５４】
上記ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの時間依存性減少をさらに特徴づけるために、カニクイザルにＡＳＯ−００５４５９(計８mg／動物)を投与し、投与後２４時間、３日、２週、４週、８週、１３週または２０週で屠殺して、各組織のＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルを評価した。図１９Ａに示すとおり、投与後２週間〜１３週間でピーク減少が観察された。髄質、小脳、橋、尾状核被殻、前頭前皮質および腰部脊髄でそれぞれ７０％、６５％、７５％、３５％、９４％および９９％のピーク減少が観察された。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現レベルのこの現象はまたＳＮＣＡタンパク質発現レベルの時間依存的減少とも相関する(図１９Ｂ)。
【０３５５】
次に、カニクイザルでの発現レベル減少が用量にも依存するかを評価するため、動物に２mg、４mgまたは８mgのＡＳＯ−００５４５９を投与し、次いで、投与２週間後屠殺した。図２０Ａおよび２０Ｂに示すとおり、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡおよびＳＮＣＡタンパク質発現レベル両者の減少は用量依存的でもあり、最大減少が８mgのＡＳＯ−００５４５９で観察された。
【０３５６】
ここに提供する結果は、ＡＡＳＯ−００５４５９がＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ減少に強力かつ選択的であり、ＡＳＯ−００５４５９が神経細胞およびインビボ前臨床種で忍容性が良好であることを示す。さらに、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣ神経細胞からの結果は、ｍＲＮＡのＡＳＯ−００５４５９介在減少が、インビトロおよびインビボでＳＮＣＡタンパク質レベル減少をもたらすことを示す。さらに、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣマウスおよびカニクイザルでの結果は、ＡＳＯ−００５４５９が、忍容性が良好な用量で脳でＳＮＣＡ  ｍＲＮＡおよびＳＮＣＡタンパク質を減少させることを示す。まとめると、これらの治験は、シヌクレイン病処置のための疾患修飾治療としてのＡＳＯ−００５４５９の開発継続を支持する。
【０３５７】
このＰＣＴ出願は２０１８年１月１２日出願の、米国仮出願６２／６１６,９９４に基づく優先権を主張し、それは引用により本明細書に全体として包含させる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図２−１６】
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【図２−１７】
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【図２−１８】
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【図２−１９】
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【図２−２０】
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【図２−２１】
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【図２−２２】
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【図２−２３】
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【図２−２４】
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【図２−２５】
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【図２−２６】
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【図２−２７】
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【図２−２８】
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【図２−２９】
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【図２−３０】
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【図２−３１】
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【図２−３８】
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【図２−３９】
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【図２−４０】
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【図２−４１】
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【図２−４９】
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【図２−５９】
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【図２−６０】
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【図２−６９】
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【図２−７０】
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【図２−７４】
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【図２−７７】
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【図２−７８】
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【図２−７９】
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【図２−８０】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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