(57)【要約】  本発明は、−  ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤；および−  少なくとも一つの細胞毒性化合物を含む医薬組み合わせ製品に関する。その抗腫瘍療法としての使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  細菌リポ多糖(ＬＰＳ)を排他的に含むリポソーム製剤；および
−  少なくとも一つの細胞毒性化合物
を含む医薬組み合わせ製品。
【請求項２】
リポソーム製剤に含まれるＬＰＳが腸内細菌科ファミリー、特にエシェリヒア属および特にエシェリヒア・コリー種の細菌からであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組み合わせ製品。
【請求項３】
ＬＰＳが排他的にリピドＡからなることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組み合わせ製品。
【請求項４】
細胞毒性化合物が治療抗体であることを特徴とする、請求項１〜３の何れかに記載の医薬組み合わせ製品。
【請求項５】
治療抗体標的がＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２、ＣＤ１、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ２５、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、内皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、インシュリン様増殖因子受容体１(ＩＧＦ１)およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組み合わせ製品。
【請求項６】
治療抗体がアブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴール、シクスツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ(ＭＤＸ−１０１)、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシツムマブ、オビヌツズマブ(ＧＡ−１０１)、オカラツズマブ(ＡＭＥ−１３３ｖ)、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ＰＲ０１３１９２１、ラニビズマブ、リツキシマブ、ＳＢＩ−０８７、トシリズマブ、ＴＲＵ−０１５、トシツモマブ、トラスツズマブ、ベルツズマブおよびこれらの任意の組み合わせからなる抗体群から選択される、請求項４または５に記載の医薬組み合わせ製品。
【請求項７】
細胞毒性化合物が
−  化学療法剤、例えばシクロホスファミド、ブスルファン、メルファラン、イホスファミド、ベンダムスチン、テモゾロミド、ブレオマイシン、メクロレタミン、カルムスチン、ホテムスチン、ＢＣＮＵ、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、アラシチン、フルダラビン、クラドリビン、クロファラビン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、６−メルカプトプリン、デシタビン、アザシチジン、トロキサシタビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、エポチロン類、エリブリン、微小化パクリタキセル、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン；
−  キナーゼ阻害剤タイプの標的化治療剤、例えばイマチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、アファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、クリゾチニブ、ルキソリチニブ、トファシチニブ、アクシチニブ、カボザンチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、ベムラフェニブ；
−  免疫調節剤、例えばサリドマイド、レナリドマイド、ポマリドミド；
−  アポトーシス助剤、例えばベネトクラクスまたはナビトクラックス；
−  他の抗腫瘍剤、例えばボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、ボリノスタット、パノビノスタット、ロミデプシン、オール・トランスレチノイン酸、ヒ素誘導体Ａｓ２Ｏ３、テムシロリムス、オラパリブ、ルカパリブ、ペントスタチン、アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素およびクロルアミノフェン
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３の何れかに記載の医薬組み合わせ製品。
【請求項８】
細胞毒性化合物が化学療法剤であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組み合わせ製品。
【請求項９】
抗腫瘍療法として使用するための、請求項１〜８の何れかに記載の医薬組み合わせ製品。
【請求項１０】
腫瘍が液性腫瘍または固形腫瘍であることを特徴とする、請求項９に記載の使用のための医薬組み合わせ製品。
【請求項１１】
腫瘍が乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍(黒色腫)、血液腫瘍(白血病)、骨腫瘍およびリンパ腫からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の使用のための医薬組み合わせ製品。
【請求項１２】
各成分の使用が同時、別々または逐次的であることを特徴とする、請求項９〜１１の何れかに記載の使用のための医薬組み合わせ製品。
【請求項１３】
リポソーム製剤が全身投与に適することを特徴とする、請求項９〜１２の何れかに記載の使用のための医薬組み合わせ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬分野、より具体的に腫瘍分野、特に癌処置分野に関する。より具体的に、本発明は、腫瘍を処置するための医薬組成物に関し、この組成物はそれ自体でまたは他の治療化合物のアジュバント組成物として使用される。本発明はまた医薬組み合わせ製品にも関する。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
癌は、生物内の細胞の制御されない増殖により特徴づけられる疾患であり、この増殖は、その細胞のＤＮＡに影響する遺伝的変異に関連する。これらの変異は自然にまたは誘導態様により、変異原性因子への暴露の結果として発現しまたは遺伝的経路で伝達される。
【０００３】
過剰の細胞増殖をしている多様な起源の癌細胞は、持続し、元の組織内で増殖し、他の組織に広がる可能性のある傾向を有する組織塊である、「腫瘍」を生じさせる。
循環する、特に血液の、癌細胞の場合、これらの細胞は、無秩序で制御されない増殖および分裂能により特徴づけられる。
【０００４】
今日、多くの抗腫瘍療法が存在する。利用可能な処置は、外科的腫瘍切除、化学療法(癌細胞を破壊する細胞毒性薬物の投与)、放射線療法(腫瘍照射)、ホルモン処置、抗血管形成処置および免疫療法を含むが、これらに限定されない。
【０００５】
免疫療法は、生物の免疫防御を強化および／または刺激するために、通常免疫系により産生される、生物学的物質を投与することからなる。実際、腫瘍発生時、罹患生物は、それ自身の免疫応答をこの腫瘍に対して生じ、該腫瘍細胞がそのようなものとして免疫系により認識されることが観察されている。しかしながら、この免疫応答は、一般に該腫瘍の排除には不十分である。よって、免疫療法の目的は、この不十分な生物学的応答の持続および／または置き替えである。
【０００６】
免疫療法で使用される生物学的物質は、例えば抗体、特にモノクローナル抗体、サイトカイン類、インターロイキン類、インターフェロン類および一般に何らかの免疫刺激化合物である。
【０００７】
各タイプの腫瘍について、臨床医は既に確認されている医療手順および各患者の特性により、適用すべき処置を決定する。現在利用可能な処置は、いずれも十分な効果がなく、あらゆる患者タイプには適用されないため、さらに改善の余地があり得る。
【０００８】
免疫療法において、治療抗体投与による有益な効果を増強するための研究がなされている。例えば、特許出願ＷＯ２０１３／１２９９３６は、粒子または小胞性物質に封入された抗体および免疫調節剤からなる組み合わせの治療的使用を記載する。封入される免疫調節剤は、特にリポソームに被覆されたサイトカインであり、その共投与は、抗体の有益な効果を刺激する。
【０００９】
リポソーム
リポソームは、同心性脂質二重層であり、その層間に分子を捕捉する。リポソームは、一般には単一または数タイプのリン脂質からなる。これらのリン脂質は、極性頭部が集まり、二層の確立を可能とするように、熱力学的に安定な状態で組織化される。リポソームは、ナノサイズ構造である。
【００１０】
リポソームは、水可溶性(水相に封入)または油可溶性または両親媒性(脂質二重層への取込み)の何れであるかにかかわらず、数タイプの化合物を保持できる。
生物学的に興味深い多様な分子のベクターとしての、医薬産業でのリポソームの使用は、多くの研究対象となっており、このタイプのいくつかの薬物が、現在静脈内投与用に承認されている。
【００１１】
実際、リポソームへの活性物質封入は、該物質の保護を可能とする。また、その物質の毒性作用の制限およびその放出速度の制御も可能とする。さらに、リポソームは、水可溶性物質が細胞の疎水性膜を通過することも可能とする。
リポソームは、薬物ベクターとして治療での用途が増加している。その主な用途は活性成分の標的化である。
【００１２】
細菌リポ多糖(ＬＰＳ)
細菌リポ多糖(ＬＰＳ)は、グラム陰性細菌の外膜の主成分である。ＬＰＳは、高免疫刺激能を有し、生物におけるその存在は、細菌汚染に応答するために、特に炎症誘導性サイトカイン類の分泌を介して、免疫系全体への刺激を生じる。この強い免疫反応のために、その可溶性形態でのＬＰＳ注射は、哺乳動物生物にとって毒性または高用量では致死性となり得る。ＬＰＳは、ヒトにおいて高熱、赤血球凝集および敗血症性ショックのような反応を誘発する。
【００１３】
ＬＰＳ分子は、３種の物質、リピドＡ、核および抗原Ｏを含む。最も有毒なＬＰＳ部分であるリピドＡは高度に保存され、核は極めて低い変動性を示し、他方抗原ＯはＬＰＳが由来する細菌種に特異的である。
【００１４】
ＬＰＳの作用形式およびシグナル経路は周知である。その標的細胞は主にマクロファージ、単球、顆粒球および上皮性細胞である。生物内で放出されたら、ＬＰＳは肝臓で合成されるＬＢＰ(ＬＰＳ結合タンパク質)タンパク質に結合し、これにより単球の膜受容体ＣＤ１４への提示および結合が可能となる。ＬＰＳは、それによりまた膜共受容体ＭＤ２およびホモ二量体化形態の受容体ＴＬＲ４と結合する。膜複合体形成は、細胞のＭＡＰキナーゼ経路の活性化および炎症誘導性サイトカイン類の分泌を誘発する。
【００１５】
基礎研究で、ＬＰＳはインビトロおよびインビボで使用され、単球またはマクロファージタイプ細胞による炎症誘導性サイトカイン類の強い分泌によって、炎症を誘導する。
治療および主に予防で、ＬＰＳまたはその‘リピドＡ’は、該ＬＰＳと共投与される抗原を指向する免疫応答を刺激するための、ワクチンアジュバントとして使用される。
【００１６】
ＬＰＳのリポソーム製剤
ＬＰＳのリポソームへの封入は、インビトロおよびインビボ両者で炎症誘導性効果を最小化することが示されている(Bakouche et al., 1987; Dijkstra et al., 1989)。
抗腫瘍療法において、ＬＰＳは特異的抗原に対する免疫応答を刺激するために、アジュバントとして使用されている。Neidhart et al. (Vaccine, 2004)は、組み換えＫＳＡタンパク質およびモノホスホリルリピドＡ(ＬＰＳの活性成分)両者を含むリポソーム製剤からなる治療的ワクチンの投与を含む、結腸直腸癌を有する患者の処置方法を記載しており、この治療的ワクチンで処置した大部分の患者がＫＳＡタンパク質に対する特異的免疫を獲得した。
【００１７】
ＬＰＳリポソーム製剤は、それ故に、既に抗腫瘍ワクチン組成物の製造の範囲内で使用されており、ＬＰＳはそのアジュバント性質のために使用されている。その抗原との共製剤は、その抗原に対する特異的免疫応答を最適化することを可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、今日まで、治療に使用するための、リポソーム製剤における単一活性成分としてのＬＰＳの使用は考えられたことがない。
さらに、ＬＰＳのみを含むリポソーム製剤と、少なくとも一つの細胞毒性化合物の組合せならびに腫瘍の処置のための該組合せは考慮されたことがない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の開示
ＬＰＳのリポソームへの封入はその毒性効果の最小化を可能とし、故に、特に全身経路による抗腫瘍治療的処置において、このリポソーム製剤が治療に使用されることを可能にする。
【００２０】
本発明は、
−  ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤；および
−  例えば治療抗体または化学療法化合物として少なくとも一つの細胞毒性化合物
を含む医薬組み合わせ製品に関する。
【００２１】
本発明はまた抗腫瘍療法として同時に、別々にまたは逐次的に使用する該治療的組み合わせ製品にも関する。
本発明はまた抗腫瘍療法として使用するための細菌リポ多糖(ＬＰＳ)を排他的に含むリポソーム製剤にも関する。
【００２２】
より一般に、薬物として使用するための細菌リポ多糖(ＬＰＳ)を排他的に含むリポソーム製剤が記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】処置していない(対照)または非封入ＬＰＳ、リツキシマブ、空リポソーム、ＬＰＳリポソーム製剤およびリツキシマブ＋ＬＰＳリポソーム製剤の組み合わせで処置したリンパ腫ＲＬ異種移植マウス(ＣＤ２０＋ヒトＢリンパ腫細胞参照ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６１)の腫瘍体積のモニタリング。
【００２４】
【図２】処置マウス脾臓重量：対照マウス(ＣＴＲＬ)、空リポソームで処置(空−Ｌｉｐｏ)、抗体リツキシマブで処置(Ｒｉｔｕｘ)、非封入ＬＰＳで処置(ＬＰＳ)、ＬＰＳリポソーム製剤で処置(Ｌｉｐｏ−ＬＰＳ)および抗体リツキシマブとＬＰＳリポソーム製剤の組み合わせで処置(Ｒｉｔｕｘ＋リポ−ＬＰＳ)。
【００２５】
【図３】処置マウス脾臓のＮＫ細胞量：対照マウス(対照)、抗体リツキシマブで処置(Ｒｉｔｕｘ)、非封入ＬＰＳで処置(ＬＰＳ)、空リポソームで処置(空−Ｌｉｐｏ)、ＬＰＳリポソーム製剤で処置(Ｌｉｐｏ−ＬＰＳ)および抗体リツキシマブとＬＰＳリポソーム製剤の組み合わせで処置(Ｒｉｔｕｘ＋リポ−ＬＰＳ)。
【００２６】
【図４】(ｉ)リツキシマブ、(ii)リツキシマブとＬＰＳリポソーム製剤の組み合わせまたは(iii)リツキシマブと非封入ＬＰＳの組み合わせで処置したＲＬリンパ腫異種移植マウスの腫瘍体積のモニタリング。
【００２７】
【図５】ＬＰＳリポソーム製剤で処置した(Ｌｉｐｏ  ＬＰＳ、灰色曲線)または処置していない(対照)ＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞異種移植ｓｃｉｄマウスの腫瘍体積のモニタリング。
【００２８】
【図６】−  １００ng／mLリポ−ＬＰＳ  ＷＯ(LPS-Biosciences)で１６時間刺激したマクロファージまたは−  ５μM  エトポシドまたは−  両者の組み合わせとインキュベートしたインビトロ培養ラット骨肉腫細胞。対照細胞は、マクロファージもエトポシドも含まない、媒体のみに暴露している。癌細胞のアポトーシス率は、IncuCyte(登録商標)カスパーゼ−３／７化合物での標識によりモニターしている。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な記載
本発明は、細菌リポ多糖(ＬＰＳ)の新規免疫刺激性質の同定に基づく。その毒性のため、この免疫刺激化合物はそのままで使用できない。ＬＰＳは、既にワクチンのアジュバントとして、抗原およびＬＰＳを含むリポソーム製剤で使用されている。
【００３０】
本発明者らは、他の化合物を含まない、特に抗原を含まないＬＰＳリポソーム製剤が、薬物として使用でき、より具体的にこの製剤が抗腫瘍処置の範囲内で治療的に有益な効果を有することを浮き彫りにした。
【００３１】
第一の態様では、本発明は、薬物として使用するための細菌リポ多糖(ＬＰＳ)を排他的に含むリポソーム製剤に関する。
【００３２】
第二の態様では、本発明は、抗腫瘍療法として使用するための細菌リポ多糖(ＬＰＳ)を排他的に含むリポソーム製剤に関する。
【００３３】
換言すると、本発明は、治療に使用するための、特に抗腫瘍療法として使用するための、リポソームに封入された細菌ＬＰＳからなる医薬製剤に関する。
【００３４】
第三の態様では、本発明は、
−  ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤および
−  少なくとも一つの細胞毒性化合物
を含む医薬組み合わせ製品に関する。
【００３５】
第四の態様では、本発明は、抗腫瘍療法として使用するための、該治療用組み合わせ製品に関する。
【００３６】
定義
本発明の目的で、「癌」は、この病理に冒された生物の、最初は正常であった細胞の形質転換により形成された、生物における癌細胞の存在により特徴づけられる病理を意味する。このような癌細胞を有する生存生物は、癌を有するとして診断される。原発腫瘍と称される最初の腫瘍が発展した組織により、約２００種の種々のタイプの癌がある。
【００３７】
本発明の目的で、「腫瘍」は、癌細胞の過剰の細胞増殖による組織塊を意味し、この組織塊は持続し、生物に向かって制御されないかつ自律性の方向で増殖する傾向を有する。
【００３８】
本発明は、全てのタイプの腫瘍であるが、より具体的に悪性腫瘍に関する。悪性腫瘍は、通常増殖が速く、局所根絶後再発する傾向がある。悪性腫瘍は制限に乏しく、被包されておらず、その外周は不均一である。
【００３９】
本発明は、原発腫瘍および原発腫瘍の転移汎発に起因する二次腫瘍の処置に関する。
腫瘍は、一般にその元の組織により分類される。例えば皮膚、骨または血液細胞腫瘍がある。
【００４０】
腫瘍の二つの主要なカテゴリーが定義されている。
・  いわゆる「固形」腫瘍は、皮膚、粘膜、骨および臓器などの組織で発達する。これらは、最も高頻度の腫瘍であり、ヒト癌の９０％を占める。
固形腫瘍の中で、上皮性細胞(皮膚、粘膜、腺)由来の癌腫；および結合組織細胞由来の肉腫がある。
【００４１】
・  いわゆる「液性」腫瘍は血液細胞由来であり、厳密に過形成組織ではないが、無秩序で、制御されない増殖および分裂能を有する癌性血液細胞の存在により特徴づけられる。
液性腫瘍の中で、骨髄の白血球前駆細胞の無秩序増殖により特徴づけられる白血病(血液癌および骨髄癌)；およびリンパ球を冒すリンパ腫(リンパ系癌)がある。
【００４２】
本発明の特定の態様によると、処置される腫瘍は液性腫瘍または固形腫瘍である。
本発明の他の特定の態様によると、処置される腫瘍は、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍(黒色腫)、血液腫瘍(白血病)、骨腫瘍およびリンパ腫からなる群から選択される。
【００４３】
細胞免疫療法
「抗腫瘍処置」または「抗腫瘍療法」または「抗腫瘍療法使用」により、本発明の目的で、生物に存在する腫瘍の体積の減少、増殖の阻害、悪性度の低減、悪性機能特性の修飾および／または排除のための治療的処置を意味する。
【００４４】
抗腫瘍処置の効果を決定およびモニターするために、指標的パラメータは、経時的な生物内の腫瘍サイズまたは体積の進行である。実験動物で、腫瘍サイズは、動物屠殺後最も頻繁に測定される。患者で、腫瘍サイズは、当業者に周知の非侵襲性造影技術によりインビボで測定され得る。
【００４５】
図１および５に示すとおり、ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤は、マウスに異種移植したヒト腫瘍の発達を、対照、未処置マウスで観察される腫瘍発達と比較して、有意に減少できる。
図１はＲＬリンパ腫細胞を異種移植されたマウスで得られた結果を示し、図５はＭＤＡ−ＭＢ３６１細胞)から形成を有するマウスで得られた結果を示す。
【００４６】
本発明は、特に免疫療法剤として使用するための、ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤に関する。
本発明はまた、自然免疫系を刺激する薬剤として使用するための、ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤にも関する。
【００４７】
より具体的に、本発明は、抗腫瘍細胞免疫療法剤として使用するための、ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤に関する。
免疫療法は、癌を有する生物の内部免疫機能の刺激からなる治療法であり、該生物の免疫系は、その中で発達している腫瘍の増殖の阻害または排除することを可能とする。
【００４８】
癌細胞の認識および破壊に関与する免疫遂行因子中、‘ナチュラルキラー’細胞(以下ＮＫ細胞と称す)は特記され得る。本細胞は、腫瘍組織を認識し、これを侵入し、腫瘍細胞に対して特異的細胞毒性を発揮することができるリンパ球である。
抗腫瘍細胞免疫療法は、ＮＫ細胞、その発達および／または活性を、それらが腫瘍細胞を認識し、破壊するように刺激することからなる治療法である。
【００４９】
図２および３に記載するとおり、ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤のマウスへの投与は、動物脾臓に存在するＮＫ細胞の数を有意に増加させる。
それ故に、ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤はＮＫ細胞の増殖を刺激し、腫瘍細胞に対する細胞毒性細胞応答の促進により、細胞免疫療法剤として作用すると考えられる。
【００５０】
リポソーム製剤
本発明の目的で、リポソーム製剤は、活性成分を封入するリポソームを含む組成物を意味し、該活性成分は、「封入されている」または「リポソーム製剤に含まれる」と称される。
【００５１】
本明細書において、用語「ＬＰＳリポソーム製剤」、「ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤」、「リポソーム−ＬＰＳ」および「リポソームに封入されたＬＰＳ」の使用は差がなく、これら全て上に定義した同じ製剤を意味し、すなわち細菌リポポリサッカライドを封入するリポソームからなる製剤／組成物である。
【００５２】
リポソーム粒子とも称されるリポソームは、リン脂質またはコレステロールなどの両親媒性分子の二層からなる脂質相が、水性内相を封入する、小胞である。
単一脂質二重層を含む単層リポソームは、数個の同心性脂質二重層を含む多重層リポソームと区別される。
【００５３】
リン脂質は、‘リン酸’基を含む脂質である。これらは、極性(親水性)「頭部」および２つの脂肪性(疎水性)「尾部」からなる脂質である。このファミリーは、特にホスファチジン酸およびホスホグリセリドを含む。リン脂質の物理化学的性質は、親水性頭部の極性分子の性質および疎水性尾部の脂肪族鎖(脂肪酸)の性質による。
【００５４】
本発明のリポソーム製剤の製造のために、種々のタイプのリン脂質が使用できる。
例えば、特許出願ＷＯ２０１３／１２９９３６に示すリポソーム製剤は、本発明の実行に適する。
【００５５】
限定しないが、次のリン脂質を組み合わせて使用できる。
−  １,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを示す‘ＤＯＰＥ’；
−  １,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたはジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを示す‘ＤＳＰＥ’；
−  ポリエチレングリコールを意味し、ＸＸＸＸがその分子量を示す‘ＰＥＧＸＸＸＸ’；特にＰＥＧ３５０およびＰＥＧ５０００が特に使用され得る；
−  １,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[メトキシ−(ポリエチレングリコール)−ＸＸＸＸ]を示す‘ＤＳＰＥ−ＰＥＧＸＸＸＸ’；
−  コレステロール(３β−ヒドロキシ−５−コレステン、５−コレステン−３β−オール)。
【００５６】
本発明の特定の遂行では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ５０００：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−３５０：コレステロール(５４：８：８：３０％mol)の組成のリン脂質からなる。
【００５７】
本発明の他の特定の遂行では、リポソーム製剤は
・  １８：１(デルタ９−Ｃｉｓ)ＤＳＰＥ(ＤＯＰＥ)
・  １８：０  ＰＥＧ５０００  ＤＳＰＥ(アンモニウム塩)
・  １８：０  ＰＥＧ３５０  ＤＳＰＥ(アンモニウム塩)および
・  コレステロール
の組成のリン脂質からなる。
【００５８】
細菌リポ多糖(ＬＰＳ)
本発明のリポソーム製剤は、排他的に細菌リポ多糖を含み、すなわち他の活性化合物を含まず、特に、ＬＰＳの成分の抗原Ｏ以外の抗原を含まない。
【００５９】
本発明の範囲内で、ＬＰＳは自然免疫系を刺激する薬剤として使用され、特定の抗原に対する特異的免疫応答の増大を可能とするアジュバントとしての使用ではない。
【００６０】
グラム陰性細菌の外膜の成分であるＬＰＳは、共有結合により互いに結合した３個の物質
−  リピドＡ；
−  オリゴサッカライドからなる「核」；および
−  抗原Ｏ
を含む。
【００６１】
ＬＰＳの最も免疫刺激部分であるリピドＡは、細菌種間で保存され、核は極めて低変動性であり、抗原ＯはＬＰＳが由来する細菌種に特異的である。
【００６２】
限定しないが、グラム陰性細菌は特に次のファミリーを含む。
−  腸内細菌科ファミリー：
〇  サルモネラ属
〇  エシェリヒア属、例えばエシェリヒア・コリー
〇  エルシニア属
−  ビブリオ科ファミリー：
〇  ビブリオ属例：ビブリオ・コレレ(コレラを担う)
−  シュードモナス科ファミリー：
〇  シュードモナス属
−  ナイセリア科ファミリー
〇  ナイセリア属例：ナイセリア・メニンギティディス(細菌髄膜炎を担う)
−  リゾビウム科ファミリー
〇  アグロバクテリウム属例：アグロバクテリウム・ツメファシエンス
〇  リゾビウム属例：リゾビウム・リゾゲネス
−  アルカリゲネス科ファミリー
〇  ボルデテラ属
【００６３】
本発明の特定の実行によると、リポソーム製剤に含まれるＬＰＳは、サモネラ・エンテリカ種以外の腸内細菌科ファミリーの細菌に由来する。
【００６４】
本発明の他の特定の実行によると、リポソーム製剤に含まれるＬＰＳは、腸内細菌科ファミリー、特にエシェリヒア属および特にエシェリヒア・コリー種の細菌に由来する。
【００６５】
用語「細菌からのＬＰＳ」は、該ＬＰＳ分子が該細菌の外膜に自然に存在するＬＰＳの物理化学的特性を有することを示す。特性は、特にリピドＡを構成する脂肪酸の性質である。
【００６６】
ＬＰＳは、天然に存在するＬＰＳでも合成ＬＰＳでもよい。
より具体的に、天然に存在するＬＰＳを、当業者に周知の技術により細菌膜から精製でき、またはSIGMA-ALDRICHなどの業者から精製形態で得ることができる。
合成ＬＰＳは、当業者に知られる何らかの合成技術により得られる。
【００６７】
使用するＬＰＳは、その完全形態(リピドＡ＋核＋抗原Ｏ)でリポソームに封入され、またはＬＰＳフラクションのみが使用されることもできる。
【００６８】
本発明の特定の態様によると、封入ＬＰＳは、不完全な形態として、すなわち、ＬＰＳフラクションの形で使用される。より具体的に、ＬＰＳは、排他的にその抗原ＯまたはそのリピドＡまたは両者の組み合わせからなる。
【００６９】
細菌種エシェリヒア・コリーからのＬＰＳのリピドＡは、β−１−６グルコサミン二量体である。
より具体的に、封入ＬＰＳは、モノホスホリルリピドＡの形で使用される、そのリピドＡからなり得る。
【００７０】
ＬＰＳが、特にその免疫刺激性質を阻止または増強するために修飾され得ることは意図される。ＬＰＳはまた、その溶解度または毒性性質修飾の目的で修飾を受けているＬＰＳでもよい。
【００７１】
本発明の特定の態様によると、治療、特に抗腫瘍療法で使用されるリポソーム製剤で、リポソームに封入されるＬＰＳは修飾ＬＰＳである。
【００７２】
ＬＰＳリポソーム製剤の製造および特徴づけ
当業者に知られるあらゆる技術が、ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤の製造に使用され得る。
【００７３】
用語「排他的にＬＰＳ」は、リポソーム製剤が、すべての他の活性化合物および／または抗原を除いて、ＬＰＳ分子しか含まないことを示すことを意図する。
封入ＬＰＳは、ある細菌種由来、例えばエシェリヒア・コリー由来である。
【００７４】
本発明の特定の遂行によると、該製剤は排他的に複数のＬＰＳ分子を含み、ここで、これら分子は異なる細菌起源であり得る。故に、これは、異なる細菌起源の１種、２種、３種またはそれ以上のＬＰＳであり得る。例えば、リポソーム製剤は、エシェリヒア・コリーからの１種のＬＰＳ、サルモネラ属細菌からの１種のＬＰＳおよびシュードモナス属細菌からの１種のＬＰＳを含み、該ＬＰＳ分子は完全または不完全形態である。
【００７５】
換言すると、医薬製剤は、少なくとも一つの細菌リポソームに封入されたＬＰＳからなる。
【００７６】
実施例部分に示されるとおり、用語「ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤」は、ＬＰＳがリポソーム粒子に厳密に取り込まれ／封入されていることを示し、ここでの媒体中での単純な並置を意味しない。
【００７７】
特定の態様によると、リポソーム製剤を製造する方法は、連続的凍結／解凍工程を含む。
【００７８】
本発明の他の態様によると、リポソーム製剤を製造する方法は、リポソーム製剤の滅菌工程を含む。
【００７９】
本発明のさらに他の態様によると、リポソーム製剤を製造する方法は、均一サイズのリポソーム粒子を得るための、リポソームの濾過工程を含む。
【００８０】
本発明の好ましい態様によると、該リポソーム製剤は、均一サイズのリポソーム粒子からなる。
【００８１】
本発明の好ましい実施態様によると、リポソーム製剤は全身投与に適する。
【００８２】
医薬組成物
本発明はまた、許容される医薬媒体中、排他的にリポ多糖を含む少なくとも一つのリポソーム製剤を含む医薬組成物にも関する。
【００８３】
換言すると、該医薬組成物は、薬学的に許容される媒体中、リポソームに封入された細菌リポ多糖からなる少なくとも一つのリポソーム製剤を含む。
【００８４】
本発明の目的で、薬学的に許容される媒体は、リポソーム製剤を保存し、かつ投与することを可能にする溶剤および所望により添加物を意味し、個体または動物へのその投与は、顕著な有害効果を伴わず、それらは当業者に知られている。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、緩衝剤またはｐＨもしくは等張性を調節する薬剤または湿潤剤などの必要な何らかの医薬添加物を含み得る。本発明の医薬組成物はまた１以上の抗酸化剤および／または１以上の防腐剤も含み得る。
【００８６】
上記リポソーム製剤または医薬組成物は、経口、バッカル、舌下、眼、直腸、局所経路または非経腸経路、特に腹腔内、皮内、皮下、静脈内または筋肉内経路などの任意の適当な経路で投与し得る。
【００８７】
本発明の好ましい実施態様によると、上記リポソーム製剤または医薬組成物は全身投与に適する。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、所望により持続または制御放出型とされた錠剤、カプセル剤または硬ゼラチンカプセル剤、あるいは丸剤、散剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤またはエマルジョン剤として、経口投与のために製剤され得る。
【００８９】
他の実施の態様によると、本発明の医薬組成物は、注射用として、非経腸投与のために製剤され得る。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、濾過などの任意の既知の慣用法により滅菌され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために条件付けされまたは凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤を、使用前に無菌溶液と組み合わせ得る。
【００９１】
本発明の好ましい実施態様によると、医薬組成物は、有効量のＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤を含む。
【００９２】
このような製剤の有効量は、所望の応答、すなわち治療効果、より具体的に腫瘍細胞の抗増殖性効果を誘発する量である。有効量は、投与経路、１回投与または複数回投与、年齢、身体的状態、身長、体重および処置する症状の他に患者に存在する状態を含む、患者の特性などの１以上のパラメータにより定まる。これらのパラメータおよびその影響は当業者に周知であり、任意の方法により決定され得る。
【００９３】
本発明はまた、薬物として使用するためのおよびより具体的に抗腫瘍療法として使用するための該医薬組成物に関する。
【００９４】
投与
抗腫瘍療法として使用するための、ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤またはそれを含む医薬組成物は、当業者に知られる任意の技術により癌を有する患者に投与され得る。
【００９５】
特に、該リポソーム製剤またはそれを含む医薬組成物は、１回または連続した期間で複数回投与され得る。
【００９６】
本発明の特定の態様によると、上記使用のためのリポソーム製剤またはそれを含む医薬組成物は、癌を有する患者に週１回投与される。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様によると、該上記使用のためのリポソーム製剤は全身経路で投与され、すなわち、製剤は患者の血管を経て、その標的細胞に到達する。より厳密に、該リポソーム製剤は、消化管経路または非経腸経路で投与される。
【００９８】
本発明はまた、腫瘍の治療的処置方法であって、該腫瘍を有する患者に、有効量のＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤を投与することを含む方法に関する。
【００９９】
医薬組み合わせ製品
第三の態様によると、本発明は、
−  ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤；および
−  少なくとも一つの細胞毒性化合物
を含む医薬組み合わせ製品に関する。
【０１００】
本発明の目的で、医薬組み合わせ製品は、一つの病態の処置のために共に使用される一組の治療剤を示し、ここで、その投与は、同時でも、別々でも逐次的でもよい。それ故に、治療剤は１つの治療組成物に混合されるかまたは一つのキットに存在するが、完全に別々のまたは逐次的方法で投与される。
【０１０１】
ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤は先に定義したとおりであり、特に：
−  腸内細菌科ファミリー、特にエシェリヒア属および特にエシェリヒア・コリー種の細菌からのＬＰＳを含む製剤；および／または
−  排他的にリピドＡからなるＬＰＳを含む製剤
であり得る。
【０１０２】
先に記載したとおり、ＬＰＳリポソーム製剤は、治療にそれ自体でまたは他の治療剤と組み合わせて使用できる。この他の治療剤は、特に細胞毒性化合物、すなわち、それが作用する細胞の細胞死を誘導する化合物である。
【０１０３】
有利に、細胞毒性化合物は、特にある細胞を標的とするのに、特に癌細胞を標的とするのに適合される。
【０１０４】
本発明の一つの実施態様によると、該細胞毒性化合物は、免疫調節性および細胞毒性活性を有するペプチドまたは非ペプチド小分子などの免疫療法剤であり、より好ましくは、免疫療法剤は治療抗体である。
【０１０５】
治療抗体は、癌の場合、破壊すべき細胞を特異的に認識できる抗体であり、これは必然的に腫瘍細胞である。腫瘍細胞は抗原をその膜表面に発現し、これはそれを指向する抗体により認識され得る。治療抗体は、毒性物質と結合でき、抗体により認識される腫瘍細胞の溶解および細胞死を誘発できる。治療抗体はまた腫瘍細胞の膜表面でのいくつかの受容体の遮断によっても作用し得る。
【０１０６】
これらの治療抗体は、抗腫瘍療法において使用が増えている。例えば、Ｂリンパ球に位置し、非ホジキンリンパ腫の９５％を超えるＢ細胞が発現するタンパク質である、膜貫通抗原ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体であるリツキシマブを、特記し得る。この治療抗体は、ステージIII〜IV瀘胞性リンパ腫の患者の処置に適応される。乳癌の一部腫瘍細胞で過発現されるＨＥＲ−２受容体に特異的なトラスツズマブも特記し得る。
【０１０７】
本発明の特定の実施態様によると、組み合わせ製品に含まれる治療抗体はモノクローナル抗体である。
【０１０８】
本発明の他の特定の実施態様によると、組み合わせ製品に含まれる治療抗体はポリクローナル抗体である。
【０１０９】
本発明のある実施態様によると、治療抗体標的は、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２、ＣＤ１、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ２５、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、内皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、インシュリン様増殖因子受容体１(ＩＧＦ１)およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。
【０１１０】
本発明のさらに他の実施態様によると、治療抗体は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴール、シクスツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ(ＭＤＸ−１０１)、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシツムマブ、オビヌツズマブ(ＧＡ−１０１)、オカラツズマブ(ＡＭＥ−１３３ｖ)、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ＰＲ０１３１９２１、ラニビズマブ、リツキシマブ、ＳＢＩ−０８７、トシリズマブ、ＴＲＵ−０１５、トシツモマブ、トラスツズマブ、ベルツズマブおよびこれらの抗体の任意の組み合わせからなる抗体の群から選択される。
【０１１１】
本発明の目的で、組み合わせ製品は少なくとも一つの治療抗体を含み、故に、数治療抗体の組み合わせを含み得ることが意図される。
【０１１２】
本発明の他の実施態様によると、治療抗体は抗腫瘍治療的適用で使用される抗体からなる群、特に次の抗体からなる群から選択される：アレムツズマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ(ＭＤＸ−１０１)、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシツムマブ、オビヌツズマブ(ＧＡ−１０１)、オカラツズマブ(ＡＭＥ−１３３ｖ)、オクレリズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ＰＲ０１３１９２１、ラニビズマブ、リツキシマブ、ＳＢＩ−０８７、トシリズマブ、ＴＲＵ−０１５、トシツモマブ、トラスツズマブ、ベルツズマブおよびこれらの抗体の任意の組み合わせ。
【０１１３】
本発明の好ましい実行によると、治療抗体は抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であり、好ましくはリツキシマブである。
【０１１４】
図１に示す実験結果は
−  腫瘍を有する未処置マウスで、腫瘍体積は経時的に増加する；
−  マウスをリツキシマブ投与により処置したならば、腫瘍体積はなお経時的に増加するが、該体積は、腫瘍移植４６日後、対照マウスの腫瘍体積より２倍小さい；
−  マウスをリツキシマブとＬＰＳリポソーム製剤を含む組み合わせ製品で処置したら、腫瘍体積は移植２３日後および４６日後に同一であり、故に腫瘍発達は完全に阻止される
ことを示す。
【０１１５】
図４は、この組み合わせ製品で処置されたマウスとリツキシマブとリポソーム非封入ＬＰＳを含む組み合わせ製品で処置されたマウスの観察される差異を示し、ＬＰＳリポソーム製剤が腫瘍発達をより効果的に阻害する。
【０１１６】
本発明の他の実施態様によると、細胞毒性化合物は次の化合物から選択される：
・  慣用の細胞毒性剤(化学療法剤)、例えば：
−  アルキル化剤など、例えばシクロホスファミド、ブスルファン、メルファラン、イホスファミド、ベンダムスチン、テモゾロミド、ブレオマイシン、メクロレタミン、カルムスチン、ホテムスチン、ＢＣＮＵ；
−  白金誘導体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、
−  ヌクレオシドアナログ、核酸塩基および他の代謝拮抗剤、例えばアラシチン、フルダラビン、クラドリビン、クロファラビン、ゲムシタビン、５    −フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、６    −メルカプトプリン、デシタビン、アザシチジン、トロキサシタビン、
−  抗チューブリン剤、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、エポチロン類、エリブリン、微小化パクリタキセル、
−  抗トポイソメラーゼ２剤、例えばエトポシド、テニポシド、イリノテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン；
・  キナーゼ阻害剤タイプの標的化治療剤、例えばイマチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、アファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、クリゾチニブ、ルキソリチニブ、トファシチニブ、アクシチニブ、カボザンチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、ベムラフェニブ；
・  免疫調節剤、例えばサリドマイド、レナリドマイド、ポマリドミド；
・  アポトーシス助剤促進剤、例えばベネトクラクスまたはナビトクラックス；
・  抗腫瘍剤、例えばボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、ボリノスタット、パノビノスタット、ロミデプシン、オール・トランスレチノイン酸、ヒ素誘導体Ａｓ２Ｏ３、テムシロリムス、オラパリブ、ルカパリブ、ペントスタチン、アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素およびクロルアミノフェン。
【０１１７】
本発明の好ましい実施態様によると、細胞毒性化合物は化学療法剤である。
【０１１８】
上記化合物は、その通常の形態下に、特に塩として使用され得ることが意図される。例えば、エトポシドは、リン酸エトポシドとして使用され得る。
【０１１９】
本明細書の実施例４は、エトポシド(５μM)と組み合わせで使用されるリポソームに封入されたＬＰＳが、相乗的様式で、インビトロで癌細胞の細胞死を引き起こすことを示す。
【０１２０】
実際、慣用的に使用される化学療法剤であるエトポシドは、予想どおり癌細胞アポトーシスを誘発し、他方で、ＬＰＳリポソーム製剤はマクロファージを刺激し、故に腫瘍細胞溶解を誘発し、そして両成分の組み合わせ効果は、各成分を別々に使用したときに達成される両効果の合計よりはるかに高い細胞死率を可能とする。
【０１２１】
本発明はまた、抗腫瘍療法において使用するための、上に示す医薬組み合わせ製品にも関する。
特に、該医薬組み合わせ製品は、液性腫瘍または固形腫瘍処置に使用される。
該腫瘍は、特に乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍(黒色腫)、血液腫瘍(白血病)、骨腫瘍およびリンパ腫からなる群から選択される。
【０１２２】
より厳密に、本発明は、抗腫瘍療法において同時に、別々にまたは逐次的に使用するための該医薬組み合わせ製品に関する。換言すると、該組み合わせ製品の各成分の使用は、同時、別々または逐次的であり得る。
【０１２３】
より具体的に、抗腫瘍免疫療法において同時に、別々にまたは逐次的に使用するための、上に示す医薬組み合わせ製品に関する。
【０１２４】
本発明はまた、腫瘍の治療的処置方法であって、該腫瘍を有する患者に、少なくとも一つの細胞毒性化合物およびＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤を投与することを含み、該投与は同時、別々または逐次的方法でなされるものに関する。
【０１２５】
本発明はまた
−  ＬＰＳを排他的に含むリポソーム製剤；および
−  上に定義した少なくとも一つの細胞毒性化合物
を含む、キットにも関する。
【０１２６】
該細胞毒性化合物は特に化学療法剤または治療抗体である。
【実施例】
【０１２７】
実施例１. ＬＰＳ分子(エシェリヒア・コリー０５５：Ｂ５から抽出および精製)が封入されたリポソーム製剤の製造、分析および特徴づけ：リポソーム−ＬＰＳ
リポソーム−ＬＰＳ製剤は、次の方法により合成された。
−  リポソーム製剤の脂質組成：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ５０００：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−３５０：Ｃｈｏｌ(５４：８：８：３０％mol)
−  脂質をクロロホルム／メタノール混合物(９：１)に溶解
−  有機溶媒蒸発後脂質フィルム調製。蒸発はロータリーエバポレーターを使用して実施する
−  脂質フィルムの水和を、減圧なしで、ロータリーエバポレーターに入れた１００μg  ＬＰＳ／mLを含むフラスコに、ＰＢＳ(緩衝化食塩水溶液)を加えることにより実施する。
−  封入率を改善するため、凍結(液体窒素中)−解凍(温水中)シリーズをリポソーム−ＬＰＳの懸濁液に適用する。
【０１２８】
リポソーム−ＬＰＳの溶液の押し出しは、均一サイズのリポソームを得ることを可能とする。この目的で、リポソーム−ＬＰＳの溶液を８００nm、４００nmおよび２００nmポリカーボネート膜で濾過する。各フィルターを５回通した後、リポソームサイズは均一であり、リポソーム−ＬＰＳの溶液は半透明である。
【０１２９】
リポソーム製剤のサイズ(平均直径)、多分散性(ＰＤＩ)および荷電の分析を、Malvern instruments(Worcestershire, UK)のZetasizerNano-Sを使用する動的光散乱法により実施した。２リポソーム製剤の３か月分析は、これらの製品の安定性の証明を可能とする(表１)。
【０１３０】
【表１】
2021510172.tif 000002
【０１３１】
こうして製造したリポソーム製剤(蛍光成分を含む)とヒト血液白血球の相互作用のインビトロ分析は、リポソームと顆粒球および単球の強い相互作用を示すことを可能とした。リンパ球性フラクションとの相互作用は観察されなかった(結果は示していない)。
さらに、ヒト血液白血球とリポソーム−ＬＰＳのインキュベーションおよびフローサイトメトリーによる分析により、食細胞活性の活性化を明らかにできた。
ＬＰＳ分子が蛍光色素ＦＩＴＣに結合した、ローダミンＢ標識リポソーム−ＬＰＳ製剤の共焦点顕微鏡分析により、ＬＰＳのリポソーム粒子への取り込みを明らかにできた。最後に、リポソーム粒子の均一性は、陰性染色後電子顕微鏡で確認された。
【０１３２】
実施例２. ＲＬ細胞異種移植マウスモデルにおける、リツキシマブ活性に対するＬＰＳリポソーム製剤のアジュバント効果の前臨床評価
この実験中、６群のＳｃｉｄ  ＣＢ１７マウスが使用された。各群６マウスからなる。
群１＝対照(無処置)
群２＝空リポソーム
群３＝０.５mg／mL  ＬＰＳ
群４＝３０mg／kgリツキシマブ
群５＝０.５mg／kgリポソーム−ＬＰＳ
群６＝０.５mg／kgリポソーム−ＬＰＳ＋３０mg／kgリツキシマブ
【０１３３】
週１回注射の割合での、異なる注射処置後の腫瘍増殖モニタリングにより、リツキシマブ抗腫瘍活性増強効果が、リポソーム−ＬＰＳの製造により示された。この増強効果は、リツキシマブ単独で処置されたマウス群と比較した、リツキシマブおよびリポソーム−ＬＰＳ組み合わせ後の腫瘍増殖の有意な減少により反映された(図１)。
【０１３４】
動物屠殺後の脾臓サイズに対する種々の処置の効果の分析により、他の群で処置された動物と比較して、リポソーム−ＬＰＳおよびリツキシマブおよびリポソーム−ＬＰＳ組み合わせで処置された動物の場合の脾臓サイズおよび重量の有意な増加を明らかにできた(図２)。
【０１３５】
ＮＫ細胞は、抗腫瘍応答において重要な役割を有することが知られる自然免疫細胞である。
脾臓の白血球特定細胞型群に対する種々の処置の効果のフローサイトメトリー分析により、他の群で処置された動物と比較して、リポソーム−ＬＰＳおよびリツキシマブおよびリポソーム−ＬＰＳ組み合わせで処置された動物の脾臓におけるナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の数の有意な増加を明らかにできた(図３は、サンプル中の全白血球に対するＮＫ細胞のパーセンテージを示す)。
【０１３６】
図４は、ＲＬリンパ腫細胞を移植されたＳＣＩＤマウスの同じ動物モデルで、
−リツキシマブ(３０mg／kg)
−リツキシマブおよびエシェリヒア・コリーの「慣用の」ＬＰＳ(０.５mg／kg)
−リツキシマブおよび上記と同じ用量のＬＰＳリポソーム製剤
の週１回投与により得られた効果を比較する。
後者のリツキシマブおよび封入ＬＰＳの組み合わせは、腫瘍移植後の発達に最良の阻害の達成を可能とする。
【０１３７】
実施例３. 固形腫瘍の異種移植モデルにおけるＬＰＳリポソーム製剤の抗腫瘍作用
ＬＰＳリポソーム製剤の抗腫瘍作用も、乳癌腫瘍細胞(ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞)を異種移植したＳＣＩＤマウスである腫瘍の他の動物モデルで示した。
図５の結果は、マウスに投与した処置の関数としての経時的な腫瘍体積進行を示す：
−  群１：未処置対照マウス(３マウス)；
−  群２：ＬＰＳリポソーム製剤の静脈内投与で処置したマウス。
週１回注射の割合での、異なる注射処置後の腫瘍増殖モニタリングにより、リポソーム−ＬＰＳ製剤の抗腫瘍活性を示すことができた。この活性は、未処置マウス群と比較した、リポソーム−ＬＰＳ注射後の腫瘍増殖の有意な減少により反映された。
【０１３８】
実施例４. ＳａＯＳ細胞の細胞死率に対する本発明の組み合わせ製品のインビトロ効果
ＳａＯＳ細胞はラット骨肉腫細胞である。これは悪性骨腫瘍である。これらの細胞を、腫瘍細胞に適合させた３Ｄスフェロイドモデルで培養できる。
ＴＨＰ−１は、急性単球性白血病由来のヒト単球性細胞である。
これらＳａＯＳ細胞の細胞死モニタリングを実施するために、蛍光製品IncuCyte(登録商標)カスパーゼ−３／７を使用して、アポトーシス細胞の数を評価した。
【０１３９】
細胞を次の表２に示すプロトコールにより処理した：
【表２】
2021510172.tif 000003
【０１４０】
結果を図６に示し、蛍光は任意単位である。
対照細胞は、小さな残存アポトーシス率。
エトポシド処理細胞は、対照に対して有意に増加したアポトーシス率であった(ｐ＜０.０５)。細胞ＬＰＳリポソーム製剤処置は類似の率であった。
両化合物の結合：エトポシドおよびリポソーム製剤は、各化合物単独で使用したとき達成されるのに比して、アポトーシス率の顕著な増加を可能とし、故に、標的癌細胞に対する両化合物の相乗効果を示した。
【０１４１】
参考文献
特許
ＷＯ２０１３／１２９９３６
文献引用
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【図１】
2021510172.tif 000004
【図２】
2021510172.tif 000005
【図３】
2021510172.tif 000006
【図４】
2021510172.tif 000007
【図５】
2021510172.tif 000008
【図６】
2021510172.tif 000009
【国際調査報告】
2021510172.tif 000010
2021510172.tif 000011
2021510172.tif 000012
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