(57)【要約】本発明は、クローディン３のＥＣＬ−２に特異的に結合する抗体及びその機能的断片の癌細胞検出、診断、映像化、癌の治療への適用（抗体自体の抗癌使用、ＡＣＤ及びＣＡＲ−発現細胞（特に、免疫細胞）への適用）と、このような使用において著しい効果を示す特有のCDR配列を含む抗体及びその機能的断片に関するものである。【選択図】図１４ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補決定部位１（ＶＨ−ＣＤＲ１）、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補決定部位２（ＶＨ−ＣＤＲ２）、及び配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補決定部位３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域;及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位１（ＶＬ−ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位２（ＶＬ−ＣＤＲ２）、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片。
【請求項２】
前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤからなる群から選択され、前記機能的断片は、ディアボディー、Ｆａｂ、Ｆ、（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖとｓｃＦｖからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３】
前記抗体又はその機能的断片はクローディン３に結合した後、細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項４】
前記抗体又はその機能的断片はクローディン３の細胞外第二ループに特異的に結合することを特徴とする、請求項３に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
請求項７の細胞を培養して軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階;及び前記細胞又はそれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、クローディン３タンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の製作方法
【請求項９】
請求項１の抗体又はその機能的断片を試料と接触させる段階;及び前記抗体又はその機能的段階を検出する段階を含むクローディン３の検出方法。
【請求項１０】
請求項１の抗体又はその機能的断片を有効成分として含むクローディン３検出用組成物。
【請求項１１】
前記抗体又はその機能的断片は発色酵素、放射性同元素、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）、発光物質、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、常磁性粒子（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）と超常磁性粒子（ｕｌｔｒａｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）からなる群から選択される1つ以上のものをカバーされていることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌診断用組成物。
【請求項１３】
前記癌は卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮がん、子宮頸がん、メラノーマ、大腸がん、腎臓がん、および転移性胸膜腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌映像化用組成物。
【請求項１５】
請求項１の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物。
【請求項１６】
前記癌は卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮がん、子宮頸がん、メラノーマ、大腸がん、腎臓がん、および転移性胸膜腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
【請求項１８】
前記薬物はマイクロチューブリン（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）構造の形成の抑制剤、有糸分裂（ｍｅｉｏｓｉｓ）抑制剤、トポアイソマラアゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）抑制剤、ＤＮＡインターカレーター（ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）、毒素（ｔｏｘｉｎ）、サイトカイン、ケモカイン、抗生剤、放射性核種、光感覚剤、光熱ナノ素材、ナノパーティクル及びミセルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の結合体。
【請求項１９】
前記薬物は抗癌剤であることを特徴とする、請求項１７に記載の結合体。
【請求項２０】
請求項１の抗体またはその機能的断片を有効成分として含む癌細胞特異的薬物伝達用組成物。
【請求項２１】
請求項１の抗体又はその機能的断片；及びそれと結合された薬物を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物。
【請求項２２】
請求項１の抗体又はその機能的断片を含むＣＡＲ（キメラ抗原受容体）タンパク質。
【請求項２３】
前記ＣＡＲは、
ｉ）請求項１の抗体又はその機能的断片;
ｉｉ）膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）;及び
ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎｌａｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むことを特徴とする、請求項２２に記載のＣＡＲタンパク質。
【請求項２４】
前記ｉｉｉ）の細胞は免疫細胞であることを特徴とする、請求項２３に記載のＣＡＲタンパク質。
【請求項２５】
前記免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ（  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、ＮＫＴ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ）細胞、  単核球、マクロファージ及び樹状細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２４に記載のＣＡＲタンパク質。
【請求項２６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ（ξ，ｚｅｔａ）、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３エプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲＩ及びその組み合わせにより、
なる群から選択されたシグナル伝達ドメインであることを特徴とする、請求項２３に記載のＣＡＲタンパク質。
【請求項２７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは共同刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌｔａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ）をさらに含むことを特徴とする、請求項２３に記載のＣＡＲタンパク質。
【請求項２８】
前記の共同刺激ドメインはＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ＴＮＦ受容体タンパク質（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、免疫グロブリン−類似タンパク質（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、サイトカイン受容体（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）、ＳＬＡＭタンパク質（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ＮＫ細胞の活性化受容体（ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体（Ｔｏｌｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＩＬ２Ｒ  ｂｅｔａ、ＩＬ２Ｒ  ｇａｍｍａ、ＩＬ７Ｒ  ａｌｐｈａ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰ１Ｇ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＰＤ−１およびその組み合わせからなる群から選択された共同刺激分子から由来したことを特徴とする、請求項２７に記載のＣＡＲタンパク質。
【請求項２９】
請求項２２のＣＡＲタンパク質を暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２２のＣＡＲタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項３１】
請求項３０の組換えベクターで形質転換された細胞。
【請求項３２】
前記細胞は免疫細胞であることを特徴とする、請求項３１に記載の形質転換された細胞。
【請求項３３】
クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む細胞内薬物伝達用組成物。
【請求項３４】
前記の断片はクローディン３に結合した後、細胞質に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることを特徴とする、請求項２８の組成物。
【請求項３５】
クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
【請求項３６】
前記薬物は、マイクロチューブリン（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）構造の形成の抑制剤、有糸分裂（meiosis）抑制剤、トポアイソマラアゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）抑制剤、ＤＮＡインターカレーター（ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）、毒素（ｔｏｘｉｎ）、サイトカイン、ケモカイン、抗生剤、放射性核種、光感覚剤、光熱ナノ素材、ナノパーティクル及びミセルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３５に記載の複合体。
【請求項３７】
前記薬物は抗癌剤であることを特徴とする、請求項３５に記載の複合体。
【請求項３８】
クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片；及びそれと結合された薬物を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物。
【請求項３９】
ｉ）クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片；
ｉｉ）膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）;及び
ｉｉｉ）前記抗体に抗原が結合するとＴ細胞活性化をもたらす細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎｌａｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含ＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質。
【請求項４０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは共同刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ）をさらに含むことを特徴とするＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質。
【請求項４１】
請求項３９のＣＡＲタンパク質を暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項３９のＣＡＲタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４３】
請求項４２の組換えベクターで形質転換された細胞。
【請求項４４】
クローディン３検出用製剤を製造するための請求項１の抗体またはその機能的断片。
【請求項４５】
請求項１の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量
を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の診断方法。
【請求項４６】
癌診断用製剤を製造するための請求項１の抗体又はその機能的断片。
【請求項４７】
請求項１の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌診断方法。
【請求項４８】
癌映像化用製剤を製造するための請求項１の抗体又はその機能的断片。
【請求項４９】
請求項１の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌映像化方法
【請求項５０】
癌の予防及び治療用製剤を製造するための請求項１の抗体又はその機能的断片。
【請求項５１】
請求項１の抗体又を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与する段階を含む癌の治療方法。
【請求項５２】
癌細胞特異的薬物伝達用製剤を製造するための請求項１の抗体又はその機能的断片。
【請求項５３】
請求項１の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌細胞特異的薬物伝達方法。
【請求項５４】
癌の予防及び治療用製剤を製造するための請求項１の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体−薬物重合体。
【請求項５５】
請求項１の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体−薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法。
【請求項５６】
細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片。
【請求項５７】
クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを特徴する細胞内薬物伝達方法。
【請求項５８】
癌の予防及び治療用製剤を製造するためのクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片;及びそれと結合された薬物。
【請求項５９】
クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片；及びそれと結合された薬物を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１８年３月２８日に出願された大韓民国特許出願第１０−２０１８−００３６１９０号を優先権として主張し、前記の明細書全体は出願の参考文献である。
【０００２】
本発明はクローディン３のＥＣＬ−２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ）に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用に関するもので、より詳しくはクローディン３のＥＣＬ−２に特異的に結合する抗体及びその機能的断片らの癌細胞検出、診断、映像化、癌の治療への適用使用（抗体自体の抗がん使用、ＡＤＣ及びＣＡＲ−発現細胞（特に、免疫細胞）への適用）と、このような使用において顕著な効果を示す特有のＣＤＲ配列を含む抗体及びその機能的断片に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
クローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）は、細胞間の密着結合（ｔｈｉｇｈ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＴＪ）の主要必須膜タンパク質として哺乳類の場合２７個のファミリーがあり、ヒトの場合は哺乳類からクローディン１３を除いたクローディンファミリーを有している。クローディンファミリーは細胞壁を透過して刺されている形態の類似した構造を有し、殆ど2つの細胞外ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｏｐ）を有している構造を有している。クローディンは細胞間分子らの流れを制御する役割をすることが知られているが、最近様々な研究を通して結腸癌、胃癌、乳房癌、食道癌及び卵巣癌など、癌の発生にも密接な関連性があるという研究が報告されている。悪性腫瘍の約９０％は上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）に由来する。正常上皮細胞では、細胞は上皮面（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｌａｎｅ）と平行に配置される。したがって、正常的な上皮組織の間のＴＪを成すクローディンは組織又は器官の表面から検出され難いが、上皮腫瘍細胞発生の初期段階から有糸分裂紡錘体（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｐｉｎｄｌｅ）の調節が解除され、細胞が平面から外れた分裂により増殖されることで、クローディンが組織表面に露出される。
【０００４】
特に、明確な症状が無く、手術と科学的療法以外に適切な治療方法が無いため、予後が思わしくないと知られている卵巣癌からクローディンファミリーの内、クローディン３とクローディン４が過剰発現されることが報告された（Ｃｌａｕｄｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ:Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｐ．Ｊ．  Ｍｏｒｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５:９６０４−９００６  （２００５））。又、８４人の卵巣漿液腺癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｓｅｒｏｕｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者の生存率とクローディン３の発現率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法の生存カーブで確認した結果、クローディン３の発現率は患者の寿命短縮と密接な関係があるという研究が報告された（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｌａｕｄｉｎ  ３  ａｎｄ  ｃｌａｕｄｉｎ  ４  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｓｅｒｏｕｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ，Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２２:１１８５〜１１９５（２００５））。このように、癌の組織で特異性が高いクローディン発現の増減有無は癌の生成に対する予測指示因子として使うことが可能なため、又、癌の診断と治療においてクローディンが有用なバイオマーカーとされ、様々なグループでクローディンをターゲットにする治療剤の開発を試みている。
【０００５】
一方、抗体−薬物−複合体（ＡＤＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は単クローン抗体の標的特異性と薬物の効能（例えば、細胞毒性）の特性を組み合わせたものである。ＡＤＣは薬物、単クローン抗体、そして抗体と薬物を繋ぐリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む３つの主要要素で構成されており、ＡＤＣテクノロジーは主に癌細胞の表面に発現された特定抗原に特異的に結合する抗体を使用して、薬物を腫瘍細胞に伝達する方法として使われている。しかし、単に特定癌抗原を標的とする抗体がＡＤＣに全て適用できるのではない。
【０００６】
従来の抗体は、大きいサイズと親水性の特徴のためで、生きている細胞の内部に直接浸透することができない。したがって、従来殆どの抗体は細胞外に分泌されたタンパク質又は細胞膜タンパク質を特異的に標的している。一般的な抗体と高分子バイオ医薬品は疎水性である細胞膜の通過が不可能であり、それによって細胞質内部の多様な病気関連物質と結合及び阻害できない限界がある。一般的に細胞の生長、特異的抑制等の機構研究のための実験で使われる細胞内部物質と特異的結合する商業的抗体は生きている細胞に対して直接処理ができず、細胞内部物質と結合するためには両親媒性グリコサイドのサポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）を利用した細胞膜透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）過程を通って、細胞膜に穿孔を形成するための前処理過程が必ず必要である。低分子物質、核酸又はナノ粒子等の場合、様々な試薬、電気穿孔法又は熱衝撃などの方法を使うことで、生きている細胞内部へ輸送できるようになるが、タンパク質及び抗体の場合、前記の殆どの試薬と実験条件等が固有な３次構造に悪影響を及ぼし、活性を消失する可能性がある。細胞内部タンパク質を特異的に結合し、活性を阻害する細胞内抗体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）が開発されているが、それもまた生きている細胞の細胞膜を浸透する活性がないため、遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）の使用のみに適用が可能なため、今後の応用可能性が極めて制限される（Ｍａｎｉｋａｎｄａｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ，２００７  Ｊａｎ  １；１２：１３４４−５２）。
【０００７】
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）、免疫毒素、そして標的化された核酸伝達をはじめとする幾つかの治療的アプローチは、受容体に結合するだけでなく、結合時に細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）する抗体を必要とする。ＡＤＣが優れた薬効を示すためにはＡＤＣが細胞内に入る（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ、内在化）過程が必要であることが知られているが、抗体によっては細胞内に入れる能力が無いか、又はこれに対する偏差が極めて大きいため、実際にＡＤＣで開発可能な抗体とこれらの効果が制限的であることが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明者等はＡＤＣ（抗体−薬物複合体）に使用に適した様々な特徴を兼備する抗体を開発するため研究していた中、クローディン３ＥＣＬ−２に特異的に結合する抗体及びその機能的断片の癌細胞検出、診断、映像化、癌治療への適用（ＡＤＣ及びＣＡＲ−発現細胞（特に、免疫細胞）への適用等）価値を確認し、このような具体的な一例として本発明で提供する特有のＣＤＲ配列を含む抗体が自ら抗癌能力を有しているだけでなく、他のクローディンファミリーとの交差反応性が無く、優れた癌細胞標的能力を示し、従来公知のクローディン３抗体と比べて極めて優れた結合力（親和度）を示し、細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）などの特性を保有し、前記の適用において著しい効果を示すことを確認し、本発明を完成させた。
【０００９】
従って、本発明の目的は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位１（ＶＨ−ＣＤＲ１）、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位２（ＶＨ−ＣＤＲ２）、及び配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む  重鎖相補性決定部位３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；及び
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位１（ＶＬ−ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位２（ＶＬ−ＣＤＲ２）、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領部位３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド、それを含むベクター、それを含む細胞及びそれを利用した前記の抗体又はその機能的断片を生産する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分と含むクローディン３検出用組成物及びそれを利用したクローディン３の検出方法を提供することである。
【００１２】
また、前記の抗体又はその機能的断片で構成されるクローディン３の検出用組成物及びそれを利用したクローディンン３の検出方法を提供することである。
【００１３】
また、前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成されるクローディン３の検出用組成物お及びそれを利用したクローディン３の検出方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌診断用又は映像化用組成物を提供することである。
【００１５】
また、前記の抗体又はその機能的断片で構成される癌診断用又は映像化用組成物を提供することである。
【００１６】
また、前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌診断用又は映像化用組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、具体的に前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供することである。
【００１８】
また、前記の抗体又はその機能的断片で構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供することである。
【００１９】
また、前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物提供することである。
【００２０】
また、本発明のさらに他の目的は、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む細胞内薬物伝達用組成物を提供することである。
【００２１】
また、クローディン３の細胞外２番目ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，  ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片で構成される細胞内薬物伝達用組成物を提供することである。
【００２２】
また、クローディン３の細胞外２番目ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，  ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片で必須的に構成される細胞内薬物伝達用組成物を提供することである。
【００２３】
本発明のさらに他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とそれを有効成分と
して含む癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
【００２４】
また、前記の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とそれを有効成分とて構成される癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
【００２５】
また、前記の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とそれを有効成分とて必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
【００２６】
また、本発明のさらに他の目的はクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体とそれを有効成分と含む癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
【００２７】
また、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ
ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とそれを有効成分として構成される癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
【００２８】
本発明のさらに他の目的は、ｉ）前記の本発明の抗体又はその機能的断片；ｉｉ）膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）；及びｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎｌａｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を提供することである。また、ｉ）クローディン３細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；ｉｉ）膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）；及びｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎｌａｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を提供することである。
【００２９】
本発明のさらに他の目的は、前記のＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドと、それを含む組換えベクター、及び前記のベクターで形質転換された細胞（特に、免疫細胞）を提供することである。
【００３０】
本発明のさらに他の目的は、クローディン３検出用製剤、癌診断用製剤、癌映像用製剤、癌細胞特異的薬物伝達用製剤を製造するための前記の抗体又はその機能的断片の使用を提供することである。
【００３１】
本発明のさらに他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量はそれを必要とする個体に投与する段階を含むクローディン３の特異的検出方法、癌診断方法、癌映像化方法、癌細胞特異的薬物伝達方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらに他の目的は、癌の予防及び治療用製剤を製造するための前記の抗体の使用又は前記の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物重合体の使用を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに他の目的は、前記の抗体を有効成分として含む組成物又は前記の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する
ことである。
【００３４】
本発明のさらに他の目的は、細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の使用を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに他の目的は、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む細胞内薬物伝達方法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらに他の目的は、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物重合体の使用を提供することである。
【００３７】
本発明のさらに他の目的は、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
前記のような目的を達成するために、本発明は配列番号３から表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）、配列番号４から表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）、配列番号５から表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；及び
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片を提供する。
【００３９】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記の抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド、それを含むベクター、それを含む細胞及びそれを利用した前記の抗体又はその機能的断片を生産する方法を提供する。
【００４０】
本発明のさらに他の目的を達成するため、本発明は前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含むクローディン３検出用組成物及びそれを利用したクローディン３の検出方法を提供する。
【００４１】
また、本発明は前記の抗体及びその機能的断片で構成されるクローディン３検出用組成物及びそれを利用したクローディン３の検出方法を提供する。
【００４２】
また、本発明は前記の抗体及びその機能的断片で必須的に構成されるクローディン３検出用組成物及びそれを利用したクローディン３の検出方法を提供する。
【００４３】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌診断用又は映像化用組成物を提供する。
【００４４】
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片で構成される癌診断用又は映像化用組成物を提供する。
【００４５】
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌診断用又は映像化用組成物を提供する。
【００４６】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の抗体を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【００４７】
また、本発明は前記の抗体で構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【００４８】
また、本発明は前記の抗体で必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【００４９】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の抗体又は、その機能的断片を有効成分として含む癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
【００５０】
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片で構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
【００５１】
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
【００５２】
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片で構成される細胞内薬物伝達用組成物を提供する。
【００５３】
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片で必須的に構成される細胞内薬物伝達用組成物を提供する。
【００５４】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とそれを有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【００５５】
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とそれを有効成分として構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【００５６】
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とそれを有効成分として必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【００５７】
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体−薬物複合体とそれを有効成分として構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【００５８】
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体−薬物複合体とそれを有効成分として必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【００５９】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はｉ）クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；ｉｉ）膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）；及び  ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎｌａｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を提供する。また、ｉ）クローディン３細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；ｉｉ）膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）;及びｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎｌａｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を提供する。
【００６０】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記のＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドと、それを含む組換えベクター、及び前記のベクターで形質転換された細胞（特に、免疫細胞）を提供する。
【００６１】
本発明のさらに他の目的を達成するために、クローディン３検出用製剤、癌診断用製剤、癌映像用製剤、癌細胞特異的薬物伝達用製剤を製造するための前記抗体又はその機能的断片の使用を提供する。
【００６２】
本発明のさらに他の目的を達成するために、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分と含む組成物の有効量はそれを必要とする個体に投与する段階を含むクローディン３の特異的検出方法、癌診断方法、癌映像化方法、癌細胞特異的薬物伝達方法を提供する。
【００６３】
本発明のさらに他の目的を達成するために、癌の予防及び治療用製剤を製造するための前記抗体の使用又は前記抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物重合体の使用を提供する。
【００６４】
本発明のさらに他の目的を達成するために、前記抗体を有効成分として含む組成物又は前記抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
【００６５】
本発明のさらに他の目的を達成するために、細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の使用を提供する。
【００６６】
本発明のさらに他の目的を達成するために、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む細胞内薬物伝達方法を提供する。
【００６７】
本発明のさらに他の目的を達成するために、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物重合体の使用を提供する。
【００６８】
本発明のさらに他の目的を達成するために、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
【００６９】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明への用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”とは、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｉｇ）とも称され、抗原に選択的に作用して生態免疫に関与するタンパク質の総称である。自然で発現される全体抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は一般に複数のドメインからなるポリペプチドの軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ，ＬＣ）及び重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ，ＨＣ）の２つのペアからなるか、それらＨＣ／ＬＣの２つのペアで成している構造を基本単位とする。哺乳類の抗体を構成する重鎖の種類はギリシャアルファベットα、δ、ε、γ及びμで表示される５つのタイプがあって、重鎖の種類によりそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ等、他の種類の抗体を構成するようになる。哺乳類の抗体を構成する軽鎖の種類はλ及びκで表示される2つの種類が存在する。
【００７０】
抗体の重鎖と軽鎖は構造的にアミノ酸配列の可変性により可変領域と不変領域に区切られる。重鎖の不変領域は抗体の種類によりＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧ抗体）及びＣＨ４（ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体）等、３つ又は４つの重鎖不変領域で構成されていて、軽鎖は１つの不変領域のＣＬで構成されている。重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の一つのドメインから成っている。軽鎖と重鎖はそれぞれの可変領域と不変領域が並べて一つの共有ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）により連結され、軽鎖と結合した２つの分子の重鎖は、２つの共有ジスルフィド結合を通って連結されて、全体抗体の形を形成する。全体抗体は重鎖及び軽鎖の可変領域を介して、抗原に特異的に結合し、全体抗体は２つの重鎖及び軽鎖の双（ＨＣ／ＬＣ）で構成されているため、1つの分子の全体抗体は２つの可変領域を通って同一な２つの抗原に結合する二価の単一特異性を有することになる。
【００７１】
抗体が抗原に結合する部位を含む可変領域は配列可変性の少ないフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）と配列可変性の高い超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）に細分される。ＶＨとＶＬはそれぞれ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲがＮ−末端からＣ−末端の方向にＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４順で配列されている。抗体の可変領域の中でも配列可変性の一番高いＣＤＲが抗原と直接結合する部位であって、抗体の抗原特異性に最も重要である。
【００７２】
本発明で用語“親和度”は分子（例、抗体）の単一結合部位とその結合相手（例、抗原）の間に非共有的相互作用の総合の強度を意味する。他に示さない限り、本願で使われたように、“結合親和度”は結合対の構成員等（例えば、抗体及び抗原）の間の1:1相互作用を反映する固有結合親和度を意味する。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和度は一般に解離定数（Ｋｄ）に表される。本発明で、抗体の“親和度”はＫｄで表現され、それは前述したように抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。抗原に対する抗体結合においてKdの値が大きいほど、特定抗原に対する結合親和度はさらに弱い。前記Ｋｄ又は親和度は当該分野に公知された通常の方法により測定可能であって、例え、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｒａｃｅｒ  Ｇｒｅｅｎ等の測定機器を利用することができる。
【００７３】
本発明で“クローディン３（ｃｌａｕｄｉｎ  ３，ＣＬＤＮ３にも表記）”はクローディ
ンファミリーに属するタンパク質であり、密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）が発するところに存在し、密着結合から細胞間の空間を除去する特有の役割を有する。密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）は動物のような有機体の組織から引接した細胞膜を連結する頑固な構造物である。クローディン３はイオンのような小さい溶質（ｓｏｌｕｔｅ）の細胞間透過性を調節する構造タンパク質である。クローディン３は４つの膜通過（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）領域を有するタンパク質であり、２つのペプチドループ（ｌｏｏｐ）を細胞外部に露出させる構造を有している。２つのペプチドループの内、クローディン３全体タンパク質配列により、N−末端に近いアミノ酸領域のループを細胞外第一ループ（本発明でＥＣＬ−１又はＥＬ１で表記）と称し、もう一つのループを本発明で細胞外第二ループ（本発明でＥＣＬ−２又はＥＬ２で表記）と称する。好ましくは、前記細胞外第一ループは、クローディン３タンパク質アミノ酸配列の２７乃至８０番目のアミノ酸を含む領域で、細胞外第二ループは、クローディン３タンパク質アミノ酸配列の１４４乃至１５９番目アミノ酸を含む領域（配列番号２参照）を意味する。
【００７４】
Ｃｌａｕｄｉｎ３はウエルシュ菌エンテロトキシン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）（ＣＰＥ）に対する毒素受容体として機能すると知られている。ＣＰＥはＣｌａｕｄｉｎ３とＣｌａｕｄｉｎ４に結合すり次第、細胞壊死を起こす大きな複合体を形成して細胞膜に空隙を生成する。
【００７５】
一方、クローディンタンパク質の細胞外ドメインはＴＪ（密着結合）の形成に関与するが、正常の上皮細胞単一層（ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）でＣｌａｕｄｉｎ３は側面膜の最頂端部（ａｐｉｃａｌ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｔｅｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）のＴＪストランドの中に存在するとされるが、上皮腫瘍形成及び腫瘍細胞からの非表面（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｌａｎｅ）分化の間の有糸分裂紡錘体の調節障害は細胞表面のTJ成分の非常識的位置を誘導することと推測される（Ｓａｅｋｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．,  Ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｌａｕｄｉｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０；２：４７−５１．）。それに関して、Ｃｌａｕｄｉｎ３タンパク質は卵巣癌、前立腺癌、乳房癌、子宮癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌及び結腸癌のような多くの癌組織からの露出程度が増加することと報告された。Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ  （ＨＰＡ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）を病気に対するＣｌａｕｄｉｎ３の発現プロファイルの参考資料として用いられる。Ｃｌａｕｄｉｎ３とＣｌａｕｄｉｎ４の発現は化学用法耐性及び／又は再発性子宮癌で特に高まるが、それはアメリカで婦人科の癌の内、最も致死率が高いと知られている。しかし、今まで腫瘍状態から露出されるＣｌａｕｄｉｎ３を特異的に検出するのには限界を示しているのが実情である。
【００７６】
本発明でクローディン３は、当業界でクローディン３として知られたものなら、その具体的生物起源及び配列に特別な制限が無い。一例で本発明のクローディン３はマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のものとして、ＮＣＢＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９Ｚ０Ｇ９等で公知されたもの、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のものとして、ＮＣＢＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ６３４００等で公知されたもの、トリ（Ｇａｌｌｕｓ    ｇａｌｌｕｓ）由来のものとして、ＮＣＢＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９８ＳＲ２等で公知されたもの、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）由来のものとして、ＮＣＢＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９５ＫＭ５等で公知されたもの、サル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）由来のものとして、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｅｎｔｒｙ．  Ｆ６ＲＱＦ６等で公知されたもの、ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のものとして、ＮＣＢＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｏ１５５５１（配列番号１参照）等で公知されたものを含むことができる。
【００７７】
そして、このような抗体及びその機能的断片の一例として、本発明から提供する特有のＣＤＲ配列を有する抗体がクローディン３発現細胞に対するＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞障害作用）効果が著しく、自ら抗癌効果を有しているだけでなく、他のクローディンファミリーとの交差反応性が無く、クローディン３のみを特異的に標的する能力が優れていて、従来公知のクローディン３抗体と比較して極めて優れた結合力（親和度）を示し、また細胞内部に入る（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ、内在化する）能力を有して癌の診断、映像化及び薬物伝達体としての機能が優れていることを確認した。特に本発明の抗体及びその機能的断片はクローディン３のＥＣＬ−２領域に特異的に付着するが、それによりクローディン３が表面に露出されない通常の正常組織とは違い、不完全な連接（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成する腫瘍組織に本発明の抗体が（又はその機能的断片が）選択的接近可能になり、そのような能力は正常細胞に対する抗癌薬物の毒性問題を凄まじく低減させるもので、より技術的意義が大きい。
【００７８】
具体的に本発明は、後記のＣＤＲ配列を含むことを特徴とする重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片を提供する:
【００７９】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位１（ＶＨ−ＣＤＲ１）、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位２（ＶＨ−ＣＤＲ２）、及び配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；及び
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位１（ＶＬ−ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位２（ＶＬ−ＣＤＲ２）、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域。
【００８０】
また本発明は、後記のCDR配列を含むことを特徴とする重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体及びその機能的断片を提供する:
【００８１】
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位１（ＶＨ−ＣＤＲ１）、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位２（ＶＨ−ＣＤＲ２）、及び配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；及び
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位１（ＶＬ−ＣＤＲ１）、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位２（ＶＬ−ＣＤＲ２）、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域。
【００８２】
本発明による抗体は前記のＣＤＲの組合せを有するのであれば、その種類に制限はない。具体的にはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤからなる群から選ばれるものもあり、特にＩｇＧ抗体であることが望ましい。前記ＩｇＧはその亜型としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等を含むが、それに限定されない。また1つのＢ細胞から由来する単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ）抗体の可能性があり、複数のＢ細胞から由来するポリクローナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体の可能性もあるが、抗体の重鎖と軽鎖のアミノ酸配列が実質的に同一の抗体の集団の単クローン抗体であることが望ましい。また、本発明の抗体又はその断片は酵素、蛍光物質、放射線物質及びタンパク質等と接合したものもあるが、これに限定されない。
【００８３】
本発明の抗体はヒトを含む哺乳動物、鳥類等を含む任意の動物から由来したものもあり、望ましくはヒトから由来するものか、ヒトから由来した抗体の部分と別種の動物から由来した抗体の部分を含むキメリック（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体もある。
【００８４】
また、本発明から抗体の機能的断片は全体抗体の抗原特異的結合力を維持している断片を意味し、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）又はｄｓＦｖなどの形態もある。
【００８５】
Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）は抗体の抗原結合断片で、重鎖と軽鎖それぞれの一つの可変ドメインと不変ドメインで構成される。Ｆ（ａｂ’）２は抗体をペプシンで加水分解させて生成される断片で、２つのＦａｂが重鎖ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）により繋がる形をしている。Ｆ（ａｂ’）はＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合を還元して分離させたＦａｂに重鎖ヒンジが加わった形の段量体抗体断片である。Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）は重鎖と軽鎖それぞれの可変領域のみに構成される抗体の断片である。ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）は重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）が柔軟なペプチドリンカーで繋がれている組換え抗体断片である。ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）はｓｃＦｖのＶＨとＶＬが極めて短いリンカーで連結され、互いに結合できず、同一な形の他のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとそれぞれ結合し、二量体を形成している形の断片を意味する。ｄｓＦｖはＶＨ及びＶＬのうちそれぞれ一つのアミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、当該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介在して結合させたものを意味する。システイン残基に置換されるアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒ等により記載された方法［参照：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７，  ６９７（１９９４）］により抗体の立体構造予測に根拠して選択できる。
【００８６】
本発明の前記又はその機能的断片はクローディン３に特異的に結合し、特にクローディン３のＥＣＬ−２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｏｐ  ２）に極めて高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）に特異的に付着して細胞内部に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）することを特徴とする。
【００８７】
前記のクローディン３は当業界にクローディン３として知られたものなら、その具体的生物起源に特に制限は無く、一例で前述したものと同様のマウス由来、ヒト由来、ラット由来、トリ由来、イヌ由来又はサル由来のものなどを含む。望ましくヒト由来のものを意味するものもあり、ヒトクローディン３のＥＣＬ−２は望ましく配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む。
【００８８】
本発明の一実施例では本発明の抗体がクローディン３と系統解析的に柔軟関係が高い他のクローディンファミリーとは交差反応性が無いことを確認し、本発明の抗体の結合特異性が相当に優れていることを証明している。このような高いレベルの結合特異性はクローディン３（特にヒトクローディン３）を検出し、それを特定の病気（特に、クローディン３の異常な（過剰）発現を特徴とする疾患）の診断及び映像化などに利用し、高い正確性を有する情報を提供することができるので、極めて意味が深い。
【００８９】
したがって、本発明は前記抗体又はその機能的断片を有効成分として含むクローディン３検出用組成物及びキットを提供する。また、本発明は、（１）前記本発明の抗体又はその機能的断片を試料と接触させる段階、及び（２）前記抗体又はその機能的断片を検出する段階を含むクローディン３の特異的検出方法を提供する。
【００９０】
また、本発明は前記抗体及びその機能的断片で構成されるクローディン３検出用組成物及
びキットを提供する。
【００９１】
また、本発明は前記抗体及びその機能的断片で必須的に構成されるクローディン３検出用組成物及びキットを提供する。
【００９２】
本発明の前記抗体又はその機能的断片は、クローディン３との結合の有無を確認し、検出及び定量を容易にするために、標識された状態で提供されることができる。即ち、検出可能な標識にリンク（例：共有結合及び架橋）されて提供されることができる。前記検出可能な標識は、それに制限されないが、発色酵素（例:ペルオキシダーゼ、アルカラインホスファターゼ）、放射性同位元素（例：１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ）、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）、発光物質又は蛍光物質（例：ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、蛍光タンパク質（ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）；ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）；ＤｓＲｅｄ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）；ＣＦＰ（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＧＦＰ（Ｃｙａｎ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７．５）、自己共鳴映像物質（例：Ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ（Ｇｄ、ガドリニウム）、常磁性粒子（ｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）又は超常磁性粒子（ｕｌｔｒａｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ））などもあり得る。
【００９３】
本発明の抗体又はその機能的断片は、検出キット（Ｋｉｔ）又は診断分析を行うための診断キットとして提供することが可能なため、そのとき使用説明書と共に、前に指定された量で包装された試薬と一緒に提供できる。抗体が酵素で標識された場合、キットには基質及び発色端又は蛍光端を提供する基質前駆体として酵素により要求される補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）が含められる。また、安定化剤、緩衝液（例えば、遮断緩衝液又は溶解緩衝液）などと同じく他の添加剤が含められる。様々な試薬の相対的量は分析の敏感度を十分最適化させる試薬の溶液内濃度を提供するため幅広く変化できる。試薬は溶解時適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、一般に凍結乾燥された、乾燥文末として提供できる。
【００９４】
前記のキットはウエスタンブロット分析法、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析法、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動法、組織免疫染色、免疫沈降分析法、補体結合分析法、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、プロテインチップ分析法などに使われるキットでもあって、それぞれの分析法により提供される試薬、補助物質、容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、固体支持体等は当業界に良く知られている。
【００９５】
前記クローディン３特異的検出方法により、当業者は試料内に存在（又は包含）するクローディン３タンパク質の有無と濃度を測定できる。
【００９６】
本願で検出とは、定量及び／又は定性分析を含むことで、存在、不存在の検出及び濃度測定を含むことでそのような方法は当業界で公知されていて、当業者であれば本願の実施のための適切な方法を選択できる。
【００９７】
前記（１）段階の前に、通常の技術者は抗体又はその機能的断片を利用してタンパク質を検出する公知の方法を適切に選択し、選択された方法に適合した試料を用意できる。また、試料はクローディン３の異常な（過剰）発現を特徴とする疾患（例えば、癌）の有無を診断しようとする被検体から採取した生検などから得られた細胞や組織、全血（血液）、血清、血漿、唾液、脳脊髄液などもあるが、これに限定されない。前期抗体を利用してタンパク質を検出する方法とはそれに制限されるものではないが、例えば、ウエスタンブロット、免疫ブロット、ドット・ブロット、免疫組織化学染色、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫検定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、競争結合分析、免疫沈降法などがある。例えば、免疫組織化学染色のためには、細胞や組織切片を固定し、ブロック（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するなどの前処理をすることができる。
【００９８】
続いて前記（１）の段階では前述したように準備された試料に本発明による抗体又はその機能的断片を接触させる。前記の接触により抗原（クローディン３）−抗体複合体が形成される。
【００９９】
前記（２）段階では試料に生成された抗原−抗体複合体を感知することで、試料内クローディン３タンパク質の存在有無とその水準を測定する段階である。前述したように検出に利用された本発明の前記抗体又はその機能的断片は、標識された状態で提供されることもあり、その場合直ぐに標識を検出することができる。それでない場合は、別途標識された２次抗体を用いられる。前記２次抗体とは、1次抗体（その場合、本発明の抗体又はその機能的断片）のＦｃ部位などに結合する抗体として、そのような2次抗体の使用については当業界に周知されている。
【０１００】
標識による検出方法は当業界に広く知られているが、例えば次のような方法により遂行できる。若し検出可能な標識で蛍光物質を利用する場合は、免疫蛍光染色法を利用することができる、例え、蛍光物質で標識された本発明のペプチドを試料と反応させて未結合又は非特異的な結合産物を除去してから、蛍光顕微鏡下でペプチドによる蛍光を観察することができる。また、検出可能な標識で酵素（例えば、ルシフェラーゼ，ペルオキシダーゼ，ガラクトシダーゼなど）を利用する場合には酵素反応を通った基質の発色反応により吸光度を測定し、放射線物質の場合には、放射線放出量（例えば、シンチレーション係数（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）により測定）を測定することで遂行できる。それ以外にも本発明による抗体又はその断片はバイオティン（ｂｉｏｔｉｎ）に接合された形で製造され、適切に標識されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）と反応させて感知することができる。併せて、検出された結果は、検出標識による公知された映像化方法によって、映像化することができる。
【０１０１】
それによって前記本発明の抗体又はその機能的断片はクローディン３の（過剰）発現を特徴とする疾患の診断及び映像化に利用できる。本発明で診断及び映像化可能な疾患では、当業界にクローディン３の異常な発現（特に、過剰発現）を同伴するものと知られているものなら、その種類が特に限られてはないが、望ましく癌を対象にする可能性がある。したがって、本発明は、前記本発明の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌診断用組成物及び癌の映像化用組成物を提供する。
【０１０２】
また、前記本発明の抗体又はその機能的断片で構成される癌診断用組成物及び癌の映像化用組成物を提供する。
【０１０３】
また、前記本発明の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌診断用組成物及び癌の映像化用組成物を提供する。
【０１０４】
本願から前記の癌（腫瘍）はその種類が特に限られてはないが、望ましくは正常状態と比較してクローディン３の過剰発現を特徴とする癌の種類でもあり、より望ましくは上皮性癌でもあって、具体的一例としては卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌、子宮頸部癌又は黒色腫等を含むが、それに限ら
れてはいない。
【０１０５】
また本発明の抗体又はその断片は前述したようにクローディン３に対する結合特異性が極めて高いだけでなく、クローディン３（特にＥＣＬ−２）に結合した後、細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることを特徴とする。こうして細胞内部に入る特性は抗体−薬物複合体（ＡＤＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の開発において大きな利点を提供して、ＡＤＣが優れた薬効を示すためにはＡＤＣが細胞内に入る（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，  内在化）過程が必要であると知られている。
【０１０６】
本発明で前記内在化は細胞が内部に入ること（浸透すること）を意味することで、内在化されるタイプ又は種類が特に限られてはいないが、一例でエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）されることもある。
【０１０７】
したがって、本発明は、前述した本発明の抗体及びその機能的断片を有効成分として含む癌細胞と特異的薬物伝達用組成物を提供する。
【０１０８】
また、前述した本発明の抗体又はその機能的断片で構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
【０１０９】
また、前述した本発明の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
【０１１０】
具体的に、本発明は前述した本発明の抗体又はその機能的断片；及び薬物が結合された抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を提供する。また、本発明の抗体又はその機能的断片；及びそれと結合された薬物を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【０１１１】
本発明において、用語“抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）”は本発明の抗体（又はその機能的断片）と薬物が連結された複合体を意味し、免疫複合体とも呼ばれる。前記抗体−薬物複合体は当業界に公知された様々な方法を利用して製造することができる。
【０１１２】
前記の抗体−薬物複合体は、直接２つの分子が結合されることもあって、またはリンカー等の任意の手段によって、間接的に２つの分子が結合されるものもある。前記リンカーは非切断性リンカー又は切断性リンカーでもある。一般に、ＡＤＣは、リンカー等の手段によって、間接的に結合されてから標的された細胞の内部で薬物が伝達できるように設計されることが理想的であると知られている。前記リンカーは細胞内環境、例えばリソゾーム又はエンドゾームに存在する切断剤によって切断可能なため、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えばリソソーム又はエンドソームプロテアーゼにより切断できるペプチドリンカーでもある。一般にペプチドリンカーは少なくとも２つ以上のアミノ酸長さを有する。一例で、前記切断性リンカーはpH敏感性で、特定のｐＨの値で加水分解に敏感なこともある。一般に、ｐＨ敏感性リンカーは酸性条件で加水分解できることを示す。例えば、リソゾームで加水分解できる酸性不安定リンカー、例えば、ハイドラゾーン、セミカバゾン、チオセミカバゾン、シス−アコニットアミド（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｉｃ  ａｍｉｄｅ）、オルソエステル、アセタール、ケタ-ールなどもある。他の一例で、前記リンカーは還元条件で切断されることもあり、例えばジスルフィド型リンカーがそれに該当することもある。ＳＡＴＡ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ、Ｓ−アセチルチオ酢酸スクシンイミジル）、ＳＰＤＰ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸  Ｎ−スクシンイミジル）、ＳＰＤＢ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｌｐｈａ−（２−ｐｙｒｉｄｙｌ−ｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ、Ｎ−スクシンイミジルーオキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して様々なジスルフィド結合が形成できる。
【０１１３】
前記の薬物及び／又は薬物−リンカーは抗体のライシンを介して無作為に接合されるか、ジスルフィド結合鎖を還元したとき露出されるシステインを介して接合できる。場合によっては、遺伝工学的に製作されたタグには例えば、ペプチド又はタンパク質に存在するシステインを介してリンカー−薬物が結合することができる。前記ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端から結実（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有するか、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端にスペーサーユニットの共有結合を介して付加を有する。
【０１１４】
本発明において、用語“薬物”は、本発明の抗体に結合して治療抗体自体の効率を増加させたり、抗体の血中内の半減期を増加させる事もあったり、抗体が標的にする位置に到達して、前記標的内の癌などを死滅させて病気の治療に用いられる物質を無制限で含み、その例として、細胞毒性薬物、毒素、サイトカイン、ケモカイン、抗生物質、核酸分解酵素のような酵素、放射線核種、光感覚剤、光熱ナノ素材、ナノパーティクル及びミセルなどがあるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本発明において、前記薬物は、抗体に直接連結（結合）されることもあり、公知の手段により間接的に連結されることもある。また、抗体に結合する薬物は、前記薬物の特定担持形態（例えば、ミセル、ナノパーティクル、リポソーム、又はデンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）などに担持された形態等をすべて含む）でも適用可能である。
【０１１６】
前記の細胞毒性薬物は、病気の治療に用いられる薬物を意味し、一例では抗癌活性を有する薬物（抗癌剤）として、マイクロチューブリン（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）構造形成抑制剤、有糸分裂（ｍｅｉｏｓｉｓ）抑制剤、トポアイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）抑制剤又はＤＮＡインターカレータ（ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）がある。前記の細胞毒性薬物は、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）、ＣＣ−１０６５薬物（ＮＳＣ  ２９８２２３）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エンジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅｓ）、タキサン（ｔａｘａｎｅ）、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋａｌｏｉｄ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、窒素マスタード（メクロレタミン塩酸塩）［ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒ（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ＨＣＬ）］、シス−白金およびその同族体、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ＣＰＴ−１１、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、モノメチルアウリスタチンＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ）、モノメチルアウリスタチンF（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｆ）又はエムタンシン（ｅｍｔａｎｓｉｎｅ,  ＤＭ１）等を含むことができ、これに限定されない。
【０１１７】
本発明において、用語“毒素（ｔｏｘｉｎ）”は、生物体が作り出す毒性を有する薬物を意味し、その種類は特に限定されてはいないが、植物毒素、動物毒素、菌体外毒素又は細菌毒素などがある。
【０１１８】
本発明の抗体は、前述のようにクローディン３に対する結合特異性がかなり高いだけでなく、抗体自体がクローディン３に結合した後ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞毒性）による細胞毒性効果が著しいことが特徴である。それは本発明の明細書の一実施例によく示されている。したがって、本発明は本発明の前記抗体を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【０１１９】
また、本発明の前記抗体で構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明の前記抗体で必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【０１２０】
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）はＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）の癌細胞の死滅機構の一つとして知られた。ＮＫ細胞は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃに対する受容体のＣＤ１６を発現し、この受容体を介して他の形のＭＨＣ非制限性殺害を行うことができる。即ち、ＮＫ細胞のＡＤＣＣは標的細胞を認識する抗体の存在に依存するが、抗体が抗原と結合すると抗体のＦｃ部位が露出され、露出されたＦｃ部位がＮＫ細胞の受容体と結合して橋を形成すると、受容体結合によって発生するシグナル伝達によりＮＫ細胞から細胞傷害物質が放出されて、標的細胞が傷害を受ける。
【０１２１】
このように，本発明の抗体は，自らにも抗癌の効能を有するため、前記抗体を抗癌活性薬物を一緒に（特に、ＡＤＣの形に）提供する場合には著しいシナジー効果を示す。
【０１２２】
本発明は、また、前記抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。
【０１２３】
前記抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドは、前述したものと同様のCDR構成を有する抗体又はその断片を暗号化できる限り、塩基の組合せに特に限定されない。アミノ酸配列が明かされた場合、当業界に公知されたコドン情報に基づいて前記アミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドを製造する技術は、当業界に周知されている。前記ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列を全て含む短鎖又は二重鎖の形態の核酸分子として提供されることができる。
【０１２４】
また、本発明は、本発明による抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
【０１２５】
本発明において、“組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）”は“遺伝子操作（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）”と互換して用いられ、遺伝子に変形を加え、切って、繋ぐ等の分子的クローニング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ）実験技法を利用して自然の状態では存在しない形の遺伝子を製造することを意味する。
本発明において、“発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）”は細胞へのタンパク質又は核酸が生成されることを意味する。
【０１２６】
本発明において、“組換え発現ベクター”とは、適した宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）から目的とするタンパク質又は核酸（ＲＮＡ）を発現できるベクターとして、ポリヌクレオチド（遺伝子）インサートが発現できるよう作動可能に連結された重要な調節要素を含む遺伝子組換え体を意味する。“作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”とは、一般的機能を行うように、核酸発現調節配列と目的するタンパク質又はＲＮＡをコーディングする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ）されているもので、発現調節配列により遺伝子が発現されるよう連結されたことを意味する。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組換え技術を利用して製造することが可能なため、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野から一般に知られた酵素等を使用する。前記“発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”とは特定の宿主細胞から作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味する。そのような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適宜のｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、転写及び解読の終結を調節する配列、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサー等を含む。前記ベクターのプロモーターは、構成的又は誘導性であることもある。前記の作動可能に連結された遺伝子配列と発現調節配列はベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカー及び／又は複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を一緒に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれることもある。また、前記発現ベクターは必要により膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含んでおり、目的によって多様に製造することができる。
【０１２７】
シグナル配列には、宿主がエシェリキア属菌の場合には、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列等が、宿主がバチルス属菌の場合には、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列等が、宿主が酵母である場合には、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列等が、宿主が動物細胞の場合には、インスリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列等が用いられるが、これに限定されない。
【０１２８】
本発明の組換え発現ベクターは、クローニング分野において通常用いられるベクターであれば、種類は特に限らず、その例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクター等を含むが、それに限らない。前記プラスミドには、大腸菌由来プラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９、ｐＥＴ−２２ｂ（+））、バチラスサブティリス由来プラスミド（ｐＵＢ１１０及びｐＴＰ５）及び酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４  及びＹＣｐ５０）等があり、前記ウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスのような動物ウイルス、バキュロウイルスのような昆虫ウイルス等が用いられ、ｐｃＤＮＡ等が用いられる。
【０１２９】
本発明で前記組換えベクターは抗体の軽鎖又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドと；重鎖又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドを一つのベクターに同時に包含（挿入）させた形で提供可能なため、又は２つの（他の種類を含む）のベクターにそれぞれ包含（挿入）させて提供できる。
【０１３０】
また、本発明は本発明による抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに形質転換された細胞を提供する。
【０１３１】
本発明において、用語宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）は、任意の手段（例:電気衝撃法、カルシウムホスファターゼ沈殿法、微細注入法、形質転換法、ウイルス感染など）によって細胞内に導入された異種性ＤＮＡを含む原核又は真核細胞を意味する。
【０１３２】
本発明の（宿主）細胞は、本発明の組換え発現ベクターの含まれる抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチドを発現するに用いられる細胞であれば、その種類は特に限定されない。本発明による組換え発現ベクターで形質転換された細胞（宿主細胞）は、原核生物（例えば、大腸菌）、真核生物（例えば、酵母又は他の菌類）、植物細胞（例えば、タバコ又はトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター（ｈａｍｓｔｅｒ）細胞、ラット細胞（ｒａｔ  ｃｅｌｌ）、マウス細胞（ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ）、昆虫細胞又はそれらから由来するハイブリドーマでもある。望ましくはヒトを含む哺乳類から由来する細胞であることもある。
【０１３３】
より具体的一例として、原核生物はグラム陰性又はグラム陽性有機体、例えば、エンテロバクテリアセー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、イ・コーライ、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセスカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）と及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、及びバシリ（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば、ビ・ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びビ・リケニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えばピ・エルギノーザ（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む。本発明の細胞は、本発明のベクターを発現できるものであれば、特に限られることはないが、望ましくはイ・コーライ、それに限られないが、例えば、イ・コーライＥＲ２５３７、イ・コーライＢ、イ・コーライＸ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、イ・コーライＷ３１（ＡＴＣＣ２７，３２５）又はＬａｃＺが発現可能なイ・コーラである可能性があり、より望ましくは、イ・コーライＥＲ２５３７かもしれない。本発明の細胞として、真核生物はサッカロマイセス・セレビジアに（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が最もよく用いられる。しかし、多くの他の属、種及び菌株、それに限られないが、例えばシジョカロマイセスプムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス宿主、例えばケイ・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ケイ・プラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、ケイ・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、ケイ・ウィカラミ（Ｋ．ｉｃｋｅｒａｍｉｉ）  （ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、ケイ・ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、ケイ・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、ケイ・テルモレランス（（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びケイ・マルシアヌス（Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）;ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）;ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）;カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）;トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４））;ニューロスポラクラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）;シュバニッシュラウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばニューロスポラ、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ポリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスパジラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の宿主、例えばエー・ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びエイ・ニーガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が用いられる。
【０１３４】
一方、本発明の細胞は動物細胞、特に脊椎動物細胞であることもある。培養（組織培養）において脊椎動物細胞の増殖は、慣用的な方法であり、様々な技術が幅広く利用できる。これに限定されないが、有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１ライン（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚腎臓ライン（懸濁培養からサブクローニングされた２９３又は２９３細胞［Ｇｒａｈａｍ等、１９７
７、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９］）、子ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−  ＤＨＦＲ"（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ等、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６；例えば、ＤＧ４４）、マウスセルリー細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ．ｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカ緑のサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト頸部癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ等、１９８２、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝癌細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）−ＨＥＫ  ２９３  ｃｅｌｌ（ｈｕｍａｎｅｍ  ｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）及びＥｘｐｉ２９３ＦＴＭｃｅｌｌであり、望ましくにはＣＨＯ  Ｃｅｌｌ、ＨＥＫ２９３  ｃｅｌｌ（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）又はＥｘｐｉ２９３ＦＴＭｃｅｌｌであることもある。宿主細胞によってタンパク質の発現量や数式等が異なるため、当業者の目的に最も適した宿主細胞を選択して用いられる。本発明の一実施例では、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）−Ｓ細胞を用いたことがある。
【０１３５】
前記形質転換は、核酸（本発明の抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド）を有機体、細胞、組織又は器官に導入するどのような方法も含み、当分野で公知されたよう宿主細胞によって適した標準技術を選んで行うことができる。このような方法には、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、シリコン炭化物ウィスカー（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｃａｒｂｉｄｅｗｈｉｓｋｅｒｓ）、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、アグロバクテリア媒介の形質転換、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）による沈殿法、デキストランサルフェート、リポフェクタミン、熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）法、粒子総衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｎ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）等が含まれるが、それに限られない。
【０１３６】
前記の細胞には抗体の軽鎖又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドと；重鎖又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドを１つのベクターに同時に包含（挿入）させた形で提供された組換えベクターが導入可能なため、又は前記ポリヌクレオチドがそれぞれ２つ（他の種類を含む）のベクターに別々で包含（挿入）された形で提供された多数の組換えベクターを１つの細胞又は多数の細胞に導入できる。前記本発明による組換え発現ベクターで形質転換された細胞は本発明による抗体の重鎖、軽鎖又はその機能的断片を生産することになる。
【０１３７】
本発明はまた、
（ａ）前記形質転換された細胞を（ポリヌクレオチドが発現される条件下で）培養して軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階;及び
（ｂ）前記細胞又はそれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、クローディン３タンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の生産方法を提供する。
【０１３８】
前記（ａ）段階は、前記形質変換された宿主細胞（ハイブリドーマを含む）を培養し、宿主細胞に導入された組換え発現ベクターから本発明による抗体の重鎖、軽鎖又は抗体の機能的断片のポリペプチドが生産されるようにする段階である。前記宿主細胞を培養するための培地組成と培養条件、培養時間などは当業界で通常用いられる方法により適切に選ぶことができる。一例で、商業的利用ができる培地、例えばハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１０（Ｓ
ｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ０）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、及びダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）改質イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）が細胞を培養するのに適合するかもしれないが、これに限定されない。前記培地は必要であればホルモン及び／又は他の成長因子、塩、緩衝液、ヌクレオチド、抗生剤、微量元素及びグルコース又は同等のエネルギー源が追加できる。
【０１３９】
宿主細胞から生産される抗体分子は細胞の細胞質内に蓄積されるか、適切なシグナル配列により細胞の外部又は培養培地に分泌されるか、ペリプラズムなどで標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ）されるように可能なため、それは前述したことを参照にして理解される。
【０１４０】
また、本発明による抗体がクローディン３（特に、ＥＣＬ−２）に対する結合特異性を維持するよう当業界に公知されている方法を利用し、タンパク質リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）させて機能性構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有するようにすることが望ましい。また、ＩｇＧ形の抗体を生産する場合、重鎖と軽鎖は別の細胞から発現させて、別途の段階から重鎖と軽鎖を接触させ完全な抗体を構成するように製造することもでき、重鎖と軽鎖を同一の細胞から発現するようにして、細胞内部から完全な抗体を形成するようにすることもできる。
【０１４１】
前記（ｂ）段階は、宿主細胞から生産された抗体又はその断片を収得する段階である。宿主細胞から生産された抗体又はその機能的断片ポリペプチドの特性、宿主細胞の特性、発現方式又はポリペプチドの標的化の有無等を考慮し、通常の技術者は収得方法を適切に選択及び調節できる。例えば、培養培地から分泌された抗体又はその断片は宿主細胞を培養した培地を収得し、遠心分離して不純物を除去する等の方法で抗体を回収できる。必要により細胞内特定小器官や細胞質に存在する抗体を細胞外部に放出して回収するために抗体またはその機能的断片の機能的構造に影響を及ぼさない範囲で細胞を融解することもできる。また、収得した抗体はクロマトグラフィー、フィルター等によるろ過、透析などの方法により、不純物をさらに除去して濃縮する過程をさらに踏むことができる。
【０１４２】
本発明による薬学的組成物は、本発明の抗体とその機能的断片、又はこれらを全部含むＡＤＣを単独で含むか、1つ以上の薬学的に許容される担体と一緒に適した形態に製剤化されることができ、賦形剤又は希釈剤をさらに含有することができる。前記で“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常的に胃腸障害、目眩などのようなアレルギー反応又はそれと同様の反応を起こさない非毒性の組成物を意味する。
【０１４３】
薬学的に許容される担体では例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体をさらに含むことができる。経口投与用担体はラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアル酸等を含むことができる。併せて、ペプチド製剤に対する経口投与用に使われる様々な薬物伝達用物質を含むことができる。また、非経口投与用担体は水、適したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等を含むことができ、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適した安定化剤には亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又は適合する保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルー又はプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。
【０１４４】
本発明の薬学的組成物は前記の成分意外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤などをさらに含むことができる。それ以外の薬学的に許容される担体及び製剤は当業界から知られている全てのタイプのものを参考にできる。
【０１４５】
本発明の組成物はヒトを伴う哺乳動物にどのような方法にも投与することができる。例えば、経口又は非経口的に投与することができる。具体的に本発明の組成物の投与経路は公知された抗体投与方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内、皮下、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、又は病変内経路による注射又は注入、又は後記記載された徐放性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）システムによる注射又は注入の可能性があり、これに限定されない。一例で本発明の抗体は全身に又は局部的に投与できる。
【０１４６】
本発明の薬学的組成物は、前述のような投与経路に応じて経口投与用又は非経口投与用製剤として剤形化することができる。
【０１４７】
本発明による薬学的組成物において、前記の抗体、この機能的断片、又はそれらを含むＡＤＣは、臨床投与時に経口及び非経口の様々の剤形で投与できるが、製剤化する場合には普段使用する充電剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して製造できる。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも1つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）又はゼラチンなどを混ぜて調剤できる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤又はシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。
【０１４８】
非経口投与のための製剤は滅菌された水溶液、非水性水溶液、懸濁用剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。本発明の治療用組成物は任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と望ましい純度を有する抗体を混合し貯蔵するため凍結乾燥されたケーキ又は安定化剤は使用された投与量及び濃度から需要者に非毒性であり、緩衝溶液、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤;低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性重合体、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えばEDTA;糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール;塩−形成反対イオン、例えばナトリウム;と（又は）非イオン性界面活性剤、例えばツイン、フルロニクス又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
【０１４９】
非経口投与用製剤の場合には注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、エアロゾル及び鼻腔吸入剤の形に、当業界に公知された方法により剤形化できる。それら剤形は全ての製薬会社に一般に公知された処方所に記載されている。特定実施様態で、薬学的組成物は鼻腔内スプレー、吸入及び／又は他のエアロゾル（ａｅｒｏｓｏｌ）伝達ビークルにより伝達できる。遺伝子、ポリヌクレオチド及びペプチド組成物は鼻腔エアロゾルスプレーを通って肺に直接伝達するための方法は、例えばアメリカ特許第５，７５６，３５３号及びアメリカ特許５，８０４，２１２号に記載されたものを参照にできる。
【０１５０】
本発明の抗体又はその機能的断片の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）で投与されることもあり、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ）が長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与されることもある。それらのＡＤＣで提供される場合はまた投与容量を異にすることができる。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度及び／又は目的により有効成分（本発明の抗体又はその機能的断片）の含有量を異にすることができるが、通常には０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ−１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、望ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙから１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、さらに好ましくは１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙから２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの有効容量に一定の間隔で数回反復投与することができる。しかし前記の薬学的組成物の容量は製剤化方法、投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決まるものであるから、このような点を考慮するとき、当分野の通常の知識を有する者であれば、本発明の組成物の適切な有効投与量を決定できるはずである。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を示す限りその剤形、投与経路及び投与方法に特に限定されない。
【０１５１】
前記のように、本発明の抗体又はその機能的断片は前述の特有のCDR構成を有することでクローディン３標的に対する特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）がかなり優秀であることが特徴である。従って本発明の抗体又はその機能的断片は細胞、特に免疫細胞に対してクローディン３に対する標的能を付与するに利用可能である。
【０１５２】
したがって本発明は、前記本発明の抗体又はその機能的断片を含むＣＡＲ（キメラ抗原受容体;  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を提供する。
【０１５３】
具体的に、本発明は
ｉ）前述した本発明の抗体又はその機能的断片を含む細胞のドメイン;
ｉｉ）膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）;及び
ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎｌａｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を提供する。
【０１５４】
本発明で用語“ＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）”は、免疫効果機細胞（ｉｍｍｕｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）に特定抗原に対する特異性を与えられる、自然的存在しない受容体を意味する。普段、前記のＣＡＲは、Ｔ細胞に単クローン抗体の特異性を移植するため用いられる受容体を意味する。ＣＡＲは大概細胞外ドメイン（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、膜透過性ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｄｏｍａｉｎ）及び細胞内ドメイン（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）で構成される。
【０１５５】
前記（ｉ）細胞外ドメインは前述した本発明の抗体又はその機能的断片を含み、その抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）を含んでいる。ＣＡＲに使われる抗体は抗体断片の形であることが望ましく、より望ましくはＦａｂ又はｓｃＦｖの形もあるが、特にそれに制限されることではない。
【０１５６】
また、前記ＣＡＲの（ｉｉ）膜通過ドメインは細胞外ドメインと連結された形で、自然的又は合成されたものから由来したものでもある。自然に存在するものから由来した場合、膜結合又は膜透過性タンパク質から由来したものでもあって、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータチェーンＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４又はＣＤ８などの様々なタンパク質のまく透過性領域から由来した部分でもあって、これに限定されない。このような膜通過ドメインの配列は膜透過性タンパク質のまく透過性領域部分を公知している当業界かから公知された文献などから得られる。
【０１５７】
前記ＣＡＲから（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインは膜通過ドメインと連結された形として細胞内部に存在する。本発明の前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＡＲの抗原結
合部位（即ち、本発明の抗体又はその機能的断片）に抗原が結合すると１次的に細胞活性化をもたらすシグナルを発生又は／及び伝達する領域である。
【０１５８】
前記“細胞”は、その種類が特に限定されないが、望ましくは免疫細胞（免疫効果機細胞）の可能性がある。前期免疫細胞は当業界に身体の免疫機能に関与するものと知られている細胞であれば、その種類が特に限定されないが、例えばＴ細胞、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、ＮＫＴ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ）細胞、単球、マクロファージ又は樹状細胞などを含み、その前駆細胞も含まれている意味である。
【０１５９】
前記の“細胞活性化”とは、該当細胞が有している活性が増加することを意味することで、このような活性の種類は特に限定されないが、一例で細胞の免疫反応促進もある。特に、前記細胞が免疫細胞の場合、前記活性化とは細胞自体の免疫反応の促進作用だけでなく、免疫細胞の数が増えることを全て含む意味として理解できる。
【０１６０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外に位置する抗原結合部位（本発明の抗体又はその機能的断片）に抗原が結合した場合、細胞（特に、免疫細胞）活性化をもたらすシグナルを伝達できるものなら、特にその種類が限られない。様々な種類の細胞内シグナル伝達ドメインが用いられ、その例としては免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）又はＩＴＡＭであることができ、前記ＩＴＡＭはＣＤ３ゼータ（ξ、ｚｅｔａ）、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃεＲＩ（特に、γ）及びその組み合わせ（１個又は２個以上）に由来するものを含むことができるが、それらに限定されるものではない。
【０１６１】
また、本発明のＣＡＲ細胞の種類によって、細胞内シグナル伝達ドメインと共に共同刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌｔａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ）をさらに含むことが望ましいかもしれないが、これに限定されない。
【０１６２】
前記共同刺激ドメインは、本発明のＣＡＲに含まれ、細胞内シグナル伝達ドメインによる１次シグナルに加え、該当細胞（特に、免疫細胞）に最大活性化シグナルを伝達する役割を行う部分として、共同刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの細胞内部分を意味する。即ち、一部免疫細胞、例えばＴリンパ球及びＮＫ細胞は、最大活性化のため２つのシグナル、即ち１次活性化シグナル及び共同刺激シグナルが必要で、ＣＡＲはまた細胞外ドメインに対する抗原の結合が１次活性化シグナル及び共同刺激シグナル両方の転送を引き起こすため、任意に共同刺激ドメインを含むことができる。
【０１６３】
前記共同刺激分子は、細胞表面分子であって、抗原に対する免疫細胞の十分な反応をもたらすことに必要な分子を意味し、当業界に知られたものであれば、その種類が特に限られてはないが、例えばＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ＴＮＦ受容体タンパク質（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、免疫グロブリン−類似タンパク質（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、サイトカイン受容体（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）、ＳＬＡＭタンパク質（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ＮＫ細胞の活性化受容体（ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体（Ｔｏｌｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＩＬ２Ｒ  ｂｅｔａ、ＩＬ２Ｒ  ｇａｍｍａ、ＩＬ７Ｒ  ａｌｐｈａ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的結合するリガンド、ＰＤ−１およびその組み合わせからなる群から選択される可能性がある。前期共同刺激ドメインはこのような共同刺激分子及びその組合せ（1つ又は2つ以上）でできる群から選ばれた分子の細胞内部分でもある。
【０１６４】
前記共同刺激ドメインは、シグナル伝達ドメインのＮ−末端又はＣ−末端に繋ぐことができ、また複数でできているシグナル伝達ドメインの間に含まれることができる。
【０１６５】
前記ＣＡＲを成す各ドメインは、直接連結することが可能なため、また、選択的に、短いオリゴペプチド又はポリペプチドリンカーがＣＡＲの細胞内ドメイン及び膜透過性ドメインを連結することが可能なため、前記のリンカーは本発明のＣＡＲに含まれても、細胞外に位置する抗体に抗原が結合したときの細胞内ドメインを介してＴ細胞活性化を誘導できるリンカーなら、特にその長さに制限は無く、その例で、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、即ち、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）などを使用することができる。
【０１６６】
また、本発明は、前記のＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。前記ポリヌクレオチドは、本発明の抗体又はその機能的断片を含むＣＡＲタンパク質を暗号化する限りこの塩基の組合せに特に制限は無く、当業界に公知されたポリヌクレオチド合成技術により製作できる。また、前記ベクターは、ＣＡＲタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドを細胞内に伝達することに用いられる物質を意味することで、組換えベクターに関して、前述のことを参照する。
【０１６７】
また、本発明は、前記ＣＡＲタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターに形質転換された細胞を提供する。即ち、前記本発明が抗体又はその機能的断片を含むＣＡＲタンパク質が発現するよう変形された細胞（ＣＡＲー発現細胞）を提供する。
【０１６８】
前記細胞は、その種類に特に制限は無く、ＣＡＲを成すドメイン構成の由来に応じて、シグナル伝達に有利な細胞種類を使用することができる。本発明でＣＡＲタンパク質が発現するように変形される細胞は望ましくは、免疫細胞であり得る。前記免疫細胞は、当業界で身体の免疫機能に関与するものと知られている細胞であれば、その種類に特に限定はないが、例えばＴ細胞、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、ＮＫＴ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ）細胞、単核球、マクロファージ又は樹状細胞等を含み、その前駆細胞も含む意味である。最も望ましいのはＴ細胞でもある。
【０１６９】
本発明で用語“Ｔ細胞”は、胸腺から由来するリンパ球であって、細胞の免疫に主な役割
をするリンパ球を意味する。前記Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞（アシスタントＴ細胞、ＴＨ細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞毒性Ｔ細胞、ＣＴＬ）、記憶Ｔ細胞、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）自然殺害Ｔ細胞等あり、本発明でＣＡＲが導入されるＴ細胞は、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である可能性があるが、それに限定されない。
【０１７０】
一例で、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は癌の免疫治療に最も効果のある免疫細胞として評価されている。しかし、癌の免疫治療に使用する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離するため複雑な過程と長い期間が必要である。それに、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を早い時間内に大量生産するための方法の１つとして、キメリック抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ,  ＣＡＲ）−変形されたＴ細胞が考案された（Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥｎｇｌ  ＪＭｅｄ．２０１１；３６５：７２５−３３．）。これに限定されないが、一般的一例として、ＣＡＲは、特定抗原を認識する抗体のｓｃＦｖをＴ細胞活性化をもたらすシグナル伝達ドメイン、望ましくは共同刺激分子及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインと結合した形のタンパク質で、ＣＡＲを構成する抗体部分が、特定の抗原を認識した場合には、強力なＴ細胞増殖シグナル伝達を誘導し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に増殖させる原理を有している。こうして増殖された細胞は癌の免疫治療作用に寄与する。
【０１７１】
このように免疫細胞の治療剤として、前記本発明のＣＡＲが発現するように変形された免疫細胞は、正常細胞に比べ癌細胞に特異的に露出されたクローディン３（特に、ＥＣＬ−２領域）を特異的に認知して結合し、それに伴う免疫細胞活性化により癌細胞治療効果を有することができることを示す。従来は血液癌中心のＣＡＲ−変形免疫細胞治療剤技術が多数を占め、また従来のＣＡＲ基準の正常細胞にもターゲットされる可能性が高いことを考慮すると、本発明は、正常細胞に比べ固形癌のみを特異的にターゲットできて、副作用が少なく（特に、正常細胞に対する副作用）、固形癌に対する優れた治療効果を有することができる。したがって本発明は、前記本発明のＣＡＲ−発現細胞を有効成分として含む癌の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することができる。
【０１７２】
さらに、本発明者等は、前述した抗体のように、クローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の前述した薬物伝達の使用、ＡＤＣ、ＤＡＲ及びＣＡＲ−発現細胞（特に、免疫細胞）技術への適用を提供する。それは前述した内容を借用して理解される。
【０１７３】
本発明は、クローディン３検出用製剤、癌診断用製剤、癌映像化用製剤、癌細胞特異的薬物伝達用製剤を製造するための前記の抗体又はその機能的断片の使用を提供する。
【０１７４】
本発明は、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含むクローディン３の特異的検出方法、癌診断方法、癌映像化方法、癌細胞特異的薬物伝達方法を提供する。
【０１７５】
本発明は、癌の予防及び治療用製剤を製造するための前記抗体の使用又は前記抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体−薬物重合体の使用を提供する。
【０１７６】
本発明は、前記抗体を有効成分として含む組成物又は前記抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体−薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
【０１７７】
本発明は、細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の使用を提供する。
【０１７８】
本発明は、細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物を有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む細胞内薬物伝達方法を提供する。
【０１７９】
本発明は、癌の予防及び治療用製剤を製造するためのクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体−薬物重合体の使用を提供する。
【０１８０】
本発明はクローディン３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｐ，ＥＣＬ−２）に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体−薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
【０１８１】
本発明の前記の“有効量”とは、個体に投与した場合、癌の改善、治療、予防、検出、診断又は癌の抑制効果を示す量を言い、前記“個体”とは動物、望ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物の可能性があり、動物で由来した細胞、組織、器官の可能性がある。前記個体は、前記の効果が必要な患者（ｐａｔｉｅｎｔ）の可能性もある。
【０１８２】
本発明の前記“治療”は、癌又は癌の症状を改善することを包括的に指し、それはこのような疾患を治癒したり、実質に予防したり、又は状態を改善させることを含むこともあり、癌から始まった一つの症状又は殆どの症状を緩和させたり、治癒したり予防することを含むが、それに制限されるのではない。
【０１８３】
本発明の用語“〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”とは、“含有する”又は“特徴とする”と同じく使われ、組成物又は方法において、言及されない追加的な成分要素又は方法段階等を排除しない。用語“〜で構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）”とは他に記載されてない追加的要素、段階又は成分等を除外することを意味する。用語“必須的に構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）”とは、組成物又は方法の範囲において、記載された成分要素又は段階と共に、その基本的特性に実質的に影響を及ぼさない成分要素又は段階等を含むことを意味する。
【発明の効果】
【０１８４】
クローディン３のＥＣＬ−２に特異的に結合する抗体及びその機能的断片は、他の癌抗原又はクローディン３のＥＣＬ−１を標的にする従来の抗体より癌細胞検出、診断、映像化、がん治療への適用（ＡＤＣ及びＣＡＲ−発現細胞（特に、免疫細胞）への適用）などにおいて価値が大きい。時にこのような具体的一例として、本発明で提供する特有のＣＤＲ配列を含む抗体は、自ら抗癌能力を有するだけではなく、他のクローディンファミリーと交差反応性の無き、優れた癌細胞標的能力を示し、従来公知のクローディン３抗体と比較して非常に優れた結合力（親和度）を示し、細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）などの特性を有して前記使用への適用において著しい効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１は、ＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞株のバイオパニングとＬ−クローディン３細胞株ＥＬＩＳＡを利用して選別されたｓｃＦｖのに対し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、対照群）の結合をフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）した結果である。
【図２】図２は、ＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞株のバイオパニングとL−クローディン３細胞株ＥＬＩＳＡを利用して選別されたｓｃＦｖのに対し、ＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞の結合をフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）した結果である。
【図３】図３は、それぞれ還元（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件および非還元（ｎｏｎ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件で生産された４Ｇ３  ＩｇＧ抗体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の結果として、各抗体の軽鎖と重鎖が予想される分子量で、すべてが上手く発現されていることを確認した。
【図４ａ】図４ａは、クローディンファミリーの系統解析柔軟関係を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、ＣＬＤＮ３と系統解析に近く、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ８、ＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ１７とＣＬＤＮ１とマウスＣＬＤＮ３の細胞外第一ループ（ＥＬ１、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ１ｓｔ  ｌｏｏｐ）と細胞外第二ループ（ＥＬ２、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ２ｎｄ  ｌｏｏｐ）領域の配列相同性を示す。
【図５ａ】、
【図５ｂ】図５ａ及び図５ｂは、それぞれのヒトクローディンファミリータンパク質（ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ８、ＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ１７）を発現するように形質転換されたHEK293細胞に、本発明の４Ｇ３抗体を処理してフローサイトメトリー分析し、CLDN3発現細胞の特異的結合能力を確認した結果を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、マウスＣＬＤＮ３を発現するように形質転換されたＨＥＫ２９３細胞に、本発明の４Ｇ３抗体を処理してフローサイトメトリー分析し、ＣＬＤＮ３発現細胞に対する結合能力を確認した結果を示す。
【図６】図６は、卵巣癌としてクローディン３を過剰発現する細胞株であるＯＶＣＡＲ−３及びＣａｏｖ−３と、クローディン３発現が極めて低い細胞株であるＴＯＶ−１１２Ｄ、ここにＣＬＤＮ３を過剰発現するように形質転換させたｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞に本発明の４Ｇ３抗体を処理してフローサイトメトリー分析して、４Ｇ３抗体の結合特異性比較的に確認した結果を示す。
【図７】図７は、ＯＶＣＡＲ−３、Ｃａｏｖ−３、ＴＯＶ−１１２ＤとｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞に対して、本発明の４Ｇ３抗体を用いて免疫沈降（Ｉｍｍｕｍｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）分析を行った結果を示す（ｉｎｐｕｔ：細胞溶解物）。
【図８ａ】図８ａは、ＯＶＣＡＲ−３、Ｃａｏｖ−３、ＴＯＶ−１１２ＤとｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞に対して対照抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ）を用いて免疫蛍光染色した結果を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、ＯＶＣＡＲ−３、Ｃａｏｖ−３、ＴＯＶ−１１２ＤとｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞に対して４Ｇ３抗体を用いて免疫蛍光染色した結果を示す。
【図９ａ】図９ａは、本発明の抗体（４Ｇ３  ＩｇＧ）のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、対照群）に対する結合をフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）した結果である。
【図９ｂ】図９ｂは、本発明の抗体（４Ｇ３  ＩｇＧ）のＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、対照群）の結合をフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）した結果である。
【図９ｃ】図９ｃは、ＣＬＤＮ３発現細胞（ｈＣＬＤＮ３／ＨＥＫ２９３とｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ）で本発明の抗体（４Ｇ３  ＩｇＧ）の結合親和性（解離定数（ＫＤ））をＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ）で測定した結果である。
【図１０ａ】図１０ａは、細胞外第一ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ１ｓｔ  ｌｏｏｐ、ＥＬ１）としてＣＬＤＮ１のアミノ酸１〜１０４番の領域と細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａ２ｎｄ  ｌｏｏｐ、ＥＬ２）としてＣＬＤＮ３のアミノ酸１０４〜２２０回の領域を含む融合タンパク質を発現する細胞（ｈＣＬＤＮ１−３／ＨＥＫ２９３）と、ＥＬ１としてＣＬＤＮ３のアミノ酸１〜１０３番の領域とＥＬ２としてＣＬＤＮ１のアミノ酸１０５〜２１１回の領域を含む融合タンパク質を発現する細胞（ｈＣＬＤＮ３−１／ＨＥＫ２９３）で、各融合タンパク質の発現（構造）面の模式図である。
【図１０ｂ】図１０ｂは、ｈＣＬＤＮ１−３／ＨＥＫ２９３又はｈＣＬＤＮ３−１／ＨＥＫ２９３細胞に対して４Ｇ３抗体を処理し、フローサイトメトリー分析した結果と（上部）、前記細胞から目的とする融合タンパク質が正常に発現されたことを確認したウェスタンブロティングの結果を示す（下段）。
【図１１ａ】図１１ａは、本発明の抗体がクローディン３に結合した後、細胞内にエンドサイトシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）されて入ることを卵巣癌細胞株であるＯＶＣＡＲ−３およびＣａｏｖ−３に対して免疫蛍光染色法を利用して、時間の経過に応じて観察した結果を示す。
【図１１ｂ】図１１ｂは、本発明の抗体特有の内在化の効果を、従来クローディン３に付着することで知られている他の抗体（ＫＭ３９０７）とは対照的に示している。
【図１２ａ】、
【図１２ｂ】、
【図１２ｃ】、
【図１２ｄ】、
【図１２ｅ】図１２ａ乃至１２ｅは、様々な癌細胞へのクローディン３発現程度を、本発明の４Ｇ３抗体を処理してフローサイトメトリー分析して、比較的に確認した結果を示す。
【図１３ａ】、
【図１３ｂ】、
【図１３ｃ】、
【図１３ｄ】、
【図１３ｅ】図１３ａ乃至１３ｅは、前記細胞の4G3抗体処理による抗体依存性細胞毒性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）の効果を濃度依存的に確認した結果を示す。
【図１４ａ】図１４ａは、腫瘍異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）動物モデルで本発明４Ｇ３抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍標的能を確認した結果を示し、
【図１４ｂ】図１４ｂは、前記動物モデルで臓器摘出後の蛍光強度を定量化した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１８６】
以下、本発明を詳細に説明する。
但し、後記実施例は、本発明を例示するのみ、本発明の内容が後記実施例に限定するものではない。
【０１８７】
実施例1:クローディン３（ＣＬＤＮ３）に特異的に結合するＳｃＦｖスクリーニング。
１−１．抗原
抗原としてクローディン３はスクリーニングの過程で、それぞれクローディン３発現細胞株とクローディン３リポパーティクル（ｌｉｐｏｐａｒｔｉｃｌｅ）の形で提供された。クローディン３（ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｎｕｍｂｅｒ_Ｏ１５５５１（配列番号1参照））の発現細胞株を作るためにCHO−K1細胞株を用いた。クローディン３発現ベクターを製作するためにｐｃＤＮＡ３．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨ１を用いてクローディン３遺伝子を挿入した。製作したクローディン３発現ベクターをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の後、４００μｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ｇ４１８）を処理して形質転換体を選別した。前記クローディン３を表面に露出しているリポパーティクル（以下、クローディン３リポパーティクルに称する）は、インテグラルモレキュラ（Ｉｎｔｅｇｒａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．  ＲＲ−０７３３Ａ）から購入して使用した。
【０１８８】
１−２．ｓｃＦｖ  ｐｈａｇｅ選別
クローディン３に特異的に結合する抗体をスクリーニングするために、ファージディスプ
レイ法（ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｄｉｓｐｌａｙ）を用いた。ライブラリは、合成したヒトｓｃＦｖライブラリを使用しており、ライブラリの具体的な情報は、Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｕｍａｎ  ｓｃＦｖ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｎ−Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＣＤＲ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｉ  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．，１０（１０）：ｅ０１４１０４５（２０１５））に示される。ｓｃＦｖライブラリで発現するｓｃＦｖは、ＨＡ  ｔａｇをタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）してａｎｔｉ−ＨＡ  ＦＩＴＣ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ａ０１６２１）によって検出することができるようにした。前記ｓｃＦｖライブラリを使用して、次のようにバイオパニング（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を行った。
【０１８９】
先ず、前記実施例１−１から製造したクローディン３発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（以下、ＣＨＯ−ＣＬＤＮ３と称する）を利用してパイオパニングを実施した。ｓｃＦｖライブラリストックを３％ＦＢＳ／ＰＢＳで常温でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を進行した。Ｔｒｙｐｓｉｎを利用しそれぞれ１×１０７個ずつ、ＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を用意する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を前記ブロッキングされているライブラリのストックと混合して、室温で１時間ディプリーション（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を進行する。ディプリーションが終わった後、遠心分離して得た上澄み液を抗原であるＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞と混合して、室温で１時間反応させる。遠心分離して得られた細胞ペレットを３％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した後、特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージのみ溶出されるように、１００ｍＭ  ＴＥＡ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）で、室温で５分間反応させ、ｐＨ８．５  Ｔｒｉｓで中和反応を経てｓｃＦｖ−抗原コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の形で準備した。用意されたｓｃＦｖ−抗原コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞に添加して感染させた後、ＬＢ／アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）／グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）アガ培地で３７℃で一晩培養した。前記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞をSB  ／アンピシリン培地に移動ＯＤ６００値が０．５になるまで培養した後、１×１０１１〜１×１０１２のヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を添加し、再度１時間、３７℃で培養した後、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加して再度一晩培養した。前記一晩培養した培養液を遠心分離し、上澄み液をＰＥＧ溶液と４℃で反応させた後、再び遠心分離してペレットを分離した。ペレットをＰＢＳに溶かした後、それを遠心分離して得た上澄み液をｓｃＦｖライブラリ溶液に確保した。このような過程を４回繰り返してクローディン３の抗原と特異的結合をするｓｃＦｖ候補群を確保した。
【０１９０】
２番目の方法としてリポパーティクルを利用してバイオパニングを進行させた。
ｓｃＦｖライブラリストックをリポパーティクルｎｕｌｌ（クローディン３を含まないリポパーティクル）と混合し、４％脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）で室温で1時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）とディプリーション（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を同時に行った。免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）にクローディン３リポパーティクルを含むＰＢＳ
１ｍｌを入れて、４℃で１６時間反応させて、チューブの内側表面にコーティングした。抗原溶液に沿って１回洗浄してコーティングされていない抗原を除去した。前記免疫チューブにコーティングしておいた抗原（クローディン３リポパーティクル）を４％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）で室温で１時間ブロッキングを行った。ブロッキングの後、スキムミルクを除去し、ｓｃＦｖライブラリストックと混合して、室温で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージのみ溶出されるように、１００ｍＭ  ＴＥＡに、室温で５分間反応させｐＨ  ８．５  Ｔｒｉｓで中和反応を経てｓｃＦｖ−抗原コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の形で準備した。用意されたｓｃＦｖ−抗原コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞に添加して感染させた後、ＬＢ／アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）／グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）アガ培地で３７℃で一晩培養した。前記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞をSB／アンピシリン培地に移動ＯＤ６００値が０．５になるまで培養した後、１×１０１１〜１×１０１２のヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を添加し、再度1時間、37℃で培養した後、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加して再度一晩培養した。前記一晩培養した培養液を遠心分離し、上澄み液をＰＥＧ溶液と４℃で反応させた後、再び遠心分離してペレットを分離した。ペレットをＰＢＳに溶かした後、それを遠心分離して上澄み液をｓｃＦｖライブラリ溶液に確保した。このような過程を４回繰り返してクローディン３の抗原と特異的結合をするscFv候補群を確保した。
【０１９１】
１−３．クローディン３（ＣＬＤＮ３）に特異的に結合するｓｃＦｖ抗体選別
実施例１−２で確保されたｓｃＦｖ候補群から結合力に優れたｓｃＦｖを選別するために、クローディン３発現細胞株に対してＥＬＩＳＡ分析を行った。クローディン３発現細胞株（以下、Ｌ−クローディン３細胞と称する）は、Ｌ  ｃｅｌｌに前記実施例１−１で作製したクローディン３発現ベクターをトランスフェクションした後、６００μｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，ｇ４１８）を処理して形質転換体を選別して使用した。前記実施例１−２の各段階のパニングが終わったライブラリストックそれぞれ（クローディン３発現細胞株またはクローディン３リポパーティクルを用いたスクリーニング結果に別に利用）をＳＢ／アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）／グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）アガ培地で一晩培養した後、それぞれの単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙ）をＳＢ／アンピシリン培地200μｌに接種して３７℃で３時間培養した後、ＩＰＴＧ濃度が１ｍＭになるように混ぜてから、再び３０℃で一晩培養した。培養が終わったら、培養液を遠心分離して細胞のみを分離した後、ＴＥＳバッファーを用いて細胞を溶解させてｓｃＦｖを確保した。確保したｓｃＦｖをL−クローディン３細胞が１×１０５ずつ分注したプレートに処理して、室温で1時間反応させた後、二次抗体（ａｎｔｉ−ＨＡ  ＨＲＰ，ｓａｎｔａｃｒｕｚ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−７３９２）を添加して４０分間反応させた。二次抗体反応が完了したら、ＴＭＢを添加して発色反応をさせてＥＬＩＳＡリーダー（４５０ｎｍ）を用いて分析した。ＥＬＩＳＡ分析値を相対的に比較して、上位２３個の優れたｓｃＦｖを１次的に選別した（１Ｃ４，１Ｆ１１，２Ａ１２，２Ｂ４，２Ｅ５，２Ｅ１２，２Ｆ８，３Ａ２，３Ｈ８，４Ａ２，４Ａ３，４Ｂ７，４Ｂ１０，４Ｄ７，３Ｄ２，３Ｄ７，３Ｆ１１，４Ａ８，４Ａ９，４Ａ１２，４Ｅ４，４Ｇ３，４Ｇ７）。
【０１９２】
前記ＥＬＩＳＡを通って選別したｓｃＦｖ候補に対し、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞との結合するかどうかを確認した。対照群に本来のＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた。継代培養中の細胞をｔｒｙｐｓｉｎを利用して、単一の細胞単位で分離して、３％ＦＢＳ／ＰＢＳで準備した。前記選別されたｓｃＦｖ候補をＳＢ／アンピシリン培地5mlに接種して３７℃で３時間培養した後、ＩＰＴＧ濃度が１ｍＭになるように混ぜた後、再び３０℃で一晩培養した。培養が完了したら、培養液を遠心分離して細胞のみを分離した後、ＴＥＳバッファーを用いて細胞を溶解させてｓｃＦｖを確保した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、対照群）とＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞（実験群）を、各グループ毎にそれぞれ２×１０５細胞ずつ入るように３％ＦＢＳ／ＰＢＳで準備した後、前記確保されたscFvを処理して、室温で1時間反応した。反応が完了すると、３％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した後、ａｎｔｉ−ＨＡ  ｔａｑ  ＦＩＴＣ抗体を１：１００に希釈（３％ＦＢＳ／ＰＢＳ  １００μｌで希釈）して１００ｕｌを処理し、室温で１時間反応した。反応完了後洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで分析した。この時、商業的に販売されているａｎｔｉ−ＣＬＤＮ３（ＦＡＢ４６２０Ｆ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を比較群として使用した。対照群（図１参照）に比べて実験群（図２参照）のみのピークの移動が起こるｓｃＦｖ候補群を選別した（２Ｂ４，４Ａ２，４Ｂ７，４Ｂ１０，４Ｄ７，４Ａ８，４Ａ９，４Ａ１２，４Ｅ４，４Ｇ３，４Ｇ７）。
【０１９３】
次に、クローディン３リポパーティクルを用いた最終的なバイオパニング結果（データ未
図示）と、前期の実験段階で選別されたｓｃＦｖ候補群の結果を比較した。選別されたｓｃＦｖについてシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実行し、クローディン３リポパーティクルとクローディン３発現細胞株の（ＣＨＯ―ＣＬＤＮ３細胞株及び／又はＬ−クローディン３細胞株）の実験では、２つの２Ｂ４と４Ｇ３クローンを確保した。２Ｂ４、４Ｇ３  ｓｃＦｖのアミノ酸配列を分析した結果は、後記の表1の通りである。
【０１９４】
【表１】
2021518758.tif 000003
【０１９５】
実施例２：４Ｇ３  ｓｃＦｖ抗体のＩｇＧへの転換及び発現
【０１９６】
２−１．全体ＩｇＧ発現ベクター製作
先に選別された４Ｇ３  ｓｃＦｖをより通常的に使用される抗体のＩｇＧの形に変換させた。前記ｓｃＦｖのＣＤＲ部位を基盤に全体ＩｇＧ形を発現できる発現ベクターを製作した。先ず、ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）と重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）をそれぞれＰＣＲを介して収得し、そのとき４Ｇ３においては後記の表２に図示されたプライマーを使用した。前記軽鎖可変領域配列は軽鎖不変領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）配列が挿入されている発現ベクターのｐＯｐｔｉＶｅｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、前期重鎖可変領域配列は重鎖不変領域（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）が挿入されている発現ベクターのｐｃＤＮＡ  3．3（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にそれぞれクローニングした。ベクターからクローニングしたｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と一緒に軽鎖及び重鎖不変領域が発現され、結果には前記ｓｃＦｖのＣＤＲ領域を含む全体ＩｇＧ抗体が作られる。
【０１９７】
【表２】
2021518758.tif 000004
【０１９８】
２−２．全体ＩｇＧ抗体発現ＣＨＯ−Ｓ細胞株製作（ｐｏｏｌ）
ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を利用し、それぞれ４Ｇ３  １ｇＧ抗体発現細胞株を製作した。前記実施例2−1から収得した重鎖及び軽鎖をコーディングする遺伝子配列に対してＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ種でコドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）し、それら配列をＦｒｅｅｄｏｍ(R)ｐＣＨＯ１．０Ｖｅｃｔｏｒでクローニングした後、トランスフェクション試薬（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTMＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）でＣＨＯ−Ｓ細胞に形質導入した。形質導入後の抗体発現細胞株を選別するために、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）とＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を利用して、2段階を経て選別した。具体的には、１次選別では、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  １０ｕｇ／ｍｌの、ＭＴＸ  １００ｎＭまたはｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ２０ｕｇ／ｍｌの、ＭＴＸ  ２００ｎＭで進行し、細胞生存率が基準内に入ってくると、２次処理を行った。２次選別では、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ３０ｕｇ／ｍｌの、ＭＴＸ  ５００ｎＭまたはｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ５０ｕｇ／ｍｌの、ＭＴＸ１０００ｎＭで進行して最終的な細胞生存率の基準に入ってきたとき、２次選別を終了してＳＦＢ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｆｅｄ  Ｂａｔｃｈ）を介して発現量が高い群を選択した。
【０１９９】
２−３．全体IgG抗体生産及び精製
前記２−２から製造されたそれぞれの抗体生産細胞株をＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯTM培地からＣＯ２  ８％，３７℃，１００~１２０ｒｐｍ条件で、ｇｌｕｃｏｓｅを３日、５日、７日目にそれぞれ４ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌずつ入れながら１４日目に培養した。培養完了後、培養液をｕｌｔｒａ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ６０００ｇで遠心分離し、この上澄み液を０．２ｕｍ  ｆｉｌｔｅｒを用いてフィルタした。精製のためにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａレジン（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、１１−００２６−０１  ＡＤ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、平衡バッファー（２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）、洗浄バッファー（３５ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）、溶出バッファー（０．１Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ３．６）を使用した。ＡＫＴＡTMａｖａｎｔを利用して、平衡バッファーは、カラム体積の２倍、洗浄バッファはカラム体積の５倍、溶出バッファーはカラム体積の５倍にして精製し、溶出時中和反応のためにｐＨ８．０  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を１／５ずつ入れた。ろ過膜（ＣｅｌｌｕＳｅｐ、１４３０−４５）を使用して、ＰＢＳで２回バッファの切り替え後、遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、ＵＦＣ９０５０２４、Ｍｅｒｃｋ）で濃縮した。
【０２００】
それぞれ還元（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件および非還元（ｎｏｎｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件で生産されたＩｇＧ抗体タンパク質を通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ技法で確認して、各抗体の軽鎖と重鎖が予想される分子量で、すべてが上手く発現されていることを確認した。図３は、４Ｇ３  ＩｇＧ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ確認結果を表す。
【０２０１】
実施例３:本発明抗体のクローディン３に対する結合特異性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び結合力評価
３−１．様々なクローディンに対するＣＬＤＮ／ＨＥＫ２９３細胞株製作
前記実施例２−３から製作された抗体の抗原特異性を確認するために、ヒトＣＬＤＮ３と系統分析的に近く位置したクローディン、特にヒトＣＬＤＮ４（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ：  Ｏ１４４９３），ＣＬＤＮ５（Ｏ００５０１），ＣＬＤＮ６（Ｐ５６７４７），ＣＬＤＮ８（Ｐ５６７４８），ＣＬＤＮ９（Ｏ９５４８４），ＣＬＤＮ１７（Ｐ５６７５０）に対する結合有無を比較評価した。（図４ａ又は図４ｂ参照）。又、前期のクローディン種類よりは系統分析的に距離があるが、典型的なクローディンのＣＬＤＮ１（Ｏ９５８３２）が本事件に比較群に使用された。又、開発された抗体がマウスＣＬＤＮ３（Ｑ９Ｚ０Ｇ９）にも結合するか調べてみた（４ｂを参照）。前述したクローディンをコーディングする遺伝子のそれぞれをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしている。このように製作された、それぞれのクローディン発現ベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｅ２３１Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ）トランスクション試薬を用いてＨＥＫ２９３（ＫＣＬＢ）に形質導入した後、Ｇ４１８で耐性細胞株を選別した。このように製作されたヒトクローディンを持続発現する細胞株（ｈＣＬＤＮ／ＨＥＫ２９３）らに対し、各クローディンがよく発現されているかどうかの確認は、商業的に販売されているａｎｔｉ−ＣＬＤＮ１（ＦＡＢ４６１８Ｇ、Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ３（ＦＡＢ４６２０Ｆ、Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ４（ＦＡＢ４２１９Ｆ、Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ５（ａｂ１３１２５９、Ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ６（ＡＢＩＮ１７２０９１６、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ）、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ８（ＭＡＢ５２７５、Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ９（ａｂ１８７１１６、Ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ１７（ＭＡＢ４６１９、Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を用いて確認した。
【０２０２】
３−２．ＣＬＤＮ／ＨＥＫ２９３細胞株に対する本発明の抗体の交差反応性の評価
実施例３−１で製作された複数のクローディンのｈＣＬＤＮｓ／ＨＥＫ２９３細胞株とｍＣＬＤＮ３／ＨＥＫ２９３者に対し、前記実施例２−３で製造された抗体の交差反応性を確認した。陰性対照群には、本来のＨＥＫ２９３細胞を使用した。まず、細胞分離バッファ（ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｇｉｂｃｏ、１３１５１−０１４）を用いて、単一の細胞に分離した後、２．５×１０５個ずつ分注（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、ここで、それぞれの抗体５ｕｇ／ｍｌを入れ、１時間の間に氷の上で反応させた。反応後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、二次抗体であるｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１０９−０９５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：１００で処理して、1時間の間氷の上で反応させた。反応後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーとしてＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して分析した。
【０２０３】
図５ａ及び図５ｂは、前記フローサイトメトリー分析の結果として、４Ｇ３抗体のクローディン３の結合特異性を比較的に示す。ＣＬＤＮ３と系統解析学的に近いＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ８、ＣＬＤＮ９とＣＬＤＮ１７を利用したどの実験群でもピークの移動が見られなかった。マウスＣＬＤＮ３を用いた実験の結果を図５ｃに示し、本発明の抗体は、マウス、ヒトＣＬＤＮ３と相同性が高いマウスＣＬＤＮ３とも結合することを確認した。
【０２０４】
それで本発明の各抗体は、ヒトＣＬＤＮ３およびマウスＣＬＤＮ３以外のクローディンファミリとは結合しないことを確認した。すなわち、本発明の各抗体は、相同性が高い他のクローディン種類とは交差反応せず、ＣＬＤＮ３のみ特異的に結合する。
【０２０５】
３−３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ癌細胞の検出能力を確認＿フローサイトメトリー分析
前記実施例２−３で製造された抗体の癌細胞に対する結合力を確認した。卵巣癌としてクローディン３を過剰発現する細胞株であるＯＶＣＡＲ−3（ＡＴＣＣ）とＣａｏｖ−３（ＡＴＣＣ）と、クローディン３発現が極めて低い細胞株であるＴＯＶ−１１２Ｄ（ＡＴＣＣ）、ここＣＬＤＮ３を過剰発現するように形質転換させたｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞を用いた。ｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞の作製は、前記実施例３−１に記載されたのと同じ方法で行われた。前記細胞に対する抗体処理とフローサイトメトリー分析は、実施例３−２と同様の方法で行われた。
【０２０６】
実験の結果、クローディン３発現細胞であるＯＶＣＡＲ−３、Ｃａｏｖ−３、ｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄは、ピークの移動が確認され、陰性細胞株であるＴＯＶ−１１２Ｄは、ピークの移動が見られなかった。代表的にも図６は、前記癌細胞に対する４Ｇ３抗体の結合特異性を比較的に示す。
【０２０７】
３−４．クローディン３特異的結合再確認_免疫沈降（Ｉｍｍｕｍｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）
免疫沈降法により、本発明の抗体が前記癌細胞でクローディン３に結合することを再確認した。抗体陰性対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ）としては、商業的に売るヒト全体抗体（００９−０００−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ）、Ｃａｏｖ−３（ＡＴＣＣ）、ＴＯＶ−１１２Ｄ（ＡＴＣＣ）、ｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄの各細胞をｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１１６９７４９８００１、Ｒｏｃｈｅ）が添加されたＰＢＳで解放した後、超音波破砕機で２秒ｏｎ／５秒ｏｆｆを１０回行った後、１５０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心分離して上澄み液を取った。ＢＣＡ定量法では、各細胞溶解物（上澄み液）のタンパク質濃度を測定した後、１ｍｇずつタンパク質をとり、それぞれの抗体１ｕｇを入れて４℃で１時間回転しながら反応させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｅａｄ（１１７１９４０８００１、Ｒｏｃｈｅ）をＰＢＳで平衡化させて、５％ＢＳＡ／ＰＢＳで前記ビーズ（ｂｅａｄ）を４℃で１時間回転しながらブロッキングした。前記抗体反応が終了したサンプルにビーズを５０ｕｌ入れて、再び４℃で１時間の間に回転しながら反応させた。抗体とビーズの反応が終わると、ＰＢＳで３回洗浄した後、２Ｘ  ＳＤＳ  ｌｏａｄｉｎｇバッファ３０ｕｌを入れて、１００℃で１０分間煮沸、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して異議上澄み液を１５％ＳＤＳ  ｇｅｌ電気泳動した。通常の方法でウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行っており、この時、一次抗体としては、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ３（３４１７００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０２０８】
分析の結果、ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ処理群では、バンドが示されず、本発明の抗体は、ＯＶＣＡＲ−3、Ｃａｏｖ−３およびｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞を用いた実験群へのみバンドが観察された。図７は、４Ｇ３抗体の前記細胞が発現するクローディン３の結合程度を示す。それにより、本発明の各抗体が癌細胞のクローディン３タンパク質に結合することを再確認した。
【０２０９】
３−５．クローディン３特異的結合再確認_免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
免疫蛍光法により、本発明の抗体が前記癌細胞でクローディン３を特異的に標的すること
を再確認した。ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ）、Ｃａｏｖ−３（ＡＴＣＣ）、ＴＯＶ−１１２Ｄ（ＡＴＣＣ）、ｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄの各細胞を４  ｗｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｌｉｄｅに２×１０５個ずつ入れて２４時間培養した。培養液に対照群の抗体（ＣｈｒｏｍｅＰｕｒｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、００９−０００−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｏｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）または本発明の抗体を５ｕｇ／ｕｌになるように入れ、４℃で１時間攪拌して反応させた。ＰＢＳで洗浄後、４％の細胞をホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定した。  ＰＢＳ洗浄後、５％ＢＳＡ／ＰＢＳで、室温で1時間ブロッキングした。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体としてｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１０９−０９５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：１００になるように入れ、常温で1時間反応した。ＰＢＳで洗浄後、核染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｈ３５７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：５０００になるように入れて、１０分間、室温で反応させ、その後、ＰＢＳで２回以上洗浄した。ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＴＭＡｑｕｅｏｕｓ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｆ４６８０、ＳＩＧＭＡ）でマウントした後、カバースライドを伏せてからコンフォーカル顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｉｎｃ．）で蛍光を観察した。
【０２１０】
分析の結果、対照群の抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ）処理群では、すべての細胞株で蛍光が観察されていないのに対し（図８ａ参照）、本発明の抗体処理群では、ＣＬＤＮ３発現細胞株であるｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶＣＡＲ−３、Ｃａｏｖ−３の細胞表面への蛍光の全て観察されたＣＬＤＮ３発現がないＴＯＶ−１１２Ｄ細胞株では、蛍光が観察されなかった。図８ｂは代表的に４Ｇ３抗体の前記実験の結果を示す。
【０２１１】
３−６．クローディン３の結合力の比較と結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を確認
前記実施例２−３で製造された４Ｇ３  ＩｇＧ抗体について、そのクローディン３の結合力を確認した。ＣＨＯ−ＣＬＤＮ３細胞を用いてフローサイトメトリー分析を実施し、具体的な実験方法は、前記実施例１−３と同様に行われた。対照群では、本来のＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いており、商業的に販売されているａｎｔｉ−ＣＬＤＮ３（ＦＡＢ４６２０Ｆ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を比較群として使用した。
【０２１２】
また、クローディン３に対する抗体の結合親和性を確認するためにＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ）を使用して測定した。ＬｉｇｎａｄＴｒｃｅｒ
Ｇｒｅｅｎ（ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ）は抗原を発現する細胞上でＦＩＴＣが接合された抗体の抗原に対する結合するかどうかをリアルタイムで測定することができる細胞ベースの測定装置である。開発した抗体にＦＩＴＣ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（５３０２７、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＦＩＴＣを接合した。一日前ｂｌａｎｋとして５％ミルク／ＰＢＳ  ５００ｕｌ、クローディン３発現が極めて低い基準細胞株、ＣＬＤＮ３過剰発現させた細胞株を３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で５００ｕｌを１００ｍｍ培養皿（１７２９３１、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）４象限にコインサイズで入れて５％ＣＯ２、３７℃で６時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、再び培地１０ｍｌを入れて一晩培養した。リファレンス細胞株としてＨＥＫ２９３（ＫＣＬＢ）とＴＯＶ−１１２Ｄ（ＡＴＣＣ）を使用し、ＣＬＤＮ３過剰発現細胞株としてｈＣＬＤＮ３／ＨＥＫ２９３とｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄを使用した。実験当日培地をすべて削除し、３ｍｌ培地に交換した後、培養皿を装備に装着して安定化した後ＦＩＴＣ接合された抗体を最終濃度で３ｎＭ、９ｎＭになるように順次入れ、それぞれ蛍光値が平衡状態に達するまで反応させ最後に3mlの新しい培地に交換した後、解離程度を確認した。蛍光測定時間は１５秒、測定遅延時間は４秒、測定間隔は７２秒し、３回繰り返し実験してＨＥＫ２９３細胞に比べｈＣＬＤＮ３／ＨＥＫ２９３細胞への蛍光値と、ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞比ｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞への蛍光値を一対一二状態適合モデル（ｏｎｅ  ｔｏ  ｏｎｅ  ｔｗｏ  ｓｔａｔｅ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）で分析した。結果の値を図９ｃ及び表３に示す。
【０２１３】
【表３】
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【０２１４】
図９ａおよび図９ｂに示したように、４Ｇ３  ＩｇＧ抗体の両方のピークの移動が現れクローディン３に結合したことを確認した。この時、４Ｇ３  ＩｇＧ抗体処理群でピークの移動の差がより大きく現れ、それにより４Ｇ３  ＩｇＧ抗体は、従来の商業的に販売されている抗体よりもクローディン３特異的な結合力がより優れていることを確認された。
【０２１５】
また、結合親和性の分析結果図９ｃ及び表３に示すように、４Ｇ３のクローディン３発現細胞のｋｉｎｅｔｉｃ  ｖａｌｕｅ（ＫＤ）は、2つの細胞株で、それぞれ４．０３ｎＭ（ｈＣＬＤＮ３／ＨＥＫ２９３）、２．３５ｎＭ（ｈＣＬＤＮ３／ＴＯＶ−１１２Ｄ）に現れ４Ｇ３のクローディン３の高い親和性を確認した。その結果は、本発明の４Ｇ３  ＩｇＧ抗体が従来のａｎｔｉ−ｃｌａｕｄｉｎ３抗体と比べ著しく優れた親和性を保持することを示してものであり、例えば、従来の“Ｃｈｉａｒａ  Ｒｏｍａｎｉ  ｅｔｌ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５”のＩｇＧＨ６抗体よりも親和性が５倍以上の優れたものである。
【０２１６】
実施例４：抗原結合部位を確認
細胞で自然に発現されたＣＬＤＮ３細胞外に表れる領域の中で、具体的に、本発明の抗体が結合する抗原結合部位がどこなのか確認しようとした。そこで、ＣＬＤＮ３の細胞外第一ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  １ｓｔ  ｌｏｏｐ）と細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａ  ２ｎｄ  ｌｏｏｐ）に対応する領域のそれぞれをＣＬＤＮ１で対応する領域と置換した融合タンパク質を作成確認した。ＣＬＤＮ１のアミノ酸１〜１０４番のＣＬＤＮ３アミノ酸１０４〜２２０回を発現する遺伝子（ｈＣＬＤＮ１−３）またはＣＬＤＮ１のアミノ酸１０５〜２１１番とＣＬＤＮ３のアミノ酸１〜１０３番を発現する
【０２１７】
遺伝子（ｈＣＬＤＮ３−１）をそれぞれｐｃＤＮＡ  ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。各遺伝子をＨＥＫ２９３（ＫＣＬＢ）に形質導入させた後、Ｇ４１８で耐性細胞株を選別して、ｈＣＬＤＮ１−３またはｈＣＬＤＮ３−１の融合タンパク質を持続的に発現する細胞株を作製した。それそれぞれｈＣＬＤＮ１−３／ＨＥＫ２９３、ｈＣＬＤＮ３−１／ＨＥＫ２９３と命名した（図１０ａ参照）。各細胞株から、目的とする融合タンパク質が発現されたがａｎｔｉ−ＣＬＤＮ３（３４１７００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ａｎｔｉ−ＣＬＤＮ１（ｓｃ−１３７１２１，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）を用いて、通常のウエスタンブロティングの方法で確認した（図１０ｂの下部を参照）。ｈＣＬＤＮ１−３／ＨＥＫ２９３又はｈＣＬＤＮ３−１／ＨＥＫ２９３細胞に対して４Ｇ３抗体の処理とフローサイトメトリー分析は、実施例３−２と同様の方法で行われた。
【０２１８】
分析結果図１０ｂに示すように、ｈＣＬＤＮ１−３／ＨＥＫ２９３の実験では、ピークの
移動が見られ、ｈＣＬＤＮ３−１／ＨＥＫ２９３の実験では、ピークの移動が見られなかった。それにより４Ｇ３抗体はｈＣＬＤＮ３の細胞外第二ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａ  ２ｎｄ  ｌｏｏｐ）部分に結合することを確認した。
【０２１９】
実施例５：ＩｇＧ  ４Ｇ３抗体の細胞内摂取（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）確認
本発明の抗体の細胞内への内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）能力を確認するために、クローディン３過剰発現卵巣癌細胞株であるＯＶＣＡＲ−3（ＡＴＣＣ）とＣａｏｖ−３（ＡＴＣＣ）を、４ウェル細胞培養スライド（ｗｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｌｉｄｅ）に２×１０５個ずつ入れて２４時間培養した。培養後、細胞にライソジョムを染色するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９（Ｌ７５２８，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）１ｍＭと、対照群の抗体としてｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ（ＣｈｒｏｍｅＰｕｒｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，００９−０００−００３，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｏｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはＫＭ３９０７（配列番号１３のＶＨおよび配列番号１４のＶＬを有する抗体であって、実施例２−１と同様の方法で製作する（ＫＭ３９０７抗体全長配列は、配列番号１５および１６を参照）／ＣＬＤＮ３＆ＣＬＤＮ４  ｔａｒｇｅｔ，ＥＣＬ−１  ｂｉｎｄｉｎｇ））、および本明細書発明の４Ｇ３抗体を１０ｕｇ／ｍｌになるように処理し、３７℃で１時間、２時間、４時間、６時間培養した。各時間によって培養が終わった後、ＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。ＰＢＳ洗浄後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳで５分間３回処理した。  PBSで洗浄後、５％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体としてｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１０９−０９５−０９８，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：１００になるように入れ、常温で１時間反応した。ＰＢＳ洗浄後、核染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｈ３５７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：５０００になるように入れて、１０分間、室温で反応させ、その後、ＰＢＳで２回以上洗浄した。ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＴＭ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｆ４６８０，ＳＩＧＭＡ）でマウントした後、カバースライドをカバーコンフォーカル顕微鏡（ＬＳＭ７００，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）で蛍光を観察した。
【０２２０】
観察結果図１１ａで示すように、４Ｇ３抗体が細胞内に入り、ライソジョム上に位置することを確認した。また、図１１ｂに示すように、公知のａｎｔｉ−クローディン３抗体であるＫＭ３９０７の場合には、細胞内への内在化が観察されなかった。
【０２２１】
実施例６：癌細胞に対する抗体依存性細胞毒性の確認
本発明の抗体の抗体依存性細胞毒性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）を確認するために、ＮＫ−９２ＭＩにＦｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒであるＣＤ１６遺伝子を持続的に発現する細胞株（以下、ＮＫ−９２ＭＩ−ＣＤ１６で呼ばれる）を使用した。ＮＫ−９２ＭＩ−ＣＤ１６細胞株を作製するためにｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＮｈｅ１、ＥｃｏＲ１制限酵素を用いてＣＤ１６遺伝子を挿入し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ技法でＮＫ−９２ＭＩ細胞のＣＤ１６発現ベクターをトランスクションした。Ｇ４１８化合物で耐性細胞株を選別した後ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ機器に過剰発現細胞株を分離した。様々な癌細胞でクローディン３発現による効果を確認するために、まず、各細胞のクローディン３発現程度を見た抗体でフローサイトメトリー分析で確認した後ＭＦＩを比較した（図１２ａ乃至図１２ｅを参照）。前記細胞に対する抗体処理とフローサイトメトリー分析は、実施例３−２と同様の方法で行われた。抗体依存性細胞毒性を示するために、各細胞を９６ウェルプレートに２×１０４個ずつ入れて２４時間培養した。対照群の抗体（ＣｈｒｏｍｅＰｕｒｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，００９−０００−００３，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｏｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）または４Ｇ３抗体を０ｎｇ／ｍｌの、０．１ｎｇ／ｍｌの、１ｎｇ／ｍｌの、１０ｎｇ／ｍｌの、１００ｎｇ／ｍｌの、１０００ｎｇ／ｍｌの、１００００ｎｇ／ｍｌの処理した後、ＮＫ−９２ＭＩ−ＣＤ１６細胞を８×１０４個ずつ入れて３７℃で４時間培養した。細胞が溶解されて出てきたＬＤＨ（Ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を測定するために遠心分離した後、上澄み液を取ってＣｙｔｏＴｏｘ９６(R)Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｇ１７８０，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４９０ｎｍへの吸光度を測定した。抗体依存性細胞毒性を測定するための計算式は以下の通りである。
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【０２２２】
分析の結果図１３ａ乃至図１３ｅに示すように、対照群の抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ）処理群では、細胞毒性が示されず、４Ｇ３抗体処理群では、クローディン３発現細胞で細胞毒性が確認された。クローディン３発現量に応じたＡＤＣＣ効果を比較してみたとき、クローディン３発現ＭＦＩ値が高いほど、細胞毒性ＥＣ５０が低くなる傾向を示した。
【０２２３】
前記実験では、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）を継続的に発現するＮＫ−９２ＭＩ−ＣＤ１６細胞がクローディン３抗原に対する細胞毒性効果を示すことはＣＡＲ−ＮＫ技術の原理と同様のメカニズムで癌細胞を死滅させることがあると示唆している。実際ＡＤＣＣ効果の評価でクローディン３の発現に基づいて効果の傾向が一致することを示しており、それはＣＡＲ−ＮＫ細胞作製に本開発の抗体を適用することができることを示している。
【０２２４】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍標的化能の確認
腫瘍異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）動物モデルは、ヒト卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ）とヒトの乳癌細胞Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ）５×１０６個を１００ｕｌ  ＰＢＳに浮遊させ、それを６週齢のＡｔｈｙｍｉｃ  ｎｕｄｅ雌マウスの下部脇腹に皮下注射する方法で作製した。Ｔ４７Ｄの場合１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｐｅｌｌｅｔ（ＳＥ−１２１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を皮下に一緒に植えた。
【０２２５】
本発明の抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍標的化能を確認するために、対照群の抗体（ＣｈｒｏｍｅＰｕｒｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、００９−０００−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｏｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と４Ｇ３抗体のＣＦ７５０蛍光体をＶｉｖｏＢｒｉｔｅＴＭ  Ｒａｐｉｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（９２１６１、Ｂｉｏｔｉｕｍ）を利用して接合した。蛍光／抗体モルラル比（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｌａｂｅｌｉｎｇ、ＤＯＬ）は、キットで提供する公式に基づいて推奨される予想比に合わせて、それぞれ２．２９と２．８２で測定された。
【０２２６】
前記動物モデルに腫瘍移植後６０日目に、ＣＦ７５０蛍光が標識された対照群の抗体または4G3抗体を１００ｕｇ／１００ｕｌの容量で静脈内注射した。６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間が経過した時点で小動物生体イメージングシステム（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＩＶＩＳ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、マウスから放出される蛍光シグナルを検出し、最後の時点で、肝臓、腎臓、肺、脾臓、小腸、および腫瘍を摘出して組織別の抗体分布の蛍光シグナルを確認した。出版社から供給されたＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて蛍光シグナルを分析した。
【０２２７】
実験結果図１４ａおよび図１４ｂに示すように、対照群の抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ）と比較して本発明の４Ｇ３抗体は、時間が経過するにつれて、移植腫瘍を特異的に標的することを確認し、他の組織と備え腫瘍に蓄積されていることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０２２８】
本発明はクローディン３のＥＣＬ−２に特異的に結合する抗体及びその機能的断片の癌細胞検出、診断、映像化、癌治療剤への適用用途（抗体自体の抗癌用途、ＡＤＣ及びＣＡＲ−発現細胞（特に、免疫細胞）への適用）と、このような用途において著しい効果を示す特有のＣＤＲ配列を含む抗体及びその機能的断片に関するものである。
【０２２９】
クローディン３のＥＣＬ−２に特異的に結合する抗体及びその機能的断片は、他の癌抗原またはクローディン３のＥＣＬ−１を標的にする従来の抗体より癌細胞検出、診断、映像化、癌の治療への適用（ＡＤＣ及び発現細胞（特に免疫細胞）への適用）などにおいて価値が大きい。特にこのような具体的一例として、本発明として抗癌能力を有しているだけでなく、他のクローディンファミリーと交差反応性のなき優れた癌細胞標的化能を示し、マウスクローディン３とも結合するため、毒性及び効能評価の非臨床実験にも有利であり、従来公知のクローディン３抗体と比較し、非常に優れた結合力（親和度）を示し、細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）などを有して、前記用途への適応において著しい効果を示すため、診断及び医薬産業分野などにおいて産業上の利用可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
2021518758.tif 000012
【図５ｂ】
2021518758.tif 000013
【図５ｃ】
2021518758.tif 000014
【図６】
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【図７】
2021518758.tif 000016
【図８ａ】
2021518758.tif 000017
【図８ｂ】
2021518758.tif 000018
【図９ａ】
2021518758.tif 000019
【図９ｂ】
2021518758.tif 000020
【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
2021518758.tif 000024
【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
2021518758.tif 000026
【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【国際調査報告】
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