(57)【要約】本発明は所定のハイブリッドＨＧＦ遺伝子序列を含むＡＡＶベクターに関するものである。本発明のＡＡＶベクターを用いる場合、ハイブリッドＨＧＦ遺伝子を高い伝達効率で対象（subject）に伝達することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５のヌクレオチド序列からなる外来核酸序列が導入されたＡＡＶ（Adeno-Associated Virus）ベクター。
【請求項２】
請求項１に従うＡＡＶベクターにより形質転換された、形質転換体。
【請求項３】
請求項１に従うＡＡＶベクターを含む筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）または糖尿病性神経病症（diabetic peripheral neuropathy、ＤＰＮ）予防または治療用組成物。
【請求項４】
前記糖尿病性神経病症は多発性末梢神経病症（polyneuropathy）または局所性末梢神経病症（focal neuropathy）であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は２０１７年１２月２９日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１７−０１８４７３８号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。
【０００２】
本発明は所定のハイブリッドＨＧＦ遺伝子序列を含むＡＡＶベクターに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療は、遺伝子再組合技術を用いて治療遺伝子を患者の細胞内に伝達して対象細胞の遺伝的変形を起こすか、または特定蛋白質を発現させて遺伝的疾患及び難病などを治療する方法である。この際、遺伝子を生体内に伝達する物質を運搬体またはベクターというが、ベクターはウイルス性ベクターと非ウイルス性ベクターとに大別される。ウイルス性ベクターにはレトロウイルス、アデノウイルスが代表的であり、非ウイルス性ベクターにはnaked DNA、リポソーム（liposome）などがある。
【０００４】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は成長因子の１つで、多様な機能に対する研究が進行中である。その例は、次の通りである：（１）リポソームを運搬体に用いたＨＧＦの心臓疾患治療（Aoki et al., Angiogenesis induced by hepatocyte growth factor in non-infarcted myocardium and infracted myocardium: up-regulation of essential transcription factor for angiogenesis, ets. Gene Therapy 7:417-427, 2000）、（２）ＡＡＶを運搬体に用いたＨＧＦの肝疾患治療（Suzumura et al., Adeno-associated virus vector-mediated production of hepatocyte growth factor attenuates liver fibrosis in mice. Hepatol. Int. 2:80-88, 2008）、（３）naked DNAを運搬体に用いたＨＧＦの糖尿病性神経疾患治療（Kessler et al., Double-blind, placebo-controlled study of HGF gene therapy in diabetic neuropathy. Annals of Clinical and Translational Neurology 2:465-478, 2015）（４）naked DNAを運搬体に用いたＨＧＦの筋萎縮性側索硬化症治療（Sufit et al., Open label study to assess the safety of VM202 in subjects with amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 18:269-278, 2017）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らはｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを含むＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）の異型体を同時発現するハイブリッドＨＧＦ遺伝子の伝達効率が増大した遺伝子伝達体を開発するために例の研究努力した。その結果、従来知られたハイブリッドＨＧＦ遺伝子のダウンサイジング変異体及び遺伝子伝達体としてのＡＡＶ（Adeno-Associated Virus）を用いる場合、遺伝子伝達効率を有意に向上させることができることを糾明することによって、本発明を完成するようになった。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、所定のヌクレオチド序列からなる外来核酸序列が導入されたＡＡＶ（Adeno-Associated Virus）ベクターを提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前述したＡＡＶベクターにより形質転換された形質転換体を提供することにある。
【０００８】
本発明の更に他の目的は、前述したＡＡＶベクターを含む糖尿病性神経病症（diabetic peripheral neuropathy、ＤＰＮ）または筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）予防または治療用組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲、及び図面により、一層明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一様態によれば、本発明は配列番号５のヌクレオチド序列からなる外来核酸序列が導入されたＡＡＶ（Adeno-Associated Virus）ベクターを提供する。
【００１１】
本発明者らはｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを含むＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）の異型体を同時発現するハイブリッドＨＧＦ遺伝子の伝達効率が増大した遺伝子伝達体を開発するために例の研究努力した。その結果、従来知られたハイブリッドＨＧＦ遺伝子のダウンサイジング変異体及び遺伝子伝達体としてのＡＡＶ（Adeno-Associated Virus）を用いる場合、遺伝子伝達効率を有意に向上させることができることを糾明した。
【００１２】
本明細書で、用語“ハイブリッドＨＧＦ遺伝子”は選択的スプライシングにより２つ以上のＨＧＦ異型体を同時発現する遺伝子序列を意味する。より詳しくは、前述した２つ以上のＨＧＦ異型体は少なくとも全長ＨＧＦ（full length HGF、ｆｌＨＧＦ）異型体及び欠損した変異型ＨＧＦ（deleted variant HGF、ｄＨＧＦ）異型体を含む。
【００１３】
本発明のハイブリッドＨＧＦ遺伝子はコドンの縮退（degeneracy）によって、または前記ＨＧＦ及びｄＨＧＦ遺伝子を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮してコーディング領域から発現される蛋白質のアミノ酸序列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形がなされることができ、コーディング領域を除外した部分でも遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で多様な変形または修飾がなされることができ、そのような変形遺伝子やはり本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明は前記配列番号５のハイブリッドＨＧＦ遺伝子と実質的に同一な塩基序列を有するポリヌクレオチド及び前記遺伝子の断片をやはり含む。実質的に同一なポリヌクレオチドとは、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の序列相同性を有することを意味する。
【００１４】
前述したハイブリッドＨＧＦ遺伝子はヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン１乃至１８に該当するｃＤＮＡ及び前記ｃＤＮＡのエクソン４と５との間に挿入されたヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４またはその断片を含むことができ、このような序列として配列番号６のヌクレオチド序列からなるＨＧＦ−Ｘ７序列が従来知られている（参照：ＫＲ２０１７−００２４６１４（２０１７．３．７．公開））。但し、前述した配列番号６のヌクレオチド序列はＡＡＶベクターに挿入するに当たって、サイズによる制限がある。本発明の配列番号５のヌクレオチド序列は前述した配列番号６のヌクレオチド序列のイントロン４断片に該当する序列のうちの一部を除去してダウンサイジングした序列のうち、有意に上昇した遺伝子伝達効率を示す序列に該当する。具体的に、例えば、配列番号５のヌクレオチド序列をＡＡＶベクターに導入して対象（subject）に伝達する場合、従来に知られた配列番号７のＨＧＦ−Ｘ８をＡＡＶベクターに導入して用いる場合に比べて有意に上昇した遺伝子伝達効率及び発現効率を示す。
【００１５】
ポリヌクレオチドはネイキッドＤＮＡ（naked DNA）状態または遺伝子運搬体に含まれた状態で対象（subject）に運搬されることができ、遺伝子運搬体としてプラスミドまたはウイルスベクターなどが利用できることが知られているが、本発明の場合、前述したようにＡＡＶ（Adeno-Associated Virus）ベクターが遺伝子運搬体に用いられる。
【００１６】
ＡＡＶベクターの場合、非分裂細胞を感染させることがあり、多様な種類の細胞を感染させることがあり、ＡＡＶベクターの製造及び用途に対する詳細な説明は米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に詳細に開示されている。遺伝子伝達システムとしてのＡＡＶに対する研究は、LaFace et al, Virology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994)及びFlotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995)に開示されている。典型的に、ＡＡＶウイルスは２つのＡＡＶ末端リピットが横に位置している目的の遺伝子序列を含むプラスミド（McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988)）及び Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)）及び末端リピットのない野生型ＡＡＶコーディング序列を含む発現プラスミド、そしてアデノウイルスのヘルパー（helper）遺伝子が含まれたプラスミド（McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991)）を同時に伝達（transfection）して製造される。
【００１７】
本発明のＡＡＶベクターは当業界に公知されている多様なウイルス感染方法によって外来遺伝子序列を細胞内に運搬することに利用されることができ、その方法は特別に制限されない。
【００１８】
本発明のＡＡＶベクターは ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６からなる群より選択されるＡＡＶ serotypeを有する。
【００１９】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前述したＡＡＶベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。
【００２０】
本発明のＡＡＶベクターは適切な宿主細胞、例えば、２９３Ｔのような哺乳動物細胞（mammalian cell）または昆虫細胞（insect cell）などに導入させることができ、形質転換された宿主細胞を用いて本発明の遺伝子のＤＮＡを大量に複製するか、または蛋白質を大量生産することができる。
【００２１】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前述したＡＡＶベクターを含む糖尿病性神経病症（diabetic peripheral neuropathy、ＤＰＮ）または筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）予防または治療用組成物を提供する。
【００２２】
本明細書で使われる用語“予防”は本発明の組成物の投与により糖尿病性神経病症または筋萎縮性側索硬化症を抑制させる全ての行為を意味する。
【００２３】
本明細書で使われる用語“治療”は（ａ）糖尿病性神経病症または筋萎縮性側索硬化症の進行／発展の遅延または抑制；（ｂ）糖尿病性神経病症または筋萎縮性側索硬化症の軽減；及び（ｃ）糖尿病性神経病症または筋萎縮性側索硬化症の除去を意味する。
【００２４】
本発明の組成物は薬剤学的に許容される担体を含むことができる。
【００２５】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアル酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるのではない。本発明の薬剤学的組成物は前記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。適合した薬剤学的に許容される担体及び製剤は Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
【００２６】
本発明の薬剤学的組成物は非経口投与が好ましく、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、脊髄腔内投与、脳室内投与（intracerebroventricular injection）、脳投与（intracerebral injection）または局部投与を用いて投与することができる。
【００２７】
本発明の薬剤学的組成物は注射に製剤化されて投与できる。本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病気症状の程度、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により多様であり、普通に熟練した医者は目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の一具現例によれば、本発明のＡＡＶベクターは１×１０８乃至１×１０１２ＧＣ／ｓｉｔｅの投与量で投与される。
【００２８】
本発明の薬剤学的組成物は本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化されることで、単位容量形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造できる。この際、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、またはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤形態でありえ、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【００２９】
本発明の一具現例において、前述した糖尿病性神経病症は多発性末梢神経病症（polyneuropathy）または局所性末梢神経病症（focal neuropathy）である。
【００３０】
本発明の一具現例において、前述した多発性末梢神経病症は高血糖性神経病症（hyperglycemic neuropathy）、遠位部対称性多発神経病症（distal symmetric polyneuropathy）、自律神経病症（autonomic neuropathy）、急性感覚神経病症（acute sensory neuropathy）、急性痛み性感覚神経病症（acute painful sensory neuropathy）、及び慢性運動性感覚神経病症（chronic sensor imotor neuropathy）から構成された群より選択される１つまたはその以上の糖尿病性神経病症である。より具体的に、前述した局所性末梢神経病症は脳神経病症（cranial neuropathy）、体幹神経病症（truncal neuropathy）、四肢神経病症（limb neuropathy）、胸腰椎神経病症（thoracolumbar radiculoneuropathy）及び腰仙骨神経叢根病症（lumbosacral radiculoplexus neuropathy）から構成された群より選択される１つまたはその以上の糖尿病性神経病症である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
【００３２】
（ａ）本発明は所定のヌクレオチド序列からなる外来核酸序列が導入されたＡＡＶ（Adeno-Associated Virus）ベクターを提供する。
【００３３】
（ｂ）本発明は前述したＡＡＶベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。
【００３４】
（ｃ）本発明は前述したＡＡＶベクターを含む糖尿病性神経病症（diabetic peripheral neuropathy、ＤＰＮ）または筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）予防または治療用組成物を提供する。
【００３５】
（ｄ）本発明のＡＡＶベクターを用いる場合、ハイブリッドＨＧＦ遺伝子を高い伝達効率で対象（subject）に伝達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７からＨＧＦ−Ｘ７のダウンサイジング変異体を製造する方法を示す模式図である。
【図２】ＨＧＦ−Ｘ７のダウンサイジング変異体をｐＣＡベクターにクローニングする方法を示す模式図である。
【図３】ＡＡＶ−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３及びＡＡＶ−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を各々感染させたＣ２Ｃ１２細胞でのＨＧＦ蛋白質の発現量を示すグラフである。
【図４】ＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４とＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ８を各々感染させたＣ２Ｃ１２細胞でのＨＧＦ蛋白質の発現量を示すグラフである。
【図５】ＡＬＳマウスでＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を筋肉投与した後、病気の進行が遅れることを示すグラフである。
【図６】ＡＬＳマウスでＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を筋肉投与した後、生存率の改善程度を示すグラフである。
【図７】ＡＬＳマウスでＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を筋肉投与した後、体重減少の鈍化程度を示すグラフである。
【図８】ＡＬＳマウスでＡＡＶ１−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を脊髄腔内投与した後、生存率調査及び行動実験分析結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【実施例】
【００３８】
実験例１：ＨＧＦ−Ｘ７誘導体（derivatives）の製作
ＨＧＦの２つの異型体を発現するＡＡＶベクターを製作するために、配列番号１（ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７）から位置指定突然変異（site-directed mutagenesis）方法により４種類の誘導体（derivative）を製作した。詳細な方法は、次の通りである。まず、配列番号１のＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ（Site-directed Mutagenesis Kit、Stratagene、US）を進行した。この時に使用したプライマー序列は次の通りであった。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
ＰＣＲ産物をＣ細胞に伝達して出たコロニーのうち、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ１、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ２、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３、及びｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を含んでいるコロニーを選別して、これからプラスミドＤＮＡを抽出した（参照：図１）。
【００４１】
実験例２：ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７誘導体の製作
実験例１から得た４種類の誘導体を含むＡＡＶ生産のために、これらの誘導体をｐＣＡベクター（AAV Helper-Free System、Agilent、USA）にクローニングした。まず、実験例１のｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ１、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ２、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３、及びｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４にＣｌａＩ及びＳａｌＩ制限酵素を処理してＨＧＦ−Ｘ７−ｄ１、ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ２、ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３、及びＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４の４種類の切片を得た。ｐＣＡベクターにもＣｌａＩ及びＳａｌＩ制限酵素を処理した後、前記ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ１、ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ２、ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３、及びＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４の４種類の切片と共に各々ligation反応をさせてｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ１、ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ２、ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３、及びｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を製作した（参照：図２）。
【００４２】
実験例３：ＡＡＶ−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７誘導体の生産
実験例２で製作した各々のプラスミドＤＮＡを使用してＡＡＶを製作した。ＡＡＶを生産するために、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を前日に準備して２４時間の間安定化させた。この２９３Ｔ細胞に実験例２で製作したプラスミドＤＮＡとＡＡＶ生産に必要なＤＮＡであるｐＨｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶ−ＲＣ（AAV Helper-Free System、Agilent、USA）を伝達（transfection）した後、３日後、ＡＡＶを収集した。収集したＡＡＶはtitrationkit（AAVpro Titration Kit、Takara、JP）を用いてtiterを測定した。総４種類のserotype（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ６）を用いてＡＡＶを生産した。
【００４３】
実験例４：ＡＡＶ−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７誘導体のｈＨＧＦ発現有無確認
４−１．実験方法
実験例３で生産したＡＡＶのうち、ＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３及びＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４に対してｈＨＧＦが発現されるかを確認するために実験を進行した。まず、Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ）を１２ウェル−プレートにウェル当たり８×１０４細胞数で敷いた後、２４時間の間細胞を安定化させた。このＣ２Ｃ１２細胞に同量のtiterを有するＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３及びＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を各々感染させた。感染後、２日後に上等液を収集してＨＧＦ ＥＬＩＳＡ（R&D systems、US）を遂行してＨＧＦ蛋白質の量を分析した。
【００４４】
４−２．実験結果
実験結果、ＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３及びＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４は全てＨＧＦ蛋白質を発現することと確認された。特に、ＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４によるＨＧＦの発現量がＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ３より高いことを確認することができた（参照：図３）。
【００４５】
実験例５：ＡＡＶ−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４とＡＡＶ−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ８のｈＨＧＦ発現比較
５−１．実験方法
ＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４とＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ８に対してｈＨＧＦの発現量を比較するために次の実験を進行した。まず、Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ）を１２ウェル−プレートにウェル当たり８×１０４細胞数で敷いた後、２４時間の間細胞を安定化させた。このＣ２Ｃ１２細胞に同量のtiterを有するＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４とＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ８を各々感染させた。感染後、２日後に上等液を収集してＨＧＦ ＥＬＩＳＡ（R&D systems、US）を遂行してＨＧＦ蛋白質の量を比較した。
【００４６】
５−２．実験結果
実験結果、ＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４とＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ８全てＨＧＦ蛋白質を発現したが、ＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４はＡＡＶ２−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ８と比較した時、約９−１０倍程度の顕著に高いＨＧＦ発現量を示すことを確認した（参照：図４）。
【００４７】
実験例６：ＡＬＳマウスモデルでの筋肉投与に従うＡＡＶ−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４の効果
６−１．実験方法
６−１−１．ＡＬＳマウスモデル製作及び遺伝子伝達
ＡＬＳモデルに広く使われるｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａモデルを使用した。ＡＬＳマウス（Jackson Laboratory、US）を交配して得た後、ジェノタイピング（genotyping）を経てＴｇ有無を確認した。生まれてから１０週後に２群（Ｔｇ−ＡＡＶ６−ＭＣＳ：８匹、Ｔｇ−ＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４：７匹）に編成した。Ｔｇでない個体は選び出して陰性対照群（negative control）（ｎｏｎ−Ｔｇ：５匹）に用いた。生後９０日のマウスの腿筋、前脛骨筋、そしてふくらはぎ筋に各々ＡＡＶを１×１０８ＧＣ／ｓｉｔｅに投与し、総３×１０８ＧＣ／ｈｅａｄを投与した。
【００４８】
６−１−２．疾患進行速度、生存率及び重さ測定
効能を評価するために、毎日病気進行速度と体重を測定し、個体の生存有無を確認した。ＡＬＳ疾患の場合、結局、病気の進行によって死に至るようになるので、前記の３つの指標はＡＬＳ動物実験で代表的に広く使われる分析基準である。病気進行速度の場合、次のような基準に測定して数値化した。
【００４９】
［Symptom score］
５点：正常
４点：マウスの尾を握った時、下肢均衡を維持する時間が１〜２秒間
３点：マウスの尾を握った時、下肢均衡を維持する時間が１秒未満であるが、歩きぶりは正常
２点：下肢均衡が維持できず、足をずって歩く
１点：下肢均衡が維持できず、足の甲で歩く
０点：死亡
【００５０】
６−２．実験結果
ＡＬＳマウス（ＡＡＶ６−ＭＣＳ投与群）の場合、時間が経るにつれて疾患が激しくなることを確認することができた。しかしながら、ＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を投与した場合、その進行程度が遅れることを確認することができた。これを数値化した時、実験期間内ＡＬＳマウスの場合、symptom scoreの平均が２．３６で、これに比べてＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４の投与を受けたグループの場合、その値が２．８８で、ＡＬＳマウス（ＡＡＶ６−ＭＣＳ投与群）対比増加した値を示した（参照：図５）。
【００５１】
また、ＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を投与した場合には生存率においても明確な改善効果があることを確認することができた。生存率の場合、ＡＡＶ６−ＭＣＳの投与を受けたグループの場合、生後平均１３９日を生存した一方、ＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４の投与を受けた場合、その期間が１４７日で、約８日増加したことを確認することができた（参照：図６）。
【００５２】
最後に、ＡＬＳマウス（ＡＡＶ６−ＭＣＳ）の場合、筋肉減少によって体重の減少が格段に増加するが、ＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を投与した場合、体重減少が鈍化されることを確認することができた。即ち、体重の相対的な比較をした時、ＡＬＳマウスの場合、投与時点から試験終了期間まで体重の平均変化が約３４％であり、これに反してＡＡＶ６−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を投与した場合、その変化幅が２２％で、体重減少程度が緩和されていることを確認することができた（参照：図７）。
【００５３】
実験例７：ＡＬＳマウスモデルでの脊髄腔内投与に従うＡＡＶ−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４の効果
７−１．実験方法
７−１−１．ＡＬＳマウスモデル製作及び遺伝子伝達
ＡＬＳモデルに広く使われるｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａモデルを使用した。ＡＬＳマウス（Jackson Laboratory、US）を交配して得た後、ジェノタイピング（genotyping）を経てＴｇ有無を確認し、一定の水準の変異遺伝子を保有した個体を選別して実験に使用した。Ｔｇでない個体の場合、陰性対照群（negative control、１３匹）に設定した。Ｔｇ個体は、各々１４、１６匹ずつＴｇ−ＡＡＶ１−ＭＣＳ群とＴｇ−ＡＡＶ１−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４群に編成した。生後６０日のマウスの脊髄腔内にＡＡＶを５×１０９ＧＣ／ｓｉｔｅで１回投与した。
【００５４】
７−１−２．生存率調査及び行動実験分析
効能を綿密に見るためにＡＬＳ疾患の最も重要な指標である生存率を調査し、これと同時にＡＬＳ疾患状況で個体の運動能を見るためにrotarod、hanging wire調査を実施した。追加で、筋肉機能の強度を見るためにgrip strengthを測定した。
【００５５】
生存率の場合、毎日個体の生存有無を調べた。Rotarodの場合、accerating方法を使用したが、マウスを回転する棒の上に載せた後、どれくらい永らく回転する棒の上で運動するかの時間を測定する方法である。特別に、回転する棒の速度は時間が経るほど加速化される。
【００５６】
Hanging wireの場合、格子紋の構造物にマウスを載せた後、覆し、覆したままで個体がぶら下がっている時間を測る。
【００５７】
Grip strength場合、strengthを測定する機器に各々マウスの前足と後足を載せた後、筋肉強度を測定するようになる。
【００５８】
データは平均±ＳＥＭで表現し、各データの統計分析は各時間帯でOne−Way ANOVAで分析後、Tukey post-hoc testを実施した。（*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１、****：ｐ＜０．０００１）
【００５９】
７−２．実験結果
ＡＡＶ１−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を脊髄腔内投与時、治療効果を表すことを確認した。まず、生存率を調べた結果、ＡＡＶ１−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４投与群の場合、ＡＡＶ１−ＭＣＳ投与群より有意味な生存率増加を示した。ＡＡＶ１−ＭＣＳを投与した場合、マウスの平均寿命が１４４日である一方、ＡＡＶ１−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４を投与した個体群の場合、その平均が１６０日で、約１６日増加したことを確認することができた。
【００６０】
実際の運動能力向上にも改善が表れたが、rotarod実験で陰性対照群の場合、平均２２６秒の時間をrotarodで維持しており、それに比べてＴｇ−ＡＡＶ１−ＭＣＳ群は１１２秒に格段に減少した。一方、ＡＡＶ１−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４の投与を受けた実験群の場合、その時間の平均が１５１秒に改善されたことを確認した。Hanging wireとgrip strengthの場合でも類似の治療効果を観察したが、特に、病気進行の最後の段階（生後１３７日目）でＡＡＶ１−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４投与群の場合hanging  wireで踏み堪える時間が約３１秒で、約７秒と調査されたＡＡＶ１−ＭＣＳ投与群に比べて格段に増加することを確認した。Grip strength測定結果でもＡＡＶ１−ＭＣＳ投与群では略２８ｇの強度を示したが、ＡＡＶ１−ｐＣＡ−ＨＧＦ−Ｘ７−ｄ４投与群の場合、その強度が６６ｇに格段に向上した（参照：図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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