(57)【要約】  患者の生体液試料中のＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を有するエラスチン断片を定量化するための、モノクローナル抗体、アッセイキットおよびイムモアッセイ方法、ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの線維性疾患を検出または定量化するためのそれらの使用が本明細書に記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の生体液試料中のＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を有するペプチドを定量化するためのイムノアッセイ方法であって、前記方法が、前記患者の生体液試料を、前記Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示すモノクローナル抗体と接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記Ｃ末端アミノ酸配列との結合量を決定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が延長された伸長型または前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が切断された短縮型を、特異的に認識しないかまたはそれに結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者の生体液試料が、血液、尿、滑液、血清、ＢＡＬＦ、または血漿である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
患者の線維性疾患を検出または定量化するためのイムノアッセイ方法であって、前記方法が、患者の生体液試料をＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示すモノクローナル抗体と接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記Ｃ末端アミノ酸配列を含むペプチドとの結合量を決定することと、前記結合量を、ｉ）健常な対象に関連する値、および／またはｉｉ）分かっている線維性疾患重症度に関連する値、および／またはｉｉｉ）過去の時点で前記患者から得られた値、および／またはｉｖ）所定のカットオフ値と相関させることと、を含む、方法。
【請求項５】
前記線維性疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記所定のカットオフ値が、少なくとも１５０．０ｎｇ／ｍＬである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が延長された伸長型または前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が切断された短縮型を、特異的に認識しないかまたはそれに結合しない、請求項４〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記患者の生体液試料が、血液、尿、滑液、血清、ＢＡＬＦ、または血漿である、請求項４〜７に記載の方法。
【請求項９】
患者が線維性疾患の治療に対して良好に反応しているかどうかを決定するための方法であって、前記方法が、請求項１〜３に記載の方法を使用して、少なくとも２つの患者の生体液試料中の前記Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を含むペプチドの量を定量化することを含み、前記患者の生体液試料が、第１の時点および前記患者への治療の投与の期間中の少なくとも１つのその後の時点で前記患者から得られ、前記第１の時点から前記治療の期間中の前記少なくとも１つのその後の時点への前記Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を含むペプチドの前記量の低減が、前記患者が前記治療に対して良好に反応していることの指標である、方法。
【請求項１０】
前記線維性疾患が、ＣＯＰＤである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示す、モノクローナル抗体。
【請求項１２】
アッセイキットであって、Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示すモノクローナル抗体と、
−ストレプトアビジンコーティングウェルプレート
−ビオチン化ペプチドであるビオチン−Ｌ−ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号５）（式中、Ｌが任意選択的なリンカーである）
−サンドイッチイムノアッセイに使用するための二次抗体
−Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を含む較正物質ペプチド
−抗体ビオチン化キット
−抗体ＨＲＰ標識キット
−抗体放射性標識キット、のうちの少なくとも１つと、を含む、アッセイキット。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体が、前記アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して産生される、請求項１２に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＯＰＤなどの線維性疾患の評価における、エラスチンアッセイおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、気道に炎症を起こし、好中球および肥満細胞が過剰に濃縮されることを特徴とする（１、２）。好中球および肥満細胞は、カテプシンＧ（ＣＧ）およびプロテアーゼ３（ＰＲ３）のような事前形成されたセリンプロテアーゼを顆粒中で合成および貯蔵し、炎症誘発性媒介物質に応答してこれらを放出する。これらのプロテアーゼは一緒に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対して広範な活性を有する（３，４）。弾性繊維は、肺の細胞外マトリックスの主要な不溶性成分であり、細胞外マトリックスの構造、機能、回復性、および弾性に不可欠である。弾性繊維は、フィブリリンミクロフィブリル内に埋め込まれた架橋エラスチンの内部コアによって構成される（５）。呼吸樹全体に細くかつ高度に分岐したネットワークを作り、呼吸時の肺胞の膨張および収縮を支持する。健康な成人組織では、高い安定性および、低いターンオーバー速度がそれらの特徴である。選択されたＭＭＰに加えて、セリンプロテアーゼなどのいくつかのプロテアーゼのみが、エラスチンコアおよびミクロフィブリルを損傷することによってエラスチン繊維を切断することが可能である（６〜８）。正常な炎症反応では、プロテアーゼ−アンチプロテアーゼバランスは、内因性プロテアーゼ阻害剤（例えば、硫酸ヘパラン）の分泌を通じて維持される（９）。病理学的状態では、このバランスが偏っており、ＣＯＰＤおよび肺気腫の主な病理学的特色である弾性の喪失につながる（１０，１１）。ＣＯＰＤではセリンプロテアーゼＣＧおよびＰＲ３の両方が上方制御されることが示唆されているが、現在、エラスチン分解の増加をそれらのプロテアーゼと結びつけることが可能なマーカーは存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、現在、エラスチンのＰＲ３分解を監視するためのイムノアッセイを開発し、線維性疾患、具体的にはＣＯＰＤの評価におけるその使用を実証している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
したがって、第１の態様において、本発明は、患者の生体液試料中のＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を有するペプチドを定量化するためのイムノアッセイ方法であって、当該方法が、当該患者の生体液試料を、当該Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示すモノクローナル抗体と接触させることと、当該モノクローナル抗体と当該Ｃ末端アミノ酸配列との結合量を決定することと、を含む、方法に関する。
【０００５】
好ましくは、モノクローナル抗体は、当該Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が延長された伸長型または当該Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が切断された短縮型を、特異的に認識しないかまたはそれに結合しない。これに関して、「当該Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が延長された伸長型」は、１つ以上のアミノ酸が配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ−ＣＯＯＨ（配列番号１）のＣ末端を超えて延長していることを意味する。例えば、Ｃ末端のアミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ−ＣＯＯＨ（配列番号１）がトレオニン残基によって伸長されている場合、対応する「Ｃ末端が延長された伸長型」は、ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴＴ−ＣＯＯＨ（配列番号２）であろう。同様に、「当該Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が切断された短縮型」は、１つ以上のアミノ酸が配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ−ＣＯＯＨ（配列番号１）のＣ末端から除去されていることを意味する。例えば、Ｃ末端のアミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ−ＣＯＯＨ（配列番号１）が１つのアミノ酸残基だけ短縮されている場合、対応する「Ｃ末端が切断された短縮型」はＬＰＧＧＹＧＬＰＹ−ＣＯＯＨ（配列番号３）であろう。
【０００６】
患者の生体液試料は、限定されないが、血液、尿、滑液、血清、ＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）、または血漿であり得る。
【０００７】
イムノアッセイは、限定されないが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであり得る。同様に、イムノアッセイは、限定されないが、酵素結合免疫吸着アッセイまたはラジオイムノアッセイであり得る。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、患者の線維性疾患を検出または定量化するためのイムノアッセイ方法であって、方法が、患者の生体液試料をＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示すモノクローナル抗体と接触させることと、当該モノクローナル抗体と当該Ｃ末端アミノ酸配列を含むペプチドとの結合量を決定することと、当該結合量を、ｉ）健常な対象に関連する値、および／またはｉｉ）分かっている線維性疾患重症度に関連する値、および／またはｉｉｉ）過去の時点で当該患者から得られた値、および／またはｉｖ）所定のカットオフ値と相関させることと、を含むイムノアッセイ方法に関する。
【０００９】
好ましくは、線維性疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【００１０】
所定のカットオフ値は、好ましくは少なくとも１５０．０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１７５．０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも２００．０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも２２５．０ｎｇ／ｍＬ、および最も好ましくは少なくとも２５０ｎｇ／ｍＬである。この点では、様々な統計分析を組み合わせた使用を通じて、少なくとも１５０．０ｎｇ／ｍＬ以上のモノクローナル抗体（上述）とＣ末端バイオマーカーとの測定結合量は、ＣＯＰＤなどの繊維症の存在の決定要因であり得ることが分かっている。少なくとも１５０．０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１７５．０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも２００．０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも２２５．０ｎｇ／ｍＬ、および最も好ましくは少なくとも２５０．０ｎｇ／ｍＬの統計的カットオフ値を有することにより、本発明の方法を利用して、ＣＯＰＤなどの線維症を高い信頼レベルで診断することが可能である。あるいは、換言すると、本発明の方法に統計的カットオフ値を適用することにより、結果として独立した診断アッセイが得られる、すなわち、診断結果に到達するために、健康な個体および／または疾患重症度が分かっている患者とのあらゆる直接比較の必要性を排除するので、特に有利である。これはまた、初期予後を裏付けるための迅速かつ決定的なツールとして機能することもでき、したがって潜在的に内視鏡検査または生検などのより侵襲性の高い手技の必要性を排除し、好適な治療計画の開始を迅速化するので、ＣＯＰＤなどの繊維症の一般的な指標である医学的徴候または症状（例えば、身体検査および／または医療専門家による診察によって決定される）を既に有する患者を評価するためにアッセイを利用すると、特に有利であり得る。最終診断の迅速化によって、より早い段階で疾患が検出され、したがって治療される結果となり得る。好ましくは、所定のカットオフ値は、ヒト血液、血清、または血漿中で測定されるカットオフ値に対応する。
【００１１】
好ましくは、モノクローナル抗体は、当該Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が延長された伸長型または当該Ｃ末端アミノ酸配列のＣ末端が切断された短縮型を、特異的に認識しないかまたはそれに結合しない。「Ｃ末端が延長された」および「Ｃ末端が切断された」という用語は、上記に説明されている。
【００１２】
患者の生体液試料は、限定されないが、血液、尿、滑液、血清、ＢＡＬＦ、または血漿であり得る。
【００１３】
第３の態様において、本発明は、患者がＣＯＰＤなどの線維性疾患の治療に対して良好に反応しているかどうかを決定するための方法であって、当該方法が、上述の方法を使用して、少なくとも２つの生物学的試料中のＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴを含むペプチドの量を定量化することを含み、当該生物学的試料が、第１の時点および当該患者への治療の投与の期間中の少なくとも１つのその後の時点で当該患者から得られ、当該第１の時点から治療期間中の当該少なくとも１つのその後の時点へのＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴを含むペプチドの量の低減が、当該患者が当該治療に対して良好に反応していることの指標である、方法に関する。
【００１４】
上記の方法を使用して、ＣＯＰＤなどの線維性疾患を治療するための新規療法の有効性を決定することもできる。その点では、Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を含むペプチドの量が、当該第１の時点から当該新規療法を使用する治療の期間中の当該少なくとも１つのその後の時点で低減される場合、新規療法は有効であるとみなされるであろう。
【００１５】
第４の態様において、本発明は、Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示すモノクローナル抗体に関する。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示す、完全モノクローナル抗体およびＦａｂ、Ｆｖなどのその抗体断片にまで及ぶ。
【００１６】
第５の態様において、本発明は、アッセイキットであって、Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）に特異的に反応性を示すモノクローナル抗体と、
−ストレプトアビジンコーティングウェルプレート
−ビオチン化ペプチドであるビオチン−Ｌ−ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号５）（式中、Ｌが任意選択的なリンカーである）
−サンドイッチイムノアッセイに使用するための二次抗体
−Ｃ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を含む較正物質ペプチド
−抗体ビオチン化キット
−抗体ＨＲＰ標識キット
−抗体放射性標識キット、のうちの少なくとも１つと、を含む、アッセイキットに関する。
【００１７】
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して産生される。
【００１８】
定義
本明細書で使用される場合、「Ｃ末端」という用語は、ポリペプチドの端を指し、すなわち、ポリペプチドのＣ末端側終端にあり、その一般的な方向を意味すると解釈されるべきではない。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「競合ＥＬＩＳＡ」という用語は、競合酵素結合免疫吸着アッセイを指し、当業者に既知の技術である。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「サンドイッチイムノアッセイ」という用語は、試料中の抗原の検出のための少なくとも２つの抗体の使用を指し、当業者に既知の技術である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「結合量」という用語は、抗体とバイオマーカーとの結合の定量化を指し、当該定量化は、生体液試料中のバイオマーカーの測定値を較正曲線と比較することによって決定され、較正曲線は、既知の濃度のバイオマーカーの標準試料を使用して作成される。生体液中でＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を有するＣ末端バイオマーカーを測定する本明細書に開示の特定のアッセイにおいて、較正曲線は、既知の濃度の較正ペプチドＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）の標準試料を使用して作成される。生体液試料中で測定される値を較正曲線と比較して、試料中のバイオマーカーの実際の量を決定する。本発明は、検量線を作成することおよび生体液試料中の結合量を測定することの両方のために分光光度分析を利用し、後述の実施例において、本方法はＨＲＰおよびＴＭＢを利用して、結合量に比例し、分光光度計によって読み取ることができる、測定可能な色の強度を生成する。当然のことながら、いずれか他の好適な分析方法も使用することができる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「カットオフ値」は、患者のＣＯＰＤなどの線維性疾患の高い可能性の指標として統計的に決定される結合量を意味し、統計的カットオフ値以上である患者の試料中のバイオマーカーの測定値は、少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも８０％の確率、好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、および最も好ましくは少なくとも９５％の確率の、ＣＯＰＤなどの線維性疾患の存在または可能性に対応する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「健常な対象に関連する値および／または分かっている疾患重症度に関連する値」という用語は、健康であるとみなされる、すなわち、ＣＯＰＤなどの線維性疾患を有さない対象の、上記方法によって決定されたＥＬＰ−３の正規化された量、および／または重症度が分かっているＣＯＰＤなどの繊維性疾患を有することが分かっている対象の、上記方法によって決定されたＥＬＰ−３の正規化された量を意味する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ＥＬＰ−３」はＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を有するペプチドを指し、「ＥＬＰ−３−ＥＬＩＳＡ」は、試料中のＣ末端アミノ酸配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を有するペプチドの量を定量化する本明細書に開示の特異的競合ＥＬＩＳＡを指す。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】健康な対象およびＣＯＰＤを有する患者のＥＬＰ−３の測定値。
【実施例】
【００２６】
本開示の実施形態を次の実施例において説明するが、それらは本開示を理解する上での助けになるように記載されており、決して後に続く特許請求の範囲に定義される本開示の範囲を制限するものであると解釈されるべきではない。次の実施例は、記載される実施形態の作製および使用方法の完全な開示および説明を、当業者に提供するために記述されており、本開示の範囲を限定することを意図せず、以下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことをも意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確保する努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力はほぼ大気圧である。
次の実施形態において、次の材料および方法を用いた。
【００２７】
試薬
提示された実験で使用した全ての適用された試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）およびＭｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）からの高品質の化学物質であった。使用した９６ウェルのストレプトアビジンコーティング微量定量プレートは、Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのものであった。適用したアッセイ緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（２ｇのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）からなった。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、Ｋｅｍ−ＥＮ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのものであった。免疫処置およびアッセイ開発に使用した合成ペプチドは、１）免疫原性ペプチド：ＫＬＨ−ＣＧＧ−ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号４）、ビオチン化ペプチド：ビオチン−ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号５）、３）標準ペプチド：ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）、および４）伸長ペプチド：ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴＴ（配列番号２）であった。全ての合成ペプチドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）から購入した。インビトロ切断に適用した試薬：エラスチン（Ｓｉｇｍａ、Ｅ７１５２）ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）タンパク質（Ａｂｃａｍ、ａｂ９１０９９）、ＰＲ３（ＥＰＣ  ＭＬ７３４）、および完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  １１８６１５３００１）。
【００２８】
標的配列の選択
エラスチン中のＰＲ３に特異的な切断部位（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５５０２−ＥＬＮ＿ヒト）は、質量分析によって以前識別されている（１２）。ＮＰＳ＠：ネットワークタンパク質配列分析を使用して、他のタンパク質からのデカペプチド配列に対する相同性について、ＰＲ３が生成したエラスチンデカペプチドをブラストで検索した。これに基づいて、配列ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）をＥＬＰ−３アッセイ抗体開発用に選択した。識別された配列の存在は、インビトロでのエラスチンのＰＲ３切断を、現場で質量分析によって検証した。
【００２９】
抗体開発
各選択された標的配列に対する、２００ｕｌの乳化抗原を含むＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバント（ＫＬＨ−ＣＧＧ−ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号４））を使用して、４〜６週齢の６匹のマウスの腹部皮下に免疫処置を実施した（免疫処置当たり５０ｕｇ）。４回の初回免疫処置を２週毎に実施し、続いて４週毎に追加の４回の免疫処置を実施した。融合に最も高い血清力価を有するマウスを選択した。マウスを１ヶ月間休息させ、次いで、脾臓の単離３日前に、１００ｕｌの０．９％ＮａＣｌ溶液中に５０ｕｌの免疫原性ペプチドを静脈内で追加免疫した。Ｇｅｆｔｅｒらによって記載されるように、脾臓細胞をＳＰ２／ｏ骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドローマ（ｈｙｂｒｉｄｒｏｍａ）を生成し、培養皿にクローニングした（１３）。限界希釈方法を用いるさらなる増殖用に、９６ウェル微量定量プレートにクローンを播種して、確実にモノクローナルを増殖した。標準ペプチドおよび天然材料に対する反応性について、ストレプトアビジンコーティングプレートを使用する間接ＥＬＩＳＡで、抗体産生ハイブリドーマの上清をスクリーニングした。ビオチン−ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号５）をスクリーニングペプチドとして使用し、標準ペプチドＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１）を較正物質として使用して、クローンのさらなる特異性を試験した。
【００３０】
ＥＬＩＳＡ試験計画
標的配列用に選択したクローンから上清を収集し、ＨｉＴｒａｐ親和性カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｒｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ））を使用してモノクローナル抗体を精製した。
【００３１】
競合ＥＬＩＳＡアッセイとして、収集した抗体に基づいてＥＬＰ−３アッセイを構築した。９６ウェルのストレプトアビジンコーティング微量定量プレート（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、２０℃でアッセイ緩衝液中に３０分間振盪溶解させた、１００ｕｌのビオチン化スクリーニングペプチド（ビオチン−ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号５））でコーティングした。洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）中でプレートを５回洗浄した。試料／標準／対照（２０ｕｌ）を添加し、続いて（１００ｕｌ）モノクローナル抗体を添加し、４℃で３時間振盪培養した。培養後、洗浄緩衝液中でプレートを５回洗浄した。体積１００ｕｌの二次ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体を添加し、続いて２０℃で１時間振盪培養した。次いで、プレートを洗浄し、ＴＭＢを添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｃａ，ＵＳＡ））によって、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍでプレートを分析した。４つのパラメータの数学的フィッティングモデルを使用して、検量線をプロットした。各ＥＬＩＳＡプレートは、アッセイ間の変動を監視するキット対照を含んだ。アッセイの範囲内で全ての試料を測定した。定量下限（ＬＬＯＱ）レベル未満の全ての試料には、ＬＬＯＱの値が割り当てられた。
【００３２】
技術的評価
希釈した健康なヒト血清（ｎ＝４）の直線性を決定するために、ヘパリン血漿（ｎ＝４）、クエン酸血漿（ｎ＝４）、およびＥＤＴＡ血漿を適用した。２倍希釈標準ペプチド（ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ（配列番号１））、伸長ペプチド（ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴＴ（配列番号２））、ナンセンスペプチド（ＰＧＧＶＰＧＧＶＦＹ（配列番号６））、およびナンセンスコーター（ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴ−Ｋ−ビオチン（配列番号７））のシグナル阻害の割合として、抗体特異性を計算した。未希釈試料の回収率によって、リナライトを評価した。アッセイ内およびアッセイ間の変動は、二重決定で実行される７つの品質対照試料の１０個の独立した測定値によって決定した。検出下限（ＬＬＯＤ）を、２１個のブランク（緩衝液）試料の平均＋３×標準偏差（ＳＤ）として決定した。検出上限（ＵＬＯＤ）を、標準Ａの平均−３×ＳＤ測定値として決定した。定量下限（ＬＬＯＱ）を、ヒト血清中で測定した最低濃度として３０％未満の誤差で決定した。精度は、標準ペプチドでスパイクした健康なヒト血清試料中および血清中で測定し、次いで、緩衝液中のスパイクしたペプチドまたは血清の回収率として計算した。アッセイは、脂質（低＝４．８３ｍＭ、高＝１０．９８ｍＭ）、ヘモグロビン（低＝０．１５５ｍＭ、高＝０．３１０ｍＭ）、およびビオチン（低＝３０ｎｇ／ｍｌ、高＝９０ｎｇ／ｍｌ）でスパイクしたヒト血清と比較して、スパイクしなかった健康な血清中の分析物の回収率を計算することによって干渉について試験した。
【００３３】
分析物の安定性
分析物の安定性は、３つの健康なヒト血清および血漿試料を４または２０℃で２、４および２４時間のいずれかで培養することによって評価し、−２０℃で維持した試料の割合として計算した（０時間試料）。加えて、最大４回凍結融解した３つの健康なヒト血清および血漿試料について、凍結融解安定性を決定した。
【００３４】
切断分析
ＥＬＰ−３断片をインビトロで生成するために、ＰＲ３またはＨＮＥと共に３７℃で２、４、２４、または４８時間エラスチンを培養した。エラスチンを緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で１ｍｇ／ｍｌの濃度で再構成した。切断溶液は、ＰＲ３では１００ｕｇ／ｍｌのエラスチンおよび１ｕｇ／ｍｌのプロテアーゼ、ＨＮＥ切断では１００ｕｇ／ｍｌのエラスチンおよび２ｕｇ／ｍｌのプロテアーゼの最終濃度を含有していた（緩衝液：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）。分析まで全ての溶液を即座に凍結した。
【００３５】
倫理的配慮
マウスで実施した作業は、国家機関によって承認された（動物実験検査局、承認番号：２０１３−１５−２９３４−００９５６）。全てのマウスを動物福祉ガイドラインに従って処理した。
【００３６】
ＣＯＰＤ患者でのＥＬＰ−３の評価は、Ｓａｎｄらによって以前説明されているコホートで実施した（１４）。この研究には、６８人の参加者が含まれ、ヘルシンキ宣言および良き臨床上の基準ガイドラインに準拠し、地元の倫理委員会によって承認された（試験計画番号Ｈ−６−２０１３−０１４）。全ての参加者に、全ての研究関連評価の前にインフォームドコンセントを提供した。
【００３７】
ＣＯＰＤ診断およびＦＥＶ１＜８０％の予測値を包含基準とした。研究前４週間以内に入院に至るＣＯＰＤの急性悪化を除外基準とした。ＣＯＰＤ患者のＥＬＰ−３レベルを、健康なドナーからの市販の対照血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉａｌ（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ，ＵＳＡ））のレベルと比較した。全ての測定を盲検で実施した。
【００３８】
統計分析
健康な対照とＣＯＰＤ患者とのＥＬＰ−３レベルの差を、両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの対応のない２群のｔ検定を使用して評価した。健康な対照とＣＯＰＤ患者との年齢比較は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの対応のない２群のｔ検定を使用して実施した。差は、ｐ＜０．０５である場合に統計的に有意とみなした。アスタリスクは次を示す：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。グラフは、平均±標準誤差の平均として示される。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））またはＭｅｄＣａｌｃ（Ｏｓｔｅｎｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で実施した。
【００３９】
結果
クローンの特徴評価
間接ＥＬＩＳＡにおいて標準ペプチド、伸長ペプチド、および切断ペプチドに対する反応性について、抗体産生ハイブリドーマ由来の上清をスクリーニングした。ペプチドビオチン−ＬＰＧＧＹＧＬＰＹＴを使用して、反応性をスクリーニングした。抗体クローンＮＢＨ１１６／６Ａ１０−Ｅ７−Ｄ１２をＥＬＰ−３に対して選択し、抗体を上清から精製した。これに基づいて、競合ＥＬＩＳＡアッセイを確立した。血清および血漿では天然の反応性が観察され、伸長ペプチドまたはナンセンスペプチドを使用して阻害は観察されなかった。
【００４０】
技術的評価
測定は、検量線の線形範囲に基づいて決定した。アッセイ内およびアッセイ間平均変動は、それぞれ、２．４〜１０％および４．７〜１４．５％の範囲であった。
【００４１】
ヒト血清およびクエン酸血漿（ただし、ＥＤＴＡおよびヘパリン血漿ではない）を１＋３で希釈すると、希釈の直線性が観察された。血清試料は、ペプチドまたは７つの異なる濃度の別の血清試料でスパイクした。血清およびペプチドの両方のスパイク回収は許容範囲内であった。平均回収率％の値は、スパイクされた試料の予想濃度と比較して±２０％以内であったため、許容可能であった。分析物の安定性は、４および２０℃での短期貯蔵中（最大４８時間）、凍結／サイクル中では許容可能であり、ヘモグロビン、脂質、またはビオチンは、２つのアッセイのいずれにおいてもシグナルが低減しなかった。
【００４２】
インビトロ分析−ＥＬＰ−３は、ＰＲ３によって生成される
ＥＬＰ−３がプロテアーゼ３切断に特異的であったかどうかを決定するために、異なるエラスターゼと共にエラスチンを培養した。ＥＬＰ−３は、２〜４８時間後にＰＲ３によって切断されたエラスチンによって生成した。ＥＬＰ−３によって認識される断片の検出可能なレベルは、ＨＮＥ切断によって生成したが、それぞれのアッセイと比較してはるかに低い濃度であった。アッセイでは、完全エラスチン、緩衝液対照、またはプロテアーゼ対照に対する交差反応性は観察されなかった。
【００４３】
健康な対照と比較して、ＣＯＰＤでは、ＥＬＰ−３レベルが増加した
ＣＯＰＤでＥＬＰ−３レベルが上昇するかどうかを決定するために、臨床的に安定なＣＯＰＤを有する６８人の患者の以前説明されているコホートでＥＬＰ−３を評価した。このうち２６人は、４週間後の再診にも出席した。比較のために、健康なドナーからの２２個の試料を含めた。人口統計は、表１に見ることができ、Ｓａｎｄらによって以前説明されている（１４）。
【表１】
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【００４４】
図１に実証されるように、ＥＬＰ−３は、健康な対象と比較すると、ＣＯＰＤ患者では統計的に上昇する（ｐ＜０．０００１）。
【００４５】
本明細書において、特に明示的に指示されない限り、「または（論理和）」という語は、条件のうちの１つのみが満たされることを必要とする演算子「排他的論理和」とは対照的に、記述される条件のうちの一方または両方が満たされるときに真の値を返すという演算子の意味で使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するものではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で認識される全ての先行する教示は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００４６】
参考文献
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２．Ｄｅｃｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２０１２，３７９：１３４１−１３５１
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５．Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１３，１５：ｅ８
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１０．Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ，１９９２，１４６：１１４３−１１４８
１１．Ｓｃｈｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ，１９９２，１４５：７６２−７６６
１２．Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２０１２，９４：１９２−２０２
１３．Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，１９７７，３：２３１−２３６
１４．Ｓａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ，２０１５，１６：６９
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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